(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコアミラーゼ及びアルファ・アミラーゼを含む、デンプンを糖化するための組成物であって、前記アルファ・アミラーゼが、配列番号２で示すアミノ酸配列を有する、バチルス・ズブチリス・アルファ・アミラーゼ（ＡｍｙＥ）変異体（ＡｍｙＥ−ｔｒ）である、前記組成物。
【請求項２】
フィターゼ、プルラナーゼ、ベータ・アミラーゼ、菌性アルファ・アミラーゼ、プロテアーゼ、セルロース、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、イソアミラーゼまたはそれらの任意の組み合わせをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
デンプンを糖化するのに十分な時間で請求項１に記載の組成物を混合する工程を含む、デンプンの加工方法。
【請求項４】
フルクトース高含有コーンシロップを生産する工程をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
グルコースイソメラーゼの混合により、フルクトース高含有コーンシロップの生産が達成される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
エタノールを生産するためにデンプンを発酵する工程をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
糖化と発酵が同時に行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
エタノールを回収する工程をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
エタノールを得るために発酵された液化マッシュを蒸留する工程であって、発酵及び蒸留が、同時に、別途または連続して行なわれる、前記工程をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
グルコアミラーゼ及びアルファ・アミラーゼをオリゴ糖またはデンプン基質と混合する工程であって、前記アルファ・アミラーゼが、配列番号２で示すアミノ酸配列を有する、バチルス・ズブチリス・アルファ・アミラーゼ（ＡｍｙＥ）変異体（ＡｍｙＥ−ｔｒ）である、前記工程を含む、デンプンの糖化方法。
【請求項１１】
前記グルコアミラーゼは、乾燥固形物のグラム当たりのグルコアミラーゼ単位（ＧＡＵ／ｇ  ｄｓ）が０．１１以下の量で用いられる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
フィターゼ、プルラナーゼ、ベータ・アミラーゼ、菌性アルファ・アミラーゼ、プロテアーゼ、セルロース、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、イソアミラーゼまたはそれらの任意の組み合わせをオリゴ糖またはデンプン基質と混合する工程をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
フルクトース高含有コーンシロップを生産する工程をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
グルコースイソメラーゼの混合により、フルクトース高含有コーンシロップの生産が達成される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
エタノールを生産するためにデンプンを発酵させる工程をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
糖化と発酵が、同時に行われる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
エタノールを回収する工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
エタノールを得るために発酵された液化マッシュを蒸留する工程であって、発酵及び蒸留が、同時に、別途または連続して行なわれる、前記工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２００８年６月６日に出願された米国仮特許出願シリアル番号６１／０５９，５３５及び２００９年４月１日に出願された米国仮特許出願シリアル番号６１／１６５，８５６の優先権を主張する。両出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列リスト
配列番号１−３４を含む配列リストを添付する。これらは参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本発明の技術分野
例えば、グルコアミラーゼ及びバチルス・ズブチリス・アルファ・アミラーゼ（ＡｍｙＥ）またはその変異体を含む組成物は、例えば、デンプン基質からの発酵性糖の生産に有用である。例えば、デンプンからエタノールを生産するためのグルコアミラーゼ及びＡｍｙＥまたはその変異体を用いる方法も開示される。
【背景技術】
【０００４】
背景
野菜デンプン、例えば、コーンスターチは、シロップ及びバイオ燃料のような製品の産業生産で広く用いられる。例えば、フルクトース高含有コーンシロップ（ＨＦＣＳ）は、高いフルクトース含量と、砂糖に匹敵する甘みをもつコーンシロップの加工品であり、ＨＦＣＳはそのためソフトドリンクや他の加工食品において砂糖の代替品として有用である。ＨＦＣＳは現在、１０億ドル規模の産業となっている。同様に、野菜デンプンに由来するエタノールの生産は、急速に拡大する産業である。エタノールは、産業化学薬品、ガソリン添加物または液体燃料として広範囲の適用をそれ自身有している。燃料または燃料添加物としてのエタノールの使用は、エンジン性能を維持するか、さらに改良する一方、大気放出を著しく削減する。他方では、エタノールは再生可能な原料であるため、その使用は、有限である化石燃料源への依存を減らすことが出来る。さらに、エタノールの使用は、空気中の二酸化炭素の正味蓄積を減少させることが出来る。
【０００５】
シロップ剤及びバイオ燃料は、グルコースへのデンプンの分解を触媒する酵素過程によりデンプンから生産することが出来る。この酵素過程は通常、酵素触媒反応の連続に関与する。
【０００６】
（１）液化：アルファ・アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１）は、最初に３０−４０％ｗ／ｗの乾燥固形物（ｄｓ）を含むデンプン懸濁液をマルトースデキストランへ分解する触媒を行う。アルファ・アミラーゼは、内部α−１，４−Ｄ−グルコシド結合の無作為な切断を触媒するエンドヒドロラーゼである。液化は通常、高温、例えば、約９０−１００℃で行われるので、熱に安定なアルファ・アミラーゼ、例えば、バシラス種由来のアルファ・アミラーゼが、この過程に適する。この工程に現在用いられるアルファ・アミラーゼ、例えば、Ｂ．リケニフォルミス（ＡｍｙＬ）、Ｂ．アミロリケファシエンス及びゲオバシルス・ステアロサーモフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ＡｍｙＳ）に由来するアルファ・アミラーゼは、多量のグルコースを生産しない。代わりに、得られた液化物（ｌｉｑｕｅｆａｃｔ）は低いデキストロース当量（ＤＥ）を有し、マルトース及び高い重合度（ＤＰｎ）の糖質を含む。
【０００７】
（２）糖化：グルコアミラーゼ及び／またはマルトース生産性（ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ）アルファ・アミラーゼは、液化の後に生成されたマルトデキストランの非還元末端の加水分解を触媒し、Ｄ−グルコース、マルトース及びイソマルトースを遊離する。糖化は、グルコース高含有シロップまたはマルトース高含有シロップのいずれかを生産する。従来、グルコアミラーゼは通常、高温、例えば、６０℃、ｐＨ４．３の酸性条件下で糖化を触媒する。この過程で使用されるグルコアミラーゼは通常、菌類、例えば、Ｏｐｔｉｄｅｘ（商標登録）Ｌ４００で使用されるアスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼまたはフミコラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ）グルコアミラーゼから得られる。脱分岐酵素、例えば、プルラナーゼは糖化を促進出来る。
【０００８】
マルトース生産性アルファ・アミラーゼは、マルトース高含有シロップ剤を生成するための糖化を代わりに触媒することが出来る。マルトース生産性アルファ・アミラーゼは通常、グルコアミラーゼより高い最適ｐＨ及びより低い最適温度を有する。また、マルトース生産性アミラーゼは通常、Ｃａ２＋を必要とする。この適用に現在用いられるマルトース生産性アルファ・アミラーゼは、Ｂ．ズブチリス・アルファ・アミラーゼ、植物アミラーゼ及びアスペルギルス・オリゼに由来するアルファ・アミラーゼであって、Ｃｌａｒａｓｅ（登録商標）Ｌの有効成分であるアルファ・アミラーゼを含む。多様な製品の生産に用いられる模範的な糖化反応を下記に示す。
【式１】
【０００９】
0005599113.tif 000002
（３）その他の過程：
前記過程での分岐点が、上記の反応経路の左側に示すグルコース高含有シロップの生成の後に生じる。最終目的生成物がバイオ燃料である場合、酵母により、グルコース高含有シロップをエタノールへ発酵させることが出来る。他方では、最終目的生成物がフルクトース高含有シロップである場合、グルコースイソメラーゼによりグルコース高含有シロップのフルクトースへの転化を触媒させることが出来る。
【００１０】
糖化は、グルコース高含有シロップの生産において律速段階である。糖化は通常、４８−７２時間にわたり起こり、その時間までに多くの菌類のグルコアミラーゼは相当の活性を失う。さらに、それは、８５％から９６％に増加するためのグルコース生産の糖化時間の大部分、例えば、７０％以上を必要とする。これは、主にグルコアミラーゼによる低分子量オリゴ糖の非能率的な加水分解による。従って、グルコース生産の最大化は、グルコアミラーゼの比較的多い供給量及び／またはより長い糖化時間を必要とするだろう。さらに、マルトース生産性アルファ・アミラーゼとグルコアミラーゼの両方は、糖化を触媒するために使用出来るが、上記のように、これらの酵素は通常、異なる最適ｐＨと温度で機能する。両方の酵素が連続して用いられる場合、前記二酵素間の反応条件の違いは、ｐＨと温度を調整することを必要とする。これは、全反応工程を遅くし、不溶性アミロース凝集物の形成の増加を引き起こし得る。
【００１１】
従って、当該技術分野で工業製品を構成する改良されたデンプン加工方法の必要性がある。糖化工程における効率の改良の必要性が特にある。
【発明の概要】
【００１２】
デンプン加工は、甘味料の生産、燃料または飲料（すなわち、飲用アルコール）のためのアルコールの生産、飲料の生産、甘蔗糖の生産、または、例えば、クエン酸、イタコン酸、乳酸、グルコン酸、ケトン、アミノ酸、抗生物質、酵素、ビタミン及びホルモン等の所望の有機化合物の生産に有用である。デンプン処理を促進するために、バチルス・ズブチリス（ＡｍｙＥ）に由来するアルファ・アミラーゼが提供される。ＡｍｙＥは、バチルス・リケニフォルミス及びバチルス・ステロサーモフィラスに由来するアルファ・アミラーゼのような、ターマミル（Ｔｅｒｍａｍｙｌ）様アルファ・アミラーゼとは異なる特性を示す。ＡｍｙＥは、従来認識されていなかったトランスグルコシダーゼ活性を有しており、マルトースからマルトトリオースを合成することが出来る。加えて、ＡｍｙＥは、マルトース、高ＤＰ基質またはさらに非加熱の顆粒デンプンをグルコースへ加水分解することが出来る。糖化にＡｍｙＥまたはその変異体及びグルコアミラーゼを加えることにより、特に、より多い量の発酵性糖及び減少した量のより高級な糖が得られる。グルコアミラーゼの供給量は、ＡｍｙＥが補給された糖化では著しく減少される。加えて、ＡｍｙＥまたはその変異体は、トリコデルマ・リーセイ・グルコアミラーゼで触媒された同時糖化発酵において、「グルコースサージ（ｇｌｕｃｏｓｅ  ｓｕｒｇｅ）」を軽減することが出来る。さらに、糖化におけるＡｍｙＥまたはその変異体の使用は、例えば、デンプンからのフルクトース高含有コーンシロップ（ＨＦＣＳ）またはエタノールの生産を顕著に改良する。
【００１３】
本発明に係る開示は、グルコアミラーゼ及びアルファ・アミラーゼを含むデンプンを糖化するための組成物を提供する。アルファ・アミラーゼは、配列番号１のアミノ酸配列を有するＡｍｙＥと少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％または約９８％の同一性があるアミノ酸配列を有するバチルス・ズブチリス・アルファ・アミラーゼ（ＡｍｙＥ）またはＡｍｙＥ変異体である。一の側面において、アルファ・アミラーゼは、配列番号１のアミノ酸配列を有するＡｍｙＥと同様のレベルのトランスグルコシダーゼ活性を有することが出来る。別の側面において、ＡｍｙＥは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３または配列番号３４で示すアミノ酸配列を含むことが出来る。別の側面において、アルファ・アミラーゼは、配列番号１のアミノ酸配列を有するＡｍｙＥ酵素と比べ、一以上の改変された特性を有し得るＡｍｙＥ変異体とすることが出来る。前記改変された特性は、基質特異性、基質結合性、基質切断パターン、熱安定性、ｐＨ／活性プロファイル、ｐＨ／安定性プロファイル、酸化への安定性、カルシウムイオンのより少ない量での安定性、比活性度またはそれらの任意の組み合わせとすることが出来る。前記組成物は、フィターゼ、プルラナーゼ、ベータ・アミラーゼ、菌性アルファ・アミラーゼ、プロテアーゼ、セルロース、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ及び／またはイソアミラーゼをさらに含むことが出来る。さらに、本開示の組成物を混合する工程を含むデンプンを加工する方法も開示される。一の側面において、前記組成物は、約６．０から約８．０のｐＨ、例えば、ｐＨ７．５でグルコースイソメラーゼをさらに混合することによる、フルクトース高含有コーンシロップを生産するために用いられることが出来る。別の側面において、前記組成物は、エタノールを生産するために用いられることが出来る。エタノール生産のために、糖化及び発酵は同時に行われることが出来る。生産されたエタノールは、回収されることが出来る。エタノール生産は、エタノールを蒸留する工程をさらに含むことが出来る。発酵と蒸留は、同時に、別途または連続して行なわれることが出来る。
【００１４】
別の側面において、本発明に係る開示は、デンプンを糖化するために十分な時間、グルコアミラーゼ及びアルファ・アミラーゼを加えることを含むデンプンの加工方法を提供する。アルファ・アミラーゼは、配列番号１のアミノ酸配列を有するＡｍｙＥと少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％または約９８％の同一性があるアミノ酸配列を有するバチルス・ズブチリス・アルファ・アミラーゼ（ＡｍｙＥ）またはＡｍｙＥ変異体である。別の側面において、ＡｍｙＥは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３または配列番号３４で示すアミノ酸配列を含むことが出来る。別の側面において、アルファ・アミラーゼは、配列番号１のアミノ酸配列を有するＡｍｙＥ酵素と比べ、一以上の改変された特性を有し得るＡｍｙＥ変異体とすることが出来る。前記改変された特性は、基質特異性、基質結合性、基質切断パターン、熱安定性、ｐＨ／活性プロファイル、ｐＨ／安定性プロファイル、酸化への安定性、カルシウムイオンのより少ない量での安定性、比活性度またはそれらの任意の組み合わせとすることが出来る。グルコアミラーゼは、グラム乾燥固形物当たりのグルコアミラーゼ単位（ＧＡＵ／ｇ  ｄｓ）が約０．２２、約０．１９、約０．１７、約０．１５、約０．１３または約０．１１以下の量で使用されることが出来る。別の側面において、前記方法は、デンプン基質と、フィターゼ、プルラナーゼ、ベータ・アミラーゼ、菌性アルファ・アミラーゼ、プロテアーゼ、セルロース、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ及び／またはイソアミラーゼとを接触させる工程をさらに含むことが出来る。さらに別の側面において、前記デンプンの糖化方法は、フルクトース高含有コーンシロップ（ＨＦＣＳ）を生産する工程をさらに含むことが出来る。フルクトース高含有コーンシロップの生産は、約６．０から約８．０のｐＨ、例えば、ｐＨ７．５でグルコースイソメラーゼをさらに混合することにより達成されることが出来る。一の実施態様において、その生産物は、約４０−４５％のフルクトースを含む。別の側面において、前記デンプンの糖化方法は、エタノールを生産するために糖化されたデンプンを発酵させる工程をさらに含むことが出来る。前記糖化及び発酵は、エタノール生産
のために同時に行われることが出来る。さらに、前記エタノールを回収する工程をさらに含む方法が提供される。エタノール生産は、エタノールを蒸留する工程を含むことが出来る。発酵と蒸留は、同時に、別途または連続して行なわれることが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
添付図面は、明細書に組み込まれ、多様な実施態様の非限定的な例証を提供する。図面の説明を下記に示す。
【図１】図１は、（ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス（配列番号２５、ＡｍｙＳ、「Ｂ．ｓｔｅａｒ」）、バチルス・リケニフォルミス（配列番号２６、ＡｍｙＬ、「Ｂ．ｌｉｃｈ」）及びバチルス・ズブチリス（配列番号２７、ＡｍｙＥ、「Ｂ．ｓｕｂ」）に由来する完全なシグナル配列を有する）全長アルファ・アミラーゼのアミノ酸配列アライメントを示す。
【図２】図２は、Ｂ．ズブチリス・アルファ・アミラーゼ（ＡｍｙＥ、プロテインデータバンク登録番号１ＵＡ７）及びＧ．ステアロサーモフィラス・アルファ・アミラーゼ（ＡｍｙＳ、プロテインデータバンク登録番号１ＨＶＸ）間の三次元構造比較を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、Ｇ．ステアロサーモフィラス・アルファ・アミラーゼ（ＡｍｙＳ、プロテインデータバンク登録番号１ＨＶＸ）（灰色の影で示す）及びＢ．リケニフォルミス（ＡｍｙＬ、プロテインデータバンク登録番号１ＢＬＩ）（黒色の影で示す）を重ね合わせた構造を示す。左のパネルは、全般的な比較を示し、右のパネルは選択されたアミノ酸側鎖の拡大表示を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、Ｇ．ステアロサーモフィラス・アルファ・アミラーゼ（ＡｍｙＳ、プロテインデータバンク登録番号１ＨＶＸ）（灰色の影で示す）及びＢ．ズブチリス・アルファ・アミラーゼ（ＡｍｙＥ、プロテインデータバンク登録番号１ＵＡ７）（黒色の影で示す）を重ね合わせた構造の立体視を示す。
【図４】図４は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＡｍｙＥ（「全長ＡｍｙＥ」）と、配列番号３５のアミノ酸配列を有するＡｍｙＥ（成熟「Ａｍｙ３１Ａ」）間の配列アラインメントを示す。アミノ酸配列の差は太字のフォントで示される。残基は、酵素の成熟形の第１のアミノ酸から番号付けする。
【図５】図５は、ＡｍｙＥ−ｔｒ（配列番号２）をコードするポリヌクレオチド（「ＳＡＭＹ  ４２５ａａ」で標識）を含むプラスミドｐＭＥ６３０−７を示す。このプラスミドは、Ｂ．リケニフォルミス・アルファ・アミラーゼに由来するシグナル配列（「ｐｒｅＬＡＴ」で標識）をコードするＳＡＭＹ遺伝子で骨組みされたポリヌクレオチドを含む。
【図６】図６は、マルトースとのインキュベーション中にＡｍｙＥで触媒された反応生成物のＨＰＬＣ解析を示す。
【図７】図７は、ＡｍｙＥを媒介するマルトトリオース合成（グルコース、マルトース及びマルトトリオース）の反応組成物を時間にわたって示す。
【図８】図８は、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス・アルファ・アミラーゼ（ＡｍｙＳ、配列番号４）と比べた、ＡｍｙＥ（「ＡｍｙＥ全長」）、ＡｍｙＥ−ｔｒ（「切断ＡｍｙＥ」）及びＡｍｙ３１ＡによるｐＨ４．５及びｐＨ５．６でのグルコース生成を示す。
【図９】図９は、０時間（上段パネル）及び７２時間（下段パネル）のマルトヘプタオース（ｍａｌｔｏｈｅｐｔａｏｓｅ）（ＤＰ７）とのＡｍｙＥ−ｔｒのインキュベーションに続く、ＨＰＬＣにより検出された分解産物を示す。
【図１０】図１０は、０時間、２時間、４時間及び２４時間（上段から下段までのパネル）のＤＰ７基質とＡｍｙＳとのインキュベーションに続く、ＨＰＬＣにより検出された分解産物を示す。
【図１１】図１１は、０時間、１時間、２時間及び３時間（上段から下段までのパネル）のＤＰ７基質とＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＦＲＥＤ（「Ｆｒｅｄ」）とのインキュベーションに続く、ＨＰＬＣにより検出された分解産物を示す。
【図１２】図１２は、０分間、３０分間及び９０分間（上段から下段までのパネル）の生のコーンフラワースターチとＡｍｙＥ（配列番号１）とのインキュベーションに続く、ＨＰＬＣにより検出された分解産物を示す。
【図１３】図１３は、ｐＨ４．３及びｐＨ５．８の従来の発酵での、ＡｍｙＥ−ｔｒ（「切断ＡｍｙＥ」）及びＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＸＴＲＡアミラーゼ（「ＸＴＲＡ」）によるエタノール生成を示す。
【図１４】図１４は、ｐＨ４．３及びｐＨ５．８で、アスペルギルス・カワチイ（ｋａｗａｃｈｉｉ）・アルファ・アミラーゼ（ＡｋＡＡ）単独またはＡ．カワチイ・アルファ・アミラーゼ及びトリコデルマ・リーセイ・グルコアミラーゼ（ＴｒＧＡ）の混合物とで比べた、全長ＡｍｙＥ（「ＡｍｙＥ  ＦＬ」）及びＡｍｙＥ−ｔｒによるエタノールへの不溶性顆粒（非加熱）デンプンの加水分解を示す。
【図１５】図１５は、ろ液中のヨウ素陽性糖類（ＩＰＳ）の存在を、ＴｒＧＡ単独またはＡｍｙＥが補給されたＴｒＧＡで触媒された糖化での時間にわたって示す。
【図１６】図１６は、ろ液中のヨウ素陽性糖類（ＩＰＳ）の存在を、多様な酵素の組み合わせにより触媒された糖化での時間にわたって示す。５２０ｎｍでの吸光度を、多様な糖化反応時間に対してプロットした。
【図１７】図１７は、多様な酵素の組み合わせにより触媒された糖化での不溶性残留デンプン（ＩＲＳ）の検出を示す。
【図１８】図１８は、（１）ＨＧＡ（フミコーラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ）グルコアミラーゼ）、（２）ＴｒＧＡ（トリコデルマ・リーセイ・グルコアミラーゼ）及び（３）ＡｍｙＥが補給されたＴｒＧＡを用いた、６０分間の糖化反応中のより高級な糖（ＤＰ４＋）の量を示す。
【図１９】図１９は、多様なグルコアミラーゼ及び／またはグルコアミラーゼとＡｍｙＥの多様な組み合わせを加えた発酵中のグルコース量を示す。
【図２０】図２０は、多様なグルコアミラーゼ及び／またはグルコアミラーゼとＡｍｙＥの多様な組み合わせを加えた発酵の後に存在するエタノールの割合（パーセンテージ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明に係る開示は、バチルス・ズブチリス・アルファ・アミラーゼ（ＡｍｙＥ）に関する。ＡｍｙＥまたはその変異体は、より効率的にデンプンから発酵性糖を生産するために用いられることが出来る。さらに、グルコアミラーゼ及び本開示のアルファ・アミラーゼを含む組成物、及び本開示のアルファ・アミラーゼが補給されたグルコアミラーゼを利用するデンプンの加工方法を含めて開示する。
【００１７】
１．定義及び略語
この詳細な説明に従い、以下の略号と定義が使用される。本明細書で用いる単数形冠詞（ａ、ａｎ）及び定冠詞（ｔｈｅ）は、文意より明らかに他の意味に解される場合を除き、その複数の場合を含む。従って、例えば、「酵素（ａｎ  ｅｎｚｙｍｅ）」への言及は複数のそのような酵素を含み、「配合物（ｔｈｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）」への言及は一以上の配合物と、当業者に知られるそれらの同等物への言及を含む。
【００１８】
別途記載のない限り、本明細書で用いる全ての技術及び科学上の用語は、当業者により通常理解されるものと同等の意味を持つ。以下の用語が下記に提供される。
【００１９】
１．１．定義
本明細書で用いる「アミノ酸配列」は、「ポリペプチド」という語及び／または「タンパク質」の語と同義である。いくつかの場合に、「アミノ酸配列」の語は、「ペプチド」の語と同義である。いくつかの場合に、「アミノ酸配列」の語は、「酵素」の語と同義である。
【００２０】
本明細書で用いる「ハイブリダイゼーション」は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術で行われる増幅の過程と同様に、核酸の鎖が塩基対合を介して、相補鎖と結合する過程を含む。ハイブリダイズされる核酸は、単鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖またはＲＮＡ／ＤＮＡ共重合体として存在することが出来る。本明細書で用いる「共重合体」は、リボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドの両方を含む単一の核酸鎖をいう。核酸は、「高度にストリンジェントな条件」の下で、本明細書で開示される核酸へハイブリダイズするものを含む。高度にストリンジェントな条件は、５０℃での０．２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）中または６５℃での０．１×ＳＳＣ中のハイブリダイゼーションとして定義される。
【００２１】
本明細書で用いる「ヌクレオチド配列」または「核酸配列」は、ゲノム、合成または組み換え型の起源の配列をいい、センス鎖またはアンチセンス鎖を表すかに関わらず、二本鎖または一本鎖とすることが出来る。本明細書で用いる「核酸」の語は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはＲＮＡについていうことが出来る。核酸の残基は、当該技術分野で通常知られ、用いられる任意の化学的修飾を含むことが出来る。
【００２２】
「単離された」は、当該物質が自然に関連され、自然に見られる少なくとも一の他の成分から、その物質が少なくとも実質的に遊離していることを意味する。
【００２３】
「精製された」は、例えば、少なくとも約９０％の純度、少なくとも約９５％の純度または少なくとも約９８％の純度である等、物質が比較的純粋な状態にあることを意味する。
【００２４】
「熱安定の」は、酵素が高温にさらされた後に活性を保持することを意味する。アルファ・アミラーゼの熱安定性は、その半減期（ｔ１／２）によって測定される。ここで、酵素活性の半分は、半減期で消失する。半減期は、所与の温度で、特に具体的な適用に用いられる温度での時間にわたって残留する酵素の特異的なアルファ・アミラーゼ活性を算出することにより測定される。
【００２５】
本明細書で用いる「食品」は、消費者になんらかの有益な効果をもたらすことが可能な、小麦粉等の食品原料と同様に調理済みの食品の両方を含む。本明細書で用いられる「食品原料」は、食品か食料であるか、またはそれらに加えられる配合物を含み、また、例えば、酸性化または乳化に必要な、多様な製品中に少量で用いられる配合物も含む。食品原料は、使用及び／または用法及び／または供給方法により、溶液または固形物の形態とすることが出来る。
【００２６】
「オリゴ糖」は、３−２０単糖から出来ている炭水化物分子を意味する。
【００２７】
「ホモログ」は、対象のアミノ酸配列または対象のヌクレオチド配列とで、所定の程度の同一性または「相同性」を有する実体を意味する。「相同配列」は、対象の配列と少なくとも８５％の配列同一性、例えば、対象の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。通常、ホモログは、対象のアミノ酸配列と同等の活性部位残基を含む。
【００２８】
本明細書で用いる「形質転換細胞」は、組み換えＤＮＡ技術の使用で形質転換された細胞を含む。形質転換は通常、細胞内への一以上のヌクレオチド配列の挿入で起こる。挿入されたヌクレオチド配列は、異種ヌクレオチド配列となり得る。すなわち、挿入されたヌクレオチド配列は、融合タンパク質のように、形質転換される細胞に自然にはない配列である。
【００２９】
本明細書で用いる「操作可能に連結された」は、記載の要素が意図された方法で機能するような関係にあることを意味する。例えば、コーディング配列と操作可能に連結された調節配列は、コーディング配列の発現がコントロール配列に適合する条件下で達成される方法でライゲートされる。
【００３０】
本明細書で用いる「生物学的に活性」は、必ずしも同じ度合いを示すわけではないが、自然に起こる配列と、同様の構造、制御または生化学的機能を有する配列をいう。
【００３１】
本明細書で用いる「デンプン」は、植物の複雑な多糖炭水化物から成る任意の物質をいい、（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）ｘの化学式をもつアミロースとアミロペクチンから成る。ここでＸはいずれの数字でも良い。特に、この語は、穀粒、草、塊茎及び塊根、さらに具体的に小麦、大麦、トウモロコシ、ライ麦、米、モロコシ、ぬか、キャッサバ、キビ、ジャガイモ、サツマイモ及びタピオカを含むが、それらに限られない任意の植物由来の物質をいう。
【００３２】
本明細書で用いる「顆粒デンプン」は、非加熱（生）のデンプンをいい、例えば、ゼラチン化されていないデンプンである。
【００３３】
本明細書で用いる「ゼラチン化」は、デンプン分子を可溶化し、粘性懸濁液を形成することを意味する。
【００３４】
本明細書で用いられる「ゼラチン化温度」は、デンプン基質のゼラチン化が起こる最低温度をいう。ゼラチン化の正確な温度は、特定のデンプンに依存し、デンプンが得られる植物種の特定の多様性及び成長条件等の要因にさらに依存し得る。
【００３５】
「ＤＥ」または「デキストロース当量」は、全還元糖の濃度の測定に用いられる業界基準であり、還元糖に転化された全固形物の割合（パーセンテージ）として計算される。非加水分解の顆粒デンプンは、本質的にＤＥが０であり、Ｄ−グルコースは、ＤＥが１００である。
【００３６】
本明細書で用いる「デンプン基質」は、精製デンプン、全粒穀粒または分留穀粒を用いた顆粒デンプンまたは液化デンプンをいう。
【００３７】
本明細書で用いる「液化デンプン」は、可溶化工程、例えば、従来のデンプン液化プロセスを経たデンプンをいう。
【００３８】
本明細書で用いる「グルコースシロップ」は、グルコース固形物を含む水性組成物を意味する。グルコースシロップは、少なくとも２０のＤＥを有する。いくつかの実施態様において、グルコースシロップは２１％以下の水分を含み、デキストロースとして換算して少なくとも２５％の還元糖を含むことが出来る。一の実施態様において、グルコースシロップは、少なくとも９０％のＤ‐グルコースを含み、他の実施態様において、少なくとも９５％のＤ‐グルコースを含むことが出来る。いくつかの実施態様において、グルコース及びグルコースシロップの語は、相互置換可能に用いられる。
【００３９】
本明細書で用いる「発酵性糖」は、酵母発酵条件下で代謝されることが可能な糖をいう。これらの糖は主に、グルコース、マルトース及びマルトトリオース（ＤＰ１、ＤＰ２及びＤＰ３）をいう。
【００４０】
本明細書で用いる「総糖含量」の語は、デンプン組成物中に存在する総糖含量をいう。
【００４１】
本明細書で用いる「ｄｓ」は、溶液中の溶解固形物（ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ  ｓｏｌｉｄｓ）をいう。
【００４２】
「ブリックス（Ｂｒｉｘ）」は、所与の温度における、溶液中の糖含量を測定するための周知の比重単位をいう。このブリックス計測器は、水性糖溶液の１００グラム当たりに溶解するスクロースのグラム数または可溶性固形物含量の総量を測定する。ブリックス測定値は頻繁に、比重計あるいは屈折計によって測定される。
【００４３】
本明細書で用いる「ボーメ度」は、液体の比重をいう。２０℃での比重（ｓ．ｇ．）及びボーメ度の関係は、
水より比重の重い液体について：
ｓ．ｇ．＝１４５÷（１４５−ボーメ度）、及び
水より比重の軽い液体について：
ｓ．ｇ．＝１４５÷（ボーメ度＋１３０）である。
【００４４】
デンプン懸濁液、例えば、スラリー及びデンプン加水分解物について、ボーメ乾燥基質関係は、Ｃｌｅｌａｎｄ  Ｊ．他、「デンプン懸濁液のボーメ乾燥基質表（Ｂａｕｍｅ−Ｄｒｙ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｔａｂｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｓｔａｒｃｈ  Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ）」、Ｉｎｄ．Ｅｎｇ．Ｃｈｅｍ．ａｎａｌ．Ｅｄ．、第１５巻、３３４−３６ページ、１９４３年で開示される。さらに、「臨界データ表（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｄａｔａ  Ｔａｂｌｅｓ）」、トウモロコシ精製者協会社（Ｃｏｒｎ  Ｒｅｆｉｎｅｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、Ｉｎｃ．）、１９９１年を参照されたい。ボーメ度は、トウモロコシ湿式粉砕産業での加水分解生成物のプロセス制御及び産業販売の両方で有用である。
【００４５】
本明細書で用いる「デンプン液化酵素」は、顆粒デンプンの加水分解または分解を触媒する酵素をいう。典型的なデンプン液化酵素は、アルファ・アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１）を含む。
【００４６】
「アミラーゼ」はとりわけ、デンプンの加水分解を触媒可能な酵素を意味する。
【００４７】
「アルファ・アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１）」は、無作為にデンプン分子内のα−Ｄ−（１→４）Ｏ−グリコシド結合を切断するエンド作用型酵素をいう。対照的に、ベータ・アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．２、α−Ｄ−（１→４）−グルカンマルトヒドロラーゼ）及びマルトース生産性アルファ・アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１３３）のようないくつかの生産物特異的アミラーゼ等のエクソ作用デンプン分解酵素は、基質の非還元末端からデンプン分子を切断する。これらの酵素は、１，４−α−結合Ｄ−グルコース単位を含む多糖類における１，４−α−結合Ｄ−グルコシド結合のエクソまたはエンド型加水分解をもたらすものとしても説明されてきた。これらの酵素を記載するために用いられる別の語は、グリコゲナーゼである。典型的な酵素は、α−１，４−グルカン４−グルカノヒドロラーゼを含む。
【００４８】
本明細書で用いる「グルコアミラーゼ」は、アミログルコシダーゼ分類の酵素をいう（ＥＣ３．２．１．３、グルコアミラーゼ、α−１，４−Ｄ−グルカン・グルコヒドロラーゼ）。これらは、アミロース及び／またはアミロペクチン分子の非還元末端からグルコシル残渣を遊離するエキソ作用型酵素である。この酵素は、α−１，６及びα−１，３結合を加水分解することも可能である。しかしながら、α−１，４結合の加水分解よりははるかに速度が遅い。
【００４９】
本明細書で用いる、ＡｍｙＥまたはその変異体の「トランスグルコシダーゼ活性」は、マルトースを加えたインキュベーションでのマルトトリオースの生成により特性化される。特に、トランスグルコシダーゼ活性は、アルファ−１，４−グルコシル・トランスフェラーゼ活性をいう。
【００５０】
本明細書で用いる「ヨウ素陽性糖」または「ＩＰＳ」は、液化と糖化の後に加水分解されないアミロースをいう。糖化されたデンプンがヨウ素と試験される場合、高ＤＰｎアミロースはヨウ素を拘束し、特有の青い色を引き起こす。ＩＰＳの存在は、不完全なデンプン分解を表すため、ＩＰＳはデンプン加工用途において非常に望ましくない。
【００５１】
本明細書で用いる「不溶性残留デンプン」または「ＩＲＳ」は、糖化の後に沈殿物として現れる不完全に加水分解されたデンプンをいう。多量の沈殿物は、それらが生産の効率を本質的に妨害し、生産高を減少させる可能性があるため、甘味料用途において不適当である。ＩＲＳはさらに、このような甘味料を含む食品に不適当な構成をもたらす。
【００５２】
本明細書で用いる「グルコースサージ」は、発酵の誘導（酵母増殖）期で顕著に増加したグルコース量をいう。
【００５３】
本明細書で用いる「デンプンの加水分解」は、水分子の付加を伴うグルコシド結合の切断をいう。
【００５４】
「重合度（ＤＰ）」は、所与の糖中の無水グルコピラノ−ス単位の数（ｎ）をいう。ＤＰ１の例は、グルコ−ス及びフルクト−ル等の単糖である。ＤＰ２の例は、マルト−ス及びスクロ−ス等の二糖である。ＤＰ４＋（＞ＤＰ４）は、重合の程度が４以上であるポリマ−を意味する。
【００５５】
本明細書で用いる「接触」または「混合」は、酵素により基質を所望の最終産物に転換させるため、個々の酵素を個別の基質に対して、十分に近い位置に置くことをいう。個別の基質と酵素溶液とを混合することが接触または混合をもたらし得ることは、当業者に理解される。
【００５６】
１．２．略語
別途記載のない限り、以下の略語が適用される。
【００５７】
ＡＥ         アルコールエトキシレート
ＡＥＯ アルコールエトキシレート
ＡＥＯＳ      アルコールエトキシ硫酸塩
ＡＥＳ アルコールエトキシ硫酸塩
ＡｋＡＡ      アスペルギルス・カワチイ・アルファ・アミラーゼ
ＡｍｙＥ      バチルス・ズブチリス・アルファ・アミラーゼ
ＡｍｙＥ−ｔｒ       切断ＡｍｙＥ
ＡｍｙＥ  ＦＬ       全長ＡｍｙＥ
ＡｍｙＬ      バチルス・リケニフォルミス・アルファ・アミラーゼ
ＡｍｙＲ      ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＸＴＲＡアミラーゼ
ＡｍｙＳ      ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス・アルファ・アミラーゼ
ＡＳ         アルコール硫酸塩
ＢＡＡ 細菌アルファ・アミラーゼ
ｃＤＮＡ      相補的ＤＮＡ
ＣＭＣ カルボキシメチルセルロース
ＤＥ         デキストロース等価物
ＤＩ         蒸留、脱イオン化
ＤＮＡ デオキシリボ核酸
ＤＰ３ ３個のサブユニットを有する重合度
ＤＰｎ ｎ個のサブユニットを有する重合度
ＤＳまたはｄｓ       乾燥固形物
ＤＴＭＰＡ    ジエチルトリアミン５酢酸
ＥＣ         酵素分類用酵素番号
ＥＤＴＡ      エチレンジアミン４酢酸
ＥＤＴＭＰＡ  エチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸
ＥＯ         エチレンオキシド
Ｆ＆ＨＣ      布及び家庭用品ケア
ｇｐｍ ガロン／分
ＧＡＵ グルコアミラーゼ活性単位
ＨＦＣＳ      フルクトース高含有コーンシロップ
ＨＦＳＳ      フルクトース高含有デンプンベースシロップ
ＨＧＡ フミコーラ・グリセア・グルコアミラーゼ
ＨＰＬＣ      高圧液体クロマトグラフィー
ＩＰＳ ヨウ素陽性糖
ＩＰＴＧ      イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド
ＩＲＳ 不溶性残留デンプン
ｋｇ         キログラム
ＬＡ         ラウリーア寒天
ＬＢ         ラウリーア培養地
Ｌ１Ｔ アミノ酸が当該技術分野で一般に知られる単一文字の略語で示される場合、位置１でのロイシン（Ｌ）残基がトレオニン（Ｔ）残基と置き換えられている
ＬＵ         リパーゼ単位
ＭＯＰＳ      ３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルホン酸
ＭＴ         メートルトン
ＭＷ         分子量
ＮＣＢＩ      全米バイオテクノロジー情報センター
ｎｍ         ナノメートル
ＮＯＢＳ      ノナノイロキシベンゼンスルホン酸塩
ＮＴＡ ニトリロ３酢酸
ＯＤ         光学密度
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＥＧ ポリエチレングリコール
ｐＩ         等電点
ｐｐｍ 百万分当たりの割合
ＰＶＡ ポリ（ビニルアルコール）
ＰＶＰ ポリ（ビニルピロリドン）
ＲＡＵ 基準アミラーゼ単位
ＲＭＳＤ      ２乗平均平方根
ＲＮＡ リボ核酸
ｒｐｍ 毎分回転数
ＳＡＳ ２級アルカンスルホン酸塩
１ＸＳＳＣ      ０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０
ＳＳＦ 同時糖化発酵
ＳＳＵ 可溶性デンプン単位、分当たりの遊離グルコース１ｍｇの還元力と等価
ＴＡＥＤ      テトラアセチルエチレンジアミン
ＴＮＢＳ      トリニトロベンゼンスルホン酸
ＴｒＧＡ      トリコデルマ・リーセイ・グルコアミラーゼ
ｗ／ｖ 重量／容量
ｗ／ｗ 重量／重量
ｗｔ         野生型
μＬ         マイクロリットル
μＮｍ マイクロニュートン×メーター
ＸＴＲＡ      ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＸＴＲＡ（ダニスコＵＳ・インク、ジェネンコー・ディビジョン）
２．アルファ・アミラーゼ
２．１．構造及び機能
アルファ・アミラーゼは、微生物及び動植物の組織に存在する酵素の群を構成する。それらは、グリコーゲン、デンプン、関連する多糖類及びいくつかのオリゴサッカライドのアルファ−１，４−グルコシド結合を加水分解することが出来る。アルファ・アミラーゼは全て、同一の触媒機能を持つが、それらのアミノ酸配列は大幅に異なる。異なるアミラーゼ間の配列同一性は、例えば、２５％未満であったりと、実質的に存在しないことが出来る。相当なアミノ酸配列の多様性にもかかわらず、アルファ・アミラーゼは、異なる種に由来するアルファ・アミラーゼの三次元構造が測定された後に同定された、共通の全体的な幾何学的構造（ｔｏｐｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｃｈｅｍｅ）を共有する。共通の三次元構造は三個のドメインを示す：
すなわち、（１）ドメインＡとして知られる「ＴＩＭ」バレル、（２）ドメインＡ内に挿入されるドメインＢとして知られる長ループ領域、及び（３）ギリシャ・キー（Ｇｒｅｅｋ−ｋｅｙ）モチーフを伴う特有のベータ構造を含むドメインＣとして知られるＣ末端に近い領域である。
【００５８】
ドメインＡのＴＩＭバレルは、ペプチド骨格に沿って交互に並ぶ八個のアルファ・ヘリックス及び八個の平行ベータ鎖、すなわち、（β／α）８から成る。保存された糖分解酵素トリオースリン酸イソメラーゼにちなんで命名されたこの構造は、保存タンパク質折り畳みの中で一般的であると知られている。ドメインＢは、βＡ３及びαＡ３（ドメインＡ内の第３のβ鎖及びα−ヘリックス）の間に挿入されたループ領域である。ドメインＡが活性部位に隣接し、ドメインＢが活性部位を側面から覆うことを三次元構造が示すため、ドメインＡ及びドメインＢの両方は、直接アルファ・アミラーゼの触媒機能に関与する。さらに、活性部位のアミノ酸残基がベータ鎖と、隣接するアルファ・ヘリックスとを連結するループ内に位置するため、ドメインＡは触媒ドメインと考えられる。ドメインＢは、基質結合への影響により酵素の特異性を決定すると考えられる。ＭａｃＧｒｅｇｏｒ他、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、第１５４６巻、１−２０ページ（２００１年）。
【００５９】
「ターマミル様」アルファ・アミラーゼは、デンプン加工産業で広く用いられるアルファ・アミラーゼの群をいう。米国特許番号６，４４０，７１６の配列番号２のアミノ酸配列を有するＢ．リケニフォルミス・アルファ・アミラーゼは、Ｔｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）として市販される。ターマミル様アルファ・アミラーゼは一般に、バチルス種により生産された相同性の高いアルファ・アミラーゼの群をいう。この群の他の構成要素は、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス（以前は、バチルス・ステアロサーモフィラスとして知られる。両方の名称は、本発明に係る開示で相互置換可能に用いられる）及びＢ．アミロリケファシエンスに由来するアルファ・アミラーゼ、及びバチルス種ＮＣＩＢ１２２８９、ＮＣＩＢ１２５１２、ＮＣＩＢ１２５１３及びＤＳＭ９３７５（その全ては、米国特許番号６，４４０，７１６及び国際公開番号ＷＯ９５／２６３９７で詳細に記載され、参照により本明細書に組み込まれる）に由来するものを含む。
【００６０】
アルファ・アミラーゼは上述の三個のドメインを普遍的に含むが、Ｂ．ズブチリスに由来するＡｍｙＥのようないくつかのアルファ・アミラーゼの三次元構造は、ターマミル様アルファ・アミラーゼと顕著に異なる。これらの酵素は、非ターマミル様アルファ・アミラーゼとしてまとめて呼ばれる。図１は、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス（配列番号２５、ＡｍｙＳ）、バチルス・リケニフォルミス（配列番号２６）及びバチルス・ズブチリス（配列番号２７、ＡｍｙＥ）に由来するアルファ・アミラーゼの配列アラインメントを示す。配列アラインメントは、コリン（Ｋａｌｉｇｎ）２．０プログラムで作製した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｋａｌｉｇｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌで利用可能である。さらに、Ｌａｓｓｍａｎｎ及びＳｏｎｎｈａｍｍｅｒ、ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、第６巻、２９８ページ（２００５年）も参照されたい）。ＡｍｙＥはＡｍｙＬまたはＡｍｙＳと、およそ１５％の同一性及び２５％未満の類似性を共有する一方、ターマミル様ＡｍｙＳ及びＡｍｙＬは、およそ６３％の同一性及びおよそ７７％の類似性を共有する。
【００６１】
バチルス・ズブチリス・アルファ・アミラーゼ（ＡｍｙＥ）またはその切断変異体の結晶構造は決定され、それは他のアルファ・アミラーゼと共通の特徴を共有する。藤本他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第２７７巻、３９３−４０７ページ（１９９８年）（プロテインデータバンク登録番号１ＢＡＧ）、香川他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、第１８５巻、６９８１−８４ページ（２００１年）（プロテインデータバンク登録番号１ＵＡ７）。ＡｍｙＥの結晶構造を、それらの「ターマミル様アルファ・アミラーゼ」のものと比べることは特に興味深い。図２で示すように、共通の幾何学的構造は、ＡｍｙＥ及びＡｍｙＳ間の三次元構造の比較により同定される。両方のアミラーゼは、三個のドメインを伴う類似の全体構造を示す。例えば、それぞれプロテインデータバンク登録番号１ＵＡ７及び１ＨＶＸを参照されたい。
【００６２】
しかしながら、ＡｍｙＳ、ＡｍｙＬ及びＡｍｙＥの三次元構造の精密な検査は、ＡｍｙＥとターマミル様アルファ・アミラーゼ間の重要な構造差を明らかにする。ＡｍｙＳとＡｍｙＬを相互に重ね合わせた場合、これらの二個のアミラーゼは、三個のドメインの各々に対してほとんどオーバーラップする。有意差は、アミノ酸側鎖レベルでのみ存在する。図３Ａを参照されたい。他方、図３Ｂは、ＡｍｙＳとＡｍｙＥの重ねられた三次元構造を提供する。ＡｍｙＳとＡｍｙＥの間には、重要な構造差がある。最も目立つ差は、ドメインＢ内に位置することが出来る。ドメインＢが触媒部位の大部分を形成すると一般に考えられるため、ＡｍｙＥがターマミル様アルファ・アミラーゼのものと異なる酵素特性を示す可能性が期待される。
【００６３】
構造類似性のより定量的測定値は、所与の三次元アライメントに基づく平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）の算出を介する。ＲＭＳＤは、重ねられたタンパク質の骨格間の平均距離の測定値である。当業者は通常、最適な剛体の重ね合せの後に、アルファ炭素原子座標のＲＭＳＤで三次元構造の類似性を測定することが出来る。ＡｍｙＬ（プロテインデータバンク登録番号１ＢＬＩ）の三次元構造が、ＡｍｙＳ（プロテインデータバンク登録番号１ＨＶＸ）の三次元構造と重ねられる場合、前記ＲＭＳＤは、ＰｙＭＯＬ（ｈｔｔｐ：／／ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇで利用可能である）に基づくと、４１９のアミノ酸残基間で０．４０８オングストロームである。しかしながら、ＡｍｙＥ（プロテインデータバンク登録番号１ＵＡ７）とＡｍｙＳ（プロテインデータバンク登録番号１ＨＶＸ）間の三次元構造比較は、３１１のアミノ酸残基間で８．１３４オングストロームのＲＭＳＤを生じる。
【００６４】
２．２．ＡｍｙＥ及びその変異体
本明細書で開示する用途の実施に有用な、ＡｍｙＥ酵素及びその変異体を提供する。ＡｍｙＥ及びその変異体をコードする核酸と同様に、その核酸を含むベクターと宿主細胞をさらに提供する。
【００６５】
本開示の目的において「ＡｍｙＥ」は、Ｂ．ズブチリスに由来する自然発生のアルファ・アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１、１，４−α−Ｄ−グルカン・グルカノヒドロラーゼ）を意味する。代表的なＡｍｙＥ配列を、配列番号１または２７に示す。配列番号１で示すＡｍｙＥのアミノ酸配列は、天然シグナル配列を持たない成熟形である。配列番号２７で示すＡｍｙＥのアミノ酸配列は、４１のアミノ酸残基から成るシグナル配列を含む。このＡｍｙＥの天然のシグナル配列のアミノ酸配列を、配列番号１７に示す。このＡｍｙＥの成熟形は、本発明に係る開示で「全長ＡｍｙＥ」とする。他のＡｍｙＥ配列は、デフォルト・アライメント・パラメーターでＢＬＡＳＴ配列アラインメント・アルゴリズムを用いて、配列番号１のＡｍｙＥと少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％または約９８％の配列同一性を有する。例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＴｒＥＭＢＬ登録番号Ｏ８２９５３で開示される、Ａｍｙ３１Ａとして知られるＡｍｙＥ（配列番号３）は、配列番号１のＡｍｙＥと８６％の配列同一性を有する。配列番号３のＮ末端の４５アミノ酸残基は、Ａｍｙ３１Ａのシグナル配列である。ＡｍｙＥ（配列番号１）とＡｍｙ３１Ａ（シグナル配列のない配列番号３）間の配列アラインメントは、図４に示す。ＡｍｙＥ酵素は、ＮＣＢＩ登録番号ＡＢＷ７５７６９（配列番号２８）で開示されるアミノ酸配列を有するＡｍｙＥを含むが、それに限られない。さらに、ＡｍｙＥタンパク質配列は、ＮＣＢＩ登録番号ＡＢＫ５４３５５（配列番号２９）、ＡＡＦ１４３５８（配列番号３０）、ＡＡＴ０１４４０（配列番号３１）、ＡＡＺ３００６４（配列番号３２）、ＡＡＱ８３８４１（配列番号３３）及びＢＡＡ３１５２８（配列番号３４）（それらの内容は参照により本明細書に組み込まれる）で開示されるものを含む。
【００６６】
ＡｍｙＥ「変異体」は、自然発生のＡｍｙＥ配列の、アミノ酸配列の修飾を含む。本明細書で用いる自然発生のＡｍｙＥは、「親酵素」、「親配列」、「親ポリペプチド」または「野生型ＡｍｙＥ」でもある。アミノ酸の修飾は、アミノ酸置換、付加または欠失を含むことが出来る。ＡｍｙＥ変異体におけるアミノ酸の修飾は、自然発生の変異の結果、または、下記に記載する修飾の目的のため当該技術分野でよく知られた方法の一を用いた、アミノ配列の計画的な修飾の結果とすることが出来る。代表的なＡｍｙＥ変異体は、２００８年６月６日に出願された米国仮出願番号６１／０５９，５１３に開示され、それらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００６７】
別途記載のない限り、ＡｍｙＥ変異体は、少なくとも一のアミノ酸修飾を有するが、この変異体は、デフォルト・アライメント・パラメーターを用いたタンパク質配列のＢＬＡＳＴアラインメントで測定して、配列番号１のＡｍｙＥと少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％または約９８％のアミノ酸配列同一性を保持する。例えば、この変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と比べ、１、２、３、５以下、１０以下、２０以下のアミノ酸置換を有することが出来る。修飾は通常、生体機能に必要とされないアミノ酸残基で行われる。修飾されるアミノ酸残基の選択は、ＡｍｙＥ配列中の配列相同性により誘導されることが出来る。一般に、ＡｍｙＥ配列内でよく保存されたアミノ酸は、生物活性に必要とされる可能性が高い。反対に、ＡｍｙＥ配列間で異なるアミノ酸位置は、生物活性に必要とされる可能性が低い。例えば、図４内の太字のフォントで示すＡｍｙＥとＡｍｙ３１Ａ間のアライメントにおいて異なるアミノ酸残基は、生物活性の損失なく、ＡｍｙＥ変異体内で修飾されることが出来る可能性が高い。
【００６８】
変異体ＡｍｙＥは、自然発生のＡｍｙＥと、Ｂドメイン、例えば、配列番号１のアミノ酸残基１０１−１５１内で実質的な構造の同一を示すことが出来る。一の実施態様において、変異体ＡｍｙＥは、自然発生のＡｍｙＥのＢドメインのアミノ酸残基に関して１−３のアミノ酸置換を含むことが出来る。別の実施態様において、変異体ＡｍｙＥは、自然発生のＡｍｙＥの三次元構造と、全体でまたはＢドメイン内のみのいずれかで、平均２オングストローム以内でオーバーラップする三次元構造を有することが出来る。
【００６９】
いくつかの実施態様において、変異体ＡｍｙＥは、親酵素の特性と比べて、一以上の改変された特性を示すことが出来る。改変された特性は、親と比べて、変異体の改良された性能を結果として生じることが出来る。これらの特性は、基質特異性、基質結合性、基質切断パターン、熱安定性、ｐＨ／活性プロファイル、ｐＨ／安定性プロファイル、酸化への安定性、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）のより少ない量での安定性及び／または比活性度を含むことが出来る。
【００７０】
ＡｍｙＥまたはその変異体は、発現、検出及び／または精製を促進する、ＡｍｙＥの成熟形のＮ末端及び／またはＣ末端での配列を含む融合蛋白質、例えば、シグナル配列またはＨｉｓタグ等として発現されることが出来る。このような配列は、宿主生物内でのＡｍｙＥの分泌及び発現を促進するシグナル配列を含む。追加のアミノ酸残基は、Ｙａｎｇ他、「バチルス・ズブチリスに由来するアミラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｍｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第１１巻、２３７−４９ページ、（１９８３年）で説明されるように、シグナル配列の切断に続き、ＡｍｙＥのＮ末端から切断されることが出来る。ＡｍｙＥの「成熟形」は、全ての発現されたＡｍｙＥ配列のこのような翻訳後修飾の生成物として定義される。成熟ＡｍｙＥを形成するために切断される、主要な翻訳産物のＮ末端で見られる配列は代わりに、「シグナル配列」、「リーダー配列」あるいは「プロ配列」として指定されることが出来る。
【００７１】
シグナル配列は、ＡｍｙＥと同一の遺伝子でコードされることが出来る。例えば、配列番号１で示すＡｍｙＥは、配列ＭＦＡＫＲＦＫＴＳＬＬＰＬＦＡＧＦＬＬＬＦＨＬＶＬＡＧＰＡＡＡＳＡＥＴＡＮＫＳＮＥ（配列番号１７）を有するシグナル配列及び追加のＮ末端アミノ酸により自然に発現される。シグナル配列は代わりに、異なるＡｍｙＥあるいはさらに異なるタンパク質に由来するＢ．ズブチリス種シグナル配列とすることが出来る。さらに、シグナル配列は異なる種、例えば、Ｂ．リケニフォルミス等に由来することが出来る。このシグナル配列は例えば、特定の宿主細胞内でＡｍｙＥまたはその変異体の最適な発現を提供するために選ばれることが出来る。成熟ＡｍｙＥは、シグナル配列ではない、Ｎ末端からの追加の配列のタンパク質分解的切断の結果、生産されることが出来る。例えば、Ｂ．リケニフォルミス（「ＬＡＴリーダー配列」）に由来する３１アミノ酸残基のシグナル配列は、ＡｍｙＥ配列を有する構造内で融合されることが出来る。
【００７２】
本開示の目的のためのＡｍｙＥ変異体は、自然発生のＡｍｙＥと比べ、少なくとも部分的かまたは同様の１，４−α−Ｄ−グルカン・グルカノヒドロラーゼ活性を有することが出来る。さらに、本開示の目的のためのＡｍｙＥ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＡｍｙＥと比べ、同様のレベルのトランスグルコシダーゼ活性も有する。このトランスグルコシダーゼ活性は、実施例２．２で記載するようにマルトースに由来するマルトトリオースの酵素合成に基づき測定される。この変異体は、野生型ＡｍｙＥと同一の活性及び特性を有することが出来る。または、この変異体は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＡｍｙＥと比べ、改変された特性を有することが出来る。改変された特性は、マルトヘプタオース及び／またはマルトトリオース基質に対し、改変された、例えば、二倍または三倍高い比活性度とすることが出来る。タンパク質の熱安定性は、代わりに、または追加して、改変されることが出来る。例えば、前記変異体は、ＡｍｙＥよりも熱安定とすることが出来る。改変された特性は、代わりに、または追加して、酵素活性の最適ｐＨとすることが出来る。例えば、前記変異体は、より酸性またはよりアルカリ性の最適ｐＨを有することが出来る。
【００７３】
「切断」ＡｍｙＥ（「ＡｍｙＥ−ｔｒ」）は、Ｃ末端デンプン結合ドメインの全てまたは一部の配列欠失を有するＡｍｙＥを意味する。配列番号２のＡｍｙＥ−ｔｒにおいて、例えば、配列番号１のＡｍｙＥは、残基Ｄ４２５で切断されている。このＡｍｙＥ−ｔｒの２．５Å解像度結晶構造は、タンパク質データバンク登録番号１ＢＡＧで利用可能である。これは、藤本他、「マルトペンタオースで合成されたＢ．ズブチリスに由来する触媒部位変異アルファ・アミラーゼの結晶構造（Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ−ｓｉｔｅ  ｍｕｔａｎｔ  ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍａｌｔｏｐｅｎｔａｏｓｅ）」、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第２７７巻、３９３−４０７ページ（１９９８年）内で開示される。ＡｍｙＥ−ｔｒは、他の位置、例えば、配列番号１のＡｍｙＥのＹ４２３、Ｐ４２４、Ｄ４２６またはＩ４２７で切断されることができ、それにより、Ｃ末端デンプン結合ドメインの全てまたは一部が除去される。
【００７４】
ＡｍｙＥまたはその変異体をコードする核酸は、配列番号１のＡｍｙＥ及びＡｍｙＥ−ｔｒ（配列番号２）をそれぞれコードする配列番号９及び配列番号１０で開示されるポリヌクレオチドを含むが、それらに限られない。さらに、代表的なポリヌクレオチドは、配列番号１１に開示される、Ａｍｙ３１Ａ（配列番号３）をコードするポリヌクレオチドを含む。ＮＣＢＩ登録番号ＡＢＫ５４３５５、ＡＡＦ１４３５８、ＡＡＴ０１４４０、ＡＡＺ３００６４、ＮＰ＿３８８１８６、ＡＡＱ８３８４１及びＢＡＡ３１５２８等で開示されるＡｍｙＥは、公にアクセス可能なデータベース内で開示されるポリヌクレオチドによりコードされる。それらの配列は、参照により本明細書に組み込まれる。核酸は、ＤＮＡ、ｍＲＮＡまたは相補的ＤＮＡ配列とすることが出来る。核酸はさらに、前述の核酸のいずれかの「縮退配列」を含む。縮退配列は、同一のアミノ酸残基をコードするが、前述の核酸配列とは異なるヌクレオチド配列を有する少なくとも一のコドンを含む。例えば、核酸は、ＡｍｙＥまたはその変異体をコードする任意の核酸配列を含む。縮退配列は、特定の宿主生物に好ましいコドンを用いることで最適な発現のために設計されることが出来る。
【００７５】
ＡｍｙＥまたはその変異体をコードする核酸を含むベクターをさらに提供する。ベクターを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、ＡｍｙＥ変異体をコードするポリヌクレオチドを発現することが出来る。前記宿主は、バチルス種、例えば、Ｂ．ズブチリスとすることが出来る。
【００７６】
２．３．ＡｍｙＥ変異体の特性評価
ＡｍｙＥ変異体は、その核酸及び主要ポリペプチド配列、３Ｄ構造モデリング及び／または比活性度により特徴づけることが出来る。ＡｍｙＥ変異体の追加の特徴は、安定性、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）依存性、ｐＨ範囲、酸化安定性及び熱安定性を含む。一の側面において、ＡｍｙＥ変異体は、野生型ＡｍｙＥの性能特性を保持する一方、野生型ＡｍｙＥよりも高いレベルで発現される。発現と酵素活性のレベルは、当業者に知られる標準的アッセイ法を用いて評価出来る。別の側面において、変異体は、野生型酵素に比べ、改良された性能特性、例えば、高温での改良された安定性または多様なｐＨ値（例えば、ｐＨ４．０−６．０またはｐＨ８．０−１１．０）での改良された活性等を示す。
【００７７】
ＡｍｙＥ変異体はＡｍｙＥと比べ、宿主細胞内で改変された量で発現されることが出来る。発現は一般に、所与の時間、当該技術分野で知られる標準的技術を用いて、培養液から回収可能な、活性のある変異体の量に関する。発現はさらに、宿主細胞内で生産されたかまたは宿主細胞により分泌された変異体の量または比率に関連することが出来る。発現はさらに、変異体酵素をコードするｍＲＮＡの翻訳の比率に関連することが出来る。
【００７８】
別の側面において、重要な変異は、例えば、糖化で使用するために、特に、６０℃付近の温度、例えば、５０−７０℃で、改変された安定性または比活性度を示す。変異体は、その変異体が他の用途または組成物で用いられるかどうかに依存して、他の温度で改変された安定性または比活性度を有することが出来る。例えば、ベーキング製品について、変異体は、より高温の範囲での改変された比活性度を示すことが出来る。
【００７９】
ＡｍｙＥ変異体はさらに、親ＡｍｙＥと比べ、改変された酸化安定性、特により高い酸化安定性を有することが出来る。例えば、酸化安定性の増大は洗剤組成物で有利であり、酸化安定性の減少はデンプン液化用の組成物において有利である。
【００８０】
本明細書で記載するＡｍｙＥ変異体は、特に、約５５℃−約９５℃またはそれ以上の高温、特に、約８０℃で、親酵素に比べ１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％またはそれ以上で半減期を長くする変異を有することが出来る。一の実施態様において、ＡｍｙＥ変異体は、８０℃以上で約１−１０分加熱出来る。
【００８１】
ＡｍｙＥ変異体は、例えば、本明細書で記載するエキソ特異性指数により測定されるエキソ特異性を有することが出来る。ＡｍｙＥ変異体は、任意で、同一条件で測定した場合、由来する親酵素またはポリペプチドと比べ、より高いまたは増加したエキソ特異性を有する変異体を含む。従って、例えば、ＡｍｙＥ変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比べ１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、５００％、１０００％、５０００％、１０，０００％またはそれ以上のエキソ特異性指数を有することが出来る。
【００８２】
一の側面において、ＡｍｙＥ変異体は、親配列と同一のｐＨ安定性を有する。別の側面において、前記変異体は、より高いｐＨ安定性の範囲を与えるか、またはｐＨ範囲を酵素の最終商業目的に望ましい範囲に移す変異を含む。例えば、一の実施態様において、前記変異体は、約ｐＨ５．０から約ｐＨ１０．５でデンプンを分解出来る。このＡｍｙＥ変異体ポリペプチドは、同一条件下で親ポリペプチドと比べ、より長い半減期またはより高い活性（アッセイ法に依存する）を有することが出来る。または、このＡｍｙＥ変異体は、親ポリペプチドと同一の活性を有することが出来る。このＡｍｙＥ変異体ポリペプチドはまた、同一ｐＨ条件下で、その親ポリペプチドと比べ約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％またはそれ以上のより長い半減期を有することが出来る。あるいは、または追加して、このＡｍｙＥ変異体は、同一ｐＨ条件下で、親ポリペプチドと比べより高い比活性度を有することが出来る。
【００８３】
別の測面において、本明細書で記載するＡｍｙＥ変異体のいずれかをコードする核酸に相補的な核酸を提供する。加えて、この相補的な核酸とハイブリダイズすることが出来る核酸を提供する。別の実施態様において、本明細書で記載する方法と組成物において使用される配列は、合成配列である。この配列は、特定の宿主生物での発現のための最適コドン使用頻度を用いて作製された配列を含むが、それらに限られない。
【００８４】
３．アルファ・アミラーゼの生産
本明細書で記載する方法により、または当該技術分野で知られる任意の別の方法により生産されたアルファ・アミラーゼをコードするＤＮＡ配列は、適したプロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル及び任意に、リプレッサー遺伝子または種々の活性化物質遺伝子をコードする制御配列を通常含む発現ベクターを用いて、酵素の形態で発現させることが出来る。
【００８５】
３．１．ベクター
アルファ・アミラーゼをコードするＤＮＡ配列を有する組み換え発現ベクターは、組み換えＤＮＡ処置が好都合に行われる任意のベクターとすることが出来る。また、ベクターの選択は、ベクターが導入される宿主細胞にしばしば依存する。従って、ベクターは自律的に複製するベクター、すなわち、染色体外に存在するベクターであり、その複製は染色体の複製と独立し、例えばプラスミド、バクテリオファージまたは染色体外エレメント、ミニクロモソームまたは人工染色体であることが出来る。あるいは、ベクターは、宿主細胞へ導入される場合、宿主細胞のゲノムに統合され、統合された染色体と共に複製されるものとすることが出来る。前記統合された遺伝子は、抗生物質の選択または他の選択圧、例えば、必須の調節遺伝子または必須の代謝経路の遺伝子の相補性等により誘導される増幅可能な構築物を使用して、染色体中でこの遺伝子の複数のコピーを作製するために増幅されることも出来る。
【００８６】
発現ベクターは通常、クローニングベクターの構成要素、例えば、選択された宿主生物中のベクターの自律複製及び選択目的のために一以上の表現型で検出可能なマーカーを可能にするエレメント等を含む。この発現ベクターは通常、プロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル及び任意に、リプレッサー遺伝子または一以上の活性化物質遺伝子をコードする制御配列を含む。一の側面において、使用する全てのシグナル配列は、酵素の容易な収集と任意の精製のため、前記物質を細胞培養地へ向かわせるものである。本明細書で記載するアルファ−アミラーゼ、プロモーター、ターミネーター及び他の要素をそれぞれコードするＤＮＡ構築物をライゲートし、複製に必要な情報を含む適切なベクターにそれらを挿入するために使用される手順は、当業者に良く知られている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、分子クローニング、ラボマニュアル（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ；Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ）、第２版、コールドスプリングハーバー、１９８９年及び第３版、２００１年）。
【００８７】
ベクターにおいて、ＤＮＡ配列は、適したプロモーター配列と操作可能に連結されるべきである。このプロモーターは、選択した宿主細胞内で転写活性を示す任意のＤＮＡ配列とすることができ、宿主細胞と同種または異種のタンパク質をコードする遺伝子に由来することが出来る。本開示のアルファ・アミラーゼをコードするＤＮＡ配列の転写の誘導に適したプロモーターは、特に、細菌性宿主において、Ｂ．ズブチリス、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．ステアロサーモフィラスまたはＢ．アミロリケファシエンスに由来するアルファ・アミラーゼ・プロモーターのような種々のバチルス由来プロモーター、大腸菌のｌａｃオペロンのプロモーター、ストレプトミセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）アガラーゼ遺伝子ｄａｇＡまたはｃｅｌＡプロモーター、及びバチルス・ズブチリスｘｙｌＡやｘｙｌＢ遺伝子のプロモータ等を含む。菌性宿主での転写について、有用なプロモーターの例は、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコル・ミヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）中性アルファ・アミラーゼ、Ａ．ニガー酸安定アルファ・アミラーゼ、Ａ．ニガー・グルコアミラーゼ、リゾムコル・ミヘイ・リパーゼ、Ａ．オリゼ・アルカリプロテアーゼ、Ａ．オリゼ・トリオースリン酸塩異性化酵素またはＡ．ニジュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼをコードする遺伝子に由来するものである。本明細書で記載するアルファ・アミラーゼをコードする遺伝子が大腸菌のような細菌種で発現される場合、適したプロモーターが選択され、例えば、Ｔ７プロモーターとファージラムダプロモーターを含むバクテリオファージプロモーター等から選択されることが出来る。酵母種での発現に適したプロモーターの例は、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＧａｌ１及びＧａｌ１０プロモーターとピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１及びＡＯＸ２プロモーターを含むが、それらに限られない。
【００８８】
発現ベクターはさらに、アルファ・アミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列と操作可能に連結される適した転写ターミネーター及び真核生物内にポリアデニル化配列を含むことが出来る。終止配列とポリアデニル化配列は、プロモーターと同一の起源に適切に由来することが出来る。このベクターは、目的の宿主細胞でベクターを複製させることの出来るＤＮＡ配列をさらに含むことが出来る。そのような配列の例は、プラスミドｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＡＭＢ１、ｐＩＣａｔＨ及びｐＩＪ７０２の複製開始点である。
【００８９】
前記ベクターはまた、選択マーカー、例えば、Ｂ．ズブチリスまたはＢ．リケニフォルミス等に由来するｄａｌ遺伝子のような、遺伝子の生産物が宿主細胞の欠陥を補う遺伝子、または抗生物質への耐性を与える遺伝子、例えば、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールまたはテトラサイクリン耐性を与える遺伝子を含むことが出来る。ベクターはさらに、ａｍｄＳ、ａｒｇＢ、ｎｉａＤ及びｘｘｓＣ、ヒグロマイシン耐性を生じるマーカーのようなアスペルギルス選択マーカーを含むことが出来る。または、この選択性は、当該技術分野で知られる同時形質転換により達成されることが出来る。国際公開番号ＷＯ９１／１７２４３を参照されたい。
【００９０】
３．２変異体発現及び宿主生物
アルファ・アミラーゼは、宿主細胞内で発現された場合、その酵素が培養地内へ分泌されることは、一般的に有利とされる。この目的のために、前記アルファ・アミラーゼは、培養地へ発現された酵素の分泌を可能にするシグナル配列を含むことが出来る。望まれる場合、このシグナル配列は、異なるシグナル配列により置き換えられることができ、これは各シグナル配列をコードするＤＮＡ配列の置換により、好都合に達成される。例えば、ＡｍｙＥをコードする核酸は、図５で示す発現ベクター内でＢ．リケニフォルミス・シグナル配列と操作可能に連結される。シグナル配列は、上記でより詳細に記載する。
【００９１】
ＤＮＡ構築物または発現ベクターのいずれかを含む単離細胞は、アルファ・アミラーゼの組み換え物の生産において宿主細胞として有利に使用される。この細胞は、アルファ・アミラーゼをコードするＤＮＡ構築物で形質転換されることができ、任意に、宿主染色体に（一以上のコピーで）そのＤＮＡ構築物を統合することで、形質転換されることが出来る。ＤＮＡ配列は細胞内において安定的に維持される可能性がより高まるため、この統合は一般的に有利であると考えられている。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への統合は、従来の方法、例えば、同種または異種の組み換え等により行われることが出来る。あるいは、前記細胞は異なる種類の宿主細胞に関連して、上述のように発現ベクターにより形質転換されることが出来る。
【００９２】
適した細菌性宿主生物の例は、Ｂ．ズブチリス、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．ステアロサーモフィラス、Ｂ．アルカロフィラス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．コアグランス、Ｂ．ラウツス、Ｂ．メガテリウム及びＢ．スリンギエンシスを含むバチルス科、Ｓ．ムリヌス（Ｓ．ｍｕｒｉｎｕｓ）のようなストレプトミセス種、Ｌ．ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）のようなラクトコッカス種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）を含む乳酸細菌種、Ｌ．ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）を含むラクトバチルス種、ロイコノストック種（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．）、ペディオコッカス種（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）及びストレプトコッカス種のようなグラム陽性細菌種である。また、他の有用な宿主は、例えば、バチルス種Ａ７−７を含む。あるいは、大腸菌を含む腸内菌またはシュードモナスに属するグラム陰性細菌種の株を、宿主生物として選択することが出来る。
【００９３】
適した酵母宿主生物は、生物工学的に関連する酵母種、例えば、限定されないが、ピキア種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、ハンセヌラ種（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｓｐ．）、クルイベロミセス種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ）、ヤロウィニア種（Ｙａｒｒｏｗｉｎｉａ  ｓｐ）、Ｓ．セレヴィシエ等のサッカロミセス種またはＳ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）のようなシゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属する種から選択出来る。メチルトローフ酵母種ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）の株は、宿主生物として使用出来る。あるいは、この宿主生物は、ハンセヌラ種とすることも出来る。糸状菌のうちの適した宿主生物は、アスペルギルス種、例えば、Ａ．ニガー、Ａ．オリゼ、Ａ．ツビゲンシス、Ａ．アワモリまたはＡ．ニジュランスを含む。あるいは、フザリウム種、例えば、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）またはＲ・ミヘイのようなリゾムコル種等の株が、宿主生物として使用出来る。他の適した酵母は、サーモミセス種及びムコル種（Ｍｕｃｏｒ  ｓｐ．）を含む。菌細胞は、当該技術分野で知られる方法による、プロトプラスト形成とプロトプラストの形質転換、その後の細胞壁の再生を伴う方法により形質転換されることが出来る。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主細胞の形質転換に適した手順は、例えば、ＥＰ２３８０２３で説明される。
【００９４】
さらに別の側面において、アルファ・アミラーゼを生産する方法が提供され、この方法は前記変異体の生産をもたらす条件下で上述の宿主細胞を培養する工程、及び前記細胞及び／または培養地から変異体を回収する工程を含む。前記細胞の培養に使用する培地は、目的の宿主細胞を増殖させ、前記アルファ・アミラーゼを発現させるために適した任意の従来の培地とすることが出来る。適した培地及び培地成分は、市販業者から入手出来るか、または、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）のカタログで述べられているように、公表された処方に従い調製することが出来る。培養地の例は、三千リットル（３，０００Ｌ）の撹拌タンク発酵槽で行われる流加回分発酵用の培地を含むが、それに限られない。この場合の培養培地は、微量元素の他、ナトリウム、カリウム、リン酸塩、マグネシウムの供給源としての無機塩や硫酸塩と共に、有機化合物源としてのトウモロコシ浸漬固形物及び大豆粉の他、微量元素から成ることが出来る。通常、グルコースのような炭水化物源も初期培地の一部をなす。一度培地が設置され、増殖が始まると、当該技術分野で知られるように、炭水化物はタンクへ秤量され、培養が維持される。例えば、色度計定量法を用いて酵素力価を測定するために、サンプルが規則的な間隔で発酵槽から回収される。測定による酵素生産速度が上昇をやめたとき、発酵工程は停止される。
【００９５】
宿主細胞から分泌されるアルファ・アミラーゼは、遠心分離またはろ過による培地からの細胞の分離、及び硫酸アンモニウムのような塩による培地のタンパク質性成分の沈殿、その後のイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフ法の使用を含む、よく知られた手順で培養地から好都合に回収されることが出来る。
【００９６】
宿主細胞は、アルファ・アミラーゼの発現を可能にする適した条件下で培養されることが出来る。タンパク質が連続的に生産されるようにタンパク質の発現は恒常的であることが出来る。あるいは、発現を開始するための刺激を必要とする誘導的であることが出来る。誘導的発現の場合において、誘導物質、例えば、デキサメタゾン、ＩＰＴＧまたはセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）を培養地へ加える要求があった場合、タンパク質生産が開始されることが出来る。ポリペプチドはまた、例えば、ＴｎＴ（商標）（プロメガ）ウサギ網状赤血球系のような、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞のない系で組み換え的に生産されることが出来る。
【００９７】
アルファ・アミラーゼを発現する宿主は、宿主に対して適当な培地中で好気的条件下でも培養することが出来る。振とうまたは撹拌及び空気供給が、宿主にとって適温、例えば、宿主の必要性及び所望のアルファ・アミラーゼ変異体の生産に依存して、約３０℃−約７５℃等での生産と共に行われる。培養は、約１２時間から約１００時間またはそれ以上長い時間（及びその間の幾時間）またはより具体的に、２４時間から７２時間で行われることが出来る。通常、培養液は、約５．５−約８．０のｐＨであるが、やはり所望のアルファ・アミラーゼの生産に関して宿主細胞に求められる培養条件に依存する。
【００９８】
発現された酵素のデンプン分解活性は、例えば、基質としてのジャガイモデンプンを用いて測定されることが出来る。この方法は、酵素により修飾されたジャガイモデンプンの分解に基づき、この反応の後に、デンプン／酵素溶液のサンプルをヨード液と混合する。最初に、黒みを帯びた青色が見られるが、デンプンの分解中に、青色は薄くなり、赤褐色に徐々に変わる。その混合液を着色ガラス基準と比較する。
【００９９】
４．アルファ・アミラーゼの精製
従来技術が、本明細書で記載するアルファ・アミラーゼを精製するために用いることが出来る。発酵の後、発酵培養液が得られ、微生物細胞と種々の懸濁された固形物が、残留未発酵物質を含めて、アミラーゼ溶液を得るための従来の分離技術により除去される。ろ過、遠心分離、精密ろ過、ロータリー真空ドラムろ過やその後の限外ろ過、抽出またはクロマトグラフィー等が一般的に使用される。
【０１００】
濃縮されていない溶液の使用は、精製された酵素を含む沈殿物を収集するために、インキュベーション時間を長くとる必要がある。そのため、回収を最適化するために、発現された本開示のアルファ・アミラーゼ変異体を含む溶液を濃縮することが望ましい。この溶液は、所望の酵素量が得られるまで、従来技術を使用して濃縮される。この酵素を含む溶液の濃度は、上述の技術のいずれかにより達成されることが出来る。一の実施態様において、ロータリー真空蒸発及び／または限外ろ過が使用される。
【０１０１】
精製用の「沈殿剤」とは、沈殿物の性質に関わらず、すなわち、結晶質、非晶質または両方の混合物であろうと、溶液から本開示のアルファ・アミラーゼを沈殿させるために効果のある化合物を意味する。沈殿は、例えば、金属ハロゲン化沈殿剤を用いて行うことが出来る。金属ハロゲン化沈殿剤は、塩化アルカリ金属、臭化アルカリ金属及びこれらの金属ハロゲン化物の二以上の混合物を含む。金属ハロゲン化は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム及びこれらの金属ハロゲン化物の二以上の混合物からなる群から選択されることが出来る。適した金属ハロゲン化物は、塩化ナトリウム及び塩化カリウム、特に、塩化ナトリウムを含み、これはさらに保存剤として使用出来る。インキュベーション時間、ｐＨ、温度及び本開示のアルファ・アミラーゼの濃度を含む、回収を最大にするための沈殿条件の選択は、一般的試験の後に、当業者に容易に理解される。
【０１０２】
一般的に、少なくとも約５％ｗ／ｖ（重量／容量）から約２５％ｗ／ｖ、通常少なくとも８％ｗ／ｖの金属ハロゲン化物が濃縮酵素変異体溶液へ加えられる。一般的に、約２５％ｗ／ｖ以下、通常約２０％ｗ／ｖ以下の金属ハロゲン化物が濃縮酵素変異体溶液へ加えられる。金属ハロゲン化沈殿剤の最適濃度は特に、本開示の特定のアルファ・アミラーゼの性質及びその溶液中の濃度に依存する。
【０１０３】
酵素を沈殿させる別の方法は、濃縮酵素変異体溶液へ加えられ得る有機化合物の使用である。有機化合物沈殿剤は、４−ヒドロキシ安息香酸、４−ヒドロキシ安息香酸のアルカリ金属塩、４−ヒドロキシ安息香酸のアルキルエステル及びこれらの有機化合物の二以上の混合物を含み得る。前記有機化合物沈殿剤の添加は、金属ハロゲン化沈殿剤の添加の前、同時またはその後に行うことが出来る。また、両沈殿剤、有機化合物と金属ハロゲン化物の添加は、連続的にまたは同時に行われることが出来る。さらなる説明については、例えば、ダニスコＵＳ・インク、ジェネンコー・ディビジョンの米国特許番号５，２８１，５２６を参照されたい。
【０１０４】
一般的に、有機化合物沈殿剤は、４−ヒドロキシ安息香酸のアルカリ金属塩、例えば、ナトリウム塩またはカリウム塩等、アルキル基が１−１２個の炭素原子を含む、４−ヒドロキシ安息香酸の直鎖または分岐アルキルエステル、及び二以上のこれらの有機化合物の混合物からなる群から選択される。前記有機化合物沈殿剤は、例えば、アルキル基が１−１０個の炭素原子を含む、４−ヒドロキシ安息香酸の直鎖または分岐アルキルエステル、及びこれらの有機化合物の二以上の混合物とすることが出来る。適した有機化合物は、アルキル基が１−６個の炭素原子を含む、４−ヒドロキシ安息香酸の直鎖アルキルエステル、及びこれらの有機化合物の二以上の混合物を含む。４−ヒドロキシ安息香酸のメチルエステル、４−ヒドロキシ安息香酸のプロピルエステル、４−ヒドロキシ安息香酸のブチルエステル、４−ヒドロキシ安息香酸のエチルエステル、及びこれらの有機化合物の二以上の混合物もまた使用されることが出来る。追加の有機化合物はまた、４−ヒドロキシ安息香酸メチルエステル（メチルパラベン）及び４−ヒドロキシ安息香酸プロピルエステル（プロピルパラベン）を含むが、これらに限られず、これらはまた、アミラーゼ保存剤でもある。このような有機化合物沈殿剤の添加は、ｐＨ、温度、酵素濃度、沈殿剤濃度及びインキュベーション時間に関する沈殿条件に高い柔軟性を与える利点を有する。一般的に、少なくとも０．０１％ｗ／ｖ、通常少なくとも０．０２％ｗ／ｖの有機化合物沈殿剤が濃縮酵素変異体溶液へ加えられる。一般的に、０．３％ｗ／ｖ以下、通常０．２％ｗ／ｖ以下の有機化合物沈殿剤が濃縮酵素変異体溶液に加えられる。
【０１０５】
金属ハロゲン化沈殿剤及び、一の側面において、前記有機化合物沈殿剤を含む濃縮酵素溶液は、精製される酵素変異体に必然的に依存するｐＨに調整される。一般的に、このｐＨは、アミラーゼの等電点（ｐＩ）近傍の水準に調整される。例えば、このｐＨは、ｐＩより約２．５ｐＨ単位下からｐＩより約２．５ｐＨ単位上の範囲内に調整されることが出来る。このｐＨは、変異体のｐＩが野生型のｐＩと異なる場合、それ相応に調整されることが出来る。
【０１０６】
精製された酵素沈殿物を得るために必要なインキュベーション時間は、その特定の酵素の性質、酵素の濃度及び特定の沈殿剤及びその濃度に依存する。一般的に、酵素変異体を沈殿させるために有効な時間は、約１−約３０時間、通常約２５時間を超えない。有機化合物沈殿剤の存在下では、インキュベーション時間はさらに約１０時間未満まで減少し、ほとんどの場合、さらに約６時間にまで減少出来る。
【０１０７】
一般的に、インキュベーション中の温度は、約４℃−５０℃である。通常、この方法は、約１０℃−約４５℃の温度で行われ、特に、約２０℃−約４０℃で行われる。沈殿を誘発する最適温度は、溶液条件及び酵素または使用する沈殿剤に従い変わる。
【０１０８】
精製された酵素沈殿の全般的な回収、及び過程が行なわれる効率、酵素及び追加金属ハロゲン化物及び追加有機化合物を含む溶液の撹拌により改良される。精製された酵素沈殿物の総回収量と、この過程が行われる効率は、酵素、添加された金属ハロゲン化物及び添加された有機化合物を含む溶液の撹拌（ａｇｉｔａｔｉｎｇ）により改善される。撹拌段階は、金属ハロゲン化物と有機化合物の添加中及びその後のインキュベーション期間の両方において行われる。適した撹拌法は、機械的撹拌（ｓｔｉｒｒｉｎｇ）または振とう、激しい空気導入、または任意の類似技術を含む。
【０１０９】
インキュベーション期間後、精製された酵素は、その後解離した色素と他の不純物から分離され、ろ過、遠心分離、精密ろ過、ロータリー真空ろ過、精密ろ過、加圧ろ過、交膜精密ろ過、交流膜精密ろ過等のような従来の分離技術によりさらに精製される。交膜精密ろ過は使用される一方法である。精製された酵素沈殿物のさらなる精製は、この沈殿物を水で洗浄することにより行うことが出来る。例えば、精製された酵素沈殿物は、金属ハロゲン化沈殿剤を含む水、例えば、金属ハロゲン化物及び有機化合物沈殿剤を含む水で洗浄される。
【０１１０】
培養の間、発現された酵素は、培養液中で蓄積され得る。発現された酵素の単離と精製のため、培養液が遠心分離されまたはろ過され、細胞が除かれる。また、得られた細胞を含まない液体は、酵素の精製に使用されことが出来る。一の実施態様において、この細胞を含まない培養液は、約７０％飽和度の硫酸アンモニウムを使用した塩析を受ける。この７０％飽和−沈澱分画は次に、緩衝液に溶解され、セファデックスＧ−１００カラムのようなカラムに移され、酵素活性分画を回収するために溶出される。さらに精製するため、イオン交換クロマトグラフィーのような従来の方法も使用出来る。
【０１１１】
精製された酵素は、酵素が一般的に利用される全ての用途で有用である。例えば、それらは、洗濯洗剤やシミ取り剤、食品産業において、デンプン加工やベーキング及び消化剤としての医薬品組成物で使用出来る。それらは、液体（溶液、スラリー）または固形物（顆粒、粉末）のどちらかの最終製品に作られることが出来る。
【０１１２】
あるいは、前記酵素生成物は回収され得、さらに酵素が精製されることなく、ろ過または遠心分離により細胞や細胞の破片を除去するために、培地へ凝集剤が加えられる。
【０１１３】
上述の方法により生産及び精製されたアルファ・アミラーゼは、種々の有用な産業的用途で使用されることが出来る。この酵素は、繊維及び家庭用品ケア（Ｆ＆ＨＣ）に関する用途に適する有益な性質を有する。例えば、本開示のアルファ・アミラーゼは、洗浄、食器洗浄及び硬質表面洗浄洗剤組成物の成分として使用出来る。本開示のアルファ・アミラーゼはまた、デンプンからの甘味料とエタノールの生産及び／または織物の糊抜きにも有用である。本開示のアルファ・アミラーゼは特に、例えば、国際公開番号ＷＯ２００５／１１１２０３及び２００６年１月１９日に米国で公開された特許出願番号２００６／００１４２６５（ダニスコＵＳ・インク、ジェネンコー・ディビジョン）で記載されるようなデンプン液化及び／または糖化過程を含むデンプン転換処置に有用である。本開示のアルファ・アミラーゼのこれらの使用は、下記により詳しく述べる。
【０１１４】
５．デンプン加工のための組成物
５．１．液化及び糖化
一の側面において、アルファ・アミラーゼを含む組成物は、例えば、液化及び／または糖化等のデンプン加工に利用出来る。この加工は、顆粒デンプンの初期ゼラチン化温度より低い温度でのゼラチン化デンプンまたは顆粒デンプンのスラリーの加水分解、特に可溶性デンプン加水分解産物への顆粒デンプンの加水分解を含むことが出来る。デンプン加工は、甘味料の生産、燃料または飲用アルコール（すなわち、飲料用アルコール）の生産、飲料の生産、サトウキビの加工または所望の有機化合物、例えば、クエン酸、イタコン酸、乳酸、グルコン酸、ケトン、アミノ酸、抗生物質、酵素、ビタミン及びホルモンの生産に有用である。デンプンのフルクトースシロップへの変換は普通、三個の連続した酵素工程からなる。すなわち、液化工程、糖化工程及び異性化工程である。
【０１１５】
本明細書で用いる「液化」または「液化する」の語は、デンプンがより粘度の低い、分子鎖の短いデキストリンに変換される過程をいう。一般的に、この過程は、本開示のアルファ・アミラーゼの添加と同時またはその後のデンプンのゼラチン化を伴う。本明細書で用いる「第一液化」の語は、スラリーの温度がそのゼラチン化の温度またはその付近まで上昇する場合の液化工程をいう。温度の上昇の後、このスラリーは、熱交換器または噴流を通して約９０−１５０℃、例えば１００−１１０℃の温度に移される。熱交換または噴流温度に適用された後、スラリーは、この温度で３−１０分間保持される。スラリーを９０−１５０℃で保持するこの工程は、第一液化と呼ばれる。
【０１１６】
本明細書で用いる「第二液化」の語は、スラリーが室温にまで冷却される、第一液化（９０−１５０℃までの加熱）の後の液化工程をいう。この冷却工程は、３０分−１８０分、例えば、９０分−１２０分の間とすることが出来る。本明細書で用いる「第二液化の経過分数」の語は、第二液化の開始からデキストロース等価物（ＤＥ）が測定される時間まで経過した時間をいう。
【０１１７】
液化工程の後、デキストリンは通常、グルコアミラーゼ（例えば、ノボザイムズ、Ａ／ＳのＡＭＧ（商標））、及び任意に脱分岐酵素、例えば、イソアミラーゼまたはプルラナーゼ（例えば、ノボザイムズ、Ａ／ＳのＰｒｏｍｏｚｙｍｅ（登録商標））の添加によりデキストロースへ変換出来る。この工程の前に、ｐＨは通常、約４．５より低い値に下げられ、一方温度は９５℃より高温に維持され、それにより、液化アルファ・アミラーゼ変異体の活性が変性される。次に、温度は６０℃にまで下げられ、グルコアミラーゼと脱分岐酵素が加えられる。この糖化工程は通常、約２４時間−約７２時間行われる。
【０１１８】
本開示のアルファ・アミラーゼの利点は、マルトース、マルトトリオース及びマルトヘプタオースのような複合糖類の分解を触媒するその能力である。この理由から、糖化は、グルコアミラーゼと共にＡｍｙＥまたはその変異体により触媒されることが出来る。本開示のアルファ・アミラーゼの別の利点は、グルコアミラーゼに最適な同一の反応条件下で、その作用によりまたは本開示の一以上のアルファ・アミラーゼにより、デキストリンがデキストロースに変換されることが出来るということである。ＡｍｙＥ及びその変異体のこの有利な特性は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、２００８年６月６日に出願された米国仮出願番号６１／０５９，６１８に開示される。ＡｍｙＥ及びその変異体は、グルコアミラーゼと同一のｐＨ及び温度で機能するため、ＡｍｙＥ及びその変異体は、グルコアミラーゼによるか、またはＡｍｙＥまたはその変異体及びグルコアミラーゼの反応混液による追加的触媒の前またはその後に加えられることが出来る。従って、グルコアミラーゼの使用に適合するように反応のｐＨ及び温度を調節するための、遅れが回避される。
【０１１９】
グルコアミラーゼは通常、糖化において単独で用いられた場合、０．５のグルコアミラーゼ活性単位（ＧＡＵ）／ｇ  ＤＳ（すなわち、乾燥固形物のグラム当たりのグルコアミラーゼ活性単位）以下またはさらにそれ未満の量で存在する。グルコアミラーゼは、０．０２−２．０ＧＡＵ／ｇ  ＤＳまたは０．１−１．０ＧＡＵ／ｇ  ＤＳ、例えば、０．２ＧＡＵ／ｇ  ＤＳの量で加えられることが出来る。グルコアミラーゼは微生物または植物に由来する。例えば、グルコアミラーゼは、菌類または細菌起源ものとすることが出来る。細菌性グルコアミラーゼの例は、アスペルギルス・グルコアミラーゼ、特に、Ａ．ニガーＧ１またはＧ２グルコアミラーゼ（Ｂｏｅｌ他、ＥＭＢＯ  Ｊ．、第３巻（５）、１０９７−１１０２ページ、（１９８４年））または国際公開番号ＷＯ９２／００３８１及びＷＯ００／０４１３６で開示されるようなそれらの変異体、Ａ．アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ（国際公開番号ＷＯ８４／０２９２１）、Ａ．オリゼ・グルコアミラーゼ（Ｈａｔａ他、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第５５巻（４）、９４１−９４９ページ、（１９９１年））、またはそれらの変異体または断片である。一の実施態様において、前記工程は、国際公開番号ＷＯ９８／２２６１３で開示される種類の炭水化物結合ドメインの使用をさらに含む。他の意図されるアスペルギルス・グルコアミラーゼ変異体は、熱安定性を増強する変異体を含む。すなわち、Ｇ１３７Ａ及びＧ１３９Ａ（Ｃｈｅｎ他、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．、第９巻、４９９−５０５ページ（１９９６年））、Ｄ２５７Ｅ及びＤ２９３Ｅ／Ｑ（Ｃｈｅｎ他、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．、第８巻、５７５−５８２ページ（１９９５年））、Ｎ１８２（Ｃｈｅｎ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、第３０１巻、２７５−２８１ページ（１９９４年））、ジスルフィド結合、Ａ２４６Ｃ（Ｆｉｅｒｏｂｅ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３５巻、８６９８−８７０４ページ（１９９６年））、及び位置Ａ４３５及びＳ４３６のプロ残基の導入（Ｌｉ他、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、第１０巻、１１９９−１２０４ページ（１９９７年））を含む。他の意図されるグルコアミラーゼは、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）グルコアミラーゼ、特に、Ｔ．エメルソニ（Ｔ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）（国際公開番号ＷＯ９９／２８４４８）、Ｔ．
リイセッタヌス（Ｔ．ｌｅｙｃｅｔｔａｎｕｓ）（米国特許番号ＲＥ３２、１５３）、Ｔ．デュポンティ（Ｔ．ｄｕｐｏｎｔｉ）、またはＴ．サーモフィルス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（米国特許番号４，５８７，２１５）を含む。意図される細菌性グルコアミラーゼは、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属由来のグルコアミラーゼ、特に、Ｃ．サーモアミロリチカム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）（ＥＰ１３５１３８）及びＣ．サーモヒドロスルフリカム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｍ）（国際公開番号ＷＯ８６／０１８３１）を含む。適したグルコアミラーゼは、アスペルギルス・オリゼ由来のグルコアミラーゼ、例えば、国際公開番号ＷＯ００／０４１３６の配列番号２に示されるアミノ酸配列と５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％またはさらに９０％の相同性を有するグルコアミラーゼを含む。また、市販のグルコアミラーゼ、例えば、ＡＭＧ２００Ｌ、ＡＭＧ３００Ｌ、ＳＡＮ（商標）ＳＵＰＥＲ及びＡＭＧ（商標）Ｅ（ノボザイムズ）、ＯＰＴＩＤＥＸ（登録商標）３００（ダニスコＵＳ・インク、ジェネンコー・ディビジョン）、ＡＭＩＧＡＳＥ（商標）及びＡＭＩＧＡＳＥ（商標）ＰＬＵＳ（ＤＳＭ）、Ｇ−ＺＹＭＥ（登録商標）Ｇ９００（エンザイム・バイオ・システム）、及びＧ−ＺＹＭＥ（登録商標）Ｇ９９０ＺＲ（Ａ．ニガー・グルコアミラーゼ及びプロテアーゼ低含量）が適する。
【０１２０】
本開示のアルファ・アミラーゼは、（例えば、糖化に用いられる組成物等として）有利にデンプン加工に用いられる組成物中でグルコアミラーゼと組み合わされることが出来る。ＡｍｙＥまたはその変異体の有利な特性のため、例えば、約５０％、約４５％、約４０％、約３５％、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％または約１０％少なく減少された量のグルコアミラーゼが、グルコアミラーゼを単独で用いる場合と同等な糖化の結果を達成するために十分であることが出来る。
【０１２１】
別の実施態様において、本開示のアルファ・アミラーゼは、広い活性スペクトルを有する「カクテル」を提供するために他のアルファまたはベータ・アミラーゼ、または他の酵素と組み合わされることが出来る。例えば、前記デンプンは、菌性アルファ・アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１）、細菌性アルファ・アミラーゼ、例えば、バチルス・アルファ・アミラーゼまたは非バチルス・アルファ・アミラーゼ及び／またはベータ・アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．２）から成る群から選ばれる一以上の酵素と接触することが出来る。一の実施態様において、さらに別のデンプン分解酵素またはイソアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６８）のような脱分岐酵素、またはプルラナーゼ（ＥＣ３．２．１．４１）が、本開示のアルファ・アミラーゼに加えられることが出来る。イソアミラーゼは、アミロペクチンとβ−制限デキストリンのα−１，６−Ｄ−グルコシド分岐結合を加水分解し、イソアミラーゼがプルランを攻撃できない点及びα−制限デキストリンに対するイソアミラーゼの作用が制限される点でプルラナーゼから識別出来る。脱分岐酵素は、当業者によく知られる有効量で加えられることが出来る。
【０１２２】
フィターゼは、インキュベーション及び液化工程の限定条件下でフィチン酸を加水分解出来ることから、本発明に係る開示に有用である。いくつかの実施態様において、フィターゼは、イノシトール６リン酸（フィチン酸）から少なくとも一の無機リン酸塩を遊離することが出来る。フィターゼは、加水分解が開始される（例えば、３−フィターゼ（ＥＣ３．１．３．８）または６−フィターゼ（ＥＣ３．１．３．２６）としての）フィチン酸塩分子上のリン酸エステル群の特定位置への優先に従って分類することが出来る。フィターゼの代表例は、ミオイノシトール−ヘキサキスリン酸塩−３−リン酸ヒドロラーゼである。
【０１２３】
フィターゼは、菌類及び／または細菌性生物のような微生物から得ることが出来る。これらの微生物のいくつかは、例えば、アスペルギルス（例えば、Ａ．ニガー、Ａ．テレウス（Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ）、Ａ．フィカム（Ａ．ｆｉｃｕｍ）及びＡ．フミガタス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ））、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）（Ｍ．サーモフィラ（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ））、タラロミセス（Ｔ．サーモフィラス）、トリコデルマ種（Ｔ．リーセイ）、及びサーモミセス（国際公開番号ＷＯ９９／４９７４０）を含む。フィターゼは、ペニシリウム種、例えば、Ｐ．ホルデイ（Ｐ．ｈｏｒｄｅｉ）（ＡＴＣＣ番号２２０５３）、Ｐ．ピセウム（Ｐ．ｐｉｃｅｕｍ）（ＡＴＣＣ番号１０５１９）またはＰ．ブレビ・コムパクタム（Ｐ．ｂｒｅｖｉ−ｃｏｍｐａｃｔｕｍ）（ＡＴＣＣ番号４８９４４）からさらに利用可能である。例えば、米国特許番号６，４７５，７６２を参照されたい。加えて、フィターゼは、バチルス（例えば、Ｂ．ズブチリス）、シュードモナス、ペニオフォラ（Ｐｅｎｉｏｐｈｏｒａ）、大腸菌、シトロバクター、腸内菌（Ｅｎｔｅｒｂａｃｔｅｒ）及びブッティアウキセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）から利用可能である（国際公開番号ＷＯ２００６／０４３１７８を参照されたい）。
【０１２４】
商業用フィターゼは、ＮＡＴＵＰＨＯＳ（バスフ）、ＲＯＮＯＺＹＭＥ  Ｐ（ノボザイムズＡ／Ｓ）、ＰＨＺＹＭＥ  ＸＰ（ダニスコＡ／Ｓ）及びＦＩＮＡＳＥ（ＡＢエンザイムズ）等が市販される。微生物フィターゼ活性を測定するための方法及びフィターゼ単位の定義は、Ｅｎｇｅｌｅｎ他、Ｊ．ｏｆ  ＡＯＡＣ  Ｉｎｔ．、第７７巻、７６０−７６４ページ（１９９４年）で公開されている。フィターゼは、野生型フィターゼ、変異体またはそれらの断片とすることが出来る。
【０１２５】
一の実施態様において、フィターゼは、細菌性ブッティアウキセラ種に由来するものである。ブッティアウキセラ種は、Ｂ．アグレスティス（Ｂ．ａｇｒｅｓｔｉｓ）、Ｂ．ブレンネレイ（Ｂ．ｂｒｅｎｎｅｒａｅ）、Ｂ．フェルラグティアーゼ（Ｂ．ｆｅｒｒａｇｕｔｉａｓｅ）、Ｂ．ガヴィニエイ（Ｂ．ｇａｖｉｎｉａｅ）、Ｂ．イザルディ（Ｂ．ｉｚａｒｄｉｉ）、Ｂ．ノアキエイ（Ｂ．ｎｏａｃｋｉａｅ）及びＢ．ワームボルディエイ（Ｂ．ｗａｒｍｂｏｌｄｉａｅ）を含む。ブッティアウキセラ種の株は、ＤＳＭＺ、ドイツ国立生物材料資源センター（ｔｈｅ  Ｇｅｒｍａｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌ）（Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｂｅ  ７Ｂ、３８１２４ブラウンシュワイク、ドイツ）から利用可能である。登録番号ＮＣＩＭＢ４１２４８で寄託されるブッティアウキセラ種株Ｐ１−２９は、フィターゼが得られる株であり、本発明に係る開示に従って用いられることが出来る、特に有用な株の例である。いくつかの実施態様において、フィターゼは、ＢＰ野生型、国際公開番号ＷＯ０６／０４３１７８で開示されるその変異体（例えば、ＢＰ−１１）、または２００８年９月１１日に公開された米国特許出願番号ＵＳ２００８／０２２０４９８で開示されるような変異体である。例えば、ＢＰ野生型及びその変異体は、国際公開番号ＷＯ０６／０４３１７８の表１で開示される。ここで、その番号付けは、前記公開ＰＣＴ出願の配列番号３を参照している。
【０１２６】
ベータ・アミラーゼは、エキソ活性のマルトース生産性アミラーゼであり、アミロース、アミロペクチン及び関連するグルコースポリマーへの１，４−α−グルコシド結合の加水分解を触媒し、それによりマルトースを遊離する。ベータ・アミラーゼは、種々の植物及び微生物から単離される（Ｆｏｒｇａｒｔｙ他、ＰＲＯＧＲＥＳＳ  ＩＮ  ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ、第１５巻、１１２−１１５ページ、１９７９年）。これらのベータ・アミラーゼは、４０℃−６５℃の範囲の最適温度及び約４．５−約７．０の範囲の最適ｐＨを有することにより特徴付けられる。意図されるベータ・アミラーゼは、大麦ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＢＢＡ１５００、ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＤＢＡ、Ｏｐｔｉｍａｌｔ（商標）ＭＥ、Ｏｐｔｉｍａｌｔ（商標）ＢＢＡ（ダニスコＡ／Ｓ）及びＮｏｖｏｚｙｍ（商標）ＷＢＡ（ノボザイムズＡ／Ｓ）からのベータ・アミラーゼを含むが、それらに限られない。
【０１２７】
糖化加工の後、デキストロース・シロップは、例えば、（Ｓｗｅｅｔｚｙｍｅ（登録商標）のような）固定されたグルコースイソメラーゼを用いて、フルクトース高含有シロップに転換されることが出来る。一の関係において、この工程の可溶性デンプン加水分解産物は、フルクトース高含有コーンシロップ（ＨＦＣＳ）のようなフルクトース高含有デンプンベースのシロップ（ＨＦＳＳ）へ転換される。この転換は、グルコースイソメラーゼ、特に、固形担体上で固定されたグルコースイソメラーゼを用いて達成されることが出来る。意図されるイソメラーゼは、市販品Ｓｗｅｅｔｚｙｍｅ（登録商標）ＩＴ（ノボザイムズＡ／Ｓ）、Ｇ−ｚｙｍｅ（登録商標）ＩＭＧＩ、及びＧ−ｚｙｍｅ（登録商標）Ｇ９９３、Ｋｅｔｏｍａｘ（登録商標）、Ｇ−ｚｙｍｅ（登録商標）Ｇ９９３リキッド及びＧｅｎＳｗｅｅｔ（登録商標）ＩＧＩ（ダニスコＵＳ・インク、ジェネンコー・ディビジョン）を含む。
【０１２８】
１ｍＭ  Ｃａ２＋以上の添加が通常、アルファ・アミラーゼの十分に高い安定性を確実にするために要求される一方、遊離Ｃａ２＋は、グルコースイソメラーゼの活性を強く抑制する。従って、Ｃａ２＋は通常、費用のかかる単位操作を用いて、異性化の前に削除され、それにより、遊離Ｃａ２＋濃度は３−５ｐｐｍ未満に抑えられる。もしこのような操作が避けられるのであれば、費用の削減が望めるだろう。
【０１２９】
本開示のアルファ・アミラーゼは、安定性のために追加されるＣａ２＋を有利にほとんどまたは全く必要としない。この理由から、液化及び／または糖化反応に加えられるＣａ２＋は、減少もしくは全てが除去されることが出来る。従って、反応混合物をグルコースイソメラーゼと接触させる前に行うイオン交換によるＣａ２＋の除去を避けることができ、時間及び費用の節約、さらにはフルクトース高含有シロップの生産工程の効率を増加させることが出来る。
【０１３０】
加工されるデンプンは、塊茎、塊根、幹、マメ科植物、穀類または全粒粉から得られることが出来る。より具体的に、顆粒デンプンは、トウモロコシ、穂軸、小麦、大麦、ライ麦、ミロ、サゴ、キャッサバ、タピオカ、モロコシ、米、えんどう、豆、バナナまたはじゃがいもから得られることが出来る。特に、トウモロコシや大麦のワックス・タイプ及び非ワックス・タイプの両方が意図される。デンプンは、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９．５％の純度等の高度に精製されたデンプンとすることが出来る。あるいは、前記デンプンは、細菌の残渣及び繊維等の非デンプン画分を含む、粉砕された全粒粉を含有する材料を含む、より粗いデンプンとすることが出来る。全粒粉等のような原料は、構造を開き、更なる加工を可能にするため、粉砕される。
【０１３１】
二式の粉砕工程、すなわち、湿式及び乾式粉砕が適当である。乾式粉砕において、全穀粒が粉砕及び使用される。湿式粉砕は、細菌と穀粉（デンプン顆粒とタンパク質）の優れた分離を行い、シロップの生産に使用される場合に、通常使用される。乾式粉砕及び湿式粉砕の両方は、デンプン処理の当該技術分野で周知であり、開示される前記組成物及び方法での使用も意図される。前記加工は、酵素、未加工のデンプン及び水が存在する再循環の下で保持液が保たれる、限外ろ過装置で行われることができ、当該透過液は、可溶性デンプン加水分解産物である。別の方法では、前記加工は、酵素、未加工のデンプン及び水が存在する再循環の下で保持液が保たれる、限外ろ過膜を有する連続膜反応器で行われ、当該透過液は、可溶性デンプン加水分解産物である。また、前記加工は、酵素、未加工のデンプン及び水が存在する再循環の下で保持液が保たれる、精密ろ過膜を有する連続膜反応器で行われ、当該透過液は、可溶性デンプン加水分解産物であることも意図される。
【０１３２】
乾式粉砕穀物はデンプンに加えて、大量の非デンプン炭水化物化合物を含む。そのような不均一物質が噴流加熱（ｊｅｔ  ｃｏｏｋｉｎｇ）により処理される場合、しばしば一部のデンプンゼラチン化のみしか行われない。従って、非ゼラチン化デンプンへの高い活性を有する本開示のアルファ・アミラーゼは、噴流加熱され乾式粉砕されたデンプンを処理する液化及び／または糖化を含む加工に有利に適用されることが出来る。
【０１３３】
上記側面のいずれかで使用されるデンプンスラリーは、約２０％−約５５％の乾燥固形物顆粒デンプン、約２５％−約４０％の乾燥固形物顆粒デンプン、または約３０％−約３５％の固形物顆粒デンプンを含むことが出来る。この酵素変異体は、顆粒デンプンの可溶性デンプンを可溶性デンプン加水分解産物に少なくとも８５％の量で、少なくとも８６％の量で、少なくとも８７％の量で、少なくとも８８％の量で、少なくとも８９％の量で、少なくとも９０％の量で、少なくとも９１％の量で、少なくとも９２％の量で、少なくとも９３％の量で、少なくとも９４％の量で、少なくとも９５％の量で、少なくとも９６％の量で、少なくとも９７％の量で、少なくとも９８％の量でまたは少なくとも９９％の量で変換する。
【０１３４】
別の実施態様において、本開示のアルファ・アミラーゼは、発酵産物、例えば、エタノールを生産するための発酵をさらに含むデンプン加工で使用される。発酵によりデンプン含有材料からエタノールを生産するそのような方法は、（ｉ）デンプン含有材料の液化、（ｉｉ）得られた液化マッシュの糖化、及び（ｉｉｉ）発酵生物の存在下、工程（ｉｉ）で得られた材料の発酵を含む。任意に、この加工は、エタノールの回収をさらに含む。発酵の間、エタノール含量は、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、例えば、少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１３％、少なくとも約１４％、少なくとも約１５％または少なくとも約１６％のエタノールに達する。
【０１３５】
糖化及び発酵工程は、同時糖化発酵（ＳＳＦ）工程として行われることが出来る。発酵が加水分解と同時に行われる場合、温度は、３０℃と３５℃の間、特に３１℃と３４℃の間とすることが出来る。この工程は、酵素、未加工のデンプン、酵母、酵母の栄養素及び水が存在する再循環の下で保持液が保たれ、透過物がエタノール含有液である限外ろ過システムで行われることが出来る。または、この工程は、酵素、未加工のデンプン、酵母、酵母の栄養素と水が存在する再循環の下で保持液が保たれ、透過物がエタノール含有液である、限外ろ過膜を有する連続膜反応器で行われることも意図される。
【０１３６】
この工程の可溶性デンプン加水分解産物は、前記処理されたデンプンを発酵産物、例えば、クエン酸、グルタミン酸モノナトリウム、グルコン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸カリウム、グルコン酸デルタラクトンまたはエリソルビン酸ナトリウム等へ発酵させる工程を含む発酵産物の生産に使用されることが出来る。
【０１３７】
５．２．デンプンからのエタノール生産
一般的に、全粒粉からのアルコール生産（エタノール）は、四個の主要工程に分けることが出来る。すなわち、粉砕、液化、糖化及び発酵である。グルコアミラーゼ及び本開示のアルファ・アミラーゼは、糖化で用いられることが出来る。
【０１３８】
穀粒は、構造を開き、更なる工程を可能にするために粉砕される。一般に用いられる二式の粉砕工程は、湿式または乾式粉砕である。乾式粉砕において、全穀粒が粉砕され、この工程の残渣部分が使用される。湿式粉砕は、細菌と穀粉（デンプン顆粒とタンパク質）の優れた分離を行い、わずかな例外を除き、シロップ剤の並行生産がある場所に適用される。
【０１３９】
液化工程において、デンプン顆粒は、ほとんどが４を超えるＤＰのマルトデキストリンへの加水分解により可溶性になる。加水分解は、酸処理またはアルファ・アミラーゼにより酵素的に行なわれることが出来る。酸加水分解は、限定的な基準量（ａ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｂａｓｉｓ）で用いられる。原料は、粉砕された全粒粉またはデンプン加工からの副流産物とすることが出来る。酵素液化は通常、三工程の高温スラリー過程として行なわれる。スラリーは、約６０−９５℃の間、通常約８０−８５℃に加熱され、酵素が添加される。次に、スラリーは、約９５−１４０℃の間、通常約１０５−１２５℃に噴流加熱された後、約６０−９５℃に冷却され、また、追加の酵素が、最終加水分解産物を得るために添加される。液化工程は、約ｐＨ４．５−６．５、通常約５．０から約６．０の間のｐＨで行われる。粉砕され、液化された穀粒は、マッシュとしても知られる。
【０１４０】
酵母により代謝される低分子の糖ＤＰ１−３を生産するために、液化からのマルトデキストリンは、さらに加水分解または糖化される必要がある。加水分解は通常、グルコアミラーゼ、あるいはアルファ・グルコシダーゼまたは酸アルファ・アミラーゼを用いて酵素的に行われる。一の実施態様において、グルコアミラーゼ及びＡｍｙＥまたはその変異体は、糖化で用いられる。完全な糖化工程は、最高７２時間続く可能性があるが、通常４０−９０分間のプレ糖化のみを行い、次に、発酵（ＳＳＦ）中で糖化を完了させることが一般的である。糖化は、約３０−６５℃、通常約６０℃前後の温度かつ約ｐＨ４．５で一般に行われる。
【０１４１】
酵母は通常、サッカロミセス種に由来し、マッシュに添加される。また、発酵は、２４−９６時間、例えば、通常３５−６０時間進行される。温度は、約２６−３４℃の間、通常約３２℃であり、ｐＨは、約ｐＨ３−６、通常約ｐＨ４−５前後である。最も広く使用される工程は、同時糖化発酵（ＳＳＦ）工程であることに留意されたい。ここで、糖化のために維持される工程はなく、これは酵母と酵素が同時に添加されることを意味する。ＳＳＦを行う場合、発酵直前に、５０℃以上の温度でプレ糖化工程を導入することは一般的である。
【０１４２】
発酵に続きマッシュは、エタノールを抽出するために蒸留される。本開示の工程に従って得られたエタノールは、例えば、燃料エタノール、飲料エタノール、すなわち、飲用中性スピリッツまたは産業エタノールとして使用されることが出来る。発酵後の残りは、穀物であり、液体の形態または乾燥された形態のいずれかの飼料に通常用いられる。エタノールの液化、糖化、発酵、蒸留及び回収を行なう方法についてのさらなる詳細は、当業者によく知られている。本開示の工程に従って、糖化及び発酵は、同時にまたは別途行なわれることが出来る。
【０１４３】
５．３．洗浄及び食器洗浄用組成物とその使用
本開示のＡｍｙＥまたはその変異体は、例えば、食器洗浄やその他の洗浄用組成物に用いられる洗剤組成物に配合されることが出来る。これらの組成物は、ゲル状、粉末状または液状とすることが出来る。前記組成物は、アルファ・アミラーゼ変異体単独から成るものでもよく、他の澱粉分解酵素、他の洗浄酵素及びその他の洗浄用組成物に一般的に用いられる成分が含まれることが出来る。
【０１４４】
従って、食器洗浄用組成物に、界面活性剤が含まれることが出来る。界面活性剤は、陰イオン性、非イオン性、カチオン性、両性イオン性、またはこれらのタイプの界面活性剤の混合物でもよい。洗剤には、低発泡性から非発泡性の直鎖アルコールエトキシレート、プロポキシレート等の非イオン性界面活性剤が重量で０％−約９０％含まれる。
【０１４５】
洗剤用途において、ＡｍｙＥまたはその変異体は通常、プロピレングリコールを含む液状組成物で用いられる。ＡｍｙＥまたはその変異体は、例えば、１０％の塩化カルシウムを含有する２５％容積／容積プロピレングリコール中を循環させる等により、プロピレングリコールに溶解されることが出来る。
【０１４６】
食器洗剤用組成物には、無機及び／または有機タイプの洗剤ビルダー塩が含まれることが出来る。洗剤ビルダーは、リン含有タイプと非リン含有タイプとに分類されることが出来る。洗剤組成物は通常、約１％−約９０％の洗剤ビルダーを含有する。用いられる場合、リン含有無機アルカリ性洗剤ビルダーの例には、水溶性塩、特に、アルカリ金属ピロリン酸塩、オルトリン酸塩及びポリリン酸塩が含まれる。用いられる場合、リン含有有機アルカリ性洗剤ビルダーの例には、水溶性ホスホン酸塩が含まれる。用いられる場合、非リン含有無機ビルダーの例には、水溶性アルカリ金属炭酸塩、ホウ酸塩及びケイ酸塩の他、ゼオライトに最も代表される種々のタイプの水不溶性の結晶または無定形アルミノケイ素塩が含まれる。
【０１４７】
適した有機ビルダーの例には、アルカリ金属、アンモニウム及び置換アンモニウム、クエン酸塩、コハク酸塩、マロン酸塩、脂肪酸スルホン酸塩、カルボキシメトキシ・コハク酸塩、アンモニウムポリ酢酸、カルボン酸塩、ポリカルボン酸塩、アミノポリカルボン酸塩、ポリアセチルカルボン酸塩及びポリヒドロキシスルホン酸塩が含まれる。
【０１４８】
他の適した有機ビルダーには、ビルダーとしての性質を有することが知られている高分子量ポリマー及び共重合体が含まれ、その例として、適切なポリアクリル酸、ポリマレイン酸、ポリアクリル酸／ポリマレイン酸共重合体、及びこれらの塩が挙げられる。
【０１４９】
洗浄用組成物には、塩素／臭素タイプ、または酸素タイプの漂白剤が含まれることが出来る。無機塩素／臭素タイプ漂白剤の例として、リチウム、ナトリウム、またはカルシウム次亜塩素酸塩及びカルシウム次亜臭素酸塩の他、塩化リン酸三ナトリウムが挙げられる。有機塩素／臭素タイプ漂白剤の例として、トリクロロイソシアヌル酸、トリブロモイソシアヌル酸、ジブロモイソシアヌル酸、ジクロロイソシアヌル酸等のヘテロ環式Ｎ−ブロモイミド及びＮ−クロロイミド、あるいは、カリウムやナトリウム等の水溶性カチオンとのそれらの塩が挙げられる。ヒダントイン化合物も適している。
【０１５０】
洗浄用組成物は、任意に、漂白前駆体またはペルオキシ酸化合物と共に、例えば、無機過酸塩基の形態で酸素漂白剤を含むことが出来る。適したペルオキシ漂白化合物の代表的な例として、四水和及び一水和の両方のアルカリ金属過ホウ酸塩、アルカリ金属過炭酸塩、ケイ酸塩及び過リン酸塩が挙げられる。適した活性化物質の例は、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）及びグリセロール三酢酸塩を含む。例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ２００５／０５６７８３に開示される過ホウ酸塩または過炭酸塩、グリセロール三酢酸塩及びペルヒドラーゼのような、酵素漂白活性化システムを用いることも出来る。
【０１５１】
洗浄用組成物は、例えば、プロピレングリコール等のポリオール、糖または糖アルコール、乳酸、ホウ酸またはホウ酸誘導体（例えば、芳香族ホウ酸塩エステル）等の従来の酵素安定剤を用いて安定化されている。洗浄用組成物は、例えば、解膠剤、フィラー材、泡抑制剤、防食剤、土懸濁化剤、金属イオン封鎖剤、再汚染防止剤、脱水剤、染料、殺菌剤、蛍光剤、増粘剤、香料等の従来の洗剤成分をさらに含むことが出来る。
【０１５２】
最後に、ＡｍｙＥまたはその変異体は、従来の食器洗浄用洗剤、例えば、以下の特許公報で記載される任意の洗剤で用いられることが出来る。その際に、本開示のＡｍｙＥまたはその変異体は、以下に列記された特許または公開出願で開示される任意のアルファ・アミラーゼの代わりに、または、それらに加えて用いられるよう配慮される：ＣＡ２００６６８７、ＧＢ２２００１３２、ＧＢ２２３４９８０、ＧＢ２２２８９４５、ＤＥ３７４１６１７、ＤＥ３７２７９１１、ＤＥ４２１２１６６、ＤＥ４１３７４７０、ＤＥ３８３３０４７、ＤＥ４２０５０７１、ＷＯ９３／２５６５１、ＷＯ９３／１８１２９、ＷＯ９３／０４１５３、ＷＯ９２／０６１５７、ＷＯ９２／０８７７７、ＷＯ９３／２１２９９、ＷＯ９３／１７０８９、ＷＯ９３／０３１２９、ＥＰ４８１５４７、ＥＰ５３０８７０、ＥＰ５３３２３９、ＥＰ５５４９４３、ＥＰ４２９１２４、ＥＰ３４６１３７、ＥＰ５６１４５２、ＥＰ３１８２０４、ＥＰ３１８２７９、ＥＰ２７１１５５、ＥＰ２７１１５６、ＥＰ３４６１３６、ＥＰ５１８７１９、ＥＰ５１８７２０、ＥＰ５１８７２１、ＥＰ５１６５５３、ＥＰ５６１４４６、ＥＰ５１６５５４、ＥＰ５１６５５５、ＥＰ５３０６３５、ＥＰ４１４１９７、及び米国特許番号５，１１２，５１８、５，１４１，６６４及び５，２４０，６３２。
【０１５３】
５．４．洗濯用洗剤組成物及びその使用
実施態様に従って、一以上のＡｍｙＥまたはその変異体は、非粉塵飛散性の顆粒、安定化された液体または保護された酵素の形態で洗剤用組成物に含まれることが出来る。非粉塵飛散性の顆粒は、例えば、米国特許番号４，１０６，９９１及び４，６６１，４５２に開示されるように生産され、任意に、当該技術分野で知られる方法でコーティングされることが出来る。ワックスコーティング用材料の例には、ポリ（エチレンオキシド）生成物、平均分子量が１，０００から２０，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレンオキサイド単位が１６から５０のエトキシ化ノニルフェノール、アルコールが１２から２０の炭素原子を含み、１５から８０のエチレンオキシド単位がある、エトキシ化脂肪アルコール、脂肪アルコール、脂肪酸、脂肪酸のモノ、ジ、またはトリグリセリドが含まれる。流動床での使用に適したフィルムコーティング用材料の例は、例えば、英国特許番号ＧＢ１，４８３，５９１に開示されている。酵素調製液は、例えば、プロピレングリコール等のポリオール、糖、糖アルコール、乳酸、ホウ酸を既存の方法で添加して安定化されることが出来る。その他の酵素安定剤も当該技術分野でよく知られている。保護された酵素は、例えば、米国特許番号ＵＳ５，８７９，９２０（ダニスコＡ／Ｓ）または欧州特許番号ＥＰ２３８２１６で開示される方法に従って調製されることが出来る。ポリオールは、タンパク質の安定剤である他、タンパク質の溶解性を向上させることが長く知られている。例えば、Ｋａｕｓｈｉｋ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７８巻、２６４５８−６５ページ（２００３年）及びその引用文献、及びＭ．Ｃｏｎｔｉ他、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、第７５７巻、２３７−２４５ページ（１９９７年）を参照されたい。
【０１５４】
洗剤用組成物は、例えば、ゲル状、粉末状、顆粒状、ペースト状、または液状の任意の好都合な形態とすることが出来る。液状洗剤は、水性であり、通常最大約７０％の水と、０％から約３０％の有機溶剤とを含有し、約３０％の水のみを含む小型ゲルタイプの形態とすることも出来る。
【０１５５】
洗剤組成物は、一以上の陰イオン性、非イオン性、カチオン性、両性イオン性となり得る界面活性剤を含む。洗剤用組成物は通常、０％から約５０％の陰イオン性界面活性剤、例えば、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩（ＬＡＳ）、α−オレフィンスルホン酸塩（ＡＯＳ）、硫酸アルキル（脂肪アルコール硫酸塩）（ＡＳ）、アルコールエトキシ硫酸塩（ＡＥＯＳまたはＡＥＳ）、二級アルカンスルホン酸塩（ＳＡＳ）、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキルまたはアルケニルコハク酸または石鹸等を含む。洗剤用組成物は、例えば、国際公開番号ＷＯ９２／０６１５４に開示されているように、０％から約４０％の非イオン性界面活性剤、例えば、アルコールエトキシレート（ＡＥＯまたはＡＥ）、カルボキシル化アルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシ化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミドまたはポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド等をさらに含む。
【０１５６】
洗剤用組成物は、リパーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ及び／またはラッカーゼ等の任意の組み合わせの一以上の他の酵素をさらに含む。
【０１５７】
洗剤用組成物は、約１％から約６５％の洗剤ビルダーまたは錯化剤、例えば、ゼオライト、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、クエン酸塩、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＭＰＡ）、アルキルまたはアルケニルコハク酸、可溶性ケイ酸塩または層状ケイ酸塩（例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ社のＳＫＳ−６）等を含む。洗剤用組成物は、非ビルダーとすること、すなわち、実質的に洗剤ビルダーを含まないことも出来る。酵素は、その酵素の安定性と適合する任意の組成物で使用することが出来る。酵素は、例えば、カプセル化、例えば、顆粒化またはヒドロゲル内への隔離によるような公知の形態で、一般的に有害な成分から保護されることが出来る。酵素及び特に、アルファ・アミラーゼは、澱粉結合領域の有無によらず、洗剤及び食器洗浄用途に限られず、表面洗浄及び澱粉またはバイオマスからのエタノール生産での使用に組み合わせることが出来る。
【０１５８】
洗剤には、一以上のポリマーが含まれることが出来る。ポリマーの例として、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリカルボン酸塩、例えば、ポリアクリレート、マレイン酸／アクリル酸共重合体、メタクリル酸ラウリル／アクリル酸共重合体が含まれる。
【０１５９】
洗剤には、過ホウ酸塩または過炭酸塩等のＨ２Ｏ２源と、任意に組み合わされる過酸形成活性剤、例えば、ＴＡＥＤまたはノナノイルオキシベンゼンスルホン酸塩（ＮＯＢＳ）等から成り得る、漂白剤系が含まれることが出来る。あるいは、漂白剤系には、例えば、アミドタイプ、イミドタイプ、またはスルホンタイプのペルオキシ酸が含まれることが出来る。漂白剤系は、ペルヒドロラーゼが、例えば、国際公開番号ＷＯ２００５／０５６７８３で開示されるようなペルオキシドを活性化する、酵素漂白剤系とすることも出来る。
【０１６０】
従来の安定化剤、例えば、プロピレングリコールまたはグリセロール等のポリオール、糖または糖アルコール、乳酸、ホウ酸またはホウ酸誘導体、例えば、芳香族ホウ酸エステル等を用いて安定化することができ、この洗剤用組成物は、例えば、国際公開番号ＷＯ９２／１９７０９及びＷＯ９２／１９７０８で記載されるように配合されることが出来る。
【０１６１】
洗剤は、他の従来の洗剤成分、例えば、粘土、泡ブースター、泡抑制剤、防食剤、汚染物質懸濁剤、再汚染防止剤、染料、殺菌剤蛍光増白剤または香料等を含む繊維柔軟剤等をさらに含むことが出来る。（使用時の水溶液中の濃度で測定した）ｐＨは通常、中性からアルカリであり、例えば、ｐＨ約７．０から約１１．０である。
【０１６２】
アルファ・アミラーゼ変異体は、従来の洗剤で用いられていた濃度で添加される。洗剤用組成物では、アルファ・アミラーゼ変異体は、洗浄液１リットル中のアルファ・アミラーゼ変異体の量が０．００００１−１．０ｍｇ（純粋な酵素タンパク質量で計算）に相当する量となるように添加され得ることが意図される。アルファ・アミラーゼ変異体を含む洗剤用組成物の特定の形態は、以下を含むように配合されることが出来る。
【０１６３】
（１）直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として計算）を約７％から約１２％、アルコールエトキシ硫酸塩（例えば、Ｃ１２−１８アルコール、１−２エチレンオキシド（ＥＯ））またはアルキル硫酸塩（例えば、Ｃ１６−１８）を約１％から約４％、アルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１４−１５アルコール、７ＥＯ）を約５％から約９％、炭酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＣＯ３）を約１４％から約２０％、可溶性ケイ素塩を約２％から約６％、ゼオライト（例えば、ＮａＡｌＳｉＯ４）を約１５％から約２２％、硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）を０％から約６％、クエン酸ナトリウム／クエン酸（例えば、Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７／Ｃ６Ｈ８Ｏ７）を約０％から約１５％、過ホウ酸ナトリウム（例えば、ＮａＢＯ３・Ｈ２Ｏ）を約１１％から約１８％、ＴＡＥＤを約２％から約６％、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を約０％から約２％、ポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸共重合体、ＰＶＰ、ＰＥＧ）を０−３％、酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）を０．０００１−０．１％及び微量成分（例えば、泡抑制剤、香料、蛍光増白剤、光退色剤）を０−５％で含む、かさ比重が少なくとも６００ｇ／Ｌの顆粒として配合された洗剤用組成物。
【０１６４】
（２）直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として計算）を約６％から約１１％、アルコールエトキシ硫酸塩（例えば、Ｃ１２−１８アルコール、１−２ＥＯ）またはアルキル硫酸塩（例えば、Ｃ１６−１８）を約１％から約３％、アルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１４−１５アルコール、７ＥＯ）を約５％から約９％、炭酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＣＯ３）を約１５％から約２１％、可溶性ケイ素塩を約１％から約４％、ゼオライト（例えば、ＮａＡｌＳｉＯ４）を約２４％から約３４％、硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）を約４％から約１０％、クエン酸ナトリウム／クエン酸（例えば、Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７／Ｃ６Ｈ８Ｏ７）を約０％から約１５％、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を約０％から約２％、ポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸共重合体、ＰＶＰ、ＰＥＧ）を１−６％、酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）を０．０００１−０．１％及び微量成分（例えば、泡抑制剤、香料）を０−５％で含む、かさ比重が少なくとも６００ｇ／Ｌの顆粒として配合された洗剤用組成物。
【０１６５】
（３）直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として計算）を約５％から約９％、アルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１２−１５アルコール、７ＥＯ）を約７％から約１４％、脂肪酸としての石鹸（例えば、Ｃ１６−２２脂肪酸）を約１から約３％、炭酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＣＯ３）を約１０％から約１７％、可溶性ケイ素塩を約３％から約９％、ゼオライト（例えば、ＮａＡｌＳｉＯ４）を約２３％から約３３％、硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）を０％から約４％、過ホウ酸ナトリウム（例えば、ＮａＢＯ３・Ｈ２Ｏ）を約８％から約１６％、ＴＡＥＤを約２％から約８％、ホスホン酸塩（例えば、ＥＤＴＭＰＡ）を０％から約１％、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を０％から約２％、ポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸共重合体、ＰＶＰ、ＰＥＧ）を０−３％、酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）を０．０００１−０．１％及び微量成分（例えば、泡抑制剤、香料、蛍光増白剤）を０−５％で含む、かさ比重が少なくとも６００ｇ／Ｌの顆粒として配合された洗剤用組成物。
【０１６６】
（４）直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として計算）を約８％から約１２％、アルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１２−１５アルコール、７ＥＯ）を約１０％から約２５％、炭酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＣＯ３）を約１４％から約２２％、可溶性ケイ素塩を約１％から約５％、ゼオライト（例えば、ＮａＡｌＳｉＯ４）を約２５％から約３５％、硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）を０％から約１０％、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を約０％から約２％、ポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸共重合体、ＰＶＰ、ＰＥＧ）を１−３％、酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）を０．０００１−０．１％及び微量成分（例えば、泡抑制剤、香料）を０−５％で含む、かさ比重が少なくとも６００ｇ／Ｌの顆粒として配合された洗剤用組成物。
【０１６７】
（５）直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として計算）を約１５％から約２１％、アルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１２−１５アルコール、７ＥＯまたはＣ１２−１５アルコール、５ＥＯ）を約１２％から約１８％、脂肪酸としての石鹸（例えば、オレイン酸）を約３％から約１３％、アルキルコハク酸（Ｃ１２−１４）を０％から約１３％、アミノエタノールを約８％から約１８％、クエン酸を約２％から約８％、ホスホン酸塩を０％から約３％、ポリマー（例えば、ＰＶＰ、ＰＥＧ）を０％から約３％、ホウ酸塩（例えば、Ｂ４Ｏ７）を０％から約２％、エタノールを０％から約３％、プロピレングリコールを約８％から約１４％、酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）を０．０００１−０．１％及び微量成分（例えば、分散剤、泡抑制剤、香料、蛍光増白剤）を０−５％で含む水性液体洗剤用組成物。
【０１６８】
（６）直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として計算）を約１５％から約２１％、アルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１２−１５アルコール、７ＥＯまたはＣ１２−１５アルコール、５ＥＯ）を３％から９％、脂肪酸としての石鹸（例えば、オレイン酸）を約３％から約１０％、ゼオライト（例えば、ＮａＡｌＳｉＯ４）を約１４％から約２２％、クエン酸カリウムを約９％から約１８％、ホウ酸塩（例えば、Ｂ４Ｏ７）を０％から約２％、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を０％から約２％、ポリマー（例えば、ＰＥＧ、ＰＶＰ）を０％から約３％、アンカーリングポリマー（例えば、ラウリルメタクリレート／アクリル酸共重合体、モル比２５：１、ＭＷ３８００）を０％から約３％、グリセロールを０％から約５％、酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）を０．０００１−０．１％及び微量成分（例えば、分散剤、泡抑制剤、香料、蛍光増白剤）を０−５％で含む水性構造の液体洗剤用組成物。
【０１６９】
（７）脂肪アルコール硫酸塩を約５％から約１０％、エトキシ化脂肪酸モノエタノールアミドを約３％から約９％、脂肪酸としての石鹸を０％から３％、炭酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＣＯ３）を約５％から約１０％、水溶性ケイ素塩を約１から約４％、ゼオライト（例えば、ＮａＡｌＳｉＯ４）を約２０％から約４０％、硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）を約２％から約８％、過ホウ酸ナトリウム（例えば、ＮａＢＯ３・Ｈ２Ｏ）を約１２％から約１８％、ＴＡＥＤを約２％から約７％、ポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸共重合体、ＰＥＧ）を約１％から約５％、酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）を０．０００１−０．１％及び微量成分（例えば、蛍光増白剤、泡抑制剤、香料）を０−５％で含む、かさ比重が少なくとも６００ｇ／Ｌの顆粒として配合された洗剤用組成物。
【０１７０】
（８）直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として計算）を約８％から約１４％、エトキシ化脂肪酸モノエタノールアミドを約５％から約１１％、脂肪酸としての石鹸を０％から約３％、炭酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＣＯ３）を約４％から約１０％、可溶性ケイ素塩を約１％から約４％、ゼオライト（例えば、ＮａＡｌＳｉＯ４）を約３０％から約５０％、硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）を約３％から約１１％、クエン酸ナトリウム（例えば、Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７）を約５％から約１２％、ポリマー（例えば、ＰＶＰ、マレイン酸／アクリル酸共重合体、ＰＥＧ）を約１％から約５％、酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）を０．０００１−０．１％及び微量成分（例えば、泡抑制剤、香料）を０−５％で含む、顆粒として配合された洗剤用組成物。
【０１７１】
（９）直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として計算）を約６％から約１２％、非イオン性界面活性剤を約１％から約４％、脂肪酸としての石鹸を約２％から約６％、炭酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＣＯ３）を約１４％から約２２％、ゼオライト（例えば、ＮａＡｌＳｉＯ４）を約１８％から約３２％、硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）を約５％から約２０％、クエン酸ナトリウム（例えば、Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７）を約３％から約８％、過ホウ酸ナトリウム（例えば、ＮａＢＯ３・Ｈ２Ｏ）を約４％から約９％、漂白剤活性剤（例えば、ＮＯＢＳまたはＴＡＥＤ）を約１％から約５％、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を０％から約２％、ポリマー（例えば、ポリカルボン酸塩またはＰＥＧ）を約１％から約５％、酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）を０．０００１−０．１％及び微量成分（例えば、蛍光増白剤、香料）を０−５％で含む、顆粒として配合された洗剤用組成物。
【０１７２】
（１０）直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として計算）を約１５％から約２３％、アルコールエトキシ硫酸塩（例えば、Ｃ１２−１５アルコール、２−３ＥＯ）を約８％から約１５％、アルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１２−１５アルコール、７ＥＯまたはＣ１２−１５アルコール、５ＥＯ）を約３％から約９％、脂肪酸としての石鹸（例えば、ラウリン酸）を０％から約３％、アミノエタノールを約１％から約５％、クエン酸ナトリウムを約５％から約１０％、ヒドロトロープ（例えば、トルエンスルホン酸ナトリウム）を約２％から約６％、ホウ酸塩（例えば、Ｂ４Ｏ７）を０％から約２％、カルボキシメチルセルロースを０％から約１％、エタノールを約１％から約３％、プロピレングリコールを約２％から約５％、酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）を０．０００１−０．１％及び微量成分（例えば、ポリマー、分散剤、香料、蛍光増白剤）を０−５％で含む水性液体洗剤用組成物。
【０１７３】
（１１）直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として計算）を約２０％から約３２％、アルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１２−１５アルコール、７ＥＯまたはＣ１２−１５アルコール、５ＥＯ）を６−１２％、アミノエタノールを約２％から約６％、クエン酸を約８％から約１４％、ホウ酸塩（例えば、Ｂ４Ｏ７）を約１％から約３％、ポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸共重合体、アンカーリングポリマー、例えば、ラウリルメタクリレート／アクリル酸共重合体等）を０％から約３％、グリセロールを約３％から約８％、酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）を０．０００１−０．１％及び微量成分（例えば、ヒドロトロープ、分散剤、香料、蛍光増白剤）を０−５％で含む水性液体洗剤用組成物。
【０１７４】
（１２）陰イオン性界面活性剤（直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルカンスルホン酸塩、石鹸）を約２５％から約４０％、非イオン性界面活性剤（例えば、アルコールエトキシレート）を約１％から約１０％、炭酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＣＯ３）を約８％から約２５％、可溶性ケイ素塩を約５％から約１５％、硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）を０％から約５％、ゼオライト（ＮａＡｌＳｉＯ４）を約１５％から約２８％、過ホウ酸ナトリウム（例えば、ＮａＢＯ３・Ｈ２Ｏ）を０％から約２０％、漂白剤活性剤（ＴＡＥＤまたはＮＯＢＳ）を約０％から約５％、酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）を０．０００１−０．１％及び微量成分（例えば、香料、蛍光増白剤）を０−３％で含む、かさ比重が少なくとも６００ｇ／Ｌの顆粒として配合された洗剤用組成物。
【０１７５】
（１３）直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩の一部または全部が、Ｃ１２−１８のアルキル硫酸塩で置き換えられた、上記１）−１２）の組成物に記載の洗剤用組成物。
【０１７６】
（１４）（Ｃ１２−Ｃ１８）アルキル硫酸塩を約９％から約１５％、アルコールエトキシレートを約３％から約６％、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミドを約１％から約５％、ゼオライト（例えば、ＮａＡｌＳｉＯ４）を約１０％から約２０％、層状二ケイ素塩（例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ社のＳＫ５６）を約１０％から約２０％、炭酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＣＯ３）を約３％から約１２％、可溶性ケイ素塩を０％から約６％、クエン酸ナトリウムを約４％から約８％、過炭酸ナトリウムを約１３％から約２２％、ＴＡＥＤを約３％から約８％、ポリマー（例えば、ポリカルボン酸塩及びＰＶＰ）を０％から約５％、酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）を０．０００１−０．１％及び微量成分（例えば、蛍光増白剤、退色剤、香料、泡抑制剤）を０−５％で含む、かさ比重が少なくとも６００ｇ／Ｌの顆粒として配合された洗剤用組成物。
【０１７７】
（１５）（Ｃ１２−Ｃ１８）アルキル硫酸塩を約４％から約８％、アルコールエトキシレートを約１１％から約１５％、石鹸を約１％から約４％、ゼオライトＭＡＰまたはゼオライトＡを約３５％から約４５％、炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３として）を約２％から約８％、可溶性ケイ素塩を０％から約４％、過炭酸ナトリウムを約１３％から約２２％、ＴＡＥＤを１−８％、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を０％から約３％、ポリマー（例えば、ポリカルボン酸塩及びＰＶＰ）を０％から約３％、酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）を０．０００１−０．１％及び微量成分（例えば、蛍光増白剤、ホスホン酸塩、香料）を０−３％で含む、かさ比重が少なくとも６００ｇ／Ｌの顆粒として配合された洗剤用組成物。
【０１７８】
（１６）追加の成分または上記のすでに特定された漂白剤系の置換物のいずれかとして、安定化またはカプセル化された過酸を含む、上記１）−１５）に記載の洗剤配合物。
【０１７９】
（１７）過ホウ素酸塩が、過炭酸塩で置き換えられる、上記１）、３）、７）、９）及び１２）に記載の洗剤組成物。
【０１８０】
（１８）マンガン触媒をさらに含む、上記１）、３）、７）、９）、１２）、１４）及び１５）に記載の洗剤組成物。
【０１８１】
（１９）例えば、直鎖一級アルコールアルコキシレートのような液体非イオン性界面活性剤、ビルダー系（例えば、リン酸塩）、酵素及びアルカリを含む、非水性の洗剤液体として配合された洗剤組成物。この洗剤は、陰イオン性界面活性剤及び／または漂白剤系をさらに含むことが出来る。
【０１８２】
別の実施態様において、２，６−β−Ｄ−フルクタンヒドロラーゼを洗剤組成物に添加し、家庭内及び／または工業用布／洗濯物に存在するバイオフィルムの除去／清掃に用いることが出来る。
【０１８３】
前記洗剤用組成物は、例えば、汚れた繊維の前処理に適した洗濯用添加剤組成物及び繊維柔軟剤組成物が添加されたリンスを含む、手洗い用または洗濯機用洗剤組成物として配合されるか、または一般的な家庭内の硬質表面清掃用に用いられる洗剤組成物として配合されるか、あるいは手洗い用または食器洗浄機用として配合されることが出来る。
【０１８４】
特定の側面において、洗剤用組成物は、２，６−β−Ｄ−フルクタンヒドロラーゼ、一以上のアルファ・アミラーゼ変異体、１以上の、プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、ラッカーゼ、及び／またはペルオキシダーゼ、及び／またはこれらの組み合わせを含むことが出来る。一般に、選択された酵素の特性は、選択された洗剤と適合すべきであり（例えば、最適ｐＨ、他の酵素性または非酵素性成分との適合性）、有効量の酵素が存在するべきである。
【０１８５】
プロテアーゼ：
適したプロテアーゼには、動物、植物または微生物由来のプロテアーゼが含まれる。化学的に修飾された変異体またはタンパク質操作された変異体も適する。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼまたはメタロプロテアーゼ、例えば、アルカリ性微生物プロテアーゼまたはトリプシン様プロテアーゼであることが出来る。アルカリ性プロテアーゼの例は、ズブチリシン、特に、バチルス種、例えば、ズブチリシン・ノボ（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ  Ｎｏｖｏ）、ズブチリシン・カールスバーグ（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ  Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）、ズブチリシン３０９、ズブチリシン１４７及びズブチリシン１６８（例えば、国際公開番号ＷＯ８９／０６２７９を参照されたい）等に由来するプロテアーゼである。トリプシン様プロテアーゼの例は、トリプシン（例えば、豚または牛由来）及びフサリウムプロテアーゼ（例えば、国際公開番号ＷＯ８９／０６２７０、ＷＯ９４／２５５８３を参照されたい）である。有用なプロテアーゼの例には、国際公開番号ＷＯ９２／１９７２９及びＷＯ９８／２０１１５で記載される変異体が含まれるが、それらに限られない。適した市販のプロテアーゼ酵素には、Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）、Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標）、Ｐｒｉｍａｓｅ（商標）、Ｄｕｒａｌａｓｅ（商標）、Ｅｓｐｅｒａｓｅ（登録商標）及びＫａｎｎａｓｅ（商標）（ノボ・ノルディスクＡ／Ｓ）、Ｍａｘａｔａｓｅ（登録商標）、Ｍａｘａｃａｌ（商標）、Ｍａｘａｐｅｍ（商標）、Ｐｒｏｐｅｒａｓｅ（商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ  ＯｘＰ（商標）、ＦＮ２（商標）及びＦＮ３（商標）（ダニスコＡ／Ｓ）が含まれる。
【０１８６】
リパーゼ：
適したリパーゼには、細菌または菌類由来のリパーゼが含まれる。化学的に修飾された変異体またはタンパク質操作された変異体も含まれる。有用なリパーゼの例は、例えば、Ｈ．ラヌギノサ（ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）由来（例えば、欧州特許番号ＥＰ２５８０６８及びＥＰ３０５２１６を参照されたい）、Ｈ．インソレンス（ｉｎｓｏｌｅｎｓ）由来（例えば、国際公開番号ＷＯ９６／１３５８０を参照されたい）等のフミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）（同義語サーモミセス）由来のリパーゼ、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）リパーゼ（例えば、Ｐ．アルカリゲネス（ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）またはＰ．シュードアルカリゲネス（ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）由来（例えば、欧州特許番号ＥＰ２１８２７２を参照されたい）、Ｐ．セパシア（ｃｅｐａｃｉａ）（例えば、欧州特許番号ＥＰ３３１３７６を参照されたい）、Ｐ．スタッツェリ（ｓｔｕｔｚｅｒｉ）（例えば、英国特許番号ＧＢ１，３７２，０３４を参照されたい）、Ｐ．フルオレセンス（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス株ＳＤ７０５（例えば、国際公開番号ＷＯ９５／０６７２０及びＷＯ９６／２７００２を参照されたい）、Ｐ．ウィスコンシネシス（ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｅｎｓｉｓ）（例えば、国際公開番号ＷＯ９６／１２０１２を参照されたい）、バチルス・リパーゼ（例えば、Ｂ．スブチリス由来、例えば、Ｄａｒｔｏｉｓ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、第１１３１巻、２５３−３６０ページ（１９９３年）を参照されたい）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（例えば、日本国特許番号ＪＰ６４／７４４９９２を参照されたい）、またはバチルス・プミルス（ｐｕｍｉｌｕｓ）（例えば、国際公開番号ＷＯ９１／１６４２２を参照されたい）が含まれるが、それらに限られない。配合剤での使用が意図される追加のリパーゼ変異体は、例えば、国際公開番号ＷＯ９２／０５２４９、ＷＯ９４／０１５４１、ＷＯ９５／３５３８１、ＷＯ９６／００２９２、ＷＯ９５／３０７４４、ＷＯ９４／２５５７８、ＷＯ９５／１４７８３、ＷＯ９５／２２６１５、ＷＯ９７／０４０７９、ＷＯ９７／０７２０２、欧州特許番号ＥＰ４０７２２５及びＥＰ２６０１０５で記載されるものが含まれる。いくつかの市販のリパーゼ酵素の例には、Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）及びＬｉｐｏｌａｓ
ｅ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（ノボ・ノルディスクＡ／Ｓ社）が含まれる。
【０１８７】
ポリエステラーゼ：
適したポリエステラーゼには、国際公開番号ＷＯ０１／３４８９９（ダニスコＡ／Ｓ）及び国際公開番号ＷＯ０１／１４６２９（ダニスコＡ／Ｓ）に記載されるものが含まれるが、これらに限られず、また本明細書に記載の他の酵素との組み合わせも含まれることが出来る。
【０１８８】
アミラーゼ：
前記組成物は、非変異体アルファ・アミラーゼのような他のアルファ・アミラーゼと組み合わされることが出来る。このようなアルファ・アミラーゼには、例えば、Ｄｕｒａｍｙｌ（登録商標）、Ｔｅｒｍａｍｙｌ（商標）、Ｆｕｎｇａｍｙｌ（登録商標）及びＢＡＮ（商標）（ノボ・ノルディスクＡ／Ｓ）、Ｒａｐｉｄａｓｅ（登録商標）及びＰｕｒａｓｔａｒ（登録商標）（ダニスコＡ／Ｓ）等に限られない市販のアルファ・アミラーゼが含まれることが出来る。
【０１８９】
セルラーゼ：
前記洗剤用組成物にセルラーゼを添加することが出来る。適したセルラーゼには、細菌または菌類由来のセルラーゼが含まれる。化学的に修飾された変異体またはタンパク質操作された変異体も含まれる。適したセルラーゼには、バチルス属、シュードモナス属、フミコーラ属、フザリウム属、シエラビア族、アクレモニウム属由来のセルラーゼが含まれ、例えば、米国特許番号４，４３５，３０７、５，６４８，２６３、５，６９１，１７８、５，７７６，７５７及び国際公開番号ＷＯ８９／０９２５９で開示されるフミコーラ・インソレンス、ミセリオフトラ・サーモフィリア（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、フザリウム・オキシスポルム由来の菌性セルラーゼが含まれる。使用が意図されるセルラーゼの例には、衣料に対しカラーケア（ｃｏｌｏｒ  ｃａｒｅ）の利点を有するものである。このようなセルラーゼの例は、例えば、欧州特許ＥＰ０４９５２５７、ＥＰ０５３１３７２、国際公開番号ＷＯ９９／２５８４６（ダニスコＡ／Ｓ）、ＷＯ９６／１１２６２、ＷＯ９６／２９３９７及びＷＯ９８／０８９４０で記載されるセルラーゼである。他の例は、セルラーゼ変異体、例えば、国際公開番号ＷＯ９４／０７９９８、ＷＯ９８／１２３０７、ＷＯ９５／２４４７１、ＰＣＴ／ＤＫ９８／００２９９、欧州特許番号ＥＰ５３１３１５、米国特許番号５，４５７，０４６、５，６８６，５９３及び５，７６３，２５４で記載されるセルラーゼ変異体である。市販のセルラーゼには、Ｃｅｌｌｕｚｙｍｅ（登録商標）及びＣａｒｅｚｙｍｅ（登録商標）（ノボ・ノルディスクＡ／Ｓ）、Ｃｌａｚｉｎａｓｅ（商標）及びＰｕｒａｄａｘ（登録商標）ＨＡ（ダニスコＡ／Ｓ）及びＫＡＣ−５００（Ｂ）（商標）（花王株式会社）が含まれる。
【０１９０】
ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ：
前記組成物での使用が意図される適したペルオキシダーゼ／オキシダーゼには、植物、細菌または菌類由来のものが含まれる。化学的に修飾された変異体またはタンパク質操作された変異体も含まれる。有用なペルオキシダーゼの例には、コプリヌス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）属、例えば、国際公開番号ＷＯ９３／２４６１８、ＷＯ９５／１０６０２及びＷＯ９８／１５２５７で記載されるＣ．シネレウス（ｃｉｎｅｒｅｕｓ）及びその変異体由来のペルオキシダーゼが含まれる。市販のペルオキシダーゼには、例えば、Ｇｕａｒｄｚｙｍｅ（商標）（ノボ・ノルディスクＡ／Ｓ）が含まれる。
【０１９１】
洗剤用酵素は、一以上の酵素を含む別々の添加剤を添加するか、または全ての酵素を含む組み合わされた添加剤を添加することにより、洗剤組成物に含まれることが出来る。洗剤用添加剤、すなわち別々または一括の添加剤は、顆粒状、液状、スラリー状等として配合されることが出来る。適した顆粒状洗剤用添加剤配合物は、非粉塵飛散性顆粒とすることが出来る。
【０１９２】
非粉塵飛散性顆粒は、例えば、米国特許番号４，１０６，９９１及び４，６６１，４５２の開示に従い調製することができ、任意に、公知の方法でコーティングすることが出来る。ワックス状のコーティング材料の例として、平均分子量が１，０００から２０，０００のポリエチレンオキシド生成物（例えば、ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）、１６から５０のエチレンオキシド単位を有するエトキシ化ノニルフェノール、アルコールが炭素数１２から２０で、１５から８０のエチレンオキシド単位を有するエトキシ化脂肪アルコール、脂肪アルコール、脂肪酸及び脂肪酸のモノ、ジ及びトリグリセライドが挙げられる。流動床での使用に適したフィルムコーティング用材料の例は、例えば、英国特許番号ＧＢ１４８３５９１に開示されている。酵素調製液は、例えば、プロピレングリコール等のポリオール、糖または糖アルコール、乳酸またはホウ酸を公知の方法で添加して安定化される。保護された酵素は、例えば、欧州特許番号ＥＰ２３８２１６に記載された方法で調製することが出来る。
【０１９３】
洗剤用組成物は、例えば、棒状、錠剤状、粉末状、顆粒状、ペースト状または液状等の任意の好都合な形態にすることが出来る。液状洗剤は水性であり、一般に最大約７０％の水と、０％から約３０％の有機溶媒が含まれることが出来る。水の含有量が３０％未満の小型洗剤ゲルも意図される。洗剤用組成物は、非イオン性若しくは半極性、陰イオン性、カチオン性、または両性イオン性またはそれらの任意の組み合わせの界面活性剤を、一以上含有する。界面活性剤は一般に、重量で０．１％から６０％の量が含有される。
【０１９４】
界面活性剤が用いられる場合、洗剤には通常、約１％から約４０％の陰イオン性界面活性剤、例えば、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩（脂肪アルコール硫酸塩）、アルコールエトキシ硫酸塩、二級アルカンスルホン酸塩、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキルまたはアルケニルコハク酸または石鹸等が含まれる。
【０１９５】
界面活性剤が用いられる場合、洗剤には通常、約０．２％から約４０％の非イオン性界面活性剤、例えば、アルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシ化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミドまたはグルコースアミンのＮ−アシル−Ｎ−アルキル誘導体（グルコアミド）等が含まれる。
【０１９６】
洗剤には、０％から約６５％の洗剤ビルダーまたは複合化剤、例えば、ゼオライト、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、ニトリロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン四酢酸、アルキルまたはアルケニルコハク酸、可溶性ケイ素塩または層状ケイ素塩（例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ社のＳＫＳ−６）等が含まれる。
【０１９７】
洗剤には一以上のポリマーが含まれることが出来る。このようなポリマーの例として、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピリジン−Ｎ−オキシド）、ポリ（ビニルイミダゾール）、ポリアクリレート、マレイン酸／アクリル酸共重合体及びラウリルメタクリレート／アクリル酸共重合体等のポリカルボン酸塩が挙げられる。
【０１９８】
洗剤には、過ホウ酸塩または過炭酸塩等のＨ２Ｏ２源と、これらと組み合わされる過酸形成漂白活性剤（例えば、テトラアセチルエチレンジアミンまたはノナノニルオキシベンゼンスルホン酸塩）を含む、漂白剤系が含まれることが出来る。あるいは、漂白剤系には、ペルオキシ酸（例えば、アミドタイプ、イミドタイプまたはスルホンタイプ）が含まれることが出来る。漂白剤系はまた、酵素漂白剤系とすることが出来る。
【０１９９】
洗剤用組成物の酵素は、従来の安定化剤、例えば、ポリオール（例えば、プロピレングリコールまたはグリセロール）、糖または糖アルコール、乳酸、ホウ酸、ホウ酸誘導体（例えば、芳香族ホウ酸エステル）またはフェニルホウ酸誘導体（例えば、４−フォルミルフェニルホウ酸）等を用いて安定化される。この洗剤用組成物は、国際公開番号ＷＯ９２／１９７０９及びＷＯ９２／１９７０８で記載されるように配合されることが出来る。
【０２００】
洗剤はまた、他の従来の洗剤成分、例えば、粘土、泡ブースター、泡抑制剤、防食剤、汚染物質懸濁剤、再汚染防止剤、染料、殺菌剤、蛍光増白剤、ヒドロトロープ、変色防止剤または香料等を含む繊維柔軟剤等を含むことが出来る。
【０２０１】
洗剤用組成物では、酵素変異体は、洗浄液１リットルにつき約０．０１から約１００ｍｇに相当する量の酵素タンパク質、特に、洗浄液１リットルにつき約０．０５から約５．０ｍｇに相当する量の酵素タンパク質、さらに具体的に、洗浄液１リットルにつき０．１から約１．０ｍｇに相当する量の酵素タンパク質が添加され得ることが意図される。
【０２０２】
ＡｍｙＥまたはその変異体を含む洗浄組成物の有効性を試験するために用いられることが出来る代表的なアッセイは、布見本試験を含む。「布見本」とは、汚染物質を付着させた布等の材料の一片である。この材料は、例えば、木綿、ポリエステルまたは天然繊維と合成繊維の混合物からなる布とすることが出来る。あるいは、この材料は、ろ紙やニトロセルロース等の紙、またはセラミック、金属、ガラス等の硬質材料の一片とすることが出来る。アルファ・アミラーゼについて、汚染物質は澱粉ベースであるが、血液、ミルク、インク、草、茶、ワイン、ホウレン草、グレイビーソース、チョコレート、卵、チーズ、粘土、絵の具、油またはこれらの混合物を含むことが出来る。一の実施態様において、ＡｍｙＥまたはその変異体は、ＢＭＩ（血液／ミルク／インク）アッセイで試験される。
【０２０３】
「微小布見本」は、布見本の小片であり、一穴のパンチ、または標準的な９６穴のマイクロタイタープレートに適合する穴のパターンを有する９６穴の特製パンチで切り取られた小片、または他の方法で布見本から切り取られた小片である。布見本は、織物、紙、金属またはその他の適切な材料で作られる。微小布見本は、２４、４８または９６穴のマイクロタイタープレートに入れる前、または後に、汚染物質を付着することが出来る。微小布見本は、材料の小片に汚染物質を付着させて作製することも出来る。微小布見本は、例えば、直径５／８”または０．２５”の汚染された繊維の一片であることが出来る。特製パンチは、９６個の微小布見本を同時に９６穴プレートのウェルに入れられるよう設計されている。特製パンチにより、同じ９６穴プレートに繰り返し微小布見本を入れることにより、ウェル当たり一個より多くの微小布見本を入れることが出来る。多穴パンチは、２４穴、４８穴、９６穴プレートを含むが、それらに限られない、任意の形状のプレートに、複数の布見本を同時に供給することが出来る。別の方法において、土壌汚染された試験プラットホームは、金属、プラスチック、ガラス、セラミックまたは土壌基質でコーティングされたその他の適した材料のいずれかで作られたビーズとすることが出来る。次に、酵素と適した緩衝液を含む、２４、４８、９６穴プレートまたはそれ以上のウェルを有するプレートに、一以上のコーティングされたビーズを入れる。この場合、放出された汚染物質について、直接吸光度測定または二次的発色反応により上清が分析されることが出来る。放出された汚染物質の分析は、マススペクトル分析で行うことも出来る。
【０２０４】
一の実施態様において、処理プロトコールは、汚染物質の固定の程度をコントロールする。その結果、試験される酵素が存在しない状態で洗浄する場合に、例えば、一様でない量の汚染物質を放つ布見本を生産することは可能である。固定された布見本の使用は、洗浄アッセイにおけるシグナル対ノイズ比の劇的な改善をもたらす。さらに、固定の程度を変えることで、当業者は、様々な洗浄条件下で最適な結果を与える汚染物質を生成することが出来る。
【０２０５】
多様な種類の材料についての「強度」として知られる汚染物質を有する布見本は、市販され（ＥＭＰＡ、セント・ガレン、スイス、ｗｆｋ−−Ｔｅｓｔｇｅｗｅｂｅ有限会社、クレーフェルト・ドイツ、または試験材料センター、ヴラールディンゲン、オランダ）及び／または技術者により作られることが出来る（Ｍｏｒｒｉｓ及びＰｒａｔｏ、Ｔｅｘｔｉｌｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ、第５２巻（４）、２８０−２８６ページ（１９８２年））。布見本は、例えば、血液／ミルク／インク（ＢＭＩ）、ホウレン草、草またはチョコレート／ミルク／すすで構成された汚染物質を含む木綿含有の繊維を含むことが出来る。ＢＭＩ汚染物質は、例えば、木綿に０．０００３％から０．３％の過酸化水素で固定されることが出来る。別の組み合わせには、０．００１％から１％のグルタールアルデヒドで固定された草またはホウレン草汚染物質、０．００１％から１％のグルタールアルデヒドで固定されたゼラチンとクマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）汚染物質、または０．００１％から１％のグルタールアルデヒドで固定されたチョコレート、ミルクとすす汚染物質とが含まれる。
【０２０６】
インキュベーション中、布見本を酵素及び／または洗剤配合物と共に撹拌することも出来る。洗浄性能データは、ウェル中、特に９６穴プレート中での、布見本の方向に依存する（水平対垂直）。これは、インキュベーション中の混合が不十分であったことを示す。インキュベーション中の十分な撹拌を確実にする方法は多々あるが、ミクロタイタープレートを２枚のアルミニウム製プレートの間に挟むプレートホルダーを作ることが出来る。これは、例えば、ウェル上に接着性プレートシーラーを取り付け、次に、二枚のアルミニウム製プレートを９６穴プレートに任意のタイプの適切な市販のクランプで挟む程度に容易に出来る。次に、市販の培養用シェーカーに取り付けることが出来る。シェーカーを約４００ｒｐｍに設定することで十分に撹拌される一方、漏れやクロスコンタミネーションはホルダーにより効果的に防止される。
【０２０７】
トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）を用いて、洗浄液中のアミノ基の濃度を数量化することが出来る。これにより、布見本から除去されたタンパク質の量を測定することが出来る（例えば、Ｃａｙｏｔ及びＴａｉｎｔｕｒｉｅｒ他、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第２４９巻、１８４−２００ページ（１９９７年）を参照されたい）。しかしながら、（例えば、サンプル中にぺプチダーゼが存在することにより）洗剤または酵素サンプルが異常に小さいタンパク質断片の形成をもたらす場合、より大きなＴＮＢＳシグナル、すなわち、「ノイズ」が高くなる。
【０２０８】
血液／ミルク／インク汚染物質について洗浄能力を測定する別の方法は、洗浄液の吸光度の測定により数量化することが出来るインクの放出に基づく方法である。吸光度は、３５０−８００ｎｍの任意の波長で測定することが出来る。一の実施態様において、測定波長は、４１０ｎｍまたは６２０ｎｍである。また、洗浄液を分析して、草、ホウレン草、ゼラチンを含む汚染物質またはクマシー汚染物質についての洗浄性能を評価することも出来る。これらの汚染物質の適した測定波長は、草とホウレン草の場合は６７０ｎｍ、ゼラチンとクマシーの場合は６２０ｎｍである。例えば、洗浄液の一部（例えば、一般に９６穴マイクロプレートから１００−１５０μＬ）を採取し、キュベットまたはマルチウェルマイクロプレートに入れる。次に、これを光学分析計に置き、適切な波長の吸光度を読み取る。この方法は、布、プラスチックまたはセラミック等の適した基質上の血液／ミルク／インク汚染物質を用いて、例えば、食器洗浄に適した酵素及び／または洗剤組成物の評価にも使用することも出来る。
【０２０９】
一の側面において、ＢＭＩ汚れは、２５℃で３０分間ＢＭＩ／木綿布見本に０．３％の過酸化水素を塗ることにより、または６０℃で３０分間ＢＭＩ／木綿布見本に０．０３％の過酸化水素を塗ることにより、木綿に固定される。一の側面において、ＢＭＩ汚染物質の木綿への固定は、ＢＭＩ／木綿布見本に０．３％の過酸化水素を２５℃において３０分間浸漬するか、ＢＭＩ／木綿布見本に０．０３％の過酸化水素を６０℃において３０分間浸漬することにより行うことが出来る。約０．２５”の微小布見本を、ＢＭＩ／木綿布見本から切り取り、９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに入れる。各ウェルに、既知の洗剤組成物と変異体タンパク質等の酵素の混合物を入れる。マイクロタイタープレートの上に接着性プレートシーラーを付けた後、マイクロタイタープレートをアルミ製プレートに挟み込み、約２５０ｒｐｍの環状シェーカーを用いて約１０から６０分間撹拌する。その時間の最後に、上清を新しいマイクロタイタープレートのウェルに移し、６２０ｎｍにおけるインクの吸光度を測定する。この方法により、木綿に固定されたホウレン草汚染物質または草汚染物質の試験を同様に行うことが出来る。ここで、ホウレン草汚染物質または草汚染物質は、０．０１％グルタールアルデヒドを用いて、２５℃で３０分間、ホウレン草／木綿または草／木綿布見本に塗布され、固定される。チョコレート、ミルク及び／またはすす汚染物質についても同様である。
【０２１０】
５．５．織物の糊抜き組成物及びその使用
本願はまた、一以上のＡｍｙＥまたはその変異体を用いた布を処理する（例えば、織物を糊抜きする）組成物及び方法が意図される。ＡｍｙＥまたはその変異体を、任意の布処理方法に用い得ることは公知である（例えば、米国特許番号６，０７７，３１６を参照されたい）。例えば、一の側面において、溶液中で布を酵素変異体と接触させる方法により、布の手触りと外観を改良することが出来る。一の側面において、前記布は、加圧下の溶液中で処理される。
【０２１１】
一の側面において、前記酵素は、織物を織っている際または織った後、または糊抜き工程中に用いられるか、または一以上の別の繊維加工工程において用いられる。織物を織っている際、糸には相当な機械的応力が加えられる。自動織機で織る前に、縦糸の引張強度を増加させて切断を防ぐため、縦糸には頻繁に糊用デンプンまたはデンプン誘導体がコーティングされる。ＡｍｙＥまたはその変異体は、糊用デンプンまたはデンプン誘導体を除去するために用いられる。織物が織られた後、布は糊抜き工程に送られる。この後、一以上の追加の繊維加工工程を行うことも出来る。糊抜きとは、織物から糊を除去する工程である。織り工程の後、均一性の確保及び洗濯に耐えるようにするため、布をさらに加工する前に糊コーティングを除去しておく必要がある。また、酵素変異体の作用による糊の酵素加水分解を含む糊抜きの方法を提供する。
【０２１２】
ＡｍｙＥまたはその変異体は、単独または他の糊抜き化学試薬剤及び／または糊抜き酵素と組み合わせて、例えば、水性組成物中に、洗剤の添加剤として、木綿含有布を含む、布の糊抜きのために用いられることが出来る。ＡｍｙＥまたはその変異体は、ストーンウォッシュ状外観のインジゴで染色されたデニム生地及び衣料を製造するための組成物及び方法にも用いられることが出来る。衣服の製造について、布は、切断及び縫製されて衣服または衣料になり、その後仕上げが行われる。特に、デニムジーンズの製造について、異なる酵素による仕上げ方法が開発されてきた。デニム衣料の仕上げは通常、酵素による糊抜き工程から始まり、この間、衣料は、繊維の柔軟性を増し、木綿を次の酵素仕上げ工程に適応し易くするために、デンプン分解酵素の作用により処理される。アルファ・アミラーゼ変異体は、デニム衣料の仕上げ方法（例えば、「バイオストーニングプロセス（ｂｉｏ−ｓｔｏｎｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｓｓ）」）、酵素糊抜き及び繊維への柔軟性の付与、及び／または仕上げ工程において用いることが出来る。
【０２１３】
意図される使用の範囲及び概念から逸脱することなく、組成物及び方法の両方における多くの修飾及び変形が実施され得ることは、当業者に明らかである。従って、与えられた修飾及び変形は、添付の特許請求の範囲またはそれらの均等の範囲内である。
【実施例】
【０２１４】
実施例１
１．１．プラスミド構築
配列番号１のＡｍｙＥまたはＣ末端切断ＡｍｙＥ変異体、ＡｍｙＥ−ｔｒ（配列番号２）をコードする核酸を、米国特許番号５，０２４，９４３で開示される、Ｂ．ズブチリスｐＨＰＬＴ発現ベクターにクローン化した。図５は、ＡｍｙＥ−ｔｒをコードする核酸を含むベクターを示す。
【０２１５】
図５について、ｐＨＰＬＴベクターは、Ｂ．リケニフォルミスＬＡＴプロモーター（「Ｐｌａｔ」）、ＬＡＴシグナルペプチド（「ｐｒｅＬＡＴ」）をコードする配列及びそれに続くクローニングのためのＰｓｔＩ及びＨｐａＩ制限部位を含む。プラスミドｐＵＢ１１０からの追加のプラスミド・エレメントは、ＭｃＫｅｎｚｉｅ他、Ｐｌａｓｍｉｄ、第１５巻（２）、９３−１０３ページ（１９８６年）で開示される：
「ｏｒｉ−ｐＵＢ」は、ｐＵＢ１１０からの複製開始点である：
「ｒｅｐｐＵＢ」は、ｐＵＢ１１０からのレプリカーゼ遺伝子であり、「ｎｅｏ」は、ｐＵＢ１１０からのネオマイシン／カナマイシン耐性遺伝子である：
「ｂｌｅｏ」はブレオマイシン耐性マーカーであり、「Ｔｌａｔ」はＢ．リケニフォルミス・アミラーゼの転写ターミネーターである。
【０２１６】
ＡｍｙＥ及びＡｍｙＥ−ｔｒの発現のためプラスミド構築は、Ｙａｎｇ他、「バチルス・ズブチリス由来のアミラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｍｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第１１巻（２）、２３７−４９ページ（１９８３年）で記載される、ＡｍｙＥをコードする配列を用いて組み立てた。プラスミドｐＭＥ６２９．５は、配列番号１の全長ＡｍｙＥをコードする核酸を含む。この遺伝子は、Ｙａｎｇ他で記載される配列と比べ、デンプン結合ドメインをコードする配列で三個の塩基が欠失している。
【０２１７】
プラスミドｐＭＥ６３０．７は、切断ＡｍｙＥ配列、ＡｍｙＥ−ｔｒを含み、図５に示される。ＡｍｙＥ−ｔｒは、配列番号１のＤ４２５で切断される。ＡｍｙＥ−ｔｒは、藤本他、「マルトペンタオースと複合するバチルス・ズブチリスに由来する触媒部位変異体アルファ・アミラーゼの結晶構造（Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ−ｓｉｔｅ  ｍｕｔａｎｔ  ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍａｌｔｏｐｅｎｔａｏｓｅ）」、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第２７７巻、３９３−４０７ページ（１９９８年）で開示される、デンプン結合ドメインを欠くＡｍｙＥ変異体の結晶構造から設計した。ＲＣＳＢタンパク質データバンク登録番号１ＢＡＧ、「マルトペンタオースと複合するバチルス・ズブチリスに由来するアルファ・アミラーゼ」を参照されたい。
【０２１８】
発現プラスミド構築について、ＡｍｙＥをコードする核酸を、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ（登録商標）（ストラタジェン、カリフォルニア州）を用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ生産物を、キアゲンＱＩＡｑｕｉｋ（商標）ＰＣＲ精製キット（キアゲン、バレンシア、カリフォルニア州）で提供されるカラムを用いて精製し、５０μＬのＭｉｌｌｉＱ（商標）精製水に再懸濁した。５０μＬの精製ＤＮＡを、ＨｐａＩ（ロッシュ）及びＰｓｔＩ（ロッシュ）で連続して消化し、得られたＤＮＡを３０μＬのＭｉｌｌｉＱ（商標）精製水で再懸濁した。１０−２０ｎｇ／μＬのＤＮＡを、ＰｓｔＩ及びＨｐａＩのクローニング部位を用いて、プラスミドｐＨＰＬＴにクローン化した。ライゲーション混合物を、コンピテントＢ．ズブチリス細胞（遺伝子型：ＤａｐｒＥ、ＤｎｐｒＥ、ｄｅｇＵＨｙ３２  ｏｐｐＡ、ＤｓｐｏＩＩＥ３５０１、ａｍｙＥ：：ｘｙｌＲＰｘｙｌＡｃｏｍＫ−ｐｈｌｅｏ）に直接形質転換した。ＳＣ６．１  Ｂ．ズブチリス細胞には、キシロース誘導プロモーターの下流に置かれるコンピテンシー遺伝子（ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｙ  ｇｅｎｅ）（ｃｏｍＫ）がある。ＤＮＡ結合及び取り込みのためのコンピテンシーは、キシロースの添加により誘導される。親プラスミド中のＡｍｙＥ遺伝子に二個のＰｓｔＩ部位があるため、ＰＣＲ融合反応はこれらの部位を除去するためにクローニングの前に行った。ＰＣＲ融合を、二度の別途ＰＣＲ反応の後に行った。以下のプライマーを、ＨｐａＩ及びＰｓｔＩ部位を用いたｐＨＰＬＴ構築物を構成するために用いた。
【０２１９】
配列番号１８：プライマーＰＳＴＡＭＹＥ−Ｆ  ５’  ＣＴＴＣＴＴＧＣＴＧＣＣＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＡＧＣＡＣＴＴＡＣＡＧＣＡＣＣＧＴＣＧＡＴＣＡＡＡＡＧＣＧＧＡＡＣ  ３’
配列番号１９：プライマーＡＭＹＥＮＯＰＳＴ−Ｒ  ５’  ＣＴＧＧＡＧＧＣＡＣＴＡＴＣＣＴＧＡＡＧＧＡＴＴＴＣＴＣＣＧＴＡＴＴＧＧＡＡＣＴＣＴＧＣＴＧＡＴＧＴＡＴＴＴＧＴＧ    ３’
配列番号２０：プライマーＡＭＹＥＮＯＰＳＴ−Ｆ  ５’  ＣＡＣＡＡＡＴＡＣＡＴＣＡＧＣＡＧＡＧＴＴＣＣＡＡＴＡＣＧＧＡＧＡＡＡＴＣＣＴＴＣＡＧＧＡＴＡＧＴＧＣＣＴＣＣＡＧ  ３’
配列番号２１：プライマーＨＰＡＩＡＭＹＥ−Ｒ  ５’  ＣＡＧＧＡＡＡＴＣＣＧＴＣＣＴＣＴＧＴＴＡＡＣＴＣＡＡＴＧＧＧＧＡＡＧＡＧＡＡＣＣＧＣＴＴＡＡＧＣＣＣＧＡＧＴＣ  ３’
配列番号２２：プライマーＨＰＡＩＡＭＹＥ４６６−Ｒ  ５’  ＣＡＧＧＡＡＡＴＣＣＧＴＣＣＴＣＴＧＴＴＡＡＣＴＣＡＡＴＣＡＧＧＡＴＡＡＡＧＣＡＣＡＧＣＴＡＣＡＧＡＣＣＴＧＧ  ３’
配列番号２３：プライマーＡＭＹＥ  ＳＥＱ−Ｆ１  ５’  ＴＡＣＡＣＡＡＧＴＡＣＡＧＴＣＣＴＡＴＣＴＧ  ３’
配列番号２４：プライマーＡＭＹＥ  ＳＥＱ−Ｆ２  ５’  ＣＡＴＣＣＴＣＴＧＴＣＴＣＴＡＴＣＡＡＴＡＣ  ３’
プラスミドｐＭＥ６２９．５及びｐＭＥ６３０．７は、翻訳後に切断される３１残基のシグナル配列と共にＡｍｙＥを発現する。上記Ｙａｎｇ他（１９８３年）により言及されるように、続く１０のＮ−末端アミノ酸は、別途処理される。
【０２２０】
１．２．タンパク質発現
ＡｍｙＥ全長及び切断クローンの形質転換体を、１０μｇ／ｍＬのネオマイシン、１％の不溶性デンプンを用いてＬＡ上で選択し、３７℃で一晩インキュベートした。コロニーのまわりに透明（または輪形）を示す形質転換体を選択し、バイアルを後の研究のために作製した。形質転換体のプレ培養を、１０μｇ／ｍＬのネオマイシンを加えたＬＢで８時間増殖させた。次に、３０μＬのこのプレ培養を、１０μｇ／ｍＬのネオマイシン及び５ｍＭ  ＣａＣｌ２で補給された、３０ｍＬの培養地（下記に記載）で満たされた、２５０ｍＬフラスコに添加した。培養地は、主要窒素源としての尿素、主要炭素源としてのグルコースを含み、堅調な細胞増殖のため１％ソイトーン（ｓｏｙｔｏｎｅ）を補給した、ＭＯＰＳ緩衝液ベースの強化半合成培地であった。振盪フラスコを、２５０ｒｐｍで混合しながら、３７℃で６０−６５時間インキュベートした。培養を、２０分間５０００ｒｐｍでの遠心分離で円錐管に採取した。ＡｍｙＥ全長及びＡｍｙＥ切断タンパク質の両方が多量に発現されたことから、培養上清を、それ以上の精製を行わずにアッセイに用いた。
【０２２１】
実施例２
下記の実施例で、以下のアッセイを用いた。下記に提供されるプロトコールの任意の逸脱も実施例で示される。これらの実験において、分光光度計を、反応の終了後に形成された生産物の吸光度を測定するために用いた。
【０２２２】
２．１．９６穴マイクロタイタープレート中のタンパク質含有量の測定のためのブラッドフォード・アッセイ
サンプル上清中のタンパク質濃度を、ブラッドフォードＱｕｉｃｋＳｔａｒｔ（商標）Ｄｙｅ試薬（バイオラッド、カリフォルニア州）を用いて測定した。サンプルを、２８０ｒｐｍで振とうし、高湿度の通気で３日間３７℃のマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）で増殖した培養からの培養液をろ過して得た。培養ろ液の１０μＬのサンプルを、第２ＭＴＰのウェル内で２００μＬのブラッドフォードＱｕｉｃｋＳｔａｒｔ（商標）Ｄｙｅ試薬と組み合わせた。完全な混合の後、ＭＴＰを室温で少なくとも１０分間インキュベートした。気泡を除去し、ＯＤ（光学密度）を５９５ｎｍで測定した。タンパク質濃度を算出するため、（植菌されていないウェルからの）バックグラウンド測定値をサンプル測定値から引き算した。
【０２２３】
２．２．ＡｍｙＥ活性の測定
ＡｍｙＥはトランスグルコシダーゼ活性を示す。すなわち、ＡｍｙＥは、マルトースからの三糖の生成を触媒する。図６は、マルトースを加えてＡｍｙＥをインキュベートした後の三糖のＨＰＬＣ検出を示す。図７は、ＡｍｙＥ媒介マルトトリオース合成の反応組成物を時間にわたって示す。ＡｍｙＥの酵素活性を、そのトランスグルコシダーゼ活性に基づき測定した。マルトースから三糖の一ミクロモルを毎分生産するアッセイ条件下で要求される酵素量から、ＡｍｙＥの一単位を定義した。代表的なアッセイにおいて、ＡｍｙＥのサンプルの一部０．１ｍｌを、リン酸緩衝液、ｐＨ４．５中の３０％マルトース５ｍｌに添加し、６０℃で６０分間インキュベートした。その反応を、１０分間熱湯浴槽にサンプルを置くことで終了させた。サンプル中に存在する三糖の量を、ＨＰＬＣで測定した。
【０２２４】
２．３．グルコアミラーゼ活性の測定
グルコアミラーゼ活性を、ｐ−ニトロフェニル−アルファ−Ｄ−グルコピラノシド（ＰＮＰＧ）からグルコース及びｐ−ニトロフェノールへの加水分解を触媒するその能力に基づいたアッセイを用いて測定した。アルカリのｐＨにおいて、遊離されたニトロフェノールは、グルコアミラーゼ活性に比例した黄色を示し、４００ｎｍでモニタリングされる。ｐＨ４．２及び６０℃で可溶性デンプン基質（４％）から、毎時グルコースとして計算される１μモルの還元糖を生産する酵素量として、一のグルコアミラーゼ活性単位（ＧＡＵ）を定義した。
【０２２５】
２．４．プルラナーゼ活性の測定
プルラナーゼ活性を、可溶性赤プラン（ｒｅｄ−ｐｕｌｌａｎ）基質を利用する比色法で測定した。プルラナーゼは、赤プラン基質の加水分解を触媒することができ、それにより、染色基質からの可溶性断片の遊離がもたらされる。酵素反応は、９５％のエタノール溶液で基質を沈殿させることにより終了する。上清を、５０１ｎｍでの分光測光法で測定した。色彩強度の程度は、酵素活性に比例する。ｐＨ４．５及び６０℃でプルランから、毎分グルコースとして一の等価還元電位を遊離する酵素量として、一の酸安定プルラナーゼ単位（ＡＳＰＵ）を定義した。
【０２２６】
２．５．従来のエタノール発酵
４００ｐｐｍの尿素を含むイリノイ川エネルギー（Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｅｎｅｒｇｙ）から得られた液化物（ｌｉｑｕｅｆａｃｔ）（３１％ＤＳ）の二バッチを、（５Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を用いて）ｐＨ４．３及びｐＨ５．８に調節した。１００ｇの基質を、１２５ｍＬのエルレンマイヤーフラスコに添加した。ＡｍｙＥ−ｔｒ及びＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＸＴＲＡアミラーゼを、０．２０ｍｇ／ｇ  ＤＳで供給した。発酵では、ＤＩ水で〜４５分間あらかじめ水和された０．２ｍｌの１０％（ｗ／ｖ）レッドスターエタノール紅色酵母（Ｒｅｄ  Ｓｔａｒ  Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｒｅｄ  ｙｅａｓｔ）を植菌した。４８時間の発酵のため、フラスコを３２０ｒｐｍの撹拌バーと共に３２℃でインキュベートした。
【０２２７】
２．６．全粒トウモロコシのエタノール発酵
４００ｐｐｍの尿素を含む３２％ＤＳコーンフラワー基質の二バッチを、（５Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を用いて）ｐＨ４．３及びｐＨ５．８に調節した。１００ｇの基質を、１２５ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに添加した。全長ＡｍｙＥ（配列番号１）及びＡｍｙＥ−ｔｒ（配列番号２）を０．２０ｍｇ／ｇ  ＤＳで供給し、Ａ．カワチイ・アルファ・アミラーゼ（ＡｋＡＡ、配列番号６）を１．５ＳＳＵ／ｇ  ＤＳで供給した。ＡｋＡＡのアミノ酸配列は、米国特許番号７，３３２，３１９の配列番号４に開示される。また、全粒トウモロコシを加水分解するＡｍｙＥ及びＡｍｙＥ−ｔｒの能力を、０．５ＧＡＵ／ｇで供給されたＴ．リーセイ・グルコアミラーゼ（ＴｒＧＡ、配列番号７）と１．５ＳＳＵ／ｇ  ＤＳで供給されたＡ．カワチイ・アルファ・アミラーゼとの混合物とで比べた。ＴｒＧＡのアミノ酸配列は、国際公開番号ＷＯ０６／０６００６２の配列番号３に開示される。発酵では、ＤＩ水で〜４５分間あらかじめ水和された０．２ｍｌの１０％（ｗ／ｖ）レッドスターエタノール紅色酵母（Ｒｅｄ  Ｓｔａｒ  Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｒｅｄ  ｙｅａｓｔ）を植菌した。７２時間の発酵のため、フラスコを３００ｒｐｍの撹拌バーと共に３２℃でインキュベートした。
【０２２８】
２．７．ＨＰＬＣ測定値によるグルコース生成の測定
マルトース及びマルトヘプタオースの加水分解
０．５％のマルトースまたはマルトヘプタオース溶液を、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５または５．６で、または５０ｍＭリンゴ酸、ｐＨ５．６で、各実験で指定されるように調製した。全ての酵素サンプルを、１ｍｇ／ｍＬに初めに希釈した。反応混合物を、１ｐｐｍの最終酵素濃度にするため、適切な基質溶液を用いた酵素の希釈で調製し、次に、２００μＬ分をねじ蓋の無菌チューブに移した後、３７℃のインキュベーターに置いた。その反応を、１０ｍＭ水酸化ナトリウムで１０倍に希釈し、所定時間で止めた。
【０２２９】
不溶性デンプンの加水分解
不溶性顆粒デンプンの加水分解の測定のため、精製ＡｍｙＥ（２４．５ｇ／ｌ）を、リンゴ酸緩衝剤、ｐＨ５．６で２０．４ｐｐｍの最終濃度に希釈した。次に、前記タンパク質を、リンゴ酸緩衝剤、ｐＨ５．６で調製された５％コーンフラワー溶液に、１ｐｐｍの最終濃度になるよう添加した。また、前記混合物を、３２℃のシェーカー内でインキュベートした。サンプルを周期的に採取し、反応を止めるため、５０ｍＭ  ＮａＯＨで１０倍に希釈した。
【０２３０】
ＨＰＬＣ検出方法
糖化生産物の組成物を、ＨＰＬＣシステム（ベックマン・システム・ゴールド３２カラット・フラートン、カリフォルニア州）で測定した。５０℃で維持された前記システムを、Ｒｅｚｅｘ  ８  ｕ８％  Ｈ単糖カラム及び屈折率（ＲＩ）検出器（ＥＲＣ−７５１５Ａ、アンスペック・カンパニー・インク（Ａｎｓｐｅｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．））に装備した。希硫酸（０．０１Ｎ）を、０．６ｍｌ／分の流速での移動相に流した。反応混合物の４．０％溶液の２０μｌを、カラムに注入した。溶出プロフィルを４５分間得た。糖の分布及び各糖の量を、事前に測定された基準から判定した。
【０２３１】
２．８．沈殿物試験
一定温度にするため、糖化されたシロップのサンプルを、１０−３０分間６０℃の水浴槽でインキュベートした。しかしながら、前記インキュベーションは、一時間より長くあるべきでない。必要な場合、ＤＳ値を、試験前に３５％±０．５％に調節した。サンプルを、磁気撹拌機上でよく混合し、シリンジで遠心分離管に移した。サンプルを、１０分間２，５００ｒｐｍ（１，３５０×ｇ）で遠心分離機にかけた。沈殿物が存在する場合、沈殿物は、遠心分離管の底に目で見える。
【０２３２】
２．９．糖化されたデンプンからのろ液の調製
カラムカバーを、６０℃で維持した。二個のろ紙ディスクを、挿入し、Ｏリングガスケットに嵌まるまで接続金具内のねじで留めた。計量された２５０ｍｌの真空フラスコを設置する一方、１００ｍｌの水を、出口を塞さいだカラムに添加した。安定した真空が２３−２４インチに達するまで、真空ポンプを作動した。チューブ出口を開け、タイマーを開始した。１００ｍｌの水は、１分１０秒間から１分間３０秒間でのろ過が必要とされる。時間が長すぎるか、短すぎる場合、紙が張っているかを確かめるために紙をチェックされたい。紙を乾燥のために引き抜いた後、出口チューブを締めた。出口チューブのクランプを外し、ポンプをそのまま作動させた。フラスコを、計量された２５０ｍｌのろ過フラスコと取り替えた。およそ２．０グラムのろ過促進剤を、２５０ｍｌビーカー内の１００グラムの試験液と混合した。サンプルを磁性プレート上で攪拌する一方、標的の分量でサンプルを採取するためにシリンジを用いた。電子ばかりが、この工程で用いられることが出来る。懸濁液内で微粒子を維持する一方、全量を、漏斗を使ってカラムに素早く移した。出口チューブのクランプを開け、タイマーを開始した。液がろ床の上部に到着するまで、ろ液を集め、その時間を記録した。集めたろ液は、その後の試験、例えば、ヨウ素試験等に適する。
【０２３３】
２．１０．ヨウ素試験
糖液のヨウ素試験のために、０．２ｍｌの糖液を１０ｍｌのＤＩ水で希釈した。希釈した糖液を、１０分間沸騰させ、次に、氷浴内で冷やした。０．５ｍｌのヨード液（０．０２Ｍ）を、冷えた糖液サンプルに添加した。
【０２３４】
ろ液試験のために、実施例２．９で得られた０．５ｍｌのろ液を、１０ｍｌのＤＩ水で希釈した。希釈されたろ液を、１０分間沸騰させ、次に、氷浴内で冷やした。０．５ｍｌのヨード液（０．０２Ｍ）を、冷えたろ液サンプルに添加した。
【０２３５】
実施例３
（酢酸ナトリウム緩衝液を用いて）ｐＨ４．５及びｐＨ５．６でＡｍｙＥがマルトースをグルコースに転換する能力を、実施例２．７に記載のグルコース生成アッセイを用いて試験した。その反応を、２、５及び８日後に分析した。図８で示すように、ＡｍｙＥ（配列番号１）、ＡｍｙＥ−ｔｒ（配列番号２）及びＡｍｙ３１Ａ（配列番号３）は、マルトースをグルコースに効果的に転換した。しかし、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス・アルファ・アミラーゼ及びＡｍｙＳ（配列番号４、３４アミノ酸のリーダー配列で示される）は、これらの条件下で最少量のグルコース生成のみを示した。
【０２３６】
実施例４
ＤＰ７または不溶性の非加熱顆粒デンプンの加水分解を触媒する、ＡｍｙＥ（配列番号１）及びＡｍｙＥ−ｔｒ（配列番号２）の能力を試験した。不溶性デンプンから生産された糖の検出に用いられたＨＰＬＣ方法は、実施例２．７に記載する。反応が開始された後の分解産物を多様な時間でのＨＰＬＣ解析で数量化した。
【０２３７】
図９は、１ｐｐｍのＡｍｙＥ−ｔｒが存在する状態で０．５％マルトヘプタオース基質を７２時間インキュベートした後に得られた加水分解生成物を示す。図９の下位パネルで見ることが出来るように、ＡｍｙＥ−ｔｒは、７２時間でＤＰ７基質のほとんど全てをグルコースに転換する。この結果は、ＡｍｙＥがグルコースへＤＰ７基質を効率的に分解することが出来ることを実証する。
【０２３８】
それに比較し、１ｐｐｍのＡｍｙＳ（配列番号４）またはＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＦＲＥＤ（「Ｆｒｅｄ」、配列番号８）のいずれかによるＤＰ７基質の分解を、図１０及び図１１にそれぞれ示す。反応からのサンプルを、上記の実施例２．４で示すＨＰＬＣ手順を用いて分析した。上位から下位までの図１０中のパネルは、ＡｍｙＳの添加後、０時間、２時間、４時間及び２４時間での反応生成物を表わす。上位から下位までの図１１中のパネルは、ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＦＲＥＤの添加後、０時間、１時間、２時間及び３時間での反応生成物を表わす。この結果は、ＡｍｙＳまたはＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＦＲＥＤが存在する状態において、所定の時間でＤＰ７基質の相当な部分が、ＤＰ２の重合度またはそれ以上で残ることを示す。
【０２３９】
図１２は、実施例２．４で示す手順に従って、３２℃で１ｐｐｍのＡｍｙＥ（配列番号１）を含む５％コーンフラワー溶液をインキュベートした結果を示す。この結果は、ＡｍｙＥ単独で不溶性顆粒デンプンをグルコースに効率的に転換出来ることを示す。
【０２４０】
実施例５
従来のエタノール発酵での切断ＡｍｙＥの性能を、実施例２．５に記載の従来のエタノール発酵アッセイを用いて、イリノイ川エネルギー液化物（３１％ＤＳ）について試験した。ＡｍｙＥ−ｔｒ（配列番号２）の性能を、ｐＨ４．３及びｐＨ５．８でのＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＸＴＲＡアミラーゼ（ダニスコＵＳ・インク、ジェネンコー・ディビジョン、ＡｍｙＲ、配列番号５）と比較した。発酵を、４８時間行なった。ＡｍｙＥ−ｔｒ及びＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＸＴＲＡアミラーゼを、０．２ｍｇ／ｇ  ＤＳで供給した。図１３で示すように、ｐＨ５．８でＡｍｙＥ−ｔｒにより生産された最終エタノール収率は、１２．０％（ｖ／ｖ）であった。ｐＨ４．３でＡｍｙＥ−ｔｒにより生産された最終エタノール収率は、７．３％（ｖ／ｖ）であった。ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＸＴＲＡアミラーゼが存在する状態での最終エタノール収率は、ｐＨ４．３で２．７％（ｖ／ｖ）及びｐＨ５．８で３．９％（ｖ／ｖ）であった。従って、ＡｍｙＥ−ｔｒは、液化物の従来のエタノール発酵で、ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＸＴＲＡアミラーゼより顕著に多くのエタノールを生産する。この実施例は、ｐＨ４．３よりもｐＨ５．８で、ＡｍｙＥ−ｔｒはより多くのエタノールを生産することをさらに実証する。
【０２４１】
実施例６
ｐＨ４．３及びｐＨ５．８での不溶性顆粒（非加熱）デンプンのエタノールへの加水分解を触媒する、ＡｍｙＥ（配列番号１）及びＡｍｙＥ−ｔｒ（配列番号２）の能力を、実施例２．７で記載の全粒トウモロコシ・アッセイにおけるエタノール発酵を用いて比較した。ＡｍｙＥ及びＡｍｙＥ−ｔｒのエタノール生産性能を、１．５ＳＳＵ／ｇで供給されたＡ．カワチイ・アルファ・アミラーゼ（ＡｋＡＡ、配列番号６）、０．５ＧＡＵ／ｇで供給されたＴ．リーセイ・グルコアミラーゼ（ＴｒＧＡ、配列番号７）プラス１．５ＳＳＵ／ｇで供給されたＡ．カワチイ・アルファ・アミラーゼとの混合物とで比較した。ＡｍｙＥ全長及び切断ＡｍｙＥの両方を、０．２ｍｇ／ｇ  ＤＳで供給した。
【０２４２】
図１４は、ｐＨ４．３及びｐＨ５．８で酵素により生産された最終エタノール収率を示す。ｐＨ５．８で試験された場合、ＡｍｙＥ（−−●−−）及びＡｍｙＥ−ｔｒ（−−■−−）の両方はＴｒＧＡ／ＡｋＡＡ（−−▲−−）に匹敵する程度に機能した。ここで、ＡｍｙＥは実際に、ＴｒＧＡ／ＡｋＡＡで観察されたエタノール収率を超えていた。ＡｍｙＥ（−−○−−）及びＡｍｙＥ−ｔｒ（−−□−−）は、ｐＨ４．３でエタノールを生産したが、その収率はＴｒＧＡ／ＡｋＡＡ（−−△−−）で得られたほど高くなかった。それに比べ、ＡｋＡＡは、試験された両方のｐＨであまり機能しなかった（−−◆◇−−）。この実施例は、ｐＨ５．８付近での糖化反応で、ＡｍｙＥがグルコアミラーゼと完全に置き換わることが出来ることを実証する。さらに、ｐＨ４．３での糖化反応で、ＡｍｙＥがグルコアミラーゼと部分的にまたは完全に置き換わることが出来ることも実証する。
【０２４３】
実施例７
糖化内の補助的な酵素としてのＡｍｙＥの能力を、液化デンプン基質にＡｍｙＥ及びＴｒＧＡの多様な組み合わせを適用することで試験した。３２％ｄｓの精製デンプン（カーギル、ミネアポリス、ミネソタ州）含有の水性スラリー、１０ｐｐｍのＣａ２＋及び１００ｐｐｍの二酸化硫黄（ＳＯ２）を、一定の攪拌と共に一晩混合した。スラリーのｐＨを、炭酸ナトリウム（２０％ｗ／ｖ）で約５．８に調節した。スラリーのボーメ度は、およそ２２．３であった。熱安定性アルファ・アミラーゼＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＦＲＥＤ（ダニスコＵＳ・インク、ジェネンコー・ディビジョン）を、０．５６ｋｇ／ＭＴ  ｄｓトウモロコシに連続して添加した。スラリーを、第一加熱のために約１０７−１０９℃の平均温度で加熱し、６分間の滞留時間と共に０．５ｇｐｍでＭ１０１ハイドロヒーターを装備したパイロットプラント噴流を通って送った。サンプルを出口で集め、９５℃の水浴槽に置いた。第２液化を、いずれの酵素も追加しないで、９５℃でさらに行なった。デンプン基質の最終ＤＥが１０ＤＥに達するまで、第２液化を継続した。次に、９５℃でデンプンスラリーのｐＨをｐＨ４．５に低下させることで液化を終了した。デンプン液化物または液化デンプン基質とも呼ばれる、加工されたスラリーを、以下の糖化実験で用いた。
【０２４４】
糖化を、商業用酵母発酵条件下、すなわち、ｐＨ５．３及び３２℃で、ＴｒＧＡ及びＡｍｙＥの異なる量を含む３２％の固形物で行った。糖の組成物（発酵性糖及びより高級な糖）を、異なる時間区間で採取したサンプルのＨＰＬＣまたはヨード染色で測定した。その結果を表１に収集した。
【表１】
0005599113.tif 000003
0005599113.tif 000004
0005599113.tif 000005
【０２４５】
表１で示すデータに基づき、ＴｒＧＡ及びＡｍｙＥの組み合わせは、糖化においてＴｒＧＡ単独よりも効率的である。ＴｒＧＡ及びＡｍｙＥの組み合わせは、（１）発酵性糖（ＤＰ１、ＤＰ２及びＤＰ３の全て）のより高いレベル、及び（２）高い速度でより高級な糖質（＞ＤＰ４＋）の加水分解を結果として生じた。従って、ＴｒＧＡへのＡｍｙＥの補給により、グルコアミラーゼのみを用いる従来の工程より多くの発酵性糖を生産することが出来る。
【０２４６】
実施例８
他のバチルス・アルファ・アミラーゼ、例えば、ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＦＲＥＤ及びＧＣ３５８（両方ともダニスコＵＳ・インク、ジェネンコー・ディビジョンから）について、実施例７のように糖化での特性解析を行った。液化デンプン基質の糖化を、ＴｒＧＡと共に、ｐＨ５．２及び３２℃で行った。糖の組成物（発酵性糖及びより高級な糖）を、６、１８、２４及び５４時間で採取したサンプルで測定した。表２で示すその結果は、グルコアミラーゼへのＡｍｙＥの補給が他のバチルス・アルファ・アミラーゼの対応量の補給よりも、より多くの発酵性糖を生産出来ることを示す。この所見は、マルトースをグルコースに転換し、かつＤＰ７を加水分解する、ＡｍｙＥの優れた能力に関して実施例５−６で記載することと一貫している。従って、ＡｍｙＥの有利な特性は、他のバチルス・アルファ・アミラーゼで普遍的に共有されるものではない。
【表２】
0005599113.tif 000006
0005599113.tif 000007
【０２４７】
実施例９
糖化されたデンプンがヨウ素と共に試験された場合、加水分解を免れた任意のアミロースはヨウ素に結合し、特有の青い色を生じる。これはヨウ素陽性糖（ＩＰＳ）と呼ばれ、液化／糖化効率の指標となる。ＩＰＳの存在は不完全なデンプン分解を表わすため、ＩＰＳはデンプン加工用途において非常に望ましくない。図１５は、ＴｒＧＡへのＡｍｙＥの補給がろ液内のＩＰＳの存在を顕著に減少させたことを示す。
【０２４８】
加えて、図１６は、多様な酵素の組み合わせにより触媒された糖化における時間を追って、ＩＰＳの存在（５２０ｎｍの吸光度で反映されたものとして）を示す。Ｓｐｉｒｉｚｙｍｅ  Ｕｌｔｒａ（商標）（ノボザイムズＡ／Ｓ）の等価量での場合に類似したＩＰＳの量に、ＴｒＧＡへの０．０２ｍｇ／ｇのＡｍｙＥの補給は顕著にＩＰＳの量を減少した。
【０２４９】
さらに、ＡｍｙＥが補給された糖化反応に存在する不溶性残留デンプン（ＩＲＳ）の量が、より低量であることが観察された。不溶性残留デンプンとは、糖化後に沈殿物として現れる不完全に加水分解されたデンプンをいう。沈殿物が生産の効率を本質的に妨害し、生産高を減少させ得るため、多量の沈殿物は甘味料用途において特に望ましくない。図１７は、糖化においてＴｒＧＡ単独により触媒された場合にＩＲＳの相当量の存在があることを示す。０．００２５ｍｇ／ｇ  ｄｓ程度に低いＡｍｙＥの補給でも、劇的にＩＲＳの量を減らした。従って、ＡｍｙＥで補給されたＴｒＧＡによる糖化はより効率的であり、糖化されたデンプンは、本明細書で記載するような一連の用途に適する。
【０２５０】
実施例１０
（１）ＡｍｙＥ、（２）ＡｎＧＡ（ＯＰＴＤＥＸ  Ｌ−４００、ダニスコＵＳ・インク、ジェネンコー・ディビジョン）、及び（３）プルラナーゼ（ＯＰＴＩＭＡＸ（商標）Ｌ−１０００、ダニスコＵＳ・インク、ジェネンコー・ディビジョン）の異なる量で、ｐＨ４．５及び６０℃で液化デンプン基質（３２％ｄｓ）についてさらに糖化を行った。糖の組成物（発酵性糖及びより高級な糖）を、６、１８、２４、４８及び７２時間で採取したサンプルのＨＰＬＣまたはヨード染色により測定した。その結果を表３に収集した。
【表３】
0005599113.tif 000008
0005599113.tif 000009
【０２５１】
表３で示すデータは、０．１１ＧＡＵ／ｇのＡｎＧＡへの０．２単位／ｇのＡｍｙＥの補給が、（１）発酵性糖のより多い量を生じることができ、（２）０．２２ＧＡＵ／ｇのＡｎＧＡ単独による加水分解よりも高い速度でより高級な糖質を減少出来ることを示す。この結果は、ＡｍｙＥが糖化で少なくとも５０％のグルコアミラーゼと置き換わることが出来ることを示唆する。さらに、ＡｍｙＥ及びグルコアミラーゼへの脱分岐酵素の追加は、発酵性糖のより多い量及び非発酵性糖（ＤＰ４＋）の顕著に減少した量を結果として生じ、これらの両方は効率的な糖化工程を示す。
【０２５２】
実施例１１
糖化において使用可能な酵素としてのＡｍｙＥの能力をさらに特性解析するため、グルコアミラーゼ混合物と同様に、異なるグルコアミラーゼと組み合わされたＡｍｙＥを、液化デンプン基質に適用した。糖化を、ｐＨ５．２及び３２℃で行った。糖の組成物（発酵性糖及びより高級な糖）を、６、１８、２４及び４８時間で採取したサンプルで測定した。表４で示すように、他のグルコアミラーゼまたはグルコアミラーゼ配合物へのＡｍｙＥの追加は、全体の発酵性糖の増加した値及び非発酵性糖の顕著に減少した値を結果として生じた。
【表４】
0005599113.tif 000010
0005599113.tif 000011
【０２５３】
さらに、上記の糖化実験の第１及び第２勾配を計算し、表５に収集した。第１及び第２勾配は、より高い分子量及びより低い分子量の基質を加水分解する相対速度をそれぞれ表わす。ここで示すデータは、ＡｍｙＥが補給された場合、第２勾配の値が顕著に増加したことから、ＡｍｙＥの補給が低分子量基質の加水分解を顕著に加速することを示す。表５及び図１８を参照されたい。
【表５】
0005599113.tif 000012
【０２５４】
実施例１２
生物燃料生産における酵素としてＡｍｙＥを用いる利点を、さらに解析した。イリノイ川エネルギー（ロシェル、イリノイ州）からの全粒トウモロコシ液化物を、室温に置く前に７５℃で溶かした。ｐＨを５．５に保った。その液化物を、１５０グラムの分量で２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコに分配した。各フラスコ内の液化物に、５００μｌの２０％酵母／水溶液及び６００μｌの１０％尿素／水溶液（最終濃度４００ｐｐｍ）を加えた。各発酵実験に供給された酵素タンパク質の合計は、０．１６ｍｇ／ｇ  ｄｓであった。ＴｒＧＡに供給された量は、０．３２５ＧＡＵ／ｇ  ｄｓの標準ＧＡ供給量と同量である。酵素及び／または酵素の組み合わせを、表６で示す実験計画法に従って供給した。
【表６】
0005599113.tif 000013
【０２５５】
フラスコを、１５０ｒｐｍでの強制空気シェーカー内において３２℃でインキュベートした。サンプルを、ＨＰＬＣ解析のために定期間隔で、さらにデンプン解析のために発酵の終了時に採取した。その結果を、表７に収集し、図１９及び図２０で示した。
【表７】
0005599113.tif 000014
【０２５６】
表４で示すデータは、ＴｒＧＡ単独及びＡｍｙＥ／ＴｒＧＡ（２５／７５）配合物が、最終エタノール収率と同様に、ほとんど同一のエタノール生産速度を示すことを表す。ＡｍｙＥ／ＴｒＧＡ（５０／５０）配合物は、エタノール生産速度の点においてＡｎＧＡ単独に匹敵して機能したが、その両方は、ＴｒＧＡ単独及びＡｍｙＥ／ＴｒＧＡ（２５／７５）配合物より有意に遅くエタノールを生産した。残留デンプン・データの比較は、ＡｍｙＥ／ＴｒＧＡ（２５／７５）配合物が全体の炭水化物の使用量の点においてＡｎＧＡ単独と同等に機能したことを示す。
【０２５７】
図１６は、ＡｍｙＥが発酵の誘導（酵母増殖）期中のグルコースサージを効果的に減少出来ることを示す。ＴｒＧＡによる糖化において標準的な、グルコースサージは、フィードバック阻害によりさらなる糖化を遅くすると考えられている。一方、図１７は、アルコール生産の酵母発酵において、ＡｍｙＥがグルコアミラーゼの全体のおよそ少なくとも２５％と置き換わることが出来ることを示す。
【０２５８】
[配列表]
配列リスト
配列番号１：全長バチルス・ズブチリスＡｍｙＥのアミノ酸配列。天然シグナル配列は示されない：
１ ＬＴＡＰＳＩＫＳＧＴ  ＩＬＨＡＷＮＷＳＦＮ  ＴＬＫＨＮＭＫＤＩＨ  ＤＡＧＹＴＡＩＱＴＳ  ＰＩＮＱＶＫＥＧＮＱ
５１ ＧＤＫＳＭＳＮＷＹＷ  ＬＹＱＰＴＳＹＱＩＧ  ＮＲＹＬＧＴＥＱＥＦ  ＫＥＭＣＡＡＡＥＥＹ  ＧＩＫＶＩＶＤＡＶＩ
１０１ ＮＨＴＴＳＤＹＡＡＩ  ＳＮＥＶＫＳＩＰＮＷ  ＴＨＧＮＴＱＩＫＮＷ  ＳＤＲＷＤＶＴＱＮＳ  ＬＬＧＬＹＤＷＮＴＱ
１５１ ＮＴＱＶＱＳＹＬＫＲ  ＦＬＤＲＡＬＮＤＧＡ  ＤＧＦＲＦＤＡＡＫＨ  ＩＥＬＰＤＤＧＳＹＧ  ＳＱＦＷＰＮＩＴＮＴ
２０１ ＳＡＥＦＱＹＧＥＩＬ  ＱＤＳＡＳＲＤＡＡＹ  ＡＮＹＭＤＶＴＡＳＮ  ＹＧＨＳＩＲＳＡＬＫ  ＮＲＮＬＧＶＳＮＩＳ
２５１ ＨＹＡＳＤＶＳＡＤＫ  ＬＶＴＷＶＥＳＨＤＴ  ＹＡＮＤＤＥＥＳＴＷ  ＭＳＤＤＤＩＲＬＧＷ  ＡＶＩＡＳＲＳＧＳＴ
３０１ ＰＬＦＦＳＲＰＥＧＧ  ＧＮＧＶＲＦＰＧＫＳ  ＱＩＧＤＲＧＳＡＬＦ  ＥＤＱＡＩＴＡＶＮＲ  ＦＨＮＶＭＡＧＱＰＥ
３５１ ＥＬＳＮＰＮＧＮＮＱ  ＩＦＭＮＱＲＧＳＨＧ  ＶＶＬＡＮＡＧＳＳＳ  ＶＳＩＮＴＡＴＫＬＰ  ＤＧＲＹＤＮＫＡＧＡ
４０１ ＧＳＦＱＶＮＤＧＫＬ  ＴＧＴＩＮＡＲＳＶＡ  ＶＬＹＰＤＤＩＡＫＡ  ＰＨＶＦＬＥＮＹＫＴ  ＧＶＴＨＳＦＮＤＱＬ
４５１ ＴＩＴＬＲＡＤＡＮＴ  ＴＫＡＶＹＱＩＮＮＧ  ＰＥＴＡＦＫＤＧＤＱ  ＦＴＩＧＫＧＤＰＦＧ  ＫＴＹＴＩＭＬＫＧＴ
５０１ ＮＳＤＧＶＴＲＴＥＫ  ＹＳＦＶＫＲＤＰＡＳ  ＡＫＴＩＧＹＱＮＰＮ  ＨＷＳＱＶＮＡＹＩＹ  ＫＨＤＧＳＲＶＩＥＬ
５５１ ＴＧＳＷＰＧＫＰＭＴ  ＫＮＡＤＧＩＹＴＬＴ  ＬＰＡＤＴＤＴＴＮＡ  ＫＶＩＦＮＮＧＳＡＱ  ＶＰＧＱＮＱＰＧＦＤ
６０１ ＹＶＬＮＧＬＹＮＤＳ  ＧＬＳＧＳＬＰＨ
配列番号２：切断バチルス・ズブチリスＡｍｙＥ（ＡｍｙＥ−ｔｒ）のアミノ酸配列。天然シグナル配列は示されない：
１  ＬＴＡＰＳＩＫＳＧＴ  ＩＬＨＡＷＮＷＳＦＮ  ＴＬＫＨＮＭＫＤＩＨ  ＤＡＧＹＴＡＩＱＴＳ  ＰＩＮＱＶＫＥＧＮＱ
５１ ＧＤＫＳＭＳＮＷＹＷ  ＬＹＱＰＴＳＹＱＩＧ  ＮＲＹＬＧＴＥＱＥＦ  ＫＥＭＣＡＡＡＥＥＹ  ＧＩＫＶＩＶＤＡＶＩ
１０１ ＮＨＴＴＳＤＹＡＡＩ  ＳＮＥＶＫＳＩＰＮＷ  ＴＨＧＮＴＱＩＫＮＷ  ＳＤＲＷＤＶＴＱＮＳ  ＬＬＧＬＹＤＷＮＴＱ
１５１ ＮＴＱＶＱＳＹＬＫＲ  ＦＬＤＲＡＬＮＤＧＡ  ＤＧＦＲＦＤＡＡＫＨ  ＩＥＬＰＤＤＧＳＹＧ  ＳＱＦＷＰＮＩＴＮＴ
２０１ ＳＡＥＦＱＹＧＥＩＬ  ＱＤＳＡＳＲＤＡＡＹ  ＡＮＹＭＤＶＴＡＳＮ  ＹＧＨＳＩＲＳＡＬＫ  ＮＲＮＬＧＶＳＮＩＳ
２５１ ＨＹＡＳＤＶＳＡＤＫ  ＬＶＴＷＶＥＳＨＤＴ  ＹＡＮＤＤＥＥＳＴＷ  ＭＳＤＤＤＩＲＬＧＷ  ＡＶＩＡＳＲＳＧＳＴ
３０１ ＰＬＦＦＳＲＰＥＧＧ  ＧＮＧＶＲＦＰＧＫＳ  ＱＩＧＤＲＧＳＡＬＦ  ＥＤＱＡＩＴＡＶＮＲ  ＦＨＮＶＭＡＧＱＰＥ
３５１ ＥＬＳＮＰＮＧＮＮＱ  ＩＦＭＮＱＲＧＳＨＧ  ＶＶＬＡＮＡＧＳＳＳ  ＶＳＩＮＴＡＴＫＬＰ  ＤＧＲＹＤＮＫＡＧＡ
４０１ ＧＳＦＱＶＮＤＧＫＬ  ＴＧＴＩＮＡＲＳＶＡ  ＶＬＹＰＤ
配列番号３：バチルス・ズブチリス・アルファ・アミラーゼ変異体Ａｍｙ３１Ａのアミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＴｒＥＭＢＬ登録番号Ｏ８２９５３）。天然シグナル配列は太字で示す：
１ ＭＦＥＫＲＦＫＴＳＬ  ＬＰＬＦＡＧＦＬＬＬ  ＦＨＬＶＬＳＧＰＡＡ  ＡＮＡＥＴＡＮＫＳＮ  ＫＶＴＡＳＳＶＫＮＧ
５１ ＴＩＬＨＡＷＮＷＳＦ  ＮＴＬＴＱＮＭＫＤＩ  ＲＤＡＧＹＡＡＩＱＴ  ＳＰＩＮＱＶＫＥＧＮ  ＱＧＤＫＳＭＳＮＷＹ
１０１ ＷＬＹＱＰＴＳＹＱＩ  ＧＮＲＹＬＧＴＥＱＥ  ＦＫＤＭＣＡＡＡＥＫ  ＹＧＶＫＶＩＶＤＡＶ  ＶＮＨＴＴＳＤＹＧＡ
１５１ ＩＳＤＥＩＫＲＩＰＮ  ＷＴＨＧＮＴＱＩＫＮ  ＷＳＤＲＷＤＩＴＱＮ  ＡＬＬＧＬＹＤＷＮＴ  ＱＮＴＥＶＱＡＹＬＫ
２０１ ＧＦＬＥＲＡＬＮＤＧ  ＡＤＧＦＲＹＤＡＡＫ  ＨＩＥＬＰＤＤＧＮＹ  ＧＳＱＦＷＰＮＩＴＮ  ＴＳＡＥＦＱＹＧＥＩ
２５１ ＬＱＤＳＡＳＲＤＴＡ  ＹＡＮＹＭＮＶＴＡＳ  ＮＹＧＨＳＩＲＳＡＬ  ＫＮＲＩＬＳＶＳＮＩ  ＳＨＹＡＳＤＶＳＡＤ
３０１ ＫＬＶＴＷＶＥＳＨＤ  ＴＹＡＮＤＤＥＥＳＴ  ＷＭＳＤＤＤＩＲＬＧ  ＷＡＶＩＧＳＲＳＧＳ  ＴＰＬＦＦＳＲＰＥＧ
３５１ ＧＧＮＧＶＲＦＰＧＫ  ＳＱＩＧＤＲＧＳＡＬ  ＦＫＤＱＡＩＴＡＶＮ  ＱＦＨＮＥＭＡＧＱＰ  ＥＥＬＳＮＰＮＧＮＮ
４０１ ＱＩＦＭＮＱＲＧＳＫ  ＧＶＶＬＡＮＡＧＳＳ  ＳＶＴＩＮＴＳＴＫＬ  ＰＤＧＲＹＤＮＲＡＧ  ＡＧＳＦＱＶＡＮＧＫ
４５１ ＬＴＧＴＩＮＡＲＳＡ  ＡＶＬＹＰＤＤＩＧＮ  ＡＰＨＶＦＬＥＮＹＱ  ＴＥＡＶＨＳＦＮＤＱ  ＬＴＶＴＬＲＡＮＡＫ
５０１ ＴＴＫＡＶＹＱＩＮＮ  ＧＱＥＴＡＦＫＤＧＤ  ＲＬＴＩＧＫＥＤＰＩ  ＧＴＴＹＮＶＫＬＴＧ  ＴＮＧＥＧＡＳＲＴＱ
５５１ ＥＹＴＦＶＫＫＤＰＳ  ＱＴＮＩＩＧＹＱＮＰ  ＤＨＷＧＮＶＮＡＹＩ  ＹＫＨＤＧＧＧＡＩＥ  ＬＴＧＳＷＰＧＫＡＭ
６０１ ＴＫＮＡＤＧＩＹＴＬ  ＴＬＰＡＮＡＤＴＡＤ  ＡＫＶＩＦＮＮＧＳＡ  ＱＶＰＧＱＮＨＰＧＦ  ＤＹＶＱＮＧＬＹＮＮ
６５１ ＳＧＬＮＧＹＬＰＨ
配列番号４：切断ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス・アルファ・アミラーゼ（ＡｍｙＳ、ａ／ｋ／ａ「Ｅｔｈｙｌ３」）のタンパク質配列。シグナル配列は太字で示す：
１ ＭＬＴＦＨＲＩＩＲＫ  ＧＷＭＦＬＬＡＦＬＬ  ＴＡＳＬＦＣＰＴＧＱ  ＨＡＫＡＡＡＰＦＮＧ  ＴＭＭＱＹＦＥＷＹＬ
５１ ＰＤＤＧＴＬＷＴＫＶ  ＡＮＥＡＮＮＬＳＳＬ  ＧＩＴＡＬＷＬＰＰＡ  ＹＫＧＴＳＲＳＤＶＧ  ＹＧＶＹＤＬＹＤＬＧ
１０１ ＥＦＮＱＫＧＴＶＲＴ  ＫＹＧＴＫＡＱＹＬＱ  ＡＩＱＡＡＨＡＡＧＭ  ＱＶＹＡＤＶＶＦＤＨ  ＫＧＧＡＤＧＴＥＷＶ
１５１ ＤＡＶＥＶＮＰＳＤＲ  ＮＱＥＩＳＧＴＹＱＩ  ＱＡＷＴＫＦＤＦＰＧ  ＲＧＮＴＹＳＳＦＫＷ  ＲＷＹＨＦＤＧＶＤＷ
２０１ ＤＥＳＲＫＬＳＲＩＹ  ＫＦＩＧＫＡＷＤＷＥ  ＶＤＴＥＮＧＮＹＤＹ  ＬＭＹＡＤＬＤＭＤＨ  ＰＥＶＶＴＥＬＫＮＷ
２５１ ＧＫＷＹＶＮＴＴＮＩ  ＤＧＦＲＬＤＡＶＫＨ  ＩＫＦＳＦＦＰＤＷＬ  ＳＹＶＲＳＱＴＧＫＰ  ＬＦＴＶＧＥＹＷＳＹ
３０１ ＤＩＮＫＬＨＮＹＩＴ  ＫＴＮＧＴＭＳＬＦＤ  ＡＰＬＨＮＫＦＹＴＡ  ＳＫＳＧＧＡＦＤＭＲ  ＴＬＭＴＮＴＬＭＫＤ
３５１ ＱＰＴＬＡＶＴＦＶＤ  ＮＨＤＴＥＰＧＱＡＬ  ＱＳＷＶＤＰＷＦＫＰ  ＬＡＹＡＦＩＬＴＲＱ  ＥＧＹＰＣＶＦＹＧＤ
４０１ ＹＹＧＩＰＱＹＮＩＰ  ＳＬＫＳＫＩＤＰＬＬ  ＩＡＲＲＤＹＡＹＧＴ  ＱＨＤＹＬＤＨＳＤＩ  ＩＧＷＴＲＥＧＶＴＥ
４５１ ＫＰＧＳＧＬＡＡＬＩ  ＴＤＧＰＧＧＳＫＷＭ  ＹＶＧＫＱＨＡＧＫＶ  ＦＹＤＬＴＧＮＲＳＤ  ＴＶＴＩＮＳＤＧＷＧ
５０１ ＥＦＫＶＮＧＧＳＶＳ  ＶＷＶＰＲＫＴＴ
配列番号５：ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス・アルファ・アミラーゼ（ＡｍｙＲ、ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＸＴＲＡアミラーゼ）のアミノ酸配列：
１  ＡＡＰＦＮＧＴＭＭＱ        ＹＦＥＷＹＬＰＤＤＧ  ＴＬＷＴＫＶＡＮＥＡ  ＮＮＬＳＳＬＧＩＴＡ  ＬＷＬＰＰＡＹＫＧＴ
５１  ＳＲＳＤＶＧＹＧＶＹ  ＤＬＹＤＬＧＥＦＮＱ  ＫＧＴＶＲＴＫＹＧＴ  ＫＡＱＹＬＱＡＩＱＡ  ＡＨＡＡＧＭＱＶＹＡ
１０１  ＤＶＶＦＤＨＫＧＧＡ  ＤＧＴＥＷＶＤＡＶＥ  ＶＮＰＳＤＲＮＱＥＩ  ＳＧＴＹＱＩＱＡＷＴ  ＫＦＤＦＰＧＲＧＮＴ
１５１  ＹＳＳＦＫＷＲＷＹＨ  ＦＤＧＶＤＷＤＥＳＲ  ＫＬＳＲＩＹＫＦＲＧ  ＩＧＫＡＷＤＷＥＶＤ  ＴＥＮＧＮＹＤＹＬＭ
２０１  ＹＡＤＬＤＭＤＨＰＥ  ＶＶＴＥＬＫＮＷＧＫ  ＷＹＶＮＴＴＮＩＤＧ  ＦＲＬＤＡＶＫＨＩＫ  ＦＳＦＦＰＤＷＬＳＹ
２５１  ＶＲＳＱＴＧＫＰＬＦ  ＴＶＧＥＹＷＳＹＤＩ  ＮＫＬＨＮＹＩＴＫＴ  ＮＧＴＭＳＬＦＤＡＰ  ＬＨＮＫＦＹＴＡＳＫ
３０１  ＳＧＧＡＦＤＭＲＴＬ  ＭＴＮＴＬＭＫＤＱＰ  ＴＬＡＶＴＦＶＤＮＨ  ＤＴＥＰＧＱＡＬＱＳ  ＷＶＤＰＷＦＫＰＬＡ
３５１  ＹＡＦＩＬＴＲＱＥＧ  ＹＰＣＶＦＹＧＤＹＹ  ＧＩＰＱＹＮＩＰＳＬ  ＫＳＫＩＤＰＬＬＩＡ  ＲＲＤＹＡＹＧＴＱＨ
４０１  ＤＹＬＤＨＳＤＩＩＧ  ＷＴＲＥＧＶＴＥＫＰ  ＧＳＧＬＡＡＬＩＴＤ  ＧＰＧＧＳＫＷＭＹＶ  ＧＫＱＨＡＧＫＶＦＹ
４５１  ＤＬＴＧＮＲＳＤＴＶ  ＴＩＮＳＤＧＷＧＥＦ  ＫＶＮＧＧＳＶＳＶＷ  ＶＰＲＫＴＴ
配列番号６：アスペルギルス・カワチイ・アルファ・アミラーゼ（ＡｋＡＡ）のアミノ酸配列：
１  ＭＲＶＳＴＳＳＩＡＬ  ＡＶＳＬＦＧＫＬＡＬ  ＧＬＳＡＡＥＷＲＴＱ  ＳＩＹＦＬＬＴＤＲＦ  ＧＲＴＤＮＳＴＴＡＴ
５１  ＣＮＴＧＤＱＩＹＣＧ  ＧＳＷＱＧＩＩＮＨＬ  ＤＹＩＱＧＭＧＦＴＡ  ＩＷＩＳＰＩＴＥＱＬ  ＰＱＤＴＳＤＧＥＡＹ
１０１  ＨＧＹＷＱＱＫＩＹＮ  ＶＮＳＮＦＧＴＡＤＤ  ＬＫＳＬＳＤＡＬＨＡ  ＲＧＭＹＬＭＶＤＶＶ  ＰＮＨＭＧＹＡＧＮＧ
１５１  ＮＤＶＤＹＳＶＦＤＰ  ＦＤＳＳＳＹＦＨＰＹ  ＣＬＩＴＤＷＤＮＬＴ  ＭＶＱＤＣＷＥＧＤＴ  ＩＶＳＬＰＤＬＮＴＴ
２０１  ＥＴＡＶＲＴＩＷＹＤ  ＷＶＡＤＬＶＳＮＹＳ  ＶＤＧＬＲＩＤＳＶＥ  ＥＶＥＰＤＦＦＰＧＹ  ＱＥＡＡＧＶＹＣＶＧ
２５１  ＥＶＤＮＧＮＰＡＬＤ  ＣＰＹＱＫＹＬＤＧＶ  ＬＮＹＰＩＹＷＱＬＬ  ＹＡＦＥＳＳＳＧＳＩ  ＳＮＬＹＮＭＩＫＳＶ
３０１  ＡＳＤＣＳＤＰＴＬＬ  ＧＮＦＩＥＮＨＤＮＰ  ＲＦＡＳＹＴＳＤＹＳ  ＱＡＫＮＶＬＳＹＩＦ  ＬＳＤＧＩＰＩＶＹＡ
３５１  ＧＥＥＱＨＹＳＧＧＤ  ＶＰＹＮＲＥＡＴＷＬ  ＳＧＹＤＴＳＡＥＬＹ  ＴＷＩＡＴＴＮＡＩＲ  ＫＬＡＩＳＡＤＳＤＹ
４０１  ＩＴＹＡＮＤＰＩＹＴ  ＤＳＮＴＩＡＭＲＫＧ  ＴＳＧＳＱＩＩＴＶＬ  ＳＮＫＧＳＳＧＳＳＹ  ＴＬＴＬＳＧＳＧＹＴ
４５１  ＳＧＴＫＬＩＥＡＹＴ  ＣＴＳＶＴＶＤＳＮＧ  ＤＩＰＶＰＭＡＳＧＬ  ＰＲＶＬＬＰＡＳＶＶ  ＤＳＳＳＬＣＧＧＳＧ
５０１  ＮＴＴＴＴＴＴＡＡＴ  ＳＴＳＫＡＴＴＳＳＳ  ＳＳＳＡＡＡＴＴＳＳ  ＳＣＴＡＴＳＴＴＬＰ  ＩＴＦＥＥＬＶＴＴＴ
５５１  ＹＧＥＥＶＹＬＳＧＳ  ＩＳＱＬＧＥＷＤＴＳ  ＤＡＶＫＬＳＡＤＤＹ  ＴＳＳＮＰＥＷＳＶＴ  ＶＳＬＰＶＧＴＴＦＥ
６０１  ＹＫＦＩＫＶＤＥＧＧ  ＳＶＴＷＥＳＤＰＮＲ  ＥＹＴＶＰＥＣＧＳＧ  ＳＧＥＴＶＶＤＴＷＲ
配列番号７：トリコデルマ・リーセイ・グルコアミラーゼ（ＴｒＧＡ）のアミノ酸配列（国際公開番号ＷＯ２００６／０６００６２の配列番号３）。プロ配列はイタリック体で示す：
１  ＭＨＶＬＳＴＡＶＬＬ  ＧＳＶＡＶＱＫＶＬＧ  ＲＰＧＳＳＧＬＳＤＶ  ＴＫＲＳＶＤＤＦＩＳ  ＴＥＴＰＩＡＬＮＮＬ
５１  ＬＣＮＶＧＰＤＧＣＲ  ＡＦＧＴＳＡＧＡＶＩ  ＡＳＰＳＴＩＤＰＤＹ  ＹＹＭＷＴＲＤＳＡＬ  ＶＦＫＮＬＩＤＲＦＴ
１００  ＥＴＹＤＡＧＬＱＲＲ  ＩＥＱＹＩＴＡＱＶＴ  ＬＱＧＬＳＮＰＳＧＳ  ＬＡＤＧＳＧＬＧＥＰ  ＫＦＥＬＴＬＫＰＦＴ
１５１  ＧＮＷＧＲＰＱＲＤＧ  ＰＡＬＲＡＩＡＬＩＧ  ＹＳＫＷＬＩＮＮＮＹ  ＱＳＴＶＳＮＶＩＷＰ  ＩＶＲＮＤＬＮＹＶＡ
２０１  ＱＹＷＮＱＴＧＦＤＬ  ＷＥＥＶＮＧＳＳＦＦ  ＴＶＡＮＱＨＲＡＬＶ  ＥＧＡＴＬＡＡＴＬＧ  ＱＳＧＳＡＹＳＳＶＡ
２５１  ＰＱＶＬＣＦＬＱＲＦ  ＷＶＳＳＧＧＹＶＤＳ  ＮＩＮＴＮＥＧＲＴＧ  ＫＤＶＮＳＶＬＴＳＩ  ＨＴＦＤＰＮＬＧＣＤ
３０１  ＡＧＴＦＱＰＣＳＤＫ  ＡＬＳＮＬＫＶＶＶＤ  ＳＦＲＳＩＹＧＶＮＫ  ＧＩＰＡＧＡＡＶＡＩ  ＧＲＹＡＥＤＶＹＹＮ
３５１  ＧＮＰＷＹＬＡＴＦＡ  ＡＡＥＱＬＹＤＡＩＹ  ＶＷＫＫＴＧＳＩＴＶ  ＴＡＴＳＬＡＦＦＱＥ  ＬＶＰＧＶＴＡＧＴＹ
４０１  ＳＳＳＳＳＴＦＴＮＩ  ＩＮＡＶＳＴＹＡＤＧ  ＦＬＳＥＡＡＫＹＶＰ  ＡＤＧＳＬＡＥＱＦＤ  ＲＮＳＧＴＰＬＳＡＬ
４５１  ＨＬＴＷＳＹＡＳＦＬ  ＴＡＴＡＲＲＡＧＩＶ  ＰＰＳＷＡＮＳＳＡＳ  ＴＩＰＳＴＣＳＧＡＳ  ＶＶＧＳＹＳＲＰＴＡ
５０１  ＴＳＦＰＰＳＱＴＰＫ  ＰＧＶＰＳＧＴＰＹＴ  ＰＬＰＣＡＴＰＴＳＶ  ＡＶＴＦＨＥＬＶＳＴ  ＱＦＧＱＴＶＫＶＡＧ
５５１  ＮＡＡＡＬＧＮＷＳＴ  ＳＡＡＶＡＬＤＡＶＮ  ＹＡＤＮＨＰＬＷＩＧ  ＴＶＮＬＥＡＧＤＶＶ  ＥＹＫＹＩＮＶＧＱＤ
６０１  ＧＳＶＴＷＥＳＤＰＮ  ＨＴＹＴＶＰＡＶＡＣ  ＶＴＱＶＶＫＥＤＴＷ  ＱＳ
配列番号８：ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＦＲＥＤアルファ・アミラーゼのアミノ酸配列：
１  ＡＮＬＮＧＴＬＭＱＹ  ＦＥＷＹＴＰＮＤＧＱ  ＨＷＫＲＬＱＮＤＳＡ  ＹＬＡＥＨＧＩＴＡＶ  ＷＩＰＰＡＹＫＧＴＳ
５１  ＱＡＤＶＧＹＧＡＹＤ  ＬＹＤＬＧＥＦＨＱＫ  ＧＴＶＲＴＫＹＧＴＫ  ＧＥＬＱＳＡＩＫＳＬ  ＨＳＲＤＩＮＶＹＧＤ
１０１  ＶＶＩＮＨＫＧＧＡＤ  ＡＴＥＤＶＴＡＶＥＶ  ＤＰＡＤＲＮＲＶＩＳ  ＧＥＹＬＩＫＡＷＴＨ  ＦＨＦＰＧＲＧＳＴＹ
１５１  ＳＤＦＫＷＨＷＹＨＦ  ＤＧＴＤＷＤＥＳＲＫ  ＬＮＲＩＹＫＦＱＧＫ  ＡＷＤＷＥＶＳＳＥＮ  ＧＮＹＤＹＬＭＹＡＤ
２０１  ＩＤＹＤＨＰＤＶＶＡ  ＥＩＫＲＷＧＴＷＹＡ  ＮＥＬＱＬＤＧＦＲＬ  ＤＡＶＫＨＩＫＦＳＦ  ＬＲＤＷＶＮＨＶＲＥ
２５１  ＫＴＧＫＥＭＦＴＶＡ  ＥＹＷＱＮＤＬＧＡＬ  ＥＮＹＬＮＫＴＮＦＮ  ＨＳＶＦＤＶＰＬＨＹ  ＱＦＨＡＡＳＴＱＧＧ
３０１  ＧＹＤＭＲＫＬＬＮＧ  ＴＶＶＳＫＨＰＬＫＳ  ＶＴＦＶＤＮＨＤＴＱ  ＰＧＱＳＬＥＳＴＶＱ  ＴＷＦＫＰＬＡＹＡＦ
３５１  ＩＬＴＲＥＳＧＹＰＱ  ＶＦＹＧＤＭＹＧＴＫ  ＧＤＳＱＲＥＩＰＡＬ  ＫＨＫＩＥＰＩＬＫＡ  ＲＫＱＹＡＹＧＡＱＨ
４０１  ＤＹＦＤＨＨＤＩＶＧ  ＷＴＲＥＧＤＳＳＶＡ  ＮＳＧＬＡＡＬＩＴＤ  ＧＰＧＧＡＫＲＭＹＶ  ＧＲＱＮＡＧＥＴＷＨ
４５１  ＤＩＴＧＮＲＳＥＰＶ  ＶＩＮＳＥＧＷＧＥＦ  ＨＶＮＧＧＳＶＳＩＹ  ＶＱＲ
配列番号９：配列番号１のＡｍｙＥをコードするヌクレオチド配列：
ＣＴＴＡＣＡＧＣＡＣＣＧＴＣＧＡＴＣＡＡＡＡＧＣＧＧＡＡＣＣＡＴＴＣＴＴＣＡＴＧＣＡＴＧＧＡＡＴＴＧＧＴＣＧＴＴＣＡＡＴＡＣＧＴＴＡＡＡＡＣＡＣＡＡＴＡＴＧＡＡＧＧＡＴＡＴＴＣＡＴＧＡＴＧＣＡＧＧＡＴＡＴＡＣＡＧＣＣＡＴＴＣＡＧＡＣＡＴＣＴＣＣＧＡＴＴＡＡＣＣＡＡＧＴＡＡＡＧＧＡＡＧＧＧＡＡＴＣＡＡＧＧＡＧＡＴＡＡＡＡＧＣＡＴＧＴＣＧＡＡＣＴＧＧＴＡＣＴＧＧＣＴＧＴＡＴＣＡＧＣＣＧＡＣＡＴＣＧＴＡＴＣＡＡＡＴＴＧＧＣＡＡＣＣＧＴＴＡＣＴＴＡＧＧＴＡＣＴＧＡＡＣＡＡＧＡＡＴＴＴＡＡＡＧＡＡＡＴＧＴＧＴＧＣＡＧＣＣＧＣＴＧＡＡＧＡＡＴＡＴＧＧＣＡＴＡＡＡＧＧＴＣＡＴＴＧＴＴＧＡＣＧＣＧＧＴＣＡＴＣＡＡＴＣＡＴＡＣＣＡＣＣＡＧＴＧＡＴＴＡＴＧＣＣＧＣＧＡＴＴＴＣＣＡＡＴＧＡＧＧＴＴＡＡＧＡＧＴＡＴＴＣＣＡＡＡＣＴＧＧＡＣＡＣＡＴＧＧＡＡＡＣＡＣＡＣＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＣＴＧＧＴＣＴＧＡＴＣＧＡＴＧＧＧＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＴＴＣＡＴＴＧＣＴＣＧＧＧＣＴＧＴＡＴＧＡＣＴＧＧＡＡＴＡＣＡＣＡＡＡＡＴＡＣＡＣＡＡＧＴＡＣＡＧＴＣＣＴＡＴＣＴＧＡＡＡＣＧＧＴＴＣＴＴＡＧＡＣＡＧＧＧＣＡＴＴＧＡＡＴＧＡＣＧＧＧＧＣＡＧＡＣＧＧＴＴＴＴＣＧＡＴＴＴＧＡＴＧＣＣＧＣＣＡＡＡＣＡＴＡＴＡＧＡＧＣＴＴＣＣＡＧＡＴＧＡＴＧＧＣＡＧＴＴＡＣＧＧＣＡＧＴＣＡＡＴＴＴＴＧＧＣＣＧＡＡＴＡＴＣＡＣＡＡＡＴＡＣＡＴＣＡＧＣＡＧＡＧＴＴＣＣＡＡＴＡＣＧＧＡＧＡＡＡＴＣＣＴＴＣＡＧＧＡＴＡＧＴＧＣＣＴＣＣＡＧＡＧＡＴＧＣＴＧＣＡＴＡＴＧＣＧＡＡＴＴＡＴＡＴＧＧＡＴＧＴＧＡＣＡＧＣＧＴＣＴＡＡＣＴＡＴＧＧＧＣＡＴＴＣＣＡＴＡＡＧＧＴＣＣＧＣＴＴＴＡＡＡＧＡＡＴＣＧＴＡＡＴＣＴＧＧＧＣＧＴＧＴＣＧＡＡＴＡＴＣＴＣＣＣＡＣＴＡＴＧＣＡＴＣＴＧＡＴＧＴＧＴＣＴＧＣＧＧＡＣＡＡＧＣＴＡＧＴＧＡＣＡＴＧＧＧＴＡＧＡＧＴＣＧＣＡＴＧＡＴＡＣＧＴＡＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＡＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＧＧＡＴＧＡＧＣＧＡＴＧＡＴＧＡＴＡＴＣＣＧＴＴＴＡＧＧＣＴＧＧＧＣＧＧＴＧＡＴＡＧＣＴＴＣＴＣＧＴＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＧＣＣＴＣＴＴＴＴＣＴＴＴＴＣＣＡＧＡＣＣＴＧＡＧＧＧＡＧＧＣＧＧＡＡＡＴＧＧＴＧＴＧＡＧＧＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＡＡＡＧＣＣＡＡＡＴＡＧＧＣＧＡＴＣＧＣＧＧＧＡＧＴＧＣＴＴＴＡＴＴＴＧＡＡＧＡＴＣＡＧＧ
ＣＴＡＴＣＡＣＴＧＣＧＧＴＣＡＡＴＡＧＡＴＴＴＣＡＣＡＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＡＣＴＣＴＣＧＡＡＣＣＣＧＡＡＴＧＧＡＡＡＣＡＡＣＣＡＧＡＴＡＴＴＴＡＴＧＡＡＴＣＡＧＣＧＣＧＧＣＴＣＡＣＡＴＧＧＣＧＴＴＧＴＧＣＴＧＧＣＡＡＡＴＧＣＡＧＧＴＴＣＡＴＣＣＴＣＴＧＴＣＴＣＴＡＴＣＡＡＴＡＣＧＧＣＡＡＣＡＡＡＡＴＴＧＣＣＴＧＡＴＧＧＣＡＧＧＴＡＴＧＡＣＡＡＴＡＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＧＧＧＴＴＣＡＴＴＴＣＡＡＧＴＧＡＡＣＧＡＴＧＧＴＡＡＡＣＴＧＡＣＡＧＧＣＡＣＧＡＴＣＡＡＴＧＣＣＡＧＧＴＣＴＧＴＡＧＣＴＧＴＧＣＴＴＴＡＴＣＣＴＧＡＴＧＡＴＡＴＴＧＣＡＡＡＡＧＣＧＣＣＴＣＡＴＧＴＴＴＴＣＣＴＴＧＡＧＡＡＴＴＡＣＡＡＡＡＣＡＧＧＴＧＴＡＡＣＡＣＡＴＴＣＴＴＴＣＡＡＴＧＡＴＣＡＡＣＴＧＡＣＧＡＴＴＡＣＣＴＴＧＣＧＴＧＣＡＧＡＴＧＣＧＡＡＴＡＣＡＡＣＡＡＡＡＧＣＣＧＴＴＴＡＴＣＡＡＡＴＣＡＡＴＡＡＴＧＧＡＣＣＡＧＡＧＡＣＧＧＣＧＴＴＴＡＡＧＧＡＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＴＴＣＡＣＡＡＴＣＧＧＡＡＡＡＧＧＡＧＡＴＣＣＡＴＴＴＧＧＣＡＡＡＡＣＡＴＡＣＡＣＣＡＴＣＡＴＧＴＴＡＡＡＡＧＧＡＡＣＧＡＡＣＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＴＡＡＣＧＡＧＧＡＣＣＧＡＧＡＡＡＴＡＣＡＧＴＴＴＴＧＴＴＡＡＡＡＧＡＧＡＴＣＣＡＧＣＧＴＣＧＧＣＣＡＡＡＡＣＣＡＴＣＧＧＣＴＡＴＣＡＡＡＡＴＣＣＧＡＡＴＣＡＴＴＧＧＡＧＣＣＡＧＧＴＡＡＡＴＧＣＴＴＡＴＡＴＣＴＡＴＡＡＡＣＡＴＧＡＴＧＧＧＡＧＣＣＧＡＧＴＡＡＴＴＧＡＡＴＴＧＡＣＣＧＧＡＴＣＴＴＧＧＣＣＴＧＧＡＡＡＡＣＣＡＡＴＧＡＣＴＡＡＡＡＡＴＧＣＡＧＡＣＧＧＡＡＴＴＴＡＣＡＣＧＣＴＧＡＣＧＣＴＧＣＣＴＧＣＧＧＡＣＡＣＧＧＡＴＡＣＡＡＣＣＡＡＣＧＣＡＡＡＡＧＴＧＡＴＴＴＴＴＡＡＴＡＡＴＧＧＣＡＧＣＧＣＣＣＡＡＧＴＧＣＣＣＧＧＴＣＡＧＡＡＴＣＡＧＣＣＴＧＧＣＴＴＴＧＡＴＴＡＣＧＴＧＣＴＡＡＡＴＧＧＴＴＴＡＴＡＴＡＡＴＧＡＣＴＣＧＧＧＣＴＴＡＡＧＣＧＧＴＴＣＴＣＴＴＣＣＣＣＡＴ
配列番号１０：ＡｍｙＥ−ｔｒをコードするヌクレオチド配列（配列番号２）：
ＣＴＴＡＣＡＧＣＡＣＣＧＴＣＧＡＴＣＡＡＡＡＧＣＧＧＡＡＣＣＡＴＴＣＴＴＣＡＴＧＣＡＴＧＧＡＡＴＴＧＧＴＣＧＴＴＣＡＡＴＡＣＧＴＴＡＡＡＡＣＡＣＡＡＴＡＴＧＡＡＧＧＡＴＡＴＴＣＡＴＧＡＴＧＣＡＧＧＡＴＡＴＡＣＡＧＣＣＡＴＴＣＡＧＡＣＡＴＣＴＣＣＧＡＴＴＡＡＣＣＡＡＧＴＡＡＡＧＧＡＡＧＧＧＡＡＴＣＡＡＧＧＡＧＡＴＡＡＡＡＧＣＡＴＧＴＣＧＡＡＣＴＧＧＴＡＣＴＧＧＣＴＧＴＡＴＣＡＧＣＣＧＡＣＡＴＣＧＴＡＴＣＡＡＡＴＴＧＧＣＡＡＣＣＧＴＴＡＣＴＴＡＧＧＴＡＣＴＧＡＡＣＡＡＧＡＡＴＴＴＡＡＡＧＡＡＡＴＧＴＧＴＧＣＡＧＣＣＧＣＴＧＡＡＧＡＡＴＡＴＧＧＣＡＴＡＡＡＧＧＴＣＡＴＴＧＴＴＧＡＣＧＣＧＧＴＣＡＴＣＡＡＴＣＡＴＡＣＣＡＣＣＡＧＴＧＡＴＴＡＴＧＣＣＧＣＧＡＴＴＴＣＣＡＡＴＧＡＧＧＴＴＡＡＧＡＧＴＡＴＴＣＣＡＡＡＣＴＧＧＡＣＡＣＡＴＧＧＡＡＡＣＡＣＡＣＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＣＴＧＧＴＣＴＧＡＴＣＧＡＴＧＧＧＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＴＴＣＡＴＴＧＣＴＣＧＧＧＣＴＧＴＡＴＧＡＣＴＧＧＡＡＴＡＣＡＣＡＡＡＡＴＡＣＡＣＡＡＧＴＡＣＡＧＴＣＣＴＡＴＣＴＧＡＡＡＣＧＧＴＴＣＴＴＡＧＡＣＡＧＧＧＣＡＴＴＧＡＡＴＧＡＣＧＧＧＧＣＡＧＡＣＧＧＴＴＴＴＣＧＡＴＴＴＧＡＴＧＣＣＧＣＣＡＡＡＣＡＴＡＴＡＧＡＧＣＴＴＣＣＡＧＡＴＧＡＴＧＧＣＡＧＴＴＡＣＧＧＣＡＧＴＣＡＡＴＴＴＴＧＧＣＣＧＡＡＴＡＴＣＡＣＡＡＡＴＡＣＡＴＣＡＧＣＡＧＡＧＴＴＣＣＡＡＴＡＣＧＧＡＧＡＡＡＴＣＣＴＴＣＡＧＧＡＴＡＧＴＧＣＣＴＣＣＡＧＡＧＡＴＧＣＴＧＣＡＴＡＴＧＣＧＡＡＴＴＡＴＡＴＧＧＡＴＧＴＧＡＣＡＧＣＧＴＣＴＡＡＣＴＡＴＧＧＧＣＡＴＴＣＣＡＴＡＡＧＧＴＣＣＧＣＴＴＴＡＡＡＧＡＡＴＣＧＴＡＡＴＣＴＧＧＧＣＧＴＧＴＣＧＡＡＴＡＴＣＴＣＣＣＡＣＴＡＴＧＣＡＴＣＴＧＡＴＧＴＧＴＣＴＧＣＧＧＡＣＡＡＧＣＴＡＧＴＧＡＣＡＴＧＧＧＴＡＧＡＧＴＣＧＣＡＴＧＡＴＡＣＧＴＡＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＡＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＧＧＡＴＧＡＧＣＧＡＴＧＡＴＧＡＴＡＴＣＣＧＴＴＴＡＧＧＣＴＧＧＧＣＧＧＴＧＡＴＡＧＣＴＴＣＴＣＧＴＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＧＣＣＴＣＴＴＴＴＣＴＴＴＴＣＣＡＧＡＣＣＴＧＡＧＧＧＡＧＧＣＧＧＡＡＡＴＧＧＴＧＴＧＡＧＧＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＡＡＡＧＣＣＡＡＡＴＡＧＧＣＧＡＴＣＧＣＧＧＧＡＧＴＧＣＴＴＴＡＴＴＴＧＡＡＧＡＴＣＡＧＧ
ＣＴＡＴＣＡＣＴＧＣＧＧＴＣＡＡＴＡＧＡＴＴＴＣＡＣＡＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＡＣＴＣＴＣＧＡＡＣＣＣＧＡＡＴＧＧＡＡＡＣＡＡＣＣＡＧＡＴＡＴＴＴＡＴＧＡＡＴＣＡＧＣＧＣＧＧＣＴＣＡＣＡＴＧＧＣＧＴＴＧＴＧＣＴＧＧＣＡＡＡＴＧＣＡＧＧＴＴＣＡＴＣＣＴＣＴＧＴＣＴＣＴＡＴＣＡＡＴＡＣＧＧＣＡＡＣＡＡＡＡＴＴＧＣＣＴＧＡＴＧＧＣＡＧＧＴＡＴＧＡＣＡＡＴＡＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＧＧＧＴＴＣＡＴＴＴＣＡＡＧＴＧＡＡＣＧＡＴＧＧＴＡＡＡＣＴＧＡＣＡＧＧＣＡＣＧＡＴＣＡＡＴＧＣＣＡＧＧＴＣＴＧＴＡＧＣＴＧＴＧＣＴＴＴＡＴＣＣＴＧＡＴ
配列番号１１：Ｂ．ズブチリスＡｍｙ３１Ａをコードするヌクレオチド配列（配列番号３）：
ＴＣＴＧＴＴＡＡＡＡＡＣＧＧＣＡＣＴＡＴＴＣＴＧＣＡＴＧＣＡＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＧＣＴＴＴＡＡＣＡＣＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＡＣＡＴＧＡＡＡＧＡＴＡＴＴＣＧＴＧＡＣＧＣＧＧＧＣＴＡＴＧＣＴＧＣＧＡＴＣＣＡＡＡＣＣＡＧＣＣＣＴＡＴＣＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＡＡＧＡＡＧＧＣＡＡＣＣＡＡＧＧＣＧＡＣＡＡＡＴＣＣＡＴＧＴＣＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＴＧＧＣＴＧＴＡＴＣＡＡＣＣＧＡＣＧＴＣＣＴＡＴＣＡＧＡＴＴＧＧＣＡＡＣＣＧＴＴＡＴＣＴＧＧＧＣＡＣＧＧＡＧＣＡＡＧＡＧＴＴＣＡＡＡＧＡＣＡＴＧＴＧＴＧＣＴＧＣＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＴＡＴＧＧＴＧＴＧＡＡＡＧＴＴＡＴＣＧＴＧＧＡＣＧＣＴＧＴＧＧＴＡＡＡＣＣＡＣＡＣＧＡＣＣＴＣＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＧＣＴＡＴＴＡＧＣＧＡＣＧＡＧＡＴＴＡＡＡＣＧＴＡＴＴＣＣＡＡＡＴＴＧＧＡＣＣＣＡＴＧＧＴＡＡＴＡＣＣＣＡＧＡＴＣＡＡＡＡＡＴＴＧＧＡＧＣＧＡＣＣＧＣＴＧＧＧＡＣＡＴＴＡＣＣＣＡＧＡＡＴＧＣＧＣＴＧＣＴＧＧＧＴＣＴＧＴＡＴＧＡＣＴＧＧＡＡＣＡＣＧＣＡＡＡＡＣＡＣＣＧＡＡＧＴＡＣＡＧＧＣＡＴＡＴＣＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＣＴＧＧＡＡＣＧＣＧＣＴＣＴＧＡＡＣＧＡＴＧＧＴＧＣＴＧＡＴＧＧＴＴＴＴＣＧＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＧＣＡＡＡＧＣＡＴＡＴＴＧＡＧＣＴＧＣＣＧＧＡＴＧＡＣＧＧＣＡＡＣＴＡＣＧＧＴＴＣＣＣＡＡＴＴＣＴＧＧＣＣＧＡＡＣＡＴＣＡＣＣＡＡＣＡＣＣＴＣＴＧＣＣＧＡＡＴＴＣＣＡＧＴＡＣＧＧＣＧＡＧＡＴＣＣＴＧＣＡＡＧＡＣＴＣＣＧＣＧＡＧＣＣＧＴＧＡＣＡＣＣＧＣＴＴＡＴＧＣＣＡＡＣＴＡＴＡＴＧＡＡＣＧＴＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＡＡＣＴＡＴＧＧＣＣＡＴＴＣＣＡＴＴＣＧＴＴＣＴＧＣＧＣＴＧＡＡＡＡＡＴＣＧＴＡＴＣＣＴＧＴＣＣＧＴＧＴＣＣＡＡＴＡＴＣＴＣＣＣＡＣＴＡＴＧＣＡＴＣＣＧＡＣＧＴＴＴＣＴＧＣＴＧＡＣＡＡＡＣＴＧＧＴＡＡＣＴＴＧＧＧＴＣＧＡＧＴＣＴＣＡＣＧＡＣＡＣＣＴＡＴＧＣＡＡＡＴＧＡＴＧＡＣＧＡＧＧＡＧＡＧＣＡＣＣＴＧＧＡＴＧＡＧＣＧＡＴＧＡＴＧＡＴＡＴＴＣＧＴＣＴＧＧＧＴＴＧＧＧＣＧＧＴＴＡＴＴＧＧＴＴＣＴＣＧＣＴＣＴＧＧＴＴＣＴＡＣＴＣＣＧＣＴＧＴＴＣＴＴＴＡＧＣＣＧＴＣＣＧＧＡＡＧＧＴＧＧＣＧＧＣＡＡＴＧＧＣＧＴＴＣＧＴＴＴＣＣＣＧＧＧＴＡＡＡＴＣＴＣＡＡＡＴＴＧＧＴＧＡＴＣＧＴＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＴＧＴＴＴＡＡＡＧＡＴＣＡＡＧＣＴＡＴＴＡＣＧＧＣＧＧ
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配列番号１２：ゲオバチルス・ステアロサーモフィラスＡｍｙＳをコードするヌクレオチド配列（配列番号４）：
ＧＣＣＧＣＡＣＣＧＴＴＴＡＡＣＧＧＴＡＣＣＡＴＧＡＴＧＣＡＧＴＡＴＴＴＴＧＡＡＴＧＧＴＡＣＴＴＧＣＣＧＧＡＴＧＡＴＧＧＣＡＣＧＴＴＡＴＧＧＡＣＣＡＡＡＧＴＧＧＣＣＡＡＴＧＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＣＴＴＡＴＣＣＡＧＣＣＴＴＧＧＣＡＴＣＡＣＣＧＣＴＣＴＴＴＧＧＣＴＧＣＣＧＣＣＣＧＣＴＴＡＣＡＡＡＧＧＡＡＣＡＡＧＣＣＧＣＡＧＣＧＡＣＧＴＡＧＧＧＴＡＣＧＧＡＧＴＡＴＡＣＧＡＣＴＴＧＴＡＴＧＡＣＣＴＣＧＧＣＧＡＡＴＴＣＡＡＴＣＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＣＧＴＣＣＧＣＡＣＡＡＡＡＴＡＴＧＧＡＡＣＡＡＡＡＧＣＴＣＡＡＴＡＴＣＴＴＣＡＡＧＣＣＡＴＴＣＡＡＧＣＣＧＣＣＣＡＣＧＣＣＧＣＴＧＧＡＡＴＧＣＡＡＧＴＧＴＡＣＧＣＣＧＡＴＧＴＣＧＴＧＴＴＣＧＡＣＣＡＴＡＡＡＧＧＣＧＧＣＧＣＴＧＡＣＧＧＣＡＣＧＧＡＡＴＧＧＧＴＧＧＡＣＧＣＣＧＴＣＧＡＡＧＴＣＡＡＴＣＣＧＴＣＣＧＡＣＣＧＣＡＡＣＣＡＡＧＡＡＡＴＣＴＣＧＧＧＣＡＣＣＴＡＴＣＡＡＡＴＣＣＡＡＧＣＡＴＧＧＡＣＧＡＡＡＴＴＴＧＡＴＴＴＴＣＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＡＡＣＡＣＣＴＡＣＴＣＣＡＧＣＴＴＴＡＡＧＴＧＧＣＧＣＴＧＧＴＡＣＣＡＴＴＴＴＧＡＣＧＧＣＧＴＴＧＡＣＴＧＧＧＡＣＧＡＡＡＧＣＣＧＡＡＡＡＴＴＡＡＧＣＣＧＣＡＴＴＴＡＣＡＡＡＴＴＣＡＴＣＧＧＣＡＡＡＧＣＧＴＧＧＧＡＴＴＧＧＧＡＡＧＴＡＧＡＣＡＣＡＧＡＡＡＡＣＧＧＡＡＡＣＴＡＴＧＡＣＴＡＣＴＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＣＧＡＣＣＴＴＧＡＴＡＴＧＧＡＴＣＡＴＣＣＣＧＡＡＧＴＣＧＴＧＡＣＣＧＡＧＣＴＧＡＡＡＡＡＣＴＧＧＧＧＧＡＡＡＴＧＧＴＡＴＧＴＣＡＡＣＡＣＡＡＣＧＡＡＣＡＴＴＧＡＴＧＧＧＴＴＣＣＧＧＣＴＴＧＡＴＧＣＣＧＴＣＡＡＧＣＡＴＡＴＴＡＡＧＴＴＣＡＧＴＴＴＴＴＴＴＣＣＴＧＡＴＴＧＧＴＴＧＴＣＧＴＡＴＧＴＧＣＧＴＴＣＴＣＡＧＡＣＴＧＧＣＡＡＧＣＣＧＣＴＡＴＴＴＡＣＣＧＴＣＧＧＧＧＡＡＴＡＴＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＡＣＡＴＣＡＡＣＡＡＧＴＴＧＣＡＣＡＡＴＴＡＣＡＴＴＡＣＧＡＡＡＡＣＡＡＡＣＧＧＡＡＣＧＡＴＧＴＣＴＴＴＧＴＴＴＧＡＴＧＣＣＣＣＧＴＴＡＣＡＣＡＡＣＡＡＡＴＴＴＴＡＴＡＣＣＧＣＴＴＣＣＡＡＡＴＣＡＧＧＧＧＧＣＧＣＡＴＴＴＧＡＴＡＴＧＣＧＣＡＣＧＴＴＡＡＴＧＡＣＣＡＡＴＡＣＴＣＴＣＡＴＧＡＡＡＧＡＴＣＡＡＣＣＧＡＣＡＴＴＧＧＣＣＧＴＣＡＣＣＴＴＣＧＴＴＧＡＴＡＡＴＣＡＴＧＡＣＡＣＣＧＡＡＣＣＣＧＧＣＣ
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配列番号１３：ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＸＴＲＡアミラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号５）：
ＧＣＣＧＣＡＣＣＧＴＴＴＡＡＣＧＧＴＡＣＣＡＴＧＡＴＧＣＡＧＴＡＴＴＴＴＧＡＡＴＧＧＴＡＣＴＴＧＣＣＧＧＡＴＧＡＴＧＧＣＡＣＧＴＴＡＴＧＧＡＣＣＡＡＡＧＴＧＧＣＣＡＡＴＧＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＣＴＴＡＴＣＣＡＧＣＣＴＴＧＧＣＡＴＣＡＣＣＧＣＴＣＴＴＴＧＧＣＴＧＣＣＧＣＣＣＧＣＴＴＡＣＡＡＡＧＧＡＡＣＡＡＧＣＣＧＣＡＧＣＧＡＣＧＴＡＧＧＧＴＡＣＧＧＡＧＴＡＴＡＣＧＡＣＴＴＧＴＡＴＧＡＣＣＴＣＧＧＣＧＡＡＴＴＣＡＡＴＣＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＣＧＴＣＣＧＣＡＣＡＡＡＡＴＡＴＧＧＡＡＣＡＡＡＡＧＣＴＣＡＡＴＡＴＣＴＴＣＡＡＧＣＣＡＴＴＣＡＡＧＣＣＧＣＣＣＡＣＧＣＣＧＣＴＧＧＡＡＴＧＣＡＡＧＴＧＴＡＣＧＣＣＧＡＴＧＴＣＧＴＧＴＴＣＧＡＣＣＡＴＡＡＡＧＧＣＧＧＣＧＣＴＧＡＣＧＧＣＡＣＧＧＡＡＴＧＧＧＴＧＧＡＣＧＣＣＧＴＣＧＡＡＧＴＣＡＡＴＣＣＧＴＣＣＧＡＣＣＧＣＡＡＣＣＡＡＧＡＡＡＴＣＴＣＧＧＧＣＡＣＣＴＡＴＣＡＡＡＴＣＣＡＡＧＣＡＴＧＧＡＣＧＡＡＡＴＴＴＧＡＴＴＴＴＣＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＡＡＣＡＣＣＴＡＣＴＣＣＡＧＣＴＴＴＡＡＧＴＧＧＣＧＣＴＧＧＴＡＣＣＡＴＴＴＴＧＡＣＧＧＣＧＴＴＧＡＴＴＧＧＧＡＣＧＡＡＡＧＣＣＧＡＡＡＡＴＴＡＡＧＣＣＧＣＡＴＴＴＡＣＡＡＡＴＴＣＡＧＧＧＧＣＡＴＣＧＧＣＡＡＡＧＣＧＴＧＧＧＡＴＴＧＧＧＡＡＧＴＡＧＡＣＡＣＡＧＡＡＡＡＣＧＧＡＡＡＣＴＡＴＧＡＣＴＡＣＴＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＣＧＡＣＣＴＴＧＡＴＡＴＧＧＡＴＣＡＴＣＣＣＧＡＡＧＴＣＧＴＧＡＣＣＧＡＧＣＴＧＡＡＡＡＡＣＴＧＧＧＧＧＡＡＡＴＧＧＴＡＴＧＴＣＡＡＣＡＣＡＡＣＧＡＡＣＡＴＴＧＡＴＧＧＧＴＴＣＣＧＧＣＴＴＧＡＴＧＣＣＧＴＣＡＡＧＣＡＴＡＴＴＡＡＧＴＴＣＡＧＴＴＴＴＴＴＴＣＣＴＧＡＴＴＧＧＴＴＧＴＣＧＴＡＴＧＴＧＣＧＴＴＣＴＣＡＧＡＣＴＧＧＣＡＡＧＣＣＧＣＴＡＴＴＴＡＣＣＧＴＣＧＧＧＧＡＡＴＡＴＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＡＣＡＴＣＡＡＣＡＡＧＴＴＧＣＡＣＡＡＴＴＡＣＡＴＴＡＣＧＡＡＡＡＣＡＡＡＣＧＧＡＡＣＧＡＴＧＴＣＴＴＴＧＴＴＴＧＡＴＧＣＣＣＣＧＴＴＡＣＡＣＡＡＣＡＡＡＴＴＴＴＡＴＡＣＣＧＣＴＴＣＣＡＡＡＴＣＡＧＧＧＧＧＣＧＣＡＴＴＴＧＡＴＡＴＧＣＧＣＡＣＧＴＴＡＡＴＧＡＣＣＡＡＴＡＣＴＣＴＣＡＴＧＡＡＡＧＡＴＣＡＡＣＣＧＡＣＡＴＴＧＧＣＣＧＴＣＡＣＣＴＴＣＧＴＴＧＡＴＡＡＴＣＡＴＧＡＣＡＣＣＧＡＡＣ
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配列番号１４：アスペルギルス・カワチイ・アルファ・アミラーゼ（ＡｋＡＡ）遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号６）：
ＡＴＧＡＧＡＧＴＧＴＣＧＡＣＴＴＣＡＡＧＴＡＴＴＧＣＣＣＴＴＧＣＴＧＴＧＴＣＣＣＴＴＴＴＴＧＧＧＡＡＧＣＴＧＧＣＣＣＴＴＧＧＧＣＴＧＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＣＧＣＡＣＴＣＡＡＴＣＣＡＴＣＴＡＣＴＴＣＣＴＴＴＴＧＡＣＧＧＡＴＣＧＧＴＴＣＧＧＴＡＧＧＡＣＧＧＡＣＡＡＴＴＣＧＡＣＴＡＣＡＧＣＴＡＣＧＴＧＣＡＡＴＡＣＧＧＧＴＧＡＣＣＡＡＡＴＣＴＡＣＴＧＴＧＧＴＧＧＡＡＧＴＴＧＧＣＡＡＧＧＡＡＴＴＡＴＣＡＡＣＣＡＴＣＴＧＧＡＣＴＡＴＡＴＣＣＡＧＧＧＣＡＴＧＧＧＡＴＴＣＡＣＡＧＣＴＡＴＣＴＧＧＡＴＣＴＣＧＣＣＴＡＴＣＡＣＴＧＡＧＣＡＧＣＴＡＣＣＣＣＡＧＧＡＴＡＣＴＴＣＧＧＡＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＴＡＣＣＡＴＧＧＡＴＡＣＴＧＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＡＴＡＴＡＣＡＡＴＧＴＧＡＡＣＴＣＣＡＡＣＴＴＣＧＧＣＡＣＧＧＣＡＧＡＴＧＡＴＣＴＧＡＡＧＴＣＣＣＴＣＴＣＣＧＡＴＧＣＴＣＴＴＣＡＣＧＣＣＣＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣＴＣＡＴＧＧＴＣＧＡＣＧＴＣＧＴＣＣＣＴＡＡＣＣＡＣＡＴＧＧＧＣＴＡＣＧＣＡＧＧＴＡＡＣＧＧＣＡＡＣＧＡＴＧＴＧＧＡＴＴＡＣＡＧＣＧＴＣＴＴＣＧＡＣＣＣＣＴＴＣＧＡＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＡＣＴＴＣＣＡＴＣＣＡＴＡＣＴＧＣＣＴＣＡＴＣＡＣＡＧＡＴＴＧＧＧＡＣＡＡＣＴＴＧＡＣＣＡＴＧＧＴＣＣＡＡＧＡＣＴＧＴＴＧＧＧＡＧＧＧＴＧＡＣＡＣＣＡＴＣＧＴＧＴＣＴＣＴＧＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡＡＣＡＣＣＡＣＧＧＡＡＡＣＣＧＣＣＧＴＧＡＧＡＡＣＣＡＴＴＴＧＧＴＡＣＧＡＴＴＧＧＧＴＡＧＣＣＧＡＣＣＴＧＧＴＡＴＣＣＡＡＣＴＡＣＴＣＡＧＴＣＧＡＣＧＧＣＣＴＣＣＧＴＡＴＣＧＡＣＡＧＴＧＴＣＧＡＡＧＡＡＧＴＣＧＡＡＣＣＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣＣＣＧＧＧＣＴＡＣＣＡＡＧＡＡＧＣＡＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＡＣＴＧＣＧＴＣＧＧＴＧＡＡＧＴＣＧＡＣＡＡＣＧＧＣＡＡＣＣＣＴＧＣＴＣＴＣＧＡＣＴＧＣＣＣＡＴＡＣＣＡＡＡＡＡＴＡＴＣＴＡＧＡＴＧＧＴＧＴＴＣＴＣＡＡＣＴＡＴＣＣＣＡＴＣＴＡＣＴＧＧＣＡＡＣＴＣＣＴＣＴＡＣＧＣＣＴＴＴＧＡＡＴＣＣＴＣＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＡＡＣＣＴＣＴＡＣＡＡＣＡＴＧＡＴＣＡＡＡＴＣＣＧＴＣＧＣＣＡＧＣＧＡＣＴＧＣＴＣＣＧＡＴＣＣＧＡＣＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＡＣＴＴＴＡＴＣＧＡＡＡＡＣＣＡＣＧＡＣＡＡＣＣＣＣＣＧＣＴＴＣＧＣＣＴＣＣＴＡＣＡＣＡＴＣＣＧＡＣＴＡＣＴＣＣＣＡＡＧＣＣＡＡＡＡ
ＡＣＧＴＣＣＴＣＡＧＣＴＡＣＡＴＣＴＴＣＣＴＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＡＴＣＣＣＣＡＴＣＧＴＣＴＡＣＧＣＣＧＧＣＧＡＡＧＡＡＣＡＧＣＡＣＴＡＣＴＣＣＧＧＣＧＧＣＧＡＣＧＴＧＣＣＣＴＡＣＡＡＣＣＧＣＧＡＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＣＴＡＴＣＡＧＧＣＴＡＣＧＡＣＡＣＣＴＣＣＧＣＧＧＡＧＣＴＣＴＡＣＡＣＣＴＧＧＡＴＡＧＣＣＡＣＣＡＣＡＡＡＣＧＣＧＡＴＣＣＧＧＡＡＡＣＴＡＧＣＴＡＴＣＴＣＡＧＣＡＧＡＣＴＣＧＧＡＣＴＡＣＡＴＴＡＣＴＴＡＣＧＣＧＡＡＣＧＡＣＣＣＡＡＴＣＴＡＣＡＣＡＧＡＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＴＣＧＣＧＡＴＧＣＧＣＡＡＡＧＧＣＡＣＣＴＣＣＧＧＣＴＣＣＣＡＡＡＴＣＡＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＴＣＣＴＣＣＧＧＡＡＧＣＡＧＣＴＡＣＡＣＣＣＴＣＡＣＣＣＴＣＡＧＣＧＧＡＡＧＣＧＧＣＴＡＣＡＣＧＴＣＣＧＧＣＡＣＧＡＡＧＣＴＣＡＴＣＧＡＡＧＣＧＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＣＧＴＣＣＧＴＧＡＣＧＧＴＧＧＡＣＴＣＧＡＡＣＧＧＧＧＡＴＡＴＣＣＣＴＧＴＧＣＣＧＡＴＧＧＣＴＴＣＧＧＧＡＴＴＡＣＣＴＡＧＡＧＴＴＣＴＣＣＴＣＣＣＴＧＣＴＴＣＧＧＴＧＧＴＴＧＡＴＡＧＴＴＣＴＴＣＧＣＴＴＴＧＴＧＧＧＧＧＧＡＧＴＧＧＴＡＡＣＡＣＡＡＣＣＡＣＧＡＣＣＡＣＡＡＣＴＧＣＴＧＣＴＡＣＣＴＣＣＡＣＡＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＣＣＡＣＣＴＣＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＡＣＴＡＣＴＴＣＴＴＣＡＴＣＡＴＧＣＡＣＣＧＣＡＡＣＡＡＧＣＡＣＣＡＣＣＣＴＣＣＣＣＡＴＣＡＣＣＴＴＣＧＡＡＧＡＡＣＴＣＧＴＣＡＣＣＡＣＴＡＣＣＴＡＣＧＧＧＧＡＡＧＡＡＧＴＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＧＧＡＴＣＴＡＴＣＴＣＣＣＡＧＣＴＣＧＧＡＧＡＧＴＧＧＧＡＴＡＣＧＡＧＴＧＡＣＧＣＧＧＴＧＡＡＧＴＴＧＴＣＣＧＣＧＧＡＴＧＡＴＴＡＴＡＣＣＴＣＧＡＧＴＡＡＣＣＣＣＧＡＧＴＧＧＴＣＴＧＴＴＡＣＴＧＴＧＴＣＧＴＴＧＣＣＧＧＴＧＧＧＧＡＣＧＡＣＣＴＴＣＧＡＧＴＡＴＡＡＧＴＴＴＡＴＴＡＡＧＧＴＣＧＡＴＧＡＧＧＧＴＧＧＡＡＧＴＧＴＧＡＣＴＴＧＧＧＡＡＡＧＴＧＡＴＣＣＧＡＡＴＡＧＧＧＡＧＴＡＴＡＣＴＧＴＧＣＣＴＧＡＡＴＧＴＧＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＴＧＧＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＧＴＴＧＡＴＡＣＧＴＧＧＡＧＧＴＡＧ
配列番号１５：トリコデルマ・リーセイ・グルコアミラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号７）：
１  ＡＴＧＣＡＣＧＴＣＣ  ＴＧＴＣＧＡＣＴＧＣ  ＧＧＴＧＣＴＧＣＴＣ  ＧＧＣＴＣＣＧＴＴＧ  ＣＣＧＴＴＣＡＡＡＡ  ＧＧＴＣＣＴＧＧＧＡ
６１  ＡＧＡＣＣＡＧＧＡＴ  ＣＡＡＧＣＧＧＴＣＴ  ＧＴＣＣＧＡＣＧＴＣ  ＡＣＣＡＡＧＡＧＧＴ  ＣＴＧＴＴＧＡＣＧＡ  ＣＴＴＣＡＴＣＡＧＣ
１２１  ＡＣＣＧＡＧＡＣＧＣ  ＣＴＡＴＴＧＣＡＣＴ  ＧＡＡＣＡＡＴＣＴＴ  ＣＴＴＴＧＣＡＡＴＧ  ＴＴＧＧＴＣＣＴＧＡ  ＴＧＧＡＴＧＣＣＧＴ
１８１  ＧＣＡＴＴＣＧＧＣＡ  ＣＡＴＣＡＧＣＴＧＧ  ＴＧＣＧＧＴＧＡＴＴ  ＧＣＡＴＣＴＣＣＣＡ  ＧＣＡＣＡＡＴＴＧＡ  ＣＣＣＧＧＡＣＴＡＣ
２４１  ＴＡＴＴＡＣＡＴＧＴ  ＧＧＡＣＧＣＧＡＧＡ  ＴＡＧＣＧＣＴＣＴＴ  ＧＴＣＴＴＣＡＡＧＡ  ＡＣＣＴＣＡＴＣＧＡ  ＣＣＧＣＴＴＣＡＣＣ
３０１  ＧＡＡＡＣＧＴＡＣＧ  ＡＴＧＣＧＧＧＣＣＴ  ＧＣＡＧＣＧＣＣＧＣ  ＡＴＣＧＡＧＣＡＧＴ  ＡＣＡＴＴＡＣＴＧＣ  ＣＣＡＧＧＴＣＡＣＴ
３６１  ＣＴＣＣＡＧＧＧＣＣ  ＴＣＴＣＴＡＡＣＣＣ  ＣＴＣＧＧＧＣＴＣＣ  ＣＴＣＧＣＧＧＡＣＧ  ＧＣＴＣＴＧＧＴＣＴ  ＣＧＧＣＧＡＧＣＣＣ
４２１  ＡＡＧＴＴＴＧＡＧＴ  ＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡ  ＧＣＣＴＴＴＣＡＣＣ  ＧＧＣＡＡＣＴＧＧＧ  ＧＴＣＧＡＣＣＧＣＡ  ＧＣＧＧＧＡＴＧＧＣ
４８１  ＣＣＡＧＣＴＣＴＧＣ  ＧＡＧＣＣＡＴＴＧＣ  ＣＴＴＧＡＴＴＧＧＡ  ＴＡＣＴＣＡＡＡＧＴ  ＧＧＣＴＣＡＴＣＡＡ  ＣＡＡＣＡＡＣＴＡＴ
５４１  ＣＡＧＴＣＧＡＣＴＧ  ＴＧＴＣＣＡＡＣＧＴ  ＣＡＴＣＴＧＧＣＣＴ  ＡＴＴＧＴＧＣＧＣＡ  ＡＣＧＡＣＣＴＣＡＡ  ＣＴＡＴＧＴＴＧＣＣ
６０１  ＣＡＧＴＡＣＴＧＧＡ  ＡＣＣＡＡＡＣＣＧＧ  ＣＴＴＴＧＡＣＣＴＣ  ＴＧＧＧＡＡＧＡＡＧ  ＴＣＡＡＴＧＧＧＡＧ  ＣＴＣＡＴＴＣＴＴＴ
６６１  ＡＣＴＧＴＴＧＣＣＡ  ＡＣＣＡＧＣＡＣＣＧ  ＡＧＣＡＣＴＴＧＴＣ  ＧＡＧＧＧＣＧＣＣＡ  ＣＴＣＴＴＧＣＴＧＣ  ＣＡＣＴＣＴＴＧＧＣ
７２１  ＣＡＧＴＣＧＧＧＡＡ  ＧＣＧＣＴＴＡＴＴＣ  ＡＴＣＴＧＴＴＧＣＴ  ＣＣＣＣＡＧＧＴＴＴ  ＴＧＴＧＣＴＴＴＣＴ  ＣＣＡＡＣＧＡＴＴＣ
７８１  ＴＧＧＧＴＧＴＣＧＴ  ＣＴＧＧＴＧＧＡＴＡ  ＣＧＴＣＧＡＣＴＣＣ  ＡＡＣＡＴＣＡＡＣＡ  ＣＣＡＡＣＧＡＧＧＧ  ＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣ
８４１  ＡＡＧＧＡＴＧＴＣＡ  ＡＣＴＣＣＧＴＣＣＴ  ＧＡＣＴＴＣＣＡＴＣ  ＣＡＣＡＣＣＴＴＣＧ  ＡＴＣＣＣＡＡＣＣＴ  ＴＧＧＣＴＧＴＧＡＣ
９０１  ＧＣＡＧＧＣＡＣＣＴ  ＴＣＣＡＧＣＣＡＴＧ  ＣＡＧＴＧＡＣＡＡＡ  ＧＣＧＣＴＣＴＣＣＡ  ＡＣＣＴＣＡＡＧＧＴ  ＴＧＴＴＧＴＣＧＡＣ
９６１  ＴＣＣＴＴＣＣＧＣＴ  ＣＣＡＴＣＴＡＣＧＧ  ＣＧＴＧＡＡＣＡＡＧ  ＧＧＣＡＴＴＣＣＴＧ  ＣＣＧＧＴＧＣＴＧＣ  ＣＧＴＣＧＣＣＡＴＴ
１０２１  ＧＧＣＣＧＧＴＡＴＧ  ＣＡＧＡＧＧＡＴＧＴ  ＧＴＡＣＴＡＣＡＡＣ  ＧＧＣＡＡＣＣＣＴＴ  ＧＧＴＡＴＣＴＴＧＣ  ＴＡＣＡＴＴＴＧＣＴ
１０８１  ＧＣＴＧＣＣＧＡＧＣ  ＡＧＣＴＧＴＡＣＧＡ  ＴＧＣＣＡＴＣＴＡＣ  ＧＴＣＴＧＧＡＡＧＡ  ＡＧＡＣＧＧＧＣＴＣ  ＣＡＴＣＡＣＧＧＴＧ
１１４１  ＡＣＣＧＣＣＡＣＣＴ  ＣＣＣＴＧＧＣＣＴＴ  ＣＴＴＣＣＡＧＧＡＧ  ＣＴＴＧＴＴＣＣＴＧ  ＧＣＧＴＧＡＣＧＧＣ  ＣＧＧＧＡＣＣＴＡＣ
１２０１  ＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴ  ＣＴＴＣＧＡＣＣＴＴ  ＴＡＣＣＡＡＣＡＴＣ  ＡＴＣＡＡＣＧＣＣＧ  ＴＣＴＣＧＡＣＡＴＡ  ＣＧＣＣＧＡＴＧＧＣ
１２６１  ＴＴＣＣＴＣＡＧＣＧ  ＡＧＧＣＴＧＣＣＡＡ  ＧＴＡＣＧＴＣＣＣＣ  ＧＣＣＧＡＣＧＧＴＴ  ＣＧＣＴＧＧＣＣＧＡ  ＧＣＡＧＴＴＴＧＡＣ
１３２１  ＣＧＣＡＡＣＡＧＣＧ  ＧＣＡＣＴＣＣＧＣＴ  ＧＴＣＴＧＣＧＣＴＴ  ＣＡＣＣＴＧＡＣＧＴ  ＧＧＴＣＧＴＡＣＧＣ  ＣＴＣＧＴＴＣＴＴＧ
１３８１  ＡＣＡＧＣＣＡＣＧＧ  ＣＣＣＧＴＣＧＧＧＣ  ＴＧＧＣＡＴＣＧＴＧ  ＣＣＣＣＣＣＴＣＧＴ  ＧＧＧＣＣＡＡＣＡＧ  ＣＡＧＣＧＣＴＡＧＣ
１４４１  ＡＣＧＡＴＣＣＣＣＴ  ＣＧＡＣＧＴＧＣＴＣ  ＣＧＧＣＧＣＧＴＣＣ  ＧＴＧＧＴＣＧＧＡＴ  ＣＣＴＡＣＴＣＧＣＧ  ＴＣＣＣＡＣＣＧＣＣ
１５０１  ＡＣＧＴＣＡＴＴＣＣ  ＣＴＣＣＧＴＣＧＣＡ  ＧＡＣＧＣＣＣＡＡＧ  ＣＣＴＧＧＣＧＴＧＣ  ＣＴＴＣＣＧＧＴＡＣ  ＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧ
１５６１  ＣＣＣＣＴＧＣＣＣＴ  ＧＣＧＣＧＡＣＣＣＣ  ＡＡＣＣＴＣＣＧＴＧ  ＧＣＣＧＴＣＡＣＣＴ  ＴＣＣＡＣＧＡＧＣＴ  ＣＧＴＧＴＣＧＡＣＡ
１６２１  ＣＡＧＴＴＴＧＧＣＣ  ＡＧＡＣＧＧＴＣＡＡ  ＧＧＴＧＧＣＧＧＧＣ  ＡＡＣＧＣＣＧＣＧＧ  ＣＣＣＴＧＧＧＣＡＡ  ＣＴＧＧＡＧＣＡＣＧ
１６８１  ＡＧＣＧＣＣＧＣＣＧ  ＴＧＧＣＴＣＴＧＧＡ  ＣＧＣＣＧＴＣＡＡＣ  ＴＡＴＧＣＣＧＡＴＡ  ＡＣＣＡＣＣＣＣＣＴ  ＧＴＧＧＡＴＴＧＧＧ
１７４１  ＡＣＧＧＴＣＡＡＣＣ  ＴＣＧＡＧＧＣＴＧＧ  ＡＧＡＣＧＴＣＧＴＧ  ＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴ  ＡＣＡＴＣＡＡＴＧＴ  ＧＧＧＣＣＡＡＧＡＴ
１８０１  ＧＧＣＴＣＣＧＴＧＡ  ＣＣＴＧＧＧＡＧＡＧ  ＴＧＡＴＣＣＣＡＡＣ  ＣＡＣＡＣＴＴＡＣＡ  ＣＧＧＴＴＣＣＴＧＣ  ＧＧＴＧＧＣＴＴＧＴ
１８６１  ＧＴＧＡＣＧＣＡＧＧ  ＴＴＧＴＣＡＡＧＧＡ  ＧＧＡＣＡＣＣＴＧＧ  ＣＡＧＴＣＧＴＡＡ
配列番号１６：ＡｍｙＬ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号８）：
ＡＣＡＡＡＴＣＴＴＡＡＴＧＧＧＡＣＧＣＴＧＡＴＧＣＡＧＴＡＴＴＴＴＧＡＡＴＧＧＴＡＣＡＣＧＣＣＣＡＡＴＧＡＣＧＧＣＣＡＡＣＡＴＴＧＧＡＡＧＣＧＴＣＴＧＣＡＡＡＡＣＧＡＣＴＣＧＧＣＡＴＡＴＴＴＧＧＣＴＧＡＡＣＡＣＧＧＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＧＴＣＴＧＧＡＴＴＣＣＣＣＣＧＧＣＡＴＡＴＡＡＧＧＧＡＡＣＧＡＧＣＣＡＡＧＣＧＧＡＴＧＴＧＧＧＣＴＡＣＧＧＴＧＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＴＴＡＴＧＡＴＴＴＡＧＧＧＧＡＧＴＴＴＣＡＴＣＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＧＧＴＴＣＧＧＡＣＡＡＡＧＴＡＣＧＧＣＡＣＡＡＡＡＧＧＡＧＡＧＣＴＧＣＡＡＴＣＴＧＣＧＡＴＣＡＡＡＡＧＴＣＴＴＣＡＴＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＴＴＡＡＣＧＴＴＴＡＣＧＧＧＧＡＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＡＡＣＣＡＣＡＡＡＧＧＣＧＧＣＧＣＴＧＡＴＧＣＧＡＣＣＧＡＡＧＡＴＧＴＡＡＣＣＧＣＧＧＴＴＧＡＡＧＴＣＧＡＴＣＣＣＧＣＴＧＡＣＣＧＣＡＡＣＣＧＣＧＴＡＡＴＴＴＣＣＧＧＡＧＡＡＴＡＣＣＴＡＡＴＴＡＡＡＧＣＣＴＧＧＡＣＡＣＡＴＴＴＴＣＡＴＴＴＴＣＣＧＧＧＧＣＧＣＧＧＣＡＧＣＡＣＡＴＡＣＡＧＣＧＡＴＴＴＴＡＡＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＴＡＣＣＡＴＴＴＴＧＡＣＧＧＡＡＣＣＧＡＴＴＧＧＧＡＣＧＡＧＴＣＣＣＧＡＡＡＧＣＴＧＡＡＣＣＧＣＡＴＣＴＡＴＡＡＧＴＴＴＣＡＡＧＧＡＡＡＧＧＣＴＴＧＧＧＡＴＴＧＧＧＡＡＧＴＴＴＣＣＡＧＴＧＡＡＡＡＣＧＧＣＡＡＣＴＡＴＧＡＴＴＡＴＴＴＧＡＴＧＴＡＴＧＣＣＧＡＣＡＴＣＧＡＴＴＡＴＧＡＣＣＡＴＣＣＴＧＡＴＧＴＣＧＴＡＧＣＡＧＡＡＡＴＴＡＡＧＡＧＡＴＧＧＧＧＣＡＣＴＴＧＧＴＡＴＧＣＣＡＡＴＧＡＧＣＴＣＣＡＡＴＴＧＧＡＣＧＧＴＴＴＣＣＧＴＣＴＴＧＡＴＧＣＴＧＴＣＡＡＡＣＡＣＡＴＴＡＡＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＧＣＧＧＧＡＴＴＧＧＧＴＴＡＡＴＣＡＴＧＴＣＡＧＧＧＡＡＡＡＡＡＣＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＡＴＧＴＴＴＡＣＧＧＴＡＧＣＴＧＡＡＴＡＴＴＧＧＣＡＧＡＡＴＧＡＣＴＴＧＧＧＣＧＣＧＣＴＧＧＡＡＡＡＣＴＡＴＴＴＧＡＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＴＴＴＴＡＡＴＣＡＴＴＣＡＧＴＧＴＴＴＧＡＣＧＴＧＣＣＧＣＴＴＣＡＴＴＡＴＣＡＧＴＴＣＣＡＴＧＣＴＧＣＡＴＣＧＡＣＡＣＡＧＧＧＡＧＧＣＧＧＣＴＡＴＧＡＴＡＴＧＡＧＧＡＡＡＴＴＧＣＴＧＡＡＣＧＧＴＡＣＧＧＴＣＧＴＴＴＣＣＡＡＧＣＡＴＣＣＧＴＴＧＡＡＡＴＣＧＧＴＴＡＣＡＴＴＴＧＴＣＧＡＴＡＡＣＣＡＴＧＡＴＡＣＡＣＡＧＣＣＧＧＧＧＣＡＧＴ
ＣＧＣＴＴＧＡＧＴＣＧＡＣＴＧＴＣＣＡＡＡＣＡＴＧＧＴＴＴＡＡＧＣＣＧＣＴＴＧＣＴＴＡＣＧＣＴＴＴＴＡＴＴＣＴＣＡＣＡＡＧＧＧＡＡＴＣＴＧＧＡＴＡＣＣＣＴＣＡＧＧＴＴＴＴＣＴＡＣＧＧＧＧＡＴＡＴＧＴＡＣＧＧＧＡＣＧＡＡＡＧＧＡＧＡＣＴＣＣＣＡＧＣＧＣＧＡＡＡＴＴＣＣＴＧＣＣＴＴＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＡＴＴＧＡＡＣＣＧＡＴＣＴＴＡＡＡＡＧＣＧＡＧＡＡＡＡＣＡＧＴＡＴＧＣＧＴＡＣＧＧＡＧＣＡＣＡＧＣＡＴＧＡＴＴＡＴＴＴＣＧＡＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＡＴＴＧＴＣＧＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＡＡＧＧＣＧＡＣＡＧＣＴＣＧＧＴＴＧＣＡＡＡＴＴＣＡＧＧＴＴＴＧＧＣＧＧＣＡＴＴＡＡＴＡＡＣＡＧＡＣＧＧＡＣＣＣＧＧＴＧＧＧＧＣＡＡＡＧＣＧＡＡＴＧＴＡＴＧＴＣＧＧＣＣＧＧＣＡＡＡＡＣＧＣＣＧＧＴＧＡＧＡＣＡＴＧＧＣＡＴＧＡＣＡＴＴＡＣＣＧＧＡＡＡＣＣＧＴＴＣＧＧＡＧＣＣＧＧＴＴＧＴＣＡＴＣＡＡＴＴＣＧＧＡＡＧＧＣＴＧＧＧＧＡＧＡＧＴＴＴＣＡＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＧＧＧＴＣＧＧＴＴＴＣＡＡＴＴＴＡＴＧＴＴＣＡＡＡＧＡ
配列番号１７：配列番号１のＡｍｙＥの天然シグナル配列：
ＭＦＡＫＲＦＫＴＳＬＬＰＬＦＡＧＦＬＬＬＦＨＬＶＬＡＧＰＡＡＡＳＡＥＴＡＮＫＳＮＥ
配列番号１８：プライマーＰＳＴＡＭＹＥ−Ｆ：
ＣＴＴＣＴＴＧＣＴＧＣＣＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＡＧＣＡＣＴＴＡＣＡＧＣＡＣＣＧＴＣＧＡＴＣＡＡＡＡＧＣＧＧＡＡＣ
配列番号１９：プライマーＡＭＹＥＮＯＰＳＴ−Ｒ：
ＣＴＧＧＡＧＧＣＡＣＴＡＴＣＣＴＧＡＡＧＧＡＴＴＴＣＴＣＣＧＴＡＴＴＧＧＡＡＣＴＣＴＧＣＴＧＡＴＧＴＡＴＴＴＧＴＧ
配列番号２０：プライマーＡＭＹＥＮＯＰＳＴ−Ｆ：
ＣＡＣＡＡＡＴＡＣＡＴＣＡＧＣＡＧＡＧＴＴＣＣＡＡＴＡＣＧＧＡＧＡＡＡＴＣＣＴＴＣＡＧＧＡＴＡＧＴＧＣＣＴＣＣＡＧ
配列番号２１：プライマーＨＰＡＩＡＭＹＥ−Ｒ：
ＣＡＧＧＡＡＡＴＣＣＧＴＣＣＴＣＴＧＴＴＡＡＣＴＣＡＡＴＧＧＧＧＡＡＧＡＧＡＡＣＣＧＣＴＴＡＡＧＣＣＣＧＡＧＴＣ
配列番号２２：プライマーＨＰＡＩＡＭＹＥ４６６−Ｒ：
ＣＡＧＧＡＡＡＴＣＣＧＴＣＣＴＣＴＧＴＴＡＡＣＴＣＡＡＴＣＡＧＧＡＴＡＡＡＧＣＡＣＡＧＣＴＡＣＡＧＡＣＣＴＧＧ
配列番号２３：プライマーＡＭＹＥ  ＳＥＱ−Ｆ１：
ＴＡＣＡＣＡＡＧＴＡＣＡＧＴＣＣＴＡＴＣＴＧ
配列番号２４：プライマーＡＭＹＥ  ＳＥＱ−Ｆ２：
ＣＡＴＣＣＴＣＴＧＴＣＴＣＴＡＴＣＡＡＴＡＣ
配列番号２５：全長ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス・アルファ・アミラーゼ（ＡｍｙＳ、Ｐ０６２７９）のタンパク質配列。シグナル配列は太字で示す：
１  ＭＬＴＦＨＲＩＩＲＫ  ＧＷＭＦＬＬＡＦＬＬ  ＴＡＬＬＦＣＰＴＧＱ  ＰＡＫＡＡＡＰＦＮＧ  ＴＭＭＱＹＦＥＷＹＬ  
５１  ＰＤＤＧＴＬＷＴＫＶ  ＡＮＥＡＮＮＬＳＳＬ  ＧＩＴＡＬＷＬＰＰＡ  ＹＫＧＴＳＲＳＤＶＧ  ＹＧＶＹＤＬＹＤＬＧ  
１０１  ＥＦＮＱＫＧＡＶＲＴ  ＫＹＧＴＫＡＱＹＬＱ  ＡＩＱＡＡＨＡＡＧＭ  ＱＶＹＡＤＶＶＦＤＨ  ＫＧＧＡＤＧＴＥＷＶ  
１５１  ＤＡＶＥＶＮＰＳＤＲ  ＮＱＥＩＳＧＴＹＱＩ  ＱＡＷＴＫＦＤＦＰＧ  ＲＧＮＴＹＳＳＦＫＷ  ＲＷＹＨＦＤＧＶＤＷ  
２０１  ＤＥＳＲＫＬＳＲＩＹ  ＫＦＲＧＩＧＫＡＷＤ  ＷＥＶＤＴＥＮＧＮＹ  ＤＹＬＭＹＡＤＬＤＭ  ＤＨＰＥＶＶＴＥＬＫ  
２５１  ＳＷＧＫＷＹＶＮＴＴ  ＮＩＤＧＦＲＬＤＡＶ  ＫＨＩＫＦＳＦＦＰＤ  ＷＬＳＤＶＲＳＱＴＧ  ＫＰＬＦＴＶＧＥＹＷ
３０１  ＳＹＤＩＮＫＬＨＮＹ  ＩＭＫＴＮＧＴＭＳＬ  ＦＤＡＰＬＨＮＫＦＹ  ＴＡＳＫＳＧＧＴＦＤ  ＭＲＴＬＭＴＮＴＬＭ  
３５１  ＫＤＱＰＴＬＡＶＴＦ  ＶＤＮＨＤＴＥＰＧＱ  ＡＬＱＳＷＶＤＰＷＦ  ＫＰＬＡＹＡＦＩＬＴ  ＲＱＥＧＹＰＣＶＦＹ  
４０１  ＧＤＹＹＧＩＰＱＹＮ  ＩＰＳＬＫＳＫＩＤＰ  ＬＬＩＡＲＲＤＹＡＹ  ＧＴＱＨＤＹＬＤＨＳ  ＤＩＩＧＷＴＲＥＧＶ  
４５１  ＴＥＫＰＧＳＧＬＡＡ  ＬＩＴＤＧＰＧＧＳＫ  ＷＭＹＶＧＫＱＨＡＧ  ＫＶＦＹＤＬＴＧＮＲ  ＳＤＴＶＴＩＮＳＤＧ  
５０１  ＷＧＥＦＫＶＮＧＧＳ  ＶＳＶＷＶＰＲＫＴＴ  ＶＳＴＩＡＷＳＩＴＴ  ＲＰＷＴＤＥＦＶＲＷ  ＴＥＰＲＬＶＡＷＰ
配列番号２６：全長バチルス・リケニフォルミス・アルファ・アミラーゼ（ＡｍｙＬ、Ｐ０６２７８）のタンパク質配列。シグナル配列は太字で示す：
１  ＭＫＱＱＫＲＬＹＡＲ  ＬＬＴＬＬＦＡＬＩＦ  ＬＬＰＨＳＡＡＡＡＡ  ＮＬＮＧＴＬＭＱＹＦ  ＥＷＹＭＰＮＤＧＱＨ  
５１  ＷＫＲＬＱＮＤＳＡＹ  ＬＡＥＨＧＩＴＡＶＷ  ＩＰＰＡＹＫＧＴＳＱ  ＡＤＶＧＹＧＡＹＤＬ  ＹＤＬＧＥＦＨＱＫＧ  
１０１  ＴＶＲＴＫＹＧＴＫＧ  ＥＬＱＳＡＩＫＳＬＨ  ＳＲＤＩＮＶＹＧＤＶ  ＶＩＮＨＫＧＧＡＤＡ  ＴＥＤＶＴＡＶＥＶＤ  
１５１  ＰＡＤＲＮＲＶＩＳＧ  ＥＨＲＩＫＡＷＴＨＦ  ＨＦＰＧＲＧＳＴＹＳ  ＤＦＫＷＨＷＹＨＦＤ  ＧＴＤＷＤＥＳＲＫＬ  
２０１  ＮＲＩＹＫＦＱＧＫＡ  ＷＤＷＥＶＳＮＥＮＧ  ＮＹＤＹＬＭＹＡＤＩ  ＤＹＤＨＰＤＶＡＡＥ  ＩＫＲＷＧＴＷＹＡＮ  
２５１  ＥＬＱＬＤＧＦＲＬＤ  ＡＶＫＨＩＫＦＳＦＬ  ＲＤＷＶＮＨＶＲＥＫ  ＴＧＫＥＭＦＴＶＡＥ  ＹＷＱＮＤＬＧＡＬＥ
３０１  ＮＹＬＮＫＴＮＦＮＨ  ＳＶＦＤＶＰＬＨＹＱ  ＦＨＡＡＳＴＱＧＧＧ  ＹＤＭＲＫＬＬＮＳＴ  ＶＶＳＫＨＰＬＫＡＶ  
３５１  ＴＦＶＤＮＨＤＴＱＰ  ＧＱＳＬＥＳＴＶＱＴ  ＷＦＫＰＬＡＹＡＦＩ  ＬＴＲＥＳＧＹＰＱＶ  ＦＹＧＤＭＹＧＴＫＧ  
４０１  ＤＳＱＲＥＩＰＡＬＫ  ＨＫＩＥＰＩＬＫＡＲ  ＫＱＹＡＹＧＡＱＨＤ  ＹＦＤＨＨＤＩＶＧＷ  ＴＲＥＧＤＳＳＶＡＮ  
４５１  ＳＧＬＡＡＬＩＴＤＧ  ＰＧＧＡＫＲＭＹＶＧ  ＲＱＮＡＧＥＴＷＨＤ  ＩＴＧＮＲＳＥＰＶＶ  ＩＮＳＥＧＷＧＥＦＨ  
５０１  ＶＮＧＧＳＶＳＩＹＶ  ＱＲ
配列番号２７：全長バチルス・ズブチリス・アルファ・アミラーゼ（ＡｍｙＥ、ＮＰ＿３８８１８６）。シグナル配列は太字で示す：
１  ＭＦＡＫＲＦＫＴＳＬ  ＬＰＬＦＡＧＦＬＬＬ  ＦＨＬＶＬＡＧＰＡＡ  ＡＳＡＥＴＡＮＫＳＮ  ＥＬＴＡＰＳＩＫＳＧ  
５１  ＴＩＬＨＡＷＮＷＳＦ  ＮＴＬＫＨＮＭＫＤＩ  ＨＤＡＧＹＴＡＩＱＴ  ＳＰＩＮＱＶＫＥＧＮ  ＱＧＤＫＳＭＳＮＷＹ  
１０１  ＷＬＹＱＰＴＳＹＱＩ  ＧＮＲＹＬＧＴＥＱＥ  ＦＫＥＭＣＡＡＡＥＥ  ＹＧＩＫＶＩＶＤＡＶ  ＩＮＨＴＴＳＤＹＡＡ  
１５１  ＩＳＮＥＶＫＳＩＰＮ  ＷＴＨＧＮＴＱＩＫＮ  ＷＳＤＲＷＤＶＴＱＮ  ＳＬＬＧＬＹＤＷＮＴ  ＱＮＴＱＶＱＳＹＬＫ  
２０１  ＲＦＬＤＲＡＬＮＤＧ  ＡＤＧＦＲＦＤＡＡＫ  ＨＩＥＬＰＤＤＧＳＹ  ＧＳＱＦＷＰＮＩＴＮ  ＴＳＡＥＦＱＹＧＥＩ  
２５１  ＬＱＤＳＡＳＲＤＡＡ  ＹＡＮＹＭＤＶＴＡＳ  ＮＹＧＨＳＩＲＳＡＬ  ＫＮＲＮＬＧＶＳＮＩ  ＳＨＹＡＳＤＶＳＡＤ
３０１  ＫＬＶＴＷＶＥＳＨＤ  ＴＹＡＮＤＤＥＥＳＴ  ＷＭＳＤＤＤＩＲＬＧ  ＷＡＶＩＡＳＲＳＧＳ  ＴＰＬＦＦＳＲＰＥＧ  
３５１  ＧＧＮＧＶＲＦＰＧＫ  ＳＱＩＧＤＲＧＳＡＬ  ＦＥＤＱＡＩＴＡＶＮ  ＲＦＨＮＶＭＡＧＱＰ  ＥＥＬＳＮＰＮＧＮＮ  
４０１  ＱＩＦＭＮＱＲＧＳＨ  ＧＶＶＬＡＮＡＧＳＳ  ＳＶＳＩＮＴＡＴＫＬ  ＰＤＧＲＹＤＮＫＡＧ  ＡＧＳＦＱＶＮＤＧＫ  
４５１  ＬＴＧＴＩＮＡＲＳＶ  ＡＶＬＹＰＤＤＩＡＫ  ＡＰＨＶＦＬＥＮＹＫ  ＴＧＶＴＨＳＦＮＤＱ  ＬＴＩＴＬＲＡＤＡＮ  
５０１  ＴＴＫＡＶＹＱＩＮＮ  ＧＰＤＤＲＲＬＲＭＥ  ＩＮＳＱＳＥＫＥＩＱ  ＦＧＫＴＹＴＩＭＬＫ  ＧＴＮＳＤＧＶＴＲＴ  
５５１  ＥＫＹＳＦＶＫＲＤＰ  ＡＳＡＫＴＩＧＹＱＮ  ＰＮＨＷＳＱＶＮＡＹ  ＩＹＫＨＤＧＳＲＶＩ  ＥＬＴＧＳＷＰＧＫＰ
６０１  ＭＴＫＮＡＤＧＩＹＴ  ＬＴＬＰＡＤＴＤＴＴ  ＮＡＫＶＩＦＮＮＧＳ  ＡＱＶＰＧＱＮＱＰＧ  ＦＤＹＶＬＮＧＬＹＮ  
６５１  ＤＳＧＬＳＧＳＬＰＨ
配列番号２８：全長バチルス・ズブチリス・アルファ・アミラーゼ（ＡｍｙＥ、ＮＣＢＩ登録番号ＡＢＷ７５７６９）：
１  ＭＦＡＫＲＦＫＴＳＬ  ＬＰＬＦＡＧＦＬＬＬ  ＦＨＬＶＬＡＧＰＡＡ  ＡＳＡＥＴＡＮＫＳＮ  ＥＬＴＡＰＳＩＫＳＧ  
５１  ＴＩＬＨＡＷＮＷＳＦ  ＮＴＬＫＨＮＭＫＤＩ  ＨＤＡＧＹＴＡＩＱＴ  ＳＰＩＮＱＶＫＥＧＮ  ＱＧＮＫＳＭＳＮＷＹ  
１０１  ＷＬＹＱＰＴＳＹＱＩ  ＧＮＲＹＬＧＴＥＱＥ  ＦＫＥＭＣＡＡＡＥＥ  ＹＧＩＫＶＩＶＤＡＶ  ＩＮＨＴＴＳＤＹＡＡ  
１５１  ＩＳＮＥＩＫＳＩＰＮ  ＷＴＨＧＮＴＱＩＫＮ  ＷＳＤＲＷＤＶＴＱＮ  ＳＬＬＧＬＹＤＷＮＴ  ＱＮＴＱＶＱＳＹＬＫ  
２０１  ＲＦＬＥＲＡＬＮＤＧ  ＡＤＧＦＲＦＤＡＡＫ  ＨＩＥＬＰＤＤＧＳＹ  ＧＳＱＦＷＰＮＩＴＮ  ＴＳＡＥＦＱＹＧＥＩ  
２５１  ＬＱＤＳＡＳＲＤＡＡ  ＹＡＮＹＭＮＶＴＡＳ  ＮＹＧＨＳＩＲＳＡＬ  ＫＮＲＮＬＧＶＳＮＩ  ＳＨＹＡＳＤＶＳＡＤ
３０１  ＫＬＶＴＷＶＥＳＨＤ  ＴＹＡＮＤＤＥＥＳＴ  ＷＭＳＤＤＤＩＲＬＧ  ＷＡＶＩＡＳＲＳＧＳ  ＴＰＬＦＦＳＲＰＥＧ  
３５１  ＧＧＮＧＶＲＦＰＧＫ  ＳＱＩＧＤＲＧＳＡＬ  ＦＥＤＱＡＩＴＡＶＮ  ＲＦＨＮＶＭＡＧＱＰ  ＥＥＬＳＮＰＮＧＮＮ  
４０１  ＱＩＦＭＮＱＲＧＳＨ  ＧＶＶＬＡＮＡＧＳＳ  ＳＶＳＩＮＴＰＴＫＬ  ＰＤＧＲＹＤＮＫＡＧ  ＡＧＳＦＱＶＮＤＧＫ  
４５１  ＬＴＧＴＩＮＡＲＳＶ  ＡＶＬＹＰＤＤＩＡＫ  ＡＰＨＶＦＬＥＮＹＫ  ＴＧＶＴＨＳＦＮＤＱ  ＬＴＩＴＬＲＡＤＡＮ  
５０１  ＴＴＫＡＶＹＱＩＮＮ  ＧＰＥＴＡＦＫＤＧＤ  ＱＦＴＩＧＫＧＤＰＦ  ＧＫＴＹＴＩＭＬＫＧ  ＴＮＳＮＧＶＴＫＡＥ  
５５１  ＥＹＳＦＶＫＲＤＰＡ  ＳＡＫＴＩＧＹＱＮＰ  ＮＨＷＳＱＶＮＡＹＩ  ＹＫＨＤＧＳＲＡＩＥ  ＬＴＧＳＷＰＧＫＰＭ
６０１  ＴＫＮＡＤＧＩＹＴＬ  ＴＬＰＡＤＴＤＴＴＮ  ＡＫＶＩＦＮＮＧＳＡ  ＱＶＰＧＱＮＱＰＧＦ  ＤＹＶＱＮＧＬＹＮＤ  
６５１  ＳＧＬＳＧＳＬＰＨ
配列番号２９：全長バチルス・ズブチリス・アルファ・アミラーゼ（ＡｍｙＥ、ＮＣＢＩ登録番号ＡＢＫ５４３５５）：
１  ＭＦＡＫＲＦＫＴＳＬ  ＬＰＬＦＡＧＦＬＬＬ  ＦＨＬＶＬＡＧＰＡＡ  ＡＳＡＥＴＡＮＫＳＮ  ＥＬＴＡＰＳＩＫＳＧ
５１  ＴＩＬＨＡＷＮＷＳＦ  ＮＴＬＫＨＮＭＫＤＩ  ＨＤＡＧＹＴＡＩＱＴ  ＳＰＩＮＱＶＫＥＧＮ  ＱＧＤＫＳＭＳＮＷＹ
１０１  ＷＬＹＱＰＴＳＹＱＩ  ＧＮＲＹＬＧＴＥＱＥ  ＦＫＥＭＣＡＡＡＥＥ  ＹＧＩＫＶＩＶＤＡＶ  ＩＮＨＴＴＳＤＹＡＡ  
１５１  ＩＳＮＥＩＫＳＩＰＮ  ＷＴＨＧＮＴＱＩＫＮ  ＷＳＤＲＷＤＶＴＱＮ  ＳＬＬＧＬＹＤＷＮＴ  ＱＮＴＱＶＱＳＹＬＫ  
２０１  ＲＦＬＥＲＡＬＮＤＧ  ＡＤＧＦＲＦＤＡＡＫ  ＨＩＥＬＰＤＤＧＳＹ  ＧＳＱＦＷＰＴＩＴＮ  ＴＳＡＥＦＱＹＧＥＩ
２５１  ＬＱＤＳＡＳＲＤＡＡ  ＹＡＮＹＭＤＶＴＡＳ  ＮＹＧＨＳＩＲＳＡＬ  ＫＮＲＮＬＧＶＳＮＬ  ＳＨＹＡＳＤＶＳＡＤ
３０１  ＫＬＶＴＷＶＥＳＨＤ  ＴＹＡＮＤＤＥＥＳＴ  ＷＭＳＤＤＤＩＲＬＧ  ＷＡＶＩＡＳＲＳＧＳ  ＴＰＬＦＦＳＲＰＥＧ
３５１  ＧＧＮＧＶＲＦＰＧＫ  ＳＱＩＧＤＲＧＳＡＬ  ＦＥＤＱＡＩＴＡＶＮ  ＲＦＨＮＶＭＡＧＱＰ  ＥＥＬＳＮＰＮＧＮＮ
４０１  ＱＩＦＭＮＱＲＧＳＨ  ＧＶＶＬＡＮＡＧＳＳ  ＳＶＳＩＮＴＡＴＫＬ  ＰＤＧＲＹＤＮＫＡＧ  ＡＧＳＦＱＶＮＤＧＫ
４５１  ＬＴＧＴＩＮＡＲＳＶ  ＡＶＬＹＰＤＤＩＡＫ  ＡＰＨＶＦＬＥＮＹＫ  ＴＧＶＴＨＳＦＮＤＱ  ＬＴＩＴＬＲＡＤＡＮ
５０１  ＴＴＫＡＶＹＱＩＮＮ  ＧＰＥＴＡＦＫＤＧＤ  ＱＦＴＩＧＫＧＤＰＦ  ＧＫＴＹＴＩＭＬＫＧ  ＴＮＳＤＧＶＴＲＡＥ
５５１  ＥＹＳＦＶＫＲＤＰＡ  ＳＡＫＴＩＧＹＱＮＰ  ＮＨＷＳＱＶＮＡＹＩ  ＹＫＨＤＧＧＲＡＩＥ  ＬＴＧＳＷＰＧＫＰＭ
６０１  ＴＫＮＡＤＧＩＹＴＬ  ＴＬＰＡＤＴＤＴＴＮ  ＡＫＶＩＦＮＮＧＳＡ  ＱＶＰＧＱＮＱＰＧＦ  ＤＹＶＱＮＧＬＹＮＤ
６５１  ＳＧＬＳＧＳＬＰＨ
配列番号３０：全長バチルス・ズブチリス・アルファ・アミラーゼ（ＡｍｙＥ、ＮＣＢＩ登録番号ＡＡＦ１４３５８）：
１  ＭＦＡＫＲＦＫＴＳＬ  ＬＰＬＦＡＧＦＬＬＬ  ＦＨＬＶＬＡＧＰＡＡ  ＡＳＡＥＴＡＮＫＳＮ  ＥＬＴＡＰＳＩＫＳＧ
５１  ＴＩＬＨＡＷＮＷＳＦ  ＮＴＬＫＨＮＭＫＤＩ  ＨＤＡＧＹＴＡＩＱＴ  ＳＰＩＮＱＶＫＥＧＮ  ＱＧＤＫＳＭＳＮＷＹ
１０１  ＷＬＹＱＰＴＳＹＱＩ  ＧＮＲＹＬＧＴＥＱＥ  ＦＫＥＭＣＡＡＡＥＥ  ＹＧＩＫＶＩＶＤＡＶ  ＩＮＨＴＴＳＤＹＡＡ
１５１  ＩＳＮＥＩＫＳＩＰＮ  ＷＴＨＧＮＴＱＩＫＮ  ＷＳＤＲＷＤＶＴＱＮ  ＳＬＬＧＬＹＤＷＮＴ  ＱＮＴＱＶＱＳＹＬＫ
２０１  ＲＦＬＥＲＡＬＮＤＧ  ＡＤＧＦＲＦＤＡＡＫ  ＨＩＥＬＰＤＤＧＳＹ  ＧＳＱＦＷＰＴＩＴＮ  ＴＳＡＥＦＱＹＧＥＩ
２５１  ＬＱＤＳＡＳＲＤＡＡ  ＹＡＮＹＭＤＶＴＡＳ  ＮＹＧＨＳＩＲＳＡＬ  ＫＮＲＮＬＧＶＳＮＬ  ＳＨＹＡＳＤＶＳＡＤ
３０１  ＫＬＶＴＷＶＥＳＨＤ  ＴＹＡＮＤＤＥＥＳＴ  ＷＭＳＤＤＤＩＲＬＧ  ＷＡＶＩＡＳＲＳＧＳ  ＴＰＬＦＦＳＲＰＥＧ
３５１  ＧＧＮＧＶＲＦＰＧＫ  ＳＱＩＧＤＲＧＳＡＬ  ＦＥＤＱＡＩＴＡＶＮ  ＲＦＨＮＶＭＡＧＱＰ  ＥＥＬＳＮＰＮＧＮＮ
４０１  ＱＩＦＭＮＱＲＧＳＨ  ＧＶＶＬＡＮＡＧＳＳ  ＳＶＳＩＮＴＡＴＫＬ  ＰＤＧＲＹＤＮＫＡＧ  ＡＧＳＦＱＶＮＤＧＫ
４５１  ＬＴＧＴＩＮＡＲＳＶ  ＡＶＬＹＰＤＤＩＡＫ  ＡＰＨＶＦＬＥＮＹＫ  ＴＧＶＴＨＳＦＮＤＱ  ＬＴＩＴＬＲＡＤＡＮ
５０１  ＴＴＫＡＶＹＱＩＮＮ  ＧＰＥＴＡＦＫＤＧＤ  ＱＦＴＩＧＫＧＤＰＦ  ＧＫＴＹＴＩＭＬＫＧ  ＴＮＳＤＧＶＴＲＡＥ
５５１  ＥＹＳＦＶＫＲＤＰＡ  ＳＡＫＴＩＧＹＱＮＰ  ＮＨＷＳＱＶＮＡＹＩ  ＹＫＨＤＧＧＲＡＩＥ  ＬＴＧＳＷＰＧＫＰＭ
６０１  ＴＫＮＡＤＧＩＹＴＬ  ＴＬＰＡＤＴＤＴＴＮ  ＡＫＶＩＦＮＮＧＳＡ  ＱＶＰＧＱＮＱＰＧＦ  ＤＹＶＱＮＧＬＹＮＤ
６５１  ＳＧＬＳＧＳＬＰＨ
配列番号３１：全長バチルス・ズブチリス・アルファ・アミラーゼ（ＡｍｙＥ、ＮＣＢＩ登録番号ＡＡＴ０１４４０）：
１  ＭＦＡＫＲＦＫＴＳＬ  ＬＰＬＦＡＧＦＬＬＬ  ＦＨＬＶＬＡＧＰＡＡ  ＡＳＡＥＴＡＮＫＳＮ  ＥＬＴＡＰＳＩＫＳＧ
５１  ＴＩＬＨＡＷＮＷＳＦ  ＮＴＬＫＨＮＭＫＤＩ  ＨＤＡＧＹＴＡＩＱＴ  ＳＰＩＮＱＶＫＥＧＮ  ＱＧＤＫＳＭＳＮＷＹ
１０１  ＷＬＹＱＰＴＳＹＱＩ  ＧＮＲＹＬＧＴＥＱＥ  ＦＫＥＭＣＡＡＡＥＥ  ＹＧＩＫＶＩＶＤＡＶ  ＩＮＨＴＴＳＤＹＡＡ
１５１  ＩＳＮＥＶＫＳＩＰＮ  ＷＴＨＧＮＴＱＩＫＮ  ＷＳＤＲＷＤＶＴＱＮ  ＳＬＬＧＬＹＤＷＮＴ  ＱＮＴＱＶＱＳＹＬＫ
２０１  ＲＦＬＥＲＡＬＮＤＧ  ＡＤＧＦＲＦＤＡＡＫ  ＨＩＥＬＰＤＤＧＳＹ  ＧＳＱＦＷＰＮＩＴＮ  ＴＳＡＥＦＱＹＧＥＩ
２５１  ＬＱＤＳＡＳＲＤＡＡ  ＹＡＮＹＭＤＶＴＡＳ  ＮＹＧＨＳＩＲＳＡＬ  ＫＮＲＮＬＧＶＳＮＩ  ＳＨＹＡＳＤＶＳＡＤ
３０１  ＫＬＶＴＷＶＥＳＨＤ  ＴＹＡＮＤＤＥＥＳＴ  ＷＭＳＤＤＤＩＲＬＧ  ＷＡＶＩＡＳＲＳＧＳ  ＴＰＬＦＦＳＲＰＥＧ
３５１  ＧＧＮＧＶＲＦＰＧＫ  ＳＱＩＧＤＲＧＳＡＬ  ＦＥＤＱＡＩＴＡＶＮ  ＲＦＨＮＶＭＡＧＱＰ  ＥＥＬＳＮＰＮＧＮＮ
４０１  ＱＩＦＭＮＱＲＧＳＨ  ＧＶＶＬＡＮＡＧＳＳ  ＳＶＳＩＮＴＰＴＫＬ  ＰＤＧＲＹＤＮＫＡＧ  ＡＧＳＦＱＶＮＤＧＫ
４５１  ＬＴＧＴＩＮＡＲＳＶ  ＡＶＬＹＰＤＤＩＡＱ  ＡＰＨＶＦＬＥＮＹＫ  ＴＧＶＴＨＳＦＮＤＱ  ＬＴＩＴＬＲＡＤＡＮ
５０１  ＴＴＫＡＶＹＱＩＮＮ  ＧＰＥＴＡＦＫＤＧＤ  ＱＦＴＩＧＫＧＤＰＦ  ＧＫＴＹＴＩＭＬＫＧ  ＴＮＳＤＧＶＴＲＴＥ
５５１  ＥＹＳＦＩＫＲＤＰＡ  ＳＡＫＴＩＧＹＱＮＰ  ＮＨＷＳＱＶＮＡＹＩ  ＹＫＨＤＧＧＱＡＩＥ  ＬＴＧＳＷＰＧＫＰＭ
６０１  ＴＫＮＡＤＧＩＹＴＬ  ＴＬＰＡＤＴＤＴＴＮ  ＡＫＶＩＦＮＮＧＳＡ  ＱＶＰＧＱＮＱＰＧＦ  ＤＹＶＱＮＧＬＹＮＤ
６５１  ＳＧＬＳＧＳＬＰＹ
配列番号３２：全長バチルス・ズブチリス・アルファ・アミラーゼ（ＡｍｙＥ、ＮＣＢＩ登録番号ＡＡＺ３００６４）：
１  ＭＦＡＫＲＦＫＴＳＬ  ＬＰＬＦＡＧＦＬＬＬ  ＦＨＬＶＬＡＧＰＮＡ  ＡＮＡＥＴＡＮＫＳＮ  ＥＬＴＡＰＳＩＫＳＧ
５１  ＴＩＬＨＡＷＮＷＳＦ  ＮＴＬＫＨＮＭＫＤＩ  ＨＤＡＧＹＴＡＩＱＴ  ＳＰＩＮＱＶＫＥＧＮ  ＱＧＮＫＳＭＬＮＷＹ
１０１  ＷＬＹＱＰＴＳＹＱＩ  ＧＮＲＹＬＧＴＥＱＥ  ＦＫＥＭＣＡＡＡＥＥ  ＹＧＩＫＶＩＶＤＡＶ  ＩＮＨＴＴＳＤＹＡＡ
１５１  ＩＳＮＥＩＫＳＩＰＮ  ＷＴＨＧＮＴＱＩＫＮ  ＷＳＤＲＷＤＶＴＱＮ  ＳＬＬＧＬＹＤＷＮＴ  ＱＮＴＱＶＱＳＹＬＫ
２０１  ＲＦＬＥＲＡＬＮＤＧ  ＡＤＧＦＲＦＤＡＡＫ  ＨＩＥＬＰＤＤＧＳＹ  ＧＳＱＦＷＰＮＩＴＮ  ＴＳＡＥＦＱＹＧＥＩ
２５１  ＬＱＤＳＡＳＲＤＡＳ  ＹＡＮＹＭＮＶＴＡＳ  ＮＹＧＨＳＩＲＳＡＬ  ＫＮＲＮＬＧＶＳＮＩ  ＳＨＹＡＳＤＶＰＡＤ
３０１  ＫＬＶＴＷＶＥＳＨＤ  ＴＹＡＮＤＤＥＥＳＴ  ＷＭＳＤＤＤＩＲＬＧ  ＷＡＶＩＡＳＲＳＧＳ  ＴＰＬＦＦＳＲＰＥＧ
３５１  ＧＧＮＧＶＲＦＰＧＫ  ＳＱＩＧＤＲＧＳＡＬ  ＦＥＤＱＡＩＴＡＶＮ  ＲＦＨＮＶＭＡＧＱＰ  ＥＥＬＳＮＰＮＧＮＮ
４０１  ＱＩＦＭＮＱＲＧＳＨ  ＧＶＶＬＡＮＡＧＳＳ  ＳＶＳＩＮＴＰＴＫＬ  ＰＤＧＲＹＤＮＫＡＧ  ＡＧＳＦＱＶＮＤＧＫ
４５１  ＬＴＧＴＩＮＡＲＳＶ  ＡＶＬＹＰＤＤＩＡＫ  ＡＰＨＶＦＬＥＮＹＫ  ＴＧＶＴＨＳＦＮＤＱ  ＬＴＩＴＭＲＡＤＡＫ
５０１  ＴＴＫＡＶＹＱＩＮＮ  ＧＰＥＴＡＦＫＤＧＤ  ＱＦＴＩＧＫＧＤＰＦ  ＧＫＴＹＴＩＭＬＫＧ  ＴＮＳＤＧＶＴＲＴＥ
５５１  ＥＹＳＦＩＫＲＤＰＡ  ＳＡＫＴＩＧＹＱＮＰ  ＮＨＷＳＱＶＮＡＹＩ  ＹＫＨＤＧＧＱＡＩＥ  ＬＴＧＳＷＰＧＫＰＭ
６０１  ＴＫＮＡＤＧＩＹＴＬ  ＴＬＰＡＤＴＤＴＴＮ  ＡＫＶＩＦＮＮＧＳＡ  ＱＶＰＧＱＮＱＰＧＦ  ＤＹＶＱＮＧＬＹＮＤ
６５１  ＳＧＬＳＧＳＬＰＨ
配列番号３３：全長バチルス・ズブチリス・アルファ・アミラーゼ（ＡｍｙＥ：ＮＣＢＩ登録番号ＡＡＱ８３８４１）：
１  ＭＦＡＫＲＦＫＴＳＬ  ＬＰＬＦＡＧＦＬＬＬ  ＦＹＬＶＬＡＧＰＡＡ  ＡＳＡＥＴＡＮＫＳＩ  ＥＬＴＡＰＳＩＫＳＧ
５１  ＴＩＬＨＡＷＮＷＳＦ  ＮＴＬＫＨＮＭＫＤＩ  ＨＤＡＧＹＴＡＩＱＴ  ＳＰＩＮＱＶＫＥＧＮ  ＱＧＤＫＳＭＳＮＷＹ
１０１  ＷＬＹＱＰＴＳＹＱＩ  ＧＮＲＹＬＧＴＥＱＥ  ＦＫＥＭＣＡＡＡＥＥ  ＹＧＩＫＶＩＶＤＡＶ  ＩＮＨＴＴＳＤＹＡＡ
１５１  ＩＳＮＥＶＫＳＩＰＮ  ＷＴＨＧＮＴＱＩＫＮ  ＷＳＤＲＷＤＶＴＱＮ  ＳＬＬＧＬＹＤＷＮＴ  ＱＮＴＱＶＱＳＹＬＫ
２０１  ＲＦＬＤＲＡＬＮＤＧ  ＡＤＧＦＲＦＤＡＡＫ  ＨＩＥＬＰＤＤＧＳＹ  ＧＳＱＦＷＰＮＩＴＮ  ＴＳＡＥＦＱＹＧＥＩ
２５１  ＬＱＤＳＡＳＲＤＡＡ  ＹＡＮＹＭＤＶＴＡＳ  ＮＹＧＨＳＩＲＳＡＬ  ＫＮＲＮＬＧＶＳＮＩ  ＳＨＹＡＳＤＶＳＡＤ
３０１  ＫＬＶＴＷＶＥＳＨＤ  ＴＹＡＮＤＤＥＥＳＴ  ＷＭＳＤＤＤＩＲＬＧ  ＷＡＶＩＡＳＲＳＧＳ  ＴＰＬＦＦＳＲＰＥＧ
３５１  ＧＧＮＧＶＲＦＰＧＫ  ＳＱＩＧＤＲＧＳＡＬ  ＦＥＤＱＡＩＴＡＶＮ  ＲＦＨＮＶＭＡＧＱＰ  ＥＥＬＳＮＰＮＧＮＮ
４０１  ＱＩＦＭＮＱＲＩＳＨ  ＧＶＶＬＡＮＡＧＳＳ  ＳＶＳＩＮＴＡＴＫＬ  ＰＤＧＲＹＤＮＫＡＧ  ＡＧＳＦＱＶＮＤＧＫ
４５１  ＬＴＧＴＩＮＡＲＳＶ  ＡＶＬＹＰＤＤＩＡＫ  ＡＰＨＶＦＬＥＮＹＫ  ＴＧＶＴＨＳＦＮＤＱ  ＬＴＩＴＬＲＡＤＡＮ
５０１  ＴＦＩＫＳＩＭＤＱＩ  ＮＸＲＸＲＲＬＲＭＥ  ＩＮＳＱＳＥＫＥＩＱ  ＦＧＫＴＹＴＩＭＬＫ  ＧＴＮＳＤＧＶＴＲＸ
５５１  ＥＫＹＳＬＰＫＲＤＰ  ＡＳＡＫＴＩＧＹＱＮ  ＰＮＨＷＳＱＶＮＡＹ  ＩＹＫＨＤＧＳＲＥＩ  ＥＬＴＧＳＷＰＧＫＰ
６０１  ＭＴＫＮＡＤＧＩＹＴ  ＬＴＬＰＡＤＴＤＴＴ  ＮＡＫＶＩＦＮＮＧＹ  ＡＱＶＰＧＱＮＱＰＧ  ＦＤＹＶＬＮＧＬＹ
配列番号３４：全長バチルス・ズブチリス・アルファ・アミラーゼ（ＡｍｙＥ、ＮＣＢＩ登録番号ＢＡＡ３１５２８）：
１  ＭＦＥＫＲＦＫＴＳＬ  ＬＰＬＦＡＧＦＬＬＬ  ＦＨＬＶＬＳＧＰＡＡ  ＡＮＡＥＴＡＮＫＳＮ  ＫＶＴＡＳＳＶＫＮＧ
５１  ＴＩＬＨＡＷＮＷＳＦ  ＮＴＬＴＱＮＭＫＤＩ  ＲＤＡＧＹＡＡＩＱＴ  ＳＰＩＮＱＶＫＥＧＮ  ＱＧＤＫＳＭＳＮＷＹ
１０１  ＷＬＹＱＰＴＳＹＱＩ  ＧＮＲＹＬＧＴＥＱＥ  ＦＫＤＭＣＡＡＡＥＫ  ＹＧＶＫＶＩＶＤＡＶ  ＶＮＨＴＴＳＤＹＧＡ
１５１  ＩＳＤＥＩＫＲＩＰＮ  ＷＴＨＧＮＴＱＩＫＮ  ＷＳＤＲＷＤＩＴＱＮ  ＡＬＬＧＬＹＤＷＮＴ  ＱＮＴＥＶＱＡＹＬＫ
２０１  ＧＦＬＥＲＡＬＮＤＧ  ＡＤＧＦＲＹＤＡＡＫ  ＨＩＥＬＰＤＤＧＮＹ  ＧＳＱＦＷＰＮＩＴＮ  ＴＳＡＥＦＱＹＧＥＩ
２５１  ＬＱＤＳＡＳＲＤＴＡ  ＹＡＮＹＭＮＶＴＡＳ  ＮＹＧＨＳＩＲＳＡＬ  ＫＮＲＩＬＳＶＳＮＩ  ＳＨＹＡＳＤＶＳＡＤ
３０１  ＫＬＶＴＷＶＥＳＨＤ  ＴＹＡＮＤＤＥＥＳＴ  ＷＭＳＤＤＤＩＲＬＧ  ＷＡＶＩＧＳＲＳＧＳ  ＴＰＬＦＦＳＲＰＥＧ
３５１  ＧＧＮＧＶＲＦＰＧＫ  ＳＱＩＧＤＲＧＳＡＬ  ＦＫＤＱＡＩＴＡＶＮ  ＱＦＨＮＥＭＡＧＱＰ  ＥＥＬＳＮＰＮＧＮＮ
４０１  ＱＩＦＭＮＱＲＧＳＫ  ＧＶＶＬＡＮＡＧＳＳ  ＳＶＴＩＮＴＳＴＫＬ  ＰＤＧＲＹＤＮＲＡＧ  ＡＧＳＦＱＶＡＮＧＫ
４５１  ＬＴＧＴＩＮＡＲＳＡ  ＡＶＬＹＰＤＤＩＧＮ  ＡＰＨＶＦＬＥＮＹＱ  ＴＥＡＶＨＳＦＮＤＱ  ＬＴＶＴＬＲＡＮＡＫ
５０１  ＴＴＫＡＶＹＱＩＮＮ  ＧＱＥＴＡＦＫＤＧＤ  ＲＬＴＩＧＫＥＤＰＩ  ＧＴＴＹＮＶＫＬＴＧ  ＴＮＧＥＧＡＳＲＴＱ
５５１  ＥＹＴＦＶＫＫＤＰＳ  ＱＴＮＩＩＧＹＱＮＰ  ＤＨＷＧＮＶＮＡＹＩ  ＹＫＨＤＧＧＧＡＩＥ  ＬＴＧＳＷＰＧＫＡＭ
６０１  ＴＫＮＡＤＧＩＹＴＬ  ＴＬＰＡＮＡＤＴＡＤ  ＡＫＶＩＦＮＮＧＳＡ  ＱＶＰＧＱＮＨＰＧＦ  ＤＹＶＱＮＧＬＹＮＮ
６５１  ＳＧＬＮＧＹＬＰＨ
【図１】
0005599113.tif 000015
【図２】
0005599113.tif 000016
【図３Ａ】
0005599113.tif 000017
【図３Ｂ】
0005599113.tif 000018
【図４】
0005599113.tif 000019
【図５】
0005599113.tif 000020
【図６】
0005599113.tif 000021
【図７】
0005599113.tif 000022
【図８】
0005599113.tif 000023
【図９】
0005599113.tif 000024
【図１０】
0005599113.tif 000025
【図１１】
0005599113.tif 000026
【図１２】
0005599113.tif 000027
【図１３】
0005599113.tif 000028
【図１４】
0005599113.tif 000029
【図１５】
0005599113.tif 000030
【図１６】
0005599113.tif 000031
【図１７】
0005599113.tif 000032
【図１８】
0005599113.tif 000033
【図１９】
0005599113.tif 000034
【図２０】
0005599113.tif 000035
【配列表】
0005599113000001.xml