(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロンガン種子粉砕物及び大豆の粉砕物に納豆菌を添加して発酵させた発酵物にシクロデキストリンを添加した混合液をセルラーゼで分解して得られた反応液中の反応物からなるチロシナーゼ阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明はチロシナーゼ阻害剤の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】紫外線による障害の一つとして日焼けやシミや皮膚がんがある。このうち、シミは皮膚のチロシナーゼが活性化されてチロシンがメラニンに変化することが原因であり、美容と健康においてシミの改善が求められている。【０００３】紫外線によるシミは肌の健康状態を損ねて皮膚癌に進展するおそれがあり、シミの生成を防止することは健康を維持するためにも必要であり、種々の美白作用を有する化粧品や健康補助食品が美白作用を追及して開発されている。【０００４】美白作用を訴求した化粧品原料としてはビタミンＣ、ビタミンＥ、トコトリエノール、過酸化水素、カテコール、アルブチンなどの抗酸化作用が優れた素材がある。一方、メラニンの生成を促進するチロシナーゼという酵素を阻害することにより、メラニン産生を抑制する物質が存在する。両者のうち、チロシナーゼ阻害作用を有する物質の方がメラニン産生を直接、抑制することから、より効果的である。【０００５】チロシナーゼ産生を阻害する物質と美白作用に関する発明としては、すでに多数認められる。まず、バクチオールを有効成分として含有することを特徴とする美白剤がある（例えば、特許文献１参照。）。しかし、このバクチオールはウシ骨の脂質由来であり、狂牛病の危険性から安全性に問題がある。【０００６】サウスレアラニセプスに属する植物の地上部からの抽出物を有効成分として含有することを特徴とするチロシナーゼ阻害剤に関する発明がある（例えば、特許文献２参照。）。しかし、その有効成分については、特定されておらず、構造も同定されていない。【０００７】水、親水性有機溶媒またはこれらの混合物によりタマリンドハスクを抽出処理して得られた抽出物を有効成分とするチロシナーゼ阻害剤に関する発明がある（例えば、特許文献３参照。）。同様に、その有効成分については、特定されておらず、構造も同定されていない。【０００８】スピロ化合物を含有することを特徴とするチロシナーゼ阻害剤に関する発明がある（例えば、特許文献４参照。）。しかし、化学合成された化合物であり、副作用もあり、産業上化粧品としては、その利用が限定される。【０００９】チロシナーゼ阻害剤、美白化粧品および変色防止剤に関する発明では、エリカのエキスである。エリカとは、ヒースとも呼ばれるツツジ科の植物であるが、このエキスでは有効成分が特定されておらず、成分の構造も解析されておらず、その働きも軽度である。【００１０】このように、植物由来のエキスについては、その作用が明確ではなく、有用成分が同定されておらず、その働きが軽度である。一方、コロイド硫酸やグルタチオンに代表される硫黄化合物については、その作用が明確ではなく、イオウによる刺激的な臭いがあり、使用が限定されている。【００１１】また、産生したメラニンを淡色漂白化するものとして、アスコルビン酸類、過酸化水素、ハイドロキノン、カテコール等が用いられてきた。【００１２】アスコルビン酸は酸化されやすく、変色して品質適に問題がある。また、過酸化水素水は安定性に乏しく、使用上の安全性に問題がある。【００１３】グルタチオンおよびコロイド硫黄は、変色や変性を起こしやすい点で問題がある。ハイドロキノンおよびカテコール類は皮膚刺激性やアレルギー性などの使用上の安全性に問題がある。これらの美白成分を化粧料等の製品に使用することは制限されており、未だ充分に満足できる美白成分やエキスは得られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【特許文献１】  特許第３９００３８８号公報
【特許文献２】  特許第３６５８５４８号公報
【特許文献３】  特許第３３４０８７８号公報
【特許文献４】  特許第３３３１０２８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】グルタチオンおよびコロイド硫黄は、変性し変色しやすい点で問題がある。ハイドロキノンおよびカテコール類は皮膚刺激性やアレルギー性などの使用上の安全性に問題がある。【００１５】一方、天然由来の物質についてその安全性は高いものの、その効果が軽度であるという問題がある。【００１６】そこで、副作用が弱く、メラニン分解作用を呈する物質が望まれている。【００１７】この発明は上記のような従来技術に存在する問題点に着目してなされたものである。その目的とするところは、副作用が弱く、優れたメラニン分解作用を呈する多糖類の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】上記の目的を達成するために、請求項１に記載の発明は、メラニン分解作用を呈する多糖類の製造方法に関するものである。【００２０】この発明は、以上のように構成されているため、次のような効果を奏する。【００２１】請求項１に記載の製造方法によれば、メラニン分解作用を呈する多糖類を効率良く製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】以下、この発明を実施するための最良の形態について詳細に説明する。【００２３】メラニン分解作用を呈する多糖類とはマクロファージや皮膚のランゲルハンス細胞に働き、メラニン分解酵素を誘導する多糖類である。【００２４】さらに、この多糖類は免疫調整作用を呈することからアレルギーの抑制にも働く。【００２５】この多糖類の製造方法はロンガン種子粉砕物及び大豆の粉砕物に納豆菌を添加して発酵させた発酵物にシクロデキストリンを添加しプロテアーゼ処理を行い、さらに、セルラーゼで分解する工程からなる。【００２６】ロンガンとは、学名Ｅｕｐｈｏｎｉａ  ｌｏｎｇａｎａであり、竜眼、龍眼、リュウガンとも言われる果実である。ムクロジ科ロンガンン属の樹木のことであり、これはインド原産であり、現在、タイやマレーシアなどの東南アジア、熱帯アメリカ、ブラジルなどの南米、日本や台湾、中国にも生息している。その果肉は無色半透明のゼリー状である。甘く、果実として利用されている。【００２７】乾燥したロンガンは東南アジアを中心として薬膳料理や漢方薬として利用されている。ロンガンの果実の中には、黒から濃紫色の種子が入っている。ロンガンの種子についても、東南アジアでは民間薬として食経験も豊富である。【００２８】しかし、ロンガンの種子は全てが民間薬としては利用されず、その大半は廃棄されており、農業廃棄物として農家の負荷となっている。この種子を原料として抽出、又は、精製することは廃棄物を有効に利用し、廃棄物の量を軽減することから環境上も好ましい。【００２９】まず、ロンガンの種子は粉砕される。粉砕工程には、粉砕機として株式会社奈良機械製作所製の自由ミル、スーパー自由ミル、サンプルミル、ゴブリン、スーパークリーンミル、マイクロス、減圧乾燥機として東洋理工製の小型減圧乾燥機、株式会社マツイ製の小型減圧伝熱式乾燥機ＤＰＴＨ−４０、エーキューエム九州テクノス株式会社製のクリーンドライＶＤ−７、ＶＤ−２０などが用いられる。【００３０】ここで用いる大豆は、日本産、中国産、アメリカ産、ブラジル産のいずれの産地のものでも、用いられる、また、遺伝子組み換え体も、用いることはできる。この大豆も前述の粉砕機により粉砕することは、発酵を効率的に実施できる点から好ましい。【００３１】ここでいう納豆菌とは、納豆や食品の加工用に用いられる枯草菌の一種である。納豆素本舗製の納豆菌は発酵に適していることから、好ましい。【００３２】前記の発酵に関するそれぞれの添加量は、ロンガン種子の粉砕物１重量に対して、大豆の粉砕物は１〜４重量が好ましく、納豆菌は０．００１〜０．０５重量が好ましい。また、前記の発酵は清浄な培養用タンクで実施され、水道水や精製水により前記の材料を事前に混合することは好ましい。【００３３】この発酵は、３４〜５６℃に加温され、発酵は２８〜７２時間行われる。発酵後に、以下のアルカリ還元を効率良く実施するために、水道水で希釈される。【００３４】この発酵工程により、ロンガン種子中の糖類とタンパク質と脂質が納豆菌の酵素により分解されて低分子化される。【００３５】得られた発酵液にはシクロデキストリンが添加される。その働きの点からアルファタイプのシクロデキストリンが好���しい。【００３６】発酵物の１重量に対してシクロデキストリンの添加量は０．１〜０．５重量が好ましい。【００３７】この混合物は２０〜４０度に加温されることが好ましい。【００３８】前記の攪拌後、上層に分離した溶媒の層を採取し、その水分を除去することは好ましい。水分を除去するために、東洋技研製ＴＧＤ−２５０ＬＦ２などの乾燥機が用いられる。【００３９】シクロデキストリンにより低分子化された糖類が吸着し、未反応の糖類や脂質は排泄される。【００４０】このシクロデキストリンとの結合体はセルラーゼにより分解され、目的とする多糖類が抽出される。【００４１】用いるセルラーゼは例えばアマノ製薬のニューラーゼは食用としても利用でき、品質が安定していることから好ましい。【００４２】セルラーゼで分解された抽出液は加熱処理によりセルラーゼを失活させた後、凍結乾燥されて粉末化される。【００４３】さらに、精製されることは好ましい。分離用担体又は樹脂としては、表面がコーティングされた、多孔性の多糖類、酸化珪素化合物、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン、スチレン−ビニルベンゼン共重合体等が用いられる。適切な分離用溶媒により分離し、精製され、有機溶媒を除去して目的とする多糖類を得ることは好ましい。【００４４】分離用溶媒としてはメタノール、エタノール、クロロホルム、ヘキサン、酢酸エチル、ベンゼン、エーテルなどが用いられ、このうち、食品加工用エタノール又は含水エタノールはその利用範囲が高いことから好ましい。【００４５】このようにして得られたメラニン分解作用を呈する多糖類は液体又は粉末として得られる。【００４６】得られたメラニン分解作用を呈する多糖類は医薬品、食品製剤、化粧品、衛生用具、衣類や繊維などに利用される。【００４７】医薬品としては、チロシナーゼ抑制作用を目的とした美白化粧剤、皮膚がん抑制剤、局所のシミ改善用医薬品などに利用される。また、動物に用いる獣医用の医薬品やペットに用いる医薬品としても美白作用を目的とした医薬品として利用される。【００４８】食品製剤としての利用する場合は、シミ改善や美白用の食品やサプリメント、ドリンクなどに使用される。【００４９】前記の化粧品としては、チロシナーゼ抑制に起因するシミやソバカスの改善と予防を目的として美白用化粧品、医薬部外品やマッサージオイルとして利用される。【００５０】以下、前記実施形態を実施例及び試験例を用いて具体的に説明する。なお、以下の説明は例であり、形態を変化させて実施することができる。【００５１】まず、発酵により得られるメラニン分解作用を呈する多糖類について説明する。
【実施例１】
【００５２】タイのチェンマイ地方で栽培されたロンガンの種子を原料として用いた。まず、ロンガンから種子を採取し、水洗後、乾燥させた。これを粉砕機（中山技術研究所製ＤＭ−６）にて粉砕した。【００５３】このロンガン種子粉砕物１ｋｇを清浄な発酵用タンクに入れ、水道水４Ｌを添加した。一方、京都産大豆を水洗後、９０分間、３７℃に加温して、粉砕し、大豆粉砕物２ｋｇを得た。この大豆粉砕物の１．８ｋｇを前記の発酵用タンクに入れた。【００５４】これに、納豆素本舗製の納豆菌２０ｇを添加した。４３℃の温度で、攪拌しながら、４２時間発酵した。【００５５】発酵が終了したタンクに水道水２Ｌを添加した。これを発酵物とした。【００５６】この発酵液を珪藻土を敷いたろ過器に供し、ろ過した。得られたろ過液に株式会社シクロケム製のアルファシクロデキストリンを添加して３０度に２時間加温した。【００５７】これを精製水により３回洗浄し、アルファデキストリン部分を得た。これを精製水に懸濁しアマノ製薬のセルラーゼにより酵素分解した。【００５８】この反応液を９０度で１時間加温し、反応液を失活させた。これを濾過器に供して液体部分を採取して目的とするメラニン分解作用を呈する多糖類を２１３ｇ得た。これを検体１とした。【００５９】以下に、メラニン分解作用を呈する多糖類の精製物について説明する。
【実施例２】
【００６０】実施例１で得られたメラニン分解作用を呈する多糖類の１００ｇをエタノール５００ｍＬに懸濁し、三菱化学製ダイヤイオンの１ｋｇを充填したカラムに供した。これを５％エタノール含有水１３００ｍＬで洗浄した。さらに１０％エタノール含有水１０００ｍＬで洗浄後、６０％エタノール含有水４００ｍＬで溶出し、次いで８０％エタノール含有水を１Ｌで流し、この分画を採取した。【００６１】この分画を減圧乾燥機に供してエタノールと水を留去した後、日本エフディ製の凍結乾燥機によりメラニン分解作用を呈する多糖類の精製物１９ｇを得た。これを実施例２の検体とした。【００６２】以下に、メラニン分解作用を呈する多糖類の同定試験について説明する。
（試験例１）【００６３】上記のように得られた実施例２で得られたメラニン分解作用を呈する多糖類を精製エタノールに溶解し、質量分析器付き高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ、島津製作所）で分析し、さらに、核磁気共鳴装置（ＮＭＲ、ブルカー製、ＡＣ−２５０）で解析した。【００６４】その結果、実施例２の検体からは、メラニン分解作用を呈する多糖類が分析された。【００６５】また、ＨＰＬＣを用いた同定試験より、実施例１の検体１についても、前記と同様のメラニン分解作用を呈する多糖類が検出された。【００６６】以下に、メラニン分解作用を呈する多糖類のチロシナーゼ阻害作用の試験について説明する。【００６７】    （試験例２）
チロシン溶液（０．０５％濃度）に前記の検体を溶解した試料溶液０．５ｍｌとチロシナーゼ溶液（シグマ社製チロシナーゼ）の濃度６０マイクロｇ／ｍｌ溶液〕０．７ｍｌおよびリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）１．８ｍｌを混合した。【００６８】これを３７℃で１時間反応させ、４７５ｎｍにおける吸光度Ａ１を測定した。吸光度Ａ１は、チロシンから生成したメラニンの濃度に比例した。【００６９】検体無添加の場合についても同様に操作して、４７５ｎｍにおける吸光度Ａ０を測定した。【００７０】［チロシナーゼ阻害作用（％）＝（１−Ａ１／Ａ０）×１００］という計算式により、チロシナーゼ阻害作用を算出した。【００７１】検体溶液の濃度を段階的に変更して阻害作用を測定し、阻害率が５０％を示す検体濃度（ＩＣ５０値）を最小二乗法により求めた。【００７２】対照物質として、既存のチロシナーゼ阻害物質であるアルブチン、バクチオール、ビタミンＣ、過酸化水素、ハイドロキノン、カテコール、ヒースエキスを用いた。【００７３】その結果、実施例１で得られたメラニン分解作用を呈する多糖類のＩＣ５０値は、０．１３マイクロｇ／ｍｌであった。また、実施例２で得られたメラニン分解作用を呈する多糖類のＩＣ５０値は、０．０１マイクロｇ／ｍｌであった。【００７４】一方、アルブチンのＩＣ５０値は６マイクロｇ／ｍｌ、バクチオールのＩＣ５０値は１３マイクロｇ／ｍｌ、ビタミンＣのＩＣ５０値は２５マイクロｇ／ｍｌ、過酸化水素のＩＣ５０値は１１マイクロｇ／ｍｌ、ハイドロキノンのＩＣ５０値は６マイクロｇ／ｍｌ、カテコールのＩＣ５０値は５マイクロｇ／ｍｌ、ヒースエキスのＩＣ５０値は３５マイクロｇ／ｍｌであった。【００７５】これらの結果から、実施例１で得られたメラニン分解作用を呈する多糖類はビタミンＣの１００倍程度、また、実施例２で得られたメラニン分解作用を呈する多糖類は、ビタミンＣの１０００倍以上の著しいチロシナーゼ阻害作用を呈した。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明であるチロシナーゼ阻害剤は、シミやソバカスの防止及び改善に適しており、かつ、副作用は少ないことから、美容業界の発達に寄与するものである。
【００７７】
また、本発明であるチロシナーゼ阻害剤は、美しい肌を求める人々の生活の質を向上するものである。
【００７８】さらに、ロンガン種子は廃棄されていることから、農業資源の有効利用を促進し、廃棄物の量を減少させ、かつ、ロンガン栽培を介して農業の発展に貢献するものである。