(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素反応におけるサンプル中のｃＤＮＡの合成のための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ポリアデニル化活性を有する第１の酵素、逆転写酵素活性を有する第２の酵素、緩衝液、少なくとも１つのリボヌクレオチド、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチド、ポリ−（Ｔ）ホモポリマー部分を含むアンカーオリゴヌクレオチドを同時に準備する工程、
（ｂ）リボ核酸を含むサンプルを添加する工程、および
（ｃ）該第１の酵素および該第２の酵素が活性を示すように選択された１つまたは複数の温度工程において工程（ａ）および（ｂ）の作用因子（ａｇｅｎｔ）をインキュベートする工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記サンプルが、原核生物ＲＮＡ、真核生物ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、古細菌ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、非ポリアデニル化ＲＮＡ、およびｒＲＮＡ、ならびにその混合物を含む群から選択されるリボ核酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アンカーオリゴヌクレオチドが、６ヌクレオチド長と１５０ヌクレオチド長との間であり、および／または３’末端にアンカー配列を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記アンカーオリゴヌクレオチドが、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）またはロックド核酸（ＬＮＡ）、ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ  ｔｈｉｏａｔｅ）−デオキシリボ核酸、シクロヘキセン−核酸（ＣｅＮＡ）、Ｎ３’−Ｐ５’−ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ  ａｍｉｄａｔｅ）（ＮＰ）、またはトリシクロ−デオキシリボ核酸（ｔｃＤＮＡ）である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記リボヌクレオチドを、アデノシン−５’−三リン酸、チミン−５’−三リン酸、シトシン−５’−三リン酸、グアニン−５’−三リン酸、ウラシル−５’−三リン酸、塩基アナログを有するリボヌクレオチドを含む群から選択することができる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記デオキシリボヌクレオチドを、デオキシアデノシン−５’−三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシチミン−５’−三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシシトシン−５’−三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアミン（ｄｅｏｘｙｇｕａｍｉｎｅ）−５’−三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシウラシル−５’−三リン酸（ｄＵＴＰ）を含む群から選択することができる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記デオキシリボヌクレオチドが標識され、前記デオキシリボヌクレオチドの標識を、放射性標識、および蛍光色素を含む群から選択することができる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記デオキシリボヌクレオチドが修飾され、前記修飾が、ビオチン化、ジゴキシゲニン標識、およびハプテンを含む群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記デオキシリボヌクレオチド濃度が、反応物中で少なくとも０．０１ｍｍｏｌであり、且つ反応物中で最大限で１０ｍｍｏｌである、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記デオキシリボヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰが、０．２ｍｍｏｌ〜２ｍｍｏｌの濃度で存在する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記緩衝液が、ｐＨ６〜ｐＨ１０であり、Ｍｇ2+イオンを有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリアデニル化活性を有する酵素が、原核生物起源、真核生物起源、ウイルス起源、古細菌起源、および植物起源の酵素を含む群から選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリアデニル化活性を有する酵素が、大腸菌由来のポリ（Ａ）−ポリメラーゼ、酵母由来のポリ（Ａ）−ポリメラーゼ、ウシ由来のポリ（Ａ）−ポリメラーゼ、カエル由来のポリ（Ａ）−ポリメラーゼ、およびヒトポリ（Ａ）−ポリメラーゼを含む群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記逆転写酵素活性を有する酵素が、ウイルス、細菌、古細菌、真核生物に由来する酵素、特に熱安定性生物に由来する酵素、およびその遺伝子配列変異誘発の変化または対応する緩衝液条件のみによってかかる機能が得られる酵素を含む群から選択される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記逆転写酵素活性を有する酵素が、ＨＩＶ逆転写酵素、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、ＥＡＩＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、サーマスサーモフィルス（Thermus thermophilus）ＤＮＡポリメラーゼＩ、およびＭ−ＭＬＶ  ＲＮＡｓｅ  Ｈ-を含む群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記反応が、６５℃〜９５℃のより高い温度での温度工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法において生成されたｃＤＮＡを、次いで、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅し、該ポリメラーゼ連鎖反応が反応ランダムプライマーおよび／または特定のプライマーおよび／または１つまたは複数のプローブを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記工程（ａ）の同時準備が、ＤＮＡ合成活性を有する熱安定性酵素の準備も含み、ｃＤＮＡの特異的検出のための少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが存在する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記反応がさらなるポリ−（Ｃ）−ポリヌクレオチドを含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
ポリアデニル化活性を有する第１の酵素、逆転写酵素活性を有する第２の酵素、緩衝液、少なくとも１つのリボヌクレオチド、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチド、およびポリ−（Ｔ）ホモポリマー部分を含むアンカーオリゴヌクレオチドを含む反応混合物。
【請求項２１】
請求項２０に記載の反応混合物を含むキット。
【請求項２２】
請求項２０に記載の反応混合物または請求項２１に記載のキットの、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の製造方法における、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本発明は、分子生物学分野および本分野における研究に関し、ヒトおよび非ヒト診断にも関する。
【０００２】
非ポリアデニル化ＲＮＡ分子、例えば、細菌ＲＮＡなどまたは小ＲＮＡ、いわゆるミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）などの分析は困難であり、特定の方法を必要とする。可能な方法が、最近、文献に記載された。この方法は、連続的につながった、すなわち、ポリ−（Ａ）−ポリメラーゼおよび適切な基質、典型的には、ＡＴＰを使用したＲＮＡのテーリング（ｔａｉｌｉｎｇ）をはじめに実施するいくつかの酵素工程を含む。次いで、ポリ−（Ａ）−反応を停止させ、反応産物を精製する。次いで、生成されたポリ−（Ａ）−ＲＮＡを逆転写酵素反応物に加え、適切なプライマーを使用してｃＤＮＡに変換する。
【背景技術】
【０００３】
連続的につながったこれら２つの酵素反応の実施費用は非常に高額であり、多数の誤差原因、例えば、ヌクレアーゼの投入、材料の損失、またはピペッティングの誤りなどを有する。
【０００４】
ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、約２０〜２５ヌクレオチドのサイズで変化する、新規の非コードＲＮＡファミリーに相当する。
【０００５】
ミクロＲＮＡは、いわゆる「ヘアピン前駆体」を介してプロセシングされ、遺伝子発現における負の調節因子としての役割を果たし得る。したがって、ミクロＲＮＡは、多数の下流遺伝子を調整する（非特許文献１）。ｍｉＲＮＡは、最初に、長い「一次転写物」（これらは、一次ｍｉＲＮＡとも呼ばれる）として転写される（非特許文献２）。次いでこれらの「一次転写物」を短縮し、それにより、その結果長さが約７０ヌクレオチドになる。いわゆる「ステム−ループ構造」を産生する；これらは、「プレｍｉＲＮＡ」とも呼ばれる。プレｍｉＲＮＡは、細胞質中に輸送される。輸送酵素は、エクスポーチンー５と呼ばれる。これらはここでさらにプロセシングされ、このような方法で、約２２ヌクレオチド長となり、成熟ｍｉＲＮＡ分子が産生される（非特許文献３）。最近の研究は、ｍｉＲＮＡが発達および分化で重要な役割を果たすと提案している。原理上、ミクロＲＮＡは、２つの異なる方法で調節作用を示し得る。植物では、ｍｉＲＮＡは、対応するｍＲＮＡと全く正確に相補する。これにより、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を含む機構によって標的−ｍＲＮＡが破壊される。動物では、ｍｉＲＮＡは、Ｌｉｎ−４およびＬｅｔ−７を含む機構によって遺伝子発現を防止する。ここで、ｍｉＲＮＡは、その対応するｍＲＮＡと正確に相補的ではないが、ｍｉＲＮＡはタンパク質の合成および機能を阻止する（非特許文献４）。ごく最近になって発見されたｍｉＲＮＡが果たす決定的な役割により、その検出または分析は決定的に重要である。
【０００６】
真核生物では、１８ｓ、５．８ｓ、および２５／２８ｓ  ｒＲＮＡの合成は、ヌクレオチド中のいわゆる前駆体−ｒＲＮＡ（プレ−ｒＲＮＡ）の修飾におけるプロセシングを含む。この複雑なｒＲＮＡ生合成経路は、核内に蓄積される多数の小さな、いわゆる「小分子ＲＮＡ」（ｓｎｏＲＮＡ）を含む。これらは、いわゆる小核小体リボ核タンパク質粒子（ｓｎｏＲＮＰ）の形態で存在する（非特許文献５）。
【０００７】
最近特徴づけられている全てのｓｎｏＲＮＡは、ＲＮアーゼ  ＭＲＰを除いて、２つのファミリーに分類される。後者は、ボックスｃ／Ｄおよびボックスｈ／ＡＣＡ  ｓｌｏｗ  ＲＮＡであり、これらは、共通する配列モチーフによって識別することができる（非特許文献６）。ｓｎｏＲＮＡ遺伝子のゲノム構築は、種々の真核生物で非常に多様である。脊椎動物では、ほとんどのｓｎｏＲＮＡは、「宿主遺伝子」を介してイントロン内に導入される。Ｕ３などの例外は、独立して転写される。酵母では、イントロン中に導入されるが、ｓｎｏＲＮＡの大部分が個別のプロモーターで単一遺伝子として転写される。クラスター化ｓｎｏＲＮＡ遺伝子は、共通のプロモーターによって上流に転写される。小さなサイズおよびポリアデニル化の欠損により、ｓｎｏＲＮＡの検出または分析は、分子生物学的課題である。
【０００８】
ＰＣＲは、微生物研究において頻繁に使用される手段であり、例えば、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を分析するためにも使用される。しかし、微生物試料中の新規の遺伝子の発見は、条件的に可能なプライマー合成のみに制限される。したがって、プライマーは、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子についての培養微生物由来の既に知られている配列に由来する（非特許文献７）。今日まで未知である生物由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の抽出に対して当然既に知られている配列に依存する合成に基づいて、微生物送達が非常に過小評価され、単離もされていない可能性がある。
【０００９】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ分子のみを単離することが困難であり得ると同時に、配列の知識の欠如、特にポリ−Ａ−テールの欠如により、原核生物ｍＲＮＡ分子を単離することは困難であり得る。
【００１０】
先行技術では、２工程の方法が知られている。この方法では、ＲＮＡ分子を酵素であるポリ−Ａ−ポリメラーゼおよび基質であるアデノシン三リン酸を用いて反応させ、その結果、ポリアデニル化リボ核酸分子が産生される。したがって、これにより、ポリアデニル化リボ核酸分子をさらなる工程で精製し、その後に第３の工程で逆転写が起こる。ポリアデニル化テール中で逆転写を使用し、それにより、ホモポリマーオリゴヌクレオチドは、一般に、相補的様式でポリＴ−オリゴヌクレオチドをポリアデニル化ＲＮＡテールへ付着させる。ポリ−Ｔ−オリゴヌクレオチドの３’末端はここでポリメラーゼによって使用されて、デオキシリボ核酸鎖を産生し、この鎖は既存のリボ核酸鎖と相補的である。したがって、産生された鎖は、「第１のｃＤＮＡ鎖」と呼ばれる。このｃＤＮＡを、ＰＣＲ反応で使用することができ、それにより、ランダムプライマーまたは他の特異的プライマーを使用することによって増幅物が生成される。Ｓｈｉらは、特に、オリゴ−ｄＴアダプター−プライマーを介したｍｉＲＮＡ検出を教示し、それにより、特異的プライマーのアダプターをＰＣＲで使用する（非特許文献８）。
【００１１】
このごく最近になって出版された方法は、上記の特定のリボ核酸分子と比較して決定的な欠点を有する。
【００１２】
したがって、２段階方法は、一般に、夾雑物の導入を伴い得る。精製工程により、希少なＲＮＡが喪失する。２段階方法には、第１の酵素の失活ならびに第１の酵素および第２の酵素をインキュベートする時間が必要であり、これらは共に非常に長時間を消費する。さらに、２段階方法は、２以上の試料を同時に処理する場合に試料を混同する危険がありうるという欠点を有する。先行技術から公知であるように、ヌクレアーゼ攻撃が懸念される限り、リボ核酸は比較的高感度である。２段階方法は、特に第１の段階後の精製工程は、ヌクレアーゼが導入される危険性を伴う。最終的に、２以上の工程は、常に、ピペッティングの誤りの危険性が増大するという事実をもたらす。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ａｍｂｒｏｓ，Ｖ．、２００１年、「ミクロＲＮＡ：大いなる可能性を秘めた小さな制御因子（ＭｉｃｒｏＲＮＡ’ｓ：Ｔｉｎｙ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｒｅａｔ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）」、Ｃｅｌｌ  １０７、Ｐ．８２３−８２６。
【非特許文献２】Ｌｅｅ，Ｙ．，Ｊｅｏｎ，Ｋ．ら、２００２年、「ミクロＲＮＡ成熟：細胞内局在化の段階的プロセシング（ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ：  Ｓｔｅｐｗｉｓｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｌｏｃａｌｉｓａｔｉｏｎ）」、Ｅｍｂｏ  Ｊ．２１、ｐ．４６６３−４６７０。
【非特許文献３】Ｌｅｅ，Ｙ．ら、２００３年、「各ＲＮＡのＩＩＩ  Ｄｒｏｓｈａは、ミクロＲＮＡプロセシングを開始する（Ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅａｒ  ＲＮＡ’ｓ  ＩＩＩ  Ｄｒｏｓｈａ  Ｉｎｉｔｉａｔｅｓ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）」、Ｎａｔｕｒｅ  ４２５、ｐ．４１５−４１９。
【非特許文献４】Ａｍｂｒｏｓ，Ｖ．、２００４年、「動物ミクロＲＮＡの機能（Ｔｈｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ）」、Ｎａｔｕｒｅ，４３１、ｐ．３５０−３５５。
【非特許文献５】Ｍａｘｗｅｌｌ，Ｅ．Ｓ．ら、１９９５年、「小核ＲＮＡ（Ｔｈｅ  Ｓｍａｌｌ  Ｎｕｃｌｅｏｌａｒ  ＲＮＡ）」、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，３５、ｐ．８９７−９３４。
【非特許文献６】Ｂａｌｌａｋｉｎ，Ａ．Ｄ．ら、１９９６年、「核のＲＮＡワールド：関連する機能を有する異なるＢｏｘエレメントによって定義される小核ＲＮＡの２つの主なファミリー（Ｔｈｅ  ＲＮＡ  Ｗｏｒｌｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｏｌｕｓ：  Ｔｗｏ  Ｍａｊｏｒ  Ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｏｆ  Ｓｍａｌｌ  Ｎｕｃｌｅｏｌａｒ  ＲＮＡ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  ｂｙ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｂｏｘ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）」、Ｃｅｌｌ，８６、ｐ．８２３−８３４。
【非特許文献７】Ｏｌｓｏｎ，Ｄ．Ｊ．、１９８６年、「微生物の生態学および進化：リボゾームＲＮＡアプローチ（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｅｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ：  Ａ  Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）」、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．４０、ｐ．３３７−３６５。
【非特許文献８】Ｓｈｉ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｃｈｉａｎｇ，Ｖ．Ｌ．（Ｓｈｉ，Ｒ．ら、「リアルタイムＰＣＲによる容易なミクロＲＮＡ発現の定量手段（Ｆａｃｉｌｅ  Ｍｅａｎｓ  ｆｏｒ  Ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２００５年、３９、ｐ．５１９−２５。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
発明の主題
したがって、本発明の目的は、ｃＤＮＡ合成を可能にし、できるだけ多くの夾雑物を回避し、あまり時間がかからず、試料を混同する危険性を最小にし、ヌクレアーゼ導入の危険性を最小にし、最終的にピペッティングの誤りの危険性をできるだけ排除する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
この目的を、酵素反応における試料中のｃＤＮＡの合成方法であって、以下：
（ａ）ポリアデニル化活性を有する第１の酵素、逆転写酵素活性を有する第２の酵素、緩衝液、少なくとも１つのリボヌクレオチド、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチド、アンカーオリゴヌクレオチドを同時に準備する工程、（ｂ）リボ核酸を含む試料を添加する工程、および（ｃ）第１の酵素および第２の酵素が活性を示すように選択される１または複数の温度工程において工程（ａ）および（ｂ）の作用物質をインキュベートする工程
を含む、方法によって達成する。
【００１６】
今日まで、酵素的ポリアデニル化と逆転写酵素との組み合わせが技術的に可能であると見なされていた。これは、さらにより最近に、すなわち、分析および単離に関して特別な分子生物学的課題を示すｓｎｏＲＮＡおよびミクロＲＮＡの発見後に示され、酵素反応が常に連続して実施された（Ｗａｎｔ，Ｊ．Ｆ．ら、「イネ由来の２０種のミクロＲＮＡの同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ２０  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｆｒｏｍ  Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、２００４年、３２、ｐ．１６８８−９５；Ｓｈｉ，Ｒ．ａｎｄ  Ｃｈｉａｎｇ，Ｖ．Ｌ．、リアルタイムＰＣＲによる容易なミクロＲＮＡ発現の定量手段（Ｆａｃｉｌｅ  Ｍｅａｎｓ  ｆｏｒ  Ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２００５年、３９、ｐ．５１９−２５；Ｆｕ，Ｈ．ら、新規の方法によるヒト胎児肝臓ｍｉＲＮＡの同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｆｅｔａｌ  Ｌｉｖｅｒ  ｍｉＲＮＡ  ｂｙ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｍｅｔｈｏｄ）」、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ、２００５年、５７９、ｐ．３８４９−５４；Ｃｈｅｎ，Ｃ．Ｌ．ら、「植物における非常に多様なｓｎｏＲＮＡ：イネ由来の１２０種のｓｎｏＲＮＡ遺伝子の同定および比較研究（Ｔｈｅ  Ｈｉｇｈ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｓｎｏＲＮＡ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔｓ：  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  １２０  ｓｎｏＲＮＡ  Ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｏｒｙｚａ  Ｓａｔｉｖａ）」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２００３年、３１、ｐ．２６０１−１３；Ｂｏｔｅｒｏ，Ｌ．Ｍ．ら、「環境ＲＮＡの修飾および逆転写酵素ＰＣＲ増幅（Ｐｏｌｙ（Ａ）Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ＰＣＲ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ＲＮＡ）」、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２００５年、７１、ｐ．１２６７−７５）。驚いたことに、両方法（すなわち、ポリアデニル化および逆転写）は、長い間当業者に既に公知であった（Ｓａｎｏ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｆｅｉｘ，Ｇ．、「大腸菌由来の末端リボアデニレートトランスフェラーゼ：特徴づけおよび適用（Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｉｂｏａｄｅｎｙｌａｔｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）」、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９７６年、７１、ｐ．５７７−８３）。一般に、当業者はポリ−Ａ−テーリング工程によって反応産物を精製している（Ｓｈｉ，Ｒ．ら、リアルタイムＰＣＲによる容易なミクロＲＮＡ発現の定量手段（Ｆａｃｉｌｅ  Ｍｅａｎｓ  ｆｏｒ  Ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２００５年、３９、ｐ．５１９−２５）。これらについての理由は、反応に必要な反応緩衝液および基質の組成が明確に異なることにある。
【００１７】
本発明の別の主題は、ｃＤＮＡ合成を可能にし、この反応を任意選択的に第３の酵素反応と連携して、同一反応容器中で生成されたｃＤＮＡを特異的に検出可能にする簡潔な方法を提供することである。非常に簡潔な取り扱いにより、この「３−イン−１（３−ｉｎ−１）」方法は、多数の試料を１種または数種の検体で分析することになる場合に特に有利である。例えば、リアルタイムＰＣＲと連携すれば、非常に迅速且つ簡潔な方法で非常に多数の試料を分析できることがその理由である。さらなる取り扱い工程および汚染をできるだけ多く防止するべきであり、それにより時間が短縮され、試料の混同の危険性が最小になり、ヌクレアーゼが導入される危険性が最小になり、最終的に、ピペッティングの誤りの危険性ができるだけ多く排除される。
【００１８】
「３−イン−１」反応の目的は、酵素反応およびその後の他の酵素反応、任意選択的に増幅、任意選択的に検出と連携して、下流または増幅中のリアルタイムのいずれかで、試料中のｃＤＮＡの合成方法によって達成され、それにより、この方法は、以下：（ａ）ポリアデニル化活性を有する第１の酵素、逆転写酵素活性を有する第２の酵素、緩衝液、少なくとも１つのリボヌクレオチド、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチド、アンカーオリゴヌクレオチド、核酸合成活性を有する少なくとも１つの第３の酵素、少なくとも１つのプライマー、および任意選択的にプローブを同時に準備する工程、（ｂ）リボ核酸を含む試料を添加する工程、および（ｃ）第１の酵素および第２の酵素が活性を示し、任意選択的に第３の酵素が活性または不活性であるように選択される１または複数の温度工程において工程（ａ）および（ｂ）の作用物質をインキュベートする工程を含む。任意選択的に、１または複数の温度工程が続き、この工程では第１の酵素および第２の酵素の活性がより低いか不活性であり、且つ第３の酵素が活性である。
【００１９】
ｉｎ  ｖｉｖｏで使用されるポリ−（Ａ）−ポリメラーゼの基質は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）である。いくつかのポリ−（Ａ）−ポリメラーゼについて、基質としての他のＮＴＰへの短いテールの付着でさえ可能であることが示された（Ｍａｒｔｉｎ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｋｅｌｌｅｒ，Ｗ．，Ｔａｉｌｉｎｇ  ａｎｄ  ３’−Ｅｎｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｗｉｔｈ  Ｙｅａｓｔ  Ｐｏｌｙ（Ａ）Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ａｎｄ  Ｖａｒｉｏｕｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ＲＮＡ，１９９８，４，２２６−３０）。
【００２０】
驚いたことに、本発明者らは、一定の要件下で、２つの依然として非常に異なる酵素反応を１つの反応容器中で同時に実施することが可能であることを発見した。本発明の好ましい実施態様では、試料は、一般に原核生物リボ核酸、真核生物リボ核酸、ウイルスリボ核酸、古細菌を起源とするリボ核酸、ミクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）、小核小体リボ核酸（ｓｎｏＲＮＡ）、メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）、転移リボ核酸（ｔＲＮＡ）、非ポリアデニル化リボ核酸、ならびにリボゾームリボ核酸（ｒＲＮＡ）を含む群から選択されるリボ核酸である。さらに、２以上の上記リボ核酸の混合物である。試料中に、勿論、ポリ−Ａ  ＲＮＡを事前に含めることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、本発明に係る１段階方法（Ｂ）と先行技術で公知の２段階方法（Ａ）との間の比較を示す。ポリＡポリメラーゼ：本発明におけるポリアデニル化活性を有する酵素；逆転写酵素：本発明における逆転写酵素活性を有する酵素；ｒＡＴＰ：リボヌクレオチド、ここでは、例としてアデノシン−５’−三リン酸；ｄＮＴＰｓ：デオキシリボヌクレオチド；オリゴｄＴテールプライマー：本発明における種々の可能な実施態様を有するアンカーオリゴヌクレオチド；Ｕｎｉ  ＧＡＰ  ｄＴプライマー：アンカーオリゴヌクレオチドの特定の実施態様；テール：アンカーオリゴヌクレオチドの選択的部分としての５’テール；ｗ：ポリアデニル化活性によって付着したホモポリマーテールの本発明に係る長さを定義する（１０〜２０塩基より大きい）；ｘ、ｙ：本発明に係るアンカーオリゴヌクレオチドの３’アンカー配列の本発明に係る種類および長さを定義する；ｚ：本発明に係るアンカーオリゴヌクレオチドのホモポリマー部分の長さを定義する。
【図２】図２は、表６からのＣｔ値のグラフを示す：条件ａ）それぞれの場合でのテンプレートを含み、条件ｂ）では、テンプレートの代わりに水のみを添加した（ＰＡＰ反応中の水）。ｂ）では、ＰＣＲサイクル４０（実施した最大サイクル数）までシグナルは得らなかった。したがって、表示は、「Ｃｔなし」である。
【図３】図３は、実施例１からのリアルタイムＰＣＲ産物のアガロース分析を示す。Ｍ：１００ｂｐラダー（インビトロジェン、カタログ番号１５６２８−０５０）。泳動緩衝液としてのＴＡＥ中で臭化エチジウムで染色した２％アガロース。ローディング図：トレース１：マーカー、次いで、それぞれの場合での、互いの隣りに３倍量がプロットされている：１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３ａ、３ｂ、４ａ、４ｂ。
【図４】図４は、表８に記載したバッチの反応産物のリアルタイムＰＣＲ分析によって得られたＣｔ値の表を示す。３および６では、ＰＣＲサイクル４０（実施した最大サイクル数）までシグナルは得らなかった。したがって、表示は、「Ｃｔなし」である。
【図５】図５は、表８に記載したバッチの反応産物のリアルタイムＰＣＲ分析によって得られたＣｔ値のグラフを示す。
【図６】図６は、表１８に記載したバッチｂ）およびｅ）の反応産物のリアルタイムＰＣＲ分析によって得られたＣｔの平均値の表を示す。標準的ＲＴを使用した２、４、および５では、サイクル３８後のみに最も早くシグナルが検出され、または２）ではシグナルが検出されなかった。したがって、表示は、「Ｃｔなし」である。
【図７】図７は、表１８からのバッチｂ）およびｄ）ならびに表１９からのたった１つのプライマーを使用したコントロール（バッチａ）〜ｄ））のリアルタイムＰＣＲの結果の表を示す。ＰＣＲサイクル４０（実施した最大サイクル数）までシグナルは得らなかった。したがって、表示は、「Ｃｔなし」である。
【図８】図８は、実施例３からのリアルタイムＰＣＲ産物のアガロースゲル分析を示す。Ｍ：１００ｂｐラダー（インビトロジェン、カタログ番号１５６２８−０５０）。泳動緩衝液としてのＴＡＥ中で臭化エチジウムで染色した２％アガロース。
【図９】図９は、表３０に記載したバッチ１ａ）、ｂ）、および２ａ）、ｂ）の反応産物のリアルタイムＰＣＲ分析によって得られたＣｔの平均値の表を示す。下の部分：表３０に記載したバッチの反応産物のリアルタイムＰＣＲ分析によって得られたＣｔの平均値のグラフ。
【図１０】図１０は、表３６の１〜５および表３７の６〜９に記載したバッチの反応産物のリアルタイムＰＣＲ分析によって得られたＣｔの平均値の表を示す。下の部分：表３６の１〜５および表３７の６〜９に記載したバッチの反応産物のリアルタイムＰＣＲ分析によって得られたＣｔの平均値のグラフ。
【図１１】図１１は、使用した核酸配列のリストを示す。
【図１２−１】図１２は、本発明に係るアンカーオリゴヌクレオチドを示す。
【図１２−２】図１２は、本発明に係るアンカーオリゴヌクレオチドを示す。
【図１３】図１３は、本発明に係る１段階「３−イン−１」方法（Ｂ）と先行技術で公知の３段階方法（Ａ）との間の比較を示す。ポリＡポリメラーゼ：本発明におけるポリアデニル化活性を有する酵素；逆転写酵素：本発明における逆転写酵素活性を有する酵素；ｒＡＴＰ：リボヌクレオチド、ここでは、例としてアデノシン−５’−三リン酸；ｄＮＴＰｓ：デオキシリボヌクレオチド；オリゴｄＴテールプライマー：本発明における種々の可能な実施態様を有するアンカーオリゴヌクレオチド；Ｕｎｉ  ＧＡＰ  ｄＴプライマー：アンカーオリゴヌクレオチドの特定の実施態様；テール：アンカーオリゴヌクレオチドの選択的部分としての５’テール；ｗ：ポリアデニル化活性によって付着したホモポリマーテールの本発明に係る長さを定義する（１０〜２０塩基より大きい）；ｘ、ｙ：本発明に係るアンカーオリゴヌクレオチドの３’アンカー配列の本発明に係る種類および長さを定義する；ｚ：本発明に係るアンカーオリゴヌクレオチドのホモポリマー部分の長さを定義する。ＰＣＲプライマー：ｃＤＮＡ種の特異的検出のための少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、任意選択的に、少なくとも１つのプローブ；ＰＣＲ酵素：試料中に含まれるｃＤＮＡ種の特異的検出を可能とする酵素活性。
【図１４】図１４は、表４１に対応する実施例７からの反応バッチおよび表４２からの反応バッチに従った「３−イン−１」反応、すなわち、１つの反応容器中で連携したポリ−（Ａ）−ポリメラーゼ反応と、逆転写と、リアルタイムＰＣＲ分析との組み合わせのＣｔの平均値の表を示す。  下の部分：表４１に対応する実施例７からの反応バッチおよび表４２からの反応バッチに従った「３−イン−１」反応、すなわち、反応容器中で連携したポリ−（Ａ）−ポリメラーゼ反応と、逆転写と、リアルタイムＰＣＲ分析との組み合わせのＣｔの平均値のグラフ。
【図１５】図１５は、表４４に対応する実施例８の反応バッチおよび表４６からの反応バッチ後の「３−イン−１」反応、すなわち、１つの反応容器中での連携したポリ−（Ａ）−ポリメラーゼ反応と、逆転写と、リアルタイムＰＣＲ分析との組み合わせのＣｔの平均値の表を示す。  下の部分：「３−イン−１」反応（すなわち、反応容器中で連携したポリ−（Ａ）−ポリメラーゼ反応と、逆転写と、リアルタイムＰＣＲ分析との組み合わせ）のＣｔの平均値のグラフ。
【図１６】図１６は、１００ｎｇのポリ−（Ａ）またはポリ−（Ｃ）の存在下または非存在下でｍｉＳｃｒｉｐｔを使用して逆転写した種々の量（１０ｐｇ〜１μｇ）のｍｉＲＮＡイージー（ｅａｓｙ）  ＲＮＡを示す。したがって、産生されたｃＤＮＡを、リアルタイムＰＣＲで使用した。この場合、ｍｉＲ−１６およびｌｅｔ−７ａを試験した。
【図１７】種々の量のポリ−（Ａ）の存在下または非存在下でｍｉＳｃｒｉｐｔを使用して逆転写した種々の量（１０ｐｇ〜１μｇ）のｍｉＲＮＡイージー  ＲＮＡを示す。したがって、産生されたｃＤＮＡを、リアルタイムＰＣＲで使用した；この場合、ｍｉＲ−１６を試験した。
【図１８】図１８は、種々の量のポリ−（Ｃ）の存在下または非存在下でｍｉＳｃｒｉｐｔを使用して逆転写した種々の量（１０ｐｇ〜１μｇ）のｍｉＲＮＡイージー  ＲＮＡを示す。したがって、産生されたｃＤＮＡを、リアルタイムＰＣＲで使用した。この場合、ｍｉＲ−１６を試験した。
【図１９】図１９は、ｍｉＳｃｒｉｐｔ  ＲＴキットを使用して５０ｎｇのポリ−（Ｃ）の存在下または非存在下で逆転写した１０ｐｇのｍｉＲＮイージー  ＲＮＡの使用を示す。したがって、産生されたｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲで使用して、ＧＡＰＤＨを検出した。
【図２０】図２０は、種々の量のポリ−（Ｃ）の存在下または非存在下でｍｉスクリプト（Ｓｃｒｉｐｔ）を使用して逆転写した種々の量（１〜１００ｎｇ）のｍｉＲＮイージー  ＲＮＡを示す。したがって、産生されたｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲで使用して、この場合、ＧＡＰＤＨを試験した。
【図２１】図２１は、５０ｎｇのポリ−（Ｃ）の存在下または非存在下でｍｉＳｃｒｉｐｔ  ＲＴキットを使用して逆転写した１０ｐｇおよび１００ｐｇのｍｉＲＮイージー  ＲＮＡの使用を示す。したがって、産生されたｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲで試験して、ＧＡＰＤＨを検出した。
【図２２】図２２は、種々の量のポリ−（Ｃ）の存在下または非存在下でｍｉＳｃｒｉｐｔを使用して逆転写した種々の量（１〜１００ｎｇ）のｍｉＲＮイージー  ＲＮＡを示す。したがって、産生されたｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲで使用して、この場合、ＣＤＣ２を試験した。
【図２３】図２３は、５０ｎｇのポリ−（Ｃ）の存在下または非存在下でｍｉＳｃｒｉｐｔＲＴキットを使用して逆転写した１ｎｇのｍｉＲＮイージー  ＲＮＡの使用を示す。したがって、産生されたｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲで試験して、ＣＤＣ２を検出した。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の特に好ましい実施態様では、試料は、原核生物リボ核酸、ｍｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、およびｒＲＮＡを含む群から選択されるリボ核酸である。本発明の最も好ましい実施態様では、試料は、ｍｉＲＮＡおよびｓｎｏＲＮＡを含む群から選択されるリボ核酸を含む。他の物質と組み合わせた異なる量の異なる種類のリボ核酸からなる他の混合物試料が好ましい。
【００２３】
さらに、本発明者らは、一定条件下で、２つの依然として非常に異なる酵素反応を１つの反応容器中で同時に実施し、生成されたｃＤＮＡの特異的検出のための第３の酵素反応、好ましくは、核酸合成活性であるに追加して後者の反応と連携することができることを発見した。本発明の好ましい実施態様では、試料は、一般に原核生物リボ核酸、真核生物リボ核酸、ウイルスリボ核酸、古細菌を起源とするリボ核酸、ミクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）、小核小体リボ核酸（ｓｎｏＲＮＡ）、メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）、転移リボ核酸（ｔＲＮＡ）、および非ポリアデニル化リボ核酸を含む群から選択されるリボ核酸ならびにリボゾームリボ核酸（ｒＲＮＡ）である。さらに、２以上の上記リボ核酸の混合物である。試料中に、勿論、ポリ−Ａ  ＲＮＡを事前に含めることもできる。
【００２４】
本発明の特に好ましい実施態様では、試料は、原核生物リボ核酸、ｍｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、およびｒＲＮＡを含む群から選択されるリボ核酸である。本発明の最も好ましい実施態様では、試料は、ｍｉＲＮＡおよびｓｎｏＲＮＡを含む群から選択されるリボ核酸を含む。他の物質と組み合わせた異なる量の異なる種類のリボ核酸からなる他の混合物試料が好ましい。
【００２５】
本発明の方法のこれらの利点に基づいて、本発明者らは、ｍｉＲＮＡを効率的且つ汚染することなく調製および特徴づけることが可能であることを示すことができた。
【００２６】
本発明の１つの実施態様では、アンカーオリゴヌクレオチドは、ポリ−（Ａ）−オリゴヌクレオチド、ポリ−（Ｃ）−オリゴヌクレオチド、ポリ−（Ｔ）−オリゴヌクレオチド、ポリ−（Ｇ）−オリゴヌクレオチド、ポリ−（Ｕ）−オリゴヌクレオチド、５’−テールをさらに含むポリ−（Ａ）−オリゴヌクレオチド、５’−テールをさらに含むポリ−（Ｃ）−オリゴヌクレオチド、５’−テールをさらに含むポリ−（Ｔ）−オリゴヌクレオチド、５’−テールをさらに含むポリ−（Ｇ）−オリゴヌクレオチド、および５’−テールをさらに含むポリ−（Ｕ）−オリゴヌクレオチドを含む群から選択されるホモポリマーオリゴヌクレオチドである。任意選択的に、上記で既に説明されているように、さらに５’−テールを含むことができるポリ−（Ｔ）−オリゴヌクレオチドが好ましい。
【００２７】
本発明に係るアンカーオリゴヌクレオチドは、一般に、６ヌクレオチド長および７５ヌクレオチド長との間にある。しかし、約１５０ヌクレオチド長まであり得る。アンカーオリゴヌクレオチドが合成である場合、最大長は、ＤＮＡ合成の技術的限度から得られる。アンカーオリゴヌクレオチドは、任意選択的に、５’−テールおよび／またはアンカー配列を含む。５’−テールは、オリゴヌクレオチドの５’末端上のさらなるヌクレオチド配列であり、例えば、クローニング配列、プライマーおよび／またはプローブ結合部位、または任意の他の配列を導入するために使用される。当業者は、各適用の要件に基づいて、５’−テールに適切な配列を同定することが可能である。
【００２８】
アンカーオリゴヌクレオチドの３’末端上に、典型的に１〜５個のさらなるヌクレオチド長を有するさらなるアンカー配列を含めることができる。アンカー配列は、少なくとも１つの塩基長を有することができ、それにより、好ましい実施態様では、第１の位置は縮重塩基であり、これは、アンカーオリゴヌクレオチドのホモポリマー部分中で使用される塩基以外の全ての塩基を含む。その後に他の塩基を続けることができる。後者も縮重することができる。本明細書中の１つの好ましい実施態様では、Ｎゆらぎを使用することが有用であり、Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、または対応するアナログである。
【００２９】
通常、アンカーオリゴヌクレオチドはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。しかし、アンカーオリゴヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）でもあり得る。ロックド核酸（ＬＮＡ）、ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ  ｔｈｉｏａｔｅ）−デオキシリボ核酸、シクロヘキセン−核酸（ＣｅＮＡ）、Ｎ３’−Ｐ５’−ホスホラメダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｅｄｉｔｅｓ）（ＮＰ）、およびトリシクロ−デオキシリボ核酸（ｔｃＤＮＡ）も可能である。しかし、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）であるアンカーオリゴヌクレオチドが好ましい。ＲＮＡとＤＮＡまたは１つまたは複数の修飾核酸またはアナログ、ならびに選択された条件下でＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズすることができる他の修飾物（対応する塩基アナログなど）との混合物が可能である。１つの特に好ましい実施態様では、アンカーオリゴヌクレオチドは、５’−テールをさらに含むポリ−（Ｔ）−オリゴヌクレオチドであり、デオキシリボ核酸であり、１５〜１５０ヌクレオチド長であり、混合物として存在する。アンカーオリゴヌクレオチドの３’末端上に、典型的には１〜５個の長さのさらなるヌクレオチドを有するさらなるアンカー配列を含めることができる。アンカー配列は、少なくとも１つの塩基長を有することができ、それにより、好ましい実施態様では、第１の位置は縮重塩基であり、これは、アンカーオリゴヌクレオチドのホモポリマー部分中で使用される塩基以外の全ての塩基を含む。その後に他の塩基を続けることができる。後者も縮重することができる。本明細書中の１つの好ましい実施態様では、Ｎゆらぎを使用することが有用であり、Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、または対応するアナログである。
【００３０】
一例として、以下の本発明に係るアンカーオリゴヌクレオチドを列挙することができる。
実施例１（配列番号１０）：5’TGG AAC GAG ACG ACG ACA GAC CAA GCT TCC CGT TCT CAG CC (T)XVVN 3’
実施例２（配列番号１１）：5’AACGAGACGACGACGACAGAC(T)x VN 3’
実施例３（配列番号１２）：5’AACGAGACGACGACAGAC(T)x V 3’
実施例４（配列番号１３）：5’AACGAGACGACGACAGAC(T)x N 3’
実施例５（配列番号１４）：5’AACGAGACGACGACAGAC(T)x NN 3’
実施例６（配列番号１５）：5’AACGAGACGACGACAGAC(T)x VNN 3’
実施例７（配列番号１６）：5’AACGAGACGACGACAGAC(T)x VNNN 3’
実施例８（配列番号１７）：5’AACGAGACGACGACAGAC(T)x NNN 3’
実施例９（配列番号１８）：5’TGG AAC GAG ACG ACG ACA GAC CAA GCT TCC CGT TCT CAG CC(T)x VN 3’
実施例１０（配列番号１９）：5’TGG AAC GAG ACG ACG ACA GAC CAA GCT TCC CGT TCT CAG CC(T)X VNN 3’
Ｘは好ましくは１０〜３０塩基である。
ＶおよびＮは、縮重塩基の一文字表記であり、Ｖ＝Ａ、Ｃ、Ｇ；Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ。
【００３１】
当業者は、他の適切な５’−テール配列の同定が可能である。
【００３２】
任意選択的な５’−テールは、さらなる１〜１００個のヌクレオチドを含み、次の分析のために使用することができる。したがって、好ましい実施態様では、５’−テールは、オリゴヌクレオチドの結合配列、例えば、１つまたは複数のＤＮＡプローブおよび／または１つまたは複数のＰＣＲプライマーなどを含むことができる。５’−テールのために使用される配列を、後者が本発明の方法に適合するように選択することが好ましい。これは、例えば、本発明の方法およびその後の分析方法の両方においていかなる望ましくない二次反応も生じない配列の選択を含む。
【００３３】
本発明によれば、アンカーオリゴヌクレオチドを図１２に示す。
【００３４】
原理上、本発明における酵素反応は、ビヒクル上またはコンテナ中で起こり得る、すなわち、反応容器中で反応が起こり得る。かかる反応容器は、反応チューブ、または例えばマイクロタイタープレートであり得る。反応は、チップ上で起こり得る。チップ上で反応が起こる場合、１つまたは複数の成分を固定することができる。試験ストリップ上または微小流体系（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｓｙｓｔｅｍ）中で反応が起こり得る。ビヒクルまたはコンテナと比較して最も多様な実施態様が当業者に公知である。
【００３５】
好ましい実施態様では、リボヌクレオチドは、アデノシン−５’−三リン酸、チミジン−５’−三リン酸、シトシン−５’−三リン酸、グアニン−５’−三リン酸、および／またはウラシル−５’−三リン酸である。リボヌクレオチドは、塩基アナログでもあり得る。リボヌクレオチドは、修飾または標識され得る。原理上、リボヌクレオチドを、基質としてポリアデニル化活性にある酵素と反応することが不可欠である。
【００３６】
本発明におけるデオキシリボヌクレオチドを、デオキシアデノシン−５’−三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシチミン−５’−三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシシトシン−５’−三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン−５’−三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシウラシル−５’−三リン酸（ｄＵＴＰ）、ならびに修飾デオキシリボヌクレオチドおよび標識デオキシリボヌクレオチドを含む群から選択することができる。ユニバーサル塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ）または塩基アナログを含む１つまたは複数のデオキシリボヌクレオチドを追加して、または代わりに使用する適用も考えられる。使用されるデオキシリボヌクレオチドがｃＤＮＡ合成を可能にすることが本発明の実施に不可欠である。
【００３７】
本発明によれば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、およびｄＧＴＰが混合物として共に存在することが好ましい。
【００３８】
本発明によれば、デオキシウラシル−５’−三リン酸も混合物中で使用することができる。これを酵素反応と組み合わせることができ、この酵素反応は、実際の反応後に起こり、ウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼを使用し、さらに使用される酵素的に産生された反応産物を分解することができない。
【００３９】
デオキシリボヌクレオチドを標識する場合、標識を、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ；蛍光色素、例えば、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、キサンテン、ローダミン、６−カルボキシ−２’，４’，７’，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、５−カルボキシローダミン−６Ｇ（Ｒ６Ｇ５）、６−カルボキシローダミン−６Ｇ（ＲＧ６）、ローダミン１１０など；ウンベリフェロンなどのクマリン；Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８などのベンズイミド；テキサスレッド、臭化エチジウム、アクリジン色素、カルバゾール色素、フェノキサジン色素、ポルフィリン色素、ポリメチン色素などのフェナントリジン；Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７などのシアニン色素、ＢＯＤＩＰＹ色素、およびキノリン色素、およびアレクサ（ａｌｅｘａ）色素を含む群から選択することができる。ビオチンまたは１つまたは複数のハプテン、例えば、ジゴキシゲニンなどの封入体などの他の標識により、核酸の直接または間接的検出が可能となる。例えば、抗体などを介する間接的な検出は、その後に、例えば、抗体とカップリングした酵素を介して酵素検出する。また、例えば、抗体またはアフィニティリガンドと組み合わさったナノ粒子の導入を介して、間接的検出が可能となる。
【００４０】
デオキシリボヌクレオチドの修飾はまた５’−リン酸を介して実施されえ、より簡潔なクローニングが可能となる。反応基、例えば、アミノリンカー（ビオチンも）などを含めることにより、デオキシリボヌクレオチドは、例えば、固定されえ、または直接もしくは間接的な検出が利用可能になり得る。
【００４１】
特に好ましい修飾物は、蛍光色素、ハプテン、５’−リン酸、５’−ビオチン、および５’−アミノリンカーを含む群から選択される。
【００４２】
本発明によれば、反応物中のデオキシリボヌクレオチド濃度は、少なくとも０．０１ｍｍｏｌであり、最大で１０ｍｍｏｌである。この濃度情報は、各デオキシリボヌクレオチドの濃度である。１つの好ましい実施態様では、デオキシリボヌクレオチドは、それぞれ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰの場合には、０．２ｍｍｏｌ〜２ｍｍｏｌの濃度で存在する。この濃度情報は、混合物中の各デオキシリボヌクレオチドの濃度である。本発明の特に好ましい実施態様では、各デオキシリボヌクレオチドであるｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰは、それぞれの場合、０．５ｍｍｏｌの濃度で存在する。
【００４３】
驚いたことに、本発明者らは、１工程の酵素反応は、本発明の主題であるように、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）の存在下にて、狭い緩衝液のｐＨ範囲であるｐＨ６〜１０で起きることを決定した。したがって、好ましい実施態様では、ｐＨ６〜１０である。
【００４４】
特に好ましい実施態様では、本発明に係る緩衝液は、ｐＨ６．８〜９である。
【００４５】
本発明に係る別の実施態様では、本発明に係る緩衝液は、Ｍｎ２＋、Ｋ＋、ＮＨ４＋、およびＮａ＋を含む群から選択することができるさらなるイオンを含む。
【００４６】
本発明に係る緩衝液は、例えば、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、酢酸マグネシウム、ＭｎＣｌ２、ＫＣｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＮＨ４Ｃｌ、およびＮａＣｌを含む。緩衝物質として、トリス、トリシン、ビシン（ｂｉｃｉｎｅ）、ＨＥＰＥＳ、ならびに本発明のｐＨ範囲内にある他の緩衝物質または２以上の適切な緩衝物質の混合物が適切である。
【００４７】
ポリアデニル化活性を有する多数の酵素が当業者に公知である。本発明によれば、後者は、原核生物起源、真核生物起源、ウイルス起源、および古細菌起源の酵素、ならびに植物起源の酵素を含む群から選択される。
【００４８】
本発明におけるポリアデニル化活性は、基質としてリボ核酸の３’末端を使用し、適切な緩衝液中で酵素的リボヌクレオチド、特に好ましくは少なくとも１０〜２０リボヌクレオチドをこの３’末端に添加することができる酵素活性である。好ましい実施態様では、酵素は、基質としてアデノシン−５’−三リン酸を使用することができる酵素である。本発明によれば、後者は、一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡ、例えば、ヘアピンＲＮＡ、例えば、プレ−ｍｉＲＮＡなどを使用する場合に本発明におけるポリアデニル化活性を有する酵素および反応条件を含む。分析すべきＲＮＡに基づいて、当業者は、一本鎖ＲＮＡ（例えば、成熟ｍｉＲＮＡ）または二本鎖ＲＮＡ（例えば、プレ−ｍｉＲＮＡ）またはその両方のいずれかが分析可能となるような酵素および反応条件を選択することができる。
【００４９】
一般に、本発明におけるポリアデニル化活性は、転写酵素活性である。
【００５０】
好ましい実施態様では、ポリアデニル化活性を有する酵素は、大腸菌由来のポリ（Ａ）−ポリメラーゼ、酵母由来のポリ（Ａ）−ポリメラーゼ、ウシ由来のポリ（Ａ）−ポリメラーゼ、カエル由来のポリ（Ａ）−ポリメラーゼ、ヒトポリ（Ａ）−ポリメラーゼ、および植物ポリ−（Ａ）−ポリメラーゼを含む群から選択される酵素である。他の酵素が当業者に公知であるか、公知のポリ−（Ａ）−ポリメラーゼにおけるホモロジー分析によって新規に同定することができる。特に好ましい実施態様では、ポリアデニル化活性を有する酵素は、大腸菌由来のポリ−（Ａ）−ポリメラーゼである。
【００５１】
本発明の逆転写酵素活性を有する酵素は、本発明にしたがって、ウイルス、細菌、古細菌、および真核生物由来の酵素を含む群から選択され、特に熱安定性生物由来の酵素である。これらには、例えば、イントロン、レトロトランスポゾン、またはレトロウイルス由来の酵素も含まれる。逆転写酵素活性を有する酵素は、本発明にしたがって、適切な緩衝液条件下でリボ核酸上にハイブリダイズするデオキシオリゴヌクレオチドまたはリボオリゴヌクレオチドの３’末端上のリボ核酸中にデオキシリボヌクレオチドを相補的方法で組み込むことができる酵素である。これは、一方では、勿論この機能を有する酵素を含むが、その遺伝子配列の変化、例えば、変異誘発などまたは対応する緩衝液条件のみによってかかる機能を得る酵素も含む。
【００５２】
逆転写酵素活性を有する酵素であり、（ＨＩＶ逆転写酵素、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、ＥＡＩＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、高度好熱菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｍ−ＭＬＶ  ＲＮアーゼ（ＲＮＡｓｅ）  Ｈ、スーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）、スーパースクリプト  ＩＩ、スーパースクリプト  ＩＩＩ、モンスタースクリプト（ＭｏｎｓｔｅｒＳｃｒｉｐｔ）（エピセンター）、オムニスクリプト（Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ）、センシスクリプト（Ｓｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔ）逆転写酵素（キアゲン）、サーモスクリプト（ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ）、およびサーモ−Ｘ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｘ）（共にインビトロジェン）を含む群から選択される酵素）が好ましい。本発明によれば、酵素は、遺伝子配列の修飾後のみでに酵素として逆転写酵素を有する酵素として酵素を使用され得るすることもできる。精度が上昇した逆転写酵素も使用することができる。一例として、例えば、アックスクリプト（ＡｃｃｕＳｃｒｉｐｔ）逆転写酵素（ストラタジェン）を本明細書中に挙げることができる。逆転写酵素活性を有する２つまたはそれを超える２以上の酵素の混合物を使用することさえも可能であることが当業者に明らかである。
【００５３】
逆転写酵素活性を有するほとんどの酵素が２価のイオンを必要とすることが当業者に公知である。したがって、好ましい実施態様では、上に既に記載したように、２価のイオンを必要とする酵素中に２価のイオンが存在する。Ｍｇ２＋およびＭｎ２＋が好ましい。
【００５４】
酵素の好ましい組み合わせは、ＨＩＶ逆転写酵素またはＭ−ＭＬＶ逆転写酵素またはＥＡＩＶ逆転写酵素またはＡＭＶ逆転写酵素または高度好熱菌ＤＮＡポリメラーゼＩまたはＭ−ＭＬＶ  ＲＮアーゼ  Ｈ、スーパースクリプト、スーパースクリプト  ＩＩ、スーパースクリプト  ＩＩＩ、またはモンスタースクリプト（エピセンター）、またはオムニスクリプト逆転写酵素（キアゲン）またはセンシスクリプト逆転写酵素（キアゲン）、サーモスクリプト、サーモ−Ｘ（共にインビトロジェン）、または逆転写酵素活性を有する２以上の酵素と大腸菌由来のポリ−（Ａ）−ポリメラーゼとの混合物である。さらに、ＨＩＶ逆転写酵素またはＭ−ＭＬＶ逆転写酵素またはＥＡＩＶ逆転写酵素またはＡＭＶ逆転写酵素または高度好熱菌ＤＮＡポリメラーゼＩまたはＭ−ＭＬＶ  ＲＮアーゼ  Ｈ、スーパースクリプト、スーパースクリプト  ＩＩ、スーパースクリプト  ＩＩＩ、またはモンスタースクリプト（エピセンター）またはオムニスクリプト逆転写酵素（キアゲン）またはセンシスクリプト逆転写酵素（キアゲン）、サーモスクリプト、サーモ−Ｘ（共にインビトロジェン）、または逆転写酵素活性を有する２以上の酵素と酵母由来のポリ−（Ａ）−ポリメラーゼとの混合物。
【００５５】
逆転写における高温が二次構造の問題が決定的な役割を果たさないとの効果を有することが当業者に公知である。さらに、一定の酵素において、高温は、逆転写の特異性が増大し、偽対および偽対合が抑制されるという影響を及ぼす。したがって、好熱性である逆転写酵素を本発明の１つの実施態様で使用する。４５℃と８５℃との間に至適な核酸合成活性を有する酵素が好ましく、５５℃と８０℃との間がより好ましく、６０℃と７５℃との間が最も好ましい。高度好熱菌（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼＩが好ましい。
【００５６】
ポリアデニル化活性を有する酵素が非好熱性酵素であり、逆転写酵素活性を有する酵素が好熱性酵素である場合、方法を、本発明にしたがっていくつかの温度工程で実施でき、それにより、第１の温度工程でポリアデニル化活性を有する酵素の至適温度である温度を使用することができ、第２の温度工程では逆転写酵素活性を有する酵素の至適温度である温度を使用することができる。
【００５７】
例えば、ＡＭＶ逆転写酵素を使用する場合、第２の温度工程を４２℃で実施する一方で、主にポリアデニル化活性を有する酵素の活性を有する第１の温度工程を３７℃の温度で実施する。しかし、一定温度での実施も可能である。
【００５８】
当業者は、各酵素活性が影響を受けるように温度を選択することができる。例えば、高度好熱菌由来のＤＮＡポリメラーゼと共に使用される大腸菌由来のポリ−（Ａ）−ポリメラーゼの組み合わせが使用される場合、一連の温度は以下と思われる。第１に、３７℃でインキュベートし、次いで、５５℃〜７０℃でインキュベートする。本発明によれば、したがって、非熱安定性酵素を、熱安定性酵素と組み合わせることができる。この場合、次いで温度工程は、２つの酵素のうちいずれがポリアデニル化活性を有するのかに依存する。本発明によれば、逆転写酵素活性を有する酵素が熱安定性であることが好ましい。反対の場合、これは当業者にもっともらしく、ポリアデニル化工程における高温でのインキュベーションにより、逆転写酵素活性を有する酵素が部分的または完全に失活するかもしれない。したがって、２つの酵素が熱安定性であることも好ましい。
【００５９】
さらに、酵素が非常に異なる程度のプロセシング能力を示すことが当業者に公知であり、その結果、当業者は、種々の長さのテンプレートが異なる方法で容易にｃＤＮＡに変換されるような方法で、異なるプロセシング能力を有する酵素を組み合わせることができる。対応する量の各酵素、１つまたは複数の適切なインキュベーション温度、およびインキュベーション時間の使用により、当業者は満足のいく結果を達成することが可能である。
【００６０】
本発明の方法は、好ましくは、さらなるポリ−（Ｃ）−ポリヌクレオチドを含む。本発明の方法は、特に好ましくは、さらなるポリ−（Ｃ）−ポリリボヌクレオチドを含む。好ましくは、それぞれ２０μｌについて１ｎｇ〜３００ｎｇのポリ−（Ｃ）−ポリリボヌクレオチドを含み、好ましくはそれぞれ２０μｌの反応物について１０ｎｇ〜１５０ｎｇのポリ−（Ｃ）−ポリリボヌクレオチドを含み、特に好ましくは各反応物について２５ｎｇ〜１００ｎｇのポリ−（Ｃ）−ポリリボヌクレオチドを含み、最も好ましくはそれぞれ２０μｌの反応物について５０ｎｇ〜７５ｎｇのポリ−（Ｃ）−ポリリボヌクレオチドを含む。
【００６１】
本発明に係る反応物は、さらなる試薬、例えば、体積排除物質（ｖｏｌｕｍｅ  ｅｘｃｌｕｄｅｒ）、一本鎖結合タンパク質、ＤＴＴ、および／または競合物質である核酸などを含むことができる。
【００６２】
体積排除物質を使用する場合、後者は、デキストランおよびポリエチレングリコールを含む群から選択され、欧州特許第１４１１１３３Ａ１号では、本発明に係る体積排除物質を言及している。
【００６３】
好ましい実施態様では、競合物質−核酸はホモポリマーリボ核酸、最も好ましくはポリアデノリボ核酸である。例は、米国特許第６，３００，０６９号に開示されている。
【００６４】
本発明の方法は、好ましくは、さらなるポリ−（Ｃ）−ポリヌクレオチドを含む。本発明の方法は、特に好ましくは、さらなるポリ−（Ｃ）−ポリリボヌクレオチドを含む。好ましくは、それぞれ２０μｌについて１ｎｇ〜３００ｎｇのポリ−（Ｃ）−ポリリボヌクレオチドを含み；好ましくはそれぞれ２０μｌの反応物について１０ｎｇ〜１５０ｎｇのポリ−（Ｃ）−ポリリボヌクレオチドを含み；特に好ましくは各反応物について２５ｎｇ〜１００ｎｇのポリ−（Ｃ）−ポリリボヌクレオチドを含み；および、最も好ましくはそれぞれ２０μｌの反応物について５０ｎｇ〜７５ｎｇのポリ−（Ｃ）−ポリリボヌクレオチドを含む。
【００６５】
競合物質−核酸自体がポリ−（Ａ）−ポリメラーゼ活性の基質として使用されることを防止することが有利であり得ることが当業者に自明である。可能な解決策は、競合物質−核酸の３’ＯＨ基の遮断である。対応する解決策、例えば、３’リン酸塩の使用、デオキシヌクレオチドまたは逆塩基（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｂａｓｅ）の包含などは、当業者に公知である。
【００６６】
競合物質−核酸自体が逆転写酵素活性の基質として使用されることを防止できることが有利であることも当業者に自明である。これは、例えば、使用されるプライマーが後者とハイブリダイズすることができないなどで、所与の反応条件下でｃＤＮＡに変換することができない競合物質−核酸を選択することによって確保されうる。別の可能な解決策は、競合物質−核酸の３’ＯＨ基のブロッキングである。対応する解決策、例えば、３’リン酸塩の使用、デオキシヌクレオチドまたは逆塩基の包含などは、当業者に公知である。
【００６７】
さらに、本発明は、ポリアデニル化活性を有する第１の酵素、逆転写酵素活性を有する第２の酵素、任意選択的に緩衝液、任意選択的に少なくとも１つのリボヌクレオチド、任意選択的に少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチド、および任意選択的に１つのアンカーオリゴヌクレオチドを含む反応混合物に関する。アンカーオリゴヌクレオチドは、好ましくは、ホモポリマー部分、アンカー配列、および／またはテールを含む。反応混合物は、さらに好ましくは、ランダムプライマーを含む。ランダムプライマーのさらなる使用は、長い転写物の５’末端でさえも効率的に変換されるという利点を有し、定量的分析で重要である。反応混合物は、本発明の方法で使用される作用物質と同一の作用物質を含むことができる。
【００６８】
本発明の１つの実施態様では、アンカーオリゴヌクレオチドは、ポリ−（Ａ）−オリゴヌクレオチド、ポリ−（Ｃ）−オリゴヌクレオチド、ポリ−（Ｔ）−オリゴヌクレオチド、ポリ−（Ｇ）−オリゴヌクレオチド、ポリ−（Ｕ）−オリゴヌクレオチド、５’−テールをさらに含むポリ−（Ａ）−オリゴヌクレオチド、５’−テールをさらに含むポリ−（Ｃ）−オリゴヌクレオチド、５’−テールをさらに含むポリ−（Ｔ）−オリゴヌクレオチド、５’−テールをさらに含むポリ−（Ｇ）−オリゴヌクレオチド、および５’−テールをさらに含むポリ−（Ｕ）−オリゴヌクレオチドを含む群から選択されるホモポリマーオリゴヌクレオチドである。上記で既に説明されているように、ポリ−（Ｔ）−オリゴヌクレオチド、さらに任意選択的に５’−テールを含むことができるポリ−（Ｔ）−オリゴヌクレオチドが好ましい。
【００６９】
本発明に係るアンカーオリゴヌクレオチドは、一般に、６ヌクレオチド長および７５ヌクレオチド長の間にある。しかし、約１５０ヌクレオチド長まであり得る。アンカーオリゴヌクレオチドが合成である場合、最大長は、ＤＮＡ合成の技術的限度から得られる。アンカーオリゴヌクレオチドは、任意選択的に、５’−テールおよび／またはアンカー配列を含む。５’−テールは、オリゴヌクレオチドの５’末端上のさらなるヌクレオチド配列であり、例えば、クローニング配列、プライマーおよび／またはプローブ結合部位、または任意の他の配列を導入するために使用される。当業者は、各適用の要件に基づいて、５’−テールに適切な配列を同定することが可能である。
【００７０】
アンカーオリゴヌクレオチドの３’末端に、典型的には１〜５個の長さのさらなるヌクレオチドを有するさらなるアンカー配列を含めることができる。アンカー配列は、少なくとも１つの塩基長を有することができ、それにより、好ましい実施態様では、第１の位置は縮重塩基であり、これは、アンカーオリゴヌクレオチドのホモポリマー部分中で使用される塩基以外の全ての塩基を含む。その後に他の塩基が続き得る。後者も縮重することができる。本明細書中の１つの好ましい実施態様では、Ｎゆらぎを使用することが有用であり、Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、または対応するアナログである。
【００７１】
任意選択的な５’−テールは１〜１００個のヌクレオチドをさらに含み、その後の分析のために使用することができる。したがって、好ましい実施態様では、５’−テールは、オリゴヌクレオチドの結合配列、例えば、１つまたは複数のＤＮＡプローブおよび／または１つまたは複数のＰＣＲプライマーなどを含むことができる。５’−テールのために使用される配列を、後者が本発明の方法に適合するように選択することが好ましい。これは、例えば、本発明の方法およびその後の分析方法の両方においていかなる望ましくない二次反応を生じない配列の選択を含む。
【００７２】
本発明の反応混合物は本発明に係るアンカーオリゴヌクレオチドを含み、アンカーオリゴヌクレオチドは、１０ヌクレオチドおよび１５０ヌクレオチドの間の長さを有し、任意選択的に３’末端に１〜５ヌクレオチド長の本発明に係るアンカー配列を保有する。本発明の反応混合物は、上記のように、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、またはロックド核酸（ＬＮＡ）であるアンカーオリゴヌクレオチドを含む。好ましい実施態様では、本発明の反応混合物は、ポリ−（Ｔ）−オリゴヌクレオチドである本発明に係るアンカーオリゴヌクレオチドを含み、さらに、５’−テールを保有し、それにより、オリゴヌクレオチドは１０〜７５ヌクレオチド長であるデオキシリボ核酸であり、混合物として存在し、それにより、アンカー配列は３’末端上に存在し、それぞれの場合、Ａ、Ｇ、およびＣを含む群から選択される１つのヌクレオチドからなり、任意選択的にその後に４つ全ての塩基Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴまたは対応するアナログを含む１〜５個のさらなるヌクレオチドが続く。
【００７３】
本発明の反応混合物のアンカーオリゴヌクレオチドを図１２に示す。
【００７４】
本発明の反応混合物は、本発明の方法のために上に記載された少なくとも１つのリボヌクレオチドも含む。特に、本発明の反応混合物は、ＡＴＰ、ＴＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ、または対応する塩基アナログから選択される少なくとも１つのリボヌクレオチドを含む。リボヌクレオチドを、任意選択的に、上記のように修飾または標識することができる。本発明の反応混合物は、本発明の方法に対して記載されたようにデオキシリボヌクレオチドを含む。特に、本発明の反応混合物は、１つまたは複数のデオキシリボヌクレオチド、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰ、および／またはｄＴＴＰなどを含む。好ましい実施態様では、ｃＤＮＡ合成が可能なデオキシリボヌクレオチドの混合物を使用する。これらのデオキシリボヌクレオチドを、任意選択的に修飾または標識することができる。
【００７５】
本発明の反応混合物のデオキシリボヌクレオチドを標識する場合、標識を、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、蛍光色素、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、キサンテン、ローダミン、６−カルボキシ−２’，４’、７’，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、５−カルボキシローダミン−６Ｇ（Ｒ６Ｇ５）、６−カルボキシローダミン−６Ｇ（ＲＧ６）、ローダミン１１０など；Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７、ウンベリフェロンなどのクマリン、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８などのベンズイミド；テキサスレッド、臭化エチジウム、アクリジン色素、カルバゾール色素、フェノキサジン色素、ポルフィリン色素、ポリメチン色素などのフェナントリジン、Ｃｙ３、Ｃｙ５などのシアニン色素、ＢＯＤＩＰＹ色素、キノリン色素、およびアレクサ（Ａｌｅｘａ）色素を含む群から選択することができる。ビオチンまたは１つまたは複数のハプテン、例えば、ジゴキシゲニンなどの封入体などの他の標識により、核酸の直接または間接的検出が可能となる。例えば、抗体などを介して間接的に検出し、その後に、例えば、抗体とカップリングした酵素を介して酵素的に検出する。また、例えば、抗体またはアフィニティリガンドとカップリングしたナノ粒子の導入を介して、間接的検出が可能となる。
【００７６】
本発明の反応混合物は、それぞれの場合、０．０１ｍｍｏｌ〜１０ｍｍｏｌの濃度のデオキシリボヌクレオチドを含む。各デオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴは、好ましくは、それぞれの場合、０．２ｍｍｏｌ〜２ｍｍｏｌの濃度で存在する。デオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴが共存することが特に好ましい。それぞれ、この好ましい実施態様では、０．５ｍｍｏｌの濃度で存在する。
【００７７】
さらに、本発明の反応混合物は、緩衝液を含む。この緩衝液は、ｐＨ６〜１０である。さらに、本発明の反応混合物中にＭｇ２＋イオンが見出される。特に好ましい実施態様では、本発明の反応混合物は、ｐＨ６．８〜９の緩衝液を有する。反応混合物は、さらなるイオンをさらに含めることができ、Ｍｎ２＋、Ｋ＋、ＮＨ４＋、およびＮａ＋を含む群から選択することができる。２つの異なる酵素活性の存在は、本発明の反応混合物に不可欠である。本発明の反応混合物は、ポリアデニル化活性を有する少なくとも１つの第１の酵素活性および二次的に逆転写酵素活性を有する第２の酵素活性を含む。これらの活性の好ましい実施態様は、方法について既に上に記載している。さらに、上記方法のように、反応混合物は、さらなる物質、例えば、体積排除物質、一本鎖結合タンパク質、ＤＴＴ、または１つまたは複数の競合物質−核酸などを含むことができる。
【００７８】
体積排除物質を使用する場合、後者は、デキストランおよびポリエチレングリコールを含む群から選択される。本発明に係る他の体積排除物質は、欧州特許第ＥＰ１４１１１３３Ａ１号に見出される。
【００７９】
反応混合物が任意選択的に競合物質−核酸を含む場合、後者は、ホモポリマーリボ核酸およびポリアデノリボ核酸を含む群から選択される。本発明に係る他の競合物質−核酸は、米国特許第６，３００，０６９号に開示されている。
【００８０】
本発明の反応混合物は、好ましくは、さらなるポリ−（Ｃ）−ポリヌクレオチドを含む。本発明の反応混合物は、特に好ましくは、さらなるポリ−（Ｃ）−ポリリボヌクレオチドを含む。好ましくは、それぞれ２０μｌについて１ｎｇ〜３００ｎｇのポリ−（Ｃ）−ポリリボヌクレオチドを含み、好ましくはそれぞれ２０μｌの反応物について１０ｎｇ〜１５０ｎｇのポリ−（Ｃ）−ポリリボヌクレオチドを含み、特に好ましくは各反応物について２５ｎｇ〜１００ｎｇのポリ−（Ｃ）−ポリリボヌクレオチドを含み、最も好ましくはそれぞれ２０μｌの反応物について５０ｎｇ〜７５ｎｇのポリ−（Ｃ）−ポリリボヌクレオチドを含む。
【００８１】
さらに、本発明は、上記のように、反応混合物を含むキットに関する。反応混合物は、好ましい実施態様では、１つの反応容器中に存在する。別の実施態様では、キットは、本発明におけるポリアデニル化活性を有する酵素、逆転写酵素活性を有する酵素、任意選択的にデオキシリボヌクレオチド、任意選択的に少なくとも１つのリボヌクレオチド、任意選択的にＭｇ２＋を含む緩衝液、および任意選択的に１つまたは複数のオリゴデオキシリボヌクレオチを含む反応容器を含む。任意選択的に、本発明のキット中の反応容器は、さらなる成分を含むことができ、これらの成分は、本発明の反応混合物について示されているとおりである。さらに、キットは、本発明に係るアンカーオリゴヌクレオチドの５’−テールに対するプローブを含むことができる。さらに、キットは、１つまたは複数のさらなるデオキシリボヌクレオチド、したがって、例えば、逆転写によって導入されるテール配列を検出するための一般的なプライマーを含むことができる。反応混合物は、「ペレット形態」、したがって、例えば、凍結乾燥形態で存在することができる。例えば、液体形態を含まないさらなる調製方法は、当業者に公知である。
【００８２】
さらに、キットを、任意選択的に、ＰＣＲ反応またはリアルタイムＰＣＲ反応に必要な試薬と組み合わせることができる。これらの試薬は、少なくとも１種のＰＣＲ反応に好ましく、本発明の方法で生成された少なくとも１つのｃＤＮＡを検出することを可能にする。
【００８３】
さらに、キットは、任意選択的なランダムプライマーおよび単一または多重ＰＣＲ反応および／またはリアルタイム単一または多重ＰＣＲ反応においてさらなる標的遺伝子を検出するための任意選択的な１つまたは複数のプライマーまたはプライマー／プローブを含むことができる。
【００８４】
本発明の方法、反応混合物、またはキットは、さらなる標的特異的プライマーを含むことができる。標的特異的プライマーの長さを、ＰＣＲ反応において特異的検出が可能なように選択すべきであり、標的プライマー配列は、生成されたｃＤＮＡ配列中のたった１つのスポットへの結合が可能なように特異的であるべきである。通常、かかるプライマーは、１５〜３０ヌクレオチド長、好ましくは１７〜２５ヌクレオチド長である。
【００８５】
特に好ましい実施態様では、反応混合物は、二酵素プレミックスとしてポリアデニル化活性を有する酵素および逆転写酵素活性を有する酵素を含む。この特に好ましい実施態様では、キットは、反応容器中および個別の容器中に、二酵素プレミックス−反応混合物、緩衝液、Ｍｇ２＋、ｒＮＴＰ（ｓ）、ｄＮＴＰ（ｓ）、任意選択的に１つの本発明に係るアンカーオリゴヌクレオチド、および任意選択的にランダムプライマー、ならびに、さらに、任意選択的に体積排除試薬および／または競合物質−核酸を含む。
【００８６】
本発明の方法は、上記で既に説明されているように、１または複数の温度工程中で起こり得る。好ましい実施態様では、本発明の方法は、インキュベーションのための単一の温度工程および酵素失活のための他の温度工程で起こる。したがって、酵素活性が起こるインキュベーション工程の好ましい実施態様では、温度は約３７℃である。インキュベーション時間は、約１〜１２０分、好ましくは５〜９０分、より好ましくは１０〜７５分、さらにより好ましくは１５〜６０分、さらにより好ましくは２０〜６０分、最も好ましくは５０〜７０分である。通常、過度のインキュベーション時間は有害ではない。酵素変性を使用する別の工程では、少なくとも６５℃の温度を使用するが、最大で１００℃である。好ましくは、約８０〜９５℃の温度を使用する。変性は、少なくとも１分間の期間実施するが、最大で３０分間実施する。好ましい実施態様では、５分間変性させる。
【００８７】
本発明のｃＤＮＡを生成するための方法は、その後にポリメラーゼ連鎖反応を含むことができる。この場合、ｃＤＮＡ合成中に導入されるテールに特異的なプライマーおよび／または特異的プライマーを、本発明の反応混合物へ添加することが好ましい。次いで、反応混合物はまた、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む。
【００８８】
その後に起こるＰＣＲ反応はまた、定量的ＰＣＲ反応であり得る。ＰＣＲ反応は、アレイで起こり得るか、微小流体系で起こり得るか、キャピラリーで起こり得るか、またはその他にリアルタイムＰＣＲであり得る。ＰＣＲの他の変形が当業者に公知であり、本発明の方法に同様に含まれる。
【００８９】
本発明はまた、ＤＮＡ中のＲＮＡの逆転写方法であって、以下：ＲＮＡを含む試料を準備する工程、逆転写酵素活性を有する第１の酵素、緩衝液、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチド、オリゴヌクレオチドを添加する工程、酵素が活性を示すように選択され、それにより、反応物がさらなるポリ−（Ｃ）−ポリヌクレオチドを含む１または複数の温度工程で作用物質をインキュベートする工程を含む方法に関する。
【００９０】
好ましくは、逆転写酵素活性を有する酵素は、ＨＩＶ逆転写酵素、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、ＥＡＩＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、高度好熱菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｍ−ＭＬＶ  ＲＮアーゼ  Ｈ−スーパースクリプト、スーパースクリプト  ＩＩ、スーパースクリプト  ＩＩＩ、モンスタースクリプト（エピセンター）、オムニスクリプト逆転写酵素（キアゲン）、センシスクリプト逆転写酵素（キアゲン）、サーモスクリプト、サーモ−Ｘ（共にインビトロジェン）、または逆転写酵素活性を有する２以上の酵素と大腸菌由来のポリ−（Ａ）−ポリメラーゼとの混合物である。ＨＩＶ逆転写酵素が特に好ましい。
【００９１】
反応物は、好ましくは、ポリ−（Ｃ）−ポリリボヌクレオチドを含む。それぞれ２０μｌについて１ｎｇ〜３００ｎｇのポリ−（Ｃ）−ポリリボヌクレオチドを含み、好ましくはそれぞれ２０μｌの反応物について１０ｎｇ〜１５０ｎｇのポリ−（Ｃ）−ポリリボヌクレオチドを含み、特に好ましくは各反応物について２５ｎｇ〜１００ｎｇのポリ−（Ｃ）−ポリリボヌクレオチドを含み、最も好ましくはそれぞれ２０μｌの反応物について５０ｎｇ〜７５ｎｇのポリ−（Ｃ）−ポリリボヌクレオチドを含む。
【００９２】
本発明の好ましい実施態様では、試料は、一般に原核生物リボ核酸、真核生物リボ核酸、ウイルスリボ核酸、古細菌を起源とするリボ核酸、ミクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）、小核小体リボ核酸（ｓｎｏＲＮＡ）、メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）、転移リボ核酸（ｔＲＮＡ）、非ポリアデニル化リボ核酸、およびリボゾームリボ核酸（ｒＲＮＡ）を含む群から選択されるリボ核酸、さらに、２以上の上記リボ核酸の混合物である。試料中に、勿論、ポリ−Ａ  ＲＮＡを事前に含めることもできる。
【００９３】
テンプレートとして、真核生物リボ核酸、ｍＲＮＡ、原核生物リボ核酸、ｍｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、およびｒＲＮＡを含む群から選択されるＲＮＡを使用することができる。本発明の最も好ましい実施態様では、試料は、ｍｉＲＮＡおよびｓｎｏＲＮＡを含む群から選択されるリボ核酸を含む。他の物質と組み合わせた異なる量の異なる種のリボ核酸由来のさらなる混合試料が好ましい。
【００９４】
本発明の方法のこれらの利点に基づいて、本発明者らは、ｍｉＲＮＡを効率的且つ汚染することなく調製および同定することが可能であることを示すことができた。少量のＲＮＡを、一般に、該方法を用いて容易に逆転写することができる。
【００９５】
本発明はまた、逆転写酵素活性を有する酵素およびポリ−（Ｃ）−ポリヌクレオチド、好ましくはポリ−（Ｃ）−ポリリボヌクレオチドを含む逆転写用キットに関する。
【００９６】
１つの実施態様では、試料を逆転写する前にＲＮＡを最初にポリアデニル化する。
【実施例１】
【００９７】
同一反応容器中でのポリ−Ａ反応および逆転写の連携した１段階方法の実行可能性の実証、２２量体ＲＮＡオリゴヌクレオチドの検出効率に及ぼす種々の緩衝液の影響
本実験では、同一反応容器中でのポリ−Ａ反応および逆転写の連携した１段階方法の実行可能性が実証されるべきである。この目的のために、連携した１段階方法を種々の条件下で実施した。これは、一方では、ポリ−（Ａ）−ポリメラーゼを供給した緩衝液であり、他方では、逆転写酵素を供給した緩衝液であった。さらに、ポリ−（Ａ）−ポリメラーゼ緩衝液と逆転写酵素緩衝液との混合物を試験した。コントロールとして、図１Ａと類似の方法で、２段階方法において反応を実施した。
【００９８】
表１に示すように、反応物を合わせた。
【００９９】
【表１】
0005409360.tif 000002
PAP:  ポリＡポリメラーゼ
RT:  逆転写
rATP:  アデノシン 5’−三リン酸
【０１００】
この目的のために、表２に示した試薬を使用した。
【０１０１】
【表２】
0005409360.tif 000003
【０１０２】
それぞれの場合、テンプレートを使用し（１ａ、２ａ、３ａ、４ａ、全てトウモロコシＲＮＡのバックグラウンドにおいて合成ＲＮＡオリゴヌクレオチドを使用）、またはテンプレートを使用しないで（１ｂ、２ｂ、３ｂ、４ｂ、全てテンプレートの代わりに水に添加した）反応を実施した。テンプレートを使用しない反応を、起こり得る非特異性バックグラウンドの発生についてのコントロールとして実施した。検出すべき２２量体ＲＮＡオリゴヌクレオチド配列がトウモロコシ中に存在しないので、トウモロコシＲＮＡをバックグラウンドＲＮＡとして選択した。
【０１０３】
酵素の失活後（表５を参照のこと：９３℃で５分間）、２μｌの各バッチ、１ａ／ｂ〜４ａ／ｂを、リアルタイムＰＣＲのテンプレートとして使用した。表３に示すように、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲキット（カタログ番号２０４１４３）および表４に示すプライマーを使用して、３倍のバッチでリアルタイムＰＣＲの準備を実施した。
【０１０４】
【表３】
0005409360.tif 000004
【０１０５】
【表４】
0005409360.tif 000005
【０１０６】
ユニバーサルテール−プライマーであるＨｕｍ  Ｕｎｉプライマー中に含まれる配列５’−ＡＡＣ  ＧＡＧ  ＡＣＧ  ＡＣＧ  ＡＣＡ  ＧＡＣ−３’は、米国特許出願公開第２００３／０１８６２８８Ａ１号に記載されていた。
【０１０７】
ＰＣＲプロトコールは、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ中に含まれるＨｏｔＳｔａｒＴａｑポリメラーゼの９５℃で１５分間の最初の再活性化およびその後の９４℃で１５秒間、５２℃で３０秒間、および７２℃で３０秒間の４０サイクルからなる（表５を参照のこと）。
【０１０８】
【表５】
0005409360.tif 000006
【０１０９】
蛍光データの収集を、７２℃の伸長工程の間に実施した。反応体積２０μｌにてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＰＣＲ分析を実施した。
【０１１０】
次いで、ＰＣＲ産物を融解曲線分析に供した。後者を、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００リアルタイムＰＣＲ装置にて実施した。
【０１１１】
【表６】
0005409360.tif 000007
【０１１２】
次いで、ＰＣＲ産物の同一性を、アガロースゲル電気泳動を使用して試験した。この目的のために、１０μｌの各ＰＣＲ反応物を、臭化エチジウムで染色した２％アガロースゲル上にロードし、分離した。１００ｂｐラダー（インビトロジェン，カタログ番号１５６２８−０５０）を、サイズ標準として使用した。結果を、図３に示す。
【実施例２】
【０１１３】
同一反応容器中でのポリ−（Ａ）−ポリメラーゼ反応および逆転写の連携した１段階方法の再現性および特異性の実証
【０１１４】
本実験では、ポリ−（Ａ）−ポリメラーゼ反応および逆転写の連携した１段階方法の実行可能性が、同一容器中で再現されるべきである。この目的のために、同一反応容器中でのポリ−（Ａ）−ポリメラーゼ反応および逆転写の１段階方法の効率が、２２量体ＲＮＡオリゴヌクレオチドの検出例で分析された。標準的条件にしたがって使用されるテンプレートのための逆転写反応を、検出特異性のコントロールとして使用した。
【０１１５】
この目的のために、種々の条件下で連携した１段階方法を実施した。後者は、一方では、ポリ−（Ａ）−ポリメラーゼを供給した緩衝液であり、他方では、逆転写酵素を供給した緩衝液であった（表７、８）。
【０１１６】
【表７】
0005409360.tif 000008
【０１１７】
【表８】
0005409360.tif 000009
【０１１８】
さらに、その後のＰＣＲで検出特異性を試験する目的で、標準的な逆転写反応を実施した（上記の表７、８を参照のこと）。ポリ−（Ａ）−ポリメラーゼ反応および逆転写後、試料を分けた。それぞれの場合、Ｕｎｉ  Ｇａｐ  ｄＴプライマーおよび逆転写酵素を、試料の半分に再度添加した（上記表７を参照のこと）。ここでの目的は、Ｕｎｉ  Ｇａｐ  ｄＴプライマーへのＡ−テールの望ましくない接着によって偽陽性シグナルが小程度に産生される可能性を排除することであった。テンプレートとして、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｄｉキット（キアゲン，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，カタログ番号７５１４４）を使用してヒト血液から単離した総ＲＮＡを添加した。
【０１１９】
各反応で使用した成分およびその名称を、表７にまとめており、上記を参照のせよ。検出された２２量体ＲＮＡは、その配列が、ヒトｌｅｕ７ａ  ｍｉＲＮＡ（ＥＭＢＬ  Ａｃｃ番号：ＡＪ４２１７２４）に対応し、白血球などのヒト血球中で発現することができる。しかし、ＲＮＡ単離のために使用されるＲＮｅａｓｙ方法の精製テクノロジーにより、かかる小ＲＮＡは非常に非効率的にしか精製されない。ＲＮｅａｓｙ方法は、ＲＮｅａｓｙカラム（キアゲン  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｄｉ／Ｍａｘｉ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，０６／２００１，ｐ．９）のシリカ膜上の２００塩基超のサイズのＲＮＡの有効な結合のみを確保し、したがって、ｍｉＲＮＡなどの小ＲＮＡの多くが除去される。
【０１２０】
さらに、合成２２量体ＲＮＡを、予想される内因性コピー数よりも明らかに高い濃度で使用した。反応物を、表８に示すように合わせた（上記を参照のこと）。
【０１２１】
この目的（ｅｎｄ）のために、表９に示した試薬を使用した。
【０１２２】
【表９】
0005409360.tif 000010
【０１２３】
酵素の失活後（９３℃で５分間）、バッチを水で１：２に希釈し、２μｌの各バッチ、１ａ／ｂ〜８ａ／ｂを、リアルタイムＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲのテンプレートとして使用した。表９（上記）に示すように、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲキット（カタログ番号２０４１４３）および表１０に示すプライマーを使用して、２倍のバッチでリアルタイムＰＣＲの準備を実施した。
【０１２４】
【表１０】
0005409360.tif 000011
【０１２５】
ユニバーサルテール−プライマーであるＨｕｍ  Ｕｎｉプライマー中に含まれる配列５’−ＡＡＣ  ＧＡＧ  ＡＣＧ  ＡＣＧ  ＡＣＡ  ＧＡＣ−３’は、米国特許出願公開第２００３／０１８６２８８Ａ１号に記載されていた。ＰＣＲプロトコールは、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ中に含まれるＨｏｔＳｔａｒＴａｑポリメラーゼの９５℃で１５分間の最初の再活性化およびその後の９４℃で１５秒間、５２℃で３０秒間、および７２℃で３０秒間の４０サイクルからなる（表１１を参照のこと）。
【０１２６】
【表１１】
0005409360.tif 000012
【０１２７】
蛍光データの収集を、７２℃の伸長工程の間に実施した。反応体積２０μｌにてＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＰＣＲ分析を行い、次いで、融解曲線分析を実施した。
【０１２８】
連携した１段階のポリ−（Ａ）−反応および逆転写は、ポリ−（Ａ）−ポリメラーゼ緩衝液およびＲＴ緩衝液の両方で可能であり、これは、リアルタイムＰＣＲ分析に基づいて明らかである。好ましい緩衝液条件は、本テキスト中にすでに示している（上記を参照のこと）。これらは、異なる緩衝液を使用した場合に得られるＣｔ値が非常に異なることを示す。
【０１２９】
特異性のモニタリングのために実施した標準的な逆転写反応（反応３、６）は、全てポリ−（Ａ）−反応なしで陰性（Ｃｔなし）である。これにより、２２量体ＲＮＡ（１、４、７）または予想される通りに天然に存在するｍｉＲＮＡ（２、５、８）のポリアデニル化を使用せずに、ＰＣＲ増幅のためのテンプレートが存在せず、したがって、シグナルを生成することができない（「Ｃｔなし」）と結論づけることが可能である。
【０１３０】
「ＲＴ二重」バッチでは、おそらく第１の反応におけるＲＴ反応によって検出可能なポリ−（Ａ）テール化ＵｎｉＧａｐ  ｄＴプライマーを作製する目的で、さらなるＲＴ酵素およびＵｎｉ  Ｇａｐ  ｄＴプライマーを最初のインキュベーション後に添加した。これらの全バッチは、Ｃｔを示さなかった、すなわち、望ましくない人工物は検出できない。
【０１３１】
ｃＤＮＡ合成のために使用したプライマーのポリ−（Ａ）−テーリングなどの望ましくない人工物も検出できない。
【実施例３】
【０１３２】
本発明の方法を使用した種々のｍｉＲＮＡの検出
本実験では、一般的な逆転写のポリ−（Ａ）−反応を使用した本発明の方法を使用して合成したｃＤＮＡテンプレート由来のｍｉＲＮＡ特異的ＰＣＲプライマーによっていくつかの標的を検出することができることが実証されるべきである。この目的のために、テンプレートとして２９３  ＲＮＡを使用して方法を実施した。標準的な条件にしたがって使用されるテンプレートのための逆転写反応を、検出の特異性のためのコントロールとして使用した。
【０１３３】
その後のＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲでは、概して、それぞれの場合、特異的プライマーのテールと共にｍｉＲＮＡに対する４つの異なる特異的プライマーの１つを使用した。さらに、ヒトβ−アクチン転写物の３’末端に位置するプライマーを、テール特異的プライマーと共に使用して、ポリ−Ａ反応および逆転写の効率を試験した。
【０１３４】
ポリ−Ａ反応および逆転写（ＰＡＰ＋ＲＴ反応）について、表１６に示すように、表１３からの試薬を共にピペッティングした。
【０１３５】
【表１２】
0005409360.tif 000013
【０１３６】
【表１３】
0005409360.tif 000014
【０１３７】
反応ａ）では２９３ＲＮＡをネガティブコントロール（ｎｅｇコントロール）として添加し、反応ｂ）では水をネガティブコントロールとして添加した。検出特異性のためのコントロールとして、表１４に示した試薬を使用した標準的な逆転写反応を、表１７中のダイアグラムに基づいて準備した。
【０１３８】
【表１４】
0005409360.tif 000015
【０１３９】
【表１５】
0005409360.tif 000016
【０１４０】
反応ｃ）では、２９３ＲＮＡをネガティブコントロール（ｎｅｇコントロール）として添加し、反応ｄ）では水をネガティブコントロールとして添加した。次いで、試料を、３７℃で１時間インキュベートした。反応を停止させるために、反応物を９３℃で５分間インキュベートした；この温度工程によって酵素が失活する。
【０１４１】
酵素の失活後、バッチを水で１：２に希釈し、２μｌの各バッチａ）〜ｄ）を、リアルタイムＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲにおけるテンプレートとして使用した。ＰＣＲのための材料を、表１５に示す。
【０１４２】
【表１６】
0005409360.tif 000017
【０１４３】
１０種の異なる反応バッチをピペッティングした。反応１〜５（表１８）では、それぞれの場合、ｍｉＲＮＡ特異的またはβ−アクチン３’プライマーおよびテールプライマー（Ｈｕｍ  Ｕｎｉ）を使用した。
【０１４４】
【表１７】
0005409360.tif 000018
【０１４５】
反応６〜１０（表１９）では、それぞれの場合、たった１つのプライマー、ｍｉＲＮＡ特異的プライマーまたはテール特異的プライマーのいずれかを使用した。
【０１４６】
反応６〜１０（表１９）では、それぞれの場合、たった１つのプライマー、ｍｉＲＮＡ特異的プライマーまたはテール特異的プライマーのいずれかを使用した。
【０１４７】
【表１８】
0005409360.tif 000019
【０１４８】
プライマーを反応で使用した配列は、表２０から認められ得る。リアルタイムＰＣＲの準備を２倍バッチで実施した。
【０１４９】
【表１９】
0005409360.tif 000020
【０１５０】
ユニバーサルテール−プライマーであるＨｕｍ  Ｕｎｉプライマーに含まれる配列ＡＡＣ  ＧＡＧ  ＡＣＧ  ＡＣＧ  ＡＣＡ  ＧＡＣは、米国特許出願公開第２００３／０１８６２８８Ａ１号に記載されていた。
【０１５１】
ＰＣＲプロトコールは、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ中に含まれるＨｏｔＳｔａｒＴａｑポリメラーゼの９５℃で１５分間の最初の再活性化およびその後の９４℃で１５秒間、５２℃で３０秒間、および７２℃で３０秒間の４０サイクルからなる（表２１を参照のこと）。蛍光データの収集を、７２℃の伸長工程の間に実施した。反応体積２０μｌにてＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７０００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＰＣＲ分析を行い、次いで、融解曲線分析を実施した。
【０１５２】
【表２０】
0005409360.tif 000021
【０１５３】
標準的条件下で実施した逆転写および一例として選択されるβ−アクチン系のための本発明の方法の効率が類似していることが示され、リアルタイムＰＣＲのＣｔ値に類似することが明らかである（図６）。
【０１５４】
標準的条件下で産生されたｃＤＮＡを使用する場合、リアルタイムＰＣＲによって３８を超える非常に高いＣｔ値が得られ、これは、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎを使用して実施したリアルタイムＰＣＲにおける非常に良好な検出特異性を意味する（図６）。ＰＣＲ産物のアガロースゲル分析では、予想される値のＰＣＲ産物が検出されるか（図８）、または標準的条件下で産生されたｃＤＮＡを使用した場合に産物が検出されなかった。
【０１５５】
ｍｉＲ２４産物は、獲得（ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ）を示す。ここで、標準的条件下で産生したｃＤＮＡを使用する場合、誤ったサイズのＰＣＲ産物が産生される（図８、図６も参照のこと）。ｃＤＮＡを使用してすぐにはこの産物を検出することはできず、本発明の方法を使用して産生された（図８）。
【０１５６】
本発明の逆転写または方法でＲＮＡテンプレートの代わりに水を使用した全てのコントロール反応は、シグナルを示さない、すなわち、問題のあるリアルタイムＰＣＲでのＣｔ値が得られなかった（図７の上の部分）。たった１つのプライマーを使用した反応にも同じことが適用される（図７の上の部分）。また、ＰＣＲにおいてｃＤＮＡの代わりに水を使用したネガティブコントロールについてはＣｔ値は得られなかった（図７）。
【実施例４】
【０１５７】
ポリ−Ａ反応および逆転写の連携した１段階方法を使用したmiRNAの検出およびテール特異的プローブを使用してリアルタイムＰＣＲで生成したｃＤＮＡのその後の検出
本実験では、テール−プライマー（Ｕｎｉ  Ｇａｐ  ｄＴ）上に特異的結合部位を有するＴａｑｍａｎプローブを使用したリアルタイムＰＣＲを実施した。プローブを介した検出は、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎリアルタイムＰＣＲを介した検出の考えられる代替方法である。プローブの使用により、多重ＰＣＲ、すなわち共増幅のさらなる可能性、または１つもしくは複数の例えばハウスキーピング遺伝子などであり得る内部コントロールなどのさらなる標的核酸を提供する。
【０１５８】
ポリ−Ａ反応および逆転写（ＰＡＰ＋ＲＴ反応）のために、表２４に示すように、表２２からの試薬を共にピペッティングした。
【０１５９】
【表２１】
0005409360.tif 000022
【０１６０】
【表２２】
0005409360.tif 000023
【０１６１】
次いで、反応バッチを３７℃でインキュベートし、その後に酵素を９３℃で５分間失活させた。
【０１６２】
酵素の失活後、２μｌ非希釈バッチを、リアルタイムＰＣＲのテンプレートとして使用し、検出用のＴａｑｍａｎプローブを含めた。ＰＣＲのための材料を表２３に示し、表２５に示すように共にピペッティングした。
【０１６３】
【表２３】
0005409360.tif 000024
【０１６４】
【表２４】
0005409360.tif 000025
【０１６５】
リアルタイムＰＣＲのバッチを、２倍バッチで実施した。
【０１６６】
ユニバーサルテール−プライマーであるＨｕｍ  Ｕｎｉプライマー中に存在する配列ＡＡＣ  ＧＡＧ  ＡＣＧ  ＡＣＧ  ＡＣＡ  ＧＡＣは、米国特許出願公開第２００３／０１８６２８８Ａ１号に記載されていた。ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子座中のＴａｑｍａｎプローブ配列を除去した；それは、米国特許出願公開第２００３／０１８６２８８Ａ１号に含まれていない。
【０１６７】
ＰＣＲプロトコールは、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔプローブＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ中に含まれるＨｏｔＳｔａｒＴａｑポリメラーゼの９５℃で１５分間の最初の再活性化およびその後の９４℃で１５秒間および５２℃で３０秒間の４５サイクルからなる（表２６を参照のこと）。
【０１６８】
【表２５】
0005409360.tif 000026
【０１６９】
蛍光データの収集を、５２℃の伸長工程中に実施した。反応体積２０μｌにて７７００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＰＣＲ分析を実施した。ＰＣＲの結果を、表２７に示す。
【０１７０】
【表２６】
0005409360.tif 000027
【０１７１】
テール特異的プローブを使用した検出が可能であり、予想される結果が得られる。
【実施例５】
【０１７２】
ポリ−Ａ反応および逆転写の連携した１段階方法におけるポリ−Ａ−ポリメラーゼの濃度およびインキュベーション時間の影響
本試験では、２つの濃度のポリ−Ａ−ポリメラーゼ（２Ｕまたは０．５Ｕ）を、本発明の方法においてそれぞれ１５分間または１時間で使用した。全条件を、それぞれの場合、ＲＴ緩衝液（キアゲン）およびポリ−Ａ−ポリメラーゼ緩衝液で試験した。
【０１７３】
ポリ−Ａ反応および逆転写（ＰＡＰ＋ＲＴ反応）について、表３０に示すように、表２８の試薬を共にピペッティングした；反応ａ）２Ｕのポリ−Ａ−ポリメラーゼ、反応ｂ）０．５Ｕのポリ−Ａ−ポリメラーゼ）。
【０１７４】
【表２７】
0005409360.tif 000028
【０１７５】
【表２８】
0005409360.tif 000029
【０１７６】
次いで、試料を、３７℃でインキュベートした（１．１時間／２．１５分間）。次いで、反応物を９３℃で５分間加熱し、それにより、酵素が失活した。
【０１７７】
次いで、それぞれの場合、２μｌを、各反応物についてＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲに希釈しないで含めた。反応物を、それぞれ２回試験した。この目的のために、表２９の試薬を、表３１に示すように共にピペッティングし、次いで、表３２に示すようにＰＣＲを実施した。
【０１７８】
【表２９】
0005409360.tif 000030
【０１７９】
【表３０】
0005409360.tif 000031
【０１８０】
【表３１】
0005409360.tif 000032
【０１８１】
ＰＣＲプロトコールは、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ中に含まれるＨｏｔＳｔａｒＴａｑポリメラーゼの９５℃で１５分間の最初の再活性化、その後の９４℃で１５秒間、５２℃で３０秒間、および７２℃で３０秒間の４０サイクルからなる（上記の表３２を参照のこと）。蛍光データの収集を、７２℃の伸長工程の間に実施した。反応体積２０μｌにてＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７０００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＰＣＲ分析を行い、次いで、融解曲線分析実施した。
【０１８２】
ポリ−Ａ反応および逆転写の１段階方法の効率がポリ−Ａ−ポリメラーゼの濃度およびインキュベーション時間の両方に依存することが認められうる（図９を参照のこと）。
【実施例６】
【０１８３】
種々の逆転写酵素を使用した本発明の方法の実施
緩衝液ＲＴ（キアゲン）中（反応１〜５）、さらに、比較の目的で、それぞれの場合、逆転写酵素を供給した緩衝液中（反応６〜９）にて全部で５種の異なる逆転写酵素（表３５を参照のこと）を本発明の方法に適用した。
【０１８４】
【表３２】
0005409360.tif 000033
【０１８５】
ポリ−Ａ反応および逆転写（ＰＡＰ＋ＲＴ反応）の１段階方法のために、表３３の試薬を、反応１〜５（反応緩衝液：緩衝液ＲＴ（キアゲン）については表３６に示すように共にピペッティングし、反応６〜９（供給すべき緩衝液のそれぞれの場合におけるさらなる逆転写酵素）については表３７に示すように共にピペッティングした。
【０１８６】
【表３３】
0005409360.tif 000034
【０１８７】
【表３４】
0005409360.tif 000035
【０１８８】
【表３５】
0005409360.tif 000036
【０１８９】
次いで、試料を、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、反応物を９３℃で５分間加熱し、それにより、酵素が失活した。
【０１９０】
次いで、それぞれの場合、２μｌを、各反応物についてＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲに含めた。反応物を、それぞれ２回試験した。この目的のために、表３４の試薬を、表３８に示すように共にピペッティングし、表３９に示すようにＰＣＲを実施した。
【０１９１】
【表３６】
0005409360.tif 000037
【０１９２】
【表３７】
0005409360.tif 000038
【０１９３】
【表３８】
0005409360.tif 000039
【０１９４】
ＰＣＲプロトコールは、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ中に含まれるＨｏｔＳｔａｒＴａｑポリメラーゼの９５℃で１５分間の最初の再活性化、その後の９４℃で１５秒間、５２℃で３０秒間、および７２℃で３０秒間の４０サイクルからなる（表３９を参照のこと）。蛍光データの収集を、７２℃の伸長工程の間に実施した。反応体積２０μｌにてＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７０００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＰＣＲ分析を実施し、次いで、融解曲線分析を実施した。
【０１９５】
逆転写酵素の使用量を、標準的な逆転写反応のために至適化し、認められるＣｔ値の相違を説明できる可能性が高い。
【実施例７】
【０１９６】
同一反応容器中でのポリ−Ａ反応、逆転写、およびＰＣＲの連携した３段階方法の実行可能性の実証；２２量体ＲＮＡオリゴヌクレオチドの検出効率への種々の添加物の影響
本実験では、同一反応容器中でのポリ−（Ａ）−ポリメラーゼ反応、逆転写、およびＰＣＲの連携した３段階方法の実行可能性が実証されるべきである。この目的のために、連携した３段階方法を、以下の条件下にて示されるバッチで実施した。
【０１９７】
コントロールとして、図１Ｂに基づいた２段階方法で反応を実施した。
【０１９８】
ポリ−Ａ反応、逆転写、およびＰＣＲの３段階方法（ＰＡＰ＋ＲＴ反応＋ＰＣＲ）について、表４０の材料を表４１に示すように合わせた。
【０１９９】
【表３９】
0005409360.tif 000040
【０２００】
【表４０】
0005409360.tif 000041
【０２０１】
反応物を、それぞれ３回試験した。この目的のために、表４０の試薬を表４１に示すように共にピペッティングし、表４２に示すように反応を実施した。
【０２０２】
【表４１】
0005409360.tif 000042
【０２０３】
反応プロトコールは、最初に、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ逆転写酵素Ｍｉｘ（３７℃で４５分間および５０℃で１５分間）を使用した逆転写とポリ−Ａポリメラーゼ反応との組み合わせ反応のための条件からなっていた。この後に、ポリ−Ａ−ポリメラーゼおよび逆転写酵素を失活させ、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ中に含まれるＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを活性化するために９５℃で１５分間インキュベートした。４５回のＰＣＲサイクル後に９４℃で１５秒間および５２℃で３０秒間（表４３を参照のこと）を実施して、リアルタイムＰＣＲで生成されたｌｅｔ７ａ−ｃＤＮＡを増幅した。検出のために、Ｕｎｉ  Ｇａｐ  ｄＴプライマーの５’−テールに特異的な蛍光標識プローブを使用した。５２℃アニーリング／伸長工程中に蛍光データの収集を実施した。反応体積２０μｌにてＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により「３−イン−１」反応を実施した。
【０２０４】
図１４に示すように、「３−イン−１」反応により、トウモロコシＲＮＡのバックグラウンド中の合成２２量体ＲＮＡオリゴヌクレオチドの特異的検出が可能である。トウモロコシＲＮＡのバックグラウンド中の合成２２量体ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む試料から２０．６１のＣｔ値が得られ、トウモロコシＲＮＡとのコントロール反応によって３０９．６５のＣｔ値を得た。この実験は、「３−イン−１」反応が所与の条件下で技術的に使用することができることを示す。
【実施例８】
【０２０５】
連携した３段階方法の反応を促進するためにマニュアルＰＣＲプライマーである“Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔｓ”を使用した本発明の“３−イン−１”方法の実施
コントロールとして、図１Ｂに基づいて２段階方法で反応を実施した。
【０２０６】
反応物を、表４４に示すように表４３に示した材料と合わせた。
【０２０７】
【表４２】
0005409360.tif 000043
【０２０８】
【表４３】
0005409360.tif 000044
【０２０９】
表４５のＰＣＲプライマーを使用して、プライマー混合物を作製し、それぞれ１つの反応についての必要量を、それぞれの場合、オプティカルキャップ（ｏｐｔｉｃａｌ  ｃａｐ）のカバー（リアルタイムＰＣＲ容器のためのカバー、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；材料番号４３２３０３２）内へピペッティングする。次いで、カバーを、３７℃で約２０分間の加熱ブロックにて液体が蒸発するまでインキュベートし、プライマーを乾燥した。
【０２１０】
カバー中でのＰＣＲプライマーの完全な乾燥後、表４４にあるように試薬を共にピペッティングし、オプティカルチューブ（Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｔｕｂｅｓ）（リアルタイムＰＣＲ容器、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；材料番号４３１６５６７）中に添加し、前処理したオプティカルキャップでシールし、表４７に示すようにＰＣＲを実施する。
【０２１１】
反応物を、それぞれ３回試験した。
【０２１２】
【表４４】
0005409360.tif 000045
【０２１３】
【表４５】
0005409360.tif 000046
【０２１４】
反応プロトコールは、最初に、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ逆転写酵素Ｍｉｘ（３７℃で４５分間および５０℃で１５分間）を使用した逆転写とポリ−Ａポリメラーゼ反応との組み合わせ反応のための条件からなっていた。次いで、ポリ−Ａ−ポリメラーゼおよび逆転写酵素を失活させるために、反応物を９５℃で３分間加熱した。次いで、カバー中に存在する乾燥プライマーを再溶解するためにＰＣＲチューブをデバイスから即座に取り出して反転させ、その後のＰＣＲ反応で利用可能にした。この後に９５℃で１２分間インキュベートしてＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ中に含まれるＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを活性化した。ポリ−Ａ−ポリメラーゼおよび逆転写酵素を失活する前に反応混合物を既に９５℃で３分間加熱しているので、３分間短い活性化ここで選択した。４５回のＰＣＲサイクルが９４℃で１５秒間および５２℃で３０秒間（表４７を参照のこと）で続き、リアルタイムＰＣＲで生成されたｌｅｔ７ａ−ｃＤＮＡを増幅した。検出のために、Ｕｎｉ  Ｇａｐ  ｄＴプライマーの５’−テールに特異的な蛍光標識プローブを使用した。５２℃アニーリング／伸長工程中に蛍光データの収集を実施した。反応体積２０μｌにてＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して「３−イン−１」反応を実施した。
【図１】
0005409360.tif 000047
【図２】
0005409360.tif 000048
【図３】
0005409360.tif 000049
【図４】
0005409360.tif 000050
【図５】
0005409360.tif 000051
【図６】
0005409360.tif 000052
【図７】
0005409360.tif 000053
【図８】
0005409360.tif 000054
【図９】
0005409360.tif 000055
【図１０】
0005409360.tif 000056
【図１１】
0005409360.tif 000057
【図１２−１】
0005409360.tif 000058
【図１２−２】
0005409360.tif 000059
【図１３】
0005409360.tif 000060
【図１４】
0005409360.tif 000061
【図１５】
0005409360.tif 000062
【図１６】
0005409360.tif 000063
【図１７】
0005409360.tif 000064
【図１８】
0005409360.tif 000065
【図１９】
0005409360.tif 000066
【図２０】
0005409360.tif 000067
【図２１】
0005409360.tif 000068
【図２２】
0005409360.tif 000069
【図２３】
0005409360.tif 000070
【配列表】
0005409360000001.xml