(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体材料足場（scaffold）であって、
ａ）培養細胞又は動物組織に由来する再構成細胞外マトリクス、及び
ｂ）高分子電解質複合体繊維
を含み、
前記マトリクス及び前記繊維が機能的に関連する、生体材料足場。
【請求項２】
前記高分子電解質複合体繊維がポリカチオン前駆体及びポリアニオン前駆体から構成される、請求項１に記載の生体材料足場。
【請求項３】
前記ポリカチオン前駆体がアルギン酸ナトリウムである、請求項２に記載の生体材料足場。
【請求項４】
再構成細胞外マトリクスが、前記ポリカチオン前駆体及び前記ポリアニオン前駆体に組み込まれる、請求項２に記載の生体材料足場。
【請求項５】
再構成細胞外マトリクスが、前記ポリカチオン前駆体又は前記ポリアニオン前駆体に組み込まれる、請求項２に記載の生体材料足場。
【請求項６】
再構成細胞外マトリクスが前記ポリアニオン前駆体に組み込まれる、請求項２に記載の生体材料足場。
【請求項７】
前記動物組織が、皮膚、肝臓、膵臓、腎臓、骨髄、筋肉、心臓、肺、胃腸管、脳及び小腸粘膜下組織を含む群から選択される、請求項１〜６のいずれかに記載の生体材料足場。
【請求項８】
前記動物組織がラットの肝臓組織である、請求項７に記載の生体材料足場。
【請求項９】
前記再構成細胞外マトリクスが、胚幹細胞、成体幹細胞、芽細胞、クローン細胞、胎盤細胞、角化細胞、表皮基底細胞、尿上皮細胞、唾液腺細胞、粘液細胞、漿液細胞、フォンエブナー腺細胞、乳腺細胞、涙腺細胞、耳道腺細胞、エクリン汗腺細胞、アポクリン汗腺細胞、Ｍｏｌｌ腺細胞、皮脂腺細胞、ボーマン腺細胞、ブルンネル腺細胞、精嚢腺細胞、前立腺細胞、尿道球腺細胞、バルトリン腺細胞、リトル腺細胞、子宮内膜細胞、気道又は消化管の杯細胞、胃の粘膜細胞、胃腺の酵素原細胞、胃腺の酸分泌細胞、インスリン産生β細胞、グルカゴン産生α細胞、ソマトスタチン産生Δ細胞、膵臓ポリペプチド産生細胞、膵管細胞、小腸のパネート細胞、肺のＩＩ型肺細胞、肺のクララ細胞、下垂体前葉細胞、下垂体中葉細胞、下垂体後葉細胞、腸管及び気道のホルモン分泌細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、副腎細胞、性腺細胞、腎臓の傍糸球体細胞、腎臓の緻密斑細胞、腎臓の周囲極細胞（peri polar cells）、腎臓のメサンギウム細胞、腸の刷子縁細胞、エクソクリン腺の線条導管細胞、胆嚢上皮細胞、腎臓の近位尿細管の刷子縁細胞、腎臓の遠位尿細管、精巣輸出管の調停細胞（conciliated cells）、精巣上体主細胞、精巣上皮基底細胞、肝細胞、脂肪細胞、Ｉ型肺胞細胞、膵管細胞、汗腺の平滑筋導管細胞（nonstriated duct cells）、唾液腺の平滑筋導管細胞、乳腺の平滑筋導管細胞、腎糸球体の傍細胞、腎糸球体の有足細胞、ヘンレ係蹄の細い部分の細胞、集合導管細胞、精嚢の導管細胞、前立腺の導管細胞、血管内皮細胞、滑膜細胞、漿膜細胞、耳の外リンパ腔の内側を覆う扁平上皮細胞、耳の内リンパ腔の内側を覆う細胞、脈絡叢細胞、軟膜クモ膜の扁平上皮細胞、目の毛様体上皮細胞、角膜内皮細胞、推進機能を有する繊毛細胞、エナメル芽細胞、耳の前庭器の半月面細胞、コルチ器官の歯間細胞、繊維芽細胞、毛細血管の周辺細胞、椎間板の核パルポサス細胞、セメント芽細胞、セメント細胞、象牙質芽細胞、象牙質細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、骨前駆細胞、目の硝子体の硝子体細胞、耳の外リンパ腔の星型細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、筋上皮細胞、赤血球細胞、血小板、巨核球、単球、結合組織マクロファージ、ランゲルハンス細胞、破骨細胞、樹状細胞、小グリア細胞、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、プラズマ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、キラーＴ細胞、キラー細胞、桿体細胞、錐体細胞、コルチ器の内有毛細胞、コルチ器の外有毛細胞、耳の前庭器のＩ型有毛細胞、耳の前庭器のＩＩ型有毛細胞、ＩＩ型味覚芽細胞、嗅覚神経細胞、嗅上皮の基底細胞、Ｉ型頸動脈小体細胞、ＩＩ型頸動脈小体細胞、メルケル細胞、接触に特化した一次感覚神経、温度に特化した一次感覚神経、痛覚に特化した一次神経、固有受容性一次感覚神経、自律神経系のコリン作動性神経細胞、自律神経系のアドレナリン作動性神経細胞、自律神経系のペプチド作動性神経細胞、コルチ器の内柱細胞、コルチ器の外柱細胞、コルチ器の内部支持細胞（phalangeal cells）、コルチ器の外部支持細胞、境界細胞、ヘンゼン細胞、前庭器の支持細胞（supporting cells）、味覚芽の支持細胞、嗅上皮の支持細胞、シュワン細胞、衛星細胞、腸のグリア細胞、中枢神経系の神経細胞、中枢神経系の星状細胞、中枢神経系の乏突起膠細胞、前水晶体上皮細胞、水晶体繊維細胞、メラニン細胞、網膜色素上皮細胞、虹彩色素上皮細胞、卵原細胞、卵母細胞、精母細胞、精原細胞、卵胞細胞、セルトリ細胞、及び胸腺上皮細胞、肝細胞癌又はその組合せ、或いはそれらに由来する細胞株を含む群のいずれか１つから選択される細胞培養物又は細胞に由来する請求項１、４、５、又は６のいずれか１項に記載の生体材料足場。
【請求項１０】
前記再構成細胞外マトリクスが骨芽細胞株又は肝細胞癌細胞株に由来する、請求項１、４、５、６、又は９のいずれか１項に記載の生体材料足場。
【請求項１１】
前記骨芽細胞株がＭＣ−３Ｔ３である、請求項１０に記載の生体材料足場。
【請求項１２】
前記肝細胞癌細胞株がＨｅｐＧ２である、請求項１０に記載の生体材料足場。
【請求項１３】
少なくとも１つの安定剤をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の生体材料足場。
【請求項１４】
少なくとも１つの生理活性剤をさらに含み、該生理活性剤が前記高分子電解質複合体繊維内で播種した複数の細胞を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の生体材料足場。
【請求項１５】
前記複数の細胞が、胚幹細胞、成体幹細胞、芽細胞、クローン細胞、胎盤細胞、角化細胞、表皮基底細胞、尿上皮細胞、唾液腺細胞、粘液細胞、漿液細胞、フォンエブナー腺細胞、乳腺細胞、涙腺細胞、耳道腺細胞、エクリン汗腺細胞、アポクリン汗腺細胞、Ｍｏｌｌ腺細胞、皮脂腺細胞、ボーマン腺細胞、ブルンネル腺細胞、精嚢腺細胞、前立腺細胞、尿道球腺細胞、バルトリン腺細胞、リトル腺細胞、子宮内膜細胞、気道又は消化管の杯細胞、胃の粘膜細胞、胃腺の酵素原細胞、胃腺の酸分泌細胞、インスリン産生β細胞、グルカゴン産生α細胞、ソマトスタチン産生Δ細胞、膵臓ポリペプチド産生細胞、膵管細胞、小腸のパネート細胞、肺のＩＩ型肺細胞、肺のクララ細胞、下垂体前葉細胞、下垂体中葉細胞、下垂体後葉細胞、腸管及び気道のホルモン分泌細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、副腎細胞、性腺細胞、腎臓の傍糸球体細胞、腎臓の緻密斑細胞、腎臓の周囲極細胞、腎臓のメサンギウム細胞、腸の刷子縁細胞、エクソクリン腺の線条導管細胞、胆嚢上皮細胞、腎臓の近位尿細管の刷子縁細胞、腎臓の遠位尿細管、精巣輸出管の調停細胞、精巣上体主細胞、精巣上皮基底細胞、肝細胞、脂肪細胞、Ｉ型肺胞細胞、膵管細胞、汗腺の平滑筋導管細胞、唾液腺の平滑筋導管細胞、乳腺の平滑筋導管細胞、腎糸球体の傍細胞、腎糸球体の有足細胞、ヘンレ係蹄の細い部分の細胞、集合導管細胞、精嚢の導管細胞、前立腺の導管細胞、血管内皮細胞、滑膜細胞、漿膜細胞、耳の外リンパ腔の内側を覆う扁平上皮細胞、耳の内リンパ腔の内側を覆う細胞、脈絡叢細胞、軟膜クモ膜の扁平上皮細胞、目の毛様体上皮細胞、角膜内皮細胞、推進機能を有する繊毛細胞、エナメル芽細胞、耳の前庭器の半月面細胞、コルチ器官の歯間細胞、繊維芽細胞、毛細血管の周辺細胞、椎間板の核パルポサス細胞、セメント芽細胞、セメント細胞、象牙質芽細胞、象牙質細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、骨前駆細胞、目の硝子体の硝子体細胞、耳の外リンパ腔の星型細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、筋上皮細胞、赤血球細胞、巨核球、単球、結合組織マクロファージ、ランゲルハンス細胞、破骨細胞、樹状細胞、小グリア細胞、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、プラズマ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、キラーＴ細胞、キラー細胞、桿体細胞、錐体細胞、コルチ器の内有毛細胞、コルチ器の外有毛細胞、耳の前庭器のＩ型有毛細胞、耳の前庭器のＩＩ型有毛細胞、ＩＩ型味覚芽細胞、嗅覚神経細胞、嗅上皮の基底細胞、Ｉ型頸動脈小体細胞、ＩＩ型頸動脈小体細胞、メルケル細胞、接触に特化した一次感覚神経、温度に特化した一次感覚神経、痛覚に特化した一次神経、固有受容性一次感覚神経、自律神経系のコリン作動性神経細胞、自律神経系のアドレナリン作動性神経細胞、自律神経系のペプチド作動性神経細胞、コルチ器の内柱細胞、コルチ器の外柱細胞、コルチ器の内部支持細胞、コルチ器の外部支持細胞、境界細胞、ヘンゼン細胞、前庭器の支持細胞、味覚芽の支持細胞、嗅上皮の支持細胞、シュワン細胞、衛星細胞、腸のグリア細胞、中枢神経系の神経細胞、中枢神経系の星状細胞、中枢神経系の乏突起膠細胞、前水晶体上皮細胞、水晶体繊維細胞、メラニン細胞、網膜色素上皮細胞、虹彩色素上皮細胞、卵原細胞、卵母細胞、精母細胞、精原細胞、卵胞細胞、セルトリ細胞、及び胸腺上皮細胞、肝細胞癌又はその組合せ、或いはそれらに由来する細胞株を含む群のいずれか１つから選択される、請求項１４に記載の生体材料足場。
【請求項１６】
生体材料足場を合成する方法であって、
ａ）細胞外マトリクスを標的細胞又は標的組織から単離すること、
ｂ）ａ）の粒子懸濁液を得ること、
ｃ）界面高分子電解質複合体形成の条件下で、ｂ）の前記懸濁液で高分子電解質複合体繊維を形成すること、及び
ｄ）前記足場を前記繊維から形成すること、
を含む、生体材料足場を合成する方法。
【請求項１７】
高分子電解質複合体及び細胞外マトリクスを含む複合材料。
【請求項１８】
前記細胞外マトリクスが、胚幹細胞、成体幹細胞、芽細胞、クローン細胞、胎盤細胞、角化細胞、表皮基底細胞、尿上皮細胞、唾液腺細胞、粘液細胞、漿液細胞、フォンエブナー腺細胞、乳腺細胞、涙腺細胞、耳道腺細胞、エクリン汗腺細胞、アポクリン汗腺細胞、Ｍｏｌｌ腺細胞、皮脂腺細胞、ボーマン腺細胞、ブルンネル腺細胞、精嚢腺細胞、前立腺細胞、尿道球腺細胞、バルトリン腺細胞、リトル腺細胞、子宮内膜細胞、気道又は消化管の杯細胞、胃の粘膜細胞、胃腺の酵素原細胞、胃腺の酸分泌細胞、インスリン産生β細胞、グルカゴン産生α細胞、ソマトスタチン産生Δ細胞、膵臓ポリペプチド産生細胞、膵管細胞、小腸のパネート細胞、肺のＩＩ型肺細胞、肺のクララ細胞、下垂体前葉細胞、下垂体中葉細胞、下垂体後葉細胞、腸管及び気道のホルモン分泌細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、副腎細胞、性腺細胞、腎臓の傍糸球体細胞、腎臓の緻密斑細胞、腎臓の周囲極細胞（peri polar cells）、腎臓のメサンギウム細胞、腸の刷子縁細胞、エクソクリン腺の線条導管細胞、胆嚢上皮細胞、腎臓の近位尿細管の刷子縁細胞、腎臓の遠位尿細管、精巣輸出管の調停細胞（conciliated cells）、精巣上体主細胞、精巣上皮基底細胞、肝細胞、脂肪細胞、Ｉ型肺胞細胞、膵管細胞、汗腺の平滑筋導管細胞（nonstriated duct cells）、唾液腺の平滑筋導管細胞、乳腺の平滑筋導管細胞、腎糸球体の傍細胞、腎糸球体の有足細胞、ヘンレ係蹄の細い部分の細胞、集合導管細胞、精嚢の導管細胞、前立腺の導管細胞、血管内皮細胞、滑膜細胞、漿膜細胞、耳の外リンパ腔の内側を覆う扁平上皮細胞、耳の内リンパ腔の内側を覆う細胞、脈絡叢細胞、軟膜クモ膜の扁平上皮細胞、目の毛様体上皮細胞、角膜内皮細胞、推進機能を有する繊毛細胞、エナメル芽細胞、耳の前庭器の半月面細胞、コルチ器官の歯間細胞、繊維芽細胞、毛細血管の周辺細胞、椎間板の核パルポサス細胞、セメント芽細胞、セメント細胞、象牙質芽細胞、象牙質細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、骨前駆細胞、目の硝子体の硝子体細胞、耳の外リンパ腔の星型細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、筋上皮細胞、赤血球細胞、血小板、巨核球、単球、結合組織マクロファージ、ランゲルハンス細胞、破骨細胞、樹状細胞、小グリア細胞、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、プラズマ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、キラーＴ細胞、キラー細胞、桿体細胞、錐体細胞、コルチ器の内有毛細胞、コルチ器の外有毛細胞、耳の前庭器のＩ型有毛細胞、耳の前庭器のＩＩ型有毛細胞、ＩＩ型味覚芽細胞、嗅覚神経細胞、嗅上皮の基底細胞、Ｉ型頸動脈小体細胞、ＩＩ型頸動脈小体細胞、メルケル細胞、接触に特化した一次感覚神経、温度に特化した一次感覚神経、痛覚に特化した一次神経、固有受容性一次感覚神経、自律神経系のコリン作動性神経細胞、自律神経系のアドレナリン作動性神経細胞、自律神経系のペプチド作動性神経細胞、コルチ器の内柱細胞、コルチ器の外柱細胞、コルチ器の内部支持細胞（phalangeal cells）、コルチ器の外部支持細胞、境界細胞、ヘンゼン細胞、前庭器の支持細胞（supporting cells）、味覚芽の支持細胞、嗅上皮の支持細胞、シュワン細胞、衛星細胞、腸のグリア細胞、中枢神経系の神経細胞、中枢神経系の星状細胞、中枢神経系の乏突起膠細胞、前水晶体上皮細胞、水晶体繊維細胞、メラニン細胞、網膜色素上皮細胞、虹彩色素上皮細胞、卵原細胞、卵母細胞、精母細胞、精原細胞、卵胞細胞、セルトリ細胞、及び胸腺上皮細胞、肝細胞癌又はその組合せ、或いはそれらに由来する細胞株を含む群のいずれか１つから選択される細胞培養物又は細胞に由来する請求項１７に記載の複合材料。
【請求項１９】
前記複合材料が生体材料足場の構成要素を含む、請求項１８に記載の複合材料。
【請求項２０】
再構成細胞外マトリクス、高分子電解質複合体繊維及び播種細胞を含む生体材料足場であって、該細胞外マトリクスが、該播種細胞と同じか、類似か、又は異なる細胞型に由来する、生体材料足場。
【請求項２１】
再構成細胞外マトリクス、高分子電解質複合体繊維及び播種細胞を含む生体材料足場であって、該細胞外マトリクスが、該播種細胞と同じ細胞型に由来する、生体材料足場。
【請求項２２】
分化した表現型及び機能の播種細胞を増殖、分化又は維持させる方法であって、所望の細胞型（複数可）を請求項１に記載の生体材料足場に播種すること、並びに該分化した表現型及び機能の播種細胞の増殖、分化又は維持を促す条件下で該播種細胞を培養することを含む、方法。
【請求項２３】
前記再構成細胞外マトリクスが、少なくともフィブロネクチン、コラーゲン及びヘパラン硫酸プロテオグリカンを含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の生体材料足場。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞外マトリクスを含む繊維足場、及び組織工学におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
組織工学（ＴＥ）は、全臓器の組織機能を回復、維持又は改善させる生体代替物の開発に対して工学及びライフサイエンスの原理を適用する学際的分野である。組織工学的な技法及び材料は、組織移植及び臓器移植を含むが、これらに限定されない広範な治療手順及び臨床手順においてますます応用されている。組織工学は、まだ相当の知識ギャップがあることを特徴とする新興の分野である。
【０００３】
１９８０年代後半及び１９９０年代前半における主要な知識ギャップとしては、所望の表現型を確実に且つ制御可能に発現する大量の細胞源、インプラント組織に対する免疫応答の詳細、インプラント組織のｉｎ  ｖｉｖｏリモデリング及び形態形成における化学的シグナル及び物理的シグナルの役割、三次元組織構築物の適切な血管化（vascularization）を達成するための血管形成を制御する手段、特定の組織工学製品の製造のためにバイオリアクター及びバイオプロセス技法を作成及び最適化する設計原理、並びに製造時から使用時までＴＥ製品を保存する手段が挙げられた。
【０００４】
組織工学では典型的に、工学材料として生細胞を用いる。組織工学のプロセスに用いられる細胞は、足場に移植される。足場は、三次元組織形成を可能にする任意の人工構造体として従来は定義され得る。
【０００５】
足場に望ましい特徴としては、細胞接着、並びに細胞栄養物及び発現産物の拡散への適合が挙げられるが、これらに限定されない。細胞栄養物の適当な拡散には、足場での組織の発達が必要である。足場が周囲組織に吸収されない場合、足場の外科的除去が一般的に必要になることから、生分解性は足場における別の望ましい特徴である。
【０００６】
組織の発達及び再生の両方に関して、無数の因子が細胞の増殖及び分化に寄与し、組織を形成する。これらの因子は、細胞に接近可能な様式で組織工学１に利用される生体材料マトリクス又は足場にある必要がある。
【０００７】
足場で発達する細胞への栄養物の提供に関連した問題が幾つかある。組換え因子等の或る特定の栄養物質の使用は、このような製品に対する非常に高いコストによって制限されている。さらに、再生に関与する因子、足場で生理活性リガンドを固定化する戦略、又は生体分子を足場から持続して送る戦略に関する知識レベルには大きなギャップがある。この知識のギャップは、足場が潜在的に恵まれ得る生理活性の全領域のうちごくわずかな部分に通常焦点を当てるという解決策をもたらしている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、足場において細胞栄養物を細胞に送る技法を改善する必要がある。特に、足場で広範の栄養物を細胞に送る技法を改善する必要がある。
【０００９】
所定の足場に対して生理活性の範囲を増大させる方法がさらに必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ＥＣＭが三次元足場を形成するように再構成することができる基礎を形成する界面高分子電解質複合体形成によって形成される繊維への培養下の細胞で分泌される、又は動物組織に由来する細胞外マトリクスの組み込みに関する。このような三次元マトリクスは細胞表現型に対するＥＣＭの影響を研究するのに有用であり、機能性組織工学に対する有力なアプローチを構成する。
【００１１】
本発明の第１の態様によれば、再構成細胞外マトリクス、及び高分子電解質複合体繊維を含み、マトリクス及び繊維が機能的に関連する、生体材料足場が提供される。
【００１２】
第１の態様の１つの実施形態によれば、高分子電解質複合体繊維がポリカチオン前駆体及びポリアニオン前駆体から構成される。別の実施形態では、ポリカチオン前駆体がキトサンであり、ポリアニオン前駆体がアルギン酸ナトリウムである。別の実施形態では、再構成細胞外マトリクスが、ポリカチオン前駆体及びポリアニオン前駆体に組み込まれる。
【００１３】
さらなる実施形態において、再構成細胞外マトリクスが、ポリカチオン前駆体又はポリアニオン前駆体に組み込まれる。またさらなる実施形態では、再構成細胞外マトリクスがポリアニオン前駆体に組み込まれる。またさらなる実施形態では、再構成細胞外マトリクスが培養細胞又は動物組織に由来する。またさらなる実施形態では、動物組織が、皮膚、肝臓、膵臓、腎臓、骨髄、筋肉、心臓、肺、胃腸管、脳及び小腸粘膜下組織を含む群から選択される。動物組織はラットの肝臓組織であり得る。
【００１４】
第１の態様の実施形態において、再構成細胞外マトリクスが、胚幹細胞、成体幹細胞、芽細胞、クローン細胞、胎盤細胞、角化細胞、表皮基底細胞、尿上皮細胞、唾液腺細胞、粘液細胞、漿液細胞、フォンエブナー腺細胞、乳腺細胞、涙腺細胞、耳道腺細胞、エクリン汗腺細胞、アポクリン汗腺細胞、Ｍｏｌｌ腺細胞、皮脂腺細胞、ボーマン腺細胞、ブルンネル腺細胞、精嚢腺細胞、前立腺細胞、尿道球腺細胞、バルトリン腺細胞、リトル腺細胞、子宮内膜細胞、気道又は消化管の杯細胞、胃の粘膜細胞、胃腺の酵素原細胞、胃腺の酸分泌細胞、インスリン産生β細胞、グルカゴン産生α細胞、ソマトスタチン産生Δ細胞、膵臓ポリペプチド産生細胞、膵管細胞、小腸のパネート細胞、肺のＩＩ型肺細胞、肺のクララ細胞、下垂体前葉細胞、下垂体中葉細胞、下垂体後葉細胞、腸管及び気道のホルモン分泌細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、副腎細胞、性腺細胞、腎臓の傍糸球体細胞、腎臓の緻密斑細胞、腎臓の周囲極細胞、腎臓のメサンギウム細胞、腸の刷子縁細胞、エクソクリン腺の線条導管細胞、胆嚢上皮細胞、腎臓の近位尿細管の刷子縁細胞、腎臓の遠位尿細管、精巣輸出管の調停細胞、精巣上体主細胞、精巣上皮基底細胞、肝細胞、脂肪細胞、Ｉ型肺胞細胞、膵管細胞、汗腺の平滑筋導管細胞、唾液腺の平滑筋導管細胞、乳腺の平滑筋導管細胞、腎糸球体の傍細胞、腎糸球体の有足細胞、ヘンレ係蹄の細い部分の細胞、集合導管細胞、精嚢の導管細胞、前立腺の導管細胞、血管内皮細胞、滑膜細胞、漿膜細胞、耳の外リンパ腔の内側を覆う扁平上皮細胞、耳の内リンパ腔の内側を覆う細胞、脈絡叢細胞、軟膜クモ膜の扁平上皮細胞、目の毛様体上皮細胞、角膜内皮細胞、推進機能を有する繊毛細胞、エナメル芽細胞、耳の前庭器の半月面細胞、コルチ器官の歯間細胞、繊維芽細胞、毛細血管の周辺細胞、椎間板の核パルポサス細胞、セメント芽細胞、セメント細胞、象牙質芽細胞、象牙質細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、骨前駆細胞、目の硝子体の硝子体細胞、耳の外リンパ腔の星型細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、筋上皮細胞、赤血球細胞、血小板、巨核球、単球、結合組織マクロファージ、ランゲルハンス細胞、破骨細胞、樹状細胞、小グリア細胞、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、プラズマ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、キラーＴ細胞、キラー細胞、桿体細胞、錐体細胞、コルチ器の内有毛細胞、コルチ器の外有毛細胞、耳の前庭器のＩ型有毛細胞、耳の前庭器のＩＩ型有毛細胞、ＩＩ型味覚芽細胞、嗅覚神経細胞、嗅上皮の基底細胞、Ｉ型頸動脈小体細胞、ＩＩ型頸動脈小体細胞、メルケル細胞、接触に特化した一次感覚神経、温度に特化した一次感覚神経、痛覚に特化した一次神経、固有受容性一次感覚神経、自律神経系のコリン作動性神経細胞、自律神経系のアドレナリン作動性神経細胞、自律神経系のペプチド作動性神経細胞、コルチ器の内柱細胞、コルチ器の外柱細胞、コルチ器の内部支持細胞、コルチ器の外部支持細胞、境界細胞、ヘンゼン細胞、前庭器の支持細胞、味覚芽の支持細胞、嗅上皮の支持細胞、シュワン細胞、衛星細胞、腸のグリア細胞、中枢神経系の神経細胞、中枢神経系の星状細胞、中枢神経系の乏突起膠細胞、前水晶体上皮細胞、水晶体繊維細胞、メラニン細胞、網膜色素上皮細胞、虹彩色素上皮細胞、卵原細胞、卵母細胞、精母細胞、精原細胞、卵胞細胞、セルトリ細胞、及び胸腺上皮細胞、肝細胞癌又はその組合せを含む群のいずれか１つから選択される細胞培養物又は細胞に由来する。
【００１５】
再構成細胞外マトリクスは、骨芽細胞株又は肝細胞癌細胞株に由来し得る。骨芽細胞株はＭＣ−３Ｔ３である。肝細胞癌細胞株はＨｅｐＧ２である。生体材料足場は少なくとも１つの安定剤をさらに含み得る。
【００１６】
第１の態様の別の実施形態において、生体材料足場は少なくとも１つの生理活性剤をさらに含み、生理活性剤が高分子電解質複合体繊維内で播種した複数の細胞を含む。
【００１７】
複数の細胞が、胚幹細胞、成体幹細胞、芽細胞、クローン細胞、胎盤細胞、角化細胞、表皮基底細胞、尿上皮細胞、唾液腺細胞、粘液細胞、漿液細胞、フォンエブナー腺細胞、乳腺細胞、涙腺細胞、耳道腺細胞、エクリン汗腺細胞、アポクリン汗腺細胞、Ｍｏｌｌ腺細胞、皮脂腺細胞、ボーマン腺細胞、ブルンネル腺細胞、精嚢腺細胞、前立腺細胞、尿道球腺細胞、バルトリン腺細胞、リトル腺細胞、子宮内膜細胞、気道又は消化管の杯細胞、胃の粘膜細胞、胃腺の酵素原細胞、胃腺の酸分泌細胞、インスリン産生β細胞、グルカゴン産生α細胞、ソマトスタチン産生Δ細胞、膵臓ポリペプチド産生細胞、膵管細胞、小腸のパネート細胞、肺のＩＩ型肺細胞、肺のクララ細胞、下垂体前葉細胞、下垂体中葉細胞、下垂体後葉細胞、腸管及び気道のホルモン分泌細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、副腎細胞、性腺細胞、腎臓の傍糸球体細胞、腎臓の緻密斑細胞、腎臓の周囲極細胞、腎臓のメサンギウム細胞、腸の刷子縁細胞、エクソクリン腺の線条導管細胞、胆嚢上皮細胞、腎臓の近位尿細管の刷子縁細胞、腎臓の遠位尿細管、精巣輸出管の調停細胞、精巣上体主細胞、精巣上皮基底細胞、肝細胞、脂肪細胞、Ｉ型肺胞細胞、膵管細胞、汗腺の平滑筋導管細胞、唾液腺の平滑筋導管細胞、乳腺の平滑筋導管細胞、腎糸球体の傍細胞、腎糸球体の有足細胞、ヘンレ係蹄の細い部分の細胞、集合導管細胞、精嚢の導管細胞、前立腺の導管細胞、血管内皮細胞、滑膜細胞、漿膜細胞、耳の外リンパ腔の内側を覆う扁平上皮細胞、耳の内リンパ腔の内側を覆う細胞、脈絡叢細胞、軟膜クモ膜の扁平上皮細胞、目の毛様体上皮細胞、角膜内皮細胞、推進機能を有する繊毛細胞、エナメル芽細胞、耳の前庭器の半月面細胞、コルチ器官の歯間細胞、繊維芽細胞、毛細血管の周辺細胞、椎間板の核パルポサス細胞、セメント芽細胞、セメント細胞、象牙質芽細胞、象牙質細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、骨前駆細胞、目の硝子体の硝子体細胞、耳の外リンパ腔の星型細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、筋上皮細胞、赤血球細胞、血小板、巨核球、単球、結合組織マクロファージ、ランゲルハンス細胞、破骨細胞、樹状細胞、小グリア細胞、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、プラズマ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、キラーＴ細胞、キラー細胞、桿体細胞、錐体細胞、コルチ器の内有毛細胞、コルチ器の外有毛細胞、耳の前庭器のＩ型有毛細胞、耳の前庭器のＩＩ型有毛細胞、ＩＩ型味覚芽細胞、嗅覚神経細胞、嗅上皮の基底細胞、Ｉ型頸動脈小体細胞、ＩＩ型頸動脈小体細胞、メルケル細胞、接触に特化した一次感覚神経、温度に特化した一次感覚神経、痛覚に特化した一次神経、固有受容性一次感覚神経、自律神経系のコリン作動性神経細胞、自律神経系のアドレナリン作動性神経細胞、自律神経系のペプチド作動性神経細胞、コルチ器の内柱細胞、コルチ器の外柱細胞、コルチ器の内部支持細胞、コルチ器の外部支持細胞、境界細胞、ヘンゼン細胞、前庭器の支持細胞、味覚芽の支持細胞、嗅上皮の支持細胞、シュワン細胞、衛星細胞、腸のグリア細胞、中枢神経系の神経細胞、中枢神経系の星状細胞、中枢神経系の乏突起膠細胞、前水晶体上皮細胞、水晶体繊維細胞、メラニン細胞、網膜色素上皮細胞、虹彩色素上皮細胞、卵原細胞、卵母細胞、精母細胞、精原細胞、卵胞細胞、セルトリ細胞、及び胸腺上皮細胞、肝細胞癌細胞又はその組合せを含む群のいずれか１つから選択される。
【００１８】
第１の態様のさらなる実施形態において、再構成細胞外マトリクスは上記の任意の細胞型由来の細胞株に由来する。
【００１９】
本発明の第２の態様によれば、生体材料足場を合成する方法であって、
ａ）細胞外マトリクスを標的細胞又は標的組織から単離すること、
ｂ）ａ）の粒子懸濁液を得ること、
ｃ）界面高分子電解質複合体形成の条件下で、ｂ）の懸濁液で高分子電解質複合体繊維を形成すること、及び
ｄ）足場を繊維から形成すること、
を含む、生体材料足場を合成する方法が提供される。
【００２０】
本発明の第３の態様によれば、高分子電解質複合体及び細胞外マトリクスを含む複合材料が提供される。
【００２１】
第３の態様の１つの実施形態において、細胞外マトリクスは、上記に記載されるような細胞型若しくは組織型、又はその組合せから得られる。第３の態様の別の実施形態では、複合材料が生体材料足場の構成要素を含む。
【００２２】
本発明の第４の態様によれば、再構成細胞外マトリクス、高分子電解質複合体繊維及び播種細胞を含み、細胞外マトリクスが、播種細胞と同じ又は類似の細胞型に由来する、生体材料足場が提供される。
【００２３】
本発明の第５の態様によれば、再構成細胞外マトリクス、高分子電解質複合体繊維及び播種細胞を含み、細胞外マトリクスが播種細胞と同じ細胞型に由来する、生体材料足場が提供される。
【００２４】
本発明の第６の態様によれば、分化した表現型及び機能の播種細胞を増殖、分化又は維持させる方法であって、所望の細胞型（複数可）を上記のような生体材料足場に播種すること、並びに分化した表現型及び機能の播種細胞の増殖、分化又は維持を促す条件下で播種細胞を培養することを含む、方法が提供される。
【００２５】
上記された本発明の概要は限定されるものではなく、本発明の他の特性及び利点は、以下の好ましい実施形態の詳細な説明及び添付の特許請求の範囲から明らかであろう。
【００２６】
本明細書内において、「含む（comprising）」という用語は、「必ずしもそれに限り含むのではなく原則的に包含する」という意味である。さらに、「含む（comprising）」という言葉の変形、例えば「含む（comprise）」及び「含む（comprises）」は対応して意味が変わる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
好ましい実施形態の詳細な説明
本発明の好ましい実施形態が、これからより詳細に記載され、以下の実施例に関して例示目的のみで挙げられる。
高分子電解質複合体の調製
足場の基礎を形成する高分子電解質複合体には、ポリアニオン及びポリカチオンが含まれ、これは集合的に高分子電解質又はポリイオンと表される。複合体は好ましくは架橋剤を含む。架橋剤は繊維ストランド内で高分子電解質を架橋し、このようにしてエンタングルメント（entanglement）処理中に隣接の繊維間での高分子電解質の二次複合体形成を阻害することができる。用いられる繊維は、任意の好適な様式、例えば界面高分子電解質複合体形成によって調製され得る。繊維は、足場を作製するために交絡される（entangled）。それから、足場でこの細胞が増殖するように、足場は標的細胞型で播種される。足場で増殖する標的細胞は、「播種細胞」と表すことができる。
【００２８】
繊維は水等の好適な液体で交絡され得る。例えば、繊維はハイドロエンタングルメント（従来はスパンレースとも呼ばれる）、ジェットエンタングルメント、ウォーターエンタングルメント、ハイドロリックニードリング、又はハイドロダイナミックニードリングによって交絡され得る。架橋剤を含む繊維を調製し、ハイドロエンタングルメント技法を用いてこれらの繊維を交絡させる技法は、本発明者等によるＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＳＧ２００５／０００１９８号「足場及び交絡繊維によって足場を形成する方法（Scaffold and Method of Forming Scaffold by Entangling Fibres）」（この内容は参照により本明細書に援用される）に記載されている。
【００２９】
繊維の不織ウェブを強化するのに織物産業で従来用いられるハイドロエンタングルメント技法は、幾つかの用途において好適であり得る。幾つかの好適な従来のハイドロエンタングルメントプロセスは、W. Albrecht, H. Fuchs, W. Kittelmann, Wiley-VCH: Weinheim, 2000編の不織繊維の原材料、製造、用途、特徴、試験プロセス（Nonwoven Fabrics Raw Materials, Manufacture, Applications, Characteristics, Testing processes）におけるU. Munstermann et al.著「ハイドロエンタングルメントプロセス（Hydroentanglement process）」、並びにGerold Fleeissner及びAlfred Watzlに対して２０００年９月５日に発行された米国特許第６，１１２，３８５号（それぞれの内容が参照により本明細書に援用される）に記載されている。
高分子電解質繊維
本発明で用いられる繊維は、任意の好適なサイズ及び形状を有し得る。繊維の平均直径は、数十ミクロン、例えば約１〜１００ミクロン、約１０〜１００ミクロン、約１５〜８５ミクロン、約３０〜７０ミクロンの範囲であり得る。直径の下限は、繊維の機械的特性によって決定され得る。直径の上限は、どの程度特定の繊維材料がハイドロエンタングルメントによって効率的に交絡し得るかによって変わり得る。繊維の長さもその用途によって変わり得る。例えば、繊維の長さは、１〜１０００ｍｍ、例えば約５０〜９００ｍｍ、約１５０〜８００ｍｍ、約３００〜７５０ｍｍ、４００〜６００ｍｍの範囲であり得る。繊維は、交絡する前に洗浄等の前処理を行ってもよい。当然ながら、湿潤繊維は乾燥繊維よりも操作が簡単であり得る。
【００３０】
繊維は任意の高分子電解質複合体を含み得る。高分子電解質複合体は、２つの反対の電荷を有する高分子電解質分子であるポリアニオン及びポリカチオンによって形成され得る。高分子電解質は典型的には水又は任意の他のイオン化溶媒に入れられると高荷電高分子に解離する巨大分子種である。例示的な高分子電解質複合体としては、アルギン酸−キトサン、ヘパリン−キトサン、コンドロイシン硫酸−キチン、ヒアルロン酸−キトサン、ＤＮＡ−キチン、ＲＮＡ−キチン、ポリ（グルタミン酸）−ポリ（オルニチン酸）、ポリアクリル酸−ポリ（リシン）、及びポリ（エチレンイミン）−ジェラン複合体等が挙げられる。
【００３１】
高分子電解質複合体を形成するのに好適な高分子電解質材料としては、天然高分子電解質、合成高分子電解質、化学修飾生体高分子等が挙げられる。例示的な高分子電解質材料としては、カルボキシル化ポリマー；ポリ（エチレンイミン）等のアミノ化ポリマー；キチン及びキトサン並びにそれらの誘導体；アクリレートポリマー；ＤＮＡ及びＲＮＡ等の核酸；ヒストンタンパク質；コンドロイチン硫酸、ヘパリン及びアルギン酸塩等の酸性多糖類並びにこれらの誘導体；ポリ（リシン）及びポリ（グルタミン酸）等のポリ（アミノ酸）；ヒアルロン酸；ポリ（オルニチン酸）；ポリアクリル酸；及びジェラン等が挙げられる。高分子電解質材料の選択は、足場が用いられる用途及び繊維を形成するのに利用される特定のプロセスによって変わり得る。例えば、アルギン酸塩とキトサンとの組が、所望の物理特性、化学特性及び生化学特性を有するので、生物医学用途に用いることができる。
【００３２】
反対の電荷を有する高分子電解質が、界面高分子電解質複合体形成として知られるプロセスにおいて互いに近づけられると、高分子電解質複合体が形成され得る。例えば、アルギン酸塩（ポリアニオン）及びキトサン（ポリカチオン）がこのようなプロセスで高分子電解質複合体を形成し得る。このようなプロセスでは、ポリアニオン溶液及びポリカチオン溶液が互いに近づき、界面を形成する。界面領域では、局所的な複合体形成が起こり得る。複合体形成とは、高分子電解質複合体を形成するための２つの反対の電荷を有する高分子電解質の結合を表す。形成された高分子電解質複合体は、電荷の中和により不溶性になり得る。したがって、繊維ストランドを界面領域から引き出すことができ、高分子電解質複合体繊維を調製することができる。
【００３３】
それぞれの繊維での高分子電解質複合体を形成する複合体形成プロセスは、本明細書で「一次」高分子電解質複合体形成と表される。隣接繊維間の高分子電解質複合体は、特に水が繊維に導入される場合、「二次」高分子電解質複合体形成によってより大きな複合体を形成することもある。
【００３４】
繊維が水中で互いに押し合わされる場合、隣接繊維由来の反対の電荷を有する群間の引力のために、二次高分子電解質複合体形成が起こり得る。二次高分子電解質複合体形成の結果として、より大きな高分子電解質複合体が形成され、共に繊維を保持する。繊維は高分子電解質複合体（ポリイオン複合体とも呼ばれる）及び架橋剤を含有する。架橋剤は、繊維ストランド内の高分子電解質を架橋することができ、このようにして、エンタングルメント処理中の隣接繊維間の高分子電解質の二次複合体形成を阻害する。高分子電解質の二次複合体形成が抑制又は低減される場合に阻害されると考えられる。架橋剤は、Ｓｉ−Ｏ結合を介して高分子電解質と結合することができるケイ素を含み得る。架橋剤は、例えば、シリカ中にシロキサン結合（Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ）を含み得る。
【００３５】
繊維中の架橋剤の相対量は、用いられる用途及び高分子電解質によって当業者が容易に決定することができる。高分子電解質としてアルギン酸塩及びキトサン、並びに架橋剤の前駆体としてＴＥＯＳを用いた界面高分子電解質複合体形成によって繊維が形成される場合、界面領域のキトサン、アルギン酸塩及びＴＥＯＳの重量比は、約８：１：０〜約１：１６：１９であり得る。この比が約８：１：３．７〜約１：１６：９．４である場合が好適であり得る。
【００３６】
当然ながら、他のシリカ前駆体を用いてもよい。例えば、ＴＥＯＳは、オルトケイ酸テトラメチル（ＴＭＯＳ）、Ｓｉ（ＯＣＨ３）４に置き換えるか若しくは共に用いるか、又はＴＰＯＳ、アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＳ）に置き換えてもよい。
【００３７】
繊維は、架橋剤及び修飾剤を組み込めるように修飾して、湿式紡糸技法等の従来既知の技法を含む任意の好適な界面高分子電解質複合体形成技法で形成され得る。従来の繊維形成技法は理解され、当業者によって容易に行うことができ、本明細書で詳細には記載しない。界面高分子電解質複合体形成による繊維の形成のさらなる詳細は、例えばAndrew CA. Wan et al.著「組織工学の構造生物学単位としての自己組織化繊維における生物学のカプセル封入（Encapsulation of biologies in self-assembled fibers as biostructural units for tissue engineering）」, Journal of Biomedical Materials Research, (2004), vol. 71A, pp. 586-595（「Wan I」）；Andrew CA. Wan et al.著「界面高分子電解質複合体形成による繊維形成のメカニズム（Mechanism of Fiber Formation by Interfacial Polyelectrolyte Complexation）」, Macromolecules, (2004), vol. 37, pp. 7019-7025（「Wan II」）；Masato Amaike et al.著「キトサン及びジェランのポリイオン複合体の球、ハニカム、規則的間隔の液滴及び繊維構造（Sphere, honeycomb, regularly spaced droplet and fiber structures of polyion complexes of chitosan and gellan）」 Macromolecules Rapid Communication, (1998), vol. 19, pp.287-289；２００３年３月２０日に公開されたGeorge A. F. Robertsに対する米国特許出願公開第２００３／００５５２１１号；及び１９９８年１１月１７日に発行されたAbhay S. Panditに対する米国特許第５，８３６,９７０号（それぞれの内容が参照により本明細書に援用される）に見出すことができる。
細胞外マトリクス
動物組織に由来する細胞外マトリクス（ＥＣＭ）は生理活性リガンド及び増殖因子の豊富な供給源であり、組織工学の足場として用いられている２。これらの足場が組織由来であるので、そのサイズ、形状及び立体配置は、元の組織の寸法及び形態によって制限される。ＥＣＭの１つの有力な供給源は、培養下で増殖した細胞である。これらには、腫瘍化細胞株又は継代一次細胞（passaged primary cells）が含まれ得る。二次代替物はＥＣＭを動物組織から単離し、その後所望の足場の形状及び寸法に再構成する。
【００３８】
本発明において、ＥＣＭは培養下で増殖するか、又は組織に由来する細胞から単離され、高分子電解質複合体に基づき、繊維足場に再構成される。骨芽細胞株であるＭＣ−３Ｔ３、肝細胞癌細胞株であるＨｅｐＧ２、及びラットの肝臓由来のＥＣＭに焦点を当てて、これらの足場のフィブロネクチン、コラーゲン及びヘパラン硫酸プロテオグリカン等のＥＣＭ成分の提示が免疫組織化学によって実証される。ＥＣＭの生来の特徴の保持が、それらの再構成ＥＣＭ上でＭＣ−３Ｔ３細胞を培養することによって示される。ＥＣＭ足場の潜在的な適用性は、再構成ＨｅｐＧ２  ＥＣＭ足場のラットの一次肝細胞の増殖及び機能を支持するという能力によって実証された。
【００３９】
しかし本発明は、ＨｅｐＧ２細胞及びＭＣ−３Ｔ３細胞又はラットの肝臓に限定されない。任意の細胞型又は組織型は、上記の繊維足場に再構成することができるＥＣＭの供給源として本発明に用いることができる。このような細胞の例としては、以下:胚幹細胞、成体幹細胞、芽細胞、クローン細胞、胎盤細胞、角化細胞、表皮基底細胞、尿上皮細胞、唾液腺細胞、粘液細胞、漿液細胞、フォンエブナー腺細胞、乳腺細胞、涙腺細胞、耳道腺細胞、エクリン汗腺細胞、アポクリン汗腺細胞、Ｍｏｌｌ腺細胞、皮脂腺細胞、ボーマン腺細胞、ブルンネル腺細胞、精嚢腺細胞、前立腺細胞、尿道球腺細胞、バルトリン腺細胞、リトル腺細胞、子宮内膜細胞、気道又は消化管の杯細胞、胃の粘膜細胞、胃腺の酵素原細胞、胃腺の酸分泌細胞、インスリン産生β細胞、グルカゴン産生α細胞、ソマトスタチン産生Δ細胞、膵臓ポリペプチド産生細胞、膵管細胞、小腸のパネート細胞、肺のＩＩ型肺細胞、肺のクララ細胞、下垂体前葉細胞、下垂体中葉細胞、下垂体後葉細胞、腸管及び気道のホルモン分泌細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、副腎細胞、性腺細胞、腎臓の傍糸球体細胞、腎臓の緻密斑細胞、腎臓の周囲極細胞、腎臓のメサンギウム細胞、腸の刷子縁細胞、エクソクリン腺の線条導管細胞、胆嚢上皮細胞、腎臓の近位尿細管の刷子縁細胞、腎臓の遠位尿細管、精巣輸出管の調停細胞、精巣上体主細胞、精巣上皮基底細胞、肝細胞、脂肪細胞、Ｉ型肺胞細胞、膵管細胞、汗腺の平滑筋導管細胞、唾液腺の平滑筋導管細胞、乳腺の平滑筋導管細胞、腎糸球体の傍細胞、腎糸球体の有足細胞、ヘンレ係蹄の細い部分の細胞、集合導管細胞、精嚢の導管細胞、前立腺の導管細胞、血管内皮細胞、滑膜細胞、漿膜細胞、耳の外リンパ腔の内側を覆う扁平上皮細胞、耳の内リンパ腔の内側を覆う細胞、脈絡叢細胞、軟膜クモ膜の扁平上皮細胞、目の毛様体上皮細胞、角膜内皮細胞、推進機能を有する繊毛細胞、エナメル芽細胞、耳の前庭器の半月面細胞、コルチ器官の歯間細胞、繊維芽細胞、毛細血管の周辺細胞、椎間板の核パルポサス細胞、セメント芽細胞、セメント細胞、象牙質芽細胞、象牙質細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、骨前駆細胞、目の硝子体の硝子体細胞、耳の外リンパ腔の星型細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、筋上皮細胞、赤血球細胞、血小板、巨核球、単球、結合組織マクロファージ、ランゲルハンス細胞、破骨細胞、樹状細胞、小グリア細胞、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、プラズマ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、キラーＴ細胞、キラー細胞、桿体細胞、錐体細胞、コルチ器の内有毛細胞、コルチ器の外有毛細胞、耳の前庭器のＩ型有毛細胞、耳の前庭器のＩＩ型有毛細胞、ＩＩ型味覚芽細胞、嗅覚神経細胞、嗅上皮の基底細胞、Ｉ型頸動脈小体細胞、ＩＩ型頸動脈小体細胞、メルケル細胞、接触に特化した一次感覚神経、温度に特化した一次感覚神経、痛覚に特化した一次神経、固有受容性一次感覚神経、自律神経系のコリン作動性神経細胞、自律神経系のアドレナリン作動性神経細胞、自律神経系のペプチド作動性神経細胞、コルチ器の内柱細胞、コルチ器の外柱細胞、コルチ器の内部支持細胞、コルチ器の外部支持細胞、境界細胞、ヘンゼン細胞、前庭器の支持細胞、味覚芽の��持細胞、嗅上皮の支持細胞、シュワン細胞、衛星細胞、腸のグリア細胞、中枢神経系の神経細胞、中枢神経系の星状細胞、中枢神経系の乏突起膠細胞、前水晶体上皮細胞、水晶体繊維細胞、メラニン細胞、網膜色素上皮細胞、虹彩色素上皮細胞、卵原細胞、卵母細胞、精母細胞、精原細胞、卵胞細胞、セルトリ細胞、及び胸腺上皮細胞、又はその組合せ、並びにそれらに由来する細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
動物組織は任意の動物組織から得ることができるが、特に皮膚、肝臓、膵臓、腎臓、骨髄、筋肉、心臓、肺、胃腸管、脳及び小腸粘膜下組織を含む群から選択される。
【００４１】
この材料は、例えば不要な成分の除去を助けるのに適切な酵素で処理することができる。適切な酵素としては例えばデオキシリボヌクレアーゼ（DNAse）Ｉが挙げられる。デオキシリボヌクレアーゼＩの濃度は、約０．００５〜１％、約０．００８〜０．８％、約０．０１１〜０．５％、約０．０１４〜０．２％であり得る。より典型的には、デオキシリボヌクレアーゼＩの濃度は、約０．０１６〜０．０８％、約０．０１８〜０．０５％、約０．０１９〜０．０３％であり得る。
【００４２】
本発明は、本明細書の実施例を参照して例示される。しかし、本発明は、具体的に例示された実施形態には限定されない。例えば、キトサンが用いられる場合の足場の調製において、このキトサンを任意の適切な体積分率の酢酸等の好適な酸において用いることができる。例えば、キトサン溶液は約０．１〜５％、典型的には約０．２〜４％、約０．２〜３％、約０．３〜２％の範囲であり得る。より典型的には、キトサン溶液は、約０．４〜１％、約０．４５〜０．７５％の範囲であり得る。酢酸は、約０．０１〜５％、典型的には約０．５〜２％、約０．８〜１．１％、約０．１〜４％の範囲であり得る。
【００４３】
本明細書で記載されるように、ＥＣＭは、好ましくは微粒子形態に分散させた後、高分子電解質複合体繊維に組み込まれる。任意の好適な微粒子形態への分散手段を利用することができる。例示的な実施形態では、ＥＣＭは特定の１％アルギン酸溶液に分散される。それは、ＥＣＭが繊維と機能的に関連する溶液中のこのような分散によるものである。
【００４４】
アルギン酸溶液等の任意の好適な溶液を用いてもよい。例えば、アルギン酸溶液は、約０．１〜５％、典型的には約０．３〜４％、約０．５〜３％、約０．６〜２％の範囲で用いられ得る。より典型的には、アルギン酸溶液は、約０．７〜１．５％、約０．９〜１．１％の範囲であり得る。
【００４５】
本明細書で記載されるように、ＥＣＭを組み込むヒドロゲル足場は、本発明の方法によって形成され得る。例示的な実施形態では、ヒドロゲル形成には、ヘテロ生体機能ＰＥＧ、ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬ（Nektar）の使用が含まれる。本明細書で提供される記載と共に、当業者には、任意の好適な作用物質を用いてもよいことが理解される。例えば、本方法がＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬを利用する場合、ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬ（水溶液）（Nektar）の容量は、約１〜１０ｍｇ／ｍＬ、典型的には約２〜９ｍｇ／ｍＬ、約３〜８ｍｇ／ｍＬ、約４〜７ｍｇ／ｍＬの範囲であり得る。より典型的には、ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬ（水溶液）（Nektar）は、約５〜６ｍｇ／ｍＬの範囲であり得る。
【００４６】
ヒドロゲル型の高分子電解質複合体繊維の足場の調製において、足場を空気乾燥し、脱イオン水で処理して、繊維の膨張及びヒドロゲル足場の形成を引き起こし得る。例示的な実施形態では、繊維の重量は、１〜２ｍｇであった。当然ながら、任意の適切な量を用いることができる。例えば、空気乾燥した繊維の集合体の重量は、約０．１〜１０ｍｇ、典型的には約０．２〜８ｍｇ、約０．５〜６ｍｇ、約０．７〜４の範囲であり得る。より典型的には、空気乾燥した繊維の集合体は、約０．９〜２ｍｇの範囲であり得る。
【００４７】
例示的な実施形態において、空気乾燥した繊維の集合体は、脱イオン水（２０〜２００μＬ）で処理される。当然ながら、任意の適切な容量を用いることができ、例えばこの容量は、約１〜１０００μＬ、約３〜９００μＬ、約６〜８００μＬ、約９〜６００μＬ、約１２〜５００μＬ、１５〜４００μＬの範囲であり得る。より典型的には、脱イオン水の容量は、約１８〜３００μＬ、約１９〜２５０μＬの範囲であり得る。
【００４８】
本明細書で記載されるように、ＥＣＭは動物組織から得ることができる。動物組織は典型的に小片に切断され、好ましくは抗生物質を含有するキレート剤で処理される。例示的な実施形態では、キレート剤はＥＤＴＡであり、ＥＤＴＡの濃度は、約０．０１〜５％、約０．０２〜０．０８％、約０．０３〜０．０７％の範囲であり得る。より典型的には、ＥＤＴＡの濃度は、約０．０４〜０．０６％の範囲であり得る。
【００４９】
典型的には、この後に緩衝液の洗浄が続く。例示的な実施形態では、細胞溶解及び抽出のために、プロテアーゼ阻害剤カクテル及び抗生物質を添加しながら、組織を１％トリトンＸ−１００の１０ｍＭトリス緩衝溶液（ｐＨ８）で処理し、オービタルシェーカーで４℃で４８時間振盪した。トリトンＸ−１００の濃度は、約０．０１〜１０％、約０.３〜４％、約０．５〜３％の範囲であり得る。より典型的には、トリトンＸ−１００の濃度は、約０．７〜２％、約０．９〜１．３の範囲であり得る。振盪時間は、約１２〜１６８時間、約１５〜１４０時間、約１８〜１１０時間、約２２〜９０時間、約２６〜７５時間、約３０〜７０時間の範囲であり得る。より典型的には、振盪時間は、約３５〜６０時間、約４０〜５５時間、約４５〜５０時間の範囲であり得る。
【００５０】
例示的な実施例では、溶解組織は４℃でさらに４８時間すすぎ、１２時間ごとに溶液を交換する。すすぎ時間は、約１２〜１６８時間、約１５〜１４０時間、約１８〜１１０時間、約２２〜９０時間、約２６〜７５時間、約３０〜７０時間の範囲であり得る。より典型的には、すすぎ時間は、約３５〜６０時間、約４０〜５５時間、約４５〜５０時間の範囲であり得る。
【００５１】
例示的な実施例において、微粒子懸濁液が得られるまで、６１％の振幅でソニケータープローブホモジナイザーを用いて産物を均質にする。振幅は、約１〜１００％、約１０〜９０％、約２０〜８０％、約３０〜７５％の範囲であり得る。より典型的には、振幅は約４０〜７０％、約５０〜６５％、約５８〜６３％の範囲であり得る。
【００５２】
特に好適には、培養下で増殖するか、又は組織に由来する細胞から単離し、高分子電解質複合体に基づき、繊維足場に再構成されるＥＣＭは、この足場で増殖する細胞に適合され得る。すなわち、細胞外マトリクスにおいて、マトリクス上で増殖する細胞と同じ又は類似した細胞を用いることが可能である。
【００５３】
さらに、ＥＣＭは、幹細胞に対する分化シグナルを提供するように選択される細胞型／組織型に由来し得る。例えば、肝臓由来の再構成ＥＣＭを含む足場で増殖した幹細胞は、肝臓細胞に分化することが可能であり得る。ＥＣＭは、一次細胞の機能を維持するのに好適な環境を与えるように選択される細胞株又は組織型にも由来し得る。以下の実施例６では、ラットの肝臓由来の一次肝細胞は、対照のキトサンアルギン酸足場及び組織培養プレートで増殖した肝細胞に比べて、肝臓様細胞株であるＨｅｐＧ２由来の再構成ＥＣＭを含む足場で培養した場合、より長期間アルブミン分泌（肝臓特異的機能）を維持することができることが示される。
足場の用途
上記されたように調製された足場は、組織工学、三次元細胞培養、ハイスループット薬剤スクリーニング用の三次元細胞培養系、薬剤放出織物、幹細胞等の細胞の増殖用容器等を含む多くの分野における用途を有する。より詳細には、細胞外マトリクスの三次元マトリクスへの組み込みは、細胞表現型に対するＥＣＭの影響を研究するためにマトリクスに適合され、機能的組織工学に対する有力なアプローチを構成している。
［実施例］
【００５４】
実施例は、本発明を例示するのに有用であることが意図され、本明細書を通して説明の開示の一般的性質を限定するように解釈されるべきではない。
【実施例１】
【００５５】
ＥＣＭの単離
骨芽細胞株であるＭＣ−３Ｔ３、及び肝細胞癌細胞株であるＨｅｐＧ２は、１．５×１０４細胞／ｃｍ２の密度で播種され、αＭＥＭ及びＤＭＥＭ（それぞれ１０％のＦＢＳ、１％のＰ／Ｓペニシリン／ストレプトマイシンで補充した）における１回の培地の交換で１週間培養した。細胞外マトリクス（ＥＣＭ）を単離するために、培地を組織培養皿からゆっくりと吸引し、リン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄した。１ｍＬの溶液Ａ（１ｍＭのフッ化フェニルメタンスルホニル（ＰＭＳＦ、Fluka）、１０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（ＴＲＩＳ）（Merck）（ｐＨ８）、０．５％デオキシコール酸ナトリウム）を１分間、それぞれ１００ｍｍ皿に入れた。溶液Ａの除去後、それぞれの皿を１ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。それから、１ｍＬの脱イオン水をペトリ皿の底部に強く注ぎ込み、ＥＣＭを分離させた。懸濁液を別々のバイアルに移し、４℃で５分間、７５００×ｇで遠心分離した。上清を取り除き、その後１ｍＬの溶液Ｂ（１０ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭの塩化カルシウム、１ｍＭのＰＭＳＦ、ウシの膵臓由来の０．０２％のデオキシリボヌクレアーゼ１（Sigma））が添加された。
【００５６】
次に、ＥＣＭはボルテックスによって分散され、バイアルの底部に回収された。それから、２５０ｒｐｍの撹拌速度で３０分間、Ｈｅｉｄｏｌｐｈ−Ｕｎｉｍａｘ振盪器に入れた。バイアルは、４℃で５分間、７５００×ｇで遠心分離した。上清を取り除き、ＥＣＭペレットを分散及び遠心分離によって脱イオン水で洗浄し、残りのデオキシリボヌクレアーゼを取り除いた。代替的に、懸濁液を固め、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ装置（Millipore）に移し、４℃、１１００×ｇで遠心分離した（溶液１．５ｍｌごとに遠心分離１時間）。固体ＥＣＭを取り除いた。１％のアルギン酸塩を添加し、繊維形成のために１．５％水溶性キチン又は０．５％キトサンの２％酢酸水溶液に懸濁液を滴下した(drawn against)。
【００５７】
デオキシリボヌクレアーゼ研究のために、ＭＣ−３Ｔ３細胞を２４ウェルプレートで培養し、試薬を以下のようにスケールダウンした：溶液Ａ  ２００μＬ、リン酸緩衝生理食塩水  ３００μＬ、脱イオン水  ２００μＬ、溶液Ｂ  ２００μＬ。
【実施例２】
【００５８】
ＥＣＭの特性評価
ＥＣＭ成分の免疫組織化学が、フィブロネクチン及びＩ型コラーゲンに対する抗体（Acris Antibodies, GmbH）を用いることによって行われた。一次抗体は、フィブロネクチン及びＩ型コラーゲンに対するウサギポリクローナル抗体であったのに対し、二次抗体は、アフィニティ精製抗ウサギＩｇＧのＦＩＴＣ標識Ｆ（ａｂ’）２断片（Acris Antibodies, GmbH）であった。共焦点顕微鏡検査を４８８ｎｍのレーザーを用いて、Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｆｌｕｏｖｉｅｗ  ３００共焦点ユニットで行った。５１０ｎｍの長透過フィルター及び５３０ｎｍの短透過フィルターを用いて緑色蛍光が観察された。
【実施例３】
【００５９】
ＨｅｐＧ２  ＥＣＭ再構成足場の調製
ポリカチオン前駆体を調製するために、初めにテトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）を、１：９の比でＴＥＯＳ、すなわち０〜２５容量％のＴＥＯＳと０．１５Ｍの酢酸とを混合することによって加水分解し、均一溶液が得られるまでボルテックスした。それから、加水分解ＴＥＯＳを２５％の体積分率で０．５％キトサンの１％酢酸溶液に添加した。ポリアニオン前駆体を調製するために、粉砕（tituration）及びボルテックスによって、ＨｅｐＧ２  ＥＣＭを１％アルギン酸塩の脱イオン水溶液に分散させた。
【００６０】
高分子電解質複合体繊維へのＥＣＭの組み込みのために、元のフィルム様材料を初めに上記のような微粒子形態に分散させる必要がある。これは、単離ＥＣＭを脱イオン水で単純に粉砕し、懸濁液を新しいバイアルに移し、その後遠心分離して、ＥＣＭペレットを得ることによって達成され得る。それから、ＥＣＭは１％アルギン酸塩の微粒子懸濁液に分散され得る。ＥＣＭの保存に関して、懸濁液の安定性は、アルギン酸塩に比べて、脱イオン水でより良好であると考えられた。したがって、ＥＣＭは使用前に脱イオン水で保存された。
【００６１】
３０μＬのポリカチオン前駆体及び２０μＬのポリアニオン前駆体を３ｍｍのＰＴＦＥチャネルに、互いに近づけるが、接触しないようにして入れた。ピンセットを用いて、液滴に接触させ、上に向かう動きを利用して繊維を形成した。新生繊維を巻き上げ機の回転腕に接着させ、高分子電解質溶液がなくなる、及び／又は繊維の終端化が起こるまで繊維を引き続けた。巻き上げ機から得られた乾燥繊維を１．７ｍＬの微小遠心管に移し、秤量した。それから、約１．５ｍＬの脱イオン水を添加し、５分間繊維を洗浄した。その後、洗浄繊維を金型（die：ダイ）のフリットに移し、脱イオン水流を１分間、３００〜３５０ｍＬ／分の流量で金型に流し、繊維を交絡させた。それから、水流量を５〜３５ｍＬ／分まで低減し、繊維をさらに５分間洗浄した。続いて、使用前に形成した足場を７０％のエタノールを含有する９６ウェルプレートに移した。
【実施例４】
【００６２】
一次肝細胞培養
これまでに報告されたように２工程のｉｎ  ｓｉｔｕコラゲナーゼ灌流手順によって、肝細胞をウィスターラットから採取した３。細胞を分散させ、１０％ウシ胎児血清を補充した既知組成培地Ｇｉｂｃｏ（商標）ＨｅｐａｔｏＺＹＭＥ−ＳＦＭで培養した。１ウェル当たり１〜２×１０５個の密度で９６ウェルプレートにおいて足場で細胞を播種した。細胞培養上清を毎日サンプリングし、等量の新しい培地に置き換えた。アッセイの前ではサンプルを−２０℃で凍結させ、アッセイ時に解凍し、任意の混入（entrapped）細胞をペレット化し取り除くために、４分間、７５００×ｇで遠心分離した。サンプル中のアルブミン濃度は、製造業者の取扱説明書に従ってＥＬＩＳＡ（R&D Systems）によって測定された。
【実施例５】
【００６３】
考察
細胞外マトリクス単離手順は、細胞外マトリクスをマウスの骨芽細胞株であるＭＣ−３Ｔ３、及び肝細胞癌細胞株であるＨｅｐＧ２から単離するのに最適化された。それらが細胞分画の除去に影響するので、デオキシコール酸溶液への曝露時間、及び後者の溶液量に関して修正が為された。過剰な曝露によって収量が低下した一方で、曝露不足によって単離材料に細胞が残った。付加的な工程として、本発明者等はデオキシリボヌクレアーゼを導入し、核酸を細胞外マトリクスから取り除いた（図１）。採取上清のＵＶ分光分析によって、プロトコルの有効性が実証された。図２によって、本発明者等のプロトコルのデオキシリボヌクレアーゼの最適量が定められる。
【００６４】
再構成ＥＣＭ足場の免疫蛍光は、骨芽細胞及び肝臓のＥＣＭの両方の主成分であるフィブロネクチン、コラーゲン及びヘパラン硫酸プロテオグリカンに対する抗体を用いて行われた５。これらの３つのＥＣＭ成分が、再構成ＭＣ３Ｔ３  ＥＣＭ足場の場合に示されたように提示されたことを示した（図３）。
【００６５】
繊維足場（再構成ＥＣＭを含有する）は、これまでに記載されたように界面高分子電解質複合体形成によって作製された６。ＥＣＭはアルギン酸塩に分散させ、水溶性のキチン又はキトサンのいずれかで複合体を形成することによって、繊維内に取り込まれた。図２は、ＥＣＭなしで足場で増殖されたＭＣ−３Ｔ３細胞と比較した、再構成ＭＣ−３Ｔ３  ＥＣＭの足場で増殖したＭＣ−３Ｔ３の共焦点顕微鏡写真を示す。ＥＣＭ足場で増殖する細胞は繊維上に拡散することができたが、無ＥＣＭ足場で増殖する細胞は球状及びクラスター化していた。これらの足場の細胞接着は、ＥＣＭ分子であるコラーゲン及びフィブロネクチンによって介在されたと考えられ、これら両方が広範な細胞型のインテグリン受容体と結合するＲＧＤ配列モチーフを含有する。
【００６６】
広範な細胞株からＥＣＭを再構成することができるという誘因性（attractiveness）は、三次元細胞培養に対して、ＥＣＭの選択には潜在的に制限がないことにある。細胞生物学の現在のモデル及び組織工学の現在の戦略は、機能や有用性が十分に確立されているタンパク質、例えばコラーゲン、フィブロネクチン及びフィブリンを利用する。エンゲルブレス−ホルム−スワーム（Engelbreth-Holm-Swarm）肉腫由来の可溶性基底膜調製物であるマトリゲルも一般的な選択である。おそらく、特定の細胞型の三次元組織培養に理想的なＥＣＭは、対象の細胞に元々あるＥＣＭである。例えば、骨髄の幹細胞ニッチ（niche）を再形成するために、骨髄細胞株（例えば間葉性幹細胞株）によって分泌されるＥＣＭを用い、このＥＣＭ組成は骨髄ＥＣＭのものに非常に近いことが予測される。
【実施例６】
【００６７】
細胞増殖に対するＥＣＭ再構成足場の効果
コラゲナーゼ灌流ラットの肝臓から単離された一次肝細胞が、肝細胞癌細胞株であるＨｅｐＧ２由来のＥＣＭを組み込む足場で培養された。ＥＣＭ足場を対照のキトサン−アルギン酸足場及び組織培養プレートで培養した肝細胞と比較した。細胞によるアルブミン合成は、肝細胞の機能の目安として用いた。図５は、２週間にわたる、ＥＬＩＳＡによって測定された培養上清におけるアルブミン濃度を示す。この結果によって、培養下で最大２週間維持される肝細胞の生存率及び機能におけるＥＣＭ再構成足場の正の影響が実証される。この見解は、ＥＣＭ分子上で細胞接着部位を肝細胞に与えることに部分的に起因し得る。
【００６８】
本発明者等によって行われた他の実験によって、肝臓のＥＣＭに存在する様々なタンパク質が肝細胞機能を支持する能力の点で異なることが示されている。例えば、Ｉ型コラーゲン足場で培養した細胞は、ラミニン足場で培養したものよりも非常に良好であり、この知見は近年公開されたデータに一致している７。この知見によって、自然環境において異なる成分及び要因の正確な相互作用が知られていないので、単離ＥＣＭ成分ではなく「全」ＥＣＭを用いることの利点が強まる。
【実施例７】
【００６９】
ヒドロゲル型の高分子電解質複合体繊維足場のＥＣＭへの含浸
５．５ｍｇ／ｍＬのＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬ（水溶液）（Nektar）は、３０分間、等量の２％のキトサン（水溶液）（NOF Corporation）でボルテックスした。実施例３と同様に、得られたキトサン−ＰＥＧ−ＭＡＬ複合混合物を界面高分子電解質複合体形成の条件下でアルギン酸と結合させ、繊維を形成した。空気乾燥したこれらの繊維の集合体（１〜２ｍｇ）を脱イオン水（２０〜２００μＬ）で処理した場合、繊維の広い膨張が起こり、ヒドロゲル足場が迅速に形成された。
【００７０】
上記の手順において、ＥＣＭは、繊維に組み込まれる前に、粉砕及びボルテックスによってアルギン酸溶液に分散させることができる。このようにして、ヒドロゲル足場をＥＣＭに組み込むことができる。
【実施例８】
【００７１】
ラットの肝臓組織からのＥＣＭの単離
ＥＣＭは肝臓から単離され、超音波処理によって均質にし、微粒子形態にすることができる。ラットの肝臓を滅菌条件化で小片に切断し、抗生物質（１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｕｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び０．０２５ｕｇ／ｍｌのアンホテリシンＢ）を含有する０．０５％ＥＤＴＡの１０ｍＭトリス緩衝溶液で洗浄した。この後に緩衝液洗浄を続けた。細胞溶解及び抽出のために、プロテアーゼ阻害剤カクテル及び抗生物質を添加しながら、組織を１％トリトンＸ−１００の１０ｍＭトリス緩衝溶液（ｐＨ８）で処理し、オービタルシェーカーで４℃で４８時間振盪した。その後、溶解組織を、４℃でさらに４８時間、抗生物質及びプロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する１０ｍＭトリス（ｐＨ＝８．０）ですすぎ、１２時間ごとに溶液を交換した。０．０２％デオキシリボヌクレアーゼＩの１０ｍＭトリス溶液（ｐＨ＝８．０）を用いて、３７℃で一晩、核酸消化を行った。同じ抗生物質及びＥＤＴＡ無含有プロテアーゼ阻害剤カクテルの他に、後者の溶液は１０ｍＭのＭｇＣｌと１ｍＭのＣａＣｌ２とを含有していた。産物をこれまでのようにすすいだ後、微粒子懸濁液が得られるまで、６１％の振幅でソニケータープローブホモジナイザーを用いて均質にした。得られた組織由来ＥＣＭ微粒子は、実施例３で細胞株由来ＥＣＭに関して記載されたように、高分子電解質複合体繊維足場に再構成された。免疫蛍光標識によって、線維上のヘパラン硫酸プロテオグリカンの存在が実証された。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）で安定して形質導入されたＨｅｐＧ２細胞は、これらの繊維足場への良好な接着を示した（図６）。
【００７２】
本明細書の従来技術文献の任意の記載、又はこれらの文献から派生した若しくはこれらの文献に基づく記述は、これらの記載又は派生した記述が、オーストラリア又は他の国々における関連技術分野の共通の一般的な知識の一部であることを認めるものではない。
【００７３】
本発明は、上記のような様式で詳細に記載されているが、広く記載された本発明の精神又は範囲に逸脱することなく、特定の実施形態で示されるように、形式又は詳細において様々な省略、置換及び／又は変更を含む多くの変形及び／又は修正が本発明に対して為され得ることは当業者にとって明らかである。したがって、本発明の実施形態はあらゆる点において限定的ではなく例示的なものであると考えられる。
参考文献
【００７４】
【表１】
0005409009.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】デオキシリボヌクレアーゼによる処理前後の上清のＵＶ分光分析を示す図である。デオキシリボヌクレアーゼと同じ濃度でのＢＳＡによる処理を対照として用いた。
【図２】異なる量のデオキシリボヌクレアーゼを含有する溶液Ｂ（１０ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭの塩化カルシウム、１ｍＭのＰＭＳＦ）２００μＬに抽出された核酸の質量を示す図である。
【図３】（ａ）フィブロネクチン、（ｂ）コラーゲン、（ｃ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンの存在を示す繊維の免疫組織化学の図である。Ａｂ：抗体、ＥＣＭ：細胞外マトリクス。
【図４】（ａ）ＥＣＭ足場、及び（ｂ）対照足場で増殖したＭＣ−３Ｔ３細胞を示す図である。
【図５】一次肝細胞培養物における上清のアルブミン濃度対時間を示す図である。
【図６】播種の２４時間後、ラットの肝臓組織由来の再構成細胞外マトリクスを含むＥＣＭ足場で培養した緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）によって安定して形質導入したＨｅｐＧ２細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図１】
0005409009.tif 000003
【図２】
0005409009.tif 000004
【図３】
0005409009.tif 000005
【図４】
0005409009.tif 000006
【図５】
0005409009.tif 000007
【図６】
0005409009.tif 000008