(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変低分子ユビキチン様修飾因子（ｓｍａｌｌ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ：ＳＵＭＯ）をコードする単離核酸分子であって、前記改変ＳＵＭＯはＳＵＭＯプロテアーゼ相互作用ドメイン中の少なくとも１つのアルギニン残基を非塩基性アミノ酸へ変更したＳＵＭＯタンパク質であり、
前記改変ＳＵＭＯは、
ａ）ヒトＳＵＭＯ１であって、位置６３のアルギニンがグルタミン、ロイシン、スレオニン、またはフェニルアラニンに変更され、および／又は位置７０のアルギニンがグルタミン酸に変更されたものである、前記ヒトＳＵＭＯ１、
ｂ）ヒトＳＵＭＯ２であって、位置５９のアルギニンがグルタミン、ロイシン、スレオニン、またはフェニルアラニンに変更され、および／又は位置６１のアルギニンがグルタミン酸に変更されたものである、前記ヒトＳＵＭＯ２、
ｃ）ヒトＳＵＭＯ３であって、位置５８のアルギニンがグルタミン、ロイシン、スレオニン、またはフェニルアラニンに変更され、および／又は位置６０のアルギニンがグルタミン酸に変更されたものである、前記ヒトＳＵＭＯ３、
ｄ）酵母Ｓｍｔ３であって、位置６４のアルギニンがグルタミン、ロイシン、スレオニン、またはフェニルアラニンに変更され、および／又は位置７１のアルギニンがグルタミン酸に変更されたものである、前記酵母Ｓｍｔ３
からなる群から選択されるものである、単離核酸分子。
【請求項２】
請求項１記載の核酸分子において、前記改変ＳＵＭＯは、
ａ）ヒトＳＵＭＯ１であって、位置６３のアルギニンがスレオニンに変更され、および位置７０のアルギニンがグルタミン酸に変更されたものである、前記ヒトＳＵＭＯ１、
ｂ）ヒトＳＵＭＯ２であって、位置５９のアルギニンがスレオニンに変更され、および位置６１のアルギニンがグルタミン酸に変更されたものである、前記ヒトＳＵＭＯ２、
ｃ）ヒトＳＵＭＯ３であって、位置５８のアルギニンがスレオニンに変更され、および位置６０のアルギニンがグルタミン酸に変更されたものである、前記ヒトＳＵＭＯ３、
ｄ）酵母Ｓｍｔ３であって、位置６４のアルギニンがグルタミン、ロイシン、スレオニン、またはフェニルアラニンに変更され、および／又は位置７１のアルギニンがグルタミン酸に変更されたものである、前記酵母Ｓｍｔ３
からなる群から選択されるものである、核酸分子。
【請求項３】
請求項１記載の核酸分子において、前記改変ＳＵＭＯは配列ＩＤ番号：１である、核酸分子。
【請求項４】
請求項１記載の核酸分子によってコードされる単離改変ＳＵＭＯタンパク質。
【請求項５】
請求項１記載の核酸分子において、前記核酸分子は複数のクローニング部位に作用するように結合しており、前記複数のクローニング部位は目的タンパク質をコードする核酸配列を、前記改変ＳＵＭＯのＧｌｙ−Ｇｌｙ切断部位をコードする核酸配列の３’側に隣接してインフレームでクローニングすることを可能とするものである、核酸分子。
【請求項６】
請求項１記載の核酸分子において、この核酸分子は、さらに、
アフィニティー・タグをコードする核酸配列を有するものであり、前記アフィニティー・タグをコードする核酸配列は前記改変ＳＵＭＯをコードする核酸配列の５’側にインフレームで作用するように結合したものである、核酸分子。
【請求項７】
請求項１記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項８】
改変低分子ユビキチン様修飾因子（ｓｍａｌｌ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ：ＳＵＭＯ）プロテアーゼをコードする単離核酸分子であって、前記改変ＳＵＭＯプロテアーゼは酵母Ｕｌｐ１であり、位置４５１のアスパラギン酸がセリンに変更され、および位置４５５のグルタミン酸がセリン、アラニン、またはメチオニンに変更されたものである、単離核酸分子。
【請求項９】
請求項８記載の単離核酸分子において、位置４５５のグルタミン酸はセリンに変更されたものである、単離核酸分子。
【請求項１０】
請求項８記載の単離核酸分子において、前記改変ＳＵＭＯプロテアーゼは、配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：４、および配列ＩＤ番号：５から成る群から選択されるものである、単離核酸分子。
【請求項１１】
請求項８記載の核酸分子によってコードされる単離改変ＳＵＭＯプロテアーゼ。
【請求項１２】
宿主細胞中で目的タンパク質の発現量を増強する方法であって、
ｉ）融合タンパク質をコードするコンストラクトを生成するために、請求項１記載の核酸を前記目的タンパク質をコードする核酸配列に作用するように結合する工程と、
ｉｉ）前記宿主細胞中へ前記核酸を導入する工程と
を有し、
それによって前記融合タンパク質中でのＳＵＭＯの存在が、前記宿主細胞中での前記目的タンパク質の発現量を増加させるものである、
宿主細胞中で目的タンパク質の発現量を増強する方法。
【請求項１３】
請求項１２記載の方法において、前記宿主細胞は、原核細胞、哺乳類細胞、酵母細胞、Ｅ．ｃｏｌｉ、昆虫細胞、および真核細胞から成る群から選択されるものである、方法。
【請求項１４】
請求項１２記載の方法において、この方法は、さらに、
前記融合タンパク質の単離の工程を有するものである、方法。
【請求項１５】
請求項１４記載の方法において、この方法は、さらに、
前記目的タンパク質を放出するための前記融合タンパク質の切断の工程を有するものである、方法。
【請求項１６】
宿主細胞中の目的タンパク質に改変アミノ末端を生成する方法であって、
ａ）前記目的タンパク質をコードする核酸配列を提供する工程と、
ｂ）前記核酸中のＮ−末端アミノ酸コード配列を改変する工程と、
ｃ）請求項１記載の核酸を、前記目的タンパク質をコードする前記核酸配列へ作用するように結合する工程と、
ｄ）宿主細胞中で前記核酸を発現する工程と、
ｅ）前記宿主細胞中で改変ＳＵＭＯを切断可能な改変ＳＵＭＯプロテアーゼを発現する工程であって、前記改変ＳＵＭＯプロテアーゼは酵母Ｕｌｐ１であり、位置４５１のアスパラギン酸がセリンに変更され、および位置４５５のグルタミン酸がセリン、アラニン、またはメチオニンに変更されたものである、前記発現する工程と
を有し、
それによって、改変ＳＵＭＯプロテアーゼが改変ＳＵＭＯの切断を引き起こして、それにより改変アミノ末端を有する目的タンパク質を生産するものである
前記宿主細胞中の目的タンパク質に改変アミノ末端を生成する方法。
【請求項１７】
請求項１６記載の方法において、この方法は、さらに、
改変アミノ末端を有する目的タンパク質の単離の工程を有するものである、方法。
【請求項１８】
宿主細胞からの目的タンパク質の分泌量を増強する方法であって、
ｉ）請求項１記載の核酸分子を、前記目的タンパク質をコードする核酸配列に作用するように結合する工程であって、それにより融合タンパク質をコードするコンストラクトを生成するものである、前記結合する工程と、
ｉｉ）前記宿主細胞中へ前記核酸を導入する工程と
を有し、
それによって、前記融合タンパク質中の改変ＳＵＭＯの存在が、前記宿主細胞からの前記目的タンパク質の分泌を増加させるものである
前記宿主細胞からの目的タンパク質の分泌量を増強する方法。
【請求項１９】
プロモーターおよび複数のクローニング部位に作用するように結合した、請求項１記載の核酸分子を含む組換えベクターを含むキットであって、
前記複数のクローニング部位は、改変ＳＵＭＯのＧｌｙ−Ｇｌｙ切断部位をコードする核酸配列の３’側へ隣接したインフレームでの、目的タンパク質をコードする核酸のクローニングを可能にするものである、キット。
【請求項２０】
請求項１９記載のキットにおいて、前記キットは、さらに、
宿主細胞を有するものである、キット。
【請求項２１】
請求項２０記載のキットにおいて、前記宿主細胞は、原核細胞、哺乳類細胞、酵母細胞、Ｅ．ｃｏｌｉ、昆虫細胞、および真核細胞から成る群から選択するものである、キット。
【請求項２２】
請求項１９記載のキットにおいて、前記キットは、さらに、
天然の目的タンパク質とは異なるアミノ末端を生成するために前記目的タンパク質をコードする核酸を改変するための、オリゴヌクレオチドベースの部位特異的変異の試薬を有するものである、キット。
【請求項２３】
宿主細胞からのタンパク質精製キットであって、
ｉ）組換えベクターであって、
ａ）請求項１記載の核酸分子と、
ｂ）プロモーターと、
ｃ）複数のクローニング部位と、選択的に、
ｄ）アフィニティー・タグをコードする核酸配列と
を有し、
前記プロモーターは請求項１記載の前記核酸に作用するように結合しており、もし存在するならば、前記アフィニティー・タグをコードする核酸配列は請求項１記載の核酸分子に対してインフレームで作用するように結合しており、前記複数のクローニング部位は改変ＳＵＭＯのＧｌｙ−Ｇｌｙ切断部位をコードする核酸配列の３’側へ隣接したインフレームでの目的タンパク質をコードする核酸配列のクローニングを可能にするものである
前記組換えベクターと、
ｉｉ）改変ＳＵＭＯをＧｌｙ−Ｇｌｙ切断部位の後で特異的に切断するプロテアーゼを含む組成物と
を有する前記宿主細胞からのタンパク質精製キット。
【請求項２４】
請求項２３記載のキットにおいて、前記キットは、さらに、
宿主細胞を有するものである、キット。
【請求項２５】
請求項２３記載のキットにおいて、前記宿主細胞は、原核細胞、哺乳類細胞、酵母細胞、Ｅ．ｃｏｌｉ、昆虫細胞、および真核細胞から成る群から選択するものである、キット。
【請求項２６】
請求項２３記載のキットにおいて、前記キットは、さらに、
ｉ）アフィニティー・タグ結合のための固体支持体、
ｉｉ）溶解緩衝液、
ｉｉｉ）洗浄緩衝液、
ｉｖ）溶出緩衝液、
ｖ）切断緩衝液、および
ｖｉ）説明資料
から成る群から選択される少なくとも１つを有するものである、キット。
【請求項２７】
請求項１９記載のキットにおいて、このキットは、さらに、
改変ＳＵＭＯを切断する改変ＳＵＭＯプロテアーゼをコードする発現ベクターを有するものであり、前記改変ＳＵＭＯプロテアーゼは酵母Ｕｌｐ１であり、位置４５１のアスパラギン酸がセリンに変更され、および位置４５５のグルタミン酸がセリン、アラニン、またはメチオニンに変更されたものである、キット。
【請求項２８】
請求項２３記載のキットにおいて、このキットは、さらに、
改変ＳＵＭＯを切断する改変ＳＵＭＯプロテアーゼをコードする発現ベクターを有するものであり、前記改変ＳＵＭＯプロテアーゼは酵母Ｕｌｐ１であり、位置４５１のアスパラギン酸がセリンに変更され、および位置４５５のグルタミン酸がセリン、アラニン、またはメチオニンに変更されたものである、キット。
【請求項２９】
請求項８記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項３０】
請求項７記載の発現ベクターを含む単離細胞。
【請求項３１】
請求項２９記載の発現ベクターを含む単離細胞。
【請求項３２】
目的タンパク質に結合した、請求項４記載の改変ＳＵＭＯを含む融合タンパク質を含むマイクロアレイ。
【請求項３３】
請求項１２記載の方法において、前記目的タンパク質は毒性タンパク質である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願明細書は２００６年１２月２９日に提出した米国仮出願第６０／８７７，９１４号に対して米国特許法１１９条（ｅ）の下における優先権を主張するものである。前述の出願はこの参照によって本願明細書に組み込まれるものである。
【０００２】
本発明は、組換えｃＤＮＡ発現および発現タンパク質の精製の分野に関連するものである。より具体的には、本発明は様々な異なる宿主細胞種からの異種タンパク質の発現増強および精製促進のための材料および方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
本発明が関連する最新技術を記載するために、本願明細書の全体を通して幾つかの公開物および特許文献を引用した。それら参考文献の完全な引用は、本願明細書の全体を通して見出すことができる。それら引用のそれぞれは、この参照によって完全に説明したものとして本願明細書に組み込まれるものである。
【０００４】
機能ゲノム学の研究は、異種発現系での生物学的に活性なタンパク質の均一な発現および精製が不可能であったことによって妨げられてきた（Ｒｙａｎ  ａｎｄ  Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ（２００２）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０：Ｓ４５〜５１）。任意の発現ベクターにおいて同一の転写および翻訳シグナルを使用しているにもかかわらず、タンパク質発現量が劇的に変動することが観察されている（Ｗｅｉｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７：４９４〜９）。このため、バクテリア、酵母、哺乳類および昆虫の細胞中で遺伝子融合体として異種タンパク質を発現するいくつもの方法が開発されてきた（Ｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４；７７１５〜９；Ｂｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８６：２５４０〜４；Ｋａｐｕｓｔ  ａｎｄ  Ｗａｕｇｈ（１９９９）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，８：１６６８〜７４；Ｉｋｏｎｏｍｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，６２：１〜２０）。バクテリア中での異種遺伝子の発現は、研究または商業的目的で用いることができる圧倒的に単純で安価な方法である。しかし、一部の異種遺伝子産物はＥ．ｃｏｌｉにおいて正しい３次元コンフォーメーションを取ることができず、またあるものは過剰な大量生産をした場合に大きな不溶性凝集体または「封入体」中に隔離されてしまう（Ｊｏｎａｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３５：９１〜１０５；Ｇｅｏｒｉｏｕ  ａｎｄ  Ｖａｌａｘ（１９９９）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３０９：４８〜５８．）。組換えタンパク質の適切な生産のためには、主要な変性剤で誘導する可溶化方法と、それに続く再折りたたみを助ける条件下での変性剤の除去がしばしば必要となる。
【０００５】
構造ゲノム学プロジェクトでオープン・リーディング・フレーム（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅｓ：ＯＲＦｓ）に選択されたものは、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させた遺伝子の約２０％だけしか、可溶性または正しく折りたたまれたタンパク質を生成しないこともまた示された（Ｗａｌｄｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１７：６９１〜５）。多くの科学者は遺伝子産物発現の最初の試みとしてＥ．ｃｏｌｉに頼っていることを特に考慮すれば、これら数値は驚くほど失望的である。ＮＵＳ  Ａ、マルトース結合タンパク質（ｍａｌｔｏｓｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＭＢＰ）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ＧＳＴ）、およびチオレドキシン（ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ：ＴＲＸ）といったタグへの結合による幾つかのタンパク質発現系が開発されている（Ｊｏｎａｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，３５：９１〜１０５）。それらの全システムは、不十分な発現から、所望の構造からの切断に至る、幾つかの難点を有する。
【０００６】
ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ：Ｕｂ）およびユビキチン様タンパク質（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｕｂｌｓ）が文献に記載されている（Ｊｅｎｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｐｙｒｏｗｏｌａｋｉｓ（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１０：３３５〜４２；Ｙｅｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｅ，２４８：１〜１４；Ｌａｒｓｅｎ  ａｎｄ  Ｗａｎｇ（２００２）Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．，１：４１１〜９）。ＳＵＭＯ系もまた述べられている（Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２：２０２〜１０）。ＳＵＭＯ（ｓｍａｌｌ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ（低分子ユビキチン様修飾因子））は、公開文献ではＳｅｎｔｒｉｎ，ＳＭＴ３，ＰＩＣ１，ＧＭＰ１，およびＵＢＬ１としてもまた知られているＵｂｌである。ＳＵＭＯ経路は真核生物界の全般に存在し、ＳＵＭＯタンパク質は酵母からヒトまでに渡って非常に良く保存されている（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９１：２５７〜６８）。ユビキチンとＳＵＭＯとの間の全体の配列相同性は１８％に過ぎないにもかかわらず、核磁気共鳴（ｎｕｃｌｅａｒ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：ＮＭＲ）による構造決定によって、これら２つのタンパク質は、密度の高い球状折り畳みと、１つのアルファ−ヘリックスで囲まれたベータ−シートによって特徴付けられる、共通の３次元構造を有することが明らかになった（Ｂａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２８０：２７５〜８６；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：１４１０２〜６）。ＳＵＭＯのシャペロン特性の解析によって、不安定なタンパク質のＮ末端へのＳＵＭＯの連結が、折りたたみの核として働いてタンパク質を凝集から保護することが可能であることが明らかになった。
全てのＳＵＭＯ遺伝子は、保存されたＣ末端のＧｌｙ−Ｇｌｙモチーフを超えて伸長した短いＣ末端配列を有する前駆体タンパク質をコードしている（Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２：２０２〜１０）。前記伸長配列は長さに変化があり、典型的には２〜１２アミノ酸である。細胞内でのＳＵＭＯ化の前に、ＳＵＭＯプロテアーゼ（加水分解酵素としてもまた知られる）がＣ末端の伸長部を除去する（Ｃｏｌｏｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１５２：８９〜１０４）。標的タンパク質のリシン残基のイプシロン−アミノ基へのＳＵＭＯのＣ末端の結合はＳＵＭＯ化として知られる。細胞タンパク質のＳＵＭＯ化は、核移行、シグナル伝達、ストレス応答、および細胞周期の進行を制御すると提唱されている（Ｋｒｅｔｚ−Ｒｅｍｙ  ａｎｄ  Ｔａｎｇｕａｙ（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７７：２９９〜３０９）。ＳＵＭＯが様々な細胞内コンパートメント間のタンパク質移行のシグナルを送るという可能性は非常に高いが、ＳＵＭＯのこの機能の正確な機構の詳細は判明していない。ＳＵＭＯ経路とユビキチン経路との間の類似性は、これら２つのタンパク質修飾による異なる効果を考えれば、注目に値することである（Ｇｏｅｔｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｂａｙｅｒ（２００２）Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．，７：ａ１４８〜６２）。
ＮｕｓＡは、おそらくその大きなサイズによって、パートナーとなるタンパク質の可溶性を促進する、もう１つの融合タグである（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，６５：３８２〜８）。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ＧＳＴ）（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ（１９８８）Ｇｅｎｅ，６７：３１〜４０）、およびマルトース結合タンパク質（ｍａｌｔｏｓｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＭＢＰ）（ｄｉＧｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｇｅｎｅ，６７：２１〜３０）の融合タグもまた、融合パートナーの発現および生産を増強することが提唱されている。しかし、ＧＳＴが２
量体を形成するように用いられ、タンパク質の可溶性を阻害する可能性がある場合には、発現量増強は必ずしも観察されない。このような全ての融合システムにおけるもう１つの問題は、所望のタンパク質を融合から除去する必要があるかもしれないことである。この問題を回避するために、Ｘａ因子、トロンビン、エンテロキナーゼ、またはＴｅｖプロテアーゼ部位などのプロテアーゼ部位を融合タグの下流に作製することが多い。しかし、それらプロテアーゼは融合／標的タンパク質中に存在する短い特異的なアミノ酸配列を認識するため、不適切な切断がしばしば観察される（Ｊｏｎａｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３５：９１〜１０５）。本発明は、これら問題点を回避する。さらに、ＳＵＭＯプロテアーゼとは異なり、Ｔｅｖプロテアーゼは、融合タンパク質の切断後に目的のタンパク質のＮ末端へ望ましくない配列を残す配列特異的プロテアーゼである。それとは対照的にＳＵＭＯプロテアーゼは、ＳＵＭＯのＣ末端からあらゆる配列を切断し、融合タンパク質の望みのＮ末端（プロリンを除く）を生成する。__
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、以下のものがある（国際出願日以降国際段階で引用された文献及び他国に国内移行した際に引用された文献を含む）。
【先行技術文献】  
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００６／０７３９７６号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】  ＫＯＮＯ，Ｋ．ｅｔ  ａｔ．Ｔｈｅ  Ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｂａｃｈ２  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆｏｃｉ  ｉｓ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ＳＵＭＯ−１  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００８，Ｖｏｌ  ３１４，ｐａｇｅｓ  ９０３−９１３．
【非特許文献２】  ＫＩＭ  ＫＥＵＮ  ＩＬ  ＥＴ  ＡＬ："Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔａｇ，ＳＵＭＯ：ｉｔｓ  ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ"ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＰＨＹＳＩＯＬＯＧＹ，ＷＩＬＥＹ  ＬＩＳＳ，ＮＥＷ  ＹＯＲＫ，ＮＹ，ＵＳ  ＬＮＫＤ−ＤＯＩ：１０．１００２／ＪＣＰ．１０１００，ｖｏｌ．１９１，ｎｏ．３，１  Ｊｕｎｅ  ２００２（２００２−０６−０１），ｐａｇｅｓ  ２５７−２６８
【非特許文献３】  ＭＡＲＢＬＥＳＴＯＮＥ  Ｊｅｆｆｒｅｙ  Ｇ  ＥＴ  ＡＬ："Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ＳＵＭＯ  ｆｕｓｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｗｉｔｈ  ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ：Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  ｗｉｔｈ  ＳＵＭＯ"ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＣＩＥＮＣＥ，ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ  ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ  ＰＲＥＳＳ，ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ，ＧＢ  ＬＮＫＤ−ＤＯＩ：１０．１１１０／ＰＳ．０５１８１２７０６，ｖｏｌ．１５，ｎｏ．１，１  Ｊａｎｕａｒｙ  ２００６（２００６−０１−０１），ｐａｇｅｓ  １８２−１８９
【非特許文献４】  ＭＡＬＡＫＨＯＶ  ＭＩＣＨＡＥＬ  Ｐ  ＥＴ  ＡＬ："ＳＵＭＯ  ｆｕｓｉｏｎｓ  ａｎｄ  ＳＵＭＯ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ"ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＡＬ  ＡＮＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ  ＧＥＮＯＭＩＣＳ，ｖｏｌ．５，ｎｏ．１−２，２００４，ｐａｇｅｓ  ７５−８６
【非特許文献５】  ＰＥＲＯＵＴＫＡ  ＲＡＹＭＯＮＤ  Ｊ  ＥＴ  ＡＬ："Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＳＵＭＯ  ｆｕｓｉｏｎｓ：Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ（２）"ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＣＩＥＮＣＥ，ｖｏｌ．１７，ｎｏ．９，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００８（２００８−０９），ｐａｇｅｓ  １５８６−１５９５
【非特許文献６】  ＬＩＵ  ＬＩ  ＥＴ  ＡＬ："Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ／ｉｎｓｅｃｔ  ｃｅｌｌ  ｓｙｓｔｅｍ  ｕｓｉｎｇ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＳＵＭＯ  ｆｕｓｉｏｎｓ．"ＰＲＯＴＥＩＮ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＡＮＤ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＮＯＶ  ２００８  ＬＮＫＤ−  ＰＵＢＭＥＤ：１８７１３６５０，ｖｏｌ．６２，ｎｏ．１，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００８（２００８−１１），ｐａｇｅｓ  ２１−２８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明に従って、野生型ＳＵＭＯプロテアーゼによって切断不可能な改変ＳＵＭＯタンパク質を提供する。改変ＳＵＭＯタンパク質をコードする核酸分子もまた提供する。特定の実施形態では、改変ＳＵＭＯは、ＳＵＭＯプロテアーゼ相互作用ドメイン中の少なくとも１つのアルギニン残基を他のアミノ酸、好ましくは非塩基性アミノ酸に変更したＳＵＭＯタンパク質である。他の一実施形態では、改変ＳＵＭＯタンパク質はアミノ酸配列Ｘ１ＦＸ２Ｘ３Ｘ４ＧＸ５Ｘ６（配列ＩＤ番号：２）を含み、ここでＸ１およびＸ６はアルギニン以外のあらゆるアミノ酸でありＸ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ５はあらゆるアミノ酸である。他の一実施形態では、Ｘ１はグルタミン、スレオニン、およびフェニルアラニンから成る群から選択され、Ｘ６はロイシンおよびグルタミン酸から成る群から選択されるものである。さらに他の一実施形態では、改変ＳＵＭＯは配列ＩＤ番号：１と少なくとも９０％の同一性を有する。
【００１０】
本発明に従って、改変ＳＵＭＯタンパク質を切断可能な改変ＳＵＭＯプロテアーゼを提供する。改変ＳＵＭＯプロテアーゼをコードする核酸分子もまた提供する。特定の実施形態では、改変ＳＵＭＯプロテアーゼは、ＳＵＭＯ相互作用ドメインを改変したＳＵＭＯプロテアーゼである。より具体的な実施形態では、改変ＳＵＭＯプロテアーゼは、アミノ酸配列ＷＬＮＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５（配列ＩＤ番号：６）を含み、ここでＸ１およびＸ５は非酸性のあらゆるアミノ酸であり、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ５はあらゆるアミノ酸である。他の一実施形態では、Ｘ１はセリン、Ｘ２はグリシンおよびスレオニンから成る群から選択されるもの、およびＸ５はセリン、アラニン、およびメチオニンから成る群から選択されるものである。さらに他の一実施形態では、改変ＳＵＭＯプロテアーゼは、配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：４、および配列ＩＤ番号：５から成る群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％の相同性を有するものである。
【００１１】
本発明の他の一観点に従って、宿主細胞中の目的のタンパク質の発現量を増強する方法を提供する。特定の実施形態では、それらの方法は、ｉｉ）改変ＳＵＭＯをコードする核酸を目的のタンパク質をコードする核酸配列に作用するように結合する工程であって、それにより融合タンパク質をコードするコンストラクトを作製するものである、前記結合する工程、およびｉｉ）宿主細胞中へ核酸を導入する工程であって、それにより融合タンパク質中での改変ＳＵＭＯの存在が前記宿主細胞中での目的タンパク質の発現量を増加させるものである、前記導入する工程を含む。特定の実施形態では、前記方法は、さらに、融合タンパク質を単離する工程、および選択的に、目的タンパク質を放出するために融合タンパク質を切断する工程を有するものである。
【００１２】
本発明のさらに他の一観点に従って、宿主細胞中での目的タンパク質の改変アミノ末端を作成する方法を提供する。特定の実施形態では、それら方法は、ａ）目的タンパク質をコードする核酸配列を提供する工程と、ｂ）核酸中でＮ−末端アミノ酸配列をコードする配列を改変する工程と、ｃ）改変ＳＵＭＯをコードする核酸を目的タンパク質をコードする核酸配列へ作用するように結合する工程と、ｄ）宿主細胞中で核酸を発現する工程と、ｅ）宿主細胞中で改変ＳＵＭＯを切断可能な改変ＳＵＭＯプロテアーゼを発現する工程であって、それにより改変ＳＵＭＯプロテアーゼが改変ＳＵＭＯの切断を生じさせ、その結果、細胞中で改変アミノ末端を有する目的タンパク質を生成するものである、前記発現する工程とを含む。特定の実施形態では、前記方法は、さらに、改変アミノ末端を有する目的タンパク質の単離の工程を有するものである。
【００１３】
本発明のさらに他の一観点に従って、宿主細胞からの目的タンパク質の分泌量を増強する方法を提供する。特定の実施形態では、それらの方法は、ｉ）改変ＳＵＭＯをコードする核酸配列を目的タンパク質をコードする核酸配列へ作用するように結合する工程であって、それにより融合タンパク質をコードするコンストラクトを作製するものである、前記結合する工程と、ｉｉ）宿主細胞中へ核酸を導入する工程であって、それにより融合タンパク質中の改変ＳＵＭＯの存在が、宿主細胞からの目的タンパク質の分泌を増加させるものである、前記導入する工程とを含む。
【００１４】
プロモーターおよび複数のクローニング部位へ作用するように結合した改変ＳＵＭＯをコードする核酸分子を含む組換えベクターもまた提供する。好ましい実施形態では、複数のクローニング部位によって、改変ＳＵＭＯのＧｌｙ−Ｇｌｙ切断部位をコードする核酸配列の３’側への、目的タンパク質をコードする核酸のクローニングを可能にする。特定の実施形態では、組換えベクターはキットに含まれ、そのキットは、さらに、宿主細胞、および目的タンパク質の野生型とは異なるアミノ末端を生成するために、目的タンパク質をコードする核酸を改変するためのオリゴヌクレオチドベースでの部位特異的変異の試薬を含むことが可能である。
【００１５】
他の一実施形態では、宿主細胞からのタンパク質の精製キットを提供し、前記キットはｉ）組換えベクターであって、ａ）改変ＳＵＭＯをコードする核酸分子と、ｂ）プロモーターと、ｃ）複数のクローニング部位と、選択的に、ｄ）アフィニティー・タグをコードする核酸配列とを含み、ここで前記プロモーターは改変ＳＵＭＯをコードする核酸分子へ作用するように結合し、もし存在するならばアフィニティー・タグをコードする核酸配列は改変ＳＵＭＯをコードする核酸配列へインフレームで作用するように結合し、改変ＳＵＭＯのＧｌｙ−Ｇｌｙ切断部位をコードする核酸配列の３’側への、目的タンパク質をコードする核酸配列のクローニングを、複数のクローニング部位が可能にするものである、前記組換えベクター、およびｉｉ）改変ＳＵＭＯプロテアーゼまたは改変ＳＵＭＯプロテアーゼをコードするベクターを含む組成物であって、ここで改変ＳＵＭＯプロテアーゼはＧｌｙ−Ｇｌｙ切断部位の後で改変ＳＵＭＯを特異的に切断するものである、前記組成物を含む。特定の実施形態では、前記キットは、さらに、少なくとも１つの宿主細胞、アフィニティー・タグ結合のための固体支持体、溶解緩衝液、洗浄緩衝液、溶出緩衝液、切断緩衝液、および説明資料を有するものである。
【００１６】
本発明の他の一態様に従って、目的タンパク質に結合した改変ＳＵＭＯを含む融合タンパク質を含むマイクロアレイを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、野生型ＳＵＭＯおよび野生型ＳＵＭＯプロテアーゼとの比較として、改変ＳＵＭＯタグ（例えばＳＵＭＯ＊）、および原核および真核細胞からのタンパク質生産および精製のための対応する改変ＳＵＭＯプロテアーゼの可能性のある適用を表した概略図である。
【図２】図２は、ＳＵＭＯ＊がその融合パートナー（本実験ではＧＦＰ）のバクテリア細胞中での発現および溶解性を、タグ付加していないＧＦＰと比較して、野生型ＳＵＭＯと同様に強く増強したことを示す、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの映像である。Ｕ＝非誘導培養；Ｉ＝誘導培養；Ｓ＝可溶性画分；ＩＢ＝封入体、不溶性。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、ＳＵＭＯ＊融合タグが、それぞれ出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）または昆虫細胞のＳＵＭＯプロテアーゼによって切断されないことを示すウエスタンブロットの映像である。図３Ａでは、ＧＦＰ（レーン１および２）、ＳＵＭＯ−ＧＦＰ（レーン３および４）、ＳＵＭＯ＊−ＧＦＰ（レーン５および６）を発現するコンストラクトで酵母を形質転換した。図３Ｂでは、昆虫Ｓｆ９細胞抽出物あり（レーン１および２）または無し（レーン３および４）で、ＳＵＭＯ＊−ＧＦＰまたはＳＵＭＯ−ＧＦＰを２２℃で３時間インキュベートした。タンパク質は１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離して、抗ＧＦＰ抗体で検出した。＊＝ＧＦＰ分解産物。
【図４Ａ】図４Ａおよび４Ｂは、Ｓｍｔ３およびＵＬＰ１、およびそれらの可能性のある相互作用の結晶構造を示している。ＳＵＭＯ−ＵＬＰ１相互作用の一部であるＳＵＭＯ中の２残基（アルギニン６４およびアルギニン７１）およびＵＬＰ１中の２残基（グルタミン酸４５５およびアスパラギン酸４５１）を特に描写した。図４Ａおよび４Ｂでは異なる角度からの見え方を示している。
【図４Ｂ】図４Ａおよび４Ｂは、Ｓｍｔ３およびＵＬＰ１、およびそれらの可能性のある相互作用の結晶構造を示している。ＳＵＭＯ−ＵＬＰ１相互作用の一部であるＳＵＭＯ中の２残基（アルギニン６４およびアルギニン７１）およびＵＬＰ１中の２残基（グルタミン酸４５５およびアスパラギン酸４５１）を特に描写した。図４Ａおよび４Ｂでは異なる角度からの見え方を示している。
【図５】図５は、ＵＬＰ１との接触が予想されるＳＵＭＯの領域の図である。Ｒ６４およびＲ７１の位置のアルギニンを強調している。配列ＩＤ番号：６６を提供した。
【図６】図６は、野生型ＳＵＭＯ（Ｓｍｔ３）はＵＬＰ１およびＳＥＮＰ２（ＳＵＭＯプロテアーゼ１および２）によってインビトロで切断されるが、しかしＳＵＭＯ＊（変異型Ｓｍｔ３）はいずれのプロテアーゼによってもインビトロで切断されないことを示した、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（上パネル）および同一ゲルの抗Ｓｍｔ３ウエスタンブロット（下パネル）の映像を提供したものである。
【図７】図７は、改変ＳＵＭＯを切断可能な改変ＳＵＭＯプロテアーゼのスクリーニングに用いた実験系の概略図である。ベータ−ラクタマーゼは、ペリプラスム空間へ輸送された場合にのみ、Ｅ．ｃｏｌｉにアンピシリン耐性を与える。図７Ａに描くとおり、ベータ−ラクタマーゼは、ＳＵＭＯおよび不溶性タンパク質のＮ−末端に結合した場合、細胞内にトラップされ、バクテリアはアンピシリン含有プレート上では成長しない。もしベータ−ラクタマーゼ複合体に加えてＳＵＭＯプロテアーゼが細胞内へ導入された場合、ベータ−ラクタマーゼはＳＵＭＯプロテアーゼによって解放され、続いてペリプラスム中へ輸送されて、そこでアンピシリン耐性を与える（図７Ｂ）。もしベータ−ラクタマーゼ上のＳＵＭＯタグが野生型ＳＵＭＯプロテアーゼによって切断されないような変異をした場合（例えば、前記ＳＵＭＯがＳＵＭＯ＊である）には、細胞はペニシリン感受性となる（図７Ｃ）。ＳＵＭＯプロテアーゼが変異型ＳＵＭＯ＊を切断するように変異／改変した場合にのみ、バクテリア細胞はアンピシリン耐性を再獲得する（図７Ｄ）。Ｉｎｓｏｌ．ｐｒｏｔｅｉｎ＝不溶性タンパク質；ＷＴ  ＳＵＭＯプロテアーゼ＝野生型ＳＵＭＯプロテアーゼ；ＢＬＡ＝ベータ−ラクタマーゼ；ＳＵＭＯ＊＝改変ＳＵＭＯ。
【図８】図８は、プロテアーゼがＳＵＭＯ含有基質を切断できない場合にはＥ．ｃｏｌｉはアンピシリン上で成長できないことを示した、インビボでのベータ−ラクタマーゼのスクリーニングの培養の映像である。プロテアーゼの誘導には、０．０２％アラビノースをプレートへ添加した。
【図９】図９は、野生型ＳＵＭＯプロテアーゼであるＵＬＰ１中の領域、および配列ＩＤ番号：２４の変異を提供した場合にＳＵＭＯ＊に対する酵素活性を復帰した特定の特異的な残基の概略図を提供するものである。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｄは、ＳＵＭＯ＊プロテアーゼはＧＦＰとの融合タンパク質から効果的にＳＵＭＯ＊を切断するが、しかしＵＬＰ１は前記ＳＵＭＯ＊タグを切断しないことを示したクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの映像である。傾斜はプロテアーゼの滴定を示しており、それぞれの連続したレーンは前のレーンの２倍少ないプロテアーゼを含む。図１０Ａは、ＵＬＰ１がＳＭＴ３タグを切断することを示している。図１０Ｂは、ＳＵＭＯ＊プロテアーゼ１がＳＵＭＯ＊タグを切断することを示している。図１０Ｃは、ＵＬＰ１がＳＵＭＯ＊タグを切断しないことを示している。図１０Ｄは、ＳＵＭＯ＊プロテアーゼ１が野生型ＳＵＭＯを切断するが、しかしＳＵＭＯ＊よりは効果が少ないことを示している。Ｕ＝非切断ＳＵＭＯまたはＳＵＭＯ＊−ＧＦＰ（プロテアーゼは存在せず）；Ｐ＝プロテアーゼのみのレーン、最初の切断反応においては同量のプロテアーゼを用いた。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜１１Ｃは、様々な生物種からのＳＵＭＯタンパク質の配列を提供するものである。下線領域はＳＵＭＯプロテアーゼとの相互作用領域である。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜１１Ｃは、様々な生物種からのＳＵＭＯタンパク質の配列を提供するものである。下線領域はＳＵＭＯプロテアーゼとの相互作用領域である。
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜１１Ｃは、様々な生物種からのＳＵＭＯタンパク質の配列を提供するものである。下線領域はＳＵＭＯプロテアーゼとの相互作用領域である。
【図１２Ａ】図１２Ａおよび１２Ｂは、様々な生物種からのＳＵＭＯプロテアーゼの配列を提供するものである。下線領域はＳＵＭＯタンパク質との相互作用領域である。
【図１２Ｂ】図１２Ａおよび１２Ｂは、様々な生物種からのＳＵＭＯプロテアーゼの配列を提供するものである。下線領域はＳＵＭＯタンパク質との相互作用領域である。
【図１３】図１３は、６×Ｈｉｓタグ付加したトリプターゼと比較して、ＳＵＭＯ＊タグ付加したトリプターゼが昆虫細胞中でより高い量を発現しており、切断されていないことを示したクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの映像である。
【図１４】図１４は、６×Ｈｉｓタグ付加したＧｚｍＢと比較して、ＳＵＭＯ＊タグ付加したＧｚｍＢがピチア細胞中でより高い量を発現および分泌しており、切断されていないことを示したウエスタンブロットの映像である。
【図１５Ａ】図１５Ａは、昆虫ｓｆ９細胞中でＳＵＭＯ＊融合によるＵＢＰ４３タンパク質の異種発現の劇的な増強を示した、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの映像である。矢印は非融合またはＳＵＭＯ＊融合ＵＢＰ４３のサイズを示している。ＳＵＭＯ＊と融合したＰＬＡ２のみが培地中へ分泌されている一方で、６×Ｈｉｓおよび野生型ＳＵＭＯとの融合では分泌されていない。６×Ｈｉｓ−ＰＬＡ２および完全に切断されたＳＵＭＯ−ＰＬＡ２が細胞抽出物中で辛うじて検出された。矢印はＰＬＡ２、切断された野生型ＳＵＭＯ、およびＳＵＭＯ＊−ＰＬＡ２の期待されるサイズを示している。ＪＯＳＤ２が細胞内で発現しており、ＳＵＭＯ＊がその発現を強く増強している。Ｈ＝６×Ｈｉｓ；Ｓ＝ＳＵＭＯ；およびＳ＊＝ＳＵＭＯ＊。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中での、マウスグループＸホスホリパーゼ２Ａ（ｍＸＰＬＡ２；左パネル）および脱ユビキチン化酵素ＪＯＳＤ２（右パネル）の発現を示したウエスタンブロットの映像を提供するものである。ＳＵＭＯ＊と融合したＰＬＡ２のみが培地中へ分泌されている一方で、６×Ｈｉｓおよび野生型ＳＵＭＯとの融合では分泌されていない。６×Ｈｉｓ−ＰＬＡ２および完全に切断されたＳＵＭＯ−ＰＬＡ２が細胞抽出物中で辛うじて検出された。矢印はＰＬＡ２、切断された野生型ＳＵＭＯ、およびＳＵＭＯ＊−ＰＬＡ２の期待されるサイズを示している。ＪＯＳＤ２が細胞内で発現しており、ＳＵＭＯ＊がその発現を強く増強している。Ｈ＝６×Ｈｉｓ；Ｓ＝ＳＵＭＯ；およびＳ＊＝ＳＵＭＯ＊。
【図１６】図１６は、マウスｓＰＬＡ２−Ｘの最初のコンストラクト（活性型（図１６Ａ）および不活性型（図１６Ｂ））の導入後（ＨＥＫ−２９３Ｔ）４８時間の培地（１５μｌ）のウエスタンブロットの映像を提供するものである。以下の５つのＮ−末端融合タグを試験した：６×Ｈｉｓ、６×Ｈｉｓ−ＣＴＨＳ、６×Ｈｉｓ−ＳＵＭＯｍｕｔ、６×Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ、および６×Ｈｉｓ−ｈＳＵＭＯ３である。全てのコンストラクトは、マウスＩｇＧカッパ分泌シグナルもまた含む。結果は少なくとも３回の独立した実験を代表するものである。
【図１７】図１７は、マウスｓＰＬＡ２−Ｘの改変したコンストラクト（不活性型（図１７Ａ）および活性型（図１７Ｂ））の導入後（ＨＥＫ−２９３Ｔ）４８時間の培地（１５μｌ）のウエスタンブロットの映像を提供するものである。以下の７つのＮ−末端融合タグを試験した：６×Ｈｉｓ、６×Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ、６×Ｈｉｓ−ＳＵＭＯｍｕｔ、６×Ｈｉｓ−ｈＳＵＭＯ１、６×Ｈｉｓ−ｈＳＵＭＯ１ｍｕｔ、６×Ｈｉｓ−ｈＳＵＭＯ３、および６×Ｈｉｓ−ｈＳＵＭＯ３ｍｕｔである。全てのコンストラクトは、マウスＩｇＧカッパ分泌シグナルを含む。結果は少なくとも３回の独立した実験を代表するものである。
【図１８】図１８は、ｓＰＬＡ２−ＩＩＣ（図１８Ａ、細胞内画分）、ＩＩＥ（図１８Ｂ、培地（１５μｌ）、ＩＩＩ（培地（１５μｌ））、およびＶ（培地（１５μｌ））のコンストラクトを導入後（ＨＥＫ−２９３Ｔ）４８時間のウエスタンブロットの映像を提供するものである。それぞれのｓＰＬＡ２に対して３つのＳＵＭＯで変異型および野生型の両方を用いて、６×Ｈｉｓタグをコントロールとすることで、比較を行った。全てのコンストラクトは、マウスＩｇＧカッパ分泌シグナルを含む。結果は２〜３回の独立した実験を代表するものである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、真核細胞系の野生型ＳＵＭＯプロテアーゼによって切断されない新規な改変ＳＵＭＯタンパク質、およびその使用方法を提供する。ＳＵＭＯの発現増強の特性を利用するために、真核細胞中で切断されない新規な改変ＳＵＭＯタグ（例えばＳＵＭＯ＊）を実際に開発した。ＳＵＭＯプロテアーゼは全ての真核生物中に存在する。従って、本発明の改変ＳＵＭＯタンパク質とは対照的に、野生型ＳＵＭＯ融合タンパク質は真核細胞中で発現させた場合に切断される。特に、原核生物はＳＵＭＯ経路またはＳＵＭＯプロテアーゼを有していない。そのため、ＳＵＭＯ融合タンパク質（野生型または改変型）は原核生物中で発現した場合には切断されない。
【００１９】
改変ＳＵＭＯタンパク質を切断することが可能な新規な改変ＳＵＭＯプロテアーゼもまた提供する。改変ＳＵＭＯタンパク質およびＳＵＭＯプロテアーゼは、真核および原核細胞系の両方で、改変ＳＵＭＯと融合した目的タンパク質の発現および精製を可能にする（例えば図１を参照）。前記細胞系は、所望のＮ−末端を有する野性型タンパク質の生成もまた可能にする。
【００２０】
例えば、１つの生物からの核酸配列を異なるホスト生物中へ挿入することで、組換えタンパク質を生成することができる。前記異なるホスト生物は、挿入した核酸分子から前記組換えタンパク質（目的タンパク質）を合成する。生成したタンパク質は、典型的には続く精製の工程で細胞から単離する。原核、真核、バクテリア、酵母、昆虫、および哺乳類の細胞の全てで組換えタンパク質の発現に用いることが可能である。目的タンパク質のコード領域の直前または直後にＤＮＡ配列を挿入したタンパク質「タグ」を開発した。結果として得られる融合タンパク質は、前記タグおよび前記目的の組換えタンパク質を含む。タンパク質タグは可溶性、正しい折りたたみ、発現量、および目的タンパク質の精製能力を増強することができる。
【００２１】
バクテリアＥ．ｃｏｌｉ中でタンパク質の発現および可溶性を増強する多くの異なるタンパク質タグが何年にもわたって開発されてきた。そうしたタンパク質タグは、限定するわけではないが、ＧＳＴ（ｇｌｕｔｈａｔｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ））、ＭＢＰ（ｍａｌｔｏｓｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（マルトース結合タンパク質））、Ｔｈｘ（ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ（チオレドキシン））、ＮｕｓＡ、Ｕｂ（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ（ユビキチン））、およびＳＵＭＯを含む。それらタグはバクテリア中でうまく良く利用されているにもかかわらず、それらは、異種タンパク質の低い発現量、またはＵｂまたはＳＵＭＯタグの場合では内在性プロテアーゼのために融合タンパク質として残存不能であるなどの様々な制限があることから、真核細胞に適用不可能である。
【００２２】
融合パートナーとしてのＳＵＭＯタンパク質は、バクテリアおよび真核細胞の両方で組換えタンパク質の量および質を非常に良く増強することが可能である（例えば、米国特許第７，０６０，４６１号明細書；米国公開特許第２００４００１８５９１号および第２００６００４０３３５；および国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０４／２０７７８を参照）。ＳＵＭＯファミリーのタンパク質は細胞制御の一部として真核生物のタンパク質に自然に付加および除去される。ＳＵＭＯの構造およびＳＵＭＯタンパク質の付加および除去の過程は、真核細胞で非常に良く保存されている。ＳＵＭＯタンパク質の構造の高度な保存により、ＳＵＭＯ融合タグと他生物宿主の内在性ＳＵＭＯ修飾酵素は種を超えて反応する結果となる。従って、真核生物はＳＵＭＯタグを切断することが可能であり、多くの場合、タグおよび組換えタンパク質が分離する結果となる。「切断されていない（"ｕｎｃｌｅａｖｅｄ"）」または未処理の野生型ＳＵＭＯ融合タンパク質の真核細胞からの発現および精製はしばしば不可能である。真核細胞中でのタンパク質生産の増強の追求におけるこの「未成熟な（"ｐｒｅｍａｔｕｒｅ"）」タグ切断という障害を克服するために、内在性ＳＵＭＯプロテアーゼに耐性のある新規なＳＵＭＯタンパク質を開発した。
【００２３】
本発明の発見は、タンパク質発現の分野における少なくとも４つの主要な問題解決に取り組むものである。１番目に、上述した通り、真核細胞中でのＳＵＭＯ、Ｕｂ、および他のユビキチン様タンパク質融合は、真核生物に天然で存在する加水分解酵素による融合結合の即時の切断によって制限されてきた。この切断を理由として、目的タンパク質の精製を助けるために、ＳＵＭＯ−加水分解酵素の切断部位の後またはパッセンジャータンパク質のＣ−末端に、アフィニティー・タグを設置する必要があった。もし融合タンパク質の利用工程の後の段階でアフィニティー・タグを除去する必要がある場合、プロテアーゼ部位もまた作製する必要があった。本願明細書で提示するシステムは、ＳＵＭＯタグの原核システムへの限定を回避し、本発明の変異ＳＵＭＯタンパク質、または真核生物を含む全てのシステムでの融合タンパク質のアフィニティー精製のために変異ＳＵＭＯタンパク質のアミノ末端へ結合したアフィニティー・タグの利用を可能にする。本願明細書で提供する改変ＳＵＭＯプロテアーゼは、インビトロまたはインビボで前記タグの効率的な除去を可能にする。
【００２４】
２番目に、多くのタンパク質は真核および原核細胞中で不安定であるか、または少ししか発現しない。改変ＳＵＭＯタンパク質と融合すると、融合しない場合と比較してタンパク質は非常に高いレベルで発現することになり（例えば、図３Ａを参照）、野生型ＳＵＭＯと融合したタンパク質と比較してもやはり高いレベルである（例えば、図４を参照）。さらに、以下に記述する通り、改変ＳＵＭＯタンパク質との融合は、非融合タンパク質または野生型ＳＵＭＯとの融合タンパク質と比較してさえ、さらに高いレベルで目的タンパク質の分泌を促進することができる。目的タンパク質へのＳＵＭＯＰ分子の結合は、前記タンパク質を安定化させることもまたできる。
【００２５】
３番目に、特定のタンパク質は、特に異種タンパク質として発現した場合、細胞に対して毒性である。それら毒性タンパク質へのＳＵＭＯの結合は、前記タンパク質の毒性を減少または排除することができ、以前には発現が困難であった毒性タンパク質の多量および持続した発現を可能とする。例えば、タンパク質のアミノ末端でのＳＵＭＯ分子の存在は、前記タンパク質のその領域に局在する前記タンパク質のあらゆる毒性を阻害することができる。実際に、実施例４での以下の記述で示すように、細胞に対して毒性／致死性であり、その活性のためにはフリーのＮ−末端が必要であるところのＰＬＡ２タンパク質は、改変ＳＵＭＯと融合した場合には、真核細胞中において高レベルで発現可能である。発現および精製した上で、前記ＳＵＭＯ分子は前記毒性タンパク質から切断可能であり、それによって、その毒性および／または活性を回復することになる。
【００２６】
４番目に、自然ではタンパク質合成をメチオニンから開始するためにこれまでは作製が不可能であった新規なＮ−末端を生成するために、原核細胞中で発現した様々な融合タンパク質をインビトロまたはインビボで切断することが可能である。当システムのこの特徴は、生理学的および生化学的活性の維持に特定のＮ−末端が必要なタンパク質（例えば、ＲＮＡ−ポリメラーゼ、プロテアーゼ、およびサイトカイン）に対して特に有用である。
【００２７】
Ｉ．定義
以下の定義は、本発明の理解を助けるために提供するものである。
【００２８】
本願明細書で用いる「核酸」または「核酸分子」とは、あらゆるＤＮＡまたはＲＮＡ分子で、１本鎖または２本鎖のいずれかであり、もし１本鎖である場合、前記分子の相補的配列は直線状または環状のいずれかであるものに言及するものである。核酸分子の議論において、特定の核酸分子の配列または構造は、５’から３’の方向の配列を提供する通常の慣例に従って、本願明細書に記述する。本発明の核酸への参照では、「単離核酸」という用語を時に用いる。この用語をＤＮＡに適用する場合は、自然状態でそのＤＮＡ配列の起源となる生物ゲノム中で直接的に連続している配列から分離したＤＮＡ分子に言及するものである。例えば、「単離核酸」は、プラスミドまたはウイルスベクターなどのベクター中へ挿入した、または原核または真核細胞または宿主生物のゲノムＤＮＡ中に取り込まれたＤＮＡ分子を含むことができる。
【００２９】
ＲＮＡに適用する場合、「単離核酸」とは、以上に定義した単離ＤＮＡによってコードされたＲＮＡ分子に言及することができる。あるいは前記用語は、自然状態（すなわち、細胞または組織中）で関連しているであろう他の核酸から十分に分離されたＲＮＡ分子に言及することができる。単離核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれでも）はさらに、生物学的または合成的方法によって直接的に作製して、その作製中に存在する他の成分から分離した分子を表すことができる。
【００３０】
１本鎖核酸、特にオリゴヌクレオチドに関して、「特異的にハイブリダイズする（"ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ"）」とは、当該技術分野で通常用いる所定の条件下でハイブリダイゼーションが許されるような（時に「十分に相補的（"ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ"）」とも言う）、十分に相補的な配列である２つの１本鎖ヌクレオチド分子の結合に言及するものである。特に前記用語は、本発明の１本鎖ＤＮＡ分子中に含まれる十分に相補的な配列とオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション、および非相補的配列の１本鎖核酸と前記オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの十分な排除に対して言及するものである。様々な相補性の１本鎖核酸分子の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする適切な条件は、当該技術分野で周知のものである。
【００３１】
例えば、特定の配列相同性を有する核酸分子間のハイブリダイゼーションを達成するのに必要とされるストリンジェンシーの条件計算のための１つの通常の公式は、以下のように示される（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）：
Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−６００／２重鎖中の＃ｂｐ
上記の公式の実例としては、［Ｎａ＋］＝［０．３６８］および５０％ホルムアミド、ＧＣ含有量４２％、および平均プローブサイズが２００塩基で、Ｔｍは５７℃である。ＤＮＡ２重鎖のＴｍは相同性が１％減少するごとに１〜１．５℃低下する。従って、約７５％以上の配列同一性を有する標的では、ハイブリダイゼーション温度４２℃を用いて観察することになる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．の方法に従って、５×ＳＳＣ、５×デンハート試薬、１．０％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サーモン精子ＤＮＡ断片、０．０５％ピロリン酸ナトリウム、および５０％までのホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液を用いて、ハイブリダイゼーションを行うことができる。ハイブリダイゼーションは３７〜４２℃で少なくとも６時間かけて実施する。ハイブリダイゼーションに続いて、以下の要領でフィルターを洗浄する：（１）２×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中室温で５分間；（２）２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中室温で１５分間；（３）１×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中３７℃で３０分〜１時間；（４）１×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中で４２〜６５℃で２時間、３０分ごとに溶液を交換する。
【００３２】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよび洗浄は主に、塩濃度および溶液の温度に依存する。プローブとその標的のアニーリング率を最大化するためには、ハイブリッドについて計算したＴｍより２０〜２５℃低い温度および塩の条件でハイブリダイゼーションを通常は実施する。洗浄条件は、前記プローブと前記標的の同一性の度合いに対して可能な限り厳しくすべきである。洗浄条件は、前記ハイブリッドのＴｍより約１２〜２０℃低くなるよう選択する。本発明の核酸に関しては、穏やかなストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ、５×デンハート溶液、０．５％ＳＤＳ、および１００μｇ／ｍｌ変性サーモン精子ＤＮＡ中で４２℃でのハイブリダイゼーション、および２×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中で５５℃での１５分間の洗浄によるものとして規定する。高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ、５×デンハート溶液、０．５％ＳＤＳ、および１００μｇ／ｍｌ変性サーモン精子ＤＮＡ中で４２℃でのハイブリダイゼーション、および１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中で６５℃での１５分間の洗浄によるものとして規定する。非常に高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ、５×デンハート溶液、０．５％ＳＤＳ、および１００μｇ／ｍｌ変性サーモン精子ＤＮＡ中で４２℃でのハイブリダイゼーション、および０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中で６５℃での１５分間の洗浄によるものとして規定する。
【００３３】
本願明細書で用いる「プローブ」という用語は、天然に存在するものを精製制限酵素によって消化する、または合成的に作製するかどうかにかかわらず、前記プローブと相補的な配列を有する核酸とアニーリングする、または特異的にハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはＤＮＡ分子に言及するものである。プローブは１本鎖または２本鎖のいずれとすることもできる。前記プローブの正確な長さは、温度、プローブのソース、および用いる方式を含む多くの要因に依存する。例えば、診断用途では、標的配列の複雑性に依存して、より少ないヌクレオチドを含むこともできるものの、オリゴヌクレオチド・プローブは典型的には１５〜２５またはそれ以上のヌクレオチドを含む。本願明細書のプローブは、特定の標的核酸配列の異なる鎖に相補的となるよう選択する。このことは、一連の所定の条件下で、前記プローブは、それら個別の標的鎖と「特異的にハイブリダイズする」またはアニーリングすることが可能であるために十分なだけ相補的である必要があることを意味する。従って、前記プローブは、標的への正確に相補的な配列を反映する必要はない。例えば、プローブ配列の残りの部分が標的鎖と相補的である時に、非相補的なヌクレオチド断片がプローブの５’または３’末端に結合することが可能である。あるいは、プローブ配列が標的核酸の配列と後で特異的にアニーリングするために十分な相補性を有しているという条件下で、非相補的な塩基またはより長い配列が前記プローブ中に散在することが可能である。
【００３４】
本願明細書で用いる「プライマー」という用語は、１本鎖または２本鎖のいずれであっても、生物系に由来する、制限酵素による消化によって生成する、または合成的に作製するもののいずれであっても、適切な環境中に設置した場合には、鋳型依存的な核酸合成のイニシエーターとして機能的に働くことが可能であるＤＮＡオリゴヌクレオチドに言及するものである。適切な核酸鋳型、適切なヌクレオシド三リン酸の核酸前駆体、ポリメラーゼ酵素、適切な補因子、および適切な温度およびｐＨといった条件で存在する場合、ポリメラーゼまたはプライマー伸長産物を生成する同様な活性の働きによるヌクレオチドの付加によって、前記プライマーはその３’末端から伸長することができる。プライマーの長さは、特定の条件および適用における必要性に依存して変化させることができる。例えば、診断用途では、オリゴヌクレオチド・プライマーは典型的には長さ１５〜２５若しくはそれ以上のヌクレオチドである。所望の伸長産物の合成を準備するために、すなわち、ポリメラーゼまたは同様の酵素による合成開始での利用のために、前記プライマーの３’水酸基部分を適切に隣接した状態で提供するのに十分な方法で、所望の鋳型鎖とアニーリングすることが可能なように、前記所望の鋳型との十分な相補性を有している必要がある。プライマー配列が所望の鋳型への正確な相補性を示す必要はない。例えば、５’末端以外の部分が相補的なプライマーの５’末端に、非相補的なヌクレオチド配列が結合することができる。あるいは、伸長産物の合成のための鋳型−プライマー複合体を機能的に提供するために、プライマー配列が所望の鋳型鎖の配列との十分な相補性を有しているという条件下で、オリゴヌクレオチド・プライマー配列中に非相補的な塩基が散在することができる。
【００３５】
「相補的ＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ：ｃＤＮＡ）」は、ｍＲＮＡの鋳型から逆転写酵素によって形成される１本鎖ＤＮＡ分子である。典型的には、ｍＲＮＡの一部分に相補的なプライマーを逆転写の開始に用いる。「ｃＤＮＡ」という用語は、そうした１本鎖ＤＮＡおよび、それに相補的なＤＮＡ鎖から成る２本鎖ＤＮＡ分子にもまた言及することができる。「ｃＤＮＡ」という用語は、ＲＮＡの鋳型から合成したｃＤＮＡ分子のクローンにもまた言及することもまたできる。
【００３６】
ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）は、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，８００，１９５号、および第４，９６５，１８８号明細書に記述されており、この参照によって本願明細書にこれらの開示内容の全てが組み込まれるものである。
【００３７】
「パーセント相似性（"ｐｅｒｓｅｎｔ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ"）」、「パーセント同一性（"ｐｅｒｓｅｎｔ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ"）」、「パーセント相同性（"ｐｅｒｓｅｎｔ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ"）」という用語は、特定の配列に言及する場合は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＧＣＧ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐｒｏｇｒａｍ中で説明されている通りに用いる。
【００３８】
「機能的」という用語は、本願明細書で用いる場合は、核酸またはアミノ酸配列が、言及するアッセイまたは目的に対して機能的であるという意味を含む。
【００３９】
特定の核酸配列の「天然対立遺伝子多型（"ｎａｔｕｒａｌ  ａｌｌｅｌｉｃ  ｖａｒｉａｎｔｓ"）」、「変異型（"ｍｕｔａｎｔｓ"）」、および「派生物（"ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ"）」とは、特定の配列に強く関係しているが、しかし、天然によるものまたは設計によるもののいずれであっても、配列または構造に変化がある核酸配列に言及するものである。強く関係している（ｃｌｏｓｅｌｙ  ｒｅｌａｔｅｄ）とは、特定の配列ＩＤ番号を用いて言及する核酸配列の規定した長さにおいて、配列の少なくとも７５％、しかし多くの場合９０％以上のヌクレオチドの一致を意味する。強く関係している核酸配列間のヌクレオチド配列中の変化または相違は、特定の核酸配列の自然における通常の複写または複製の過程で生じる前記配列中のヌクレオチドの変化を表す。他の変化を、アミノ酸コドンまたは核酸の調節領域中の配列を変化させるなどの特定の目的で、配列中に特別に設計および導入することができる。そうした特定の変化は、様々な変異技術を用いてインビトロで作製する、または変化を誘導または選択する特定の選択条件下に宿主生物を設置することで生成することができる。そうした特別に生成した配列の変異体は、元の配列の「変異型」または「派生物」として言及する。
【００４０】
特定のヌクレオチドまたはアミノ酸に言及する場合の「基本的に〜から成る（"ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ"）」という表現は、所与の配列ＩＤ番号の特性を有する配列を意味する。例えば、アミノ酸配列への言及で用いる場合、前記表現はその配列自体、および前記配列の基本的および新規な特性に影響しないであろう分子の変更を含む。
【００４１】
本願明細書で用いる「プロモーター」は、組換え産物をコードするＤＮＡ配列に隣接して位置するＤＮＡ配列に言及する場合がある。プロモーターは隣接するＤＮＡ配列に作用するように結合することが望ましい。プロモーターは典型的には、プロモーターが存在しない場合に発現する組換え産物の量と比較して、ＤＮＡ配列から発現する組換え産物の量を増加させる。１つの生物種からのプロモーターは、他の生物種に由来するＤＮＡ配列からの組換え産物の発現増強に用いることが可能である。例えば、脊椎動物のプロモーターを、クラゲのＧＦＰの脊椎動物中での発現に用いることができる。さらに、１つのプロモーター因子は、１列に並んで結合した複数のＤＮＡ配列の組換え産物の発現量を増加させることが可能である。従って、１つのプロモーター因子は、１若しくはそれ以上の組換え産物の発現を増強することが可能である。複数のプロモーター因子は、当業者にとって周知のものである。
【００４２】
本願明細書で用いる「エンハンサー」という用語は、組換え産物をコードするＤＮＡ配列に隣接して位置するＤＮＡ配列に言及することが可能である。エンハンサー因子は、典型的にはプロモーター因子の上流に位置する、またはＤＮＡコード配列（例えば、組換え産物へ転写または翻訳されるＤＮＡ配列）の下流または配列中に位置することが可能である。従って、エンハンサー因子は組換え産物をコードするＤＮＡ配列の１００塩基対、２００塩基対、または３００塩基対またはそれ以上の塩基対の上流または下流に位置することが可能である。エンハンサー因子は、プロモーター因子によって得られる発現の増加以上に、ＤＮＡ配列からの組換え産物量を増加可能である。当業者は複数のエンハンサー因子を容易に入手可能である。
【００４３】
本願明細書で用いる「導入（した）（"ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ"）」および「導入（"ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ"）」という用語は、外因性ＤＮＡの細胞中への輸送方法に言及するものである。それら方法は、宿主細胞の外膜または細胞壁に目的の核酸分子に対する浸透性を与えるための、高濃度の塩、電界、リポソーム、ポリカチオン性ミセル、または界面活性剤などによる細胞処理といった様々な技術を含む。それら特定の方法は非限定的であり、本発明は当業者にとって周知のあらゆる形質転換技術に関連するものである。
【００４４】
「レプリコン」は、例えば、プラスミド、コスミド、バクミド、ファージ、またはウイルスなど、それ自体の制御下で多量な複製が可能なあらゆる遺伝的因子である。レプリコンは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれでも良く、１本または２本鎖でも良い。
【００４５】
「ベクター」は、プラスミド、コスミド、バクミド、ファージ、またはウイルスといったレプリコンであり、他の遺伝的配列または因子（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれでも）を結合して、結合した配列または因子の複製を引き起こすことができる。
【００４６】
「発現オペロン（"ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｐｅｒｏｎ"）」は、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（例えば、ＡＴＧまたはＡＵＧコドン）、ポリアデニル化シグナル、終止シグナル、およびそれらに類するものなどの転写および翻訳制御配列を有する核酸部分に言及するものであり、それは宿主細胞または生物中でのポリペプチドのコード配列の発現を促進する。
【００４７】
本願明細書で用いる「オリゴヌクレオチド」という用語は、本発明の配列、プライマー、およびプローブに言及するものであり、２若しくはそれ以上、好ましくは３以上のリボまたはデオキシリボヌクレオチドを含む核酸分子として定義する。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、様々な要因、および前記オリゴヌクレオチドの特定の適用および利用に依存する。
【００４８】
「十分に純粋な（"ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｐｕｒｅ"）」という用語は、所与の材料（例えば、核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質など）を重量で少なくとも５０〜６０％含む調整物に言及するものである。より好ましくは、前記調整物は所与の化合物を重量で少なくとも７５％、および最も好ましくは９０〜９５％含むものである。純粋さは、所与の化合物に対して適切な方法（例えば、クロマトグラフィー方式、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ解析、およびそれらに類するもの）によって測定する。
【００４９】
「遺伝子」という用語は、エクソンおよび（選択的に）イントロン配列の両方を含み、ポリペプチドをコードするオープン・リーディング・フレームを含む核酸に言及するものである。前記核酸は、プロモーターまたはエンハンサー配列といった非コード配列もまた選択的に含むことができる。「イントロン」という用語は、タンパク質に翻訳されず、エクソン間に見られる、所与の遺伝子中に存在するＤＮＡ配列に言及するものである。
【００５０】
本願明細書で用いる「作用するように結合する（"ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ"）」という表現は、他の核酸配列と機能的な関係で設置した核酸配列に言及するものである。作用するように結合した核酸配列の例は、限定するわけではないが、プロモーター、切断部位、精製タグ、転写終止シグナル、エンハンサーまたはアクチベーター、および異種遺伝子であり、転写されて、もし適切であれば翻訳された場合に、タンパク質、リボザイム、またはＲＮＡ分子など機能的産物を生成するものである。「作用するように結合する」という表現は、例えば、Ｕｂｌのカルボキシ−末端をコードする核酸と機能的関係を持つように設置した目的タンパク質をコードする核酸配列であり、タンパク性形態のＵｂｌのカルボキシ−末端ドメインの触媒的切断活性が目的タンパク質の放出をもたらすものにもまた言及することができる。
【００５１】
「固体支持体」という表現は、限定するわけではないが、あらゆるチップ（例えば、石英系、ガラス、またはゴールド・チップ）、スライドガラス、膜、ビーズ、固体粒子（例えば、アガロース、セファロース、ポリスチレン、または磁性ビーズ）、カラム（または、カラム材料）、試験管、またはマイクロタイターディッシュを含む、あらゆる固体表面に言及するものである。
【００５２】
「アフィニティー・タグ」、「精製タグ」、および「エピトープ・タグ」という表現は全て、目的タンパク質の精製に効果的に用いることが可能なタグに言及するものである。精製／アフィニティー／エピトープ・タグは当該技術分野で周知のものであり（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、限定するわけではないが、以下のものを含む：ポリヒスチジン・タグ（例えば、６×Ｈｉｓ）、ポリアルギニン・タグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ｍａｌｔｏｓｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＭＢＰ）、Ｓ−タグ、インフルエンザウイルスＨＡタグ、チオレドキシン、ブドウ球菌プロテインＡタグ、ＦＬＡＧ（商標）エピトープ、（続くビオチン化のための）ＡｖｉＴａｇエピトープ、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ：ＤＨＦＲ）、抗体エピトープ（例えば、抗体によって認識および結合されるアミノ酸配列）、ｃ−ｍｙｃエピトープ、およびヘム結合ペプチド。
【００５３】
本願明細書で用いる場合、「毒性タンパク質」という用語は、宿主細胞中で発現した場合、細胞死を引き起こす、または細胞成長を阻害するタンパク質に言及するものである。
【００５４】
本願明細書で用いる場合、「説明資料」は、刊行物、録音、図表、または本発明の方法の実施のための本発明の構成の有用性を伝達するために用いることが可能なあらゆる他の表現媒体を含む。本発明のキットの説明資料は、例えば、本発明のキットを含む容器に添付して、キットを含む容器と共に発送することが可能である。あるいは、受領者が前記説明資料およびキットを共に用いることを意図して、説明資料を本発明の容器とは別に発送することが可能である。
【００５５】
本願明細書で用いる場合、「変更（"ｍｏｄｉｆｉｅｄ"）」、「改変（"ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ"）」、または「変異型（"ｍｕｔａｎｔ"）」という用語は、改変したポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列に言及するものである。一実施形態では、ＳＵＭＯまたはＳＵＭＯプロテアーゼをコードするポリヌクレオチド配列を、特に部位特異的変異による１若しくはそれ以上の変異の導入によって変更／改変／変異する。さらに、ランダム変異導入法、またはＤＮＡシャッフリング技術を用いて、少なくとも１つの変異を含む変異ポリヌクレオチドのライブラリーを調製することもまたできる。特定の実施形態では、ランダム変異導入法はポリヌクレオチドの所望の領域、特にＳＵＭＯとＳＵＭＯプロテアーゼとの間の相互作用に関与するアミノ酸をコードすると信じられる領域に制限される。一般的な変異技術は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ（２００６）、および米国特許第５，６０５，７９３号；第５，８１１，２３８号；第５，８３０，７２１号；第５，８３４，２５２号；および第５，８３７，４５８号明細書に記述されている。本願明細書で用いる場合、「変異（"ｍｕｔａｔｉｏｎ"）」または「改変（"ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ"）」は、自然状態または通常のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較した場合の、遺伝子のヌクレオチドまたはアミノ酸配列中の変化に言及するものである。変異は、少なくとも１つのヌクレオチドまたはアミノ酸の欠失、挿入、または置換の結果である。好ましい実施形態では、変異は置換（すなわち、少なくとも１つのヌクレオチドまたはアミノ酸と、他のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の交換）である。
【００５６】
本願明細書で用いる場合、「ドメイン」という用語は、タンパク質またはポリペプチドの機能的な部分、区画、または領域を意味する。「相互作用ドメイン」は特に、タンパク質、タンパク質断片、または単離したドメインと、他のタンパク質、タンパク質断片、または単離したドメインとの物理的結合に関与する、タンパク質、ポリペプチド、またはタンパク質断片の部分、区画、領域に言及するものである。相互作用ドメインは、タンパク質の１次配列中の連続したアミノ酸残基であることが可能であり、または１次配列中では互いに近い位置になくとも、ポリペプチド鎖の３次構造では接近するポリペプチド鎖の部分のアミノ酸残基から成ることができる。
【００５７】
本願明細書で用いる場合、「複数のクローニング部位」または「ポリリンカー」という用語は、核酸断片をベクターなどの他の核酸中へクローニングする目的のための少なくとも１つの制限部位を含む、人工的に作製した核酸配列に言及するものである。
【００５８】
ＩＩ．改変ＳＵＭＯタンパク質
本発明は、ＳＵＭＯプロテアーゼ（例えば、Ｕｌｐ１）によって切断不可能なＳＵＭＯタンパク質を包含する。ＳＵＭＯは、あらゆる真核生物種からのもの、またはあらゆるＳＵＭＯ分子の変異型であることが可能である。特定の実施形態では、ＳＵＭＯは酵母またはヒトのものである。酵母とは異なり、脊椎動物では現在までに４種類のＳＵＭＯが記述されている：ＳＵＭＯ−１、および近縁のホモログであるＳＵＭＯ−２、ＳＵＭＯ−３、およびＳＵＭＯ−４である。それら脊椎動物の全てのＳＵＭＯタンパク質は、本発明に包含される。ＳＵＭＯタンパク質の例は、図１１Ａ〜１１Ｃに提供する。ヒトＳＵＭＯタンパク質をコードする核酸配列の例は、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＭ＿００３３５２．４（ＳＵＭＯ１）、ＮＭ＿００１００５７８１．１（ＳＵＭＯ１）、ＮＭ＿００１００５７８２．１（ＳＵＭＯ１）、ＮＭ＿００６９３７．３（ＳＵＭＯ２）、ＮＭ＿００１００５８４９．１（ＳＵＭＯ２）、ＮＭ＿００６９３６．２（ＳＵＭＯ３）、およびＮＭ＿００１００２２５５．１（ＳＵＭＯ４）にもまた提供されている。
【００５９】
特定の実施形態では、本発明の改変ＳＵＭＯタンパク質は、同一条件下（例えば、標準的インビトロ切断アッセイまたは真核細胞中での発現）で野生型ＳＵＭＯの少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％、およびさらにより好ましくは１００％を切断するＳＵＭＯプロテアーゼによって、本発明の改変ＳＵＭＯタンパク質は１０％以下だけ切断される。より好ましい実施形態では、改変ＳＵＭＯは５％以下、好ましくは１％以下、より好ましくは０．１％以下、およびさらにより好ましくは０％または検出レベル以下だけ切断される。以下に議論するように、改変ＳＵＭＯタンパク質は、改変ＳＵＭＯプロテアーゼによって切断することができる。
【００６０】
改変ＳＵＭＯタンパク質は、ＳＵＭＯプロテアーゼと接触または相互作用する少なくとも１残基の改変または変化によって作製することができる。前記残基は、他の２０種の天然アミノ酸のいずれか、または合成または変更アミノ酸（例えば、表４の§２４２２のＭＰＥＰを参照）へ変化させることができる。変化は控えめ（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）または控えめでなく（ｎｏｎ−ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）することができる。控えめな変化は、アミノ酸と、それに類似した特性のもう１つのアミノ酸との置換である。例えば、ＡｓｐおよびＧｌｕは共に酸性アミノ酸であり；Ｌｙｓ，Ａｒｇ，およびＨｉｓは塩基性アミノ酸；Ａｓｎ，Ｇｌｎ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，およびＴｙｒは非荷電極性側鎖を有する；Ａｌａ，Ｇｌｙ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｐｒｏ，Ｐｈｅ，Ｍｅｔ，Ｔｒｐ，およびＣｙｓは非極性側鎖を有する；Ａｌａ，Ｇｌｙ，およびＬｅｕは小さなアミノ酸である；Ｐｈｅ，Ｔｙｒ，およびＴｒｐは大きな芳香族側鎖を有する；およびＰｈｅ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐ，Ｖａｌ，Ｉｌｅ，およびＴｈｒは大きな非荷電側鎖を有する。従って、ＡｓｐとＧｌｕの置換は控えめな変化と考えることができるが、しかしＡｓｐとＨｉｓの置換は控えめな変化とはならないであろう。
【００６１】
特定の実施形態では、ＳＵＭＯプロテアーゼと相互作用する領域中で変異を作製する。図１１に見られる通り、ＳＵＭＯプロテアーゼと相互作用するＳＵＭＯの領域は、おおよそ残基５３〜残基７２の範囲内である。例えば、酵母ＳＵＭＯ（Ｓｍｔ３）の場合、前記領域はおおよそ残基６３〜７２の領域である。特定の実施形態では、少なくとも１つのアルギニン残基、および好ましくは両方（もし存在するならば、それ以上）のアルギニン残基を改変する（例えば、Ｓｍｔ３では、ＳＵＭＯプロテアーゼ相互作用ドメイン中のアルギニン残基は位置６４および７１である）。好ましい実施形態では、アルギニン残基は非塩基性アミノ酸へ改変する。特定の実施形態では、位置６４のアルギニンをスレオニンに、位置７１のアルギニンをグルタミン酸に変化させる。このコンストラクトはＳＵＭＯ＊であり、以下のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：１）を有する。
【００６２】
【化１】
0005469786.tif 000002
【００６３】
他の一実施形態では、本発明の改変ＳＵＭＯは、配列ＩＤ番号：１との相同性を少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％、特に少なくとも９０％または９５％の相同性を有する。特定の実施形態では、位置６４および７１の両方の残基はアルギニンではない。
【００６４】
さらに他の一実施形態では、本発明の改変ＳＵＭＯは、以下の配列（ＳＵＭＯプロテアーゼ相互作用ドメイン）：
Ｘ１ＦＸ２Ｘ３Ｘ４ＧＸ５Ｘ６（配列ＩＤ番号：２）
を含むように改変したＳＵＭＯタンパク質（例えば、酵母ＳＵＭＯ（Ｓｍｔ３）またはヒトＳＵＭＯ１）であり、ここで、Ｘ１およびＸ６はアルギニン以外のあらゆるアミノ酸であり、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ５はあらゆるアミノ酸および野生型（すなわち変異なし）とすることができる。特定の実施形態では、Ｘ１およびＸ６は非塩基性アミノ酸である。好ましい実施形態では、Ｘ２はＬまたはＲ；Ｘ３はＦ，Ｗ，またはＹ、Ｘ４はＤまたはＥ；およびＸ５はＩ，Ｑ、またはＲである。特定の実施形態では、Ｘ１はグルタミン、スレオニン、およびフェニルアラニンから成る群から選択したもの、および／またはＸ６は位置７１におけるロイシンおよびグルタミン酸から成る群から選択したものである。
【００６５】
他の一実施形態では、本発明の改変ＳＵＭＯは、以下の配列（ＳＵＭＯプロテアーゼ相互作用ドメイン）
Ｘ１ＦＸ２Ｆ（配列ＩＤ番号：６５）
を含むように改変したＳＵＭＯタンパク質（例えば、ヒトＳＵＭＯ２、ＳＵＭＯ３、およびＳＵＭＯ４）であり、ここで、Ｘ１およびＸ２はアルギニン以外のあらゆるアミノ酸である。特定の実施形態では、Ｘ１およびＸ２は非塩基性のあらゆるアミノ酸である。特定の実施形態では、Ｘ１は非荷電側鎖を有するアミノ酸、特にスレオニンであり、Ｘ２は酸性アミノ酸、特にグルタミン酸である。
【００６６】
好ましくは、改変ＳＵＭＯタンパク質は、野生型ＳＵＭＯの少なくとも１つの特性を保持する。例えば、改変ＳＵＭＯは、野生型ＳＵＭＯと同様またはそれ以上に、目的の融合タンパク質の発現を増加させる。改変ＳＵＭＯは、目的タンパク質の分泌および／または溶解性もまた増加させる、および／または目的の融合タンパク質の細胞局在を変化させる。
【００６７】
切断不可能なＳＵＭＯタンパク質をコードする核酸分子もまた、本発明に包含される。本発明の改変ＳＵＭＯをコードする核酸分子は、当該技術分野で既知のあらゆる方法で調製することができる。前記核酸分子は、あらゆる便利なベクター、特に発現ベクター中に維持することができる。発現させる細胞に基づいて、前記核酸配列の発現を誘導するためには、異なるプロモーターを利用することができる。形質転換細胞の選択を可能にするために、それらベクター中には抗生物質耐性マーカーもまた含まれる。本発明の改変ＳＵＭＯをコードする核酸分子は、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらの断片を含み、それらは１または２本鎖とすることができる。本発明は、改変ＳＵＭＯタンパク質をコードする核酸分子、好ましくは、野生型ＳＵＭＯと比較して変異型ＳＵＭＯに優先的または排他的にハイブリダイズするために野生型配列から変異した領域、に作用するまたはハイブリダイズする、プライマー、オリゴヌクレオチド、プローブ、アンチセンス分子、およびｓｉＲＮＡ分子もまた包含する。
【００６８】
本発明は、改変ＳＵＭＯタンパク質に対して免疫特異的な結合が可能な抗体もまた包含する。改変ＳＵＭＯに作用するポリクローナルおよびモノクローナル抗体は、標準的な方法に従って調製することができる。好ましい実施形態では、前記抗体は、野生型ＳＵＭＯと比較して切断不可能な変異ＳＵＭＯの変異領域に免疫特異的に作用する。切断不可能な変異ＳＵＭＯタンパク質と免疫特異的に相互作用するポリクローナルおよびモノクローナル抗体は、そういったタンパク質の同定および精製に利用可能である。前記抗体は野生型ＳＵＭＯを排除して改変ＳＵＭＯに対して免疫特異的とすることができ、または両方に対して免疫交差反応することもできる。
【００６９】
本発明の改変ＳＵＭＯタンパク質は、翻訳後修飾することもまたできる。改変ＳＵＭＯタンパク質は細胞中またはインビトロで翻訳後修飾することができる。アミノ酸の翻訳後修飾（ｐｏｓｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：ＰＴＭ）は、タンパク質の構造、活性、機能、および安定性を変化させることが可能である。ＰＴＭｓは、限定するわけではないが、タンパク質のアミノ酸への酢酸塩、リン酸塩、脂質、および炭水化物といった生化学的官能基の付加を含む。タンパク質がどのように翻訳後修飾されるかは、前記タンパク質のアミノ酸配列の改変によって変化させることが可能である。例えば、タンパク質のアミノ酸配列を、Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒのいずれかの配列を含むように変化させることで、アスパラギンをグリコシル化させることができる。
【００７０】
ＰＴＭｓは、限定するわけではないが、アセチル化（通常はタンパク質のＮ−末端への、アセチル基の付加）、アルキル化（アルキル基（例えば、メチル、エチル）の付加）、メチル化（メチル基、通常はリシンまたはアルギニン残基の付加）、ビオチン化（ビオチン付加物を有する保存されたリシン残基のアシル化）、グルタミル化（チューブリンまたは他のタンパク質へのグルタミン酸残基の共有結合）、グリシル化（チューブリンＣ−末端部への少なくとも１つのグリシン残基の共有結合）、グリコシル化（アスパラギン、ヒドロキシリジン、セリン、またはスレオニンへのグリコシル基の付加であり、糖タンパク質を生成する結果となる）、イソプレニル化（イソプレノイド基（例えば、ファルネソールおよびゲラニルゲラニオール）の付加）、脂質化（脂質の付加）、リポイル化（リポ酸塩官能性の結合）、ホスホパンテテイニル化（脂肪酸、ポリケチド、非リボソームペプチド、およびロイシンの生合成中でのコエンザイムＡからの４’−ホスホパンテテイニル部分の付加）、リン酸化（通常はセリン、チロシン、スレオニン、またはヒスチジンへのリン酸基の付加）、硫酸化（チロシンへの硫酸基の付加）、セレン化、およびＣ−末端のアミド化を含む。翻訳後修飾は当業者にとって周知である（例えば、Ｃｅｒｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｗｏｌｄ，Ｆ．，Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．１９８３；Ｓｅｉｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，"Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｆａｃｔｏｒｓ"（１９９０）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｙｍｏｌ．，１８２：６２６〜６４６；および  Ｒａｔｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ａｇｉｎｇ"（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６６３：４８〜６２）。
【００７１】
本発明の改変ＳＵＭＯタンパク質は、少なくとも１つのアフィニティー・タグを、好ましくはアミノ末端に含むことができる。特定の実施形態では、アフィニティー・タグはヘム結合ペプチドである。完全長のシトクロムＣ（ＣＹＣ７、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＡＡＡ３４９４０）は、一旦、ヘム補因子が接着するとペルオキシダーゼ活性を有する（Ｓａｎｄｅｒ  Ｃ．  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃ−ｔｙｐｅ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｓ．Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｅｓ．２００１．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｏｓｎａｂｒｕｅｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。ＣＹＣ７などのシトクロムＣのヘム結合モチーフを含むペプチドは、本発明の改変ＳＵＭＯタンパク質またはあらゆる目的タンパク質に対するアフィニティー・タグとして利用可能である。一例となるヘム結合ペプチドは、ヘム結合モチーフＣＱＱＣＨ（配列ＩＤ番号：６３）を含む。ヘム結合ペプチドの具体的な例は、ＧＳＡＫＫＧＡＴＬＦＫＴＲＣＱＱＣＨ（配列ＩＤ番号：６４）である。ヘム結合ペプチドの長さは、約５〜約５０アミノ酸、好ましくは約５〜約２５アミノ酸、より好ましくは約５〜約２０アミノ酸、およびさらに好ましくは約５〜約１５アミノ酸とすることが可能である。ヘム結合ペプチドはペルオキシダーゼ活性を有する。特に、前記ペプチドを変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析およびメンブレンへのブロッティングに供しても、この活性は失われない。従って、前記アフィニティー・タグはペルオキシダーゼの基質の利用のみによって、抗体なしでの検出を可能にする。さらに、ヘム結合ペプチドは、共有結合した目的タンパク質を赤色にし、容易な検出および精製中の追跡を可能にする。ヘム結合ペプチドはシトクロム・リアーゼに対して非常に強い結合力を有する（例えば、ＣＹＣ３、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＡＡＣ０４９９２．１）。ＣＹＣ３は、固体表面に固定して、ヘム結合ペプチドを含むタンパク質の精製のためのアフィニティー樹脂として利用可能であろう。
【００７２】
ＩＩＩ．改変ＳＵＭＯプロテアーゼ
本発明は、野生型ＳＵＭＯプロテアーゼでは切断できない改変ＳＵＭＯを切断可能な改変ＳＵＭＯプロテアーゼもまた包含する。ＳＵＭＯプロテアーゼは、あらゆる真核生物種由来とすることが可能である。特定の実施形態では、切断しようとする改変ＳＵＭＯと同じ生物種由来のものとする。ＳＵＭＯプロテアーゼの例は、ＵＬＰ１およびＳＥＮＰ１〜５を含み、特定のアミノ酸配列を図１２Ａ〜１２Ｂに提供する。
【００７３】
特定の実施形態では、本発明の改変ＳＵＭＯプロテアーゼは、改変ＳＵＭＯの少なくとも５０％、好ましくは７５％、９０％、または９５％、より好ましくは少なくとも９９％、およびさらにより好ましくは１００％を切断可能である。
【００７４】
改変ＳＵＭＯプロテアーゼは、野生型ＳＵＭＯまたは改変ＳＵＭＯと接触または相互作用する少なくとも１残基の改変または変化によって生成することができる。前記残基は他の２０種類の天然アミノ酸のいずれか、または合成または修飾アミノ酸へ変化させることができる。前記変化は、控えめ（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）または控えめでなく（ｎｏｎ−ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）することができる。
【００７５】
特定の実施形態では、ＳＵＭＯプロテアーゼのＳＵＭＯ相互作用ドメイン中に改変を作製する（例えば、図１２を参照）。例えば、酵母ＵＬＰ１のＳＵＭＯ相互作用ドメインは、おおよそ残基４４６〜４６０、より好ましくは４５１〜４５５に対応する。特定の実施形態では、残基４５１、４５２，および４５５のうち少なくとも１つを改変する。好ましくは、少なくとも残基４５１および４５５を改変し、より好ましくは３つ全てのアミノ酸を改変する。特に、位置４５１のアスパラギン酸をセリンに変化させ、位置４５２のスレオニン残基をグリシンに変化させ、位置４５５のグルタミン酸残基をセリンに変化させる。このコンストラクトは以下のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：３）を有する。
【００７６】
【化２】
0005469786.tif 000003
【００７７】
特定の実施形態では、ＳＵＭＯプロテアーゼは、アミノ末端またはアミノ末端中の欠失を有することができる（例えば、残基４０２まで、および残基４０２を含む）。切断型ＳＵＭＯプロテアーゼのアミノ酸配列の１例は以下である（配列ＩＤ番号：４）。
【００７８】
【化３】
0005469786.tif 000004
【００７９】
ＳＵＭＯ＊プロテアーゼ１は６×ヒスチジンを有する切断型ＳＵＭＯプロテアーゼであり、以下のアミノ酸配列を有する（配列ＩＤ番号：５）。
【００８０】
【化４】
0005469786.tif 000005
【００８１】
他の一実施形態では、本発明の改変ＳＵＭＯプロテアーゼは配列ＩＤ番号：３，４，または５との相同性を少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％、特に少なくとも９０％または９５％有する。特定の実施形態では、位置４５１の残基はアスパラギン酸ではなく、より好ましくは酸性アミノ酸ではなく、位置４５５の残基はグルタミン酸ではなく、より好ましくは酸性アミノ酸ではなく、さらに選択的に、位置４５２の残基はスレオニンではない。
【００８２】
さらに他の一実施形態では、本発明の改変ＳＵＭＯプロテアーゼは配列：
ＷＬＮＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５（配列ＩＤ番号：６）
を含むよう改変したＳＵＭＯプロテアーゼであり、ここで、Ｘ１およびＸ５は非酸性のあらゆるアミノ酸であり、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４はあらゆるアミノ酸であって、野生型（すなわち変異なし）とすることもできる。特定の実施形態では、Ｘ１は非荷電極性側鎖アミノ酸、非極性側鎖アミノ酸、または小さなアミノ酸である。Ｘ５は非荷電極性側鎖アミノ酸、非極性側鎖アミノ酸、または小さなアミノ酸とすることができる。他の一実施形態では、Ｘ３はＩまたはＶ、Ｘ４はＩまたはＴである。特定の実施形態では、Ｘ１はセリンであり、Ｘ２はグリシンおよびスレオニンから成る群から選択されるものであり、および／またはＸ５はセリン、アラニン、およびメチオニンから成る群から選択されるものである。
【００８３】
改変ＳＵＭＯプロテアーゼをコードする核酸配列もまた、本発明に包含される。本発明の改変ＳＵＭＯプロテアーゼをコードする核酸分子は、当該技術分野で既知のあらゆる方法で調製することができる。前記核酸分子はあらゆる便利なベクター、特に発現ベクター中に維持することができる。発現させる細胞に基づいて、前記核酸配列の発現を誘導するためには、異なるプロモーターを利用することができる。形質転換細胞の選択を可能にするために、それらベクター中には抗生物質耐性マーカーもまた含まれる。本発明の改変ＳＵＭＯプロテアーゼをコードする核酸分子は、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらの断片を含み、それらは１または２本鎖とすることができる。本発明は、改変ＳＵＭＯプロテアーゼをコードする核酸分子、好ましくは、野生型ＳＵＭＯプロテアーゼと比較して改変ＳＵＭＯプロテアーゼに優先的または排他的にハイブリダイズするために野生型配列から変異した領域に作用するまたはハイブリダイズする、プライマー、オリゴヌクレオチド、プローブ、アンチセンス分子、およびｓｉＲＮＡ分子もまた包含する。
【００８４】
本発明は、改変ＳＵＭＯプロテアーゼに対して免疫特異的な結合が可能な抗体もまた包含する。改変ＳＵＭＯプロテアーゼに作用するポリクローナルおよびモノクローナル抗体は、標準的な方法に従って調製することができる。好ましい実施形態では、前記抗体は、野生型ＳＵＭＯプロテアーゼと比較して改変ＳＵＭＯプロテアーゼの変異した領域に免疫特異的に作用する。改変ＳＵＭＯプロテアーゼと免疫特異的に相互作用するポリクローナルおよびモノクローナル抗体は、そういったタンパク質の同定および精製に利用可能である。前記抗体は野生型ＳＵＭＯプロテアーゼを排除して改変ＳＵＭＯプロテアーゼに対して免疫特異的とすることができ、または両方に対して免疫交差反応することもできる。
【００８５】
本発明の改変ＳＵＭＯプロテアーゼは、上述した通りに翻訳後修飾することもまたできる。改変ＳＵＭＯプロテアーゼは細胞中またはインビトロで翻訳後修飾することができる。
【００８６】
本発明の改変ＳＵＭＯプロテアーゼは、少なくとも１つのアフィニティー・タグを、好ましくはアミノ末端に含むことができる。特定の実施形態では、前記アフィニティー・タグは上述のヘム結合ペプチドである。
【００８７】
ＩＶ．利用方法
本発明の融合タンパク質技術は、タンパク質およびペプチドの生産および精製においていくつもの適用を有している。限定するわけではないが、この技術を用いる方法の例は：
（１）タンパク質およびペプチド（目的タンパク質）、特に発現の少ないものを、改変ＳＵＭＯタンパク質のＣ−末端への融合によって発現増強する。前記ＳＵＭＯ−融合タンパク質の構造は、原核生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ；図２参照）または真核生物（酵母および昆虫細胞；図３参照）中のいずれにおける発現中にも、改変ＳＵＭＯプロテアーゼもまた細胞中へ導入しない限り、切断されることはない。目的タンパク質の例は、限定するわけではないが、多量体タンパク質、サイトカイン、ワクチン、酵素、成長因子、受容体、インターフェロン、増血剤、アルブミン、インスリン、およびホルモンを含む。
【００８８】
（２）改変ＳＵＭＯタンパク質は、アフィニティー・タグと融合することが可能である。好ましくは、アフィニティー・タグは改変ＳＵＭＯのアミノ−末端に設置して、目的タンパク質は改変ＳＵＭＯタンパク質のカルボキシ−末端に付加する。アフィニティー・タグは融合タンパク質の精製を可能にし、本発明の改変ＳＵＭＯプロテアーゼによる改変ＳＵＭＯの切断によって目的タンパク質を得ることが可能である。
【００８９】
（３）改変ＳＵＭＯは、アフィニティー・タグがなくとも、目的タンパク質の精製に利用可能である。改変ＳＵＭＯは目的タンパク質のＮ−末端に結合可能である。融合タンパク質は発現させた後、免疫特異的抗体など改変ＳＵＭＯに特異的に結合する試薬によって精製可能である。次に、本発明の改変ＳＵＭＯプロテアーゼによって前記融合タンパク質から目的タンパク質を切断できる。
【００９０】
（４）改変ＳＵＭＯプロテアーゼは、改変ＳＵＭＯを含む融合タンパク質のインビトロでの切断に利用できる。例えば、ＳＵＭＯまたは存在するならばアフィニティー・タグとの相互作用を介して固体支持体に融合タンパク質が結合している場合、溶液中で切断を生じさせることができる。
【００９１】
（５）免疫特異的抗体など改変ＳＵＭＯおよび／またはＳＵＭＯプロテアーゼに特異的に結合する試薬を含む固体支持体と反応混合液との接触によって、融合タンパク質とおそらくアフィニティー・タグもまた含むであろう改変ＳＵＭＯ切断後の混合液から、改変ＳＵＭＯおよびＳＵＭＯプロテアーゼを除去可能である。
【００９２】
（６）アフィニティー・リガンドを含む固体支持体と反応混合液との接触によって、切断後の混合液からアフィニティー・タグ付加改変ＳＵＭＯおよびアフィニティー・タグ付加改変ＳＭＯプロテアーゼを除去可能である（例えば、ヘキサヒスチジン・タグ付加改変ＳＵＭＯまたはＳＵＭＯプロテアーゼは、金属キレートアフィニティークロマトグラフィーを用いて除去可能である）。
【００９３】
（７）本発明は、アミノ末端にあらゆるアミノ酸を有する目的タンパク質の生成を可能にする。例えば、改変ＳＵＭＯのカルボキシ−末端に目的タンパク質を結合した融合タンパク質を生成可能である。所望のアミノ酸をコードするように、または変異コドンによってコードされる１つ以上のアミノ酸を包含するライブラリーを構築するように、部位特異的変異によって目的タンパク質のアミノ−末端残基をコードするコドンを変化させることが可能である。変異は改変ＳＵＭＯとの結合前または後に起こすことが可能である。そして、選択的にアフィニティー・タグを含む融合タンパク質の発現後に、改変アミノ−末端を有する目的タンパク質を解放する目的で、融合タンパク質から改変ＳＵＭＯを切断するために、ＳＵＭＯプロテアーゼをインビボまたはインビトロで用いることができる。
（８）ペプチドライブラリーを構築するために、改変ＳＵＭＯを含む融合タンパク質を原核および／または真核細胞中で発現可能である。
（９）ペプチドライブラリーを構築するために、目的タンパク質、および選択的にアフィニティー・タグへ結合した改変ＳＵＭＯを含む融合タンパク質を、原核および／または真核細胞中で発現することができる。発現させたタンパク質ライブラリーを次に、改変ＳＵＭＯまたはアフィニティー・タグを介して精製可能である。選択的に、切断したタグからのライブラリーの単離によって、純粋なタンパク質またはペプチドのライブラリーを構築するために、改変ＳＵＭＯプロテアーゼによって、改変ＳＵＭＯ、およびもし存在するならばアフィニティー・タグを融合タンパク質から切断することができる。
【００９４】
（１０）改変ＳＵＭＯおよび、選択的に、アフィニティー・タグを含む融合タンパク質のｃＤＮＡライブラリーを構築することができる。それらｃＤＮＡライブラリーは、あらゆる宿主中で融合タンパク質の発現に用いることができる。
【００９５】
（１１）改変ＳＵＭＯおよび、選択的に、アフィニティー・タグを含む、発現した融合タンパク質は、固体支持体上に固定することもまたできる。特定の実施形態では、融合タンパク質は目的タンパク質のライブラリーを含み、固体支持体上のアレイ中に配置する。融合タンパク質は、ＳＵＭＯタグまたはアフィニティー・タグを介して固体支持体に固定することができる。例えば、作製したアレイは、固定した目的タンパク質とのタンパク質相互作用の検出および／または定量化に利用できる。
【００９６】
Ｖ．キット
本発明は、目的タンパク質の発現増強、分泌、精製、局在化、およびアミノ末端の改変の効率化に用いるキットもまた包含する。そのようなキットは、所望の宿主細胞中での発現に適したプロモーターへ作用するように結合した改変ＳＵＭＯをコードする核酸配列、および改変ＳＵＭＯをコードする核酸配列に対してインフレームで目的タンパク質をコードする核酸配列をクローニングするのに適した複数のクローニング部位を含む、少なくとも１つの組換えベクターを含む。前記プロモーターは好ましくは強いプロモーターであり、恒常的または調節性とすることができる。そのようなプロモーターは当該技術分野で周知のものであり、限定するわけではないが、ＣＭＶ，ＲＳＶ，ＳＶ４０，ＡＤＨ１，Ｔ７，およびＣＵＰ１プロモーターを含む。
【００９７】
組換えベクターは、改変ＳＵＭＯをコードする配列に対してインフレームで、少なくとも１つのアフィニティー・タグをコードする核酸配列もまた含む。好ましくは、アフィニティー・タグをコードした核酸配列は、改変ＳＵＭＯをコードする配列の５’末端に、作用するように結合する。限定するわけではないが、少なくとも１つの固体支持体（例えば、少なくとも１つのアフィニティー・タグを結合可能なもの）、溶解緩衝液、洗浄緩衝液、および溶出緩衝液を含む試薬もまた、発現した融合タンパク質の精製を助けるために、キットに含まれる。
【００９８】
キットは、さらに、改変ＳＵＭＯの切断のための少なくとも１つの改変ＳＵＭＯプロテアーゼを含むことができる。改変ＳＵＭＯプロテアーゼは、改変ＳＵＭＯをコードする核酸配列（例えば、発現ベクター）および／または溶液中で発現したタンパク質として提供することができる。改変ＳＵＭＯプロテアーゼは選択的に、改変ＳＵＭＯに結合しているアフィニティー・タグと同一または異なるアフィニティー・タグを有する。キットは、さらに、少なくとも１つの切断緩衝液、宿主細胞の凍結ストック、および／または説明資料もまた含むことができる。
【００９９】
キットは、さらに、野生型タンパク質本来のものとは異なるアミノ末端を生成するために、目的タンパク質をコードする核酸配列を改変する試薬もまた含むことができる。核酸を変異させる方法は当該技術分野で周知であり、限定するわけではないが、部位特異的変異、およびオリゴヌクレオチドベースの部位特異的変異を含む（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，２００６，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照）。試薬の例としては、限定するわけではないが、ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＲバッファー、およびｄＮＴＰｓ溶液を含む。
【０１００】
以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を説明するために提供するものである。実施例は説明のためのものであり、いかなる意味においても本発明を限定するよう意図したものではない。
【実施例１】
【０１０１】
材料および方法
ＳＭＴ３−ＧＴＰおよびＵＬＰ１プロテアーゼを同一のＥ．ｃｏｌｉ細胞中で共発現させるために、プライマー２３（５’−ＧＧＣＧＣＴＣＧＡＧＴＣＣＣＧＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡ−３’；配列ＩＤ番号：７）およびプライマー４６（５’−ＣＧＣＡＡＡＧＣＴＴＧＡＧＣＴＣＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＣＧＡ−３’：配列ＩＤ番号：８）を用いて、ｐＥＴ２４ｄ−Ｓｍｔ３−ＧＦＰベクター（Ｍａｌａｋｈｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，５：７５〜８６）からＴ７−ＳＭＴ３−ＧＦＰカセットを増幅し、ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化して、ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＡＣＹＣ１７７ベクター（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｘ０６４０２）へ挿入した。この操作でｐＡＣＹＣ１７７中のＫａｎ耐性遺伝子をＳＭＴ３−ＧＦＰ発現カセットで置換した結果がｐＡＣＹＣ−ＳＭＴ３−ＧＦＰベクターである。ｐＡＣＹＣ−ＳＭＴ３−ＧＦＰで、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞を形質転換した。ｐＡＣＹＣ−ＳＭＴ３−ＧＦＰを保有する細胞を、アンピシリン含有培地上で増殖し、標準的なＣａＣｌ２法を用いてコンピテントにした。それらコンピテント細胞を、以前に記述された（Ｍａｌａｋｈｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，５：７５〜８６）誘導性Ｔ７プロモーター下にＵＬＰ１プロテアーゼを保有するもう１つの他のベクターｐＥＴ２４−ＵＬＰ１で形質転換した。形質転換細胞は、アンピシリンおよびカナマイシンを含むＬＢ培地上で選択した。細胞中でＵＬＰ１プロテアーゼと共発現したＳＭＴ３−ＧＦＰ融合タンパク質は、ＩＰＴＧで誘導した場合にＳＭＴ３（２０ｋＤ）およびＧＦＰ（２８ｋＤ）へとプロセシングされる。ＵＬＰ１を共発現していない細胞は、サイズ４８ｋＤの全長のＳＭＴ３−ＧＦＰ融合タンパク質を生産した。
【０１０２】
位置Ｒ６４およびＲ７１をランダム化するために、ｐＡＣＹＣ−ＳＭＴ３−ＧＦＰを鋳型として用いて、２つのオーバーラップしたＰＣＲ産物を生産した。１番目のＰＣＲはプライマー２３および８０（５’−ＡＡＴＡＣＣＧＴＣＧＴＡＣＡＡＧＡＡＮＮＮＴＡＡＧＧＡＧＴＣＣＡ−３’；配列ＩＤ番号：９）、２番目はプライマー７９（５’−ＴＣＴＴＧＴＡＣＧＡＣＧＧＴＡＴＴＮＮＮＡＴＴＣＡＡＧＣＴＧＡＴＣＡＧＡ−３’；配列ＩＤ番号：１０）および４６で行った。２つのＰＣＲ断片はゲルで分離し、混合して、プライマー２３および４６による２番目のＰＣＲの鋳型として用いた。結果として得られた変異型ＳＵＭＯ−ＧＦＰ断片のライブラリーを、ＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＡＣＹＣ１７７ベクター中へクローニングした。ライゲーション混合物を、ｐＥＴ２４−ＵＬＰ１プラスミドを保持するＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞へ導入した。
【０１０３】
改変ＳＵＭＯの選択のために、形質転換したコロニーをアンピシリンおよびカナマイシンを含むＬＢ培地中でＯＤ−０．５まで増殖させて、１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導した。誘導は２０℃で１２時間継続した。集菌後に細胞を凍結して−８０℃で保存した。１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１ユニット／ｍｌリゾチームを含むｐＨ−８．０の１０ｍＭ  ＴＲＩＳ緩衝液中へペレットを再懸濁した。室温で１０分間のインキュベーション後、最終濃度１０ｍＭのＭｇＣｌ２および１０ユニット／ｍｌの濃度のＤＮａｓｅＩを添加した。１０分間のインキュベーション後、１μｌの染色液をサンプルへ添加して、それらをドデシル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ−ｓｕｌｐｈａｔｅ：ＳＤＳ）を含まない１２％ポリアクリルアミドゲル上へロードした。ゲル泳動は１５Ｖ／ｃｍで１時間行い、３６５ｎＭのＵＶボックスで可視化した。
【０１０４】
図７に示すベータ−ラクタマーゼのコンストラクトは以下の方法で作製した。ベータ−ラクタマーゼ遺伝子は、オリゴ対６５（５’−ＣＧＣＧＡＣＡＴＡＴＧＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＴＡＣＴＡＧＣＴＣＴＴＧＣＴＧＴＧＧＣＴＣＴＣＧＣＡＧＴ−３’；配列ＩＤ番号：１１）／６１（５’−ＣＧＣＧＡＧＧＴＣＴＣＡＡＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＴＴＣＧＣＧＧＴＧＡＧＣＣＴ−３’；配列ＩＤ番号：１２）および６６（５’−ｃｇｃｇｃａｇｇｔｃｔｃｔａｇｇｔａｇｇｇｔｇｃｔｔｇｔａｃｔａｇｃｔｃｔｔｇｃｔｇｔｇｇｃｔｃｔｃｇｃａｇｔ−３’；配列ＩＤ番号：１３）／６１または６７（５’−ＣＧＣＧＣＡＧＧＴＣＴＣＴＡＧＧＴＣＣＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＴＡＣＴＡＧＣＴＣＴＴＧＣＴＧＴＧＧＣＴＣＴＣＧＣＡＧＴ−３’；配列ＩＤ番号：１４）／６１による２回の連続したＰＣＲ反応でプロリンから開始するベータ−ラクタマーゼを増幅した。結果として得られたベータ−ラクタマーゼは、ベータ−ラクタマーゼのオープン・リーディング・フレーム（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ：ＯＲＦ）に融合した１５アミノ酸の分泌シグナルを有する。変異ＳＵＭＯは、オリゴ２６（５’−ＴＧＴＡＣＡＧＡＧＣＴＣＡＣＧＣＧＴＧＣＡＴＧＣＴＣＧＧＡＣＴＣＡＧＡＡＧＴＣＡＡＴＣＡ−３’；配列ＩＤ番号：１５）および６１で増幅した。結果として得られたＳＵＭＯおよびベータ−ラクタマーゼのＰＣＲ産物をＥｃｏ３１Ｉ制限エンドヌクレアーゼで消化して再結合した。ライゲーション産物は、オリゴ２６および５９（５’−ＣＧＣＧＡＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＣＡＡＴＧＣＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＡＧＧＣＡ−３’；配列ＩＤ番号：１６）によるＰＣＲ反応の鋳型として用いて、融合産物（変異ＳＵＭＯ）−（分泌シグナル）−（ベータ−ラクタマーゼ）を生産した。不溶性タンパク質ＭＭＰ１３を変異ＳＵＭＯのＮ−末端に付加するために、オリゴ６０（５’−ＧＧＣＧＡＡＧＣＴＴＴＣＣＣＧＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡ−３’；配列ＩＤ番号：１７）および３５（５’−ＣＧＣＡＧＣＡＴＧＣＧＧＧＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＣＣＴＧＧＡＣＣＡ−３’；配列ＩＤ番号：１８）によって、発現カセット中のＭＭＰ１３のＯＲＦをＴ７プロモーターと共にｐ２４ｄ−ＭＭＰ１３ベクターから増幅した。結果として得られた産物Ｔ７−ＭＭＰ１３をＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｈＩで消化して３つの断片を、ＳｐｈＩ−ＳａｌＩ消化（変異ＳＵＭＯ）−（分泌シグナル）−ベータ−ラクタマーゼ）と共に結合してＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ消化したｐＡＣＹＣ１８４中へクローニングした。この結果、ｐＡＣＹＣ−ｍｕｔＳＵＭＯ−Ｌａｃプラスミドが得られた。
【０１０５】
アラビノース誘導プロモーターＰ−ＢＡＤ下のＵＬＰ１発現ベクターを作製するために、Ｔ７プロモーターを伴うＬａｃ１遺伝子をｐＥＴ２４ｄ−ＵＬＰ１中でＡｒａＣ遺伝子およびＰ−ＢＡＤプロモーターと置換した。具体的には、ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ／Ａベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＮｃｏＩおよびＡｃｃＩで消化して、ａｒａＣ遺伝子およびＰ−ＢＡＤプロモーターを保持する断片をゲルで分離した。この断片をＮｃｏＩ−ＡｃｃＩで消化したｐＥＴ２４ｄ−ＵＬＰ１に結合して、ｐＡＲＡ−６Ｈｉｓ−ＵＬＰプラスミドを生産した。
【０１０６】
ＵＬＰ１を変異させるために、その遺伝子の５’末端をオリゴ８８（５’−ＧＧＡＡＴＴＡＡＣＣＡＴＧＧＧＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＧＧＡＧＧＴ−３’；配列ＩＤ番号：１９）および９１（５’−ＴＴＡＧＣＣＡＴＣＴＴＣＧＴＧＧＴＧＣＣＡＡＧＧＴＣＴ−３’；配列ＩＤ番号：２０）で増幅し、ここで３’部分は変異を導入するためにオリゴ１９１（５’−ＡＡＧＡＣＣＴＴＧＧＣＡＣＣＡＣＧＡＡＧＡＴＧＧＣＴＡＡＡＧＮＮＮＮＮＮＡＴＣＡＴＴＮＮＮＴＴＴＴＴＴＡＴＧＡ−３’；配列ＩＤ番号：２１）および８９（５’−ＧＴＧＧＴＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＴＴＴＴＡＡＡＧＣＧＴＣＧＧＴＴＡ−３’；配列ＩＤ番号：２２）、または１９２（５’−ＡＡＧＡＣＣＴＴＧＧＣＡＣＣＡＣＧＡＡＧＡＴＧＧＣＴＡＡＡＴＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＴＴＴＴＴＡＴＧＡ−３’；配列ＩＤ番号：２３）および８９で増幅した。５’および３’部分はゲルで分離して、プライマー８８および８９による変異ＵＬＰ１（すなわち、変異ＳＵＭＯプロテアーゼ）を増幅するための２番目のＰＣＲの鋳型として用いた。ＰＣＲ結果はＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで消化してｐＡＲＡ−６Ｈｉｓベクター中へクローニングした。
【０１０７】
変異ＳＵＭＯプロテアーゼのライブラリーを、ｐＡＣＹＣ−ｍｕｔＳＵＭＯ−Ｌａｃプラスミドを保持したＴＯＰ１０Ｅ．ｃｏｌｉコンピテント細胞へ導入した。４２℃でのヒートショック後、細胞を２×ＹＴ培地中３７℃で１時間再活性化した。次に、４倍量のＬＢ培地を添加して、細胞を３７℃で２時間攪拌した。３４ｍｇ／Ｌクロラムフェニコール、５０ｍｇ／Ｌカナマイシン、５０ｍｇ／Ｌアンピシリンおよび０．０２％アラビノースを補ったＬＢプレート上へ細胞を播種した。非変異Ｕｌｐ１遺伝子を保持するプラスミドはアンピシリン上で成長できない。成長したポジティブな変異クローンを配列解析して、インビトロでの切断のためのプロテアーゼの精製に用いた。変異ＳＵＭＯプロテアーゼは標準的なＮｉ−セファロース法を用いて精製し、以前に記述されたように（Ｍａｒｂｌｅｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，１５：１８２〜９）標準的な切断反応中で用いた。（Ｍｕｔａｎｔ  ＳＵＭＯ）−ＧＦＰは切断反応の基質として用いた。
【０１０８】
結果
ＳＵＭＯタンパク質は、融合パートナーとして目的タンパク質へ結合した場合、バクテリアおよび真核細胞中での組換えタンパク質の量および質を非常に良く増強した（図２および図３Ａを参照；Ｍａｌａｋｈｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．Ｇｅｎｏｍ．，５：７５〜８６）。ＳＵＭＯファミリーのタンパク質は、細胞制御の一部として自然状態で真核生物タンパク質に付加または除去される。ＳＵＭＯの構造およびＳＵＭＯタンパク質の付加および除去の過程は真核細胞中で非常に良く保存されている。ＳＵＭＯタンパク質構造の高度な保存の結果、ＳＵＭＯ融合タグと他種の宿主の内在性ＳＵＭＯ修飾酵素とは種を超えた反応性を示す。従って、真核生物はＳＵＭＯタグを切断可能であり、この切断により、組換えタンパク質からタグが分離される結果となる。従って、「切断されていない」またはプロセシングされていない野生型ＳＵＭＯ融合タンパク質を真核細胞から発現および精製することは容易ではない。
【０１０９】
真核細胞中でのタンパク質の生産増強を目的とした、「未成熟な」タグの切断という障害の克服のために、内在性ＳＵＭＯプロテアーゼに耐性であるＳＵＭＯ＊と呼ぶ新規ＳＵＭＯタンパク質を作製した。そのようなＳＵＭＯタグ開発の遺伝的基盤としてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ遺伝子ＳＭＴ３を用いた。
【０１１０】
Ｓｍｔ３およびそれに対応するプロテアーゼＵｌｐ１の結晶構造の評価（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ＃１ＥＵＶ）（図４）の後、Ｕｌｐ１と相互作用すると見られるＳｍｔ３タンパク質の領域を変異させた（図５）。まず、標準的なＰＣＲ変異技術を用いて、アミノ酸６４〜７１をコードする領域をランダム化した。次に、位置６４および７１のアルギニン（Ｒ６４およびＲ７１）がＵｌｐ１と直接的に向かい合っているため（図４Ａおよび４Ｂ）、それら残基をＰＣＲ変異によって特異的に変異させた。結果として得られたＳＵＭＯ−ＧＦＰ変異体は、新規なインビボ切断アッセイ、すなわちＵｌｐ１形質転換Ｅ．ｃｏｌｉを用いてスクリーニングした。
【０１１１】
Ｅ．ｃｏｌｉ中のインビボでのＵＬＰ１存在下で切断を示さなかった変異体の１つは、位置６４のアルギニンの箇所にスレオニンを、位置７１のアルギニンの箇所にグルタミン酸を含む。本願明細書では、この特定の変異体をＳＵＭＯ＊として言及する。いくつかのＳＵＭＯ変異体を以下の表１に提供する。
【０１１２】
【表１】
0005469786.tif 000006
【０１１３】
図３Ａおよび３Ｂに示すとおり、ＳＵＭＯ−ＧＦＰはそれぞれ酵母および昆虫のＳＵＭＯプロテアーゼによってほぼ完全に切断されたが、ＳＵＭＯ＊−ＧＦＰは切断されずに残った。さらに、タグ付加しないＧＦＰと比較して、ＳＵＭＯ＊の融合はＧＦＰの発現を強く増強した（レーン１および２を、５および６と比較のこと）。
【０１１４】
ＳＵＭＯ＊―ＧＦＰは精製してインビトロの切断反応に供した。ＳＵＭＯプロテアーゼ１（Ｕｌｐ１）およびＳＵＭＯプロテアーゼ２（ＳＥＮＰ２）の両方を試験した（図６）。いずれのプロテアーゼもＳＵＭＯ＊を切断しなかった（図６）。実際、ＳＵＭＯの完全な切断に必要な酵素濃度の１０００倍の過剰量まで量を増加させたＵｌｐ１と共にＳＵＭＯ＊タグ融合タンパク質をインキュベートしてもなお、切断は全く検出されなかった（図１０）。さらに、酵母または昆虫細胞中でＳＵＭＯ＊−ＧＦＰを発現した場合、野生型Ｓｍｔ３タグとは異なり、変異タグはいずれの生物の天然ＳＵＭＯプロテアーゼによっても切断されなかった（図３）
融合タグを最適なものとするためには、続く精製工程で除去して目的タンパク質のみを残すようにする能力を有する必要がある。ＳＵＭＯ＊タグを切断するプロテアーゼを作製するために、Ｅ．ｃｏｌｉ中で融合パートナーから変異ＳＵＭＯｓを切断可能な加水分解酵素をスクリーニングした（図７）。スクリーニングは、アンピシリン耐性タンパク質であるベータ−ラクタマーゼが細胞中で発現している場合に、抗生物質アンピシリンを含有する培地上でＥ．ｃｏｌｉが成長する能力に基づいたものである。非融合ベータ−ラクタマーゼのみがアンピシリン耐性を与えることが示されている。従って、ＳＵＭＯタグをベータ−ラクタマーゼに融合させた場合は、アンピシリン耐性が与えられない。ベータ−ラクタマーゼをＳＵＭＯ＊のＣ−末端へ融合して、様々な加水分解酵素と共に発現させた。タグが切断された場合にのみ、ベータ−ラクタマーゼが活性型で解放されてアンピシリン耐性を与えることで細胞の生存を可能にする。タンパク質がプロリンで開始する場合には、ＳＵＭＯ−タンパク質融合体はＵｌｐ１で切断されないことが知られている。従って、Ｓｍｔ３タグの直後のアミノ酸がプロリンであるＳｍｔ３−ｐｒｏ−ＢＬＡ融合タンパク質をスクリーニングのコンセプトの実証として作製した（図８）
Ｕｌｐ１の構造解析によって、ＳＵＭＯのアミノ酸Ｒ６４およびＲ７１と相互作用するアミノ酸残基は残基４５０と４５６との間の領域に存在することを決定した。Ｒ６４およびＲ７１と相互作用する可能性のあるアミノ酸は、それぞれ位置４５１および４５５のアスパラギン酸およびグルタミン酸、その他に位置４５２のスレオニンである（図４および９）。Ｕｌｐ１中のそれら３残基は、ＰＣＲ飽和変異技術を用いてランダムに変異させた。変異後に、インビボのベータ−ラクタマーゼ・アッセイを用いてアンピシリン含有プレート上で変異体を選択した。スクリーニングで同定したＵｌｐ１変異体は、さまざまな度合いの切断効率を示した。最も効率的な変異体２．２を選別して「ＳＵＭＯ＊プロテアーゼ１」と命名した（図１０）。変異体の例を以下の表２中に提供する。
【０１１５】
【表２】
0005469786.tif 000007
【実施例２】
【０１１６】
野生型ＳＵＭＯと同様に、改変ＳＵＭＯｓは異種タンパク質の発現を増強できる。実際、タグ付加なしのＧＦＰと比較して、ＳＵＭＯ＊と融合した場合にＧＦＰはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で高レベルで発現することを図３Ａは示している。さらに、図１３はＳＵＭＯ＊が昆虫細胞中で異種タンパク質の発現を増強する証拠を提供するものである。具体的には、ｐＦａｓｔＢａｃベクター中へ、６×ＨｉｓタグまたはＳＵＭＯ＊タグのいずれかと共にトリプターゼをクローニングした。融合タンパク質は昆虫ｓｆ９細胞中で発現した。細胞内タンパク質のクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、６×Ｈｉｓタグ付加トリプターゼと比較して、ＳＵＭＯ＊−トリプターゼの発現が増強していることを明らかに示している。特に、ＳＵＭＯ＊−トリプターゼ融合体は昆虫細胞中で切断されていない。
【０１１７】
さらに、本発明の改変ＳＵＭＯｓは野生型ＳＵＭＯと同様に、異種タンパク質の分泌を増加させる。図１４は、６×Ｈｉｓタグを有するグランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ：ＧｚｍＢ）またはＳＵＭＯ＊と融合したＧｚｍＢを発現するＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓからの培地中タンパク質のウエスタンブロットである。培地は細胞から分離して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびＳＵＭＯ＊−ＧｚｍＢおよび６×Ｈｉｓタグを可視化する抗−ＧｚｍＢ抗体を用いたウエスタンブロット解析によって解析した。特に、ＳＵＭＯ＊−ＧｚｍＢ融合体はピチア細胞中で切断されていない。
【実施例３】
【０１１８】
昆虫発現ベクターはｐＦａｓｔＢａｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）に基づいて、ピチアと同様に２工程で作製した。まず、６×Ｈｉｓ、ＳＵＭＯ、およびＳＵＭＯ＊融合タグをＰ−ｐｏｌｈプロモーターの後へクローニングした。そして、ユビキチンプロテアーゼであるＵＢＰ４３（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９：３０２９〜３０２８）を、ＢｓｍＢＩ−ＸｂａＩであらかじめ消化したベクター中へ融合タグをインフレームで挿入した。マウスＵＢＰ４３は、プライマー＃２６５（ＣＧＣＧＡＣＣＴＧＣＡＴＣＧＡＧＧＴＡＴＧＧＧＣＡＡＧＧＧＧＴＴＴＧＧＧＣＴＣＣＴＧＡＧＧ；配列ＩＤ番号：２９）および＃２６６（ＣＧＣＧＡＣＣＴＧＣＡＴＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＧＡＴＣＣＡＧＴＣＴＴＣＧＴＧＴＡＡＡＣＣＡＡＧ；配列ＩＤ番号：３０）で増幅して、ＢｆｕＡＩで消化した。バクミドはＤＨ１０ｂａｃ  Ｅ．ｃｏｌｉ中で作製した。ウイルスの取得および滴定の後、ｓｆ９細胞へ導入して、７２時間後にタンパク質生産についてサンプルを解析した。
【０１１９】
哺乳類での発現にはｐＣＤＮＡ３．１ベクターを用いた。マウスＩｇＧカッパ分泌シグナルおよび３種のタンパク質タグ、６×Ｈｉｓ、６×Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ、および６×Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ＊をＣＭＶプロモーター後のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部位中へクローニングした。マウス分泌グループＸ  ＰＬＡ２は、プライマー５７６（ＡＴＣＡＣＧＴＣＴＣＧＡＧＧＴＧＧＡＣＴＣＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣＡＧＧＧＡＣ；配列ＩＤ番号：３１）および２８５（ＧＣＡＴＣＧＴＣＴＣＡＣＴＡＧＴＣＡＡＴＴＧＣＡＣＴＴＧＧＧＡＧＡＧＴ；配列ＩＤ番号：３２）で増幅し、ＢｓｍＢＩ制限エンドヌクレアーゼで消化して、６×Ｈｉｓ、ＳＵＭＯ、またはＳＵＭＯ＊融合タグのいずれかの後へクローニングした。ＪＯＳＤ２は、カッパ分泌タグなしで細胞内で発現させた。ＪＯＳＤ２のオープン・リーディング・フレームをＤＮＡオリゴ３４４（ＡＴＧＡＴＧＧＧＴＣＴＣＡＡＧＧＴＡＴＧＴＣＣＣＡＧＧＣＣＣＣＧＧＧＡＧＣＡ；配列ＩＤ番号：３３）および３４５（ＡＴＧＡＴＧＧＧＴＣＴＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＧＴＣＴＧＴＣＣＧＣＡＧＣＣＡ；配列ＩＤ番号：３４）で増幅して、ｐＣＤＮＡ３．１に基づいたベクター中の６×ＨｉｓまたはＳＵＭＯ＊タグのいずれかの後へクローニングした。
【０１２０】
２ｍｌ培地中のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を含む６穴プレートの各ウェルへ導入するために、それぞれ２．５マイクログラムの精製プラスミドを用いた。４８時間後に、細胞および培地サンプルを収集してウエスタンブロットで解析した。
【０１２１】
図１５Ａおよび１５Ｂに見られるとおり、昆虫および哺乳類細胞中でＳＵＭＯ＊融合タグは融合パートナーの発現を増強し、切断はされていない。
【実施例４】
【０１２２】
ｓＰＬＡ２酵素は、加水分解反応であるリン脂質のｓｎ−２エステル結合の触媒作用によって追跡できる。加水分解に続いて、リゾリン脂質およびフリーの脂肪酸が結果として生じる。それら脂肪酸はシグナル伝達におけるセカンドメッセンジャーとして作用することができ、一方でリゾリン脂質は特にリン脂質のリモデリングを助ける。
【０１２３】
ＰＬＡ２は最初、１８９０年にコブラの毒液中から発見された（Ｓｉｘ  ａｎｄ  Ｄｅｎｎｉｓ（２０００）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１４８８：１〜１９）。現在、マウスで１１種の異なるｓＰＬＡ２群が同定されており、アミノ酸配列の相同性および構造の類似性に基づいて分類されている。既知の１１グループから、ＩＩＣ、ＩＩＥ、ＩＩＩ、Ｖ、およびＸを本研究で用いた（英文字は特定グループの異なるホモログに対応する）。８つのジスルフィド結合を有するグループＩＩＣは、齧歯類の睾丸、脳、および膵臓中に見られるが、しかしヒト中では発現していない（Ｓｉｘ  ａｎｄ  Ｄｅｎｎｉｓ（２０００）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１４８８：１〜１９）。インビボでは炎症反応に関わるグループＩＩＥは、ヒト（肺組織）およびマウス（脳、心臓、および肝臓組織）に見られる。興味深いことに、元はハチの毒液から単離されたグループＩＩＩは、ヒト中では樹状突起の成熟を誘導するが、しかし病的なヒト内皮細胞中でもまた多く発現して、腫瘍細胞での血管新生を増加させると見られている（Ｍｕｒａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０：２４９８７〜２４９９８）。６つのジスルフィド結合を有する１４ｋＤａのタンパク質であるグループＶ  ＰＬＡ２はその構造中に独特のループを有しておらず、炎症性刺激の存在下でラットおよびヒトの心臓で発現する（Ｓｉｘ  ａｎｄ  Ｄｅｎｎｉｓ（２０００）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１４８８：１〜１９）。解析するＰＬＡ２ｓのうち最後のグループＸは１２３アミノ酸を含み、グループＩ、ＩＩ、およびＶに対して２７〜３５％の配列同一性を有する。それはヒトの脾臓、白血球、肺、肺胞組織、および胸腺中、マウスの胃中に見られる。多くのＰＬＡ２ｓと同様に、グループＸ  ＰＬＡ２ｓは炎症性刺激によって現れ、シグナル伝達にもまた関与する。
【０１２４】
多くの真核生物タンパク質は、正確な折りたたみおよび活性のための複雑な翻訳および翻訳後の環境を必要とする。それら条件はＥ．ｃｏｌｉまたは酵母などの生物には存在しないことから、それら宿主中での組換えタンパク質発現の試みの際に、不正確なプロセシングおよび／または非常に少ない生産を引き起こす可能性がある。分泌されるホスホリパーゼＡ２はＥ．ｃｏｌｉ中で生産することが困難なタンパク質ファミリーであり、しばしば封入体として発現する。さらに、典型的には５と８間で比較的多い数のジスルフィド結合のため、ＰＬＡ２ｓは可溶化後の再折りたたみが困難である。発現量は通常低く、続く再折りたたみ処理はしばしば結果として貧弱な生産となる。洗練されたプロトコルおよび多くの努力にもかかわらず、再折りたたみしたタンパク質の活性は天然産物とは大きく異なる可能性があり、適切な特性解析を難しいものとしている。哺乳類細胞中でのｓＰＬＡ２ｓ発現のこれまでの試みは発現量が低くなる結果に終わっている。しかし、本願明細書に記述するとおり、低分子ユビキチン様修飾因子（ｓｍａｌｌ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ：ＳＵＭＯ）ファミリーのメンバーとの融合によって、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、およびバキュロウイルス／昆虫細胞システム中で異種タンパク質の発現を増強することが可能である。従って、従来と同様のアプローチで、哺乳類細胞中でｓＰＬＡ２、具体的にはマウスＰＬＡ２群の生産を増強することができる。
【０１２５】
さらに、ＰＬＡ２のＮ−末端はＰＬＡファミリーのタンパク質の生物学的活性に必須である。活性型ＰＬＡ２の生産は細胞にとって有害であり、活性型ＰＬＡ２の過剰生産は細胞を殺傷する。ＰＬＡ２のＮ−末端に改変ＳＵＭＯを含む融合タンパク質は細胞内で切断されず、休止状態／不活性型ＰＬＡ２が細胞内に蓄積する、または培地中（細胞外）へ分泌される。そして、改変ＳＵＭＯ−ＰＬＡ２融合タンパク質を精製して、インビトロでの改変ＳＵＭＯプロテアーゼによる切断によって活性型ＰＬＡ２タンパク質を生産することが可能である。従って、改変ＳＵＭＯ融合タンパク質は活性型毒性タンパク質の発現、特にタンパク質の毒性が前記タンパク質のＮ−末端に関係している場合に優れた方法を提供する。特に、トリプシン、Ｘ因子、トロンビン、およびグランザイムＢは過剰発現した場合に細胞に対して毒性となる可能性があり、活性には自由な状態のＮ−末端を必要とする。ＰＬＡ２と同様に、それらタンパク質は改変ＳＵＭＯ融合タンパク質として容易に発現して、その後に改変ＳＵＭＯプロテアーゼによってＳＵＭＯタグから解放することが可能である。
【０１２６】
材料および方法
融合タグ・ベクターの作製
全てのベクター・コンストラクトに対して、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を基盤として用いた。Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を全てのＰＣＲ反応に用い、全ての制限酵素およびＴ４  ＤＮＡリガーゼはＦｅｒｍｅｎｔａｓ（カナダ、オンタリオ州Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ）の物である。クローニングは標準的技術に従って実施した。全てのクローンはシーケンシングによって点検した。まず、２つの間で相同性のある領域を有するオーバーラップしたプライマー（それぞれ、プライマー１＋２および３＋４；プライマー配列については表３を参照）によって、ｋａｐｐａ  Ｓ．Ｓ．および６×Ｈｉｓタグを生成した。ｋａｐｐａ  Ｓ．Ｓ．および６×Ｈｉｓタグは、プライマー１＋４を用いた２番目のＰＣＲ反応で結合した。ｋａｐｐａ−６×Ｈｉｓ融合体をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ制限部位によってｐｃＤＮＡ３．１へ挿入して、ｐｃＤＮＡ３．１−ｋａｐｐａ−６×Ｈｉｓを生成した。プライマー３および４は、Ｈｉｓタグの後へ２つのグリシンが続き、反対鎖のＢａｍＨＩ部位の上流にＥｓｐ３Ｉ／ＢｓｍＢＩ制限部位ができるように設計した。Ｅｓｐ３Ｉによる消化で、ジ−グリシンのｇｇａｇｇｔコード配列の部分の非コード鎖上にｔｃｃａから成る４塩基の突出末端を生成した。ＣＴＨＳ，ＳＵＭＯ，ＳＵＭＯｍｕｔ，およびｈＳＵＭＯ３は、それぞれプライマー５＋６、７＋６、７＋６、および８＋９によって増幅した。全てのリバースプライマーは様々なＳＵＭＯ末端のジ−グリシン・コドン下流へＥｓｐ３Ｉ認識部位を再生成したが、しかし下流の２番目のＥｓｐ３Ｉ認識部位を利用した。ＳＵＭＯタグはＥｃｏ３１ＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を用いてｐｃＤＮＡ３．１−ｋａｐｐａ−６×Ｈｉｓ中へ挿入して、以下のベクターを生成した：ｐｃＤＮＡ３．１−ｋａｐｐａ−６×Ｈｉｓ−ＣＴＨＳ，ｐｃＤＮＡ３．１−ｋａｐｐａ−６×Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ，ｐｃＤＮＡ３．１−ｋａｐｐａ−６×Ｈｉｓ−ＳＵＭＯｍｕｔ，ｐｃＤＮＡ３．１−ｋａｐｐａ−６×Ｈｉｓ−ｈＳＵＭＯ３。
【０１２７】
最初のマウスｓＰＬＡ２−Ｘコンストラクト作製
活性型ｓＰＬＡ２−Ｘは、プライマー１０＋１１を用いてＰＣＲ増幅した。不活性型ｓＰＬＡ２−Ｘは、プライマー１２＋１１を用いて同じクローンからＰＣＲ増幅した。活性型および不活性型の両方のｓＰＬＡ２−Ｘコンストラクトは、ＰＣＲ産物およびベクターの両方のＥｓｐ３Ｉでの消化によって作製した。
【０１２８】
融合タグ・ベクターの拡張
ヒトＳＵＭＯ−１は、プライマー１３＋１４を用いてｃＤＮＡからＰＣＲ増幅して、Ｅｓｐ３ＩおよびＸｂａＩ制限部位を用いてｐｃＤＮＡ３．１−ｋａｐｐａ−６×Ｈｉｓ中へクローニングし、ｐｃＤＮＡ３．１−ｋａｐｐａ−６×Ｈｉｓ−ｈＳＵＭＯ１を作製した。変異型ヒトＳＵＭＯ−１および３は、Ｎ−末端およびＣ−末端側の半分ずつを個別の反応で生成するＰＣＲ部位特異的変異を用いて作製して、ゲルで分離し、続くＰＣＲ反応で結合した。ヒトＳＵＭＯ−１の１番目のＰＣＲでは、ＮおよびＣ−末端側に対してそれぞれプライマー１３＋１５および１６＋１４を用いた。ヒトＳＵＭＯ−３の１番目のＰＣＲでは、ＮおよびＣ−末端側に対してそれぞれプライマー８＋１７および１８＋９を用いた。２番目のＰＣＲでは、精製した１番目の産物をそれぞれのヒトＳＵＭＯと混合して、ｈＳＵＭＯ１ｍｕｔに対してはプライマー１３＋１４を、ｈＳＵＭＯ３ｍｕｔに対してはプライマー８＋９を用いた。産物をｐｃＤＮＡ３．１−ｋａｐｐａ−６×Ｈｉｓ中へ挿入してｐｃＤＮＡ３．１−ｋａｐｐａ−６×Ｈｉｓ−ｈＳＵＭＯ１ｍｕｔおよびｐｃＤＮＡ３．１−ｋａｐｐａ−６×Ｈｉｓ−ｈＳＵＭＯ３ｍｕｔを作製した。
【０１２９】
マウスｓＰＬＡ２コンストラクトの拡張
マウスｓＰＬＡ２−ＩＩＣ，ＩＩＥ、ＩＩＩおよびＶのｃＤＮＡはＯｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（アラバマ州Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ）から購入した。ＰＬＡ２プライマーは、精製およびタグ除去の後の成熟タンパク質の生成を目的として設計した。従ってプライマー設計では、文献レビューおよびシグナルＰ解析に基づいて、分泌シグナルおよびプロペプチドは省略した。マウスｓＰＬＡ２−ＩＩＣは、プライマー１９＋２０を用いて、ＧｅｎＢａｎｋエントリーＢＣ０２９３４７に対応するｃＤＮＡからクローニングした。マウスｓＰＬＡ２−ＩＩＥは、プライマー２１＋２２を用いて、ＧｅｎＢａｎｋエントリーＢＣ０２７５２４に対応するｃＤＮＡからクローニングした。全長のマウスｓＰＬＡ２−ＩＩＩは、プライマー２３＋２４を用いて、ＧｅｎＢａｎｋエントリーＢＣ０７９５５６に対応するｃＤＮＡからクローニングした。マウスｓＰＬＡ２−Ｖは、プライマー２５＋２６を用いて、ＧｅｎＢａｎｋエントリーＢＣ０３０８９９に対応するｃＤＮＡからクローニングした。マウスｓＰＬＡ２−ＩＩＩの活性ドメイン（Ｍｕｒａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０：２４９８７〜２４９９８）は、プライマー２７＋２８を用いて、ＧｅｎＢａｎｋエントリーＢＣ０７９５５６に対応するｃＤＮＡからクローニングした。活性型および不活性型ｓＰＬＡ２−Ｘを含む全てのｓＰＬＡ２遺伝子は、ｐｃＤＮＡ３．１−ｋａｐｐａ−６×Ｈｉｓ、ｐｃＤＮＡ３．１−ｋａｐｐａ−６×Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ、ｐｃＤＮＡ３．１−ｋａｐｐａ−６×Ｈｉｓ−ＳＵＭＯｍｕｔ、ｐｃＤＮＡ３．１−ｋａｐｐａ−６×Ｈｉｓ−ｈＳＵＭＯ１、ｐｃＤＮＡ３．１−ｋａｐｐａ−６×Ｈｉｓ−ｈＳＵＭＯ１ｍｕｔ、ｐｃＤＮＡ３．１−ｋａｐｐａ−６×Ｈｉｓ−ｈＳＵＭＯ３、およびｐｃＤＮＡ３．１−ｋａｐｐａ−６×Ｈｉｓ−ｈＳＵＭＯ３ｍｕｔ中へサブクローニングした。
【０１３０】
ＨＥＫ−２９３細胞中への一過性導入
ＨＥＫ−２９３細胞は、ＤＭＥＭ含有１０％ウシ胎仔血清培地中でウェル当たり５００，０００細胞の密度となるように６穴プレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；メリーランド州Ｓｐａｒｋｓ）中へ播種して、９５％空気／ＣＯ２で３７℃にてオーバーナイトでインキュベートした。製造者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による記述に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−ＬＴＸを用いて、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（２．５μｇ／ウェル）中の様々なＰＬＡ２のｃＤＮＡコンストラクトを細胞へ一過性に導入した。導入後、ＰＬＡ２発現の解析前に３７℃でさらに４８時間、細胞をインキュベートした。
【０１３１】
発現解析
トランスフェクションに続く４８時間のインキュベーション後、培地および細胞を解析のために採取した。各ウェルからカルチャー培地（〜１．５ｍｌ）を取り除き、残留物を遠心分離で分離する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロッティングのためには、１００μｌの培地を６×ＳＤＳローディング緩衝液と混合して、５分間煮沸した。残りの培地は後のアッセイのために−８０℃で保存した。プレートの各ウェルからの細胞は洗浄して、遠心分離し、１８０μｌの冷却ＲＩＰＡ緩衝液中で再懸濁し、軽く超音波処理して、６×ＳＤＳローディング緩衝液と混合して５分間煮沸した。全てのサンプルは４％アクリルアミドのスタッキングレイヤーを伴う変性１５％アクリルアミドゲル状で分離した。Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ（登録商標）ｓｅｍｉ−ｄｒｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｃｅｌｌ（ＢｉｏＲａｄ；カリフォルニア州Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）を用いて、ゲルをＩｍｍｏｂｌｉｎ（商標）ニトロセルロース（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；マサチューセッツ州Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ）へ転写した。膜への転写後、ＰＢＳ  ｐＨ７．５  ＋  ０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）中の５％脱脂乳によって１時間、ブロット膜をブロックした。ブロッキングに続いて、ＰＢＳＴ  ＋  脱脂乳中の１：１０００モノクローナル抗−Ｈｉｓ抗体（Ｓｉｇｍａ）中でブロット膜を１時間インキュベートした。ブロット膜をＰＢＳＴで３回洗浄して、ＰＢＳＴ  ＋  脱脂乳中の１：２５００抗−マウスＨＲＰ合成抗体（Ｓｉｇｍａ；ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を加えて１時間インキュベートした。ブロット膜は再度ＰＢＳＴで３回洗浄した。ＨＲＰ結合はＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  ｃｈｅｍｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ；イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）によって検出した。ブロット膜はＬＡＳ−３０００（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ；コネチカット州Ｓｔａｍｆｏｒｄ）を用いて映像化した。
【０１３２】
【表３−１】
0005469786.tif 000008
【０１３３】
【表３−２】
0005469786.tif 000009
【０１３４】
結果
哺乳類の分泌経路中での改変ＳＵＭＯ−融合タンパク質の可能性のある有用性を評価するために、マウスｓＰＬＡ２−Ｘをモデルタンパク質として用いた。まず、以下の４つのＮ−末端融合タンパク質を試験した：Ｓｍｔ３（ＳＵＭＯ）、ＡＡ４５−９９（ＣＴＨＳ）を含むＳｍｔ３のＣ−末端側の半分、ＳＵＭＯプロテアーゼによって切断されない２重変異体であるＳｍｔ３  Ｒ６４ＴＲ７１Ｅ（ＳＵＭＯｍｕｔ（ＳＵＭＯ＊））、およびヒトＳＵＭＯ−３（ｈＳＵＭＯ３）。全てのタグはヘキサヒスチジン（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ：６×Ｈｉｓ）のＮ−末端で作製し、マウスのＩｇＧカッパ分泌シグナルを用いて分泌させるようにした。コントロールを目的として、シグナル配列および６×Ｈｉｓタグのみを有するベクターを作製して、ＳＵＭＯをベースとするタグの部分のみ異なる全部で５種のベクターを作製した。Ｓｍｔ３との融合はＥ．ｃｏｌｉ中で異種タンパク質発現を増強することが示されており、ヒトＳＵＭＯ−３との融合はＥ．ｃｏｌｉおよびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ中で発現が増強する結果となった。特定の発現データは表４に提供した。
【０１３５】
【表４】
0005469786.tif 000010
【０１３６】
全長ＳＵＭＯ融合タンパク質は内在性の脱ＳＵＭＯ化酵素によって切断されるため、ＣＴＨＳは最初、バキュロウイルス／昆虫細胞での発現のために開発された（国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０４／２０７７８および米国特許出願第１０／５０４，７８５号を参照）。スプリット−ユビキチン（Ｊｏｈｎｓｓｏｎ  ａｎｄ  Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ（１９９４）ＰＮＡＳ  ９１：１０３４０〜１０３４４）の開発に基づいて、ＣＴＨＳは、そのＮ−末端側半分（ＮＴＨＳ）の存在下でのみ切断される。ＣＴＨＳ融合は融合パートナーの生産を増強する一方で、内在性の切断を回避することが見いだされている。
【０１３７】
本願明細書で記述するとおり、変異型Ｓｍｔ３は、真核生物宿主中のインビボで切断されずに、原核生物中で示されるＳｍｔ３融合による全てのポジティブな増強を維持するＳＵＭＯ融合体の作製を目的として開発したものである。Ｓｍｔ３と、その天然のプロテアーゼＵｌｐ１との結合の大々的な結晶構造解析に続く、合理的な変異体スクリーニング活動によって、２つの接触面のアミノ酸が変更される結果となった。それらの変更、Ｒ６４ＴおよびＲ７１Ｅは、酵素濃度に関わらずＵｌｐ１によって切断されないＳＵＭＯを結果として与えた。スクリーニングでは、新規なＳＵＭＯは、野生型Ｓｍｔ３によって得られるのと同等の融合パートナーの発現増強を示した。変異型Ｓｍｔ３の作製に続いて、Ｕｌｐ１もまた合理的な変異体スクリーニングに供して、変異型Ｓｍｔ３融合タンパク質をインビトロで切断可能な変異酵素を開発した。
【０１３８】
ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中でのｓＰＬＡ２−Ｘ発現は図１６Ａに見ることができる。ＳＵＭＯｍｕｔは他のタグと比較してｓＰＬＡ２−Ｘ生産の増強を明らかに示している；しかし、Ｓｍｔ３およびｈＳＵＭＯ３培養細胞は４８時間の最終時点でコンフルエンシーが低いように見られた。トランスフェクションは数回繰り返したが、同様の結果であった。ｓＰＬＡ２−Ｘは自然状態では酵素前駆体として生産されるが、成熟型を様々なタグの後へクローニングした。ｓＰＬＡ２−Ｘの過剰発現は、その融合パートナーから放出される場合には、細胞にとって毒性となる可能性がある。ｓＰＬＡ２−Ｘについて提唱される毒性が切断の結果であるかどうかを評価するために、ｓＰＬＡ２−ＸのＮ−末端グリシンを省略した一連の不活性型ｓＰＬＡ２−Ｘ融合体を作製した。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中でのそれら不活性型ｓＰＬＡ２−Ｘとの融合タンパク質の発現は図１６Ｂに見ることができる。切断産物は全く見られないものの、ｓＰＬＡ２−Ｘ活性およびそのＮ−末端プロペプチドの切断され易さが、過剰発現において明らかに役割を果たしていることを結果は示している。
【０１３９】
ヒトＳＵＭＯ−１、２、３、およびＳｍｔ３の結晶構造の比較は、２つの接触面のアルギニン残基がほぼ同一の位置にある、ＳＵＭＯ構造間の強い保存を明らかにした。特に、ＳＵＭＯ−２および３は９７％の同一性を示す。従って、ＳＵＭＯ−２はＳＵＭＯ−３と同様に振る舞うであろうとの予想から、ｈＳＵＭＯ−１および３を詳細に調べた。ｈＳＵＭＯ−１では、位置６３のアルギニンをスレオニンに変化させ（Ｒ６３Ｔ）、位置７０のアルギニンをグルタミン酸へ変化（Ｒ７０Ｅ）させた。ｈＳＵＭＯ−３では、位置５８のアルギニンをスレオニンへ（Ｒ５８Ｔ）、位置６０のアルギニンをグルタミン酸へ変化（Ｒ６０Ｅ）させた。変異体および野生型のＳｍｔ３、ｈＳＵＭＯ１および３と、活性型および不活性型ｓＰＬＡ２−Ｘとの融合タンパク質を作製した。不活性型および活性型融合タンパク質の４８時間目の発現結果を、それぞれ図１７ＡおよびＢに見ることができる。野生型Ｓｍｔ３、ｈＳＵＭＯ１およびｈＳＵＭＯ３を発現する培養細胞は、ｓＰＬＡ２−Ｘを発現していないことに加えて、やはり成長しなかった。これは、融合タンパク質の切断および毒性ＰＬＡ２の放出によるものであろう。興味深いことに、図１７ＡではいくらかのＨｉｓ−タグ付加ｈＳＵＭＯ１を見ることができ、一方で他の野生型ＳＵＭＯとｓＰＬＡ２−Ｘとの融合タンパク質では全く見られない。
【０１４０】
マウスｓＰＬＡ２−Ｘを用いた発現データを前提として、他のｓＰＬＡ２グループを試験した。以前に報告された組換え産物の発現量のばらつき（Ｒｏｕａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４６：１６４７〜１６６２）に基づいて、４つの追加的なマウスｓＰＬＡ２遺伝子を試した。マウスｓＰＬＡ２−ＩＩＣおよびＩＩＩは、それぞれ１５０および７０ｎｇ／Ｌの生産量で昆虫細胞において以前に生産した。現在、いずれのｓＰＬＡ２の再折りたたみのプロトコルは無く、両方の酵素は天然ではグリコシル化されるため、真核生物での生産が必要とされた。マウスｓＰＬＡ２−ＩＩＥはバクテリアでの生産では８００ｎｇ／Ｌと、最も低い生産量が報告されており、一方でｓＰＬＡ２−ＶはＥ．ｃｏｌｉで２０ｍｇ／Ｌと、最も高い生産量を示した。マウスｓＰＬＡ２−ＸはＥ．ｃｏｌｉで１０ｍｇ／Ｌ発現した。
【０１４１】
活性型のマウスｓＰＬＡ２−ＩＩＣ、ＩＩＥ、ＩＩＩ、およびＶを試験した。ｓＰＬＡ２−ＩＩＣの４８時間目の細胞内発現は図１８Ａに見ることができる。Ｈｉｓ−タグ付加タンパク質は培地中で検出できなかった。全てのＳＵＭＯタグによる発現の明らかに大きな増加にもかかわらず、分泌はなぜか阻害された。ｓＰＬＡ２−ＩＩＥの発現および分泌は図１８Ｂに見ることができる。４８時間目では、ほとんどのＳＵＭＯ融合タンパク質でｓＰＬＡ２−ＩＩＥはＨｉｓ−タグのみの場合と比較して濃度測定解析によってＳＵＭＯｍｕｔでは１４０倍、ｈＳＵＭＯ３ｍｕｔでは１９０倍と、遙かに多く視認できた。マウスおよびヒトｓＰＬＡ２−ＩＩＩは５５ｋＤのタンパク質として発現されるが、しかし多くの場合、翻訳後および細胞特異的なタンパク質分解プロセシングを介して成熟し、２８ｋＤの活性ドメインとなる（Ｍｕｒａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８：１０６５７〜１０６６７；Ｍｕｒａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０：２４９８７〜２４９９８）。活性またはＳドメインは、その前にＮドメイン、後にＣドメインが存在する。まず、全長のｓＰＬＡ２−ＩＩＩとの融合タンパク質を生成して、唯一の置換は天然の分泌シグナルと、ＳＵＭＯおよびカッパ・シグナルとの置換のみである。ＨＥＫ−２９３細胞中では、全てのｓＰＬＡ２−ＩＩＩ融合タンパク質はその最初の切断部位でプロセシングを受けて、図１８Ｃに見られるようにＮおよびＳドメインを分断し、たった１２ｋＤのＨｉｓタグ付加タンパク質、または様々なＳＵＭＯｓを有する約３２ｋＤのタンパク質となる。細胞内のブロッティングは５５ｋＤのタンパク質生産を示し、他の追加的な形態は全く見られなかった。ｓＰＬＡ２−Ｖの発現および分泌は図１８Ｄに見ることができる。グループＸと同様に、ｓＰＬＡ２−Ｖの発現では変異型ＳＵＭＯ融合タンパク質への強い優先性がある。野生型ＳＵＭＯ融合タンパク質の発現の明らかな欠如があるにもかかわらず、ｓＰＬＡ２−Ｖの場合には同様の細胞培養の問題点は見られなかった。
【０１４２】
本発明の特定の好ましい実施形態を記述して、以上に具体的な例証を行ったが、しかしこれは本発明をそういった実施形態に限定するよう意図したものではない。それらに対しては、以下の請求項に説明する本発明の範囲および精神から逸脱することなく、様々な変更を行うことができる。
【図１】
0005469786.tif 000011
【図２】
0005469786.tif 000012
【図３】
0005469786.tif 000013
【図４Ａ】
0005469786.tif 000014
【図４Ｂ】
0005469786.tif 000015
【図５】
0005469786.tif 000016
【図６】
0005469786.tif 000017
【図７】
0005469786.tif 000018
【図８】
0005469786.tif 000019
【図９】
0005469786.tif 000020
【図１０】
0005469786.tif 000021
【図１１Ａ】
0005469786.tif 000022
【図１１Ｂ】
0005469786.tif 000023
【図１１Ｃ】
0005469786.tif 000024
【図１２Ａ】
0005469786.tif 000025
【図１２Ｂ】
0005469786.tif 000026
【図１３】
0005469786.tif 000027
【図１４】
0005469786.tif 000028
【図１５Ａ】
0005469786.tif 000029
【図１５Ｂ】
0005469786.tif 000030
【図１６】
0005469786.tif 000031
【図１７】
0005469786.tif 000032
【図１８】
0005469786.tif 000033