(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７００であるハイブリドーマによって産生される、配列番号１のペプチドに対するモノクローナル抗体、及びインフルエンザウイルスのリボ核タンパク質に対する抗体を含む、オセルタミビル耐性インフルエンザウイルス検出のためのキット。
【請求項２】
インフルエンザウイルスのリボ核タンパク質に対する抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
キットが、ＥＬＩＳＡのためである、請求項２に記載のキット。
【請求項４】
キットが、イムノクロマトグラフィーのためである、請求項３に記載のキット。
【請求項５】
さらに、金コロイドを含む、請求項４に記載のキット。
【請求項６】
さらに、白金コロイドを含む、請求項４に記載のキット。
【請求項７】
さらに、パラジウムコロイドを含む、請求項４に記載のキット。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のキットを用いる、オセルタミビル耐性インフルエンザウイルスを検出するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤耐性インフルエンザウイルス検出キット及びそれを用いる検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザは、インフルエンザウイルスによって引き起こされる極めて重要な疾患である。日本などの温帯では、季節性インフルエンザは冬季に毎年のように流行する。抗インフルエンザウイルス薬として、ザナミビルやオセルタミビル等が知られている。オセルタミビルは、非常に有効であり、かつ、経口剤であることから使用しやすことから、インフルエンザ治療に第一選択薬として用いられている。【０００３】
しかし、オセルタミビルに耐性のインフルエンザウイルスが報告されている。この場合、オセルタミビルがインフルエンザの治療に無効であるばかりか、オセルタミビルのみを使用した場合には、インフルエンザをさらに悪化させ、重症化させてしまう可能性がある。このため、感染インフルエンザウイルスが、オセルタミビルに耐性であるか否かを、迅速かつ簡便に判定する技術が切望されている。【０００４】
インフルエンザウイルスのオセルタミビル耐性出現のメカニズムは、ウイルスビリオンのノイラミニダーゼを構成するペプチドのアミノ酸配列の特定の部分の突然変異、すなわち、位置２７４のアミノ酸のヒスチジンからチロシンへの置換（Ｈｉｓ２７４Ｔｙｒ）であることが知られている。このため、ウイルスビリオンのノイラミニダーゼ遺伝子の塩基配列を増幅し、その塩基配列の解析から耐性の有無が判断されている。しかし、この方法は、労力と時間を要し、臨床的に応用することは極めて困難である。【０００５】
最近、ＥＫＧＫＶＴＫＳＩＥＬＮＡＰＮＦＹＹＥＥ（配列番号１）からなるペプチドに対する抗体を用いる方法が報告されているが、実際に、臨床的に応用した場合の感度及び特異性は、報告されていない（特許文献１）。また、特許文献１には、ウイルスビリオンの薬剤耐性ノイラミニダーゼペプチドに対し特異的に反応するモノクローナル抗体と抗インフルエンザウイルスリボ核タンパク質抗体との組合わせについては、記載も示唆もされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１１／０９６３０２号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、薬剤耐性インフルエンザ検出キット及びそれを用いる検出方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、予想外にも、ウイルスビリオンの薬剤耐性ノイラミニダーゼペプチドに対し特異的に反応するモノクローナル抗体と抗インフルエンザウイルスリボ核タンパク質抗体を組合わせることによって、高感度かつ特異的にオセルタミビル耐性ウイルスを検出することができることを初めて見出し、本発明を完成させた。【０００９】
すなわち、本発明は、下記のとおりである。
［１］受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７００であるハイブリドーマによって産生される、配列番号１のペプチドに対するモノクローナル抗体及びインフルエンザウイルスのリボ核タンパク質に対する抗体を含む、オセルタミビル耐性インフルエンザウイルス検出のためのキット、
［２］インフルエンザウイルスのリボ核タンパク質に対する抗体が、モノクローナル抗体である、［１］に記載のキット、
［３］キットが、ＥＬＩＳＡのためである、［２］に記載のキット、
［４］キットが、イムノクロマトグラフィーのためである、［２］に記載のキット。
［５］さらに、金コロイドを含む、［４］に記載のキット、
［６］さらに、白金コロイドを含む、［４］に記載のキット、
［７］さらに、パラジウムコロイドを含む、［４］に記載のキット、
［８］［１］〜［７］のいずれかに記載のキットを用いる、オセルタミビル耐性インフルエンザウイルスを検出するための方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得する方法は、従来公知の任意の方法を用いることができる。たとえば、ハイブリドーマを所望数以上に増殖させた後、動物、たとえば、マウスの腹腔内に移植し、ハイブリドーマを腹水内で増殖させ、得られた腹水を精製することによって、目的のモノクローナル抗体を得ることができる。腹水の精製には、プロテインＧ、プロテインＡ等を用いたアフィニティークロマトグラフィーが公的に用いられる。また、抗原を固相化したアフィニティークロマトグラフィーを用いることもできる。さらには、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、硫安分画及び遠心分離等の手段を用いることもできる。【００１１】
本発明のキットは、抗原抗体反応を利用した様々な測定方法に用いることができる。具体的には、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、イムノクロマトグラフィーを例示することができる。好ましい測定法としては、ＥＩＡ法及びイムノクロマトグラフィーを挙げることができる。これらの方法によれば、高感度、迅速かつ簡便に検出することができる。ＥＩＡ法では、酵素標識したＩｇＧを用い、酵素反応に基づく発色をシグナルとして免疫複合体を検出する。ＥＩＡ法の中でも、サンドイッチＥＬＩＳＡが、特に好ましい。【００１２】
イムノクロマトグラフィーの原理は、概略下記のとおりである。被分析物と結合可能な固定化試薬（抗体、抗原等）を含む少なくとも１つの反応部位を有するクロマトグラフィー担体を固定相として用いる。このクロマトグラフィー担体上で、分析対象物に結合可能な試薬によって修飾された検出用標識物が分散している分散液を移動させる。分析対象物と検出用標識物とが特異的に結合し、反応部位まで到達する。反応部位において、分析対象物と検出用標識物との複合体が固定化試薬に特異的に結合することにより、被分析液中に分析対象物が存在する場合にのみ、固定化試薬部に検出用標識物が濃縮される。これを目視または適当な機器を用いて被分析液中に被検出物が存在することを定性的に分析する手法である。
イムノクロマトグラフィーは、簡便性の点で特に優れた方法といえる。イムノクロマトグラフィーを利用した検出には、通常、テストストリップが用いられる。【００１３】
検出用抗体の標識には、従来公知の任意のものを用いることができる。なかでも、検出結果を肉眼で観察することができ、迅速かつ簡便な判定が可能になることから、呈色物質が好ましい。呈色物質としては、金属コロイド（金コロイド、白金コロイド、パラジウムコロイド）、顔料などで着色した合成ラテックス、天然ラテックスを例示することができる。
【実施例】
【００１４】
ペプチドモノクローナル抗体の作製
配列番号１の合成ペプチド１ｍｇをＤＭＳＯ１０μｌ及びＰＢＳ１９０μｌに懸濁し、この懸濁液に卵白アルブミン（２ｍｇ／ｍｌ）２００μｌを加え、さらに２％グルタルアルデヒド８０μｌを加え、室温で６０分間反応させた。反応終了後に、１Ｍ  Ｔｒｉｓ４０μｌを加えて反応を停止し、１Ｎ  ＨＣｌ  １０μｌを加えて中和し、免疫用ペプチド抗原を作製した。【００１５】
免疫には、マウスを用いた。得られた免疫用ペプチド抗原１５０μｌにＴｉｔｅｒ  Ｍａｘ（登録商標）ｇｏｌｄ１５０μｌを加え、エマルションを調製した。このエマルションをマウス足底部に２０μｌ注射し、さらに２週間後に同量を注射した。１週間後に、免疫用ペプチド４０μｌを足底部に注射し、３日後に脾臓を摘出し、脾細胞をマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）と融合させた。常法にしたがって、融合細胞をクローニングし、ＥＬＩＳＡでスクリーニングし、５株のハイブリドーマを得た（ＲＮＡ−１〜５）。【００１６】
得られたハイブリドーマの中でＲＮＡ−３は、２０１３年８月３０日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（2920818  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７００で寄託された。【００１７】
抗インフルエンザウイルスリボ核タンパク質抗体
抗インフルエンザウイルスリボ核タンパク質抗体は、市販のものを用いることができる。たとえば、イムノプローブ社のインフルエンザモノクローナル抗体  Ｎｏ．２を挙げることができる。【００１８】
５株のハイブリドーマ  ＲＮＡ−１〜５から得られたモノクローナル抗体ＲＮＡ１〜５（２ｍｇ／ｍｌ）１０μｌを、それぞれ、ニトロセルロースメンブラン（ミリポア）に直線状に塗布し、５０℃で３時間乾燥させた。【００１９】
金コロイド（BB International、４０ｎｍ）１００μｌに、抗インフルエンザウイルスリボ核タンパク質抗体（インフルエンザモノクローナル抗体  Ｎｏ．２、４０μｇ／ｍｌ）１００μｌを混合し、室温で１０分間放置した。洗浄後、ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル）で３０分間ブロッキングし、次いで洗浄し、１００μｌのＰＢＳ（ｐＨ７．２）に懸濁して、感作金コロイドを調製した。【００２０】
オセルタミビル耐性インフルエンザウイルスＡ／Ａｉｃｈｉ／１７３／０９（１０７／ｍｌ）と感作金コロイドを混合し、モノクローナル抗体塗沫ラインから約２ｃｍ離れたメンブラン上に滴下した。室温で１５分間放置した後に、モノクローナル抗体塗沫ライン上の金コロイドの発色の有無を肉眼で判定した。対照として、オセルタミビル感受性インフルエンザウイルスＡソ連型（Ｈ１Ｎ１）を用いた。【００２１】
オセルタミビル耐性インフルエンザウイルスでは、ＲＮＡ１〜３で明瞭な発色が認められたが、ＲＮＡ４及び５では、発色が認めらなかった。一方、オセルタミビル感受性インフルエンザウイルスＡソ連型では、ＲＮＡ３及び４〜５では、発色が認めらなかったが、ＲＮＡ１及び２では、発色が認められた。結果として、ＲＮＡ３のみが、ＳＮＡ抗原（オセルタミビル感受性インフルエンザウイルスＡソ連型（Ｈ１Ｎ１））との非特異反応なしで、ＲＮＡ抗原（オセルタミビル耐性ウイルスＡ／Ａｉｃｈｉ／１７３／０９）を特異的に検出することができた。なお、供試したウイルス株は、名古屋大学医学系研究科分子病原細菌学山田景子博士から分与されたものである。ＲＮＡ１及び２は、ＲＮＡ抗原を特異的に検出することができたが、ＳＮＡ抗原との反応が認められた。ＲＮＡ４及び５は、ＲＮＡ抗原を検出することができなかった。
【要約】
本発明は、受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７００であるハイブリドーマによって産生される、配列番号１のペプチドに対するモノクローナル抗体及びインフフエンザウイルスのリボ核タンパク質に対する抗体を含む、オセルタミビル耐性インフルエンザウイルス検出のためのキットに関する。【配列表】
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