(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）患者の癌領域から得られた試験試料および対照試料におけるＧＢＰ−１の発現レベルを測定する工程、および
ｂ）試験試料および対照試料において測定されたＧＢＰ−１の発現レベルを比較する工程
を含み、対照試料と比較した場合の、試験試料において測定されたＧＢＰ−１の発現レベルの低下が、タキソイドファミリー分子に対する感受性の増加を表す、患者の腫瘍細胞におけるタキソイドファミリー分子に対する応答を予測またはモニタリングする方法。
【請求項２】
ＧＢＰ−１が、配列番号９２に示されるヌクレオチド配列からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
タキソイドファミリーの分子が、パクリタキセル、ドセタキセル、ＸＲＰ９８８１およびＸＲＰ６２５８からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＧＢＰ−１の発現レベルが、ｍＲＮＡ、ＤＮＡまたはタンパク質により測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ｍＲＮＡが、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、核酸ハイブリダイゼーション、電気泳動、ノーザンブロッティングおよび質量分析からなる群から選択される方法を用いて測定される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＤＮＡが、定量的ポリメラーゼ連鎖反応、ゲノムＤＮＡチップ、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、電気泳動、サザンブロッティングおよび質量分析からなる群から選択される方法を用いて測定される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
タンパク質が、イムノアッセイ、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、および質量分析からなる群から選択される方法を用いて測定される、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
検出可能な標識化抗体、検出可能な標識化抗体断片、または、ＧＢＰ−１に対しストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸を含む検出可能な標識化オリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法により、患者の腫瘍細胞におけるタキソイドファミリー分子に対する応答を予測またはモニタリングするためのキット。
【請求項９】
ａ）身体試料から全ＲＮＡを得る手段、
ｂ）全ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを得る手段、および
ｃ）一方または両方のプライマーが検出可能に標識され、且つ、両方のプライマーがＧＢＰ−１のヌクレオチド配列に由来する、１組のプライマーを用いて上記ｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応にかける手段
を含む、請求項１に記載の方法により、患者の腫瘍細胞におけるタキソイドファミリー分子に対する応答を予測またはモニタリングするためのキット。
【請求項１０】
検出可能な標識が、酵素、放射性同位元素、または蛍光する化学物質、化学発光分子、放射線不透過性物質、リポソーム、およびハプテン分子からなる群から選択される、請求項８または９に記載のキット。
【請求項１１】
ａ）患者の癌領域から得られた試験試料におけるＧＢＰ−１の発現レベルを測定する工程、
ｂ）該試験試料におけるＧＡＰＤＨおよびＲＰＳ９からなる群から選択される１種またはそれ以上の参照遺伝子マーカーの発現レベルを測定する工程、
ｃ）該試験試料において測定されたＧＢＰ−１および上記１種またはそれ以上の参照遺伝子マーカーの発現レベルを比較する工程
を含み、上記１種またはそれ以上の参照遺伝子マーカーの発現レベルと比較した場合の、ＧＢＰ−１の発現レベルの低下が、タキソイドファミリー分子に対する感受性の増加を表す、患者の腫瘍細胞におけるタキソイドファミリー分子に対する応答を予測またはモニタリングする方法。
【請求項１２】
ＧＢＰ−１が、配列番号９２に示されるヌクレオチド配列からなり、
ＧＡＰＤＨが、配列番号１１５に示されるヌクレオチド配列からなり、
ＲＰＳ９が、配列番号１１６に示されるヌクレオチド配列からなる、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
タキソイドファミリーの分子が、パクリタキセル、ドセタキセル、ＸＲＰ９８８１およびＸＲＰ６２５８からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
ＧＢＰ−１の発現レベルが、ｍＲＮＡ、ＤＮＡまたはタンパク質により測定される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
ｍＲＮＡが、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、核酸ハイブリダイゼーション、電気泳動、ノーザンブロッティングおよび質量分析からなる群から選択される方法を用いて測定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＤＮＡが、定量的ポリメラーゼ連鎖反応、ゲノムＤＮＡチップ、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、電気泳動、サザンブロッティングおよび質量分析からなる群から選択される方法を用いて測定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
タンパク質が、イムノアッセイ、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、および質量分析からなる群から選択される方法を用いて測定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
検出可能な標識化抗体、検出可能な標識化抗体断片、または、ＧＢＰ−１並びにＧＡＰ
ＤＨおよびＲＰＳ９からなる群から選択される上記１種またはそれ以上の参照遺伝子マーカーに対しストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸を含む検出可能な標識化オリゴヌクレオチド、を含む、請求項１１に記載の方法により、患者の腫瘍細胞におけるタキソイドファミリー分子に対する応答を予測またはモニタリングするためのキット。
【請求項１９】
ａ）身体試料から全ＲＮＡを得る手段、
ｂ）全ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを得る手段、および
ｃ）一方または両方のプライマーが検出可能に標識され、且つ、両方のプライマーがＧＢＰ−１のヌクレオチド配列に由来する、１組のプライマーを用いてｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応にかける手段
を含む、請求項１１に記載の方法により、患者の腫瘍細胞におけるタキソイドファミリー分子に対する応答を予測またはモニタリングするためのキット。
【請求項２０】
検出可能な標識が、酵素、放射性同位元素、蛍光する化学物質、化学発光分子、放射線不透過性物質、リポソーム、またはハプテン分子を含む、請求項１８または１９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タキソイドファミリー分子に対する患者の応答を、対照と比較した特異的遺伝子マーカーの増減を測定することで予測またはモニタリングすることができる、新規の、有用な、これまで知られていない方法に関する。本発明はまた、タキソイドファミリー分子に対する患者の応答を、特定の遺伝子マーカーの核酸またはタンパク質レベルを測定すること、およびこれらのレベルを対照または参照マーカーと比較することで予測またはモニタリングするキットも提供する。
【背景技術】
【０００２】
ドセタキセルは、乳癌、肺癌および卵巣癌の治療に幅広く使用されている抗有糸分裂剤であり、これほどではないが頭頚部癌、胃癌および前立腺癌を治療するのに使用されている（Ｈｏｎｇ、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １６：９頁、２００２年）。ドセタキセルは、ベータ−チューブリンに結合し、アルファ−およびベータ−チューブリンへテロダイマーの解離を抑制して微小管動態を阻害することで腫瘍増殖を抑制する（ＲｉｎｇｅｌおよびＨｏｒｗｉｔｚ、Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ８３：２８８頁、１９９１年）。ドセタキセルおよび関連するタキサンであるパクリタキセルの抗腫瘍活性は、紡錘体の微小管を標的とすることにより生じ、染色体の整列および分離を抑制し、細胞周期の進行を阻害し、アポトーシス経路を活性化する（Ｗａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  ８８：２６１９頁、２０００年）。パクリタキセルのプロアポトーシス活性は、ｐ５３／ｐ２１ｗａｆ１／Ｃｉｐ１、ｒａｆ／ｒａｓおよびマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）を伴う細胞シグナル伝達事象を介して、Ｂｃｌ−２のリン酸化および不活性化に関連している（Ｗａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  ８８：２６１９頁、２０００年）。ドセタキセルは、パクリタキセルより強力な抗癌剤であるが、この細胞毒性に関わる経路は、パクリタキセルほど明確になっていない（Ｋａｔｓｕｍａｔａ、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ８９：Ｓ９頁、２００３年）。ドセタキセル誘導アポトーシスは、Ｂｃｌ−２リン酸化およびカスパーゼ−３活性化を伴うメカニズムを介して、任意の細胞系で観察されている（Ｋｏｌｆｓｃｈｏｔｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ６３：７３３頁、２００２年）。異なる培養系においてタキサン誘導細胞殺傷を調節する他のタンパク質には、ＨｅＬａ細胞のＡｕｒｏｒａ−Ａ（Ａｎａｎｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ３：５１頁、２００３年）、乳癌細胞のＨＥＲ−２（Ｔａｎａｂｅら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ  ２２：８７５頁、２００３年）、膠芽腫細胞のｐ２１ｗａｆ１／Ｃｉｐ１（Ｌｉら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：１１３５２頁、２００２年）および卵巣癌細胞のＪＮＫ／ＭＫＫ１（Ｌｅｅら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３：２８２５３頁、１９９８年）が挙げられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
この分野には、ドセタキセル耐性を媒介する、薬剤の標的になり得るタンパク質を同定することで、創薬にこれらを利用して、タンパク質のインビボでの機能を抑制し、抗腫瘍剤化学療法に細胞を感作させる可能性のある試薬（低分子、ｓｉＲＮＡなど）を同定できるようにする必要が依然として残っている。この分野にはまた、どの患者が、抗腫瘍ドセタキセル薬に基づく化学療法に応答するか否かを、化学療法による治療の前に確信をもって予測できるアッセイを行う必要も残っている。出願者は、本明細書で、ドセタキセルに対する耐性および／または感受性を予測できる新規アッセイを説明し、癌における薬剤耐性を抑制する新規療法を開発するためのスクリーニングアッセイを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明により、タキソイドファミリー分子に対する患者の応答を、患者および対照にお
ける特異的遺伝子マーカーの活性化および／または発現レベルを比較することでモニタリングおよび／または予測する、新規で有用な方法が提供される。
【０００５】
１つの実施形態では、本発明は、
ａ）患者の癌領域から試験試料を得る工程と、
ｂ）対照試料を得る工程と、
ｃ）１種またはそれ以上の遺伝子マーカーのレベルを測定する工程と、
ｄ）試験試料および対照試料における前記１種またはそれ以上の遺伝子マーカーの測定レベルを比較する工程と
を含み、対照試料と比較した場合の、試験試料において測定された前記１種またはそれ以上の遺伝子マーカーレベルの低下が、タキソイドファミリー分子に対する耐性の増加を表す、タキソイドファミリー分子に対する癌患者の応答を予測またはモニタリングするための方法を提供する。
【０００６】
本発明のこの態様では、特定の遺伝子マーカーとして以下が挙げられる。
ＢｕｂＲ１，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｓｉｍｉｌａｒ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ（ＢＵＢＲ１）ｍＲＮＡ，ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｄｓ（ＢｕｂＲ１、ホモサピエンス、プロテインキナーゼ（ＢＵＢＲ１）に類似、ｍＲＮＡ、完全配列）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＦ０４６０７９）、
Ｍａｄ２，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｍＲＮＡ  ｆｏｒ  ＭＡＤ２  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｍａｄ２、ホモサピエンスｍＲＮＡ、ＭＡＤ２タンパク質対応）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＪ０００１８６）、
Ｍｐｓ１，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＴＴＫ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ（ＴＴＫ），ｍＲＮＡ（Ｍｐｓ１、ホモサピエンスＴＴＫプロテインキナーゼ（ＴＴＫ）、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００３３１８）、
ＧＥＦＴ  ｆｏｒ  Ｒａｃ１／ＣＤＣ４２，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＲＡＣ／ＣＤＣ４２  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｆａｃｔｏｒ（ＧＥＦＴ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  ２，ｍＲＮＡ（ＧＥＦＴ、Ｒａｃ１／ＣＤＣ４２対応、ホモサピエンスＲＡＣ／ＣＤＣ４２交換因子（ＧＥＦＴ）、転写変異体２、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿１３３４８３）、
Ｂｕｂ１，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＢＵＢ１  ｂｕｄｄｉｎｇ  ｕｎｉｎｈｉｂｉｔｅｄ  ｂｙ  ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅｓ  １  ｈｏｍｏｌｏｇ（ｙｅａｓｔ）（ＢＵＢ１），ｍＲＮＡ（Ｂｕｂ１、ホモサピエンスＢＵＢ１、出芽はベンゾイミダゾール１ホモログによって阻害されず（酵母）（ＢＵＢ１）、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００４３３６）、
ｈＳｅｐｈａｒａｓｅ，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｅｘｔｒａ  ｓｐｉｎｄｌｅ  ｐｏｌｅｓ  ｌｉｋｅ  １（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＥＳＰＬ１），ｍＲＮＡ（ｈセファラーゼ、ホモサピエンス、余分紡錘体極類似１（Ｓ．セレヴィシエ）（ＥＳＰＬ１）、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０１２２９１）、
ＣａｍＫＩＩｄ，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｃａｌｃｉｕｍ／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ（ＣａＭ  ｋｉｎａｓｅ）ＩＩ  ｄｅｌｔａ（ＣＡＭＫ２Ｄ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  ３，ｍＲＮＡ（ＣａｍＫＩＩｄ、ホモサピエンス、カルシウム／カルモジュリン依存症プロテインキナーゼ（ＣａＭキナーゼ）ＩＩδ（ＣＡＭＫ２Ｄ）、転写変異体３、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００１２２１）、
ＣＤＫ６，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ  ６（ＣＤＫ６），ｍＲＮＡ（ＣＤＫ６、ホモサピエンス、サイクリン依存性キナーゼ６（ＣＤＫ６）、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００１２５９）、および
ＧＲＢ２，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏ
ｒ−ｂｏｕｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２（ＧＲＢ２），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ（ＧＲＢ２、ホモサピエンス、成長因子受容体結合プロテイン２（ＧＲＢ２）、転写変異体１、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００２０８６）
【０００７】
別の実施形態では、本発明は、
ａ）患者の癌領域から試験試料を得る工程と、
ｂ）対照試料を得る工程と、
ｃ）１種またはそれ以上の遺伝子マーカーのレベルを測定する工程と、
ｄ）試験試料および対照試料における前記１種またはそれ以上の遺伝子マーカーの測定レベルを比較する工程と
を含み、対照試料と比較した場合の、試験試料において測定された前記１種またはそれ以上の遺伝子マーカーレベルの低下が、タキソイドファミリー分子に対する感受性の増加を表す、タキソイドファミリー分子に対する癌患者の応答を予測またはモニタリングするための方法に関する。
【０００８】
本発明のこの特定の態様では、１種またはそれ以上の遺伝子マーカーは、以下からなる群から選択することができる。
Ｐ２１（Ｗａｆ１），Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ
ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  １Ａ（ｐ２１，Ｃｉｐ１）（ＣＤＫＮ１Ａ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ（Ｐ２１（Ｗａｆ１）、ホモサピエンス、サイクリン依存症キナーゼ阻害因子１Ａ（ｐ２１，Ｃｉｐ１）（ＣＤＫＮ１Ａ）、転写変異体１、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０００３８９）、
Ｐｉｍ−１，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｐｉｍ−１  ｏｎｃｏｇｅｎｅ（ＰＩＭ１），ｍＲＮＡ（Ｐｉｍ−１、ホモサピエンス、ｐｉｍ−１発癌遺伝子（ＰＩＭ１）、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００２６４８）、
ＧＢＰ−１，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｇｕａｎｙｌａｔｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １，ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ，６７ｋＤａ（ＧＢＰ１），ｍＲＮＡ（ＧＢＰ−１、ホモサピエンス、グアニレート結合プロテイン１、インターフェロン誘導性、６７ｋＤａ（ＧＢＰ１）、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００２０５３）、
ＲＸＲＡ，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｒｅｔｉｎｏｉｄ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ａｌｐｈａ（ＲＸＲＡ），ｍＲＮＡ（ＲＸＲＡ、ホモサピエンス、レチノイドＸ受容体、α（ＲＸＲＡ）、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００２９５７）、
ＳＰＦ４５，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＲＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｔｉｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １７（ＲＢＭ１７），ｍＲＮＡ（ＳＰＦ４５、ホモサピエンス、ＲＮＡ結合モチーフプロテイン１７（ＲＢＭ１７）、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０３２９０５）、
Ｈｅｃ１，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｋｉｎｅｔｏｃｈｏｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ２（ＫＮＴＣ２），ｍＲＮＡ（Ｈｅｃ１、ホモサピエンス、動原体結合２（ＫＮＴＣ２）、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００６１０１）、
Ｒａｆ１，Ｈｕｍａｎ  ｍＲＮＡ  ｆｏｒ  ｒａｆ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ（Ｒａｆ１、ヒトｍＲＮＡ、ｒａｆ発癌遺伝子対応）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｘ０３４８４）、
Ａｕｒｏｒａ  Ａ，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ａｕｒｏｒａ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ  １（ＡＲＫ１）ｍＲＮＡ，ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｄｓ（Ａｕｒｏｒａ  Ａ、ホモサピエンス、オーロラ関連キナーゼ１（ＡＲＫ１）ｍＲＮＡ、完全配列）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＦ００８５５１）、
ＴＡＣＣ３，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ，ａｃｉｄｉｃ  ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３（ＴＡＣＣ３），ｍＲＮＡ（ＴＡＣＣ３、ホモサピエンス、形質転換性酸性コイルドコイル含有プロテイン３（ＴＡＣＣ３）、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００６３４２）、
ＲｅｌＢ，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｖ−ｒｅｌ  ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓｉｓ  ｖｉｒａｌ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ  Ｂ，ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ｋａｐｐａ  ｌｉｇｈｔ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｉｎ  Ｂ−ｃｅｌｌｓ  ３（ａｖｉａｎ）（ＲＥＬＢ），ｍＲＮＡ（ＲｅｌＢ、ホモサピエンス、ウイルス関連細網内皮症ウイルス発癌遺伝子ホモログＢ、Ｂ細胞内κ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーの核因子３（鳥類）（ＲＥＬＢ）、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００６５０９）、
ＰＲＫＣＤ，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ，ｄｅｌｔａ（ＰＲＫＣＤ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ（ＰＲＫＣＤ、ホモサピエンス、プロテインキナーゼＣ、δ（ＰＲＫＣＤ）、転写変異体１、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００６２５４）、
ＢＲＡＦ３５，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｈｉｇｈ−ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｒｏｕｐ
２０Ｂ（ＨＭＧ２０Ｂ），ｍＲＮＡ（ＢＲＡＦ３５、ホモサピエンス、高移動度グループ２０Ｂ（ＨＭＧ２０Ｂ）、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００６３３９）、
ＨＳＰＡ１Ｌ，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ７０ｋＤａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １Ａ（ＨＳＰＡ１Ａ），ｍＲＮＡ（ＨＳＰＡ１Ｌ、ホモサピエンス、熱ショック７０ｋＤａプロテイン１Ａ（ＨＳＰＡ１Ａ）、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００５３４５）、
ＳＴＫ１１，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  １１（Ｐｅｕｔｚ−Ｊｅｇｈｅｒｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＳＴＫ１１），ｍＲＮＡ（ＳＴＫ１１、ホモサピエンス、セリン／トレオニンキナーゼ１１（ポイツジェガース症候群）（ＳＴＫ１１）、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０００４５５）、および
ＭＫＫ３，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ  ３（ＭＫＫ３）ｍＲＮＡ，ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｄｓ（ＭＫＫ３、ホモサピエンス、ＭＡＰキナーゼキナーゼ３（ＭＫＫ３）ｍＲＮＡ、完全配列）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｌ３６７１９）。
【０００９】
さらなる実施形態では、本発明は、
ａ）患者の癌領域から試験試料を得る工程と、
ｂ）ＢｕｂＲ１，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｓｉｍｉｌａｒ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ
ｋｉｎａｓｅ（ＢＵＢＲ１）ｍＲＮＡ，ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｄｓ（ＢｕｂＲ１、ホモサピエンス、プロテインキナーゼ（ＢＵＢＲ１）に類似、ｍＲＮＡ、完全配列）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＦ０４６０７９）、
Ｍａｄ２，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｍＲＮＡ  ｆｏｒ  ＭＡＤ２  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｍａｄ２、ホモサピエンスｍＲＮＡ、ＭＡＤ２タンパク質対応）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＪ０００１８６）、
Ｍｐｓ１，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＴＴＫ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ（ＴＴＫ），ｍＲＮＡ（Ｍｐｓ１、ホモサピエンスＴＴＫプロテインキナーゼ（ＴＴＫ）、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００３３１８）、
ＧＥＦＴ  ｆｏｒ  Ｒａｃ１／ＣＤＣ４２，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＲＡＣ／ＣＤＣ４２  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｆａｃｔｏｒ（ＧＥＦＴ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  ２，ｍＲＮＡ（ＧＥＦＴ、Ｒａｃ１／ＣＤＣ４２対応、ホモサピエンスＲＡＣ／ＣＤＣ４２交換因子（ＧＥＦＴ）、転写変異体２、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿１３３４８３）、
Ｂｕｂ１，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＢＵＢ１  ｂｕｄｄｉｎｇ  ｕｎｉｎｈｉｂｉｔｅｄ  ｂｙ  ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅｓ  １  ｈｏｍｏｌｏｇ（ｙｅａｓｔ）（ＢＵＢ１），ｍＲＮＡ（Ｂｕｂ１、ホモサピエンスＢＵＢ１、出芽はベンゾイミダゾール１ホモログによって阻害されず（酵母）（ＢＵＢ１）、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番
号：ＮＭ＿００４３３６）、
ｈＳｅｐｈａｒａｓｅ，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｅｘｔｒａ  ｓｐｉｎｄｌｅ  ｐｏｌｅｓ  ｌｉｋｅ  １（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＥＳＰＬ１），ｍＲＮＡ（ｈセファラーゼ、ホモサピエンス、余分紡錘体極類似１（Ｓ．セレヴィシエ）（ＥＳＰＬ１）、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０１２２９１）、
ＣａｍＫＩＩｄ，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｃａｌｃｉｕｍ／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ（ＣａＭ  ｋｉｎａｓｅ）ＩＩ  ｄｅｌｔａ（ＣＡＭＫ２Ｄ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  ３，ｍＲＮＡ（ＣａｍＫＩＩｄ、ホモサピエンス、カルシウム／カルモジュリン依存症プロテインキナーゼ（ＣａＭキナーゼ）ＩＩδ（ＣＡＭＫ２Ｄ）、転写変異体３、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００１２２１）、
ＣＤＫ６，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ  ６（ＣＤＫ６），ｍＲＮＡ（ＣＤＫ６、ホモサピエンス、サイクリン依存性キナーゼ６（ＣＤＫ６）、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００１２５９）、および
ＧＲＢ２，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｏｕｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２（ＧＲＢ２），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ（ＧＲＢ２、ホモサピエンス、成長因子受容体結合プロテイン２（ＧＲＢ２）、転写変異体１、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００２０８６）からなる群から選択される１種またはそれ以上の遺伝子マーカーのレベルを測定する工程と、
ｃ）ＧＡＰＤＨ，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤ），ｍＲＮＡ（ＧＡＰＤＨ、ホモサピエンス、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤ）、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００２０４６）、および
ＲＰＳ９，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅ  ＩＭＡＧＥ：６６４７２８３、ｐａｒｔｉａｌ  ｃｄｓ（ＲＰＳ９、ホモサピエンス、ｃＤＮＡクローンＩＭＡＧＥ：６６４７２８３、部分配列）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＢＣ０７１９４１）
からなる群から選択される１種またはそれ以上の参照遺伝子マーカーのレベルを測定する工程と、
ｄ）試験試料における前記１種またはそれ以上の遺伝子マーカーおよび前記１種またはそれ以上の参照遺伝子マーカーの測定レベルを比較する工程と
を含み、
前記１種またはそれ以上の参照遺伝子マーカーレベルと比較した場合の、前記１種またはそれ以上の遺伝子マーカーレベルの低下が、タキソイドファミリー分子に対する耐性の増加を表す、タキソイドファミリー分子に対する癌患者の応答を予測またはモニタリングするための方法に関する。
【００１０】
本発明のさらなる実施形態は、
ａ）患者の癌領域から試験試料を得る工程と、
ｂ）Ｐ２１（Ｗａｆ１），Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  １Ａ（ｐ２１，Ｃｉｐ１）（ＣＤＫＮ１Ａ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ（Ｐ２１（Ｗａｆ１）、ホモサピエンス、サイクリン依存症キナーゼ阻害因子１Ａ（ｐ２１，Ｃｉｐ１）（ＣＤＫＮ１Ａ）、転写変異体１、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０００３８９）、
Ｐｉｍ−１，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｐｉｍ−１  ｏｎｃｏｇｅｎｅ（ＰＩＭ１），ｍＲＮＡ（Ｐｉｍ−１、ホモサピエンス、ｐｉｍ−１発癌遺伝子（ＰＩＭ１）、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００２６４８）、
ＧＢＰ−１，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｇｕａｎｙｌａｔｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １，ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ，６７ｋＤａ（ＧＢＰ１）
，ｍＲＮＡ（ＧＢＰ−１、ホモサピエンス、グアニレート結合プロテイン１、インターフェロン誘導性、６７ｋＤａ（ＧＢＰ１）、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００２０５３）、
ＲＸＲＡ，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｒｅｔｉｎｏｉｄ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ａｌｐｈａ（ＲＸＲＡ），ｍＲＮＡ（ＲＸＲＡ、ホモサピエンス、レチノイドＸ受容体、α（ＲＸＲＡ）、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００２９５７）、
ＳＰＦ４５，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＲＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｔｉｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １７（ＲＢＭ１７），ｍＲＮＡ（ＳＰＦ４５、ホモサピエンス、ＲＮＡ結合モチーフプロテイン１７（ＲＢＭ１７）、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０３２９０５）、
Ｈｅｃ１，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｋｉｎｅｔｏｃｈｏｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ２（ＫＮＴＣ２），ｍＲＮＡ（Ｈｅｃ１、ホモサピエンス、動原体結合２（ＫＮＴＣ２）、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００６１０１）、
Ｒａｆ１，Ｈｕｍａｎ  ｍＲＮＡ  ｆｏｒ  ｒａｆ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ（Ｒａｆ１、ヒトｍＲＮＡ、ｒａｆ発癌遺伝子対応）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｘ０３４８４）、
Ａｕｒｏｒａ  Ａ，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ａｕｒｏｒａ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ  １（ＡＲＫ１）ｍＲＮＡ，ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｄｓ（Ａｕｒｏｒａ  Ａ、ホモサピエンス、オーロラ関連キナーゼ１（ＡＲＫ１）ｍＲＮＡ、完全配列）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＦ００８５５１）、
ＴＡＣＣ３，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ，ａｃｉｄｉｃ  ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３（ＴＡＣＣ３），ｍＲＮＡ（ＴＡＣＣ３、ホモサピエンス、形質転換性酸性コイルドコイル含有プロテイン３（ＴＡＣＣ３）、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００６３４２）、
ＲｅｌＢ，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｖ−ｒｅｌ  ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓｉｓ  ｖｉｒａｌ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ  Ｂ，ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ｋａｐｐａ  ｌｉｇｈｔ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｉｎ  Ｂ−ｃｅｌｌｓ  ３（ａｖｉａｎ）（ＲＥＬＢ），ｍＲＮＡ（ＲｅｌＢ、ホモサピエンス、ウイルス関連細網内皮症ウイルス発癌遺伝子ホモログＢ、Ｂ細胞内κ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーの核因子３（鳥類）（ＲＥＬＢ）、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００６５０９）、
ＰＲＫＣＤ，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ，ｄｅｌｔａ（ＰＲＫＣＤ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ（ＰＲＫＣＤ、ホモサピエンス、プロテインキナーゼＣ、δ（ＰＲＫＣＤ）、転写変異体１、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００６２５４）、
ＢＲＡＦ３５，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｈｉｇｈ−ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｒｏｕｐ
２０Ｂ（ＨＭＧ２０Ｂ），ｍＲＮＡ（ＢＲＡＦ３５、ホモサピエンス、高移動度グループ２０Ｂ（ＨＭＧ２０Ｂ）、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００６３３９）、
ＨＳＰＡ１Ｌ，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ７０ｋＤａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １Ａ（ＨＳＰＡ１Ａ），ｍＲＮＡ（ＨＳＰＡ１Ｌ、ホモサピエンス、熱ショック７０ｋＤａプロテイン１Ａ（ＨＳＰＡ１Ａ）、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００５３４５）、
ＳＴＫ１１，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  １１（Ｐｅｕｔｚ−Ｊｅｇｈｅｒｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＳＴＫ１１），ｍＲＮＡ（ＳＴＫ１１、ホモサピエンス、セリン／トレオニンキナーゼ１１（ポイツジェガース症候群）（ＳＴＫ１１）、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０００４５５）、および
ＭＫＫ３，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ  ３（ＭＫＫ３）ｍＲＮＡ，ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｄｓ（ＭＫＫ３、ホモサピエンス、ＭＡＰキナーゼキナーゼ３（ＭＫＫ３）ｍＲＮＡ、完全配列）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｌ３６７１９）
からなる群から選択される１種またはそれ以上の遺伝子マーカーのレベルを測定する工程と、
ｃ）ＧＡＰＤＨ，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤ），ｍＲＮＡ（ＧＡＰＤＨ、ホモサピエンス、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤ）、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００２０４６）、および
ＲＰＳ９，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅ  ＩＭＡＧＥ：６６４７２８３、ｐａｒｔｉａｌ  ｃｄｓ（ＲＰＳ９、ホモサピエンス、ｃＤＮＡクローンＩＭＡＧＥ：６６４７２８３、部分配列）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＢＣ０７１９４１）
からなる群から選択される１種またはそれ以上の参照遺伝子マーカーのレベルを測定する工程と、
ｄ）試験試料における前記１種またはそれ以上の遺伝子マーカーおよび前記１種またはそれ以上の参照遺伝子マーカーの測定レベルを比較する工程と
を含み、
前記１種またはそれ以上の参照遺伝子マーカーレベルと比較した場合の、前記１種またはそれ以上の遺伝子マーカーレベルの低下が、タキソイドファミリー分子に対する感受性の増加を表す、タキソイドファミリー分子に対する癌患者の応答を予測またはモニタリングするための方法に関する。
【００１１】
本発明は、タキソイドファミリー分子に対する癌患者の応答を予測またはモニタリングするための方法に関する。この、本発明のさらなる実施形態には、タキソイドファミリー分子であるパクリタキセル、ドセタキセルＸＲＰ９８８１およびＸＲＰ６２５８が含まれる。
【００１２】
本発明で説明される遺伝子マーカーは、以下でさらに詳細に説明される様々な方法により、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはタンパク質のレベルを測定することで評価することができる。本発明の他の実施形態は、タキソイドファミリー分子に対する患者の応答を予測またはモニタリングするためのキットに関する。
【００１３】
本発明の上記態様および他の態様、特徴、および利点は、添付図面と併せて以下の詳細な説明からさらに理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ダウンレギュレーションによりドセタキセル耐性をもたらす遺伝子の特性を示す図である。ドセタキセルは、対照ｓｉＲＮＡ（白い四角）に比べ、ＲＢ１、ＢｕｂＲ１、Ｍａｄ２およびＭｐｓ１のｓｉＲＮＡ（黒い四角）をトランスフェクトされたＨＣＴ１１６細胞に対し用量反応曲線を描いた。ＲＢ１は、スクリーニングでスコア化されなかったｓｉＲＮＡの一例であった。細胞の生存は、ＷＳＴ−１添加後、吸光度４５０ｎＭで測定した。最小比（ＭＲ）は、４０ｎＭドセタキセルにおける対照に対する遺伝子のＷＳＴ−１値である。
【図２】対照ｓｈＲＮＡ（白い四角）と比較した、ＢｕｂＲ１およびＭｐｓ１のｓｈＲＮＡ（黒い四角）の用量反応曲線を示す図である。
【図３】ＢｕｂＲ１およびＭｐｓ１のｓｈＲＮＡをそれぞれ含有する細胞におけるＢｕｂＲ１およびＭｐｓ１のｍＲＮＡレベルに関するＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲ分析を示す図である。
【図４】ドセタキセル処理の有無による、Ｍａｄ２、ＢｕｂＲ１およびＭｐｓ１のｓｉＲＮＡをトランスフェクトされたＨＣＴ１１６細胞に関する、細胞の生存および形態を示す図である。トランスフェクション２４時間後、細胞は未処理のまま（−ドセタキセル）または２００ｎＭドセタキセルで処理（＋ドセタキセル）され、処理１６時間後および７２時間後の生細胞を視覚化するためカルセイン−ＡＭで染色した。
【図５】ドセタキセル処理後、Ｍａｄ２、ＢｕｂＲ１およびＭｐｓ１および対照のｓｉＲＮＡをトランスフェクトされたＨＣＴ１１６細胞に関する、有糸分裂指数を示す図である。トランスフェクション２４時間後、細胞を、２００ｎＭドセタキセルで１６時間および７２時間処理し、処理した。有糸分裂細胞は、リン酸化ヒストンＨ３抗体により検出され、ここでは細胞核上の赤い点状染色として示された（有糸分裂指数キット、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ）。核は、ヘキスト染料により青色に染色された。
【図６】Ｍｐｓ１、ＢｕｂＲ１およびＭａｄ２のｓｉＲＮＡをそれぞれトランスフェクトされたＨＣＴ１１６細胞におけるＭｐｓ１、ＢｕｂＲ１およびＭａｄ２のｍＲＮＡに関するＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲ分析を示す図である。
【図７】３つの有糸分裂チェックポイント遺伝子ｓｉＲＮＡをトランスフェクトされたＨＣＴ１１６細胞の細胞周期分析を示す図である。Ｍｐｓ１、ＢｕｂＲ１およびＭａｄ２のｓｉＲＮＡをトランスフェクション後、細胞を未処理（−ドセタキセル）とするかまたは２００ｎＭドセタキセルで２４時間処理（＋ドセタキセル）した。ドセタキセル添加７２時間後、細胞を収集し、細胞周期を分析した。ピークを上回る数は、２Ｎ、４Ｎ、８Ｎ、１６Ｎまたは３２ＮなどのＤＮＡ量を示している。
【図８】安定したノックダウン細胞株によるコロニー形成細胞生存アッセイを示す図である。ＢｕｂＲ１またはベクター対照のｓｈＲＮＡを含有するＨＣＴ１１６細胞を、１０ｃｍ皿に播種し、５ｎＭドセタキセル中で１０日間維持した。コロニーは、ＰＢＳで洗浄し、クリスタルバイオレットで染色した。
【図９】ダウンレギュレーションによりドセタキセル感受性の増加をもたらす遺伝子のいくつかの用量反応曲線を示す図である。ドセタキセルは、対照ｓｉＲＮＡ（白い四角）に比べ、ＲＢ１、Ｐｉｍ−１、ｐ２１、Ａｕｒｏｒａ  ＡおよびＴＡＣＣ３のｓｉＲＮＡ（黒い四角）をトランスフェクトしたＨＣＴ１１６細胞に対し用量反応曲線を描いた。最小比（ＭＲ）は、４０ｎＭドセタキセル濃度における対照のＷＳＴ−１読み出し値に対する遺伝子のＷＳＴ−１読み出し値の比である。ＩＣ５０（ＩＲ）比は、対照のＩＣ５０に対する遺伝子のＩＣ５０の比である。
【図１０】ベクター対照（白い四角）と比較した、Ａｕｒｏｒａ  ＡのｓｈＲＮＡ（黒い四角）の用量反応曲線を示す図である。
【図１１】Ａｕｒｏｒａ  ＡのｓｈＲＮＡを含有する細胞におけるＡｕｒｏｒａ  ＡのｍＲＮＡレベルに関するＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲ分析を示す図である。
【図１２】対照ｓｉＲＮＡ（白い四角）と比較した、Ｐｉｍ−１およびＴＡＣＣ３のｓｉＲＮＡ（黒い四角）をトランスフェクトしたＨＣＴ１１６細胞の増殖の差を示す図である。Ｐｉｍ−１、ＴＡＣＣ３および対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクション後様々な時点で、６ウェルプレートに残存している細胞数。
【図１３】ｓｉＲＮＡトランスフェクション後、Ｐｉｍ−１およびＴＡＣＣ３のｍＲＮＡレベルに関するＴａｑＭａｎ分析を示す図である。
【図１４】Ｐｉｍ−１およびＢｕｂＲ１のｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＨＣＴ１１６細胞における活性カスパーゼ−３レベルを示す図である。活性カスパーゼ−３レベルは、活性カスパーゼ−３Ｂｅａｄｍａｔｅｓキット（Ｕｐｓｔａｔｅ）による蛍光強度として示された。３つのドセタキセル濃度、０、５および４０ｎＭ、および３つの時点であるドセタキセル添加後２４、４８および７２時間が調べられた。
【図１５】Ｐｉｍ−１およびＢｕｂＲ１のｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＨＣＴ１１６細胞におけるＡＫＴリン酸化レベルを示す図である。リン酸化ＡＫＴレベルおよび全ＡＫＴレベルの比は、ビーズベースのアッセイ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）により定量された。トランスフェクション２４時間後、細胞は未処理のままとするか、または５および４０ｎＭドセタキセルで処理した。ドセタキセル処理４８時間後、細胞溶解物を分析した。リン酸化レベルは、全ＡＫＴ（ｔ−ＡＫＴ）に対するリン酸化ＡＫＴ（ｐ−ＡＫＴ）の比として算出した。
【図１６】トランスフェクション４８時間後のＰｉｍ−１およびＢｕｂＲ１レベルの低下を示すウェスタンブロットの図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、被験対象がタキソイドファミリーの薬剤に耐性であるかまたは感受性であるかを予測することができる遺伝子マーカーの、出願者による同定に広く基づいている。細胞ベースのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）スクリーニングにより、出願者は、ドセタキセルに対する薬剤耐性または感受性が、特定の遺伝子マーカーと関連があることを認めた。
【００１６】
本明細書および特許請求の範囲を通じて、数多くの用語および語句が使用されていることが注目される。これらの用語および語句の定義は、以下の通りである。
【００１７】
本明細書では、「予後」という用語は、薬剤耐性の他、再発、転移、および腫瘍性疾患を含め、癌に起因する死または進行の予測または見込みを言う。
【００１８】
本明細書では、「予測」という用語は、患者がある薬剤または一連の薬剤に対し、好ましいまたは好ましくない応答を示す見込みを言う。また、患者が、原発腫瘍の外科的除去および／または化学療法後、癌が再発することなく一定の期間生存するかどうかなどの応答の程度も言う。本発明により想定される予測方法は、任意の特定の患者に対し、最も適切な治療法、特にタキソイドファミリーの化学療法薬を選択することにより治療決定を行うために、臨床的に用いることができる。本発明の予測方法は、患者が、所与の薬剤または薬剤併用による化学療法、および／または放射線療法などの治療法に良好に応答する見込みがあるかどうか、または化学療法もしくは他の治療法を中止した後に患者から長期生存する見込みがあるかどうかを予測する上で貴重なツールとなる。
【００１９】
本明細書では、「腫瘍」という用語は、悪性または良性にかかわらず、すべての新生細胞の成長および増殖、およびすべての前癌性および癌性の細胞ならびに組織のことを言う。
【００２０】
本明細書では、「癌」および「癌性」という用語は、一般に未制御な細胞の成長を特徴とする、哺乳類における生理的状態を言う。癌の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない。乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌および卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿管癌、癌腫、メラノーマ、膠芽細胞腫および髄芽腫を含む脳癌、胆道癌、絨毛腫、食道癌、胃癌、急性リンパ性および骨髄性白血病を含む血液腫瘍、多発性骨腫、ＡＩＤＳ関連白血病および成人Ｔ細胞白血病リンパ腫、ボーエン病およびページェット病を含む上皮内腫瘍、ホジキン病およびリンパ球性リンパ腫を含むリンパ腫、神経芽腫、扁平上皮癌を含む口腔癌、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、および骨肉腫を含む肉腫、メラノーマ、カポジ肉腫、基底細胞癌、および扁平上皮癌を含む皮膚癌、精上皮腫、非精上皮腫（奇形腫、絨毛腫）、間質腫瘍、および生殖細胞腫瘍などの生殖腫瘍を含む睾丸癌、甲状腺癌（ｔｈｙｒｏｉｄ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）および髄様癌を含む甲状腺癌（ｔｈｙｒｏｉｄ  ｃａｎｃｅｒ）、腺癌およびウイルムス腫瘍を含む腎臓癌。
【００２１】
本明細書では、「患者」という用語は、好ましくはヒトを言うが、ヒト以外の霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたはげっ歯類を含めてもよい。好ましくは、対象は、癌であることが疑われる、または癌もしくは例えば、癌の家族歴があるなど癌を発症するハイリスク群にあると診断されたヒトである。本発明の好ましい実施形態では、癌は、乳癌である。癌であることが疑われる対象を特定する方法には、指診、生検、対象の家族の病歴、対象の病歴、またはマンモグラフィー、磁気共鳴分光法、もしくは陽電子放出断層撮影法などのいくつかの画像技術を挙げることができる。癌の診断方法および癌診断の臨床特性は、医術における当業者に公知である。
【００２２】
本明細書では、「試料」とは、関連医術の当業者に公知の方法を用いて得られた組織のことである。生検などの方法には、グロスアポーショニングオブアマス（ｇｒｏｓｓ  ａｐｐｏｒｔｉｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｍａｓｓ）、マイクロダイセクション、レーザーベースのマイクロダイセクション、または他の当業者に公知の細胞分離法が含まれる。罹患組織の生検材料には、多様な細胞型、および使用される診断方法の多様な感受性があるため、分析に必要な試料サイズは、１、１０、５０、１００、２００、３００、５００、１０００、５０００、１０,０００〜５０,０００個またはこれを上回る細胞となり得る。適切な試料サイズは、細胞組成および生検条件に基づき決定することができ、この決定に関する標準的な調製工程、および次いで発明で使用するための核酸の単離は、当業者に公知である。例えば、生検からの試料は、増幅を伴わないＲＮＡ発現の評価には十分であり得る。反対に、小さな生検範囲における適切な細胞数の欠如は、核酸分子の解像度を高めるため、ＲＮＡ変換および／もしくは増幅方法または他の方法の使用が必要となり得る。限られた生検材料の使用を可能にするような方法は、当業者に公知である。いくつかの例としては、直接ＲＮＡ増幅、ＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写、ｃＤＮＡ増幅、または放射線標識された核酸の生成が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
本明細書では、試料に関する「試験」という用語は、身体の癌領域またはある病期の癌もしくは癌の特性を発現している身体の領域から採取された試料を言う。
【００２４】
本明細書では、試料に関する「対照」という用語は、比較目的で使用される試料を言う。好ましくは、これらの試料は、遺伝子発現に影響を及ぼすであろういずれかの疾患もしくは状態のいずれかの徴候、特に、該試料を基準として使用する疾患に関するいずれかの徴候を、該試料が示さない、または該試料が、遺伝子発現に影響を及ぼすであろういずれかの疾患もしくは状態を有すると考えられるという意味での「対照」である。あるいは、疾患または状態の様々な病期は、比較することができ、このような場合、「対照」試料とは、該疾患または状態の早期に相当すると理解されてよい。例えば、対照試料は、非癌性ではあるが同等の身体領域から採取することができる。さらに、対照試料は、同一対象由来の比較可能領域、または第１対象に実質的に類似した第２対象（同一のまたは類似の種、年齢、体重、性別等）由来の身体非癌領域であってよい。最後に、対照試料は、タキソイドファミリー分子を用いた治療によく応答する第２対象の癌領域由来であることもできる。
【００２５】
「核酸分子」とは、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジン、もしくはシチジン；「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、もしくはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステル多量体、または一本鎖型、もしくは二本鎖ヘリックスの、ホスホロチオエートおよびチオエステルといった、これらのいずれかのリン酸エステルアナログを言う。二本鎖のＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡヘリックスは、可能である。核酸分子、および特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子という用語は、分子の一次構造および二次構造を言うに過ぎず、いずれか特定の三次形態に限定するものではない。したがって、この用語には、特に線状または環状ＤＮＡ分子（例えば、制限断片）、プラスミド、および染色体で見られる二本鎖ＤＮＡが含まれる。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を考察する際、配列は、ＤＮＡの非転写ストランド（すなわち、ｍＲＮＡに相同な配列を有するストランド）に沿って５’から３’方向の配列のみを生成する通常の慣例に従い、本明細書では説明され得る。「組換えＤＮＡ分子」とは、分子的生物学的操作を受けたＤＮＡ分子のことである。
【００２６】
本明細書では、特定のタンパク質をコードする、単離された核酸分子の「部分」という用語は、ペプチドまたはポリペプチドをコードする、十分な数の連続した核酸を含む単離
された核酸分子の一部または断片を言う。本来、単離された核酸分子の「部分」とは、１つのヌクレオチドより大きく、以下のペプチドまたはポリペプチドの定義に記載されているように、多数のアミノ酸残基を含有するタンパク質にコードされたペプチドまたはポリペプチドのことである。
【００２７】
本明細書では、「ペプチド」という用語は、ペプチド結合により共有結合された２つまたはこれ以上のアミノ酸を言う。特定の実施形態では、ペプチドは、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも２０個、より好ましくは少なくとも３０個、さらにより好ましくは少なくとも４０個、および最も好ましくは５０個またはこれ以上のアミノ酸を含む。
【００２８】
本明細書では、「ポリペプチド」という用語は、複数の連続したアミノ酸からなる線状ポリマーを言う。特に、ポリペプチドは、１００ｋＤを超える分子量を有することができる。
【００２９】
本明細書では、「遺伝子マーカー」という用語は、試料中の測定されたＲＮＡ、ＤＮＡまたはタンパク質レベルが、タキソイドファミリーの薬剤に被験対象が耐性であるかまたは感受性であるかを予測するのに役立つ、生理学的組成物を言う。さらに、遺伝子マーカーは、特定のタンパク質をコードすることができ、または活性が、身体試料中の遺伝子マーカーレベルに関連しているタンパク質の「代理」マーカーの役目をすることができる。この関係は、順相関であり得る。この場合、タンパク質活性レベルの低下は、遺伝子マーカーレベルの低下に相当する。または、該関係は、逆相関であり得る。この場合、タンパク質活性レベルの低下は、遺伝子マーカーレベルの上昇に相当する。このような生理学的組成物には、ほんの数例を挙げると、細胞（例えば、前駆幹細胞）タンパク質、ポリペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、炭水化物、または脂肪酸があるが、これらの限定されるものではまったくない。本発明の特定の実施形態では、特定の遺伝子マーカーの測定レベルは、被験対象が、タキソイドファミリーの薬剤に耐性であるかまたは感受性であるかを予測することができる。このような遺伝子マーカーの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されるものではまったくない。
【００３０】
ＢｕｂＲ１，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｓｉｍｉｌａｒ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ（ＢＵＢＲ１）ｍＲＮＡ，ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｄｓ（ＢｕｂＲ１、ホモサピエンス、プロテインキナーゼ（ＢＵＢＲ１）に類似、ｍＲＮＡ、完全配列）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＦ０４６０７９）、
Ｍａｄ２，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｍＲＮＡ  ｆｏｒ  ＭＡＤ２  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｍａｄ２、ホモサピエンスｍＲＮＡ、ＭＡＤ２タンパク質対応）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＪ０００１８６）、
Ｍｐｓ１，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＴＴＫ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ（ＴＴＫ），ｍＲＮＡ（Ｍｐｓ１、ホモサピエンスＴＴＫプロテインキナーゼ（ＴＴＫ）、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００３３１８）、
ＧＥＦＴ  ｆｏｒ  Ｒａｃ１／ＣＤＣ４２，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＲＡＣ／ＣＤＣ４２  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｆａｃｔｏｒ（ＧＥＦＴ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  ２，ｍＲＮＡ（ＧＥＦＴ、Ｒａｃ１／ＣＤＣ４２対応、ホモサピエンスＲＡＣ／ＣＤＣ４２交換因子（ＧＥＦＴ）、転写変異体２、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿１３３４８３）、
Ｂｕｂ１，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＢＵＢ１  ｂｕｄｄｉｎｇ  ｕｎｉｎｈｉｂｉｔｅｄ  ｂｙ  ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅｓ  １  ｈｏｍｏｌｏｇ（ｙｅａｓｔ）（ＢＵＢ１），ｍＲＮＡ（Ｂｕｂ１、ホモサピエンスＢＵＢ１、出芽はベンゾイミダゾール１ホモログによって阻害されず（酵母）（ＢＵＢ１）、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００４３３６）、
ｈＳｅｐｈａｒａｓｅ，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｅｘｔｒａ  ｓｐｉｎｄｌｅ  ｐ
ｏｌｅｓ  ｌｉｋｅ  １（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＥＳＰＬ１），ｍＲＮＡ（ｈセファラーゼ、ホモサピエンス、余分紡錘体極類似１（Ｓ．セレヴィシエ）（ＥＳＰＬ１）、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０１２２９１）、
ＣａｍＫＩＩｄ，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｃａｌｃｉｕｍ／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ（ＣａＭ  ｋｉｎａｓｅ）ＩＩ  ｄｅｌｔａ（ＣＡＭＫ２Ｄ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  ３，ｍＲＮＡ（ＣａｍＫＩＩｄ、ホモサピエンス、カルシウム／カルモジュリン依存症プロテインキナーゼ（ＣａＭキナーゼ）ＩＩδ（ＣＡＭＫ２Ｄ）、転写変異体３、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００１２２１）、
ＣＤＫ６，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ  ６（ＣＤＫ６），ｍＲＮＡ（ＣＤＫ６、ホモサピエンス、サイクリン依存性キナーゼ６（ＣＤＫ６）、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００１２５９）、および
ＧＲＢ２，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｏｕｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２（ＧＲＢ２），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ（ＧＲＢ２、ホモサピエンス、成長因子受容体結合プロテイン２（ＧＲＢ２）、転写変異体１、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００２０８６）
Ｐ２１（Ｗａｆ１），Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ
ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  １Ａ（ｐ２１，Ｃｉｐ１）（ＣＤＫＮ１Ａ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ（Ｐ２１（Ｗａｆ１）、ホモサピエンス、サイクリン依存症キナーゼ阻害因子１Ａ（ｐ２１，Ｃｉｐ１）（ＣＤＫＮ１Ａ）、転写変異体１、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０００３８９）、
Ｐｉｍ−１，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｐｉｍ−１  ｏｎｃｏｇｅｎｅ（ＰＩＭ１），ｍＲＮＡ（Ｐｉｍ−１、ホモサピエンス、ｐｉｍ−１発癌遺伝子（ＰＩＭ１）、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００２６４８）、
ＧＢＰ−１，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｇｕａｎｙｌａｔｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １，ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ，６７ｋＤａ（ＧＢＰ１），ｍＲＮＡ（ＧＢＰ−１、ホモサピエンス、グアニレート結合プロテイン１、インターフェロン誘導性、６７ｋＤａ（ＧＢＰ１）、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００２０５３）、
ＲＸＲＡ，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｒｅｔｉｎｏｉｄ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ａｌｐｈａ（ＲＸＲＡ），ｍＲＮＡ（ＲＸＲＡ、ホモサピエンス、レチノイドＸ受容体、α（ＲＸＲＡ）、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００２９５７）、
ＳＰＦ４５，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＲＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｔｉｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １７（ＲＢＭ１７），ｍＲＮＡ（ＳＰＦ４５、ホモサピエンス、ＲＮＡ結合モチーフプロテイン１７（ＲＢＭ１７）、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０３２９０５）、
Ｈｅｃ１，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｋｉｎｅｔｏｃｈｏｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ２（ＫＮＴＣ２），ｍＲＮＡ（Ｈｅｃ１、ホモサピエンス、動原体結合２（ＫＮＴＣ２）、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００６１０１）、
Ｒａｆ１，Ｈｕｍａｎ  ｍＲＮＡ  ｆｏｒ  ｒａｆ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ（Ｒａｆ１、ヒトｍＲＮＡ、ｒａｆ発癌遺伝子対応）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｘ０３４８４）、
Ａｕｒｏｒａ  Ａ，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ａｕｒｏｒａ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ  １（ＡＲＫ１）ｍＲＮＡ，ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｄｓ（Ａｕｒｏｒａ  Ａ、ホモサピエンス、オーロラ関連キナーゼ１（ＡＲＫ１）ｍＲＮＡ、完全配列）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＦ００８５５１）、
ＴＡＣＣ３，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ，ａｃｉｄｉｃ  ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３（ＴＡＣＣ３），ｍＲＮＡ（ＴＡＣＣ３、ホモサピエンス、形質転換性酸性コイルドコイル含有プロテイン３（ＴＡＣＣ３）、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００６３４２）、
ＲｅｌＢ，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｖ−ｒｅｌ  ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓｉｓ  ｖｉｒａｌ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ  Ｂ，ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ｋａｐｐａ  ｌｉｇｈｔ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｉｎ  Ｂ−ｃｅｌｌｓ  ３（ａｖｉａｎ）（ＲＥＬＢ），ｍＲＮＡ（ＲｅｌＢ、ホモサピエンス、ウイルス関連細網内皮症ウイルス発癌遺伝子ホモログＢ、Ｂ細胞内κ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーの核因子３（鳥類）（ＲＥＬＢ）、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００６５０９）、
ＰＲＫＣＤ，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ，ｄｅｌｔａ（ＰＲＫＣＤ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ（ＰＲＫＣＤ、ホモサピエンス、プロテインキナーゼＣ、δ（ＰＲＫＣＤ）、転写変異体１、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００６２５４）、
ＢＲＡＦ３５，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｈｉｇｈ−ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｒｏｕｐ
２０Ｂ（ＨＭＧ２０Ｂ），ｍＲＮＡ（ＢＲＡＦ３５、ホモサピエンス、高移動度グループ２０Ｂ（ＨＭＧ２０Ｂ）、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００６３３９）、
ＨＳＰＡ１Ｌ，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ７０ｋＤａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １Ａ（ＨＳＰＡ１Ａ），ｍＲＮＡ（ＨＳＰＡ１Ｌ、ホモサピエンス、熱ショック７０ｋＤａプロテイン１Ａ（ＨＳＰＡ１Ａ）、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００５３４５）、
ＳＴＫ１１，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  １１（Ｐｅｕｔｚ−Ｊｅｇｈｅｒｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＳＴＫ１１），ｍＲＮＡ（ＳＴＫ１１、ホモサピエンス、セリン／トレオニンキナーゼ１１（ポイツジェガース症候群）（ＳＴＫ１１）、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０００４５５）、および
ＭＫＫ３，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ  ３（ＭＫＫ３）ｍＲＮＡ，ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｄｓ（ＭＫＫ３、ホモサピエンス、ＭＡＰキナーゼキナーゼ３（ＭＫＫ３）ｍＲＮＡ、完全配列）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｌ３６７１９）
【００３１】
本明細書では、「参照遺伝子マーカー」という用語は、測定されたＲＮＡ、ＤＮＡまたはタンパク質レベルが、タキソイドファミリーの薬剤への曝露前、曝露中、曝露後で変化しないままである生理学的組成物を言う。「参照遺伝子マーカー」は、ハウスキーピング遺伝子と呼ばれている。これらは、例えば、癌など特定の疾患で検討されている系における比較的不変の発現レベルに基づき、選択される遺伝子である。ハウスキーピング遺伝子は、発現結果を標準化するのに使用される。このような遺伝子マーカーの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されるものではまったくない。
ＧＡＰＤＨ，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤ），ｍＲＮＡ（ＧＡＰＤＨ、ホモサピエンス、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤ）、ｍＲＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００２０４６）、および
ＲＰＳ９，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅ  ＩＭＡＧＥ：６６４７２８３、ｐａｒｔｉａｌ  ｃｄｓ（ＲＰＳ９、ホモサピエンス、ｃＤＮＡクローンＩＭＡＧＥ：６６４７２８３、部分配列）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＢＣ０７１９４１）
【００３２】
本明細書では、「タキソイドファミリー分子」という用語は、タキサンファミリーに属する化学療法化合物の１つのクラスを言う。タキソイドファミリーの具体的なメンバーには、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテール）およびこれらのアナログ（すなわち、ＸＲＰ９８８１およびＸＲＰ６２５８；ＯｊｉｍａおよびＧｅｎｅｙ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ  ４：７３７頁、２００４年参照）が挙げられるが、これらに限定されない。分子のこのクラスは、ベータ−チューブリン結
合剤であり、ドセタキセルに類似した微小管の重合型を安定させるため、本明細書に記載されたバイオマーカーの臨床的発現は、これら薬剤と類似の反応状態を反映することが予測される。
【００３３】
本明細書では、「分子」、「化合物」または「物質」という用語は、現在知られている、または後に発見されるいずれかの組成物を言う。本明細書で適用となる化合物または物質の例には、有機化合物（例えば、人工、天然および光学活性の）、ペプチド（人工、天然、および光学活性の、すなわち、Ｄアミノ酸またはＬアミノ酸）、炭水化物、核酸分子などがある。
【００３４】
本明細書では、「ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー」または「ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーション」とは、当業者により容易に定量可能な条件を言い、一般には、プローブの長さ、洗浄温度、および塩分濃度に依存する経験的計算のことである。一般に、プローブが長いほど、適切なアニールには高温を要し、プローブが短いほど、低温を要する。ハイブリダイゼーションは一般に、相補鎖が、これらの溶解温度を下回る環境で存在する場合の、変性ＤＮＡの再アニール能に依存する。プローブとハイブリダイゼーション可能な配列との間の所望のホモロジー程度が高いほど、使用され得る相対温度は上昇する。その結果、相対温度が高いほど、反応条件はより厳密になり、相対温度が低いほど、反応条件は厳密でなくなる傾向になるであろう。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーに関するさらなる詳細および説明は、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、（１９９５年）を参照されたい。
【００３５】
本明細書では、「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」とは、以下のようなパラメータを言う：（１）例えば０.０１５Ｍ塩化ナトリウム／０.００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０.１％ドデシル硫酸ナトリウムを５０℃で洗浄するため、低イオン強度および高温を用いるパラメータ；（２）ハイブリダイゼーション中に、例えば、０.１％ウシ血清アルブミン／０.１％フィコール／０.１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を含む５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドなどのホルムアミドといった変性剤を、ｐＨ６.５にて７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムと共に４２℃で用いるパラメータ；または（３）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０.７５Ｍ  Ｎａｃｌ、０.０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６.８）、０.１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波破砕されたサケ精子ＤＮＡ（５０.ｍｕ.ｇ／ｍｌ）、０.１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを４２℃で用いる溶液中で一晩ハイブリダイゼーションし、０.２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中で４２℃にて１０分間洗浄した後、ＥＤＴＡを含有する０.１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄を５５℃で１０分間行うパラメータ。中程度にストリンジェントな条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年に記載されているように同定することができ、洗浄液および上述のものほどストリンジェントでないハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度および％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度にストリンジェントな条件の例は、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７.６）、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０ｍｇ／ｍｌ変性剪断されたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で３７℃にて一晩インキュベーションした後、１×ＳＳＣ中で約３７〜５０℃にてフィルターを洗浄することである。当業者であれば、プローブの長さ等など要素を調整するため必要に応じて温度、イオン強度等を調整する方法がわかるであろう。核酸をハイブリダイズするための適切なストリンジェンシーは、核酸の長さおよび相補性の程度、当技術分野で公知の変数に依存している。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が高いほど、これらの配列を有する核酸をハイブリダイズするためのＴｍ値は高くなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性（高いＴｍに相当）は、以下の順で低下する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。好ましくは、ハイブリダイズ可能な核酸の最小の長さは、少なくとも約１２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約１６ヌクレオチド、より好ましくは長さは、少なくとも約２４ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも３６ヌクレオチドである。
【００３６】
本明細書では、「標識」または「検出可能な標識」とは、「標識された」抗体、オリゴヌクレオチドまたは他の有機分子を生成するため、抗体、オリゴヌクレオチドまたは他の有機分子に直接的または間接的に結合された、検出可能な標識化合物または組成物を言う。標識は、これ自体（例えば、放射性同位元素または蛍光標識）により検出することができ、または、酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物または組成物の化学変換を触媒することができる。
【００３７】
本明細書では、「直接標識」とは、自然状態では、肉眼で、または光学フィルターおよび／もしくは応用刺激（例えば、蛍光を促すための紫外線）の助けにより、容易に可視可能な、実体を言う。例としては、着色標識、金属ゾル粒子、染料ゾル粒子、染色されたラテックスまたはリポソームに封入された色素が挙げられる（米国特許第４,３１３,７３４号、米国特許第４,３７３,９３２号、ＷＯ８８／０８５３４、ＥＰ−Ａ０  ２８０  ５５９、ＥＰ−Ａ０  ２８１  ３２７、米国特許第４,７０３,０１７号により記載されている）が、これらに限定されない。他の直接標識には、ラジオヌクレオチド、放射線不透過性物質、蛍光部分または発光部分がある。
【００３８】
本明細書では、「間接標識」とは、本発明により使用することもできる酵素を言う。イムノアッセイに結合される酵素の様々な種類は、当技術分野で公知の、例えば、アルカリホスファターゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼ、リゾチーム、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、乳酸脱水素酵素、ウレアーゼであり、これらおよびその他の物は、Ｅｖａ  Ｅｎｇｖａｌｌ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ＥＬＩＳＡ  ａｎｄ  ＥＭＩＴ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、７０：４１９〜４３９頁（１９８０年）および米国特許第４,８５７,４５３号に詳細に説明されている。
【００３９】
本明細書では、「キット」という用語は、１種またはそれ以上の容器、および該容器上のまたは該容器に関連したラベルまたは添付文書を含む製品を言う。好ましい実施形態では、容器は、検出可能な標識された抗体、検出可能な標識された抗体断片または検出可能な標識されたオリゴヌクレオチドを含有することができる。別の実施形態では、容器は、身体試料から全ＲＮＡを得、該全ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを得、一方または両方のプライマーが検出可能な標識された１組のプライマーを用いて、該ｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応にかけるための手段を提供する。キットの別の容器には、例えば、希釈剤および緩衝剤、対照抗体、オリゴペプチドまたは小さな有機分子を含有するものが含まれてよい。ラベルまたは添付文書は、組成物の説明の他、保存指示およびインビトロ使用または診断的使用目的の指示を提供することができる。
【００４０】
さらに、本発明により、当業者には従来型の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡの技法が使用することができる。このような技術は、文献で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９年）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（本明細書では「Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年」）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩおよびII巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５年）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＭＪ  Ｇａｉｔ編、１９８４年）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５年）］；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４年）］；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、（１９８６年）］；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ［ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、（１９８６年）］；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４年）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４年）を参照されたい。
【００４１】
一般に、ＲＮＡｉ技術は、合成のまたはベクターにより生成された二本鎖ＲＮＡを用いて、相同な配列を含有するｍＲＮＡの分解を誘発する（ＭｃＭａｎｕｓおよびＳｈａｒｐ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  ３：７３７頁、２００２年）。ＲＮＡｉスクリーニングは、シノラブディスエレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）（Ｓｉｍｍｅｒら、ＰｌｏＳ  Ｂｉｏｌ  １：Ｅ１２頁、２００３年）、ショウジョウバエ（Ｌｕｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９：２０３９頁、２００３年）および哺乳類細胞（Ａｚａ−Ｂｌａｎｃら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  １２：６２７頁、２００３年）など多くの生物における遺伝子機能を解明するために使用されている。
【００４２】
本発明では、ＨＣＴ１１６結腸癌細胞は、ほとんどがキナーゼファミリーメンバーを含む、１０１種の癌関連遺伝子に対するｓｉＲＮＡをスクリーニングするために使用され、ドセタキセルの死滅効果は、高分解能の用量反応曲線により定量した。このアプローチを用いて、出願者は、ＢｕｂＲ１、Ｂｕｂ１、Ｍａｄ２、Ｍｐｓ１およびＧＥＦＴ  Ｒａｃ／ＣＤＣを含む、９種類の遺伝子の過少発現が、ドセタキセルによる死滅を阻害することができるのに対し、Ｐｉｍ１、ｐ２１、ＴＡＣＣ３およびＡｕｒｏｒａ−Ａを含む、１５種類の他の遺伝子の過少発現は、ドセタキセル誘導細胞死を促進することができることを明らかにした。
【００４３】
故に、本発明は、ドセタキセルを服用している、または服用を検討している個人が、該薬剤に耐性となるかまたは感受性となるかを特定するのに使用することができる診断方法およびキットにまで広範に及ぶ。
【００４４】
出願者は、薬剤耐性が、ＢｕｂＲ１、Ｂｕｂ１、Ｍａｄ２、Ｍｓｐ１およびＧＥＦＴ  Ｒａｃ／ＣＤＣを含む、幅広いチェックポイント遺伝子の欠損に関連していることにより、ドセタキセルに対する薬剤耐性を観察した。
【００４５】
ドセタキセル感受性の増加は、ＧＢＰ−１、ＳＴＫ１１、ＲＸＲＡ、Ｈｅｃ１、ＳＰＦ４５、Ｒａｆ１、ＲＥＬＢ、ＭＫＫ３、ＰＲＫＣＤ、ＨＳＰＡ１Ａ、ＢＲＡＦ３５、Ａｕｒｏｒａ−Ａ、Ｐｉｍ−１、ＴＡＣＣ３およびｐ２ｌｗａｆ１／Ｃｉｐ１を含む、いくつかの遺伝子のいずれか１つの欠損に相当し、これらの遺伝子に対する阻害剤は、ドセタキセル療法に対する有益な補助剤として働くことができる。
【００４６】
有糸分裂チェックポイント遺伝子は、姉妹染色体の動原体が、紡錘体に適切に接着され、赤道で整列されるまで、Ｃｄｃ２０−ＡＰＣ（後期促進複合体）の阻害により有糸分裂後期を遅延させるための二重安全機構（ｆａｉｌｓａｆｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）の役目をする（Ｚｈｏｕら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１５：３５４７頁、２００２年）ため、細胞が、ＤＮＡの正確な相補体を伴って有糸分裂を確実に終了し、別の細胞周期に確実に入ることを可能にする。微小管阻害剤の存在下では、有糸分裂から出た細胞は、もはやこれらの染色体を適切に分離することができず、一般的にはすぐに、またはいくつかの細胞周期後にアポトーシスを引き起こす（ＴａｙｌｏｒおよびＭｃＫｅｏｎ、Ｃｅｌｌ  ８９：７２７頁、１９９７年）。微小管阻害剤とＢｕｂＲ１などの有糸分裂チェックポイント遺伝子欠損との組合せは、細胞が、アポトーシスを引き起こすことなく有糸分裂の停止を逃れ、染色体安定性（ＣＩＮ）および異数性をもたらすことを可能にする（Ｓｈｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ４：４８３頁、２００３年）。最近では、薬剤耐性データは、微小管阻害剤パクリタキセルが、ＢｕｂＲ１およびＭａｄ２をダウンレギュレートされたＭＣＦ−７細胞を治療するのに使用された際に得られた（Ｓｕｄｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６４：２５０２頁、２００４年）。
【００４７】
Ｐｉｍ−１遺伝子は、関連キナーゼの小さなファミリーに属するセリン／スレオニンキナーゼをコードしている。Ｐｉｍ−１の機能は、増殖、分化、アポトーシス、腫瘍形成、低酸素症、血管形成および有糸分裂に関連している（Ｗａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １５９３：４５頁、２００２年）。顕微鏡画像データは、ＡＫＴ低リン酸化データおよびカスパーゼ３活性測定値の上昇と共に、Ｐｉｍ−１ダウンレギュレーションが、細胞生存を媒介するＡＫＴシグナル伝達を不活化することにより、ドセタキセル誘導アポトーシスを増強することを示している。Ｐｉｍ−１およびｐ２１は、ＨＣＴ１１６細胞の感作において、ドセタキセルにきわめて類似した特性を有する。これは、ｐ２１が、Ｐｉｍ−１のリン酸化基質であることを示す複数の報告と一致する（Ｗａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １５９３：４５頁、２００２年）。Ｐｉｍ−１ダウンレギュレーションは、ドセタキセル非存在下でいくつかのアポトーシスを誘発するが、薬剤存在下でより効果的であったのに対し、形質転換酸性コイルドコイルタンパク質ＴＡＣＣ３のダウンレギュレーションは、ドセタキセル非存在下で細胞死を誘発せず、ＲＮＡｉだけでは細胞増殖に影響しないことを示した。これらの結果は、異なるタンパク質の枯渇は、ドセタキセルに対し細胞を感作させるための異なる機序を惹起することができることを示唆している。
【００４８】
したがって、本発明の１つの態様では、表ＩおよびＩＩに記載された１種またはそれ以上の遺伝子の活性化、およびこれらの遺伝子のタンパク質レベルは、治療処置方法を選択し、選択された治療方法の有効性をモニターするために利用することができる。
【００４９】
特定の実施形態では、化学療法の過程において、表ＩおよびＩＩに示された１種またはそれ以上の遺伝子の活性化レベルをモニターして、患者に対する化学療法の有効性を評価し予測する方法が提供される。腫瘍（例えば、乳腺腫瘍、結腸腫瘍、非小細胞肺腫瘍、および胃腫瘍）からの生検、または未診断癌患者もしくは現在治療を行っている患者からの腫瘍生検の短期培養は、表ＩおよびIIに記載された遺伝子またはこれらのサブセットの、遺伝子活性化レベルもしくはタンパク質レベルを評価するためのＤＮＡ（Ｈａｆｎｅｒら、Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ  １２７：１２２１頁、２００３年；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０：５７８５頁、２００４年）、メッセンジャーＲＮＡ（Ｃｈａｎｇら、Ｌａｎｃｅｔ  ３６２：３４０頁、２００３年）および／またはタンパク質（Ｅｓｐｉｎａら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２９０：１２１頁、２００４年）を単離するために処理される。遺伝子転写およびタンパク質発現プロファイリングは、可能性のある治療戦略に対する患者の応答の診断、予測に実用性を有し、患者の治療応答をモニターするための有用なツールになることができる。
【００５０】
本発明により、ＲＮＡは、当技術分野で一般に使用される入手可能な方法のいずれかを用いて、腫瘍試料から単離することができる（Ｕｌｌｍａｎｎら、Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  ９：９５頁、２００４年；Ｂａｄｉｅｅら、ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
３：２３頁、２００３年）。被験対象由来の１種またはそれ以上の細胞を得て、ＲＮＡ
を、これらの細胞から単離する。例えば、末梢血白血球（ＰＢＬ）細胞は、対象から得られることができ、または細胞試料を得て、該試料を所望の細胞型に濃縮することも可能である。細胞は、所望の細胞型上にある特定のエピトープに結合する抗体を用いた細胞分離など、様々な技法を用いて細胞混合物から分離することができる。所望の細胞が、固形組織内にある場合、特定の細胞は、例えば、マイクロダイセクションまたはレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）により切断することができる（Ｂｏｎｎｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８：１４８１頁、１９９７年；Ｆｅｎｄら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈ  １５４：６１頁、１９９９年）。ＲＮＡは、様々な方法、例えば、チオシアン酸グアニジウム溶解に続くＣｓＣｌ遠心分離により、組織または細胞試料から抽出することができる（Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １８：５２９４頁、１９７９年）。単一細胞由来のＲＮＡは、単一細胞由来のｃＤＮＡライブラリの製造方法に記載されているように得られることができる（Ｄｕｌａｃ、Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．３６：２４５頁、１９９８年）。ＲＮＡ試料は、さらに特定の種に関して濃縮することができる。１つの実施形態では、例えば、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、ＲＮＡ試料から単離することができる。特に、ポリ−Ｔオリゴヌクレオチドは、固体担体に固定化させ、ｍＲＮＡの親和性リガンドとして働くことができる。このためキットは、例えば、ＭｅｓｓａｇｅＭａｋｅｒキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、グランドアイランド、ＮＹ）などが市販されている。濃縮は、例えば、プライマー特異的ｃＤＮＡ合成、またはｃＤＮＡ合成に基づく複数回の線形増幅およびテンプレート特異的インビトロ転写により、実現することができる（Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：９７１７頁、１９８９年；Ｄｕｌａｃら、上記参照）。
【００５１】
例えば、ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０頁、１９８９年）、自律配列複製法（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＳＲ）、（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８７：１８７４頁、１９９０年）、核酸配列ベースの増幅法（ＮＡＳＢＡ）および転写増幅法（Ｋｗｏｈら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：１１７３頁、１９８９年）を含む、様々な増幅方法が、本発明の方法に使用するのに適している。ＰＣＲ技術の方法は、当技術分野に公知である（例えば、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ編、Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ.、Ｎ．Ｙ.、１９９２年）、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ.、１９９０年）参照）。
【００５２】
ＲＮＡは、当業者に公知のいずれかの方法、例えば、アフィメトリックス社製のもののようなマイクロアレイにより検出するために標識することができる。ＲＮＡは、シアニン−３またはシアニン−５（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＭＰＳ５４４００１ＫＴ）などの色素による直接ＲＮＡ標識といった、一般に使用されている方法のいずれかを用いて、ハイブリダイゼーションにより標識し、検出する。さらなる方法には、シアニン−３またはシアニン−５（Ｂａｄｉｅｅ  Ａ、２００３年）、フルオレセインもしくはアレクサ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、または他のフルオロフォアで標識された核酸による逆転写により行われる、直接ｃＤＮＡ標識がある。さらに、ＦａｉｒＰｌａｙ（商標）／アミノアリル標識（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  カタログ番号：２５２００２）、３ＤＮＡデンドリマー標識（Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ  Ｉｎｃ）または酵素的シグナル増幅（ＭＩＣＲＯＭＡＸ  ＴＳＡ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）などの間接ｃＤＮＡ標識を利用することができる。あるいは、ＲＮＡは、酵素、フルオレセイン、放射性または発光する方法により検出されるＲＮＡプローブを用いて定量することができる。
【００５３】
本発明の１つの態様では、ＲＮＡを、腫瘍試料から得、Ｔａｑｍａｎ技術を、遺伝子マーカーの検出に使用する。プライマーは、表ＩおよびＩＩに指定された特定のＲＮＡまたはこれらのサブセットを検出するために作成され、逆転写酵素により増幅される。逆転写により増幅された特定断片の検出は、ゲル電気泳動、ポリマー電気泳動、直接ＤＮＡシークエンシング、光検出、フルオレセインシグナルの消失、酵素反応、または相補的ＲＮＡへのハイブリダイゼーションによる検出により実現される。
【００５４】
本発明の別の態様では、リアルタイムＰＣＲを利用して、オリゴヌクレオチドを検出する。腫瘍試料から得たｍＲＮＡは、ｃＤＮＡへ逆翻訳される。プライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応技術を用いて、表ＩおよびIIに指定された特定のＲＮＡまたはこれらのサブセットを増幅するために作成される。ｍＲＮＡレベルの検出は、ゲル電気泳動および臭化エチジウムもしくはＣＹＢＲグリーン染色により、またはポリメラーゼにより放出される、フルオロフォア標識された配列特異的プローブからの蛍光強度を測定することで実現される。
【００５５】
本発明のさらなる態様では、ノーザンブロッティング技術を利用する。ＲＮＡを、腫瘍試料から得、次いでゲル電気泳動により分離し、膜に移す。ＲＮＡ量は、Ｐ32などの放射性同位元素で標識されたプローブを用いたハイブリダイゼーション、または酵素ベースの発色もしくは発光アッセイにより定量する。
【００５６】
本発明のさらに別の態様では、遺伝子量は、転写レベルの代理指標として使用することができる。表ＩおよびＩＩの転写物またはこれらのサブセットの遺伝子量を、定量的に測定し、腫瘍がドセタキセル療法に対し応答性となるか否かを評価することができる（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０：５７８５頁、２００４年）。この評価は、ネオアジュバント（術前の治療）療法の前に行うことができ、患者が応答者に分類されれば、患者をドセタキセルで治療し、患者が非応答者に分類されれば、別の化学療法剤を投与することができる。
【００５７】
ＤＮＡは、患者の腫瘍生検から抽出し、当業者により行われているような方法を用いて汚染物質を除去するために精製する。腫瘍ＤＮＡにおける遺伝子量の定量に使用される方法には、定量的ＰＣＲ、ゲノムＤＮＡチップ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションまたはサザンブロットがある（Ｈａｆｎｅｒら、Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ
１２７：１２２１頁、２００３年；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０：５７８５頁、２００４年）が、これらに限定されない。したがって、これらの方法は、表ＩおよびIIにおける１種またはそれ以上の遺伝子のコピー数を定量するのに使用することができ、対照試料または参照マーカーと比較することができる。
【００５８】
本発明のさらに別の態様では、タンパク質レベルを、転写レベルの代理測定値として使用する。タンパク質レベルは、転写レベルの抑制または上昇に相当することが明らかにされている。したがって、本発明は、表ＩおよびIIの転写物にコードされたポリペプチド産物に相当するタンパク質のレベルを測定する技法を包含する。タンパク質を検出し、ドセタキセルに対する予測的応答マーカーとして使用する。タンパク質検出方法は、当技術分野で公知である。例えば、イムノアッセイは、抗体を用いて標的タンパク質の発現を検出する方法である。
【００５９】
特定の実施形態では、表ＩおよびIIに列挙された１種またはそれ以上の遺伝子のタンパク質産物を検出するために、イムノアッセイを使用する。さらに、表ＩおよびＩＩに列挙されたタンパク質のいずれか１種に対する抗体は、いくつかの他の検出方法で使用することができる。これらの検出方法には、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡアッセイ、サンドイッチＥＬＩＳＡ。あるいは、抗体を使用
しない他のアッセイが考えられ、表ＩおよびIIの転写物（例えば、アプタマー）にコードされたタンパク質を認識するＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリペプチドを利用するアプローチが挙げられる。タンパク質分解切断後にペプチド断片の正確な分子量を定量して、ポリペプチドの組成を判定する生物学的試料の質量分析もまた、使用することができる。
【００６０】
本発明はさらに、酵素、フルオロフォアを含む適切な標識を包含する（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、テキサスレッド（ＴＲ）、ローダミン、遊離またはキレート化ランタニド系列の塩、クロモフォア、放射性同位元素、キレート剤、色素、コロイド金、ラテックス粒子、リガンド（例えば、ビチオン）、および化学発光剤）。
【００６１】
本発明の別の態様では、使用される放射性標識は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ，５８Ｃｏ，５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、および１８６Ｒｅなどのアイソトープであってよい。放射能レベルの定量化は、現在既知の利用可能な計数方法を介して行うことができる。反対に、放射線不透過性物質の使用を用いてもよい。標識が酵素である実施形態では、検出は、当技術分野で公知の、現在利用されている熱量測定法、分光光度法、蛍光分光光度法、アンペロメトリック法またはガス定量法のいずれかにより実現することができる。
【００６２】
本発明のさらなる態様は、抗体または抗体断片などのペプチド結合剤の使用である。抗体には、従来方法により製造されるポリクローナルおよびモノクローナル抗体がある。抗体分子のごく小さな部分であるパラトープは、このエピトープへの抗体の結合に関与している（一般には、Ｃｌａｒｋ，Ｗ．Ｒ（１９８６年）、Ｔｈｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｏｄｅｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ.、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｒｏｉｔｔ，Ｌ（１９９１年）、Ｅｓｓｅ
ｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第７版、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｏｘｆｏｒｄ参照）。例えば、ｐＦｃ’およびＦｃ領域は、補体カスケードのエフェクターであるが、抗原結合に関与しない。ｐＦｃ’領域が、酵素により切断された抗体、またはｐＦｃ’領域なしで生成され、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントと称される抗体は、無処置の抗体の２つの抗原結合部位を保持する。したがって、本発明の１つの実施形態は、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントなどの検出可能な標識された抗体フラグメントを利用する。同様に、Ｆｃ領域が、酵素により切断された抗体、またはＦｃ領域なしで生成され、Ｆａｂフラグメントと称される抗体は、無処置の抗体分子の抗原結合部位の１つを保持する。Ｆａｂフラグメントは、共有結合抗体軽鎖および抗体重鎖を意味するＦｄの一部から成る。Ｆｄフラグメントは、抗体特異性の主要な決定因子であり（単一のＦｄフラグメントは、抗体特異性を変更することなく、１０種類の異なる軽鎖に関連することができる）、Ｆｄフラグメントは、単独でエピトープ結合能を保持することができる。
【００６３】
当技術分野で公知の通り、抗体の抗原結合部分には、抗原のエピトープと直接相互作用する相補性決定領域（ＣＤＲ）、およびパラトープの３次構造を維持するフレームワーク領域（ＦＲ）がある（一般的には、Ｃｌａｒｋ、１９８６年；Ｒｏｉｔｔ、１９９１年参照）。ＩｇＧ免疫グロブリンの重鎖Ｆｄフラグメントおよび軽鎖フラグメントのどちらにも、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）によりそれぞれ隔てられる４つのフレームワーク領域（ＦＲ１〜ＦＲ４）がある。ＣＤＲ、および特にＣＤＲ３領域、およびより特別には重鎖ＣＤＲ３は、大部分が抗体特異性に関与している。哺乳類抗体の非ＣＤＲ領域は、オリジナル抗体のエピトープ特異性を保持しつつ、同種または異種特異的抗体の類似の領域と置換することができることは、現在当技術分野でよく知られている。これは、非ヒトＣＤＲが、ヒトＦＲおよび／またはＦｃ／ｐＦｃ’領域に共有結合されて機能的抗体を生成する「ヒト化」抗体の開発および使用において最も明白に示されている（米国特許第４,８１６,５６７号、第５,２２５,５３９号、第５,５８５,０８９号、第５,６９３,７６２号および第５,８５９,２０５号参照）。
【００６４】
完全なヒトモノクローナル抗体も、ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子座の大部分のトランスジェニックマウスを免疫することで製造することができる。これらのマウス（例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ）、ＨｕＭＡｂマウス（Ｍｅｄａｒｅｘ／ＧｅｎＰｈａｒｍ））を免疫化後、モノクローナル抗体は、標準的ハイブリドーマ技術により製造することができる。これらのモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンアミノ酸配列を有するため、ヒトに投与された場合にヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応を惹起することはないであろう。
【００６５】
したがって、本発明はまた、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖおよびＦｄフラグメント；Ｆｃおよび／またはＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が、ヒトまたは非ヒト相同配列で置換されたキメラ抗体；ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が、ヒトまたは非ヒト相同配列で置換されたキメラＦ（ａｂ’）２フラグメント抗体；ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が、ヒトまたは非ヒト相同配列で置換されたキメラＦａｂフラグメント抗体；ならびにＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２領域が、ヒトまたは非ヒト相同配列で置換されたキメラＦｄフラグメント抗体も包含することは、当業者には容易に明らかである。本発明にはまた、いわゆる一本鎖抗体も含まれる。
【００６６】
本発明は、本発明の見本として提供される以下の実施例を参照することで、より理解することができるが、これに限定されない。実施例は、本発明の好ましい実施形態を十分に説明するために示される。しかし、これらは、本発明の幅広い範囲を限定するものとして解釈されるべきではまったくない。
【実施例】
【００６７】
〔実施例１〕
ｓｉＲＮＡスクリーニング
ドセタキセル処理に対し細胞をより耐性または感受性にする遺伝子を同定するため、用量反応曲線を作成するための様々なドセタキセル濃度を用いて、ＨＣＴ１１６細胞中において１０１種類の遺伝子に対するｓｉＲＮＡをスクリーニングした。ヒト結腸癌細胞株ＨＣＴＴ１１６は、ＡＴＣＣから入手し、１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、４ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１０％胎児ウシ血清を補充したＭｃＣｏｙ  ５Ａ中で、３７℃にて９５％ＣＯ２および５％Ｏ２で培養した。ｓｉＲＮＡのリストは、遺伝子発現プロファイリング実験（Ｃｈａｎｇら、Ｌａｎｃｅｔ  ３６２：３６２頁、２００３年）で検出されたようなドセタキセル耐性乳腺腫瘍において過剰発現されたものを含む、癌関連遺伝子で構成された。さらなる基準は、標的が創薬に適していることであった。全体的なスキームを以下にまとめた。第１日目、ＨＣＴ１１６細胞を、９６ウェルフォーマットでウェルあたり５，０００細胞にてプレーティングし、翌日、遺伝子あたり３〜４ｓｉＲＮＡプールでトランスフェクトした。使用したｓｉＲＮＡの代表的試料を、表ＩおよびＩＩに示した。リポフェクタミン２０００（インビトロゲン）を用いて、ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を９６ウェルプレートのＨＣＴ１１６細胞にトランスフェクトした。第３日目、ｓｉＲＮＡを除去し、ドセタキセルを、０〜４０ｎＭの濃度で添加した。第６日目、細胞の生存を、ＷＳＴ−１アッセイにより定量した。これは、生存細胞に存在するミトコンドリアのデヒドロゲナーゼ活性をモニターするアッセイである。デヒドロゲナーゼ活性は、テトラゾリウム塩ＷＳＴ−１の開裂をもたらし、フォルマザンを形成する。アッセイ当日、培地を９６ウェルプレートから除去した。ＷＳＴ−１試薬（Ｒｏｃｈｅ）を、ＭｃＣｏｙ  ５Ａ培地で１０倍に希釈し、１００ｕｌを各ウェルに添加した。プレートを次いで、４０〜８０分間、３７℃にてインキュベートした後、ＳｐｅｃｔｒｏＭａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で４５０ｎｍにて読み取った。ＷＳＴ−１値は、実験ｓｉＲＮＡの対照ｓｉＲＮＡに対する比を計数して階層的にクラスター化し、下記の表ＩＩＩに示したように、合計１５遺伝子を感受性を付与するもの、９遺伝子を耐性を付与するものとして特徴づけた。感受性および耐性集団を、さらに別の群に分けた：１）ｓｉＲＮＡ効果が、低濃度ドセタキセル（１〜６ｎＭ）で観察され、ＩＣ５０がシフトした群、または２）主な効果は、高濃度（＞６ｎＭ）で観察され、ＩＣ５０のシフトがより小さかった群。
【００６８】
Ｍａｄ２、ＢｕｂＲ１およびＭｐｓ１のｓｉＲＮＡに比べ、Ｇｒｂ２、ＣＤＫ６、セファラーゼ、およびカルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩデルタ（ＣａｍＫＩＩＤ）を標識するｓｉＲＮＡは、より低濃度（１〜６ｎＭ）のドセタキセルでより顕著な効果を示し、ＩＣ５０に特徴的なシフトが見られた。全体に、このサブグループは、有糸分裂チェックポイント遺伝子より弱い耐性を示し、ＣａｍＫＩＩＤのｓｉＲＮＡは、対照細胞に対し２倍となる、最も高い保護レベルを示した。これらのデータは、４つの有糸分裂チェックポイント遺伝子は、いくつかの他の遺伝子と共に様々な程度でドセタキセル耐性を増加させることができることを示した。図１のデータは、ｓｉＲＮＡをトランスフェクトされた後、様々な濃度のドセタキセルに曝露された細胞の、いくつかの特徴的な用量反応曲線を示している。ＢｕｂＲ１、Ｂｕｂ１、Ｍａｄ２、およびＭｓｐ１（Ｂｕｂ１のデータは不図示）を含む、４つの有糸分裂チェックポイント遺伝子の他、Ｒａｃ／Ｃｄｃ４２のグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦＴ）に対するｓｉＲＮＡは、効果が高ドセタキセル濃度（６＞ｎＭ）でより顕著となり、有意なドセタキセル耐性を示した。最大の耐性レベルを示したのは、Ｍａｄ２であり、細胞の生存が、細胞をトランスフェクトされた対照ｓｉＲＮＡに比べて５倍に増加していた。ｓｉＲＮＡの大半は、スクリーニングでスコア化されず、ここでは本発明者は、代表例としてヒト網膜芽細胞腫１（ＰＢ１）を示している。
【００６９】
以上のことから、これらの結果は、遺伝子発現のダウンレギュレーションが、ドセタキセル処理から細胞をいかに感作または保護し、濃度に応じて、様々な作用機序をいかに惹起してドセタキセルによる細胞死を調節するかの洞察を、ｓｉＲＮＡスクリーニングが提供できることを示している。
【００７０】
【表１】
0005531001.tif 000002
【００７１】
【表２】
0005531001.tif 000003
【００７２】
【表３】
0005531001.tif 000004
【００７３】
〔実施例２〕
ドセタキセル耐性の増加を付与するｓｉＲＮＡサブセットの交差検定
ｓｉＲＮＡスクリーニングアプローチの短所となる可能性があるのは、ｓｉＲＮＡが、部分的に同一の転写物にアニールする、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の翻訳阻害を起こすことができるため、標的特異的な作用と非特異的（部位外の（ｏｆｆ−ｓｉｔｅ））作用との区別が困難になる点である（Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌ  ２１：６３５頁、２００３年）。第２配列を伴う独立のアプローチを用いて耐性を確認するため、ショートヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡをコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドを有しているレトロウイルスベクターに、ＨＣＴ１１６細胞を感染させて、ＢｕｂＲ１およびＭｐｓ１用の安定したノックダウン細胞株を生成した。ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡよりも異なる配列を含有しており、オープンリーディングフレームの明確な領域を標的する。レトロウイルスパッケージング細胞株ＧＰ２−２９３は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手した。細胞は、１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、４ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１０％胎児ウシ血清を補充したＤＭＥＭで維持した。ウイルスは、ＧＰ２−２９３細胞を一過性トランスフェクトして生成した。合計３.６×１０6細胞を、トランスフェクション２４時間前に１０ｃｍ皿に播種した。培地は、トランスフェクション４時間前に、１０％ＦＢＳ（抗生物質を含まない）を含有するＤＭＥＭと交換した。細胞は、６μｇベクターＤＮＡ、６μｇエンベローププラスミドＶＳＶ−Ｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）および７２μｌリポフェクタミン−２０００をトランスフェクトした。培地は、１４〜１６時間後に交換した。ウイルス上清を２４時間後に回収し、０.４５μＭフィルターを介して濾過し、８μｇ／ｍｌポリブレンの存在下で、Ｍ．Ｏ．Ｉ５でＨＣＴ１１６を感染させるために用いた。感染後４８時間目に、細胞を、０.５μｇ／ｍｌピューロマイシン中で７日間、またはバックグラウンド細胞が死滅するまで選択した。ＢｕｂＲ１およびＭｐｓ１ノックダウン細胞株で作成された用量反応曲線は、ここでも、高いドセタキセル濃度でより顕著であった耐性の増大を示した（図２）。これは、ｓｉＲＮＡ一過性トランスフェクションで得られた結果と類似していた。ｓｈＲＮＡがｍＲＮＡレベルを低下させるかどうかを調べるため、本発明者は、リアルタイムＰＣＲを用いて内因性転写物を検出し、ＲＮＡレベルが、ベクター対照安定株に比べＢｕｂＲ１およびＭｐｓ１安定ノックダウン細胞株で減少していることを確認した（図３）。
【００７４】
細胞を溶解し、ＲＮＡを、ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ−９６（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて抽出した。Ｔａｑｍａｎ（商標）プローブおよびフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）ソフトウェア（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＫ）によりデザインした。プローブおよびプライマー配列のＢＬＡＳＴ検索は、試験中の特定の遺伝子以外の他の配列とは有意な同一性が見られないことを明らかにした。リアルタイムＰＣＲには、マスターＴａｑＭａｎ（商標）ミックス２０μｌを、各ウェル用に作製した。内訳は、４.８２５μｌＲＮアーゼフリーを含まない水、１２.５μｌ  ２×ユニバーサルＰＣＲマスターミックスおよび０.６２５μｌ  ４０×ＭｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅＴＭおよびＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）、０.９μｌフォワードおよびリバースプライマー（１００μＭ）、０.２５ｕｌプローブ（１００μＭ）である。各ウェルに、５ｕｌ試料ＲＮＡ（約１ｎｇ／μｌ）を添加した。プレートは、ＴａｑＭａｎ（商標）ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、ＵＫ）で分析した。循環パラメータは、３０分間４８℃、１０分間９５℃、１５秒間９５℃を４０サイクル、および１分間６０℃であった。試験遺伝子のｍＲＮＡ値は、標準曲線から推定し、残留率（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｒｅｍａｉｎｉｎｇ）で表した。
【００７５】
〔実施例３〕
Ｍａｄ２、ＢｕｂＲ１およびＭｐｓ１のダウンレギュレーションは、異数性の発生と共に、有糸分裂停止を回避することでドセタキセル誘導死から細胞を保護する
ＷＳＴ−１アッセイで定量した通り、ドセタキセル存在下の有糸分裂チェックポイント遺伝子の欠損は、耐性を示す細胞生存の増加と相関していた（図１）。ＷＳＴ−１測定法の妥当性をさらに試験するため、細胞学的実験を行い、細胞の形態および生存能力を調べた（図４）。細胞は、共焦点顕微鏡法および、代謝的に活性な細胞の指標として働く細胞内エステラーゼにより、緑色蛍光に変換される生体染色色素であるカルセイン−ＡＭを用いて追跡した。図４は、ドセタキセル添加後１６時間目に、Ｍａｄ２、ＢｕｂＲ１および
、（程度は低いものの）Ｍｐｓ１のｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞は、時期尚早に有糸分裂を終わらせ、平板な細胞形態と一致する明らかな間期の状態に入っていたのに対し、対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞の大半が、集合した細胞形態を伴う有糸分裂で停止していた。扁平な細胞の表現型は、以前に他の微小管阻害剤で記述されており、有糸分裂停止から出て、実際には有糸分裂を終了させることなく明らかな間期状態へ入る細胞の能力を言う（Ｋｕｎｇら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８７：９５５３頁、１９９０年；ＬａｎｎｉおよびＪａｃｋｓ、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １８：１０５５頁、１９９８年）。処理後７２時間目、Ｍａｄ２、ＢｕｂＲ１またはＭｐｓ１のｓｉＲＮＡダウンレギュレート細胞に関する最も顕著な観察は、ドセタキセル処理により事実上除去されたｓｉＲＮＡ対照トランスフェクト細胞に比べ、より多くの細胞が存在し、およびこれらのサイズがきわめて大きかった点であった。ドセタキセル非存在下では、有糸分裂チェックポイントダウンレギュレート細胞は、２つの異なる時点において対照細胞と類似しているように見え、７２時間目の細胞数の増加は、細胞が、ｓｉＲＮＡ存在下で活発に成長していることを示唆した。
【００７６】
有糸分裂チェックポイントを障害された細胞は、コルセミド、ノコダゾールおよびパクリタキセルなどの微小管阻害剤による処理後は、有糸分裂停止を迂回し、時期尚早に有糸分裂を終了させることができる（ＴａｙｌｏｒおよびＭｃＫｅｏｎ、Ｃｅｌｌ  ８９：７２７頁、１９９７年；Ｓｈｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ４：４８３頁、２００３年；Ｍａｓｕｄａら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １６３：１１０９頁、２００３年；Ｓｕｄｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６４：２５０２頁、２００４年）。ドセタキセル処理したＨＣＴ１１６細胞が、３つの特異的チェックポイント遺伝子Ｍａｄ２、ＢｕｂＲ１またはＭｐｓ１を抑制後、有糸分裂を時期尚早に終了させるかどうかを判定するため、本発明者は、トランスフェクト細胞の有糸分裂指標を測定した。そこで、ｓｉＲＮＡをトランスフェクトされたＭａｄ２、ＢｕｂＲ１またはＭｐｓ１細胞を、未処理（０）またはドセタキセル処理後８、１６、２４、３６、４８および７２時間目で回収し、次いで、固定化し、有糸分裂指標であるヒストンＨ３のリン酸化を検出するポリクローナル抗体（Ｍｉｔｏｔｉｃ  Ｉｎｄｅｘ  Ｋｉｔ、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ）によりインキュベートした。すべての時点を図５にグラフで示した。有糸分裂指標のピークは、処理後１６時間目および２４時間目であり、全例で有糸分裂停止があったことを示している。有糸分裂指標は、対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトされた細胞で最も高値に達したのに対し、Ｍａｄ２およびＢｕｂＲ１のｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞は、有糸分裂指標の有意な低下を示した。Ｍｐｓ１のｓｉＲＮＡ効果は、Ｍａｄ２、ＢｕｂＲ１ほど重度ではなかった。これらの結果は、有糸分裂チェックポイントを障害された細胞は、ドセタキセルにより誘発された有糸分裂停止を迂回すること、ＢｕｂＲ１のｓｉＲＮＡは、最も有効であり、次いでＭａｄ２およびＭｐｓ１となることを明らかに示すものである。
【００７７】
有糸分裂指標の変化が、ノックダウン効率における大きな差と一致していた可能性を除外するため、本発明者は、リアルタイムＰＣＲを用いて有糸分裂チェックポイント転写レベルを測定した。図６に示された実験は、ｍＲＮＡレベルが、Ｍａｄ２、ＢｕｂＲ１およびＭｐｓ１のｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞では同等レベルにまで低下したことを示している。これは、有糸分裂指標の差が、遺伝子機能をより大きく反映していたことを示唆するものである。
【００７８】
顕微鏡データから、きわめて大きな細胞は、異常なＤＮＡ量を保有できることが明らかになった。これらの有糸分裂チェックポイント障害細胞は、ドセタキセル誘導細胞周期停止を抑制し、Ｓ期に再進入して異数性細胞を産生することが可能かどうかをさらに調査するため、本発明者は、ＦＡＣＳ分析を行いＤＮＡ量を測定した。Ｍｐｓ１、ＢｕｂＲ１、Ｍａｄ２および対照のｓｉＲＮＡをトランスフェクトされた細胞を、ドセタキセル非存在下または存在下で増殖し、固定化し、ヨウ化物プロピルで染色し、ＦＡＣＳにより分析し
た。ドセタキセル添加後、いくつかの異なる時点でデータを回収し（データ不図示）、７２時間時点のヒストグラムを図７に示した。ドセタキセル添加後７２時間目、Ｍｐｓ１、ＢｕｂＲ１、Ｍａｄ２のｓｉＲＮＡトランスフェクションは、８Ｎ、１６Ｎで細胞蓄積を引き起こしており、ＢｕｂＲ１の場合は３２ＮのＤＮＡ量であった。対照ｓｉＲＮＡを用いるだけで、ドセタキセル存在下で８Ｎの細胞集団を検出したが、８Ｎの数は、有糸分裂チェックポイントをダウンレギュレートされた細胞でより高かった。ドセタキセル添加後の早い時点では（データ不図示）、対照細胞の大半が４Ｎで停止していたのに対し、Ｍｐｓ１、ＢｕｂＲ１およびＭａｄ２のｓｉＲＮＡをトランスフェクトされた細胞は、４Ｎから８Ｎへ進行していた。これらの結果は、有糸分裂チェックポイント遺伝子のノックダウンは、野生型細胞細胞に比べ、細胞がより迅速に異常なＤＮＡレベルを蓄積し、倍数性のより高い閾値を交差できるようにすることを示している。本発明者の結果は、有糸分裂指標の制御、これまで明らかにされなかった微小管阻害剤ドセタキセルによる細胞周期の進行における、Ｍａｄ２、ＢｕｂＲ１およびＭｐｓ１の役割を示すものである。
【００７９】
〔実施例４〕
ＢｕｂＲ１をダウンレギュレートされた細胞におけるドセタキセル耐性コロニーの形成
抗微小管剤を併用したＢｕｂＲ１の過少発現が、異数性細胞のチェックポイントおよびアポトーシスの活性化と関連したＢｕｂＲ１の異数性、ならびに回復と関連があったことを考えると、ＢｕｂＲ１のアポトーシス機能は、染色体忠実度の制御にとって重要であるように思われる（Ｓｈｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ４：４８３頁、２００３年）。永続的な有糸分裂チェックポイント遺伝子のダウンレギュレーションは、細胞の、増殖能の増大による増殖を可能にするかどうかを判定するため、ＢｕｂＲ１およびＭｐｓ１の安定ノックダウン細胞株（図４）の、ドセタキセルの連続存在下で増殖しコロニーを構築する能力について試験した。Ｍａｄ２安定ノックダウン細胞株は、Ｍａｄ２の障害が、細胞にとって致死的であったため（Ｍｉｃｈｅｌら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ
１０１：４４５９頁、２００４年）作製することができなかった。ＢｕｂＲ１、Ｍｐｓ１および対照ｓｈＲＮＡの安定ノックダウン細胞株は、５ｎＭドセタキセルに１０日間曝した後、クリスタルバイオレットで染色した。図８は、ＢｕｂＲ１ノックダウン細胞株は、対照細胞株に比べ、より多くの大きなコロニーを発生したことを示している。Ｍｐｓ１ノックダウン細胞株は、５ｎＭドセタキセル存在下でコロニーを成長させることができなかった。プレートを１７日間にわたりインキュベートした場合、対照プレートではコロニーが観察されたが、ＢｕｂＲ１ノックダウン細胞株に比べ、数はより少なかった。これらの結果は、ＢｕｂＲ１の低レベルを、化学療法剤ドセタキセル存在下の細胞成長の進行と関連づけるものであるが、Ｍｐｓ１を関連づけるものではない。
【００８０】
〔実施例５〕
ドセタキセル感受性の増加を付与するｓｉＲＮＡの交差検定
ドセタキセル誘導死滅から細胞を保護するｓｉＲＮＡの同定に加えて、スクリーニングは死滅に対し細胞を感作させるｓｉＲＮＡを同定した。表IIIでは、Ｐｉｍ−１、ｐ２１waf1/Cip1、ＧＢＰ−１、ＲＸＲＡ、Ｈｅｃｌ，ＳＰＦ４５、Ｒａｆ１は、ＩＣ50のシフトはごく小さいが、高ドセタキセル濃度（＞６ｎＭ）で顕著な死滅を示したｓｉＲＮＡ群を表している。発癌性セリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１および細胞周期阻害剤ｐ２１waf1/Cip1のｓｉＲＮＡ用量反応曲線は、きわめて類似していた（図９）。これは、シグナル伝達経路における重複するまたは協調的な役割を反映している可能性があり、過去の報告は、ｐ２１waf1/Cip1が、Ｐｉｍ−１の基質であることを明らかにしている（Ｗａｎ
ｇら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １５９３：４５頁、２００２年）。さらに興味深いのは、前立腺上皮細胞のＰｉｍ−１過剰発現に関するデータであり、これは、有糸分裂チェックポイント干渉および遺伝的不安定性につながるものである（Ｒｏｈら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６３：８０７９頁、２００３年）。これらの結果は、反対の発現レベルと同等の表現型を示す、Ｍａｄ２、ＢｕｂＲ１およびＭｐｓ１過少発現データ
と一致していた（図１参照）。ドセタキセル感受性を付与する別のｓｉＲＮＡは、Ｈｅｃ１であった。
【００８１】
表IIIでは、ＴＡＣＣ３、ＲＥＬＢ、Ａｕｒｏｒａ−Ａ、ＰＲＫＣＤ（ＰＫＣ）、ＨＳ
ＰＡ１Ａ、およびＢＲＡＦ３５は、ＩＣ５０のシフトが特徴的な、低ドセタキセル濃度（１〜６ｎＭ）で感受性を増大させるｓｉＲＮＡ群を表している。Ａｕｒｏｒａ−Ａは、有糸分裂開始時に機能し、これまで、中心体成熟および紡錘体集合に関与するとされてきたセリン／スレオニンキナーゼである（Ｍｅｒａｌｄｉら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ  １４：２９頁、２００４年で再検討された）。最も興味深いのは、ＨｅＬａ細胞のＡｕｒｏｒａ−Ａ過剰発現が、パクリタキセルから細胞を保護することを示した公表データであり、Ａｕｒｏｒａ−Ａ過少発現が、ドセタキセル死滅力を増大させた本発明者の結果と一致していた（Ａｎａｎｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ３：５１頁、２００３年）。確かに、生存の２５％減少を示したＡｕｒｏｒａ−Ａに関しては、これはＩＣ５０のわずかな減少であったが、この結果は、ＨＣＴ１１６細胞でＡｕｒｏｒａ−Ａの安定ノックダウンを生じているｓｈＲＮＡを、レトロウイルス送達することで正確に再現された（図９を図１０および１１と比較のこと）。
【００８２】
〔実施例６〕
Ｐｉｍ１はドセタキセル非存在下でＨＣＴ１１６増殖を阻害する
スクリーニングからの陽性結果を評価するためには、ドセタキセル非存在下で細胞の生存に影響するｓｉＲＮＡと、ドセタキセルと協調して死滅力を増大する働きをするものとを区別することが重要であった。これらの可能性を区別するため、本発明者は、トリパンブルー排除法を用いてｓｉＲＮＡトランスフェクションが増殖に与える影響を試験し、トランスフェクション後２４、４８、７２時間目に、６ウェルプレートの生細胞数を判定するため、細胞を計数した。本発明者の結果は、Ｐｉｍ−１のｓｉＲＮＡはＨＣＴ１１６細胞の成長を阻害するのに対し、ＴＡＣＣのｓｉＲＮＡは、成長に影響しない（図１２、ノックダウンを定量した図１３）が、ｓｉＲＮＡは両方ともドセタキセル誘導細胞死を増大させた（図９）。
【００８３】
〔実施例７〕
Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄアッセイを用いた耐性および感受性遺伝子サブセットの検証
ドセタキセル感受性および耐性を付与するｓｉＲＮＡを視覚的に比較するため、顕微鏡撮像を用いて生細胞対死細胞の比を測定した。ここでは、生細胞を緑色に染色するカルセイン−ＡＭを、および死細胞の核酸を赤く染色するヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いた。ドセタキセル添加後（７２時間目）、ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＢｕｂＲ１細胞は、生細胞数が最大となったのに対し、ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＰｉｍ−１およびＴＡＣＣ３は、死細胞数が最大となり、対照細胞はこの中間であった（データ不図示）。ＢｕｂＲ１のｓｉＲＮＡ単独では、７２時間まで細胞死は増加したが、細胞は最終的にドセタキセルに対し更に耐性となった。Ｐｉｍ−１のｓｉＲＮＡ単独では、２４時間まで細胞死を誘発したのに対し、ＴＡＣＣ３のｓｉＲＮＡは、細胞死を引き起こさなかった。これらの結果は、ＢｕｂＲ１ダウンレギュレーションは、細胞の生存および薬剤耐性と関連があるのに対し、Ｐｉｍ−１およびＴＡＣＣ３ダウンレギュレーションは、細胞死および薬剤感受性と関連があることを示した。Ｐｉｍ−１およびＴＡＣＣ３はいずれも、ドセタキセル存在下で死滅が増加したが、このアッセイは、相加効果と協調的死滅とを区別することができなかった。
【００８４】
〔実施例８〕
ドセタキセル誘導カスパーゼ３活性はＢｕｂＲ１ダウンレギュレーションにより低下し、Ｐｉｍ−１ダウンレギュレーションで増大した
ドセタキセルは、アポトーシスの誘発を介して細胞死を引き起こす（Ｋｉｍら、Ｉｎｔ
Ｊ  Ｍｏ１  Ｍｅｄ  １１：７９９頁、２００３年）。Ｐｉｍ−１およびＢｕｂＲ１のｓｉＲＮＡが、ドセタキセル存在下および非存在下でアポトーシス標準経路を調節することができるかどうかを判定するため、本発明者は、ＨＣＴ１１６細胞における活性化カスパーゼ３レベルを試験した（バイオプレックスアッセイ（ｂｉｏｐｌｅｘ  ａｓｓａｙ）により）（図１４）。４０ｎＭドセタキセル添加４８時間後、カスパーゼ３活性を対照細胞で誘導し、Ｐｉｍ−１をダウンレギュレートして誘導をさらに増大させ、ＢｕｂＲ１をダウンレギュレートして減少させた（中段および下段パネル）。ドセタキセル非存在下では、Ｐｉｍ−１のダウンレギュレーションは、２４時間目にカスパーゼ３活性のわずかな増加をもたらしたが、カスパーゼ３活性は、４８および７２時間目までに対照レベルに戻っていた（上段パネル）。これは、他のアポトーシス機構が活性化されて、ＷＳＴ−１およびＬＩＶＥ／ＤＥＡＤアッセイにより７２時間目に観察された死滅の増大を維持したことを示している。ドセタキセル非存在下におけるＢｕｂＲ１のダウンレギュレーションは、カスパーゼ３活性のきわめてわずかな増加をもたらした。これは、ＢｕｂＲ１ノックダウンが当初、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤアッセイで７２時間目に細胞死を引き起こした所見と一致していた。これらの結果はさらに、Ｐｉｍ−１およびＢｕｂＲ１が、カスパーゼ３活性の調節を介したドセタキセル死滅エフェクターであることを示唆した。
【００８５】
〔実施例９〕
ドセタキセル誘導Ｐｉｍ−１関連感受性およびＢｕｂＲ１関連耐性に関与するシグナル伝達経路
Ｐｉｍ−１に起因する活性は、細胞死につながるシグナル伝達イベントを阻害する一方、細胞生存を促進するシグナル伝達イベントを促す上で中心的な役割を果たしていることを示唆した。Ｐｉｍ−１ノックダウンに関連した細胞死の増大に関する分子基盤を明らかにするため、本発明者は、細胞生存に関与する鍵となる細胞経路、ＡＫＴの活性化状態を調べた。ＨＣＴ１１６は、４×１０5細胞／ウェルで６ウェルプレートに播種し、翌日、リポフェクタミン２０００（インビトロゲン）により１６ｎＭにてｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。２４時間後、細胞を５および４０ｎＭドセタキセルで処理するか未処理とした。ドセタキセル添加後２４、４８および７２時間目に、氷冷した溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ＰＨ７.４）、１％ＮＰ４０、２.５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭフッ化ナトリウム、１０ｍＭ  ＰＰLナトリウム、プロテーアーゼ阻害剤カクテルタブレット（Ｒｏｃｈｅ）、２ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム）で細胞を溶解し、１２，０００ｇで１０分間遠心分離した。溶解物は、次いでＤＣタンパク質アッセイ（ＢｉｏＲａｄ）により全タンパク質レベルを定量化した。活性化カスパーゼ３レベルは、活性化カスパーゼ３Ｂｅａｄｍａｔｅｓキット（アップステート）およびルミネックス１００（商標）システムを用いて、メーカーにより指示されたプロトコールで判定した。総合およびリン酸化ＡＫＴレベルは、トータルＡＫＴ抗体ビーズキットおよびリン酸特異的ＡＫＴS473抗体ビーズキット（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）およびルミネックス１００（商標）システムを用いて、メーカーにより指示されたプロトコールで判定した。
【００８６】
図１５に示された実験は、Ｐｉｍ−１ダウンレギュレーションが、対照に比べてベースラインのＡＫＴリン酸化を減少させ、この効果は、ドセタキセル濃度の上昇に伴い有意に倍加したことを示している。対して、ＢｕｂＲ１ダウンレギュレーションは、ベースラインのＡＫＴリン酸化を増加させ、この効果は、ドセタキセルの高くはなく低い濃度で強調された。これは、代替シグナル伝達経路の変化が、高用量で活性化される可能性があることを示している。
【００８７】
本発明者は、Ｐｉｍ−１およびＢｕｂＲ１に対する抗体を用いてウェスタンブロット分析を行い、４８時間時点のタンパク質レベルを測定した。同量のタンパク質を、ＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（インビトロゲン）に添加した。Ｐｉｍ−１に対する抗体（サンタクルスバイオテクノロジー）、ＢｕｂＲ１に対する抗体（ＢＤバイオ
サイエンス）およびα−チューブリンに対する抗体（シグマ）は、メーカーの指示通りに使用した。第２抗体は、ＨＲＰ（ＢｉｏＲａｄ）に結合させ、ＥＣＬウェスタンブロット検出システム（Ａｍｈｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で検出した後、ハイパーフィルムＥＣＬ（Ａｍｈｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に曝露した。図１６に示された実験は、Ｐｉｍ−１およびＢｕｂＲ１のタンパク質レベルが、対照に比べて低下したことを示しており、タンパク質レベルの低下は、機能的変化（図１５）に対応していたことを示している。これらのデータは、Ｐｉｍ−１タンパク質レベルのダウンレギュレーションは、細胞をアポトーシスへ押しやるため、ＡＫＴのリン酸化および活性化を阻害することができることを示唆している。Ｐｉｍ−１は、プロサバイバル経路（ｐｒｏ−ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｐａｔｈｗａｙ）の活性化により細胞の生存を媒介しているように思われる。
【００８８】
本発明は、本明細書に記載された特定の実施形態により範囲を限定されない。実際、本明細書に記載されたものに加え、本発明の様々な変更が可能であることは、先述の説明および添付図面から当業者には明らかであろう。このような変更は、添付の特許請求の範囲にあるものである。
【００８９】
本明細書で引用されている文献はすべて、参照により全体が組み込まれている。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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