(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一、第二及び第三のポリヌクレオチドを含むクラミジア・トラコマチスの核酸配列の検出のためのポリヌクレオチド試薬の組み合わせであって、
第一のポリヌクレオチドは、配列番号１、１３及び１４からなる群から選択されるポリヌクレオチドからなり、フォワードプライマーとして使用され、
第二のポリヌクレオチドは、配列番号２及び１５からなる群から選択されるポリヌクレオチドからなり、リバースプライマーとして使用され、及び
第三のポリヌクレオチドは、配列番号３からなるポリヌクレオチドであり、プローブとして使用される、
クラミジア・トラコマチスの核酸配列の検出のためのポリヌクレオチド試薬の組み合わせ。
【請求項２】
少なくとも１個のポリヌクレオチド試薬が検出可能な標識を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド試薬の組み合わせ。
【請求項３】
第四のポリヌクレオチド（第四のポリヌクレオチドは、配列番号２８−３０及びこれらの相補体からなる群から選択されるポリヌクレオチドであって、フォワードプライマーとして使用される。）、
第五のポリヌクレオチド（第五のポリヌクレオチドは、配列番号３１及びこれの相補体からなる群から選択されるポリヌクレオチドであって、リバースプライマーとして使用される。）及び
第六のポリヌクレオチド（第六のポリヌクレオチドは、配列番号３２−３４及びこれらの相補体からなる群から選択されるポリヌクレオチドであって、プローブとして使用される。）
をさらに含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド試薬の組み合わせ。
【請求項４】
少なくとも１つのポリヌクレオチド試薬が検出可能な標識を含む、請求項３に記載のポリヌクレオチド試薬の組み合わせ。
【請求項５】
少なくとも１つのポリヌクレオチド試薬がさらに消光剤を含む、請求項３に記載のポリヌクレオチド試薬の組み合わせ。
【請求項６】
第三のポリヌクレオチドが標識及び消光剤を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド試薬の組み合わせ。
【請求項７】
請求項１に記載のポリヌクレオチド試薬の組み合わせ及び増幅試薬を含む、クラミジア・トラコマチスの核酸配列の検出のためのキット。
【請求項８】
（ａ）増幅試薬、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）核酸配列を含有する疑いのある試料及び請求項１に記載の第一及び第二のポリヌクレオチドの組み合わせを含む反応混合液を形成すること、並びに
（ｂ）前記混合液を、前記増幅試薬が請求項１に記載の第三のポリヌクレオチドに相補的な核酸配列の少なくとも１個のコピーの増幅を促進するような条件に供すること
を含む、試料中のクラミジア・トラコマチス核酸配列を増幅する方法。
【請求項９】
前記反応混合物が、対照標的ポリヌクレオチド及び対照ポリヌクレオチドプローブをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）増幅試薬、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）核酸配列を含有する疑いのある試料及び請求項１に記載の第一及び第二のポリヌクレオチドの組み合わせを含む反応混合液を形成すること、
（ｂ）前記混合液を、前記増幅試薬が請求項１に記載の第三のポリヌクレオチドに相補的な核酸配列の少なくとも１個のコピーの増幅を促進するような条件に供すること、
（ｃ）前記混合物を、第三のポリヌクレオチド試薬が標的配列との特異的ハイブリッド形成を促進するような条件に供すること、並びに
（ｄ）第三のポリヌクレオチド：標的配列ハイブリッドを検出すること
を含む試料中でクラミジア・トラコマチスを検出する方法。
【請求項１１】
反応混合物が、対照標的ポリヌクレオチドと、対照ポリヌクレオチドプローブと、をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本願は、２００７年４月１３日提出の米国仮出願第６０／９１１，６８４号（本明細書中にその全体を参照により組み込む。）に対する優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、スウェーデンで被験者において最近観察された欠損変異体を含む、クラミジア・トラコマチスプラスミド（ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）の検出のための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
クラミジア・トラコマチス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ又はＣＴ）は、性病性リンパ肉芽腫、男性及び女性泌尿生殖器系の様々な炎症性疾患及び５億人が罹患し失明を導くことがある慢性疾患であるトラコーマを含む、一般的な性感染病の原因菌である。早期に診断し、適切な治療を行わないと、ＣＴにより誘発される尿道炎及び子宮頸管炎から、例えば不妊症や子宮外妊娠を引き起こすことがある、膣炎、卵管炎及び骨盤炎などの、慢性炎症が起こり得る。さらに、感染した母親から生まれた新生児は、分娩中に肺及び／又は眼の感染に罹患し得る。
【０００４】
クラミジアエ（ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ）
クラミジアエは、リポ多糖及びいくつかの膜タンパク質を含有する三層の外膜を含むグラム陰性細菌と形態学的及び構造学的類似性を示す原核生物である。クラミジアエは、その形態及びユニークな発育環がその他の細菌とは異なる。偏性細胞内寄生体、クラミジアエは、代謝的に不活性であるが感染性のある細胞外段階とおよび複製するが非感染性の細胞内段階とからなるユニークな二相の生活環を有する。生活環の複製段階は、感染した宿主細胞の細胞質から細菌を隔離する膜結合封入体内で起こる。
【０００５】
クラミジアエの多くの様々な株が（ヒトを含む）哺乳動物及び鳥類から単離されてきた。宿主域、毒性、病原性及び抗原性組成に基づき、株を分類することができる。それぞれの種内で強いＤＮＡ配列同一性があるが、驚くべきことに、種間では同一性は小さく、このことから非常に早く進化的に分かれたことが示唆される。
【０００６】
未知の機能を有する約７５０１ｂｐの潜在プラスミド（染色体外ＤＮＡ）が、ほぼ全てのＣＴ単離株で見出され、知られている（例えばＬＧＶ株において「ｐＬＧＶ４４０」として）。このプラスミドはＣＴの生存に必須ではないが、注目すべきことに、この配列は単離株間で非常によく保存されている（例えば、（Ｃｏｍａｎｄｕｃｃｉら、１９９０）を参照。）。
【０００７】
診断テスト
迅速かつ特異的な診断テストが、ＣＴに対してうまく介入するのに非常に重要である。病原性細菌の選択的増殖に基づく診断が標準的であるが、細胞増殖には時間がかかる。多くの臨床分離株は、インビトロで増殖させるのが困難である。細菌感染は宿主において抗体産生を引き起こすので、生殖管感染に罹患している患者からの血清がまたＣＴ感染を診断するために使用されてきた。しかし、血清学的マーカーに基づくアッセイは非定量的であり、解釈が困難であることが多い。例えば、抗体タイターは急性感染では検出不可能（偽陰性の結果）であり、過去に感染歴のある非感染者で持続し（偽陽性の結果）、交差反応種が存在するために偽陽性（例えば、異なるクラミジア種による呼吸器感染）となり得又は他の因子に依存して全く発現し得ない場合がある（偽陰性の結果）（Ｂｌａｃｋら、１９９１；Ｎｇｅｏｗ、１９９６）。これらの理由のために、血清学のみというのはＣＴ感染の診断には不適切である。
【０００８】
これらの不適切な点を改善する試みが行われてきた。例えば、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＲＥＡＬＴＩＭＥ（登録商標）  ＣＴ／ＮＧ（２Ｇ２８）及びＣＴ（１Ｌ３１）製品は、均質なリアルタイム方式でクラミジア潜在プラスミドポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー及びプローブを使用する（Ｐａｂｉｃｈら、２００４）。Ｊａｌａｌら（Ｊａｌａｌら、２００６）は、１反応でＣＴを検出し、同定し、定量するために、Ｒｏｔｏｒ−ｇｅｎｅリアルタイムＰＣＲアッセイを開発した。Ｐｉｃｋｅｔら（Ｐｉｃｋｅｔｔら、２００５）は、リアルタイムＰＣＲも使用して、ＣＴ及びＣ．ニューモニア（Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）（Ｎ１６）のコピー数を正確に決定することができた。
【０００９】
ＣＴ検出における新しい課題
ＰＣＲに基づくＣＴ検出方法により、殆ど全てのＣＴ株で見出される潜在プラスミドの長所が分かってきた。このプラスミドは、細菌あたり、およそ４−１０コピーのプラスミドがあるため、ＣＴ感染のポリヌクレオチドに基づく診断のための標的として好ましい（Ｊａｌａｌら、２００６；Ｐａｌｍｅｒ及びＦａｌｋｏｗ、１９８６；Ｐｉｃｋｅｔtら、２００５；Ｔａｍら、１９９２）。
【００１０】
しかし、ＣＴ感染が予想外に２５％低下したことがスウェーデンのＨａｌｌａｎｄ郡で指摘された後、プラスミドに欠失があるＣＴの新しい変異体（「ＣＴＳＷ」）がスウェーデンで検出された（Ｒｉｐａ及びＮｉｌｓｓｏｎ、２００６）。
【００１１】
過去１０年間、スウェーデンの研究所は、ＣＴ感染を診断するためのＤＮＡ増幅に対する鋳型として潜在プラスミドを用いた核酸増幅試験（ＮＡＡＴ）を使用してきた。
【００１２】
２００６年の９月中頃から１０月にかけて、Ｈａｌｍｓｔａｄ、Ｈａｌｌａｎｄ郡の郡微生物研究所は、Ａｂｂｏｔｔのｍ２０００プラスミドＰＣＲと平行して、主要な外膜タンパク質（ＭＯＭＰ）−特異的ＰＣＲによって、連続的に入ってくる１７００検体を試験した。この期間中にＨａｌｌａｎｄ郡で診断した全ＣＴ症例の１３％において、Ｒｉｐａらは、ＭＯＭＰ試験でのみ陽性である変異株を発見した。臨床データから、野生型株による感染とは差がないことが示される。この株は、スウェーデン中に広がっていると思われるが、これらの地方の有病率は依然として分からない。
【００１３】
この変異株からのプラスミドの一部の配列決定を行った。Ｒｉｐａらは、Ａｂｂｏｔｔ及びＲｏｃｈｅ製のＣＴ  ＮＡＡＴ試験に対する標的領域で３７７塩基対が欠失していることを見出した（登録番号Ｘ０６７０７のヌクレオチド６５４から１０３０；配列番号４）。１２種類の変異株が現在配列決定され、同じ欠失があることが分かっている（Ｒｉｐａ及びＮｉｌｓｓｏｎ、２００６）。従って、当技術分野において、この変異株を検出し、ＣＴのその他の株からこの変異株を区別することができる新しいＮＡＡＴ試験が必要とされている。
【発明の開示】
【００１４】
発明の要旨
第一の態様において、本発明は、ＣＴ及びＣＴＳＷを増幅及び／又は検出するのに有用なポリヌクレオチド試薬の組み合わせに関し、このポリヌクレオチド試薬の組み合わせは、第一及び第二のポリヌクレオチドを含み、第一のポリヌクレオチドは、配列番号１、５−９、１１−１３又は１４及びこれらの相補体のポリヌクレオチドと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列から必ずなり、第二のポリヌクレオチドは、配列番号２、１０、１５、１６及び２６及びこれらの相補体のポリヌクレオチドと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列から必ずなる。このポリヌクレオチド試薬の組み合わせは、配列番号３、１７−２５、２７、４２及び［配列番号４４のｎ個（１０≦ｎ≦１４０）の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチド］並びにこれらの相補体からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列からなる第三のポリヌクレオチドをさらに含み得る。
【００１５】
本発明は、第一の態様のポリヌクレオチド試薬の組み合わせが第四、第五及び第六のポリヌクレオチドをさらに含み、この組み合わせはＣＴ及びＣＴＳＷの検出及び／又は増幅に有用である第二の態様にも関する。このポリヌクレオチド試薬の組み合わせにおいて、第四のポリヌクレオチドは、配列番号２８−３０及びこれらの相補体からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列から必ずなり、第五のポリヌクレオチドは、配列番号３１及びこれの相補体からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列から必ずなり、第六のポリヌクレオチドは、配列番号３２−３４及びこれらの相補体からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列から必ずなる。
【００１６】
本発明は、第一の態様のポリヌクレオチド試薬の組み合わせが第四、第五及び第六のポリヌクレオチドをさらに含み、この組み合わせはＣＴ、ＣＴＳＷ及びＮＧの検出及び／又は増幅に有用である第三の態様にも関する。このポリヌクレオチド試薬の組み合わせにおいて、第四のポリヌクレオチドは、配列番号３５及びこれの相補体のポリヌクレオチドと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列から必ずなり、第五のポリヌクレオチドは、配列番号３６及びこれらの相補体のポリヌクレオチドと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列から必ずなり、第六のポリヌクレオチドは、配列番号３７−３９及びこれらの相補体からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列から必ずなる。
【００１７】
本発明は、第一の態様のポリヌクレオチド試薬の組み合わせが、第四、第五、第六、第七、第八及び第九のポリヌクレオチドをさらに含み、この組み合わせはＣＴ、ＣＴＳＷ及びＮＧの検出及び／又は増幅に有用である第四の態様にも関する。このポリヌクレオチド試薬の組み合わせにおいて、第四のポリヌクレオチドは、配列番号２８−３０及びこれらの相補体からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列から必ずなり、第五のポリヌクレオチドは、配列番号３１及びこれの相補体のポリヌクレオチドと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列から必ずなり、第六のポリヌクレオチドは、配列番号３２、３３及び３４及びこれらの相補体からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列から必ずなり、第七のポリヌクレオチドは、配列番号３５又はこれの相補体のポリヌクレオチドと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列から必ずなり、第八のポリヌクレオチドは、配列番号３６及びこれの相補体のポリヌクレオチドと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列から必ずなり、第九のポリヌクレオチドは、配列番号３７、３８、３９及びこれらの相補体からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列から必ずなる。
【００１８】
各態様において、少なくとも１つのポリヌクレオチド試薬は、検出可能な標識又は消光剤を含み得る。
【００１９】
第五の態様において、本発明は、態様１−５のポリヌクレオチドの組み合わせを含むキットに関し、このキットは増幅試薬をまた含む。
【００２０】
第六の態様において、本発明は、態様１−４のポリヌクレオチド試薬の組み合わせを用いて、ＣＴ、ＣＴＳＷ及び／又はＮＧを増幅及び／又は検出する方法に関する。これらの反応液は、少なくとも１つの対照ポリヌクレオチド（陽性及び／又は陰性の）並びに正規化に使用することができる対照をさらに含み得る。しかし、ＣＴ又はＣＴＳＷを検出する場合で、反応液がＤＮＡポリメラーゼ７．５ユニット、１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＫＣｌ、９．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、第一及び第二のポリヌクレオチド５００ｎＭ及び６０ｎＭ  ＲＯＸからなる場合、
第一のポリヌクレオチドが配列番号１又はこれの相補体の核酸配列からなるとき、第二のポリヌクレオチドは配列番号１６又はこれの相補体の核酸配列から構成されなく及び第三のポリヌクレオチドは配列番号２３又はこれの相補体の核酸配列から構成されなく、
第一のポリヌクレオチドが配列番号１又はこれの相補体の核酸配列からなるとき、第二のポリヌクレオチドは配列番号２又はこれの相補体の核酸配列から構成されなく及び第三のポリヌクレオチドは配列番号２２又はこれの相補体の核酸配列から構成されなく、
第一のポリヌクレオチドが配列番号８もしくは９又はこれらの相補体の核酸配列からなるとき、第二のポリヌクレオチドは配列番号１０もしくは２６又はこれらの相補体の核酸配列から構成されなく及び第三のポリヌクレオチドは配列番号１７又はこれの相補体の核酸配列から構成されなく、
第一のポリヌクレオチドが配列番号５もしくは６又はこれらの相補体の核酸配列からなるとき、第二のポリヌクレオチドは配列番号１０又はこれの相補体の核酸配列から構成されなく及び第三のポリヌクレオチドは配列番号１９又はこれの相補体の核酸配列から構成されなく、
第一のポリヌクレオチドが配列番号１４又はこれの相補体の核酸配列からなるとき、第二のポリヌクレオチドは配列番号２又はこれの相補体の核酸配列から構成されなく及び第三のポリヌクレオチドは配列番号２２又はこれの相補体の核酸配列から構成されない。
【００２１】
詳細な説明
本発明は、ある種のアッセイ条件下で、ＣＴＳＷ株を検出することならびに他のＣＴ株からＣＴＳＷを区別することの両方の問題を解決する。慎重に設計され厳格に試験されたプローブ及びプライマーを提供することにより、感染がＣＴによるものかＣＴＳＷによるものかのＣＴ感染の診断は、今や単純であり確実である。
【００２２】
本発明は、具体的に、一緒に使用した場合、感度が高く、特異的で再現性のある、ＣＴ及びＣＴＳＷ株両方の検出を実現するポリヌクレオチド配列を組み合わせる。ＣＴＳＷを同定できるだけでなく、試料中にＣＴ、ＣＴＳＷ又は両方が含有されるか否かを同時に調べることができる。
【００２３】
さらに、本発明はまた、ＣＴ及びＣＴＳＷ配列を検出するための、方法、アッセイ及びキットも提供する。
【００２４】
本発明者らは、スウェーデンの３つの郡からの３８の臨床検体からＤＮＡ調製物を得て、分析した。尿、頸部スワブと組み合わせた尿、尿道スワブ及び眼のスワブを含む、様々なタイプの試料があった。潜在プラスミド内のおよそ１，０００ヌクレオチドの領域をインビトロで増幅し、得られた増幅領域の大きさを分析した。全部で３８の試料で同じように、およそ３５０から４００塩基対（ｂｐ）の欠失が示された。次に、３６の試料の配列決定を行った。３６の全ての試料で、同一の３７７ｂｐの欠失が見られた。
【００２５】
次に、本発明者らは、欠失領域の外側の領域を標的とすることにより、この欠失株の検出について、プライマー及びプローブの複数の組み合わせを評価した。選択されたあるプライマー−プローブセットは、野生型潜在プラスミドならびに欠損変異体を含有するＣＴクラミジア・トラコマチスを検出することが分かった。このプライマー−プローブセットもクラミジア・トラコマチス血清型（細菌の細胞表面で見出されるタンパク質によって、血清型がその他の血清型とは異なる。）のパネルの全１４種類のメンバーを検出した。
【００２６】
本発明の分子「ツール」には、表１で示される配列及びそれらの相補体が含まれる。
【００２７】
【表１】
0005619602.tif 000002
0005619602.tif 000003
【００２８】
本発明を説明するために、次の用語を使用する。
【００２９】
定義
「特異的にハイブリッド形成する」とは、核酸が検出可能に及び特異的に、第二の核酸に結合する能力を指す。ポリヌクレオチドは、非特異的核酸による検出可能な結合の相当量を最小限に抑えるハイブリッド形成及び洗浄条件下で標的核酸鎖と特異的にハイブリッド形成する。
【００３０】
「標的配列」又は「標的核酸配列」は、本明細書中で提供されるポリヌクレオチドの１以上を用いて、増幅される又は検出される又は両方の、ＣＴ又はＣＴＳＷ又はこれらの相補体の核酸配列を意味する。さらに、標的配列という用語は２本鎖核酸配列を指すことがある一方、標的配列は１本鎖でもあり得る。標的が２本鎖である場合、本発明のポリヌクレオチドプライマー配列は、好ましくは標的配列の両鎖を増幅する。特定の生物に対する特異性がより高い又はより低い標的配列を選択することができる。例えば、標的配列は属全体に特異的であり得、複数の、属、種又は亜種、血清群、オクソタイプ（ａｕｘｏｔｙｐｅ）、血清型、株、単離株又は生物のその他のサブセットに特異的であり得る。
【００３１】
「試験試料」は、ＣＴ又はＣＴＳＷ標的配列を含有し得る生物又は体液から採取された試料を意味する。試験試料は、例えば組織、血液、唾液、痰、粘液、汗、尿、尿道スワブ、子宮頸部スワブ、泌尿性器又は肛門スワブ、結膜スワブ、水晶体液、脳脊髄液などの何れかのソースから採取することができる。試験試料は、（ｉ）ソースから入手したままで直接、又は（ｉｉ）試料の特徴を修飾するための前処理後に、使用することができる。従って、試験試料は、例えば血液から血漿又は血清を調製すること、細胞又はウイルス粒子を破壊すること、固体物質から液体を調製すること、粘性のある液体を希釈すること、液体をろ過すること、試薬を添加すること、核酸を精製することなどによって使用前に前処理することができる。
【００３２】
「標識」とは、検出することができ及び場合により定量することができる、特性又は特徴を有する分子又は部分を意味する。標識は、例えば、放射性同位元素、発蛍光団、化学発光団、酵素、コロイド粒子、蛍光微粒子で直接検出可能であり得；又は標識は、例えば特異的結合メンバーで間接的に検出可能であり得る。直接検出可能な標識は、標識の検出及び／又は定量を可能にする、基質、トリガー試薬、消光部分及び光などのさらなる成分を必要とすることがある。間接的に検出可能な標識を使用する場合、典型的にはこれらを「コンジュゲート」と組み合わせて使用する。コンジュゲートは、典型的には直接検出可能な標識に結合又は連結された特異的結合メンバーである。コンジュゲートを合成するためのカップリング化学は周知であり、例えば特異的結合メンバーの特異的結合特性又は標識の検出可能な特性を破壊しない何らかの化学的手段及び／又は物理的手段を含む。「特異的結合メンバー」は、結合対、即ち、例えば化学的又は物理的手段を通して、分子の１個が他の分子に特異的に結合する場合の２個の異なる分子のメンバーを意味する。抗原及び抗体の特異的結合対に加えて、その他の特異的結合対には、（ストレプト）アビジン及びビオチン；ハプテン及びハプテンに特異的な抗体；相補的ヌクレオチド配列；酵素補因子又は基質及び酵素などが含まれる。
【００３３】
「量子ドット（ＱＤ）」は、通常、セレン化カドミウムから作製されるナノスケールの半導体結晶構造を意味し、光を吸収し、次いで特異的な色で数ナノ秒後に光を再発光する。
【００３４】
様々な結合又は反応性表面（例えば、アミノ、カルボキシル、ストレプトアビジン、プロテインＡ、ビオチン及び免疫グロブリン）を有するＱＤが市販されている（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）。
【００３５】
ポリヌクレオチドは、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡ又はＲＮＡもしくはＤＮＡ模倣物（ＰＮＡなど）の核酸ポリマー及びこれらの誘導体、及びその相同体である。従って、ポリヌクレオチドは、天然の核酸塩基、糖類及びヌクレオシド間（骨格）共有結合から成るポリマー、ならびに同様に機能する非天然部分を有するポリマーを包含する。このような修飾又は置換核酸ポリマーは当技術分野で周知であり、本発明の目的に対して「類似体」と呼ばれる。オリゴヌクレオチドは一般に、約１０から約１６０又は２００ヌクレオチドの短いポリヌクレオチドである。
【００３６】
「ＣＴ又はＣＴＳＷ変異体ポリヌクレオチド」又は「ＣＴ又はＣＴＳＷ変異体核酸配列」は、ＣＴ又はＣＴＳＷの核酸配列と、少なくとも約６０％の核酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも約６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％の核酸配列同一性及びさらにより好ましくは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有するＣＴ又はＣＴＳＷ変異体ポリヌクレオチドを意味する。変異体には天然のヌクレオチド配列は包含されない。
【００３７】
通常、ＣＴ又はＣＴＳＷ変異体ポリヌクレオチドは、少なくとも約８ヌクレオチド長、多くは少なくとも約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９  ３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０ヌクレオチド長又はさらに約７５−２００ヌクレオチド長以上である。
【００３８】
ＣＴ又はＣＴＳＷ−核酸配列に関する「パーセンテージ（％）核酸配列同一性」は、％配列同一性を最大にするように配列をアライン（整列）させ（必要に応じて）ギャップを導入した後、関心のあるＣＴ又はＣＴＳＷ配列のヌクレオチドと同一である候補配列におけるヌクレオチドのパーセンテージとして定義される。当技術分野の技術内である様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公開されているコンピュータソフトウェアを用いて、％核酸配列同一性を調べるためのアラインメント（整列化）を行うことができる。当業者は、比較する配列の全長にわたり最大のアラインメントを得るのに必要とされる何らかのアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するのに適切なパラメータを決定することができる。
【００３９】
ヌクレオチド配列のアラインメント（整列化）を行う場合、ある核酸配列Ｄに対する、ある核酸配列Ｃの％核酸配列同一性（ある核酸配列Ｄに対する、ある程度の％核酸配列同一性を有する又は含むある核酸配列Ｃとして代替的に使用することができる。）を次のように計算することができる：
％核酸配列同一性＝Ｗ／Ｚ・１００（式中、Ｗは、配列アラインメントプログラム又はアルゴリズムのＣ及びＤのアラインメントにより完全な一致としてスコア化されるヌクレオチド数であり、ＺはＤにおけるヌクレオチド総数である。）。
【００４０】
核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと等しくない場合、Ｄに対するＣの％核酸配列同一性はＤに対するＣの％核酸配列同一性とは等しくない。
【００４１】
「％配列同一性を有するポリヌクレオチドから必ずなる」とは、ポリヌクレオチドに適用される場合、ポリヌクレオチドが実質的に長さは異なるが配列は異ならないことを意味する。このように、１００ヌクレオチドの既知の配列「Ｂ」に対して８０％配列同一性を有するポリヌクレオチドから必ずなるポリヌクレオチド「Ａ」は、ポリヌクレオチド「Ａ」が約１００ｎｔｓ長であるが、２０ｎｔｓ以下が「Ｂ配列」と異なり得ることを意味する。ポリヌクレオチドは、意図する二次構造を生成させるために実質的に非同一配列が付加される場合など、特異的な型のプローブ、プライマー及び他の分子ツールなどを生成させるための末端への１−１５ヌクレオチドの付加のために、より長い又はより短くてもよい。このような非同一ヌクレオチドは、配列が「から必ずなる」により修飾される場合、配列同一性の計算において考慮されない。
【００４２】
核酸分子ハイブリッド形成及びクローニングのための当技術分野で周知の方法を用いて、プローブとしての特定のヒト配列の全て又は一部との、低、中程度又は高ストリンジェンシーハイブリッド形成により、オルトログ（即ち、ヒト以外の種由来のＣＴ又はＣＴＳＷをコードする核酸）又は他の関連配列（例えば、パラログ及びキセノログ）を得ることができる。
【００４３】
反応状態の「ストリンジェンシー」により、相補的断片とハイブリッド形成するための１本鎖ＤＮＡの特異性が決定される。ハイブリッド形成ストリンジェンシーは、ＤＮＡ２本鎖を形成する傾向の低下につれて高くなる。核酸分子ハイブリッド形成反応において、（例えばライブラリからの全長クローンを同定するために使用することができる）特異的ハイブリッド形成（高ストリンジェンシー）を促進するために、ストリンジェンシーを選択することができる。関連するが完全に同じではないＤＮＡ分子（相同であるが同一ではない）又はセグメントを同定するために、低い特異的ハイブリッド形成（低ストリンジェンシー）を使用することができる。
【００４４】
（１）相補的塩基対の数、（２）塩基対のタイプ、（３）反応混合物の塩濃度（イオン強度）、（４）反応温度及び（５）ＤＮＡ２本鎖安定性を低下させるホルムアミドなどのある種の有機溶媒の存在によって、ＤＮＡ２本鎖を安定化させる。一般的なアプローチは、温度を変化させることであり、比較的高い温度で反応条件がよりストリンジェントになること（Ａｕｓｂｅｌら、１９８７）は、ハイブリッド形成反応のストリンジェンシーを良好に説明する。
【００４５】
「ストリンジェントな条件」下でのハイブリッド形成とは、互いに少なくとも６０％相同のヌクレオチド配列がハイブリッド形成し続けるハイブリッド形成プロトコールを言う。
【００４６】
ポリヌクレオチドは、ペプチド（例えばインビボでの宿主細胞の標的化のため）又は細胞膜を越える輸送を促進する物質などの他の付加基を含み得る。さらに、ハイブリッド形成を惹起する切断剤（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌら、１９８８）又は挿入剤（Ｚｏｎ、１９８８）でオリゴヌクレオチドを修飾することができる。オリゴヌクレオチドを別の分子、例えば、ペプチド、ハイブリッド形成惹起架橋剤、輸送剤、ハイブリッド形成惹起切断剤などに連結することができる。
【００４７】
有用なポリヌクレオチド類似体には、修飾骨格又は非天然ヌクレオシド間連結を有するポリマーが含まれる。修飾骨格は、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル及び他のアルキルホスホネートなど、骨格にリン原子を保持するもの、ならびに、短鎖アルキル又はシクロアルキルヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子及びアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結又は１以上の短鎖へテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド間連結により形成される骨格など、リン原子を持たないものを含む。修飾核酸分子ポリマー（類似体）は、１以上の修飾糖部分を含有し得る。
【００４８】
ヌクレオチド単位の糖及びヌクレオシド間連結の両方が新規の基で置換されているＲＮＡ又はＤＮＡ模倣物である類似体も有用である。これらの模倣物において、塩基単位は、標的配列とのハイブリッド形成のために維持される。優れたハイブリッド形成特性を有することが示されているこのような模倣物の例は、ペプチド核酸分子（ＰＮＡ）である（Ｂｕｃｈａｒｄｔら、１９９２；Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９１）。
【００４９】
ヌクレオチドの領域には、天然のヌクレオチド以外の部分、例えば、本明細書中で記載のように標識として機能する部分で、置換、化学的、酵素的又はその他の適切な手段により核酸分子が共有結合的に修飾されている誘導体が含まれる。
【００５０】
従って、本発明のポリヌクレオチドは、標的配列、例えば、配列番号１−３及び５−２５（この核酸配列の類似体及び／又は誘導体及びその相同体を含む。）の核酸配列の何れか１つを有する核酸分子、に対して特異的にハイブリッド形成するプライマー及びプローブを含む。ＣＴＳＷを含むクラミジア・トラコマチスを増幅又は検出するために、プライマー及び／又はプローブとして、本発明のポリヌクレオチドを使用することができる。
【００５１】
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ；ＵＳＡ）、ＤｕＰｏｎｔ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ；ＵＳＡ）又はＭｉｌｌｉｇｅｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ；ＵＳＡ）から入手可能なものなどの市販の装置を用いた固相合成など、従来の技術によって、配列番号１−３及び５−２５のポリヌクレオチドを調製することができる。ホスホロチオエート及びアルキル化誘導体などの修飾ポリヌクレオチドもまた、当技術分野で公知の同様の方法で、容易に調製することができる（Ｆｉｎｏ、１９９５；Ｍａｔｔｉｎｇｌｙ、１９９５；Ｒｕｔｈ、１９９０）。
【００５２】
試験試料中のＣＴ又はＣＴＳＷ核酸の検出又は定量又は両方のために、本発明によるポリヌクレオチドをプローブとして使用することができる。適切なハイブリッド形成条件下で、配列番号１−３及び５−２５のポリヌクレオチドの少なくとも１つと試験試料を接触させ、次に、当技術分野で周知の方法によって、標的配列とこのポリヌクレオチドの少なくとも１つとの間のハイブリッド形成を検出する。
【００５３】
「プローブ」は、具体的な用途に依存して、様々な長さ、好ましくは少なくとも約１０ｎｔ、１００ｎｔ以上、のポリヌクレオチド配列である。同一、同様又は相補的なポリヌクレオチド配列を検出するために、プローブを使用する。天然又は組み換えソースから、非常に特異的で、短いオリゴマープローブよりもハイブリッド形成が遅い、より長いプローブを得ることができる。プローブは、１本鎖、２本鎖又はより多くの鎖であり得、ＰＣＲ、膜に基づくハイブリッド形成技術又は酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）のような技術において特異性を有するように設計し得る。プローブは、ｍＲＮＡ標的など、１２、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０又は４００塩基ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する実質的に精製されたオリゴヌクレオチドであり得る。
【００５４】
ポリヌクレオチドのその標的配列とのハイブリッド形成能に悪影響を及ぼさないように配列番号１−３及び５−２５のポリヌクレオチドに検出可能な標識を組み込み得る。
【００５５】
「捕捉標識」は、通常、伸長産物及び何らかのそのような産物と会合したプローブをその他の増幅反応物と識別するために使用される。特異的結合メンバーはこの目的に非常に適している。このようなプローブは、ハイブリッド形成条件下で伸長しないようにその３’末端を遮断し得る。プローブの伸長を妨げるための方法は周知であり、当業者が選択できることである。通常、プローブの３’末端にリン酸基を付加することで、プローブの伸長を十分に遮断することができる。
【００５６】
プライマー増幅産物を検出するために標識を用いる場合、場合によっては捕捉標識又は検出可能な標識の何れかでプライマー配列を標識することができる。プローブ配列は、プライマー配列により生成された配列とハイブリッド形成させるために使用され、通常はプライマー配列を含まない配列とハイブリッド形成する。プローブ配列も捕捉標識又は検出標識の何れかで標識することができるが、但し、プライマーを捕捉標識で標識する場合はプローブを検出標識で標識し、逆もまた同様である。コピー配列：プローブハイブリッドが形成されたら、コピー配列及びプローブ配列上の識別標識（即ち、捕捉及び検出標識）を使用してそのようなハイブリッドを分離し、検出することができる。本発明のある実施形態において、市販のＡｂｂｏｔｔ  ｍ２０００（登録商標）機器（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｃ．、Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅ、ＩＬ；ＵＳＡ）によって使用されるプロトコールに従って検出を行う。
【００５７】
配列番号１−３及び５−２５は、サンドイッチ型アッセイにおける捕捉プローブ又はディスクロージャー（ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ）プローブとして使用することもできる。簡潔に述べると、ポリヌクレオチド捕捉プローブを固体支持体に連結させ、捕捉プローブと試験試料中に存在する何らかの標的核酸との間でプローブ：標的ハイブリッドが形成されるように、適切なハイブリッド形成条件下で試験試料と接触させる。１回以上の適切な洗浄段階後、通常は第二の「ディスクロージャー（ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ）」プローブによって又はハイブリッド分子を認識する特異的抗体によって、プローブ：標的ハイブリッドを検出する。
【００５８】
修飾核酸ハイブリッド形成アッセイにおいて本発明のポリヌクレオチドを使用することができる。例えばＰａｎｄｉａｎら（Ｐａｎｄｉａｎら、１９９７）は、核酸分子ハイブリッド形成アッセイにおいて検出シグナルを増幅するための方法を開示する。第一のポリヌクレオチドプローブ配列を標的配列とハイブリッド形成させ、その後プローブ：標的ハイブリッドを免疫学的に捕捉して固定化する。次に、多数の反復配列単位を含有する第二のポリヌクレオチドプローブをプローブ：標的ハイブリッドのプローブ成分に対してハイブリッドを形成させる。標識した核酸配列プローブを用いて、第二のプローブ中の反復配列単位の各々に１つずつハイブリッド形成させることによって複合体を検出する。第二のプローブへの複数の標識化プローブの結合により、検出シグナルが増幅され、アッセイ感度が向上する。第一のプローブとして直接、又はさらなる反復配列単位を組み込むために修飾されている第二のプローブとして、の何れかで、このような修飾ハイブリッド形成アッセイにおいて配列番号１−３及び５−２５を使用することができる。
【００５９】
本発明の実施
ＣＴ及びＣＴＳＷヌクレオチド配列の増幅及び検出
試料中のＣＴ又はＣＴＳＷを増幅及び検出するために、プライマー／プローブセットとして、配列番号１−３及び５−２５のポリヌクレオチドを使用することができる。標的配列を増幅するために、何らかの特定のプライマー／プローブセット（セットは表２で例示する。）中のプライマーを使用することができる。殆どの場合、このプローブは、プライマーの１つにより生成された標的配列のコピーとハイブリッド形成し、一般に、一連の増幅反応中に生成された標的配列の何れかのコピーの検出を促進する。適切なプライマー及びプローブが組み合わせられる場合、ＣＴ又はＣＴＳＷの何れか又はＣＴ及びＣＴＳＷの両方を特異的かつ高感度で検出するための核酸増幅手順に従い、全てのプライマー／プローブセットを使用することができる。その他のプライマー及び／又はプローブと組み合わせて、プライマー／プローブセットの個々のプライマー及びプローブを使用することもできる。
【００６０】
増幅手順は当技術分野で周知であり、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＴＭＡ、ローリングサークル増幅、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、リガーゼ連鎖反応及び鎖置換増幅（ＳＤＡ）が含まれる。当業者にとって当然のことながら、ある種の増幅技術での使用のために、プライマーを修飾する必要がある場合があり得；例えば、ＳＤＡプライマーは通常、制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位を構成するさらなるヌクレオチドを５’末端付近に含む。ＮＡＳＢＡの場合、プライマーは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを構成するさらなるヌクレオチドを５’末端付近に含む。このように修飾されたポリヌクレオチドは、本発明の範囲内であるとみなされる。
【００６１】
増幅反応のためにプライマーを選択する場合、基準を考慮する必要がある。例えば、プライマーは、３’での２本鎖形成の可能性が最小になるように、及び融解温度（Ｔｍ）が標的配列へのアニーリングを最適化し非特異的アニーリングを最小化するために十分に近くなるように、選択されるべきである。これに関連して、標的核酸配列を特異的に増幅するための増幅反応においてプライマーとして使用することができる組み合わせにおいて、本発明によるポリヌクレオチドが提供される。これらの組み合わせを表２に与え、プローブとして使用することができる配列を下記で詳述する。
【００６２】
【表２】
0005619602.tif 000004
0005619602.tif 000005
0005619602.tif 000006
0005619602.tif 000007
0005619602.tif 000008
0005619602.tif 000009
0005619602.tif 000010
0005619602.tif 000011
【００６３】
プローブ
「プローブ」として表２で列挙した配列に加えて、プローブは、配列番号４４の何れかの部分、配列番号１及び２が増幅プライマーとして使用された場合に増幅される領域又はその相補体を含み得る。このプローブは、通常配列番号４４のｎ個の連続ヌクレオチド又はその相補体であり、１０≦ｎ≦１４０である。配列番号４４は以下のとおりである。
【００６４】
【化１】
0005619602.tif 000012
【００６５】
さらに、プローブは、感度又は検出を実質的に損なわずに、配列番号４４の配列又はその一部から逸脱し得る。従って、プローブが、配列番号４４又はその相補体又はその一部又はこれらの部分の相補体の核酸配列と、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％の核酸配列同一性及びさらにより好ましくは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し得る。プローブは修飾された配列であり得るので、例えば、二次構造形成（例えばステムループ）を促進するためにさらなるヌクレオチドが３’及び／又は５’末端に付加される又は配列番号４４の配列内に散在するようにされ、また、プローブ配列は配列番号４４の配列との同一性が７０％未満であり得、アッセイは実質的に感度を保持する。
【００６６】
同様に、プライマーは感度を実質的に損なうことなく、表２で示される配列から逸脱し得る。
【００６７】
ＣＴ及びＣＴＳＷ標的の増幅
増幅法は通常、（ａ）核酸増幅試薬と、少なくとも１つの本発明のプライマー／プローブセットと及び少なくとも１つの標的配列を含有する疑いのある試験試料と、を含む反応混合液；及び（ｂ）標的配列が存在する場合、標的配列に相補的な核酸配列の少なくとも１コピーを生成させるための増幅条件にその混合物を供することを含む。
【００６８】
例えば１０回から１００回の間の（通常は約２０回から約６０回、より一般的には約２５回から約４５回）反応混合物の温度サイクリングによって、例えば検出段階の前に上記方法の段階（ｂ）を何れかの適切な回数、繰り返すことができる。
【００６９】
核酸増幅試薬は、ポリメラーゼ活性を有する酵素、酵素補因子、例えばマグネシウム又はマンガンなど；塩；ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）；及びデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ）を含む。
【００７０】
増幅条件は、１以上の核酸配列のアニーリング及び伸長を促進するものである。このようなアニーリングは、かなり予測可能な形で、温度、イオン強度、配列の長さ、相補性及び配列のＧ：Ｃ含量を含むいくつかのパラメータに依存する。例えば、相補的核酸配列の環境において温度を低下させることによってアニーリングが促進される。通常、診断への適用では、Ｔｍより約２℃から１８℃（例えばおよそ１０℃）低いハイブリッド形成温度を使用する。イオン強度もＴｍに影響を与える。一般的な塩濃度は、陽イオンの性質及び価数に依存するが、これは当業者にとって当然であろう。同様に、Ｇ：Ｃ含量が高くなること及び配列が長くなることによっても２本鎖形成が安定化される。一般に、約３０ｂｐ以下でＧ：Ｃ含量が高いプローブは良好に働く。
【００７１】
最後に、プライマー又はプローブのＴｍ前後でハイブリッド形成温度を選択する。このように、特定のプライマー／プローブセットに対する適切なハイブリッド形成条件を得ることはＰＣＲ技術分野の通常の技術の範囲内である。
【００７２】
何れかの特定のプライマー／プローブセットのプライマー配列（配列番号１、２及び５−１６）を増幅プライマーとして使用することができる。
【００７３】
ある実施形態において、検出方法は、一般に、核酸増幅試薬と、少なくとも１つの本発明のプライマー／プローブセットと及び少なくとも１個の標的配列を含有する疑いのある試験試料と、を含む反応混合液を形成すること；（ｂ）標的配列に相補的な核酸配列の少なくとも１コピーを生成させるための増幅条件にこの混合物を供すること；（ｃ）プローブ及びその標的配列に相補的な核酸配列を含むハイブリッドを形成させるために、標的配列に相補的な核酸配列とプローブをハイブリッド形成させること；及び（ｄ）試料中での標的配列（ＣＴ及びＣＴＳＷ及び／又は対照配列）の存在の指標としてハイブリッドを検出することを含む。
【００７４】
当技術分野で公知の何れかの方法によって、本発明のポリヌクレオチドを用いた標的核酸配列増幅により産生された特異的単位複製配列を検出することができる。例えば、増幅反応後に従来の技術により単位複製配列を直接検出できるように、増幅反応で使用されるプライマーの１以上を標識することができる。あるいは、増幅反応を完了した後に、増幅反応で使用されるプライマーの１つからなる標識されたプローブ又は標識されているプライマー配列と異なる、増幅配列の領域と相補的な第三のポリヌクレオチドを添加することができる。プローブをハイブリッド形成させ、あらゆる複合体を洗浄し、標識を検出する。当業者にとって当然のことながら、上記で概説したように、当技術分野で公知の標準的技術により反応混合物の温度サイクリングを行うことによって、段階（ｃ）の前に上記方法の段階（ｂ）を数回繰り返すことができる。
【００７５】
増幅の間又はその後、あらゆる増幅産物を検出することができる。増幅中に標的配列の増幅を検出するための方法は上記で述べられており、Ｇｅｌｆａｎｄら（Ｇｅｌｆａｎｄら、１９９３）による方法である。増幅産物ならびに何らかの増幅セグメントのおおよその大きさを検出するために、ゲル電気泳動を使用することができる。あるいは、増幅産物をプローブとハイブリッド形成させ、次いで他の反応成分から分離し、微小粒子及び標識したプローブを用いて検出する。
【００７６】
１つの密閉反応容器中で同時に行う標的核酸配列の増幅及び検出両方を可能にする手段が有利である。このような手段により、増幅後プロセシング段階における「持ち越し」混入のリスクが避けられ、これにより、ハイスループットアッセイ及び自動化手段が可能になる。さらに、このタイプの手段により、増幅反応の「リアルタイム」の監視ならびに従来の「エンドポイント」監視が可能になる。
【００７７】
本発明は、単一容器方式で試験試料中の標的核酸配列を特異的に増幅及び検出するための方法における配列番号１−３及び５−２５のポリヌクレオチドの使用を含む。ある実施形態において、挿入色素（例えばＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ）又は増幅配列に特異的に結合する抗体を反応容器に添加する。別の実施形態において、増幅配列の領域に相補的な、プライマー配列とは異なる第三のポリヌクレオチドがプローブとして反応に含まれ得る。
【００７８】
プライマーでの増幅及びプローブでの標的の検出の両方が１本の密閉反応容器中で同時に行われるアッセイでの使用の場合、プローブはある種の特性を有する。例えば、プローブは増幅反応中に存在するので、プローブは反応を妨害せず、また反応条件下で安定であるべきでもある。リアルタイム検出の場合、プローブは増幅条件下でその標的配列に結合し、標的配列に結合する際のみシグナルを放出しなければならない。特にこのタイプの手段によく適しているプローブ分子の例には、Ａｂｒａｖａｙａら（Ａｂｒａｖａｙａら、２００５）により記載されるものなどの、分子指標プローブ、ＴＡＱＭＡＮ（Ｒ）プローブ及び直線状プローブが含まれる。
【００７９】
ＴＡＱＭＡＮ（Ｒ）プローブは、蛍光色素分子で一方の末端が標識され、消光剤で他方の末端が標識される標的配列に相補的なポリヌクレオチドから構成される、二重標識、蛍光性核酸分子プローブである。増幅反応において、リアルタイムプローブとしてＴＡＱＭＡＮ（Ｒ）プローブを使用することができる。構築された場合、蛍光色素分子及び消光剤の近接近によって、確実に蛍光色素分子が内部で消光される。伸びている際は、ポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によってプローブが切断され、蛍光色素分子が放出される。放出された蛍光色素分子はもはや消光されず、従って検出可能なシグナルが生じる。
【００８０】
分子指標は、ステムループ（ヘアピン）構造を形成するポリヌクレオチドプローブである。このループは１本鎖であり、標的配列に相補的な配列を含有し、一方、このステムは通常、標的配列に無関係であり、自己ハイブリッド形成して２本鎖を形成する。標的配列に相補的であり、且つ、自己ハイブリッド形成することができるヌクレオチドもまた、ステム領域の部分を形成することができる。ステムの片方の腕に蛍光色素分子部分が結合し、他方の腕に消光剤部分が結合する。ポリヌクレオチドがヘアピンを形成する場合、蛍光色素分子及び消光剤は近接近であり、蛍光色素分子が消光される。標的配列に結合すると、蛍光色素分子及び消光剤が分離され、蛍光色素分子はもはや消光されず、検出可能なシグナルが生じる。ある実施形態において、プローブは、隣接自己−相補的領域とともに本発明のポリヌクレオチドを含む分子指標プローブである。本発明のポリヌクレオチドは、分子指標のループ領域を構成するか又はこれらはループ領域及びステム領域の一部を構成することができる。このように、自己相補的なステム配列は標的配列と無関係であり得るか又は標的配列と部分的に相補的であり得る。
【００８１】
Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ消光剤（ＢＨＱ（Ｒ）；Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．；Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）などの、蛍光色素分子及び高効率消光剤とともに、直線状プローブとして本発明のポリヌクレオチドを使用することもできる。高消光効率及びＢＨＱ（Ｒ）色素の生来の蛍光の欠失によって、「ランダムコイル」消光が、一方の末端が蛍光色素分子で標識され他方がＢＨＱ（Ｒ）色素で標識される直線状プローブで起こり得るようになり、このように、プローブが溶液中にある場合、確実に、蛍光色素分子が蛍光を発しないようになる。その標的配列に結合すると、プローブが伸びて、従って蛍光色素分子及び消光剤が空間的に分離され、蛍光色素分子はもはや消光されない。分子指標又はＴＡＱＭＡＮ（Ｒ）プローブにおいて、消光剤部分として、ＢＨＱ（Ｒ）色素を使用することもできる。
【００８２】
本発明のポリヌクレオチドとの使用のための適切な蛍光色素分子及び消光剤を容易に決定することができる（Ｍａｒｒａｓら、１９９９；Ｔｙａｇｉら、１９９８）。多くの蛍光色素分子及び消光剤は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、ＵＳＡ）又はＢｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．（Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡ、ＵＳ）から市販されている。有用な蛍光色素分子の例には、ジハロ−（Ｃ１からＣ８）ジアルコキシカルボキシフルオレセイン、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、クマリン及びクマリン誘導体、Ｎ−（２−アミノエチル）−４−アミノ−３，６−ジスルホ−１，８−ナフタルイミド２カリウム塩（Ｌｕｃｉｆｅｒ  ｙｅｌｌｏｗ）、スルホローダミン１０１塩化スルホニル（ＴＥＸＡＳ  ＲＥＤ（Ｒ））、テトラメチルローダミン、テトラクロロ−６−カルボキシフルオロセイン、５−カルボキシローダミン、シアニン色素及び誘導体などの、蛍光及び蛍光誘導体が含まれる。消光剤の例には、ＤＡＢＣＹＬ、４’−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＳＹＬ）、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−マレイミド（ＤＡＢＭＩ）、テトラメチルローダミン、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、ＢＨＱ（Ｒ）色素などが含まれる。金及び銀から形成されるものなど、何らかの蛍光シグナルを増強するために、金属ナノ粒子を使用することができる。これらが染色されたＤＮＡの近接近となるように、標的化分子でタグ付加することができることが多い。ＱＤを使用することもできる。
【００８３】
分子指標プローブとの使用のためのプライマー選択には、ある種の基準に合致する必要がある。例えば、分子指標がプライマーと結合して結果として高いバックグラウンドシグナルが生じ得る相補性領域がないことは重要である。
【００８４】
従って、試験試料中の標的核酸配列を特異的に増幅及び検出するのに使用することができる、２つのプライマー及び少なくとも１つのプローブを含む組み合わせにおいて、本発明によるポリヌクレオチドがさらに提供される。関連実施形態において、分子指標ＰＣＲによる標的核酸配列の増幅及び検出のために、プライマー／プローブセットが提供される。
【００８５】
リアルタイムで増幅反応の進行を監視するために、分子指標プローブを使用することができる。一連の増幅反応中、分子指標はプローブに対するアニーリング温度でその標的配列と相互作用し、蛍光シグナルが生じる。増幅反応で生成する標的鎖の数が増加するにつれて、その標的に結合する分子指標の数が同時に増加し、蛍光シグナルの強度が上昇する。
【００８６】
従って、本発明によると、増幅反応の最後に検出可能なシグナルの強度を測定する検出において又は増幅反応を通じてシグナルを監視するリアルタイム検出においての何れでも、２つのプライマー及び少なくとも１つのプローブの組み合わせを使用することができる。
【００８７】
複数の同時単位複製配列検出
１つの増幅反応で何れか又は両方の生物から標的配列を増幅するために、ナイゼリア・ゴノーホエア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）（ＮＧ）などの疾患に対するその他のマーカーの増幅のためのプライマーと組み合わせて、ＣＴプライマーを使用することができる。同時増幅反応と続く種−特異的ハイブリッド形成反応により、ＣＴ又はＮＧの何れか又は両方の生物による感染に関する、試験試料の同時評価が可能となる。プライマー／プローブセットの組み合わせ（例えば、１つがＣＴ特異的プライマー／プローブセットから選択され、他方がＮＧ−特異的プライマー／プローブセットから選択される；表３で例を示す。）を用いて、１つの反応混合液中で、ＮＧ及びＣＴ又はＣＴＳＷの何れかの両方（又はＣＴ及びＣＴＳＷの両方）を同時に増幅及び／又は検出することができる。言うまでもなく、各プローブは、その他のプローブのそれぞれから検出可能に区別される。例えば、２以上のプローブが同じ反応混合液中に存在する場合、各プローブの蛍光色素分子部分は異なる波長で蛍光を発する。
【００８８】
【表３】
0005619602.tif 000013
【００８９】
ある実施形態において、本発明は、第一及び第二のポリヌクレオチドを含む、ＣＴ及びＣＴＳＷを増幅及び／又は検出するのに有用なポリヌクレオチド試薬の組み合わせに関し、第一のポリヌクレオチドは、配列番号１、５−９、１１−１３及び１４並びにこれらの相補体のポリヌクレオチドと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列から必ずなり；第二のポリヌクレオチドは、配列番号２、１０、１５、１６及び２６並びにこれらの相補体のポリヌクレオチドと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列から必ずなる。第一及び第二のポリヌクレオチドは、増幅反応においてプライマーとして働き得る。このポリヌクレオチド試薬の組み合わせは、配列番号３、１７−２５、２７、４２及び［配列番号４４のｎ個（１０≦ｎ≦１４０）の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチド］及びこれらの相補体からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する第三のポリヌクレオチドをさらに含み得る。第三のポリヌクレオチドは、例えば増幅反応において、配列番号１、２、５−１４、１６及び２６（又はその相補体）のポリヌクレオチドにより増幅される配列のハイブリッド形成及び検出のためのプローブとして作用し得る。
【００９０】
本発明はまた追加の実施形態を含み、ここにおいて、上記で列挙された第一及び第二の実施形態の、前記ポリヌクレオチド試薬の組み合わせは、第四、第五及び第六のポリヌクレオチドをさらに含み、この組み合わせは、ＣＴ及びＣＴＳＷの検出及び／又は増幅に有用であり、第四のポリヌクレオチドは、配列番号２８−３０及びこれらの相補体からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列から必ずなり；第五のポリヌクレオチドは、配列番号３１及びこれの相補体からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列から必ずなり；第六のポリヌクレオチドは、基本的に、配列番号３２−３４及びこれらの相補体からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列から必ずなる。ＣＴとＣＴＳＷを区別するために、配列番号３２−３４のプローブ上の検出可能な標識とは異なる波長でシグナルを放出する検出可能な標識で配列番号３、１７−２５、２７、４２及び４４のプローブを標識することができる。
【００９１】
本発明はまた別の実施形態も含み、ここにおいて、上記で列挙された第一及び第二の実施形態の、前記ポリヌクレオチド試薬の組み合わせは、第四、第五及び第六のポリヌクレオチドをさらに含み、この組み合わせは、ＣＴ、ＣＴＳＷ及びＮＧの検出及び／又は増幅に有用であり、第四のポリヌクレオチドは、配列番号３５及びこれの相補体のポリヌクレオチドと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列から必ずなり；第五のポリヌクレオチドは、配列番号３６及びこれの相補体のポリヌクレオチドと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列から必ずなり；第六のポリヌクレオチドは、配列番号３７−３９及びこれらの相補体からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列から必ずなる。ＣＴとＣＴＳＷを区別するために、配列番号３２−３４のプローブ上の検出可能な標識とは異なる波長でシグナルを生じる検出可能な標識で配列番号３、１７−２５、２７、４２及び４４のプローブを標識することができ；さらに、配列番号３７−３９のＮＧプローブは、ＣＴ及びＣＴＳＷに対するプローブとは異なる波長で放出するさらなる第三の検出可能な標識を含み得る。
【００９２】
本発明はまた別の実施形態を含み、ここにおいて、上記で列挙された第一及び第二の実施形態の、前記ポリヌクレオチド試薬の組み合わせは、第四、第五、第六、第七、第八及び第九のポリヌクレオチドをさらに含み、この組み合わせは、ＣＴ、ＣＴＳＷ及びＮＧを検出及び／又は増幅するのに有用であり、第四のポリヌクレオチドは、配列番号２８−３０及びこれらの相補体からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列から必ずなり；第五のポリヌクレオチドは、配列番号３１及びこれの相補体のポリヌクレオチドと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列から必ずなり；第六のポリヌクレオチドは、配列番号３２、３３及び３４及びこれらの相補体からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列から必ずなり；第七のポリヌクレオチドは、配列番号３５及びこれの相補体のポリヌクレオチドと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列から必ずなり；第八のポリヌクレオチドは、配列番号３６及びこれの相補体のポリヌクレオチドと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列から必ずなり；第九のポリヌクレオチドは、配列番号３７、３８、３９及びこれらの相補体からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列から必ずなる。ＣＴをＣＴＳＷと区別するために、配列番号３２−３４のプローブ上の検出可能な標識とは異なる波長でシグナルを放出する検出可能な標識で配列番号３、１７−２５、２７、４２及び４４のプローブを標識することができ；さらに、配列番号３７−３９のＮＧプローブは、ＣＴ及びＣＴＳＷに対するプローブとは異なる波長で放出するさらなる第三の検出可能な標識を含み得る。
【００９３】
他の実施形態において、少なくとも１つのポリヌクレオチド試薬が検出可能な標識又は消光剤を含み得る。
【００９４】
他の実施形態において、本発明は、上記で列挙した実施形態のポリヌクレオチドの組み合わせを含むキットを含み、このキットはまた増幅試薬も含む。
【００９５】
さらに他の実施形態において、本発明は、上記で列挙された実施形態１−５のポリヌクレオチド試薬の組み合わせを用いて、ＣＴ、ＣＴＳＷ及び／又はＮＧを増幅及び／又は検出する方法を含む。これらの反応液はさらに、少なくとも１つの対照ポリヌクレオチド、陽性及び／又は陰性対照、並びに正規化に使用することができるものに対するもの、を含み得る。しかし、ＣＴ又はＣＴＳＷを検出する場合で、反応がＤＮＡポリメラーゼ７．５ユニット、１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＫＣｌ、９．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、第一及び第二のポリヌクレオチド５００ｎＭ及び６０ｎＭ  ＲＯＸからなる場合、
第一のポリヌクレオチドが配列番号１又はこれの相補体の核酸配列からなるとき、第二のポリヌクレオチドは配列番号１６又はこれの相補体の核酸配列から構成されなく及び第三のポリヌクレオチドは配列番号２３又はこれの相補体の核酸配列から構成されなく、
第一のポリヌクレオチドが配列番号１又はこれの相補体の核酸配列からなるとき、第二のポリヌクレオチドは配列番号２又はこれの相補体の核酸配列から構成されなく及び第三のポリヌクレオチドは配列番号２２又はこれの相補体の核酸配列から構成されなく、
第一のポリヌクレオチドが配列番号８もしくは９又はこれらの相補体の核酸配列からなるとき、第二のポリヌクレオチドは配列番号１０もしくは２６又はこれらの相補体の核酸配列から構成されなく及び第三のポリヌクレオチドは配列番号１７又はこれの相補体の核酸配列から構成されなく、
第一のポリヌクレオチドが配列番号５もしくは６又はこれらの相補体の核酸配列からなるとき、第二のポリヌクレオチドは配列番号１０又はこれの相補体の核酸配列から構成されなく及び第三のポリヌクレオチドは配列番号１９又はこれの相補体の核酸配列から構成されなく、
第一のポリヌクレオチドが配列番号１４又はこれの相補体の核酸配列からなるとき、第二のポリヌクレオチドは配列番号２又はこれの相補体の核酸配列から構成されなく及び第三のポリヌクレオチドは配列番号２２又はこれの相補体の核酸配列から構成されない。
【００９６】
定量
ＣＴ及びＣＴＳＷ核酸を定量するために、アッセイにおいて配列番号１−３及び５−２５のポリヌクレオチドを使用することもできる。このように、試験試料中の標的核酸配列を特異的に増幅、検出及び定量するための方法において、本発明によるポリヌクレオチドを使用することができる。
【００９７】
対照
定量的アッセイのための様々なタイプの標準物質が利用可能である。例えば、標準は、アッセイ条件下でのＣＴ又はＣＴＳＷ核酸分子の既知の量の増幅及び検出により収集された標準曲線から構成され得る。あるいは、反応に内部標準を含むことができる。このような内部標準は通常、対照標的核酸配列及び対照ポリヌクレオチドプローブを含む。内部標準は、場合によっては、プライマーのさらなる対をさらに含み得る。これらの対照プライマーの一次配列は本発明のポリヌクレオチドに無関係であり、対照標的核酸配列に特異的であり得る。あるいは、第一の標的配列（例えばＣＴ）に向けられた第一のプライマー／プローブセットからのプライマーと一方の末端で結合し、第二の標的配列（例えばＮＧ）に向けられた第二のプライマー／プローブセットに対するプライマーと他方の末端で結合し、増幅条件下でコピーが生成されるように対照標的配列が設計される場合、さらなるプライマーを使用する必要はない。
【００９８】
本発明に関連して、対照標的核酸配列は、
（ａ）特定の反応で使用されているＣＴ又はＣＴＳＷプライマー又はプライマー対の何れかにより又は個別のＣＴ対照プライマーにより増幅することができ；
（ｂ）適切な条件下で対照プローブと特異的にハイブリッド形成し；及び
（ｃ）同じ条件下でＣＴ−又はＣＴＳＷ−特異的プローブとハイブリッド形成しない、核酸配列である。
【００９９】
本発明に関連して、プローブ分子に対する標準的条件を満たすことに加えて、定量的反応での使用のための対照ポリヌクレオチドプローブは、
（ａ）適切な条件下で対照配列と特異的にハイブリッド形成し；
（ｂ）ＣＴ又はＣＴＳＷ標的配列を検出している場合、同じ条件下でＣＴもしくはＣＴＳＷ配列、ＣＴもしくはＣＴＳＷ−特異的プローブ又はＣＴもしくはＣＴＳＷ特異的プライマーとハイブリッドを形成せず；及び
（ｃ）同じ反応混合液中で使用されるその他のプローブに組み込まれた標識とは異なる検出可能な標識を組み込む。
【０１００】
対照標的核酸及び対照プローブの実際の核酸配列は、それらが両方とも上記で概説した基準に合致するならば、重要ではない。
【０１０１】
「エンドポイント」法又は「リアルタイム」法を用いて、試験試料中の標的核酸の量を定量することができる。定量的アッセイにおいて配列番号１−３及び５−２５のポリヌクレオチドをプローブとして使用する場合、従来のハイブリッド形成プローブ、直線状ＢＨＱ（Ｒ）プローブ、ＴＡＱＭＡＮ（Ｒ）プローブ、分子指標プローブ又はこれらの組合せもしくは修飾型としてこれらを使用することができる。
【０１０２】
ハイスループットアッセイ
ハイスループットアッセイの場合、反応成分は通常、様々な試験試料を含む複数のアッセイ反応物を同じアッセイにおいて監視することを可能にする、マルチウェルマイクロタイタープレートなどの多容器担体又はプラットフォームに収容される。本発明はまた、スクリーニング又はアッセイ工程の効率を高めるための高度に自動化されたハイスループットアッセイももくろむ。スループット時間を大幅に高速化する、試料及び試薬のピペット分注、液体の分配、時間指定温置、マイクロアレイへの試料のフォーマット化、マイクロプレートの温度サイクリング及び適切な検出器でのマイクロプレートの読み取りなどの多くの手順に対する自動化能力のように、多くのハイスループット系が現在市販されている。
【０１０３】
キット
配列番号１−３及び５−２５のポリヌクレオチドは、ＣＴ及びＣＴＳＷ核酸の検出及び／又は定量を可能にするキットの一部として含まれ得る。このようなキットは、プライマー及び／又はプローブとして使用するための本発明の１以上のポリヌクレオチドを含む。本発明のある実施形態において、このポリヌクレオチドは、表２で示されるように、試験試料中のＣＴ及びＣＴＳＷ核酸を特異的に増幅するプライマーとしての使用のための組合せでキット中で提供される。
【０１０４】
ＣＴ及びＣＴＳＷ核酸の検出のためのキットはまた、対照標的核酸及び対照ポリヌクレオチドプローブも含み得る。キットはまた、対照プライマーも含み得、これは対照標的核酸配列を特異的に増幅する。
【０１０５】
キットは、増幅試薬、反応成分及び／又は反応容器を含み得る。１以上のポリヌクレオチドに検出可能標識を組み込むことができる。キットは、ポリヌクレオチドを標識するための試薬も含み得る。キットの１以上の成分は凍結乾燥され得、キットは、凍結乾燥成分の再溶解に適切な試薬をさらに含み得る。このキットは、使用説明書をさらに含有し得る。
【０１０６】
キットを供給する際、組成物の様々な成分を個別の容器に封入し、使用直前に混合し得る。このような成分封入は、個々に、活性成分の長期保存を可能にし得る。例えば、それに連結するポリヌクレオチドを有する粒子のより多くの１つ；基質；及び核酸酵素を個別の容器で供給する。
【０１０７】
様々な成分が保存され、容器の材料に吸着しないか又はそれにより変化しないような何らかの種の容器中でキットに含まれる試薬を供給することができる。例えば、密封ガラスアンプルは、中性の、窒素などの無反応性の気体下で密封されている試薬又は緩衝液のより多くの１つを含有し得る。アンプルは、ガラス、有機ポリマー（ポリカーボネート、ポリスチレンなど）；陶磁、金属又は同様の試薬を保持するために通常使用される何らかのその他の材料などの何らかの適切な材料からなり得る。適切な容器のその他の例には、アンプルと同様の物質から作ることができる単純なボトル及び、アルミニウム又は合金など、内側がアルミ箔で覆われ得る包装材料が含まれる。その他の容器としては、試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、シリンジなどが含まれる。
【０１０８】
説明書とともにキットを供給することもできる。紙又はその他の材料の上に説明書を印刷し得、及び／又は、フロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、ジップディスク、ビデオテープ、オーディオテープなど、電子的可読媒体として供給し得る。
【０１０９】
本発明の、ポリヌクレオチド、方法及びキットは、ＣＴ及びＣＴＳＷ核酸の検出及び／又は定量のための臨床又は研究状況において有用である。従って、これらの状況において、本ポリヌクレオチドは、被験者においてＣＴ及びＣＴＳＷ感染を診断するため、又はＣＴ及びＣＴＳＷに感染した被験者においてＣＴ及びＣＴＳＷ標的核酸配列の量を監視するためのアッセイにおいて使用することができる。被験者における細菌の量を監視することは、抗菌薬治療に対する応答を特定又は監視する上で特に重要であるが、このアッセイは最近死んだ細菌を検出し得るので、治療介入に対してアッセイを好時期に行うことが重要である。
【０１１０】
実施例
以下の実施例は例示のみを目的とし、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。同じように首尾よく本発明を行うことができる、当業者にとって利用可能な様々な代替的技術及び手法がある。
【実施例１】
【０１１１】
ＣＴＳＷプライマー／プローブの組み合わせの候補のスクリーニング
ＣＴの特異的増幅及び検出について、様々な組合せで、新たに設計したプライマー／プローブを試験した。全体で、プライマー又はプローブとして２７種類の配列を試験し、これには配列番号１−３、５−２５、２６、２７及び４３（表１）が含まれた。様々な組み合わせの１５４種類のセットを作った（表２）。配列番号４３を除き、全ての候補プローブをＱＵＡＳＡＲ（登録商標）Ｑ６７０（ＢｉｏＳｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．；Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡ）（ＣＹ５（登録商標）の代替品；Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡ；ＵＳＡ）及びＢＨＱ−２（登録商標）（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（消光剤として）で標識した。配列番号４３を６−カルボキシ-フルオレセイン（ＦＡＭ（登録商標）；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ、ＣＡ；ＵＳＡ）及びＢＨＱ−１（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（消光剤として）で標識した。ＣＴゲノムＤＮＡ調製物をいくつかの異なる希釈度で希釈し、標的として使用し、プライマー／プローブの各セットに対して、ＣＴ／ＮＧ陰性希釈液を陰性対照として使用した。
【０１１２】
各プライマー／プローブの組み合わせに対してマスターミックスを調製した（７．５Ｕ  ＡＭＰＬＩＴＡＱ（登録商標）Ｇｏｌｄ、１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＫＣｌ、９．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、各試験プライマー５００ｎＭ、２００ｎＭプローブ及び６０ｎＭ  ＲＯＸ）。光学反応プレートに試料を添加し、密封した。次に、このプレートをサイクラー／リーダー装置にセットし、実施例２で具体的に述べるサイクリング条件に供した。
【０１１３】
全実施例に対するＰＣＲサイクリング条件には、９５℃で５７０秒、次いで９２℃で１０秒、５８℃で３０秒及び６５℃で６０秒を４５サイクル行うことが含まれた。ＰＣＲ及びリアルタイム検出に使用した装置は、Ａｂｂｏｔｔ  ｍ２０００ｒｔ  サイクラー／リーダー（統合型ＲＥＡＬＴＩＭＥ（登録商標）ＰＣＲ増幅及び検出機器）であった。
【０１１４】
試験したＰＣＲ成分濃度及びサイクル条件下で、全部で１５４種類のうち１４５種類の様々なプライマー／プローブの組み合わせがロバストなリアルタイム増幅及び検出を示した。残りの９種類の組み合わせは、増幅曲線ができないか、結果が不明瞭であるか、シグナルノイズ比が悪いか又は再現性がなかった。これらの９種類の組み合わせは、４、５、１１、１２、１９、２０、４７、４８及び９１であり、これらはさらなる最適化が必要であろう。
【実施例２】
【０１１５】
ＣＴＳＷプライマー／プローブの試験
この実施例において、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ、ＵＳＡ）ＲＥＡＬＴＩＭＥ（登録商標）ＣＴ／ＮＧ診断キットで提供される現在のＣＴ／ＮＧオリゴヌクレオチド試薬に対する特異性及びロバスト性について、新たに発見されたＳｗｉｓｓ  ＣＴ欠損変異体に適応するように新たに設計したプライマー／プローブセットを試験した。ＣＴ／ＮＧオリゴヌクレオチド試薬は、６種類のプライマー及び３種類のプローブ（ＣＴ、ＮＧ及び内部対照（ＩＣ）に対するプライマー及びＣＴ、ＮＧ及びＩＣに対するプローブ）を含有する。６−カルボキシ−フルオレセイン（ＦＡＭ（登録商標）；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ、ＣＡ；ＵＳＡ）でオリジナルのＣＴプローブを標識した。候補プローブは、蛍光色素分子としてＱＵＡＳＡＲ（登録商標）Ｑ６７０（ＣＹ５（登録商標）の代替品；ＢｉｏＳｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡ；ＵＳＡ）を、消光剤としてＢＨＱ−２（登録商標）（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。
【０１１６】
現在のＣＴ／ＮＧに対するプライマー及びプローブ配列を表４で示す。
【０１１７】
【表４】
0005619602.tif 000014
【０１１８】
ＣＴ及びＣＴＳＷを検出するための候補プライマーは、配列番号１及び２であり、プローブは配列番号３であった。配列番号３の５’末端をＱＵＡＳＡＲ（登録商標）Ｑ６７０で標識し、３’末端を消光剤ＢＨＱ−２（登録商標）で標識した。下記表５において、このアッセイ及びこれらの実施例で記載した全アッセイ（必要に応じて）で使用した試薬をまとめる。
【０１１９】
【表５】
0005619602.tif 000015
【０１２０】
【表６】
0005619602.tif 000016
【０１２１】
全ての実施例に対するＰＣＲサイクリング条件には、９５℃で５７０秒、次いで９２℃で１０秒、５８℃で３０秒及び６５℃で６０秒を４５サイクル行うことが含まれた。ＰＣＲ及びリアルタイム検出に使用した装置は、Ａｂｂｏｔｔ  ｍ２０００ｒｔ  サイクラー／リーダー（統合型ＲＥＡＬＴＩＭＥ（登録商標）ＰＣＲ増幅及び検出機器）であった。
【０１２２】
スウェーデンからの２４のＣＴＳＷ臨床分離株を試験した。当技術分野で公知でありＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓに与えられた方法を用いて臨床試料からＤＮＡを精製した。この実施例において、ＲＥＡＬＴＩＭＥ（登録商標）ＣＴ／ＮＧ診断キットからの試薬（表４）にＣＴＳＷプライマー及びプローブを添加した。
【０１２３】
マスターミックスを調製し、これには全部で８プライマー及び４プローブが含有され（表６の組成物を参照）；次に混合液にＩＣを添加し、８４コピー／反応の最終ＩＣ濃度とした。プレート中の各ウェルに最終混合液４７．５μＬを添加した。最終的に、２４のＣＴＳＷ欠損変異体からの溶出液２．５μＬをウェルに添加し、各溶出液が個別に反応条件に供されるようにした。反応プレートを密封し、次いでＡｂｂｏｔｔ  ｍ２０００ｒｔサイクラー／リーダーに置き、サイクリング条件に供した。
【０１２４】
全試料に対して、ＣＹ５（登録商標）シグナルを検出し、これから、配列番号１及び２の配列を有するプライマーによりＣＴＳＷ株プラスミドの標的領域が増幅され、ＣＹ５（登録商標）で標識されている配列番号３の配列を有するプローブによって検出されることが分かった。陰性対照（鋳型不含）はシグナルを示さず、このことから、増幅が特異的であることが示唆された。全試料から有効なＩＣ反応が生じた。
【実施例３】
【０１２５】
現在のＣＴ、ＮＧ及びＩＣ標的の増幅における潜在的影響の評価
この実施例の目的は、配列番号３の配列を有するプローブと組み合わせた配列番号１及び２の配列を有するプライマー、及び配列番号３の配列を有するプローブと組み合わせた配列番号１４及び１５の配列を有するプライマーが、非ＣＴＳＷ  ＣＴ及びＮＧ検出の市販品において現在使用されているプライマー及びプローブを妨害しないことを明らかにすることである。
【０１２６】
それぞれ４８の反応に十分な３種類のマスターミックスを調製した。混合液０（ＭＭ０）には、市販のＣＴ及びＮＧプライマー及びプローブのみが含有された（表４参照）。その他の２つの混合液は、ＣＴ及びＮＧプライマー及びプローブを有し、候補ＣＴプライマー及びプローブの２セットのうち一方が添加された。混合液１（ＭＭ１）は配列番号１、２（ＣＴＳＷプライマー）及び３（ＣＴＳＷプローブ）を有し、混合液４（ＭＭ４）は配列番号１４、１５（ＣＴＳＷプライマー）及び３（ＣＴＳＷプローブ）を有した。候補プローブの５’末端をＱＵＡＳＡＲ（登録商標）Ｑ６７０で、３’末端を消光剤ＢＨＱ−２（登録商標）で標識した。プライマー及びプローブの濃度は表５で示す。各混合液にＩＣを添加し、８４コピー／反応の最終ＩＣ濃度とした。市販のＲＥＡＬＴＩＭＥ（登録商標）ＣＴ／ＮＧ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｋｉｔ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）からのＣＴ／ＮＧカットオフ対照を試料として３種類の全ての混合液に対して試験した。
【０１２７】
試料を光学反応プレートに添加し、密封した。次に、プレートをサイクラー／リーダー装置に入れ、実施例２で具体的に述べたようなサイクリング条件に供した。
【０１２８】
混合液０と混合液１及び４との間で検出されるシグナルの差が有意ではなかったので、配列番号３プローブ及び配列番号１、２、１４及び１５プライマーの添加によって、標的（現在のＣＴ、ＮＧ又はＩＣ標的）の増幅に影響はなかった。
【実施例４】
【０１２９】
非特異的増幅を導入する可能性の評価
この実施例において、本発明のプライマー／プローブによって陰性対照が増幅されないという仮説を試験した。
【０１３０】
配列番号３の配列を有するプローブと組み合わせて配列番号１及び２を市販のＣＴ／ＮＧ反応混合液に添加することによって、マスターミックス（ＭＭ１）を調製した。配列番号３のＣＴプローブの５’末端をＱＵＡＳＡＲ（登録商標）Ｑ６７０で、３’末端を消光剤ＢＨＱ−２（登録商標）で標識した。プライマー及びプローブの濃度は表６で述べるとおりである。各混合液にＩＣを添加し、８４コピー／反応の最終ＩＣ濃度とした。
【０１３１】
陽性対照の２回の反復測定とともに、ＰＣＲ試料プレートあたり９４回の反復測定で陰性試料として陰性希釈液を試験した。ＣＴゲノムＤＮＡ調製物の希釈液及びＣＴゲノム−陽性調製物２５μＬから陽性対照を調製した。光学反応プレートに試料を添加し、密封した。次に、プレートをサイクラー／リーダー装置に入れ、実施例２で具体的に述べたようなサイクリング条件に供した。次いで、ＦＡＭ（登録商標）、ＶＩＣ（登録商標）及びＣＹ５（登録商標）に対して分析し、蛍光色素分子シグナルについてプレートを分析した。下記表７で結果を示す。
【０１３２】
【表７】
0005619602.tif 000017
【０１３３】
表７で示されるように、測定１−３で散発的な低レベルのＣＴ  ＦＡＭ（登録商標）、ＮＧ  ＶＩＣ（登録商標）及びＣＴ  ＣＹ５（登録商標）シグナルが観察された。実験環境からの混入があるか否かを確認するために、全ての実験ベンチを漂白剤で洗浄し、さらに４回実験を繰り返した（表７の測定４−７）。全部で３７６の陰性試料の反復試験のうち（測定４−７）、ＦＡＭ（登録商標）において反復測定のうち１つで低レベルの遅発増幅（ｌａｔｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）が示され、反復測定のうち別の１つでＶＩＣ（登録商標）において低レベルの遅発増幅が示された。その他の全ての反復測定では３つ全てのチャネル（ＦＡＭ（登録商標）、ＶＩＣ（登録商標）及びＣＹ５（登録商標））で増幅シグナルは生じなかった。両低レベル増幅発生は、後の方のサイクル数で起こり、市販のＲＥＡＬＴＩＭＥ（登録商標）ＣＴ／ＮＧアッセイによって陽性として報告されていない。陽性対照によって、有効な陽性増幅曲線が生成された。
【０１３４】
いくつかの散発的で低レベルのシグナルを除き、陰性対照の全ての反復において全３チャネルでシグナルは生じなかった。このように、配列番号１及び２の配列を有するプライマー及び配列番号３の配列を有するプローブをＣＴ／ＮＧオリゴヌクレオチド試薬混合液（表４）に添加することによって、何れのチャネルでもシグナルの上昇は起こらなかった。
【実施例５】
【０１３５】
オリジナルと新規候補プライマー／プローブセットとの間の低レベルＣＴ標的の検出における潜在的相違の評価
この実施例において、ＣＴゲノムＤＮＡ調製物（ＴＥ  ｐＨ８．０及びサケ精巣ＤＮＡ（担体として）中で希釈したＤＮＡ）の３種類の異なる希釈液を用いて、感度について配列番号１−３の配列を有するプライマー／プローブセットを試験した。相対的希釈率は、１、１：７．５及び１：５０であり、患者試料からの低レベルのＣＴを試料が模倣するようにした。
【０１３６】
配列番号３の配列を有するプローブと組み合わせて配列番号１及び２を市販のＣＴ／ＮＧ反応混合液（表４）に添加することによって、マスターミックス（ＭＭ１）を調製した。配列番号３のＣＴプローブの５’末端をＱＵＡＳＡＲ（登録商標）Ｑ６７０で、３’末端を消光剤ＢＨＱ−２（登録商標）で標識した。プライマー及びプローブの濃度は表６で述べるとおりであった。各混合液にＩＣを添加し、８４コピー／反応の最終ＩＣ濃度とした。光学反応プレートに試料を添加し、密封した。次に、プレートをサイクラー／リーダー装置に入れ、実施例２で具体的に述べたようなサイクリング条件に供した。次に、蛍光色素分子シグナル（ＦＡＭ（登録商標）及びＣＹ５（登録商標））についてプレートを分析した。下記表８及び９で結果を示す。
【０１３７】
【表８】
0005619602.tif 000018
【０１３８】
【表９】
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【０１３９】
ボトル１及び２は、別に調製された同じＭＭ１マスターミックスの２つの調製液であった。表８で示されるように、この２つのボトル間でＦＡＭ（登録商標）及びＣＹ５（登録商標）両方に対する平均サイクル数コールの差はあまり見られなかった。ＣＹ５（登録商標）チャネルと比較して、ＦＡＭ（登録商標）での平均サイクル数について僅かな遅延が観察された。ＣＴゲノムＤＮＡ調製物のより希釈度が高い試料について、表９は、１：７．５又は１：５０希釈と１ｘ希釈との間のサイクル数における平均差を示す。各場合、表９は、ＦＡＭ（登録商標）及びＣＹ５（登録商標）の両チャネルにおいて、ボトル２でサイクル数の僅かな遅延が観察されたことを示す。従って、希釈に関わらず、各標的レベルにおいて、標的（ＦＡＭ（登録商標）、ＣＹ５（登録商標））に関わらずアッセイ性能は同様であった。
【実施例６】
【０１４０】
全ＣＴ血清型亜型の検出
配列番号１−３の配列を有するプライマー／プローブの組み合わせが高感度であり対照鋳型において特異的であることが示されたので、このプライマー／プローブの組み合わせが様々な血清型亜型においてＣＴ（その細胞表面で発現される場合、タンパク質組成が異なるＣＴ）を検出する能力について試験した。１００コピー／反応で１６種類の血清型亜型を試験し、陰性対照と比較した。このプライマー／プローブの組み合わせによって血清型亜型の標的領域が増幅され検出される場合、シグナルが生じ；そうでなければ、陰性対照により生じたシグナルと同等であるバックグラウンドシグナルのみが観察される。
【０１４１】
２つのマスターミックスを調製した：Ｍｉｘ０には、市販のＣＴ及びＮＧプライマー及びプローブのみが含有され（表４参照）、一方、ＭＭ１は、市販のＣＴ／ＮＧ反応混合液に、配列番号３の配列を有するプローブと組み合わせて配列番号１及び２を添加することにより調製した。配列番号３のＣＴプローブの５’末端をＱＵＡＳＡＲ（登録商標）Ｑ６７０で、３’末端を消光剤ＢＨＱ−２（登録商標）で標識した。プライマー及びプローブの濃度は表６で示すとおりであった。各混合液にＩＣを添加し、８４コピー／反応の最終ＩＣ濃度とした。光学反応プレートに試料を添加し、密封した。次に、プレートをサイクラー／リーダー装置に入れ、実施例２で具体的に述べたようなサイクリング条件に供した。次いで、蛍光色素分子シグナル（ＦＡＭ（登録商標）及びＣＹ５（登録商標））についてプレートを分析した。
【０１４２】
様々なＣＴ血清型亜型ＤＮＡを含有する全試料においてシグナルが観察され、一方、陰性対照ではシグナルは示されなかった。従って、配列番号１−３の配列を有するプライマー／プローブの組み合わせは全１６種類の試験血清型亜型を検出した。
【実施例７】
【０１４３】
一連の潜在的交差反応物を用いたスクリーニング
この実施例において、配列番号１−３の配列を有するプライマー／プローブセット（実施例６中のようなＭＭ１）の交差反応性を試験した。１０７種類の潜在交差反応生物を用いて、プライマーの各セットの性能を試験した。ＣＴ／ＮＧ  ＲＥＡＬＴＩＭＥ（登録商標）ＰＣＲアッセイ交差反応性パネルとして株を収集した。
【０１４４】
潜在的交差反応生物（「交差反応物」）のリストを下記表１０で示す。
【０１４５】
【表１０】
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【０１４６】
配列番号３のＣＴプローブの５’末端をＱＵＡＳＡＲ（登録商標）Ｑ６７０で、３’末端を消光剤ＢＨＱ−２（登録商標）で標識した。プライマー及びプローブの濃度は表６で示されるとおりである。各混合液にＩＣを添加し、８４コピー／反応の最終ＩＣ濃度とした。マスターミックスの２５μＬ及び陰性希釈液２５μＬを各ウェルに添加し、これを潜在的交差反応物試料又は陰性対照とした。潜在的交差反応物試料としたウェルに、交差反応物ＤＮＡ試料１μＬを添加し（ｎ＝３の各交差反応物）、陽性対照として使用されたウェルにＣＴゲノムＤＮＡ２５μＬを添加した。トレイを密封し、次にＡｂｂｏｔｔ  ｍ２０００ｒｔサイクラー／リーダーに入れ、実施例２で具体的に述べたようなサイクリング条件に供した。次いで、蛍光色素分子シグナル（ＦＡＭ（登録商標）及びＣＹ５（登録商標））についてプレートを分析した。
【０１４７】
下記表１１で示される５種類の株（これらはＶＩＣ（登録商標）シグナルが上昇した。）を除き、全ての潜在的交差反応物は無反応であった。２ｘ１０６個分子／反応で各試料を試験した。
【０１４８】
【表１１】
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【０１４９】
ＭＲＢ及びＦＣＮＢはそれぞれ、最大比率及びフラクショナルサイクル数（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｃｙｃｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ）である。両者は、ＰＣＲ増幅の曲面形状分析のアウトプットである。
【０１５０】
次に、表１１で列挙される株をＭＭ０及びＭＭ１に対する試薬と比較するための別の回の試験に供した（実施例６におけるように）。１ｘ１０６及び３．３ｘ１０５個分子／反応でこれらの株を試験した。この２回目の試験のセットの結果を下記表１２で示す。
【０１５１】
【表１２】
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【０１５２】
表１２で示されるように、ＭＭ０及びＭＭ１試薬の両方からの結果は、ＭＭ０で無反応であった株ＩＤ１０を除き同等であった。
【実施例８】
【０１５３】
ガードバンド試験
この試験において、最適濃度を確認するために互いに対して配列番号１−３を滴定した。表１３は、この試験で使用する様々なマスターミックス（ＭＭ）を示すが、この表でプライマー及びプローブの様々な濃度を示す。ＩＣを各混合液に添加し、８４コピー／反応の最終ＩＣ濃度とした。
【０１５４】
【表１３】
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【０１５５】
標的は、実施例４のように１：７．５で希釈されたＣＴゲノムＤＮＡ調製物から構成された。マスターミックス２５μＬ及び標的２５μＬを各ウェルに添加した。トレイを密封し、次にＡｂｂｏｔｔ  ｍ２０００ｒｔサイクラー／リーダーに入れ、９５℃で５７０秒、次いで９２℃で１０秒、５８℃で３０秒及び６５℃で６０秒を４５サイクル行った。次に、蛍光色素分子シグナル（ＦＡＭ（登録商標）及びＣＹ５（登録商標））についてプレートを分析した。蛍光色素分子シグナル（ＦＡＭ（登録商標）及びＣＹ５（登録商標））についてプレートを分析した。
【０１５６】
その結果から、ＣＹ５（登録商標）チャネルにおいて、公称条件（ｎｏｍｉｎａｌ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）よりもＭＭ１を用いてＦＣＮが僅かに遅延（両方のプライマー（配列番号１、２）に対して−２５％）したことが示された。公称条件と比較した場合、ＭＭ４でＦＣＮは僅かに早く（両プライマーに対して＋５０％）、このことから、僅かにより効率的に増幅されることが示唆される。全体として、全てのマスターミックスは、公称条件と同等であった。ＩＣの場合、ＦＣＮ及びＭＲは、公称条件と比較して全てのマスターミックスにわたり同程度であった。ＦＣＮ及びＭＲは、陽性試料全てに対して、ＦＣＮＢ及びＭＲＢと同一であった（表１３）。
【実施例９】
【０１５７】
患者試料の試験及びＦＡＭ（登録商標）（オリジナルセット）及びＣＹ５（登録商標）（新規セット）チャネルにおける増幅の比較
この実施例において、ｍ２０００ｓｐ及びｍ２０００ｒｔでの、ｍ２０００実験適用仕様ファイルを用いて、ヒト被検者尿試料において配列番号１−３を含有するＭＭ１マスターミックス（実施例６参照）を試験した。全体で４３検体の尿試料を試験した。ｍ２０００実験適用仕様ファイルの試料調製部分は、現在市販されているｍ２０００ＣＴ／ＮＧ適用仕様ファイル第２．００版の改訂版である。Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄにより承認されたプロトコール下で、患者の同意を得て、Ａｂｂｏｔｔのために、Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｕｌｔｉ−Ｃｏｌｌｅｃｔトランスポートチューブにおいて、尿試料を回収した。ｍ２０００ｓｐにおいてＰＣＲプレートを準備し、次に、ＰＣＲ増幅及び検出のためにｍ２０００ｒｔに移した。サイクリング条件は実施例２に記載のとおりであった。この実験適用仕様ファイルのｍ２０００ｒｔ検出部分は、ＣＹ５（登録商標）チャネルでの検出が追加された現在市販されているｍ２０００ＣＴ／ＮＧ適用仕様ファイル第２．００版とは異なっていた。次に、同一の試料調製プロトコールから調製したこれらの同じ尿試料での結果とこの結果を比較し（ＣＴ／ＮＧ実験適用仕様ファイルｖ０．２４）、現在市販されているｍ２０００ＣＴ／ＮＧアッセイ試薬（ＭＭ０、実施例６）で試験した。
【０１５８】
マスターミックスの２５μＬ及び尿試料検体２５μＬを各ウェルに添加した。プライマー及びプローブの濃度は表６に記載のとおりであった。トレイを密封し、次にＡｂｂｏｔｔ  ｍ２０００ｒｔサイクラー／リーダーに入れ、９５℃で５７０秒、次いで９２℃で１０秒、５８℃で３０秒及び６５℃で６０秒を４５サイクル行った。次に、蛍光色素分子シグナル（ＦＡＭ（登録商標）及びＣＹ５（登録商標））についてプレートを分析した。
【０１５９】
ｍ２０００ｓｐ及びｍ２０００ｒｔの両方の測定は良好であった。ＭＭ１からの全ての試料の結果は、尿試料＃１１４を除き、以前に試験したＭＭ０の結果とよく相関した。この試料は、ＭＭ０で陰性として以前報告されたが、ＭＭ１ではＣＹ５（登録商標）チャネルで遅発増幅を示した。同じ被験者から採取したスワブ試料におけるＭＭ０試験データのまとめから、スワブ試験が陽性であったことが分かった。従って、尿試料＃１１４は、低い真の陽性ＣＴ試料と思われ、この試料においてＣＹ５（登録商標）チャネルで観察される増幅はＣＴに特異的と思われる。
【実施例１０】
【０１６０】
単一のＣＴ結果を提供するためのプローブ標識
この実施例において、配列番号３をＦＡＭ（登録商標）で標識した。この形態において、ＣＴ又はＣＴＳＷが検出されるか否かに関わらず、１つのＣＴの結果のみが得られる。
【０１６１】
この実施例の第一の部分において、ＭＭ０（実施例６）、配列番号１、２（プライマー）及び３（プローブ）及び配列番号１４、１５（プライマー）及び３（プローブ）に対してマスターミックスを調製した。配列番号３に対するプローブの５’末端をＦＡＭ（登録商標）で、３’末端を消光剤ＢＨＱ−１（登録商標）で標識した。プライマー及びプローブの濃度は表５に記載のとおりである。各混合液にＩＣを添加し、８４コピー／反応の最終ＩＣ濃度とした。４種類の標的レベル：（１）１ｘＣＴゲノムＤＮＡ調製物；この試料調製物の、（２）１：７．５希釈液；及び（３）１：５０希釈液（実施例４に対する１−３）及び（４）陰性対照でこれらの混合液を試験した。プライマー及びプローブの濃度は表６に記載のとおりである。
【０１６２】
この実施例の第二の部分において、（１）ＣＴ／ＮＧ試薬（ＭＭ０）；（２）ＭＭ１（配列番号１、２及び３；ＦＡＭ（登録商標）で標識されている３）及び（３）配列番号１３、１５及び配列番号３を含有し、やはりＦＡＭ（登録商標）で標識されたマスターミックス（ＭＭ４）を２枚のＰＣＲプレートで試験した。第一のプレートは、ＣＴ／ＮＧカットオフ対照及びＣＴゲノムＤＮＡ標的の３種類の希釈液（実施例４参照）を含有し、第二のプレートは、標的としてＣＴＳＷ  ＤＮＡ調製物を使用した（実施例２でのようなある１つの臨床試料の溶出液から１：１００、１：２００、１：４００及び１：８００希釈）。プライマー及びプローブの濃度は表５に記載のとおりである。ＭＭ４は、プライマーが配列番号１３及び１５であることを除きＭＭ１と同じであった。
【０１６３】
試料をトレイに添加し、トレイを密封した後、次にトレイをＡｂｂｏｔｔ  ｍ２０００ｒｔ  サイクラー／リーダーに置き、９５℃で５７０秒、次いでで９２℃で１０秒、５８℃で３０秒及び６５℃で６０秒を４５サイクル行った。次いで、蛍光色素分子シグナル（ＦＡＭ（登録商標）及びＣＹ５（登録商標））についてプレートを分析した。
【０１６４】
ＦＡＭ（登録商標）プローブとして配列番号３を用いた全ての標的レベルで、標的に関わらず、配列番号１及び２のプライマーは、配列番号１３及び１５のプライマーよりもわずかに「ロバスト」であった。
【０１６５】
参考文献
【０１６６】
【表１４】
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【配列表】
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