(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アレルゲンから得られる少なくとも１つの低アレルギー誘発性分子から構成される低アレルギー誘発性タンパク質であって、
当該少なくとも１つの低アレルギー誘発性分子が少なくとも１つの第２の非アレルギー誘発性タンパク質またはこれらの断片と融合されており、
アレルゲンから得られる少なくとも１つの上記低アレルギー誘発性分子は、野生型のアレルゲンと比べて、少なくとも５０％低下したＩｇＥ結合能および少なくとも３０％低下したＴ細胞反応性を示し、
上記少なくとも１つの低アレルギー誘発性分子が、上記少なくとも１つの第２のタンパク質またはこれらの断片のＮ末端および／またはＣ末端に対して融合されており、
上記少なくとも１つの第２のタンパク質がウイルスタンパク質である、低アレルギー誘発性タンパク質。
【請求項２】
上記ウイルスタンパク質がカプシドタンパク質であることを特徴とする請求項１に記載の低アレルギー誘発性タンパク質。
【請求項３】
上記ウイルスタンパク質の少なくとも１つが、ヒト病原性ウイルス、好ましくはピコルナウイルス科のウイルスから得られることを特徴とする請求項１または２に記載の低アレルギー誘発性タンパク質。
【請求項４】
ピコルナウイルス科の上記ウイルスが、ライノウイルス属、好ましくはヒトライノウイルス、特にヒトライノウイルス８９または１４の種に属することを特徴とする請求項３に記載の低アレルギー誘発性タンパク質。
【請求項５】
上記アレルゲンが、主要なカンバ花粉アレルゲン、特にＢｅｔ  ｖ  １およびＢｅｔ  ｖ  ４；主要なオオアワガエリ花粉アレルゲン、特にＰｈｌ  ｐ  １、Ｐｈｌ  ｐ  ２、Ｐｈｌ  ｐ  ５、Ｐｈｌ  ｐ  ６およびＰｈｌ  ｐ  ７；主要なイエダニアレルゲン、特にＤｅｒ  ｐ  １、Ｄｅｒ  ｐ  ２、Ｄｅｒ  ｐ  ５、Ｄｅｒ  ｐ  ７、Ｄｅｒ  ｐ  １０、Ｄｅｒ  ｐ  ２１およびｃｌｏｎｅ  ３０；主要なネコアレルゲン、特にＦｅｌ  ｄ  １およびＦｅｌ  ｄ  ２；主要なミツバチアレルゲン；主要なスズメバチアレルゲン；プロフィリン、特にＰｈｌ  ｐ  １２；オリーブアレルゲン、特にＯｌｅ  ｅ  １；パリエタリア  ユダイカアレルゲン、特にＰａｒ  ｊ  ２；ブタクサアレルゲン、特にＡｍｂ  ａ  １；ヨモギ花粉アレルゲン、特にＡｒｔ  ｖ  １；ならびに貯蔵庫ダニアレルゲン、特にＬｅｐ  ｄ  ２、Ａｌｔ  ａ  １、Ａｌｔ  ａ  ２、Ａｌｔ  ａ  ６、Ｃａｎ  ｆ  １、Ｃａｎ  ｆ  ２からなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の低アレルギー誘発性タンパク質。
【請求項６】
アレルゲンから得られる少なくとも１つの上記低アレルギー誘発性分子が、Ｐｈｌ  ｐ  １の１５１〜１７７、８７〜１１７、１〜３０、４３〜７０もしくは２１２〜２４１番目のアミノ酸、Ｐｈｌ  ｐ  ５の９３〜１２８、９８〜１２８、２６〜５３、２６〜５８、１３２〜１６２、２１７〜２４６、２５２〜２８３もしくは１７６〜２１２番目のアミノ酸、Ｆｅｌ  ｄ  １の鎖  １の１〜３４もしくは３５〜７０番目のアミノ酸、Ｆｅｌ  ｄ  １の鎖  ２の１〜３４、３５〜６３もしくは６４〜９２番目のアミノ酸、Ｂｅｔ  ｖ  １の３０〜５９、５０〜７９もしくは７５〜１０４番目のアミノ酸、Ｄｅｒ  ｐ  ２の１〜３３、２１〜５１、４２〜７３、６２〜１０３もしくは９８〜１２９番目のアミノ酸、Ｄｅｒ  ｐ  ７の１〜３０、２０〜５０、５０〜８０、９０〜１２５、１２５〜１５５もしくは１６５〜１９８番目のアミノ酸、Ｄｅｒ  ｐ  １０の１〜３５、３６〜７０、７１〜１１０、１１１〜１４５、１４０〜１７０、１７５〜２０５、２１０〜２５０もしくは２５０〜２８４番目のアミノ酸、Ｄｅｒ  ｐ  ２１の１〜３５、３５〜７２、７０〜１００もしくは９０〜１２２番目のアミノ酸、クローン３０の１〜３２、１５〜４８もしくは３２〜７０番目のアミノ酸、Ａｌｔ  ａ  １の１９〜５８、５９〜９５、９１〜１２０もしくは１２１〜１５７番目のアミノ酸、Ｐａｒ  ｊ  ２の３１〜６０、４５〜８０、６０〜９６もしくは９７〜１３３番目のアミノ酸、Ｏｌｅ  ｅ  １の１〜４０、３６〜６６、６３〜９９、８６〜１２０もしくは１０７〜１４５番目のアミノ酸、Ｆｅｌ  ｄ  ２の２５〜５８、９９〜１３３、１５４〜１８３、２７７〜３０７、３３４〜３６３、３７３〜４０２、５４４〜５７３、５７９〜６０８、５８〜９９、１２５〜１６５、１８３〜２２４、２２４〜２６１、２５２〜２８９、３０３〜３４０、４１６〜４５７、４６０〜５００もしくは５０１〜５４２番目のアミノ酸、Ｃａｎ  ｆ  ２の１９〜５８、５２〜９１、８２〜１１９、１０６〜１４４もしくは１３９〜１８０番目のアミノ酸、Ｃａｎ  ｆ  １の１９〜５６、５１〜９０、７８〜１１８、１０６〜１４５もしくは１３５〜１７４番目のアミノ酸、Ａｒｔ  ｖ  １の２７〜７０、７０〜１００もしくは９２〜１３２番目のアミノ酸、Ａｍｂ  ａ  １の３１〜７０、８０〜１２０、１２５〜１５５、１６０〜２００、２２５〜２６３、２６４〜３００  ３０５〜３５０もしくは３５６〜３９６番目のアミノ酸、Ａｌｔ  ａ  ６の１〜３４、３５〜７４、７４〜１１５、１２５〜１６５、１７４〜２１３、２４１〜２８０、２９４〜３３３、３６１〜４００もしくは４０１〜４３８番目のアミノ酸、Ａｌｔ  ａ  ２の  １〜４０、４１〜８０、８１〜１２０もしくは１２１〜１６０番目のアミノ酸、またはこれらの配列変異によって構成されることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の低アレルギー誘発性タンパク質。
【請求項７】
ヒトもしくは動物におけるウイルス感染および／またはアレルギーの処置または予防における使用のための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の低アレルギー誘発性タンパク質。
【請求項８】
０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜５ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜２ｍｇ／ｋｇ体重の量において個体に投与されることを特徴とする請求項７に記載の低アレルギー誘発性タンパク質。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合した低アレルギー誘発性タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸分子を包含するベクター。
【請求項１１】
請求項９に記載の核酸分子または請求項１０に記載のベクターを包含する宿主。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の低アレルギー誘発性タンパク質を包含するワクチンの調合物。
【請求項１３】
個体におけるアレルギーおよび／またはウイルス感染の診断用の薬剤の製造における、請求項１〜６のいずれか１項に記載の低アレルギー誘発性タンパク質の利用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、新規な低アレルギー誘発性分子およびこれらの利用に関する。
【０００２】
タイプＩアレルギーは、人口のほぼ２５％を冒しているＩｇＥ媒介過敏性疾患である。それは、本質的に無害な抗原源（例えば、花粉、昆虫、カビおよび動物タンパク質）から得られる無害な風媒、昆虫、毒物、食物のアレルゲンおよび接触アレルゲン抗原の、特異的な免疫グロブリンＥによる認識に基づく。効果細胞結合ＩｇＥ抗体の架橋が、炎症性媒介物（例えば、ヒスタミン、ロイコトリエン）の放出を導き、そしてこのようにしてアレルギーの即時型の症状に導く。ＩｇＥ依存性およびＩｇＥ非依存性の機序を介するＴ細胞活性化は、慢性的なアレルギー炎症の原因になる。
【０００３】
アレルギー処置のおそらく唯一の原因作用形態は、ほとんどの起源に関するアレルゲン抽出物の漸次的に増加する量の繰り返し投与に基づく、アレルゲン特異的な免疫療法である。多くの臨床研究は、注入免疫療法の臨床的有効性を立証しており、かつこの処置の基礎を成す種々の免疫学的機序に関する証拠がある。あるアレルゲン源に対する高品質なアレルゲン抽出物を調製することの困難性、および患者に対するアレルゲンの投与が種々の副作用の原因になる可能性があるという事実に起因して、アレルゲン特異的免疫療法は、ある患者の群およびある疾患の症状に対してのみ推奨され得る。種々のアレルゲン源に対する共感作を有する患者、および重篤な疾患症状（例えば、アレルギー喘息）にかかっている患者に対する処置は、特に困難である。アレルギーの最も激しい症状の１つであるアレルギー喘息は、日々の生活の質に対して重篤に影響するので、高い入院の割合を招き、かつ患者の集中的な看護を必要とする深刻な生命に関わる形態においてそれ自身を明確に示すことができる。
【０００４】
天然のアレルゲン源から調製されるアレルゲン抽出物は、本質的に天然のままであり、かつ技術的手段によって、当該調製物における個々のアレルゲンの質および量に影響を与えることが不可能である。また、それらは、多くの不確定な非アレルギー誘発性成分を含んでおり、かつ種々の最近の研究は、当該抽出物の低品質を指摘しかつそれらの非常な不均一性を立証している。
【０００５】
ここ１０年において、組み換えＤＮＡ技術を用いた分子アレルゲンの性質決定の分野において、大きな進展がなされている。最も重要な疾患誘発アレルゲンは、分子レベルに至るまで性質決定されており、かつ天然アレルゲン抽出物のエピトープの複雑性を模倣する組み換えアレルゲンが製造されている。さらに、種々の研究団体は、アレルゲン構造に関する知識を用いて、定義済の新たなアレルゲンワクチンを開発している。遺伝子工学、合成ペプチド化学、および免疫刺激性ＤＮＡ配列を用いたアレルゲンの接合が使用されて、新たなワクチンのアレルギー性活性を低減させ、かつこのようにして治療誘導副作用の割合を低減させる。まず、有望な臨床研究は、当該アレルゲン誘導体を用いて実施された。興味深いことに、遺伝子工学的な組み換えアレルゲンおよびアレルゲン由来合成Ｔ細胞含有ペプチドのＩｇＥ反応性が、大きく低減され得るか、または消滅さえし得るが、これらの誘導体が、やはり注入の数時間後に現れる全身性の副作用を誘導し得ることが判明した。例えば、主要なネコアレルゲンであるＦｅｌ  ｄ  １のＴ細胞エピトープペプチドが、内皮注入後の数時間において、喘息および気管支過敏性を誘導したことが、報告され、かつこの影響がＴ細胞媒介性であり、かつＭＨＣ限定的であるという強力な証拠がある。
【０００６】
これらの結果は、即時型の反応がこれらの免疫治療研究の過程において記録されなかったことから、ＩｇＥ反応性の排除がＩｇＥ媒介性の副作用を減少させることを指し示している。しかし、組み換えアレルゲン誘導体およびペプチド混合物において保持されているアレルゲン特異的Ｔ細胞エピトープは、遅発型の副作用（例えば、非常に問題となるか、またはアトピー性の皮膚炎、慢性のＴ細胞媒介アレルギー性皮膚症状）の原因である。組み換えアレルゲン誘導体の場合に引き起こされる副作用は、相対的に穏やかであって、かつＴ細胞ペプチドワクチンの場合に引き起こされる副作用は、適切な投薬によって克服され得る。従って、新たな２つの取り組みの両方は、アレルギー性の鼻結膜炎の免疫療法にとって非常に見込みがあるように思われるが、アレルギー性の喘息の重篤な形態の治療に取り組む場合に制限を有し得、ここで、肺における遅発型の副作用の低減が非常に問題になり得る。
【０００７】
投与するために、およびその結果としてペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質に対する有効な免疫応答を刺激するために、補佐剤および／または担体が定期的に用いられる。例えば、完全フロインド補助液は、利用可能な最も効力のある補佐剤の１つである。しかし、その使用は、その副作用のせいでヒトに対して認可されない。従って、ペプチドおよびポリペプチド由来のアレルゲンに対して強力な免疫応答を誘導できるワクチン組成物に対する要求、およびもちろん完全フロインド補助液の使用を回避する他の抗原の要求が存在する。さらに、ＢＳＡは、動物モデルにおいて担体としてうまく使用されている一方において、副作用の危険（例えば、プリオン病（種々のクロイツフェルトヤコブ病）の感染の危険）のせいで、ヒトワクチン組成物における使用に関して適切では有り得ない。アレルゲンに対する有効なワクチンの開発に対するさらなる試みは、個体または動物において急速にアレルゲンを減少させることが可能な免疫応答を必要としている。従って、血中における高濃度の、主にＩｇＧサブタイプからなるアレルゲン特異的抗体が、求められる。粘膜表面ＩｇＡ抗体は、一次サブタイプである。
【０００８】
また、当該技術において公知の担体タンパク質であるコレラ毒素は、ワクチン組成物における完全フロインド補助液の使用を排除する補佐剤として恒常的に使用される。しかし、コレラ毒素は、相対的および特異的なＩｇＥ抗体レベルを増加させ、かつＩｇＥ関連炎症性反応を導く。
【０００９】
ワクチン接種用に使用されるほとんどの担体タンパク質によって刺激される副作用に起因して、毒性のある補佐剤を使用することなく、寛容性に乏しい担体タンパク質を用いることなく、かつある状況において強い病理的免疫応答を刺激することなく、アレルゲンまたは他の抗原に対する免疫応答を刺激することができる担体系に対する必要性がある。これらの指定に合致する新規な担体系は、アレルギー性疾患のような疾患の治療または予防に好適である新規な、接合物および組成物の形成に関して使用され得る。
【００１０】
Ｂｏｈｌｅ  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．（J. Immunol. 172 (11) (2004): 6642-6648）において、Ｓ層タンパク質の部分およびＢｅｔ  ｖ  １部分を包含する組み換え融合タンパク質について説明されている。この分子は、本来の高アレルギー性Ｂｅｔ  ｖ  １タンパク質を包含する。
【００１１】
国際公開第２００４／００４７６１号パンフレットは、免疫原と融合され、かつ免疫化に使用され得るウイルス様粒子に関する。
【００１２】
国際公開第２００４／００３１４３号パンフレットにおいて、ウイルス様粒子およびワクチン接種に関する免疫原として、高アレルギー性分子を包含する融合タンパク質の利用が、開示されている。
【００１３】
上述の欠点を克服し、かつ低下した副作用を有するアレルゲンワクチン接種を可能にする薬剤および担体を提供することが、本発明の目的である。
【００１４】
従って、本発明は、アレルゲンから得られる少なくとも１つの低アレルギー誘発性分子から構成される低アレルギー誘発性タンパク質であって、当該少なくとも１つの低アレルギー誘発性分子が少なくとも１つの第２の非アレルギー誘発性タンパク質またはこれらの断片と融合されているかまたは接合されている、低アレルギー誘発性タンパク質に関する。
【００１５】
分子、特に本発明に係る低アレルギー誘発性分子に対する増強された免疫応答を刺激するために、当該分子は、担体に対して（遺伝子工学によって）融合されるか、または（化学反応によって）接合される。従来のおよび恒常的に採用される担体は、例えば、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）である。大きな海の軟体動物であるメガトゥーラ  クレヌラータ（Ｍｅｇａｔｈｕｒａ  ｃｒｅｎｕｌａｔａ）から単離されるＫＬＨは、注入用の免疫原を作り出すために使用される最も有名な担体タンパク質の１つである。ＫＬＨは、その大きな分子量のせいで、そして非哺乳類タンパク質であるために、強い抗体応答を誘導する。
【００１６】
本発明の低アレルギー誘発性分子と融合されるかまたは接合される第２のタンパク質（“担体”または“担体タンパク質”）は、アレルゲンに由来しない（非アレルギー誘発性である）。しかし、本発明に使用される担体タンパク質は、動物またはヒトに対して投与される場合に、Ｔ細胞反応性を示し得、および／または自身および融合されるか、または接合されている低アレルギー誘発性分子に対する免疫応答を誘導し得る。従って、担体タンパク質が病原体（例えば、ウイルス、細菌など）から得られる場合に、当該担体および病原体を対象化する（防御）抗原が製造される。
【００１７】
本明細書において使用されるときに、“低アレルギー誘発性タンパク質”は、非アレルギー誘発性源の担体の、低アレルギー誘発性分子との融合タンパク質／ポリペプチドを意味する。さらにまた、“低アレルギー誘発性タンパク質”は、低アレルギー誘発性分子との担体の接合産物（例えば、化学結合、吸着）であることを意図される。
【００１８】
本明細書において使用されるときに“低アレルギー誘発性”は、低下したアレルギー誘発性の潜在性を有する分子を指す。当該分子は、これらの分子が得られる野生型のタンパク質と比較して、個々においてアレルギー性反応を刺激する低減された能力を有する。
【００１９】
アレルゲンから得られし、かつ第２のタンパク質と融合される／接合される少なくとも１つの低アレルギー誘発性分子は、Ｃ末端および／またはＮ末端において好ましく切り詰められている（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）。本明細書において使用されるときに“Ｃ末端および／またはＮ末端の切り詰め（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）”は、野生型アレルゲンのＮ末端もしくはＣ末端のいずれか、またはＮ末端およびＣ末端の両方からアミノ酸残基が、少なくとも１、２、３、４、５、７、１０、１５、２０、３０アミノ酸残基の欠失によって除去されていることを意味する。
【００２０】
低アレルギー誘発性分子（すなわち、ペプチド／ポリペプチド）は、好ましくは１０〜５０アミノ酸、より好ましくは１５〜４０アミノ酸、特に２０−３０アミノ酸を包含し、かつ低下したＩｇＥ反応性を示す。これらの分子は、Ｔ細胞媒介性の副作用の原因になり得るＴ細胞エピトープを排除するために設計される。低下したＴ細胞応答を示すＴ細胞エピトープおよび分子は、当業者によって公知の方法（例えば、Bercovici N. et al. Clin Diagn Lab Immunol. (2000) 7:859-864）によって決定され得、かつ同定され得る。
【００２１】
表面露出ペプチドを用いて、主要な草本花粉アレルゲン（例えば、Ｐｈｌ  ｐ  １）に似たアレルゲンから得られるペプチドワクチン、および主要なカンバ花粉アレルゲンであるＢｅｔ  ｖ  １に対するペプチドワクチンが設計可能であることは、見出された。得られたデータは、当該ペプチドワクチンが、一次構造がＩｇＥエピトープマッピング、３次元構造データまたはコンピュータを用いた表面露出ドメインの予測に従って知られている、あらゆるアレルゲンに対して製造され得ることを示している。しかし、これらの方法を用いて同定されているペプチドのすべてがワクチン接種に採用され得るわけではないので、ワクチン接種用に使用され得る好適なペプチドの選択は、困難なままである。ワクチン接種の目的に対して好適に使用され得るペプチドは、低下したＩｇＥ結合能を示すべきであり、かつ−遅発型の副作用を低減させるか、もしくは回避するために−低下したＴ細胞反応性を示すべきである。
【００２２】
本明細書において使用されるときに、“アレルゲンから得られる”という用語は、本発明に係る低アレルギー誘発性分子が、断片化または切り詰めによってアレルゲンから直接に取得されることを意味する。本発明の低アレルギー誘発性分子のアミノ酸配列は、当該低アレルギー誘発性分子が得られる野生型アレルゲンのアミノ配列の範囲に対して、好ましくは少なくとも８０％が同一、より好ましくは少なくとも９０％が同一、最も好ましくは少なくとも９５％が同一、特に１００％が同一である。しかし、野生型アレルゲン断片に対して１００％が同一ではない分子は、当該野生型アレルゲン断片に対象化されている１つの抗体または複数の抗体、好ましくはＩｇＧ抗体に対して、少なくとも６０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、最も好ましくは９０％の強度を有して結合可能であるべきである。
【００２３】
第１のアミノ酸の、第２のアミノ酸に対する同一性の程度は、ある演算手順を用いた両方のアミノ酸配列の直接的な比較によって決定され得る。当該演算手順は、例えば、種々のコンピュータプログラム（例えば、"BLAST 2 SEQUENCES (blastp)" (Tatusova et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-25; Corpet F, Nucl. Acids Res. (1988) 16:10881-10890)に組み込まれている。
【００２４】
本発明に係る切り詰めた分子は、完全な野生型アレルゲンよりもアレルゲン特異的Ｔ細胞の低い活性化（好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは５０％、最も好ましくは７０％の低下）を誘導し、ＩｇＥ結合アッセイによって評価されるような５０％以上（好ましくは７０％以上）が低減したアレルギー誘発性活性およびＩｇＥ媒介細胞の活性化の誘導能を示し、かつ上述のような担体に対して結合される場合に、アレルギー性患者から得られるポリクロナルＩｇＥの完全な野生型アレルゲンに対する結合を阻害するＩｇＧ抗体を誘導する、アレルゲンの一部として定義され得る。
【００２５】
ペプチドは、ミモトープとの重複を回避するために、アレルゲンからの配列を含有すべきである。しかし、抗原断片の小ペプチド模倣物（１５アミノ酸未満）であり、かつ無作為のペプチドライブラリから得られるミモトープは、本明細書に定義されるような、本来の、アレルゲン由来分子を表さない。それらは、それらがＩｇＧ応答を強く阻害するためには小さすぎるので、本発明に従って使用され得ない。
【００２６】
本発明に係る低アレルギー誘発性分子は、組み換え法または化学合成によって得られ得る。また代替可能に、それは、野生型アレルゲンまたは関心のある分子を包含するペプチド／タンパク質の酵素的または化学的な切断によって、分子を取得可能であることはもちろんである。
【００２７】
低アレルギー誘発性分子は、少なくとも１つのアレルゲンから得られる少なくとも２つの切り詰めたアレルゲン分子を好ましく包含し得、ここで、少なくとも２つの当該分子が同じアレルゲンから得られている場合に、切り詰めたアレルゲン断片の順序は、野生型アレルゲンにおける断片の順序とは異なる。
【００２８】
本発明に係る低アレルゲン誘発性分子は、本明細書に定義されるような１つ以上（好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ）の低アレルギー誘発性分子を包含し得、このようにして融合タンパク質を生じる。またもちろんのことＩｇＥ結合能を欠如し、かつＴ細胞エピトープを欠如している、単一の低アレルギー誘発性分子は、同じ、および／または異なる起源のアレルゲンから得られ得る。分子が同じアレルゲンから得られる場合に、低アレルギー誘発性融合タンパク質における順序は、野生型アレルゲンにおける順序と同一であるべきではない（これは、ＩｇＥ結合部位の再構成および形成を予防する）（例えば、国際公開第２００４／０６５４１４、Linhart B and Valenta R （Int Arch Allergy Immunol. (2004) 134:324-31）を参照すればよい）。
【００２９】
本発明の好ましい実施形態によれば、少なくとも１つの低アレルギー誘発性分子は、上記第２のタンパク質またはこれらの断片のＮ末端および／またはＣ末端に対して融合される。
【００３０】
アレルゲンまたはこれらの断片は、互いに化学的に（例えば、または組み換え法によって）接合され得る。アレルゲンまたはこれらの断片が担体に対して化学的に接合される場合に、上記アレルゲンまたはこれらの断片は、末端のシステイン残基を供給されるべきである（結果として、遊離スルフィドリル基を生じる）。上記末端（Ｎ末端またはＣ末端）のシステイン残基に対して、あらゆるマレイミド活性化担体が接合され得、このようにして免疫原／担体複合体を作り出す。アレルゲンまたはこれらの断片が末端にスルフィドリル基を有していない場合に、担体タンパク質に対してアミン（リジン）またはカルボン酸（グルタミン酸、アスパラギン酸または５’−リン酸塩）を結合させるために、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）化学的性質が採用され得る。
【００３１】
低アレルギー誘発性分子が、担体のＮ末端またはＣ末端に対して融合される場合に、組み換え法が採用され得る。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態によれば、少なくとも１つの第２のタンパク質は、ウイルスタンパク質、特にＲＮＡウイルスまたはＤＮＡウイルスタンパク質、細菌タンパク質、真菌タンパク質または原生生物タンパク質である。
【００３３】
少なくとも１つの第２のタンパク質（“担体”）は、上述の起源のあらゆるものに属し得る。しかし、そのタンパク質自身、およびこれらに対して融合されるかまたは接合される低アレルギー誘発性分子に対する免疫応答を刺激するタンパク質を使用することが、特に好ましい。また、少なくとも１つの第２のタンパク質に対象化される（防御）抗体の形成の誘導に起因して、本発明に係る低アレルギー誘発性タンパク質はまた、上記第２のタンパク質およびその起源になる源（例えば、ウイルス、細菌、真菌）に対するワクチンとして、として採用され得る。もちろん、少なくとも１つの第２のタンパク質として、当該技術において公知の担体タンパク質（例えば、ＫＬＨ）を使用することが可能である。
【００３４】
本発明に係るウイルスタンパク質は、好ましくはカプシドタンパク質である。
【００３５】
ウイルスカプシドタンパク質は、カプシドタンパク質が使用されてヒトが継続的にさらされる場合に、それらが抗ウイルス活性を誘導し、上皮細胞に対するウイルス（例えば、ライノウイルス）の吸着を阻害する抗体の形成を刺激し、Ｔｈ１応答に対する免疫調節性活性を示し、予防的なワクチン接種（ウイルスワクチン接種）に対して適しかつ証明されており、かつ安全であるので、特に適している。
【００３６】
本発明の他の好ましい実施形態によれば、少なくとも１つのヒト病原性ウイルス、好ましくはピコルナウイルス科から得られる。
【００３７】
ピコルナウイルス科のウイルスは、好ましくはライノウイルス属、好ましくはライノウイルス種、特にヒトライノウイルス８９および１４に属す。カプシドタンパク質は、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３および／またはＶＰ４で有り得る。
【００３８】
ウイルスカプシドタンパク質に対して融合されるアレルゲンは、主要なカンバ花粉アレルゲン、特にＢｅｔ  ｖ  １およびＢｅｔ  ｖ  ４；主要なオオアワガエリ花粉アレルゲン、特にＰｈｌ  ｐ  １、Ｐｈｌ  ｐ  ２、Ｐｈｌ  ｐ  ５、Ｐｈｌ  ｐ  ６およびＰｈｌ  ｐ  ７；主要なイエダニアレルゲン、特にＤｅｒ  ｐ  １およびＤｅｒ  ｐ  ２；主要なネコアレルゲン、特にＦｅｌ  ｄ  １；主要なミツバチアレルゲン；主要なスズメバチアレルゲン；プロフィリン、特にＰｈｌ  ｐ  １２；ならびに貯蔵庫ダニ、特にＬｅｐ  ｄ  ２からなる群から好ましく選択される。
【００３９】
本発明に従って使用されるべき他の適したアレルゲンは、以下の表から得られ得る。
【００４０】
【表１】
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【００４１】
【表２】
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【００４２】
【表３】
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【００４３】
【表４】
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【００４４】
【表５】
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【００４５】
【表６】
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【００４６】
【表７】
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【００４７】
【表８】
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【００４８】
【表９】
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【００４９】
【表１０】
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【００５０】
【表１１】
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【００５１】
【表１２】
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【００５２】
【表１３】
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【００５３】
【表１４】
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【００５４】
【表１５】
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【００６２】
本発明の好ましい実施形態によれば、低アレルギー誘発性分子は、低下したＩｇＥ結合能を示す。
【００６３】
本発明の好ましい他の実施形態によれば、低アレルギー誘発性分子は、低下したＴ細胞反応性を示す。
【００６４】
しかし、少なくとも１つのＴ細胞エピトープを包含するアレルゲン断片はまた、本発明に係る低アレルギー誘発性タンパク質に使用され得る。
【００６５】
本発明において使用されるときに“低下したＩｇＥ結合能を示すこと”は、本発明に係る分子が、有意に低下したＩｇＥ結合能もしくはＩｇＥ結合活性（野生型アレルゲンと比較して、少なくとも５０％だけ少ない、好ましくは少なくとも７０％だけ少ない、より好ましくは少なくとも８０％だけ少ない、さらに好ましくは少なくとも９０％だけ少ない、最も好ましくは少なくとも９５だけ少ない結合能）、またはこれらのすべての欠如さえも示すことを意味する。
【００６６】
ペプチドおよびタンパク質のような分子のＩｇＥ結合活性／能は、野生型アレルゲンにあらかじめさらされている、例えば対象（例えば、アレルギー体質の対象）から得られる血清を用いた、例えば酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって、決定され得る。簡単に言うと、試験されるペプチドは、マイクロタイタープレートのウェル上に対してまぶされる。洗浄およびブロッキングの後に、試験されるペプチドまたは当該ペプチドが由来するタンパク質にさらされているアレルギー体質の対象の血漿からなる抗体溶液が、ウェルにおいてインキュベーションされる。標識２次抗体が、ウェルに加えられ、かつインキュベーションされる。それから、ＩｇＥ結合の量が、定量され、かつ精製した野生型アレルゲンによって結合されるＩｇＥの量と比較される。
【００６７】
代替可能に、ペプチドの結合活性は、ウエスタンブロッティング分析によって測定され得る。例えば、試験されるペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてポリアクリルアミドゲル上を流される。それから、ペプチドは、ニトロセルロースに転写され、かつ続いてアレルギー体質の対象からの血清を用いてインキュベーションされる。標識２次抗体を用いたインキュベーションの後に、ＩｇＥ結合の量が測定され、かつ定量化される。
【００６８】
ペプチドのＩｇＥ結合活性を測定するために使用され得る他のアッセイは、競合ＥＬＩＳＡアッセイである。簡単に言うと、ＩｇＥ抗体プールは、直接ＥＬＩＳＡによってＩｇＥ反応性であることを示されているアレルギー体質の対象からの血漿を、野生型アレルゲンと混ぜあわせることによって、生成される。このプールは、ＥＬＩＳＡ競合アッセイに使用されて、野生型アレルゲンに対するＩｇＥ結合を試験されるペプチドと比較する。野生型アレルゲンおよび試験されるペプチドに関するＩｇＥ結合が、測定され、かつ定量化される。
【００６９】
“Ｔ細胞エピトープ”は、Ｔ細胞が抗原特異的結合部位を有し、上記部位に対する結合の結果がＴ細胞を活性化するタンパク質（例えば、アレルゲン）またはこれら断片を意味する。本明細書において使用されるときに、“低下したＴ細胞反応性を示すこと”という用語は、低アレルギー誘導性分子が、当該技術における公知の標準的なアッセイにおいて等モル量を用いて得られる野生型アレルゲンによって誘導される刺激と比較して、有意に低減されているＴ細胞反応性を示す分子を指す（低下したＴ細胞反応性は、等モル量における野生型アレルゲンと比較して、低アレルギー誘発性分子の刺激が少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも９０％少ないことを意味する）。本発明の特に好ましい実施形態において、分子は、Ｔ細胞エピトープを“欠如”し得、かつこのようにして分子が処置される個体（すなわち、エピトープ提示価数プラットフォーム分子（ｅｐｉｔｏｐｅ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｖａｌｅｎｃｙ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を受け取るべき）において低下したＴ細胞反応性を示し得る。例えば、アレルゲン由来分子が、個体または個体の集団に関してＴ細胞エピトープを欠如し得る一方において、他の個体に関してＴ細胞エピトープを保有することは、あり得る。Ｔ細胞エピトープの存在を検出する方法は、当該技術において公知であり、かつＴ細胞増殖（例えば、チミジンの取り込み）を検出する方法を包含する。チミジン取り込みの定量的な量は、試験される免疫原に依存して変化し得るが、バックグラウンドを超えて統計的に有意な（すなわち、一般的に、標準的な統計学的方法を用いて０．０５以下のｐ）取り込みを誘導できない免疫原は、Ｔ細胞エピトープを欠如すると考えられる（例えば、Zhen L. et al. (Infect Immun. (2003) 71:3920-3926)を参照すればよい）。一般的に、約２−３に足りない、より好ましくは１未満の刺激指標は。Ｔ細胞反応性およびエピトープの欠如を示す。また、Ｔ細胞エピトープの存在は、標準的な方法に従ってＴ細胞由来のリンホカインの分泌を測定することによって決定され得る。刺激指標（ＳＩ）は、刺激細胞の増殖率（チミジンの取り込み）を、培地単独における非刺激細胞の増殖率によって割ることによって算出され得る。ＳＩ＝１は、非刺激細胞を意味し、ＳＩ＜１は、毒性影響を示し、かつＳＩ＞１は細胞の刺激を示す。Ｔ細胞の位置および含有量は、存在するならば、経験的に決定され得る。
【００７０】
サイトカイン分泌は、Ｔ細胞刺激に加えて測定され得る。例えば、ＩＦＮ−ガンマは、有害なサイトカインとして認識されている。他の例は、ＴＦＮ−アルファ、ＩＬ−５、ＩＬ−４、ＩＬ−８などであり得る。
【００７１】
アレルゲン断片は、Ｐｈｌ  ｐ  １の１５１〜１７７、８７〜１１７、１〜３０、４３〜７０もしくは２１２〜２４１番目のアミノ酸、Ｐｈｌ  ｐ  ５の９３〜１２８、９８〜１２８、２６〜５３、２６〜５８、１３２〜１６２、２１７〜２４６、２５２〜２８３もしくは１７６〜２１２番目のアミノ酸、Ｆｅｌ  ｄ  １の鎖  １の１〜３４もしくは３５〜７０番目のアミノ酸、Ｆｅｌ  ｄ  １の鎖  ２の１〜３４、３５〜６３もしくは６４〜９２番目のアミノ酸、Ｂｅｔ  ｖ  １の３０〜５９、５０〜７９もしくは７５〜１０４番目のアミノ酸、Ｄｅｒ  ｐ  ２の１〜３３、２１〜５１、４２〜７３、６２〜１０３もしくは９８〜１２９番目のアミノ酸、Ｄｅｒ  ｐ  ７の１〜３０、２０〜５０、５０〜８０、９０〜１２５、１２５〜１５５もしくは１６５〜１９８番目のアミノ酸、Ｄｅｒ  ｐ  １０の１〜３５、３６〜７０、７１〜１１０、１１１〜１４５、１４０〜１７０、１７５〜２０５、２１０〜２５０もしくは２５０〜２８４番目のアミノ酸、Ｄｅｒ  ｒ  ２１の１〜３５、３５〜７２、０７０〜１００もしくは９０〜１２２番目のアミノ酸、クローン３０の１〜３２、１５〜４８もしくは３２〜７０番目のアミノ酸、Ａｌｔ  ａ  １の１９〜５８、５９〜９５、９１〜１２０もしくは１２１〜１５７番目のアミノ酸、Ｐａｒ  ｊ  ２の３１〜６０、４５〜８０、６０〜９６もしくは９７〜１３３番目のアミノ酸、Ｏｌｅ  ｅ  １の１〜４０、３６〜６６、６３〜９９、８６〜１２０もしくは１０７〜１４５番目のアミノ酸、Ｆｅｌ  ｄ  ２の２５〜５８、９９〜１３３、１５４〜１８３、２７７〜３０７、３３４〜３６３、３７３〜４０２、５４４〜５７３、５７９〜６０８、５８〜９９、１２５〜１６５、１８３〜２２４、２２４〜２６１、２５２〜２８９、３０３〜３４０、４１６〜４５７、４６０〜５００もしくは５０１〜５４２番目のアミノ酸、Ｃａｎ  ｆ  ２の１９〜５８、５２〜９１、８２〜１１９、１０６〜１４４もしくは１３９〜１８０番目のアミノ酸、Ｃａｎ  ｆ  １の１９〜５６、５１〜９０、７８〜１１８、１０６〜１４５もしくは１３５−１７４番目のアミノ酸、Ａｒｔ  ｖ  １の２７〜７０、７０〜１００もしくは９２〜１３２番目のアミノ酸、Ａｍｂ  ａ  １の３１〜７０、８０〜１２０、１２５〜１５５、１６０〜２００、２２５〜２６３、２６４〜３００  ３０５〜３５０もしくは３５６〜３９６番目のアミノ酸、Ａｌｔ  ａ  ６の１〜３４、３５〜７４、７４〜１１５、１２５〜１６５、１７４〜２１３、２４１〜２８０、２９４〜３３３、３６１〜４００もしくは４０１〜４３８番目のアミノ酸、Ａｌｔ  ａ  ２の１〜４０、４１〜８０、８１〜１２０、１２１〜１６０番目のアミノ酸またはこれらの断片または配列変異から好ましく構成される。
【００７２】
上記において特定されたアレルゲン由来分子の特定のアミノ酸配列は、以下の表の通りである。
【００７３】
【表２２】
0005399895.tif 000023
【００７４】
【表２３】
0005399895.tif 000024
【００７５】
【表２４】
0005399895.tif 000025
【００７６】
【表２５】
0005399895.tif 000026
【００７７】
【表２６】
0005399895.tif 000027
【００７８】
“これらの断片”および“配列変異”という用語は、本明細書に開示されているアレルゲン由来分子から推論され、かつ上記アレルゲン由来分子と類似するか、または同一である生化学性的性質（例えば、これらの分子が得られるアレルゲンに対するＩｇＥ結合を妨げる能力）を示すペプチドを指す。本発明の断片は、アレルゲン由来分子、少なくとも５つ、好ましくは少なくとも７つ、より好ましくは少なくとも１０の連続するアミノ酸残基および／または最大で９５％、好ましくは最大で９０％、より好ましくは最大で８０％のアミノ酸残基を包含する。“配列変異”という用語は、断片化（上記を参照すればよい）、（例えば、非天然もしくは天然のアミノ酸またはアミノ酸誘導体を用いた）アミノ酸置換、欠失または付加といった、ペプチドの修飾を含む。また、“配列変異”は、上記表の上記アレルゲン由来分子を指し、ここで少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ、さらにより好ましくは少なくとも４つ（５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１５、２０）のアミノ酸残基が、Ｃ末端および／またはＮ末端に加えられる。
【００７９】
クローン３０アレルゲンは、イエダニであるデルマトファゴイデス  プテロニッシヌスから得られるアレルゲンであり、かつ以下の配列：ＭＡＮＤＮＤＤＤＰＴＴＴＶＨＰＴＴＴＥＱＰＤＤＫＦＥＣＰＳＲＦＧＹＦＡＤＰＫＤＰＨＫＦＹＩＣＳＮＷＥＡＶＨＫＤＣＰＧＮＴＲＷＮＥＤＥＥＴＣＴ（配列番号１４０；またＡＴ  Ａ  ７３３／２００６明細書を参照すればよい）からなることが言及される。
【００８０】
また、本発明によれば、上記において開示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％が同一である、好ましくは９０％が同一である、ペプチドが包含される。
【００８１】
本発明の他の局面は、本発明に係る融合された低アレルギー誘発性タンパク質をコードする核酸分子に関する。
【００８２】
本発明の他の局面は、本発明に係る核酸分子を包含するベクターに関する。
【００８３】
上記ベクターは、発現ベクターであることが好ましい。
【００８４】
本発明の核酸分子を内部に含むベクターは、クローニング用または発現ベクターの製作用に使用され得る。上記ベクターは、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージまたは遺伝子工学におい通常に使用されるあらゆる他のベクターであり得、かつ本発明の核酸分子、発現制御用の真核生物または原核生物のエレメント（例えば、転写および／または翻訳の開始および終結に関する制御配列、エンハンサ、プロモータ、ならびにシグナル配列など）を含むことができる。
【００８５】
本発明の好ましい実施形態によれば、ベクターは、細菌ベクター、真菌ベクター、昆虫ベクター、ウイルスベクターまたは哺乳類ベクターである。
【００８６】
本発明のベクターは、種々の宿主におけるクローニング目的または発現目的に対して採用され得る。従って、上記ベクターは、本発明に係る低アレルギー誘発性分子または融合タンパク質のほかに、宿主特異的な制御配列を包含する。
【００８７】
本発明の他の局面は、本発明に係る核酸分子またはベクターを包含する宿主に関する。
【００８８】
本発明に係る核酸分子またはベクターは、好適な宿主に導入され得る。上記分子は、宿主のゲノムに組み込まれ得る。ベクターは、細胞質において染色体外的に存在し得るか、または宿主の染色体に組み込まれ得る。
【００８９】
本発明のさらに他の局面は、本発明に係る低アレルギー誘発性分子、低アレルギー誘発性融合タンパク質または融合タンパク質に対して対象化された抗体に関する。
【００９０】
本発明の好ましい実施形態によれば、抗体は、モノクロナル抗体またはポリクロナル抗体である。
【００９１】
本発明に係る抗体としては、限定されないが、ポリクロナル抗体、モノクロナル抗体、多重特異性抗体、ヒト化した抗体もしくはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片ならびに上述のこれらのエピトープ結合断片が挙げられる。さらに、抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリンの免疫学的に活性な部分（すなわち、抗原を免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子）と考えられる。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリンのタイプ  ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスに好ましく属する。
【００９２】
ポリクロナル抗体は、本発明のポリペプチドを、好ましくは補佐剤を用いて、非ヒトの哺乳類に投与し、かつ結果物である抗血清を回収することによって調整され得る。期間の初めから終わりまで繰り返して注入することによって、向上した力価が得られ得る。抗体を導くために使用され得る哺乳類の種に対して特に制限はなく；ウサギまたはテンジクネズミを使用することが好まれるが、ウマ、ネコ、イヌ、ヤギ、ブタ、ラット、ウシ、ヒツジ、ラクダなども使用され得る。抗体の産生において、一定量の本発明の免疫原は、例えば、生理的食塩水を用いて好適な濃度にまで希釈され、かつ結果の希釈溶液は、例えば、懸濁液を調製するために完全フロインド補助液と混合されるか、または水酸化アルミニウムといったミネラルゲル、リゾレシチン、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールといった界面活性物質、ならびにＢＣＧ（ウシ型弱毒結核菌ワクチン）およびコリネバクテリウム  パルブムといった潜在的に有用なヒト補佐剤と混合される。懸濁物および混合物は、投与ごとに約５０μｇから約２５００μｇの本発明のポリペプチドを用いて、動物に対して、例えばウサギに対して、例えば腹腔内に、投与される。懸濁物は、免疫化をもたらすために、約２−３ヶ月、好ましくは約１ヶ月までの期間に渡って約２週間ごとに好ましく投与される。抗体は、最後の投与後から１から２週間が経過した後に免疫化動物から血液が回収され、血液を遠心分離し、かつ血液から血清を単離することによって、回収される。
【００９３】
モノクロナル抗体は、例えば、ヒトまたはマウス由来であり得る。マウスのモノクロナル抗体は、Kohler and Milsteinの方法（Kohler, G. and Milstein, C., Nature 256 (1975) 495）によって（例えば、適切なマウス骨髄腫細胞株を用いて免疫したマウスの脾臓細胞の融合によって）調製され得る。
【００９４】
キメラ抗体は、抗体の異なる部分が異なる動物種から得られている分子（例えば、マウスモノクロナル抗体から得られる可変領域およびヒト免疫グロブリンの定常部を有する抗体）である。キメラ抗体を生成する方法は、当該技術において公知である。例えば、Morrison, Science 229:1202 (1985)；Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986)；Gillies et al., (1989) J. Immunol. Methods 125:191-202；米国特許第５，８０７，７１５号明細書；米国特許第４，８１６，５６７号明細書および米国特許第４，８１６，３９７号明細書を参照すればよい。
【００９５】
ヒト化した抗体は、非ヒト種に由来する１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）およびヒト免疫グロブリン分子に由来するフレームワーク領域を有し、所望の抗原と結合する非ヒト種の抗体に由来する抗体分子である。多くの場合に、ヒトフレームワーク領域におけるフレームワーク残基は、ＣＤＲドナー抗体に由来する対応する残基を用いて置換して、抗原結合を変える、好ましくは向上する。これらのフレームワーク置換は、当該技術において公知の方法によって（例えば、抗原結合にとって重要なフレームワーク残基を特定するための、ＣＤＲ残基およびフレームワーク残基の相互作用のモデリング、および特定の位置における異常な残基を特定するための抗原結合配列比較によって）特定される（例えば、Queen et al., 米国特許第５，５８５，０８９号明細書；Riechmann et al., Nature 332:323 (1988)を参照すればよい）。抗体は、当該技術において種々の公知の技術（例えば、ＣＤＲグラフティング（欧州特許第２３９，４００号明細書；国際公開第９１／０９９６７号パンフレット；米国特許第５，２２５，５３９号明細書；米国特許第５，５３０，１０１；および米国特許第５，５８５，０８９号明細書）、ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）もしくは表面形成（欧州特許第５９２，１０６号明細書；欧州特許第５１９，５９６号明細書；Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991)；Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994)；Roguska. et al., PNAS 91:969-913 (1994)）、およびチェインシャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号明細書）が挙げられる）を用いてヒト化され得る。
【００９６】
本発明に係る抗体は、アレルギー、特にイエダニアレルギーにかかっている個体の脱感作に対して有利に使用され得る。受動免疫に対して、抗体は、ＩｇＧまたはこれらの誘導体（例えば、キメラ抗体またはヒト化抗体）であることが好ましい。さらにまた、この抗体は、個体の脱感作に使用され得る。
【００９７】
本発明の他の局面は、本発明に係る低アレルギー誘発性タンパク質または抗体を包含するワクチン調合物に関する。
【００９８】
本発明に係るワクチン調合物は、当該技術において公知のように調合され得、かつ上記ワクチン調合物の投与経路に対して必然的に適応させられ得る。
【００９９】
（本発明の）ワクチン調合物の好ましい投与経路は、一般的におよびアレルギー免疫療法特定的に、説明され、かつ示唆されるすべての標準的な投与管理体制（経口的、経皮的、静脈内的、鼻腔内的、経粘膜的、直腸的など）を包含する。しかし、本発明に係る分子を皮下的にか、または筋肉内に投与することが特に好ましい。
【０１００】
本発明に係るワクチン調合物は、ライノウイルス属の一員のウイルスカプシドタンパク質またはこれらの断片のみを包含し得る。
【０１０１】
上記調合物は、少なくとも１つの補佐剤、薬学的に受容可能な賦形剤および／または防腐剤をさらに、好ましく包含する。
【０１０２】
本発明に係る低アレルギー誘発性分子の免疫原性を増強するために、例えば、補佐剤は、本発明に係る薬剤に使用され得る。本発明に係る補佐剤は、抗原とともにか、または抗原と平行して投与される場合に、その免疫原性を増強する、および／または免疫応答の性質に影響を与える、補助剤である。従って、補佐剤は、液性免疫応答または細胞性免疫応答の程度に相当に影響することができる。慣例の補佐剤は、例えば、アルミニウム化合物、脂質含有化合物または不活化マイコバクテリアである。
【０１０３】
一般的に、補佐剤は、それらがヒトに対する投与に好適であることを規定されている、異なる形態であり得る。当該補佐剤のさらなる例は、ミネラル由来または植物由来の油乳濁液、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウムまたはリン酸カルシウムといった無機化合物、Ｐ４０（コリネバクテリウム  グラヌロスムの細胞壁から得られる）、モノホスホリル脂質  Ａ（ＭＰＬ、ＬＰＳの派生物）およびムラミルペプチド誘導体といった細菌性の産物および派生物およびこれらの接合物（マイコバクテリウム成分に由来する派生物）ミョウバン、不完全フロインド補助液、リポシン、サポニン、スクアレンなど（例えば、Gupta R. K. et al. (Vaccine 11:293-306 (1993)) and Johnson A. G. (Clin. Microbiol. Rev. 7:277-289を参照すればよい)。
【０１０４】
本発明の他の実施形態によれば、上記調合物は、１０ｎｇ〜１ｇ、好ましくは１０ｎｇ〜１０ｍｇ、特に０．５μｇ〜２００μｇの上記低アレルギー誘発性分子または抗体を包含する。
【０１０５】
本発明の他の局面は、ヒトまたは動物におけるウイルス感染および／またはアレルギーを処置するかまたは予防する薬剤の製造に対する、本発明に係る低アレルギー誘発性タンパク質または抗体の利用に関する。
【０１０６】
上記薬剤は、少なくとも１つの補佐剤、薬学的に受容可能な賦形剤および／または防腐剤を好ましく、さらに包含する。
【０１０７】
本発明に係る薬剤は、能動免疫（本発明の低アレルギー誘発性タンパク質および／または分子の投与）および受動免疫（本発明の低アレルギー誘発性タンパク質および／または分子に対して対象化された抗体）に使用され得る。
【０１０８】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記薬剤は、１０ｎｇ〜１ｇ、好ましくは１００ｎｇ〜１０ｍｇ、特に０．５μｇ〜２００μｇの上記低アレルギー誘発性分子、核酸分子、ベクター、宿主または抗体を包含する。
【０１０９】
薬剤は、０．０１ｋｇ／ｋｇ体重〜５ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜２ｍｇ／ｋｇ体重の量において個体に好ましく投与される。
【０１１０】
特定の投与計画（すなわち、投与量、時間的調節および頻度）は、特定の個体、および個体の病歴に依存する。経験的な考慮すべき事項（例えば、半減期）は、投与量の決定に対して一般的に貢献する。投与の頻度は、治療の過程を通して、決定され得、かつ調整され得る。
【０１１１】
本発明に係る薬剤が投与される個体は、アレルギーになる危険性がある個体または動物であることが好ましい。
【０１１２】
アレルギー性の状態、障害もしくは疾患を有する対象または有する危険がある対象としては、既存のアレルギー性の状態、またはアレルギー性の状態と関連するかもしくはアレルギー性の状態によって引き起こされる症状の発現に向かう、公知のもしくは疑わしい傾向を有する対象が挙げられる。従って、対象は、活発な慢性アレルギー性の状態、障害または疾患、急性アレルギー性の症状の発見、潜在性のアレルギーの状態、障害または疾患を有する可能性がある。あるアレルギー性の状態は、季節的または地理的な環境因子と関連する。従って、危険な状態にある対象としては、これまでの個人的な履歴もしくは家族歴、ならびに季節もしくは自然界の位置に基づく状態に苦しんでいるという観点から危険な状態にある対象が挙げられるが、上記状態と関連する状態または症状は、患者において現在において顕著になっていなくてもよい。
【０１１３】
本明細書に記載されているような少なくとも１つの低アレルギー誘発性分子を包含する本発明に係る薬剤の対象に対する投与は、上記個体の感作を予防し得るか、またはアレルゲンに対する好適な免疫応答を誘導し得る。本発明の薬剤が感作の予防に使用される場合には、当該薬剤は、上記アレルゲンとの最初の接触の前に個体に投与されるべきである。従って、新生児および子供に対して本発明に係る薬剤を投与することが好ましい。妊娠中の個体に対する本発明の薬剤の投与は、胎児の子供におけるアレルゲンに対して対象化される抗体の形成を誘導する。Ｔ細胞エピトープの欠如に起因して、アレルゲン免疫療法の経過において生じる副作用が、有意に低減され得るか、または完全な回避でさえなされ得るので、本発明に係る低アレルギー誘発性分子を当該治療に対して使用することは、特に受益者（ｂｅｎｅｆｉｃｉａｒｙ）である。
【０１１４】
本発明のさらに他の局面は、個体におけるアレルギーおよび／またはウイルス感染の診断に対する、本発明に係る低アレルギー誘発性タンパク質または抗体の利用に関する。
【０１１５】
本発明の他の局面は、薬剤もしくはワクチンにおける担体として、またはウイルス感染、特に風邪の診断用に、ピコルナウイルス科に属するウイルスに由来するウイルスカプシドタンパク質を利用することに関する。
【０１１６】
広範に普及するＫＬＨ担体タンパク質に対する有益な選択肢として、ピコルナウイルス科に属するウイルスのウイルスカプシドタンパク質が使用され得る。担体は、ペプチド、タンパク質およびポリペプチドか、または他の抗原に対して、化学的に接合され得るか、または組み換え技術を用いて融合され得る。さらにウイルスカプシドタンパク質は、例えば、個体の血清において上記カプシドタンパク質に対して対象化された抗体を検出することに使用され得る。
【０１１７】
当該担体の利点１つは、それらに対して融合されるか、または接合される抗原が、免疫系にさらされ得るだけでなく、ライノウイルスのカプシドタンパク質に対する免疫応答もまた誘導され得ることである。従って、当該ワクチン接種は、ライノウイルスに起因する疾患の予防および／または処置に通じる。ウイルスは、ヒトライノウイルス種、特にヒトライノウイルス８９および１４に属することが好ましい。
【０１１８】
本発明の他の局面は、Ｃ末端および／またはＮ末端に切り詰めを有し、かつ実質的にＩｇＥ結合能を欠如している、Ｐｈｌ  ｐ  ５（Ｇｅｎｅｂａｎｋ  番号Ｘ７４３５）から得られるアレルギー誘発性分子に関する。
【０１１９】
草本花粉は、花粉症およびアレルギー性喘息の原因である風媒介アレルゲンの最も可能性のある野外における、季節的な供給源の１つである。
【０１２０】
アレルギー体質の個体の４０％以上が、１１群以上に分けられる草本花粉アレルゲンとのＩｇＧ反応性を示す。草本花粉アレルギー患者の８０％以上は、群５のアレルゲンに反応する。
【０１２１】
群５のアレルゲンは、２５−３３ｋＤａの範囲の分子量を有する、非グリコシル化の高い相同性のあるタンパク質である。種々の群５のアレルゲンは、クローン化されており、および／または性質決定されている。
【０１２２】
点変異、列におけるいくつかのアミノ酸の変異、または欠失を導入することによるアレルギー誘発性活性を低下させるための試みは、影響を示さなかった（Schramm G, et al. J Immunol 1999; 162: 2406-1435）。Ｐｈｌ  ｐ  ５のＩｇＥ結合領域（Flicker S, et al. J Immunol 2000; 165: 3849-3859）は、すでに説明されており、かつ３次元構造が解明されている（Maglio O, et al. 2002. Protein Eng. 15:635-642）。
【０１２３】
Ｃ末端および／またはＮ末端において切り詰められ、かつＩｇＥ結合能を欠如している、本発明に係るＰｈｌ  ｐ  ５ペプチドは、個体の積極的なワクチン接種に採用され得る。
【０１２４】
本発明の好ましい実施形態によれば、切り詰めた分子は、Ｔ細胞エピトープを欠如している。
【０１２５】
低アレルギー誘発性分子が実質的にＴ細胞エピトープを欠如している場合に、上記においてすでに要点がまとめられているように、遅発性のアレルゲン免疫療法の副作用は、有意に低減されるか、または回避でさえなされ得る。
【０１２６】
Ｔ細胞エピトープを欠如する切り詰めたＰｈｌ  ｐ  ５分子は、Ｐｈｌ  ｐ  ５の９３〜１２８、９８〜１２８、２６〜５３、２６〜５８もしくは２５２〜２８３番目のアミノ酸、またはこれらの配列変異から構成される。
【０１２７】
特に、これらの切り詰めた分子は、Ｔ細胞エピトープを実質的に示さず、かつそれでもなお、野生型アレルゲンに対して対象化された適切な免疫応答を誘発することができる。
【０１２８】
本発明の他の好ましい実施形態によれば、低アレルギー誘発性の切り詰めたＰｈｌ  ｐ  ５は、Ｐｈｌ  ｐ  ５の１３２〜１６２、２１７〜２４６もしくは１７６〜２１２番目のアミノ酸、またはこれらの配列変異から構成される。
【０１２９】
これらの低アレルギー誘発性分子は、１つ以上のＴ細胞エピトープを包含するが、ＩｇＥ結合能を欠如する。
【０１３０】
本発明の他の局面は、Ｃ末端および／またはＮ末端に切り詰めを有し、かつＩｇＥ結合能を欠如する、Ｆｅｌ  ｄ  １（Ｇｅｎｂａｎｋ  番号  Ｘ６２４７７）から得られる低アレルギー誘発性分子に関する。
【０１３１】
動物に対するアレルギーは、アレルギー性患者の４０％にまで影響を及ぼす。家庭環境において、最も人気のあるペットであるネコおよびイヌに対するアレルギーは、特に流行しており、かつ年中続く症状と結び付けられる。動物アレルゲンは、鱗屑、上皮、唾液、血清または尿に存在する。アレルゲンに対するばくろは、アレルゲンを運ぶ粒子の、直接的な皮膚接触によってか、または吸入によって生じ得る。主要なネコおよびイヌアレルゲンは、広範に存在することを示され、かつペットを所有していない家庭および公共の場（例えば、学校）においてさえ検出され得た。これは、先進国においてペットを飼う家庭の高くかつ増加する数、ならびに運び去られ、かつばらまかれるアレルゲンの高い安定性に助長され得る。
【０１３２】
Ｆｅｌ  ｄ  １は、ネコアレルギー体質の患者の９０％以上によって認識される、主要なネコアレルゲンとして同定された。Ｆｅｌ  ｄ  １は、生物学的機能が分かっていない３８ｋＤａの酸性糖タンパク質を表す。Ｆｅｌ  ｄ  １は、非共有結合型の等しい２つの異種２量体（さらに、３つのジスルフィド結合によって逆平行に結合された２つのポリペプチド鎖から構成される）からなる。鎖  １および鎖  ２は、３つのエキソンからそれぞれなっている、異なる遺伝子にコードされている。鎖  １に対する鎖  ２の融合タンパク質として発現される、組み換えＦｅｌ（ｒＦｅｌ  ｄ  １）は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて生成されている。この組み換えＦｅｌ  ｄ  １は、野生型アレルゲンの免疫学的性質を完全に模倣することができる。
【０１３３】
主要なネコアレルゲンＦｅｌ  ｄ  １から得られ、かつＩｇＥ結合能を欠如するペプチドは、例えば、免疫療法および予防的なアレルギーワクチン接種に好適である。これらのペプチドは、大きなポリペプチドに包含され得るか、またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）といった好適な担体タンパク質と結合され得る。本明細書に開示されているＰｈｌ  ｐ  ５およびアレルゲン由来ペプチドのような、Ｆｅｌ  ｄ  １由来合成ペプチドは、ＩｇＧ応答（すなわち、いわゆる“遮断抗体”または“防御抗体”の産生）を誘導することができる。これらの抗体は、アレルゲンであるＦｅｌ  ｄ  １に対するＩｇＥ結合を妨げる。このようにして、アレルギー性の症状に関する有意な低減が、達成され得る。
【０１３４】
本発明の好ましい実施形態によれば、切り詰めた分子は、低下したＴ細胞反応性を示す。
【０１３５】
遅発型の副作用を回避するか、または有意に低下させるために、Ｆｅｌ  ｄ  １由来低アレルギー誘発性分子は、本発明において定義されるように低下したＴ細胞反応性を示す。
【０１３６】
切り詰めたＦｅｌ  ｄ  １は、Ｆｅｌ  ｄ  １の鎖  １の１〜３４もしくは３５〜７０番目のアミノ酸、Ｆｅｌ  ｄ  １の鎖  ２の１〜３４、３５〜６３もしくは６４〜９２番目のアミノ酸、またはこれらの配列変異から、好ましく構成される。
【０１３７】
本発明の他の局面は、以下のものから構成されるか、または当該以下のものを包含する低アレルギー誘発性分子に関する：Ｄｅｒ  ｐ  ２の１〜３３、２１〜５１、４２〜７３、６２〜１０３もしくは９８〜１２９番目のアミノ酸、Ｄｅｒ  ｐ  ７の１〜３０、２０〜５０、５０〜８０、９０〜１２５、１２５〜１５５もしくは１６５〜１９８番目のアミノ酸、Ｄｅｒ  ｐ  ２１の１〜３５、３５〜７２、７０〜１００もしくは９０〜１２２番目のアミノ酸、クローン３０の１〜３２、１５〜４８もしくは３２〜７０番目のアミノ酸、Ａｌｔ  ａ  １の１９〜５８、５９〜９５、９１〜１２０もしくは１２１〜１５７番目のアミノ酸、Ｐａｒ  ｊ  ２の３１〜６０、４５〜８０、６０〜９６もしくは９７〜１３３番目のアミノ酸、Ｏｌｅ  ｅ  １の１〜４０、３６〜６６、６３〜９９、８６〜１２０もしくは１０７〜１４５番目のアミノ酸、Ｆｅｌ  ｄ  ２の２５〜５８、９９〜１３３、１５４〜１８３、２７７〜３０７、３３４〜３６３、３７３〜４０２、５４４〜５７３、５７９〜６０８、５８〜９９、１２５〜１６５、１８３〜２２４、２２４〜２６１、２５２〜２８９、３０３〜３４０、４１６〜４５７、４６０〜５００もしくは５０１〜５４２番目のアミノ酸、Ｃａｎ  ｆ  ２の１９〜５８、５２〜９１、８２〜１１９、１０６〜１４４もしくは１３９〜１８０番目のアミノ酸、Ｃａｎ  ｆ  １の１９〜５６、５１〜９０、７８〜１１８、１０６〜１４５もしくは１３５−１７４番目のアミノ酸、Ａｒｔ  ｖ  １の２７〜７０、７０〜１００もしくは９２〜１３２番目のアミノ酸、Ａｍｂ  ａ  １の３１〜７０、８０〜１２０、１２５〜１５５、１６０〜２００、２２５〜２６３、２６４〜３００  ３０５〜３５０もしくは３５６〜３９６番目のアミノ酸、Ａｌｔ  ａ  ６の１〜３４、３５〜７４、７４〜１１５、１２５〜１６５、１７４〜２１３、２４１〜２８０、２９４〜３３３、３６１〜４００もしくは４０１〜４３８番目のアミノ酸、Ａｌｔ  ａ  ２の１〜４０、４１〜８０、８１〜１２０、１２１〜１６０番目のアミノ酸、またはこれらの断片または配列変異。
【０１３８】
本発明の他の局面は、低下したＩｇＥ結合能を示し、かつ低下したＴ細胞反応性を任意に示す本発明に係る少なくとも２つの低アレルギー誘発性分子を包含する、融合タンパク質に関する。
【０１３９】
アレルゲンから得られ、かつＩｇＥ結合能を欠如する本発明の低アレルギー誘発性分子は、互いに組み換え的に融合され得るか、または化学的に接合され得る。また、融合タンパク質／ポリペプチドの単一の成分（アレルゲン断片）としての、上記融合タンパク質／ポリペプチドは、ＩｇＥ結合能を欠如する。
【０１４０】
本発明に係る融合タンパク質は、少なくとも２つの、好ましくは少なくとも３つの、より好ましくは少なくとも４つの、さらに好ましくは少なくとも５つの本発明に係る低アレルギー誘発性分子を包含し得る。また、アレルゲンから得られない他のペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質に対して低アレルギー誘発性分子を融合することは、もちろん可能である。また、これらのペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質は、個体に投与される場合に、免疫反応を誘導し得るか、または担体としての役割を果たし得るか、または酵素活性を示し得る。本発明に係る融合タンパク質における低アレルギー誘発性分子は、互いに直接に連結され得るか、またはアミノ酸残基から好ましく構成されるリンカーを介して連結され得る。
【０１４１】
融合タンパク質の生成方法は、当該技術において公知であり、かつSambrook et al（Molecular Cloning, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）およびAusubel et al.（Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed; Wiley and Sons, 1995）といった標準的な分子生物学の参考文献に見られ得る。一般的に、融合タンパク質は、好適な宿主Ｔ細胞に形質移入するために次に使用される好適な発現ベクターに挿入される融合遺伝子を、まず構築することによって生成される。一般的に、組み換え融合構築物は、プラスミドに組み込まれている所望の配列を結果として生じる、一連の制限酵素消化およびライゲーション反応によって生成される。好適な制限酵素部位が利用できない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーは、当業者によって公知のように使用され得、かつ上記に引用した参考文献に記載されている。アレルゲンおよび本来のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、好適なベクターに挿入される前に構築され得るか、またはアレルゲンをコードする配列は、ベクター内にすでに存在する本来のタンパク質をコードする配列に隣接して挿入され得る。ベクター内への配列の挿入は、配列がタンパク質に翻訳されるように、インフレームに挿入されるべきである。適確な制限酵素、リンカーおよび／またはアダプターならびに適確な反応条件が、使用される配列およびクローニングベクターによって変わることは、当業者にとって明白である。しかし、ＤＮＡ構築物の構築は、当該技術において日常的な操作であり、かつ当業者によって容易に達成され得る。
【０１４２】
本発明の好ましい実施形態によれば、少なくとも２つの分子が同じアレルゲンから得られる場合に、分子は、野生型アレルゲンにおける断片の順序とは異なる順序において互いに、融合される。
【０１４３】
本発明に係る融合タンパク質は、同じ野生型アレルゲンから得られる少なくとも２つの低アレルギー誘発性分子を包含し得る。当該場合において、単一の分子（アレルゲン断片）は、野生型アレルゲンにおける順序とは異なる順序において互いに融合される。当該方法は、低アレルギー誘発性融合タンパク質における潜在的なＩｇＥ結合部位／エピトープの再形成を防ぐ。
【０１４４】
本発明の他の局面は、本発明に係る低アレルギー誘発性分子および融合タンパク質をコードする核酸分子に関する。
【０１４５】
本発明の核酸分子は、例えば上記分子を組み替え的に産生するために、採用され得る。
【０１４６】
上記核酸分子は、−本発明の他の局面に係る−ベクターに包含され得る。
【０１４７】
このベクターは、発現ベクターであることが好ましい。
【０１４８】
本発明の他の局面は、本発明に係る低アレルギー誘発性タンパク質、融合タンパク質または抗体を包含するワクチン調合物に関する。
【０１４９】
調合物は、少なくとも１つの補佐剤、薬学的に受容可能な賦形剤および／または防腐剤を、さらに包含することが好ましい。
【０１５０】
また、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）といった特定の担体の利用は、免疫応答を増強するための、現在における最新の方法の１つである。また、本発明の低アレルギー誘発性分子は、担体としての役割をも果たすウイルスカプシドタンパク質に対して融合され得るか、または接合され得る（上記を参照すればよい）。
【０１５１】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記調合物は、１０ｎｇ〜１ｇ、好ましくは１００ｎｇ〜１０ｍｇ、特に０．５μｇ〜２００μｇの上記低アレルギー誘発性分子または抗体を包含する。
【０１５２】
ワクチン調合物は、本発明の薬剤として実質的に構成され得る（上記を参照すればよい）。
【０１５３】
本発明の他の局面は、個体におけるアレルギーを処置するかまたは予防する薬剤の製造に対する、本発明に係る低アレルギー誘発性分子、融合タンパク質または抗体の利用に関する。
【０１５４】
本発明に係る低アレルギー誘発性分子、融合タンパク質および抗体は、個体のワクチン接種に使用され得る。このワクチン接種は、野生型アレルゲンによって引き起こされるアレルギー性応答を低下させ得るか、または予防し得る。
【０１５５】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記薬剤は、少なくとも１つの補佐剤、薬学的に受容可能な賦形剤および／または防腐剤を、さらに包含する。
【０１５６】
本発明に係る薬剤は、１０ｎｇ〜１ｇ、好ましくは１００ｎｇ〜１０ｍｇ、特に０．５μｇ〜２００μｇの上記免疫原性分子、核酸分子、ベクター、宿主または抗体を好ましく包含する。
【０１５７】
本発明の他の好ましい実施形態によれば、薬剤は、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜５ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜２ｍｇ／ｋｇ体重の量において個体に投与される。
【０１５８】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記個体は、アレルギーにかかる危険がある。
【０１５９】
本発明の他の局面は、個体におけるアレルギーを診断するかまたはアレルギー療法の経過を監視用する、低アレルギー誘発性分子、融合タンパク質または抗体に関する。
【０１６０】
本発明に係る低アレルギー誘発性分子、融合タンパク質または抗体は、薬剤において使用され得るだけでなく、種々の診断目的に対して好適に採用され得る。例えば、これらの分子および融合タンパク質は、例えば、ヒスタミン放出細胞を包含する個体の試料を上記ポリペプチドにさらすことによって、アレルギーの診断に使用され得る（例えば、Purohit et al., Clin.Exp.Allergy 35 (2005): 186-192を参照すればよい）。さらに、これらの分子、融合タンパク質および抗体は、ポリペプチドアレイ／チップを形成するために、表面上に固定化される。当該アレイは、例えば、多くの個体から取った多くの試料におけるアレルギーを診断するために、高速処理スクリーニングに使用され得る。
【０１６１】
本発明は、以下の図面および実施例によってさらに例証されるが、しかしこれらに限定されない。
【０１６２】
図１Ａは、ベクター  ｐ８９ＶＰ１の模式的な概要を示す。
【０１６３】
図１Ｂは、ｐＥＴ−１７ｂベクターのマルチクローニング部位および８９ＶＰ１コード遺伝子のＤＮＡ配列を示す。
【０１６４】
図１Ｃは、核酸融合を作り出すための３つの可能性の模式的な説明を示す。
【０１６５】
図２は、精製した８９ＶＰ１  ヒスタグ付きタンパク質を含む、クーマシーブルー染色した１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す（レーン１：５μｇの分子マーカー；レーン２−５：１０μの８９ＶＰ１  溶出試料）。
【０１６６】
図３は、１４ＶＰ１のＩｇＧ認識：１４ＶＰ１および対照の免疫ブロッティングを示す。ドットは、オートラジオグラフィーによって可視化されている（レーン１−６：１：５００−１：１６０００に希釈したウサギ抗１４ＶＰ１抗血清を用いたインキュベーション；レーン７−１２：１：５００−１：１６０００に希釈した免疫前の血清を用いたインキュベーション）。
【０１６７】
図４は、マウスにおける８９ＶＰ１特異的なＩｇＧ１応答を示す。マウスの群は、箱のそれぞれの上部に示されるように、異なる抗原を用いて免疫化された。８９ＶＰ１特異的ＩｇＧ１の力価が、ＥＬＩＳＡによって測定され、かつｙ軸にＯＤ値として表された。結果は、ボックスプロット（ｂｏｘ  ｐｌｏｔ）として示され、ここで、数値の５０％が箱の中にあり、かつバーの間にある外れ値ではない。箱の中の線は、中央値を示している。
【０１６８】
図５は、マウスにおけるＰｈｌ  ｐ  １特異的ＩｇＧ１応答を示す。マウスの群は、箱のそれぞれの上部に示されるように、異なる抗原を用いて免疫化された。ｒＰｈｌ  ｐ  １特異的ＩｇＧ１の力価は、ＥＬＩＳＡによって測定され、かつｙ軸に光学値（ＯＤ  ４０５ｎｍ）として表された。光学値は、マウス血清におけるＩｇＧ１抗対のレベルと一致している。ボックスプロットとして示される結果は、数値の５０％が箱の中にあり、かつバーの間にある外れ値ではなかった。箱の中の線は、中央値を示している。
【０１６９】
図６は、免疫化マウスにおけるオオアワガエリ花粉抽出物特異的ＩｇＧ１応答を示す。マウスの群は、箱のそれぞれの上部に示されているように異なる抗原を用いて免疫化された。オオアワガエリ花粉抽出物特異的ＩｇＧ１の力価は、ＥＬＩＳＡによって測定され、かつｙ軸における光学値（ＯＤ  ４０５ｎｍ）として表される。光学値は、マウス血清におけるＩｇＧ１抗体のレベルと一致する。結果は、ボックスプロットとして示され、ここで、数値の５０％が箱の中にあり、かつバーの間にある外れ値ではない。箱の中の線は、中央値を示している。
【０１７０】
図７は、１９人の患者のすべてのｒＰｈｌ  ｐ  １、ｒ９８Ｐ５およびＫＬＨＰ５に対する抗血清を用いた前インキュベーションによる、患者のｒＰｈｌ  ｐ  １に対するＩｇＥ結合の阻害％の平均を示している。阻害％は、ｙ軸に示されている。結果は、バーとして示されている。
【０１７１】
図８は、免疫化マウスの脾臓細胞の増殖を示す。箱のそれぞの上部に示されているように異なる抗原を用いて免疫化されたマウスのＴ細胞は、ペプチド  ５、８９ＶＰ１（８９）およびＫＬＨによって刺激された。培地は、基準として使用された。結果は、バーで示される。
【０１７２】
図９は、ヒトの血清においてＥＬＩＳＡ測定によって検出された、１４ＶＰ１、８９ＶＰ１およびｒＰｈｌ  ｐ  １に対するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４およびＩｇＡ応答を示している。１０人の患者の血清が、箱のそれぞれの上部に示されているように、８９ＶＰ１、１４ＶＰ１およびｒＰｈｌ  ｐ  １に対して特異的な４つの抗体に関して試験された。秋および冬に取られた血清は、“バーの対”のそれぞれの左側および右側にそれぞれ示されている。力価は、ＥＬＩＳＡによって測定され、かつｙ軸における光学値（ＯＤ  ４０５ｎｍ）として表される。光学値は、ヒトの血清における抗体のレベルと一致する。結果はボックスプロットとして示され、ここで、数値の５０％が箱の中にあり、かつバーの間にある外れ値ではない。箱の中の線は、中央値を示している。
【０１７３】
図１０は、アレルギー性患者の血清における抗８９Ｖｐ１抗体および抗ｒＰｈｌ  ｐ  １抗体の検出を示している。Ｐｈｌ  ｐ  １アレルギー性患者の５つの血清が、８９ＶＰ１（各対の左のバー）およびｒＰｈｌ  ｐ  １（各対の右のバー）に対して特異的な７つの抗体に関して試験された。力価はＥＬＩＳＡによって測定され、かつｙ軸において光学値（ＯＤ  ４０５ｎｍ）として表されている。光学値は、ヒトの血清における抗体のレベルと一致する。結果はボックスプロットとして示され、ここで、数値の５０％が箱の中にあり、かつバーの間にある外れ値ではない。箱の中の線は、中央値を示している。
【０１７４】
図１１は、ＨＲＶ１４タンパク質抽出物および精製１４ＶＰ１に対する抗１４ＶＰ１ＩｇＧ結合を示す（レーン１および４：５μｇのマーカー；レーン２および４：ウイルス抽出物；レーン２および５：５μｇの１４ＶＰ１）。ブロットＡおよびＢは、抗１４ＶＰ１免疫血清および免疫前の血清のそれぞれを用いてインキュベーションされた。結合したＩｇＧは、ウエスタンブロッティングによって検出され、かつオートラジオグラフィーによって可視化された。
【０１７５】
図１２は、ＨＲＶ１４の中和化を示している（レーンＡ（細胞対照）：抗１ＶＰ１免疫血清の１：１０２−１：１０８の希釈液を用いたＨＲＶ１４の前インキュベーション後の細胞（列Ａ１−Ａ６）；レーンＢ：免疫前の血清の１：１０２−１：１０８の希釈液を用いたＨＲＶ１４の前インキュベーション後の細胞（列Ｂ１−Ｂ６）；レーンＣ：１０のＴＣＤ５０−１０６のＴＣＤ５０のＨＲＶ１４を用いたインキュベーション後の細胞（列Ｃ１−Ｃ６）；Ｄ５：免疫前の血清を用いたインキュベーション後の細胞；Ｄ６：免疫血清を用いたインキュベーション後の細胞）。細胞は、すべてのウェルにおいて培養され、かつ３日後にクリスタルバイオレットを用いて着色された。
【０１７６】
図１３は、完全なＰｈｌ  ｐ  ５に対する抗ペプチド血清のＩｇＧ反応性を示す。Ｐｈｌ  ｐ  ５に対するＩｇＧ反応性（ＯＤ値）は、ＫＬＨ接合ペプチドの１つを用いてそれぞれが免疫化されている６匹のウサギから得られた３つの血清試料（採血１：免疫前の血清；採血２−３：１ヶ月の間隔を置いて回収された血清試料）に関して示されている。
【０１７７】
図１４は、ＣＤ２０３ｃ発現によって検出されるときの、ｒＰｈｌ  ｐ  ５およびペプチド混合物のアレルギー誘発性活性を示す。Ｐｈｌ  ｐ  ５に対するアレルゲン性の３人の患者に由来するヘパリン添加血液は、組み換えアレルゲン、Ｐｈｌ  ｐ  ５由来ペプチドの等モル濃度混合物、抗ＩｇＥまたは対照緩衝液（ｃｏ、ｘ軸）の１０−４から１０μｇ／ｍＬまでの希釈系列とともにインキュベーションされた。細胞は、それからＣＤ２０３ｃ  ｍＡｂを用いて染色され、かつＦＡＣＳｃａｎにおいてＣＤ２０３ｃ発現に関して分析された。刺激指標（ＳＩ）は、ｙ軸に表示されている。
【０１７８】
図１５は、低いリンパ球増殖応答を誘導するＰｈｌ  ｐ  ５由来ペプチドの同定を示す。オオアワガエリ花粉アレルギー性患者からのＰＢＭＣは、異なる濃度のペプチド、および対照を目的としたインターロイキン−２（ｘ軸）を用いて刺激された。刺激指標（ＳＩ）は、ｙ軸において示されている。
【０１７９】
図１６は、ウサギにおけるＦｅｌ  ｄ  １特異的ＩｇＧ免疫応答を誘導するＦｅｌ  ｄ  １由来合成ペプチドを示す。６匹のウサギが、ＫＬＨ接合Ｆｅｌ  ｄ  １由来合成ペプチドまたは非接合ｒＦｅｌ  ｄ  １を用いて免疫化され、かつ３−４回の出血が、１ヶ月の間隔をおいて引き出された。免疫前の血清および抗血清のＥＬＩＳＡプレート結合ｒＦｅｌ  ｄ  １に対するＩｇＧ反応性が、光学濃度（Ｏ．Ｄ．値、ｙ軸）として示されている。
【０１８０】
図１７は、アレルギー性患者の抗塩基球上におけるＣＤ６３およびＣＤ２０３ｃによって決定されるときの、Ｆｅｌ  ｄ  １由来合成ペプチドの低いアレルギー誘発性活性を示す。５人のネコアレルギー性患者のからのＰＢＭＣは、Ｆｅｌ  ｄ  １（閉じた箱）またはＦｅｌ  ｄ  １由来合成ペプチドの混合物（開いた箱）の希釈系列を用いてインキュベーションされた（ｘ軸）。また、患者ＲＲに関して、ＰＢＭＣは、単一の成分として、Ｆｅｌ  ｄ  １由来合成ペプチドの希釈系列を用いて検証された。表面マーカーであるＣＤ２０３ｃおよびＣＤ６３の発現の誘導は、蛍光強度の平均値として測定され、かつｙ軸に示される刺激指標を算出した。
【０１８１】
図１８は、ＫＬＨ連結Ｂｅｔ  ｖ  １由来ペプチドを用いた処理が、感作したマウスにおいてｒＢｅｔ  ｖ  １に対してリンパ球増殖応答を誘導することを示す。Ｔ細胞増殖は、組み換えカンバ花粉アレルゲンＢｅｔ  ｖ  １（白バー）、ＫＬＨ（黒バー）、またはペプチド混合物（灰色バー）を用いたインビトロ刺激の後に、脾臓細胞において測定された。バーは、マウスの異なる群に関する刺激指標の平均値（ＳＩ±ＳＤ）を表している。
【０１８２】
図１９は、感作後においてｒＢｅｔ  ｖ  １に対するリンパ球増殖応答を低下させるＫＬＨ連結Ｂｅｔ  ｖ  １由来ペプチドを用いた天然のマウスの予防的ワクチン接種を示している。
【０１８３】
図２０は、Ｂｅｔ  ｖ  １特異的ＩｇＧ応答を誘導し、かつ完全なアレルゲンによるアレルゲン特異的ＩｇＧ応答の誘導を開始するＫＬＨ連結Ｂｅｔ  ｖ  １由来ペプチドを用いた天然のマウスの予防的ワクチン接種を示す。Ｂｅｔ  ｖ  １に対するＩｇＧ応答（ＯＤ値：ｙ軸）は、異なる時点（ｘ軸）において、４つの処置群において測定された。
【０１８４】
図２１は、ＩｇＥ反応性の比較を示す：Ｐｈｌ  ｐ  ５由来ペプチド（１、２）および異形（１ａ、２ｂ）のＩｇＥ結合能が、７人の草本花粉アレルギー患者からの血清（ｐ１−ｐ７）および非アトピー性の個体からの血清（ＮＨＳ）を用いた、０．２□ｇ／ドットを適用するドットプロットアッセイにおいて決定された。ｒＰｈｌ  ｐ  ５は、陽性対照として使用され、ＨＳＡは、陰性対照として使用された。結合したＩｇＥは、１２５Ｉ−標識抗ヒトＩｇＥを用いて検出された。
【０１８５】
図２２は、Ｐｈｌ  ｐ  ５由来ペプチド（１、２）および異形（１ａ、２ｂ）のリンパ球増殖応答を示す。草本花粉アレルギー性患者からのＰＢＭＣは、異なる濃度のペプチド、および対照を目的とした等モル濃度のｒＰｈｌ  ｐ  ５を用いて刺激された。刺激指標（ＳＩ）は、ｙ軸において示されている。
【０１８６】
図２３は、抗ＶＰ１抗体の交差防御を示している。
【０１８７】
〔実施例〕
（実施例１：ベクター  ｐ８９ＶＰ１の構築）
ウイルスストック試料は、ＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡキット（Ｑｕｉａｇｅｎ、ドイツ）による細胞培養上清からのＲＮＡ抽出の後に、最終濃度が０．０１Ｕ／μｌになるまで１μｌのＲＮａｓｅ阻害剤（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ株式会社  Ｇｍｂｈ）を添加することによって、ＲＴ−ＰＣＲ用に調製された。
【０１８８】
プラスミドｐ８９ＶＰ１（図１Ａ）は、ｐＥＴ−１７ｂのマルチクローニング部位のＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ断片を、ヒトライノウイルス８９株のＶＰ１タンパク質（８９ＰＶ１）コードするｃＤＮＡ配列と置き換えることによって構築された。（ｐＥＴ−１７ｂにおける）ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩの制限酵素認識部位は、５’末端においてＡＴＧ、３’末端において６ヒスチジンに続いてストップコドンＴＧＡを有するＡｓｅＩ／ＥｃｏＲＩ連結８９ＶＰ１の挿入に使用された（図１Ｂ）。
【０１８９】
ｐＥＴ−１７ｂにおける８９ＶＰ１の挿入は、ヌクレオチド配列決定によって確認された。
【０１９０】
ＮｄｅＩ部位の代えてＮｄｅＩ／ＡｓｅＩ融合した後に、ＣＡＴＡＡＴは、作り出され、かつあらゆる利用可能な酵素を用いて切断できなくなった。このため、上記部位は、ＡｆｌＩＩの制限酵素認識部位であるＣＴＴＡＡＧに変異された。さらなるアレルゲン断片を挿入するために、３’末端におけるＡＣＣＧＴＴ配列が、ＡｇｅＩの制限酵素認識部位であるＡＣＣＧＧＴに変異された。アミノ酸配列は、８９ＶＰ１のヌクレオチド配列以下に表示されている。制限酵素認識部位は、図１Ｂにおいて下線を付して示されている。
【０１９１】
上記ＡｆｌＩＩ制限酵素認識部位およびＡｇｅＩ制限酵素認識部位は、Ｑｕｉｃｋ  ｃｈａｎｇｅ部位変異生成キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて作り出された。
【０１９２】
このようにして、遺伝子断片に対するｃＤＮＡは、図１Ｃに示されるように、５’末端において（ＡｆｌＩＩを用いて）か、または３’末端において（ＡｇｅＩを用いて）残っている制限酵素認識部位にか、または両方の部位に簡易精製用に挿入され得る。組み換えアレルゲン断片は、８９ＶＰ１のＮ末端および／またはＣ末端において発現される。
【０１９３】
【表２７】
0005399895.tif 000028
【０１９４】
（実施例２：８９ＶＰ１−アレルゲン断片融合タンパク質を発現する構築物のクローニング）
上述した方法は、Ｃ末端のＰｈｌ  ｐ  １アレルゲン断片、すなわちペプチド  ５（ＣＶＲＹＴＴＥＧＧＴＫＴＥＡＥＤＶＩＰＥＧＷＫＡＤＴＡＹＥＳＫ；M. Focke et al. FASEB J (2001) 15:2042-4）に対して例証された。ペプチド  ５のＤＮＡ配列は、鋳型としてＰｈｌ  ｐ  １のｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ７８８１３）を用いたＰＣＲ（プライマー１Ｐｈｌ  ｐ  １  ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＣＧＣＧＣＴＴＡＡＧＡＴＧＧＴＣＣＧＣＴＡＣＡＣＣＡＣＣＧＡＧＧＧＣ−３’（配列番号７）：Ｐｈｌ  ｐ  １  ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＣＧＣＧＣＴＴＡＡＧＣＴＴＧＧＡＣＴＣＧＴＡＧＧＣＧＧＴＧＴＣＧＧＣ−３’（配列番号８））によって増幅された。ＰＣＲ産物は、ｐ８９ＶＰ１ベクターのＡｆｌＩＩ制限酵素認識部位に挿入され、かつ結果構築物は、ベクターｐ８９Ｐ５および遺伝子産物ｒ８９Ｐ５と呼ばれる。
【０１９５】
（実施例３：８９ＶＰ１  ペプチド  ５−融合タンパク質および（）ＶＰ１の発現および精製）
８９ＶＰ１またはｒ８９Ｐ５（組み換え８９ＶＰ１−ペプチド  ５融合タンパク質）の発現を達成するために、プラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換された。形質転換したＥ．ｃｏｌｉ細胞は、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含有する２５０ｍｌのＬＢ培地において、３７℃において、０．４の光学濃度（６００ｎｍ）になるまで培養され、かつタンパク質発現が、イソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトシダーゼ（ＩＰＴＧ）を１ｍＭの最終濃度になるまで加えることによって、誘導された。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞は、４時間後に、３５００ｒｐｍにおいて、４℃における１０分間の遠心分離によって回収された。精製は、Ｑｕｉａｇｅｎ  Ｎｉ−ＮＴＡおよびカラムを用いて、Ｑｉａｇｅｎの手順を用いて実施された。細胞ペレットは、５ｍｌの６Ｍのグアジニン塩酸塩において１時間の変性条件下において再懸濁された。遠心分離（２０分間、１００００×ｇ）の後に、上清は、１ｍｌのＮｉ−ＮＴＡを用いて追加の時間においてインキュベーションされた。それから、懸濁液は、カラムに装填され、５ｍｌの洗浄緩衝液（８Ｍの尿素、ｐＨ６．３）を用いて２回洗浄され、かつそれから４ｍｌの溶出緩衝液（８Ｍの尿素、ｐＨ３．５）を用いて溶出された。復元は、尿素のモル濃度を減少させることを伴う透析の後に、達成された。
【０１９６】
精製タンパク質の精製度および大きさは、図２に示されるように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された。タンパク質のバンドは、予測されたタンパク質サイズである３３．６ｋＤと相関した。また、タンパク質の完全性は、抗ヒスチジン抗体を用いたウエスタンブロッティングによって確認された。
【０１９７】
（実施例４：免疫ブロットによる１４ＶＰ１特異的ウサギ抗体の検出）
５μｇの１４ＶＰ１（ヒトライノウイルス１４株のＶＰ１タンパク質）および対照（Ｂｅｔ  ｖ  １、Ｐｈｌ  ｐ  ５、ＢＳＡ）は、ニトロセルロース膜条辺の上にドット化された。これらの条辺は、ウサギ抗１４ＶＰ１抗血清（レーン１−６）および免疫前の血清（レーン８−１２）の希釈物にさらされた。結合したウサギＩｇＧ抗体は、１：１０００の１２５Ｉ標識ロバ抗ウサギＩｇＧを用いて検出され、かつオートラジオグラフィーによって可視化された（図３）。
【０１９８】
ウサギ抗１４ＶＰ１血清のドットブロット分析は、１４ＶＰ１が強い免疫原性を有することを示す。ＩｇＧ抗体は、免疫前の血清およびＢｅｔ  ｖ  １、Ｐｈｌ  ｐ  ５およびＢＳＡの対照とは対照的に、血清の１：１６０００の希釈物を用いてもまだ検出された。
【０１９９】
（実施例５：ＥＬＩＳＡによって決定される、免疫マウスにおける８９ＶＰ１特異的な抗体反応）
８９ＶＰ１の免疫原性、およびペプチド  ５に対する担体として働く能力を決定するために、６週齢のメスのｂｌａｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）の群は、以下の抗原：ＫＬＨ、ＫＬＨマレイミド結合ペプチド  ５（ＫＬＨＰ５）およびＫＬＨ  ＥＤＣ結合ペプチド  ５（ＫＬＨＰ５ｅｄｃ）を用いて免疫された。化学結合は、イムジェクト（Ｉｍｊｅｃｔ）マレイミドｍｃＫＬＨキットおよびイムジェクト免疫原ＥＤＣキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて作製された。マレイミド基は、ＳＨ基と反応し、かつＥＤＣは、カルボキシル基およびアミノ基と反応して、安定な結合を形成する。４匹のマウスの群は、８９ＶＰ１、ｒ８９Ｐ５および８９Ｐ５ｅｄｃを用いて免疫され、かつ２匹のマウスは、ペプチド  ５のみを用いて免疫された（それぞれ５μｇ、および水酸化アルミニウムを用いて１：２に混合された）。マウスは、３週間の間隔を置いて皮下に免疫され、かつ尾の血管から採血された。８９ＶＰ１特異的ＩｇＧ１抗体レベルは、ＥＬＩＳＡによって決定された。
【０２００】
ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）は、５μｇ／ｍｌの８９ＶＰ１を用いて表面を被われた。マウスの抗８９ＶＰ１、抗ｒ８９Ｐ５およびペプチド  ５血清は、１：５００に希釈された。結合したＩｇＧ１は、１：１０００のラットの抗マウスＩｇＧ１（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて検出され、かつそれからＰＯＸ結合したヤギ抗ラットＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて検出された。光学濃度（ＯＤ  ５０４ｎｍ）は、ｙ軸に表示されており、かつマウス血清においてＩｇＧ１抗体のレベルと相関している（図４）。
【０２０１】
ＫＬＨＰ５、ＫＬＨＰ５ｅｄｃ、ＫＬＨおよびペプチド  ５は、対照として使用された。ＩｇＧ１抗体は、８９ＶＰ１（８９ＶＰ１、８９Ｐ５ｅｄｃおよびｒ８９Ｐ５）を注入したマウスの免疫化の間において、増加する力価とともに検出された。８９ＶＰ１、ｒ８９Ｐ５およびＫＬＨＰ５を用いて免疫したウサギは、同じ結果を示す。
【０２０２】
（実施例６：ＥＬＩＳＡによって決定される、免疫マウスにおけるｒＰｈｌ  ｐ  １特異的な抗体応答）
ｒ８９Ｐ５を用いた免疫化が、完全なＰｈｌ  ｐ  １と反応するＩｇＧ抗体を誘導するか否かを評価するために、同じ方法および同じマウス血清が実施例５に記載されるように使用された。ＥＬＩＳＡプレートは、５μｇ／ｍｌのｒＰｈｌ  ｐ  １を用いて被われ、かつＩｇＧ１抗体の力価が決定された（図５）。
【０２０３】
ＫＬＨまたは８９ＶＰ１のいずれかと結合されたＰｈｌ  ｐ  １由来抗体のすべては、免疫化の間において増加する応答を伴ってＰｈｌ  ｐ  １特異的ＩｇＧ１抗体を誘導した。ｒ８９Ｐ５およびＫＬＨＰ５を用いて免疫したウサギは、同じ結果を示す。
【０２０４】
（実施例７：オオアワガエリ抽出物特異的なＩｇＧ１抗体のＥＬＩＳＡ検出）
マウスの免疫化およびＥＬＩＳＡ分析は、項５に記載されているように実施された。完全なオオアワガエリ花粉抽出物は、ＥＬＩＳＡプレート上にまぶされ、かつＩｇＧ１抗体の力価が決定された（図６）。
【０２０５】
３回の免疫化の後に、抽出物特異的ＩｇＧ１抗体が、ペプチド  ５を用いて免疫したマウスにおいて検出された。
【０２０６】
（実施例８：ウサギ抗ｒ８９Ｐ５がｒＰｈｌ  ｐ  １に対する患者のＩｇＥ結合を阻害する）
アレルギー性患者のＩｇＥ抗体のｒＰｈｌ  ｐ  １に対する結合を阻害するペプチド由来ウサギＩｇの能力を決定するために、ＥＬＩＳＡプレートは、１μｇ／ｍｌのｒＰｈｌ  ｐ  １を用いて被われ、洗浄され、かつブロッキングされた。プレートは、１：１００に希釈したウサギ抗ペプチド（８９Ｐ５、ＫＬＨＰ５）、ウサギ抗ｒＰｈｌ  ｐ  １とともに、かつ対照を目的として対応する免疫前の血清とともに、前インキュベーションされた。洗浄の後に、プレートは、Ｐｈｌ  ｐ  １アレルギー性患者からのヒト血清（１：３に希釈）とともにインキュベーションされ、かつ結合したＩｇＥは、マウス抗ヒトＩｇＥ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、１：１０００）を用いて、かつそれからＰＯＸ結合ヒツジ抗マウスＩｇＧ（Ａｍａｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて検出された。抗ペプチド血清をともなう前インキュベーションによって達成されたＩｇＥ結合の阻害％は、以下のように（１００ＯＤｉ／ＯＤｐ×１００）算出された。
【０２０７】
ＯＤｉおよびＯＤｐは、ウサギ免疫血清およびウサギ免疫前の血清のそれぞれを用いた前インキュベーション後における吸光度を表している。表２は、１９人のアレルギー性患者のＩｇＥの完全なＰｈｌ  ｐ  １に対する結合を阻害する、抗Ｐｈｌ  ｐ  １ペプチド抗体の能力を示している。図７は、抗ｒＰｈｌ  ｐ  １免疫血清、抗ｒ８９Ｐ５免疫血清および抗ＫＬＨＰ５免疫血清のすべての、阻害平均値（％でもって）を表示している。抗ペプチド血清は、ｒＰｈｌ  ｐ  １よりも遥かに良好にＩｇＥ結合を遮断した。阻害に関する能力は、８９Ｐ５およびＫＬＨＰ５とほとんど一緒である。表２は、１９人の患者の阻害（％でもって）を示す。
【０２０８】
【表２８】
0005399895.tif 000029
【０２０９】
（実施例９：抗原刺激後におけるマウス脾臓細胞のＴ細胞増殖）
３匹のマウスの群は、ＫＬＨ、ＫＬＨＰ５およびＫＬＨＰｅｄｃを用いて免疫された。４匹のマウスの群は、８９ＶＰ１、ｒ８９Ｐ５および８９Ｐ５ｅｄｃを用いて４回免疫され、かつ２匹のマウスは、ペプチド  ５のみを用いて免疫された（それぞれ５μｇ）。脾臓細胞は、最後の免疫の後における１０日目に採られ、かつ単一の培養細胞は、ペプチド  ５（Ｐ５）、８９ＶＰ１、ＫＬＨ、Ｃｏｎ  Ａならびに陽性対照および陰性対照として培地をそれぞれ用いて、９６ウェルプレートにおいて３つ１組にして、刺激された。４日後に、０．５μＣｉの放射性の［３Ｈ］チミジンが、各ウェルに加えられた。それから、細胞は、１５時間後に単一フィルタプレート上において、パッカードセルハーベスター（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｃｅｌｌ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ）を用いて回収された。細胞関連放射性は、ベータ計測器を用いて測定された。刺激は、予想された場合において誘導され、かつｙ軸に示されている。刺激に使用された抗原は、ｘ軸に示されている。各箱は、マウスの免疫に使用された抗原のデータを表している（図８）。２以上のすべての値は、陽性として数える。ＫＬＨおよびＫＬＨＰ５の免疫マウスは、ＫＬＨを用いて刺激された場合にのみ陽性であり、かつペプチド  ５マウスは、完全に陰性である。また、ＫＬＨＰ５ｄｅｃ群は、ＥＬＩＳＡの結果と対応して陰性である。ｒ８９Ｐ５、８９Ｐ５ｄｅｃおよび８９ＶＰ１の免疫マウスから得られる細胞は、８９ＶＰ１を用いた刺激の後にのみ増殖した。未処置の対照マウスは、すべての場合において増殖を示さない。これらの結果は、Ｔ細胞エピトープが、担体８９ＶＰ１によって提供され、かつペプチド  ５によって提供されないことを示している。
【０２１０】
（実施例１０：秋および冬に得られたヒト血清における、１４ＶＰ１−、８９ＶＰ１−およびｒＰｈｌ  ｐ  １−特異的抗体のＥＬＩＳＡによる検出）
無作為に選ばれた個人の５つのヒト血清は、秋に採られ、かつ５つは、冬に採られた。１４ＶＰ１、８９ＶＰ１およびｒＰｈｌ  ｐ  １に対するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４およびＩｇＡの抗体レベルは、実施例５に記載されたようにＥＬＩＳＡによって決定された。ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４およびＩｇＡ４は、１：２０００のＰＯＸ結合ヒツジ抗マウスＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）１：１０００を検出された。秋および冬に採られた血清の抗１４ＶＰ１および８９ＶＰ１のＩｇＧ１の高い力価を検出することができた（図９）。抗ｒＰｈｌ  ｐ  １のＩｇＧ１抗体の力価は、非常に低かった。ＩｇＧ２、ＩｇＧ４およびＩｇＡ抗体を、すべての場合において、非常に低いレベルにおいて検出することができた。異なるＨＲＶ株のＶＰ１タンパク質は、近縁関係にあり、かつその交差反応性が他の研究において示されている。
【０２１１】
（実施例１１：Ｐｈｌ  ｐ  １アレルギー性患者の抗８９ＶＰ１抗体および抗ｒＰｈｌ  ｐ  １抗体）
５人のＰｈｌ  ｐ  １アレルギー性患者の血清が採られ、かつＥＬＩＳＡ実験が、実施例５に記載のように実施された。ＥＬＩＳＡプレートは、ｒＰｈｌ  ｐ  １および８９ＶＰ１を用いて被われ、かつ特異的なＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡおよびＩｇＥ抗体の力価が、決定された（図１０）。抗ｒＰｈｌ  ｐ  １のＩｇＧ１抗体よりも抗８９ＶＰ１  ＩｇＧ１の方が、検出され得た。
【０２１２】
（実施例１２：完全なウイルスと結合する抗１４ＶＰ１抗体のウエスタンブロッティングによる検出）
１４ＶＰ１を注入したウサギの血清の、完全なウイルスに対する抗体結合は、完全なＨＲＶ１４ウイルス（レーン２および５）および対照として５μｇの精製１４ＶＰ１（レーン３および６）を用いて確認された。ウイルス抽出物は、１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、かつニトロセルロース膜上にブロットされた。１：５００のウサギ抗１４ＶＰ１抗血清（レーン１−３）および１：５００の免疫前の血清（レーン４−６）がＨＲＶ１４および１４ＶＰ１に対する結合に関して試験された。結合したＩｇＧは、１２５Ｉ標識されたロバ抗ウサギ抗体を用いて検出され、かつオートラジオグラフィーによって可視化された（図１１）。
【０２１３】
１４ＶＰ１抗血清の結合は、１４ＶＰ１と同じサイズ（３３．６ｋＤ）において検出され得た。
【０２１４】
（実施例１３：原型を保ったヒトライノウイルス１４の抗１４ＶＰ１抗体による中和）
ＨＲＶ１４の組織培養投与量５０（ＴＤＣ５０）が決定された。従って、１％ＦＳＣおよび４０ｍＭのＭｇＣｌ２のＭＥＭ−Ｅａｇｌｅにおける、１：１０２−１：１０８のウイルス希釈が実施され、かつＨｅＬａ  Ｏｈｉｏ細胞とともに、２４ウェルプレート、３４℃、加湿した５％ＣＯ２雰囲気において、３日間培養された。また、ウイルスなしの対照が播かれた。
【０２１５】
ウイルスの細胞毒性効果が、３日後にクリスタルバイオレットを用いて可視化され、かつＴＣＤ５０（５０％の細胞が死ぬ場合の希釈率）が、算出された。
【０２１６】
列ＡおよびＢにおける血清希釈物およびウイルス（１００のＴＣＤ５０）が、３４℃においてインキュベーションされた。２時間後に、細胞は、すべてのウェルに播かれた。Ｄ５およびＤ６は血清対照である。実験概要は、図１２に示されている。抗体の中和化効果は、クリスタルバイオレットを用いて３日後に検出された（図１２）。
【０２１７】
（実施例１４：Ｐｈｌ  ｐ  ５由来合成ペプチドの特性）
ペプチドは、アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）ペプチド合成機モデル４３３Ａにおいて、ＨＢＴＵ活性化（０．１ｍｍｏｌの小規模サイクル）を伴うＦｍｏｃストラテジーを用いて、Focke et al. Faseb J (2001) 15:2042に記載のように合成された。Ｐｈｌ  ｐ  １アレルゲンの詳細な分析の後に、溶媒にさらされるアミノ酸が豊富な、長さが３１アミノ酸（Ｐ１：３０２６ダルトン）から３８アミノ酸（Ｐ５：３８５３ダルトン）の範囲にある６つのＰｈｌ  ｐ  ５由来ペプチドが、調製された（表３）。
【０２１８】
これらのペプチドは、４．３２から８．９８の間の等電点を有しており、かつこれらのうちの３つ（ペプチド３、４および６）は、ヒトＴ細胞エピトープを含んでいる。
【０２１９】
表３．非アレルギー誘発性のＰｈｌ  ｐ  ５由来合成ペプチドの特性。位置（Ｐｈｌ  ｐ  ５分子に対する）、配列、長さ、分子量（ＭＷ）、等電点およびＰｈｌ  ｐ  ５由来ペプチドのＴ細胞エピトープの存在が表示されている。結合を容易にするために加えられたシステイン残基は、太字および下線をもって印を付けられている。
【０２２０】
【表２９】
0005399895.tif 000030
【０２２１】
（実施例１５：Ｐｈｌ  ｐ  ５由来ペプチドは、ＩｇＥ反応性およびアレルギー誘発性活性に乏しい）
１５．１．  ＩｇＥ反応性の欠如
６つのＰｈｌ  ｐ  ５由来ペプチドのＩｇＥ反応性を分析するために、単離したＰｈｌ  ｐ  ５由来ペプチドおよびＫＬＨ結合Ｐｈｌ  ｐ  ５由来ペプチドは、２９人の草本花粉アレルギー性患者からの血清を用いたＥＬＩＳＡによって、ＩｇＥ結合能に関して完全なｒＰｈｌ  ｐ  ５と比較された（表４）。
【０２２２】
表４：２９人の草本花粉アレルギー性患者および非アレルギー誘発性の対照の血清学的特性。性別、年齢、総血清ＩｇＥレベル（ｋＵ／Ｌ）、オオアワガエリ抽出物特異的ＩｇＥ（ｋＵＡ／Ｌ）、ｒＰｈｌ  ｐ  ５に対して特異的なＩｇＥ抗体ならびに６つの単離したペプチド（Ｐ１−Ｐ６）および６つのＫＬＨ結合ペプチド（ＫＬＨ−Ｐ１−ＫＬＨ−Ｐ６）がＥＬＩＳＡによって測定され、かつＯＤｓ（光学濃度）が示されている。ダッシュ記号は、単離したペプチドおよびおよびＫＬＨ結合ペプチドに対するＩｇＥ反応性の欠如を示している。
【０２２３】
【表３０】
0005399895.tif 000031
【０２２４】
ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ、デンマーク）は、Ｐｈｌ  ｐ  ５由来ペプチド（５μｇ／ｍｌ）または対照（５μｇ／ｍｌ）を用いて被われ、洗浄され、かつブロッキングされた。続いて、プレートは、２９人の草本花粉アレルギー性患者からの、および非アトピー性の個人からの、１：３に希釈した血清を用いて、４℃において夜通しインキュベーションされた。アレルギー性の鼻結膜炎および／または喘息にかかっている草本花粉アレルギー性患者は、季節的な草本花粉症に関して表示している既往歴に従って選択され、かつオオアワガエリ抽出物を用いた皮膚プリックテスト、および血清学的なＣＡＰ−ＦＥＩＡ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｄｉａｇｏｓｔｉｃｓ、ウプサラ、スウェーデン）試験によって性質決定された。血清における総ＩｇＥレベルは、ＣＡＰ測定（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって決定された。ｒＰｈｌ  ｐ  ５に対して特異的なＩｇＥ抗体は、ＥＬＩＳＡによって決定された。２９人の草本アレルギー性患者および非アトピー性の個人からの血清が、ＩｇＥ競合研究に使用された。草本花粉アレルギー性患者の群は、平均年齢３５歳（２５−５１歳の範囲にある）の１３人の男性および１６人の女性から構成された（表４）。
【０２２５】
結合したＩｇＥ抗体は、１：１０００に希釈したアルカリ性ホスファターゼ結合マウスモノクロナル抗ヒトＩｇＥ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ＣＡ）を用いて検出された。
【０２２６】
総ＩｇＥレベルおよび草本花粉抽出物特異的ＩｇＥは、それぞれ２４．９−２０００ｋＵ／Ｌ（平均値：２６２．７）および２．２−１００ｋＵＡ／Ｌ（平均値：４１．５）の範囲であった。すべての患者は、０．１５７−２．５３０ＯＤユニット（平均値：１．０８２ＯＤユニット）の範囲において、ｒＰｈｌ  ｐ  ５特異的ＩｇＥ抗体を有していたが、２９人の患者は、あらゆるペプチドまたはペプチドの等モル濃度の混合物に対して、ＩｇＥ反応性を示さなかった。この結果は、血清が、６つのＰｈｌ  ｐ  ５由来ペプチドのあらゆるものに対する特異性を有する検出可能なＩｇＥ抗体を含んでいなかったことを証明している。
【０２２７】
１５．２．  好塩基球におけるＣＤ２０３ｃ発現によって検出されるようなペプチドの低下したアレルギー誘発性活性：好塩基球活性化およびフローサイトメトリー：
ＣＤ２０３ｃの上方制御は、アレルゲン誘導好塩基球の活性および脱顆粒に対する代用マーカーとして説明されている（Hauswirth et al., J Allergy Clin Immunol 2002; 110:102）。従って、草本花粉アレルギー性患者の好塩基球に対するＣＤ２０３ｃを測定することによる、完全なｒＰｈｌ  ｐ  ５アレルゲンおよびペプチドの等モル濃度の混合物のアレルギー誘発性活性は、比較された。
【０２２８】
末梢血細胞は、インフォームドコンセントを得た後に、３人のアレルギー性のドナーから得られた。ヘパリンを添加した血液の部分標本（１００μｌ）は、組み換えアレルゲンの希釈系列（１０−４から１０μｇ／ｍｌ）、抗ＩｇＥ抗体（１μｇ／ｍｌ）、または対照緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水：ＰＢＳ）とともに３７℃において１５分間に渡ってインキュベーションされた。インキュベーションの後に、細胞は、２０ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳにおいて洗浄された。それから、細胞は、１０μｌのＰＥ接合ＣＤ２０３ｃ  ｍＡｂ  ９７Ａ６とともに、室温（ＲＴ）において１５分間に渡ってインキュベーションされた。その後に、赤血球が、２ｍｌのＦＡＣＳ（商標）Ｌｙｓｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いて溶解された。それから、細胞は、洗浄され、ＰＢＳに再懸濁され、かつＰａｉｎｔ−ａ−Ｇａｔｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いたＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）における２色フローサイトメトリーによって分析された。ＣＤ２０３ｃのアレルゲン誘導上方制御は、刺激した細胞（ＭＦＩｓｔｉｍ）および未刺激の細胞（ＭＦＩｃｏｎｔｒｏｌ）を用いて得られた蛍光強度（ＭＦＩｓ）の平均値から算出され、かつ刺激指標（ＭＦＩｓｔｉｍ：ＭＦＩｃｏｎｔｒｏｌ）として表された。≧２．０のＳＩ（２倍以上の上方制御）は、特異的応答と見做された。
【０２２９】
図１４に示されるように、完全なｒＰｈｌ  ｐ  ５が、感作された個人における末梢血においてＣＤ２０３ｃの発現の、用量依存的な（１０−４から１０μｇ／ｍｌ）増加を示す一方において、ペプチドの等モル濃度の混合物は、効果を示さないことが見出された。
草本花粉アレルギー性患者からの好塩基球におけるＣＤ２０３ｃの決定は、アレルギー誘発活性がＰｈｌ  ｐ  ５由来ペプチドを用いて観察され得ないことを示している。
【０２３０】
（実施例１６：Ｐｈｌ  ｐ  ５由来ペプチドを用いた免疫化は、異なる草本種からのｒＰｈｌ  ｐ  ５および天然アレルゲンと反応性のＩｇＧ抗体を誘導する）
１６．１．  組み換えアレルゲンおよびアレルゲン抽出物
精製組み換えＰｈｌ  ｐ  ５は、Vrtala et al. J of Immunol (1993) 151:4773-4781に記載のように、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現された。
【０２３１】
フレウム  プラテンセ、ロリウム  ペレンネ、ポア  プラテンシス、ダクティリス  グロメラタ、セカーレ  ケレアーレ、トゥリティクム  アエスティブム、アベナ  サティバ、ホルデウム  ブルガレ、アントクサントゥム  オドラトゥムからの草本花粉は、Ａｌｌｅｒｇｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ（スウェーデン）から取得され、かつ水性花粉抽出物は、Vrtala et al., Int Arch Allergy Immunol (1993) 102:160-9.に記載のように調製された。
【０２３２】
１６．２．  ウサギの免疫化
ＨＰＬＣ精製ペプチドは、製造者の助言に従ってＫＬＨに対して結合され、かつコンジュゲーションキット（Ｃｏｎｊｕｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）（Ｓｉｇｍａ、アメリカ）を用いて精製された。
【０２３３】
ウサギは、フロインド完全補助液およびフロインド不完全補助液を用いて、ＫＬＨ接合ペプチド（２００μｇ／注入）のそれぞれ、ならびに対照の目的として完全なｒＰｈｌ  ｐ  ５を用いて免疫された。血清試料は、４週間の間隔を置いて得られた。
【０２３４】
１６．３．  異なる草本種からの完全なｒＰｈｌ  ｐ  ５および天然アレルゲンとのウサギ抗体の反応性
ＫＬＨ結合ペプチドを用いて免疫化した後に誘導される抗体が、ｒＰｈｌ  ｐ  ５、天然のＰｈｌ  ｐ  ５および他の草本花粉種からのＰｈｌ  ｐ  ５関連草本花粉アレルゲンを認識したか否かを調べるために、ＥＬＩＳＡ試験が実施された。ＥＬＩＳＡ検出に関して、プレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ、デンマーク）は、花粉アレルゲン抽出物（１００μｇ／ｍｌ：フレウム  プラテンセ、ロリウム  ペレンネ、ポア  プラテンシス、ダクティリス  グロメラタ、セカーレ  ケレアーレ、トゥリティクム  アエスティブム、アベナ  サティバ、ホルデウム  ブルガレ、アントクサントゥム  オドラトゥム）または精製組み換えアレルゲン（５μｇ／ｍｌ：ｒＰｈｌ  ｐ  ５）を用いて被われた。ＥＬＩＳＡプレートは、洗浄され、かつブロッキングされ、続いて１：２５００に希釈したウサギ抗血清および免疫前の血清とともにインキュベーションされた。結合したウサギＩｇＧは、ＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギＩｇ抗血清（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｒｅｓｅａｒｃｈ、ペンシルバニア）を用いて検出された。結果は、＜５％の誤差を有する、２つ１組の決定の平均値を表している（図１３、表５）。
【０２３５】
表５：ｒＰｈｌ  ｐ  ５、およびフレウム  プラテンセ、ロリウム  ペレンネ、ポア  プラテンシス、ダクティリス  グロメラタ、セカーレ  ケレアーレ、トゥリティクム  アエスティブム、アベナ  サティバ、ホルデウム  ブルガレ、アントクサントゥム  オドラトゥムからの天然群の５つのアレルゲンに対する抗Ｐｈｌ  ｐ  ５ペプチドの交差反応性。Ｐｈｌ  ｐ  ５および草本花粉からの花粉抽出物に対するペプチド抗血清（抗−Ｐ１から抗−Ｐ６まで）のＩｇＧ反応性（ＯＤ値）は、ＫＬＨ接合Ｐｈｌ  ｐ  ５由来ペプチド（Ｐ１−Ｐ６）を用いて免疫された６匹のウサギに関して表示されている。
【０２３６】
【表３１】
0005399895.tif 000032
【０２３７】
１６．４．  Ｐｈｌ  ｐ  ５由来ペプチドを用いた免疫化は、交差反応性のＩｇＧ抗体を誘導する
ペプチドのそれぞれを用いた免疫化は、最初の免疫から４週間目において検出可能になり、かつ２回目の免疫の後に増強される、強いＰｈｌ  ｐ  ５特異的ＩｇＧ応答を誘導した。ペプチド  ２を用いた免疫化は、最も高いＰｈｌ  ｐ  ５特異的ＩｇＧ応答を誘導し、ペプチド６、４、５および最も低い応答を誘導した１と続く。ロリウム  ペレンネ、ポア  プラテンシス、ダクティリス  グロメラタ、セカーレ  ケレアーレおよびホルデウム  ブルガレにおけるアレルゲンの群５に対する反応性を欠如した抗ペプチド  １抗体を除いて、他のペプチド抗血清が、試験された草本花粉抽出物のそれぞれと交差反応した。
【０２３８】
（実施例１７：Ｐｈｌ  ｐ  ５由来ペプチドを用いた免疫化は、草本花粉アレルギー性患者のＩｇＥのＰｈｌ  ｐ  ５に対する結合を阻害するＩｇＧ抗体を誘導する）
１７．１．  ペプチド特異的ＩｇＧによる、ｒＰｈｌ  ｐ  ５ａに対するアレルギー性患者のＩｇＥ結合の阻害
遮断抗体が免疫療法において重要な役割を果たすことを示されているので、ペプチドの遮断抗体を誘導する能力に関する情報は、重要である。
【０２３９】
ペプチド誘導ウサギＩｇが完全なｒＰｈｌ  ｐ  ５に対するアレルギー性患者のＩｇＥの結合を阻害する能力を調べるために、ＥＬＩＳＡ競合実験が２９人のアレルギー性患者からの血清を用いて実施された。
【０２４０】
ＥＬＩＳＡプレートは、ｒＰｈｌ  ｐ  ５（１μｇ／ｍｌ）を用いて被われ、かつ抗ペプチド抗血清（抗−Ｐ１−抗−Ｐ６）のそれぞれの１：２５０の希釈物、抗ペプチド抗血清、抗ｒＰｈｌ  ｐ５抗血清、または対照を目的とした対応する免疫前の血清もしくは免疫前の血清の混合物のいずれかとともに前インキュベーションされた。洗浄の後に、プレートは、２９人のアレルギー性患者からの、１：３に希釈した血清とともにインキュベーションされ、かつ結合したＩｇＥ抗体が、アルカリ性ホスファターゼ結合マウスモノクロナル抗ヒトＩｇＥ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて検出された。抗ペプチド抗血清との前インキュベーションによって達成されるＩｇＥ結合の阻害％は、以下のように（ＩｇＥ結合の阻害％＝１００−ＯＤＩ／ＯＤＰ×１００）算出された。ＯＤＩおよびＯＤＰは、ウサギの免疫血清および免疫前の血清のそれぞれを用いた前インキュベーションの後における吸光度を表している。ペプチド誘導ウサギＩｇＧとのＰｈｌ  ｐ  ５の前インキュベーションは、種々の程度にアレルギー性患者のＩｇＥ反応性を阻害した。ＩｇＥ結合の阻害の平均的な程度は、抗ペプチド  ６ＩｇＧに関して１９．３％から抗ペプチド  １ＩｇＧに対する２８．５％の範囲にあった。完全なＰｈｌ  ｐ  ５に対して産生されたウサギ抗体は、４３．６％のＩｇＥ結合の阻害平均値を誘導した。
【０２４１】
表６：ウサギ抗Ｐｈｌ  ｐ  ５ペプチド抗血清は、Ｐｈｌ  ｐ  ５に対するオオアワガエリ花粉アレルギー性患者の血清ＩｇＥ結合を阻害する。Ｐｈｌ  ｐ  ５に対するＩｇＥ結合の阻害％は、抗ペプチド抗血清（抗Ｐ１−抗Ｐ６）、６つの抗ペプチド抗血清（抗Ｐ１−Ｐ６）または抗ｒＰｈｌ  ｐ  ５との、Ｐｈｌ  ｐ  ５の前インキュベーションの後における患者のそれぞれに対して表示されている。阻害％の平均値は、下端の列に表示されている。Ｎ．ｄ．：実施せず。
【０２４２】
【表３２】
0005399895.tif 000033
【０２４３】
（実施例１８：Ｐｈｌ  ｐ  ５由来ペプチドは、特異的リンパ球増殖の低い応答を誘導する）
１８．１．  リンパ球増殖アッセイ
最も低いと見込まれるＴ細胞反応性を有するペプチドを同定して、治療関連副作用を最小化するために、Ｔ細胞反応性が、リンパ球増殖アッセイによって試験された。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、２人の草本花粉アレルギー性患者から、Ｆｉｃｏｌｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、イギリス）密度勾配遠心分離によって単離された。ＰＢＭＣ（２×１０５）は、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃｌｏｎｅ；Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、デンマーク）の中の、２ｍＭのＬ−グルタミン（ＳＩＧＭＡ、アメリカ）、５０μＭのベータメルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ）および１ｍｌごとに０．１ｍｇのゲンタマイシン（ＳＩＧＭＡ）を補った２００μｌの無血清のＵｌｔｒａ  Ｃｕｌｔｕｒｅ培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、ロックランド、ＭＥ）において、加湿した雰囲気において３７℃および５％のＣＯ２において、３つ１組にして培養された。細胞は、異なる濃度の合成ペプチド（ウェル毎に１．２５、０．６および０．３μｇ）および比較を目的として、ウェル毎に４Ｕのインターロイキン−２（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）および培地単独を用いて刺激された。培養から６日後に、ウェル毎に０．５μＣｉの［３Ｈ］チミジンが加えられ、その１６時間後において、取り込まれた放射性がマイクロベータシンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ  ＡＤＬ、ドイツ）を用いて液体シンチレーションカウントによって測定された。ｃｐｍの平均値は、３つ１組から算出され、かつ刺激指標（ＳＩ）は、抗原刺激またはインターロイキン−２刺激および未刺激対照によって得られたｃｐｍの商として算出された。
【０２４４】
オオアワガエリ花粉アレルギー性患者からのＰＢＭＣは、異なる濃度の合成ペプチドを用いて刺激された。ペプチドに対する刺激指標は、ＩＬ２よりも有意に低かった。Ｐｈｌ  ｐ  ５由来ペプチドは、低い特異的なリンパ球増殖応答を誘導した。最も低い応答は、ペプチド  ５に続いてペプチド  ４に対して見られた。
【０２４５】
（実施例１９：Ｆｅｌ  ｄ  １由来合成ペプチドの特性）
ネコアレルギーのワクチン接種に好適なペプチドを得るために、長さ３０から３６アミノ酸であり、かつ分子の全体の範囲に渡る５つのペプチドが、Ｆｅｌ  ｄ  １の公知のアミノ酸配列に従って設計された。
【０２４６】
ペプチドは、アプライドバイオシステムペプチド合成機モデル４３３Ａ（アメリカ）において、ＨＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）１，１，３，３テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート）活性化（０．１ｍｍｏｌの小規模サイクル）を伴ってＦｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシ−カルボニル）ストラテジーを用いて、合成された。前充填されたＰＥＧ−ＰＳ（ポリスチレングリコール  ポリスチレン）樹脂（０．１５−０．２ｍｍｏｌ／ｇを充填）（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、イギリス）が、ペプチドを構築するための固定相として使用された。アミノ酸の結合は、フィードバック制御システムにおいて導電性を監視することによって確認された。１つのシステイン残基が、ペプチド１、３、４および５に加えられて、単体に対する結合を容易にした（表７）。ペプチドは、２５０μｌの蒸留水、２５０μｌのトリイソプロピルシラン（Ｆｌｕｋａ、スイス）、９．５ｍｌのＴＦＡの混合物を用いて、２時間に渡って樹脂から切断され、かつｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（Ｆｌｕｋａ、スイス）（Ｆｏｃｋｅ  ２００１）において沈降された。ペプチドの同定は、質量分析によって確認され、かつペプチドは、調整用のＨＰＬＣ（ＰｉＣｈｅｍ、オーストリア）によって＞９０％まで精製された。
【０２４７】
表７：Ｆｅｌ  ｄ  １由来合成ペプチドの分子特性。Ｆｅｌ  ｄ  １由来合成ペプチドの、本来のＦｅｌ  ｄ  １分子内の位置、アミノ酸配列、アミノ酸の数、算出された分子量（ＭＷ）および等電点の理論値（ｐＩ）が示されている。すべてのペプチドｇは、水に可溶である。
【０２４８】
【表３３】
0005399895.tif 000034
【０２４９】
５つのＦｅｌ  ｄ  １由来合成ペプチドは、３２４６から４０８３ダルトンの範囲における分子量を有し、かつ４．３０から４．９３の算出された等電点を有する。５つのペプチドのすべては、水溶性であり、かつペプチド  １、２および３は、ヒトＴ細胞エピトープを含み得る（表７）。
【０２５０】
【表３４】
0005399895.tif 000035
【０２５１】
（実施例２０：Ｆｅｌ  ｄ  １由来合成ペプチドは、ｒＦｅｌ  ｄ  １と比較して低いＩｇＥ反応性を有し、かつＦｅｌ  ｄ  １由来ペプチドは、アレルギー誘発性活性に乏しい）
ワクチン接種に好適化された低アレルゲン誘導性ペプチドを同定するために、Ｆｅｌ  ｄ  １由来合成ペプチドに対する血清ＩｇＥ反応性が調べられた。
【０２５２】
ＩｇＥ媒介ネコアレルゲンの診断は、既往歴、皮膚プリック試験（Ａｌｌｅｒｇｏｐｈａｒｍａ、ラインベック、ドイツ）ならびに総血清ＩｇＥおよびネコの鱗屑特異的な血清ＩｇＥ（ＣＡＰ−ＦＥＩＡ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、スウェーデン）の測定の基づかれた。非アレルギー性の個人は、対照の目的として含められた。
【０２５３】
２０．１．  ＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定したＩｇＥ結合能
５つのＦｅｌ  ｄ  １由来合成ペプチドのＩｇＥ結合能は、１４人のネコアレルギー性患者からの血清を用いて、完全なｒＦｅｌ  ｄ  １アレルゲンのＩｇＥ結合能と比較された。ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｂ、デンマーク）は、Ｆｅｌ  ｄ  １由来合成ペプチドまたは対照としてのｒＦｅｌ  ｄ  １を用いて被われ（０．５μｇ／ウェル）、洗浄され、かつブロッキングされた。それから、プレートは、ネコアレルギー性患者および非アトピー性の個人からの、１：５希釈した血清を用いて、４℃において夜通しインキュベーションされた。結合したＩｇＥ抗体は、１：２５００に希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ標識した抗ヒトＩｇＥ抗体（ＫＰＬ、アメリカ）を用いて検出された。
【０２５４】
２２歳から７５歳までの、７人の女性および７人の男性のアレルギー性患者からの血清は、ＣＡＰ−ＦＥＩＡ測定にかけられた。測定された総ＩｇＥレベルは、１２２から＞４０００ｋＵ／ｌの範囲であり、かつネコ鱗屑特異的ＩｇＥレベルは、１．９９から＞１００ｋＵＡ／ｌの範囲であった（表７）。ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、主要なネコアレルゲンＦｅｌ  ｄ  １に対する１４の試験した血清のすべてのＩｇＥ反応性が、確かめられた。結果は、光学濃度（ＯＤ）として得られ、かつ０．１７８から２．８３８ＯＤユニットの範囲であった。Ｆｅｌ  ｄ  １由来合成ペプチドに対する１４の血清のＩｇＥ反応性が、同じＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定された。ＩｇＥ結合が、ペプチド  １、２、３、および５に対して保持されていることが見出された。ＩｇＥ結合は、ペプチド  １に対しては６／１４の血清について、ペプチド  ２に対しては３／１４の血清について、ペプチド  ３に対しては１／１４の血清について、かつペプチド  ５に対しては１０／１４の血清について観察された。測定されたＯＤユニットは、ペプチド  １に関して０．０５１から１．９９８の間、ペプチド  ２に関して０．０６０から０．１２３の間、ペプチド  ３に関して０．１８６、およびペプチド  ５に関して０．０５６から０．０５６から０．６７７の間であった。要約すると、測定されたすべてのＯＤユニットは、完全なＦｅｌ  ｄ  １アレルゲンに対して測定されたそれぞれの値によりも相当に低かった。
【０２５５】
これは、Ｆｅｌ  ｄ  １由来合成ペプチドが、完全なＦｅｌ  ｄ  １アレルゲンと比較して低下したＩｇＥ反応性を有することを証明している。従って、Ｆｅｌ  ｄ  １由来合成ペプチドは、ＳＩＴに使用された場合に、低下したＩｇＥ媒介副作用を提供する低アレルゲン誘導性であると見做され得る。
【０２５６】
２０．２．  ヒト好塩基球における表面マーカーＣＤ２０３ｃおよびＣＤ６３の発現の特異的誘導（図１７）
ＩｇＥ結合は、効果細胞結合特異的なＩｇＥの交差結合をも要求するタイプＩのアレルギー性反応の誘導に対して、十分条件ではないが、必要条件であるので、Ｆｅｌ  ｄ  １由来合成ペプチドの実際のアレルギー誘導性活性は、好塩基球活性化アッセイにおいて試験される。これらのアッセイは、好塩基球活性化に対するマーカーとしていずれもが認識されている表面マーカーＣＤ２０３ｃ、およびＣＤ６３のアレルゲン特異的な上方制御を検出する（Hauswirth et al. J Allergy Clin Immunol. (2002) 110:102-109）。
【０２５７】
ヘパリン添加血液試料は、インフォームドコンセントが得られた後に、５人のネコアレルギー性患者から採られた。血液の部分標本（１００μｌ）は、ｒＦｅｌ  ｄ  １の希釈系列、単一成分としてもしくは等モル濃度の混合物としてＦｅｌ  ｄ  １由来合成ペプチド、抗ＩｇＥ抗体または緩衝液（ＰＢＳ）とともに、３７℃において１５分間に渡ってインキュベーションされた。インキュベーションの後に、細胞は、２０ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳにおいて洗浄された。それから、細胞は、１０μｌのＰＥ接合ＣＤ２０３ｃ  ｍＡｂ  ９７Ａ６、および２０μｌのＦＩＴＣ接合ＣＤ６３  ｍＡｂ  ＣＬＢ−ｇｒａｎ１２とともに、室温において１５分に渡ってインキュベーションされた。その後に、試料は、ＦＡＣＳ（商標）  Ｌｙｓｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いた赤血球溶解にかけられた。それから、細胞は、洗浄され、ＰＢＳに再懸濁され、かつＰａｉｎｔ−ａ−Ｇａｔｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いた、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、アメリカ）において２色フローサイトメトリーによって分析された。ＣＤ２０３ｃおよびＣＤ６３のアレルゲン誘導上方制御は、刺激した細胞（ＭＦＩｓｔｉｍ）および未刺激の細胞（ＭＦＩｃｏｎｔｒｏｌ）を用いて得られる蛍光強度の平均値（ＭＦＩｓ）から算出され、かつ刺激指標（ＭＦＩｓｔｉｍ：ＭＦＩｃｏｎｔｒｏｌ）として表された。２以上のＳＩ（すなわち、２倍以上の上方制御）は、特異的な（診断的な）応答の指標と見做された。
【０２５８】
５人の研究対象であるすべてのネコアレルギー性患者（ＲＲ、ＥＢ、ＫＣ、ＭＧおよびＳＭ）の好塩基球において、ｒＦｅｌ  ｄ  １を用いた刺激が、表面マーカーＣＤ２０３ｃおよびＣＤ６３のアレルゲン特異的上方制御を誘導した。ＣＤ２０３ｃおよびＣＤ６３の上方制御は、４／５の患者（ＲＲ、ＫＣＭＧおよびＳＭ）に関して用量依存的であることを観察された。これらの患者に関して、ＣＤ２０３ｃ刺激誘導は、０．００１μｇｒＦｅｌ  ｄ  １／ｍｌの最も低い試験濃度に対して１．１（ＳＭ）から３．２（ＲＲ）まで、および１０μｇｒＦｅｌ  ｄ  １／ｍｌの最も高い試験濃度に対して３．６（ＫＣ）から６．２（ＲＲ）までの範囲であった。同じアッセイにおいて測定されたＣＤ６３刺激誘導は、０．００１μｇ／ｍｌの最も低いｒＦｅｌ  ｄ  １試験濃度に対して１．１（ＲＲ）から２．０（ＭＧ）まで、および１０μｇ／ｍｌの最も高いｒＦｅｌ  ｄ  １試験濃度に対して３．９（ＲＲ）から７．３（ＭＧ）までの範囲であった。患者ＥＢに関して、０．００１μｇ／ｍｌのＦｅｌ  ｄ  １は、表面マーカー上方制御の用量依存性の観察を妨げる表面マーカーＣＤ２０３ｃおよびＣＤ６３の高レベルな上方制御を、すでに誘導するに十分であった。
【０２５９】
５人のネコアレルギー性患者からの好塩基球は、５つの漸増する濃度（０．００５、０．０５、０．５、５および５０μｇ／ｍｌ）の５つのＦｅｌ  ｄ  １由来合成ペプチドの等モル濃度の混合物を用いて精査された。患者ＲＲからの好塩基球は、５つの漸増する濃度の５つの単一Ｆｅｌ  ｄ  １由来合成ペプチド（０．００１、０．０１、０．１、１および１０μｇ／ｍｌ）を用いて付加的に精査された。ペプチドは、好塩基球表面マーカーＣＤ２０３ｃおよびＣＤ６３を上方制御することに関して欠陥があることを見出された。ペプチドは、患者ＲＲ、ＫＣおよびＳＭの細胞におけるＣＤ２０３ｃおよびＣＤ６３のあらゆる増強された発現を誘導できなかった。ＣＤ２０３ｃ（ＳＩ＝２．３）およびＣＤ６３（ＳＩ＝２．５）のわずかな上方制御は、患者ＭＧに対して検出され得た（但し、５０μｇペプチド混合物／ｍｌの最も高い試験濃度に対してのみ）一方において、適用された最も低い濃度はまた、刺激効果を有していなかった。ＣＤ２０３ｃ（ＳＩ＝４．２）およびＣＤ６３（ＳＩ＝４．３）のより明白な上方制御は、患者ＥＢに対して観察されたが、同様に最も高いペプチド混合物の試験濃度に対してのみであった。患者ＭＧおよびＥＢの両方の場合において、ペプチドを用いた刺激後の上方制御の割合は、完全なＦｅｌ  ｄ  １アレルゲンを用いた刺激に関する対応する値よりも相当に低かった。
【０２６０】
これは、Ｆｅｌ  ｄ  １由来合成ペプチドが完全なＦｅｌ  ｄ  １アレルゲンよりも低いアレルギー誘導性活性を保持するという利点を与えることを証明している。これは、Ｆｅｌ  ｄ  １由来合成ペプチドがＳＩＴに使用される場合に、ＩｇＥ媒介副作用の低下した危険性と関連する。
【０２６１】
（実施例２１：Ｆｌ  ｄ  １由来合成ペプチドを用いた免疫化は、完全なｒＦｅｌ  ｄ  １アレルゲンと反応性のＩｇＧ抗体を誘導する）
Ｆｅｌ  ｄ  １由来合成ペプチドは、ＩｇＥ結合に関して欠陥があることを示された。アレルゲン特異的ＩｇＧ抗体の誘導を目的とするワクチン接種の候補分子として、ペプチドは、特異的なアレルゲン構造を保持している必要があり、かつ完全なアレルゲンに対する特異的なＩｇＧ免疫応答を依然として誘導することができる必要がある。Ｆｅｌ  ｄ  １由来合成ペプチドがこの要求を満たすか否かを見出すために、ウサギにおける免疫実験が実施された。
【０２６２】
ウサギは、未結合のｒＦｅｌ  ｄ  １およびＫＬＨ結合Ｆｅｌ  ｄ  １由来合成ペプチドを用いて免疫された。ＨＰＬＣ精製ペプチドは、Ｉｍｊｅｃｔ  Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｃｅ、アメリカ）を用いて、それらのシステイン残基を介して結合された。
【０２６３】
ウサギ（ニュージーランドホワイトウサギ）は、ＣＦＡ（初回免疫）およびＩＦＡ（４週間後における初回追加注入；７週間後に不完全補助剤とともに２回目の追加注入が与えられた）（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ドイツ）を用いた免疫原（２００μｇ／注入）を用いて免疫された。ウサギは、初回免疫後の８週間後およびその後は４週間の間隔をおいて、採血された。
【０２６４】
ペプチド−およびｒＦｅｌ  ｄ  １特異的抗体の誘導は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて監視された。ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｂ、デンマーク）は、ｒＦｅｌ  ｄ  １（０．５μｇ／ウェル）を用いて被われ、洗浄され、かつブロッキングされた。それから、プレートに結合されたｒＦｅｌ  ｄ  １は、１：１０００に希釈された血清および対応するウサギ免疫前の血清を用いて２つ１組において精査され、かつ結合したＩｇＧは、１：２０００に希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ抗血清（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．、アメリカ）を用いて検出された。２つ１組の平均値が算出され、かつ５％未満の誤差を示した。
【０２６５】
Ｆｅｌ  ｄ  １由来合成ペプチドを用いた免疫化は、Ｆｅｌ  ｄ  １反応性ＩｇＧ抗体を誘導した。Ｆｅｌ  ｄ  １由来合成ペプチドのそれぞれを用いた初回免疫の８週間後において、完全なＦｅｌ  ｄ  １アレルゲンに対して反応性を有するＩｇＧ抗体は、５つのウサギ抗血清のそれぞれにおいて、検出され得た。ＩｇＧ抗体レベルは、次の採血において匹敵するレベルを維持した（図１６）。
【０２６６】
抗ペプチド  １、抗ペプチド  ２、抗ペプチド  ４および抗ペプチド  ５の抗ウサギ血清は、抗Ｆｅｌ  ｄ  １ウサギ抗血清とおよそ同程度において、Ｆｅｌ  ｄ  １に対するＩｇＧ反応性を示した。また、抗ペプチド  ３ウサギ抗血清は、識別可能であるが、やや低いＦｅｌ  ｄ  １に対するＩｇＧ反応性を示した。
【０２６７】
これは、Ｆｅｌ  ｄ  １合成ペプチドのすべてが、Ｆｅｌ  ｄ  １特異的ＩｇＧ抗体反応を誘導するための候補分子であることを示している。
【０２６８】
（実施例２２：Ｆｅｌ  ｄ  １由来合成ペプチドは、Ｆｅｌ  ｄ  １よりも低いリンパ球増殖応答を誘導する）
改良されたＳＩＴに関して所望の候補分子は、低下したＩｇＥ関連副作用という利点を与えるだけでなく、低下したＴ細胞媒介副作用という利点も与える。Ｆｅｌ  ｄ  １由来合成ペプチドＴ細胞活性化特性を調べるために、リンパ球増殖アッセイが実施された。
【０２６９】
ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、イギリス）によって７人のネコアレルギー性患者から単離された。ＰＢＭＣ（２×１０５）は、加湿した雰囲気において５％のＣＯ２を用いて３７℃において、２ｍＭのＬ−グルタミン、（Ｓｉｇｍａ、アメリカ）、５０μＭのβ−メルカプトエタノール、（Ｓｉｇｍａ）およびｍｌごとに０．１ｍｇのゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ）を補った２００μｌの無血清Ｕｌｔｒａ  Ｃｕｌｔｕｒｅ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ、ベルギー）において、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃｌｏｎｅ、Ｎａｌｇｅｎｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、デンマーク）において、３つ１組にして培養された。細胞は、異なる濃度（５、２．５、１．２５および０．６μｇ／ウェル）のＦｅｌ  ｄ  １および単一の成分としてもしくは等モル濃度の混合物としてＦｅ  ｄ  １由来合成ペプチド、ならびに対照を目的とした４Ｕのインターロイキンもしくは培地単独を用いて刺激された。６日間の培養の後に、ウェルごとに０．５μＣｉの３Ｈ−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）が、添加され、かつその１６時間後に、取り込まれた放射性がミクロベータシンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ  ＡＤＩ、ドイツ）を用いた液体シンチレーション計数によって測定され、かつｃｐｍの平均値は、３つ１組から算出された。刺激指標（ＳＩ）は、抗原刺激もしくはインターロイキン−２刺激、および未刺激の培地対照によって得られたｃｐｍの商として算出された。
【０２７０】
ＩＬ−２は、７人の試験ネコアレルギー性患者のすべてからのＰＢＭＣの増殖の増殖を刺激して、ＲＲに関して９．８、ＥＢに関して５．２、ＫＣに関して３．２、ＭＧに関して６．７、ＳＭに関して６．３、ＲＡに関して１５．７およびＡＲに関して１３．９の刺激指標を結果として生じた。
【０２７１】
Ｆｅｌ  ｄ  １由来合成ペプチドは、より低い刺激を誘導した。
【０２７２】
表９：等モル濃度の基準がＦｅｌ  ｄ  １よりも低いリンパ球増殖応答を誘導するＦｅｌ  ｄ  １由来合成ペプチドは、同定され得る。７人のネコアレルギー性患者からのＰＢＭＣは、ｒＦｅｌ  ｄ  １または単一の成分としてＦｅｌ  ｄ  １由来合成ペプチドの希釈系列を用いて刺激された。特異的リンパ球増殖応答は、刺激指標として示されている。
【０２７３】
【表３５】
0005399895.tif 000036
【０２７４】
（実施例２３：Ｆｅｌ  ｄ  １由来合成ペプチドを用いた免疫化によって誘導されるＩｇ抗体は、ネコアレルギー性患者のＩｇＥの完全なＦｅｌ  ｄ  １アレルゲンに対する結合を阻害する）
完全なｒＦｅｌ  ｄ  １に対するアレルギー性患者のＩｇＥ抗体の結合を阻害する、ペプチド誘導ウサギＩｇＧの能力は、ＥＬＩＳＡ競合アッセイにおいて試験された。ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｂ、デンマーク）は、ｒＦｅｌ  ｄ  １（０．０５μｇ／ウェル）を用いて被われ、洗浄され、かつブロッキングされた。それから、プレート結合ｒＦｅｌ  ｄ  １は、１：１００に希釈したウサギ抗ペプチド抗血清（単一の抗ペプチド抗血清および抗ペプチド抗血清の混合物が使用された）、ウサギ抗ｒＦｅｌ  ｄ  １抗血清、および対照を目的としてまた、それぞれのウサギ免疫前の血清とともに、前インキュベーションされた。プレートが洗浄された後に、それらは、ネコアレルギー性患者からの、１：５に希釈したヒト血清とともにインキュベーションされた。結合したＩｇＥ抗体は、１：２５００に希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＥ抗体（ＫＰＬ、アメリカ）を用いて検出された。抗ペプチド抗血清との前インキュベーションによって達成されたＩｇＥ結合の阻害％は、以下のように（ＩｇＥ結合の阻害％＝１００−Ｏ．Ｄ．Ｉ／Ｏ．Ｄ．Ｐ×１００（Ｏ．Ｄ．Ｉは、ウサギ免疫血清との前インキュベーションの後に測定された光学密度であり、かつＯ．Ｄ．Ｐは、ウサギ免疫前の血清との前インキュベーションの後に測定された光学密度である））算出された。
【０２７５】
５つの抗ペプチドウサギ抗血清とのＥＬＩＳＡプレート結合Ｆｅｌ  ｄ  １の前インキュベーションは、ネコアレルギー性患者からの１４の異なる試験血清の間において変化する阻害様式を結果として生じた。抗ペプチド  １ウサギ抗血清は、１３／１４の試験患者の血清についてＦｅｌ  ｄ  １に対する患者のＩｇＥ結合を阻害し、抗ペプチド  ２ウサギ抗血清は、８／１４の試験患者の血清についてＦｅｌ  ｄ  １に対する患者のＩｇＥ結合を阻害し、抗ペプチド  ３ウサギ抗血清は、１３／１４の試験患者の血清につてのＦｅｌ  ｄ  １に対する患者のＩｇＥ結合を阻害し、抗ペプチド  ４ウサギ抗血清は、９／１４の試験患者の血清につてのＦｅｌ  ｄ  １に対する患者のＩｇＥ結合を阻害し、かつ抗ペプチド  ５ウサギ抗血清は、５／１４の試験患者の血清につてのＦｅｌ  ｄ  １に対する患者のＩｇＥ結合を阻害した。
【０２７６】
また、阻害の範囲は、異なる抗血清の間において変化を示した。単一の試験抗ペプチドウサギ抗血清のなかでも、抗ペプチド  １ウサギ抗血清は、０−５５％（平均２９％）の阻害を伴う最高の阻害率を示した。抗ペプチド  ２ウサギ抗血清について０−１８％（平均５％）の阻害率が達成され得、抗ペプチド  ３ウサギ抗血清について０−２９％（平均１１％）の阻害率が達成され得、抗ペプチド  ３ウサギ抗血清について０−２４％（平均８％）の阻害率が達成され得、抗ペプチド  ５ウサギ抗血清について０−１８％（平均４％）の阻害率が達成され得た。
【０２７７】
５つの抗ペプチドウサギ抗血清のすべての混合物は、すべての患者の血清について達成された阻害および２５−８４％（平均５９％）の阻害を伴って、最も効率的にＦｅｌ  ｄ  １に対する患者のＩｇＥ結合を阻害した。これらの阻害は、抗Ｆｅｌ  ｄ  １ウサギ抗血清との免疫前によって達成される阻害よりもはるかに明らかであった（表１０）。
【０２７８】
Ｆｅｌ  ｄ  １由来合成ペプチドに対して産生されたウサギ抗血清は、Ｆｅｌ  ｄ  １に対するヒトＩｇＥの結合を阻害する。ウサギ抗血清とのＦｅｌ  ｄ  １の前インキュベーションによって達成されたＦｅｌ  ｄ  １に対するＩｇＥ結合の阻害％は、１４人の患者について、かつ平均値として示されている。前インキュベーションは、５つのＦｅｌ  ｄ  １由来合成ペプチド（抗ペプチド１−５）に対して産生された５つのウサギ抗血清、５つの抗ペプチド抗血清の混合物（Ｍｉｘ）およびＦｅｌ  ｄ  １に対して産生された抗血清（抗ｒＦｅｌ  ｄ  １）とともに実施された。
【０２７９】
【表３６】
0005399895.tif 000037
【０２８０】
抗ペプチド  １ウサギ抗血清が、他の抗ペプチド抗血清のそれぞれと組み合わせられた場合に、アレルギー性患者のＩｇＥ結合の阻害は、抗ｒＦｅｌ  ｄ  １抗体を用いて得られる値（６７％）にほとんど達するまでに実質的に増加された（例えば、抗ペプチド  １＋２：４１％、抗ペプチド  １＋４：４２％）（表１１）。
【０２８１】
【表３７】
0005399895.tif 000038
【０２８２】
（実施例２４：Ｂｅｔ  ｖ  １由来ペプチドは、担体由来のＴ細胞エピトープからのＴ細胞の援助を受けるＢｅｔ  ｖ  １特異的ＩｇＧ応答を誘導し、かつＢｅｔ  ｖ  １特異的Ｔ細胞増殖を低下させる）
Ｂｅｔ  ｖ  １に由来する、表面露出Ｂ細胞エピトープは、治療的ワクチン接種および予防的ワクチン接種のモデルマウスにおける防御性のＢｅｔ  ｖ  １特異的ＩｇＧ応答を誘導することを、すでに示されている（Focke M et al. Clin Exp Allergy (2004) 34:1525-1533）。Focke M et al. (2004) において、６つのＢｅｔ  ｖ  １由来ペプチドがマウスの免疫化の前に担体分子ＫＬＨに対して結合された。本実施例において、これらのペプチド（表１）を用いて誘導されたＢｅｔ  ｖ  １特異的ＩｇＧ応答が、Ｂｅｔ  ｖ  １アレルゲンではなく、担体に由来するＴ細胞エピトープの助けによって促進されることが示される。ＬＦＰＫＶＡＰＱＡＩＳＳＶＥＮＩＥＧＮＧＧＰＧＴＩＫＫＩＳＦ（配列番号２０）、ＧＰＧＴＩＫＫＩＳＦＰＥＧＦＰＦＫＹＶＫＤＲＶＤＥＶＤＨＴＮ（配列番号２１）およびＶＤＨＴＮＦＫＹＮＹＳＶＩＥＧＧＰＩＧＤＴＬＥＫＩＳＮＥＩＫ（配列番号２２）の配列を有するＢｅｔ  ｖ  １由来ペプチドが、関連するＴ細胞応答を誘導しないことが、驚くことに見出され、かつＴ細胞応答の大部分が、担体分子であるＫＬＨに対して対象化されていることが証明され得た（図１８および１９）。この知見は、治療的なワクチン接種の間における副作用の低下にとって、かつ予防的ワクチン接種の間における潜在的な感作の危険を低下させることにとって、非常に重要なものである。あらゆるＩｇＥ反応性を欠如するが、アレルゲン由来Ｔ細胞エピトープを含むアレルゲン由来ペプチドが、Ｔ細胞活性化に起因する副作用を誘導したことは、過去に証明されている。Ｂｅｔ  ｖ  １について例証されているような、ＩｇＥおよびＴ細胞反応性を欠如するアレルゲン由来ペプチドは、治療的ワクチン接種の間において、ＩｇＥ媒介副作用もＴ細胞媒介服作用も誘導しない。予防的ワクチン接種に使用される場合に、ペプチドは、Ｂｅｔ  ｖ  １特異的Ｔ細胞の準備刺激なしに、Ｂｅｔ  ｖ  １特異的防御性ＩｇＧ応答を誘導する。これは、続くアレルギー性感作のための道を敷き得るワクチンを介した、アレルギー性免疫応答を前準備刺激することの危険を最小化すべきである。
【０２８３】
本実施例において、治療的および予防的なアレルゲンワクチン接種のモデルマウスにおけるアレルゲン−、および担体−特異的Ｔ細胞応答が、分析された。Ｂｅｔ  ｖ  １由来ペプチド  ２、３、および６（Focke M et al. (2004)）は、選択され、かつそれらがＢＡＬＢ／ｃマウスにおける公知のＢｅｔ  ｖ  １特異的Ｔ細胞エピトープのうちのあらゆるものを含有するか否かについて試験された。マウスは、以下のように免疫化された（表１０は、感作および処置を示す）。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）の群は、１０μｇの組み換えＢｅｔ  ｖ  １（Ｂｉｏｍａｙ、オーストリア）、および／またはペプチド  ２、３および６（１０μｇのそれぞれ）を用いて免疫化された。ペプチドは、これまでに説明されているように（Focke M et al. (2004)）、ＫＬＨに対して結合された。免疫化に関して、Ｂｅｔ  ｖ  １およびペプチド混合物は、１５０μｌ／マウスの総量において水酸化アルミニウム（Ａｌｕ−Ｇｅｌ−ｓ、Ｓｅｒｖａ、ドイツ）に対して吸収された。
【０２８４】
【表３８】
0005399895.tif 000039
【０２８５】
アレルゲン−、ペプチド−および担体−特異的なリンパ球増殖が、Ｔ細胞増殖アッセイにおいて分析された。脾臓は、無菌条件下において取り出され、かつホモジナイズされた。赤血球の溶解の後に、細胞は、洗浄され、かつ完全培地（ＲＰＭＩ、１０％ウシ胎児血清、０．１ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン、２ｍＭのグルタミン）に再懸濁された。単一細胞の懸濁液は、９６ウェルの丸底プレートの中に、２×１０５細胞／ウェルの濃度において播かれ、かつ陽性対照としてのコンカバリン  Ａ（０．５μｇ／ウェル）、ｒＢｅｔ  ｖ  １（２μｇ／ウェル）、ＫＬＨ（２μｇ／ウェル）、ペプチド混合物（それぞれのペプチドが０．３４μｇ／ウェル）または培地単独を用いて４日間に渡って刺激された。培養液は、０．５μＣｉ／ウェルのトリチウムを含むチミジンを適用され、かつ回収された。増殖応答は、シンチレーション計数によって測定された。抗原刺激後の増殖平均値および培地対照値の割合（すなわち、刺激指標（ＳＩ））が算出された。
【０２８６】
興味深いことに、Ｂｅｔ  ｖ  １由来ペプチドを用いた治療的ワクチン接種が、感作されたが、未処理のマウスである群Ｓ＋／Ｔ−と比較して、Ｂｅｔ  ｖ  １感作されたマウス（群Ｓ＋／Ｔ＋）におけるＢｅｔ  ｖ  １特異的増殖を低減し得ることが示され得た。感作されかつ処理された群において、ペプチド特異的増殖は、測定され得なかったが、担体の影響に従って、ＫＬＨ特異的増殖が観察された。ペプチドワクチン単独（群Ｓ−／Ｔ＋）は、ＫＬＨ特異的なＴ細胞を主に誘導したが、Ｂｅｔ  ｖ  １特異的なＴ細胞応答をほとんど誘導しなかった（図１８）。
【０２８７】
ペプチドを用いた予防的ワクチン接種は、Ｂｅｔ  ｖ  １感作群Ｐ−／Ｓ＋と比較して、Ｂｅｔ  ｖ  １特異的増殖（群Ｐ＋／Ｓ−）を誘導しなかったが、ＫＬＨ特異的増殖を誘導した。予防的にワクチン接種され、かつ続いて感作されたマウス（群Ｐ＋／Ｓ＋）において、Ｂｅｔ  ｖ  １特異的増殖が顕著に誘導され、さらにペプチド特異的応答が、あらゆるマウスの群において観察されなかった（図１９）。
【０２８８】
このようにして、担体結合アレルゲン由来Ｂ細胞ペプチドを用いた予防的ワクチン接種が、ペプチド特異的Ｔ細胞を準備刺激しなかったが、アレルゲン特異的ではほとんどないが担体特異的なＴ細胞を準備刺激したことは、示され得た。アレルゲン感作に先立つ予防的ワクチン接種だけでなく、感作されたマウスの治療的ワクチン接種はまた、アレルゲン特異的Ｔ細胞増殖を低減させた。
【０２８９】
Ｂｅｔ  ｖ  １由来ペプチドを用いた予防的処置は、Ｂｅｔ  ｖ  １特異的Ｔ細胞の助けなしで、Ｂｅｔ  ｖ  １特異的ＩｇＧ応答を誘導した。さらに、予防的処置は、初回感作後の２０および４０日においてすでに、Ｂｅｔ  ｖ  １アレルゲンによって誘導されたＢｅｔ  ｖ  １特異的ＩｇＧ応答を増強した（図２０）。
【０２９０】
これらの結果は、ペプチドワクチンが、アレルゲンばくろによって促進され得るＢｅｔ  ｖ  １特異的ＩｇＧ応答を誘導することを証明している。
【０２９１】
（実施例２５：低下したＩｇＥ結合能を示すＤｅｒ  ｐ  ２由来ペプチド）
Ｄｅｒ  ｐ  ２由来ペプチドのＩｇＥ結合能は、表１３に従ったペプチドを採用し、かつイエダニアレルギーにかかっている個体の血清を用いる、実施例１５．１および２０．１に記載のように決定された。
【０２９２】
【表３９】
0005399895.tif 000040
【０２９３】
結果は、本発明のＤｅｒ  ｐ  ２由来ペプチドが、有意に低減したＩｇＥ結合活性を示すことを明確に示す。
【０２９４】
【表４０】
0005399895.tif 000041
【０２９５】
（実施例２６：ペプチドの長さに関する変動は、ペプチドの、ＩｇＥ結合活性、Ｔ細胞反応性および免疫原性に対する効果を有しない。）
２６．１．  ペプチドの設計
ＩｇＥ結合活性能に対する、ペプチド長における変動の影響を研究するために、Ｐｈｌ  ｐ  ５由来ペプチドのＴ細胞反応性および免疫原性の変異体が、少数のアミノ酸だけ、ペプチド  １（Ｐ１）の長さを伸ばすこと、およびペプチド  ２（Ｐ２）の長さを減らすことによって設計された（表１５）。
【０２９６】
表１５：合成Ｐｈｌ  ｐ  ５由来ペプチド（１、２）ならびにそれらの変異体（１ａ、２ｂ）の位置、配列、アミノ酸の数で数えた長さおよび分子量。
【０２９７】
【表４１】
0005399895.tif 000042
【０２９８】
２６．２．  ＩｇＥ反応性の欠如
Ｐｈｌ  ｐ  ５由来ペプチド１、２およびこれらの変異体１ａ、２ｂのＩｇＥ反応性を分析するために、０．２μｇのペプチド／ドットを適用し、かつ７人の草本花粉アレルギー性患者からの血清（ｐ１−ｐ７）および非アトピー性患者からの血清（ＮＨＳ）を用いて、ドットブロットアッセイが実施された。結合したＩｇＥは、１２５Ｉ標識抗ヒトＩｇＥ（Ｐｈａｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）を用いて検出された。ｒＰｈｌ  ｐ  ５は、陽性対照として使用され、かつＨＳＡは、陰性対照として使用された。患者は、ｒＰｈｌ  ｐ  ５に対して反応するが、ペプチドおよびペプチドの変異体に対して反応しない（図２１）。
【０２９９】
２６．３．  リンパ球増殖性応答
２人のアレルギー性患者からのＰＢＭＣは、異なる濃度の、Ｐｈｌ  ｐ  ５由来ペプチド  １、２、それらの変異体  １ａ、２ｂおよび対照を目的としたｒＰｈｌ  ｐ  ５を用いて、刺激された。ペプチドを用いて得られた刺激指標は、ｒＰｈｌ  ｐ  ５を用いて得られた刺激指標よりも有意に低かった（図２２）。
【０３００】
２６．４．  ペプチド変異の免疫原性
ウサギは、ＫＬＨ結合Ｐｈｌ  ｐ  ５由来ペプチドおよび変異体を用いて免疫された。ＥＬＩＳＡ実験が用いられて、ペプチドおよびそれらの変異体に対する、得られたウサギ抗血清のＩｇＧ反応性を測定した（表１６）。ペプチドおよびそれらの変異体を用いた免疫化は、ペプチドおよび対応する変異体を認識する交差反応性ＩｇＧ抗体を誘導した。
【０３０１】
表１６：ＫＬＨ接合ペプチドを用いた免疫化によってウサギにおいて、産生された抗Ｐｈｌ  ｐ  ５ペプチド抗血清の交差反応性。ペプチド（１、２）および変異体（１ａ、２ｂ）に対するペプチド抗血清のＩｇＧ反応性が示される。免疫前の血清（前Ｐ１、前Ｐ１ａ、前Ｐ２、前Ｐ２ｂ）を用いて反応性が観察されなかった。
ａ．抗ペプチド  １血清（抗Ｐ１）は、ペプチド  １変異体（１ａ）と交差反応し、かつ抗ペプチド  １ａ血清（抗Ｐ１ａ）は、ペプチド  １と交差反応する。
ｂ．抗ペプチド  ２血清（抗Ｐ２）は、ペプチド  ２変異体（２ｂ）と交差反応し、かつ抗ペプチド  ２ｂ血清（抗Ｐ２ｂ）は、ペプチド  １と交差反応する。
【０３０２】
【表４２】
0005399895.tif 000043
【０３０３】
２６．５．  ペプチド誘導されたウサギ抗血清は、草本花粉アレルギー性患者のｒＰｈｌ  ｐ  ５に対するＩｇＥ結合を阻害する
ヒトＩｇＥがｒＰｈｌ  ｐ  ５に対して結合することを阻害する、ウサギ抗ペプチド２および２ｂ  ＩｇＧの能力は、競合ＥＬＩＳＡにおいて研究された。ｒＰｈｌ  ｐ  ５を結合させたＥＬＩＳＡプレートは、抗Ｐ２、抗Ｐ２ｂ、および対照を目的とした抗Ｐｈｌ  ｐ  ５抗血清を用いて前インキュベーションされた。それから、プレートは、１２人の草本花粉アレルギー性患者からの血清にさらされた。ｒＰｈｌ  ｐ  ５に対するＩｇＥ結合の阻害％は、表１７に示される。抗ペプチド  ２抗血清および抗ペプチド  ２ｂ抗血清は、患者のｒＰｈｌ  ｐ  ５に対するＩｇＥ結合を同程度に阻害する。
【０３０４】
また、競合ＥＬＩＳＡは、ウサギ抗ペプチド  １および１ａ抗血清を用いて実施された。実施例１７（Ｐｈｌ  ｐ  ５由来ペプチドを用いた免疫化が、草本花粉アレルギー性患者ＩｇＥのＰｈｌ  ｐ  ５に対する結合を阻害するＩｇＧ抗体を、誘導する）において、抗ペプチド  １（Ｐ１）抗体は、患者のＰｈｌ  ｐ  ５に対するＩｇＥ結合を、２８．５％の平均阻害率において、阻害した。同様の結果が、２３．７％の阻害率を示したペプチド  １ａ抗血清を用いて得られた。
【０３０５】
表１７：抗ペプチド抗血清による、ｒＰｈｌ  ｐ  ５に対する患者のＩｇＥ結合の阻害。抗ペプチド  ２および抗ペプチド  ２ｂ抗血清は、患者のｒＰｈｌ  ｐ  ５に対するＩｇＥ結合を同程度に阻害する。ｒＰｈｌ  ｐ  ５を結合させたＥＬＩＳＡプレートは、抗Ｐ２、抗Ｐ２ｂ、および対照を目的とした抗Ｐｈｌ  ｐ  ５抗血清を用いて、前インキュベーションされた。それから、プレートは、１２人の草本花粉アレルギー性患者からの血清にさらされた。ｒＰｈｌ  ｐ  ５に対するＩｇＥ結合の阻害の％が示されている。
【０３０６】
【表４３】
0005399895.tif 000044
【０３０７】
（実施例２７：抗ＶＰ１抗体の交差反応性）
ヒトライノウイルスは、１００を越えて異なる株からなる。この中和試験において、１つの株のライノウイルス感染がまた、他の株のＶＰ１特異的抗体よって阻害され得ることは、示される。ＨｅＬａ細胞は、等しい密度において、ウェルに播種された。１００ＴＣＤ５０のＨＲＶ１４は、抗１４ＶＰ１−および抗８９ＶＰ１−抗体の希釈物（未希釈；１：２−１：３２を１−６のウェル）を用いて前インキュベーションされ、かつレーンＡおよびＤのそれぞれにおけるウェルに加えられた。レーンＢおよびＣにおいてＴＣＤ５０のＨＲＶ８９は、抗１４ＶＰ１−および抗８９ＶＰ１抗体の希釈物のそれぞれを用いて前インキュベーションされ、かつ細胞に対して加えられた。３日後に、生細胞が、紫に染色された。抗８９ＶＰ１抗体および抗１４ＶＰ１抗体は、類似の様式において、ＨＲＶ１４の感染を阻止する。また、１４ＶＰ１および８９ＶＰ１に対して産生された抗体は、同じ濃度までのＨＲＶ８９の感染を阻害する。
【図面の簡単な説明】
【０３０８】
【図１Ａ】ベクター  ｐ８９ＶＰ１の模式的な概要を示す。
【図１Ｂ】ｐＥＴ−１７ｂベクターのマルチクローニング部位および８９ＶＰ１コード遺伝子のＤＮＡ配列を示す。
【図１Ｃ】核酸融合を作り出すための３つの可能性の模式的な説明を示す。
【図２】生成した８９ＶＰ１  ヒスタグ付きタンパク質を含む、クーマシーブルー染色した１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図３】１４ＶＰ１のＩｇＧ認識：１４ＶＰ１および対照の免疫ブロッティングを示す。
【図４】マウスにおける８９ＶＰ１特異的なＩｇＧ応答を示す。
【図５】マウスにおけるＰｈｌ  ｐ  １特異的ＩｇＧ１応答を示す。
【図６】免疫化マウスにおけるオオアワガエリ花粉抽出物特異的ＩｇＧ１応答を示す。
【図７】１９人の患者のすべてのｒＰｈｌ  ｐ  １、ｒ９８Ｐ５およびＫＬＨＰ５に対する抗血清を用いた前インキュベーションによる、患者のｒＰｈｌ  ｐ  １に対するＩｇＥへ都合の阻害％の平均を示す。
【図８】免疫化マウスの脾臓細胞の増殖を示す。
【図９】ＥＬＩＳＡ測定によってヒトの血清において決定された１４ＶＰ１、８９ＶＰ１およびｒＰｈｌ  ｐ  １に対するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４およびＩｇＡ応答を示す。
【図１０】アレルギー性患者の血清における抗８９Ｖｐ１抗体および抗ｒＰｈｌ  ｐ  １抗体の検出を示す。
【図１１】ＨＲＶ１４タンパク質抽出物および生成１４ＶＰ１に対する抗１４ＶＰ１ＩｇＧ結合を示す。
【図１２】ＨＲＶ１４の中和化を示す。
【図１２Ａ】ＨＲＶ１４の中和化を示す。
【図１２Ｂ】ＨＲＶ１４の中和化を示す。
【図１３】完全なＰｈｌ  ｐ  ５に対する抗ペプチド血清のＩｇＧ反応性を示す。
【図１４】ｒＰｈｌ  ｐ  ５およびＣＤ２０３ｃ発現によって検出されるような、ペプチド混合物のアレルギー誘発性活性を示す。
【図１５】Ｐｈｌ  ｐ  ５由来ペプチドが低いリンパ球増殖応答を誘導することの検証を示す。
【図１６】ウサギにおけるＦｅｌ  ｄ  １特異的なＩｇＧ免疫応答を誘導するＦｅｌ  ｄ  １由来合成ペプチドを示す。
【図１７】アレルギー性患者の抗塩基球上におけるＣＤ６３およびＣＤ２０３ｃによって決定されるように、Ｆｅｌ  ｄ  １由来合成ペプチドの低いアレルギー誘発性活性を示す。
【図１８】ＫＬＨ連結Ｂｅｔ  ｖ  １由来ペプチドを用いた処理が感作したマウスにおいて、ｒＢｅｔ  ｖ  １に対してリンパ球増殖応答を誘導することを示す。
【図１９】感作後においてｒＢｅｔ  ｖ  １に対するリンパ球増殖応答を誘導するＫＬＨ連結Ｂｅｔ  ｖ  １由来ペプチドを用いた、天然のマウスの予防的ワクチン接種を示す。
【図２０】Ｂｅｔ  ｖ  １特異的ＩｇＧ応答を誘導し、かつ完全なアレルゲンによるアレルゲン特異的ＩｇＧ応答の誘導を開始するＫＬＨ連結Ｂｅｔ  ｖ  １由来ペプチドを用いた、天然のマウスの予防的ワクチン接種を示す。
【図２１】ＩｇＥ反応性の比較を示す。
【図２２】Ｐｈｌ  ｐ  ５由来ペプチド（１、２）および異形（１ａ、２ｂ）のリンパ球増殖応答を示す。
【図２３】抗ＶＰ１抗体の干渉効果を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
0005399895.tif 000051
【図６】
0005399895.tif 000052
【図７】
0005399895.tif 000053
【図８】
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【図９】
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【図１０】
0005399895.tif 000056
【図１１】
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【図１２】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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