(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞集団がインビボで安定な硝子軟骨を生成する能力を調べるためのインビトロ方法であって、
ａ）前記集団によるマーカーＦＲＺＢ（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質）と、マーカーＡＬＫ１（アクチビンＡ受容体、ＩＩ型様キナーゼ１）と、ＰＥＤＦ（色素上皮由来因子）、ＣＯＬ１１（コラーゲン、ＸＩ型Ａ１）、ＣＯＬ２（コラーゲン、ＩＩ型、α１）、ＦＧＦＲ３（線維芽細胞増殖因子受容体３）、ＯＰＮ（オステオポンチン）、ＢＭＰ−２（骨形成タンパク質２）およびＲＡＳＦ−ＰＬＡ（ホスホリパーゼＡ２、ＩＩＡ群）からなる群より選択される１つ以上のマーカーとを含む少なくとも３つのマーカー遺伝子のセットの発現を調べる工程と、
ｂ）数値によりそれぞれの個々のマーカーの発現レベルを表す工程と、
ｃ）累加スコアに個々のマーカーについての数値を結びつける工程と、
ｄ）インビボで、安定な硝子軟骨を生成するために、関節から採取された細胞集団の能力を、累加スコアに基づき、予測し、それにより累加スコアの値が安定な軟骨を生成する能力を示す、工程とを含む、方法。
【請求項２】
細胞集団がインビボで安定な硝子軟骨を生成する能力を調べる前に、該細胞集団が、インビトロで軟骨生成を生じる細胞の能力に影響を及ぼし得る化合物または条件と接触させられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
さらに、
−  前記接触させる工程の前に、前記細胞集団による前記少なくとも３つのマーカー遺伝子のセットの発現レベルを測定する工程、ならびに
−  前記接触させる工程の後に、該化合物または条件が、前記少なくとも３つのマーカー遺伝子のセットの中の１つ以上の発現に影響を及ぼし得るものであるか否かを判定する工程
を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該少なくとも３つのマーカーのセットが、ＦＲＺＢと、ＡＬＫ１と、それぞれＰＥＤＦ、ＣＯＬ１１、ＣＯＬ２およびＦＧＦＲ３からなる群より選択される２つ、３つおよび４つのマーカー遺伝子とを含む少なくとも４つ、５つまたは６つのマーカー遺伝子のセットである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該少なくとも３つのマーカー遺伝子のセットが、ＦＲＺＢ、ＡＬＫ１、ＰＥＤＦ、ＣＯＬ１１、ＣＯＬ２およびＦＧＦＲ３を含む少なくとも６つのマーカー遺伝子のセットである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
さらに、該少なくとも３つのマーカー遺伝子のセットの発現に対する該化合物の存在の効果に基づいて、該化合物が、インビボで安定な硝子軟骨を生成する細胞集団の能力に影響を及ぼす能力を測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＦＲＺＢ、ＣＯＬ１１、ＣＯＬ２、ＦＧＦＲ３、ＯＰＮ、ＢＭＰ−２およびＲＡＳＦ−ＰＬＡからなる群より選択される１つ以上の陽性マーカー遺伝子の発現を増大させ得る化合物が軟骨形成に正に影響を及ぼすと特定され、ＰＥＤＦおよび／またはＡＬＫ−１のいずれかの発現を増大させ得る化合物が軟骨形成に負に影響を及ぼすと特定される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
化合物または条件が軟骨形成に影響を及ぼす能力が、ＦＲＺＢ、ＣＯＬ１１、ＣＯＬ２、ＦＧＦＲ３、ＯＰＮ、ＢＭＰ−２、ＲＡＳＦ−ＰＬＡからなる群より選択される陽性マーカー遺伝子と、陰性マーカー遺伝子ＰＥＤＦおよび／またはＡＬＫ−１の発現に対する該化合物または条件の累加効果に基づいて測定される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
細胞集団が関節から採取されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
軟骨形成性細胞における遺伝子のセットの発現を検出するためのプローブを備えるキットであって、該遺伝子のセットが、ＦＲＺＢ、ＡＬＫ１、ＰＥＤＦ、ＣＯＬ１１、ＣＯＬ２およびＦＧＦＲ３からなる、キット。
【請求項１１】
軟骨形成性細胞における遺伝子のセットの発現を検出するためのデバイスであって、下記の
−  マーカー遺伝子の発現を検出するためのユニット、および
−  ＦＲＺＢと、ＡＬＫ１と、ＰＥＤＦと、ＣＯＬ１１と、ＣＯＬ２と、ＦＧＦＲ３と、ＯＰＮと、ＢＭＰ−２と、ＲＡＳＦ−ＰＬＡからなるマーカー遺伝子のセットに対するプローブ
の１つ以上を備える、デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、軟骨細胞表現型の安定性を調べるための方法およびツール、ならびに軟骨欠損および軟骨関連疾患の処置に有用な化合物を特定するためのスクリーニングシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
軟骨欠損の修復は、主に、外科的方法（骨髄刺激術など）、または軟骨形成性細胞（軟骨細胞、その（軟骨）前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）および一過性細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）もしくは軟骨に発達する幹細胞）の移植によって行なわれる。これに鑑みると、インビボ軟骨形成に正に影響を及ぼし得る因子の特定は重要である。実際、欠損部内または欠損部近傍に存在する局所細胞によって媒介される軟骨形成に正に影響を及ぼし得る外科処置または治療法もしくは治療用化合物が特定されることが望ましい。また、細胞系療法剤は、拡大培養または継代培養された単離細胞集団がインビボで安定な軟骨を生成する能力に正に影響を及ぼし得る因子または処置が、インビトロで特定されるものであることが重要である。
【０００３】
軟骨形成に関与している遺伝子の発現を化合物のスクリーニングのパラメータとして使用する種々のアッセイが報告されている。ＵＳ２００２０６１５１４には、レポーター遺伝子が転写因子ＳＯＸ９に応答性である方法が記載されている。ＳＯＸ９は、軟骨細胞、軟骨前駆細胞および他の組織において発現される高移動度群（ＨＭＧ）ドメイン転写因子であり、軟骨細胞の分化と軟骨形成に不可欠であることがわかっている。他に、軟骨代謝と骨軟骨欠損に関与している個々の遺伝子の発現レベルに基づいた方法がある［例えば、ＷＯ０２０８１７４５の骨粗鬆症関連遺伝子］。
【０００４】
また、軟骨への細胞のインビトロ分化に基づいたスクリーニング方法が報告されている。しかしながら、かかるモデルの予測値は限定的であることがわかっており、このようなアッセイには大量の細胞が必要とされ、時間もかかる。
【０００５】
ＷＯ２００４６６７２３には、ゼブラフィッシュでの骨および軟骨の形成に対する化合物の効果をインビボで評価したインビボモデルが示されている。細胞が安定な軟骨を形成する能力を評価するための最も信頼性のあるモデルの一例は、ヌードマウスに細胞を筋肉内移植した後、生成した移植組織の組織学的評価を行なうものである。本来時間がかかり、ハイスループットスクリーニングに非実用的であるこのヌードマウスモデルの使用は、ＷＯ０１２４８３３に開示された手法の使用により回避された。この特許出願には、軟骨形成のヌードマウスモデルに基づいて特定された分子マーカーを使用し、拡大培養または継代培養された移植目的の細胞の軟骨形成潜在能を評価することが記載されている。同様に、軟骨細胞表現型の安定性に関する適当なマーカーのセットが、ＵＳ２００３２３５８１３に記載されている。しかしながら、これらのマーカーの特定により、インビボで安定な硝子軟骨を生成し得る細胞集団を特定する基準は得られたが、依然として、さらなる改善の必要性が存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明の概要
本発明は、任意の所与の状況において、すなわち細胞にとって天然であれ誘発された状態であれ、軟骨形成を示す特異的マーカープロファイルを提供するという新規な概念に基づくものであり、これは、軟骨形成に影響を及ぼし得る因子の特定における標的プロファイルとみなされ得る。
【０００７】
したがって、本発明は、細胞集団の軟骨形成潜在能を予測するために、信頼性をもって使用され得るマーカーのセットを提供する。このようなマーカーの発現レベルを用いて、細胞集団（例えばインビトロまたはインビボ）が移植または刺激されたときにインビボで軟骨を生成し得るか否かが予測され得る。これは、細胞集団の治療的潜在能を判定するのに重要である。また、該マーカーのセットにより、移植前に、細胞集団の軟骨細胞表現型の安定性に対する所与の処置の影響を調べるための信頼性のあるツールが提供される。さらに、本発明は、関節の幹細胞または骨軟骨細胞を投与すること、および投与された細胞集団の軟骨形成潜在能に影響を及ぼす医薬を投与することを含む併用処置レジメン（ｒｅｇｉｍｅ）を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明によれば、インビトロでの細胞集団の表現型安定性を、インビトロおよび／またはインビボでの軟骨細胞表現型の安定性に影響を及ぼし得る因子の特定のためのスクリーニングアッセイで使用する。本発明は、軟骨細胞表現型の安定性を示すマーカーのセットを提供し、その発現を、細胞集団がインビボで軟骨を生成する能力に対する化合物および／または条件のインビトロまたはインビボでの効果を予測するために使用する。このようなマーカーをスクリーニングアッセイで使用することにより、時間と労力を要する動物実験を行なうことなく、軟骨細胞に対する多数の化合物および／または条件のスクリーニングが可能になる。
【０００９】
本発明の一態様では、細胞集団が安定な硝子軟骨を生成する能力を調べるための方法を提供する。より具体的には、細胞集団がインビボで安定な硝子軟骨を生成する能力をインビトロで調べるための方法を提供する。特定の実施形態では、細胞集団によるＦＲＺＢと、ＡＬＫ１と、ＰＥＤＦ、ＣＯＬ１１、ＣＯＬ２、ＦＧＦＲ３、ＯＰＮ、ＢＭＰ−２およびＲＡＳＦ−ＰＬＡからなる群より選択される１つ以上のマーカーとを含む少なくとも３つのマーカー遺伝子のセットの発現を調べることを含む方法を提供する。
【００１０】
本明細書において提供する方法の特定の実施形態では、細胞集団を化合物または条件と接触させる。
【００１１】
特定の実施形態では、細胞集団を化合物または条件と接触させる工程、および該細胞集団におけるＦＲＺＢと、ＡＬＫ１と、ＰＥＤＦ、ＣＯＬ１１、ＣＯＬ２、ＦＧＦＲ３、ＯＰＮ、ＢＭＰ−２およびＲＡＳＦ−ＰＬＡからなる群より選択される１つ以上のマーカー遺伝子とを含む少なくとも３つのマーカー遺伝子のセットの発現レベルを測定する工程を含む方法を提供する。この方法では、該少なくとも３つのマーカーの組の発現レベルにより、該細胞が、例えば患者に移植されたときにインビボで安定な硝子軟骨を生成する能力が示される。
【００１２】
本明細書に記載の方法のさらなる実施形態は、細胞集団を化合物または条件と接触させる工程の前に該細胞集団における該少なくとも３つのマーカー遺伝子のセットの発現レベルを測定する工程、および該接触させる工程の後に、該化合物または条件の存在が、該細胞集団における該少なくとも３つのマーカー遺伝子の組の中の１つ以上の発現に影響を及ぼすか否かを判定する工程を含むものである。より具体的には、該細胞集団における該少なくとも３つのマーカー遺伝子のセットの発現に対する該化合物または条件の存在の効果に基づいて、該細胞集団がインビボで安定な硝子軟骨を生成する能力に対する該化合物ま
たは条件の効果を判定することを含む方法を提供する。本明細書に記載の方法の特定の実施形態では、ＦＲＺＢ、ＣＯＬ１１、ＣＯＬ２、ＦＧＦＲ３、ＯＰＮ、ＢＭＰ−２およびＲＡＳＦ−ＰＬＡからなる群より選択される１つ以上の陽性マーカー遺伝子の発現を増大させ得る化合物または条件は、軟骨形成に正に影響を及ぼすと特定され、ＰＥＤＦおよび／またはＡＬＫ−１のいずれかの発現を増大させ得る化合物は軟骨形成に負に影響を及ぼすと特定される（より具体的には、細胞がインビボで安定な硝子軟骨を生成する能力）。
【００１３】
本明細書に記載の方法のさらなる特定の実施形態では、該マーカーの組は、ＦＲＺＢと、ＡＬＫ１と、それぞれＰＥＤＦ、ＣＯＬ１１、ＣＯＬ２およびＦＧＦＲ３からなる群より選択される２つ、３つおよび４つのマーカー遺伝子とを含む少なくとも４つ、５つまたは６つのマーカー遺伝子のセットである。本明細書に記載の方法のより特定的な実施形態は、マーカー遺伝子がＦＲＺＢ、ＡＬＫ１、ＰＥＤＦ、ＣＯＬ１１、ＣＯＬ２およびＦＧＦＲ３を含む少なくとも６つのマーカー遺伝子のセットである方法に関する。
【００１４】
本明細書に記載の方法の特定の実施形態では、化合物または条件が軟骨形成に影響を及ぼす能力が、該少なくとも３つのマーカー遺伝子のセットの発現に対する該化合物または条件の累加効果に基づいて測定される。より具体的には、ＦＲＺＢ、ＣＯＬ１１、ＣＯＬ２、ＦＧＦＲ３、ＯＰＮ、ＢＭＰ−２およびＲＡＳＦ−ＰＬＡからなる群より選択される陽性マーカー遺伝子の発現に対する化合物または条件の累加効果と、陰性マーカー遺伝子ＰＥＤＦおよび／またはＡＬＫ−１の発現に対する該化合物または条件の累加効果によって、該化合物または条件が細胞集団の軟骨細胞表現型の安定性に影響を及ぼす能力が示される。
【００１５】
本明細書に記載の方法の特定の実施形態では、細胞集団は関節から採取されたものである。細胞集団は、健常ドナーまたは骨軟骨欠損を有する個体から採取されたものである。特定のアッセイでは、両方の型の細胞に対する化合物または条件の効果が想定される。本明細書に記載の方法の特定の実施形態では、該マーカーの１つ以上の発現レベルを、定量的方法を用いて測定する。
【００１６】
本発明のさらなる態様は、細胞、より具体的には軟骨細胞または軟骨細胞の一過性細胞がインビボで軟骨を生成する能力に影響を及ぼし得る化合物を特定するためのマーカーのセットの使用に関する。特定の実施形態では、該使用は、マーカーのセットがＦＲＺＢと、ＡＬＫ１と、ＰＥＤＦ、ＣＯＬ１１、ＣＯＬ２、ＦＧＦＲ３、ＯＰＮ、ＢＭＰ−２およびＲＡＳＦ−ＰＬＡからなる群より選択される１つ以上のマーカーとを含む少なくとも３つのマーカー遺伝子のセットを含むことを特徴とする。特定の実施形態では、該使用は、ＦＲＺＢ、ＡＬＫ１、ＰＥＤＦ、ＣＯＬ１１、ＣＯＬ２およびＦＧＦＲ３を含む少なくとも６つのマーカー遺伝子のセットを伴う。
【００１７】
本発明のさらなる態様は、軟骨形成性細胞における遺伝子のセットの発現を検出するためのプローブを備えるキットであって、該遺伝子のセットが、ＦＲＺＢと、ＡＬＫ１と、ＰＥＤＦ、ＣＯＬ１１、ＣＯＬ２、ＦＧＦＲ３、ＯＰＮ、ＢＭＰ−２およびＲＡＳＦ−ＰＬＡからなる群より選択される１つ以上のマーカーとを含む少なくとも３つのマーカー遺伝子のセットを含むキットを提供する。
【００１８】
特定の実施形態では、マーカー遺伝子のセットが、ＦＲＺＢ、ＡＬＫ１、ＰＥＤＦ、ＣＯＬ１１、ＣＯＬ２およびＦＧＦＲ３を含む少なくとも６つのマーカー遺伝子のセットであるキットを提供する。
【００１９】
本明細書において提供するキットの特定の実施形態は、プローブがｍＲＮＡとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるキット、プローブが抗体であるキットおよび／また
はプローブが試験対象のマーカーに特異的なＰＣＲプライマーのセットであるキットである。種々の型のプローブを備えるキットも想定される。キットのさらなる特定の実施形態では、標識されたプローブが提供される。
【００２０】
本発明のまたさらなる態様は、細胞における、より具体的には、典型的に軟骨形成を行ない得る細胞における遺伝子のセットの発現を検出するためのデバイスを提供する。かかるデバイスの特定の実施形態には、下記の構成要素：マーカー遺伝子の発現を検出するためのユニット、ならびにＦＲＺＢと、ＡＬＫ１と、ＰＥＤＦ、ＣＯＬ１１、ＣＯＬ２、ＦＧＦＲ３、ＯＰＮ、ＢＭＰ−２およびＲＡＳＦ−ＰＬＡからなる群より選択される１つ以上のマーカーとを含む少なくとも３つのマーカー遺伝子のセットに対するプローブの１つ以上が提供される。本明細書に記載のデバイスの特定の実施形態は、細胞集団によるマーカー遺伝子のセットの発現を検出するのに特に適したデバイスであって、該マーカー遺伝子のセットがＦＲＺＢ、ＡＬＫ１、ＰＥＤＦ、ＣＯＬ１１、ＣＯＬ２およびＦＧＦＲ３を含む少なくとも６つのマーカー遺伝子のセットであるデバイスである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、軟骨形成潜在能スコアに対する組織学的検査スコアの散布図を示す（各点は、点同士が重なるのを回避するため、移動させてある（量と方向は無作為でわずか））。
【図２】図２は、Ｐ０からＰ３まで単層で培養されたヒト軟骨細胞において、リアルタイム定量的ＰＣＲで測定したときの累加マーカースコア（実施例１で測定したＣＣスコア）に対する化合物Ａの効果を示す。結果を、コントロール（ＤＭＳＯ）と比べた平均累加マーカースコアで示す。＊は、ＤＭＳＯコントロールと比較したときｐ＜０．０５（ｎ＝４）。
【図３】図３は、リアルタイム定量的ＰＣＲで測定したときの、単層で培養されたヒトＰ３軟骨細胞の軟骨形成潜在能と正に相関する分子マーカーＣＯＬ２（Ａ）、ＣＯＬ１１（Ｂ）、ＦＲＺＢ（Ｃ）およびＦＧＦＲ３（Ｄ）の発現に対する化合物Ａの効果を示す。結果を、ＤＭＳＯコントロールと比べた標的遺伝子発現で示す（２−ｄｅｌｔａｄｅｌｔａＣＴで測定）。＊は、ＤＭＳＯ対照と比較したときｐ＜０．０５（ｎ＝４）。
【図４】図４は、リアルタイム定量的ＰＣＲで測定したときの、単層で培養されたヒトＰ３軟骨細胞の軟骨形成潜在能と負に相関する分子マーカーＰＥＤＦ（Ａ）およびＡＬＫ１（Ｂ）の発現に対する化合物Ａの効果を示す。結果を、ＤＭＳＯコントロールと比べた標的遺伝子発現で示す（２−ｄｅｌｔａｄｅｌｔａＣＴで測定）。＊は、ＤＭＳＯコントロールと比較したときｐ＜０．０５（ｎ＝４）。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
発明の詳細な説明
定義
用語「軟骨形成性（の）」は、細胞または集団に適用される場合、該細胞または集団が適切な状況下で軟骨を生成するか、または軟骨成長を刺激する固有の能力をいう。
【００２３】
「軟骨形成性化合物」は、本明細書で用いる場合、安定な軟骨細胞表現型を誘導する化合物および／または軟骨形成を促進する化合物をいう。
【００２４】
用語「軟骨細胞表現型の安定性」または「軟骨形成潜在能」は、細胞集団に言及している場合、該細胞集団がインビボで軟骨を生成する能力をいう。この能力は、細胞集団の一部（少なくとも約１〜２０×１０６細胞）を免疫不全マウスなどの哺乳動物（インビボ）に（異所）注射し、血管浸潤、鉱化作用または骨もしくは線維組織による置換の徴候なく、軟骨移植組織の発生を（約３週間の時間枠で）調べることにより試験され得る。あるいはまた、細胞集団の一部（少なくとも約１〜２０×１０６細胞／ｃｍ２）を、生体適合性
マトリックス上に播種するか、またはその内部に封入し、皮下に約６〜８週間皮下移植した後、血管浸潤または軟骨内性骨形成の徴候のない安定な軟骨移植組織の発生を調べてもよい。本発明によれば、インビボで安定な硝子軟骨を生成し得る細胞集団は、本明細書に記載の表現型安定性の特定のマーカーの組合せの存在を特徴とする。軟骨細胞表現型の安定性は、継代培養すると成熟軟骨細胞において徐々に失われる。
【００２５】
用語「新鮮単離細胞」（ＦＩ）は、本明細書で用いる場合、組織消化後の生検材料から得た細胞集団をいう。したがって、用語「新鮮単離軟骨細胞」は、本明細書で用いる場合、継代培養せずに、消化によって軟骨などの軟骨細胞含有組織から直接得た細胞集団をいう。
【００２６】
用語「拡大培養された」は、軟骨などの組織から得た細胞集団に言及している場合、該細胞集団が、増殖によって細胞数が増加する条件下に置かれていたことを示す。最も単純な形態では、拡大培養は、細胞集団を、適切な培養培地を入れた培養容器内に、任意選択でコンフルエンシーまで供給することにより行われる。新鮮単離細胞の拡大培養の結果得られた集団をＰ０と称する。
【００２７】
用語「継代培養された」は、拡大培養された細胞であって、拡大培養後、培養容器から酵素的、化学的および／または物理的方法を用いて回収され、より低密度で別の培養容器に入れられた細胞をいう。継代培養細胞は、その継代培養回数（Ｐ１、Ｐ２など）、その培養期間、あるいはまたその集団倍加（ＰＤ１、ＰＤ２など）によって呼称される。
【００２８】
用語「軟骨欠損」は、本明細書で用いる場合、軟骨または軟骨の任意の疾患部分の減損または損傷に起因する任意の状態をいう。
【００２９】
用語「マーカースコア」は、そのままで用いて、本発明によるマーカーの発現に帰属させ得る数値を示す。「累加マーカースコア」は、本発明のマーカーの組の種々のマーカーのマーカースコアの組合せをいう。これは、個々のマーカーの合計の結果であってもよい。あるいはまた、累加マーカースコアには、軟骨細胞表現型の安定性の予測能における各マーカーの寄与の違いが考慮され、したがって、より複雑な数式に基づくものである。
【００３０】
用語「組織学的検査スコア」は、組織学的解析（例えば、軟骨なし、線維軟骨、硝子軟骨）に基づいた軟骨に帰属させた定性値または半定性値をいう。
【００３１】
本出願書類の本文中で遺伝子に対して使用する略語は、
ＦＲＺＢ：Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質１［ＯＭＩＭ  ６０５０８３、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｕ９１９０３］
ＡＬＫ１：アクチビンＡ受容体、ＩＩ型様キナーゼ１［ＯＭＩＭ  ６０１２８４、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｚ２２５３３］
ＰＥＤＦ：色素上皮由来因子［ＯＭＩＭ  １７２８６０、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｍ７６９７９］
ＣＯＬ１１：コラーゲン、ＸＩ型Ａ１［ＯＭＩＭ  １２０２８０、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｊ０４１７７］
ＣＯＬ２：コラーゲン、ＩＩ型、α１［ＯＭＩＭ  １２０１４０、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｌ１０３４７］
ＦＧＦＲ３：線維芽細胞増殖因子受容体３［ＯＭＩＭ  １３４９３４、Ｇｅｎｂａｎｋ
Ｍ５８０５１］
ＢＭＰ−２：骨形成タンパク質２［ＯＭＩＭ  １１２２６１、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｍ２２４８９］
ＲＡＳＦ−ＰＬＡ２：ホスホリパーゼＡ２、ＩＩＡ群［ＯＭＩＭ  １７２４１１、Ｇｅ
ｎｂａｎｋ  Ｍ２２４３０］
ＯＰＮ：オステオポンチン［ＯＭＩＭ  １６６４９０、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｘ１３６９４］
である。
【００３２】
本発明は、その発現が細胞のインビボでの軟骨形成能力を示すことがわかっている選択したマーカー遺伝子のセットの特定に基づく。より詳しくは、このようなマーカーの各々に値を帰属させることにより、累加マーカースコアで示され得る累加値が、細胞集団が表現型の安定な軟骨をインビボで生成する能力を反映することが測定された。
【００３３】
本発明において細胞集団が軟骨形成を確実に行なう能力の評価に有用であると特定されたマーカー遺伝子は、陽性マーカー遺伝子ＦＲＺＢ、ＣＯＬ１１、ＣＯＬ２、ＦＧＦＲ３、ＢＭＰ−２、ＲＡＳＦ−ＰＬＡ２およびＯＰＮならびに陰性マーカー遺伝子ＡＬＫ１およびＰＥＤＦを含む群から選択される。この組に、例えば、コントロールなどのさらなるマーカーを含めてもよい。
【００３４】
したがって、本発明により、陽性マーカーと陰性マーカーの両方を含む９個のマーカーのセットが特定された。陽性マーカーは、インビボで安定な硝子軟骨を生成し得る集団によって強く発現され、一方、陰性マーカーは、安定な硝子軟骨を生成し得る集団によって低いレベルで発現されるか、または該集団によって発現されない。本発明によれば、陰性マーカーの発現の非存在は、陽性マーカーとしての機能を果たし得る。しかしながら、本発明との関連において、本明細書では、その発現の非存在が軟骨細胞の表現型安定能を示すかかるマーカーを陰性マーカーと称する。
【００３５】
本発明のマーカー遺伝子の発現は、典型的にはおよそ０．２×１０５〜１．０×１０６細胞からなる細胞集団に特徴的な特徴である。
【００３６】
種々の遺伝子発現測定方法が当該技術分野で知られている。最も典型的には、本発明によれば、ＲＮＡを細胞集団の一部（典型的には、０．２×１０５〜１．０×１０６細胞、好ましくは０．２×１０６〜１×１０６）から単離し、逆ＰＣＲを用いて増幅する。かかる増幅は、半定量的様式にて、増幅断片の電気泳動およびハウスキーピング遺伝子（β−アクチンなど）と比較したその相対強度の測定によって行われ得る。しかしながら、より少ない量の細胞、さらには個々の細胞で、ヌクレオチド増幅手法を使用し、細胞の発現について解析を行なってもよい。さらにあるいは代替的に、ＤＮＡの量が、定量的様式にて、例えばＴａｑｍａｎ手法を用いて測定される。本出願書類に記載のマーカーに適したプライマーは、該マーカー遺伝子の既知配列に基づき、当業者によって容易に特定され得る。
【００３７】
代替的にまたはさらに、該マーカーの発現をタンパク質レベルで測定する。タンパク質レベルは、ウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡなどの免疫学的方法によって測定され得る。
【００３８】
本発明の特定の実施形態では、マーカーの発現は、マイクロアレイ手法または１Ｄもしくは２Ｄタンパク質電気泳動後の解析などにより、コントロール集団と実験集団においてマーカーの発現を比較することによって評価される。この場合、マーカータンパク質は、そのＭｒ（１Ｄ）や等電点（ＩＥＰ）（２Ｄ）に従ってゲル内を泳動する。タンパク質レベルでの発現の差異は、そのＭｒおよび／またはＩＥＰに対応する位置に存在するタンパク質の量を検出することにより測定され得る。タンパク質は、クマシーブリリアントブルーでの染色もしくは同等の染色後に定量され得るか、または放射性代謝性標識（例えば、３５Ｓメチオニン）を組み込むことにより定量され得る。
【００３９】
使用する手法に応じて、抗体、オリゴヌクレオチドプローブまたはタンパク質プローブ（抗体など）が、例えば、発色性または磁性または放射性標識により、発現の検出が可能となるように標識され得る。
【００４０】
特定の実施形態では、種々のマーカーを異なる手法で検出することが想定される。例えば、いくつかのマーカーをＥＬＩＳＡによって検出し、他をＰＣＲによって検出する。
【００４１】
本発明のさらなる態様は、本発明のマーカーの検出に適したデバイスを提供する。特定の実施形態では、かかるデバイスは、本発明のマーカーを（ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質レベルで）直接または間接的に検出するためのユニットを備えている。該ユニットは、ＲＮＡ、ＤＮＡのハイブリダイゼーションに基づいたもの、または免疫学的検出に基づいたものであり得る。かかるユニットは、（定量的）ＰＣＲ装置、免疫学的アッセイを行なうためのデバイス、またはタンパク質を測定するためのデバイス（例えば、ＨＰＬＣ、質量分析計、電気泳動装置）であり得るが、（使い捨て）マイクロアレイデバイスまたはチップであってもよい。かかるユニットは、適用可能な場合は、本発明のマーカー遺伝子またはタンパク質を検出するためのプローブまたは抗体を備えている。任意選択で、かかるデバイスはさらに、２種類以上の細胞集団を同一または異なる条件（例えば、密度、継代培養回数、培地組成）下で培養することができる細胞培養ユニットを備えていてもよい。さらに、本発明のデバイスは、１種類以上の試験化合物を細胞培養ユニットに送達するためのユニットを備えていてもよい（該送達は、量または時間プロファイルが個々に異なってもよい）。最後に、該デバイスは、細胞を収集して細胞内物質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質）を単離するためのユニットを備えていてもよい。
【００４２】
また、本明細書に記載のマーカーに対するプローブまたは特異的試薬を備えた使い捨てカートリッジも想定され、これは、細胞集団の状態の迅速かつ効率的な測定のために測定するために、このようなマーカーの発現を、使用され得る。したがって、本発明では自動化されたデバイスが想定され、これは任意選択で使い捨てカートリッジと併用され、これにより、インビボまたはインビトロ用途に用いられる細胞の効率的な品質管理が可能になる。
【００４３】
本発明の特定の実施形態によれば、特定されたマーカー遺伝子のサブセットが提供され、これにより、細胞集団の軟骨細胞表現型の安定性の信頼性のある評価、および化合物または条件が細胞集団によるインビボでの軟骨形成に影響を及ぼす能力の信頼性のある評価が可能になる。最も具体的には、適当なマーカー遺伝子の組は、少なくとも３つ、より具体的には少なくとも４つ、さらにより具体的には少なくとも５つ、最も具体的には少なくとも６つの該特定されたマーカー遺伝子を含む。一実施形態によれば、適当なマーカー遺伝子のセットは、少なくとも１つの陽性マーカー遺伝子と１つの陰性マーカー遺伝子を含む。
【００４４】
一般に、考慮されるマーカー遺伝子の数が少ないほど、測定誤差と特定の１つのマーカーの異常な発現の可能性の両方に対する影響が大きくなる。また、異なるマーカーは、異なるプロセス（例えば、同化プロセス、異化プロセスなど）ならびに軟骨細胞代謝に関与する異なる経路（シグナル伝達経路、受容体およびリガンド、マトリックス成分、プロセシング酵素など）を反映し、このようなプロセスの各々が個々に、軟骨細胞表現型の安定性に対して影響を及ぼし得る。したがって、考慮されるマーカー遺伝子が多いほど、そのアッセイは、安定な軟骨形成が確実となる完全な環境を表示する。他方において、測定されるマーカー遺伝子が多いほど、そのアッセイは技術的に複雑となり、ハイスループットスクリーニングにおける使用の容易さが損なわれる。また、各マーカー遺伝子の評価全体に対する寄与の関与度を維持するため、マーカー遺伝子の数は１０種未満に保つのがよい
。実際には、多数のマーカー遺伝子のセットの中の１つのマーカー遺伝子の発現の変化は、該多数のマーカー遺伝子の発現スコア全体に対してほとんど影響がない。このような論拠および特定された種々のマーカーの観察された相対寄与に基づき、３〜９個の任意の数のマーカーが、細胞集団の軟骨細胞表現型の安定性の測定、または細胞集団の軟骨細胞表現型の安定性に対する化合物または条件の影響の評価に好適であると決定された。一実施形態によれば、５つ、６つまたは７つのマーカーのセットが、かかるマーカーの組から得られるスコアの正確さと、ハイスループットスクリーニングにおけるこのアッセイの実用的な実現可能性とを最適に両立させる。
【００４５】
したがって、本発明の一態様は、陽性マーカー遺伝子ＦＲＺＢ、ＣＯＬ１１、ＣＯＬ２、ＦＧＦＲ３、ＢＭＰ−２、ＲＡＳＦ−ＰＬＡ２およびＯＰＮならびに陰性マーカー遺伝子ＡＬＫ１およびＰＥＤＦからなる群より選択される、軟骨形成を表示する少なくとも３つのマーカーのセットを提供する。
【００４６】
本発明の特定の実施形態によれば、軟骨形成潜在能マーカーを構成する、すなわち軟骨形成を表示する該少なくとも３つのマーカーのセットには、ＦＲＺＢと、ＡＬＫ１と、ＰＥＤＦ、ＣＯＬ１１、ＣＯＬ２、ＦＧＦＲ３、ＢＭＰ−２、ＲＡＳＦ−ＰＬＡ２およびＯＰＮからなる群より選択されるマーカー遺伝子とが含まれる。より具体的には、軟骨形成を表示する該少なくとも３つのマーカーのセットには、ＦＲＺＢと、ＡＬＫ１と、ＰＥＤＦ、ＣＯＬ１１、ＣＯＬ２およびＦＧＦＲ３からなる群より選択されるマーカー遺伝子が含まれる。本発明のさらなる実施形態は、ＦＲＺＢと、ＡＬＫ１と、それぞれＰＥＤＦ、ＣＯＬ１１、ＣＯＬ２、ＦＧＦＲ３、ＢＭＰ−２、ＲＡＳＦ−ＰＬＡ２およびＯＰＮからなる群より選択される２つ、３つおよび４つのマーカーとを含む少なくとも４つ、５つまたは６つのマーカー遺伝子のセットに関する。より特別には、該少なくとも４つ、５つまたは６つのマーカー遺伝子のセットは、ＦＲＺＢと、ＡＬＫ１と、それぞれＰＥＤＦ、ＣＯＬ１１、ＣＯＬ２およびＦＧＦＲ３からなる群より選択される２つ、３つおよび４つのマーカーとを含む。特定の実施形態によれば、６つのマーカー遺伝子のセットを用いてインビボでの安定な軟骨生成能を評価し、このセットは、ＦＲＺＢ、ＡＬＫ１、ＰＥＤＦ、ＣＯＬ１１、ＣＯＬ２およびＦＧＦＲ３からなる。このマーカー遺伝子のセットの累加的なスコア（実施例１に記載）を本明細書では、「ＣｈｏｎｄｒｏＣｅｌｅｃｔ（商標）マーカー」（ＣＣマーカー）と称し、また、「ＣｈｏｎｄｒｏＣｅｌｅｃｔ（商標）スコア」とも称する。あるいはまた、該マーカーのセットには、マーカーＰＥＤＦ、ＣＯＬ１１、ＣＯＬ２およびＦＧＦＲ３の１つがＲＡＳＦ−ＰＬＡ２、ＯＰＮおよびＢＭＰ−２の群から選択される１つのマーカーで置き換えられたこの軟骨形成潜在能マーカーのセットのバリエーションが含まれる。より具体的には、該マーカーのセットには、陽性マーカーＣＯＬ１１、ＣＯＬ２の一方がＲＡＳＦ−ＰＬＡ、ＯＰＮまたはＢＭＰ−２のいずれかで置き換えられた上記の軟骨形成潜在能マーカーのバリエーションが含まれる。本明細書の実施例のセクションでは、軟骨形成性細胞集団による本明細書に開示したマーカーのセットの発現に基づくマーカースコアによって、該細胞集団により生成される軟骨の性質が信頼性をもって予測される（組織学的解析により測定）ことが示されている。
【００４７】
別の態様によれば、本発明は、細胞集団の軟骨細胞表現型の安定性を調べる方法を提供する。より具体的には、本発明は、細胞集団の軟骨細胞表現型の安定性の評価におけるツールとしての本明細書に開示したマーカー遺伝子のセットの使用を提供する。これは、例えば、軟骨欠損の処置の状況において細胞移植に使用される細胞集団の品質管理において重要である。このような方法は、該細胞集団による本明細書に記載のマーカー遺伝子のセットの発現を調べる工程を含むことを特徴とする。より具体的には、本発明によるマーカー遺伝子のセットの発現（任意選択で、累加マーカースコア、より特別には軟骨形成潜在能スコアで示される）が、移植目的のための細胞集団の品質表示として使用される。典型的には、細胞集団の品質評価は、実験室内で、本明細書に記載のものなどの標準的な手法
を用いて行われ、評価の結果は、報告書に記載されるか、または品質管理シートにまとめられる。細胞集団は、ヒトまたは動物組織から採取されたＰ０または該細胞集団の任意の継代培養物であり得る。一実施形態によれば、細胞集団は、ヒト軟骨生検材料から採取したＰ２〜Ｐ６の集団である。あるいはまた、集団倍加数が考慮され得る。本発明との関連において考慮されるほとんどの細胞集団では、継代培養ごとに２〜３の集団倍加を伴う。したがって、本発明との関連において、細胞集団は１または２の集団倍加（Ｐ０）後に評価される。任意選択で、細胞集団は、１種または種々の生検材料由来の細胞の種々の継代培養物の組合せ（任意選択で、Ｐ０を含む）である。細胞の自己移植が意図される場合、特定の患者の１種類以上の生検材料から採取された細胞を、任意選択で合わせ、（合わせる前および／または後に）軟骨細胞表現型の安定性について確認する。典型的には、品質評価は、特定の時点で、すなわち、移植（骨格またはマトリックス内の細胞または２Ｄもしくは３Ｄ組織として）の前、保存（例えば、凍結）の前、および／または保存からの回復時、細胞集団を特定の処理および／または条件に供する前および／または供した後に行われる。
【００４８】
実際、本発明の一態様の目的は、直接移植、または生体適合性のマトリックス上への播種もしくは該マトリックス内への封入およびその後の移植のいずれかの前に、細胞集団がインビボで安定な硝子軟骨を生成する能力を調べることである。マーカースコアにより、該細胞集団または細胞が血管浸潤または軟骨内性骨形成の徴候なく軟骨移植を確実に行なう能力が示される。
【００４９】
典型的には、本発明によるマーカースコアを決定するためのマーカーの発現は、細胞集団全体において行われ、この場合、代表的な試料を用いて、本明細書に記載のものなどの方法によって、該マーカーが調査対象の細胞集団によって発現されているか否かを調べる。あるいはまた、当該技術分野で知られた細胞特異的な方法を用いて、個々の細胞を特定の遺伝子の発現について確認してもよい。
【００５０】
別の態様によれば、本発明は、軟骨形成性細胞がインビボで安定な硝子軟骨を生成する能力に対する化合物または条件の効果を調べるための方法を提供し、該方法は、スクリーニングツールとして有用である。このような方法は、軟骨形成性細胞集団を化合物または条件と接触させる工程、および該細胞集団による本発明によるマーカー遺伝子のセットの発現を調べる工程を含む。
【００５１】
したがって、本発明は、細胞集団の軟骨形成能に影響を及ぼす化合物または条件を特定するための方法およびアッセイを提供する。一実施形態によれば、該方法は、軟骨欠損の処置の状況における移植用の細胞集団を培養、保存および／または投与するのに充分な条件を特定するために使用される。かかる方法では、軟骨形成性細胞集団を、特定の条件に供し、マーカー遺伝子の発現を調べる。典型的な条件は、特定の培養培地、培養温度、培養期間、培養密度など、ならびに他の細胞型との組合せである。さらにあるいは代替的に、該方法およびアッセイは、軟骨形成性細胞の軟骨細胞表現型の安定性に影響を及ぼし得る分子因子の特定に使用される。かかる因子としては、増殖因子、マイトジェン、添加剤、化学的小分子などが挙げられ得る。スクリーニングの目的は、軟骨欠損の処置の状況における移植用の細胞集団の培養、保存または投与に有用な因子を特定することであり得る。典型的には、目的の因子は、細胞集団の軟骨細胞表現型の安定性に正に影響を及ぼし得る因子、および／または該細胞集団の軟骨細胞表現型の安定性に負に影響を及ぼすことなく、該細胞の他の特徴（例えば、細胞の数、安定性など）および／または培養条件のパラメータ（例えば、使用され得る保存期間、継代培養回数など）に正に影響を及ぼす因子である。
【００５２】
さらにあるいは代替的に、本発明のアッセイおよび方法は、軟骨形成性細胞による軟骨
形成に対するインビボ潜在効果を有する化合物のスクリーニングおよび特定に有用である。本発明のスクリーニング方法の用途としては、処置対象の患者の体内の局所細胞による軟骨形成および／または細胞移植の状況における細胞による軟骨形成に影響を及ぼす化合物の特定が想定される。該スクリーニング方法を用いて、病的状況に存在する因子または条件を妨げ得る化合物が特定および／または評価され得る。例えば、細胞を例えばＩＬ−１で刺激した後（炎症状態を刺激するため、異化経路を増強するため、および同化プロセスを下方調節するため）、この効果を妨げる潜在能を有する化合物が添加され得る。
【００５３】
また、本発明の範囲において、軟骨形成性細胞がインビボで軟骨を生成する能力に対する治療用化合物（軟骨修復の状況以外で使用されるものを含む）の副作用の可能性を評価するためのマーカー遺伝子の使用が想定される。本発明の方法により、インビボで直接試験したとき、長期間でしか認められ得ない骨形成に対する化合物の効果を、直接確認することが可能になる可能性がある。
【００５４】
化合物のスクリーニングに関する本発明の方法は、典型的には、軟骨形成性細胞集団を１種類以上の対象の化合物と接触させる工程、および軟骨形成性細胞集団による本明細書に記載のマーカー遺伝子のセットの発現を測定する工程を含む。本発明の方法により、例えば、化学物質の化合物ライブラリー、ペプチドライブラリー、発現ライブラリーなどのハイスループットスクリーニングが可能になる。
【００５５】
一実施形態によれば、本発明の方法は、１種類以上の化合物が添加された／特定の条件に供された細胞集団において、本発明によるマーカー遺伝子のセットの発現を、同じまたは種々の細胞集団における該化合物または条件の非存在下での該マーカー遺伝子のセットの発現と比較する工程を含む。典型的な実施形態では、同じ細胞集団に由来する異なる一部（１つまたは複数）を、互いに比較するため、および／または陽性および／または陰性コントロールとの比較のために種々の条件および／または化合物に供する。陰性コントロールは、ブランクまたは軟骨細胞表現型の安定性に影響を及ぼさないことがわかっている化合物であり得る。陽性コントロールは、（正または負に）細胞集団の表現型安定性に影響を及ぼすことがわかっている化合物または条件であり得る。
【００５６】
本発明のスクリーニング方法では、種々のパラメータが評価され得る。細胞は、個々の容器またはマルチウェルプレートに種々の密度で播種され得る。細胞は、種々の期間でインキュベートした後、化合物／因子の添加もしくは条件の適用またはその両方が行われ得る。種々のレジメンならびに化合物および培養条件の組合せが併用され得る。化合物／因子は、種々の濃度で添加され得、種々の期間にわたって細胞と接触させたままにする。同じことが培養条件にもあてはまる。
【００５７】
本発明は、細胞集団が移植後にインビボで硝子軟骨を生成する能力が、移植前に、該細胞集団によるインビトロでの特定の遺伝子（マーカー遺伝子）の発現に基づいて予測され得るという観察結果に基づく。したがって、マーカー遺伝子の発現を用いて、移植前の細胞の軟骨形成性の「特質」と、それに対する化合物および条件の効果がモニターされる。以下に詳述するように、該遺伝子の発現はマーカースコアとして表示され得、この場合、種々のマーカー遺伝子の（相対）発現レベルを加算して値を得、これが、最適値（すなわち、考慮される全陽性マーカーの高発現、全陰性マーカーの低発現）と比較され得る。さらにあるいは代替的に、スクリーニングでは、該化合物または条件が、この遺伝子のセットの任意の１つのマーカーに影響を及ぼし得る能力が考慮され得る。
【００５８】
本発明のマーカー遺伝子の発現は、絶対値または相対値に基づいて評価され得る。典型的には、ハウスキーピング遺伝子と比較したマーカー遺伝子の発現が使用される。これを、本明細書ではアクチンを用いて例示する。ハウスキーピング遺伝子が異なると発現レベ
ルは異なり得るため、当業者には、選択したハウスキーピング遺伝子と比較したマーカー遺伝子の相対発現は、事前に、使用する各ハウスキーピング遺伝子について、軟骨細胞表現型の安定性を有する集団において確立されている必要があることが理解されよう。本発明によれば、選択したマーカーの発現に関する情報の併合により、該細胞がインビボで軟骨形成し得るか否かが示される。
【００５９】
本発明では、所与の細胞集団の特質の評価、および細胞が移植後にインビボで軟骨を生成する能力に対する因子／条件の影響の評価の両方の状況での本明細書に記載のマーカーの組合せの使用が想定される。該マーカーのセットを用いて細胞集団がインビボで硝子軟骨を生成する能力に対する化合物、細胞または条件の効果を調べる場合、この効果は、コントロールと比べたとき、または該細胞集団を該化合物または条件と接触させる前の発現レベルと比べたときに測定される本発明のマーカー遺伝子の発現の「増大」または「減少」に基づくものであり得る。これに関連して、本発明による１つ以上の陽性マーカー遺伝子の発現を増大させる、および／または１つ以上の陰性マーカー遺伝子の発現を減少させる化合物、細胞または条件は、軟骨形成に正に影響を及ぼし得るとみなされ得る。本発明による１つ以上の陽性マーカー遺伝子の発現を減少させる、および／または１つ以上の陰性マーカー遺伝子の発現を増大させる化合物、細胞または条件は、軟骨形成に負に影響を及ぼし得るとみなされ得る。
【００６０】
本発明の一態様によれば、細胞集団による該マーカーのセットの種々のマーカー遺伝子の発現は、「累加マーカースコア」で示され、これは、該細胞集団の軟骨細胞表現型の安定性と相関し、該表現型安定性を示す。累加マーカースコアは、本発明の方法およびアッセイの結果の定性的および／または定量的解釈に使用される。
【００６１】
種々の型のマーカースコアが、本発明との関連において想定される。マーカーのセットの発現レベルは、該マーカーのセットの各遺伝子産物の絶対発現レベルの合計である／該合計に相当する数値で示され得る。かかる計算方法は、マーカー遺伝子の発現の定量的検出が、例えば定量的ＰＣＲまたはＥＬＩＳＡによって行われる場合に使用され得る。
【００６２】
あるいはまた、該マーカーのセットの各遺伝子の発現レベルは比率で示され得る。すなわち、遺伝子の発現レベルを、細胞の処理にかかわらず等しい発現レベルを有するとみなされるか、または細胞が安定な硝子軟骨を生成する能力にかかわらずその発現が比較的安定であるとみなされる別の遺伝子（ハウスキーピング遺伝子など）のものと比較する。これにより、より比較可能（ほとんどの場合、０．００１〜１０の範囲）である種々のマーカーの発現レベルの値が得られる。したがって、累加マーカースコアは、各マーカー遺伝子の比率の合計であり得る。
【００６３】
しかしながら、本発明の特定の実施形態によれば、累加マーカースコアは、各マーカー遺伝子の発現の絶対値または相対値に基づくものではなく、この発現の定性的評価に基づくものである。
【００６４】
本発明の特定の実施形態によれば、マーカー遺伝子の定性的評価は、自由裁量で数値、例えば「１」が割り当てられる。より具体的には、本発明によれば、陽性マーカーの発現の増大／高発現に値「１」が割り当てられ、また、陰性マーカーの発現の非存在にも値「１」が割り当てられる。最も具体的には、本発明によれば、発現レベル（または発現の比）の範囲は、軟骨細胞表現型の安定性の陽性マーカー遺伝子の発現レベルと陰性マーカーの発現レベルの両方に対して規定され、この場合、所定の範囲内に含まれる発現レベルを、ある値に帰属させる。また、さらなる実施形態によれば、陽性および／または陰性マーカー遺伝子の発現の所定の範囲外である発現値（例えば、陽性マーカー遺伝子の非常に低い発現、または陰性マーカー遺伝子の非常に高い発現が観察される場合）を、ある値に帰
属させる。
【００６５】
累加マーカースコアにおける各マーカー遺伝子の相対的な影響を測定する場合、各遺伝子の発現が同じウェイトを有する場合があり得る。あるいはまた、１つ以上の遺伝子の発現レベルが他の遺伝子よりも軟骨細胞表現型の安定性に対して強い影響を有するとみなされる場合もあり得、これは、累加マーカースコアの計算に対する該マーカー遺伝子の相対的な影響に組み込まれ得る。本発明の特定の実施形態によれば、種々のマーカーの相対的な影響が同じであり、発現（または発現の比）の所定の範囲内に含まれる場合は値「１」に帰属させ、所定の範囲外である（陽性マーカーおよび陰性マーカーが、それぞれ所定の範囲より低いか高い）場合は値「−１」に帰属させる。任意選択で、一定の範囲内の発現レベルは値「０」に対応するとみなされ得、これは、細胞における軟骨細胞表現型の安定性に正にも負にも影響を及ぼさない陽性または陰性マーカー遺伝子の発現レベルに相当する。
【００６６】
本明細書に記載の実施例のセクションには、本発明のさらなる特定の実施形態を記載している。安定な軟骨表現型を示す累加マーカースコアは、各々が等しい重要度で帰属される再大６つのマーカーのセットによって決定される。各マーカーの発現を定量し、マーカー遺伝子に対する発現に基づくスコアリングアプローチが適用される。この特定の実施形態では、このようなマーカーから計算されるスコアを「軟骨形成潜在能スコア」（すなわち、軟骨表現型安定性の規定の６つのマーカーのセットの発現全体を反映する累加マーカースコア）と称する。本発明のこの実施形態によれば、各遺伝子の発現レベルは半定量的方法によって測定され、得られた値を参照遺伝子（例えば、βアクチン）との比較によって標準化する。したがって、発現レベル１は、アクチンと同じレベルの発現を示し、発現レベル１未満は、アクチンより低いレベルの発現を示し（０．１は、β−アクチンより１０倍低い発現レベルに相当する）、１より大きい発現レベルは、アクチンより高い発現レベルを示す。
【００６７】
本発明のこの特定の実施形態において、各マーカー遺伝子の発現レベルは、可能な３つのスコアの１つに対応する。陽性マーカー（ＦＲＺ、ＣＯＬ１１、ＣＯＬ２、ＦＧＦＲ３）の場合は、非常に低い発現レベル（０〜０．１）をスコア−１で示し、低発現レベル（０．１〜１）をスコア０で示し、高発現（＞１）をスコア＋１で示す。逆に、陰性マーカー（ＡＬＫ１、ＰＥＤＦ）では、非常に低い発現レベル（０〜０．１）をスコア＋１で示し、低発現レベル（０．１〜１）をスコア０で示し、高発現レベル（＞１）をスコア−１で示す。これらの個々のスコアすべての合計は、マーカーのセット全体としての発現レベルを示す。したがって、６つのマーカーのセットでは、スコアは、−６（すべての陽性マーカーが参照より低いレベルで発現され、すべての陰性マーカーが参照遺伝子より高いレベルで発現される）〜＋６（すべての陽性マーカーが参照遺伝子より高いレベルで発現され、すべての陰性マーカーが参照遺伝子より低いレベルで発現される）の範囲であり得る。このスコアが、細胞集団によるマーカーＦＲＺＢ、ＣＯＬ１１、ＣＯＬ２、ＦＧＦＲ３、ＡＬＫ１およびＰＥＤＦの発現に基づくものである場合、本明細書では、このスコアをＣｈｏｎｄｒｏｃｅｌｅｃｔ（商標）スコアと称する。
【００６８】
本発明の実施例に示すように、マーカーのセットの発現レベルならびに該レベルから得られる累加マーカースコアを、軟骨細胞の細胞集団の軟骨細胞表現型の安定性と相関させることが可能である。したがって、規定のマーカーのセットの発現レベルの評価、またはある種の化合物を投与したときの軟骨形成性細胞集団の（累加）マーカースコアの評価を用いて、該化合物が細胞の軟骨細胞表現型の安定性に影響を及ぼす能力および／または細胞がインビボで軟骨を生成する能力が評価され得る。より具体的には、特定の化合物を拡大培養された軟骨細胞の細胞集団に添加することにより、この細胞集団の軟骨形成潜在能スコアおよび表現型が改善されることが示される。陰性コントロール（例えば、骨形成を
促進する化合物の添加）は、軟骨形成潜在能スコアを減少させる。
【００６９】
したがって、本発明は累加マーカースコアを提供し、これは、軟骨形成性集団が安定な軟骨を生成する能力に対する任意の因子または条件の影響を評価するための細胞系スクリーニングアッセイにおいて使用され得る。インビトロで確認される細胞集団の軟骨表現型安定性が該細胞のインビボでの活性を示すことに鑑みると、該アッセイは、軟骨欠損部に投与すると局所の軟骨形成性細胞による軟骨形成に影響を及ぼし得る化合物を特定するために信頼性をもって使用され得る。重要なことは、本発明で開示したアッセイおよびマーカー解析では、結果を確認するために後で、または並行して行われるインビトロまたはインビボ軟骨形成アッセイが必要とされず、これにより、化合物の大規模スクリーニングが劇的に短縮および簡素化される。
【００７０】
本発明によれば、累加マーカースコアの使用は、細胞集団の軟骨細胞表現型の安定性を評価するため、および／または軟骨形成性細胞の軟骨細胞表現型の安定性に対する条件または化合物の効果を評価するための信頼性のある効率的なツールである。スコアの信頼性は、一方において陽性スコアとインビボで表現型が安定な軟骨を生成する能力との相関関係、および陰性スコアと細胞がインビボで表現型が安定な軟骨を生成できないこととの相関関係によって決定される。信頼性のある累加マーカースコアのさらなる望ましい要件は、その効率、すなわちインビボで表現型が安定な軟骨を生成し得る集団と、生成できない集団とを効率的に識別できる能力である。例えば、マーカーの数が６つであり、スコアリングシステムが上記のように＋６〜−６の間で変化する場合、典型的には「グレイゾーン」（＋６〜−６の間に存在する範囲の累加マーカースコアを特徴とする集団）が存在し、その累加マーカースコアは明確ではなく、試験した場合、安定な硝子軟骨を形成し得る集団と形成できない集団の両方を含むことが認められることがあり得る。理想的には、マーカースコアは、該グレイゾーンの集団の数を最小限とするが、集団を「陽性」または「陰性」のいずれかに最大限に効率的に分類することを可能にするものである。
【００７１】
より具体的には、移植に使用される細胞集団の軟骨細胞表現型の安定性を調べる状況において、該細胞集団の運命の直接的かつ正確な測定を可能にするためには、累加マーカースコアの信頼性と効率の両方が重要であり得る。実際、移植が意図される細胞集団を特性評価するのに比較的低い予測値の累加マーカースコアを使用することは、移植の可否を決定することができないため、価値が限定的である。かかる適用用途には、高い信頼性と効率に鑑みて、本発明の軟骨形成潜在能スコアをスコアリングツールとして使用することが特に適切であると考えられる。しかしながら、スクリーニングにおける使用では、予測値の効率があまり重要でない場合があり得ることが想定される。上記のように、本発明のスクリーニングアッセイの潜在目的は、細胞集団の軟骨細胞表現型の安定性に影響を及ぼす、より具体的には軟骨細胞表現型の安定性を改善する医薬化合物を特定することである。したがって、かかるスクリーニング方法では、化合物が完璧な軟骨細胞表現型の安定性を誘導または維持する能力ではなく、軟骨細胞表現型の安定性の相対的な改善が重要な要件であることが想定され得る。例えば、スクリーニングアッセイの実施の際、低品質の細胞（移植後軟骨なし）を中間品質の軟骨（移植後の結果を明確に予測するためには使用され得ないスコアを有する細胞）に変換し得る化合物も、目的物とみなされることが想定される。
【００７２】
本発明の方法およびアッセイに使用される細胞集団には、軟骨を生成し得ると考えられるか、または軟骨生成細胞に発達し得る任意の細胞が包含される。典型的には、該細胞は、骨軟骨細胞、例えば、関節軟骨、半月または滑液から採取された軟骨細胞およびその一過性細胞または前駆細胞などである。一実施形態によれば、本発明との関連において使用される細胞は、ＷＯ０１／２５４０２に記載の一過性細胞である。一部の実施形態では、該細胞集団は、他の組織（血液、骨髄もしくは脂肪など）に由来する一過性細胞または幹
細胞、骨軟骨細胞系統に誘導され得る一過性細胞または幹細胞である。本発明のアッセイは、この細胞が骨軟骨細胞系統になるように拘束されたものであるか否かを判定するために使用され得る。
【００７３】
本発明のスクリーニング方法およびアッセイに使用される細胞は、新鮮単離、拡大培養または１回以上継代培養されたものであり得る。細胞は、培養フラスコ内にあるか、またはマトリックスもしくは骨格上に存在するかのいずれかで細胞培養物として存在するものであってもよい。マトリックス上の細胞によるマーカーのセットの発現は、マトリックスを溶解し、該細胞による発現を調べることにより測定され得る。細胞は、ヒトまたは動物由来のものであり得る。軟骨の試験に使用されている動物の例としては、ツメガエル、ゼブラフィッシュ、ニワトリ、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジおよびヤギが挙げられる。
【００７４】
本発明の方法およびアッセイは、由来および／または培養条件の結果、安定な軟骨細胞表現型を有する細胞を用いて行われ得る。かかる細胞は、所与の化合物、処置または条件の有害な影響をアッセイするのに特に有用である。
【００７５】
代替的な実施形態によれば、本発明の方法およびアッセイは、由来および／または培養条件の結果、安定な軟骨細胞表現型をもたないか、または軟骨細胞の安定な表現型を失った細胞を用いて行われる。その例は、何度も継代培養が行われた軟骨細胞および幹細胞である。また、骨軟骨欠損（変形性関節症または関節リウマチ（に起因するもの）など）を有する個体由来、または遺伝子構成に基づいて骨軟骨の障害を獲得する素因のある個体由来の軟骨細胞も好適である。また、軟骨腫瘍細胞または軟骨肉腫細胞も好適である。
【００７６】
軟骨細胞表現型の安定性をもたない細胞は、細胞の安定な軟骨表現型を改善もしくは回復させる化合物もしくは条件、または、特定の細胞集団（幹細胞など）を安定な軟骨表現型を有する細胞に変換させ得る化合物もしくは条件をスクリーニングする本発明の方法において特に有用である。
【００７７】
本発明では、本発明の方法およびアッセイをさまざまな異なる適用用途に使用することが想定される。先に詳述したように、本発明の方法およびアッセイによって、ＡＣＴにおける使用が意図される細胞の培養条件、（細胞密度、継代培養回数、培地組成、２次元または３次元の基材内または該基材上での培養、酸素濃度、圧力、剪断応力など）を試験することが可能になる。特に、該アッセイにより、軟骨細胞表現型の安定性に対する培地組成の影響の試験が可能になる。軟骨細胞表現型の安定性に影響を与える可能性がある培地中の因子としては、限定されないが、血清の型およびバッチ、合成無血清培地の種々の配合、ならびにさまざまなホルモン、増殖因子、ビタミン類、タンパク質および軟骨細胞表現型の安定性に影響する疑いのある有機化合物が挙げられる。
【００７８】
本発明の方法およびアッセイの適用用途の一例は、一過性細胞または幹細胞を骨軟骨系統に、より具体的には軟骨形成性系統に分化させる化合物または条件のスクリーニングである。別の適用用途は、充分な数の細胞が採取されるように、それぞれ、多数回継代培養された健常細胞、または多数回の継代培養を経ている健常細胞の軟骨細胞表現型の安定性を回復または維持させ得る化合物または条件のスクリーニングである。また別の適用用途は、骨軟骨欠損を有する、またはその素因のある個体から採取された細胞において軟骨細胞表現型の安定性を誘導し得る化合物または条件のスクリーニングである。
【００７９】
別の適用用途では、該アッセイは、細胞移植術でよく使用されるマトリックス、骨格、ゲルまたはその構成成分の影響を評価するために使用される。
【００８０】
また、本発明の方法およびアッセイは、ペプチドライブラリー、アンチセンスライブラ
リーまたは化合物ライブラリーの古典的なスクリーニングにも適している。このようなライブラリーを構成する化合物としては、限定されないが、合成により作製されるか、または天然供給源から得られる生物製剤および有機または無機化合物が挙げられる。使用され得るその例は、化合物のライブラリー、例えば、抗体断片ライブラリー、ペプチドファージディスプレイライブラリー、ペプチドライブラリー（例えば、ＬＯＰＡＰ＃、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、脂質ライブラリー（ＢｉｏＭｏｌ）、合成化合物ライブラリー（例えば、ＬＯＰＡＣ＠、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）または天然化合物ライブラリー（Ｓｐｅｃｓ、ＴｉｍＴｅｃ）などである。
【００８１】
本明細書に記載のスクリーニング方法およびアッセイは、骨軟骨障害の処置用の医薬のリード化合物の特定に特に有用である。本発明のスクリーニング方法の状況で対象として想定される骨軟骨欠損としては、限定されないが、関節（限定されないが、膝、肘、踝など）に生じた欠損（一般に関節軟骨欠損と称される）が挙げられる。また、軟骨欠損は近位骨にちなんで命名される（大腿骨の顆、上腕骨の顆の欠損など）。軟骨細胞表現型の安定性に影響を及ぼし得る化合物のスクリーニングが想定される対象の頻繁に起こる軟骨障害は、変形性関節症、関節リウマチ、関節軟骨損傷、軟骨軟化症、脊椎関節症である。
【００８２】
実施例
以下の実施例は本発明を説明することが意図され、なんら本発明を本明細書に記載の特定の実施形態に限定することを示唆するものではない。これらの実施例は、添付の図面に図示される。
【００８３】
方法論
軟骨細胞の培養
Ｄｅｌｌ’Ａｃｃｉｏら（２００１），Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．４４、１６０８−１６１９）に記載の標準的な条件を用いて成人ヒト関節軟骨由来の軟骨細胞を単離し、インビトロで拡大培養した。
【００８４】
インビボアッセイ
本発明のマーカーを、別々の人から採取した４８例の軟骨細胞試料の組を用いて検証し、新鮮単離したもの、または１回から５回まで継代培養されたものとした。軟骨細胞の一部をマーカー解析（実施例３参照）に使用し、一方で、別の一部を各試料の軟骨形成能を検証するためのインビボアッセイに使用した。雌ＮＭＲＩ  ｎｕ／ｎｕマウス（大腿部の尾側部分）に、約５００万個のヒト細胞を筋肉内注射した。移植組織を２週間後に収集した［Ｌｉｐｍａｎら（１９８３）Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ．３５，７６７−７７２；Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉら（１９７５）Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．１，３９１−３９５］。軟骨移植組織を筋肉から解離し、ヘマトキシリン−エオシン、トルイジンブルーおよびサフラニンＯ染色を用いて組織学的検査を行なった。染色後の移植組織に１〜３の範囲の組織学的検査スコアを帰属させる。組織学的検査スコア３は、高度に硫酸化されたプロテオグリカンを有する硝子様軟骨、トルイジンブルーおよびサフラニンＯによる強い染色を示す。組織学的検査スコア２は、充分分化した硝子様軟骨、トルイジンブルーによる強い染色、サフラニンＯによる弱い染色を示す。組織学的検査スコア１は、未分化線維性組織である「線維軟骨」、トルイジンブルーによる染色なしまたは弱い染色を示す。組織学的検査スコア０は、移植組織が回収されなかった実験を示す。組織学的検査スコア２または３の軟骨は成功裡の移植を示す。組織学的検査スコア０または１の軟骨は非成功裡の移植を示す。
【実施例１】
【００８５】
実施例１：マーカーの解析
注射された細胞の一部を遺伝子発現解析に使用した。ＲＮＡの単離、逆転写およびＰＣ
Ｒは、ＷＯ０１２４８３２に記載の方法を用いて行なった。これらのマーカーに対するＰＣＲプライマーを表１に示す。
【００８６】
【表１】
0005455219.tif 000002
【００８７】
マーカーの発現レベルは、電気泳動後のＰＣＲ産物の強度を測定することにより測定される。次いで、すべての値をＤＮＡマーカーの６００ｂｐのバンドと比較し、値を得る。個々のマーカーの濃度を数値で示す。陽性マーカー（ＣＯＬ１１、ＣＯＬ２、ＦＧＦＲ３）の場合、非常に低い発現（０〜０．１）を−１で示し、低発現（０．１〜１）を０で示し、高発現を＋１で示す。これに対して、陰性マーカー（ＡＬＫ１、ＰＥＤＦ）の場合は、非常に低い発現（０〜０．１）を＋１で示し、低発現（０．１〜１）を０で示し、高発現を−１で示す。これらの個々のマーカーすべての合計（軟骨形成潜在能スコアと定義）は、マーカーのセット全体の発現レベルを示す。この数は、−６〜＋６の範囲であり得る。
【００８８】
各マーカー個々のデータ、その軟骨形成潜在能スコアおよび組織学的検査スコアを表２にまとめる。
【００８９】
【表２】
0005455219.tif 000003
【００９０】
【表３】
0005455219.tif 000004
【実施例２】
【００９１】
実施例２：データ解析
実施例１で測定した軟骨形成潜在能スコアと組織学的検査スコアとの相関関係を表３および図１に示す。軟骨形成潜在能スコアと組織学的検査スコアとの相関係数は０．７８であり、統計学的に有意である（ｐ＜０．０００１）。
【００９２】
軟骨形成潜在能スコア−３以下の試料では、常に線維軟骨が生じるか、または軟骨が全
く生じない。軟骨形成潜在能スコア２以上の試料では、常に硝子軟骨が生じる。軟骨形成潜在能スコア１の試料では、６例中１例に硝子軟骨が生じる。
【００９３】
判断基準として、軟骨形成潜在能スコア０以上の試料を移植に適するとみなす。本データセットに基づくと、移植の結果は、７７％（３７／４８）で高い確実性で予測することが可能であり、６４％でエラーなく予測することが可能である。このデータセットに基づき、軟骨細胞培養物は、軟骨形成潜在能スコアが０以上の場合、ＡＣＩ処置における使用に承認される。
【００９４】
まとめると、安定な硝子様軟骨は、軟骨形成潜在能スコア０以上を有する細胞でのみ得られ得る。軟骨を全く形成しない細胞は負のスコアを有した。個々の遺伝子のさらなる解析により、このモデルの精密化がさらに補助されよう。
【００９５】
ａ）軟骨形成潜在能スコアと組織学的検査スコアとの関係
軟骨形成潜在能スコアと組織学的検査スコアとの関係を図１および表３に示す。
【００９６】
【表４】
0005455219.tif 000005
【００９７】
度数分布表に加え、表３には、軟骨形成潜在能スコアの各値での平均組織学的検査スコアも示す。この平均値は、軟骨形成潜在能スコア−１から０の間で有意に増加する（１．０から２．７に）。これは、軟骨形成潜在能スコア０以上を有する試料がＡＣＩに適することを示唆する。
【００９８】
ｂ）分類尺度を用いたデータ解析
「順序分類尺度（ｏｒｄｅｒｅｄ  ｃａｔｅｇｏｒｉｃａｌ  ｓｃａｌｅ）」は、単にカテゴリーに番号付けして、その順位を示す尺度である。割り当てられた実際の数値は他の情報を示さない。例えば、ここでは、組織学的検査の尺度は０、１、２、３の値をとる。これを順序分類尺度と解釈するということは、１は０よりも良好であることを示すが、どれだけ良好であるかは言及していない。しかしながら、間隔尺度は、実際の数値が意味を持つとみなされ、例えば１が０よりも良好である量は２が１よりも良好である量と同じである。表３の場合の平均値の計算では、組織学的検査スコアは間隔尺度として有効に処理され得るという暗黙の想定がなされる。
【００９９】
尺度が多くの点を有するほど、かかる尺度が間隔尺度であることがより許容される。したがって、１３のデータポイントで示される軟骨形成潜在能スコアは、間隔スコアとして処理される。
【０１００】
組織学的検査スコアを順序分類尺度として処理したさらなる解析を表３の最後の欄に示す。本明細書では、このスコアを０または１（線維軟骨がないか、もしくは少ない）と、２または３（硝子軟骨）の２つのカテゴリーにまとめており、このデータは、組織学的検査スコア２または３が観察される確率を示す。
【０１０１】
表３の最後の２つの欄のうち、見出しが「観測値」の欄は、各軟骨形成潜在能スコアに対するこのカテゴリー（およびパーセンテージ）内の試料の実際の数値を示す。この値はまた、軟骨形成潜在能スコア−１〜０の間で増加し、これは、閾値排除点を示す。この解析では、軟骨形成潜在能スコアを順序分類尺度とみなす。
【０１０２】
ｃ）間隔尺度を用いたデータ解析
軟骨形成潜在能スコアを間隔尺度として処理する場合、観察された応答は、ロジスティック解析を用いてスムージング処理され得る。この方法により、所望のカテゴリー（２または３）である確率が予測される。フィット値は妥当な範囲（０〜１００％）を超えない。このようなフィット値を表３の最後の欄に示し、スムージングの効果を示す。このようなフィット推定値は、任意の所与の軟骨形成潜在能スコアで２または３の組織学的検査スコアが得られる可能性に関して、他の方法よりも信頼性のある予測をもたらすと考えられる。特に軟骨形成潜在能スコア−１では、フィットモデルによって、２または３が得られる可能性が４１．５％で予測されている結果、スコア−１は許容されるべきか否かという問題が生じることに注意されたい。
【実施例３】
【０１０３】
実施例３．個々のマーカーの影響
個々のマーカーの影響は、実施例１の軟骨形成潜在能スコアを決定したマーカーのセットの６つのマーカーの代わりに５つのマーカーの発現プロフィールを再計算することにより評価される。同じスコアリングシステムを適用したが、この場合、スコアは−５〜＋５の範囲であり得る。
【０１０４】
データを表４〜９に示す。
【０１０５】
【表５】
0005455219.tif 000006
【０１０６】
【表６】
0005455219.tif 000007
【０１０７】
【表７】
0005455219.tif 000008
【０１０８】
【表８】
0005455219.tif 000009
【０１０９】
【表９】
0005455219.tif 000010
【０１１０】
【表１０】
0005455219.tif 000011
【０１１１】
以下の表１０のパートＡは、上記の表４〜９に示した各データセットに関して、マーカースコアの閾値に関して、どれだけ多くの試料が低品質（表１０の「−」に相当する組織学的検査スコア０または１）を示す、または高品質軟骨（表１０の「＋」で示される組織学的検査スコア２または３）を示すと明確に分類され得るかを示す。マーカースコアと組織学的検査スコア間に相関関係がない試料は「？」試料に分類する。このデータは、ＣＯＬ１１、ＣＯＬ２またはＣＯＬ１１を除いた５つのマーカーのセットを使用した場合、同様またはさらに良好な結果が得られる（すなわち、「？」で表示される試料が少ない）ことを示す。
【０１１２】
表１０のパートＢでは、排除値の限定性が低い。表示した範囲内のあるマーカースコアについて、６つの試料のうち少なくとも５つがマーカースコアと軟骨の品質間に相関関係を示す場合、そのマーカースコアの範囲は予測性をもつと考えられる。このアプローチを用いると、ＣＯＬ１１の除外によって改善された結果がもたらされるが、他のいずれかのマーカーの除外では、より悪い結果がもたらされる（特に、Ｃｏｌ２またはＦＧＦＲ３を
実施例１のマーカーのセットから除外した場合）。
【０１１３】
【表１１】
0005455219.tif 000012
【０１１４】
本データセットおよびその解釈に基づくと、軟骨のインビボ生成に関するマーカーのセットの発現プロフィールの予測力は、任意選択で、該解釈にかかわらずＣＯＬ１１なしでも得られ得ると考えられる。他方、ＡＬＫ１またはＦＲＺＢのいずれかの除外により、本データセットの解釈にかかわらず該マーカーの予測力の低下がもたらされる。
【実施例４】
【０１１５】
実施例４．スクリーニングアッセイにおけるマーカースコアの使用
累加マーカースコアを用いた軟骨細胞表現型の安定性の評価を、細胞がインビボで安定な軟骨を生成する能力に影響を及ぼし得る化合物を特定するため、および該細胞に対するかかる化合物の効果の性質を調べるためのスクリーニングアッセイにおいて試験した。
【０１１６】
スクリーニングアッセイは、軟骨生検材料から採取した１００００〜１０００００個の軟骨細胞を播種した９６ウェルプレートにおいて行なった（継代培養物０〜Ｐ５から新鮮単離）。試験化合物を種々の濃度で種々の期間で添加した。インキュベーション後、軟骨細胞を収集し、ＲＮＡを単離し、逆転写酵素で処理した。定量的ＰＣＲをＴａｑＭａｎ手順の使用説明書に従って行ない、細胞の軟骨形成潜在能スコアを実施例１に記載のようにして決定した（ＣＣスコア）。
【０１１７】
１．単層培養状態の軟骨細胞の脱分化を妨げる分子の試験
化合物Ａは、軟骨保護効果を有すること、および軟骨細胞表現型に対する推定安定化効果を有することが予測される候補化合物であった。累加マーカースコア、より具体的には実施例１の軟骨形成潜在能スコアの決定を用いて、軟骨細胞単層培養物の軟骨細胞表現型の安定性に対するこの化合物の効果を調べた。
【０１１８】
ａ）軟骨細胞単層培養物
軟骨細胞を単層培養にて、Ｔ２５フラスコ内で４×１０４細胞／ｍｌで培養した。化合物Ａを、平板培養直後の細胞に添加した。最終総容量５ｍｌの完全培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）を添加した。各条件（１μＭまたは１０μＭの化合物Ａ、ＤＭＳＯ対照）に対して３つのフラスコを使用した。培地と化合物を１週間に１回交換した。コンフルエントになったら、継代培養０の軟骨細胞（Ｐ０）をトリプシン処理し、計数し、２×１０５細胞を再度平板培養してＰ１培養物とした。残りの細胞を溶解培地に入れ、ＲＮＡ抽出を行なった。同じ手順を、Ｐ１、Ｐ２およびＰ３軟骨細胞培養物に対して行なった。ＴａｑＭａｎ  ＲＴ−ＰＣＲを用いて軟骨形成マーカーの発現を調べた。
【０１１９】
ｂ）ＲＮＡの単離、ｃＤＮＡの作製
単層培養により得た軟骨細胞をＰＢＳで洗浄し、１％のメルカプトエタノールを含有するＲＬＴバッファー（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて溶解させた。溶解細胞は、使用するまで−８０℃で保存した。ｍＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙマイクロキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の使用説明書に従って用いて精製した。ｃＤＮＡは、ランダムヘキサマーを用いて製造業者の使用説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って合成した。
【０１２０】
ｃ）ＴａｑＭａｎリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
リアルタイム定量的ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）は、ＡＢＩ  ｐｒｉｓｍ  ７７００配列検出装置システムを用いて行なった。ＲＴ−ＰＣＲにはＭａｓｔｅｒｍｉｘ  ｑＰＣＲキット（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）を、製造業者の使用説明書に従って使用した。ＴａｑＭａｎ解析に使用するプライマーおよびプローブは、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓまたはＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃにオーダーした。リアルタイムＰＣＲのデータは、２−ｄｅｌｔａｄｅｌｔａＣＴ（２ＤＤＣＴ）法を用いて計算した。これは、内因性参照（β−アクチン）に対して標準化し、標準物質（この場合は、コントロール条件（ＤＭＳＯ）下での選択した遺伝子の発現レベル）と比較した標的遺伝子の量と定義される。
【０１２１】
ｄ）結果
化合物Ａは、軟骨形成能、表現型安定性および軟骨細胞の恒常性を示すいくつかの分子マーカーの発現に対して効果を有し、単層培養での軟骨細胞の拡大培養中、軟骨形成潜在能スコアの減少を妨げる能力を有した（図２参照）。したがって、１μＭおよび１０μＭの両方の濃度で、Ｐ０およびＰ３の軟骨細胞の軟骨形成潜在能スコアは、該化合物の非存在下で培養された軟骨細胞と比較すると、同等であったか、または上昇している場合さえあった。後者の場合、Ｐ０軟骨細胞に対してＰ３軟骨細胞では累加マーカースコアの低下が観察された。
【０１２２】
化合物Ａは、軟骨細胞の細胞外マトリックス成分のいくつかの遺伝子発現に対して正の効果を有した。化合物Ａは、低（１μＭ）濃度では、Ｃｏｌ２とＣｏｌ１１両方の遺伝子転写物の発現を誘導したが、高（１０μＭ）濃度では誘導しなかった（図３）。また、該化合物は、ＦＧＦＲ３マーカーの発現を増大させるが、この増大は統計学的に有意ではなかった。さらに、化合物Ａは試験した両方の濃度で、ＰＤＥＦの発現を強く阻害した（図４）。また、１０μＭでは、該化合物の添加によりＡＬＫ１の発現の低下がもたらされた（図４）。どちらのマーカーも、上方調節されると細胞の軟骨形成能と負に相関し、これは、化合物Ａが軟骨細胞の軟骨形成潜在能に対して正の刺激効果を有し、したがって、軟骨形成に対して正の刺激効果を有することを示す。
【０１２３】
２．３Ｄ培養状態の脱分化軟骨細胞の再分化を媒介する能力に関する分子のスクリーニング
１４種類の化合物を、アルジネート培養物の脱分化軟骨細胞の再分化を増強する能力についてスクリーニングした。該化合物が３Ｄ培養状態での軟骨形成性表現型の細胞の収集に影響を及ぼす能力を評価するため、種々の分子マーカー発現に対する該分子の効果、および累加マーカースコア（実施例１で測定した軟骨形成潜在能スコア）に対する該分子の効果を調べた。
【０１２４】
ａ）アルジネート培養物の軟骨細胞の再分化
完全培地中での単層培養における拡大培養後、５例のＯＡ患者（５０〜６５歳）から採取した３回継代培養のヒト軟骨細胞（Ｐ３）をトリプシン処理によって解離させ、計数し、トリパン排除試験によってバイアビリティを試験した。軟骨細胞を２％アルジネートに懸濁させ、等量のＨＢＳＳを添加した。細胞懸濁液を１０ｍｌ容シリンジニードル内に吸引し、２４ゲージ針で１滴ずつ塩化カルシウム溶液中に移した（５粒／ウェル、細胞総数
２５００００／ウェル）。この粒をＮａＣｌで洗浄し、新たな完全培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）を添加した。４日間の培養後、上清みを除去し、新たな培地を、１０μＭの濃度の該化合物とともに添加した。化合物添加の４日後、上清みを除去し、細胞を粒から遊離させ、溶解させた。ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡを作製し、ＴａｑＭａｎ  ＲＴ−ＰＣＲを用いて実施例１に記載のようにして、ＣＯＬ２、ＣＯＬ１１、ＦＧＲ３、ＦＲＺＢ、ＡＬＫ１、ＰＥＤＦの発現を測定した。
【０１２５】
ｂ）結果
アルジネート中で培養された軟骨細胞におけるマーカー遺伝子発現のアップレギュレートまたはダウンレギュレートに対する化合物の相対効果を表１１にまとめる。効果は、分子の非存在（但しビヒクルＤＭＳＯの存在下）で培養された軟骨細胞と比較したものである。結果をコントロール（軟骨細胞＋ＤＭＳＯ）と比べた平均発現（５例のＯＡ患者の平均）で示す。ＮＳ＝有意でない；−＝阻害；＋＝増強；＃＝ｐ＜０．０５（コントロールＤＭＳＯと比較したとき有意）。化合物は１０μＭで使用した。
【０１２６】
いくつかの分子は、種々のマーカー遺伝子の発現に正または負に影響を及ぼす能力を有した。２つの化合物だけ（化合物８と化合物１４）は、累加マーカースコア（ＣＣスコア）に対して正の効果を有し、これは、これらの化合物が軟骨細胞の再分化を増強／媒介し得たことを示す。しかしながら、化合物１４だけは、個々の各マーカーに対して所望の効果を有したが、ＢＭＰ２またはＡＬＫ１遺伝子の発現には効果がなかった。この化合物は、再移植前の軟骨細胞のエキソビボ脱分化の刺激に有用であり得、したがって、インビボでの関節の硝子軟骨形成に対する情勢が変わり得る。
【０１２７】
【表１２】
0005455219.tif 000013
【０１２８】
実施例５．軟骨保護化合物のインビボ効果の試験
軟骨形成潜在能スコアに有意に影響を及ぼす実施例４の化合物について、細胞の軟骨細胞表現型の安定性に対する該化合物の効果もまたインビボで試験される。この目的のため、細胞集団を試験化合物またはバッファーのいずれかと接触させ、インキュベーション後、ヌードマウスモデル（上記参照）に注射する。各細胞集団が安定な硝子軟骨を生成する能力を評価する。軟骨形成潜在能スコアに対する化合物の効果は、該細胞集団の軟骨形成
潜在能に対する効果と相関することが確立される。
【図１】
0005455219.tif 000014
【図２】
0005455219.tif 000015
【図３】
0005455219.tif 000016
【図４】
0005455219.tif 000017
【配列表】
0005455219000001.app