(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アシタバの葉、大豆粉末、納豆菌と金の粉末を混合して発酵させた発酵液をさらにベニコウジ菌で発酵させ、さらに、プロテアーゼ処理して得られる脂肪分解作用を呈する組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は脂肪分解作用を呈する組成物の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】脂肪の蓄積としては内臓脂肪や皮下脂肪の例があり、いずれも生活習慣病の原因となり、健康と美の観点からも対策が急がれる。また、美容においても皮脂の脂質の蓄積は酸化を引き起こし、皮膚の健康も損なわれる。【０００３】脂肪を分解する働きはリパーゼそのものにもあるものの腸管や皮膚が高分子を浸透させることは不可能である。より低分子の物質で安全性の高い成分が必要とされている。【０００４】脂肪を分解する酵素活性化剤も有機合成されているものの、安全性に問題が残る。そのため、種々の研究が行われているものの、脂肪分解の働きには限りがあり、問題の解決には至っていない。【０００５】脂肪分解に関する発明として例えば、アカシア属樹皮由来物を含有する血糖降下及び／又は抗肥満組成物がある（例えば、特許文献１参照。）もののその応用は限られている。【０００６】
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】  特願２００８−４９９８４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】既存の物質による脂肪分解作用は軽度であり、産業上への利用が限定されるという課題があり、また、化学合成された物質では安全性に問題があり、利用が限られている。【０００９】そこで、副作用が弱く優れた脂肪分解作用を呈する有機酸誘導体を効率良く製造する製造方法が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の目的を達成するために、請求項１に記載の発明は、脂肪分解作用を有する組成物の製造方法に関するものである。
【発明の効果】
【００１１】この発明は、以上のように構成されているため、次のような効果を奏する。【００１２】請求項１に記載の製造方法によれば、効率良く有機酸誘導体を製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】以下、この発明を具体化した実施形態について詳細に説明する。
【００１４】
アシタバの葉、大豆粉末、納豆菌と金の粉末を混合して発酵させた発酵液をさらにベニコウジ菌で発酵させ、さらに、プロテアーゼ処理する工程からなる脂肪分解作用を呈する組成物の製造方法について説明する。
【００１８】
得られた組成物を医薬品素材として利用する場合、目的とする脂肪分解作用を呈する有機酸誘導体を分離精製することは、目的とする有機酸誘導体の純度が高まり、不純物を除去できる点から好ましい。
【００１９】医薬品として、注射剤または経口剤または塗布剤などの非経口剤として利用され、医薬部外品としては、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤、石鹸、塗布剤、ゲル剤、歯磨き粉等に配合されて利用される。
【００２０】経口剤としては、錠剤、カプセル剤、散剤、シロップ剤、ドリンク剤等が挙げられる。前記の錠剤及びカプセル剤に混和される場合には、結合剤、賦形剤、膨化剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤等とともに用いることができる。前記の錠剤は、シェラックまたは砂糖で被覆することもできる。
【００２１】また、前記のカプセル剤の場合には、上記の材料にさらに油脂等の液体担体を含有させることができる。前記のシロップ剤及びドリンク剤の場合には、甘味剤、防腐剤、色素香味剤等を添加することができる。
【００２２】非経口剤としては、軟膏剤、クリーム剤、水剤等の外用剤の他に、注射剤が挙げられる。外用剤の基材としては、ワセリン、パラフィン、油脂類、ラノリン、マクロゴールド等が用いられ、通常の方法によって軟膏剤やクリーム剤等とすることができる。
【００２３】注射剤には、液剤があり、その他、凍結乾燥剤がある。これは使用時、注射用蒸留水や生理食塩液等に無菌的に溶解して用いられる。
【００２４】食品製剤として脂肪分解と美容を目的とした健康食品、美容食品などに利用される。また、保健機能食品として、栄養機能食品や特定保健用食品に利用することは好ましい。
【００２５】得られた食品製剤をイヌやネコなどのペットや家畜動物に利用する場合、脂肪の分解と皮膚の健康を維持する目的として飼料やサプリメントとして利用される。
【００２６】化粧料として常法に従って界面活性化剤、溶剤、増粘剤、賦形剤等とともに用いることができる。例えば、クリーム、毛髪用ジェル、洗顔剤、美容液、化粧水等の形態とすることができる。
【００２７】化粧料の形態は任意であり、溶液状、クリーム状、ペースト状、ゲル状、ジェル状、固形状または粉末状として用いることができる。
【００２８】得られた化粧料は過剰な皮脂を分解し、皮膚の清浄作用を発揮する。
【００２９】また、皮脂は細菌の栄養素になるため、本誘導体により脂質を分解することによりアトピー患者の角質の脂質の改善と皮膚再生を促進する。
【００３０】
この製造方法とはアシタバの葉、大豆粉末、納豆菌と金の粉末を混合して発酵させた発酵液を、さらに、ベニコウジ菌により発酵させた後に、プロテアーゼ処理する工程からなる。
【００３１】原料となる物質はアシタバの葉、大豆粉末、納豆菌、ベニコウジ菌とプロテアーゼである。
【００３２】ここでいうアシタバは学名Ａｎｇｅｌｉｃａ  ｋｅｉｓｋｅｉであり、日本原産で房総半島から紀伊半島と伊豆諸島の太平洋岸に自生する植物である。別名は八丈草であり、アジアやアメリカでも栽培されており、食用としても利用されている。
【００３３】アシタバの葉にはポリフェノールや有機酸が含有されていることからこの誘導体の原料として好ましい。
【００３４】アシタバの葉は日本、中国、台湾、アメリカなどいずれの国の由来でも良い。また、低農薬や減農薬で生産されたものは好ましい。
【００３５】アシタバの葉は乾燥され、粉末化されることが好ましく、発酵の前にオートクレーブ滅菌されることは発酵をスムーズに行うことから好ましい。
【００３６】３マイクロメーター以下の粒子サイズの粉末が発酵の工程を実施しやすくすることから好ましい。
【００３７】原料となる大豆粉末は、日本産、中国産、アメリカ産、ロシア産などいずれの産地の大豆でも利用できるが、トレーサビリティーが確実であり、生産者が明確である日本産が好ましい。
【００３８】このうち、有機栽培や無農薬で栽培された大豆は有害な農薬や金属を含有しないことから、さらに好ましい。
【００３９】大豆は使用に際して、株式会社奈良機械製作所製の自由ミル、スーパー自由ミル、サンプルミル、ゴブリン、スーパークリーンミル、マイクロス、減圧乾燥機として東洋理工製の小型減圧乾燥機、株式会社マツイ製の小型減圧伝熱式乾燥機ＤＰＴＨ−４０、エーキューエム九州テクノス株式会社製のクリーンドライＶＤ−７、ＶＤ−２０、中山技術研究所製ＤＭ−６などの粉砕機で粉砕される。これにより発酵の工程が効率的に進行しやすい。
【００４０】さらに、アシタバの葉と大豆は粉砕後、オートクレーブなどにより滅菌されることは雑菌の繁殖を防御できることから好ましい。
【００４１】用いる納豆菌は学名バチルス  サブチリスで日本では納豆の製造に汎用され、食経験が豊富で有用な食用菌である。沖縄や鹿児島などの日本産、中国や台湾の東南アジア原産の菌種が用いられる。このうち、納豆本舗製の納豆菌は高い発酵性を呈することから好ましい。
【００４２】この納豆菌はアシタバの葉と大豆からなる有機酸とタンパク質を同時に発酵させることにより有機酸とタンパク質が結合する。
【００４３】前記の発酵に関するそれぞれの添加量はアシタバの葉の乾燥粉末１重量に対し、大豆粉末は０．２〜３重量及び納豆菌は０．００１〜０．０４重量が好ましい。納豆菌は発酵される前に、前培養することは、発酵の初発時間を短縮し、発酵時間が短縮されることから好ましい。
【００４４】前記の発酵は清浄な培養用タンクで実施され、滅菌された水道水により前記の材料を混合することは好ましい。
【００４５】また、この発酵は３３〜４０℃に加温され、発酵は、２日間から１４日間行われる。目的とする有機酸誘導体をＨＰＬＣやＴＬＣにより定量すること、ならびに、菌体の増殖性を確認することにより、発酵の工程管理を実施することは好ましい。
【００４６】得られたバチルス発酵液は引き続きベニコウジ菌によって発酵される。このベニコウジ菌による発酵により有機酸誘導体が分離され、吸収も促進される。
【００４７】用いるベニコウジ菌は学名Ｍｏｎａｓｃｕｃ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｓの糸状菌であり、古くから日本、中国や台湾において紅酒や豆腐ようなどの発酵食品に利用されている。また、沖縄や鹿児島などの日本産、中国や台湾の東南アジア原産の菌種が用いられる。
【００４８】前記の発酵に関するそれぞれの添加量は前記の発酵物１重量に対してベニコウジ菌は０．０００１〜０．００５重量が好ましい。ベニコウジ菌は発酵される前に、前培養することは、発酵の初発時間を短縮し、発酵時間が短縮されることから好ましい。
【００４９】前記の発酵は清浄な培養用タンクで実施され、滅菌された水道水により前記の材料を混合することは好ましい。
【００５０】また、この発酵は３５〜４７℃に加温され、発酵は１日間から１４日間行われる。
【００５１】この発酵の工程によってタンパク質が有機酸と結合するものの、分子量が大きいため、吸収及び皮膚からの浸透を促進する目的でプロテアーゼにより分解され低分子化される。
【００５２】プロテアーゼはタンパク質を分解し、ペプチドやアミノ酸を生成する加水分解の酵素であり、食用としても利用されている。アマノ製薬のプロテアーゼＮは酵素活性が高いことから好ましい。
【００５３】前記の発酵物にプロテアーゼを添加して加温することにより有機酸とタンパク質が分解され、ペプチド型の有機酸誘導体になる。
【００５４】発酵物の１重量に対してプロテアーゼの添加量は０．００１〜０．０２重量が好ましい。加温温度は３０〜４０度が好ましい。加温時間は１時間から６時間が好ましい。
【００５５】前記のプロテアーゼ処理した分解物は含水エタノールで抽出されることは、生成物を効率良く回収でき、プロテアーゼを失活でき、次の工程が実施しやすいことから、好ましい。
【００５６】また、得られた発酵物を超音波処理することは、生成物が分離しやすいことから、好ましい。また、凍結乾燥などにより、濃縮することは、以下の工程が短時間に実施できることから好ましい。
【００５７】前記の還元反応物から、目的とする有機酸誘導体を分離し、精製することは純度の高い物質として摂取量を減少させることができる点から好ましい。この精製の方法としては、分離用の樹脂などの精製操作を利用することが好ましい。
【００５８】例えば、分離用担体または樹脂により分離され、分取されることにより目的とする有機酸誘導体が得られる。分離用担体または樹脂としては、表面が後述のようにコーティングされた、多孔性の多糖類、酸化珪素化合物、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン、スチレン−ビニルベンゼン共重合体等が用いられる。０．１〜３００μｍの粒度を有するものが好ましく、粒度が細かい程、精度の高い分離が行なわれるが、分離時間が長い欠点がある。
【００５９】例えば、逆相担体または樹脂として表面が疎水性化合物でコーティングされたものは、疎水性の高い物質の分離に利用される。陽イオン物質でコーティングされたものは陰イオン性に荷電した物質の分離に適している。また、陰イオン物質でコーティングされたものは陽イオン性に荷電した物質の分離に適している。特異的な抗体をコーティングした場合には、特異的な物質のみを分離するアフィニティ担体または樹脂として利用される。
【００６０】アフィニティ担体または樹脂は、抗原抗体反応を利用して抗原の特異的な調製に利用される。分配性担体または樹脂は、シリカゲル（メルク社製）等のように、物質と分離用溶媒の間の分配係数に差異がある場合、それらの物質の単離に利用される。
【００６１】これらのうち、製造コストを低減することができる点から、吸着性担体または樹脂、分配性担体または樹脂、分子篩用担体または樹脂及びイオン交換担体または樹脂が好ましい。さらに、分離用溶媒に対して分配係数の差異が大きい点から、逆相担体または樹脂及び分配性担体または樹脂はより好ましい。
【００６３】分離用溶媒として有機溶媒を用いる場合には、有機溶媒に耐性を有する担体または樹脂が用いられる。また、医薬品製造または食品製造に利用される担体または樹脂は好ましい。
【００６４】これらの点から吸着性担体としてダイヤイオン（三菱化学（株）社製）及びＸＡＤ−２またはＸＡＤ−４（ロームアンドハース社製）、分子篩用担体としてセファデックスＬＨ−２０（アマシャムファルマシア社製）、分配用担体としてシリカゲル、イオン交換担体としてＩＲＡ−４１０（ロームアンドハース社製）、逆相担体としてＤＭ１０２０Ｔ（富士シリシア社製）がより好ましい。
【００６５】これらのうち、ダイヤイオン、セファデックスＬＨ−２０及びＤＭ１０２０Ｔはさらに好ましい。
【００６６】得られた抽出物は、分離前に分離用担体または樹脂を膨潤化させるための溶媒に溶解される。その量は、分離効率の点から抽出物の重量に対して１〜３５倍量が好ましく、４〜２５倍量がより好ましい。分離の温度としては物質の安定性の点から４〜３０℃が好ましく、１０〜２５℃がより好ましい。
【００６６】分離用溶媒には、水、または、水を含有する低級アルコール、親水性溶媒、親油性溶媒が用いられる。低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールが用いられるが、食用として利用されているエタノールが好ましい。
【００６７】セファデックスＬＨ−２０を用いる場合、分離用溶媒には低級アルコールが好ましい。シリカゲルを用いる場合、分離用溶媒にはクロロホルム、メタノール、酢酸またはそれらの混合液が好ましい。
【００６８】ダイヤイオン及びＤＭ１０２０Ｔを用いる場合、分離用溶媒はメタノール、エタノール等の低級アルコールまたは低級アルコールと水の混合液が好ましい。
【００６９】有機酸誘導体を含む画分を採取して乾燥または真空乾燥により溶媒を除去し、目的とする有機酸誘導体を粉末または濃縮液として得ることは溶媒による影響を除外できることから、好ましい。
【００７０】また、最終抽出を食用油や化粧料に用いる油脂で実施することは、得られる有機酸誘導体が安定に維持されることから好ましい。例えば、大豆油、米ぬか油、グレープシード油、オリーブ油、ホホバ油で抽出することは好ましい。
【００７１】また、この有機酸誘導体を粉末化することは防腐の目的から好ましい。
【００７２】以下、前記実施形態を実施例及び試験例を用いて具体的に説明する。なお、これらは一例であり、素材、原料や検体の違いに応じて常識の範囲内で条件を変更させることが可能である。
【実施例１】
【００７３】宮崎県で減農薬栽培されたアシタバの葉を用いた。葉を採取した後、水道水で水洗後、天日で乾燥させ、粉砕機（株式会社奈良機械製作所製のスーパー自由ミル）にて粉砕し、アシタバの葉の乾燥粉末粉砕物を１．１ｋｇ得た。【００７４】北海道産の大豆をミキサー（クイジナート）に供し、大豆の粉砕物１．１ｋｇを得た。前記のアシタバの葉と大豆の粉砕物をオートクレーブに供し、１２１℃、２０分間、滅菌した。【００７５】これらを清浄な発酵タンク（滅菌された発酵用丸形４０リットルタンク）に入れ、滅菌された水道水７ｋｇを添加し、攪拌した。【００７６】これとは別に、粉末納豆菌（納豆本舗製）１０ｇを小型発酵タンクに供し、滅菌した大豆粉末と前培養させた培養液を用意した。【００７７】前記の前培養した納豆菌の溶液を前記の金の粉砕物、アシタバの葉の乾燥粉末と大豆を入れた発酵タンクに添加し、攪拌後、４０〜４３℃の温度範囲で加温し、発酵させた。【００７８】発酵過程では、通気によりバブリングと攪拌を行いつつ、発酵液のサンプリングを行った。【００７９】このバチルスによる発酵物１ｋｇに対してベニコウジ菌の１０ｇを添加し、３７度で２日間発酵させた。【００８０】得られた発酵物１ｋｇに対してアマノ製薬のプロテアーゼＮを１０ｇ添加し、４０度で２時間加温した。【００８１】
この処理物を加温し、エタノールを添加して目的とする有機酸誘導体を含む組成物１２０ｇを得た。
【００８２】以下に、有機酸誘導体の構造解析に関する試験方法及び結果について説明する。
（試験例１）【００８３】上記のように得られた検体１をエタノールに溶解し、質量分析器付き高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ、島津製作所）で分析した。【００８４】さらに、核磁気共鳴装置（ＮＭＲ、ブルカー製、ＡＣ−２５０）で解析した。構造解析の結果、検体１からシアル酸およびポリフェノールとその結合体が検出された。【００８５】以下にヒト脂肪細胞を用いた確認試験について述べる。
（試験例２）【００８６】クラボウ株式会社より購入したヒト脂肪細胞を用いた。培養液としては、５％牛胎児血清含有ＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ製）を用いて培養した、１０００個の細胞を３５ｍｍ培養シャーレに播種し、５％炭酸ガス下、３７℃で培養した。これに、前記の実施例１で得られた検体１及び対照としてカテキンを０．１ｍｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。これを４８時間培養した。【００８７】細胞を剥離後、細胞数を計数した後、細胞懸濁液を調整し、細胞内の中性脂肪量をＥＬＩＳＡ法（和光純薬）にて測定した。なお、シャーレは５枚を用いてその平均値を算出した。【００８８】その結果、検体１の０．１ｍｇ／ｍｌの添加により脂肪細胞数が対照群に比して平均値として３４％に減少した。カテキンでは８８％の減少であり検体１の方が優れていた。【００８９】中性脂肪については検体１により対照群に比して２０％に低下した。カテキンでは７７％となり、検体１の減少が著しかった。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明で得られる組成物は脂肪の分解と皮膚の脂質を分解し、脂肪過多による健康障害を軽減し、かつ、副作用が少ないことから、国民のＱＯＬを改善し、健康な労働人口を増加させ、かつ、医療費を削減できる。
【００９１】
本発明で得られる組成物は皮膚の脂質を改善する作用を有することから、化粧料として皮脂過多やアトピー、肌トラブルに悩む方の改善に貢献し、化粧品業界の発展に寄与する。
【００９２】
本発明で得られる組成物は食品としても利用できることから、食品業界の発展に寄与する。
【００９３】アシタバの葉の乾燥粉末を利用することによって廃棄物の有効利用と農業資源の有効活用ができ、農業及びその二次加工産業を発展させる。【００９４】本製造方法は、高度な発酵技術を利用するものであり、新しい発酵技術の向上と発酵産業の進展に貢献する。