(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｅ）：
（ａ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列；または
（ｂ）配列番号１の相補体であるヌクレオチド配列；または
（ｃ）配列番号１が縮重したヌクレオチド配列；または
（ｄ）配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つの一部
を含む核酸分子であって、
前記一部は、
（ｉ）配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４、２６，２８，３０，３２，３４，３６，３８，４０，４２もしくは４４のいずれか１つで示されるヌクレオチド配列；または該配列と相補的であるヌクレオチド配列、もしくは、該配列が縮重したヌクレオチド配列；あるいは該配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列か、
（ｉｉ）配列番号３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，２７，２９，３１，３３，３５，３７，３９，４１，４３もしくは４５から選択される１以上のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；または該ヌクレオチド配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、を含み、
１以上のポリペプチドをコードする核酸分子をコードするか、もしくは、１以上のポリペプチドをコードする核酸分子と相補的であり、当該核酸分子はポリケチドをベースとした分子またはマクロラクタム分子を合成するＮＲＰＳ−ＰＫＳ生合成系をコードするものであり；または
１以上の遺伝因子を含む核酸分子を含むか、もしくは、１以上の遺伝因子を含む核酸分子と相補的であり、
ポリケチドをベースとした分子またはマクロラクタム[macrolactam]分子の合成に機能的な活性を有する、核酸分子。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸分子でコードされるポリペプチドであって、下記（ａ），（ｂ）：
（ａ）配列番号３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，２７，２９，３１，３３，３５，３７，３９，４１，４３もしくは４５のいずれか１つ以上で示されるアミノ酸配列の全部；
あるいは
（ｂ）配列番号３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，２７，２９，３１，３３，３５，３７，３９，４１，４３もしくは４５のいずれか１つ以上と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列の全部
を含むポリペプチド。
【請求項３】
修飾されたＢＥ−１４１０６分子を調製するための、修飾されたＢＥ−１４１０６生合成遺伝子群の調製における請求項１に記載の核酸分子の使用。
【請求項４】
修飾されたＢＥ−１４１０６のＮＲＰＳ−ＰＫＳ系をコードする核酸分子の調製方法であって、
該ＢＥ−１４１０６のＮＲＰＳ−ＰＫＳ系をコードする請求項１に記載の核酸分子を修飾することを含む、方法。
【請求項５】
上記核酸分子が、該核酸分子にコードされた１以上の活性またはタンパク質をコードする配列を、導入すること，突然変異すること，欠失すること，置換すること，または失活することによって修飾される請求項４に記載の方法。
【請求項６】
配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，３２，３４，３６，３８，４０，４２もしくは４４のいずれか１つで示されるヌクレオチド配列；または
該配列と相補的であるヌクレオチド配列、もしくは、該配列が縮重したヌクレオチド配列；あるいは
該配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
から選択される１以上のヌクレオチド配列が修飾される請求項４または請求項５に記載の方法。
【請求項７】
上記核酸分子が、下記（ｉ）〜（ｖｉｉ）：
（ｉ）ＰＫＳをコードする配列の修飾であって、ローディングモジュールのドメインを修飾することで、スターターユニットの特徴を変更する；
（ｉｉ）ＰＫＳをコードする配列の修飾であって、モジュール数を変更する（好ましくは、モジュール数を減少する）；
（ｉｉｉ）ＰＫＳをコードする配列の修飾であって、ＡＴドメインを修飾することで、伸長ユニットに対するその特異性を変更する；
（ｉｖ）ＰＫＳをコードする配列の修飾であって、デヒドラターゼ（ＤＨ）ドメインまたはケトレダクターゼ（ＫＲ）ドメインの活性を変更する；
（ｖ）ヒドロキシラーゼをコードする配列（ｂｅｃＯ；配列番号２６）の修飾であって、ヒドロキシラーゼ酵素を失活するか、またはその特異性を変更する；
（ｖｉ）ＰＫＳをコードする配列の欠失、またはＰＫＳをコードする配列の修飾であって、このコードされたＰＫＳ酵素を失活する；
（ｖｉｉ）グリコシル化酵素をコードするヌクレオチド配列の導入
のやり方の１以上を用いて修飾される請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
上記ＤＨドメインまたはＫＲドメインの活性を変更する修飾が、ＤＨドメインまたはＫＲドメインを失活または欠失するものである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
上記核酸分子に対する上記修飾が、下記（ｉ）〜（ｖ）：
（ｉ）表３に記載の、ＤＨドメインをコードするヌクレオチド配列の欠失または失活；
（ｉｉ）表４に記載の、ＫＲドメインをコードするヌクレオチド配列の欠失または失活；
（ｉｉｉ）ｂｅｃＡ（配列番号５）またはそのモジュールの欠失または失活；
（ｉｖ）表２に記載のヌクレオチドの位置で定義される、ＢｅｃＢ，ＢｅｃＤ，ＢｅｃＥ，ＢｅｃＦもしくはＢｅｃＧのモジュールをコードする１以上のヌクレオチド配列の欠失または失活；
（ｖ）ｂｅｃＯ（配列番号２６）の欠失または失活
の１以上を含む請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
上記核酸分子が、ＢＥ−１４１０６またはその誘導体を産生する微生物に内在的に存在し、
該微生物中で実施される請求項４〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
上記微生物が、ＢＥ−１４１０６またはその誘導体を産生する、２００８年１月２５日にＤＳＭＺに寄託したストレプトミセス種（寄託番号ＤＳＭ２１０６９）またはその突然変異株もしくはその修飾株であり、当該菌株は、配列番号４６で示される１６Ｓ  ＲＮＡ遺伝子配列を含むものである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項４〜１１のいずれか１項に従って得られる修飾核酸分子を微生物中で発現させることを含む、修飾されたＢＥ−１４１０６のＮＲＰＳ−ＰＫＳ系の調製方法。
【請求項１３】
請求項４〜１１のいずれか１項に従って得られる修飾された核酸分子を微生物中で発現させることを含む、ポリケチドをベースとした分子またはマクロラクタム分子の調製方法。
【請求項１４】
さらに、上記のポリケチドをベースとした分子またはマクロラクタム分子を回収することを含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項４〜１１のいずれか１項に従って得られる修飾された核酸分子を含む微生物。
【請求項１６】
ＢＥ−１４１０６またはその誘導体を産生する、ＤＳＭＺに寄託したストレプトミセスの菌株（寄託番号ＤＳＭ２１０６９）またはその突然変異株もしくはその修飾株であって、配列番号４６で示される１６Ｓ  ＲＮＡ遺伝子配列を含む菌株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリケチドのマクロラクタムであるＢＥ−１４１０６を合成する生合成機構をコードする遺伝子群のクローニングおよびシークエンシングに関し、この生合成機構は、非リボソーム性ペプチドシンセターゼ酵素（ＮＲＰＳ）アデニル化ドメインとモジュール型のポリケチド生合成酵素または酵素複合体（ＰＫＳ；ポリケチドシンターゼ酵素もしくは酵素複合体）との両方を含む。生合成機構には、このようにＮＲＰＳ−ＰＫＳハイブリッド酵素系が含まれる。従って、本発明は、マクロラクタムであるＢＥ−１４１０６を合成する生合成機構をコードする新規な遺伝子および核酸分子に関し、この生合成機構は、ＢＥ−１４１０６の生合成に関与するモジュール型のＮＲＰＳ−ポリケチド生合成酵素または酵素系を含み、モジュール型のＮＲＰＳ−ポリケチドシンターゼ酵素系または複合体それ自体（その成分も同様）を含む。本発明は、さらに、ＢＥ−１４１０６生合成の促進と、ＢＥ−１４１０６誘導体および新規なマクロラクタム構造物の合成との両方における、これらの遺伝子，核酸分子，このような機構，酵素および酵素系またはその複合体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリケチドまたはポリケチドをベースとした構造物もしくはポリケチドに関連した構造物は、細菌，菌類，植物および動物に合成される天然物であるか、あるいはその天然物のベースを形成するものであり、その多くが、例えば、抗生物質，抗菌類，細胞分裂阻害薬，コレステロール低下薬[anticholesterolemics]，駆虫薬，抗コクシジウム薬[coccidiostatic]，動物の成長促進剤および天然殺虫剤など、医薬として、または農薬もしくは動物薬として利用する可能性があるものである。
【０００３】
グラム陽性菌であるストレプトミセス属[Streptomyces]は、ポリケチドおよびポリケチドをベースとした分子の主要生産者であり、これら微生物におけるポリケチド生合成は、遺伝学および生化学によって比較的よく特徴付けられている（McDaniel R.ら; Chem Rev. 2005 Feb;105(2):543-58）。
【０００４】
他の生産者として、他の放線菌類が挙げられる。種々の広範なポリケチドをベースとした分子（またはポリケチドに関連した分子）は公知であり、マクロラクタムはこれら分子の１つのクラスを表す。マクロラクタムであるビセニスタチンおよびサリニラクタム[salinilactam]を合成する生合成遺伝子群は、それぞれOgasawara Y.ら; Chem Biol. 2004 Jan; 11(1):79-98、およびUdwaryら; Proc Natl Acad Sci USA 2007 Jun 19; 104(25):10376-81に報告されている。
【０００５】
ＢＥ−１４１０６（代替名はＧＴ−３２Ａ）は、図１に示す化学構造を有するマクロラクタム抗生物質である。ＢＥ−１４１０６は、ストレプトミセス・スフェロイド[Streptomyces spheroides]の菌株から単離され、広範な試験生物に対する抗菌作用やＨ−ラスで形質転換されたＢＡＬＢ３Ｔ３株化細胞に対する増殖抑制作用および混合リンパ球反応に対する阻害作用と同様に、白血病細胞株に対する細胞傷害効果を有することが示されている（JP4001179；Kojiriら 1992 Journal of Antibiotics, 868-74；Takahashiら 1997, Journal of Antibiotics 186-8）。８−デオキシ類似体（ＧＴ−３２Ｂ）も、詳細不明であるがストレプトミセス種から単離され、ＢＥ−１４１０６の活性の多くを共有していることが示されている（Takahashiら, 上記を参照）。
【０００６】
ＢＥ−１４１０６のようなマクロラクタム化合物は、活性化されたアミノ酸を用いたＰＫＳ系の活性化およびプライミング，ならびにポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）によって単純なカルボン酸の縮合を繰り返すことによるアミノ酸残基（アミノアシル鎖）の伸長を通して、脂肪酸生合成と似たやり方で形成することができる。従って、「スターターユニット」がカルボン酸残基である、単純なポリケチド鎖についてのケースとは異なり、このケースでは、ＰＫＳのスターターユニットが、アミノ酸およびアシル鎖から合成されたアミノアシル中間体である。周期的にドメインを再利用する反復型ＰＫＳとして、または、一連の独立したモジュール（または繰り返しユニット）を含み、ドメインを再利用しないモジュール型（Ｉ型）ＰＫＳとして、ＰＫＳは体系化できる。各モジュールは、ポリケチド鎖を合成する縮合サイクルの１つに関与し、様々な酵素ドメインを含む。ＢＥ−１４１０６の場合、「ポリケチド」鎖は厳密に言うと、ハイブリッドアミノ酸−ポリケチド鎖（またはアミノアシル鎖）であるが、本明細書では「ポリケチド鎖」と称す。このように、成長するポリケチド鎖に次のカルボン酸を縮合するドメイン（β−ケトアシルシンターゼ（ＫＳ）ドメインによって触媒される）に加えて、Ｉ型ＰＫＳのモジュールは、β−ケトレダクターゼ（ＫＲ）活性，デヒドラターゼ（ＤＨ）活性またはエノイルレダクターゼ（ＥＲ）活性を有するドメインを含んでもよく、これらのドメインによって、取り込まれた伸長ユニットの還元状態が決定される。各モジュールに存在するアシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）ドメインおよびアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）ドメインはそれぞれ、伸長ユニットの選択およびＰＫＳの成長するポリケチド鎖の保持に関与している。合成が完了次第、ポリケチド鎖は、チオエステラーゼ（ＴＥ）の働きによって、ＰＫＳから放出される。このＴＥは最終産物の環化にも関与していると思われる。このように、Ｉ型ＰＫＳは、ポリケチド生合成の組立ラインに相当するものであり、モジュール数（カルボン酸に対するこれらの特異性）を変えることによって、そして還元能を有するドメインを失活させるか、または挿入することによって、組立ラインを操作することができる（Weissman および Leadlay, Nat. Rev. Microbiol. 2005 Dec;3(12):925-36）。ポリケチド部分が、マクロラクトン環（またはマクロラクタム環）を形成するよう合成および環化された後、ポリケチド部分は、ヒドロキシル化，グリコシル化，メチル化および／またはアシル化によって修飾されてもよい。これらの修飾は、ポリケチドがベースとなった特定の産物の生物活性に重要となるかもしれない。以下でさらに詳述するが、本発明に至るまでの研究において、ＢＥ−１４１０６のＮＲＰＳ−ＰＫＳ酵素系をコードする遺伝子（ＢＥ−１４０１６「遺伝子群」）をクローン化し、シークエンシングして、そしてこのＢＥ−１４１０６のＮＲＰＳ−ＰＫＳ酵素系がいくつかのＩ型ＰＫＳを含み（それぞれモジュール式で体系化される）、繰り返しユニット（モジュール）で構成されていることを究明した。
【０００７】
ストレプトミセスにおいてポリケチドを生合成する遺伝子は通常、いくつもの群れをなして体系化され、このような群れの多くは既に同定されており、様々な天然物の生合成に関与している。ストレプトミセスのいくつかのマクロライド系抗生物質（アベルメクチン，ピクロマイシンおよびラパマイシンが挙げられる）遺伝子群の分子クローニングおよび完全なＤＮＡシークエンシングは文書化されている（Ikeda H., Omura S. (2002). Biosynthesis, Regulation , and Genetics of Macrolide Production. In: Macrolide Antibiotics: Chemistry, Biology and Practice, 2nd Ed. (ed. S. Omura), pp. 286-326, アカデミックプレス社, ニューヨーク）。上記のとおり、特定のマクロラクタム抗生物質の生物系のための遺伝子群も報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】JP4001179
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】McDaniel R.ら; Chem Rev. 2005 Feb;105(2):543-58
【非特許文献２】Ogasawara Y.ら; Chem Biol. 2004 Jan; 11(1):79-98
【非特許文献３】Udwaryら; Proc Natl Acad Sci USA 2007 Jun 19; 104(25):10376-81
【非特許文献４】Kojiriら 1992 Journal of Antibiotics, 868-74
【非特許文献５】Takahashiら 1997, Journal of Antibiotics 186-8
【非特許文献６】WeissmanおよびLeadlay, Nat. Rev. Microbiol. 2005 Dec;3(12):925-36
【非特許文献７】Ikeda H., Omura S. (2002). Biosynthesis, Regulation , and Genetics of Macrolide Production. In: Macrolide Antibiotics: Chemistry, Biology and Practice, 2nd Ed. (ed. S. Omura), pp. 286-326, アカデミックプレス社, ニューヨーク
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記のように（下記にもあるが）、本発明は、これまで利用されていなかったＢＥ−１４１０６を生合成する新規な遺伝子群の同定，クローニングおよびシークエンシングに基づく。さらに、クローン化された遺伝子を解析することで、ＢＥ−１４１０６の生合成経路を解明することができた。従って、ＢＥ−１４１０６の通常の生合成工程が、アシル部分がプロプリオナート[proprionate]１個およびアセテート２個のユニットから合成される、スターターユニット（Ｃ１７〜Ｃ２５）の合成から開始されることがここに提唱される。スターターユニットの合成は、ＮＲＰＳアデニル化ドメインによるグリシン分子の活性化と、この活性化グリシンのペプチジルキャリアタンパク質へのローディングによって続けられる。グリシンが酸化的脱アミノ化されるとアンモニウムが放出される。これは、Ｃ−１７カルボニル基への求核攻撃を起こしてＣ−１７イミノ基が形成され、このＣ−１７イミノ基はその後アミノ基まで還元される。ペプチジルキャリアタンパク質からアミノアシル鎖が解放された結果、カルボン酸が形成され、その後アデニル化され、コエンザイムＡ（ＣｏＡ）に結合する。このように活性化されたアミノアシル−ＣｏＡは、アシルトランスフェラーゼによってＰＫＳのＡＣＰドメインに運搬され、以下でさらに詳述するようなＰＫＳ系酵素の一連の作用によって伸長され、修飾される。各モジュールのβ−ケトアシルシンターゼ（ＫＳ）酵素ドメインは、アシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）モジュールによって決められた適切なカルボン酸（例えば、アセテートやプロピオネート）の縮合を触媒する。β−ケトレダクターゼ（ＫＲ）活性またはデヒドラターゼ（ＤＨ）活性を有する酵素ドメインは、取り込まれた伸長ユニットの還元状態を決定する。
【００１１】
ＢＥ−１４１０６のＣ２０〜Ｃ２５炭化水素側鎖は、スターターユニットの一部から構成され、マクロラクタム環の環化に起因する。最後に、マクロラクタム環がヒドロキシル化によってさらに修飾される。
【００１２】
ＢＥ−１４１０６の生合成遺伝子群には、様々な調節因子および合成された分子を運搬するタンパク質もコードされているか、または含まれている。
【００１３】
このような化合物の化学合成は高度に複雑であるから、実際には、生合成経路を用いる必要があり、従って、適切な宿主からこれら化合物を単離または精製することが望ましい。このことは、当該分野で認識されているように、生合成を変化させて、それによって新規のもしくは修飾されたポリケチドまたはポリケチドがベースとなった化合物を合成させるために、ＰＫＳ遺伝子群の遺伝子を操作する機会が生じる。様々な新規化合物の合成をもたらす多くのＰＫＳ遺伝子群の修飾が記載されているが、利用可能な化合物（特に抗生物質）のレパートリを増やし、および／または、存在する薬物の特性（例えば、有効性，毒性，水への溶解性など）を向上する必要性ならびに願望は依然存在する。本発明は、これらを目的とし、ＢＥ−１４１０６の生合成遺伝子群のクローニングおよびＤＮＡシークエンシングに基づく。本発明は、ＢＥ−１４１０６の発現レベルもしくは特性および／または産生微生物を修飾するため、あるいは役立つかもしれない新規の化合物を得るための、遺伝子操作するツールとともに、これら抗生物質の生合成遺伝子の最初の配列を提供するものである。この点で、抗生物質であるＢＥ−１４１０６は公知であるが、ストレプトミセスで合成されるポリケチドをベースとした複数の分子および対応する複数の生合成遺伝子群を背景として、ＢＥ−１４１０６のための的確な遺伝子群を同定しクローン化することは容易なことではない；配列解析およびプローブの設計または選択に関して相当な努力および創意工夫を必要とした。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、今まで知られていなかった供給源である細菌の分離株ＭＰ２８−１３からＢＥ−１４１０６を単離し精製した。この分離株は、ノルウェイのトロンヘイムのフィヨルドで浅瀬の沈殿物から単離されたストレプトミセスの新規な株（２００８年１月２５日に、寄託番号ＤＳＭ２１０６９の下、ドイツ微生物・細胞培養コレクション（ＤＳＭＺ）に寄託した）であると考えられた。本発明者らがこの新規な微生物を単離したことによって、ＢＥ−１４１０６のすべての生合成遺伝子群をクローン化しシークエンシングすることが可能となった。この群は、ＢＥ−１４１０６分子の生合成に関与していると推定されるタンパク質をコードする２２個の遺伝子を含む（表１を参照）。
【００１５】
このクローニングを実施するために、ケトシンターゼ（ＫＳ）ドメインの一部をコードする配列に相当し、特別に設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを、分離株であるＭＰ２８−１３からＫＳドメインのコード領域を増幅するために用いた。一旦、増幅された配列が得られ特徴付けられると、複雑で広範囲に及ぶ生物情報分析に基づき、それら配列の１個をプローブとして選択した。このプローブを用いて、ＭＰ２８−１３を構築するゲノムライブラリをスクリーニングした。すべての生合成群を提供するために、このようなやり方で同定されたコスミドを分析し、シークエンシングした。図２Ａおよび２Ｂに示すように、配列すべてに注釈を付け、ＢＥ−１４１０６を生合成する２つの部分経路を解明した。アミノアシル・スターターユニットの生合成経路のうち第一の部分を図２Ａに示し、アミノアシル鎖の伸長，マクロラクタム環の形成をもたらす環化およびＰＫＳ後修飾に係る第二の部分を図２Ｂに示す。このように、モジュールのＰＫＳ後修飾に係る酵素，この経路の調節に係るタンパク質，および抵抗性タンパク質／排出タンパク質とともに、アミノアシル鎖を合成するＰＫＳおよび他の酵素もしくはタンパク質を含む最初の酵素系または複合体、ならびにアミノアシル鎖を伸長する追加のＰＫＳ酵素系または酵素複合体をコードする、ＢＥ−１４１０６を生合成する遺伝子群を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
この配列についての知見に基づき、ストレプトミセス種であるＭＰ２８−１３の遺伝子操作方法を開発した。このようにして、新規配列が実際にＢＥ−１４１０６の生合成に関与していたことを示すことができた。
【００１７】
さらに、下記で詳述するが、同定された新規生合成遺伝子群内の機能的ＤＮＡ配列を操作することによって、例えば、機能または特性が変更された（例えば、向上した）ＢＥ−１４１０６の誘導体または類似体などの新規分子構造物を合成することができる。このように、有益な新規ＢＥ−１４１０６誘導体もしくは類似体を得るだけではなく、生合成の産生工程を向上および促進する（例えば、収量もしくは産生条件を向上する、または利用可能な宿主細胞の範囲を広げる等）、より好ましくは、新しい活性および／または特性を有する新規化合物を提供するよう、ＢＥ−１４１０６遺伝子群を操作することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、マクロラクタム抗生物質であるＢＥ−１４１０６の化学構造を示す。
【図２】図２Ａは、提唱されている、ＢＥ−１４１０６の生合成経路の開始を示し；図２Ｂは、提唱されている、ＢＥ−１４１０６生合成の終了を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
ＢＥ−１４１０６の生合成遺伝子群に係る完全なコード配列（すなわち、ＢＥ−１４１０６の生合成遺伝子群をコードする完全なヌクレオチド配列）を配列番号１に示す。配列番号１は、多くの遺伝子またはＯＲＦを含むことを示し、それらは、ＢＥ−１４１０６生合成に必要とされる活性に関与する様々なタンパク質およびポリペプチドをコードする。
【００２０】
生合成遺伝子群は、ＢＥ−１４１０６の正常な生合成に必要なタンパク質およびポリペプチドのすべてをコードすると考えられる遺伝子およびＯＲＦを含む。しかしながら、コードされるタンパク質およびポリペプチドのすべてがこの生合成での役割を担うわけではないから、コードされるこの群のタンパク質およびポリペプチドのすべてがＢＥ−１４１０６の生合成に必須であるというわけではないかもしれない。様々な遺伝子およびＯＲＦは、１以上の生化学反応を触媒する酵素、または触媒活性がない代わりに他の工程（例えば、ＢＥ−１４１０６合成もしくはＢＥ−１４１０６輸送の工程の調節など）に関与するタンパク質をコードしてもよい。
【００２１】
この酵素のいくつかはポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）であり、これらＰＫＳの多くは酵素複合体を形成するため物理的に結合することができることはあり得るが、このことはまだ立証されていない。このような群または一連の酵素は、本明細書において、ポリケチド生合成酵素系もしくは複合体またはＰＫＳ酵素系もしくは複合体と称されるが、この系／複合体における酵素／タンパク質のすべてが実際のポリケチドシンターゼである必要はない、すなわち、該酵素／タンパク質のすべてがポリケチドシンターゼ活性を有するわけではない；それらがＢＥ−１４１０６合成で他の活性または機能的役割を有していればよい。例えば、非リボソーム性ペプチドシンセターゼ（ＮＲＰＳ）の別のアデニル化ドメイン（ＢｅｃＬ）は、この群にコードされる他の付属タンパク質のいくつか（例えば、ＢｅｃＪ，ＢｅｃＳ，ＢｅｃＵ等）とともに、アミノ酸（グリシンであると推定される）を活性化し、さらなる伸長のためにいくつかのＢＥ−１４１０６のＰＫＳモジュールの１つにローディングすることによって、ＢＥ−１４１０６を生合成するためのスターターユニットの合成に関与する。ＢｅｃＯなどのような他のタンパク質はマクロラクタム環のＣ−８をヒドロキシル化する。このようなＮＲＰＳドメインおよびＰＫＳ酵素を含む群または一連の酵素は、ハイブリッドＮＲＰＳ−ＰＫＳ酵素系または酵素複合体と称することができる。この遺伝子群全体にコードされるタンパク質およびポリペプチドの一群は、ＢＥ−１４１０６を生合成する生合成機構として集合的に称される。
【００２２】
このように、本発明の１つの態様は、下記（ａ）〜（ｅ）：
（ａ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列；または
（ｂ）配列番号１の相補体であるヌクレオチド配列；または
（ｃ）配列番号１が縮重したヌクレオチド配列；または
（ｄ）配列番号１と少なくとも８５％の配列同一性（好ましくは、少なくとも８７％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％もしくは９９％の配列同一性）を有するヌクレオチド配列；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つの一部を含む核酸分子を提供するものであり、該一部は、ＢＥ−１４１０６生合成遺伝子もしくはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に対応する配列、またはそれと相補的な配列もしくはそれが縮重した配列を含むことが好ましい。
【００２３】
より具体的には、このような核酸分子は、１以上のポリペプチドをコードする（もしくはコードするヌクレオチド配列を含む）、または１以上の遺伝因子を含み、ポリケチド分子もしくはマクロラクタム分子の合成（より具体的に、ＢＥ−１４０６もしくはその誘導体、またはＢＥ−１４０６に関連した分子の合成）に機能的な活性を有し、あるいはこのような核酸分子の相補体である。このような機能的な活性は、例えば、ポリケチドまたはマクロラクタム分子の合成または輸送または運搬に関与する活性（これは、ポリケチド鎖もしくはマクロラクタム環の合成またはこれに寄与する任意の段階、あるいはマクロラクタム環またはポリケチド鎖の修飾等であり得る）などの酵素活性であってもよく、および／または、このような機能的な活性は、例えば、上記遺伝子の発現（例えば、転写制御因子）もしくは合成に関与するタンパク質の調節や合成工程の調節などの調節活性であってもよく、および／または、このような機能的な活性は、「輸送体活性」であってもよい。このように、ポリケチド部分またはマクロラクタム部分の運搬または輸送に関与する輸送タンパク質、例えば、合成された分子の細胞内でのもしくは細胞外への輸送または排出に関与する輸送タンパク質も、通常含まれる。
【００２４】
所望する産物をコードするヌクレオチド配列は本発明に従って好ましい一方、プロモータ，プロモータ−オペレータ領域，エンハンサや他の調節配列などの機能的な遺伝因子を含むヌクレオチド配列も包含される。このように、本発明の核酸分子は、すべてのＰＫＳ遺伝子群を含む必要はなく、その部分または一部、例えば、特定の機能または調節配列を有するポリペプチドをコードする一部を含んでいればよい。これは、１以上の遺伝子，および／または調節配列，および／または１以上のモジュールまたは，酵素ドメイン，または非コードもしくはコードする機能的遺伝因子（例えば、遺伝子発現，転写，翻訳などを制御する因子など）を含むことができる。一般的に言えば、本発明の核酸分子は、例えば、ＢＥ−１４１０６誘導体や修飾されたＢＥ−１４１０６分子などの、ポリケチドがベースとなった分子もしくはマクロラクタム分子の合成に導く種々の遺伝子および／または調節配列の多くを含むだろう。
【００２５】
「ＢＥ−１４１０６の生合成遺伝子またはＯＲＦ」を以下でさらに定義するが、上記（ｅ）項に照らして、簡単には、ＢＥ−１４１０６あるいはＢＥ−１４１０６誘導体もしくは類似体またはＢＥ−１４１０６に関連した分子の生合成工程で機能するタンパク質もしくはポリペプチドをコードする遺伝子またはＯＲＦを意味する。上記のように、これは、出発アミノ酸の活性化，活性化アミノ酸／アミノアシル鎖のＰＫＳ酵素への運搬，ポリケチド鎖の生成もしくはその修飾，あるいはこの生合成の任意の段階でこの分子を調節または輸送もしくは運搬するのに必要なタンパク質に関与する酵素であり得るかもしれない。
【００２６】
本発明の核酸分子は、単離された核酸分子であってもよく（換言すれば、通常天然から見出される成分から単離されるか、または分離されてもよく）、組換え核酸分子または合成核酸分子であってもよい。
【００２７】
本明細書中の他でも述べているが、ＢＥ−１４１０６の生合成遺伝子群は、ＢＥ−１４１０６分子あるいはＢＥ−１４１０６誘導体もしくは類似体またはＢＥ−１４１０６に関連した分子の生合成に必要なタンパク質またはペプチドをコードする種々の遺伝因子または種々の遺伝子もしくはＯＲＦを含む大きな核酸分子である。ＢＥ−１４１０６生合成遺伝子またはＯＲＦはそれぞれ、ＢＥ−１４１０６分子あるいはＢＥ−１４１０６誘導体もしくは類似体またはＢＥ−１４１０６に関連した分子の生合成で機能する、またはそう考えられている単一のポリペプチド鎖（代わりにタンパク質とも記載することができる）をコードする。このような遺伝子またはＯＲＦを２２個同定した（表１を参照）。図２Ａおよび２Ｂに示すように、これらのうち１４個は、ＢＥ−１４１０６の生合成に直接的な役割を担う。以下でさらに説明するが、他の特定のものも、ＢＥ−１４１０６生合成に役割を担うと考えられ、提唱されている。このように、例えば、ｂｅｃＨおよびＭは調節因子をコードすると考えられ、ＢｅｃＬはグリシンの活性化に関与すると考えられ、ＢｅｃＵは、ＢｅｃＣのＡＣＰとＢｅｃＳのＰＣＰとのタンパク質相互作用を仲介すると考えられ、ＢｅｃＮは排出および／または抵抗に関与すると考えられ、ＢｅｃＰはマクロラクタム環の環化を援助すると考えられ、ＢｅｃＱは、ＢｅｃＣ−ＢｅｃＵ−ＢｅｃＳ複合体から、開始アミノアシル鎖を解放すると考えられている。
【００２８】
このタンパク質のいくつかは酵素活性を有していることから、酵素であると定義できる。これらの様々な酵素はポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）であると言うことができる。このような酵素は１個または複数個のモジュールを含み、各モジュールは１〜６個、好ましくは２，３，４または５個の酵素ドメインを含んでおり、各酵素ドメインは、ＢＥ−１４１０６分子あるいはＢＥ−１４１０６誘導体もしくは類似体またはＢＥ−１４１０６に関連した分子の生合成での種々の活性に関与している。これらＰＫＳの複数の活性部位それ自体は、単一のポリペプチドまたは酵素に存在することがある。
【００２９】
例えば、酵素であるＢｅｃＢは、ＰＫＳであり、３個のモジュールを有する；モジュール１（図２Ｂ中の「ローディングモジュール」）は、単一の活性部位またはドメイン（ＡＣＰ）を有し、モジュール２および３（図２Ｂ中のＭｏｄｕｌｅ１および２）それぞれは、ＫＳ活性，ＡＴ活性，ＤＨ活性，ＫＲ活性およびＡＣＰ活性を有する５個の活性部位またはドメインを有する。上記遺伝子群にコードされる他のＰＫＳは、ＢｅｃＡ，ＢｅｃＣ，ＢｅｃＤ，ＢｅｃＧ，ＢｅｃＦおよびＢｅｃＥである。このようなＰＫＳは、多数のドメインを含むことができ、それぞれが、ポリケチドの構造を伸長および／または変更する触媒活性を有する。このポリケチドは、この種々の活性が成長するポリケチド鎖で順次作用するように、このタンパク質を通り過ぎる。上述したように、上記遺伝子群にコードされる様々なＰＫＳは、生合成酵素複合体を形成するために結合することができる。
【００３０】
本発明の核酸分子は、ＢＥ−１４１０６分子あるいはＢＥ−１４１０６誘導体もしくは類似体またはＢＥ−１４１０６に関連した分子の生合成に関与するポリペプチドまたはタンパク質のいくつか（より好ましくは、すべて）をコードする（または、コードするヌクレオチド配列を含む）。例えば、この核酸分子は、２２個の遺伝子もしくはＯＲＦのそれぞれを含むことから、表１に示すＢＥ−１４１０６分子の生合成に関与するタンパク質のそれぞれをコードしていてもよく、またはこの核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド配列の部分もしくは一部（例えば、ＢＥ−１４１０６の生合成遺伝子群の単一遺伝子もしくはＯＲＦにコードされる単一のタンパク質もしくはポリペプチドをコードする配列など）を含んでいてもよい。例えば、少なくとも１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１個、または２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１個まで（例えば、１〜２１，２〜２０，３〜１９，４〜１８，５〜１７，６〜１６，７〜１５，８〜１４，９〜１３，１０〜１２個）の遺伝子またはＯＲＦを含む一部を意図している。好ましくは、本発明の核酸分子は、表１に示されるＢＥ−１４１０６分子の生合成に関与するタンパク質のすべてをコードする。あるいは、本発明の核酸分子は、ｂｅｃＲおよびＯＲＦ６の任意の１以上を除いて、表１に示されるＯＲＦ／遺伝子のすべてを含んでもよい。表１が、特徴付けられている遺伝子またはＯＲＦのすべてを示しているから、表１に示されるＢＥ−１４１０６分子の生合成に関与するタンパク質のすべてをコードする核酸分子は、ＢＥ−１４１０６の生合成遺伝子群を含む配列として定義することができる。
【００３１】
本発明の核酸分子は、このように、ＢＥ−１４１０６分子あるいはＢＥ−１４１０６誘導体もしくは類似体またはＢＥ−１４１０６に関連した分子の合成において、その生合成に関与するか、またはその機能的活性を有する１以上のポリペプチドをコードする。あるいは、本発明の核酸分子は、１以上の機能的に等価なバリアントまたはその機能的等価物をコードしてもよい。上記で定義したとおり、本発明の核酸分子は、配列番号１の機能的に等価なバリアントを含んでいてもよく、このようなバリアントは、配列番号１と配列同一性（％）で定義した一部，縮重した配列，またはホモログを含んでいてもよい。このような機能的に等価なバリアントは、上記で定義した機能的活性を有するタンパク質／ポリペプチドをコードする。このような機能的活性は酵素活性、例えば、ポリケチド部分またはマクロラクタム分子の合成または輸送もしくは運搬に関与する活性（これは、例えば、ＢｅｃＡ，ＢｅｃＵ，ＢｅｃＢ，ＢｅｃＪ，ＢｅｃＫ，ＢｅｃＳ，ＢｅｃＯ，ＢｅｃＤ，ＢｅｃＧ，ＢｅｃＦ，ＢｅｃＥ，ＢｅｃＴ，ＢｅｃＱ，ＢｅｃＰ，ＢｅｃＣ，ＢｅｃＩ，ＢｅｃＬの、鎖もしくは環の合成またはそれに寄与する任意の段階、あるいは生合成の任意の段階での修飾などであり得る）であってもよく、および／または、このような機能的活性は調節活性、例えばＢｅｃＨ，ＢｅｃＭの、合成やその合成工程の調節に関与する遺伝子またはタンパク質の発現の調節などであってもよく、および／または、このような機能的活性は、例えばＢｅｃＮの「輸送体活性」または抵抗であってもよい。このように、合成された分子の細胞内でのまたは細胞外への運搬，輸送または排出に関与する輸送タンパク質も通常含まれる。１以上のモジュールまたは酵素ドメインをコードする配列も意図する。
【００３２】
このような分子は、少なくとも２００塩基の長さ、より好ましくは、少なくとも、３００，５００，６００，７００，８００，９００，１０００，１５００，２０００，３０００，５０００，１００００，１５０００，２００００，３００００，または５００００塩基の長さであってもよい。このように、代表的な断片長は、１００ｂｐ〜１８０００ｂｐ、例えば、１００〜３０００ｂｐ，２００〜２５００ｂｐ，２０００〜８０００ｂｐ，３０００〜５０００ｂｐ，４０００〜１７０００ｂｐ，７０００〜１２０００ｂｐや８０００〜１１０００ｂｐの長さの断片を含む。上記のとおり、多くの遺伝子およびＯＲＦは、配列番号１の中で同定されており、この遺伝子またはＯＲＦを含む一部または断片は、配列番号１の好ましい「一部」または断片を表す。これらを以下の表１にまとめる：
【００３３】
【表１】
0005514185.tif 000002
【００３４】
上表において、「Ｃ」は、このタンパク質が相補鎖にコードされることを示す。
【００３５】
上記の配列は、このようにＢＥ−１４１０６の生合成遺伝子またはＯＲＦを表す。換言すれば、このような遺伝子／ＯＲＦは、ＢＥ−１４１０６の生合成遺伝子群の中に見出され、ストレプトミセスのＢＥ−１４１０６生合成における役割を有する、もしくは有すると提唱されるタンパク質またはポリペプチドをコードする。「ＢＥ−１４１０６の生合成遺伝子」または「ＢＥ−１４１０６の生合成ＯＲＦ」という用語も、活性または機能を上記のタンパク質と共有する（例えば、本明細書中の他に記載されているような、配列同一性を高いレベルで共有する）タンパク質をコードする遺伝子およびＯＲＦを含む。それらは、代わりに「機能的に等価なバリアント」または「機能的な等価物」とも言うことができる。
【００３６】
一般に、「遺伝子」という用語は、プロモータなどの任意の調節配列とともに、上記タンパク質をコードするＯＲＦを含む一方で、「ＯＲＦ」という用語は、該タンパク質のコードを担う遺伝子の一部のみに言及する。
【００３７】
本明細書中で言及されるように、「機能的に等価なバリアント」または「機能的な等価物」は、例えば、実質的に同じ特性を有するタンパク質をコードするか、または実質的に同じ調節特性や活性もしくは他の機能的特性や活性を示し、それらが関連する（または、それらが由来する）実体の少なくとも１つの機能を保持する。この特性や活性は、当該分野で公知の標準的な技術を用いて試験することができる。
【００３８】
所望する産物をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦおよび遺伝子）は本発明に従って好ましい一方、プロモータ，プロモータ−オペレータ領域，エンハンサや他の調節配列などの機能的な遺伝因子を含むヌクレオチド配列も包含する。このように、本発明の核酸分子は、すべてのＰＫＳ遺伝子群を含む必要はなく、その部分または一部、例えば、特定の機能または調節配列を有するポリペプチドをコードする一部を含んでいればよい。これは、１以上の遺伝子および／または調節配列を含むことが好ましい。一般に、これより小さいものであり、１以上のモジュールまたは，酵素ドメイン，または非コードもしくはコードする機能的遺伝因子（例えば、遺伝子発現，転写，翻訳などを制御する因子など）をコードするだろう配列も意図する。
【００３９】
このように、本発明は、配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，３２，３４，３６，３８，４０，４２および４４から選択されるヌクレオチド配列（表１に示すような、配列番号１におけるヌクレオチドの開始および終了位置を参照することにより同定される）またはそれと相補的なヌクレオチド配列もしくはそれが縮重しているヌクレオチド配列を含む核酸分子に拡張する。
【００４０】
配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４、２６，２８，３０，３２，３４，３６，３８，４０，４２もしくは４４のいずれか１つと少なくとも８０％（好ましくは、少なくとも８５％，８７％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％もしくは９９％）の配列同一性を示すヌクレオチド配列または該配列と相補的であるヌクレオチド配列もしくは該配列が縮重したヌクレオチド配列を含む核酸分子も提供する。
【００４１】
本発明は、さらに、配列番号３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，２７，２９，３１，３３，３５，３７，３９，４１，４３もしくは４５から選択される１以上のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列または該配列と相補的であるヌクレオチド配列もしくは該配列が縮重したヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。
【００４２】
配列番号３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，２７，２９，３１，３３，３５，３７，３９，４１，４３もしくは４５のいずれか１つと少なくとも８０％（好ましくは、少なくとも８５％，８７％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％もしくは９９％）の配列同一性を示す１以上のアミノ酸配列（すなわちポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列または該配列と相補的であるヌクレオチド配列もしくは該配列が縮重したヌクレオチド配列を含む核酸分子も提供する。
【００４３】
いずれのケースにおいても、この核酸分子は、本明細書中に定義されるＢＥ−１４１０６の生合成遺伝子またはＯＲＦであることが好ましい。
【００４４】
ヌクレオチド配列同一性またはアミノ酸配列同一性は、任意の簡便な方法で評価することができる。しかしながら、配列どうしの配列同一性の度合いを測定するのには、配列を複数アライメントするコンピュータプログラム、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗなどが役立つ（Thompson, J. D et al., 1994, "CLUSTAL W: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice". Nucleic Acids Res 22: 4673-4680）。この目的のためには、ＡＬＩＧＮ（E. Myers and W. Miller, 1988, "Optical Alignments in Linear Space", CABIOS 4: 11-17），ＦＡＳＴＡ（W.R. PearsonおよびD.J. Lipman, 1988, "Improved tools for biological sequence analysis", PNAS 85:2444-2448,ならびにW.R. Pearson, 1990, "Rapid and sensitive sequence comparison with FASTP and FASTA"Methods in Enzymology 183:63-98）やギャップドＢＬＡＳＴ（Altschul, S.F.ら, 1997, "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs". Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402）のような、一対の配列を比較しアライメントするプラグラムも役立つ。さらにまた、欧州バイオインフォマティクス研究所のＤａｌｉサーバによって、タンパク質配列の構造をベースとしたアライメント（Holm, 1993, J. of Mol. Biology, 233: 123-38；Holm, 1995, Trends in Biochemical Sciences, 20: 478-480；Holm, 1998, Nucleic Acid Research, 26: 316-9）が提供される。
【００４５】
例えば、ヌクレオチド配列同一性は、ウィスコンシン大学から届けられる、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）のＢｅｓｔＦｉｔプログラム  Ｖｅｒｓｉｏｎ１０  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて測定することができる。このプログラムは、デフォルト値：ギャップ・クリエーション・ペナルティ＝５０，ギャップ・エクステンション・ペナルティ＝３，アベレージ・マッチ＝１０，０００，アベレージ・ミスマッチ＝−９．０００を有する、スミスとウォーターマンの局所相同アルゴリズムを用いる。
【００４６】
本発明による核酸配列は、配列番号１と少なくとも８５％，８７％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％または９９％の配列同一性を示すことができ、このような配列は、好ましくは、ＢＥ−１４１０６分子の生合成に関与するタンパク質の一部もしくは全部をコードする配列をコードするか、または該配列と相補的であるだろう。本明細書で定義する配列同一性（％）の基準を満たすヌクレオチド配列は、「実質的に同一の」配列と考えてもよい。
【００４７】
本発明のさらなる態様は、本明細書で定義されるように、本発明の核酸分子にコードされるポリペプチドを提供する。
【００４８】
上記のとおり、配列番号１はいくつかのタンパク質またはポリペプチドをコードし、本発明のこの態様自体が、下記（ａ），（ｂ）：
（ａ）配列番号３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，２７，２９，３１，３３，３５，３７，３９，４１，４３もしくは４５のいずれか１つ以上で示されるアミノ酸配列の全部または一部；
あるいは
（ｂ）配列番号３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，２７，２９，３１，３３，３５，３７，３９，４１，４３もしくは４５のいずれか１つ以上と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列の全部または一部
を含むポリペプチドを提供する。
【００４９】
特に、このアミノ酸配列は、配列番号３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，２７，２９，３１，３３，３５，３７，３９，４１，４３もしくは４５のいずれか１つのポリペプチドと少なくとも８０％，８５％，８７％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％または９９％の同一性を示してもよい。あるいは、このアミノ酸配列は、配列番号３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，２７，２９，３１，３３，３５，３７，３９，４１，４３もしくは４５のいずれか１つのポリペプチドと少なくとも８０％，８５％，８７％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％または９９％の類似性を示してもよい。
【００５０】
本明細書中の配列同一性または配列類似性（％）の基準を満たすアミノ酸（ポリペプチド）配列は、「実質的に同一である」と考えられる。
【００５１】
本発明のポリペプチドは、単離，精製または合成されたポリペプチドであってもよい。「ポリペプチド」という用語は、２以上のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列（すなわち、短いペプチドとより長い長さ（ポリペプチドまたはタンパク質）との両方が含まれる。）を含むよう本明細書で用いられる。
【００５２】
アミノ酸配列同一性を測定するプログラムは上述されている。例えば、アミノ酸配列同一性または類似性は、ウィスコンシン大学から届けられる、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）のＢｅｓｔＦｉｔプログラム  Ｖｅｒｓｉｏｎ１０  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて測定することができる。このプログラムは、デフォルト値：ギャップ・クリエーション・ペナルティ＝−８，ギャップ・エクステンション・ペナルティ＝２，アベレージ・マッチ＝２．９１２，アベレージ・ミスマッチ＝−２．００３を有する、スミスとウォーターマンの局所相同アルゴリズムを用いる。配列番号３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，２７，２９，３１，３３，３５，３７，３９，４１，４３もしくは４５のいずれか１つの（または上記のような「実質的に同一の」配列の）アミノ酸配列の「一部」は、少なくとも２０の隣接したアミノ酸、好ましくは、少なくとも３０，４０，５０，７０，１００，１５０，２００，３００，４００，５００，１，０００，２，０００，５，０００もしくは１０，０００の隣接するアミノ酸を含んでもよい。
【００５３】
ポリペプチドは（好ましくは、その一部も）、上記の定義に従って、機能的に活性である、例えば、酵素的に活性であるか、あるいはＢＥ−１４１０６もしくはＢＥ−１４１０６の誘導体またはその修飾されたバージョンの生合成における調節または輸送機能活性を有する。このように、この一部は、上記のとおり、活性部位またはドメインまたはモジュールに対応してもまたはそれらを含んでもよい。
【００５４】
本発明のヌクレオチド配列およびポリペプチド配列は特徴付けられており、それらの中の様々な機能的領域は同定されている。このような機能的領域は、本発明の別の態様を形成する。本明細書で定義されるとおり、「一部」は、このように、少なくとも１つのモジュールもしくは酵素ドメイン、または非コードもしくはコードする機能的遺伝因子に対応することが好ましい。下記の表２は、ＰＫＳ酵素をコードする配列番号１で同定されるＯＲＦの翻訳産物と同一な機能的領域を示す。
【００５５】
【表２−１】
0005514185.tif 000003
【００５６】
【表２−２】
0005514185.tif 000004
【００５７】
【表２−３】
0005514185.tif 000005
【００５８】
【表２−４】
0005514185.tif 000006
【００５９】
【表２−５】
0005514185.tif 000007
【００６０】
【表２−６】
0005514185.tif 000008
【００６１】
【表２−７】
0005514185.tif 000009
【００６２】
ＢＥ−１４１０６の生合成の経路は、以下のように解明されており、図２Ａおよび２Ｂに示される。
【００６３】
ＢＥ−１４１０６の生合成は、タンパク質であるＢｅｃＡ（配列番号５の配列を有し、配列番号４にコードされる）およびＢｅｃＣ（配列番号９の配列を有し、配列番号８にコードされる）による、プロピオネート１個とアセテート２個とのユニットからのＣ１７〜Ｃ２５のアシル部分の組立により開始される（図２Ａ）。ＢｅｃＣのＫＲドメインはほぼ失活しており、合成されたポリケチド鎖のＣ１９のカルボニル基はそのままの状態にある。そのアミノアシルスターターの生合成は、不連続なＮＲＰＳアデニル化ドメインであるＢｅｃＬ（配列番号２１の配列を有し、配列番号２０にコードされる）による、グリシンの活性化と、この活性化グリシンの、不連続なペプチジルキャリアタンパク質であるＢｅｃＳ（配列番号１９の配列を有し、配列番号１８にコードされる）上へのローディングによって続けられる。ＢｅｃＵ（配列番号１１の配列を有し、配列番号１０にコードされる）は、ＢｅｃＣおよびＢｅｃＳそれぞれの近傍に基質を持ってくることで、ＢｅｃＣのＡＣＰとＢｅｃＳとの間の相互作用を仲介すると考えられる。Ｄ−アミノ酸オキシダーゼであるＢｅｃＩは、おそらくグリシンの酸化的脱アミノ化を触媒しアンモニウムを放出する。これは、Ｃ−１７カルボニルへの求核攻撃を起こしてＣ−１７イミノ基が生成し、このＣ−１７イミノ基はその後アミノ基まで還元される。後半の還元によって、おそらくアシル鎖が酸化され、二重結合が移動する。チオエステラーゼであるＢｅｃＱ（配列番号４１の配列を有し、配列番号４０にコードされる）は、ＢｅｃＣ−ＢｅｃＵ−ＢｅｃＳ複合体からアミノアシル鎖を解放し、その結果アミノアシル−カルボン酸が形成される。アシル−ＣｏＡリガーゼと推定されるＢｅｃＪ（配列番号１５の配列を有し、配列番号１４にコードされる）は、アデニル化およびそれに続くＣｏＡとの結合によって、得られたアミノアシル−カルボン酸を活性化し、アミノアシル−ＣｏＡをアシルトランスフェラーゼであるＢｅｃＫ（配列番号１７の配列を有し、配列番号１６にコードされる）に受け入れられる基質にすると推測される。不連続なアシルトランスフェラーゼであるＢｅｃＫは、活性化アミノアシル鎖を、ＰＫＳのＢｅｃＢ（配列番号１３の配列を有し、配列番号１２にコードされる）上モジュール１のＡＣＰドメインに運搬する。後半のＰＫＳは、ＡＣＰを除いて、モジュール１のすべてのドメインを欠いている（図２Ｂのローディングモジュール）。ＢｅｃＢのモジュール２および３（図２Ｂ中のモジュール１および２）はそれぞれ、アセテート１個とプロピオネート１個とのユニットを用いて、Ｃ１７からアミノアシル部分を伸長する（Ｃ１６〜１５およびＣ１４〜１３）。
【００６４】
成長鎖はその後、ＢｅｃＤ（配列番号２９の配列を有し、配列番号２８にコードされる）に渡され、さらに伸長し修飾される。ＢｅｃＤはモジュール４および５（図２Ｂ中のモジュール３および４）を含み、２個のアセテートのユニットを用いて、この鎖を伸長する（Ｃ１２〜１１およびＣ１０〜９）。
【００６５】
この鎖はその後、ＢｅｃＥ（配列番号３７の配列を有し、配列番号３６にコードされる）に渡される。ＰＫＳのＢｅｃＥのモジュール６（図２Ｂ中のモジュール５）は、１個のアセテートのユニットを用いてこの鎖を伸長する（Ｃ８〜７）。このモジュールのＤＨドメインが失活しているという事実は、Ｃ−９ヒドロキシ基が出現することの原因となっている。（ＤＨドメインは、Ｃ末端領域で欠失を含んでおり、その活性を失っていると考えられる）。
【００６６】
この鎖はその後、ＢｅｃＦ（配列番号３５の配列を有し、配列番号３４にコードされる）に渡される。ＰＫＳのＢｅｃＦのモジュール７および８（図２Ｂ中のモジュール６および７）はそれぞれ、１個のプロピオネート（Ｃ６〜５）と１個のアセテート（Ｃ４〜３）のユニットを用いてこの鎖を伸長する。
【００６７】
この鎖はその後、ＢｅｃＧ（配列番号３３の配列を有し、配列番号３２にコードされる）に渡される。ＰＫＳのＢｅｃＧのモジュール９（図２Ｂ中のモジュール８）は、１個のアセテートのユニットを用いてこの鎖を伸長し、ＢｅｃＧのＴＥドメインは、チオエステル結合の加水分解および完成したアミノ化ポリケチド鎖の、ＰＫＳからの解放に関与する。これによって、マクロラクタム環が環化し、おそらく、プロリンイミノペプチダーゼのホモログと推定されるＢｅｃＰ（配列番号３１の配列を有し、配列番号３０にコードされる）が補助していると思われる。この生合成は、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼであるＢｅｃＯ（配列番号２７の配列を有し、配列番号２６にコードされる）によって完結し、ＢｅｃＯは、８−デオキシＢＥ−１４１０６のＣ−８をヒドロキシル化する。
【００６８】
ＢＥ−１４１０６の生合成において、ＢｅｃＴ（配列番号３９の配列を有し、配列番号３８にコードされる）は明確な役割を定義することができない。ＢｅｃＲ（配列番号４３の配列を有し、配列番号４２にコードされる）も、遺伝子失活実験（実施例１０）で証明されたように、ＢＥ−１４１０６の生合成に関与していない。
【００６９】
この経路の調節に関与すると考えられるタンパク質として、ＬｕｘＲ型タンパク質であるＢｅｃＨ（配列番号３の配列を有し、配列番号２にコードされる）およびＴｅｔＲ型調節制御因子であるＢｅｃＭ（配列番号２３の配列を有し、配列番号２２にコードされる）が挙げられる。
【００７０】
ＭＦＳ型排出ポンプであるＢｅｃＮ（配列番号２５の配列を有し、配列番号２４にコードされる）は、ＢＥ−１４１０６の排出／抵抗に関与すると考えられる。
【００７１】
本発明のヌクレオチド配列は、ＢＥ−１４１０６生合成を操作する方法；新しいＢＥ−１４１０６誘導体もしくは類似体あるいはポリケチドがベースとなった新規の分子もしくは構造物または新規のマクロラクタム分子もしくは構造物を合成する方法；および、このような新規ポリケチド分子もしくは構造物または新規マクロラクタム分子もしくは構造物の生合成のための、新規のまたは修飾されたＰＫＳ生合成機構を提供する方法などの多くで利用することができる、重要なツールおよび情報を提供する。ＰＫＳ生合成機構とは、タンパク質の複合体，集積または会合を形成することができる１以上のＰＫＳを含む（例えば、遺伝子群によりコードされている）タンパク質の群を意味し、このタンパク質の群は、ポリケチド合成に機能的であるが、ＰＫＳ酵素または酵素ドメインの存在のみに限定する必要はなく、例えば、他の酵素的（修飾的等）機能タンパク質や輸送機能タンパク質や調節機能タンパク質などの、他の機能的活性も含むことができる。このように、この遺伝子群にコードされるタンパク質は、いかなる形であれ系内のタンパク質が物理的に関連することを暗示する必要のない、「酵素系」または「酵素複合体」または「タンパク質系」または「タンパク質複合体」として見なすことができる。それらは、ＢＥ−１４１０６の生合成機構を構成するという意味において、「機能的に」関連する。あるいは、それらは、「生合成系」または「生合成複合体」または「会合」と称することができる。
【００７２】
このように、例えば、本明細書で提供されるような、すべてのＢＥ−１４１０６生合成遺伝子群もしくは生合成機構または構成酵素もしくは酵素複合体、あるいはその一部は、修飾を受けることができる。この修飾は、コードされた１以上のタンパク質またはペプチド（例えば、コードされたタンパク質／ペプチドまたは酵素の中の、酵素もしくはモジュール、または酵素ドメイン、あるいは機能的配列など）を修飾するように、遺伝子群の１以上の遺伝子またはＯＲＦを修飾することによって起こる。このように、酵素活性は、合成される分子（例えば、ポリケチドやマクロラクタム構造物）に修飾を生じさせるように、変更するまたは失活させることができる。このように修飾されるか、または誘導化されたＮＲＰＳ−ＰＫＳ生合成機構は、詳細は後述するが、このように、新規のまたは修飾されたポリケチド部分もしくはマクロラクタム部分を合成するために用いることができる。この状態において、本明細書で提供される、ＢＥ−１４１０６生合成遺伝子群または酵素複合体もしくは酵素群、あるいはその断片または一部は、修飾のための「起源」または「テンプレート」または「ソース」系または配列として機能することができる。このように、ＮＲＰＳ−ＰＫＳ生合成機構は、ＮＲＰＳ−ＰＫＳ生合成系または「ＮＲＰＳ−ＰＫＳ系」と見なすことができる。
【００７３】
詳細は後述するが、１つの態様として、この遺伝子群はイン・シトゥで修飾されてもよい。換言すれば、ＢＥ−１４１０６を産生する微生物に含まれるような内因性の遺伝子群は、例えば、遺伝子置換または遺伝子失活によって修飾されてもよい。このように、微生物内に天然に存在するような野生型の遺伝子群は修飾されてもよい。本発明の核酸分子の組換え型が発現する可能性はある（すなわち、核酸分子を宿主細胞（例えば、異種の宿主細胞）へ導入すること、そして核酸分子を発現し、かつポリケチドまたはマクロラクタム分子を産生することができる条件（すなわち、核酸分子の発現産物がポリケチド／マクロラクタム分子を合成することができる条件）下でその宿主細胞を培養（増殖）すること）が、これはあまり好ましくない。このような組換え発現系において、核酸分子は、宿主細胞に導入され、発現される前に修飾を受けてもよい。
【００７４】
さらに後述するが、本発明によれば、上記系の（すなわち、遺伝子群またはタンパク質複合体または会合または生合成機構の）機能しない一部（例えば、非コード性の一部などの、非生物学的活性の一部）は、「足場」として利用することができ、そして修飾されないままにしておくこともでき、この機能的な一部（例えば、酵素部分をコードする配列）は、誘導された、または修飾されたＮＲＰＳ−ＰＫＳ系を産生するために修飾されてもよい。好ましい態様において、１種または少数の選択された機能的（例えば、酵素的）領域，モジュールまたはドメインが修飾され、残りの配列または構造の大部分は修飾されないままである。
【００７５】
合成のまたは組換え型のポリケチドシンターゼや他の酵素およびそのような酵素を含む複合体または系、あるいは生合成機構の他のタンパク質（すなわち、ＢＥ−１４１０６の生合成遺伝子群にコードされる少なくとも１つのタンパク質の特性を変えるために修飾されるＢＥ−１４１０６の生合成遺伝子群にコードされる足場に由来する酵素もしくはタンパク質または複合体あるいは系）は、本発明の範囲内に包含される。
【００７６】
例えば、このような修飾は、他のモジュール型酵素に由来する１以上の機能的ユニット（例えば、モジュールもしくはドメインまたは全遺伝子／ＯＲＦさえも）をコードする配列を含むべきである。あるいは、このような修飾は、ＢＥ−１４１０６の生合成遺伝子群に由来する１以上の機能的ユニットをコードする配列を導入すべきであるが、該生合成遺伝子群は、天然に存在する配列の異なった位置で見出されるものである。この修飾も、ＢＥ−１４１０６の生合成機構の、コードされたドメイン，モジュール，酵素または他の機能的ユニットの失活または欠失をもたらす修飾であり得る。
【００７７】
このような機能的ユニットは、触媒でもあっても、輸送または調節タンパク質ドメインであってもよい。この操作を実施するために用いられる配列は、本発明の核酸分子からのものであってもよく、また、ドメインをコードしている適切な配列は、他のポリケチドを合成する酵素，ペプチドを合成する酵素，ハイブリッドのペプチドポリケチドを合成する酵素，脂肪酸を合成する酵素もしくは当該分野に公知の他の酵素ドメインをコードするヌクレオチド分子に由来するものであってもよい。
【００７８】
このように、極めて一般的な意味で、本発明は、修飾されたＢＥ−１４１０６の生合成遺伝子群，コードされた生合成機構（またはタンパク質系）およびそれから合成される結果生じる修飾された分子の調製における、本明細書で定義されるような、本発明の核酸分子の使用を提供する。
【００７９】
ランダムな，直接的な，または計画的なやり方で、例えば、前もって決定されるか、もしくは設計された特定の構造物を得て試験するために、または、例えばスクリーニング等のために、ランダムな分子（例えばポリケチド構造物のライブラリ）を創出するために、本発明に従ったこの方法で、本発明の核酸分子のヌクレオチド配列を利用してもよい。
【００８０】
修飾されたＢＥ−１４１０６分子またはＢＥ−１４１０６誘導体とは、ＢＥ−１４１０６の化学構造が、図１に記載の化学構造と関連して変えられることを意味する。このように修飾することによって、ＢＥ−１４１０６分子の強度または効能（例えば、細胞毒性または増殖抑制作用）を上げるか下げるかして、ＢＥ−１４１０６の機能特性を変更でき、または、例えば、選択毒性，溶解性，薬物動態，細胞性標的に対する親和性やこの化合物の他の特性に影響を及ぼすことができる。
【００８１】
あるいは、本明細書に記載の修飾は、ＢＥ−１４１０６分子が輸送される方法または調節されるその生合成を変えるために用いることができる。
【００８２】
このような新規または修飾された生合成的な遺伝子群，構成タンパク質またはタンパク質系を含むコードされた生合成機構，およびそれから合成される結果生じる修飾された分子はそれぞれ、本発明の別の態様を形成する。生合成遺伝子群が導入された細胞，あるいは、この修飾された生合成遺伝子群もしくは修飾されたコード生合成機構からなる細胞か、またはそれらを含む細胞もまた、本発明の一部として包含される。
【００８３】
修飾できる遺伝子または遺伝因子として、実際のＰＫＳ遺伝子もしくはＯＲＦ（ＢｅｃＡ，ＢｅｃＢ，ＢｅｃＣ，ＢｅｃＤ，ＢｅｃＥ，ＢｅｃＦ，ＢｅｃＧをコードする）または個々のモジュールもしくはそのドメインのみならず、ＢＥ−１４１０６の生合成（例えば、ＢｅｃＵ，ＢｅｃＩ，ＢｅｃＰ，ＢｅｃＪ，ＢｅｃＫ，ＢｅｃＳ，ＢｅｃＬ，ＢｅｃＯ，ＢｅｃＴ，ＢｅｃＱをコードする）および輸送（例えば、ＢｅｃＮをコードする）もしくは調節（例えば、ＢｅｃＨ，ＢｅｃＭをコードする）に関与する他の酵素もしくは機能的タンパク質をコードする遺伝子またはＯＲＦが挙げられ、これらのすべてが「ＢＥ−１４１０６の生合成遺伝子」として集合的に本明細書中で称される。
【００８４】
詳細は後述するが、実際のＰＫＳ遺伝子に関して、それらは、ポリケチド鎖の構造を決定する様々なデヒドラターゼ活性，レダクターゼ活性およびシンターゼ活性と同様に、スターターユニットの特徴，モジュールの数，伸長ユニット[extender]の特徴を決定するローディングモジュールドメインの特徴を変えるために修飾してもよい。
【００８５】
このように、例えば、ＰＫＳ酵素のモジュールの数は増減されてもよい（例えば、ＰＫＳ酵素の１以上のモジュールは欠失してもよい）；ＰＫＳ酵素のＫＳ，ＤＨおよび／またはＫＲドメインは、欠失，失活または（例えば、同じＰＫＳ遺伝子または他のＰＫＳ遺伝子から）導入してもよく、ＰＫＳ酵素のＡＴドメインは、スターターユニットまたは伸長ユニットに対する特異性を変更するために修飾してもよい；ＢｅｃＡ（配列番号４／５）のＫＳQドメインは、側鎖の一部を構成するスターターユニットの特徴を変更するために修飾（例えば、失活）してもよい。
【００８６】
ＢｅｃＯのハイドロキシラーゼの特異性を変えることによって、ＢＥ−１４１０６（またはその類似体）のＣ−８以外の炭素原子でのヒドロキシル化を提供することができる。
【００８７】
合成された分子の特徴を変えるＮＲＰＳ酵素またはＰＫＳ酵素の修飾に加えて、本発明の核酸分子は、例えば、宿主の範囲を拡張するか、または収率もしくは生産効率を増加させることなどによって、生合成工程を操作するか、または容易にするために利用することもできる。
【００８８】
本発明の核酸分子の組換え発現を可能にするため、本発明はまた、例えば、クローニングベクターや発現ベクターなどのベクターを提供し、本発明は、このような分子を含む本発明の核酸分子および宿主細胞も含むものである。しかしながら、上記のとおり、本発明のこの態様はあまり好ましくない。
【００８９】
実際には、この修飾は、例えば、酵素活性を失活もしくは修飾するか、またはある活性を導入するよう酵素活性をコードするヌクレオチド配列を変更するために、細胞（本明細書中「宿主細胞」として見なすことができる）内でＢＥ−１４１０６生合成遺伝子群配列をイン・シトゥで操作することによって、有利に実施することができる。内因性の核酸分子（換言すれば、宿主細胞に含まれる核酸分子）に含まれるようなＢＥ−１４１０６の生合成遺伝子群配列（例えば、配列番号１）に導入するのに必要な修飾を有する配列を含む適切な遺伝子構造物を創出することができる。その後、この配列を有するベクター（例えば、プラスミド）を適切な宿主細胞に導入することができる。最終的に、これは、対応する（例えば、内因性の、または天然に存在する）生合成遺伝子群の部分の近くで、相同組換えによって、修飾された配列の（例えば、宿主細胞のゲノム内の）遺伝子群への統合に至る。第二の組換え現象として、遺伝子群の内因性の部分が修正されたバージョンに置換され、ベクターは排除される。
【００９０】
したがって、その結果修飾された宿主細胞は、修飾されたＢＥ−１４１０６生合成遺伝子群を含むこととなり、該遺伝子群は、修飾されたＢＥ−１４１０６酵素系をコードする。この修飾されたＢＥ−１４１０６生合成機構は、このように、修飾されたＢＥ−１４１０６分子を合成する。
【００９１】
上記のとおり、修飾される遺伝子群は、ＢＥ−１４１０６または誘導体を産生する宿主細胞（微生物）中に天然に存在する野生型の遺伝子群であってもよい（故に、野生型の核酸分子または内因性の核酸分子が修飾される）。あまり好ましいことではないが、本発明に依然として包含されているのは、本発明の核酸分子は修飾される前に宿主細胞に導入してもよいことである。あるいは、核酸分子は、修飾された後に宿主細胞に導入してもよい。よって、外因性の核酸分子も、修飾されてもよい。
【００９２】
本発明が完全長のＢＥ−１４１０６遺伝子群の配列を提供すると仮定すると、この遺伝子置換の方策は、ＢＥ−１４１０６遺伝子群を修飾するのに通常利用されるものである。この方策は、例えば、遺伝子群の一部を欠失させるか，天然もしくは野生型の配列のモジュールに見出された活性を導入するか，または置換するために用いることができる。この方策は、遺伝子群配列の情報を必要とするが、この操作を実施するために宿主細胞から単離される完全な遺伝子群を必ずしも必要としない。
【００９３】
このように、本発明のさらなる態様は、修飾されたＢＥ−１４１０６のＮＲＰＳ−ＰＫＳ生合成機構（または、修飾されたＢＥ−１４１０６のＮＲＰＳ−ＰＫＳ系）をコードする核酸分子を調製する方法を提供するものであり、該方法は、該ＢＥ−１４１０６のＮＲＰＳ−ＰＫＳ生合成機構（または、修飾されたＢＥ−１４１０６のＮＲＰＳ−ＰＫＳ系）をコードする核酸分子（上記で定義した）を修飾することを含む。
【００９４】
この核酸分子は、その配列を修飾することによって、修飾され、より具体的には、該核酸分子にコードされる１以上の活性（またはタンパク質）をコードする配列を、導入すること，突然変異すること，欠失すること，置換すること，または失活することによって修飾されてもよい。このように、酵素活性または他の機能的活性をコードする１以上の配列を修飾してもよい。このような修飾によって、天然のもしくは野生型のＢＥ−１４１０６のＮＲＰＳ−ＰＫＳ生合成機構（またはＢＥ−１４１０６のＮＲＰＳ−ＰＫＳ系）と比較して機能もしくは活性または特性が変更されたＢＥ−１４１０６のＮＲＰＳ−ＰＫＳ生合成機構（またはＢＥ−１４１０６のＮＲＰＳ−ＰＫＳ系）をコードする核酸分子がもたらされる。このように、この修飾された生合成機構（またはＮＲＰＳ−ＰＫＳ系）は、１以上の変更されたか修飾された酵素活性を有していてもよく、天然の（すなわち、修飾されていない）生合成機構（またはＮＲＰＳ−ＰＫＳ系）から合成された分子以外の（または、該分子と異なる）分子（例えば、ポリケチドまたはマクロラクタム分子）の合成をもたらしてもよい。あるいは、上記のとおり、生合成機構の修飾は、生合成工程の向上（例えば、収量の増大など）をもたらすことができる。
【００９５】
修飾される核酸は、細胞または微生物の中に含まれてもよく、該細胞または該微生物は、修飾された生合成機構で合成されるポリケチド／マクロラクタム分子の産生に用いられる細胞または微生物であってもよい。
【００９６】
上記のとおり、修飾される核酸分子が、ＢＥ−１４１０６（またはその誘導体）を産生する微生物の中に内因的に（または天然に）存在する核酸分子であると都合良いことがある。このように、本発明の方法は、ＢＥ−１４１０６またはその誘導体を産生する細胞または生物（通常、微生物細胞または微生物）の中で、天然核酸分子をイン・シトゥで修飾する（より具体的には、核酸分子の配列を修飾する）ことを含むことができる。核酸分子は、ＢＥ−１４１０６生合成遺伝子群もしくはその一部であるか、またはそえらを代表し、それによって、ＢＥ−１４１０６生合成機構またはＢＥ−１４１０６のＮＲＰＳ−ＰＫＳ系もしくはその一部をコードする核酸分子として見なしてもよい。
【００９７】
種々の多くの微生物は、ＢＥ−１４１０６を産生することができ、いくつかの微生物は、８−デオキシ誘導体などのような、天然に存在するＢＥ−１４１０６の誘導体を産生することができることも知られている（Takahashiら，上記を参照）。ＢＥ−１４１０６遺伝子群もしくは生合成機構（またはＮＲＰＳ−ＰＫＳ系など）に言及する場合、ＢＥ−１４１０６自体のみならず、８−デオキシ誘導体（ＧＴ３２−Ｂと言う）などのような、天然に存在する誘導体も産生する遺伝子群または生合成機構なども含むことが意図される。
【００９８】
さらに本発明は、修飾されたＢＥ−１４１０６のＮＲＰＳ−ＰＫＳ生合成機構（または修飾されたＢＥ−１４１０６のＮＲＰＳ−ＰＫＳ系）を調製する方法を提供するものであり、該方法は、上記のとおり調製される（または得られる）修飾された核酸分子を発現することを含む。これは、単に、上記のとおり細胞の中に含まれる核酸分子を修飾し、修飾された核酸分子が発現する条件下でこの細胞を増殖させることによって、達成することができる。このように、例えば、細胞内の天然核酸分子は、イン・シトゥで修飾することができ、かつこの細胞は増殖することができる。
【００９９】
本発明のこの態様は、このような方法によって得られる、修飾されたＢＥ−１４１０６のＮＲＰＳ−ＰＫＳ生合成機構（または修飾されたＢＥ−１４１０６のＮＲＰＳ−ＰＫＳ系）も提供することができる。
【０１００】
本発明は、修飾されたポリケチドまたは修飾されたマクロラクタム分子を調製する方法も提供するものであり、該方法は、上記のとおり調製される（または得られる）修飾された核酸分子を発現することを含むものである。
【０１０１】
一般的に言って、核酸分子は、修飾された生合成機構が発現されてもよい条件下で、宿主細胞の中で発現されるだろう。上記のとおり、これは、核酸分子を宿主細胞に導入することで達成することができるが、通常「宿主細胞」は、核酸分子が天然にもしくは内在的に存在し、そして核酸分子が修飾される細胞または生物であろう。宿主細胞は、修飾された核酸分子および生合成機構が発現され得る条件下ならびに生合成機構から産生された分子が合成され得る条件下で、増殖または培養されるだろう。
【０１０２】
このように、核酸分子は、所望する任意の宿主細胞の中で発現されてもよいが、好ましくは、該分子が由来した（もしくは由来するかもしれない）、該（修飾されていない）分子が天然に存在する細胞または微生物の中で発現されるだろう。
【０１０３】
修飾されたポリケチドまたはマクロラクタム分子を調製する本発明の方法は、例えば、宿主細胞が増殖した培地や宿主細胞から分子を回収する（例えば、単離する、または精製する）さらなる段階を含んでもよい。このように、本発明のこの態様は、このような方法によって得られる、修飾されたポリケチドまたはマクロラクタム分子も提供することができる。
【０１０４】
本発明のさらなる態様は、このように、先に定義したような方法で得られる、修飾されたＢＥ−１４１０６のＮＲＰＳ−ＰＫＳ生合成機構（もしくは修飾されたＢＥ−１４１０６のＮＲＰＳ−ＰＫＳ系）をコードする核酸分子を含む、細胞または微生物も提供する。あるいは、細胞または微生物は、先に定義したような方法で得られる、修飾されたＢＥ−１４１０６のＮＲＰＳ−ＰＫＳ生合成機構（もしくは修飾されたＢＥ−１４１０６のＮＲＰＳ−ＰＫＳ系）を含んでいてもよい。
【０１０５】
本発明の別の態様であるが、あまり好ましくない態様は、上記のとおり、核酸分子を含む宿主細胞も提供するものであり、該分子は、該宿主細胞の中に導入されている。
【０１０６】
典型的な例として、遺伝子群のこのような操作は、ＢＥ−１４１０６もしくは誘導体またはその修飾されたバージョンのＣ−２，３，４，７，１１，１３，１５，１７，２１および２３のいずれか１以上の位置でヒドロキシル基が導入される、修飾されたＢＥ−１４１０６分子を生成する目的で実施することができると想定される。これは、ＢＥ−１４１０６生合成遺伝子群のＤＨドメインを適切に失活または欠失することで達成することができる。本願明細書で提唱される生合成経路によれば、以下のように修飾されるはずである：
【０１０７】
【表３】
0005514185.tif 000010
【０１０８】
加えて、または、その代わりとして、遺伝子群のこのような操作は、ＢＥ−１４１０６もしくは誘導体またはその修飾されたバージョンのＣ−２，３，４，７，９，１１，１３，１５，１７，２１および２３のいずれか１以上の位置でオキソ（ケト）基が導入される、修飾されたＢＥ−１４１０６分子を生成する目的で実施することができると想定される。これは、ＢＥ−１４１０６生合成遺伝子群のＫＲドメインを適切に失活または欠失することで達成することができる。本願明細書で提唱される生合成経路によれば、以下のように修飾されるはずである：
【０１０９】
【表４】
0005514185.tif 000011
【０１１０】
このように、本発明のさらなる態様は、ＢＥ−１４１０６生合成経路の遺伝子／タンパク質を修飾することによって産生することができるＢＥ−１４１０６の類似体を提供する。本発明のＢＥ−１４１０６類似体としては、８−デオキシＢＥ−１４１０６、３−，５−，７−，１１−，１３−，１５−，１７もしくは２３−ヒドロキシＢＥ−１４１０６および３−，５−，７−，９−，１１−，１３−，１５−，１７−もしくは２３−オキソＢＥ−１４１０６またはこれらの組合せからなる群のいずれか１以上から選択される修飾を含む分子が挙げられるが、これに限定されるものではない。表５に、本発明のこのようなＢＥ−１４１０６類似体の代表的なものを抽出し、その構造と、該類似体を生成するのに失活を必要とするモジュールとを示す。
【０１１１】
【表５】
0005514185.tif 000012
【０１１２】
0005514185.tif 000013
【０１１３】
0005514185.tif 000014
【０１１４】
上記修飾に加えて、またはそれに代わるものとして、Ｃ２０〜Ｃ２５の側鎖は、ＰＫＳのＢｅｃＡモジュールすべてをコードするｂｅｃＡにおいて、ＤＮＡ領域を欠失させることによって短くすることができる。あるいは、ＢｅｃＡの１以上の分子は、その側鎖を短くするために欠失してもよい。例えば、ＢｅｃＡの１個のモジュールすべてを欠失させると、その側鎖を短くすることができる。
【０１１５】
上記修飾に加えて、またはそれに代わるものとして、ＰＫＳの（例えば、ＢｅｃＡ，ＢｅｃＢ，ＢｅｃＤ，ＢｅｃＥ，ＢｅｃＦ，ＢｅｃＧの）モジュールの１以上は、より少ない員（例えば、１８−，１６−，１４−，１２−，１０−および８−員環）を有するマクロラクタム環を有する類似体を産生するために欠失することができる。
【０１１６】
上で記載または表にした他の修飾に加えて、またはそれに代わるものとして、表５に示すように、ＢｅｃＯは、８位のヒドロキシル基を取り除くために失活または欠失することができる。
【０１１７】
上記修飾に加えて、またはそれに代わるものとしてなされてもよいさらなる修飾として、分子の安定性を増す（例えば、ＢＥ−１４１０６の−Ｎ−Ｃ＝Ｏ結合がペプチド結合と似ていることからＢＥ−１４１０６が受け易いと思われるプロテアーゼ分解に備える）ための、ＢＥ−１４１０６のＣ−１カルボニルのチオカルボニル（Ｃ＝Ｓ）またはカルボキサミド（Ｃ＝ＮＨ）への置換；ＢＥ−１４１０６または修飾されたＢＥ−１４１０６分子の、例えば、単糖部分でのグリコシル化；遊離のヒドロキシル基のアシル化およびＢＥ−１４１０６の側鎖にあるＣ２１〜Ｃ２２二重結合の還元が挙げられる。
【０１１８】
調節タンパクは、合成された分子（例えば、ＢＥ−１４１０６またはその誘導体もしくは類似体）の産生を増加させるために過剰発現することができる。
【０１１９】
このように、修飾されたＢＥ−１４１０６生合成遺伝子群を産生する方法が提供され、この方法において、上述した修飾の１以上が、本明細書で定義されるような本発明の核酸分子になされる。該修飾は、本発明の核酸分子を内因的に含む宿主細胞の遺伝子置換を実施することによって都合良くなされてもよい。
【０１２０】
「遺伝子置換」とは、本発明の核酸分子中に見出されるような遺伝子もしくはＯＲＦまたはその一部（例えば、モジュール，ドメインまたは他の機能的なユニット）が、その修飾されたバージョンで効率的に置換または交換される任意の方法を意味する。この修正されたバージョンは、遺伝子もしくはＯＲＦまたはその一部（例えば、タンパク質もしくはペプチドまたはそのドメインもしくはモジュールをコードする配列）を変化するかまたは変更する（例えば、１以上のヌクレオチド残基を置換，欠失または挿入することなどによって突然変異する）ものであることができる。このような変化は、コードされたポリペプチドの活性に変化をもたらすことができるが、１以上のタンパク質もしくはポリペプチドまたはそのドメインもしくはモジュールを失活または欠失させる原因となる変化も挙げられる。好ましくは、修正されたバージョンは、該タンパク質もしくはポリペプチドまたはその１以上のモジュールもしくはドメインをコードする配列が失活または欠失したものである。
【０１２１】
この方法が、全部の遺伝子またはＯＲＦが物理的に取り除かれ置換されることを必要とするものではなく、むしろ本発明の核酸分子中に見出されるような配列の一部または全部を、その修飾されたバージョンに置換するものである点に留意する必要がある。
【０１２２】
遺伝子置換は、当該分野において公知の技術に従って実施することができる（例えば、Sekurova ら., 1999 FEMS Microbiol. Lett., 177, 297-304を参照）。
【０１２３】
本発明の核酸分子を内因的に含む宿主細胞（例えば、微生物）は、該宿主細胞内に存在するＢＥ−１４１０６生合成遺伝子群を変化させるかまたは変更するように、例えば、遺伝子置換などによって、核酸分子が修飾されることが好ましい。本発明の核酸分子が、宿主細胞内に通常見出されるか、または宿主細胞内に天然に存在する場合（すなわち、核酸分子は、宿主細胞の遺伝物質に含まれる）、その宿主細胞は、本発明の核酸分子を内因的に含む。換言すれば、本発明の核酸分子は、例えばプラスミドのような組換えＤＮＡ分子に含むかたちで宿主細胞に該分子を導入（例えば、トランスフェクトまたは輸送）しただけでは宿主細胞内に存在するとは言えない。
【０１２４】
宿主細胞が本発明の核酸分子を含むか否かは、その宿主細胞がＢＥ−１４１０６またはその誘導体を合成することができるかどうか判別することによって確認することができる。その代わりに、または、さらに、宿主細胞中に存在する核酸分子の配列を解析する遺伝子工学を実施することができる（例えば、当該分野において公知である、ＰＣＲ，サザンブロッティングや他の標準的な技術など）。このような遺伝子工学は、核酸分子が内因的に存在するかどうかを決定するために用いることができる。
【０１２５】
本発明の方法に用いられる宿主細胞は、所望する任意の細胞または微生物であっても、原核生物または真核生物であってもよいが、通常、微生物、具体的には細菌であろう。より具体的には、宿主細胞は放線菌であるだろう。
【０１２６】
好ましい宿主細胞として、ストレプトミセス菌株が挙げられ、本発明の核酸分子を内因的に含むストレプトミセス菌株が好ましい。好適な例は、ストレプトミセス菌株のｅｓｐｉ−Ａ１４１０６（ＪＰ４００１１７９に記載されているようなＦＥＲＭＰ−１１３７８）である。遺伝子群がシークエンシングされ、寄託番号ＤＳＭ２１０６９の下ＤＳＭＺに寄託されている、上記の新規単離株（分離株ＭＰ２８−１３）が特に好ましい。
【０１２７】
さらに、ＢＥ−１４１０６生合成酵素系にコードされる、修飾されたポリペプチドを産生する方法が提供され、上記方法によって得られる、修飾されたＢＥ−１４１０６生合成遺伝子群が、宿主細胞中で発現される。一旦、適切な修飾が、例えば上記方法によって、ＢＥ−１４１０６生合成遺伝子群になされると、修飾されたＢＥ−１４１０６生合成ポリペプチドを産生するために、修飾された遺伝子群からポリペプチドおよびタンパク質が発現できる条件下で、宿主細胞が増殖または培養できる。
【０１２８】
このように、修飾されたＢＥ−１４１０６生合成遺伝子群を含む、修飾された宿主細胞は、この遺伝子群にコードされたポリペプチドおよびタンパク質を発現することになり、これによって、この遺伝子群にコードされる他のタンパク質と同様に、修飾されたポリペプチドまたはタンパク質の産生に繋がる。１以上の修飾されたポリペプチドまたはタンパク質がこの生合成機構に含まれる結果、ＢＥ−１４１０６の生合成機構の特性が変化するだろう。ＢＥ−１４１０６生合成遺伝子群になされた修飾の性質に応じて、コードされるポリペプチド，タンパク質および酵素の特性は、それらの野生型と異なることになる。
【０１２９】
ＢＥ−１４１０６生合成機構を細胞中に産生することで、大部分の目的にとって、充分であろう。あるいは、ＢＥ−１４１０６生合成機構を形成するタンパク質は、そのタンパク質が発現された細胞から精製することができる。
【０１３０】
本発明のさらなる態様は、上記のとおり修飾された、本発明の核酸分子にコードされるポリペプチドを提供する。
【０１３１】
修飾されたＢＥ−１４１０６分子を産生する方法も提供される。この方法によれば、上記方法により得られる、修飾されたＢＥ−１４１０６生合成遺伝子群が、宿主細胞内で発現される。上記方法で得られる、修飾されたＢＥ−１４１０６生合成遺伝子群が存在する宿主細胞を、修飾されたＢＥ−１４１０６生合成遺伝子群にコードされるポリペプチド，タンパク質および酵素が発現できる条件下で増殖または培養することによって達成される。このように、この細胞は、修飾されたＢＥ−１４１０６分子を生合成するために必要な生合成機構を含むことになり、この分子は確実に合成されるだろう。
【０１３２】
この方法は、修飾されたＢＥ−１４１０６分子を回収する、例えば、単離する、または精製する段階をさらに含むことができる。適切な場合これが輸送または分泌された細胞培地から、さもなければ、それが含まれる宿主細胞から、これは単離または精製できる。このように、例えば、産生微生物である細胞を、例えば遠心分離によって、採取してもよく、例えば有機溶媒（メタノールや他のアルコールなど）を用いて、抽出してもよい。この分子は、例えば遠心分離によって、このような抽出物から回収することができる。このようにして得られる粗生成物をさらに精製するには、例えば、クロマトグラフィ（ＨＰＬＣなど）が挙げられる。
【０１３３】
上記原理に従って本発明の実施を可能にするためには、本発明は、本明細書に定義されている核酸分子を含む宿主細胞、より具体的には、上記のとおりに修飾された本発明の核酸分子を含む細胞も提供する。
【０１３４】
一般に、本発明の方法は、本発明の核酸分子を含む任意の宿主細胞、好ましくはこの分子を内因的に含む宿主細胞に実施することができる。上記のとおり、好ましい宿主細胞として、ストレプトミセス種の細胞が挙げられる。より好ましい細胞は、表６に示すように、抗生物質に抵抗性および感受性を示す特徴を有するストレプトミセス細胞である。
【０１３５】
極めて好ましい態様において、本発明の方法は、ＢＥ−１４１０６またはその誘導体を産生する、寄託番号ＤＳＭ２１０６９の下でＤＳＭＺに寄託された新規菌株であるストレプトミセスＭＰ２８−１３またはその変異体もしくは修飾株を用いて実施される。
【０１３６】
このように、本発明は、本明細書に記載した方法で得られる、微生物、具体的には細菌、特にストレプトミセスをさらに提供する。
【０１３７】
本発明の重要な態様は、ＢＥ−１４１０６またはその誘導体を産生する、寄託番号ＤＳＭＺ  ２１０６９の下でＤＳＭＺに寄託されたストレプトミセスの菌株、またはその変異体もしくは修飾された菌株も提供する。
【０１３８】
本発明の方法は、上記の本発明の核酸分子に由来する、核酸分子の誘導体の産生をもたらすように見えるかもしれない。
【０１３９】
核酸分子の誘導体は、修飾されていない核酸分子が含まれる宿主細胞または微生物の中、イン・シトゥで形成されてもよい。その代わりに、しかし、あまり好ましくないが、核酸分子の誘導体は、核酸分子が導入された宿主細胞中で形成されてもよい。本発明による誘導体または修飾された核酸分子を含む、このように「修飾された」微生物は、例えば、ポリケチドもしくはポリケチドがベースとなった分子またはマクロラクタム分子のライブラリなどのライブラリを形成するために用いることができ、このライブラリのメンバーは、本明細書で提供される、天然に存在するＢＥ−１４０６系に由来する、修飾されたＢＥ−１４１０６生合成機構またはＮＲＰＳ−ＰＫＳ系によって合成される。概して、これらライブラリの多くのメンバーは、それ自体、新規化合物かもしれず、本発明は、これらライブラリの新規メンバー（化合物）をさらに含む。本発明の方法は、このように、個々の化合物の調製を目指してもよい。この化合物は新規であっても新規でなくてもよいが、それを調製する方法は、より簡便なものも許容される。その結果得られた化合物（例えばポリケチド）は、例えば、それをさらに活性な分子に（グリコシル化などによって抗生物質などに）変換するために、さらに修飾してもよい。本発明は、本発明のライブラリをスクリーニングすることによって、所望の活性を有する新規化合物を回収する方法も含む。
【０１４０】
本発明は、ＢＥ−１４１０６のＮＲＰＳ−ＰＫＳ遺伝子群により産生されたタンパク質が１以上の点で活性を変更するように、この群が修飾されることによって、ライブラリまたは個々に修飾された型（最終的にはポリケチドがベースとなった分子またはマクロラクタム分子）を提供し、このように、遺伝子群にコードされるＮＲＰＳ−ＰＫＳ系の天然物（すなわち、ＢＥ−１４１０６）以外の化合物を産生する。このように新規化合物は、この方法を用いて調製することができ、たいていの化合物はより容易に調製できる。天然に存在するＢＥ−１４０１６遺伝子群に由来する種々の遺伝子または遺伝子群の大多数（それぞれが、天然の群から異なる方法で修飾されている）を提供することによって、効率的な化合物のコンビナトリアルライブラリが、これら活性の複数のバリエーションの結果として産生され得る。本発明で用いる、修飾されたＮＲＰＳ−ＰＫＳがコードする配列および生合成機構／系は、このように、天然に存在するＢＥ−１４１０６のＮＲＰＳ−ＰＫＳ生合成機構または系に「由来」する、コードする配列および酵素／タンパク質機構または系を表す。
【０１４１】
ＢＥ−１４０１６生合成機構に「由来」する生合成機構またはＮＲＰＳ−ＰＫＳ系とは、活性を変更するように、少なくとも１つの酵素活性または機能的活性を変異させるか、欠失させるか、失活させるか、または置換させる、生合成機構またはＮＲＰＳ−ＰＫＳ系を意味する。これら活性が欠失するか、もしくはこの活性とは異なるバージョンに置換されるか、または単に、天然物以外の化合物（例えば、ポリケチドまたはマクロラクタム）がこれらの総体的な活性から生じるというような方法で突然変異する場合、変更という結果になる。スターターユニットおよび／または伸長ユニット、および／または立体化学、および／または鎖長もしくは環化および／または還元サイクルもしくは脱水サイクルの成果において、そうして得られる変更が、産生された化合物の対応する位置にあったことから、該変更が起こる。欠失された活性が置換される場合、置換された活性の起源は、天然に存在する種々のＮＲＰＳもしくはポリケチドシンターゼに対応する活性から、または、同じＮＲＰＳ−ＰＫＳ系／機構の異なる領域から来てもよい。
【０１４２】
モジュール型のＮＲＰＳ−ＰＫＳの修飾または操作は、例えば、遺伝子，ドメインもしくはモジュールの欠失などの切り詰め、またはドメイン／遺伝子／モジュールの交換，付加もしくは失活を伴い、挿入または欠失を伴ってもよい。あるいは、ランダム修飾または定方向修飾（すなわち、突然変異）は、選択された部分の核酸配列において（例えば、遺伝子／ドメイン／モジュールなどにおいて）なされてもよい。
【０１４３】
都合の良いことに、ＢＥ−１４１０６機構または系に「由来」する生合成機構またはＮＲＰＳ−ＰＫＳ系は、少なくともＰＫＳ酵素のＮＲＰＳアデニル化ドメインおよび少なくともＰＫＳ酵素の２個のモジュールを含み、その結果得られる化合物の性質が変更するように、これら機能的なドメインまたはモジュールの１以上の活性の突然変異，欠失，または置換を任意に含んでもよい。この定義は、タンパク質レベルおよび遺伝子レベルの両方に適用する。特定の好ましい態様は、ＫＳ，ＡＴ，ＫＲまたはＤＨが、失活もしくは欠失したか、あるいは種々の機構もしくはＰＫＳ／ＮＲＰＳ系からの、または同じ機構もしくはＮＲＰＳ−ＰＫＳ系内の他の位置からの、活性のバージョンと置換したものを含む。少なくとも１個の非縮合サイクル酵素活性（例えば、ＫＲもしくはＤＨ）が削除された誘導体、またはこれら活性のいずれかが、合成される最終化合物が変化するように、突然変異した誘導体も好ましい。
【０１４４】
このように、産生されることになる化合物に関して、ＰＫＳ生合成機構または系を構築するためには５つの自由度が存在する。第一に、ポリケチド鎖長は、機構または系のモジュール数によって決定されることになる。第二に、ポリケチドの炭素骨格の性質は、例えば、マロニル，メチルマロニルやエチルマロニルなどの各位置で伸長ユニットの性質を決定するアシルトランスフェラーゼの特異性によって決定されることになる。第三に、ローディングドメインの特異性は、その結果得られるポリケチドの炭素骨格にも影響を及ぼすことになる。このように、ローディングドメインは、アセチルやプロピオニルなどのような種々のスターターユニットを用いてもよい。第四には、ポリケチドの様々な位置での酸化状態は、モジュールのデヒドラターゼ部分およびレダクターゼ部分によって決定されることになる。これによって、ポリケチドのケトン，アルコール，二重結合または単結合の存在および位置が決定されることになる。
【０１４５】
最後に、得られるポリケチドの立体化学は、シンターゼの様々な側面の機能である。この第１の態様は、伸長ユニットとしての置換マロニルに関するＡＴ／ＫＳ特異性と関連があり、デヒドラターゼによって鏡像異性が除かれるだろうから、還元サイクルが失われている場合にだけ、または、還元サイクルがケトレダクターゼだけを含む場合にだけ、立体化学に影響を及ぼす。第２に、ケトレダクターゼの特異性によって、任意のβ−ＯＨの鏡像異性が決定されるだろう。
【０１４６】
アミノアシル「スターター」の生合成に関与するＰＫＳを修飾することによって、産生される化合物は、変更することができる。
【０１４７】
このように、修飾された機構またはＮＲＰＳ−ＰＫＳ系によって、広範囲にわたる化合物を合成することができる。
【０１４８】
合成される産物の大きさは、モジュール数を変えることによって変化させることができる。
【０１４９】
修飾された生合成機構のポリケチド／マクロラクタム産物は、抗生物質活性などの活性を呈するかまたは向上させるために、例えば、グリコシル化や他の誘導体化によって、さらに修飾されてもよい。ポリケチドをグリコシル化する方法は、当該分野において一般に公知である；適切なグリコシル化酵素を提供することによって細胞内でグリコシル化してもよく、または化学合成手段を用いてインビトロでグリコシル化してもよい。
【０１５０】
天然に存在するＢＥ−１４０１６のＮＲＰＳ−ＰＫＳ系の様々な誘導体（または類似体）をコードする核酸分子ひいてはポリケチド・マクロラクタムをベースとした様々な化合物をコードする核酸分子を得るためには、酵素活性をコードする部分を「混合し、マッチさせる」ことによって、所望する多くの構造物を得ることができ、天然の宿主の核酸分子／遺伝子群またはその一部に、突然変異を導入することができる。
【０１５１】
従来技術を用いて天然の配列を突然変異させることができる。突然変異用の基質は、遺伝子のすべての群または遺伝子の１個か２個だけであり得る；突然変異用の基質も、これら遺伝子の１以上の部分であってよい。突然変異させる技術は、当該分野において周知であり、文献に記載されている。このような技術として、突然変異を含む合成オリゴヌクレオチドを調製すること、および制限エンドヌクレアーゼ消化を用いて遺伝子に突然変異した配列を挿入することが挙げられる。あるいは、天然のヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションするミスマッチプライマー（通常１５〜３０ヌクレオチドの長さ）を用いて、このミスマッチした二本鎖の融点未満の温度で、突然変異させることもできる。このプライマーは、プライマー長と塩基組成とを比較的狭い範囲内に保持し、かつ突然変異の塩基を中央に位置させることで、特異的なものとすることができる。ＤＮＡポリメラーゼ，クローン化された産物および突然変異したＤＮＡ（プライマー伸長した鎖を分離して得られ、選択されたもの）を含むクローンを用いてプライマー伸長する。この技術は、複数の点突然変異を生成することにも適用できる。ＰＣＲ突然変異誘起も、所望する突然変異をもたらす利用法として見出されるだろう。
【０１５２】
宿主遺伝子もしくはＯＲＦの酵素活性を置換したり、または宿主遺伝子もしくはＯＲＦのこれら領域の突然変異を支援したりという様々な操作をするために用いられるベクターは、得られるコード配列が宿主中で発現してもよいという形で、そのコード配列と動作可能に連結した対照配列を含むように選択することができる。しかしながら、単純なクローニングベクターを用いる方が良い場合もある。
【実施例】
【０１５３】
これから、以下の実施例において、図面を参照しながら本発明をさらに詳細に説明する。本発明は実施例に限定されるものではない。
【０１５４】
図１は、マクロラクタム抗生物質であるＢＥ−１４１０６の化学構造を示す；
図２Ａは、提唱されている、ＢＥ−１４１０６の生合成経路の開始を示す；
図２Ｂは、提唱されている、ＢＥ−１４１０６生合成の終了を示す。
【０１５５】
実施例１−分離株ＭＰ２８−１３（ストレプトミセス菌株ＤＳＭ２１０６９）の特徴付け
ＩＳＰ２寒天成長培地（ディフコ社，ＵＳＡ）上：基質菌糸は淡黄色であり、ＩＳＰ２寒天プレートと同じ色である。気中菌糸体は白く、胞子もほぼ白くてわずかに緑がかっているだけである。
【０１５６】
ＳＦＭ寒天成長培地（大豆小麦粉が２０ｇ／ｌ；マンニトールが２０ｇ／ｌ；寒天が２０ｇ／ｌ）上：基質菌糸はＩＳＰ２上のものよりベージュ色が強く、気中菌糸体および胞子はＩＳＰ２上のものと同じ色である。
【０１５７】
増殖はＩＳＰ２プレート上で２日後に見られるが、胞子形成には約２０日かかる。胞子形成は、いずれの培地でもまったく芳しくない。
【０１５８】
液体培地での増殖：ＴＳＢ液体成長培地（オキソイド社，ＵＫ）中、ガラスビーズ（３ｍｍ）とともに２２５ｒｐｍで振盪することでよく増殖する。充分な菌糸体を得るのに、２５℃で２日を必要とする。
【０１５９】
この菌株は２０℃，２５℃および３０℃で増殖するが、至適温度は約２５℃である。３０℃で胞子形成する。
【０１６０】
菌株ＤＳＭ２１０６９（分離株ＭＰ２８−１３）の１６Ｓ  ＲＮＡ遺伝子配列を配列番号４６に示す。
【０１６１】
表６は、菌株ＤＳＭ２１０６９の抗生物質に対する抵抗性を示す。
【０１６２】
【表６】
0005514185.tif 000015
【０１６３】
実施例２−ＢＥ−１４１０６生合成遺伝子群用プローブの生成
ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いてＤＳＭ２１０６９（ＭＰ２８−１３）から全ＤＮＡを単離した。Izumikawaら（(2003) Bioorg. Med. Chem., 11, 3401-3405）に記載の縮重したプライマーであるＫＳＭＡ−Ｆ（５’−ＴＳ  ＧＣＳ  ＡＴＧ  ＧＡＣ  ＣＣＳ  ＣＡＧ  ＣＡＧ−３’［配列番号４７］）およびＫＳＭＢ−Ｒ（５’−ＣＣ  ＳＧＴ  ＳＣＣ  ＧＴＧ  ＳＧＣ  ＣＴＣ  ＳＡＣ−３’［配列番号４８］）を用いて、β−ケトアシルシンターゼ（ＫＳ）ドメインを増幅した。５０μｌの反応ミックスに、ＭＰ２８−１３から単離された全ＤＮＡ（１０〜２０ｎｇ），１×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ニュー・イングランド・バイオラボ社），４００ｎＭの各プライマー，２００μＭの各ｄＮＴＰおよび２．５ＵのＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ニュー・イングランド・バイオラボ社）を含ませた。この反応は、９５℃で５分、そして９５℃で１分，６０℃で１分および７２℃で２分の３５サイクルの後、最後に７２℃で５分伸長させることで実行した。
【０１６４】
この５０μｌの反応ミックスをゲル電気泳動し、その結果得られた約７００ｂｐのＤＮＡ断片を、ＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ（キアゲン社）を用いて精製した。精製されたＰＣＲ産物は、ＱＩＡＧＥＮ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉであるＥＺ細胞で、ｐＤｒｉｖｅベクター（キアゲン社）にクローニングした。プラスミドＤＮＡを、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）Ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を用いて形質転換体から単離した。
【０１６５】
ＱＩＡＧＥＮ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（キアゲン社，２００１年）に記載のｐＤｒｉｖｅに特異的なプライマーであるＭ１３フォワード（−２０）（５’ＧＴＡ  ＡＡＡ  ＣＧＡ  ＣＧＧ  ＣＣＡ  ＧＴ  ３’［配列番号４９］）およびＭ１３リバース（５’ＡＡＣ  ＡＧＣ  ＴＡＴ  ＧＡＣ  ＣＡＴ  Ｇ  ３’［配列番号５０］）を用いて、８個の組換えプラスミドをシークエンシングした。シークエンシングは、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ１．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社）を用いて実施した。得られた８個の配列のうち５個は互いに異なるものだった。タンパク質配列に翻訳し、ＢＬＡＳＴで検索することによって、すべての配列がＩ型ＰＫＳとマッチすることがわかった（表７を参照）。
【０１６６】
もっとも興味深い配列はｎｏ．１，３，６，７および８であった。ＰＫＳとマッチしたｎｏ．１の配列は、Ｓ．ビオラセウスニガー[S. violaceusniger]におけるメリダマイシン[meridamycin]の生合成（Sunら, 2006 Microbiol., 152, 3507-3515）に関与するものであった。ｎｏ．３，７，８の配列は、Ｓ．アトロオリバセウス[S. atroolivaceus]におけるレイナマイシンの生合成に関与するＬｎｍＪ（Chengら, 2003 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 3149-3154）とマッチした。ｎｏ．６の配列は、Ｓ．ハルステデイ[S. halstedii]における、マクロラクタムであるビセニスタチン[vicenistatin]の生合成に関係するＶｉｎＰ１（Ogasawaraら, 2004 Chem. & Biol., 11, 79-86）と強くマッチし、またＳ．アベルミチリス[S. avermitilis]における、マクロライドであるアベルメクチンの生合成に関係するＡＶＥＳ２（Ikedaら, 1999 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 9509-9514）にも強くマッチした。
【０１６７】
ｎｏ．６の配列（配列番号５１）を、ＤＳＭ２１０６９（ＭＰ２８−１３）のために構築されたゲノムライブラリをスクリーニングするためのプローブとして選択した。ＰＣＲ  ＤＩＧ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ロシュ・アプライド・サイエンス社）および上記のＭ１３プライマーを用いて、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識プローブを作製した。ｎｏ．６の配列を含むプラスミドを鋳型として用いた。この反応は、９５℃で３分、そして９５℃で４５秒，４４℃で１分および６８℃で３分の３０サイクルの後、最後に６８℃で７分伸長させて実行した。その結果得られたＰＣＲ産物をゲル電気泳動し、そのＤＮＡ断片を、ＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ（キアゲン社）を用いて精製した。
【０１６８】
【表７】
0005514185.tif 000016
【０１６９】
実施例３−接合手順の最適化
ＤＳＭ２１０６９（ＭＰ２８−１３）菌株を遺伝的に修飾する手順を確立するために、Ｅ．ｃｏｌｉであるＥＴ１２５６７（ｐＳＯＫ８０４＋ｐＵＺ８００２）（Sekurovaら, 2004, J. Bacteriol., 186, 1345-1354）との接合を、Flettら（1997 FEMS Microbiol. Lett., 155, 223-229）に記載された手順に従って試験した。この手順に対して、いくらか改変した。ＯＤ600が０．４〜０．５になるまで、ドナーであるＥ．ｃｏｌｉを増殖させた。ＭＰ２８−１３の新鮮な胞子の懸濁液のみを用い、この胞子懸濁液を２×ＹＴで作製した（Sambrookら, 2000 Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, ニューヨーク, NY）。胞子およびドナー細胞を混合して、遠心分離によりペレット化し、このペレットを極少量に再懸濁して、ＳＦＭプレート２枚に塗布した。抗生物質（０．９ｍｇ／ｍｌのナリジキシン酸および１．５ｍｇ／ｍｌのアプラマイシン）を添加する前に、接合用のプレートを２４時間インキュベーションした。インキュベーションする時間およびヒートショックの温度と時間とを、その最適条件を見つけるために変えた。インキュベーション時間を２５℃、ヒートショックを５０℃で５分間とすることで最良の結果が得られた。
【０１７０】
実施例４−遺伝子失活実験
ｐＤｒｉｖｅベクターでクローニングされた、ＤＳＭ２１０６９（ＭＰ２８−１３）菌株のｎｏ．６のＰＫＳ配列を、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素を用いてこのプラスミドから切り取り、ｐＳＯＫ２０１ベクター（Zotchevら, 2000 Microbiol., 146, 611-619）のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片（３．１ｋｂ）とライゲーションし、Ｅ．ｃｏｌｉであるＤＨ５αに形質転換した。制限分析によってこの新しい構造物を確認した後、Ｅ．ｃｏｌｉであるＥＴ１２５６７（ｐＵＺ８００２）に形質転換した。上記手順に従い接合することによって、この構造物をＤＳＭ２１０６９に乗り換えさせた。ｐＳＯＫ２０１ベクターのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片（３．１ｋｂ）は、ストレプトミセスの自律複製に必要とされる遺伝因子を含んでいない。従って、ベクターのこの部分が、ＤＳＭ２１０６９の染色体ＤＮＡ断片と高いレベルで相同性を有する断片とライゲーションしなければ、トランス接合体が得られることはない。このような相同性を有すると、ベクター全体がその対応する染色体領域に統合する組換えを可能にしてしまう。このクローン化断片が遺伝子の開始コドンまたは終止コドンを含まない場合、このような統合は、遺伝子破壊に繋がることになり、遺伝子の染色体コピーを効率的に失活させる。
【０１７１】
トランス接合体がたった１つ得られ、それをＢＥ−１４１０６産物であるか解析した。ＢＥ−１４１０６産物が観察されなかったことから、ｎｏ．６の配列がＢＥ−１４１０６生合成遺伝子群に帰属することが確かめられた。
【０１７２】
実施例５−ゲノムライブラリの構築
メーカーの使用説明書（ストラタジーン社，２００５年）に従って、ＤＳＭ２１０６９のゲノムライブラリを、コスミドベクターであるＳｕｐｅｒＣｏｓ１（ストラタジーン社）に構築した。Ｋｉｒｂｙミックス手順（Kieserら, 2000 Practical Streptomyces Genetics, The John Innes Foundation, ノリッジ, イギリス）に従ってＤＳＭ２１０６９からゲノムＤＮＡを単離し、ＭｂｏＩで部分的に消化し、ＸｂａＩ，ＣＩＡＰおよびＢａｍＨＩで処理したＳｕｐｅｒＣｏｓ１とライゲーションする前に、脱リン酸化した。ライブラリを構築するために、Ｅ．ｃｏｌｉであるＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲ（ストラタジーン社）を宿主として用いた。
【０１７３】
実施例６−ゲノムライブラリのスクリーニング
このライブラリを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むルリア−ベルターニ（ＬＢ）寒天プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）  Ｌｏｗ  Ｐｒｏｆｉｌｅ  Ｓｑｕａｒｅ  ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｄｉｓｈ）に塗布し、プレート１枚当り〜２０００個のコロニーが得られた。Ｇｅｎｅｔｉｘ  ＱＰｉｘＩＩ  Ｃｏｌｏｎｙ  Ｐｉｃｋｅｒを用いて２３０４個のコロニーを選定し、ＬＢブロスを含む９６ウェルプレート（ヌンク社）２４枚に移した。２４枚の９６ウェルプレートはＲｅｄｕｃｅｄ  Ｈｉ＋ＹＥ培地（各ウェルに１２０μｌ）を含んでいる。このウェルプレートを、終夜３０℃で振盪（９００ｒｐｍ）してインキュベートした。最終濃度が１５％（ｖ／ｖ）になるよう２４枚のＬＢプレートにグリセロールを添加した後、−８０℃で保存した。
【０１７４】
Ｔｅｃａｎ  Ｇｅｎｅｓｉｓ  ＲＳＰ  ２００ロボット液体ハンドリングシステムを用いて、２４枚のＲｅｄｕｃｅｄ  Ｈｉ＋ＹＥプレートの培養液を３８４ウェルプレート（ヌンク社）６枚に移した後、Ｇｅｎｅｔｉｘ  ＱｐｉｘＩＩ  Ｃｏｌｏｎｙ  Ｐｉｃｋｅｒを用いて、フィルタに押し付けた（複製として４枚のフィルタに押し付けた）。４枚の複製フィルタを得るために、この方法を４回繰り返した。無菌フード下で２０分間このフィルタを乾燥した。
【０１７５】
１０％のＳＤＳで飽和させた３ＭＭワットマン濾紙上にこのフィルタを５分間置くことで培養液を溶解させた。ＮａＯＨ／Ｃｈｌｏｒｉｄｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（１．５ＭのＮａＣｌ，０．５ＭのＮａＯＨ）で飽和させた３ＭＭワットマン濾紙上に１０分間置くことでＤＮＡを変性させ、Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌ  Ｂｕｆｆｅｒ（３ＭのＮａＣｌ，１ＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ  ７．４）で１０分間中和させた。最後に、コロニー破片を除去するために、２×ＳＳＣＰ  Ｂｕｆｆｅｒ（２×ＳＳＣ＋０．１％（ｗ／ｖ）のピロリン酸ナトリウム）中に浸し、８０℃で２時間乾燥させた。ハイブリダイゼーションを始めるまで、このフィルタを４℃で保存した。ＤＳＭ２１０６９から得られたプローブを用いて、ＤＩＧ  Ｓｙｓｔｅｍ（ロシュ・アプライド・サイエンス社）に記載されているように、ハイブリダイゼーションを実施した。フィルタをＸ線フィルムに曝すことによって、コスミドの候補を３個同定し、−８０℃で保存したＬＢプレート上の、これらに対応する宿主を用いて、再び画線を引くことができた。
【０１７６】
Ｗｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を用いて、終夜培養したものからコスミドＤＮＡを単離し、挿入部位の両末端と結合するコスミド領域に合わせて設計したプライマー（ＳｕｐｅｒＣｏｓ＿ｆｏｒｗ；５’ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＡＡＴ  ＴＡＡ  ＣＣＣ  ＴＣＡ  Ｃ３’［配列番号５２］およびＳｕｐｅｒＣｏｓ＿ｒｅｖ；５’ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＡＴＡ  ＡＴＡ  ＣＧＡ  ＣＴＣ  ＡＣ３’［配列番号５３］）を用いて末端シークエンシングした。ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ１．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、シークエンシングを実施した。結果を表８に示す。
【０１７７】
【表８】
0005514185.tif 000017
【０１７８】
この結果から、コスミド１が群の一端を、コスミド３がもう一端を含むかもしれないことが示された。末端シークエンシングのためにプライマーを設計し、これらのプライマーを他のコスミドをシークエンシングするために用いて、３個のコスミドが任意の重複配列を含むか見るための試験をした。これらの結果から、コスミド２およびコスミド３は重複するが、コスミド１は、コスミド２および３と一切重複していなかったことがわかった。群の失われた一部のための新しいプローブを増幅するために、コスミド２を末端シークエンシングするフォワードプライマーを設計した。ＰＣＲ  ＤＩＧ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ロシュ・アプライド・サイエンス社）を用いて、コスミド２を鋳型としてジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識プローブを作製した。この反応は、９５℃で５分、そして９５℃で１分，６０℃で１分および７２℃で２分の３５サイクルの後、最後に７２℃で５分伸長することで実行した。この結果得られたＰＣＲ産物をゲル電気泳動し、このＤＮＡ断片をＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ（キアゲン社）を用いて精製した。新しいプローブとハイブリダイゼーションするために複製フィルタの１枚を用いて、新規なコスミドの候補を２個同定した（コスミド４および５）。他のコスミドを用いた、末端シークエンシングおよび中間シークエンシングによる工程を繰り返し、コスミド４がコスミド１および２の両方と重複することがわかった。
【０１７９】
実施例７−ＢｅｃＡ機能の確認
コスミド１〜４に含まれる遺伝子群がＢＥ−１４１０６産生に関与するか確認するために、もう一つの遺伝子失活実験を実施した。コスミド用の１つのプライマー（ＳｕｐｅｒＣｏｓ＿ｆｏｒｗ［配列番号５２］またはＳｕｐｅｒＣｏｓ＿ｒｅｖ［配列番号５３］）およびＫＳドメイン用の１つの縮重プライマー（ＫＳＭＡ−Ｆ［配列番号４７］またはＫＳＭＢ−Ｒ［配列番号４８］）を用いて、コスミド２および３からＰＫＳ断片を増幅した。コスミド２から１．２ｋｂの断片が、コスミド３から３．７ｋｂの断片が得られた。上記のｐＤｒｉｖｅおよびｐＳＯＫ２０１に両方の断片をクローニングし、接合によって得られた構造物をＭＰ２８−１３内に移した。コスミド２の断片について、トランス接合体は１個しか得られなかった。コスミド３の断片について、いくつかのトランス接合体が得られ、さらなる分析のため６個を選定した。
【０１８０】
【表９】
0005514185.tif 000018
【０１８１】
コスミドの中間シークエンシングおよび遺伝子失活実験の結果に基づき、コスミド１，２，３および４をシークエンシングした。
【０１８２】
実施例８−ＢＥ−１４１０６の産生，精製および同定
ＭＰ２８−１３の培養
標準的な植菌物の調製
植菌物：ブドウ糖を補充した５０ｍｌの修飾ＴＳＢ培地（表９に組成を示す）を有する振盪フラスコ（２５０ｍｌ，邪魔板付き）に、寒天プレートの胞子を移した。振盪フラスコの剪断力を増すために、３ｍｍのガラスビーズを３ｇ添加した。
培養： この培養物を２５℃で３日間、２２５ｒｐｍでインキュベーションした（Ｉｎｆｏｒｓ  Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ振盪培養機，環状運動，振幅２．５ｃｍ）。
保存： １５％の濃度となるようにグリセロールを培養物に添加した。この混合物を、凍結用バイアル[cryo vial]に移し、−８０℃で保存した。
【０１８３】
産生のための前培養の調製
植菌物：１．５ｍｌの標準的な植菌物を、ブドウ糖を補充した５０ｍｌの修飾ＴＳＢ培地（表１０に組成を示す）および３ｇの３ｍｍガラスビーズを有する振盪フラスコ（２５０ｍｌ，邪魔板付き）に移した。
培養：この培養物を２５℃で２日間、２００ｒｐｍでインキュベーションした（Ｉｎｆｏｒｓ  Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ振盪培養機，環状運動，振幅２．５ｃｍ）。
【０１８４】
産生培養
植菌物：産生のための前培養物３ｍｌを、ブドウ糖を補充した１００ｍｌの０．３×ＢＰＳ培地（表１１に組成を示す）および５ｇの３ｍｍガラスビーズを有する振盪フラスコ（５００ｍｌ，邪魔板付き）に移した。
培養：この培養物を２５℃で２日間、２００ｒｐｍでインキュベーションした（Ｉｎｆｏｒｓ  Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ振盪培養機，環状運動，振幅２．５ｃｍ）。
【０１８５】
産生に用いる培地の組成
【０１８６】
【表１０】
0005514185.tif 000019
【０１８７】
【表１１】
0005514185.tif 000020
【０１８８】
これら成分を予め加熱した水に加え、培地をオートクレーブする前に１０分間膨張させた。オートクレーブ後、ｐＨ指示薬としてフェノールレッドを用いる場合にｐＨ＝７でオレンジ色が発色するまで、ＨＣｌまたはＮａＯＨを用いて培地のｐＨを調整した。
【０１８９】
ＢＥ−１４１０６の精製
細胞集団の回収およびホモジナイゼーション
産生培養物中の細胞集団を遠心分離で回収し、凍結乾燥した。凍結乾燥したペレットを、磁鉄ビーズを用いて微細なペレットになるまでホモジナイゼーションした。
【０１９０】
ＢＥ−１４１０６の粗精製
凍結乾燥した細胞のペレットを、２４０ｍｌのメタノ−ル／ｇで１時間抽出した。剪断力が増すようガラスビーズを添加した。細胞ペレットを遠心分離によって除去した後、不溶物をすべて除去するため濾過した。透明な上澄み液を水に添加し、ＢＥ−１４１０６を沈殿させるため、約３０分間氷上に置いた。沈殿物を遠心分離して回収して、残留するメタノールを除去するために水で洗浄し、凍結乾燥した。凍結乾燥産物は、粗生成物に相当する。
【０１９１】
粗生成物の分取用ＨＰＬＣ精製
粗生成物をＤＭＳＯに溶解し、逆相カラムで精製した。
【０１９２】
調製方法：ＢＩＯＰ  ＰＲＥＰ  ＢＥ１４１０６＿ＫＦＤ．Ｍ
ＨＰＬＣ系：分別捕集系[fraction collection system]を有するＡｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズ分取用ＨＰＬＣ
カラム：ＰＲＥＰ−Ｃ１８，１０μｍ，５０×２５０ｍｍ（ＰＮ４１０９１０）
カラム温度：室温
移動相：１０ｍＭの酢酸アンモニウム  ｐＨ４．０（Ａ）およびメタノール（Ｂ）。
【０１９３】
【表１２】
0005514185.tif 000021
【０１９４】
溶出液フロー：８５ｍｌ／分
画分を１％の２Ｍ  ＮＨ3溶液に添加し−２０℃で保存した。
【０１９５】
分取用ＨＰＬＣ画分の産物濃度
画分中のメタノールのほとんどを、ロータリ真空エバポレータを用いて５０℃で蒸発させた。ＢＥ−１４１０６を含む残りの水相を、沈殿収率を上げるために凍結し、沈殿物を遠心分離してペレット化した。このペレットを水で洗浄し、凍結乾燥して、終末産物が得られた。
【０１９６】
分取用ＨＰＬＣで精製されたＢＥ１４１０６のＬＣ−ＤＡＤ−ＴＯＦ分析
ＬＣ−ＤＡＤ−ＴＯＦによる純度の計算
分取用ＬＣによる精製後のＢＥ−１４１０６は、ＵＶおよびＴＯＦデータからわかるように、２９１ｎｍで吸収する検体に含まれる化合物の＞９９％を構成することがわかった。汚染物質の吸光係数はＢＥ−１４１０６と同じであるとみなされる。
【０１９７】
ＢＥ−１４１０６のＴＯＦ−ＭＳデータ
ＴＯＦ−ＭＳによって、精製されたＢＥ−１４１０６のＬＣＴＯＦプロットが得られる。ＢＥ−１４１０６（Ｃ27Ｈ73ＮＯ3）の理論的で正確なｍ／ｚ（陰イオン）が４２２．２７０１であることが、これからわかる。このｍ／ｚは、許容し得る精度で観測され、４２２のピークは、ヘプタエンのＵＶピークとよく相関する。
【０１９８】
ＬＣＴＯＦ方法：ＢＩＯＰ  ＢＥ１４１０６  ＳＥ．Ｍ
カラム：Ｚｏｒｂａｘ  Ｂｏｎｕｓ−ＲＰ  ２．１×５０ｍｍ，３．５μｍ（アジレント・テクノロジー社）。
移動相Ａ：    １０ｍＭの酢酸アンモニウム（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ−Ｈａeｎ  Ｃａｔ＃：３４６７４),
移動相Ｂ：１００％のアセトニトリル特級品（Ｌａｂｓｃａｎ  ＵＮ１６４８）
フロー：０．３ｍｌ／分
カラム温度：  室温
【０１９９】
【表１３】
0005514185.tif 000022
【０２００】
ＴＯＦ−ＭＳパラメータ：
ＡＰＩ−ＥＳの陰イオン化
乾燥ガス：                  １０ｌ／分
噴霧器圧：                  ４０ｐｓｉｇ
乾燥ガス温度：              ３５０℃
キャピラリ電圧：            ３０００Ｖ
フラグメンター[fragmentor]：２００Ｖ
実施例９−ＤＳＭ２１０６９菌株の抗真菌活性の特徴付け
ＤＳＭ２１０６９菌株が抗真菌活性を産生するか調べた。ＰＭ２培地（Bredholtら, 2008, Marine Drugs, 6(1) pp. 12-24）で７日間２５℃という条件で増殖させたら、抗真菌活性が強くなった。培養後、培地を乾燥させて、ＤＭＳＯで抽出した。濾過後、指標生物としてカンジダ・アルビカンスＣＣＵＧ３９４３およびＣ．グラブラタ[C. glabrata]ＣＣＵＧ３９４２の菌株を用いるロボット・バイオアッセイ手順において、ＤＭＳＯ抽出物を検体として用いた。後者の菌株はポリエン抗生物質に対して高いレベルで抵抗性を有する一方で、Ｃ．アルビカンス菌株はポリエンに感受性を有する。このバイオアッセイで用いる培地は、ＡＭ１９（Ｂ）（９．４ｇ／ｌのペプトン［オキソイド社］，４．７ｇ／ｌの酵母エキス［オキソイド社］，２．４ｇ／ｌの牛肉エキス［ディフコ社］，１０ｇ／ｌのブドウ糖［ＢＤＨ社］，蒸留水）であった。
【０２０１】
興味深い生理活性を有するＤＭＳＯ抽出物の検体を、ダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）およびフラクションコレクタを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＨＰＬＣ系を用いて分画した。２種類の異なる型のＬＣカラム：Ａｇｉｌｅｎｔ  ＺＯＲＢＡＸ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ１８，５ｕｍ，４．６×１５０ｍｍおよびＡｇｉｌｅｎｔ  ＳＢ−ＣＮ  ３．５ｕｍ，４．６×７５ｍｍを用いて、各検体を並行して分画した。両方の型のカラムにおいて、脱イオン水およびアセトニトリル中０．００５％の蟻酸の混合物１ｍｌ／分のフローを、移動相として用いた。いずれの場合においても、最初の１分間はアセトニトリル濃度を４０％に保った後、次の９分間は４０％から９５％まで線形に増加させて、残りのランは９５％の濃度に保った。注入から１分後から１３分まで、溶出液の１２画分を回収するためにフラクションコレクタを用いた。
【０２０２】
この検体をＳｐｅｅｄＶａｃ装置（サーモサイエンティフィック社）で乾燥し、ＤＭＳＯに溶解して、画分の生理活性を測定した（上記の分析）。
【０２０３】
生理活性を有する画分を、ダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）および飛行時間（ＴＯＦ）質量分析計を接続したＡｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＨＰＬＣ系を用いて分析した。上記したこの分析において、同じカラムおよび緩衝液を分画段階に用いた。陰の（ＥＳＩ−）モードでエレクトロスプレーイオン化を実施した。分画した化合物中の生理活性化合物およびＬＣ−ＭＳ−ＴＯＦ分析の生理活性化合物の近似の保持時間を同定するためにＤＡＤプロットを用いた。生理活性検体の並行した分画（Ｃ１８およびＣＮカラム）から同定した顕著なピークに対応する分子量を比較し、Ｃ１８カラムおよびＣＮカラムの画分に共通する分子量を同定した。生理活性を有し、予め特徴付けられた化合物を検索するため、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓのオンライン版（http://dnp.chemnetbase.com/）にこれらの分子量（１０ｐｐｍのウィンドウ）を提出した。
【０２０４】
生理活性画分のＬＣＭＳ分析において、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ＢＥ１４１０６に対応する分子量を有する顕著なピークを同定した。ＬＣ−ＭＳ−ＴＯＦ分析で観測された分子量は、ＤＮＰ（正確な分子量４２３．２７７３４４）で得られる分子量の１ｐｐｍ以内にあった。加えて、これら抽出物のＤＡＤ分析結果を、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ＢＥ１４１０６のＵＶ吸光度スペクトルに係るＤＮＰで得られる情報と比較した。ＤＮＰで得られるデータと抽出物から同定された化合物のＤＡＤ分析結果とに良好な相関が見られた。
【０２０５】
実施例１０−ＢｅｃＩ，ＢｅｃＯ，ＢｅｃＲ，ＢｅｃＣおよびＢｅｃＰの機能の特徴付け
ＢＥ−１４１０６生合成における特定の遺伝子の役割を検証するために、一連の遺伝子失活実験を実施した。上記（実施例７）のとおり、コスミド２および３の、ＰＣＲで増幅した断片を用いて遺伝子失活実験も行った。これら断片のシークエンシングおよびＢＥ−１４１０６群との比較によって、これら断片両方が、ｂｅｃＡ遺伝子の一部、モジュール２のＫＳおよびＡＴドメインをコードする１．１ｋｂ断片およびモジュール２のＫＳ，ＡＴおよびＤＨドメインをコードする３．７ｋｂ断片であることが示された。両方の変異体において、ＢＥ−１４１０６が明らかに産生された（表９）。
【０２０６】
遺伝子失活実験のためのベクターの構築
ｂｅｃＩ置換ベクター：コスミド２由来のＢｇｌＩＩ−ＫｐｎＩ断片（３．６３ｋｂ）を、ＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩで消化されたｐＧＥＭ３Ｚｆ（−）にクローニングした結果、構造物であるｐＢＩＲ１が得られた。この構造物からＮｒｕＩ−ＦｓｐＡＩ断片（０．８ｋｂ）を除去し、この構造物を再度ライゲーションした結果、構造物であるｐＢＩＲ２が得られた。新しい構造物からＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（２．８６ｋｂ）を切り取り、ｐＳＯＫ２０１由来のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（３．１１ｋｂ）とライゲーションした結果、ｂｅｃＩ置換ベクターであるｐＢＩＲ３が得られた。
【０２０７】
ｂｅｃＯ置置換ベクター：コスミド４由来のＳｐｈＩ断片（１４．７７ｋｂ）を、ＳｐｈＩで消化されたｐＧＥＭ３Ｚｆ（−）にクローニングした結果、構造物であるｐＢＯＲ１Ａが得られた。ｐＢＯＲ１ＡからＳｐｈＩ−ＸｂａＩ断片（３．７１ｋｂ）を切り取り、ＳｐｈＩ−ＸｂａＩで消化されたｐＧＥＭ３Ｚｆとライゲーションし、構造物であるｐＢＯＲ１Ｂを得た。ｐＢＯＲ１Ｂ由来のＥｃｏＮＩ−ＡｇｅＩ断片（６．３７ｋｂ）の末端を埋めるためにＫｌｅｎｏｗ処理し、再びライゲーションして、構造物であるｐＢＯＲ２を得た。構造物であるｐＢＯＲ２からＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（３．２３ｋｂ）を切り取り、ｐＳＯＫ２０１由来のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（３．１１ｋｂ）とライゲーションした結果、ｂｅｃＯ置換ベクターであるｐＢＯＲ３が得られた。
【０２０８】
ｂｅｃＲ置換ベクター：コスミド１由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片（４．３５ｋｂ）を、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩで消化されたｐＧＥＭ３Ｚｆ（−）にクローニングした結果、構造物であるｐＢＲＲ１が得られた。ｐＢＲＲ１からＳｎａＢＩ−ＢｓａＢＩ断片（０．４ｋｂ）を除去し、再度ライゲーションした結果、新しい構造物であるｐＢＲＲ２が得られた。構造物であるｐＢＲＲ２由来のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（３．９６ｋｂ）を、ｐＳＯＫ２０１由来のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（３．１１ｋｂ）とライゲーションした結果、ｂｅｃＲ置換ベクターであるｐＢＲＲ３が得られた。
【０２０９】
ｂｅｃＣ置換ベクター：コスミド４由来のＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片（５．２４ｋｂ）を、ＢａｍＨＩ−ＳａｃＩで消化されたｐＧＥＭ３Ｚｆ（−）にクローニングし、構造物であるｐＢＣＲ１が得られた。ｐＢＣＲ１由来のＮｏｔＩ−Ａｃｃ６５Ｉ断片（７．４８ｋｂ）の末端を埋めるためＫｌｅｎｏｗ処理し、ライゲーションして、構造物であるｐＢＣＲ２を得た。構造物であるｐＢＣＲ２からＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（４．３３ｋｂ）を切り取り、ｐＳＯＫ２０１由来の３．１１ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片とライゲーションした結果、ｂｅｃＣ置換ベクターであるｐＢＣＲ３が得られた。
【０２１０】
ｂｅｃＰ置換ベクター：コスミド４由来のＳａｃＩ−ＳｐｈＩ断片（６．４９ｋｂ）を、ＳａｃＩ−ＳｐｈＩで消化されたｐＧＥＭ３Ｚｆ（−）にクローニングした結果、構造物であるｐＢＰＲ１Ａが得られた。ｐＢＰＲ１ＡからＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｃｌＩ断片（３．７４ｋｂ）を切り取り、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩで消化されたｐＬＩＴＭＵＳ２８とライゲーションした結果、構造物であるｐＢＰＲ１Ｂが得られた。ｐＢＰＲ１Ｂ由来のＸｍｎＩ−ＢｂｖＣＩ断片（５．８５ｋｂ）の末端を埋めるためにＫｌｅｎｏｗ処理し、再度ライゲーションして、構造物であるｐＢＰＲ２が得られた。ｐＢＰＲ２由来のＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩ断片（１．８２ｋｂ）とＨｉｎｄＩＩＩ−ＡｐａＩ断片（１．２３ｋｂ）とを、ｐＳＯＫ２０１由来のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（３．１１ｋｂ）とライゲーションした結果、ｂｅｃＰ置換ベクターであるｐＢＰＲ３が得られた。
【０２１１】
ＥＴ１２５６７（ｐＵＺ８００２）に導入した後、Ｆｌｅｔｔら，１９９７年（FEMS Microbiol. Lett., 155, pp, 223,-229）に記載の手順に従って、置換ベクターのすべてを、ストレプトミセス種であるＤＳＭ２１０６９との接合に用いた。ただし、このドナー細胞をＯＤ600が０．４〜０．５になるまで増殖させ、ヒートショックの時間を５分まで減じた。抗生物質を２４時間のインキュベーション後に添加した。
【０２１２】
ＢｅｃＲは、当初、ＢｅｃＡによって作られたＣ２０〜Ｃ２５アシル側鎖とマクロラクタム環とをともに連結するという役割を果たすと推定されていた。ＢＥ−１４１０６を産生するか、発酵抽出物のＬＣ−ＭＳによって変異体（サザンブロット分析によって確認された）を試験した。ΔｂｅｃＲ変異体ではＢＥ−１４１０６の産生に影響されなかったことから、ＢｅｃＲは生合成に関与しないことがわかった。
【０２１３】
ＢｅｃＲの役割に加えて、ＢＥ−１４１０６の生合成におけるＢｅｃＩ，ＢｅｃＣおよびＢｅｃＰの役割についても疑問があり、Ｃ−８ヒドロキシラーゼとしてのＢｅｃＯの示唆される役割について確かめる必要があった。二次的な交差変異体は、上記ベクターを用いて遺伝子すべてから得られ、サザンブロット分析によって確認された。各突然変異株がＢＥ−１４１０６を産生するか、発酵抽出物のＬＣ−ＭＳで試験した。ΔｂｅｃＯ変異体について、示唆される８−デオキシＢＥ−１４１０６の化学量論的式（Ｃ27Ｈ37ＮＯ2）に対応する予想される分子量は、理論的な分子量との違いが１．０ｐｐｍであることがわかった。これによって、ＢｅｃＯがＢＥ−１４１０６をヒドロキシル化するＰ４５０モノオキシゲナーゼという役割を有することを確認した。Ｃ−９のヒドロキシル基は、マクロラクタム環の生合成に関係するＰＫＳのＢｅｃＥのＤＨドメイン活性が欠如することによって現れることから、Ｃ−８の炭素は、ＢｅｃＯが唯一標的としそうなものに相当する。
【０２１４】
ΔｂｅｃＩ，ΔｂｅｃＣおよびΔｂｅｃＰ変異体による発酵抽出物のＬＣ−ＭＳ分析はすべてＢＥ−１４１０６が完全に産生されないことを示し、推定されるＢＥ−１４１０６類似体／前駆体を確認することができなかった。これは、３個の酵素すべてが生合成の極めて早い時期に機能することを示し、おそらくスターターアミノアシルユニットの合成に関与するものと思われる。
【０２１５】
実施例１１−アミノ酸がＢＥ−１４１０６に取り込まれるか決定する供給研究
15Ｎ  Ｓｉｌａｎｔｅｓ  ＯＤ２培地（Ｓｉｌａｎｔｅｓ  ｐｒ．Ｎｏ．１０３２０２）に基づく明確な製品の培地を用いて、ＤＳＭ２１０６９の供給研究を実施した。この培地の組成は、15Ｎ  Ｓｉｌａｎｔｅｓ  ＯＤ２培地５３６ｍｌ／ｌに、ＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ，０．４；ＣａＣＯ3，５．０；（15ＮＨ4）2ＳＯ4，０．５４；ＫＨ2ＰＯ4，０．２およびブドウ糖，１０（１リットル当りのグラム数）を加えたものである。この培地に、微量元素液ＴＭＳ１（Borgosら, 2006, Arch. Microbiol., 185, pp. 165-171）３ｍｌ／ｌを補充した。標識されていないアミノ酸の取り込みは、０．１４ｇ／ｌのＤ−アスパラギンもしくは０．０６ｇ／ｌのグリシンもしくは０．１０ｇ／ｌのグルタミン酸ナトリウムを添加する、または標識されていないアミノ酸を添加しないことで試験した。上記のとおりに培養した（ただし、プレカルチャーから成分を除去するために植菌前に一度この細胞を産生培養物で洗浄したことを除く。）３％の０．５×ＴＳＢプレカルチャーに、産生培養物を植菌した。産生培養物およびプレカルチャーの両方を、上記のとおりに、ガラスビーズを有する邪魔板付き振盪フラスコの中で培養した。
【０２１６】
ＢＥ−１４１０６および８−デオキシＢＥ−１４１０６の定量的および定性的なＬＣ−ＭＳ分析を、ダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）およびＴＯＦ質量分析計に接続したＡｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＨＰＬＣ系を用いて、培養ペレット由来のメタノール抽出物について実施した。基本的には以前記載されているように（Bruheimら, 2004, Antimicrob. Agents Chemother, 48, pp. 4120-4129）、陰の（ＥＳＩ−）モードまたは陽の（ＥＳＩ＋）モードでエレクトロスプレーイオン化を実施した。ただし、以下の改変をした：ＬＣ分離をＡｇｉｌｅｎｔ  ＺＯＲＢＡＸ  Ｂｏｎｕｓ−ＲＰ  ２．１×５０ｍｍカラムで実施した。最初の１０分間はアセトニトリル濃度を４０％から７０％まで線形に上げていき、その後、残りのランは９０％の濃度で保った。ＢＥ−１４１０６の濃度は、分取用ＨＰＬＣで精製したＢＥ−１４１０６を標準として用いて、２９１ｎｍでのＵＶの吸収ピークによって決定した。
【０２１７】
生合成における取り込みを試験するために、アミノ酸添加前の培地中の窒素すべてを、15Ｎ同位元素標識した。試験されるアミノ酸は、14Ｎとして加えた。Ｄ−アスパラギンおよびグリシンに加えて、Ｌ−グルタミン酸塩を添加したものおよび余分のアミノ酸を添加しないものを、実験の対照として用いた。培地中の15Ｎアミノ酸に関連するものの濃度は次のとおりであった：アスパラギン０μＭ（アスパラギン酸５４μＭ），グリシン２９μＭ（セリン１１μＭ）およびグルタミン酸２９μＭ。標識されていない追加のアミノ酸を、15Ｎアスパラギン酸の２０×濃度，15Ｎグリシンの２７×濃度ならびにＤ−アスパラギン，グリシンおよびグルタミン酸それぞれのために15Ｎグルタミン酸の２０×濃度に加えた。産物培養物をＤＭＳＯで抽出し、抽出物をＬＣ−ＤＡＤ−ＴＯＦで分析した。ＢＥ−１４１０６分子は窒素原子を１個含むことから、添加した14Ｎアミノ酸の１つからＮが取り込まれる場合、15Ｎ標識ＢＥ−１４１０６が４２３．２８という正確な分子量（Ｍ−Ｈ）を有するのに対して、４２２．２７という正確な分子量（Ｍ−Ｈ）を有するＢＥ−１４１０６分子がＬＣ−ＴＯＦ−スペクトラムで観測されることになる。産物培養物をＤＭＳＯで抽出し、抽出物をＬＣ−ＤＡＤ−ＴＯＦで分析した。ＴＯＦ−質量スペクトルから、Ｄ−アスパラギンおよびグルタミン酸の添加による取り込み比率は、対照と同じ３％であったのに対して、標識されていないグリシンを添加した結果14Ｎが２０％取り込まれたことがわかった。
【図１】
0005514185.tif 000023
【図２】
0005514185.tif 000024
【配列表】
0005514185000001.app