(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジカルボン酸を製造する方法であって、
（ａ）生育段階であって、アシル−ＣｏＡオキシダーゼをコードする、ＰＯＸ２、ＰＯＸ３、ＰＯＸ４およびＰＯＸ５遺伝子が少なくとも破壊された、ヤロウイア・リポリティカの変異株が、少なくとも１種の炭素源および窒素源を含むエネルギー性基質からなる培養培地において培養される、段階と、
（ｂ）生物変換段階であって、前記株が、少なくとも１種の炭素源および窒素源を含むエネルギー性基質の存在下に、オレインヒマワリ油である生物変換基質に供される、段階と、
（ｃ）形成されたジカルボン酸を回収する段階と
を包含する、方法。
【請求項２】
用いられる変異体が、Collection Nationale de Cultures de Microorganismesに、登録番号ＣＮＣＭ  Ｉ−３３２０の下に登録されている新ヤロウイア・リポリティカ変異株ＭＴＬＹ８１であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
用いられる変異体が、Collection Nationale de Cultures de Microorganismesに、登録番号ＣＮＣＭ  Ｉ−３５２７の下に登録されている新ヤロウイア・リポリティカ変異株ＦＴ１２０であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
用いられる変異体が、Collection Nationale de Cultures de Microorganismesに、登録番号ＣＮＣＭ  Ｉ−３５２８の下に登録されている新ヤロウイア・リポリティカ変異株ＦＴ１３０であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
生物変換段階において、培養培地がペプトンを含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
生物変換段階において、培養培地が、二次的エネルギー性基質の供給を含み、該エネルギー性基質は、少なくとも１種のポリヒドロキシ化合物からなることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
前記ポリヒドロキシ化合物は、グリセロールまたは糖であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
段階（ｃ）において、ジカルボン酸は、カルシウム塩の形態での析出によって回収されることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物変換基質からの酵母ヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）の変異株を用いた発酵によってジカルボン酸を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ジカルボン酸（「二塩基酸」とも称される）は、ポリアミドおよびポリエステル、潤滑油、可塑剤または香料の合成のためのベース材料として用いられる。
【０００３】
二塩基酸製造方法は、考慮される二塩基酸の炭素ネットワークの炭素原子の数に従って変動する（非特許文献１）。それ故に、アゼライン酸（Ｃ９二塩基酸）が、通常、オゾンによるオレイン酸の化学酸化によって得られる一方で、セバシン酸（Ｃ１０二塩基酸）は、リシノール酸のアルカリ性酸化によって製造される。ドデカン二酸（Ｃ１２二塩基酸）は、石油化学の製品である。細菌学は、トリデカンからブラッシル酸（Ｃ１３二塩基酸）を製造するために用いられる。
【０００４】
種々の適用において用いられる二塩基酸の多様性を考慮すると、最も広い範囲の考えられる二塩基酸に適用可能な製造経路の利点は疑う余地がない。化学製造より遅い反応速度によって特徴付けられるものの、生物学的製造は、非常に多様な基質に適用可能であるという利点を提供する（生物学的二塩基酸製造法は、概略的に図１に示される）。
【０００５】
事実、多くの野生型の細菌種、例えば、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、キャンジダ・クロアカエ（Candida cloacae）等は、少量の二塩基酸を分泌することができる（非特許文献２〜３）。
【０００６】
しかしながら、十分な量の二塩基酸分泌物を得るために、β酸化が阻止された変異体が用いられる必要がある。多くの種について、ランダムな突然変異生成およびその後の適切な選択によってこのような変異体が得られた（特許文献１（シイオ（Shiio）ら著）、非特許文献４）。
【０００７】
しかしながら、特異的変異技術を用いるはるかによりエレガントではあるがより制限的な選択肢が、キャンジダ・トロピカリスについて開発された。この種に属する野生型株から、Picataggioらは、第１のβ酸化段階を触媒するアセチル−ＣｏＡオキシダーゼ（Ａｏｘ）の２つのイソ酵素をコードする４つの遺伝子を連続的に破壊した（非特許文献５および特許文献２）。
【０００８】
これらの著者は、その時、ｎ−アルカンの二塩基酸への変換の反応速度論を制限する活性を構成していた、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼおよびＮＡＤＰＨ−シトクロムリダクターゼをコードする遺伝子を過剰発現させた。（非特許文献６および特許文献３）。しかしながら、多コピー増幅システムに従って生じさせられたキャンジダ・トロピカリスの変異体は、全体的に安定でないようであり、それらは、場合によっては、復帰変異（reversions）を経る。これは、従来技術においてなぜ改良が行われなければならないかの理由である（特許文献４）。
【特許文献１】欧州特許第０２２９２５２号明細書
【特許文献２】米国特許第５２５４４６６号明細書
【特許文献３】米国特許第５６４８２４７号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００４／００１４１９８号明細書
【非特許文献１】ジョンソン・ＲＷ（Johnson RW）、ポロック・ＣＭ（Pollock CM）、キャントレル・ＲＲ（Cantrell RR）著、出版者「キルク・オスマー・エンサイクロペディア・オフ・ケミカル・テクノロジー（Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology）」、第４版、１９８３年、ｐ．１１８−１３６
【非特許文献２】チャン（Chan）ら著、「スティミュレーション・オフ・ｎ−アルカン・コンバージョン・ツー・ジカルボキシリック・アシッド・バイ・オーガニック−ソルベント−アンド・デタージェント・トリーテッド・マイクローブス（Stimulation of n-alkane conversion to dicarboxylic acid by organic-solvent-and detergent-treated microbes）」、Appl.Microbiol.Biotechnol.、１９９１年、第３４巻、ｐ．７７２−７７７
【非特許文献３】シイオ（Shiio）ら著、「ミクロバイアル・プロダクション・オフ・ロング−チェイン・ジカルボキシリック・アシッド・フロム・ｎ−アルカンズ（Microbial Production of Long-chain Dicarboxylic Acids from n-Alkanes）  パートＩ（Part I）  スクリーニング・アンド・プロパティーズ・オフ・ミクロオーガニスムズ・プロデューシング・ジカルボキシリック・アシッド（Screening and Properties of Microorganisms Producing Dicarboxylic Acids）」、Agr.Biol.Chem.、１９７１年、第３５巻，第１３号、ｐ．２０３３−２０４２
【非特許文献４】ジアオ（Jiao）ら著、「アイソレーション・アンド・エンザイム・デターミネーション・オフ・キャンジダ・トロピカリス・ミュータンツ・フォー・ＤＣＡ・プロダクション（Isolation and Enzyme Determination of Candida tropicalis Mutants for DCA Production）」、J.Gen.Appl.Microbiol.、２０００年、第４６巻，ｐ．２４５−２４９
【非特許文献５】ピカタジオ（Picataggio）ら著、「デタミネーション・オフ・キャンジダ・トロピカリス・アシルコエンザイム・Ａ・オキシダーゼ・イソエンザイム・ファンクション・バイ・シークエンシャル・ジーン・ディスラプション（Determination of Candida tropicalis Acylcoenzyme A Oxidase Isoenzyme Function by Sequential Gene Disruption）」、Mol.Cell.Biol.、１９９１年、第１１巻、ｐ．４３３３−４３３９
【非特許文献６】ピカタジオ（Picataggio）ら著、「メタボリック・エンジニアリング・オフ・キャンジダ・トロピカリス・フォー・ザ・プロダクション・オフ・ロング−チェイン・ジカルボキシリック・アシッド（Metabolic Engineering of Candida tropicalis for the Production of Long-chain Dicarboxylic Acids）」、Biotechnol.、１９９２年、第１０巻、ｐ．８９４−８９８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
（発明の目的）
本発明の目的は、従来技術の欠点を克服することである。実際に、アシル−ＣｏＡオキシダーゼをコードする遺伝子が破壊されたヤロウイア・リポリティカ変異体を用いて二塩基酸を生じさせることが有利には可能であることが発見された。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明による方法が調製することを目的とする二塩基酸は、少なくとも１０個の炭素原子を有する直線状炭化水素鎖を有し、鎖の各端部にカルボン酸基を含む有機化合物である。
【００１１】
用いられる微生物は、ヤロウイア・リポリティカ変異体であって、β酸化において部分的に阻止するように少なくともＰＯＸ２、ＰＯＸ３、ＰＯＸ４およびＰＯＸ５遺伝子が破壊されたものである。
【００１２】
ＰＯＸ２、ＰＯＸ３、ＰＯＸ４およびＰＯＸ５遺伝子によってコードされたアシル−ＣｏＡオキシダーゼとは別に、ＰＯＸ１およびＰＯＸ６遺伝子によってコードされる（未知機能の）２つの他のアシル−ＣｏＡオキシダーゼがヤロウイア・リポリティカのゲノムに存在する。
【００１３】
これらの２つのアシル−ＣｏＡオキシダーゼは、２つの炭素原子の連続的脱離によって生合成された二塩基酸の再消費に必要とされる。ＰＯＸ１およびＰＯＸ６遺伝子のさらなる破壊は、それ故に、生物変換基質のプロファイルに相当する二塩基酸の産生をもたらす。例えば、１８個の炭素原子を有する脂肪酸から主としてなるオレイン酸ヒマワリ油が生物変換基質として用いられる場合、ＰＯＸ遺伝子の全部が除かれた株は、１８個の炭素原子を有する二塩基酸の大部分を生じさせるだろう。
【００１４】
他方、生物変換基質は、脂肪体の形態の細胞内でトリグリセリドの形態で保存され得、それ故に、その二塩基酸への生物変換のために利用しにくくなる。遺伝子はプロテオーム解析によって、生物変換基質の蓄積において必要とされることが確認された。本発明者らは、下記遺伝子を確認した：ＤＧＡ１（アシル−ＣｏＡ：ジアシルグリセロール・アシルトランスフェラーゼ）、ＴＧＬ１（トリアシルグリセロール・リパーゼ）、Ｇ３Ｐ（グリセロール−３−ホスファート・デヒドロゲナーゼ）、ＳＣＰ２（推定のステロールキャリア）、ＬＲ０１（推定のレシチン・コレステロール・アシルトランスフェラーゼ）並びにＩＦＰ  ６２１  ＩＰＦ（未知機能）、ＩＰＦ  ９０５（未知機能）およびＩＰＦ  ２５６９（ＮＡＤＨ−ユビキノン・リダクターゼ・サブユニット）。
【００１５】
これらの遺伝子の活性の改変（破壊または過剰発現による）は、それ故に、ヤロウイア・リポリティカ細胞内の脂肪体の形態の生物変換基質の蓄積の減少をもたらす。
【００１６】
ヤロウイア・リポリティカの遺伝系は、キャンジダ・トロピカリスのものとは全く異なることが留意され得る。二倍体酵母であるキャンジダ・トロピカリスとは異なり、ヤロウイア・リポリティカは、実際に、半数体種である。したがって、後者の微生物では、単一セットの染色体の存在のため、遺伝子削除操作は、より効果的かつ確実である。
【００１７】
他方、アシル−ＣｏＡオキシダーゼをコードするＰＯＸ２遺伝子のプロモーターは、遺伝子、例えば、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ・シトクロムおよびＮＡＤＰＨシトクロムリダクターゼをコードする遺伝子を過剰発現させるために用いられる。プロモーターｐＰＯＸ２は、生物変換基質によって高誘導性であるという特性を有する。それ故に、興味のある遺伝子の過剰発現は、プロモーターｐＰＯＸ２の制御下に単一遺伝子コピーを付与することによって行われ、多コピー増幅システムによって得られるキャンジダ・トロピカリス変異体とは異なる、効率的、安定、かつ、非復帰性のヤロウイア・リポリティカ変異体を得ることが可能である。
【００１８】
脂肪酸エステルまたは天然油（例えば、植物油）からの二塩基酸の産生についてのキャンジダ・トロピカリスを超えるヤロウイア・リポリティカの別の利点は、次の通りである：キャンジダ・トロピカリスによる天然油の二塩基酸への変換は、発酵に先行して基質の化学的な加水分解を少なくとも部分的に必要とする（米国特許５，９６２，２８５を参照）。この加水分解は、カルシウムまたはマグネシウムの水酸化物の存在中の鹸化によって行われる。それは、対応する脂肪酸塩（石鹸）を生じさせる。ここで、ヤロウイア・リポリティカは、トリグリセリドを炭素源として吸収する能力を有する。この異化の第１の段階は、１９５１年にPetersとNelsonにより確認された脂肪分解酵素（リパーゼ）によるトリグリセリドのフリーな脂肪酸とグリセロールへの加水分解を必要とする。細胞外のリパーゼ活性および３９および４４ｋＤａの２つの膜リパーゼ（Barthら，ヤロウイア・リポリティカ、「Nonconventional Yeasts in Biotechnology A Handbook（Wolf,K.Ed.）Ｖｏｌ．１，１９９６，ｐｐ．３１３−３８８．Springer-Verlag」）がその後に記載された。ヤロウイア・リポリティカは、複数のリパーゼ（細胞外、膜および細胞内活性）を産生し得る。最近、上記のリパーゼに対応する遺伝子が特定された。ＬＩＰ２遺伝子は、細胞外リパーゼＬｉｐ２ｐ（Pignedeら，２０００）をコードする。それは好ましくはオレイン残基の長鎖トリグリセリドを加水分解することが示された（Barthら，１９９６）。
【００１９】
ヤロウイア・リポリティカは、それ故に、発酵を行うのに適したｐＨ条件下にエステルおよび天然油をフリーの脂肪酸とグリセロールに直接的に加水分解する。このような条件下に、エステルまたは油の加水分解および二塩基酸へのその変換は同時に起こり、これは、化学的加水分解段階が除かれるので、単純化された操作手順もたらすという利点を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
（詳細な説明）
より詳細な方法では、本発明は、少なくとも１種のジカルボン酸を製造する方法であって、
（ａ）生育段階であって、（アシル−ＣｏＡオキシダーゼをコードする）ＰＯＸ２、ＰＯＸ３、ＰＯＸ４およびＰＯＸ５遺伝子が少なくとも破壊されたヤロウイア・リポリティカの変異株が、炭素源および窒素源を少なくとも含むエネルギー性の基質から本質的になる培養培地において培養される、段階と、
（ｂ）生物変換段階であって、前記株が、エネルギー性の基質の存在下に少なくとも１０個の炭素原子を有するｎ−アルカン、少なくとも１０個の炭素原子を有する脂肪酸、これらの脂肪酸の１〜４個の炭素原子を有するアルキルエステル（例えば、メチルまたはエチルエステルの混合物）および天然油（グリセロールの脂肪酸エステルの混合物）の中から選択される生物変換基質に供される、段階と、
（ｃ）形成されたジカルボン酸を回収する段階と
を包含する方法を提供する。
【００２１】
本発明による方法において用いられる株は、野生型ヤロウイア・リポリティカＷ２９株（ATCC 20460，Collection de Levures d’Interet Biotechnologique（ＣＬＩＢ）においてＣＬＩＢ８９の下に記録された）に由来する。
【００２２】
それ故に、G.Barthらの概説に記載されたPold株［ロイシン（ｌｅｕ−）およびウラシル（ｕｒａ−）栄養要求性の株］によってヤロウイア・リポリティカ  ＡＴＣＣ２０４６０株に由来する新しい変異株を用いることが可能である。それは、ＣＬＩＢにおいてＣＬＩＢ１３９の下に記録されている。
【００２３】
これらの新しい変異株（ＭＴＬＹ３７、ＭＴＬＹ６６、ＭＴＬＹ７４、ＭＴＬＹ７９、ＭＴＬＹ８０、ＭＴＬＹ８１、ＦＴ１２０およびＦＴ１３０）が得られる方法は、下記に記載される。
【００２４】
本発明による二塩基酸製造方法において、選択された変異株は、炭素源および窒素源を少なくとも含むエネルギー性の基質から本質的になる培地において生育が終わるまで培養される。次いで、生物変換基質（アルカンまたはアルカン混合物、脂肪酸または脂肪酸混合物、脂肪酸エステルまたは脂肪酸エステル混合物、天然油、またはこれらの種々の基質の混合物）が、二塩基酸への生物変換を開始するように加えられ、形成された二塩基酸は、当業者に知られる技術、例えば、カルシウム塩沈殿によって回収される。
【００２５】
生物変換段階の間、培養培地は、一般的には、少なくとも１種のポリヒドロキシ化合物、例えば、グリセロール、糖等からなる二次的なエネルギー性の基質の供給を必要とし得る。
【００２６】
（１．変異株ＭＴＬＹ３７の取得）
この株を得るための手順は、次の通りであり得る：
１）興味のある遺伝子の配列を決定する（または、この遺伝子の配列は、データバンクにおいて入手可能である）；
２）対抗選択マーカー（counter-selectable marker）、例えば、マーカーＵＲＡ３（これにより、Ｕｒａ＋表現型またはＵｒａ−表現型について選択し得る）を用いるＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）またはクローニングによって破壊用カセットを構築する；
３）削除された興味株を有する株を選択し（変換および軽質転換体の選択）（マーカーがＵＲＡ３であれば有利にはＵｒａ＋）、遺伝子崩壊をチェックする。
【００２７】
変異株ＭＴＬＹ３７を得る特定の方法は以降に記載される。
【００２８】
野生型株のＰＯＸ遺伝子（その配列は、キャンジダ・トロピカリスの配列とは異なる）が、最初に、クローニングされかつ配列決定される。アシル−ＣｏＡオキシダーゼのイソ酵素をコードする遺伝子についての破壊用カセットが、次いで、構築される。アシル−ＣｏＡオキシダーゼの遺伝子は、選択マーカーＵＲＡ３を用いて破壊される。プロモーターおよびターミネーター領域は、特定のオリゴヌクレオチド対を用いる第１のＰＣＲによって増幅させられ、これは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）から全配列を除去する。次いで、第２のＰＣＲが外部のプライマーと、プロモーターおよびターミネーターのＰＣＲ産物とにより行われ、これらは、制限酵素Ｉ−Ｓｃｅｌについての部位を含む２０ｂｐの共通の延長部を介して融合する。ＰＣＲ産物がクローニングされて、プロモーター−ターミネーターモジュールを含有する一連のプラスミド（ｐＰＯＸ−ＰＴによって設計される）が与えられる（破壊用カセット２）。
【００２９】
ＵＲＡ３遺伝子が、ＰＯＸ−ＰＴカセットのＩ−Ｓｃｅｌ部位に導入される。プロモーター−ＵＲＡ３−ターミネーターモジュールを含有する一連のｐＰＯＸ−ＰＵＴプラスミドが構築される（破壊用カセット１）。これらの構築物は、一方で破壊用カセット１を含有するプラスミドについてｐＰＯＸ１−ＰＵＴ、ｐＰＯＸ２−ＰＵＴ、ｐＰＯＸ３−ＰＵＴ、ｐＰＯＸ４−ＰＵＴおよびｐＰＯＸ５−ＰＵＴと称され、他方で、破壊用カセット２を含有するプラスミドについてｐＰＯＸ１−ＰＴ、ｐＰＯＸ２−ＰＴ、ｐＰＯＸ３−ＰＴ、ｐＰＯＸ４−ＰＴおよびｐＰＯＸ５−ＰＴと称される。
【００３０】
破壊用カセットは、特定の外部プライマーによるＰＣＲによって、例えば、Ｐｆｕポリメラーゼ（Stratagene，La Jolla，Californiaによって提供される）を用いて増幅させられる。タンパク質配列の最終分析は、ヤロウイア・リポリティカのアシル−ＣｏＡオキシダーゼが、他の酵母のものと４５％の同一性度（５０％類似性）を有することを示す。それらの間の同一性度は、５５〜７０％（６５〜７６％の類似性）である。
【００３１】
アシル−ＣｏＡオキシダーゼをコードする遺伝子の破壊用カセットを構築した後、ヤロウイア・リポリティカの変換が、種々の方法によって行われ得る。エレクトロポレーションが行われ得、ここでは、ＤＮＡは、電気ショックによって導入される。より有利には、酢酸リチウムおよびポリエチレングリコール法が用いられ得る。それは、Gaillardinらによって記載されている：LEU2 Directed Expression of Beta-gallactosidase Activity and Phleomycin Resistance in Yarrowia lipolytica.Curr.Genet.11，１９８７，３６９−３７５。
【００３２】
破壊の存在は、ＰＣＲによって、Gussowらの技術にしたがってチェックされ：Direct Clone Characterization from Plaques and Colonies by the Polymerase Chain Reaction.Nucleic Acids Res.17，１９８９，４０００；次いで、サザンブロットハイブリッド形成によって確認される。
【００３３】
Pold株の開始時に、破壊は２段階で行われる。
【００３４】
Poldは、最初に、ＰＣＲ  ＰＵＴ破壊用カセット１により変換され、選択される。次いで、Ｕｒａ＋クローンが、破壊用カセット２により変換され、ＵＲＡ３遺伝子が除かれ、それらが選択される。この手順は、四重崩壊ＭＴＬＹ３７−ｐｏｘ２ΔＰＴ−ｐｏｘ３ΔＰＴ−ｐｏｘ４ΔＰＴ−ｐｏｘ５ΔＰＵＴを得ることを可能にする。この変異体の構築物の図表表示は、下記表１において要約される。
【００３５】
【表１】
0005615859.tif 000002
【００３６】
遺伝子の破壊およびマーカーの切除はまた、組み換えを含む方法またはリコンビナーゼによってなされ得る。例えば、いずれかの側に、反復配列（選択された組み換えを可能にする）またはリコンビナーゼＣｒｅによって認識されるｌｏｘ配列を有するマーカーを用いることが可能である。リコンビナーゼＣｒｅが発現させられた場合に切除は起こる（Fickersら，2003 New Disruption Cassettes for Rapid Gene Disruption and Marker Rescue in the Yeast Yarrowia lipolytica.J.Microbiol.Methods 55/3:727-737）。
【００３７】
（２．ヤロウイア・リポリティカ変異株ＭＴＬＹ７４の取得）
株ＭＴＬＹ７４Ｌｅｕ＋Ｕｒａ−は変異株ＭＴＬＹ３７から構築された。
【００３８】
（２ａ）原栄養性変異体ＭＴＬＹ３７（Ｌｅｕ＋、Ｕｒａ＋）から、本発明者らは、ロイシンおよびウラシル栄養要求性ヤロウイア・リポリティカ変異株ＭＴＬＹ６６（Ｌｅｕ−、Ｕｒａ−）を構築する。第一段階は、マーカーｕｒａ３−４１によるマーカーＵＲＡ３の変換、このマーカーを含有するＰＣＲフラグメントを形質転換することおよび５ＦＯＡの存在下にＵｒａ−を選択することによるウラシル栄養要求性株ＭＴＬＹ４０（Ｌｅｕ＋、Ｕｒａ−）の構築である。変異体ＭＴＬＹ４０から、本発明者らは、ロイシン栄養要求性ヤロウイア・リポリティカ変異株ＭＴＬＹ６４（Ｌｅｕ−、Ｕｒａ−、Ｈｙｇ＋）を、マーカーＬＥＵ２を破壊すること、破壊用カセットＰＨＴｌｅｕ２を変換することおよび抵抗性ヒグロマイシン形質転換体（ｌｅｕ２：：Ｈｙｇ）を選択することによって構築する。ＭＴＬＹ６４変異株から、本発明者らは、ロイシン栄養要求性ヤロウイア・リポリティカ変異株ＭＴＬＹ６６（Ｌｅｕ−、Ｕｒａ−）を、ＨＹＧマーカーを切除すること、リコンビナーゼＣｒｅおよびマーカーＬＥＵ２（Ｃｒｅ−ＬＥＵ２）を含有する複製ベクターｐＲＲＱ２を軽質転換することおよび感受性ハイゴロマイシン形質転換体Ｌｅｕ＋を選択することにより構築する。プラスミドｐＲＲＱ２の喪失は、富栄養培地ＹＰＤ上での培養およびクローン（Ｌｅｕ−、Ｕｒａ−、Ｈｙｇ−）の単離によって達成される。
【００３９】
（２ｂ）変異体ＭＴＬＹ６６から、本発明者らは、ＮＡＤＰＨ−シトクロムリダクターゼを過剰発現させるヤロウイア・リポリティカ変異株ＭＴＬＹ７４  Ｌｅｕ＋  Ｕｒａ−を、脂肪酸、脂肪酸エステルまたは天然油タイプの生物変換基質によって誘導される強いプロモーターｐＰＯＸ２の制御下にそれを発現させることにより構築する。
【００４０】
ＮＡＤＰＨ−シトクロムリダクターゼをコードする遺伝子（ＣＰＲ）は、脂肪酸、脂肪酸エステルまたは天然油によって誘導可能なプロモーターｐＰＯＸ２の制御下に、選択遺伝子ＬＥＵ２、ＪＭＰ２１（例）を含有するベクター中に導入される。マーカー−プロモータ−遺伝子のカセット（ＬＥＵ２−ｐＰＯＸ２−ＣＰＲ）は、変換によって導入される。
【００４１】
この変異体の構築物の概略表示は、以下の表２に要約される。
【００４２】
【表２】
0005615859.tif 000003
【００４３】
（３  共通の変異体ＭＴＬＹ７４からの株ＭＴＬＹ７９、ＭＴＬＹ８０およびＭＴＬＹ８１の取得）
（３ａ）脂肪酸、脂肪酸エステルまたは天然油によって誘導可能なプロモーターｐＰＯＸ２の制御下にＮＡＤＰＨ−シトクロムリダクターゼおよびシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼＡＬＫ１を発現させるＭＴＬＹ７９。
【００４４】
変異体ＭＴＬＹ７４から、本発明者らは、ＮＡＤＰＨ−シトクロムリダクターゼおよびシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼＡＬＫ１を過剰発現させるヤロウイア・リポリティカ変異株ＭＴＬＹ７９を、生物変換条件下、脂肪酸、脂肪酸エステルまたは天然油タイプの生物変換基質によって誘導される強いプロモーターｐＰＯＸ２の制御下に構築する。
【００４５】
本発明者らは、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼをコードするＡＬＫ１遺伝子を、脂肪酸、脂肪酸エステルまたは天然油によって誘導可能なプロモーターｐＰＯＸ２の制御下に、ＵＲＡ３選択遺伝子（例えば、ＪＭＰ６１）を含有するベクター中に導入する。マーカー−プロモーター−遺伝子のカセット（ＵＲＡ３−ｐＰＯＸ２−ＡＫＬ１）は変換によって導入される。
【００４６】
この変異体の構築物の概略表示は、以下の表３に要約される。
【００４７】
【表３】
0005615859.tif 000004
【００４８】
（３ｂ）脂肪酸、脂肪酸エステルまたは天然油によって誘導可能なプロモーターｐＰＯＸ２の制御下にＮＡＤＰＨ−シトクロムリダクターゼおよびシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼＡＬＫ２を発現させるＭＴＬＹ８０。
【００４９】
変異体ＭＴＬＹ７４から、本発明者らは、ＮＡＤＰＨ−シトクロムリダクターゼ（ＣＰＲ）およびシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＡＬＫ２）をコードする遺伝子を過剰発現させるヤロウイア・リポリティカ変異株ＭＴＬＹ８０を、生物変換条件下、脂肪酸、脂肪酸エステルまたは天然油タイプの生物変換基質によって誘導される強いプロモーターｐＰＯＸ２の制御下に構築する。
【００５０】
本発明者らは、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼをコードするＡＬＫ２遺伝子を、脂肪酸、脂肪酸エステルまたは天然油によって誘導可能なプロモーターｐＰＯＸ２の制御下に、ＵＲＡ３選択遺伝子（例えばＪＭＰ６１）を含有するベクター中に導入する。マーカー−プロモーター−遺伝子のカセット（ＵＲＡ３−ｐＰＯＸ２−ＡＫＬ２）は、変換によって導入される。
【００５１】
この変異体の構築物の概略表示は、以下の表４に要約される。
【００５２】
【表４】
0005615859.tif 000005
【００５３】
（３ｃ）脂肪酸、脂肪酸エステルまたは天然油によって誘導可能なプロモーターｐＰＯＸ２の制御下にシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＡＬＫ１またはＡＬＫ２）の遺伝子なしでＮＡＤＰＨ−シトクロムリダクターゼを発現させるＭＴＬＹ８１。
【００５４】
変異体ＭＴＬＹ７４から、本発明者らは、ＮＡＤＰＨ−シトクロムリダクターゼ（ＣＰＲ）をコードする遺伝子を過剰発現させるヤロウイア・リポリティカ変異株ＭＴＬＹ８１を、脂肪酸、脂肪酸エステルまたは天然油タイプの生物変換基質によって誘導される強いプロモーターｐＰＯＸ２の制御下に構築する。
【００５５】
変異体ＭＴＬＹ７４は、マーカーＵＲＡ３を有するプラスミドＪＭＰ６１による形質転換によって無機物栄養性にされる。
【００５６】
この変異体の構築物の概略表示は、以下の表５に要約される。
【００５７】
【表５】
0005615859.tif 000006
【００５８】
（４  変異株ＦＴ１２０の取得）
この株は、ＭＴＬＹ３７株またはＭＴＬＹ６６株の構築と同一の手順に従うことによって得られ得る。
【００５９】
１）対抗選択マーカー、例えばマーカーＵＲＡ３（これにより、Ｕｒａ＋表現型またはＵｒａ−表現型について選択し得る）を用いる、または、いずれかの側上に、反復配列（選択された組み換えを可能にする）またはリコンビナーゼＣｒｅによって認識されるｌｏｘ配列を有するマーカー（選択された組み換えを可能にする）を用いる、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）またはクローニングにより破壊用カセットを構築する。
【００６０】
２）削除された興味遺伝子を有する株を選択し（変換、および軽質転換体；マーカーがＵＲＡ３ならば有利にはＵｒａ＋の選択）および遺伝子破壊をチェックする。
【００６１】
３）削除されたマーカーを有する株を選択し（変換および軽質転換体の選択）；マーカーがＵＲＡ３ならば有利には５ＦＯＡＲまたはマーカーがｌｏｘ配列を示すならば有利にはリコンビナーゼを発現させるプラスミド；および遺伝子破壊をチェックする。
【００６２】
変異株ＦＴ１２０を得るための特定の方法が以下に記載される。
【００６３】
変異体ＭＴＬＹ６６から、本発明者らは、株ＦＴ１２０Ｌｅｕ−Ｕｒａ−，Δｐｏｘ１−６を構築する。
【００６４】
（４ａ）変異体ＭＴＬＹ６６  Δｐｏｘ２−５から、本発明者らは、ヤロウイア・リポリティカ変異株ＭＴＬＹ９５  Δｐｏｘ１−６を、ＰＯＸ１およびＰＯＸ６遺伝子の削除部およびマーカーの削除部の挿入により上記の方法に従って構築する。
【００６５】
（４ｂ）変異体ＭＴＬＹ９５から、本発明者らは、生物変換条件下にＮＡＤＰＨ−シトクロムリダクターゼ（ＣＰＲ）をコードする遺伝子を過剰発現させるヤロウイア・リポリティカ変異株ＦＴ１０１  Ｌｅｕ＋Ｕｒａ−を、脂肪酸、脂肪酸エステルまたは天然油タイプの生物変換基質によって誘導される強いプロモーターｐＰＯＸ２の制御下にそれを発現させることによって構築する。
【００６６】
本発明者らは、脂肪酸、脂肪酸エステルまたは天然油によって誘導可能なプロモーターｐＰＯＸ２の制御下に、ＮＡＤＰＨ−シトクロムリダクターゼをコードする遺伝子を、切除可能なＬＥＵ２選択遺伝子ＪＭＰ２１−ＬＥＵ２ｅｘ（例）を含有するベクター内に導入した。マーカー−プロモーター−遺伝子のカセット（ＬＥＵ２ｅｘ−ｐＰＯＸ２−ＣＰＲ）は、形質転換によって導入される。ＦＴ１２０株は、マーカーＬＥＵ２ｅｘの切除後に、ｐＵＢ４−ＣＲＥプラスミド（Ｈｙｇ＋選択）による変換、ＹＰＤ上のプラスミド喪失および最後のＬｅｕクローンの単離によって得られる。
【００６７】
この変異体の構築物の概略表示は、以下の表６に要約される。
【００６８】
【表６】
0005615859.tif 000007
【００６９】
（５  変異株ＦＴ１３０の取得）
この株は、株ＦＴ１２０の構築物と同一の手順に従うことによって得られ得る。
【００７０】
１）対抗選択マーカー、例えば、マーカーＵＲＡ３（これにより、Ｕｒａ＋表現型またはＵｒａ−表現型を選択することができる）を用いる、または、いずれかの側上に、反復配列を有するマーカー（選択された組み換えを可能にする）またはリコンビナーゼＣｒｅによって認識されるｌｏｘ配列を用いる、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）またはクローニングによって破壊用カセットを構築する。
【００７１】
２）削除された興味遺伝子を有する株を選択し（変換および形質転換体の選択：マーカーがＵＲＡ３であれば有利にはＵｒａ＋）、遺伝子破壊をチェックする。
【００７２】
３）削除されたマーカーを有する株を選択し（変換および形質転換体の選択；マーカーがＵＲＡ３ならば有利には５ＦＯＡＲ、または、マーカーがｌｏｘ配列を示すならば有利にはリコンビナーゼＣｒｅを発現させるプラスミド）、遺伝子破壊をチェックする。
【００７３】
変異株ＦＴ１３０を得るための特定の方法が以下に記載される。
【００７４】
変異体ＦＴ１２０から、本発明者らは、株ＦＴ１３０Ｌｅｕ−Ｕｒａ−，Δｐｏｘ１−６，Δｄｇａ１を構築する。
【００７５】
（６）変異体ＦＴ１２０  Ｌｅｕ−Ｕｒａ−，Δｐｏｘ１−６，ｐＰＯＸ２−ＣＰＲから、本発明者らは、ヤロウイア・リポリティカ変異体ＦＴ１３０  Ｌｅｕ−Ｕｒａ＋Δｐｏｘ１−６，ｐＰＯＸ２−ＣＰＲ，Δｄｇａｌを、アシル−ＣｏＡジアシルグリセロール・アセチルトランスフェラーゼをコードするＤＧＡ１遺伝子の削除物の挿入によって構築する。
【００７６】
【表７】
0005615859.tif 000008
【００７７】
株ＭＴＬＹ６６、ＭＴＬＹ８１、ＦＴ１２０およびＦＴ１３０は、Collection Nationale de Cultures de Microorganismesに、それぞれ登録番号ＣＮＣＭ  Ｉ−３３１９、ＣＮＣＭ  Ｉ−３３２０、ＣＮＣＭ  Ｉ−３５２７およびＣＮＣＭ  Ｉ−３５２８の下に登録されている。
【００７８】
以下の実施例は本発明を説明するが、本発明の範囲を制限するものではない。
【００７９】
（実施例）
これらの実施例において、本発明者らは、二塩基酸の産生についての培養条件および培地組成の影響を試験した。そして、本発明者らは、変異体ＭＴＬＹ３７により、ペプトンの使用が、特にバクト−トリプトンと関連して、二塩基酸の産生に非常に有利であることを観察した（実施例１および２）。
【００８０】
本発明者らはまた、同じ条件下に、変異体ＭＴＬＹ７９、ＭＴＬＹ８０およびＭＴＬＹ８１を試験した。そして、本発明者らは、ＮＡＤＰＨ−シトクロムリダクターゼが、二塩基酸の産生における制限段階を触媒することを観察した。実際に、この酵素の過剰発現のみが、二塩基酸の産生および産生能を大幅に増加させることを可能にする（実施例４〜６）。
【００８１】
本発明者らは、同一条件下に、変異株ＦＴ１２０およびＦＴ１３０を試験した（実施例７および８）。ＰＯＸ１およびＰＯＸ６遺伝子の削除は、ＦＴ１２０についての二塩基酸の分解を減少させることを可能にする。アシル−ＣｏＡジアシルグリセロール・アセチルトランスフェラーゼをコードするさらなるＤＧＡ１遺伝子の削除により、ヤロウイア・リポリティカの細胞内の脂肪体の形態にある生物変換基質の蓄積が減少する。それ故に、これらの実施例において得られた二塩基酸の大部分は、１８個の炭素原子を有する脂肪酸を有する脂肪酸から本質的になる用いられる生物変換基質のような１８個の炭素原子を有する二塩基酸からなる。
【００８２】
（実施例１：変異体ＭＴＬＹ３７によりオレインヒマワリ油からジカルボン酸を製造する方法）
組成物：酵母抽出物１０ｇ・Ｌ−１、ペプトン１０ｇ・Ｌ−１、グルコース１０ｇ・Ｌ−１、寒天（Agar）２０ｇ・Ｌ−１のグロース培地（gelosed medium）において維持される、変異体ＭＴＬＹ３７の予備培養が、０．３０近くの予備培養培地の初期吸光度を提供する播種によって行われた。予備培養は、軌道攪拌下（２００ｒｐｍ）に２４時間にわたり３０℃で、２５ｍＬの培地（１０ｇ・Ｌ−１の酵母抽出物、１０ｇ・Ｌ−１のペプトン、２０ｇ・Ｌ−１のグルコース）を含有する５００ｍＬのフランジ付きフラスコにおいて行われる。
【００８３】
培養のために用いられた培地は、脱イオン水、１０ｇ・Ｌ−１の酵母抽出物、２０ｇ・Ｌ−１のトリプトン、４０ｇ・Ｌ−１のグルコースおよび３０ｇ・Ｌ−１のオレインヒマワリ油から構成される。
【００８４】
発酵槽の播種は、予備培養フラスコの全てにより達成される。
【００８５】
培養は、３０℃で、２Ｌの培地を有し、複動半径流タービン（double-acting centripetal turbine）を備えた４Ｌの発酵槽において、０．５ｖｖｍの通気速度、８００ｒｐｍの攪拌速度で行われる。
【００８６】
１７時間の培養後、培地のグルコースが除去されて直ぐに、６０ｍＬのオレインヒマワリ油（１８個の炭素原子を有する脂肪酸から本質的になる）が、反応器に加えられ、１ｍＬ・ｈ−１の速度での連続的なグリセロール供給に付される。その時、培養のｐＨ値は、４Ｍのソーダの調整された添加によって８の一定値に維持される。発酵は１３０時間で終了する。
【００８７】
培養手順の終了時に、遠心分離によって細胞バイオマスが取り除かれる。その後、６ＭのＨＣｌを添加することによって上澄は２．５のｐＨ値まで酸性にされ、酸性ワート（wort）の遠心分離によって不溶性のジカルボン酸が集められ、次いで、乾燥させられる。
【００８８】
混合物のジカルボン酸組成は、Uchioらの「Microbial Production of Long-chain Dicarboxylic Acids from n-Alkanes.Part II.Production by Candida cloacae Mutant Usable to Assimilate Dicarboxylic Acid」（Agr Biol.Chem.36,No.3,1972,426-433）によって記載された方法によるジカルボン酸のジエステルへの変換後に、カラムＤＢ１におけるガスクロマトグラフィーによって測定される。クロマトグラフ・オーブンの温度は、１５０℃から２８０℃に８℃／分の速さでプログラムされる。
【００８９】
結果は、１３０時間後に上澄における最大の二塩基酸産生度５．９ｇ・Ｌ−１を示す。
【００９０】
（実施例２）
培養培地において、同一濃度でトリプトンをペプトンに置き換えることによって実施例１が繰り返される。培養１３０時間後に、９．９ｇ・Ｌ−１のジカルボン酸が得られた。すなわち、実施例１と関連して約６８％産生度が増加した。
【００９１】
（実施例３：連続的なオレインヒマワリ油の供給による変異体ＭＴＬＹ３７によるジカルボン酸の産生）
オレインヒマワリ油が培養培地から除かれ、かつ、反応器内への１ｍＬの二次制限（sublimiting）流量でのこの油の連続注入によって置き換えられて、実施例２が繰り返される。
【００９２】
このような条件下に、１３０時間後に１４．７ｇ・Ｌ−１のジカルボン酸が培養培地において産生される。
【００９３】
（実施例４：ＣＰＲおよびＡＬＫ１を過剰発現させる変異体ＭＴＬＹ７９によるオレインヒマワリ油からのジカルボン酸の産生）
変異体ＭＴＬＹ３７を、ＣＰＲおよびＡＬＫ１遺伝子を過剰発現させる変異体ＭＴＬＹ７９によって置き換えることによって実施例３が繰り返される。１３０時間の培養後、１６ｇ・Ｌ−１のジカルボン酸が得られた。
【００９４】
（実施例５：ＣＰＲおよびＡＬＫ２を過剰発現させる変異体ＭＴＬＹ８０によるオレインヒマワリ油からのジカルボン酸の産生）
変異体ＭＴＬＹ３７を、ＣＰＲおよびＡＬＫ２遺伝子を過剰発現させる変異体ＭＴＬＹ８０によって置き換えることによって実施例３が繰り返される。１３０時間の培養後、１６ｇ・Ｌ−１のジカルボン酸が得られる。
【００９５】
（実施例６）
変異体ＭＴＬＹ３７を、ＣＰＲ遺伝子のみを過剰発現させる変異体ＭＴＬＹ８１によって置き換えることによって実施例３が繰り返される。１３０時間の培養後、１６ｇ・Ｌ−１のジカルボン酸が得られる。
【００９６】
（実施例７：６のＰＯＸ（Δｐｏｘ１−６）遺伝子が削除され、ＣＰＲ遺伝子を過剰発現させる変異体ＦＴ１２０によるオレインヒマワリ油からのジカルボン酸の産生）
変異体ＭＴＬＹ３７を、６のＰＯＸ遺伝子が削除され、ＣＰＲ遺伝子のみを過剰発現させる変異体ＦＴ１２０によって置き換えることによって実施例３が繰り返される。１３０時間の培養後、１８ｇ・Ｌ−１のジカルボン酸が得られる。
【００９７】
（実施例８：６のＰＯＸ（Δｐｏｘ１−６）遺伝子が削除され、ＤＧＡ１遺伝子（Δｄｇａ１）が削除され、かつ、ＣＰＲ遺伝子を過剰発現させる変異体ＦＴ１３０によるオレインヒマワリ油からのジカルボン酸の産生）
変異体ＭＴＬＹ３７を、６のＰＯＸ遺伝子およびＤＧＡ１遺伝子が削除され、ＣＰＲ遺伝子を過剰発現させる変異体ＦＴ１３０によって置き換えることによって実施例３が繰り返される。１３０時間の培養後、２３ｇ・Ｌ−１のジカルボン酸が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】生物学的二塩基酸製造法を示す概略図である。
【図１】
0005615859.tif 000009