(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたPCSK9特異的拮抗薬であって：
配列番号：13を含むCDR1配列、配列番号：15を含むCDR2配列、および配列番号：17を含むCDR3配列、をそれぞれ含む重鎖可変部；および
配列番号：3を含むCDR1配列、配列番号：5を含むCDR2配列、および配列番号：7を含むCDR3配列、をそれぞれ含む軽鎖可変部；を含み、
前記PCSK9特異的拮抗薬は、PCSK9の細胞LDL取り込み阻害を拮抗する、PCSK9特異的拮抗薬。
【請求項２】
CDR1、CDR2およびCDR3ドメインがそれぞれそのCDR1、CDR2およびCDR3領域内のヒト生殖系列可変領域内にある請求項１のPCSK9特異的拮抗薬。
【請求項３】
配列番号：11を含む重鎖可変部および／または配列番号：27を含む軽鎖可変部を含む請求項１のPCSK9特異的拮抗薬。
【請求項４】
配列番号：24を含む定常配列を持つ重鎖を含む請求項１のPCSK9特異的拮抗薬。
【請求項５】
単離されたPCSK9特異的拮抗薬であって：
（a）配列番号：1を含む軽鎖；および
（b）配列番号：11を含む重鎖；
を含み、
前記PCSK9特異的拮抗薬は、PCSK9の細胞LDL取り込み阻害を拮抗する抗体分子である、PCSK9特異的拮抗薬。
【請求項６】
配列番号：11に、配列番号：21、配列番号：22、配列番号：23および配列番号：24を含む群から選択されるアミノ酸配列が順に（in sequence）続く請求項５のPCSK9特異的拮抗薬。
【請求項７】
単離されたPCSK9特異的拮抗薬であって：
（a）配列番号：26を含む軽鎖；および
（b）配列番号：25を含む重鎖；
を含み、
前記PCSK9特異的拮抗薬は、PCSK9の細胞LDL取り込み阻害を拮抗する抗体分子である、PCSK9特異的拮抗薬。
【請求項８】
単離されたPCSK9特異的拮抗薬であって：
（１）配列番号：39の重鎖可変部CDR3配列、配列番号：37の重鎖可変部CDR1配列および配列番号：38の重鎖可変部CDR2配列；及び
配列番号：42の軽鎖可変部CDR3配列、配列番号：40の軽鎖CDR1配列および配列番号：41の軽鎖CDR2配列；
（２）配列番号：98の重鎖可変部CDR3配列、配列番号：37の重鎖可変部CDR1配列および配列番号：97の重鎖CDR2配列；及び
配列番号：101の軽鎖可変部CDR3配列、配列番号：99の軽鎖CDR1配列および配列番号：100の軽鎖CDR2配列；
（３）それぞれ配列番号：44および43を含む重鎖および軽鎖の可変部；又は
（４）それぞれ配列番号：109および108を含む重鎖および軽鎖の可変部；を含み、
前記PCSK9特異的拮抗薬は、PCSK9の細胞LDL取り込み阻害を拮抗する抗体分子である、PCSK9特異的拮抗薬。
【請求項９】
1200 nM未満の平衡解離定数（KD）でヒトPCSK9に結合する請求項１〜８のいずれかの請求項に記載のPCSK9特異的拮抗薬。
【請求項１０】
500 nM未満のKDでヒトPCSK9に結合する請求項１〜８のいずれかの請求項に記載のPCSK9特異的拮抗薬。
【請求項１１】
100 nM未満のKDでヒトPCSK9に結合する請求項１〜８のいずれかの請求項に記載のPCSK9特異的拮抗薬。
【請求項１２】
5 nM未満のKDでヒトPCSK9に結合する請求項１〜８のいずれかの請求項に記載のPCSK9特異的拮抗薬。
【請求項１３】
PCSK9の細胞LDL取り込みの阻害を500 nM未満のIC50で拮抗する請求項１〜８のいずれかの請求項に記載のPCSK9特異的拮抗薬。
【請求項１４】
PCSK9の細胞LDL取り込みの阻害を200 nM未満のIC50で拮抗する請求項１〜８のいずれかの請求項に記載のPCSK9特異的拮抗薬。
【請求項１５】
PCSK9の細胞LDL取り込みの阻害を100 nM未満のIC50で拮抗する請求項１〜８のいずれかの請求項に記載のPCSK9特異的拮抗薬。
【請求項１６】
PCSK9の細胞取り込みの阻害を少なくとも20％拮抗する請求項１〜８のいずれかの請求項に記載のPCSK9特異的拮抗薬。
【請求項１７】
請求項１から１６のいずれかのPCSK9特異的拮抗薬および医薬品として容認される担体を含む組成物。
【請求項１８】
（a）50 mg/ｍLから200 mg/ｍLの請求項１から１６のいずれかのPCSK9特異的拮抗薬であるタンパク質；
（b）ポリヒドロキシ炭化水素および／または二糖（前記ポリヒドロキシ炭化水素および／または二糖の合計は、製剤の1％〜6％ w/vである。）；
（c）5 mMから200 mMのヒスチジン、イミダゾール、ホスフェートまたは酢酸；
（d）5 mMから200 mMのアルギニン、プロリン、フェニルアラニン、アラニン、グリシン、リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはメチオニン；
（e）5.5から7.5の範囲のpHを達成するために十分な量の0.01 Mから0.1 Mの塩酸（「HCl」）；および
（f）滅菌水、石油、動物油、植物油、鉱油、合成油、生理学的生理食塩水、サッカライド溶液またはグリコールを含む液体担体；
を含むタンパク質の投与のための組成物であって：
前記薬剤組成物は5.5から7.5の範囲のpHを持ち；かつ前記薬剤組成物は任意に、製剤の0.01％から1％ w/vの非イオン性界面活性剤を含む、組成物。
【請求項１９】
（a）50 mg/ｍLから200 mg/ｍLの請求項１から１６のいずれかのPCSK9特異的拮抗薬；
（b）1％から6％ w/vのマンニトール、トレハロースまたはショ糖；
（c）10 mMから150 mMのヒスチジン；
（d）10 mMから150 mMのアルギニンまたはプロリン；
（e）5.8から6.5の範囲のpHを達成するために十分な量の0.003 Mから0.005 Mの塩酸（「HCl」）；および
（f）滅菌水、石油、動物油、植物油、鉱油、合成油、生理学的生理食塩水、サッカライド溶液またはグリコールを含む液体担体；
を含む請求項１８の組成物であって：
前記薬剤組成物は5.8から6.5の範囲のpHを持ち；かつ前記薬剤組成物は任意に、0.01％から1％ w/vのポリソルビン酸-80（Tween 80（商標））またはポリソルビン酸-20（Tween 20（商標））を含む、組成物。
【請求項２０】
（a）50から200 mg/ｍLの請求項１から１６のいずれかのPCSK9特異的拮抗薬；
（b）2％から6％ w/vのショ糖；
（c）25 mMから100 mMのヒスチジン；
（d）25から100 mMのアルギニン；
（e）6の範囲のpHを達成するために十分な量の0.0040 Mから0.0045 Mの塩酸（「HCl」）；および
（f)滅菌水；
を含む請求項１８の組成物であって：
前記薬剤組成物は6の範囲のpHを持ち、また前記薬剤組成物は任意に、0.01％から1％ w/vのポリソルビン酸-80（Tween 80（商標））またはポリソルビン酸-20（Tween 20（商標））を含む、組成物。
【請求項２１】
（a）50から200 mg/ｍLの請求項１から１６のいずれかのPCSK9特異的拮抗薬；
（b）以下のうちの1つの量のショ糖、ヒスチジンおよびアルギニン：（i）3％ w/vのショ糖、50 mMのヒスチジンおよび50 mMのアルギニン；または（ii）6％ w/vのショ糖、100 mMのヒスチジンおよび100 mMのアルギニン；
（c）6の範囲のpHを達成するために十分な量の0.0040 Mから0.0045 Mの塩酸（「HCl」）；および
（d）滅菌水；
を含む請求項１７の組成物であって：
前記薬剤組成物は6の範囲のpHを持ち；かつ前記薬剤組成物は任意に、0.01％から1％ w/vのポリソルビン酸-80（Tween 80（商標））またはポリソルビン酸-20（Tween 20（商標））を含む、組成物。
【請求項２２】
PCSK9機能によって引き起こされ、および／もしくは増悪される障害、状態または病気を回復させるための医薬の製造における請求項１から１６のいずれかのPCSK9特異的拮抗薬の使用。
【請求項２３】
請求項１から１６のいずれかのPCSK9特異的拮抗薬をコードする単離された核酸。
【請求項２４】
請求項１のPCSK9特異的拮抗薬をコードする単離された核酸であって、重鎖可変部のCDR3ドメインは、配列番号：18を含むヌクレオチド配列によりコードされ、および軽鎖可変部のCDR3ドメインは、配列番号：8を含むヌクレオチド配列によりコードされ、
それぞれ配列番号：14および配列番号：16を含むヌクレオチド配列によりコードされる重鎖可変部内のCDR1およびCDR2ドメイン；並びに
それぞれ配列番号：4および配列番号：6を含むヌクレオチド配列によりコードされる軽鎖可変部内のCDR1およびCDR2ドメイン
を含む単離された核酸。
【請求項２５】
請求項１のPCSK9特異的拮抗薬をコードする単離された核酸であって、前記PCSK9特異的拮抗薬は：
（a） 配列番号：12を含むヌクレオチド配列によりコードされる重鎖可変部；および
（b） 配列番号：28を含むヌクレオチド配列によりコードされる軽鎖可変部
を含む、単離された核酸。
【請求項２６】
請求項１のPCSK9特異的拮抗薬をコードする単離された核酸であって、前記PCSK9特異的拮抗薬は：
（a） 配列番号：29を含むヌクレオチド配列によりコードされる重鎖領域；および
（b） 配列番号：30を含むヌクレオチド配列によりコードされる軽鎖領域
を含む、単離された核酸。
【請求項２７】
請求項２３から２６のいずれかの核酸を含むベクター。
【請求項２８】
請求項２３から２６のいずれかの核酸を含むインビトロもしくはインサイチューの単離された宿主細胞または宿主細胞の集団。
【請求項２９】
PCSK9特異的拮抗薬を製造する方法であって
（a） PCSK9特異的拮抗薬の製造に適切な条件下で請求項２８の細胞を培養すること；および
（b） 製造したPCSK9特異的拮抗薬を単離すること、
を含む、方法。
【請求項３０】
請求項１のPCSK9特異的拮抗薬を含むインビトロもしくはインサイチューの単離された宿主細胞または宿主細胞の集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国仮出願第61／063,980号（2008年2月7日出願）の利益を主張する。
該当せず
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
プロタンパク質転換酵素サブチリシンケクシン9（本書ではこれ以降「PCSK9」と呼ぶ）は、神経アポトーシス調節コンベルターゼ1（「NARC-1」）としても知られており、分泌性サブチラーゼ系統群の9番目の構成要素として識別されるタンパク質分解酵素K様のサブチラーゼである（Seidah  et  al.,2003  PNAS  100:928-933を参照）。PCSK9のための遺伝子は、ヒト染色体1p33-p34.3に局在している（Seidah  et  al.、  上記）。PCSK9は、例えば、肝実質細胞、腎臓間葉細胞、回腸、および大腸上皮、並びに胚性脳終脳ニューロン（embryonic  brain  telencephalon  neurons）を含む、増殖および分化の能力のある細胞に発現される（Seidah  et  al.,  上記）。
【０００３】
PCSK9の本来の合成（Original  synthesis）は、〜72-kDaの不活性酵素前駆体、または酵素前駆体の形態であり、これが小胞体（「ER」）において自己触媒的な分子内処理を受けて、その機能性を活性化する。この内部プロセシングイベントは、SSVFAQ↓SIPWNL158モチーフ（それぞれ配列番号：19および20）で発生することが報告されている（Benjannet  et  al.,  2004  J.  Biol.  Chem.  279:48865-48875）。こうした内部プロセシングは、ERから抜け出るための要件として報告されている（Benjannet  et  al.,上記；Seidah  et  al.,上記）。切断され、それによって活性化したタンパク質は、切断ペプチドに付随して分泌される。（上記）。
【０００４】
ヒトPCSK9の配列（692アミノ酸タンパク質をコードする12のエキソンを持ち、長さ〜22-kb）は、一例では、寄託番号NP_777596.2で見つかる。ヒト、マウスおよびラットのPCSK9核酸配列が登録されている（例えば、それぞれGenBank  Accession  Nos.：AX127530（またAX207686）、NP_705793（またQ80W65）、およびP59996を参照）。PCSK9は、N-末端シグナル配列、プロドメイン、触媒ドメインおよびシステインが豊富なC端末領域を含む、他のプロタンパク質転換酵素において見いだされるいくつかのドメインを持つ。PCSK9触媒ドメインは、サブチラーゼのタンパク質分解酵素Kファミリーおよび特に、触媒三組（catalytic  triad）D186、H226およびS386と高い配列類似性を共有する。
【０００５】
PCSK9は、限定されないものの、PCT公開番号WO  01／31007号、WO  01／57081号、WO  02／14358号、WO  01／98468号、WO  02／102993号、WO  02／102994号、WO  02／46383号、WO  02／90526号、WO  01／77137号およびWO  01／34768号、米国公開番号US  2004／0009553号およびUS  2003／0119038号、並びに欧州公開番号EP  1  440  981号、EP  1  067  182号およびEP  1  471  152号などを含むいくつかの特許公開で開示および／または請求されている。
【０００６】
PCSK9は、肝臓や神経細胞の分化において役割が与えられてきて（Seidah  et  al.、上記）、胚性肝臓で非常によく発現され、およびコレステロール恒常性に強く関連してきた。研究では、コレステロール生合成または取り込みにおけるPCSK9の具体的な役割が示唆されてきた。コレステロールを与えたラットの研究では、Maxwell  et  al.は、コレステロール生合成に関与する3つのその他の遺伝子と同様な方法で、PCSK9がダウンレギュレートされることを見出した（Maxwell  et  al.,  2003  J.  Lipid  Res.  44:2109-2119）。PCSK9の発現は、実際に、コレステロール代謝に関与する他の遺伝子で見られるように、ステロール調節要素結合タンパク質（「SREBP」）により制御されることが示された（上記）。後に、これらの研究結果についての裏付けがPCSK9の転写性の制御の研究を通してなされ、こうした制御がリポタンパク質の代謝に関連する他の遺伝子にとって全く一般的なものであることが示された（Dubuc  et  al.,  2004  Arterioscler.  Thromb.  Vasc.  Biol.  24:1454-1459）。スタチンは、薬物のコレステロール低下効果に起因する方法で、PCSK9の発現をアップレギュレートすることが示されてきた（上記）。その上、PCSK9プロモーターは、コレステロール制御に関与する2カ所の保存部位（conserved  sites）、ステロール調節要素およびSp1部位を持つことが示されてきた（上記）。
【０００７】
特にPCSK9が肝臓LDLRタンパク質の量を低下させ、そのため、肝臓のLDLコレステロールを循環から除去する能力を弱めることを、いくつかの系統の証拠が示している。マウスの肝臓におけるアデノウイルスを媒介したPCSK9過剰発現は、肝臓LDLRタンパク質の劇的な損失による循環LDL-Cの蓄積を生じ、LDLR  mRNAレベルに対する影響はない（Benjannet  et  al.,  2004  J.  Biol.  Chem.  279:48865-48875；Maxwell  ＆  Breslow,  2004  PNAS  101:7100-7105、Park  et  al.,  2004  J.  Biol.  Chem.  279:50630-50638、およびLalanne  et  al.,  2005  J.  Lipid  Res.  46:1312-1319）。マウスにおけるPCSK9過剰発現の循環LDL-Cレベル上昇に対する効果は、LDLRの発現に完全に依存し、やはり、PCSK9によるLDL-Cの制御は、LDLRタンパク質のダウンレギュレーションにより媒介されることを示している。これらの研究結果と一致して、PCSK9を欠損したマウスまたはPCSK9  mRNAがアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害薬により低下したマウスは、高いレベルの肝臓LDLRタンパク質および循環LDL-Cを一掃する高い能力を持つ（Rashid  et  al.,  2005  PNAS  102:5374-5379、およびGraham  et  al.,  2007  J.  Lipid  Res.  48（4):763-767）。さらに、siRNAにより培養したヒト肝実質細胞におけるPCSK9レベルを低下させることでも、LDLRタンパク質レベルの上昇およびLDL-C取り込み能力の増大につながる（Benjannet  et  al.,  2004  J.  Biol.  Chem.  279:48865-48875、およびLalanne  et  al.,  2005  J.  Lipid  Res.  46:1312-1319）。総合して、これらのデータは、PCSK9の作用が、LDLRタンパク質レベルの低下によるLDL-C増大につながることを示している。
【０００８】
遺伝子PCSK9での多数の突然変異も、血漿中の低密度リポタンパク質（「LDL」）粒子の著しい増加で特徴付けられ、早発性の心臓血管障害につながりうる遺伝性の代謝障害である常染色体優性高コレステロール血症（「ADH」）と結論的に関連してきた（Abifadel  et  al.,  2003  Nature  Genetics  34:154-156、Timms  et  al.,  2004  Hum.  Genet.  114:349-353、Leren,  2004  Clin.  Genet.  65:419-422を参照）。後に公開されたAbifadel  et  al.（上記）のS127R突然変異に関する研究では、こうした突然変異を有する患者は、（1）低密度リポタンパク質（「LDL」）、超低密度リポタンパク質（「VLDL」）および中間密度リポタンパク質（「IDL」）など、apoB100を含有するリポタンパク質の過剰産生、および（2）それに関連する前記リポタンパク質のクリアランスまたは転換の減少に起因して、血漿中で高めの総コレステロールおよびapoB100を示すことが報告されている（Ouguerram  et  al.,  2004  Arterioscler.  Thromb.  Vasc.  Biol.  24:1448-1453）。
【０００９】
従って、PCSK9がLDLの制御においてある役割をすることは疑いないと考えられる。PCSK9の発現またはアップレギュレーションは、LDLコレステロールの血漿濃度の増加に関連し、またそれに対応するPCSK9の阻害または発現の欠如は、LDLコレステロール血漿濃度の減少に関連する。PCSK9での配列の変化に関連したLDLコレステロール濃度の減少によって、冠動脈心疾患に対する保護が与えられることが分かっている（Cohen、2006  N.  Engl.  J.  Med.  354:1264-1272）。
【００１０】
心臓血管系の病気の治療に効果のある化合物および／または薬剤の同定が、非常に望ましい。臨床試験において、LDLコレステロールレベルの低減は、冠動脈性事象の発生率に直接関連している（Law  et  al.,  2003  BMJ  326:1423-1427）。ごく最近では、適度の生涯にわたる血漿LDLコレステロールレベルの低減は、冠動脈性事象の発生の大幅な低減に関連していることが分かっている（Cohen  et  al.、上記）。このことは、非リピド関連の心臓血管危険因子の高い有病性を持つ集団でもそうであった（上記）。従って、LDLコレステロールレベルを管理して制御することによって、大きな利益が得られる。
【００１１】
本発明は、様々な治療状態において、PCSK9の活性およびそれに対応してPCSK9の果たす役割を阻害する目的で使用するPCSK9の拮抗薬を提供することにより、これらの関心事を促進するものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第０１／３１００７号
【特許文献２】国際公開第０１／５７０８１号
【特許文献３】国際公開第０２／１４３５８号
【特許文献４】国際公開第０１／９８４６８号
【特許文献５】国際公開第０２／１０２９９３号
【特許文献６】国際公開第０２／１０２９９４号
【特許文献７】国際公開第０２／４６３８３号
【特許文献８】国際公開第０２／９０５２６号
【特許文献９】国際公開第０１／７７１３７号
【特許文献１０】国際公開第０１／３４７６８号
【特許文献１１】米国特許出願公開第２００４／０００９５５３号明細書
【特許文献１２】米国特許出願公開第２００３／０１１９０３８号明細書
【特許文献１３】欧州特許出願公開第1  ４４０  ９８１号明細書
【特許文献１４】欧州特許出願公開第１  ０６７  １８２号明細書
【特許文献１５】欧州特許出願公開第１  ４７１  １５２号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｓｅｉｄａｈ  ｅｔ  ａｌ．、２００３  ＰＮＡＳ  １００：９２８−９３３
【非特許文献２】Ｂｅｎｊａｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７９：４８８６５−４８８７５
【非特許文献３】Ｍａｘｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３  Ｊ．  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．  ４４：２１０９−２１１９
【非特許文献４】Ｄｕｂｕｃ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｖａｓｃ．  Ｂｉｏｌ．  ２４：１４５４−１４５９
【非特許文献５】Ｍａｘｗｅｌｌ  ＆  Ｂｒｅｓｌｏｗ，  ２００４  ＰＮＡＳ  １０１：７１００−７１０５
【非特許文献６】Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７９：５０６３０−５０６３８
【非特許文献７】Ｌａｌａｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５  Ｊ．  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．  ４６：１３１２−１３１９
【非特許文献８】Ｒａｓｈｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５  ＰＮＡＳ  １０２：５３７４−５３７９
【非特許文献９】Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７  Ｊ．  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．  ４８（４)：７６３−７６７
【非特許文献１０】Ａｂｉｆａｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３４：１５４−１５６
【非特許文献１１】Ｔｉｍｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．  １１４：３４９−３５３
【非特許文献１２】Ｌｅｒｅｎ，  ２００４  Ｃｌｉｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ６５：４１９−４２２
【非特許文献１３】Ｏｕｇｕｅｒｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｖａｓｃ．  Ｂｉｏｌ．  ２４：１４４８−１４５３
【非特許文献１４】Ｃｏｈｅｎ、２００６  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３５４：１２６４−１２７２
【非特許文献１５】Ｌａｗ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３  ＢＭＪ  ３２６：１４２３−１４２７
【発明の概要】
【００１４】
（発明の要旨）
本発明は、PCSK9の拮抗薬、また特定の実施形態において、ヒトおよびマウス両方のPCSK9を抑制し、プロセスされたPCSK9の優先的ターゲティングを示す拮抗薬に関する。広くは、タンパク質特異的なPCSK9の拮抗薬（または、本書では「PCSK9特異的拮抗薬」という）は、PCSK9タンパク質結合分子またはPCSK9の選択的結合およびPCSK9機能の阻害に効果的な分子である。これらの分子は、限定されないものの、高コレステロール血症、冠動脈心疾患、代謝症候群、急性冠動脈症候群および関連する状態を含む、PCSK9機能と関連性があるか、またはその影響を受ける状態の治療において重要である。PCSK9特異的拮抗薬は、PCSK9の選択的な認識およびそれへの結合により特徴付けられる。PCSK9特異的拮抗薬は、PCSK9特異的結合要素に対する追加的な明確な特異性を与えるよう補助されたか設計されている特定の場合を除き、PCSK9以外のタンパク質との有意な結合は示さない。
【００１５】
本書の特定の実施形態を形成するPCSK9特異的拮抗薬は、（a）配列番号：17または配列番号：17の同等物を含むCDR3ドメインを含む重鎖可変部であって、前記同等物はCDR3ドメインに1つ以上の保存的アミノ酸置換を持つことで特徴付けられる重鎖可変部、および／または（b）配列番号：7または配列番号：7の同等物を含むCDR3ドメインを含む軽鎖可変部であって、前記同等物はCDR3ドメインに1つ以上の保存的アミノ酸置換を持つことで特徴付けられる）を含む。特定の実施形態において、PCSK9特異的拮抗薬は、ヒトおよび／またはマウスのPCSK9に1.2×10-6  M以下のKDで結合する。さらに特定の実施形態において、PCSK9特異的拮抗薬は、ヒトおよび／またはマウスのPCSK9に1×10-7  M以下のKDで結合する。別の実施形態において、PCSK9特異的拮抗薬は、ヒトおよび／またはマウスのPCSK9に1×10-8  M以下のKDで結合する。さらなる実施形態において、PCSK9特異的拮抗薬は、ヒトおよび／またはマウスのPCSK9に5×10-9  M以下、または1×10-9  M以下のKDで結合する。特に選んだ実施形態において、PCSK9特異的拮抗薬は、ヒトおよび／またはマウスのPCSK9に1×10-10  M以下のKD、1×10-11  M以下のKD、または1×10-12  M以下のKDで結合する。特定の実施形態において、PCSK9特異的拮抗薬は、PCSK9への結合について示した上記レベルで、PCSK9以外のタンパク質には結合しない。
【００１６】
本発明の特定の実施形態には、上記の所定のレベルの1つでPCSK9との結合を示し、PCSK9との結合を1B20抗体分子と競争するPCSK9特異的拮抗薬が含まれる。1B20抗体分子は、本書において重要なPCSK9特異的拮抗薬を形成する。1B20抗体分子は、（i）配列番号：11を含む重鎖可変部（「VH」）および（ii）配列番号：27を含む軽鎖可変部（「VL」）を含むものとして特徴付けられる。前記VHおよびVL領域は、それぞれVH（配列番号：13、15および17）およびVL領域（配列番号：3、5および7）について開示したCDR  1、2および3を完全に補完するものである。1B20抗体分子の例には、限定はされないものの、（i）配列番号：1を含む軽鎖および配列番号：9のアミノ酸1〜221を含むアミノ酸を含むFd鎖を含むFab（つまり配列番号：9）、並びに（ii）配列番号：26を含む軽鎖および配列番号：25を含む重鎖を含む全長抗体分子が含まれる。
【００１７】
PCSK9特異的拮抗薬は、PCSK9依存的細胞LDL取り込みの阻害、また特にヒトおよび／またはマウスのPCSK9依存的細胞LDL取り込みの阻害の影響を弱めるのに効果的である。繰り返すと、PCSK9特異的拮抗薬1B20は、PCSK9のLDL取り込みに対する効果の用量依存的阻害が示された。従って、開示したPCSK9特異的拮抗薬は、血漿LDLコレステロールレベルの低下にとって重要である。また、開示した拮抗薬は、PCSK9の検出および数量化を含む各種の診断目的での有用性を持つ。特に選んだ1B20拮抗薬は、ヒトおよびマウス両方のPCSK9との交差反応性のために有用である。この特質により、マウスがヒトPCSK9を発現することを確認することなく、特定の1B20拮抗薬をマウスモデルで薬理学的に研究することが可能となっている。こうした実験において、マウスモデルは、標的とされたタンパク質の天然の活性およびその拮抗薬の阻害を十分に示す。
【００１８】
特定の実施形態において、本発明には、PCSK9特異的拮抗薬が含まれる。特定の実施形態において、本発明には、開示した重鎖および／または軽鎖の可変部、1つ以上の保存的アミノ酸置換を持つ前記領域の同等物、およびその相同体を含む抗体分子が含まれる。特に選んだ実施形態は、開示したCDRドメインまたは何組かの重鎖および／または軽鎖CDRドメイン、および1つ以上の保存的アミノ酸置換を持つものとして特徴付けられるドメインの同等物を含む、単離されたPCSK9特異的拮抗薬を含む。当業者であれば理解されるとおり、PCSK9を拮抗する能力を保持するPCSK9特異的拮抗薬の断片を各種のフレームワークに挿入することもできる（例えば、米国特許第6,818,418号およびそれに含まれる参考資料を参照し、抗原結合に基づきこれまでに選択された抗体ループを示すために使用しうる各種の骨格について考察したその開示全体を参照することにより本書に組み込む）。別の方法で、VLおよびVHをコードする遺伝子は、組み換え法を使用して、例えばそれらをVLおよびVH領域ペアが一価分子を形成する単一のタンパク質鎖にすることができ、別の点では単鎖Fvs（「ScFVs」）として知られている合成リンカーを使用して結合しうる（例えば、Bird  et  al.,  1988  Science  242：423-426、およびHuston  et  al.,  1988  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  85:5879-5883を参照し、その開示内容を参照することにより本書に組み込む）。
【００１９】
PCSK-9特異的拮抗薬および断片は、限定されないものの、アビマー（Avidia）；DARPins（Molecular  Partners）；アドネクチン（Adnexus）、アンチカリン（Pieris）およびアフィボディ（Affibody）を含む、各種の非抗体ベースの骨格の形態でもよい。タンパク質結合のための代替的な骨格の使用は、学術論文で高く評価されている（例えば、Binz  ＆  Pluckthun,  2005  Curr.  Opin.  Biotech.  16:1-11を参照し、その開示内容を参照することにより本書に組み込む）。従って、（i）開示した重鎖および／または軽鎖の可変部CDR3配列（それぞれ配列番号：17および7）、（ii）開示した重鎖可変CDR1、CDR2およびCDR3配列または開示した軽鎖可変CDR1、CDR2およびCDR3配列：CDR1（それぞれ配列番号：13および3）、CDR2（それぞれ配列番号：15および5）およびCDR3（それぞれ配列番号：17および7）、（iii）それぞれヒトの重鎖および／または軽鎖配列の可変部フレームワーク内の開示した重鎖および軽鎖CDRの完全な相補物（配列番号：13、15、17、3、5および7）、または（iv）開示した重鎖および／または軽鎖の可変部配列番号：11および／または配列番号：27を含む、非抗体ベースの骨格または拮抗薬分子は、本発明の重要な実施形態を形成し、ここでこうした骨格または拮抗薬分子は、PCSK9についての選択性を示し、PCSK9依存的細胞LDL取り込みの阻害の影響を弱める。別の態様において、本発明は、開示したPCSK9特異的拮抗薬、また特定の実施形態において、開示した重鎖および軽鎖、開示した可変の重領域および軽領域、並びにその選択成分（CDR  1、2および／または3など）、特に開示したそれぞれのCDR3領域を含むPCSK9特異的拮抗薬をコードする核酸を提供する。別の態様において、本発明は、前記核酸を含むベクターを提供する。さらに、本発明は、PCSK9特異的拮抗薬をコードする核酸を含む単離された細胞を提供する。別の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドまたはベクターを含む単離された細胞を提供する。
【００２０】
本発明は、限定されないものの、抗体、抗原結合断片、誘導体、キメラ分子、上記のいずれかと別のポリペプチドの融合物、または開示した配列を含むPCSK9と特異的に結合する能力を持つ代替の構造／組成物を含む、本書で開示したPCSK9特異的拮抗薬を製造する方法を提供する。本方法は、（i）PCSK9特異的拮抗薬をコードする核酸を含む細胞、またはその1つ以上の成分をコードする個別の核酸を含む細胞の培養であって、前記核酸は発現されると、PCSK9特異的拮抗薬の発現および／または組立が許容される条件下で集合的に拮抗薬を生成する、培養、および（ii）細胞からの前記拮抗薬の単離を含む。当業者は、本書で開示したPCSK9特異的拮抗薬を同様に標準的な組み換えDNA技術を使用して得ることもできる。
【００２１】
本発明は、PCSK9の活性もしくは機能またはPCSK9の特筆すべき効果を拮抗する方法であって、前記拮抗薬のPCSK9への結合が許容される条件下で、PCSK9を発現する（またはヒトもしくはマウスのPCSK9で処理したか、またはその内部にヒトもしくはマウスのPCSK9を有する）関心対照の細胞、細胞の集団または組織試料を、本書で開示したPCSK9特異的拮抗薬と接触させることを含む方法を提供する。本発明の具体的な実施形態には、細胞がヒトまたはマウスの細胞である方法が含まれる。別の実施形態は、細胞がヒトまたはマウス由来のPCSK9を発現するものである。
【００２２】
別の態様において、本発明は、PCSK9活性に関連した状態またはPCSK9の機能が特定の被験者について禁忌である状態を示す被験者において、PCSK9の活性もしくは機能またはPCSK9の特筆すべき効果を拮抗する方法であって、薬剤組成物またはその他の組成物中の本発明のPCSK9特異的拮抗薬の治療的に有効な量を被験者に投与することを含む方法を提供する。
【００２３】
こうして、本発明は、PCSK9活性に関連した状態またはPCSK9の機能が特定の被験者について禁忌である状態を治療する方法であって、薬剤組成物またはその他の組成物中の本発明のPCSK9特異的拮抗薬の治療的に有効な量を被験者に投与することを含む方法が含まれる。特に選んだ実施形態において、状態は、高コレステロール血症、冠動脈心疾患、代謝症候群、急性冠動脈症候群または関連する状態である。
【００２４】
特定の実施形態において、本発明には、治療的に有効な量の本書で開示したPCSK9特異的拮抗薬を含む薬剤組成物またはその他の組成物の送達を含む、開示したPCSK9特異的拮抗薬を被験者に投与する方法が含まれる。
【００２５】
別の態様において、本発明は、限定されないものの、賦形剤、希釈剤、安定剤、緩衝液、または代替的に拮抗薬の希望する量での治療対象者への投与を促進するように設計されたものを含む医薬品として容認される担体を含むものとして特徴付けられる本発明のPCSK9特異的拮抗薬を含む薬剤組成物またはその他の組成物を提供する。
【００２６】
次の表は、本出願で考察した配列についての全般的概要を提供するものである。全ての記号、配列および特徴（features）を含む配列リストは、本書の開示の明示的部分（express  part）を形成する。
【００２７】
【表１】
0005514743.tif 000002
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【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】6CX1B20（「1B20」）Fab重鎖および軽鎖をコードするFab発現ベクター  pMORPH_x9_MHを図示する。
【図２】PCSK9-LDLR相互作用TR-FRET試験法での1B20の活性を図示する。1B20のFabおよびIgGはどちらも強力で、相互作用を完全に抑制する。この実験では、[AF647-PCSK9]  =  10nM、[Eu-sLDLR]  〜4  nM（FI620nmで〜20000カウント）である。
【図３】図3A〜3Dは、（i）1B20（Fab）の用量依存的なマウスPCSK9依存的細胞LDL取り込みの損失の阻害（図3A）；（ii）1B20（Fab）の用量依存的なヒトPCSK9依存的細胞LDL取り込みの損失の阻害（図3B）；（iii）1B20（IgG）の用量依存的なマウスPCSK9依存的細胞LDL取り込みの損失の阻害（図3C）；および（iv）1B20（IgG）の用量依存的なヒトPSCK9依存的細胞LDL取り込みの損失の阻害（図3D）を図示する。1B20は、明確にヒトおよびマウスのPCSK9の両方と交差反応をする。図3A〜3Dには、（i）細胞LDL取り込みの基礎レベルを示す細胞のみの対照、および（ii）PCSK9依存的LDL取り込みの損失レベルを示すPCSK9（5  μg/ml）対照の2つの対照がある。1B20およびPCSK9が含まれる滴定実験は、一定の濃度のPCSK9（5  μg/ml）で、およびグラフに示すとおり次第に増える濃度の1B20で実施した。図示したとおり、1B20は、細胞LDL取り込みに対するPCSK9の効果を抑制しうる。1B20（Fab）についてのIC50は、マウスおよびヒトのPCSK9タンパク質についてそれぞれ152  nM（n=5）および145  nM（n=5）である。1B20（IgG）についてのIC50は、マウスおよびヒトのPCSK9タンパク質についてそれぞれ13  nMおよび22  nMである。
【図４】1B20（IgG）によるPCSK9インターナリゼーションの阻害を図示する。HEK293細胞を平板培養し、AlexaFluor標識化したPCSK9およびLDLを細胞に加え、37℃で4時間培養した。培養後、細胞によって内部移行されたPCSK9またはLDLの量を共焦点顕微鏡（cofocal  microscopy）を使用して決定した。対照には、細胞のみの添加（処理なし）、および50Xの未標識のPCSK9（50X  Cold  Wt）にAF標識化したPCSK9のみ（250  μg/ml）を加えたものを含む。5  μg/mlの野生型AF標識化PCSK9および10μg/mlのAF標識化LDLに加え、次第に増加する量の1B20  IgGを加えたところ、その後、結果的に細胞へのPCSK9インターナリゼーションが阻害された。総合すると、これらの研究は、1B20  IgGは、細胞へのPCSK9インターナリゼーションを阻止することを示している。
【図５】一組の結合シンボルで表示されるそれぞれのマウスについてのLDLレベルを図示し；LDL（postbleed  -  prebleed）の変化が各治療群についての平均として表示されている（Δ  mg／dL）。PBSでの治療は、LDL測定に全く効果がない（-4  mg／dL、5％減少）。対照的に、血清LDLは、1B20の完全IgGで20％減少した（-19  mg／dL）。
【図６】IgG1（配列番号：21；そのFcドメインは、配列番号：21の残基  110-130によって表される）、IgG2（配列番号：22、そのFcドメインは、配列番号：22の残基107-326によって表される）、IgG4（配列番号：23；そのFcドメインは、配列番号：23の残基107-327によって表される）およびIgG2m4（配列番号：24；そのFcドメインは、配列番号：24の残基107-326によって表される）アイソタイプの定常部の配列比較を図示する。
【図７】アカゲザルにおいて、1、3および10  mpkで1B20がLDL-Cを〜50％減少させることを図示する。プロットしたのは、抗体治療単回IV投与後の試験した異なる時点での、血清中の％LDL変化である。
【図８】表示した用量レベルでの1B20の薬物動態的プロフィールを図示する。プロットしたのは、抗体の単回IV用量後の試験した時点での血清薬物（1B20）レベルである。1B20の半減期は39時間である。
【図９】37℃で時点0からSECで測定した合計凝集量の変化を図示する。
【図１０】37℃で1、2および3カ月貯蔵した後での各種製剤におけるMK-2370の動的光散乱（「DLS」）測定を図示する。
【図１１】タンパク質濃度50  mg/ｍLの液体中で、25℃で時点0からSEC-HPLCで測定した合計凝集量の変化を図示する。
【図１２】タンパク質濃度50  mg/ｍLの液体中で、25℃で時点0からSEC-HPLCで測定した合計凝集量の変化を図示する。
【図１３】液体の形態で25℃で6カ月貯蔵した後の、50、100および150  mg/ｍLで観察された合計凝集量を図示する。
【図１４】50  mg/ｍLで時点0から25℃で、SEC-HPLCで測定した合計凝集量の変化を図示する。*6／100／100データは異なる研究からのもの。
【図１５】25℃でSEC-HPLCで測定した各種濃度のmAb3の合計凝集量を図示する。
【図１６】25℃でタンパク質濃度50  mg/ｍLでSEC-HPLCで測定した観察した合計凝集量を図示する。
【図１７】25℃でタンパク質濃度50  mg/ｍLでSEC-HPLCで測定した観察した合計凝集量を図示する。
【図１８】50  mg/ｍLで凍結乾燥形態での3カ月間の貯蔵中、様々な温度でSEC-HPLCで測定した合計凝集量の変化を図示する。
【図１９】50  mg/ｍLで凍結乾燥形態でSEC-HPLCで測定した合計凝集量を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
（発明の詳細な記述）
本発明は、PCSK9の拮抗薬、また特定の実施形態において、ヒトおよびマウス両方のPCSK9を抑制し、プロセスされたPCSK9を優先的にターゲティングする拮抗薬に関する。本書によるタンパク質特異的なPCSK9の拮抗薬（または「PCSK9特異的拮抗薬」）は、PCSK9機能への選択的結合およびPCSK9機能の阻害に効果があり、よって、限定されないものの、高コレステロール血症、冠動脈心疾患、代謝症候群、急性冠動脈症候群および関連する状態を含むPCSK9機能に関連するか、またはPCSK9機能の影響を受けた状態の治療にとって重要である。用語「拮抗薬」の使用は、主題の分子がPCSK9の機能を拮抗しうる事実を意味する。用語「拮抗する」またはその派生語の使用は、PCSK9の1つ以上の機能に対抗、反作用、阻害、中和または抑制する作用を意味する。本書におけるPCSK9機能またはPCSK9活性への言及は、PCSK9により促進される、それを必要とする、またはそれにより悪化もしくは向上される何らかの機能または活性を意味する。本書で説明したPCSK9特異的拮抗薬は、ヒトおよび／またはマウスPCSK9依存的細胞LDL取り込みの阻害の影響を弱めることに効果があることが実証されている。
【００３０】
本発明の重要な一実施形態は、1B20抗体分子に関する。こうした1B20抗体分子は、（i）配列番号：11を含む重鎖可変部（「VH」）および（ii）配列番号：27を含む軽鎖可変部（「VL」）を含むものとして特徴付けられる。前記VHおよびVL領域は、それぞれVH（配列番号：13、15および17）およびVL領域（配列番号：3、5および7）について開示したCDR  1、2および3の完全相補物を含む。1B20抗体分子の例には、限定はされないものの、（i）配列番号：1を含む軽鎖および配列番号：9のアミノ酸1〜221を含むFd鎖を含むFab（または配列番号：9）、および（ii）配列番号：26を含む軽鎖および配列番号：25を含む重鎖を含む全長抗体分子が含まれる。特に選んだ群の1B20抗体は、本書で開示したPCSK9特異的拮抗薬がヒトおよびマウス両方のPCSK9を効果的に阻害すること、およびヒトPCSK9の発現が不在のマウスモデルで薬理学的に研究しうることを示す。
【００３１】
本書で到達し、開示したCDR定義は、Morphosysソフトウェアプログラム配列分析ソフトウェア（「SAS」）を使用して定義したものである。ただし、出願人は、CDR配列の開始点および終了点の描写および定義には、その他の様々な方法が利用できることの注記を希望し、これには、限定されないものの、Kabat,  1991  Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest,  5th  edit.,  NIH  Publication  no.  91-3242  U.S.  Department  of  Health  and  Human  Services、Clothia  et  al.,  1987  J.  Mol.  Biol.  196:901-917、Clothia  et  al.,  1989  Nature  342:877-883、Lefranc,  1997  Immunol.  Today,  18:509、およびChen  et  al.,  1999  J.  Mol.  Biol.  293:865-881を含む。これらおよびその他の方法が、検討（reviewed）されてきており、十分に当業者の有する技能の範囲内である（例えば、Honegger  ＆  Pluckthun,  2001  J.  Mol.  Biol.  309:657-670を参照）。CDRを定義するために当発明人はSASソフトウェアを採用したが、本発明は配列に関連する異なる定義や異なる任意の分析ソフトウェアまたは方法を用いることにより到達した異なるCDR描写も全面的に包括する。現時点で開示されている配列に基づく前記使用および結果的なCDR定義は、十分に本開示の範囲内にあり、本書で予想される。
【００３２】
PCSK9特異的分子は、PCSK9の検出および数量化での各種の診断目的のための有用性も持つ。
【００３３】
その上、開示したPCSK9特異的拮抗薬は、特に選んだ実施形態はプロセスされたPCSK9、活性形態のPCSK9の優先的認識を示してきたという点でユニークである。
【００３４】
本書で開示したPCSK9特異的拮抗薬は、血漿LDLコレステロールレベルの低下にとって望ましい分子であり、また商業的または家畜の獣医学上の重要性のある任意の霊長類、哺乳動物または脊椎動物にとって有用である。PCSK9特異的拮抗薬は、LDL受容体を有する任意の細胞の集団または組織においてPCSK9の活性を抑制するという有用性もある。開示した拮抗薬の有用性は、当業者がたやすく利用できるアッセイにより直接測定される。LDL取り込みの測定手段は、文献に記載されている（例えば、Barak  ＆  Webb,  1981  J.  Cell  Biol.  90:595-604、およびStephan  ＆  Yurachek,  1993  J.  Lipid  Res.  34:325330を参照）。さらに、血漿中のLDLコレステロールを測定する手段は、文献に詳しく記載されている（例えば、McNamara  et  al.,  2006  Clinica  Chimica  Acta  369:158-167を参照）。開示した拮抗薬の細胞LDL取り込みに対する特定の影響は、精製した（purified）PCSK9および標識化したLDL粒子を細胞試料に供給すること、PCSK9拮抗薬を細胞試料に供給すること、LDL粒子が細胞により取り込みされるために十分な期間の間で前記細胞試料を培養すること、細胞に取り込まれた標識の量を数量化すること、およびPCSK9を単独で投与したときに観測された量と比較して、細胞により取り込みされた数量化した標識の量の増加につながる拮抗薬を同定（identifying）することを含む方法によっても測定しうる。開示した拮抗薬の影響を測定する追加的な方法は、精製した（purified）PCSK9および標識化したLDL粒子を細胞試料に供給すること、PCSK9拮抗薬を細胞試料に供給すること、LDL粒子が細胞により取り込みされるために十分な期間の間で前記細胞試料を培養すること、上澄みを除去することで細胞試料の細胞を分離すること、標識化したLDL粒子の非特異的な関連を低減すること（プレート、細胞、またはLDL受容体以外の物に対してかどうか）、細胞を溶解させること、細胞可溶化物内に保持されている標識の量を数量化すること、およびPCSK9を単独で投与したときに観測された量と比較して、細胞により取り込みされた数量化した標識の量の増加につながる拮抗薬を同定（identifying）することを含む。数量化した標識の量の増加につながる拮抗薬がPCSK9拮抗薬である。
【００３５】
LDL受容体を持つ任意のタイプの細胞が、上記の方法で採用でき、これには、限定されないものの、HEK細胞、HepG2細胞、およびCHO細胞を含む。任意の出所（source）に由来するLDL粒子が、上述のアッセイで使用される。特定のアッセイにおいて、LDL粒子は、血液に由来する新鮮な粒子である。これは、当業者が利用できる任意の方法により達成でき、これには、限定されないものの、Havel  et  al.,  1955  J.  Clin.  Invest.  34：1345-1353の方法を含む。LDL粒子は、蛍光で標識化することもできる。標識化したLDL粒子は、その内部に可視光の波長で励起したフルオロフォア  3,3'-ジオクタデシルインドカルボシアニンヨウ化物（dil（3））が取り込まれて、高い蛍光性のあるLDL誘導体dil（3）-LDLを形成することもある。当業者が細胞可溶化物内のLDLを検出できるようにする任意の標識を使用しうる。細胞内で代謝されたときにのみ（例えば、蛍光性を持つようになるかまたは異なる波長で蛍光を発するなど）、または、例えば、内部移行される過程でその他の分子と結合する（または分離する）ようになった場合（例えば、LDL類似体が二次蛍光と結合するようになるか、または他の場合に消光剤と分離する、FRET試験法）に検出可能となるLDL類似体を使用できる。標識化したLDL粒子のインターナリゼーションの検出のために当技術で利用できる任意の手段を採用できる。LDL粒子およびPCSK9を細胞とともに培養する時間は、細胞によるLDL粒子の取り込みが許容されるのに十分な時間量である。この時間は、5分〜360分の範囲内である。細胞に追加するPCSK9の濃度は、1  nM〜5  μMの範囲とすることができ、また、特定の方法において、0.1  nM〜3  μMの範囲である。当業者が特定のPCSK9タンパク質についての濃度の範囲を決定できる1つの特定の手段は、LDL取り込み試験法での用量反応曲線の作成である。PCSK9の濃度は、LDL取り込みの最大に近い損失が促進され、なおかつ用量反応曲線の直線範囲内にあるように選択できる。一般に、この濃度は、用量反応曲線から求めたタンパク質のEC-50に〜5倍をかけたものである。濃度は、タンパク質によって変化しうる。
【００３６】
概して、本書で定義したPCSK9特異的拮抗薬は、PCSK9を選択的に認識し、それに対して特異的に結合される。抗体は、一般に解離定数が  ≦1μM、望ましくは  ≦100  nMおよび最も望ましくは  ≦10  nMのときに、抗原に対して特異的に結合されるといわれる。さらに本書での用語「選択的」または「特異的」の使用は、開示した拮抗薬がPSCK9以外のタンパク質に対して有意な結合を示さないという事実を意味するが、拮抗薬が追加的な、明確な特異性をPCSK9特異的結合部分に対して与えるよう補完または設計されている特定の場合（例えば、分子が2つの分子と結合するか、もしくは2つの機能に影響を及ぼすよう設計されている二重特異性または二機能性の分子において、そのうち少なくとも一方が、PCSK9と特異的に結合するような場合）を除く。特定の実施形態において、PCSK9特異的拮抗薬は、ヒトおよび／またはマウスのPCSK9に1.2×10-6  M以下のKDで結合する。さらに特定の実施形態において、PCSK9特異的拮抗薬は、ヒトおよび／またはマウスのPCSK9に5×10-7  M以下、2×10-7  M以下、または1×10-7  M以下のKDで結合する。別の実施形態において、PCSK9特異的拮抗薬は、ヒトおよび／またはマウスのPCSK9に1×10-8  M以下のKDで結合する。さらなる実施形態において、PCSK9特異的拮抗薬は、ヒトおよび／またはマウスのPCSK9に5×10-9  M以下、または1×10-9  M以下のKDで結合する。特に選んだ実施形態において、PCSK9特異的拮抗薬は、ヒトおよび／またはマウスのPCSK9に1×10-10  M以下のKD、1×10-11  M以下のKD、または1×10-12  M以下のKDで結合する。特定の実施形態において、PCSK9特異的拮抗薬は、上記レベルではPCSK9以外のタンパク質には結合しない。KDは、Kd（特定の結合分子-標的のタンパク質相互作用の解離率）のKa（特定の結合分子-標的のタンパク質相互作用の関連率）に対する比率から得られる解離定数、またはモル濃度（M）で表現されるKd／Kaを意味する。KD値は、当技術で十分に確立された方法を用いて決定できる。結合分子のKDを決定するための望ましい方法は、表面プラズモン共鳴を使用することで、例えばBiacore（商標）（GE  Healthcare  Life  Sciences）システムなどのバイオセンサーシステムを採用する方法である。
【００３７】
本書で開示したPCSK9特異的拮抗薬は、LDL取り込みに対するヒトおよび／またはマウスPCSK9依存的効果を用量依存的に抑制することが示された。従って、本書で開示したPCSK9特異的拮抗薬は、細胞へのLDL取り込みのPCSK9依存的阻害の影響を弱める能力によって特徴付けられる。LDL受容体による細胞内へのこのLDLの取り込みを、本書では「細胞LDL取り込み」という。特定の実施形態において、PCSK9特異的拮抗薬は、ヒトおよび／またはマウスのPCSK9依存的細胞内へのLDL取り込みの阻害の影響を弱めるかまたは拮抗し、1.0×10-6  M未満、あるいは、優先される順に、1×10-7  M未満、1×10-8  M未満、1×10-9  M未満、1×10-10  M未満、1×10-11  M未満および1×10-12  M未満のIC50を示している。任意のPCSK9特異的拮抗薬による阻害の度合いは、対照との統計的比較において、またはPCSK9機能に対するマイナスの影響またはその阻害を評価するために当技術で利用可能な任意の代替的な方法（すなわち、PCSK9機能の拮抗作用を評価する能力のある任意の方法）により、数量的に測定しうる。特定の実施形態において、阻害は少なくとも約10％の阻害である。その他の実施形態において、阻害は少なくとも20％、30％、40％、50％、60％、70,％、80％、90％、または95％である。従って、PCSK9機能のこれらの阻害レベルを達成する能力のあるPCSK9特異的拮抗薬は、本書の特定の実施形態を形成する。
【００３８】
本発明によるPCSK9特異的拮抗薬には、ヒトおよび／またはマウスPCSK9タンパク質に特異的に結合する任意の結合分子（限定されないものの、下記に定義する抗体分子を含む）、任意のPCSK9特異的結合構造、PCSK9と特異的に結合する任意のポリペプチドまたは核酸構造、および各種のタンパク質骨格（限定されないものの、各種の非抗体ベースの骨格を含む）に組み込まれた上記のいずれか、およびPCSK9との選択的結合を産出または許容する各種の構造（限定されないものの、「SMIP」（small  modular  immunopharmaceuticals）（Haan  ＆  Maggos,  2004  Biocentury  Jan  26を参照）、免疫タンパク質（例えば、Chak  et  al.,  1996  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  93:6437-6442を参照）、シトクロムb562（Ku  and  Schultz,  1995  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  92:6552-6556を参照）、ペプチドα2p8（Barthe  et  al.,  2000  Protein  Sci.  9:942-955を参照）、アビマー（Avidia；Silverman  et  al.,  2005  Nat.  Biotechnol.  23:1556-1561を参照）、DARPins（Molecular  Partners；Binz  et  al.,  2003  J.  Mol.  Biol.  332:489-503、およびForrer  et  al.,  2003  FEBS  Lett.  539:2-6を参照）、テトラネクチン（Kastrup  et  al.,  1998  Acta.  Crystallogr.  D.  Biol.  Crystallogr.  54:757-766を参照）、アドネクチン（Adnexus；Xu  et  al.,  2002  Chem.  Biol.  9:933-942を参照）、アンチカリン（Pieris；Vogt  ＆  Skerra,  2004  Chemobiochem.  5:191-199、Beste  et  al.,  1999  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  96:1898-1903、Lamla  ＆  Erdmann,  2003  J.  Mol.  Biol.  329:381-388、およびLamla  ＆  Erdmann,  2004  Protein  Expr.  Purif.  33:39-47を参照）、Aドメインタンパク質（North  ＆  Blacklow,  1999  Biochemistry  38:3926-3935を参照）、リポカリン（Schlehuber  ＆  Skerra,  2005  Drug  Discov.  Today  10:23-33を参照）、アンキリンリピートタンパク質などのリピートモチーフタンパク質（Sedgwick  ＆  Smerdon,  1999  Trends  Biochem.  Sci.  24:311-316、Mosavi  et  al.,  2002  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  99:16029-16034、およびBinz  et  al.,  2004  Nat.  Biotechnol.  22:575-582を参照）、インセクトディフェンシンA（Zhao  et  al.,  2004  Peptides  25:629-635を参照）、Kunitzドメイン（Roberts  et  al.,  1992  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  89:2429-2433、Roberts  et  al.,  1992  Gene  121:9-15、Dennis  ＆  Lazarus,  1994  J.  Biol.  Chem.  269:22129-22136、およびDennis  ＆  Lazarus,  1994  J.  Biol.  Chem.  269:22137-22144を参照）、PDZドメイン（Schneider  et  al.,  1999  Nat.  Biotechnol.  17:170-175を参照）、カリブドトキシンなどのサソリ毒（Vita  et  al.,  1998  Biopolymers  47:93-100を参照）、10thフィブロネクチンIII型ドメイン（or  10Fn3、Koide  et  al.,  1998  J.  Mol.  Biol.  284:1141-1151、およびXu  et  al.,  2002  Chem.  Biol.  9:933-942を参照）、CTLA-4（細胞外ドメイン、Nuttall  et  al.,  1999  Proteins  36:217-227、およびIrving  et  al.,  2001  J.  Immunol.  Methods  248:31-45を参照）、ノッチン（Souriau  et  al.,  2005  Biochemistry  44:7143-7155およびLehtio  et  al.,  2000  Proteins  41:316-322を参照）、ネオカルチノスタチン（Heyd  et  al.  2003  Biochemistry  42:5674-5683を参照）、炭水化物結合モジュール4-2（CBM4-2、Cicortas  et  al.,  2004  Protein  Eng.  Des.  Sel.  17:213-221を参照）、テンダミスタット（McConnell  ＆  Hoess,  1995  J.  Mol.  Biol.  250:460-470、およびLi  et  al.,  2003  Protein  Eng.  16:65-72を参照）、T細胞受容体（Holler  et  al.,  2000  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  97:5387-5392、Shusta  et  al.,  2000  Nat.  Biotechnol.  18:754-759、およびLi  et  al.,  2005  Nat.  Biotechnol.  23:349-354を参照）、アフィボディ（Affibody、Nord  et  al.,  1995  Protein  Eng.  8:601-608、Nord  et  al.,  1997  Nat.  Biotechnol.  15:772-777、Gunneriusson  et  al.,  1999  Protein  Eng.  12:873-878を参照）、および文献で認識されているその他の選択的に結合するタンパク質または骨格（例えば、Binz  ＆  Pluckthun,  2005  Curr.  Opin.  Biotech.  16:1-11、Gill  ＆  Damle,  2006  Curr.  Opin.  Biotechnol.  17:1-6、Hosse  et  al.,  2006  Protein  Science  15:14-27、Binz  et  al.,  2005  Nat.  Biotechnol.  23:1257-1268、Hey  et  al.,  2005  Trends  in  Biotechnol.  23:514-522、Binz  ＆  Pluckthun,  2005  Curr.  Opin.  Biotech.  16:459-469、Nygren  ＆  Skerra,  2004  J.  Immunolog.  Methods  290:3-28、Nygren  ＆  Uhlen,  1997  Curr.  Opin.  Struct.  Biol.  7:463-469を参照）などが含まれ、その開示内容を参照することにより本書に組み込む。抗体および抗原結合断片の使用については、文献で十分に定義され、理解されている。タンパク質結合のための代替的な骨格の使用については、同様に学術論文で十分に認識されている（例えば、Binz  ＆  Pluckthun,  2005  Curr.  Opin.  Biotech.  16:1-11、Gill  ＆  Damle,  2006  Curr.  Opin.  Biotechnol.  17:1-6、Hosse  et  al.,  2006  Protein  Science  15:14-27、Binz  et  al.,  2005  Nat.  Biotechnol.  23:1257-1268、Hey  et  al.,  2005  Trends  in  Biotechnol.  23:514-522、Binz  ＆  Pluckthun,  2005  Curr.  Opin.  Biotech.  16:459-469、Nygren  ＆  Skerra,  2004  J.  Immunolog.  Methods  290:3-28、Nygren  ＆  Uhlen,  1997  Curr.  Opin.  Struct.  Biol.  7:463-469を参照し、その開示内容を参照することにより本書に組み込む）。従って、PCSK9依存的細胞LDL取り込みの阻害の影響を弱めるPCSK9の選択性を示す、本発明による非抗体ベースの骨格または拮抗薬分子は、本発明の重要な実施形態を形成する。アプタマー（目標の分子と選択的に結合する能力のある核酸またはペプチド分子）は、1つの具体的な例である。これらは、無作為な配列プールから選択するか、またはリボスイッチなど天然の出所から同定することができる。ペプチドアプタマー、核酸アプタマー（例えば、DNAおよびRNAの両方をベースにした構造を含む構造化された核酸）および核酸デコイが、選択的な結合および目的のタンパク質の阻害に効果的でありうる（例えば、Hoppe-Seyler  ＆  Butz,  2000  J.  Mol.  Med.  78:426-430、Bock  et  al.,  1992  Nature  355:564-566、Bunka  ＆  Stockley,  2006  Nat.  Rev.  Microbiol.  4:588-596、Martell  et  al.,  2002  Molec.  Ther.  6:30-34、Jayasena,  1999  Clin.  Chem.  45:1628-1650を参照し、その開示内容を参照することにより本書に組み込む）。
【００３９】
1B20の著しい中和活性を考慮すると、1B20と同じ方法でPCSK9に結合するその他のPCSK9特異的拮抗薬を同定することは、明らかに関心事である。1B20と同じ領域もしくはエピトープまたは重複するエピトープに結合する拮抗薬および特に抗体を同定する1つの手段は、競合または類似した試験法によるもので、この場合、候補抗体または結合分子がそのエピトープについて1B20を凌ぐ（out-compete）必要がある。本書で包含された競合的拮抗薬は、1B20の結合を少なくとも50％、60％、70％、および80％（優先順）（さらにより望ましくは、少なくとも90％で、最も望ましくは、少なくとも95％）だけ抑制するか（すなわち、対照と比較して1B20の結合を阻止するか、または妨害する）または1  μM以下で、1B20がそのKD以下で低減する分子であり、また特に（i）LDL受容体へのPCSK9の結合、（ii）細胞へのPCSK9のインターナリゼーション、あるいは（iii）LDL受容体へのPCSK9の結合および細胞へのPCSK9のインターナリゼーションの両方を拮抗する分子である。結合する構成要素間での競合は、例えば、ELISAを用いて、および／または溶液中での抗体のPCSK9との相互作用を監視することで、インビトロ容易にアッセイしうる。分析を実施する厳密な手段は重要ではない。PCSK9は、96ウェルプレートに固定化したり、同種（同質）の溶液中に配置することができる。特定の実施形態において、標識化した1B20の結合を阻止する未標識の候補抗体の能力は、放射能、酵素またはその他の標識を使用して測定できる。逆アッセイでは、標識化された1B20のPCSK9との相互作用（ここで前記1B20およびPCSK9は既に結合されている）を妨害する未標識の抗体の能力が決定される。特定の実施形態において、（i）PCSK9が標識化された1B20（配列番号：27を含むVLおよび配列番号：11を含むVHを含む抗体分子）と接触し；（ii）PCSK9が候補抗体または抗体プールと接触し、および（iii）PCSK9および1B20の間の複合体の妨害または阻止をする能力のある抗体が同定される。こうした例での読み出しは、結合された標識の測定による。1B20および候補抗体は、任意の順序でまたは同時に追加しうる。
【００４０】
上記またはその他の適切なアッセイにおいて1B20競合相手として同定された抗体を、（i）LDL受容体へのPCSK9の結合、および／または（ii）細胞へのPCSK9のインターナリゼーションを拮抗もしくは中和する能力について試験することができる。これらのパラメーターは、本明細書で採用または説明したものと類似したアッセイの使用により測定することができる。特定の実施形態において、競合する抗体により示される阻害は、少なくとも約10％の阻害である。その他の実施形態において、阻害は少なくとも20％、30％、40％、50％、60％、70,％、80％、90％または95％である。
【００４１】
本発明は、特にPCSK9特異的拮抗薬を含み、また特に、1B20と同一のエピトープまたは1B20のPCSK9との結合を妨害する重複するエピトープ（およびそれらの対応するアミノ酸および核酸配列）に選択的に結合するモノクローナル抗体分子を含む。1B20のエピトープまたは重複するエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体は、（i）LDL受容体へのPCSK9の結合；（ii）細胞へのPCSK9のインターナリゼーション、または（iii）両方を拮抗または中和する。本書によるモノクローナル抗体分子は、無傷の（完全または全長）抗体、実質的に無傷の抗体、または抗原結合部分を含む抗体の部分または断片、例えば、マウス抗体の、もしくはキメラ抗体の、もしくはヒト化抗体の、もしくはヒト抗体のFab断片、Fab'断片またはF（ab'）2断片としうる。本書で使用するとき、モノクローナルは、均質または実質的に均質（または純粋）な抗体集団（すなわち、集団内の少なくとも約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、より望ましくは少なくとも約97％または98％、または最も望ましくは少なくとも99％の抗体が、同一であり、また同じ抗原またはエピトープについてのELISA試験法で競合する）。本発明の特定の実施形態において、本発明は、（i）1B20抗体分子と、PCSK9への結合について競合し、1  μM以下で1B20がそのKD以下で1B20結合を少なくとも50％低減し、（ii）LDL受容体へのPCSK9の結合をブロックし、（iii）細胞内へのPCSK9のインターナリゼーションを抑制し、および（iv）特定の抗原結合領域、VH、VL、CDRのセットまたは重鎖CDR3、重鎖および／もしくは軽鎖または本書で説明したこれらの成分の任意の変異体を含むモノクローナル抗体を提供する。
【００４２】
1B20と同一または重複するエピトープ領域に結合する抗体を同定するための上記のアッセイのいずれかにおいて、既知の結合剤（すなわち、1B20抗体分子）の結合は、候補結合剤の結合と比較して、識別可能であるべきである。これは、当業者により用意に理解されるとおり、一方または両方の分子に標識を使用することにより達成することができる（ただし必ずしもその必要はない）。本書で使用するとき、標識は、抗体分子に組み込まれる／添付される別の分子または薬剤を意味する。一実施形態において、標識は、検出可能マーカー、例えば放射標識化したアミノ酸または標識を付けたアビジンにより検出可能なビオチニル部分のポリペプチドへの付着（例えば、光学的または比色分析の方法により検出が可能な蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジン）である。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識化する様々な方法が当技術で知られており、それを使用することができる。ポリペプチドの標識の例には、限定されないものの、以下を含む：放射同位元素または放射性核種（例えば、3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I）、蛍光標識（例えば、FITC、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ）、化学発光法マーカー、ビオチニル基、二次レポーターにより認識される所定のポリペプチド抗原決定基（例えば、ロイシンジッパー配列対、二次抗体の結合部位、金属結合領域、抗原決定基タグ）、磁性物質（ガドリニウムキレートなど）、毒素（百日咳毒素など）、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルチシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、並びにこれらの類似体または相同体。一部の実施形態において、標識は、様々な長さのスペーサーの腕によって付着し、潜在的な立体障害が低減される。
【００４３】
競合アッセイに使用される1B20抗体は、本書で提供した1B20の描写に該当する任意の抗体分子（つまり配列番号：27を含むVLおよび配列番号：11を含むVHを含む、PCSK9について選択的な任意の抗体分子）としうる。こうした抗体の例には、限定はされないものの、（i）配列番号：1を含む軽鎖および配列番号：9のアミノ酸1〜221を含むFd鎖を含むFab（または配列番号：9）、（ii）配列番号：26を含む軽鎖および配列番号：25を含む重鎖を含む全長抗体が含まれる。
【００４４】
本出願で説明した任意のPCSK9特異的拮抗薬の発現および選択は、限定されないものの、ファージディスプレイ（例えば、国際出願番号WO  92／01047号、Kay  et  al.,  1996  Phage  Display  of  Peptides  and  Proteins：A  Laboratory  Manual,  San  Diego：Academic  Pressを参照）、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイ、T7ディスプレイ、およびリボソームディスプレイ（例えば、Lowe  ＆  Jermutus,  2004  Curr.  Pharm.  Biotech.  517-527を参照）を含む、適切な技術を使用して達成できる。
【００４５】
本発明の一部を形成する特定のPCSK9特異的拮抗薬は、抗体分子または抗体である。本書で記載される「抗体分子」または「抗体」は、ヒトおよび／またはマウスPCSK9に対する選択的結合性を持つ免疫グロブリン由来の構造を意味し、これには、限定されないものの、全長抗体または抗体全体、抗原結合断片（物理的にまたは概念的に抗体構造に由来する断片）、上記のいずれかの誘導体、上記のいずれかの別のポリペプチドとの融合体、またはPCSK9との選択的な結合／PCSK9の機能の阻害の目的で上記のいずれかを組み込む任意の代替的な構造／組成物が含まれる。
【００４６】
抗体「全体」または「全長」抗体は、（1）重鎖については、可変部（本書では「VH」として省略）および3つのドメインCH1、CH2およびCH3を含む重鎖定常部、並びに（2）軽鎖については、軽鎖可変部（本書では「VL」として省略）および1つのドメインCLを含む軽鎖定常部を含むジスルフィド結合により内部結合した2本の重（H）鎖および2本の軽（L）鎖を含むタンパク質を意味する。
【００４７】
抗体断片および、さらに具体的には、抗原結合断片は、抗体可変部またはその断片（必要に応じて、1つ以上の開示したCDR  3ドメイン、重鎖および／もしくは軽鎖のフレームワーク領域内の重鎖および／または軽鎖を含む）を持つ分子であり、これが、PCSK9および特にヒトおよび／またはマウスのPCSK9に対する選択的結合を与える。こうした抗体可変部を含む抗体断片には、限定はされないものの、Fab、F（ab’）2、Fd、Fv、scFv、二重特異性抗体分子（抗体とは異なる結合特異性を持つ第二の機能的部分に連結された、本書で開示したPCSK9特異的な抗体または抗原結合断片を含む抗体分子で、これには、限定されないものの、抗体もしくは受容体リガンドといった別のペプチドまたはタンパク質が含まれる）、二重特異性単鎖Fv二量体、単離されたCDR3、ミニボディー、「scAb」、dAb断片、二重特異性抗体、三量体、四量体、ミニボディーおよびタンパク質骨格を基にした人工抗体（これには、限定されないものの、フィブロネクチンIII型ポリペプチド抗体（例えば、米国特許第6,703,199号および国際出願番号WO  02／32925号およびWO  00／34784号を参照）またはシトクロムB（例えば、Nygren  et  al.,  1997  Curr.  Opinion  Struct.  Biol.  7:463-469を参照）があり、その開示内容を参照することにより本書に組み込む）などの抗体分子が含まれる。抗体部分または結合断片は、天然でも、または部分的または完全に合成的製造したものでもよい。こうした抗体部分は、限定されないものの、パパインまたはペプシン消化などの保存的技術を含む、当業者に周知の各種の手段により準備できる。
【００４８】
本書で抗体分子、一般的にPCSK9特異的拮抗薬、コードする核酸またはその他に関連して使用される、用語「単離された」は、それが属するという属性を、それらが天然に見いだされる開示のPCSK9特異的拮抗薬、核酸またはその他のものとは異なるものにすることを記述する。例えば、それらの純度、またはその構造もしくは構造の形態部分が天然に見いだされるものとは異なるなどの差異があり得る。天然に見いだされない構造には、例えば組み換え体ヒト免疫グロブリン構造を含み、これには、限定されないものの、最適化されたCDRを持つ組み換え体ヒト免疫グロブリン構造が含まれる。天然に見いだされない構造のその他の例は、実質的にその他の細胞材料が含まれていないPCSK9特異的拮抗薬または核酸である。単離されたPCSK9特異的拮抗薬は、一般的に、異なるタンパク質特異性を持つ（すなわち、PCSK9以外に対する親和性を持つ）その他のタンパク質特異的拮抗薬は含まれていない。
【００４９】
特定の一態様において、本発明は、PCSK9機能を拮抗する単離されたPCSK9特異的拮抗薬を提供する。特定の実施形態において、前記PCSK9特異的拮抗薬は、LDL受容体へのPCSK9の結合の妨害およびその結果としてのPCSK9細胞インターナリゼーションにより、ヒトおよび／またはマウスPCSK9の細胞LDL取り込みの拮抗作用を阻害する。よって、開示したPCSK9特異的拮抗薬は、血漿LDL-コレステロールレベルを低下させるための望ましい分子を形成する（例えば、Cohen  et  al.,  2005  Nat.  Genet.  37:161-165（ここでは、対立遺伝子PCSK9におけるナンセンス変異に対してヘテロ接合性の個人で著しく低い血漿LDLコレステロールレベルが見られた）、Rashid  et  al.,  2005  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  102:5374-5379（ここでは、PCSK9-ノックアウトマウスにより、肝実質細胞におけるLDLR数の増加、血漿LDLクリアランス（clearance）の加速および著しく低い血漿コレステロールレベルが見られた）およびCohen  et  al.,  2006  N.  Engl.  J.  Med.  354:1264-1272（ここでは、機能喪失した、突然変異PCSK9についてヘテロ接合性のヒトは、アテローム硬化性心臓病の長期的な発病リスクの著しい低減を示した）を参照）。
【００５０】
繰り返し実験により、本書で開示した1B20抗体分子は、ヒトおよび／またはマウス両方のPCSK9のLDL取り込みに対する効果を用量依存的に阻害した。特定の実施形態において、よって本発明には、単離されたPCSK9特異的拮抗薬が、さらに特定の実施形態において、（これらの1B20抗体分子内または重鎖および／もしくは軽鎖に含まれる重鎖および／または軽鎖の可変部（それぞれ、配列番号：11および27）を含む抗体分子、例えば、それぞれ配列番号：9のアミノ酸1〜221（または配列番号：9）および配列番号：1、またはそれぞれ配列番号：25および26）、並びにこれらの同等物（1B20のPCSK9選択的な性質を低下させない1つ以上の保存的アミノ酸置換を持つことで特徴付けられる）または相同体が含まれる。特定の実施形態は、本書で開示したCDRドメインまたは本書で開示した重鎖および／もしくは軽鎖CDRドメインのセットまたは1つ以上の保存的アミノ酸置換を持つことで特徴付けられるその同等物を含む単離されたPCSK9特異的拮抗薬を含む。
【００５１】
本書での用語「ドメイン」または「領域」の使用は、単に、問題の配列またはセグメントが存在することになるか、または別の方法では、現時点で存在する抗体分子のそれぞれの部分を意味する。
【００５２】
特定の実施形態において、本発明は、単離されたPCSK9特異的拮抗薬および、さらに特定の実施形態において、配列番号：11を含む重鎖可変部を含む抗体分子、1つ以上の保存的アミノ酸置換を持つことで特徴付けられるその同等物、およびその相同体を提供する。開示した拮抗薬は、ヒトおよび／またはマウスのPCSK9依存的細胞LDL取り込みの阻害の影響を弱めるか阻害すべきである。特定の実施形態において、本発明は、配列番号：11の重鎖可変部に対して少なくとも90％同一であることで特徴付けられる開示した拮抗薬の相同体を提供し、前記拮抗薬は、ヒトおよび／またはマウスのPCSK9依存的細胞LDL取り込みの阻害を少なくとも10％阻害する。
【００５３】
特定の実施形態において、本発明は、単離されたPCSK9特異的拮抗薬および、さらに特定の実施形態において、配列番号：27を含む軽鎖可変部を含む抗体分子、1つ以上の保存的アミノ酸置換を持つことで特徴付けられるその同等物、およびその相同体を提供する。開示した拮抗薬は、ヒトおよび／またはマウスのPCSK9依存的細胞LDL取り込みの阻害の影響を弱めるか阻害すべきである。特定の実施形態において、本発明は、配列番号：27の軽鎖可変部に対して少なくとも90％同一であることで特徴付けられる開示した拮抗薬の相同体を提供し、前記拮抗薬は、ヒトおよび／またはマウスのPCSK9依存的細胞LDL取り込みの阻害を少なくとも10％阻害する。
【００５４】
特定の実施形態において、本発明は、配列番号：11を含む重鎖可変部および配列番号：27を含む軽鎖可変部、または所定の配列において1つ以上の保存的アミノ酸置換を持つことで特徴付けられるその同等物を含む単離されたPCSK9特異的抗体分子を提供する。具体的な実施形態は、ヒトおよび／またはマウスのPCSK9依存的細胞LDL取り込みの阻害を少なくとも  10％阻害する前記拮抗薬である。特定の実施形態において、本発明は、それぞれ配列番号：11および27の重鎖および軽鎖の可変部に対して少なくとも90％同一であることで特徴付けられる開示した拮抗薬の相同体を提供し、前記拮抗薬は、ヒトおよび／またはマウスのPCSK9依存的細胞LDL取り込みの阻害を少なくとも10％阻害する。
【００５５】
特定の実施形態において、本発明は、単離されたPCSK9特異的拮抗薬および、さらに特定の実施形態において、可変重CDR3配列（配列番号：17）を含むPCSK9抗体分子、および1つ以上の保存的アミノ酸置換を持つことで特徴付けられるその同等物を提供し、その具体的な実施形態は、ヒトおよび／またはマウスのPCSK9依存的細胞LDL取り込みの阻害を少なくとも10％阻害する。具体的な実施形態は、それぞれ配列番号：13および／または配列番号：15を含む重鎖可変部CDR1および／またはCDR2配列を含む単離された拮抗薬、または1つ以上の任意のCDR配列内にある1つ以上の保存的アミノ酸置換を持つことで特徴付けられるその同等物を提供する。特定の実施形態において、本発明は、CDR3配列に対して、またはCDR1、CDR2およびCDR3配列のそれぞれ内で配列番号：17またはそれぞれ必要に応じて配列番号：13、15および17に対して少なくとも90％同一であることで特徴付けられる開示した拮抗薬の相同体を提供し、前記拮抗薬は、ヒトおよび／またはマウスのPCSK9依存的細胞LDL取り込みの阻害を少なくとも10％阻害する。
【００５６】
特定の実施形態において、本発明は、単離されたPCSK9特異的拮抗薬および、さらに特定の実施形態において、配列番号：7を含む可変軽CDR3配列を含む抗体分子；および1つ以上の保存的アミノ酸置換を持つことで特徴付けられるその同等物を提供し、その具体的な実施形態は、ヒトおよび／またはマウスのPCSK9依存的細胞LDL取り込みの阻害を少なくとも10％阻害する。具体的な実施形態は、それぞれ配列番号：3および／または配列番号：5を含む軽鎖可変部CDR1および／またはCDR2配列を含む単離された拮抗薬、または1つ以上の任意のCDR配列内にある1つ以上の保存的アミノ酸置換を持つことで特徴付けられるその同等物を提供する。特定の実施形態において、本発明は、CDR3配列に対して、またはCDR1、CDR2およびCDR3配列のそれぞれ内で配列番号：7またはそれぞれ必要に応じて配列番号：3、5および7に対して少なくとも90％同一であることで特徴付けられる開示した拮抗薬の相同体を提供し、前記拮抗薬は、ヒトおよび／またはマウスのPCSK9依存的細胞LDL取り込みの阻害を少なくとも10％阻害する。
【００５７】
特定の実施形態において、本発明は、単離されたPCSK9特異的拮抗薬および、さらに特定の実施形態において、それぞれ配列番号：17および7を含む重鎖可変部CDR3配列および軽鎖可変部CDR3配列を含む抗体分子、または1つ以上の任意のCDR3配列内に1つ以上の保存的アミノ酸置換を持つことで特徴付けられるその同等物を提供し、その具体的な実施形態は、ヒトおよび／またはマウスのPCSK9依存的細胞LDL取り込みの阻害を少なくとも10％阻害する。特定の実施形態において、本発明は、それぞれ配列番号：17および7の重鎖および軽鎖の可変部CDR3配列に対して少なくとも90％同一であることで特徴付けられる開示した拮抗薬の相同体を提供し、前記拮抗薬は、ヒトおよび／またはマウスのPCSK9依存的細胞LDL取り込みの阻害を少なくとも10％阻害する。
【００５８】
具体的な実施形態は、単離されたPCSK9特異的拮抗薬および、さらに特定の実施形態において、重鎖可変部CDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む抗体分子、およびそれぞれ配列番号：13、15、17、3、5および7を含む軽鎖可変部CDR1、CDR2、およびCDR3配列、および1つ以上の任意のCDR配列内に1つ以上の保存的アミノ酸置換を持つことで特徴付けられるその同等物を提供し、その具体的な実施形態は、ヒトおよび／またはマウスのPCSK9依存的細胞LDL取り込みの阻害を少なくとも10％阻害する。特定の実施形態において、本発明は、それぞれ配列番号：13、15、17、3、5および7に対する重鎖および軽鎖の可変部CDR1、CDR2およびCDR3配列に対して少なくとも90％同一であることで特徴付けられる開示した拮抗薬の相同体を提供し、前記拮抗薬は、ヒトおよび／またはマウスのPCSK9依存的細胞LDL取り込みの阻害を少なくとも10％阻害する。
【００５９】
本発明の特定の一態様には、単離されたPCSK9特異的拮抗薬および、さらに特定の実施形態において、配列番号：39の重鎖可変部CDR3配列（または、特定の実施形態において、配列番号：98）を含み、CDR3配列が配列番号：17ではない、上記に開示したその変異体である抗体分子が含まれ、その具体的な実施形態は、ヒトおよび／またはマウスのPCSK9依存的細胞LDL取り込みの阻害を少なくとも10％阻害する。本発明のさらなる実施形態は、さらに配列番号：37の重鎖可変部CDR1配列で、変異体配列が配列番号：13ではないもの、および／または配列番号：38の重鎖可変部CDR2配列（または、特定の実施形態において、配列番号：97）で、変異体配列が配列番号：15ではないものを含み、その具体的な実施形態は、ヒトおよび／またはマウスのPCSK9依存的細胞LDL取り込みの阻害を少なくとも10％阻害する。その他の実施形態において、本発明には、それぞれ、各領域内の配列番号：37、38および39（または特定の実施形態において、配列番号：37、97、および98）を含むCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、それぞれ配列番号：13、15および17ではない重鎖可変部配列が含まれ、その具体的な実施形態は、ヒトおよび／またはマウスのPCSK9依存的細胞LDL取り込みの阻害を少なくとも10％阻害する。
【００６０】
本発明の別の態様では、単離されたPCSK9特異的拮抗薬および、さらに特定の実施形態において、配列番号：42（または、特定の実施形態において、配列番号：101）の軽鎖可変部CDR3配列を含み、CDR3配列が配列番号：7ではない、上記に開示したその変異体である抗体分子が含まれ、その具体的な実施形態は、ヒトおよび／またはマウスのPCSK9依存的細胞LDL取り込みの阻害を少なくとも10％阻害する。本発明のさらなる実施形態は、さらに配列番号：40（または、特定の実施形態において、配列番号：99）の軽鎖可変部CDR1配列で、変異体配列が配列番号：3でないもの、および／または配列番号：41（または、特定の実施形態において、配列番号：100）の軽鎖可変部CDR2配列で、変異体配列が配列番号：5でないものを含み、その具体的な実施形態は、ヒトおよび／またはマウスのPCSK9依存的細胞LDL取り込みの阻害を少なくとも10％阻害する。その他の実施形態において、本発明には、それぞれ、各領域内のそれぞれ配列番号：40、41および42（または、特定の実施形態において、配列番号：99、100および101）を含み、配列番号：3、5および7ではないCDR1、CDR2およびCDR3配列を含む軽鎖可変部配列が含まれ、その具体的な実施形態は、ヒトおよび／またはマウスのPCSK9依存的細胞LDL取り込みの阻害を少なくとも10％阻害する。
【００６１】
その他の別個の実施形態には、（a）CDR1、CDR2およびCDR3配列を含む重鎖可変部であって、（i）CDR1配列は配列番号：13または配列番号：37を含み、配列番号：37は配列番号：13とは配列が異なり、（ii）CDR2配列は配列番号：15、配列番号：38または配列番号：97を含み、配列番号：38および97は配列番号：15とは配列が異なり、および（iii）CDR3配列は配列番号：17、配列番号：39または配列番号：98を含み、配列番号：39および配列番号：98は配列番号：17とは配列が異なる重鎖可変部、および／または（b）CDR1、CDR2およびCDR3配列を含む軽鎖可変部であって、（i）CDR1配列は配列番号：3または配列番号：40を含み、配列番号：40は配列番号：3とは配列が異なり、（ii）CDR2配列は配列番号：5、配列番号：41または配列番号：100を含み、配列番号：41および100は配列番号：5とは配列が異なり、および（iii）CDR3配列は配列番号：7、配列番号：42または配列番号：101を含み、配列番号：42および配列番号：101は配列番号：7とは配列が異なる軽鎖可変部を含む、単離されたPCSK9特異的拮抗薬が含まれ、その具体的な実施形態は、ヒトおよび／またはマウスのPCSK9依存的細胞LDL取り込みの阻害を少なくとも10％阻害する。
【００６２】
本発明のその他の態様には、単離されたPCSK9特異的拮抗薬および、さらに特定の実施形態において、（i）それぞれ各領域で配列番号：37、38および39（または、特定の実施形態において、配列番号：37、97および98）を含むCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、それぞれ、配列番号：13、15および17ではない重鎖可変部配列、および（ii）それぞれ各領域で配列番号：40、41および42（または、特定の実施形態において、配列番号：99、100および101）を含むCDR1、CDR2およびCDR3配列を含み、それぞれ、配列番号：3、5および7ではない軽鎖可変部配列を含む上記に開示したその変異体である抗体分子が含まれ、その具体的な実施形態は、ヒトおよび／またはマウスのPCSK9依存的細胞LDL取り込みの阻害を少なくとも10％阻害する。
【００６３】
本発明の特定の実施形態において、CDRは、保存的アミノ酸置換のない1B20の対応する領域の代わりであり、その具体的な実施形態は、ヒトおよび／またはマウスのPCSK9依存的細胞LDL取り込みの阻害を少なくとも10％阻害する。特定の実施形態において、本発明には、単離されたPCSK9特異的拮抗薬および、さらに特定の実施形態において、それぞれ配列番号：44および43（または、特定の実施形態において、配列番号：109および108）を含む重鎖および／または軽鎖の可変部を含む抗体分子が含まれ、前記変異体配列番号は、それぞれ配列番号：11および27ではなく、その具体的な実施形態は、ヒトおよび／またはマウスのPCSK9依存的細胞LDL取り込みの阻害を少なくとも10％阻害する。
【００６４】
具体的な実施形態には、任意の単離されたPCSK9特異的拮抗薬および、さらに特定の実施形態において、任意に本書で開示した軽鎖可変部配列（例えば、配列番号：27）を含む配列番号：45〜96および102〜107のいずれかに見いだされる重鎖可変部配列を含む抗体分子が含まれ、その具体的な実施形態は、ヒトおよび／またはマウスのPCSK9依存的細胞LDL取り込みの阻害を少なくとも10％阻害する。
【００６５】
特定の実施形態は、全長抗体の上述のVHおよびVL領域を含む単離されたPCSK9特異的拮抗薬である。本書における具体的な実施形態はさらに、配列番号：21（IgG1）、配列番号：22（IgG2）、配列番号：23（IgG4）および配列番号：24（IgG2m4）を含む群から選択した一連のアミノ酸を含む。
【００６６】
当業者が理解するとおり、保存的アミノ酸置換はアミノ酸残基を、類似しているか、またはより適切な（意図した目的について）機能的および／または化学的な特性を与えるものと置き換える置換である。こうした保存的アミノ酸置換を持つ拮抗薬は、当技術で利用可能な、または本書で説明した機能的アッセイを使用して、活性が同等またはより適切かどうかについて試験することができる。ヒトPCSK9に選択的に結合する能力を保持し、本書で説明した1B20抗体分子と同じかまたは高いレベルでPCSK9機能を拮抗する1つ以上の保存的アミノ酸置換を持つPCSK9特異的拮抗薬は、本書では開示した拮抗薬の「機能的同等物」といい、本発明の具体的な実施形態を形成する。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似した側鎖を持つアミノ酸残基で置き換えられるものであることがよくある。類似した側鎖を持つアミノ酸残基のファミリーは、当技術で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を持つアミノ酸が含まれる。こうした修飾は、PCSK9特異的拮抗薬の結合または機能的阻害特性を著しく低減または変化させるようにはデザインされていないが、にもかかわらずこうした性質（特性）が改善されうる。置換をする目的は、重要ではなく、また、いかなる形でもこれに限定されるわけではないが、残基を、分子の構造、分子の電荷もしくは疎水性または分子のサイズをより良く維持または高めるものと置き換えることが含まれうる。例えば、単にそれほど望ましくない残基を同じ極性または電荷のものと置き換えることもできる。こうした修飾は、部位特異的変異誘発およびPCR媒介の突然変異誘発など、当技術で既知の標準技法により導入できる。当業者が保存的アミノ酸置換を実行する1つの特定の手段は、例えば、MacLennan  et  al.,  1998  Acta  Physiol.  Scand.  Suppl.  643:55-67、およびSasaki  et  al.,  1998  Adv.  Biophys.  35:1-24で考察されているアラニンスキャニング突然変異誘発である。
【００６７】
別の態様において、本発明は、単離されたPCSK9特異的拮抗薬および、さらに特定の実施形態において、開示した抗体の対応するアミノ酸配列に対して相同的なアミノ酸配列を含む重鎖および／または軽鎖の可変部を含む抗体分子であって、抗体分子がPCSK9依存的細胞LDL取り込みの阻害を抑制する抗体分子を提供する。具体的な実施形態は、それぞれ開示した重鎖および／または軽鎖の可変部と少なくとも90％同一である重鎖および／または軽鎖の可変部を含む拮抗薬である。「少なくとも90％同一」の言及には、本書で開示した分子の全長に沿って、少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99および100％同一の配列が含まれる。
【００６８】
本書で説明した拮抗薬のアミノ酸配列と相同的なアミノ酸配列を持つPCSK9特異的拮抗薬は一般に、そのPCSK9に対する特異性にマイナスの影響を与えずに拮抗薬の1つ以上の性質を改善させるように製造される。こうした配列を得る1つの方法は、これは当業者が利用できる唯一の方法ではないが、PCSK9特異的拮抗薬またはその特異性を決定する領域をコードする配列を変異させ、変異した配列を含む拮抗薬を発現させ、保持された機能について、本書に記載したものを含む利用可能な機能的アッセイを使用して、コードした拮抗薬を試験する方法である。突然変異は、部位特異的またはランダム突然変異誘発によるものとすることができる。ただし、当業者が理解するとおり、その他の突然変異誘発方法によっても、簡単に同じ効果をもたらしうる。例えば、ある一定の方法において、突然変異体のスペクトルは、アミノ酸の化学的もしくは構造的特性のいずれかに基づいて非ランダムに保存的置換をターゲティングすることにより、またはタンパク質構造を考慮することにより、制約される。親和性成熟実験において、こうしたいくつかの突然変異は、ランダムまたは非ランダムに選択されたかどうかによらず、選択した単一の分子内で見つかることがある。親和性成熟についてはまた、例えば、米国特許第7,117,096号、PCT公開番号WO  02／084277号およびWO  03／099999号で例証されているとおり、構造をベースにした様々なアプローチもあり、その開示内容を参照することにより本書に組み込む。
【００６９】
本書で使用するとき、2つのアミノ酸または核酸配列間の相同性パーセント値は、2つの配列間の同一性パーセント値と等価であり、これら2つの用語は全体にわたり置き換えが可能なものとして使用する。本書で使用するとき、2つの核酸またはアミノ酸配列の同一性パーセント値は、KarlinおよびAltschul（Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  90:5873-5877,  1993）のアルゴリズムを使用して決定される。こうしたアルゴリズムは、Altschul  et  al.,  1990  J.  Mol.  Biol.  215:403-410のNBLASTおよびXBLASTプログラムに組み込まれる。BLASTヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子と相同的な核酸配列を得るために、NBLASTプログラムを用いて、score=100、wordlength=12で実行される。BLASTタンパク質検索は、本書で開示したアミノ酸配列と相同的なアミノ酸配列を得るためにXBLASTプログラムを用いて、score=50、wordlength=3で実行される。比較の目的でギャップアライメントを得るために、Altschul  et  al.,  1997  Nucleic  Acids  Res.  25:3389-3402に記載のあるGapped  BLASTが利用される。BLASTおよびGapped  BLASTプログラムを利用するとき、それぞれのプログラムのデフォルトのパラメーター（例えば、XBLASTおよびNBLAST）を使用する。
【００７０】
類似したまたはより良い特異性を持つその他の結合分子を製造するために、1つ以上の開示したPCSK9特異的分子の成分を利用することは、十分に当業者の範囲内にある。これは、例えば、組み換えDNA技術を使用して達成することができる。これの1つの特定の例には、抗体の免疫グロブリン可変部、または1つ以上のCDRをコードするDNAを、必要に応じて異なる免疫グロブリンの可変部、定常部、または定常部とフレームワーク領域に導入することが関与する。こうした分子は、本発明の重要な態様を形成する。特異的免疫グロブリンまたはそれに対応する配列は、特定の開示した配列をそれに挿入でき、また別の方法では、その不可欠の部分を形成するが、これには、本発明の特定の実施形態を形成する以下の抗体分子が含まれるが、これらに限定されない：Fab（可変軽（VL）、可変重（VH）、定常軽（CL）および定常重1（CH1）ドメインを有する一価の断片）、F（ab’）2（ジスルフィド架橋または代替的方法でヒンジ領域で連結した2つのFab断片を含む二価の断片）、Fd（VHおよびCH1ドメイン）、Fv（VLおよびVHドメイン）、scFv（VLおよびVHがリンカーで結合された単鎖Fv、例えば、ペプチドリンカー、例えば、Bird  et  al.,  1988  Science  242:423-426,  Huston  et  al.,  1988  PNAS  USA  85:5879-5883を参照）、二重特異性抗体分子（抗体とは異なる結合特異性を持つ第二の機能的部分と連結した本書で開示したPCSK9特異的な抗体または抗原の結合断片を含む抗体分子で、限定されないが、抗体、または受容体リガンドなどの別のペプチドまたはタンパク質が含まれる）、二重特異性単鎖Fv二量体（例えば、PCT／US92／09965を参照）、単離されたCDR3、ミニボディー（約80  kDaの二価の二量体に自己集合する単鎖-CH3融合）、「scAb」（VHおよびVL、並びにCLまたはCH1のいずれかを含む抗体断片）、dAb断片（VHドメイン、例えば、Ward  et  al.,  1989  Nature  341:544-546、およびMcCafferty  et  al.,  1990  Nature  348:552-554、またはVLドメイン、Holt  et  al.,  2003  Trends  in  Biotechnology  21:484-489を参照）、二重特異性抗体（例えば、Holliger  et  al.,  1993  PNAS  USA  90:6444-6448および国際出願番号WO  94／13804号を参照）、三量体、四量体、ミニボディー（CH3に連結されたscFv、例えば、Hu  et  al.,  1996  Cancer  Res.  56:3055-3061を参照）、IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgD、IgA、IgEまたは何らかのその誘導体、およびタンパク質骨格をベースにした人工抗体（これには、限定されないものの  フィブロネクチンIII型ポリペプチド抗体が含まれる）（例えば、米国特許第6,703,199号および国際出願番号WO  02／32925号を参照）またはシトクロムBで、例えば、Koide  et  al.,  1998  J.  Molec.  Biol.  284:1141-1151、およびNygren  et  al.,  1997  Current  Opinion  in  Structural  Biology  7:463-469を参照し、その開示内容を参照することにより本書に組み込む。限定されないものの、Fv、scFv、二重特異性抗体分子または領域抗体（Domantis）を含む一定の抗体分子は、ジスルフィド架橋を組み込みVHおよびVLドメインを整列させることで安定化させることができる（例えば、Reiter  et  al.,  1996  Nature  Biotech.  14:1239-1245を参照し、その開示内容を参照することにより本書に組み込む）。二重特異性抗体は、保存的技術（例えば、Holliger  ＆  Winter,  1993  Current  Opinion  Biotechnol.  4:446-449を参照、その特定の方法には、化学的な製造、またはハイブリッドのハイブリドーマからの製造���含まれる）、および限定されないものの、BiTE（商標）技術（異なる特異性の抗原結合領域を持つ分子とペプチドリンカー）および適当なアミノ酸置換法（knobs-into-holes  engineering）（例えば、Ridgeway  et  al.,  1996  Protein  Eng.  9:616-621を参照し、その開示内容を参照することにより本書に組み込む）などその他の技術を使用して製造しうる。二重特異性抗体は、大腸菌内で製造でき、またその他のPCSK9特異的拮抗薬と同様にこれらの分子は、当業者が理解するとおり、適切なライブラリ内のファージディスプレイを使用して選択できる（例えば、国際出願番号WO  94／13804号を参照し、その開示内容を参照することにより本書に組み込む）。
【００７１】
関心対照のCDRが挿入される可変ドメインは、任意の生殖系列または再配列したヒト可変ドメインから得ることができる。可変ドメインは、合成的に製造することもできる。CDR領域は、組み換えDNA技術を使用して、それぞれの可変ドメインに導入できる。これを達成できる1つの手段は、Marks  et  al.,  1992  Bio／Technology  10:779-783に記載があり、その開示内容を参照することにより本書に組み込む。可変重ドメインを可変軽ドメインと対にして抗原結合部位を提供することもできる。さらに、独立した領域（例えば、可変重ドメインのみ）を抗原の結合に使用することもできる。当業者は、Fv断片の2つのドメインVLおよびVHは、おそらく別個の遺伝子によりコードされているが、その一方、それらをVLおよびVH領域の対が一価分子（scFvs）を形成する単一のタンパク質鎖とすることができる合成的なリンカーにより組み換え法を使用して結合できることも、十分承知している。
【００７２】
具体的な実施形態は、生殖系列フレームワーク領域内のCDRを提供する。限定されないものの、ヒトフレームワーク領域を含むフレームワーク領域は、当業者に周知である（例えば、ヒトまたはヒト以外のフレームワーク）。フレームワーク領域は、天然に存在するまたはコンセンサスフレームワーク領域としうる。一態様において、本発明の抗体のフレームワーク領域は、ヒトである（ヒトフレームワーク領域のリストについては、例えば、Clothia  et  al.,  1998  J.  Mol.  Biol.  278:457-479を参照し、その前記開示内容を参照することによりその全文を本書に組み込む）。本書における具体的な実施形態は、重鎖可変CDR3配列番号：17を関連するCDRの代わりにVH5_3に入れたものを提供する。本書における具体的な実施形態は、重鎖可変CDR1、CDR2および／またはCDR3配列（それぞれ配列番号：13、15および17）を関連するCDRの代わりにVH5_3に入れたものを提供する。本書における具体的な実施形態は、軽鎖可変CDR3配列番号：7を関連するCDRの代わりにVK4_3に入れたものを提供する。本書における具体的な実施形態は、軽鎖可変CDR1、CDR2および／またはCDR3配列（それぞれ配列番号：3、5および7）を関連するCDRの代わりにVK4_3に入れたものを提供する。具体的な実施形態はさらに、重鎖可変CDR3配列番号：17および軽鎖可変CDR3配列番号：7をそれぞれVH5_3およびVK4_3生殖系列配列に入れたものを提供する。さらに、実施形態は、重鎖可変CDR1、CDR2および／またはCDR3配列（それぞれ配列番号：13、15および17）を関連するCDRの代わりにVH5_3に入れたものを提供し、また軽鎖可変CDR1、CDR2および／またはCDR3配列（それぞれ配列番号：3、5および7）を関連するCDRの代わりにVK4_3に入れたものを提供する。
【００７３】
本発明には、ヒト、ヒト化、脱免疫化、キメラおよび霊長類化の抗体分子が含まれる。本発明には、ベニアリングのプロセスにより製造された抗体分子も含まれる（例えば、Mark  et  al.,  1994  Handbook  of  Experimental  Pharmacology,  vol.  113：The  pharmacology  of  monoclonal  Antibodies,  Springer-Verlag,  pp.  105-134を参照し、その開示内容を参照することにより本書に組み込む）。開示した抗体分子に関連した「ヒト」は具体的に、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する変数部および／または定常部を持つ抗体分子を意味し、ここで前記配列は、必ずしもその必要はないが、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされていない一定のアミノ酸置換または残基を持つように修飾／変更することができる。こうした突然変異は、限定されないものの、インビトロのランダムもしくは部位特異的変異誘発またはインビボでの体細胞突然変異などの方法により導入することができる。文献で考察されている突然変異技法の特定の例が、Gram  et  al.,  1992  PNAS  USA  89:3576-3580、Barbas  et  al.,  1994  PNAS  USA  91:3809-3813、およびSchier  et  al.,  1996  J.  Mol.  Biol.  263:551-567に開示されており、その開示内容を参照することにより本書に組み込む。これらは単に特定の例であり、唯一利用できる技術を表すものではない。学術論文には、当業者が利用でき、広く認識されている多数の突然変異技法がある。開示した抗体分子に関連した「ヒト化」は、マウスなど別の哺乳類の種に由来するCDR配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体分子を具体的に意味する。開示した抗体分子に関連する「霊長類化」は、非霊長類のCDR配列が霊長類フレームワーク配列に挿入される抗体分子を意味する（例えば、WO  93／02108号およびWO  99／55369号を参照し、その開示内容を参照することにより本書に組み込む）。
【００７４】
本発明の特定の抗体は、モノクローナル抗体で、また特定の実施形態において、IgD、IgA、IgE、IgM、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4または上記のいずれかの任意の誘導体の抗体形式のいずれか1つである。この点での用語「その誘導体」または「誘導体」には、とりわけ、（i）片方または両方の可変部（すなわち、VHおよび／またはVL）に保存的修飾を持つ抗体および抗体分子、（ii）重鎖および／または軽鎖の定常部に操作のある抗体および抗体分子、並びに／または（iii）通常は免疫グロブリン分子の一部ではない追加的な化学的部分を含む抗体および抗体分子（例えば、ペグ化）が含まれる。
【００７５】
可変部の操作は、1つ以上のVHおよび／またはVL  CDR領域内とすることができる。配列または分子の多様性を生成するための部位特異的変異誘発、ランダム突然変異誘発またはその他の方法を利用して、突然変異体を作成でき、その後、本書に記載したものを含む利用可能なインビトロまたはインビボでのアッセイで目的とする特定の機能的性質について試験することができる。
【００７６】
また、本発明の抗体には、関心対照の抗体の1つ以上の性質（特性）を改善させるために、修飾がVHおよび／またはVL内のフレームワーク残基に対してなされたものも含まれる。一般に、こうしたフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を減少させるためになされる。例えば、1つのアプローチは、1つ以上のフレームワーク残基を対応する生殖系列配列に「逆突然変異（backmutate）」させることである。さらに具体的に言えば、体細胞突然変異を受けた抗体には、その抗体が由来する生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基が含まれることがある。こうした残基は、抗体フレームワーク配列をその抗体が由来する生殖系列配列と比較することで同定できる。こうした「逆突然変異した（backmutated）」抗体も、本発明に含まれることが意図される。別のタイプのフレームワーク修飾には、T細胞エピトープを除去し、それによって抗体の潜在的免疫原性を低減させるために、フレームワーク領域内で、あるいは場合によっては1つ以上のCDR領域内で、1つ以上の残基の突然変異が関与する。このアプローチは、「脱免疫化」とも呼ばれ、Carr  et  alによる米国特許公開番号第20030153043号にさらに詳細な記載があり、その開示内容を参照することにより本書に組み込む。
【００７７】
フレームワークまたはCDR領域内での修飾に加えて、またはその代わりとして、一般に血清半減期、補体定着、Fc受容体結合、および／または抗原依存的細胞毒性など、その抗体の1つ以上の機能的な特性を変更するために、Fcまたは定常部がある場合にその内部に修飾を含むよう、本発明の抗体を操作（engineered）できる。
【００７８】
希望のエフェクター機能性に対して磨きをかける各種の抗体アイソタイプを含む「ハイブリッド」または「コンビナトリアル」IgG形態を生成するという概念は、一般に記載がある（例えば、Tao  et  al.,  1991  J.  Exp.  Med.  173:1025-1028を参照）。本発明の特定の実施形態には、抗体の一部でのFcγR受容体、C1qまたはFcRnへの結合を低減または変化させることが分かっている特定の操作をFc領域に含む抗体分子が含まれる。従って、本発明には、抗体依存細胞性細胞毒素（「ADCC」）、補体-媒体細胞毒性（「CMC」）を誘発しないか（あるいはより少ない程度で誘発する）、または免疫複合体を形成して、正常な薬物動態学的（「PK」）性質（特性）を保持する、本明細書による抗体が含まれる。本発明の具体的な実施形態は、本発明に従い定義される、その免疫グロブリン構造の一部として、配列番号：24を含み、また特定の実施形態において、免疫グロブリン構造の一部として配列番号：24の残基107-326を含む抗体分子を提供する。本発明には、配列番号：21（IgG1）、配列番号：22（IgG2）、配列番号：23（IgG4）および配列番号：24（IgG2m4）からなる群から選択される一連のアミノ酸と連続（隣接）して、またはそれが続いて、（i）配列番号：1を含む軽鎖、および（ii）配列番号：11を含む重鎖を含む抗体分子が含まれる。図6は、配列番号：24、特にIgG1、IgG2およびIgG4を持つIgG2m4を含む配列の比較を図示する。成熟し、分泌された抗PCSK9  IgG2m4重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：25および26として見つけることができる。前記配列により少なくとも部分的にコードされている抗体分子が、本書に含まれている。
【００７９】
特定のPCSK9特異的拮抗薬は、検出可能ラベルを持つことができ、または毒素（例えば、細胞毒）、放射性同位元素、放射性核種、リポソーム、標的部分、バイオセンサー、陽イオン性尾部、または酵素（例えば、ペプチジル結合またはリンカーにより）に抱合することができる。こうしたPCSK9特異的拮抗薬の組成物は、本発明の追加的な一態様を形成する。
【００８０】
別の態様において、本発明は、単離されたPCSK9特異的拮抗薬をコードする核酸提供する。前に言及した「単離された」は、それを天然に存在するものとは異なるものにする、言及したものの性質を意味する。例えば、それらの純度、またはその構造もしくは構造の形態部分が天然に見いだされるものとは異なるなどの差異があり得る。天然には存在しない核酸の一例は、例えば、その他の細胞材料が実質的に含まれない核酸である。核酸は、細胞全体内に、細胞可溶化物内に、または部分的に精製した、もしくは実質的に純粋な形態で存在しうる。特定の例において、核酸は、例えば、限定はされないものの、アルカリ／SDS処理、CsClバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当技術で既知のその他の適切な方法など、標準技法を使用して、その他の細胞構成成分またはその他の汚染物質（例えば、その他の細胞の核酸またはタンパク質）から精製したときに単離されうる。核酸には、DNA（cDNAを含む）および／またはRNAが含まれうる。本発明の核酸は、標準的な分子生物学技術を使用して獲得することができる。ハイブリドーマ（例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子を持つ遺伝子導入マウスから準備したハイブリドーマ）により発現された抗体については、ハイブリドーマにより生成した抗体の軽鎖および重鎖をコードするcDNAは、標準的PCR増幅またはcDNAクローニング技術で得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリ（例えば、ファージディスプレイ技術を使用して）から得られた抗体については、その抗体をコードする核酸は、ライブラリから回収することができる。
【００８１】
本発明には、開示した可変の重鎖および／または軽鎖およびその特定成分をコードする単離された核酸、特に開示した可変部またはそれぞれのCDR領域、特にCDR3が含まれる。本書の特定の実施形態において、CDRは、抗体フレームワーク領域内、また特定の実施形態において、ヒトフレームワーク領域内に提供される。具体的な実施形態では、CDRを生殖系列フレームワーク領域にコードする単離された核酸が提供され、これには、限定されないものの、ヒト生殖系列フレームワーク領域が含まれる。本書における具体的な実施形態では、重鎖CDR配列番号：17を、関連するCDRをコードする核酸の代わりにVH5_3にコードする、単離された核酸（特定の実施形態において、前記核酸は配列番号：18を含む）が提供される。本書における具体的な実施形態では、重鎖可変CDR1、CDR2および／またはCDR3配列、それぞれ配列番号：13、15および17を関連するCDRの代わりにVH5_3にコードする核酸（また、特定の実施形態において、前記核酸は、それぞれ配列番号：14、16および18を含む）が提供される。本書における具体的な実施形態では、軽鎖CDR配列番号：7を、関連するCDRをコードする核酸の代わりにVK4_3にコードする、単離された核酸（特定の実施形態において、前記核酸は配列番号：8を含む）が提供される。本書における具体的な実施形態では、軽鎖可変CDR1、CDR2および／またはCDR3配列、それぞれ配列番号：3、5および7を関連するCDRの代わりにVH4_3にコードする核酸（また、特定の実施形態において、前記核酸は、それぞれ配列番号：4、6および8を含む）が提供される。具体的な実施形態ではさらに、それぞれVH5_3およびVK4_3生殖系列配列に入れる、重鎖可変CDR3配列番号：17（および、特定の実施形態において、前記核酸は配列番号：18を含む）および軽鎖可変CDR3配列番号：7（および、特定の実施形態において、前記核酸は配列番号：8を含む）が提供される。さらなる実施形態では、重鎖可変CDR1、CDR2および／またはCDR3配列、それぞれ配列番号：13、15および17（および、特定の実施形態において、前記核酸はそれぞれ配列番号：14、16および18を含む）を関連するCDRの代わりにVH5_3に入れたもの、並びに軽鎖可変CDR1、CDR2および／またはCDR3配列、それぞれ配列番号：3、5および7（および、特定の実施形態において、前記核酸は、それぞれ配列番号：4、6および8を含む）を関連するCDRの代わりにVK4_3に入れたものが提供される。
【００８２】
可変部をコードする単離された核酸は、限定されないものの、F（ab’）2、Fab、Fv、scFv、二重特異性抗体分子（本書で開示したPCSK9特異的抗体または抗原結合断片を含む抗体分子で、抗体とは異なる結合特異性を持つ第二の機能的部分と連結したもので、これには、限定はされないが、抗体、または受容体リガンドなどの別のペプチドまたはタンパク質がある）、二重特異性単鎖Fv二量体、ミニボディー、dAb断片、二重特異性抗体、三量体または四量体、ミニボディー、IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgD、IgA、IgEまたは任意のその誘導体を含む、望ましい任意の抗体分子の形式内で提供できる。
【００８３】
具体的な実施形態では、PCSK9特異的拮抗薬および、さらに特定の実施形態において、配列番号：11を含む重鎖可変ドメインを含む抗体分子をコードする単離された核酸が提供されており、その具体的な実施形態は核酸配列（配列番号：12）を含む。本発明の具体的な実施形態では、PCSK9特異的拮抗薬および、さらに特定の実施形態において、さらに（i）重鎖CDR1アミノ酸配列（配列番号：13）をコードする核酸（その具体的な実施形態は核酸配列番号：14を含む）および／または（ii）重鎖CDR2アミノ酸配列（配列番号：15）をコードする核酸（その具体的な実施形態は核酸配列番号：16を含む）を含む抗体分子をコードする単離された核酸が提供される。具体的な実施形態では、PCSK9特異的拮抗薬および、さらに特定の実施形態において、配列番号：27を含む軽鎖可変ドメインを含む抗体分子をコードする単離された核酸が提供されており、その具体的な実施形態は核酸配列（配列番号：28）を含む。本発明の具体的な実施形態では、PCSK9特異的拮抗薬および、さらに特定の実施形態において、さらに（i）軽鎖CDR1アミノ酸配列（配列番号：3）をコードする核酸（その具体的な実施形態は核酸配列番号：4を含む）および／または（ii）軽鎖CDR2アミノ酸配列（配列番号：5）をコードする核酸（その具体的な実施形態は核酸配列番号：6を含む）を含む抗体分子をコードする単離された核酸が提供される。具体的な実施形態では、PCSK9特異的拮抗薬および、さらに特定の実施形態において、配列番号：11を含む重鎖可変ドメイン（その具体的な実施形態は核酸配列（配列番号：12）を含む）、および配列番号：27を含む軽鎖可変ドメイン（その具体的な実施形態は核酸配列（配列番号：28）を含む）を含む抗体分子をコードする単離された核酸が提供される。具体的な実施形態では、（i）重鎖CDR1、CDR2および／またはCDR3配列（それぞれ配列番号：13、15および17で、その具体的な実施形態は核酸、それぞれ配列番号：14、16および／または18を含む）で、望ましくはフレームワーク領域（限定されないもののヒトフレームワーク領域を含む）内にあるもの、並びに（ii）軽鎖CDR1、CDR2および／またはCDR3配列（それぞれ配列番号：3、5および7で、その具体的な実施形態は核酸、それぞれ配列番号：4、6および／または8を含む）で、望ましくはフレームワーク領域（限定されないもののヒトフレームワーク領域を含む）内にあるものをコードする単離された核酸が提供されている。本発明はさらに、特定の実施形態において、重鎖および／または軽鎖の可変部、または場合に応じてCDR領域、どちらか1B20の対応する配列に対して存在する方に対して少なくとも90％同一であることを特徴とする、上記に開示した拮抗薬の相同体を提供する。
【００８４】
別の実施形態は、PCSK9特異的拮抗薬および、さらに特定の実施形態において、配列番号：1を含む軽鎖（その具体的な実施形態は核酸配列番号：2を含む）並びに配列番号：9のアミノ酸1-221、または配列番号：9を含む重鎖またはFd鎖（その具体的な実施形態はそれぞれ配列番号：10の核酸1-663、または配列番号：10を含む）抗体分子をコードする単離された核酸を提供する。さらなる実施形態は、PCSK9特異的拮抗薬および、さらに特定の実施形態において、配列番号：26を含む軽鎖（その具体的な実施形態は配列番号：30を含む）および配列番号：25を含む重鎖（その具体的な実施形態は配列番号：29を含む）を含む抗体分子をコードする単離された核酸を提供する。本発明はさらに、特定の実施形態において、1B20の対応する配列に対して重鎖および／または軽鎖にわたって少なくとも90％同一であることを特徴とする上記に開示した拮抗薬の相同体を提供する。
【００８５】
本発明の具体的な実施形態には、抗体の一部でのFcγR受容体、C1qもしくはFcRnへの結合を低減または変化させるFc領域内の操作を持つ抗体分子をコードする核酸が含まれる。本発明の1つの特定の実施形態は、免疫グロブリン構造の一部として配列番号：24、また特定の実施形態において、配列番号：24の残基107〜326を含む抗体分子をコードする単離された核酸である。特定の実施形態において、合成的なPCSK9特異的拮抗薬は、適切な発現ベクター内で合成・組立をしたオリゴヌクレオチドから生成した核酸から発現させて製造できる（例えば、Knappick  et  al.,  2000  J.  Mol.  Biol.  296:57-86、およびKrebs  et  al.,  2001  J.  Immunol.  Methods  254:67-84を参照）。
【００８６】
本発明には、（i）配列番号：1を含む軽鎖をコードする核酸（その具体的な実施形態は核酸配列番号：2を含む）および（ii）配列番号：11を含む重鎖をコードする核酸（その具体的な実施形態は核酸配列番号：12を含む）を含む抗体分子をコードする核酸が含まれ、これは配列番号：21（IgG1）、配列番号：22（IgG2）、配列番号：23（IgG4）および配列番号：24（IgG2m4）を含む群から選択される一組のアミノ酸をコードする一組のヌクレオチドの後に順に続く（それに隣接する）。成熟し、分泌された抗PCSK9  IgG2m4重鎖および軽鎖のヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号：29および30として見つけることができる。重鎖および軽鎖1B20抗PCSK9  IgG2m4抗体分子を含むプラスミド配列は、それぞれ配列番号：35および36で見つけることができる。こうした抗体分子をコードする核酸は、本発明の重要な実施形態を形成する。
【００８７】
また、本発明には、本書に記載した全長ヌクレオチド配列に対して少なくとも約90％同一で、より望ましくは少なくとも約95％同一なヌクレオチド配列、およびPCSK9依存的細胞LDL取り込みの阻害を少なくとも10％抑制するPCSK9特異的拮抗薬をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸が含まれる。
【００８８】
出願全体を通して、「少なくとも約90％同一」の言及は、少なくとも約90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100％同一が含まれる。
【００８９】
本発明はさらに、その少なくとも一部分が配列番号：12および／または配列番号：28を含む核酸の相補物に、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成された単離された核酸を提供し、その前記核酸は抗体分子にPCSK9に特異的に結合しPCSK9機能を拮抗する能力を与え、またPCSK9特異的拮抗薬は前記核酸を採用して発現される。核酸のハイブリッド形成方法は、当技術では周知である（例えば、Ausubel,  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  John  Wiley  ＆  Sons,  N.Y.,  6.3.1-6.3.6,  1989を参照。）ストリンジェントなハイブリッド形成条件には、68℃、5x  SSC／5x  デンハート液（または同等物）／1.0％  SDS内でのハイブリッド形成、および0.2x  SSC／0.1％  SDSで室温での洗浄が含まれる。適度にストリンジェントな条件には、3x  SSCで、42℃での洗浄が含まれる。塩分濃度および温度のパラメーターは、プローブおよび標的の核酸間で最適なレベルの同一性を達成するために変化させうる。当業者であれば、配列番号：12および／または配列番号：28に対して少なくとも  80、85、90、95、98または99％同一のハイブリッド形成する部分で核酸を特異的にターゲティングするために、ハイブリッド形成および／または洗浄の各種の条件を操作できる。ハイブリッド形成条件の選択に影響する基本的なパラメーターおよび適切な条件を導く指針は、Sambrook  et  al.,  Molecular  Cloning：A  Laboratory  Manual,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  Cold  Spring  Harbor,  N.Y.,  chapters  9  and  11,  1989およびAusubel  et  al.  （eds),  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  John  Wiley  ＆  Sons,  Inc.,  sections  2.10  and  6.3-6.4,  1995（その開示内容を参照することにより本書に組み込む）に記載があり、また通常の技能を持つ当業者であれば、簡単に判断できる。ストリンジェントなハイブリッド形成条件下で配列番号：12および／または配列番号：28を含む核酸の補体にハイブリッド形成する核酸を含む1つ以上の可変部を持つPCSK9拮抗薬は、PCSK9の1つ以上の機能の拮抗において有効であるはずである。こうして、前記拮抗薬およびコードする核酸は、本発明の重要な実施形態を形成する。
【００９０】
別の態様において、本発明は、本書で開示した核酸を含むベクターを提供する。本発明によるベクターには、限定されないものの、意図した目的の適切なレベルでの望ましい抗体分子の発現にとって適切なプラスミドおよびその他の発現構成物（例えば、場合に応じてファージまたはファージミド）が含まれる（例えば、Sambrook  ＆  Russell,  Molecular  Cloning：A  Laboratory  Manual：3rd  Edition,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Pressを参照し、その開示内容を参照することにより本書に組み込む）。ほとんどのクローニングの目的で、DNAベクターを使用することもできる。一般的なベクターには、プラスミド、変性ウイルス、バクテリオファージ、コスミド、酵母人工染色体、細菌人工染色体および遺伝子副体または組み込み型DNAのその他の形態が含まれる。特定の遺伝子導入、組み換え体PCSK9特異的拮抗薬の生成、またはその他の用途での適切なベクターの決定は、十分に当業者の認識範囲内である。特定の実施形態において、組み換え遺伝子に加えて、ベクターには、宿主細胞内の自律増殖のための複製起点、適切な制御配列（プロモーター、終端配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、選択マーカー、限定数の有用な制限酵素部位および／または必要に応じてその他の配列など）および高いコピー数の潜在性も含まれる。タンパク質特異的拮抗薬の製造のための発現ベクターの例は、当技術では周知である（例えば、Persic  et  al.,  1997  Gene  187:9-18、Boel  et  al.,  2000  J.  Immunol.  Methods  239:153-166、およびLiang  et  al.,  2001  J.  Immunol.  Methods  247:119-130を参照し、その開示内容を参照することにより本書に組み込む）。希望に応じて、拮抗薬をコードする核酸を、当技術で周知の技術を使用して宿主染色体に組み込むこともできる（例えば、Ausubel,  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  John  Wiley  ＆  Sons,  1999、およびMarks  et  al.、国際出願番号WO  95／17516号を参照）。核酸は、エピソームで維持されているか、または人工染色体に組み込まれたプラスミド上に発現することもできる（例えば、Csonka  et  al.,  2000  J.  Cell  Science  113:3207-3216、Vanderbyl  et  al.,  2002  Molecular  Therapy  5:10を参照）。特に抗体分子に関しては、抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は、別個のベクターに挿入でき、またより一般的には、両方の遺伝子を同じ発現ベクターに挿入することができる。どのPCSK9特異的拮抗薬またはその構成要素をコードする核酸も、標準的な方法（例えば、核酸断片およびベクター上の相補的制限部位（complementary  restriction  sites）の連結または制限部位（restriction  sites）が存在しない場合、ブラントエンド連結）を使用して発現ベクターに挿入できる。これをどのように遂行しうるかについての別の特定の例は、例えば、Clontech「InFusion」システムもしくはInvitrogen「TOPO」システムなどの組み換え法（どちらもインビトロ）の使用または細胞内（例えば、Cre-Loxシステム）での方法がある。特に抗体分子に関して、軽鎖および重鎖の可変部は、希望のアイソタイプの重鎖定常および軽鎖定常部を既にコードした発現ベクターに、VH断片がベクター内のCH断片に操作できる形で連結され、またVL断片がベクター内のCL断片に操作できる形で連結されるように挿入することにより、任意の抗体アイソタイプの全長抗体遺伝子を作成するために使用できる。追加的に、または代替的に、PCSK9特異的拮抗薬をコードする核酸を含む組み換え体発現ベクターは、宿主細胞からの拮抗薬の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることできる。核酸は、シグナルペプチドをコードする核酸が、PCSK9特異的拮抗薬をコードする核酸に隣接してインフレームで連結されるように、ベクター内にクローン化できる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンまたは非免疫グロブリンのシグナルペプチドとすることができる。当業者が利用できる任意の技術を採用して、核酸を宿主細胞に導入することができる（例えば、Morrison,  1985  Science,  229:1202を参照）。関心対照の核酸分子を発現ベクターにサブクローニングして、ベクターを含む宿主細胞を形質転換または形質移入する方法、並びにそれぞれの発現ベクターを宿主細胞に導入すること、および宿主細胞を適切な条件下で培養することを含む実質的に純粋なタンパク質を作成する方法は、周知のとおりである。そのように製造されるPCSK9特異的拮抗薬は、宿主細胞から保存的方法で収穫しうる。核酸を所定の細胞に導入するために適切な技術は、使用する細胞のタイプに依存する。一般的な技術には、限定されないものの、リン酸カルシウム形質移入、DEAE-デキストラン、エレクトロポーレーション、関心対照の株細胞にとって適切なウイルス（例えば、レトロウイルス、ワクシニア、バキュロウイルス、またはバクテリオファージ）を使用したリポソーム媒介の形質移入および形質導入が含まれる。
【００９１】
別の態様において、本発明は、PCSK9特異的拮抗薬をコードする核酸を含む単離された細胞を提供する。本書では、限定されないものの、原核生物（例えば、大腸菌、バシラス属、およびストレプトマイセス）からの株細胞および真核生物（例えば、酵母、バキュロウイルス、および哺乳類）からの株細胞を含む、多様な異なる株細胞が意図されており、PCSK9特異的拮抗薬の組み換え体製造に使用できる（例えば、Breitling  et  al.,  Recombinant  antibodies,  John  Wiley  ＆  Sons,  Inc.  and  Spektrum  Akademischer  Verlag,  1999を参照し、その開示内容を参照することにより本書に組み込む）。本書で開示した核酸または拮抗薬を含む、遺伝子組み換え植物を含む植物細胞および遺伝子組み換え動物（ヒト以外）を含む動物細胞も、本発明の一部として意図されている。限定されないものの、チャイニーズハムスター卵巣（CHO細胞、限定されないもののDHFR-CHO細胞（Urlaub  and  Chasin,  1980  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  77:4216-4220に記載）を例えばDHFR選択マーカーとともに使用したものを含む）（例えば、Kaufman  and  Sharp,  1982  Mol.  Biol.  159:601-621に記載のあるとおり）、NS0骨髄腫細胞（ここでWO  87／04462号、WO  89／01036号、およびEP  338,841号に記載のあるGS発現システムを使用できる）、COS細胞、SP2  細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、YB2／0ラット骨髄腫細胞、ヒト胚性腎臓細胞、ヒト胚性網膜細胞および本書で開示した核酸または拮抗薬を含むその他に由来するものが含まれる適切な哺乳類の細胞または株細胞は、本発明の別の実施形態を形成し、その前述の開示内容を、参照して本書に組み込む。PCSK9特異的拮抗薬をコードする核酸を含む本発明の具体的な実施形態には、限定されないものの、大腸菌（例えば、Pluckthun、1991  Bio／Technology  9:545-551を参照）、またはピキアなどの酵母、およびその組み換え誘導体が含まれる（例えば、Li  et  al.、2006  Nat.  Biotechnol.  24:210-215を参照）が含まれ、その前述の開示内容を、参照して本書に組み込む。本発明の具体的な実施形態は、開示したPCSK9特異的拮抗薬をコードする核酸を含む真核細胞に関連する（Chadd  ＆  Chamow,  2001  Current  Opinion  in  Biotechnology  12:188-194、Andersen  ＆  Krummen,  2002  Current  Opinion  in  Biotechnology  13:117、Larrick  ＆  Thomas,  2001  Current  Opinion  in  Biotechnology  12:411-418を参照し、その開示内容を参照することにより本書に組み込む。本発明の具体的な実施形態は、適切な翻訳後修飾をしてPCSK9特異的拮抗薬を製造できる、開示したPCSK9特異的拮抗薬をコードする核酸を含む哺乳類の細胞に関する。翻訳後修飾には、いかなる形でも限定されることはないが、ジスルフィド結合形成およびグリコシル化が含まれる。別のタイプの翻訳後修飾は、シグナルペプチド切断である。本発明の好ましい実施形態には、適切なグリコシル化がある（例えば、Yoo  et  al.,  2002  J.  Immunol.  Methods  261:1-20を参照し、その開示内容を参照することにより本書に組み込む）。天然に存在する抗体には、重鎖に付着した少なくとも1つのN-連鎖した炭水化物が含まれる（同書）。効果的な翻訳後修飾を提供するために、異なるタイプの哺乳類の宿主細胞を使用できる。こうした宿主細胞の例としては、チャイニーズハムスターの卵巣（CHO）、HeLa、C6、PC12および骨髄腫細胞などがある（Yoo  et  al.,  2002  J.  Immunol.  Methods  261:1-20、およびPersic  et  al.,  1997  Gene  187:9-18を参照し、その開示内容を参照することにより本書に組み込む）。
【００９２】
別の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドを含む単離された細胞を提供する。
【００９３】
別の態様において、本発明は、本発明のPCSK9特異的拮抗薬を製造する方法であって、PCSK9特異的拮抗薬をコードする核酸またはヒトおよび／もしくはマウスのPCSK9に対する特異性を持つ望ましいPCSK9特異的拮抗薬（望ましい拮抗薬の影響を受ける）の重鎖および／もしくは軽鎖またはその断片（例えば、VHおよび／もしくはVLまたは1つ以上の開示した重鎖および／もしくは軽鎖の可変部CDR）を含む細胞を、PCSK9特異的拮抗薬の発現またはPCSK9特異的拮抗薬内の前記重鎖および／もしくは軽鎖または断片の発現および組立が許容される条件下で培養すること、並びに前記PCSK9特異的拮抗薬を細胞から分離することを含む方法を提供する。特定の望ましい重鎖および／もしくは軽鎖配列または断片を作製する一例は、まずPCRを用いて生殖系列の重鎖および／または軽鎖の可変配列または断片を増幅（および修飾）することである。ヒトの重鎖および／または軽鎖可変部用の生殖系列配列は、当業者にとってたやすく入手できる（例えば、「Vbase」ヒト生殖系列of  Immunological  Interest,  Fifth  Edition,  U.S.  Department  of  Health  and  Human  Services,  NIH  Publication  No.  91-3242、Tomlinson,  I.M.  et  al.,  1992  "The  Repertoir配列データベース、およびKabat,  E.A.  et  al.,  1991  Sequences  of  Proteins  e  of  Human  Germline  VH  Sequences  Reveals  about  Fifty  Groups  of  VH  Segments  with  Different  Hypervariable  Loops"  J.  Mol.  Biol.  227:776-798、およびCox,  J.P.L.  et  al.,  1994  "A  Directory  of  Human  Germ-line  Vκ  Segments  Reveals  a  Strong  Bias  in  their  Usage"  Eur.  J.  Immunol.  24:827-836を参照し、その開示内容を参照することにより本書に組み込む）。生殖系列配列の突然変異誘発は、標準的な方法、例えば、突然変異がPCRプライマーに組み込まれるPCRを媒介した突然変異誘発または部位特異的変異誘発を使用して遂行しうる。全長抗体が望ましい場合には、ヒト重鎖定常部遺伝子用の配列が入手できる（例えば、Kabat.  E.A.  et  al.,  1991  Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest,  Fifth  Edition,  U.S.  Department  of  Health  and  Human  Services,  NIH  Publication  No.  91-3242を参照）。これらの領域を含む断片は、例えば標準的なPCR増幅により入手できる。あるいは、当業者は、重鎖および／または軽鎖の定常部を既にコードする自身のベクターを利用できる。
【００９４】
元の抗体の特異性を保持するその他の抗体分子を組み換えにより製造するために利用可能な技術が存在する。この特定の例は、免疫グロブリン可変部またはCDRをコードするDNAが、別の抗体分子の定常部に、または定常部およびフレームワーク領域に、または単にフレームワーク領域に導入される場合である（例えば、EP-184,187、GB  2188638、およびEP-239400を参照し、その開示内容を参照することにより本書に組み込む）。キメラ抗体を含む、抗体分子のクローニングおよび発現については、文献に記載がある（例えば、EP  0120694およびEP  0125023を参照し、その開示内容を参照することにより本書に組み込む）。
【００９５】
本発明による抗体分子は、一例において、産生した後、本書で同定した特性について既知の技術を用いて選別することもできる。モノクローナル抗体の準備のための基本的技術については、文献（例えば、Kohler  and  Milstein  （1975,  Nature  256:495-497を参照）に記載があり、その開示内容を参照することにより本書に組み込む。完全ヒトモノクローナル抗体は、利用可能な方法により製造できる。これらの方法には、いかなる形でも限定はされないが、免疫系を持ち、それによってマウス抗体遺伝子が不活性となり、それにかわりに各種の機能的ヒト抗体遺伝子で置き換えられるが、マウス免疫系のその他の成分は未変化のまま残る、遺伝子組み換えマウス株の使用が含まれる。こうした遺伝子組み換えのマウスにより、自然なインビボでの免疫応答および親和性成熟プロセスが許容され、高い親和性の完全ヒトモノクローナル抗体がもたらされる。この技術は、当技術で周知のとおりであり、また限定されないものの、米国特許第5,545,806号、第5,569,825号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,789,650号、第5,877,397号、第5,661,016号、第5,814,318号、第5,874,299号、第5,770,249号（GenPharm  Internationalに譲渡され、「UltraMab  Human  Antibody  Development  System」の保護のもとMedarexを通じて入手可）、また同様に米国特許第5,939,598号、第6,075,181号、第6,114,598号、第6,150,584号および関連する対応特許（XenoMouse（登録商標）技術を開示しているAbgenixに譲渡）を含む様々な公開に詳細が記載されており、その開示内容を参照することにより本書に組み込む。Kellerman  and  Green,  2002  Curr.  Opinion  in  Biotechnology  13:593-597、およびKontermann  ＆  Stefan,  2001  Antibody  Engineering,  Springer  Laboratory  Manualsによるレビューも参照し、その開示内容を参照することにより本書に組み込む。
【００９６】
あるいは、本発明によるPCSK9特異的拮抗薬のライブラリを、PCSK9と接触させて、特異的結合を示しうるものを選択することができる。次に、機能的研究を実施し、適切な機能性、例えば、PCSK9依存的細胞LDL取り込みの阻害の阻害を確認する。濃縮技術を使用して、ライブラリからタンパク質特異的な分子を選択するために、当業者が利用できる様々な技術があり、これには、限定されないものの、ファージディスプレイ（例えば、米国特許第5,565,332号、第5,733,743号、第5,871,907号、第5,872,215号、第5,885,793号、第5,962,255号、第6,140,471号、第6,225,447号、第6,291,650号、第6,492,160号、第6,521,404号、第6,544,731号、第6,555,313号、第6,582,915号、第6,593,081号、並びにその他の米国の対応特許および／または優先出願GB  9206318（1992年5月24日出願）に依存する出願で開示されたCambridge  Antibody  Technology（「CAT」）の技術を参照するほか、またVaughn  et  al.,  1996,  Nature  Biotechnology  14:309-314を参照）、リボソームディスプレイ（例えば、Hanes  and  Pluckthun,  1997  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  94:4937-4942を参照）、細菌ディスプレイ（例えば、Georgiou,  et  al.,  1997  Nature  Biotechnology  15:29-34を参照）および／または酵母ディスプレイ（例えば、Kieke,  et  al.,  1997  Protein  Engineering  10:1303-1310を参照）があるが、その前述の開示内容を、参照して本書に組み込む。例えば、ライブラリをバクテリオファージ粒子の表面に表示して、PCSK9特異的拮抗薬またはその断片をコードする核酸を、その表面に提示することができる。次に核酸は、望ましいレベルの活性を示すバクテリオファージ粒子および望ましい拮抗薬の開発に使用した核酸から単離できる。ファージディスプレイについては、文献（例えば、Kontermann  ＆  Stefan、上記、および国際出願番号WO  92／01047号を参照）に十分な記載があり、その開示内容を参照することにより本書に組み込む。特に抗体分子に関連して、本発明による個別の重鎖または軽鎖クローンは、それらとの間で相互作用して、組み合わされた重鎖および軽鎖の分子を形成する能力のある、それぞれ相補的な重鎖または軽鎖を選別するために使用することもできる（例えば、国際出願番号WO  92／01047号を参照）。PCSK9特異的拮抗薬を同定するために、当業者が利用できる任意のパニング方法が使用できる。これを達成するための別の特定の方法は、溶液中で標的の抗原に対して、例えば、ビオチン化した可溶性のPCSK9をパニングした後、ストレプトアビジン被覆した磁性ビーズ上でPCSK9特異的拮抗薬-ファージ複合体を捕獲し、その後、洗浄して非特異的に結合したファージを除去する方法である。次に捕獲したファージは、本書に記載したとおり、プレートの表面から回収する方法と同じ方法でビーズから回収できる（例えば、DTT）。
【００９７】
PCSK9特異的拮抗薬は、当業者が利用できる技術により精製できる。関連する拮抗薬の製剤、腹水、ハイブリドーマ培養液、または関連する試料の力価は、各種の血清学的または免疫学的アッセイで決定することができ、これには、限定されないものの、沈殿、受身凝集反応、酵素免疫測定法（「ELISA」）技術および放射免疫アッセイ（「RIA」）技術が含まれる。
【００９８】
本発明は、部分的に、本書で説明したPCSK9特異的拮抗薬をPCSK9機能を拮抗するために使用する方法に関し、その前記方法を下記にさらに説明する。本出願全体での用語  「拮抗する」の使用は、1つ以上のPCSK9の機能を妨害、阻害、相殺、中和または低減する作用を意味する。PCSK9に関連した1つ以上の機能的な特性の阻害または拮抗作用は、当技術で既知の方法（例えば、Barak  ＆  Webb,  1981  J.  Cell  Biol.  90:595-604、Stephan  ＆  Yurachek,  1993  J.  Lipid  Res.  34:325330、およびMcNamara  et  al.,  2006  Clinica  Chimica  Acta  369:158-167を参照）、および本書に記載した方法により簡単に判断できる。阻害または拮抗作用により、拮抗薬がない場合に見られるもの、または、例えば、無関係の特異性の対照拮抗薬があるときに見られるものと比較したPCSK9活性の減少が達成される。望ましくは、本発明によるPCSK9特異的拮抗薬は、測定したパラメーター（限定されないものの、本書で開示した作用が含まれる）の少なくとも10％の減少があった時点で、またより望ましくは、測定したパラメーターの少なくとも20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％および95％の減少があった時点で、PCSK9機能を拮抗する。こうしたPCSK9機能の阻害／拮抗作用は、PCSK9機能が被験者にマイナスの影響を与える特定の表現型、病気、障害または状態に少なくとも部分的に寄与している場合において特に効果的である。
【００９９】
一態様において、本発明は、PCSK9による影響を受ける能力のある細胞、細胞集団または組織試料（すなわち、LDL受容体を発現するか、および／またはLDL受容体を含むもの）を、前記拮抗薬が存在するときPCSK9に結合して、PCSK9の細胞LDL取り込みの阻害を抑制する条件で、本書で開示したPCSK9特異的拮抗薬と接触させることを含む、PCSK9の活性を拮抗するための方法を提供する。本発明の具体的な実施形態には、細胞がヒト細胞である方法が含まれる。本発明の追加的な実施形態には、細胞がマウスの細胞である方法が含まれる。
【０１００】
別の態様において、本発明は、被験者に治療的に有効な量の本発明のPCSK9特異的拮抗薬を投与することを含む、被験者においてPCSK9の活性を拮抗する方法を提供する。特定の実施形態において、PCSK9機能を拮抗する方法は、PCSK9に関連した病気、障害もしくは状態あるいは、PCSK9拮抗薬の効果から利益を得ることのできる病気、障害もしくは状態の治療のためのものである。薬剤は、PCSK9活性に関連した状態またはPCSK9の機能が特定の被験者にとって禁忌である状態を示す被験者において有用といえる。特に選んだ実施形態において、状態は、高コレステロール血症、冠動脈心疾患、代謝症候群、急性冠動脈症候群または関連する状態が考えられる。
【０１０１】
こうして、本発明は、PCSK9機能の拮抗が望ましい様々な治療方法における、本書に記載したPCSK9特異的拮抗薬の使用が意図されている。治療方法は、性質上、予防的または治療的なものとしうる。特定の実施形態において、本発明は、治療的に有効な量の本発明のPCSK9特異的拮抗薬の被験者への投与を含む、PCSK9活性に関連した／起因する状態またはPCSK9の機能が特定の被験者について禁忌である状態のための治療方法に関する。特に選んだ実施形態において、状態は、高コレステロール血症、冠動脈心疾患、代謝症候群、急性冠動脈症候群または関連する状態が考えられる。
【０１０２】
本発明による治療方法は、個体に対して、本発明のPCSK9特異的拮抗薬の治療的に（または予防的に）有効な量を投与することを含む。量に関連した用語「治療的に有効な」または「予防的に有効な」の使用は、望ましい期間にわたり、望ましい治療的／予防的な効果を達成するための、意図した投薬に必要な量を意味する。望ましい効果は、例えば、治療する状態に関連した少なくとも1つの症状の改善としうる。これらの量は、当業者が理解するとおり、限定されないものの、個人の病気の状態、年齢、性別および体重、およびその個人に望ましい効果を誘発するPCSK9特異的拮抗薬の能力などの様々な要因により変化する。反応は、インビトロの試験法、インビボでの非ヒト動物の研究、および／または臨床試験でサポートされたそれ以外の方法により文書化しうる。
【０１０３】
PCSK9特異的拮抗薬は、薬剤組成物として投与しうる。本発明は、本発明のPCSK9特異的拮抗薬および限定されないものの、賦形剤、希釈剤、安定剤、緩衝液または拮抗薬の望ましい形態と量での治療対象者への投与を促進するように設計された代替物を含む医薬品として容認される担体を含む医薬品として容認される組成物を提供する。
【０１０４】
薬剤組成物は、当技術で既知の任意の数の方法で調製することができる（例えば、McGoff  and  Scher,  2000  Solution  Formulation  of  Proteins／Peptides：In  -  McNally,  E.J.,  ed.  Protein  Formulation  and  Delivery.  New  York,  NY：Marcel  Dekker；pp.  139-158、Akers  ＆  Defilippis,  2000,  Peptides  and  Proteins  as  Parenteral  Solutions.  In  -  Pharmaceutical  Formulation  Development  of  Peptides  and  Proteins.  Philadelphia,  PA：Taylor  and  Francis；pp.  145-177、Akers  et  al.,  2002,  Pharm.  Biotechnol.  14:47-127を参照）。患者への投与に適切な医薬品として容認される組成物には、許容可能な温度範囲での貯蔵時に生物活性を保持しつつ、最大の安定性も促進する製剤形態での、有効量のPCSK9特異的拮抗薬が含まれることになる。
【０１０５】
拮抗薬をベースにした医薬品として容認される組成物は、特定の実施形態において、液体もしくは固形とし、またはガス粒子もしくはエアロゾル化した粒子とすることもできる。液体または固形の製剤を製造する任意の技術が利用されうる。こうした技術は、十分に当業者の技能の範囲である。固形製剤は、限定されないものの、凍結乾燥、噴霧乾燥または超臨海流体技術による乾燥を含む、利用可能な任意の方法で製造できる。経口投与のための固形製剤は、処方量で、また処方された時間内に拮抗薬を患者が利用できるようにする任意の形態とすることができる。経口の製剤形態は、限定されないものの、錠剤、カプセルまたは粉末を含む、多数の固形製剤の形態をとることができる。固形製剤は代替的に、当業者に既知の方法に従って、単一または複数回のいずれかの投薬の前に、凍結乾燥して溶液とすることもできる。拮抗薬の組成物は一般に、生物学的に適切なpH範囲内に調製すべきで、また貯蔵中に適切なpH範囲を維持するために緩衝化することもできる。液体および固形のどちらの製剤でも一般に、長期間にわたり安定性を保持するために、低めの温度（例えば、2〜8℃）の貯蔵を必要とする。製剤化した拮抗薬および組成物、特に液体製剤には、貯蔵中のタンパク質分解の阻止または最小化のために静菌剤が含まれうるが、これには、限定されないものの、有効濃度（例えば、≦1％  w/v）のベンジルアルコール、フェノール、m-クレゾール、クロロブタノール、メチルパラベンおよび／またはプロピルパラベンを含む。静菌剤は、一部の患者にとって禁忌であることがある。従って、こうした構成要素を含むか、または含まない凍結乾燥した製剤形態を、溶液に戻すことができる。緩衝化した液体または固体拮抗薬のどちらの製剤形態にも、追加的な成分を加えることもでき、これには、限定されないものの、凍結保護物質としての糖類（これには、限定されないものの、ソルビトール、マンニトール、グリセロールおよびズルシトールなどのポリヒドロキシ炭化水素、並びに／またはショ糖、ラクトース、麦芽糖もしくはトレハロースなどの二糖類を含む）および、一部の例において、適切な塩（これには、限定されないものの、NaCl、KClまたはLiClを含む）を含む。こうした拮抗薬製剤は、とくに長期間貯蔵される予定の液体製剤は、例えば、2〜8℃またはそれ以上の温度での長期にわたる安定性を促進しつつも、非経口的な注射用に製剤形態を有用なものとする有用範囲の合計浸透圧に依存することになる。適切な場合、防腐剤、安定剤、緩衝液、酸化防止剤および／またはその他の添加物を含みうる。製剤には、二価の陽イオン（これには、限定されないものの、MgCl2、CaCl2、およびMnCl2を含む）、および／または非イオン性界面活性剤（これには、限定されないものの、ポリソルビン酸-80（Tween  80（商標））、ポリソルビン酸-60（Tween  60（商標））、ポリソルビン酸-40（Tween  40（商標））およびポリソルビン酸-20（Tween  20（商標））、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（これには、限定されないものの、Brij  58（商標）、Brij35（商標）のほかに、トリトンX-100（商標）、トリトンX-114（商標）、NP40（商標）、Span  85およびPluronicシリーズの非イオン性界面活性剤（例えば、Pluronic  121）などを含む）が含みうる。こうした成分の任意の組み合わせが、本発明の具体的な実施形態を形成する。
【０１０６】
液体形態での薬剤組成物には、液体担体、例えば、水、石油、動物油、植物油、鉱油または合成油が含まれうる。液体形態には、生理学的生理食塩水、ブドウ糖もしくはその他のサッカライド溶液またはエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなどのグリコールも含まれうる。
【０１０７】
望ましくは、薬剤組成物は、発熱物質を含まない適切なpH、緊張度および安定性の非経口的に容認可能な水溶液の形態としうる。薬剤組成物は、例えば生理食塩液注射液、リンガー液または乳酸リンゲル液など、等張性の溶媒に希釈した後で投与するよう製剤化することもできる。
【０１０８】
本発明の一態様は、以下の薬剤組成物である：（i）、限定されないものの、本書で説明したPCSK9特異的拮抗薬を含む約50〜約200  mg/ｍLのタンパク質、（ii）ポリヒドロキシ炭化水素（これには、限定されないものの、ソルビトール、マンニトール、グリセロールおよびずるしトールが含まれる）および／または二糖類（これには、限定されないものの、ショ糖、ラクトース、麦芽糖およびトレハロースが含まれる）、前記ポリヒドロキシ炭化水素および／または二糖類の合計は、製剤の体積百分率で約1％〜約6％（「w/v」）であり、（iii）薬剤組成物の有効期間全体を通したpHの浮動を阻止する緩衝剤として、また緊張度モディファイヤーとしての役目をする約5  mM〜約200  mMのヒスチジン、イミダゾール、ホスフェートまたは酢酸、（iv）凝集の影響を弱めるための約5  mM〜約200  mMのアルギニン、プロリン、フェニルアラニン、アラニン、グリシン、リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはメチオニン、（v）約5.5〜約7.5の範囲のpHを達成するために十分な量の約0.01M〜約0.1Mの塩酸（「HCl」）および（vi）限定されないものの、滅菌水、石油、動物油、植物油、鉱油、合成油、生理学的生理食塩水、ブドウ糖もしくはその他のサッカライド溶液またはエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなどのグリコールを含む液体担体、ここで前記薬剤組成物は、約5.5〜約7.5の範囲のpHを持ち、また前記薬剤組成物は、製剤の約0.01％〜約1％  w/vの非イオン性界面活性剤（これには、限定されないものの、ポリソルビン酸-80（Tween  80（商標））、ポリソルビン酸-60（Tween  60（商標））、ポリソルビン酸-40（Tween  40（商標））、およびポリソルビン酸-20（Tween  20（商標））、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（これには、限定されないものの、Brij  58（商標）、Brij35（商標）のほかに、トリトンX-100（商標）、トリトンX-114（商標）、NP40（商標）、Span  85およびPluronicシリーズの非イオン性界面活性剤（例えば、Pluronic  121）などを含む）を任意に含む。
【０１０９】
遊離酸、ヒスチジン-HClまたはアルギニン-HClとして、HClを加えることもできる。ヒスチジン-HClまたはアルギニン-HClとして供給される場合には、HCl中のヒスチジンまたはアルギニンの合計量は、上記に指定したものとすべきである。従って、ヒスチジンおよび／またはアルギニンの量に応じた一部または全てのHClは、場合に応じてヒスチジン-HClおよび／またはアルギニン-HClとして供給しうる。明細書中で開示した量に関して用語「約」の使用は、提示した指定の数の10％以内を意味する。例えば、「約50〜約200」で提示された範囲は、明確な実施形態として前記範囲内にある各数が含まれることを明示的に示す。上記の例のとおり、これには、限定されないものの、50、100、125、150および200を持つものなどを含む実施形態は、本書での具体的な実施形態を形成する。本書で開示した薬剤組成物は、投与方法にかかわらず一般的な適応性を持つ。特定の実施形態において、開示した薬剤組成物は、液体として、または凍結乾燥した形態を戻して、皮下投与に有用である。開示した製剤に採用しうるタンパク質には、任意の重合体タンパク質または治療上の利益を達成する目的で供給された共有結合的に連結したアミノ酸残基を含むものとして特徴付けられるポリペプチドが含まれる。本組成物で使用するタンパク質には、限定はされないが、本書で定義した任意の抗体分子または任意の非抗体または非免疫グロブリンタンパク質、ペプチド、ペグ化タンパク質および融合タンパク質が含まれる。
【０１１０】
本発明の特定の態様は、上記に開示した薬剤組成物に関連するが、これは以下を含む：（i）限定されないものの、本書で説明したPCSK9特異的拮抗薬を含む約50〜約200  mg/ｍLのタンパク質、（ii）約1％〜約6％（特定の実施形態では約2％〜約6％）w/vのマンニトール、トレハロースまたはショ糖、（iii）約10  mM〜約100  mMのヒスチジン、（iv）約25  mM〜約100  mMのアルギニンまたはプロリン、（v）約5.8〜約7の範囲のpHを達成するために十分な量の約0.02  M〜約0.05Mの塩酸（「HCl」）および（vi）限定されないものの、滅菌水、石油、動物油、植物油、鉱油、合成油、生理学的生理食塩水、ブドウ糖もしくはその他のサッカライド溶液またはエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなどのグリコールを含む液体担体、ここで前記薬剤組成物は、約5.8〜約7の範囲のpHを持ち、また前記薬剤組成物は製剤の約0.01％〜約1％  w/vの非イオン性界面活性剤（これには、限定されないものの、ポリソルビン酸-80（Tween  80（商標））、ポリソルビン酸-60（Tween  60（商標））、ポリソルビン酸-40（Tween  40（商標））、およびポリソルビン酸-20（Tween  20（商標））、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（これには、限定されないものの、Brij  58（商標）、Brij35（商標）のほかに、トリトンX-100（商標）、トリトンX-114（商標）、NP40（商標）、Span  85およびPluronicシリーズの非イオン性界面活性剤（例えば、Pluronic  121）などを含む）を任意に含む。
【０１１１】
具体的な実施形態は、以下を含む薬剤組成物を提供する：（i）限定されないものの、本書で説明したPCSK9特異的拮抗薬を含む約50〜約200  mg/ｍLのタンパク質、（ii）約1％〜約6％（特定の実施形態では約2％〜約6％）w/vのマンニトール、トレハロースまたはショ糖、（iii）約10  mM〜約150  mMのヒスチジン、（iv）約10  mM〜約150  mMのアルギニンまたはプロリン、（v）約5.8〜約6.5の範囲のpHを達成するために十分な量の約0.03  M〜約0.05  Mの塩酸（「HCl」）および（vi）限定されないものの、滅菌水、石油、動物油、植物油、鉱油、合成油、生理学的生理食塩水、ブドウ糖もしくはその他のサッカライド溶液またはエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなどのグリコールを含む液体担体、ここで前記薬剤組成物は約5.8〜約6.5の範囲のpHを持ち、また前記薬剤組成物は製剤の約0.01％〜約1％  w/vのポリソルビン酸-80（Tween  80（商標））またはポリソルビン酸-20（Tween  20（商標））を任意に含む。
【０１１２】
本書における具体的な実施形態は、以下を含む薬剤組成物を提供する：（i）限定されないものの、本書で説明したPCSK9特異的拮抗薬を含む、約50〜約200  mg/ｍLのタンパク質、（ii）約1％〜約6％（特定の実施形態では約2％〜約6％）w/vのショ糖、（iii）約25  mM〜約100  mMのヒスチジン、（iv）約25  mM〜約100  mMのアルギニン、（v）約6のpHを達成するために十分な量の約0.040  M〜約0.045  Mの塩酸（「HCl」）および（vi）滅菌水、ここで前記薬剤組成物は約6のpHを持ち、また前記薬剤組成物は、約0.01％〜約1％  w/vのポリソルビン酸-80（Tween  80（商標））またはポリソルビン酸-20（Tween  20（商標））を任意に含む。その特定の実施形態において、ヒスチジンおよびアルギニンのレベルは、互いに25  mM以内で、その他の実施形態では同じである。
【０１１３】
本書における具体的な実施形態は、以下を含む薬剤組成物を提供する：（i）限定されないものの、本書で説明したPCSK9特異的拮抗薬を含む約50〜約200  mg/ｍLのタンパク質、（ii）（a）約1％  w/vのショ糖、約10  mMのヒスチジンおよび約25  mMのアルギニン、（b）約2％  w/vのショ糖、約25  mMのヒスチジンおよび約25  mMのアルギニン、（c）約3％  w/vのショ糖、約50  mMのヒスチジンおよび約50  mMのアルギニン、または（d）約6％  w/vのショ糖、約100  mMのヒスチジンおよび約100  mMのアルギニンのいずれかの量でのショ糖、ヒスチジンおよびアルギニン、（iii）約0.04  molまたは、別の方法で、約1.46  gのHCl、並びに（iv）滅菌水、ここで前記薬剤組成物は約6のpHを持ち、また前記薬剤組成物は、約0.01％〜約1％  w/vのポリソルビン酸-80（Tween  80（商標））またはポリソルビン酸-20（Tween  20（商標））を任意に含む。本書における具体的な実施形態は、上記の（ii）のショ糖、ヒスチジンおよびアルギニンの量が、（c）または（d）で記載されたものである。ショ糖、ヒスチジンおよびアルギニンの量が（ii）（c）で指定された、上記に記載した医薬製剤を採用する具体的な実施形態は、生理学的値の300  mOsmに類似したオスモル濃度が得られること、および液体および凍結乾燥した形態の両方で安定性が得られることが分かった。
【０１１４】
本書における具体的な実施形態は、50〜200  mg/ｍLの本書で記載した様々なPCSK9特異的拮抗薬のいずれか1つを含む、記載した薬剤組成物を提供する。例証の目的で、また限定としては解釈してはならないが、明確なその1つの実施形態は、（a）配列番号：26を含む軽鎖、および（b）配列番号：25を含む重鎖を含む、PCSK9特異的拮抗薬を含む上記記載の医薬品製剤であり、ここで、前記PCSK9特異的拮抗薬は、PCSK9の細胞LDL取り込みの阻害を拮抗する抗体分子である。
【０１１５】
本書における特定の実施形態は、冷凍乾燥して元に戻した上記記載による薬剤組成物である。特定の実施形態において、前記冷凍乾燥して元に戻した溶液中の前記タンパク質濃度は、凍結乾燥前の組成物中よりも最高2倍高い。特定の実施形態において、タンパク質もしくはPCSK9特異的拮抗薬の冷凍乾燥し、および／または元に戻した薬剤組成物中の濃度は、約50  mg/ｍL〜約300  mg/ｍLの範囲内である。凍結乾燥した薬剤組成物を元に戻すために有用な希釈剤には、限定はされないが、滅菌水、静菌性注射用水（「BWFI」）、リン酸緩衝生理食塩水、無菌生理食塩水、生理学的生理食塩水、リンゲル液またはブドウ糖液などが含まれ、また特定の実施形態において、0.01〜1％（w/v）のポリソルビン酸-80（Tween  80（商標））またはポリソルビン酸-20（Tween  20（商標））を含みうる。特定の実施形態において、凍結乾燥した粉末は、1／60.2X原体積（または0.167  ｍL）から最高1X（1ｍL）で戻すことができる。
【０１１６】
本発明の模範的実施形態は、本書で説明した安定した薬剤組成物である。本発明のその他の実施形態は、本書で説明した凍結乾燥および再生（戻すこと）に対して安定した薬剤組成物である。凍結乾燥した組成物の調製には、当業者は様々な方法を利用できる（例えば、Martin  ＆  Mo,  2007  "Stability  Considerations  for  Lyophilized  Biologics"  Amer.  Pharm.  Rev.を参照）。本書で使用するとき「安定」は、タンパク質またはPCSK9特異的拮抗薬の、その物理的または化学的な安定性を保持する性質、立体配置的完全性、または対照試料と比較して4〜37℃の温度範囲で少なくとも約30日間にわたり、少ない変性、タンパク質クリッピング、凝集、断片化、酸性変異体の生成または生物活性の喪失を示すその能力を意味する。その他の実施形態は、最高3カ月、6カ月、12カ月、2年間またはそれより長い期間、上記の温度で安定性が保たれる。特定の実施形態において、製剤形態は、2〜8℃で、優先順に、少なくとも6カ月間、また望ましくは12カ月、2年間またはそれより長く、有意な変化は示さない。具体的な実施形態では、対照試料と比較して、25〜45℃（または他の方法では2〜8℃）の温度範囲で、少なくとも  約30日間、3カ月、6カ月、12カ月、2年間またはそれより長く、10％未満または、特定の実施形態において、5％未満の変性、タンパク質クリッピング、凝集、断片化、酸性変異体生成または生物活性の喪失が起こる。製剤の安定性は、当業者に周知のいくつかの手段により試験することができ、これには、限定されないものの、凝集および断片化を測定するサイズ排除クロマトグラフィー（SEC-HPLC）、濃縮した試料の粒子サイズを測定する動的光散乱（DLS）、断片化（分裂）を測定する毛細管SDS-PAGEおよび酸性変異体の生成を測定するキャピラリー等電点電気泳動（cIEF）または陽イオン交換クロマトグラフィー（「CEX」）を含む。タンパク質安定性の分析に適した技術は、当業者により良く理解されており、Peptide  and  Protein  Drug  Delivery,  247-301,  Vincent  Lee  Ed.,  Marcel  Dekker,  Inc.,  New  York,  N.Y.,  Pubs.  （1991)およびJones,  1993  Adv.  Drug  Delivery  Rev.  10:29-90のレビューを参照。
【０１１７】
本書で説明した薬剤組成物は、無菌であるべきである。これを達成するために、当業者が利用できる様々な技術があり、これには、限定されないものの、無菌ろ過膜を通すろ過がある。凍結乾燥して元に戻す組成物を採用する特定の実施形態において、これは凍結乾燥して元に戻す前または後に実施することができる。
【０１１８】
拮抗薬治療薬の投薬は、十分に当業者の理解の範囲内であり（例えば、Lederman  et  al.,  1991  Int.  J.  Cancer  47:659-664、Bagshawe  et  al.,  1991  Antibody,  Immunoconjugates  and  Radiopharmaceuticals  4:915-922を参照）、また多数の要因に基づき変化するが、これには、限定されないものの、利用される特定のPCSK9特異的拮抗薬、治療を受ける患者、患者の病状、治療する部位、投与経路および望まれる治療を含む。通常の技能を持つ医師または獣医であれば、拮抗薬の効果的な治療の量を簡単に決定し、および処方することができる。投薬範囲は、宿主体重の約0.01〜100  mg／kg、およびより通常的には0.05〜25  mg／kgとしうる。例えば、投与量は、0.3  mg／kg体重、1  mg／kg体重、3  mg／kg体重、5  mg／kg体重または10  mg／kg体重または1〜10  mg／kgの範囲内としうる。例証の目的で、また限定することなく、特定の実施形態において、拮抗薬を全身的に送達するために5  mg〜2.0  gの用量を利用しうる。特定の実施形態において、提供される用量の濃度は、約8  mg/ｍL〜約200  mg/ｍLの範囲となる。その他の実施形態において、本発明での使用が意図されている用量は、約50  mg/ｍL〜約150  mg/ｍLである。特定の実施形態において、用量は、約0.1  ｍL〜約1.5  ｍLで、また特定の実施形態において1ｍLである。毒性なしに効力を得る範囲内の拮抗薬の濃度を達成する最適な精度には、標的部位への薬物の利用可能性の動態学に基づく療法を必要とする。これには、PCSK9特異的拮抗薬の配給、平衡および除去が関与する。本書で説明した拮抗薬は、適切な投薬量で単独で使用しうる。あるいは、その他の薬剤の同時投与または順次投与が望ましいこともある。代替治療法とともに、本発明のPCSK9特異的拮抗薬のための治療の投薬療法が提示することもできるであろう。例えば、PCSK9特異的拮抗薬は、その他の薬物との組み合わせまたは併用により使用することもでき（治療的および／または予防的に）、これには、限定されないものの、コレステロール低下薬、例えば、コレステロール吸収阻害剤（例えば、Zetia（登録商標））およびコレステロール合成阻害剤（例えば、  Zocor（登録商標）およびVytorin（登録商標））を含む。本発明では、こうした組み合わせが意図されており、これらは本発明の重要な実施形態を形成する。従って、本発明は、PCSK9特異的拮抗薬が、別の薬物もしくは複数の薬物と同時に、その後に、またはその前に投与／送達（治療および／または予防的に）される上述の治療の方法に関するものであり、この薬物には、限定されないものの、コレステロール低下薬、コレステロール吸収（absorportion）阻害剤およびコレステロール吸収阻害剤を含む。
【０１１９】
本書で記載した治療の能力を持つ個人（被験者）には、霊長類、ヒトおよび非ヒトが含まれ、また商業的または家畜での獣医学上の重要性のあるヒト以外の任意の哺乳動物または脊椎動物が含まれる。
【０１２０】
PCSK9特異的拮抗薬は、当技術で認識されている任意の投与経路で個人に投与しうるが、これには、限定されないものの、経口投与、注射による投与（その具体的な実施形態には、静脈内、皮下、腹腔内または筋肉内の注射が含まれる）または吸入による投与、鼻腔内もしくは局所的投与を含み、これは単独でまたは個人の治療を支援するために設計されたその他の薬剤との組み合わせのいずれかで投与される。PCSK9特異的拮抗薬は、注射装置、ペン型注射器、無針装置および皮下パッチ送達システムによって投与することもできる。投与経路は、当業者により認識される多数の考慮事項をもとに決定すべきで、これには、限定されないものの、望まれる治療の生理化学的特性が含まれる。治療は、毎日、毎週、2週間ごと、もしくは毎月または望まれる治療が行われて、維持されるように、適切な量のPCSK9特異的拮抗薬を処方された時間に個人に供給するその他の任意の療法（regimen）で供給しうる。製剤は、単回用量、または2回以上の用量を時間を分けて投与することができる。
【０１２１】
また、PCSK9に関連した病気、障害もしくは状態、または代替的に、PCSK9拮抗薬の効果から利益を得ることのできる病気、障害もしくは状態の治療のための薬剤の製造において、開示した拮抗薬を使用する方法も意図されている。薬剤は、PCSK9活性に関連した状態またはPCSK9の機能（作用）が特定の被験者にとって禁忌である状態を示す被験者において有用といえる。特に選んだ実施形態において、状態は、高コレステロール血症、冠動脈心疾患、代謝症候群、急性冠動脈症候群または関連する状態が考えられる。
【０１２２】
本書で開示したPCSK9特異的拮抗薬は、PCSK9の診断方法としても使用しうる。特に選んだ実施形態において、本発明には、試料（これには、限定されないものの、生体試料、例えば、血清または血液などを含む）内に存在するPCSK9を同定しそのレベルを数量化する方法が含まれ、これは、試料を本書で説明したPCSK9特異的拮抗薬に接触させること、およびPCSK9への結合をそれぞれ検出または定量することを含む。PCSK9特異的拮抗薬は、当業者にとって既知の様々な試験法形式で使用することができ、またキットの一部を形成することもできる（そのキットの一般的な特徴については、下記にさらに記載する）。
【０１２３】
本発明はさらに、遺伝子治療の目的での開示した抗PCSK9拮抗薬の投与を提供する。こうした方法によって、被験者の細胞が、本発明のPCSK9特異的拮抗薬をコードする核酸によって形質転換される。この核酸を有する被験者は、次に内因的にPCSK9特異的拮抗薬を精製する。以前、Alvarez,  et  al,  Clinical  Cancer  Research  6:3081-3087,  2000では、単鎖の抗ErbB2抗体が遺伝子治療アプローチを用いて被験者に導入された。Alvarez、et  al、上記、により開示された方法は、本発明の抗PCSK9抗体をコードする核酸の被験者への導入に簡単に適応させることができる。
【０１２４】
任意のPCSK9特異的拮抗薬をコードする核酸を、被験者に導入することができる。
【０１２５】
核酸は、当技術で既知の任意の手段で被験者の細胞に導入することができる。望ましい実施形態において、核酸は、ウイルスベクターの一部として導入される。ベクターを引き出すのに好ましいウイルスの例には、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、アルファウイルス、インフルエンザウイルスおよび望ましい細胞の向性を持つその他の組み換え体ウイルスが含まれる。
【０１２６】
各社が、ウイルスベクターを商業的に製造しており、これには、いかなる形でも制限されないが、Avigen,  Inc.（カリフォルニア州アラメダ；AAVベクター）、Cell  Genesys（カリフォルニア州フォスターシティ；レトロウイルス、アデノウイルス、AAVベクター、およびレンチウイルスベクター）、Clontech（レトロウイルスおよびバキュロウイルスベクター）、Genovo,  Inc.（ペンシルべニア州シャロンヒル；アデノウイルスおよびAAVベクター）、Genvec（アデノウイルスベクター）、IntroGene（オランダ、ライデン；アデノウイルスベクター）、Molecular  Medicine（レトロウイルス、アデノウイルス、AAV、およびヘルペス（疱疹）ウイルスベクター）、Norgen（アデノウイルスベクター）、Oxford  BioMedica（英国オックスフォード；レンチウイルスベクター）、およびTransgene（フランス、ストラスブール；アデノウイルス、ワクシニア、レトロウイルス、およびレンチウイルスベクター）などを含む。
【０１２７】
ウイルスベクターの構築および使用の方法は、当技術で既知である（例えば、Miller,  et  al,  BioTechniques  7:980-990,  1992を参照）。ウイルスベクターは、複製欠陥、つまり、標的細胞内において自立的には複製できず、またそれ故、感染性でないことが望ましい。複製欠陥ウイルスは、最小ウイルス、すなわち、ウイルス粒子を生成するためのゲノムのキャプシド形成に必要なゲノムの配列のみを保持することが望ましい。ウイルス遺伝子を完全にまたはほぼ完全に欠損した欠陥ウイルスが望ましい。欠陥ウイルスベクターの使用により、ベクターがその他の細胞に感染しうる心配なしに、特定の局在的な領域にある細胞への投与が許容される。こうして、特定の組織を特異的に標的としうる。
【０１２８】
弱毒化したまたは欠陥のDNAウイルス配列を含むベクターの例としては、限定されないものの、欠陥ヘルペスウイルスベクターが含まれる（Kanno  et  al,  Cancer  Gen.  Ther.  6:147-154,  1999、Kaplitt  et  al,  J.  Neurosci.  Meth.  71:125-132,  1997およびKaplitt  et  al,  J.  Neuro  Onc.  19:137-147,  1994）。
【０１２９】
アデノウイルスは、変性させて、本発明の核酸を多様な細胞タイプに効率よく供給することのできる真核生物のDNAウイルスである。Strafford-Perricaudet  et  al,  J.  Clin.  Invest.  90:626-630,  1992に記載のあるベクターなどの弱毒化されたアデノウイルスベクターが、一部の例で望ましい。様々な複製欠陥のアデノウイルスおよび最小のアデノウイルスベクターについて記載がある（PCT公開番号WO94／26914号、WO94／28938号、WO94／28152号、WO94／12649号、WO95／02697号およびWO96／22378号）。本発明による複製欠陥の組み換えアデノウイルスは、当業者に既知の任意の技術で用意できる（Levrero  et  al,  Gene  101:195,  1991；EP  185573、Graham,  EMBO  J.  3:2917,  1984、Graham  et  al,  J.  Gen.  Virol.  36:59,  1977）。
【０１３０】
アデノ随伴ウイルス（AAV）は、それらが感染する細胞のゲノム内に、安定し部位特異的な方法で組み込むことができる比較的小さなサイズのDNAウイルスである。これらは、細胞の成長、形態または分化には何の影響も誘発することなく、非常に多様な細胞に感染することができ、またヒトの病気には関与していないと見られる。AAVに由来するベクターのインビトロおよびインビボでの遺伝子の転写への使用についての記載がある（Daly,  et  al,  Gene  Ther.  8:1343-1346,  2001、Larson  et  al,  Adv.  Exp.  Med.  Bio.  489:45-57,  2001、PCT公開番号WO  91／18088号およびWO  93／09239号、米国特許第4,797,368号および第5,139,941号、並びにEP  488528B1号を参照）。
【０１３１】
別の実施形態において、遺伝子は、レトロウイルスのベクターに導入することができ、例えば、米国特許第5,399,346号、第4,650,764号、第4,980,289号および第5,124,263号、Mann  et  al,  Cell  33:153,  1983、Markowitz  et  al,  J.  Virol.,  62:1120,  1988、EP  453242号およびEP  178220号に記載のあるとおりである。レトロウイルスは、分割する細胞に感染する組み込み型ウイルスである。
【０１３２】
レンチウイルスベクターは、脳、網膜、筋肉、肝臓および血液を含む複数の組織タイプで本発明のPCSK9特異的拮抗薬をコードする核酸の直接送達および持続的発現のための媒介物として使用できる。本ベクターは、それらの組織内の分割する細胞および分割しない細胞で効率よく形質導入でき、また長期にわたるPCSK9特異的拮抗薬の発現が維持される。レビューについては、Zufferey  et  al,  J.  Virol.  72:9873-80,  1998およびKafri  et  al,  Curr.  Opin.  Mol.  Ther.  3:316-326,  2001を参照。レンチウイルスパッケージング細胞株が利用でき、当技術では一般的に知られている。これらは、遺伝子治療のための力価の高いレンチウイルスベクターの製造を促進する。ウイルス粒子を106  IU/mlを超える力価で少なくとも  3〜4日間生成できるテトラサイクリン誘導性のVSV-G偽型レンチウイルスパッケージング細胞株の例については、Kafri  et  al,  J.  Virol.  73:576-584,  1999を参照。誘導性の細胞株で生成したベクターは、非分裂細胞をインビトロおよびインビボで効率よく形質導入するために必要に応じて濃縮できる。
【０１３３】
シンドビスウイルスは、動植物分類上、アルファウイルス属の一種であり、また1953年より世界中の様々な場所でそれが発見されたことから、広範にわたり研究されてきた。アルファウイルス、特にシンドビスウイルスによる遺伝子形質導入は、インビトロでよく研究されてきた（Straus  et  al,  Microbiol.  Rev.,  58:491-562,  1994、Bredenbeek  et  al,  J.  Virol.,  67:6439-6446,  1993、Ijima  et  al,  Int.  J.  Cancer  80:110-118,  1999およびSawai  et  al,  Biochim.  Biophyr.  Res.  Comm.  248:315-323,  1998を参照）。アルファウイルスベクターの数多くの性質によって、開発中のその他のウイルス由来のベクターシステムに対して望ましい代替方法となっているが、これには、発現構築物の迅速なエンジニアリング、力価の高い感染性粒子ストックの製造、非分裂細胞の感染および高いレベルの発現を含む（Strauss  et  al,  1994  上記）。遺伝子治療でのシンドビスウイルスの使用が記載されている。（Wahlfors  et  al,  Gene.  Ther.  7:472-480,  2000およびLundstrom,  J.  Recep.  Sig.  Transduct.  Res.  19（1-4):673-686,  1999）。
【０１３４】
別の実施形態において、ベクターは、リポフェクションによって、またはその他のトランスフェクション促進剤（ペプチド、ポリマーなど）を用いて細胞に導入できる。合成的なカチオン脂質を使用して、マーカーをコードする遺伝子のインビボおよびインビトロでのトランスフェクションのためにリポソーム調製することができる（Feigner  et  al,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  84:7413-7417,  1987およびWang  et  al,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  84:7851-7855,  1987）。核酸の転写に有用な脂質化合物および組成物については、PCT公開番号WO  95／18863号およびWO  96／17823号、並びに米国特許第5,459,127号に記載がある。
【０１３５】
ベクターをインビボで裸のDNAプラスミドとして導入することも可能である。遺伝子治療用の裸のDNAベクターは、望ましい宿主細胞に当技術で既知の方法、例えば、エレクトロポーレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃の使用またはDNAベクタートランスポーターの使用により導入することができる（例えば、Wilson,  et  al,  J.  Biol.  Chem.  267:963-967,  1992、Williams  et  al,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  88:2726-2730,  1991を参照）。プラスミドのトランスフェクションに一般的に使用されるその他の試薬には、いかなる形でも限定はされないが、FuGene、LipofectinおよびLipofectamineなどが含まれる。受容体を媒介したDNA送達アプローチも使用することができる（Wu  et  al,  J.  Biol.  Chem.  263:14621-14624,  1988）。米国特許第5,580,859号および第5,589,466号には、哺乳動物におけるトランスフェクション促進剤を使用しない外来性DNA配列の送達についての開示がある。最近では、エレクトロトランスファーと呼ばれる比較的低い電圧、高効率のインビボでのDNA転写技術についての記載がある（Vilquin  et  al,  Gene  Ther.  8:1097,  2001、Payen  et  al,  Exp.  Hematol.  29:295-300,  2001、Mir,  Bioelectrochemistry  53:1-10,  2001、PCT公開番号WO  99／01157号、WO  99／01158号およびWO  99／01175号）。
【０１３６】
こうした遺伝子治療アプローチに適し、本発明の抗PCSK9拮抗薬をコードする核酸を含む薬剤組成物は、本発明の範囲内に含まれる。
【０１３７】
別の態様において、本発明は、所定の試料について、本発明のPCSK9特異的拮抗薬を使用した、PCSK9の同定、分離、数量化または拮抗の方法を提供する。PCSK9特異的拮抗薬を、ウエスタンブロット、ELISA、放射免疫アッセイ、免疫組織化学アッセイ、免疫沈降または当技術（例えば、Immunological  Techniques  Laboratory  Manual,  ed.  Goers,  J.  1993,  Academic  Pressを参照）もしくは各種の精製プロトコルで既知のその他の免疫化学的アッセイなどの、免疫化学的アッセイにおける研究ツールとして利用することもできる。拮抗薬には、素早い同定またはそれに関連する活性の測定を促進するために、その中に標識が組み込まれていたり、またはそれに添付されている場合がある。当業者であれば、上記のプロトコルで有用な、または有用である可能性のある各種の検出可能標識（例えば、酵素、染料または簡単に検出可能であるか、もしくは簡単に検出可能な何らかの活性／結果をもたらすその他の適切な分子）を十分によく分かっている。
【０１３８】
本発明の追加的な態様は、本書で開示したPCSK9特異的拮抗薬または薬剤組成物および使用説明を含むキットである。キットには一般的に、必ずしもその必要はないが、キットの内容物の意図される用途を示すラベルが含まれる。標識という用語には、キット上にあるいは同封して供給されるか、もしくは別の方法でキットに付属する任意の書面または記録された資料が含まれる。薬剤組成物が凍結乾燥して提供される特定の実施形態において、キットには、製剤形態を液体の形態に戻すための滅菌水または生理食塩水を含むことができる。特定の実施形態において、水または生理食塩水の量は、約0.1  ml〜1.0  mlである。
【０１３９】
以下の実施例は、本発明を例証するために提供したもので、それに対する実施例を制限することはない。
【実施例】
【０１４０】
実施例1
組み換え体Fabディスプレイファージ1B20の分離
Recombinant  Morphosys  HuCAL  Gold  Fabファージディスプレイライブラリ（例えば、Knappik  et  al.,  2000  J.  Mol.  Biol.  296:57-86を参照）を、固定化した組み換え体ヒトおよびマウスのPCSK9に対して、下記に簡単に説明するプロセスによってパニングした。PCSK9タンパク質を、製造者の説明書に従い、化学的にビオチン化（Pierce,  Cat.  #21455）した。MoprhosysファージFabディスプレイライブラリをプールし、3回にわたりあらかじめ吸収させ、ストレプトアビジン被覆したビーズをブロックした（Dynal  ビーズ  M280）。交差反応性のFabを分離するという目的で、ヒト（h）およびマウス（m）のPCSK9を次のとおり交互にした：ラウンド  1／2／3、h／m／hからのPCSK9を利用。
【０１４１】
3ラウンドの毎回のパニングについて、あらかじめ吸収させたファージライブラリを、ストレプトアビジン被覆したDynalビーズに固定化したあらかじめブロックしたビオチン化PCSK9で培養した（最初のラウンドは150nMで、次からのラウンドは100nM）。固定化したファージ-PCSK9複合体をPBS／0.05％  Tween（商標）20で5回素早く洗浄し、その後PBSで4回素早く洗浄して順次洗浄した後、PBSを新しくブロックしたチューブに移した。次に結合されたファージを20mM  DTTで溶出した。TG1細胞を、溶出したファージで感染させた。プールしたファージミドを有する細胞（クロラムフェニコール耐性）の培養液を培養し、ファージミドを有する培養液の冷凍ストックを作成した。ファージをヘルパーファージで同時感染させて培養液から取り出し（rescued）、次のパニングのラウンド用のファージストックを作成した。
【０１４２】
3ラウンド目のパニングのあと、ファージミド感染細胞を一晩培養し、ファージミドDNAを準備した。
【０１４３】
ラウンド3ファージミドDNAからのXbaI-EcoRI挿入物を、Morphosys  Fab発現ベクターpMORPH_x9_MHにサブクローン化して、プラスミドpMORPHx9_MH／PCSK9_6_CX1_B20が得られ（例えば、図1を参照）、またFab発現クローンのライブラリが大腸菌  TG1  F-内に生成された。形質転換体を、LB  +  クロラムフェニコール  +  ブドウ糖のプレート上に広げ、一晩培養して細菌コロニーを生成した。個別の形質転換体コロニーを取り、培養用およびFab発現についてのスクリーニング用に2つの96ウェルプレートのウェルに載せた。
【０１４４】
実施例2
細菌で発現させたFABのELISAスクリーニング
個別の形質転換体の培養液をIPTG誘発し、Fab発現のために一晩培養した。培養上清（Fab候補）を96ウェルNunc  Maxisorpプレートのウェルに固定化した精製したV5-、His-タグ付きPCSK9タンパク質とともに培養し、プレートウォッシャーを用いてPBS中0.1％のTween（商標）20で洗浄し、HRP結合した抗Fab抗体とともに培養し、再びPBS／Tween（商標）20で洗浄した。結合したHRPを、TMP基質を加えて検出し、ウェルのA450値をプレートリーダーを用いて読み取った。
【０１４５】
負の対照を次のとおりに含めた：
各プレート上の非特異的Fab結合についての対照を、並行して発現させた無関係のFabである抗EsBのプレパラートとともに培養した。
培地のみ。
【０１４６】
ELISAおよびFab発現についての正の対照を次のとおり含めた。
EsB抗原をプレートの3つのウェルに結合させ、その後、抗EsB  Fabとともに培養した。組み換え体PCSK9抗原のV5タグまたはHisタグとのFabsの反応を対照（control）するために、同じ細胞で発現したV5-、His-タグ付きの分泌したアルカリフォスファターゼタンパク質（SEAP）を、オリジナルのPCSK9抗原として用いて、並列ELISAを実施し、同様に精製した。推定上のPCSK9-反応性Fabを、PCSK9抗原で培養したとき、＞  3Xのバックグラウンド値を生じるが、SEAPと培養したときにはネガティブとして同定した。最初のラウンドのスクリーニングでPCSK9-反応性として採点されたクローンを、単一のプレート上にまとめ、3通りに再培養し、IPTGで再誘発し、PCSK9およびSEAPに対して並行のELISAで再試験（re-assayed）した。正および負の対照を上述のとおり含めた。3つの複製のうち少なくとも2つで陽性となったクローンは、その後の性質決定に進めた。既知または疑いのある混合した予備的なクローンの場合には、培養液を再精製し、クロラムフェニコールを用いて2xYT  プレート上の単一のコロニーについて画線培養し、3つ以上の異なるコロニーからの液体培養を再びELISAで上記のとおり3通りに検査した。
【０１４７】
実施例3
PCSK9  ELISA陽性のFABクローンのDNA配列決定
1.2  mlの2xYT液体培養にクロラムフェニコールを接種することで、陽性Fabのグリセロールのマスターストックから、DNA精製用の菌液を作成し、一晩培養した。DNAを一晩培養したものから遠心分離した細胞ペレットから、BioRobot  9600上でQiagen  Turbo  Miniプレップを使用して準備した。ABI  Dye  Terminatorサイクル配列決定を、Morphosysで確定した配列決定プライマーを用いてDNAについて実施し、およびABI  3100  Genetic  Analyzerを実行して、FabクローンのDNA配列を得た。DNA配列を互いに比較し、一意のクローン配列を決定し、またFabクローンの軽鎖および重鎖サブタイプを決定した。
【０１４８】
実施例4
一意のPCSK9  ELISA陽性クローンからのFABの発現および精製
ELISA陽性クローン1B20からのFabおよびEsB（負の対照）Fabを大腸菌TG1F-細胞内でIPTG誘発により発現させた。培養を溶解させ、His-タグ付きのFabを固定化した金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（IMAC）により精製し、遠心ダイアフィルトレーションにより、タンパク質を25mM  HEPES  pH  7.3／150  mM  NaClに交換した。タンパク質をCaliper  Lab-Chip  90で電気泳動法により、また保存的SDS-PAGEにより分析し、Bradfordタンパク質試験法により数量化した。精製したFabタンパク質を段階希釈でELISAにより再び試験し、精製したFabの活性を確認した。正および負の対照を、前述のとおり実行した。次に、精製したFabプレパラートを下記に記載したとおり分析した。
【０１４９】
実施例5
1B20  FABの完全長IgGへの変換
1B20軽κ鎖可変部をコードするDNA配列を、ポリメラーゼ連鎖反応により、プラスミドテンプレートpMORPHx9_MH／PCSK9_6_CX1_B20から、順方向プライマー5'-ACAGATGCCAGATGCGATATCGTGATGACCCAGA-3'（配列番号：31）および逆方向プライマー5'-TGCAGCCACCGTACGTTTAATTTCAACTTTCGTACC-3'（配列番号：32）を用いて増幅した。この増幅の生成物を、InFusionクローニングシステム（Clontech）を用いて、事前にFspIおよびBmtIで消化しておいたプラスミドpV1JNSA-GS-FB-LCKにクローン化した。その結果生じるプラスミドを可変部全体にわたりDNA配列決定により検証した。エンドトキシンの含まれないプラスミドのプレパラートを、Qiagen  Endo-Freeプラスミド・マキシプレップ・キットを用いて作成した。
【０１５０】
pMORPHx9_MH／PCSK9_6_CX1_B20の重γ鎖可変部をコードするDNA配列を、ポリメラーゼ連鎖反応により、順方向プライマー5'-ACAGGTGTCCACTCGCAGGTGCAATTGGTTCAGAGC-3'（配列番号：33）および逆方向プライマー5'-GCCCTTGGTGGATGCTGAGCTAACCGTCACCAGGGT-3'（配列番号：34）を用いて増幅し、増幅した生成物を、FspIおよびBmtIにあらかじめ消化させておいたプラスミドpV1JNSA-BF-HCG2M4にクローン化した。その結果生じるプラスミドを可変部全体にわたりDNA配列決定により検証した。エンドトキシンの含まれないプラスミドのプレパラートを、Qiagen  Endo-Freeプラスミド・マキシプレップ・キットを用いて作成した。
【０１５１】
1B20の軽鎖コード用および重鎖コード用プラスミドを用いたHEK293細胞の同時トランスフェクションの後、発現したIgGのタンパク質A精製により、全長IgGが得られた。
【０１５２】
実施例6
表面プラズモン共鳴（「SPR」）を用いたFAB:PCSK9相互作用の動態学的評価
Biacore（商標）（Pharmacia  Biosensor  AB、スウェーデン、ウプサラ）2000システムを使用してSPR測定を実施した。固定化用のセンサーチップCM5およびアミン・カプリング・キットはBiacore（商標）製である。
【０１５３】
抗Fab  IgG（ヒト特異的）（Sigma、カタログ番号I5260）を、Biacore（商標）アミン・カプリング・キット（カタログ番号BR-1000-50）を用い、固定化ウィザードを「Aim  for  immobilization」（固定化を目標）オプションにして使用して、一級アミン基を介してセンサーチップCM5の表面1および2に共有結合的に結合した。標的固定化5000  RUを指定した。ウィザードでは、100  mM  NHS（N-ヒドロキシスクシンイミド）および400  mM  EDC（1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）-カルボジイミド）の1:1混合物の7分間の活性化を使用して、望ましいレベルを達成するために複数パルスでリガンドが注入して、その後、エタノールアミンの7分間のパルスにより、残りの表面を非活性化させる。
【０１５４】
抗PCSK9  Fabを取り込み表面2に取り込み、また表面1をFab:PCSK9相互作用の動態学的研究用の基準として使用した。それぞれのFabを、反応についてR最大値100〜150  RUに対して標的のRLにいたるまで、500  ng/ml溶液を5または10  μl/minで1〜1.5分間流して取り込んだ。5〜10のhPCSK9v5HisまたはmPCSK9v5His抗原の濃縮物を、表面全体に30  μl/minで3〜4分間流した。15〜60分の解離時間を許容した後、10  mMグリシンpH  2.0の30秒のパルスで抗Fab表面を再生した。
【０１５５】
各Fabを用いて分析したPCSK9抗原の複数の濃縮物からのセンソグラムをBiaEvaluationソフトウェアを使用して評価し、Fab:PCSK9相互作用の動態学的定数を予測した。
【０１５６】
動態学的定数は以下のとおり決定した。
【０１５７】
【表２】
0005514743.tif 000006
【０１５８】
実施例7
表面プラズモン共鳴（「SPR」）を用いたIgG:PCSK9相互作用の動態学的評価
Biacore（商標）（Pharmacia  Biosensor  AB、スウェーデン、ウプサラ）2000システムを使用してSPR測定を実施した。固定化用のセンサーチップCM5およびアミン・カプリング・キットはBiacore（商標）製である。
【０１５９】
ヤギ抗ヒトIgG（ヒト特異的）（Caltag、カタログ番号H10700）を、Biacore（商標）アミン・カプリング・キット（カタログ番号BR-1000-50）を用い、固定化ウィザードを「Aim  for  immobilization」（固定化を目標）オプションにして使用して、一級アミン基を介してセンサーチップCM5の表面1および2に共有結合的に結合した。標的固定化5000  RUを指定した。ウィザードでは、100  mM  NHS（N-ヒドロキシスクシンイミド）および400  mM  EDC（1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）-カルボジイミド）の1:1混合物の7分間の活性化を使用して、望ましいレベルを達成するために複数パルスでリガンドを注入し、その後、エタノールアミンの7分間のパルスにより、残りの表面を非活性化させる。
【０１６０】
抗PCSK9  IgGを取り込み表面2に取り込み、また表面1はIgG:PCSK9相互作用の動態学的研究用の基準として使用した。IgGを、反応についてR最大値100〜150  RUに対して標的のRLにいたるまで、10  nM  溶液を10  μl/minで1〜1.5分間流して取り込んだ。5〜10のhPCSK9v5HisまたはmPCSK9v5His抗原の濃縮物を、表面全体に30または60  μl/minで4分間流した。15〜60分の解離時間を許容した後、10  mMグリシンpH  1.7の60秒のパルスで抗IgG表面を再生した。
【０１６１】
各IgGを用いて分析したPCSK9抗原の複数の濃縮物からのセンソグラムを、BiaEvaluationソフトウェアを使用して評価し、IgG:PCSK9相互作用の動態学的定数を予測した。
【０１６２】
動態学的定数は以下のとおり決定した。
【０１６３】
【表３】
0005514743.tif 000007
【０１６４】
実施例8
1B20についてのPCSK9-LDLR  TR-FRET試験法
この試験法は、Fisher  et  al.,  2007  J.  Biol.  Chem.  282:20502-20512に記載のあるものの変形である。AlexaFluor647-標識化したPCSK9（最終濃度  10  nM）を可変量の1B20と組み合わせ、これに、96ウェルのブラックDynatech  Uボトムプレートを用いて、Eu（8044）-標識化したLDLR外部ドメインを最終濃度〜4  nM（Rubystar上でFl620  nMで〜20,000カウントを得るために十分な量）になるまで加えた（10  mM  HEPES（pH  7.4）、150  mM  NaCl、0.1  mM  CaCl2、0.05％（w/v）BSA中、合計体積50  μL）。少なくとも90分の平衡状態の後、ウェル当たり20回のフラッシュ、50  usecの取り込み遅延、および200  usec合計取り込み時間を使用して、試料をRubystarリーダー（BMG  Corp.）で読み取った。データは（Fl665／Fl620  x  10000）の比として表し、1B20についてのIC50を標準的な4個のパラメータフィットを使用して、シグモイド用量-反応曲線の反曲点から決定した。
【０１６５】
図2は、PCSK9-LDLR相互作用TR-FRET試験法での1B20の活性を図示する。1B20のFabおよびIgGはどちらも強力で、相互作用を完全に抑制する。
【０１６６】
実施例9
EXOPOLAR試験法：細胞LDL取り込みに対する外来性PCSK9の効果
1日目に、96ウェルpolyD-リジン被覆プレートに30,000  HEK細胞／ウェルを平板固定した。2日目に、培養液を血清を含まないDMEM培養液と交換した。3日目に培養液を除去し、細胞をOptiMEMで洗浄した。精製したPCSK9をLPDSおよびジ-LDLを含む100  μlのDMEM培養液に加えた。プレートを37℃で6.5時間培養した。細胞を2  mg/ml  BSAを含むTBS中で素早く洗浄してから、TBS-BSAで2分間洗浄し、その後、TBSで2回（ただし素早く）洗浄した。細胞を100  μl  RIPA緩衝液中で溶解させた。次に、Ex  520、Em  580  nmを使用して、プレートにおいて蛍光性を測定した。各ウェルにおける合計細胞タンパク質を、BCAタンパク質試験法を使用して測定した後、蛍光単位を総タンパクに正規化した。
【０１６７】
Exopolar試験法は、LDL取り込みに対する変異体の効果の特徴付けに効果的である。Exopolar試験法でPCSK9突然変異体の作用強度が血漿LDL-コレステロールとどう相関するかを図示した下記の表4を参照。
【０１６８】
【表４】
0005514743.tif 000008
【０１６９】
結果:1B20（FabおよびIgGの両方）は、ヒトおよびマウスの両方のPCSK9のLDL取り込みに対する効果を用量依存的に阻害し、その効果は再現可能な形で観察された。細胞に加えたPCSK9の量は、〜60〜320  nMであった。
【０１７０】
1B20（Fab）は、配列番号：1（配列番号：27のVLを含む）の軽鎖と、リンカーおよびタグを含む配列番号：9のFd  鎖（配列番号：11のVH）を含む。
【０１７１】
1B20（IgG）は、配列番号：26の軽鎖と、配列番号：25を含む重鎖を含む。
【０１７２】
図3A〜3Dは、（i）1B20（Fab）のマウスPCSK9依存的細胞LDL取り込みの損失に対する用量依存的阻害（図3A）、（ii）1B20（Fab）のヒトPCSK9依存的細胞LDL取り込みの損失に対する用量依存的阻害（図3B）、（iii）1B20（IgG）のマウスPCSK9依存的細胞LDL取り込みの損失に対する用量依存的阻害（図3C）、および（iv）1B20（IgG）のヒトPSCK9依存的細胞LDL取り込みの損失に対する用量依存的阻害（図3D）を図示する。
【０１７３】
1B20は、ヒトおよびマウスのPCSK9の両方と明らかに交差反応する。図3A〜3Dには、（i）細胞LDL取り込みの基礎レベルを示す細胞のみの対照、および（ii）PCSK9依存的LDL取り込みの損失レベルを示すPCSK9（5  μg/ml）対照の2つの対照がある。1B20およびPCSK9が含まれる滴定実験は、一定の濃度のPCSK9（5  μg/ml）、およびグラフに示すとおり次第に増える濃度の1B20で実施した。
【０１７４】
1B20は、細胞LDL取り込みに対するPCSK9の効果を阻害しうる。1B20（Fab）についてのIC50は、マウスおよびヒトのPCSK9タンパク質についてそれぞれ152  nM（n=5）および145  nM（n=5）である。1B20（IgG）についてのIC50は、マウスおよびヒトのPCSK9タンパク質についてそれぞれ13  nMおよび22  nMである。
【０１７５】
実施例10
PCSK9細胞取り込み
以下の試験法を、Fisher  et  al.,  2007  J.  Biol.  Chem.  282：20502-12の方法により実施した。
【０１７６】
Alexa  Fluor  647-標識化したPCSK9で処理した細胞を下記のとおり画像処理した。CHO細胞を、ポリ-D-リジン-被覆した96ウェル光学CVG滅菌ブラックプレート（Nunc）に密度20,000細胞／ウェルで平板固定した。細胞は、100単位のペニシリンおよび100  μg/mlのストレプトマイシン硫酸塩を含み、10％  FBSで補充したF-12K培養液（栄養混合物、Kaighnの改変（1x））（Invitrogen）に平板固定した。プレートを37℃および5％  CO2で一晩培養した。翌朝、培養液を除去し、100単位のペニシリンおよび100  μg/mlのストレプトマイシン硫酸塩を含む100  μlのF-12K培養液で置き換えた。18時間後、培養液を除去した。精製したPCSK9タンパク質を「実験手順」の項に記載されたとおり、Alexa  Fluor  647で標識化した。Alexa  Fluor  647-標識化されたPCSK9（1、5、または20  μg/ml）を、10％リポタンパク質欠損の血清を含む50  μlのF-12K培養液にいれて、細胞に加えた。プレートを37℃で4時間培養し、細胞を画像処理の前にトリス緩衝化した生理食塩水で素早く洗浄した。細胞核を標識化するために、最終濃度0.1  μg/mlでHoechst  33342を各ウェルに加えた。プレートを×40水浸対物レンズを備えたOperaイメージャー（Evotec  Technologies  GmbH、ドイツ、ハンブルグ）にかけた。蛍光核について励起波長405  nm、およびAlexa  Fluor  647-標識化されたPCSK9について635  nmを使用して、画像を取り込んだ。各ウェルについて、＞500個の細胞が含まれる個別の11のフィールドを2種の発光波長について取り込んだ。Acapella言語（Evotec  Technologies  GmbH）を用いて記述された特注アルゴリズムでデータを分析した。アルゴリズムにより個別の細胞の核および細胞質の領域を同定して標識した後、細胞の合計細胞質強度を測定した。強度は、任意蛍光単位で表現した。
【０１７７】
1B20  Abの試験では、HEK293細胞について同一の手続きを使用した。
【０１７８】
結果：図4は、1B20（IgG）によるPCSK9インターナリゼーションの阻害を図示する。
【０１７９】
実施例11
インビボ試験法
ヒト1B20の完全なIgGをマウスにおいてインビボで試験し、LDLコレステロールレベルの変化を監視した。これらの研究で使用したマウスは、ヒトCETP（これはマウスでは欠損）の導入遺伝子（Tg）発現、並びにLDL受容体（tm1）の分裂についてヘミ接合性である（B6  x  B6-Tg（CETP）Ldlrtm1）F1マウスである。これらのマウスは、そのヒトに似たリピドプロフィールおよびLDLが豊富な性質から、特に有用である。
【０１８０】
各マウスについて2回出血させ、1度目はLDLコレステロールの個別のベースラインレベルを確立するために研究開始時（「pre」）に、2度目は処理後にLDLレベルに発生した変化を評価するために3時間後（「post」）に出血させた。各マウスは、媒体管理として3時間の過程中に、DulbeccoのPBS、1B20  IgG（0.5  mg）、または1B20  Fab断片（0.5  mg）の2回にわたるIV投与を受けた。The  1B20の完全IgGを230,000  x  gで遠心分離し、注射の直前に凝集体を除去した。
【０１８１】
図5では、一組の結合シンボルおよびLDL（postbleed  -  prebleed）の変化で表示されるそれぞれのマウスについてのLDLレベルは、各治療群についての平均として示してある（Δmg／dL）。PBSでの治療は、LDL測定に全く効果がない（-4  mg／dL、5％減少）。対照的に、血清LDLは、1B20の完全IgGで20％減少した（-19  mg／dL）。
【０１８２】
実施例12
1B20アカゲザルPK／PD研究
1B20の薬物動態、薬力学および標的の関与（target  engagement）を特徴付けるために、オスのアカゲザルでそれぞれ1、3および10  mg／kg（3.8〜9.6kg、群当たりn=3）で単回用量IV研究を実施した。この研究で使用した全てのアカゲザルは、生物製剤で未処置であった。
【０１８３】
サルに、橈側皮静脈または伏在静脈を介して1B20のIVボーラス投与をした。伏在／大腿血管から投薬後の計画した時点で血液試料を採取し、その結果得られた血漿／血清を分析まで-70℃で貯蔵した。
【０１８４】
1B20の投薬用溶液は、100mMのヒスチジン、100mMのアルギニン、6％ショ糖、pH  6.0に対して、10  mg/ｍL（1mg／kg用量について）または37.1  mg/ｍL（3および10mg／kg用量）で調製した。投薬用溶液は、4℃で貯蔵し、投薬中はウェットアイスで保冷した。
【０１８５】
血清試料のリポタンパク質分析を下記のとおりに実施した。市販の試薬を使用した抗ヒトIgG  ELISAを使用して、1B20レベルを数量化した。
【０１８６】
図7に示すとおり、1B20は、試験した3つ全ての用量でLDL-Cを≧  50％低下させ、また≧  8日で≧  25％のLDL-C低下が観察された。1B20のt1／2（図8）は、39時間であった。
【０１８７】
実施例13
1B20  アカゲザルPK／PD研究からの血漿／血清試料のリポタンパク質分析
リポタンパク質プロフィールを作成するために、血漿または血清をSuperose-6サイズ排除カラム（GE  LifeSciences,  Inc.）でのクロマトグラフィーにより分画した。カラム流出液中の総コレステロールレベルを、市販の酵素による比色分析コレステロール検出試薬（Total  Cholesterol  E、Wako  USA）を用いてインライン混合により連続的に測定した後、下流で反応生成物の分光光度検出を600nmの吸光度で実施した。カラムから溶出したコレステロールの最初のピークは、VLDL、第二のピークはLDL、および第三のピークはHDLによるもので、各ピークの下の面積は、HPLCとともに提供されたソフトウェアを用いて計算した。リポタンパク質の各部についてのコレステロール濃度を計算するために、対応するピーク面積の合計面積に対する比に、試料において測定された総コレステロール濃度をかけた。
【０１８８】
実施例14
製剤
限定されないものの、mAb1（配列番号：26を含む軽鎖および配列番号：25を含む重鎖を含む）を含む、異なる治療標的に向けられたモノクローナル抗体を、適切な製剤に透析して、標的濃度（50、100、125または150  mg/ｍL）に濃縮した。次に大量の溶液を、安定性研究用の3  ｍLのガラス製バイアルに分配した。液体形態で実施された研究は、2〜8℃、25℃および37℃で直ちに安定状態に置いた。凍結乾燥した試料は、実験室規模の凍結乾燥器で凍結乾燥し、その結果生じる凍結乾燥ケーキを液体試料と同じ温度で安定性ステーションに置いた。
【０１８９】
分析方法には、凝集および断片化を測定するサイズ排除クロマトグラフィー（SEC-HPLC）、濃縮した試料の粒子サイズを測定する動的光散乱（DLS）、断片化を測定する毛細管SDS-PAGEおよび酸性変異体の生成を測定するキャピラリー等電点電気泳動（cIEF）を含む。
【０１９０】
mAb1（上記で言及したPCSK9特異的拮抗薬）、並びにmAb2、mAb3およびmAb4のもの（代替的抗体、そのうち2つは本書で開示したIgG2m4フレームワークにあり、そのうち1つはIgG1であり、どれもが明確な標的に対して特異的である）の液体安定性は、3％のショ糖、50  mMのヒスチジン、50  mMのアルギニン、pH  6.0または6％のショ糖、100  mMのヒスチジン、100  mMのアルギニン、pH  6.0のいずれかの製剤中に保存したときに、試験したその他の製剤、例えば塩化ナトリウム、ホスフェートまたは異なる低濃度のショ糖、ヒスチジンおよびアルギニンを含む製剤と比較して改善された。mAb2およびmAb3（mAb1は未試験）の凍結乾燥時の安定性は、凍結乾燥前の3％のショ糖、50  mMのヒスチジン、50  mMのアルギニン、pH6.0の製剤中に貯蔵したときに改善され、また元の体積の0.5倍（0.5  ml；0.5  X  元の濃度1  ml）に戻して再生した後でも安定性が保たれ、およそ6％のショ糖、100  mMのヒスチジン、100  mMのアルギニン、pH  6.0および2倍のタンパク質濃度の製剤を生じた。
【０１９１】
mAb2およびmAb3（mAb1は未試験）の凍結乾燥時の安定性は、3％のショ糖、50  mMのヒスチジン、50  mMのアルギニン、pH  6.0を含む凍結乾燥した製剤形態中に貯蔵したときに改善された。次に、凍結乾燥した試料を元の体積の半分の水で戻したら、6％のショ糖、10  mMのヒスチジン、100  mMのアルギニン、pH  6.0およびタンパク質濃度100  mg/ｍLの製剤を生じた。試験した全てのmAbについて、凝集および断片化の両方が、液体および凍結乾燥した製剤において抑制された。
【０１９２】
下記の表5に図示したとおり、45℃で1カ月の貯蔵後のmAb1の外観は、3／50／50および6／100／100の製剤で透明であった。3／100／0および2／25／25はわずかに混濁した。試験したその他の製剤では混濁した。外観の混濁は、可視的な凝集体が形成しているか、溶液が2相に分離し始めていることを示し得る。
【０１９３】
【表５】
0005514743.tif 000009
【０１９４】
pH  5.0で、またヒスチジン／NaCl製剤でmAb1のクリッピングの増加が観察された（表6）。
【０１９５】
【表６】
0005514743.tif 000010
【０１９６】
37℃でのmAb1の凝集速度は、3％のショ糖、50  mMのヒスチジン、50  mMのアルギニン、pH  6.0または6％のショ糖、100  mMのヒスチジン、100  mMのアルギニン、pH  6.0の液体製剤中に貯蔵したときに遅くなった（図9を参照）。
【０１９７】
ヒスチジン／NaCl粒子サイズ中のmAb1の粒子サイズは、ショ糖、ヒスチジンおよびアルギニンの組み合わせを含むどの製剤よりもずっと早く増大した。これは、タンパク質が自己会合しつつあること、および／または凝集体が形成されつつあることを示す（図10を参照）。
【０１９８】
25℃、50  mg/ｍLで6カ月貯蔵した後、mAb2は、3％のショ糖、50  mMのヒスチジン、50  mMのアルギニン（3／50／50）の製剤中に貯蔵したとき、試験したその他の製剤よりも含まれている凝集が最も少なかった（図11を参照）。25℃で同じ時間経過後、3％のショ糖、50  mMのヒスチジン、50  mMのアルギニン、pH  6.0（3／50／50）および6％のショ糖、100  mMのヒスチジン、100  mMのアルギニン、pH  6.0（6／100／100）中のmAb2の凝集レベルは同一であった（図12を参照）。
【０１９９】
mAb2は、3％のショ糖、50  mMのヒスチジン、50  mMのアルギニン、pH  6.0中、50  mg/ｍL、100  mg/ｍLおよび150  mg/ｍLで、25℃で最高6カ月間、安定していた（図13を参照）。
【０２００】
mAb3は、3／50／50および6／100／100中で、50  mg/ｍL、25℃で、6カ月間安定していた。これらの製剤および2／25／25では、試験したその他の液体製剤よりも観察された凝集体は少なかった（図14を参照）。
3／50／50で濃度を上げると、mAb3の凝集の増加が観察されたが、25℃での増加率は最小限であった（図15を参照）。
【０２０１】
試験したその他の製剤と比べて、3／50／50または2／25／25の製剤中で25℃で12カ月貯蔵した後、mAb4で観察された凝集は最小限であった（図16および17を参照）。
【０２０２】
3％のショ糖、50  mMのヒスチジン、50  mMのアルギニン、pH  6.0の凍結乾燥した製剤では、25℃でmAb2（図18）でもmAb3（図19）でも凝集は観察されなかった。試験したその他の製剤では、凝集は著しく増加した。
【０２０３】
実施例15
変異体
突然変異体1B20の配列を設計し、ライブラリを作製し、1B20誘導体について選別した。ライブラリ最適化は、一般的に米国特許第7,117,096号に従って実行した。次にライブラリを選別し、パニングして、PCSK9-結合を持つ変異体を同定した。抗PCSK9抗体分子を同定し、本書に配列番号：45〜96として開示した。次の表は、抗体により得られたBiacore（登録商標）分析によるKdデータをまとめたものである。
【０２０４】
【表７】
0005514743.tif 000011
さらなる部位特異的1B20の突然変異体を生成し（重鎖内の突然変異）、本書では配列番号：102〜107として開示している。1B20  Fabの部位特異的突然変異体のKdは、Bio-Rad  ProteOnを使用して、ヒトPCSK9-V5-Hisに対して測定される親和性を用いて決定した。Fab親和性の測定方法は、Biacore（登録商標）について前期の方法と本質的に同じである。
【０２０５】
【表８】
0005514743.tif 000012
【図１】
0005514743.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0005514743.tif 000019
【図８】
0005514743.tif 000020
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
0005514743.tif 000023
【図１２】
0005514743.tif 000024
【図１３】
0005514743.tif 000025
【図１４】
0005514743.tif 000026
【図１５】
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【図１６】
0005514743.tif 000028
【図１７】
0005514743.tif 000029
【図１８】
0005514743.tif 000030
【図１９】
0005514743.tif 000031
【配列表】
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