(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
スフィンゴモナス属（Sphingomonas sp.）ＭＤ２菌株（KCTC 11845BP）。
【請求項２】
スフィンゴモナス属（Sphingomonas sp.）ＭＤ２菌株（KCTC 11845BP）を含むメタン又は悪臭誘発化合物の分解用組成物。
【請求項３】
前記悪臭誘発化合物は、硫化水素、メタンチオール（methanethiol）、ジメチルスルフィド（dimethyl sulfide）、ベンゼン及びトルエンからなる群から選択された少なくとも１つの化合物である請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物は、土壌、活性炭、真砂土及びミミズ堆肥からなる群から選択された少なくとも１つをさらに含む請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
請求項２の組成物を含むメタン又は悪臭誘発化合物の分解用バイオカバー。
【請求項６】
前記バイオカバーは酸素生成剤をさらに含む請求項５に記載のバイオカバー。
【請求項７】
請求項２の組成物を含むメタン又は悪臭誘発化合物の分解用バイオフィルター。
【請求項８】
前記バイオフィルターは酸素生成剤をさらに含む請求項７に記載のバイオフィルター。
【請求項９】
請求項２〜４のいずれかの組成物をメタン又は悪臭誘発化合物の発生源に処理する段階と、
前記組成物がメタン又は悪臭誘発化合物を分解する段階とを含むメタン又は悪臭誘発化合物を分解する方法。
【請求項１０】
前記メタン又は悪臭誘発化合物の発生源は、廃棄物埋立地、ゴミ埋立地、廃水処理場、糞尿処理場、畜産廃水処理場、生ゴミ処理場、石油化学製品製造場、下水処理場、産業廃水処理場、家畜飼育場、食品加工工場、ペンキ製造工場、鋳物製造工場、石油精製施設、糞尿処理場、屠殺場、肥料製造工場、プラスチック製造焼却施設、塗装施設又はめっき工場である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
メタン又は悪臭誘発化合物の発生源にバイオ活性層を設置することにより、メタン又は悪臭誘発化合物を生物学的に分解するメタン又は悪臭誘発化合物の分解システムにおいて、
前記バイオ活性層は、
請求項５のバイオカバーが少なくとも１つ積層されたバイオカバー層と、
前記バイオカバー層を覆う通気層又は前記バイオカバー層の下部に積層される通気層とを含むメタン又は悪臭誘発化合物の分解システム。
【請求項１２】
前記メタン又は悪臭誘発化合物の発生源は、廃棄物埋立地、ゴミ埋立地、廃水処理場、糞尿処理場、畜産廃水処理場、生ゴミ処理場、石油化学製品製造場、下水処理場、産業廃水処理場、家畜飼育場、食品加工工場、ペンキ製造工場、鋳物製造工場、石油精製施設、糞尿処理場、屠殺場、肥料製造工場、プラスチック製造焼却施設、塗装施設又はめっき工場である請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
メタン又は悪臭誘発化合物の発生源にバイオ活性層を設置することにより、メタン又は悪臭誘発化合物を生物学的に分解するメタン又は悪臭誘発化合物の分解システムにおいて、
前記バイオ活性層は、
請求項７のバイオフィルターが少なくとも１つ積層されたバイオフィルター層と、
前記バイオフィルター層を覆う通気層又は前記バイオフィルター層の下部に積層される通気層とを含むメタン又は悪臭誘発化合物の分解システム。
【請求項１４】
前記メタン又は悪臭誘発化合物の発生源は、廃棄物埋立地、ゴミ埋立地、廃水処理場、糞尿処理場、畜産廃水処理場、生ゴミ処理場、石油化学製品製造場、下水処理場、産業廃水処理場、家畜飼育場、食品加工工場、ペンキ製造工場、鋳物製造工場、石油精製施設、糞尿処理場、屠殺場、肥料製造工場、プラスチック製造焼却施設、塗装施設又はめっき工場である請求項１３に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スフィンゴモナス属（Sphingomonas sp.）ＭＤ２菌株（KCTC 11845BP）、前記菌株を含むメタン又は悪臭誘発化合物の分解用組成物、前記組成物を含むバイオカバー又はバイオフィルター、前記組成物を用いたメタン又は悪臭誘発化合物の分解方法、前記バイオカバー又はバイオフィルターを用いたメタン又は悪臭誘発化合物の分解システム、及びメタン又は悪臭誘発化合物を分解するための前記菌株の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
嫌気性条件下においては、有機物が微生物により分解されてメタンと二酸化炭素に最終分解され、このような分解過程で硫化水素、メタンチオール（methanethiol, MT）、ジメチルスルフィド（dimethyl sulfide, DMS）、アンモニア、アミン、脂肪酸などの悪臭物質が発生する。よって、埋立地、生ゴミ処理施設、嫌気性消化槽などの有機性廃棄物処理施設及び工程、畜舎などはメタンと悪臭が同時に排出される代表的な施設（工程）として知られている。とりわけ、埋立地はメタンと悪臭が同時に排出される最も代表的な施設であり、２００７年現在、韓国全国に２２７箇所（環境部資源循環局, 2007）が あり、総埋立可能面積と埋立容量はそれぞれ２９，２１３，０００ｍ2、３７９，４１６，０００ｍ3である。これら埋立地の埋立ガスの処理状況を見ると、埋立ガスを捕集して高濃度メタンを資源化できる設備を備えた埋立地は全体の４％（10箇所）にすぎず、ほとんどの埋立地（199箇所, 89%）において埋立ガスは大気中に拡散している状況である。
【０００３】
メタンは二酸化炭素に次いで重要な温室気体であり、大気全体の放射強制力（radiative forcing）の１８％を占める。大気中のメタン濃度は産業革命以降２倍以上増加したので、多くの研究はメタンの発生源（source）と除去（sink）に関するものであるか、それに関する微生物の発見に焦点が合わされている（Bodelier et al., FEMS Microbiol. Ecol. 52, 163-174, 2005）。また、従来の研究は、地球規模炭素循環（global carbon cycle）において重要な役割を果たすメタン酸化細菌の生息地による分布と多様性の調査に集中していた（Bodelier et al., FEMS Microbiol. Ecol. 52, 163-174, 2005）。
【０００４】
代表的なメタン発生源は埋立地であるが、埋立地から発生するメタンは米国で人為的に発生するメタンの約３５％、大気中で発生するグローバルメタンの５〜１０％を占めるものと推定される（IPCC, 2001; Stern et al., Waste Manage. 27, 1248-1258, 2007）。廃棄物処理中で 発生するメタンの低減に関する代表的な従来技術は埋立ガスの捕集及び資源化技術であるが、この技術は不良埋立地やメタンが低濃度で排出される場合には適用が困難であるという問題がある。
【０００５】
また、埋立地、生ゴミ処理施設、畜産廃棄物処理施設などの有機性廃棄物処理施設においては、メタンと同時に排出される悪臭が苦情の主因となっている。２００６年の生活インフラに対する悪臭苦情のうち、これら有機性廃棄物処理施設に対する悪臭苦情が６０％を占め（環境部大気管理課, 2006）、有機性廃棄物処理施設に対する悪臭苦情のうち、３２％は埋立地の悪臭に関するものであることが報告されている（環境部大気管理課, 2006）。このような埋立地の悪臭誘発物質は非常に多様であるが、そのうち硫化水素が悪臭に対する寄与が最も高く、硫化水素の濃度は０．７〜１４６３．５ｍｇ／ｍ3、排出速度は０．３〜６３３．５ｍｇ・ｍ-2・ｈ-1程度であることが知られている。韓国国内における埋立地の悪臭状況調査によれば、高濃度の悪臭を伴う埋立ガスが埋立層と覆土層のクラック（crack）やホール（hole）の発生部分から大気中に排出されて深刻な悪臭問題を引き起こすことが報告されており、クラックが発生した覆土表面の埋立ガスにおける悪臭濃度は希釈倍数で約１７，０００、硫化水素濃度は４００，０００ｐｐｂ以上であることが報告されている。また、圧縮機を用いて廃棄物が過度に固められると埋立ガスが側面傾斜面に移動排出されるので、傾斜面の悪臭管理が必要であることが知られている。
【０００６】
このような埋立地などの有機性廃棄物処理施設（工程）における悪臭管理は悪臭測定とモニターを中心に行われており、悪臭制御対策としては脱臭剤散布など消極的な対応しか行われていない現状である。また、今後、埋立地、糞尿／家畜糞尿処理施設、その他有機性廃棄物処理施設などの公共環境施設における悪臭排出施設設置申告が義務化される予定であるので、これらの施設に対するより根本的な悪臭低減が求められている現状である。
【０００７】
近年、悪臭低減効率に優れた覆土材の活用、クラックが発生した部分へのｏｎ−ｓｉｔｅバイオフィルターの設置、埋立ガス捕集孔への移動式バイオフィルターの設置など様々な悪臭低減技術の適用が提案されているが、悪臭低減の投資額の割りには便益が低く、根本的かつ積極的な悪臭低減技術を適用できていない現状である。特に、メタン低減技術に比べて悪臭管理の技術開発は非常に活発に進められ、物理、化学、生物、複合技術など非常に多様な悪臭管理技術が開発されて商用化されており、様々な種類の悪臭管理及び制御技術が開発されているにもかかわらず、埋立地をはじめとする大規模な非特定汚染源に従来の悪臭低減技術を適用するには設置費や操業費などの経済的妥当性が低く、これらの発生源の悪臭問題は解決できずにいる現状である。
【０００８】
よって、悪臭低減と同時にメタン低減が可能であれば、メタン低減に伴う炭素排出権確保という経済的な効果が新たに創出されるので、このような悪臭のみ低減する技術を導入する際に発生するコスト負担の問題は解消される。また、埋立地などの廃棄物処理施設の悪臭問題が解決されると、国家的な土地利用効率が向上し、関連産業の活性化により国家的な産業競争力の強化をもたらすことが期待される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このような背景から、本発明者らは埋立地などから発生するメタンと悪臭を同時に除去するための技術開発のために鋭意努力した結果、新規なスフィンゴモナス属菌株がメタンのみならず、悪臭誘発化合物も同時に除去できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、スフィンゴモナス属（Sphingomonas sp.）ＭＤ２菌株（KCTC 11845BP）を提供することを目的とする。
【００１１】
また、本発明は、スフィンゴモナス属（Sphingomonas sp.）ＭＤ２菌株（KCTC 11845BP）を含むメタン又は悪臭誘発化合物の分解用組成物を提供することを目的とする。
【００１２】
さらに、本発明は、前記組成物を含むメタン又は悪臭誘発化合物の分解用バイオカバーを提供することを目的とする。
【００１３】
さらに、本発明は、前記組成物を含むメタン又は悪臭誘発化合物の分解用バイオフィルターを提供することを目的とする。
【００１４】
さらに、本発明は、前記組成物を用いてメタン又は悪臭誘発化合物を分解する方法を提供することを目的とする。
【００１５】
さらに、本発明は、メタン又は悪臭誘発化合物の発生源に前記バイオカバーが少なくとも１つ積層されたバイオカバー層と、前記バイオカバー層を覆う通気層又は前記バイオカバー層の下部に積層される通気層とを含むバイオ活性層を設置することにより、メタン又は悪臭誘発化合物を生物学的に分解するメタン又は悪臭誘発化合物の分解システムを提供することを目的とする。
【００１６】
さらに、本発明は、メタン又は悪臭誘発化合物の発生源に前記バイオフィルターが少なくとも１つ積層されたバイオフィルター層と、前記バイオフィルター層を覆う通気層又は前記バイオフィルター層の下部に積層される通気層とを含むバイオ活性層を設置することにより、メタン又は悪臭誘発化合物を生物学的に分解するメタン又は悪臭誘発化合物の分解システムを提供することを目的とする。
【００１７】
さらに、本発明は、メタン又は悪臭誘発化合物を分解するためのスフィンゴモナス属（Sphingomonas sp.）ＭＤ２菌株（KCTC 11845BP）の用途を提供することを目的とする。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によるスフィンゴモナス属ＭＤ２菌株及びそれを用いたメタン又は悪臭誘発化合物の同時分解方法によれば、メタンのみならず、悪臭も同時に効果的に除去することができるので、従来のメタンと悪臭を個別に処理するのにかかっていた経費を削減することができ、埋立地などのメタンと悪臭成分を同時に効果的に分解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】スフィンゴモナス属ＭＤ２の系統発生学的関係を示す図である。
【図２】従来のメタン酸化細菌Ｍ６とＭＤ２菌株の成長曲線を比較した結果を示すグラフである。
【図３】スフィンゴモナス属ＭＤ２のメタン及びＤＭＳ分解特性を示すグラフであり、（ａ）はメタンのみ添加した条件、（ｂ）、（ｃ）はメタンとＤＭＳを共に添加した条件、（ｄ）はＤＭＳのみ添加した条件である。
【図４】スフィンゴモナス属ＭＤ２菌株を用いたバイオカバーの性能評価のためのバイオカバー装置の構成を示す図である。
【図５】バイオカバー１におけるメタンの出口と入口の濃度（ａ）及び除去効率（ｂ）を示すグラフである。
【図６】バイオカバー２におけるメタンの出口と入口の濃度（ａ）及び除去効率（ｂ）を示すグラフである。
【図７】バイオカバー２におけるＤＭＳの出口と入口の濃度（ａ）及び除去効率（ｂ）を示すグラフである。
【図８】バイオカバー３におけるメタンの出口と入口の濃度（ａ）及び除去効率（ｂ）を示すグラフである。
【図９】バイオカバー３におけるベンゼン又はトルエンの出口と入口の濃度（ａ）及び除去効率（ｂ）を示すグラフである。
【図１０】バイオカバー３におけるＤＭＳの出口と入口の濃度（ａ）及び除去効率（ｂ）を示すグラフである。
【図１１】スフィンゴモナス属ＭＤ２菌株を用いたバイオフィルターの性能評価のためのバイオフィルター装置の構成を示す図である。
【図１２】バイオフィルター１におけるメタンの出口と入口の濃度（ａ）及び除去効率（ｂ）を示すグラフである。
【図１３】バイオフィルター２におけるメタンの出口と入口の濃度（ａ）及び除去効率（ｂ）を示すグラフである。
【図１４】バイオフィルター２におけるＤＭＳの出口と入口の濃度（ａ）及び除去効率（ｂ）を示すグラフである。
【図１５】バイオフィルター３におけるメタンの出口と入口の濃度（ａ）及び除去効率（ｂ）を示すグラフである。
【図１６】バイオフィルター３におけるＤＭＳの出口と入口の濃度（ａ）及び除去効率（ｂ）を示すグラフである。
【図１７】バイオフィルター３におけるベンゼン又はトルエンの出口と入口の濃度（ａ）及び除去効率（ｂ）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
上記課題を解決するための一様態として、本発明は、スフィンゴモナス属（Sphingomonas sp.）ＭＤ２菌株（KCTC 11845BP）を提供する。
【００２１】
本発明によるスフィンゴモナス属（Sphingomonas sp.）ＭＤ２菌株は、本発明者らにより新たに同定された微生物であり、メタンのみならず、ジメチルスルフィド、硫化水素などの悪臭誘発化合物も分解できる微生物である。
【００２２】
本発明者らは、埋立地及び湿地の土壌と集積培養培地を添加した培養瓶を密封し、炭素源としてメタンとＤＭＳを注入するが、培養中は窒素とリンを継続的に供給し、その後集積培養液を接種源として用いてメタン及び悪臭（悪臭誘発化合物）分解能に優れた新規メタン酸化細菌を分離し、菌体のＤＮＡを抽出して１６Ｓ ｒＤＮＡ部分の塩基配列を分析した結果、スフィンゴモナス属の新規菌株であることを見出し、この新規のメタンと悪臭誘発化合物を同時に分解できるスフィンゴモナス属微生物をＭＤ２菌株と命名した（表１及び図１）。前記スフィンゴモナス属ＭＤ２菌株は２０１１年１月６日付けで韓国生命工学研究院生物資源センターに寄託して寄託番号ＫＣＴＣ １１８４５ＢＰが付与された。
【００２３】
また、本発明によるスフィンゴモナス属ＭＤ２菌株の成長速度を従来のメタン酸化細菌のメチロシスティス属Ｍ６（Methylocystis sp. M6, KCTC 11519BP）と比較した結果、メチロシスティス属Ｍ６菌株は４日間培養すると６００ｎｍでの吸光度値が１程度に増加したが、スフィンゴモナス属ＭＤ２菌株は複合基質を炭素源として用いながらも、従属栄養細菌であるので、培養２日以内に希釈して６００ｎｍで測定した吸光度値が１８程度まで増加した（図２）。よって、従来のメタン酸化細菌は、成長速度が非常に遅く、爆発の恐れがあって高価なメタンガスを基質として使用しなければならないので、メタン酸化細菌の大量培養が容易でなく、産業的利用に多くの制約があったが、本発明によるスフィンゴモナス属ＭＤ２菌株は有機性廃棄物などの安価な基質を用いて短時間で大量培養できるので、様々な産業分野に応用できるという利点がある。
【００２４】
他の様態として、本発明は、スフィンゴモナス属（Sphingomonas sp.）ＭＤ２菌株（KCTC 11845BP）を含むメタン又は悪臭誘発化合物の分解用組成物を提供する。
【００２５】
本発明による組成物は、メタンと悪臭を同時に分解できるスフィンゴモナス属ＭＤ２菌株（KCTC 11845BP）を含むので、メタン又は悪臭誘発化合物を分解する用途に有用に使用される。
【００２６】
本発明において、前記悪臭誘発化合物は、人を含む動物の嗅覚を刺激して不快感を感じさせる物質であり、悪臭は、食欲を失わせ、呼吸を困難にし、乗物酔いや嘔吐などを引き起こして精神の混乱をきたすことが知られている。
【００２７】
前記悪臭誘発化合物は、これらに限定されないが、アンモニア、メタンチオール、硫化水素、ジメチルスルフィド、ジメチルジスルフィド、トリメチルアミン、アセトアルデヒド、スチレン、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、ｎ−バレルアルデヒド、ｉ−バレルアルデヒド、トルエン、ベンゼン、キシレン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン及びブチルアセテートからなる群から選択された少なくとも１つの化合物であり、好ましくは硫化水素、メタンチオール、ジメチルスルフィド、ベンゼン及びトルエンからなる群から選択された少なくとも１つの化合物である。
【００２８】
本発明によるメタン又は悪臭誘発化合物の分解用組成物は、本発明によるスフィンゴモナス属ＭＤ２菌株の培養のための通常の培地を含んでもよい。また、本発明による組成物は、細菌培養液の培養環境の造成のための充填剤として土壌、活性炭、真砂土及びミミズ堆肥からなる群から選択された少なくとも１つの充填剤を含んでもよい。
【００２９】
前記土壌は、これらに限定されないが、田／畑の土壌、森林の土壌、湿地の土壌などを使用することができ、表面層から１０〜２００ｃｍの深さで採取し、その後２ｍｍ以下の篩にかけて大きな粒子を除去して使用することができる。
【００３０】
前記ミミズ堆肥は、ミミズの体内から分泌された各種酵素、鉱物質、まだ消化されていない餌、腸から分泌されたアンモニアなどが混合した物質であり、下水処理過程で発生した下水汚泥をミミズの餌として供給し、生産されたミミズ堆肥を６カ月以上かけて自然発酵／乾燥させ、その後不純物を除去して粒子サイズを０．２〜２ｍｍにしたものを使用することができる。
【００３１】
本発明によるメタン又は悪臭誘発化合物の分解用組成物に含まれる充填剤については、メタン又は悪臭発生源の環境、悪臭誘発化合物の種類及び量、使用環境及び使用条件などの諸事情を考慮して、当業者が充填剤の種類及び量を適宜選択して本発明による組成物に含ませてもよいことは明らかである。
【００３２】
また、本発明によるメタン又は悪臭誘発化合物の分解用組成物は、メタンの分解効率を向上させるために、通常のメタン酸化細菌をさらに含んでもよい。前記メタン酸化細菌としては、メチロモナス属（Methylomonas）、メチロミクロビウム属（Methylomicrobium）、メチロバクター属（Methylobacter）、メチロカルダム属（Methylocaldum）、メチロファーガ属（Methylophaga）、メチロサルシナ属（Methylosarcina）、メチロサーマス属（Methylothermus）、メチロハロビウス属（Methylohalobius）、メチロスファエラ属（Methylosphaera）、メチロシスティス属（Methylocystis）、メチロセラ属（Methylocella）、メチロカプサ属（Methylocapsa）、メチロシナス属（Methylosinus）、メチロコッカス属（Methylococcus）などを単独で又は２種以上含んでもよい。
【００３３】
さらに他の様態として、本発明は、スフィンゴモナス属（Sphingomonas sp.）ＭＤ２菌株（KCTC 11845BP）を含むメタン又は悪臭誘発化合物の分解用組成物を含むメタン又は悪臭誘発化合物の分解用バイオカバーを提供する。
【００３４】
本発明によるメタン又は悪臭誘発化合物の分解用組成物をメタン又は悪臭誘発化合物の分解用バイオカバーに入れ、前記バイオカバーをメタン又は悪臭誘発化合物の発生源に設置してメタン又は悪臭誘発化合物と接触させると、メタン又は悪臭誘発化合物を効果的に分解することができる。
【００３５】
本発明によるバイオカバーは、本発明によるメタン又は悪臭誘発化合物の分解用組成物を含有するバイオメディア層を含んでもよく、前記バイオメディア層は、メタン及び悪臭誘発化合物を生物学的に分解でき、メタンと悪臭誘発化合物を同時に分解できるスフィンゴモナス属（Sphingomonas sp.）ＭＤ２菌株（KCTC 11845BP）を含む。
【００３６】
また、前記バイオメディア層は、メタンの分解効率を向上させるために、通常のメタン酸化細菌をさらに含んでもよく、前記メタン酸化細菌の種類は前述した通りである。
【００３７】
また、前記バイオメディア層は、細菌の培養のための培地と培養液の培養環境の造成のための充填剤として土壌、活性炭、真砂土及びミミズ堆肥からなる群から選択された少なくとも１つを含んでもよい。
【００３８】
また、前記バイオメディア層は、スフィンゴモナス属（Sphingomonas sp.）ＭＤ２菌株（KCTC 11845BP）などの微生物が必要とする酸素を供給し、バイオカバーの厚さを薄くするために、酸素生成剤をさらに含んでもよく、これらに限定されないが、過酸化マグネシウム、過酸化カルシウム及び過炭酸ナトリウムからなる群から選択された少なくとも１つを酸素生成剤として含んでもよい。
【００３９】
さらに他の様態として、本発明は、スフィンゴモナス属（Sphingomonas sp.）ＭＤ２菌株（KCTC 11845BP）を含むメタン又は悪臭誘発化合物の分解用組成物を含むメタン又は悪臭誘発化合物の分解用バイオフィルターを提供する。
【００４０】
本発明によるメタン又は悪臭誘発化合物の分解用組成物をバイオフィルター内の担体に入れ、前記バイオフィルターをメタン又は悪臭誘発化合物の発生源に設置してメタン又は悪臭誘発化合物をフィルタリングすると、メタン又は悪臭誘発化合物を効果的に分解することができる。
【００４１】
本発明によるバイオフィルターは、本発明によるメタン又は悪臭誘発化合物の分解用組成物を含有する担体を含んでもよく、前記担体は、本発明によるメタン及び悪臭誘発化合物を分解するスフィンゴモナス属ＭＤ２菌株の付着及び生育のためのものであり、これらに限定されないが、土壌、ミミズ堆肥、泥炭材、活性炭繊維、ポリウレタン、珪藻土、溶岩石、繊維状担体、高分子フォーム又はセラミック多孔体、軽石及び活性炭を単独で又は組み合わせて使用し、好ましくは軽石及び活性炭を組み合わせて使用し、より好ましくは直径５〜１０ｍｍの軽石及び直径４〜８ｍｍの活性炭を組み合わせて使用する。
【００４２】
また、前記バイオフィルターは、スフィンゴモナス属（Sphingomonas sp.）ＭＤ２菌株（KCTC 11845BP）などの微生物が必要とする酸素を供給し、バイオフィルターの厚さを薄くするために、酸素生成剤をさらに含んでもよく、これらに限定されないが、酸素生成剤として過酸化マグネシウム、過酸化カルシウム及び過炭酸ナトリウムからなる群から選択された少なくとも１つを含んでもよい。
【００４３】
さらに他の様態として、本発明は、本発明による組成物を用いてメタン又は悪臭誘発化合物を分解する方法を提供する。具体的には、前記分解方法は、本発明による組成物をメタン又は悪臭誘発化合物の発生源に処理する段階と、前記組成物がメタン又は悪臭誘発化合物を分解する段階とを含んでもよい。
【００４４】
前記メタン又は悪臭誘発化合物の発生源は、メタン又は悪臭誘発化合物が発生する場所であり、これらに限定されないが、廃棄物埋立地、ゴミ埋立地、廃水処理場、糞尿処理場、畜産廃水処理場、生ゴミ処理場、石油化学製品製造場、下水処理場、産業廃水処理場、家畜飼育場、食品加工工場、ペンキ製造工場、鋳物製造工場、石油精製施設、糞尿処理場、屠殺場、肥料製造工場、プラスチック製造焼却施設、塗装施設又はめっき工場である。
【００４５】
さらに他の様態として、本発明は、メタン又は悪臭誘発化合物の発生源にバイオ活性層を設置することにより、メタン又は悪臭誘発化合物を生物学的に分解するメタン又は悪臭誘発化合物の分解システムにおいて、前記バイオ活性層は、本発明によるバイオカバーが少なくとも１つ積層されたバイオカバー層と、前記バイオカバー層を覆う通気層又は前記バイオカバー層の下部に積層される通気層とを含むメタン又は悪臭誘発化合物の分解システムを提供する。
【００４６】
さらに他の様態として、本発明は、メタン又は悪臭誘発化合物の発生源にバイオ活性層を設置することにより、メタン又は悪臭誘発化合物を生物学的に分解するメタン又は悪臭誘発化合物の分解システムにおいて、前記バイオ活性層は、本発明によるバイオフィルターが少なくとも１つ積層されたバイオフィルター層と、前記バイオフィルター層を覆う通気層又は前記バイオフィルター層の下部に積層される通気層とを含むメタン又は悪臭誘発化合物の分解システムを提供する。
【００４７】
前記メタン又は悪臭誘発化合物の発生源は、前述したように、廃棄物埋立地、ゴミ埋立地、廃水処理場、糞尿処理場、畜産廃水処理場、生ゴミ処理場、石油化学製品製造場、下水処理場、産業廃水処理場、家畜飼育場、食品加工工場、ペンキ製造工場、鋳物製造工場、石油精製施設、糞尿処理場、屠殺場、肥料製造工場、プラスチック製造焼却施設、塗装施設又はめっき工場であってもよい。
【００４８】
前記バイオカバー層及びバイオフィルター層は、本発明によるスフィンゴモナス属ＭＤ２菌株を含むので、メタン又は悪臭誘発化合物を生物学的に分解することができる。
【００４９】
前記バイオカバー層及びバイオフィルター層は、前述した通常のメタン酸化細菌をさらに含んでもよい。
【００５０】
前記バイオカバー層は、メタン及び悪臭誘発化合物の酸化効率を向上させるために、充填剤として土壌、活性炭、真砂土及びミミズ堆肥からなる群から選択された少なくとも１つを含み、好ましくは土壌、活性炭、ミミズ堆肥及び真砂土を含み、より好ましくは４：２：１：１の重量比で土壌、活性炭、ミミズ堆肥及び真砂土を含む。
【００５１】
前記バイオフィルター層は、本発明によるメタン又は悪臭誘発化合物の分解用組成物を含有する担体を含んでもよく、前記担体は、これらに限定されないが、土壌、ミミズ堆肥、泥炭材、活性炭繊維、ポリウレタン、珪藻土、溶岩石、繊維状担体、高分子フォーム又はセラミック多孔体、軽石及び活性炭を単独で又は組み合わせて使用し、好ましくは軽石及び活性炭を組み合わせて使用し、より好ましくは直径５〜１０ｍｍの軽石及び直径４〜８ｍｍの活性炭を組み合わせて使用する。
【００５２】
前記バイオカバー層の厚さは２０〜１００ｃｍであることが好ましい。前記厚さが２０ｃｍ未満では、メタン酸化細菌とメタンガスが接触する時間が短く、酸化作用が十分に起こらないので、メタンガスが二酸化炭素に変換されず、前記厚さが１００ｃｍを超えると、大気に拡散する酸素がバイオカバー層の底面まで拡散しないので、好気性条件を形成することができない。
【００５３】
前記バイオカバー層及びバイオフィルター層は酸素を供給するための通気層が覆っており、前記通気層を構成する成分は酸素供給が可能な粒子サイズを有するものであれば特に限定されるものではない。例えば、砂や砂利で構成される。また、前記通気層には空気を供給できる通気管が少なくとも１つ設置され、前記通気管を介して送風機で空気を注入することができる。
【００５４】
さらに他の様態として、本発明は、メタン又は悪臭誘発化合物を分解するためのスフィンゴモナス属（Sphingomonas sp.）ＭＤ２菌株（KCTC 11845BP）の用途を提供する。
【００５５】
本発明によるスフィンゴモナス属ＭＤ２菌株は、メタンのみならず、悪臭も同時に効果的に除去することができるので、従来の埋立地などでメタンと悪臭を個別に処理するのにかかっていた経費を削減することができ、メタンと悪臭成分を同時に効果的に分解するために有用に使用される。
【００５６】
以下、本発明の実施例及び比較例により本発明をより詳細に説明するが、本発明の範囲が後述する実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００５７】
実施例１
メタンと悪臭誘発化合物の同時分解細菌コンソーシアムの確保
メタンと悪臭誘発化合物（以下、悪臭と混用して使用する）の同時分解集積培養液を得るために、埋立地と湿地から土壌を採取した。土壌試料は、韓國公州埋立地と加平埋立地の覆土層の表面から約１０ｃｍの深さで土壌を採取した。また、公州錦江湿地の表面から約１０ｃｍの深さで土壌を採取した。採取した土壌はそれぞれメッシュ（mesh）２ｍｍの篩にかけて小さな粒子のみ選別して運搬し、その後使用するまで４℃で保管した。
【００５８】
メタンと悪臭を同時に分解する混合菌株を得るために、集積培養を次のように行った。公州埋立地、加平埋立地及び湿地から採取した土壌を同比率（重量比）で混合した混合土壌を接種源として用いた。６００ｍｌ血清瓶に無機塩培地（nitrate mineral salts培地, NMS培地; MgSO47H2O 1g/L; CaCl22H2O 0.295g/L; KNO3 1g/L; KH2PO4 0.26g/L; Na2HPO412H2O 0.41g/L）２０ｍｌと混合土壌８ｇ−湿重量をブチルゴム栓で密封した。密封された血清瓶に、ガスタイトシリンジ（gas-tight syringe）を用いて、メタンガスシリンダ（99%v/v, Dong-A gases, Korea）からメタンガスを最終濃度が５％（v/v）になるように注入した。また、マイクロシリンジ（micro syringe）を用いてＤＭＳ溶液（99%, Acros Organics, USA）を２μｌ注入した。メタンとＤＭＳを注入して血清瓶を３０℃、２００ｒｐｍで振盪培養しながら、２日に１回ずつ血清瓶上部のヘッドスペースガスをガスタイトシリンジに０．３ｍｌ採取し、水素炎イオン化検出器（Flame Ionization detector, FID）が装着されたガスクロマトグラフィー（Gas chromatography, Agilent 6890 plus, USA）を用いてメタンとＤＭＳの残留濃度を分析した。血清瓶内のメタンとＤＭＳの濃度が検出限界（メタン20ppm, DMS5ppm）以下になると、酸素供給のために血清瓶の栓を開けて血清瓶内部の空気を外部空気に置換し、その後栓を閉めてメタンガスとＤＭＳを前記量で注入して前記条件で再培養した。このようにして再培養を５回行った。再培養中に窒素とリンが不足しないように、再培養２回に１回、窒素濃縮液（KNO3 20g/L, KH2PO4 5.2g/L）とリン濃縮液（Na2HPO412H2O 16.5g/L）をそれぞれ１ｍｌずつ血清瓶に添加した。
【００５９】
実施例２
メタン及び悪臭誘発化合物に対する分解能を有する細菌の分離及び同定
メタンと悪臭を同時に分解できる細菌を純粋分離するために、前記方法で濃化した培養液を接種源として用いて純粋菌を分離した。０．９％ＮａＣｌ溶液９ｍｌに集積培養液１ｍｌを入れて希釈し、この希釈液を０．９％ＮａＣｌ溶液に１／１０ずつ連続的に希釈した。このようにして得た希釈液をそれぞれＮＭＳ寒天プレート（NMS培地に寒天を15g/L注入して製造）に平板塗抹した。５Ｌデシケーターの内部を７０％エタノールできれいに拭いて消毒し、その後前記平板塗抹したＮＭＳ寒天プレートをデシケーターに入れ、デシケーターの蓋からメタンガス（99%）とＤＭＳ（99%）をそれぞれ２５０ｍｌ、１６．７ｍｌ注入し、３０℃で静置培養して菌株の成長を観察した。成長したコロニーを形態と色で７種選別し、各コロニーをＤｉｆｃｏTM Ｒ２Ａ寒天培地（Becton, Dickinson and Company, USA, Yeast extract 0.5g/L; Proteose Peptone No.3 0.5g/L; Casamino Acids 0.5g/L; Dextrose 0.5g/L; Soluble Starch 0.5g/L; Sodium Pyruvate 0.3g/L; Dipotassium Phosphate 0.3g/L; Magnesium sulfate 0.05g/L; Agar 15.0g/L）に接種してストリークし、３０℃で静置培養することにより、各プレートでは１種類のコロニーのみ生成されることが確認された。
【００６０】
このようにして得た７種のコロニーが純粋菌であることを確認してから、各コロニーをＲ２Ａ寒天培地に大量培養し、その後菌体を集めて４ｍｌのＮＭＳ培地が含まれる血清瓶に接種してブチルゴム栓で閉塞し、メタンは最終濃度が５％（v/v）になるように注入し、ＤＭＳ溶液は２ｍｌ注入した。時間による血清瓶のヘッドスペースのメタンとＤＭＳの濃度を分析した結果、選別された７種からメタンとＤＭＳの酸化能を明確に示す２種の菌株のうち活性が良好な１種の菌株を選択してＭＤ２と命名した。
【００６１】
メタンと悪臭の同時分解純粋菌であるＭＤ２を同定するために、メタンとＤＭＳを唯一炭素源として注入したＮＭＳ培地で２６日間培養した培養液１ｍｌを１４，０００×ｇで５分間遠心分離して得た菌体から、土壌用ＢＩＯ１０１ ＦａｓｔＤＮＡ ＳＰＩＮ Ｋｉｔ（MP Biomedicals LLC, Solon, USA）を用い、説明書に従ってＤＮＡを抽出した。抽出されたＤＮＡを２７ｆ（配列番号1; 5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3'）と１４９２ｒ（配列番号2; 5'-TAC GGY TAC CTT GTT ACG AC-3'）で増幅した。増幅条件は、第１段階で初期変性が９５℃、５分、第２段階で変性９６℃、１分、アニーリング５８℃、３０秒、増幅７２℃、１分４５秒を３０回行い、最後の段階で７２℃を１０分間維持し、増幅が終わった後は４℃に維持されるようにした。増幅されたＤＮＡはＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（QIAGEN GnH, Hilden, Germany）を用いて精製し、その後塩基配列を分析した。分析された塩基配列は、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（BLAST）アルゴリズムを用いてジェンバンクデータベース（GenBank database）と比較することにより、類似性が最も高い菌株を検索した。
【００６２】
検索の結果、メタンとジメチルスルフィドを同時に分解できる菌株ＭＤ２を分離し、１６Ｓ ｒＤＮＡ部分の塩基配列分析の結果、スフィンゴモナス属に属した。ＭＤ２菌株の塩基配列（配列番号３）を表１に示し、ＭＤ２菌株に類似する系統発生学的ツリーを図１に示す。
【００６３】
【表１】
0005627770.tif 000002
【００６４】
系統発生学的分析の結果、スフィンゴモナス属ＭＤ２は未だメタン酸化の機能が明らかにされていないアルファプロテオバクテリア（Alphaproteobacteria）綱に属するスフィンゴモナス目（Sphingomonadales）であり、そのうちスフィンゴモナス種と類似度が最も高いことが分かった。このスフィンゴモナス属ＭＤ２は、一般にメタン酸化細菌として周知のアルファプロテオバクテリア綱のリゾビウム目（Rhizobiales）やガンマプロテオバクテリア（Gammaproteobacteria）綱のメタン酸化細菌とは系統発生学的に区分されることが分かる（図１）。このような結果は、スフィンゴモナス属ＭＤ２菌株が現在まで明らかにされていないメタン酸化細菌であることを示し、前記ＭＤ２菌株は２０１１年１月６日付けで韓国生命工学研究院生物資源センターに寄託した（寄託番号KCTC 11845BP）。
【００６５】
実施例３
本発明によるスフィンゴモナス属ＭＤ２菌株と従来のメタン酸化細菌の成長速度の比較
従来のメタン酸化細菌と本発明によるＭＤ２菌株の成長速度を次の方法で比較した。従来のメタン酸化細菌としては第２型メタン資化細菌（type II methanotroph）に属するメチロシスティス属Ｍ６（Methylocystis sp. M6, KCTC 11519BP）を対象菌株として実験を行った。メチロシスティス属Ｍ６菌株は、炭素が１個のメタン又はメタノールでのみ成長が可能であるので、ＮＭＳ培地を１Ｌ添加した２Ｌ発酵槽容器にＭ６菌株を初期吸光度値（600nm）が０．１０９±０．０００２になるように接種し、２０％（v/v）メタンが含まれる空気を連続的に注入して３０℃、１８０ｒｐｍで振盪培養した。
【００６６】
本発明によるＭＤ２菌株は、複合基質を用いた培地条件でも成長可能な従属栄養細菌であるので、ＢａｃｔｏTM Ｔｒｉｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ（Becton, Dickinson and Company, USA）にＭＤ２菌株を初期吸光度値（600nm）が０．０６±０．０００７になるように接種して３０℃、１８０ｒｐｍで振盪培養した。
【００６７】
２種の菌株を培養しながら所定時間間隔で培養液を１ｍｌずつ採取し、培養液の吸光度値を６００ｎｍで測定して図２に示す。
【００６８】
図２に示すように、メチロシスティス属Ｍ６菌株を４日間培養した結果、６００ｎｍでの吸光度値が１程度に増加した。これに対して、本発明によるＭＤ２菌株は複合基質を炭素源として用いながらも、従属栄養細菌であるので、培養２日以内に希釈して６００ｎｍで測定して算出した吸光度値が１８程度まで増加した。このような結果は、従来のメタン酸化細菌は成長速度が非常に遅く、爆発の恐れがあり、高価なメタンガスを基質として使用しなければならないので、メタン酸化細菌の大量培養が容易でなく、産業的利用に多くの制約があったが、本発明によるＭＤ２菌株は有機性廃棄物などの安価な基質を用いて短時間で大量培養できるので、様々な産業分野に応用できるという特徴を有することを示す。
【００６９】
実施例４
本発明によるスフィンゴモナス属ＭＤ２のメタン及び悪臭分解能の調査
４−１．メタン及びＤＭＳ分解能の調査
本発明によるスフィンゴモナス属ＭＤ２菌株のメタン及び悪臭分解能を評価するために、ＭＤ２菌株の前培養を次のように行った。６００ｍｌ血清瓶にＮＭＳ培地を２０ｍｌずつ添加し、分離したメタン酸化純粋菌を接種してブチルゴム栓で密封した。ゴム栓で密封した血清瓶に、メタンは最終濃度が５％（v/v）となるように、ＤＭＳ溶液は２μｌ注入して３０℃、２００ｒｐｍで振盪培養しながら、２日ごとにメタンとＤＭＳの濃度を測定し、注入されたメタンとＤＭＳが検出限界点以下になると、メタンとＤＭＳを同一濃度で注入した。３回のメタンとＤＭＳの再注入後に、メタンとＤＭＳの酸化速度が低下すると、ゴム栓を開いて８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して菌体のみ回収した。回収した菌体にＮＭＳを４０ｍｌ添加して混濁させ、これを６００ｍｌ血清瓶にそれぞれ２０ｍｌずつ分注して計２本の血清瓶に継代培養した。このような方法で計３回の継代培養を経て計８本の血清瓶に菌株を準備した。
【００７０】
計８本の血清瓶で前培養された菌株を全て１本に集め、８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して菌体のみ回収した。回収した菌体にＮＭＳを５０ｍｌ添加して混濁させ、１２０ｍｌ血清瓶にそれぞれ４ｍｌずつ分注した。各血清瓶をゴム栓で密封し、３つの条件（メタンのみ添加、メタンとDMSを共に添加、及びDMSのみ添加）でメタンとＤＭＳを添加した。メタンは最終濃度が５％（v/v）になるように注入し、ＤＭＳ溶液は２ｍｌ注入した。各血清瓶を３０℃、２００ｒｐｍで振盪培養しながら、３時間に１回ずつ血清瓶上部のヘッドスペースガスをガスタイトシリンジで０．３ｍｌ採取し、ガスクロマトグラフィーを用いてメタンとＤＭＳの残留濃度を分析した。時間によるメタンとＤＭＳの濃度変化のグラフの傾きから各比酸化速度を計算した。全ての実験は３回繰り返し行い、その結果を図３に示す。
【００７１】
図３において、ＭＤ２菌株がメタンのみを単独で添加した条件ではメタンを分解することができ（図３のａ）、メタンとＤＭＳを同時に添加した条件ではメタンのみならず（図３のｂ）ＤＭＳも２日以内に完全に分解した（図３のｃ）。しかし、メタンを添加せずにＤＭＳのみを添加した条件ではＤＭＳ分解速度が非常に低かった（図３のｄ）。メタンを単独で添加した条件でのＭＤ２菌株のメタン分解速度は２６３４±１４６μｍｏｌｅ・ｇ−ｄｒｙ ｃｅｌｌ ｗｅｉｇｈｔ-1ｈ-1、メタン及びＤＭＳを同時に添加した条件でのメタンとＤＭＳの分解速度はそれぞれ２３２０±９６μｍｏｌｅ・ｇ−ｄｒｙ ｃｅｌｌ ｗｅｉｇｈｔ-1ｈ-1、５０±１６μｍｏｌｅ・ｇ−ｄｒｙ ｃｅｌｌ ｗｅｉｇｈｔ-1ｈ-1であった。このような結果は、本発明によるスフィンゴモナス属ＭＤ２菌株がメタン及びＤＭＳを同時に分解する微生物であることを示す。
【００７２】
４−２．メタン、ＭＴ及び硫化水素分解能の調査
ＤＭＳ以外の代表的な硫化系悪臭物質であるＭＴと硫化水素をＭＤ２菌株が分解できるか否かを調査するために、前記条件と同様に準備した１２０ｍｌ血清瓶（MD2菌株が接種されたNMS培地を4mｌ添加）にメタンガスを最終濃度が５％になるように注入した。これにＭＴガス（99%, Sigma Aldrich, USA）を最終濃度が１０００ｐｐｍになるように添加するか、又は硫化水素ガス（99%, Seoul special gas, Korea）を最終濃度が２０００ｐｐｍになるように添加し、その後血清瓶を３０℃、２００ｒｐｍで振盪培養した。振盪培養しながら、１日に１回ずつ血清瓶上部のヘッドスペースガスをガスタイトシリンジで０．３ｍｌ採取し、水素炎イオン化検出器を装着したガスクロマトグラフィーを用いてメタン濃度を分析した。また、血清瓶から０．０６ｍｌのガスを採取し、水素炎イオン化検出器を装着したガスクロマトグラフィーを用いてＭＴ又は硫化水素の濃度を分析して表２に示す。
【００７３】
【表２】
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【００７４】
表２の結果から、ＭＤ２菌株はＭＴや硫化水素などの悪臭誘発化合物が共存する条件でもメタンを分解できることが確認された。また、メタンのみ添加した条件でのＭＤ２菌株によるメタン分解速度と比較して、ＭＴと硫化水素が共存する条件でのメタン分解速度はそれぞれ８５％、９０％であり、ほとんど阻害されることなくメタンを分解できることが確認され、ＭＴと硫化水素をメタン共存下でも分解できることが確認された（表２）。
【００７５】
図３と表２の結果から、本発明によるスフィンゴモナス属ＭＤ２菌株は、メタンのみならず、代表的な悪臭誘発化合物であるＤＭＳ、ＭＴ及び硫化水素を分解できる能力を有する菌株であることが分かった。
【００７６】
実施例５
本発明によるスフィンゴモナス属ＭＤ２菌株の微生物製剤の製造及び菌株の生存率の評価
本発明によるＭＤ２菌株の微生物製剤は次の方法で製造した。ＢａｃｔｏTM Ｔｒｉｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ（Becton, Dickinson and Company, USA）を用い、３０℃、１８０ｒｐｍの条件で大量培養したＭＤ２菌株培養液を前処理することなくそのまま脱脂糠に吸収させ、４５℃の熱風で乾燥させて脱脂糠微生物製剤を製造した。また、ＭＤ２菌株培養液を遠心分離して（8,000rpm, 10分）菌体のみ回収し、菌体を培養液と同体積の蒸留水に懸濁し、その後ショ糖を１０ｇ／Ｌ添加してよく混合した。このＭＤ２菌体混合液をベントナイト又は澱粉に完全に吸収させ、４５℃の熱風で乾燥させた。ベントナイトを吸収剤として用いる場合はベントナイト１ｋｇにＭＤ２菌体懸濁液０．４Ｌを吸収させ（ベントナイト微生物製剤）、澱粉の場合は澱粉１ｋｇに微生物懸濁液１Ｌを吸収させて微生物製剤（澱粉微生物製剤）を製造した。
【００７７】
このように製造された各微生物製剤を容器に入れて暗室に保管し、菌株の生存率を次のように調査した。各製剤１ｇを９ｍｌの０．９％ＮａＣｌ溶液に懸濁し、０．９％ＮａＣｌ溶液を用いて順次１／１０倍ずつ滅菌水で希釈した。ＢａｃｔｏTM Ｔｒｉｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈに寒天を１５ｇ／Ｌ添加して製造したＢａｃｔｏTM Ｔｒｉｐｔｉｃ Ｓｏｙ寒天プレートに希釈液を塗抹して３０℃で培養し、プレートに生育したコロニー数を測定して表３に示す。
【００７８】
【表３】
0005627770.tif 000004
【００７９】
表３に示すように、３種のＭＤ２微生物製剤は６カ月の保管においても生菌数が大きく減少しなかった（表３）。このような結果は、本発明によるＭＤ２菌株を用いて製造した微生物製剤の安定性が優れていることを示す。
【００８０】
実施例６
本発明によるスフィンゴモナス属ＭＤ２菌株を用いたバイオカバーの性能評価
６−１．実験方法
ＭＤ２菌株を接種した機能性バイオカバーによるメタンと悪臭の同時除去特性を解明するために、実験室規模のバイオカバーを製作した。実験室規模のバイオカバーはアクリルカラムを用いて製作し、装置の詳細な構成を図４に示す。
【００８１】
バイオカバーは、直径８ｃｍ、高さ５０ｃｍの充填部と、直径８ｃｍ、高さ１５ｃｍの換気部と、直径８ｃｍ、高さ５ｃｍのガス注入部とから構成される。加平埋立地の土壌、活性炭、ミミズ堆肥、真砂土を重量比４：２：１：１で混合した土壌２．２ｋｇにＢａｃｔｏTM ｔｒｉｐｔｉｃ ｓｏｙ培地で前培養したＭＤ２菌株培養液を２００ｍｌ添加し、手でよく混合して各バイオカバーの充填部に充填した。
【００８２】
バイオカバー下端のガス注入部は、流入するガスがバイオカバー充填層に均一に供給されるように軽石（直径5〜10mm）を充填した。バイオカバーの乾燥を防止するために、給湿器（humidifier）を通過させてから、メタン／二酸化炭素（40:60%（v/v）, Seoul special gas, Korea）ガスを５ｍｌ／分の速度でバイオカバーに供給した。
【００８３】
「バイオカバー１」にはメタン／二酸化炭素ガスのみ供給した。「バイオカバー２」にはメタン／二酸化炭素／ＤＭＳ混合ガスを次の方法で供給した。ＤＭＳ溶液（99%, Junsei, Japan）と水を１：９（v/v）で混合した溶液２００ｍｌと食用油５０ｍｌを注入した１Ｌ容器をメタン／二酸化炭素ガスチューブに連結し、気化させたＤＭＳガスと混合させたメタン／二酸化炭素／ＤＭＳ混合ガスをバイオカバー２に供給した。
【００８４】
「バイオカバー３」にはメタン／二酸化炭素／ＤＭＳ／ベンゼン／トルエン混合ガスを次の方法で供給した。ベンゼン溶液（99.7%, Kanto chemical, Japan）と食用油を１：２（v/v）で混合した溶液、及びトルエン溶液（100%, JC Baker, USA）と食用油を１：２（v/v）で混合した溶液をそれぞれ２００ｍｌずつ添加した０．５Ｌ容器と、ＤＭＳ溶液を添加した１Ｌ容器をメタン／二酸化炭素ガスチューブに連結し、気化させたＤＭＳ、ベンゼン及びトルエンガスと混合させたメタン／二酸化炭素／ＤＭＳ混合ガスをバイオカバー３に供給した。各ガスの注入濃度は、メタン４０％、ＤＭＳ５００〜２，９００ｐｐｍ、ベンゼン３００〜８００ｐｐｍ、トルエン５０〜１５０ｐｐｍであった。
【００８５】
バイオカバー上端の換気部は、空気を１００ｍｌ／分の流量で注入を続けて埋立地土壌に接する大気状態を摸写したものである。バイオカバーは２０日間常温（２０±５℃）で運転した。バイオカバーを運転する間、１〜２日に１回ずつバイオカバーの入口と出口のサンプリングポートから５００−μｌガスタイトシリンジを用いて３００μｌずつ採取し、水素炎イオン化検出器が装着されたガスクロマトグラフィーで各ガス濃度を分析し、入口と出口の濃度差から各ガスの除去率を求めた。
【００８６】
６−２．実験結果
実施例６−１で得た、本発明によるスフィンゴモナス属ＭＤ２菌株を接種したバイオカバーによるメタンと悪臭の同時分解結果を図５〜図１０に示す。
【００８７】
メタンのみを単独で供給したバイオカバー１の場合、バイオカバーに流入するメタン濃度が４００，０００ｐｐｍのときのメタン除去効率は７８〜８１％で、平均約８０％の安定した除去効率を得ることができた（図５）。
【００８８】
メタンとＤＭＳを同時に供給したバイオカバー２の場合、流入メタン濃度が４００，０００ｐｐｍのときのメタン除去効率が９１〜９７％と非常に高く維持された（図６）。ＤＭＳはバイオカバーの運転初期からほぼ完全に除去され、ＤＭＳ流入濃度を段階的に５００〜２，９００ｐｐｍに増加させても安定して１００％のＤＭＳ除去能が維持された（図７）。
【００８９】
メタン、ＤＭＳ、ベンゼン、トルエンを同時に供給したバイオカバー３の場合、流入メタン濃度が４００，０００ｐｐｍのときのメタン除去効率が９６〜９８％と非常に高く維持された（図８）。ＤＭＳ、ベンゼン、トルエンはバイオカバーの運転初期からほぼ完全に除去された。また、ＤＭＳ流入濃度を段階的に５００〜２，３００ｐｐｍに増加させ、ベンゼン及びトルエンはそれぞれ３００〜８００ｐｐｍ、５０〜１５０ｐｐｍに増加させた場合も、３種の悪臭誘発化合物の全てが安定して１００％除去された（図９及び図１０）。
【００９０】
このような結果は、スフィンゴモナス属ＭＤ２菌株を接種したバイオカバーがメタンとジメチルスルフィド／ベンゼン／トルエンなどの悪臭誘発化合物を同時に効果的に除去できることを示し、その性能も安定して維持されることを意味する。
【００９１】
実施例７
本発明によるスフィンゴモナス属ＭＤ２菌株を用いたバイオフィルターの性能評価
７−１．実験方法
ＭＤ２菌株を接種した機能性バイオフィルターによるメタンと悪臭の同時除去特性を解明するために、実験室規模のバイオフィルターを製作した。実験室規模のバイオフィルターはアクリルカラムを用いて製作し、装置の詳細な構成を図１１に示す。直径８ｃｍ、高さ１００ｃｍのバイオフィルターと、直径２０ｃｍ、高さ１５ｃｍのドレイン（drain）貯蔵槽と、液体散水装置とから構成される。バイオフィルター下端に流入するガスが充填層に均一に供給されるように多孔網を設け、軽石と活性炭を担体として充填した。バイオフィルターの担体の乾燥を防止し、微生物に無機塩を連続して供給するために、ドレイン貯蔵槽に無機塩培地であるＮＭＳ培地を添加した。循環ポンプを用いて、この溶液をバイオフィルターの上部から下部に１日４回１分間噴射した。ドレイン貯蔵槽の無機塩培地は７日に１回交換した。
【００９２】
「バイオフィルター１」にはメタン／空気混合ガスを供給した。バイオフィルターの乾燥を防止するために、給湿器を通過させてから、純粋メタン（99%, Seoul special gas, Korea）ガスと空気をバイオフィルターに供給した。「バイオフィルター２」にはメタン／空気／ＤＭＳ混合ガスを次の方法で供給した。ＤＭＳ溶液（99%, Junsei, Japan）と食用油を１：２０（v/v）で混合した溶液２００ｍｌを注入した１Ｌ容器に圧縮空気を連結し、強制気化させたＤＭＳ／空気ガスとメタンガスを給湿器を通過させてから、バイオフィルター２に供給した。
【００９３】
「バイオフィルター３」にはメタン／空気／ＤＭＳ／ベンゼン／トルエン混合ガスを次の方法で供給した。ベンゼン（99.7%, Kanto, Japan）と食用油を１：２０（v/v）で混合した溶液、トルエン（100%, JC Baker, USA）と食用油を１：２０（v/v）で混合した溶液、及びＤＭＳと食用油を１：２０（v/v）で混合した溶液をそれぞれ２００ｍｌずつ添加した１Ｌ容器に並列に圧縮空気を連結し、強制気化させたＤＭＳ／ベンゼン／トルエン／空気ガスとメタンガスを給湿器を通過させてから、「バイオフィルター３」に供給した。
【００９４】
本研究で用いた担体としては軽石（直径5〜10mm, Japan）と活性炭（直径4〜8mm, Korea）を用いた。軽石と活性炭の重量比は１：１０（w/w）であり、各バイオフィルターに軽石２０００ｇ、活性炭２００ｇずつ充填した。
【００９５】
ＢａｃｔｏTM Ｔｒｉｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈで前培養したＭＤ２菌株培養液５００ｍｌとミミズ堆肥（蘭芝汚物処理場, Korea）をＮＭＳで１０倍希釈した溶液５００ｍｌを１．５ＬのＮＭＳと共にドレイン貯蔵槽に接種し、菌が担体に吸着されるように、循環ポンプを用いてこの溶液をバイオフィルターに計７日間１日４回２分間噴射した。
【００９６】
「バイオフィルター１」はメタン供給濃度１〜６％、滞留時間２０分（250mｌ/min; 3h-1）の条件で２０日間常温（２０±５℃）で運転した。「バイオフィルター２」は、メタン供給濃度１〜６％、ＤＭＳ５０〜３００ｐｐｍ、滞留時間２０分（250mｌ/min; 3h-1）の条件で２０日間常温（２０±５℃）で運転した。また、「バイオフィルター３」はメタン供給濃度１〜５％、ＤＭＳ５０〜３００ｐｐｍ、ベンゼンとトルエン１０〜２００ｐｐｍ、滞留時間２０分（250mｌ/min; 3h-1）の条件で２０日間常温（２０±５℃）で運転した。
【００９７】
メタン、ＤＭＳ、ベンゼン及びトルエンの濃度はバイオフィルターの入口と出口のガスを５００−μｌガスタイトシリンジで３００μｌずつ採取し、水素炎イオン化検出器が装着されたガスクロマトグラフィーで各ガス濃度を分析した。入口と出口の濃度差から各ガスの除去率を求めた。また、メタン、ＤＭＳ、ベンゼン及びトルエン分解産物をモニターするために、試料ガス中の二酸化炭素濃度を熱伝導度検出器（Thermal Conductivity Detector）が装着されたガスクロマトグラフィーで分析し、ＭＴ及び硫化水素濃度を水素炎イオン化検出器が装着されたガスクロマトグラフィーで分析した。さらに、各バイオフィルターのドレイン貯蔵槽内の溶液をフィルタリング（0.4μm注射器フィルター）して得た濾液中のＤＭＳＯと硫酸塩濃度をそれぞれ高速液体クロマトグラフィー（high performance liquid chromatography, HPLC）とイオンクロマトグラフィー（ion chromatography, IC）で分析した。
【００９８】
７−２．実験結果
本発明によるスフィンゴモナス属ＭＤ２菌株を接種したバイオフィルターによるメタンと悪臭の同時低減結果を図１２〜図１７及び表４〜表５に示す。
【００９９】
メタンのみ単独で供給したバイオフィルター１の場合、運転初期は２０％未満のメタン分解効率を示したが、時間の経過に伴って効率が増加し、１２日後には９０％以上のメタン除去効率を示した。時間と共に入口メタン濃度を増加させたにもかかわらず、バイオフィルターのメタン除去能が平均約８０％と安定して維持された（図１２）。
【０１００】
メタンとジメチルスルフィドを同時に供給したバイオフィルター２の場合、運転初期は２０％未満のメタン分解効率を示したが、時間の経過に伴って急速に効率が増加し、８０％以上のメタン除去効率を８日後に示した。時間と共に入口のメタン濃度を増加させたにもかかわらず、バイオフィルターのメタン除去能が平均８０％と安定して維持された（図１３）。ジメチルスルフィドは初期から安定して完全に分解された（図１４）。
【０１０１】
メタン、ジメチルスルフィド、ベンゼン、トルエンを同時に供給したバイオフィルター３の場合、運転初期は１０％未満のメタン分解効率を示したが、時間の経過に伴って効率が増加し、６０％以上のメタン除去効率を８日後に示した。時間と共に入口のメタン濃度を増加させたにもかかわらず、バイオフィルターのメタン除去能が６０％以上と安定して維持された（図１５）。ジメチルスルフィド／ベンゼン／トルエンは初期から完全に安定して分解され、入口の濃度が変化しても全量が分解されていることが分かった（図１６及び図１７）。
【０１０２】
また、各バイオフィルターについて、炭素源としてのメタンとジメチルスルフィド／ベンゼン／トルエンの代謝産物を明らかにし、マスバランスを計算して表４に示す。ジメチルスルフィド、ベンゼン、トルエンの流入量はメタンの流入量に比較して１／１００以下であるので無視した。
【０１０３】
【表４】
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【０１０４】
表４において、バイオフィルター１では３．６％のメタンがバイオフィルターにより除去され、その時に発生した二酸化炭素の量は３．７％であった。バイオフィルター２では４％のメタンがバイオフィルターにより除去され、その時に発生した二酸化炭素の量は４％以上であった。バイオフィルター３では２．３％のメタンがバイオフィルターにより除去され、その時に発生した二酸化炭素の量は２．３％であった。二酸化炭素の濃度分析により、メタン、ジメチルスルフィド、トルエン及びベンゼンに含まれる炭素はバイオフィルターで二酸化炭素に全量が酸化されることが確認された（表４）。
【０１０５】
また、バイオフィルターについて、硫黄源としてのジメチルスルフィドの代謝産物を明らかにし、マスバランスを計算した。バイオフィルター２とバイオフィルター３でジメチルスルフィドの分解代謝産物を分析するために、ＤＭＳＯ、硫酸塩などの溶存性ＤＭＳの分解産物を定性／定量分析した結果を表５に示す。
【０１０６】
【表５】
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【０１０７】
表５において、出口のガス中にＭＴや硫化水素は検出されず、バイオフィルター２の貯蔵槽の液相にはジメチルスルフィドの流入量比で約７６％の量が硫酸塩に完全に酸化され、約８％の量はＤＭＳＯに変換された。硫黄の回収率は８４％であり、この時のジメチルスルフィドの９０％以上が硫酸塩に酸化された。バイオフィルター３の貯蔵槽の液相にはジメチルスルフィドの流入量比で約８４％は硫酸塩に完全に酸化され、１９％はＤＭＳＯに変換された。計算された回収率は１０３％であり、ジメチルスルフィドの約８２％が硫酸塩に酸化された（表５）。
【０１０８】
本発明によるバイオフィルターにおいては、ジメチルスルフィドがＤＭＳＯへの変換よりもＤＭＳ−ＭＴ−硫化水素の代謝経路に沿って分解され、このような結果は最終分解産物が悪臭を発生しない物質に完全に酸化されることを意味するので、悪臭除去の面では非常に有意な結果である。
【０１０９】
前述した結果は、メタン及びジメチルスルフィドを同時に分解できるスフィンゴモナス属ＭＤ２菌株を接種したバイオフィルターを用いて、メタン及びジメチルスルフィドを同時に効果的に低減できることを示す。
【０１１０】
【表６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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