(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１６個のヌクレオチドの次の配列：配列５’−Ｃ＋ＴＴ＋Ｃ＊Ｃ＋ＴＴ＋ＴＴ＋ＴＴ＋ＴＴ＋Ｃ＊Ｔ＋Ｔ＋−３’（配列番号２、Ｃ＊は５−メチルシトシンを表し、Ｃ＋はＬＮＡｄＣを表し、Ｔ＋はＬＮＡ−Ｔを表す）からなるアンチジーンオリゴヌクレオチドであって、
−前記オリゴヌクレオチドが、相補的塩基間のフーグスティーン型対合により、ヒトチロシナーゼ関連タンパク質−１をコードする遺伝子と特異的にハイブリダイズし、ヒトチロシナーゼ関連タンパク質−１遺伝子とともに三重らせん構造を形成する、オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドを含んでなる、化粧用または皮膚用組成物。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドが、前記組成物の総重量の０．０００１％〜１０％の量で存在するものである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチドが、前記組成物の総重量の０．００３％〜３％の量で存在するものである、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
水性、水性アルコール性もしくは油性溶液、水中油型もしくは油中水型の単純もしくは複合エマルション、水性もしくは油性ゲル、液状、ペースト状もしくは固体状無水物、固体粒子（ナノ球体もしくは高分子ナノカプセルなど）の水性もしくは油性分散液、またはイオン性もしくは非イオン性脂質小胞の水性分散液から選択される、局所適用に適する形態である、請求項２〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
美容ケア製品および／または化粧品として使用されるように処方されたものである、請求項２〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
化粧料において使用し得る１種以上の活性成分を更に含んでなる、請求項２〜６のいずれか一項に記載の化粧用組成物。
【請求項８】
１種以上の活性成分が、１種以上の化学的または物理的サンスクリーンである、請求項７に記載の化粧用組成物。
【請求項９】
皮膚を脱色素化または漂白するための、請求項２〜８のいずれか一項に記載の化粧用組成物。
【請求項１０】
毛髪を脱色素化または漂白するための、請求項２〜８のいずれか一項に記載の化粧用組成物。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドの含有量が、前記組成物の総重量の０．００３％〜３％である、請求項９または１０に記載の化粧用組成物。
【請求項１２】
チロシナーゼの過剰発現および活性亢進を特徴とする疾患の治療または予防を目的とした局所適用薬剤を製造するための、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項１３】
メラノサイトの活性亢進による局所的な色素過剰（特発性黒皮症など）、メラノサイトの活性亢進および良性メラノサイト増殖による局在的な色素過剰（老化色素斑（老人性黒子）など）および偶発的な色素過剰（光感作または病変後の瘢痕形成など）の治療または予防、ならびに白斑症（白斑など）の治療を目的とした局所適用薬剤を製造するための、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、相補的塩基間のフーグスティーン型対合により、ヒトチロシナーゼ関連タンパク質−１（ＴＲＰ−１）をコードする遺伝子と特異的にハイブリダイズするアンチジーンオリゴヌクレオチドであって、該ヒトチロシナーゼ関連タンパク質−１遺伝子とともに三重らせん構造を形成するオリゴヌクレオチドに関する。本発明はまた、化粧用組成物または皮膚用組成物における、皮膚脱色素剤または皮膚漂白剤としての前記オリゴヌクレオチドの使用に関する。
【０００２】
ヒトにおいて、色素沈着は、皮膚、毛包または目におけるメラニン色素の合成および分布により生じる。色素沈着は、遺伝的には予め決められたものであるが、多数の内的要因または外的要因により調節される。メラノサイトの数、それらのチロシナーゼ活性、メラノサイトによって生成されるメラニンおよびメラニンをケラチノサイトへ送出するそれらの能力、メラニン粒子を含有するメラノソームの大きさにより、ヒトの皮膚の色が調節される。各個体に関し、皮膚の色は主に、程度の差はあるがかなりの紫外（ＵＶ）線照射量に応じて異なる。換言すると、各個体について、その個体が最も弱いＵＶ照射を受けると、基本的な皮膚の色素沈着が生じ、これは最も白い皮膚色に相当する。より強いＵＶ照射を受けると、より強い皮膚の色素沈着が生じ、最大の色素沈着は、強いＵＶ照射に対して広範囲にわたって曝される時の最も黒い皮膚色に相当する。
【０００３】
一方、世界中の人種（population）の皮膚の色素沈着は遺伝的には非常に多岐にわたる。故に、人種に応じて、先に定義した基本的な色素沈着に相当する皮膚色は、非常に白い色と非常に黒い色という二極端の間にある、より黒いまたはより白い肌色を有する。また、人種に応じて、基本的な色素沈着と、最大の色素沈着との皮膚の肌色についての差異は、程度の差はあるが大きい。故に、白い皮膚（基本的な色素沈着）を有する一部の人種に属する人々は、ＵＶ作用に対して迅速におよび／または著しく反応するので、これらの人々が自発的に広範囲にわたって太陽に曝されたのではない場合でも、たやすく黒い肌色の皮膚を呈する可能性がある。以下の説明では、これらの人々を「ＵＶ放射に対して非常に反応性である人々」と表現する。これは、とりわけ、アジア人種、または一部のいわゆる混血人種の場合に当てはまる。
【０００４】
更に、より黒いおよび／またはより有色である領域および／または斑点が、自身の皮膚、とりわけ、顔または手に出現するために、皮膚の色が不均質になるという出来事を目の当たりにする者もいる。これらの斑点は、メラノサイトにおけるメラニン形成活性が増強するために生じる表皮ケラチノサイトにおけるメラニン濃度の高さに起因する。
【０００５】
皮膚の色素沈着が形成される機序にはメラニン合成が含まれる。この機序は特に複雑であり、模式的に表すと以下の主工程を含む：
チロシン→ドーパ→ドーパキノン→ドーパクロム→メラニン。
【０００６】
チロシナーゼおよびチロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＲＰ−１）は、この一連の反応に関与する必須酵素である。チロシナーゼは、チロシンをヒドロキシル化してドーパ（ジヒドロキシフェニルアラニン）にし、ドーパを変換してドーパキノンにする反応を触媒し、これによりメラニン色素が形成される。ＴＲＰ−１もまた、メラニン形成において重要な役割を果たす。ＴＲＰ−１は最も豊富なメラノソームタンパク質であり（Vijayasaradhi S. et al., Exp. Cell. Res., 196, 233-240, 1991）、チロシナーゼと７０％〜８０％のヌクレオチド配列相同性および４０％〜４５％のアミノ酸配列相同性を有する。ＴＲＰ−１は、それらの成熟の調節に関与する、メラノソームを包含する膜貫通タンパク質である。ヒトでは、ＴＲＰ−１は、マウスとは違って、いかなるＤＨＩＣＡオキシダーゼ活性も有さない（Boissy R.E., et al., Exp. Dermatol., 7, 198-204, 1998）。チロシナーゼおよびＴＲＰ−１は酵素複合体を形成し（Winder A et al., Cell. Mol. Biol. Res., 40, 7-8, 1994; Orlow SJ. et al., J. Invest. Dermatol., 103, 196-211, 1994）、チロシナーゼ活性は完全にＴＲＰ−１の存在に依存しており、分離することができないことが示された（Zhao Y. et al., J. Invest. Dermatol., 106, 744-752, 1996; Wu H. et Park H-Y, Biochem. Biophys. Res. Comm., 311, 948-953, 2003）。更に、最近ではＴＲＰ−１発現の民族間でのばらつきが報告されており、これは、皮膚色素沈着のｉｎ  ｖｉｖｏ調節におけるその役割を示唆している。これらの要素は、ＴＲＰ−１が、ヒトメラノサイトにおけるチロシナーゼ活性を阻害し、したがって皮膚の色素沈着を調節するために選択される生物学的標的であることを示している。
【０００７】
ある分子が表皮メラノサイトの活性を阻害することによってこれらの細胞に直接作用する場合、および／または、メラニン生合成工程の１つを阻止する場合、その他、形成されたメラニンを分解する場合には、該分子は脱色素分子であると認識される。これは、とりわけ、分子がメラニン形成に関与する酵素の１つを阻害する場合、またはメラニン合成鎖の化学的化合物と反応する場合である。
【０００８】
既知の脱色素物質は、特に、ハイドロキノンおよびその誘導体、アスコルビン酸およびその誘導体、コウジ酸、アルブチン、イミノフェノール、カルニチンとキノンとの組み合わせ、アミノフェノールアミド誘導体、およびベンゾチアゾール誘導体である。これらの物質は幾つかの欠点を有し得る。これらの物質は不安定である可能性があるか、高濃度での使用を必要とする可能性があるか、それらの作用方法に関する特異性が欠如している可能性があるか、または細胞毒性もしくは刺激性を有する可能性がある。
【０００９】
効果的かつ無害な脱色素物質の局所使用は、化粧料および皮膚科学において特に求められている。これらの物質は、特に、メラノサイトの活性亢進による局所的な色素過剰（例えば、特発性黒皮症）、メラノサイトの活性亢進による局在的な色素過剰（例えば、色素斑、いわゆる太陽黒子および老人性黒子）、偶発的な色素過剰（例えば、光感作または病変後の瘢痕形成）、および幾つかの白皮症（例えば、白斑）の治療に使用される。後者の場合、皮膚の再色素沈着が不可能である場合、脱色素化された区域周辺での色素沈着が低減され、皮膚の色がより均一になる。
【００１０】
脱色素物質はまた、一部の人々、特に上記に定義したようなＵＶ照射に対して非常に反応性である人々によって、彼らの肌色、特に顔や手の肌色を薄くするための皮膚漂白剤としても使用され、それにより、皮膚の色をできる限り白くかつ均一に維持するか、またはＵＶ光線の色素沈着作用を少なくとも低減する。
【００１１】
故に、専門家が直面する課題は、既知の物質の欠点を有さない、すなわち、皮膚に対して非刺激性、非毒性および／または非アレルギー性であり、かつ組成物中で安定である、ヒトの皮膚および／または毛髪用の新規脱色素物質または新規漂白剤を設計、生成または単離することである。
【００１２】
メラノサイトの機能障害を治療するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用については、ＵＳ２００４００１４７００に記載されている。更に、脱色素化を行うための幾つかの方策は、二重鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドを用いてチロシナーゼ合成を阻害することにある（仏国特許第２８４０２１７号）。上述の出願において、関連する生物学的標的は、メッセンジャーＲＮＡである。
【発明の概要】
【００１３】
本発明の目的は、メラニン形成過程に作用する脱色素剤を提供することにあり、該脱色素剤は、一方では、実質的に均質な色素沈着の場合に皮膚および／または毛髪を漂白すること、すなわちその色素沈着を低減することを目的とし、他方では、皮膚の色素過剰を制御すること、すなわち、皮膚が不均質な色素沈着を呈する際に使用することを目的とする。
【００１４】
本発明者らは、チロシナーゼ関連タンパク質−１をコードする遺伝子とハイブリダイズすることができ、かつ、この遺伝子のみとハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドが脱色素活性を有することを見出した。
【００１５】
したがって、上述のｍＲＮＡターゲッティング方策とは異なり、本発明の目的は、遺伝子それ自体とハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを使用することにある。この利点は、本発明のオリゴヌクレオチドは二重鎖ＤＮＡとしての遺伝子とハイブリダイズすることができるが、特にＵＳ２００４００１４７００または仏国特許第２８４０２１７号に記載されるオリゴヌクレオチドにはこの能力がないということである。この新規方策の別の利点は、大半の遺伝子が２倍体細胞内に２つの対立遺伝子を有するので、該遺伝子が、その遺伝子がコードするメッセンジャーＲＮＡまたはタンパク質よりも少ないエンティティであるということである。結果として、この活性は非常に低い濃度でも存在し、これらオリゴヌクレオチドの利点を増大する。更に、本発明によるオリゴヌクレオチドは、細胞毒性を示さず、工業的に合成し、高純度で単離し、特徴付けることができる。
【００１６】
故に、本発明によるオリゴヌクレオチドは、チロシナーゼ関連タンパク質−１遺伝子に対して直接的に相互作用することによって、メラニン形成機序のかなり上流に関与してその発現を調節し、結果としてチロシナーゼ関連タンパク質−１をコードするメッセンジャーＲＮＡの発現を阻害する。この結果、メラノサイト中のチロシナーゼ関連タンパク質−１の量が低下し、それにより、チロシナーゼ活性が低下する。本発明によるオリゴヌクレオチドは、従来より使用されている物質が提起する課題に対する理想的な解決策を提供する。チロシナーゼ活性を阻害する既知の物質は、特異性が低いために複数の許容し得ない副作用を有する。チロシナーゼを直接的に阻害して脱色素効果を得る代わりに、試験を行った様々な配列の中で、以下に記載される配列番号２の配列、つまり、以下に記載される配列番号１の配列のキメラ型が、チロシナーゼ関連タンパク質−１遺伝子の発現、結果としてチロシナーゼ関連タンパク質−１をコードするメッセンジャーＲＮＡの生成、および故に対応する酵素の生成を可能な限り上流で調節することによって、従来の研究者らが直面してきた課題を解決することを見出した。
【発明の具体的説明】
【００１７】
したがって、第一の態様では、本発明は、ｎ個のヌクレオチドの配列からなるアンチジーンオリゴヌクレオチド（ｎは１０〜２５の整数）に関し、
−ｎが１０〜１６である場合、前記オリゴヌクレオチド配列は、配列５’−ＣＴＴＣ＊ＣＴＴＴＴＴＴＴＴＣ＊ＴＴ−３’（配列番号１、Ｃ＊は５−メチルシトシンを表す）のｎ個の構成ヌクレオチドからなり、
−ｎが１７〜２５である場合、前記オリゴヌクレオチド配列は、配列５’−ＣＴＴＣ＊ＣＴＴＴＴＴＴＴＴＣ＊ＴＴ−３’（配列番号１、Ｃ＊は５−メチルシトシンを表す）を含んでなり、
−前記オリゴヌクレオチドは、相補的塩基間のフーグスティーン型対合により、ヒトチロシナーゼ関連タンパク質−１をコードする遺伝子と特異的にハイブリダイズし、ヒトチロシナーゼ関連タンパク質−１遺伝子とともに三重らせん構造を形成する。
【００１８】
好ましくは、このアンチジーンオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの数ｎは、１３〜２１、好ましくは１５〜１９であり、更に好ましくは、ヌクレオチドの数ｎは１６に等しい。
【００１９】
したがって、ｎが１６未満またはそれに等しい場合、すなわち、本発明によるアンチジーンオリゴヌクレオチドのサイズが配列番号１の配列のサイズ未満またはそれに等しい場合、本発明によるアンチジーンオリゴヌクレオチドは、配列番号１の配列のｎ個のヌクレオチドの断片であるか、またはこの配列それ自体である。
【００２０】
ｎが１７〜２５である場合、すなわち、本発明によるアンチジーンオリゴヌクレオチドのサイズが厳密には配列番号１の配列のサイズよりも大きい場合、本発明によるアンチジーンオリゴヌクレオチドは、配列番号１の配列ならびに配列番号１の５’ 位および／または３’位に位置する他のヌクレオチドを含んでなる。
【００２１】
この場合、配列番号１の５’位および／または３’ 位に位置する前記他のヌクレオチドは、アンチジーンオリゴヌクレオチドと、ヒトチロシナーゼ関連タンパク質−１をコードする遺伝子の２つの鎖との間の、以下に記載されるように算出される相補性度が最大となり、それにより、相補的塩基間のフーグスティーン型対合およびアンチジーンオリゴヌクレオチドとヒトチロシナーゼ関連タンパク質−１遺伝子との間での三重らせん構造の形成が可能になるように選択される。
【００２２】
本発明において、「チロシナーゼ関連タンパク質−１をコードする遺伝子」は、チロシナーゼ関連タンパク質−１遺伝子のゲノム配列を意味する（ヒト配列に関しては、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベース（National Institute of Health, United States）の受託番号ＡＦ００１２９５のリファレンスを参照のこと）。
【００２３】
本発明によるオリゴヌクレオチドは、細胞内のＤＮＡ二重らせんとしての遺伝子に対して直接的にハイブリダイズする。したがって、これらのオリゴヌクレオチドにより、チロシナーゼ関連タンパク質−１をコードするメッセンジャーＲＮＡの量、故に対応する酵素の量を最終的に調節することができる。
【００２４】
ワトソン−クリック対合スキームに従って水素結合を形成するオリゴヌクレオチドに基づいて二重らせん構造を形成するＵＳ２００４００１４７００および仏国特許第２８４０２１７号に記載された発明とは異なり、本明細書では、「ハイブリダイゼーション」という用語は、一方ではワトソン−クリックスキームに従って二重らせんを形成する核酸の２つの鎖上に通常分布されている相補的塩基と、他方ではトリプレックス、つまり三重らせん構造を形成するための第三鎖との間で水素結合を形成すること（フーグスティーン型または逆転（reverse）フーグスティーン型対合としても知られている）を意味するのに使用される。
【００２５】
核酸配列間の相補性度は、アライメント後に、第一配列と、第二配列に相補的な配列とを比較することによって決定される。相補性度は、そのようにして比較された２つの配列間でヌクレオチドが相補的である相補的位置の数を測定し、この相補的位置の数を、位置の総数で除算し、得られた結果を１００倍することによって計算され、これら２つの配列間の相補性度（パーセンテージで表す）が得られる。
【００２６】
「特異的ハイブリダイゼーション」という用語は、特に、特異的結合が所望される条件下で非ターゲッティング配列に対してオリゴヌクレオチドが非特異的に結合するのを回避するのに十分な相補性度があるということを意味する。本発明によるオリゴヌクレオチドは、好ましくは特異的に、チロシナーゼ関連タンパク質−１をコードする遺伝子とハイブリダイズする。特に、本発明のオリゴヌクレオチドは、チロシナーゼ関連タンパク質−１をコードする遺伝子のＤＮＡとだけハイブリダイズすることができる。本発明によるオリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズするために、同一性および数の点で十分な数のヌクレオチドを含む。
【００２７】
本発明において、「チロシナーゼ関連タンパク質−１をコードするＤＮＡ」は、エクソンとイントロンの両方、特にエクソンを意味するよう意図されている。
【００２８】
また、本発明の目的は、それらの糖部分、それらの核酸塩基部分またはそれらのヌクレオチド間骨格に１つ以上の化学修飾を含むオリゴヌクレオチドであり、該化学修飾は、高いバイオアベイラビリティ、標的配列に対する親和性の増大、細胞内在化の増大もしくはより良好な生物学的安定性、または細胞ヌクレアーゼの存在下での安定性の増大などの所望の物理化学的特性を、本発明によるオリゴヌクレオチドに付与する。
【００２９】
例として、これらの特性を付与し得る修飾は、固定核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、該ヌクレオシドの糖部分上の２’−Ｏ−アルキル誘導体および２’−Ｏ−フルオロ誘導体、ならびにヌクレオチド間骨格上のホスホロチオエート誘導体またはメチルホスホネート誘導体、またはその他、５’位または３’位に挿入型反応基を有する誘導体（例えば、アクリジン）、もしくは標的配列と架橋を形成することができる誘導体（例えば、ソラレンおよびアジド基）である。
【００３０】
「ＰＮＡ」という用語は、当業者に既知であり、ＤＮＡの化学構造と類似するが、その骨格がペプチド結合により連結されたＮ−（２−アミノエチル）−グリシンの反復単位からなる化学構造を意味する。様々なプリン塩基およびピリミジン塩基がメチレンカルボニル結合により骨格に連結される。該構造を以下に示す：
【００３１】
【化１】
0005599615.tif 000002
【００３２】
「ＬＮＡ」という用語は、当業者に既知であり、２’−Ｏ，４’−Ｃメチレン架橋を含有する核酸類似体を示す。この架橋は、強靭な二環構造を形成することにより、リボフラノース環の柔軟性を阻止する。該構造を以下に示す：
【００３３】
【化２】
0005599615.tif 000003
【００３４】
本明細書中の「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然の核酸塩基と、天然のホスホジエステル結合により互いに連結されるヌクレオシドを形成するペンタフラノシル基（糖）とから形成されたポリヌクレオチドを指す。故に、「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然種、または天然のサブユニットもしくはそれに近い相同体から形成された合成種を指す。
【００３５】
「オリゴヌクレオチド」という用語はまた、天然のオリゴヌクレオチドに類似する機能を有するが、非天然部分を有し得る成分を指す。オリゴヌクレオチドは、修飾された糖部分、核酸塩基部分またはヌクレオチド間結合を有し得る。先に示したように、可能な修飾の中で、好ましい修飾は、Braasch DAおよびCorey DRにより記載されたような固定核酸（ＬＮＡ）（Chem. Biol. 2001, 8, 1-7）、Faria MおよびGiovannangeli C．により記載されたようなＮ３’−Ｐ５’ホスホルアミダイト誘導体（J. Gene Med 2001, 3, 299-310）、Wang GおよびXu XSにより記載されたペプチド核酸（ＰＮＡ）（Cell Res. 2004, 14, 111-118）、糖部分上の２’−Ｏ−アルキル誘導体（特に、２’−Ｏ−エチルオキシメチルもしくは２’−Ｏ−メチル誘導体）、ならびに／またはヌクレオチド間骨格用のホスホロチオエートもしくはメチルホスホネート、またはその他、５’位または３’位に挿入型反応基を有する誘導体（例えば、アクリジン）、もしくは標的配列と架橋を形成することができる誘導体（例えば、ソラレンまたはアジド基）である。
【００３６】
キメラオリゴヌクレオチドも、本発明の好ましい修飾に含まれる。これらのオリゴヌクレオチドは、化学的に異なり、かつ各々が少なくとも１つのヌクレオチドを含んでなる少なくとも２つの領域を含有する。これは特に、より良好な生物学的安定性、高いバイオアベイラビリティ、細胞内在化の増大または標的ＤＮＡに対する親和性の増大などの１つ以上の有利な特性を付与する修飾ヌクレオチドを含む１つ以上の領域である。
【００３７】
好ましくは、本発明によるキメラオリゴヌクレオチドは、固定核酸（ＬＮＡ）、Ｎ３’−Ｐ５’ホスホルアミダイト誘導体、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、または、全体的にもしくは部分的にホスホジエステル、ホスホロチオエートもしくはメチルホスホネート、またはホスホジエステルおよび／もしくはホスホロチオエートおよび／もしくはメチルホスホネート結合の組み合わせであり得るヌクレオチド間骨格を有する分子を含んでなる。
【００３８】
本発明によるキメラオリゴヌクレオチドは、有利には固定核酸（ＬＮＡ）またはペプチド核酸（ＰＮＡ）を含んでなり、より有利には固定核酸（ＬＮＡ）を含んでなる。特に好ましい実施態様では、キメラオリゴヌクレオチドがＬＮＡを含んでなる場合、配列番号１の１、３、５、７、９、１１、１３、１５および１６位のヌクレオチドがＬＮＡであるために、配列５’−Ｃ＋ＴＴ＋Ｃ＊Ｃ＋ＴＴ＋ＴＴ＋ＴＴ＋ＴＴ＋Ｃ＊Ｔ＋Ｔ＋−３’（配列番号２、Ｃ＊は５−メチルシトシンを表し、Ｃ＋はＬＮＡｄＣを表し、Ｔ＋はＬＮＡ−Ｔを表す）を生じる。
【００３９】
「オリゴヌクレオチド」という用語はまた、プラスミドタイプの円形投与ベクター、または、核酸もしくはペプチドタイプの線状投与ベクターがグラフトされたオリゴヌクレオチドを指すこともある。
【００４０】
本発明の目的はまた、上述のオリゴヌクレオチドを少なくとも１つ、および、化粧料として、または皮膚科学的に許容可能な賦形剤またはキャリアを少なくとも１つ含有する化粧用または皮膚用組成物である。このような組成物はまた、１種以上の活性成分を含有し得る。この（これらの）活性成分は、おそらくは所望の脱色素効果を補完するか、または増強することを目的とする。
【００４１】
本発明はまた、チロシナーゼ関連タンパク質−１をコードする遺伝子と特異的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドの、化粧剤としての使用、特に、皮膚もしくは毛髪を脱色素化および／もしくは漂白するため、ならびに／またはヒトの皮膚上の色素斑を低減するための使用に関する。
【００４２】
特に、本発明は、これらのオリゴヌクレオチドを化粧剤として用いた化粧用組成物を含む。該組成物は、特に、肌色を薄くする、太陽からの照射の作用による色素斑の形成を予防または治療する、特に手の上の老化性色素斑（老人性黒子）を低減する、またはその他、身体もしくは四肢の毛髪の色を薄くすることを意図している。
【００４３】
また、本発明は、局所経路を介して、チロシナーゼの過剰発現および活性亢進を特徴とする疾患を治療または予防することを目的とする皮膚用薬剤を製造するための、上述のオリゴヌクレオチドの使用に関する。この薬剤は、メラノサイトの活性亢進による限局的な色素過剰（例えば、特発性黒皮症）、偶発的な色素過剰（例えば、光感作または一部の病変後の瘢痕形成の場合）を治療または予防すること、および白斑などの一部の白皮症の形態における色素コントラストを低減することを目的とする。
【００４４】
本発明の目的はまた、化粧料として、および／または皮膚科学的に許容可能な媒質中に、チロシナーゼ関連タンパク質−１をコードする遺伝子に対するオリゴヌクレオチド配列を含んでなる脱色素組成物である。
【００４５】
本発明による化粧用組成物および薬剤は局所使用に適するものであり、故に、化粧料として、または皮膚科学的に許容可能な媒質、すなわち、皮膚と適合する媒質を含有する。本発明によるオリゴヌクレオチド配列は、これら組成物の総重量の０．０００１％〜１０％、および好ましくは０．００３％〜３％の量で存在し得る。
【００４６】
本発明の組成物は、局所適用に適したいずれかの形態、特に、水性、水性アルコール性もしくは油性溶液、水中油型もしくは油中水型の単純もしくは複合エマルション、水性もしくは油性ゲル、液状、ペースト状もしくは固体状無水物、高分子ナノカプセルもしくはナノ球体などの固体粒子の水性もしくは油性分散液、またはその他、仏国特許第２５３４４８７号に記載されるようなイオン性もしくは非イオン性の脂質小胞の水性分散液の形態であり得る。
【００４７】
これらの組成物は、多少なりとも流体であり、かつ、白色もしくは着色クリーム、軟膏、ミルク、ローション、美容液（セラム）、ペーストまたはフォームの外観を有してもよい。おそらくは、該組成物をエアロゾルとして皮膚に適用してもよい。該組成物はまた、粉体または非粉体固体形状、例えば、スティック形状であり得る。また、該組成物は、顔または手の斑に対する局所適用を可能とする、単回投与、パッチ、ペンシルまたはアプリケーターとしてもよい。
【００４８】
化粧用組成物は、特に、ケア製品および／または化粧品として使用するべく処方され得る。
【００４９】
既知の方法では、本発明の組成物はまた、化粧料および皮膚科学分野における通常のアジュバント、例えば、親水性もしくは親油性ゲル化剤、親水性もしくは親油性活性剤、防腐剤、酸化防止剤、溶媒、香料、充填剤、サンスクリーン、顔料、臭気吸収剤および着色剤を含有し得る。これらの様々なアジュバントの量は、関連分野において従来より使用される量である。これらのアジュバントは、その性質に応じて、脂肪相、水相、脂質小胞、ならびに／または、ナノ粒子および／もしくはナノ球体内へ導入することができる。
【００５０】
本発明の化粧用組成物または皮膚用組成物がエマルションの場合、脂肪相の割合は、該組成物の総重量に対して５重量％〜８０重量％、好ましくは５重量％〜５０重量％であり得る。エマルションとしての該組成物中で使用される油分、乳化剤および共乳化剤は、関連分野で従来より使用されるものから選択される。乳化剤および共乳化剤は、該組成物の総重量に対して０．３重量％〜３０重量％、好ましくは０．５重量％〜２０重量％の割合で該組成物中に存在する。
【００５１】
本発明によるオリゴヌクレオチドと組み合わせて使用できる油分としては、鉱物油（ワセリンオイル）、植物性油（アボカドオイル、大豆油）、動物性油（ラノリン）、合成油（ペルヒドロスクアレン）、シリコーン油（シクロメチコン）およびフッ化オイル（パーフルオロポリエーテル）が挙げられる。脂肪族アルコール（セチルアルコール）、脂肪酸およびワックス（カルナバワックス、オゾケライト）も脂肪物質として使用できる。
【００５２】
本発明によるオリゴヌクレオチドと組み合わせて使用できる乳化剤および共乳化剤としては、例えば、脂肪酸ポリエチレングリコールエステル（例えば、ステアリン酸ＰＥＧ−２０）、ならびに脂肪酸およびグリセリンのエステル（例えば、ステアリン酸グリセリル）が挙げられる。
【００５３】
本発明によるオリゴヌクレオチドと組み合わせて使用できる親水性ゲル化剤としては、特に、カルボキシビニルポリマー（カルボマー）、アクリルコポリマー（例えば、アクリレート／アルキルアクリレートコポリマー）、ポリアクリルアミド、多糖類、天然ゴムおよび粘土が挙げられる。親油性ゲル化剤としては、改質粘土（例えば、ベントン（bentones））、脂肪酸の金属塩、疎水性シリカおよびポリエチレンが挙げられる。
【００５４】
本発明の目的は、少なくとも１つの上述のオリゴヌクレオチドと、１種以上の他の活性剤とを含んでなる化粧用または皮膚用組成物である。
【００５５】
本発明はまた、ヒトの皮膚を脱色素化および／または漂白するための美容的または皮膚科学的方法に関し、該方法は、チロシナーゼ関連タンパク質−１をコードする遺伝子に対するオリゴヌクレオチド配列を含む化粧用組成物を、色素沈着した皮膚に適用することにある。より詳細には、本発明は、皮膚の１つ（またはそれ以上）の色素沈着領域に、先に定義した組成物を所要期間適用することを含んでなる、皮膚を脱色素化および／または漂白するための美容的処置方法に関する。場合により、脱色素効果が現れるまで、この操作を繰り返すことができる。この美容的用途のために、オリゴヌクレオチド含有量は、該組成物の総重量の０．００３％〜３％であるのが好ましい。
【００５６】
本発明はまた、１種以上の活性剤と組み合わせて、同時に、別個にまたは長期間投与されるべき薬剤を製造するための、上述のようなオリゴヌクレオチドの使用に関する。
【００５７】
本発明の化粧用組成物はまた、化粧料に使用され得る１種以上の活性成分を含み得る。前述の活性剤は、純粋なもの、またはこれらの活性剤を含有する抽出物から得られたものを、本発明によるオリゴヌクレオチドと組み合わせて使用される。該活性剤は、特に以下の化合物から選択される：エラグ酸およびその誘導体；レゾルシノールおよびその誘導体；アルブチンおよびその誘導体；ビタミンＣおよびその誘導体；パントテン酸塩・スルホン酸塩およびその誘導体；α−メラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）またはその受容体もしくは副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）に直接的または間接的に干渉する分子；ポリオール（例えば、グリセリン、グリコールまたはプロピレングリコール）；角質溶解剤および／または落屑剤（例えば、サリチル酸およびその誘導体）；単独の、またはグラフト化したα−ヒドロキシ酸（例えば、乳酸またはリンゴ酸）；レチノイン酸；レチンアルデヒド；リポソーム性であってもなくてもよい製剤中のレチノールおよびその誘導体（例えば、パルミチン酸、プロピオン酸または酢酸レチノール）；単独の、もしくは組み合わせた抗糖化剤および／または抗酸化剤（例えば、トコフェロールおよびその誘導体、エルゴチオネイン、チオタウリン、ヒポタウリン、アミノグアニジン、チアミンピロリン酸、ピリドキサミン、リシン、ヒスチジン、アルギニン、フェニルアラニン、ピリドキシン、アデノシン三リン酸）；抗炎症剤（例えば、グリシルレチン酸ステアリル）；鎮静剤およびそれらの混合物、１種以上の化学または物理サンスクリーン（例えば、メトキシケイ皮酸オクチル、ブチル−メトキシジベンゾイル−メタン、酸化チタニウムおよび酸化亜鉛）；ならびにデオキシリボ核酸および／または核酸から選択される。これらの活性剤と本発明のオリゴヌクレオチドの間に相溶性がない場合、それらのいずれか一方を、ナノ構造体、特に、仏国特許第２５３４４８７号に記載されるようなイオン性もしくは非イオン性の両親媒性脂質で形成されたリポソームもしくは小胞、および／またはナノ粒子、および／またはナノ球体、および／またはナノカプセル内に配合してもよい。
【実施例】
【００５８】
以下の実施例は、本発明を例証するものであるが、本発明を制限するものではない。
【００５９】
以下の実施例において、全ての百分率は、特記されない限り重量を基準とする。
【００６０】
実施例１：オリゴヌクレオチド合成
天然の塩基を有するオリゴヌクレオチドを、標準のホスホルアミダイト（phosphoramidite）誘導体の化学的性質を用いて、構築者のプロトコールにしたがって、自動合成器（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｅｘｐｅｄｉｔｅモデル８９０９）により合成した。ヌクレオシドのβ−シアノエチルジイソプロピルホスホルアミダイト誘導体を使用した。ヨウ素溶液を用いて、亜リン酸酸化工程を行った。カラム（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓｓ、Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から開裂させ、３３％の水性アンモニア溶液で５５℃にて１８時間処理することによって配列を完全に脱保護化した後、オリゴヌクレオチドを、酢酸ナトリウムの存在下でエタノールから析出させることにより精製した。次いで、塩化ナトリウムの勾配を用いた溶出によるイオン交換クロマトグラフィーにより、およびトリエチルアンモニウムの存在下でアセトニトリルの勾配を用いた溶出によるＣ１８逆相クロマトグラフィーにより、高圧液体クロマトグラフィーによる確認を行った。
【００６１】
ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、Ｐｒｏｌｉｇｏ社またはＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社によって合成された。
【００６２】
例として、いくつかのオリゴヌクレオチドを合成した。これらのオリゴヌクレオチドを表１に記載する。シトシンの隣にある星印（＊）は、これらの塩基が５位においてメチル化されていることを示す。塩基の隣にある「＋」印は、これらの塩基が固定核酸であることを示す。この表の上から５個の配列（配列番号２〜配列番号６と番号を付している）に対して検査を行った。これらオリゴヌクレオチドの、チロシナーゼ関連タンパク質−１遺伝子上のそれらの標的配列とのハイブリダイゼーション特性および脱色素活性を以下の実施例において報告する。
【００６３】
表１において、配列の各末端に付した番号は、基となる配列中のオリゴヌクレオチドの位置を示している。
【００６４】
これらの配列は、ヒトチロシナーゼ関連タンパク質−１遺伝子のいわゆる「ＡＦ００１２９５」配列（Box, N.F., Wyeth, J.R., Mayne, C.J., O’Gorman, L.E., Martin, N.G. and Sturm, R.A. Complete sequence and polymorphism study of the human TYRP1 gene encoding tyrosinase related protein 1, Mamm. Genome, 9(1), 50-53 (1998）により出版) (Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ００１２９５）から推測される。
【００６５】
更に、チロシナーゼ関連タンパク質−１をコードする遺伝子に対する、本発明のオリゴヌクレオチドの特異性を確認するための比較として、本発明の配列番号２の配列に基づく２種のヌクレオチドを合成した。
【００６６】
・表１の配列番号７で示されるいわゆる「反転対照」配列。配列番号２の配列の塩基の順番が反転している。
【００６７】
・同じく表１の配列番号８で示されるいわゆる「スクランブル対照」配列。配列番号２の配列の塩基と、性質および数の点においては同じであるが、任意の順番で並んでいる塩基を含む。
【００６８】
【表１】
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【００６９】
実施例２：ゲル遅延による、配列番号２と、ヒトチロシナーゼ関連タンパク質−１遺伝子上のその二重らせん標的配列との相互反応に関する試験
ゲル遅延技術により、オリゴヌクレオチドと、その標的ＤＮＡ配列とのハイブリダイゼーションを検出することができる。標的ＤＮＡを、本発明の放射標識された本発明のオリゴヌクレオチドの存在下に置くことによってＤＮＡ−オリゴヌクレオチド複合体を生成する。その移動は、遊離しているオリゴヌクレオチドと比較して低速であろう。遅延したオリゴヌクレオチドの量を測定することにより、三重らせん形成効率を測定することができる。
【００７０】
５００μＭの溶液から始め、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、γ−［３２Ｐ］ＡＴＰで配列番号２および配列番号７の配列を標識する。放射標識された配列番号２および配列番号７を排除カラム上で単離する。
【００７１】
１５％アクリルアミド−尿素ゲル上での電気泳動（７０Wで１時間３０分移動させる）によりオリゴヌクレオチドの純度を確認する。次いで、真空下にて７０℃でゲルを乾燥させ、ＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅｒ（Ｓｔｏｒｍ ８６０， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて放射線痕跡を読み取る。
【００７２】
放射標識されたオリゴヌクレオチド（配列番号２および７）と、ヒトチロシナーゼ関連タンパク質−１遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片との間のハイブリダイゼーションを、様々な標的ＤＮＡ／オリゴヌクレオチド濃度比率値で４℃にて一晩行う。条件を表２に示す。
【００７３】
非変性８％ビスアクリルアミドゲル上での電気泳動を、３Ｗの電力で、３７℃にて１時間行う。次いで、真空下にて７０℃でゲルを乾燥させ、一晩露光プレートと接触させる。
【００７４】
【表２】
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【００７５】
得られた画像から、オリゴヌクレオチドとその標的配列との複合体の形成効率（百分率で表す）を、ＬｕｍｉＡｎａｌｙｓｔソフトウェア（Roche（Ｍeylan, France））を用いて測定することができる。
【００７６】
試験の結果を以下の表３に示す。これらの結果は、配列番号２が、その標的配列とハイブリダイズすること、および、標的ＤＮＡ／オリゴヌクレオチド比率に応じて変化するハイブリダイゼーション収率がこの濃度範囲ではそれほど大きくは変化しないことを示している。等モル比の場合には３７％、比率が２の場合には４２％、および比率が４の場合には４０％である。陰性対照配列である配列番号７は、チロシナーゼ関連タンパク質−１ＤＮＡ配列とは相互作用しない（表３）。
【００７７】
【表３】
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【００７８】
実施例３：正常なヒトメラノサイト上でのヒトチロシナーゼ関連タンパク質−１遺伝子発現の阻害についての、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲによる試験
正常なヒトメラノサイトを、直径６０ｍｍのペトリ皿に７１０，０００細胞／皿の量で、培地１に播種する（表４）。配列番号２〜８のそれぞれの配列について、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（Qiagen（Courtaboeuf, France））で複合化した配列を５００ナノモルの濃度で添加した培地１からなる即時溶液を調製する。播種から２４時間後、細胞をこれらの様々な溶液で一回処理し、次いで処理から８時間後に回収し、全ＲＮＡを抽出する。
【００７９】
【表４】
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【００８０】
全ＲＮＡ（全ての細胞ＲＮＡ、故にチロシナーゼ関連タンパク質−１のメッセンジャーＲＮＡを含む）を抽出し（Ｒｎｅａｓｙ Ｋｉｔ（Qiagen（Courtaboeuf, France））、計量し、分析器Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｕｒ２１００（Agilent Technologies（Massy, France））を用いてそれらの品質を確認した。次いで、それらをＤＮＡアーゼで処理して、残留するであろうゲノムＤＮＡの全ての痕跡を除去する。ＤＮＡ増幅反応であるリアルタイムでの定量的ＰＣＲ反応を進めるため、酵素Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Qiagen）による逆転写反応により、ＲＮＡから相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成することができる。次いで、この得られた逆転写産物を用いて、表５に記載した反応混合物に応じて、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Roche（Meylan, France））上でリアルタイムでの定量的ＰＣＲを行い、初期の細胞集団に存在する目的のメッセンジャーＲＮＡを定量化する。
【００８１】
【表５】
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【００８２】
細胞ｃＤＮＡを含有する上述の逆転写反応産物２μｌを、リアルタイムでの定量的ＰＣＲ反応に使用され、表５に記載されるタイプの反応培地に添加する。１サンプルについて測定したチロシナーゼ関連タンパク質−１遺伝子をコードする転写産物比率は、β−２−ミクログロブリン非変性遺伝子をコードする転写産物比率と関連している。この比率について得られた結果を以下の表ＶＩにまとめ、添付した図１および図２に示す。配列番号２は、チロシナーゼ関連タンパク質−１遺伝子の転写産物比率を２３％有意に低下させる。一方、配列番号３〜６の配列は、チロシナーゼ関連タンパク質−１遺伝子発現の阻害に対して何ら有意な活性を示さず、配列番号７および８の配列でさえも示さず、これらの配列はそれぞれ、この活性を有する唯一のものである配列番号２の配列の反転対照およびスクランブル対照である。
【００８３】
【表６】
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【００８４】
実施例４：チロシナーゼのドーパ−オキシダーゼ活性を測定することによる、正常なヒトメラノサイトでのヒトチロシナーゼ関連タンパク質−１遺伝子発現の阻害についての試験
実施例１の表１に示す本発明のオリゴヌクレオチド（配列番号２〜配列番号６）を、それらのメラニン形成作用について、故にメラノサイトによるメラニン色素の生成を調節するそれらの能力について試験する。比較要素として、「反転対照」（配列番号６）および「スクランブル対照」（配列番号８）オリゴヌクレオチドも、この作用について試験する。
【００８５】
念のため、メラニン形成のための反応機序では、チロシナーゼおよびＴＲＰ−１が酵素複合体を形成し、この酵素複合体がＬ−ドーパからドーパキノン、次いでドーパクロムへの変換を触媒する（Kobayashi T. et al., J. Biol. Chem. 273, 31801-318055 (1998); Sarangarajan R., Boissy R.E., Pigment Cell Res., 16, 437-44 (2001)）。チロシナーゼはまた、その多機能な性質により「ドーパ−オキシダーゼ」と呼ばれることに留意すべきである。チロシナーゼは、チロシンのドーパへの酸化を触媒する、ドーパ−オキシダーゼ活性を有する。
【００８６】
本試験の原理は、基質として使用するＬ−ドーパをドーパクロムへ変換する際にドーパ−オキシダーゼにより触媒される反応の速度の測定に基づいている。所要期間に光学密度を測定することによってドーパクロムの出現を定量化し、それにより、試験した各オリゴヌクレオチドおよび対照私権に関する、Ｌ−ドーパ変換のための反応速度を計算することができる。この反応速度が利用できる酵素の活性に依存している場合、チロシナーゼ関連タンパク質−１遺伝子発現に対する、目的のオリゴヌクレオチドの阻害作用、すなわち、チロシナーゼ活性を、得られた結果から検証することができる。対照試験と比較した反応速度の低下は、チロシナーゼ酵素活性の低下に相当し、結果として、メラニン形成の低下、故に脱色素効果に相当する。
【００８７】
通常のヒトメラノサイトを、９６ウェルマイクロプレート内の培地１に、１０，０００細胞／ウェルの両で播種する（表４）。配列番号２〜配列番号８の各々の配列に関し、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（Qiagen（Courtaboeuf, France））で複合化した配列が５００ｎＭの濃度で添加された培地１からなる即時溶液を調製する。播種から２４時間後に細胞を一旦処理し、次いで該処理から７２時間後、４５０ｎｍでの分光光度法によりドーパ−オキシダーゼ活性を測定する。結果を表７および添付図面の図３に示す。
【００８８】
【表７】
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【００８９】
表７は、５００ナノモルの配列番号２により処理された正常なヒトメラノサイトにおいて、ドーパ−オキシダーゼ活性が４０％有意に阻害されることを示している。
【００９０】
実施例３に見られるように、配列番号３〜配列番号６は何ら有意な活性を有さず、このことは、該配列の理論的なハイブリダイゼーション特性がそれらの生物学的活性を体系的に調節しないことを示す。
【００９１】
配列番号７および配列番号８は、ドーパ−オキシダーゼ活性に対する活性を有さない。これは、ＬＮＡ塩基からなる配列番号２の配列で観察された阻害効果が標的配列に特異的であることを示している。
【００９２】
実施例５：顔の肌色を改善するための化粧パウダー
【表８】
0005599615.tif 000011
【００９３】
この粉末は二重作用を有している。該粉末は皮膚のクレンジングを行い、また、数日間の規則的な使用により肌色を白くする。該粉末は１日に１〜２回、顔の皮膚に適用することができる。
【００９４】
実施例６：エマルション−ゲルとしての脱色素用化粧デイクリーム
【表９】
0005599615.tif 000012
【００９５】
日光の、更には太陽から直接の、多少なりとも強い照射に曝される人々の中には、肌色の透明さを保ち、色素沈着斑が出現しないことを望む者もいる。上述のゲル−エマルションを使用することにより、この目的を達成することができる。この組成物を、一般的には午前中に顔に適用する。該組成物は、顔の平坦なまたは凸凹のある色素沈着に対して、予防的かつ治癒的に作用する。
【００９６】
実施例７：太陽照射から保護する流体化粧用組成物（ＳＰＦ３０）
【表１０】
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【００９７】
この組成物は、太陽からの強い照射に曝露される前に使用されるべきものである。該組成物は、この現象を起こしやすい人々における色素斑の出現を予防する。高濃度のサンスクリーンの存在により、メラニン量の減少から生じる天然保護の低下を補償することに留意すべきである。
【００９８】
実施例８：病気またはトラウマによる皮膚の色素過剰を治療するための皮膚用クリーム
【表１１】
0005599615.tif 000014
【００９９】
このクリームを使用することにより、病気またはトラウマによる皮膚の色素過剰を低減することができる。また、このクリームにより、白斑の場合の脱色素化領域周辺での色のコントラストを低減することもできる。
【０１００】
実施例９：肌色を白くするための顔用化粧ローション
【表１２】
0005599615.tif 000015
【０１０１】
肌色を白くするためのこのローションは、メイクアップ（化粧）を除去して皮膚をクレンジングした後に使用する。
【０１０２】
実施例１０：皮膚を白くするための化粧美容液（セラム）
【表１３】
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【０１０３】
一般的には顔用クリームを適用する前に、美容液中に非常に濃縮されたこの組成物の液滴を顔に適用する。この美容液は、通常、１〜２週間の治療で使用することにより、肌色を白くするか、またはその白さを持続させる。
【０１０４】
実施例１１：毛髪の色を薄くするための化粧ローション
【表１４】
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【０１０５】
脱色すべき毛髪がある領域、特に腕に対して、該毛髪の色が徐々に薄くなるのに十分な時間、このローションを適用する。
【０１０６】
実施例１２：手用シミ防止化粧クリームゲル
【表１５】
0005599615.tif 000018
【０１０７】
このクリームは、手の斑（太陽黒子および／または老人性黒子）の着色を低減するために、該斑に対して直接適用すべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】配列番号２の配列の、５００ｎＭのオリゴヌクレオチドで８時間処理した正常なヒトメラノサイトにおけるチロシナーゼ関連タンパク質−１（ＴＲＰ−１）転写産物の比率に関する試験。「＊」という記号は、未処理細胞と比較した、統計的に有意な差異（ｐ＜０．０５）を表している。
【図２】配列番号７の配列の、５００ｎＭのオリゴヌクレオチドで８時間処理した正常なヒトメラノサイトにおけるチロシナーゼ関連タンパク質−１（ＴＲＰ−１）転写産物の発現率に関する試験。「＊」という記号は、未処理細胞と比較した、統計的に有意な差異（ｐ＜０．０５）を表している。
【図３】配列番号２のオリゴヌクレオチドの、正常なヒトメラノサイトにおけるチロシナーゼのドーパ−オキシダーゼ活性に関する試験。ドーパ−オキシダーゼ活性をＯＤ／分で測定し、ＸＴＴ試験を行って得られた生存率に関して標準化する。「＊」という記号は、未処理細胞と比較した、統計的に有意な差異（ｐ＜０．０５）を表している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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