(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において内皮細胞の数を維持しつつ内皮細胞接着を妨害するための組成物であって、該組成物は、ＥＧＦＬ７誘導性内皮細胞接着を妨害する能力を有するＥＧＦＬ７アンタゴニストを含み、該ＥＧＦＬ７アンタゴニストは抗体である、組成物。
【請求項２】
前記内皮細胞がヒト内皮細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記内皮細胞が血管内皮細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物が管形成を抑制する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
内皮細胞の数を維持しつつ内皮細胞接着をインビトロで妨害する方法であって、該方法は、該細胞を、ＥＧＦＬ７アンタゴニストと接触させる工程を包含し、該ＥＧＦＬ７アンタゴニストは抗体である、方法。
【請求項６】
前記内皮細胞がヒト内皮細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記内皮細胞が血管内皮細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記ＥＧＦＬ７アンタゴニストが管形成を抑制する、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
仮出願ではない本出願は、米国特許法施行規則第１．５３条の下で出願され、２００４年４月１４日に出願された、米国特許仮出願第６０／５６２，０５４号についての米国特許法第１１９条第（ｅ）項に則る利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般的には、血管発達をモジュレートするのに有用な組成物および方法に関する。より詳しくは、本発明は、新規な内皮細胞由来分泌因子であるＥＧＦ様ドメイン７（ＥＧＦＬ７）に関する。本発明は、さらに、血管新生と関連する状態および疾患の診断および処置に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
血管供給の発達（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）は、多くの生理学的および病理学的プロセスの基本要件である。胚および腫瘍などの活発に成長する組織は、充分な血液の供給を必要とする。これらは、プロ（ｐｒｏ−）血管新生因子（これは、血管新生と呼ばれるプロセスにより新しい血管の形成を促進する）を産生することにより、この必要性を満たす。血管の形成は複雑であるが、秩序ある生物学的事象であり、以下の工程：ａ）内皮細胞（ＥＣ）が既存のＥＣから増殖するか、または前駆細胞から分化する；ｂ）ＥＣが、遊走および合着して髄（ｃｏｒｄ）様構造を形成する；ｃ）血管髄は、次いで、管形成を受け、中央に内腔を伴う脈管を形成する  ｄ）既存の髄または脈管は、外側に送られて出芽し（ｓｅｎｄ  ｏｕｔ  ｓｐｒｏｕｔｓ）、二次性脈管を形成する；ｅ）始原性の管叢は、さらなるリモデリング（ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）および再形態形成（ｒｅｓｈａｐｉｎｇ）を受ける；ならびにｆ）内皮周囲細胞が、漸増し、内皮管に入り（ｅｎｃａｓｅ）、維持およびモジュレーター機能を脈管に提供する；（かかる細胞としては、小さな毛管の周皮細胞、大きな脈管の平滑筋細胞、および心臓内の心筋細胞が挙げられる）のすべてまたは多くを伴う。非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３。
【０００４】
今では、血管新生が様々な障害の病原に関与していることは充分確立されている。これらとしては、充実腫瘍および転移、アテローム性動脈硬化、水晶体後線維増殖症、血管腫、慢性炎症、眼内新生血管形成疾患、例えば、増殖性網膜症、例えば、糖尿病網膜症、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、血管新生緑内障、移植角膜組織および他の組織の免疫拒絶、関節リウマチ、ならびに乾癬が挙げられる。非特許文献４；非特許文献５；および非特許文献６。
【０００５】
腫瘍成長の場合、血管新生は、過形成から新形成への移行、および腫瘍の成長および転移のための栄養の供給に非常に重要であると思われる。非特許文献７。新生血管形成は、腫瘍細胞が正常細胞と比べて成長の有利性および増殖自律性を獲得するのを可能にする。腫瘍は、通常、利用可能な毛細血管床から距離があることにより数立方ミリメートルの大きさまでしか増殖し得ない単一の異常な細胞として始まり、長期間、さらなる成長および播種することなく「潜伏」の状態で継続し得る。一部の腫瘍細胞は、次いで、血管新生表現型に転換して内皮細胞を活性化し、この内皮細胞は、増殖して新しい毛細血管に成熟する。これらの新しく形成された血管は、始原腫瘍の成長の継続を許容するだけでなく、転移腫瘍細胞の播種および転移再増殖（ｒｅｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ）も許容する。したがって、腫瘍切片の微細血管密度と乳癌およびいくつかの他の腫瘍における患者の延命との間に相関性が観察されている。非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０。血管新生への変換を制御する正確な機序は、充分理解されていないが、腫瘍塊の新生血管形成は、多くの血管新生刺激因子および阻害因子の正味の均衡に起因すると考えられる（非特許文献１１）。
【０００６】
血管発達のプロセスは、厳重に規制されており、これまで、かなりの数の分子（ほとんどは、周囲細胞によって産生される分泌因子）が、ＥＣの分化、増殖、遊走および髄様構造への合着を調節することが示されている。例えば、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、血管新生の刺激および血管透過性の誘導に関与する重要な因子として同定された。非特許文献１２。たとえ１つのＶＥＧＦ対立遺伝子の欠損でも、胚の死をもたらすという知見は、この因子が血管系の発達および分化において果たすかけがえのない役割を示す。さらにまた、ＶＥＧＦは、腫瘍および眼内障害と関連する新生血管形成の重要なメディエーターであることが示されている。非特許文献１２。ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡは、検査された大部分のヒト腫瘍によって過剰発現されている。非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７。
【０００７】
また、眼内液中のＶＥＧＦの濃度レベルは、糖尿病および他の虚血関連網膜症の患者内の血管の活性な増殖の存在と高度に相関している。非特許文献１８。さらにまた、諸研究により、ＡＭＤに罹患した患者の脈絡膜血管新生膜内におけるＶＥＧＦの局在が示されている。非特許文献１９。
【０００８】
抗ＶＥＧＦ中和抗体は、ヌードマウスにおいて様々なヒト腫瘍細胞株の成長を抑制し（非特許文献２０；非特許文献２１；非特許文献２２；非特許文献２３）、また、虚血性腎障害のモデルにおいて眼内血管新生を阻害する。非特許文献２４。したがって、抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体または他のＶＥＧＦ作用の阻害剤は、腫瘍および種々の眼内血管新生障害の処置のための有望な候補物質である。かかる抗体は、例えば、特許文献１（１９９８年１月１４日に公開）；ならびに特許文献２および特許文献３（ともに１９９８年１０月１５日に公開）に記載されている。抗ＶＥＧＦ抗体の１つであるベバシズマブは、ＦＤＡによって、転移性結腸直腸癌（ＣＲＣ）を処置するために化学療法レジメンとの併用における使用が承認されている。そして、ベバシズマブは、種々の癌適応症を処置するために多くの進行中の臨床試験において、詳しい調査が行なわれている。
【０００９】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、血管新生のプロセス中に重要な役割を果たすことが知られている。非特許文献２５。ＥＣは、その遊走中、暫定ＥＣＭに囲まれており、内腔の形成後、新しく合成された血管基底膜に接着する。毛細形態形成の際の骨組を提供することに加え、ＥＣＭは、ＥＣの機能に対して複雑な局所制御機能を発揮することが示されている。例えば、ＥＣＭは、ＥＣに対する可溶性血管新生メディエーターの利用可能性を調節し、インテグリンおよび細胞接着分子との相互作用の性質および型を特定することができる。また、ＥＣ生存は、成長因子レセプターとインテグリン（さらに、これらは局所ＥＣＭの組成に支配されている）間の協同作用によって調節されていることが示されている。非特許文献２６。
【特許文献１】欧州特許第８１７，６４８号明細書
【特許文献２】国際公開第９８／４５３３１号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９８／４５３３２号パンフレット
【非特許文献１】Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）２７７：４８−５０
【非特許文献２】Ｈｏｇａｎ，Ｂ．Ｌ．＆Ｋｏｌｏｄｚｉｅｊ，Ｐ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．（２００２）３：５１３−２３
【非特許文献３】Ｌｕｂａｒｓｋｙ，Ｂ．＆Ｋｒａｓｎｏｗ，Ｍ．Ａ．Ｃｅｌｌ．（２００３）１１２：１９−２８
【非特許文献４】Ｆｏｌｋｍａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（１９９２）２６７：１０９３１−１０９３４
【非特許文献５】Ｋｌａｇｓｂｒｕｎら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９１）５３：２１７−２３９
【非特許文献６】Ｇａｒｎｅｒ  Ａ．，「Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｏｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ．Ａ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」，Ｇａｒｎｅｒ  Ａ．，Ｋｌｉｎｔｗｏｒｔｈ  ＧＫ編．，第２版（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ，１９９４），ｐｐ  １６２５−１７１０
【非特許文献７】Ｆｏｌｋｍａｎら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３３９：５８
【非特許文献８】Ｗｅｉｄｎｅｒら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ（１９９１）３２４：１−６
【非特許文献９】Ｈｏｒａｋら，Ｌａｎｃｅｔ（１９９２）３４０：１１２０−１１２４
【非特許文献１０】Ｍａｃｃｈｉａｒｉｎｉら，Ｌａｎｃｅｔ（１９９２）３４０：１４５−１４６
【非特許文献１１】Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｎａｔ  Ｍｅｄ（１９９５）１（１）：２７−３１
【非特許文献１２】Ｆｅｒｒａｒａら，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．（１９９７）１８：４−２５
【非特許文献１３】Ｂｅｒｋｍａｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９３）９１：１５３−１５９
【非特許文献１４】Ｂｒｏｗｎら，Ｈｕｍａｎ  Ｐａｔｈｏｌ．（１９９５）２６：８６−９１
【非特許文献１５】Ｂｒｏｗｎら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９３）５３：４７２７−４７３５
【非特許文献１６】Ｍａｔｔｅｒｎら，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９６）７３：９３１−９３４
【非特許文献１７】Ｄｖｏｒａｋら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ（１９９５）１４６：１０２９−１０３９
【非特許文献１８】Ａｉｅｌｌｏら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（１９９４）３３１：１４８０−１４８７
【非特許文献１９】Ｌｏｐｅｚら，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ（１９９６）３７：８５５−８６８
【非特許文献２０】Ｋｉｍら，Ｎａｔｕｒｅ（１９９３）３６２：８４１−８４４
【非特許文献２１】Ｗａｒｒｅｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９５）９５：１７８９−１７９７
【非特許文献２２】Ｂｏｒｇｓｔｒｏｅｍら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９６）５６：４０３２−４０３９
【非特許文献２３】Ｍｅｌｎｙｋら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９６）５６：９２１−９２４
【非特許文献２４】Ａｄａｍｉｓら，Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．（１９９６）１１４：６６−７１
【非特許文献２５】Ｍａｄｒｉ，Ｔｒａｎｓｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７）５：１７９−８３
【非特許文献２６】ＳｔｕｐａｃｋおよびＣｈｅｒｅｓｈ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００３）２２：９０２２−２９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
血管新生分野における多大な進歩にもかかわらず、脈管の管形成の際の工程のいくつかは、依然として充分明確にされていない。特に、管形成がどのようにして調節されているのか、どのようにして血管髄が進行して管となるのか、およびどの因子がこの移行を調節しているのかについてはほとんどわかっていない。多くの疾患および障害における血管新生の役割に鑑み、このようなプロセスを引き起こす生物学的効果の１つ以上を低減または抑制する手段があることが望ましい。また、病原性ポリペプチドの存在を正常状態および疾患状態、特に癌においてアッセイする手段があることが望ましい。また、標的を識別し、既存の抗血管新生療法の有効性を増強し得る手段を開発する必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の概要）
本発明は、新規なＥＣ由来分泌因子であるＥＧＦ様ドメイン７（ＥＧＦＬ７）の同定およびキャラクタリゼーションに基づくものである。ＥＧＦＬ７は、高レベルで、組織増殖に付随する脈管構造内で発現され、正常な成体組織内の成熟脈管のほとんどにおいて下方調節される。ＥＧＦＬ７機能の低下は、動物胚においてかなりの脈管欠陥を引き起こし、腫瘍成長を低減させた。その構造、発現および活性に基づき、ＥＧＦＬ７は、新規なＥＣＭ分子とみなされる。さらにまた、ＥＧＦＬ７は、ＥＣの接着および遊走を支持することがわかっており、腫瘍血管新生において血管新生因子に支持的役割を果たすことに関与している。他方で、ＥＧＦＬ７アンタゴニストは、ＥＧＦＬ７関連ＥＣ接着および遊走を有効に遮断することがわかった。したがって、本発明は、血管新生に関与するプロセスをモジュレートする（例えば、促進または抑制する）ための新規な組成物およびその使用を提供する。
【００１２】
一実施形態では、本発明は、ＥＧＦＬ７アンタゴニストを薬学的に許容され得る担体と混合された状態で含む組成物を提供する。一態様において、該組成物は、治療有効量の該アンタゴニストを含む。別の態様において、該組成物は、さらなる活性成分、例えば、抗血管新生剤を含む。好ましくは、該組成物は、滅菌されたものである。ＥＧＦＬ７アンタゴニストは液状医薬製剤の形態で投与され得、これは、保存されると長期の保存安定性を達成し得る。保存された液状医薬製剤は複数回投与量のＥＧＦＬ７アンタゴニストを含み得、したがって、反復使用に好適であり得る。好ましい実施形態では、該組成物が抗体を含む場合、該抗体は、モノクローナル抗体、抗体断片、ヒト化抗体または単鎖抗体である。
【００１３】
別の実施形態では、本発明は、治療有効量のＥＧＦＬ７アンタゴニストを薬学的に許容され得る担体と混合することを含む、血管新生関連障害の処置に有用なかかる組成物の調製方法を提供する。
【００１４】
なおさらなる態様では、本発明は、
（ａ）ＥＧＦＬ７アンタゴニストを含む主題の組成物；
（ｂ）前記組成物を収容する容器；および
（ｃ）前記容器に付けられたラベル、または前記容器内に含まれる血管新生関連障害の処置における前記ＥＧＦＬ７アンタゴニストの使用を示す添付文書
を含む製造品であって、該アンタゴニストが、ＥＧＦＬ７に結合し、その活性をブロックする抗体であり得る製造品を提供する。該組成物は、治療有効量のＥＧＦＬ７アンタゴニストを含み得る。
【００１５】
別の実施形態では、本発明は、試験化合物をＥＧＦＬ７ポリペプチドと、試験化合物とポリペプチドが相互作用するのを可能にする条件下および該相互作用するのに充分な時間接触させること、およびＥＧＦＬ７ポリペプチドの活性が阻害されたか否かを判定することを含む、ＥＧＦＬ７ポリペプチドの活性を阻害する化合物の同定方法を提供する。ある特定の好ましい態様では、試験化合物またはＥＧＦＬ７ポリペプチドのいずれかが、固相支持体上に固定化されている。別の好ましい態様では、非固定化成分は検出可能な標識を担持している。好ましい態様では、この方法は、
（ａ）細胞とスクリーニング対象の試験化合物を、ＥＧＦＬ７ポリペプチドの存在下、ＥＧＦＬ７ポリペプチドによって通常誘導される細胞応答の誘導に適した条件下で接触させる工程；および
（ｂ）前記細胞応答の誘導を判定し、試験化合物が有効なアンタゴニストであるか否かを判定する工程
を含む。
【００１６】
別の好ましい態様では、この方法は、
（ａ）細胞とスクリーニング対象の試験化合物を、ＥＧＦＬ７ポリペプチドの存在下、ＥＧＦＬ７ポリペプチドによる細胞増殖の刺激に適した条件下で接触させる工程；および
（ｂ）該細胞の増殖を測定し、試験化合物が有効なアンタゴニストであるか否かを判定する工程
を含む。
【００１７】
ＥＧＦＬ７ポリペプチドの機能または活性の１つ以上を阻害するＥＧＦＬ７ポリペプチドのアンタゴニストの種類の１つは、抗体である。したがって、別の態様において、本発明は、ＥＧＦＬ７ポリペプチドに結合する単離された抗体を提供する。好ましい態様では、該抗体はモノクローナル抗体であり、これは、好ましくは、非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基およびヒトフレームワーク領域（ＦＲ）の残基を有する。該抗体は、標識されていてもよく、固相支持体上に固定化されていてもよい。さらなる態様では、該抗体は、抗体断片、単鎖抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である。好ましくは、該抗体は、該ポリペプチドに特異的に結合する。
【００１８】
なおさらなる態様では、本発明は、哺乳動物における心臓血管、内皮または血管新生の障害の診断方法を提供し、これは、ＥＧＦＬ７ポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを、（ａ）前記哺乳動物から得た組織細胞の試験試料において、および（ｂ）同じ細胞型の既知の正常組織細胞の対照試料において解析することを含み、ここで、対照試料と比べた試験試料の高いかまたは低い発現レベルが、前記哺乳動物における心臓血管、内皮または血管新生の障害の存在を示す。ＥＧＦＬ７ポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、任意選択で、対照試料と比べた試験試料中のｍＲＮＡまたはポリペプチドのレベルを測定することによりなされ得る。
【００１９】
なおさらなる態様では、本発明は、哺乳動物における心臓血管、内皮または血管新生の障害の診断方法を提供し、これは、前記哺乳動物から得た組織細胞の試験試料においてＥＧＦＬ７ポリペプチドの存在または非存在を検出することを含み、ここで、前記試験試料中の前記ＥＧＦＬ７ポリペプチドの存在または非存在が、前記哺乳動物における心臓血管、内皮または血管新生の障害の存在を示す。
【００２０】
なおさらなる実施形態では、本発明は、（ａ）抗ＥＧＦＬ７抗体を哺乳動物から得た組織細胞の試験試料と接触させること、および（ｂ）試験試料中において該抗体とＥＧＦＬ７ポリペプチド間の複合体の形成を検出することを含む、哺乳動物における心臓血管、内皮または血管新生の障害の診断方法であって、前記複合体の形成が、哺乳動物における心臓血管、内皮または血管新生の障害の存在を示す方法を提供する。この検出は、定性的または定量的であり得、同じ細胞型の既知の正常組織細胞の対照試料における複合体形成のモニタリングとの比較において行なわれ得る。試験試料において、形成された複合体のより多くの量、またはより少ない量は、試験組織細胞を得た哺乳動物における心臓血管、内皮または血管新生の機能不全の存在を示す。該抗体は、好ましくは、検出可能な標識を担持する。複合体形成は、例えば、光学顕微鏡検査、フローサイトメトリー、蛍光定量法または当該技術分野で知られた他の手法によってモニターされ得る。試験試料は、通常、心臓血管、内皮または血管新生の障害を有することが疑われる個体から得る。
【００２１】
別の実施形態では、本発明は、ＥＧＦＬ７ポリペプチドを含有することが疑われる試料を抗ＥＧＦＬ７抗体に曝露すること、および前記試料の成分に対する前記抗体の結合を判定することを含む、試料中のＥＧＦＬ７ポリペプチドの存在の判定方法を提供する。ある特定の態様では、試料は、ＥＧＦＬ７ポリペプチドを含むことが疑われる細胞を含み、該抗体が該細胞に結合する。該抗体は、好ましくは、検出可能に標識されている、および／または固相支持体に結合されている。
【００２２】
さらなる態様では、本発明は、抗ＥＧＦＬ７抗体および担体を適当なパッケージング内に含む、心臓血管、内皮または血管新生の障害の診断用キットを提供する。好ましくは、かかるキットは、ＥＧＦＬ７ポリペプチドの存在を検出するのに前記抗体を使用するための使用説明書をさらに含む。好ましくは、担体は、例えばバッファーである。好ましくは、心臓血管、内皮または血管新生の障害は癌である。
【００２３】
また別の実施形態では、本発明は、血管新生と関連する病理学的状態を有する被験体において血管新生を低減または抑制する方法であって、該被験体に、ＥＧＦＬ７誘導性内皮細胞遊走を妨害する能力を有するＥＧＦＬ７アンタゴニストを投与し、それにより被験体における血管新生を低減または抑制することを含む方法を提供する。好ましくは、ＥＧＦＬ７アンタゴニストは抗ＥＧＦＬ７抗体である。アンタゴニストがＥＧＦＬ７誘導ＥＣ遊走を妨害する能力は、例えば、インビトロ細胞遊走アッセイにおいて検出され得る。
【００２４】
好ましい一実施形態では、血管新生と関連する病理学的状態は癌である。別の好ましい実施形態では、血管新生と関連する病理学的状態は、眼内新生血管形成疾患である。また別の好ましい実施形態では、ＥＧＦＬ７アンタゴニストは、別の抗血管新生剤（例えば、ベバシズマブなどの抗ＶＥＧＦ抗体）と共投与される。本発明はまた、血管新生と関連する病理学的状態を有する被験体における抗血管新生剤処置有効性の増強方法であって、該被験体に、ＥＧＦＬ７アンタゴニストを抗血管新生剤との組み合わせで投与することを含む方法を提供する。かかる方法は、癌または眼内新生血管形成疾患、特に、抗血管新生剤単独での処置に対して応答が不充分である疾患またはその病気の処置に有用である。抗血管新生剤は、血管新生を低減または抑制する能力を有する任意の薬剤であり得、抗ＶＥＧＦ抗体などのＶＥＧＦアンタゴニストが挙げられる。腫瘍を処置する場合、単独または抗血管新生剤と組み合せたＥＧＦＬ７アンタゴニストを、さらに、１種類以上の化学療法剤を含む化学療法レジメン（ｒｅｇｉｍｅ）と組み合わせ得る。また、放射線療法も、有効性の増強のために組み合わせ得る。
【００２５】
また別の実施形態では、本発明は、哺乳動物に、ＥＧＦＬ７ポリペプチドまたはＥＧＦＬ７ポリペプチドのアゴニストを投与することを含む、哺乳動物において脈管の形成を促進するための方法であって、前記哺乳動物における脈管の形成が刺激される方法を提供する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００２６】
また別の実施形態では、本発明は、治療有効量のＥＧＦＬ７ポリペプチドまたはそのアゴニストを哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における血管新生の刺激方法を提供する。好ましくは、哺乳動物はヒトであり、より好ましくは、血管新生が組織再生または創傷治癒を促進し得る。
【００２７】
また別の実施形態では、本発明は、哺乳動物に、ＥＧＦＬ７ポリペプチド、そのアゴニストまたはアンタゴニストを含む組成物を投与することを含む、哺乳動物において脈管の管形成をモジュレート（例えば、抑制または刺激）するための方法を提供する。
【００２８】
また別の実施形態では、本発明は、哺乳動物における内皮細胞遊走をモジュレート（例えば、誘導または低減）することにより、血管新生モジュレート（例えば、誘導または低減）するための方法であって、哺乳動物にＥＧＦＬ７ポリペプチド、そのアゴニストまたはアンタゴニストを投与することを含み、前記哺乳動物における内皮細胞遊走がモジュレートされる方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
好ましい実施形態の詳細な説明
定義
特に記載のない限り、本明細書において用いる科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  第２版，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  １９９４）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  １９８９）を参照のこと。本発明の目的のため、以下の用語を以下に規定する。
【００３０】
本明細書で用いる場合、用語「ＥＧＦＬ７」および「ＥＧＦＬ７ポリペプチド」は、互換的に用いられ、天然配列ＥＧＦＬ７，ＥＧＦＬ７バリアントおよびキメラＥＧＦＬ７をいい、これらの各々を本明細書において規定する。任意選択で、ＥＧＦＬ７は、天然グリコシル化と関連していない。「天然グリコシル化」は、哺乳動物細胞内、特に、天然状態で産生される細胞内で産生されたとき、ＥＧＦＬ７に共有結合している炭水化物部分をいう。したがって、非ヒト細胞内で産生されるヒトＥＧＦＬ７は、「天然グリコシル化と関連していない」ものであり得るＥＧＦＬ７の一例である。ある場合においては、ＥＧＦＬ７は、原核生物（例えば、大腸菌）内で産生される場合のように、全くグリコシル化されていないものであり得る。
【００３１】
ＥＧＦＬ７核酸は、上記規定のＥＧＦＬ７ポリペプチドをコードするＲＮＡまたはＤＮＡであるか、またはかかるＤＮＡまたはＲＮＡに、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつこれに対して安定的に結合した状態を維持しているものであって、約１０ヌクレオチド長より大きいものである。ストリンジェント条件は、（１）洗浄に低イオン強度および高温、例えば、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ／０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム／０．１％ＮａＤｏｄＳＯ４を５０℃で用いる、または（２）ハイブリダイゼーション中に、変性剤、例えばホルムアミド、例えば５０％（容量／容量）ホルムアミドを、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５、７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウム含有）とともに４２°Ｃで使用するものである。
【００３２】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係で配置される場合、作動可能に連結されている。ＥＧＦＬ７核酸は、別の核酸配列とベクター内に、ある特定の宿主生物内で発現されるように作動可能に連結され得る。これは、当該技術分野でよく知られた方法によって行なわれ得る。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、これが、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、該ポリペプチドのＤＮＡと作動可能に連結され；プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、該配列と作動可能に連結され；またはリボソーム結合部位は、翻訳が助長されるように配置される場合、コード配列と作動可能に連結される。一般的に、「作動可能に連結される」は、連結されるＤＮＡ配列が連続的であり、分泌リーダーの場合は、連続的かつ読み枠（ｒｅａｄｉｎｇ  ｐｈａｓｅ）内にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、連続的である必要はない。連結は、簡便な制限部位でのライゲーションによってなされる。かかる部位が存在しないならば、合成オリゴヌクレオチドのアダプターまたはリンカーを、慣用的実務にしたがって使用する。
【００３３】
「天然配列ＥＧＦＬ７」は、その調製様式または種に関わらず、天然に由来するＥＧＦＬ７と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含する。したがって、天然配列ＥＧＦＬ７は、天然に存在するヒトＥＧＦＬ７、マウスＥＧＦＬ７、ツメガエル属ＥＧＦＬ７、ゼブラフィッシュＥＧＦＬ７または任意の他の種由来のＥＧＦＬ７のアミノ酸配列を有するものであり得る。例えば、好ましい完全長天然配列ヒトＥＧＦＬ７アミノ酸配列を、図１Ａ（配列番号：１）に示す。天然配列マウスＥＧＦＬ７アミノ酸を配列を図１Ａ（配列番号：２）に示す。かかる天然配列ＥＧＦＬ７は、天然から単離されたものであり得、または組換えおよび／または合成手段によって作製されたものであり得る。用語「天然配列ＥＧＦＬ７」は、具体的には、天然に存在するプレプロ形態、プロ形態および成熟形態および切断型形態のＥＧＦＬ７、天然に存在するバリアント形態および天然に存在する対立遺伝子バリアントを包含する。
【００３４】
「ＥＧＦＬ７バリアント」は、天然配列ＥＧＦＬ７ポリペプチドの配列と異なるアミノ酸配列、例えば、それぞれヒト、マウス、ツメガエル属およびゼブラフィッシュＥＧＦＬ７について図１Ａ（配列番号：１−４）に示したような、天然配列内の１個以上のアミノ酸残基の挿入、欠失、修飾および／または置換によって異なるアミノ酸配列を有する、生物学的に活性なＥＧＦＬ７ポリペプチドである。ＥＧＦＬ７バリアントは、一般的には、配列番号：１のヒトＥＧＦＬ７などの天然配列ＥＧＦＬ７と１００％未満の配列同一性を有する。しかしながら、通常、生物学的に活性なＥＧＦＬ７バリアントは、配列番号：１のヒトＥＧＦＬ７などの天然に存在するＥＧＦＬ７のアミノ酸配列と、少なくとも約７０％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約８５％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、少なくとも約９５％〜少なくとも約９９％アミノ酸配列同一性（１％増加するごとに好ましさが増す）である。ＥＧＦＬ７バリアントとしては、対応する天然配列ＥＧＦＬ７ポリペプチドの生物学的活性を保持している少なくとも５個のアミノ酸のペプチド断片が挙げられる。ＥＧＦＬ７バリアントとしてはまた、１個以上のアミノ酸残基が、天然ＥＧＦＬ７配列のＮ−末端もしくはＣ−末端またはその内部に付加されたＥＧＦＬ７ポリペプチドが挙げられる。ＥＧＦＬ７バリアントとしてはまた、いくつかのアミノ酸残基が欠失されており、任意選択で、１個以上のアミノ酸残基で置換されたＥＧＦＬ７ポリペプチドが挙げられる。ＥＧＦＬ７バリアントはまた、例えば、天然に存在するアミノ酸以外の部分で置換によって、またはアミノ酸残基を修飾することによって天然に存在しないアミノ酸を作製することにより、共有結合修飾されたものであり得る。ＥＧＦＬ７バリアントは、ヘパリン結合ドメインを含み得る。
【００３５】
ＥＧＦＬ７配列に関する「アミノ酸配列同一性割合」は、本明細書において、両配列をアラインメントし、必要であれば、最大割合の配列同一性が得られるようにギャップを導入した後の、ＥＧＦＬ７配列内の残基と同一である候補配列内のアミノ酸残基の割合と規定し、保存的置換は配列同一性の一部とみなさない。候補ＥＧＦＬ７配列内のＮ末端、Ｃ末端または内部の伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）、欠失または挿入は、いずれも、配列の同一性または相同性に影響すると解釈されないものとする。アラインメントのための方法およびコンピュータプログラムは、当該技術分野でよく知られている。かかるコンピュータプログラムの一例は、「ＡＬＩＧＮ−２」（著作権者Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）であり、これは、ドキュメンテーション・マニュアル（ｕｓｅｒ  ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）により米国著作権局（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．２０５５９）に出願され、著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されたものである。
【００３６】
「キメラＥＧＦＬ７」分子は、非相同性ポリペプチドと融合または結合された完全長ＥＧＦＬ７またはその１種類以上のドメインを含むポリペプチドである。キメラＥＧＦＬ７分子は、一般的には、天然に存在するＥＧＦＬ７と共通の少なくとも１つの生物学的特性を共有する。キメラＥＧＦＬ７分子の一例は、精製目的でエピトープタグ付け（ｅｐｉｔｏｐｅ  ｔａｇｇｅｄ）されたものである。別のキメラＥＧＦＬ７分子はＥＧＦＬ７イムノアドヘシンである。
【００３７】
「単離されたＥＧＦＬ７」は、ＥＧＦＬ７供給源から精製されたＥＧＦＬ７、または組換えもしくは合成方法によって調製し、精製されたＥＧＦＬ７を意味する。精製されたＥＧＦＬ７は、他のポリペプチドまたはペプチドを実質的に含まない。「実質的に含まない」は、ここでは、約５％未満、好ましくは約２％未満、より好ましくは約１％未満、さらにより好ましくは約０．５％未満、最も好ましくは、約０．１％未満の他の供給源のタンパク質による夾雑を意味する。
【００３８】
「本質的に純粋な」タンパク質は、組成物の全重量に対して少なくとも約９０重量％の該タンパク質、好ましくは少なくとも約９５重量％、より好ましくは少なくとも約９０重量％、さらにより好ましくは少なくとも約９５重量％を含む組成物を意味する。「本質的に均一な」タンパク質は、組成物の全重量に対して少なくとも約９９重量％のタンパク質を含む組成物を意味する。
【００３９】
用語「アンタゴニスト」は、最も広い意味で用い、天然ＥＧＦＬ７ポリペプチドの生物学的活性を部分的または完全にブロック、阻害または中和する任意の分子が含まれる。好適なアンタゴニスト分子としては、具体的には、アンタゴニスト抗体もしくは抗体断片、天然ＥＧＦＬ７ポリペプチドの断片もしくはアミノ酸配列バリアント、ペプチド、ＥＧＦＬ７レセプター（１つまたは複数）の可溶性断片、有機低分子などが含まれる。ＥＧＦＬ７ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストを同定するための方法は、ＥＧＦＬ７ポリペプチドを候補アゴニストまたはアンタゴニスト分子と接触させること、および通常ＥＧＦＬ７ポリペプチドと会合する（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ）１種類以上の生物学的活性における検出可能な変化を測定することを含み得る。
【００４０】
「活性な」または「活性」は、本発明における目的のため、天然または天然に存在するＥＧＦＬ７の生物学的および／または免疫学的活性を保持しているＥＧＦＬ７の形態（１つまたは複数）をいい、ここで、「生物学的」活性は、天然または天然に存在するＥＧＦＬ７が有する抗原性エピトープに対する抗体の産生を誘導する能力以外の、天然または天然に存在するＥＧＦＬ７によって引き起こされる生物学的機能（阻害性または刺激性のいずれか）をいい、「免疫学的」活性は、天然または天然に存在するＥＧＦＬ７が有する抗原性エピトープに対する抗体の産生を誘導する能力をいう。
【００４１】
したがって、「生物学的に活性な」は、「ＥＧＦＬ７」もしくは「単離されたＥＧＦＬ７」またはＥＧＦＬ７のアゴニストと関連して使用する場合、天然配列ＥＧＦＬ７のエフェクター機能を発揮または共有するＥＧＦＬ７ポリペプチドを意味する。ＥＧＦＬ７の主なエフェクター機能は、脈管の形成を促進するその能力である。さらにより好ましくは、該生物学的活性は、管形成を調節する能力である。
【００４２】
「ＥＧＦＬ７レセプター」は、ＥＧＦＬ７が結合し、かつＥＧＦＬ７の生物学的特性を媒介する分子である。
【００４３】
用語「抗体」は、本明細書では、最も広い意味で用い、具体的には、所望の生物学的活性を発揮する限り、ヒト、非ヒト（例えば、マウス）およびヒト化モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体断片を包含する。
【００４４】
「抗体」（Ａｂ）および「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、同じ構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体は、ある特定の抗原に対する結合特異性を発揮するが、免疫グロブリンは、抗体および抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両方を含む。後者の種類のポリペプチドは、例えば、リンパ系によって低レベルで産生され、メラノーマによって増大したレベルで産生される。
【００４５】
「天然（ｎａｔｉｖｅ）抗体」および「天然免疫グロブリン」は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖で構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は重鎖と、１つのジスルフィド共有結合によって連結されているが、ジスルフィド結合の数は、種々の免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各重鎖および軽鎖はまた、一定間隔で鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）、その後にいくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、可変ドメインを一端に（ＶＬ）および定常ドメインをその他端に有する。軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１定常ドメインと並んでおり、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと並んでいる。特定のアミノ酸残基が、軽鎖および重鎖の可変ドメイン間の界面を形成していると考えられる。
【００４６】
用語「可変」は、可変ドメインのある特定部分が、抗体間で配列において広範囲に異なり、特定の抗原に対するその各特定の抗体の結合および特異性において用いられるという事実をいう。しかしながら、その可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均一には分布していない。これは、軽鎖および重鎖の可変ドメインの両方にある超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、各々、４つのＦＲ（それぞれ、ＦＲｌ、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）を含み、大部分は、βシート構造をとり、３つの超可変領域で連結され、βシート構造が連結されてループ（場合によっては、その一部）を形成している。各鎖における超可変領域は、ＦＲによって互いに近接して団結しており、他の鎖由来の超可変領域とともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ  第５版．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１），第６４７〜６６９頁を参照のこと）。定常ドメインは、抗原に対する抗体の結合に直接関与しないが、種々のエフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与など）を発揮する。
【００４７】
用語「超可変領域」は、本明細書で用いる場合、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基をいう。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」（すなわち、軽鎖可変ドメイン内の残基２４〜３４（Ｌｌ）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン内の３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）由来のアミノ酸残基（Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ  第５版．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））および／または「超可変ループ」（すなわち、軽鎖可変ドメイン内の残基２６〜３２（Ｌｌ）、５０〜５２（Ｌ２）および９１−９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン内の２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６−１０１（Ｈ３）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））由来の残基を含む。「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書に規定の超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００４８】
抗体のパパイン消化により、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片が生成し、各々は、単一の抗原結合部位および残留（ｒｅｓｉｄｕａｌ）「Ｆｃ」断片を有し、その名称は、容易に結晶化させるその能力を反映する。ペプシン処理では、Ｆ（ａｂ’）２断片が得られ、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原を架橋する能力を有する。
【００４９】
「Ｆｖ」は、最小限の抗体断片であり、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含有する。この領域は、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインが強固に非共有結合した二量体からなる。この構成では、各可変ドメインの３つの超可変領域が相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を規定する。集合的に６つの超可変領域が、抗原結合特異性を抗体に付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（抗原に特異的な超可変領域を３つだけ含むＦｖの半分）であっても、抗原を認識および結合する能力を有するが、全結合部位よりも親和性が低い。
【００５０】
Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆａｂ’断片はＦａｂ断片とは、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端における数個の残基（例えば、抗体ヒンジ領域由来の１種類以上のシステイン（１つまたは複数））の付加で異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書においてＦａｂ’を指定するものであり、定常ドメインのシステイン残基（１つまたは複数）が遊離チオール基を有する。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、最初は、Ｆａｂ’断片との対で作製され、これらの間にヒンジシステインを有する。抗体断片の他の化学的カップリングも知られている。
【００５１】
任意の脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの明白に異なる型の一方に指定され得る。
【００５２】
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、異なるクラスに分類され得る。免疫グロブリンには、５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、これらの一部は、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡｌおよびＩｇＡ２にさらに細分され得る。種々のクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖の定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。種々のクラスの免疫グロブリンサブユニット構造および三次元立体配置はよく知られている。
【００５３】
「抗体断片」は、完全長抗体の一部分、一般的には、その抗原結合ドメインまたは可変ドメインを含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片；抗体断片から形成されるダイアボディ；線状抗体；単鎖抗体分子；ならびに多重特異性抗体が挙げられる。
【００５４】
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で用いる場合、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体をいい、すなわち、該集団を構成する個々の抗体が、微量に存在し得る考えられ得る天然に存在する変異体を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原性部位に対して指向される。さらにまた、典型的には、異なる決定基（エピトープ）に対して指向される異なる抗体を含む慣用の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。修飾因子（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）「モノクローナル」は、該抗体が、実質的に均一な抗体集団から得られたものであるという性質を示し、抗体がなんら特定の方法によって作製されることを要するという解釈ではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）に最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作製され得、または組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）によって作製され得る。「モノクローナル抗体」はまた、ファージ抗体ライブラリーから、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載された手法を用いて単離されたものであり得る。
【００５５】
モノクローナル抗体は、本明細書において、具体的には、所望の生物学的活性を発揮する限り、重鎖および／または軽鎖の一部分が、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同性であり、残りの鎖（１つまたは複数）は、別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体ならびにかかる抗体の断片の対応する配列と同一または相同性である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）が挙げられる。（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５（１９８４））。
【００５６】
「ヒト化」形態の非ヒト（例えば、マウス）抗体は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含有するキメラ抗体である。通常、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域残基が、非ヒト種（ドナー抗体）、例えばマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類由来の超可変領域残基と置き換えられた、所望の特異性，親和性および能力（ｃａｐａｃｉｔｙ）を有するヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ある場合においては、、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基と置き換えられる。さらにまた、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体には見られない残基を含み得る。このような修飾体は、抗体の性能をさらに洗練させるために作製される。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ここで、超可変領域のすべてまたは実質的にすべてが、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲのすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、任意選択で、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的には、ヒト免疫グロブリンのものを含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ  Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照のこと。
【００５７】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖で存在する。一般的に、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨおよびＶＬドメイン間に、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成するのを可能にするポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，第１１３巻，ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照のこと。
【００５８】
用語「ダイアボディ」は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片をいい、この断片は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）内に連結された状態で含む。同じ鎖上でのこの２つのドメインの対合（ｐａｉｒｉｎｇ）を許容するには短すぎるリンカーを用いることにより、これらのドメインは、別の鎖の相補的ドメインとの対合が強制され、２つの抗原結合部位を創出する。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）に、より充分に記載されている。
【００５９】
「線状抗体」という表現は、本出願書類全体を通して用いる場合、Ｚａｐａｔａら  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５）に記載された抗体をいう。簡単には、このような抗体は、一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。線状抗体は、二重特異性または単一特異性であり得る。線状抗体は、二重特異的または単一特異的であり得る。
【００６０】
用語「エピトープ」は、タンパク質抗原上の（モノクローナルまたはポリクローナル）抗体に対する結合部位をいうために用いる。
【００６１】
「アゴニスト抗体」により、ＥＧＦＬ７アゴニストであり、したがって、天然配列ＥＧＦＬ７の生物学的特性の１種類以上を有する抗体が意図される。
【００６２】
用語「ＥＧＦＬ７イムノアドヘシン」は、用語「ＥＧＦＬ７−免疫グロブリンキメラ」と互換的に用いられ、ＥＧＦＬ７分子（天然またはバリアント）の少なくとも一部分と免疫グロブリン配列を合わせたキメラ分子をいう。免疫グロブリン配列は、好ましくは（必ずしもそうではないが）免疫グロブリン定常ドメインである。イムノアドヘシンは、ヒト抗体の重要な化学的および生物学的特性の多くを有し得る。イムノアドヘシンは、所望の特異性を有するヒトタンパク質配列を、適切なヒト免疫グロブリンヒンジおよび定常ドメイン（Ｆｃ）配列と連結させて構築され得るので、目的の結合特異性は、完全にヒトの成分を用いて得られ得る。かかるイムノアドヘシンは、患者に対する免疫原性が最小限であり長期的または反復的使用に安全である。
【００６３】
治療用途に関して記載されているホモ多量体イムノアドヘシンの例としては、細胞表面ＣＤ４に対するＨＩＶの結合をブロックするためのＣＤ４−ＩｇＧイムノアドヘシンが挙げられる。ＣＤ４−ＩｇＧを妊娠女性に分娩直前に投与した臨床試験フェーズＩで得られたデータでは、このイムノアドヘシンが、ＨＩＶの母体−胎児間移動の予防に有用であり得ることが示されている（Ａｓｈｋｅｎａｚｉら，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：２１９−２２７（１９９３））。また、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に結合するイムノアドヘシンも開発されている。ＴＮＦは、敗血性ショックの主なメディエーターであることが示されているプロ炎症サイトカインである。敗血性ショックのマウスモデルに基づき、ＴＮＦレセプターイムノアドヘシンは、敗血性ショックの処置における臨床用途のための候補として有望であることが示されている（Ａｓｈｋｅｎａｚｉ，Ａ．ら  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８：１０５３５−１０５３９（１９９１））。ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）は、ＩｇＧ  Ｆｃ領域と融合させたＴＮＦレセプター配列を含むイムノアドヘシンであり、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって、１９９８年１１月２日に関節リウマチの処置に関して承認された。関節リウマチの処置におけるＥＮＢＲＥＬ（登録商標）の新しい拡張された使用は、ＦＤＡによって２０００年６月６日に承認された。ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）などのＴＮＦ遮断薬に関する最近の情報については、Ｌｏｖｅｌｌら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４２：７６３−１６９（２０００）、およびｐ８１０〜８１１の添付の論説；ならびにＷｅｉｎｂｌａｔｔら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４０：２５３−２５９（１９９９）；ＭａｉｎｉおよびＴａｙｌｏｒ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５１：２０７−２２９（２０００）の概説を参照のこと。
【００６４】
イムノアドヘシン構造の２つのアームが異なる特異性を有する場合、このイムノアドヘシンは、二重特異性抗体との類似性により「二重特異性イムノアドヘシン」と呼ばれる。Ｄｉｅｔｓｃｈら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １６２：１２３（１９９３）には、接着分子であるＥ−セレクチンおよびＰ−セレクチン（各セレクチンは、天然では異なる細胞型において発現される）の細胞外ドメインが結合した、かかる二重特異性イムノアドヘシンが記載されている。結合性試験により、このようにして形成された二重特異性免疫グロブリン融合タンパク質は、骨髄性細胞株に結合する能力が、単一特異性イムノアドヘシン（該細胞株に由来）と比べて増大することが示された。
【００６５】
用語「ヘテロアドヘシン」は、表現「キメラヘテロ多量体アドヘシン」と互換的に用いられ、キメラ分子（アミノ酸配列）の複合体をいい、ここで、各キメラ分子は、生物学的に活性な部分（例えば、ヘテロ多量体レセプター単量体の各々の細胞外ドメインなど）と多量体化ドメインとを結合している。「多量体化ドメイン」は、ヘテロ多量体複合体内でのキメラ分子の安定な相互作用を促進する。多量体化ドメインは、免疫グロブリン配列、ロイシンジッパー、疎水性領域、親水性領域、またはキメラヘテロ多量体キメラ分子間に分子間ジスルフィド結合を形成する遊離チオールを介して相互作用し得る。多量体化ドメインは、免疫グロブリン定常領域を含み得る。また、多量体化領域は、立体相互作用が安定な相互作用を促進するだけでなく、単量体の混合物からホモ二量体よりもヘテロ二量体の形成をさらに促進するように遺伝子操作し得る。「隆起（ｐｒｏｔｕｂｅｒａｎｃｅ）」は、第１ポリペプチドの界面（ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）由来の小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）と置き換えることにより構築される。隆起と同一または類似の大きさの補完的「空洞」を、任意選択で第２ポリペプチドの界面上に、大きなアミノ酸側鎖をより小さいもの（例えば、アラニンまたはトレオニン）と置き換えることにより創出する。免疫グロブリン配列は、好ましくは（必ずしもそうではないが）免疫グロブリン定常ドメインである。本発明のキメラ内の免疫グロブリン部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭから得られるものであり得るが、好ましくは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３から得られるものであり得る。
【００６６】
本明細書で用いる場合、「処置」は、有益な、または所望の臨床成績を得るためのアプローチである。本発明の目的のため、有益な、または所望の臨床成績としては、限定されないが、症状の緩和、疾患の程度の減衰、疾患の状態の安定化（すなわち、悪化しない）、疾患進行の遅延または遅滞、疾患の状態の改善または一時的軽減、および寛解（一部または完全のいずれか）であって、検出可能なものまたは検出不可能なものが挙げられる。「処置」はまた、処置を受けない場合に予想される生存と比べたときの生存の延長を意味し得る。「処置」は、障害の発症を予防するか、またはその病態を改変する意図を伴って行なわれる介入である。したがって、「処置」は、治療的処置および予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃまたはｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段の両方をいう。処置を必要とする人としては、既に障害を有する人ならびに障害が予防されるべき人が挙げられる。具体的には、処置は、細胞の変性または損傷の病態（例えば、癌処置における腫瘍細胞の病態など）を直接予防、遅延あるいは低減させるものであり得、または該細胞を、他の治療剤による処置に対してより感受性とするものであり得る。
【００６７】
「慢性」投与は、急性様式とは対照的に、初期治療効果（活性）が長期間維持されるように連続的様式での薬剤（１つまたは複数）の投与をいう。「間欠」投与は、中断することなく連続的に行なわれないというのではなく、事実上、周期的に行なわれる処置である。
【００６８】
処置の目的のための「哺乳動物」は、哺乳動物に分類される任意の動物をいい、ヒト、他の高等霊長類、家畜動物，および動物園、競技用または愛玩動物（例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ）などが挙げられる。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００６９】
「腫瘍」は、本明細書で用いる場合、あらゆる新生物性細胞の成長および増殖であって悪性または良性のいずれかであるもの、ならびにあらゆる前癌性および癌性の細胞および組織をいう。
【００７０】
用語「癌」および「癌性」は、典型的には無秩序な細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態をいうか、または示す。癌の例としては、限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病が挙げられる。かかる癌のより具体的な例としては、扁平上皮癌、肺癌（肺の小細胞癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、および肺の扁平上皮癌を含む）、腹膜の癌、肝細胞の癌、胃（ｇａｓｔｒｉｃまたはｓｔｏｍａｃｈ）癌（胃腸癌を含む）、膵臓癌、グリア芽細胞腫、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーム、乳癌、結腸癌，結腸直腸癌、子宮内膜または子宮の癌腫、唾液腺癌腫、腎臓（ｋｉｄｎｅｙまたはｒｅｎａｌ）癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部の癌、甲状腺癌、肝細胞（ｈｅｐａｔｉｃ）癌腫ならびに種々の型の頭部および頚部の癌、ならびにＢ細胞リンパ腫（例えば、低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中等悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中等悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度非分割小細胞ＮＨＬ；大きな腫瘍の（ｂｕｌｋｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；ヘアリーセル白血病；慢性骨髄芽球性白血病；および移植後リンパ球増殖症障害（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症、浮腫と関連する異常な脈管増殖（脳腫瘍と関連するものなど）、ならびにメグス症候群が挙げられる。
【００７１】
「化学療法剤」は、癌の処置に有用な化合物である。化学療法剤の例としては、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロスホスファミドなど；スルホン酸アルキル、例えば、ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなど；アッジリジン、例えば、ベンゾドパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボクオン、メツレドパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、およびウレドパ（ｕｒｅｄｏｐａ）など；エチレンイミンおよびメチルアメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）、例えば、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレン（ｅｔｙｌｅｎｅ）ホスホルアミド、トリエチレン（ｅｔｈｉｙｌｅｎｅ）チオホスホルアミドおよびトリメチロールメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシンオン）；カンプトテシン（合成アナログのトポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成アナログを含む）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成アナログＫＷ−２１８９およびＣＢｌ−ＴＭｌを含む）；エレウテロビン（ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｂｉｎ）；パンクラチスタチン；アサルコジスチン（ａ  ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンジスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン、トロスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フェテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン；抗生物質、例えば、エンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特に、カリケアマイシンγ１ＩおよびカリケアマイシンωＩ１（例えば、Ａｇｎｅｗ、Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：１８３−１８６（１９９４）を参照のこと）；ジメミシン、例えば、ジメミシンＡ；ビスホスホネート、例えば、クロドロネート；エスペラマイシン；ならびにネオカルジノスタチンクロモフォアおよび関連色素蛋白エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オートラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、例えばマイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、プ���マイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）；代謝拮抗剤、例えば、メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸アナログ、例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリンアナログ、例えば、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン；アンドロゲン、例えば、カルステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗アドレナリン作用薬、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補給剤、例えば、フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルホルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ）酢酸塩；アネポチロン（ａｎｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）；エトグルシド（ｅｔｏｇｌｕｃｉｄ）；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシノイド、例えば、メイタンシンおよびアンサミトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎ）；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメト（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）；ラゾオキサン；リソキシン（ｒｈｉｚｏｘｉｎ）；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ−２毒素、ベラクリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジンＡおよびアグイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ））；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（“Ａｒａ−Ｃ”）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、ＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭクレモホール無含有、アルブミン操作ナノ粒子製剤のパクリタキセル（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）、ならびにＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドキセタキセル（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；���金配位錯体、例えば、シスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イフォスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセロダ（ｘｅｌｏｄａ）；イバンドロネート；イリノテカン（例えば、ＣＰＴ−１１）；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えば、レチノイン酸；カペシタビン；ならびに上記のものの薬学的に許容され得る塩、酸または誘導体が挙げられる。
【００７２】
また、この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するために作用する、抗エストロゲン剤および選択的エストロゲンレセプターモジュレーター（ＳＥＲＭ）などの抗ホルモン剤も含まれ、例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェンを含む）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、塩酸ラロキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹ１１７０１８、オナプリストンおよびＦＡＲＥＳＴＯＮ−トレミフェン；副腎においてエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害因子、例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）メゲストロール酢酸塩、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）エキセメスタン、ホルメスタニー（ｆｏｒｍｅｓｔａｎｉｅ）、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）レトロゾール、およびＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）アナステレソール；ならびに抗アンドロゲン、例えば、フルタミド，ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリン；ならびにトロキサシタビン（ｔｒｏｘａｃｉｔａｂｉｎｅ）（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシンアナログ）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、異常細胞増殖に関与するシグナル伝達経路の遺伝子の発現を阻害するもの、例えば、ＰＫＣ−α、ＲａｌｆおよびＨ−Ｒａｓなど；リボザイム、例えば、ＶＥＧＦ発現阻害剤（例えば、ＡＮＧＩＯＺＹＭＥ（登録商標）リボザイム）およびＨＥＲ２  発現阻害剤；ワクチン、例えば、遺伝子療法ワクチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、およびＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ−２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１インヒビター；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；ならびに上記の任意の薬学的に許容され得る塩、酸または誘導体が挙げられる。
【００７３】
「眼内新生血管形成疾患」は、眼の新生血管形成を特徴とする疾患である。眼内新生血管形成疾患の例としては、限定されないが、増殖性網膜症、脈絡膜新生血管形成（ＣＮＶ）、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病および他の虚血関連網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、目のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、網膜血管新生などが挙げられる。
【００７４】
疾患の「病態」には、患者の満足な健康状態に欠陥を生じさせるあらゆる現象が含まれる。癌としては、限定されないが、異常または制御不可能な細胞成長、転移、隣接細胞の正常な機能の干渉、サイトカインまたは他の分泌産物の異常レベルでの放出、炎症性応答または免疫学的応答の抑制または悪化などが挙げられる。
【００７５】
１種類以上のさらなる治療剤「との組み合わせでの」投与としては、同時（併用）および任意の順序での連続投与が挙げられる。
【００７６】
「担体」としては、本明細書で用いる場合、使用する投薬量および濃度において、曝露対象の細胞または哺乳動物に対して非毒性である薬学的に許容され得る担体、賦形剤または安定剤が挙げられる。多くの場合、生理学的に許容され得る担体は、水性ｐＨ緩衝化溶液である。生理学的に許容され得る担体の例としては、バッファー、例えば、リン酸、クエン酸および他の有機酸；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシン；単糖、二糖および他の炭水化物、例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリン；キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖アルコール、例えば、マンニトールまたはソルビトール；塩形成性対イオン、例えば、ナトリウム；および／または非イオン界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮＴＭ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭが挙げられる。
【００７７】
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質および／または薬物（例えば、ＥＧＦＬ７ポリペプチドまたはこれに対する抗体）の哺乳動物への送達に有用な界面活性剤から構成される小胞である。リポソームの該成分は、一般に、生体膜の脂質の配列と類似した二重層を形成した状態で配列されている。
【００７８】
「低分子」は、本明細書において、約５００ダルトン未満の分子量を有すると定義する。
【００７９】
用語「血管内皮成長因子」、「ＶＥＧＦ」、「ＶＥＧＦポリペプチド」および「ＶＥＧＦタンパク質」は本明細書で用いる場合、天然配列ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦバリアント（これは、本明細書においてさらに定義する）を包含する。ＶＥＧＦポリペプチドは、様々な供給源、例えば、ヒト組織型または別の供給源から単離されたものであってもよく、または組換えおよび／または合成方法によって調製されたものであってもよい。
【００８０】
「天然配列ＶＥＧＦ」は、天然由来のＶＥＧＦと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含する。かかる天然配列ＶＥＧＦは、天然から単離されたもの、または組換えおよび／または合成手段によって作製されたものであり得る。用語「天然配列ＶＥＧＦ」は、具体的には、ＶＥＧＦの天然に存在する切断型または分泌された形態（例えば、細胞外ドメイン配列）、天然に存在するバリアント形態（例えば、選択的スプライシングされた形態）および天然に存在する対立遺伝子バリアントを包含する。本発明の一実施形態では、天然配列ＶＥＧＦは、例えば、米国特許第５，３３２，６７１号および同第５，２４０，８４８号；ＰＣＴ公開公報ＷＯ  ９８／１００７１；Ｌｅｕｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１３０６−１３０９（１９８９）；およびＫｅｃｋら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１３０９−１３１２（１９８９）に記載されているような、それぞれ１２１、１４５、１６５、１８９および２０６個のアミノ酸残基からなる５つの公知のアイソフォームの１つである。
【００８１】
「ＶＥＧＦバリアントポリペプチド」は、以下に定義するように、天然配列ＶＥＧＦのアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％、最も好ましくは少なくとも約９８％アミノ酸配列同一性を有する活性なＶＥＧＦポリペプチドを意味する。かかるＶＥＧＦバリアントポリペプチドとしては、例えば、天然配列のＮ−および／またはＣ末端ならびに１つ以上の内部ドメイン内において１個以上のアミノ酸残基が付加または欠失したＶＥＧＦポリペプチドが挙げられる。
【００８２】
ＶＥＧＦについての配列同一性（アミノ酸または核酸いずれか）は、ＥＧＦＬ７に関して具体的に記載したものと同じアプローチを用いて測定される。同様に、ＥＧＦＬ７のアゴニストおよびアンタゴニスト（限定されないが、抗体など）で示した定義も、ＶＥＧＦのアゴニストおよびアンタゴニストに当てはまる。
【００８３】
（本発明を実施するための方法）
（ＥＧＦＬ７）
ＥＧＦＬ７遺伝子は、進化の過程で保存された約３０ｋＤのＥＣＭ関連（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）分泌タンパク質をコードする。ヒト（ホモサピエンス）アミノ酸配列（配列番号：１）は、それぞれ、マウス（ハツカネズミ；配列番号：２）、カエル（アフリカツメガエル；配列番号：３）およびゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ；配列番号：４）のものと約７７％、４７％および４３％相同性を共有する。ＥＧＦＬ７タンパク質は、シグナル配列、ＥＭＩドメインをＮ末端に（ＥＭＩドメインは、細胞接着の調節に関与するいくつかの細胞外マトリックス関連（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）タンパク質内に存在する）、その後に２つのＥＧＦ様ドメインと、ロイシンおよびバリン高含有Ｃ末端領域を含有する。
【００８４】
核酸およびポリペプチド分子を本発明において使用する。ヒト、マウス、ツメガエル属およびゼブラフィッシュのＥＧＦＬ７のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号：１〜４として示す（図１Ａ参照）。ゼブラフィッシュｃＤＮＡ（部分的にゲノムイントロン配列を有する）を配列番号：５として示す（図１Ｂ参照）。本発明において使用するポリヌクレオチドは、当業者によく知られた標準的な手法、例えば、ハイブリダイゼーションスクリーニングおよびＰＣＲ方法論などを用いて得られ得る。
【００８５】
ＥＧＦＬ７の受託番号は、ＮＭ＿０１６２１５（ホモサピエンスＥＧＦＬ７／ＶＥ種）、ＮＭ＿１７８４４４（ハツカネズミＥＧＦＬ７）、ＡＦ１８４９７３（ハツカネズミＮｏｔｃｈ４様）、Ｐ＿ＡＡＺ３７１３５（ハツカネズミＴＡＮＧＯ１２５）、ＢＣ０４４２６７（アフリカツメガエルＮＥＵｌ）、ＡＹ５４２１７０（ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ  ＥＧＦＬ７）である。Ｅｇｆｌ８受託番号は：ＮＭ＿０３０６５２（ホモサピエンス）、ＮＭ＿１５２９２２（ハツカネズミ）である。
【００８６】
（ＥＧＦＬ７活性のモジュレーターの調製および同定）
本発明はまた、ＥＧＦＬ７（アゴニスト）の１種類以上の生物学的活性を模倣もしくは増強するもの；またはＥＧＦＬ７（アンタゴニスト）の効果を阻害もしくは低減するものを同定するための化合物のスクリーニング方法を包含する。ＥＧＦＬ７アゴニストおよびアンタゴニストはまた、ＥＧＦＬ７モジュレーターともいう。アンタゴニスト薬物候補のスクリーニングアッセイは、ＥＧＦＬ７ポリペプチドと結合または複合体化するか、あるいは他の細胞のタンパク質とのＥＧＦＬ７の相互作用を妨害する化合物が同定されるように設計する。
【００８７】
（低分子スクリーニング）
低分子は、ＥＧＦＬ７アゴニストまたはアンタゴニストとして作用し、したがって、治療上有用となり得る能力を有し得る。かかる低分子には、天然に存在する低分子，合成有機系または無機系化合物およびペプチドが含まれ得る。しかしながら、本発明における低分子は、これらの形態に限定されない。低分子の広範なライブラリーが市販されており、このような分子を所望の活性についてスクリーニングするための多種多様なアッセイが当該技術分野でよく知られている。
【００８８】
候補ＥＧＦＬ７アゴニストまたはアンタゴニスト低分子は、好ましくは、まず、ＥＧＦＬ７活性の潜在的モジュレーターの迅速な同定を可能にするアッセイにおいて同定する。かかるアッセイの一例は、候補分子がＥＧＦＬ７レセプターに結合する能力を測定するタンパク質−タンパク質結合アッセイである。別の例では、候補分子が、ＥＧＦＬ７レセプターに対するＥＧＦＬ７結合を妨害する能力を測定する。
【００８９】
好ましい実施形態では、低分子ＥＧＦＬ７アゴニストは、ＥＧＦＬ７の生物学的活性の１つ以上を模倣するその能力によって同定される。例えば、低分子を、内皮細胞の増殖を誘導し、内皮細胞生存を促進するその能力（以下の実施例２および３に記載）または血管新生を誘導するその能力（以下の実施例４に記載）についてスクリーニングする。
【００９０】
別の実施形態では、低分子ＥＧＦＬ７アンタゴニストは、ＥＧＦＬ７の生物学的活性の１つ以上を阻害するその能力によって同定される。したがって、候補化合物をＥＧＦＬ７と接触させる。次いで、ＥＧＦＬ７の生物学的活性を評価する。一実施形態では、ＥＧＦＬ７が内皮細胞増殖を刺激する能力を、例えば、実施例２に記載のようにして測定する。別の実施形態では、ＥＧＦＬ７が内皮細胞生存を促進する能力を、例えば、実施例３に記載のようにして測定する。化合物は、ＥＧＦＬ７の生物学的活性が阻害される場合、アンタゴニストと同定される。
【００９１】
ＥＧＦＬ７アゴニストまたはアンタゴニストと同定された化合物は、本発明の方法において使用され得る。例えば、ＥＧＦＬ７アンタゴニストは、癌を処置するために使用され得る。
【００９２】
（ＥＧＦＬ７と相互作用するタンパク質のスクリーニングアッセイ）
タンパク質−タンパク質相互作用を検出するのに適した任意の方法が、タンパク質または他の分子を同定するのに使用され得、限定されないが、ＥＧＦＬ７と相互作用する膜貫通タンパク質または細胞内タンパク質が挙げられる。使用され得る伝統的な方法には、ＥＧＦＬ７と相互作用するタンパク質を同定するための免疫共沈降、架橋および勾配またはクロマトグラフィーカラムによる同時精製がある。かかるアッセイでは、ＥＧＦＬ７成分は、完全長タンパク質、その可溶性誘導体、目的のドメインに対応するペプチド、またはＥＧＦＬ７のいくつかの領域を含有する融合タンパク質であり得る。
【００９３】
ＥＧＦＬ７と相互作用する能力を有するタンパク質をコードする遺伝子の同時同定をもたらす方法を用いてもよい。これらの方法としては、例えば、λｇｔ１１ライブラリーの抗体プロービングのよく知られた手法と同様にして、標識されたＥＧＦＬ７またはそのバリアントを用いた発現ライブラリーのプロービングが挙げられる。
【００９４】
タンパク質相互作用をインビボで検出する方法であるツーハイブリッドシステムを、詳細に、例示のためだけであって限定を意図せずに記載する。この系の種類の一例は、記載されており（Ｃｈｉｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：９５７８−９５８２（１９９１））、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）から市販されている。
【００９５】
簡単には、かかるシステムを利用し、ツーハイブリッドタンパク質をコードするプラスミドを構築する。一方のプラスミドは、転写活性化因子タンパク質のＤＮＡ−結合ドメインをコードするヌクレオチドを、ＥＧＦＬ７またはこれに由来するポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と融合させたものからなり、他方のプラスミドは、転写活性化因子タンパク質の活性化ドメインをコードするヌクレオチドを、このプラスミド内にｃＤＮＡライブラリーの一部として組み込まれた未知タンパク質をコードするｃＤＮＡと融合させたものからなる。ＤＮＡ−結合ドメイン融合プラスミドおよびｃＤＮＡライブラリーで、レポーター遺伝子（例えば、ＨＢＳまたはｌａｃＺ）（その調節領域は、転写活性化因子の結合部位を含有する）を含有する酵母株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを形質転換する。いずれのハイブリッドタンパク質も、単独ではレポーター遺伝子の転写を活性化することができない。ＤＮＡ−結合ドメインハイブリッドは、活性化機能を提供することができないため活性化することができず、活性化ドメインハイブリッドは、該活性化因子の結合部位に局在化することができないため活性化することができない。ツーハイブリッドタンパク質の相互作用により、機能性活性化因子タンパク質が再構成され、レポーター遺伝子の発現がもたらされ、これをレポーター遺伝子産物に関するアッセイによって検出する。
【００９６】
ツーハイブリッドシステムまたは関連する方法論は、活性化ドメインライブラリーを、「おとり（ｂａｉｔ）」遺伝子産物と相互作用するタンパク質についてスクリーニングに使用され得る。一例としてであって、限定を意図しないが、ＥＧＦＬ７を、おとり遺伝子産物として使用し得る。全ゲノムまたはｃＤＮＡ配列を、活性化ドメインをコードするＤＮＡと融合させる。このライブラリーと、ＤＮＡ−結合ドメインと融合させたおとりＥＧＦＬ７遺伝子産物のハイブリッドをコードするプラスミドでレポーター酵母株を同時形質転換し、得られた形質転換体を、レポーター遺伝子を発現するものについてスクリーニングする。例えば、限定を意図しないが、おとりＥＧＦＬ７遺伝子配列（例えば、オープンリーディングフレームの遺伝子）は、ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ−結合ドメインをコードするＤＮＡと翻訳されるように融合されるようにベクター内にクローン化し得る。これらのコロニーを精製し、レポーター遺伝子発現を担うライブラリープラスミドを単離する。次いで、ＤＮＡシーケンシングを用い、該ライブラリープラスミドにコードされるタンパク質を同定する。
【００９７】
おとりＥＧＦＬ７遺伝子産物と相互作用するタンパク質の検出対象の細胞株のｃＤＮＡライブラリーは、当該技術分野において常套的に行なわれる方法を用いて作製され得る。本明細書に記載した特定のシステムによれば、例えば、ｃＤＮＡ断片はベクター内に、ＧＡＬ４の転写活性化ドメインと翻訳されるように融合されるように挿入し得る。このライブラリーで、おとりＥＧＦＬ７遺伝子−ＧＡＬ４融合プラスミドとともに、ＧＡＬ４活性化配列を含有するプロモーターによって駆動されるｌａｃＺ遺伝子を含有する酵母株を同時形質転換し得る。ｃＤＮＡにコードされ、ＧＡＬ４転写活性化ドメインと融合させた、おとりＥＧＦＬ７遺伝子産物と相互作用するタンパク質により、活性なＧＡＬ４タンパク質が再構成され、それにより発現が駆動される。発現を駆動するコロニーは、当該技術分野において常套的な方法によって検出され得る。次いで、ｃＤＮＡをこれらの株から精製し、当該技術分野において常套的に行なわれる手法を用い、おとりＥＧＦＬ７遺伝子相互作用性タンパク質の産生および単離のために使用し得る。
【００９８】
（ＥＧＦＬ７発現または活性をモジュレートする化合物のアッセイ）
下記のアッセイは、身体内において、ＥＧＦＬ７と相互作用（例えば、結合）する化合物、ＥＧＦＬ７のその結合パートナー、コグネート（ｃｏｇｎａｔｅ）もしくはレセプターとの相互作用を妨害する化合物、およびＥＧＦＬ７遺伝子発現活性をモジュレートする（すなわち、ＥＧＦＬ７遺伝子発現のレベルをモジュレートする）またはＥＧＦＬ７のレベルをモジュレートする化合物を同定するために設計されたものである。ＥＧＦＬ７遺伝子調節配列（例えば、プロモーター配列）と結合し、その結果、ＥＧＦＬ７遺伝子発現をモジュレートし得る化合物を同定するアッセイをさらに利用してもよい。例えば、Ｐｌａｔｔ，Ｋ．Ａ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２８５５８−２８５６２（１９９４）（これは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【００９９】
本発明に従ってスクリーニングされ得る化合物としては、限定されないが、ペプチド、抗体およびその断片、ならびにＥＧＦＬ７またはＥＧＦＬ７レセプターに結合し、天然リガンドによって誘発される活性を模倣する（すなわち、アゴニスト）が、または天然リガンドによって誘発される活性を阻害する（すなわち、アンタゴニスト）のいずれかである他の有機化合物（例えば、ペプチド模倣物）が挙げられる。
【０１００】
かかる化合物としては、限定されないが、ペプチド、例えば可溶性ペプチド（限定されないが、ランダムペプチドライブラリーの構成員が挙げられる）など；（例えば、Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４（１９９１）；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８４−８６（１９９１）を参照のこと）、ならびにＤ−および／またはＬ−型アミノ酸、ホスホペプチドで作製されたコンビナトリアルケミストリー由来分子ライブラリー（限定されないが、ランダムまたは一部変性（ｐａｒｔｉａｌｌｙ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）指向型（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）ホスホペプチドライブラリーの構成員が挙げられる）；例えば、Ｓｏｎｇｙａｎｇ，Ｚ．ら，Ｃｅｌｌ  ７２：７６７−７７８（１９９３）を参照のこと）、抗体（限定されないが、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イデオタイプ、キメラまたは単鎖抗体、ならびにＦＡｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦＡｂ発現ライブラリー断片、ならびにそのエピトープ結合断片が挙げられる）、および有機系または無機系低分子が挙げられ得る。
【０１０１】
本発明に従ってスクリーニングされ得る他の化合物としては、限定されないが、適切な細胞（例えば、内皮細胞）内への侵入を達成し、ＥＧＦＬ７遺伝子またはＥＧＦＬ７媒介性経路に関与するいくつかの他の遺伝子の発現に影響を及ぼす（例えば、遺伝子発現に関与する調節領域または転写因子と相互作用することにより）ことができる有機低分子；またはＥＧＦＬ７の活性またはＥＧＦＬ７シグナル伝達、異化経路または代謝経路に関与するいくつかの他の細胞内因子の活性に影響を及ぼすか、またはその代わりをするような化合物が挙げられる。
【０１０２】
コンピュータモデリングおよび検索技術により、ＥＧＦＬ７の発現または活性をモジュレートし得る化合物の同定、または既に同定されているかかる化合物の改良が可能である。かかる化合物または組成物が同定されたら、活性部位または活性領域を同定する。かかる活性部位は、典型的には、リガンド結合部位であり得る。活性部位は、例えば、ペプチドのアミノ酸配列から、核酸のヌクレオチド配列から、または関連する化合物または組成物とその天然リガンドとの複合体を調べることからなどの、当該技術分野で知られた方法を用いて同定され得る。後者の場合、化学的またはＸ線結晶学的方法を用い、該因子のどこに複合体形成したリガンドが見られるかを見い出すことにより活性部位を見出し得る。
【０１０３】
次に、活性部位の三次元幾何構造を決定する。これは、公知の方法（例えば、Ｘ線結晶学）によって行なわれ得、完全な分子構造が決定され得る。他方で、固相または液相ＮＭＲを用い、ある特定の分子内距離が決定され得る。構造決定の任意の他の実験方法が、部分的または完全な幾何構造を得るために使用され得る。幾何構造は、複合体形成したリガンド（天然または人工）について測定され得、決定される活性部位構造の精度が増大し得る。
【０１０４】
不完全または不充分に正確な構造が決定された場合、コンピュータを用いる数多くのモデリング方法が、構造を完成させるため、またはその精度を改善するために使用され得る。任意の認められたモデリング方法が使用され得、特定の生体高分子（例えば、タンパク質または核酸）などに特異的なパラメーター化（ｐａｒａｍｅｔｅｒｉｚｅｄ）モデル、分子運動のコンピュータ処理に基づく分子動力学的モデル、熱的集団（ｔｈｅｒｍａｌ  ｅｎｓｅｍｂｌｅ）に基づく統計力学モデル、または組み合せたモデルが挙げられる。ほとんどの型のモデルでは、構成原子や構成基間の力を表す標準的な分子力場が必要であり、物理化学において知られた力場から選択され得る。不完全な、または精度の低い実験構造は、これらのモデリング方法によってコンピュータ処理される、完全でより制度の高い構造に対する制約（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ）としての機能を果たし得る。
【０１０５】
最後に、モデリングまたは組み合わせのいずれかによって実験的に活性部位（または結合部位）の構造が決定されたら、候補モジュレーター化合物は、化合物をその分子構造に関する情報とともに含むデータベースを検索することにより同定し得る。かかる検索により、決定された活性部位構造と適合し、かつ該活性部位を規定する基（ｇｒｏｕｐ）と相互作用する構造を有する化合物を探し出す。かかる検索は手動で行い得るが、好ましくは、コンピュータを用いる。この検索で見い出されたこれらの化合物は、ＥＧＦＬ７活性の潜在的モジュレーターである。
【０１０６】
あるいはまた、これらの方法を用い、既知のモジュレーター化合物またはリガンドから改善されたモジュレーター化合物を同定し得る。新しい組成に適用した上記の実験的およびコンピュータモデリング方法を用い、既知の化合物の組成を改変し得、および改変の構造的効果が測定され得る。次いで、改変された構造を、該化合物の活性部位の構造と比較し、改善された嵌合（ｆｉｔ）または相互作用が結果をもたらすか否かを判定する。このように、側鎖基を変えるなどによる組成の組織的バリエーションが速やかに評価され、改善された特異性または活性の改変されたモジュレーター化合物またはリガンドが得られ得る。
【０１０７】
さらに、ＥＧＦＬ７の活性部位（または結合部位）、ならびに関連する形質導入および転写因子の同定に基づいてモジュレーター化合物を同定するのに有用な実験的およびコンピュータモデリング方法は、当業者に自明であろう。
【０１０８】
分子モデリングシステムの例は、ＣＨＡＲＭｍおよびＱＵＡＮＴＡプログラム（Ｐｏｌｙｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）である。ＣＨＡＲＭｍは、エネルギー最小化および分子力学機能を行う。ＱＵＡＮＴＡは、分子構造の構築、グラフィックモデリングおよび解析を行う。ＱＵＡＮＴＡは、分子同士の挙動の相互作用的構築、修飾、可視化および解析を可能にする。
【０１０９】
いくつかの論文に、特定のタンパク質と相互作用する薬物のコンピュータモデリングが、Ｒｏｔｉｖｉｎｅｎら，Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｅｎｎｉｃａ  ９７：１５９−１６６（１９８８）；Ｒｉｐｋａ，Ｎｅｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ  ５４−５７（１９８８年６月１６日）；ＭｃＫｉｎａｌｙおよびＲｏｓｓｍａｎｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｉｏｌ．２９：１１１−１２２（１９８９）；ＰｅｒｒｙおよびＤａｖｉｅｓ，ＯＳＡＲ：Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｐｐ．１８９−１９３（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８９）；ＬｅｗｉｓおよびＤｅａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．２３６：１２５−１４０（１９８９）および１４１−１６２に、ならびに核酸成分のモデルレセプターに関しては、Ａｓｋｅｗら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：１０８２−１０９０（１９８９）に概説されている。化学物質をスクリーニングおよびグラフィック表示する他のコンピュータプログラムは、ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ，Ｉｎｃ．（Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ．）、Ａｌｌｅｌｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）、およびＨｙｐｅｒｃｕｂｅ，Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｏｎｔａｒｉｏ）などの会社から入手可能である。これらは、主に、特定のタンパク質に特異的な薬物への適用のために設計されたものであるが、これらは、ＤＮＡまたはＲＮＡの領域がいったん同定されたら、該領域に特異的な薬物の設計に適合させ得る。
【０１１０】
結合性を改変し得る化合物の設計および作製に関して上記に示したが、公知化合物、例えば、天然産物または合成化学物質、および生物学的に活性な物質（例えば、タンパク質）などのライブラリーもまた、阻害因子または活性化因子である化合物に関してスクリーニングされ得る。
【０１１１】
本明細書に記載したものなどのアッセイにより同定された化合物は、例えば、ＥＧＦＬ７遺伝子産物の生物学的機能の解明に有用であり得る。かかる化合物は、様々な生理学的障害のいずれかを処置するために、患者に治療有効用量で投与され得る。治療有効用量は、任意の生物学的症状の任意の改善、障害、予防または改変をもたらすのに充分な化合物の量をいう。
【０１１２】
（ＥＧＦＬ７に結合する化合物のアッセイ）
ＥＧＦＬ７と相互作用（例えば、これに結合する）か模倣する能力を有するか、またはコグネートレセプター、結合パートナーまたは基質へのＥＧＦＬ７の結合を妨害する能力を有する化合物を同定するための系が設計され得る。同定された化合物は、例えば、野生型および／または変異ＥＧＦＬ７遺伝子産物の活性をモジュレートするのに有用であり得る；ＥＧＦＬ７の生物学的機能の詳述（ｅｌａｂｏｒａｔｉｎｇ）に有用であり得る；正常なＥＧＦＬ７相互作用を破壊する化合物の同定のためのスクリーニングに用いられ得る；またはそれ自体がかかる相互作用を破壊または活性化し得る。
【０１１３】
ＥＧＦＬ７に結合する化合物またはＥＧＦＬ７コグネートレセプターもしくは基質を同定するために使用されるアッセイの原理は、ＥＧＦＬ７と試験化合物の反応混合物を、この２つの成分が相互作用および結合し、したがって複合体が形成される（これは、取り出され得る、および／または反応混合物中で検出され得る）ことを可能にする条件下かつそれに充分な時間で調製することを含む。使用されるＥＧＦＬ７種は、スクリーニングアッセイの目的に応じて異なり得る。例えば、天然レセプターのアゴニストが所望される場合、完全長ＥＧＦＬ７または可溶性切断型ＥＧＦＬ７、１つ以上のＥＧＦＬ７ドメインを含有するペプチドまたは融合タンパク質であってアッセイ系において利点（例えば、得られる複合体の標識、単離など）を与えるタンパク質またはポリペプチドと融合させたものが使用され得る。ＥＧＦＬ７と直接相互作用する化合物が追求される場合、ＥＧＦＬ７に対応するペプチドおよびＥＧＦＬ７を含有する融合タンパク質が使用され得る。
【０１１４】
該スクリーニングアッセイは、様々な様式で行なわれ得る。例えば、かかるアッセイを実施するための方法の１つは、ＥＧＦＬ７、これに由来するポリペプチド、ペプチドもしくは融合タンパク質、または試験物質を固相に固定すること、および該固相上に固定されたＥＧＦＬ７／試験化合物複合体を反応の最後に検出することを含み得る。かかる方法の一実施形態では、ＥＧＦＬ７反応体を固相表面上に固定し得、試験化合物は固定せず、直接または間接的のいずれかで標識し得る。
【０１１５】
実際には、マイクロタイタープレートが、簡便に固相として使用され得る。固定される成分は、非共有結合または共有結合によって固定化され得る。非共有結合は、単純に、固相表面を、タンパク質の溶液でコートし、乾燥することによりなされ得る。あるいはまた、固定化される該タンパク質に特異的な固定化した抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）を用いて、該タンパク質を固相表面に固定化し得る。該表面は、あらかじめ調製しておき、保存してもよい。
【０１１６】
該アッセイを実施するため、非固定化成分を、固定された成分を含有するコート表面に添加する。反応が終了した後、未反応成分を、形成されたあらゆる複合体が固相表面上に固定化された状態で残るような条件下で、除去（例えば、洗浄により）する。固相表面上に固定された複合体の検出は、いくつかの様式で行なわれ得る。あらかじめ固定化しない成分を先に標識しておく場合、表面上に固定化される標識の検出は、複合体が形成されたことを示す。あらかじめ固定化しない成分を先に標識しない場合、間接標識を用いて表面上に固定された複合体を検出し得る；例えば、あらかじめ固定化しない成分に特異的な標識された抗体を用いる（この抗体は、直接標識されたもの、または標識された抗Ｉｇ抗体で間接的に標識されたものであり得る）。
【０１１７】
あるいはまた、反応を液相で行うこともでき、反応生成物を未反応成分から分離し、複合体を検出する；例えば、ＥＧＦＬ７タンパク質、ポリペプチド、ペプチドもしくは融合タンパク質に特異的は固定化された抗体または試験化合物を用い、溶液中で形成された複合体があれば固定し、生じ得る複合体の他方の成分に特異的な標識された抗体を用い、固定された複合体を検出する。
【０１１８】
（ＥＧＦＬ７相互作用を妨害する化合物のアッセイ）
ＥＧＦＬ７と相互作用する巨大分子を、本記述の目的のため、「結合パートナー」とよぶ。このような結合パートナーは、ＥＧＦＬ７媒介性生物学的経路に関与している可能性がある。したがって、かかる結合パートナーの相互作用を妨害または破壊する化合物を同定することが望ましく、身体内におけるＥＧＦＬ７活性の調節または増大、および／あるいはこの活性（またはその不足）と関連する障害の制御に、有用であり得る。
【０１１９】
ＥＧＦＬ７と１つまたは複数の結合パートナーとの相互作用を妨害する化合物を同定するために使用されるアッセイ系の基本原理は、ＥＧＦＬ７または一部のそのバリアントおよび結合パートナーを含有する反応混合物を、この２つが相互作用および結合し、したがって複合体が形成されることを可能にする条件下かつそれに充分な時間で調製することを含む。化合物を阻害活性に関して試験するため、反応混合物を試験化合物の存在および非存在で調製する。試験化合物は、最初に反応混合物中に含めてもよく、またはＥＧＦＬ７およびその結合パートナーの添加後の時点で添加してもよい。対照反応混合物は、試験化合物なしで、またはプラセボとともにインキュベートする。次いで、ＥＧＦＬ７と結合パートナーとのあらゆる複合体の形成を検出する。試験化合物を含有する反応混合物中には無い対照反応における複合体の形成は、該化合物がＥＧＦＬ７と相互作用性結合パートナーとの相互作用を妨害することを示す。さらに、試験化合物および正常ＥＧＦＬ７タンパク質を含有する反応混合物内での複合体形成を、試験化合物および変異体ＥＧＦＬ７を含有する反応混合物内での複合体形成と比較し得る。この比較は、変異体ＥＧＦＬ７または変異されたＥＧＦＬ７の相互作用を特異的に破壊し、正常な該タンパク質のは破壊しない化合物を同定することが望ましい場合において重要であり得る。
【０１２０】
ＥＧＦＬ７と結合パートナーとの相互作用を妨害する化合物のアッセイは、不均一系形式または均一系形式において行なわれ得る。不均一系アッセイは、ＥＧＦＬ７または結合パートナーのいずれかを固相上に固定すること、および固相上に固定された複合体を反応の最後に検出することを含む。均一系アッセイでは、反応全体を液相中で行う。いずれのアプローチにおいても、反応体の添加の順序は、試験対象の化合物に関する種々の情報を得るために変更し得る。例えば、競合によって該相互作用を妨害する試験化合物は、反応を試験物質の存在下で行うことにより、すなわち、試験物質を反応混合物に、ＥＧＦＬ７および相互作用性結合パートナーより前、またはこれらと同時に添加することにより同定され得る。あるいはまた、既に形成された複合体を破壊する試験化合物、例えば、高い結合定数を有し、複合体から成分の１つを外す化合物は、試験化合物を反応混合物に、複合体が形成された後に添加することにより試験し得る。種々の形式を以下に簡単に記載する。
【０１２１】
不均一系アッセイ系では、ＥＧＦＬ７または相互作用性結合パートナーのいずれかを、固相表面上に固定し、固定しない種を、直接または間接的のいずれかで標識する。実際には、マイクロタイタープレートが簡便に利用される。固定する種は、非共有結合または共有結合によって固定化され得る。非共有結合は、固相表面をＥＧＦＬ７または結合パートナーの溶液でコートし、乾燥することにより簡単になされ得る。あるいはまた、固定する種に特異的な固定化抗体を用いて該種を固相表面に固定し得る。該表面は、あらかじめ調製しておき、保存してもよい。
【０１２２】
該アッセイを実施するため、固定化した種のパートナーをコート表面に、試験化合物とともに、またはこれなしで曝露する。反応が終了した後、未反応成分を除去し（例えば、洗浄により）、形成された複合体があれば、該固相表面上に固定化されたまま残る。固相表面上に固定された複合体の検出は、いくつかの様式で行なわれ得る。固定化しない種を予備標識する場合、表面上に固定化された標識の検出は、複合体が形成されたことを示す。固定化しない種を予備標識しない場合、間接標識を用いて表面上に固定された複合体を検出し得る；例えば、最初に固定化しない種に特異的な標識された抗体を用いる（この抗体は、直接標識されたもの、または標識された抗Ｉｇ抗体で間接的に標識されたものであり得る）。反応成分の添加の順序に応じて、複合体形成を阻害する試験化合物または既に形成された複合体を破壊する試験化合物が検出され得る。
【０１２３】
あるいはまた、該反応は、液相中、試験化合物の存在下または非存在下で行なわれ得、反応生成物を未反応成分から分離し、複合体を検出する；例えば、結合成分の一方に特異的な固定化抗体を用い、溶液中で形成された複合体があれば固定し、他方のパートナーに特異的な標識された抗体を用い、固定された複合体を検出する。この場合も、反応体を液相に添加する順序に応じて、複合体を阻害する試験化合物または既に形成された複合体を破壊する試験化合物が同定され得る。
【０１２４】
本発明の別の実施形態では、均一系アッセイが使用され得る。このアプローチでは、ＥＧＦＬ７と相互作用性結合パートナーの複合体をあらかじめ調製する。ここで、ＥＧＦＬ７またはその結合パートナーのいずれかを標識し、標識によって生成するシグナルが、複合体の形成により消失する（例えば、このアプローチをイムノアッセイに利用しているＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎによる米国特許第４，１０９，４９６号を参照のこと）。既に形成された複合体に由来する種の一方と競合し、これと置き換わる試験物質の添加は、バックグラウンドを超えるシグナルの生成をもたらす。このようにして、相互作用を破壊する試験物質が同定され得る。
【０１２５】
ある特定の実施形態では、ＥＧＦＬ７融合体が、固定化のために調製され得る。例えば、ＥＧＦＬ７またはそのペプチド断片をグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子と、融合ベクター（例えば、ｐＧＥＸ−５Ｘ−ｌなど）を用い、結合活性が、得られる融合タンパク質において維持されるような様式で融合させ得る。相互作用性結合パートナーは、当該技術分野において常套的に行なわれる上記の方法を用いて、モノクローナル抗体を生成させるために精製され使用され得る。この抗体は、放射性同位体（例えば１２５Ｉ）により当該技術分野において常套的に行なわれる方法によって標識し得る。不均一アッセイでは、融合タンパク質をグルタチオン−アガロースビーズに固定し得る。次いで、相互作用性結合パートナーを、試験化合物の存在下または非存在下、相互作用および結合が起こることを許容する様式で添加し得る。反応期間の最後に、未結合物質を洗い流すのがよく、標識したモノクローナル抗体を系に添加し、複合体形成した成分と結合させ得る。ＥＧＦＬ７と相互作用性結合パートナーとの相互作用は、グルタチオン−アガロースビーズと結合した状態で残っている放射能の量を測定することにより検出され得る。試験化合物による相互作用の成功裏の阻害は、測定される放射能の減少をもたらす。
【０１２６】
あるいはまた、ＧＳＴ融合タンパク質および相互作用性結合パートナーを、一緒に液体中で、固体グルタチオン−アガロースビーズの非存在下で混合し得る。試験化合物は、これらの種を相互作用させている間またはその後のいずれかで添加し得る。次いで、この混合物をグルタチオン−アガロースビーズに添加し得、未結合物質を洗い流す。この場合も、ＥＧＦＬ７と結合パートナーとの相互作用の阻害の程度は、標識された抗体を添加し、ビーズと結合している放射能を測定することにより検出され得る。
【０１２７】
本発明の別の実施形態では、一方または両方の完全長タンパク質の代わりに、ＥＧＦＬ７および／または相互作用性もしくは結合パートナーの結合ドメインに相当するペプチド断片を用いて、これらの同じ手法を使用し得る（結合パートナーがタンパク質である場合）。当該技術分野において常套的に行なわれる任意の数の方法を用いて該結合部位を同定および単離し得る。これらの方法としては、限定されないが、該タンパク質の一方をコードする遺伝子の突然変異誘発および免疫共沈降アッセイにおける結合の破壊のスクリーニングが挙げられる。次いで、複合体の他方の種をコードする遺伝子補完的突然変異を選択し得る。それぞれのタンパク質をコードする遺伝子の配列解析により、タンパク質の相互作用性結合に関与する領域に対応する突然変異を明らかにする。あるいはまた、一方のタンパク質を、固相表面に上記の方法を用いて固定し、トリプシンなどのタンパク質分解酵素で処理しておいた、標識されたその結合パートナーと相互作用および結合させ得る。洗浄後、結合ドメインを含有する、比較的短い標識されたペプチドが、該固相物質と結合した状態で残り得、これを、単離し、アミノ酸配列決定によって同定し得る。また、いったん、細胞内結合パートナーをコードする遺伝子が得られたら、短い遺伝子セグメントを、該タンパク質のペプチド断片が発現されるように遺伝子操作し得、次いで、これらを結合活性について試験し、精製および合成し得る。
【０１２８】
例えば、限定を意図しないが、ＥＧＦＬ７を、ＧＳＴ融合タンパク質を作製しこれをグルタチオンアガロースビーズと結合させることにより、上記のような固相物質に固定し得る。相互作用性結合パートナーは、放射性同位体（例えば、３５Ｓなど）により標識し、タンパク質分解酵素（例えば、トリプシンなど）により切断し得る。次いで、切断生成物を、固定した融合タンパク質に添加して結合させ得る。未結合ペプチドを洗い流した後、結合された被標識物質は細胞内結合パートナー結合ドメインを示し、この被標識物質をよく知られた方法によって溶出、精製およびアミノ酸配列解析し得る。このようにして同定されるペプチドは、合成により作製されたもの、または組換えＤＮＡ手法を用いて適切な助長性（ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｖｅ）タンパク質と融合させたものであり得る。
【０１２９】
（ＥＧＦＬ７組成物の使用）
（心臓血管の活性、内皮の活性および脈管形成活性のアッセイ）
種々のアッセイを用い、本発明のポリペプチドを心臓血管の活性、内皮の活性および血管新生の活性について試験し得る。かかるアッセイとしては、以下の実施例に示すものが挙げられる。
【０１３０】
組織形成活性のアッセイとしては、限定されないが、ＷＯ９５／１６０３５（骨、軟骨、腱）；ＷＯ９５／０５８４６（神経、ニューロン）、およびＷＯ９１／０７４９１（皮膚、内皮）に記載のものが挙げられる。
【０１３１】
創傷治癒活性のアッセイとしては、例えば、Ｗｉｎｔｅｒ，Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ，Ｍａｉｂａｃｈ，ＨＩおよびＲｏｖｅｅ，ＤＴ編．（Ｙｅａｒ  Ｂｏｏｋ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ），ｐｐ．７１−１１２（これは、ＥａｇｌｓｔｅｉｎおよびＭｅｒｔｚ，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．７１：３８２−３８４（１９７８）の論文により修正）に記載のものが挙げられる。
【０１３２】
心臓肥大のアッセイにはいくつかある。インビトロアッセイは、成体ラットの心筋細胞の拡散（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）の誘導を含む。このアッセイでは、心室筋細胞を、１匹の（雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットから、本質的には、Ｐｉｐｅｒら，“Ａｄｕｌｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｒａｔ  ｈｅａｒｔ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ”、Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｈｅａｒｔ  ａｎｄ  Ｖｅｓｓｅｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｈ．Ｍ．Ｐｉｐｅｒ編（Ｂｅｒｌｉｎ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９０），ｐｐ．３６−６０に詳述された手順の改良法に従って単離する。この手順は、杆状体表現型での成体心室筋細胞の単離およびこれらの細胞の長期培養を可能にする。フェニレフリンおよびプロスタグランジンＦ２α（ＰＧＦ２α）は、このような成体細胞の拡散応答を誘導することが示されている。ＰＧＦ２αまたはＰＧＦ２αアナログ（例えば、フルプロステノール（ｆｌｕｐｒｏｓｔｅｎｏｌ））およびフェニレフリンにより誘導される筋細胞拡散の、心臓肥大の種々の潜在的阻害因子による阻害を、次いで、試験する。
【０１３３】
癌については、よく知られた様々な動物モデルが、腫瘍の発生および病原におけるＥＧＦＬ７の役割をさらに理解するため、および候補治療剤、例えば、天然ＥＧＦＬ７ポリペプチドの抗体および他のアンタゴニスト（例えば、低分子アンタゴニスト）の有効性を試験するために使用され得る。かかるモデルのインビボでの性質により、特に、ヒト患者における応答が予測される。腫瘍および癌（例えば、乳癌、結腸癌、前立腺癌、肺癌など）の動物モデルには、非組換えおよび組換え（トランスジェニック）動物の両方が含まれる。非組換え動物モデルとしては、例えば、齧歯類（例えば、マウス）モデルが挙げられる。かかるモデルは、腫瘍細胞を同系マウスに、標準的な手法、例えば、皮下注射、尾静脈注射、脾臓移植、腹腔内移植、腎臓嚢下への移植またはオルトピン（ｏｒｔｈｏｐｉｎ）移植（例えば、結腸組織内に移植した結腸癌細胞）を用いて導入することにより作製し得る。例えば、ＰＣＴ公開公報ＷＯ９７／３３５５１（１９９７年９月１８日公開）を参照のこと。おそらく、腫瘍学的研究においてほとんどの場合に使用される動物種は免疫不全マウスであり、特にヌードマウスである。胸腺形成不全症／の無形成症のヌードマウスは、成功裏に、ヒト腫瘍異種移植片の宿主としての役割を果たし得るという観察は、この目的のためのその使用の普及をもたらした。常染色体劣性ｎｕ遺伝子が、非常に多数の異なる共通遺伝子系統のヌードマウス（例えば、ＡＳＷ、Ａ／Ｈｅ、ＡＫＲ、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｂ１０．ＬＰ、Ｃ１７、Ｃ３Ｈ、Ｃ５７ＢＬ、Ｃ５７、ＣＢＡ、ＤＢＡ、ＤＤＤ、Ｉ／ｓｔ、ＮＣ、ＮＦＲ、ＮＦＳ、ＮＦＳ／Ｎ、ＮＺＢ、ＮＺＣ、ＮＺＷ、Ｐ、ＲＩＩＩおよびＳＪＬが挙げられる）に導入された。また、ヌードマウス以外に遺伝性免疫学的欠陥を有する多種多様な他の動物の繁殖がなされており、腫瘍異種移植片のレシピエントとして使用されている。さらなる詳細事項については、例えば、Ｔｈｅ  Ｎｕｄｅ  Ｍｏｕｓｅ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｅ．ＢｏｖｅｎおよびＢ．Ｗｉｎｏｇｒａｄ編（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９１）を参照のこと。
【０１３４】
かかる動物内に導入される細胞は、公知の腫瘍／癌細胞株、例えば、上記の腫瘍細胞株のいずれか、例えば、Ｂ１０４−１−１細胞株（ｎｅｕプロトオンコジーンでトランスフェクトされた安定なＮＩＨ−３Ｔ３細胞株）；ｒａｓ−トランスフェクトＮＩＨ−３Ｔ３細胞；Ｃａｃｏ−２（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−３７）；もしくは中程度に充分分化したグレードＩＩのヒト結腸腺癌細胞株、ＨＴ−２９（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−３８）に由来するもの；または腫瘍および癌に由来するものであり得る。腫瘍または癌細胞の試料は、術中の患者から、液体窒素中の凍結保存を伴う標準的な条件を用いて入手され得る。Ｋａｒｍａｌｉら，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４８：６８９−６９６（１９８３）。
【０１３５】
腫瘍細胞は、ヌードマウスまたはＥＧＦＬ７ノックアウトマウスなどの動物内に、様々な手順によって導入され得る。マウスの皮下（ｓ．ｃ．）空間は、腫瘍移植に非常に好適である。腫瘍は、固形塊、トロカールの使用による針生検材料または細胞懸濁液としてｓ．ｃ．移植し得る。固形塊またはトロカール移植では、適当な大きさの腫瘍組織断片をｓ．ｃ．空間内に導入する。細胞懸濁液は、始原腫瘍または安定な腫瘍細胞株から新しく調製し、皮下注射する。腫瘍細胞はまた、皮下移植組織として注入し得る。この部分では、該移植組織は、真皮の結合組織の下側とｓ．ｃ．組織との間に蓄積される。
【０１３６】
乳癌の動物モデルは、例えば、ラット神経芽細胞腫細胞（該細胞からｎｅｕオンコジーンが最初に同定された）またはｎｅｕ−形質転換ＮＩＨ−３Ｔ３細胞をヌードマウスに、本質的に、Ｄｒｅｂｉｎら  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：９１２９−９１３３（１９８６）に記載のようにして移植することによって作製され得る。
【０１３７】
同様に、結腸癌の動物モデルは、結腸癌細胞を動物、例えばヌードマウス内で継代培養し、これらの動物に腫瘍の出現をもたらすことにより作製され得る。ヌードマウスにおけるヒト結腸癌の同所性移植モデルが、例えば、Ｗａｎｇら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５４：４７２６−４７２８（１９９４）およびＴｏｏら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５５：６８１−６８４（１９９５）に記載されている。このモデルは、いわゆる「ＭＥＴＡＭＯＵＳＥＴＭ」（ＡｎｔｉＣａｎｃｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）により販売されている）をもとにしている。
【０１３８】
動物内に生じる腫瘍を、取り出してインビトロで培養し得る。インビトロ培養物由来の細胞を、次いで、動物に継代培養し得る。かかる腫瘍は、さらなる試験または薬物スクリーニングのための標的として供し得る。あるいはまた、継代培養物に由来する腫瘍を単離し、継代培養前の細胞および１回以上の継代培養後に単離した細胞に由来するＲＮＡを、目的遺伝子の差次的発現について解析し得る。かかる継代培養手法は、任意の公知の腫瘍または癌細胞株を用いて行い得る。
【０１３９】
例えば、Ｍｅｔｈ  Ａ、ＣＭＳ４、ＣＭＳ５、ＣＭＳ２１およびＷＥＨＩ−１６４は、ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスの化学的に誘導された線維肉腫であり（ＤｅＬｅｏら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４６：７２０（１９７７））、これらは、種々の薬剤の抗腫瘍活性の試験のための高度に制御可能なモデル系を提供している。Ｐａｌｌａｄｉｎｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：４０２３−４０３２（１９８７）。簡単には、腫瘍細胞を、インビトロで細胞培養にて繁殖させる。動物への注射の前に、該細胞株を洗浄し、バッファー中に約１０×１０６〜１０×１０７細胞／ｍｌの細胞密度で懸濁する。動物を、次いで、１０〜１００μｌの該細胞懸濁液で皮下に感染させ、腫瘍が出現するよう１〜３週間おく。
【０１４０】
また、マウスのルイス肺癌腫は、もっとも徹底的に試験された実験的腫瘍の１つであり、治験用腫瘍モデルとして使用され得る。この腫瘍モデルの有効性は、肺の小細胞癌（ＳＣＣＬ）と診断されたヒト患者の処置において有益な効果と相関している。この腫瘍は正常マウス内に、罹患マウス由来の腫瘍断片または培養で維持した細胞の注射にて導入され得る。Ｚｕｐｉら，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４１  ：増補版４，３０（１９８０）。腫瘍は、たとえ１個の細胞の注射からでも開始され得ること、および非常に高割合の感染腫瘍細胞が生存することを示す証拠がある。この腫瘍モデルに関するさらなる情報については、Ｚａｃｈａｒｓｋｉ，Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  １６：３００−３２０（１９８６）を参照のこと。
【０１４１】
移植した腫瘍を有する動物モデルにおける試験化合物の有効性の評価方法の一例は、処置の前後での腫瘍の大きさを測定することである。伝統的には、移植した腫瘍の大きさは、ノギスにより二次元または三次元で測定されている。二次元に限定される測定値は、腫瘍の大きさを正確に反映しない。したがって、これは、通常、数式を用いて対応する容積に変換する。しかしながら、腫瘍の大きさの測定は、非常に不確かである。薬物候補の治療効果は、処置誘導型成長遅延および特異的成長遅延として、より良好に示され得る。腫瘍成長の描写の別の重要な変量は、腫瘍容積の倍増時間である。腫瘍成長の計算および描写のためのコンピュータプログラム、例えば、ＲｙｇａａｒｄおよびＳｐａｎｇ−Ｔｈｏｍｓｅｎ，Ｐｒｏｃ．６ｔｈ  Ｉｎｔ．Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｏｎ  Ｉｍｍｕｎｅ−Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ａｎｉｍａｌｓ，ＷｕおよびＳｈｅｎｇ編（Ｂａｓｅｌ，１９８９），ｐ．３０１に報告されているプログラムもまた、利用可能である。しかしながら、現実には、処置後の壊死および炎症性応答が、少なくとも初期に腫瘍の大きさの増加をもたらし得ることに注意されたい。したがって、このような変化は、形態計測方法およびフローサイトメトリー解析の組み合わせによって注意深くモニターする必要がある。
【０１４２】
さらに、組換え（トランスジェニック）動物モデルを、本発明において同定されるＥＧＦＬ７遺伝子のコード部分を目的の動物のゲノム内に、トランスジェニック動物作製のための標準的な手法を用いて導入することにより遺伝子操作し得る。トランスジェニック操作の標的に供し得る動物としては、限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ならびに非ヒト霊長類、例えば、ヒヒ、チンパンジーおよびサルが挙げられる。導入遺伝子をかかる動物内に導入するための当該技術分野で知られた手法としては、前核マイクロインジェクション（米国特許第４，８７３，１９１号）；生殖細胞系内へのレトロウイルス媒介性遺伝子導入（例えば、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：６１４８−６１５（１９８５））；胚性幹細胞内への遺伝子ターゲティング（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，Ｃｅｌｌ  ５６：３１３−３２１（１９８９））；胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１８０３−１８１４（１９８３））；および精子媒介性遺伝子導入が挙げられる。Ｌａｖｉｔｒａｎｏら，Ｃｅｌｌ  ５７：７１７−７３（１９８９）。概説は、例えば、米国特許第４，７３６，８６６号を参照のこと。
【０１４３】
本発明の目的のため、トランスジェニック動物としては、導入遺伝子をその細胞の一部においてのみ担持するもの（「モザイク動物」）が挙げられる。導入遺伝子は、単一の導入遺伝子として、またはコンカテマー（例えば、頭部−頭部または頭部−尾部タンデム）内のいずれかで組み込まれ得る。特定の細胞型への導入遺伝子の選択的導入もまた、例えば、Ｌａｓｋｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６２３２−６３６（１９９２）の手法に従うことにより可能である。トランスジェニック動物内での導入遺伝子の発現は、標準的な手法によってモニターされ得る。例えば、サザンブロット解析またはＰＣＲ増幅を用いて導入遺伝子の組込みを確認し得る。次いで、ｍＲＮＡ発現のレベルを、インサイチュハイブリダイゼーション、ノーザンブロット解析、ＰＣＲまたは免疫細胞化学などの手法を用いて解析し得る。該動物を、腫瘍または癌の発生の徴候についてさらに検査する。
【０１４４】
あるいはまた、ＥＧＦＬ７をコードする内在性遺伝子と動物の胚性細胞内に導入された同ポリペプチドをコードする改変されたゲノムＤＮＡとの相同組換えの結果として、本発明において同定されるＥＧＦＬ７をコードする欠陥遺伝子または改変遺伝子を有する「ノックアウト」動物を作出し得る。例えば、ある特定のＥＧＦＬ７ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを用い、該ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを、確立された手法にしたがってクローン化し得る。ある特定のＥＧＦＬ７ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの一部分を欠失させるか、または別の遺伝子（例えば、組込みをモニターするために使用され得る選択可能マーカーをコードする遺伝子など）と置換させ得る。典型的には、数キロベースの非改変隣接ＤＮＡ（５’および３’末端の両方に）をベクター内に含める。例えば、相同組換えベクターの記載については、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ  ５１：５０３（１９８７）を参照のこと。該ベクターを胚性幹細胞株内に導入し（例えば、エレクトロポレーションにより）、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同組換えされた細胞を選択する。例えば、Ｌｉら，Ｃｅｌｌ  ６９：９１５（１９９２）を参照のこと。選択した細胞を、次いで、動物（例えば、マウスまたはラット）の胚盤胞内に注入し、キメラ集団を形成する。例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編（ＩＲＬ：Ｏｘｆｏｒｄ，１９８７），ｐｐ．１１３−１５２を参照のこと。次いで、キメラ胚を、適当な偽妊娠雌繁殖（ｆｏｓｔｅｒ）動物内に移植し、胚を出産へと至らせ、「ノックアウト」動物を作出し得る。相同組換えされたＤＮＡをその生殖細胞内に有する子孫は、標準的な手法によって確認され得、全細胞が相同組換えされたＤＮＡを含有する動物を繁殖させるために使用され得る。ノックアウト動物は、例えば、ある種の病理学的状態に対して防御する能力およびＥＧＦＬ７の非存在による病理学的状態の発生により特徴付けられ得る。
【０１４５】
本発明において同定されるＥＧＦＬ７に特異的に結合する抗体および他の薬物候補の有効性はまた、動物の自然発生腫瘍の処置においても試験され得る。かかる試験に好適な標的は、ネコ口腔扁平上皮癌腫（ＳＣＣ）である。ネコ口腔ＳＣＣは、高度に浸潤性であり、ネコの最もよく見られる口腔悪性腫瘍である悪性腫瘍であり、この種において報告された口腔腫瘍の６０％超を占める。遠位部位に転移するのは稀であるが、この低い転移発生率は、この腫瘍を有するネコの生存期間が短いことの単なる反映であり得る。この腫瘍は、通常、主にネコ口腔の骨格が理由で手術に対して受け入れられない（ａｍｅｎａｂｌｅ）。現在のところ、この腫瘍に対する有効な処置はない。試験に入る前、各ネコを完全な臨床検査および生検に供し、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）によりスキャンする。舌下口腔扁平上皮細胞腫瘍と診断されたネコは本試験から除外する。舌は、かかる腫瘍の結果、麻痺状態となり得、処置により腫瘍が死滅したとしても、動物は、自身で摂食ができないことがある。各ネコを、反復的に長期間処置する。腫瘍の写真を処置期間中、毎日、各再検査の後に撮影する。処置後、各ネコをさらなるＣＴスキャンに供する。その後、ＣＴスキャンおよび胸部Ｘ腺写真を８週毎に評価する。データを、生存、応答および毒性の差について対照群と比較して評価する。陽性応答には、腫瘍退化の証拠（好ましくは、生活の質の改善および／または寿命の延長を伴う）が必要とされ得る。
【０１４６】
また、動物の他の自然発生腫瘍、例えば、イヌ、ネコおよびヒヒの線維肉腫、腺癌、リンパ腫、軟骨腫または平滑筋肉腫などもまた試験し得る。これらのうち、イヌおよびネコの乳腺癌は、その外観および挙動がヒトのものと非常に類似しているため、好ましいモデルである。しかしながら、このモデルの使用は、動物においてこの型の腫瘍の発生が稀であることにより制限される。
【０１４７】
当該技術分野で知られた他のインビトロおよびインビボでの心臓血管の試験、内皮の試験および血管新生の試験もまた、本発明に適する。
【０１４８】
（組織分布）
本発明における心臓血管のアッセイ結果、内皮のアッセイ結果、および血管新生のアッセイ結果は、さらなる試験により、例えば、種々のヒト組織におけるｍＲＮＡ発現を測定することにより確認し得る。
【０１４９】
上記のように、種々の組織における遺伝子増幅および／または遺伝子発現は、慣用のサザンブロッティング、ノーザンブロッティングによってｍＲＮＡの転写を定量すること（Ｔｈｏｍａｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：５２０１−５２０５（１９８０））、ドットブロッティング（ＤＮＡ解析）、またはインサイチュハイブリダイゼーションにより、適切に標識されたプローブを用い、本明細書に提供した配列に基づいて測定され得る。あるいはまた、特定の二重らせん（ＤＮＡ二重らせん、ＲＮＡ二重らせんおよびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重らせんまたはＤＮＡ−タンパク質二重らせんが挙げられる）を認識し得る抗体を用いてもよい。
【０１５０】
あるいはまた、種々の組織における遺伝子発現は、免疫学的方法、例えば、組織切片の免疫組織化学的染色および細胞培養物または体液のアッセイなどによって測定し、遺伝子産物の発現を直接定量し得る。免疫組織化学的染色および／または試料液のアッセイに有用な抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルどちらであってもよく、任意の哺乳動物において調製され得る。簡便には、抗体は、天然配列ＥＧＦＬ７ポリペプチドに対して、または本明細書に提供するＤＮＡ配列に基づく合成ペプチドに対して、もしくはＥＧＦＬ７  ＤＮＡと融合させ、かつある特定の抗体エピトープをコードする外来配列に対して調製され得る。インサイチュハイブリダイゼーションのための抗体生成のための一般的な手法および特別なプロトコルを、本明細書において以下に示す。
【０１５１】
（抗体結合試験）
心臓血管の試験結果、内皮の試験結果、および血管新生の試験結果は、抗ＥＧＦＬ７抗体が、心臓血管のアッセイ、内皮のアッセイ、および血管新生のアッセイにおいて使用した内皮細胞または他の細胞に対するＥＧＦＬ７の効果を阻害する能力を試験する抗体結合試験によってさらに確認し得る。例示的な抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性およびヘテロコンジュゲート（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）抗体が挙げられ、その調製は、本明細書において以下に記載する。
【０１５２】
抗体結合試験は、任意の公知のアッセイ方法、例えば、競合的結合アッセイ、直接および間接的サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイにて行い得る。Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７），ｐｐ．１４７−１５８。
【０１５３】
競合的結合アッセイは、標識された標準物質が試験試料検体と、限定量の抗体との結合に関して競合する能力に依存する。試験試料中の標的タンパク質の量は、抗体と結合した標準物質の量と反比例する。結合状態になった標準物質の量の測定を容易にするため、抗体を、好ましくは、競合の前または後に不溶化すると、抗体に結合している物質および検体が、未結合の状態のままの標準物質および検体から簡便に分離され得る。
【０１５４】
サンドイッチアッセイは、各々が、検出対象のタンパク質の異なる免疫原性部分（すなわち、エピトープ）に結合する能力を有する２種類の抗体の使用を伴う。サンドイッチアッセイでは、試験試料分析物が、まず、固相支持体上に固定化された一次抗体に結合し、その後で二次抗体が分析物に結合し、したがって、可溶性３部複合体が形成される。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号を参照のこと。二次抗体は、それ自体が検出可能な部分で標識されていてもよく（直接サンドイッチアッセイ）、検出可能な部分で標識された抗免疫グロブリン抗体を用いて測定されるものであってもよい（間接的サンドイッチアッセイ）。例えば、サンドイッチアッセイの種類の一例は、ＥＬＩＳＡアッセイであり、この場合、検出可能な部分は酵素である。
【０１５５】
免疫組織化学では、組織試料は、例えば、新鮮なもの、または凍結乾燥したもの、またはパラフィン内に包埋し、ホルマリンなどの保存剤で固定したものであり得る。
【０１５６】
（細胞系腫瘍アッセイ）
心臓血管の障害、内皮の障害、および血管新生の障害（例えば、腫瘍など）の細胞系アッセイおよび動物モデルを用い、本発明における心臓血管の、内皮の、および血管新生のアッセイの所見を確認し、さらに、本発明において同定される遺伝子と、望ましくない心臓血管の細胞成長、内皮の細胞成長、および血管新生の細胞成長の発生および病原との関係を理解することができる。望ましくない心臓血管の細胞成長、内皮の細胞成長、および血管新生の細胞成長（例えば、腫瘍細胞）の発生および病態における、本発明において同定される遺伝子産物の役割は、本発明におけるＥＧＦＬ７によって刺激または阻害されると確認された細胞または細胞株を用いることにより試験され得る。かかる細胞としては、例えば、以下の実施例に示したものが挙げられる。
【０１５７】
別のアプローチでは、特定の心臓血管の障害、内皮の障害、および血管新生の障害に関与していることが知られた細胞型の細胞を、本発明のｃＤＮＡでトランスフェクトし、これらのｃＤＮＡが過度の成長を誘導する能力または成長を阻害する能力が解析される。心臓血管の障害、内皮の障害、および血管新生の障害が癌である場合、好適な腫瘍細胞としては、例えば、安定な腫瘍細胞株、例えば、Ｂ１０４−１−１細胞株（ｎｅｕプロトオンコジーンでトランスフェクトされた安定なＮＩＨ−３Ｔ３細胞株）およびｒａｓ−トランスフェクトされたＮＩＨ−３Ｔ３細胞が挙げられ、これらを所望の遺伝子でトランスフェクトし、腫瘍形成性の成長についてモニターし得る。次いで、かかるトランスフェクト細胞株を用い、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体または抗体組成物が、形質転換細胞の成長に対して細胞増殖抑制性または細胞傷害活性を発揮することにより、または抗体依存性の細胞の細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介することにより、腫瘍形成性細胞の成長を阻害する能力を試験し得る。さらに、本発明において同定される遺伝子のコード配列でトランスフェクトされた細胞を用い、心臓血管の障害、内皮の障害、および血管新生の障害（例えば、癌など）の処置のための薬物候補が同定され得る。
【０１５８】
また、トランスジェニック動物（上記のような）腫瘍由来の初代培養物が、本発明における細胞系アッセイにおいて使用され得るが、安定な細胞株が好ましい。トランスジェニック動物から連続継代細胞系を誘導させる手法は、当該技術分野でよく知られている。例えば、Ｓｍａｌｌら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：６４２−６４８（１９８５）を参照のこと。
【０１５９】
（診断薬としての遺伝子の使用）
本発明はまた、ＥＧＦＬ７をコードする遺伝子の診断薬としての使用に関する。変異形態のＥＧＦＬ７の検出は、心臓血管の疾患、内皮の疾患、および血管新生の疾患、ならびに心臓血管の疾患、内皮の疾患、および血管新生の疾患（例えば、腫瘍など）に対する感受性の診断を可能にする。
【０１６０】
ヒトＥＧＦＬ７ポリペプチドをコードする遺伝子に突然変異を有する個体は、ＤＮＡレベルで、様々な手法によって検出され得る。診断用の核酸は、患者の細胞、例えば、血液、尿、唾液、組織生検および剖検材料などから得られ得る。ゲノムＤＮＡを、直接検出に用いてもよく、解析の前にＰＣＲを用いることにより酵素的に増幅してもよい（Ｓａｉｋｉら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：１６３−１６６（１９８６））。また、ＲＮＡまたはｃＤＮＡも同じ目的に使用され得る。一例として、ＥＧＦＬ７をコードする核酸に相補的なＰＣＲプライマーを用い、ＥＧＦＬ７突然変異を同定および解析することができる。例えば、欠失および挿入は、正常な遺伝子型と比較したときの増幅産物の大きさの変化により検出され得る。点変異は、増幅されたＤＮＡを、ＥＧＦＬ７をコードする放射標識ＲＮＡと、あるいはまたＥＧＦＬ７をコードする放射標識アンチセンスＤＮＡ配列とをハイブリダイズさせることにより確認され得る。完全にマッチした配列は、ミスマッチ二重らせんと、ＲＮアーゼＡ消化によって、または融解温度の差によって区別され得る。
【０１６１】
ＤＮＡ配列の違いに基づく遺伝子検査は、変性剤を含むまたは含まないゲル中でのＤＮＡ断片の電気泳動移動度における変化の検出によってなされ得る。小さい配列の欠失および挿入は、高分離能ゲル電気泳動によって可視化され得る。異なる配列のＤＮＡ断片は、変性ホルムアミド（ｆｏｒｍａｍｉｄｉｎｅ）勾配ゲル上で識別され得、このとき、種々のＤＮＡ断片の移動度が、ゲル中の異なる位置で、その特定の融解温度または部分融解温度に従って遅滞される。例えば、Ｍｙｅｒｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１２４２（１９８５）を参照のこと。
【０１６２】
また、特定の位置における配列変化が、ヌクレアーゼ保護アッセイ（例えば、ＲＮアーゼおよびＳｌ保護）または化学的切断方法（例えば、Ｃｏｔｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：４３９７−４４０１（１９８５））によって明らかとなり得る。
【０１６３】
したがって、ある特定のＤＮＡ配列の検出は、ハイブリダイゼーション、ＲＮアーゼ保護、化学的切断、直接ＤＮＡシーケンシング、または制限酵素（例えば、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ））の使用、およびゲノムＤＮＡのサザンブロッティングなどの方法によってなされ得る。
【０１６４】
（ポリペプチド発現レベルの検出のための使用）
より慣用的なゲル電気泳動およびＤＮＡシーケンシングに加え、突然変異はまた、インサイチュ解析によっても検出され得る。
【０１６５】
ＥＧＦＬ７をコードする核酸の発現は、腫瘍形成を伴う脈管疾患または新生血管形成との関連があり得る。ＥＧＦＬ７がシグナル配列を有し、そのｍＲＮＡが内皮細胞において高度に、より低い程度で平滑筋細胞において発現される場合、これは、ＥＧＦＬ７が血清中に存在することを示す。したがって、抗ＥＧＦＬ７ポリペプチド抗体は、このＥＧＦＬ７ポリペプチドの変化したレベルがかかる障害を示し得るため、腫瘍形成を伴う脈管疾患または新生血管形成を診断するのに使用され得る。
【０１６６】
競合アッセイを用いてもよく、この場合、ＥＧＦＬ７に特異的な抗体を固相支持体に結合させ、標識されたＥＧＦＬ７ポリペプチドおよび宿主由来の試料を固相支持体の上側を通過させ、固相支持体に結合された検出標識の量を、試料中のＥＧＦＬ７の量と相関させ得る。
【０１６７】
（染色体マッピング）
本発明の配列はまた、染色体の同定にも重要である。該配列は、個々のヒト染色体上の特定の位置に特異的に標的化され、これとハイブリダイズし得る。さらに、現在、染色体上の特定の部位を同定する必要性がある。実際の配列データ（反復性の多型）に基づいて染色体をマーク付け（ｍａｒｋｉｎｇ）する試薬で、現在、染色体上の位置をマーク付けするのに利用可能なものはほとんどない。本発明による染色体へのＤＮＡのマッピングは、これらの配列を疾患に関連する遺伝子と相関させるのに重要な第一段階である。
【０１６８】
簡単には、ｃＤＮＡからＰＣＲプライマー（好ましくは、１５〜２５ｂｐ）を調製することにより、配列を染色体にマッピングする。３’−非翻訳領域のコンピュータ解析を用いると、ゲノムＤＮＡ内の１つより多くのエキソンにまたがらないプライマーが速やかに選択され、したがって、増幅プロセスを複雑にしない。これらのプライマーを、次いで、個々のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用する。プライマーに対応するヒト遺伝子を含有するハイブリッドのみが増幅断片をもたらす。
【０１６９】
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定のＤＮＡを特定の染色体に割り当てるための迅速な手順である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを用いて本発明を使用すると、細部位置（ｓｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）が、特定染色体由来の断片パネルまたは大きなゲノムクローンのプールについて同様にしてなされ得る。染色体へのマッピングに同様に使用され得る他のマッピングストラテジーとしては、インサイチュハイブリダイゼーション、流動分取した（ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ）標識染色体を用いるプレスクリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによる予備選択が挙げられる。
【０１７０】
分裂中期の染色体伸展標本（ｓｐｒｅａｄ）に対するｃＤＮＡクローンの蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用い、正確な染色体上の位置が一工程で提供され得る。この手法は、５００または６００塩基という短いｃＤＮＡを用いて使用され得る。しかしながら、２，０００ｂｐより大きいクローンは、特異な染色体上の位置に、簡単な検出に充分なシグナル強度で結合する可能性がより高い。ＦＩＳＨは、ＥＧＦＬ７をコードする遺伝子が由来するクローンの使用を必要とし、長いほどよい。例えば、２，０００ｂｐがよく、４，０００ｂｐがよりよいが、良好な結果を妥当な割合の時間で得るために、おそらく、４，０００を超える必要はない。この手法の概説については、Ｖｅｒｍａら，Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８）を参照のこと。
【０１７１】
いったん配列が正確な染色体上の位置に配置されたら、染色体上の配列の物理的な位置は、遺伝子マップデータと相関させ得る。かかるデータは、例えば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ（オンラインでＪｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｗｅｌｃｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙから入手可能）に見られる。同じ染色体上の領域にマッピングされた遺伝子と疾患との関係を、次いで、連鎖解析（物理的に隣接する遺伝子の共遺伝（ｃｏｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ））により確認する。
【０１７２】
次に、ｃＤＮＡまたはゲノム配列において、罹患したと罹患していない個体間の違いを調べる必要がある。突然変異が一部またはすべての罹患した個体において観察されるが、正常な個体では全く見られない場合、この突然変異は該疾患の原因因子である可能性がある。
【０１７３】
物理的マッピングおよび遺伝子マッピング手法という現行の手段により、疾患と関連する染色体上の領域を正確に位置決定されたｃＤＮＡは、５０〜５００個の潜在的原因遺伝子の１つであり得る。（これは、１メガベースのマッピング手段で、２０ｋｂあたり１遺伝子と仮定している）。
【０１７４】
（薬物候補のスクリーニングアッセイ）
本発明は、ＥＧＦＬ７を模倣するもの（アゴニスト）、またはＥＧＦＬ７の効果を抑制するもの（アンタゴニスト）を同定するための化合物のスクリーニング方法を包含する。アンタゴニスト薬物候補のスクリーニングアッセイは、ＥＧＦＬ７と結合もしくは複合体形成する化合物、あるいはまた、コードされたポリペプチドと他の細胞のタンパク質との相互作用を妨害する化合物が同定されるように設計される。かかるスクリーニングアッセイとしては、化合物ライブラリーのハイスループットスクリーニングに従順なアッセイが挙げられ、低分子薬物候補の同定に特に好適である。
【０１７５】
該アッセイは、様々な形式で行なわれ得、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイおよび細胞系アッセイが挙げられ、これらは、当該技術分野において充分特性付けされている。
【０１７６】
アンタゴニストについてのすべてのアッセイは、薬物候補をＥＧＦＬ７と、これらの２つの成分が相互作用するのを可能にする条件下かつそれに充分な時間での接触を必要とする点で共通している。
【０１７７】
結合アッセイでは、相互作用は結合であり、形成される複合体が、反応混合物中で単離または検出され得る。ある特定の実施形態では、ＥＧＦＬ７または薬物候補を、固相上、例えばマイクロタイタープレート上に、共有結合または非共有結合によって固定化する。非共有結合は、一般的には、固相表面をＥＧＦＬ７の溶液でコートし乾燥することによりなされる。あるいはまた、固定化するＥＧＦＬ７に特異的な固定化抗体（例えば、モノクローナル抗体）を用いてこれを固相表面に固定し得る。該アッセイは、非固定化成分（検出可能な標識によって標識してもよい）を、固定化された成分（例えば、固定された成分を含有するコート表面）に添加することにより行なわれる。反応が終了したら、未反応成分を、例えば洗浄により除去し、固相表面上に固定された複合体を検出する。最初に固定化しない成分が検出可能な標識を担持する場合、表面上に固定化された標識の検出は、複合体形成が起こったことを示す。最初に固定化しない成分が標識を担持しない場合、複合体形成は、例えば、固定化される複合体に特異的に結合する標識抗体を用いることにより検出され得る。
【０１７８】
候補化合物が、ある特定のＥＧＦＬ７ポリペプチドと相互作用するが、結合はしない場合、該ポリペプチドとのその相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するためのよく知られた方法によってアッセイされ得る。かかるアッセイとしては、伝統的なアプローチ、例えば、架橋、免疫共沈降、および勾配またはクロマトグラフィーカラムによる同時精製などが挙げられる。また、タンパク質−タンパク質相互作用は、Ｆｉｅｌｄｓおよび共働者（ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３４０：２４５−２４６（１９８９）；Ｃｈｉｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：９５７８−９５８２（１９９１））に記載の酵母系遺伝子系を、ＣｈｅｖｒａｙおよびＮａｔｈａｎｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５７８９−５７９３（１９９１）に開示されたようにして用いることによりモニターされ得る。多くの転写活性化因子（例えば、酵母ＧＡＬ４など）は、２つの物理的に異なるモジュラードメインからなり、一方は、ＤＮＡ−結合ドメインとしての機能を果たし、他方は、転写活性化ドメインとしての機能を果たす。前記の刊行物に記載された酵母発現系（一般的に、「ツーハイブリッドシステム」と称する）は、この性質を利用しており、一方は標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインと融合されたもの、他方は候補活性化タンパク質が活性化ドメインと融合されたものである２つのハイブリッドタンパク質が用いられる。ＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下でのＧＡＬ１−ｌａｃＺレポーター遺伝子の発現は、タンパク質−タンパク質相互作用によるＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用性ポリペプチドを含有するコロニーは、βガラクトシダーゼの発色基質を用いて検出される。ツーハイブリッド手法を用いて２つの特定のタンパク質間のタンパク質−タンパク質相互作用を同定するための完全キット（ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲＴＭ）が、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから市販されている。この系はまた、特定タンパク質の相互作用に関与するタンパク質ドメインのマッピング、ならびにこれらの相互作用に不可欠なアミノ酸残基の特定に拡張され得る。
【０１７９】
ＥＧＦＬ７と他の細胞内成分または細胞外成分との該相互作用を妨害する化合物は、以下のように試験され得る。通常、ＥＧＦＬ７および細胞内成分または細胞外成分を含有する反応混合物を、２つの産物の相互作用および結合を可能にする条件下および時間で調製する。候補化合物が結合を阻害する能力を試験するため、反応を、試験化合物の非存在下および存在下で行う。また、プラセボを第３の反応混合物に添加し、陽性対照としてもよい。混合物中に存在する試験化合物と細胞内成分または細胞外成分間の結合（複合体形成）は、上記のようにしてモニターする。対照反応（１つまたは複数）にはあるが試験化合物を含有する反応混合物にはない複合体の形成は、試験化合物が、該試験化合物とその反応パートナーとの相互作用を妨害することを示す。
【０１８０】
ＥＧＦＬ７アンタゴニストは、ＥＧＦＬ７および潜在的アンタゴニストを膜結合ＥＧＦＬ７ポリペプチドレセプターまたは組換えレセプターと、競合的阻害アッセイに適した条件下で合わせることにより検出され得る。ＥＧＦＬ７は、例えば放射能などによって、該レセプターに結合されたＥＧＦＬ７ポリペプチド分子の数を潜在的アンタゴニストの有効性を測定するのに使用し得るように標識され得る。該レセプターをコードする遺伝子は、当業者に知られた数多くの方法、例えば、リガンドパニングおよびＦＡＣＳ分取によって同定され得る。Ｃｏｌｉｇａｎら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎ．１（２）：第５章（１９９１）。好ましくは、ポリアデニル化ＲＮＡをＥＧＦＬ７に応答性の細胞から調製し、このＲＮＡから作製したｃＤＮＡライブラリーをプールに分割してＣＯＳ細胞またはＥＧＦＬ７に応答性でない他の細胞にトランスフェクトするのに使用する、発現クローニングを用いる。ガラススライド上で成長させたトランスフェクト細胞を、標識したＥＧＦＬ７ポリペプチドに曝露する。ＥＧＦＬ７は、様々な手段、例えば、ヨード化または部位特異的プロテインキナーゼの認識部位を含めることなどで標識し得る。固定およびインキュベーション後、スライドをオートラジオグラフィー解析に供する。陽性プールを同定してサブプールを調製し、相互作用性サブプールおよび再スクリーニングプロセスを用いて再トランスフェクトし、最終的に、推定レセプターをコードする単一のクローンを得る。
【０１８１】
レセプター同定の別のアプローチとして、標識されたＥＧＦＬ７ポリペプチドを、該レセプター分子を発現する細胞膜または抽出調製物と光親和性結合させ得る。架橋した物質をＰＡＧＥによって分離し、Ｘ線フィルムに露光する。該レセプターを含有する標識された複合体を切り出し、ペプチド断片に分離し、タンパク質ミクロシークエンシングに供する。ミクロシークエンシングから得られたアミノ酸配列は、推定レセプターをコードする遺伝子を同定するためのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための一組の縮重オリゴヌクレオチドプローブを設計するのに使用され得る。
【０１８２】
アンタゴニストの別のアッセイでは、該レセプターを発現する哺乳動物細胞または、膜調製物を標識されたＥＧＦＬ７ポリペプチドと、候補化合物の存在下でインキュベートし得る。該化合物がこの相互作用を増強または遮断する能力を、次いで測定し得る。
【０１８３】
心臓血管の障害、内皮の障害、および血管新生の障害の処置に有用な組成物としては、限定されないが、標的遺伝子産物の発現および／または活性を阻害する、抗体、有機系および無機系低分子、ペプチド、ホスホペプチド、アンチセンスおよびリボザイム分子、三重ヘリックス分子などが挙げられる。
【０１８４】
潜在的アンタゴニストのより具体的な例としては、免疫グロブリンとＥＧＦＬ７との融合体に結合するオリゴヌクレオチドおよび、特に、抗体（例えば、限定されないが、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体ならびに抗体断片、単鎖抗体、抗イデオタイプ抗体、ならびにかかる抗体または断片のキメラ型またはヒト化型、ならびにヒトの抗体および抗体断片など）が挙げられる。あるいはまた、潜在的アンタゴニストは、密接に関連したタンパク質、例えば、該レセプターを認識するが効果をもたらさず、それによりＥＧＦＬ７の作用を競合的に阻害するＥＧＦＬ７の変異形態であり得る。
【０１８５】
別の潜在的ＥＧＦＬ７アンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製されるアンチセンスＲＮＡ構築物またはアンチセンスＤＮＡ構築物であり、この場合、例えば、アンチセンスＲＮＡ分子またはアンチセンスＤＮＡ分子は、ｍＲＮＡの翻訳を、標的化ｍＲＮＡとハイブリダイズし、タンパク質翻訳を妨げることにより直接遮断する機能を果たす。アンチセンス技術は、遺伝子発現を三重ヘリックス形成またはアンチセンスＤＮＡもしくはアンチセンスＲＮＡにより制御するために使用され得、どちらの方法も、ＤＮＡまたはＲＮＡに対するポリヌクレオチド結合に基づく。例えば、本発明の成熟ＥＧＦＬ７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５’コード部分を用いて、約１０〜４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する該遺伝子の領域に相補的となるように設計し（三重ヘリックス−Ｌｅｅら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：４５６（１９８８）；Ｄｅｒｖａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３６０（１９９１）を参照のこと）、それによりＥＧＦＬ７の転写および産生を妨げる。ＲＮＡのある部分に「相補的」な配列は、本明細書でいう場合、該ＲＮＡとハイブリダイズして安定な二重らせんを形成することができるのに充分な相補性を有する配列を意味する。したがって、二本鎖アンチセンス核酸の場合は、二重らせんＤＮＡの単一の鎖が試験され得るか、または三重らせんヘリックスの形成がアッセイされ得る。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度およびアンチセンス核酸の長さの両方に依存する。一般的に、ハイブリダイズする核酸が長いほど、なお安定な二重らせん（または、場合によっては三重らせん）を形成するＲＮＡが含む塩基ミスマッチが多い。当業者は、ハイブリダイズした複合体の融解点を測定するための標準的な手順の使用により、ミスマッチの許容され得る程度を確定できよう。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡとインビボでハイブリダイズし、ＥＧＦＬ７へのｍＲＮＡ分子の翻訳を遮断する（アンチセンス−Ｏｋａｎｏ，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ：Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９８８）。
【０１８６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡまたはそのキメラ混合物もしくは誘導体または修飾型であり得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションなどを改善するために、塩基部分、糖部分またはリン酸主鎖が修飾されていてもよい。オリゴヌクレオチドには、ペプチドなどの他の懸垂基（例えば、宿主細胞レセプターのインビボでの標的化のため）または細胞膜を通過する輸送を容易にする薬剤（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３−６５５６（１９８９）；Ｌｅｍａｉｔｒｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：６４８−６５２（１９８７）；ＰＣＴ公開公報ＷＯ８８／０９８１０（１９８８年１２月１５日公開を参照のこと）もしくは血液脳関門を通過する輸送を容易にする薬剤（例えば、ＰＣＴ公開公報ＷＯ８９／１０１３４、１９８８年４月２５日公開を参照のこと）、ハイブリダイゼーション誘発型切断薬（例えば、Ｋｒｏｌら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８−９７６（１９８８）を参照のこと）またはインターカレーション剤（例えば、Ｚｏｎ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９（１９８８）を参照のこと）が含まれ得る。この目的のため、オリゴヌクレオチドを、別の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発型架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発型切断剤などとコンジュゲートさせ得る。
【０１８７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは少なくとも１個の修飾塩基部分を含み得、これは、例えば、限定されないが、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルケオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンを含む群から選択される。
【０１８８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、限定されないが、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシロース、およびヘキソースを含む群から選択される少なくとも１個の修飾糖部分を含み得る。
【０１８９】
また別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチオエート、ホスホラミデート、ホスホロジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホルムアセタールまたはそのアナログからなる群より選択される少なくとも１個の修飾リン酸主鎖を含む。
【０１９０】
また別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アノマー（−ａｎｏｍｅｒｉｃ）オリゴヌクレオチドである。二本鎖に特異的な−アノマーオリゴヌクレオチド形態は相補的ＲＮＡとハイブリッドを形成するが、通常の単位とは対照的に、該鎖は互いに平行である（Ｇａｕｔｉｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１（１９８７））。該オリゴヌクレオチドは、２’−０−メチルリボヌクレオチドであるか（Ｉｎｏｕｅら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８（１９８７））、またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログである（Ｉｎｏｕｅら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０（１９８７））。
【０１９１】
本発明のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野で知られた標準的な方法によって、例えば、自動ＤＮＡ合成装置（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されているものなど）の使用によって合成され得る。一例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３２０９（１９８８））の方法によって合成され得、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、細孔制御（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ）ガラスポリマー支持体（Ｓａｒｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：７４４８−７４５１（１９８８））などの使用によって調製され得る。
【０１９２】
上記のオリゴヌクレオチドはまた、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡがインビボで発現され、ＥＧＦＬ７の産生が阻害され得るように細胞に送達され得る。アンチセンスＤＮＡを使用する場合、翻訳開始部位に由来するオリゴデオキシリボヌクレオチド、例えば、標的遺伝子ヌクレオチド配列の約−１０〜＋１０の間の位置が好ましい。
【０１９３】
アンチセンスＲＮＡ分子またはアンチセンスＤＮＡ分子は、一般的には、少なくとも約５塩基長、約１０塩基長、約１５塩基長、約２０塩基長、約２５塩基長、約３０塩基長、約３５塩基長、約４０塩基長、約４５塩基長、約５０塩基長、約５５塩基長、約６０塩基長、約６５塩基長、約７０塩基長、約７５塩基長、約８０塩基長、約８５塩基長、約９０塩基長、約９５塩基長、約１００塩基長、またはそれ以上である。
【０１９４】
潜在的アンタゴニストは、ＥＧＦＬ７の活性部位、レセプター結合部位または成長因子もしくは他の関連結合部位に結合し、それによりＥＧＦＬ７の正常な生物学的活性を遮断する低分子をさらに含む。低分子としての例としては、限定されないが、小ペプチドまたはペプチド様分子（好ましくは可溶性ペプチド）、および合成非ペプチジル有機または無機化合物が挙げられる。
【０１９５】
さらなる潜在的アンタゴニストはリボザイムであり、これは、特定のＲＮＡ切断を触媒する能力を有する酵素性ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡに対する配列特異的ハイブリダイゼーションの後、エンドヌクレアーゼによる切断によって作用する。潜在的ＲＮＡ標的内の特定のリボザイム切断部位は、公知の手法によって同定され得る。さらなる詳細事項については、例えば、Ｒｏｓｓｉ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４：４６９−４７１（１９９４）、およびＰＣＴ公開公報ＷＯ  ９７／３３５５１（１９９７年９月１８日公開）を参照のこと。
【０１９６】
ｍＲＮＡを特定の認識配列の部位で切断するリボザイムが、標的遺伝子のｍＲＮＡを破壊するために使用され得るが、ハンマーヘッドリボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッドリボザイムはｍＲＮＡを、標的ｍＲＮＡと相補的塩基対を形成する隣接領域によって指示される位置で切断する。唯一の要件は、標的ｍＲＮＡが２塩基の以下の配列：５’−ＵＧ−３’を有することである。ハンマーヘッドリボザイムの構築および作製は、当該技術分野でよく知られており、Ｍｙｅｒｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９５）（特に、図４、第８３３頁を参照のこと）ならびにＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ，３３４：５８５−５９１（１９８８）（これらは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に、より充分に記載されている。
【０１９７】
好ましくは、リボザイムは、切断認識部位が標的遺伝子ｍＲＮＡの５’末端付近に位置するように、すなわち、効率が増大し、非機能性ｍＲＮＡ転写物の細胞内蓄積が最小限となるとなるように遺伝子操作する。
【０１９８】
本発明のリボザイムにはまた、ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（以下、「Ｃｅｃｈ型リボザイム」）、例えば、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ中に天然に存在するもの（ＩＶＳまたはＬ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡとして知られる）などが含まれ、これは、Ｔｈｏｍａｓ  Ｃｅｃｈおよび共働者（Ｚａｕｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４：５７４−５７８（１９８４）；ＺａｕｇおよびＣｅｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３１：４７０−４７５（１９８６）；Ｚａｕｇら，Ｎａｔｕｒｅ，３２４：４２９−４３３（１９８６）；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐａｔｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．による国際特許公開公報ＷＯ８８／０４３００；ＢｅｅｎおよびＣｅｃｈ，Ｃｅｌｌ，４７：２０７−２１６（１９８６））に広範に記載されている。Ｃｅｃｈ型リボザイムは、標的ＲＮＡ配列とハイブリダイズし、その後、標的ＲＮＡの切断が起こる８塩基対活性部位を有する。本発明は、標的遺伝子内に存在する８塩基対活性部位配列を標的化するＣｅｃｈ型リボザイムを包含する。
【０１９９】
アンチセンスアプローチの場合のように、リボザイムは、修飾オリゴヌクレオチド（例えば、安定性、標的化などの改善のため）から構成されたものであり得、標的遺伝子をインビボで発現する細胞に送達されるのがよい。好ましい送達方法は、トランスフェクト細胞が充分な量のリボザイムを産生して内在性標的遺伝子メッセージを破壊し、翻訳を阻害するような強い構成ｐｏｌ  ＩＩＩまたはｐｏｌ  ＩＩプロモーターの制御下にある、リボザイム「をコードする」ＤＮＡ構築物の使用を含む。リボザイムは、アンチセンス分子とは違って触媒性であるため、効率に必要とされる細胞内濃度はより低い。
【０２００】
転写を阻害するのに使用される三重ヘリックス形成における核酸分子は、単鎖であり、デオキシヌクレオチドから構成されたものがよい。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成は、一般的に、二重らせんの一方の鎖上のプリンまたはピリミジンのかなりの伸長物（ｓｉｚｅａｂｌｅ  ｓｔｒｅｔｃｈ）を必要とするフーグスティーン型塩基対合規則により三重ヘリックス形成が促進されるように設計する。さらなる詳細事項については、例えば、ＰＣＴ公開公報ＷＯ  ９７／３３５５１（前出）を参照のこと。
【０２０１】
これらの低分子は、本明細書において上記の任意の１種類以上のスクリーニングアッセイおよび／または当業者によく知られた任意の他のスクリーニング手法によって同定され得る。
【０２０２】
（処置対象の心臓血管の障害、内皮の障害、および血管新生の障害の型）
本明細書に記載の心臓血管のアッセイ、血管新生のアッセイ、および内皮のアッセイにおいて活性を有するＥＧＦＬ７またはこれに対するアゴニストは、様々な心臓血管の障害、内皮の障害、および血管新生の障害（真性糖尿病などの、血管に障害を与える全身性障害を含む）において治療用途を有する可能性がある。その治療的有用性としては、動脈、毛細血管、静脈および／またはリンパ管の疾患が挙げられ得る。本記載に従った処置の例としては、筋肉疲労疾患の処置、骨粗鬆症の処置、インプラント周囲での細胞の成長を刺激し、したがってその目的部位への生着を促進するためのインプラント固定の補助、組織または血清中におけるＩＧＦ安定性の増大、および適用可能であれば、ＩＧＦレセプターへの結合の増大（ＩＧＦは、ヒト骨髄の赤芽球および顆粒球前駆細胞成長を増強することがインビトロで示されているため）が挙げられる。
【０２０３】
ＥＧＦＬ７またはこれに対するアゴニストはまた、赤血球形成または顆粒球形成を刺激して、創傷治癒または組織再生および組織（例えば、結合組織、皮膚、骨、軟骨、筋肉、肺、または腎臓など）の再成長に関連する関連治療を刺激するため、血管新生を促進するため、内皮細胞の遊走を刺激または阻害するため、ならびに血管平滑筋の成長および内皮細胞生成を増大させるために使用され得る。ＥＧＦＬ７またはアゴニストによって媒介される血管新生の増大は、虚血性組織および冠動脈狭窄の後の心臓内の側枝（ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ）冠動脈の発達に有益であり得る。アンタゴニストは、かかるポリペプチドの作用を阻害するため、例えば、ＥＧＦＬ７が過剰な結合組織の生成を促進する場合、創傷治癒または肺線維症の際のかかる生成を制限するために使用される。これには、急性心筋梗塞および心不全の処置が含まれ得る。
【０２０４】
具体的な型の疾患を以下に記載するが、この場合、ＥＧＦＬ７は、該障害の処置または予防のための血管関連薬物標的化に、または治療標的として有用な機能を果たし得る。アテローム性動脈硬化は、動脈壁内での脂質の蓄積、平滑筋細胞の増殖および線維性組織の形成により動脈内にプラークが蓄積した内膜性肥厚を特徴とする疾患である。該疾患は、任意の臓器内の大動脈、中動脈および小動脈に障害を与え得る。内皮および血管平滑筋細胞の機能の変化は、これらのプラークの蓄積および縮退のモジュレーションに重要な役割を果たすことが知られている。
【０２０５】
高血圧は、全身の動脈系、肺動脈系または門脈系の脈管圧の上昇を特徴とする。圧力上昇は、内皮機能の障害および／または血管疾患に起因し得るか、またはこれらをもたらし得る。
【０２０６】
炎症性脈管炎としては、巨大細胞性動脈炎、高安動脈炎、結節性多発性動脈炎（微小血管障害性形態を含む）、川崎病、顕微鏡的多発性血管炎、ヴェグナー肉芽腫症、および様々な感染症関連血管障害（ヘノッホ−シェーンライン紫斑病を含む）が挙げられる。内皮細胞機能の改変は、これらの疾患に重要であることが示されている。
【０２０７】
レイノー病およびレイノー現象は、寒気への曝露時の四肢での血液循環の間欠性異常機能障害を特徴とする。内皮細胞機能の改変は、これらの疾患に重要であることが示されている。
【０２０８】
動脈瘤は、内皮細胞および／または血管平滑筋細胞の改変と関連する、動脈または静脈の樹脂上分岐の嚢状または紡錘状の膨張である。
【０２０９】
動脈の再狭窄（動脈壁の再狭窄）は、血管形成術の後に、内皮および血管平滑筋細胞の機能の改変および増殖の結果として起こり得る。
【０２１０】
血栓性静脈炎およびリンパ管炎は、それぞれ、静脈およびリンパ管の炎症性障害であり、内皮細胞機能の改変に起因し得る、および／またはこれをもたらし得る。同様に、リンパ水腫は、内皮細胞機能に起因するリンパ管の障害が関与する状態である。
【０２１１】
良性および悪性の血管腫瘍のファミリーは、血管系の細胞の成分の異常な増殖および成長を特徴とする。例えば、リンパ管腫はリンパ系の良性腫瘍であり、これは、先天性で多くの場合嚢胞性であるリンパ管の先天性異常であり、通常、新生児に生じる。嚢胞性腫瘍は、隣接組織内へと成長する傾向にある。嚢胞性腫瘍は、通常、子宮頚部および腋窩部に生じる。これはまた、四肢の軟組織においても生じ得る。主な症状は、拡張した、場合によっては網状の構造のリンパ管および結合組織に囲まれたリンパ嚢胞である。リンパ管腫は、胚のリンパ管の不正確な連結またはその欠損によって引き起こされると考えられている。その結果、局所リンパ排出の障害が生じる。Ｇｒｉｅｎｅｒら，Ｌｙｍｐｈｏｌｏｇｙ  ４：１４０−１４４（１９７１）。
【０２１２】
ＥＧＦＬ７アンタゴニストの別の使用は、腫瘍が成長および／または転移するのを可能にする脈管化を伴う腫瘍血管新生の予防におけるものである。このプロセスは、新しい血管の成長に依存性である。新生物および腫瘍血管新生を伴う関連状態に例としては、扁平上皮癌、肺癌（肺の小細胞癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、および肺の扁平上皮癌を含む）、腹膜の癌、肝細胞の癌、胃癌（胃腸癌を含む）、膵臓癌、グリア芽細胞腫、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーム、乳癌、結腸癌，結腸直腸癌、子宮内膜または子宮の癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部の癌、甲状腺癌、肝細胞癌腫ならびに種々の型の頭部および頚部の癌、ならびにＢ細胞リンパ腫（例えば、低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中等悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中等悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度非分割小細胞ＮＨＬ；大きな腫瘍のＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；ヘアリーセル白血病；慢性骨髄芽球性白血病；および移植後リンパ球増殖症（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症、浮腫と関連する異常な脈管増殖（脳腫瘍と関連するものなど）、ならびにメグス症候群が挙げられる。
【０２１３】
ＥＧＦＬ７アンタゴニストはまた、眼内新生血管形成疾患（限定されないが、増殖性網膜症、脈絡膜新生血管形成（ＣＮＶ）、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病および他の虚血関連網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、目のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、網膜血管新生などが挙げられる）の処置に有用であり得る。
【０２１４】
関節リウマチは、さらなる適応症である。血管成長および脈管構造による炎症性細胞の標的化は、リウマチおよび血清陰性形態の関節炎の病原における重要な要素である。
【０２１５】
上記に鑑みると、内皮細胞の機能および遊走を改変するか、または影響を与えることが示されている本明細書に記載のＥＧＦＬ７、そのアゴニストまたはアンタゴニストは、上記の障害の多くまたはすべての病因および病原に重要な役割を果たす可能性があり、したがって、これらのプロセスを増大または抑制するための、またはこれらの障害における血管関連薬物ターゲティングための治療標的としての機能を果たし得る。
【０２１６】
（投与プロトコル、計画、用量および製剤）
本明細書に記載の分子ならびにそれに対するアゴニストおよびアンタゴニストは、上記の種々の障害および疾患の予防剤または治療剤として、薬学的に有用である。
【０２１７】
ＥＧＦＬ７またはアゴニストもしくはアンタゴニストの治療用組成物は、保存のために、適度な純度を有する所望の分子を任意選択の薬学的に許容され得る担体、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０））と混合することにより、凍結乾燥製剤または水性溶液の形態で調製される。許容され得る担体、賦形剤または安定剤は、用いる投薬量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、バッファー、例えばリン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸およびメチオニン；保存剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベンなど；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリシン；単糖、二糖および他の炭水化物、例えばグルコース、マンノースまたはデキストリンなど；キレート化剤、例えばＥＤＴＡなど；糖類、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩形成性対イオン、例えばナトリウムなど；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／または非イオン界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。
【０２１８】
かかる単体のさらなる例としては、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、植物性飽和脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、およびポリエチレングリコールが挙げられる。局所用またはゲル系形態のアゴニストまたはアンタゴニストの担体としては、多糖類、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロースまたはメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、およびモクロウ（ｗｏｏｄ  ｗａｘ）アルコール類が挙げられる。すべての投与について、慣用のデポー形態が好適に使用される。かかる形態としては、例えば、マイクロカプセル、ナノカプセル、リポソーム、膏剤（ｐｌａｓｔｅｒ）、吸入形態、鼻孔スプレー、舌下用錠剤および徐放性調製物が挙げられる。ＥＧＦＬ７またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、典型的には、かかるビヒクル中に約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤化される。
【０２１９】
別の製剤は、ＥＧＦＬ７またはそのアゴニストまたはアンタゴニストが成形された物品内に組み込まれたもの（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ）を含む。かかる物品は、内皮細胞成長および血管新生のモジュレーションに使用され得る。また、腫瘍浸潤および転移は、これらの物品によりモジュレートされ得る。
【０２２０】
インビボ投与に使用されるＥＧＦＬ７ポリペプチドまたはアゴニストもしくはアンタゴニストは、滅菌されたものでなければならない。これは、凍結乾燥および再構成の前または後で滅菌濾過膜に通す濾過によって容易になされる。ＥＧＦＬ７ポリペプチドは、全身投与の場合、通常、凍結乾燥形態または溶液状で保存される。凍結乾燥形態の場合、ＥＧＦＬ７またはそれに対するアゴニストもしくはアンタゴニストは、典型的には、使用時に適切な希釈剤を用いた再構成のために、他の成分との組み合わせて製剤化される。ＥＧＦＬ７またはアゴニストもしくはアンタゴニストの液状製剤の一例は、皮下注射用単回用量バイアル内に充填した滅菌された無色透明の非保存（ｕｎｐｒｅｓｅｒｖｅｄ）溶液である。反復使用に適した保存医薬組成物は、例えば、主に適応症およびポリペプチドの型に応じて：
ＥＧＦＬ７ポリペプチドまたはそれに対するアゴニストもしくはアンタゴニスト；
ｐＨを、溶液中でのポリペプチドまたは他の分子の安定性が最大である範囲、好ましくは約４〜８に維持する能力を有するバッファー；
主に、ポリペプチドまたは分子を攪拌誘導型凝集に対して安定化させるためのデタージェント／界面活性剤；
等張剤（ｉｓｏｔｏｎｉｆｉｅｒ）；
フェノール、ベンジルアルコールおよびハロゲン化ベンゼトニウム（例えば、塩化物）の群より選択される保存剤；および
水
を含有し得る。
【０２２１】
使用されるデタージェントが非イオン系である場合、これは、例えば、ポリソルベート（例えば、ＰＯＬＹＳＯＲＢＡＴＥＴＭ（ＴＷＥＥＮＴＭ）２０、８０など）またはポロキサマー（例えば、ＰＯＬＯＸＡＭＥＲＴＭ  １８８）であり得る。非イオン界面活性剤に使用は、製剤が、該ポリペプチドの変性が引き起こされることなく剪断表面応力に曝露されるのを可能にする。さらに、かかる界面活性剤含有製剤は、肺投与において使用されるものなどのエーロゾル装置、および無針リガンド噴射式注射ガン（例えば、ＥＰ２５７，９５６を参照のこと）に使用され得る。
【０２２２】
等張剤は、ＥＧＦＬ７またはそれに対するアゴニストもしくはアンタゴニストの液状組成物の等張性を確保するために存在させ得、多価糖アルコール、好ましくは３価以上の糖アルコール、例えばグリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、およびマンニトールなどが挙げられる。これらの糖アルコールは、単独または組み合わせで使用され得る。あるいはまた、塩化ナトリウムまたは他の適切な無機系塩が、溶液を等張性とするために使用され得る。
【０２２３】
バッファーは、所望されるｐＨに応じて、例えば酢酸、クエン酸、コハク酸またはリン酸バッファーであり得る。本発明の液状製剤の一例の型のｐＨは約４〜８の範囲内、好ましくは、ほぼ生理学的ｐＨに緩衝化される。
【０２２４】
保存剤であるフェノール、ベンジルアルコールおよびハロゲン化ベンゼトニウム（例えば、塩化物）は、使用され得る公知の抗菌剤である。
【０２２５】
本明細書に記載する治療用ポリペプチド組成物は、一般的には、滅菌された投与口を有する容器内、例えば、皮下注射用注射針による穿刺が可能なストッパーを有する静注用溶液バッグまたはバイアルに入れられる。該製剤は、好ましくは、反復性に静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓ．ｃ．）もしくは筋肉内（ｉ．ｍ．）注射として、または鼻腔内または肺内送達（肺内送達については、例えばＥＰ２５７，９５６を参照のこと）に適したエーロゾル製剤として投与される。
【０２２６】
治療用ポリペプチドはまた、徐放性調製物の形態で投与され得る。徐放性調製物の好適な例としては、該タンパク質を含有する固形疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、成形された物品，例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（これは、Ｌａｎｇｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）およびＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２）に記載）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ  ２２：５４７−５５６（１９８３））、非分解性エチレン−酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒら（前出））、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばＬｕｐｒｏｎ  ＤｅｐｏｔＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射用ミクロスフェア）、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）が挙げられる。
【０２２７】
エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーは１００日間を超える分子の放出を可能にするが、ある種のヒドロゲルは、該タンパク質を、より短い期間で放出する。カプセル化されたタンパク質が身体内に長期間残留すると、これらは、３７°Ｃでの湿気への曝露の結果、変性または凝集し得、生物学的活性の低下および免疫原性の変化の可能性が生じ得る。合理的なストラテジーを、タンパク質安定化のために関与する機序に応じて考案するのがよい。例えば、凝集の機序が、チオ−ジスルフィド間の置換による分子間Ｓ−Ｓ結合形成であるとわかった場合、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、湿分を制御し、適切な添加剤を用い、特定のポリマーマトリックス組成物を開発することによって達成され得る。
【０２２８】
また、徐放性ＥＧＦＬ７ポリペプチド組成物には、リポソームに内包されたＥＧＦＬ７ポリペプチドも含まれる。ＥＧＦＬ７ポリペプチドを含有するリポソームは、それ自体が公知の方法によって調製される：ＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４０３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日本国特許出願第８３−１１８００８号；米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号；およびＥＰ１０２，３２４。通常、リポソームは、小さな（約２００〜８００オングストローム）単層型で、脂質含量が約３０モル％超のコレステロール（至適治療のために、選択される割合は調整される）のものである。
【０２２９】
治療有効用量のＥＧＦＬ７またはそれに対するアゴニストもしくはアンタゴニストは、もちろん、処置対象の（予防を含む）病理学的状態，投与方法，処置に使用される化合物の型、関与している任意の共治療、患者の年齢、体重、一般的な病状，病歴などの要素に応じて異なり、その決定は、専門医師（ｐｒａｃｔｉｃｉｎｇ  ｐｈｙｓｉｃｉａｎ）の技能の範囲内である。したがって、治療施行者は、最大治療効果を得るのに必要とされるとおりに投与量を加減（ｔｉｔｅｒ）し、投与の経路を修正することが必要である。ＥＧＦＬ７の宿主範囲が狭い場合、ヒト患者の処置には、ＥＧＦＬ７ポリペプチドを含む製剤、より好ましくは天然配列ヒトＥＧＦＬ７ポリペプチドが好ましい。臨床医は、投薬量が、対象の状態の所望の処置効果の達成が得られるまでＥＧＦＬ７を投与する。例えば、目的がＣＨＦの処置である場合、その量は、この状態と関連する進行性の心臓肥大を阻害するものであり得る。この治療の経過は、脳エコー検査法によって容易にモニターされる。同様に、肥大型心筋症の患者において、ＥＧＦＬ７は経験的に投与され得る。
【０２３０】
上記のガイドラインにより、有効用量は、一般的には、約０．００１〜約１．０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．０１〜１．０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは約０．０１〜０．１ｍｇ／ｋｇの範囲内である。
【０２３１】
ヒト成体高血圧の処置における非経口使用では、ＥＧＦＬ７を、注射の形態で約０．０１〜５０ｍｇ、好ましくは約０．０５〜２０ｍｇ、最も好ましくは１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重にて、１日１〜３回静脈内注射により投与するの好都合である。経口投与では、ＥＧＦＬ７を主とする分子は、好ましくは、約５ｍｇ〜１ｇ、好ましくは約１０〜１００ｍｇ／ｋｇ体重で、１日１〜３回投与される。内毒素の侠雑（ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ）は、最小限に安全レベル（例えば、０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満）に維持されるべきであることを認識されたい。さらに、ヒト投与には、該製剤は、好ましくは、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ基準によって求められる滅菌度、発熱性、一般的安全性および純度を満たすものである。
【０２３２】
組織再生において使用されるＥＧＦＬ７を含有する医薬組成物の投薬レジメンは、担当医師により、ポリペプチドの作用を修正する種々の要素、例えば、所望される形成組織重量の量、損傷の部位、損傷された組織の状態、創傷の大きさ、損傷された組織の種類（例えば、骨）、患者の年齢、性別、および食事，感染症があればその重篤度、投与期間、および他の臨床的要素を考慮して決定される。投薬量は、再構成に使用されるマトリックスの種類によって、および医薬組成物内に他のタンパク質が含まれているか（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）によって異なり得る。例えば、他の公知の成長因子（例えば、ＩＧＦ−Ｉなど）を最終組成物に添加することも、投薬量に影響を与え得る。経過は、組織／骨成長、および／または修復の定期的評価、例えば、Ｘ線、組織形態計測測定およびテトラサイクリン標識によりモニターされ得る。
【０２３３】
ＥＧＦＬ７ポリペプチドまたはアンタゴニストもしくはアゴニストの投与の経路は、公知の方法に合うもの、例えば、静脈内、筋肉内、大脳内、腹腔内、頚管内、皮下、眼内、関節内、滑液包内、鞘内、口腔内、局所的もしくは吸入経路による注射または輸液によるもの、または以下に記載する徐放性系によるものである。ＥＧＦＬ７またはそのアゴニストもしくはアンタゴニストはまた、局所ならびに全身に治療効果が奏するように、腫瘍内、腫瘍周囲、病変内または病変周囲経路によって好適に投与される。腹腔内経路は、例えば、卵巣腫瘍の処置において特に有用であることが期待される。
【０２３４】
該ペプチドまたは低分子がアンタゴニストまたはアゴニストとして使用される場合、これは、好ましくは、経口または非経口で、液体または固体の形態で哺乳動物に投与される。
【０２３５】
塩形成し、本記載に従って有用な分子の薬理学的に許容され得る塩の例としては、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩）、アンモニウム塩、有機塩基の塩（例えば、ピリジン塩、トリエチルアミン塩）、無機酸の塩（例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩）、有機酸の塩（例えば、酢酸塩、シュウ酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩）が挙げられる。
【０２３６】
骨、軟骨、腱または靱帯の再生に有用な本明細書に記載の組成物について、治療的方法は、組成物を、限局的に、全身または局所に、インプラントまたは装置として投与することを含む。投与する場合、使用のための治療用組成物は、発熱源無含有の、生理学的に許容され得る形態である。さらに、該組成物は、望ましくは、骨、軟骨または組織損傷の部位への送達のための粘性形態で、カプセル化または注射され得る。局所投与は、創傷治癒および組織修復に好適であり得る。好ましくは、骨および／または軟骨の形成のためには、該組成物は、タンパク質含有組成物を骨および／または軟骨の損傷部位に送達し、骨および軟骨の発達（ｄｅｖｅｌｏｐ）のための構造を提供する能力を有し、好ましくは身体内に吸収され得るマトリックスを含み得る。かかるマトリックスは、他のインプラント医療適用用途に現在使用されている材料で形成されたものであり得る。
【０２３７】
マトリックス材料の選択は、生体適合性、生分解性、機械的特性、表面（ｃｏｓｍｅｔｉｃ）外観および界面特性に基づく。該組成物の特定の適用用途により適切な製剤が規定される。該組成物の潜在的マトリックスは、生分解性であり、化学物質として規定されるカルシウム硫酸塩、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびポリ無水物であり得る。他の潜在的材料は、生分解性であり、生物学的に明確に規定されたもの（例えば、骨または真皮のコラーゲンなど）である。さらに、マトリックスは、純粋なタンパク質または細胞外マトリックス成分で構成されたものである。他の潜在的マトリックスは、非生分解性であり、化学物質として規定される、例えば焼結ヒドロキシアパタイト、生体ガラス、アルミン酸塩、または他のセラミックスなどである。マトリックスは、任意の前記の型の材料、例えば、ポリ乳酸およびヒドロキシアパタイトまたはコラーゲンおよびリン酸三カルシウムなどの組合せから構成されたものであってもよい。生体セラミックスを、組成物（例えば、リン酸アルミン酸カルシウムなど）に改変し、孔径、粒径、粒子形状および生分解性を改変するための処理を行ってもよい。
【０２３８】
具体的な一実施形態は、乳酸とグリコール酸の５０：５０（モル重量）コポリマーであって、１５０〜８００ミクロンの範囲の直径を有する多孔質粒子の形態のものである。一部の適用用途では、金属イオン封鎖剤（例えば、カルボキシメチルセルロースまたは自家血餅など）を利用し、ポリペプチド組成物がマトリックスから解離するのを抑制するのが有用である。
【０２３９】
金属イオン封鎖剤の好適なファミリーの一例は、セルロース系材料、例えばアルキルセルロース（ヒドロキシアルキルセルロースを含む）、例えばメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース，およびカルボキシメチルセルロースが挙げられ、好ましい一例は、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）のカチオン塩である。他の好ましい金属イオン封鎖剤としては、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ（エチレングリコール）、ポリオキシエチレンオキシド、カルボキシビニルポリマー、およびポリ（ビニルアルコール）が挙げられる。本発明において有用な金属イオン封鎖剤の量は、製剤総重量に対して０．５〜２０ｗｔ％、好ましくは１〜１０ｗｔ％であり、これは、ポリペプチド（またはそのアンタゴニスト）のポリマーマトリックスからの脱離を抑制するため、および組成物の適切な取扱い性を提供するために必要な量を表すが、前駆細胞がマトリックス内に浸潤するのを抑制し、それにより、ポリペプチド（またはそのアンタゴニスト）に前駆細胞の骨形成活性を補助する機会を提供するほど多くない。
【０２４０】
（併用療法）
対象の障害の予防または処置におけるＥＧＦＬ７またはそのアゴニストもしくはアンタゴニストの有効性は、該活性剤を連続的に、またはこのような目的に有効な別の薬剤との組み合わせで同じ組成物にて、または別個の組成物としてのいずれかで投与することにより改善され得る。
【０２４１】
例えば、血管新生と関連する状態（例えば、癌または眼の疾患など）を処置するために使用されるＥＧＦＬ７アンタゴニストは、上記のような細胞傷害剤、化学療法剤または抗血管新生剤と組み合せ得る。腫瘍モデルでは、ＥＧＦＬ７が、腫瘍を抗ＶＥＧＦ抗体で処置した後、退化した腫瘍脈管道（ｔｒａｃｋ）内に残留することがわかった（実施例を参照のこと）。特定の理論に拘束されることを望まないが、ＥＧＦＬ７は、既存のＥＣＭ道に沿ったＥＣ遊走を支持し、したがって抗血管新生処置後の腫瘍血管の再成長を補助する機能を果たすことが考えられ得る。したがって、ＥＧＦＬ７アンタゴニストを抗血管新生剤との組み合わせで使用し、抗血管新生剤の活性を増強または増感させることが望ましい。好ましい実施形態では、ＥＧＦＬ７アンタゴニストを、抗ＶＥＧＦ抗体ベバシズマブとの組み合わせで使用し、その抗腫瘍有効性を増強させる。
【０２４２】
ＥＧＦＬ７またはそのアゴニストまたはアンタゴニストとの組み合わせで投与される治療剤の有効量は、医師または獣医の裁量である。投薬量の投与および調整を行ない、処置対象の状態の最大限のマネージメントを達成する。例えば高血圧症の処置には、これらの量は、理想的には、利尿薬またはジギタリスの使用、および高血圧または低血圧、腎臓障害などの状態を考慮している。用量は、さらに、使用する治療的薬剤の型および処置される具体的な患者などの要素に依存する。典型的には、使用される量は、所定の治療的薬剤をＥＧＦＬ７なしで投与する場合に使用される量と同じ用量である。
【０２４３】
（製造品）
上記の障害の診断または処置に有用なＥＧＦＬ７またはそのアゴニストまたはアンタゴニストを含むキットなどの製造品は、少なくとも容器およびラベルを含む。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジおよび試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料で形成され得る。容器は、該状態の診断または処置に有効な組成物を保持し、滅菌された投与口有し得る（例えば、容器は、皮下注射用注射針による穿刺が可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る）。組成物中の活性剤は、ＥＧＦＬ７またはそれに対するアゴニストもしくはアンタゴニストである。容器上、またはこれに付随するラベルは、該組成物を、選択肢の状態の診断または処置に使用するよう指示するものである。製造品は、薬学的に許容され得るバッファー（例えば、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液など）を含む第２の容器をさらに備えていてもよい。これは、市販品としておよびユーザーの観点から望ましい他の物質（他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジが挙げられる）ならびに添付文書（使用のための使用説明書とともに）をさらに含み得る。製造品はまた、上記のような別の活性剤を有する第２または第３の容器を備えていてもよい。
【０２４４】
（ＥＧＦＬ７抗体）
本発明による最も有望な薬物候補の一部のものは、本発明において同定される遺伝子の遺伝子産物の産生を阻害および／または遺伝子産物の活性を低下させ得る抗体および抗体断片である。
【０２４５】
（ポリクローナル抗体）
ポリクローナル抗体の調製方法は、当業者に知られている。ポリクローナル抗体は、哺乳動物において、例えば、免疫剤および所望によりアジュバントの１回以上の注射によって生成させ得る。典型的には、免疫剤および／またはアジュバントは、哺乳動物に、複数回の皮下または腹腔内注射によって注射される。免疫剤は、ＥＧＦＬ７ポリペプチドまたはその融合タンパク質を含み得る。免疫剤を、免疫処置される哺乳動物において免疫原性であることがわかっているタンパク質とコンジュゲートさせることは、有用であり得る。かかる免疫原性タンパク質の例としては、限定されないが、スカシガイヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、および大豆トリプシンインヒビターが挙げられる。使用され得るアジュバントの例としては、完全フロイントアジュバントおよびＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリル脂質Ａまたは合成トレハロースジコリノミコレートｄｉｃｏｒｙｎｏｍｙｃｏｌａｔｅ）。免疫処置プロトコルは、当業者によって、過度に実験することなく選択され得る。
【０２４６】
（モノクローナル抗体）
あるいはまた、抗ＥＧＦＬ７抗体は、モノクローナル抗体であり得る。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）に記載のものなど）を用いて調製され得る。ハイブリドーマ法では、典型的には、マウス、ハムスターまたは他の適切な宿主動物を免疫剤で免疫処置し、該免疫剤に特異的に結合する抗体を産生させるか、または産生能力を有するリンパ球を誘発する。あるいはまた、リンパ球をインビトロで免疫処置してもよい。
【０２４７】
免疫剤は、典型的には、ＥＧＦＬ７ポリペプチドまたはその融合タンパク質を含む。一般的に、ヒト起源の細胞が所望される場合は、いずれかの末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）が使用され、または非ヒト哺乳動物供給源が所望される場合は、脾臓細胞またはリンパ節細胞が使用される。次いで、リンパ球を不死化細胞株と、適当な融合剤（例えば、ポリエチレングリコール）を用いて融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する。Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６），ｐｐ．５９−１０３。不死化細胞株は、通常、哺乳動物の形質転換細胞、特に、齧歯類、ウシおよびヒト起源の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株が用いられる。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、融合されていない不死化細胞の成長または生存を抑制する物質を１種類以上を含有する適当な培養培地中で培養し得る。例えば、親細胞で酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）が欠損している場合、ハイブリドーマの培養培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含み（「ＨＡＴ培地」）、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を抑制する。
【０２４８】
好ましい不死化細胞株は、効率的に融合し、選択した抗体産生細胞による抗体の安定な高レベル発現を支持し、かつＨＡＴ培地などの培地に感受性であるものである。より好ましい不死化細胞株はマウス骨髄腫株であり、これは、例えば、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａおよびＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａから得られ得る。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体の産生に関して記載されている。Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）ｐｐ．５１−６３。
【０２４９】
ハイブリドーマ細胞を培養した培養培地を、次いで、ＥＧＦＬ７ポリペプチドに対して指向されるモノクローナル抗体の存在に関してアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降によって、またはインビトロ結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくは固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定する。かかる手法およびアッセイは、当該技術分野で知られている。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、ＭｕｎｓｏｎおよびＰｏｌｌａｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０（１９８０）のスキャチャード解析によって測定され得る。
【０２５０】
所望のハイブリドーマ細胞が同定されたら、該クローンを限界希釈手順によってサブクローニングし、標準的な方法によって成長させ得る。Ｇｏｄｉｎｇ（前出）。この目的に適した培養培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地およびＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。あるいはまた、ハイブリドーマ細胞は、インビボで腹水として哺乳動物内で成長させ得る。
【０２５１】
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、培養培地腹水液から、慣用の免疫グロブリン精製手順（例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティクロマトグラフィーなど）によって単離または精製され得る。
【０２５２】
モノクローナル抗体はまた、米国特許第４，８１６，５６７号に記載のものなどの組換えＤＮＡ方法によって作製され得る。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、慣用の手順を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合する能力を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）容易に単離され、配列決定され得る。本発明のハイブリドーマ細胞は、かかるＤＮＡの好ましい供給源として供される。いったん単離されたら、ＤＮＡを発現ベクター内に配置し、次いで、宿主細胞（例えば、別の場合は、免疫グロブリンタンパク質を産生しない類人猿ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または骨髄腫細胞）にトランスフェクトし、組換え宿主細胞内でのモノクローナル抗体の合成が得られ得る。ＤＮＡはまた、例えば、相同なマウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列で置換することにより（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（前出））、または免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列のすべてまたは一部を共有結合させることにより修飾してもよい。かかる非免疫グロブリンポリペプチドは、キメラ二価抗体を創製するために、本発明の抗体の定常ドメインの代わりに使用され得、または本発明の抗体の抗原結合部位の１つの可変ドメインの代わりに使用され得る。
【０２５３】
抗体は、一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は、当該技術分野でよく知られている。例えば、方法の一例は、免疫グロブリン軽鎖および修飾重鎖の組換え発現を伴う。重鎖は、一般的には、重鎖の架橋を妨げるようにＦｃ領域内に任意の点での切断型である。あるいはまた、関連システイン残基が、架橋を妨げるように別のアミノ酸残基で置換されているか、または欠失している。
【０２５４】
インビトロ方法もまた、一価抗体の調製に適している。抗体を消化してその断片、特にＦａｂ断片を作製することは、当該技術分野で知られた常套手法を用いてなされ得る。
【０２５５】
（ヒトおよびヒト化抗体）
抗ＥＧＦＬ７抗体は、さらに、ヒト化抗体またはヒト抗体を含み得る。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体他の抗原結合サブ配列など）である。ヒト化抗体としては、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であって、該レシピエントのＣＤＲ由来の残基が、所望の特異性、親和性および許容性を有する非ヒト種（ドナー抗体）（例えば、マウス、ラットまたはウサギなど）のＣＤＲ由来の残基で置き換えられたものが挙げられる。ある場合においては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が対応する非ヒト残基で置き換えられたものである。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体にも取り込まれたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見られない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ここで、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体はまた、好ましくは、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的には、ヒト免疫グロブリンのものを含む。Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）。
【０２５６】
非ヒト抗体のヒト化の方法は、当該技術分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された１個以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「外来の（ｉｍｐｏｒｔ）」残基と呼ばれ、典型的には、「外来の」可変ドメインから採用される。ヒト化は、本質的には、Ｗｉｎｔｅｒおよび共働者（Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８））の方法に従って、齧歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列を対応するヒト抗体の配列に置換することにより行なわれ得る。したがって、かかる「ヒト化」抗体はキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）であり、これは、完全なヒト可変ドメインより実質的に少ない部分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されている。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、一部のＣＤＲ残基およびおそらく一部のＦＲ残基が、齧歯類抗体内の同様の部位に由来する残基で置換されたヒト抗体である。
【０２５７】
ヒト抗体はまた、当該技術分野で知られた種々の手法（例えば、ファージディスプレーライブラリー）を用いて作製され得る。ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１（１９９１）。ＣｏｌｅらおよびＢｏｅｒｎｅｒらの手法もまた、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である。Ｃｏｌｅら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）およびＢｏｅｒｎｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４７（ｌ）：８６−９５（１９９１）。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば、内在性免疫グロブリン遺伝子が一部または完全に不活化されたマウス内に導入することにより作製され得る。抗原刺激すると、すべての点（例えば、遺伝子再編成、アセンブリおよび抗体レパートリーなど）でヒトにおいて見られるものと非常によく似たヒト抗体産生が観察される。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第および５，６６１，０１６，号、ならびに以下の科学系出版物：Ｍａｒｋｓら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇら，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３６８：８１２−８１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８２６（１９９６）；ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３：６５−９３（１９９５）に記載されている。
【０２５８】
（二重特異性抗体）
二重特異性抗体は、モノクローナルで、好ましくはヒトまたはヒト化された抗体であって、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するものである。本発明の場合、結合特異性の一方は、ＥＧＦＬ７ポリペプチドに対するものであり、他方は、任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質またはレセプターまたはレセプターサブユニットに対するものである。
【０２５９】
二重特異性抗体の作製方法は、当該技術分野で知られている。伝統的には、二重特異性抗体の組換え産生は、２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づくものであり、この場合、２つの重鎖は異なる特異性を有する。ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７−５３９（１９８３）。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな組み合わせ（ｒａｎｄｏｍ  ａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ）のため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ（ｑｕａｄｒｏｍａｓ））は、１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物をもたらし、そのうち１種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、通常、アフィニティクロマトグラフィー工程によってなされる。同様の手順が、ＷＯ  ９３／０８８２９（１９９３年５月１３日公開）およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５−３６５９（１９９１）に開示されている。
【０２６０】
所望の結合特異性（抗体抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインを、免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させ得る。融合は、好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の少なくとも一部分を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインで行う。融合体の少なくとも１つに存在する軽鎖結合に必要な部位を含有する第１重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、および所望により免疫グロブリン軽鎖を、個々の発現ベクター内に挿入し、適当な宿主生物をコトランスフェクトする。二重特異性抗体の作製のさらなる詳細事項については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １２１：２１０（１９８６）を参照のこと。
【０２６１】
（ヘテロコンジュゲート抗体）
ヘテロコンジュゲート抗体は、２種類の共有結合した抗体から構成される。かかる抗体は、例えば、免疫系細胞を不必要な細胞に標的化させること（米国特許第４，６７６，９８０号）、およびＨＩＶ感染の処置用であることが提案されている。ＷＯ  ９１／００３６０；ＷＯ  ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９。該抗体は、インビトロで、公知の方法を用いて合成タンパク質化学（架橋剤を伴うものを含む）において調製され得ることが考えられる。例えば、イムノトキシンを、ジスルフィド交換反応を用いて、またはチオエーテル結合を形成することにより構築し得る。この目的に適した試薬の例としては、イミノチオレート（ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｔｅ）およびメチル−４−メルカプトブチルイミデートならびに例えば、米国特許第４，６７６，９８０号に開示されたものが挙げられる。
【０２６２】
（イムノコンジュゲート）
本発明はまた、細胞傷害剤、例えば化学療法剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物もしくは動物が起源の酵素的に活性な毒素、またはその断片）、または放射性同位体（すなわち、ラジオコンジュゲート（ｒａｄｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ））などとコンジュゲートさせた抗体を含む、イムノコンジュゲートに関する。
【０２６３】
かかるイムノコンジュゲートの作製に有用な化学療法剤は、上記に記載している。使用され得る酵素的に活性な毒素およびその断片としては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、エクソトクシンＡ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａインヒビター、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓインヒビター、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン、およびトリコテセンが挙げられる。種々の放射性核種が、ラジオコンジュゲート抗体の作製に利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙおよび１８６Ｒｅが挙げられる。
【０２６４】
抗体と細胞傷害剤のコンジュゲートは、様々な二元機能タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二元機能誘導体（ジメチルアジピミデート（ａｄｉｐｉｍｉｄａｔｅ）ＨＣｌ）、活性なエステル（スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド類（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トリエン２，６−ジイソシアネート）、およびビス−活性フッ素化合物（ｌ，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）などを用いて作製される。例えば、リシンイムノトキシンは、Ｖｉｔｅｔｔａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８（１９８７）に記載のようにして調製され得る。炭素−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性ヌクレオチドのコンジュゲーションのためのキレート化剤の一例である。ＷＯ９４／１１０２６を参照のこと。
【０２６５】
別の実施形態では、抗体は、腫瘍予備標的化における利用のために、「レセプター」（ストレプトアビジンなど）とコンジュゲートさせ得、ここで、抗体−レセプターコンジュゲートを患者に投与した後、未結合コンジュゲートを循環系から清澄化（ｃｌｅａｒ）剤を用いて除去し、次いで、細胞傷害剤（例えば、放射性ヌクレオチド）とコンジュゲートさせ「リガンド」（例えば、アビジン）を投与する。
【０２６６】
（イムノリポソーム）
本明細書に開示した抗体はまた、イムノリポソームとして製剤化され得る。該抗体を含有するリポソームは、当該技術分野で知られた方法、例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４０３０（１９８０）；および米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号に記載された方法などによって調製される。循環時間を向上させたリポソームが、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
【０２６７】
特に有用なリポソームは、逆相エバポレーション方法により、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ−誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いて作製され得る。リポソームは、規定の孔径のフィルターを通して押出すことにより所望の直径を有するリポソームが得られる。本発明の抗体のＦａｂ’断片をリポソームと、Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６−２８８（１９８２）に記載のようにしてジスルフィド交換反応によりコンジュゲートさせ得る。化学療法剤（例えば、ドキソルビシンなど）を、任意選択でリポソーム内に含める。Ｇａｂｉｚｏｎら，Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８１（１９）：１４８４（１９８９）を参照のこと。
【０２６８】
（抗体の医薬組成物）
本発明において同定されるＥＧＦＬ７ポリペプチドに特異的に結合する抗体、ならびに本明細書において先に開示したスクリーニングアッセイによって同定される他の分子は、上記および下記の種々の障害の処置のために医薬組成物の形態で投与され得る。
【０２６９】
本発明の製剤はまた、処置対象の特定の適応症に対する必要に応じて１種類より多い活性化合物（好ましくは、互いに悪影響を与えない相補的活性を有するもの）を含有し得る。あるいはまたさらに、該組成物は、その機能を増強させる薬剤、例えば、細胞傷害剤、サイトカイン、化学療法剤または成長阻害剤などを含み得る。かかる分子は、組み合せて、意図される目的に有効な量で好適に存在させる。
【０２７０】
活性成分はまた、マイクロカプセル内に内包させ得、例えば、コアセルベーション手法によって、または界面重合によって調製したマイクロカプセル（それぞれ、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル）内に、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）内に、またはマクロエマルジョン内に内包させ得る。かかる手法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（前出）に開示されている。
【０２７１】
インビボ投与に使用される製剤は、滅菌されたものでなければならない。これは、滅菌濾過膜に通す濾過によって容易になされる。
【０２７２】
徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の好適な例としては、該抗体を含有する固形疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、成形された物品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態である。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射用ミクロスフェア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニルや乳酸−グリコール酸などのポリマーは、１００日間以上にわたる分子の放出を可能にするが、ある種のヒドロゲルは、より短い期間でタンパク質を放出する。カプセル化された抗体が身体内に長期間残留すると、これらは、３７℃での湿気への曝露の結果、変性または凝集し得、生物学的活性の低下および免疫原性の変化の可能性が生じ得る。合理的なストラテジーを、安定化のために関与する機序に応じて考案するのがよい。例えば、凝集の機序が、チオ−ジスルフィド間の置換による分子間Ｓ−Ｓ結合形成であるとわかった場合、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、湿分を制御し、適切な添加剤を用い、特定のポリマーマトリックス組成物を開発することによって達成され得る。
【０２７３】
（抗体を用いた処置方法）
ＥＧＦＬ７ポリペプチドに対する抗体は、上記の状態と関連する種々の血管新生を処置するために使用され得ることが予想される。
【０２７４】
抗体は、哺乳動物（好ましくは、ヒト）に、公知の方法に従って、例えば、ボーラスとして静脈内投与によって、または筋肉内、腹腔内、頚管内、皮下、関節内、滑液包内、鞘内、口腔内、局所的もしくは吸入経路により一定期間にわたる連続注入によって投与される。抗体の静脈内投与が好ましい。
【０２７５】
他の治療レジメンを上記の本発明の抗体の投与と組み合せ得る。例えば、抗体が癌を処置するためのものである場合、かかる抗体で処置する患者は、放射線療法を受けてもよい。あるいはまたさらに、化学療法剤を患者に投与してもよい。かかる化学療法剤の調製および投薬スケジュールは、製造業者の使用説明書に従って、または当業者が経験的に決定して使用され得る。かかる化学療法剤の調製および投薬スケジュールはまた、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ編集Ｍ．Ｃ．Ｐｅｒｒｙ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ：Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，１９９２）に記載されている。化学療法剤は、抗体を投与する前もしくは後に投与され得、またはこれと同時に投与され得る。抗体を抗エストロゲン化合物、例えば、タモキシフェンもしくはＥＶＩＳＴＡＴＭまたは抗プロゲステロン、例えば、オナプリスト（ＥＰ６１６８１２を参照のこと）と、かかる分子について既知の投薬量で組み合わせてもよい。
【０２７６】
抗体が癌の処置に使用される場合、他の腫瘍関連抗原に対する抗体（例えば、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ，ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４またはＶＥＧＦ  レセプター（１つまたは複数）の１種類以上と結合する抗体など）を投与することも望ましいことがある。これらもまた、上記の薬剤を含む。また、抗体は、放射線照射または放射性物質の投与のいずれかでの放射線処置と連続的に、またはこれとの組み合わせで好適に投与される。あるいはまたさらに、本明細書に開示した同じ抗原または２つ以上の異なる抗原に結合する２種類以上の抗体を、患者に共投与してよい。場合によっては、１種類以上のサイトカインを患者に投与することも有益であり得る。好ましい実施形態では、本発明の抗体は、成長阻害剤と共投与される。例えば、成長阻害剤が最初に投与された後、本発明の抗体がされ得る。しかしながら、同時投与または最初に本発明の抗体を投与することも想定される。成長阻害剤の好適な投薬量は現在使用されているものであるが、成長阻害剤と本発明の抗体の併用作用（相乗効果）により、少なくしてもよい。
【０２７７】
一実施形態では、腫瘍の脈管化が併用療法において攻撃される。抗ＥＧＦＬ７抗体と別の抗体（例えば、抗ＶＥＧＦ）が腫瘍を有する患者に、例えば、腫瘍またはその転移性病巣の壊死（あれば）を観察することにより決定される治療有効用量で投与される。さらなる抗腫瘍薬剤、例えば、α−、β−またはγ−インターフェロン、抗ＨＥＲ２抗体、ヘレグリン（ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ）、抗ヘレグリン抗体、Ｄ−因子、インターロイキン−１（ＩＬ−Ｉ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、または腫瘍内での微小血管の凝固を促進する薬剤、例えば、抗プロテインＣ抗体、抗プロテインＳ抗体もしくはＣ４ｂ結合タンパク質（ＷＯ  ９１／０１７５３（１９９１年２月２１日公開）を参照のこと）、または熱もしくは放射線をさらに投与してもよい。
【０２７８】
他の実施形態では、ＦＧＦまたはＰＤＧＦアンタゴニスト（抗ＦＧＦまたは抗ＰＤＧＦ中和抗体など）を患者に、抗ＥＧＦＬ７抗体と組み合わせて投与する。抗ＥＧＦＬ７抗体での処置は、好ましくは、創傷治癒または所望の新生血管形成の期間中、中止（ｓｕｓｐｅｎｄ）してもよい。
【０２７９】
心臓血管の障害、内皮の障害、および血管新生の障害の予防または処置に関し、本発明の抗体の適切な投薬量は、処置対象の上記のような障害の型、疾患の重篤度および過程、抗体が予防目的で投与されたのか治療目的で投与されたのか、以前の治療、患者の病歴および抗体に対する応答、ならびに担当医師の裁量に依存する。抗体は患者に、１回の処置または一連の処置で好適に投与される。
【０２８０】
例えば、障害の型および重篤度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、患者に対する投与（例えば、１種類以上の独立した投与によって、または連続注入によってのいずれか）の初期投薬量候補である。典型的な１日または１週間の投薬量は、前記の要素に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。数日間以上にわたる反復投与では、状態に応じ、障害の症状の所望の抑制が生じるまで処置が反復または持続される。しかしながら、他の投薬量レジメンも有用であり得る。この治療の経過は、慣用の手法およびアッセイ（例えば、Ｘ線撮影による腫瘍の画像形成が挙げられる）によって容易にモニターされる。
【０２８１】
（抗体を有する製造品）
抗体を有する容器およびラベルを含む製造品もまた提供される。かかる物品は、先に記載しており、活性剤は抗ＥＧＦＬ７抗体である。
【０２８２】
（抗体を用いる診断および予後）
抗体が使用される適応症が癌である場合、ある種の腫瘍で過剰発現される細胞表面タンパク質（例えば、成長レセプター）が薬物候補または腫瘍（例えば、癌）処置の優れた標的となるが、同タンパク質とともにＥＧＦＬ７ポリペプチドに、腫瘍の診断および予後におけるさらなる用途が見出された。例えば、ＥＧＦＬ７ポリペプチドに対して指向される抗体は、腫瘍診断薬または予後診断薬として使用され得る。
【０２８３】
例えば、ＥＧＦＬ７ポリペプチドをコードする遺伝子を含む遺伝子の発現を検出する抗体（抗体断片を含む）が、定性的または定量的に使用され得る。該抗体には、好ましくは、検出可能な、例えば蛍光標識が取り付けられ、結合が、光学顕微鏡検査、フローサイトメトリー、蛍光定量法または当該技術分野で知られた他の手法によってモニターされ得る。かかる結合アッセイは、本質的に上記のようにして行なわれる。
【０２８４】
マーカー遺伝子産物に対する抗体結合のインサイチュ検出は、例えば、免疫蛍光顕微鏡検査または免疫電子顕微鏡検査によって行なわれ得る。この目的のため、組織学的検体を患者から取り出し、標識された抗体をこれに、好ましくは、生物学的試料に抗体を重層することにより適用する。この手順はまた、検査した組織内でのマーカー遺伝子産物の分布を測定するのを可能にする。当業者には、多種多様な組織学的方法が、インサイチュ検出に容易に利用可能であることが自明であろう。
【０２８５】
以下の実施例は、例示の目的のためのみに提供し、本発明の範囲をなんら制限することを意図しない。
【０２８６】
本明細書で引用したすべて特許および参考文献の開示内容は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０２８７】
実施例に示す市販の試薬は、特に記載のない限り、製造業者の使用説明書に従って使用した。以下の実施例、および本明細書全体を通してＡＴＣＣ受託番号で識別される細胞の供給源は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１０８である。本明細書で引用したすべての参考文献は、引用により本明細書に組み込まれる。
【０２８８】
（実施例１．ＥＧＦＬ７のクローニング）
ＥＧＦＬ７を、新規なヒト分泌膜貫通タンパク質、特に、血管発達の調節に関与するものを見出すための試行において確認およびクローニングした。ヒトＥＧＦＬ７のクローニングおよび発現の詳細は、例えば、特許出願ＵＳ２００３０２２４９８４  Ａｌ（ＥＧＦＬ７をＰＲＯ１４４９で識別）に記載されている。簡単には、全固定インサイチュハイブリダイゼーションスクリーニングを行ない、マウス胚脈管構造内に富化される分泌因子およびレセプターを同定した。シグナル配列の予測および細胞外ドメイン相同性検索により、推定分泌因子およびレセプターを表す数百のヒトおよびマウスｃＤＮＡを同定し、収集した。マウスｃＤＮＡを鋳型として用いてリボプローブを作製し、インサイチュハイブリダイゼーションをＥ７．５〜Ｅ１４．５の範囲の全マウス胚において行った。この発生期の時間枠は、脈管形成および血管新生における多くの重要な段階を含むため、選択した。このスクリーニングで同定された多くの遺伝子のうち、ＥＧＦＬ７は、活発に成長している血管の内皮において特有に発現される。下記の発現の詳細を参照のこと。
【０２８９】
ツメガエル属ＥＧＦＬ７を、単一のｇｅｎｂａｎｋ登録ＢＣ０４４２６７に由来する原料（ｒｏｕｇｈ  ｄｒａｆｔ）とした。ゼブラフィッシュＥＧＦＬ７は、２４ｈｐｆ胚から３種類の既知の種（ヒト、マウスおよびツメガエル属）間の相同性に基づいて作製したｃＤＮＡライブラリーの低ストリンジェンシーＰＣＲおよび続くスクリーニングによってクローニングした。ゼブラフィッシュＥＧＦＬ７  ｃＤＮＡ、部分ゲノムＤＮＡおよびアミノ酸の配列を図１Ｂに示す。ＥＧＦＬ８は、ＥＧＦＬ７配列を用いたＢＬＡＳＴによって同定した。
【０２９０】
Ｔ５１パネルを用いた放射線ハイブリッドマッピング実験により、ゼブラフィッシュＥＧＦＬ７を、ＥＳＴマーカーｆｋ２０ｄ１２．ｙ１（受託番号ＡＷ５６６８４６）付近の連鎖群２１（ＬＧ２１）内に配置した。ゼブラフィッシュＬＧ２１のこの領域は、ヒトＥＧＦＬ７残基が存在する遺伝子座であるヒト染色体９ｑ３３〜９ｑ３４とシンテニーであると思われる。以下の遺伝子：Ｎｏｔｃｈｌ（９ｑ３４）、カルボキシルエステルリパーゼ（ＣＥＬＬ；９ｑ３４）およびプロテアソームサブユニットβ７（ｐｓｍｂ７；９ｑ３３）がこのヒト遺伝子座内に見られる。これらの遺伝子は、ゼブラフィッシュＥＧＦＬ７がマップされたＬＧ２１の領域内に存在する（ＬＧ２１、１９．６〜２９．０  ＣＭ）。
【０２９１】
ＥＧＦＬ７遺伝子は、約３０ｋＤの相対分子量を有する推定分泌タンパク質をコードする。ＥＧＦＬは進化において保存されている。図１ａ参照。ヒト（ホモサピエンス）アミノ酸配列は、マウス（ハツカネズミ）、ツメガエル属（アフリカツメガエル）およびゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）のものと、それぞれ、７７．４５％、４７．１２％および４２．９６％相同性を共有する。
【０２９２】
ＥＧＦＬ７タンパク質は、シグナル配列、ＥＭＩドメインをＮ末端に（ＥＭＩドメインは、細胞接着の調節に関与するいくつかの細胞外マトリックス関連（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）タンパク質内に存在する）、その後に２つのＥＧＦ様ドメインと、ロイシンおよびバリン高含有Ｃ末端領域を含有する。哺乳動物ＥＧＦＬ７は、小さい遺伝子ファミリーに属する。ＢＬＡＳＴ検索により、１つの密接に関連する遺伝子ＥＧＦＬ８が同定され、これは、ＥＧＦＬ７と同一のドメイン構成を有する。興味深いことに、この遺伝子ファミリーは、いくつかの魚類ゲノム（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ，ＭｅｄａｋａおよびＦｕｇｕ）ではＥＧＦＬ８オルソログが確認されていないため、哺乳動物において、より複雑であるようである。
【０２９３】
ヒトＥＧＦＬ７をコードするｃＤＮＡは、ブダペスト条約の下、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９，ＵＳＡ（ＡＴＣＣ）に、ＡＴＣＣ寄託番号２０３２４３で寄託した（１９９８年９月９日に寄託）。
【０２９４】
これらの寄託は、ブダペスト条約の規定の下、これに従うＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｅｐｏｓｉｔ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｕｒｐｏｓｅ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ（ブダペスト条約）においてなされた。これにより、寄託物の生育可能な培養物の維持が寄託日から３０年間保証される。寄託物は、ＡＴＣＣによりブダペスト条約の下に入手可能であり、本出願の譲受人とＡＴＣＣ間の同意に供され、これによって、米国特許の発行時、または米国または外国特許出願のいずれかの公開時のいずれか早いときに、寄託物の培養物の子孫の公に対する永続的かつ非拘束的利用可能性が保証され、３５  ＵＳＣ  §  １２２およびそれに準じる長官の規則（３７  ＣＦＲ  §  １．１４、特に８８６  ＯＧ  ６３８の言及を含む）にしたがって権限のある米国特許商標局長官によって決定される者に対する子孫の利用可能性が保証される。
【０２９５】
本出願の譲受人は、適当な条件下での培養時に、寄託された該材料の培養物が死滅または紛失または破壊された場合、通知に基づいて、該材料を速やかに別の同じものと交換することに同意した。寄託した材料の利用可能性は、特許法に従う政府の権限のもとに付与される権利に違反して本発明の実施に対する許可と解釈されない。
【０２９６】
（実施例２．ＥＧＦＬ７の発現）
ＥＧＦＬ７の発現パターンを解明するため、全固定インサイチュハイブリダイゼーション、免疫蛍光染色法および放射性インサイチュハイブリダイゼーションを、マウスおよびゼブラフィッシュ胚ならびにマウスおよびヒト組織切片において行った。
【０２９７】
（ゼブラフィッシュおよびマウス系統）
マウス胚を、妊娠期のＣＤ−１マウスから採取した。ＴUｅｂｉｎｇｅｎ  ｌｏｎｇ  ｆｉｎ（ＴＬ）野生型ゼブラフィッシュ系統約３０ｈｐｆ  ｃｌｏｃｈｅ（ｃｌｏｍ３９）ホモ接合変異胚およびその野生型同胞を、本明細書において以下に記載する発現および活性試験で使用した。成体ゼブラフィッシュおよび胚は、既報のとおりに維持した（Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ  １９９３  Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  Ｂｏｏｋ）。
【０２９８】
（放射性インサイチュハイブリダイゼーション）
組織をインサイチュハイブリダイゼーション用に、既報の方法によって加工した。Ｐｈｉｌｌｉｐｓら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５０：２９０−４。３３Ｐ−ＵＴＰ−標識ＲＮＡプローブを、既報のとおりに作製した。Ｍｅｌｔｏｎら（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：７０３５−５６。ＥＧＦＬ７センスおよびアンチセンスプローブを、それぞれ、ヌクレオチド３８２〜１０６２、−１３７〜１５０および１７３〜７７４に対応する２つのヒトｃＤＮＡおよび１つのマウスｃＤＮＡから合成した（開始コドン内のヌクレオチドＡをヌクレオチド＃１とカウントする）。
【０２９９】
（全固定インサイチュハイブリダイゼーション）
全固定インサイチュハイブリダイゼーションは、若干の修正を伴って既報のとおりに行った。Ｓｈｉｍａｍｕｒａら  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２０：２２２５−２２３４（１９９４）。染色した胚を、写真撮影のため、ベンジルアルコール／安息香酸ベンジルの２：１混合物中で洗浄した。センスおよびアンチセンスリボプローブを、以下の鋳型：マウスＥＧＦＬ７部分ｃＤＮＡクローン（ＩＭＡＧＥクローン５１９２４９、Ｇｅｎｂａｎｋ受託：ＡＡ１０７３５８）；ヌクレオチド１６９〜８０７に対応するゼブラフィッシュＥＧＦＬ７部分ｃＤＮＡクローンを用いて作製した；他のすべての分子マーカーは、Ｆｉｓｈｍａｎ（ＭＧＨ）、Ｓｔａｉｎｉｅｒ（ＵＣＳＦ）およびＷｅｉｎｓｔｅｉｎ（ＮＩＨ）ｌａｂｓ製であった。全固定インサイチュハイブリダイゼーション解析後、胚を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）含有１×ＰＢＳ中に再固定し、エタノール列により脱水し、ＪＢ−４Ｐｌｕｓプラスチック（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）内に包埋した。５μｍ切片を０．２％ヌクレアーファーストレッドで対比染色し、Ｃｙｔｏｍｏｕｎｔ  ６０内に配置した。
【０３００】
（ＡＰ染色）
４８ｈｐｆ全固定ゼブラフィッシュ胚における内在性アルカリホスファターゼ活性を、既報のとおりに検出した。Ｃｈｉｌｄｓら  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２９：９７３−９８２（２００２）。
【０３０１】
（デコンボリューション顕微鏡検査）
胚を、一晩、４℃で４％ＰＦＡ中に固定し、２０％スクロース／ＰＢＳ中で凍結防止し、７．５％ゼラチン／１５％スクロース中でスナップ凍結し、細分した。スライドを風乾し、１×ＰＢＳ／０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／１％ＤＭＳＯ中で透過させ、２０分間、上記の溶液＋１％ＢＳＡ中でブロックし、６６  ｎＭ  ＡＬＥＸＡ  Ｆｌｕｏｒ５９４−ファロイジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）にて２０分間で染色し、洗浄し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ  ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｓ．）にマウントし、Ｄｅｌｔａｖｉｓｉｏｎ  Ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（６０×油浸対物レンズ）を用いて解析した。
【０３０２】
（免疫蛍光染色）
アルメニアンハムスターを、大腸菌内で発現された組換えマウスＥＧＦＬ７タンパク質にて免疫処置した。モノクローナル抗体を、ハイブリドーマ融合およびサブクローニングによって作製した。異なるエピトープを認識する２種類のモノクローナル抗体１Ｃ８および５Ｈ７を免疫蛍光染色法に使用した。マウス組織をスナップ凍結し、凍結切片を作製した。固定細胞または５μｍ非固定組織切片を、既報のとおりに染色した。Ｐａｒｋｅｒら  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５９：３１３−３６（１９９９）。この試験で用いた抗体は、抗ＺＯ−１  ｍａｂ（Ｚｙｍｅｄ  Ｉｎｃ．カタログ番号３３−９１００）；抗ＧＦＰ（Ｔｏｒｒｅｙ  Ｐｉｎｅｓ  Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号ＴＰ４０１）；抗ビンクリンｍａｂ（Ｓｉｇｍａ）である。
【０３０３】
（結果）
ＥＧＦＬ７の発現パターンもまた、種間で進化において保存されている。マウス、ヒトおよびゼブラフィッシュ胚では、高レベルのＥＧＦＬ７転写物が、すべて血管の内皮前駆細胞およびＥＣ（図２ａ、２ｂ、２ｇ、２ｊ〜２ｍ）、ならびに心内膜において検出された。脈管での強い発現が、胚および新生児の発達の間、持続した。しかしながら、該メッセージ（ｍｅｓｓａｇｅ）は、多くの成体臓器で検出され得なかった（図２ｈ）。成体マウスでは、わずかに高度に脈管形成された臓器、例えば、肺、心臓および腎臓が、脈管の小サブセットにおいてＥＧＦＬ７の発現を継続した。興味深いことに、ＥＧＦＬ７発現は、多くの増殖性組織、例えば、腫瘍（図２ｉ）、妊娠中の生殖器官（図２ｃ）および炎症組織において強く情報調節された。さらに、強いＥＧＦＬ７発現は、ヒト疾患一次組織、例えば、限定されないが、肺腺癌および扁平上皮癌、腎臓細胞癌腫、前立腺癌腫、卵巣癌腫、肝臓癌腫、胃癌腫、軟骨肉腫、骨肉腫、疾患のある眼および炎症部位由来の血管新生膜において見られた。
【０３０４】
この特有の発現パターンは、高レベルのＥＧＦＬ７が血管成長およびリモデリングと関連することを示す。ＥＧＦＬ７は、心臓血管系および造血系の外側では検出されず、この観察結果は、ＥＧＦＬ７発現はゼブラフィッシュ変異体ｃｌｏｃｈｅの脈管では完全に破壊されているという事実によって確認された（図２ｎ）。Ｓｔａｉｎｉｅｒら  Ｄｅｖ．Ｓｕｐｐｌ．１２１：３１４１−３１５０（１９９５）。
【０３０５】
免疫蛍光染色は、ＥＧＦＬ７タンパク質が、ＥＣの近傍において分泌されるが残留しており（図２ｃの差し込み図）、明白に細胞外マトリックスと会合していることを示す。さらに、抗ＶＥＧＦ抗体で処置した腫瘍モデルを用いた試験では、腫瘍脈管構造が、抗ＶＥＧＦ処置によって断片状となった後、ＥＧＦＬ７が、退化した腫瘍脈管のＥＣＭ道内に残留することが示された。これは、腫瘍脈管が最終的に再成長し、したがって、抗ＶＥＧＦ処置を「逃れる」のを支持するＥＧＦＬ７の潜在的に重要な役割を示し得る。
【０３０６】
（実施例３．低下したＥＧＦＬ７活性を有する動物の表現型解析）
（Ａ．  ＥＧＦＬ７ノックダウンゼブラフィッシュにおける脈管の血管）
最近の報告において、組換えＥＧＦＬ７タンパク質を含有する馴化培地が、平滑筋細胞（ＳＭＣ）遊走をインビトロで阻害することが示されている。Ｓｏｎｃｉｎら  ＥＭＢＯ  Ｊ．２２：５７００−５７１１（２００３）。しかしながら、そのインビボ機能は明確になっていない。インビボでのＥＧＦＬ７の生物学的機能を明らかにするため、モデル生物ゼブラフィッシュを、脈管形成および血管新生を試験するためのツールとしての入手し易いこと、および胚において遺伝子発現を操作し易いことから使用した。Ｆｉｓｈｍａｎら  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７４：７５７−６３（１９９４）；Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１：Ｅ１７−２４（１９９６）；Ｄｏｏｌｅｙら  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １０：２５２−６（２０００）；Ｎａｓｅｖｉｃｉｕｓ＆Ｅｋｋｅｒ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２６：２１６−２０（２０００）。さらにまた、Ｅｇｆｌ８は、マウス胚の血管および末梢神経のサブセットにおいて発現され、ＥＧＦＬ７の潜在的重複因子となっていることがわかった。他方で、Ｅｇｆｌ８オルソログは、ゼブラフィッシュおよびいくつかの他の魚類ゲノムでは見られなかった。したがって、ゼブラフィッシュは、この遺伝子ファミリーの生物学的機能を規定する特有のツールを提供する。
【０３０７】
遺伝子ノックダウン実験は、ゼブラフィッシュＥＧＦＬ７を標的化する２種類の異なるモルホリノアンチセンスオリゴを用いて行った。オリゴ  ＡＳ−ｚ（−４７）は、５’ＵＴＲとハイブリダイズして翻訳をブロックし、オリゴＡＳ１９５は、エキソン−イントロンジャンクションとハイブリダイズし、イントロン保持、したがって早期翻訳終結をもたらす。２つのアンチセンスオリゴの位置を図１Ｂに示す。無作為化対照は、
ＣＯＮ（−４７）：ＡＣＧＡＣＧＧＴＣＡＣＧＡＴＧＡＡ  ＴＧＧＡＧＡＧＴ（配列番号１０）；および
ＣＯＮ（１９５）：ＣＡＴＴＧＴＴＣＡＴＣＧＴＣＴＴＧＴＴＧＣＧＴＧＴ（配列番号１１）
である。
【０３０８】
適正に注入された胚の同定を補助するため、および発達中の胚内でのオリゴヌクレオチドの均一な分布を確認するため、フルオレセインタグを付加した。５ｍＭオリゴストック水溶液（約４０ｍｇ／ｍｌ）を、０．２５％フェノールレッドを含む１×Ｄａｎｉｅｕ溶液（５８ｍＭ  ＮａＣｌ、０．７ｍＭ  ＫＣｌ、０．４ｍＭ  ＭｇＳＯ４、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６）中で希釈した。およそ４．６ｎｌのボーラスを、各１細胞〜８細胞期胚に、Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  Ｎａｎｏｊｅｃｔマイクロインジェクターを用いて注入した。滴定実験により、無作為化対照オリゴ注入胚では、４ｎｇのアンチセンスオリゴ／胚の注射が特異的脈管欠陥を引き起こし、他の構造では欠陥は観察され得ず、死亡率の有意な増加もないことが示された。
【０３０９】
両方のオリゴにより、同一の表現型の結果が得られる。循環開始後に調べると、［受精の約２４時間後（ｈｐｆ）］、ＥＧＦＬ７ノックダウン胚（ＫＤ）の４０％超が脈管の欠陥の明白な徴候を示し、これらは、全く循環を有しないか、または不完全な循環ループを示すかのいずれかである。多くは心膜水腫および出血を有する（図３ａ）。対照的に、対照オリゴ注入魚は３％のみが、軽微な脈管の欠陥を有する。
【０３１０】
さらにまた、以下のいくつかの血管内皮マーカー：ｆｌｉ１１４、ｆｌｋ１１５およびｔｉｅ１、ｅｐｈｒｉｎＢ２ならびにｇｒｉｄｌｏｃｋ（動脈ＥＣマーカー）、ｆｌｔ４およびＥｐｈＢ４（静脈ＥＣマーカー）の発現パターン、ならびに内在性アルカリホスファターゼ活性を解析した。Ｂｒｏｗｎら  Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．９０：２３７−２５２（２０００）；Ｆｏｕｑｕｅｔら  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１８３：３７−４８（１９９７）；Ｌｉａｏら  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２４：３８１−３８９（１９９７）；Ｌｙｏｎｓら  Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２１２：１３３−１４０（１９９８）；Ｌａｗｓｏｎ＆Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．３：６７４−６８２（２００２）；Ｚｈｏｎｇら  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：１８２０−１８２４（２０００）；Ｃｈｉｌｄｓら  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２９：９７３−９８２（２００２）。ノックダウン実験はまた、ｆｌｋ１−プロモーター−ＧＦＰトランスジェニック系統においても行った。１６  ７体節期から３０ｈｐｆで、上記マーカーの全空間的分布および強度は、ＫＤでは影響を受けず、さらにまた、すべての初期動脈および静脈は、ＫＤ内において正しい位置に形成され（図３、４）、これは、初期のＥＣ分化、増殖および遊走において３０ｈｐｆ（受精後、数時間）では、有意な欠陥はないことを示す。しかしながら、系全体にわたる管形成は、ＫＤにおいて破壊された。３０ｈｐｆでは、Ｚ（−４７）ＫＤの多くの初期脈管は、乱れた組織の内腔を有するか、または内腔を全く有しないかのいずれかであった（図３ｃ〜ｄ、３ｈ）。３０ｈｐｆで検出された部分形成Ｓｅは、不安定なようである。というのは、４８ｈｐｆでの分極した（ｐｏｌａｒｉｚｅｄ）内皮を検出する内在性ＡＰ染色は、すべてのＺ（−４７）注入魚でＳｅを示さないが、対照オリゴ注入魚でのＳｅは影響を受けなかったためである（図４ｄおよび４ｅ）。さらにまた、ＡＰ染色魚の横軸切片では、Ｓｅに似た構造はＺ（−４７）注入魚において見られ得ず（図４ｆ）、これは、３０ｈｐｆで見られる部分Ｓｅが、発達が進行するにつれて、退化したかもしれないことを示す。分子マーカーによって示される管形成欠陥の有病率は、多重実験において７５〜８５％の間である（図３ｄ）。例えば、３０ｈｐｆでのｆｌｉｌ染色により、Ｚ（−４７）ＫＤの７６％（２８／３７）が、重度に奇形の管形成欠陥である脈管構造を有したが、対照胚（ｎ＝３７）ではすべて正常な脈管の管が発達したことが示された。ノックダウン特異性を確認するため、ＡＳ−４７によって引き起こされる脈管の表現型を、５’非翻訳領域のないＥＧＦＬ７コードＲＮＡによってレスキューした。
【０３１１】
ＥＧＦＬ７  ＫＤにおける内腔形成の欠陥は、これらの胚内の主要な脈管内に色素が充填され得ないという所見によって確認した。管形成欠陥が、血流の欠乏による脈管の崩壊の結果であることが考えられるが、以下の観察結果：第１に、心臓収縮機能は、ＥＧＦＬ７  ＫＤにおいて正常であったこと；第２に、初期血管内腔形成および短期間維持が、循環を欠く心臓サイレント変異体において正常であったことにより、ありえそうにない。Ｓｅｈｎｅｒｔら  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３１：１０６−１１０（２００２）；Ｉｓｏｇａｉら  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３０：５２８１−５２９０（２００３）。
【０３１２】
ＥＧＦＬ７  ＫＤ動物はまた、進行性の血管新生欠陥を示した。セグメント間脈管（ＩＳＶ）の初期出芽は、２２〜２４ｈｐｆの変異体において正常に起こった（図３ｂ）。しかしながら、これらの二次血管は、３０ｈｐｆでＩＳＶが部分的に欠損すると、徐々に消失し（図２ｃ−ｄ）、４８〜７２ｈｐｆまでに完全に排除された。循環の欠如は、ＩＳＶは血流の非存在下で退化を受けることが示されていることから、血管新生欠陥に一部寄与するようである。Ｉｓｏｇａｉら  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３０：５２８１−５２９０（２００３）。初期脈管における優性表現型により、血管新生におけるＥＧＦＬ７の正確な役割は、誘導性ノックアウトなどの方法を用いてさらに規定され得る。
【０３１３】
血管発達は隣接組織に依存性であるため、ＥＧＦＬ７  ＫＤに診られる脈管の欠陥が周囲組織の破壊の間接的な結果であるのか否かに関する疑問が残る。Ｂｒｏｗｎら  Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．９０：２３７−２５２（２０００）；Ｓｕｍｏｙら  Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．６３：１５−２７（１９９７）；Ｖｏｋｅｓ＆Ｋｒｉｅｇ  Ｄｅｖ．Ｓｕｐｐｌ．１２９：７７５−７８５（２００２）。ＫＤの断面には、組織の通常の補体が存在するようである（図３）。さらにまた、ｆｋｄ７、ｎｔｌ、ａｘｉａｌ／ｆｋｄ１およびｇａｔａ１を用いたインサイチュハイブリダイゼーションにより、すべての軸方向の構造および造血系統は、ＫＤにおいて正常に発達することが示された。Ｏｄｅｎｔｈａｌ＆Ｎｕｓｓｌｅｉｎ−Ｖｏｌｈａｒｄ  Ｄｅｖ．Ｇｅｎｅｓ  Ｅｖｏｌ．２０８：２４５−２５８（１９９８）；Ｓｃｈｕｌｔｅ−Ｍｅｒｋｅｒら  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１６：１０２１−１０３２（１９９２）；Ｓｔｒａｈｌｅら  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．７：１４３６−１４４６（１９９３）；Ｐａｒｋｅｒら  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５９：３１３−３３６（１９９９）。循環の開始後、ＫＤのｇａｔａ１＋細胞は、最初に発達した胚後部腹両側（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｖｅｎｔｒｏｌａｔｅｒａｌ）領域内に残留し、脈管構造が欠陥性であることが確認された。最後に、ＳＭＣの欠陥性漸増は原因要素ではないようである。それは、脈管の欠陥がＫＤにおいて明白であった時点である２６体節期の野生型胚における脈管周囲でのＳＭ２２Ａ発現の証拠がないためである。総合すると、データは、脈管の管形成の機能不全は、ＥＧＦＬ７ノックダウンによって引き起こされる初期欠陥であることを示す。
【０３１４】
ＥＣ数が、脈管の形態形成を決定するため、さらなる観察結果は、ＥＣ数がＥＧＦＬ７  ＫＤにおいて変化するか否かに焦点を当てた。Ｆｏｎｇら  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２６：３０１５−３０２５（１９９９）。連続断面により、ノックダウンしたＥＧＦＬ７は、すべての軸方向レベルで、発達段階とは無関係にＥＣの総数が変化しないことが示された（図４）。さらにまた、ｅｐｈｒｉｎＢ２およびｆｌｔ４発現、ならびにｆｌｋ１：ＧＦＰ胚における動脈と静脈間のｆｌｋ１プロモーターの差次的調節に基づくと、動脈および静脈のＥＣ数もまた影響されていないことがわかった（図４）。ＥＧＦＬ７とは対照的に、ノックダウンしたｖｅｇｆ（ＥＣの公知のマイトジェン因子）は、ＥＣ数を有意に低下させ、続いて管形成を破壊した。したがって、データは、ＥＧＦＬ７が、ＶＥＧＦとは区別され、かつ脈管の管形成中に主に必要とされる特有の役割を果たすことを示す。
【０３１５】
脈管の表現型を細胞レベルで示すため、経時的解析を、ｆｌｋ１：ＧＦＰ魚を用いて行った。胴体部の連続断面および頭部の長手方向の切片を、２２−、２４−、２６−体節（循環前）、２４ｈｐｆ（循環の開始）および３０ｈｐｆ期の時に採取した。これらの切片の解析により、対照胚における髄から管への移行の間の一連の細胞事象が示される。２２体節期のとき、動脈および静脈の血管芽細胞が、単一の髄に合着した。広範な密着結合により、血管芽細胞間の密接な連結が示された。２４体節期あたりで、血管芽細胞の緩徐な分離が、密着結合の実質的な純化（ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ）によって明白になった。２６体節期までに、血管芽細胞は充分に分離し、動脈および静脈の血管芽細胞が異なるドメインを占め、未発達の管の形態で整列された。続いて、ＥＣは、広範な形態学的変化を受けて鱗片状となり、それにより、脈管の管がその最終形状となった。主要な脈管の管の形成がもたらすこの一連の事象は、ＥＧＦＬ７  ＫＤにおいてかなり障害された。調べたすべての期において、ノックダウン血管芽細胞は、分離せず、広範な密着結合を保持した。これらはまた、後期において形状が変化しなかった（図４ｈ）。
【０３１６】
（Ｂ．ＥＧＦＬ７ノックアウトマウスにおける腫瘍成長の低下および脈管構造の欠陥）
哺乳動物におけるＥＧＦＬ７の機能をさらに解明するため、ｍＥＧＦＬ７ノックアウト（ＫＯ）マウスを作製し、腫瘍インプラントの宿主動物として使用した。ＫＯマウスは、最初は、１２９／ＢＬ６を元に作製し、ＢＬ６に戻し交配した。本実験で使用した動物は、３〜４世代戻し交配したものであった。
【０３１７】
５００，０００個を超えるＢ１６（Ｆ１０）メラノーマ腫瘍細胞を、各動物のわき腹に皮下注射した。地注射部位を、毎日、腫瘍発生について検査した。腫瘍を定期的に測定し、成長速度を調べた。ＥＧＦＬ７−／−ホモ接合  動物の腫瘍成長速度を、ＥＧＦＬ７＋／−ヘテロ接合または野生型同腹仔のものと比較した。
【０３１８】
図６および７に示すように、Ｂ１６メラノーマ腫瘍成長は、ＥＧＦＬ７が完全にノックアウトされた動物において有意に低減された。
【０３１９】
また、ルイス肺癌腫（ＬＬＣ）腫瘍インプラントを用いた同様の腫瘍成長試験でも、ホモ接合ＥＧＦＬ７−／−ＫＯマウスにおいて腫瘍成長の低下が示された。さらにまた、ＥＧＦＬ７−／−ＫＯマウスのサブセットにおけるＬＬＣ腫瘍は脈管形成を行わず、これは、腫瘍の脈管形成におけるＥＧＦＬ７の役割を示す。
【０３２０】
ＥＧＦＬ７−／−ＫＯマウス対野生型マウスにおける網膜の脈管構造形成を比較する試験では、ＥＧＦＬ７機能の欠如が、相対的に正常な網膜の形成にもかかわらず、網膜の脈管の遊走の遅延をもたらすことが示された。さらに、野生型マウスでは、ＥＧＦＬ７発現が網膜の発達前の遊走に局在する。
【０３２１】
（実施例４．ＥＧＦＬ７はＥＣ接着および遊走を支持する）
実施例３に示すようにＥＣ分離が行なわれないことは、ＥＣの移動または接着のいずれかが、ＥＧＦＬ７  ＫＤにおいて適正に調節されていないことを示す。インビトロでの内皮細胞の遊走および接着アッセイを行ない、これらの２つの可能性の区別を行なった。
【０３２２】
プレートを、５μｇ／ｃｍ２タンパク質［ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）、コラーゲン（Ｕｐｓｔａｔｅ）、フィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈにて大腸菌内で産生させた組換えヒトＥＧＦＬ７］でコートした。ＰＢＳリンスの後、ＨＵＶＥＣ（Ｃａｍｂｒｅｘ）を５×１０５／ｃｍ２の密度で、ＥＧＭ２培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）中にプレーティングし、５分間、１４０×ｇで遠心分離し、細胞接着をシンクロナイズ（ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚｅ）させ、次いで、インキュベートした。特異性を解析するため、ＨＵＶＥＣプレーティングの前に、プレートを表示した濃度の抗体とともにプレインキュベートした。
【０３２３】
モノクローナル抗ヒトＥＧＦＬ７抗体を、組換えヒトおよびマウスＥＧＦＬ７ポリペプチドを免疫原として用いて作製した。抗体−抗原結合をＥＬＩＳＡによって評価した。これらの抗体のブロック活性を、ＨＵＶＥＣ接着アッセイなどのアッセイにおいて試験した。最初のアッセイにより、ハイブリドーマ１０Ｇ９、１８Ｆ７、３Ａ５および１Ｂ１２由来の抗ＥＧＦＬ７  Ｍａｂが最も強い阻害活性を有すると確認された。
【０３２４】
接着強度を測定するため、６０分間のインキュベーション後、逆さにしたプレートを４６、１８３または４１１×ｇで遠心分離した。接着細胞の数を蛍光系アッセイ（ＣｙＱＵＡＮＴ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ）を用いて定量し、蛍光プレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて目盛りを読み取った。
【０３２５】
結果は、培養プレートにコートしたＥＧＦＬ７はＨＵＶＥＣ接着を増強することを示した（図５）。興味深いことに、ＥＧＦＬ７によって促進される接着の強度は、フィブロネクチンおよびコラーゲンなどの他の古典的細胞接着分子よりも有意に弱かった（図５ｅ）。さらに、ＥＧＦＬ７に対するＨＵＶＥＣ接着の反応速度論は、他の基質よりもずっと低かった（図５ｇ）。ＥＧＦＬ７発現パターン、細胞下局在、インビボ機能および細胞接着特性を考慮すると、活発な脈管の成長中、ＥＧＦＬ７は、安定な接着よりも移動に都合のよいことを許容する基質を提供し、それにより管形成に必要とされる血管芽細胞の局所移動を可能にすることが示唆された。さらにまた、ブロック性抗ＥＧＦＬ７ありまたはなしでＥＧＦＬ７  Ｍａｂコート基質を用いた遊走アッセイにより、ＥＧＦＬ７基質はＨＵＶＥＣ遊走を支持することが示された。
【０３２６】
選択した抗ＥＧＦＬ７  Ｍａｂの存在下でのインビトロ管形成アッセイにより、一部のブロック性抗体（例えば、ハイブリドーマ１８Ｆ７、３Ａ５、１０Ｇ９および１Ｂ１２由来のもの）は、インビトロ管形成を有意に改変することが示され、脈管の形成時のＥＧＦＬ７の重要な役割をさらに支持する。
【０３２７】
上述の明細書は、当業者が本発明を実施するのを可能な程度に充分であると考える。しかしながら、本明細書に示し、記載したことに加えて本発明の種々の変形が、上述の説明から当業者に自明であり、添付の特許請求の範囲内に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０３２８】
【図１】図１ａおよび１ｂは、ＥＧＦＬ７が、脊椎動物の進化の間で保存されていることを示す。ａ：ヒト、マウス、ツメガエル属およびゼブラフィッシュのＥＧＦＬ７間でのアミノ酸アラインメント。ＥＧＦＬ７遺伝子は、約３０ｋＤの推定分泌タンパク質をコードする。ヒト（ｈｕｍａｎ：ホモサピエンス）アミノ酸配列は、マウス（ｍｏｕｓｅ：ハツカネズミ）、カエル（ｘｅｎｏｐｕｓ：アフリカツメガエル）およびゼブラフィッシュ（ｚｅｂｒａｆｉｓｈ：Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）のものと、それぞれ、７７．４５％、４７．１４％および４２．９６％相同性を共有する。いくつかのアルゴリズムを用いた構造解析により、ＥＧＦＬ７タンパク質が、以下のドメイン（囲み内、Ｎ’末端から始めて）：シグナル配列、ＥＭＩドメインａ、２つのＥＧＦ様ドメインを中央部分に、続いて、ロイシンおよびバリン高含有Ｃ末端領域を含有することが予測される。ｂ：ゼブラフィッシュＥＧＦＬ７  ｃＤＮＡ、アミノ酸およびイントロン配列。矢印の線は、イントロン保持を検出するために使用した２つのアンチセンスオリゴ、ＡＳ−４７（配列番号６）およびＡＳ１９５（配列番号７）およびＰＣＲプライマー（配列番号８および９）を示す。
【図２】図２ａ〜２ｎは、ＥＧＦＬ７発現プロフィールを示す。マウス（ａ〜ｂ）およびゼブラフィッシュ（ｊ〜ｎ）胚におけるＥＧＦＬ７全固定（ｗｈｏｌｅ  ｍｏｕｎｔ）インサイチュハイブリダイゼーション、ｂ：ヌクレアーファーストレッドで染色したａの断面。ＲＢＣ＝赤血球。ｊ〜ｍ：薄い矢印＝側板中胚葉、濃い矢印＝背側大動脈、濃い矢印先端＝ＩＳＶ。差し込み図：主要部の拡大。ｎ：ｃｌｏｃｈｅ  変異体。ｓｏ＝体節。ｃ：ＥＧＦＬ７およびＰＥＣＡＭについて染色した妊娠マウス子宮。角かっこ＝脱落膜。ｄ〜ｉ：ヒト肺切片における、放射性インサイチュハイブリダイゼーション（ｇ〜ｉ）およびＨ＆Ｅ（ｄ〜ｆ）。スケールバー：０．４５ｍｍ（ａ、ｍ、ｎ）、０．０７ｍｍ（ｂ）、０．３８ｍｍ（ｃ〜ｉ）、０．２５ｍｍ（ｊ、ｌ）、０．１５ｍｍ（ｋ）、０．２６ｍｍ（ｍ  差し込み図）および０．０４ｍｍ（ｃ  差し込み図）。
【図３】図３ａ〜３ｄは、ＥＧＦＬ７遺伝子ノックダウンが、ゼブラフィッシュ胚において脈管の管形成欠陥を引き起こすことを示す。対照（Ｃｏｎ−４７もしくはＣｏｎ１９５）またはＥＧＦＬ７アンチセンス（ＡＳ−４７またはＡＳ１９５）オリゴを注射したゼブラフィッシュ胚。ａ：４８ｈｐｆにおける外部形態（ｇｒｏｓｓ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）。矢印は、心膜水腫（ｐｅｒｉｃａｒｄｉａｌ  ｅｄｅｍａ）を示す。矢印先端は、出血を示す。ｂ−ｄ：２３ｈｐｆ（ｂ）および３０ｈｐｆ（ｃ−ｄ）におけるｆｌｉ１発現。ｄ：中央のｃで囲んだ中央脈管構造の拡大図。白矢印先端：背側大動脈の内腔、黒矢印先端：後主静脈の内腔、黒矢印：セグメント間脈管。スケールバー：０．６ｍｍ（ａ）、０．２３ｍｍ（ｄ）および０．５ｍｍ（ｂ、ｃ）。
【図４】図４ａ〜４ｈは、ＥＣ数が、ＥＧＦＬ７  ＫＤにおいて変わらないことを示す。ｆｌｋ１：  対照オリゴ（ａ、ｃ、ｅ、ｇ）またはアンチセンスオリゴ（ｂ、ｄ、ｆ、ｈ）を注射したＧＦＰトランスジェニックフィッシュを、２２−体節（ａ−ｄ）または３０ｈｐｆ（ｅ−ｈ）において解析した。ａ、ｂ：背側の図、ｅ、ｆ：側面図、ｃ、ｄ、ｇ、ｈ：ａ−ｂ、ｅ−ｆの白線で示す水平面の断面をファロイジンおよびＤＡＰＩで対比染色した。ＰＤ：原腎管、Ｓｏ：体節、Ｎ：脊索、白矢印：動脈のＥＣ、白矢印先端＝静脈のＥＣ、ＤＡ＝背側大動脈、ＰＣＶ＝後主静脈。スケールバー：０．３３ｍｍ（ａ、ｂ）、０．０３ｍｍ（ｃ、ｄ、ｇ、ｈ）、０．４７ｍｍ（ｅ、ｆ）。
【図５】図５ａ〜５ｇは、ＥＧＦＬ７がＥＣ接着を促進することを示す。ヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のビンクリン染色は、フィブロネクチン（ｂ）、Ｉ型コラーゲン（ｃ）、およびＥＧＦＬ７（ｄ）の病巣の接着形成を示すが、ＢＳＡ（ａ）にはないことを示す。ＥＧＦＬ７における接着強度は、４６ｇでスピンさせた後ＥＧＦＬ７基質に接着したまま残っている細胞はほとんどないため、コラーゲンまたはフィブロネクチンよりも弱い（ｅ）。抗ＥＧＦＬ７抗体によりＥＧＦＬ７に対するＨＵＶＥＣ接着が用量依存的に遮断されるが、フィブロネクチンにはないことにより基質特異性が確認される。対照抗体（抗Ｂ７ｘ）は、いずれの基質に対しても効果を有しない（ｆ）。ｇ：種々の基質におけるＨＵＶＥＣ接着の速度論。スケールバー：０．０３ｍｍ（ａ〜ｄ）。
【図６】図６は、ＥＧＦＬ７−／−ホモ接合（ｎ＝１１）とＥＧＦＬ７＋／−ヘテロ接合（ｎ＝１１）ノックアウトマウスにおけるＢ１６メラノーマ腫瘍成長速度の比較を示す。
【図７Ａ】図７ａ〜７ｂは、ＥＧＦＬ７−／−ホモ接合ノックアウトマウス（ｎ＝１０）対その野生型同腹仔（ｎ＝１３）におけるＢ１６メラノーマ腫瘍発生と成長速度の比較を示す。７ｂにおいて、腫瘍無含有マウスは除外した。
【図７Ｂ】図７ａ〜７ｂは、ＥＧＦＬ７−／−ホモ接合ノックアウトマウス（ｎ＝１０）対その野生型同腹仔（ｎ＝１３）におけるＢ１６メラノーマ腫瘍発生と成長速度の比較を示す。７ｂにおいて、腫瘍無含有マウスは除外した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【配列表】
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