(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｈｅｒ−２のレベルを、がんを有する被験体がＨｅｒ−２作用剤による治療に応答する可能性があるかどうかの、疾患の時間経過の、そして／または前記被験体のがんの時間経過における重要事象の可能性の指標とする方法であって、前記方法は、
前記被験体のがん由来の生物学的試料におけるＨｅｒ−２の発現を測定する工程
を含み、ここで、
前記生物学的試料が、低レベルのＨｅｒ−２、中程度に高レベルのＨｅｒ−２、または極めて高レベルのＨｅｒ−２を有するかが決定され、ここで、
前記低レベルは、Ｈｅｒ−２の量が第１のＨｅｒ−２閾値レベル以下であることを含み、
前記中程度に高レベルは、前記第１のＨｅｒ−２閾値レベルよりも高く、第２のＨｅｒ−２閾値レベル未満であるＨｅｒ−２の量を含み、そして、
前記極めて高レベルは、前記第２の閾値レベル以上のＨｅｒ−２の量を含み、ここで、前記第２の閾値レベルは、前記第１の閾値レベルより高く；
前記生物学的試料において測定されたＨｅｒ−２の前記量は、前記被験体がＨｅｒ−２作用剤による治療に応答する可能性、前記疾患の時間経過、および／または前記被験体のがんの時間経過における重要事象の可能性のうちの少なくとも一つと相関付けられ；そして
前記生物学的試料における中程度に高レベルのＨｅｒ−２は、Ｈｅｒ−２の前記量が低いかまたは極めて高い場合と比較して、前記被験体が、Ｈｅｒ−２作用剤による治療に応答する可能性がより高く、長い疾患の時間経過を有する可能性がより高く、そして／または重要事象を有する可能性がより低いことの指標となる、方法。
【請求項２】
前記方法が、
前記生物学的試料におけるＨｅｒ−３の発現を測定する工程をさらに含み、ここで、
前記生物学的試料における前記Ｈｅｒ−３の量が低いかまたは高いかが決定され、ここで、低いレベルは、第１の閾値レベル未満の前記Ｈｅｒ−３の量を含み、そして高いレベルは、第１の閾値レベル以上の前記Ｈｅｒ−３の量を含み；
前記生物学的試料において測定された前記Ｈｅｒ−２およびＨｅｒ−３の前記量は、前記被験体がＨｅｒ−２作用剤による治療に応答する相対的な可能性、前記疾患の時間経過、および／または前記被験体のがんの時間経過における重要事象の可能性のうちの少なくとも一つと相関付けられ、
中程度に高レベルのＨｅｒ−２、および低い量のＨｅｒ−３は、前記被験体が、Ｈｅｒ−２作用剤による治療に応答する可能性がより高く、長い疾患の時間経過を有する可能性がより高く、そして／または重要事象を有する可能性がより低いことの指標となる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記被験体のがんが、乳がんを含む、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記がんが、Ｈｅｒ２陽性がんを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
Ｈｅｒ−２および／またはＨｅｒ−３の前記量が、
前記生物学的試料を、Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−３に特異的な結合化合物、および切断誘導部分を有する切断プローブと接触させる工程であって、各結合化合物は切断可能な結合によって前記結合化合物に結合した分子タグを含む、工程、ならびに、
Ｈｅｒ−２および／またはＨｅｒ−３に特異的な前記結合化合物に対応する前記分子タグが放出されるかどうかを検出する工程
により測定される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｈｅｒ−２発現が、全Ｈｅｒ−２、Ｈｅｒ−２ホモ二量体、Ｈｅｒ−２ヘテロ二量体を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｈｅｒ−３発現が、Ｈｅｒ−３、Ｈｅｒ−３ホモ二量体、またはＨｅｒ−３／Ｈｅｒ−２ヘテロ二量体を含む、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記被験体のがんが、癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、リンパ腫、芽腫、肉腫、または白血病である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記被験体のがんが、扁平上皮がん、肺がん、消化器がん、膵臓がん、神経膠芽腫、子宮頚がん、卵巣がん、肝がん（ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、膀胱がん、肝がん（ｈｅｐａｔｏｍａ）、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝癌（ｈｅｐａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、および／または頭頚部がんを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記被験体のがんが、転移性がんまたは原発性がんを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記応答する可能性が、全生存率に関して、無増悪期間に関して、かつ／またはＲＥＣＩＳＴもしくは他の効果判定基準を用いて測定される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｈｅｒ−２作用剤が、トラスツズマブ、ラパチニブ、ＡＥＥ−７８８、または４Ｄ５のうちの少なくとも一つを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｈｅｒ−２作用剤が、トラスツズマブを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記重要事象が、前記がんに関する診断と、初回の診断、前記がんの１つの病期からより進行した病期への増悪、転移性疾患への増悪、再発、手術、または死亡のうちの少なくとも１つとの間の期間の短縮である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記生物学的試料が、ホルマリン固定されたパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
Ｈｅｒ−２発現および／もしくはＨｅｒ−３発現の量が、ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイ、ＦＲＥＴアッセイ、ＢＲＥＴアッセイ、ならびに／または生体分子補完および近接アッセイを用いて測定される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
Ｈｅｒ−２発現および／またはＨｅｒ−３発現の前記量が、試料におけるタンパク質間相互作用の量を測定および／または定量化することが可能なアッセイを用いて測定される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｈｅｒ−３発現が、Ｈｅｒ−３／Ｈｅｒ−２ヘテロ二量体を含む、請求項２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下、２００９年１月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／１４５，０２９号の利益を主張し、この米国仮特許出願の全体は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、Ｈｅｒ−２作用剤による治療が、癌患者に奏効する可能性があるかどうかを判定する方法を提供する。該方法は、ＨＥＲ３マーカーの存在または不在など、別のバイオマーカーを用いて、ＨＥＲ２陽性患者をさらに層別化することにより、ＨＥＲ２陽性患者のサブクラスの可能な無増悪期間を提供する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
Ｈｅｒ−２など、個々の細胞表面受容体の発現レベルが、バイオマーカーとして用いられている。Ｈｅｒ−２の過剰発現を検出し、Ｈｅｒ２作用剤、例えば、トラスツズマブによる治療が正当化されるかどうかを判定するのに、従来の免疫組織化学（ＩＨＣ）解析、または蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）解析が用いられてきた。また、特許文献１は、癌のバイオマーカーとしてのＨｅｒ−２発現について記載している。しかし、２つの異なる試験において、トラスツズマブ治療が実際に奏効したのは、Ｈｅｒ−２を過剰発現する患者の２０％または３５％に過ぎない。非特許文献１；非特許文献２；および非特許文献３を参照されたい。さらに、転移性乳癌状況でのトラスツズマブと化学療法との組合せについての他の試験においても、トラスツズマブ組合せ療法が実際に奏効したのは、Ｈｅｒ−２を過剰発現する患者の約５０％に過ぎない。非特許文献４を参照されたい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第４，９６８，６０３号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｂａｓｅｌｇａら、１９９６年、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  １４巻：７３７〜４４頁
【非特許文献２】Ｃｏｂｌｅｉｇｈら、１９９９年、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  １７巻：２６３９〜４８頁
【非特許文献３】Ｖｏｇｅｌら、２００２年、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ２０巻：７１９〜２６頁
【非特許文献４】Ｓｌａｍｏｎら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４４巻：７８３〜９２頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在のところ、トラスツズマブなどのＨｅｒ−２作用剤による治療が、癌を有する被験体に奏効する可能性があるかどうかを判定することは、問題でありうる。トラスツズマブおよび／または他のＨｅｒ作用剤がこのような患者に奏効する可能性がないかどうかが判定されれば、これらの患者に高価ではあるが有効でない治療を施すことが回避される。例えば、Ｈｅｒ−２作用剤に対する患者の感受性を判定するアッセイはまた、Ｈｅｒ−２作用剤に加えた、化学療法剤が奏効する可能性がない患者を同定し、これにより、化学療法剤の潜在的な毒性作用を回避することを被験体に可能とするのにも用いることができる。また、Ｈｅｒ−２作用剤に対する患者の感受性を判定するアッセイは、疾患の時間経過、またはＨｅｒ−２陽性患者の疾患において重要事象（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｅｖｅｎｔ）が生じる確率を予測するのにも用いることができる。したがって、癌患者に対する療法を最大化するように、Ｈｅｒ−２作用剤が該患者に奏効するかどうかを判定する方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、Ｈｅｒ−２作用剤による治療が、癌を有する被験体に奏効するかどうかを判定する方法を提供する。例えば、特定の実施形態では、本発明は、被験体に由来する生物学的試料における全Ｈｅｒ−２（Ｈ２Ｔ）またはＨｅｒ−２ホモ二量体のうちの少なくとも１つの量の相対レベルを、Ｈｅｒ−２作用剤による治療が該被験体に奏効する可能性についての予後診断と関連付ける方法であって、（ａ）該被験体の癌に由来する生物学的試料において、Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体のうちの少なくとも１つの量を検出するステップと；（ｂ）該Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量を、Ｈｅｒ−２作用剤による治療が該被験体に奏効する可能性についての予後診断と関連付けるステップとを含む方法を含む。
【０００８】
特定の実施形態では、本発明はまた、予測された、Ｈｅｒ−２作用剤に対する患者の感受性に基づき、癌を有する被験体における疾患の時間経過および／または該疾患の時間経過において重要事象が生じる確率を予測する方法も提供する。特定の実施形態では、方法は、本明細書の下記で説明される、Ｈｅｒ−２作用剤による治療の有効性（ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ）と関連するバイオマーカーまたはバイオマーカーの組合せを検出するステップと、該Ｈｅｒ−２作用剤による治療が該被験体に奏効する可能性があるかどうかを判定するステップとを含む。特定の実施形態では、方法は、バイオマーカーまたはバイオマーカーの組合せを検出するステップと、癌を有する被験体における疾患の増悪と関連する時間経過、または該疾患の時間経過において重要事象が生じる確率を予測するステップとを含む。
【０００９】
例えば、特定の実施形態では、本発明は、癌を有し、Ｈｅｒ−２作用剤により治療されている被験体に重要事象が生じる可能性があるかどうかを予測する方法であって、（ａ）該被験体の癌に由来する生物学的試料において、Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体のうちの少なくとも１つの量を検出するステップと；（ｂ）該Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量を、該被験体に重要事象が生じる可能性と関連付けるステップとを含む方法を含む。
【００１０】
他の態様では、本発明は、Ｈｅｒ−２作用剤による治療が、癌を有する被験体に奏効する可能性があるかどうかを判定する方法を対象とする。別の態様では、本発明は、疾患の時間経過を予測する方法を対象とする。別の態様では、本方法は、疾患の時間経過において重要事象が生じる確率を予測する方法を対象とする。
【００１１】
本発明の各々の方法の特定の実施形態では、方法は、被験体の癌に由来する生物学的試料において、Ｈｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量を検出するステップと、該Ｈｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体が、低レベルまたは高レベルのＨｅｒ−２発現と相関するかどうかを判定するステップとを含む。
【００１２】
本発明の各々の方法の特定の実施形態では、高いＨｅｒ−２発現は、ｌｏｇ１０Ｈ２Ｔ（全Ｈｅｒ−２についてのｌｏｇ１０）≧約１．１４〜１．１２５である。本明細書で開示される各々の方法の特定の実施形態では、高いＨｅｒ−２発現は、極めて高い発現、および／または中程度に高い発現を含む。本明細書で開示される各々の方法の特定の実施形態では、極めて高いＨｅｒ−２発現は、ｌｏｇ１０Ｈ２Ｔ≧約１．８４〜２．２１である。本明細書で開示される各々の方法の特定の実施形態では、中程度に高いＨｅｒ−２発現は、約１．１４〜１．２５と、約１．８４〜２．２１との間のｌｏｇ１０Ｈ２Ｔである（すなわち、≧１．１４〜１．２５かつ≦１．８４〜２．２１）。あるいは、患者コホートおよび／またはモニタリングされる重要事象に応じて、他の範囲も用いることができる。したがって、本明細書に記載される閾値および／または閾値範囲の各々は、ｌｏｇ１０目盛で記載する場合、約０．５ｌｏｇ単位、または線形目盛で約２５％以下（すなわち、本明細書で開示される具体的な範囲より≦２５％大きく、かつ／または≦２５％小さい）、もしくは約２０％以下、もしくは約１５％以下、もしくは約１０％以下、もしくは約５％以下変化しうる。
【００１３】
特定の実施形態では、Ｈｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量が高ければ、Ｈｅｒ−２作用剤が患者に奏効する可能性があり、かつ／または該患者は長い時間経過を有する。
【００１４】
一部の実施形態では、Ｈｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量が中程度に高ければ、Ｈｅｒ−２作用剤が患者に奏効する可能性あり、かつ／または該患者は長い時間経過を有する。
【００１５】
また、一部の実施形態では、Ｈｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量が極めて高く、および／または低ければ、Ｈｅｒ−２作用剤が患者に奏効する可能性がなく、かつ／または該患者は短い時間経過を有する。
【００１６】
したがって、特定の実施形態では、Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体のうちの少なくとも１つの量が、第１の閾値レベルを上回れば（例えば、「高い」場合）、Ｈｅｒ−２作用剤が奏効する可能性があると被験体が予後診断される。加えて、かつ／または代替的に、特定の実施形態では、かつ、本明細書でより詳細に論じられる通り、Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体のうちの少なくとも１つの量が、第１の閾値レベルより高い第２の閾値レベルを上回れば（例えば、「極めて高い」場合）、Ｈｅｒ−２作用剤が奏効する可能性がないと被験体が予後診断される。
【００１７】
特定の実施形態では、癌は乳癌である。一部の実施形態では、乳癌は、転移性である。一部の実施形態では、乳癌は、早期乳癌（すなわち、アジュバント療法）である。特定の実施形態では、Ｈｅｒ−２作用剤がトラスツズマブである。特定の実施形態では、方法を、ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイにより実施する。特定の実施形態では、奏効する可能性を、全生存率、無増悪期間に関して、かつ／またはＲＥＣＩＳＴもしくは他の効果判定基準（ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ）を用いて測定する。
【００１８】
特定の実施形態では、患者試料を、少なくとも３つの患者サブグループに分割することにより所定の量を創出する。例えば、特定の実施形態では、患者を、Ｈｅｒ−２発現（すなわち、全Ｈｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２二量体）が低いサブグループと、Ｈｅｒ−２発現が高いサブグループとに分割する。次いで、Ｈｅｒ−２発現が高いサブグループを、Ｈｅｒ−２発現が極めて高い群と、Ｈｅｒ−２発現が中程度に高い群とに細分化し得る。したがって、特定の実施形態では、そのＨｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体が極めて高い患者サブグループと、そのＨｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体が低いサブグループと、そのＨｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体が中程度に高いサブグループとに患者試料が分割されるように、サブグループの数が３つである。特定の実施形態では、被験体におけるＨｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量を、高いサブグループまたは低いサブグループと比較し、該患者におけるＨｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量が中程度に高ければ、Ｈｅｒ−２作用剤が患者に奏効する可能性があり、かつ／または該患者は長い時間経過を有する可能性がある。
【００１９】
例えば、本明細書で開示される各々の方法の特定の実施形態では、複数の患者試料を、少なくとも３つのサブグループに分割することにより所定の量（ｍｅａｓｕｒｅ）を創出し、第１のサブグループは、該Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体が低レベルである試料を含み、該低レベルは、該Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体のうちの少なくとも１つの量（ａｍｏｕｎｔ）が第１の閾値レベル以下であることを含み、該Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体のうちの少なくとも１つの量が該第１の閾値以上である試料は、該Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体が高レベルである試料を含み、次いで、該Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体が高レベルである該試料を、該Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体のうちの少なくとも１つの量が、該第１の閾値レベルより高い第２の閾値レベル以上である試料を含む極めて高いサブグループと、該Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体のうちの少なくとも１つの量が、該第１の閾値レベル以上であり、かつ、該第２の閾値レベル以下である試料を含む中程度に高いサブグループとの２つのサブグループに分割する。
【００２０】
Ｈｅｒ−２を測定する、本発明の方法の各々の実施形態では、Ｈｅｒ−３発現が、Ｈｅｒ−２、Ｈｅｒ−２ホモ二量体、またはＨｅｒ−２ヘテロ二量体を含みうる。例えば、特定の実施形態では、試料におけるタンパク質間相互作用の量を測定および／または定量化することが可能なアッセイを用いて全てのＨｅｒ−２、Ｈｅｒ−２ホモ二量体、および／またはＨｅｒ−２ヘテロ二量体の量を測定する。
【００２１】
別の実施形態では、そのＨｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体が中程度に高い（すなわち、中程度量（ｍｅｄｉｕｍ））サブグループを、別のバイオマーカーを発現するサブグループにさらに細分化する。他のバイオマーカーは、ＦＯＸＭ１、ＰＲＡＭＥ、Ｂｃ１２、ＳＴＫ１５、ＣＥＧＰ１、Ｋｉ−６７、ＧＳＴＭ１、ＣＡ９、ＰＲ、ＢＢＣ３、ＮＭＥ１、ＳＵＲＶ、ＧＡＴＡ３、ＴＦＲＣ、ＹＢ−１、ＤＰＹＤ、ＧＳＴＭ３、ＲＰＳ６ＫＢ１、Ｓｒｃ、Ｃｈｋ１、ＩＤ１、ＥｓｔＲ１、ｐ２７、ＣＣＮＢ１、ＸＩＡＰ、Ｃｈｋ２、ＣＤＣ２５Ｂ、ＩＧＦ１Ｒ、ＡＫ０５５６９９、Ｐ１３ＫＣ２Ａ、ＴＧＦＢ３、ＢＡＧＩ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＥｐＣＡＭ、ＶＥＧＦＣ、ｐＳ２、ｈＥＮＴ１、ＷＩＳＰ１、ＨＮＦ３Ａ、ＮＦＫＢｐ６５、ＢＲＣＡ２、ＥＧＦＲ、ＴＫ１、ＶＤＲ、Ｃｏｎｔｉｇ５１０３７、ｐＥＮＴ１、ＥＰＨＸ１、ＩＦ１Ａ、ＣＤＨ１、ＨＩＦｌα、ＩＧＦＢＰ３、ＣＴＳＢ、Ｈｅｒ３、またはＤＩＡＢＬＯのうちの少なくとも１つでありうる。特定の実施形態では、他のバイオマーカーが、ＶＥＧＦ、ＣＤ３１、ＫＤＲ、ｐ９５、またはＨｅｒ３でありうる。他の実施形態では、バイオマーカーが、Ｈｅｒ３でありうる。さらなるマーカーを用いて、Ｈｅｒ−２サブグループをさらに識別することができる。
【００２２】
特定の実施形態では、Ｈｅｒ−２が中程度に高い患者試料を、少なくとも２つの患者サブグループに分割することにより所定の量を創出する。特定の実施形態では、そのＨｅｒ−３発現が高い患者サブグループと、そのＨｅｒ３発現が低い別の患者サブグループとに患者試料が分割されるように、サブグループの数が２つである。
【００２３】
したがって、本発明の各々の方法の特定の実施形態では、中程度に高いサブグループを、Ｈｅｒ−３発現に基づきさらに分割し、ここで、高レベルは、Ｈｅｒ−３が第１の閾値レベル以上であることを含み、低レベルは、Ｈｅｒ−３が該第１の閾値レベルを下回ることを含み、該Ｈｅｒ−２作用剤は、該少なくとも１つのＨｅｒ−２および／もしくはＨｅｒ−２二量体が中程度に高レベルであり、かつ、Ｈｅｒ−３が低レベルである被験体に奏効する可能性があり、かつ／または該Ｈｅｒ−２作用剤は、該少なくとも１つのＨｅｒ−２および／もしくはＨｅｒ−２二量体が中程度に高レベルであり、かつ、Ｈｅｒ−３が高レベルである被験体に奏効する可能性がないかもしくは可能性が低い。
【００２４】
Ｈｅｒ−３を測定する場合は、Ｈｅｒ−３発現が、Ｈｅｒ−３、Ｈｅｒ−３ホモ二量体、またはＨｅｒ−３ヘテロ二量体を含みうる。例えば、特定の実施形態では、試料におけるタンパク質間相互作用の量を測定および／または定量化することが可能なアッセイを用いて全Ｈｅｒ−３、Ｈｅｒ−３ホモ二量体、および／またはＨｅｒ−３ヘテロ二量体（例えば、Ｈｅｒ２／Ｈｅｒ−３）の量を測定する。
【００２５】
例えば、一実施形態では、高いＨｅｒ３発現（低いＨｅｒ３発現と比較した）のカットオフ値が、０．１５８である。あるいは、約２５％低い値および／または約２５％高い値も用いることができる。したがって、本明細書に記載される閾値および／または閾値範囲の各々は、ｌｏｇ１０目盛で約０．５ｌｏｇ単位、かつ／または線形目盛で約２５％以下（すなわち、本明細書で開示される具体的な範囲より≦２５％大きく、かつ／または≦２５％小さい）、もしくは約２０％以下、もしくは約１５％以下、もしくは約１０％以下、もしくは約５％以下変化しうる。
【００２６】
高いＨｅｒ３対低いＨｅｒ３の実際のカットオフ値は、患者コホートおよび／またはモニタリングされる重要事象に応じて変化しうる。特定の実施形態では、サブグループ数が３つを超え、４つのサブグループ、５つのサブグループ、および６つのサブグループが含まれるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、奏効する可能性を、全生存率、無増悪期間に関して、かつ／またはＲＥＣＩＳＴもしくは他の効果判定基準を用いて測定する。特定の実施形態では、Ｈｅｒ−２作用剤が、トラスツズマブである。
【００２７】
別の態様では、本発明は、Ｈｅｒ２作用剤による治療がＨｅｒ−２陽性癌を有する被験体に奏効し、かつ／または疾患の時間経過が長いかどうかを判定する方法を対象とする。別の態様では、本発明は、Ｈｅｒ−２陽性癌を有する被験体における疾患の時間経過を予測する方法を対象とする。別の態様では、本発明は、Ｈｅｒ−２陽性癌を有する被験体において重要事象が生じる確率を予測する方法を対象とする。
【００２８】
したがって、開示される本発明の各々の方法の特定の実施形態では、方法は、被験体の癌に由来する生物学的試料においてＨｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量を測定するステップを含み、該Ｈｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量が中程度に高く、Ｈｅｒ−３発現が低ければ、Ｈｅｒ−２作用剤が患者に奏効する可能性があり、かつ／または該患者は長い時間経過を有する。特定の実施形態では、方法は、被験体の癌に由来する生物学的試料においてＨｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量を測定するステップを含み、該Ｈｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量が中程度に高く、Ｈｅｒ−３発現が高ければ、Ｈｅｒ−２作用剤が患者に奏効する可能性がなく、かつ／または該患者は短い時間経過を有する。特定の実施形態では、生物学的試料は、ＦＦＰＥを含む。特定の実施形態では、被験体の癌は乳癌である。特定の実施形態では、乳癌は、転移性である。特定の実施形態では、乳癌は、早期乳癌（すなわち、アジュバント療法）である。特定の実施形態では、Ｈｅｒ−２作用剤はトラスツズマブである。
【００２９】
特定の実施形態では、Ｈｅｒ−２の量を測定する。特定の実施形態では、Ｈｅｒ−２ホモ二量体の量を測定する。例えば、特定の実施形態では、いずれの測定値によっても同じ予後診断適応（すなわち、Ｈｅｒ−２作用剤が患者に奏効するかどうか）がもたらされるように、全Ｈｅｒ−２レベルが、Ｈｅｒ−２ホモ二量体レベルに相関する。特定の実施形態では、試料におけるタンパク質間相互作用の量を測定および／または定量化することが可能なアッセイを用いてＨｅｒ−２ホモ二量体の量を測定する。特定の実施形態では、アッセイは、ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイである。特定の実施形態では、奏効する可能性を、全生存率、無増悪期間に関して、かつ／またはＲＥＣＩＳＴもしくは他の効果判定基準を用いて測定する。
【００３０】
別の態様では、本発明は、Ｈｅｒ２作用剤による治療が、Ｈｅｒ２陽性癌を有する被験体に奏効する可能性がなく、かつ／または該患者が短い時間経過を有するかどうかを判定する方法を提供する。特定の実施形態では、方法は、被験体の癌に由来する生物学的試料においてＨｅｒ−２量を検出するステップを含み、該Ｈｅｒ−２量が低ければ、Ｈｅｒ２作用剤による治療が該被験体に奏効する可能性がなく、かつ／または該患者が短い時間経過を有する。特定の好ましい実施形態では、Ｈｅｒ２作用剤は、トラスツズマブである。
【００３１】
別の態様では、本発明は、Ｈｅｒ２作用剤に加えた、少なくとも１つの化学療法剤による治療が、Ｈｅｒ２陽性癌を有する被験体に奏効する可能性がなく、かつ／または該患者が短い時間経過を有する可能性があるかどうかを判定する方法を対象とする。特定の実施形態では、方法は、被験体の癌に由来する生物学的試料において、Ｈｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量を測定するステップを含み、該Ｈｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体のレベルが高く、および／または極めて高ければ、Ｈｅｒ２作用剤に加えた、少なくとも１つの化学療法剤が該被験体に奏効する可能性がない。
【００３２】
特定の実施形態では、生物学的試料は、ＦＦＰＥを含む。特定の実施形態では、被験体の癌は乳癌である。特定の実施形態では、乳癌は、転移性である。他の実施形態では、乳癌は、早期乳癌（すなわち、アジュバント療法）である。特定の実施形態では、Ｈｅｒ−２作用剤はトラスツズマブである。特定の実施形態では、化学療法剤は、パクリタキセルである。特定の実施形態では、全Ｈｅｒ−２量を測定する。特定の実施形態では、Ｈｅｒ−２ホモ二量体の量を測定する。特定の実施形態では、試料におけるタンパク質間相互作用の量を測定および／または定量化することが可能なアッセイを用いてＨｅｒ−２ホモ二量体の量を測定する。特定の実施形態では、アッセイは、ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイである。特定の実施形態では、奏効する可能性を、全生存率、無増悪期間に関して、かつ／またはＲＥＣＩＳＴもしくは他の効果判定基準を用いて測定する。
【００３３】
さらに別の態様では、本発明は、Ｈｅｒ−２を測定するキットと、Ｈｅｒ−２発現を、Ｈｅｒ２作用剤による治療が患者に奏効する可能性があるという可能性と関連付けるための指示書とを提供する。特定の実施形態では、本発明はまた、予測された、Ｈｅｒ２作用剤に対する患者の感受性に基づき、癌を有する被験体における疾患の時間経過および／または該疾患の時間経過において重要事象が生じる確率を予測するためのキットも提供する。特定の実施形態では、キットは、さらなるマーカーを測定するための試薬を含む。他のバイオマーカーは、ＦＯＸＭ１、ＰＲＡＭＥ、Ｂｃ１２、ＳＴＫ１５、ＣＥＧＰ１、Ｋｉ−６７、ＧＳＴＭ１、ＣＡ９、ＰＲ、ＢＢＣ３、ＮＭＥ１、ＳＵＲＶ、ＧＡＴＡ３、ＴＦＲＣ、ＹＢ−１、ＤＰＹＤ、ＧＳＴＭ３、ＲＰＳ６ＫＢ１、Ｓｒｃ、Ｃｈｋ１、ＩＤ１、ＥｓｔＲ１、ｐ２７、ＣＣＮＢ１、ＸＩＡＰ、Ｃｈｋ２、ＣＤＣ２５Ｂ、ＩＧＦ１Ｒ、ＡＫ０５５６９９、Ｐ１３ＫＣ２Ａ、ＴＧＦＢ３、ＢＡＧＩ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＥｐＣＡＭ、ＶＥＧＦＣ、ｐＳ２、ｈＥＮＴ１、ＷＩＳＰ１、ＨＮＦ３Ａ、ＮＦＫＢｐ６５、ＢＲＣＡ２、ＥＧＦＲ、ＴＫ１、ＶＤＲ、Ｃｏｎｔｉｇ５１０３７、ｐＥＮＴ１、ＥＰＨＸ１、ＩＦ１Ａ、ＣＤＨ１、ＨＩＦｌα、ＩＧＦＢＰ３、ＣＴＳＢ、Ｈｅｒ３、またはＤＩＡＢＬＯのうちの少なくとも１つでありうる。特定の実施形態では、他のバイオマーカーは、ＶＥＧＦ、ＣＤ３１、ＫＤＲ、ｐ９５、またはＨｅｒ３でありうる。
【００３４】
本明細書で開示される各々の実施形態のさらなる態様では、本発明は、癌を有する被験体を治療する方法を提供する。一態様では、方法は、本発明の方法により、Ｈｅｒ−２作用剤による治療が奏効する可能性があり、かつ／または長い時間経過を有する癌に被験体が罹患していることを判定するステップと、前記判定の結果として、該被験体に有効量のＨｅｒ−２作用剤を投与するステップとを含む。別の態様では、方法は、本発明の方法により、Ｈｅｒ−２作用剤による治療が奏効する可能性がある癌に被験体が罹患していることを判定し、次いで、該被験体に有効量のＨｅｒ−２作用剤を投与する治療選択肢について、医療従事者に助言するステップを含む。別の態様では、方法は、増悪が速く、かつ／またはＨｅｒ２作用剤に加えた化学療法剤が奏効する可能性がない癌に被験体が罹患していることを判定するステップを含む。特定の実施形態では、Ｈｅｒ−２作用剤はトラスツズマブである。特定の実施形態では、化学療法剤は、パクリタキセルである。特定の実施形態では、癌は乳癌である。特定の実施形態では、乳癌は、転移性である。
【００３５】
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
被験体に由来する生物学的試料におけるＨｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体のうちの少なくとも１つの量の相対レベルを、Ｈｅｒ−２作用剤による治療が前記被験体に奏効する可能性についての予後診断と関連付ける方法であって、
（ａ）前記被験体のがんに由来する生物学的試料において、前記Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体のうちの少なくとも１つの量を検出するステップと、
（ｂ）前記Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量を、Ｈｅｒ−２作用剤による治療が前記被験体に奏効する可能性についての予後診断と関連付けるステップと
を含む方法。
（項目２）
がんが、転移性乳がん、または原発性早期乳がん（すなわち、アジュバント療法）のうちの少なくとも１つである、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体のうちの前記少なくとも１つの前記量が、第１の閾値レベル以上であれば、前記Ｈｅｒ−２作用剤が奏効する可能性があると前記被験体が予後診断される、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体のうちの前記少なくとも１つの前記量が、前記第１の閾値レベルより高い第２の閾値レベル以上であれば、前記Ｈｅｒ−２作用剤が奏効する可能性がないと前記被験体が予後診断される、項目１に記載の方法。
（項目５）
複数の患者試料を、少なくとも３つのサブグループに分割することにより所定の量を創出し、第１のサブグループは、前記Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体が低レベルである試料を含み、前記低レベルは、前記Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体のうちの前記少なくとも１つの量が第１の閾値レベル以下であることを含み、前記Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体のうちの前記少なくとも１つの量が前記第１の閾値を上回る前記試料は、前記Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体が高レベルである試料を含み、次いで、前記Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体が高レベルである前記試料を、前記Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体のうちの前記少なくとも１つの量が、前記第１の閾値レベルより高い第２の閾値レベル以上である試料を含む極めて高いサブグループと、前記Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体のうちの前記少なくとも１つの量が、前記第１の閾値レベル以上であり、かつ、前記第２の閾値レベル以下である試料を含む中程度に高いサブグループとの２つのサブグループに分割する、項目１に記載の方法。
（項目６）
試料におけるタンパク質間相互作用の量を測定および／または定量化することが可能なアッセイを用いて前記Ｈｅｒ−２ホモ二量体の量を測定する、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記Ｈｅｒ−２が中程度に高いサブグループを、少なくとも１つの他のバイオマーカーを発現するサブグループにさらに細分化する、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記少なくとも１つの他のバイオマーカーが、ＦＯＸＭ１、ＰＲＡＭＥ、Ｂｃ１２、ＳＴＫ１５、ＣＥＧＰ１、Ｋｉ−６７、ＧＳＴＭ１、ＣＡ９、ＰＲ、ＢＢＣ３、ＮＭＥ１、ＳＵＲＶ、ＧＡＴＡ３、ＴＦＲＣ、ＹＢ−１、ＤＰＹＤ、ＧＳＴＭ３、ＲＰＳ６ＫＢ１、Ｓｒｃ、Ｃｈｋ１、ＩＤ１、ＥｓｔＲ１、ｐ２７、ＣＣＮＢ１、ＸＩＡＰ、Ｃｈｋ２、ＣＤＣ２５Ｂ、ＩＧＦ１Ｒ、ＡＫ０５５６９９、Ｐ１３ＫＣ２Ａ、ＴＧＦＢ３、ＢＡＧＩ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＥｐＣＡＭ、ＶＥＧＦＣ、ｐＳ２、ｈＥＮＴ１、ＷＩＳＰ１、ＨＮＦ３Ａ、ＮＦＫＢｐ６５、ＢＲＣＡ２、ＥＧＦＲ、ＴＫ１、ＶＤＲ、Ｃｏｎｔｉｇ５１０３７、ｐＥＮＴ１、ＥＰＨＸ１、ＩＦ１Ａ、ＣＤＨ１、ＨＩＦｌα、ＩＧＦＢＰ３、ＣＴＳＢ、Ｈｅｒ３、ＤＩＡＢＬＯ、ＶＥＧＦ、ＣＤ３１、ＫＤＲ、またはｐ９５のうちの少なくとも１つを含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記少なくとも１つの他のバイオマーカーのレベルに基づき、前記Ｈｅｒ−２が中程度量である試料および／または前記Ｈｅｒ−２が高量である試料を、少なくとも２つのサブグループに分割することにより所定の量を作製する、項目７に記載の方法。
（項目１０）
前記中程度に高いサブグループを、Ｈｅｒ−３発現に基づきさらに分割し、ここで、高レベルは、Ｈｅｒ−３が第１の閾値レベルを上回ることを含み、低レベルは、Ｈｅｒ−３が第２の閾値レベルを下回ることを含み、前記Ｈｅｒ−２作用剤は、前記少なくとも１つのＨｅｒ−２および／もしくはＨｅｒ−２二量体が中程度に高レベルであり、かつ、Ｈｅｒ−３が低レベルである被験体に奏効する可能性があり、かつ／または前記Ｈｅｒ−２作用剤は、前記少なくとも１つのＨｅｒ−２および／もしくはＨｅｒ−２二量体が中程度に高レベルであり、かつ、Ｈｅｒ−３が高レベルである被験体に奏効する可能性がないかもしくは可能性が低い、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記Ｈｅｒ−３発現が、Ｈｅｒ−３、Ｈｅｒ−３ホモ二量体、またはＨｅｒ−３／Ｈｅｒ−２ヘテロ二量体を含む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
試料におけるタンパク質間相互作用の量を測定および／または定量化することが可能なアッセイを用いて前記Ｈｅｒ−３ホモ二量体および／またはＨｅｒ−２／Ｈｅｒ−３ヘテロ二量体の量を測定する、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
がんを有し、Ｈｅｒ−２作用剤により治療されている被験体に重要事象が生じる可能性があるかどうかを予測する方法であって、
（ａ）前記被験体のがんに由来する生物学的試料において、Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体のうちの少なくとも１つの量を検出するステップと、
（ｂ）前記Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量を、前記被験体に重要事象が生じる可能性と関連付けるステップと
を含む方法。
（項目１４）
前記がんが、転移性乳がん、または原発性早期乳がん（すなわち、アジュバント療法）のうちの少なくとも１つである、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記重要事象が、前記がんに関する診断と、初回の診断、前記がんの１つの病期からより進行した病期への増悪、転移性疾患への増悪、再発、手術、または死亡のうちの少なくとも１つとの間の期間の短縮である、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
前記重要事象が生じうる間の時間経過を予測するステップをさらに含む、項目１３に記載の方法。
（項目１７）
前記Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体のうちの前記少なくとも１つの前記量が、第１の閾値レベル以下であれば、前記重要事象は、前記Ｈｅｒ−２作用剤が前記被験体に奏効する可能性が低いことである、項目１３に記載の方法。
（項目１８）
前記Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体のうちの前記少なくとも１つの前記量が、前記第１の閾値レベルより高い第２の閾値レベル以上であれば、前記Ｈｅｒ−２作用剤が前記被験体に奏効する可能性がないと前記被験体が予後診断される、項目１３に記載の方法。
（項目１９）
複数の患者試料を、少なくとも３つのサブグループに分割することにより所定の量を創出し、第１のサブグループは、前記Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体が低レベルである試料を含み、前記低レベルは、前記Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体のうちの前記少なくとも１つの量が第１の閾値レベル以下であることを含み、前記Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体のうちの前記少なくとも１つの量が前記第１の閾値以上である試料は、前記Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体が高レベルである試料を含み、次いで、前記Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体が高レベルである前記試料を、前記Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体のうちの前記少なくとも１つの量が、前記第１の閾値レベルより高い第２の閾値レベル以上である試料を含む極めて高いサブグループと、前記Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体のうちの前記少なくとも１つの量が、前記第１の閾値レベル以上であり、かつ、前記第２の閾値レベル以下である試料を含む中程度に高いサブグループとの２つのサブグループに分割する、項目１３に記載の方法。
（項目２０）
試料におけるタンパク質間相互作用の量を測定および／または定量化することが可能なアッセイを用いて前記Ｈｅｒ−２ホモ二量体の量を測定する、項目１３に記載の方法。
（項目２１）
前記中程度量であるサブグループを、少なくとも１つの他のバイオマーカーを発現するサブグループにさらに細分化する、項目１３に記載の方法。
（項目２２）
前記少なくとも１つの他のバイオマーカーが、ＦＯＸＭ１、ＰＲＡＭＥ、Ｂｃ１２、ＳＴＫ１５、ＣＥＧＰ１、Ｋｉ−６７、ＧＳＴＭ１、ＣＡ９、ＰＲ、ＢＢＣ３、ＮＭＥ１、ＳＵＲＶ、ＧＡＴＡ３、ＴＦＲＣ、ＹＢ−１、ＤＰＹＤ、ＧＳＴＭ３、ＲＰＳ６ＫＢ１、Ｓｒｃ、Ｃｈｋ１、ＩＤ１、ＥｓｔＲ１、ｐ２７、ＣＣＮＢ１、ＸＩＡＰ、Ｃｈｋ２、ＣＤＣ２５Ｂ、ＩＧＦ１Ｒ、ＡＫ０５５６９９、Ｐ１３ＫＣ２Ａ、ＴＧＦＢ３、ＢＡＧＩ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＥｐＣＡＭ、ＶＥＧＦＣ、ｐＳ２、ｈＥＮＴ１、ＷＩＳＰ１、ＨＮＦ３Ａ、ＮＦＫＢｐ６５、ＢＲＣＡ２、ＥＧＦＲ、ＴＫ１、ＶＤＲ、Ｃｏｎｔｉｇ５１０３７、ｐＥＮＴ１、ＥＰＨＸ１、ＩＦ１Ａ、ＣＤＨ１、ＨＩＦｌα、ＩＧＦＢＰ３、ＣＴＳＢ、Ｈｅｒ３、ＤＩＡＢＬＯ、ＶＥＧＦ、ＣＤ３１、ＫＤＲ、またはｐ９５を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記Ｈｅｒ−２が中程度に高い試料を、前記少なくとも１つの他のバイオマーカーのレベルみ基づき、重要事象が生じる時間経過が異なる可能性がある、少なくとも２つのサブグループに分割することにより所定の量を作製する、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
被験体に由来する生物学的試料におけるＨｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体のうちの少なくとも１つの量の相対レベルを、Ｈｅｒ−２作用剤による治療が前記被験体に奏効する可能性についての予後診断と関連付けるためのキットであって、
（ａ）前記被験体のがんに由来する生物学的試料において、前記Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体のうちの少なくとも１つの量を検出するための試薬と、
（ｂ）前記Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量を、Ｈｅｒ−２作用剤による治療が前記被験体に奏効する可能性についての予後診断と関連付けるための指示書と
を含むキット。
本発明は、以下の非限定的な図を参照することにより、よく理解されうる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、本発明の実施形態による、ＦＦＰＥ  ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイの概要を示す図である。
【図２Ａ】図２Ａおよび図２Ｂは、本発明の代替的な実施形態による、反応性の一重項酸素の拡散によりＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）レポーター分子と抗体との間の共有結合が切断されるＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）反応を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ａおよび図２Ｂは、本発明の代替的な実施形態による、反応性の一重項酸素の拡散によりＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）レポーター分子と抗体との間の共有結合が切断されるＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）反応を示す図である。
【図３】図３は、４つのよく特徴付けられた乳癌細胞系に対して生成したＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）シグナルの代表的な電気泳動図を、相当するＨｅｒ−２のＩＨＣ顕微鏡写真と一緒に示した図である。グラフの左側は細胞系を示し、真ん中は対応する電気泳動図を示し、右側は本発明の実施形態による、対応するＩＨＣを示す。
【図４】図４は、本発明の実施形態による、全ＨＥＲ２陽性患者についての無増悪期間（ＴＴＰ）を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明の実施形態による、Ｈｅｒ２遺伝子増幅のＦＩＳＨ検出によって決定されたＨＥＲ２陰性またはＨＥＲ２陽性である患者についてのＴＴＰを示すグラフである。
【図６】図６は、本発明の実施形態による、遺伝子増幅のＦＩＳＨ測定によるカテゴリー化に関係なく、トラスツズマブを用いた治療が奏効しない低ＨＥＲ２発現体（ｅｘｐｒｅｓｓｏｒ）である患者についてのＴＴＰを示すグラフである。
【図７】図７は、本発明の実施形態による、トラスツズマブを用いた治療が奏効しない、非常に高いＨＥＲ２発現体（Ｈ２Ｔ≧１．８４）である患者および／または低ＨＥＲ２発現体（ＦＩＳＨにかかわらず、Ｈ２Ｔ＜１．１４）である患者、ならびに中程度に高いレベルのＨＥＲ２発現（１．１４〜１．８４のＨ２Ｔ）を有する患者についてのＴＴＰを示すグラフである。
【図８】図８は、本発明の実施形態による、ＨＥＲ３過剰発現（Ｈ３Ｔｈｉ）またはＨＥＲ３過小発現（Ｈ３Ｔｌｏ）によってさらに層別化することができ、ここでＨＥＲ３過小発現が、ＨＥＲ３過剰発現と比較してトラスツズマブを用いた治療の奏効性（ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ）の増大に関連する、中程度に高いＨＥＲ２量を有し、ＦＩＳＨによる測定が陽性である患者についてのＴＴＰを示すグラフである。
【図９】図９は、本発明の実施形態による、原発性早期（すなわち、アジュバント療法）Ｈｅｒ−２陽性実例（ｓａｍｐｌｅ）の試験を示すグラフである。パネルＢは、Ｈ２Ｔ＞２．２１のカットオフを有するＣＩＳＨ陽性、非常に高いＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）Ｈ２Ｔである患者は、パネルＡに示したＨｅｒ−２がさほど高くない実例と比較して、化学療法にトラスツズマブを加えることにほとんど利益がないことを示している。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本明細書で用いられる「実施形態」および「態様」という用語は、互換的に用いられる。
【００３８】
別段に指示しない限り、本明細書で用いられる「約」という用語は、該用語により修飾される値を上回るかまたは下回る範囲が１０％を超えない値を指す。例えば、「約５μｇ／ｋｇ」という用語は、４．５μｇ／ｋｇ〜５．５μｇ／ｋｇの範囲を意味する。別の例として記すと、「約１時間」とは、４８分間〜７２分間の範囲を意味する。
【００３９】
「抗体」とは、特定の空間的および極性的構成を有する別の分子に特異的に結合し、したがって、これと相補的なものとして定義される、免疫グロブリンを意味する。抗体は、モノクローナル抗体の場合もあり、ポリクローナル抗体の場合もあり、組換え抗体の場合もあり、宿主の免疫および血清の回収など、当技術分野で周知の技法により調製することもでき（ポリクローナル抗体）、ハイブリッドの継代細胞系（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｈｙｂｒｉｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）を調製して、分泌されるタンパク質を回収することにより調製することもでき（モノクローナル抗体）、少なくとも、天然抗体の特異的な結合に必要とされるアミノ酸配列を少なくともコードするヌクレオチド配列またはそれらの変異誘発異形をクローニングして発現させることにより調製することもできる。抗体は、完全免疫グロブリンを包含する場合もあり、その断片を包含する場合もあり、これらの免疫グロブリンは、ＩｇＡ；ＩｇＤ；ＩｇＥ；ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、およびＩｇＧ３；ＩｇＭなど、各種のクラスおよびアイソタイプを包含する。これらの断片には、Ｆａｂ、ＦｖおよびＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’などが含まれうる。抗体はまた、単鎖抗体もしくはその抗原結合断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、または、特定の結合部位に対して特異的な結合活性を保持する、当業者に公知の他の任意の抗体誘導体でもありうる。加えて、適切な場合は、特定の結合部位に対する結合親和性が維持される限りにおいて、免疫グロブリンまたはそれらの断片の凝集体、ポリマー、およびコンジュゲートを用いることもできる。放出可能な分子タグ（下記で説明される）を用いるようなアッセイを含め、イムノアッセイにおいて用いられる抗体および抗体誘導体を作製および選択する際の指針は、容易に入手可能な教科書およびマニュアル、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８年、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  ＨｏｗａｒｄおよびＢｅｔｈｅｌｌ、２００１年、「Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ」、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；  Ｗｉｌｄ編、１９９４年、「Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋにおいて見出すことができる。
【００４０】
「抗体結合組成物」とは、１つ以上の抗体、または分子に結合する抗原結合断片を含み、その結合特異性がこのような抗体または抗体結合断片に由来する、分子または分子複合体を意味する。抗体結合組成物には、（ｉ）第１の抗体が標的分子に特異的に結合し、第２の抗体が該第１の抗体の定常領域に特異的に結合する抗体対；標的分子と、ビオチン部分を介して、分子タグまたは光増感剤などの部分により誘導体化されたストレプトアビジンタンパク質とに特異的に結合するビオチン化抗体；（ｉｉ）標的分子に対して特異的であり、デキストランなどのポリマーにコンジュゲートし、ポリマーが、共有結合により直接的に、またはストレプトアビジン−ビオチン結合を介して間接的に、分子タグまたは光増感剤などの部分により誘導体化されている抗体；（ｉｉｉ）標的分子に特異的であり、ビーズ、もしくはマイクロビーズ、または他の固相支持体にコンジュゲートし、ビーズ、もしくはマイクロビーズ、または他の固相支持体が、分子タグもしくは光増感剤、または後者を含有するポリマーなどの部分により直接的または間接的に誘導体化されている抗体が含まれるがこれらに限定されない。
【００４１】
「抗原決定基」または「エピトープ」とは、単一の抗体分子が結合する分子、通常はタンパク質の表面における部位を意味する。一般に、タンパク質は、数個または多くの異なる抗原決定基を有し、異なる特異性を有する抗体と反応する。好ましい抗原決定基は、タンパク質のリン酸化部位である。
【００４２】
「結合化合物」とは、抗体結合組成物、抗体、ペプチド、細胞表面受容体に対するペプチドリガンドもしくはペプチド以外のリガンド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸などのオリゴヌクレオチド類似体、レクチン、あるいは、標的タンパク質もしくは標的分子、またはタンパク質複合体など、目的の検体との安定的な複合体形成物に特異的に結合することが可能な他の任意の分子実体を指すものとする。一態様では、以下の式により表わされうる結合化合物が、結合部分に結合している１つ以上の分子タグを含む。
【００４３】
「結合部分」とは、分子タグを直接的または間接的に結合させうる任意の分子であって、検体に特異的に結合することが可能な分子を意味する。結合部分には、抗体、抗体結合組成物、ペプチド、タンパク質、核酸、ならびに、分子量が最大で約１０００ドルトンであり、水素、炭素、酸素、窒素、硫黄、およびリンからなる群から選択される原子を含有する有機分子が含まれるがこれらに限定されない。結合部分は、抗体または抗体結合組成物であることが好ましい。
【００４４】
「癌」および「癌性」は、制御不能の細胞増殖を特徴とすることが典型的である、哺乳動物を含めた生物の生理的状態を指すか、またはこれについて記載する。癌（ｃａｎｃｅｒ）の例には、癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、リンパ腫、芽腫、肉腫、および白血病が含まれるがこれらに限定されない。このような癌のより具体的な例には、扁平上皮癌、肺癌、例えば、小細胞肺癌または非小細胞肺癌、；消化器癌、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頚癌、卵巣癌、肝癌（ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、膀胱癌、肝癌（ｈｅｐａｔｏｍａ）、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌（ｈｅｐａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、および各種の頭頚部癌が含まれる。
【００４５】
「化学療法剤」とは、状態、特に、癌を治療するのに用いられる化学物質、主に、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤を意味する。化学療法剤には、本明細書に記載のパクリタキセルなどの化合物が含まれるものとする。
【００４６】
本明細書で用いられる「切断可能な結合」とは、切断可能な結合で結合部分に連結されている分子タグの構造を分解しないか、またはその検出特性に影響を与えることのない条件下で切断されうる、化学結合基を指す。
【００４７】
本明細書で用いられる「切断誘導部分」または「切断剤」とは、好ましくは、酸化により切断可能な結合を切断することが可能な活性種をもたらす基である。活性種とは、その切断誘導効果が、その発生部位の近接距離内だけにおいて存在するように、短寿命の活性を示す化学種であることが好ましい。
【００４８】
本明細書で用いられる「切断プローブ」とは、本明細書で定義される切断誘導部分と、抗体結合組成物、抗体、ペプチド、細胞表面受容体に対するペプチドリガンドもしくはペプチド以外のリガンド、ビオチンもしくはストレプトアビジンなどのタンパク質、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸などのオリゴヌクレオチド類似体、レクチン、あるいは、標的タンパク質もしくは標的分子、またはタンパク質複合体など、目的の検体との安定的な複合体形成物に特異的に結合することが可能な他の任意の分子実体とを含む試薬を指す。
【００４９】
「ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）」「ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）」および「ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイ」は互換的に用いられ、単一アッセイならびに多重アッセイおよび多重標識アッセイ；試薬、分析手順、ならびにこれらのアッセイに関連するソフトウェアが含まれるがこれらに限定されない、このようなアッセイを実施および利用するための材料、方法、および技法を指す。このようなアッセイは、本出願のほか、任意の図面を含め、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，１０５，３０８号において開示されている。
【００５０】
「ＦＦＰＥ」とは、固定された、特に、従来のホルマリンで固定されたパラフィン包埋試料である、一群の細胞またはある量の組織を指す。このような試料は、顕微鏡のスライドまたは同等の表面に載せた固定組織の、例えば、３〜１０μｍの厚さである、薄い切片の形態で、限定されないが、受容体複合体についてのアッセイで用いられることが典型的である。このような試料はまた、アッセイによる測定の一部として、またはその準備として、従来の再水和手順、ならびに、場合によって、抗原回復手順を経ることが典型的である。
【００５１】
本明細書で用いられる「ハザード比」とは、相対危険度の推定値をもたらすのに用いられる統計的方法を指す。「ハザード比」とは、１つの群対別の群について予測されるハザード間の比である。例えば、Ｈｅｒ−２作用剤が疾患の遠い再発までの期間（ｔｉｍｅ  ｔｏ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅ）を延長させるのに有効であるかどうかについて、Ｈｅｒ−２作用剤により治療される患者集団対Ｈｅｒ−２作用剤によらずに治療される患者集団を評価することができる。次いで、ハザード比を、Ｈｅｒ−２ホモ二量体対全Ｈｅｒ−２比など、独立の量と比較することができる。ハザード比が１未満であるときのＨｅｒ−２ホモ二量体対全Ｈｅｒ−２比では、Ｈｅｒ−２作用剤による治療が、有効である可能性がある。ハザード比が１と区別できないときのＨｅｒ−２ホモ二量体対全Ｈｅｒ−２比では、Ｈｅｒ−２作用剤による治療が、有効である可能性が低い。
【００５２】
本明細書では、「Ｈｅｒ−２」、「ＥｒｂＢ２」、「ｃ−Ｅｒｂ−Ｂ２」、「ＨＥＲ２」、「Ｈｅｒ２」および「ｎｅｕ」が互換的に用いられ、例えば、Ｓｅｍｂａら、１９８５年、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．  ＵＳＡ  ８２巻：６４９７〜６５０頁；およびＹａｍａｍｏｔｏら、１９８６年、Ｎａｔｕｒｅ  ３１９巻：２３０〜２３４頁；ならびにＧｅｎｅｂａｎｋ受託番号Ｘ０３３６３において記載される通り、天然のＨｅｒ−２と、その対立遺伝子変異体とを指す。別段に示さない限り、本明細書で用いられる場合の「Ｈｅｒ−２」、「ＥｒｂＢ２」、「ｃ−Ｅｒｂ−Ｂ２」、「ＨＥＲ２」、および「Ｈｅｒ２」は、ヒトタンパク質を指す。本明細書では、Ｈｅｒ２をコードする遺伝子を、「ｅｒｂＢ２」と称する。本明細書で用いられるＨ２Ｔとは、例えば、ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）であるがこれに限定されない方法により示される通り、全Ｈｅｒ−２発現を指すものとする。
【００５３】
本明細書で用いられる「Ｈｅｒ−２作用剤」とは、Ｈｅｒ−２、またはＨｅｒ−２発現細胞、またはＨｅｒ−２陽性癌細胞の生物学的活性を阻害しうる化合物を指す。このような生物学的活性には、二量体化、自己リン酸化、別の受容体のリン酸化、シグナル伝達などが含まれるがこれらに限定されない。生物学的活性には、細胞の生存および細胞の増殖が含まれうるがこれらに限定されず、Ｈｅｒ−２作用剤によるこのような活性の阻害は、直接的または間接的な細胞殺滅（例えば、ＡＤＣＣ）、タンパク質複合体もしくは複合体形成の破壊、タンパク質輸送の調節、または酵素阻害でありうる。生物学的活性にはまた、本出願に記載の患者への効果（ｒｅｓｐｏｎｓｅ）も含まれうる。例示的なＨｅｒ−２作用剤には、高分子である４Ｄ５およびトラスツズマブ、ならびにＡＥＥ−７８８およびラパチニブなどの低分子が含まれるがこれらに限定されない。細胞表面におけるＨｅｒ−２膜受容体との関連における「Ｈｅｒ−２ホモ二量体」とは、２つ以上の膜結合Ｈｅｒ−２タンパク質の複合体を意味する。二量体は通常、互いと接触する２つの受容体からなる。二量体は、細胞表面膜において、ファンデルワールス相互作用など、受動的過程により創出される場合もあり、リガンドにより誘導される二量体化、共有結合、細胞構成要素との相互作用など、能動的過程により創出される場合もある。例えば、Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ、２０００年、Ｃｅｌｌ  １０３巻：２１１〜２２５頁を参照されたい。本明細書で用いられる「二量体」という用語は、文脈から別段に理解されるのでない限り、「細胞表面における膜受容体の二量体」を指すことが理解される。本明細書で用いられるＨ２２Ｄとは、例えば、ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）であるがこれに限定されない方法により示される通り、定量化された二量体を指すものとする。
【００５４】
「Ｈｅｒ−２ホモ二量体対全Ｈｅｒ−２比」とは、当業者に利用可能な任意の単一の定量的方法による、被験体の組織に由来する試料における全Ｈｅｒ−２量により除したＨｅｒ−２ホモ二量体の量について記載する量を指す。
【００５５】
本明細書で用いられる「Ｈｅｒ−２陽性」の癌、癌細胞、被験体、または患者とは、ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（登録商標）（カリフォルニア州、カーペンテリア、ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ社製）を用いる場合に少なくとも２のスコアを示す癌、細胞、被験体、もしくは患者、またはＦＩＳＨなどにより同定された癌、癌細胞、被験体、もしくは患者を指す。特定の実施形態では、Ｈｅｒ−２陽性細胞が、ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（登録商標）を用いて少なくとも２＋または３＋のスコアを示す。
【００５６】
「高い（ｈｉｇｈ）」とは、量が正常の量より大きいこと、所定の量などの標準の量より大きいこと、またはあるサブグループの量が別のサブグループの量より比較的大きいことを指す。例えば、高いＨｅｒ−２とは、Ｈｅｒ−２量が、正常のＨｅｒ−２量より大きいことを指す。正常のＨｅｒ−２量は、当業者に利用可能な任意の方法により決定することができる。高いＨｅｒ−２はまた、量が、所定のカットオフ値など、所定の量以上であることも指す場合がある。高いＨｅｒ−２はまた、高いＨｅｒ−２であるサブグループのＨｅｒ−２レベルが、別のサブグループのＨｅｒ−２レベルより比較的高い場合のＨｅｒ−２量も指すことがある。例えば、限定されないが、本明細書によれば、中央値などであるがこれに限定されない、数学的に決定された点の近傍で試料を分割し、このようにして、その量が高い（すなわち、中央値より高い）サブグループと、その量が低い別のサブグループとを創出することにより、２つの異なる患者サブグループを創出することができる。例えば、ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）、または、ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（登録商標）など、任意の標準的な免疫組織化学（ＩＨＣ）法などであるがこれらに限定されない、当業者に公知の任意の方法を用いることにより、Ｈｅｒ−２を測定することができる。別の例として、高Ｈｅｒ−２ホモ二量体とは、Ｈｅｒ−２陽性である特定の患者試料セットにおいて、Ｈｅｒ−２ホモ二量体量が、正常のホモＨｅｒ−２二量体量より大きいことを指す。正常のＨｅｒ−２ホモ二量体量は、当業者に利用可能な任意の方法により決定することができる。高Ｈｅｒ−２ホモ二量体はまた、量が、所定のカットオフなど、所定の量より大きいことも指す場合がある。高Ｈｅｒ−２ホモ二量体はまた、高Ｈｅｒ−２ホモ二量体であるサブグループのＨｅｒ−２ホモ二量体レベルが、別のサブグループのＨｅｒ−２ホモ二量体レベルより比較的高い場合のＨｅｒ−２ホモ二量体量も指すことがある。蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）法、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）法、近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）法、二量体特異的抗体もしくはＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）、または当業者に周知の他の任意の方法など、当技術分野で公知の任意の方法により、Ｈｅｒ−２ホモ二量体を測定することができる。別の例として、高Ｈｅｒ−２ホモ二量体対全Ｈｅｒ−２比とは、１つ以上のサブグループのＨｅｒ−２ホモ二量体対全Ｈｅｒ−２比の量が、中間のまたは低いサブグループの比より大きいことを指す。高Ｈｅｒ−２ホモ二量体対全Ｈｅｒ−２比は、当業者に利用可能な任意の個々の定量的方法により決定することができる。場合によって、「高い」発現レベルは、極めて高い発現範囲と、「中程度に高い」発現範囲とを含む場合があり、この場合、中程度に高レベルとは、正常レベルよりは大きいが、「極めて高レベル」には満たない発現レベルである。本明細書では、高いＨｅｒ−２発現（極めて高いＨｅｒ−２発現および中程度に高いＨｅｒ−２発現を含めた）の例示的な範囲が示される。
【００５７】
本明細書で用いられる「中程度に高い（ｍｏｄｅｒａｔｅｌｙ  ｈｉｇｈ）」、「中程度値」、または「中間の（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）」とは、量が、「低い」量より大きく、かつ、極めて「高い」量より小さいことを指す。例えば、「中間の」は、少なくとも３つのサブグループのうちの１つ以上が、Ｈｅｒ−２ホモ二量体対全Ｈｅｒ−２比の量の中程度の範囲内に収まることについて記載するのに用いることができる。
【００５８】
本明細書で用いられる「〜する可能性がある」とは、項目、対象、事柄、または患者（ｐｅｒｓｏｎ）が生じる確率が高いことを指す。したがって、一例では、トラスツズマブによる治療が奏効する可能性がある被験体は、参照の被験体または被験体群と比べて、トラスツズマブによる治療が奏効する確率が高い。
【００５９】
本明細書で用いられる「長い」とは、期間である量が正常の量より長いこと、所定の量などの標準の量より長いこと、またはあるサブグループの量が別のサブグループの量より相対的に長いことを指す。例えば、患者の寿命との関連で、増悪までの期間が長いとは、無増悪期間が、代表的な（ｎｏｒｍａｌ）無増悪期間（ｔｉｍｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）よりも長いことを指す。増悪までの期間が長いかどうかは、当業者に利用可能な任意の方法により決定することができる。「長い」は、例えば、無増悪も包含しうる。一実施形態では、「長い」とは、期間が、疾患において重要事象が生じるのに必要な時間経過の中央値より長いことを指す。
【００６０】
「低い」とは、量が正常の量より小さいこと、所定の量などの標準の量より小さいこと、またはあるサブグループの量が別のサブグループの量より比較的小さいことを指す用語である。例えば、低Ｈｅｒ−２とは、Ｈｅｒ−２陽性である特定の患者試料セットにおいて、Ｈｅｒ−２量が、正常のＨｅｒ−２量より小さいことを意味する。正常のＨｅｒ−２量は、当業者に利用可能な任意の方法により決定することができる。低Ｈｅｒ−２はまた、量が、所定のカットオフなど、所定の量より小さい方法を指す場合もある。低Ｈｅｒ−２はまた、低Ｈｅｒ−２であるサブグループが、別のサブグループより比較的低い場合の量も意味することがある。例えば、限定なしに、本明細書によれば、中央値などであるがこれに限定されない、数学的に決定された点の近傍で試料を分割し、このようにして、その量が高い別の群に関して、その量が低い（すなわち、中央値より小さい）群を創出することにより、２つの異なる患者サブグループを創出することができる。例えば、ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）、または、ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（登録商標）方法など、任意の標準的な免疫組織化学（ＩＨＣ）法などであるがこれらに限定されない、当業者に公知の任意の方法により、Ｈｅｒ−２を測定することができる。別の例として、低Ｈｅｒ−２ホモ二量体とは、Ｈｅｒ−２陽性である特定の患者試料セットにおいて、Ｈｅｒ−２ホモ二量体量が、正常のホモＨｅｒ−２二量体量より小さいことを指す。低Ｈｅｒ−２ホモ二量体はまた、量が、所定のカットオフなど、所定の量より小さいことも意味する場合がある。低Ｈｅｒ−２ホモ二量体はまた、低Ｈｅｒ−２ホモ二量体であるサブグループが、別のサブグループのＨｅｒ−２ホモ二量体より比較的低い場合の量も意味することがある。蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）法、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）法、近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）法、二量体特異的抗体もしくはＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）、または当業者に周知の他の任意の方法など、当技術分野で公知の任意の方法により、Ｈｅｒ−２ホモ二量体を測定することができる。別の例として、低Ｈｅｒ−２ホモ二量体対全Ｈｅｒ−２比とは、１つ以上のサブグループのＨｅｒ−２ホモ二量体対全Ｈｅｒ−２比の量が、中間のまたは高いサブグループの比より小さいことを指す。低Ｈｅｒ−２ホモ二量体対全Ｈｅｒ−２比は、当業者に利用可能な任意の個々の定量的方法により決定することができる。本明細書では、低Ｈｅｒ−２発現値の例示的な範囲が示される。
【００６１】
本明細書で用いられる「分子タグ」とは、分離される分子間における、電気泳動移動度、分子量、形状、溶解性、ｐＫａ、疎水性、電荷、電荷／質量比、極性などが含まれるがこれらに限定されない、１つ以上の、物理的、化学的、または光学的差違に基づき、他の分子から識別することができる分子を指す。一態様では、複数の分子タグまたは分子タグのセットは、電気泳動移動度および光学的検出特性において異なり、電気泳動により分離することができる。別の態様では、複数の分子タグまたは分子タグのセットが、分子量、形状、溶解性、ｐＫａ、疎水性、電荷、極性において異なり、正相もしくは逆相のＨＰＬＣ、イオン交換ＨＰＬＣ、キャピラリー電気クロマトグラフィー、質量分析、気相クロマトグラフィーなどの技法により分離することができる。
【００６２】
本明細書で用いられる「最適のカットオフ」とは、２つの属性カテゴリー間の最良の識別を可能とする、特定の属性を示す被験体についての所定の量を指す。例えば、最適のカットオフ値を見出すことにより、高いＨ２Ｔ発現および低いＨ２Ｔ発現など、ＯＳを決定するための２つのカテゴリー間の最良の識別が可能となる。最適のカットオフを用いて、これより低い値、またはその最適のカットオフより高い値を示す被験体を分けて、予測モデルを最適化する、例えば、該モデルの特異性を最大化するか、該モデルの感度を最大化するか、転帰の差違を最大化するか、またはハザード比もしくは反応（ｒｅｓｐｏｎｓｅ）の差違に由来するｐ値を最小化するなどであるがこれらに限定されない。
【００６３】
「全生存期間」または「ＯＳ」とは、治療の開始から死亡または打ち切りまでに測定される期間を指す。打ち切りは、試験の終了または治療の変更から生じうる。全生存期間とは、例えば、治療の開始から死亡または打ち切りまでの期間である特定の期間において生存する、キャプラン−マイヤープロットで表わされる場合の確率などの確率を指す場合がある。
【００６４】
「光増感剤」とは、光により活性化されると、酸素分子を一重項酸素に転換する、光吸収分子を意味するものとする。
【００６５】
「ＲＥＣＩＳＴ」とは、「固形腫瘍における効果の評価基準」を表わす頭字語を意味するものとし、これは、治療期間において、癌患者が、改善する場合（「奏効」）、同じ状態にとどまる場合（「安定」）、または増悪する場合（「増悪」）を定義する一連の公表規則である。ＲＥＣＩＳＴ基準により定義される効果（ｒｅｓｐｏｎｓｅ）は、例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、９２巻、３号、２０００年２月２日において公表されており、ＲＥＣＩＳＴ基準は、他の同様に公表された定義および規則のセットを包含しうる。当業者であれば、「ＰＲ」、「ＣＲ」、「ＳＤ」、および「ＰＤ」など、本明細書で用いられるＲＥＣＩＳＴ基準に準拠する定義を理解する。
【００６６】
「相対蛍光単位」または「ＲＦＵ」は互換的に用いられ、標準値と比較した人為の蛍光単位を用いる、特定のキャピラリー電気泳動ピークの時間による積分を指すものとする。ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）の場合、ＲＦＵは、キャピラリー電気泳動に注入されたＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）の濃度に比例するが、例えば、注入およびキャピラリーの差違により、ある予測されるばらつきが導入される。
【００６７】
「相対ピーク面積」または「ＲＰＡ」は互換的に用いられ、特定のＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）によるＲＦＵと、既知および一定の濃度による、既知の内部蛍光標準によるＲＦＵとの比を指すものとする。
【００６８】
本明細書で用いられる通り、治療の「有効性」、治療が「奏効する」、ならびにこの動詞の他の形態は、Ｈｅｒ−２作用剤による治療に対する被験体の反応を指す。例として、被験体における腫瘍の増殖が約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上遅延すれば、Ｈｅｒ−２作用剤による治療が被験体に奏効する。別の例では、被験体における腫瘍が、任意の適切な量、例えば、質量または容量により決定したときに約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％以上縮小すれば、Ｈｅｒ−２作用剤による治療が被験体に奏効する。別の例では、被験体の予測寿命が、治療薬を投与しない場合に予測される予測寿命より約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％以上長くなれば、Ｈｅｒ−２作用剤による治療が被験体に奏効する。別の例では、被験体の無病生存期間、全生存期間、または無増悪期間が長くなれば、Ｈｅｒ−２作用剤による治療が被験体に奏効する。上記の通り、ＲＥＣＩＳＴ基準を含め、いくつかの方法を用いて、治療が患者に奏効するかどうかを判定することができる。
【００６９】
「試料」または「組織試料」または「患者試料」または「患者の細胞試料もしくは組織試料」または「被検物」は各々が、被験体または患者の組織から得られる同様の細胞の回収物を指す。組織試料の供給源は、新鮮な内臓試料もしくは組織試料、凍結および／もしくは保存した内臓試料もしくは組織試料、または生検もしくは吸引物などに由来する固体組織の場合もあり；血液または任意の血液構成成分の場合もあり；脳脊髄液、羊水、腹水、または間質液などの体液の場合もあり；被験体の妊娠または発達の任意の時点に由来する細胞の場合もある。組織試料は、防腐剤、抗凝固剤、バッファー、固定剤、栄養物、抗生物質などのような、天然の組織と天然では混合しない化合物を含有しうる。細胞は、ＦＦＰＥ法など、従来の方法により固定することができる。
【００７０】
本明細書で用いられる「短い」とは、期間である量が正常の量より短いこと、所定の量などの標準の量より短いこと、またはあるサブグループの量が別のサブグループの量より相対的に短いことを指す。例えば、患者の寿命との関連で、増悪までの期間が短いとは、無増悪期間が代表的な（ｎｏｒｍａｌ）無増悪期間（ｔｉｍｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）より短いことを指す。増悪までの期間が短いかどうかは、当業者に利用可能な任意の方法により決定することができる。一実施形態では、「短い」とは、疾患において重要事象が生じるのに必要な時間経過の中央値より短い期間を指す。
【００７１】
本明細書で用いられる「重要事象」とは、当業者により重要であると判定される、患者の疾患における事象を指すものとする。重要事象の例には、例えば、初回の診断、死亡、再発、患者の疾患が転移性であるという判定、患者の疾患の再発、または患者の疾患が、上記で言及した病期のうちの任意の１つから別の病期に進行することが含まれるがこれらに限定されない。重要事象とは、ＯＳ、ＴＴＰを評価するのに用いられ、かつ／または当業者により判定される通り、ＲＥＣＩＳＴもしくは他の効果判定基準を用いてＯＳ、ＴＴＰを評価するのに用いられる任意の重要な事象でありうる。
【００７２】
本明細書で用いられる「被験体」および「患者」という用語は、互換的に用いられる。本明細書で用いられる「被験体（ｓｕｂｊｅｃｔ）」および「被験体（ｓｕｂｊｅｃｔｓ）」は、動物、好ましくは霊長動物以外（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ロバ、ヤギ、ラクダ、ネコ、イヌ、モルモット、ラット、マウス、またはヒツジ）と、霊長動物（例えば、カニクイザルなどのサル、ゴリラ、チンパンジー、またはヒト）とを含めた哺乳動物を指す。
【００７３】
本明細書で用いられる「時間経過」とは、初期事象と後続事象との間の期間の量を指すものとする。例えば、患者の癌の場合、時間経過は、患者の疾患に関し、疾患の進行における重要事象を判断することにより測定することが可能であり、例えば、最初の事象が診断であり、後続事象が転移でありうる。
【００７４】
「無増悪期間」または「ＴＴＰ」とは、治療の開始から癌の増悪または打ち切りまでに測定される期間を指す。打ち切りは、試験の終了から生じる場合もあり、治療の変更から生じる場合もある。無増悪期間はまた、例えば、キャプラン−マイヤープロットなどにおける確率としても表わすことができ、この場合、無増悪期間は、治療の開始から増悪または打ち切りまでの間の期間である特定の期間にわたり無増悪である確率を表わしうる。
【００７５】
「治療する」、「治療」、およびこの語の他の形態は、Ｈｅｒ−２作用剤を投与して、癌の増殖を阻害し、癌の重量もしくは容積を縮小させ、被験体の予測生存期間および／または腫瘍の無増悪期間を延長させることなどを指す。
【００７６】
「〜する可能性がない」とは、項目、対象、事柄、または患者が生じる確率が低いことを指す。したがって、トラスツズマブに加えたパクリタキセルによる治療が奏効する可能性がない被験体は、参照の被験体または被験体群と比べて、パクリタキセルおよびトラスツズマブによる治療が奏効する確率が低い。
【００７７】
したがって、本発明の実施形態は、Ｈｅｒ−２作用剤による治療が、癌を有する被験体に奏効する可能性があるかどうかを判定する方法、ならびに／または癌を有する被験体における疾患の時間経過および／もしくは該疾患の時間経過において重要事象が生じる確率を予測する方法を提供する。特定の実施形態では、方法は、本明細書に記載されるＨｅｒ−２作用剤による治療の有効性と関連するバイオマーカーまたはバイオマーカーの組合せを検出するステップと、該Ｈｅｒ−２作用剤による治療が被験体に奏効する可能性があるかどうかを判定するステップとを含む。特定の実施形態では、方法は、バイオマーカーまたはバイオマーカーの組合せを検出するステップと、癌を有する被験体における疾患の増悪と関連する疾患の時間経過、または該疾患の時間経過において重要事象が生じる確率を予測するステップとを含む。
【００７８】
一態様では、本発明は、Ｈｅｒ−２作用剤による治療が、癌を有する被験体に奏効する可能性があるかどうかを判定する方法を対象とする。別の態様では、本発明は、疾患の時間経過を予測する方法を対象とする。別の態様では、本方法は、疾患の時間経過において重要事象が生じる確率を予測する方法を対象とする。
【００７９】
特定の実施形態では、患者の疾患の進行における重要事象間の期間を決定することにより、時間経過を測定し、測定により、患者が長い時間経過を有するかどうかが予測される。例えば、好ましい実施形態では、重要事象は、初回の診断から死亡までの増悪である。好ましい実施形態では、重要事象は、初回の診断から転移性疾患までの増悪である。好ましい実施形態では、重要事象は、初回の診断から再発までの増悪である。好ましい実施形態では、重要事象は、転移性疾患から死亡までの増悪である。好ましい実施形態では、重要事象は、転移性疾患から再発までの増悪である。好ましい実施形態では、重要事象は、再発から死亡までの増悪である。特定の実施形態では、全生存率、無増悪期間との関連で、かつ／またはＲＥＣＩＳＴ基準もしくは他の効果判定基準を用いて、時間経過を測定する。
【００８０】
特定の実施形態では、方法は、被験体の癌に由来する生物学的試料においてＨｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量を検出するステップを含み、該Ｈｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量が高ければ、Ｈｅｒ−２作用剤が患者に奏効する可能性があり、かつ／または該患者は長い時間経過を有する。
【００８１】
したがって、特定の実施形態では、本発明は、被験体に由来する生物学的試料におけるＨｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体のうちの少なくとも１つの量の相対レベルを、Ｈｅｒ−２作用剤による治療が該被験体に奏効する可能性についての予後診断と関連付ける方法であって、（ａ）該被験体の癌に由来する生物学的試料において、該Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体のうちの少なくとも１つの量を検出するステップと；（ｂ）該Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量を、Ｈｅｒ−２作用剤による治療が該被験体に奏効する可能性についての予後診断と関連付けるステップとを含む方法を含む。
【００８２】
特定の実施形態では、Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体のうちの少なくとも１つの量が、第１の閾値レベル以上であれば、Ｈｅｒ−２作用剤が奏効する可能性があると被験体が予後診断される。加えて、かつ／または代替的に、Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体のうちの少なくとも１つの量が、第１の閾値レベルより高い第２の閾値レベル以上であれば、Ｈｅｒ−２作用剤が奏効する可能性がないと被験体が予後診断される。
【００８３】
また、特定の実施形態では、複数の被験体試料を、少なくとも３つのサブグループに分割することにより所定の量を創出し、第１のサブグループは、該Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体が低レベルである試料を含み、該低レベルは、該Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体のうちの少なくとも１つの量が第１の閾値レベル以下であることを含み、該Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体のうちの少なくとも１つの量が該第１の閾値以上である試料は、該Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体が高レベルである試料を含み、次いで、該Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体が高レベルである該試料を、該Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体のうちの少なくとも１つの量が、該第１の閾値レベルより高い第２の閾値レベル以上である試料を含む極めて高いサブグループと、該Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体のうちの少なくとも１つの量が、該第１の閾値レベル以上であり、かつ、該第２の閾値レベル以下である試料を含む中程度に高いサブグループとの２つのサブグループに分割する。
【００８４】
本明細書で論じられる通り、特定の実施形態では、試料におけるタンパク質間相互作用の量を測定および／または定量化することが可能なアッセイを用いてＨｅｒ−２ホモ二量体の量を測定する。
【００８５】
本発明の各々の方法の特定の実施形態では、高いＨｅｒ−２発現は、ｌｏｇ１０Ｈ２Ｔ≧約１．１４〜１．１２５である。本明細書で開示される各々の方法の特定の実施形態では、高いＨｅｒ−２発現は、極めて高い発現、および／または中程度に高い発現を含む。本明細書で開示される各々の方法の特定の実施形態では、極めて高いＨｅｒ−２発現は、ｌｏｇ１０Ｈ２Ｔ≧約１．８４〜２．２１である。本明細書で開示される各々の方法の特定の実施形態では、中程度に高いＨｅｒ−２発現は、１．１４〜１．２５と、１．８４〜２．２１との間である。あるいは、患者コホートおよび／またはモニタリングされる重要事象に応じて、他の範囲（すなわち、本明細書に記載される、最大で約２５％大きいかまたは小さい範囲）も用いることができる。
【００８６】
特定の実施形態では、癌は乳癌である。一部の実施形態では、乳癌は、転移性である。一部の実施形態では、乳癌は、早期乳癌（すなわち、アジュバント療法）である。または、Ｈｅｒ−２作用剤に対して感受性でありうる任意の癌をモニタリングすることができる。Ｈｅｒ−２作用剤は、任意のＨｅｒ−２作用剤でありうる。特定の実施形態では、Ｈｅｒ−２作用剤は、本明細書に記載される薬剤のうちの１つである。例えば、特定の実施形態では、Ｈｅｒ−２作用剤は、トラスツズマブである。
【００８７】
本発明の各々の方法の特定の実施形態では、中程度に高いＨｅｒ−２サブグループを、少なくとも１つの他のバイオマーカーを発現するサブグループにさらに細分化する。例えば、一部の実施形態では、少なくとも１つの他のバイオマーカーのレベルに基づき、Ｈｅｒ−２が中程度量である試料および／またはＨｅｒ−２が高い試料を、少なくとも２つのサブグループに分割することにより所定の量をもたらす。
【００８８】
代替的な実施形態では、少なくとも１つの他のバイオマーカーは、ＦＯＸＭ１、ＰＲＡＭＥ、Ｂｃ１２、ＳＴＫ１５、ＣＥＧＰ１、Ｋｉ−６７、ＧＳＴＭ１、ＣＡ９、ＰＲ、ＢＢＣ３、ＮＭＥ１、ＳＵＲＶ、ＧＡＴＡ３、ＴＦＲＣ、ＹＢ−１、ＤＰＹＤ、ＧＳＴＭ３、ＲＰＳ６ＫＢ１、Ｓｒｃ、Ｃｈｋ１、ＩＤ１、ＥｓｔＲ１、ｐ２７、ＣＣＮＢ１、ＸＩＡＰ、Ｃｈｋ２、ＣＤＣ２５Ｂ、ＩＧＦ１Ｒ、ＡＫ０５５６９９、Ｐ１３ＫＣ２Ａ、ＴＧＦＢ３、ＢＡＧＩ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＥｐＣＡＭ、ＶＥＧＦＣ、ｐＳ２、ｈＥＮＴ１、ＷＩＳＰ１、ＨＮＦ３Ａ、ＮＦＫＢｐ６５、ＢＲＣＡ２、ＥＧＦＲ、ＴＫ１、ＶＤＲ、Ｃｏｎｔｉｇ５１０３７、ｐＥＮＴ１、ＥＰＨＸ１、ＩＦ１Ａ、ＣＤＨ１、ＨＩＦｌα、ＩＧＦＢＰ３、ＣＴＳＢ、Ｈｅｒ３、ＤＩＡＢＬＯ、ＶＥＧＦ、ＣＤ３１、ＫＤＲ、またはｐ９５のうちの少なくとも１つを含む。
【００８９】
例えば、特定の実施形態では、中程度に高いサブグループを、Ｈｅｒ−３発現に基づきさらに分割し、高いレベルは、Ｈｅｒ−３が第１の閾値レベル以上であることを含み、低レベルは、Ｈｅｒ−３が該第１の閾値レベルを下回ることを含み、該Ｈｅｒ−２作用剤は、該少なくとも１つのＨｅｒ−２および／もしくはＨｅｒ−２二量体が中程度に高いレベルであり、かつ、Ｈｅｒ−３が低いレベルである被験体に奏効する可能性があり、かつ／または該Ｈｅｒ−２作用剤は、該少なくとも１つのＨｅｒ−２および／もしくはＨｅｒ−２二量体が中程度に高いレベルであり、かつ、Ｈｅｒ−３が高いレベルである被験体に奏効する可能性がないかもしくは可能性が低い。Ｈｅｒ−３を測定する場合は、Ｈｅｒ−３発現が、Ｈｅｒ−３、Ｈｅｒ−３ホモ二量体、またはＨｅｒ−３ヘテロ二量体（例えば、Ｈｅｒ−２／Ｈｅｒ−３）を含みうる。
【００９０】
特定の実施形態では、アッセイを、ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイにより実施する。特定の実施形態では、奏効する可能性を、全生存率、無増悪期間に関して、かつ／またはＲＥＣＩＳＴもしくは他の効果判定基準を用いて測定する。
【００９１】
特定の実施形態では、方法は、被験体の癌に由来する生物学的試料において、Ｈｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量を検出するステップを含み、該Ｈｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量が、中程度に高い（例えば、中程度量）、患者群を、高いＨｅｒ−３発現体および低いＨｅｒ−３発現体にさらに細分化しうる。この実施形態では、Ｈｅｒ−２作用剤が、Ｈｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体が中程度に高く、Ｈｅｒ−３が低い患者に奏効し、かつ／または患者は長い時間経過を有する。代替的な実施形態では、Ｈｅｒ−３発現は、Ｈｅｒ−３、Ｈｅｒ−３ホモ二量体、またはＨｅｒ−３／Ｈｅｒ−２ヘテロ二量体の発現でありうる。
【００９２】
Ｈｅｒ２およびＨｅｒ３の両方を測定する特定の実施形態では、癌は乳癌である。一部の実施形態では、乳癌は、転移性である。他の実施形態では、乳癌は、早期乳癌（すなわち、アジュバント療法）である。または、Ｈｅｒ−２作用剤に対して感受性である他の癌をモニタリングすることができる。Ｈｅｒ−２作用剤は、任意のＨｅｒ−２作用剤でありうる。特定の実施形態では、Ｈｅｒ−２作用剤は、本明細書に記載される薬剤のうちの１つである。例えば、特定の実施形態では、Ｈｅｒ−２作用剤は、トラスツズマブである。特定の実施形態では、アッセイを、ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイにより実施する。特定の実施形態では、奏効する可能性を、全生存率、無増悪期間に関して、かつ／またはＲＥＣＩＳＴもしくは他の効果判定基準を用いて測定する。
【００９３】
特定の実施形態では、患者試料を、少なくとも２つの患者サブグループに分割することにより所定の量を創出する。特定の実施形態では、そのＨｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体が極めて高い患者サブグループと、そのＨｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体が低いサブグループと、そのＨｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体が中程度に高い（すなわち、中程度量である）サブグループとに患者試料が分割されるように、サブグループの数が３つである。次いで、各々のサブグループを、そのＨｅｒ−３が高量または中程度量であるサブグループにさらに細分化することができる。
【００９４】
Ｈｅｒ−２ホモ二量体レベルは、全Ｈｅｒ−２レベルと密接に相関しうる。したがって、本発明の各々の方法の特定の実施形態では、被験体におけるＨｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量を、極めて高いサブグループ、中程度に高いサブグループ、または低いサブグループのうちの少なくとも１つと比較する。患者におけるＨｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量が中程度に高く、Ｈｅｒ−３発現が低ければ、Ｈｅｒ−２作用剤が患者に奏効する可能性があり、かつ／または該患者は長い時間経過を有する可能性がある。患者におけるＨｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量が中程度に高く、Ｈｅｒ−３発現が高ければ、Ｈｅｒ−２作用剤が患者に奏効する可能性がなく、かつ／または該患者は短い時間経過を有する可能性がある。特定の実施形態では、サブグループ数が２つより多く、３つのサブグループ、４つのサブグループ、５つのサブグループ、および６つのサブグループが含まれるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、奏効する可能性を、全生存率、無増悪期間に関して、かつ／またはＲＥＣＩＳＴ基準を用いて測定する。特定の好ましい実施形態では、Ｈｅｒ−２作用剤が、トラスツズマブである。
【００９５】
特定の実施形態では、所定の量が、最適のカットオフである。このような最適のカットオフは、本明細書で開示されており、本発明の特定の実施形態は、本明細書で言及および開示される量に近似される量を包含することを意味する。特定の実施形態では、被験体におけるＨｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量を、最適のカットオフと比較して、該患者におけるＨｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量が中程度に高ければ（例えば、１．１４〜１．２５  Ｈ２Ｔと、１．８４〜２．２１  Ｈ２Ｔとの間）、Ｈｅｒ−２作用剤が患者に奏効する可能性があり、かつ／または該患者は長い時間経過を有する可能性がある。別の実施形態では、Ｈｅｒ−２量が高ければ、Ｈｅｒ−２作用剤が患者に奏効する可能性があり、かつ／または該患者は長い時間経過を有する可能性がある。別の実施形態では、Ｈｅｒ−２量が高く、Ｈｅｒ−２ホモ二量体の量が低く、かつ／またはＨｅｒ−２ホモ二量体対Ｈｅｒ−２比が低値であれば、Ｈｅｒ−２作用剤が患者に奏効する可能性があり、かつ／または該患者は長い時間経過を有する可能性がある。別の実施形態では、Ｈｅｒ−２量が高く、Ｈｅｒ−２二量体の量が高ければ、Ｈｅｒ−２作用剤が患者に奏効する可能性があり、かつ／または該患者は長い時間経過を有する可能性がある。
【００９６】
別の態様では、本発明は、Ｈｅｒ２作用剤による治療がＨｅｒ−２陽性癌を有する被験体に奏効し、かつ／または疾患の時間経過が長いかどうかを判定する方法を対象とする。別の態様では、本発明は、Ｈｅｒ−２陽性癌を有する被験体における疾患の時間経過を予測する方法を対象とする。別の態様では、本発明は、Ｈｅｒ−２陽性癌を有する被験体において重要事象が生じる確率を予測する方法を対象とする。
【００９７】
例えば、本発明は、癌を有し、Ｈｅｒ−２作用剤により治療されている被験体に重要事象が生じる可能性があるかどうかを予測する方法であって、（ａ）該被験体の癌に由来する生物学的試料において、Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体のうちの少なくとも１つの量を検出するステップと；（ｂ）該Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量を、該被験体に重要事象が生じる可能性と関連付けるステップとを含む方法を含み得る。
【００９８】
ある実施形態では、重要事象が、癌についての診断と、初回の診断、１つの病期からより進行した病期への癌の増悪、転移性疾患への増悪、再発、手術、または死亡のうちの少なくとも１つとの間の期間が短縮されることである。また、特定の実施形態では、方法は、重要事象が生じうる間の時間経過を予測するステップもさらに含みうる。
【００９９】
ある実施形態では、Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体のうちの少なくとも１つの量が、第１の閾値レベル以下であれば、Ｈｅｒ−２作用剤が、被験体に奏効する可能性が低いことが重要事象である。加えて、かつ／または代替的に、Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−２ホモ二量体のうちの少なくとも１つの量が、第１の閾値レベルより高い第２の閾値レベル以上であれば、Ｈｅｒ−２作用剤が奏効する可能性がないと被験体が予後診断される。
【０１００】
好ましい実施形態では、患者の疾患の進行における重要事象間の期間を決定することにより、時間経過を測定し、測定により、患者が長い時間経過を有するかどうかが予測される。一実施形態では、重要事象は、初回の診断から死亡までの増悪である。別の実施形態では、重要事象は、初回の診断から転移性疾患までの増悪である。さらに別の実施形態では、重要事象は、初回の診断から再発までの増悪である。別の実施形態では、重要事象は、転移性疾患から死亡までの増悪である。別の実施形態では、重要事象は、転移性疾患から再発までの増悪である。別の実施形態では、重要事象は、再発から死亡までの増悪である。特定の実施形態では、全生存率、無増悪期間との関連で、かつ／またはＲＥＣＩＳＴもしくは他の効果判定基準を用いて、時間経過を測定する。
【０１０１】
特定の実施形態では、方法は、被験体の癌に由来する生物学的試料においてＨｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量を測定するステップを含み、該Ｈｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量が高く、および／または中程度に高ければ、Ｈｅｒ−２作用剤が患者に奏効する可能性があり、かつ／または該患者は長い時間経過を有する。特定の実施形態では、生物学的試料は、ＦＦＰＥを含む。特定の実施形態では、被験体の癌は乳癌である。特定の実施形態では、乳癌は、転移性である。他の実施形態では、癌は、早期乳癌（すなわち、アジュバント療法）である。または、Ｈｅｒ−２作用剤に対して感受性である他の癌をモニタリングすることができる。本明細書で言及する通り、Ｈｅｒ−２作用剤は、公知の薬剤のうちの１つでありうる。特定の実施形態では、Ｈｅｒ−２作用剤は、トラスツズマブである。または、他のＨｅｒ−２作用剤も用いることができる。
【０１０２】
特定の実施形態では、Ｈｅｒ−２量を測定する。特定の実施形態では、Ｈｅｒ−２ホモ二量体の量を測定する。特定の実施形態では、試料におけるタンパク質間相互作用の量を測定および／または定量化することが可能なアッセイを用いてＨｅｒ−２ホモ二量体の量を測定する。特定の実施形態では、アッセイが、ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイである。特定の実施形態では、奏効する可能性を、全生存率、無増悪期間に関して、かつ／またはＲＥＣＩＳＴ基準を用いて測定する。
【０１０３】
特定の実施形態では、方法は、被験体の癌に由来する生物学的試料において、Ｈｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量のほか、Ｈｅｒ−３および／またはＨｅｒ−３ホモ二量体の量も測定するステップを含み、該Ｈｅｒ−３および／またはＨｅｒ−３ホモ二量体の量が高ければ、Ｈｅｒ−２作用剤が患者に奏効する可能性があり、かつ／または該患者は長い時間経過を有する。特定の実施形態では、生物学的試料は、ＦＦＰＥを含む。特定の実施形態では、被験体の癌は乳癌である。特定の実施形態では、乳癌は、転移性である。または、乳癌は、早期乳癌（すなわち、アジュバント療法）でありうる。または、Ｈｅｒ−２作用剤に対して感受性である他の癌をモニタリングすることができる。本明細書で言及する通り、Ｈｅｒ−２作用剤は、公知であり、かつ／または本明細書に記載される薬剤のうちの１つでありうる。特定の実施形態では、Ｈｅｒ−２作用剤は、トラスツズマブである。
【０１０４】
特定の実施形態では、Ｈｅｒ−３ホモ二量体の量を測定する。特定の実施形態では、試料におけるタンパク質間相互作用の量を測定および／または定量化することが可能なアッセイを用いてＨｅｒ−３ホモ二量体の量を測定する。特定の実施形態では、アッセイが、ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイである。特定の実施形態では、奏効する可能性を、全生存率、無増悪期間に関して、かつ／またはＲＥＣＩＳＴ基準を用いて測定する。
【０１０５】
特定の実施形態では、方法は、被験体の癌に由来する生物学的試料においてＨｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量を測定するステップを含み、該Ｈｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量が中程度に高ければ（すなわち、中程度量）、該生物学的試料を、Ｈｅｒ−３、Ｈｅｒ−３ホモ二量体、またはＨｅｒ−２／Ｈｅｒ−３ヘテロ二量体の発現でありうるＨｅｒ−３発現体の量についてさらに解析する。患者におけるＨｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量が中程度に高く、Ｈｅｒ−３発現体の量が高ければ、Ｈｅｒ−２作用剤が患者に奏効する可能性があり、かつ／または該患者は長い時間経過を有する。逆に、患者におけるＨｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量が中程度に高く、Ｈｅｒ−３発現体の量が低ければ、Ｈｅｒ−２作用剤が患者に奏効する可能性がなく、かつ／または該患者は短い時間経過を有する。特定の実施形態では、生物学的試料は、ＦＦＰＥを含む。特定の実施形態では、被験体の癌は乳癌である。特定の実施形態では、乳癌は、転移性である。または、乳癌は、早期乳癌（すなわち、アジュバント療法）でありうる。または、Ｈｅｒ−２作用剤が奏効する他の任意の癌をモニタリングすることができる。本明細書で言及する通り、Ｈｅｒ−２作用剤は、公知であり、かつ／または本明細書に記載される薬剤のうちの１つでありうる。特定の実施形態では、Ｈｅｒ−２作用剤は、トラスツズマブである。特定の実施形態では、アッセイは、ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイである。特定の実施形態では、奏効する可能性を、全生存率、無増悪期間に関して、かつ／またはＲＥＣＩＳＴ基準を用いて測定する。
【０１０６】
特定の実施形態では、患者試料を、少なくとも２つの患者サブグループに分割することにより所定の量を創出する。特定の実施形態では、そのＨｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体が高い患者サブグループと、そのＨｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体が低いサブグループとに患者試料が分割されるように、サブグループの数が３つである。特定の実施形態では、高いＨｅｒ−２サブグループを、そのＨｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体が極めて高いサブグループと、そのＨｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体が中程度に高い（すなわち、中程度量）サブグループとに分割する。ある実施形態では、被験体におけるＨｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量を、極めて高いサブグループ、中程度に高いサブグループ、または低いサブグループのいずれかと比較する。患者におけるＨｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量が中程度に高ければ、Ｈｅｒ−２作用剤が患者に奏効する可能性があり、かつ／または該患者は長い時間経過を有する可能性がある。患者におけるＨｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量が極めて高いかまたは低ければ、Ｈｅｒ−２作用剤が患者に奏効する可能性がなく、かつ／または該患者は短い時間経過を有する可能性がある。
【０１０７】
別の実施形態では、患者におけるＨｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量が中程度に高く、Ｈｅｒ−３発現体の量が高ければ、Ｈｅｒ−２作用剤が患者に奏効する可能性がなく、かつ／または該患者は短い時間経過を有する。別の実施形態では、患者におけるＨｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量が中程度に高く、Ｈｅｒ−３発現体の量が低ければ、Ｈｅｒ−２作用剤が患者に奏効する可能性がある、かつ／または該患者は長い時間経過を有する。特定の実施形態では、サブグループ数が３つより多く、４つのサブグループ、５つのサブグループ、および６つのサブグループが含まれるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、奏効する可能性を、全生存率、無増悪期間に関して、かつ／またはＲＥＣＩＳＴ基準を用いて測定する。特定の実施形態では、Ｈｅｒ−２作用剤が、トラスツズマブである。
【０１０８】
特定の実施形態では、所定の量（ｍｅａｓｕｒｅ）は、最適のカットオフである。このような最適のカットオフは、本明細書で開示されており、本発明の特定の実施形態は、本明細書で言及および開示される量（ａｍｏｕｎｔ）に近似される量（ａｍｏｕｎｔ）を包含することを意味する。特定の実施形態では、被験体におけるＨｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量を、最適のカットオフと比較する；該患者におけるＨｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量が高いかまたは中程度に高ければ、Ｈｅｒ−２作用剤が患者に奏効する可能性があり、かつ／または該患者の時間経過が長い可能性がある。別の実施形態では、Ｈｅｒ−２量が高く、Ｈｅｒ−２ホモ二量体の量が低く、かつ／またはＨｅｒ−２ホモ二量体対Ｈｅｒ−２比が低値であれば、Ｈｅｒ−２作用剤が患者に奏効する可能性があり、かつ／または時間経過が長い可能性がある。別の実施形態では、Ｈｅｒ−２量が高く、Ｈｅｒ−２ホモ二量体の量が高く、かつ／またはＨｅｒ−２ホモ二量体対Ｈｅｒ−２比が高値であれば、Ｈｅｒ−２作用剤が患者に奏効する可能性があり、かつ／または時間経過が長い可能性がある。
【０１０９】
別の態様では、本発明は、Ｈｅｒ２作用剤による治療が、Ｈｅｒ２陽性癌を有する被験体に奏効する可能性がなく、かつ／または該患者の時間経過が短い可能性があるかどうかを判定する方法を提供する。特定の実施形態では、方法は、被験体の癌に由来する生物学的試料においてＨｅｒ−２量を検出するステップを含み、該Ｈｅｒ−２量が低ければ、Ｈｅｒ２作用剤による治療が該被験体に奏効する可能性がなく、かつ／または該患者が短い時間経過を有する可能性がある。特定の実施形態では、Ｈｅｒ２作用剤は、トラスツズマブである。
【０１１０】
本発明により、Ｈｅｒ−２発現および／もしくはＨｅｒ−２ホモ二量体の量、ならびに／またはＨｅｒ−３発現の量および／もしくはＨｅｒ−３ホモ二量体の量、ならびに／またはＨｅｒ−３発現の量および／もしくはＨｅｒ−３ホモ二量体の量、ならびに／またはＨｅｒ−２／Ｈｅｒ−３ヘテロ二量体の量を決定するのに有用であることが当業者に公知である任意の方法を用いることができる。例えば、このような発現の量または二量体の量を決定する任煮の定量的アッセイを用いて、細胞または癌によりどのくらいの量のシグナルが発生するかを決定することができ、次いで、該シグナルを、ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイで発生したシグナルと比較して、２つのアッセイ間における一致を判定する。このような方法には、ＦＲＥＴ法、ＢＲＥＴ法、生体分子蛍光補完法、および近接ライゲーションアッセイ法が含まれうるが、必ずしもこれらに限定されない。
【０１１１】
特定の実施形態では、癌を有する被験体に由来する生物学的試料を、切断可能な結合により分子タグがそれに結合している結合化合物、および切断誘導部分を有する切断プローブと接触させ、分子タグが放出されるかどうか、およびどの分子タグが放出されるかを検出することにより、量を決定する。図１は、このようなＦＦＰＥ  ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイの概要を示すものであり、この場合、組織切片を固定し（上パネルまたは第１のパネル）、次いで、これを、切断誘導剤（切断ツールとして示す）を有する第１の抗体、および検出可能部分（ＥＴＡＧ（登録商標））に連結した第２の抗体に結合させ（第２のパネル）、光（ｈν）により切断誘導剤を光誘導し（第３のパネル）、電気泳動によりｅ−Ｔａｇ（複数可）を分離し（第４のパネル）、データを読み取る（下パネルまたは第５のパネル）。
【０１１２】
特定の実施形態では、結合化合物および切断プローブの各々が、Ｈｅｒ−２またはＨｅｒ−３に特異的に結合する。特定の実施形態では、切断プローブおよび結合プローブの両方が、同じエピトープに結合することはない。特定の実施形態では、結合化合物が、切断プローブの切断誘導部分の有効近接距離内にあれば、分子タグが放出されるように、切断誘導部分により切断可能なリンカーが切断される。特定の実施形態では、Ｈｅｒ−２ホモ二量体、Ｈｅｒ−３ホモ二量体、またはＨｅｒ−２／Ｈｅｒ−３ヘテロ二量体が存在すれば放出される分子タグが、Ｈｅｒ−２単量体および／またはＨｅｒ−３単量体が存在すれば放出される分子タグから識別される。全Ｈｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体を検出するアッセイによりＨｅｒ−２を検出する例は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる共有特許である、米国特許出願公開第２００９／０１９１５５９号に示されている。同様の戦略を用いて、Ｈｅｒ−３、ｐ−９５など、他のバイオマーカーを測定することができる。
【０１１３】
特定の実施形態では、切断誘導部分を活性化することにより、切断可能なリンカーを切断する。特定の実施形態では、結合化合物は、Ｈｅｒ−２エピトープまたはＨｅｒ−３エピトープに特異的に結合する。特定の実施形態では、結合化合物は、抗体または抗原結合断片を含む。特定の実施形態では、結合化合物は、Ｈｅｒ−２のリガンド結合部位またはＨｅｒ−３のリガンド結合部位に特異的に結合する。特定の実施形態では、結合化合物は、Ｈｅｒ−２リガンドおよび／またはＨｅｒ−３リガンドを含む。特定の実施形態では、結合化合物および切断プローブは、同じＨｅｒ−２エピトープおよび／またはＨｅｒ−３エピトープに結合する。
【０１１４】
特定の実施形態では、１つは切断剤を伴い、１つはタグを伴う、２つの異なる抗体を用いる全Ｈｅｒ−２の測定を示す図２Ａと、切断剤または結合部分のいずれかをどちらか一方に結合させた単一の抗体を用いるＨｅｒ−２二量体の測定を示す図２Ｂとにおいて例示される通り、１つ以上のＨｅｒ−２ホモ二量体、Ｈｅｒ−３ホモ二量体、またはＨｅｒ−２／Ｈｅｒ−３ヘテロ二量体の量を測定するステップは、以下のステップ：（ｉ）１つ以上のＨｅｒ−２ホモ二量体の各々に対して、１または複数のＨｅｒ−２ホモ二量体のうちの各々における第１のＨｅｒ−２タンパク質に特異的な切断プローブ（例えば、図２Ａにおける抗体１５、および図２Ｂにおける抗体８）を供給するステップであって、各切断プローブが、有効近接距離を有する切断誘導部分を有するステップ；（ｉｉ）各結合化合物が１つ以上の分子タグを有し、その分子タグ各々は切断可能な結合によってそれに結合しており、かつ、異なる結合化合物に結合している１つ以上の分子タグが異なる分離特性を有し、分離したとき、異なる結合化合物に由来する分子タグが、分離プロファイルにおいて異なるピークを形成するように、１つ以上のＨｅｒ−２ホモ二量体のうちの各々の第２のタンパク質に特異的な、１つ以上の結合化合物（例えば、図２Ａおよび図２Ｂの両方における抗体８）を供給するステップ；（ｉｉｉ）切断プローブが、Ｈｅｒ−２ホモ二量体の第１のタンパク質に特異的に結合し、結合化合物が、Ｈｅｒ−２ホモ二量体の第２のタンパク質に特異的に結合し、結合化合物の切断可能な結合が、切断プローブの切断誘導部分の有効近接距離内に入って、分子タグが放出されるように、切断プローブと、結合化合物と、１つ以上の複合体とを混合するステップ；（ｉｖ）放出された分子タグを分離および同定して、Ｈｅｒ−２ホモ二量体の存在もしくは不在または量を決定するステップを含む。
【０１１５】
特定の実施形態では、１つ以上のＨｅｒ−２ホモ二量体、Ｈｅｒ−３ホモ二量体、またはＨｅｒ−２／Ｈｅｒ−３ヘテロ二量体の量を測定するステップは、以下のステップ：（ｉ）１つ以上のＨｅｒ−２ホモ二量体の各々に対して、１または複数のＨｅｒ−２ホモ二量体のうちの各々における第１のＨｅｒ−２タンパク質に特異的な切断プローブを供給するステップであって、各切断プローブが、有効近接距離を有する切断誘導部分を有するステップ；（ｉｉ）各結合化合物が１つ以上の分子タグを有し、その分子タグ各々は切断可能な結合によってそれに結合しており、かつ、異なる結合化合物に結合している１つ以上の分子タグが異なる分離特性を有し、分離したとき、異なる結合化合物に由来する分子タグが、分離プロファイルにおいて異なるピークを形成するように、１つ以上のＨｅｒ−３ホモ二量体のうちの各々の第２のタンパク質に特異的な、１つ以上の結合化合物を供給するステップ；（ｉｉｉ）切断プローブが、Ｈｅｒ−３ホモ二量体の第１のタンパク質に特異的に結合し、結合化合物が、Ｈｅｒ−３ホモ二量体の第２のタンパク質に特異的に結合し、結合化合物の切断可能な結合が、切断プローブの切断誘導部分の有効近接距離内に入って、分子タグが放出されるように、切断プローブと、結合化合物と、１つ以上の複合体とを混合するステップ；（ｉｖ）放出された分子タグを分離および同定して、Ｈｅｒ−３ホモ二量体の存在もしくは不在または量を決定するステップを含む。
【０１１６】
Ｈｅｒ−２およびＨｅｒ−３に特異的な切断プローブおよび結合プローブを用いて、例えば、Ｈｅｒ−２に特異的な切断プローブと、Ｈｅｒ−３に特異的な結合プローブとを用いて、かつ／またはＨｅｒ−３に特異的な切断プローブと、Ｈｅｒ−２に特異的な結合プローブとを用いて、Ｈｅｒ−２／Ｈｅｒ−３ヘテロ二量体を同様に決定することができる。
【０１１７】
本発明は、Ｈｅｒ−２作用剤に関する。Ｈｅｒ−２作用剤は、当業者に公知の任意のこのような薬剤でありうる。特定の実施形態では、Ｈｅｒ２作用剤は、４Ｄ５、トラスツズマブ、ＡＥＥ−７８８、およびラパチニブからなる群から選択される。好ましい実施形態では、Ｈｅｒ−２作用剤は、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））である。例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、１９９９年、Ｃｌｉｎ  Ｔｈｅｒ．  ２１巻：３０９〜１８頁；およびＳｈａｋ、１９９９年、Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．  ２６巻：７１〜７頁を参照されたい。また、本明細書に記載される方法を用いて、他のＨｅｒ−２作用剤も評価することができる。
【０１１８】
バイオマーカーとして用いるのに適するＨｅｒ−２、および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体、および／またはＨｅｒ−３、および／またはＨｅｒ−３ホモ二量体、および／またはＨｅｒ−２／Ｈｅｒ−３ヘテロ二量体を含有する試料は、細胞培養物、動物組織または植物組織、患者生検などを含め、多種多様な供給源に由来しうる。試料は、ヒト患者試料であることが好ましい。試料がそこから採取される供給源に依存しうる、従来の技法を用いる本発明のアッセイに応じて、試料を調製する。生検および医学的被検物については、以下の参考文献：Ｂａｎｃｒｏｆｔ  ＪＤおよびＳｔｅｖｅｎｓ  Ａ編、１９７７年、「Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ；
Ｐｅａｒｓｅ、１９８０年、「Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｅｄ」、第４版、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈにおいて、指針が示されている。
【０１１９】
癌性疾患状態の領域において、用いうる患者組織試料の例には、乳房組織、前立腺組織、卵巣組織、結腸組織、肺組織、子宮内膜組織、胃組織、唾液腺組織、または膵臓組織が含まれるがこれらに限定されない。組織試料は、手術による切除、吸引、または生検を含め、各種の手順により得ることができる。組織は、新鮮試料の場合もあり、凍結試料の場合もある。一実施形態では、固定され、パラフィンに包埋された組織試料に対して本発明のアッセイを実施し、脱パラフィンのステップを実施する。従来の方法により、組織試料を固定（すなわち、保存）することができる。例えば、Ｌｅｅ  Ｇ．  Ｌｕｎａ，  ＨＴ（ＡＳＣＰ）編、１９６０年、「Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｒｍｅｄ  Ｆｏｒｃｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ」、第３版、Ｔｈｅ  Ｂｌａｋｓｔｏｎ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｂｏｏｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ｕｌｒｅｋａ  Ｖ．  Ｍｉｋｅｌ編、１９９４年、「Ｔｈｅ  Ａｒｍｅｄ  Ｆｏｒｃｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ」、Ａｒｍｅｄ  Ｆｏｒｃｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．を参照されたい。当業者は、組織を組織学的に染色するか、または他の形で分析する目的により、固定剤の選択が決定されることを理解する。当業者はまた、固定化の長さが、組織試料のサイズ、ならびに用いられる固定剤に依存することも理解する。
【０１２０】
一般に、まず、組織試料を固定し、次いで、濃度を上昇させた一連のアルコールにより脱水し、組織試料を切片化しうるように、パラフィンまたは他の切片化媒体を浸透させてこれにより包埋する。代替的に、組織を切片化し、得られた切片を固定することもできる。例示目的で、上記に示した参考文献により説明される従来の技法に従う従来の方法により、組織試料をパラフィンに包埋および加工することができる。用いうるパラフィンの例には、Ｐａｒａｐｌａｓｔ、Ｂｒｏｌｏｉｄ、およびＴｉｓｓｕｅｍａｙが含まれるがこれらに限定されない。組織試料を包埋したら、従来の技法により、ミクロトームにより試料を切片化することができる。切片は、厚さが約３ミクロン〜約１２ミクロンの範囲であり、約５ミクロン〜約１０ミクロンの範囲の厚さであることが好ましい。一態様では、切片が、約１０ｍｍ２〜約１ｃｍ２の面積でありうる。切断したら、数種の標準的な方法により、切片をスライドに付着させることができる。スライド接着剤の例には、シラン、ゼラチン、およびポリ−Ｌ−リシンが含まれるがこれらに限定されない。パラフィン包埋された切片は、正に帯電したスライド、および／またはポリ−Ｌ−リシンによりコーティングされたスライドに付着させることができる。
【０１２１】
パラフィンを包埋材料として用いた場合は、一般に、バイオマーカーを検出する前に、組織切片を脱パラフィンおよび再水和する。従来の数種の標準的な方法により、組織切片を脱パラフィンすることができる。例えば、上記の参考文献により説明される従来の技法により、キシレンと、段階的に濃度を低下させる一連のアルコールとを用いることができる。代替的に、Ｈｅｍｏ−Ｄｅ（登録商標）（テキサス州、ヒューストン、ＣＭＳ社製）など、市販の非有機の脱パラフィン剤を用いることもできる。
【０１２２】
従来の細胞溶解法（例えば、０．１４Ｍ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ８．６）、０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、および、必要に応じてプロテアーゼ阻害剤ならびに／またはホスファターゼ阻害剤）により、哺乳動物組織培養細胞または新鮮組織もしくは凍結組織を調製することができる。新鮮な哺乳動物組織の場合、試料調製はまた、粉砕（ｃｒｕｓｉｎｇ）、ミンチ化（ｍｉｎｃｉｎｇ）、すりつぶし（ｇｒｉｎｄｉｎｇ）、または超音波処理など、組織の脱凝集（ｔｉｓｓｕｅ  ｄｉｓａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）ステップも包含する。
【０１２３】
放出可能な分子タグを用いて二量体集団を測定することにより、（１）放出された分子タグをアッセイ混合物から分離することにより、バックグラウンドが大幅に軽減され、感度が大幅に増大すること；ならびに（２）分離および検出を容易にするために特にデザインされた分子タグを用いることにより、同じアッセイにおいて同時に、受容体複合体の複数の成分を容易に測定しうるような、簡便な多重化能がもたらされることを含め、多くの利点がもたらされる。このようなタグを用いるアッセイは、各種の形態を取ることが可能であり、以下の参考文献：それらの各々が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第７，１０５，３０８号；同第６，６２７，４００号；米国特許出願公開第２００２／００１３１２６号；同第２００３／０１７０９１５号；同第２００２／０１４６７２６号；および同第２００９／０１９１５５９号；ならびに国際特許公開第ＷＯ２００４／０１１９００号において開示されている。例えば、電気泳動移動度、分子量、形状、溶解性、ｐＫａ、疎水性、電荷、電荷／質量比、または極性を含め、分離される分子間における、１つ以上の、物理的、化学的、または光学的差違に基づき分子を識別しうる、多種多様な分離法を用いることができる。一態様では、複数の分子タグまたは分子タグのセットが、電気泳動移動度および光学的検出特性において異なり、電気泳動により分離される。別の態様では、複数の分子タグまたは分子タグのセットが、分子量、形状、溶解性、ｐＫａ、疎水性、電荷、極性において異なり得、正相もしくは逆相のＨＰＬＣ、イオン交換ＨＰＬＣ、キャピラリー電気クロマトグラフィー、質量分析、または気相クロマトグラフィーにより分離される。
【０１２４】
結合化合物から放出された後で、分離技法により異なるバンドまたはピークに分離されうる、分子タグのセットが供給される。このようなピークを同定および定量化することにより、受容体二量体の存在および／または量の尺度またはプロファイルがもたらされる。セットにおける分子タグは、化学的に多様でありうる；しかし、簡便のため、分子タグのセットは、通常、化学的に類縁である。例えば、それらがすべてペプチドの場合もあり、それらが同じ基本的構成要素（ｂａｓｉｃ  ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｌｏｃｋ）または単量体の異なる組合せからなる場合もあり、それらを、異なる置換基を有して異なる分離特性を付与する、同じ基本的足場（ｂａｓｉｃ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）を用いて合成する場合もある。複数の分子タグの数は、用いられる分離方式、検出用分子タグにおいて用いられる標識、結合部分の感度、および切断可能な結合が切断される効率を含め、複数の因子に応じて変化しうる。
【０１２５】
組織試料に対して直接なされた測定は、試料における全細胞数、および／または試料における特定の細胞亜型の数を表わす細胞標的または組織標的についての測定を組み入れることにより、正規化することができる。実質的な割合の正常細胞を含みうる患者試料、特に、腫瘍試料においては、細胞および組織が不均質性であるため、さらなる測定が好ましい場合もあり、さらに必要な場合もある。
【０１２６】
上記で言及した通り、異なる結合化合物各々が切断可能な結合を介して１つ以上の分子タグを有する、複数の異なる結合化合物を含有する混合物を供給することができる。結合化合物、切断可能な結合、および分子タグの性質は、多様に異なりうる。結合化合物は、抗体結合組成物、抗体、ペプチド、細胞表面受容体に対するペプチドリガンドもしくはペプチド以外のリガンド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸などのオリゴヌクレオチド類似体、レクチン、あるいは、標的タンパク質もしくは標的分子、またはＨｅｒ−２ホモ二量体など、目的の検体との安定的な複合体形成物に特異的に結合することが可能な他の任意の分子実体を含みうる。一態様では、結合化合物を、以下の式：
Ｂ−（Ｌ−Ｅ）ｋ
［式中、Ｂは、結合部分であり；Ｌは、切断可能な結合であり；Ｅは、分子タグである］により表わすことができる。ホモジニアスアッセイでは、切断可能な結合Ｌが、易酸化結合であり得、より好ましくは、それが一重項酸素により切断されうる結合である。部分「−（Ｌ−Ｅ）ｋ」は、単一の結合化合物が、切断可能な結合を介して複数の分子タグを結合させうることを示す。一態様では、ｋが１以上の整数であるが、他の実施形態では、ｋが数百を超える、例えば、１００〜５００の場合もあり、または、ｋが数百を超えて最大数千もの数である、例えば、５００〜５０００の場合もある。通常、複数の異なる種類の結合化合物の各々は、異なる分子タグＥを有する。切断可能な結合、例えば、易酸化結合と、分子タグＥとは、通常の化学反応によりＢに結合している。
【０１２７】
Ｂは、Ｈｅｒ−２における抗原決定基などの標的に特異的に結合する抗体結合組成物であることが好ましい。Ｈｅｒ−２エピトープに特異的な抗体は、本明細書に記載の実施例で示される。抗体組成物は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である多種多様な市販の抗体から容易に形成することができる。特に、上皮増殖因子受容体に特異的な抗体は、それらの各々が参照によりその全体において組み込まれる、米国特許第５，６７７，１７１号；同第５，７７２，９９７号；同第５，９６８，５１１号；同第５，４８０，９６８号；同第５，８１１，０９８号において開示されている。参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５９９，６８１号は、タンパク質のリン酸化部位に特異的な抗体について開示している。Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（マサチューセッツ州、ビバリー）、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社（カリフォルニア州、カマリロ）、およびＵｐｓｔａｔｅ社（バージニア州、シャーロッツビル）などの販売元もまた、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を提供している。
【０１２８】
切断可能な結合Ｌは、放出される分子タグＥの構造を分解しないし、その検出特性に影響を与えることのない条件下で切断されうる、実質的に任意の化学結合基でありうる。ホモジニアスアッセイフォーマットで切断プローブを用いる場合は常に、切断可能な結合Ｌが、切断プローブの有効近接距離内にある切断可能な結合だけを切断するように、作用距離が短い切断プローブにより作製される切断剤により切断される。拡散して、切断可能な結合に至り、切断に影響を及ぼす短命の活性種が、このような薬剤によりもたらされるように、反応混合物に物理的または化学的な変化をもたらすことにより、その薬剤を活性化しなければならないことが典型的である。ホモジニアスフォーマットでは、切断剤は抗体などの結合部分に結合することが好ましく、切断剤は、活性化する前に、放出可能な分子タグを伴う結合化合物の近接距離内における特定の部位に対して標的とする。本明細書では、このような実施形態の切断剤を、「切断誘導部分」と称する。
【０１２９】
非ホモジニアスフォーマットでは、特異的に結合した結合化合物が、結合しなかった結合化合物から分離されるため、切断可能な結合および切断剤のより広い選択を用いることが可能である。切断可能な結合には、過酸化水素、一重項酸素など、局所的に作用する反応種との反応を受けやすい結合だけでなく、塩基に不安定な結合、光により切断可能な結合、還元により切断可能な結合、酸化により切断される結合、酸に不安定な結合、および特定のプロテアーゼにより切断可能なペプチド結合など、反応混合物全体に作用する薬剤に対して不安定な結合も含まれる。多くのこのような結合について記載する参考文献には、それらの各々が参照により本明細書に組み込まれる、ＧｒｅｅｎｅおよびＷｕｔｓ、１９９１年、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、１９９６年、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ならびに米国特許第５，５６５，３２４号が含まれる。
【０１３０】
一態様では、市販の切断可能な試薬システムを本発明と共に用いることができる。例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（イリノイ州、ロックフォード）などの販売元から入手可能な、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ  （ＳＰＤＰ））、スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ−α−ｍｅｔｈｙｌ−α−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｔｏｌｕｅｎｅ  （ＳＭＰＴ））などのヘテロ官能性薬剤を用いて、抗体結合組成物と分子タグとの間に、ジスルフィド結合を導入することができる。このような連結により導入されたジスルフィド結合は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、２−メルカプトエタノール、または水素化ホウ素ナトリウムなどの還元剤で処理することにより壊すことができる。ジスルフィド結合を切断する還元剤の典型的な濃度は、１０〜１００ｍＭの範囲にある。ホモ二官能性ＮＨＳエステルによる架橋試薬、過ヨウ素酸ナトリウム（例えば、生理的ｐＨにおいて４時間にわたる１５ｍＭ過ヨウ素酸塩）による切断を受けやすいｃｉｓ−ジオール類を中央部に含有する酒石酸ジスクシンイミジル（ＤＳＴ）（Ｐｉｅｒｃｅ社から入手可能）を用いて、抗体結合組成物と分子タグとの間に、易酸化結合を導入することができる。エステル化されたスペーサー構成要素を含有する結合は、ヒドロキシルアミン、例えば、３７℃で３〜６時間にわたる、ｐＨ８．５の０．１Ｎヒドロキシルアミンなど、強力な求核剤により切断することができる。このようなスペーサーは、Ｐｉｅｒｃｅ社（イリノイ州、ロックフォード）から入手可能な、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）など、ホモ二官能性の架橋剤により導入することができる。塩基に不安定な結合は、スルホン基により導入することができる。切断可能な結合にスルホン基を導入するのに用いうるホモ二官能性の架橋剤には、ビス［２−（スクシンイミジルオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）、および４，４−ジフルオロ−３，３−ジニトロフェニルスルホン（ＤＦＤＮＰＳ）が含まれる。切断のための例示的な塩基性条件には、３７℃で２時間にわたるインキュベーションを伴う、６Ｍ尿素、０．１％ＳＤＳ、および２ｍＭ  ＤＴＴを含有するトリス塩基を添加することによりｐＨ１１．６に調整した、０．１Ｍリン酸ナトリウムが含まれる。光により切断可能な結合にはまた、米国特許第５，９８６，０７６号において開示される結合も含まれる。
【０１３１】
Ｌが易酸化性である場合、Ｌは、チオエーテルまたはそのセレニウム類似体の場合もあり；オキソ基に対する二重結合が切断されると分子タグＥが放出される、炭素間の二重結合を含有するオレフィンの場合もある。例示的な易酸化結合は、それらの各々が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第６，６２７，４００号および同第５，６２２，９２９号；ならびに米国特許出願公開第２００２／００１３１２６号および同第２００３／０１７０９１５号において開示されている。
【０１３２】
ガスクロマトグラフィーまたは質量分析により複数の分子タグを分離する場合、本発明における分子タグＥは、以下の参考文献（例えば、それらの各々が参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｚｈａｎｇら、２００２年、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ
Ｃｈｅｍ．  １３巻：１００２〜１０１２頁；  Ｇｉｅｓｅ、１９８３年、Ａｎａｌ．
Ｃｈｅｍ．  ２巻：１６５〜１６８頁；ならびに米国特許第４，６５０，７５０号；同第５，３６０，８１９号；同第５，５１６，９３１号；および同第５，６０２，２７３号を参照されたい）において記載される電気泳動タグを含みうる。
【０１３３】
分子タグＥは、活性種、とりわけ、一重項酸素に対して安定であり、検出基またはレポーター基を包含する、水溶性の有機化合物であることが好ましい。その他の点において、Ｅは、サイズおよび構造が多種多様に変化しうる。一態様では、Ｅの分子量が、約５０〜約２５００ドルトン、より好ましくは、約５０〜約１５００ドルトンの範囲にある。Ｅは、電気化学シグナル、蛍光シグナル、または発色シグナルを発生させる検出基を含みうる。質量による検出を用いる実施形態では、Ｅは、検出の目的で別個の部分を有し得ない。検出基は、蛍光シグナルを発生させることが好ましい。
【０１３４】
複数の分子タグは、各々が、同じ複数タグの他のメンバーに対して、固有の分離特性および／または固有の光学特性を有するように選択される。一態様では、クロマトグラフィーまたは電気泳動における分離特性が、当技術分野における従来の標準的な一連の分離条件（例えば、電圧、カラム圧、カラム種類、移動相、または電気泳動の分離媒体）下における保持時間である。別の態様では、光学特性が、所与の波長または波長バンドにおける発光スペクトル、蛍光寿命、または蛍光強度などの蛍光特性である。蛍光特性は、蛍光強度であることが好ましい。例えば、複数の分子タグのうちの各々は、同じ蛍光発光特性を示しうるが、固有の保持時間により互いとは異なる。他方、複数の分子タグのうちの１つまたは２つまたはそれより多くは、同一の移動時間または保持時間を有しうるが、分子の分離および蛍光の測定を組み合わせることにより、該複数の分子タグのうちのすべてのメンバーが識別可能であるように、それらは、固有の蛍光特性、例えば、スペクトル分解可能な発光スペクトルを有す。
【０１３５】
放出された分子タグは、電気泳動による分離、および検出基による蛍光発光によって検出することが好ましい。このような実施形態では、分離条件下で、電気泳動図において異なるピークが形成されるように、実質的に同一の蛍光特性を示す分子タグが、異なる電気泳動移動度を有す。本発明による複数の分子タグは、従来のふるい分けマトリックス（ｓｉｅｖｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ）が存在する場合も、これが不在の場合も、従来のキャピラリー電気泳動装置により分離することが好ましい。電気泳動による分離中において、またはその後において、蛍光シグナルおよび分離される化合物の移動時間（または移動距離）を記録することにより、または相対蛍光発光および分子タグの移動順序についてのチャート（例えば、電気泳動図としての）を構築することにより、分子タグを検出または同定する。分子タグの存在、不在、および／または量は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００３／０１７０７３４Ａ１号により開示されている、１つ以上の標準品を用いることにより測定することが好ましい。図３は、本発明の実施形態に従う、電気泳動によるＨｅｒ−２タグの分離についての例を示す。
【０１３６】
また、例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００３／０２３５８３２号により開示される通り、分子量、形状、溶解性、ｐＫａ、疎水性、電荷、極性などが含まれる、１つ以上の物理的特性に基づく、クロマトグラフィーによる分離を行うための複数の分子タグもデザインすることができる。クロマトグラフィーによる分離技術は、カラムの種類、固相、移動相などのパラメータに基づき選択され、続いて単回の操作において分離されて異なるピークまたはバンドを形成しうる複数の分子タグが選択される。検出される分子タグの数（すなわち、該複数のサイズ）、アッセイにおいて発生する各分子タグの推定量、多重化アッセイにおいて用いられるセットの候補である分子タグを合成する有用性および容易さ、用いられる検出モダリティー、ならびにＨＰＬＣ装置、カラム、および溶媒の入手可能性、頑健性、費用、および操作の容易さを含め、数種の因子により、本発明で用いるのにどのＨＰＬＣ法を選択するかが決定される。一般に、限定量の試料を解析するのに適し、最高の解像度による分離をもたらすカラムおよび技法が好ましい。このような選択を行うための指針は、例えば、Ｓｎｙｄｅｒら、１９８８年、「Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ＨＰＬＣ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ｍｉｌｌｎｅｒ、１９９９年、「Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ｃｈｉ−Ｓａｎ  Ｗｕ、１９９９年、「Ｃｏｌｕｍｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ；およびＯｌｉｖｅｒ、１９８９年、「ＨＰＬＣ  ｏｆ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄなどの文献において見出すことができる。
【０１３７】
一態様では、分子タグＥが、（Ｍ、Ｄ）［表記中、Ｍとは、移動度修飾部分（ｍｏｂｉｌｉｔｙ−ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｙ）であり、Ｄとは検出部分である］である。「（Ｍ、Ｄ）」という表記を用いて、そのどちらの部分も切断可能な結合Ｌに隣接しうるように、Ｍ部分およびＤ部分の順序づけがなされうることを示す。すなわち、「Ｂ−Ｌ−（Ｍ、Ｄ）」とは、結合化合物が、２つの形態：「Ｂ−Ｌ−Ｍ−Ｄ」または「Ｂ−Ｌ−Ｄ−Ｍ」のうちのいずれかであることを示す。
【０１３８】
検出部分Ｄは、蛍光標識または蛍光色素の場合もあり、発色標識または発色色素の場合もあり、電気化学標識の場合もある。Ｄは、蛍光色素であることが好ましい。本発明と共に用いられる例示的な蛍光色素には、以下の参考文献：著者不詳、２００２年、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ」、第８版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ；米国特許第６，１９１，２７８号；同第６，３７２，９０７号；同第６，０９６，７２３号；同第５，９４５，５２６号；同第４，９９７，９２８号；および同第４，３１８，８４６号；ならびにＬｅｅら、１９９７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５巻：２８１６〜２８２２頁において開示される、水溶性のローダミン色素類、フルオレセイン類、４，７−ジクロロフルオレセイン類、ベンゾキサンテン色素類、およびエネルギー移動色素類が含まれる。Ｄは、フルオレセインまたはフルオレセイン誘導体であることが好ましい。
【０１３９】
結合化合物の各々を、異なる分子タグにより個別に誘導体化したら、これを他の結合化合物と共にプールして、複数の結合化合物を形成する。通常、組成物には、各異なる種類の結合化合物が同じ比率で存在するが、特定の実施形態またはアッセイの所望性または必要性に応じ、特定の結合化合物のうちの１つまたはサブセットが、より大きいかまたはより小さな比率で存在するように、デザインの選択として、比率を変化させることができる。このようなデザインの選択に影響を及ぼしうる因子には、特定の標的に対して産生させた抗体の親和性およびアビディティー、標的の相対存在率、分子タグの検出部分の蛍光特性などが含まれるがこれらに限定されない。
【０１４０】
切断誘導部分または切断剤とは、好ましくは酸化により、切断可能な結合を切断することが可能な活性種を生成させる基である。活性種とは、その切断誘導効果が、その発生部位の近接距離内だけにおいて存在するように、短寿命の活性を示す化学種である。活性種が創出される近接距離を越えて顕著なバックグラウンドを創出しないように、活性種を固有の形で短命とするか、またはその発生部位からの短距離を越えて、切断可能な結合と反応することが可能でないように、活性種を効果的に除去するスカベンジャーを用いる。例示的な活性種には、一重項酸素、過酸化水素、ＮＡＤＨおよびヒドロキシルラジカル、フェノキシラジカル、スーパーオキサイドなどが含まれる。酸化を引き起こす活性種に対する例示的な抑制剤には、ポリエン類、カロテノイド類、ビタミンＥ、ビタミンＣ、チロシン、ヒスチジン、およびグルタチオンのアミノ酸−ピロールＮ−コンジュゲートが含まれる。例えば、Ｂｅｕｔｎｅｒら、２０００年、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ３１９巻：２２６〜２４１頁を参照されたい。
【０１４１】
切断誘導部分および切断可能な結合を用いるアッセイをデザインする際の１つの考慮点は、受容体複合体と結合したとき、切断誘導部分により生成される活性種が切断可能な結合を効果的に切断することが不可能となる程度に遠く、切断誘導部分および切断可能な結合が、互いから引き離されないようにすることである。一態様では、切断可能な結合が、結合した切断誘導部分の約１０００ｎｍ以内にあることが好ましく、約２０〜２００ｎｍ以内にあることが好ましい。一重項酸素を発生させる、光増感剤の切断誘導部分の場合は、切断可能な結合が、受容体複合体において光増感剤の約２０〜１００ｎｍ以内にあることがより好ましい。本明細書では、切断誘導部分により切断可能な結合が有効に切断されうる（すなわち、検出可能なシグナルを発生させるのに十分な分子タグを切断できる）範囲を、その「有効近接距離」と称する。当業者は、特定の光増感剤の有効近接距離が、特定のアッセイデザインの詳細に依存する場合があり、日常的な実験により決定または改変されうることを認識する。
【０１４２】
増感剤とは、反応中間体、または、通常一重項酸素である種を発生させるように誘導されうる化合物である。本発明により用いられる増感剤は、光増感剤であることが好ましい。本発明の範囲内に包含される他の増感剤は、熱、光、イオン化放射、または化学的活性化により励起されると、一重項酸素分子を放出する化合物である。このクラスの化合物のうちで最も周知のメンバーには、１，４−ビスカルボキシエチル−１，４−ナフタレンエンドペルオキシド、９，１０−ジフェニルアントラセン−９，１０−エンドペルオキシド、および５，６，１１，１２−テトラフェニルナフタレン−５，１２−エンドペルオキシドなどのエンドペルオキシド類が含まれる。これらの化合物を加熱するか、またはこれらの化合物が直接的に光を吸収すると、一重項酸素が放出される。さらなる増感剤については、Ｄｉ  Ｍａｓｃｉｏら、１９９４年、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ３５５巻：２８７頁；およびＫａｎｏｆｓｋｙ、１９８３年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５８巻：５９９１〜５９９３頁；  Ｐｉｅｒｌｏｔら、２０００年、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ３１９巻：３〜２０頁により開示されている。
【０１４３】
光増感剤は、共有結合または非共有結合により、直接的または間接的にクラス特異的な試薬による結合剤と結合しうる。このような組成物を構築するための指針、特に、結合剤としての抗体についての指針は、例えば、光線力学療法、免疫診断学などの分野の文献において得られる。例示的な指針は、Ｕｌｌｍａｎら、１９９４年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１巻、５４２６〜５４３０頁；  Ｓｔｒｏｎｇら、１９９４年、Ａｎｎ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ７４５巻：２９７〜３２０頁；  Ｙａｒｍｕｓｈら、１９９３年、Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．  １０巻：１９７〜２５２頁；ならびに米国特許第５，７０９，９９４号；同第５，３４０，７１６号；同第６，２５１，５８１号；および同第５，５１６，６３６号において見出すことができる。
【０１４４】
光増感剤を光活性化して一重項酸素を発生させるには、多種多様な光源が利用できる。光源が、実用的な時間内で十分な一重項酸素を生成させるのに十分な強度を示す限りにおいて、多色光源および単色光源の両方を用いることができる。照射の距離は、光増感剤の性質、切断可能な結合の性質、照射光源の出力、および試料からの照射光源の距離に依存する。一般に、照射時間は、約マイクロ秒間未満〜最長約１０分間であることが可能であり、通常、約１ミリ秒間〜約６０秒間の範囲内である。照射の強度および距離は、光増感剤分子のうちの少なくとも約０．１％、通常、光増感剤分子のうちの少なくとも約３０％、ならびに、好ましくは、光増感剤分子のうちの実質的にすべてを励起するのに十分であるものとする。例示的な光源には、例えば、ヘリウム−ネオンレーザー、アルゴンレーザー、ＹＡＧレーザー、Ｈｅ／Ｃｄレーザー、およびルビーレーザー；光ダイオード；水銀灯、ナトリウム灯、およびキセノン灯；ならびに、例えば、タングステン灯およびタングステン／ハロゲン灯および閃光灯などの白熱灯が含まれる。本発明の方法において用いるのに適する例示的な光活性化デバイスは、国際特許公開第ＷＯ０３／０５１６６９号において開示されている。このような実施形態では、光活性化デバイスは、９６ウェルプレートのすべてのウェルを同時に照射することが可能な、ハウジング内に搭載された発光ダイオード（ＬＥＤ）のアレイである。
【０１４５】
本発明において用いうる光増感剤の例は、上記の特性を有する増感剤、ならびに、米国特許第５，５３６，８３４号；同第５，７６３，６０２号；同第５，５６５，５５２号；同第５，７０９，９９４号；同第５，３４０，７１６号；同第５，５１６，６３６号；同第６，２５１，５８１号；および同第６，００１，６７３号；欧州特許出願公開第０４８４０２７号；  Ｍａｒｔｉｎら、１９９０年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １８６巻：６３５〜６４５頁；およびＹａｒｍｕｓｈら、１９９３年、Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．
Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．  １０巻：１９７〜２５２頁により開示される増感剤である。増感剤の場合と同様、特定の実施形態では、固相支持体の表面に共有結合または非共有結合により結合させるか、または固相支持体の本体に組み込むことにより、光増感剤を、固相支持体と会合させることができる。一般に、光増感剤は、必要量の一重項酸素を達成するのに必要な量で、支持体と会合させる。一般に、光増感剤の量は、日常的な方法により、経験的に決定される。
【０１４６】
一実施形態では、例えば、米国特許第５，７０９，９９４号；および同第６，３４６，３８４号；ならびに国際特許公開第ＷＯ０１／８４１５７号により開示される通り、光増感剤を、ラテックス粒子に組み込み、光増感剤ビーズを形成する。代替的に、Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、９７巻：３７４１頁（１９７５年）において記載される通り、ローズベンガルなどの光増感剤を、ラテックスにおけるクロロメチル基を介して、０．５ミクロンのラテックスビーズに共有結合させることにより調製することもできる。この反応は、例えば、真空を適用することにより試薬の除去を可能とするウェルの１つの壁面、例えば、その底面を形成するフィルター膜を有する、従来の９６ウェルまたは３８４ウェルのマイクロタイタープレートにおいて実施することができる。結合化合物の特異的な結合に必要とされるバッファーが、一重項酸素の生成または分離に必要とされるバッファーと異なる場合、これにより、バッファーの簡便な交換が可能となる。例えば、抗体ベースの結合化合物の場合、高塩濃度バッファーが必要となる。放出されたタグを電気泳動により分離する場合は、バッファーを、電気泳動に適する、塩濃度がより低いバッファーに交換することにより、より良好な性能が達成される。
【０１４７】
例として、切断プローブは、複数の光増感剤分子により誘導体化された、ハプテン化一次抗体、ならびに二次抗ハプテン結合タンパク質を含みうる。好ましいハプテン化一次抗体は、ビオチン化抗体であり、好ましい二次抗ハプテン結合タンパク質は、抗ビオチン抗体またはストレプトアビジンのいずれかでありうる。このような一次試薬および二次試薬の他の組合せは、当技術分野において周知である。このような試薬の例示的な組合せは、Ｈａｕｇｌａｎｄ、２００２年、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ」、第９版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲにより教示されている。このような試薬の例示的な組合せは、以下に記載される。放出可能なタグ（「ｍＴ１」および「ｍＴ２」）と、ビオチンにより誘導体化された一次抗体とを有するこれらの結合化合物は、膜の受容体二量体の異なるエピトープに特異的に結合する。ビオチン特異的な結合タンパク質、例えば、ストレプトアビジンは、ビオチンに結合して、複数の光増感剤を、結合化合物の有効近接距離内にもたらす。ビオチン特異的な結合タンパク質はまた、抗ビオチン抗体の場合もあり、従来の結合化学反応（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（前出））により、該タンパク質における遊離アミン基を介して、光増感剤を結合させることもできる。このような使用のための例示的な光増感剤は、欧州特許出願公開第０５１０６８８号において開示される通りに調製される、メチレンブルーのＮＨＳエステルである。
【０１４８】
方法および特定の条件ならびに材料についての以下の一般的な議論は、例示を目的とするものであり、限定を目的とするものではない。当業者は、本明細書に記載される方法を、特に、異なる試料、細胞型、および標的複合体を用いることにより、他の適用にどのように適合させうるかについて理解する。
【０１４９】
本発明の方法を実施するには、被験試料と、結合化合物と、場合によって、切断プローブとを含めた、アッセイ成分の組み合わせを作製する。一般に、アッセイ成分は、任意の順序で組み合わせることができる。しかし、特定の適用では、添加の順序が重要となりうる。例えば、定量的アッセイなどにおいて、競合的結合についてモニタリングしたい場合がある。または、会合した複合体の安定性をモニタリングしたい場合もある。このような適用では、反応物を段階的に会合させることができる。
【０１５０】
各試薬の量は、一般に、経験的に決定することができる。アッセイで用いられる試料の量は、存在することが予測される標的複合体の数と、アッセイのシグナルをモニタリングするのに用いられる分離および検出の手段とにより決定される。一般に、結合化合物および切断プローブの量は、試料において予測される標的分子の量と比べたモル過剰、一般に、少なくとも約１．５モルの過剰、より望ましくは約１０倍以上のモル過剰で供給することができる。特定の適用において、用いられる濃度は、結合剤の親和性、および単一の細胞において存在することが予測される標的分子の数に応じて高濃度の場合もあり、低濃度の場合もある。細胞表面オリゴマー複合体の形成に対する化合物の効果を決定しようとする場合は、モニタリングされる効果に応じて、プローブを添加する前に、これと同時に、またはこの後において、該化合物を細胞に添加することができる。
【０１５１】
アッセイ混合物は、通常、約１０〜２００ｍＭの範囲の濃度のバッファーにより維持される、一般に、生理的ｐＨ（細胞が培養されるｐＨと同等のｐＨ）にある水性媒体において、細胞表面分子へのプローブの結合をもたらす条件下で混合およびインキュベートすることができる。従来のバッファーのほか、必要に応じて、糖、増殖媒体、安定化剤など、他の従来の添加物も用いることができる。一般に、生理的な一定温度を用いる。インキュベーション温度は、一般に、約４℃〜７０℃、通常約１５℃〜４５℃であり、より通常の場合には、約２５℃〜３７℃である。
【０１５２】
アッセイ混合物を組み立て、インキュベートして、プローブを細胞表面分子に結合させた後、該混合物を処理して、切断剤を活性化させ、切断剤の有効近接距離内にある結合化合物からタグを切断させ、該細胞表面から対応するタグを溶液に放出させることができる。この処理の性質は、切断剤の作用機構に依存する。例えば、切断剤として光増感剤を用いる場合、切断の活性化は、用いられる特定の増感剤に適切な光の波長で、混合物を照射することを含みうる。
【０１５３】
次いで、切断後、試料を解析して、放出されたタグを識別することができる。複数の結合化合物を用いるアッセイを用いる場合は、一般に、放出されたタグの分離が、それらの検出に先行する。分離および検出のいずれの方法も、アッセイのためにタグをデザインする過程で決定される。好ましい分離方式では電気泳動が用いられ、そこでは、各種のタグが、それらの電気泳動移動度における公知の差違に基づき分離される。
【０１５４】
上記で言及した通り、一部の実施形態では、アッセイ反応条件が、用いられる分離法に干渉しうる場合、分子タグを切断および分離する前に、アッセイ反応バッファーを除去または交換することが必要でありうる。例えば、アッセイ条件には、電気泳動移動度に基づき分子タグを分離する場合、分離の効能を劣化させる塩濃度（例えば、特異的な結合に必要とされる）が含まれうる。したがって、例えば、分子タグを切断する前に、このような高塩濃度のバッファーを除去し、濾過、吸引、希釈、または他の手段により、電気泳動による分離に適する別のバッファーで置換することができる。
【０１５５】
特定の実施形態では、被験体に、トラスツズマブを包含する組合せ療法を投与することができる。組合せ療法は、当業者に公知の任意の化学療法剤のうちの１つ以上であるがこれらに限定されない化学療法剤との組合せで、トラスツズマブを包含しうる。化学療法剤は、作用機構が、トラスツズマブとは異なることが好ましい。例えば、化学療法剤は、代謝拮抗薬（例えば、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、フルダラビンなど）、抗微小管剤（例えば、ビンクリスチン；ビンブラスチン；パクリタキセルおよびドセタキセルなどのタキサン類など）、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、メルファラン、ビスクロロエチルニトロソウレア（ｂｉｓｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）など）、白金剤（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ＪＭ−２１６、ＣＩ−９７３など）、アントラサイクリン類（例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシンなど）、抗生物質（例えば、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤなど）、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポシド、カンプトテシンなど）、または、当業者に公知である、他の任意の化学療法剤でありうる。
【０１５６】
本発明の薬学的組成物、剤形、およびキットを含め、本発明の各種の実施形態で用いうる化学療法剤の具体例には、シタラビン、メルファラン、トポテカン、フルダラビン、エトポシド、イダルビシン、ダウノルビシン、ミトキサントロン、シスプラチン、パクリタキセル、およびシクロホスファミドが含まれるがこれらに限定されない。
【０１５７】
用いうる他の化学療法剤には、アバレリクス、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリトレチノイン、アロプリノール、アルトレタミン、アミフォスチン、アナストロゾール、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、ＢＣＧ生菌、ベバセイズマブ、ベキサロテン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、カルステロン、カンプトテシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、セレコキシブ、セツキシマブ、クロラムブシル、シナカルセト、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダルベポエチンアルファ、ダウノルビシン、デニロイキンジフチトクス、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドロモスタノロン、エリオットのＢ溶液、エピルビシン、エポエチンアルファ、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチム、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルベストラント、ゲムシタビン、ゲムツズマブ  オゾガマイシン、ゲフィチニブ、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イブリツモマブチウキセタン、イダルビシン、イフォスファミド、イマチニブ、インターフェロンアルファ２ａ、インターフェロンアルファ２ｂ、イリノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、メトキサレン、メチルプレドニゾロン、マイトマイシンＣ、ミトーテン、ミトキサントロン、ナンドロロン、ノフェツモマブ、オブリメルセン、オプレルベキン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペガデマーゼ、ペグアスパルガーゼ、ペグフィルグラスチム、ペメトレキセド、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ポリフェプロサン、ポルフィマー、プロカルバジン、キナクリン、ラスブリカーゼ、リツキシマブ、サルグラモスチム、ストレプトゾシン、滑石、タモキシフェン、タルセバ、テモゾロミド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレチノイン、ウラシルマスタード、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、およびゾレドロネートが含まれる。
【０１５８】
別の態様では、本発明は、Ｈｅｒ２作用剤に加えた、少なくとも１つの化学療法剤による治療が、Ｈｅｒ２陽性癌を有する被験体に奏効する可能性がなく、かつ／または該患者が短い時間経過を有する可能性があるかどうかを判定する方法を対象とする。特定の実施形態では、方法は、被験体の癌に由来する生物学的試料において、Ｈｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量を測定するステップを含み、ここで、該Ｈｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体のレベルが高いレベルまたは極めて高いレベルであれば、Ｈｅｒ２作用剤に加えた、少なくとも１つの化学療法剤該被験体に奏効する可能性がない。
【０１５９】
特定の実施形態では、方法は、Ｈｅｒ−２が高い患者を、２つの群：極めて高い群と、中程度に高い群とに層別化するステップを含みうる。層別化は、本明細書に記載されるＨｅｒ−２の使用を含みうる。一部の実施形態では、方法は、被験体の癌に由来する生物学的試料において、Ｈｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量を検出するステップをさらに含み、ここで、該Ｈｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量が、中程度に高ければ、患者群を、高いＨｅｒ−３発現体および低いＨｅｒ−３発現体にさらに細分化（すなわち、層別化）する。一部の実施形態では、Ｈｅｒ−２作用剤が、Ｈｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体が中程度に高く（すなわち、中程度量）、かつ、Ｈｅｒ−３が低い患者よりも、Ｈｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体が中程度に高く（すなわち、中程度量）、かつ、Ｈｅｒ−３が高い患者に奏効する可能性が低く、かつ／または、Ｈｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体が中程度に高く（すなわち、中程度量）、かつ、Ｈｅｒ−３が高い患者は、Ｈｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体が中程度に高く（すなわち、中程度量）、かつ、Ｈｅｒ−３が低い患者より長い時間経過を有する。本発明の各々の方法の特定の実施形態では、高いＨｅｒ−２発現は、ｌｏｇ１０Ｈ２Ｔ≧約１．１４〜１．１２５である。本明細書で開示される各々の方法の特定の実施形態では、高いＨｅｒ−２発現は、極めて高い発現、および／または中程度に高い発現を含む。本明細書で開示される各々の方法の特定の実施形態では、極めて高いＨｅｒ−２発現は、ｌｏｇ１０Ｈ２Ｔ≧約１．８４〜２．２１である。本明細書で開示される各々の方法の特定の実施形態では、中程度に高い発現は、１．１４〜１．２５と、１．８４〜２．２１との間である。あるいは、患者コホートおよび／またはモニタリングされる重要事象に応じて、他の範囲も用いることができる。
【０１６０】
特定の実施形態では、生物学的試料は、ＦＦＰＥを含む。特定の実施形態では、被験体の癌は乳癌である。特定の実施形態では、乳癌は、転移性である。一部の実施形態では、乳癌は、早期乳癌（すなわち、アジュバント療法）である。または、Ｈｅｒ−２作用剤に対して感受性でありうる任意の癌をモニタリングすることができる。Ｈｅｒ−２作用剤は、任意のＨｅｒ−２作用剤でありうる。特定の実施形態では、Ｈｅｒ−２作用剤が、本明細書に記載される薬剤のうちの１つである。例えば、特定の実施形態では、Ｈｅｒ−２作用剤はトラスツズマブである。特定の実施形態では、化学療法剤は、パクリタキセルである。
【０１６１】
特定の実施形態では、Ｈｅｒ−２の量を測定する。特定の実施形態では、Ｈｅｒ−２ホモ二量体の量を測定する。特定の実施形態では、Ｈｅｒ−２が中程度量であれば、Ｈｅｒ−３の量を測定する。特定の実施形態では、Ｈｅｒ−２が中程度に高ければ（すなわち、中程度量）、Ｈｅｒ−３ホモ二量体および／またはＨｅｒ−２／Ｈｅｒ−３ヘテロ二量体の量を測定する。特定の実施形態では、試料におけるタンパク質間相互作用の量を測定および／または定量化することが可能なアッセイを用いてＨｅｒ−２および／またはｈｅｒ−３の量を測定する。特定の実施形態では、アッセイが、ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイである。特定の実施形態では、奏効する可能性を、全生存率、無増悪期間に関して、かつ／またはＲＥＣＩＳＴ基準もしくは他の効果判定基準を用いて測定する。
【０１６２】
別の態様では、本発明は、Ｈｅｒ２作用剤に加えた、少なくとも１つの化学療法剤による治療が、Ｈｅｒ２陽性癌を有する被験体に奏効する可能性があるかどうかを判定する方法を対象とする。特定の実施形態では、方法が、被験体の癌に由来する生物学的試料において、Ｈｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量を測定するステップを含み、ここで、該Ｈｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体のレベルが低レベルであれば、Ｈｅｒ２作用剤に加えた、少なくとも１つの化学療法剤が該患者に奏効する可能性がある。特定の実施形態では、生物学的試料は、ＦＦＰＥを含む。特定の実施形態では、被験体の癌は乳癌である。特定の実施形態では、乳癌は、転移性である。一部の実施形態では、乳癌は、早期乳癌（すなわち、アジュバント療法）である。または、Ｈｅｒ−２作用剤に対して感受性でありうる任意の癌をモニタリングすることができる。Ｈｅｒ−２作用剤は、任意のＨｅｒ−２作用剤でありうる。特定の実施形態では、Ｈｅｒ−２作用剤は、本明細書に記載される薬剤のうちの１つである。例えば、特定の実施形態では、Ｈｅｒ−２作用剤はトラスツズマブである。特定の実施形態では、さらなる化学療法剤は、パクリタキセルである。あるいは、当技術分野で公知であり、かつ／または本明細書で開示さえる他のさらなる化学療法剤も評価することができる。特定の実施形態では、奏効する可能性または時間経過を、全生存率、無増悪期間に関して、かつ／またはＲＥＣＩＳＴを用いて測定する。
【０１６３】
別の態様では、本発明は、Ｈｅｒ２作用剤がＨｅｒ−２陽性癌を有する被験体に奏効する可能性があるかどうかを判定し、かつ／または疾患の時間経過が長いかどうかを予測し、かつ／または該被験体に重要事象が生じるかどうかを予測する方法であって、被験体の癌に由来する生物学的試料において、Ｈｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量を検出するステップと、Ｈｅｒ−２ホモ二量体対全Ｈｅｒ−２比を決定するステップとを含み、該対象の比が、少なくとも３つのサブグループのうちの１つにあると決定し、該対象の比が低値のサブグループまたは高値のサブグループにあれば、該Ｈｅｒ−２作用剤が該被験体に奏効する可能性があり、該被験体は長い時間経過を有する可能性があり、かつ／または該被験体に重要事象が生じる可能性がない方法を対象とする。好ましい実施形態では、Ｈｅｒ−２作用剤により治療される集団対Ｈｅｒ−２作用剤によらずに治療される集団について、Ｈｅｒ−２ホモ二量体対全Ｈｅｒ−２比を、ハザード比と比較することにより、少なくとも３つのサブグループを決定し、ハザード比が１未満であれば、該Ｈｅｒ−２作用剤が該被験体に奏効する可能性があり、該患者は長い時間経過を有する可能性がより高く、かつ／または該被験体に重要事象が生じる可能性がより低い。
【０１６４】
例えば、早期状況（すなわち、アジュバント療法）におけるトラスツズマブの有効性について調べるようにデザインされたＦＩＮ  ＨＥＲ臨床試験において、トラスツズマブの有効性との関連でもまた、Ｈ２Ｄ／Ｈ２Ｔ比、Ｈｅｒ−２発現（Ｈ２Ｔ）、およびＨｅｒ−２ホモ二量体レベル（Ｈ２Ｄ）を試験した。Ｈ２Ｔ、Ｈ２Ｄ、およびＨ２Ｄ／Ｈ２Ｔを、該試験におけるＩＨＣ、ＣＩＳＨ、および臨床転帰と比較した。ＩＨＣまたはＦＩＳＨによるＨｅｒ−２の陽性度（ｐｏｓｉｔｉｖｉｔｙ）は、予後診断の悪化、およびトラスツズマブによる臨床転帰の改善と相関することが示されているので、ＨＥＲＭａｒｋアッセイなどの定量的アッセイにより、奏効する可能性のある患者と、奏効する可能性のない患者とを識別することが可能であると期待された。しかし、コックス比例ハザード解析により示される通り、Ｈ２ＴおよびＨ２Ｄのいずれも、転帰と著明には相関しなかった。これに対し、Ｈ２Ｄ／Ｈ２Ｔは、無再発期間（ＴＡＲ）と独立に関連し、無遠隔再発期間（ＴＤＲ）とはほぼ著明に関連した。これらの知見が得られたため、ＳＴＥＰＰ（部分集団治療効果パターンプロット）解析を実施して、Ｈ２Ｔ、Ｈ２Ｄ、およびＨ２Ｄ／Ｈ２Ｔの分布全体にわたり、被治療患者対対照患者について、ハザード比を試験した。これらの解析には、患者８０例の部分集団を用いた。Ｈ２ＤおよびＨ２Ｔのいずれによっても、トラスツズマブから利益を得ない患者群が同定されなかったのに対し、Ｈ２Ｄ／Ｈ２Ｔによれば、トラスツズマブが奏効する患者群と、トラスツズマブが奏効しない患者群とが識別されることが示された。この後者の群のＨ２Ｄ／Ｈ２Ｔ比は、Ｈ２Ｄ／Ｈ２Ｔ比が低い群と、Ｈ２Ｄ／Ｈ２Ｔ比が高い群との間の中間である。本出願者らは、機構についての理論に拘束されることを望まないが、この観察についての１つの可能な説明は、Ｈ２Ｄ／Ｈ２Ｔが、乳腺腫瘍におけるＨｅｒ−２活性化の尺度であり、したがって、トラスツズマブを施されていない、早期状況（すなわち、アジュバント療法）にあるＨｅｒ−２陽性患者について予後診断するバイオマーカーであり、早期状況（すなわち、アジュバント療法）において、トラスツズマブにより治療された場合に患者が得る臨床的有益性の程度について予測するバイオマーカーであるということである。
【０１６５】
特定の実施形態では、被験体の癌は乳癌である。特定の実施形態では、被験体の癌は、転移性癌または原発性早期癌（すなわち、アジュバント療法）である。特定の実施形態では、Ｈｅｒ−２作用剤はトラスツズマブである。特定の実施形態では、ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイを用いて、Ｈｅｒ−２、Ｈｅｒ−２ホモ二量体、Ｈｅｒ−３、Ｈｅｒ−３ホモ二量体、およびＨｅｒ−２／Ｈｅｒ−３ヘテロ二量体を検出する。特定の実施形態では、奏効する可能性、長い時間経過を有する可能性、および／または重要事象が生じる可能性を、全生存率として、無増悪期間として、無遠隔再発期間および無病生存期間として、かつ／またはＲＥＣＩＳＴを用いる効果または臨床的有益性として測定する。特定の実施形態では、ＩＨＣまたはＦＩＳＨまたはＣＩＳＨにより、癌がＨｅｒ−２陽性であるかどうかを判定する。他の実施形態では、本発明は、被験体の癌のＨｅｒ−２ホモ二量体対全Ｈｅｒ−２比を、最適のカットオフと比較することにより、Ｈｅｒ−２ホモ二量体対全Ｈｅｒ−２比が低いか、中間であるか、または高いかを決定するステップを含む方法を対象とする。またさらなる実施形態では、Ｈｅｒ−２ホモ二量体対全Ｈｅｒ−２比が中間であり、かつ／またはハザード比が１以上であれば、Ｈｅｒ−２作用剤が患者に奏効する可能性が低く、かつ／または該患者は長い時間経過を有する可能性が低く、かつ／または該患者に重要事象が生じる可能性がより高い。
【０１６６】
さらなる態様では、本発明は、癌を有する被験体を治療する方法を提供する。一態様では、方法は、本発明の方法により、被験体が、Ｈｅｒ−２作用剤による治療が奏効する可能性があり、かつ／または長い時間経過を有する癌に罹患していることを判定するステップと、前記判定の結果として、該被験体に有効量のＨｅｒ−２作用剤を投与するステップとを含む。別の態様では、本方法は、本発明の方法により、被験体が、Ｈｅｒ−２作用剤による治療が奏効する可能性があり、かつ／または長い時間経過を有する癌に罹患していることを判定し、次いで、該被験体に有効量のＨｅｒ−２作用剤を投与する治療選択肢について、医療従事者に助言するステップを含む。別の態様では、本方法は、被験体が、短い時間経過を有し、かつ／またはＨｅｒ２作用剤に加えた化学療法剤が奏効する可能性がない癌に罹患していることを判定するステップを含む。本発明のこれらの態様の各々が、各種の実施形態の各々（例えば、Ｈｅｒ−２、ならびに本明細書で開示される他のマーカーの発現による層別化；各種のＨｅｒ−２作用剤、および／または他の化学療法剤の評価；多様な癌の種類についての分析）を含む。特定の実施形態では、Ｈｅｒ−２作用剤はトラスツズマブである。特定の実施形態では、化学療法剤は、パクリタキセルである。特定の実施形態では、癌は乳癌である。特定の実施形態では、乳癌は、転移性乳癌または原発性早期乳癌（すなわち、アジュバント療法）である。
【実施例】
【０１６７】
（実施例１）
抗体、ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）抗体、ビオチンおよび分子はさみ
モノクローナル抗体である、ＨＥＲ２の細胞質ドメインに対するＡｂ８およびＨＥＲ２のＣ末端に対するＡｂ１５を、Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎから購入した。ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）レポーター（Ｐｒｏ１１およびＰｒｏ１４）およびストレプトアビジンをコンジュゲートしたメチレンブルー（「分子はさみ」）を以前記載されたプロトコールに従って合成し、精製した（例えば、任意の図を含め、上記、および本明細書に参照により組み込まれている米国特許第７，１０５，３０８号を参照されたい）。抗体−ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）コンジュゲートおよび抗体−ビオチンコンジュゲート、すなわち、Ａｂ８−Ｐｒｏ１１およびＡｂ−１５−ビオチンを、ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ  ）を製造者のプロトコールに従ってリンカーとして使用して作製し、コンジュゲート産物をＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ）によって精製した。
【０１６８】
（実施例２）
細胞培養、固定、処理およびパラフィン包埋
４つの乳癌細胞系である、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３およびＳＫＢＲ−３をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入した。全ての細胞系を、３７℃、５％ＣＯ２において、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ））：Ｆ１２（５０：５０）、１０％ＦＢＳ、１％ＰＳＱ（１０％ウシ胎仔血清、１％ペニシリン−ストレプトマイシン）および２ｍＭのＬ−グルタミンで維持した。各細胞系につき少なくとも１０個の１５０ｍｍの培養皿で細胞をほぼ集密になるまで増殖させた。培地を取り除いた後、細胞を冷たい１×ＰＢＳで１回洗浄し、各皿に１０％ＮＢＦ（中性緩衝ホルマリン）１５ｍＬを加えた。細胞を４℃で一晩（＞１６時間）固定した。固定液を取り除いた後、残りの固定液で掻き取ることによって細胞を回収し、３２００×ｇで１５分間遠心分離した。細胞ペレットをゴム製のＯリングに移し、濾紙で包み、処理カセットに置いた。処理するために自動Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ処理装置を使用した。簡単に記載すると、細胞ペレットを、濃度を次第に上昇させたアルコール、Ｃｌｅａｒ−ｒｉｔｅ（キシレン代替品）、およびパラフィンに曝露させた。処理後、パラフィン包埋ステーション（ｐａｒａｆｆｉｎ  ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ  ｓｔａｔｉｏｎ）を使用してペレットをブロックに包埋した。細胞ペレットを処理するために使用した全ての溶媒は、Ｒｉｃｈａｒｄ−Ａｌｌｅｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手した。
【０１６９】
（実施例３）
乳房組織、固定、処理およびパラフィン包埋
Ｈｅｒ−２発現レベルが異なる凍結乳房組織をＢｉｏｏｐｔｉｏｎｓから購入した。組織の塊（０．９〜１．９グラム）を１０％ＮＢＦに、４℃で約２４時間固定し、細胞系ペレットについて記載した通り、処理し、パラフィン包埋した。
【０１７０】
（実施例４）
顕微鏡切片作成法
ミクロトーム（ＬＥＩＣＡ）を用いて厚さ７μｍの切片を切り取り、連続番号を付した正電荷を帯びたガラススライド（ＶＷＲ）に置いた。スライドを３０分間風乾し、次いで、６０℃に設定した加熱したオーブンで１時間焼いた。全ての試料スライドを将来のアッセイのために４℃で貯蔵した。
【０１７１】
（実施例５）
免疫組織化学検査およびＨ＆Ｅ染色
Ｖｅｎｔａｎａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＸＴシステムで、製造者の説明書に従ってＨｅｒ−２についての免疫組織化学検査を行った。Ｈｅｒ−２に対する一次抗体（ＣＢ１１）および他の試薬はＶｅｎｔａｎａから購入した。ＦＦＰＥ乳房組織のＨ＆Ｇ染色を標準のプロトコールに従って行った。
【０１７２】
（実施例６）
ホルマリン固定パラフィン包埋された細胞系および乳房組織における、Ｈｅｒ−２  ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイ
ＦＦＰＥ試料を、一連の溶媒を使用して脱パラフィン／再水和させた。簡単に記載すると、スライドをキシレン（２×、５分）、１００％エタノール（２×、５分）、７０％エタノール（２×、５分）および脱イオン水（２×、５分）に順次浸漬した。再水和した試料の熱誘導性エピトープ回復（Ｈｅａｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）を、１×クエン酸バッファー（ｐＨ６．０）（Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ）２５０ｍＬを含有する皿中で、電子レンジ（Ｓｐａｃｅｍａｋｅｒ  ＩＩ、ＧＥ）を使用して行った：出力１０で３分、次に出力３で１０分。室温で２０分間冷却した後、スライドを脱イオン水で１回すすいだ。疎水性ペン（Ｚｙｍｅｄ）を使用してスライドに疎水性の円を描いて試薬をスライド上に保持した。次いで、１×ＰＢＳ中１％マウス血清、１．５％ＢＳＡおよびプロテアーゼ阻害剤とホスファターゼ阻害剤のカクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含有するブロッキングバッファーで試料を１時間ブロッキングした。吸引してブロッキングバッファーを取り除いた後、ブロッキングバッファーで調製した、ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）をコンジュゲートした抗体およびビオチンをコンジュゲートした抗体の混合物（どちらの濃度も４μｇ／ｍＬ）を加え、結合反応物を加湿チャンバー内、４℃で振とうしながら一晩インキュベートした。抗体混合物を吸引し、試料を、１×ＰＢＳ中０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有する洗浄バッファーで洗浄し、ストレプトアビジンをコンジュゲートしたメチレンブルーを１×ＰＢＳ中、２．５μｇ／ｍＬの濃度で加えた。抗体およびストレプトアビジン−光増感剤コンジュゲートの濃度は、細胞系および乳房組織の試料の両方を使用して、シグナル特異性およびアッセイの読み取りのダイナミックレンジに基づいて全て最適化した。室温で１時間インキュベートした後、ストレプトアビジンメチレンブルー試薬を吸引し、試料を洗浄バッファーで１回洗浄した後、脱イオン水を３回交換して洗浄した。０．０１×ＰＢＳ中、３ｐＭのフルオレセインおよび２種のＣＥ内部マーカー（ＭＦおよびＭＬ）を含有するイルミネーションバッファーを試料切片に加えた。電子冷却ブロック（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ｉｃｅ  ｃｕｂｅ）（Ｔｏｒｒｅｙ  Ｐｉｎｅ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を備えた自家のＬＥＤアレイイルミネーターを使用して、結合したＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）を約４℃で光活性化切断によって遊離させた。遊離したＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）レポーターを含有するＣＥ試料を上記スライド上の組織切片から採取し、ＣＥ試料の遊離したＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）レポーターを、３０℃で６ｋＶ、５０秒のＣＥ注入条件下、ＡＢＩ３１００  ＣＥ機器（２２ｃｍのキャピラリーアレイ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分離し、検出した。
【０１７３】
（実施例７）
データ分析
ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）Ｉｎｆｏｒｍｅｒソフトウェアを使用してＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）の同定および定量化を行った（例えば、任意の図面を含め、参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願公開第２００７／０２０３４０８−Ａ１号を参照されたい）。未加工のＣＥ電気泳動図においてＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）シグナルを分析するために、２種のＣＥ内部マーカーである、ＭＦ（最初のマーカー）およびＭＬ（最後のマーカー）を使用して、ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）ピークを、それらの電気泳動移動度、または２種のマーカーに対する移動時間ｔ、すなわち［ｔ（ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標））−ｔ（ＭＦ）］／［ｔ（ＭＬ）−ｔ（ＭＦ）］に従って同定した。次いで、同定されたＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）ピークを、各ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）についてピーク面積を算出することによって定量化した。組織切片からのＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）回収におけるばらつき、およびキャピラリーアレイにわたるＣＥ注入効率および／または検出感度における処理のばらつきを補正するために、フルオレセイン（３ｐＭ）をイルミネーションバッファーおよびＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）回収バッファーに含め、各試料の処理における内部参照対照として一緒に電気泳動した。次いで、各ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）ピーク面積を、ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）ピーク（ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）ピーク面積）を内部フルオレセインピーク（フルオレセインピーク面積／１ｐＭ）に対して面積正規化することによってＲＦＵまたはＲＰＡとして報告し、それは濃度（ｐＭ）の単位を有した。ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイによって検出された標的タンパク質についての最終的な定量化の項は、同様の試料についてのＲＰＡ（ｐＭ）または可変の腫瘍試料に対するＲＰＡ＊ＩＢ  容積／ＴＡ（＝相対ピーク面積×試料切片にローディングされたイルミネーションバッファーの容積（ＩＢ）÷腫瘍面積ｍｍ２（ＲＰＡ＊ＩＢ  容積／ＴＡ＝ｐモル／Ｌ＊Ｌ／ｍｍ２＝ｐモル／ｍｍ２）のいずれかとすることができる。
【０１７４】
（実施例８）
試料切片サイズの滴定および腫瘍面積の推定
ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイの、同じ試料被検物における標的タンパク質を定量化する能力を評価するために、スライド上の７μｍに切り取った細胞系試料の切片サイズをかみそりの刃を用いて連続的に滴定し、また、異なる数の、ミクロトームで切り取った乳房組織切片を、その組織材料の各滴定のため１枚のスライドに捕捉した。ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイ後、細胞系のスライドを風乾し、フォトスキャンした。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用してスキャンされた画像についてｍｍ２単位の試料の切片面積を測定し、算出した。乳房組織試料について、ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイ後のスライドをＨ＆Ｅ染色し、マウント媒体（Ｒｉｃｈａｒｄ−Ａｌｌａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でマウントした。組織試料の腫瘍内容物が認定病理学者によってマーカーペンを使用して画定され、ｍｍ２単位の腫瘍内容物の面積を、細胞系試料と同じ様式でＩｍａｇｅＪソフトウェアで測定し、算出した。
【０１７５】
（実施例９）
ＦＦＰＥ細胞に対するＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイの開発
ＦＦＰＥ  ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイの概要を図１に示す。アッセイを開始する前に、ヒト乳癌の細胞系または腫瘍組織からＦＦＰＥミクロトーム切片を作製し、上記の通りガラススライドに焼き付けた。ＦＦＰＥ細胞系またはＦＦＰＥ腫瘍組織切片を標準のキシレン／エタノール／水プロトコールによって脱パラフィンし、再水和させ、次いで熱誘導性抗原回復に供し、その後ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイに供した。ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）をコンジュゲートした抗体とビオチンをコンジュゲートした抗体の対を加えてＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイを開始し、その後洗浄し、ストレプトアビジンをコンジュゲートした光増感剤（すなわち、ＳＡ−メチレンブルー、ＳＡ−ＭＢ）と一緒にインキュベートした。細胞系および腫瘍切片を６７０ｎｍの光照射に曝露させ、その間に、ビオチン抗体に結合した光増感剤により、バッファー溶液で、溶存酸素が反応性の高い一重項状態の酸素（Ｏ２）に変換された。これは吸収、項間交差およびＯ２産生によって起こる。
【０１７６】
Ｏ２分子は短寿命（水中で約４μｓ）であり、したがって限られた平均拡散距離を有し、例えば、産生したＯ２は、クエンチされるまでにその５０％が約８０ｎｍ拡散し、＜０．１％が２５０ｎｍ拡散する（Ｌａｔｃｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００６）。したがって、拡散したＯ２がＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）レポーター分子と抗体との間の共有結合と反応し、それにより近接であることに基づいてチオエーテル結合が切断され、組織細胞に結合したＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）レポーター分子が遊離する（例えば、図２Ａおよび２Ｂを参照されたい）。従来のキャピラリー電気泳動（ＣＥ）機器を適用して、遊離したＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）レポーターを、その移動特性に従って分離し、電気泳動図において、ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）Ｉｎｆｏｒｍｅｒソフトウェアを使用してピーク面積として同定および定量化することができる蛍光ピークとして検出する。したがって、ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）蛍光レポーター分子のピーク面積は、細胞に存在する標的抗原の量に直接比例する。ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）ピーク面積は、最初にＲＦＵで算出する。ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）シグナルを、組織切片からの回収の変動およびＣＥへの注入の変動について補正するために、既知濃度の内部標準フルオレセインのピーク面積に対するピーク面積（ＲＰＡ）を算出する。
【０１７７】
ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイを開発するために適したＨｅｒ−２抗体の近接対を同定するために、５種の抗体を、ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）蛍光レポーター基またはビオチンのいずれかにコンジュゲートし、１０種の近接対を、ＦＦＰＥ調製したヒト乳腺腫瘍細胞系に対して、それぞれ１μｇ／ｍＬで試験した。各抗体対の性能を、ＳＫ−ＢＲ−３細胞（６×１０５／細胞）、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞（１．５×１０５／細胞）；ＢＴ−２０細胞（６×１０４／細胞）；ＭＣＦ−７細胞（２×１０４／細胞）およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞（陰性対照；＜１０４／細胞）においてＦＡＣＳ分析および他の独立した方法によって決定される相対的なＨｅｒ−２タンパク質発現レベルに相当するその能力によって評価した。Ｈｅｒ−２抗体対、Ａｂ１５およびＡｂ８により、シグナルの最大ダイナミックレンジが生成し、これは他の方法によって定量化された相対的なＨｅｒ−２発現レベルと一致している。４つのよく特徴付けられたＦＦＰＥ乳癌細胞系に対して生成したＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）シグナルの代表的な電気泳動図を、ＤＡＢ発色を利用した相当するＨｅｒ−２のＩＨＣ顕微鏡写真と一緒に図３に示す。Ｈｅｒ−２  ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイから生成したＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）のピーク面積は、ＩＨＣシグナル強度に相当し、一般に認められたＨｅｒ−２発現レベルのＩＨＣ試験カテゴリー（すなわち、ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ：ＳＫ−ＢＲ−３＝３＋；ＭＤＡ−ＭＢ−４５３＝２＋；ＭＣＦ−７＝０−１＋；ＭＤＡ−ＭＢ−４６８＝０）と一致している。
【０１７８】
（実施例１０）
ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）抗体およびアッセイの最適化
ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイを近接フォーマット（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ｆｏｒｍａｔ）で開発するのに適した抗体対を同定して、個々の抗体について、非近接の、直接ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）遊離条件下での相対的な親和性および特異性、ならびに近接条件下でのＫ１／２および飽和濃度を決定した。抗体滴定を、ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）をコンジュゲートしたＡｂ８−Ｐｒｏ１１またはＡｂ１５−Ｐｒｏ１１を用い、陽性Ｈｅｒ−２発現ＦＦＰＥ細胞系（ＳＫＢＲ−３）および陰性Ｈｅｒ−２発現ＦＦＰＥ細胞系（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８）に対して、ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）を遊離させるために飽和濃度（２００μＭ）のＯ２増感剤メチレンブルーを利用して行った。濃度を上昇させた結合抗体からのこの非近接のＰｒｏ１１  ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）の遊離は、抗体の相対的な親和性を反映する。Ａｂ８−Ｐｒｏ１１に対する多パラメータカーブフィッティングの結果が、ＫＤ＝６〜８μｇ／ｍＬ（４０〜５０ｎＭ）である単一結合部位と最も一致し、ＫＤ＝２〜３μｇ／ｍＬ（１２〜１８ｎＭ）であるＡｂ１５−Ｐｒｏ１１の単一結合部位と類似している。陰性対照のＭＤＡ−ＭＢ−４６８から、Ａｂ８−Ｐｒｏ１１の非特異的結合が総ＳＫ−ＢＲ−３シグナルの＜４％であると推定することができ、一方、Ａｂ１５−Ｐｒｏ１１の非特異的結合は約１０％であることが推定される。
【０１７９】
総Ｈｅｒ−２の近接アッセイのために最適なＡｂ８−Ｐｒｏ１１およびＡｂ１５−ビオチンの濃度を、ＦＦＰＥ乳癌細胞系およびヒト乳腺腫瘍試料に対する抗体滴定によって決定した。どちらの抗体の濃度も、滴定の間、等しく０．２５μｇ／ｍＬ〜８μｇ／ｍＬに保持した。どちらの抗体についても、およそ２μｇ／ｍＬに等しい最大ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）シグナルＫ１１２が観察され、飽和濃度は３〜４μｇ／ｍＬに達した。この滴定実験および他の同様の滴定実験において、最適なシグナル対バックグラウンド比１００〜２００は、Ａｂ８−Ｐｒｏ１１およびＡｂ１５−ビオチンのどちらについても２〜４μｇ／ｍＬである。追加的な最適化実験により、Ｏ２増感試薬ＳＡ−ＭＢはほとんどの条件下で２．５μｇ／ｍＬの濃度で飽和し、最適な照射時間は２時間であることが決定された。これらの結果を考慮し、さらなるアッセイ最適化および性能の特徴付けのために、Ａｂ８−Ｐｒｏ１１およびＡｂ１５−ビオチンについてはどちらも４μｇ／ｍＬ（２６ｎＭ）の濃度を選択し、ＳＡ−ＭＢについては２．５μｇ／ｍＬを選択した。
【０１８０】
３つのＨｅｒ−２  ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイフォーマットを４μｇ／ｍＬの抗体濃度で比較して、最良のアッセイ性能がもたらされる条件を同定した。これらはＡｂ１５−ビオチン＋Ａｂ８−Ｐｒｏ１１と、Ａｂ８−ビオチン＋Ａｂ１５−Ｐｒｏ１１からなる２つの近接フォーマット、および飽和メチレンブルーの存在下でＡｂ８−Ｐｒｏ１１からのＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）の非近接の直接遊離である。最も高い全体的なシグナルはメチレンブルー直接遊離フォーマットによってもたらされたが、どちらの近接アッセイ方法の結果もバックグラウンドが低く、シグナル対バックグラウンド比およびダイナミックレンジが高く、独立した方法によって決定された予測される細胞当たりの受容体数が最も密接に追跡された。Ａｂ１５−ビオチンおよびＡｂ８−Ｐｒｏ１１を用いた近接フォーマットによって、最良のシグナル対バックグラウンド比がもたらされ、この近接フォーマットを、さらなる試験のための最終アッセイフォーマットとして選択した。
【０１８１】
Ｈｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量が中程度である生物学的試料を、上記の方法を用いてＨｅｒ−３の発現についてさらに分析した。したがって、中程度のＨｅｒ−２発現体（ｅｘｐｒｅｓｓｏｒ）を、Ｈｅｒ−３発現体のレベルが高いか低いかによって、さらに層別化、もしくは分類した。
【０１８２】
（実施例１１）
転移性乳癌患者におけるＨｅｒ−２およびＨｅｒ−３分類の適用
ＭＢＣ患者のコホートにおいてＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイを行った。このコホート（Ｎ＝１０３）は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｅｒｕｍ  Ｈｅｒ２／ｎｅｕ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ（ＩＳＨＳＧ）から得られ、Ｌｉｐｔｏｎコホートと称される。中心の場所（ｃｅｎｔｒａｌ  ｌｏｃａｔｉｏｎ）−オーストリアのＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｖｉｅｎｎａにおいて、一人の病理学者によって患者に対してＩＨＣが行われ、患者はＩＨＣ３＋または２＋／ＦＩＳＨ陽性であった。患者１０３人から、９９人が中心でのＦＩＳＨ測定（ｃｅｎｔｒａｌ  ＦＩＳＨ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）を受け、９８人がＨ２Ｔ測定を受け、７９人がＨ３Ｔ測定を受けた。このようにして選択された７９人の患者のうち、Ｈ２Ｔ≧１．１４のＦＩＳＨ陰性であった３人を除外した。したがって、患者７６人の最終的な試験群を試験した。
【０１８３】
以下の通り５つの群を試験した。
【０１８４】
【表１】
0005615986.tif 000002
図４に示した通り、Ｈｅｒ−２陽性患者のプール全体は７．９ヵ月の無増悪期間（ＴＴＰ）中央値を有した。第１群の患者についてのデータを図５に示し、それにより４．４ヵ月のＴＴＰ中央値が示されている。
【０１８５】
ＦＩＳＨ陽性かつ低ＨＥＲ−２発現体である第２群の患者についてのデータを図６に示し、それによりＦＩＳＨ陰性かつＨ２Ｔ＜１．４について４．４ヵ月、ＦＩＳＨ陽性かつＨ２Ｔ＜１．１４について３．２ヵ月、そしてＦＩＳＨ陽性かつＨ２Ｔ≧１．１４について１１．３ヵ月のＴＴＰ中央値が示されている。ＦＩＳＨ陽性、Ｈ２Ｔ≧１．１４である群と比較して、ＦＩＳＨ陰性、Ｈ２Ｔ＜１．１４である群（ＨＲ＝２．７；ｐ＝０．０００２）およびＦＩＳＨ陽性、Ｈ２Ｔ＜１．１４である群（ＨＲ＝２．９；ｐ＝０．００４）である群は、転帰が劣った。
【０１８６】
ＦＩＳＨ陽性かつ高ＨＥＲ−２発現体である第３群の患者についてのデータを図７に示し、それによりＦＩＳＨ陽性かつ１．１４≦Ｈ２Ｔ＜１．８４について１２．２１ヵ月のＴＴＰが示されている。したがって、このデータにより、中程度に高いＨ２Ｔを有する（例えば、１．１４≦Ｈ２Ｔ＜１．８４である患者）ＦＩＳＨ陽性患者が、低Ｈ２Ｔ（例えば、Ｈ２Ｔ＜１．１４）のＦＩＳＨ陽性患者（ＨＲ＝４．０；ｐ＝０．０００２）、低Ｈ２ＴのＦＩＳＨ陰性患者（ＨＲ＝３．５；ｐ＜０．０００１）または高Ｈ２Ｔ（例えば、Ｈ２Ｔ＞１．８４）のＦＩＳＨ陽性患者（ＨＲ＝３．０；ｐ＝０．０００５）よりもよい動作をすることが示されている。
【０１８７】
ＦＩＳＨ陽性かつ高ＨＥＲ−２発現体であり、Ｈｅｒ−３発現が高いか低いかによってさらに層別化される第４群および第５群の患者についてのデータを図８に示し、それによりＦＩＳＨ陽性かつ１．１４≦Ｈ２Ｔ＜１．８４（例えば、中程度に高いＨ２Ｔ）かつ高Ｈｅｒ−３発現について７．４ヵ月のＴＴＰ中央値、およびＦＩＳＨ陽性かつ１．１４≦Ｈ２Ｔ＜１．８４（例えば、中程度に高いＨ２Ｔ）について１５．０ヵ月のＴＴＰ中央値が、および低Ｈｅｒ−３発現について１５．０ヵ月のＴＴＰ中央値が示されている。
【０１８８】
５つの群について、ＦＩＳＨ陰性、Ｈ２Ｔ＜１．１４に対するＴＴＰ中央値（月）およびハザード比を以下に示す。
【０１８９】
【表２】
0005615986.tif 000003
したがって、データにより、ＩＨＣに基づいてトラスツズマブを用いた治療を受けた患者のかなりの数がＦＩＳＨ陰性であり、治療が奏効しなかったことが示されている。ＨＥＲｍａｒｋによって測定されたときに低Ｈｅｒ−２発現を有したＦＩＳＨ陽性患者のサブグループにはトラスツズマブを用いた治療が奏効しなかった一方で、ＨＥＲｍａｒｋによって測定されたときに非常に高いＨｅｒ−２発現を有するＦＩＳＨ陽性患者の別のサブグループにも、トラスツズマブを用いた治療が奏効しなかった。ＨＥＲｍａｒｋによって測定されたときに中程度に高い（例えば、中間の）Ｈｅｒ−２発現を有するＦＩＳＨ陽性患者の第３のサブグループに、トラスツズマブを用いた治療が最良の奏効を示した。
【０１９０】
中程度に高い（例えば、中間の）Ｈｅｒ−２発現を有するＦＩＳＨ陽性患者の第３のサブグループは、Ｈｅｒ−３発現レベルに基づいてさらに細分することができた。第３のサブグループにおいて、データにより、高Ｈｅｒ−３発現を有する患者（第４群）は、ＦＩＳＨ陰性、低Ｈｅｒ−２発現患者（第１群）よりも有意に長いＴＴＰを有し（ｐ＝０．０５１）、増悪の危険性は約半分であったことが示されている。一方、低Ｈｅｒ−３発現を有する第３のサブグループの患者（第５群）が、いずれのサブグループのうちで最良の奏効を有し、ＦＩＳＨ陰性、低Ｈｅｒ−２発現患者（第１群）と比較して危険性が５分の１であり、中間のＨｅｒ−２かつ高Ｈｅｒ−３の発現体よりも有意によく奏効した（ｐ＝０．０００３）。
【０１９１】
したがって、データにより、Ｈｅｒ−２陽性癌の患者に、Ｈｅｒ２作用剤を用いた治療が奏効する可能性があるかどうかを決定すること、および／またはＨｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量を測定することによって疾患の時間経過を予測することが可能であることが示されており、ここで、Ｈｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量が中程度に高ければ（例えば、中間）、Ｈｅｒ−３の量を測定することによって患者をさらに分類する。Ｈｅｒ−２作用剤を用いて治療される患者で、中程度のＨｅｒ−２発現を有するが高Ｈｅｒ−３発現を有する患者はより長いＴＴＰを有し、一方、中程度のＨｅｒ−２発現を有するが低Ｈｅｒ−３発現を有する患者では最もよく奏効する。
【０１９２】
（実施例１２）
早期状況（すなわち、アジュバント療法）の乳癌患者におけるＨｅｒ−２およびＨｅｒ−３分類の適用
ＦｉｎＨｅｒ（Ｊｏｅｎｓｕｕら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００６、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００９）は、早期化学療法（すなわち、アジュバント療法）に加えたトラスツズマブの臨床的利益を示しているいくつかの前向き無作為化臨床試験の１つである。本発明者らは、トラスツズマブの臨床的利益と、ＨＥＲｍａｒｋアッセイによって決定された定量的なＨＥＲ２タンパク質発現（Ｈ２Ｔ）との間の関連を調査した。ＨＥＲｍａｒｋアッセイのために適切な浸潤性腫瘍組織を有するＦｉｎＨｅｒ試験の浸潤性乳癌の８９９症例からのホルマリン固定されたパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織を含めた。これらのうち１９６が、ＣＩＳＨによりＨＥＲ−２陽性であった。この試験において、ＨＥＲ２陽性癌を有する患者（ｎ＝２３２）を、化学療法と同時にトラスツズマブ投与を９週間受けるか、化学療法単独を受けるかに無作為に割り当てた。この試験において、本発明者らは、トラスツズマブ治療または対照に無作為化されたＨＥＲ２陽性癌の患者に焦点を置いた。位置走査分析を行って、非常に高いＨ２Ｔの群を識別する最適なカットオフを同定した。図９に示している通り、Ｈ２Ｔ値が非常に高い（ｌｏｇＨ２Ｔ≧２．２１；≧１２５．９ＨＥＲｍａｒｋ単位）患者には、対照と比較して、化学療法にトラスツズマブを加えた治療の利益はなかったが（ＴＤＲについて、ＨＲ＝１．２３、Ｐ＝０．７５、ＯＳについて、ＨＲ＝１．０５、Ｐ＝０．９５）、Ｈ２Ｔ値が＜１２５．９の患者には利益があった（ＴＤＲについて、ＨＲ＝０．５２、Ｐ＝０．０５、ＯＳについて、ＨＲ＝０．４８、Ｐ＝０．１）。
【０１９３】
本出願において言及した全ての出版された特許および刊行物は、ここで、本参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１９４】
本発明の好ましい実施形態を例示し、記載しているが、本発明の主旨および範囲から逸脱することなく種々の変更を行うことができることを理解されたい。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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