(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
【化１】
0005599610.tif 000016
で表されるＰＵ−ＢＳＩ１２、
式
【化２】
0005599610.tif 000017
で表されるＰＵ−ＢＳ１８、
式
【化３】
0005599610.tif 000018
で表されるＰＵ−ＢＳＩ６、
式
【化４】
0005599610.tif 000019
で表されるＰＵ−ＢＳＩ１１、
式
【化５】
0005599610.tif 000020
で表されるＰＵ−ＢＳＩ７、
式
【化６】
0005599610.tif 000021
で表されるＰＵ−ＢＳＩ１３、
式
【化７】
0005599610.tif 000022
で表されるＰＵ−ＢＳＩ１４、
式
【化８】
0005599610.tif 000023
で表されるＰＵ−ＢＳＩ５、
式
【化９】
0005599610.tif 000024
で表されるＰＵ−ＨＺ１５０、
式
【化１０】
0005599610.tif 000025
で表されるＰＵ−ＨＺ１５１、
式
【化１１】
0005599610.tif 000026
で表されるＰＵ−ＤＺ１３、
式
【化１２】
0005599610.tif 000027
で表されるＰＵ−ＤＺ１４、
及び
式
【化１３】
0005599610.tif 000028
で表されるＰＵ−ＤＺ１６からなる群から選択されるプリン骨格の化合物の治療有効量を含む、神経変性疾患の処置のための医薬。
【請求項２】
化合物がＰＵ−ＨＺ１５０である、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
化合物がＰＵ−ＨＺ１５１である、請求項１に記載の医薬。
【請求項４】
化合物がＰＵ−ＢＳＩ５である、請求項１に記載の医薬。
【請求項５】
化合物がＰＵ−ＤＺ１３である、請求項１に記載の医薬。
【請求項６】
化合物がＰＵ−ＤＺ１４である、請求項１に記載の医薬。
【請求項７】
化合物がＰＵ−ＢＳＩ１１である、請求項１に記載の医薬。
【請求項８】
神経変性疾患がアルツハイマー病である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項９】
神経変性疾患治療用医薬の製造のための請求項１〜７のいずれか一項に記載のプリン骨格の化合物の使用。
【請求項１０】
神経変性疾患がアルツハイマー病である、請求項９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、本明細書に参照によって全ての目的で組み入れられる、２００６年６月３０日出願の米国仮出願第６０／８０６４２７号の優先権の利益を主張するものである。
【０００２】
本発明は、ＮＩＨ助成金ＡＧ０９４６４によって一部支援されている。米国政府は、本発明にある種の権利を有することができる。
【背景技術】
【０００３】
本出願は、熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）の阻害による神経変性疾患の処置に関する。
【０００４】
ＨＳＰ９０ファミリーのタンパク質は、哺乳動物細胞において認められたメンバー４つ：Ｈｓｐ９０α及びβ、Ｇｒｐ９４、並びにＴｒａｐ−１を有する。Ｈｓｐ９０α及びβは、サイトゾル及び核において、数々の他のタンパク質と会合して存在している。その様々な形態のＨｓｐ９０は、最も豊富な細胞シャペロンであり、変性又は「アンフォールドの」タンパク質のＡＴＰ依存性のリフォールディングに必要とされていることが実験上のシステムで示されている。したがって、これは、ストレスに対する細胞防御の一部として機能すると提唱されている。細胞が、熱又は他の環境ストレスに曝露されると、アンフォールドのタンパク質の凝集は、そのリフォールディング又は変性を触媒する経路によって防止される。このプロセスは、複数のシャペロン（Ｈｓｐ６０、９０、及び７０、並びにｐ２３）との秩序ある様式において、アンフォールドのタンパク質の会合に依存しており、「リフォルドソーム（ｒｅｆｏｌｄｏｓｏｍｅ）」を形成し、最終的にリフォールドされたタンパク質からシャペロンをＡＴＰ依存性に放出する。
【０００５】
Ｈｓｐ９０は、変異タンパク質の安定性及び機能を維持する役割も果たしていることがある。これは、変異ｐ５３及びｖ−ｓｒｃの発現には、それらの野生型の対応物よりもかなりの度合いで必要とされると思われる。これはタンパク質のアンフォールディングをもたらす突然変異の表現型の、Ｈｓｐ９０が媒介する抑制の結果として起こることが示唆されていた。
【０００６】
Ｈｓｐ９０は、細胞外因子に対する細胞の増殖応答に関与するいくつかの主要なタンパク質の立体配座上の成熟にも必要である。これらには、ステロイド受容体、及びある種の膜貫通型のキナーゼ（即ち、Ｒａｆセリンキナーゼ、ｖ−ｓｒｃ、及びＨｅｒ２）が含まれる。Ｈｓｐ９０がこれらのタンパク質に影響を及ぼす機序は完全に理解されていないが、タンパク質のリフォールディングにおけるその役割に類似する様子である。プロゲステロン受容体の場合は、受容体からのＨｓｐ９０の結合及び放出は、他のシャペロン及びイムノフィリンの放出に協力して循環様式で起こり、受容体に対するステロイドの高親和性の結合に必要とされることが示されている。このように、Ｈｓｐ９０は、ストレスの非存在下でも、シグナル経路の生理学的調節因子として機能し得る。
【０００７】
Ｈｓｐ９０は、複数の腫瘍型において、及び癌化の機能として過剰発現されることが示されている。トランスフォーメーションを維持する上でそれが必要な役割を果たしているか否かは知られていないが、この点について少なくとも３つの機能を有すことができる。癌細胞は、低酸素、低ｐＨ、及び低濃度の栄養の環境で増殖する。癌細胞は、また、放射線照射及び細胞毒性の化学療法剤に耐性になるように速やかに適応し、又は選択される。このように、ストレス下でタンパク質の安定性を維持するＨｓｐ９０の一般的役割は、これらの条件下での細胞の生存性にとって必要であり得る。第２に、癌細胞は、突然変異の発癌タンパク質を内部に持つ。これらのいくつかは、トランスフォームされた表現型に必要である機能獲得型の突然変異である。Ｈｓｐ９０は、これらのタンパク質のフォールドされ、機能的に活性な立体配座を維持するのに必要とされ得る。第３に、Ｒａｆ及び他のＨｓｐ９０のターゲットである、ステロイド受容体によって媒介されるシグナル経路の活性化は、このような機能的なＨｓｐ９０もおそらく必要とする多くの腫瘍の増殖及び生存に必要とされる。
【０００８】
神経変性は、癌と同様、単一の調節不全の事象の結果ではない様子であるが、それどころか、異常な発現、翻訳後修飾、及びある種のタンパク質のプロセシングによって明らかにされる複雑なトランスフォームされた表現型の創出をもたらす、環境の、エピジェネティックの、及び遺伝的な事象を伴う数ステップのプロセスである。ニューロンにおいて、これら調節不全のタンパク質を機能的に維持するには、癌に罹患している細胞に類似して、トランスフォームのプロセスとともに進化する分子シャペロンの制御の機序が必要とされ得る。
【０００９】
神経変性疾患の状況下では、Ｈｓｐ９０は２つの役割を果たし得る。第１に、神経変性疾患において、異常に活性化したキナーゼ（例えば、ｃｄｋ５／ｐ３５．ｇｓｋ３β）は、機能するのにＨｓｐ９０を必要とし得る。したがって、Ｈｓｐ９０を阻害することで、罹患している脳において損傷を受けたシグナリングネットワークを、異常なリン酸化を軽減することによって修復し、異常なタンパク質の凝集の低減、並びに凝集物及びそれらに付随する毒性の排除又は低減をもたらす。第２に、病原性の突然変異体（例えば、ＡＤにおけるＡＰＰ若しくはプレセニリン、又はＦＴＤＰ−１７におけるｍタウ、又は延髄性筋萎縮症における突然変異体のアンドロゲン受容体）は、正確なフォールディング及び機能にＨｓｐ９０を必要とすることがあり、したがってＨｓｐ９０を阻害すると、これらのタンパク質の排除をもたらし、凝集及び結果としてプラーク又は濃縮体の形成の低減をもたらし得る。
【００１０】
殆どの神経変性疾患は、おそらく、突然変異体及び異常なシグナリングの両方を特徴とし、Ｈｓｐ９０は病原性の突然変異体に関しても役割を果たすことができる。タウ突然変異は、常染色体優性の前頭側頭型認知症を引き起こす。アンドロゲン受容体の突然変異に関連する病原性には、完全型アンドロゲン不応症（ＣＡＩＳ）、及び球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ又はＫｅｎｎｅｄｙ病）が含まれる（４）。プレセニリン遺伝子における突然変異は、家族性ＡＤの主な原因である。コンディショナルノックアウトマウスの分析により、プレセニリンの不活性化が進行性の記憶障害及び年齢依存性の神経変性をもたらすことが示されており、プレセニリンの活性を低減すると、重要な病原の機序を表し得ることを示唆している。プレセニリンは、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）含有遺伝子の転写を正方向に調節し、そのいくつかは、記憶の形成及びニューロンの生存にとって重要であることが知られている（５）。アルツハイマー病（ＡＤ）は、ＮＦＴ（タウ凝集物）及びプラーク（Ａβ沈着）の両方を特徴とする。アルツハイマー病では、アミロイド前駆タンパク質又はプレセニリンにおける突然変異が、常染色体優性遺伝病を引き起こす。これらは、沈着したペプチドＡβの生成を担う基質及びプロテアーゼである。プリオンの突然変異は、ゲルストマンシュトロイスラー症候群、及び遺伝性クロイツフェルトヤコブ病を引き起こし、αシヌクレインの突然変異は、常染色体優勢性パーキンソン病を引き起こす。これらの場合において、病原性の突然変異は罹患している組織に沈着しているタンパク質におけるものであリ、タンパク質全体が沈着している。ハンチントン病は、突然変異体のハンチンチンに起因する（９）。このように、全ての場合において、突然変異が、沈着のプロセスを伴う機序によって疾患をもたらす。
【００１１】
Ｈｓｐ９０のこれらの特徴により、Ｈｓｐ９０は治療用薬剤として実行可能な標的となっている。ＨＳＰ９０ファミリーのメンバーは、細菌から哺乳動物までの全てのＨｓｐ９０に特異的であり、且つその間に保存されている独特のポケットをそのＮ末端領域に保有しているが、このポケットは他の分子シャペロンには存在しない。このポケットに対する内在性のリガンドは知られていないが、これはＡＴＰ及びＡＤＰに低親和性で結合し、弱いＡＴＰアーゼ活性を有する。アンサマイシン系抗生物質であるゲルダナマイシン（ＧＭ）及びハービマイシン（ＨＡ）は、この保存されているポケットに結合することが示されており、この結合親和性は、Ｈｓｐ９０ファミリーの全メンバーに対して示されている。国際特許公開第ＷＯ９８／５１７０２号は、標的の細胞におけるタンパク質の変性、及び標的の細胞の死滅をもたらすアンサマイシンの標的送達を提供するための、ターゲットとする部分に連結しているアンサマイシン系抗生物質の使用を開示している。国際特許公開第ＷＯ００／６１５７８号は、特に、アンサマイシン系抗生物質のホモダイマー及びヘテロダイマーを含む、シャペロンタンパク質Ｈｓｐ９０と相互作用する２つの部分を有する二官能性の分子に関する。これらの二官能性分子は、ＨＥＲファミリーチロシンキナーゼの変性及び／又は阻害を促進するように作用し、Ｈｅｒ−キナーゼを過剰発現する癌の処置に有効である。
【００１２】
ＡＴＰ及びアンサマイシン系抗生物質と同じＨｓｐ９０の結合ポケットに結合する例示の小分子治療法は、ＰＣＴ公開第ＷＯ０２／３６０７５号、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０６／０３６７６号、及び米国特許公開第２００５−０１１３３３９号、第２００５−０００４０２６号、第２００５−００４９２６３号、第２００５−０２５６１８３号、第２００５−０１１９２９２号、第２００５−０１１３３４０号、及び第２００５−０１０７３４３号に開示されており、これら全てが本明細書に参照によって組み入れられる。
【００１３】
老齢の生物体においては、シャペロンの過負荷は、細胞の網状組織の頑強さにおける大幅な低減をもたらし、これらの機能をより確率論的な挙動に向かって転換する。不均衡なシャペロンの要求及びシャペロンの能力は、非常に制限されたニューロンの増殖の可能性により、特に神経系において、ミスフォールドされ、凝集したタンパク質の蓄積を助ける。さらに、損傷を受けたシグナリングネットワークは、それらのもともとの厳密さを失い、不規則なタンパク質のリン酸化が起こる。このような損傷効果を軽減及び逆転する訴求力ある取組みは、Ｈｓｐ９０活性を変調することによるものである。Ｈｓｐ９０活性の阻害薬は、Ｈｓｐ９０複合体からＨＳＦ１を放出し、熱ストレス後のＨＳＦ１活性の欠陥のある制御を修正し、Ｈｓｐ７０及びＨｓｐ４０などのシャペロンの細胞レベルにおける増大をもたらす。これらのシャペロンの過剰発現は、適切なフォールディングを回復させ、ミスフォールドされたタンパク質の毒性効果を軽減する一般的な方法を代表することが示されている。正確なフォールディングの回復に対するこれらの効果の他に、Ｈｓｐ９０阻害薬は、罹患しているニューロンのシグナリングネットワークに関与するタンパク質を制御し得る。
【００１４】
しかし、神経変性疾患の処置における臨床薬としてのＨｓｐ９０阻害薬の有用性は、患者にとって許容できる薬物の濃度でそれらの効果が生じるか否かに、及び脳においてこれらの濃度を達成するような様式で薬物を投与することができるか否かに依存している。残念なことに、ゲルダナマイシン及び１７ＡＡＧなどの知られているＨｓｐ９０阻害薬、癌に対する第Ｉ相の臨床試験中のその誘導体、及び非関連の化合物であるラジシコールには、重大な限界が存在する。これらは難溶性であり、調合するのが困難であり、血液脳関門を越えない。したがって、神経変性疾患の処置に対する可能性を実現するために、Ｈｓｐ９０を阻害する治療薬、並びに十分な可溶性及び血液脳関門を超える能力を有し、又は他の方法で脳に送達される治療薬が必要とされる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明に従って、神経変性疾患の処置が、Ｈｓｐ９０を阻害し、血液脳関門を越える能力を有する小分子プリン骨格の化合物を用いて実現される。したがって、本発明に従って、そのような処置を必要とする個体に、Ｈｓｐ９０を阻害し、血液脳関門を越え、又はその他の方法で脳に送達される、プリン骨格の化合物の有効量を投与するステップを含む神経変性疾患を処置するための方法が提供される。
【００１６】
一実施形態では、本発明の方法で用いられるプリン骨格の化合物は、リンカーによって単環式の置換基に、８位又は９位で連結しているプリン部分を有する。このような化合物は、ＰＣＴ公開第ＷＯ０２／３６０７５号、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０６／０３６７６号、及び米国特許公開第２００５−０１１３３３９号、第２００５−０００４０２６号、第２００５−００４９２６３号、第２００５−０２５６１８３号、第２００５−０１１９２９２号、第２００５−０１１３３４０号、及び第２００５−０１０７３４３号に記載されている。
【００１７】
一実施形態では、本発明の方法は、一般構造：
【化１】
0005599610.tif 000002
［式中、
Ｒは、水素；場合により２’位に連結して８から１０員環を形成する、Ｎ又はＯなどのヘテロ原子を場合により含む、Ｃ１からＣ１０アルキル、アルケニル、アルキニル、又はアルコキシアルキル基であり、
Ｙ１及びＹ２は、Ｙ１及び／又はＹ２がＯである場合は二重結合が欠損している、又は環のアリールの性質を保持するように再構成されるという条件で、独立に、Ｃ、Ｎ、Ｓ、又はＯであり、
Ｘ４は、水素、ハロゲン、例えば、Ｆ、又はＣｌ、又はＢｒであり、
Ｘ３は、ＣＨ２、ＣＦ２、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、Ｏ、ＮＨ、又はＮＲ２であり、式中Ｒ２はアルキルであり、
Ｘ２は、ハロゲン、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、ハロゲン化アルコキシ、ヒドロキシアルキル、ピロリル、場合により置換されているアリールオキシ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルバミル、アミド、アルキルアミド、ジアルキルアミド、アシルアミノ、アルキルスルホニルアミド、トリハロメトキシ、トリハロ炭素、チオアルキル、ＳＯ２−アルキル、ＣＯＯ−アルキル、ＮＨ２、ＯＨ、又はＣＮ、又はＲによって形成される環の部分であり、
Ｘ１は、Ｘ１が５’位における少なくとも１つの置換基を表す場合は５’位における前記置換基はＸ２と同じ選択、即ちＣ１からＣ６アルキル若しくはアルコキシから選択されるという条件で、アリール基上のもう１つの置換基を表し、又はＸ１は式−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−を有し、式中ｎは１又は２であり、酸素の一方はアリール環の５’位で結合しており、他方は４’位に結合している］
を有する小分子プリン骨格の化合物を使用する。
【００１８】
右側のアリール基は、フェニルであってもよく、又は１つ若しくは複数のヘテロ原子を含んでいてもよい。例えば、右側のアリール基は、ピリミジンなどの含窒素芳香族複素環であってよい。
【００１９】
本発明の化合物の詳しい実施形態では、右側のアリール基は２’及び５’位のみで置換されている。他の実施形態では、右側のアリール基は２’、４’、及び５’位で置換されている。さらに他の実施形態では、右側のアリール基は４’及び５’位のみで置換されている。当業者であれば理解されるように、番号付けは描いた通りの構造をもとにしており、ヘテロ原子の挿入など、構造における変動により、公式の命名法の目的で番号付けが変更されることがある。
【００２０】
本発明の化合物の他の詳しい実施形態では、右側のアリール基は２’位に置換基を有し、Ｘ１は、式−Ｘ−Ｙ−Ｚ−を有し、Ｘ及びＺは右側のアリールに対して４’及び５’位で連結しており、式中、Ｘ、Ｙ、及びＺは独立に、単結合若しくは二重結合によって、及び原子価を満たすのに好適な水素、アルキル、又は他の置換と連結しているＣ、Ｎ、Ｓ、又はＯである。いくつかの実施形態では、Ｘ、Ｙ、及びＺの少なくとも１つは炭素原子である。詳しい一実施形態では、Ｘ１は−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−であり、式中ｎは１又は２であり、酸素原子の一方はアリール環の５’位で、及び他方は４’位で結合している。このタイプの化合物のさらなる例を、図４に示す。
【００２１】
本発明の詳しい実施形態によると、プリン骨格の化合物は、図５に示す式を有する。
【００２２】
本発明の化合物は、化合物がｈｓｐ９０を阻害し、さらに血液脳関門を越える能力も維持していれば、式：
【化２】
0005599610.tif 000003
を有するこれらの化合物のホモダイマー又はヘテロダイマーであってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】ＰＵ２４ＦＣｌ短期投与後のマウスの脳におけるタウのリン酸化活性を示す図である。
【図１Ｂ】短期投与後のマウスの脳におけるＰＵ２４ＦＣｌの濃度を示す図である。
【図２】ＰＵ２４ＦＣｌでのＨｓｐ９０長期阻害の、タウのリン酸化及び他のタンパク質の発現に対する効果を示す図である。
【図３】ＰＵ−ＤＺ８でのＨｓｐ９０長期阻害の、タウのリン酸化に対する効果を示す図である。
【図４】本発明の方法に有用な化合物を示す図である。
【図５】本発明の方法に有用な化合物を示す図である。
【図６】本発明に有用な化合物を作成する合成図式を示す図である。
【図７】本発明に有用な化合物を作成する合成図式を示す図である。
【図８Ａ】プリン骨格の化合物の腹腔内投与による、本発明に従って処置したマウスの脳における様々なタンパク質のレベルを示す図である。
【図８Ｂ】プリン骨格の化合物の腹腔内投与による、本発明に従って処置したマウスの脳における様々なタンパク質のレベルを示す図である。
【図９】ＰＵ−ＤＺ８を１投与量投与後の、変異タンパク質であるｍタウ（ＨＴ７）の分解を示す図である。シャペロンレベル（ｈｓｐ７０の増大）及びキナーゼ発現（ｐ３５レベル）における変化も示されている。
【図１０】ｈｓｐ９０のシャペロニング（ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎｇ）に対する変異タウタンパク質の依存性を示す図である。
【図１１Ａ】神経芽細胞腫細胞におけるプリン骨格の化合物によるｈｓｐ９０の結合及びｈｓｐ７０の誘発を示す図である。
【図１１Ｂ】神経芽細胞腫細胞におけるプリン骨格の化合物によるｈｓｐ９０の結合及びｈｓｐ７０の誘発を示す図である。
【図１２】ＪＮＰＬ３脳抽出物におけるＰＵ−ＤＺ８、ＰＵ２４ＦＣｌ、及び１７ＡＡＧのｈｓｐ９０に対する結合親和性を示す図である。
【図１３】ＰＵ−ＤＺ８の１投与量７５ｍｇ／ｋｇをｉ．ｐ．投与後、ＪＮＰＬ３トランスジェニックマウスの脳において、ＰＵ−ＤＺ８が薬理学的に関連ある濃度に到達することを示す図である。
【図１４Ａ】ＰＵ−ＤＺ８の１投与量の短期投与の、ＪＮＰＬ３マウス脳における可溶性の変異タウのレベルに対する効果を示す図である。２．５から４カ月齢のマウスの皮質下の脳領域を表す。ヒトタウのレベルを、Ｈｓｐ９０のレベルに標準化した。
【図１４Ｂ】ＰＵ−ＤＺ８の１投与量の短期投与の、ＪＮＰＬ３マウスの脳における不溶性の変異タウのレベルに対する効果を示す図である。ＰＵ−ＤＺ８（７５ｍｇ／ｋｇ）で４、８、１２、及び２４時間処置後の６カ月齢のマウスの皮質下の脳領域から抽出した不溶性タウ（Ｐ３）分画の分析を表す。
【図１５】ＰＵ−ＤＺ８の長期投与の、毒性のタウ凝集物における過剰リン酸化のタウに対する効果を示す図である。
【図１６Ａ】アルツハイマー病患者に類似する、病原性に過剰リン酸化されたＷＴタウを発現するｈタウマウスにおけるｐ３５に対するＰＵ−ＤＺ８の効果を示す図である。
【図１６Ｂ】アルツハイマー病患者に類似する、病原性に過剰リン酸化されたＷＴタウを発現するｈタウマウスにおけるＰＵ−ＤＺ８のタウのリン酸化の効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、そのような処置を必要とする個体に、Ｈｓｐ９０を阻害し、血液脳関門を越え、又はその他の方法で脳に送達される、プリン骨格の化合物の治療有効量を投与するステップを含む、神経変性疾患を処置するための方法を提供する。
【００２５】
本出願で用いられる、「処置」の語は、個体における神経変性疾患の、徴候の開始を遅らせ、重症度を低減し、又は徴候の進行を遅らせることを意味する。疾患の治療法は、処置の範囲内である必要はない。さらに、これらの処置の目的の詳しい結果は個体によって変化し、個体によっては、代表的な集団に対する統計学的な平均値を超え、又はそれより劣る恩恵を得ることがあることが理解されよう。このように、処置は、治療上の恩恵を得るであろうという期待を持って、必要とする個体に化合物を投与することを意味する。
【００２６】
「神経変性疾患」の語は、キナーゼ活性の調節不全、突然変異のタンパク質（変異タウ、突然変異ＡＰＰ）、並びにミスフォールディング及びアポトーシスの増大をもたらすシャペロンの不均衡による異常なリン酸化など、シグナル経路における異常を特徴とする疾患を意味する。詳しい一実施形態では、神経変性疾患は、タウオパシー、即ち、過剰リン酸化したタウタンパク質、及び細胞内神経原線維変化（ＮＦＴ）の形成の特徴を共有するタウタンパク質の異常を特徴とする神経変性疾患である。制限なしに、本出願で用いられる「神経変性疾患」の語は、アルコール誘導性神経変性（１０）、アルツハイマー病（１１）、筋萎縮性側索硬化症（１３、１４）、脳虚血（１５：２０）、コカイン中毒（２１）、びまん性レビー小体病（２２）、電撃痙攣（２３）、胎児性アルコール症候群（１０）、限局性皮質形成異常（２４）、遺伝性イヌ脊髄筋萎縮症（２５）、封入体筋炎（２６）、多系統萎縮症（２７、２８）、ニーマン−ピック  タイプＣ、パーキンソン病（２２）、及び末梢神経損傷（７１）を意味し、包含する。
【００２７】
「投与する」の語は、個体中に治療用化合物を導入する行為を意味する。一般に、あらゆる投与経路を用いることができる。本発明の方法に用いられる化合物は、血液脳関門を越えることができる可能性があるので、全身的な投与を用いることができる。したがって、本発明のある実施形態では、経口の、静脈内の、筋肉内の、又は非経口の注射による投与が好適である。投与は、吸入によって脳に対して行ってもよい、というのは、ＢＢＢ毛細血管を有することなしに脳と連結している鼻の上側にコンパートメントが存在するからである。血液脳関門を越える化合物は、この投与様式にとって、同様に好ましいが、この特徴が厳密に必要とされるわけではない。
【００２８】
「治療有効量」の語は、投与する化合物の量、及び統計学的根拠に基づいて個体における神経変性疾患の防止、重症度の低減、又は進行の遅延の結果を得る投与スケジュールの両方を包含する。理解されるように、好ましい量は、毒性／耐性を、治療効果及び投与様式と釣り合わせるために、化合物によって変化する。投与の数及び頻度に関する、最大耐容薬量の決定、及び処置レジメンの決定は、化合物の早期の臨床評価のルーチンの部分である。
【００２９】
本明細書で用いられる「血液脳関門を越える」の語は、全身投与の後、検出可能な量の化合物が脳に移行する能力を意味する。化合物が血液脳関門を越える能力は、マウスなどの動物モデルを用いて評価することができる。以下の実施例で説明するように、例えば５０から２００ｍｇ／ｋｇの単一投与量の投与を用い、間をおいて動物を屠殺し、化合物の脳内濃度を決定することができる。化合物が脳に移行する程度は、やはり、必要である治療用化合物の量に影響を及ぼすことも理解されよう。しかし、一般的に、血液脳関門を越える化合物は、分子量が４００ダルトン未満であり、本明細書に開示する化合物に好ましくは匹敵するある程度の脂溶性があり、血漿タンパク質の結合に制限がなく、ｐ糖タンパク質などのいくつかのＢＢＢ活性排出トランスポーターのいずれにも有意な親和性がないものとなろう。この点に関して、１７−ＡＡＧは血液脳関門を効果的に越えず、Ｐ−糖タンパク質の基質であることが注目されている。
【００３０】
本発明の方法で使用される治療用化合物は、適切には、Ｈｓｐ９０を阻害し、血液脳関門を越える能力を有する小分子プリン骨格の化合物である。「プリン骨格の化合物」の語は、それに対して８位又は９位にさらなるアリール環又はヘテロアリール環が結合しているプリン部分を有する化合物を意味し、化合物は全体として、Ｈｓｐ９０のＮ末端ポケット内に受け止められるべき必要な柔軟性及び置換基を有している。これらの一般的な必要条件はＰＣＴ公開第ＷＯ０２／３６０７５号で論じられている。
【００３１】
一実施形態では、本発明の方法は、一般構造：
【化３】
0005599610.tif 000004
［式中、
Ｒは、水素；場合により２’位に連結して８から１０員環を形成する、Ｎ又はＯなどのヘテロ原子を場合により含む、Ｃ１からＣ１０アルキル、アルケニル、アルキニル、又はアルコキシアルキル基であり、
Ｙ１及びＹ２は、Ｙ１及び／又はＹ２がＯである場合は二重結合が欠損している、又は環のアリールの性質を保持するように再構成されるという条件で、独立に、Ｃ、Ｎ、Ｓ、又はＯであり、
Ｘ４は、水素、ハロゲン、例えば、Ｆ、若しくはＣｌ、又はＢｒであり、
Ｘ３は、ＣＨ２、ＣＦ２、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、Ｏ、ＮＨ、又はＮＲ２であり、式中Ｒ２はアルキルであり、
Ｘ２は、ハロゲン、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、ハロゲン化アルコキシ、ヒドロキシアルキル、ピロリル、場合により置換されているアリールオキシ、アルキルアミノ、ジアリルアミノ、カルバミル、アミド、アルキルアミド、ジアルキルアミド、アシルアミノ、アルキルスルホニルアミド、トリハロメトキシ、トリハロ炭素、チオアルキル、ＳＯ２−アルキル、ＣＯＯ−アルキル、ＮＨ２、ＯＨ、又はＣＮ、又はＲによって形成される環の部分であり、
Ｘ１は、Ｘ１が５’位における少なくとも１つの置換基を表す場合は５’位における前記置換基はＸ２と同じ選択、即ちＣ１からＣ６アルキル若しくはアルコキシから選択されるという条件で、アリール基上のもう１つの置換基を表し、又はＸ１は式−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−を有し、式中ｎは１又は２であり、酸素の一方はアリール環の５’位で結合しており、他方は４’位に結合している］
を有する小分子プリン骨格の化合物を使用する。
【００３２】
右側のアリール基はフェニルであってもよく、又は１つ若しくは複数のヘテロ原子を含んでいてもよい。例えば、右側のアリール基は、ピリミジンなどの含窒素芳香族複素環でもよい。
【００３３】
本発明の化合物の詳しい実施形態では、右側のアリール基は２’及び５’位のみで置換されている。他の実施形態では、右側のアリール基は２’、４’、及び５’位で置換されている。さらに他の実施形態では、右側のアリール基は４’及び５’位のみで置換されている。当業者であれば理解されるように、番号付けは描いた通りの構造をもとにしており、ヘテロ原子の挿入など、構造における変動により、公式の命名法の目的で番号付けが変更されることがある。
【００３４】
本発明の化合物の他の詳しい実施形態では、右側のアリール基は２’位に置換基を有し、Ｘ１は、式−Ｘ−Ｙ−Ｚ−を有し、Ｘ及びＺは右側のアリールに対して４’及び５’位で連結しており、式中、Ｘ、Ｙ、及びＺは独立に、単結合若しくは二重結合によって、及び原子価を満たすのに好適な水素、アルキル、又は他の置換と連結しているＣ、Ｎ、Ｓ、又はＯである。いくつかの実施形態では、Ｘ、Ｙ、及びＺの少なくとも１つは炭素原子である。−Ｘ−Ｙ−Ｚ−におけるＹは、Ｘ−Ｙ−Ｚ基が６員環を形成するように、−（ＣＨ２）２であってもよい。詳しい一実施形態では、Ｘ１は−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−であり、式中ｎは０から２までの１又は２であり、酸素原子の一方はアリール環の５’位で、及び他方は４’位で結合している。このタイプの化合物のさらなる例を図４に示す。
【００３５】
本発明の詳しい実施形態では、Ｒは、３−イソプロピルアミノプロピル、３−（イソプロピル（メチル）アミノ）プロピル、３−（イソプロピル（エチル）アミノ）プロピル、３−（（２−ヒドロキシエチル）（イソプロピル）アミノ）プロピル、３−（メチル（プロプ−２−イニル）アミノ）プロピル、３−（アリル（メチル）アミノ）プロピル、３−（エチル（メチル）アミノ）プロピル、３−（シクロプロピル（プロピル）アミノ）プロピル、３−（シクロヘキシル（２−ヒドロキシエチル）アミノ）プロピル、３−（２−メチルアジリジン−１−イル）プロピル、３−（ピペリジン−１−イル）プロピル、３−（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル）プロピル、３−モルホリノプロピル、３−（トリメチルアンモニオ）プロピル、２−（イソプロピルアミノ）エチル、２−（イソブチルアミノ）エチル、２−（ネオペンチルアミノ）エチル、２−（シクロプロピルメチルアミノ）エチル、２−（エチル（メチル）アミノ）エチル、２−（イソブチル（メチル）アミノ）エチル、又は２−（メチル（プロプ−２−イニル）アミノ）エチルである。
【００３６】
本発明の詳しい実施形態によると、プリン骨格の化合物は図５に示す式を有する。
【００３７】
本発明の化合物は、化合物がｈｓｐ９０を阻害し、さらに血液脳関門を越える能力を保持していれば、式：
【化４】
0005599610.tif 000005
を有するこれらの化合物のホモダイマー又はヘテロダイマーであってもよい。
【００３８】
ｉｎ  ｖｉｖｏの活性化合物がダイマーの形態である場合、化合物は、ｈｓｐ９０を阻害する能力、及び血液脳関門を越える能力も保持している。この場合、リンカーは、ダイマーの２つの部分に、両方がＨＳＰ９０のＮ末端ポケットと独立に相互作用するのを可能にする十分な回転の自由を提供する原子の、あらゆる一般的に直鎖の基であってよい。適切なリンカーの非限定的な例には、Ｃ４からＣ１０アルキル、アルケニル、又はアルキニル基、及び原子４個から１０個の全長を有する第２級アミンが含まれる。
【００３９】
このタイプの化合物には、モノマーの薬剤がｉｎ  ｖｉｖｏで提供されるように、分解可能な、又は切断可能なリンカーも提供され得る。この実施形態では、ダイマーの形態は、血液脳関門を越える活性又は能力を保持している必要はなく、したがってリンカーの性質は、活性に関連なく、活性のモノマー種を形成する能力だけに関連している。一般的に、ＰＵなどの中程度に親油性の薬物は、受動拡散によってＢＢＢを越える。ＢＢＢ透過性に対する優れた骨格上の理解は未だに欠如しているが、いくつかのパラメータがこのような挙動を促進すると考えられている。親油性は、ＣＮＳ透過に重要であると同定されている最初の記述子であった。いくつかのクラスのＣＮＳ活性物質について、Ｈａｎｓｃｈ及びＬｅｏ（８９）は、ＬｏｇＰ値が１．５〜２．７の範囲であり、平均値２．１である場合に血液脳関門の透過が最適であることを見出した。販売されているＣＮＳ薬物に対するＣｌｏｇＰの平均値は２．５である。ＰＵ−ＤＺ８のｌｏｇＰの計算値は１．７３（Ｍｏｌｉｎｓｐｉｒａｔｉｏｎを使用）であり、実験的に求めた値は１．５３（ＲＰ−ＨＰＬＣを使用）である。ＣＮＳ薬物は、他の治療法に比べると、分子量（ＭＷ）が大幅に低減している。ＣＮＳ薬物における分子量に対するルールは再検討されており、この場合、小分子は、分子量が４００から６００Ｄａの範囲に、又はそれ未満に保たれている場合、血液脳関門を通して著しい受動性の脂質媒介性の輸送を受けることがある（９０）。ＰＵ−ＤＺ８のＭＷは５１２である。ＱＳＡＲの方程式は全て、水素結合−ＣＮＳ透過が５又はそれ未満の水素結合のアクセプターを必要とする重要性を強調している（９１）。ＰＵ−ＤＺ８は４を有する。ＰＳＡは、腸管吸収、バイオアベイラビリティー、Ｃａｃｏ−２透過性、及びＢＢＢ透過を含めた薬物吸収を特徴付ける、非常に優れた記述子であることが示されている。ＰＳＡは、多くの研究者によって、ＢＢＢ透過に関するプレディクターとして用いられている（９２）。一般的に、ＣＮＳを目標とする薬物は、他のクラスよりも極性表面積が小さい傾向にある（９３、９４）。ＣＮＳ薬物に対するＰＳＡは、他の治療法に対するよりも大幅に低く、ＣＮＳ透過に対するＰＳＡは、６０〜７０Å２から９０Å２と推定されている（９５、９６）。分子が脳を透過するＰＳＡの上限は、約９０Å２である。ＤＺ８のＰＳＡは１０４Å２である。第２級アミンから第３級アミンまでの９Ｎ位に付着している鎖の性質を変化させると、ＰＳＡは９０Å２に低下する。回転可能な結合の数は、薬物の経口バイオアベイラビリティーの非常に優れた記述子であることが示されている（９７〜９９）。（１）回転可能な結合が１０又はそれより少なく、（２）極性表面積が１４０Å２に等しく若しくはそれ未満である（又は、Ｈ結合ドナー及びアクセプターが１２若しくはそれより少ない）という２つの判定基準だけを満たす化合物は、ラットにおいて経口のバイオアベイラビリティーが優れている可能性が高いことが示唆されている（９９）。ＣＮＳ薬物の多くは塩基性であり、生理学的条件下ではその荷電状態と中性状態との間の平衡で存在しており、又はＣＮＳ薬物が酸性基も有する場合は両親媒性である。ｐＨ７〜���で正の電荷を有すると、脳の透過性を好む傾向にある（１００）。さらに、第３級窒素を有する化合物（多くのＣＮＳ薬物の特徴）は、高度の脳の透過性を示す。これらの特徴は全て、本明細書に記載する、プリン骨格の化合物を倣うものである。
【００４０】
血液脳関門を越える能力の指標となる別の特徴は、タンパク質の結合である。薬物−タンパク質相互作用は、可逆的なプロセスであり、成功しているＣＮＳ薬物は、効率的なＰ−糖タンパク質基質ではないはずである（ｉｎ  ｖｉｖｏ）（１０２）。潜在的な神経治療薬がＢＢＢを横切って移動するのは十分ではなく、それはまた、脳に十分長く留まって望ましい作用を遂行しなければならない。これは、脳から化合物を追放するように働く様々な輸送タンパク質に対する基質であることも避けなければならないことを意味している。Ｈｓｐ９０阻害薬である１７ＡＡＧはＰ−ｇｐ基質であるが、プリン骨格の治療用ＰＵ−ＤＺ８はＰ−ｐｇの基質ではなく、したがってこの機序によって脳から簡単に追放されることはない。
【００４１】
本発明の方法で有用な化合物を作成する合成方法は、ＰＣＴ公開第ＷＯ０２／３６０７５号、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０６／０３６７６、及び米国特許公開第２００５−０１１３３３９号、第２００５−０００４０２６号、第２００５−００４９２６３号、第２００５−０２５６１８３号、第２００５−０１１９２９２号、第２００５−０１１３３４０号、及び第２００５−０１０７３４３号に記載されている。図６及び図７は、図４に示す構造を有する化合物を作成する合成図を示している。炭素のリンカーの場合には、メチレンジオキシ架橋を図６に図示した代謝上安定なアイソスターで置き換えることによって、フェニル酢酸を最初に産生する。２，４，５，６−テトラアミノピリミジンを、対応するカルボキシル酸の酸フッ化物とカップリングすることによって合成が開始する。フェニル酢酸をＣＨ２Ｃｌ２中のフッ化シアヌル及びピリジンで処理することによって、酸フッ化物が産生される。水で手早く洗浄した後、得られた酸フッ化物を、さらなる精製なしで次のステップで用いる。ピリミジン−酸フッ化物のカップリングから得られたアミドを、アルコール性ＮａＯＭｅ中加熱することによって環化する。Ｃ２−アミノ基のフッ素への変換（ＮＨ２からＦ）をＮａＮＯ２の存在下ＨＦ／ピリジン中アミノ誘導体の改変シーマンジアゾ化−フルオロ脱ジアゾ化によって行う。一般にこの位置におけるフッ素は、おそらくＣ６ＮＨ２の水素ドナー能力を増大することによって、得られるプリンの効力を増強することが、本発明者ら及び他者らによって以前に決定されている。ＮＩＳ又はＮＢＳのいずれかを用いたさらなる選択的ハロゲン化によって、対応するヨウ素又は臭素誘導体がもたらされる。これらを、Ｃｓ２ＣＯ３の存在下、最初に１，３−ジブロモプロパン、又は１，２−ジブロモブタンでアルキル化する。ダイマーの形成は、この反応では検出されない。得られた臭素を、過剰のＲ１Ｒ２ＮＨの存在下でさらにアルキル化して、最終生成物を得る。
【００４２】
イオウのリンカーを含む誘導体に関しては、Ｈｅら（１）によって以前に記載された方法を用いて合成を行い、銅が触媒する８−メルカプトアデニンのヨウ化アリールとのカップリングを用いる（図７）。反応は、窒素下、１１０℃の無水ＤＭＦで起こる。８−アリールスルファニルアデニンを、求電子性のヨウ素の供給源としてＮＩＳ、触媒としてＴＦＡを用いてアリール部分の２位を、さらに選択的にヨウ素化する。これを、過剰のＲ１Ｒ２ＮＨの存在下で９Ｎをさらにアルキル化して、最終生成物を得る。
【００４３】
タウオパシーへの本発明の適用
アルツハイマー病（ＡＤ）は、主に大脳皮質及び海馬における、老人斑の存在、神経原線維変化、及びニューロンの大量の喪失に付随する認知及び記憶の進行性の悪化を特徴とする、最も一般的な神経変性障害である。老人斑は、異栄養性の神経突起、反応性のミクログリア、及びアストロサイトによって取り囲まれているβアミロイド（Ａβ）原線維からなる、細胞外沈着物である。繊維状タウの封入は、ＡＤ、ダウン症候群（ＤＳ）、プリオン病のいくつかの変種、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、筋萎縮性側索硬化症／グアムのパーキンソニズム−認知症コンプレックス（ＡＬＳ／ＰＤＣ）、パーキンソニズムを伴う孤発性前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ）、ピック病、及び家族性ＦＴＤＰ−１７症候群を含めた神経変性疾患の増大するファミリーであるタウオパシーの顕著な特徴としてますます認められている。タウは、ニューロンの細胞骨格の決定的な成分である。ニューロンのアポトーシスに付随する形態学的変化のいくつかは、細胞骨格の網状構造の著しい修飾を伴い、その後のニューロンの変性の一因となる可能性があり、細胞骨格の網状構造の破壊が神経変性を引き起こし得ることを示している。軸索では、タウタンパク質は、タンパク質に会合する主な微小管の１つである（３０）。これは微小管を安定化し、神経突起の成長を促進する。タウのこの見かけ上有益な役割は、いくつかの神経変性疾患、最も顕著にはＡＤにおける異常なその挙動と対照をなし、ＡＤでは、タウは高度にリン酸化した形態で生じ、微小管から引き離され、凝集する。病原性のタウの突然変異又は異常なタウのリン酸化（ＡＤ及び前頭側頭型認知症で生じる）は、ＮＦＴ及び神経原性疾患のより速やかな発生をもたらし、この特徴は、これらの疾患がタウの凝集に起因するという見解と一致する（３１）。
【００４４】
染色体１７上のヒトタウイソ型におけるいくつかの突然変異により、「第１７染色体に連鎖する前頭側頭型認知症及びパーキンソニズム（ＦＴＤＰ−１７）」と呼ばれる一団の神経変性疾患がもたらされ、罹患した脳の領域においてＡＤにおけるものと同様の神経原線維変化の蓄積によって特徴づけられる。これらのタウ突然変異体の生化学的研究により、これらが正常タウよりも安定性が劣り、原繊維の凝集物を形成する傾向があることが明らかにされ（３２）、タウオパシーがタンパク質のフォールディング及び安定性に関連する疾患であるという見解に一致している。ＡＤにおけるタウタンパク質は突然変異していないが、それにもかかわらずＮＦＴを含んでいる。ＡＤでは、タウは過剰リン酸化となり、これがタウの微小管を安定化する役割を損なうことが仮定されている。
【００４５】
過剰リン酸化されたタウは、ミスフォールドし、微小管からの最終的な解離を経験し、異常な繊維状の凝集（ペアードヘリカルフィラメント、ＰＨＦ）を形成し、重合してＮＦＴになると考えられている（３３）。このプロセスにおけるタンパク質のミスフォールディングの主な役割は、ＦＤＴＰ−１７に関連する様々なタウの突然変異はそれらのリン酸化のレベルにおいて異なり、微小管に対するそれらの効果において異なるという観察によって説明される（３４）。本発明者らは、凝集したタウと、タウトランスジェニックマウス及びアルツハイマー病の脳における熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ）７０／９０のレベルとの間の逆相関を示している。様々な細胞モデルにおいて、Ｈｓｐ７０及びＨｓｐ９０のレベルの増大がタウの可溶性及びタウの微小管への結合を促進し、不溶性タウを低減し、タウのリン酸化の減少を引き起こした。それとは逆に、Ｈｓｐ７０及びＨｓｐ９０のレベルの低下は逆の効果をもたらした。本発明者らは、シャペロンのタウタンパク質との直接の会合も実証している。本発明者らの結果は、タウを生産的なフォールディング経路に分割することによって、及びそれによってタウの凝集を防ぐことによって、分子シャペロンの上方制御が神経原線維変化の形成を抑制し得ることを示唆していた（１２）。
【００４６】
Ｈｓｐ９０阻害薬は、他の神経変性システムにおいてＨｓｐ７０シャペロンのレベルを有益に増大することが見出された。シャペロン、特にＨｓｐ７０及びＨｓｐ４０の誘発は、フォールディングの疾患における開始を遅らせ、又は症状を低減することが見出された（３）。ＧＭは、熱ショック反応を活性化し、ハンチントン病の細胞培養モデルにおいてハンチンチン凝集を阻害することが見出された（１６）。ＧＭは、スクレーピー感染細胞における欠陥のある熱ショック反応に対する機能を回復することが報告された（１７、１８）。Ａｕｌｕｃｋら（１９）は、ＧＭを有するパーキンソン病のハエモデルの処置は、α−シヌクレインの毒性に対して完全に保護することを報告した。これらの効果は、ニューロン封入体の顕微鏡的外観を変えることなく観察され、シャペロンは、タンパク質の凝集の形成を単に防止するよりも、タンパク質凝集物を、より微妙な方法で「解毒する」ことを示唆している。Ａｕｌｕｃｋは、また、シャペロンの中程度の変化又は再分布だけでも、神経保護には十分であり得ることも示唆した（１９）。
【００４７】
Ｈｓｐ９０阻害薬のこれらの効果は、これらのＨＳＦ１−ｈｓｐ９０複合体の調節によって生じる。正常細胞では、ミスフォールドされた、又は凝集されたタンパク質の存在が、熱ショック反応と呼ばれる、複合の生物学的反応を誘発する（６）。これは熱ショックタンパク質（ＨＳＰ、分子シャペロン）の発現、及びユビキチン−プロテアソーム経路に関与するタンパク質の発現に関与する。このような複合の機構の進化は、アンフォールドのタンパク質が出現するとすぐに細胞が単離し、速やかに一掃することが必要であるという事実を証明するものである。ストレス無負荷の細胞では、ＨＳＦ１は、Ｈｓｐ９０との動的複合体を形成する（７）。タンパク質のアンフォールディングが増大すると、これらの非天然タンパク質は、Ｈｓｐ９０の結合に対してＨＳＦ１と競合し、非結合のＨＳＦ１における増大及びＨＳＰの誘発をもたらす。ストレス誘発性のシャペロンの合成が損なわれる場合に、フォールディングの疾患が可能である（８）。そのＨＳＦ１活性の制御によって示唆されるように、Ｈｓｐ９０阻害薬によるＨｓｐ９０活性の妨害は、熱ショック反応を誘発する。ニューロンの疾患が活性化するキナーゼの活性は、Ｈｓｐ９０によって制御される。
【００４８】
本発明者らは、また、病理学的部位におけるタウのリン酸化レベルは、ＡＤの細胞モデルにおいてＨｓｐ９０阻害薬であるゲルダナマイシン（ＧＭ）で処置した後に低減したことも示している。Ｃｄｋ５、Ｇｓｋ３、及びＭＡＰＫは、病理学的部位でタウをリン酸化することができる、主要な３つのキナーゼである。リン酸化によりタウが微小管から放出され、ＰＨＦにおけるタウは高度にリン酸化されているので、キナーゼの病原性における可能な役割については疑わしいと考えられている。ＣＤＫ５及びＧＳＫ３ａは、いくつかの神経変性障害の病原性に関与し得ることに、ますます増加する証拠が存在する。最早分割されないニューロンでは、Ｃｄｋ、特にＣｄｋ５の脱制御は、アルツハイマー病（ＡＤ）及びパーキンソン病（ＰＤ）を含めた多くの神経学的障害に生じる。Ｆａｔｈらは、知られているリン酸化の部位のあるアミノ酸の、荷電したアミノ酸との置換により、過剰リン酸化タウの構造及び機能的側面を模倣し得る「偽過剰リン酸化された」タウが創出されることを示している（３５）。タウとの相互作用に対するｉｎ  ｖｉｖｏの証拠は、Ｃｄｋ５及びＧｓｋ３に対して存在する。マウスにおけるヒトｐ２５（Ｃｄｋ５の活性化因子）の過剰発現は、タウの過剰リン酸化、及びＡＤを暗示する細胞骨格の破壊を誘発したが、繊維状の沈着物を誘発しなかった（３６）。Ｎｏｂｌｅらは、Ｃｄｋ５活性化因子であるｐ２５を過剰発現するトランスジェニックマウスを、突然変異の（Ｐ３０１Ｌ）ヒトタウを過剰発現するトランスジェニックマウスと交雑させた。タウは、ダブルトランスジェニックにおけるいくつかの部位で過剰リン酸化され、脳幹及び皮質において、凝集タウの非常に著しい蓄積が生じた。銀染色した神経原線維変化（ＮＦＴ）の数の増大は、これらの変化、及び活性ＧＳＫの不溶性タウとの会合を伴っていた（３７）。テトラサイクリンに感受性のトランス活性化因子の制御下でのＧＳＫ−３の過剰発現もまた、タウの過剰リン酸化、タウの細胞体樹状突起の誤った局在化、及びニューロンのアポトーシスを誘発した（３８）。最近の研究は、β−アミロイドペプチド（Ａβ）は培養した脳細胞においてＣｄｋ５の脱制御を誘発し、Ａβによって誘発されるニューロン死をもたらす一連の分子事象における、このタウリン酸化タンパク質キナーゼの可能な役割について問題を提起していることを示す。この状況下では、このオリゴマー形態のＡβによって促進されるタウの過剰リン酸化にＣｄｋ５が関与する証拠が存在する（４２）。Ｃｄｋ５阻害薬は、タウの異常なリン酸化及びニューロン死に対して、海馬のニューロンを保護する。正常の神経発生におけるＣｄｋ５／ｐ３５システムと、神経変性における主張されている関与の研究との間の接点は、このキナーゼシステムの調節の関連性を理解するための枠組みを提供し、その調節における変化はアルツハイマー病において生じるものなどの妨害に結びつけられ得る（７０）。これらの研究は全体的に、タウの過剰リン酸化をタウに関連する神経変性に結びつけ、プロセスにおける主要なプレーヤーとしてＣｄｋ５、Ｇｓｋ３、及びＭＡＰＫをほのめかすものである。
【００４９】
以下に述べる実施例で実証するように、小分子プリン骨格の化合物は、タウのリン酸化に関与するキナーゼを不活性化することができ、好適な置換パターンが選択される場合に血液脳関門を越えることができる。さらに、Ｈｓｐ９０阻害薬であるＰＵ２４ＦＣｌを１パネルのトランスフォームした細胞に加えることで、Ｈｓｐ７０及びＨｓｐ４０の投与量依存性の誘発がもたらされる。この現象は、その起源となる組織に無関係に試験した細胞系全てで起こり、ラット皮質の１次ニューロンで繰り返された。ストレス反応を誘発するＰＵ２４ＦＣｌ及びＰＵ２９ＦＣｌ（別の、初期のＰＵクラス化合物）の投与量は、１パネルの正常の上皮細胞及び繊維芽細胞で実証されたように、正常細胞に対して毒性ではなかった。
【００５０】
本発明の他の神経変性疾患への応用
筋萎縮性側索硬化症は、脳及び脊髄の運動ニューロンを選択的に冒す神経学的障害である。筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、重篤な筋力低下及び骨格筋の萎縮をもたらす、運動ニューロンの進行性の変性を特徴とする。この疾患は進行性であり、患者は通常、発症２〜５年以内に、延髄麻痺、悪液質、又は呼吸不全のため死亡する（４４）。ＡＬＳの顕著な特徴は、脊髄の運動ニューロンの核周囲部及び軸索における神経フィラメントの蓄積である（再考には、Ｊｕｌｉｅｎ、２００１年、４５巻を参照されたい）。ＮＦ−Ｈ及びＮＦ−ＭはＣＤＫ５の基質であり、ＡＬＳの症例に生じる運動ニューロンの封入体は、過剰リン酸化されたＮＦ−Ｈを含んでいる（再考には、Ｊｕｌｉｅｎ、１９９９年、４７巻を参照されたい）。明らかになりつつある証拠は、病原におけるセリン／スレオニンサイクリン依存キナーゼ５（Ｃｄｋ５）の関与を指摘している。その切断された活性化補助因子であるｐ２５及びｐ２９によるＣｄｋ５の脱制御は、細胞質ゾルの、及び細胞骨格のタンパク質のリン酸化の状態を変えることによって、且つ、おそらく細胞周期の制御因子の誘発によって、神経変性の一因となっている。
【００５１】
パーキンソン病は、殆どの患者において動作緩慢を特徴とし、患者の多くが静止時振戦を発症し得る（再考には、Ｆａｈｎ、２００３年、４８巻を参照されたい）。古典的な病理学上所見には、黒質内のニューロメラニン含有ニューロンの喪失、及びレビー小体の存在が含まれる（４８）。レビー小体は、好酸性の細胞質内ニューロン封入であり（再考には、Ｆａｈｎ、２００３年、４８巻を参照されたい）、ＣＤＫ５の免疫反応性は、パーキンソン病患者の中脳におけるレビー小体で生じる（２２）。ラットでは、黒質ニューロンにおけるアポトーシスの誘発により、ＣＤＫ５レベルの増大、及びアポトーシスの後期において活性がもたらされた（４９）。さらに、ＣＤＫ５及びｐ３５の免疫反応性が、アポトーシスのニューロンの周囲及び核に観察されたが、健康なニューロンにおける免疫反応性は軸索に限定されていた（４９）。
【００５２】
ＰＤにおいてやはり脱制御される他のキナーゼ、及びそれに対して病原性の突然変異が孤発性ＰＤ患者で同定されている他のキナーゼは、ＨＳＰ９０クライアントの強力な候補である。これらには、ロイシンリッチリピートキナーゼ−２（ＬＲＲＫ２）遺伝子が含まれ、これは常染色体優性及び孤発性パーキンソン病のある種の症例を引き起こす病原性の突然変異であった。ＬＲＲＫ２におけるＧ２０１９Ｓ置換は、これまでに同定されているパーキンソン病の最も一般的な遺伝的決定要因であり、活性化セグメントと呼ばれるキナーゼドメインの特定の領域に対するマップである。ここで、本発明者らは、ＬＲＲＫ２の自己リン酸化は分子間反応であり、活性化セグメント内の２つの残基を標的にすることを示している。ＬＲＲＫ２における顕著な病原性のＧ２０１９突然変異は、活性化セグメントの再構成を伴うと思われるプロセスによって、自己リン酸化の変更、並びに自己リン酸化及び基質のリン酸化の増大をもたらす。ＰＴＥＮにおける別の突然変異のキナーゼは、推定上のキナーゼ１（ＰＩＮＫ１）遺伝子を誘発した。これらの突然変異は、もともと、劣性遺伝のＰＤを有する３つの系統で発見されたものである。短縮型ナンセンス突然変異（Ｗ４３７Ｘ）及びＧ３０９Ｄミスセンス突然変異の、２つのホモ接合性のＰＩＮＫ１突然変異が最初に同定された。引き続き、複数のさらなるタイプのＰＤ関連の突然変異、又はＰＩＮＫ１における切断が報告され、ＰＩＮＫ１は劣性ＰＤの２番目に最も一般的な原因遺伝子となった。興味深いことに、ＰＩＮＫ１関連の早発性ＰＤの常染色体の劣性の伝達にも関わらず、ＰＩＮＫ１対立遺伝子の１個だけに影響を及ぼす数々のヘテロ接合型の突然変異が、遅発性ＰＤと関連していた。それによってＰＩＮＫ１突然変異が神経変性をもたらす病理学的機序は知られていない。
【００５３】
ＰＩＮＫ１は、予想されているＮ末端ミトコンドリアの標的配列、及び保存されているセリン／スレオニンキナーゼドメインを有する、アミノ酸タンパク質５８１個をコードしている。ＰＩＮＫ１タンパク質は、ミトコンドリアに局在し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで自己リン酸化活性を表すことが示されている。ｉｎ  ｖｉｖｏの基質、及びＰＩＮＫ１の生化学的機能は、依然として知られていない。培養哺乳動物細胞では、野生型ＰＩＮＫ１の過剰発現は、アポトーシス刺激に対して細胞を保護するが、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が媒介するＰＩＮＫ１の枯渇は、アポトーシス細胞死に対する感受性を増大する。ショウジョウバエでは、ＰＩＮＫ１の喪失によりミトコンドリアの欠陥、並びに筋肉及びドパミン性ニューロンの変性がもたらされる。細胞保護におけるＰＩＮＫ１の本質的な役割を示す証拠が十分あるにもかかわらず、それによってＰＩＮＫ１がアポトーシスに対して保護する機序は理解されていない。
【００５４】
本発明者らの結果は、少なくともＣｄｋ５及びＰ３５はＨｓｐ９０のクライアントタンパク質であることを示していた。Ｈｓｐ９０を阻害すると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＣｄｋ５／Ｐ３５タンパク質レベル、及びｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＰ３５レベルを低減し得る。蓄積した証拠は、Ｃｄｋ５／Ｐ３５がこれらの神経変性疾患に関連することを意味づけているので、Ｈｓｐ９０阻害薬をこれらの疾患の処置にも用いることができる。
【００５５】
本発明を、ここに、以下の非限定的な実施例を参考にしてさらに記載する。
【実施例】
【００５６】
（実施例１）
若年マウス：４から６週齢のｎｕ／ｎｕメス胸腺欠損マウスを、国立癌研究所−Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒから入手し、換気式ケージで維持した。実験はＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ及びＵｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ認可のプロトコールの下で行い、研究における動物の適切且つ人道的使用のための制度的なガイドラインにしたがった。投与前に、ＰＵ２４ＦＣｌの溶液を、５０μＬのビヒクル（１：１：１の割合の、ＰＢＳ：ＤＭＳＯ：ＥｔＯＨ）中、望ましい濃度で調製した。ＰＵ２４ＦＣｌの、タウのリン酸化に対する短期の効果を規定するためにデザインした実験では、マウス（１時間点あたり２匹）を、ＰＵ２４ＦＣｌ  ２００ｍｇ／ｋｇ又はビヒクル単独で処置した。屠殺の時間点に脳を回収し、直ちに瞬間凍結した。タンパク質分析用に、脳をＳＤＳ溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４、２％ＳＤＳ）でホモジナイズした。長期投与の研究用には、マウス（ｎ＝５）を１日おきに３０日間、ＰＵ２４ＦＣｌの示された投与量で処置した。全ての動物に対して、体重及び行動の変化をモニターした。マウスを、最終ＰＵ２４ＦＣｌの注射８時間後、ＣＯ２安楽死によって屠殺した。脳を、上記に記載したように回収し、処理加工した。タンパク質を、ウエスタンブロットによりさらに分析した。
【００５７】
若年及び胎仔の脳においてタウのリン酸化は増強され（５０）、ＡＤに罹患した脳に類似する（５１、５２）。さらに、４〜６週齢の胸腺欠損ヌードマウスは、関連する疾患のエピトープでタウのリン酸化を発現している可能性がある。最初のｉｎ  ｖｉｖｏの実験で、これらの動物の脳におけるＨｓｐ９０の短期の変調を評価した。ＰＵ２４ＦＣｌの１投与量（２００ｍｇ／ｋｇ）をこれらのマウスに腹腔内投与し、０、６、１２、２４、３６、及び４８時間後に動物を屠殺した。脳全体を溶解バッファーでホモジナイズし、Ｓ２０２／Ｔ２０５のタウのリン酸化をウエスタンブロットにより評価した。このエピトープにおけるタウのリン酸化の突発が、投与１２時間後に観察され、直後に基底レベルに低下した（図１Ａ）。脳組織における薬物レベルをＬＣ−ＭＳによって分析し、約２４時間後にスパイクのある、治療上関連のあるレベルが脳組織に存在することが示された（図１Ｂ）。これら同じマウスにおいて、ＰＵ２４ＦＣｌは、肝臓、血清、及び子宮から速やかに一掃された。
【００５８】
第２の実験で、本発明者らは、ＰＵ２４ＦＣｌで３０日間、隔日処置したタウのリン酸化マウスに対するＨｓｐ９０長期阻害の効果を分析し、これらの動物において顕著な毒性又は体重の喪失は観察されなかった。図２に見られるように、Ｓ２０２／Ｔ２０５のタウのリン酸化における有意な低下が、全ての処置マウスにおいて明らかであった。Ｈｓｐ９０の短期と長期の変調との間の効果におけるこのような相違が、Ｈｓｐ９０によってシャペロンされた他のタンパク質に対して記録されている。Ｈｓｐ９０阻害薬での細胞の処置により、長期の時間経過にわたってＲａｆ−１の分解が引き起こされ、短期間投与した場合にはＲａｆ−１活性の一過性の突発が引き起こされた（５３）。同様の証拠が、ＲＮＡ依存性キナーゼＰＫＲの活性に対して実証されており、ＰＫＲはＧＭで短期の処置時に活性となっている（５４）。これらの所見は、Ｈｓｐ９０が、これらのキナーゼの基底のシグナリングを制限するように作用し得ることを示唆している。さらなる例は、ステロイドホルモン受容体の制御に見出される。Ｈｓｐ９０は、典型的にはホルモン結合の結果として２量体化をマスクし、シャペロンの相互作用が中断されるまでステロイドホルモン受容体のＤＮＡ結合を阻害する。このように、シャペロンから剥がされたステロイドホルモン受容体は、ホルモンの非存在下で２量体化及びＤＮＡ結合に対して能力がある（５５）。Ｈｓｐ９０のこの機能は、全てのそのクライアントタンパク質に対して当てはまらないことがあるが、ｐ３５／ｃｄｋ５の場合には、Ｈｓｐ９０は複合体の内因性の活性を抑制する同様の役割を果たすことがあり、一方、タウと相互作用する用意ができているプライムされた立体配座に保持する。
【００５９】
長期処置の実験におけるタウのリン酸化における低下は、ｐ３５の発現における６０から７０％の低減に関連づけられた（図２）。さらに、誘導性のＨｓｐ７０の発現における増大が、これらのマウスで観察された（図２）。脳全体におけるｃｄｋ５の発現は、影響を受けなかった。ｃｄｋ５タンパク質は、哺乳動物組織及び培養細胞系統に広く分布しており、数多くの他のタンパク質と複合しており、各会合は多様な細胞の役割を果たしている。ｃｄｋ５／ｐ３５に関連するキナーゼ活性は、大脳皮質においてのみ実証されている（５６、５７）。免疫沈降したｃｄｋ５活性をＡＤの脳で試験した場合、前頭前野皮質において上昇することが見出された（５８）。ｐ３５／ｃｄｋ５の局在が皮質に限定されていることが、Ｈｓｐ９０の阻害に際して脳全体における全ｃｄｋ５の発現が変更しなかった理由を説明し得る。他のコンパートメントに局在するｃｄｋ５が引き起こした高いバックグラウンドのために、ウエスタンブロットによるｃｄｋ５の安定状態における小さな変化をモニターすることが不可能になった可能性がある。これらの結果は、脳におけるＨｓｐ９０によるｃｄｋの管理は、ｐ３５／ｃｄｋ５複合体の活性の制御に制限される可能性があることも示唆し得る。
【００６０】
（実施例２）
トランスジェニックマウス：この試験では、突然変異のヒトタウを過剰発現するＪＮＰＬ３系（５９）トランスジェニックマウス（Ｐ３０１Ｌ、４Ｒ０Ｎ）を用いた。マウスはヘテロ接合性であり、参考文献５９に公開されるように、Ｃ５７ＢＬ／ＤＢＡ２／ＳＷからなる混合のハイブリッドの遺伝的バックグラウンド上にあった。これらのマウスは、基底終脳、間脳、脳幹、及び脊髄にＮＦＴを発症し、＞１２カ月齢のマウスではジストニア、麻痺、及び死をもたらす脊髄における変性を伴う重篤な病理を有する。９カ月齢のオスＪＮＰＬ３マウス（ｎ＝２）を、５日間、ＰＵ−ＤＺ８又はビヒクルで腹腔内処置した。最終の処置の１２時間後にマウスを、麻酔下、頚椎脱臼によって屠殺した。
【００６１】
タウのリン酸化に対するＨｓｐ９０の効果をさらに実験するために、本発明者らは、突然変異の（Ｐ３０１Ｌ）タウタンパク質を発現するＪＮＰＬ３系マウスを用いた（５９）。遺伝的分析により、タウ遺伝子における突然変異がＦＴＤＰ−１７に関連付けられている（６０、６１）。２０を超える明らかな病原性の突然変異が同定されており、Ｐ３０１Ｌが、タウオパシーにおける最も一般的な突然変異として同定されている（３３）。ＪＮＰＬ３マウスは、タウのリン酸化及びＮＦＴの発生において、年齢、及び遺伝子の投与量依存性の増大を表している（５９、６２）。ＪＮＰＬ３におけるタウタンパク質は、主にヒトであり、複数の部位でリン酸化されている：Ｔ１８１（ＡＴ２７０）、Ｓ２０２／Ｔ２０５（ＡＴ８）、Ｔ２１２（ＡＴ１００）、Ｔ２３１（ＡＴ１８０）、Ｓ２６２、Ｓ３９６／Ｓ４０４、Ｓ４０９、及びＳ４２２（５９、６２）。若年胸腺欠損ヌードマウスにおける実験に一致して、水溶性ＰＵ２４ＦＣｌ誘導体であるＰＵ−ＤＺ８で、９カ月齢オスＪＮＰＬ３マウスを５日間処置（２）すると、脳全体におけるｐ３５レベルは低減し、推定上のｃｄｋ５部位であるＳ２０２／Ｔ２０５及びＴ２１２でタウのリン酸化の著しい軽減がもたらされた。ｐ３５発現の度合いは、リン酸化の軽減に言い換えられる。ｐ３５レベルにおける５０％の低減は、Ｓ２０２／Ｔ２０５（ＡｂＡＴ−８）に対してほぼ同様の効果ということになるが、Ｔ２１２／Ｓ２１４（ＡｂＡＴ−１００）に対して殆ど完全にリン酸化を低減する。ＰＨＦにおけるタウと会合しているＴ２３１（ＡｂＡＴ−１８０）のタウのリン酸化に対しては著しい効果はなく、濃縮体（６３、６４）が、ｐ３５発現において５０％低減して見られた。しかし、コントロールと比べて効果がより顕著であり、ｐ３５の発現が約２０％に低減したマウスでは、Ｓ２０２／Ｔ２０５及びＴ２１２／Ｓ２１４におけるタウのリン酸化に対して著しい効果、並びにＴ２３１に対して５０％の低減が観察された。本発明者らは、Ｔ１８１では著しい量のタウのリン酸化を検出することができず、部位は、ＰＨＦ、濃縮体、及び神経フィラメントにおいて過剰リン酸化されていることが見出された（６５）。繰り返すと、ｃｄｋ５の脳全体の発現は、影響を受けなかった（図３）。
【００６２】
薬理学的に関連のあるレベルのＰＵ−ＤＺ８が、これらの脳において記録された。
【００６３】
（実施例３）
６．５カ月齢のＪＮＰＬ３メスマウスを、５日／週で３０日間、Ｈｓｐ９０阻害薬であるＰＵ−ＤＺ８（図５）若しくはビヒクルで処置し、或いは時間ゼロで屠殺した。１グループあたりｎ＝４。脳を、皮質下及び皮質の領域で分割し、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ及びＤａｖｉｅｓの抽出プロトコールを用いて処理加工した（７７）。サルコシル可溶性の分画（Ｓ１）を、ｐ３５及びＨｓｐ７０に対してＷＢによって分析し、ＡＴ８によって認識されるＳ２０２及びＴ２０５、ＡＴ２７０によって認識されるＴ１８１、ＡＴ１８０によって認識されるＴ２３１など、ＡＤの脳において異常に過剰リン酸化されていることが見出されたタウのエピトープに対して分析した。これらは推定上のｃｄｋ／ｐ３５部位である。タンパク質のバンドをＨｓｐ９０に対して標準化し、相対的な単位としてプロットした。結果を図８Ａ及びＢに示す。タウの病原性のリン酸化を特徴とするタウオパシーは異常なキナーゼ活性によることもあるので、ｈｓｐ９０阻害薬が有効である、というのは、ｈｓｐ９０は病原性のある部位でタウをリン酸化することが知られているｃｄｋ５の活性化因子であるｐ３５タンパク質の発現に影響を及ぼし、したがってこの部位でタウのリン酸化を軽減するからである。
【００６４】
（実施例４）
６カ月齢のＪＮＰＬ３メスマウスを、Ｈｓｐ９０阻害薬であるＰＵ−ＤＺ８（７５ｍｇ／ｋｇ）でＩＰ処置し、図９に示すように様々な時間に屠殺した。脳を、皮質下及び皮質の領域で分割し、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ及びＤａｖｉｅｓの抽出プロトコールを用いて処理加工した（７７）。皮質下の領域から抽出されたサルコシル可溶性の分画（Ｓ１）を、ｐ３５、ｃｄｋ５、変異タウ（ＨＴ７）、Ｈｓｐ９０、及びＨｓｐ７０に対してＷＢによって分析した。タンパク質のバンドをアクチンに対して標準化し、非処置のマウスからの相対的な変化としてプロットした。図９は、ＤＺ８を１投与量投与した後の、突然変異のタンパク質であるｍタウ（ＨＴ７）の分解を示している。これはまた、シャペロンのレベル（ｈｓｐ７０増大）及びキナーゼ発現（ｐ３５レベル）における変化も示している。
【００６５】
（実施例５）
ＣＯＳ−７細胞に、ＷＴ及びｍタウに対応するｃＤＮＡをトランスフェクトし、細胞をＰＵ２４ＦＣｌで２４時間さらに処置した。細胞を溶解し、タンパク質内容物をウエスタンブロットによって分析した。結果を図１０に示す。示したように、変異タウ（Ｐ３０１Ｌ）は、Ｈｓｐ９０阻害薬であるＰＵ２４ＦＣｌに対して非常に感受性であるが、ＷＴタウは同様の投与量の薬物によって影響を受けない。
【００６６】
（実施例６）
本発明による化合物であるＨｓｐ９０阻害薬がＨｓｐ９０に結合する能力を、Ｃｈｉｏｓｉｓら（ＷＯ２００５０１２４８２、６６、６７、６８）が開発した蛍光偏光アッセイを用いて試験した。ＳＫ−Ｎ−ＳＨ神経芽細胞腫細胞を、Ｈｓｐ９０阻害薬で２４時間処置し、Ｈｓｐ７０のレベルを、Ｃｈｉｏｓｉｓら（ＷＯ２００５０１２４８２、６９）が開発した表現型の細胞ベースのアッセイによって検出した。結果を図１１Ａ及びＢにまとめてある。示したように、阻害薬はＳＫ−Ｎ−ＳＨ神経芽細胞腫細胞においてストレス反応を誘発し、Ｈｓｐ９０阻害薬によるＨｓｐ７０の誘発は、Ｈｓｐ９０シャペロンのＡＴＰ制御ポケットへの結合におけるこれらの効力に相関する。
【００６７】
（実施例７）
胎仔性原発性ラット皮質ニューロン、並びに、ｐ３５単独（ＣＯＳ−７／ｐ３５）又はｐ３５及びタウの両方（ＣＯＳ−７／ｐ３５／タウ）のいずれかに対応するｃＤＮＡをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞は、異常のニューロンのキナーゼ活性を研究するのに、関連ある実験システムである、というのは、推定上のｃｄｋ５部位におけるタウのリン酸化は、これらの細胞、並びに胎仔及び若年の脳において増強され（５０、５２）、ＡＤに罹患している脳におけるリン酸化に類似しているからである（５０）。ヒトＷＴタウ（ＣＯＳ−７／タウ）又は第７染色体に連鎖する前頭側頭型認知症及びパーキンソニズムに特徴的なＰ３０１Ｌ突然変異を内部に持つタウ（ＣＯＳ−７／タウＰ３０１Ｌ）のいずれかに対応するｃＤＮＡをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞は、その正常の対応物に比べて、突然変異のタンパク質に対するＨｓｐ９０阻害の効果を区別するのに用いることができる細胞モデルである。
【００６８】
タウオパシーにおいてＨｓｐ９０が果たす役割をさらに試験するために、本発明者らは、ＰＵ２４ＦＣｌ及び１７−（アリルアミノ）−１７−デメトキシゲルダナマイシン（１７ＡＡＧ）の両方を使用し、１次ニューロン及びＣＯＳ−７細胞の培養物において、ｃｄｋ５／ｐ３５及びタウＰ３０１Ｌの両方に対するこれらの効果を調査した。１次ニューロンの培養物は、胎生１７日のラット胎仔の大脳皮質に由来しており、先に記載してあるように維持した（１０５）。タンパク質の定常状態に対する、及びタウのリン酸化に対する、ＰＵ２４ＦＣｌの効果を決定するために、培養６日目にＰＵ２４ＦＣｌを加え、示したように細胞を３７度でインキュベートした。１０％ＦＢＳ及びペニシリン／ストレプトマイシン（それぞれ５０単位及び５０μｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭ中で増殖させたＣＯＳ−７細胞を、ＦｕＧＥＮＥ６試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いることによって、ｐ３５、及びＷＴタウ又はＰ３０１Ｌ突然変異を内部に持つタウのいずれかを過剰発現するように、一過性にトランスフェクトした。トランスフェクト１２時間後、示された濃度のＰＵ２４ＦＣｌとともに、細胞を２４時間インキュベートした。インキュベート後、細胞を収集し、２％ＳＤＳで溶解し、得られたサンプルをウエスタンブロッティングによって分析した。
【００６９】
ｃｄｋ５によるタウのリン酸化は、ニューロン特異的なタンパク質であるｐ３５又はｐ３９の１つとの複合体の形成による活性化によって開始する。しかし、高度に関連しているイソ型のｐ３９の抑制ではなく、アンチセンスのオリゴヌクレオチド処置によるｐ３５の抑制のみが、選択的にｃｄｋ５活性を低減した。さらに、ｃｄｋ５タンパク質ではなくｐ３５のレベルが、ｃｄｋ５活性に対して律速的である。それと一致して、本発明者らは、ｐ３５の細胞発現に対するＨｓｐ９０阻害の影響を評価した。ＰＵ２４ＦＣｌによる投与量及び時間依存性のｐ３５の分解が、免疫ブロット及び免疫蛍光の技術によって１次ニューロンにおいて検出され、同様にＣＯＳ−７／ｐ３５及びＣＯＳ−７／ｐ３５／タウ細胞において検出された。Ｈｓｐ９０に対するこの化合物の親和性に一致して、約１〜５μＭのＰＵ２４ＦＣｌで効果が見られ、１０μＭのＨｓｐ９０阻害薬で最大であった。外因性に導入されたｐ３５は、内因性のタンパク質よりもＨｓｐ９０阻害に対して感受性であり、Ｈｓｐ９０腫瘍性タンパク質との類似性によって、タウオパシーにおける異常なタンパク質の緩衝作用及び安定化がＨｓｐ９０を取り込むことによって遂行され得ることを示唆していた。Ｈｓｐ９０の阻害によるｐ３５レベルの低減は、ｃｄｋ５の基質であるヒストン−Ｈ１を用いて測定して、ｃｄｋ５／ｐ３５複合体の活性に影響を及ぼし、正常のタウタンパク質の発現に影響を及ぼさずにＡＤの脳においてリン酸化されることが示されている推定のｃｄｋ５のタウのリン酸化を低減した。しかし、ｍタウは、ＷＴタウの発現を妨害しなかったＰＵ２４ＦＣｌの濃度に感受性であった。Ｈｓｐ９０阻害に対して、ＷＴタウに比べて高いｍタウの感受性は、Ｈｓｐ９０の突然変異の腫瘍タンパク質のクライアントの観察された不安定さに一致している。ｐ３５及びｍタウに対する類似の効果が、１７ＡＡＧで観察された。正常のタウの活性を制御するいくつかのキナーゼ及びホスファターゼ（ＰＫＡ、ＣＫ−１、ＣＫ−２、ＰＰ−１−α、ＰＰ−１−γ、及びＰＰ２Ａ）の発現はＨｓｐ９０阻害薬によって影響を受けないので、ＰＵ２４ＦＣｌのニューロンタンパク質に対する効果は、詳細に明らかにされ、選択的である。
【００７０】
Ｈｓｐ９０阻害薬によるＨｓｐ７０の誘発は、いくつかの神経変性疾患モデルで記述されている（１２、１６、１９）。Ｈｓｐ７０の発現は、Ｈｓｐ９０によって間接的に制御されている（７）。したがって、１次ニューロン又はトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞のいずれかをＰＵ２４ＦＣｌで処置すると、Ｈｓｐ７０における投与量依存性の増大をもたらした。Ｈｓｐ７０の誘発は、ｐ３５及びｍタウの両方をやはり変調するＰＵ２４ＦＣｌの投与量で起こり、異常なタンパク質の分解及び熱ショック反応の誘発は、両方ともＰＵ２４ＦＣｌによるＨｓｐ９０阻害の直接的な結果であることを示唆していた。
【００７１】
（実施例８）
Ｈｓｐ９０がこれらｐ３５及びｍタウの安定性を維持するのに直接的な役割を果たすか否かを調べるために、本発明者らは、ＰＵ２４ＦＣｌによるＨｓｐ９０機能の阻害がこれらの半減期に影響を及ぼすか否かを試験した。１次ニューロンの培養物を、シクロヘキシミドの存在下、阻害薬又はビヒクルで処置した。タンパク質レベルの定量により、内因性ｐ３５の半減期は、ビヒクルの存在下で１２０分であり、ＰＵ２４ＦＣｌをシステムに加えると６０分に低減することが実証された。外因性ｐ３５は内因性タンパク質よりも、ＣＯＳ−７／ｐ３５／タウ細胞及び１次ニューロンの両方に関して、内因性タンパク質よりも不安定であり、半減期が大幅に短い（ｔ１／２＝ビヒクルの存在下で６０分、及びＰＵ２４ＦＣｌの存在下で３０分）。ｍタウに対して同様の結果が観察され、Ｈｓｐ９０阻害薬の存在下タンパク質の５０％が２〜４時間で分解され、ビヒクル処置細胞におけるｍタウの半減期は１０時間を超えた。阻害薬は、ＷＴタウのレベルに影響がなかった。さらに、ｍタウ及びｐ３５は、Ｈｓｐ７０の誘発がシクロヘキシミドによって阻止された場合でも、ＰＵ２４ＦＣｌ処置時に分解された。これらの所見は、Ｈｓｐ９０を、ｐ３５及び変異タウ両方の安定性の直接的且つ重要な制御因子として強力に位置付けるものである。
【００７２】
（実施例９）
Ｈｓｐ９０が、タンパク質複合体の形成によって、これらのタンパク質の安定性を制御するのか否かを試験するために、本発明者らは、Ｈｓｐ９０又はその推定上のクライアントタンパク質のいずれかに選択的に結合する、いくつかの化学的及び免疫学的ツールを用いた。Ｈｓｐ９０の、ｐ３５及びｍタウとの会合が観察された。細胞を、コントロールのＩｇＧと免疫精製した場合には、著しい会合は観察されなかった。Ｈｓｐ９０のコシャペロンであるＣｄｃ３７は、いくつかのシャペロン−キナーゼの集合と会合することが見出され、Ｌａｍｐｈｅｒｅらの以前の観察と一致して（１０６）、ｐ３５−免疫精製した複合体に非存在であった。細胞をＰＵ２４ＦＣｌと前処置すると、Ｈｓｐ９０のｐ３５との相互作用を変更した。
【００７３】
上記に示した細胞モデルは、Ｈｓｐ９０と異常なニューロンのタンパク質との間の相互作用は、分子レベルで可能であることを実証している。しかし、トランスフェクションによるタンパク質の外来性の導入は、細胞のタンパク質含有量を不安定化し、Ｈｓｐ９０による異質のタンパク質の安定性の制御を強要する。したがって、内因性の環境におけるＨｓｐ９０の、タウＰ３０１Ｌ及びＰ３５との相互作用を評価するために、本発明者らは、タウオパシーの動物モデルから得た脳のホモジネートを使用した。突然変異の（Ｐ３０１Ｌ）ヒトタウ（ｈタウ）タンパク質を発現するＪＮＰＬ３系統のマウスは、タウのリン酸化及び不溶性のタウ沈着における年齢、性別、及び遺伝子の投与量依存性の増大を示した。これらの脳においてＨｓｐ９０と会合しているタンパク質を単離するために、本発明者らは、１０カ月齢のＪＮＰＬ３メスマウス（ｎ＝４）から得た脳ホモジネートを使用し、ストレプトアビジンビーズ上に固定化したビオチン化ＰＵ誘導体、又は特異的な抗Ｈｓｐ９０抗体のいずれかを使用した。ＰＵビーズによって単離したＨｓｐ９０は、ｍタウに特異的に結合した。タンパク質のフォールディングを促進する上で分子シャペロンと協力することが見出されているユビキチンＥ３リガーゼである熱ショック類似７０−相互作用性タンパク質のＣ末端の存在も、Ｈｓｐ９０複合体において同定されており、Ｓａｈａｒａら（６２）の所見と一致していた。Ｈｓｐ９０抗体は、ｐ３５及びそのキナーゼパートナーであるｃｄｋ５と複合しているシャペロンを特異的に同定した。まとめると、これらのデータは、直接的なタンパク質複合体の形成により、ｐ３５及びｍタウの安定性の制御因子として、Ｈｓｐ９０を位置付けるものである。
【００７４】
（実施例１０）
ＪＮＰＬ３脳Ｈｓｐ９０への結合。アッセイバッファー（ＨＦＢ）は、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｋ）ｐＨ７．３、５０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  Ｎａ２ＭｏＯ４、０．０１％ＮＰ４０を含んでいた。各々を使用する前に、０．１ｍｇ／ｍＬウシγグロブリン（ＢＣＧ）（Ｐａｎｖｅｒａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）及び２ｍＭ  ＤＴＴ（Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｆａｉｒ  Ｌａｗｎ、ＮＪ）を新たに加えた。特異的なＨｓｐ９０のリガンドであるＧＭ−ｃｙ３Ｂを先に報告されている通りに合成し（１０）、ＤＭＳＯ中に溶解して１０μＭ溶液を形成した。脳を、プロテアーゼ及びホスファターゼの阻害薬を加えたＨＦＢでホモジナイズした。ＧＭ−ｃｙ３Ｂ（３ｎＭ）を増大量の脳ホモジネートで処置した飽和曲線を記録した。Ｈｉｌｌ及びＳｃａｔｃｈａｒｄのプロット分析の実験を構築して、飽和に到達するのに必要とされる少量の脳ホモジネートでは、他の細胞材料からの相互作用は除外されることを示した。それに対して９０％を超えるＧＭ−ｃｙ３Ｂが平衡時（２４時間）に結合するＨｓｐ９０であった脳ホモジネートの量を、競合試験用に選択した。競合実験には、各９６ウェルは、最終体積１００μＬの、３ｎＭ  ＧＭ−ｃｙ３Ｂ、脳ホモジネート、及び試験した阻害薬（ＤＭＳＯに初期保存）を含んでいた。プレートを、４℃、２４時間、シェーカー上に放置し、ｍＰにおける蛍光偏光の値を記録した。ＥＣ５０値を、５０％のＧＭ−ｃｙ３Ｂが置き換えられた競合物質の濃度として決定した。蛍光偏光の測定を、ＡｎａｌｙｓｔＧＴ機器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）上で行った。ＧＭ−ｃｙ３Ｂに対して、５６５ｎｍのダイクロイックミラーとともに、５４５ｎｍの励起フィルター、及び６１０から６７５ｎｍの発光フィルターを用いた。測定を、黒色９６ウェルマイクロタイタープレートで行った。
【００７５】
図１２は、この手順を用いて決定した、ＪＮＰＬ３脳抽出物におけるＰＵ−ＤＺ８、ＰＵ２４ＦＣｌ、及び１７ＡＡＧのｈｓｐ９０に対する結合親和性を示す。示したように、ＰＵ−ＤＺ８に対するＥＣ５０は、他の化合物に対するＥＣ５０よりも低い（ＰＵ２４ＦＣｌに対する８２２．６ｎＭ、及び１７ＡＡＧに対する９８．４０ｎＭに対して、４６．７１ｎＭ）。
【００７６】
図５の化合物を用いて、同じ手順を繰り返した。これらの化合物に対して決定したＥＣ５０値を表１に示す。様々なプリン骨格の化合物による、神経芽細胞腫細胞におけるＨｓｐ７０の誘発を測定した。ｈｓｐ７０の誘発に対する効力は、ｈｓｐ９０の結合親和性に対応している。
【表１】
0005599610.tif 000006
【００７７】
（実施例１１）
ＰＵ−ＤＺ８脳レベルの評価。化合物の濃度を、タンデム高速液体クロマトグラフィー−マス／マススペクトロメトリー（ＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を用いて、ＭＲＭモードによって決定し、定量した。脳断片の重量を量り、等張食塩水ですすぎ、ガーゼで水分を取り、次いで移動相（アセトニトリル（ＡＣＮ）／０．１％ギ酸＝１．２／２．８、ｖ／ｖ）でホモジナイズした。内部標準としてハロペリドールを加えた。ＰＵ−ＤＺ８を塩化メチレンに抽出し、有機層を分離し、真空下で速やかに乾燥し、移動相で再構成した。Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣシステム及び９６ウェルプレートオートサンプラーと連結したＡＰＩ４０００（商標）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で化合物の分析を行った。ＬＣ分離用に、Ｇｅｍｉｎｉ  Ｃ１８カラム（粒子サイズ５μ、内径５０×４．６ｍｍ）を用いた。分析物を、均一濃度の条件下、４分間、流速０．４ｍＬ／分で溶出した。
【００７８】
ＰＵ−ＤＺ８の１投与量（７５ｍｇ／ｋｇ）を、２．５〜４カ月齢のメスマウス（ｎ＝３２）に腹腔内（ｉ．ｐ．）投与し、０から３６時間の間隔で動物を屠殺した。これらのマウスの皮質下及び皮質の領域から、凝集なしのタウ（Ｓ１）及び不溶性タウ（Ｐ３）の分画の両方を調製した。脳におけるＰＵ−ＤＺ８レベルは、４時間で０．３５μｇ／ｇ（約７００ｎＭ）に到達し、薬理学的に関連性のある投与量が、投与後少なくとも１２時間保持された（０．２μｇ／ｇ、約３９０ｎＭ）。結果を図１３に示す。
【００７９】
図１３は、ＰＵ−ＤＺ８が、ｉ．ｐ．投与の７５ｍｇ／ｋｇの１投与量のＰＵ−ＤＺ８を投与後、ＪＮＰＬ３トランスジェニックマウスの脳において、薬理学的に関連性のある濃度に到達したことを示している。これは、ＰＵ−ＤＺ８は、ＰＵ２４ＦＣｌよりもずっと速やかに脳組織に到達することを示している（図１Ｂ）。
【００８０】
（実施例１２）
「第１７染色体に連鎖する前頭側頭型認知症及びパーキンソニズム（ＦＴＤＰ−１７）」と呼ばれる一団のタウオパシーでは、トランスフォーメーションが第１７染色体上のヒトタウのイソ型におけるいくつかの突然変異によって引き起こされ、ＡＤにおけるものに類似した凝集したタウの蓄積をもたらし、またそれを特徴としている（１０、１１）。２０を超える特徴的な病原性の突然変異が同定されており、Ｐ３０１Ｌがタウオパシーにおける最も一般的な突然変異である。
【００８１】
Ｈｓｐ９０制御からのｍタウ及びｐ３５の放出が、正常ニューロンの活性を回復し、毒性タウの凝集物の排除をもたらすか否かを調べるために、本発明者らはタウオパシーのＪＮＰＬ３マウスモデルを使用した。ＪＮＰＬ３マウスの脳組織は溶解性の異なるタウタンパク質を含んでおり、これらをバッファー抽出可能（Ｓ１）、高濃度の塩で抽出可能（Ｓ２）、及びサルコシル不溶性（Ｐ３）の分画に分離にすることができる。Ｓ１分画は５０〜６０ｋＤａのヒトタウタンパク質を含んでいるが、ヘミ接合性のメスにおいて３カ月という早期に、６４ｋＤ及びそれより高い分子量のサルコシル不溶性タウタンパク質が、ＪＮＰＬ３マウスの皮質下の脳領域で検出されている。これらは、Ｔ１８１、Ｓ２０２／Ｔ２０５、Ｔ２１２、及びＴ２３１などの複数の部位で、リン酸化された不溶性の毒性タウを含んでいる（３７、３８）。
【００８２】
マウスのＪＮＰＬ３系統に存在するヒトタウＰ３０１ＬがＨｓｐ９０阻害に感受性の標的であるか否かを調べるために、動物を、脳関門透過性のＨｓｐ９０阻害薬であるＰＵ−ＤＺ８で処置した。この薬剤は、ＰＵ２４ＦＣｌの、効力の高い水溶性誘導体である（ＥＣ５０ＪＮＰＬ３脳Ｈｓｐ９０＝７０ｎＭ）。ＰＵ−ＤＺ８の１投与量（７５ｍｇ／ｋｇ）を、２．５〜４カ月齢のメスマウス（ｎ＝３２）に腹腔内（ｉ．ｐ．）投与し、０から３６時間の間隔で動物を屠殺した。これらのマウスの皮質下及び皮質の領域から、凝集なしのタウ（Ｓ１）及び不溶性タウ（Ｐ３）の分画の両方を調製した。ヒトタウのレベルを、ヒト特異的抗タウ抗体（ＨＴ−７）で免疫ブロッティングすることによって評価した。投与４時間後、Ｈｓｐ９０阻害薬は、皮質下の脳領域に存在する、可溶性の前駆体プールのｍタウにおける有意な低減を誘発し（４時間のＰ＝０．００３１）、これらの効果は３６時間まで維持された（８時間のＰ＝０．００６６、１２時間０．００３０、２４時間０．０１１１、及び３６時間０．０４２）（図１４Ａ）。本発明者らは、次に、タウ凝集物（Ｐ３分画）に存在するｍタウの安定性が、Ｈｓｐ９０によってさらに制御されるか否かを、４から６カ月齢のマウスのグループ（ｎ＝１５）で試験した。図１４Ｂで実証するように、不溶性のタウ（Ｐ＜０．０００１）及び過剰リン酸化されたタウ（Ｐ＝０．００１）の有意の減少が、Ｈｓｐ９０阻害薬を投与しなかったマウス（ｎ＝７）に比べて、処置マウス（ｎ＝８）に観察された。
【００８３】
ｃｄｋ５発現において有意な変化は検出されず、脳におけるＨｓｐ９０によるｃｄｋ５の管理は、ｐ３５／ｃｄｋ５複合体の活性を制御することに制限され得ることを示していた。悪性細胞においてＨｓｐ９０によって厳重に制御されている、それぞれ細胞の生存及び増殖の経路における結節タンパク質である、Ａｋｔ及びＲａｆ−１の発現は、ＰＵ−ＤＺ８によって変更されなかった。
【００８４】
Ｈｓｐ９０阻害薬によるｍタウ及びｐ３５の変調の動力学を試験するためにデザインされた実験用に、動物にＰＢＳ中（６％ＤＭＳＯ）ＰＵ−ＤＺ８  ７５ｍｇ／ｋｇを腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。ＰＵ−ＤＺ８投与後、示された時間に、マウスをＣＯ２安楽死によって屠殺した。脳半球を、皮質−辺縁（皮質、扁桃体、及び海馬）、並びに皮質下の（大脳基底核、間脳、脳幹、及び小脳）領域に分け、ドライアイス上で速やかに凍結し、−８０℃で貯蔵し、処理加工した。要約すると、各脳片の重量を量り、プロテアーゼ及びホスファターゼの阻害物質を含むＴｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳ）（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、５ｍＭ  ピロリン酸ナトリウム、３０ｍＭ  β−グリセロリン酸、３０ｍＭ  フッ化ナトリウム、１ｍＭ  フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ））の３容量でホモジナイズした。ホモジネートを、４℃、２７０００ｇで１５分間遠心分離した。上清をＳ１分画として回収し、ペレット（Ｐ１）を３容量の塩／ショ糖バッファー（０．８Ｍ  ＮａＣｌ、１０％ショ糖、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）で再びホモジナイズし、上記同様遠心分離した。得られたペレットを廃棄し、上清をサルコシル（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ、最終濃度１％）と、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、サルコシル混合液を、４℃、１５０００ｇで３０分間遠心分離した。上清（Ｓ２分画）を回収し、ペレット（Ｐ３）をＴＢＳ中２％ＳＤＳ５０μＬで再懸濁し、ウエスタンブロッティング用に−８０℃で貯蔵した。タンパク質をウエスタンブロットによって分析した。
【００８５】
図１４Ａは、ＪＮＰＬ３マウス脳における可溶性の変異タウのレベルに対する、ＰＵ−ＤＺ８の１投与量の、短期投与の効果を示す図である。２．５〜４カ月齢のマウスの皮質下の脳領域を表す。ヒトタウのレベルを、Ｈｓｐ９０のレベルに標準化した。図１４Ｂは、ＪＮＰＬ３マウスの脳における不溶性の変異タウのレベルに対する、ＰＵ−ＤＺ８の１投与量の、短期投与の効果を示す。４、８、１２、及び２４時間、ＰＵ−ＤＺ８（７５ｍｇ／ｋｇ）で処置した６カ月齢のマウスの皮質下の脳領域から抽出した不溶性タウ（Ｐ３）分画の分析を表す。
【００８６】
（実施例１３）
ｍタウの変調が、マウスに毒性であることなしに、Ｈｓｐ９０阻害薬でのより長い処置期間にわたって維持され得るか否かを調べるために、ＪＮＰＬ３マウスをこれらの物質に３０日間曝露した。６．５カ月齢のＪＮＰＬ３メスマウス（ｎ＝１０）に、ビヒクル（ｎ＝５）、又はＨｓｐ９０阻害薬であるＰＵ２４ＦＣｌ（２００ｍｇ／ｋｇ）若しくはＰＵ−ＤＺ８（７５ｍｇ／ｋｇ）の１つ（ｎ＝５）を、毎日、１週間あたり５回のスケジュールでｉ．ｐ．投与し、阻害薬の投与量の最終投与の８時間後に動物を屠殺した。動物の体重、毛生、食欲、及び姿勢において著しい変化がないことによって明らかなように、毒性は観察されなかった。さらに、屠殺時の肉眼による検査時には、肉眼で観察できる内部臓器の損傷は検出されなかった。これらのマウスの皮質下の脳領域から抽出したＳ１分画及びＰ３分画の両方を、ｍタウの発現及びリン酸化について分析した。前駆タンパク質のプール（Ｓ１分画）（ｈタウ、Ｐ＜０．０００１）及び毒性の凝集物（Ｐ３分画）（Ｔ２３１におけるリン酸化したタウ、Ｐ＝０．００３４）の両方におけるタウの発現及びリン酸化における有意の低減、並びにＳ１分画におけるｐ３５の低減が、Ｈｓｐ９０阻害薬で処置したマウスに観察された。
【００８７】
まとめると、可溶性のプール、及びＨｓｐ９０阻害薬による凝集形態の両方におけるタウの分解の動力学が速やかなことは、Ｈｓｐ９０が毒性のタウ凝集物を制御し、その形成及び蓄積を促進することが示唆される。これらのデータは、また、Ｈｓｐ９０阻害薬を、毒性の凝集物の形成を防ぐため、及びすでに凝集した毒性のタウを可溶化するための両方で、タウオパシーの処置において用いることができることを示唆するものである。
【００８８】
図１５は、毒性のタウ凝集物における過剰リン酸化のタウに対する、ＰＵ−ＤＺ８の長期投与の効果を示す。
【００８９】
（実施例１４）
タウオパシーにおいて、トランスフォーメーションは、過剰リン酸化され、凝集したタウの蓄積をもたらすタウタンパク質における異常を特徴とする（５〜７）。アルツハイマー病（ＡＤ）では、タウの過剰リン酸化は、いくつかのキナーゼ、特にサイクリン依存性タンパク質キナーゼ５（ｃｄｋ５）及びグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ｇｓｋ３β、病原性の部位上のタウのリン酸化をもたらす）の異常な活性化によってもたらされる病原プロセスであることが示唆されている。ＡＤにおいて過剰リン酸化されたタウは、ミスフォールドされ、微小管からの純粋な解離を経験し、毒性のタウ凝集物を形成すると考えられている（９、１０）。ｃｄｋ５によるタウのリン酸化は、ニューロン特異的なタンパク質であるｐ３５又はｐ３９の１つとの複合体形成による活性化によって開始する（２２、２３）。しかし、高度に関連するイソ型のｐ３９の抑制ではなく、アンチセンスのオリゴヌクレオチド処置によるｐ３５の抑制だけが、ｃｄｋ５活性を選択的に低減する（２４）。さらに、ｃｄｋ５タンパク質ではなくｐ３５のレベルは、ｃｄｋ３５活性に対して律速的である（２５）。それと一致して、本発明者らは、ｐ３５発現に対するＨｓｐ９０阻害の影響を評価した。
【００９０】
本発明者らは、１次ニューロン、並びにＣＯＳ−７／ｐ３５及びＣＯＳ−７／ｐ３５／タウ細胞におけるＰＵ２４ＦＣｌによるｐ３５の投与量及び時間依存的の分解を検出した。ｐ３５単独（ＣＯＳ−７／ｐ３５）、又はｐ３５及びタウの両方（ＣＯＳ−７／ｐ３５／タウ）のいずれかに対応するｃＤＮＡをトランスフェクトした、ラット胎仔性１次皮質ニューロン及びＣＯＳ−７細胞が、ｃｄｋ５／ｐ３５活性及び安定性に対して、並びに推定上のｃｄｋ５部位におけるタウのリン酸化にも対してこれらの阻害薬を評価することを可能にする細胞のシステムである。これらは、異常なニューロンのキナーゼ活性を研究するための関連ある実験上のシステムである、というのは、これらの部位でのタウのリン酸化は、胎仔及び若年の脳において増強され（２０）、ＡＤに罹患している脳に類似しているからである（２１）。さらに、ｃｄｋ５の活性化因子であるｐ３５をトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞は、病原性の部位でリン酸化されたタウを発現する（２１）。Ｈｓｐ９０に対するこの化合物の親和性と一致して、約１〜５μＭのＰＵ２４ＦＣｌで効果が見られ、１０μＭのＨｓｐ９０阻害薬で最高であった。外因性に導入したｐ３５は、内因性のタンパク質よりもＨｓｐ９０の阻害に対してより感受性であり、Ｈｓｐ９０腫瘍性タンパク質に対する類似性によって、タウオパシーにおける異常タンパク質の緩衝及び安定化が、Ｈｓｐ９０を取り込むことによって遂行し得ることが示唆された。ｃｄｋ５の基質であるヒストン−Ｈ１を用いて測定して、Ｈｓｐ９０の阻害によるｐ３５のレベルの低減は、ｃｄｋ５／ｐ３５複合体の活性に影響を及ぼした。
【００９１】
ｐ３５発現の低減が、タウのリン酸化の低減をもたらすか否かを調べるために、本発明者らは、３つの推定上のｃｄｋ５部位、即ちＳ２０２／Ｔ２０５、Ｔ２３１、及びＴ１８１上のタウのリン酸化を測定した（２６、２７）。これらの部位は、ＡＤの脳において異常にリン酸化されていることが示されている（２８）。ＰＵ２４ＦＣｌは、これらの部位上で、正常タウタンパク質の発現に影響を及ぼすことなしに、投与量依存性の様式でリン酸化を低減する。ｐ３５レベル及び活性に対して観察されるように、効果は阻害薬５μＭで明白であり、１０μＭで最高であった。さらに、ｐ３５分解の動力学は、タウのリン酸化における低減に観察された物に類似していた。
【００９２】
ＷＴタウの環境における、Ｈｓｐ９０阻害のｐ３５に対するｉｎ  ｖｉｖｏの効果を調べるために、本発明者らはｈタウマウスを使用した（４１）。ｈタウマウスは、ＡＤの早期に生じるものに匹敵する分布を有するタウの病理を発症する。ｈタウマウスにおけるタウの病理の大多数は、皮質の脳領域に位置する。これらのマウスは、６つのイソ型の非変異のヒトタウを発現するが、ＡＤ様のタウの病理を発症する。これらのマウスの皮質のホモジネートから調製した熱安定性の分画（Ｓ１）は、推定上のｃｄｋ５部位でリン酸化されたタウの年齢に関連した蓄積を示している。本発明者らは、これらの脳におけるＨｓｐ９０の阻害は、ｐ３５の発現における低減及びその結果としてのタウのリン酸化の軽減をもたらし得るか否かを試験した。４及び８〜１０カ月齢のｈタウメスマウス（ｎ＝１０）に、ビヒクル又は１投与量のＰＵ−ＤＺ８（７５ｍｇ／ｋｇ）のいずれかをｉ．ｐ．投与し、投与４時間又は８時間後に動物を屠殺した。凝集物のないタウ（Ｓ１）分画をこれらのマウスの皮質領域から調製し、ヒトのタウのレベルを、３リピートドメインのタウ（ＲＤ３）に特異的な抗体での免疫ブロッティングによって評価した。１次ニューロン培養物及びＷＴタウをトランスフェクトした細胞に対する実験との類似性によって、Ｈｓｐ９０阻害薬は可溶性のＷＴタウの発現に効果がなかった。しかし、ｐ３５レベルにおける時間依存性の有意な低減（Ｐ＝０．００１９）（図１６Ａ）及び抗体ＣＰ１３によって検出したＳｅｒ２０２上のタウのリン酸化の軽減（Ｐ＝０．００７８）は両方とも、Ｈｓｐ９０阻害薬の投与８時間後に明らかであった（図１６Ｂ）。モノクローナル抗体ＣＰ１３は、タウの凝集が蓄積する早期及びより進行した段階の両方において、タウの病理を検出するのに一般的に用いられる（４１）。まとめると、これらのデータは、ＷＴ及び変異タウを異常にリン酸化する傾向があるキナーゼ複合体としてｐ３５／ｃｄｋ５を位置づけており、Ｈｓｐ９０を、両方のタウの環境におけるその活性の調節因子として示唆している。
【００９３】
図１６Ａは、アルツハイマー患者に類似する、病原性に過剰リン酸化されたＷＴタウを発現するｈタウマウスにおけるｐ３５に対するＰＵ−ＤＺ８の効果を示している。図１６Ｂは、アルツハイマー患者に類似する、病原性に過剰リン酸化されたＷＴタウを発現するｈタウマウスにおけるＰＵ−ＤＺ８タウのリン酸化の効果を示している。
（参考文献）
以下の参考文献を本明細書に引用し、その全文が参照として本明細書に組み入れられる。
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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