(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピキア・パストリス宿主細胞が、Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生するように選択又は設計され、方法が、
（ａ）以下の（ｉ）又は（ｉｉ）の１以上をコードする核酸を前記宿主細胞に導入すること：
（ｉ）ＮｅｕＣ、ＮｅｕＢ及びＣＭＰ−Ｓｉａシンターゼ；又は
（ｉｉ）ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ、Ｎ−アセチルノイラミナート−９−ホスファートシンターゼ及びＣＭＰ−シアル酸シンターゼ；
（ｂ）ＣＭＰ−シアル酸トランスポーターをコードする核酸を前記宿主細胞に導入すること；及び
（ｃ）２，６−シアリル転移酵素触媒ドメインと該２，６−シアリル転移酵素触媒ドメインを前記宿主細胞の分泌経路に向ける細胞内指向性シグナルペプチドとの結合体をコードする核酸を前記宿主細胞に導入すること；
を含み、該宿主細胞において組換え糖タンパク質が宿主細胞の分泌経路を通過すると、ＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質が産生される、該ピキア・パストリス宿主細胞中で組換えシアル酸付加糖タンパク質を製造する方法。
【請求項２】
細胞内指向性シグナルペプチドが、小胞体、ゴルジ体、トランスゴルジ網及び分泌小胞からなる群から選択される分泌経路中の場所に２，６−シアリル転移酵素触媒ドメインを向ける、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記宿主細胞がＣＭＰ−シアル酸の細胞プールを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
シアル酸供与体又はシアル酸供与体前駆体の存在下で前記宿主細胞を培養することを更に含む、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
糖転移酵素、グリコシダーゼ及び糖トランスポーターからなる群から選択される１種類以上の酵素をコードする１種類以上の追加の核酸を前記宿主細胞に導入する段階を更に含む、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記宿主細胞が内在性シアリル転移酵素活性を欠く、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法によって製造される組換え糖タンパク質を含む、糖タンパク質組成物。
【請求項８】
前記組換え糖タンパク質が、ＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む、請求項７に記載の糖タンパク質組成物。
【請求項９】
（ａ）２，６−シアリル転移酵素触媒ドメインを宿主細胞のゴルジ体に向ける細胞内指向性シグナルペプチドに作用可能に結合した２，６−シアリル転移酵素触媒ドメインを含む酵素をコードする核酸、
（ｂ）以下の（ｉ）又は（ｉｉ）の１以上をコードする核酸：
（ｉ）ＮｅｕＣ、ＮｅｕＢ及びＣＭＰ−Ｓｉａシンターゼ；又は
（ｉｉ）ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ、Ｎ−アセチルノイラミナート−９−ホスファートシンターゼ及びＣＭＰ−シアル酸シンターゼ、及び
（ｃ）ＣＭＰ−シアル酸トランスポーターをコードする核酸、
を含むピキア・パストリス宿主細胞。
【請求項１０】
ＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質を産生することができる、請求項９に記載の宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真菌、他の真核細胞などの非ヒト真核生物宿主細胞を遺伝子改変して、ヒト又は動物の治療薬として有用である、動物細胞、特にヒト細胞によって産生される糖タンパク質に類似したグリコシル化パターンを有するグリコシル化タンパク質（糖タンパク質）を製造することができる方法及び組成物を対象とする。特に、本願は、シアル酸付加糖タンパク質を通常は産生しない非ヒト真核生物宿主細胞においてシアル酸付加糖タンパク質を製造する方法及び組成物に関係する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト及び下等真核生物におけるグリコシル化経路
ＤＮＡが転写され、タンパク質に翻訳された後、更なる翻訳後プロセシングは、グリコシル化として知られるプロセスである、糖残基の結合である。異なる生物体は、異なるグリコシル化酵素（糖転移酵素及びグリコシダーゼ）を産生し、利用可能な異なる基質（ヌクレオチド糖）を有する。その結果、特定のタンパク質が発現される宿主系に応じて、個々のオリゴ糖の、さらには同じタンパク質でさえも、グリコシル化パターン及び組成が異なる。細菌は、一般にタンパク質をグリコシル化せず、グリコシル化する場合には、極めて非特異的な様式に限られる（Ｍｏｅｎｓ，  １９９７）。（本明細書を通して、科学関係の刊行物を上位の著者及び刊行年を参照することによって引用する。完全な引用は、本明細書の最後にある。）糸状菌、酵母などの下等真核生物は、主にマンノース及びマンノシルホスファート糖を付加させる。生成したグリカンは、「高マンノース」型グリカン又はマンナンとして知られる。植物細胞及び（Ｓｆ９細胞などの）昆虫細胞は、タンパク質を更に別の方法でグリコシル化する。これに対し、ヒトなどの高等真核生物においては、新生オリゴ糖側鎖が切り取られて、幾つかのマンノース残基が除去され、下等真核生物のＮ−グリカン中には一般に存在しない追加の糖残基で伸長され得る。例えば、Ｂｒｅｔｔｈａｕｅｒ，  １９９９、Ｍａｒｔｉｎｅｔ，  １９９８、Ｗｅｉｋｅｒｔ，  １９９９、Ｍａｌｉｓｓａｒｄ，  ２０００、Ｊａｒｖｉｓ  １９９８及びＴａｋｅｕｃｈｉ，  １９９７を参照されたい。
【０００３】
ほ乳動物型オリゴ糖構造体の合成は、タンパク質が宿主生物中の分泌経路に沿って移動する間に、一組の逐次反応によって開始され、その過程で糖残基が付加し、除去される。宿主生物又は細胞のグリコシル化経路に沿って存在する酵素によって、生成する分泌タンパク質のグリコシル化パターンが決定する。したがって、下等真核生物宿主細胞中で発現されるタンパク質のグリコシル化パターンは、ヒト、他のほ乳動物などの高等真核生物において発現されるタンパク質のグリコシル化パターンとはかなり異なる（Ｂｒｅｔｔｈａｕｅｒ，  １９９９）。典型的な真菌のＮ−グリカンの構造を図１Ａに示す。
【０００４】
ヒトグリコシル化の初期段階は、少なくとも２つの異なる相に区分することができる。（ｉ）脂質に結合したＧｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２オリゴ糖が、小胞体（ＥＲ）膜における一連の反応によって組み立てられる。（ｉｉ）脂質アンカーのドリコールピロリン酸から新規合成タンパク質上へのこのオリゴ糖の移行。特定の移行部位は、Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ配列中のアスパラギン（Ａｓｎ）残基によって規定される（Ｇａｖｅｌ，  １９９０）。ここで、Ｘａａは、プロリン以外の任意のアミノ酸であり得る。グルコシダーゼ及びマンノシダーゼによる更なるプロセシングは、新生糖タンパク質が初期ゴルジ体に移行する前にＥＲ中で起こる。初期ゴルジ体では、付加されたマンノース残基がゴルジ特異的アルファ（α−１，２−マンノシダーゼによって除去される。プロセシングは、タンパク質がゴルジを通過する間継続する。中間ゴルジでは、Ｎ−アセチルグルコサミニル転移酵素（ＧｎＴＩ、ＧｎＴＩＩ、ＧｎＴＩＩＩ、ＧｎＴＩＶ及びＧｎＴＶ）、マンノシダーゼＩＩ及びフコシル転移酵素を含めて、幾つかの修飾酵素が特定の糖残基を付加し、除去する。最後に、トランスゴルジにおいて、ガラクトシル転移酵素（ＧａｌＴ）及びシアリル転移酵素（ＳＴ）によって、糖タンパク質構造体が産生される。糖タンパク質構造体は、ゴルジから放出される。糖タンパク質にヒト特性を付与するのは、ガラクトース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン及び高度の末端シアル酸を含む、二、三及び四分岐構造を特徴とするこの構造である。典型的なヒトＮ−グリカンの構造を図１Ｂに示す。
【０００５】
ほぼすべての真核生物において、糖タンパク質は、脂質に結合した共通のオリゴ糖前駆体Ｇｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２−ドリコール−ピロリン酸に由来する。小胞体内では、ドリコールピロリン酸に結合したオリゴ糖の合成及びプロセシングは、すべての公知真核生物間で同一である。しかし、真菌細胞（例えば、酵母）による核オリゴ糖の更なるプロセシングは、ＥＲを離れてゴルジに入ったペプチドに核オリゴ糖が転移すると、分泌経路に沿って移動し、幾つかのマンノース糖が付加するので、ヒトとはかなり異なる。
【０００６】
酵母では、これらの段階は、マンノース糖を核オリゴ糖に逐次的に付加させる、Ｏｃｈ１ｐ、Ｍｎｔ１ｐ及びＭｎｎ１ｐのような、ゴルジに存在するマンノシル転移酵素によって触媒される。得られる構造は、ヒト様（ｈｕｍａｎ−ｌｉｋｅ）タンパク質の産生には望ましくなく、したがってマンノシル転移酵素活性を低下又は失活させることが望ましい。マンノシル転移酵素活性を欠くサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｓ．セレビシエ）の変異体（例えば、ｏｃｈ１又はｍｎｎ９変異体）は、非致死的であり、酵母糖タンパク質のオリゴ糖のマンノース含有量を低下させることが判明した。マンノシルホスファート転移酵素などの他のオリゴ糖プロセシング酵素も、宿主の特別な内在性グリコシル化パターンに応じて、除去しなければならない場合がある。
【０００７】
糖ヌクレオチド前駆体
動物糖タンパク質のＮ−グリカンは、ガラクトース、フコース及び末端シアル酸を一般に含む。これらの糖は、酵母及び糸状菌において産生される糖タンパク質上には存在しない。ヒト及び他の非ヒト真核細胞においては、あらゆる種類の糖ヌクレオチド前駆体（例えば、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸、ＵＤＰ−ガラクトース、ＧＤＰ−フコースなど）は、サイトゾル中で合成され、ゴルジ中に輸送され、ゴルジ中で糖転移酵素によって核オリゴ糖に結合する。（Ｓｏｍｍｅｒｓ，  １９８１、Ｓｏｍｍｅｒｓ，  １９８２、Ｐｅｒｅｚ，  １９８７）。
【０００８】
グリコシル転移反応は、副生物のヌクレオシド二リン酸又は一リン酸を一般に生成する。一リン酸は、逆輸送機序によってヌクレオシド三リン酸糖と交換に直接搬出され得るが、ジホスホヌクレオシド（例えば、ＧＤＰ）は、搬出される前に、ホスファターゼ（例えば、ＧＤＰａｓｅ）によって切断されて、ヌクレオシド一リン酸と無機ホスファートにされなければならない。この反応は、効率的グリコシル化に重要である。例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．セレビシエ）由来のＧＤＰａｓｅは、マンノシル化に必要であることが見いだされた。しかし、ＧＤＰａｓｅは、ＵＤＰに対しては活性が９０％低下する（Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅ，  １９９４）。下等真核生物は、ゴルジでの糖タンパク質合成にＵＤＰ糖前駆体を利用しないので、ゴルジにおけるＵＤＰ特異的ジホスファターゼ活性が一般に欠如している。ガラクトース残基を（ＵＤＰ−ガラクトース由来の）細胞壁多糖に付加させることが見いだされた酵母であるシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）は、特異的ＵＤＰａｓｅ活性を有することが見いだされた。これは、かかる酵素の潜在的な必要性を示している（Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅ，  １９９４）。ＵＤＰは、糖転移酵素の強力な阻害剤であることが知られており、このグリコシル化副生物の除去は、ゴルジ内腔における糖転移酵素阻害を防止するのに重要であり得る（Ｋｈａｔａｒａ，  １９７４）。Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅ，  １９９５、Ｂｅａｕｄｅｔ，  １９９８を参照されたい。
【０００９】
区画化された酵素活性によるＮ−グリカンの逐次プロセシング
糖転移酵素及びグリコシダーゼ（例えば、マンノシダーゼ）は、ＥＲ及びゴルジ体の内部（内腔）表面に沿って並び、それによって、糖タンパク質がＥＲ及びゴルジネットワークを通過するときに糖タンパク質の逐次プロセシングを可能にする「触媒作用」面を与える。シス、中間及びトランスゴルジの複数の区画並びにトランスゴルジ網（ＴＧＮ）は、順序づけられた一連のグリコシル化反応が起こり得る場所（ｌｏｃａｌｉｔｉｅｓ）を与える。糖タンパク質が、ＥＲにおける合成から後期ゴルジ又はＴＧＮにおける完全成熟に進行するときには、特定の糖鎖構造体が合成できるように、糖タンパク質は、異なるグリコシダーゼ、マンノシダーゼ及び糖転移酵素に順次曝露される。これらの酵素が、それぞれの細胞小器官に保留され、固定される正確な機序を明らかにするために多数の研究がなされている。進展状況（ｅｖｏｌｖｉｎｇ  ｐｉｃｔｕｒｅ）は複雑であるが、証拠によれば、ステム領域、膜貫通領域及び細胞質側末端は、個々に、又は協調して、個々の細胞小器官の膜に酵素を誘導し、それによって随伴する触媒ドメインをその部位に局在させる（例えば、Ｇｌｅｅｓｏｎ，  １９９８参照）。
【００１０】
幾つかの例では、これらの特異的相互作用が種間で機能することが見いだされた。例えば、動物のトランスゴルジに局在することが知られている酵素である、ラット由来のα２，６−ＳＴの膜貫通ドメインは、酵母ゴルジ中にもレポーター遺伝子（インベルターゼ）を局在させることが判明した（Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋ，  １９９５）。しかし、完全長α２，６−ＳＴの一部と全く同じ膜貫通ドメインは、ＥＲ中に保留され、酵母のゴルジにそれ以上輸送されなかった（Ｋｒｅｚｄｏｍ，  １９９４）。ヒト由来の完全長ＧａｌＴは、明らかに高い転写レベルにもかかわらず、酵母では合成さえされない。これに対し、インベルターゼレポーターと融合した同じヒトＧａｌＴの膜貫通領域は、低生成レベルではあるが、酵母ゴルジへの局在化を誘導することができた。Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋと共同研究者は、酵母マンノシル転移酵素（ＭＮＴ１）の２８個のアミノ酸、細胞質側末端を含む領域、膜貫通領域、及びステム領域の８個のアミノ酸を、ヒトＧａｌＴの触媒ドメインに融合させることが、活性ＧａｌＴのゴルジ局在化に十分であることを示した。他のガラクトシル転移酵素は、その膜貫通領域を除去した後も、適切に局在し得ることから、特に細胞小器官に内在する酵素との相互作用に依拠すると考えられる。
【００１１】
グリコシル化酵素の局在化が不適当であると、経路中の酵素の適切な機能が阻害され得る。例えば、多数のα−１，２−マンノシダーゼを有する（Ｅａｄｅｓ，  ２０００）アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）は、ウサギＧｎＴＩ遺伝子で形質転換すると、全体のＧｎＴＩ活性レベルが高いにもかかわらず、ＧｌｃＮＡｃをＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に付加しない（Ｋａｌｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５）。ＧｎＴＩは、活発に発現されるが、その基質、すなわち、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ及び生産的なＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２基質（すべてのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造体が生産的なわけではない。下記参照。）の両方と接触しないように、不正確に局在し得る。或いは、宿主生物がゴルジ中で適切なレベルのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを与えない場合もあり、又はＧｎＴＩが、適切に局在しているが、それにもかかわらずその新しい環境で不活性である場合もある。また、宿主細胞中に存在するＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造体は、ほ乳動物に存在するＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２とは構造が異なり得る。Ｍａｒａｓと共同研究者は、Ｔ．リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）から得られるセロビオヒドロラーゼＩ（ＣＢＨＩ）由来のＮ−グリカンの約３分の１が、Ａ．サイトイ（Ａ．ｓａｉｔｏｉ）１，２マンノシダーゼによってインビトロでＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に切り取られ得ることを見いだした。しかし、このＮ−グリカンの１％未満しか、ＧｎＴＩに対する生産的な基質として役立たなかった。したがって、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が単に存在するだけでは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の更なるプロセシングがなされる保証はない。必要なのは、ＧｎＴＩと反応する生産的なＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造体の形成である。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は細胞中で産生することができたが（約２７ｍｏｌ％）、ほんの一部分しかＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に転化することができなかった（約５％未満、国際公開第０１／１４５２２号参照）。
【００１２】
現在まで、下等真核生物において特別な異種的に発現される糖転移酵素又はマンノシダーゼが、（１）十分に翻訳されるかどうか、（２）触媒作用的に活性であるかどうか、又は（３）分泌経路内の適切な細胞小器官に位置するかどうかを予測する信頼できる方法はない。下等真核生物におけるグリコシル化パターンに影響を及ぼすにはこれら３つのすべてが必要なので、現在利用不可能な予測ツールなしで、酵素の所望の触媒機能及び適切な保留を実現する系統的スキームが望まれる。
【００１３】
治療用糖タンパク質の製造
ヒト又は動物から単離されるかなりの数のタンパク質が翻訳後修飾を受け、グリコシル化は、最も重要な修飾の一つである。すべての治療用タンパク質の推定７０％は、グリコシル化されており、したがってヒトと同様にグリコシル化することができる産生系（すなわち、宿主細胞）に現在は依拠している。幾つかの研究によれば、グリコシル化は、治療用タンパク質の（１）免疫原性、（２）薬物動態学的性質、（３）輸送及び（４）効力を決定する重要な役割を果たす。したがって、医薬産業によるかなりの労力が、できるだけ「ヒト型（ｈｕｍａｎｏｉｄ）」又は「ヒト様（ｈｕｍａｎ−ｌｉｋｅ）」である糖タンパク質を得るプロセスの開発に向けられていることは、驚くことではない。現在まで、大部分の糖タンパク質は、ほ乳動物宿主系において製造される。これは、かかるタンパク質の薬物動態学的性質を改善することが知られている、細胞によって発現されるタンパク質のシアリル化（すなわち、シアル酸の末端付加）の程度を高める、かかるほ乳動物細胞の遺伝子操作を必要とし得る。或いは、公知糖転移酵素とそれぞれのヌクレオチド糖（例えば、２，３−シアリル転移酵素とＣＭＰ−シアル酸）を用いて、かかる糖のインビトロでの付加によってシアリル化度を改善することができる。
【００１４】
大部分の高等真核生物は、ヒトに類似したグリコシル化反応を行うが、上記宿主系において発現される組換えヒトタンパク質は、その「天然の」ヒト対応物とは常に異なる（Ｒａｊｕ，  ２０００）。したがって、大規模な開発事業は、これらの発現系で生成されるタンパク質の「ヒト特性（ｈｕｍａｎ  ｃｈａｒａｃｔｅｒ）」を改善する方法を発見することに向けられている。これは、ヒト様グリコフォームの形成に関与する酵素をコードする遺伝子を導入することによる、タンパク質発現宿主の発酵条件及び遺伝子改変の最適化を含む（Ｗｅｒｎｅｒ，  １９９８、Ｗｅｉｋｅｒｔ，  １９９９、Ａｎｄｅｒｓｅｎ，  １９９４、Ｙａｎｇ，  ２０００）。すべてのほ乳動物発現系に関連する固有の問題は、解決されていない。
【００１５】
したがって、全部と言わないまでも、現在製造されている大部分の治療用糖タンパク質は、ほ乳動物細胞において発現され、これらの組換えタンパク質のグリコシル化パターンを改善する（すなわち、「ヒト化する」）ことに多大な努力が向けられている。培地組成の変化、及びヒトグリコシル化に関与する酵素をコードする遺伝子の同時発現が、首尾よく使用された（例えば、Ｗｅｉｋｅｒｔ，  １９９９参照）。
【００１６】
真核微生物を用いた糖タンパク質製造
適切なほ乳動物発現系の欠如は、治療用組換えヒト糖タンパク質の低コストで安全な製造に重大な障害となっている。下等真核生物（真菌及び酵母）において、そのほ乳動物（例えば、ヒト）対応物に類似した組換えタンパク質を製造することが望ましい。微生物発酵による糖タンパク質の製造は、既存の系よりも多数の利点がある。小胞体中でタンパク質に転移した核オリゴ糖構造体は、ほ乳動物と下等真核生物で基本的に同一であるが、真菌とほ乳動物のゴルジ体中で起こる後続のプロセシング反応にはかなりの違いが見られる。実際、異なる下等真核生物間でさえ、多様なグリコシル化構造体が存在する。その他の点ではほ乳動物発現系に勝る注目すべき利点にもかかわらず、この多様なグリコシル化構造体は、組換えヒト糖タンパク質製造用宿主としての下等真核生物の使用を歴史的に妨げてきた。
【００１７】
内在性宿主のグリコシル化経路を利用して、酵母などの微生物宿主において産生される治療用糖タンパク質は、ほ乳動物細胞において産生される治療用糖タンパク質とは構造的に異なり、一般には治療効力が大きく低下する。かかる糖タンパク質は、ヒトにおいて一般には免疫原性であり、インビボでの半減期（したがって生理活性）が投与後に低下する（Ｔａｋｅｕｃｈｉ，  １９９７）。ヒト及び動物における特異的受容体（すなわち、マクロファージマンノース受容体）は、末端マンノース残基を認識し、異質な糖タンパク質を血流から迅速に排除するのを促進し得る。更に別の有害作用としては、タンパク質折りたたみ、溶解性、プロテアーゼに対する感受性、細胞内輸送、輸送、区画化、分泌、他のタンパク質若しくは因子による認識、抗原性、アレルゲン性の変化などが挙げられる。
【００１８】
酵母及び糸状菌は、細胞内と分泌の両方の組換えタンパク質の産生に首尾よく使用されてきた（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ，  ２０００、Ｈａｒｋｋｉ，  １９８９、Ｂｅｒｋａ，  １９９２、Ｓｖｅｔｉｎａ，  ２０００）。Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）などの種々の酵母は、高細胞密度に増殖し、多量の組換えタンパク質を分泌することができるので、真核生物発現系として特に重要な役割を果たしてきた。同様に、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、フザリウム種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）などの糸状菌は、糖タンパク質を工業規模で効率的に製造するのに使用されてきた。しかし、上述したように、これらの真核微生物のいずれにおいても発現される糖タンパク質は、動物において発現される糖タンパク質のＮ−グリカン構造とはかなり異なる。この違いは、多数の治療用糖タンパク質製造用宿主としての酵母又は糸状菌の使用を妨げている。
【００１９】
酵母及び真菌におけるグリコシル化はヒトとは極めて異なるが、幾つかの共通要素がある。第一段階である、新生タンパク質への核オリゴ糖構造体の転移は、酵母、真菌、植物及びヒトを含めて、すべての真核生物で高度に保存されている（図１Ａと１Ｂを比較されたい。）。しかし、それに続く核オリゴ糖のプロセシングは、酵母においてかなり異なり、幾つかのマンノース糖の付加を含む。この段階は、ゴルジ中に存在するマンノシル転移酵素（例えば、ＯＣＨ１、ＭＮＴ１、ＭＮＮ１など）によって触媒され、マンノース糖が核オリゴ糖に逐次的に付加する。得られる構造は、ヒト型タンパク質の製造には望ましくなく、したがってマンノシル転移酵素活性を低下又は失活させることが望ましい。マンノシル転移酵素活性を欠くＳ．セレビシエの変異体（例えば、ｏｃｈ１又はｍｎｎ９変異体）は、非致死的であり、酵母糖タンパク質のオリゴ糖のマンノース含有量を低下させることが判明した。マンノシルホスファート転移酵素などの他のオリゴ糖プロセシング酵素も、宿主の特別な内在性グリコシル化パターンに応じて、除去しなければならない場合がある。望ましくない内在性グリコシル化反応を削減後、複合型Ｎ−グリカンの形成を宿主系中に設計しなければならない。それには、幾つかの酵素及び糖−ヌクレオチドトランスポーターの安定な発現が必要である。さらに、これらの酵素を局在化させて、成熟グリコシル化構造体の逐次プロセシングを確保しなければならない。
【００２０】
真核微生物のグリコシル化経路を改変して、ほ乳動物治療薬としての使用により適切である糖タンパク質を与える幾つかの取組がなされなければならない。しかし、ヒト細胞において生成されるＮ−グリカンに類似したＮ−グリカン（例えば、複合型又は混成型グリカン構造体）は、得られなかった。
【００２１】
酵母は、種々のマンノシル転移酵素（例えば、Ｓ．セレビシエ中のＭＮＮ１などの１，３−マンノシル転移酵素；Ｇｒａｈａｍ，  １９９１、１，２−マンノシル転移酵素（例えば、Ｓ．セレビシエ由来のＫＴＲ／ＫＲＥファミリー）、１，６−マンノシル転移酵素（例えば、Ｓ．セレビシエ由来のＯＣＨ１）、マンノシルホスファート転移酵素及びその制御因子（例えば、Ｓ．セレビシエ由来のＭＮＮ４及びＭＮＮ６）、並びに内在性グリコシル化反応に関与する更に別の酵素を産生する。これらの遺伝子の多くは、個々に欠失されて、グリコシル化プロファイルの変化した生存可能な生物体が生じてきた。
【００２２】
一次Ｎ−グリカン構造体としてＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を生成し得る系統を設計することは有用であるが、これらの高マンノース前駆体構造体を更に改変して、ヒトグリカンにより近似させる試みには、追加のインビボ又はインビトロ段階が必要である。真菌及び酵母源由来のグリカンをインビトロで更にヒト化する方法は、米国特許第５，８３４，２５１号に記載されている。しかし、上述したように、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２をインビボで更にヒト化する場合、生成したＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造体が、実際に細胞内で産生され、培地中でのマンノシダーゼ活性の産物ではないことを確実にしなければならない。細胞内Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリカンのみがインビボで更にプロセシングされて、混成型及び複合型Ｎ−グリカンにすることができるので、酵母又は真菌中での複合型Ｎ−グリカンの形成には、高レベルのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が細胞内で産生される必要がある。また、産生されるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造体の大多数が実際にＧｎＴＩに対する基質であり、したがって混成型及び複合型Ｎ−グリカンを形成することができることを実証しなければならない。
【００２３】
したがって、非ヒト真核生物宿主細胞中で、特に酵母及び糸状菌中で、ヒト様糖タンパク質構造体に更にプロセシングすることができる、高い細胞内Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２含有量を特徴とする糖タンパク質を製造する方法が求められている。
【００２４】
Ｎ−グリカンへのシアル酸の付加
シアル酸（Ｓｉａ）は、ヒトデからヒトまでの後口動物系統の動物に広範に分布するＮ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）のＮ又はＯ置換誘導体特有の基である。大部分の植物、原生生物、古細菌及び真正細菌を含めて、他の生物体では、これらの化合物は存在しないと考えられる（Ｗａｒｒｅｎ，  １９９４）。例外も確認されたが、そのすべては、ある種の細菌、原生動物及び真菌を含めた病原体である（Ｋｅｌｍ，  １９９７、Ｐａｒｏｄｉ，  １９９３、Ａｌｖｉａｎｏ，  １９９９）。クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）及びカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）を含めた病原性真菌が、細胞表面糖タンパク質及び糖脂質上でシアル酸を獲得する機序は、明らかにされていない（Ａｌｖｉａｎｏ，  １９９９）。これらの生物体をシアル酸を含まない培地中で増殖させたときに、シアル酸残基が細胞グリカン上に見られ、シアル酸の新規合成を示唆している。現在まで、シアル酸の生合成に関与する真菌において、酵素は確認されていない。原生動物が、細胞表面グリカンにシアル酸を付加する機序は、特徴がはっきりしている。トリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）などの原生動物は、ＣＭＰ−Ｓｉａとは無関係である機序において細胞表面糖タンパク質及び糖脂質にシアル酸を付加する外部トランスシアリダーゼを有する（Ｐａｒｏｄｉ，  １９９３）。真菌中の類似のトランスシアリダーゼを特定することは、細胞グリカン上のシアル酸転移の機序を解明するのに役立つが、かかるタンパク質は、まだ特定も単離もされていない。
【００２５】
真菌中のシアル酸生合成の欠如及び／又は不確かさにもかかわらず、病原菌及びほ乳動物細胞中でのシアル酸生合成は、よく理解されている。シアル酸を新規合成して、細胞表面に存在するシアル酸付加糖脂質を生成する病原菌の一群が確認された（Ｖｉｍｒ，  １９９５）。これらの病原体表面のシアル酸は、宿主免疫系を逃れる手段であると主に考えられているが、これらの同じシアル酸分子は、タンパク質指向性（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）、細胞−細胞相互作用、細胞−基質認識及び接着を含めて、高等生物における多数のプロセスにも関与する（Ｓｃｈａｕｅｒ，  ２０００）。
【００２６】
シアル酸の存在は、糖タンパク質のインビボでの生物活性及び半減期に影響を及ぼし得る（ＭａｃＤｏｕｇａｌｌ，  １９９９）。例えば、シアル酸の重要性は、ヒトエリスロポイエチン（ｈＥＰＯ）の研究で実証されている。この糖タンパク質のＮ結合型グリカンの糖鎖上の末端シアル酸残基は、血液からｈＥＰＯが急速に排除されるのを防止し、インビボでの活性を改善する。ガラクトース残基で終結するアシアリル化（ａｓｉａｌｙｌａｔｅｄ）ｈＥＰＯ（アシアロｈＥＰＯ）は、インビボでの赤血球新生活性を劇的に低下させる。この低下は、肝臓アシアロ糖タンパク質受容体によるアシアロｈＥＰＯのクリアランスの増加によって引き起こされる（Ｆｕｋｕｄａ，  １９８９、Ｓｐｉｖａｋ，  １９８９、Ｓｐｉｖａｋ，  １９８９）。同様に、多数の治療用糖タンパク質上の末端シアル酸の欠如は、インビボでの効力を低下させ得、したがってより頻繁な患者投与計画が必要になり得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
発明の要旨
ほ乳動物、特にヒトにおける糖タンパク質のプロセシングを模倣した指定順序の酵素反応を実施することができる遺伝子改変されたグリコシル化経路を有する宿主細胞及び細胞系が開発された。これらの操作された宿主中で発現される組換えタンパク質は、そのほ乳動物（例えば、ヒト）対応物に実質的に同一ではなくても、より類似した糖タンパク質を生成する。さらに、特定の所望のグリカン構造を有する実質的に均一な糖タンパク質集団が産生され得る。本発明の宿主細胞（例えば、培養増殖された下等真核微生物及び他の非ヒト真核生物宿主細胞）を改変して、ヒトグリコシル化経路に沿って生成するＮ−グリカンを産生する。これは、（１）真菌の糖タンパク質に特徴的な望ましくない構造体を生成するある種の酵素を発現しない系統、（２）宿主細胞中の活性が得られる条件下で最適な活性を有するように選択された異種酵素を発現する系統、又は（３）これらの組合せの系統の設計（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）及び／又は選択の組合せを用いて達成される。ここで、遺伝子操作された宿主細胞は、「ヒト様」糖タンパク質の産生に必要である少なくとも１つの異種酵素活性を発現する。本発明の宿主細胞は、糖転移酵素、（マンノシダーゼなどの）グリコシダーゼ、糖ヌクレオチドトランスポーターなどの１つ以上の活性の異種発現によって更に改変して、ほ乳動物（例えば、ヒト）治療用糖タンパク質の製造用系統にすることができる。
【００２８】
したがって、本発明は、（１）単細胞真菌、糸状菌などの下等真核生物宿主を用いて、又は（２）任意の真核生物（例えば、ヒトとは異なるグリコシル化パターンを有する非ヒト真核細胞若しくは生物体）を用いて、ほ乳動物中に存在する糖鎖構造体（例えば、ヒトタンパク質）により近似するように、宿主生物（「宿主細胞」）中で生成するタンパク質のグリコシル化組成及び構造を改変することによって、糖タンパク質を製造する方法を提供する。望ましい遺伝子（例えば、グリコシル化に関与する遺伝子）が発現され、その産物が、科学文献で確立された方法、及びタンパク質発現分野の当業者に一般に知られている方法によって、宿主細胞中の細胞内位置を標的にするように操作された宿主細胞を、本発明の方法によって得ることができる。治療用タンパク質の製造では、この方法は、操作された細胞中で発現されるタンパク質上で任意の所望のグリコシル化構造体を得ることができる細胞系を設計するようになされ得る。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
一実施形態において、宿主細胞中で生成されるＮ−グリカンは、次いで、１種類以上の酵素（例えば、糖転移酵素、マンノシダーゼなどのグリコシダーゼ、糖トランスポーターなど）の異種発現によって更に改変して、（例えば、ヒト様複合型又は混成型Ｎ−グリカン構造を有する）修飾糖タンパク質を産生することができる、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２核構造を有する。ある実施形態において、宿主細胞中で生成されるＮ−グリカンは、次いで、１種類以上の酵素（例えば、糖転移酵素、マンノシダーゼなどのグリコシダーゼ、糖トランスポーターなど）の異種発現によって更に改変して、（例えば、ヒト様複合型又は混成型Ｎ−グリカン構造を有する）修飾糖タンパク質を産生することができる、複合型Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を有する。別の実施形態において、宿主細胞中で生成されるＮ−グリカンは、次いで、１種類以上の酵素（例えば、糖転移酵素、マンノシダーゼなどのグリコシダーゼ、糖トランスポーターなど）の異種発現によって更に改変して、（例えば、ヒト様複合型又は混成型Ｎ−グリカン構造を有する）修飾糖タンパク質を産生することができる、混成型ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を有する。
【００３０】
一実施形態において、操作された宿主細胞中で生成される糖タンパク質は、Ｎ−グリカンの複合型ＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡ２グリコフォームを有する。別の実施形態において、操作された宿主細胞中で生成される糖タンパク質は、Ｎ−グリカンの混成型ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡ２グリコフォームを有する。したがって、一実施形態において、本発明の糖タンパク質組成物は、複合型ＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡ２グリコフォームを優勢に含み得る。別の実施形態において、本発明の糖タンパク質組成物は、混成型ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡ２グリコフォームを優勢に含む。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２核構造体及びその改変構造体を生成して、複合型及び混成型グリコフォームを形成する方法は、Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ、国際公開第０２／００８７９号及び米国特許第７，０２９，８７２号に記載されている。これらの明細書を、本明細書に引用したその開示を参照することによって、本明細書に取り込む。
【００３１】
したがって、一実施形態において、本発明は、非ヒト真核生物宿主細胞中でヒト様糖タンパク質を製造する方法を提供する。本発明の宿主細胞は、さもなければマンノース残基を糖タンパク質上のＮ−グリカンに付加する１，６−マンノシル転移酵素活性が欠乏するように選択又は設計される。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２糖鎖構造体の高収率（例えば、少なくとも３０モルパーセント）での生成を可能にする１種類以上の酵素（酵素活性）を宿主細胞中に導入する。好ましい実施形態において、宿主細胞内で産生されるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の少なくとも１０％は、ＧｎＴＩに対する生産的な基質であり、したがってほ乳動物、特にヒトにおいて形成されるＮ−グリカンと類似している又は同一である、完成したＮ−グリカンを産生するインビボ及び／又はインビトロでの更なるグリコシル化反応に対する生産的な基質である。
【００３２】
別の実施形態において、１種類以上のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２糖鎖構造体生成用酵素をコードする核酸分子を、１，６−マンノシル転移酵素活性が欠乏するように選択又は設計された宿主細胞に導入する。好ましい一実施形態において、宿主細胞に導入された少なくとも１種類の酵素は、糖鎖構造体が生成される細胞内位置のｐＨで最適な活性を有するように選択される。別の好ましい実施形態において、少なくとも１種類の酵素は、例えば、酵素に通常は付随しない細胞内指向性シグナルペプチドを含むキメラタンパク質によって、この酵素が最適な活性を有する宿主細胞内小器官を標的にする。
【００３３】
本発明は、Ｐ．パストリス又はＫ．ラクチスから単離された開始（ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ）α１，６−マンノシル転移酵素活性をコードする分子を含む単離核酸分子及びベクターを更に提供する。これらの核酸分子は、Ｓ．セレビシエ中のＯＣＨ１遺伝子と相同である配列を含む。これらの配列及び相同配列は、糖タンパク質のＮ−グリカンを過剰マンノシル化（ｈｙｐｅｒｍａｎｎｏｓｙｌａｔｅ）しない宿主細胞を構築するのに有用である。
【００３４】
別の実施形態において、宿主細胞は、例えば、グリコシダーゼをコードする１個以上の核酸分子を宿主に導入することによって、異種グリコシダーゼを発現するように操作される。一実施形態において、核酸分子は、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２又はＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２からのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の生成に関与する１つ以上のマンノシダーゼ活性をコードする。好ましい実施形態において、コードされたマンノシダーゼ活性の少なくとも１つは、マンノシダーゼ活性が局在する細胞小器官中の他の代表的な酵素の平均最適ｐＨの１．４ｐＨ単位内に最適ｐＨを有し又は約５．１から約８．０のｐＨ、好ましくは約５．５から約７．５のｐＨで最適な活性を有する。好ましくは、異種酵素は、小胞体、ゴルジ体、又は宿主生物のＥＲとゴルジの間の輸送小胞を標的にし、そこでＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２などのＮ−グリカンを切り取って高レベルのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を生成する。
【００３５】
別の実施形態において、宿主細胞は、異種ガラクトシル転移酵素を発現するように操作される。更に別の実施形態において、宿主細胞は、異種シアリル転移酵素又はトランスシアリダーゼを発現するように操作される。
【００３６】
ある実施形態において、グリコシル化酵素は、酵素の触媒ドメインと細胞内指向性シグナルペプチドとの融合タンパク質を形成することによって、例えば、細胞内指向性シグナルペプチドをコードするＤＮＡ断片とグリコシル化酵素又は触媒作用的に活性なその断片をコードするＤＮＡ断片とのインフレーム連結によって、細胞内位置を標的にする。
【００３７】
ある実施形態において、宿主のグリコシル化経路は、糖ヌクレオチドトランスポーターを発現するように改変される。好ましい実施形態において、ヌクレオチドジホスファターゼ酵素も発現される。トランスポーター及びジホスファターゼは、適切な区画においてグリコシル化酵素に適切な基質を提供し、競合的生成物阻害を抑制し、ヌクレオシド二リン酸の除去を促進することによって、操作されたグリコシル化段階の効率を改善する。
【００３８】
別の実施形態において、宿主細胞は、機能的ＣＭＰ−シアル酸（ＣＭＰ−Ｓｉａ）生合成経路を発現するように操作される。
【００３９】
別の実施形態において、ＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路を非ヒト真核細胞中に操作する方法を提供する。この方法は、宿主細胞、特に真菌宿主細胞、又は内在性シアリル化のない他の宿主細胞、若しくは高いＣＭＰ−Ｓｉａレベルの利点を得ることができる他の宿主細胞における、ほ乳動物起源、細菌起源又はその両方の幾つかの酵素のクローン化及び発現を含む。操作されたＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路は、シアル酸付加糖脂質、Ｏ−グリカン及びＮ−グリカンをインビボで産生するのに有用である。したがって、本発明は、内在性シアリル化のない非ヒト宿主細胞、又は十分なレベルの内在性シアリル化のない非ヒト宿主細胞における、治療用シアル酸付加糖タンパク質の産生を促進するのに有用である。十分なレベルの内在性シアリル化のない非ヒト宿主細胞の例としては、下等真核生物宿主細胞、昆虫細胞及び植物細胞が挙げられる。したがって、本発明のある実施形態において、宿主細胞は、シアル酸付加糖タンパク質を産生するように操作され、さもなければ内因的に何も産生しない。本発明の別の実施形態において、宿主細胞は、シアル酸付加糖タンパク質レベルを未変性内在レベルよりも増加させるように操作される。
【００４０】
本発明は、所望のタンパク質又はポリペプチド断片（例えば、グリコシル化に関与する酵素又はその触媒ドメイン）を、宿主細胞の選択された細胞内領域に向けることができる融合構築物を生成するのに有用であるコンビナトリアル核酸ライブラリーも提供する。好ましい一実施形態において、コンビナトリアル核酸ライブラリーは、（ａ）異なる細胞内指向性（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）シグナルペプチドをコードする核酸配列、及び（ｂ）異なる標的ポリペプチドをコードする核酸配列を含む。（ａ）と（ｂ）の核酸配列、又は（ａ）と（ｂ）に由来する核酸配列を連結して、融合構築物を作製する。その少なくとも１つは、異種細胞内指向性シグナルペプチドに、すなわち、通常は付随しないものに、インフレームで連結された機能的タンパク質ドメイン（例えば、酵素の触媒ドメイン）をコードする。
【００４１】
本発明は、本発明の核酸（例えば、コンビナトリアル）ライブラリーで宿主細胞を形質転換して、通常は付随しない細胞内指向性シグナルペプチドにインフレームで連結された触媒ドメインを有する少なくとも１種類、好ましくは２種類以上のキメラグリコシル化酵素を発現する、遺伝的に混合された細胞集団を生成することによって、グリコシダーゼ及び糖転移酵素を含めて、Ｎ−グリカンの修飾に関与する酵素を用いて、宿主細胞（例えば、ヒト宿主細胞を含めた任意の真核生物宿主細胞）のグリコシル化経路を改変する方法も提供する。所望のグリコシル化表現型を有する宿主細胞を、この細胞集団から選択してもよい。本発明のライブラリー及び関連方法を用いて改変された宿主細胞は、例えば、ほ乳動物、特にヒトにおいて生成されるグリコシル化パターンに類似した、又は同一のグリコシル化パターンを有する糖タンパク質の製造に有用である。
【００４２】
別の態様においては、本発明のコンビナトリアルライブラリーによって、グリコシル化／分泌経路において効率的に機能する細胞内区画に首尾よく局在する、触媒作用的に活性なグリコシル化酵素の１種類又は組合せを生成することができる。好ましい酵素は、（α−１，２−Ｍａｎ）３−９Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２をＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２にインビボで高効率で転化する。また、本発明は、優勢なＮ−グリカンとしてＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２及び／又はＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を含む糖タンパク質中間体又は産物を産生し得る真核生物宿主系統、特に酵母、真菌、昆虫、植物、植物細胞、藻類及び昆虫細胞宿主を提供する。
【００４３】
本発明は、タンパク質（例えば、本発明の宿主細胞中で発現される組換えタンパク質）に共有結合したＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２又はＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンを優勢に含む糖タンパク質中間体又は産物をインビボで産生するコンビナトリアルライブラリーを用いた方法も提供する。本発明は、末端ガラクトースを有する、好ましくは構造Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を有する、複合型糖タンパク質産物、及び末端ガラクトースを有する、好ましくは構造ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有する、混成型糖タンパク質産物をインビボで産生する方法も提供する。本発明は、末端シアル酸を有する、好ましくは構造ＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を有する、糖タンパク質産物、及び末端シアル酸を有する、好ましくは構造ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有する、混成型糖タンパク質産物をインビボで産生する方法も提供する。
【００４４】
本発明は、コンビナトリアル核酸ライブラリー由来の組換え分子、かかる組換え分子を含む、発現ベクターを含めたベクター、組換え分子及びベクターによってコードされるタンパク質、組換え分子又はベクターで形質転換された宿主細胞、並びにかかる形質転換された宿主から産生される糖タンパク質も提供する。
【００４５】
本発明の別の態様として、糖タンパク質上のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２及び／又はＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の有無を検出することができる、診断用及び治療用の方法、組成物及びキットなどが挙げられる。
【００４６】
一実施形態において、本発明は、シアリル転移酵素をコードする核酸を宿主細胞に導入することを含む、非ヒト真核生物宿主細胞中でシアル酸を含む組換え糖タンパク質を製造する方法を含む。ある実施形態において、前記宿主細胞は、内在性シアリル転移酵素活性を欠く。シアリル転移酵素は、シアリル転移酵素触媒ドメインと、シアリル転移酵素触媒ドメインを宿主細胞の分泌経路に向ける細胞内指向性シグナルペプチドとを含む、融合タンパク質であり得る。細胞内指向性シグナルペプチドは、Ｍｎｎ２に由来し得、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号（「ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＮ」）ＮＰ＿００９５７１のアミノ酸１から１０８を含み得る。
【００４７】
本発明は、トランスシアリダーゼ酵素をコードする核酸を宿主細胞に導入することを含む、非ヒト真核生物宿主細胞中でシアル酸を含む組換え糖タンパク質を製造する方法も含む。別の実施形態において、前記核酸は、トランスシアリダーゼ触媒ドメインを宿主細胞の分泌経路、細胞壁又は原形質膜に向ける細胞内指向性シグナルペプチドと一緒にトランスシアリダーゼ触媒ドメインを含む融合タンパク質をコードする。一実施形態において、前記方法は、宿主細胞増殖用培地にＣＭＰ−Ｓｉａなどのシアル酸供与体を補充することを更に含む。別の実施形態において、前記方法は、１種類以上のシアル酸供与体前駆体を培地に補充することを含み得る。かかる前駆体は、例えば、それぞれグルコサミン［ＧｌｃＮ］、ＧｌｃＮＡｃ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ及びＭａｎＮＡｃの１個以上を含み得る。一実施形態において、この方法は、ＣＭＰ−シアル酸の生合成又は輸送に関与する１種類以上の酵素をコードする１種類以上の核酸を宿主細胞に導入する段階を更に含む。
【００４８】
一実施形態において、本発明は、宿主細胞中で組換えシアル酸付加糖タンパク質を製造する方法を提供する。宿主細胞は、Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生するように選択又は設計される。この方法は、シアリル転移酵素活性を有する酵素をコードする核酸を宿主細胞に導入する段階を含む。この酵素は、シアリル転移酵素触媒ドメインと、シアリル転移酵素触媒ドメインを宿主細胞の分泌経路に向ける細胞内指向性シグナルペプチドとを含む。組換え糖タンパク質が宿主細胞の分泌経路を通過すると、ＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質が産生される。一実施形態において、細胞内指向性シグナルペプチドは、小胞体、ゴルジ体、トランスゴルジ網及び分泌小胞からなる群から選択される分泌経路中の場所にシアリル転移酵素触媒ドメインを向ける。一実施形態において、この方法は、ＣＭＰ−Ｓｉａの生合成又は輸送に関与する１種類以上の酵素をコードする核酸を宿主細胞に導入する段階を更に含む。
【００４９】
別の実施形態において、本発明は、宿主細胞中で組換えシアル酸付加糖タンパク質を製造する方法を提供する。宿主細胞は、Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生するように選択又は設計される。この方法は、（ａ）シアリル転移酵素活性を有する酵素をコードする核酸、及び（ｂ）ＣＭＰ−Ｓｉａの生合成又は輸送に関与する１種類以上の酵素をコードする核酸を宿主細胞に導入する段階を含む。組換え糖タンパク質が宿主細胞の分泌経路を通過すると、ＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質が産生される。一実施形態において、シアリル転移酵素活性を有する酵素は、シアリル転移酵素触媒ドメインと、シアリル転移酵素触媒ドメインを宿主細胞の分泌経路に向ける細胞内指向性シグナルペプチドとを含む。
【００５０】
別の実施形態において、本発明は、宿主細胞中で組換えシアル酸付加糖タンパク質を製造する方法を含む。宿主細胞は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生するように選択又は設計される。この方法は、シアリル転移酵素活性を有する酵素をコードする核酸を宿主細胞に導入する段階を含む。この酵素は、シアリル転移酵素触媒ドメインと、シアリル転移酵素触媒ドメインを宿主細胞の分泌経路に向ける細胞内指向性シグナルペプチドとを含む。組換え糖タンパク質が宿主細胞の分泌経路を通過すると、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質が産生される。
【００５１】
別の実施形態において、本発明は、宿主細胞中で組換えシアル酸付加糖タンパク質を製造する方法を含む。宿主細胞は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生するように選択又は設計される。この方法は、（ａ）シアリル転移酵素活性を有する酵素をコードする核酸、及び（ｂ）ＣＭＰ−Ｓｉａの生合成又は輸送に関与する１種類以上の酵素をコードする核酸を宿主細胞に導入する段階を含む。組換え糖タンパク質が宿主細胞のゴルジ体を通過すると、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質が産生される。
【００５２】
本発明は、トランスシアリダーゼ酵素及びシアル酸供与体を宿主細胞増殖用培地に導入することを含む、組換え非ヒト真核生物宿主細胞中でシアル酸を含む組換え糖タンパク質を製造する方法も含む。
【００５３】
別の実施形態において、上記方法は、糖転移酵素、グリコシダーゼ及び糖トランスポーターからなる群から選択される１種類以上の酵素をコードする１種類以上の追加の核酸を宿主細胞に導入する段階を更に含み得る。
【００５４】
一実施形態において、前記方法は、ＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質を生成する。別の実施形態において、前記方法は、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質を生成する。
【００５５】
ある実施形態において、特許請求の範囲に記載した方法に用いられる宿主細胞は、ＣＭＰ−シアル酸の細胞プールを含むように選択若しくは設計することができ、又はＣＭＰ−シアル酸などのシアル酸供与体の存在下で若しくはシアル酸供与体前駆体の存在下で、培養することができる。ある実施形態において、宿主細胞は、ＣＭＰ−シアル酸を産生するように選択又は設計することができる。別の実施形態において、宿主細胞は、ＣＭＰ−Ｓｉａ経路に関与する１つ以上の酵素活性を発現するように改変することができる。
【００５６】
更に別の実施形態において、特許請求の範囲に記載した方法に用いられる宿主細胞は、糖転移酵素、グリコシダーゼ及び糖トランスポーターからなる群から選択される１種類以上のグリコシル化酵素を発現するように改変することができる。好ましい実施形態において、特許請求の範囲に記載した方法の宿主細胞は、ＣＭＰ−シアル酸トランスポーターを発現するように改変（選択又は設計）することができる。グリコシル化酵素も、触媒ドメインと、触媒ドメインを宿主細胞中の細胞内位置に向ける細胞内指向性シグナルペプチドとを含む融合タンパク質であり得る。
【００５７】
上記方法に用いられる宿主細胞は、任意の宿主細胞であり得る。一部の実施形態において、宿主細胞は、内在性シアリル転移酵素活性を欠く。一部の実施形態において、宿主細胞は、内在性ＣＭＰ−Ｓｉａを欠く。別の実施形態において、宿主細胞は、下等真核生物宿主細胞、昆虫細胞又は植物細胞からなる群から選択される。別の実施形態において、宿主細胞は、ピキア種（Pichia sp.）のいずれか、サッカロミセス種（Saccharomyces sp.）のいずれか、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、クルイベロミセス種(Kluyveromyces sp.)のいずれか、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、アスペルギルス種(Aspergillus sp.)のいずれか、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）、クリソスポリウム・ルクノウエンス（Chrysosporium lucknowense）、フザリウム種(Fusarium sp.)のいずれか及びニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crossa）からなる群から選択される。
【００５８】
別の実施形態において、上記方法に用いられる宿主細胞は、末端ガラクトースを含む糖タンパク質を産生する。
【００５９】
一部の実施形態において、特許請求の範囲に記載した方法に用いられる宿主細胞は、末端ガラクトースを含む糖タンパク質を産生し得る。一部の実施形態において、宿主細胞は、Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む複合型糖タンパク質を産生し得る。別の実施形態において、宿主細胞は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む混成型糖タンパク質を産生し得る。
【００６０】
ある実施形態において、上記方法は、内在性ＣＭＰ−Ｓｉａを欠く宿主細胞に、ＣＭＰ−シアル酸の生合成又は輸送に関与する１種類以上の酵素をコードする１種類以上の追加の核酸を導入する段階を更に含み得る。一実施形態において、上記方法は、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ、Ｎ−アセチルノイラミナート−９−ホスファートシンターゼ、Ｎ−アセチルノイラミナート−９−ホスファターゼ、ＣＭＰ−シアル酸ホスファターゼ及びＣＭＰ−シアル酸シンターゼからなる群から選択される１種類以上のほ乳動物酵素をコードする１種類以上の追加の核酸を宿主細胞に導入する段階を含む。別の実施形態において、上記方法は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ、シアラートシンターゼ及びＣＭＰ−Ｓｉａシンターゼからなる群から選択される１種類以上の細菌酵素をコードする１種類以上の追加の核酸を宿主細胞に導入する段階を含む。別の実施形態において、上記方法は、細菌ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ（ＮｅｕＣ）、シアラートシンターゼ（ＮｅｕＢ）及びほ乳動物ＣＭＰ−Ｓｉａシンターゼからなる群から選択される１種類以上の細菌酵素をコードする１種類以上の追加の核酸を宿主細胞に導入する段階を含む。
【００６１】
本発明は、シアリル転移酵素触媒ドメインとシアリル転移酵素触媒ドメインを宿主細胞の分泌経路に向ける細胞内指向性シグナルペプチドとを含む融合タンパク質をコードする核酸も含む。例えば、適切な細胞内指向性シグナルペプチドは、シアリル転移酵素触媒ドメインを小胞体、ゴルジ体、トランスゴルジ網又は分泌小胞に向けることができる。一実施形態において、この細胞内指向性シグナルペプチドは、シアリル転移酵素触媒ドメインをゴルジ体に向ける。一実施形態において、前記細胞内指向性シグナルは、ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＮ：ＮＰ＿００９７１のアミノ酸１から１０８を含む。
【００６２】
本発明は、トランスシアリダーゼ触媒ドメインとトランスシアリダーゼ触媒ドメインを宿主細胞の分泌経路、細胞壁又は細胞膜に向ける細胞内指向性シグナルペプチドとを含む融合タンパク質をコードする核酸も含む。
【００６３】
本発明は、特許請求の範囲に記載した方法に関連して、上記特性を有する、本発明の方法に用いられる宿主細胞も含む。一実施形態において、本発明の宿主細胞は、シアリル転移酵素活性又はトランスシアリダーゼ活性を有する酵素をコードする核酸を発現するように遺伝子操作された非ヒト真核生物宿主細胞を含む。一実施形態において、本発明の宿主細胞は、ＣＭＰ−シアル酸を産生するように遺伝子操作された非ヒト真核生物宿主細胞である。一実施形態において、本発明の宿主細胞は、シアリル転移酵素活性又はトランスシアリダーゼ活性を有する酵素をコードする核酸を発現するように、また、ＣＭＰ−シアル酸を産生するように遺伝子操作された非ヒト真核生物宿主細胞を含む。
【００６４】
別の実施形態において、本発明は、複合型ＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォーム又は混成型ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２若しくはＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質を産生可能な下等真核生物宿主細胞を含む。
【００６５】
本発明は、本発明の方法によって製造される糖タンパク質組成物も含む。ある実施形態において、前記糖タンパク質組成物は、複合型ＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを優勢に含み得る。別の実施形態において、前記糖タンパク質組成物は、混成型ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を含み得る。
【００６６】
本発明は、本発明の方法によって製造される糖タンパク質組成物も含む。ある実施形態において、前記糖タンパク質組成物は、複合型ＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを優勢に含む。別の実施形態において、前記糖タンパク質組成物は、混成型ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を優勢に含む。
【００６７】
本発明は、トランスシアリダーゼ酵素及びシアル酸供与体を宿主増殖用培地に導入することを含む、組換え非ヒト真核生物宿主細胞中でシアル酸付加糖タンパク質を製造する方法も提供する。
【００６８】
本発明は、ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸を宿主細胞に導入する段階を含む、宿主細胞におけるＣＭＰ−シアル酸の産生を促進する方法も提供する。
【００６９】
本発明は、シアラートアルドラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸を宿主細胞に導入する段階を含む、宿主細胞におけるＣＭＰ−シアル酸の産生を促進する方法も提供する。
【００７０】
図面の簡単な説明
【００７１】
図１Ａは、典型的な真菌Ｎ−グリコシル化経路の略図である。
【００７２】
図１Ｂは、典型的なヒトＮ−グリコシル化経路の略図である。
【００７３】
図２は融合構築物のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーの構築を示す。図２Ａは、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）へのターゲティングペプチド断片の挿入を示す図である。図２Ｂは、生成した、制限酵素切断部位ＮｏｔＩ−ＡｓｃＩを有する指向性ペプチドサブライブラリーを示す。図２Ｃは、改変ｐＵＣ１９ベクターであるｐＪＮ３４７への触媒ドメイン領域の挿入を示す図である。図２Ｄは、生成した、制限酵素切断部位ＮｏｔＩ、ＡｓｃＩ及びＰａｃＩを有する触媒ドメインサブライブラリーを示す。図２Ｅは、指向性ペプチドサブライブラリー及び触媒ドメインサブライブラリーから作製された特別な一融合構築物を示す。
【００７４】
図３（出現順にそれぞれ配列番号４５−４６）は、ハツカネズミα−１，２−マンノシダーゼＩＡオープンリーディングフレームを示す。Ｎ末端切断部の作製に用いたＰＣＲプライマーの配列には下線が引かれている。
【００７５】
図４Ａ−４Ｆは、複数の栄養要求性マーカーを含むベクターの操作、及びＰ．パストリスＯＣＨ１座中への標的タンパク質の遺伝子組み込みを示す。
【００７６】
図５Ａ−５Ｅは、Ｐ．パストリスにおける、優勢なＮ−グリカン構造としてＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有するヒトプラスミノゲン（Ｋ３）糖タンパク質のクリングル３ドメインの生成を示すＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析結果を示す。図５Ａは、標準Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ａ］グリカン（Ｇｌｙｋｏ、Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡ）及びＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２＋Ｎａ＋［ｂ］を示す。図５Ｂは、Ｋ３野生型由来の、ＰＮＧａｓｅによって遊離されたグリカンを示す。示したＮ−グリカンは、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］、Ｍａｎ１０ＧｌｃＮＡｃ２［ｅ］、Ｍａｎ１１ＧｌｃＮＡｃ２［ｆ］、Ｍａｎ１２ＧｌｃＮＡｃ２［ｇ］である。図５Ｃは、優勢なＮ−グリカンとしてＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２［ｃ］の産生をもたらすｏｃｈ１欠損を示す。図５Ｄ及び５Ｅは、キメラα−１，２−マンノシダーゼを用いてＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２をインビボで切り取った後のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］の産生を示す。優勢なＮ−グリカンは、質量（ｍ／ｚ）１２５３のピークによって示され、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］としての同定と一致する。
【００７７】
図６Ａ−６Ｆは、Ｐ．パストリスにおける、優勢なＮ−グリカン構造としてＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有するＩＦＮ−β糖タンパク質の生成を示すＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析結果を示す。図６Ａは、標準Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ａ］、及び標準としてのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２＋Ｎａ＋［ｂ］（Ｇｌｙｋｏ、Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡ）を示す。図６Ｂは、ＩＦＮ−β野生型由来の、ＰＮＧａｓｅによって遊離されたグリカンを示す。図６Ｃは、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２［ｃ］、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］、Ｍａｎ１０ＧｌｃＮＡｃ２［ｅ］、Ｍａｎ１１ＧｌｃＮＡｃ２［ｆ］、Ｍａｎ１２ＧｌｃＮＡｃ２［ｇ］を産生し、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］を産生しないｏｃｈ１ノックアウトを示す。図６Ｄは、他の中間体Ｎ−グリカンＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｃ］からＭａｎ１２ＧｌｃＮＡｃ２［ｇ］のうち比較的少量のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］を示す。図６Ｅは、ｐＧＣ５（サッカロミセスＭＮＳ１（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＢ  Δ９９）によって産生される他のグリカンＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２［ｃ］及びＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］に比べて、かなりの量のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］を示す。図６Ｆは、ｐＦＢ８（サッカロミセスＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡ  Δ１８７）による、分泌糖タンパク質ＩＦＮ−β上のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］の優勢な産生を示す。Ｎ−グリカンは、質量（ｍ／ｚ）１２５４のピークによって示され、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］としての同定と一致する。
【００７８】
図７は、（Ａ）２−ＡＢで標識されたＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２標準（負の対照）、（Ｂ）上清中の細胞外マンノシダーゼ活性の欠如を示す、ｐＦＢ８マンノシダーゼで形質転換された培地Ｐ．パストリス、Δｏｃｈ１の上清、及び（Ｃ）Ｔ．リーセイマンノシダーゼに曝露後の２−ＡＢで標識されたＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２標準（正の対照）の高速液体クロマトグラムを示す。
【００７９】
図８は、（Ａ）２−ＡＢで標識されたＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２標準（負の対照）、（Ｂ）上清中の細胞外マンノシダーゼ活性の欠如を示す、ｐＧＣ５マンノシダーゼで形質転換された培地Ｐ．パストリス、Δｏｃｈ１の上清、及び（Ｃ）Ｔ．リーセイマンノシダーゼに曝露後の２−ＡＢで標識されたＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２標準（正の対照）の高速液体クロマトグラムを示す。
【００８０】
図９は、（Ａ）２−ＡＢで標識されたＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ−３標準（負の対照）、（Ｂ）上清中の細胞外マンノシダーゼ活性の欠如を示す、ｐＢＣ１８−５マンノシダーゼで形質転換された培地Ｐ．パストリス、Δｏｃｈ１の上清、及び（Ｃ）上清中の活性を示す、ｐＤＤ２８−３で形質転換された培地Ｐ．パストリス、Δｏｃｈ１の上清（正の対照）の高速液体クロマトグラムを示す。
【００８１】
図１０Ａ−１０Ｂは、Ｐ．パストリス中のＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の産生におけるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターの活性を示す。図１０Ａは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］のある程度の産生とＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ａ］の優勢な産生をもたらす、ヒトＧｎＴＩを含むがＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターを含まないＰ．パストリス株（ＹＳＨ−３）を示す。図１０Ｂは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］の優勢な産生をもたらした、ヒトＧｎＴＩを含む系統（ＰＢＰ−３）におけるＫ．ラクチス由来のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターの付加を示す。図１０Ｂに示すように、質量（ｍ／ｚ）１４５７の単一の突出したピークは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］としての同定と一致する。
【００８２】
図１１は、Ｐ．パストリス中で発現されるｐＢＢ２７−２（サッカロミセスＭＮＮ１０（ｓ）／線虫マンノシダーゼＩＢ  Δ３１）によってコードされる異種マンノシダーゼ酵素の最適ｐＨを示す。
【００８３】
図１２Ａ−１２Ｃは、Ｋ．ラクチスの無細胞抽出物から遊離したＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析結果を示す。図１２Ａは、高マンノース型Ｎ−グリカンを含む野生型細胞から遊離したＮ−グリカンを示す。図１２Ｂは、ｏｃｈ１  ｍｎｎ１欠損細胞から遊離したＮ−グリカンを示す。質量（ｍ／ｚ）１９０８の明確なピークは、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］としての同定と一致する。図１２Ｃは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２と一致したピークに対応する、インビトロでのα−１，２−マンノシダーゼ消化（ｄｉｇｅｓｔ）後のｏｃｈ１  ｍｎｎ１欠損細胞から遊離したＮ−グリカンを示す。
【００８４】
図１３は、異なるリーダー配列にインフレームで融合したグリコシル化酵素の触媒ドメインを含むＴ−ＤＮＡカセットを示す。Ｔ−ＤＮＡの両端は、右縁（ｒｂ）及び左縁（ｌｂ）で印がつけられている。種々のプロモーター及びターミネーターを使用することもできる。植物選択マーカーも変わり得る。右縁と左縁は、アグロバクテリウムによって媒介される形質転換にのみ必要であり、微粒子銃又は電気穿孔法には不要である。
【００８５】
図１４は、ほ乳動物及び細菌におけるＣＭＰ−シアル酸生合成経路を示す。各経路に関与する酵素をイタリック体で表記する。一次基質、中間体及び生成物をボールド体で表記する。（ＰＥＰ：ホスホエノールピルビン酸、ＣＴＰ：シチジン三リン酸）。
【００８６】
図１５は、Ｅ．コリタンパク質ＮｅｕＣのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＮ：Ｍ８４０２６．１、配列番号５７）、及び予測アミノ酸配列（配列番号５８）を示す。下線を引いたＤＮＡ配列は、プライマーがＯＲＦを増幅するように設計された領域である。
【００８７】
図１６は、Ｅ．コリタンパク質ＮｅｕＢのＯＲＦ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＮ：Ｕ０５２４８．１、配列番号５９）、及び予測アミノ酸配列（配列番号６０）を示す。下線を引いたＤＮＡ配列は、プライマーがＯＲＦを増幅するように設計された領域である。
【００８８】
図１７は、Ｅ．コリタンパク質ＮｅｕＡのＯＲＦ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＮ：Ｊ０５０２３．１、配列番号６１）及び予測アミノ酸配列（配列番号６２）を示す。下線を引いたＤＮＡ配列は、プライマーがＯＲＦを増幅するように設計された領域である。
【００８９】
図１８はハツカネズミＣＭＰ−ＳｉａシンターゼのＯＲＦ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＮ：ＡＪ００６２１５、配列番号６３）、及びアミノ酸配列（配列番号６４）を示す。下線を引いたＤＮＡ配列は、プライマーがＯＲＦを増幅するように設計された領域である。
【００９０】
図１９は、Ｎ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）をインビボで生成する代替生合成経路を示す。各経路に関与する酵素をイタリック体で表記する。一次基質、中間体及び生成物をボールド体で表記する。
【００９１】
図２０は、イノシシＧｌｃＮＡｃエピメラーゼのＯＲＦ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＮ：Ｄ８３７６６、配列番号６５）、及びアミノ酸配列（配列番号６６）を示す。下線を引いたＤＮＡ配列は、プライマーがＯＲＦを増幅するように設計された領域である。
【００９２】
図２１は、シアラートアルドラーゼによって触媒される可逆反応、及びそのシアル酸（Ｓｉａ）濃度依存性を示す。各経路に関与する酵素をイタリック体で表記する。一次基質、中間体及び生成物をボールド体で表記する。
【００９３】
図２２は、コリシアラートアルドラーゼのＯＲＦ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＮ：Ｘ０３３４５、配列番号６７）、及びアミノ酸配列（配列番号６８）を示す図である。下線を引いたＤＮＡ配列は、プライマーがＯＲＦを増幅するように設計された領域である。
【００９４】
図２３は、受容体グリカンの非存在下で、アッセイ条件（実施例１６）下でインキュベートされた系統ＹＳＨ９９ａからの細胞抽出物の負の対照のＨＰＬＣを示す。２６．５分で溶出した二重ピークは、汚染細胞成分によるものである。
【００９５】
図２４は、２−ＡＢ（アミノベンズアミド）標識受容体グリカンの存在下でアッセイ条件（実施例１６）下でインキュベートされ、ＣＭＰ−シアル酸を補充された系統ＹＳＨ９９ａからの正の対照の細胞抽出物のＨＰＬＣを示す。２３分で溶出したピークは、二分岐ガラクトシル化Ｎ−グリカンの各枝上のシアリル化に対応する。２６．５分で溶出した二重ピークは、汚染細胞成分によるものである。
【００９６】
図２５は、受容体グリカンの存在下でアッセイ条件（実施例１６）下でインキュベートされ、外来性ＣＭＰ−シアル酸を含まない系統ＹＳＨ９９ａからの細胞抽出物のＨＰＬＣを示す。２０分及び２３分で溶出したピークは、二分岐ガラクトシル化Ｎ−グリカンのモノ及びジシアリル化に対応する。２６．５分で溶出した二重ピークは、汚染細胞成分によるものである。
【００９７】
図２６は、ＹＳＨ９９ａ抽出物インキュベーションからのＮ−グリカンのシアリダーゼ処理を示す。図２５に示す試料が、シアリダーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｅｙ、ＭＡ）１００Ｕの存在下で３７℃で終夜インキュベートされた。モノ及びジシアル酸付加Ｎ−グリカンに対応する２０分及び２３分で溶出したピークは、図２５において除去された。２６分の汚染ピークは残っている。
【００９８】
図２７は、市販モノ及びジシアル酸付加Ｎ−グリカン標準を示す。２０分及び２３分で溶出したピークは、市販標準Ａ１及びＡ２（Ｇｌｙｋｏ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｒａｆａｅｌ、ＣＡ）のモノ及びジシアリル化に対応する。
【００９９】
図２８は、実施例１７で使用されたベクターｐＳＨ３２１ｂを示す。
【０１００】
図２９は、実施例１７で使用されたベクターｐＪＮ７１１ｂを示す。
【０１０１】
図３０は、実施例１７で使用されたベクターｐＳＨ３２６ｂを示す。
【０１０２】
図３１は、実施例１７で使用されたベクターｐＳＨ３７０を示す。
【０１０３】
図３２は、実施例１７で使用されたベクターｐＳＨ３７３を示す。
【０１０４】
図３３は、実施例１７に記載した、コドンが最適化されたｈＳＴ６Ｇａｌリーダー５３融合物の核酸（配列番号１０１）及びアミノ酸配列（配列番号１０２）を示す
【０１０５】
図３４は、実施例１７で使用されたベクターｐＳＨ５６８を示す。
【０１０６】
図３５は、ＹＳＨ  １２６及びＹＳＨ１４５中で産生されたグリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析結果を示す。各ＭＡＬＤＩ−ＲＯＦの右上隅の「＋ｖｅ」の記号は陽イオンの分析結果を示し、「−ｖｅ」の記号は陰イオンの分析結果を示す。
【０１０７】
図３６は、ＹＳＨ１４５及びＹＳＨ１６０中で産生されたグリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析結果を示す。
【０１０８】
図３７は、ＹＳＨ２７２中で産生されたグリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析結果を示す。実線の矢印は、シアル酸を含むグリカンである。破線の矢印は、中性グリカンである。
【０１０９】
別段の記載がない限り、本発明に関連して用いられる科学及び技術用語は、当業者によって一般に理解されている意味を有するものとする。また、状況によって必要でない限り、単数の用語は複数を含み、複数の用語は単数を含むものとする。本発明の方法及び技術は、当分野で周知の従来法によって一般に実施される。一般に、関連して用いられる命名法、並びに本明細書に記載の生化学、酵素学、分子・細胞生物学、微生物学、遺伝学、タンパク質・核酸化学及びハイブリダイゼーションの技術は、当分野では周知であり、一般に用いられるものである。
【０１１０】
本発明の方法及び技術は、別段の記載がない限り、当分野で周知の従来法によって一般に実施され、本明細書を通して引用及び考察される種々の一般的参考文献及びより具体的な参考文献に記載のように実施される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．（１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  （１９９２及び補遺  ２００２）、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．（１９９０）；  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｍａｕｒｅｅｎ  Ｅ．  Ｔａｙｌｏｒ，  Ｋｕｒｔ  Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．  Ｐｒｅｓｓ（２００３）、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．  Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，  ＮＪ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｖｏｌ  Ｉ  １９７６  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｖｏｌ  ＩＩ  １９７６  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）を参照されたい。関連して用いられる命名法、並びに本明細書に記載の分子・細胞生物学、タンパク質生化学、酵素学及び医薬品・製薬化学の実験手順及び技術は、当分野では周知であり、一般に用いられるものである。
【０１１１】
本明細書に記載のすべての刊行物、特許、及び他の参考文献を参照により本明細書に取り込む。
【０１１２】
以下の用語は、別段の記載がない限り、以下の意味を有すると理解されたい。
【０１１３】
本明細書では「Ｎ−グリカン」という用語は、Ｎ結合型オリゴ糖（例えば、ポリペプチドのアスパラギン残基とのアスパラギン−Ｎ−アセチルグルコサミン結合によって結合されたオリゴ糖）を指す。Ｎ−グリカンは、共通したＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の五糖の核を有する（「Ｍａｎ」はマンノースを指し、「Ｇｌｃ」はグルコースを指し、「ＮＡｃ」はＮ−アセチルを指し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを指す。）。Ｎ−グリカンに関して用いられる「トリマンノース核」という用語も、構造Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ３」）を指す。Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ３核構造体に付加した周囲の糖（例えば、フコース及びシアル酸）を含む枝（分岐（ａｎｔｅｎｎａｅ））数に関して異なる。Ｎ−グリカンは、その分枝成分に従って分類される（例えば、高マンノース、複合型又は混成型）。
【０１１４】
「高マンノース」型Ｎ−グリカンは、５個以上のマンノース残基を有する。「複合」型Ｎ−グリカンは、一般に、トリマンノース核の１，３マンノース腕に結合した少なくとも１個のＧｌｃＮＡｃと、１，６マンノース腕に結合した少なくとも１個のＧｌｃＮＡｃとを有する。複合型Ｎ−グリカンは、シアル酸又は誘導体（「ＮｅｕＡｃ」。ここで、「Ｎｅｕ」はノイラミン酸を指し、「Ａｃ」はアセチルを指す。）で修飾されていてもよいガラクトース（「Ｇａｌ」）残基も有し得る。複合型Ｎ−グリカンは、一般に、例えば、ＮｅｕＮＡｃ−、ＮｅｕＡｃａ２−６ＧａｌＮＡｃａ１−、ＮｅｕＡｃａ２−３Ｇａｌｂ１−３ＧａｌＮＡｃａ１−、ＮｅｕＡｃａ２−３／６Ｇａｌｂ１−４ＧｌｃＮＡｃｂ１−、ＧｌｃＮＡｃａ１−４Ｇａｌｂ１−（ムチンのみ）、Ｆｕｃａ１−２Ｇａｌｂ１−（血液型Ｈ）などのオリゴ糖で終結する少なくとも１本の枝を有する。硫酸エステルは、ガラクトース、ＧａｌＮＡｃ及びＧｌｃＮＡｃ残基上に存在し得、リン酸エステルはマンノース残基上に存在し得る。ＮｅｕＡｃ（Ｎｅｕ：ノイラミン酸、Ａｃ：アセチル）は、Ｏ−アセチル化し得、又はＮｅｕＧｌ（Ｎ−グリコリルノイラミン酸）で置換し得る。複合型Ｎ−グリカンは、「バイセクト（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）」ＧｌｃＮＡｃ及び核フコース（「Ｆｕｃ」）を含む鎖内置換も有し得る。「混成型」Ｎ−グリカンは、トリマンノース核の１，３マンノース腕の末端上の少なくとも１個のＧｌｃＮＡｃと、トリマンノース核の１，６マンノース腕上の０個以上のマンノースとを有する。
【０１１５】
第１のファミリー又は種の最初の酵素又は遺伝子に対して用いられる「相同体」という用語は、機能、構造又はゲノム分析によって、第１のファミリー又は種の最初の酵素又は遺伝子に対応する第２のファミリー又は種の酵素又は遺伝子であると判定された、第２のファミリー又は種の異なる酵素又は遺伝子を指す。ほとんどの場合、相同体は、機能、構造又はゲノム上の類似点を有する。酵素又は遺伝子の相同体を遺伝子プローブ及びＰＣＲを用いて容易にクローン化することができる技術が知られている。相同体としてのクローン配列の同一性は、機能アッセイ、及び／又は遺伝子のゲノムマッピングによって確認することができる。
【０１１６】
Ｎ−グリカンの生成に関して用いられる「優勢な」又は「優勢に」という用語は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）によって検出される主要ピークの構造体を指す。
【０１１７】
本明細書において使用する略語は、当分野で一般的な用法のものであり、例えば、上記糖の略語を参照されたい。他の一般的略語としては、ペプチドＮ−グリコシダーゼＦ（ＥＣ  ３．２．２．１８）を指す「ＰＮＧａｓｅ」、Ｎ−アセチルグルコサミニル転移酵素を指す「ＧｌｃＮＡｃ  Ｔｒ」又は「ＧｎＴ」、Ｎ−アセチルノイラミン酸を指す「ＮＡＮＡ」などが挙げられる。
【０１１８】
本明細書では「ヒト化糖タンパク質」又は「ヒト様糖タンパク質」とは、タンパク質に結合した、４個未満のマンノース残基を有するΝ−グリカンと、少なくとも５個のマンノース残基を有する（やはり有用であり、インビトロ又はインビボで更に処理することができる）合成糖タンパク質中間体とを有する該タンパク質を二者択一的に指す。好ましくは、本発明によって製造される糖タンパク質は、少なくとも３０モル％、好ましくは少なくとも４０モル％、より好ましくは５０−１００モル％のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２中間体を、少なくとも過渡的に含む。これは、例えば、本発明の宿主細胞を操作して、「より良い」、すなわち、より効率的なグリコシル化酵素を発現させることによって達成することができる。例えば、マンノシダーゼは、タンパク質がグリコシル化される宿主細胞中の部位に存在する条件下で最適な活性を有するように選択され、好ましくは、活性が要求される宿主細胞小器官にマンノシダーゼを向けることによって、宿主細胞に導入される。
【０１１９】
変化する（ａｌｔｅｒｉｎｇ）宿主細胞グリコシル化に関連して、本明細書において使用される「酵素」という用語は、少なくとも１つの酵素活性を有する分子を指し、完全長酵素、触媒作用的に活性な断片、キメラ、複合体などを含む。酵素の「触媒作用的に活性な断片」とは、検出可能なレベルの機能的（酵素）活性を有するポリペプチドを指す。
【０１２０】
グリコシル化プロファイルに関連して、本明細書において使用する「下等真核生物宿主細胞」とは、高マンノース含有Ｎ−グリカンを通常産生する任意の真核細胞を指し、したがってグリコシル化プロファイルが、下等真核生物細胞、並びに単細胞及び多細胞の真菌細胞及び藻類細胞を含めて、最も典型的な下等真核生物細胞のグリコシル化プロファイルに類似した一部の動物又は植物細胞を、機能的な意味で、含むものとする。
【０１２１】
本明細書では「分泌経路」という用語は、脂質に結合したオリゴ糖前駆体及びＮ−グリカン基質が逐次的に曝露される種々のグリコシル化酵素の集合列（ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｌｉｎｅ）を指し、細胞質から小胞体（ＥＲ）及びゴルジ体の区画までの新生ポリペプチド鎖の分子の流れに沿う。したがって、「分泌経路」という用語は、糖タンパク質が分泌に備えて修飾される細胞小器官及び細胞内構成要素を指す。分泌経路は、小胞体、すなわちＥＲ、ゴルジ体、トランスゴルジ網及び分泌小胞を含む。酵素は、この経路に沿って局在すると言われている。脂質に結合したグリカン又はＮ−グリカンに対して酵素Ｙの前に作用する酵素Ｘは、酵素Ｙの「上流」にある、又は「上流」で作用すると言われており、同様に、酵素Ｙは、酵素Ｘの「下流」にあり、又は「下流」で作用する。
【０１２２】
本明細書では「指向性ペプチド」α「指向性シグナルペプチド」という用語は、随伴する配列が細胞内位置（例えば、細胞小器官）に局在する（又は保留される）のを媒介する細胞内指向性シグナルペプチドをコードするヌクレオチド又はアミノ酸配列を指す。
【０１２３】
「ポリヌクレオチド」又は「核酸分子」という用語は、少なくとも１０塩基長のヌクレオチドの重合体を指す。この用語は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又は合成ＤＮＡ）及びＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ又は合成ＲＮＡ）、並びに非自然（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ）ヌクレオチド類似体、外来（ｎｏｎ−ｎａｔｉｖｅ）ヌクレオシド間結合、又は両方を含む、ＤＮＡ又はＲＮＡの類似体を含む。核酸は、任意の形態をとり得る。例えば、核酸は、一本鎖、二本鎖、三本鎖、四本鎖、部分二本鎖、分枝、ヘアピン、環状又は南京錠型（ｐａｄｌｏｃｋｅｄ）形態であり得る。この用語は、一本鎖ＤＮＡ及び二本鎖ＤＮＡを含む。本発明の核酸分子は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の両方、並びに上記の合成体及び混合ポリマーを含み得る。これらの核酸は、当業者には容易に理解されるように、化学的若しくは生化学的に修飾することができ、又は非自然若しくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含み得る。かかる修飾としては、例えば、標識（ｌａｂｅｌ）、メチル化、天然ヌクレオチドの１個以上と類似体の置換、ヌクレオチド間修飾、例えば、無電荷結合（例えば、メチルホスホン酸、リン酸トリエステル、ホスホルアミダート、カルバマートなど）、荷電結合（例えば、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアートなど）、懸垂成分（例えば、ポリペプチド）、挿入物（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレート剤、アルキル化剤、及び修飾された結合（例えば、アルファアノマー核酸など）が挙げられる。水素結合及び他の化学的相互作用を介して指定配列に結合する能力に関して、ポリヌクレオチドを模倣した合成分子も挙げられる。かかる分子は、当分野で公知であり、例えば、ペプチド結合が分子骨格中のリン酸結合を置換した分子が挙げられる。
【０１２４】
別段の記載がない限り、「配列番号Ｘを含む核酸」は、少なくともその一部が（ｉ）配列番号Ｘの配列、又は（ｉｉ）配列番号Ｘに相補的な配列を有する核酸を指す。この２つの間の選択は状況に応じて決まる。例えば、核酸をプローブとして使用する場合、この２つの間の選択は、プローブが所望の標的に対して相補的である必要条件に応じて決まる。
【０１２５】
「単離」又は「実質的に純粋な」核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ又は混合ポリマー）は、その天然宿主細胞中の未変性ポリヌクレオチドに天然に付随する他の細胞成分（例えば、天然に付随するリボソーム、ポリメラーゼ及びゲノム配列）から、実質的に分離された核酸又はポリヌクレオチドである。この用語は、（１）その天然環境から取り出された核酸若しくはポリヌクレオチド、（２）「単離ポリヌクレオチド」が天然に存在するポリヌクレオチドの全部若しくは一部を伴わない核酸若しくはポリヌクレオチド、（３）天然に結合していないポリヌクレオチドに作用可能に結合した核酸若しくはポリヌクレオチド、又は（４）天然に存在しない核酸若しくはポリヌクレオチドを包含する。「単離」又は「実質的に純粋」という用語は、組換え若しくはクローン化ＤＮＡ単離物、化学合成されたポリヌクレオチド類似体、又は異種の系によって生物学的に合成されたポリヌクレオチド類似体に関連して使用することもできる。
【０１２６】
しかし、「単離」は、そのように記述された核酸又はポリヌクレオチド自体がその自然環境から物理的に取り出されたことを必ずしも必要としない。例えば、生物体のゲノム中の内在性核酸配列は、異種配列（すなわち、この内在性核酸配列に天然に隣接しない配列）が内在性核酸配列に隣接し、この内在性核酸配列の発現が変化する場合には、本明細書では「単離」と考えられる。例として、外来プロモーター配列は、ヒト細胞のゲノム中の遺伝子の未変性プロモーターを（例えば、相同組換えによって）置換することができ、この遺伝子は、変化した発現パターンを有する。この遺伝子は、天然に隣接する配列の少なくとも一部から分離されるので、「単離」されたことになる。
【０１２７】
核酸も、ゲノム中の対応する核酸に自然には生じない任意の修飾を含む場合に、「単離」とみなされる。例えば、内在性コード配列は、例えば人間の介入によって、人工的に導入された挿入、欠失又は点変異を含む場合に、「単離」とみなされる。「単離核酸」は、宿主細胞染色体の非相同的部位に組み込まれた核酸、エピソームとして存在する核酸構築物も含む。さらに、「単離核酸」は、他の細胞材料を実質的に含まないことができ、又は組換え技術によって製造されたときに培地を実質的に含まないことができ、又は化学合成されたときに化学前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まないことができる。
【０１２８】
本明細書では基準核酸配列の「縮重変種」という句は、標準遺伝コードに従って翻訳されて、基準核酸配列から翻訳されたアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を与え得る核酸配列を包含する。
【０１２９】
核酸配列に関連して「配列同一性百分率」又は「同一」という用語は、最大一致で整列させたときに、２つの配列中の同じである残基を指す。配列同一性比較の長さは、少なくとも約９ヌクレオチド、通常は少なくとも約２０ヌクレオチド、より通常は少なくとも約２４ヌクレオチド、典型的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より典型的には少なくとも約３２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約３６ヌクレオチド以上の一配列であり得る。ヌクレオチド配列同一性の測定に使用することができる当分野で公知の幾つかの異なるアルゴリズムがある。例えば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ中のプログラムである、ＦＡＳＴＡ、Ｇａｐ又はＢｅｓｔｆｉｔを用いて、ポリヌクレオチド配列を比較することができる。ＦＡＳＴＡは、照会配列と検索配列の重なりが最大である領域のアラインメント及び配列同一性百分率を与える（参照により本明細書に取り込むＰｅａｒｓｏｎ，  １９９０）。例えば、核酸配列間の配列同一性百分率は、ＦＡＳＴＡをその初期設定パラメータ（ワードサイズ６、及びスコアリングマトリックスに対するＮＯＰＡＭ因子）で用いて求めることができ、又は参照により本明細書に取り込むＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１で提供されるＧａｐをその初期設定で用いて求めることができる。
【０１３０】
核酸又はその断片に関して「有意なアラインメント」、「実質的相同性」又は「実質的類似度」という用語は、適切なヌクレオチド挿入又は欠失状態で、別の核酸（又はその相補鎖）と最適に整列させたときに、上述したように、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐなどの任意の周知の配列同一性アルゴリズムによって測定して、ヌクレオチド塩基の少なくとも約５０％、より好ましくは６０％、通常は少なくとも約７０％、より通常は少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のヌクレオチド配列同一性があることを示す。
【０１３１】
或いは、有意なアラインメント、実質的相同性又は類似度は、核酸又はその断片が、厳密なハイブリダイゼーション条件下で、別の核酸、別の核酸の鎖、又はその相補鎖とハイブリッド形成するときに存在する。核酸ハイブリダイゼーション実験に関連して「厳密なハイブリダイゼーション条件」及び「厳密な洗浄条件」は、幾つかの異なる物理的パラメータに依存する。核酸ハイブリダイゼーションは、当業者には容易に理解されるように、塩濃度、温度、溶媒、ハイブリッド形成種の塩基組成、相補領域の長さ、及びハイブリッド形成核酸間のヌクレオチド塩基ミスマッチの数などの条件に影響され得る。当業者は、ハイブリダイゼーションの特別な厳密性を得るためにこれらのパラメータを変更する方法を知っている。
【０１３２】
一般に、「厳密なハイブリダイゼーション」は、特別な条件セット下で、特定のＤＮＡハイブリッドの熱融解点（Ｔｍ）よりも約２５℃低温で実施される。「厳密な洗浄」は、特別な条件セット下で、特定のＤＮＡハイブリッドのＴｍよりも約５℃低温で実施される。Ｔｍは、標的配列の５０％が、完全に一致したプローブとハイブリッド形成する温度である。参照により本明細書に取り込むＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、前掲、９．５１ページを参照されたい。本明細書では「厳密性の高い条件」は、溶液相ハイブリダイゼーションに対して、６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣは、３．０Ｍ  ＮａＣｌ及び０．３Ｍクエン酸ナトリウムを含む。）、１％ＳＤＳ中で６５℃で８−１２時間の水性ハイブリダイゼーション（すなわち、ホルムアミドを含まない。）と、それに続く０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによる６５℃で２０分間の２回の洗浄として定義される。６５℃でのハイブリダイゼーションは、ハイブリッド形成する配列の長さ及び同一性百分率を含めて、幾つかの因子に応じて異なる速度で起こることを当業者は理解されたい。
【０１３３】
本発明の（ポリヌクレオチドとも称される）核酸は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の両方、並びに上記の合成体及び混合ポリマーを含み得る。これらの核酸は、当業者には容易に理解されるように、化学的若しくは生化学的に修飾することができ、又は非自然若しくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含み得る。かかる修飾としては、例えば、標識、メチル化、類似体による天然ヌクレオチドの１個以上の置換、ヌクレオチド間修飾、例えば、無電荷結合（例えば、メチルホスホン酸、リン酸トリエステル、ホスホルアミダート、カルバマートなど）、荷電結合（例えば、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアートなど）、懸垂成分（例えば、ポリペプチド）、挿入物（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレート剤、アルキル化剤、及び修飾された結合（例えば、アルファアノマー核酸など）が挙げられる。水素結合及び他の化学的相互作用を介して指定配列に結合する能力に関して、ポリヌクレオチドを模倣した合成分子も挙げられる。かかる分子は、当分野で公知であり、例えば、ペプチド結合が分子骨格中のリン酸結合を置換した分子が挙げられる。
【０１３４】
「変異」という用語は、核酸配列に適用するときには、核酸配列中のヌクレオチドが、基準核酸配列に比べて挿入され、欠失し又は変化し得ることを意味する。単一の改変が遺伝子座においてなされ得（点変異）、又は複数のヌクレオチドが単一の遺伝子座において挿入され、欠失し若しくは変化し得る。また、１つ以上の改変が、核酸配列内の任意の数の遺伝子座においてなされ得る。核酸配列は、「誤りがちな（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ」（ＤＮＡポリメラーゼの複製忠実度が低い条件下でＰＣＲを実施し、高い率の点変異がＰＣＲ産物の全長に沿って得られるプロセス。例えば、Ｌｅｕｎｇ，  １９８９、Ｃａｌｄｗｅｌｌ，  １９９２を参照されたい。）、「オリゴヌクレオチド特異的変異誘発」（任意の目的クローン化ＤＮＡセグメントにおける部位特異的変異の生成を可能にするプロセス。例えば、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ  １９８８を参照されたい。）などの変異誘発技術を含めて、ただしこれらだけに限定されない、当分野で公知の任意の方法によって、変異させることができる。
【０１３５】
本明細書では「ベクター」という用語は、それが結合した別の核酸を輸送することができる核酸分子を指すものとする。ベクターの１タイプは「プラスミド」である。プラスミドは、追加のＤＮＡセグメントを連結することができる環状二重鎖ＤＮＡループである。他のベクターとしては、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）などが挙げられる。ベクターの別のタイプはウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに連結することができる（後でより詳細に考察する。）。ある種のベクターは、ベクターが導入された宿主細胞中で自己複製することができる（例えば、宿主細胞中で機能する複製開始点を有するベクター）。他のベクターは、宿主細胞に導入すると宿主細胞のゲノム中に組み込むことができ、それによって宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、ある種の好ましいベクターは、それが作用可能に連結された遺伝子の発現を誘導することができる。かかるベクターを本明細書では「組換え発現ベクター」（又は単に「発現ベクター」）と称する。
【０１３６】
「作用可能に結合した」発現制御配列とは、発現制御配列が目的遺伝子に隣接して、目的遺伝子を制御する結合、並びにトランスにて又は目的遺伝子を制御する距離で、作用する発現制御配列を指す。
【０１３７】
本明細書では「発現制御配列」という用語は、作用可能に結合したコード配列の発現に影響を及ぼすのに必要であるポリヌクレオチド配列を指す。発現制御配列は、核酸配列の転写、転写後の諸現象及び翻訳を制御する配列である。発現制御配列は、適切な転写開始、終結、プロモーター及びエンハンサー配列；スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナルなどの効率的ＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を向上させる配列（例えば、リボソーム結合部位）；タンパク質の安定性を向上させる配列、並びに所望のときには、タンパク質分泌を増大させる配列を含む。かかる制御配列の性質は、宿主生物によって異なる。原核生物では、かかる制御配列は、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結配列を含む。「制御配列」という用語は、その存在が発現に必須である全成分を最低限含むものとし、その存在が有利である追加の成分（例えば、リーダー配列及び融合パートナー配列）も含むことができる。
【０１３８】
本明細書では「組換え宿主細胞」（又は単に「宿主細胞」）という用語は、遺伝子操作された細胞を指すものとする。組換え宿主細胞としては、組換えベクターを導入した細胞などが挙げられる。かかる用語は、特定の対象細胞だけでなく、かかる細胞の子孫も指すものであることを理解すべきである。変異又は環境の影響のためにある種の改変が後継世代に起こり得るので、かかる子孫は、親細胞と実際には同一でないこともあるが、それでも本明細書では「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。組換え宿主細胞は、培養増殖された単離細胞若しくは細胞系であり得、又は生組織若しくは生物体中に存在する細胞であり得る。「宿主」という用語は、１個以上の「宿主細胞」を含む任意の生物体、動物若しくは植物を指し、又は「宿主細胞」源を指す。
【０１３９】
さらに、本明細書では「内在性ＣＭＰ−Ｓｉａを欠く宿主細胞」は、ＣＭＰ−Ｓｉａ経路を欠く細胞を含めて、ＣＭＰ−Ｓｉａを内因的に産生しない細胞を指す。本明細書では「真菌宿主細胞」は、ＣＭＰ−Ｓｉａを欠く真菌宿主細胞を指す。
【０１４０】
本明細書では「ペプチド」という用語は、短いポリペプチド、例えば、典型的には約５０アミノ酸長未満、より典型的には約３０アミノ酸長未満であるポリペプチドを指す。この用語は、本明細書では、構造的、したがって生物学的機能を模倣した類似体及び模倣物を包含する。
【０１４１】
本明細書では「ポリペプチド」という用語は、天然及び非天然タンパク質、並びにその断片、変異体、誘導体及び類似体を包含する。ポリペプチドは、単量体又は重合体であり得る。また、ポリペプチドは、その各々が１つ以上の異なる活性を有する幾つかの異なるドメインを含み得る。
【０１４２】
「単離タンパク質」又は「単離ポリペプチド」という用語は、その誘導起源又は誘導源によって、（１）その未変性の状態でそれに伴う、天然に付随する成分を付随しないタンパク質若しくはポリペプチド、（２）自然界に存在しない純度で存在する（例えば、同じ種由来の他のタンパク質を含まない）ときのタンパク質若しくはポリペプチド（純度は、他の細胞材料の存在に対して判定することができる。）、（３）異なる種由来の細胞によって発現されるタンパク質若しくはポリペプチド、又は（４）自然界に存在しないタンパク質若しくはポリペプチド（例えば、タンパク質又はポリペプチドは、自然界に存在するポリペプチドの断片であり、又は自然界に存在しないアミノ酸類似体若しくは誘導体、又は標準ペプチド結合以外の結合を含む。）である。したがって、ポリペプチドが天然に生ずる細胞とは異なる細胞系中で化学合成又は合成されたポリペプチドは、その天然に付随する成分から「単離」されていることになる。ポリペプチド又はタンパク質は、当分野で周知のタンパク質精製技術を用いて、単離によって、天然に付随する成分を実質的に含まなくすることもできる。このように定義された「単離」は、記述したタンパク質、ポリペプチド、ペプチド又はオリゴペプチドをその自然環境から物理的に除去する必要は必ずしもない。
【０１４３】
本明細書では「ポリペプチド断片」という用語は、完全長ポリペプチドに比べて、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端が欠損しているポリペプチドを指す。好ましい実施形態において、ポリペプチド断片は、断片のアミノ酸配列が天然配列中の対応する位置と同一であるコンティグ配列である。断片は、典型的には少なくとも５、６、７、８、９又は１０アミノ酸長、好ましくは少なくとも１２、１４、１６又は１８アミノ酸長、より好ましくは少なくとも２０アミノ酸長、より好ましくは少なくとも２５、３０、３５、４０又は４５アミノ酸、更に好ましくは少なくとも５０又は６０アミノ酸長、更に好ましくは少なくとも７０アミノ酸長である。
【０１４４】
「修飾誘導体」は、一次構造配列が実質的に相同であるが、例えば、インビボ若しくはインビトロでの化学及び生化学修飾を含む、又は未変性ポリペプチドには存在しないアミノ酸を取り込んでいるポリペプチド又はその断片を指す。かかる修飾としては、当業者には容易に理解されるように、例えば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、例えば放射性核種による標識化、及び種々の酵素修飾が挙げられる。ポリペプチドを標識する種々の方法、及びかかる目的に有用である置換基又は標識の種々の方法は、当分野で周知であり、１２５Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈなどの放射性同位体、標識抗リガンド（例えば、抗体）に結合したリガンド、蛍光団、化学発光剤、酵素、及び標識リガンド用特異的結合対メンバーとして役立ち得る抗リガンドを含む。標識の選択は、必要な感度、プライマーとの複合化の容易さ、安定性要件及び利用可能な計測手段に依存する。ポリペプチドを標識する方法は当分野で周知である。参照により本明細書に取り込むＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２を参照されたい。
【０１４５】
「ポリペプチド変異体」、「変異タンパク質」又は「変種」は、その配列が、未変性又は野生型タンパク質のアミノ酸配列に比べて、１個以上のアミノ酸の挿入、重複、欠失、再配列又は置換を含む、ポリペプチドを指す。変異タンパク質は、ある位置における単一のアミノ酸が別のアミノ酸に変化した、１個以上のアミノ酸点置換（ｐｏｉｎｔ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、天然タンパク質の配列中の１個以上のアミノ酸がそれぞれ挿入され、若しくは欠失した、１個以上の挿入及び／又は欠失、及び／又はアミノ末端若しくはカルボキシ末端の一方若しくは両方におけるアミノ酸配列の切断を有し得る。変異タンパク質は、天然タンパク質と同じでもよいが、好ましくは異なる生物活性を有する。
【０１４６】
変異タンパク質は、その野生型対応物との全配列相同性が少なくとも７０％である。更に好ましいのは、野生型タンパク質との全配列相同性が８０％、８５％又は９０％である変異タンパク質である。更に好ましい実施形態において、変異タンパク質は、９５％の配列同一性、更に好ましくは９７％、更に好ましくは９８％、更に好ましくは９９％の全配列同一性を示す。配列相同性は、Ｇａｐ、Ｂｅｓｔｆｉｔなどの任意の一般的な配列解析アルゴリズムによって測定することができる。
【０１４７】
好ましいアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させるアミノ酸置換、（２）酸化に対する感受性を低下させるアミノ酸置換、（３）タンパク質複合体を形成するために結合親和性を変えるアミノ酸置換、（４）結合親和性又は酵素活性を変えるアミノ酸置換、及び（５）かかる類似体の他の物理化学的又は機能的諸性質を付与又は改変するアミノ酸置換である。
【０１４８】
本明細書では、２０種類の従来のアミノ酸及びその略語は、従来の用法に従う。参照により本明細書に取り込むＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｅ．Ｓ．  Ｇｏｌｕｂ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．  Ｇｒｅｎ，  Ｅｄｓ．，  Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，  Ｍａｓｓ．（１９９１））を参照されたい。２０種類の従来のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、α−，α−二置換アミノ酸などの異常アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、及び他の従来と異なるアミノ酸も、本発明のポリペプチドに適切な成分であり得る。従来と異なるアミノ酸の例としては、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、ｓ−Ｎ−メチルアルギニン並びに他の類似のアミノ酸及びイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書で使用するポリペプチド表記では、標準の用法及び慣行に従って、左手方向がアミノ末端方向であり、右手方向がカルボキシ末端方向である。
【０１４９】
タンパク質は、該タンパク質をコードする核酸配列が、第２のタンパク質をコードする核酸配列に類似した配列を有する場合、第２のタンパク質に対して「相同性」を有し、又は第２のタンパク質と「相同」である。或いは、２つのタンパク質が「類似の」アミノ酸配列を有する場合、タンパク質は、第２のタンパク質に相同性を有する。（したがって、「相同タンパク質」という用語は、２つのタンパク質が類似のアミノ酸配列を有することを意味すると定義される。）。好ましい実施形態において、相同タンパク質は、野生型タンパク質と６０％の配列相同性を示すタンパク質であり、より好ましくは７０％の配列相同性である。更に好ましいのは、野生型タンパク質と８０％、８５％又は９０％の配列相同性を示す相同タンパク質である。更に好ましい実施形態において、相同タンパク質は、９５％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を示す。本明細書では、（特に、予測される構造上の類似性に関して）アミノ酸配列の２つの領域の相同性は、機能上の類似性を意味すると解釈される。
【０１５０】
タンパク質又はペプチドに関連して「相同」を使用するときには、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なることが多いと認識される。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、化学的性質（例えば、電荷又は疎水性）の類似した側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基で置換される置換である。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的諸性質を大きくは変えない。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、配列同一性百分率、又は相同性の程度を上方に調節して、置換の保存的性質を補正することができる。この調節を行う手段は、当業者に周知である（例えば、参照により本明細書に取り込むＰｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４を参照されたい。）。
【０１５１】
以下の６群は、互いに保存的置換であるアミノ酸を各々含む。１）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、及び６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【０１５２】
ポリペプチドの配列相同性は、配列同一性百分率とも称され、一般には、配列解析ソフトウェアによって測定される。例えば、ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，  ９１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ５３７０５を参照されたい。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含めて、種々の置換、欠失及び他の修飾に割り当てられた相同性の基準を用いて、類似配列を照合する。例えば、ＧＣＧは、「Ｇａｐ」、「Ｂｅｓｔｆｉｔ」などのプログラムを含む。これらのプログラムは、初期設定パラメータで使用して、異なる生物種由来の相同ポリペプチドなどの密接に関連したポリペプチド間の配列相同性若しくは配列同一性、又は野生型タンパク質とその変異タンパク質との配列相同性若しくは配列同一性を求めることができる。例えば、ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１を参照されたい。
【０１５３】
抑制性分子配列を異なる生物体由来の多数の配列を含むデータベースと比較するときに好ましいアルゴリズムは、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  １９９０、Ｇｉｓｈ，  １９９３、Ｍａｄｄｅｎ，  １９９６、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  １９９７、Ｚｈａｎｇ，  １９９７）、特にｂｌａｓｔｐ又はｔｂｌａｓｔｎ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  １９９７）である。ＢＬＡＳＴｐの好ましいパラメータは、Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ  ｖａｌｕｅ：１０（初期設定）；Ｆｉｌｔｅｒ：ｓｅｇ（初期設定）；Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ａ  ｇａｐ：１１（初期設定）；Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ａ  ｇａｐ：１（初期設定）；Ｍａｘ．  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ：１００（初期設定）；Ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ：１１（初期設定）；Ｎｏ．  ｏｆ  ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ：１００（初期設定）；Ｐｅｎａｌｔｙ  Ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＷＳＵＭ６２である。
【０１５４】
相同性のために比較されるポリペプチド配列の長さは、一般に、少なくとも約１６アミノ酸残基、通常は少なくとも約２０残基、より通常は少なくとも約２４残基、典型的には少なくとも約２８残基、好ましくは約３５残基を超える長さである。多数の異なる生物体由来の配列を含むデータベースを検索するときには、アミノ酸配列を比較することが好ましい。アミノ酸配列を用いたデータベース検索は、当分野で公知のｂｌａｓｔｐ以外のアルゴリズムによって測定することができる。例えば、ポリペプチド配列は、ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１中のプログラムＦＡＳＴＡを用いて比較することができる。ＦＡＳＴＡは、照会配列と検索配列の重なりが最大である領域のアラインメント及び配列同一性百分率を与える（参照により本明細書に取り込むＰｅａｒｓｏｎ，  １９９０）。例えば、アミノ酸配列間の配列同一性百分率は、参照により本明細書に取り込むＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１で提供されるＦＡＳＴＡをその初期設定パラメータ（ワードサイズ２及びＰＡＭ２５０スコアリングマトリックス）で用いて求めることができる。
【０１５５】
「融合タンパク質」という用語は、異種アミノ酸配列に結合したポリペプチド又は断片を含む、ポリペプチドを指す。融合タンパク質は、２種類以上のタンパク質から２種類以上の所望の機能的要素を含むように構築することができるので、有用である。融合タンパク質は、目的ポリペプチド由来の少なくとも１０隣接アミノ酸、より好ましくは少なくとも２０又は３０アミノ酸、更に好ましくは少なくとも４０、５０又は６０アミノ酸、更に好ましくは少なくとも７５、１００又は１２５アミノ酸を含む。融合タンパク質は、異なるタンパク質又はペプチドをコードする核酸配列と一緒に、ポリペプチド又はその断片をインフレームでコードする核酸配列を構築し、次いで融合タンパク質を発現させることによって、組換え産生することができる。或いは、融合タンパク質は、ポリペプチド又はその断片を別のタンパク質と架橋させることによって、化学的に生成させることができる。
【０１５６】
本明細書では「領域」という用語は、生体分子の一次構造の物理的に連続した部分を指す。タンパク質の場合には、領域は、該タンパク質のアミノ酸配列の連続部分によって規定される。
【０１５７】
本明細書では「ドメイン」という用語は、生体分子の公知又はあり得る機能に寄与する生体分子構造を指す。ドメインは、その領域又は部分と同一の広がりをもち得る。ドメインは、生体分子の異なる非隣接領域も含み得る。タンパク質ドメインの例としては、Ｉｇドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通領域及び細胞質ドメインが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【０１５８】
本明細書では「分子」という用語は、小分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチド、核酸、脂質などを含めて、ただしこれらだけに限定されない任意の化合物を意味する。かかる化合物は、天然でも、合成でもよい。
【０１５９】
「特異的結合」は、環境中の他の分子に結合するよりも優先して、互いに結合する２個の分子の能力を指す。典型的には、「特異的結合」は、反応における偶発的結合よりも少なくとも２倍、より典型的には少なくとも１０倍、しばしば少なくとも１００倍区別される。典型的には、特異的結合反応の親和性又は結合活性は、少なくとも約１０−７Ｍ（例えば、少なくとも約１０−８Ｍ又は１０−９Ｍ）である。
【０１６０】
本明細書では「ＣＭＰ−シアル酸生合成経路」又は「ＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路」は、宿主中でＣＭＰ−Ｓｉａの形成をもたらす１種類以上のグリコシル化酵素を指す。
【０１６１】
本明細書では「ＣＭＰ−Ｓｉａプール」は、検出可能なレベルの細胞ＣＭＰ−Ｓｉａを指す。ＣＭＰ−Ｓｉａプールは、宿主細胞によるＣＭＰ−Ｓｉａの産生、又は培地からのＣＭＰ−Ｓｉａの取り込みの結果であり得る。
【０１６２】
基質ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃは、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンの略語である。中間体ＭａｎＮＡｃは、Ｎ−アセチルマンノサミンの略語である。中間体ＭａｎＮＡｃ−６−Ｐは、Ｎ−アセチルマンノサミン−６−リン酸の略語である。中間体Ｓｉａ−９−Ｐは、シアラート−９−リン酸の略語である。中間体シチジン一リン酸−シアル酸は、「ＣＭＰ−Ｓｉａ」と略記される。シアル酸は、本明細書では「Ｓｉａ」、「Ｎｅｕ５Ａｃ」、「ＮｅｕＡｃ」又は「ＮＡＮＡ」と略記される。
【０１６３】
本明細書では「シアル酸」という用語は、共通分子が、結合したアセチル基で５炭素位において修飾された塩基性９炭素ノイラミン酸核を有するＮ−アセチル−５−ノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）を含む分子群を指す。５炭素位におけるＮｅｕ５Ａｃの共通誘導体としては以下が挙げられる：アセチル基の代わりにヒドロキシル基を有する２−ケト−３−デオキシ−ｄ−グリセロ−ｄ−ガラクトノノン酸（ＫＤＮ）；５−Ｎ−アセチル基の脱Ｎ−アセチル化は、ノイラミン酸（Ｎｅｕ）を生成する；５−Ｎ−アセチル基のヒドロキシル化は、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）を生成する。これらの４分子（Ｎｅｕ５Ａｃ、ＫＤＮ、Ｎｅｕ及びＮｅｕ５Ｇｃ）の４、７、８及び９位のヒドロキシル基を、Ｏ−アセチル、Ｏ−メチル、Ｏ−硫酸及びリン酸基で更に置換して、化合物のこの基を拡張することができる。また、シアル酸の不飽和体及びデヒドロ体の存在は公知である。
【０１６４】
ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードする遺伝子は、「ＮｅｕＣ」と略記される。シアラートシンターゼをコードする遺伝子は、「ＮｅｕＢ」と略記される。ＣＭＰ−シアラートシンターゼをコードする遺伝子は、「ＮｅｕＡ」と略記される。
【０１６５】
シアラートアルドラーゼは、シアラートリアーゼ及びシアラートピルバート−リアーゼとも一般に称される。より具体的には、Ｅ．コリでは、シアラートアルドラーゼは、ＮａｎＡと称される。Ｒｉｎｇｅｒｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）を参照されたい。
【０１６６】
本明細書では「シアル酸供与体」という用語は、酵素手段又は合成手段によってシアル酸残基を基質に転移させることができる分子又は実体を指す。シアル酸供与体は、ＣＭＰ−Ｓｉａなどの糖ヌクレオチド前駆体であり得る。本発明のある実施形態において、シアル酸供与体前駆体は、前駆体分子をシアル酸供与体に転化する能力のある適合した宿主細胞と併用することができる。かかる適合した宿主細胞は、例えば、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ［グルコサミン］、ＭａｎＮＡｃなど、ＣＭＰ−Ｓｉａの１種類以上の糖ヌクレオチド前駆体を産生することができる。したがって、「シアル酸供与体」は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＭａｎＮＡｃなどの１個以上の糖ヌクレオチド前駆体を含む適合した宿主細胞であって、これらの分子をＣＭＰ−シアル酸に転化する機能的酵素活性を有する適合した宿主細胞を提供することによって、供給することができる。宿主細胞は、かかる酵素活性を内因的に有し得、又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ若しくはＭａｎＮＡｃをＣＭＰ−Ｓｉａに転化することができる酵素を発現するように操作することができる。別の実施形態において、宿主細胞は、前駆体分子をシアル酸供与体に転化するのに必要な酵素を含む培地中で培養することができる。
【０１６７】
特に断らない限り、本明細書において使用するすべての技術用語及び科学用語は、本発明が関係する分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。例示的方法及び材料を以下に記述するが、本明細書に記載の方法及び材料と類似した、又は等価である、方法及び材料も本発明の実施に使用することができ、当業者には明白なはずである。本明細書に記載するすべての刊行物及び他の参考文献を参照によりその全体を取り込む矛盾が生じた場合には、定義を含めて、本明細書が基準になる。材料、方法及び実施例は、単なる説明のためのものであり、限定的なものではない。本明細書及び特許請求の範囲を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、示した整数又は整数群を含むが、任意の他の整数又は整数群を排除しないことを意味すると理解されたい。
【０１６８】
ヒト様Ｎ−グリカン産生用のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２修飾オリゴ糖を有する宿主細胞の生成方法
本発明は、非ヒト真核生物宿主細胞中でヒト様グリコシル化を有する糖タンパク質を製造する方法を提供する。以下でより詳細に記述するように、高マンノース構造体の生成に関与する１種類以上の酵素を天然に発現しない、又は発現しないように操作された、真核生物宿主細胞を、出発宿主細胞として選択する。選択したかかる宿主細胞を、ヒト様糖タンパク質の産生に必要である１種類以上の酵素又は他の因子を発現するように操作する。所望の宿主系統は、同時に操作された１種類の酵素又は１種類を超える酵素であり得る。また、１種類以上の酵素又は活性をコードする核酸分子を使用して、本発明の宿主系統を操作することができる。好ましくは、潜在的に有用である酵素（例えば、異種細胞内指向性配列にインフレームで連結された触媒作用的に活性な酵素断片を含むキメラ酵素）をコードする核酸分子のライブラリーを（例えば、酵素断片を含むサブライブラリーと細胞内指向性配列との連結によって）作製し、標的宿主細胞を１つ以上のライブラリーメンバーで形質転換することによって、最適活性を有する１種類以上の酵素を含む系統、又は最も「ヒト様」である、若しくは望ましい、糖タンパク質を産生する系統を選択することができる。
【０１６９】
特に、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造体を更に修飾して複合型Ｎ−グリカンを得るために、本明細書に記載の方法によって、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造体を高収率で、少なくとも過渡的に、インビボで得ることができる。適切なＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造体を下等真核生物などの宿主細胞中で適切な収率で得ることができるスキームは、一般に、２つの並列手法、すなわち、（１）内在性マンノシル転移酵素活性によって生成された高マンノース構造体があれば、それを削減する手法、及び（２）１，２−α−マンノースをマンノシダーゼによって除去して、高レベルの適切なＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造体を生成させる手法（Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造体は、宿主細胞内で更に反応させて、複合ヒト様グリコフォームを形成することができる。）を含む。
【０１７０】
したがって、第一段階は、ＧｌｃＮＡｃ転移酵素Ｉ（「ＧｎＴＩ」）の作用によってＧｌｃＮＡｃをインビボで受容することができるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の特定の前駆体構造体を生成することができる真核生物宿主細胞（例えば、下等真核細胞）の選択又は生成を含む。一実施形態において、この方法は、糖タンパク質上のＮ−グリカンに対して１，６マンノシル転移酵素活性が欠乏した非ヒト真核生物宿主細胞の生成又は使用を含む。好ましくは、宿主細胞は、アルファ１，６マンノシル転移酵素活性などの開始１，６マンノシル転移酵素活性が欠乏している（下記参照）。かかる宿主細胞は、ヒト様糖タンパク質の産生に望ましくない高マンノース構造体の生成に関与する１種類以上の酵素を欠く。
【０１７１】
次いで、１つ以上の酵素活性をかかる宿主細胞に導入して、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ５」）糖鎖構造体の少なくとも３０ｍｏｌ％を有することを特徴とする宿主細胞内でＮ−グリカンを生成する。後続のほ乳動物様及びヒト様グリコシル化反応は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２又はその誘導体を必要とするので、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造体は、複合型Ｎ−グリカンの形成に必要である。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は、インビボで（例えば、３０％を超える）高収率で、少なくとも過渡的に、形成されなければならない。
【０１７２】
この段階は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の特別な異性体構造体を細胞内で高収率で形成する必要もある。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造体は、複合型Ｎ−グリカンの形成に必要であるが、その存在は決して十分ではない。これは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が、ＧｌｃＮＡｃ転移酵素Ｉの基質として役立ち得る又は役立ち得ない、異なる異性体として生じ得るからである。大部分のグリコシル化反応は完全ではないので、特定のグリコシル化タンパク質は、一般に、ある範囲の異なる糖鎖構造体（すなわちグリコフォーム）をその表面に含む。したがって、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のような特別な構造体が痕跡量（すなわち、５％未満）単に存在しても、ほ乳動物様又はヒト様糖タンパク質の産生には実際的な関連性はほとんどない。必要なのは、ＧｌｃＮＡｃ転移酵素Ｉに受け入れられるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２中間体（図１Ｂ）を高収率で（すなわち、３０％を超える収率で）形成することである。この中間体の形成は、その後に複合型Ｎ−グリカンを目的グリコシル化タンパク質（標的タンパク質）上でインビボ合成するのに必要である。
【０１７３】
したがって、選択された宿主細胞によって産生されるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の一部又は全部は、ほ乳動物のグリコシル化経路に沿った酵素活性の生産的な基質でなければならず、例えば、ＧｌｃＮＡｃ転移酵素Ｉ活性の基質としてインビボで役立ち、それによってヒト様Ｎ−グリカン中間体ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を宿主細胞中で形成することができる。好ましい実施形態において、本発明の宿主細胞中で産生されるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２中間体の少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも３０％、最も好ましくは５０％以上は、ＧｎＴＩのインビボでの生産的な基質である。例えば、標的タンパク質上でＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が１０％で産生され、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が２５％で産生される場合、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２はＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の生成物であるので、過渡的に産生されるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の総量は３５％であると理解される。
【０１７４】
後述するように、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２などの末端ＧｌｃＮＡｃ残基を有するＮ−グリカンは、ガラクトース［例えば、ＵＤＰ−ガラクトシル転移酵素］及びシアル酸［例えば、シアリル転移酵素、ＣＭＰ−Ｓｉａ］を逐次的に付加して、本発明の混成型Ｎ−グリカンを産生するための基質として役立ち得る。
【０１７５】
当業者は、宿主細胞を自然（例えば、かなりのレベルのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２をインビボで産生する既存の真菌又は他の下等真核生物）から選択することができる。しかし、今までのところ、かかる構造体をインビボで総Ｎ−グリカンの１．８％を超える量で与えることが示された下等真核生物はない（例えば、Ｍａｒａｓ，  １９９７参照）。或いは、かかる宿主細胞を遺伝子操作して、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造体をインビボで産生することができる。米国特許第５，５９５，９００号に記載の方法などの方法を使用して、標的宿主細胞又は目的生物体中の特定の糖転移酵素、マンノシダーゼ及び糖ヌクレオチドトランスポーターの有無を確認することができる。
【０１７６】
望ましくない宿主細胞グリコシル化酵素の不活性化
本発明の方法は、改変された、好ましくはヒト様の、Ｎ−グリカン構造を有する糖タンパク質を産生する宿主細胞の作製を対象とする。好ましい実施形態において、この方法は、オリゴ糖前駆体がＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に富む宿主細胞の作製を対象とする。好ましくは、高マンノース構造体の生成に関与する１種類以上の酵素を発現しない真核生物宿主細胞を用いる。かかる宿主細胞は、自然界に存在し得、又は、例えば、酵母において既に記述された多数のかかる変異体の１つから出発して、若しくはかかる変異体の１つに由来して、操作することができる。したがって、選択した宿主細胞に応じて、非ヒトグリコシル化反応に特有であることが知られている酵素をコードする１個又は幾つかの遺伝子を欠失させなければならない場合もある。かかる遺伝子及びその対応するタンパク質は、幾つかの下等真核生物（例えば、Ｓ．セレビシエ、Ｔ．リーセイ、Ａ．ニデュランスなど）において広範に特徴づけられており、それによって下等真核生物中の公知糖転移酵素の一覧表、それらの活性、及びそれぞれの遺伝子配列が提供される。これらの遺伝子は、マンノシル転移酵素、例えば、１，３マンノシル転移酵素（例えば、Ｓ．セレビシエ中のＭＮＮ１）（Ｇｒａｈａｍ，  １９９１）、１，２マンノシル転移酵素（例えば、Ｓ．セレビシエ由来のＫＴＲ／ＫＲＥファミリー）、１，６マンノシル転移酵素（Ｓ．セレビシエ由来のＯＣＨ１）、マンノシルホスファート転移酵素及びそれらの制御因子（Ｓ．セレビシエ由来のＭＮＮ４及びＭＮＮ６）、並びに異常な、すなわち非ヒト、グリコシル化反応に関与する追加の酵素からなる群から選択される可能性がある。これらの遺伝子の多くは、実際に個々に欠失して、変化したグリコシル化プロファイルを有する生存可能な表現型を生じる。例を表１に示す。
【０１７７】
本発明の好ましい下等真核生物宿主細胞は、必要な取扱い段階を例示するのに本明細書に記載したように、ピキア・パストリス又はＫ．ラクチスの過剰マンノシル化−マイナス（ｏｃｈ１）変異体である。他の下等真核生物同様、Ｐ．パストリスは、ＥＲ中のＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２構造体をα−１，２−マンノシダーゼによってプロセシングして、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２を産生する（図１Ａ）。次いで、幾つかのマンノシル転移酵素の作用を通して、この構造体を、マンナンとしても知られる過剰マンノシル化構造体（Ｍａｎ＞９ＧｌｃＮＡｃ２）に転化する。また、Ｐ．パストリスは、マンノシルホスファート転移酵素の作用を通して、非末端リン酸基を糖鎖構造体に付加できることが見いだされた。これは、マンノース糖の付加ではなく除去を含む、ほ乳動物細胞においてなされる反応とは異なる。既存のＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２構造体を過剰マンノシル化する真核生物宿主細胞（例えば、真菌）の能力を除去することは特に重要である。これは、過剰マンノシル化しない宿主細胞を選択することによって、又はかかる細胞を遺伝的に操作することによって、実施することができる。
【０１７８】
過剰マンノシル化過程に関与する遺伝子は、例えばピキア・パストリスにおいて、特定されており、これらの遺伝子中で変異を起こすことによって、「望ましくない」グリコフォームの産生を減少させることができる。かかる遺伝子は、Ｃ．アルビカンス、ピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）、Ｓ．セレビシエなどの他の下等真核生物中に存在する既存のマンノシル転移酵素若しくはその制御因子（例えば、ＯＣＨ１、ＭＮＮ４、ＭＮＮ６、ＭＮＮ１）との相同性によって、又は宿主系統を変異誘発させ、マンノシル化が減少したグリコシル化表現型を選択することによって、特定することができる。公知マンノシル転移酵素及びマンノシルホスファート転移酵素の中での相同性に基づいて、ＰＣＲプライマーを設計することができ（出現順に、それぞれ、配列番号７、８、４７及び４  左から右）（その例を表２に示す。）、又はかかる酵素をコードする遺伝子若しくは遺伝子断片をプローブとして使用して、標的生物体若しくは関連生物体のＤＮＡライブラリー中の相同体を特定することができる。或いは、関連生物体中の特別なグリコシル化表現型を補完するその能力によって、マンノシル転移酵素活性を有する機能的相同体を特定することができる。
【０１７９】
【表１】
0005514541.tif 000002
凡例：Ｍ＝Ａ又はＣ、Ｒ＝Ａ又はＧ、Ｗ＝Ａ又はＴ、Ｓ＝Ｃ又はＧ、Ｙ＝Ｃ又はＴ、Ｋ＝Ｇ又はＴ、Ｖ＝Ａ又はＣ又はＧ、Ｈ＝Ａ又はＣ又はＴ、Ｄ＝Ａ又はＧ又はＴ、Ｂ＝Ｃ又はＧ又はＴ、Ｎ＝Ｇ又はＡ又はＴ又はＣ。
【０１８０】
Ｐ．パストリス中の１，６−マンノシル転移酵素活性をコードする１個又は複数の遺伝子を得るために、例えば、以下の段階を実施する。すなわち、Ｓ．セレビシエのＯＣＨ１変異体は、温度感受性であり、高温では成長が遅い。したがって、Ｓ．セレビシエのＯＣＨ１変異体をＰ．パストリスＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーで補完することによって、Ｐ．パストリス中のＯＣＨ１の機能的相同体を特定することができる。Ｓ．セレビシエの変異体は、例えばＳｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから入手可能であり、ＲｅｓＧｅｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から市販されている。高温で正常な成長表現型を示す変異体は、Ｐ．パストリスＤＮＡライブラリーで形質転換された後、Ｐ．パストリスのＯＣＨ１相同体を保有する可能性がある。かかるライブラリーは、Ｐ．パストリスの染色体ＤＮＡを適切な制限酵素で部分的に消化し、制限酵素を不活性化した後、消化されたＤＮＡを、適合性の制限酵素で消化された適切なベクター中に連結することによって、作製することができる。
【０１８１】
適切なベクターとしては、例えば、Ｔｒｐ１マーカーを含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに基づく低コピー（ＣＥＮ６／ＡＲＳ４）プラスミドｐＲＳ３１４（Ｓｉｋｏｒｓｋｉ，  １９８９）、及びＵＲＡ３マーカーを含む修飾ｐＵＣ１９に基づく高コピー（２μ）プラスミドｐＦＬ４４Ｓ（Ｂｏｎｎｅａｕｄ，  １９９１）が挙げられる。かかるベクターは、学術研究者によって一般に使用され、類似のベクターが幾つかの異なる納入業者（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ））から入手可能である。更なる例としては、２μ複製開始点に基づく酵母発現プラスミドｐＹＥＳ／ＧＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、又はＹｅｐ２４クローニング媒体（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）が挙げられる。
【０１８２】
染色体ＤＮＡとベクターの連結後、特定の変異を有するＳ．セレビシエ系統にＤＮＡライブラリーを転換し、対応する表現型の補正のために選択することができる。野生型表現型を回復することができるＤＮＡ断片をサブクローニングし、配列を決定した後、この断片を用いて、当業者に周知のインビボ変異誘発及び／又は組換え技術によって、Ｐ．パストリス中のＯＣＨ１によってコードされる遺伝子産物の活性を除去することができる。
【０１８３】
或いは、目的とする特別な宿主細胞（例えば、真菌）のゲノム配列全体が既知の場合、ＮＣＢＩ、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔなどの幾つかの情報源から利用可能である公的に利用可能なＤＮＡデータベースを単に検索することによって、かかる遺伝子を特定することができる。例えば、既知の１，６マンノシル転移酵素遺伝子（例えば、Ｓ．セレビシエ由来のＯＣＨ１）由来の配列を含む所与のゲノム配列又はデータベースを検索することによって、１，６−マンノシル転移酵素活性を有するタンパク質をコードし得る（ただし、必ずしもコードするとは限らない。）宿主細胞ゲノム中の相同性の高い遺伝子を特定することができる。しかし、同じ活性を有する酵素をコードする相同体を特定し、単離したことを証明するには、核酸配列相同性だけでは不十分である。現在まで、例えば、Ｐ．パストリス中のＯＣＨ１欠失によって、極めて重要な開始１，６−マンノシル転移酵素活性が除去されたことを示すデータはない。（Ｍａｒｔｉｎｅｔ，  １９９８；国際公開第０２／００８５６号Ａ２）。したがって、Ｐ．パストリスＯＣＨ１遺伝子相同体が、この機能を実際にコードすることを証明するデータはない。この実証は、本明細書で初めて提供される。
【０１８４】
幾つかのＳ．セレビシエマンノシル転移酵素の相同体が、Ｐ．パストリスにおいて、これらの手法を用いて特定された。相同遺伝子群は、Ｓ．セレビシエ中のタンパク質のマンノシル化に関与する遺伝子に類似した機能を有することが多く、したがってその欠失を利用して、Ｐ．パストリスにおける又は類似性によって類似のグリコシル化経路を有する任意の他の宿主細胞（例えば、真菌、植物、昆虫若しくは動物細胞）における、グリコシル化パターンを操作することができる。
【０１８５】
所与の標的遺伝子配列を決定した後の遺伝子ノックアウトの作製は、当分野で確立された技術であり、当業者が実施することができる（例えば、Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，  １９９１を参照されたい。）。宿主生物の選択は、良好な形質転換及び遺伝子破壊技術の利用可能性によって左右され得る。
【０１８６】
幾つかのマンノシル転移酵素をノックアウトする場合、例えば、Ａｌａｎｉ，  １９８７によって開発された方法によって、選択マーカー（例えば、酵母におけるＵＲＡ３マーカー）を繰り返し使用して、すべての望ましくない内在性マンノシル転移酵素活性を逐次的に除去することができる。この技術は、別の人によって改良されたが、対抗選択マーカーに隣接する２つの繰り返しＤＮＡ配列を基本的に使用する。例えば、ＵＲＡ３をマーカーとして使用して、構築物を組み込んだ形質転換体を確実に選択することができる。ＵＲＡ３マーカーに直接反復配列を隣接させることによって、構築物を組み込んだ形質転換体をまず選択し、標的遺伝子を破壊することができる。形質転換体を単離し、その特性を分析した後、５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）に抵抗性である形質転換体を第２のラウンドで対抗選択することができる。５−ＦＯＡを含むプレート上で生存することができるコロニーは、上述の反復配列を含む交差現象によってＵＲＡ３マーカーを再び失う。したがって、この手法は、同じマーカーを繰り返し使用することができ、追加のマーカーを必要とせずに同義遺伝子の破壊を促進する。別の選択マーカーと対抗選択マーカーを用いて、別の真核生物宿主細胞における使用に適合した遺伝子を逐次的に除去する類似の技術を使用することもできる。
【０１８７】
Ｐ．パストリス中の特定のマンノシル転移酵素（１，６マンノシル転移酵素（ＯＣＨ１）、マンノシルホスファート転移酵素（ＭＮＮ６、又はｌｂｄ変異体を補完する遺伝子）など）又は制御因子（ＭＮＮ４）を除去することによって、この生物体の操作された系統を作製することができる。この系統は、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２を主に合成し、この系統を用いて、グリコシル化パターンを更に改変して、複合型グリコフォーム構造体（例えば、ほ乳動物（例えばヒト）細胞中で産生される複合型グリコフォーム構造体）により近似させることができる。この方法の好ましい実施形態は、生化学的グリコシル化活性をコードするＤＮＡ配列を利用して、Ｐ．パストリス中の類似又は同一の生化学的機能を除去し、遺伝子改変されたＰ．パストリス系統中で産生される糖タンパク質のグリコシル化構造体を修飾する。
【０１８８】
本明細書に例示する酵母中のグリコシル化経路を操作するのに用いる方法を糸状菌に使用して、後続の修飾用の好ましい基質を産生することができる。例えば、Ａ．ニガー及び他の糸状菌中のグリコシル化経路を改変する戦略は、酵母中でヒト様糖タンパク質を産生するように系統を操作する本明細書に記載のプロトコルに類似したプロトコルを用いて開発することができる。１，２マンノシル転移酵素活性（例えば、ＫＴＲ／ＫＲＥ相同体）に関与する望ましくない遺伝子活性を修飾又は除去する。アスペルギルスなどの糸状菌は、１，６マンノシル転移酵素活性を欠き、したがって、この宿主中の過剰マンノシル化遺伝子活性（例えば、ＯＣＨ１）が予想されないので、好ましい宿主である。これに対し、グリコシル化に関与する他の所望の活性（例えば、α−１，２−マンノシダーゼ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター、糖転移酵素（ＧｎＴ）、ガラクトシル転移酵素（ＧａｌＴ）及びシアリル転移酵素（ＳＴ））は、本発明のターゲティング方法によって宿主に導入される。
【０１８９】
開始α−１，６マンノシル転移酵素活性の低下した宿主の設計又は選択
好ましい実施形態において、本発明の方法は、開始□−１，６−マンノシル転移酵素、すなわち、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２核構造体のα−１，３腕上の外側の鎖のマンノシル化を惹起する開始特異的酵素の活性が低下又は欠乏した宿主細胞の作製又は使用を含む。Ｓ．セレビシエにおいては、この酵素は、ＯＣＨ１遺伝子によってコードされる。Ｓ．セレビシエ中のＯＣＨ１遺伝子を破壊すると、Ｎ結合型糖がポリマンノース外鎖を完全に欠く表現型がもたらされる。真菌系統においてほ乳動物型グリコシル化を得る以前の手法は、ＯＣＨ１の不活性化を必要とした（例えば、Ｃｈｉｂａ，  １９９８参照）。しかし、本発明の宿主細胞における開始α１，６−マンノシル転移酵素活性の破壊は（選択した宿主細胞に応じて）任意に選択することができ、Ｏｃｈ１ｐ酵素は、効率的なマンノース外鎖の開始に完全なＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２を必要とする。したがって、７個以下のマンノース残基を有するオリゴ糖を蓄積する本発明によって選択又は製造される宿主細胞は、Ｏｃｈ１ｐの不良基質である可能性がある低グリコシル化Ｎ−グリカンを産生し得る（例えば、Ｎａｋａｙａｍａ，  １９９７参照）。
【０１９０】
ＯＣＨ１遺伝子は、上記のとおり、Ｐ．パストリス（実施例１）及びＫ．ラクチス（実施例１８）からクローン化された。Ｋ．ラクチス由来のＯＣＨ１遺伝子の核酸及びアミノ酸配列を配列番号４１及び４２で示す。遺伝子特異的プライマーを用いて、構築物を各クローンから作製して、Ｐ．パストリス及びＫ．ラクチス（それぞれ、実施例１及び１８）のゲノムからＯＣＨ１遺伝子を除去した。それによって、開始α−１，６−マンノシル転移酵素活性が欠乏し、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２糖鎖構造を有するＮ−グリカンを産生するように操作された宿主細胞を得た（例えば、図５及び６、実施例１１及び１８参照）。
【０１９１】
したがって、別の実施形態において、本発明は、Ｋ．ラクチスＯＣＨ１遺伝子（配列番号４１）並びにその相同体、変種及び誘導体の少なくとも４５、好ましくは少なくとも５０、より好ましくは少なくとも６０、最も好ましくは７５ヌクレオチド残基以上を含む、又は該ヌクレオチド残基からなる核酸配列を有する単離核酸分子を提供する。本発明は、厳密な条件下で上記核酸分子とハイブリッド形成する核酸分子も提供する。同様に、本発明の核酸分子によってコードされる（変異タンパク質、対立遺伝子変異体、断片、誘導体及び類似体を含めた）単離ポリペプチドも提供する。本明細書に更に記述するように、本発明の核酸分子を含む、発現ベクターを含めたベクターも提供する。同様に、本発明の核酸分子又はベクターで形質転換された宿主細胞も提供する。
【０１９２】
Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に富む宿主細胞
本発明の好ましい宿主細胞は、下等真核生物細胞（例えば、酵母、単細胞真菌、多細胞真菌又は糸状菌）である。しかし、多種多様な宿主細胞が、本発明の方法に有用であると予見される。例えば、植物細胞又は昆虫細胞を操作して、本発明によるヒト様糖タンパク質を発現させることができる（実施例１９及び２０）。同様に、種々の非ヒトほ乳動物宿主細胞を、本発明の方法によって改変して、よりヒト様の、又は改変された糖タンパク質を発現させることができる。当業者には理解されるように、（ヒト細胞を含めた）任意の真核生物宿主細胞を、本発明のライブラリーと併せて使用して、タンパク質の活性が改変され、好ましくは増強された宿主細胞中の細胞内位置（例えば、細胞小器官）を標的にする１種類以上のキメラタンパク質を発現させることができる。かかるタンパク質は、本明細書で例示するように、好ましくは、ただし必ずしも必要ではないが、タンパク質グリコシル化に関与する酵素である。本明細書に記載の方法を用いて、真核生物宿主細胞中の改変された活性のために、任意のタンパク質コード配列を標的にでき、選択できることが予見される。
【０１９３】
Ｎ−グリカンＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が結合した糖タンパク質を産生することができる下等真核生物は、特に有用である。というのは、（ａ）この糖タンパク質は、高度のマンノシル化（例えば、Ｎ−グリカン１個当たり８個を超えるマンノース、特に３０−４０個のマンノース）を欠き、ヒトにおける免疫原性が低下しているからであり、（ｂ）このＮ−グリカンは、例えば、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を形成するＧｌｃＮＡｃ転移酵素Ｉ（図１Ｂ、β１，２ＧｎＴＩ）の作用によって、更にヒト様のグリコフォームを形成する、更なるグリコシル化反応用の基質であるからである。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を有するＮ−グリカンを含む糖タンパク質の３０モル％を超える収率、より好ましくは５０−１００モル％の収率が得られる。好ましい実施形態において、５０％を超えるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造体がＧｎＴＩ活性の基質であることが示され、かかる基質としてインビボで役立ち得る。下等真核生物も、（付加するように操作しない限り）ガラクトース、フコース及びＮ−アセチルグルコサミンを典型的には欠くので、本発明の有用な宿主細胞であり得る。したがって、例えばフコースを欠く組換えタンパク質が、これらの宿主細胞中で産生され得る。
【０１９４】
本発明の好ましい下等真核生物としては、ピキア・パストリス、ピキア・フィンランジカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピキア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピキア・コクラマエ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピキア・メンブラナエファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピキア・オプンチアエ（Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピキア・サーモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピキア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピキア・グエルキューム（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピキア・ピジュペリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピキア・スチプチス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ）及びピキア・メタノリカを含めて、ただしこれらだけに限定されない任意のピキア種、サッカロミセス・セレビシエ、ハンゼヌラ・ポリモルファを含めて、ただしこれらだけに限定されない任意のサッカロミセス種、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）を含めて、ただしこれらだけに限定されない任意のクルイベロミセス種、カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・ニデュランス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・リーセイ、クリソスポリウム・ルクノウエンス、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）及びフザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）を含めて、ただしこれらだけに限定されない任意のフザリウム種、ニューロスポラ・クラッサなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【０１９５】
上記各実施形態において、この方法は、オリゴ糖前駆体がＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に富む宿主細胞の作製を対象とする。これらの構造体は、次いで、例えば米国特許第５，８３４，２５１号の方法を用いて、インビトロで処理することによってプロセシングすることができるので、望ましい。しかし、好ましい実施形態において、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に富む前駆体を、グリコシダーゼ（例えば、α−マンノシダーゼ）及び糖転移酵素（例えば、ＧｎＴＩ）を用いて、少なくとも１つの更なるグリコシル化反応によってインビボでプロセシングして、ヒト様Ｎ−グリカンを産生する。例えば、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に富むオリゴ糖前駆体を、好ましくは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎＸＧｌｃＮＡｃ２核構造（式中、Ｘは３、４又は５、好ましくは３である。）を有するものにプロセシングする。ＧｌｃＮＡｃＭａｎＸＧｌｃＮＡｃ２核構造（式中、Ｘは３を超える。）を有するＮ−グリカンは、適用可能な場合には、例えばα−１，３及び／又はα−１，６マンノシダーゼ活性によって処理することによって、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に転化することができる。ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を糖転移酵素（例えば、ＧｎＴＩＩ）によって処理することによって更にプロセシングすると、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２核構造体が生成する。次いで、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２核構造体を、例えば、生体外で処理することによって、又は宿主細胞中での糖転移酵素、糖トランスポーター及びマンノシダーゼ（下記参照）を含めた追加のグリコシル化酵素の異種発現によって、所望のとおりに修飾して、特定のヒト様Ｎ−グリカンを所望のとおりに構成することができる。
【０１９６】
本発明によって製造することができる好ましいヒト様糖タンパク質としては、７個未満又は３個未満のマンノース残基を有するＮ−グリカンを含むヒト様糖タンパク質、ガラクトース、ＧｌｃΝＡｃ、シアル酸及びフコースからなる群から選択される１種類以上の糖を含むヒト様糖タンパク質などが挙げられる。本発明によって製造することができる他の好ましいヒト様糖タンパク質は、フコースを欠く。
【０１９７】
複合型Ν−グリカンの形成
複合型Ν−グリカン合成の形成は、特定の糖残基が除去され、核オリゴ糖構造体に結合される逐次プロセスである。高等真核生物では、これは、基質を種々のプロセシング酵素に逐次的に曝露することによって実施される。これらの酵素は、プロセシングカスケード全体内のその特別な場所に応じて、特異反応を起こす。この「集合列」は、すべてその特異的プロセシング環境を有する、ＥＲ、初期、中間及び後期ゴルジ並びにトランスゴルジ網からなる。下等真核生物のゴルジ及びＥＲにおけるヒト糖タンパク質のプロセシングを再現するために、好ましくは、その環境に対して、また、経路中の他の酵素に対して最も効率的に機能するような場所で、多数の酵素（例えば、糖転移酵素、グリコシダーゼ、ホスファターゼ及びトランスポーター）が発現されなければならず、これらの細胞小器官を特異的に標的にしなければならない。
【０１９８】
本明細書に記載の方法の一目的は、工業発酵プロセスにおいて十分実施することができる堅牢なタンパク質産生系統を得ることであるので、宿主細胞染色体への同義遺伝子の組み込みは、慎重に計画する必要がある。上述したように、非ヒトグリコシル化反応に特徴的であることが知られている酵素をコードする１個以上の遺伝子は、好ましくは欠失している。操作された細胞株は、所望の活性をコードするある範囲の異なる遺伝子で形質転換され、これらの遺伝子は安定に形質転換され、それによって所望の活性が発酵プロセスを通して確実に維持されるようにする。
【０１９９】
本発明の方法によって、以下の酵素活性の任意の組合せを、単独で又は複合的に宿主中に設計することができる：シアリル転移酵素、マンノシダーゼ、フコシル転移酵素、ガラクトシル転移酵素、ＧｌｃＮＡｃ転移酵素、ＥＲ及びゴルジ特異的トランスポーター（例えば、ＵＤＰ−ガラクトース及び他の前駆体の同方向及び対向輸送トランスポーター）、オリゴ糖のプロセシングに関与する他の酵素、並びにＵＤＰ−ガラクトース、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸などの活性化オリゴ糖前駆体の合成に関与する酵素。好ましくは、酵素活性は、１個以上の核酸分子上に導入される（下記も参照されたい。）。核酸分子は、例えば、本発明のコンビナトリアルライブラリーなどの核酸ライブラリーに関連して、単独で又は複合的に導入することができる。しかし、単一又は複数の酵素活性は、本発明の核酸ライブラリー又はコンビナトリアルライブラリーを必ずしも用いずに、タンパク質送達方法を含めて、ただしこれだけに限定されない任意の様式で、及び／又は１個以上の核酸分子の使用によって、宿主細胞に導入できることを理解されたい。
【０２００】
複合型Ｎ−グリカンを産生する糖転移酵素の発現
ＤＮＡ配列情報を用いて、当業者は、ＧｎＴＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ又はＩＶ（例えば、実施例３及び４）などの１つ以上のＧｎＴ活性、ガラクトシル転移酵素活性（実施例４）、及び／又はシアリル転移酵素活性（実施例６及び１７）をコードするＤＮＡ分子をクローン化することができる。これらのほ乳動物酵素の１種類以上が、ヒト様複合型糖タンパク質の産生に最適な宿主細胞中で活発に発現されるように、本明細書に記載のとおり、当業者に周知の標準技術を用いて、上記酵素の１種類以上をコードする（又は触媒作用的に活性なその断片をコードする）核酸分子を、本発明の選択された宿主細胞（例えば、ピキア種、クルイベロミセス種、アスペルギルス種などの真菌宿主）における転写を駆動することができるプロモーター及び他の発現制御配列の転写制御下で、適切な発現ベクターに挿入することができる（例えば、実施例１５、１６、１７、１９及び２０）。
【０２０１】
幾つかの個々の糖転移酵素が、Ｓ．セレビシエ（ＧａｌＴ、ＧｎＴＩ）、アスペルギルス・ニデュランス（ＧｎＴＩ）及び他の真菌中でクローン化され、発現されたが、生物体のグリコシル化パターン上の「ヒト化」の所望の成果は実証されなかった（Ｙｏｓｈｉｄａ，  １９９５、Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋ，  １９９５、Ｋａｌｓｎｅｒ，  １９９５）。かかる糖転移酵素の作用によって糖を受容するのに必要な糖鎖構造体が、十分な量存在しなかったと推測され、これが複合型Ｎ−グリカン形成の不足の一因になっている可能性が最も高い。
【０２０２】
本発明の好ましい方法は、初期又は中間ゴルジ体中のＧｎＴＩなどのＧｎＴの機能的発現を与え、並びに（例えば、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターの発現による）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの十分な供給を確保する（下記参照）。
【０２０３】
本発明の別の好ましい方法は、ゴルジ中のＳＴ６Ｇａｌ、ＳＴ３Ｇａｌなどのシアリル転移酵素の機能的発現を与え、並びに（例えば、実施例１６に説明する宿主中でのＣＭＰ−シアル酸生合成経路の発現によって）ＣＭＰ−シアル酸の十分な供給を確保する。多数の種由来のシアリル転移酵素は公知であり、本発明に有用であり得る。シアリル転移酵素は、例えば、Ｈａｒｄｕｉｎ−Ｌｅｐｅｒｓ，  ２００１、Ｈａｒｄｅｕｉｎ−Ｌｅｐｅｒｓ，  ２００５及びＴｓｊｉ，  １９９６に記載されている。これらの参考文献すべての開示を参照により本明細書に取り込む。
【０２０４】
糖ヌクレオチド前駆体をゴルジ体に供給する方法
糖転移酵素がゴルジ中で満足に機能するためには、酵素は、新生糖タンパク質に付加した糖成分の高エネルギー供与体である適切なヌクレオチド糖を十分な濃度必要とする。ヒト及び他の非ヒト真核細胞においては、あらゆる種類のヌクレオチド糖前駆体（例えば、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸、ＵＤＰ−ガラクトースなど）は、サイトゾル中で一般に合成され、ゴルジ中に輸送され、ゴルジ中で糖転移酵素によって核オリゴ糖に結合する。
【０２０５】
ゴルジ中にこれらのヌクレオチド前駆体を含まない宿主細胞中で（例えば、下等真核生物などの非ヒト宿主細胞中で）このプロセスを複製するために、糖ヌクレオシド特異的トランスポーターをゴルジ中で発現させて、十分なレベルのヌクレオシド糖前駆体を確保しなければならない（Ｓｏｍｍｅｒｓ，  １９８１、Ｓｏｍｍｅｒｓ，  １９８２、Ｐｅｒｅｚ，  １９８７）。例えば、糖ヌクレオチドトランスポーターをコードする外来遺伝子を宿主細胞中で発現させることによって、ヌクレオチド糖を適切な区画に供給することができる。トランスポーター酵素の選択は、使用する外来糖転移酵素の性質によって影響される。例えば、ＧｌｃＮＡｃ転移酵素はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターを必要とし、フコシル転移酵素はＧＤＰ−フコーストランスポーターを必要とし、ガラクトシル転移酵素はＵＤＰ−ガラクトーストランスポーターを必要とし、シアリル転移酵素はＣＭＰ−シアル酸トランスポーターを必要とし得る。
【０２０６】
付加した輸送タンパク質は、ヌクレオチド糖をサイトゾルからゴルジ体中に輸送し、ゴルジ体中でヌクレオチド糖は、糖転移酵素によって反応して、例えば、Ｎ−グリカンを伸長させることができる。反応によって、ヌクレオシド二リン酸又は一リン酸（例えば、ＵＤＰ、ＧＤＰ又はＣＭＰ）が遊離する。ヌクレオシド一リン酸は、逆輸送機序によってヌクレオシド三リン酸糖と交換にゴルジから直接搬出することができる。しかし、ヌクレオシド二リン酸の蓄積は、糖転移酵素の更なる活性を阻害する。この反応は、効率的グリコシル化に重要であると考えられるので、ヌクレオチドジホスファターゼをコードする遺伝子の発現されたコピーを供給することが望ましいことが多い。（ＵＤＰ又はＧＤＰに特異的なしかるべき）ジホスファターゼは、ジホスホヌクレオシドを加水分解して、ヌクレオシド一リン酸及び無機リン酸を生成する。
【０２０７】
典型的にはほ乳動物起源である、適切なトランスポーター酵素を以下に記述する。かかる酵素は、本発明の方法によって、選択された宿主細胞中に操作することができる（実施例７−１０も参照されたい。）。
【０２０８】
別の例においては、α２，３−又はα２，６−シアリル転移酵素は、ヒトのトランスゴルジ及びＴＧＮ中でガラクトース残基をシアル酸でキャップして、糖タンパク質の成熟型をもたらす（図１Ｂ）。シアリル転移酵素活性を天然に欠く下等真核生物宿主細胞及び他の宿主細胞にこのプロセシング段階を再設計するには、（１）α２，３−又はα２，６−シアリル転移酵素活性と、（２）後期ゴルジにおけるＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の十分な供給とが必要である（実施例６、１６及び１７）。分泌経路（例えば、後期ゴルジ）において十分なα２，３−シアリル転移酵素活性を得るには、例えば、（例えば、ヒト由来の）公知シアリル転移酵素の触媒ドメインを下等真核生物宿主細胞中の分泌経路に誘導しなければならない（上記参照）。同様に、トランスポーターを操作して、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を分泌経路（例えば、後期ゴルジ）の同じ場所に輸送しなければならない。下等真核生物宿主細胞などの宿主細胞が、十分な量のＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を合成し、さらにはゴルジ中に輸送することさえできることは、現在指摘されていない。その結果、対応する糖転移酵素用基質の十分な供給を確保するためには、これらの宿主細胞中へのＣＭＰ−シアル酸の産生を代謝的に操作しなければならない。
【０２０９】
ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミントランスポーター
発現配列タグデータベース（ｄｂＥＳＴ）における相同性検索によって識別されたヒトＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミントランスポーターのｃＤＮＡは、クローン化されている（Ｉｓｈｉｄａ，  １９９９）。ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンのほ乳動物ゴルジ膜トランスポーターは、上記ヌクレオチド糖のゴルジ輸送が欠乏した、最近特徴づけられたクルイベロミセス・ラクチス変異体のイヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）由来のｃＤＮＡを用いた表現型補正によってクローン化された（Ｇｕｉｌｌｅｎ，  １９９８）。結果によれば、ほ乳動物ゴルジＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター遺伝子は、タンパク質の発現に必要な情報のすべてを有し、酵母のゴルジ体を機能的に標的にし、極めて異なるアミノ酸配列を有する２種類のタンパク質が、同じゴルジ膜内の同じ溶質を輸送することができる（Ｇｕｉｌｌｅｎ，  １９９８）。
【０２１０】
したがって、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターの発現を核酸構築物によって宿主細胞に組み入れることができる。核酸構築物は、例えば、（１）形質転換された構築物が細胞中に維持される領域（例えば、複製開始点、又は染色体の組み込みを媒介する領域）、（２）ｕｒａ３、Ｔ−ｕｒｆ１３などの対抗選択可能で再利用可能なマーカー（Ｓｏｄｅｒｈｏｌｍ，  ２００１）、又は他の特徴がはっきりした選択マーカー（例えば、ｈｉｓ４、ｂｌａ、Ｓｈ  ｂｌｅなど）を含めて、形質転換された細胞の選択を可能にするマーカー遺伝子、（３）例えば、Ｋ．ラクチス（Ａｂｅｉｊｏｎ，  １９９６）又はＨ．サピエンス（Ｉｓｈｉｄａ，  １９９６）由来の、機能的ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターをコードする遺伝子又はその断片、及び（４）上記局在化／触媒ドメイン融合構築物ライブラリーの発現を活性化するプロモーターを含み得る。
【０２１１】
ＧＤＰ−フコーストランスポーター
ラット肝臓ゴルジ膜ＧＤＰ−フコーストランスポーターは、Ｐｕｇｌｉｅｌｌｉ，  Ｌ．及びＣ．Ｂ．  Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇによって特定され、精製された（Ｐｕｇｌｉｅｌｌｉ，  １９９９）。対応する遺伝子は特定されていない。しかし、Ｎ末端配列決定法は、対応する遺伝子に特異的であるオリゴヌクレオチドプローブの設計に使用することができる。これらのオリゴヌクレオチドをプローブとして使用して、ＧＤＰ−フコーストランスポーターをコードする遺伝子をクローン化することができる。
【０２１２】
ＵＤＰ−ガラクトーストランスポーター
２種類の異種遺伝子、すなわち、シゾサッカロミセス・ポンベ由来のアルファ１，２−ガラクトシル転移酵素（アルファ１，２ＧａｌＴ）をコードするｇｍａｌ２（＋）及びヒトＵＤＰ−ガラクトース（ＵＤＰ−Ｇａｌ）トランスポーターをコードする（ｈＵＧＴ２）を、Ｓ．セレビシエ中で機能的に発現させて、ガラクトシル化に必要な細胞内条件を検討した。タンパク質ガラクトシル化とＵＤＰ−ガラクトース輸送活性の相関によれば、アルファ１，２ＧａｌＴではなく、ＵＤＰ−Ｇａｌトランスポーターの外因的な供給が、Ｓ．セレビシエにおける効率的なガラクトシル化に対して重要な役割を果たした（Ｋａｉｎｕｍａ，  １９９９）。同様に、Ｓ．ポンベ由来のＵＤＰ−ガラクトーストランスポーターがクローン化された（Ａｏｋｉ，  １９９９、Ｓｅｇａｗａ，  １９９９）。
【０２１３】
ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−シアル酸）トランスポーター
ヒトＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（ｈＣＳＴ）がＬｅｃ  ８  ＣＨＯ細胞中でクローン化され、発現された（Ａｏｋｉ，  １９９９、Ｅｃｋｈａｒｄｔ，  １９９７）。ネズミＣＭＰ−シアル酸トランスポーターの機能的発現がサッカロミセス・セレビシエ中で実施された（Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅ，  １９９７）。シアル酸は幾つかの真菌中で見いだされたが、選択された宿主系が、十分なレベルのＣＭＰ−シアル酸を供給することができるかどうかは不明である。シアル酸は培地に供給することができ、又は以下に示すように、シアル酸合成に関与する真菌経路を宿主ゲノムに組み込むこともできる。
【０２１４】
ジホスファターゼの発現
糖が糖タンパク質上に移されると、ヌクレオシド二リン酸又は一リン酸が糖ヌクレオチド前駆体から放出される。一リン酸は、逆輸送機序によってヌクレオシド三リン酸糖と交換に直接搬出され得るが、ジホスホヌクレオシド（例えば、ＧＤＰ）は、ホスファターゼ（例えば、ＧＤＰａｓｅ）によって切断されて、搬出前に、ヌクレオシド一リン酸と無機ホスファートにされなければならない。Ｓ．セレビシエ由来のＧＤＰａｓｅはマンノシル化に必要であることが判明したので、この反応は、効率的グリコシル化に重要であると考えられる。しかし、この酵素は、ＵＤＰに対する活性の１０％しか持たない（Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅ，  １９９４）。下等真核生物は、ゴルジ中での糖タンパク質合成のためにＵＤＰ糖前駆体を利用しないので、ゴルジ中にＵＤＰ特異的ジホスファターゼ活性を持たないことが多い。ガラクトース残基を（ＵＤＰ−ガラクトース由来の）細胞壁多糖に付加する酵母であるシゾサッカロミセス・ポンベは、特異的ＵＤＰａｓｅ活性を有することが見いだされ、かかる酵素の必要性が更に示唆された（Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅ，  １９９４）。ＵＤＰは、糖転移酵素の強力な阻害剤であることが知られており、このグリコシル化副生物の除去は、ゴルジ内腔における糖転移酵素阻害を防止するのに重要である（Ｋｈａｔａｒａ，  １９７４）。
【０２１５】
混成型糖タンパク質の形成
軽微な修飾によって、酵素の同じ「集合列」及びグリコシル化経路を利用して、複合型Ｎ−グリカンを形成することができる。主要な相違は、ＧＮＴ  ＩがＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２核に作用して、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が産生された後、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を作用マンノシダーゼＩＩに曝露して、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を形成する必要がないことである。例えば、Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ、国際公開第０２／００８７９号及び米国特許第７，０２９，８７２号を参照されたい。
【０２１６】
核酸分子から標的酵素活性を発現させることによって、宿主中でＮ−グリカンを改変する方法
好ましい一実施形態において、本発明は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を含む糖タンパク質を製造する方法を提供する。好ましい一実施形態において、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２又はＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２からのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の生成に関与する１つ以上のマンノシダーゼ活性をコードする核酸分子を宿主に導入する。
【０２１７】
別の実施形態において、本発明は、ＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖鎖構造体を生成するために、１種類又は複数の酵素をコードする１個以上の核酸分子を宿主細胞に導入する段階を含む、非ヒト真核生物宿主細胞中でヒト様糖タンパク質を製造する方法を提供する。
【０２１８】
本発明は、さらに、１種類以上のグリコシル化酵素又は活性をコードする核酸分子を宿主細胞に導入する段階を含む、改変された糖タンパク質を宿主細胞中で作製する方法にも関する。好ましい酵素活性は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ転移酵素、ＵＤＰ−ガラクトシル転移酵素、ＧＤＰ−フコシル転移酵素、ＣＭＰ−シアリル転移酵素、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター、ＵＤＰ−ガラクトーストランスポーター、ＧＤＰ−フコーストランスポーター、ＣＭＰ−シアル酸トランスポーター及びヌクレオチドジホスファターゼからなる群から選択される。特に好ましい実施形態において、宿主は、一方の活性の生成が他方の活性の基質レベルを増加させる２つ以上の酵素活性（例えば、糖転移酵素と対応する糖トランスポーター（例えば、ＧｎＴＩとＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター）活性）を発現するように選択又は設計される。別の好ましい実施形態において、宿主は、活性（例えば、ＵＤＰ又はＧＤＰ特異的ジホスファターゼ活性）を発現して、後続のグリコシル化反応を阻害し得る生成物を除去するように選択又は設計される。
【０２１９】
本発明の好ましい方法は、宿主細胞中で核酸分子から１つ以上の酵素活性を発現することを含み、酵素触媒ドメインと細胞内指向性シグナルペプチド（例えば、触媒ドメインに通常は連結されない、又は付随しない異種シグナルペプチド）とを含む融合タンパク質を形成することによって、少なくとも１つの酵素活性を所望の細胞内位置（例えば、細胞小器官）に向ける段階を含む。融合タンパク質は、酵素（例えば、グリコシル化酵素）又は触媒作用的に活性な断片をコードする核酸断片に同じ翻訳読み枠（「インフレーム」）で連結された細胞内指向性シグナルペプチドをコードする核酸断片を含む、少なくとも１個の遺伝子構築物（「融合構築物」）によってコードされる。
【０２２０】
融合構築物又はタンパク質の指向性シグナルペプチド成分は、ＥＲ又はゴルジの膜結合タンパク質、回収シグナル、ＩＩ型膜タンパク質、Ｉ型膜タンパク質、膜貫通ヌクレオチド糖トランスポーター、マンノシダーゼ、シアリル転移酵素、グルコシダーゼ、マンノシル転移酵素及びホスホマンノシル転移酵素からなる群のメンバーに好ましくは由来する。
【０２２１】
融合構築物又はタンパク質の触媒ドメイン成分は、ＧｎＴＩ、ＧｎＴＩＩ、ＧｎＴＩＩＩ、ＧｎＴＩＶ、ＧｎＴＶ、ＧｎＴＶＩ、ＧａｌＴ、フコシル転移酵素及びシアリル転移酵素からなる群のメンバーに由来する、グリコシダーゼ、マンノシダーゼ又は糖転移酵素活性に好ましくは由来する。触媒ドメインは、好ましくは、酵素が局在する細胞小器官中の他の代表的な酵素の平均最適ｐＨの１．４ｐＨ単位内に最適ｐＨを有し、又は５．１から８．０のｐＨで最適な活性を有する。
【０２２２】
グリコシル化酵素の選択：最適ｐＨ及び細胞内局在化
本発明の一実施形態において、ヒト様糖タンパク質は、標的細胞内区画中の他の酵素の最適ｐＨに類似した最適ｐＨを有するように選択されたグリコシル化酵素を細胞内区画に導入することによって、非ヒト真核生物宿主細胞中で効率的に作製される。例えば、Ｓ．セレビシエのＥＲ及びゴルジ体中で活性である大部分の酵素は、約６．５から７．５の最適ｐＨを有する（表３参照）。タンパク質のグリコシル化は高度に進化した効率的プロセスであるので、ＥＲ及びゴルジの内部ｐＨも約６−８の範囲である可能性がある。しかし、真菌宿主中での組換えマンノシダーゼの作用によってマンノシル化を抑制する従前の手法はすべて、最適ｐＨが約ｐＨ５．０である酵素を導入した（Ｍａｒｔｉｎｅｔ，  １９９８及びＣｈｉｂａ，  １９９８）。ｐＨ７．０では、これらのマンノシダーゼのインビトロで求められた活性は１０％未満に低下し、使用場所、すなわちＥＲ及び初期ゴルジにおいて、Ｎ−グリカン上のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のインビボでの効率的生成に対する活性が不十分である可能性がある。
【０２２３】
したがって、本発明の好ましい実施形態は、選択されたグリコシル化酵素（又はその触媒ドメイン）（例えば、α−マンノシダーゼ）を、宿主細胞中の細胞内位置（例えば、細胞小器官）に向ける。細胞内位置では、酵素又はドメインの最適ｐＨは、同じ細胞小器官中に局在する他の代表的マーカー酵素の最適平均ｐＨの１．４ｐＨ単位内である。特定の細胞小器官に向けられる酵素の最適ｐＨは、得られる単位酵素当たりの活性を最大にするために、同じ細胞小器官中に存在する他の酵素の最適ｐＨと一致すべきである。表３に、種々の出所由来のマンノシダーゼの活性、及びそれぞれの最適ｐＨを要約する。表４に、その典型的な細胞内位置を要約する。
【０２２４】
【表２】
0005514541.tif 000003
【０２２５】
好ましい実施形態において、特定の酵素又は触媒ドメインは、酵素ドメインに通常は付随しない細胞内指向性シグナルペプチドを含むタンパク質をコードするキメラ融合構築物によって、宿主細胞中の細胞内位置を標的にする。好ましくは、酵素又はドメインは、宿主細胞のトランスゴルジ体のＥＲ、初期、中間又は後期ゴルジを標的にする。
【０２２６】
より好ましい一実施形態において、標的グリコシル化酵素は、糖転移酵素又は（マンノシダーゼなどの）グリコシダーゼである。特に好ましい実施形態において、シアリル転移酵素活性を有する酵素は、グリコシル化の初期反応が起こる後期ゴルジを標的にする。本明細書に開示する方法は、非ヒト宿主細胞中でヒト様糖タンパク質を製造するのに有用であるが、本明細書で考察する方法は、ヒト宿主細胞を含めて、任意の真核生物宿主細胞中の糖タンパク質の糖質プロファイルを改変するのにもより一般的に有用であることを理解されたい。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ、国際公開第０２／００８７９号を参照されたい。
【０２２７】
宿主細胞分泌経路のある細胞小器官中のタンパク質の保留を媒介する指向性配列は、指向性配列及び標的酵素の選択用ライブラリーに関して後でより詳細に考察するように、周知であり、科学文献及び公開データベースに記載されている。かかる細胞内指向性配列は、単独で又は組み合わせて使用して、選択したグリコシル化酵素（又はその触媒ドメイン）を宿主細胞中の特別な細胞内位置（特に、最適ｐＨ又は他の刺激因子の存在に基づいて、増大された又は最適な活性を酵素が有する細胞内位置）に向けることができる。
【０２２８】
例えば、高マンノース構造体を切り取って、Ｓ．セレビシエなどの宿主細胞のＥＲ又はゴルジ体中でＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を生成しようとするときには、（１）十分に近い最適ｐＨ（すなわちｐＨ５．２からｐＨ７．８）を有し、（２）ＧｎＴＩによる後続のＧｌｃＮＡｃの付加を受容するのに必要な特定の異性体Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造体を単独で又は協調して生成することが知られている、任意の酵素又は酵素の組合せを選択することができる。ＧｎＴＩによってインビトロでＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に転化することができる構造体を生成することが示された任意の酵素又は酵素の組合せは、適切な選択となる。この知識は、科学文献から、又は実験的に得ることができる。
【０２２９】
例えば、可能性があるマンノシダーゼが、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２−２ＡＢ（２−アミノベンズアミド）をＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＡＢに転化させることができるかどうかを判断し、次いで得られたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−２ＡＢ構造体が、ＧｎＴＩ及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ用基質に役立ち、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２をインビトロで生成できることを検証することができる。例えば、ヒト又はネズミ源由来のマンノシダーゼＩＡは、適切な選択である（例えば、実施例１１参照）。本明細書に記載の実施例は、２−アミノベンズアミド標識Ｎ結合型オリゴマンノースを利用し、続いてその測定にＨＰＬＣ分析を利用する。
【０２３０】
【表３】
0005514541.tif 000004
【０２３１】
したがって、本発明に従って使用されるα−１，２−マンノシダーゼ酵素などのグリコシル化酵素は、ｐＨ５．１から８．０に最適活性を有する。好ましい実施形態において、この酵素はｐＨ５．５から７．５に最適活性を有する。例えば、線虫マンノシダーゼ酵素は、本発明の方法において十分働き、みかけの最適ｐＨ約５．５を有する）。
【０２３２】
α−１，２−マンノシダーゼ酵素の最適ｐＨを説明する実験を実施例１４に記述する。培地に漏出したキメラ融合タンパク質ＢＢ２７−２（サッカロミセスＭＮＮ１０（ｓ）／線虫マンノシダーゼＩＢ  Δ３１）を種々のｐＨ範囲に供して、酵素の最適活性を求めた。実験結果によれば、α１，２−マンノシダーゼは、その機能に対して約５．５の最適ｐＨを有する（図１１）。
【０２３３】
好ましい実施形態において、単一のクローン化マンノシダーゼ遺伝子が宿主生物中で発現される。しかし、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を十分に生成するために、幾つかの異なるマンノシダーゼ遺伝子を発現させることが望ましい場合もあり、又は１個の特別な遺伝子の幾つかのコピーを発現させることが望ましい場合もある。同義遺伝子を使用する場合には、コードされたマンノシダーゼは、好ましくはすべて約５．１から約８．０、特に約５．５から約７．５の好ましい範囲内の最適ｐＨを有する。好ましいマンノシダーゼ活性としては、マウス、ヒト、鱗し目、アスペルギルス・ニデュランス又はバチルス種、線虫、キイロショウジョウバエ、Ｐ．シトリナム（ｃｉｔｒｉｎｕｍ）、アフリカツメガエル又はＡ．ニデュランス由来のα−１，２−マンノシダーゼが挙げられる。
【０２３４】
コンビナトリアルＤＮＡライブラリーを用いた宿主細胞グリコシル化のインビボでの改変
本発明のある方法は、好ましくは（ただし、必ずしも必要ではないが）、１つ以上の核酸ライブラリーを用いて実施される。本発明のコンビナトリアル核酸ライブラリーの例示的特徴は、細胞内指向性シグナルペプチドをコードする配列と、標的タンパク質（例えば、グリコシル化を媒介する酵素又はその触媒ドメインを含めて、ただしこれらだけに限定されない酵素又はその触媒ドメイン）をコードする配列とを含むことである。
【０２３５】
一実施形態において、コンビナトリアル核酸ライブラリーは、（ａ）異なる細胞内指向性シグナルペプチドをコードする少なくとも２個の核酸配列、及び（ｂ）標的ポリペプチドをコードする少なくとも１個の核酸配列を含む。別の実施形態において、コンビナトリアル核酸ライブラリーは、（ａ）細胞内指向性シグナルペプチドをコードする少なくとも１個の核酸配列、及び（ｂ）宿主細胞中に向けられるポリペプチドをコードする少なくとも２個の核酸配列を含む。以下に更に記述するように、（ａ）由来の核酸配列と（ｂ）由来の核酸配列とを連結して、目的ポリペプチドドメインに機能的に連結された細胞内指向性シグナルペプチドをコードする１種類以上の融合構築物を生成する。機能的結合の一例は、細胞内指向性シグナルペプチドが同じ翻訳読み枠（「インフレーム」）中の目的ポリペプチドドメインに連結されたときである。
【０２３６】
好ましい実施形態において、コンビナトリアルＤＮＡライブラリーは、触媒酵素ドメインにインフレームで連結された細胞内指向性シグナルペプチドを含む１種類以上の融合タンパク質を発現する。コードされた融合タンパク質は、好ましくは、Ｎ−グリカンのほ乳動物様修飾又はヒト様修飾に関与する酵素の触媒ドメインを含む。より好ましい一実施形態において、触媒ドメインは、１個以上の指向性シグナルペプチドにインフレームで連結された、マンノシダーゼ、糖転移酵素及び他のグリコシダーゼからなる群から選択される酵素に由来する。酵素ドメインは、宿主細胞に対して外来性及び／又は内在性であり得る。特に好ましいシグナルペプチドは、ＥＲからゴルジに輸送されるタンパク質に通常付随するシグナルペプチドである。
【０２３７】
本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーを使用して、ほ乳動物様又はヒト様Ｎ−グリカン修飾に関与する酵素をインビボで産生し、局在化させることができる。コンビナトリアルＤＮＡライブラリーの融合構築物は、コードされた酵素が目的糖タンパク質上で特定のＮ−グリカンを産生するのに関与する、宿主細胞のＥＲ、ゴルジ又はトランスゴルジ網中に、コードされた酵素が局在するように操作される。本発明のＮ−グリカン修飾酵素の局在化は、アンカー機序又はタンパク質−タンパク質相互作用によって達成され、コンビナトリアルＤＮＡライブラリーから構築された局在化ペプチドは、ＥＲ、ゴルジ、トランスゴルジ網などの分泌経路の所望の細胞小器官に局在する。
【０２３８】
ヒト様（複合型）グリコシル化反応によって更なる修飾のために効率的に十分な量で産生される有用なＮ−グリカンの例は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２である。（例えば、３０モル％を超える）十分な量のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が、インビボでの更なるヒト様プロセシングのために目的糖タンパク質上に必要である。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２中間体は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を産生する更なるＮ−グリカン修飾のための基質として使用することができる（図１Ｂ、上記参照）。したがって、本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーを使用して、酵素を生成することができ、続いてこの酵素は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２又は他の所望の複合型Ｎ−グリカンを有用な量で生成する。
【０２３９】
本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーを用いて生成される融合構築物の別の態様は、融合構築物が、操作された宿主細胞中で、十分で、しばしばほぼ完全な細胞内Ｎ−グリカントリミング活性を可能にすることである。本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーによって生成される好ましい融合構築物は、グリコシル化酵素（例えば、マンノシダーゼ）をコードする。グリコシル化酵素は、細胞内宿主細胞区画に効果的に局在し、それによって細胞外活性をほとんど、好ましくは全く示さない。マンノシダーゼ酵素をコードする、本発明の好ましい融合構築物は、Ｎ−グリカンが修飾される場所、すなわち、ＥＲ及びゴルジに局在することが示されている。本発明の融合酵素は、分泌経路中のかかる特別な細胞小器官を標的にする。細胞小器官で、融合酵素は、局在し、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２などのＮ−グリカンに作用して、目的糖タンパク質上でＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を産生する。
【０２４０】
それぞれ図５及び図６に示す、Ｐ．パストリス中で発現されるＫ３又はＩＦＮ−βタンパク質について示したように、本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーによって生成される酵素は、目的糖タンパク質上でＮ−グリカンを修飾することができる（実施例２及び１１も参照されたい。）。しかし、エリスロポイエチン、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターフェロンω、顆粒球ＣＳＦなどのサイトカイン、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ヒトプロテインＣなどの凝固因子、可溶性ＩｇＥ受容体α鎖、ＩｇＧ、ＩｇＧ断片、ＩｇＭ、インターロイキン、ウロキナーゼ、キマーゼ及び尿素トリプシン阻害剤、ＩＧＦ結合タンパク質、上皮成長因子、成長ホルモン放出因子、アネキシンＶ融合タンパク質、アンギオスタチン、血管内皮増殖因子２、骨髄系前駆細胞抑制因子１、オステオプロテジェリン、α−１抗トリプシン、ＤＮａｓｅ  ＩＩ、α−フェトプロテイン、ＡＡＴ、ｒｈＴＢＰ−１（ＴＮＦ結合タンパク質１としても知られるオネルセプト（ｏｎｅｒｃｅｐｔ））、ＴＡＣＩ−Ｉｇ（膜貫通活性化因子及びカルシウム調節因子及びサイクロフィリンリガンド相互作用因子（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ａｎｄ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒ  ａｎｄ  ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ  ｌｉｇａｎｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｏｒ））、ＦＳＨ（卵胞刺激ホルモン）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＣを含むＧＬＰ−１及びＦＣを含まないＧＬＰ−１（グルカゴン様タンパク質１）  ＩＬ−１受容体作動物質、ｓＴＮＦｒ（可溶性ＴＮＦ受容体Ｆｃ融合物としても知られるＥｎｂｒｅｌ）  ＡＴＩＩＩ、ｒｈトロンビン、グルコセレブロシダーゼ並びにＣＴＬＡ４−Ｉｇ（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４−Ｉｇ）を含めて、ただしこれらだけに限定されない別のタイプの糖タンパク質を、このようにしてグリコシル化できることを理解されたい。
【０２４１】
融合構築物のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーの構築
融合構築物のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーは、（例えば、Ｃ末端を欠失させることによって）未変性タンパク質のＮ末端ドメインに一般に由来する１個以上の細胞内指向性シグナルペプチド（「指向性ペプチド」）を特徴として備える。しかし、一部の指向性ペプチドは、未変性タンパク質のＣ末端に由来する（例えば、ＳＥＣ１２）。ＥＲ又はゴルジの膜結合タンパク質は、好ましくは、指向性ペプチド配列の出所として用いられる。これらのタンパク質は、長さの異なるサイトゾル側末端（ｃｔ）、膜貫通領域（ｔｍｄ）及びステム領域（ｓｒ）をコードする配列を有する。これらの領域は、タンパク質配列アラインメント、並びに既知相同体及び／又は他の局在タンパク質との比較によって（例えば、疎水性のプロットを比較することによって）認識される。
【０２４２】
指向性ペプチドは、本明細書では、ＩＩ型膜の部分に比較して短い（ｓ）、中間（ｍ）及び長い（ｌ）と表す。短い（ｓ）と表された指向性ペプチド配列は、膜結合タンパク質の膜貫通領域（ｔｍｄ）に対応する。長い（ｌ）と表された指向性ペプチド配列は、膜貫通領域（ｔｍｄ）とステム領域（ｓｒ）の長さに対応する。中間（ｍ）と表された指向性ペプチド配列は、膜貫通領域（ｔｍｄ）と、ステム領域（ｓｒ）のほぼ半分の長さに対応する。触媒ドメイン領域は、ここでは、その野生型グリコシル化酵素に対するヌクレオチド欠失の数によって示される。
【０２４３】
サブライブラリー
一部の例では、本発明のコンビナトリアル核酸ライブラリーは、既存の遺伝子又は野生型遺伝子から直接組み立てることができる。好ましい実施形態において、ＤＮＡライブラリーは、２つ以上のサブライブラリーの融合から組み立てられる。サブライブラリーのインフレーム連結によつて、グリコシル化活性を有するタンパク質ドメインなどの有用な標的タンパク質ドメインをコードする多数の新規遺伝子構築物を生成することができる。
【０２４４】
グリコシル化活性をコードする触媒ドメインサブライブラリー
有用な一サブライブラリーは、グリコシダーゼ（例えば、マンノシダーゼ）、糖転移酵素（例えば、フコシル転移酵素、ガラクトシル転移酵素、グルコシル転移酵素）、ＧｌｃＮＡｃ転移酵素、シアリル転移酵素などの酵素をコードするＤＮＡ配列を含む。触媒ドメインは、操作される宿主、他の関連生物体又は無関係な生物体から選択することができる。ほ乳動物、植物、昆虫、は虫類、藻類又は真菌の各酵素はすべて有用であり、温度及び最適ｐＨに関して広範な生化学的性質を示すように選択すべきである。好ましい実施形態において、遺伝子は、その一部が酵素の触媒ドメインをコードする断片を与えるように切断される。次いで、内在性指向性配列を除去することによって、他の細胞部位中で酵素を再誘導し、発現させることができる。
【０２４５】
触媒ドメインがその後に活性になる特別な環境を知ることによって、かかる触媒ドメインを選択することができる。例えば、特定のグリコシル化酵素が後期ゴルジ中で活性になり、後期ゴルジ中の宿主生物の既知の全酵素がある最適ｐＨを有する場合、又は後期ゴルジが特別なｐＨを有することが知られている場合、上述したように、そのｐＨで十分な、好ましくは最大の活性を示す触媒ドメインを選択する。
【０２４６】
指向性ペプチド配列サブライブラリー
別の有用であるサブライブラリーは、ＥＲ、ゴルジ又はトランスゴルジ網内の特別な場所へのタンパク質の局在化をもたらす指向性シグナルペプチドをコードする核酸配列を含む。これらの指向性ペプチドは、操作される宿主生物、他の関連生物体又は無関係な生物体から選択することができる。一般にかかる配列は、３つのカテゴリーに分類される：（１）ゴルジの内部（内腔）膜にタンパク質を一緒に、又は個々に固定する、サイトゾル側末端（ｃｔ）、膜貫通領域（ｔｍｄ）、及びステム領域（ｓｒ）の一部又は全部をコードするＮ末端配列、（２）ＨＤＥＬ（配列番号５）、ＫＤＥＬ（配列番号６）テトラペプチドなどのＣ末端に一般に存在する回収シグナル、及び（３）ゴルジに局在することが知られている種々のタンパク質（例えば、ヌクレオチド糖トランスポーター）由来の膜貫通領域。
【０２４７】
指向性ペプチドが種々の要素（ｃｔ、ｔｍｄ及びｓｒ）からなる第１の場合、ライブラリーは、ｃｔ、ｔｍｄ、及びステム領域の種々の部分が示されるように設計される。したがって、指向性ペプチド配列のサブライブラリーの好ましい実施形態は、ＥＲ又はゴルジの膜結合タンパク質由来のｃｔ、ｔｍｄ及び／又はｓｒ配列を含む。ｓｒ配列の長さが異なるサブライブラリーを用意することが望ましい場合もある。これは、サイトゾル領域をコードするＤＮＡの５’末端に結合したプライマーと、ステム領域の様々な部分に結合した一連の対向（ｏｐｐｏｓｉｎｇ）プライマーとを用いたＰＣＲによって実施することができる。
【０２４８】
指向性ペプチド配列の更に別の有用な出所は、ＥＲ又はゴルジ中に逆方向に輸送されるタンパク質のＣ末端に典型的には存在する回収シグナルペプチド（例えば、テトラペプチドＨＤＥＬ（配列番号５）又はＫＤＥＬ（配列番号６））を含む。更に別の指向性ペプチド配列源としては、（ａ）ＩＩ型膜タンパク質、（ｂ）表３に記載の酵素、（ｃ）ゴルジに局在する膜貫通ヌクレオチド糖トランスポーター、及び（ｄ）表５に記載の配列が挙げられる。（１列８セルのＨＤＥＬシグナルは配列番号５で示される。）。
【０２４９】
【表４】
0005514541.tif 000005
0005514541.tif 000006
【０２５０】
いずれにしても、特定の１つ又は複数の酵素活性が一連の所望のグリコシル化反応内で最適に機能するのに適切である、指向性ペプチド配列を選択することが極めて好ましい。例えば、ヒトの後期ゴルジ中で起こるプロセスである新生Ｎ−グリカンの末端シアリル化が可能な改変微生物の開発においては、後期ゴルジタンパク質由来の指向性ペプチド配列のサブライブラリーを利用することが望ましい。同様に、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を与えるα−１，２−マンノシダーゼによるＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２のトリミングは、ヒトにおける複合型Ｎ−グリカン形成の初期段階である（図１Ｂ）。したがって、操作された宿主微生物のＥＲ又は初期ゴルジ中でこの反応が起きることが望ましい。ＥＲ及び初期ゴルジ保留シグナルをコードするサブライブラリーを使用する。
【０２５１】
次いで、触媒ドメインをコードする１個又は一連の配列に１個又は一連の指向性ペプチド配列を機能的に連結することによって、一連の融合タンパク質構築物（すなわち、コンビナトリアルＤＮＡライブラリー）を構築する。好ましい実施形態において、これは、指向性ペプチド配列をコードするＤＮＡを含むサブライブラリー（上記）とグリコシル化酵素又は触媒作用的に活性なその断片をコードするＤＮＡを含むサブライブラリー（下記参照）とのインフレーム連結によって実施される。
【０２５２】
生成したライブラリーは、指向性ペプチド配列を含む融合タンパク質をコードする合成遺伝子を含む。融合タンパク質のＮ末端に指向性ペプチド配列を備えることが望ましい場合もあり、又はＣ末端に備えることが望ましい場合もある。個々の折りたたドメインのタンパク質構造が破壊されないという前提で、指向性ペプチド配列を酵素のオープンリーディングフレーム内に挿入できる場合もある。各タイプの融合タンパク質を（段階的に定方向（ｓｔｅｐ−ｗｉｓｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ）に、又は半無作為に）構築し、本発明の方法を用いて、宿主細胞を形質転換し、形質転換細胞中のグリコシル化パターンの特性を分析することによって、最適構築物を選択することができる。かかる方法を用いて、下等真核生物宿主細胞を操作して、例えば特定の目的タンパク質に適合した、望ましいＮ−グルカン特性を有する組換え糖タンパク質を産生することができる。
【０２５３】
別の配列多様性の生成
この実施形態の方法は、核酸（例えば、宿主に転換されたＤＮＡライブラリー）が大きい配列多様性を含み、それによって少なくとも１種類の形質転換体が所望の表現型を示す確率が増加するときに、最も有効である。例えば、単一のアミノ酸変異は、糖タンパク質プロセシング酵素の活性を激変させ得る（Ｒｏｍｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）。したがって、形質転換前に、ＤＮＡライブラリー又は構成要素サブライブラリーを１つ以上の技術に供して、別の配列多様性を生じさせることができる。例えば、１ラウンド以上の遺伝子シャフリング、誤りがちな（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ、インビトロ変異誘発、又は配列多様性を生じる別の方法を実施して、融合構築物のプール内のより大きな配列多様性を得ることができる。
【０２５４】
発現制御配列
上記オープンリーディングフレーム配列に加えて、プロモーター、転写終結因子、エンハンサー、リボソーム結合部位、宿主生物への融合構築物の転換時に融合タンパク質の有効な転写及び翻訳を確実にするのに必要であり得る他の機能的配列などの発現制御配列を有する各ライブラリー構築物を提供することが一般に好ましい。
【０２５５】
適切なベクター成分（例えば、選択マーカー、発現制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなど）及び場合によっては、宿主細胞中での自己複製に必要な配列）は、特定のどの宿主細胞を選択するかに応じて選択される。特定のほ乳動物又は下等真核生物宿主細胞に用いられる適切なベクター成分の選択判定基準は、定常的なものである。本発明の好ましい下等真核生物宿主細胞としては、ピキア・パストリス、ピキア・フィンランジカ、ピキア・トレハロフィラ、ピキア・コクラマエ、ピキア・メンブラナエファシエンス、ピキア・オプンチアエ、ピキア・サーモトレランス、ピキア・サリクタリア、ピキア・グエルキューム、ピキア・ピジュペリ、ピキア・スチプチス及びピキア・メタノリカを含めて、ただしこれらだけに限定されない任意のピキア種、サッカロミセス・セレビシエ、ハンゼヌラ・ポリモルファを含めて、ただしこれらだけに限定されない任意のサッカロミセス種、クルイベロミセス・ラクチスを含めて、ただしこれらだけに限定されない任意のクルイベロミセス種、カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・ニドランス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼ、トリコデルマ・リーセイ、クリソスポリウム・ルクノウエンス、フザリウム・グラミネウム及びフザリウム・ベネナツムを含めて、ただしこれらだけに限定されない任意のフザリウム種、ニューロスポラ・クラッサなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。宿主がピキア・パストリスである場合、適切なプロモーターとしては、例えば、ＡＯＸ１、ＡＯＸ２、ＧＡＰＤＨ及びＰ４０プロモーターが挙げられる。
【０２５６】
選択マーカー
薬剤耐性を付与する遺伝子、宿主の代謝的損傷（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｌｅｓｉｏｎ）を補完する遺伝子などの少なくとも１個の選択マーカーを各構築物に備えることも好ましい。マーカーの存在は、後続の形質転換体の選択に有用である。例えば、酵母では、ＵＲＡ３、ＨＩＳ４、ＳＵＣ２、Ｇ４１８、ＢＬＡ又はＳＨ  ＢＬＥ遺伝子を使用することができる。複数の選択マーカーが公知であり、酵母、真菌、植物、昆虫、ほ乳動物及び他の真核生物宿主細胞に利用可能である。メチロトローフの酵母中の少なくとも２つの生合成経路を交互に不活性化することによって酵母細胞を形質転換する方法は、参照により本明細書に取り込むＵＳ２００４／０２２９３０６、ＵＳ２００５／０１７０４５２及びＮｅｔｔ，  ２００５に記載されている。この方法は、（ａ）アデニン、アルギニン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、プロリン及びウラシルからなる群から選択されるアミノ酸又はヌクレオチドの合成に関与する経路中の第１の酵母遺伝子を第１の選択マーカーを用いて不活性化し、それによってアミノ酸又はヌクレオチドに対して宿主を栄養要求性にすること、次いで（ｂ）アデニン、アルギニン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、プロリン及びウラシルからなる群から選択されるアミノ酸又はヌクレオチドの合成に関与する（ａ）で不活性化されたのと同じ経路由来ではない第２の酵母遺伝子を、（ａ）で不活性化された酵母遺伝子を第２の選択マーカーとして用いて不活性化することを含む。
【０２５７】
形質転換
次いで、核酸ライブラリーを宿主生物に転換する。酵母では、電気穿孔法、塩化リチウム法、スフェロプラスト法など、任意の好都合なＤＮＡ転移法を使用することができる。糸状菌及び植物細胞では、従来の方法としては、微粒子銃、電気穿孔法、アグロバクテリウム媒介性転換などが挙げられる。高密度培養（例えば、酵母中での発酵）に適切な安定な系統を生成するために、ＤＮＡライブラリー構築物を宿主染色体に組み込むことが望ましい。好ましい実施形態において、組み込みは、当分野で周知の技術を用いた相同組換えによって起こる。例えば、ＤＮＡライブラリー成分は、宿主生物の配列と相同である隣接配列を備える。このようにして、組み込みは、望ましい又は必須遺伝子の破壊なしに、宿主ゲノム中の限定された部位で起こる。
【０２５８】
特に好ましい実施形態において、ライブラリーＤＮＡは、宿主染色体中の望ましくない遺伝子の部位に組み込まれ、遺伝子の破壊又は欠失をもたらす。例えば、ＯＣＨ１、ＭＮＮ１又はＭＮＮ４遺伝子部位への組み込みによって、糖タンパク質の酵母過剰マンノシル化に関与する酵素の発現を防止しながら、所望のライブラリーＤＮＡの発現が可能になる。別の実施形態において、ライブラリーＤＮＡは、核酸分子、プラスミド、ベクター（例えば、ウイルス又はレトロウイルスベクター）、染色体によって宿主に導入することができ、また、自律的核酸分子として、又は相同的若しくは無作為的な組み込みによって、宿主ゲノムに導入することができる。いずれにしても、各ライブラリーＤＮＡ構築物少なくとも１個の選択マーカー遺伝子を含んで、安定に形質転換された宿主生物を容易に選択できることが一般に望ましい。そのために、又はそれに反して選択することができる、ｕｒａ３などの再利用可能なマーカー遺伝子は特に適切である。
【０２５９】
スクリーニング及び選択プロセス
宿主系統をＤＮＡライブラリーで形質転換後、所望のグリコシル化表現型を示す形質転換体を選択する。選択は、種々のアッセイ又は検出方法のいずれかを用いて、一段階で、又は一連の表現型の集積及び／又は減少段階によって、実施することができる。表現型の特性分析は、手作業で、又は自動化ハイスループットスクリーニング装置を用いて、実施することができる。一般に、宿主微生物は、種々の糖タンパク質が局在する細胞表面でタンパク質Ｎ−グリカンを示す。
【０２６０】
例えば、細胞表面の末端ＧｌｃＮＡｃの濃度が最も高い細胞をスクリーニングすることができ、又は末端ＧｌｃＮＡｃ含有量が最も高いタンパク質を分泌する細胞をスクリーニングすることができる。かかるスクリーニングは、染色操作のような視覚的方法、マーカーと複合化された特異的末端ＧｌｃＮＡｃ結合抗体若しくはレクチン（かかるレクチンは、Ｅ．Ｙ．  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｍａｔｅｏ、ＣＡから入手可能である。）との結合能、末端マンノース残基に対する特定のレクチンの低結合能、放射性標識糖をインビトロで導入する能力、色素若しくは帯電表面との変化した結合に基づくことができ、又は蛍光団標識レクチン若しくは抗体と併せて蛍光支援細胞選別（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ）（ＦＡＣＳ）装置を用いて実施することができる（Ｇｕｉｌｌｅｎ，  １９９８）。
【０２６１】
したがって、無傷細胞は、所望のＮ−グリカンに特異的に結合するレクチン又は抗体に細胞を曝露することによって、所望のグリコシル化表現型についてスクリーニングすることができる。多種多様なオリゴ糖特異的レクチンが（例えば、ＥＹ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｍａｔｅｏ、ＣＡから）市販されている。或いは、特定のヒト若しくは動物Ｎ−グリカンに対する抗体が市販されており、又は標準技術によって製造することができる。適切なレクチン又は抗体を、発色団、蛍光団、放射性同位体、色素生産性基質を有する酵素などのレポーター分子と複合化することができる（Ｇｕｉｌｌｅｎ，  １９９８）。
【０２６２】
次いで、分光測光法、蛍光定量法、蛍光活性化細胞選別、シンチレーション測定などの分析法によって、スクリーニングを実施することができる。形質転換細胞からの単離糖タンパク質又はＮ−グリカンを分析することが必要な場合もある。タンパク質の単離は、当分野で公知の技術によって実施することができる。好ましい実施形態において、レポータータンパク質が培地に分泌され、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、Ｎｉ親和性又はグルタチオンＳ転移酵素アフィニティークロマトグラフィー）によって精製される。単離Ｎ−グリカンが好ましい場合には、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏ．、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）などの酵素を使用して、糖タンパク質からＮ−グリカンを切断することができる。次いで、単離タンパク質又はＮ−グリカンを、液体クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）、質量分析又は他の適切な手段によって分析することができる。米国特許第５，５９５，９００号は、所望の細胞外糖鎖構造を有する細胞を特定することができる幾つかの方法を教示する。好ましい実施形態において、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって、切断されたＮ−グリカンを分析する。
【０２６３】
所望の形質転換体を選択する前に、望ましくない表現型を有する、形質転換された細胞集団を枯渇させることが望ましい場合もある。例えば、方法を用いて、機能的マンノシダーゼ活性を細胞中に操作すると、所望の形質転換体は、細胞の糖タンパク質中のマンノースレベルが低下する。形質転換された集団を、培地中のマンノースの致死的放射性同位体に曝露すると、望ましくない表現型を有する形質転換体の集団、すなわち高レベルの取り込まれたマンノースが枯渇する（Ｈｕｆｆａｋｅｒ，  １９８３）。或いは、望ましくないＮ−グリカンに対する細胞傷害性レクチン又は抗体を使用して、形質転換された、望ましくない表現型の集団を枯渇させることができる（例えば、Ｓｔａｎｌｅｙ，  １９７７）。米国特許第５，５９５，９００号は、所望の細胞外糖鎖構造を有する細胞を特定することができる幾つかの方法を教示する。この戦略を繰り返し実施することによって、下等真核生物において、なお一層複雑なグリカンを逐次操作することができる。
【０２６４】
高度のヒト様Ｎ−グリカン中間体ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を表面に有する宿主細胞を検出するために、例えば、インビトロ細胞アッセイにおいて、ＧｌｃＮＡｃ転移酵素によってＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからＧｌｃＮＡｃを最も効率的に転移させることができる形質転換体を選択することができる。このスクリーニングは、形質転換されたライブラリーを含む細胞を選択圧下で寒天板上で増殖させ、個々のコロニーを９６ウェルマイクロタイタープレートに移すことによって実施することができる。細胞を増殖させた後、細胞を遠心分離し、細胞を緩衝剤に再懸濁させ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ及びＧｎＴ  ＩＩを添加後、ＵＤＰの放出をＨＰＬＣ又は酵素結合アッセイによってＵＤＰについて測定する。或いは、放射性標識ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ及びＧｎＴ  ＩＩを使用し、細胞を洗浄し、次いでＮ−アセチルグルコサミニダーゼによる放射性ＧｌｃＮＡｃの放出を探索することができる。これらすべてを手作業で、又はハイスループットスクリーニング装置を用いて自動的に実施することができる。第１のアッセイにおいてより多くのＵＤＰを放出する形質転換体、又は第２のアッセイにおいてより放射性標識されたＧｌｃＮＡｃは、より高度のＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を表面に有すると予想され、したがって所望の表現型を構成する。類似のアッセイは、分泌タンパク質上のＮ−グリカンを同様に調べるのにも適合し得る。
【０２６５】
或いは、形質転換細胞表面の変化したグリコシル化パターンを明らかにすることができるレクチン結合アッセイなどの任意の他の適切なスクリーニングを使用することができる。この場合、末端マンノースに特異的なレクチンの結合の減少は、適切な選択ツールになり得る。スノードロップ（Ｇａｌａｎｔｕｓ  ｎｉｖａｌｉｓ）レクチンは、十分なマンノシダーゼＩＩ活性がゴルジ中に存在する場合に低下すると予想される末端α−１，３マンノースに特異的に結合する。高い末端マンノース含有量を有する細胞の除去を可能にするクロマトグラフィー分離段階を実施することによって、所望の形質転換体を濃縮することもできる。この分離段階は、低い末端マンノース含有量を有する細胞よりも、高い末端マンノース含有量を有する細胞に特異的に結合するレクチンカラム（例えば、アガロースに結合したスノードロップレクチン、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて実施される。
【０２６６】
また、かかる融合タンパク質構築物を直接生成することができ、異なる下等真核生物宿主中の活性糖質修飾酵素の局在化に関する追加の情報は、科学文献中で利用可能になる。例えば、ヒトβ１，４−ＧａｌＴｒは、その触媒活性を保持しながら、Ｓ．セレビシエ由来のマンノシル転移酵素ＭＮＴの膜ドメインと融合し、ゴルジ体に局在し得ることが知られている（Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７０：５４８３−９  １９９５）。Ｓ．セレビシエ又は関連生物体が操作すべき宿主である場合には、かかる知見を戦略全体に直接組み込んで、かかる宿主から複合型Ｎ−グリカンを得ることができる。Ｓ．セレビシエ中の糖転移酵素に関係する、Ｐ．パストリス中の幾つかのかかる遺伝子断片が特定され、したがってその目的に使用することができる。
【０２６７】
コンビナトリアルライブラリー由来の融合構築物を用いた宿主細胞グリコシル化の改変
好ましいコンビナトリアルＤＮＡライブラリーの構築を、図２に模式的に示し、実施例１１に記述する。融合構築物は、当分野で周知の発現ベクターなどの複数のベクターに作動可能に結合することができる。多種多様なかかる融合構築物を、表６に示す代表的な活性を用いて組み立てた。指向性ペプチド／触媒ドメインの組合せを組み立てて、本発明によるＥＲ、ゴルジ及びトランスゴルジ網における糖転移酵素及び（マンノシダーゼなどの）グリコシダーゼ活性のターゲティングに使用することができる。驚くべきことに、同じ触媒ドメインでも、使用する指向性ペプチドのタイプによっては、Ｎ−グリコシル化パターンに極めて重大な効果を引き起こさない場合もある（例えば、表７、実施例１１参照）。
【０２６８】
本発明は、本明細書に記載の融合構築物をコードする核酸、かかる融合構築物を含むベクター、及びかかる融合構築物で形質転換された宿主細胞も与える。
【０２６９】
マンノシダーゼ融合構築物
本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリー由来のマンノシダーゼ融合構築物の代表例は、ｐＦＢ８である。ｐＦＢ８は、マウスα−マンノシダーゼＩＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＮ：６６７８７８７）の１８７  Ｎ末端アミノ酸欠損部にインフレームで連結された切断型サッカロミセスＳＥＣ１２（ｍ）指向性ペプチド（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ｐ１１６５５由来のＳＥＣ１２の９８８−１２９６ヌクレオチド）である。したがって、本明細書で使用する命名法によれば、グリコシル化酵素の指向性ペプチド／触媒ドメイン領域をサッカロミセスＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡ  Δ１８７と称する。コードされた融合タンパク質は、そのマンノシダーゼ触媒ドメイン活性を保持しながら、ＳＥＣ１２指向性ペプチド配列によってＥＲに局在し、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を有するＮ−グリカンをインビボで産生することができる（実施例１１、図６Ｆ、図７Ｂ）。
【０２７０】
融合構築物ｐＧＣ５、サッカロミセスＭＮＳ１（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＢ  Δ９９は、細胞内マンノシダーゼトリミング活性を有する融合構築物の別の例である（実施例１１、図５Ｄ、図８Ｂ）。融合構築物ｐＢＣ１８−５（サッカロミセスＶＡＮ１（ｓ）／線虫マンノシダーゼＩＢ  Δ８０）は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を有するＮ−グリカンをインビボで産生することができる効率的融合構築物の更に別の例である。本発明によるこれらのマンノシダーゼ融合構築物及び他のかかるマンノシダーゼ融合構築物のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーを作製するために、当業者は、最適な細胞内トリミング活性を有する構築物を、比較的低活性の構築物又は不活性な構築物から識別し、選択することができる。本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーを用いた方法は、選択されたわずか数個のマンノシダーゼ融合構築物によって、特に所望のＮ−グリカンをインビボで産生することができるので、有利である。
【０２７１】
また、マンノシダーゼトリミング活性は、特定の目的タンパク質に特異的であり得る。したがって、すべての指向性ペプチド／マンノシダーゼ触媒ドメイン融合構築物が、等しく十分に機能して、目的糖タンパク質上で適切なグリコシル化を生じ得るとは限らないことを更に理解されたい。したがって、コンビナトリアルＤＮＡライブラリーを移入した宿主細胞に目的タンパク質を導入して、目的タンパク質に最適なマンノシダーゼ活性を発現する１種類以上の融合構築物を特定することができる。当業者は、本明細書に記載のコンビナトリアルＤＮＡライブラリー手法を用いて、最適な融合構築物を製造し、選択することができる。
【０２７２】
さらに、局在した活性マンノシダーゼ触媒ドメイン（又はより一般的に、任意の酵素のドメイン）を示す別のかかる融合構築物を、実施例１１に例示する技術、本明細書に記載の技術などの技術を用いて、作製できることは明らかである。当業者が、本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーを作製し、使用して、例えば、特定の宿主細胞に導入された特定の発現ベクターにおける融合構築物ライブラリーからのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の生成を最適化することは、定常的な実験法の問題である。
【０２７３】
糖転移酵素融合構築物
同様に、糖転移酵素コンビナトリアルＤＮＡライブラリーを本発明の方法によって作製することができる。糖転移酵素Ｉ（ＧｎＴＩ）活性に由来する配列のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーを指向性ペプチドを用いて組み立て、下等真核生物宿主細胞中のマーカー糖タンパク質上でのＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカン構造体の効率的産生についてスクリーニングした。ある融合構築物がＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（ｐＰＢ１０４）を産生することを示し、サッカロミセスＭＮＮ９（ｓ）／ヒトＧｎＴＩ  Δ３８を特定した（実施例１５）。多種多様なかかるＧｎＴＩ融合構築物を組み立てた（実施例１５、表１０）。指向性ペプチド／ＧｎＴＩ触媒ドメインの別の組合せは、コンビナトリアルＤＮＡライブラリーを作製することによって、容易に組み立てることができる。実施例１５に示すように、糖転移酵素活性を示す別のかかる融合構築物を作製できることも当業者には明らかである。当業者が、本明細書に記載のコンビナトリアルＤＮＡライブラリー方法を使用して、特定の発現ベクター及び宿主細胞系中で、選択された融合構築物を用いて、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の生成を最適化することは、定常的な実験法の問題である。
【０２７４】
マンノシダーゼ融合構築物の場合に上述したように、すべての指向性ペプチド／ＧｎＴＩ触媒ドメイン融合構築物が、等しく十分に機能して、本明細書に記載のように目的糖タンパク質上で適切なグリコシル化を生じるとは限らない。しかし、当業者は、本明細書に記載のように、ＤＮＡライブラリー手法を用いて、最適な融合構築物を製造し、選択することができる。実施例１５は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造体を優勢に含む糖タンパク質の産生に関与する、指向性ペプチドとＧｎＴＩ触媒ドメイン融合構築物とを含むコンビナトリアルＤＮＡライブラリーの好ましい実施形態である。実施例１７は、シアリル転移酵素融合構築物、並びに２種類のＧｎＴＩＩ及びＭａｎｎＩＩ融合構築物の使用を開示する。
【０２７５】
複数の融合構築物を用いた宿主細胞グリコシル化の改変
本発明の方法及びライブラリーを用いて宿主細胞グリコシル化を改変する別の例においては、レポータータンパク質（Ｋ３）を発現する、ＯＣＨ１欠損を含むＰ．パストリス系統を、本発明のコンビナトリアルライブラリーから単離された複数の融合構築物で形質転換して、高マンノースＮ−グリカンをヒト様Ｎ−グリカンに転化した（実施例１５）。第１に、マンノシダーゼ融合構築物ｐＦＢ８（サッカロミセスＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡ  Δ１８７）を、１，６開始マンノシル転移酵素活性を欠くＰ．パストリス系統に転換した（すなわちｏｃｈ１欠損、実施例１）。第２に、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターをコードするＫ．ラクチスＭＮＮ２−２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＮ：ＡＦ１０６０８０）を含むｐＰＢ１０３を構築して、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の更なる生成を増加させた。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターを付加すると、図１０Ｂに示すように、Ｐ．パストリス系統におけるＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の生成がかなり増加した。第３に、サッカロミセスＭＮＮ９（ｓ）／ヒトＧｎＴＩ  Δ３８を含むｐＰＢ１０４を系統に導入した。このＰ．パストリス系統を「ＰＢＰ−３」と称する。
【０２７６】
上記酵母系統などの宿主細胞は、１個以上の発現ベクターで、逐次的に形質転換でき、及び／又は同時形質転換できることを当業者は理解されたい。形質転換の順序は、目的糖タンパク質の生成に特に関係しないことも理解されたい。当業者は、本明細書に開示する手順の定常的な改変によって、目的糖タンパク質の生成が改善した結果が得られ得ることを認識している。
【０２７７】
特定の触媒ドメイン配列を含む特定の指向性ペプチド配列を使用する重要性は、本明細書に記載の実験から容易に明らかになる。コンビナトリアルＤＮＡライブラリーは、ヒト様糖タンパク質の生成に特に有用である目的糖タンパク質上でＮ−グリカンを改変するのに関与する酵素融合物を構築するツールを提供する。（しかし、任意の酵素融合物を本発明のライブラリー及び方法によって選択することができる。）適切に標的にされた活性α−１，２−マンノシダーゼを発現する所望の形質転換体は、図５Ｄ及び５Ｅに示す構造Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のＮ−グリカンを含むＫ３を産生する。これによって、図５ＣのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって検出して、切断されたグリカンは、親ＯＣＨ１欠損系統のＫ３よりも分子量が低くなる。
【０２７８】
同様に、同じ手法を用いて、別の分泌糖タンパク質、すなわち、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を優勢に含むＩＦＮ−βを生成させた。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２をＰＮＧａｓｅ消化（Ｐａｐａｃ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８）によって除去し、図６Ａ−６Ｆに示すようにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦに供した。１２５４（ｍ／ｚ）の単一の突出したピークによって、図６Ｅ（ｐＧＣ５）（サッカロミセスＭＮＳ１（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＢ  Δ９９）及び図６Ｆ（ｐＦＢ８）（サッカロミセスＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡ  Δ１８７）におけるＩＦＮ−β上のＭａｎ５ＧｌｃＮＡ２産生が確認される。また、ｐＦＢ８（サッカロミセスＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡ  Δ１８７）、ｐＰＢ１０４（サッカロミセスＭＮＮ９（ｓ）／ヒトＧｎＴＩ  Δ３８）及びｐＰＢ１０３（Ｋ．ラクチスＭＮＮ２−２遺伝子）を含むＰ．パストリス系統ＰＢＰ−３では、混成型Ｎ−グリカンＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］がＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって検出された（図１０）。
【０２７９】
高度のマンノーストリミングを含む形質転換体を特定後、追加の実験を実施して、マンノシダーゼ（トリミング）活性がインビボで生じ、増殖培地中の細胞外活性の主たる結果ではないことを確認した（実施例１３、図７−９）。
【０２８０】
逐次グリコシル化反応
好ましい実施形態において、かかる指向性ペプチド／触媒ドメインライブラリーは、高等真核生物におけるグリコシル化反応の逐次的な性質についての既存の情報を組み入れるように設計される。糖タンパク質プロセシング過程の初期に起こることが知られている反応は、かかる反応を触媒する酵素をゴルジ又はＥＲの初期部分に向ける必要がある。例えば、マンノシダーゼによるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２へのＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２のトリミングは、複合型Ｎ−グリカン形成における初期段階である。タンパク質プロセシングは、ＥＲ中で開始され、次いで初期、中間及び後期ゴルジを通過するので、この反応をＥＲ又は初期ゴルジ中で起こすことが望ましい。したがって、例えば、マンノシダーゼＩ局在化のためのライブラリーを設計するときには、ＥＲ及び初期ゴルジターゲティングシグナルをマンノシダーゼＩの触媒ドメインに対応させようとする。別の例として、糖タンパク質のシアリル化は、ゴルジ中で起こる。したがって、シアリル転移酵素発現用のライブラリーを設計するときには、したがって、ゴルジターゲティングシグナルをシアリル転移酵素の触媒ドメインに対応させようとする。
【０２８１】
コドン最適化及びヌクレオチド置換
本発明の方法は、真菌宿主などの特定の宿主におけるコードされたタンパク質の効率的転写／翻訳のための塩基組成の最適化と併せて実施することができる。この最適化は、ｔＲＮＡの細胞プールが確実に十分であるようにするコドン最適化を含む。外来遺伝子（ＯＲＦ）は、真菌宿主における完全な転写／翻訳に有害なモチーフを含み得、したがって、より適した配列に置換する必要があり得る。導入された各タンパク質の発現後には、転写及び翻訳段階において、それぞれ周知のノーザン及びウェスタンブロット法が続き得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｄ．Ｗ．，  ２００１）。
【０２８２】
ベクター
別の態様においては、本発明は、活性をコードする遺伝子  グリコシル化酵素、プロモーター、ターミネーター、選択マーカー及びターゲティング隣接領域を含む（発現ベクターを含めた）ベクターを提供する。かかるプロモーター、ターミネーター、選択マーカー及び隣接領域は、当分野で容易に利用可能である。好ましい実施形態において、各場合におけるプロモーターは、所望の酵素反応の十分な触媒作用を可能にする特別なＯＲＦによってコードされるタンパク質の最適な発現を与えるように選択される。この段階は、恒常的又は誘導性であるプロモーターを選択する必要があり、調節された転写レベルを与える。別の実施形態において、選択されたターミネーターは、十分な転写終結を可能にする。更に別の実施形態において、用いられる選択マーカーは、各ＯＲＦに特有であり、導入されるＯＲＦの特定の組合せを含む真菌系統のその後の選択を可能にする。更なる実施形態において、（プロモーター、ＯＲＦ及びターミネーターをコードする）各融合構築物が局在する位置は、隣接領域を選択することによって求められる。本発明は、本明細書に開示するベクターの使用に限定されない。
【０２８３】
組み込み部位
この遺伝子操作取組の最終的一目的は、工業発酵プロセスにおいて十分実施することができる堅牢なタンパク質産生系統であるので、宿主（例えば、真菌）染色体への同義遺伝子の組み込みは、好ましくは、慎重に計画する必要がある。操作された系統は、ある範囲の異なる遺伝子で形質転換されなければならない可能性があり、これらの遺伝子は、発酵プロセスを通して所望の活性が確実に維持されるように安定に形質転換されなければならない。本明細書に記載のように、種々の所望の酵素活性の任意の組合せを、真菌タンパク質発現宿主中に設計することができる（例えば、シアリル転移酵素、マンノシダーゼ、フコシル転移酵素、ガラクトシル転移酵素、グルコシル転移酵素、ＧｌｃＮＡｃ転移酵素、ＥＲ及びゴルジ特異的トランスポーター（例えば、ＵＤＰ−ガラクトース及び他の前駆体の同方向及び対向輸送トランスポーター）、オリゴ糖のプロセシングに関与する他の酵素、並びにＵＤＰ−ガラクトース、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸などの活性化オリゴ糖前駆体の合成に関与する酵素）。真菌（ｆｕｇａｌ）宿主中の非ヒトグリコシル化反応に特徴的であることが知られている酵素、及びその対応するタンパク質をコードする遺伝子は、幾つかの下等真核生物（例えば、サッカロミセス・セレビシエ、トリコデルマ・リーセイ、アスペルギルス・ニデュランス、Ｐ．パストリスなど）において広範に特徴づけられており、それによって下等真核生物中の公知糖転移酵素の一覧表、それらの活性、及びそれぞれの遺伝子配列が提供される。これらの遺伝子は、マンノシル転移酵素、例えば、１，３マンノシル転移酵素（例えば、Ｓ．セレビシエ中のＭＮＮ１）（Ｇｒａｈａｍ，  １９９１）、１，２マンノシル転移酵素（例えば、Ｓ．セレビシエ由来のＫＴＲ／ＫＲＥファミリー）、１，６マンノシル転移酵素（Ｓ．セレビシエ由来のＯＣＨ１）、マンノシルホスファート転移酵素及びそれらの制御因子（Ｓ．セレビシエ由来のＭＮＮ４及びＭＮＮ６）、並びに異常（すなわち非ヒト）グリコシル化反応に関与する追加の酵素からなる群から選択される可能性がある。ピキア・パストリスなどの下等真核生物宿主細胞中のグリコシル化を改変する好ましい方法の例を表６に示す。（第３列第２行のＨＤＥＬ及びＫＤＥＬシグナルペプチドは、それぞれ配列番号５及び６で示される。）。
【０２８４】
【表５】
0005514541.tif 000007
0005514541.tif 000008
0005514541.tif 000009
0005514541.tif 000010
【０２８５】
組み換えＮ−グリカンを作製するためのＣＭＰ−Ｓｉａを生産する方法
本発明は、真菌細胞などの内在性ＣＭＰ−Ｓｉａを欠く宿主細胞中に機能的ＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路を作製するための方法を提供する。本発明は、新しいＣＭＰ−Ｓｉａ経路又は変化を受けたＣＭＰ−Ｓｉａ経路を発現するように修飾された宿主細胞を作製するための方法も提供する。さらに、本発明は、ＣＭＰ−Ｓｉａの細胞プールを含む宿主細胞を作製するための方法を提供する。
【０２８６】
本方法は、ＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路の酵素をコードする幾つかの遺伝子を宿主細胞中でクローニング及び発現させることを含み、目的のタンパク質上にシアル化されたグリカンを作製する上で使用することができる、ＣＭＰ−Ｓｉａの細胞プールを宿主細胞中にもたらす。一般に、グリカンへのシアル酸の付加は、シアル転移酵素、グリカンアクセプター（例えば、Ｇａｌ２ＧＩｃＮＡｃ２ＭａＨ３ＧｌｃＮＡｃ２）及びシアル供与体分子、ＣＭＰ−Ｓｉａの存在を必要とする。高等生物（例えば、ほ乳動物）中でのＣＭＰ−Ｓｉａドナー分子の合成は、基質ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃから始まるＣＭＰ−Ｓｉａに至る４酵素の複数反応工程である（図１４Ａ）。本工程は、細胞質中で始まり、シアル酸を産生し、次いで、シアル酸は、核内へ移行され、ＣＭＰ−シアル酸合成酵素によって、ＳｉａはＣＭＰ−Ｓｉａへ転化される。その後、ＣＭＰ−Ｓｉａは核を出て、細胞質に入り、次いで、ゴルジ体へ輸送され、ゴルジ体において、シアル転移酵素はシアル酸のアクセプターグリカン上への転移を触媒する。これに対して、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからＣＭＰ−Ｓｉａを合成するための細菌の経路は、３つの酵素と２つの中間体のみを含み（図１４）、すべての反応が細胞質中で起こる。
【０２８７】
従って、本発明の方法は、機能的なＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路を導入することによって、内在性ＣＭＰ−Ｓｉａを欠く非ヒト宿主細胞中にＣＭＰ−Ｓｉａのプールを作製することを含む。遺伝学的データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ）から容易に入手可能なＤＮＡ配列情報を用いて、ＣＭＰ−Ｓｉａ経路に関与する酵素及び／又は活性（実施例１６）がクローニングされる。当業者に公知の標準的な技術を用いて、ＣＭＰ−Ｓｉａの生合成又は輸送に関与する１つ又はそれ以上の酵素（又は触媒的に活性なその断片）をコードする核酸分子は、本発明の選択された宿主細胞（例えば、真菌宿主細胞）中で転写を駆動することができるプロモーター及び／又は他の発現調節配列の転写調節下にある適切な発現ベクター中に挿入される。本発明の選択された宿主細胞中のこのような酵素の機能的な発現は検出することが可能である。一実施形態において、本発明の選択された宿主細胞中のこのような酵素の機能的な発現は、酵素によって形成される中間体を測定することによって、検出することが可能である。本発明の方法は、本明細書に開示されている特定の酵素源の使用に限定されない。ある種の好ましい実施形態において、本発明のコンビナトリアルライブラリーは、選択された宿主細胞中のＣＭＰ−Ｓｉａ経路活性を選択及び／又は最適化するために使用される。
【０２８８】
宿主細胞中のほ乳動物のＣＭＰ−シアル酸生合成経路を工作する
本発明の一実施形態において、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ、Ｎ−アセチルノイラマート−９−ホスファートシンターゼ、Ｎ−アセチルノイラマート−９−ホスファターゼ、ＣＭＰ−シアル酸ホスファターゼ及びＣＭＰ−シアル酸合成酵素などの、ＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路中の合成酵素をコードする幾つかの遺伝子をクローニングすること、並びに真菌宿主細胞などの、内在性ＣＭＰ−Ｓｉａを欠く宿主細胞中で前記クローニングされた遺伝子の１つ又はそれ以上を発現させることを含む。各酵素を生成するために遺伝子が発現され、その後の酵素反応のために使用される中間体を産生する。実施例１６は、選択マーカーを用いて、これらの酵素を真菌宿主（例えば、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｒｉｓ）を導入するための方法を記載する。あるいは、その後の酵素が作用することができる下流の中間体を産生し、又は増加させるために、酵素は一緒に発現される。
【０２８９】
経路中の最初の酵素は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ兼Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼである二機能性酵素であり、Ｎ−アセチルマンノアサミン（ＭａｎＮＡｃ）を通じて、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃをＮ−アセチルマンノサミン−６−リン酸（ＭａｎＮＡｃ−６−Ｐ）へと転化する（Ｈｉｎｄｅｒｌｉｃｈ，１９９７）。本酵素は、ラット肝臓ｃＤＮＡライブラリーから最初にクローニングされた（Ｓｔａｓｃｈｅ，１９９７）。その後、他の種、例えば、ヒト（ＮＭ ００５４７６）；イー・コリ（Ｒｉｎｇｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．２００３）；マンヘミア・ヘモリチカ（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ（ＭｃＫｅｒｒｅｌｌ  ａｎｄ  Ｌｏ，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００２  Ｍａｙ；７０（５）：２６２２−９）中に、本酵素に対する相同体が存在することが見出された。好ましい実施形態において、機能的ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ酵素（その相同体、バリアント及び誘導体を含む。）をコードする遺伝子がクローニングされ、宿主細胞（真菌宿主細胞などの、内在性ＣＭＰ−Ｓｉａを欠く非ヒト宿主細胞）中で発現される。別の好ましい実施形態において、機能的Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ酵素（その相同体、バリアント及び誘導体を含む。）をコードする遺伝子がクローニングされ、真菌宿主細胞などの宿主細胞中で発現される。さらに好ましい実施形態において、二機能性ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ酵素（その相同体、バリアント及び誘導体を含む。）をコードする遺伝子がクローニングされ、真菌宿主細胞（例えば、Ｐ．パストリス）などの宿主細胞中で発現される。これらの遺伝子の機能的発現は、機能的アッセイを用いて検出することができる。一実施形態において、このような遺伝子の機能的発現は、ＭａｎＮＡｃ及びＭａｎＮＡｃ−６−Ｐ中間体の形成をモニタリングすることによって検出することができる。
【０２９０】
経路中の第二の酵素であるＮ−アセチルノイラミナートホスファートシンターゼは、イー・コリのシアル酸合成酵素遺伝子ＮｅｕＢに対するその相同性に基づいて、ヒト肝臓からクローニングされた（Ｌａｗｒｅｎｃｅ，２０００）。ラット肝臓（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．２００２  １２（２）：６５−７１）及びマウス（Ｎａｋａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０００；２７３（２）：６４２−８）中に、Ｎ−アセチルノイラミナートホスファートシンターゼの相同体も知られている。本酵素は、ＭａｎＮＡｃ−６−Ｐの、シアル酸９−リン酸（Ｓｉａ−９Ｐ、Ｎ−アセチルノイラミナート−９−ホスファート又はＮｅｕ５Ａｃ−９Ｐとも称される。）への転化を触媒する。従って、好ましい実施形態において、機能的Ｎ−アセチルノイラミナート−９−ホスファートシンターゼ（その相同体、バリアント及び誘導体を含む。）をコードする遺伝子がクローニングされ、宿主細胞（真菌宿主細胞などの、内在性ＣＭＰ−Ｓｉａを欠く非ヒト宿主細胞）中で発現される。宿主中でのＮ−アセチル−ノイラミナートホスファートシンターゼの発現は、機能的アッセイを用いて検出することができる。一実施形態において、Ｎ−アセチル−ノイラミナートホスファートシンターゼの機能的発現は、Ｓｉａ−９Ｐの形成をモニタリングすることによって検出することができる。
【０２９１】
経路中の第三の酵素は、Ｎ−アセチルノイラミナート９−ホスファターゼ（Ｓｉａ−９−ホスファターゼ）が、Ｓｉａ−９−Ｐのシアル酸への転化に関与する。本酵素のクローニングは、最近、Ｍａｌｉｅｋａｌら、２００６（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＮＮＭ １５２６６７）によって報告された。本酵素の活性はほ乳動物細胞中で検出されるが、このような活性は、真菌細胞中には同定されない。従って、Ｓｉａ−９−ホスファターゼの欠如は、経路中に分断を引き起こす。従って、好ましい実施形態において、本発明の方法は、Ｓｉａ−９−ホスファターゼ遺伝子を単離及びクローニングすること、並びに、真菌宿主細胞などの非ヒト宿主細胞中でＳｉａ−９−ホスファターゼ遺伝子を発現させることを含む。（実施例１６参照）。このような宿主には、例えば、酵母、真菌、昆虫及び細菌細胞が含まれる。より好ましい実施形態において、Ｓｉａ−９−ホスファターゼ遺伝子（その相同体、バリアント及び誘導体を含む。）は、真菌宿主など、内在性ＣＭＰ−Ｓｉａを欠く非ヒト宿主細胞又はＣＭＰ−Ｓｉａの不十分なレベルを発現する非ヒト宿主細胞中で発現される。宿主中でのＳｉａ−９−ホスファターゼの発現は、機能的アッセイを用いて検出することができる。一実施形態において、Ｓｉａ−９−ホスファターゼの機能的発現は、シアル酸の形成をモニタリングすることによって検出することができる。
【０２９２】
ほ乳動物経路中の次の酵素であるＣＭＰ−Ｓｉａ合成酵素は、本酵素を欠損する細胞株の機能的相補によって、マウスの下垂体から最初にクローニングされた（Ｍｕｎｓｔｅｒ，１９９８）。イー・コリ（Ｍｅｒｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｔｒｏｙ，１９９０）及びヒト（Ｒａｊｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）中に、相同体が存在することが見出されている。本酵素は、シアル酸をＣＭＰ−Ｓｉａへ転化させ、ＣＭＰ−Ｓｉａは、ゴルジ体中のシアル転移酵素反応における供与体基質である。従って、さらに、好ましい実施形態において、ＣＭＰ−Ｓｉａ合成酵素（その相同体、バリアント及び誘導体を含む。）をコードする遺伝子がクローニングされ、宿主細胞（例えば、真菌宿主細胞などの、内在性ＣＭＰ−Ｓｉａを欠く非ヒト）中で発現される。宿主中での機能的ＣＭＰ−Ｓｉａ合成酵素の発現は、機能的アッセイを用いて検出することができる。一実施形態において、ＣＭＰ−Ｓｉａ合成酵素の機能的発現は、ＣＭＰ−Ｓｉａの形成をモニタリングすることによって検出することができる。
【０２９３】
さらに、本発明の方法は、ＣＭＰ−Ｓｉａ経路中で上記酵素を発現させることの結果として、宿主細胞中で産生される中間体の産生を含む。好ましくは、産生される中間体には、以下のもの：ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＭａｎＮＡｃ、ＭａｎＮＡｃ−６−Ｐ、Ｓｉａ−９−Ｐ、Ｓｉａ及びＣＭＰ−Ｓｉａの１つ又はそれ以上が含まれる。さらに、好ましくは、本酵素によって産生される各中間体は検出される。例えば、中間体の存在又は不存在を検出するために、実施例１６に記載されているアッセイが使用される。従って、本発明は、真菌細胞などの内在性ＣＭＰ−Ｓｉａを欠く非ヒト宿主細胞中で産生されたＮ−グリカン中間体を検出するためのアッセイも提供する。
【０２９４】
当業者は、ＣＭＰ−シアル酸生合成経路中で１つ又はそれ以上の酵素が利用可能であるというだけで、このような酵素が真菌細胞などの内在性ＣＭＰ−Ｓｉａを欠く宿主細胞中で機能的に発現され得ることを示唆しないことを認める。現在まで、このような宿主細胞がこれらのほ乳動物の酵素を発現して、機能的な新規ＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路を作り出すことができることは記載されていない。本発明は、真菌宿主中のＣＭＰ−Ｓｉａ生合成に関与する少なくとも１つのほ乳動物酵素、すなわちマウスＣＭＰ−Ｓｉａ合成酵素（実施例１６）の機能的な発現を初めて提供し、ほ乳動物経路を介したＣＭＰ−Ｓｉａの産生（完全に又は部分的に）が真菌宿主中において可能であり、内在性ＣＭＰ−Ｓｉａを欠く他の非ヒト宿主中において可能であることを示唆する。
【０２９５】
本明細書に記載されている本発明は、本明細書に開示されている特定の酵素、遺伝子、プラスミド及び構築物の使用に限定されない。当業者は、ＣＭＰ−Ｓｉａの合成に関与する遺伝子のあらゆる相同体、バリアント、誘導体及び機能的均等物をどのようにして使用するかを容易に理解する。
【０２９６】
内在性ＣＭＰ−Ｓｉａを欠く宿主細胞（例えば、Ｐ．パストリスなどの真菌宿主）中で、又はＣＭＰ−Ｓｉａの増加したレベルを必要とする若しくはＣＭＰ−Ｓｉａの増加したレベルが有益である宿主細胞中でシアル酸付加された組み換え糖タンパク質を産生するために、上記ほ乳動物酵素は、本明細書に開示されているコンビナトリアルＤＮＡライブラリーアプローチを用いて発現させることができ、シアル転移酵素の存在下でガラクトシル化されたＮ−グリカン上に転移されるＣＭＰ−Ｓｉａのプールを生成する。従って、本発明は、選択された宿主細胞中において標的誘導される細胞内部位で、前記各酵素の１つ又はそれ以上が機能するように、好ましくは、それらが、最適に機能するように、前記各酵素の１つ又はそれ以上を発現させることによって、宿主細胞中にＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路を設計するための方法を提供する。ほ乳動物、細菌又はハイブリッドの工作されたＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路が提供される。
【０２９７】
宿主細胞中の細菌のＣＭＰ−シアル酸生合成経路を工作する
代謝中間体ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃは真核生物及び原核生物に共通であり、ＣＭＰ−Ｓｉａの合成を開始するそこから開始するための内在性基質を提供する（図１４）。この共通中間体の存在に基づいて、例えば、プラスミド上などの形質転換法によって、好ましくは、宿主細胞染色体中への組み込みによって細菌のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ（ＮｅｕＣ）、シアラート合成酵素（ＮｅｕＢ）及びＣＭＰ−Ｓｉａ（ＮｅｕＡ）合成酵素をコードする遺伝子を導入することによって、内在性ＣＭＰ−Ｓｉａを欠く非ヒト宿主細胞中に、ＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路を工作することができる。従って、本発明の別の態様は、内在性ＣＭＰ−Ｓｉａ経路を欠く宿主細胞中に、又はＣＭＰ−Ｓｉａの増加したレベルを必要とし、若しくはＣＭＰ−Ｓｉａの増加したレベルが有益である宿主細胞中に、細菌のＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路を工作することを含む。内在性ＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路を欠く細胞中での細菌のＮｅｕ遺伝子の発現によって、細胞性ＣＭＰ−Ｓｉａプールの生成が可能となり、続いて、これは、組み換え的に発現された糖タンパク質などの目的のタンパク質上での、シアル酸付加の検出可能なレベルを有する組み換えＮ−グリカンの産生を促進する。ＣＭＰ−Ｓｉａの合成に関与する細菌の酵素には、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ（ＮｅｕＣ）、シアラート合成酵素（ＮｅｕＢ）及びＣＭＰ−Ｓｉａ合成酵素（ＮｅｕＡ）が含まれる。一実施形態において、それぞれ、これらの機能的酵素をコードするＮｅｕＣ、ＮｅｕＢ及びＮｅｕＡ遺伝子（その相同体、バリアント及び誘導体を含む。）がクローニングされ、真菌宿主細胞などの、内在性ＣＭＰ−Ｓｉａ経路を欠く非ヒト宿主細胞中で発現される。ＮｅｕＣ、ＮｅｕＢ及びＮｅｕＡ遺伝子の配列は、それぞれ、図１５から１７に示されている。宿主細胞中でこれらの遺伝子が発現することによって、ＣＭＰ−シアル酸の生合成経路中の中間分子が生成される（図１４Ｂ）。
【０２９８】
これら３つの酵素の他に、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃから細菌のＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路を合成するための方法は、２つの中間体：ＭａｎＮＡｃ及びＳｉａを作製することを含む（図１４Ｂ）。ＭａｎＮＡｃへのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの転化は、ＮｅｕＣ遺伝子によって促進される。ＳｉａへのＭａｎＮＡｃの転化はＮｅｕＢ遺伝子によって促進され、ＣＭＰ−ＳｉａへのＳｉａの転化はＮｅｕＡ遺伝子によって促進される。従って、これら３つの酵素（又はこれらの相同体）は、これまでのところ、病原性細菌中において、一緒に結合して見出されている。すなわち、何れの１つの遺伝子も、他の２つの遺伝子なしに見出されていない。従って、真菌宿主などの宿主細胞中への細菌経路の導入は、ほ乳動物経路を導入することより少ない遺伝子の取り扱いを要する。
【０２９９】
イー・コリＮｅｕＣ遺伝子によってコードされるイー・コリＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼは、ポリシアル酸の細菌合成に関与する最初の酵素である（Ｒｉｎｇｅｎｂｅｒｇ，２００１）。この酵素をコードするＮｅｕＣ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＮ：Ｍ８４０２６．１；配列番号５７）は、病原性イー・コリＫ１株から単離され、３９１アミノ酸のタンパク質（配列番号５８）をコードする（図１５）（Ｚａｐａｔａ，１９９２）。コードされるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼは、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃのＭａｎＮＡｃへの転化を触媒する。ストレプトコッカス・アガラクティアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、シネココッカス種ＷＨ８１０２（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＷＨ  ８１０２）、クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）、ビブリオ・バルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｕｅｍｏｐｈｉｌａ）及びカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）などの幾つかの病原性細菌中に、この酵素の相同体が同定されている。一実施形態において、機能的なイー・コリＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ酵素（ＮｅｕＣ）（その相同体、バリアント及び誘導体を含む。）をコードする遺伝子がクローニングされ、宿主細胞（例えば、真菌宿主細胞などの非ヒト宿主細胞）中で発現される。宿主中でのＮｅｕＣ合成酵素の発現は、機能的アッセイを用いて検出することができる。一実施形態において、ＮｅｕＣの機能的発現は、ＭａｎＮＡｃの形成をモニタリングすることによって検出することができる。
【０３００】
細菌性経路中の第二の酵素は、ＭａｎＮＡｃをＳｉａへ直接転化するシアラート合成酵素であり、ほ乳動物経路中に存在する幾つかの酵素及び中間体を短絡する。３４６アミノ酸の本酵素（配列番号６０）は、イー・コリＮｅｕＢ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＮ：Ｕ０５２４８．１；配列番号５９）によってコードされる（図１６）（Ａｎｎｕｎｚｉａｔｏ，１９９５）。別の実施形態において、機能的なイー・コリのシアラート合成酵素（ＮｅｕＢ）（その相同体、バリアント及び誘導体を含む。）をコードする遺伝子がクローニングされ、宿主細胞（例えば、真菌宿主細胞などの非ヒト宿主細胞）中で発現される。宿主中でのＮｅｕＢの発現は、機能的アッセイを用いて検出することができる。一実施形態において、ＮｅｕＢの機能的発現は、Ｓｉａの形成をモニタリングすることによって検出することができる。
【０３０１】
この細菌の経路中の第三の酵素は、４１９アミノ酸（配列番号６２）からなり、イー・コリＮｅｕＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受付番号：Ｊ０５０２３；配列番号６１）によってコードされるＣＭＰ−Ｓｉａ合成酵素である（図１７）。ＣＭＰ−Ｓｉａ合成酵素は、ＳｉａをＣＭＰ−Ｓｉａへ転化する（Ｚａｐａｔａ，１９８９）。ＮｅｕＡ遺伝子は、ＮｅｕＣ及びＮｅｕＢ遺伝子と同じ生物中に見出される。従って、さらに別の実施形態において、機能的なイー・コリのＣＭＰ−Ｓｉａ合成酵素（その相同体、バリアント及び誘導体を含む。）をコードする遺伝子（ＮｅｕＡ）がクローニングされ、宿主細胞（例えば、真菌宿主細胞などの非ヒト宿主細胞）中で発現される。一実施形態において、ＮｅｕＡの発現は、ＣＭＰ−Ｓｉａの形成をモニタリングすることによって検出することができる。
【０３０２】
さらに別の実施形態において、機能的な細菌のＣＭＰ−Ｓｉａ合成酵素をコードする遺伝子（例えば、ＮｅｕＡ）は、細菌のＣＭＰ−Ｓｉａ合成酵素の活性を有する触媒ドメインと及び宿主細胞の核へ酵素を標的誘導するために選択された細胞標的誘導シグナルペプチド（本来、前記触媒ドメインに付随しない。）とを含む融合タンパク質をコードする。一実施形態において、前記細胞標的誘導シグナルペプチドは、ＳＶ４０キャプシドポリペプチドＶＰＩのドメインを含む。別の実施形態において、このシグナルペプチドは、核への酵素の正しい局在化を確保するほ乳動物ＣＭＰ−Ｓｉａ合成酵素由来の１つ又はそれ以上の内在性シグナル伝達モチーフを含む。前記融合タンパク質を作製する方法は、本分野において周知である。
【０３０３】
イー・コリのＮｅｕＡ、ＮｅｕＢ及びＮｅｕＣ遺伝子のＰＣＲ増幅後に、プロモーターの調節下で、選択可能な酵母組み込みベクター中に、増幅された断片を連結した（実施例１６）。宿主株（例えば、Ｐ．パストリス）を形質転換した後（各ベクターはＮｅｕ遺伝子断片を担持する。）、ベクターの存在に関する正の選択を適用し、続いて、Ｎｅｕ遺伝子酵素活性に関して形質転換体をスクリーニングすることによって、コロニーをスクリーニングした。内在性シアル酸付加を欠く非ヒト宿主細胞が新規ＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路の作製に関与する細菌の酵素を発現する能力は、本発明によって初めて与えられる。
【０３０４】
宿主細胞中のハイブリッドほ乳動物／細菌のＣＭＰ−シアル酸生合成経路を工作する
ほ乳動物及び細菌のＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路は何れも、ＣＭＰ−Ｓｉａ合成酵素にＣＴＰ及びシアル酸の両者が利用可能であることを要する。対応する細菌酵素と酵素的機能が類似しているにも関わらず、ほ乳動物のＣＭＰ−Ｓｉａ合成酵素は、核への正しい局在化を確保する１つ又はそれ以上の内在性シグナル伝達モチーフを含み得る。真核生物はＣＴＰの核局在化されたプールを有し、原核生物のＣＭＰ−Ｓｉａ合成酵素はこの区画に局在化し得ないので、ほ乳動物の酵素と細菌の酵素を両方組み合わせたハイブリッドＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路は、真菌宿主細胞など、内在性シアル酸付加を欠く非ヒト宿主細胞中でのシアル酸及びその中間体を作製するための好ましい方法である。この目的のために、ＮｅｕＣ及びＮｅｕＢ並びにほ乳動物のＣＭＰ−Ｓｉａ合成酵素を組み込んだ経路を宿主細胞中に工作することができる。ＣＭＰ−Ｓｉａ合成酵素は、これまでにクローニングされ、性質決定された幾つかのほ乳動物の相同体から選択され得る（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＮ：ＡＪ００６２１５；配列番号６３）（Ｍｕｎｓｔｅｒ，１９９８）（例えば、マウスＣＭＰ−Ｓｉａ合成酵素を参照）（図１８）。１つの好ましい実施形態において、宿主細胞は、マウスＣＭＰ−Ｓｉａ合成酵素とともに、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ（イー・コリＮｅｕＣ）及びシアラート合成酵素（イー・コリＮｅｕＢ）で形質転換される。このハイブリッドＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路を有するように工作された宿主は、供与体分子ＣＭＰ−Ｓｉａの細胞プールを産生する（図２５）。より好ましい実施形態において、供与体分子ＣＭＰ−Ｓｉａの増強された産生のために、宿主中で発現された酵素の組み合わせが選択される。
【０３０５】
宿主細胞中のＣＭＰ−シアル酸経路中間体の産生を増強させるための別の経路に関与する酵素を工作する
本発明のさらに別の態様において、ＣＭＰ−シアル酸生合成の別の経路に関与する酵素は、真菌宿主細胞などの、内在性シアル酸付加を欠く非ヒト宿主細胞中に、又は内在性シアル酸付加が変化され得る（例えば、増強される。）宿主細胞中に工作される。例えば、上に概説されている方法の１つの間に中間体が限られた状態になる場合には、その中間体を産生するための別の機序を使用する酵素を導入することが、ＣＭＰ−シアル酸又は本経路中のあらゆる中間体の産生における十分な代替物としての役割を果たす。中間体ＭａｎＮＡｃ及びＳｉａの産生に関して、実施形態が本明細書に記載されているが、本アプローチは、他の中間体を産生するために拡張され得る。さらに、これらの酵素の何れもが、先述されている酵素（すなわち、同じ中間体を産生する酵素）の不存在下で、又は先述されている酵素の存在下で（すなわち、総合的な産生を増強するために）、ほ乳動物、細菌又はハイブリッド経路中に取り込まれ得る。
【０３０６】
上記実施形態において、ＭａｎＮＡｃは、ほ乳動物酵素ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ−２−エピメラーゼ／ＭａｎＮＡｃキナーゼによって、又は細菌の酵素ＮｅｕＣによって、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃから産生される。この反応のための基質であるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃは、内在性Ｎ−グリカンなどの分子の幾つかのクラスを産生する上で必要とされるために、ＣＭＰ−Ｓｉａの合成に関して、十分な量で細胞中に存在すると予想される。しかしながら、ＭａｎＮＡｃが制限された状態になった場合には（シアル酸生合成経路からのＭａｎＮＡｃに対する需要の増加が原因となり得る。）、基質ＧｌｃＮＡｃと反応して、ＭａｎＮＡｃを産生するＧｌｃＮＡｃエピメラーゼを導入することによって、ＭａｎＮＡｃの細胞性供給を増加させ得る。
【０３０７】
従って、一実施形態において、機能的ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ酵素（その相同体、バリアント及び誘導体を含む。）をコードする遺伝子がクローニングされ、宿主細胞中で発現される。ＧｌｃＮＡｃをＭａｎＮＡｃへ直接転化するためにＧｌｃＮＡｃエピメラーゼを使用することは、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの合成を含む二段階プロセスと比べて、より効率的な、より短いアプローチである（図１９）。ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼは、容易に入手可能であり、現在まで、唯一の確認された、クローニングされたＧｌｃＮＡｃエピメラーゼはブタの腎臓に由来する（Ｍａｒｕ，１９９６）（実施例１６）。ブタ腎臓から単離された遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＮ：Ｄ８３７６６；配列番号６５）は、４０２アミノ酸のタンパク質をコードする（配列番号６４）（図２０）。この酵素がクローニングされると、この酵素は、以前にクローニングされたブタレニン結合タンパク質と同一であることが明らかとなった（Ｉｎｏｕｅ，１９９０）。これは確認されたＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ活性を有する唯一のタンパク質であるが、幾つかの他のレニン結合タンパク質が、とりわけ、ヒト、マウス、ラット及び細菌を含む他の生物から単離されている。すべて、著しい相同性を有することが示されている。例えば、ヒトＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ相同体（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＮ：Ｄ１０２３２．１）は、ブタＧｌｃＮＡｃエピメラーゼタンパク質と８７％の同一性及び９２％の類似性を有している。これらの相同体の配列は極めて似通っているが、これまでのところ、ブタタンパク質は、明らかなエピメラーゼ活性を有する唯一のものである。本発明の方法は、機能的なＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ活性をコードする何れの遺伝子を用いても実施することができる。ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ活性の存在に基づいて、真菌宿主細胞などの非ヒト宿主細胞中での本遺伝子のクローニング及び発現は、ＭａｎＮＡｃの細胞レベルを増強させ、これにより、ＣＭＰシアル酸生合成経路中でＭａｎＮＡｃを使用する酵素に対して十分な基質を提供するものと予測される。
【０３０８】
別の実施形態において、シアラートアルドラーゼは、図２１に示されているように、シアル酸の細胞レベルを増加させるために使用される。本酵素（シアラートリアーゼ及びシアラートピルビン酸リアーゼの別称でも知られる。）は、ＭａｎＮＡｃのシアル酸への可逆的反応を直接触媒する。Ｓｉａの低濃度の存在下において、本酵素は、ＭａｎＮＡｃとピルビン酸の縮合を触媒して、Ｓｉａを産生する。逆に、Ｓｉａ濃度が高い場合には、酵素は逆の反応を進行させて、ＭａｎＮＡｃとピルビン酸を産生する（Ｖｉｍｒ，１９８５）。上の実施形態において、ＣＭＰ−Ｓｉａ合成酵素の存在は、実質的にすべてのＳｉａをＣＭＰ−Ｓｉａへと転化し、これにより、アルドラーゼ反応の平衡をＭａｎＮＡｃとピルビン酸の縮合の方向にシフトさせて、Ｓｉａを産生する。好ましくは、本実施形態において使用されるシアラートアルドラーゼは、イー・コリＮａｎＡ遺伝子から発現されるが、本発明は、本酵素源に限定されるものではない。本酵素に対する遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＮ：Ｘ０３３４５；配列番号６７）は、２９７アミノ酸のタンパク質をコードする（配列番号６８）（図２２）（Ｏｈｔａ，１９８５）。本酵素に近い相同体が、とりわけ、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、スタフィロコッカス・オーレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、クロストリジウム・ペルフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、ヘモフィラス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）などの多くの病原性細菌中に見出されている。さらに、マウス及びヒトを含むほ乳動物中にも、相同体が存在する。一実施形態において、シアラートアルドラーゼ活性をコードする遺伝子をクローニングし、この遺伝子を真菌宿主細胞中で発現させることによって、Ｓｉａの細胞レベルが増大し、これにより、ＣＭＰ−シアル酸生合成経路中でＳｉａを使用する酵素に対して十分な基質が提供される（実施例１６）。
【０３０９】
ＣＭＰ−シアル酸合成の制御：フィードバック阻害及び誘導性プロモーター
ほ乳動物細胞では、ＣＭＰ−シアル酸の産生は、高度に制御されている。ＣＭＰ−シアル酸は、フィードバック阻害剤として作用し、ＣＭＰ−Ｓｉａのさらなる産生を防ぐために、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ／ＭａｎＮＡｃキナーゼに対して作用する（Ｈｉｎｄｅｒｌｉｃｈ，１９９７；Ｋｅｐｐｌｅｒ，１９９９）。これに対して、細菌のＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路（図１４Ｂ）は、ＣＭＰ−Ｓｉａの産生を制限するフィードバック阻害的調節機序を有するようには見受けられない（Ｒｉｎｇｅｎｂｅｒｇ，２００１）。しかしながら、上記されている経路の１つにイー・コリのシアラートアルドラーゼを取り込むことによって、平衡のバランスに応じて、イー・コリのシアラートアルドラーゼが触媒する反応の方向へシフトを引き起こすことが可能となり、これにより、Ｓｉａの加水分解を引き起こして、ＭａｎＮＡｃの方に戻し得る。従って、上に概説されているシアル酸アルドラーゼを伴う方法は、ＳｉａをＣＭＰ−Ｓｉａへ素早く転化させるＣＭＰ−シアラート合成酵素が存在すれば、この逆反応が起こることを防ぐ。
【０３１０】
ここまでに記載されている実施形態は、ＣＭＰ−Ｓｉａの特定の生合成経路中での本酵素の恒常的な過剰発現について詳述している。掲記されている中間体及び／又は最終産物の何れかの存在が、真菌宿主などの非ヒト宿主に対して有害であり得ることを示唆する文献は、現在のところ入手できないが、本発明の好ましい実施形態は、制御可能な（例えば、誘導性）プロモーターの調節下にある前記酵素の１つ又はそれ以上を有する。本実施形態では、目的のタンパク質（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ２−エピメラーゼ／ＭａｎＮＡｃキナーゼ、ＮｅｕＣ、及びＧｌｃＮＡｃエピメラーゼを含むが、これらに限定されない。）をコードする遺伝子（又は翻訳領域）が、当該酵素の調節された発現を促進し、これにより、ＣＭＰ−Ｓｉａの産生を制御するために、誘導性プロモーター又は制御可能なプロモーター（アルコールオキシダーゼプロモーター（ＡＯＸ１又はＡＯＸ２；Ｔｓｃｈｏｐｐ，１９８７）、ガラクトース誘導性プロモーター（ＧＡＬ１０；Ｙｏｃｕｍ，１９８４）、テトラサイクリン誘導性プロモーター（ＴＥＴ；Ｂｅｌｌｉ，１９９８））の下流にクローニングされている。
【０３１１】
ＣＭＰ−シアル酸の合成における、ＣＭＰ−シアル酸及び中間体化合物の検出
本発明の方法は、内在性ＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路を欠く非ヒト宿主細胞中において、ＣＭＰ−Ｓｉａの細胞プールを産生するために、及び／又は内在性経路を有する宿主細胞中でのＣＭＰ−Ｓｉａの産生を増強するために工作された経路を提供する。本経路中における各中間体の産生を評価するために、これらの中間体は検出可能でなければならない。従って、本発明は、このような中間体を検出するための方法も提供する。ＣＭＰ−Ｓｉａの細胞プールを検出するための方法は、例えば、実施例１６に掲載されている。現在、文献は、細胞のＣＭＰ−Ｓｉａ及びその前駆体を測定するための数個の方法を記載しているに過ぎない。初期の方法では、ペーパークロマトグラフィー及びチオバルビツール酸分析を使用し、複雑で、時間がかかることが明らかとなった（Ｂｒｉｌｅｓ，１９７７；Ｈａｒｍｓ，１９７３）。ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィー）も使用されてきたが、初期の方法では、ＣＭＰ−Ｓｉａの急速な加水分解をもたらす酸溶出を使用した（Ｒｕｍｐ，１９８６）。ごく最近では、アンペロメトリック電気化学検出法（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）と組み合わせて、アルカリ溶出プロトコールを使用する、高性能陰イオン交換クロマトグラフィーを使用するより強固な方法が記載された（Ｆｒｉｔｓｃｈ，１９９６）。ＣＭＰ−Ｓｉａを検出することに加え、本方法は、前駆体のシアル酸を検出することも可能であり、従って、これらの化合物の一方又は両方の細胞性合成を確認するのに有用である。
【０３１２】
シアル転移酵素を用いて、シアル酸をＮ−グリカンにインビボで転移するための方法
本発明は、組み換え非ヒト真核宿主細胞中でシアル酸付加された糖タンパク質を産生するための方法を提供する。一実施形態において、前期非ヒト真核宿主細胞は、本来、シアル転移酵素活性を示さない。
【０３１３】
一実施形態において、前記方法は、シアル転移酵素をコードする核酸を宿主中に導入することを含む。シアル転移酵素活性を有する酵素は、あらゆるα−２，３ＳＴ、あらゆるα−２，６ＳＴ、ヒトＳＴ６Ｇａｌ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＮ：ＮＭ ００３０２）若しくはその相同体、ヒトＳＴ３Ｇａｌ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＮ：Ｌ２３７６７）若しくはその相同体、又はＸｅｎｏｐｕｓＳＴ３Ｇａｌ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＮ：ＣＡＦ２２０５８）若しくはその相同体などの（但し、これらに限定されない。）シアル転移酵素活性を有する何れの酵素でもあり得る。
【０３１４】
本明細書において使用される、ヒトＳＴ６Ｇａｌの相同体は、ヒトＳＴ６Ｇａｌ（ＮＭ ００３０３２）と顕著なアラインメントを有する核酸を表す。ヒトＳＴ６Ｇａｌの相同体には、以下のＧｅｎＢａｎｋ受付番号によって同定される酵素が含まれる。ＡＡＨ４０００９．１、ＣＡＦ２９４９２．１、ＣＡＩ２９５８４．１、ＣＡＡ３８２４６．１．ＣＡＡ７５３８５．１、ＡＡＨ９２２２２．１、Ｐ１３７２１、Ｑ６４６８５、ＮＰ ９９０５７２．１、ＸＰ ５３５８３９．１、ＸＰ ５１７００５．１、ＮＰ ７７５３２４．１、ＸＰ ５１６９３８．１、ＮＰ ００１００３８５３．１、ＣＡＩ３９６４３．１、ＣＡＩ２９１８３．１、ＣＡＧ３２８３６．１、ＸＰ ５４５２４３．１、ＣＡＦ２９４９６．１、ＸＰ ４１６９２７．１、ＣＡＰ２９４９７．１、ＡＡＢ２２８５８．１、ＮＰ ６７１７３８．１、ＣＡＩ２９１８４．１、ＡＡＢ２２８５９．１、ＢＡＣ２４７９３．１、ＢＡＢ４７５０６．１、ＣＡＦ２９４９３．１、ＸＰ ５１５７０５．１、ＸＰ ６１４３９２．１、ＣＡＦ２９４９５．１、ＸＰ ２３６８２６．２、ＢＡＣ８７７５２．１、ＣＡＩ２９１８５．１、ＣＡＦ９７３３６．１、ＣＡＩ３９６４４．１、ＣＡＤ５４４０８．１、ＣＡＧ０５８０８．１、ＸＰ ５３８４３６．１、ＢＡＣ９８２７２．１、ＸＰ ６０４４４８．１、ＡＡＤ３３０５９．１、ＢＡＣ２８８２８．１、ＢＡＢ００６３６．１、ＡＡＨ０８６８０．１、ＮＰ ７６６４１７．１、ＥＡＡ０４０３８．２、ＣＡＨ２５３９０．１、ＮＰ ７２６４７４．１及びＮＰ ５２３８５３．１。
【０３１５】
本明細書において使用される、ヒトＳＴ３Ｇａｌの相同体は、ヒトＳＴ３Ｇａｌ（Ｌ２３７６７）と顕著なアラインメントを有する核酸を表す。ヒトＳＴ３Ｇａｌの相同体には、以下のＧｅｎＢａｎｋ受付番号によって同定される酵素が含まれる。ＡＡＡ１６４６０．１、ＡＡＭ８１３７８．１、ＡＡＨ１０６４５．１、ＣＡＨ９０３１６．１、ＡＡＭ６６４３３．１、ＣＡＦ２５１８２．１、ＡＡＫ９３７９０．１、ＡＡＭ６６４３１．１、ＣＡＡ５２６６２．１、ＡＡＭ６６４３２．１、ＡＡＦ２８８７１．１、ＮＰ ９７６０８２．１、ＡＡＨ１１１２１．１、ＮＰ ０３３２０４．２、ＡＡＰ２２９４２．１、ＣＡＡ６５０７６．１、ＮＰ ９９８９２２．１、ＮＰ ９９１３７５．１、ＣＡＢ５３３９５．１、ＸＰ ５２２２４５．１、ＡＡＣ１４１６２．１、ＣＡＩ２９１８２．１、ＸＰ ４１７８６０．１、ＡＡＣ１４１６３．１、ＢＡＢ２５７３２．１、ＢＡＢ１３９４０．１、ＣＡＦ２２０５８．１、ＮＰ ００１００３８５４．１、ＣＡＧ００９５３．１、ＣＡＩ２６２８９．１、ＸＰ ５４６４０８．１、ＹＰ ２２７５２５．１、ＡＡＨ８４８４０．１、ＣＡＦ２５０５４．１、ＮＰ ９８９８１０．１、ＣＡＦ２５５０３．１、Ｑ６ＫＢ５４、ＮＰ ００１００２８８３．１、ＡＡＨ２３３１２．１、ＣＡＨ８９９２２．１、ＣＡＦ２５１７８．１、ＡＡＨ５３１７９．１、ＡＡＯ１３８７０．１、ＡＡＯ１３８６９．１、ＡＡＯ１３８６７．１、ＡＡＯ１３８６６．１、ＡＡＯ１３８６１．１、ＡＡＯ１３８５９．１、ＮＰ ７７７６３１．１及びＮＰ ７７７６２８．１。
【０３１６】
本明細書において使用される、ゼノパス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）ＳＴ３Ｇａｌの相同体は、ゼノパスＳＴ３Ｇａｌ（ＣＡＦ２２０５８）と顕著なアラインメントを有する核酸を表す。ゼノパスＳＴ３Ｇａｌの相同体には、以下のＧｅｎＢａｎｋ受付番号によって同定される酵素が含まれる。ＣＡＦ２２０５８．１、ＣＡＩ２９１８２．１、ＸＰ ４１７８６０．１、ＡＡＨ１０６４５．１、ＡＡＡ１６４６０．１、ＡＡＦ２８８７１．１、ＣＡＨ９０３１６．１、ＣＡＡ５２６６２．１、ＡＡＭ６６４３３．１、ＡＡＭ６６４３２．１、ＡＡＨ１１１２１．１、ＮＰ ９７６０８２．１、ＡＡＰ２２９４２．１、ＮＰ ０３３２０４．２、ＮＰ ９９８９２２．１、ＣＡＦ２５１８２．１、ＮＰ ９９１３７５．１、ＡＡＫ９３７９０．１、ＡＡＭ８１３７８．１、ＣＡＡ６５０７６．１、ＡＡＭ６６４３１．１、ＣＡＢ５３３９５．１、ＡＡＣ１４１６２．１、ＸＰ ５２２２４５．１、ＢＡＢ２５７３２．１、ＮＰ ００１００３８５４．１、ＡＡＣ１４１６３．１、ＣＡＩ２６２８９．１、ＣＡＧ００９５３．１、ＹＰ ２２７５２５．１、ＢＡＢ１３９４０．１、ＡＡＨ８４８４０．１、ＣＡＥ５１３８８．１、ＣＡＦ２５１８１．１、Ｑ６ＫＢ５４、ＮＰ ００１００２８８２．１、ＡＡＨ２３３１２．１、ＮＰ ９９８９２４．１、ＣＡＨ８９９２２．１、ＡＡＦ１８０１９．１、ＮＰ ００１００２８８３．１、ＡＡＯ１３８７０．１、ＡＡＯ１３８６９．１、ＡＡＯ１３８６７．１、ＡＡＯ１３８６６．１、ＡＡＯ１３８６１．１、ＡＡＯ１３８５９．１、ＮＰ ７７７６３１．１、ＮＰ ７７７６２８．１及びＮＰ ７７７６２３．１。
【０３１７】
一実施形態において、シアル転移酵素活性を有する前記酵素は、本明細書に記載されている本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブアリーアプローチを用いて得られる。一実施形態において、シアル転移酵素活性を有する前記酵素は融合タンパク質である。好ましい実施形態において、前記融合タンパク質は、シアル転移酵素触媒ドメインと及びシアル転移酵素活性を宿主細胞のゴルジ装置に標的誘導するための細胞性標的誘導シグナルペプチドとを含む。一実施形態において、前記細胞性標的誘導シグナルペプチドは、Ｍｎｎ２（リーダー５３）遺伝子に由来する。より好ましくは、前記細胞性標的誘導シグナルペプチドは、Ｇｅｎｂａｎｋ受付番号ＮＰ ００９５７１から得られるＭｎｎ２（リーダー５３）の最初の１０８塩基によってコードされる。
【０３１８】
宿主細胞は、増強され得るＣＭＰ−シアル酸の細胞プールを含み得る。別の実施形態において、前記宿主細胞は、ＣＭＰ−シアル酸の内在性細胞プールを欠如し、ＣＭＰ−シアル酸を発現するように修飾され得る。別の実施形態において、前記宿主細胞は、ＣＭＰ−Ｓｉａ経路に関与する１つ又はそれ以上の酵素活性を発現するように修飾されている。（実施例１６参照）。
【０３１９】
別の実施形態において、前記宿主細胞は、グリコシル転移酵素、マンノシダーゼなどのグリコシダーゼ、糖トランスポーターなどからなる群から選択される１つ又はそれ以上のグリコシル化酵素を発現するようにさらに修飾され得る。さらに別の実施形態において、末端のガラクトースを含む糖タンパク質を産生するように修飾され得る。別の実施形態において、前記宿主細胞は、Ｇａｌ（１ ４）ＧｌｃＮＡｃ（１ ４）Ｍａｎ（３ ５）ＧｌｃＮＡｃ２を含む糖タンパク質を産生するように修飾され得る。好ましい実施形態において、前記宿主は、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を含む複合糖タンパク質又はＧａｌ１ＧｌｃＮＡｃ１Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を含むハイブリッド糖タンパク質を産生するように修飾された。
【０３２０】
他の実施形態において、本発明は、組み換え非ヒト真核宿主細胞中でシアル酸付加された糖タンパク質を作製する方法を提供し、この方法はシアル転移酵素活性を有する酵素をコードする核酸を宿主細胞中に導入することを含み、及びＣＭＰ−シアル酸の生合成又は輸送に関与する１つ又はそれ以上の酵素をコードする１つ又はそれ以上のさらなる核酸を宿主細胞中に導入することをさらに含む。
【０３２１】
他の実施形態において、本明細書に記載されている方法において使用されるべき宿主細胞は、マンノシル転移酵素及びホスホマンノシル転移酵素からなる群から選択される１つ又はそれ以上の酵素の活性を欠く。他の実施形態において、本明細書に記載されている方法において使用されるべき宿主細胞は、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）のＯＣＨ１変異体である。
【０３２２】
別の実施形態において、本明細書に記載されている方法において使用されるべき宿主細胞は、あらゆるピキア種（ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピキア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピキア・コクラマエ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピキア・メンブラナエファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピキア・オプンティアエ（Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピキア・サーモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピキア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピキア・グエルキューム（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピキア・ピジュペリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピキア・スティプティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ）及びピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）を含むが、これらに限定されない。）、あらゆるサッカロミセス種（サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）を含むが、これらに限定されない。）、あらゆるクルイベロマイセス種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）（クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）を含むが、これに限定されない。）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、あらゆるアスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）（アスペルギルス・ニドウランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、  アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）及びアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）を含むが、これらに限定されない。）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｓｅｅｉ）、クリソスポリウム・ルクノエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｈｎｏｗｅｎｓｅ）、あらゆるフザリウム種（フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）及びフザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）を含むが、これらに限定されない。）及びノイロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）からなる群から選択される。
【０３２３】
本発明は、細胞性標的誘導シグナルへ機能的に連結されたシアル転移酵素触媒ドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸も提供する。本発明は、前記核酸配列を含む宿主細胞も提供する。さらに、本発明は、前記核酸を含み、さらにＣＭＰ−シアル酸を発現する非ヒト真核宿主細胞を提供する。
【０３２４】
本発明は、細胞性標的誘導シグナルへ機能的に連結されたシアル転移酵素触媒ドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸も提供する。本発明は、前記核酸配列を含む宿主細胞も提供する。さらに、本発明は、前記核酸を含み、さらにＣＭＰ−シアル酸を発現する非ヒト真核宿主細胞を提供する。
【０３２５】
本発明は、ＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を含む複合糖タンパク質又はＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を含むハイブリッド糖タンパク質を作製するために遺伝的に操作された非ヒト宿主細胞を提供する。
【０３２６】
本発明は、本明細書に記載されている方法の何れか１つによって作製された組み換え糖タンパク質も提供する。
【０３２７】
実施例１７は、シアル酸が付加された糖タンパク質がインビボで産生される特許請求の範囲に記載されている発明の方法を例示する。
【０３２８】
トランスシアリダーゼを用いて、シアル酸をＮ−グリカンにインビボで転移するための方法
ＣＭＰ−Ｓｉａ経路を欠く非ヒト宿主細胞中でシアル酸付加されたタンパク質を取得するための別の方法は、受容可能な基質糖タンパク質上にシアル酸を転移するためにトランスシアリダーゼを使用することである。トリパノソーマ・クルージなどの原虫は、α２，３−結合している宿主糖タンパク質からシアル酸をＣＭＰ非依存性の様式で、細胞表面糖タンパク質及び糖脂質に転移する細胞表面トランスシアリダーゼを有する（例えば、Ｐａｒｏｄｉ，１９９３，Ｓｃｈｅｎｋｍａｎ，１９９４参照）。トランスシアリダーゼをコードする遺伝子は、触媒活性を有するアミノ末端領域と形質膜固着ドメインを有するＣ末端領域を含有する（Ｐｅｒｅｉｒａ，１９９１）。シアル酸供与体の存在下において、バキュロウイルス−昆虫細胞系内で発現されたトリパノソーマ・クルージのトランスシアリダーゼは、外来性のガラクトシル化されたアクセプターのシアル酸付加をもたらす（Ｍａｒｃｈａｌ，Ｉ．２００１）。研究のためにトランスシアリダーゼの大量を取得するための手段として、トリパノソーマ・クルージのトランスシアリダーゼは、Ｐ．パストリス中でも発現されている（Ｌａｒｏｙ，Ｗ．２０００）。従って、トランスシアリダーゼは、望ましいＮ−グリカン構造を有する組み換えタンパク質を作製するために、付着されたオリゴ糖を有する末端ガラクトースで糖タンパク質にシアル酸付加するための手段として、本発明において工作された宿主細胞（例えば、Ｐ．パストリスなどの真菌宿主）中で使用することができる。トリパノソーマ・クルージ中に見出されるもの以外のトランスシアリダーゼを使用し得る。本発明において使用するのに適したトランスシアリダーゼは、例えば、Ｃｏｌｌｉ，１９９３に記載されている。これらの参考文献の開示は、参照により本明細書中に組み込まれる。
【０３２９】
従って、本発明は、トランスシアリダーゼ活性を有する酵素をコードする核酸を宿主中に導入する工程を含む、組み換え真核宿主細胞中のシアル酸付加された糖タンパク質を作製するための方法を提供する。トランスシアリダーゼ活性を有する酵素は、トリパノソーマ・クルージのトランスシアリダーゼ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受付番号ＡＪ２７６６７９，ＡＪ００２１７４）、Ｔ．ランゲル（Ｔ．ｒａｎｇｅｌｉ）トランスシアリダーゼ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受付番号Ｌ１４９４３）；Ｔ．ブルセイ（Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ）トランスシアリダーゼ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受付番号ＸＭ ３４０６２６）及びＴ．カラサッシイ（Ｔ．ｃａｒａｓａｓｉｉ）トランスシアリダーゼ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受付番号ＡＹ２４９１４２，ＡＹｌ４１１１）又はこれらの相同体及びバリアントを含む（但し、これらに限定されない。）、トランスシアリダーゼ活性を有するあらゆる酵素であり得る。一実施形態において、前記方法は、宿主細胞を増殖させるための培地にシアル酸供与体を補充することをさらに含む。
【０３３０】
一実施形態において、トランスシアリダーゼ活性を有する前記酵素は融合タンパク質である。好ましい実施形態において、トランスシアリダーゼ活性を有する前記酵素は、細胞性標的誘導シグナルペプチドへ機能的に連結されたトランスシアリダーゼ触媒ドメインを含む融合タンパク質である。一実施形態において、前記細胞性標的誘導シグナルペプチドは、トランスシアリダーゼ活性を宿主細胞の細胞壁に標的誘導することができる。
【０３３１】
別の実施形態において、前記宿主細胞は、末端のガラクトースを含む糖タンパク質を産生するように工作又は選択される。別の実施形態において、前記宿主細胞は、構造Ｇａｌ（１ ４）ＧｌｃＮＡｃ（１ ４）Ｍａｎ（２ ５）ＧｌｃＮＡｃ２を含む糖タンパク質を産生するように修飾されている。好ましい実施形態において、前記宿主細胞は、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を含む複合糖タンパク質又はＧａｌ１ＧｌｃＮＡｃ１Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を含むハイブリッド糖タンパク質を産生する。
【０３３２】
本発明は、組み換え真核宿主細胞中でシアル酸付加された糖タンパク質を作製する方法を提供し、この方法は、トランスシアリダーゼ活性を有する酵素をコードする核酸を宿主中に導入することを含み、並びにグリコシル転移酵素、マンノシダーゼなどのグリコシダーゼ、糖トランスポーター及びＣＭＰ−シアル酸の生合成又は輸送に関与する酵素から選択される１つ又はそれ以上の酵素をコードする１つ又はそれ以上のさらなる核酸を宿主細胞中に導入することをさらに含む。
【０３３３】
一実施形態において、前記宿主細胞は、シアル酸供与体をさらに含む。一実施形態において、シアル酸供与体は、宿主細胞を増殖させるために使用される培地に添加される。別の実施形態において、ＣＭＰ−シアル酸に対する１つ又はそれ以上の前駆体が培地に添加され得るこのようなＣＭＰ−Ｓｉａ前駆体には、グルコサミン［ＧｌｃＮ］、ＧｌｃＮＡｃ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ及びＭａｎＮＡｃが含まれる。先述されているように、他の実施形態において、前記宿主細胞は、グルコサミン又はＭａｎＮＡｃ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸又はＵＤＰ−ガラクトースなどの１つ又はそれ以上の糖前駆体を含むように改変されている。
【０３３４】
本発明は、トランスシアリダーゼ活性を有する酵素及びシアル酸供与体を、宿主細胞を増殖させるために使用される培地中に導入することを含む、組み換え非ヒト真核宿主細胞中のシアル酸付加された糖タンパク質を作製するための方法も提供する。シアル酸供与体はＣＭＰ−Ｓｉａであり得、又はＣＭＰ−Ｓｉａ、グルコサミン、ＧｌｃＮＡｃ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ及びＭａｎＮＡｃなどの糖ヌクレオチド前駆体の添加によって増加され得る。さらに、宿主細胞は、グルコサミン又はＭａｎＮＡｃ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸又はＵＤＰ−ガラクトースなどの１つ又はそれ以上の糖前駆体を含むように改変され得る。
【０３３５】
一実施形態において、本明細書に記載されている方法において使用されるべき宿主細胞は、ピキア種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）（ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピキア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピキア・コクラマエ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピキア・メンブラナエファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピキア・オプンティアエ（Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピキア・サーモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピキア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピキア・グエルキューム（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピキア・ピジュペリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピキア・スティプティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ）及びピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）を含むが、これらに限定されない。）、あらゆるサッカロミセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）（サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を含むが、これに限定されない。）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、あらゆるクルイベロマイセス種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）（クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）を含むが、これに限定されない。）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、あらゆるアスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）（アスペルギルス・ニドウランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）及びアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）を含むが、これらに限定されない。）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｓｅｅｉ）、クリソスポリウム・ルクノエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｈｎｏｗｅｎｓｅ）、あらゆるフザリウム種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）（フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）及びフザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）を含むが、これらに限定されない。）及びノイロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）からなる群から選択される。
【０３３６】
一実施形態において、本明細書に記載されている方法において使用されるべき宿主細胞は、マンノシル転移酵素及びホスホマンオシル転移酵素からなる群から選択される１つ又はそれ以上の酵素の活性を欠く。一実施形態において、本明細書に記載されている方法において使用されるべき宿主細胞は、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）のＯＣＨ１変異体である。
【０３３７】
ＣＭＰ−Ｓｉａ経路が内在性である場合でさえ、又はＣＭＰ−Ｓｉａが宿主細胞中に工作されている場合でさえ、トランスシアリダーゼ活性を宿主細胞中に導入することも有用であり得る。トランスシアリダーゼ活性は、分泌経路内でシアル酸が付加されていない又は不完全なシアル酸付加を有する、組み換え的に産生された糖タンパク質上に、供与体タンパク質からシアル酸を転移させることによって、シアル酸で終結した分泌される糖タンパク質の収率を増加させることができる。
【０３３８】
トランスシアリダーゼ活性が単独で使用される場合であれ又は工作されたＣＭＰ−Ｓｉａ経路及びシアリル転移酵素活性と組み合わせて使用される場合であれ、トランスシアリダーゼは、（１）熱ショックタンパク質１５０（Ｍａｔｔｉｌａ，１９９６）のＣ末端ドメイン又は細胞壁に固着された別のタンパク質（Ｂｇｌ２、ＣＲＨ１及びＳＣＷ１９，（Ｗｅｉｇ，２００４））との融合によって、細胞壁中に存在するように工作され得、（２）培地中に供給され得、又は（３）タンパク質精製中のクロマトグラフィー工程において使用するために、カラムに固定化され得る。トランスシアリダーゼが、宿主を増殖させるための培地中に供給される場合には、タンパク質精製中の簡略化された除去のために、トランスシアリダーゼは、好ましくは、樹脂に結合される。トランスシアリダーゼがカラム中に固定化される場合には、組み換え的に産生された糖タンパク質上にシアル酸をインビトロで転移させるために、シアル酸供与体の存在下で、組み換え糖タンパク質を産生する宿主細胞の上清をカラムに通過させる。
【０３３９】
低級真核生物などの宿主細胞中に複雑なＮ−グリカンの形成を工作するためのすべての戦略は、特定のグリコシル転移酵素活性の除去及び付加の両方を含むので、包括的なスキームは、両要件を調和させることを試みる。望ましくない酵素をコードする遺伝子は、望ましい遺伝子に対する組み込み部位としての役割を果たす可能性を秘めている。例えば、１，６−マンノシル転移酵素活性は、多くの公知の下級真核生物中でのグリコシル化の特徴である。α−１，６マンノシル転移酵素をコードする遺伝子（ＯＣＨ１）がＳ．セレビシエからクローニングされ、本遺伝子中の変異は、減少したマンノシル化を有する生存可能な表現型を生じる。従って、α―１，６マンノシル転移酵素活性をコードする遺伝子座は、グリコシル転移酵素活性をコードする遺伝子を組み込むための主な標的である。同様にして、当該遺伝子座における遺伝子破壊現象に基づいて、（１）よりヒトに類似した様式で、細胞がグリコシル化する能力を改善する、（２）細胞がタンパク質を分泌する能力を改善する、（３）外来タンパク質のタンパク質分解を低下させる、及び（４）精製又は発酵プロセスそのものを促進するプロセスの他の特徴を改善することが予想される他の多様な染色体組み込み部位を選択することができる。
【０３４０】
宿主細胞
本発明は、Ｐ．パストリス宿主生物を使用することが典型であるが、ヒト様糖タンパク質を作製するために、植物、藻類、昆虫並びに酵母及び真菌宿主の他の種を含む他の真核宿主細胞を本明細書に記載されているとおり変化させ得ることが、当業者によって理解される。他の酵母及び真菌株などの他の真核宿主細胞中のこれら及び／又はその他の相同な遺伝子又は機能的に関連する遺伝子に対して、望ましくない宿主細胞グリコシル化遺伝子、例えば、ＯＣＨ１を同定及び破壊するための、本明細書に記載されている技術を適用できることが理解される。好ましくは、産業的発酵工程において、優れた成績を発揮することができる真菌宿主の頑強なタンパク質産生株が選択される。これらの株には、あらゆるピキア種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）（ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピキア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピキア・コクラマエ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピキア・メンブラナエファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピキア・オプンティアエ（Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピキア・サーモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピキア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピキア・グエルキューム（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピキア・ピジュペリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピキア・スティプティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ）及びピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）を含むが、これらに限定されない。）、あらゆるサッカロミセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）（サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を含むが、これに限定されない。）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、あらゆるクルイベロマイセス種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）（クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）を含むが、これに限定されない。）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、あらゆるアスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）（アスペルギルス・ニドウランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）及びアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）を含むが、これらに限定されない。）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｓｅｅｉ）、クリソスポリウム・ルクノエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｈｎｏｗｅｎｓｅ）、あらゆるフザリウム種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）（フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）及びフザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）を含むが、これらに限定されない。）及びノイロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０３４１】
従って、本発明の別の態様は、ヒト細胞によって作製されたＮ−グリカンに類似する修飾されたＮ−グリカンを含む糖タンパク質を発現する非ヒト真核生物宿主株に関する。従って、酵母及び真菌細胞以外の種において本発明の方法を実施することが想定され、本発明に包含される。何れかの真核宿主細胞系中のグリコシル化経路を修飾する構築物を選択するために、本発明のコンビナトリアル核酸ライブラリーを使用し得ることが想定される。例えば、本発明のコンビナトリアルライブラリーは、宿主細胞分泌経路中の所望の位置に、グリコシル化酵素又はその触媒ドメインを含むタンパク質が位置するようにするために、植物、藻類及び昆虫並びにほ乳動物及びヒト細胞を含む他の真核宿主細胞中でも使用され得る。好ましくは、グリコシル化酵素又は触媒ドメインなどは、宿主細胞分泌経路に沿った細胞内の位置に標的誘導され、そこで、グリコシル化酵素又は触媒ドメインなどは機能することができ、好ましくは、最も効率的に機能するように設計又は選択される。
【０３４２】
実施例１９及び２０に記載されているように、植物及び昆虫細胞は、本発明のコンビナトリアルライブラリー及び方法を用いて、発現されたタンパク質のグリコシル化を変化させるように工作され得る。さらに、ヒト細胞を含むほ乳動物の細胞中のグリコシル化は、本発明のコンビナトリアルライブラリー及び方法を用いても修飾され得る。例えば、本発明のコンビナトリアルライブラリー及び方法を用いて、特定の酵素活性を最適化し、又はほ乳動物宿主中で作製された様々なＮ−グリカンの相対的割合をその他修飾することが可能であり得る。
【０３４３】
本発明の本実施形態に係る方法を用いて実施され得るグリコシル化に対する修飾の例は、（１）Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２Ｎグリカンを得るために、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２由来のマンノース残基を整形するように、真核生物宿主細胞を工作すること、（２）ＧｌｃＮＡｃ転移酵素Ｉの作用によって、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基をＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に付加するように、真核生物宿主細胞を工作すること、（３）Ｎ−アセチルグルコサミニル転移酵素（ＧｎＴＩ、ＧｎＴＩＩ、ＧｎＴＩＩＩ、ＧｎＴＩＶ、ＧｎＴＶ、ＧｎＴＶＩ）、マンノシダーゼＩＩ、フコシル転移酵素（ＦＴ）、ガラクトシル転移酵素（ＧａｌＴ）又はシアリル転移酵素（ＳＴ）などの酵素を機能的に発現するように、真核生物宿主細胞を工作すること、（４）ＣＭＰ−Ｓｉａ経路を工作することである。
【０３４４】
本発明は、内在性ＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路を欠き（又は効率的な内在性ＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路を欠き）、機能的な組み換えＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路を発現する宿主細胞も提供する。好ましくは、宿主は、シアル酸付加反応において、シアリル転移酵素及びグリカン受容体（Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）の存在下で、供与体分子として使用され得るＣＭＰ−Ｓｉａの細胞プールを産生する。本発明の方法を用いて、ＣＭＰ−Ｓｉａを産生する様々な異なる宿主が作製され得る。
【０３４５】
本方法を反復することによって、より複雑さが増大したグリコシル化経路を、低級真核微生物などの標的宿主中に工作することができる。１つの好ましい実施形態において、宿主生物は、グリコシル化活性をコードする配列を含むＤＮＡライブラリーで、２回又はそれ以上形質転換される。形質転換の各回後にあるいは複数の形質転換が起こった後に、所望の表現型の選択を実施し得る。複雑なグリコシル化経路は、このようにして、迅速に工作することができる。
【０３４６】
標的糖タンパク質及び糖タンパク質組成物
本明細書に記載されている方法は、糖タンパク質、特に、ヒトにおいて治療的に使用される糖タンパク質及びこのような糖タンパク質を含む組成物を作製するために有用である。特定のグリコフォームを有する糖タンパク質は、例えば、治療用タンパク質の標的化において特に有用であり得る。本発明の糖タンパク質組成物は、主に、特定のグリコフォームを含む。例えば、マンノース−６−リン酸は、タンパク質をリソゾームに誘導することが示されており、これは、一例として、ゴーシェ病、ハンター病、ハーラー病、シャイエ病、ファブリー病及びテイ・サックス病などのリソゾーム蓄積症に関連する幾つかの酵素の適切な機能にとって不可欠であり得る。同様に、グリカン側鎖に１つ又はそれ以上のシアル酸残基を付加することは、投与後に、インビボでの治療用糖タンパク質の寿命を増加させ得る。従って、（例えば、低級真核生物又はほ乳動物の）宿主細胞は、細胞中で発現された糖タンパク質における末端シアル酸の度合いを増加させるように、遺伝学的に工作され得る。あるいは、シアル酸は、シアリル転移酵素及び適切な基質を用いて、投与前に、インビトロで、対象のタンパク質へ連結され得る。よりヒト形態に密接に類似する糖タンパク質を作製するために、ヒト様グリコシル化に関与する活性を発現させることに加えて、増殖培地の組成の変化を使用し得る（Ｗｅｉｋｅｒｔ，１９９９；Ｗｅｒｎｅｒ，１９９８；Ａｎｄｅｒｓｅｎ，１９９４；Ｙａｎｇ，２０００）。モノクローナル抗体に対する特異的なグリカン修飾（例えば、二分岐ＧｌｃＮＡｃの付加）は、抗体依存性細胞毒性を改善させることが示されており（Ｕｍａｎａ，１９９９）、これは、抗体又は他の治療用タンパク質の製造に関して望ましい場合があり得る。
【０３４７】
治療用タンパク質は、典型的には、注射、経口、経肺又は他の手段によって投与される。本発明に従って作製され得る適切な標的糖タンパク質の例には、エリスロポエチン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターフェロン−ω、ＴＮＦα及び顆粒球−ＣＳＦなどのサイトカイン、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子及びヒトプロテインＣ、アンチトロンビンＩＩＩ及びトロンボポエチン可溶性ＩｇＥ受容体α鎖などの凝固因子、ＩｇＧ、ＩｇＧ断片、ＩｇＭ、ＩＬ−１ｒａなどのインターロイキン、ウロキナーゼ、キマーゼ、尿素トリプシン阻害剤、ＩＧＦ結合タンパク質、上皮増殖因子、成長ホルモン放出因子、アネキシンＶ融合タンパク質、アンギオスタチン、血管内皮増殖因子−２、骨髄系前駆細胞阻害因子−１、破骨細胞形成抑制因子、α−１アンチトリプシン、ＤＮアーゼＩＩ、α−プロテイン、ＡＡＴ、ｒｈＴＢＰ−１（オネルセプト、別名ＴＮＦ結合タンパク質１）、ＴＡＣＩ−Ｉｇ（膜貫通活性化因子及びカルシウム調節物質及びシクロフィリンリガント相互作用物質）、ＦＳＨ（卵胞刺激ホルモン）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＬＰ−１ｗ／及びｗ／ｏＦＣ（グルカゴン様タンパク質１）ＩＬ−１受容体アゴニスト、ｓＴＮＦｒ（エンブレル、別名可溶性ＴＮＦ受容体Ｆｃ融合物）、ＡＴＩＩＩ、ｒｈトロンビン、グルコセレブロシダーゼ及びＣＴＬＡ４−Ｉｇ（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４−Ｉｇ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０３４８】
以下は、本発明の組成物及び方法を例示する実施例である。これらの実施例は限定的なものであると解釈すべきではなく、実施例は、例示の目的のみで記載されている。例えば、実施例は、複合糖タンパク質に関連する本発明の組成物及び方法の実施形態を例示するが、当業者は、本明細書中に先述されているとおり、ハイブリッド糖タンパク質に関連する組成物及び方法に適合するように、実施例に例示されている方法及び組成物が改変され得ることを認める。
【実施例１】
【０３４９】
Ｐ．パストリス中のＯＣＨ１遺伝子のクローニング及び破壊
Ｐ．パストリスのＯＣＨ１変異体の作製
Ｐ．パストリスＯＣＨ１配列（日本国特許出願公開８−３３６３８７）に基づいて設計されたオリゴヌクレオチド５’−ＡＴＧＧＣＧＡＡＧＧＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧＴ−３’（配列番号７）及び５’−ＴＴＡＧＴＣＣＴＴＣＣＡＡＣＴＴＣＣＴＴＣ−３’（配列番号８）を用いて、Ｐ．パストリスゲノムＤＮＡ（株Ｘ−３３，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）からα−１，６マンノシル転移酵素の候補をコードするＰ．パストリスＯＣＨ１遺伝子の１２１５塩基対のＯＲＦを増幅した。続いて、ＯＣＨ１遺伝子中の内部オリゴヌクレオチド５’−ＡＣＴＧＣＣＡＴＣＴＧＣＣＴＴＣＧＣＣＡＴ−３’（配列番号９）並びにプラスミドλＺＡＰＩＩを有するライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）の骨格中の５’−ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’Ｔ７（配列番号１０）及び５’−ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧ−３’Ｔ３（配列番号１１）オリゴヌクレオチドを用いて、Ｐ．パストリスゲノムＤＮＡライブラリーから、ＯＣＨ１遺伝子のＯＲＦの上流２６８５塩基対及び下流１１７５塩基対を増幅した（Ｂｏｅｈｍ，１９９９）。得られた５０７５塩基対の断片をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中にクローニングし、ｐＢＫ９と表記した。
【０３５０】
ＯＣＨ１の翻訳領域をＨＩＳ４耐性遺伝子で置換した遺伝子ノックアウト構築物を組み立てた後、Ｐ．パストリスを形質転換し、３７℃での温度感受性に関して、コロニーをスクリーニングした。Ｓ．セレビジエのＯＣＨ１変異体は温度感受性であり、高温での増殖は遅い。従って、Ｓ．セレビシエのＯＣＨ１変異体をＰ．パストリスＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーで相補することによって、Ｐ．パストリス中のＯＣＨ１の機能的相同体を同定することができる。欠失されたｏｃｈ１遺伝子を有するコロニーを同定するために、約２０の温度感受性株をさらにコロニーＰＣＲスクリーンに供した。幾つかのｏｃｈ１欠失が得られた。
【０３５１】
野生型ＯＣＨ１遺伝子をノックアウトするために、Ｐ．パストリスＢＫ１［ＡＯＸ１遺伝子坐の中にヒトＩＦＮ−β遺伝子を担持するＧＳＩ１５（ｈｉｓ４Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）］中に、直鎖化されたｐＢＫ９．１（ピキアＨＩＳ４遺伝子を担持するＯＣＨ１遺伝子カセットの２．１ｋｂの上流配列及び１．５ｋｂ下流配列）を形質転換した。温度感受性コロニーを選択するために、ヒスチジンドロップアウト培地後に、レプリカ平板法を用いて、形質転換体の最初のスクリーニングを実施した。２００のヒスチジン陽性コロニーの２０が、３７℃で温度感受性表現型を示した。ピキアゲノム中にｐＢＫ９．１の無作為な組み込みを排除するために、組み込み部位の上流配列に特異的なプライマー及びＨＩＳ４ＯＲＦに特異的なプライマーを用いて、２０の温度感受性単離株をコロニーＰＣＲに供した。２０のコロニーのうち２つがｏｃｈ１欠損であり、サザンブロット及びウェスタンブロットを用いてさらに分析を行い、ｏｃｈ１ノックアウト構築物による機能的なｏｃｈ１破壊が示唆された。ｏｃｈ１のノックアウトを確認するために、及び翻訳領域での組み込みを確認するために、２つの別個の制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＣｌａＩを用いて、ゲノムＤＮＡを消化した。ウェスタンブロットは、４６．２ｋＤａのＧＳＩ１５野生型中で産生された分離したバンドを欠くｏｃｈ１変異体を示した。
【実施例２】
【０３５２】
Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２含有ＩＦＮ−β前駆体を作製するための、α−１，２−マンノシダーゼによるＰ．パストリスの工作
複雑なＮ−グリカンの形成に不可欠な中間体であるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を得るためのＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２の整形のために、α−１，２−マンノシダーゼが必要とされる。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２前駆体の産生は不可欠であるが、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の特異的な異性体はＧｎＴＩに対する基質であり得又はあり得ないので、ハイブリッド及び複合グリカンの産生のために必ずしも十分であるとは限らない。ａｏｘプロモーターの制御下にある分泌されたヒトインターフェロン−γを発現するために、Ｐ．パストリスのｏｃｈ１変異体が工作される。ヒトマンノシダーゼＩＢ（α−１，２−マンノシダーゼ）の触媒ドメインを、初期ゴルジ及び小胞体局在化ペプチドをコードする配列を含むサブライブラリーと翻訳領域内部で連結することによって、ＤＮＡライブラリーを構築する。次いで、宿主生物中にＤＮＡライブラリーを形質転換し、各形質転換体がそれぞれ、インターフェロン−β及びライブラリーから得られる合成マンノシダーゼ遺伝子を発現する、遺伝的に混合された手段を得る。各形質転換体コロニーを培養し、メタノールの添加によって、インターフェロンの作製が誘導される。これらの条件下で、分泌されたタンパク質の９０％超はグリコシル化されたインターフェロン−βである。
【０３５３】
Ｃ１８シリカ逆相クロマトグラフィーによって、塩及び低分子量きょう雑物を除去するために、上清を精製する。適切に標的化された活性なα−１，２−マンノシダーゼを発現する所望の形質転換体は、親株のインターフェロン−βと比べて、減少した分子量を有する構造Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のＮ−グリカンを含むインターフェロン−βを産生する。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって、精製されたインターフェロン−βを分析し、インターフェロン−βの所望の形態を発現するコロニーが同定される。
【実施例３】
【０３５４】
ヒト様糖タンパク質を作製するための、α−１，２−マンノシダーゼ、ＧｎＴＩ及びＧｎＴＩＩを発現するｏｃｈ１変異体株の作製
Ｐ．パストリスＯＣＨ１遺伝子の１２１５塩基対の翻訳領域並びに２６８５塩基対の上流及び１１７５塩基対の下流を、ＰＣＲによって増幅し（ＷＯ０２／００８７９も参照）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、ｐＢＫ９と表記した。複数の栄養要求性マーカーを含有するｏｃｈ１ノックアウト株を作製するために、ｐＪＮ３２９（ＳｆｉＩ制限部位と隣接したｏｃｈ１：：ＵＲＡ３変異体対立遺伝子を含有するプラスミド）１００μｇをＳｆｉＩで消化し、電気穿孔によって、Ｐ．パストリス株ＪＣ３０８（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ２６３（２００１）１５９−１６９）を形質転換するために使用した。ウラシルを欠く所定の培地上において、室温で１０日間温置した後、１０００個のコロニーを拾い上げ、再度画線した。ｏｃｈ１：：ＵＲＡ３変異体対立遺伝子の正しい組み込みに関して検査するために、３７℃で増殖することができなかったが、室温で増殖したＵＲＡ＋クローンをコロニーＰＣＲに供した。予想されるＰＣＲパターンを示した１つのクローンをＹＪＮ１５３と表記した。ヒトプラスミノーゲンのクリングル３ドメインをモデルタンパク質として使用した。Ｋ３遺伝子を含有するＮｅｏＲで印を付されたプラスミドを株ＹＪＮ１５３中に形質転換し、Ｋ３を発現する得られた株をＢＫ６４−１と名付けた。
【０３５５】
ゴルジＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミントランスポーターをコードするクルイベロミセス・ラクティスＭＮＮ２−２遺伝子を含有するプラスミドｐＰＢ１０３は、Ｐ．パストリスＡＤＥ１遺伝子を含有する、ＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩ消化され、平滑末端で終了するｐＢＬＡＤＥ−ＳＸ中に（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ｇｅｎｅ  ２６３：１５９−１６９）、ベクターｐＤＬ０２（Ａｂｅｉｊｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：５９６３−５９６８）由来のＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ平滑末端断片をクローニングすることによって構築された。ＥｃｏＮＩを用いて、このプラスミドを直鎖化し、電気穿孔によって、株ＢＫ６４−１中に形質転換し、ＰＣＲ分析によってＭＮＮ２−２を含有することが確認された１つの株をＰＢＰ１と名付けた。
【０３５６】
ヒト、マウス、ハエ、虫及び酵母源由来の幾つかのα−１，２−マンノシダーゼ遺伝子の触媒ドメインと融合されたＳ．セレビシエ及びＰ．パストリス由来の幾つかのＩ型又はＩＩ型のリーダードメインのフレーム内融合物を含むマンノシダーゼ構築物のライブラリーを作製した（例えば、ＷＯ０２／００８９７（参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。）。ＳａｌＩで直鎖化し、電気穿孔によって株ＰＢＰ１中に形質転換し、Ｋ３レポータータンパク質から放出されたグリカンを分析することによって、このライブラリーをＰ．パストリスＨＩＳ４組み込みベクター中に作製し、スクリーニングした。選択された１つの活性な構築物は、１８７ヌクレオチドを喪失しているマウスα−１，２−マンノシダーゼＩＡ遺伝子のＮ末端欠失と融合された酵母ＳＥＣ１２遺伝子の９８８から１２９６ヌクレオチド（Ｃ末端）のキメラであった（図３）。この構築物を発現しているＰ．パストリス株をＰＢＰ２と名付けた。
【０３５７】
ヒト、虫、蛙及びハエ源由来のＧｎＴＩ遺伝子の触媒ドメインとの、同じリーダーライブラリーのフレーム内融合物を含むＧｎＴＩ構築物のライブラリーを作製した（ＷＯ０２／００８７９）。ＡａｔＩＩで直鎖化し、電気穿孔によって株ＰＢＰ２中に形質転換し、Ｋ３から放出されたグリカンを分析することによって、このライブラリーをＰ．パストリスＡＲＧ４組み込みベクター中に作製し、スクリーニングした。選択された１つの活性な構築物は、最初の１５４塩基対を喪失しているヒトＧｎＴＩ遺伝子の欠失に融合されたＳ．セレビシエＭＮＮ９遺伝子の最初の１２０塩基対のキメラであった。この構築物を発現しているＰ．パストリス株をＰＢＰ３と名付けた。
【０３５８】
ヒト及びラット源由来のＧｎＴＩＩ遺伝子の触媒ドメインとの、リーダーライブラリーのフレーム内融合物を含むＧｎＴＩＩ構築物のライブラリーを作製した（ＷＯ０２／００８７９）。このライブラリーは、薬物ヌルセオスリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）に対する耐性を付与するＮＳＴＲ遺伝子を含有するＰ．パストリス組み込みベクター中に作製された。ＥｃｏＲＩでライブラリープラスミドを直鎖化し、電気穿孔によって株ＲＤＰ２７中に形質転換し、精製されたＫ３からの放出されたグリカンの分析によって、得られた株をスクリーニングした。
【０３５９】
以下の反応のための材料
ＭＯＰＳ、カコジル酸ナトリウム、塩化マンガン、ＵＤＰ−ガラクトース及びＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸は、Ｓｉｇｍａから入手した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）は、Ｓｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから入手した。スポドプテラ・フルギペルダから得た組み換えラットα２，６−シアリ酸転移酵素及び牛乳から得たβ１，４−ガラクトシル転移酵素はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手した。プロテインＮ−グリコシダーゼＦ、マンノシダーゼ及びオリゴ糖は、Ｇｌｙｋｏ（Ｓａｎ  Ｒａｆａｅｌ，ＣＡ）から入手した。ＤＥＡＥ  ＴｏｙｏＰｅａｒｌ樹脂は、ＴｏｓｏＨａａｓから入手した。金属キレート「ＨｉｓＢｉｎｄ」樹脂は、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から入手した。９６ウェル可溶化液クリアリングプレートは、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から入手した。タンパク質結合９６ウェルプレートは、Ｍｉｌｌｐｏｒｅ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から入手した。塩及び緩衝剤は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。ＭＡＬＤＩマトリックスは、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から入手した。
【０３６０】
１．タンパク質精製
Ｂｅｃｋｍａｎ  ＢｉｏＭｅｋ  ２０００試料操作ロボット（Ｂｅｃｋｍａｎ／Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｒａｎｃｈ  Ｃｕｃａｍｏｎｇａ，ＣＡ）上で、９６ウェルフォーマットを用いて、クリングル３を精製した。Ｃ末端の６ヒスチジンタグを用いて、クリングル３を発現培地から精製した。ロボット精製は、それらのＨｉｓＢｉｎｄ樹脂に対して、Ｎｏｖａｇｅｎによって提供されたプロトコールを改変したものである。要約すると、樹脂の静置容量１５０μＬ（μＬ）を９６ウェル可溶化液結合プレートのウェル中に注ぎ、水の３容量で洗浄し、５０ｍＭＮｉＳＯ４の５容積を充填し、結合緩衝液の３容量で洗浄した（５ｍＭイミダゾール、０．５ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．９）。タンパク質発現培地を３：２に希釈し（培地／ＰＢＳ（６０ｍＭＰＯ４、１６ｍＭＫＣｌ、８２２ｍＭＮａＣｌｐＨ７．４））、カラム上に搭載する。排出後、結合緩衝液の１０容量及び洗浄緩衝液（３０ｍＭイミダゾール、０．５ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．９）の６容量で洗浄し、溶出緩衝液（１Ｍイミダゾール、０．５ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．９）の６容量によって、タンパク質を溶出する。凍結乾燥によって、溶出された糖タンパク質を乾燥状態まで蒸発させる。
【０３６１】
２．Ｎ結合型グリカンの放出
以前に報告された方法（Ｐａｐａｃ，１９９８）の改変によって、糖タンパク質からグリカンを放出及び分離する。９６ウェルＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ  ＩＰ（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜）プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）のウェルをメタノール１００μＬで湿らせ、水３×１５０μＬ及びＲＣＭ緩衝液（８Ｍ尿素、３６０ｍＭＴｒｉｓ、３．２ｍＭＥＤＴＡｐＨ８．６）５０μＬで洗浄し、各添加後に穏やかな真空を用いて排出する。乾燥されたタンパク質試料をＲＣＭ緩衝液３０μＬ中に溶解し、ＲＣＭ緩衝液１０μＬを含有するウェルに移した。ウェルを排出し、ＲＣＭ緩衝液で２回洗浄する。３７℃で１時間、ＲＣＭ緩衝液中の０．１ＭＤＴＴの６０μＬを添加することによって、タンパク質を還元する。水３００μＬでウェルを３回洗浄し、室温で、暗所中にて３０分間、０．１Ｍヨード酢酸６０μＬを添加することによって、カルボキシメチル化する。水で、ウェルを再度３回洗浄し、室温で１時間、水中の１％ＰＶＰ３６０の１００μＬを添加することによって、膜をブロックする。ウェルを排出し、水３００μＬで３回洗浄し、Ｎ−グリカナーゼ（Ｇｌｙｋｏ）の１ミリユニットを含有する１０ｍＭＮＨ４ＨＣＯ３ｐＨ８．３の３０μＬを添加することによって、脱グリコシル化する。３７℃で１６時間後、遠心によってグリカンを含有する溶液を除去し、乾燥状態になるまで蒸発させた。
【０３６２】
３．マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析法
遅延抽出を使用するＶｏｙａｇｅｒＤＥＰＲＯ線形ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）質量分析装置を用いて、グリカンの分子量を測定した。各ウェルからの乾燥されたグリカンを水１５μＬ中に溶解し、ステンレス鋼試料プレート上に０．５μＬを点状に添加し、Ｓ−ＤＨＢマトリックス（ジヒドロキシ安息香酸９ｍｇ／ｍＬ、１：１水／アセトニトリル中の５−メトキシサリチル酸１ｍｇ／ｍＬ、０．１％ＴＦＡ）の０．５μＬと混合し、乾燥させた。
【０３６３】
４ナノ秒のパルス時間で、パルス化された窒素レーザー（３３７ｎｍ）で照射によって、イオンを作製した。本装置は、１２５ナノ秒の遅延及び２０ｋＶの加速電圧を有する遅延抽出モードで操作された。格子電圧は９３．００％であり、ガイドワイヤー電圧は０．１０％であり、内部圧は５×１０−７ｔｏｒｒ未満であり、低質量ゲートは８７５Ｄａであった。１００から２００レーザーパルスの合計からスペクトルを生成し、２ＧＨｚデジタイザで取得した。外部分子量標準として、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２オリゴ糖を使用した。全てのスペクトルは、正のイオンモードで装置を生成した。スペクトルの推定質量の精度は０．５％であった。
【実施例４】
【０３６４】
ガラクトシル転移酵素を作製するための株の工作
４．ガラクトシル転移酵素反応
ニッケルアフィニティークロマトグラフィーによって、タンパク質約２ｍｇ（ｒ−Ｋ３：ｈＰｇ［ＰＢＰ６−５］）を精製し、０．１％ＴＦＡに対して徹底的に透析し、乾燥状態になるまで凍結乾燥した。５０ｍＭＭＯＰＳ、２０ｍｍＭｎＣｌ２、ｐＨ７．４の１５０μＬ中に、タンパク質を再度溶解させた。ＵＤＰ−ガラクトース３２．５ｇ（５３３ｎｍｏｌ）及びβ１，４−ガラクトシル転移酵素４ｍＵの添加後、試料を３７℃で１８時間温置した。次いで、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析による分析のために、０．１％ＴＦＡに対して試料を透析した。
【０３６５】
ガラクトシル転移酵素と反応したタンパク質のスペクトルは、酵素なしで温置された類似のタンパク質試料のスペクトルと比べた場合に、２つのガラクトース部分の添加と合致する質量の増加を示した。次に、タンパク質試料を還元し、カルボキシメチル化し、ＰＮＧアーゼＦで脱グリコシル化した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって、回収されたＮ−グリカンを分析した。ガラクトシル転移酵素反応を行ったタンパク質からの主なグリカンの質量は、２つのガラクトース部分（３２５．４Ｄａ）の添加と合致する質量だけ、対照グリカンの質量より大きかった。
【０３６６】
参照により本明細書に組み込まれるＢｏｂｒｏｗｉｃｚら（２００４）は、末端のガラクトースを含有する糖タンパク質を産生することができるＰ．パストリスの株を工作することを開示している。この株は、本明細書に開示されているように、本発明の方法を用いて、β１、４ＧａｌＴ、ＵＤＰガラクトーストランスポーター及びＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼを発現した。２００５年４月１５日に出願されたＤａｖｉｄｓｏｎ，ＵＳＳＮ１１／１０８，０８８（その開示内容は、参照により、本明細書に組み込まれる。）の開示も参照されたい。
【実施例５】
【０３６７】
機能的及び活性なマンノシダーゼＩＩを発現するための株の工作
ヒト様グリコフォームを作製するために、構造ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２から２つの残存する末端マンノースを除去するマンノシダーゼＩＩ酵素を発現するように、微生物を工作する（図１Ｂ参照）。シス及び内側ゴルジ局在化シグナルをコードする配列を含むＤＮＡライブラリーを、マンノシダーゼＩＩ触媒ドメインをコードするライブラリーへインフレームに融合する。宿主生物は、高マンノシル化を欠失する株（例えば、ｏｃｈ１変異体）、例えば、酵母であり、ゴルジ及び／又は小胞体中に構造ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有するＮ−グリカンを提供する。形質転換後、所望のグリコシル化表現型を有する生物が選択される。ある方法では、インビトロアッセイが使用される。所望の構造ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（但し、所望されないＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ではない。）は、ＧｌｃＮＡｃ転移酵素ＩＩに対する基質である（図１Ｂ参照）。従って、基質ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの存在下で、インビトロにおいて本酵素を用いて、単一のコロニーをアッセイし得る。ＵＤＰの放出は、ＨＰＬＣ又はＵＤＰに対する酵素的アッセイによって決定される。あるいは、放射線標識されたＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ又はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを使用し得る。ＤａｖｉｄｓｏｎｒａのＷＯ０５／００５８４（その開示内容は、参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。
【０３６８】
先述のインビトロアッセイは、高情報量スクリーニング装置を用いて各コロニーに対して都合よく行われる。あるいは、レクチン結合アッセイが使用される。この場合には、末端のマンノースに対して特異的なレクチンの減少した結合が、所望の表現型を有する形質転換体の選択を可能とする。例えば、ガランタス・ニバリス（Ｇａｌａｎｔｕｓ  ｎｉｖａｌｉｓ）のレクチンは末端のα−１，３−マンノース（その濃度は、作用可能に発現されたマンノシダーゼＩＩ活性の存在下では低下されている。）に対して特異的に結合する。１つの適切な方法において、固体アガロース支持体（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手可能）に付着されたＧ．ニバリスのレクチンは、末端のα−１，３−マンノースの高いレベルを有する細胞の形質転換された集団を枯渇するために使用される。
【実施例６】
【０３６９】
シアリル転移酵素を発現するための株の工作
酵素α２，３−シアリル転移酵素及びα２，６−シアリル転移酵素は、新生ヒトＮ−グリカン中のガラクトース残基へ末端のシアル酸を付加し、成熟した糖タンパク質をもたらす（図１Ｂにおける「α２，３ＳＴ；α２，６ＳＴ」を参照）。ヒト細胞において、反応は、トランスゴルジ又はＴＧＮ中で起こる。従って、トランスゴルジ又はＴＧＮ局在化シグナルをコードする配列を有するシアリル転移酵素触媒ドメインをコードする配列のフレーム内融合によって、ＤＮＡライブラリーを構築する（Ｍａｌｉｓｓａｒｄ，２０００；Ｂｏｒｓｉｇ，１９９５）。宿主生物は、高マンノシル化を欠失する株（例えば、ｏｃｈ１変異体）、例えば、酵母であり、これは、後期ゴルジ又はＴＧＮ中に末端ガラクトース残基を有するＮ−グリカンを与え、後期ゴルジ又はＴＧＮ中にＣＭＰ−シアル酸の十分な濃度を与える。形質転換後に、例えば、末端のシアル酸を有するＮ−グリカンに対して特異的な蛍光性抗体を用いて、所望の表現型を有する形質転換体が選択される。さらに、実施例１６に記載されているように、ＣＭＰ−ＮＡＮＡ前駆体を作製するために、株が工作される。
【０３７０】
実施例１７は、α２，６ＳＴ及びＣＭＰ−Ｓｉａを発現する株の工作をさらに例示し、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を作製することができる。
【０３７１】
５．シアリル転移酵素反応
５０ｍＭカコジル酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０の１０μＬ中に（ガラクトシル転移酵素反応された）（実施例４）タンパク質を再懸濁した後、同じ緩衝液の１５μＬ中に溶解されたＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮＡＮＡ）の３００μｇ（４８８ｎｍｏｌ）及び組み換えα−２，６シアリル転移酵素の５μＬ（２ｍＵ）を添加した。３７℃で１５時間の温置後、ＣＭＰ−ＮＡＮＡの２００μｇ及びシアリル転移酵素の１ｍＵをさらに添加した。タンパク質試料をさらに８時間温置し、次いで透析し、上のように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって分析した。シアリル転移酵素と反応した糖タンパク質のスペクトルは、出発材料（ガラクトシル転移酵素反応後のタンパク質）と比べた場合に、質量の増加を示した。Ｎ−グリカンが放出され、上のように分析した。主なグリカンの２つのイオン付加物の質量の増加は、２つのシアル酸残基の添加と合致していた（５８０及び５８３Ｄａ）。
【実施例７】
【０３７２】
ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターを発現するための株の工作
Ｉｓｉｄａ及び共同研究者によって、ヒトゴルジＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターのｃＤＮＡがクローニングされた。（Ｉｓｈｉｄａ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．１９９９  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１２６（１）：６８−７７）。Ｇｕｉｌｌｅｎ及び共同研究者は、ゴルジＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターが欠失したクルイベロミセス・ラクティス変異体の表現型補正によって、ネコ腎臓ゴルジＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターをクローニングした。（Ｇｕｉｌｌｅｎ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．１９９８）。従って、ほ乳動物のゴルジＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター遺伝子は、タンパク質を発現し、酵母のゴルジ装置へ機能的に標的化するために必要な情報の全てを有している。これら又はその他のクローニングされたトランスポーター遺伝子は、宿主のゴルジ及び／又は小胞体中の効率的なＧｎＴ反応のためのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ基質を提供するために、宿主生物中に工作され得る。図１０Ｂは、Ｋ．ラクティスＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターを発現する株の効果を示している。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターを欠く図１０Ａと比べて、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターを添加するという効果は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の産生の劇的な増加を示している。
【実施例８】
【０３７３】
ＧＤＰ−フコーストランスポーターを発現するための株の工作
ラット肝臓ゴルジ膜ＧＤＰ−フコーストランスポーターは、「Ｐｕｇｌｉｅｌｌｉ，Ｌ．ａｎｄ  Ｃ．Ｂ．Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ  １９９９  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（５０）：３５５９６−３５６００」によって同定及び精製されている。対応する遺伝子は、Ｎ末端配列及び縮重ＤＮＡプローブを用いるサザンブロッティングなどの標準的な技術を用いて同定することが可能である。次いで、フコシル転移酵素も発現する宿主微生物中で、完全な状態の遺伝子が発現される。
【実施例９】
【０３７４】
ＵＤＰ−ガラクトーストランスポーターを発現するための株の工作
ヒトＵＤＰ−ガラクトース（ＵＤＰ−Ｇａｌ）トランスポーターはクローニングされており、Ｓ．セレビシエ中で活性を有することが示されている（Ｋａｉｎｕｍａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．１９９９  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ９（２）：１３３−１４１）。第二のヒトＵＤＰ−ガラクトーストランスポーター（ｈＵＧＴ１）がクローニングされており、チャイニーズハムスター卵巣細胞中で機能的に発現されている（Ａｏｋｉ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．１９９９  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２６（５）：９４０−９５０）。同様に、Ｓｅｇａｗａ及び共同研究者は、シゾサッカロミセス・ポンベ由来のＵＤＰ−ガラクトーストランスポーターをクローニングした（Ｓｅｇａｗａ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．１９９９  Ｆｅｂｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４５１（３）：２９５−２９８）。ＵＤＰ−ガラクトーストランスポーター活性をコードするこれらの又は他の配列は、増加したＵＤＰ−ガラクトーストランスポーター活性を有する株を工作するために、宿主細胞中に直接導入され得、又は本発明のサブライブラリーの成分として使用され得る。
【実施例１０】
【０３７５】
ＣＭＰ−シアル酸トランスポーターを発現するための株の工作
ヒトＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（ｈＣＳＴ）は、Ａｏｋｉ及び共同研究者（１９９９）によってクローニングされ、Ｌｅｃ８ＣＨＯ細胞中に発現されている。ハムスターＣＭＰ−シアル酸トランスポーターの分子クローニングも達成されている（Ｅｃｋｈａｒｄｔ，１９９７）。マウスＣＭＰ−シアル酸トランスポーターの機能的発現が、Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎ，１９９７によってサッカロミセス・セレビシエ中で達成された。ＣＭＰ−シアル酸トランスポーター活性をコードするこれらの又は他の配列は、増加したＣＭＰ−シアル酸トランスポーター活性を有する株を工作するために、宿主細胞中に直接導入され得、又は本発明のサブライブラリーの成分として使用され得る。
【実施例１１】
【０３７６】
コンビナトリアルＤＮＡライブラリーを用いて、主要なＮ−グリカン構造としてＭａｎ５ＧｌｃＮＡ２を作製するためのＰ．パストリスの工作
誘導性ＡＯＸＩプロモーターの調節下にあるヒトプラスミノーゲン（Ｋ３）のクリングル３ドメインなどのタンパク質を発現し、分泌するように、Ｐ．パストリスのｏｃｈ１変異体（実施例１及び３参照）を工作した。ヒトプラスミノーゲン（Ｋ３）のクリングル３ドメインをモデルタンパク質として使用した。Ｐｆｕターボポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いてＫ３をコードするＤＮＡ断片を増幅し、ｐＰＩＣＺαＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩ部位中にクローニングして、Ｃ末端６−Ｈｉｓタグを得た。Ｋ３のＮ結合型グリコシル化の効率を改善するために（Ｈａｙｅｓ，１９７５）、部位特異的突然変異誘発を用いて、Ｐｒｏ４６をＳｅｒ４６と置換した。得られたプラスミドは、ｐＢＫ６４と表記した。ＤＮＡは配列決定によって、ＰＣＲ構築物の正しい配列を確認した。
【０３７７】
マウスα−１，２−マンノシダーゼＩＢ（Ｇｅｎｂａｎｋ：６６７８７８７）及びＩＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ：６７５４６１９）触媒ドメインを、表６に記載されているＣｏｐＩＩ小胞、小胞体及び初期ゴルジ局在化ペプチドをコードする配列を含むサブライブラリーとフレーム内に連結することによって、コンビナトリアルＤＮＡライブラリーを構築した。組み合わせたＤＮＡライブラリーを使用して、それぞれの融合構築物を作製し、次いで、Ｋ３を発現している宿主生物中に形質転換し、各形質転換体がそれぞれ、Ｋ３及びライブラリー由来の局在化シグナル／マンノシダーゼ融合遺伝子を発現する遺伝的に混合された集団を得る。各形質転換体を培養し、メタノール含有培地に移すことによって、Ｋ３の産生を誘導した。これらの条件下で、誘導の２４時間後、培地中のタンパク質の９０％超がＫ３であった。Ｎｉ−アフィニティークロマトグラフィーによって塩及び低分子量きょう雑物を除去するために、Ｋ３レポータータンパク質を上清から精製した。アフィニティー精製後に、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ１０樹脂（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｕｉｓ，ＭＯ）上でのサイズ排除クロマトグラフィーによってタンパク質を脱塩し、以下に記載されているＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析へ直接供し、又は以下に記載されているＰＮＧアーゼ消化によってＮ−グリカンを除去し（Ｎ−グリカンの放出）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析に供した（Ｍｉｅｌｅ，１９９７）。
【０３７８】
このアプローチ後に、形質転換体の多様な組を得た。幾つかの形質転換体は、ｏｃｈ１ノックアウト株に比べてＮ−グリカンの修飾を全く示さず、他の形質転換体は、マンノース整形の高い程度を示した（図５Ｄ、５Ｅ）。適切に標的化された活性なα−１，２−マンノシダーゼを発現する所望の形質転換体は、構造Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のＮ−グリカンを有するＫ３を産生した。これは、親ｏｃｈ１欠失株のＫ３と比べて、糖タンパク質に低下した分子量を付与し、この差はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって容易に検出された（図５）。表７は、相対的なＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２産生レベルを示している。
【０３７９】
【表６】
0005514541.tif 000011
【０３８０】
【表７】
0005514541.tif 000012
【０３８１】
標的化ペプチドは、Ｓ．セレビシエ中のＭＮＳＩ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔＰ３２９０６）（長い、中間及び短い）（上記核酸ライブラリー；融合構築物のコンビナトリアルＤＮＡライブラリー参照）並びにＳ．セレビシエ中のＳＥＣ１２（９８８−１１４０ヌクレオチド：短い）及び（９８８−１２９６：中間）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔＰ１１６５５）から選択された。標的化ペプチド配列の大半はＮ末端が欠失していたが、ＳＥＣ１２などの幾つかの標的化ペプチド配列はＣ末端が欠失していた。この実験において使用される触媒ドメインは、１８７アミノ酸のＮ末端欠失を有するマウスマンノシダーゼ１Ａ並びに５８、９９及び１７０アミノ酸の欠失を有するマウスマンノシダーゼ１Ｂから選択された。本明細書に使用されている（＋）の数字は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡ２産生の相対レベルを示す。表記（−）は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡ２の明白な産生が存在しないことを示す。表記（＋）は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡ２の１０％未満の産生を示す。表記（＋＋）は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡ２の約１０から２０％の産生を示す。表記（＋＋＋）は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡ２の約２０から４０％の産生を示す。表記（＋＋＋＋）は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡ２の約５０％の産生を示す。表記（＋＋＋＋＋）は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡ２の５０％を上回る産生を示す。
【０３８２】
表９は、分泌されたＫ３に対するＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の相対的な量を示している。１９のα−１，２マンノシダーゼ触媒ドメインを３２の真菌ＥＲ及びシス−ゴルジリーダーに融合することによって作製されたコンビナトリアル遺伝学的ライブラリーの単一の構築物でＰ．パストリス、デルタｏｃｈ１を形質転換することによって、Ｐ．パストリス、デルタｏｃｈ１の異なる６０８の株を作製した。
【０３８３】
【表８】
0005514541.tif 000013
＊Ｐ．パストリス中への形質転換前に、対応するプラスミドをイー・コリ中で増殖させることができなかったので、幾つかの融合構築物を検査しなかった。
†Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２トリミングの最も高い程度（３０／５１）を有するクローンを、培地の上清中のマンノシダーゼ活性に関してさらに分析した。大半（２８／３０）は、上清中に検出可能なマンノシダーゼ活性（例えば、図４Ｂ）を示した。２つの構築物のみが高いＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２レベルを示したが、培地中のマンノシダーゼ活性を欠如していた（例えば、図４Ｃ）。
【０３８４】
表７は、とりわけ、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を示す２つの構築物ｐＦＢ８及びｐＧＣ５を示している。表８は、より好ましい構築物ｐＢＣ１８−５、Ｃ．エレガンスマンノシダーゼ１Ｂ（ＧｅｎｂａｎｋＡＮ：ＣＡＡ９８１１４）８０アミノ酸Ｎ末端欠失（サッカロミセスＶＡＮ１（ｓ）／Ｃ．エレガンスマンノシダーゼＩＢデルタ８０）へインフレームに連結されたＳ．セレビシエＶＡＮ１（ｓ）標的化ペプチド配列（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ２３６４２）を示している。この融合構築物は、図５Ｅに示されているように、主なＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造も産生する。この構築物は、５０％超のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を産生することが示された（＋＋＋＋＋）。
【０３８５】
６．コンビナトリアル局在化／マンノシダーゼライブラリーの作製：
標的化ペプチドに融合されたα−１，２−マンノシダーゼ触媒ドメインのコンビナトリアルＤＮＡライブラリーを作製するには、多数の生物から得られるＮ末端欠失の異なる長さを有するマンノシダーゼドメインの増幅を必要とした。この最終目標に近づくために、以下の源：ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、ムス・ムスキュラス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、ケノルハブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）及びペニシリウムシトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）から得られたｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡの何れかから、α−１，２−マンノシダーゼの完全長翻訳領域（ＯＲＦ）をＰＣＲ増幅した。各事例において、ＰＣＲ反応を実施するために必要とされる試薬に加えて、所望のマンノシダーゼ配列に対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーの存在下でＤＮＡを温置した。例えば、Ｍ．ムスキュラスのα−１，２−マンノシダーゼＩＡの翻訳領域を増幅するために、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）の存在下で、５’−プライマーＡＴＧＣＣＣＧＴＧＧＧＧＧＧＣＣＴＧＴＴＧＣＣＧＣＴＣＴＴＣＡＧＴＡＧＣ（配列番号１２）及び３’−プライマーＴＣＡＴＴＴＣＴＣＴＴＴＧＣＣＡＴＣＡＡＴＴＴＣＣＴＴＣＴＴＣＴＧＴＴＣＡＣＧＧ（配列番号１３）を温置し、９４℃１分間（１サイクル）、９４℃３０秒間、６８℃３０秒間、７２℃３分間（３０サイクル）というサイクリングパラメータを用いて、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅによって推奨される条件下で増幅した。増幅後、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中への連結前に、読み取り枠をコードするＤＮＡ配列を、７２℃で５分間、１ＵＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）とともに温置し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって推奨されているように、ＴＯＰ１０化学的形質転換受容性イー・コリ中に形質転換した。マンノシダーゼ翻訳領域に対して特異的なプライマーを用いたＡＢＩ配列決定によって、クローニングされたＰＣＲ産物を確認した。
【０３８６】
各マンノシダーゼの所望のＮ末端切断を作製するために、５’−プライマーの徐冷位置が所望の末端切断の５’末端に対して特異的であり、３’−プライマーがなお翻訳領域の元の３’末端に対して特異的であるＰＣＲ反応のその後のラウンドにおいて、各マンノシダーゼの完全な翻訳領域をテンプレートとして使用した。末端切断されたマンノシダーゼ断片の酵母発現ベクターｐＪＮ３４７（図２Ｃ）中へのサブクローニングを容易にするために、それぞれ、５’及び３’末端において、ＡｓｃＩ及びＰａｃＩ制限部位を各末端産物上に作製した。各マンノシダーゼ翻訳領域に対して作製されたＮ末端切断の数及び位置は、触媒ドメイン（ＣＤ）に関する膜貫通（ＴＭ）領域の位置に依存した。例えば、ＴＭ及びＣＤの間に位置するステム領域が１５０塩基対未満である場合には、当該タンパク質に対して１つの末端切断のみが生じた。しかしながら、ステム領域が１５０塩基対より長い場合には、ステム領域の長さに応じて、１つ又は２つ以上の末端切断が生じた。
【０３８７】
Ｍ．ムスキュラスのマンノシダーゼＩＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ：６６７８７８７）に対する末端切断の作製の仕方についての例が本明細書に記載されており、他のマンノシダーゼに対しても、類似のアプローチが使用される。図３はＭ．ムスキュラスのα−１，２−マンノシダーゼＩＡの翻訳領域を示しており、予想される膜貫通及び触媒ドメインが太字で強調表示されている。この構造に基づいて、デルタ６５−、デルタ１０５−及びデルタ１８７−Ｎ末端欠失を作製するために、３つの５’−プライマーを設計した（図３に下線が付された徐冷位置）。例としてデルタＮ−末端欠失を用いると、使用された５’−プライマーは、３’−プライマー５’−ＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＴＴＣＴＣＴＴＴＧＣＣＡＴＣＡＡＴＴＴＣＣＴＴＣＴＴＣＴＧＴＴＣＡＣＧＧ−３’（配列番号１５）（ＰａｃＩ制限部位が太字で強調表示されている。）と組み合わせた５’−ＧＧＣＧＣＧＣＣＧＡＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＣＡＧＣＧＧＧＧＴＣＣＴＧＴＴＣＣＡＣ−３’（配列番号１４）（ＡｓｃＩ制限部位が太字で強調表示されている。）であった。完全長のＭ．ムスキュラスのマンノシダーゼ１Ａ翻訳領域の増幅に関して上に概説されている条件下で、１５６１塩基対の断片を増幅するためにこれらの両プライマーの量を使用した。さらに、完全長のＯＲＦに関して得られた産物と同様に、末端切断された産物もＴａｑＤＮＡポリメラーゼとともに温置し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中に連結し、ＴＯＰ１０中に形質転換し、ＡＢＩ配列決定した。末端切断されたマンノシダーゼ断片の配列を増幅及び確認した後、得られたプラスミドｐＣ２．１−デルタ６５ｍＭａｎｎＩＡを、１６時間３７℃で、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ緩衝液＃４（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）中のＡｓｃＩ及びＰａｃＩで消化した。並行して、同じ酵素を用いて、ｐＪＮ３４７（図２Ｃ）を消化し、上に記載されているように温置した。消化後、ｐＪＮ３４７（図２Ｃ）骨格及び末端切断された触媒ドメインの両方をゲル抽出し、製造業者によって推奨されているように、Ｑｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いて連結され、化学的に形質転換受容性のＤＨ５α細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中に形質転換した。ｐＪＮ３４７マウスマンノシダーゼＩＡデルタ６５構築物の作製を確認するために、コロニーＰＣＲを使用した。
【０３８８】
酵母発現ベクターｐＪＮ３４７中に末端切断されたα−１，２−マンノシダーゼ触媒ドメインのライブラリーを作製したので（図２Ｃ）、標的化ペプチド／触媒ドメインライブラリーを作製する上での残りの工程は、標的化ペプチド配列をインフレームにクローニングすることであった（図２）。ｐＪＮ３４７−マンノシダーゼ構築物（図２Ｄ）及びｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ標的化ペプチド構築物（図２Ｂ）の両方を、制限酵素ＮｏｔＩ及びＡｓｃＩの存在下で、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ緩衝液＃４中において、３７℃で一晩温置した。消化後、ｐＪＮ３４７マンノシダーゼ骨格及び標的化ペプチド領域の両方をゲル抽出し、製造業者によって推奨されているように、Ｑｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いて連結され、化学的に形質転換受容性のＤＨ５α細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中に形質転換した。続いて、作製された融合物がインフレームの状態にあるかを確認するために、ｐＪＮ３４７−標的化ペプチド／マンノシダーゼ構築物をＡＢＩ配列決定した。最終的な標的化ペプチド／α−１，２−マンノシダーゼライブラリーの推定サイズは、上記アプローチによって作製された１３００超の構築物を含有する。図２は、コンビナトリアルＤＮＡライブラリーの構築を示している。
【０３８９】
７．複数の栄養要求性マーカーを有するＰ．パストリスＯＣＨ１ノックアウト株を工作する。
【０３９０】
プラスミド構築における第一の工程は、ノックアウトされるべき遺伝子の５’及び３’領域に対するスペースホルダーとして、Ｐ．パストリスのＫＥＸ１遺伝子のＤＮＡ領域を含有する普遍的プラスミド（Ｂｏｅｈｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｙｅａｓｔ  １９９９  Ｍａｙ；１５（７）：５６３−７２）の一群を作製することを含んだ。プラスミドは、栄養要求性マーカーに対するスペースホルダーとしてのＳ．セレビシエＵｒａ−ブラスター（Ａｌａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１６，５４１−５４５．１９８７）及び外来遺伝子を挿入するために複数クローニング部位を有する発現カセットも含有した。プライマーＧＧＣＧＡＧＣＴＣＧＧＣＣＴＡＣＣＣＧＧＣＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＡＴＣＡＴＴＴＧＴＣＣＡＧＣＴＴＣＡＧＡ（配列暗号１６）及びＧＣＣＣＡＣＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＧＴＴＴＡＡＡＣＡＴＣＧＡＴＴＧＧＡＧＡＧＧＣＴＧＡＣＡＣＣＧＣＴＡＣＴＡ（配列番号１７）を使用するＰＣＲによって、Ｐ．パストリスＫＥＸ１−５’領域の０．９ｋｂ断片を増幅し、ｐＵＣ１９のＳａｃＩ，ＳａｌＩ部位（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）中にクローニングした。ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩを用いて、得られたプラスミドを切断し、プライマーＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＡＧＴＡＴＴＴＡＡＡＴＣＡＴＡＴＧＴＧＣＧＡＧＴＧＴＡＣＡＡＣＴＣＴＴＣＣＣＡＣＡＴＧＧ（配列番号１８）及びＧＧＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＧＧＣＣＴＡＣＣＣＧＧＣＣＧＴＡＣＧＡＧＧＡＡＴＴＴＣＴＣＧＧＡＴＧＡＣＴＣＴＴＴＴＣ（配列番号１９）を用いて増幅されたＫＥＸ１−３’領域の０．８ｋｂ断片を開放部位中にクローニングし、ｐＪＮ２６２を作製した。ＢａｍＨＩでこのプラスミドを切断し、ｐＮＫＹ５１の３．８ｋｂＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ断片（Ａｌａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．１９８７）を、可能な両配向で挿入し、プラスミドｐＪＮ２６３（図４Ａ）及びｐＪＮ２８４（図４Ｂ）を得た。
【０３９１】
ＮｏｔＩ及びＰａｃＩを用いて、発現カセットをクローニング部位として作製した。プライマーＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＣＧＡＧＡＧＡＴＣＴＴＴＴＴＴＧＴＡＧＡＡＡＴＧＴＣＴＴＧＧＴＧＣＣＴ（配列暗号２０）及びＧＧＡＣＡＴＧＣＡＴＧＣＡＣＴＡＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＧＴＧＡＴＡＧＴＴＧＴＴＣＡＡＴＴＧＡＴＴＧＡＡＡＴＡＧＧＧＡＣＡＡ（配列番号２１）及びテンプレートとしてのプラスミドｐＧＡＰＺ−Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、Ｐ．パストリスのＧＡＰＤＨプロモーターを増幅し、ｐＵＣ１９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）のＢａｍＨＩ、ＳｐｈＩ部位中にクローニングした（図４Ｂ）。ＳｐｅＩ及びＳｐｈＩを用いて、得られたプラスミドを切断し、プライマーＣＣＴＴＧＣＴＡＧＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＣＧＣＧＧＣＡＣＧＴＣＣＧＡＣＧＧＣＧＧＣＣＣＡＣＧＧＧＴＣＣＣＡ（配列番号２２）及びＧＧＡＣＡＴＧＣＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＣＴＴＡＡＧＡＧＣＣＧＧＣＡＧＣＴＴＧＣＡＡＡＴＴＡＡＡＧＣＣＴＴＣＧＡＧＣＧＴＣＣＣ（配列番号２３）及びテンプレートとしてのプラスミドｐＰＩＣＺ−Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）用いて増幅されたＣＹＣ１転写ターミネータ領域（「ＴＴ」）を開放部位中にクローニングして、ｐＪＮ２６１を得た（図４Ｂ）。
【０３９２】
ＳａｌＩ及びＳｐｅＩでｐＪＮ２６３を消化することによって、Ｐ．パストリスＯＣＨ１遺伝子に対するノックアウトプラスミドを作製し、プライマーＧＡＡＣＣＡＣＧＴＣＧＡＣＧＧＣＣＡＴＴＧＣＧＧＣＣＡＡＡＡＣＣＴＴＴＴＴＴＣＣＴＡＴＴＣＡＡＡＣＡＣＡＡＧＧＣＡＴＴＧＣ（配列番号２４）及びＣＴＣＣＡＡＴＡＣＴＡＧＴＣＧＡＡＧＡＴＴＡＴＣＴＴＣＴＡＣＧＧＴＧＣＣＴＧＧＡＣＴＣ（配列番号２５）及びテンプレートとしてのＰ．パストリスゲノムＤＮＡを用いて増幅されたＯＣＨ１−５’領域の２．９ｋｂＤＮＡ断片を開放部位中に挿入した（図４Ｃ）。ＥｃｏＲＩ及びＰｍｅＩを用いて、得られたプラスミドを切断し、プライマーＴＧＧＡＡＧＧＴＴＴＡＡＡＣＡＡＡＧＣＴＡＧＡＧＴＡＡＡＡＴＡＧＡＴＡＴＡＧＣＧＡＧＡＴＴＡＧＡＧＡＡＴＧ
（配列番号２６）及びＡＡＧＡＡＴＴＣＧＧＣＴＧＧＡＡＧＧＣＣＴＴＧＴＡＣＣＴＴＧＡＴＧＴＡＧＴＴＣＣＣＧＴＴＴＴＣＡＴＣ（配列番号２７）を用いて作製されたＯＣＨ１−３’領域の１．０ｋｂＤＮＡ断片を挿入して、ｐＪＮ２９８を作製した（図４Ｃ）。新しい遺伝子を導入するためにプラスミドを同時使用することを可能とするために、ｐＪＮ２６１のＢａｍＨＩ発現カセット（図４Ｂ）をｐＪＮ２９８のユニークなＢａｍＨＩ部位（図４Ｃ）中にクローニングして、ｐＪＮ２９９（図４Ｅ）を作製した。
【０３９３】
Ｌｕ．Ｐら１９９８（Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  β−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｇｅｎｅ（Ｌｅｕ２）  ｏｆ  Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｄｉｓ  ｗｉｔｈ  ＵＲＡ３  ａｎｄ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｏｕｂｌｅ  ａｕｘｏｔｒｏｐｈ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４９，１４１−１４６）に記載されているものと類似の戦略を用いて、Ｐ．パストリスＵｒａ３−ブラスターカセットを構築した。Ｐ．パストリスＵＲＡ３の２．０ｋｂＰｓｔＩ、ＳｐｅＩ断片をｐＵＣ１９のＰｓｔＩ、ＸｂａＩ部位中に挿入して（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）ｐＪＮ３０６を作製した（図４Ｄ）。次いで、ｌａｃＺ翻訳領域の０．７ｋｂＳａｃＩ、ＰｖｕＩＩＤＮＡ断片をＳａｃＩ、ＳｍａＩ部位中にクローニングして、ｐＪＮ３０８を得た（図４Ｄ）。ＰｓｔＩでのｐＪＮ３０８の消化（図４Ｄ）及びＴ４ＤＮＡポリメラーゼでの処理後に、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端されたｌａｃＺから得られたＳａｃＩ−ＰｖｕＩＩ断片を挿入して、ｐＪＮ３１５を作製した（図４Ｄ）。ＳａｃＩ及びＳｐｈＩでの消化によってｌａｃＺ／ＵＲＡ３カセットを放出させ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、ＰｍｅＩ及びＡｆｌＩＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化されたｐＪＮ２９９の骨格中にクローニングした。得られたプラスミドは、ｐＪＮ３２９と名付けた（図４Ｅ）。
【０３９４】
ｐＪＮ２６１（図４Ｆ）をＥｃｏＩＣＲＩ（図４Ｆ）で切断することによって、ＨＩＳ４の印が付された発現プラスミドを作製した。次いで、プライマーＧＣＣＣＡＡＧＣＣＧＧＣＣＴＴＡＡＧＧＧＡＴＣＴＣＣＴＧＡＴＧＡＣＴＧＡＣＴＣＡＣＴＧＡＴＡＡＴＡＡＡＡＡＴＡＣＧＧ（配列番号２８）及びＧＧＧＣＧＣＧＴＡＴＴＴＡＡＡＴＡＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣＴＡＴＣＧＡＡＴＣＴＡＡＡＴＧＴＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＣＴＣＴＡＡ（配列番号２９）を用いて増幅され、ＮｇｏＭＩＶ及びＳｗａＩで切断され、次いで、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端化されたピキア・パストリスＨＩＳ４遺伝子の２．７ｋｂ断片を開放部位中に連結した。このプラスミドは、ｐＪＮ３３７と名付けた（図４Ｆ）。融合ライブラリーの構築に適した多重クローニング部位を有するプラスミドを構築するために、ＮｏｔＩ及びＰａｃＩでｐＪＮ３３７を切断し、インビトロで徐冷された２つのオリゴヌクレオチドＧＧＣＣＧＣＣＴＧＣＡＧＡＴＴＴＡＡＡＴＧＡＡＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＣＴＴＡＡＴ（配列番号３０）及びＴＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＴＴＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧＧＧＣ（配列番号３１）を開放部位中に連結して、ｐＪＮ３４７を作製した（図４Ｆ）。
【０３９５】
複数の栄養要求性マーカーを含有するｏｃｈ１ノックアウト株を作製するために、ｐＪＮ３２９の１０００μｇをＳｆｉＩで消化し、電気穿孔によって、Ｐ．パストリス株ＪＣ３０８（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ，２００１）を形質転換するために使用した。形質転換後に、室温で１０日間、ＵＲＡドロップアウトプレートを温置した。１０００のコロニーを拾い上げ、再度画線した。次いで、ＵＲＡドロップアウトプレートの２組上に、１０００個のクローン全てを画線した。１つの組は室温で温置したのに対して、第二の組は３７℃で温置した。正しいＯＣＨ１ノックアウトに関して検査するために、３７℃で増殖することができなかったが、室温で増殖したクローンをコロニーＰＣＲに供した。予想されるＰＣＲシグナル（約４．５ｋｂ）を示した１つのクローンをＹＪＮ１５３と表記した。
【実施例１２】
【０３９６】
コンビナトリアルＤＮＡライブラリーの性質決定
続いて、ＯＤ６００が２から６になるまで、増殖培地として、１％酵素抽出物、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０、１．３４％酵母窒素塩基、４×１０−５％ビオチン、及び１％グリセロールからなるＢＭＧＹ緩衝化されたメタノール複合培地５０ｍＬ中において、マンノシダーゼ構築物のＰ．パストリスゲノム中への組み込みを確認するコロニーＰＣＲによってスクリーニングされた陽性形質転換体を室温で増殖させ、ＯＤ６００が２から６になった時点で、５ｍＬＢＭＭＹ中において、室温で２４時間、レポータータンパク質の誘導前に、ＢＭＭＹ（１％酵素抽出物、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０、１．３４％酵母窒素塩基、４×１０−５％ビオチン及び１．５％メタノールからなる、増殖培地としての緩衝化されたメタノール複合培地）１０ｍＬで洗浄した。その結果、レポータータンパク質が単離され、そのグリカン構造を性質決定するために、質量分析法及びＨＰＬＣによって分析された。表６中の標的化ペプチドを用いて、小胞体又はゴルジの何れかに局在化されたマンノシダーゼ触媒ドメインは、主にＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２を含有するグリカンの、主にＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を含有するグリカンへのトリミングの著しいレベルを示した。レポーターの糖タンパク質のグリカン構造が、図５Ｃ、６Ｃ中のＰ．パストリスｏｃｈ１ノックアウトのものと、図５Ｄ、５Ｅ、６Ｄから６Ｆ中に示されているＭ．ムスキュラスのマンノシダーゼ構築物で形質転換された同じ株との間で比較すると、これは明瞭である。図５及び６は、Ｐ．パストリス中で著しいマンノシダーゼ活性を示すコンビナトリアルＤＮＡライブラリーから作製された構築物の発現を示す。ｐＧＣ５（サッカロミセスＭＮＳ１（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＢデルタ９９）（図５Ｄ、６Ｅ）の発現は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に修飾された全グリカンの約３０％を有するタンパク質を産生したのに対して、ｐＦＢ８（サッカロミセスＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡデルタ１８７）（図６Ｆ）は、約５０％のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を産生し、ｐＢＣ１８−５（サッカロミセスＶＡＮ１（ｓ）／Ｃ．エレガンスマンノシダーゼＩＢデルタ８０）（図５Ｅ）の発現は７０％Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を産生した。
【０３９７】
８．Ｎ−グリカンの放出
以前に報告された方法（Ｐａｐａｃ  ｅｔ  ａｌ．１９９８  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ８，４４５−４５４）の改変によって、糖タンパク質からグリカンを放出及び分離した。タンパク質を還元し、カルボキシメチル化し、膜をブロッキングした後、ウェルを水で３回洗浄した。Ｎ−グリカナーゼ（Ｇｌｙｋｏ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）の１ミリユニットを含有する１０ｍＭＮＨ４ＨＣＯ３ｐＨ８．３の３０μＬの添加によって、タンパク質を脱グリコシル化した。３７℃で１６時間後、遠心によってグリカンを含有する溶液を除去し、乾燥状態になるまで蒸発させた。
【０３９８】
９．マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析法
ＰＮＧアーゼ消化によって、Ｎ−グリカンが放出された後、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析法によってＮ−グリカンを分析した。遅延抽出を使用するＶｏｙａｇｅｒＤＥＰＲＯ線形ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）質量分析装置を用いて、グリカンの分子量を測定した。各ウェルからの乾燥されたグリカンを水１５μＬ中に溶解し、ステンレス鋼試料プレート上に０．５μＬを点状に添加し、Ｓ−ＤＨＢマトリックス（ジヒドロキシ安息香酸９ｍｇ／ｍＬ、１：１水／アセトニトリル中の５−メトキシサリチル酸１ｍｇ／ｍＬ、０．１％ＴＦＡ）の０．５μＬと混合し、乾燥させた。４ナノ秒のパルス時間で、パルス化された窒素レーザー（３３７ｎｍ）で照射によって、イオンを作製した。本装置は、１２５ナノ秒の遅延及び２０ｋＶの加速電圧を有する遅延抽出モードで操作された。格子電圧は９３．００％であり、ガイドワイヤー電圧は０．１％であり、内部圧は５×１０−７ｔｏｒｒ未満であり、低質量ゲートは８７５Ｄａであった。１００から２００レーザーパルスの合計からスペクトルを生成し、５００ＭＨｚデジタイザで取得した。外部分子量標準として、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２オリゴ糖を使用した。全てのスペクトルは、正のイオンモードで装置を生成した。
【実施例１３】
【０３９９】
α−１，２−マンノシダーゼによるインビボでのトリミング
実施例１１の工作された新しい株が実際に所望のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造をインビボで産生することを確かめるために、マンノシダーゼ活性に関して、細胞上清を検査した（図７から９参照）。以下に記載されている各構築物／宿主株に関して、４０分間、１．０ｍｌ／分の流速で、Ａｌｔｅｃｈ（Ａｖｏｎｄａｌｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）Ｅｃｏｎｏｓｉｌ−ＮＨ２樹脂（５μｍ）の４．０ｍｍ×２５０ｍｍカラムを用いて、３０℃でＨＰＬＣを実施した。図７及び８には、標準的なＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］の分解が起こり、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２に相関するピークをもたらすことが示された。図７には、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］の標準は２４．６１分で溶出し、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ａ］は１８．５９分で溶出した。図８では、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２は２１．３７分で溶出し、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は１５．６７分で溶出した。図９では、標準的なＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］は２０．８８分で溶出することが示された。
【０４００】
約１０のＯＤ６００になるまで、プラスミドｐＢＢ８（サッカロミセスＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡデルタ１８７）を含むＰ．パストリス細胞を、ＢＭＧＹ中において、３０℃で増殖させた。遠心によって細胞を採集し、ＡＯＸ１プロモーターの調節下で、Ｋ３（ヒトプラスミノーゲン由来のクリングル３）の産生を誘導するために、ＢＭＭＹに移した。誘導の２４時間後、遠心によって細胞を除去して、実質的に透明な上清を得た。マンノシダーゼアッセイのために上清の分取試料を取り出し、残りは分泌された可溶性Ｋ３を回収するために使用した。ＣＭ−セファロースクロマトグラフィー及び２５ｍＭＮａＡｃ、ｐＨ５．０の２５ｍＭＮａＡｃ、ｐＨ５．０、１ＭＮａＣｌの溶出グラジエントを用いる単一の精製工程は、３００から５００ｍＭＮａＣｌの間で溶出する９５％純粋なＫ３を得た。Ｋ３に由来するグリカンのＮ−グリカン分析は図６Ｆに示されている。上清のより初期に取り出された分取試料を、分泌されたマンノシダーゼ活性の存在に関してさらに検査した。２−アミノベンゾアミド標識されたＮ結合型オリゴマンノース９（Ｍａｎ９−２−ＡＢ）（Ｇｌｙｋｏ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）の市販されている標準をＢＭＭＹ（図７Ａ）、上記分取試料由来の上清（図７Ｂ）及び（Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ０２／００８５６Ａ２から得られた）トリコデルマ・リーゼイ由来のα１，２−マンノシダーゼの７５ｍＵ／ｍＬの１０ｎｇを含有するＢＭＭＹ（図７Ｃ）に添加した。室温で２４時間温置した後、マンノシダーゼトリミングの程度を測定するために、アミノシリカＨＰＬＣによって試料を分析した。
【０４０１】
同様に、プラスミドｐＧＣ５（サッカロミセスＭＮＳ１（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＢデルタ９９）を含むＰ．パストリス細胞を増殖させ、アッセイした。約１０のＯＤ６００になるまで、ＢＭＧＹ中にて、室温で細胞を増殖させた。遠心によって細胞を採集し、ＡＯＸ１プロモーターの調節下で、Ｋ３の産生を誘導するために、ＢＭＭＹに移した。誘導の２４時間後、遠心によって細胞を除去して、実質的に透明な上清を得た。マンノシダーゼアッセイのために上清の分取試料を取り出し、残りは分泌された可溶性Ｋ３を回収するために使用した。ＣＭ−セファロースクロマトグラフィー及び２５ｍＭＮａＡｃ、ｐＨ５．０の２５ｍＭＮａＡｃ、ｐＨ５．０、１ＭＮａＣｌの溶出グラジエントを用いる単一の精製工程は、３００から５００ｍＭＮａＣｌの間で溶出する９５％純粋なＫ３を得た。Ｋ３に由来するグリカンのＮ−グリカン分析は図５Ｄに示されている。図８Ｂに示されているように、上清のより初期に取り出された分取試料を、分泌されたマンノシダーゼ活性の存在に関してさらに検査した。Ｍａｎ９−２−ＡＢ（Ｇｌｙｋｏ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）の市販されている標準をＢＭＭＹ（図８Ａ）、上記分取試料由来の上清（図８Ｂ）及び（Ｃｏｎｔｒｅｒａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ０２／００８５６Ａ２から得られた）トリコデルマ・リーゼイ由来のα１，２−マンノシダーゼの７５ｍＵ／ｍＬの１０ｎｇを含有するＢＭＭＹ（図８Ｃ）に添加した。室温で２４時間温置した後、マンノシダーゼトリミングの程度を測定するために、アミノシリカＨＰＬＣによって試料を分析した。
【０４０２】
Ｍａｎ９−２−ＡＢを基質として使用し、温置の２４時間後に、ｐＦＢ８（サッカロミセスＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡデルタ１８７）株消化物（図７Ｂ）及びｐＧＣ５（サッカロミセスＭＮＳ１（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＢデルタ９９）株消化物（図８Ｂ）の上清中には、マンノシダーゼ活性は実質的に存在しないのに対して、図７Ｃ及び８Ｃに示されているように、陽性対照（Ｃｏｎｔｒｅｒａｓから得られたＴ．リーゼイ由来の精製されたα−１，２−マンノシダーゼ）は、同じ条件下で、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２への完全な転化をもたらす。これは、Ｐ．パストリスｐＧＣ５株及びこれまでに報告されたものとは明瞭に異なるｐＦＢ８株（Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ０２／００８５６Ａ２）中でのインビボマンノシダーゼトリミングを示す決定的なデータである。
【０４０３】
図９は、マンノシダーゼ酵素の局在化及び活性をさらに実証する。約１０のＯＤ６００になるまで、ｐＢＣ１８−５（サッカロミセスＶＡＮ１（ｓ）／Ｃ．エレガンスマンノシダーゼＩＢデルタ８０）を含むＰ．パストリスを、ＢＭＧＹ中において、室温で増殖させた。遠心によって細胞を採集し、ＡＯＸ１プロモーターの調節下で、Ｋ３の産生を誘導するために、ＢＭＭＹに移した。誘導の２４時間後、遠心によって細胞を除去して、実質的に透明な上清を得た。マンノシダーゼアッセイのために上清の分取試料を取り出し、残りは分泌された可溶性Ｋ３を回収するために使用した。ＣＭ−セファロースクロマトグラフィー及び２５ｍＭＮａＡｃ、ｐＨ５．０の２５ｍＭＮａＡｃ、ｐＨ５．０、１ＭＮａＣｌの溶出グラジエントを用いる単一の精製工程は、３００から５００ｍＭＮａＣｌの間で溶出する９５％純粋なＫ３を得た。Ｋ３に由来するグリカンのＮ−グリカン分析は図５Ｅに示されている。図９Ｂに示されているように、上清のより初期に取り出された分取試料を、分泌されたマンノシダーゼ活性の存在に関してさらに検査した。Ｍａｎ８−２−ＡＢ市販されている標準（Ｇｌｙｋｏ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）を、ＢＭＭＹ（図９Ａ）、上記分取試料ｐＢＣ１８−５（サッカロミセスＶＡＮ１（ｓ）／Ｃ．エレガンスマンノシダーゼＩＢデルタ８０）由来の上清（図９Ｂ）及び異なる融合構築物ｐＤＤ２８−３（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ５０１０８）由来のサッカロミセスＭＮＮ１０（ｍ）／Ｈ．サピエンスマンノシダーゼＩＢデルタ９９）由来の培地を含有するＢＭＭＹ（図９Ｃ）に添加した。室温で２４時間温置した後、マンノシダーゼトリミングの程度を測定するために、アミノシリカＨＰＬＣによって試料を分析した。図９Ｂは、陰性結果を示す融合構築物ｐＤＤ２８−３（サッカロミセスＭＮＮ１０（ｍ）Ｈ．サピエンスマンノシダーゼＩＢデルタ９９）（図９Ｃ）と比較した細胞内マンノシダーゼ活性を示す。
【実施例１４】
【０４０４】
工作されたα−１，２−マンノシダーゼの至適ｐＨアッセイ
約１７のＯＤ６００になるまで、プラスミドｐＢＢ２７−２（サッカロミセスＭＮＮ１０（ｓ）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ５０１０８から得た）／Ｃ．エレガンスマンノシダーゼＩＢデルタ３１）を含むＰ．パストリス細胞を、ＢＭＧＹ中において、室温で増殖させた。これらの細胞約８０μＬをＢＭＧＹ６００μＬ中に接種し、一晩増殖させた。続いて、遠心によって細胞を採集し、ＡＯＸ１プロモーターの調節下で、Ｋ３（ヒトプラスミノーゲン由来のクリングル３）の産生を誘導するために、ＢＭＭＹに移した。誘導の２４時間後、遠心によって細胞を除去して、実質的に透明な上清を得た（ｐＨ６．４３）。マンノシダーゼ至適ｐＨアッセイのために、上清を取り出した。様々なｐＨに調整された上清２０μＬに、蛍光標識されたＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２（０．５μｇ）を添加し（図１１）、室温で８時間温置した。温置後、ＥｃｏｎｏｓｉｌＮΗ２４．６Ｘ２５０ｍｍ、５ミクロンビーズ、アミノ結合されたシリカカラム（Ａｌｔｅｃｈ，Ａｖｏｎｄａｌｅ，ＰＡ）を用いるＨＰＬＣによって、試料を分析した。流速は、４０分間１．０ｍｌ／分であり、カラムは３０℃に維持した。等濃度的に（６８％Ａ：３２％Ｂ）３分間溶出した後、グリカン（１８）を溶出するために、線形溶媒グラジエント（６８％Ａ：３２％Ｂから４０％Ａ：６０％Ｂへ）を２７分にわたって使用した。溶媒Ａ（アセトニトリル）及び溶媒Ｂ（ギ酸アンモニウム、５０ｍＭ、ｐＨ４．５。走行の間、カラムを溶媒（６８％Ａ：３２％Ｂ）で２０分間平衡化させた。  
【実施例１５】
【０４０５】
構造ＧＩｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有するＮ−グリカンを産生するようにＰ．パストリスを工作する
複雑なハイブリッドＮ−グリカンの成熟のために、ＧｌｃＮＡｃ転移酵素Ｉ活性が必要とされる（米国特許第５，８３４，２５１号）。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は、ＧｌｃＮＡｃ転移酵素Ｉによるトリマンノースステムの末端α−１，３マンノース残基にＮ−アセチルグルコサミンの付加後に、マンノシダーゼＩＩによってのみトリミング（ヒトグリコフォームの形成において必要な工程）され得る（Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ，１９９１Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ１(５):４５３−４６１）。従って、Ｃ．エレガンス及びホモサピエンス由来のＧｌｃＮＡｃ転移酵素Ｉ遺伝子の適切に標的化された触媒ドメインをコードするＤＮＡ断片並びにＫＴＲ相同体であるＳ．セレビシエ：Ｄ２、Ｄ９及びＪ３由来の相同性に基づくＳ．セレビシエ及びＰ．パストリスα−１，２−マンノシル転移酵素由来のＧＬＳ、ＭＮＳ、ＳＥＣ、ＭＮＮ９、ＶＡＮ１、ＡＮＰ１、ＨＯＣ１、ＭＮＮ１０、ＭＮＮ１１、ＭＮＴ１、ＫＴＲ１、ＫＴＲ２、ＭＮＮ２、ＭＮＮ５、ＹＵＲ１、ＭＮＮ１及びＭＮＮ６を含むコンビナトリアルＤＮＡライブラリーを調製した。表１０は、Ｐ．パストリス及びＫ．ラクティスＧｎＴＩ由来のＳＥＣ及びＯＣＨ１などの標的化ペプチド配列を含むが、これらに限定されない（表６及び表１０参照）。
【０４０６】
【表９】
0005514541.tif 000014
【０４０７】
Ｐ．パストリス中のＯＣＨ１（長い、中間及び短い）（実施例１１参照）及びＳ．セレビシエのＭＮＮ９（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔＰ３９１０７）（短い及び中間）から、標的化ペプチド配列を選択した。触媒ドメインは、それぞれ、３８及び８６アミノ酸Ｎ末端欠失を有するヒトＧｎＴＩ、３５及び６３アミノ酸欠失を有するＣ．エレガンス（ｇｌｙ−１２）ＧｎＴＩ並びに８８アミノ酸Ｎ末端欠失を有するＣ．エレガンス（ｇｌｙ−１４）ＧｎＴＩ及び３３及び１０３アミノ酸Ｎ末端欠失を有するＸ．レアビス（Ｘ．ｌｅａｖｉｓ）ＧｎＴＩから選択された。
【０４０８】
オリゴヌクレオチド５’−ＴＧＧＣＡＧＧＣＧＣＧＣＣＴＣＡＧＴＣＡＧＣＧＣＴＣＴＣＧ−３’（配列番号３２）及び５’−ＡＧＧＴＴＡＡＴＴＡＡＧＴＧＣＴＡＡＴＴＣＣＡＧＣＴＡＧＧ−３’（配列番号３３）及びテンプレートとしてのベクターｐＨＧ４．５（ＡＴＣＣ＃７９００３）を用いるＰＣＲによって、最初の１５４塩基対を欠く、ヒトＮ−アセチルグルコサミニル転移酵素Ｉ（ＭＧＡＴＩ、ＧｅｎＢａｎｋ受付番号ＮＭ００２４０６）をコードする遺伝子の一部を増幅した。得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ中にクローニングし、正しい配列を確認した。ＡｓｃＩ及びＰａｃＩでの消化後、ｐＮＡを作製するために、末端切断されたＧｎＴＩをプラスミドｐＪＮ３４６中に挿入した。ＮｏｔＩ及びＡｓｃＩでのｐＪＮ２７１の消化後、ＧｎＴＩとのＭＮＮ９膜貫通ドメインのインフレーム融合物を作製するために、１２０塩基対挿入物をｐＮＡ中に連結して、ｐＮＡ１５を作製した。
【０４０９】
宿主生物は、高マンノシル化を欠失し（例えば、ｏｃｈ１変異体）、ゴルジ及び／又は小胞体中で基質ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを提供し（すなわち、機能的ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターを含有する。）、並びにゴルジ及び／又は小胞体中で構造Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のＮグリカンを提供する（例えば、Ｐ．パストリスｐＦＢ８（上記のサッカロミセスＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡデルタ１８７））Ｐ．パストリスの株である。まず、クルイベロミセス・ラクティスＭＮＮ２−２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受付番号：ＡＦＩ０６０８０）（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターをコードする。）を含有するｐＰＢ１０３で、Ｐ．パストリスｐＦＢ８を形質転換し、ｐＢＬＡＤＥ−ＳＸプラスミドのＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩ部位の中にクローニングした（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ，２００１）。次いで、外来又は内在性のＧｎＴＩ／局在化遺伝子の組み合わせをコードする先述のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーを形質転換し、コロニーＰＣＲによって、ＧｎＴＩ構築物の存在に関して、コロニーを選択し、分析した。本発明者らの形質転換及び組み込み効率は、一般に、８０％を上回り、一旦、強固な形質転換パラメータが確立されたら、ＰＣＲスクリーニングを省略することができる。
【０４１０】
タンパク質精製
Ｂｅｃｋｍａｎ  ＢｉｏＭｅｋ  ２０００研究室ロボット上で、９６ウェルフォーマットを使用するＮｉ−アフィニティークロマトグラフィーによって、培地からＫ３を精製した。ロボット精製は、それらのＨｉｓＢｉｎｄ樹脂に対して、Ｎｏｖａｇｅｎによって提供されたプロトコールを改変したものである。特異的な末端ＧｌｃＮＡｃ結合抗体又は末端ＧｌｃＮＡｃを結合するグリフォニア・シンプリフィコリア（Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ  ｓｉｍｐｌｉｆｉｃｏｌｉａ）由来のＧＳＩＩレクチンなどのレクチン（ＥＹ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｍａｔｅｏ，ＣＡ）を用いて、別のスクリーニング法を実施し得る。これらのスクリーニングは、ＦＩＴＣなどの蛍光標識で修飾されたレクチン若しくは抗体を使用することによって自動化し、又はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって分析することができる。
【０４１１】
分泌されたＫ３は、Ｎｉ−アフィニティークロマトグラフィーによって精製し、定量することが可能であり、タンパク質の等しい量が高タンパク質結合９６ウェルプレートに結合され得る。ＢＳＡでのブロッキング後、ＧＳＩＩ−ＦＡＣＳレクチンでプレートを探査し、最大蛍光応答に関してスクリーニングすることができる。上記グリコシル化されたタンパク質を検出する好ましい方法は、ＭＡＬＤ−ＴＯＤ質量分析法によるスクリーニングに続く、９６ウェル培養された形質転換体の上清からの分泌されたＫ３のアフィニティー精製を含む。形質転換されたコロニーを拾い上げ、ＢＭＧＹ中、３０℃で、２ｍＬの９６ウェルプレート中、１０のＯＤ６００まで増殖させた。遠心によって細胞を採集し、ＢＭＭＹ中で洗浄し、ＢＭＭＹ２５０μＬ中に再懸濁した。誘導の２４時間後に、遠心によって細胞を除去し、上清を回収し、Ｎｉアフィニティークロマトグラフィーによって上清からＫ３を精製した。Ｎ−グリカンを放出させ、本明細書に記載されているように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ遅延抽出質量分析法によって分析した。
【０４１２】
要約すれば、本発明の方法は、図１０Ｂに示されているように、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を高い収率で産生するＰ．パストリスの株を与える。Ｎ−グリカンの少なくとも６０％が、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２である。現在まで、何れかの酵母中において、分泌された可溶性糖タンパク質上でのＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の形成を記載する報告は存在しない。本明細書に提示されている結果は、ＧｎＴＩ活性とともにＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターの添加が主なＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を産生することを示しており、これは、１４５７（ｍ／ｚ）のピークによって確認される（図１０Ｂ）。
【０４１３】
株ＰＢＰ−３の構築：
Ｋ３（デルタｏｃｈ１、ａｒｇ−、ａｄｅ−、ｈｉｓ−）を発現するＰ．パストリス株を、以下のベクターで連続して形質転換した。まず、電気穿孔によって、Ｐ．パストリス株中に、ｐＦＢ８（サッカロミセスＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡデルタ１８７）を形質転換した。第二に、ｐＢＬＡＤＥ−ＳＸプラスミド（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ２６３（２００１）１５９−１６９）中にクローニングされ、ＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩ酵素で消化されたクルイベロミセス・ラクティスＭＮＮ２−２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受付番号：ＡＦ１０６０８０）（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターをコードする。）を含有するｐＰＢ１０３をＰ．パストリス株中に形質転換した。第三に、ｐＪＮ３３６中にＮｏｔＩ−ＰａｃＩ断片としてクローニングされた遺伝子をコードするサッカロミセスＭＮＮ９（ｓ）／ヒトＧｎＴＩデルタ３８を含有するｐＰＢ１０４をＰ．パストリス株中に形質転換した。
【実施例１６】
【０４１４】
Ｐ．パストリス中のＣＭＰ−シアル酸生合成経路を工作する
ＣＭＰ−シアル酸合成に関与する酵素をクローニングする
真菌宿主細胞中にＣＭＰ−シアル酸生合成経路をクローニングするための１つの方法は、各翻訳領域（ＯＦＲ）に対して特異的なプライマー対とともに、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、イー・コリゲノムＤＮＡからイー・コリＮｅｕＡ、ＮｅｕＢ及びＮｅｕＣ遺伝子を増幅することを含む（下表１２、並びに、それぞれ、図１７、１６及び１５）。
【０４１５】
ほ乳動物のＣＭＰ−シアル酸生合成経路をクローニングするために、表１２に記されているプライマー対の組と組み合わせたマウス下垂体ｃＤＮＡライブラリーから、マウスＣＭＰ−Ｓｉａ合成酵素翻訳領域（図１８）を増幅した。ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ（ＣＭＰ−Ｓｉａ中間体を作製するための別の方法において既に議論した。）は、対応する遺伝子に対して特異的なプライマー対と組み合わせてＰＣＲを用いて、ブタｃＤＮＡから増幅した（表１２及び図２０）。シアラートアルドラーゼ遺伝子（図２２）は、表１２に示されているプライマー対と組み合わせて、ポリメラーゼ連鎖反応を用いてイー・コリゲノムＤＮＡから増幅した。表１２に示されているプライマー対と組み合わせたポリメラーゼ連鎖反応を用いて、マウス二機能性ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ遺伝子をマウス肝臓から増幅した。表１２に示されているプライマー対と組み合わせたポリメラーゼ連鎖反応を用いて、マウスＮ−アセチルノイラミナート−９−ホスファートシンターゼ遺伝子をマウス肝臓から増幅した。表１２に示されているプライマー対と組み合わせたポリメラーゼ連鎖反応を用いて、ヒトＣＭＰ−Ｓｉａ合成酵素遺伝子をヒト肝臓から増幅した。各事例において、以下の温度サイクリング条件、すなわち、９７℃１分間、１サイクル；９７℃２０秒間、６０℃３０秒間、７２℃２分間、２５サイクル；７２℃２分間、１サイクル下で、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ酵素を用いて増幅した。変異の不存在を確認するためのＤＮＡ配列決定後に、適切な真菌発現ベクター中にそれぞれのサブクローニングを容易にするための適合性の制限部位を含有するプライマーを用いて、各ＯＲＦを再度増幅する。
【０４１６】
【表１０】
0005514541.tif 000015
0005514541.tif 000016
【０４１７】
１１．Ｐ．パストリス中の細菌のＮｅｕ遺伝子の発現
酵母組み込みベクターｐＪＮ３４８（ＧＡＰＤＨプロモーター、ＮｏｔＩＡｓｃＩＰａｃＩ制限部位カセット、ＣｙｃＩＩ転写ターミネーター、陽性選択マーカーとしてＵＲＡ３を含む修飾されたｐＵＣ１９ベクター）中のＮｏｔＩ−ＡｓｃＩ部位中に、ＮｅｕＣ遺伝子のＰＣＲ増幅された１１７６塩基対断片を連結して、ｐＳＨ２５６を産生する。同様に、陽性選択マーカーとしてＡＤＥを使用して、ＧＡＰＤＨプロモーターの調節下で、酵母組み込みベクターｐＪＮ３３５中のＮｏｔＩ−ＰａｃＩ部位中にＮｅｕＢ遺伝子のＰＣＲ増幅された断片（１０４１塩基対）を連結して、ｐＳＨ２５５を作製した。陽性選択マーカーとしてＡＲＧを使用して、ＧＡＰＤＨプロモーターの調節下で、酵母組み込みベクターｐＪＮ３４６中のＮｏｔＩ−ＰａｃＩ部位中にＮｅｕＡ遺伝子のＰＣＲ増幅された１２６０塩基対断片を連結して、ｐＳＨ２５４を作製した。電気穿孔によって、各ベクターでＰ．パストリスを形質転換した後、新たに導入されたベクターの陽性選択を容易にするために、対応するドロップアウト寒天プレート上に、細胞を播種した。各遺伝子の導入を確認するために、各ドロップアウトプレート上に数百のクローンの再度斑点状に播種し、２６℃で２日間増殖させた。十分な材料が増殖したら、導入された遺伝子に対して特異的なプライマーを用いるコロニーＰＣＲによって、各クローンをスクリーニングした。Ｔａｋａｒａ（Ｍａｄｉｓｏ，ＷＩ）のポリメラーゼＥｘＴａｑＴＭを使用するコロニーＰＣＲのための条件は、以下のとおりであった。９７℃３分間、１サイクル；９７℃２０秒間、５０℃３０秒間、７２℃２分間／ｋｂ、３０サイクル；７２℃１０分間、１サイクル。続いて、増殖培地２００ｍＬを含有するバッフル付きフラスコ中で、コロニーＰＣＲから得られた数個の陽性クローンを増殖した。２．６８ｇ／Ｌ酵母窒素塩基、２００ｍｇ／Ｌビオチン及び２ｇ／Ｌデキストロースを含有する増殖培地の塩基組成に、使用されている株に応じて、適切なアミノ酸を補充した。２０ｍＭＭａｎＮＡｃの存在又は不存在下において、この培地中で細胞を増殖した。３０℃で、４から６日間、バッフル付きフラスコ中での増殖後、本実施例で以下に記載されているように、細胞を沈降させ、シアル酸経路の中間体に関して分析した。
【０４１８】
１２．Ｐ．パストリス中でのＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ遺伝子の発現
陽性選択マーカーとしてＵＲＡ３を使用して、ＧＡＰＤＨプロモーターの調節下で、酵母組み込みベクターｐＪＮ３４８中のＮｏｔＩ−ＰａｃＩ部位中にブタＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ遺伝子のＰＣＲ増幅された断片を連結する。内在性ＧｌｃＮＡｃを産生するＰ．パストリス株を、ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ遺伝子断片を担持するベクターで形質転換し、形質転換体に関してスクリーニングした。
【０４１９】
１３．Ｐ．パストリス中のシアル酸アルドラーゼ遺伝子の発現
陽性選択マーカーとしてＡＤＥを使用して、ＧＡＰＤＨプロモーターの調節下で、酵母組み込みベクターｐＪＮ３３５中のＮｏｔＩ−ＰａｃＩ部位中にイー・コリシアル酸アルドラーゼ遺伝子のＰＣＲ増幅された断片を連結し、ｐＳＨ２７５を作製する。ＭａｎＮＡｃを産生するＰ．パストリス株を、シアル酸アルドラーゼ遺伝子断片を担持するベクターで形質転換し、形質転換体に関してスクリーニングした。
【０４２０】
１４．Ｐ．パストリス中でのＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼをコードする遺伝子の発現
陽性選択マーカーとしてＵＲＡを使用して、ＧＡＰＤＨプロモーターの調節下で、酵母組み込みベクターｐＪＮ３４８中のＮｏｔＩ−ＰａｃＩ部位中にマウス二機能性ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ酵素をコードする遺伝子のＰＣＲ増幅された断片を連結し、ｐＳＨ２８４を作製する。ＭａｎＮＡｃを産生するＰ．パストリス株を、前記遺伝子断片を担持するベクターで形質転換し、形質転換体に関してスクリーニングした。
【０４２１】
１５．Ｐ．パストリス中でのＮ−アセチルノイラミナート−９−ホスファートシンターゼをコードする遺伝子の発現
陽性選択マーカーとしてＡＤＥを使用して、ＧＡＰＤＨプロモーターの調節下で、酵母組み込みベクターｐＪＮ３３５中のＮｏｔＩ−ＰａｃＩ部位中にマウスＮ−アセチルノイラミナート−９−ホスファートシンターゼ遺伝子のＰＣＲ増幅された断片を連結し、ｐＳＨ２８５を作製する。ＭａｎＮＡｃ−６−Ｐを産生するＰ．パストリス株を、上記遺伝子断片を担持するベクターで形質転換し、形質転換体に関してスクリーニングした。
【０４２２】
１６．Ｎ−アセチルノイラミナート−９−ホスファターゼをコードする遺伝子の同定、クローニング及び発現
Ｎ−アセチルノイラミナート−９−ホスファターゼ活性は、ラット肝細胞の細胞質画分中に検出されている（Ｖａｎ  Ｒｉｎｓｕｍ，１９８４）。本発明者らは、この方法を繰り返し、ＮｅｕＡｃ−９−Ｐに対して選択的なホスファターゼ活性を含有する細胞抽出画分を単離した。この画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動は、単一のタンパク質バンドを同定する。続いて、この試料をＰＤＶＦ膜上に電気ブロットし、エドマン分解によってＮ末端アミノ酸配列を同定した。同定された配列によって、単離されたタンパク質の翻訳領域の５’末端に対する縮重オリゴヌクレオチドの作製が可能となる。製造業者の指示書に従って、ラット肝臓Ｍａｒａｔｈｏｎ−ｒｅａｄｙｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中に供給されたＡＰ１プライマーと組み合わせたこれらの縮重プライマーを用いて、完全長翻訳領域を単離した。続いて、陽性選択マーカーとしてＨＩＳ遺伝子を用いて、ＧＡＰＤＨプロモーターの調節下で、完全な翻訳領域を酵母組み込みベクターｐＪＮ３４７中に連結した。ＮｅｕＮＡｃ−９−Ｐを産生するＰ．パストリス株を、本実施例で上記されているように、所望の遺伝子断片を担持するベクターで形質転換し、形質転換体に関してスクリーニングした。
【０４２３】
１７．Ｐ．パストリス中でのＣＭＰ−シアル酸合成酵素遺伝子のクローニング及び発現
陽性選択マーカーとしてＡＲＧ遺伝子を使用して、ＧＡＰＤＨプロモーターの調節下で、酵母組み込みベクターｐＪＮ３４６中のＮｏｔＩ−ＰａｃＩ部位中にマウスＣＭＰ−Ｓｉａ合成酵素遺伝子のＰＣＲ増幅された断片を連結した。シアル酸を産生するＰ．パストリス株を、本実施例で上記されているように、上記遺伝子断片を担持するベクターで形質転換し、形質転換体に関してスクリーニングした。同様に、ヒトＣＭＰ−Ｓｉａ合成酵素遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受付番号：ＡＦ３９７２１２）を増幅し、陽性選択マーカーとしてＡＲＧを使用して、ＧＡＰＤＨプロモーターの調節下で、酵母発現ベクターｐＪＮ３４６のＮｏｔＩ−ＰａｃＩ部位中に連結して、ベクターｐＳＨ２５７を作製した。シアル酸を産生することができるＰ．パストリス株を、電気穿孔によってｐＳＨ２５７で形質転換し、ＣＭＰ−Ｓｉａを生成することができる株を作製する。
【０４２４】
１８．Ｐ．パストリス中でのハイブリッドＣＭＰ−Ｓｉａ経路の発現
Ｐ．パストリス株ＪＣ３０８（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ，２００１）を超形質転換した。すなわち、電気穿孔によって、ＮｅｕＣ（ｐＳＨ２５６）、ＮｅｕＢ（ｐＳＨ２５５）及びｈＣＭＰ−Ｓｉａ合成酵素（ｐＳＨ２５７）を含有するベクターの各々２０ｍｇで同時に形質転換した。ヒスチジンが補充された最小培地（１．３４ｇ／Ｌ酵母窒素塩基、２００ｍｇ／Ｌビオチン、２ｇ／Ｌデキストロース、２０ｇ／Ｌ寒天及び２０ｍｇ／ＬＬ−ヒスチジンを含有する。）上に、得られた細胞を播種した。３０℃で４日間の温置後、ヒスチジンが補充された最小培地プレート上に（組成に関しては、上記参照）再度斑点状に播種することによって、数百のクローンを単離した。クローンに対してコロニーＰＣＲ（本実施例において上記されているとおり）を実施する前に、斑点状にサ再度播種されたクローンを２日間増殖した。形質転換されたクローン中での各翻訳領域の存在を確認するために、ＮｅｕＣ、ＮｅｕＢ及びｈＣＭＰ−Ｓｉａ合成酵素に対して特異的なプライマーを使用した。（２．６８ｇ／Ｌ酵母窒素塩基、２００ｍｇ／Ｌビオチン、２０ｍｇ／ＬＬ−ヒスチジン及び２ｇ／Ｌデキストロースを含有する）増殖培地２０ｍｍＬを含有するバッフル付きフラスコ中で、３つの翻訳領域全てに対して陽性な１２のクローン（ＹＳＨ９９ａ−１と表記される。）を増殖させた。２０ｍＭＭａｎＮＡｃの存在又は不存在下で細胞を増殖させることによって、ＭａｎＮＡｃを加えた増殖培地を補充することの効果を調べた。３０℃で、４から６日間、バッフル付きフラスコ中での増殖後、細胞を沈降させ、本実施例で以下に記載されているように、シアル酸経路の中間体の存在に関して分析する。
【０４２５】
本実施例の以下で概説されているアッセイを用いて細胞抽出物を比較すると、外来ＣＭＰ−Ｓｉａなしに増殖されたＰ．パストリスＹＳＨ９９ａ由来の細胞抽出物は、Ｓｉａの受容体基質上への転移を示し、外来ＣＭＰ−Ｓｉａ産生の存在を示唆する（図２５）。一シアル酸付加された及び二シアル酸付加された二分岐Ｎ−グリカンは何れも、それぞれの対応する時間である２０分及び２３分に溶出した。さらに、その後のシアリダーゼ処理は、シアル酸の除去を示した（図２６）。従って、上述のようなハイブリッドＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路を有するように工作された酵母株（ＮｅｕＣ、ＮｅｕＢ及びｈＣＭＰ−Ｓｉａ合成酵素を含有する。）は、ＣＭＰ−シアル酸の内在性プールを生成できることが示された。
【０４２６】
１９．遺伝的に改変されたＰ．パストリス中のシチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の存在に関するアッセイ
冷ＰＢＳ緩衝液で酵母細胞を３回洗浄し、１００ｍＭ炭酸水素アンモニウムｐＨ８．５中に懸濁し、氷上に保った。Ｆｒｅｎｃｈ圧力セル、次いで、音波処理を用いて、細胞を溶解した。超遠心によって、可溶性の細胞内容物を細胞破片から分離した。６０％の最終濃度になるように、氷冷したエタノールを上清に添加し、超遠心による不溶性タンパク質を除去する前に、１５分間氷上に保った。上清を凍結し、凍結乾燥によって濃縮した。乾燥された試料を（ｐＨが８．０であることを確保しながら）水の中に再懸濁し、次いで、予めすすがれた１０，０００ＭＷＣＯＣｅｎｔｒｉｃｏｎカートリッジを通してろ過した。製造業者の指示書に従ってＭｏｎｏＱイオン交換カラム上でろ液を分離し、真正のＣＭＰ−シアル酸と同時溶出した溶出画分をプールし、凍結乾燥した。
【０４２７】
乾燥されたろ液を１００ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ６．５の１００μＬ中に溶解し、α−２，６シアリル転移酵素１１μＬ（５ｍＵ）及びα−２，３シアリル転移酵素３．３μＬ（１２ｍＵ）を添加し、陰性対照のために混合物１０μＬを取り出した。続いて、残りの混合物に、２−アミノベンゾアミド標識されたアシアロ二分岐Ｎ−グリカン（ＮＡ２，Ｇｌｙｃｏ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｒａｆａｅｌ，ＣＡ）７μＬ（１．４μｇ）を添加した後、陽性対照のために１０μＬを取り除いた。次いで、試料及び対照反応を３７℃で１６時間温置した。次いで、製造業者の指示書に従って、各試料の１０μＬをＧｌｙｃｏＳｅｐ−Ｃ陰イオン交換カラム上で分離した。相対保持時間を確立するために、一シアル酸付加及び二シアル酸付加された二分岐グリカンのそれぞれの約０．０５μｇからなる別個の対照をカラム上で分離した。結果は、図２３から２７に示されている。
【０４２８】
２０．シアリダーゼ処理
シアリル転移酵素の存在下で、Ｐ．パストリスＹＨＳ９９ａ由来の抽出物とともに、二分岐のガラクトシル化されたＮ−グリカンを温置することによって、シアル酸付加されたＮ−グリカンが産生され、続いて、これを以下のように脱シアル酸化した。転移酵素を除去するために、１０，０００分子量のカットオフを有するシアル酸処理された試料をＭｉｃｒｏｃｏｎカートリッジに通過させた。水１００μＬでカートリッジを２回洗浄し、元の溶出液とともにこれをプールした。溶出液のＨＰＬＣによる分析（図２６）は、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ処理の前のＨＰＬＣスペクトルと同様のスペクトルを与えた。乾燥状態まで残りの試料を凍結乾燥し、１×ＮＥＢＧ１緩衝液２５μＬ中に再懸濁した。シアリダーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ＃Ｐ０７２０Ｌ，Ｂｅｖｅｒｌｅｙ，ＭＡ）の１００Ｕの添加後、以前に記載されているように、再懸濁された試料を、ＨＰＬＣ分析の前に、３７℃で一晩温置した。
【実施例１７】
【０４２９】
シアル酸をＮ−グリカンに転移することができるＰ．パストリス株を工作する
本明細書に詳しく記載されているように、インビボでシアル酸をＮ−グリカンに転移することができるＰ．パストリス株を作製した。
【０４３０】
２１．ヒトＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ（ｈＧＮＥ）及びＮ−アセチルノイラミナート−９−ホスファートシンターゼ（ＨｓｉａＰｓｙｎ）の作製
製造業者の指示に従って、ＡｄｖａｎｔａｇｅＴＭＤＮＡポリメラーゼ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともに、オリゴヌクレオチドプライマーＧＧＧＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧＡＡＴＧＧＡＡＡＴＡＡＣＣＧＡＡＡＧＣＴＧＣＧ（ｈＧＮＥＮｏｔＩ／Ｋｏｚ）（配列番号７７）及びＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＴＡＧＴＡＧＡＴＣＣＴＧＣＧＴＧＴＴＧＴＧＴＡＧＴＣＣＡＧＡＡＣ（ｈＧＮＥＰａｃＩｒｅｖ）（配列番号７８）を用いて、ヒトＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼをコードする遺伝子配列（ｈＧＮＥ；Ｇｅｎｂａｎｋ受付番号ＡＪ２３８７６４）を、ヒト肝臓ｃＤＮＡからＮｏｔＩ−ＰａｃＩ断片として増幅した。サーモサイクリングに対して使用した条件は、以下のとおりであった。９５℃２分、１サイクル；９７℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃５分、２５サイクル；７２℃５分。得られた２．２ｋｂの断片をｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、配列を決定し、ｐＳＨ２８１と表記した。（米国公開２００４／０２３００４２に記載されているように）、ＮｏｔＩ−ＰａｃＩ断片として、ｈＧＮＥをｐＳＨ２８１からｐＪＮ３４８中にクローニングし、ベクターｐＳＨ２８４を作製した。株に応じてアミノ酸が補充された、２．６８ｇ／Ｌ酵母窒素塩基、２００ｍｇ／Ｌビオチン及び２ｇ／ＬデキストロースからなるＢＭＧＹ培地２００ｍＬを含有するバッフル付きフラスコ中で、コロニーＰＣＲから得られた陽性コロニーを増殖させた。
【０４３１】
プライマーＧＧＧＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＣＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＴＧＴＣＣＣＧ（ｈＳｉａＰｓｙｎＮｏｔＩ／Ｋｏｚ）（配列番号７９）及びＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＡＧＡＣＴＴＧＡＴＴＴＴＴＴＴＧＣＣＡＴＧＡＴＴＡＴＣＴＡＣＣ（ｈＳｉａＰｓｙｎＰａｃＩｒｅｖ）（配列番号８０）を用いて、ヒトＮ−アセチルノイラミナート−９−ホスファートシンターゼをコードする遺伝子配列（ｈＳｉａＰｓｙｎ；Ｇｅｎｂａｎｋ受付番号ＡＦ２５７４６６）を上記のように増幅した。サーモサイクリングのために使用した条件は、５分に代えて、２．５分の伸長であった。得られた１．１ｋｂの断片をｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、配列を決定し、ｐＳＨ２８２と表記した。（米国公開２００４／２３００４２に開示されているように）、ＮｏｔＩ−ＰａｃＩ断片として、ｈＳｉａＰｓｙｎをｐＳＨ２８２からｐＪＮ６６４中にクローニングし、ベクターｐＳＨ３０２を得た。プライマーＧＧＣＴＣＧＡＧＡＴＴＴＡＡＡＴＧＣＧＴＡＣＣＴＣＴＴＣＴＡＣＧＡＧＡＴＴＣ（Ｘｈｏｌに対するｐＰＭＡ）（配列番号８１）及びＣＣＣＴＣＧＡＧＡＴＴＴＡＡＡＴＣＣＡＡＣＣＧＡＴＡＡＧＧＴＧＴＡＣＡＧＧＡＧ（ＰＭＡｔｔｒｅｖＸｈｏｌ）（配列番号８２）を用いて、ＸｈｏＩ部位が隣接するＰＭＡｈＳｉａＰｓｙｎカセットを増幅するためのテンプレートとして、この構築物を使用した。得られたベクターは、ｐＳＨ３１５と表記した。
【０４３２】
ＰＭＡｈＳｉａＰｓｙｎカセットを含有する、ｐＳＨ３１５由来の２．６ＫｂＸｈｏＩ断片をｐＳＨ２８４のＸｈｏＩ部位中に連結して、二重発現カセットベクターｐＳＨ３２１ｂを得た（図２８）。
【０４３３】
２２．ガラクトシル化された糖タンパク質の作製に関与する遺伝子を発現するためのｐＪＮ７１１ｂの作製
Ｄ．メラノガスターｃＤＮＡライブラリー（ＵＣ  Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ，卵巣λ−ＺＡＰライブラリーＧＭ）から、ＵＤＰガラクトーストランスポーター（Ｇｅｎｂａｎｋ受付番号ＢＡＢ６２７４７）（ＤｍＵＧＴと称される。）をコードするＤ．メラノガスター遺伝子をＰＣＲ増幅し、ｐＣＲ２．１ＰＣＲクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、配列決定した。遺伝子を増幅するために、プライマーＤｍＵＧＴ−５’（５’−ＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＣＡＴＧＡＡＣＧＣＣＡＡＴＡＣＧ−３’）（配列番号８３）及びＤｍＵＧＴ−３’（５’−ＣＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＴＴＡＡＣＴＡＧＡＣＧＣＧＣＧＧＣＡＧＣＡＧＣＴＴＣＴＣＣＴＣＡＴＣＧ−３’）（配列番号８４）を使用し、これらは、それぞれ、５’及び３’末端にＮｏｔＩ及びＰａｃＩ部位を導入した。次いで、ｐＲＣＤ３９３中のＮｏｔＩ／ＰａｃＩ部位において、ＰｐＯＣＨ１及びプロモーターの下流に融合されたＤｍＵＧＴをサブクローニングするために、ＮｏｔＩ及びＰａｃＩ部位を使用して、プラスミドｐＳＨ２６３を作製した。ＤａｖｉｄｓｏｎらＷＯ０５／１００５８４Ａ２（参照により、本明細書中に組み込まれる。）を参照されたい。
【０４３４】
プライマーＧＡＬＥ２−Ｌ（５’  ＡＴＧ  ＡＣＴ  ＧＧＴ  ＧＴＴ  ＣＡＴ  ＧＡＡ  ＧＧＧ  ３’）（配列番号８５）及びＧＡＬＥ２−Ｒ（５’ＴＴＡ  ＣＴＴ  ＡＴＡ  ＴＧＴ  ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＡＴＧ３’）（配列番号８６）を用いて、Ｓ．ポンベゲノムＤＮＡから、ＵＤＰ−ガラクトース４−エピメラーゼをコードするＳ．ポンベ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受付番号ＡＴＣＣ２４８４３）（ＳｐＧＡＬＥと称される。）を増幅した。増幅された産物をｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、配列決定した。配列決定によって、＋６６位にイントロン（１７５ｂｐ）の存在が明らかとなった。イントロンを除去するために、上流プライマーＧＤ１（９４塩基）を設計した。本プライマーは、イントロンの６６塩基上流にＮｏｔＩ部位を有しており、その後ろには、イントロンに先行する２０塩基が続く。ＧＤ２は下流プライマーであり、Ｐａｃ部位を有する。ｐＣＲ２．１サブクローンからＳｐＧＡＬＥ無イントロン遺伝子を増幅するために、プライマーＧＤ１（５’ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＡ  ＴＧＡ  ＣＴＧ  ＧＴＧ  ＴＴＣ  ＡＴＧ  ＡＡＧ  ＧＧＡ  ＣＴＧ  ＴＧＴ  ＴＧＧ  ＴＴＡ  ＣＴＧ  ＧＣＧ  ＧＣＧ  ＣＴＧ  ＧＴＴ  ＡＴＡ  ＴＡＧ  ＧＴＴ  ＣＴＣ  ＡＴＡ  ＣＧＴ  ＧＣＧ  ＴＴＧ  ＴＴＴ  ＴＧＴ  ＴＡＧ  ＡＡＡ  Ａ  ３’）（配列番号８７）及びＧＤ２（５’ＴＴＡ  ＡＴＴ  ＡＡＴ  ＴＡＣ  ＴＴＡ  ＴＡＴ  ＧＴＣ  ＴＴＧ  ＧＴＡ  ＴＧ  ３’）（配列番号８８）を使用し、産物を再びｐＣＲ２．１中に再度クローニングし、配列決定した。
【０４３５】
プライマーＲＣＤ１９２（５’−ＧＣＣＧＣＧＡＣＣＴＧＡＧＣＣＧＣＣＴＧＣＣＣＣＡＡＣ−３’）（配列番号８９）及びＲＣＤ１８６（５’−ＣＴＡＧＣＴＣＧＧＴＧＴＣＣＣＧＡＴＧＴＣＣＡＣＴＧＴ−３’）（配列番号９０）を用いて、ヒト腎臓ｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙｃＤＮＡ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から、Ｈ．サピエンスβ−１，４−ガラクトシル転移酵素Ｉ遺伝子（ｈＧａｌＴＩ、Ｇｅｎｂａｎｋ受付番号ＡＨ００３５７５）をＰＣＲ増幅した。ｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中に、このＰＣＲ産物をクローニングし、配列決定した。このクローンから、１）野生型タンパク質配列を維持しながら、翻訳領域内のＮｏｔＩ部位を除去するため、２）内在性膜貫通ドメインのすぐ下流でタンパク質を末端切断するために、３）分子クローニングのため、５’及び３’末端にＡｓｃＩ及びＰａｃＩ部位を導入するためという３つの目的のために、ＰＣＲ重複突然変異導入を行った。これを行うために、プライマーＲＣＤ１９８（５’−ＣＴＴＡＧＧＣＧＣＧＣＣＧＧＣＣＧＣＧＡＣＣＴＧＡＧＣＣＧＣＣＴＧＣＣＣ−３’）（配列番号９１）及びＲＣＤ２０１（５’−ＧＧＧＧＣＡＴＡＴＣＴＧＣＣＧＣＣＣＡＴＣ−３’）（配列番号９２）を用いてＮｏｔＩ部位までの遺伝子の５’末端を増幅し、プライマーＲＣＤ２００（５’−ＧＡＴＧＧＧＣＧＧＣＡＧＡＴＡＴＧＣＣＣＣ−３’）（配列番号９３）及びＲＣＤ１９９（５’−ＣＴＴＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＴＡＧＣＴＣＧＧＴＧＴＣＣＣＧＡＴＧＴＣＣＡＣ−３’）（配列番号９４）を用いて３’末端を増幅した。ＮｏｔＩ部位を除去しながら、野生型アミノ酸配列を有する翻訳領域を再合成するために、産物をプライマー１９８及び１９９と重複させた。ｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中に、末端切断された新しいｈＧａｌＴＩＰＣＲ産物をクローニングし、配列決定した。次いで、プラスミドｐＲＣＤ２５９（ＰｐＵＲＡ３／ＨＹＧＲロールインベクターである。）中にこの断片をサブクローニングするために、導入されたＡｓｃＩ／ＰａｃＩ部位を使用して、ｐＲＣＤ２６０を作製した。本明細書に記載されている酵母標的化配列膜貫通ドメインのライブラリーを、ｈＧＡｌＴＩ遺伝子の上流に位置するＮｏｔＩ／ＡｓｃＩ部位中に連結して、プラスミドｐＸＢ２０−ｐＸＢ６７を作製した。ｐＸＢ５３は、ヒトβ１，４−ガラクトシル転移酵素Ｉ（Ｇｅｎｂａｎｋ受付番号ＡＨ００３５７５）の４３Ｎ末端アミノ酸欠失に、インフレームに連結された、末端切断されたＳ．セレビシエＭｎｎ２（ｓ）標的化ペプチド（Ｇｅｎｂａｎｋ受付番号ＮＰ ００９５７１から得られたＭＮＮ２の１から１０８ヌクレオチド）である。
【０４３６】
上記ベクターを用いて、ｈＧａｌＴＩ−５３，ＰＯＣＨ１−ＳｐＧＡＬＥ及びＤｍＵＧＴを含有するＨＹＧＲプラスミドであるｐＪＮ７１１ｂ（図２９）を構築した。
【０４３７】
２３．ヒトＣ−シアル酸合成酵素（ｈＣＭＰ−Ｓｉａｓｙｎ）及びマウスＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（ｍＣＭＰ−ＳｉａＴｒ）を発現するためのｐＳＨ３２６ｂの作製
ヒトＣＭＰ−シアル酸合成酵素（Ｇｅｎｂａｎｋ受付番号ＡＦ３９７２１２）（ｈＣＭＰ−Ｓｉａｓｙｎと称された。）をコードする遺伝子を、ヒト前立腺ｃＤＮＡからＮｏｔＩ−ＰａｃＩ断片として増幅した。サーモサイクリングに対して使用した条件は、以下のとおりであった。ＡｄｖａｎｔａｇｅＴＭＤＮＡポリメラーゼ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともに、オリゴヌクレオチドプライマー：ＧＧＧＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＴＣＧＧＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＧＧＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣ（ｈＣＭＰ−ＮＡＮＡｓｙｎＮｏｔＩ／Ｋｏｚ）（配列番号９５）及びＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＴＡＴＴＴＴＴＧＧＣＡＴＧＡＡＴＴＡＴＴＡＡＣＴＴＴＴＴＣＣＡＴＴＡ（ｈＣＭＰ−ＮＡＮＡｓｙｎＰａｃＩ）（配列番号９６）を用いて、９５℃２分、１サイクル；９７℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃２．５分、２５サイクル；７２℃５分。得られた１．３ｋｂの断片をｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、配列を決定し、ｐＨＷ６と表記した。ｐＨＷ６からｈＣＭＰ−Ｓｉａｓｙｎを、ＮｏｔＩ−ＰａｃＩ断片として、ｐＰＢ１４０（「ローリングイン」組み込みを促進するためのＰ．パストリスＨＩＳ３遺伝子坐の１．２Ｋｂ断片及びＧＡＰＤＨ−ＣＹＣプロモーター−ターミネーター発現カセットを含有するカナマイシン耐性ベクター）中にクローニングし、ベクターｐＳＨ３０１を得た。
【０４３８】
マウスＣＭＰ−シアル酸トランスポーターをコードする遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受付番号Ｚ７１２６８）（ｍＣＭＰ−ＳｉａＴｒと称される。）を、オリゴヌクレオチドプライマー：ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＣＣＧＧＣＧＡＧＡＧＡＡＡＡＴＧＴＣＡＧ（ｍＣＭＰ−ＮＡＮＡｔｒａｎｓＫｏｚ／ｆｏｒ）（配列番号９７）及びＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＡＣＡＣＣＡＡＴＧＡＴＴＣＴＣＴＣＴＴＴＴＧＡＡＧ（ｍＣＭＰ−ＮＡＮＡｔｒａｎｓｒｅｖ）（配列番号９８）を用いて、マウス脳ｃＤＮＡから（２．５分の伸長時間を用いて）、上述のように増幅した。得られた断片をｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、配列を決定し、ｐＳＨ１９４と表記した。ＥｃｏＲＩで、ｐＳＨ１９４からｍＣＭＰ−Ｓｉａｓｙｎを消化し、予めＮｏｔＩ−ＰａｃＩで消化され、平滑末端化されたｐＪＮ６６４中にサブクローニングする前に、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、ベクターｐＳＨ３０６を得た。プライマーＧＧＣＴＣＧＡＧＡＴＴＴＡＡＡＴＧＣＧＴＡＣＣＴＣＴＴＣＴＡＣＧＡＧＡＴＴＣ（ＸｈｏＩに対するｐＰＭＡ）（配列番号９９）及びＣＣＣＴＣＧＡＧＡＴＴＴＡＡＡＴＣＣＡＡＣＣＧＡＴＡＡＧＧＴＧＴＡＣＡＧＧＡＧ（ＰＭＡｔｔｒｅｖＸｈｏＩ）（配列番号１００）を用いて、ＸｈｏＩ部位が隣接するＰＭＡｍＣＭＰ−Ｓｉａカセットを増幅するためのテンプレートとして、この構築物を使用した。得られたベクターは、ｐＳＨ３１７と表記した。
【０４３９】
ＰＭＡｍＣＭＰ−Ｓｉａトランスポーターカセットを含有する、ｐＳＨ３１７由来の２．６ＫｂＸｈｏＩ断片を（ｈＣＭＰ−Ｓｉａｓｙｎを含有する。）ｐＳＨ３０１のＸｈｏＩ部位中に連結して、二重発現カセットベクターｐＳＨ３２６ｂを得た（図３０）。
【０４４０】
２４．ラットＳＴ６Ｇａｌを発現するためのｐＳＨ３７０の作製
ｈＧＮＥに関して上述されている条件を用いて、但し、５分に代えて２分の伸長時間を用いて、ラットＳＴ６Ｇａｌ（Ｇｅｎｂａｎｋ受付番号Ｍ１８７６９）のＮ末端欠失をラット肝臓ｃＤＮＡから増幅した。プライマーは、ＧＧＣＧＣＧＣＣＡＧＣＡＡＧＣＡＡＧＡＣＣＣＴＡＡＧＧＡＡＧＡＣＡＴＴＣＣ（ｒＳＴ６ＧａｌＩｄ６３ＡｓｃＩ）（配列番号１０１）及びＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＴＣＡＡＣＡＡＣＧＡＡＴＧＴＴＣＣＧＧＡＡＧＣＣＡＧＡＡＡＧＧ（ｒＳＴ６ＧａｌＩＰａｃＩ）（配列番号１０２）であった。得られた断片をｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、配列を決定し、ｐＳＨ２７１と表記した。続いて、ヌルセオスリシン選択可能なベクター（Ｈａｎｓｅｎ，２００３）中に、コードされたｒＳＴ６Ｇａｌ触媒ドメインを含有する１ｋｂ断片をサブクローニングし、ＰＭＡプロモーターの調節下にある、ｒＳＴ６Ｇａｌの、Ｍｎｎ２の最初の１０８塩基対（リーダー５３）への融合物を得た。得られたベクターは、ｐＳＨ３７０と表記した（図３１）。
【０４４１】
２５．マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎｎＩＩ）及びＧｎＴＩＩを発現するためのｐＳＨ３７３の作製
リーダー５３に融合されたＤ．メラノガスターマンノシダーゼＩＩ（Ｇｅｎｂａｎｋ受付番号Ｘ７７６５２）（ＫＤ５３）を、ｐＫＤ５３由来のＮｏｔＩ−ＰａｃＩ断片として、発現ベクターｐＪＮ７０２中にサブクローニングした。得られたベクターは、ｐＳＨ３６８と表記した。
【０４４２】
Ｍｎｎ２（リーダー５３）の最初の１０８塩基対に融合されたラットＧｎＴＩＩ（Ｇｅｎｂａｎｋ受付番号Ｕ２１６６２）を、ＮｏｔＩ−ＰａｃＩ断片として、ｐＴＣ５３（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，２００３参照）から消化し、同じ酵素で消化されたｐＪＮ６６４中にサブクローニングした。得られたベクターは、ｐＳＨ３２７と表記した。
【０４４３】
ＰＭＡＧｎＴＩＩ発現カセットを含有するｐＳＨ３２７の２．７ｋｂＳｗａＩ断片を、ｐＳＨ３６８のＰｍｅＩ部位中に連結した。得られたベクターは、ｐＳＨ３７３と表記した（図３２）。
【０４４４】
２６．コドンが最適化されたヒトＳＴ６Ｇａｌを発現させるためのｐＳＨ５６８の作製
Ｍｎｎ２の最初の１０８塩基対（リーダー５３）に融合されたヒトＳＴ６Ｇａｌ（Ｇｅｎｂａｎｋ受付番号ＮＭ ００３０３２）のＮ末端欠失のコドン最適化されたバージョンを、ＧＥＮＥＡＲＴＧｍｂＨ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ  Ｇｅｒｍａｎｙ）によって作製した。このコドン最適化されたｈＳＴ６Ｇａｌの核酸及びアミノ酸配列が図３３に示されている。得られたＮｏｔＩ−ＰａｃＩ断片を発現ベクターｐＪＮ７０３ｂ中にサブクローニングして、構築物ｐＳＨ５６８を得た（図３４）。
【０４４５】
ＳｆｉＩでｐＳＨ５６８を消化し、ｒＳＴ６Ｇａｌの導入を省略したこと、及びｐＳＨ３７３の代わりにベクターｐＳＨ５０５を使用したことを除き、ＹＳＨ１６０と同様の様式で作製された株ＹＳＨ２７２中に形質転換した。ベクターｐＳＨ５０５では、それぞれ、リーダー４及びリーダー５融合物として、ＭａｎｎＩＩ及びＧｎｔＩＩ遺伝子を導入した。それぞれ、リーダー４はＳ．セレビシエｍｎｓ１ｓリーダーを含み、リーダー５はＳ．セレビシエｍｎｓ１ｍを含む。ＵＳ２００２／０１３７１３４を参照。
【０４４６】
２７．酵母中でのシアル酸のＮ−グリカンへのインビボ転移を工作する
シアル酸付加された糖タンパク質を作製するために必要とされるグリコシル化機構を工作するために、Ｐ．パストリスＹＳＨ１（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，２００３）を最初の宿主株として使用した。ｐＳＨ３２１（ｈＧＥＮ、ｈＳｉａＰｓｙｎ、ＵＲＡ３；上記）でＹＳＨ１（Ｕｒａ３−）を形質転換し、ＡｐａＩで消化し、選択可能マーカーとしてＵｒａ３を用いて、ＹＳＨ１０３と表記された陽性クローンを同定した。次いで、選択可能マーカーとしてＨｙｇを用いて、ＳｆｉＩ消化されたｐＪＮ７１１ｂ（ｈＧａｌＴＩ−５３，ＰＯＣＨ１−ＳｐＧＡＬＥ，ＤｍＵＧＴ，デルタｈｉｓ１：：Ｈｙｇ；上記）で、ＹＳＨ１０３を形質転換した。ＹＳＨ１１６（デルタｈｉｓ１）と表記される形質転換体を選択し、選択可能マーカーとしてＫａｎを用いて、ＢｓｐＥＩ消化されたｐＳＨ３２６（ｈＣＭＰ−Ｓｉａｓｙｎ，ｍＣＭＰ−ＳｉａＴｒ；上記）で形質転換した。ＹＳＨ１２５（デルタｈｉｓ１）と表記される形質転換体を選択し、ｐＳＨ３７０（ｒＳＴ６Ｇａｌ；上記）で形質転換し、ＥｃｏＲＩで消化し、選択可能マーカーとしてＮａｔを用いて、陽性クローンを選択した（Ｈａｎｓｅｎ，２００３）。ＹＳＨ１４５（デルタｈｉｓ１）と表記される形質転換体を選択し、続いて、これを選択可能マーカーとして用いて、ＳｆｉＩ消化されたｐＳＨ３７３（ＭａｎｎＩＩ，ＧｎＴＩＩ，（デルタａｒｇ１：：Ｈｉｓ１）、上記）で形質転換した。ＹＳＨ１６０（デルタａｒｇ１）として表記される得られた形質転換体は、図３６に示されているようなオリゴ糖構造ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を提示する糖タンパク質を産生した。
【０４４７】
あるいは、ＹＳＨ１２５（デルタｈｉｓ１）を選択し、ＳｆｉＩで消化されたｐＳＨ５６８（コドン最適化されたｈＳＴ６Ｇａｌ）で形質転換し、選択可能マーカーとしてＮａｔを用いて、陽性クローンを選択した。形質転換体を選択し、続いて、ＳｆｉＩ消化されたｐＳＨ５０５（ＭａｎｎＩＩ，ＧｎＴＩＩ，（デルタａｒｇ１：：Ｈｉｓ１）、上記）で形質転換した。ＹＳＨ２７２（デルタａｒｇ１）として表記される得られた形質転換体は、図３７に示されているようなオリゴ糖構造ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を提示する糖タンパク質を産生した。（電気穿孔装置の製造業者ＢｉｏＲａｄによって推奨されたように）電気穿孔によって、酵母株の全てを形質転換した。宿主ゲノム中への組み込みは、ＰＣＲによって確認された（Ｎｅｔｔ，２００５）。
【０４４８】
２８．グリカン分析
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを用いて、上記各株中で発現された組み換えＫｒｉｎｇｌｅ３糖タンパク質上のオリゴ糖を分析した。
【０４４９】
株ＹＳＨ１１６がｐＳＨ３２６でさらに形質転換されている株ＹＳＨ１２６中で産生された糖タンパク質のグリカン分析は、グリカン構造ＧａｌＧｌｃＮａｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２と合致する質量を示し、末端ガラクトース残基のインビボでの転移を確認した（図３５）。
【０４５０】
株ＹＳＨ１４５中に産生された糖タンパク質のグリカン分析は、グリカン構造ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２と合致する質量を示し、少なくとも１つのオリゴ糖分岐上へのシアル酸のインビボでの転移を確認した（図３５及び３６）。
【０４５１】
株ＹＳＨ１６０中に産生された糖タンパク質のグリカン分析は、グリカン構造ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２と合致する質量を示し、少なくとも１つのオリゴ糖分岐上へのシアル酸のインビボでの転移を確認した（図３６）。
【０４５２】
株ＹＳＨ２７２中に産生された糖タンパク質のグリカン分析は、グリカン構造ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２と合致する質量を示し、少なくとも１つのオリゴ糖分岐上へのシアル酸のインビボでの転移を確認した（図３７）。
【０４５３】
表１３は、本明細書に開示されている本発明に従って作製された、工作されたＰ．パストリス株中での、組み換え糖タンパク質上へのインビボでのシアル酸転移の程度を要約する。値は、シアル酸を含有する総グリカンのパーセントを表し、従って、シアリーゼ処理の影響を受ける。
【０４５４】
【表１１】
0005514541.tif 000017
【０４５５】
実施例１７に記載されている実験のための材料及び方法
ＭＯＰＳ、カコジル酸ナトリウム、塩化マンガン、ＵＤＰ−ガラクトース及びＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸は、Ｓｉｇｍａから入手した。ＴＦＡは、Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。牛乳由来のβ１，４−ガラクトシル転移酵素は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから入手した。プロテインＮ−グリコシダーゼＦ、マンノシダーゼ及びオリゴ糖は、Ｇｌｙｋｏ（Ｓａｎ  Ｒａｆａｅｌ，ＣＡ）から入手した。ＤＥＡＥＴｏｙｏＰｅａｒｌ樹脂は、ＴｏｓｏＨａａｓから入手した。金属キレート「ＨｉｓＢｉｎｄ」樹脂は、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から入手した。９６ウェル可溶化液クリアリングプレートは、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から入手した。タンパク質結合９６ウェルプレートは、Ｍｉｌｌｐｏｒｅ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から入手した。塩及び緩衝剤は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。ＭＡＬＤＩマトリックスは、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，  ＷＩ）から入手した。
【０４５６】
振盪フラスコ培養
目的の株を含有するＹＰＤプレート（２週未満）から単一のコロニーを拾い上げ、５０ｍＬの「Ｆａｌｃｏｎ」遠心管中のＢＭＧＹ培地１０ｍＬ中に播種した。２４℃で、飽和状態になるまで（約４８時間）、培養物を増殖させた。ＢＭＧＹ培地１５０ｍＬを含有するバッフル付きメスフラスコ５００ｍＬ中に種培養を移し、５±２のＯＤ６００になるまで（約１８時間）、２４℃で増殖させた。ＯＤ６００の自然対数の時間に対するプロットの勾配として、細胞の増殖速度を求めた。１０分間、３０００ｇでの遠心によって、増殖培地（ＢＭＧＹ）から細胞を採集し、ＢＭＭＹで洗浄し、２５０ｍＬのバッフル付きメスフラスコ中のＢＭＭＹ１５ｍＬ中に懸濁する。２４時間後に、発現培地フラスコを遠心（３０００ｇ、１０分間）によって採集し、Ｋ３産生に関して上清を分析した。
【０４５７】
バイオリアクター培養
ＢＭＧＹ培地１５０ｍＬを加えた５００ｍＬのバッフル付きメスフラスコに、種培養１ｍＬを接種した（フラスコ培養参照）。２４℃で、４から６のＯＤ６００になるまで（約１８時間）、接種菌液を増殖させた。次いで、接種菌液培養物から得た細胞を遠心し、発酵培地（培地の１リットル当り：ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ０．３Ｏｇ、Ｋ２ＳＯ４６．０Ｏｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ５．００ｇ、グリセロール４０．０ｇ、ＰＴＭ１塩２．０ｍｌ、ビオチン４×１０−３ｇ、Ｈ３ＰＯ４（８５％）３０ｍｌ、ＰＴＭ１塩／リットル：ＣｕＳＯ４・Ｈ２Ｏ６．００、ＮａＩ０．０８ｇ、ＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ３．０Ｏｇ、ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ０．２Ｏｇ、Ｈ３ＢＯ３０．０２ｇ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ０．５０ｇ、ＺｎＣｌ２２０．０ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ６５．０ｇ、ビオチン０．２０ｇ、Ｈ２ＳＯ４（９８％）５．００ｍｌ）５０ｍＬ中に再懸濁した。
【０４５８】
３リットルの皿状底（１．５Ｌの初期搭載容積）Ａｐｐｌｉｋｏｎバイオリアクター中で、発酵を行った。流加モードにて、２４℃の温度で、発酵槽を稼動させ、３０％水酸化アンモニウムを用いて、ｐＨを４．５±０．１に調節した。撹拌速度（４５０から９００ｒｐｍ）及び純粋酸素の供給を調整することによって、１ａｔｍの空気での飽和に対して４０％を上回るように、溶解酸素を保った。空気の流速は、１ｖｖｍに維持した。バッチ相中の最初のグリセロール（４０ｇ／Ｌ）が枯渇した時点で（これは、ＤＯの増加によって示される。）、ＰＴＭ１塩の１２ｍＬ／Ｌを含有する５０％グリセロール溶液を、１２ｍＬ／Ｌ／時間の供給速度で、所望のバイオマス濃度に到達するまで供給した。半時間の飢餓相の後、メタノール供給（１２ｍＬ／リットルＰＴＭ１を加えた１００％メタノール）を開始する。発酵装置中のメタノール濃度を０．２と０．５％の間に調節するために、メタノール供給速度を使用する。発酵装置からの放出気体中に配置されたＴＧＳ気体センサー（Ｆｉｇａｒｏ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｉｎｃ．から入手したＴＧＳ８２２）を用いて、メタノール濃度をオンラインで測定する。８時間ごとに、発酵装置から試料を採取し、バイオマス（ＯＤ６００、湿潤細胞重量及び細胞数）、残存炭素源レベル（グリセロール及びメタノール、Ａｍｉｎｅｘ８７Ｈを使用するＨＰＬＣによる）及び細胞外タンパク質含量（ＳＤＳＰＡＧＥ及びＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイによる）に関して分析した。
【０４５９】
レポータータンパク質発現、精製及びＮ結合型グリカンの放出
アルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）プロモーターの調節下にあるＫ３ドメインをモデルタンパク質として使用し、以前報告されたように（Ｃｈｏｉ，２００３）として、６×ヒスチジンタグを用いて精製した。以前に報告された方法（Ｐａｐａｃ  ａｎｄ  Ｂｒｉｇｇｓ，１９９８）の改変によって、糖タンパク質からグリカンを放出及び分離した。タンパク質を還元し、カルボキシメチル化し、膜をブロッキングした後、ウェルを水で３回洗浄した。Ｎ−グリカナーゼ（Ｇｌｙｋｏ）の１ミリユニットを含有する１０ｍＭＮＨ４ＨＣＯ３ｐＨ８．３の３０μＬの添加によって、タンパク質を脱グリコシル化した。３７℃で１６時間後、遠心によってグリカンを含有する溶液を除去し、乾燥状態になるまで蒸発させた。
【０４６０】
タンパク質精製
Ｂｅｃｋｍａｎ  ＢｉｏＭｅｋ  ２０００試料操作ロボット（Ｂｅｃｋｍａｎ／Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｒａｎｃｈ  Ｃｕｃａｍｏｎｇａ，  ＣＡ）上で、９６ウェルフォーマットを用いて、クリングル３を精製した。Ｃ末端の６ヒスチジンタグを用いて、Ｋｒｉｎｇｌｅ３を発現培地から精製した。ロボット精製は、それらのＨｉｓＢｉｎｄ樹脂に対して、Ｎｏｖａｇｅｎによって提供されたプロトコールを改変したものである。要約すると、樹脂の静置容積１５０μＬを９６ウェル可溶化液結合プレートのウェル中に注ぎ、水の３容量で洗浄し、５０ｍＭＮｉＳＯ４の５容積を充填し、結合緩衝液の３容量で洗浄した（５ｍＭイミダゾール、０．５ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．９）。タンパク質発現培地を３；２培地／ＰＢＳ（６０ｍＭＰＯ４、１６ｍＭＫＣｌ、８２２ｍＭＮａＣｌｐＨ７．４））に希釈し、カラム上に搭載する。排出後、結合緩衝液の１０容量及び洗浄緩衝液（３０ｍＭイミダゾール、０．５ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．９）の６容量でカラムを洗浄し、溶出緩衝液（１Ｍイミダゾール、０．５ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．９）の６容量によって、タンパク質を溶出する。凍結乾燥によって、溶出された糖タンパク質を乾燥状態まで蒸発させる。
【０４６１】
Ｎ結合型グリカンの放出
以前に報告された方法（Ｐａｐａｃ  ｅｔ  ａｌ．Ａ．Ｊ．Ｓ．１９９８  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ８，  ４４５−４５４）の改変によって、糖タンパク質からグリカンを放出及び分離する。９６ウェルＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎＩＰ（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜）プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）のウェルをメタノール１００μＬで湿らせ、水３×１５０μＬ及びＲＣＭ緩衝液（８Ｍ尿素、３６０ｍＭＴｒｉｓ、３．２ｍＭＥＤＴＡｐＨ８．６）５０μＬで洗浄し、各添加後に穏やかな真空を用いて排出する。乾燥されたタンパク質試料をＲＣＭ緩衝液３０μＬ中に溶解し、ＲＣＭ緩衝液１０μＬを含有するウェルに移した。ウェルを排出し、ＲＣＭ緩衝液で２回洗浄する。３７℃で１時間、ＲＣＭ緩衝液中の０．１ＭＤＴＴの６０μＬを添加することによって、タンパク質を還元する。水３００μＬでウェルを３回洗浄し、室温で、暗所中にて３０分間、０．１Ｍヨード酢酸６０μＬを添加することによって、カルボキシメチル化する。水で、ウェルを再度３回洗浄し、室温で１時間、水中の１％ＰＶＰ３６０の１００μＬを添加することによって、膜をブロックする。ウェルを排水し、水３００μＬで３回洗浄し、Ｎ−グリカナーゼ（Ｇｌｙｋｏ）の１ミリユニットを含有する１０ｍＭＮＨ４ＨＣＯ３ｐＨ８．３の３０μＬを添加することによって、脱グリコシル化する。３７℃で１６時間後、グリカンを含有する溶液を遠心によって除去し、乾燥状態になるまで蒸発させた。
【０４６２】
その他
タンパク質は、Ｌａｅｍｍｌｉ（Ｌａｅｍｍｌｉ１９７０）に従い、ＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分離した。
【０４６３】
マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析法
遅延抽出を使用するＶｏｙａｇｅｒＤＥＰＲＯ線形ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）質量分析装置を用いて、グリカンの分子量を測定した。各ウェルからの乾燥されたグリカンを水１５μＬ中に溶解し、ステンレス鋼試料プレート上に０．５μＬを点状に添加し、Ｓ−ＤＨＢマトリックス（ジヒドロキシ安息香酸９ｍｇ／ｍＬ、１：１水／アセトニトリル中の５−メトキシサリチル酸１ｍｇ／ｍＬ、０．１％ＴＦＡ）の０．５μＬと混合し、乾燥させた。
【０４６４】
４ナノ秒のパルス時間で、パルス化された窒素レーザー（３３７ｎｍ）で照射によって、イオンを作製した。本装置は、１２５ナノ秒の遅延及び２０ｋＶの加速電圧を有する遅延抽出モードで操作された。格子電圧は９３．００％であり、ガイドワイヤー電圧は０．１０％であり、内部圧は５×１０−７ｔｏｒｒ未満であり、低質量ゲートは８７５Ｄａであった。１００から２００レーザーパルスの合計からスペクトルを生成し、２ＧＨｚデジタイザを用いて取得した。外部分子量標準として、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２オリゴ糖を使用した。全てのスペクトルは、正のイオンモードで装置を生成した。スペクトルの推定質量の精度は０．５％であった。
【実施例１８】
【０４６５】
構造Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有するＮ−グリカンを作製するためのＫ．ラクティス細胞の工作
Ｋ．ラクティスＯＣＨ１遺伝子の同定及び破壊
出芽酵母Ｓ．セレビシエのＯＣＨ１遺伝子は、分泌されたタンパク質上のＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカン構造への最初のゴルジ局在化マンノース付加に必要とされる１，６−マンノシル転移酵素をコードする（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ−Ｓｈｉｎｄｏ，１９９３）。このマンノース転移は、一般に、真菌に特異的な、Ｎ−グリカン構造のポリマンノシル化における中心的な最初の段階として認められている（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ−Ｓｈｉｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｎａｋａｙａｍａ，１９９２；Ｍｏｒｉｎ−Ｇａｎｅｔ，２０００）。Ｓ．セレビシエ中のこの遺伝子の欠失は、この典型的なポリマンノシル化を含まない著しくより短いＮ−グリカン構造又は高温での増殖欠損をもたらす（Ｎａｋａｙａｍａ，１９９２）。
【０４６６】
関連するが、異なるマンノシル転移酵素であるＳ．セレビシエ（Ｎｅｉｍａｎ，１９９７）及びＫ．ラクティス（ＰＥＮＤＡＮＴＥＳＴデータベース）のＨｏｃ１タンパク質とともに、Ｓ．セレビシエ由来のＯｃｈ１ｐ配列を、カンジダ・アルビカンス（Ｇｅｎｂａｎｋ受付番号ＡＡＬ４９９８７）及びＰ．パストリス（Ｃｈｏｉ，２００３）由来の公知の相同体と並列させた。Ｋ．ラクティス株ＭＧ１／２由来のゲノムＤＮＡに対して誘導された縮重プライマーの対を設計するために、Ｏｃｈ１ｐ相同体間で共通しているが、Ｈｏｃ１ｐ相同体とは異なる高相同性の領域を使用した（Ｂｉａｎｃｈｉ，  １９８７）。プライマーＲＣＤ３３（ＣＣＡＧＡＡＧＡＡＴＴＣＡＡＴＴＹＴＧＹＣＡＲＴＧＧ）（配列番号３４）及びＲＣＤ３４（ＣＡＧＴＧＡＡＡＡＴＡＣＣＴＧＧＮＣＣＮＧＴＣＣＡ）（配列番号３５）を用いたＰＣＲ増幅は、クローニング及び配列決定された３０２塩基対の産物をもたらし、予想された翻訳はＯｃｈ１タンパク質に対する相同性の高い程度を有することが示された（Ｓ．セレビシエＯｃｈ１ｐに対して５５％超）。
【０４６７】
高い厳密性で、Ｋ．ラクティス株（ＭＧ１／２）由来のゲノムＤＮＡのサザンブロットを探索するために、３０２塩基対ＰＣＲ産物を使用した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。ハイブリッド形成は単一の遺伝子と合致するパターンで観察され、この３０２塩基対セグメントがＫ．ラクティスゲノムの一部に対応し、Ｋ．ラクティス（ＫｌＯＣＨ１）は遺伝子の単一コピーを含有することが示唆された。ＫｌＯＣＨ１遺伝子全体をクローニングするために、サザンブロットを用いて、ゲノムの遺伝子坐をマッピングした。従って、Ｋ．ラクティスサブゲノムライブラリーを作製するために、ゲノムＤＮＡを消化し、５．２ｋｂの範囲の断片をｐＵＣ１９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）中に連結することによって、５．２ｋｂＢａｍＨＩ／ＰｔｓＩ断片をクローニングした。このサブゲノムライブラリーをイー・コリ中に形質転換し、ＲＣＤ３３／３４を用いるコロニーＰＣＲによって、数百のクローンを検査した。予想されるＫｌＯＣＨ１遺伝子を含有する５．２ｋｂクローンを配列決定し、Ｓ．セレビシエＯＣＨ１遺伝子と４６．５％同一である予想タンパク質をコードする１３６２塩基対の翻訳領域。ＰＣＲ重複法を用いて、ｏｃｈ１：：ＫＡＮＲ欠失対立遺伝子の構築用のプライマーを作製するために５．２ｋｂ配列を使用した（Ｄａｖｉｄｓｏｎ，２００２）。この欠失対立遺伝子を２つのＫ．ラクティス株中に形質転換し、Ｇ４１８耐性コロニーを選択した。ＯＣＨ１ＯＲＦが欠失した株を得るために、ＰＣＲ及び温度感受性の両者によって、これらのコロニーをスクリーニングした。実験の結果は、様々な温度での増殖の分析及びＰＮＧアーゼ消化後の分泌されたタンパク質及び細胞壁タンパク質のＮ−グリカン炭水化物分析によって特徴付けられた変異体ＰＣＲパターンを表す株を示す。ｏｃｈ１変異は、３０℃では増殖するが、３５℃で増殖しない温度感受性を株に付与した。図１２Ａは、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２［ｃ］のＮ−グリカン及びこれ以上のＮ−グリカンを産生する野生型Ｋ．ラクティス株のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を示している。
【０４６８】
Ｋ．ラクティスＭＮＮ１遺伝子の同定、クローニング及び破壊
Ｓ．セレビシエＭＮＮ１は、ゴルジα−１，３−マンノシル転移酵素に対する構造遺伝子である。ＭＮＮ１の産物は、７６２アミノ酸ＩＩ型膜タンパク質である（Ｙｉｐ，１９９４）。ｍｎｎ１変異体から単離されたＮ結合型及びＯ結合型オリゴ糖はともに、α−１，３−マンノース結合を欠く（Ｒａｓｃｈｋｅ，１９７３）。
【０４６９】
Ｋ．ラクティス翻訳されたゲノム配列（ＰＥＤＡＮＴ）を検索するために、Ｓ．セレビシエ由来のＭｎｎ１ｐ配列を使用した。Ｍｎｎ１ｐに対して著しい類似性を有する候補タンパク質断片をコードする１つの４０５塩基対ＤＮＡ配列が同定された。続いて、プライマーＫＭＮ１（ＴＧＣＣＡＴＣＴＴＴＴＡＧＧＴＣＣＡＧＧＣＣＣＧＴＴＣ）（配列番号３６）及びＫＭＮ２（ＧＡＴＣＣＣＡＣＧＡＣＧＣＡＴＣＧＴＡＴＴＴＣＴＴＴＣ）（配列番号３７）を用いて、この配列の内部セグメントをＰＣＲ増幅し、Ｋ．ラクティス株（ＭＧ１／２）由来のゲノムＤＮＡのサザンブロットを探索するために使用した。サザンハイブリッド形成データに基づいて、本明細書に記載されているようにサイズ選択されたライブラリーを作製することによって、４．２ＫｂＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片をクローニングした。プライマーＫＭＮ１（配列番号３６）及びＫＭＮ２（配列番号３７）を用いた完全なコロニーＰＣＲによって、Ｋ．ラクティスＭＮＮ１遺伝子を含有する単一のクローンを同定し、配列決定した。このクローン内に、Ｓ．セレビシエＭＮＮ１遺伝子に対して３４％同一である予想されたタンパク質をコードする２２４１塩基対の翻訳領域が同定された。ＰＣＲ重複法を用いてｍｎｎ１：：ＮＡＴＲ欠失対立遺伝子を構築するために、プライマーを設計した（Ｄａｖｉｄｓｏｎ，２００２）。
【０４７０】
電気穿孔によって、この破壊対立遺伝子をＫ．ラクティスの株中に形質転換し、ヌルセオスリシン耐性形質転換を選択し、破壊対立遺伝子の相同的な挿入のためにＰＣＲ増幅した。変異体ＰＣＲパターンを示す株を、既知のレポーター遺伝子のＮ−グリカン炭水化物分析に供し得る。
【０４７１】
図１２Ｂは、本明細書に記載されているとおり、ＰＮＧアーゼ消化及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの後に観察されたＫ．ラクティスｏｃｈ１ｍｎｎ１欠失株から得られたＮ−グリカンを図示している。［ｄ］として示されている１９０８（ｍ／ｚ）の主ピークは、Ｍａｎ９ＧＩｃＮＡｃ２の質量と一致する。
【実施例１９】
【０４７２】
ＧｌｃＮＡｃ転移酵素又はガラクトシル転移酵素を発現するように植物細胞を工作する
ＧｌｃＮＡｃ転移酵素ＩＶは、ヒトにおいて、複雑なＮ−グリカン中のα−１，６マンノース残基及びα−１，３マンノース残基に、β１，４−ＧｌｃＮＡｃを付加するために必要とされる。これまで、ＧｌｃＮＡｃ転移酵素ＩＶは、植物中に検出されておらず、又は植物から単離されていない。従って、ヒト様Ｎ−グリカンを付加することができるトランスジェニック植物は、ＧｌｃＮＡｃ転移酵素ＩＶを発現するように工作しなければならない。従って、植物宿主細胞又はトランスジェニック植物は、本酵素が適切なマンノース残基にβ１，４ＧｌｃＮＡｃを付加することができるように、宿主中の正しい細胞内区画へ、発現されたＧｌｃＮＡｃ転移酵素ＩＶを局在化させなければならない。
【０４７３】
ほ乳動物及び植物由来のグリコシル転移酵素は類似のターゲティングシグナルを有するという幾つかの証拠が存在する。例えば、完全長のラットα−２，６−シアリル転移酵素は、トランスジェニックアラビドプシス植物細胞中のトランスゴルジ網に正しく局在化するが、必ずしも、そこで活性を有するわけではないことが示されている（Ｗｅｅ，１９９８）。緑色蛍光レポータータンパク質（ＧＦＰ）に融合されたα−２，６−シアリル転移酵素由来の５２のＮ末端アミノ酸を有する融合構築物も、植物ゴルジに正しく局在化することが示された（Ｂｏｅｖｉｎｋ，１９９８）。トランスゴルジ網に局在化する、２つのほ乳動物タンパク質ＴＧＮ３０及びフューリン並びにアラビドプシス膜内在性タンパク質であるＡｔＥＬＰ（Ｓａｎｄｅｒｆｏｏｔ，１９９８）は、それぞれ、おそらくは形質膜を介したリサイクリング機序によって、これらをゴルジに標的誘導するチロシンテトラペプチドモチーフを含有する。ほ乳動物及び植物はタンパク質標的化に関連する幾つかの共通の機序を共有するようであるが、それにも関わらず、外来のグリコシラーゼは植物細胞中で正しく標的誘導され得ず、しかしながら、局在化は、必ずしも、酵素活性と等しいわけではない。従って、これらの酵素及び／又は複雑なヒト様Ｎ−グリカンの形成に関与するその他の酵素を植物中で正しく標的誘導するための手段を考案することが不可欠となっている。
【０４７４】
グリコシル化酵素は、小胞体及びゴルジ装置中に存在する膜内在性タンパク質である。標的化及び局在化シグナルは、本来、細胞質及び／又は膜貫通ドメイン中に含有されず、幾つかの事例では、幾つかの管腔ドメインに含有されている。例えば、トランスゴルジ網へＧＦＰを標的誘導するためには、α−２，６−シアリル転移酵素の、膜貫通ドメインを構成する５２のアミノ酸、９つの細胞質アミノ酸及び２６の管腔アミノ酸が必要とされる（Ｂｏｅｖｉｎｋ，１９９８）。
【０４７５】
従って、実施例１１に記載されているように、細胞質及び膜貫通ドメインのみ又は細胞質、膜貫通ドメイン並びに小胞体及びゴルジ特異的タンパク質の管腔ドメインを含む細胞内指向性シグナルペプチドをコードする配列のライブラリーが作製される。標的化ペプチド配列は、小胞体及びゴルジ常在性植物、酵母又は動物タンパク質から選択され得る。グリコシル化関連タンパク質、例えば、グリコシラーゼ又は膜内在型酵素などの酵素（又はその触媒ドメイン）を、標的化ペプチド配列のライブラリーへインフレームに融合させ、植物中に導入することができる（図１３）。植物標的化ペプチド配列は、キメラ酵素を小胞体及びゴルジへ局在化させる上で最も効率的であり得るが、真菌及びほ乳動物由来の標的化ペプチド配列も有効であり得る。例えば、タバコＮ−アセチルグルコサミニル転移酵素Ｉ由来のＮ末端７７アミノ酸は、レポータータンパク質をゴルジへ正しく標的誘導することが示されている（Ｅｓｓｌ，１９９９）。一実施形態において、これらの７７アミノ酸（又はこれらのアミノ酸の亜群）を含む１つ又はそれ以上のＮ末端断片は、ＧｌｃＮＡｃ転移酵素ＩＶの触媒ドメインを含む１つ又はそれ以上の断片に融合される。本明細書に記載されている技術を用いて、植物宿主細胞中に常在し、又は導入されたレポーター糖タンパク質のグリコシル化状態をモニターすることから明らかとなるように、得られた少なくとも１つの融合タンパク質は機能的なｇｌｃＮＡｃ転移酵素ＩＶを植物細胞中のゴルジ装置へ正しく局在化させる。
【０４７６】
ゴルジに局在化することが示されている別の植物酵素は、アラビドプシスＧｌｃＮＡｃ転移酵素ＩＩである（Ｓｔｒａｓｓｅｒ，１９９９）。従って、別の実施形態において、アラビドプシスＧｌｃＮＡｃ転移酵素ＩＩ標的化ペプチドの１つ又はそれ以上の異なる断片が、上述のように作製され、検査されたＧｌｃＮＡｃ転移酵素ＩＶ触媒ドメイン及び融合構築物に融合される。アラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来の植物特異的なβ１，２−キシロシル転移酵素は、ゴルジに局在化し、ゴルジ中へのその局在化及び保持がその細胞質及び膜貫通配列に依存する別のタンパク質である（Ｄｉｒｎｂｅｒｇｅｒ，２００２）。従って、別の実施形態において、β１，２−キシロシル転移酵素の細胞質及び膜貫通配列を含む１つ又はそれ以上の断片は、ＧｌｃＮＡｃ転移酵素ＩＶ触媒ドメインを含む１つ又はそれ以上の断片に融合され、得られた融合構築物は植物細胞中に形質転換され、それらがヒト様Ｎグリカンを産生する能力、その他植物宿主細胞中でグリコシル化を調節する能力に関して検査される。ある生物由来のＧｌｃＮＡｃ転移酵素ＩＶ又はガラクトシル転移酵素は、別の生物由来のものより、特定の植物宿主中でより効率的に機能し得るので、様々な真核生物由来のＧｌｃＮＡｃ転移酵素ＩＶ（又は触媒ドメイン）を含む断片は、小胞体（ＥＲ）及びゴルジ標的化ペプチド配列のライブラリーへインフレームに融合され、次いで、植物中に導入される。異なる種から単離又は誘導された酵素ドメインをコードする核酸のライブラリーを使用することによって、ＧｌｃＮＡｃ転移酵素ＩＶによる正しい局在化及びグリコシル化に加えて、効率的なグリコシル化の確率が増大する。
【０４７７】
本発明の方法及びコンビナトリアル核酸ライブラリーは、ヒト様Ｎグリカンで植物中のタンパク質をグリコシル化するために必要とされる複数の酵素を順次に又はまとめて導入及び局在化するために使用され得る。異なる植物種は異なる増殖条件を必要とし得るので、形質転換のためのプロトコールは、形質転換される種に応じて変動し得る（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，１９９０）。トランスジェニック植物を作製するために一般に使用されている方法には、アグロバクテリウムによって媒介される形質転換、粒子衝撃（Ｓａｎｆｏｒｄ，１９９０）及び電気穿孔が含まれる。
【０４７８】
アグロバクテリイウム法
ＧｌｃＮＡｃ転移酵素ＩＶの触媒ドメインは、植物中の小胞体及びゴルジにタンパク質を標的誘導することが知られた複数の異なる標的化ペプチド配列へインフレームに融合される。これらの融合構築物の各々は、３５ＳＣａＭＶ、ユビキチン若しくはアクチンプロモーターのような遍在的に発現されているプロモーター、組織特異的プロモーター又は誘導性プロモーターの調節下において導入される。植物特異的ターミネーター領域も使用される。アグロバクテリウムによって媒介される形質転換に適したベクター中に、このカセット（プロモーター：：標的化ペプチド−ＧｌｃＮＡｃ転移酵素ＩＶ：：ターミネーター）をクローニングする（図１３）。本ベクターは、形質転換された植物の選択を可能とする選択可能なマーカーも含有する。使用される一般的な選択可能なマーカーには、カナマイシン、ハイグロマイシン及びバスタ耐性をもたらすものが含まれる。本分野において利用可能な十分に確立された形質転換法を介して、この構築物をアグロバクテリウム中に導入する。これにより、ゴルジ標的化されたＧｌｃＮＡｃ転移酵素ＩＶのアグロバクテリウムライブラリーが作製される。
【０４７９】
胚性組織及び成長点の組織を形質転換し得、トランスジェニック植物を再生することができる。組織を形質転換するために、まず、組織外植片（これらは、出芽した種子から得られた幼芽及び根（ｒａｄｉｃａｌ）であり得る。）を浸し、アグロバクテリウム接種材料で被覆する。次いで、カルスと称される細胞の未分化塊を形成するために、接種材料を含有するプレート上で、それらを培養する。培地に添加することによって、（構築物に対して使用される選択可能なマーカーに応じて）適切なカナマイシン、ハイグロマイシン又はバスタに関して、形質転換された植物細胞を選択する。形質転換された植物細胞は、培地中で増殖され、未分化の状態に留まることができ、又は芽再生培地及び芽伸長培地で処理される。分化する外植片は、トランスジェニック植物を作製するために発根培地上に移される。アラビドプシスのような幾つかの植物は、アグロバクテリウム溶液中に花を浸すことによって形質転換することができる。適切な除草剤又は抗生物質選択を含有するプレート上で、形質転換された植物から得られた種子を出芽させる。トランスジェニック植物は、選択培地上で増殖する植物である。次いで、植物外植片から糖タンパク質を単離し、本明細書の他の箇所に記載されているように、例えば、特異的な抗体又はレクチンを使用することにより糖タンパク質のパターンを分析することによって、適切にグリコシル化されたタンパク質（すなわち、複雑なヒト様Ｎ−グリカンを有するタンパク質）を有するトランスジェニック植物に関して、トランスジェニック植物をスクリーニングする。アグロバクテリウム法は経済的で、簡易であるが、植物の一部の種に限定される。従って、アグロバクテリウムを用いて形質転換することができない植物は、衝撃法又は電気穿孔によって形質転換することができる。
【０４８０】
粒子衝撃法及び電気穿孔
アグロバクテリウムによって媒介される形質転換と比べて、これらの方法は、導入遺伝子の複数コピーをゲノム中に挿入するより高い傾向を有する。これは、遺伝子サイレンシング及びコサプレッションをもたらし得る。しかしながら、アグロバクテリウムによって媒介される形質転換とは異なり、これらの方法は種限定的でなく、従って、トランスジェニック植物を作製するために、アグロバクテリウム法を使用することができない場合に有用である。粒子衝撃法では、培養された植物細胞は、ＤＮＡ（プロモーター：：標的化ペプチド−ＧｌｃＮＡｃ転移酵素ＩＶ−ターミネーター：：選択可能なマーカー）（図１３）（ｒｂ及びｌｂは必要とされない。）で被覆された極めて微小なタングステン又は金粒子による衝撃を受けるのに対して、電気穿孔法では、ＤＮＡ（プロモーター：：標的化ペプチド−ＧｌｃＮＡｃ転移酵素ＩＶ−ターミネーター：：選択可能なマーカー）溶液中の植物細胞は、細胞を貫通する電気パルスで処理され、植物細胞がＤＮＡを取り込むようにする。次いで、細胞を培養し、回収できるようにする。適切な選択培地上で植物を培養及び再生することによって、安定な形質転換体を選択する。
【０４８１】
大豆子葉節アグロバクテリウム媒介形質転換系を用いて、ＧｌｃＮＡｃ転移酵素ＩＶを発現するように大豆を工作する
上述のように、ゴルジ標的化されたＧｌｃＮＡｃ転移酵素ＩＶのアグロバクテリウムライブラリーを作製する。Ｈｉｎｃｈｅｅ，１９８８によって記載されているプロトコールを用いて、大豆外植片をライブラリーで形質転換する。Ｈｉｓタグとともに、レポータータンパク質を発現させ、精製し、次いで分析する。例えば、質量分析法を用いて、α−１，６マンノース及びα１，３−マンノース残基を有するタンパク質に関して、トランスジェニック植物をアッセイする。
【０４８２】
粒子衝撃を用いて、ＧｌｃＮＡｃ転移酵素ＩＶを発現するように豆を工作する
タングステン又は金粒子上に、ＧｌｃＮＡｃ転移酵素ＩＶプラスミドライブラリーを被覆し、記載されているように（Ｍｏｌｎａｒ，１９９９）、豆胚組織に由来するカルスに衝撃を与えるための微粒子銃として使用する。Ｈｉｓタグとともに、レポータータンパク質を発現させ、精製し、次いで分析する。例えば、ＭＡＬＤＩを用いて、α−１，６マンノース及びα１，３−マンノース残基を有するタンパク質に関して、トランスジェニック植物をアッセイする。
【０４８３】
ＧｌｃＮＡｃ転移酵素Ｉを発現するように植物を工作する
ＧｌｃＮＡｃ転移酵素Ｉは、末端のα−１，３マンノース残基にＧｌｃＮＡｃを付加して、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を形成させることに関与する（複雑なＮ−グリカンの成熟において不可欠な工程である。）。ＧｌｃＮＡｃ転移酵素Ｉは植物から単離されているが、そのほ乳動物相同体と同じ機能を有しているようであり、ほ乳動物又は外来タンパク質のグリコシル化のために最も効率的な酵素でない場合があり得、全ての植物種には見出されない場合があり得る。末端のα−１，３マンノース残基へのＧｌｃＮＡｃの付加は、ほ乳動物のグリコシル化経路における調節工程であり、この工程を効率的に実施することができるトランスジェニック植物を有することが有利である。複雑なＮ−グリカンの形成を促進するように効率的に機能し得るＧｌｃＮＡｃ転移酵素Ｉを発現するトランスジェニック植物を作製するために、本明細書に記載されている方法に従って、複数の植物ゴルジ標的化ペプチド配列へインフレームに、様々な生物から単離又は誘導されるＧｌｃＮＡｃ転移酵素Ｉのライブラリーを融合する。このようにして作製されたコンビナトリアルライブラリーは、ＧｌｃＮＡｃ転移酵素ＩＶに関して上述されているように、植物細胞又は生物中に導入される。
【０４８４】
粒子衝撃を用いて、ＧｌｃＮＡｃ転移酵素Ｉを発現するようにトウモロコシを工作する
トランスジェニックトウモロコシは、ＧｌｃＮＡｃ転移酵素ＩＶを発現する豆を作製するために使用されたプロトコールと同様のプロトコールを用いて得ることができる。ここでは、タングステン又は金粒子上に、ＧｌｃＮＡｃ転移酵素Ｉプラスミドライブラリーを被覆し、例えば、トランスジェニックトウモロコシの作製専用のプロトコールを用いて（Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ，１９９０）、トウモロコシ胚組織に由来するカルスに衝撃を与えるために使用する。例えば、特異的な抗体を用いて、又はある種のレクチンへのＮ−グリカンの低下した結合をアッセイすることによって、又はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを使用することによって、末端のα−，１３マンノース残基上にＧｌｃＮＡｃを有するタンパク質に関して、トランスジェニック植物をアッセイする。
【０４８５】
本発明に従って、植物宿主細胞を使用するために有用な他の参考文献には、Ｄｉｒｎｂｅｒｇｅｒ，２００２；Ｆｒａｍｅ，２００２；Ｇｏｍｏｒｄ，１９９９；Ｌａｕｒｓｅｎ，１９９４；Ｏｒｃｉ，２０００；Ｎｅｗｅｌｌ，２００２；Ｐａｗｌｏｗｓｋｉ，１９９６；Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，１９９３；Ｓｏｒｏｋｉｎ，２０００；Ｓｔｒａｓｓｅｒ，１９９９；Ｔｏｍｅｓ，１９９０が含まれる。
【０４８６】
β１，４−ガラクトシル転移酵素を産生するように植物細胞を工作する
β１，４−ガラクトシル転移酵素は、植物中には存在しない重要なヒトグリコシル転移酵素である。Ｌｅｒｏｕｇｅ，１９９８。ほ乳動物では、α１，４−ガラクトシル転移酵素はゴルジ中に局在化しており、複雑なＮ−グリカンのコアＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の末端Ｎ−アセチルグルコサミンへガラクトース残基を転移させるために必要とされる。植物では、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２コアは、β１，２−キシロース及びα１，３−フコース残基を含有し、β１，４−ガラクトースを欠く。キシロース及びフコース修飾はアレルギーに関与すると推定されており、抗原性エピトープとして作用し、従って、治療用タンパク質の望ましい修飾ではない。
【０４８７】
β１，４−ガラクトシル転移酵素によって実施されるガラクトースの修飾は、治療用タンパク質の適切な機能にとって重要であり得る。ほ乳動物において、β１，４−ガラクトシル転移酵素は、Ｎ−アセチルグルコサミニル転移酵素Ｉ及びＮ−アセチルグルコサミニル転移酵素ＩＩの後に作用し、複雑なＮ−グリカンの分岐を開始することが示されている。Ｌｅｒｏｕｇｅ，１９９８；Ｐａｌａｃｐａｃ，１９９９。タバコ細胞では、ヒトβ１，４−ガラクトシル転移酵素の発現は、低下したフコース及びキシロース修飾を有するガラクトシル化されたＮ−グリカンをもたらすことが示されている。Ｂａｋｋｅｒ，２００１；Ｆｕｊｉｙａｍａ，２００１；Ｐａｌａｃｐａｃ，１９９９。これらの研究では、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター（３５ＳＣａＭＶ）の下流にヒトβ１，４−ガラクトシル転移酵素の１，２ｋｂ断片をクローニングし、バイナリーベクターｐＧＡ４８２中に導入し、最後に、タバコ細胞中に導入する。Ｐａｌｃｐａｃ，１９９９。
【０４８８】
Ｒｅｍｐｅｌら（Ｒｅｍｐｅｌ，１９９５）によって記載されているアグロバクテリウム法を用いて、タバコ細胞を形質転換した。タバコ細胞の形質転換も記載されている（Ａｎ，１９８５）。３５ＳＣａＭＶ下でのβ１，４−ガラクトシル転移酵素の発現は、タバコ細胞中での遺伝子の遍在性の発現をもたらした。ヒトβ１，４−ガラクトシル転移酵素を発現するタバコ細胞は、ガラクトシル化されたＮ−グリカンの存在を示した。（Ｐａｌａｃｐａｃ，１９９９；Ｂａｋｋｅｒ１９９１）は、ヒトβ１，４−ガラクトシル転移酵素を発現するタバコ植物を、マウス抗体の重鎖及び軽鎖を発現する植物と交雑させると、抗体が３０％のガラクトシル化を示す植物が得られることが示された（Ｂａｋｋｅｒ，２００１）。
【０４８９】
ガラクトース残基の付加のためのβ１，４−ガラクトシル転移酵素植物細胞株を得るために、コンビナトリアルＤＮＡライブラリーを構築することができる。コンビナトリアルＤＮＡライブラリーは、ガラクトース残基の付加において、より効率的な細胞株を効果的に産生することができる。このような細胞株が作製されたら、ヒト様グリコシル化を有する治療用タンパク質を作製するために、このような細胞は、他のグリコシル化酵素を発現している細胞株と、及び治療用タンパク質を発現している細胞株と容易に交雑することができる。次いで、最終的な株を植物として増殖させ、タンパク質を抽出するために採集することができ、又はバイオリアクター中でタンパク質を作製するために、懸濁培養中で植物細胞として培養することができる。シグナルペプチドのライブラリーを用いて治療用タンパク質を発現することによって、細胞内に治療用タンパク質を保持することが可能であり、又は治療用タンパク質を培地中に分泌させることが可能である。β１，４ガラクトシル転移酵素を発現するタバコ細胞は、ガラクトシル化されたＮ−グリカンを分泌する（Ｒｙｏ，２００２）。β１，４ガラクトシル転移酵素を発現するタバコ植物中で発現された西洋ワサビペルオキシダーゼイソ酵素Ｃはキシロース及びフコース修飾を含有していたのに対して、β１，４−ガラクトシル転移酵素を発現するタバコ細胞（ＧＴ６細胞）中で発現された西洋ワサビペルオキシダーゼイソ酵素Ｃ中には、キシロース又はフコース修飾は検出することができなかった。（Ｆｕｊｉｙａｍａ，２００１）。このことは、植物の個体に代えて、細胞株中で治療用タンパク質を発現させることが有利であり得ることを示唆する。
【０４９０】
シアリル転移酵素を産生するように植物を工作する
ほ乳動物では、シアリル転移酵素は、グリコシル化されたポリペプチドに末端シアル酸残基を付加するトランスゴルジ酵素である。これまでのところ、末端のシアル酸残基は、植物中に検出されていない（Ｗｅｅ，１９９８）。Ｗｅｅらは、トランスジェニックアラビドプシス中でラットα−２，６−シアリル転移酵素を発現させ、酵素がゴルジに適切に局在化され、機能的であることを示した。Ｗｅｅらは、トランスジェニックアラビドプシスから単離された膜は、ＣＭＰ−３Ｈ−シアル酸及びアシアロフェチュイン受容体とともに温置されると、シアル酸残基の付加をもたらすのに対して、野生型アラビドプシスから単離された膜はシアル酸残基の付加をもたらさないことを示した。アラビドプシス中でラットα−２，６−シアリル転移酵素を発現させると、シアル酸残基を取り込むことができる機能的な酵素がもたらされるのに対して、（上記されている）本発明のライブラリーアプローチを用いて、ほ乳動物の酵素α−２，３−シアリル転移酵素及びα−２，６−シアリル転移酵素を、様々な輸送ペプチドに融合すると、他の植物種中において、より効率的なシアル化をもたらすことができる。アラビドプシスはＣＭＰ−シアル酸又はそのトランスポーターを有さないので、Ｗｅｅらは、膜を単離し、ＣＭＰ−３Ｈ−シアル酸及びアシアロフェチュイン受容体とともに温置しなければならなかった。この追加工程を克服し、植物中でシアル酸の付加を得るために、α−２，３−シアリル転移酵素及びα−２，６−シアリル転移酵素を発現するトランスジェニック植物中で、ＣＭＰ−シアル酸生合成経路及びＣＭＰ−シアル酸トランスポーターを同時発現させることができる（実施例６、１６及び１７参照）。あるいは、懸濁培養中で増殖された植物細胞中で、α−２，３−シアリル転移酵素及びα−２，６−シアリル転移酵素とともに、ＣＭＰ−シアル酸トランスポーターを同時発現させ、ＣＭＰ−シアル酸又はＣＭＰ−シアル酸の他の前駆体を培地中に供給することができる。
【０４９１】
レムナ（Ｌｅｍｎａ）中でα−２，３−シアリル転移酵素及びα−２，６−シアリル転移酵素を発現させる
米国特許第６，０４０，４９８号（「’４９８特許」）に記載されているように、レムナ（ウキクサ（ｄｕｃｋｗｅｅｄ））は、アグロバクテリウム法及び衝撃法の両方を用いて形質転換することができる。’４９８特許に記載されているプロトコールを用いて、ゴルジ標的化されたα−２，３−シアリル転移酵素及び／又はα−シアリル転移酵素のライブラリー及びほ乳動物ＣＭＰ−シアル酸トランスポーターのライブラリーでレムナを形質転換する。トランスジェニック植物は、本明細書に論述されているスクリーニング技術に従って、末端のシアル酸残基を有するタンパク質を産生するものに関してアッセイすることができる（実施例１７）。
【０４９２】
タバコ細胞中でα−２，３−シアリル転移酵素及びα−２，６−シアリル転移酵素を発現させる
α−２，３−シアリル転移酵素及び／又はα−２，６−シアリル転移酵素及び／又はほ乳動物のＣＭＰ−シアル酸トランスポーターのライブラリーは、β１，４−ガラクトシル転移酵素に関して記載されているように、懸濁培養中で増殖されたタバコ細胞中に導入することもできる。ＣＭＰ−シアル酸を培地に添加することができる。細胞及び培地（分泌されたタンパク質）は何れも、本明細書に論述されているスクリーニング技術に従って、末端のシアル酸残基を有するタンパク質に関してアッセイすることができる（実施例１７）。
【実施例２０】
【０４９３】
グリコシル転移酵素を産生するように昆虫細胞を工作する
昆虫細胞は糖タンパク質を産生するための別の機序を与えるが、得られた糖タンパク質は複雑なヒト様糖タンパク質でない。（Ｍａｒｚ，１９９５；Ｊａｒｖｉｓ，１９９７）。分泌経路中の細胞小器官へ標的誘導される昆虫細胞中の酵素を提供することが、本発明の別の特徴である。好ましい実施形態において、グリコシル転移酵素、ガラクトシル転移酵素及びシアリル転移酵素などの酵素が、レピドプテラン昆虫細胞（ＳｆＰ）中の小胞体、ゴルジ又はトランスゴルジ網に標的誘導される。ほ乳動物のβ１，４−ガラクトシル転移酵素の発現は、Ｓｆ９細胞中で示されている。Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，１９９８。これらの酵素は、本来酵素に付随していない細胞内指向性シグナルペプチドを含むキメラタンパク質を用いて標的誘導される。本明細書に記載されている標的化配列及びグリコシル化酵素を含む核酸ライブラリーを構築することによって、キメラタンパク質が作製される。昆虫細胞中にほ乳動物のグリコシル転移酵素を付加するための安定な形質転換のために、昆虫細胞中でのバキュロウイルス発現が一般的に使用されている。（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，２００１）。
【０４９４】
【表１２】
0005514541.tif 000018
0005514541.tif 000019
0005514541.tif 000020
【０４９５】
グリコシル化を修飾するための方法において使用することができるさらなる方法及び試薬は、米国特許第５，９５５，４２２号、同第４，７７５，６２２号、同第６，０１７，７４３号、同第４，９２５，７９６号、同第５，７６６，９１０号、同第５，８３４，２５１号、同第５，９１０，５７０号、同第５，８４９，９０４号、同第５，９５５，３４７号、同第５，９６２，２９４号、同第５，１３５，８５４号、同第４，９３５，３４９号、同第５，７０７，８２８号及び同第５，０４７，３３５号などの文献に記載されている。適切な酵母発現系は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤなどの入手源から取得することができる。ベクターは、様々な入手先から市販されている。
【０４９６】
配列表
配列番号１から６は、米国特許出願０９／８９２，５９１号に見出すことができる。
【０４９７】
【化１】
0005514541.tif 000021
0005514541.tif 000022
0005514541.tif 000023
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0005514541.tif 000025
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【０４９８】
配列番号４５−５６：表１２参照。
【０４９９】
【表１３】
0005514541.tif 000027
【０５００】
配列番号５７−６８は、明細書を通じて開示されている。
【０５０１】
配列番号６９−７６：表１２参照。
【０５０２】
【表１４】
0005514541.tif 000028
【０５０３】
【化２】
0005514541.tif 000029
0005514541.tif 000030
0005514541.tif 000031
【０５０４】
配列番号１０３及び１０４
コドン最適化されたｈＳＴ６Ｇａｌリーダー５３融合物の核酸（配列番号１０３）及びアミノ酸配列（配列番号１０４）（図３３）
【０５０５】
参考文献
【０５０６】
【表１５】
0005514541.tif 000032
0005514541.tif 000033
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0005514541.tif 000038
0005514541.tif 000039
【図面の簡単な説明】
【０５０７】
【図１Ａ】図１Ａは、典型的な真菌Ｎ−グリコシル化経路の略図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、典型的なヒトＮ−グリコシル化経路の略図である。
【図２】図２は融合構築物のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーの構築を示す。図２Ａは、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）へのターゲティングペプチド断片の挿入を示す図である。図２Ｂは、生成した、制限酵素切断部位ＮｏｔＩ−ＡｓｃＩを有する指向性ペプチドサブライブラリーを示す。図２Ｃは、改変ｐＵＣ１９ベクターであるｐＪＮ３４７への触媒ドメイン領域の挿入を示す図である。図２Ｄは、生成した、制限酵素切断部位ＮｏｔＩ、ＡｓｃＩ及びＰａｃＩを有する触媒ドメインサブライブラリーを示す。図２Ｅは、指向性ペプチドサブライブラリー及び触媒ドメインサブライブラリーから作製された特別な一融合構築物を示す。
【図３】図３（出現順にそれぞれ配列番号４５−４６）は、ハツカネズミα−１，２−マンノシダーゼＩＡオープンリーディングフレームを示す。Ｎ末端切断部の作製に用いたＰＣＲプライマーの配列には下線が引かれている。
【図４Ａ】図４Ａは、複数の栄養要求性マーカーを含むベクターの操作、及びＰ．パストリスＯＣＨ１座中への標的タンパク質の遺伝子組み込みを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、複数の栄養要求性マーカーを含むベクターの操作、及びＰ．パストリスＯＣＨ１座中への標的タンパク質の遺伝子組み込みを示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、複数の栄養要求性マーカーを含むベクターの操作、及びＰ．パストリスＯＣＨ１座中への標的タンパク質の遺伝子組み込みを示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、複数の栄養要求性マーカーを含むベクターの操作、及びＰ．パストリスＯＣＨ１座中への標的タンパク質の遺伝子組み込みを示す。
【図４Ｅ】図４Ｅは、複数の栄養要求性マーカーを含むベクターの操作、及びＰ．パストリスＯＣＨ１座中への標的タンパク質の遺伝子組み込みを示す。
【図４Ｆ】図４Ｆは、複数の栄養要求性マーカーを含むベクターの操作、及びＰ．パストリスＯＣＨ１座中への標的タンパク質の遺伝子組み込みを示す。
【図５】図５は、Ｐ．パストリスにおける、優勢なＮ−グリカン構造としてＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有するヒトプラスミノゲン（Ｋ３）糖タンパク質のクリングル３ドメインの生成を示すＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析結果を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、Ｐ．パストリスにおける、優勢なＮ−グリカン構造としてＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有するヒトプラスミノゲン（Ｋ３）糖タンパク質のクリングル３ドメインの生成を示すＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析結果を示し、標準Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ａ］グリカン（Ｇｌｙｋｏ、Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡ）及びＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２＋Ｎａ＋［ｂ］を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、Ｐ．パストリスにおける、優勢なＮ−グリカン構造としてＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有するヒトプラスミノゲン（Ｋ３）糖タンパク質のクリングル３ドメインの生成を示すＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析結果を示し、Ｋ３野生型由来の、ＰＮＧａｓｅによって遊離されたグリカンを示す。示したＮ−グリカンは、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］、Ｍａｎ１０ＧｌｃＮＡｃ２［ｅ］、Ｍａｎ１１ＧｌｃＮＡｃ２［ｆ］、Ｍａｎ１２ＧｌｃＮＡｃ２［ｇ］である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、Ｐ．パストリスにおける、優勢なＮ−グリカン構造としてＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有するヒトプラスミノゲン（Ｋ３）糖タンパク質のクリングル３ドメインの生成を示すＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析結果を示し、優勢なＮ−グリカンとしてＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２［ｃ］の産生をもたらすｏｃｈ１欠損を示す。
【図５Ｄ】図５Ｄは、Ｐ．パストリスにおける、優勢なＮ−グリカン構造としてＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有するヒトプラスミノゲン（Ｋ３）糖タンパク質のクリングル３ドメインの生成を示すＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析結果を示し、キメラα−１，２−マンノシダーゼを用いてＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２をインビボで切り取った後のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］の産生を示す。
【図５Ｅ】図５Ｅは、Ｐ．パストリスにおける、優勢なＮ−グリカン構造としてＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有するヒトプラスミノゲン（Ｋ３）糖タンパク質のクリングル３ドメインの生成を示すＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析結果を示し、キメラα−１，２−マンノシダーゼを用いてＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２をインビボで切り取った後のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］の産生を示す。
【図６】図６は、Ｐ．パストリスにおける、優勢なＮ−グリカン構造としてＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有するＩＦＮ−β糖タンパク質の生成を示すＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析結果を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、Ｐ．パストリスにおける、優勢なＮ−グリカン構造としてＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有するＩＦＮ−β糖タンパク質の生成を示すＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析結果を示し、標準Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ａ］、及び標準としてのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２＋Ｎａ＋［ｂ］（Ｇｌｙｋｏ、Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡ）を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂ、Ｐ．パストリスにおける、優勢なＮ−グリカン構造としてＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有するＩＦＮ−β糖タンパク質の生成を示すＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析結果を示し、ＩＦＮ−β野生型由来の、ＰＮＧａｓｅによって遊離されたグリカンを示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、Ｐ．パストリスにおける、優勢なＮ−グリカン構造としてＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有するＩＦＮ−β糖タンパク質の生成を示すＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析結果を示し、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２［ｃ］、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］、Ｍａｎ１０ＧｌｃＮＡｃ２［ｅ］、Ｍａｎ１１ＧｌｃＮＡｃ２［ｆ］、Ｍａｎ１２ＧｌｃＮＡｃ２［ｇ］を産生し、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］を産生しないｏｃｈ１ノックアウトを示す。
【図６Ｄ】図６Ｄは、Ｐ．パストリスにおける、優勢なＮ−グリカン構造としてＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有するＩＦＮ−β糖タンパク質の生成を示すＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析結果を示し、他の中間体Ｎ−グリカンＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｃ］からＭａｎ１２ＧｌｃＮＡｃ２［ｇ］のうち比較的少量のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］を示す。
【図６Ｅ】図６Ｅは、Ｐ．パストリスにおける、優勢なＮ−グリカン構造としてＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有するＩＦＮ−β糖タンパク質の生成を示すＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析結果を示し、ＧＣ５（サッカロミセスＭＮＳ１（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＢ  Δ９９）によって産生される他のグリカンＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２［ｃ］及びＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］に比べて、かなりの量のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］を示す。
【図６Ｆ】図６Ｆは、Ｐ．パストリスにおける、優勢なＮ−グリカン構造としてＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有するＩＦＮ−β糖タンパク質の生成を示すＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析結果を示し、ｐＦＢ８（サッカロミセスＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡ  Δ１８７）による、分泌糖タンパク質ＩＦＮ−β上のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］の優勢な産生を示す。
【図７】図７は、（Ａ）２−ＡＢで標識されたＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２標準（負の対照）、（Ｂ）上清中の細胞外マンノシダーゼ活性の欠如を示す、ｐＦＢ８マンノシダーゼで形質転換された培地Ｐ．パストリス、Δｏｃｈ１の上清、及び（Ｃ）Ｔ．リーセイマンノシダーゼに曝露後の２−ＡＢで標識されたＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２標準（正の対照）の高速液体クロマトグラムを示す。
【図７Ａ】図７Ａは、２−ＡＢで標識されたＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２標準（負の対照）の高速液体クロマトグラムを示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、上清中の細胞外マンノシダーゼ活性の欠如を示す、ｐＦＢ８マンノシダーゼで形質転換された培地Ｐ．パストリス、Δｏｃｈ１の上清の高速液体クロマトグラムを示す。
【図７Ｃ】図７Ｃは、Ｔ．リーセイマンノシダーゼに曝露後の２−ＡＢで標識されたＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２標準（正の対照）の高速液体クロマトグラムを示す。
【図８】図８は、（Ａ）２−ＡＢで標識されたＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２標準（負の対照）、（Ｂ）上清中の細胞外マンノシダーゼ活性の欠如を示す、ｐＧＣ５マンノシダーゼで形質転換された培地Ｐ．パストリス、Δｏｃｈ１の上清、及び（Ｃ）Ｔ．リーセイマンノシダーゼに曝露後の２−ＡＢで標識されたＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２標準（正の対照）の高速液体クロマトグラムを示す。
【図８Ａ】図８Ａは、２−ＡＢで標識されたＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２標準（負の対照）の高速液体クロマトグラムを示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、上清中の細胞外マンノシダーゼ活性の欠如を示す、ｐＧＣ５マンノシダーゼで形質転換された培地Ｐ．パストリス、Δｏｃｈ１の上清の高速液体クロマトグラムを示す。
【図８Ｃ】図８Ｃは、Ｔ．リーセイマンノシダーゼに曝露後の２−ＡＢで標識されたＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２標準（正の対照）の高速液体クロマトグラムを示す。
【図９】図９は、（Ａ）２−ＡＢで標識されたＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ−３標準（負の対照）、（Ｂ）上清中の細胞外マンノシダーゼ活性の欠如を示す、ｐＢＣ１８−５マンノシダーゼで形質転換された培地Ｐ．パストリス、Δｏｃｈ１の上清、及び（Ｃ）上清中の活性を示す、ｐＤＤ２８−３で形質転換された培地Ｐ．パストリス、Δｏｃｈ１の上清（正の対照）の高速液体クロマトグラムを示す。
【図９Ａ】図９Ａは、２−ＡＢで標識されたＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ−３標準（負の対照）の高速液体クロマトグラムを示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、上清中の細胞外マンノシダーゼ活性の欠如を示す、ｐＢＣ１８−５マンノシダーゼで形質転換された培地Ｐ．パストリス、Δｏｃｈ１の上清の高速液体クロマトグラムを示す。
【図９Ｃ】図９Ｃは、上清中の活性を示す、ｐＤＤ２８−３で形質転換された培地Ｐ．パストリス、Δｏｃｈ１の上清（正の対照）の高速液体クロマトグラムを示す。
【図１０】図１０は、Ｐ．パストリス中のＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の産生におけるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターの活性を示す。図１０Ａは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］のある程度の産生とＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ａ］の優勢な産生をもたらす、ヒトＧｎＴＩを含むがＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターを含まないＰ．パストリス株（ＹＳＨ−３）を示す。図１０Ｂは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］の優勢な産生をもたらした、ヒトＧｎＴＩを含む系統（ＰＢＰ−３）におけるＫ．ラクチス由来のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターの付加を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、Ｐ．パストリス中のＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の産生におけるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターの活性を示し、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］のある程度の産生とＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ａ］の優勢な産生をもたらす、ヒトＧｎＴＩを含むがＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターを含まないＰ．パストリス株（ＹＳＨ−３）を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、Ｐ．パストリス中のＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の産生におけるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターの活性を示し、図１０Ｂは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］の優勢な産生をもたらした、ヒトＧｎＴＩを含む系統（ＰＢＰ−３）におけるＫ．ラクチス由来のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターの付加を示す。
【図１１】図１１は、Ｐ．パストリス中で発現されるｐＢＢ２７−２（サッカロミセスＭＮＮ１０（ｓ）／線虫マンノシダーゼＩＢ  Δ３１）によってコードされる異種マンノシダーゼ酵素の最適ｐＨを示す。
【図１２】図１２は、Ｋ．ラクチスの無細胞抽出物から遊離したＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析結果を示す。図１２Ａは、高マンノース型Ｎ−グリカンを含む野生型細胞から遊離したＮ−グリカンを示す。図１２Ｂは、ｏｃｈ１  ｍｎｎ１欠損細胞から遊離したＮ−グリカンを示す。質量（ｍ／ｚ）１９０８の明確なピークは、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］としての同定と一致する。図１２Ｃは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２と一致したピークに対応する、インビトロでのα−１，２−マンノシダーゼ消化（ｄｉｇｅｓｔ）後のｏｃｈ１  ｍｎｎ１欠損細胞から遊離したＮ−グリカンを示す。
【図１２Ａ】図１２Ａは、Ｋ．ラクチスの無細胞抽出物から遊離したＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析結果を示し、高マンノース型Ｎ−グリカンを含む野生型細胞から遊離したＮ−グリカンを示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、Ｋ．ラクチスの無細胞抽出物から遊離したＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析結果を示し、ｏｃｈ１  ｍｎｎ１欠損細胞から遊離したＮ−グリカンを示す。質量（ｍ／ｚ）１９０８の明確なピークは、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］としての同定と一致する。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、Ｋ．ラクチスの無細胞抽出物から遊離したＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析結果を示し、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２と一致したピークに対応する、インビトロでのα−１，２−マンノシダーゼ消化（ｄｉｇｅｓｔ）後のｏｃｈ１  ｍｎｎ１欠損細胞から遊離したＮ−グリカンを示す。
【図１３】図１３は、異なるリーダー配列にインフレームで融合したグリコシル化酵素の触媒ドメインを含むＴ−ＤＮＡカセットを示す。Ｔ−ＤＮＡの両端は、右縁（ｒｂ）及び左縁（ｌｂ）で印がつけられている。
【図１４】図１４は、ほ乳動物及び細菌におけるＣＭＰ−シアル酸生合成経路を示す。各経路に関与する酵素をイタリック体で表記する。一次基質、中間体及び生成物をボールド体で表記する。（ＰＥＰ：ホスホエノールピルビン酸、ＣＴＰ：シチジン三リン酸）。
【図１５】図１５は、Ｅ．コリタンパク質ＮｅｕＣのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＮ：Ｍ８４０２６．１、配列番号５７）、及び予測アミノ酸配列（配列番号５８）を示す。下線を引いたＤＮＡ配列は、プライマーがＯＲＦを増幅するように設計された領域である。
【図１６】図１６は、Ｅ．コリタンパク質ＮｅｕＢのＯＲＦ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＮ：Ｕ０５２４８．１、配列番号５９）、及び予測アミノ酸配列（配列番号６０）を示す。下線を引いたＤＮＡ配列は、プライマーがＯＲＦを増幅するように設計された領域である。
【図１７】図１７は、Ｅ．コリタンパク質ＮｅｕＡのＯＲＦ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＮ：Ｊ０５０２３．１、配列番号６１）及び予測アミノ酸配列（配列番号６２）を示す。下線を引いたＤＮＡ配列は、プライマーがＯＲＦを増幅するように設計された領域である。
【図１８】図１８はハツカネズミＣＭＰ−ＳｉａシンターゼのＯＲＦ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＮ：ＡＪ００６２１５、配列番号６３）、及びアミノ酸配列（配列番号６４）を示す。下線を引いたＤＮＡ配列は、プライマーがＯＲＦを増幅するように設計された領域である。
【図１９】図１９は、Ｎ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）をインビボで生成する代替生合成経路を示す。各経路に関与する酵素をイタリック体で表記する。一次基質、中間体及び生成物をボールド体で表記する。
【図２０】図２０は、イノシシＧｌｃＮＡｃエピメラーゼのＯＲＦ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＮ：Ｄ８３７６６、配列番号６５）、及びアミノ酸配列（配列番号６６）を示す。下線を引いたＤＮＡ配列は、プライマーがＯＲＦを増幅するように設計された領域である。
【図２１】図２１は、シアラートアルドラーゼによって触媒される可逆反応、及びそのシアル酸（Ｓｉａ）濃度依存性を示す。各経路に関与する酵素をイタリック体で表記する。一次基質、中間体及び生成物をボールド体で表記する。
【図２２】図２２は、コリシアラートアルドラーゼのＯＲＦ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＮ：Ｘ０３３４５、配列番号６７）、及びアミノ酸配列（配列番号６８）を示す図である。下線を引いたＤＮＡ配列は、プライマーがＯＲＦを増幅するように設計された領域である。
【図２３】図２３は、受容体グリカンの非存在下で、アッセイ条件（実施例１６）下でインキュベートされた系統ＹＳＨ９９ａからの細胞抽出物の負の対照のＨＰＬＣを示す。２６．５分で溶出した二重ピークは、汚染細胞成分によるものである。
【図２４】図２４は、２−ＡＢ（アミノベンズアミド）標識受容体グリカンの存在下でアッセイ条件（実施例１６）下でインキュベートされ、ＣＭＰ−シアル酸を補充された系統ＹＳＨ９９ａからの正の対照の細胞抽出物のＨＰＬＣを示す。２３分で溶出したピークは、二分岐ガラクトシル化Ｎ−グリカンの各枝上のシアリル化に対応する。２６．５分で溶出した二重ピークは、汚染細胞成分によるものである。
【図２５】図２５は、受容体グリカンの存在下でアッセイ条件（実施例１６）下でインキュベートされ、外来性ＣＭＰ−シアル酸を含まない系統ＹＳＨ９９ａからの細胞抽出物のＨＰＬＣを示す。２０分及び２３分で溶出したピークは、二分岐ガラクトシル化Ｎ−グリカンのモノ及びジシアリル化に対応する。２６．５分で溶出した二重ピークは、汚染細胞成分によるものである。
【図２６】図２６は、ＹＳＨ９９ａ抽出物インキュベーションからのＮ−グリカンのシアリダーゼ処理を示す。
【図２７】図２７は、市販モノ及びジシアル酸付加Ｎ−グリカン標準を示す。
【図２８】図２８は、実施例１７で使用されたベクターｐＳＨ３２１ｂを示す。
【図２９】図２９は、実施例１７で使用されたベクターｐＪＮ７１１ｂを示す。
【図３０】図３０は、実施例１７で使用されたベクターｐＳＨ３２６ｂを示す。
【図３１】図３１は、実施例１７で使用されたベクターｐＳＨ３７０を示す。
【図３２】図３２は、実施例１７で使用されたベクターｐＳＨ３７３を示す。
【図３３】図３３は、実施例１７に記載した、コドンが最適化されたｈＳＴ６Ｇａｌリーダー５３融合物の核酸（配列番号１０１）及びアミノ酸配列（配列番号１０２）を示す
【図３４】図３４は、実施例１７で使用されたベクターｐＳＨ５６８を示す。
【図３５】図３５は、ＹＳＨ  １２６及びＹＳＨ１４５中で産生されたグリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析結果を示す。各ＭＡＬＤＩ−ＲＯＦの右上隅の「＋ｖｅ」の記号は陽イオンの分析結果を示し、「−ｖｅ」の記号は陰イオンの分析結果を示す。
【図３６】図３６は、ＹＳＨ１４５及びＹＳＨ１６０中で産生されたグリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析結果を示す。
【図３７】図３７は、ＹＳＨ２７２中で産生されたグリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析結果を示す。実線の矢印は、シアル酸を含むグリカンである。破線の矢印は、中性グリカンである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５】
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【図５Ａ】
0005514541.tif 000051
【図５Ｂ】
0005514541.tif 000052
【図５Ｃ】
0005514541.tif 000053
【図５Ｄ】
0005514541.tif 000054
【図５Ｅ】
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【図６】
0005514541.tif 000056
【図６Ａ】
0005514541.tif 000057
【図６Ｂ】
0005514541.tif 000058
【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
0005514541.tif 000060
【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７】
0005514541.tif 000063
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
0005514541.tif 000077
【図１１】
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【図１２】
0005514541.tif 000079
【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
0005514541.tif 000081
【図１２Ｃ】
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【図１３】
0005514541.tif 000083
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
0005514541.tif 000087
【図１８】
0005514541.tif 000088
【図１９】
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【図２０】
0005514541.tif 000090
【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【配列表】
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