(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面プラズモン励起光がセンサに照射されることで、表面プラズモン共鳴を前記センサの表面に発生させることが可能であり、前記励起光の波長または入射角度によって前記センサの表面の外側に存在する物質の量を測定可能であり、プロセスライン内に設けられた表面プラズモン測定器と、
前記プロセスラインにおける前記表面プラズモン測定器より前のプロセスを通過した流体を前記表面プラズモン測定器のセンサ表面上に連続的に導入する流体導入手段と、
を備え、
前記センサの表面には、前記流体内の特定の物質と特異的に結合可能な物質であるプローブが固定され、
前記プロセスを通過した流体内の特定の物質を前記プローブと結合させることで、前記特定の物質の量をインラインで測定可能とし、
前記センサの表面におけるプローブと前記特定の物質との結合を解離させる解離動作を行う解離手段をさらに備え、
前記表面プラズモン測定器による前記プローブと結合した前記特定の物質の量の測定と、前記解離手段による前記プローブと結合した前記特定の物質の解離と、を交互に行うことにより、該プローブと結合した特定の物質の量について複数回の測定を連続的に行い、
前記解離動作は、前記センサの表面におけるプローブと前記特定の物質との結合を解離させる解離剤の前記流体内へのインジェクトであり、
前記流体導入手段は、前記表面プラズモン測定器より前のプロセスを通過した流体を流通させる流路であり、
前記表面プラズモン測定器の前記センサの表面は、前記流路内に前記流体に臨むように配置され、
前記解離剤の前記流体内へのインジェクト用の注入口は、前記流路内において前記センサの表面と略同一の面内であって、前記流路における前記センサの表面の上流側に設けられていることを特徴とする表面プラズモン共鳴センシングシステム。
【請求項２】
前記センサの表面において、前記特定の物質と結合するプローブを固定した第１の測定領域と、前記特定の物質と結合するプローブを固定しない第２の測定領域とが設けられ、前記第１の測定領域において測定された測定値から、前記第２の測定領域で測定された測定値を差し引くことで、前記特定の物質の量を測定することを特徴とする請求項１に記載
の表面プラズモン共鳴センシングシステム。
【請求項３】
前記表面プラズモン測定器の前記センサは、
前記センサの表面の少なくとも一部を覆うように形成された金属層と、前記センサの表面の前記金属層が形成されている部分に形成された複数の溝からなる溝構造と、を有するとともに、該溝構造における各溝の側壁面は、該側壁面を覆う前記金属層による対向面を形成し、該金属層による対向面で挟まれる領域において局在型の表面プラズモン共鳴を発生させる局在型表面プラズモン共鳴センサであることを特徴とする、請求項１または２に記載の表面プラズモン共鳴センシングシステム。
【請求項４】
前記表面プラズモン測定器の前記センサは、
前記センサの表面の少なくとも一部を覆うように形成された金属層と、前記センサの表面の前記金属層が形成されている部分に形成された複数の溝からなる溝構造と、を有するとともに、該溝構造における各溝の側壁面は、該側壁面を覆う前記金属層による対向面を形成し、該金属層による対向面で挟まれる領域において局在型の表面プラズモン共鳴を発生させる局在型表面プラズモン共鳴センサであり、
前記注入口は、前記流路において、前記センサの表面における前記溝構造に対して上流側２ｍｍ以内の場所に設けられたことを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の表面プラズモン共鳴センシングシステム。
【請求項５】
前記注入口は円形断面を有するとともに、その直径は、前記センサの表面において前記プローブが固定された領域の前記流路幅方向の長さ以上であり、前記流路幅以下であることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の表面プラズモン共鳴センシングシステム。
【請求項６】
前記解離手段による前記解離動作は、前記表面プラズモン測定器からの前記特定の物質の量に応じた信号に基づき、該信号の大きさが予め定められた閾値を越えてから一定時間後に行われることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の表面プラズモン共鳴センシングシステム。
【請求項７】
前記流路における前記センサの下流側に設けられ、前記流体を回収するか廃液として廃棄するかを制御するバルブを有し、
前記表面プラズモン測定器からの前記特定の物質の量に応じた信号に基づき、該信号が予め定められた閾値を越えてから、前記解離手段による前記解離動作が行われるまでの間は、前記バルブを作動させて前記流体を回収することを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の表面プラズモン共鳴センシングシステム。
【請求項８】
前記流路を流通する前記流体の流量を検出する流量センサをさらに有し、前記表面プラズモン測定器からの前記特定の物質の量に応じた信号と、前記流量センサにより検出された前記流体の流量とに基づいて、前記流体を回収する時期を制御することを特徴とする請求項７に記載の表面プラズモン共鳴センシングシステム。
【請求項９】
前記流体導入手段は、前記プロセスライン上における所定のプロセスを通過した流体を前記プロセスラインから分岐して流通させる流路であり、
前記流路の分岐点と前記表面プラズモン測定器との間に流量制御用の開閉バルブを有することを特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載の表面プラズモン共鳴センシングシステム。
【請求項１０】
前記開閉バルブが一定間隔で開閉制御されることで、前記表面プラズモン測定器が、前記流体内の前記特定の物質の量を一定間隔でモニタリングすることを特徴とする請求項９
に記載の表面プラズモン共鳴センシングシステム。
【請求項１１】
前記プロセスラインにおける前記表面プラズモン測定器より前のプロセスは精製クロマトグラフィであり、
該精製クロマトグラフィを通過した前記流体の精製抽出状態を前記表面プラズモン測定器によってリアルタイムにモニタリングすることを特徴とする請求項１から１０のいずれか一項に記載の表面プラズモン共鳴センシングシステム。
【請求項１２】
前記プロセスラインにおける前記表面プラズモン測定器より前のプロセスは細胞培養槽であり、前記流体内における、該細胞培養槽において生成した物質を前記表面プラズモン測定器によってリアルタイムにモニタリングすることを特徴とする請求項１から１０のいずれか一項に記載の表面プラズモン共鳴センシングシステム。
【請求項１３】
表面プラズモン励起光がセンサに照射されることで、表面プラズモン共鳴を前記センサの表面に発生させることが可能であり、前記励起光の波長または入射角度によって前記センサの表面の外側に存在する物質の量を測定可能な表面プラズモン測定器による、表面プラズモン共鳴インライン測定方法であって、
前記プロセスラインにおける前記表面プラズモン測定器より前のプロセスを通過した流体を前記表面プラズモン測定器のセンサ表面上に導入する流体導入工程と、
前記プロセスを通過した流体内の特定の物質を、前記センサの表面に固定された前記特定の物質と特異的に結合可能な物質であるプローブと結合させることで、前記特定の物質の量をインラインで測定する測定工程と、
を有し、
前記センサの表面におけるプローブと前記特定の物質との結合を解離させる解離動作を行う解離工程をさらに有し、
前記解離動作は、前記センサの表面におけるプローブと前記特定の物質との結合を解離させる解離剤の前記流体内へのインジェクトであり、
前記解離剤の前記流体内へのインジェクトは、前記流路内において前記センサの表面と略同一の面内であって、前記流路における前記センサの表面の上流側に設けられた注入口から行われることを特徴とする表面プラズモン共鳴インライン測定方法。
【請求項１４】
前記センサの表面において、前記特定の物質と結合するプローブを固定した場合の測定値から、前記特定の物質と結合するプローブを固定しない場合の測定値を差し引くことで、前記特定の物質の量を測定することを特徴とする請求項１３に記載の表面プラズモン共鳴インライン測定方法。
【請求項１５】
前記表面プラズモン測定器の前記センサは、
前記センサの表面の少なくとも一部を覆うように形成された金属層と、前記センサの表面の前記金属層が形成されている部分に形成された複数の溝からなる溝構造と、を有するとともに、該溝構造における各溝の側壁面は、該側壁面を覆う前記金属層による対向面を形成し、該金属層による対向面で挟まれる領域において局在型の表面プラズモン共鳴を発生させる局在型表面プラズモン共鳴センサであることを特徴とする、請求項１３または１４に記載の表面プラズモン共鳴インライン測定方法。
【請求項１６】
前記解離工程における前記解離動作は、前記表面プラズモン測定器により測定された前記特定の物質の量に基づき、該特定物質の量が予め定められた閾値を越えてから一定時間後に行われることを特徴とする請求項１３から１５のいずれか一項に記載の表面プラズモン共鳴インライン測定方法。
【請求項１７】
前記表面プラズモン測定器により測定された前記特定の物質の量に基づき、該特定の物
質の量が予め定められた閾値を越えてから、前記解離工程による前記解離動作が行われるまでの間は、前記流体を回収することを特徴とする請求項１３から１６のいずれか一項に記載の表面プラズモン共鳴インライン測定方法。
【請求項１８】
前記表面プラズモン測定器により測定された前記特定の物質の量と、前記流体の流量とに基づいて、前記流体を回収する時期を決定することを特徴とする請求項１７に記載の表面プラズモン共鳴インライン測定方法。
【請求項１９】
前記流体導入工程においては、前記プロセスライン上における所定のプロセスを通過した流体を前記プロセスラインから分岐して前記表面プラズモン測定器のセンサ表面上に導入し、
前記表面プラズモン測定器が、前記流体内の前記特定の物質の量を一定間隔でモニタリングすることを特徴とする請求項１３から１８のいずれか一項に記載の表面プラズモン共鳴インライン測定方法。
【請求項２０】
前記プロセスラインにおける前記表面プラズモン測定器より前のプロセスは精製クロマトグラフィであり、
該精製クロマトグラフィを通過した前記流体の精製抽出状態を前記表面プラズモン測定器によってリアルタイムにモニタリングすることを特徴とする請求項１３から１９のいずれか一項に記載の表面プラズモン共鳴インライン測定方法。
【請求項２１】
前記プロセスラインにおける前記表面プラズモン測定器より前のプロセスは細胞培養プロセスであり、前記流体内における、該細胞培養プロセスにおいて生成した物質を前記表面プラズモン測定器によってリアルタイムにモニタリングすることを特徴とする請求項１３から１９のいずれか一項に記載の表面プラズモン共鳴インライン測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、本発明は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用した測定器（以下、「ＳＰＲ測定器」ともいう）による、プロセスラインにおける特定の物質のセンシングシステム及び、インライン測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人体における疾病と人体を構成するタンパク質の変異との間には、高い相関が認められる場合がある。例えば、癌、インフルエンザその他の病気では、病気の進行に伴って体内（血液中など）において特定のタンパク質が増加することが知られている。
【０００３】
従って、特定のタンパク質の状態（特定のタンパク質の有無、量など）を検査することによって疾病の罹患や進行具合についての知見を得ることができる。例えば、腫瘍（癌）の進行に伴って増加する生体分子は腫瘍マーカーと呼ばれ、腫瘍の発生部位に応じてそれぞれ異なる腫瘍マーカーが特定されている。
【０００４】
上記のような腫瘍マーカーを含め、特定のタンパク質の有無や量を簡便かつ高精度に測定する方法として、表面プラズモン共鳴が利用されている。表面プラズモン共鳴（SPR: Surface Plasmon Resonance）とは、金属表面の自由電子と電磁波（光）との相互作用によって生じる共鳴現象である。
【０００５】
図２３には、表面プラズモン共鳴を利用して特定の物質（例えばタンパク質の他、糖、脂質、環境ホルモンや生理活性物質等の低分子化合物、病原菌等の微生物などを含む）を検出するバイオセンサの概念図を示す。
【０００６】
ここで、ここに図２３（ａ）における左下方向から入射光が金属層１００に入射し右下方向に反射される場合について考える。図２３（ａ）の金属層１００には金属自由電子１０１が存在する。そうすると、入射光の波長及び入射角に依存する電界が金属自由電子１０１に作用し、金属自由電子１０１は振動する。そして、特定の波長及び入射角において金属自由電子１０１の運動と入射光の電界とが共鳴し、入射光のエネルギーが金属自由電子１０１の振動運動に遷移し、結果として、図２３（ｂ）に実線で示すようにこの波長における反射光強度が減少する。
【０００７】
上記した金属自由電子１０１の運動と光との共鳴現象において、金属層１００の外側には数百ｎｍ程度の範囲で電界１０２が発生する。表面プラズモン共鳴を利用したバイオセンサにおいては、この電界１０２と、検出ターゲットである特定の物質（以下、ターゲットともいう）１０３との相互作用により、表面プラズモン共鳴の共鳴周波数が変化することを利用している。
【０００８】
検出のターゲット１０３を特異的に検出するためには、まず、特異的にターゲットと結合するプローブ１０４を測定領域に固定化する。その後に所定の速度でターゲットを含む試料の送液を行なってターゲット１０３を流す。そうすると、金属層１００の表面に固定されたプローブ１０４にターゲット１０３が特異的に結合し、金属層１００の近傍の屈折率が変化する。そして、金属層１００の近傍の屈折率がターゲット１０３の結合により変化することに起因して、図２３（ｂ）に破線で示すように、表面プラズモン共鳴の共鳴周波数または共鳴入射角が変化する。すなわち、図２３（ｂ）に示すような反射率が低下する波長（若しくは、入射光の入射角でも同じ）の移動を検知することで、ターゲット１０
３の検出を行うことが可能となる。
【０００９】
このような、表面プラズモン共鳴を利用したセンサには、伝搬型表面プラズモン共鳴センサと局在型表面プラズモン共鳴センサとがある。伝搬型表面プラズモン共鳴センサの原理を図２４により簡単に説明する。伝搬型表面プラズモン共鳴センサ１１０は、図２４（ａ）に示すように、ガラスプリズム１１１の表面に厚み５０ｎｍ程度のＡｕ、Ａｇ等の金属膜１１２を形成したものである。この伝搬型表面プラズモン共鳴センサ１１０は、ガラスプリズム１１１側から光を照射し、ガラスプリズム１１１と金属膜１１２との界面において光を全反射させる。全反射した光を受光し、光の反射率を測定することによってターゲットである生体分子等がセンシングされる。
【００１０】
すなわち、この光の入射角θを変化させながら、反射率の測定を行うと、図２３（ｂ）に示したように、ある入射角（共鳴入射角）で反射率が大きく減衰する。ガラスプリズム１１１と金属膜１１２の界面に入射した光が当該界面で全反射するとき、図２４（ｂ）及び図２４（ｃ）に示すように、当該界面で発生するエバネッセント光（近接場光）と金属膜１１２の表面プラズモン波が相互作用する。ある特定の波長や特定の入射角においては、入射光の波数と自由電子の振動とが共鳴することで、入射光のエネルギーが金属膜１１２中に吸収され、金属膜１１２中の自由電子の振動エネルギーに変化する。これにより、光の反射率が著しく低下するのである。
【００１１】
つぎに、図２５を用いて、ナノギャップ構造を用いた局在型表面プラズモン共鳴センサについて説明する。局在型表面プラズモン共鳴センサは、光（電磁波）の交流電界によって図２５（ａ）に示すような複数の溝状の金属ナノ溝構造１２０中の自由電子が振動し、ある振動数で入射光と自由電子が共鳴して自由電子が光エネルギーを吸収し、共鳴波長で吸光度がピークとなるものである。そして、表面プラズモン共鳴によって発生する自由電子振動は、図２５（ｂ）に示すような複数の溝状の金属ナノ溝構造１２０の局所領域に集中的に定在する。従って、そのセンシング領域は数十ｎｍというように、伝搬型表面プラズモン共鳴センサに比べて非常に小さくなる。
【００１２】
局在型表面プラズモン共鳴センサにおいても、金属ナノ溝構造１２０の周囲の誘電率（屈折率）の影響を受けるので、金属ナノ溝構造１２０に予め分散させたプローブ１２１にターゲット１２２である何らかの誘電体物質（例えば、抗原）が付着すると、吸光度が変化する。例えば、金属ナノ溝構造１２０にターゲット１２２である誘電体物質が付着する前後における吸光度のピーク値における波長を読み取ることにより誘電体物質の付着の有無や付着量を検知できる。
【００１３】
ＳＰＲ測定器は、上記の原理を応用して例えば抗原抗体反応の測定などに利用される。その測定方法の例を示すと、被検体がバッファ液に溶質として存在する抗原で、センサの検出表面に抗体が固定化されている場合、まず抗原を含まないバッファ液をセンサセル（バッファ液や被検液などの流体を検出表面に接触させて流すための部屋）に流し、そのときの表面プラズモン共鳴の共鳴角を測定する。次に、被検体の抗原を含むバッファ液をセンサセルに流し抗原抗体反応を起こさせた後、抗原を含まないバッファ液でセンサセルを洗浄して再度表面プラズモン共鳴の共鳴角を測定する。こうして得られた抗原抗体反応の前後での表面プラズモン共鳴角の差が、抗体と反応した抗原の数に相当するので、これを溶質として存在した抗原の濃度に換算する。
【００１４】
ところで、クロマトグラフィは、低〜高分子の物質の電気的性質あるいは分子サイズの違いを利用して所望の物質を精製する手法であり、現在では主に生理活性物質の精製等に広く用いられている。その際、生体物質の追跡には２６０ｎｍあるいは２８０ｎｍの紫外光（以下、ＵＶという）吸光度計が最も広く用いられており、特定の物質を含む種々の物
質溶出位置はＵＶ吸収のチャ一トで判別することができる。
【００１５】
図２６には、クロマトグラフィと上記のＵＶ吸光度計とを組み合わせたセンシングシステムについて示す。図２６（ａ）はセンシングシステムの全体図、図２６（ｂ）はＵＶ吸光度計における測定原理を示す図、図２６（ｃ）は、ＵＶ吸光度計による計測結果の一例を示す図である。
【００１６】
図２６（ａ）に示すように、このシステムにおいては、計測の標的物（以下、ターゲットとも言う。）とノイズ成分である夾雑物とが混在した試料をクロマトグラフィ用のカラム１３１に導入する。すると、ターゲットと夾雑物とはカラム内で分子量の相違やカラムとのアフィニティの相違に基づいて分離される。そして、ＵＶ吸光度計１３２にターゲットと夾雑物が時間差を伴って導入される。ＵＶ吸光度計１３２では、図２６（ｂ）に示すように試料にＵＶが照射され、試料に含まれるタンパク質の量に応じた割合の光が吸収される。そして、図２６（ｃ）に示すように、横軸を試料の通過時間、縦軸を吸光度とした場合に、ターゲットや夾雑物が通過する際にその量に応じたピークが観察される。このピークの有無によりターゲットの含有量を測定する。なお、図２６に示す例では、ＵＶ吸光度計から排出された試料は電導度計１３３に導入され念のため電導度が計測される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】特開２００８−２１６０５５号公報
【特許文献２】特開平１１−１８３３７２号公報
【特許文献３】特表２００３−５０４６３８号公報
【特許文献４】特表平９−５０３０６４号公報
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】岡本 隆之、”金属ナノ粒子相互作用およびバイオセンサに関する調査研究”（図２）、プラズモニック研究会、平成１４年度科学研究費補助金（基礎研究Ｃ）、研究成果報告書、http://www.plasmon.jp/index.html
【非特許文献２】N. Felidj et al. "Controlling the optical response of regular arrays of gold particles for surface-enhanced Raman scattering", Phys. Rev. B 65, 075419(2002)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
上記のシステムにおいては、カラム１３１によってターゲットと夾雑物とは分離されるが、ＵＶ吸光度計１３２、電導度計１３３からの情報だけでは検出感度が低いため、また、ターゲットだけを特異的に検出することが困難で図２６（ｃ）に示すような結果しか得られない。そのため、どのタイミングにおけるデータがターゲットに相当するのか判別が困難となる場合があった。従って、時間毎に試料を分画して、分画毎に内容分析をする必要があった。
【００２０】
また、タンパク質の量に応じてＵＶ吸光度は変化するが、タンパク質の種類に対する特異性が無い。さらに、一般的には感度が１０μｇ／ｍｌ程度と低いため、極微量しか含まれないターゲットの検出が困難な場合があった。
【００２１】
本発明は、このような技術的課題に鑑みてなされたものであって、その目的とするところは、プロセスライン上に組み込んで、前のプロセスを通過した流体内の特定の物質を特異的、高感度にインラインで測定可能な表面プラズモン測定技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明は、表面プラズモン測定器のセンサ表面に特定の物質と特異的に結合可能なプローブを固定しておき、この表面プラズモン測定器をプロセスライン内に設けることで、前のプロセスを通過した流体を表面プラズモン測定器のセンサ表面上に連続的に導入し、前記プロセスを通過した流体内の特定の物質をプローブと結合させることで、特定の物質の量をインラインで特異的に高精度に測定可能としたことを最大の特徴とする。
【００２３】
より詳しくは、表面プラズモン励起光がセンサに照射されることで、表面プラズモン共鳴を前記センサの表面に発生させることが可能であり、前記励起光の波長または入射角度によって前記センサの表面の外側に存在する物質の量を測定可能であり、プロセスライン内に設けられた表面プラズモン測定器と、
前記プロセスラインにおける前記表面プラズモン測定器より前のプロセスを通過した流体を前記表面プラズモン測定器のセンサ表面上に連続的に導入する流体導入手段と、
を備え、
前記センサの表面には、前記流体内の特定の物質と特異的に結合可能な物質であるプローブが固定され、
前記プロセスを通過した流体内の特定の物質を前記プローブと結合させることで、前記特定の物質の量をインラインで測定可能としたことを特徴とする。
【００２４】
これによれば、プローブと特異的に結合する物質だけについて、プロセスライン内で濃度測定を行うことができる。その結果、夾雑物の濃度を一緒に測定してしまうこともなく、より精度よく、特定の物質の濃度を測定することが可能である。また、プロセスライン内で測定を行うため、より容易またはより迅速な測定が可能となる。
【００２５】
また、本発明においては、前記センサの表面におけるプローブと前記特定の物質との結合を解離させる解離動作を行う解離手段をさらに備え、
前記表面プラズモン測定器による前記プローブと結合した前記特定の物質の量の測定と、前記解離手段による前記プローブと結合した前記特定の物質の解離と、を交互に行うことにより、該プローブと結合した特定の物質の量について複数回の測定を連続的に行うようにしてもよい。
【００２６】
一般に、表面プラズモン測定器においては、センサ表面に固定されたプローブの全部とターゲットとが結合してしまうと、屈折率の変化が飽和してしまい、それ以上の測定が不可能となる。これに対し、本発明では、解離動作を行うことで、表面プラズモン測定器のセンサにおいてプローブとターゲット（特定の物質）とを解離させることとした。これにより、プロセスライン中で、特定の物質の濃度測定を、高精度に、且つ、連続的、特異的に行うことが可能となる。また、本発明においては、一回の測定が終了すると、解離動作を少なくとも２回行うこととしてもよい。そうすれば、より確実に、プローブとターゲットとを解離することができ、センサの表面を再生することが可能となる。なお、その場合においては、複数の測定のうちの各測定が終了する毎に全ての解離動作を２回以上行ってもよいし、一部の測定が終了した際にのみ、２回以上解離動作を行うようにしてもよい。
【００２７】
また、本発明においては、前記解離動作は、前記センサの表面におけるプローブと前記特定の物質との結合を解離させる解離剤の前記流体内へのインジェクトであることとしてもよい。
【００２８】
これによれば、前のプロセスを通過した流体の流れを利用して、解離剤がセンサの表面に導入されプローブに到達するので、解離剤を流体内にインジェクトするだけで、より簡単に解離動作を完了させることが可能である。
【００２９】
また、本発明においては、前記流体導入手段は、前記表面プラズモン測定器より前のプロセスを通過した流体を流通させる流路であり、
前記表面プラズモン測定器の前記センサの表面は、前記流路内に前記流体に臨むように配置され、
前記解離剤の前記流体内へのインジェクト用の注入口は、前記流路内において前記センサの表面と略同一の面内であって、前記流路における前記センサの表面の上流側に設けられているようにしてもよい。
【００３０】
これによれば、注入口からインジェクトされた解離剤を、流体内に拡散する前の層流状態で、直接センサ表面に到達させることができる。よって、より高濃度のまま効率よくプローブとターゲットとの解離を行うことができる。また、これによれば、解離剤の使用量をより少量にすることができるので、プロセスライン内の流体の成分についての影響をより小さくすることができる。
【００３１】
また、本発明においては、前記センサの表面において、前記特定の物質と結合するプローブを固定した第１の測定領域と、前記特定の物質と結合するプローブを固定しない第２の測定領域とが設けられ、前記第１の測定領域において測定された測定値から、前記第２の測定領域で測定された測定値を差し引くことで、前記特定の物質の量を測定するようにしてもよい。
【００３２】
すなわち本発明においては、表面プラズモン測定器のセンサ表面に複数の測定領域を有する。その中の第１の測定領域においては、測定対象である特定の物質と結合するプローブを固定する。また、他の第２の測定領域においては、前記したプローブは固定しない。ここで、測定対象である特定の物質以外の夾雑物が流体内に混入していた場合について考える。この場合は、第１の測定領域で測定されたデータは、特定の物質と夾雑物の量を測定しており、第２の測定領域で測定されたデータは、夾雑物の量を測定していると考えられる。従って、第１の測定領域で測定された測定値から第２の測定領域で測定された測定値を差し引くことで、夾雑物の影響が排除された、特定の物質のみによる測定値を得る事が可能となる。
【００３３】
従って、本発明によれば、前のプロセスを通過した流体内において、測定の対象である特定の物質以外の夾雑物が存在したとしても、より正確に、特定の物質の量の測定を行うことが可能となる。なお、この場合、第２の測定領域には、第１の測定領域に固定されたプローブと光学的性質が類似している物質を固定してもよい。そうすれば、第１の測定領域と第２の測定領域における、特定の物質以外の条件をより近似させることができるので、より精度よく、特定の物質の量を測定することが可能となる。
【００３４】
また、本発明においては、前記表面プラズモン測定器の前記センサは、
前記センサの表面の少なくとも一部を覆うように形成された金属層と、前記センサの表面の前記金属層が形成されている部分に形成された複数の溝からなる溝構造と、を有するとともに、該溝構造における各溝の側壁面は、該側壁面を覆う前記金属層による対向面を形成し、該金属層による対向面で挟まれる領域において局在型の表面プラズモン共鳴を発生させる局在型表面プラズモン共鳴センサであるようにしてもよい。
【００３５】
表面プラズモン測定器のセンサとして、局在型表面プラズモン共鳴センサを選択した場合には、伝搬型表面プラズモン共鳴センサを選択した場合と比較し、センサ表面から外部に発生する電界の及ぶ領域が限定されるという特徴がある。従って、本発明のように表面プラズモン測定器のセンサとして、局在型表面プラズモン共鳴センサを選択した場合には、発生電界の領域をプローブ及びターゲットの存在する領域に限定することができ、夾雑物の影響を低減することができる。その結果、リファレンス部で得られた測定値で、セン
シング部で得られた測定値を補正するなどの対策をとらずとも、より簡単な構成及び方法で、夾雑物の影響を低減することが可能となる。
【００３６】
表面プラズモン測定器のセンサとして、伝搬型表面プラズモン共鳴センサを選択した場合には、センサにおける金属膜と反対側の面には、プリズムが貼り合わされる場合が多い。そうすると、解離剤の注入口をセンサ自体に形成することが困難となる。それに対して本発明のように、表面プラズモン測定器のセンサとして、ナノ溝構造を有する局在型表面プラズモン共鳴センサを選択すれば、センサ自体にプリズムを貼り合わす必要がなくなる。そうすると、センサ自体に解離剤の注入口を加工し易く、より簡単に、高効率に解離動作を行うことができるセンサを実現することができる。また、センサにおいて実際に表面プラズモン共鳴が発生するナノ溝構造に対して、より近い場所に注入口を形成することができ、さらに効率的に、解離動作を行うことが可能になる。
【００３７】
また、本発明においては、センサとして局在型表面プラズモン共鳴センサを選択した上で、前記注入口は、前記流路において、前記センサの表面における前記溝構造に対して上流側２ｍｍ以内の場所に設けられるようにしてもよい。そうすれば、より確実に、高濃度の層流状態の解離剤をセンサ表面に到達させることが可能である。その結果、より効率よく解離動作を行うことが可能となる。また、前記注入口は円形断面を有するとともに、その直径は、前記センサの表面において前記プローブが固定された領域の前記流路の幅方向の長さ以上であり、前記流路幅以下であるようにしてもよい。そうすれば、より確実に、高濃度の層流状態の解離剤をセンサ表面の全域に到達させることができる。
【００３８】
また、本発明においては、前記解離手段による前記解離動作は、前記表面プラズモン測定器からの前記特定の物質の量に応じた信号に基づき、該信号の大きさが予め定められた閾値を越えてから一定時間後に行われるようにしてもよい。
【００３９】
すなわち、表面プラズモン測定器からの信号が小さい場合には、前のプロセスからの流体内にターゲットが殆ど無い状態であると言える。このような状態では解離動作を行う必要もない。一方、表面プラズモン測定装置からの信号が所定の閾値を越えた場合には、ターゲットが流れ始めていることを示しており、近い将来にセンサ表面に固定されたプローブがターゲットで飽和するおそれがある。
【００４０】
これに対し、本発明においては、表面プラズモン測定器からの信号が所定の閾値を越えた場合には、それ以降一定時間が経過した後には解離動作を行うこととした。これによれば、解離動作が必要ない状況においては解離動作を行わず、本当に必要になった時点で解離動作を行うことができる。従って、解離剤の無駄を抑制することができるとともに、不要にプロセスライン中の流体に解離剤が混入することを抑制できる。なお、本発明において予め定められた閾値とは、表面プラズモン測定器の信号がこれを越えた場合には、ターゲットが流れはじめており、解離動作が必要になると考えられる閾値であって、予め実験などの結果に基づいて定められる。また、一定時間とは、表面プラズモン測定器の信号が前記閾値を越えた場合に、この時間だけ経過した際に解離動作を行えば、プローブがターゲットで飽和してそれ以上の測定が困難になる状態が生じづらいと考えられる時間であって、これも予め実験などによって定められる。
【００４１】
また、本発明においては、前記流路における前記センサの下流側に設けられ、前記流体を回収するか廃液として廃棄するかを制御するバルブを有し、
前記表面プラズモン測定器からの前記特定の物質の量に応じた信号に基づき、該信号が予め定められた閾値を越えてから、前記解離手段による前記解離動作が行われるまでの間は、前記バルブを作動させて前記生成物を含む溶液を回収するようにしてもよい。
【００４２】
ここで、プロセスラインにおいては、測定対象である特定の物質（ターゲット）は、測定においてできる限り消費されるべきではない。すなわち、表面プラズモン共鳴センサによる測定が終わった後には、回収されて、後のプロセスに送られるべきである。しかしながら、表面プラズモン共鳴センサによる測定が終わった後の流体は、解離剤を含んでいる可能性がある。この解離剤についてはできる限り回収されるべきでなく、廃液として廃棄されることが望ましい。
【００４３】
そこで、本発明においては、測定後の流体が回収されるか廃棄されるかを制御するバルブを有しており、表面プラズモン共鳴センサからの信号に基づいて、バルブを作動させる。より具体的には、表面プラズモン共鳴センサからの信号が予め定められた閾値を越えてから、前記解離手段による前記解離動作が行われるまでの間は、前記バルブを作動させて前記流体を回収することとした。
【００４４】
これは、表面プラズモン共鳴センサからの信号がある程度大きくなっている状態は、前回に解離動作が行われてからある程度の時間が経過しており、流体中に解離剤が混入している危険性も少なくなっているので、このような状態においては、表面プラズモン共鳴センサによる測定が終わった後の流体を回収することにした。また、それ以外の期間においては、表面プラズモン共鳴センサによる測定が終った後の流体に解離剤が混入している危険性が高いため、これを廃液として廃棄することとした。
【００４５】
これによれば、より簡単な制御で精度よく、解離剤が流体に混入していない状態と、解離剤が流体に混入している状態とを区別することができ、ターゲットである特定の物質の無駄を減らすことができるとともに解離剤の流体への混入をより確実に抑制することができる。なお、本発明において予め定められた閾値とは、表面プラズモン測定器からの信号がこれを越えた場合には、センサ表面のプローブにターゲットである特定の物質がある程度以上結合しており、前回の解離動作において注入された解離剤はもはや廃棄された状態であると判定される信号の値であり、予め実験などによって定められる。
【００４６】
また、本発明においては、前記流路を流通する前記流体の流量を検出する流量センサをさらに有し、前記表面プラズモン測定器からの前記特定の物質の量に応じた信号と、前記流量センサにより検出された前記流体の流量とに基づいて、前記流体を回収する時期を制御するようにしてもよい。これによれば、前回の解離動作において注入された解離剤はもはや廃棄されたかどうかを流体の流量を考慮に入れた上で判定することができ、回収の開始すべき時期をより精度よく決定することができる。
【００４７】
また、本発明においては、前記流体導入手段は、前記プロセスライン上における所定のプロセスを通過した流体を前記プロセスラインから分岐して流通させる流路であり、
前記流路の分岐点と前記表面プラズモン測定器との間に流量制御用の開閉バルブを有するようにしてもよい。
【００４８】
これによれば、特定の物質の量の測定は、プロセスラインの制御とは独立して行うことができ、プロセスラインの制御及び、表面プラズモン測定器による測定の双方の自由度を高めることができる。
【００４９】
この場合は、前記開閉バルブが一定間隔で開閉制御されることで、前記表面プラズモン測定器が、前記流体内の前記特定の物質の量を一定間隔でモニタリングするようにしてもよい。これによれば、一定間隔で一定量の流体をセンサ表面に導入すればよいので、測定のために用いられるターゲットの量を低減し、無駄を排除することができる。
【００５０】
また、本発明においては、前記プロセスラインにおける前記表面プラズモン測定器より
前のプロセスは精製クロマトグラフィであり、該精製クロマトグラフィを通過した前記流体の精製抽出状態を前記表面プラズモン測定器によってリアルタイムにモニタリングするようにしてもよい。あるいは、前記プロセスラインにおける前記表面プラズモン測定器より前のプロセスは細胞培養槽であり、前記流体内における、該細胞培養槽において生成した物質を前記表面プラズモン測定器によってリアルタイムにモニタリングするようにしてもよい。
【００５１】
また、本発明は、表面プラズモン励起光がセンサに照射されることで、表面プラズモン共鳴を前記センサの表面に発生させることが可能であり、前記励起光の波長または入射角度によって前記センサの表面の外側に存在する物質の量を測定可能な表面プラズモン測定器による、表面プラズモン共鳴インライン測定方法であって、
前記プロセスラインにおける前記表面プラズモン測定器より前のプロセスを通過した流体を前記表面プラズモン測定器のセンサ表面上に導入する流体導入工程と、
前記プロセスを通過した流体内の特定の物質を、前記センサの表面に固定された前記特定の物質と特異的に結合可能な物質であるプローブと結合させることで、前記特定の物質の量をインラインで測定する測定工程と、
を有することを特徴とする表面プラズモン共鳴インライン測定方法であってもよい。
【００５２】
その際、本発明においては、前記センサの表面におけるプローブと前記特定の物質との結合を解離させる解離動作を行う解離工程をさらに有するようにしてもよい。
【００５３】
また、本発明においては、前記解離動作は、前記センサの表面におけるプローブと前記特定の物質との結合を解離させる解離剤の前記流体内へのインジェクトであるようにしてもよい。
【００５４】
また、本発明においては、前記解離剤の前記流体内へのインジェクトは、前記流路内において前記センサの表面と略同一の面内であって、前記流路における前記センサの表面の上流側に設けられた注入口から行われるようにしてもよい。
【００５５】
また、本発明においては、前記センサの表面において、前記特定の物質と結合するプローブを固定した場合の測定値から、前記特定の物質と結合するプローブを固定しない場合の測定値を差し引くことで、前記特定の物質の量を測定するようにしてもよい。
【００５６】
また、本発明においては、前記表面プラズモン測定器の前記センサは、
前記センサの表面の少なくとも一部を覆うように形成された金属層と、前記センサの表面の前記金属層が形成されている部分に形成された複数の溝からなる溝構造と、を有するとともに、該溝構造における各溝の側壁面は、該側壁面を覆う前記金属層による対向面を形成し、該金属層による対向面で挟まれる領域において局在型の表面プラズモン共鳴を発生させる局在型表面プラズモン共鳴センサであることとしてもよい。
【００５７】
また、本発明においては、前記解離工程における前記解離動作は、前記表面プラズモン測定器により測定された前記特定の物質の量に基づき、該特定物質の量が予め定められた閾値を越えてから一定時間後に行われるようにしてもよい。
【００５８】
また、本発明においては、前記表面プラズモン測定器により測定された前記特定の物質の量に基づき、該特定の物質の量が予め定められた閾値を越えてから、前記解離工程による前記解離動作が行われるまでの間は、前記流体を回収するようにしてもよい。
【００５９】
また、本発明においては、前記表面プラズモン測定器により測定された前記特定の物質の量と、前記流体の流量とに基づいて、前記流体を回収する時期を決定するようにしても
よい。
【００６０】
また、本発明においては、前記流体導入工程においては、前記プロセスライン上における所定のプロセスを通過した流体を前記プロセスラインから分岐して前記表面プラズモン測定器のセンサ表面上に導入し、
前記表面プラズモン測定器が、前記流体内の前記特定の物質の量を一定間隔でモニタリングするようにしてもよい。
【００６１】
また、本発明においては、前記プロセスラインにおける前記表面プラズモン測定器より前のプロセスは精製クロマトグラフィであり、
該精製クロマトグラフィを通過した前記流体の精製抽出状態を前記表面プラズモン測定器によってリアルタイムにモニタリングするようにしてもよい。
【００６２】
また、本発明においては、前記プロセスラインにおける前記表面プラズモン測定器より前のプロセスは細胞培養プロセスであり、前記流体内における、該細胞培養プロセスにおいて生成した物質を前記表面プラズモン測定器によってリアルタイムにモニタリングするようにしてもよい。
【００６３】
なお、上記した課題を解決するための手段は、可能な限り組み合わせて使用することが可能である。
【発明の効果】
【００６４】
本発明によれば、プロセスラインにおいて、プロセス間を流通する流体内の特定の物質の量を特異的、高感度にインラインで測定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】本発明の実施例１に係るセンシングシステムの概略構成について示す図である。
【図２】本発明の実施例１に係る分画試料の構成例を示す図である。
【図３】本発明の実施例１におけるＵＶ吸光度計による吸光度の測定結果を示すグラフである。
【図４】本発明の実施例１に係るＳＰＲ測定器による測定結果を示すグラフである。
【図５】本発明の実施例１に係る夾雑物によるバックグラウンドノイズの対策について説明するための概念図である。
【図６】本発明の実施例１に係るリファレンス補正を行った場合の、各センシング部において得られた信号及び、その差分を示すグラフである。
【図７】本発明の実施例２に係るセンサチップの概略構成を示す図である。
【図８】本発明の実施例２に係る局在型表面プラズモン共鳴を利用したＳＰＲ測定器による測定結果を示すグラフである。
【図９】本発明の実施例２に係る局在型表面プラズモン共鳴を利用したＳＰＲ測定器による測定結果を纏めたグラフである。
【図１０】本発明の実施例３に係るＳＰＲ測定器の概略構成を示す図である。
【図１１】本発明の実施例３に係る局在型のセンサチップと、伝搬型のセンサチップとを比較する図である。
【図１２】本発明の実施例３に係る解離剤インジェクト方法と通常の解離剤インジェクト方法とを比較した説明図である。
【図１３】本発明の実施例３に係る解離剤インジェクト方法と通常の解離剤インジェクト方法とにおけるエタノールのインジェクト量と信号変化量との関係を比較したグラフである。
【図１４】本発明の実施例４に係るＳＰＲ測定器を含むセンシングシステムの概略構成を示す図である。
【図１５】本発明の実施例４に係るセンシングシステムにおけるＳＰＭ測定器よって得られたＳＰＲ信号のグラフである。
【図１６】本発明の実施例４に係るセンシングシステムの制御コンピュータにおいて実行されるＳＰＲ測定ルーチンについてのフローチャートである。
【図１７】本発明の実施例４に係るセンシングシステムにおいてＳＰＲ測定ルーチンが実行された結果行われる制御の概要を示す図である。
【図１８】本発明の実施例４におけるターゲットの回収タイミングについて示す図である。
【図１９】本発明の実施例５に係るプロセスラインの例を示す概略図である。
【図２０】本発明の実施例５に係るプロセスラインの例の別の態様を示す概略図である。
【図２１】本発明の実施例５に係るプロセスラインの例の第３の態様を示す概略図である。
【図２２】本発明の実施例５に係るプロセスラインの例の第３の態様におけるバッファ液、試料、解離剤の流通タイミングを示す図である。
【図２３】表面プラズモン共鳴の発生を利用したバイオセンサの原理を説明する図である。
【図２４】伝搬型表面プラズモン共鳴の発生源理を説明する図である。
【図２５】局在型表面プラズモン共鳴の発生源理を説明する図である。
【図２６】従来のクロマトグラフィ、ＵＶ吸光度計、伝導度計の組合せによる測定装置について説明するための図である。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
以下に図面を参照して、この発明を実施するための形態を例示的に詳しく説明する。
【００６７】
＜実施例１＞
図１には、本実施例で使用したセンシングシステム１の概略構成を示す。試料は精製クロマトグラフィ（以下、単にクロマトグラフィともいう）のカラム２から導入する。カラム２はＵＶ吸光度計３に接続されており、カラム２を通過した後の試料がＵＶ吸光度計３に導入され吸光度の測定が行われる。ＵＶ吸光度計３を通過した試料はＳＰＲ測定器４に導入される。なお、ＵＶ吸光度計３とＳＰＲ測定器４とを連結させて試料を流通させる管は、本実施例において流体導入手段に相当する。また、カラム２を通過した後の試料がＵＶ吸光度計３に導入される工程は本実施例において流体導入工程に相当する。ＳＰＲ測定器４においては図示しないＳＰＲセンサによって試料の測定が行われ、測定結果は制御コンピュータ７に送られ記録される。この工程は、本実施例において測定工程に相当する。
【００６８】
また、測定にあっては、ＳＰＲセンサにおいてプローブと結合したターゲットを、プローブから解離させる解離剤を導入し、新たなターゲットの捕捉を可能とする解離動作が制御コンピュータ７からの指令により間欠的に行われる。本実施例においてこの工程は解離工程に相当する。また、解離手段は図示されていないが制御コンピュータ７を含んで構成される。また、ＳＰＲセンサによるターゲットの測定結果と連動して、制御コンピュータ７によりバルブ８が制御されることで、試料の回収と廃棄とが制御される。これにより、ＳＰＲ測定器４から排出されたターゲットは選択的に試料回収管５を通過して回収されるとともに、解離剤などは廃棄管６を通過して廃棄される。
【００６９】
本実施例においては、クロマトグラフィや製薬プロセスを想定し、夾雑物も含む、濃度勾配を持った試料を準備した。そして、ＵＶ吸光度計３とＳＰＲ測定器４による検出結果の比較を行った。ターゲットとしてＡＦＰ（α-fetoprotein）、夾雑物としてＢＳＡ(Bovine Serum Albumin)のタンパク質が含まれる分画試料を用いた。この分画試料は、図２に
示すように、ＢＳＡに関しては分画Ｎｏ.１０、１２に１００μｇ／ｍｌ、Ｎｏ．１１に
５００μｇ／ｍｌ含ませた。ＡＦＰはＮｏ．３、７に０．１μｇ／ｍｌ、Ｎｏ．４、６に０．５μｇ／ｍｌ、Ｎｏ．５に３μｇ／ｍｌと、ＢＳＡに比べると１００分の１以下の低濃度となるように分画試料に含ませた。このようなＡＦＰとＢＳＡが混在したサンプルを実際にまずＵＶ吸光度計３で測定した。
【００７０】
図３には、本実施例におけるＵＶ吸光度計３による吸光度の測定結果を示す。高濃度のＢＳＡが含まれる分画Ｎｏ.１０、１１、１２で大きな信号変化が得られているが、ＡＦ
Ｐが含まれている分画Ｎｏ．３−７ではノイズに埋もれて、信号変化が観察されなかった。これは、ＵＶ吸光度計３の検出限界が約１０μｇ／ｍｌと低感度であるため、濃度が０．１μｇ／ｍｌのＡＦＰの検出が困難であることによる。さらに、ＵＶ吸光度計３の場合はＡＦＰ、ＢＳＡなどタンパク質の種類による特異性が無いため、例えターゲットが高濃度だとしても、このデータだけではどのピークがターゲットに対応しているか判別できないという問題がある。
【００７１】
次に、ＳＰＲ測定器４を使用して、上述したものと同じ分画試料を用いた連続的な測定の模擬実験を行った。図示しないＳＰＲセンサのチップ表面は、あらかじめポリエチレングリコールの膜でコートしておき、その表層に対して、プローブとして抗ＡＦＰ抗体を固定化した（非特異吸着を防止するためのブロッキング剤を添加する方法もある）。
【００７２】
連続的な測定を実現するために、ターゲットであるＡＦＰが一度結合した表面に対して解離剤を一定時間間隔でインジェクトすることで表面の再生を連続的に行った。非特異吸着を完全に除去するため、一回の再生に対して２回の解離剤のインジェクトを行った（３回以上行ってもよい）。得られた測定結果を図４（ａ）に、当該結果を横軸を分画Ｎｏ．とし、縦軸をＳＰＲ測定器４の信号の値として纏めた結果を図４（ｂ）に示す。上述のＵＶ吸光度計３による検出ではＡＦＰが含まれるＮｏ．３−７で信号変化が検出できなかったが、ＳＰＲ測定器４を用いた結果では、Ｎｏ．３−７において濃度に応じた大きな信号変化が観察されており、ターゲットであるＡＦＰの存在が確認できる。
【００７３】
このようにＳＰＲ測定器４を用いることで、従来のＵＶ吸光度計３では測定できなかった低濃度のターゲットを測定することができる。また従来のＵＶ吸光度計３だとタンパク質の検出時に選択性は無かったが、ＳＰＲ測定器４を用いることである程度の選択性が得られた。
【００７４】
但し、この場合でも、図４（ｂ）から分かるように、高濃度の夾雑物（ＢＳＡ）が混在している場合には、Ｎｏ．１０−１２で信号変化が発生しておりノイズ成分となっている。これは、ＳＰＲセンサチップの近傍を浮遊しているＢＳＡ分子が、表面プラズモン共鳴の感度領域（数百ｎｍ）に入ってくることで、屈折率の変化を発生させることによるバックグラウンドノイズ（バルク効果）である。
【００７５】
次に、今回のＢＳＡのような夾雑物によるバックグラウンドノイズの対策について説明する。このような夾雑物が存在する場合には、ターゲットであるＡＦＰ抗体を結合しないセンサチップをもう一つ用意しておき、そのセンサチップでのバックグラウンド量をリファレンスとして補正することで、測定全体のＳ／Ｎを改善することが可能である。
【００７６】
図５には、この場合の概念図を示す。バックグラウンドノイズを低減するために、あらかじめＳＰＲセンサチップ１０に測定領域を２つ以上用意しておく。一方のセンシング部１０ａ（第１の測定領域に相当する）にはターゲットであるＡＦＰ１１を捕捉するためのプローブ（今回の場合、抗ＡＦＰ抗体）１２を固定化する。他方のリファレンス部１０ｂ（第２の測定領域に相当する）には基本的にサンプル中に含まれる分子とは反応しないプ
ローブ（今回、抗ＦＬＡＧ抗体）１３を固定化する。この際、できるだけ物理化学的性質または光学的性質の近いプローブを各同じ量だけ固定化することが、正確な補正を行うために望ましい。ＡＦＰ１１は抗ＡＦＰ抗体１２にのみ結合し、抗ＦＬＡＧ抗体１３には結合しないため、センシング部１０ａにおいては、ＡＦＰ１１の濃度に応じて信号変化が得られる。一方、ＢＳＡのような夾雑物１４に対しては、センシング部１０ａ及びリファレンス部１０ｂのいずれの測定部分にもバックグラウンドノイズとして共通に信号変化が起こる。そのため、センシング部１０ａで得られた信号からリファレンス部１０ｂで得られた信号を差し引きすることで、バックグラウンドノイズを除去したＳＰＲ信号を得ることができる。
【００７７】
図６には、リファレンス補正を行った場合の、センシング部１０ａで得られた信号と、リファレンス部１０ｂで得られた信号と、前者の信号から後者の信号を差し引いて得られる信号とを示す。図６（ａ）に示すように、センシング部１０ａで得られた信号には、ＡＦＰ１１の濃度に応じたピークと、ＢＳＡによるピークが見られる。図６（ｂ）に示すように、リファレンス部１０ｂで得られた信号には、ＢＳＡによるピークのみが見られる。図６（ｃ）に示すように、両者の差分をとることで、夾雑物であるＢＳＡの影響を排除し、ターゲットであるＡＦＰ１１の濃度に応じた信号のみを得ることができる。
【００７８】
＜実施例２＞
次に、本発明における実施例２について説明する。前述の実施例のように、ＳＰＲをクロマトグラフィ等のプロセスにインライン的に接続することにより、従来のＵＶ吸光度計を用いる場合と比べて高感度、高選択的な検出が可能であることが確認された。但し、夾雑物が大量に存在する場合にはバックグラウンドノイズが発生してＳ／Ｎが低下してしまうという課題があった。これに対しリファレンス補正を行う場合は、リファレンス部を作製するための高度な固定化技術が必要であり、また、装置のコスト、サイズが大きくなるといった課題がある。
【００７９】
そこで、本実施例においては、ＳＰＲ測定器４においてバックグラウンドノイズを低減するために局在型表面プラズモン共鳴を利用した場合の検証を行った。本方式を用いれば、図５で説明したようなリファレンス補正が不要となり、システムの簡素化、ローコスト化を図ることができる。
【００８０】
本実施例においては、図７（ａ）に示すように、センサチップに金属のナノ溝構造を形成した。具体的には、スライドガラス製のベース２０の表面に透明の樹脂を滴下してモールドでナノ溝構造２１がナノインプリンティングにより形成されている。ここで樹脂はＵＶ硬化型のアクリル系樹脂を使用した。また、樹脂上のナノ溝構造２１は平行な溝形状であり、ピッチは３００ｎｍ、深さは５０〜６０ｎｍである。また、溝幅は１００〜１４０ｎｍである。本実施例では図７（ｂ）に示すように、ナノ溝構造２１の溝の上には金スパッタにより膜厚１００ｎｍの金属膜２２が形成されている。なお、ナノ溝構造は、熱ナノインプリンティングや射出成形で作製しても良い。また、本実施例において、一般的な金コロイド等の局在型表面プラズモン共鳴センサを使用しても良い。
【００８１】
実施例１と同じ分画試料について、局在型表面プラズモン共鳴を利用したＳＰＲ測定器を用いて同様の測定を行った。得られた測定結果を図８に示す。また、横軸を分画Ｎｏ．とし、縦軸をＳＰＲ測定器の信号の値として当該測定結果を纏めた結果を図９に示す。ＡＦＰについては同様に大きな信号変化が得られたが、ＢＳＡによるバックグラウンドノイズは実施例１におけるＳＰＲ測定器に比べると小さく、ほとんど測定に影響しないレベルであることが確認できた。これは、局在型表面プラズモン共鳴を利用したことによるセンシングエリアの局在化によって、バックグラウンドの影響を低減できていることに起因している。
【００８２】
このように、局在型表面プラズモン共鳴を利用したＳＰＲ測定器を用いることで、バックグラウンドの影響をほとんど受けずにインライン測定が可能であることが確認できた。さらに、パターンの最適化を行うことにより、さらにバックグラウンドノイズの低減が可能である。また、逆に特異的な信号変化のみを増大させることも可能である。本方式を用いれば、小型、簡便、ローコストな特異的、連続的高感度なインラインセンシングシステムの実現が可能である。
【００８３】
＜実施例３＞
次に、本発明における実施例３について説明する。実施例１及び実施例２では、連続的なセンシングを実現するために、解離剤を使用して間欠的にセンサチップ表面のターゲットをプローブから解離した。このように解離剤はセンサチップ表面の再生を行うのに有効な手段であるが、タンパク質自体の変性を起こさせるおそれがあるため、クロマトグラフィや製薬プロセスに扱うような貴重な試料内への混入はできる限り少ないことが望ましい。
【００８４】
従来は試料が流れる流路内全体に充填する形で解離剤をインジェクトしていたが、本実施例では試料の流路におけるセンサチップの表面と同一面にインジェクト用の注入口を設けることで、センサチップの表面に沿った薄い解離剤の層（層流）を形成し、微量の解離剤で効果的な解離を行うこととした。特に、局在型表面プラズモン共鳴を用いたセンサチップでは従来の伝搬型表面プラズモン共鳴を用いたセンサチップの場合と異なり、センサチップ裏面側のプリズムを必要としないので、センシング部に極めて近い場所に解離剤の注入口を設けることが可能である。従って、極めて少量の解離剤を用いた効率的な表面再生が可能となる。
【００８５】
図１０には、本実施例におけるＳＰＲ測定器３０の概略構成を示す。図１０（ａ）はＳＰＲ測定器３０の断面図である。図１０（ａ）においてターゲットを含む試料は試料用流路３５内を白抜き矢印の方向に流れる。また、試料用流路３５におけるセンサチップ３１の直上流には、解離剤を試料内にインジェクトする解離剤注入口３２が設けられている。解離剤はインジェクタ３３により解離剤注入口３２から試料内にインジェクトされる。
【００８６】
図１０（ｂ）にはインジェクタ３３の断面図を示す。本実施例におけるインジェクタ３３は、エポキシ樹脂系の複合材料からなるブラケット４３とインジェクト部３６とを有する。また、インジェクト部３６の表面には解離剤が付着しづらいように撥水膜４０が施されている。また、ブラケット４３とインジェクト部３６には、解離剤用流路３７が設けられており、矢印方向に解離剤が供給されることで、解離剤用流路３７は解離剤で満たされている。解離剤用流路３７は先端で絞られてノズル４１が形成されている。また、解離剤用流路３７のノズル４１の上流側は比較的流路断面積が広い圧力室４２になっている。インジェクト部３６における圧力室４２の上側の厚みは薄くなっており振動膜３８を形成している。この振動膜３８をＰＺＴ素子３９で周期的に押圧することで、振動膜３８を振動させる。このことにより、圧力室４２の容積が周期的に変化することとなり、ノズル４１から連続的に解離剤が吐出されるようになっている。
【００８７】
解離剤注入口３２から試料用流路３５に注入された解離剤は、注入後すぐに試料中に拡散するのではなく、液の流れが層として振舞い、徐々に広がっていく（層流、Sheath-flow）。一方で、解離剤の試料中への混入率はできる限り少なくすることが求められること
から、解離剤注入口３２はセンサチップ３１にできる限り近い部分にあることが望ましい。また、センサチップ３１と同一面の直上流に解離剤注入口３２を設けることで、拡散前の層流状態の解離剤がセンサチップ３１のセンシング部に高濃度で到達し、少量の解離剤でも効率的な解離動作が可能となる（単位溶液量あたりの反応効率を上げることが可能で
あり、抗原抗体反応の反応効率上昇にも、この仕組みは応用できる）。
【００８８】
ここで、従来の伝搬型表面プラズモン共鳴センサでは図１１（ａ）に示すようにセンサチップ４５の金属膜４５ａとは反対側にプリズム４６をマッチングオイル４６ａなどを介して貼り付ける必要があった。従って、センサチップ４５自体に貫通穴を設けてセンシング部の近傍に解離剤のインジェクトを行うことは困難であった。これに対し、ナノ溝構造を形成し、ナノ溝構造において発生する局在型ＳＰＲを利用したセンサチップ４７を用いることでプリズムが不要になるため、ナノ溝構造部分であるセンシング部４８の近傍に貫通穴４９を設けることが可能となる。よって、この貫通穴４９から解離剤をインジェクトし、センシング部４８のプローブに結合されているターゲットを効率的に解離することが可能である。なお、本実施例におけるセンサチップ４７を射出成形で作製する場合には、射出成形の時点でセンシング部４８近傍に貫通穴４９を形成しておいても良い。
【００８９】
次に、センサチップのセンシング部近傍から解離剤をインジェクトした場合の層流の効果についての評価を行った。図１２には、通常の場合の解離剤インジェクト方法と、本実施例における解離剤インジェクト方法の概念図を対比して示す。図１２（ａ）に示すように、通常のインジェクト方法においては、試料用流路５１におけるセンサチップ５０の上流側の離れた部分において、解離剤用流路５２から解離剤をインジェクトする。従って、解離剤はセンサチップ５０に到達するまでに、試料用流路５１中である程度拡散してしまい、センサチップ５０上のターゲットを効率よく解離することが困難である。一方、本実施例においては、解離剤用流路５３は、センサチップ５０のセンシング部５０ａの直上流に配置され、この解離剤用流路５３から解離剤が直接インジェクトされる。
【００９０】
評価に用いた装置の具体的な内容は以下のとおりである。まず、ナノインプリントで作製したナノ溝構造を有するセンシング部５０ａの約２ｍｍ上流側においてセンサチップ５０に貫通穴５４を設け、その貫通穴５４に裏面側から解離剤をインジェクトした。また、試料用流路には常時、水(ｎ＝１．３３)を流し、模擬的な解離剤としてエタノール(ｎ＝
１．３６)をインジェクトした。そして、模擬解離剤としてのエタノールのインジェクト
量を減らした場合に、通常のインジェクト方法と本実施例における貫通穴５４からのインジェクト方法とにおける信号変化を観察した。
【００９１】
図１３に結果のグラフを示す。横軸はエタノールのインジェクト量、縦軸はエタノールのインジェクト前後における信号変化の大きさである。信号変化の大きさ（実際には、ターゲットの検出によるＳＰＲ発生波長のシフト量）信号は５０μｌのエタノールを流したときの信号の大きさを１として規格化している。通常のインジェクト方法における解離剤用流路のサイズは、幅２．０ｍｍ、高さ２５μｍとし、解離剤の流速は４０μｌ/ｍｉｎ
とした。また、通常インジェクトは市販のインジェクタ（レオダイン社製、型式９７３５)をセンサチップ５０の手前に接続して使用した。図１３より、通常のインジェクト方法
においては、エタノールの量が微量(２０μｌ以下）になると液の混合、拡散が発生して
濃度が低下しており、本来の信号変化量が得られないことが分かる。
【００９２】
一方、本実施例における、貫通穴５４からのインジェクト方法においては、貫通穴５４の直径は約１．５ｍｍとし、センサチップ５０の裏面側からシリンジポンプを使用（流速は４０μｌ／ｍｉｎで合わせた）してエタノールをインジェクトした。この場合においては、インジェクト量が５μｌと微量であっても、５０μｌの場合とほぼ同等の信号変化が得られている。つまり、層流でセンサチップ５０におけるセンシング部５０ａの表面にエタノールの溶液層が存在していることと、センシング部５０ａと貫通穴５４との距離が短いことにより、液の拡散、混合が起こらないことが分かる。つまり、本構成を利用して解離剤のインジェクトを行えば、解離剤の混入比率を低減することが可能である。
【００９３】
なお、本実施例において、解離手段は、インジェクタ、解離剤注入口と、インジェクタを制御する図示しない制御コンピュータを含んで構成される。また、本実施例における流体導入手段は流体用流路を含んで構成される。なお、本実施例の結果から、解離剤の注入口（貫通穴５４）は、ナノ溝構造を有するセンシング部５０ａに対して少なくとも上流側２ｍｍ以内の場所に配置されれば好適な解離動作が可能となることが分かる。なお、注入口（貫通穴５４）の径はセンサの表面においてプローブが固定された領域のサイズと同等以上であることが望ましい。注入口からインジェクトされた解離剤が若干拡散しながら下流に移動することを考えると、プローブが固定された領域のサイズと同等程度がさらに望ましい。例えば、実際にスポッティング装置を用いてプローブ固定を行った場合、その径は２０〜５００μｍ程度となるため、解離剤注入口の径は２０〜５００μｍ程度とするとよい。もちろん、本実施例のように１．５ｍｍであっても、センサの表面においてプローブが固定された領域をカバーできれば問題ない。
【００９４】
＜実施例４＞
次に、本発明の実施例４について説明する。本実施例においては、前述のようにセンシング部表面の再生のための解離剤はできるだけ混入量を減らす必要がある。また、クロマトグラフィ等と合わせて測定をする場合、ＳＰＲ測定器で得られた信号を利用してターゲットの含まれた試料を取り出し回収することが望ましい。このため、測定結果に基づいて解離装置及び回収装置へフィードバックするシステムが要求される。
【００９５】
図１４には、本実施例におけるＳＰＲ測定器を含むセンシングシステム６０の概略構成を示す。ＳＰＲ測定器６１には、前段プロセスより試料が供給される。ＳＰＲ測定器６１で測定したターゲットの濃度に関連するデータは、制御コンピュータ６３に送られて解析、記録される。制御コンピュータ６３は、受け取ったデータをもとに、解離剤の注入タイミングを決定し、解離剤注入ポンプ６２を駆動させることで、解離動作を行う。また、制御コンピュータ６３は、受け取ったデータをもとに、ターゲットの回収のためのバルブ駆動タイミングを決定し、バルブ６４を駆動させることでＳＰＲ測定器６１から排出された試料のうちターゲットを多く含む部分を回収し、解離剤を多く含む部分を廃液として廃棄する。なお、本実施例において回収手段は、制御コンピュータ６３、解離剤注入ポンプ６２を含んで構成される。
【００９６】
図１５には、本実施例のセンシングシステム６０におけるＳＰＭ測定器６１よって得られたＳＰＲ信号の値のグラフを示す。横軸は時間、縦軸はＳＰＲ信号の値である。このＳＰＲ信号は、実際には、センシング部におけるターゲットとプローブとの結合による表面プラズモン共鳴の発生波長のシフトに相当する信号であり、試料中のターゲットの量（濃度）に相当する信号である。図１５において、ターゲットが流れていない状態では解離剤をインジェクトする必要が無い。従って、ターゲットが流れ出した後に、ＳＰＲ信号の大きさが予め定められた閾値Ａ以上になった時点を起点として、やはり予め定められたΔＴの経過後に初めて解離剤をインジェクトする。例えば、この閾値Ａはベースライン＋９σ（σはΔＴ間の信号標準偏差）などとして良い。ΔＴの値はターゲットの濃度、送液速度等によって決定されるが例えば１分間などと固定しても良い。ここで、信号変化量ΔＳを、解離剤をインジェクトする直前のＳＰＲ信号値から、ΔＴ´前のＳＰＲ信号値を差し引いたものとして定義する。ここで、ΔＴ´の値は、０＜ΔＴ´＜ΔＴを満たすという条件で予め定められた時間である。
【００９７】
図１５に示すように、解離剤のインジェクトを開始した後はΔＳが一定値以下になるまではΔＴ間隔で解離剤をインジェクトし続ける。その際、ΔＴ間隔で解離剤を２回ずつインジェクトしてもよい。そして、ΔＳが一定値以下になった際には、ターゲットが無くなったと判断して、解離剤のインジェクトを停止する。この場合のΔＳの閾値は例えば９σなどで定義する。２回以上連続してΔＳが閾値（９σ）以下になることを停止の条件とし
ても良い。このサイクルは何度繰り返しても良い。
【００９８】
図１６には、センシングシステム６０の制御コンピュータ６３においてＳＰＲ測定の際に実行されるＳＰＲ測定ルーチンについてのフローチャートを示す。本ルーチンが実行されると、まず、Ｓ１０１において、ＳＰＲ信号がＡより大きいか否かが判定される。ここで、ＳＰＲ信号がＡ以下であると判定された場合には、Ｓ１０１の処理の前に進む。すなわち、Ｓ１０１においてＳＰＲ信号がＡより大きいと判定されるまでＳ１０１の処理を繰り返し実行する。一方、Ｓ１０１においてＳＰＲ信号がＡより大きいと判定された場合には、Ｓ１０２に進む。
【００９９】
Ｓ１０２においては、試料回収が開始される。具体的には、制御コンピュータ６３からの指令によりバルブ６４が回収側に駆動される。Ｓ１０２の処理が終了するとＳ１０３に進む。Ｓ１０３においては、ΔＴの待機処理が行われ、ΔＴの経過時間が確保される。Ｓ１０３の処理が終了するとＳ１０４に進む。Ｓ１０４では解離剤のインジェクトが実施される。Ｓ１０４の処理が終了するとＳ１０５に進む。Ｓ１０５においては、ΔＳの値が９σ未満か否かが判定される。ここで、ΔＳの値が９σ以上である場合には、Ｓ１０３の処理の前に戻り、Ｓ１０３及びＳ１０４の処理が実行される。すなわち、Ｓ１０５においてΔＳの値が９σ未満となるまで、ΔＴ間隔で解離剤のインジェクトが繰り返し行われる。Ｓ１０５においてΔＳの値が９σ未満となった場合には、Ｓ１０６に進む。Ｓ１０６においては、試料回収が終了される。具体的にはバルブ６４が廃液側に駆動される。Ｓ１０６の処理が終了するとＳ１０１の前に戻り、次にターゲットが流れてくるのを待機する。
【０１００】
なお、上記のＳＰＲ測定ルーチンにおいて、ルーチンがスタートするとともに、流体導入工程と測定工程は実行される。そして、Ｓ１０４において解離工程が実行される。
【０１０１】
図１７には、センシングシステム６０においてＳＰＲ測定ルーチンが実行された結果行われる制御について示す。図１７に示すように、ターゲットの流入とともにＳＰＲ信号が増大し、Ａを超えた時点で、試料（ターゲット）の回収と、ΔＴ間隔での解離剤のインジェクトが実行される。その後、ターゲットの流量の増加とともにＳＰＲ信号は増加し、ターゲットの流量の減少とともにＳＰＲ信号が減少する。そして、ΔＳが９σ未満となった時点で、ターゲットの回収が終了し試料が廃液として廃棄されるとともに、解離剤のインジェクトが終了する。
【０１０２】
なお、試料の回収については、ＳＰＲ信号の大きさがＡを超えた時点から、解離剤のインジェクトを停止するまでの間はバルブ６４を回収側へと切り替えることで、ターゲットの回収を効率的に実施できる。また、回収したターゲットを含む試料への解離剤の混入を低減するには、ＳＰＲ測定器６１のＳＰＲ信号から解離剤が混入している試料がバルブ６４を通過する時間帯を特定して、解離剤が混入していない時間帯でのみバルブ６４を回収側に切り替えても良い。解離剤の混入を特定する判断としては、例えばＳＰＲ信号がＡ以下である時間帯については解離剤が混入していると判断しても良い。この場合のターゲットの回収タイミングについて図１８に示す。
【０１０３】
＜実施例５＞
次に、本発明の実施例５について説明する。本実施例では、製薬プロセス、培養などの液状態の濃度管理、異物検査などに、本発明に係るセンシングシステムを適用した場合の、プロセスラインの構築例について説明する。製薬プロセス等においては、解離剤の試料への混入がプロセス上問題となる場合がある。このような場合は、解離動作に合わせて下流側のバルブを切り替えて、解離剤が含まれる溶液部分のみ廃液として分離する。図１９には、このような場合のプロセスラインの例を示す。
【０１０４】
本ラインにおいては前段プロセスＰ１と後段プロセスＰ２との間が試料用パイプ７５で連結されている。前段プロセスＰ１は例えば、細胞培養槽（細胞培養プロセス）であってもよい。これは以下の態様についても同じである。そして、試料用パイプ７５には、ＳＰＲ測定器７０が備えられている。ＳＰＲ測定器７０には、試料用流路７０ａが設けられており、上流側と下流側の試料用パイプ７５を連結させている。試料用流路７０ａにはセンサチップ７１と、その直上流側には解離剤インジェクト用の貫通穴７２が設けられている。また、ＳＰＲセンサ７０にはインジェクタ７３が併設されており、貫通穴７２に対して解離剤を吐出する。
【０１０５】
なお、試料用パイプ７５におけるＳＰＲ測定器７０の下流側にはバルブ７４が設けられている。このバルブ７４が駆動されることで、ＳＰＲ測定器７０から流出する試料を後段プロセスＰ２に導入するか廃液として廃棄するかを選択可能となっている。また、試料用パイプ７５におけるＳＰＲ測定器７０の上流側には試料の流量を計測する流量センサとしてのフローセンサ７６が備えられている。本実施例では、精度良く解離剤を試料から分離するために、フローセンサ７６の情報をもとにバルブ切替のタイミングを算出する。具体的には、試料の流量が多い場合には、インジェクトした解離剤が下流側に流れ去る時間が早くなるので、図１８においてはＡとした、回収開始のためのＳＰＲ信号の閾値を小さくするようにしてもよい。すなわち、試料の流量が多いほど、回収開始のためのＳＰＲ信号の閾値を小さくする。流量の増加量とＳＰＲ信号の閾値の低下量との関係は直線的であってもよいし、上側に凸あるいは下側に凸といった曲線的な関係でもよい。なお、上記において試料用パイプ７５及び試料用流路７０ａは、流体導入手段を構成する。また、インジェクタ７３及び貫通穴７２は解離手段を構成する。
【０１０６】
図２０には、プロセスラインの別の態様について示す。この態様では、前段プロセスＰ１と後段プロセスＰ２は同一とし、試料を循環させる構成となっている。また、試料を循環させるためのポンプ７７が備えられている。ポンプ７７はベリスタポンプ、プランジャーポンプ、電気浸透流ポンプなどのいずれの方式であっても良い。この態様は培養槽などの管理に使用可能である。
【０１０７】
図２１は本実施例における第３の態様を示す図である。本態様は、試料中への解離剤の混入を完全に無くすために、メインのプロセスラインＰ３から分岐パイプ７８が分岐され、モニタリング用パイプ７９にＳＰＲ測定器８０、ポンプ８１、バルブ８２が設けられている。ＳＰＲ測定器８０の場合、１００μｌ以下の微量の試料でも検出が可能である。また、本実施例では、常にモニタリング用パイプ７９への試料の分岐を行っていると試料のロスが大きくなるため、一定時間毎（例えば１時間毎）にバルブ８２を切替えて、図２２に示すように、試料または解離剤をＳＰＲ測定器８０に流し、それ以外の時間はバッファ液を送液しておくことで、試料の採集効率を上げることが可能である。
【０１０８】
本態様においては、モニタリング用パイプ７９の流通内容を試料からバッファ液に切り替えた後にターゲットの濃度判断を行うことで、バックグラウンドノイズの影響を完全に排除することが可能である。この場合の流体導入手段は、分岐パイプ７８、モニタリング用パイプ７９、ポンプ８１、バルブ８２を含んで構成される。また、図２２において試料が供給される期間は流体導入工程に相当する。試料が供給されてから解離動作までの期間は測定工程に相当する。解離動作が行われる期間は解離工程に相当する。
【０１０９】
なお、図２１に示した態様のプロセスラインは、抗体医薬等の製造ラインにおいては、培養により作製された抗体の濃度管理や、抗体のリークチェック等に応用可能である。そのような場合において抗体を検出するために、センサチップの表面上にはプロテインＡを含むプローブ層やプロテインＧ、ＬおよびAnti-IgGなどの抗Ｆｃ抗体などを含むプローブ層を形成することが望ましい。また、目的対象が発現タンパク質であるプロセスラインに
おいても、同様のシステムが構築可能である。この場合、センサチップの表面上には、抗ＧＳＴ抗体、抗His-tag抗体、抗ＦＬＡＧ抗体、抗ビオチン抗体、ストレプトアビジン、
ニュートラアビジン、アビジン、Ｎｉ-ＮＴＡ(nickel-nitrilotriacetic acid) など、発現タンパク質を結合可能なプローブ層の形成が望ましい。
【０１１０】
なお、上記の実施例においては、試料は前段プロセスを通過したターゲットを含む液体である例について説明したが、本発明は、プロセスラインにおける上記以外のあらゆる流体（気体も含む）である試料に対して適用可能である。
【符号の説明】
【０１１１】
１・・・センシングシステム
２・・・カラム
３・・・ＵＶ吸光度計
４・・・ＳＰＲ測定器
５・・・試料回収管
６・・・廃棄管
１０・・・ＳＰＲセンサチップ
１１・・・ターゲット（ＡＦＰ）
１２・・・プローブ（抗ＡＦＰ抗体）
１３・・・プローブ（抗ＦＬＡＧ抗体）
１４・・・夾雑物（ＢＳＡ）
２０・・・ベース
２１・・・ナノ溝構造
２２・・・金属膜
３０・・・ＳＰＲ測定器
３１・・・センサチップ
３２・・・解離剤注入口
３３・・・インジェクタ
６０・・・センシングシステム
【図１】
0005556139.tif 000002
【図２】
0005556139.tif 000003
【図３】
0005556139.tif 000004
【図４】
0005556139.tif 000005
【図５】
0005556139.tif 000006
【図６】
0005556139.tif 000007
【図７】
0005556139.tif 000008
【図８】
0005556139.tif 000009
【図９】
0005556139.tif 000010
【図１０】
0005556139.tif 000011
【図１１】
0005556139.tif 000012
【図１２】
0005556139.tif 000013
【図１３】
0005556139.tif 000014
【図１４】
0005556139.tif 000015
【図１５】
0005556139.tif 000016
【図１６】
0005556139.tif 000017
【図１７】
0005556139.tif 000018
【図１８】
0005556139.tif 000019
【図１９】
0005556139.tif 000020
【図２０】
0005556139.tif 000021
【図２１】
0005556139.tif 000022
【図２２】
0005556139.tif 000023
【図２３】
0005556139.tif 000024
【図２４】
0005556139.tif 000025
【図２５】
0005556139.tif 000026
【図２６】
0005556139.tif 000027