(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性ポリペプチド、免疫グロブリンＦｃ領域である二量体蛋白質、及び３つの官能基を有する非ペプチド性重合体を含み、前記の非ペプチド性重合体の２つの官能基は前記の二量体蛋白質の２つのＮ−末端に共有結合し、かつ、その第３の官能基は前記の生理活性ポリペプチドに共有結合している蛋白質結合体。
【請求項２】
前記の免疫グロブリンＦｃ領域が非糖鎖化されたものである、請求項１に記載の蛋白質結合体。
【請求項３】
前記の免疫グロブリンＦｃ領域がＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメインからなる群より選択される１〜４つの相異したドメインからなる、請求項１に記載の蛋白質結合体。
【請求項４】
前記の免疫グロブリンＦｃ領域がヒンジ領域をさらに含む、請求項３に記載の蛋白質結合体。
【請求項５】
前記の免疫グロブリンＦｃ領域がＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、それらの組み合わせおよびそれらのハイブリッドのＦｃ領域からなる群より選択される、請求項１に記載の蛋白質結合体。
【請求項６】
前記の免疫グロブリンＦｃ領域がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、それらの組み合わせおよびそれらのハイブリッドのＦｃ領域からなる群より選択される、請求項５に記載の蛋白質結合体。
【請求項７】
前記の免疫グロブリンＦｃ領域が、同一起源のドメインからなる糖鎖免疫グロブリンから構成される二量体または多量体(免疫グロブリンＦｃの組み合わせ)である、請求項５に記載の蛋白質結合体。
【請求項８】
前記の免疫グロブリンＦｃ領域がＩｇＧ４  Ｆｃ領域である、請求項５に記載の蛋白質結合体。
【請求項９】
前記の免疫グロブリンＦｃ領域がヒト非糖鎖化ＩｇＧ４  Ｆｃ領域である、請求項８に記載の蛋白質結合体。
【請求項１０】
前記の非ペプチド性重合体が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルアルコールエチルエーテル、ポリ乳酸、ポリ乳酸−グリコール酸、生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の蛋白質結合体。
【請求項１１】
前記の非ペプチド性重合体がポリエチレングリコールである、請求項１０に記載の蛋白質結合体。
【請求項１２】
前記の非ペプチド性重合体の官能基がアルデヒド群、プロピオンアルデヒド群、ブチルアルデヒド群、マレイミド群およびスクシンイミド誘導体からなる群より選択される、請求項１に記載の蛋白質結合体。
【請求項１３】
前記の非ペプチド性重合体が三末端に反応アルデヒド群の官能基を有する、請求項１２に記載の蛋白質結合体。
【請求項１４】
前記の非ペプチド性重合体の三末端が、それぞれ免疫グロブリンＦｃ領域と生理活性ポリペプチドのＮ−末端、リジン残基、ヒスチジン残基およびシステイン残基から構成される群より選択される官能基に結合されている、請求項１に記載の蛋白質結合体。
【請求項１５】
前記の生理活性ポリペプチドが、ホルモン、サイトカイン、インターロイキン、インターロイキン結合蛋白質、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、構造蛋白質、リガンド蛋白質、受容体、細胞表面抗原および受容体拮抗物質からなる群より選択される、請求項１に記載の蛋白質結合体。
【請求項１６】
前記の生理活性ポリペプチドが、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン類、インターフェロン受容体類、コロニー刺激因子類、グルカコン様ペプチド類、エキセンディン−４−ペプチド類、ＡＮＰ、ＢＮＰ、ＣＮＰ、ＤＮＰ、Ｇ蛋白質共役型受容体(G-protein-coupled receptor)、インターロイキン類、インターロイキン受容体類、酵素類、インターロイキン結合蛋白質類、サイトカイン結合蛋白質類、マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、蛋白質Ａ、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖蛋白質、免疫毒素、リンポ毒素、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、アルファ−１アンチトリプシン、アルブミン、α−ラクトアルブミン、アポリポ蛋白質−Ｅ、赤血球生成因子、高糖鎖化赤血球生成因子、アンジオポエチン類、ヘモグロビン、トロンビン、トロンビン受容体活性ペプチド、トロンボモジュリン、血液因子ＶＩＩ、ＶＩＩａ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、およびＸＩＩＩ、プラズミノゲン活性因子、フィブリン−結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、蛋白質Ｃ、Ｃ−反応性蛋白質、レニン抑制剤、コラゲナーゼ抑制剤、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンギオスタチン、アンギオテンシン、骨形成成長因子、骨形成促進蛋白質、カルシトニン、インスリン、ソマトスタチン、オクトレオチド（ソマトスタチンアゴニスト）、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性因子、組織因子経路抑制剤、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子類、副甲状腺ホルモン、レラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、受容体類、受容体拮抗物質、細胞表面抗原、ウイルス由来ワクチン抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および抗体断片類からなる群より選択される、請求項１５に記載の蛋白質結合体。
【請求項１７】
前記の生理活性ポリペプチドが、ヒト成長ホルモン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、顆粒球コロニー刺激因子、赤血球生成因子、エキセンディン−４、イミダゾールアセチルエキセンディン−４ペプチド（エキセンディン−４アゴニスト）、カルシトニン、オクトレオチド（ソマトスタチンアゴニスト）、ＢＮＰおよびＦａｂ’抗体断片からなる群より選択される、請求項１６に記載の蛋白質結合体。
【請求項１８】
（１）三末端の官能基を有する非ペプチド性重合体の三末端官能基のうち、二末端官能基を免疫グロブリンＦｃ領域である二量体蛋白質のＮ−末端アミノ基に共有結合で連結する段階；
（２）前記の（１）で製造された反応混合物から非ペプチド性重合体と連結された前記二量体蛋白質を含む連結体を分離する段階；および
（３）前記の分離された連結体の非ペプチド性重合体の反対側の末端に生理活性ポリペプチドを共有結合で連結する段階を含む、生理活性ポリペプチド、免疫グロブリンＦｃ領域である二量体蛋白質、及び３つの官能基を有する非ペプチド性重合体から構成され、前記の生理活性ポリペプチドおよび二量体蛋白質が、非ペプチド性重合体を介してそれぞれ連結された、蛋白質結合体の製造方法。
【請求項１９】
前記の非ペプチド性重合体が三末端にアルデヒド官能基を有することを特徴とする、請求項１８に記載の蛋白質結合体の製造方法。
【請求項２０】
前記の段階（１）で二量体蛋白質と非ペプチド性重合体との反応モル比が１：２〜１：５である、請求項１８に記載の蛋白質結合体の製造方法。
【請求項２１】
前記の段階（３）の段階（２）で収得された二量体蛋白質を含む連結体と生理活性ポリペプチドとの反応モル比が１：０．５〜１：０．０５である、請求項１８に記載の蛋白質結合体の製造方法。
【請求項２２】
前記の段階（１）および段階（３）の反応が還元剤の存在下で行われる、請求項１８に記載の蛋白質結合体の製造方法。
【請求項２３】
前記の還元剤が、シアノ水素化ホウ素ナトリウム(NaCNBH3)、水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンホウ酸塩およびピリジンホウ酸塩からなる群より選択される、請求項２２に記載の蛋白質結合体の製造方法。
【請求項２４】
請求項１乃至１７のいずれか一項に記載の蛋白質結合体および薬学的に許容可能な賦形剤を含む、薬剤学的組成物。
【請求項２５】
請求項１８乃至２３のいずれか一項に記載の製造方法によって生成された、蛋白質結合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二量体蛋白質を用いた生理活性ポリペプチドの持続型蛋白質結合体に関する発明であって、具体的には、生理活性ポリペプチド、三末端官能基を有する非ペプチド性重合体および二量体蛋白質の領域が相互に共有結合によって連結されており、生理活性の持続性および安定性が向上された蛋白質結合体およびその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ポリペプチドは、一般的に安定性が低くて変性し易く、体内の蛋白質分解酵素によって分解されてその活性を失い、ペプチドは相対的にサイズが小さく、腎臓を介して容易に除去されるため、薬理成分としてポリペプチドおよびペプチドを含む蛋白質医薬品の血中濃度および力価を保つためには、蛋白質薬物を患者に頻繁に投与する必要がある。ところが、大部分注射剤の形態で患者に投与される蛋白質医薬品の場合、生理活性ポリペプチドおよびペプチドの血中濃度を保つために頻繁に注射を打つことになるが、これは患者に夥しい苦痛を引き起こす。
【０００３】
このような問題点を克服するために、蛋白質薬物の血中安定性を増加させ、血中薬物濃度を長期間に高く持続させて薬効を最大化しようという努力が続けられてきた。このような蛋白質薬物の持続性製剤は、蛋白質薬物の安定性を高めると共に薬物自体の力価が十分高く維持されなければならず、患者に免疫反応を誘発してはいけない。
【０００４】
蛋白質を安定させ、蛋白質分解酵素との接触を防止し、サイズが小さいペプチドの腎臓による消失を抑制するために、従来では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの溶解度の高い高分子物質をペプチドの表面に化学的に付加させる方法が使用されてきた。ＰＥＧは、標的蛋白質の特定の部位またはさまざまな部位に非特異的に結合して溶解度を高めることにより、蛋白質を安定化させ、且つ蛋白質の加水分解を防止する効果があり、しかも、深刻な副作用も起こさない。また、ペプチドの分子量を増加させ、腎臓による消失を抑制し、生理活性を持続させる。
【０００５】
例えば、国際公開公報ＷＯ２００６／０７６４７１には、ＮＰＲ−Ａに結合してｃＧＭＰの生産を活性化し、動脈内の血圧を低下させることにより、うっ血性心不全(Congestive heart failure)治療剤として使用するＢ型ナトリウム利尿ペプチド(B-type natriuretic peptide、BNP)にＰＥＧを結合し、生理活性を持続させることについて開示しており、米国特許６，９２４，２６４ではエキセンディン−４のリジン残基にＰＥＧを結合させて生体内の持続時間を増加させる方法を開示している。
【０００６】
生理活性ポリペプチドの場合は、ＰＥＧの連結体両末端に同一の蛋白質の薬物を結合させた二活性重合体を形成し、活性増加を図るか(米国特許５，７３８，８４６号)、互いに異なる種類の蛋白質薬物をＰＥＧの両末端に結合させ、同時に２つの活性を示す蛋白質(国際出願公開第ＷＯ９２／１６２２１号)も開発されたが、これらは蛋白質薬物の活性を持続させる面では明確な効果を示さなかった。
【０００７】
また、キンストラーらは顆粒球コロニー刺戟因子（Ｇ−ＣＳＦ）とヒトアルブミンをＰＥＧに結合させた融合蛋白質が増加された安定性を示すと報告した(Kinstler et al., Pharmaceutical Research 12(12):1883-1888, 1995)。しかし、Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−アルブミンの構造を有する前記文献の変形された薬物は、体内残留時間が天然型薬物を単独投与した場合に比べて約４倍に増加するのに過ぎず、血中半減期の増加が微々であり、蛋白質薬物の効果的な持続性製剤として実用化されていない。
【０００８】
このようなＰＥＧをペプチドに結合させる方法は、蛋白質の安定性を高め、生体内の持続時間を延長することができる一方、ＰＥＧの分子量が増加すればするほど生理活性蛋白質の力価が著しく低下し、蛋白質との反応性が低くなり、収率が減少するという問題がある。
【０００９】
生理活性蛋白質の生体内安定性を高める他の方法として、遺伝子組換えによって血中の安定性が高い蛋白質遺伝子と生理活性蛋白質遺伝子とを連結した後、前記の組換え遺伝子に形質転換された動物細胞などを培養して融合蛋白質を生産する方法が開発されている。
【００１０】
例えば、現在まで蛋白質の安定性増加に最も効果が高いものとして知られているアルブミンまたはその断片を遺伝子組換えによって目的とする生理活性蛋白質に結合させて生産した融合蛋白質が報告された(国際公開出願第９３／１５１９９号及び第９３／１５２００号、ヨーロッパ公開特許第４１３,６２２号)。また、ヒューマン・ゲノム・サイエンシズ(Human Genome Sciences)社が酵母から生産したインターフェロンアルファとアルブミンの融合蛋白質として開発されたアルブフェロン(商品名:Albuferon（登録商標）)とは、猿でインターフェロンの半減期が５時間から９３時間に増加させたが、変形されないインターフェロンに比べて、生体活性度が５％未満に著しく減少する問題があった(Osborn et al., J. Phar. Exp. Ther. 303(2):540-548, 2002)。
【００１１】
ペプチドの場合、ＷＯ０２／４６２２７には、組換え遺伝子技術を用いたＧＬＰ−１、エキセンディン−４およびその類似体とヒト血清アルブミンまたは免疫グロブリン断片（Ｆｃ）との融合蛋白質について開示しており、米国特許６，７５６，４８０では、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）およびその類似体と免疫グロブリン断片（Ｆｃ）との融合蛋白質について開示している。これらの方法は、低いペグ化(pegylation)収率問題と非特異性を克服することができる一方で、血中半減期の増加効果が予想より画期的ではなく、場合によっては力価が低い問題点を有している。血中半減期の増加効果を極大化するために、様々な種類のペプチドリンカーが使用されることもあるが、免疫反応を誘発する可能性がある。また、ＢＮＰのようにジスルフィド結合(disulfide bond)を有してているペプチドを用いる場合、ミスフォールディング(misfolding)の確率が高く、適用が難しいという問題点がある。
【００１２】
また、遺伝子組換え方法によるインターフェロン(大韓民国特許公開第２００３−９４６４号)、インターロイキン−４受容体、インターロイキン−７受容体または赤血球生成因子受容体(大韓民国特許登録第２４９５７２号)を免疫グロブリンのＦｃ領域と融合した形に哺乳動物で発現させることが知られており、国際特許公開ＷＯ０１／０３７３７号においては、サイトカインまたは成長因子をオリゴペプチドリンカー(linker)を介して免疫グロブリンのＦｃ断片に結合させた融合蛋白質が開示されている。また、米国特許５，１１６，９６４号は、ＬＨＲ(lymphocyte cell surface glycoprotein)またはＣＤ４蛋白質を免疫グロブリンＦｃ領域のアミノ末端またはカルボキシ末端に遺伝子組換え方法によって融合させた蛋白質を開示しており、米国特許５，３４９，０５３号は、ＩＬ−２の免疫グロブリンＦｃ領域に融合させた融合蛋白質を開示している。その他にも、遺伝子組換えによって構築されたＦｃ融合蛋白質の例として、インターフェロン−ベータまたはその誘導体と免疫グロブリンＦｃ領域との融合蛋白質(国際特許公開ＷＯ００／２３４７２号)、ＩＬ−５受容体と免疫グロブリンＦｃ領域との融合蛋白質(米国特許５，７１２，１２１号)、インターフェロンアルファと免疫グロブリンＧ４のＦｃ領域との融合蛋白質(米国特許５，７２３，１２５号)及び、ＣＤ４蛋白質と免疫グロブリンＧ２のＦｃ領域との融合蛋白質(米国特許６，４５１，３１３号)が開示された。また、免疫グロブリンＦｃ領域のアミノ酸を変形させた米国特許５，６０５，６９０号には、免疫グロブリンのＦｃ領域で、特に補体結合部位や受容体結合部位のアミノ酸を変形させたＦｃを用いて、遺伝子組換え方法によって製造されたＴＮＦＲ−ＩｇＧ１のＦｃ融合蛋白質を開示しており、このように変形された免疫グロブリンのＦｃ領域を用いた遺伝子組換え方式の融合蛋白質の製造方法は、米国特許６，２７７，３７５号、６，４１０，００８号および６，４４４，７９２号に開示されている。
【００１３】
免疫グロブリンは、抗体−依存性細胞毒性(antibody-dependent cell cytotoxicity，ADCC)または補体−依存性細胞毒性(complement dependent cytotoxicity，CDC)効果のような抗体としての機能を有しており、免疫グロブリンＦｃ領域に存在する糖鎖は、ＡＤＣＣおよびＣＤＣの効果に重要な役割を果たすと報告された(Burton D., Molec. Immun. 22，161-206，1985）。糖鎖がない場合には、免疫グロブリン自体の血中半減期は、糖鎖がある免疫グロブリンと似ているが、補体結合力および受容体結合力は、１０〜１０００倍に減少すると知られている(Waldmann H.，Eur. J. Immunol. 23，403-411，1993; Morrison S.，J. Immunol 143，2595-2601，1989）。
【００１４】
一方、米国特許６，６６０，８４３号は、免疫グロブリンのＦｃ領域と標的蛋白質とをリンカーを使用して融合させた結合体を大腸菌で遺伝子組換え方法によって生産する方法を開示している。リンカを使用した結合体の製造は、結合部位および結合される2つの蛋白質の方向性を選択して調整することができ、単量体、二量体または多量体の製造が可能であり、同種または異種形態のいずれも製造できるというメリットがある。また、前記の方法は、哺乳動物細胞を用いる方法よりも低コストで生産が可能であり、糖鎖が除去された形態で結合体を得ることができる。しかし、標的蛋白質と免疫グロブリンＦＣ領域とを大腸菌で同時に生産するため、天然型に糖鎖がある標的蛋白質には適用が困難であるだけでなく、封入体(inclusion body)を使用するので、ミスフォールディング(misfolding)の確率が非常に高いという問題がある。このような遺伝子組換え方法によって生産されたＦｃ融合蛋白質は、免疫グロブリンのＦｃ領域の特定部位、すなわち、アミノ末端またはカルボキシ末端でのみ蛋白質の融合が可能であり、同種二量体の形でのみ発現され、単量体の形態では生産が不可能であり、糖鎖化蛋白質間または非糖鎖化蛋白質間の融合だけが可能であるから、糖鎖化蛋白質と非糖鎖化蛋白質の融合は不可能であるという問題がある。また、融合によって新たに生じたアミノ酸の配列により免疫反応が誘発され得るだけでなく、リンカー部位に対する蛋白質加水分解酵素の感受性が増加され得る。
【００１５】
免疫グロブリンＦｃ領域を用いた融合蛋白質の開発において、天然型人体由来Ｆｃおよび架橋剤を用いて、標的蛋白質との結合体を得ようとする試みは、今まで報告されたところがない。また、免疫グロブリンＦｃ領域は、哺乳動物細胞または大腸菌を用いた組換え方法によって生産が可能であるが、標的蛋白質を含んでいない天然型免疫グロブリンＦｃ領域のみを、大腸菌から高収率で大量生産して持続型剤形に使用した例は、現在までに報告されたところがない。それだけでなく、このような組換え方法によって生産された大腸菌由来の免疫グロブリンＦｃ領域を使用して、架橋剤を介して標的蛋白質との結合体を生産する試みも、今まで報告されたところがない。
【００１６】
このように、生理活性ポリペプチドに高分子を結合させるさまざまな方法が試みられてきたが、従来の方法などは、ポリペプチドの安定性を向上させると、活性が著しく減少したり、安定性とは関係なく、活性だけを増加させることであるから、変形による蛋白質薬物の活性減少を最小化し、安定性の向上を同時に達成する方法の開発が依然として求められている実情である。
【００１７】
そこで、本発明者らは、増加された血中半減期と高い活性とを有する蛋白質薬物を提供するために、非ペプチド性リンカーの両末端に免疫グロブリンおよび生理活性ポリペプチドをそれぞれ結合させた蛋白質結合体を開発し、これについて出願して登録受けたことがある(大韓民国登録特許第１０−０７２５３１５号及び１０−０７７５３４３号)。このような本発明者らの前記特許文献は、すべて本願発明の参考文献として組み込まれている。
【００１８】
従来の非ペプチド性重合体の両末端に免疫グロブリンおよび生理活性ポリペプチドが結合した結合体の場合、その製造方法において、生理活性ポリペプチドと非ペプチド性重合体とを優先的に結合させた後、それに応じて製造された産物に免疫グロブリンＦｃ領域を結合させる方法によって製造しなければならなかった。しかし、これに応じる場合、所望しない不純物が多く生成され、これにより、原料の生理活性ポリペプチドが、その製造過程において多く失われ、工業的な生産時に非経済的であり、製造された結合体をやや複雑な方法によって精製しなければならないという欠点を有している。また、生理活性ポリペプチドが二量体である場合には、両末端の非ペプチド性重合体とブリッジのフォームを形成し、免疫グロブリンＦｃと結合体を製造することができなく、非常に低い製造収率で製造される問題がある。一方、両末端の非ペプチド性重合体と免疫グロブリンＦｃ領域を最初に結合させる方法によって製造する場合には、免疫グロブリンＦｃは、ホモ二量体の形で２つのＮ−末端を有し、また、２つのＮ−末端が非常に近接しているので、２つのＮ−末端に非ペプチド性重合体の両末端がそれぞれ結合して免疫グロブリンＦｃ領域がブリッジのフォームを形成することになり、結局、これ以上の生理活性ポリペプチドと反応する官能基末端がなく、製造収率が著しく低下する欠点を有している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】国際公開公報ＷＯ２００６／０７６４７１
【特許文献２】米国特許６，９２４，２６４
【特許文献３】米国特許５，７３８，８４６号
【特許文献４】国際出願公開第ＷＯ９２／１６２２１号
【特許文献５】国際公開出願第９３／１５１９９号
【特許文献６】国際公開出願第９３／１５２００号
【特許文献７】ヨーロッパ公開特許第４１３,６２２号
【特許文献８】ＷＯ０２／４６２２７
【特許文献９】米国特許６，７５６，４８０
【特許文献１０】大韓民国特許公開第２００３−９４６４号
【特許文献１１】大韓民国特許登録第２４９５７２号
【特許文献１２】国際特許公開ＷＯ０１／０３７３７号
【特許文献１３】米国特許５，１１６，９６４号
【特許文献１４】米国特許５，３４９，０５３号
【特許文献１５】国際特許公開ＷＯ００／２３４７２号
【特許文献１６】米国特許５，７１２，１２１号
【特許文献１７】米国特許５，７２３，１２５号
【特許文献１８】米国特許６，４５１，３１３号
【特許文献１９】米国特許５，６０５，６９０号
【特許文献２０】米国特許６，２７７，３７５号
【特許文献２１】米国特許６，４１０，００８号
【特許文献２２】米国特許６，４４４，７９２号
【特許文献２３】米国特許６，６６０，８４３号
【特許文献２４】大韓民国登録特許第１０−０７２５３１５号
【特許文献２５】大韓民国登録特許第１０−０７７５３４３号
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Kinstler et al., Pharmaceutical Research 12(12):1883-1888, 1995
【非特許文献２】Osborn et al., J. Phar. Exp. Ther. 303(2):540-548, 2002
【非特許文献３】Burton D., Molec. Immun. 22，161-206，1985
【非特許文献４】Waldmann H.，Eur. J. Immunol. 23，403-411，1993
【非特許文献５】Morrison S.，J. Immunol 143，2595-2601，1989
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明の目的は、生理活性ポリペプチド、３つの末端に官能基を有する非ペプチド性重合体および二量体蛋白質が相互に共有結合によって連結された蛋白質結合体およびその製造方法を提供することにある。
【００２２】
本発明の他の目的は、生理活性ポリペプチドの生体内活性を維持しながら、血中の半減期が延長された前記の蛋白質結合体を含む持続性蛋白質薬物の製剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
このような背景下で、本発明者らは、効率的な生産が可能であり、簡易な精製方法によっても、高純度に精製が可能な、半減期および生理活性の優れた蛋白質の結合体について、継続的な研究を行い、その結果、二量体蛋白質および生理活性ポリペプチドが３つの結合部位を有した非ペプチド性重合体に連結された蛋白質結合体の場合、従来の製造方法が有する問題点の改善が可能になり、生理活性ポリペプチドの損失を大幅に防ぐことができ、著しい収率で蛋白質結合体を製造し、簡易な精製方法を使用しても精製が可能であり、蛋白質結合体の構造的な安定性を増加させることを確認して、本発明を完成した。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の蛋白質結合体は、３つの官能基末端を有した(3-arm)非ペプチド性重合体を使用して、生理活性ポリペプチドと二量体蛋白質とを相互に共有結合によって連結させたものであって、活性ポリペプチドの血中濃度を持続的に維持し、薬効を安定的に示すことができる。
【００２５】
また、本発明の蛋白質結合体の製造方法は、従来の両末端官能基を有した非ペプチド性重合体の利用の際に、原料の生理活性ポリペプチドの不必要な消費量を大幅に削減することができ、より簡易な精製法を導入することができるというメリットを有し、従来に比べて著しく向上された収率で蛋白質結合体を製造することができる。特に、二量体生理活性ポリペプチドの場合は、持続性蛋白質結合体を製造するために、必ず三末端非ペプチド性重合体を用いた本願の製造方法が不可欠であるといえる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は二量体蛋白質を用いた生理活性ポリペプチドの薬物結合体の代表図である。
【図２】図２は免疫グロブリンＦｃ−三末端  ＰＥＧ−オクトレオチド（Ｎ）結合体の生体内の効能を測定した結果である(ＨＭ１１７６０Ｂは、免疫グロブリンＦｃ−３  ａｒｍ  ＰＥＧ−Ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ（Ｎ）結合体、Ｓａｎｄｏｓｔａｔｉｎ−ＬＡＲは、Ｓａｎｄｏｓｔａｔｉｎ−ＬＡＲである)。
【図３】図３は免疫グロブリンＦｃ−三末端  ＰＥＧ−ＦＳＨ（Ｎ）結合体の生体内の効能を測定した結果である(ＨＭ１２１６０Ａは、免疫グロブリンＦｃ−２  ａｒｍ  ＰＥＧ−ＦＳＨ（Ｎ）結合体、ＨＭ１２１６０Ｂは、 免疫グロブリンＦｃ−３  ａｒｍ  ＰＥＧ−ＦＳＨ（Ｎ）の結合体)。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
一つの態様として、本発明は、生理活性ポリペプチドおよび二量体蛋白質が三末端に官能基を有する非ペプチド性重合体を介して相互に共有結合によって連結されている蛋白質結合体に関するものである。
【００２８】
以下、本発明を詳細に説明すると、以下の通りである。
【００２９】
本発明における用語“蛋白質結合体(complex)”または“結合体”とは、１つ以上の生理活性ポリペプチド、三末端に官能基を有する１つ以上の非ペプチド性重合体および1つ以上の二量体蛋白質を含み、これらの構成要素が共有結合で相互に連結されていることを指す。また、前記の“結合体”と区別するために、生理活性ポリペプチド、非ペプチド性重合体および二量体蛋白質から選ばれた２種類の物質分子だけが共有結合で連結された構造物は、“連結体(conjugate)”と表示する。
【００３０】
本発明の蛋白質結合体は、蛋白質薬物の生理活性の低下を最小化し、生体内の持続性を最大限に増加させるための蛋白質薬物の変形体であり、本発明では、特に、生理活性ポリペプチドの製造時の損失を最小化し、簡易の方法によっても精製が可能な安定した構造の蛋白質結合体の製造方法が適用され得るように、三末端が官能基を有する非ペプチド性重合体を用いて、生理活性ポリペプチドと二量体蛋白質とを結合させることを特徴とする。
【００３１】
本発明における用語“二量体蛋白質”は、Ｎ−末端が２つの蛋白質を意味し、好ましくは、キャリアとして使用する免疫グロブリンＦｃ領域であり、同種二量体と異種二量体として存在する生理活性物質を含む。
【００３２】
免疫グロブリンＦｃ領域は、生体内で代謝される生分解性のポリペプチドであるため、薬物のキャリアとして使用するのに安全である。また、免疫グロブリンＦｃ領域は、免疫グロブリン全体の分子に比べて相対的に分子量が少ないので、結合体の製造、精製および収率の面から有利であるだけでなく、アミノ酸配列が抗体別に異なり、高い非均質性を示すＦａｂ部分が除去されるので、物質の同質性が大幅に増加され、血中抗原性の誘発可能性も低くなる効果も期待できる。
【００３３】
本発明における用語“免疫グロブリンＦｃ領域”は、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域、重鎖不変領域１(ＣＨ１)と軽鎖不変領域(ＣＬ１)を除いた、重鎖不変領域２(ＣＨ２)および重鎖不変領域３(ＣＨ３)の部分を意味し、重鎖不変領域にヒンジ(hinge)部分を含むこともある。また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型と実質的に同等であるか、または改善効果を有する限り、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域を除いて、一部または全体の重鎖不変領域１(ＣＨ１)および／または軽鎖不変領域１(ＣＬ１)を含む拡張されたＦｃ領域であることができる。また、ＣＨ２および／またはＣＨ３に該当する非常に長い一部のアミノ酸配列が除去された領域であることもある。すなわち、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよびＣＨ４ドメイン、２）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、５）１つまたは２つ以上のドメインと免疫グロブリンのヒンジ領域（またはヒンジ領域の一部）との組み合わせ、６）重鎖不変領域の各ドメインと軽鎖不変領域の二量体であることができる。
【００３４】
また、本発明における用語“免疫グロブリンＦｃ領域”は、天然型アミノ酸配列だけでなく、その配列誘導体(mutant)を含む。アミノ酸配列誘導体とは、天然アミノ酸配列のうちの一つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的または保存的置換、またはそれらの組み合わせによって異なる配列を有することを意味する。例えば、ＩｇＧ  Ｆｃの場合には、結合に重要であると知られている２１４〜２３８、２９７〜２９９、３１８〜３２２または３２７〜３３１のアミノ酸残基などが変形のために適当な部位として利用され得る。また、ジスルフィド結合を形成できる部位が除去されるか、天然型ＦｃからＮ−末端の複数のアミノ酸が削除されるか、または天然型ＦｃのＮ−末端にメチオニン残基が付加され得ることもあるなど、様々な種類の誘導体が可能である。また、エフェクター機能をなくすために、補体結合部位、例えば、Ｃ１ｑ結合部位が除去され得ることもあり、ＡＤＣＣ(antibody dependent cell mediated cytotoxicity)部位が除去され得ることもある。これらの免疫グロブリンＦｃ領域の配列誘導体を製造する技術は、国際特許公開ＷＯ９７／３４６３１号、国際特許公開ＷＯ９６／３２４７８号などに開示されている。
【００３５】
分子の活性を全体的に変更させない蛋白質およびペプチドでのアミノ酸の交換は、当該分野に公知されている(H. Neurath，R.L.Hill，The Proteins，Academic Press，New York，1979）。
【００３６】
最も通常的に生じる交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙの間の交換である。また、場合によっては、リン酸化(phosphorylation)、 硫酸化(sulfation)、アクリル化(acrylation)、糖化(glycosylation)、メチル化(methylation)、ファルネシル化(farnesylation)、アセチル化(acetylation)、アミド化(amidation)などに修飾(modification)され得ることもある。
【００３７】
前述したＦｃ誘導体は、本発明のＦｃ領域と同一の生物学的活性を示すが、Ｆｃ領域の熱、ｐＨなどの構造的安定性を増大させた誘導体である。
【００３８】
このようなＦｃ領域は、ヒト、牛、山羊、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラットおよびモルモットなどの動物の生体内から分離した天然型から得ることもでき、形質転換された動物細胞または微生物から得られた組換え型またはその誘導体である場合もある。ここで、天然型から取得する方法は、全免疫グロブリンをヒトまたは動物の生体から分離した後、蛋白質分解酵素を処理して得ることができる。パパインを処理する場合には、ＦａｂおよびＦｃに切断され、ペプシンを処理する場合には、ｐＦ’ｃおよびＦ(ａｂ)２に切断される。これをサイズ排除クロマトグラフィー(size-exclusion chromatography)などを用いて、ＦｃまたはｐＦ’ｃを分離することができる。好ましくは、ヒト由来のＦｃ領域を微生物から収得した組換え型免疫グロブリンＦｃ領域である。
【００３９】
また、免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型糖鎖、天然型に比べて増加された糖鎖、天然型に比べて減少した糖鎖または糖鎖が除去された形態でもある。このような免疫グロブリンＦｃ糖鎖の増減または除去には、化学的方法、酵素学的方法および微生物を用いた遺伝工学的方法のような通常的な方法が利用され得る。
【００４０】
ここで、Ｆｃから糖鎖が除去された免疫グロブリンＦｃ領域は、補体(ｃ１ｑ)の結合力が著しく低下し、抗体−依存性細胞毒性または補体−依存性細胞毒性が減少または削除されるので、生体内で不要な免疫反応を誘発しない。
【００４１】
このことから薬物のキャリアとしての本来の目的により適合する形態は、糖鎖が除去されるか非糖鎖化された免疫グロブリンＦｃ領域と言えるだろう。
【００４２】
本発明における用語“糖鎖の除去(Deglycosylation)”は、酵素で糖を除去したＦｃ領域をいい、“非糖鎖化(Aglycosylation)”は、真核生物、好ましくは、大腸菌で生産され、糖鎖化されていないＦｃ領域を意味する。
【００４３】
免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒトまたは牛、山羊、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物起源でもあり、好ましくはヒト起源である。また、免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来またはこれらの組み合わせ、またはこれらのハイブリッド(hybrid)によるＦｃ領域でもある。好ましくは、ヒトの血液中の最も豊富なＩｇＧまたはＩｇＭ由来であり、最も好ましくは、リガンド結合蛋白質の半減期を向上させるものとして公知されたＩｇＧ由来である。
【００４４】
また、免疫グロブリンＦｃ領域は、同一起源のドメインからなる糖鎖免疫グロブリンから構成された二量体または多量体(免疫グロブリンFcの組み合わせ)でもある。
【００４５】
一方、本発明における用語“組み合わせ(combination)”とは、二量体または多量体を形成する際に、同一起源の単鎖免疫グロブリンＦｃ領域を暗号化するポリペプチドが異なる起源の単鎖ポリペプチドとの結合を形成することを意味する。すなわち、ＩｇＧのＦｃ、ＩｇＡのＦｃ、ＩｇＭのＦｃ、ＩｇＤのＦｃおよびＩｇＥのＦｃ断片からなる群より選ばれた２つ以上の断片から二量体または多量体の製造が可能である。
【００４６】
本発明における“ハイブリッド(hybrid)”とは、単鎖免疫グロブリンＦｃ領域内に２つ以上の異なる起源の免疫グロブリンＦｃ断片に該当する配列が存在することを意味する用語である。本発明の場合は、様々な形態のハイブリッドが可能である。すなわち、ＩｇＧ  Ｆｃ、ＩｇＭ  Ｆｃ、ＩｇＡ  Ｆｃ、ＩｇＥ  ＦｃおよびＩｇＤ  ＦｃのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４からなる群より１つ乃至４つのドメインからなるドメインのハイブリッドが可能であり、ヒンジを含むことができる。
【００４７】
一方、ＩｇＧもＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のサブクラスに分けることができ、本発明では、これらの組み合わせ、またはこれらのハイブリッドも可能である。好ましくは、ＩｇＧ２とＩｇＧ４のサブクラスであり、最も好ましくは、補体依存性毒性(ＣＤＣ、Complementdependent cytotoxicity)のようなエフェクター機能(effector function)がほとんどないＩｇＧ４のＦｃ領域である。
【００４８】
つまり、最も好ましい本発明の薬物キャリア用の免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４由来の非−糖鎖化されたＦｃ領域である。ヒト由来のＦｃ領域は、ヒトの生体で抗原として作用し、これに対する新たな抗体を生成するなどの好ましくない免疫反応を引き起こす可能性のある非−ヒト由来のＦｃ領域に比べて好ましい。
【００４９】
本発明で蛋白質薬物は、二量体蛋白質と非ペプチド性重合体に連結されることを特徴とする。
【００５０】
本発明で非ペプチド性重合体は、繰り返し単位が２つ以上結合された生体適合性重合体を意味し、前記の繰り返し単位などは、ペプチド結合でなく、任意の共有結合を介して互いに連結される。
【００５１】
従来のインフレーム フュージョン(inframe fusion)の方法にて製造された融合蛋白質で使用されたペプチド性リンカーの欠点は、生体内で蛋白質分解酵素によって容易に切断され、キャリアによる活性薬物の血中半減期の増加効果が期待ほど得られないということである。しかし、本発明では、蛋白質分解酵素に抵抗性の重合体を使用してキャリアと同様にペプチドの血中半減期を維持することができる。したがって、本発明で使用され得る非ペプチド性重合体は、前記のような役割、すなわち、生体内の蛋白質分解酵素に抵抗性のある重合体であれば、制限なく使用され得る。非ペプチド性重合体の分子量は、１〜１００ｋＤａの範囲、好ましくは１〜２０ｋＤａの範囲である。また、前記の免疫グロブリンＦｃ領域と結合される本発明の非ペプチド性重合体は、一種類の重合体だけでなく、異なる種類の重合体などの組み合わせが使用され得ることもある。
【００５２】
本発明で使用可能な非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルアルコールエチルエーテル、ＰＬＡ(ポリ乳酸、polylactic acid)およびＰＬＧＡ(ポリ乳酸−グリコール酸、polylactic-glycolic acid)のような生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸およびこれらの組み合わせから構成される群から選択されることができ、好ましくは、ポリエチレングリコールである。当該分野におけるすでに知られているこれらの誘導体および当該分野の技術レベルで容易に製造することができる誘導体なども本発明の範囲に含まれる。
【００５３】
本発明で使用される非ペプチド性重合体は、免疫グロブリンＦｃ領域および蛋白質薬物と結合することができる官能基を有する。
【００５４】
本発明では、従来に使用されていた両末端官能基を有した非ペプチド性重合体を用いた蛋白質結合体の製造方法(大韓民国登録特許第１０−０７２５３１５号)に記載されているとは異なって三末端官能基を有した非ペプチド性重合体を導入した。本発明で使用された非ペプチド性重合体は、従来によく使われてきた官能基の末端が一つであり、核分子を中心に、枝状を示す非ペプチド性重合体とは差別され、三つの官能基末端のうち、２つは二量体蛋白質に、残りの一つは、生理活性ポリペプチドに互いに共有結合することをその特徴とする。
【００５５】
具体的には、免疫グロブリンＦｃは、ホモ二量体の形で２つのＮ−末端を有し、また２つのＮ−末端が非常に近接しているので、両末端官能基を有した非ペプチド性重合体を用いて免疫グロブリンＦｃ領域に先に共有結合させる場合には、２つのＮ−末端に非ペプチド性重合体の両末端がそれぞれ結合し、それ以上生理活性ポリペプチドと結合する確率が非常に低く、製造収率が著しく低かったため、生理活性ポリペプチドを先に結合する方法によって製造する方法を使用していた。また、生理活性ポリペプチドを先に結合させる場合には、所望しない不純物が多く生成され、これにより生理活性ポリペプチドが失われる重大な欠点があった。しかし、三末端官能基を有した非ペプチド性重合体の使用によって３つの末端のうち、２つの末端が免疫グロブリンＦｃの２つのＮ−末端と共有結合をすることになり、その後、非ペプチド性重合体の一つの残余末端が生理活性ポリペプチドと結合するようになって高収率で製造することができ、具体的な実施例として、２〜９倍の製造収率の向上を確認することができた。
【００５６】
また、好ましくは、非ペプチド性重合体の三末端官能基は、それぞれ免疫グロブリンＦｃ領域と生理活性ポリペプチドのＮ−末端、リジン残基、ヒスチジン残基またはシステイン残基の遊離官能基に結合され得る。
【００５７】
前記の非ペプチド性重合体の三末端官能基は、アルデヒド群、プロピオンアルデヒド群、ブチルアルデヒド群、マレイミド(maleimide)群およびスクシンイミド(succinimide)誘導体からなる群より選ばれるのが好ましい。前記において、スクシンイミド誘導体は、スクシンイミジルプロピオン酸、ヒドロキシスクシンイミジル、スクシンイミジルカルボキシメチルまたはスクシンイミジル炭酸が利用されることができ、より好ましくは、アルデヒド群である。前記の非ペプチド性重合体が三末端に反応アルデヒド群の官能基を有する場合には、非特異的反応を最小化し、非ペプチド性重合体の三末端で生理活性ポリペプチドおよび二量体蛋白質とそれぞれ結合するのに効果的であり、アルデヒド結合にによる還元性アルキル化によって生成された最終産物は、アミド結合に連結されたものよりもはるかに安定的である。アルデヒド官能基は、低いｐＨでアミノ末端に選択的に反応し、高いｐＨ、例えば、ｐＨ９．０の条件では、リジン残基と共有結合を形成することができる。また、前記の非ペプチド性重合体の三末端官能基は、互いに同一または異なることもある。
【００５８】
一方、本発明において、前記の二量体蛋白質と非ペプチド性重合体との連結体は、生理活性ポリペプチドに結合されて蛋白質結合体を形成するようになる。
【００５９】
本発明における用語“生理活性ポリペプチド”、“生理活性蛋白質”、“活性蛋白質”、“活性ポリペプチド”または“蛋白質薬物”とは、生体内で生理的現象に拮抗作用を示すポリペプチド、ペプチドまたは蛋白質を意味する用語であり、相互交換的に使用され得る。
【００６０】
本発明の蛋白質結合体に適用され得る生理活性ポリペプチドは、ホルモン、サイトカイン、インターロイキン、インターロイキン結合蛋白質、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、構造蛋白質、リガンド蛋白質、受容体、細胞表面抗原または受容体拮抗物質のような様々な生理活性ポリペプチド、それらの誘導体および類似体が挙げられる。
【００６１】
具体的には、生理活性ポリペプチドは、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン類とインターフェロン受容体類（例えば、インターフェロン−α、−βおよび−γ、水溶性タイプＩインターフェロン受容体など）、コロニー刺激因子、グルカコン様ペプチド類（ＧＬＰ−１など）、エキセンディン−４−ペプチド類、ＡＮＰ、ＢＮＰ、ＣＮＰ、ＤＮＰ、Ｇ蛋白質共役型受容体(G-protein-coupled receptor)、インターロイキン類（例えば、インターロイキン−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−１２、−１３、−１４、−１５、−１６、−１７、−１８、−１９、−２０、−２１、−２２、−２３、−２４、−２５、−２６、−２７、−２８、−２９、−３０など）とインターロイキン受容体類（例えば、ＩＬ−１受容体、ＩＬ−４受容体など）、酵素類（例えば、グルコセレブロシダーゼ(glucocerebrosidase)、イズロネート−２−スルファターゼ(iduronate-2-sulfatase)、α−ガラクトシダーゼ−Ａ、α−Ｌ−イズロニダーゼ(alpha-L-iduronidase)、ブチリルコリンエステラーゼ(butyrylcholinesterase)、キチナーゼ(chitinase)、グルタミン酸デカルボキシラーゼ(glutamate decarboxylase)、イミグルセラーゼ(imiglucerase)、リパーゼ(lipase)、 ウリカーゼ(uricase)、血小板−活性因子アセチルハイドロラーゼ(platelet-activating factor acetylhydrolase)、中性エンドペプチダーゼ(neutral endopeptidase)、ミエロペルオキシダーゼ(myeloperoxidase)など）、インターロイキンおよびサイトカイン結合蛋白質類（例えば、ＩＬ−１８ｂｐ、ＴＮＦ−結合蛋白質など）、マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、蛋白質Ａ、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖蛋白質、免疫毒素、リンポ毒素、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、アルファ−１アンチトリプシン、アルブミン、α−ラクトアルブミン(alpha-lactalbumin)、アポリポ蛋白質−Ｅ、赤血球生成因子、高糖鎖化赤血球生成因子、アンジオポエチン類(angiopoietin)、ヘモグロビン、トロンビン(thrombin)、トロンビン受容体活性ペプチド(thrombin receptor activating peptide)、トロンボモジュリン(thrombomodulin)、血液因子ＶＩＩ、ＶＩＩａ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、およびＸＩＩＩ、プラズミノゲン活性因子、フィブリン−結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン(hirudin)、蛋白質Ｃ、Ｃ−反応性蛋白質、レニン抑制剤、コラゲナーゼ抑制剤、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンギオスタチン(angiostatin)、アンギオテンシン(angiotensin)、骨形成成長因子、骨形成促進蛋白質、カルシトニン、インスリン、ソマトスタチン、オクトレオチド（ソマトスタチンアゴニスト）、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン(elcatonin)、結合組織活性因子、組織因子経路抑制剤(tissue factor pathway inhibitor)、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子類（例えば、神経成長因子(Nerve growth factor)、毛様体神経栄養因子(cilliary neurotrophic factor)、アキソジェネシス因子−１(axogenesis factor-1)、グルカゴン様ペプチド類（ＧＬＰ−１）、エキセンディン−４−ペプチド類、脳−ナトリウム利尿ペプチド(brain-natriuretic peptide)、神経膠由来���経栄養因子(glial derived neurotrophic factor)、ネトリン(netrin)、好中球抑制因子(neurophil inhibitor factor)、神経栄養因子、ニューチュリン(neuturin)など)、副甲状腺ホルモン、レラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン(autotaxin)、ラクトフェリン(lactoferrin)、ミオスタチン(myostatin)、受容体類（例えば、ＴＮＦＲ（Ｐ７５）、ＴＮＦＲ（Ｐ５５）、ＩＬ−１受容体、ＶＥＧＦ受容体、Ｂ細胞活性因子受容体など）、受容体拮抗物質（例えば、ＩＬ１−Ｒａなど）、細胞表面抗原（例えば、ＣＤ２、３、４、５、７、１１ａ、１１ｂ、１８、１９、２０、２３、２５、３３、４０、４５、６９など）、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片類（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｄ）、ウイルス由来ワクチン抗原など様々な種類を含む。好ましくは、ヒト成長ホルモン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、顆粒球コロニー刺激因子、赤血球生成因子、エキセンディン−４、イミダゾールアセチルエキセンディン−４ペプチド（エキセンディン−４アゴニスト）、カルシトニン、オクトレオチド（ソマトスタチンアゴニスト）、ＢＮＰまたはＦａｂ’抗体断片を生理活性ポリペプチドとする場合である。
【００６２】
このような蛋白質薬物は、変性し易い、あるいは生体内に存在する蛋白質分解酵素によってよく分解されるなどの理由で長時間にわたって生理学的活性を持続することができないという欠点がある。しかし、本発明の二量体蛋白質とポリペプチドを結合させた結合体の場合、薬物の構造的安定性が増加し、分解半減期が増加する。この時、二量体蛋白質の結合によるポリペプチドの生理学的活性の減少は、その他公知となっている他のポリペプチド薬物製剤に比べて非常に軽微であるといえる。したがって、既存のポリペプチド薬物の生体内利用率に比べて本発明のポリペプチドおよび免疫グロブリンＦｃ領域の結合体は、生体内利用率が著しく増加したことを特徴とする。
【００６３】
また、本発明のまた他の態様として、（１）三末端の官能基を有する非ペプチド性重合体の二端官能基に二量体蛋白質の両Ｎ−末端アミノ基に共有結合で連結させる段階；（２）（１）の反応混合物からＮ−末端に非ペプチド性重合体が共有結合された二量体蛋白質を含む連結体を分離する段階；および（３）分離された連結体の非ペプチド性重合体の反対側の末端に生理活性ポリペプチドを共有結合で連結して、非ペプチド性重合体の３箇所の末端がそれぞれ二量体蛋白質および生理活性ポリペプチドと結合された蛋白質結合体を生成する段階を含む製造方法を提供する。
【００６４】
好ましくは、（１）の二量体蛋白質が免疫グロブリンのＦｃ領域である場合である。より好ましくは、（１）の非ペプチド性重合体の三末端はアルデヒド官能基を有し、さらに好ましくは、（１）の非ペプチド性重合体および生理活性ポリペプチドのＮ−末端アミノ基は、ｐＨ６．０で連結される。
【００６５】
一方、段階（１）の二量体蛋白質と非ペプチド性重合体反応モル比が１：２〜１：５であることが好ましく、段階（３）の段階（２）で収得された二量体蛋白質を含む連結体：生理活性ポリペプチドの反応モル比が１：０．５〜１：０．０５であるのが好ましい。
【００６６】
段階（１）および段階（３）の反応は、反応に参加する非ペプチド性重合体の三末端官能基の種類を考慮し、必要に応じて還元剤の存在下で行うことができる。好ましい還元剤としては、シアノ水素化ホウ素ナトリウム(NaCNBH3)、水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンホウ酸塩およびピリジンホウ酸塩などを使用され得る。
【００６７】
一方、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域と蛋白質の結合は、従来の組換え的な方法による融合ではない共有結合であることを特徴とする。
【００６８】
本発明のまた他の態様として、本発明は、蛋白質結合体および薬学的に許容可能な賦形剤を含む、生体内の持続性が増加された生理活性ポリペプチドの薬剤学的組成物を提供する。
【００６９】
本発明の薬剤学的組成物はある適切な方法で患者に所定の物質を導入することであって、前記薬剤学的組成物の投与経路は、薬物が目的の組織に到達することができる限り、いずれの一般的な経路を介して投与され得る。例えば、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与、直腸内投与が可能であるが、これに制限されず、好ましくは、本発明の薬剤学的組成物は、注射剤の形態で投与できる。本薬剤学的組成物は、活性物質が標的細胞に移動することが可能な任意の装置によって投与できる。
【００７０】
本発明の結合体を含んだ薬剤学的組成物は、薬剤学的に許容可能な担体を含むことができる。薬剤学的に許容される担体は、経口投与の場合には結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを使用することができ、注射剤の場合には緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤などを混合して使用することができ、局所投与の場合には基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などを使用することができる。本発明の薬剤学的組成物の剤形は、上述したような薬剤学的に許容される担体と混合して様々に製造できる。例えば、経口投与の場合には錠剤、トローチ剤、カプセル、エリキシル剤(elixir)、サスペンション、シロップ、ウェーハなどの形態で製造することができ、注射剤の場合には、単位投薬アンプルまたは多数回投薬の形態で製造することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、散剤、カプセル、徐方形製剤などに剤形化することができる。製剤化に適した担体、賦形剤および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、珪酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシ安息香酸、プロピルヒドロキシ安息香酸、タルク、ステアリン酸マグネシウムまたは鉱物油などが使用され得る。製剤は、また充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤などをさらに含むことができる。
【００７１】
本発明の蛋白質結合剤は、治療する疾患、投与経路、患者の年齢、性別、体重、および疾患の重症度などのいろいろの関連因子とともに、活性成分である生理活性ポリペプチドの種類によって治療容量が決定される。本発明の蛋白質結合剤は、生体内持続性および力価が非常に優れるので、本発明の蛋白質結合剤を含む薬剤学的組成物は、投与回数および頻度を著しく減少させることができる。
【００７２】
大韓民国登録特許第１０−０７２５３１５号および１０−０７７５３４３号などによって公知されているように、従来には非ペプチド性重合体を介して免疫グロブリン不変領域と生理活性ポリペプチドが非ペプチド性重合体の両末端に連結された蛋白質の結合体のみが存在し、このような蛋白質結合体は、生理活性ポリペプチドを非ペプチド性重合体と、先に結合させた後にその過程で製造された生理活性ポリペプチド−非ペプチド性連結体(conjugate)と免疫グロブリンＦｃを結合させる製造方法を使用することができ、このような製造方法によって製造される場合、その過程で生理活性ポリペプチドが製造過程で多量に失われる欠点があった。しかし、本発明による蛋白質結合体の場合、三末端の官能基を有する非ペプチド性重合体を使用して蛋白質結合体を製造する場合、多量の生理活性ポリペプチドの損失を大幅に減らすことができ、今後、非常に簡易な精製法を介して製造された蛋白質結合体を製造できるようになった。
【００７３】
以下、下記の実施例によって本発明をより詳細に説明する。但し、下記の実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００７４】
〔実施例１.免疫グロブリンＦｃ−３  ａｒｍ  ＰＥＧ−オクトレオチド（Ｎ）結合体の製造〕
５Ｋ  プロピオンＡＬＤ（３）ＰＥＧ（プロピオンアルデヒド基を３つ有しているＰＥＧ、ＮＯＦ、日本）を免疫グロブリンＦｃのＮ−末端にペグ化させるために免疫グロブリンＦｃとＰＥＧのモル比を１：２、免疫グロブリンＦｃ濃度を１０ｍｇ／ｍｌにし、４℃で４．５時間反応させた。この時の反応は、ｐＨ６．０の１００ｍＭ濃度のリン酸カリウム緩衝液中で行われ、還元剤の２０ｍＭ  ＳＣＢ(NaCNBH3)を添加して反応させた。反応液は、ＳＯＵＲＣＥ  Ｑ(XK 16ml、GE Healthcare)を介してモノペグ免疫グロブリンのＦｃを精製した。その後、オクトレオチドと免疫グロブリンＦｃ−５Ｋ  ＰＥＧのモル比を１：２、全蛋白質濃度を２５ｍｇ／ｍｌにし、４℃で２０時間反応させた。反応液は、１００ｍＭリン酸カリウム  ｐＨ６．０であり、還元剤の２０ｍＭ  ＳＣＢを添加した。カップリング反応液は、ＳＰ  ＨＰ精製コラムで精製される。ＳＰ  ＨＰ(XK 16ml、GE Healthcare)に１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液(pH5.4)を用い、カップリング反応に参与していない免疫グロブリンＦｃ−５Ｋは、コラムにつけず、ローディングを介して分離し、免疫グロブリン−ＰＥＧ−オクトレオチド(HM11760B)は、コラムに弱くつけ、１Ｍ  塩化ナトリウム(Nacl)を用いて塩勾配で溶出させる。
【００７５】
コラム：ＳＰ  ＨＰ(XK16ml、GE Healthcare)
流速：２．０ｍｌ／分
勾配：Ａ  ０→２０％６０分Ｂ(A:10mM Na-P pH5.4、B:A+1M NaCl)。
【００７６】
〔実施例２．免疫グロブリンＦｃ−３  ａｒｍ  ＰＥＧ−カルシトニン（Ｎ）結合体の製造〕
実施例１の方法を用い、５Ｋ  プロピオンＡＬＤ（３）ＰＥＧを免疫グロブリン−ＦｃのＮ−末端と反応させた後、モノペグ免疫グロブリンＦｃのみを精製してカルシトニンとカップリングさせた。カルシトニンと免疫グロブリンＦｃ−５Ｋ  ＰＥＧモル比を１：２、全蛋白質濃度を２５ｍｇ／ｍｌにし、４℃で２０時間反応させた。反応液は、１００ｍＭリン酸カリウム  ｐＨ６．０であり、還元剤の２０ｍＭ  ＳＣＢを添加した。カップリング反応液は、ＳＰ  ＨＰ精製コラムで精製される。
【００７７】
まず、カップリング反応に参与していない多量の免疫グロブリンＦｃ−５Ｋ  ＰＥＧを除去するために、ＳＰ  ＨＰ(XK 16ml、GE Healthcare)を用いた。１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液(pH5.4)を用い、カップリング反応に参与していない免疫グロブリンＦｃ−５Ｋ  ＰＥＧはコラムにつけず、ローディングを介して分離し、免疫グロブリン−ＰＥＧ−カルシトニンは、コラムに弱くつけ、１Ｍ  塩化ナトリウム(Nacl)を用いて塩勾配で溶出させる。
【００７８】
コラム：ＳＰ  ＨＰ(XK16ml、GE Healthcare) 
流速：２．０ｍｌ／分
勾配：Ａ  ０→２０％６０分Ｂ(A:10mM Na-P pH5.4、B:A+1M NaCl)。
【００７９】
〔実施例３．３  ａｒｍ  ＰＥＧ結合体（実施例１および２）と２  ａｒｍ  ＰＥＧ結合体との製造収率および精製簡易性の比較〕
実施例１および２で製造した免疫グロブリンＦｃ−３  ａｒｍ  ＰＥＧ−オクトレオチド（Ｎ）結合体および免疫グロブリンＦｃ−３  ａｒｍ  ＰＥＧ−カルシトニン（Ｎ）結合体を用いて、３  ａｒｍ  ＰＥＧ結合体と２  ａｒｍ  ＰＥＧ結合体との製造収率比較した（表１）。
【００８０】
２  ａｒｍ  ＰＥＧ結合体、すなわち、対照群として、オクトレオチドおよびカルシトニンをそれぞれ生理活性ポリペプチドにし、２  ａｒｍ  ＰＥＧ（プロピオンアルデヒド基を２つ有しているＰＥＧ、ＩＤＢ、韓国）をリンカにし、免疫グロブリンＦｃ領域と共有結合させて２  ａｒｍ  ＰＥＧ結合体を製造した。より具体的には、２  ａｒｍ  ＰＥＧにオクトレオチドまたはカルシトニンを結合させた後、免疫グロブリンＦｃ領域を結合させた(ＫＲ１０−０７２５３１５)。
【００８１】
【表１】
0005563572.tif 000002
【００８２】
さらに、前記の結合体製造方法で得られたカップリング反応液内の結合体を精製する工程の簡易性、および１次コラムのサイズを比較してみた結果は以下のとおりである。
【００８３】
【表２】
0005563572.tif 000003
【００８４】
２  ａｒｍ  ＰＥＧを用いた結合体の場合、既存の反応に参与していない免疫グロブリンＦｃと免疫グロブリンのＦｃ−２  ａｒｍ  ＰＥＧ−オクトレオチドまたは免疫グロブリンＦｃ−２  ａｒｍ  ＰＥＧ−カルシトニンを精製するために、反応に参与していない免疫グロブリンＦｃをすべてコラムにつけて精製を行ったが、３  ａｒｍ  ＰＥＧを用いた結合体の場合、反応に参与していない免疫グロブリンＦｃ−５Ｋ  ＰＥＧ連結体と免疫グロブリンＦｃ−３  ａｒｍ  ＰＥＧ−オクトレオチドまたは免疫グロブリンＦｃ−３  ａｒｍ  ＰＥＧ−カルシトニンを分離精製するために、反応に参与していない免疫グロブリンＦｃ−ＰＥＧ連結体をローディングを介して削除した後、蛋白質結合体だけをコラムにつけて精製するため、精製過程を２段階から１段階に減少するだけでなく、不必要に大きくならなければならないコラムのサイズを１／５のレベルに減らすことができた。
【００８５】
〔実施例４．免疫グロブリンＦｃ−３  ａｒｍ  ＰＥＧ−ＦＳＨ（Ｎ）結合体の製造〕
実施例１の方法を用いて５Ｋ  プロピオンＡＬＤ（３）ＰＥＧを免疫グロブリン−ＦｃのＮ−末端と反応させた後、モノペグ免疫グロブリンＦｃのみを精製してＦＳＨとカップリングさせた。ＦＳＨと免疫グロブリンＦｃ−５Ｋ  ＰＥＧのモル比を１：１５、全蛋白質濃度を４０ｍｇ／ｍｌにし、４℃で２０時間反応させた。反応液は、１００ｍＭ  リン酸カリウム  ｐＨ６．０であり、還元剤の２０ｍＭ  ＳＣＢを添加した。カップリング反応液は、２つの精製カラムを経て精製される。まず、カップリング反応に参与していない多量の免疫グロブリンＦｃ−５Ｋ  ＰＥＧを除去するために、ブルー  ＨＰ(Hitrap 5ml、GE Healthcare)を用いた。その後、リソース  Ｉｓｏ(1ml、GE Healthcare)を用いて、ＦＳＨに免疫グロブリンＦｃ−５Ｋ  ＰＥＧが２つ以上ついた多重合体不純物を疎水性に基づいて除去する。
【００８６】
コラム：ブルーＨＰ(Hitrap5ml, GE Healthcare)
流速：３．０ｍｌ／分
勾配：Ａ  ０→１００％  ２０分  Ｂ  
A:50mM Gly-NaOH+0.2M KCl
B:50mM Gly-NaOH+2.5M KCl
コラム：リソース  ＩＳＯ(1ml, GE Healthcare)
Ａ  ０→１００％  ９０分  Ｂ(A: 20mM Tis pH7.5, B: A + 1.3M A.S)。
【００８７】
〔実施例５．免疫グロブリンＦｃ−３  ａｒｍ  ＰＥＧ−インシュリン（Ｎ）結合体の製造〕
５Ｋ  プロピオンＡＬＤ（３）ＰＥＧ（プロピオンアルデヒド基を３つ有しているＰＥＧ、ＮＯＦ、日本）を免疫グロブリンＦｃのＮ−末端にペグ化させるために、免疫グロブリンＦｃとＰＥＧのモル比を１：２、免疫グロブリンＦｃ濃度を１０ｍｇ／ｍｌにし、４℃で４．５時間反応させた。この時の反応は、ｐＨ  ６．０の１００ｍＭ濃度のリン酸カリウム緩衝液中で行われ、還元剤の２０ｍＭ  ＳＣＢ(NaCNBH3)を添加して反応させた。反応液は、ソースＱ(LRC25 85ml、GE Healthcare)を介してモノペグ免疫グロブリンのＦｃを精製した。その後、インスリンと免疫グロブリンＦｃ−５Ｋ  ＰＥＧのモル比を１：４、全蛋白質濃度を２０ｍｇ／ｍｌにし、４℃で１９．５時間反応させた。反応液は、１００ｍＭ  リン酸カリウム  ｐＨ６．０であり、還元剤の２０ｍＭ  ＳＣＢを添加した。カップリング反応液は、２つの精製コラムを経て精製される。まず、カップリング反応に参与していない多量の免疫グロブリンＦｃ−５Ｋを除去するために、ソース  Ｑ(LRC25 85ml、GE Healthcare)を用いた。２０ｍＭ  トリス（ｐＨ７．５）で、１Ｍ  塩化ナトリウム(Nacl)を用いて塩勾配を与えると、相対的に結合力の弱い免疫グロブリンＦｃ−５Ｋ  ＰＥＧが先に溶出され、引き続いて免疫グロブリンＦｃ−ＰＥＧ−インスリンが溶出される。１次精製を介して免疫グロブリンＦｃ−５Ｋが除去されるが、免疫グロブリンＦｃ−５Ｋ  ＰＥＧとインスリン多重合体不純物は完全に分離されない。したがって、２つ物質の分子量の差を用いて、セファクリル  Ｓ−３００(GE Healthcare)コラムで２次精製を行い、これと同時に、免疫グロブリンＦｃ−ＰＥＧ−インスリン結合体を剤形化した。分子量の大きい免疫グロブリンＦｃ−５Ｋ  ＰＥＧとインスリンの多重合体が先に溶出され、続いて免疫グロブリンＦｃ−ＰＥＧ−インスリン結合体が溶出される。
【００８８】
コラム：ソースＱ(LRC25 85ml, GE Healthcare)
流速：８．０ｍｌ／分
勾配：Ａ  ０→２５％  １００分  Ｂ(A:20mM Tis pH7.5, B:A+1M NaCl)
コラム：セファクリル Ｓ−３００(HiPrep 120ml, GE Healthcare)
流速：０．６ｍｌ／分。
【００８９】
〔実施例６．３  ａｒｍ  ＰＥＧ結合体（実施例４および５）と２  ａｒｍ  ＰＥＧ結合体との製造収率の比較〕
実施例４および５で製造した免疫グロブリンＦｃ−３  ａｒｍ  ＰＥＧ−ＦＳＨ（Ｎ）結合体および免疫グロブリンＦｃ−３  ａｒｍ  ＰＥＧ−インスリン（Ｎ）結合体を用いて、３  ａｒｍ  ＰＥＧ結合体と２  ａｒｍ  ＰＥＧ結合体との製造収率を比較した（表３）。
【００９０】
ＦＳＨ(Mw.〜40,000 Da)とインスリン(Mw. 5,807)のように生理活性ポリペプチドが二量体である場合、従来の２  ａｒｍ  ＰＥＧを用いた製造方法で製造する際に、非ペプチド性重合体の両末端が生理活性ポリペプチドとすべて結合するようになって持続性を付与する免疫グロブリンのＦｃ領域と共有結合をすることができなくなる。このような現象は、インスリンのような、分子量の小さい二量体生理活性ポリペプチドで、より顕著に示される。
【００９１】
したがって、二量体生理活性ポリペプチドを用いた持続性蛋白質結合体の製造の場合、３  ａｒｍ  ＰＥＧを用いた製造方法が必ず要求される。
【００９２】
ＦＳＨおよびインスリンの場合、２  ａｒｍ  ＰＥＧと３  ａｒｍ  ＰＥＧを使用した製造収率の差は以下の通りである。
【００９３】
【表３】
0005563572.tif 000004
【００９４】
〔実施例７．免疫グロブリンＦｃ−ＰＥＧ−ＦａｃＶＩＩａ（Ｎ）結合体の製造〕
５Ｋ  プロピオンＡＬＤ（３）ＰＥＧ（プロピオンアルデヒド基を３つ有しているＰＥＧ、ＮＯＦ、日本）を免疫グロブリンＦｃのＮ−末端にペグ化させるために、免疫グロブリンＦｃとＰＥＧのモル比を１：２、免疫グロブリンＦｃ濃度を６ｍｇ／ｍｌとし、４℃で４．５時間反応させた。この時の反応は、ｐＨ６．０の１００ｍＭ濃度のリン酸カリウム緩衝液中で行われ、還元剤の２０ｍＭ  ＳＣＢ(NaCNBH3)を添加して反応させた。反応液は、ソースＱ(LRC25 85ml、GE Healthcare)を介してモノペグ免疫グロブリンのＦｃを精製した。その後、ＦＶＩＩａと免疫グロブリンＦｃ−５Ｋ  ＰＥＧのモル比を１：９、全蛋白質濃度を２０ｍｇ／ｍｌにし、４℃で１８時間反応させた。反応液は、１００ｍＭ  リン酸カリウム  ｐＨ６．０であり、還元剤の２０ｍＭ  ＳＣＢを添加した。カップリング反応液は、２つの精製コラムを経て精製される。まず、カップリング反応に参与していない多量の免疫グロブリンＦｃ−５Ｋを除去するために、ソース  Ｑ(LRC25 85ml、GE Healthcare)を用いた。２０ｍＭ  トリス（ｐＨ７．５）で、１Ｍ  塩化ナトリウム(Nacl)を用いて塩勾配を与えると、相対的に結合力の弱い免疫グロブリンＦｃ−５Ｋが先に溶出され、免疫グロブリンＦｃ−３  ａｒｍ  ＰＥＧ−ＦＶＩＩａが溶出される。以後、免疫グロブリンＦｃ−３  ａｒｍ  ＰＥＧ−ＦＶＩＩａとＦＶＩＩａ多量体不純物を除去するために、リソースＩＳＯ(GE Healthcare)コラムで２次精製を行った。免疫グロブリンＦｃ−３  ａｒｍ  ＰＥＧ−ＦＶＩＩａが先に溶出され、続いてＦＶＩＩａ多量体不純物が溶出される。
【００９５】
コラム：ソースＱ(LRC25 85ml, GE Healthcare)
流速：４ｍｌ／分
勾配：Ａ  ０→７％  １分  Ｂ、７％→３７％  ８０分  Ｂ(A:20mM Tris pH7.5, B:A+1M NaCl)
コラム：リソースＩＳＯ(Pre-packed 1ml, GE Healthcare)
流速：２ｍｌ／分
勾配：Ｂ  １００→０％  ６０分  Ａ(A:20mM Tris pH7.5, B:A+1.6M (NH4)2SO4)。
【００９６】
【表４】
0005563572.tif 000005
【００９７】
〔実施例８．免疫グロブリンＦｃ−３  ａｒｍ  ＰＥＧ−オクトレオチド（Ｎ）結合体の生体内効力試験〕
免疫グロブリンＦｃ−３  ａｒｍ  ＰＥＧ−オクトレオチド（Ｎ）をＳＤラットに皮下投与して試験動物の体重変化と、試験動物での試験物質によるＩＧＦ−１の変化を測定した。オクトレオチドは、強力な成長ホルモン抑制剤であって、末端肥大症(acromegaly)を適応症として置いており、速効性製品であるサンドスタチンと持続型製剤であるサンドスタチン−ＬＡＲ（Ｎｏｖａｔｉｓ）で市販されている。末端肥大症は、ｈＧＨの過分泌によって成長抑制が阻害される現象である。オクトレオチドの生体内試験としてラットＧＨの分泌低下で体重増加の抑制およびＧＨの減少によるラットのＩＧＦ−１の変化を測定する試験が用いられており、免疫グロブリンのＦｃ−３  ａｒｍ  ＰＥＧ−オクトレオチド（Ｎ）の効能もラットの体重変化およびＩＧＦ−１の変化を測定する試験として進行された。試験物質は、免疫グロブリンのＦｃ−３  ａｒｍ  ＰＥＧ−オクトレオチド（Ｎ）を０．５、１．０、２．０ｍｇ／ｋｇ用量で単回投与し、対照物質としてサンドスタチン−ＬＡＲを１．０、２．０ｍｇ／ｋｇで単回投与して２週間での変化を測定した。２つの試験物質のいずれも皮下投与で進行された。
【００９８】
試験結果、ビークル(vehicle)投与群に比べてサンドスタチン−ＬＡＲ  １．０ｍｇ／ｋｇ投与群は約３．７％の体重減少を示し、サンドスタチン−ＬＡＲ  ２．０ｍｇ／ｋｇ投与群は約８．９％の体重減少を示した。これに比べて、免疫グロブリンＦｃ−３  ａｒｍ  ＰＥＧ−オクトレオチド（Ｎ）の０．５ｍｇ／ｋｇ投与群は約４４．３％が減少し、１．０ｍｇ／ｋｇ投与群は約４０．１％、２．０ｍｇ／ｋｇ投与群は５５．１％の体重減少を示した。
【００９９】
ラットのＩＧＦ−１の変化は、ラットＩＧＦ−１  ＥＬＩＳＡ  キットを用いて定量し、血中ＩＧＦ−１  レベルのＡＵＣを基準にしてビークル(vehicle)対比サンドスタチン  １．０ｍｇ／ｋｇ投与群は約１５％、２．０ｍｇ／ｋｇ投与群は約１１％減少した。これに比べて、免疫グロブリンＦｃ−３  ａｒｍ  ＰＥＧ−オクトレオチド（Ｎ）投与群は、０．５ｍｇ／ｋｇ投与群が約２３％、１．０ｍｇ／ｋｇ投与群が約１８％、２．０ｍｇ／ｋｇ投与群が約２５％減少することを確認できた（図２）。
【０１００】
前記の試験結果から見ると、免疫グロブリンＦｃ−３  ａｒｍ  ＰＥＧ−オクトレオチド（Ｎ）がサンドスタチン持続型製剤であるサンドスタチン−ＬＡＲに比べて、高い生体内効果を有することが分かる。
【０１０１】
〔実施例９．免疫グロブリンＦｃ−３  ａｒｍ  ＰＥＧ−ＦＳＨ（Ｎ）結合体の生体内効力試験〕
免疫グロブリンＦｃ−３  ａｒｍ  ＰＥＧ−ＦＳＨ（Ｎ）の生体内効力の測定は、Ｓｔｅｅｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｐｏｈｌｅｙ試験法(Endocrinology 53、504-616)に基づいて行われた。詳細には、免疫グロブリンＦｃ−３  ａｒｍ  ＰＥＧ−ＦＳＨ（Ｎ）の生体内効果を測定するために、未成熟雌ＳＤラット(２１日齢)が使用された。試験物質は、免疫グロブリンＦｃ−３  ａｒｍ  ＰＥＧ−ＦＳＨ（Ｎ）を０．０１８、０．０７５、０．３ｕｇ／ｒａｔ容量で単回投与し、対照物質として天然型市販品であるＦｏｌｌｉｔｒｏｐｅを４、２、１ＩＵ／ｒａｔの容量で３日間毎日投与した。ビークル(vehicle)投与群と試験物質投与群のいずれも１３．３Ｕ／ｒａｔ容量のｈｃＧ(human chorionic gonadotropin)を併用投与した。各試験物質は、いずれも０．２５ｍＬ／ｋｇ投与液量で皮下投与された。試験物質の最初の投与後７２時間後に、試験動物などを安楽死させ、卵巣を摘出し、各試験動物で卵巣の重量を測定した。
【０１０２】
図３によると、免疫グロブリンＦｃ−３  ａｒｍ  ＰＥＧ−ＦＳＨ（Ｎ）は、濃度依存性を示し、免疫グロブリンＦｃ−２  ａｒｍ  ＰＥＧ−ＦＳＨ（Ｎ）と同一の効果を示すことが分かる。
【図１】
0005563572.tif 000006
【図２】
0005563572.tif 000007
【図３】
0005563572.tif 000008