(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ヒトＣＤ３と特異的に結合する第１の結合ドメイン、および
（ｂ）ヒトＣＥＡと特異的に結合する第２の結合ドメインを含む二重特異性一本鎖抗体で
あって、
ヒトＣＥＡに特異的な前記第２の結合ドメインが、
（ｉ）アミノ酸配列「ＳＹＷＭＨ」（配列番号６８）を有するＣＤＲ−Ｈ１、アミノ酸配列「ＦＩＲＮＫＡＮＧＧＴＴＥＹＡＡＳＶＫＧ」（配列番号６７）を有するＣＤＲ−Ｈ２、アミノ酸配列「ＴＬＲＲＧＩＮＶＧＡＹＳＩＹ」（配列番号７３）を有するＣＤＲ−Ｌ１、アミノ酸配列「ＹＫＳＤＳＤＫＱＱＧＳ」（配列番号７２）を有するＣＤＲ−Ｌ２、アミノ酸配列「ＭＩＷＨＳＧＡＳＡＶ」（配列番号７１）を有するＣＤＲ−Ｌ３；
（ｉｉ）アミノ酸配列「ＳＹＷＭＨ」（配列番号６８）を有するＣＤＲ−Ｈ１、アミノ酸配列「ＦＩＬＮＫＡＮＧＧＴＴＥＹＡＡＳＶＫＧ」（配列番号１４５）を有するＣＤＲ−Ｈ２、アミノ酸配列「ＴＬＲＲＧＩＮＶＧＡＹＳＩＹ」（配列番号７３）を有するＣＤＲ−Ｌ１、アミノ酸配列「ＹＫＳＤＳＤＫＱＱＧＳ」（配列番号７２）を有するＣＤＲ−Ｌ２、アミノ酸配列「ＭＩＷＨＳＧＡＳＡＶ」（配列番号７１）を有するＣＤＲ−Ｌ３；または
（ｉｉｉ）アミノ酸配列「ＴＹＡＭＨ」（配列番号７０）を有するＣＤＲ−Ｈ１、アミノ酸配列「ＬＩＳＮＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ」（配列番号６９）を有するＣＤＲ−Ｈ２、アミノ酸配列「ＴＬＲＲＧＩＮＶＧＡＹＳＩＹ」（配列番号７３）を有するＣＤＲ−Ｌ１、アミノ酸配列「ＹＫＳＤＳＤＫＱＱＧＳ」（配列番号７２）を有するＣＤＲ−Ｌ２、アミノ酸配列「ＭＩＷＨＳＧＡＳＡＶ」（配列番号７１）を有するＣＤＲ−Ｌ３；
を含み、
ヒトＣＥＡに特異的な前記第２の結合ドメインが、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置９５〜１０２に相当するアミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号６６）を少なくとも含む、前記二重特異性一本鎖抗体。
【請求項２】
前記結合ドメインが、ＶＨCEA−ＶＬCEA−ＶＨCD3−ＶＬCD3またはＶＬCEA−ＶＨCEA−
ＶＨCD3−ＶＬCD3の順序で配置されている、請求項１に記載の二重特異性一本鎖抗体。
【請求項３】
ヒトＣＥＡに特異的な第２の結合ドメインのＶＨ領域のアミノ酸配列が、配列番号６０、１４６、５８または６２である、請求項１から２のいずれか一項に記載の二重特異性一本鎖抗体。
【請求項４】
ヒトＣＥＡに特異的な第２の結合ドメインのＶＬ領域のアミノ酸配列が、配列番号６４である、請求項１から３のいずれか一項に記載の二重特異性一本鎖抗体。
【請求項５】
ＣＥＡに特異的な第２の結合ドメインのＶ領域が、以下、
（ａ）配列番号６０に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ領域および配列番号６４に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ領域；
（ｂ）配列番号１４６に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ領域および配列番号６４に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ領域；
（ｃ）配列番号５８に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ領域および配列番号６４に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ領域；
（ｄ）配列番号６２に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ領域および配列番号６４に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ領域；ならびに
（ｅ）配列番号５６に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ領域および配列番号６４に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ領域
からなる群より選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の二重特異性一本鎖抗体。
【請求項６】
ヒトＣＤ３に特異的な第１の結合ドメインのＶＨ領域及びＶＬ領域のアミノ酸配列が、配列番号７７に示されるアミノ酸配列を含むものである、請求項１から５のいずれか一項に記載の二重特異性一本鎖抗体。
【請求項７】
配列番号１２２及び配列番号７７に示されるアミノ酸配列を含む第１及び第２の結合ドメインのＶ領域を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の二重特異性一本鎖抗体。
【請求項８】
（ａ）配列番号６、８、１６、１８、２４、２６、３２、３４、４０、４２、１２６、１３０、１３４または１４３のいずれか１つに表されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号５、７、１５、１７、２３、２５、３１、３３、３９、４１、１２５、１２９、１３３または１４２に示される核酸配列によりコードされるアミノ酸配列；
（ｃ）ストリンジェントな条件下で（ｂ）の相補的な核酸配列とハイブリダイズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列；
（ｄ）（ｂ）の核酸配列に対する遺伝暗号の結果として縮重した核酸配列によりコードされるアミノ酸配列；および
（ｅ）（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の二重特異性一本鎖抗体。
【請求項９】
前記第１または第２の結合ドメインの少なくとも１つが、キメラ、ヒト化、ＣＤＲ移植、および／または脱免疫化またはヒトである、請求項１から８のいずれかに記載の二重特異性一本鎖抗体。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか一項に記載の二重特異性一本鎖抗体を含み、場合により、担体、安定剤および／または賦形剤の適した製剤をさらに含む、上皮性腫瘍の治療のための医薬組成物。
【請求項１１】
前記上皮性腫瘍が、胃腸腺癌、乳腺癌または肺腺癌であり、前記胃腸腺癌が結腸直腸腺癌、膵臓腺癌、食道腺癌または胃腺癌である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
進行性腫瘍、後期腫瘍、腫瘍量の多い腫瘍患者、転移性腫瘍、またはＣＥＡ血清中濃度が１００ｎｇ／ｍｌより高い腫瘍患者の治療のための、請求項１０または１１に記載の組成物。
【請求項１３】
さらなる薬剤または化合物と組み合わせて投与されることに適している、請求項１０から１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
免疫エフェクター細胞の活性化シグナルを提供することのできるタンパク質性化合物をさらに含む、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
請求項１から９のいずれかに記載の二重特異性一本鎖抗体をコードする核酸分子。
【請求項１６】
請求項１５に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１７】
請求項１５に記載の核酸分子又は請求項１６に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主。
【請求項１８】
請求項１７に記載の宿主を二重特異性一本鎖抗体の発現を可能にする条件下で培養することと、産生された二重特異性一本鎖抗体を培養物から回収することを含む、二重特異性一本鎖抗体の製造プロセス。
【請求項１９】
請求項１から９のいずれかに記載の二重特異性一本鎖抗体を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、可溶性ＣＥＡに対する抵抗性を有する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゴールドおよびフリードマンが最初にヒト結腸癌組織抽出物における腫瘍関連癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を記載してから３０年以上が経過した（Gold and Freedman; J. Exp. Med. 122 (1965); 467-481）。
その間、ＣＥＡ遺伝子ファミリーに関連する２８のその他の遺伝子／偽遺伝子が見出された。ＣＥＡ遺伝子ファミリーのメンバーに用いる命名を簡略化するために、該ファミリーは最近「ＣＥＡ関連細胞接着分子」（ＣＥＡＣＡＭ）と改名され、そのメンバーの命名が統一された（Beauchemin, Exp. Cell Res. 252 (1999), 243-249）。例えば、この命名に従って、ヒトＣＥＡ（ＣＤ６６ｅ）はＣＥＡＣＡＭ５と名付けられる。
【０００３】
ヒトＣＥＡ遺伝子ファミリーは、染色体１９ｑ１３．２の上に集まる（Olsen et al., Genomics 23 (1994); 659-668）。その２９遺伝子および偽遺伝子は３つのサブグループ、すなわち、７つの発現遺伝子を含有するＣＥＡサブグループ、１１の発現遺伝子を含有する妊娠特異的糖タンパク質（ＰＳＧ）サブグループおよび偽遺伝子のみを含有する第３のサブグループに分割することができる（Hammarstroem, Sem. Cancer Biol. 9 (1999), 67-81; Beauchemin, Exp. Cell Res. 252 (1999), 243-249）。ＣＥＡのアミノ酸配列および他のファミリーメンバーの解析により、それらが免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーに属することが明らかとなった（Williams and Barclay, Annul. Rev. Immunol. 6 (1988), 381-405）。ＣＥＡサブグループの全てのメンバーは細胞表面膜に付着している。胆汁糖タンパク質（ＣＥＡＣＡＭ１；ＢＧＰ１；ＴＭ−ＣＥＡ；ＣＤ６６ａ）、ＣＥＡ遺伝子ファミリーメンバー１（ＣＥＡＣＡＭ３；ＣＧＭ１；ＣＤ６６ｄ）およびＣＥＡ遺伝子ファミリーメンバー７（ＣＥＡＣＡＭ４；ＣＧＭ７）は疎水性の膜貫通ドメインを有するのに対し、癌胎児性抗原（癌胎児性抗原関連細胞接着分子５；ＣＥＡＣＡＭ５；ＣＥＡ；ＣＤ６６e）、非特異的交差反応性抗原（ＣＥＡＣＡＭ６；ＮＣＡ；ＮＣＡ−５０／９０；ＣＤ６６ｃ）、ＣＥＡ遺伝子ファミリーメンバー２（ＣＥＡＣＡＭ７；ＣＧＭ２）およびＣＥＡ遺伝子ファミリーメンバー６（ＣＥＡＣＡＭ８；ＣＧＭ６；ＣＤ６６ｂ）はグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）脂質部分によって血漿膜と繋がれている。ＣＥＡタンパク質は、Ｉｇドメインの数に応じて約３００ｋＤａまでの分子量で高度にグリコシル化されている。
【０００４】
ＣＥＡタンパク質の生物活性に関して、腫瘍細胞株を用いるインビトロ研究から、胆汁糖タンパク質、ＣＥＡおよび非特異的交差反応性抗原を含むいくつかのＣＥＡサブファミリーは、腫瘍細胞表面に発現すると、同種親和性の異型細胞接着分子として作用することができることが示唆された（Oikawa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 186 (1992), 881-887；Zhou et al., Cancer Res. 53 (1993), 3817-3822）。より最近には、微生物による攻撃から結腸を守る自然免疫応答におけるＣＥＡおよび非特異的交差反応抗原の可能性のある役割が考察されている（Hammarstroem and Baranov, Trends Microbiol. 9 (2001), p. 119-125）。特に、これらのタンパク質は微生物と結合および捕獲することにより、それらが微絨毛の上皮細胞に到達し、侵入することを防ぐことが提唱されている。
【０００５】
ＣＥＡは、胎児期の間に発現し、健常成人には存在せず、再び癌に発現する癌胎児性抗原であると仮定された。しかし、ＣＥＡは、正常成人組織にも発現する。例えば、胆汁糖タンパク質、ＣＥＡ、非特異的交差反応性抗原およびＣＥＡ遺伝子ファミリーメンバー２は、正常ヒト結腸に、特に腸管内腔に面している成熟した円柱上皮細胞におよび陰窩口（crypt mouth）で高度に分化した細胞に発現する（Fraengsmyr et al., Cancer Res. 55 (1995), 2963-2967；Fraengsmyr et al., Tumor Biol. 20 (1999), 277-292）。より具体的には、これらのタンパク質は、フリーな管腔表面の内側を覆う成熟した結腸細胞の刷子縁多糖外被に局在する。胆汁糖タンパク質、ＣＥＡおよび非特異的交差反応性抗原はまた、多数の上皮性起源の腫瘍にも発現する（Hammarstriem, Sem. Cancer Biol. 9 (1999), 67-81; Shively and Beatty CRC Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2 (1985), 355-399）。
【０００６】
既に１９７０年代後半および１９８０年代前半に、ＣＥＡは結腸直腸およびその他の上皮腫瘍の放射免疫学的局在に好まれる標的抗原となった。これは、ＣＥＡが胃腸癌および膵臓癌の９５％に、ならびに大部分の小細胞および非小細胞肺癌腫に過剰発現するという事実に起因する。また、それは乳癌ならびに頭部および頚部の扁平上皮癌にも発現する（Primus et al., Cancer 42 (1978), 1540-1545）。実際に、ＣＥＡは最も広く用いられている臨床腫瘍マーカーの１つである。それは、その安定性、正常成人組織での相当に制限された発現、ならびに上皮性起源の腫瘍での高度な発現のために、結腸直腸癌およびその他のいくつかの癌の血清腫瘍マーカーとして用いられている。健康な個体においてＣＥＡの大半は結腸で産生される。そこでそれは成熟した円柱細胞の頂端膜側から腸管内腔に放出され、糞便の中で消失する。従って、健康な個体からは、血液中に極めて低いレベルしか通常見出されない。例えば、健康な個体の血液中のＣＥＡレベルは２μｇ／ｌ未満である。それに対して、結腸直腸癌およびその他の癌腫の患者からの血清中のＣＥＡレベルは２０００μｇ／ｌを超える範囲まで増加している（Thomson et al., PNAS 64 (1969), 161-167）。特に、進行性、悪性、または後期の上皮腫瘍は、しばしば高い血清濃度の可溶性ＣＥＡを伴う（Fletcher; Ann. Intern. Med. 104 (1986), 66-73）。ＣＥＡを含む血漿膜からの成分は、血漿膜由来小胞のように表面から継続的に剥脱することが知られ（Taylor and Black, J. Natl. Cancer Inst. 74 (1985), 859-866；Sack et al., J Clin Invest. 82 (1988), 586-93）、それはリンパ管および血管を流れて最後に血液に行き着き得る。腫瘍サイズが増大するにつれて、より多くのＣＥＡが血液に蓄積する。腫瘍マーカーとしての血清ＣＥＡ決定の主な用途は、結腸癌の手術後のサーベイランスにある。増加したＣＥＡレベルは、患者のそれぞれ８１％（Minton et al., Cancer 55 (1985), 1284-1290）および８９％（Wanebo et al., Surg. Gynecol. Obstet. 169 (1989), 479-487）において、再発性疾患の最初の指標であった。血清ＣＥＡレベルはまた、予後指標としても用いることができる（Mulcahy and Benson, Curr. Oncol. Rep. 1 (1999), 168-172）。
【０００７】
多くの上皮癌でのその過剰発現に起因して、ＣＥＡは腫瘍マーカーとして用いられるだけでなく、抗腫瘍療法の標的としても用いられる。例えば、胃腸癌は高い割合のヒト上皮腫瘍の原因であり、米国において２００１年の胃癌の新規症例は２１，７００、結腸直腸癌の新規症例は１３５，４００と推定される（Greenlee; CA Cancer J Clin 51 (2001), 15-36）。結腸直腸癌は３番目に頻度の高い悪性腫瘍であり、男性および女性の両方において癌死の３番目の主な原因である（Ries; Cancer 88 (2000), 2398-2424）。これらの腫瘍に対する新規な治療法を見出すために、抗ＣＥＡモノクローナル抗体がＣＥＡ陽性癌の可能性のある治療法として調査されてきた（Murakami et al., Immunol. Invest. 25 (1996), 23-35）。
【０００８】
腫瘍量の少ない患者（低い血清ＣＥＡレベルに相当する）が首尾よく治療を受けるアプローチの一例は、ベアらによって行われた研究である。このアプローチでは、ラベツズマブ（labetuzumab）（ラベツズマブは、ヒト化形態の抗ＣＥＡモノクローナル抗体ＭＮ−１４である；Behr et al., Cancer, 94: 1373-1381, (2002), 1559-64）の131Ｉ標識変異体が、５−フルオロウラシルおよびフォリン酸に、または肝転移後のアジュバント・セッティングに対して化学療法抵抗性の、少量の転移性疾患を有する３０名のＣＲＣ患者が登録された第ＩＩ相試験において分析された。131Ｉ標識ラベツズマブの単回注射が行われた。評価可能な１９名の患者のうち、３名が部分的緩解を有し、８名がわずかな応答を１５ヶ月まで持続して示した。アジュバント・セッティングにおいて、９名のうち７名の患者が３年間まで疾患に罹らなかったのに対して、対照群の再発率は同じ期間で６７％であった。患者の血清ＣＥＡレベルは３．９〜４５ｎｇ／ｍｌの範囲であった（Behr et al., Cancer, 94: 1373-1381, 2002）。ＣＥＡ血清レベルの低い（＜５ｎｇ／ｍｌ）患者を特徴とする別の研究では、131Ｉ−ラベツズマブ（上記引用文中）を用いるＣＥＡの放射免疫療法は、肝臓における結腸直腸癌転移の救済切除（salvage resection）後の生存を向上したことが示された。２３名の患者に４０〜６０ｍＣｉ／ｍ2 131Ｉ−ラベツズマブの用量が投与された。５年生存率は、それぞれ処置群について５１．３％、対照群について７．４％であった（Liersch et al., JCO, 2005, ASCO Proc, Vol 23, No 16S: 3627）。
【０００９】
けれども、高い血清ＣＥＡ濃度に対応する治療的アプローチは、しばしば低いかまたは全くない抗腫瘍応答という結果をもたらした。例えば、ヒト化抗ＣＥＡモノクローナル抗体を臨床で評価するために行われた臨床研究では、ＭＮ−１４のＣＤＲ移植形(version)（ｈＭＮ−１４；Sharkey, Cancer Res. 55 (23 Suppl) (1995) 5935s- 5945s）が131Ｉで標識された。１９名の進行したＣＥＡ産生腫瘍患者に131Ｉ標識したｈＭＮ−１４を与えた。ｈＭＮ−１４の体内分布、腫瘍ターゲッティング、および薬物動態挙動は、マウスＭＮ−１４に見られるものに類似していた。しかし、血漿中ＣＥＡの上昇した（＞２００ｎｇ／ｍｌ）患者は、注射後１時間以内に３０％を上回る標識抗体が複合体化した。これらの患者の一部では、合併症の増加の結果、血漿中ＣＥＡの低い患者において見られるものよりも、血液からのクリアランスが急速な抗体の代謝の促進がもたらされた（Sharkey、前掲）。Yuらにより実施された別の第１相試験では、ＣＥＡに対する131Ｉ標識した高親和性マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ＣＯＬ−１（Muraro, Cancer Res. 45 (1985), 5769-80）が胃腸悪性腫瘍の患者において調査された。特に、血清ＣＥＡおよび腫瘍体積の薬物動態学への影響が分析された。本目的のため、１８名の進行した胃腸悪性腫瘍患者に、２０ｍｇの131Ｉ標識したＣＯＬ−１を１０ｍＣｉ／ｍ2〜７５ｍＣｉ／ｍ2の用量で投与した。血清ＣＥＡレベルは６〜２７３９ｎｇ／ｍＬの範囲であった（平均＋／−ＳＤ、５００＋／−６３９）。すべての腫瘍の浸潤した(tumor-involved)器官のうち８２％が陽性であり、全ての病変の５８％であった。しかし、今回も上昇した血清ＣＥＡ（＞５００ｎｇ／ｍＬ）および腫瘍体積が血清放射能のクリアランスと直接相互に関連があることが見出された。著者らは、高度に上昇した循環ＣＥＡレベルおよび／または増大した腫瘍体積を有する患者は、131Ｉ標識したＣＯＬ−１をより急速に循環から排除すると結論付けた（Yu et al., J. Cli. Oncol. 14 (1996), 1798-1809）。Hajjarらによる、転移性胃腸および大腸直腸癌患者におけるヨウ素１３１標識ヒト化ＭＮ−１４抗ＣＥＡモノクローナル抗体での研究において同様の結果が得られた。この第１相試験では、２１名の患者が事前外部照射の後かまたは標準的な化学療法の後に抗体で処置された。２１名のうち７名の患者がヒト抗ヒト抗体（ＨＡＨＡ）を有したが、有害作用はなかった。抗腫瘍応答は認められなかった。この場合も、上昇した血漿ＣＥＡレベルが血液および身体全体からの抗体のクリアランスを増大させることが見出され（Hajjar et al., Clin Colorectal Cancer, 2 (2002), 31-42）、そのことは、少なくとも一部分、この研究において見出された抗腫瘍応答の欠如の説明をもたらし得る。血液および身体からの治療用抗体の急速なクリアランスという現象は、器官の損傷を防ぐために身体から急速に取り除かれる必要のある免疫複合体の形成増加により説明され得る。最も可能性が高いと思われるモノクローナル抗体の急速なクリアランスに起因して、これらの研究に登録した腫瘍患者に治療効果を見出すことはできなかった。
【００１０】
免疫複合体形成および、大部分が免疫細胞のＦｃ受容体により認識される抗体のＦｃ部分に媒介される、治療用モノクローナル抗体の急速なクリアランスにより生じる問題を回避するために、Ｆｃ部分を含まない抗体誘導体（例えばｓｃＦｖ構築物）または断片（例えばＦａｂおよびＦａｂ2断片）を産生し、臨床で分析した。これらの研究の大部分は、腫瘍画像形成および検出／局在化を対象とする（例えば、Chester et al., Cancer Chemother Pharmacol, 46 (2000) Suppl: S8-12；Mayer et al., Clin Cancer Res, 6: (2000) 1711-1719; Begent et al., Nat Med, 2 (1996): 979-984参照）。そのような抗体誘導体／断片の治療効力を臨床で調査したものはほんのわずかの研究しかなかった。例えば、Francisらによる臨床アプローチでは（Francis, Br. J. Cancer 87(6) (2002), 600-607）、ｓｃＦｖ−カルボキシペプチダーゼ構築物の抗腫瘍活性が調査された。この第１相試験では、酵素プロドラッグ療法（ＡＤＥＰＴ）に対する抗体が、進行した結腸直腸癌またはその他のＣＥＡ産生腫瘍を有する患者に使用された。本目的のため、抗体酵素標的化薬剤として細菌酵素カルボキシペプチダーゼ（ＣＰＧ２）と結合した、ＣＥＡに対するマウスモノクローナル抗体（Ａ５Ｂ７）のＦ（ａｂ）2断片からなるＡ５ＣＰ、およびＺＤ２７６７Ｐ、ビス−ヨードフェノールマスタードプロドラッグが用いられた。結果として、この研究において臨床応答および放射性応答は見られなかった。処置前の血清ＣＥＡレベルは１０００ｎｇ／ｍｌまでの範囲であった。これらの処置した腫瘍患者の高い血清中ＣＥＡ濃度は、少なくとも一部分、この研究で観察された抗腫瘍応答の欠如の原因であり得る。
【発明の開示】
【００１１】
上に述べた課題を考慮すると、進行性、悪性、または後期上皮腫瘍のための効果的な治療法のための手段および方法の提供が大いに望まれる。
【００１２】
従って、本発明の一態様は医薬組成物に関し、前記医薬組成物は、
（ａ）ヒトＣＤ３と特異的に結合する第１の結合ドメイン、および
（ｂ）ヒトＣＥＡと特異的に結合する第２の結合ドメイン
を有する二重特異性一本鎖抗体を含み、
前記第２の結合ドメインが少なくともアミノ酸配列「ＤＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＦＹＦＤＹ」（配列番号６５）を含み、「Ｘ1」、「Ｘ2」、「Ｘ3」または「Ｘ4」は、任意のアミノ酸残基を表し、該アミノ酸残基「Ｄ」はマウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のＫａｂａｔ位置９５に相当し、該アミノ酸残基「ＦＹＦＤＹ」は、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置１００、１００ａ、１００ｂ、１０１、および１０２にそれぞれ相当する。一実施形態では、「Ｘ1」は、「Ｒ」（アルギニン）、「Ｆ」（フェニルアラニン）、「Ｍ」（メチオニン）、「Ｅ」（グルタミン酸）、または「Ｔ」（トレオニン）を表し；「Ｘ2」は、「Ｇ」（グリシン）、「Ｙ」（チロシン）、「Ａ」（アラニン）、「Ｄ」（アスパラギン酸）、または「Ｓ」（セリン）を表し；「Ｘ3」は、「Ｌ」（ロイシン）、「Ｆ」（フェニルアラニン）、「Ｍ」（メチオニン）、「Ｅ」（グルタミン酸）、または「Ｔ」（トレオニン）を表し；かつ、「Ｘ4」は、「Ｒ」（アルギニン）、「Ｙ」（チロシン）、「Ａ」（アラニン）、「Ｄ」（アスパラギン酸）、または「Ｓ」（セリン）を表す。
【００１３】
本発明の医薬組成物の一実施形態では、本明細書に定義される二重特異性一本鎖抗体のヒトＣＥＡに特異的な前記第２の結合ドメインは、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置９５〜１０２に相当するアミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号６６）を少なくとも含む。
【００１４】
本発明は、その血漿中の可溶性ＣＥＡ濃度の高い上皮性腫瘍患者の治療に特に適した手段および方法を提供する。そのような高い可溶性ＣＥＡ濃度は、進行性腫瘍、再発性、転移性、後期腫瘍を有する上皮性腫瘍患者および高腫瘍量の患者の血清／血漿に見出される。アミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号６６）を含むＣＥＡ結合ドメインを含む二重特異性一本鎖抗体はＣＥＡ陽性標的細胞と結合するだけでなく、可溶性ＣＥＡとも結合することが見出された；本発明の実施例３および図２；ならびにＥＰ  Ｂ１  ４９１０３１号参照。示されるアミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」は、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置９５〜１０２（配列番号６６）に相当する（Harwood, Br J Cancer. 54 (1986), 75-82）。驚くことに、可溶性ＣＥＡと結合しているにもかかわらず、前記二重特異性一本鎖抗体は、高い濃度の可溶性ＣＥＡの存在下でさえも（最大１μｇ／ｍｌの可溶性ＣＥＡを試験）、ＣＥＡを有する腫瘍細胞を死滅させる。言い換えれば、前記二重特異性構築物は、可溶性ＣＥＡによって、ＣＥＡ陽性の腫瘍細胞に対するそれらの細胞障害活性を阻害されない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下の実施例５および８（併せて図５、６、８、１０、１９、２０、２２および２７）に示されるように、アミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」を含むＣＥＡ結合ドメインを含む二重特異性一本鎖抗体は、高い濃度の可溶性ＣＥＡの存在下でさえもＣＥＡ陽性腫瘍細胞に対する細胞障害性を媒介した。例えば、図１０は、漸増量の可溶性ＣＥＡ抗原の存在下で、ＫａｔｏＩＩＩ細胞（ＣＥＡ陽性のヒト胃癌細胞株）に再指向されたＣＥＡ反応性の二重特異性一本鎖構築物の細胞障害性アッセイを示す。刺激を受けたヒトＣＤ８陽性細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）をエフェクター細胞として用いた。ＣＥＡＩ  ＶＨＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬに媒介される細胞障害性は、可溶性ＣＥＡに対して抵抗性である。対照的に、ＣＥＡＩＩ  ＶＨＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬに媒介される細胞障害活性は、漸増量の可溶性ＣＥＡにより阻害される。ＣＥＡＩは、マウスｍＡｂ  Ａ５Ｂ７に由来する可変領域であるのに対して、ＣＥＡＩＩ  ＶＨＶＬは、ｍＡｂ  Ｔ８４．６６に由来する。
【００１６】
重要なことに、抗ＣＥＡｘ抗ＣＤ３二重特異性一本鎖抗体のヒトＣＥＡ結合ドメイン（すなわち、ヒトＣＥＡと特異的に結合するヒト結合ドメイン）で使用される場合、アミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」が可溶性ＣＥＡに対する抵抗性を媒介するために十分であることが見出された；例えば、図１９、２０、２２および２７参照。下記において、本明細書に定義される二重特異性一本鎖抗体は、従って可溶性ＣＥＡ抗原に対して抵抗性であると称される。本明細書において、用語「可溶性ＣＥＡ抗原に対する抵抗性」、「可溶性ＣＥＡに対する抵抗性」または関連する用語は、前記二重特異性一本鎖抗体により媒介されるＣＥＡ陽性標的または腫瘍細胞に対する細胞障害性が漸増濃度の可溶性ＣＥＡにより影響を受けないという事実を指す。特に、細胞障害活性は、高い濃度の可溶性ＣＥＡ（最大１μｇ／ｍｌまでを試験）にさえ阻害されない。上に述べたように、健康な個体の血液中のＣＥＡレベルは、２ｎｇ／ｍｌ未満である。腫瘍患者の血清／血漿中の高い可溶性ＣＥＡ濃度は、進行性、再発性、転移性、または後期腫瘍および高腫瘍量の患者に特有である。従って、本発明は、その血漿中の可溶性ＣＥＡ濃度がそのように高い上皮性腫瘍患者の治療に特に適した手段および方法を提供する。本明細書において、用語「高い可溶性ＣＥＡ濃度」は、１０、２０、５０、７０、８０、９０または１００ｎｇ／ｍｌよりも高い可溶性血清／血漿ＣＥＡ濃度を示す。この血清／血漿ＣＥＡ濃度は、特に、ＥＬＩＳＡにより測定することができる。好ましくは、前記可溶性血清／血漿ＣＥＡ濃度は、例えばＥＬＩＳＡにより測定して、１００ｎｇ／ｍｌよりも高い。
【００１７】
可溶性ＣＥＡ抗原に抵抗性を有する前記二重特異性一本鎖抗体の作製は、以下の実施例から明らかなように平凡な作業ではなかった。例えば、膜結合ＣＥＡと結合するが可溶性ＣＥＡとは結合しないことの知られているモノクローナル抗体（ｍＡｂ）に由来するＣＥＡ結合ドメインを有する二重特異性一本鎖抗体、すなわち、ｍＡｂ  ＰＲ１Ａ３（Durbin, Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (1994), 4313-7）は、産生させることができなかった。二重特異性一本鎖抗体形式中で用いた場合、抗ＣＤ３ｘ抗ＣＥＡ二重特異性一本鎖構築物の発現／分泌は達成できなかった。ＰＲ１Ａ３のヒト化形(version)（Durbin、前掲）を作製に利用した場合、二重特異性一本鎖抗体構築物は発現し、宿主細胞から分泌された。しかし、抗ＣＥＡ結合ドメインと膜結合ＣＥＡの結合は得られなかった。
【００１８】
十分に説明されているモノクローナル抗体Ｔ８４.６６（Neumaier, M. et al., Cancer Res 50 (1990), 2128-34）またはＭＦＥ−２３（Boehm, M. K. Biochem J 2 (2000), 519-28）に由来する二重特異性一本鎖抗体を作製した場合、これらの二重特異性抗体は可溶性ＣＥＡ抗原に対し高い感受性があった、すなわち、ＣＥＡ陽性標的または腫瘍細胞に対するそれらの細胞障害活性は、可溶性ＣＥＡ抗原の存在下で阻害された。前記構築物は可溶性ＣＥＡと結合することが見出されていることから、可溶性ＣＥＡ抗原は抗体が膜結合ＣＥＡと結合することを妨げ、それにより抗体に媒介される細胞障害活性を阻害するとの結論が下された。例えば、図７は、可溶性ヒトＣＥＡの存在下で、ＣＥＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に再指向されたＣＥＡ反応性の二重特異性一本鎖構築物の細胞障害性アッセイを示す。刺激を受けたヒトＣＤ８陽性細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）をエフェクター細胞として用いた。ＣＥＡＩＩ  ＶＨＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬの細胞障害活性は、漸増量の可溶性ＣＥＡにより明らかに阻害される。ＣＥＡＩＩ  ＶＨＶＬはｍＡｂ  Ｔ８４．６６に由来する；配列番号７７は抗ＣＤ３ＶＨ−ＶＬドメインである。
【００１９】
可溶性ＣＥＡ抗原に対する抵抗性は二重特異性一本鎖抗体にのみ見出すことができ、そのＣＥＡ結合ドメインはマウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のアミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」を含んだ（Harwood, Br J Cancer. 54 (1986), 75-82）。ＭＦＥ−２３由来およびＴ８４．６６由来の二重特異性一本鎖構築物に関して、Ａ５Ｂ７由来の二重特異性一本鎖抗体は可溶性ＣＥＡと結合する。ＭＦＥ−２３由来およびＴ８４．６６由来の二重特異性一本鎖構築物に関して得られた結果を鑑みると、可溶性ＣＥＡは、Ａ５Ｂ７由来一本鎖二重特異性抗体構築物において細胞障害活性に影響を及ぼさないことが予期され得る。
【００２０】
上に述べたように、ヒトにおけるＣＥＡを有する上皮性腫瘍に対して向けられる多くの治療的アプローチは、癌患者の血漿中に高いレベルの可溶性ＣＥＡ抗原が存在することにより著しく妨害される。例えば、血漿中の高いＣＥＡ濃度の存在下での、増加した免疫複合体形成および治療用抗ＣＥＡモノクローナル抗体のクリアランスは、いくつかの臨床研究で観察されている。さらに、可溶性ＣＥＡ抗原（しばしば、進行性腫瘍、再発性癌、転移性腫瘍、高腫瘍量、または後期腫瘍の癌患者の血清中に高い濃度で存在する）は、ＣＥＡ陽性腫瘍細胞に対して向けられる治療薬を阻害し、従って腫瘍細胞の認識および破壊を妨げる。従って、腫瘍に到達する治療薬の実際の量は減少し、結果として抗腫瘍活性が低下し、低いかさらに全くなくなる。この制限は、これまでのところ、例えば、治療薬と腫瘍細胞の相互作用を妨げる可能性が低い、極めて低い量の可溶性ＣＥＡ抗原を有する患者に対する抗体に基づくアプローチを制限する。
【００２１】
本発明において、ヒトＣＤ３およびヒトＣＥＡに特異的な二重特異性一本鎖抗体治療薬を作製することが可能であることが見出され、その腫瘍細胞に対する細胞障害活性は、高濃度の可溶性ＣＥＡ抗原（最大１μｇ／ｍｌの可溶性ＣＥＡを試験）に対してさえも抵抗性である。この知見は、本発明の二重特異性一本鎖抗体が可溶性ＣＥＡ抗原と結合するという事実を考えると、全く予期せぬものである（本発明の実施例３および図２；ならびにＥＰ  Ｂ１  ４９１０３１号も参照）。それにもかかわらず、本明細書に定義される二重特異性一本鎖抗体は、腫瘍細胞に対するその細胞障害活性において、高レベルの可溶性ＣＥＡの存在に対してさえも完全に抵抗性である。従って、本発明は、例えば、腫瘍進行中に観察される、血漿中の可溶性ＣＥＡ濃度の高い腫瘍患者の治療に、再発性癌に、転移に、高腫瘍量の患者に、または後期腫瘍に特に適した手段および方法を提供する。
【００２２】
本発明によれば、用語「医薬組成物」は、ヒト患者への投与のための組成物に関する。好ましくは、医薬組成物は、担体、安定剤および／または賦形剤からなる適した製剤を含む。好ましい実施形態では、医薬組成物は、非経口、経皮、管腔内、動脈内、くも膜下腔内および／または鼻腔内投与のための、または組織への直接注射による組成物を含む。前記組成物は、注入または注射によって患者へ投与されることが特に想定される。適した組成物の投与は、様々な方法によって、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所または皮内投与によって達成されてよい。本発明の組成物は、製薬上許容される担体をさらに含んでよい。適した医薬担体の例は当分野で周知であり、それにはリン酸緩衝生理食塩水溶液、水、様々な種類の湿潤剤、滅菌溶液、リポソームなどが含まれる。このような担体を含む組成物は、周知の従来法によって処方されてよい。これらの組成物は、被験体に適した用量で投与することができ、それは、本明細書に記載される可溶性血清ＣＥＡ抗原に対して抵抗性を示す二重特異性一本鎖抗体の漸増用量の投与による用量漸増試験により決定することができる。上記に示したように、本明細書に記載される、可溶性血清ＣＥＡ抗原に対する抵抗性を有する二重特異性一本鎖抗体は、高いＣＥＡ血清中濃度を有する癌患者、例えば、進行性腫瘍、再発性癌、転移性腫瘍、腫瘍量の大きな腫瘍、または後期腫瘍の治療に有利に用いることができる。これらの組成物はまた、その他のタンパク質性および非タンパク質性薬剤と組み合わせて、例えば併用療法（co-therapy）の形で投与することができる。これらの薬剤は、本明細書に定義される二重特異性一本鎖抗体を含む組成物と同時に投与してもよいし、前記二重特異性一本鎖抗体の投与の前後に適時に定められた間隔および用量で別々に投与してもよい。投与計画は主治医および臨床学的要因により決定される。医学分野で周知のように、任意の患者一人への投薬量は多くの要因によって決まり、それには患者の大きさ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時間および経路、全体的な健康状態、および同時に投与されるその他の薬剤が含まれる。非経口投与のための製剤としては、滅菌水溶液または非水溶液、および懸濁液が挙げられる。非水溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、および注射用の有機エステル類、例えばオレイン酸エチルである。水性担体としては、水、水溶液、または生理食塩水および緩衝媒体を含む懸濁液が挙げられる。非経口媒体としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、または乳酸化リンゲル液が挙げられる。静脈内媒体としては、液体および栄養素補充液、電解質補充液（リンゲルデキストロースに基づくものなど）などが挙げられる。防腐剤およびその他の添加剤も存在してよく、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどが挙げられる。さらに、本発明の組成物は、例えば、好ましくはヒト起源の血清アルブミンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質性担体を含んでもよい。併用療法は、本明細書に定義される二重特異性一本鎖抗体に加えて、組成物の意図される使用によって、さらなる生物活性��質を含むことが想定される。このような物質は、胃腸管系に作用する薬剤、抗悪性腫瘍薬として作用する薬剤、化学療法薬、細胞増殖抑制剤（cytostatica）、高尿酸血症を予防する薬剤、免疫反応を阻害する薬剤（例えばコルチコステロイド）、炎症応答を調節する薬剤、循環系に作用する薬剤および／またはサイトカインなどの当分野で公知の薬剤であってよい。
【００２３】
好ましくは、本明細書に定義される二重特異性一本鎖抗体は、緩衝液、安定剤および界面活性剤中に処方される。緩衝液は、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液または酢酸緩衝液であってよい。安定剤は、アミノ酸および／または糖であってよい。界面活性剤は、合成洗剤、ＰＥＧなどであってよい。より好ましくは、本明細書に定義される二重特異性一本鎖抗体は、クエン酸塩、リシン、トレハロースおよびＴｗｅｅｎ８０中に処方される。本発明の医薬組成物の希釈液として、等張生理食塩水およびＴｗｅｅｎ８０が好ましい。
【００２４】
本明細書において、「二重特異性一本鎖抗体」は、２つの結合ドメインを含む単一ポリペプチド鎖を意味する。各「結合ドメイン」は、本明細書において、抗体重鎖由来の１つの可変領域（「ＶＨ領域」）を含み、第１の結合ドメインのＶＨ領域は、前記第１の分子、すなわちヒトＣＤ３分子と特異的に結合し、第２の結合ドメインのＶＨ領域は、下により詳細に定義されるヒトＣＥＡと特異的に結合する。２つの結合ドメインは、場合により、一般に約５アミノ酸を含む短いポリペプチドスペーサーにより相互に連結されている。各結合ドメインは、抗体軽鎖（「ＶＬ領域」）由来の１つの可変領域をさらに含み、第１および第２の結合ドメインのそれぞれの中のＶＨ領域およびＶＬ領域は、ポリペプチドリンカー（例えば、ＥＰ  Ｂ１  ６２３６７９に開示およびクレームされる種類のもの）を介して相互に連結されているが、いずれの場合も、第１の結合ドメインのＶＨ領域およびＶＬ領域と、第２の結合ドメインのＶＨ領域およびＶＬ領域を、ともにそれぞれの第１および第２の分子と特異的に結合することが可能であるように、相互に２つで一組とさせるのに十分なほど長い。第１または第２の結合ドメインのＶ領域の配置は、ＶＨ−ＶＬであっても、ＶＬ−ＶＨであってもよい。好ましくは、ヒトＣＤ３と特異的に結合する第１の結合ドメインの配置は、以下の実施例に示されるように、ＶＨ−ＶＬである。第１の結合ドメインは、第２の結合ドメインに対してＮ末端に位置してもＣ末端に位置してもよいことが想定されている。従って、本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体の結合ドメインの配置は、ＶＨCEA−ＶＬCEA−ＶＨCD3−ＶＬCD3、ＶＬCEA−ＶＨCEA−ＶＨCD3−ＶＬCD3、ＶＨCD3−ＶＬCD3−ＶＨCEA−ＶＬCEAまたはＶＨCD3−ＶＬCD3−ＶＬCEA−ＶＨCEAであってよい。好ましくは、ＣＤ３に特異的な前記第１の結合ドメインは、第２の結合ドメインに対してＣ末端に位置している。より好ましくは、本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体の結合ドメインは、ＶＨCEA−ＶＬCEA−ＶＨCD3−ＶＬCD3またはＶＬCEA−ＶＨCEA−ＶＨCD3−ＶＬCD3の順序で配置される。さらにより好ましくは、配置はＶＬCEA−ＶＨCEA−ＶＨCD3−ＶＬCD3である。最も好ましいのは、配列番号３４に定義される二重特異性一本鎖抗体構築物Ａ２４０ＶＬ−Ｂ９ＶＨｘ配列番号７７ＶＨＶＬである。本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体の前記第１および／または第２の結合ドメインは、非ヒト起源（すなわち、非ヒト配列に由来）であってよいことが想定されている。例えば、前記第１および／または第２の結合ドメインは、マウスモノクローナル抗体に由来してよい。しかし、マウス抗体に由来する二重特異性一本鎖抗体は、ヒト患者に投与される場合、異物と認識される可能性がある。従って、本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体の前記第１および／または第２の結合ドメインは、ヒト起源（すなわち、ヒト配列に由来）であることが好ましい。そのようなＣＥＡまたはＣＤ３と特異的に結合するヒト結合ドメインは、例えば、ファージディスプレイに基づく技法により同定することができる。例えば、第１（または第２）の結合ドメインのＶＨ領域はヒトＶＨ領域であるのに対して、第１（または第２��の結合ドメインの対応するＶＬ領域は非ヒト起源であってよいことも想定される。そのような結合ドメインは、キメラ結合ドメインとも称され得る。あるいは、前記結合ドメインの１つが非ヒト起源であるのに対して、他方はヒト起源であり、その結果キメラ二重特異性一本鎖抗体がもたらされる。前記第１および／または第２の結合ドメインは、ヒト患者に投与される際に、本明細書に記載される二重特異性一本鎖抗体の免疫原性を低下させるために、さらに修飾してもよい。例えば、本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体の前記第１または第２の結合ドメインのうちの少なくとも１つは、下により詳細に述べられるように、ヒト化、ＣＤＲ移植、キメラおよび／または脱免疫化またはヒトであってよい。第１および／または第２の結合ドメイン中でＶＨおよびＶＬ領域を連結するポリペプチドリンカーが脱免疫化されていることも想定される。好ましくは、脱免疫化された第１の結合ドメイン（ＣＤ３に特異的）内のＶＨおよびＶＬ領域を連結するポリペプチドリンカーは、配列「ＧＥＧＴＳＴＧＳ（Ｇ2Ｓ）2ＧＧＡＤ」（配列番号１４１）を有する脱免疫化されたポリペプチドリンカーである。本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体の前記結合ドメインの一方または両方が、例えば、タンパク質の発現、精製、検出または富化に用いることのできる、いわゆる「タグ」（Ｆｌａｇタグ、ｃ−ｍｙｃタグ、ＧＳＴタグまたはＨｉｓタグなど）を有することもさらに想定されている。例えば、Ｆｌａｇタグに最も広く用いられている親水性のオクタペプチドは、現在ＤＹＫＤＤＤＤＫであるが（Chubet and Brizzard, Biotechniques 20 (1996): 136- 141）、最近の研究から、より短いペプチド、ＤＹＫＤが、Ｍ１モノクローナル抗体にほぼ同じ親和性で認識され得ることが示唆されている（Knappik A, Pluckthun A; Biotechniques 17 (1994): 754-761）。Ｆｌａｇタグ、ｃ−ｍｙｃタグ、ＧＳＴタグ、Ｈｉｓタグなどは、例えば、タグ−ＶＨCEA−ＶＬCEA−ＶＨCD3−ＶＬCD3またはＶＬCEA−ＶＨCEA−ＶＨCD3−ＶＬCD3−タグなど、二重特異性一本鎖抗体のＮ末端かまたはＣ末端のいずれかに位置してよい。発現、検出または精製目的のそのようなタグの起源および特性は当分野で十分説明されている；例えば、Lichty, Protein Expr Purif. 41 (2005), 98-105参照。
【００２５】
本明細書において、用語「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」とは、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む抗体フラグメントを指し、これらのドメインは単一ポリペプチド鎖中に存在する。可変ドメインはＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨの順序で配置することができる。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーをＶＨドメインおよびＶＬドメインの間にさらに含む。ｓｃＦｖの概説には、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)参照。特定の実施形態では、本発明は、本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体に由来する抗ＣＥＡ  ｓｃＦｖに関する。
【００２６】
本発明によれば、Ｉｇ由来抗原相互作用に関する文脈中で用いられる用語「結合ドメイン」または「可変領域」は、抗体、抗体断片またはその誘導体に由来する少なくとも１つのＣＤＲを含む、ポリペプチドの断片および誘導体を含む。本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体のヒトＣＥＡと特異的に結合する第２の結合ドメインは、少なくとも１つのＣＤＲ、好ましくはＣＤＲ−Ｈ３、より好ましくはマウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置１００、１００ａ、１００ｂ、１０１、および１０２にそれぞれ相当するアミノ酸配列「ＦＹＦＤＹ」（配列番号１１２）を含むマウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３の一部分；さらにより好ましくはアミノ酸配列「ＤＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＦＹＦＤＹ」（配列番号６５）（「Ｘ1」、「Ｘ2」、「Ｘ3」または「Ｘ4」は、任意のアミノ酸残基を表し、該アミノ酸残基「Ｄ」は、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のＫａｂａｔ位置９５に相当し、アミノ酸残基「ＦＹＦＤＹ」は、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置１００、１００ａ、１００ｂ、１０１、および１０２にそれぞれ相当する）を含むマウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３の一部分を含むことは、本発明により想定されている。マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置９６（「Ｘ1」）、９７（「Ｘ2」）、９８（「Ｘ3」）および９９（「Ｘ4」）にそれぞれ相当する「Ｘ1」、「Ｘ2」、「Ｘ3」または「Ｘ4」は、アミノ酸残基「Ｒ」（アルギニン）、「Ｇ」（グリシン）、「Ｌ」（ロイシン）、「Ｙ」（チロシン）、「Ａ」（アラニン）、「Ｄ」（アスパラギン酸）、「Ｓ」（セリン）、「Ｗ」（トリプトファン）、「Ｆ」（フェニルアラニン）または「Ｔ」（トレオニン）を表すことが想定されている。本明細書において、「Ｘ1」、「Ｘ2」、「Ｘ3」および「Ｘ4」が同じアミノ酸を表す、例えば「Ｘ1」、「Ｘ2」、「Ｘ3」および「Ｘ4」がすべて「Ｆ」（フェニルアラニン）である場合は、本発明の範囲から除外される。好ましくは、「Ｘ1」が、「Ｒ」（アルギニン）、「Ｆ」（フェニルアラニン）、「Ｍ」（メチオニン）、「Ｅ」（グルタミン酸）、または「Ｔ」（トレオニン）を表し；「Ｘ2」が、「Ｇ」（グリシン）、「Ｙ」（チロシン）、「Ａ」（アラニン）、「Ｄ」（アスパラギン酸）、または「Ｓ」（セリン）を表し；「Ｘ3」が、「Ｌ」（ロイシン）、「Ｆ」（フェニルアラニン）、「Ｍ」（メチオニン）、「Ｅ」（グルタミン酸）、または「Ｔ」（トレオニン）を表し；かつ、「Ｘ4」が、「Ｒ」（アルギニン）、「Ｙ」（チロシン）、「Ａ」（アラニン）、「Ｄ」（アスパラギン酸）、または「Ｓ」（セリン）を表す。あるいは最も好ましいものは、本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体のヒトＣＥＡと特異的に結合する第２の結合ドメインは、Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置９５〜１０２に相当するアミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号６６）を含むＡ５Ｂ７の完全なＣＤＲ−Ｈ３を含む。以下の実施例に示されるように、前記ｍＡｂ  Ａ５Ｂ７由来ＣＤＲ−Ｈ３「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号６６）アミノ酸配列をＣＥＡと相互作用する第２の結合ドメイ���中に含む、本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体の腫瘍細胞に対する細胞障害活性は、可溶性ＣＥＡ抗原に対して抵抗性であり、それによりその血漿中の血清ＣＥＡ濃度の高い腫瘍患者の治療を可能にする。ＣＤＲの決定は、当業者に公知である；例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／＃ｃｄｒｉｄ参照。抗体中のアミノ酸配列の番号付けは、例えば、当分野に記載されるKabatの番号付けスキームに従って行ってよい；例えば、Kabat, E. A., T. T. Wu, H. M. Perry, K. S. Gottesman, and C. Foeller. 1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Bethesda, Md.: National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine参照。
【００２７】
最も好ましくは、そして添付の実施例に記録されるように、本発明の医薬組成物に用いられる「二重特異性一本鎖抗体」は、脱免疫化された抗ＣＤ３結合ドメイン（ＷＯ  ２００５／０４０２２０号）と、少なくともマウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置９５〜１０２（配列番号６６）に相当するアミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」を含むヒト抗ＣＥＡ結合ドメインを含む、二重特異性一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。二重特異性一本鎖分子は当分野で公知であり、例えば、ＷＯ  ９９／５４４４０号またはMack, PNAS, (1995), 92, 7021-7025に記載されている。
【００２８】
本発明に従って用いられる用語「一本鎖」は、好ましくは、単一の核酸分子によりコードすることのできる共直線性(co-linear)アミノ酸配列の形態で、二重特異性一本鎖構築物の前記第１および第２のドメインが共有結合していることを意味する。
【００２９】
本明細書において、「ヒト」とは、種Homo sapiensを指す。「ヒト」分子、例えばヒトＣＥＡまたはヒトＣＤ３（ＣＤ３ε）は、従って、Homo sapiensにおいて天然に発現するその分子の変異体である。
【００３０】
用語「上皮腫瘍」とは、本明細書において、ＣＥＡ陽性である上皮性起源の腫瘍を意味する（Cancer Medicine;6th ed.; Kufe, Donald W.; Pollock, Raphael E.; Weichselbaum, Ralph R.; Bast, Robert C., Jr.; Gansler, Ted S.; Holland, James F.; Frei III, Emil., editors. Hamilton (Canada): BC Decker Inc. 2003;http://www.dkfz.de: http://www.krebsinformationsdienst.de/Krebsarten/index.html）。治療し得る上皮腫瘍は、胃腸腺癌、乳腺腺癌または肺腺癌である。前記胃腸腺癌は、好ましくは結腸直腸腺癌、膵臓腺癌、食道腺癌または胃腺癌である。本明細書に示されるように、本発明の医薬組成物は、腫瘍患者の血漿中の高レベルの可溶性ＣＥＡ抗原を特徴とする、進行性腫瘍、転移、再発性癌、後期上皮腫瘍、上皮腫瘍量の多い患者、またはＣＥＡ血清中濃度が１００ｎｇ／ｍｌより高い腫瘍患者（例えばＥＬＩＳＡにより測定）の治療に特に有利である。前記医薬組成物を原発腫瘍の外科切除の後に使用することも本発明の範囲内である。従って例えば、ＣＥＡ産生上皮腫瘍に由来する散在性の（disseminated）残存腫瘍細胞も、ＣＥＡをそれらの微小環境に流し、その周囲では可溶性ＣＥＡのレベルも高い。従って、本発明の医薬組成物の細胞障害活性の可溶性ＣＥＡに対する抵抗性は、最小残存病変の治療にも有利である。前記医薬組成物は、残りの腫瘍細胞を死滅させるために、（ＣＥＡ源、すなわち原発腫瘍の除去によって）血清ＣＥＡレベルの低下する期間に投与し得ることが想定される。また、前記医薬組成物は、二次性腫瘍または転移の形成によって血清ＣＥＡレベルが増大する場合に、原発腫瘍の除去後に有用であり得る。ＣＥＡ血清中濃度は、例えばＣＥＡ  ＥＬＩＳＡアッセイ（例えばＩＢＬ  ＣＥＡ  ＥＩＡ、ＩＢＬ  Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ参照）により決定することができる。上記に示したように、多くの抗体に基づく治療的アプローチにおいて、前記血清ＣＥＡは、抗体と腫瘍細胞上の膜結合ＣＥＡの結合を阻害し、抗体の活性を遮断し、それにより抗腫瘍療法の成功を悪化させる。
【００３１】
本明細書において、用語「特異的に結合する」または「特異的結合」または「〜との／〜に対する特異的反応性」などの関連表現は、本明細書に定義される二重特異性一本鎖抗体の第１および／または第２の結合ドメインの、可能な結合パートナーとしての複数の異なる分子のプールから、前記それぞれの第１および／または第２の分子にのみ結合する、あるいは有意に結合する程度までそれぞれの第１および／または第２の分子を識別する能力を指す。このような結合測定は、例えばＢｉａｃｏｒｅ装置で、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ分析などにより日常的に行うことができる。より具体的には、本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体の第１の結合ドメインは、ヒトＣＤ３、好ましくは、ヒトＣＤ３εと結合する。本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体の第２の結合ドメインは、下に述べるように、上皮性腫瘍抗原、すなわち、ヒトＣＥＡ（癌胎児性抗原、癌胎児性抗原関連細胞接着分子５；ＣＥＡＣＡＭ５；ＣＤ６６e）と結合する。用語「特異的結合」は、本発明によれば、二重特異性一本鎖抗体分子が本明細書に定義されるヒト標的分子それぞれの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、またはさらにそれより多くのアミノ酸と特異的に相互作用かつ／または結合できることを意味する。前記用語は、抗体分子の特異性、すなわち、本明細書に定義されるヒト標的分子の特定の領域を識別するその能力に関する。抗原相互作用部位とその特異的抗原との特異的相互作用は、例えば抗原の立体構造の変化の誘導、抗原のオリゴマー化などに起因する、シグナルの開始をもたらし得る。さらに、前記結合は、「キーロックの原則（key-lock-principle）」という特異性に例証され得る。従って、抗原相互作用部位および抗原のアミノ酸配列中の特異的モチーフは、それらの一次、二次または三次構造の結果ならびに前記構造の二次修飾の結果として相互に結合する。抗原相互作用部位のその特異的抗原との特異的相互作用は、さらに前記部位と抗原との結合をもたらし得る。
【００３２】
抗体の「特異的結合」は、主に２つのパラメータ：定性的パラメータ（結合エピトープ、すなわち抗体が結合する場所）および定量的パラメータ（結合親和性、すなわちそれが結合する場所でどの程度強く結合するか）に特徴付けられる。どのエピトープが抗体によって結合されるかは、例えば公知のＦＡＣＳ方法論、ペプチドスポットエピトープマッピング、質量分析またはペプチドＥＬＩＳＡにより有利に決定することができる。特定のエピトープと結合している抗体の強度は、例えば公知のＢｉａｃｏｒｅおよび／またはＥＬＩＳＡ法により有利に決定することができる。このような技法を組み合わせることにより、結合特異性の代表的な尺度としてのシグナル対ノイズ比の算出が可能となる。そのようなシグナル対ノイズ比では、シグナルは注目されるエピトープと結合する抗体の強度を表すのに対して、ノイズは注目されるエピトープとは異なる他の非関連エピトープと結合する抗体の強度を表す。好ましくは、注目されるエピトープに対するシグナル:ノイズ比（注目されるエピトープと異なるその他のエピトープに対するものより約５０倍高い）は、評価される抗体が注目されるエピトープと特異的な方法で結合する指標として考えることができる、言い換えれば「特異的結合剤」である。
【００３３】
本発明に従って用いられる用語「特異的結合」または「特異的相互作用」は、二重特異性一本鎖抗体構築物が類似構造のポリペプチドと交差反応しないか、または本質的に交差反応しないことを意味する。研究中の二重特異性一本鎖のパネルの交差反応は、例えば、注目されるポリペプチドならびに程度の差はあるが（構造的かつ／または機能的に）密接に関連した多数のポリペプチドとの、従来条件下で二重特異性一本鎖抗体構築物の前記パネルの結合（例えば、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 ならびに Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999参照）を評価することにより試験することができる。例えば、本発明の二重特異性一本鎖抗体の最初の結合ドメインが、ヒトＣＥＡ（癌胎児性抗原；ＣＥＡＣＡＭ５；ＣＥＡ；ＣＤ６６ｅ）、すなわち可溶性ＣＥＡ抗原及び膜結合ＣＥＡの双方と結合することは本発明の範囲内であるが、それに対して、その他のＣＥＡファミリーメンバー、例えば胆汁糖タンパク質（ＣＥＡＣＡＭ１；ＢＧＰ１；ＴＭ−ＣＥＡ；ＣＤ６６ａ）と結合している二重特異性抗体は、前記範囲から除外される。
【００３４】
抗原相互作用部位と特異的抗原との特異的相互作用の例は、その受容体のリガンドの特異性を含む。前記定義は、特にその特異的な受容体との結合の際にシグナルを誘導するリガンドの相互作用を含む。対応するリガンドの例は、その特異的なサイトカイン受容体と相互作用／結合するサイトカインを含む。また、前記定義により特に含まれるものは、抗原相互作用部位と、セレクチンファミリー、インテグリンおよびＥＧＦなどの成長因子のファミリーの抗原などの抗原との結合である。前記相互作用の別の例（それも前記定義により特に含まれる）は、抗原決定基（エピトープ）と抗体の抗原結合部位の相互作用である。
【００３５】
用語「〜と結合／相互作用する」もまた、立体構造エピトープ、構造エピトープまたはヒト標的分子の２つの領域からなる不連続エピトープまたはその部分に関連する。本発明の文脈において、立体構造エピトープは、ポリペプチドが折りたたまれて未変性タンパク質となる際に分子の表面上に集まる一次配列において分離した２またはそれ以上の別個のアミノ酸配列により定義される（Sela, (1969) Science 166, 1365 およびLaver, (1990) Cell 61, 553-6）。
【００３６】
用語「不連続エピトープ」とは、本発明の文脈において、ポリペプチド鎖の離れた部分の残基から構築される非直線状エピトープを意味する。これらの残基は、ポリペプチド鎖が三次元構造に折りたたまれて立体構造／構造エピトープを構成する際に分子の表面上に集まる。
【００３７】
本明細書において「ＣＤ３」は、多分子Ｔ細胞受容体複合体の一部としてＴ細胞で発現し、少なくとも５つの異なる鎖、ＣＤ３−γ、−δ、−ε、−ζ、および−ηからなる抗原を意味する。Ｔ細胞でのＣＤ３のクラスター形成（例えば、固定化された抗ＣＤ３抗体による）は、Ｔ細胞受容体の関与に似たＴ細胞の活性化を引き起こすが、そのクローンに典型的な特異性とは無関係である。実際に、大部分の抗ＣＤ３抗体はＣＤ３ε鎖を認識する。ヒトＣＤ３εのアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００７３３に表され、配列番号１１１を含む。
【００３８】
「ＣＥＡ」とは、上皮性起源の多数の腫瘍に発現した抗原である、癌胎児性抗原（癌胎児性抗原関連細胞接着分子５；ＣＥＡＣＡＭ５；ＣＥＡ；ＣＤ６６ｅ）を意味する（Hammarstroem, Sem. Cancer Biol. 9 (1999), 67-81; Shively and Beatty CRC Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2 (1985), 355-399）。ヒトＣＥＡのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４３６３に表され、配列番号７６を含む。
【００３９】
本発明において、驚くことに、ヒトＣＤ３およびヒトＣＥＡに対して特異性を有する抗体に基づく治療薬を生成することが可能であり、腫瘍細胞に対して向けられる細胞障害活性がさらに高い濃度の可溶性ＣＥＡ抗原に対して抵抗性であることが見出された。この知見は、本発明の二重特異性一本鎖抗体が可溶性ＣＥＡ抗原と結合するという事実を考えると全く予期されないものである。例えば、モノクローナル抗体Ｔ８４．６６またはＭＦＥ−２３に由来する二重特異性一本鎖抗体構築物が作製される場合、これらの抗体は可溶性ＣＥＡ抗原に感受性が高かった、すなわちそれらの細胞障害活性は可溶性ＣＥＡ抗原の存在下で遮断されていた。可溶性ＣＥＡによる前記構築物の細胞障害活性の阻害は、抗体の量を増加させることによっても克服できなかった。これらの構築物はまた、可溶性ＣＥＡとの結合が可能であることが見出されている。このことを考えて、可溶性ＣＥＡ抗原は、抗体がその細胞障害活性を発揮することを妨げると結論付けられた。その一方、本明細書に定義される二重特異性一本鎖抗体は、腫瘍細胞に対するそれらの細胞障害活性においてさらに高いレベルの可溶性ＣＥＡの存在に対して完全に抵抗性である。さらに、その高い細胞障害活性に起因して、本明細書において定義される前記二重特異性構築物は、低い濃度であってさえもそれらの生物活性を誘起する。故に、本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体を含む少量の医薬組成物は、血清／血漿中の可溶性ＣＥＡ濃度が高いことを特徴とする上皮性腫瘍患者において治療効果を達成するために十分である。上皮性腫瘍患者の血清／血漿中の可溶性ＣＥＡ濃度が高いことは、進行性、再発性、転移性、または後期腫瘍および高腫瘍量の患者の特徴である。さらに一層驚くことに、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置９５〜１０２に相当するアミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号６６）は、抗ＣＥＡｘ抗ＣＤ３二重特異性一本鎖抗体のヒトＣＥＡ結合ドメイン（すなわち、ヒトＣＥＡと特異的に結合するヒト結合ドメイン）に使用した場合、可溶性ＣＥＡ抗原に対する抵抗性を媒介するのに十分であることが見出された。それがヒト起源であることに起因して、前記構築物はヒト腫瘍患者に投与される場合、免疫原性が低いか免疫原性がない。要約すると、本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体を含む医薬組成物は、例えば、腫瘍進行中に観察される、血漿中の可溶性ＣＥＡ濃度の高い上皮性腫瘍患者の治療に、再発性癌に、転移に、高腫瘍量の患者に、または後期腫瘍に特に有用である。
【００４０】
本発明の医薬組成物のもう１つの好ましい実施形態では、本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体のＣＤ３に特異的な前記第１の結合ドメインは、第２の結合ドメインに対してＣ末端に位置している。
【００４１】
本発明のおよび全ての実施形態の範囲内で、単一ポリペプチド鎖上の、すなわち、本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体の中の、第１および第２の結合ドメインの配置の順序は関連性がある。本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体の結合ドメインの配置は、ＶＨCEA−ＶＬCEA−ＶＨCD3−ＶＬCD3、ＶＬCEA−ＶＨCEA−ＶＨCD3−ＶＬCD3、ＶＨCD3−ＶＬCD3−ＶＨCEA−ＶＬCEAまたはＶＨCD3−ＶＬCD3−ＶＬCEA−ＶＨCEAであり得ることが想定されている。以下の実施例に示されるように、上述の利点は、第１の結合ドメイン（ＣＤ３と特異的に結合する）が第２の結合ドメインに対してＣ末端に位置している、すなわち、第２の結合ドメインよりも二重特異性一本鎖抗体のＣ末端に近い場合、特に実現可能である。ヒトＣＤ３と特異的に結合する第１の結合ドメインは、ＶＨ−ＶＬの配向に配置されていることが好ましい。例えば、本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体の結合ドメインは、ＶＨCEA−ＶＬCEA−ＶＨCD3−ＶＬCD3またはＶＬCEA−ＶＨCEA−ＶＨCD3−ＶＬCD3の順序で配置されてよい。本明細書において、「〜に対してＮ末端に」または「〜に対してＣ末端に」およびそれらの文法上の変化形は、二重特異性一本鎖抗体の絶対的なＮまたはＣ末端での配置よりもむしろ一次アミノ酸配列内の相対的な位置を意味する。故に、限定されない例として、「第２の結合ドメインに対してＣ末端に位置する」第１の結合ドメインとは、単に第１の結合ドメインが二重特異性一本鎖抗体内の第２の結合ドメインのカルボキシル側に位置することを意味し、さらなる配列、例えば上に述べたタグ、または別のタンパク質性もしくは非タンパク質性化合物（放射性同位元素など）が二重特異性一本鎖抗体の最終的なＣ末端に位置する可能性を排除するものではない。
【００４２】
好ましくは、本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体の前記結合ドメインは、ＶＨCEA−ＶＬCEA−ＶＨCD3−ＶＬCD3またはＶＬCEA−ＶＨCEA−ＶＨCD3−ＶＬCD3の順序で配置される。さらにより好ましくは、配置は、ＶＬCEA−ＶＨCEA−ＶＨCD3−ＶＬCD3である。最も好ましいのは、配列番号３４に定義される二重特異性一本鎖抗体構築物Ａ２４０ＶＬ−Ｂ９ＶＨｘ配列番号７７ＶＨＶＬである。
【００４３】
本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体のヒトＣＥＡと特異的に結合する第２の結合ドメインは、少なくとも１つのＣＤＲ、好ましくはＣＤＲ−Ｈ３、より好ましくはマウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置１００、１００ａ、１００ｂ、１０１、および１０２にそれぞれ相当するアミノ酸配列「ＦＹＦＤＹ」（配列番号１１２）を含むマウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３の一部分；さらにより好ましくはアミノ酸配列「ＤＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＦＹＦＤＹ」（配列番号６５）（「Ｘ1」、「Ｘ2」、「Ｘ3」または「Ｘ4」は、任意のアミノ酸残基を表し、該アミノ酸残基「Ｄ」は、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のＫａｂａｔ位置９５に相当し、アミノ酸残基「ＦＹＦＤＹ」は、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置１００、１００ａ、１００ｂ、１０１、および１０２にそれぞれ相当する）を含むマウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３の一部分を含むことが好ましい。本明細書において、「Ｘ1」、「Ｘ2」、「Ｘ3」および「Ｘ4」は、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置９６（「Ｘ1」）、９７（「Ｘ2」）、９８（「Ｘ3」）および９９（「Ｘ4」）にそれぞれ相当する。「Ｘ1」、「Ｘ2」、「Ｘ3」または「Ｘ4」は、アミノ酸残基「Ｒ」（アルギニン）、「Ｇ」（グリシン）、「Ｌ」（ロイシン）、「Ｙ」（チロシン）、「Ａ」（アラニン）、「Ｄ」（アスパラギン酸）、「Ｓ」（セリン）、「Ｗ」（トリプトファン）、「Ｆ」（フェニルアラニン）または「Ｔ」（トレオニン）を表すことが想定されている。本明細書において、「Ｘ1」、「Ｘ2」、「Ｘ3」および「Ｘ4」が同じアミノ酸を表す、例えば「Ｘ1」、「Ｘ2」、「Ｘ3」および「Ｘ4」がすべて「Ｆ」（フェニルアラニン）である場合は、本発明の範囲から除外される。好ましくは、「Ｘ1」が、「Ｒ」（アルギニン）、「Ｆ」（フェニルアラニン）、「Ｍ」（メチオニン）、「Ｅ」（グルタミン酸）、または「Ｔ」（トレオニン）を表し；「Ｘ2」が、「Ｇ」（グリシン）、「Ｙ」（チロシン）、「Ａ」（アラニン）、「Ｄ」（アスパラギン酸）、または「Ｓ」（セリン）を表し；「Ｘ3」が、「Ｌ」（ロイシン）、「Ｆ」（フェニルアラニン）、「Ｍ」（メチオニン）、「Ｅ」（グルタミン酸）、または「Ｔ」（トレオニン）を表し；かつ、「Ｘ4」が、「Ｒ」（アルギニン）、「Ｙ」（チロシン）、「Ａ」（アラニン）、「Ｄ」（アスパラギン酸）、または「Ｓ」（セリン）を表す。さらにより好ましくは、ヒトＣＥＡに特異的な第２の結合ドメインは、モノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のアミノ酸配列「ＲＦＹＦＤＹ」（配列番号１１３）、「ＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号１１４）、「ＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号１１５）、または「ＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号１１６）を少なくとも含む。最も好ましいのは、Kabatの位置９５（「Ｄ」、アスパラギン酸）、９６（「Ｒ」；アルギニン）、９７（「Ｇ」；グリシン）、９８（「Ｌ」；ロイシン）、９９（「Ｒ」；アルギニン）、１００（「Ｆ」；フェニルアラニン）、１００ａ（「Ｙ」；チロシン）、１００ｂ（「Ｆ」；フェニルアラニン）、１０１（「Ｄ」；アスパラギン酸）、��よび１０２（「Ｙ」；チロシン）にそれぞれ相当する、アミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号６６）を含むＡ５Ｂ７の完全なＣＤＲ−Ｈ３である。Kabatの方式に従う番号付けは、例えば、Kabat, E. A., T. T. Wu, H. M. Perry, K. S. Gottesman, and C. Foeller. 1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Bethesda, Md.: National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicineに説明されている。
【００４４】
以下の実施例に示されるように、ＣＥＡと相互作用する第二の結合ドメインの前記ｍＡｂ  Ａ５Ｂ７由来のＣＤＲ−Ｈ３「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号６６）アミノ酸配列を含む、本明細書に定義される二重特異性一本鎖抗体の腫瘍細胞に対する細胞障害活性は、可溶性ＣＥＡ抗原に対して抵抗性であり、それにより血漿中の血清ＣＥＡ濃度の高い腫瘍患者の治療が可能となる。
【００４５】
このＡ５Ｂ７由来「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」ＣＤＲ−Ｈ３アミノ酸配列は、例えば、（上皮腫瘍細胞上の）ＣＥＡ標的抗原に対する親和性を改良するため、かつ／または本明細書に定義される二重特異性一本鎖抗体の「微細な（fine）特異性」を最適化するためにさらに修飾することが望ましい。本目的のため、アミノ酸配列「ＤＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＦＹＦＤＹ」（配列番号６５）において、改良された親和性および／または微細な特異性を有する、修飾されたＣＤＲ−Ｈ３を同定するために、様々なアミノ酸残基を位置「Ｘ1」、「Ｘ2」、「Ｘ3」および／または「Ｘ4」（それぞれ、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置９６（「Ｘ1」）、９７（「Ｘ2」）、９８（「Ｘ3」）および９９（「Ｘ4」）に対応）で試験してよい。例えば、「Ｘ1」、「Ｘ2」、「Ｘ3」または「Ｘ4」は、アミノ酸残基「Ｒ」（アルギニン）、「Ｇ」（グリシン）、「Ｌ」（ロイシン）、「Ｙ」（チロシン）、「Ａ」（アラニン）、「Ｄ」（アスパラギン酸）、「Ｓ」（セリン）、「Ｗ」（トリプトファン）、「Ｆ」（フェニルアラニン）または「Ｔ」（トレオニン）で表され得る。ここで、表示される「Ｘ」の位置の１、２、３または４つ全ては、ＣＤＲ−Ｈ３「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号６６）アミノ酸配列中のKabatの位置９６〜９９にて本来の「ＲＧＬＲ」アミノ酸配列と比較して交換されてよい。しかし、「Ｘ1」、「Ｘ2」、「Ｘ3」および「Ｘ4」が同じアミノ酸を表す場合、例えば「Ｘ1」、「Ｘ2」、「Ｘ3」および「Ｘ4」が全て「Ｆ」（フェニルアラニン）である場合は本発明の特許請求の範囲から除外される。上記のＡ５Ｂ７由来の「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」ＣＤＲ−Ｈ３アミノ酸配列の修飾は当分野で公知の方法、例えば、ＣＥＡ結合ドメイン中に、このような修飾されたＣＤＲ−Ｈ３領域を含む二重特異性一本鎖抗体の作製を可能にするランダム化されたプライマーを用いるＰＣＲにより達成することができる。これらの修飾された二重特異性一本鎖抗体の親和性または微細な特異性は、当分野で記載される方法、例えばＥＬＩＳＡ、ＢｉａｃｏｒｅまたはＦＡＣＳ分析により試験することができる。そのような修飾されたＣＤＲ−Ｈ３を含む二重特異性一本鎖抗体の可溶性ＣＥＡ抗原に対する抵抗性は、以下の実施例に記載されるように、漸増量の可溶性ＣＥＡの存在下で、細胞障害活性アッセイで試験することができる。
【００４６】
より好ましくは、本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体のヒトＣＥＡに特異的な前記第２の結合ドメインは、配列番号６５もしくは６６および／またはアミノ酸配列「ＳＹＷＭＨ」（配列番号６８）を有するＣＤＲ−Ｈ１および／またはアミノ酸配列「ＦＩＲＮＫＡＮＧＧＴＴＥＹＡＡＳＶＫＧ」（配列番号６７）もしくは「ＦＩＬＮＫＡＮＧＧＴＴＥＹＡＡＳＶＫＧ」（配列番号１４５）を有するＣＤＲ−Ｈ２を含む。従って、本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体のヒトＣＥＡに特異的な前記第２の結合ドメインは、上に定義される１、２または３のＣＤＲ−Ｈ領域を含んでよい。あるいは、本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体のヒトＣＥＡに特異的な前記第２の結合ドメインは、配列番号６５もしくは６６および／またはアミノ酸配列「ＴＹＡＭＨ」（配列番号７０）を有するＣＤＲ−Ｈ１および／またはアミノ酸配列「ＬＩＳＮＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ」（配列番号６９）を有するＣＤＲ−Ｈ２を含む。従って、その代わりとして、本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体のヒトＣＥＡに特異的な前記第２の結合ドメインは、上に定義される１、２または３のＣＤＲ−Ｈ領域を含んでよい。さらにより好ましくは、本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体のヒトＣＥＡに特異的な前記第２の結合ドメインは、上に示される１、２または３のＣＤＲ−Ｈ領域に加えて、アミノ酸配列「ＴＬＲＲＧＩＮＶＧＡＹＳＩＹ」（配列番号７３）を有するＣＤＲ−Ｌ１および／またはアミノ酸配列「ＹＫＳＤＳＤＫＱＱＧＳ」（配列番号７２）を有するＣＤＲ−Ｌ２および／またはアミノ酸配列「ＭＩＷＨＳＧＡＳＡＶ」（配列番号７１）を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む。
【００４７】
本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体のヒトＣＥＡに特異的な第２の結合ドメインのＶＨ領域のアミノ酸配列は、好ましくは、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置９５〜１０２に相当する「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号６６）、およびアミノ酸配列「ＳＹＷＭＨ」（配列番号６８）を有するＣＤＲ−Ｈ１およびアミノ酸配列「ＦＩＲＮＫＡＮＧＧＴＴＥＹＡＡＳＶＫＧ」（配列番号６７）を有するＣＤＲ−Ｈ２を含む、配列番号６０である。
【００４８】
本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体のヒトＣＥＡに特異的な第２の結合ドメインのＶＨ領域のアミノ酸配列は、好ましくは、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置９５〜１０２に相当する「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号６６）、およびアミノ酸配列「ＳＹＷＭＨ」（配列番号６８）を有するＣＤＲ−Ｈ１、およびアミノ酸配列「ＦＩＬＮＫＡＮＧＧＴＴＥＹＡＡＳＶＫＧ」（配列番号１４５）を有するＣＤＲ−Ｈ２を含む、配列番号１４６である。
【００４９】
本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体のヒトＣＥＡに特異的な第２の結合ドメインのＶＨ領域のアミノ酸配列は、好ましくは、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置９５〜１０２に相当する「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号６６）、およびアミノ酸配列「ＴＹＡＭＨ」（配列番号７０）を有するＣＤＲ−Ｈ１、およびアミノ酸配列「ＬＩＳＮＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ」（配列番号６９）を有するＣＤＲ−Ｈ２を含む、配列番号５８または配列番号６２である。
【００５０】
本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体のヒトＣＥＡに特異的な第２の結合ドメインのＶＬ領域は、好ましくは、アミノ酸配列「ＴＬＲＲＧＩＮＶＧＡＹＳＩＹ」（配列番号７３）を有するＣＤＲ−Ｌ１、およびアミノ酸配列「ＹＫＳＤＳＤＫＱＱＧＳ」（配列番号７２）を有するＣＤＲ−Ｌ２、およびアミノ酸配列「ＭＩＷＨＳＧＡＳＡＶ」（配列番号７１）を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む、配列番号６４である。
【００５１】
上に述べたように、ＣＥＡと特異的に結合する第２の結合ドメインの可変領域の順序または配置は、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨであってよい。両方の配置が本発明の範囲内である。配列番号６０のＶＨと配列番号６４のＶＬを含む第２の結合ドメインについて、ＶＨ−ＶＬ配置は配列番号５２に示され、一方、ＶＬ−ＶＨ配置は配列番号１２２に示される。配列番号１４６のＶＨと配列番号６４のＶＬを含む第２の結合ドメインについて、ＶＨ−ＶＬ配置は配列番号１４７に示される。
【００５２】
配列番号５８のＶＨと配列番号６４のＶＬを含む第２の結合ドメインについて、ＶＨ−ＶＬ配置は配列番号５０に示され、一方、ＶＬ−ＶＨ配置は配列番号１２０に示される。配列番号６２のＶＨと配列番号６４のＶＬを含む第２の結合ドメインについて、ＶＨ−ＶＬ配置は配列番号５４に示され、一方、ＶＬ−ＶＨ配置は配列番号１２４に示される。配列番号５６のＶＨと配列番号６４のＶＬを含む第２の結合ドメインについて、ＶＨ−ＶＬ配置は配列番号４８に示され、一方、ＶＬ−ＶＨ配置は配列番号１１８に示される。
【００５３】
さらにより好ましくは、本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体のＣＥＡに特異的な第２の結合ドメインのＶ領域は、以下、
（ａ）配列番号６０に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ領域および配列番号６４に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ領域；
（ｂ）配列番号１４６に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ領域および配列番号６４に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ領域；
（ｃ）配列番号５８に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ領域および配列番号６４に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ領域;
（ｄ）配列番号６２に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ領域および配列番号６４に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ領域；ならびに
（ｅ）配列番号５６に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ領域および配列番号６４に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ領域
からなる群より選択される。
【００５４】
最も好ましくは、前記二重特異性一本鎖抗体は、以下、
（ａ）配列番号６、８、１６、１８、２４、２６、３２、３４、４０、４２、１２６、１３０、１３４または１４３のいずれかに表されるアミノ酸配列;
（ｂ）配列番号５、７、１５、１７、２３、２５、３１、３３、３９、４１、１２５、１２９、１３３または１４２に示される核酸配列によりコードされるアミノ酸配列；
（ｃ）ストリンジェントな条件下で（ｂ）の相補的な核酸配列とハイブリダイズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列;
（ｄ）（ｂ）の核酸配列に対する遺伝暗号の結果として縮重した核酸配列によりコードされるアミノ酸配列；ならびに
（ｅ）（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一、最も好ましくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００５５】
本発明の医薬組成物のもう１つの好ましい実施形態では、治療されるべき前記上皮腫瘍は、胃腸腺癌、乳腺腺癌または肺腺癌である。前記胃腸腺癌は、好ましくは結腸直腸腺癌、膵臓腺癌、食道腺癌または胃腺癌である。
【００５６】
より好ましくは、本発明の前記医薬組成物は、進行性腫瘍、後期腫瘍、腫瘍量の多い腫瘍患者、転移性腫瘍、またはＣＥＡ血清中濃度が１００ｎｇ／ｍｌより高い腫瘍患者の治療のためのものである。前記ＣＥＡ血清中濃度は、例えばＥＬＩＳＡにより測定され得る。
【００５７】
本発明の医薬組成物のさらに好ましい実施形態では、本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体の前記第１または第２の結合ドメインの少なくとも１つは、キメラ、ヒト化、ＣＤＲ移植、および／または脱免疫化またはヒトである。
【００５８】
本明細書において、用語「キメラ」は、上に定義されている。本明細書において、用語「ヒト」結合ドメイン、例えば、ヒトＣＥＡと特異的に結合するヒト結合ドメインは、本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体が、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３または上記定義のＡ５Ｂ７由来ＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置１００、１００ａ、１００ｂ、１０１、および１０２（配列番号１１２）に相当するアミノ酸配列「ＦＹＦＤＹ」を少なくとも有する、ヒト生殖細胞系列抗体レパートリーまたは抗体レパートリーに含有されているアミノ酸配列を含むことを意味するものと理解される。本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体はまた、それが、体細胞突然変異のインプリントに起因して予測され得る程度に、その（それらの）最も近いヒト生殖細胞系列配列に由来する配列からなる場合にヒトとみなされ得る。さらに、多くの非ヒト哺乳類、例えばマウスおよびラットなどのげっ歯類の抗体は、発現したヒト抗体レパートリー中にも存在することが予期され得るＶＨ  ＣＤＲアミノ酸配列を含む。発現したヒト抗体レパートリー中に存在することが予期され得る、ヒトまたは非ヒト起源の任意のそのような配列も本発明の目的において「ヒト」とみなされ得る。
【００５９】
本明細書において、用語「ヒト化した」、「ヒト化」または「ヒト様」は、同義的に用いられて、その結合ドメインの少なくとも１つにおいて、非ヒト抗体またはその断片由来の少なくとも１つの相補性決定領域（「ＣＤＲ」）を含む二重特異性一本鎖抗体を指す。ヒト化アプローチは、例えばＷＯ  ９１／０９９６８号および米国特許第６,４０７，２１３号に記載されている。限定されない例として、この用語は、少なくとも１つの結合ドメインの可変領域が別の非ヒト動物（例えばげっ歯類）由来の単一のＣＤＲ領域（例えばＶＨの３番目のＣＤＲ領域）を含む場合、ならびに、一方または両方の可変領域がそれらのそれぞれの１番目、２番目および３番目のＣＤＲの各々に前記非ヒト動物由来のＣＤＲを含む場合を包含する。二重特異性一本鎖抗体の結合ドメインの全てのＣＤＲが、例えばげっ歯類由来のそれらの対応する同等物で置換されている場合、通常「ＣＤＲ移植（CDR-grafting）」といい、この用語は本明細書において用語「ヒト化」またはその文法上の変化形も包含していると理解される。用語「ヒト化」または文法上の変化形はまた、第一および／または第二の結合ドメインのＶＨおよび／またはＶＬ内での１またはそれ以上のＣＤＲ領域の置換に加えて、ＣＤＲ間のフレームワーク（「ＦＲ」）領域内の少なくとも単一のアミノ酸残基のさらなる変異（例えば置換）が、その位置のアミノ酸を、置換に用いたＣＤＲ領域の由来する動物におけるその位置のアミノ酸に合致させている場合も包含する。当分野で公知のように、このような個々の変異は、その標的分子のＣＤＲ供与体として用いられる非ヒト抗体の本来の結合親和性を回復させるために、ＣＤＲ移植の後にフレームワーク領域に作製される場合が多い。用語「ヒト化」は、上記のフレームワーク領域中のアミノ酸置換に加えて、非ヒト動物由来のＣＤＲ領域における、ヒト抗体由来の相当するＣＤＲ領域のアミノ酸へのアミノ酸置換（１または複数個所）をさらに包含する。
【００６０】
本明細書において、用語「脱免疫化された」または「脱免疫化」は、元の野生型構築物と向かい合う第一および／または第二の結合ドメインを、ヒトにおいて前記野生型構築物を非免疫原性または低免疫原性にすることにより修飾することを意味する。脱免疫化アプローチは、例えばＷＯ  ００／３４３１７号、ＷＯ  ９８／５２９７６号、ＷＯ  ０２／０７９４１５号またはＷＯ  ９２／１０７５５号に示されている。用語「脱免疫化された」はまた、Ｔ細胞エピトープを形成する傾向の低下を示す構築物に関する。本発明に従って、用語「Ｔ細胞エピトープを形成する傾向の低下」とは、特異的なＴ細胞活性化をもたらすＴ細胞エピトープの除去に関する。さらに、「Ｔ細胞エピトープを形成する傾向の低下」とは、Ｔ細胞エピトープの形成に寄与するアミノ酸の置換、すなわち、Ｔ細胞エピトープの形成に必須のアミノ酸の置換を意味する。言い換えれば、「Ｔ細胞エピトープを形成する傾向の低下」は、免疫原性の低下または抗原非依存性のＴ細胞増殖を誘導する能力の低下に関する。用語「Ｔ細胞エピトープ」は、細胞内でペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の分解中に放出され、その後に、Ｔ細胞の活性化を引き起こすために主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）の分子より提示される短いペプチド配列に関する；特に、ＷＯ  ０２／０６６５１４号参照。ＭＨＣクラスＩＩで表されるペプチドに関して、このようなＴ細胞の活性化は、次に、Ｔ細胞の直接刺激による抗体応答を引き起こし、前記抗体を産生することができる。「Ｔ細胞エピトープを形成する傾向の低下」および／または「脱免疫化」は、当分野で公知の技法により測定することができる。Ｔ細胞増殖アッセイによりインビトロでタンパク質の脱免疫化を試験することが好ましい。このアッセイでは、世界で８０％を超えるＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子を提示するドナー由来のＰＢＭＣを、野生型かまたは脱免疫化されたペプチドのいずれかに応答する増殖についてスクリーニングする。理想的には、細胞増殖は野生型ペプチドに抗原提示細胞を負荷する（loading）際にのみ検出される。あるいは、全てのハプロタイプを提示するＨＬＡ−ＤＲ四量体を発現させることにより、脱免疫化を試験することができる。これらの四量体は、ペプチド結合について試験するか、または増殖アッセイにおいて抗原提示細胞の代わりをするペプチドを負荷してよい。脱免疫化されたペプチドがＨＬＡ−ＤＲハプロタイプに提示されるかどうかを試験するため、例えばＰＢＭＣ上の蛍光標識ペプチドの結合を測定することができる。さらに、脱免疫化は、患者への投与後に脱免疫化分子に対する抗体が形成されたかどうかを判定することにより証明することができる。好ましくは、ＣＤＲ領域の結合親和性が影響を受けないように、Ｔ細胞エピトープを誘導する傾向の低下をもたらすために、抗体由来分子をフレームワーク領域で脱免疫化し、大部分のＣＤＲ領域は修飾されない。たとえ１つのＴ細胞エピトープの除去であっても、結果として免疫原性が低下する。
【００６１】
要約すると、上記のアプローチは、上皮性腫瘍患者に投与された場合、本明細書において定義される治療用二重特異性一本鎖抗体の免疫原性を低下させるのに役立つ。例えば、配列番号７７に示されるＣＤ３と特異的に結合している第１の結合ドメインは脱免疫化されている；ＷＯ  ２００５／０４０２２０号も参照のこと。好ましくは、このＣＤ３結合ドメインにおけるＶ領域の配置は、ＶＨ−ＶＬである。
【００６２】
別の態様では、本発明は、
（ａ）配列番号６、８、１６、１８、２４、２６、３２、３４、４０、４２、１２６、１３０、１３４または１４３のいずれか１つに表されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号５、７、１５、１７、２３、２５、３１、３３、３９、４１、１２５、１２９、１３３または１４２に示される核酸配列によりコードされるアミノ酸配列；
（ｃ）ストリンジェントな条件下で（ｂ）の相補的な核酸配列とハイブリダイズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列；
（ｄ）（ｂ）の核酸配列に対する遺伝暗号の結果として縮重した核酸配列によりコードされるアミノ酸配列；および
（ｅ）（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一、最も好ましくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、二重特異性一本鎖抗体に関する。
【００６３】
一実施形態では、本発明は、上記に定義される二重特異性一本鎖抗体を含む組成物に関する。好ましくは、上記に定義される前記二重特異性一本鎖抗体は、ヒトにおける上皮性腫瘍の治療のための医薬組成物として使用される。前記上皮性腫瘍は、ＣＥＡ陽性である。これらの医薬組成物のＣＥＡ陽性上皮性腫瘍細胞に対する細胞障害活性は、腫瘍患者の血漿中の高い濃度の可溶性ＣＥＡ抗原にさえも抵抗性である。さらに、上記に定義される前記二重特異性一本鎖抗体またはそれに由来する抗ＣＥＡ  ｓｃＦｖは、下にさらに詳細に述べられるようにヒトにおける上皮性腫瘍の検出のための診断用組成物として使用することができる。
【００６４】
本明細書において、用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号５、７、１５、１７、２３、２５、３１、３３、３９、４１、１２５、１２９、１３３または１４２に示される配列、またはその相補物とハイブリダイズすることができ、ＣＥＡ陽性腫瘍細胞に対して細胞障害活性を有する二重特異性一本鎖抗体をコードする核酸配列を指す。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、５０％ ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘ デンハート液、１０％ 硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性断片化サケ精子ＤＮＡを含む溶液中、４２℃にて一晩のインキュベーション、その後、約６５℃にて０．１ｘ ＳＳＣ中でのフィルターの洗浄を指す。
【００６５】
任意の特定の核酸分子またはポリペプチドが本明細書に定義されるヌクレオチドまたはアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるかどうかは、公知のコンピュータープログラムを用いて従来法で決定してよい。クエリー配列（本明細書に定義される配列）と対象配列（subject sequence）との間で最も全体的に適合するものを決定するための好ましい方法（グローバル配列アラインメントとも称される）は、Bultragらのアルゴリズム（Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990)）に基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを用いて決定してよい。配列アラインメントにおいてクエリー配列と対象配列は、双方ともＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列はＵをＴに変換することにより比較され得る。
【００６６】
本発明はまた、本明細書に定義される二重特異性一本鎖抗体をコードする核酸配列を含む医薬組成物を提供する。前記核酸は、以下により詳細に示されるように、ヒトにおいて上皮腫瘍を治療するために、例えば遺伝子治療アプローチに利用することができる。
【００６７】
本発明はさらに上記に定義される核酸配列を含むベクターを含む医薬組成物に関する。好ましくは、前記ベクターは、上記に定義される前記核酸配列と作動可能なように連結されている調節配列をさらに含む。より好ましくは、前記ベクターは発現ベクターである。
【００６８】
さらに、本発明のベクターはまた、遺伝子導入または標的遺伝子組換えベクターであってよい。エキソビボ（ex-vivo）またはインビボ技術により治療遺伝子または核酸を細胞に導入することに基づく遺伝子治療は、遺伝子導入の最も重要な適用の一つである。インビトロまたはインビボでの遺伝子治療に適したベクター、方法または遺伝子送達系は、文献に記載され、当業者に公知である；例えば、Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813, Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086;Onodua, Blood 91 (1998), 30-36; Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (199８), 2243-2251; Verma, Nature 389 (1997), 239-242; Anderson, Nature 392 (Supp. 1998), 25-30; Wang, Gene Therapy 4 (1997), 393-400;Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716；ＷＯ  ９４／２９４６９；ＷＯ  ９７／００９５７；ＵＳ５，５８０，８５９；ＵＳ５，５８９，４６６；ＵＳ４，３９４，４４８またはSchaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640、ならびにそれに引用される参照文献を参照。本明細書に定義される核酸分子およびベクターは、細胞への直接導入用に、またはリポソーム、ウイルス（例えばアデノウイルス、レトロウイルス）ベクター、エレクトロポレーション、またはその他の送達系を介する細胞への導入用に設計することができる。さらに、バキュロウイルス系を本明細書に定義される核酸分子のための真核生物発現系として用いてもよい。導入および遺伝子治療アプローチは、好ましくは、本明細書に定義される機能的二重特異性一本鎖抗体構築物の発現をもたらすべきであり、それによって、前記発現した二重特異性一本鎖抗体構築物はヒトにおける上皮腫瘍の治療、寛解および／または予防に特に有用である。
【００６９】
さらなる態様では、本発明は、上記に定義されるベクターまたは核酸で形質転換またはトランスフェクトされた宿主を含む医薬組成物に関する。
【００７０】
本発明のさらなる態様は、免疫エフェクター細胞の活性化シグナルを提供することのできるタンパク質性化合物をさらに含む、上記に定義される医薬組成物に関する。
【００７１】
好ましくは、医薬組成物は、担体、安定剤および／または賦形剤からなる適した製剤をさらに含む。
【００７２】
別の態様では、本発明は、上記に定義される医薬組成物の製造のためのプロセスに関し、前記プロセスは上記に定義される宿主を上記に定義される二重特異性一本鎖抗体の発現を可能にする条件下で培養することと、産生された二重特異性一本鎖抗体を培養物から回収することを含む。
【００７３】
本発明のさらなる態様は、ヒトにおける上皮腫瘍の予防、治療または寛解のための医薬組成物の調製のための、上記に定義される二重特異性一本鎖抗体または上記に定義されるプロセスにより産生された二重特異性一本鎖抗体、上記に定義される核酸分子、上記に定義されるベクターまたは上記に定義される宿主の使用に関する。本発明の別の態様は、ヒトにおける上皮腫瘍の予防、治療または寛解のための方法に関し、前記方法は本発明の、または上に示されるプロセスによって製造された医薬組成物の有効量を投与する段階を含む。当業者、特に主治医であれば、本発明の二重特異的分子／二重特異的一本鎖抗体の投与を必要とする患者の治療の成功を評価することができる。従って、投与計画ならびに投薬量および投与回数は前記当業者により判断され得る。つまり、判断される、対応する「寛解」および／または「治療」は下に定義される。
【００７４】
本明細書において、上皮性腫瘍との関連で、本発明の医薬組成物の「有効量」または「治療上有効な量」とは、一次、局所または転移性腫瘍組織を破壊、改変、制御または除去するために十分な治療薬の量を指す。治療上有効な量とは、上皮性腫瘍の広がりを遅延または最小化するために十分な治療薬の量を指し得る。また、治療上有効な量とは、上皮性腫瘍の治療または管理において治療上の利益をもたらす治療薬または医薬品の量も指し得る。さらに、本発明の治療薬または医薬品に関して治療上有効な量とは、上皮性腫瘍の治療または管理において治療上の利益をもたらす治療薬または医薬品の、単独の、または他の治療法と組み合わせた量を意味する。本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体の量に関連して用いられる場合、この用語は、全体的な治療法を改善するか、望ましくない効果を低下または回避するか、または別の治療薬の治療効力または別の治療薬との相乗効果（本明細書において定義される通り）を促進する量を包含し得る。好ましくは、治療薬の治療上有効な量は、上皮性腫瘍の治療において、全体的な治療法を改善するか、望ましくない効果を低下または回避するか、または別の治療薬の治療効力または別の治療薬との相乗効果を促進する。例えば、本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体は、単一療法として患者に投与される場合、上皮性腫瘍の直径を２０％縮小させることができる。これに対し、第２の治療薬、例えば、下に定義される抗癌剤は、腫瘍を１０％縮小させることができる。しかし、本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体と前記第２の治療薬の両方を併用療法の形態で組み合わせて投与する場合、５０％の腫瘍の縮小を観察することができる。このような効果は本明細書において相乗効果として理解される。
【００７５】
本明細書において言及されるように、用語「治療法」とは、上皮性腫瘍の予防、治療または寛解に用いられ得る任意の投与計画、方法および／または薬剤を指す。用語「上皮性腫瘍の予防、治療または寛解」は、下に詳細に説明されている。用語「治療法(therapies)」および「治療法(therapy)」は、上皮性腫瘍、あるいはその１またはそれ以上の症状の治療、予防、または寛解に有用な生物学的療法、支持療法、化学療法、放射線療法および／またはその他の治療法を称し得る。
【００７６】
本明細書において、患者に１または複数の治療法を投与することとの関連で、用語「治療する」、「治療」および「治療すること」は、上皮性腫瘍の進行、重篤度、および／または持続の低下または寛解を指す。前記上皮性腫瘍は、異常な発現（例えば、ＣＥＡの過剰発現もしくは過剰活性）および／または、１もしくはそれ以上の治療法（１またはそれ以上の医薬品または治療薬の投与を含む）の投与の結果として生じるその１またはそれ以上の症状の寛解を伴い得る。
【００７７】
最も好ましい投与方法は、所与の時間／期間の静脈内投与である。本明細書に定義される二重特異性一本鎖抗体は１回につき単独で投与されてよいが、好ましいものは、製薬上許容される担体中の投与である。適した医薬担体の例は当分野で周知であり、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、リポソーム、様々な種類の湿潤剤、滅菌溶液などが含まれる。このような担体を含む組成物は、周知の従来法により処方されてよい。これらの医薬組成物は被験体に適した用量で投与することができる。投与計画は主治医および臨床学的因子により決定される。医学分野で周知のように、任意の患者一人への投薬量は多くの要因によって決まり、それには患者の大きさ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時間および経路、全体的な健康状態、および同時に投与されるその他の薬剤が含まれる。非経口投与のための製剤としては、滅菌水溶液または非水溶液、および懸濁液が挙げられる。非水溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、および注射用の有機エステル類、例えばオレイン酸エチルである。水性担体としては、水、水溶液、または生理食塩水および緩衝媒体を含む懸濁液が挙げられる。非経口媒体としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸化リンゲル液、または硬化油が挙げられる。静脈内媒体としては、液体および栄養素補充液、電解質補充液（リンゲルデキストロースに基づくものなど）などが挙げられる。防腐剤およびその他の添加剤も存在してよく、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどが挙げられる。さらに、組成物は、例えば、好ましくはヒト起源の血清アルブミンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質性担体を含んでもよい。併用療法は、タンパク質性二重特異性一本鎖抗体に加えて、医薬組成物の意図される使用に応じて、さらなる生物活性物質を含むことが想定される。このような物質は、胃腸管系に作用する物質、細胞増殖抑制剤として作用する物質、高尿酸血症を予防する物質、免疫反応を阻害する物質（例えばコルチコステロイド、ＦＫ５０６）、循環系に作用する薬剤および／またはＴ細胞共刺激分子またはサイトカインなどの当分野で公知の薬剤であってよい。好ましくは、本明細書に定義される二重特異性一本鎖抗体は、緩衝液、安定剤および界面活性剤中に処方される。緩衝液は、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液または酢酸緩衝液であってよい。安定剤は、アミノ酸および／または糖であってよい。界面活性剤は、合成洗剤、ＰＥＧなどであってよい。より好ましくは、本明細書に定義される二重特異性一本鎖抗体は、クエン酸塩、リシン、トレハロースおよびＴｗｅｅｎ８０中に処方される。前記医薬組成物の希釈液として、等張生理食塩水およびＴｗｅｅｎ８０が好ましい。
【００７８】
本明細書において用語「寛解」とは、疾患、すなわち上皮腫瘍の重篤度の改善または緩和を指す。例えば、そのような寛解は、本発明の医薬組成物の投与に起因する、安定な疾患の達成、またさらにより好ましくは、上皮腫瘍の縮小、すなわち、微小、部分的応答または完全寛解であり得る。「安定な疾患」とは、臨床および／または組織学的診断方法により腫瘍進行／増殖が全くまたはほとんど観察されないまたは検出されない疾患状態を指す。例えば、指標病変の断面積の合計の５０％より多くの縮小である、腫瘍の縮小は、「部分応答」と考えられる。「完全寛解」は、治療後に病変がこれ以上全く検出されない状態を意味する。安定疾患と部分応答との間の腫瘍縮小を伴う応答は、微小応答と考えられ得る。例えば、指標病変の断面積の合計の２０％、２５％または３０％縮小は、微小応答と称され得る。
【００７９】
用語「寛解」は、本明細書において、上皮腫瘍の数の減少も包含する。それは、さらに腫瘍進行の阻止／減速を意味する。さらに、治療しなかった腫瘍患者と比較して、治療した腫瘍患者の全体的な生存の改善は、本明細書において「寛解」と考えられる。これは、必要な変更を加えて、治療しなかった腫瘍患者と比較して、治療した腫瘍患者の進行のない生存または再発のない生存の改善にも当てはまる。さらに、用語「寛解」はまた、上皮腫瘍の症状の強度の減少も指し、その結果得られる、例えば治療した腫瘍患者の生活の質の改善も指す。
【００８０】
用語「上皮腫瘍の予防」は、本明細書において、次のように理解される。原発上皮腫瘍のヒト患者からの外科切除後、および／または原発上皮腫瘍の化学療法または放射線治療後に、腫瘍細胞全てが身体から排除されない場合もあり得る。しかし、これらの残存腫瘍細胞は患者において再発性癌、すなわち、局所再発および／または転移を引き起こす可能性がある。転移はよく見られる癌の合併症であるが、癌細胞が原発腫瘍から播種されて遠位のコロニーを形成する過程ははあまり分かっていない。転移性癌は、ほぼ例外なく難治性で新しい治療方法の必要性が生じる。本発明の医薬組成物を用いると、これらの播種された腫瘍細胞を死滅させて二次性腫瘍（一次治療後に身体に残存する腫瘍細胞から生じる）の形成を予防することができる。このように、本医薬組成物は、腫瘍患者において局所再発および／または転移の形成を予防するために役立つ。
【００８１】
抗腫瘍治療の成功は、それぞれの疾病について、例えばコンピュータ断層撮影、Ｘ線、核磁気共鳴断層撮影（例えば、米国国立癌研究所の判定基準に基づく応答評価（Cheson (1999), J. Clin. Oncol.; 17 (4):1244））、陽電子放射断層撮影走査、内視鏡検査、蛍光活性化セルソーター、骨髄の吸引、胸水または腹水、組織／組織学、および様々な上皮腫瘍特異的臨床化学パラメータ（例えば血清中の可溶性ＣＥＡ濃度）により確立された標準的な方法でモニターすることができ、さらに、その他の確立された標準的な方法を用いてよい。さらに、Ｔ細胞の活性化を測定するアッセイを用いてよい；例えば、ＷＯ  ９９／０５４４４０号を参照。治療しなかった腫瘍患者と比較して、治療した腫瘍患者の全体的な生存、進行のない生存または再発のない生存の決定のために統計学を用いてもよい。
【００８２】
好ましくは、前記上皮腫瘍は、胃腸腺癌、乳腺腺癌または肺腺癌である。前記胃腸腺癌は、より好ましくは、結腸直腸腺癌、膵臓腺癌、食道腺癌または胃腺癌である。
【００８３】
さらにより好ましくは、前記本発明の医薬組成物は、進行性腫瘍、後期腫瘍、腫瘍量の多い腫瘍患者、転移性腫瘍、またはＣＥＡ血清中濃度が１００ｎｇ／ｍｌより高い腫瘍患者の治療のためのものである（例えばＥＬＩＳＡにより測定され得る）。
【００８４】
本発明の使用または方法のもう１つの好ましい実施形態では、上記に定義される前記医薬組成物は、さらなる薬剤と組み合わせて、すなわち、併用療法の一部として投与されるのに適している。
【００８５】
特定の実施形態では、本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体または医薬組成物は、１またはそれ以上のその他の治療法と組み合わせて投与される。特定の実施形態では、本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体または医薬組成物は、１またはそれ以上のその他の治療法と同時に患者に投与される。そのような治療法は上皮性腫瘍の治療に有用であることが好ましい。用語「同時に」は、医薬組成物または治療薬を全く同時に投与することに限定するのではなく、むしろ、本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体または医薬組成物とその他の薬剤が、患者に順番に投与されること、及び本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体または医薬組成物が他の薬剤と一緒に作用して、別の方法で投与された場合よりも増大した利益をもたらすことのできるような間隔で投与されることを意味する。例えば、それぞれの治療薬は同時にまたは任意の順序で異なる時点に順次投与されてよい；しかし、同時に投与されない場合、それらは所望の治療効果を得るために時間的に十分に接近して投与されるべきである。
【００８６】
それぞれの治療薬は、任意の適当な形態で、任意の適した経路から別々に投与することができる。他の実施形態では、本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体または医薬組成物は、外科的手術の前に、同時に、または後に投与される。該外科的手術は局在した上皮性腫瘍を完全に除去するか、または大きな上皮性腫瘍のサイズを縮小させることが好ましい。外科的手術はまた、予防的手段としてなされるか、または疼痛を軽減するためになされてよい。
【００８７】
本明細書において提供される投薬量および投与の頻度は、上に定義される「治療上有効な」という用語に包含される。投薬量および頻度は、一般に、投与される特定の治療薬または予防薬、上皮性腫瘍の重篤度および種類、投与経路、ならびに患者の年齢、体重、応答、および過去の病歴に依存する各患者についての特異的な因子に従ってさらに変動する。当業者は、そのような因子を考慮すること、および、例えば、文献に報告され、Physicians' Desk Reference (59th ed., 2005) で推奨されている投薬量に従うことにより、適した投与計画を選択することができる。
【００８８】
一部の実施形態では、本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体または医薬組成物の投与による治療法は、１またはそれ以上の治療法、例えば化学療法、放射線療法、ホルモン療法、および／または生物学的療法／免疫療法の投与と組み合わされる。治療薬としては、限定されるものではないが、タンパク質性分子（限定されるものではないが、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質（翻訳後修飾されたタンパク質、抗体などを含む）を含む）；または小分子（１０００ダルトン未満）、無機もしくは有機化合物；または核酸分子（二本鎖もしくは一本鎖ＤＮＡ、または二本鎖もしくは一本鎖ＲＮＡ、ならびに三重らせん核酸分子を含む）が挙げられる。治療薬は、任意の既知生物（限定されるものではないが、動物、植物、細菌、真菌、および原生生物、またはウイルスを含む）に由来するか、または合成分子ライブラリーに由来してよい。
【００８９】
特定の実施形態では、本発明の方法および使用は、キナーゼ、例えば当分野に記載されるゲフィチニブ（イレッサ）、エルロチニブ（タルセバ）、抗ＥＧＦＲ抗体（例えば、セツキシマブ；エルビタックス）、または抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体（例えば、トラスツズマブ；ハーセプチン）の阻害剤である１またはそれ以上の治療薬の投与と組み合わせた、本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体または医薬組成物の投与を包含する；例えば、Hardie and Hanks (1995) The Protein Kinase Facts Book, I and II, Academic Press, San Diego, California 参照。
【００９０】
別の特定の実施形態では、本発明の方法および使用は、血管形成阻害剤、例えば当分野に記載される、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ベバシズマブ；アバスチン）、小分子化合物（例えば、バタラニブもしくはソラフェニブ）またはＣＯＸ阻害剤である、１またはそれ以上の治療薬の投与と組み合わせた、本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体または医薬組成物の投与を包含する。
【００９１】
別の特定の実施形態では、本発明の方法および使用は、抗癌剤、例えば当分野に記載される、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、カペシタビン、オキサリプラチン、イリノテカン、ゲムシタビン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、シスプラチン、カルボプラチン、タキサン類（例えば、ドセタキセル、パクリタキセル）である、１またはそれ以上の治療薬の投与と組み合わせた、本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体または医薬組成物の投与を包含する。
【００９２】
本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体または医薬組成物をさらなる治療薬と組み合わせて用いる上皮性腫瘍患者の併用療法は、相乗作用をもたらすことが好ましい。本明細書において、用語「相乗的な」とは、任意の２またはそれ以上の単一の治療法（例えば、１またはそれ以上の治療薬）の付加的効果よりも効果的な、治療法の組み合わせ（例えば、上に説明される、本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体とさらなる治療薬の組み合わせ）を指す。例えば、本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体は、単一療法として患者に投与される場合、２０％の上皮性腫瘍の直径の縮小をもたらすことができる。その一方、第２の治療薬、例えば、下に定義される抗癌剤は、腫瘍を１０％縮小させることができる。しかし、本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体と前記第２の治療薬の両方を併用療法の形態で組み合わせて投与する場合、５０％の腫瘍の縮小を観察することができる。
【００９３】
治療法の組み合わせ（例えば、上に説明される、本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体と、さらなる治療薬の組み合わせ）の相乗作用により、低投薬量の１またはそれ以上の治療法（例えば、１またはそれ以上の治療薬）の使用および／または疾患、例えば、上皮性腫瘍のある患者へ前記治療法の低頻度の投与が可能となる。低い投薬量の治療法（例えば、治療薬）を用いることができ、かつ／または前記治療法を低頻度で投与することができると、疾患（例えば上皮性腫瘍）の予防または治療において前記治療法の効力を低下させることなく、前記治療法の被験体への投与に関連する毒性が低減される。さらに、相乗作用は、上皮性腫瘍（ＣＥＡの異常な発現（例えば、過剰発現）または活性を伴う可能性がある）の予防、管理、治療および／または寛解において、治療法（例えば、治療薬）の改善された有効性をもたらし得る。最後に、治療法（例えば、治療薬）の組み合わせの相乗作用は、任意の単一療法の使用に関連する、有害なまたは望ましくない副作用を回避または減少させることができる。
【００９４】
前記併用療法において、活性薬剤は場合により本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体と同じ医薬組成物に含まれても、別個の医薬組成物に含まれてもよい。この後者の場合、前記別個の医薬組成物は、本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体を含む前記医薬組成物投与よりも前に、同時に、または後に、投与されるのに適している。さらなる薬剤または医薬組成物は、非タンパク質性化合物もしくはタンパク質性化合物であり得る。さらなる薬剤がタンパク質性化合物である場合、該タンパク質性化合物は免疫エフェクター細胞の活性化シグナルを提供できることが有利である。
【００９５】
好ましくは、前記タンパク質性化合物または非タンパク質性化合物は、同時にまたは非同時に、上記において定義される二重特異性一本鎖抗体、上記において定義される核酸分子、上記において定義されるベクター、または上記において定義される宿主とともに投与されてよい。好ましくは、処置されるべき前記被験体は、ヒトである。
【００９６】
さらなる実施形態では、本明細書において定義される一本鎖二重特異性抗体または抗ＣＥＡ  ｓｃＦｖは、診断用または検出可能な薬剤と複合体化され得る。そのような診断および検出は、抗体またはｓｃＦｖを、検出可能な物質、例えば様々な酵素類、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼ；補欠分子族、例えばストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチン；蛍光物質、例えば、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリン；発光物質、例えば、ルミノール；生物発光物質、例えば、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリン；放射性物質および同位元素、例えばコバルト（５７Ｃｏ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、またはイットリウム（９０Ｙ）、様々な陽電子放出断層撮影を用いる陽電子放出金属、および非放射性常磁性金属イオンと結合させることにより達成することができる。
【００９７】
部分と抗体を複合体化するための技法は周知である。部分は、当分野で公知の任意の方法により抗体と複合体化させることができ、それには、限定されるものではないが、アルデヒド／シッフ結合、スルフヒドリル結合、酸に不安定な結合、シス−アコニチル結合、ヒドラゾン結合、酵素分解可能な結合が含まれる；一般に、 Garnett, 2002, Adv. Drug Deliv. Rev. 53:171-216 参照。部分と抗体を複合体化するためのさらなる技法は当分野で周知である、例えば、Arnon et al., Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy. In Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. （eds.）, pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)参照。抗体とポリペプチド部分を融合または複合体化させるための方法は当分野で公知である；例えば、Ashkenazi et al., 1991, PNAS 88: 10535-10539 参照。抗体と部分の融合は必ずしも直接的である必要はなく、リンカー配列によって生じるものであってよい。そのようなリンカー分子は一般に当分野で公知であり、Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4:2483-90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10:553 に記載されている。
【００９８】
さらなる態様において、本発明は、上記に定義される二重特異性一本鎖抗体、上記に定義される核酸分子、上記に定義されるベクター、または上記に定義される宿主を含むキットに関する。
【００９９】
これらのおよびその他の実施形態は、本発明の説明および実施例に開示され、包含される。免疫学分野の組換え技術および方法は、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition 2001; Lefkovits; Immunology Methods Manual;The Comprehensive Sourcebook of Techniques;Academic Press, 1997; Golemis; Protein-Protein Interactions: A Molecular Cloning Manual;Cold Spring Laboratory Press, 2002に記載されている。本発明に従って用いられ得る抗体、方法、用途および化合物のいずれかに関するさらなる参照文献は、例えば電子装置を用いて公開されているライブラリーおよびデータベースから得ることができる。例えば、インターネットで利用可能な公開データベース「Ｍｅｄｌｉｎｅ」を、例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｑｏｖ／ＰｕｂＭｅｄ／ｍｅｄｌｉｎｅ．ｈｔｍｌで利用してよい。さらなるデータベースおよびアドレス、例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｍ．ｎｉｈ．ｑｏｖ／、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｆｏｂｉｏａｅｎ．ｆｒ／、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｍｉ．ｃｈ／ｂｉｏｌｏｑｖ／ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｑｒ．ｏｒＱ／が当業者に公知であり、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｖｃｏｓ．ｃｏｍを用いて得ることもできる。腫瘍関連の話題は、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｈ．ｇｏｖまたはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｋｆｚ．ｄｅを参照のこと。
【実施例】
【０１００】
以下の実施例は本発明を説明する。
【０１０１】
実施例１：ヒトＣＥＡ（癌胎児性抗原関連細胞接着分子５；ＣＥＡＣＡＭ５）がトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の作製
ＣＥＡ陽性ＫａｔｏＩＩＩ細胞（ヒト胃癌腫細胞株；ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１０３）を用いて全ＲＮＡを得、それをキットマニュアルの説明書（Ｑｉａｇｅｎ、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ）に従って単離した。得られたＲＮＡを、ランダムに開始される逆転写によるｃＤＮＡ合成に用いた。ＣＥＡ抗原の全長配列のクローニングのため、以下のオリゴヌクレオチドを用いた。５’ＣＥＡＣＡＭ５  ＥｃｏＲＩ  ＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＣＴＣＣＣＴＣＧＧＣＣＣＣ（配列番号７４）および３’ＣＥＡＣＡＭ５  Ｓａｌ  Ｉ  ＧＴＣＧＡＣＣＴＡＴＡＴＣＡＧＡＧＣＡＡＣＣＣＣ（配列番号７５）。ＰＣＲ（第１サイクルに関して、９３℃にて５分間の変性、５８℃にて１分間のアニーリング、７２℃にて１分間の伸張；９３℃にて１分間の変性、５８℃にて１分間のアニーリング、７２℃にて１分間の伸張を３０サイクル；７２℃にて５分間の末端伸張）を用いてコード配列を増幅した。その後、ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化し、適切に消化した発現ベクターｐＥＦ−ＤＨＦＲに連結し、大腸菌に形質転換した。単離したプラスミドＤＮＡを配列決定し、確立されたＣＥＡＣＡＭ５の核酸配列（米国国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for biotechnology information）のＮＭ＿００４３６３、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）と比較した。標準的なプロトコールに従って、上述の手順を実行した（Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (1989；2001)。確認された核酸配列を含むクローンを、構築物の真核生物における発現のためにＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞における真核生物タンパク質発現を、Kaufmannに記載のとおり行った（Kaufmann R.J., Methods Enzymol. 185 (1990), 537-566）。構築物の遺伝子増幅を、最大２０ｎＭ ＭＴＸの終濃度までの、漸増濃度のＭＴＸにより誘導した。次に、トランスフェクトした細胞を、ＦＡＣＳアッセイを用いてＣＥＡ抗原の発現について試験した。その目的のため、２．５×１０5のトランスフェクト細胞を、濃度５μｇ／ｍｌのマウスモノクローナル抗体ＣＯＬ−１（Ｎｏ．ＭＳ−６１３−Ｐ１ＡＢＸ，Ｎｅｏｍａｋｅｒｓ；Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ，ＵＳＡ）とともにインキュベートした。５０μｌ ＰＢＳ中２％ ＦＣＳ（Ｄｉａｎｏｖａ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙより入手）を用いて１：１００で希釈した、Ｒ−フィコエリトリン結合アフィニティー精製Ｆ（ａｂ’）２断片、ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ−γ断片特異的抗体を用いて、抗体の結合を検出した。細胞を、ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）でフローサイトメトリーにより分析した。ＦＡＣＳ染色および蛍光強度の測定を、Current Protocols in Immunology （Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach and Strober, Wiley-Interscience, 2002）に記載のとおり行った。結果として、形質転換体は、ヒトＣＥＡ抗原について明らかな陽性染色を実証した。
【０１０２】
実施例２：ＣＥＡｘＣＤ３二重特異性一本鎖抗体の生成
一般に、それぞれヒトＣＥＡ抗原に対して結合特異性を有するドメインを含む二重特異性一本鎖抗体分子、ならびに配列番号７７に示されるヒトＣＤ３抗原に対して結合特異性を持つ脱免疫化されたドメインを、表１に提示されるように設計した。このＣＤ３結合ドメイン中のＶ領域の配置は常にＶＨ−ＶＬである。本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体において用いられる、この脱免疫化された抗ＣＤ３結合ドメインは、例えば、ＷＯ  ２００５／０４０２２０号において既に記載されている。
【０１０３】
１．抗ＣＥＡ特異性および抗ＣＤ３特異性を含む二重特異性一本鎖抗体分子の形式（表１）
【表１】
0005399712.tif 000002
0005399712.tif 000003
【０１０４】
モノクローナル抗体若しくはハイブリドーマに由来するか、またはファージディスプレイ誘導選択（ＰＤＧＳ）により得た、ヒトＣＥＡ抗原に特異的な可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）領域を含有する前述の構築物は、遺伝子合成およびその後の、ＣＤ３に特異的なＶＨとＶＬの組み合わせを含む発現ベクターへのクローニングにより得た。前記二重特異性一本鎖構築物の作製はまた、例えば、Sambrook（前掲）に記載の組換え技術に従っても行うことができる。そのための詳細な指示は、例えば、ＷＯ  ９９／０５４４４０号に規定されている。
【０１０５】
抗ＣＤ３結合ドメインは、ヒトＣＤ３抗原に対する結合特異性を有する脱免疫化されたドメインに相当する。本明細書に記載される二重特異性一本鎖構築物中の脱免疫化された抗ＣＤ３結合ドメインのＶ領域の配置は、常にＶＨ−ＶＬである。対応する前記ＶＨ−ＶＬドメインのアミノ酸配列は配列番号７７に示される。ヒト癌胎児性抗原に特異的なＣＥＡＩ、ＣＥＡＩＩおよびＣＥＡＩＩＩは、それぞれ、ｍＡｂ  Ａ５Ｂ７（Chester, K. A. et al., Int J Cancer 57 (1994), 67-72）、Ｔ８４.６６（Neumaier, M. et al., Cancer Res 50 (1990), 2128-34）およびＭＦＥ−２３（Boehm, M. K. Biochem J 2 (2000), 519-28）に由来する可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）領域を含む。Ａ５、Ｂ９、Ｄ８、およびＥ１２は、ヒトＣＥＡに特異的なヒトＶＨ領域であり、一方、Ａ２４０は同じ特異性を有するヒトＶＬ領域である。ヒトＡ５、Ｂ９、Ｄ８、Ｅ１２およびＡ２４０Ｖ領域の作製は、実施例６および７に詳細に記載されている。本明細書に記載されるすべての二重特異性一本鎖抗体の対応するヌクレオチドおよびアミノ酸配列はリストする配列に示される。
【０１０６】
以下では、ＣＥＡＩ  ＶＬＶＨｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号６）構築物の作製がさらに詳細に説明される。上に言及されるその他の構築物の作製は、十分当業者の範囲内である方法に必要な改変を施して適宜に行うことができる。前述のＣＥＡＩ特異性および脱免疫化された抗ＣＤ３（配列番号７７）特異性を含む二重特異性一本鎖抗体分子を作製するため、最初に、標準的なプロトコールに従う遺伝子合成により得たＣＥＡＩの可変領域をＰＣＲにより改変して相当する一本鎖Ｆｖ抗体フラグメントを得る必要があった。本目的のため、２段階の融合ＰＣＲを用いて可変領域をコードする配列を増幅させた。一組の適切なプライマーを設計してＰＣＲに基づくクローニング段階を行い、最後に、その結果として、１５アミノ酸リンカー（［Ｇｌｙ4Ｓｅｒ］3）をＶＬ−リンカー−ＶＨの順序で含む２つの可変ドメインを連結している一本鎖抗体がもたらされた。
【０１０７】
要するに、以下のプライマーの組み合わせを用いた。
【表２】
0005399712.tif 000004
【０１０８】
オリゴヌクレオチドプライマーの核酸配列を下に示す。
５’ＣＥＡＩ  ＬＨ：５'ＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＴＣＣＧＡＣＡＴＴＧＡＧＣＴＣＡＣＣＣＡＧ３’（配列番号１３７）
３’ＣＥＡＩ  ＶＬリンカー：５'ＧＧＡＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＴＴＴＧＡＴＣＴＣＧＡＧＣＴＴＧＧ３'（配列番号１３８）
５’ＣＥＡＩ  ＶＨリンカー：５'ＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＣＡＧＧＴＣＣＡＡＣＴＧＣＡＧＧＡＧ３'（配列番号１３９）
３’ＣＥＡＩ  ＬＨ：５’ＡＡＴＣＣＧＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＧ３'（配列番号１４０）
【０１０９】
一本鎖抗体を作製するため、上記のそれぞれのプライマーの組み合わせで２回のＰＣＲをＰＣＲ段階１および２として行った。このＰＣＲの間、重複する相補的配列を（それぞれのリンカープライマーから生じる）ＰＣＲ生成物に導入し、それは一体となって(combined)その後の融合ＰＣＲの間に１５アミノ酸リンカーのコード配列を形成した。その後、増幅したＶＨおよびＶＬドメインを、外側のプライマーのみと両方のＰＣＲ生成物を必要とする、この融合ＰＣＲ中で結合させた。得られるｓｃＦｖ抗体は、５’末端でＢｓｒＧＩの制限酵素認識部位に隣接し、３’末端でＢｓｐＥＩの制限酵素認識部位に隣接している。ＷＯ  ２００５／０４０２２０号に記載されるようにマウス免疫グロブリンリーダーペプチドのコード配列とのインフレーム融合を可能にするために、ＢｓｒＧＩ部位の付加を行った。二重特異性一本鎖抗体を作製するためのＣＤ３特異的一本鎖抗体をコードする配列とのインフレーム融合を可能にするために、ＢｓｐＥＩ部位を作製した。一本鎖Ｆｖ抗体の融合を達成するため、かつ真核生物の発現を可能にするため、ＣＥＡ特異的一本鎖Ｆｖ抗体のコード配列は、ＢｓｒＧＩおよびＢｓｐＥＩを介して、ＷＯ  ２００５／０４０２２０号に記載されるように脱免疫化された抗ＣＤ３一本鎖Ｆｖ抗体（本発明において配列番号７７と称される）を含有するｐＥＦＤＨＦＲ発現ベクターにクローン化された（ｐＥＦＤＨＦＲは、Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025 に記載されている）。構築物の単一のクローンを単離し、標準的なプロトコールに従って発現ベクター中で隣接領域と相補的なプライマーを用いて配列決定した（Sambrock, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbour laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (1989)）。さらなる実験のため、検証された核酸配列を含む構築物のクローンが選択された。
【０１１０】
２．ＣＥＡｘＣＤ３二重特異性一本鎖抗体の発現および精製
二重特異性一本鎖抗体をチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現させた。ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞における真核生物タンパク質発現を、Kaufmann（前掲）に記載のとおり行った。構築物の遺伝子増幅は漸増濃度のＭＴＸにより２０ｎＭ ＭＴＸまでの終濃度まで誘導した。静置培養の二代継代後、細胞をＣＨＯ改変ＤＭＥＭ培地（ＨｉＱ（登録商標）、ＨｉＣｌｏｎｅ）を含むローラーボトル中で７日間増殖させた後、回収した。細胞を遠心分離により取り除き、発現タンパク質を含有する上清を−２０℃で保存した。
【０１１１】
Ａｋｔａ（登録商標）ＦＰＬＣシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）およびＵｎｉｃｏｒｎ（登録商標）ソフトウェアをクロマトグラフィーに使用した。全ての化学物質は研究等級のものであり、Ｓｉｇｍａ社（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ）またはＭｅｒｃｋ社（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）より購入した。固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（「ＩＭＡＣ」）を、製造業者の提供するプロトコールに従って、ＺｎＣｌ2を装填したＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）カラム（Ｍｅｒｃｋ）を用いて行った。カラムをバッファーＡ２（２０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．５、０．４Ｍ ＮａＣｌ）で平衡化し、細胞培養上清（５００ｍｌ）を３ｍｌ／分の流速にてカラム（１０ｍｌ）に適用した。カラムをバッファーＡ２で洗浄して結合しなかったサンプルを取り除いた。結合したタンパク質は、２段階勾配のバッファーＢ２（２０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．５、０．４Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ イミダゾール）を用いて、以下に従って溶出した。
段階１：６カラム容積中バッファーＢ２  ２０％；
段階２：６カラム容積中バッファーＢ２  １００％。
【０１１２】
段階２からの溶出したタンパク質画分を、さらなる精製のためにプールした。ゲルろ過クロマトグラフィーを、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｓ２００  ＨｉＰｒｅｐカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で行った。溶出したタンパク質サンプル（流速１ｍｌ／分）を、検出のため、標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットに付した。精製より前に、カラムを分子量決定のために較正した（分子量マーカーキット、Ｓｉｇｍａ  ＭＷ  ＧＦ−２００）。プロテインアッセイ染料（ＭｉｃｒｏＢＣＡ、Ｐｉｅｒｃｅ）およびＩｇＧ（Ｂｉｏｒａｄ）を標準タンパク質として用いて、タンパク質濃度を測定した。
【０１１３】
ＣＥＡｘＣＤ３二重特異性一本鎖抗体を、ＩＭＡＣの２段階精製プロセスおよびゲルろ過で単離した。主生成物の分子量は、未変性条件下でＰＢＳでのゲルろ過により測定して約５２ｋＤａであった。この分子量は二重特異性一本鎖抗体に一致する。全ての構築物がこの方法に従って精製された。
【０１１４】
精製された二重特異性一本鎖抗体タンパク質を、還元条件下で事前成形された４〜１２％ Ｂｉｓ  Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で行われたＳＤＳ  ＰＡＧＥで分析した。製造業者の提供するプロトコールに従ってサンプルの調製および適用を行った。ＭｕｌｔｉＭａｒｋタンパク質標準品（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて分子量を測定した。コロイドクマシーでゲルを染色した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎプロトコール）。単離したタンパク質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定して＞９５％であった。Ｏｐｔｉｔｒａｎ（登録商標）ＢＡ−Ｓ８３膜およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎブロットモジュールを製造業者の提供するプロトコールに従って用いてウエスタンブロットを行った。使用した抗体は、基質としてＨｉｓタグ（Ｐｅｎｔａ  Ｈｉｓ、Ｑｉａｇｅｎ）およびアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）で標識したヤギ抗マウスＩｇ（Ｓｉｇｍａ）、およびＢＣＩＰ／ＮＢＴ（Ｓｉｇｍａ）に対して指向された。二重特異性一本鎖抗体は、ウエスタンブロットにより特異的に検出することができた。精製した二重特異性一本鎖抗体分子に対応する５２ｋＤで単一のバンドが検出された。
【０１１５】
３．ＣＥＡｘＣＤ３二重特異性一本鎖抗体のフローサイトメトリー結合分析
膜結合ヒトＣＥＡおよびヒトＣＤ３との結合能に関して構築物の官能性を試験するため、ＦＡＣＳ分析を行った。本目的のため、ヒトＣＥＡトランスフェクトＣＨＯ細胞とＣＤ３陽性ヒトＴ細胞白血病細胞株ＨＰＢ−ＡＩＩ（ＤＳＭＺ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，ＡＣＣ４８３）を使用した。２００，０００個のＣＥＡ陽性ＣＨＯ細胞または２００，０００個のＨＰＢ−ＡＩＩ細胞を、氷上で３０分間、異なる配置のＣＥＡおよびＣＤ３のＶＨおよびＶＬ領域（上記の通り）を含む二重特異性抗体をそれぞれ発現しているＣＨＯ細胞培養の純粋な細胞上清５０μｌとともにインキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、構築物の結合を、構築物のＣ末端のヒスチジンタグを介して細胞と結合した構築物と特異的に結合する、標識されていないマウスＰｅｎｔａ  Ｈｉｓ抗体（２％ ＦＣＳを含む５０μｌ ＰＢＳに１：２０で希釈；Ｑｉａｇｅｎ）を用いて検出した。洗浄段階の後に、結合していないマウスＰｅｎｔａ  Ｈｉｓ抗体を取り除いた。結合した抗Ｈｉｓ抗体を、フィコエリトリンと複合体化し、２％ ＦＣＳを含む５０μｌ ＰＢＳに１：１００で希釈されたＦｃγ特異的抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）を用いて検出した。ヒトＣＥＡとの結合の陽性対照として、モノクローナル抗体Ｃｏｌ−１（実施例３参照）を用いた。ヒトＣＤ３との結合の対照には、ＷＯ  ９９／０５４４４０号に記載のＣＤ１９ｘＣＤ３二重特異性一本鎖構築物を使用した。陰性対照として、培養上清の代わりに新鮮な培地を用いた。
【０１１６】
細胞をフローサイトメトリーで分析した（ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ,Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）。ＦＡＣＳ染色および蛍光強度の測定を、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach and Strober, Wiley-lnterscience, 2002）に記載のとおり行った。
【０１１７】
図１に示されるように、二重特異性一本鎖抗体の数個のドメイン配置、すなわち、ＣＥＡＩ  ＶＨＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号８）、ＣＥＡＩ  ＶＬＶＨｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号６）、ＣＥＡＩＩ  ＶＨＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号１０）、ＣＥＡＩＩＩ  ＶＬＶＨｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号１２）およびＣＥＡＩＩＩ  ＶＨＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号１４）は、ヒト膜結合ＣＥＡおよびヒトＣＤ３と結合した。陰性対照として、培地ならびに１．および２．検出抗体を使用した。
【０１１８】
実施例３：ＣＥＡｘＣＤ３二重特異性一本鎖抗体と可溶性ヒトＣＥＡの結合
可溶性ヒトＣＥＡに対する特異性を決定するため、様々なＣＥＡｘＣＤ３二重特異性一本鎖抗体をＥＬＩＳＡで試験した。
【０１１９】
本目的のため、可溶性ヒトＣＥＡ抗原を最初にビオチン化した。ビオチン化は、５％ ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳ中、１５倍モル過剰のＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ  ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）とともに、１時間室温にてサンプルミキサー（Ｄｙｎａｌ）中で達成した。遊離ビオチンとビオチン化ＣＥＡ抗原を分離するため、アッセイを標準的なプロトコールに従ってＰＢＳに対して過剰に透析した。保持された、ビオチン標識ＣＥＡの生物活性をＥＬＩＳＡ結合実験で確認した。
【０１２０】
可溶性ヒトＣＥＡに対するＣＥＡｘＣＤ３二重特異性一本鎖抗体の特異性を測定するための直接ＥＬＩＳＡを、標準的な手順に従って行った。要するに、５０μｌ／ウェルのＰＢＳまたは可溶性ビオチン化ヒトＣＥＡ（Ａｂｃａｍ；１ｘＰＢＳ中５μｇ／ｍｌ）を、４℃にて約１６時間インキュベートすることにより９６ウェルストレプトアビジンコートＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）上に固定化した。ウェルあたり２００μｌの水で洗浄した後、２００μｌのブロッキング溶液（ＰＢＳ／３％ ＢＳＡ）を添加した。室温にて１時間ブロッキングした後、ブロッキング溶液を除去した。その後の洗浄段階（２００μｌ／ウェルの１ｘＰＢＳ／０.０５％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ２０）およびインキュベーション段階はすべて室温にて行った。１回洗浄した後、ＣＥＡＩ  ＶＨＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号８；ｍＡｂ  Ａ５Ｂ７に由来する抗ＣＥＡ部分）、ＣＥＡＩＩ  ＶＨＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号１０；ｍＡｂ  Ｔ８４．６６に由来する抗ＣＥＡ部分）、およびＣＥＡＩＩＩ  ＶＨＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号１４；ｍＡｂ  ＭＦＥ−２３に由来する抗ＣＥＡ部分）二重特異性一本鎖抗体と、マウスモノクローナル抗体ＣＥＡ／ＣＤ６６  Ａｂ−３（Ｃｏｌ−１；Ｄｕｎｎ）を異なる濃度（１ｘＰＢＳ中０．５μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌ；５０μｌ／ウェル）中で１時間インキュベートした。１ｘＰＢＳ（５０μｌ／ウェル）を非特異的結合の対照として添加した。３回の洗浄段階の後、５０μｌ／ウェルのＰｅｎｔａ−Ｈｉｓ  ＩｇＧ（Ｑｉａｇｅｎ；１ｘＰＢＳ中２μｇ／ｍｌ）をＨｉｓ−タグ二重特異性一本鎖抗体の検出のために添加した。その後、ウェルを３回洗浄し、５０μｌの西洋ワサビペルオキシダーゼ標識されたヤギ抗マウスＦｃγ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｅＲｅｓｅａｒｃｈ；１ｘＰＢＳ中１:１０００）とともに１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ＥＬＩＳＡはＡＢＴＳ基質溶液（Ｒｏｃｈｅ）を添加することにより発色（develop）させ、４０５ｎｍの波長で吸光度を測定した。
【０１２１】
図２は、ＥＬＩＳＡで検出された様々な二重特異性一本鎖抗体の吸光度を示す。ＣＥＡＩ  ＶＨＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号８；ｍＡｂ  Ａ５Ｂ７に由来する抗ＣＥＡ部分）、ＣＥＡＩＩ  ＶＨＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号１０；ｍＡｂ  Ｔ８４．６６に由来する抗ＣＥＡ部分）、およびＣＥＡＩＩＩ  ＶＨＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号１４；ｍＡｂ  ＭＦＥ−２３に由来する抗ＣＥＡ部分）二重特異性一本鎖抗体と、マウスモノクローナル抗体Ｃｏｌ−１は、可溶性ヒトＣＥＡと特異的に結合した。ＣＥＡ抗原の不在下（ＰＢＳ対照）で、結合シグナルは観察されなかった。要約すると、ｍＡｂ  Ａ５Ｂ７、Ｔ８４．６６およびＭＦＥ−２３に由来する抗ＣＥＡ結合ドメインは、可溶性および膜結合ＣＥＡの両方と結合する。
【０１２２】
実施例４：ＣＥＡｘＣＤ３二重特異性一本鎖抗体の生物活性
作製したＣＥＡｘＣＤ３二重特異性一本鎖抗体の生物活性を、標的細胞としてヒト胃癌細胞株ＫａｔｏＩＩＩまたはヒトＣＥＡトランスフェクトＣＨＯ細胞、およびエフェクター細胞として刺激を受けたヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞または未変性のＰＢＭＣをそれぞれ用いるインビトロクロム放出細胞障害性アッセイにより分析した。
【０１２３】
刺激を受けたＣＤ８＋Ｔ細胞の作製は、以下の通り行った。
ペトリ皿（直径１４５ｍｍ、ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ）を抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３  Ｊａｎｓｓｅｎ−Ｃｉｌａｇ  ＧｍｂＨ，Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ１ｍｇ／ｍｌ；終濃度１μｇ／ｍｌ）および抗ＣＤ２８抗体（ＢＤ、１ｍｇ／ｍｌ；終濃度１μｇ／ｍｌ）で３７℃にて１時間プレコートした。インキュベーション時間の後、結合しなかったタンパク質をＰＢＳでの１回の洗浄段階により除去した。新鮮なＰＢＭＣを、標準的なプロトコールに従ってフィコール勾配遠心分離により末梢血（３０〜５０ｍｌ）から単離した。３〜５×１０7ＰＢＭＣを、１５０ｍｌ ＲＰＭＩ１６４０／１０％ ＦＣＳ／ＩＬ−２ ２０Ｕ／ｍｌ（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ，Ｃｈｉｒｏｎ）中のプレコートしたペトリ皿に添加し、２日間刺激した。３日目に細胞を回収し、ＲＰＭＩ１６４０で１回洗浄し、大きなＴフラスコに移した。ＩＬ−２を２０Ｕ／ｍｌの終濃度に添加し、再び１日間培養した。マニュアルの指示に従ってＣＤ８陰性単離キット（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用してＣＤ８＋ＣＴＬを単離した。未変性のＰＢＭＣは、フィコール勾配遠心分離の後に刺激手順を踏まずに直接用いた。標的細胞をＰＢＳで２回洗浄し、５０％ＦＣＳを含む最終容量１００μｌのＲＰＭＩ中で３７℃にて４５分間、１１．１ＭＢｑ51Ｃｒで標識した。その後、標識した標的細胞を５ｍｌのＲＰＭＩで３回洗浄し、次に細胞障害性アッセイで使用した。アッセイは、Ｅ：Ｔ比が１０：１（１ウェルあたり５０００個の標的細胞および５００００個のエフェクター細胞に相当）のＲＰＭＩ（上記の通り）を補給した９６丸底プレートにおいて総量２５０μｌで行った。構築物の評価のため、アッセイ容量中出発濃度１μｇ／ｍｌの二重特異性一本鎖分子および１２個のその三倍希釈液を用いた。アッセイ時間は１８時間であり、細胞障害性は、最大溶解（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘの添加）および自発的溶解（エフェクター細胞なし）の差に関連した、上清中に放出されたクロムの相対値として測定された。全ての測定は三つ組みで行われた。上清中のクロム活性の測定は、Ｗｉｚａｒｄ３ガンマカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＧｍｂＨ，Ｋｏｌｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で行った。実験データの分析は、Ｐｒｉｓｍ４  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）（バージョン４．０２、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて行った。シグモイド型用量応答曲線は、一般に、ソフトウェアで測定してＲ2値が＞０．９０である。分析プログラムにより計算されるＥＣ50値を生物活性の比較に用いた。
【０１２４】
図３は、様々なドメイン配置、すなわち、配列番号７７ＶＨＶＬｘＣＥＡＩ  ＶＨＶＬ（配列番号４）および配列番号７７ＶＨＶＬｘＣＥＡＩ  ＶＬＶＨ（配列番号２）（両構築物はＮ末端に抗ＣＤ３部分を含む）、ならびにＣＥＡＩ  ＶＬＶＨｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号６）およびＣＥＡＩ  ＶＨＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号８）（Ｃ末端に抗ＣＤ３を含む）についてのヒトＣＥＡトランスフェクト標的細胞（ＣＨＯ−ＣＥＡ+細胞）に対する細胞障害活性を示す。非トランスフェクトＣＨＯ細胞（ヒトＣＥＡを欠く）を陰性対照として用いた。
【０１２５】
図４では、ＣＥＡＩ  ＶＨＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号８）、ＣＥＡＩＩＩ  ＶＬＶＨｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号１２）、ＣＥＡＩＩＩ  ＶＨＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号１４）、およびＣＥＡＩＩ  ＶＨＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号１０）は、ヒトＣＥＡトランスフェクトＣＨＯ細胞に対する細胞障害活性を提示した。非トランスフェクトＣＨＯ細胞（ヒトＣＥＡを欠く）を陰性対照として用いた。上に述べたように、ＣＥＡＩは、マウスｍＡｂ  Ａ５Ｂ７に由来する可変領域を意味し、ＣＥＡＩＩは、マウスｍＡｂ  Ｔ８４.６６に由来する可変領域であり、ＣＥＡＩＩＩは、マウスｍＡｂ  ＭＦＥ−２３由来の可変領域を指す。
【０１２６】
要約すると、試験した構築物はすべて、可溶性ヒトＣＥＡの不在下で、（ヒト）ＣＥＡ発現ＫａｔｏＩＩＩおよびヒトＣＥＡトランスフェクトＣＨＯ細胞に対する細胞障害活性を示した。
【０１２７】
実施例５：可溶性ＣＥＡ抗原の存在下で特異的なＣＥＡｘＣＤ３二重特異性一本鎖抗体の生物活性
競合アッセイを、次の例外：ＣＥＡｘＣＤ３二重特異性一本鎖抗体の生物活性を様々な濃度の可溶性ヒトＣＥＡ抗原の存在下で試験する、を除いて実施例４に記載のとおり行う。使用した可溶性ヒトＣＥＡ抗原（ＡｂＣＡＭ  Ｌｔｄ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＵＫ）を単独の患者の肝臓からの転移性結腸癌から単離した。細胞を添加する前に、所定量の二重特異性一本鎖抗体を漸増量の可溶性ヒトＣＥＡ抗原（０μｇ／ｍｌ；０．１μｇ／ｍｌ；１μｇ／ｍｌ、または０μｇ／ｍｌ；０．００４μｇ／ｍｌ；０．０２μｇ／ｍｌ；０．１μｇ／ｍｌ；０．５μｇ／ｍｌ；１μｇ／ｍｌのいずれか）で３７℃にて３０分間プレインキュベーションすることにより実験的に競合アッセイを行った。残りのアッセイは、実施例４に記載されるとおり行った。これらの競合実験の結果を図５〜１１に示す。
【０１２８】
ヒトＣＥＡ陽性標的細胞に対する二重特異性一本鎖抗体、ｍＡｂ  Ｔ８４．６６に由来する抗ＣＥＡ部分を含むＣＥＡＩＩ  ＶＨＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号１０；図７および９〜１１）、およびｍＡｂ  ＭＦＥ−２３に由来する抗ＣＥＡ領域を含むＣＥＡＩＩＩ  ＶＬＶＨｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号１２；図８参照）の細胞障害活性は、漸増量の可溶性ヒトＣＥＡ抗原により大幅に阻害された。上に述べたように、前記構築物は膜結合と可溶性ヒトＣＥＡ抗原の両方と結合する；例えば、実施例２および３ならびに図１および２参照。従って、最も確かなことには、可溶性ヒトＣＥＡは、前記二重特異性一本鎖抗体の抗ＣＥＡ部分が標的細胞、例えば、ＣＨＯ−ＣＥＡ＋またはＫａｔｏＩＩＩ腫瘍細胞上の膜結合ヒトＣＥＡと結合することを阻害し、それにより前記抗体構築物により媒介される細胞障害活性を阻害する。
【０１２９】
それに対して、驚くことに、ｍＡｂ  Ａ５Ｂ７に由来する抗ＣＥＡ部分を有する二重特異性一本鎖抗体が可溶性ヒトＣＥＡに対して抵抗性であることが見出された。例えば、ＣＥＡＩ  ＶＬＶＨｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号６；図５参照）、ＣＥＡＩ  ＶＨＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号８；図５、８および１０参照）、配列番号７７ＶＨＶＬｘＣＥＡＩ  ＶＨＶＬ（配列番号４；図６参照）および配列番号７７ＶＨＶＬｘＣＥＡＩ  ＶＬＶＨ（配列番号２；図６参照）は、漸増量の可溶性ヒトＣＥＡにより阻害されず、高い濃度（１μｇ／ｍｌ）によってさえも阻害されない。これは、前記二重特異性一本鎖抗体の抗ＣＥＡ部分が可溶性ヒトＣＥＡと結合するという事実を考慮すると予測することができなかった（図２）。むしろ、漸増量の可溶性ヒトＣＥＡによるＣＥＡ陽性標的細胞に対する細胞障害活性の阻害を、Ｔ８４.６６由来構築物およびＭＦＥ−２３由来構築物の場合と同じように、予測することができた；上記参照。
【０１３０】
従って、本発明は、高いレベルの可溶性ＣＥＡ抗原の存在下でさえ細胞障害性抗腫瘍活性を有する医薬組成物を提供する。そのため、これらの医薬組成物はその血漿中の可溶性ＣＥＡ抗原濃度の高い腫瘍患者、例えば、進行性上皮性腫瘍、転移性上皮性腫瘍、高腫瘍量、後期上皮性腫瘍の患者またはＥＬＩＳＡで測定してＣＥＡ血清濃度が１００ｎｇ／ｍｌよりも高い腫瘍患者の治療に特に適している。
【０１３１】
実施例６：ヒトＶＬ領域の選択
癌患者に投与される際に免疫原性の低下した医薬組成物を提供するため、可溶性ＣＥＡ抗原に対する抵抗性を有するヒト二重特異性一本鎖抗体を作製した。第１段階で、可溶性ＣＥＡに対する抵抗性を有するヒトＶＬ領域が単離された。従って、この実験の目的は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）Ａ５Ｂ７の母親由来のマウスＶＨと対となり得るヒトＶＬ領域の選択である。
【０１３２】
１．可溶性ヒトＣＥＡ抗原のビオチン化
ファージライブラリー選択のため、可溶性ＣＥＡ抗原をビオチン化した。ビオチン化は、５％ ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳ中で、サンプルミキサー（Ｄｙｎａｌ）中で室温にて１時間１５倍モル過剰のＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ  ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて達成した。遊離ビオチンとビオチン化ＣＥＡ抗原の分離のため、標準的なプロトコールに従って、アッセイをＰＢＳに対して過剰に透析した。ビオチン標識したＣＥＡの保持された生物活性をＥＬＩＳＡ結合アッセイで確認した。
【０１３３】
２．ＲＮＡのヒトＢ細胞からの単離
１００ｍＬの血液を５名の健康なヒトドナーから採取した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を標準的な方法に従ってフィコール勾配により単離した。ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を製造業者の説明書に従って用いて、全ＲＮＡを単離細胞から単離した。標準的な方法に従ってｃＤＮＡを合成した（Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, 2001）。
【０１３４】
３．可変軽鎖領域（ＶＬ−領域）のＰＣＲ増幅
軽鎖Ｖ領域ＤＮＡの単離のため、ＲＴ−ＰＣＲを、Ｖ−κ−（５’−ｈｕ−ＶＫ１−ＳａｃＩ−２００１（５’−ＧＡＧＣＣＧＣＡＣＧ  ＡＧＣＣＣＧＡＧＣＴ  ＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣ  ＣＡＧＴＣＴＣＣ−３’）（配列番号７８）、５’−ｈｕ−ＶＫ２／４−ＳａｃＩ−２００１（５’−ＧＡＧＣＣＧＣＡＣＧ  ＡＧＣＣＣＧＡＧＣＴ  ＣＧＴＧＡＴＧＡＣＹ  ＣＡＧＴＣＴＣＣ−３’）（配列番号７９）、５’−ｈｕ−ＶＫ３−ＳａｃＩ−２００１（５’−ＧＡＧＣＣＧＣＡＣＧ  ＡＧＣＣＣＧＡＧＣＴ  ＣＧＴＧＷＴＧＡＣＲ  ＣＡＧＴＣＴＣＣ−３’）（配列番号８０）、５’−ｈｕ−ＶＫ５−ＳａｃＩ−２００１（５’−ＧＡＧＣＣＧＣＡＣＧ  ＡＧＣＣＣＧＡＧＣＴ  ＣＡＣＡＣＴＣＡＣＧ  ＣＡＧＴＣＴＣＣ−３’）（配列番号８１）、５’−ｈｕ−ＶＫ６−ＳａｃＩ−２００１（５’−ＧＡＧＣＣＧＣＡＣＧ  ＡＧＣＣＣＧＡＧＣＴ  ＣＧＴＧＣＴＧＡＣＴ  ＣＡＧＴＣＴＣＣ−３’）（配列番号８２）、３’−ｈｕ−Ｖｋ−Ｊ１−ＳｐｅＩ−ＢｓｉＷＩ（５’−ＧＡＣＧＡＣＡＣＴＡ  ＧＴＴＧＣＡＧＣＣＡ  ＣＣＧＴＡＣＧＴＴＴ  ＧＡＴＴＴＣＣＡＣＣ  ＴＴＧＧＴＣＣ−３’）（配列番号８３）、３’−ｈｕ−Ｖｋ−Ｊ２／４−ＳｐｅＩ−ＢｓｉＷＩ（５’−ＧＡＣＧＡＣＡＣＴＡ  ＧＴＴＧＣＡＧＣＣＡ  ＣＣＧＴＡＣＧＴＴＴ  ＧＡＴＣＴＣＣＡＳＣ  ＴＴＧＧＴＣＣ−３’）（配列番号８４）、３’−ｈｕ−Ｖｋ−Ｊ３−ＳｐｅＩ−ＢｓｉＷＩ（５’−ＧＡＣＧＡＣＡＣＴＡ  ＧＴＴＧＣＡＧＣＣＡ  ＣＣＧＴＡＣＧＴＴＴ  ＧＡＴＡＴＣＣＡＣＴ  ＴＴＧＧＴＣＣ−３’）（配列番号８５）、３’−ｈｕ−Ｖｋ−Ｊ５−ＳｐｅＩ−ＢｓｉＷＩ（５’−ＧＡＣＧＡＣＡＣＴＡ  ＧＴＴＧＣＡＧＣＣＡ  ＣＣＧＴＡＣＧＴＴＴ  ＡＡＴＣＴＣＣＡＧＴ  ＣＧＴＧＴＣＣ−３’）（配列番号８６））およびＶλ（５’−ｈｕＶＬ１ａ−ＳａｃＩ−２００１（ＧＡＧ  ＣＣＧ  ＣＡＣ  ＧＡＧ  ＣＣＣ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＧＴＧ  ＴＴＧ  ＡＣＧ  ＣＡＧ  ＣＣＧ  ＣＣＣ  ＴＣ）（配列番号８７）、５’−ｈｕＶＬ１ｂ−ＳａｃＩ−２００１（ＧＡＧ  ＣＣＧ  ＣＡＣ  ＧＡＧ  ＣＣＣ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＧＴＧ  ＣＴＧ  ＡＣＴ  ＣＡＧ  ＣＣＡ  ＣＣＣ  ＴＣ）（配列番号８８）、５’−ｈｕＶＬ２−ＳａｃＩ−２００１（ＧＡＧ  ＣＣＧ  ＣＡＧ  ＧＡＧ  ＣＣＣ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＧＣＣ  ＣＴＧ  ＡＣＴ  ＣＡＧ  ＣＣＴ  ＳＣＣ  ＴＣＣ  ＧＴ）（配列番号８９）、５’−ｈｕＶＬ４−ＳａｃＩ−２００１（ＡＣＣ  ＴＧＣ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＧＴＧ  ＣＴＧ  ＡＣＴ  ＣＡＲ  ＹＣＭ  ＹＣＣ  ＴＣＴ  ＧＣ）（配列番号９０）、５’−ｈｕＶＬ５−ＳａｃＩ−２００１（ＡＣＣ  ＴＧＣ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＧＴＧ  ＣＴＧ  ＡＣＴ  ＣＡＧ  ＣＣＲ  ＳＣＴ  ＴＣＣ）（配列番号９１）、５’−ｈｕＶＬ６−ＳａｃＩ−２００１（ＡＣＣ  ＴＧＣ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＡＴＧ  ＣＴＧ  ＡＣＴ  ＣＡＧ  ＣＣＣ  ＣＡＣ  ＴＣ）（配列番号９２）、５’−ｈｕＶＬ３／９−ＳａｃＩ−２００１（ＧＡＧ  ＣＣＧ  ＣＡＣ  ＧＡＧ  ＣＣＣ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＧＷＧ  ＣＴＧ  ＡＣＴ  ＣＡＧ  ＣＣＡ  ＣＣＹ  ＴＣ）（配列番号９３）、５’−ｈｕＶＬ７／８−ＳａｃＩ−２００１（ＧＡＧ  ＣＣＧ  ＣＡＣ  ＧＡＧ  ＣＣＣ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＧＴＧ  ＧＴＧ  ＡＣＹ  ＣＡＧ  Ｇ��Ｇ  ＣＣＭ  ＴＣ）（配列番号９４）、３’−ｈｕ−Ｖｌａｍ−ＢｌｎＩ−ＳｐｅＩ−２００１（ＣＧＴ  ＧＧＧ  ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＣＴＴ  ＧＧＧ  ＣＴＧ  ＡＣＣ  ＴＡＧ  ＧＡＣ  ＧＧＴ）（配列番号９５）、３’−ｈｕ−Ｖｌａｍ２−ＢｌｎＩ−ＳｐｅＩ−２００２：ＣＧＴ  ＧＧＧ  ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＣＴＴ  ＧＧＧ  ＣＴＧ  ＡＣＣ  ＧＡＧ  ＧＡＣ  ＧＧＴ）（配列番号９６）プライマーセットを用いて行った。
【０１３５】
ヒトＢ細胞由来のＲＮＡをｃＤＮＡに転写し（上記の通り）、ＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡとして用いた。１回のＰＣＲ反応につき、１個の５’−プライマーを１個の３’−プライマーと組み合わせた。異なるＰＣＲ反応の数を、５’−および３’−プライマーの可能な組み合わせの数により決定した。増幅には次のＰＣＲプログラムを用いた。すなわち９４℃にて１５秒間の変性、５２℃にて５０秒間のプライマーアニーリングおよび７２℃にて９０秒間のプライマー伸張を４０サイクル以上行い、それに続いて７２℃にて１０分間の最終伸張を行った。次に、軽鎖ＤＮＡ  Ｖ断片を標準的なプロトコールに従って単離した。
【０１３６】
４．ライブラリー構築−ヒトＶＬプールのクローニング
ファージディスプレイライブラリーは、概して、例えば「Phage Display: A Laboratory Manual」; Ed. Barbas, Burton, Scott & Silverman; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001に開示されるような標準的な手順に基づいて構築された。
【０１３７】
ＰＣＲ増幅のために選択されるプライマーは、軽鎖Ｖ断片の５’−ＳａｃＩおよび３’−ＳｐｅＩ認識部位を生じた。４回の連結反応をセットアップし、各々４００ｎｇの軽鎖断片（ＳａｃＩ−ＳｐｅＩ消化、２×κおよび２×λ）および１４００ｎｇのファージミドｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓ（ＳａｃＩ−ＳｐｅＩ消化；大きな断片；このベクターは、Ｒａｌｆ  Ｌｕｔｔｅｒｂｕｅｓｅ博士の論文に記載されている）で構成された。次に、得られる４つの抗体Ｖ軽鎖プールを、エレクトロポレーション（２．５ｋＶ、０．２ｃｍギャップキュベット、２５ｍＦ、２００  Ｏｈｍ、Ｂｉｏｒａｄ  ｇｅｎｅ−ｐｕｌｓｅｒ）により３００μｌのエレクトロコンピテント(electrocompetent)大腸菌（Escherichia coli）ＸＬ１  Ｂｌｕｅ株に各々形質転換して、
κ１：２×１０8
κ２：６×１０7
λ１：９×１０7
λ２：６×１０7
の独立したクローンからなるライブラリーサイズを得た。
【０１３８】
様々なＰＣＲ増幅から得たκ（軽鎖）ＤＮＡ断片を、各連結について次のように秤量した。それぞれの５’−プライマーは特定のグループを定義する。これらのグループの中で、３’−プライマーはサブグループを定義する。κサブグループを、１：２：１：１（プライマー３’−ｈｕ−Ｖｋ−Ｊ１−ＳｐｅＩ−ＢｓｉＷＩ：３’−ｈｕ−Ｖｋ−Ｊ２／４−ＳｐｅＩ−ＢｓｉＷＩ：３’−ｈｕ−Ｖｋ−Ｊ３−ＳｐｅＩ−ＢｓｉＷＩ：３’−ｈｕ−Ｖｋ−Ｊ５−ＳｐｅＩ−ＢｓｉＷＩに対応）に秤量した。グループを、それらの生殖系列分布１：１：１：０．２：０．２（プライマー５’−ｈｕＶＫ１−Ｓａｃ−２００１：５’−ｈｕＶＫ３−Ｓａｃ−２００１：５’−ｈｕＶＫ２／４−Ｓａｃ−２００１：５’−ｈｕＶＫ５−Ｓａｃ−２００１：５’−ｈｕＶＫ６−Ｓａｃ−２００１に対応）に従って秤量した。
【０１３９】
異なるＰＣＲ増幅から得たλ（軽鎖）ＤＮＡ断片を、各連結について次のように秤量した。それぞれの５’−プライマーは、特定のグループを定義する。これらのグループの中で、３’−プライマーはサブグループを定義する。λサブグループを、３：１（プライマー３’−ｈｕ−Ｖｌａｍ−ＢｌｎＩ−ＳｐｅＩ−２００１：３’−ｈｕ−Ｖｌａｍ２−ＢｌｎＩ−ＳｐｅＩ−２００２に対応）に秤量した。
【０１４０】
グループを、それらの生殖系列分布１：１：２：２：２：３（プライマー５’−ｈｕＶＬ１ａ−ＳａｃＩ−２００１：５’−ｈｕＶＬ１ｂ−ＳａｃＩ−２００１：５’−ｈｕＶＬ２−ＳａｃＩ−２００１：５’−ｈｕＶＬ４−ＳａｃＩ−２００１＋５’−ｈｕＶＬ５−ＳａｃＩ−２００１：５’−ｈｕＶＬ６−ＳａｃＩ−２００１＋５’−ｈｕＶＬ７／８−ＳａｃＩ−２００１：５’−ｈｕＶＬ３／９−ＳａｃＩ−２００１に対応）に従って秤量した。
【０１４１】
エレクトロポレーション後、それぞれの反応液を表現型発現のためにＳＯＣ培養液（Ｆｌｕｋａ）中でインキュベートした。２つのκ培養物を組み合わせ、同様に２つのλ培養物も組み合わせた。得られるκ培養物および得られるλ培養物を、次にそれぞれ５００ｍＬの、５０μｇ／ｍｌ カルベニシリンおよび２％ ｗ／ｖ グルコースを含有するＳＢ選択培地中で一晩インキュベートした。翌日、細胞を遠心分離により回収し、市販のプラスミド調製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプラスミドの調製を行った。
【０１４２】
５．抗体ライブラリーの構築−ヒトＶＬ−母親由来ＶＨ
ＰＣＲを行ってｍＡｂ  Ａ５Ｂ７の母親由来のＶＨを前記母親由来のＶＨを含有するベクターから増幅した。増幅のために、５’−プライマー５’−ＡＶＨ−Ｘｈｏ  Ｉ（５’−ＧＴＣ  ＡＣＡ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＴＣＡ  ＧＧＡ  ＧＧＡ  ＧＧＣ  ＴＴＧ  ＧＴＡ  Ｃ−３’）（配列番号９７）および３’−プライマー３’−ＡＶＨ−ＢｓｔＥＩＩ（５’−ＧＴＣ  ＡＣＡ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＣＧＴ  ＧＧＴ  ＣＣＣ  ＴＴＧ  ＧＣＣ  ＣＣＡ  Ｇ−３’（配列番号９８）を用いて標準的手順に従うＰＣＲプロトコールに従った。分析用アガロースゲルからの約３５０ｂｐ増幅産物の精製後、ＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｔＥＩＩおよびＸｈｏ  Ｉで切り出した。ファージミドｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓ（このベクターはＲａｌｆ Ｌｕｔｔｅｒｂｕｅｓｅ博士の論文に記載されている。）をしかるべく消化させ、大きな断片を上述の断片と連結させた。大腸菌ＸＬ１  ｂｌｕｅへの形質転換後、単一のクローンを１００ｍＬ  ＳＢ培地（５０μｇ／ｍｌ カルベニシリン含有）で培養し、プラスミドを標準的なプロトコールに従って調製した。挿入物を配列決定することにより首尾よいクローニングを確認した（Ｓｅｑｕｉｓｅｒｖｅ，Ｍｕｎｉｃｈ）。
【０１４３】
このベクターｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓ／ｍＡｂ  Ａ５Ｂ７の母親由来ＶＨを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｅＩで制限した。大きなベクター断片を単離した。プラスミド−ＤＮＡを含有するＶκライブラリーおよびＶλライブラリーを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｅＩで制限した。小さなＶκ断片およびそれぞれのＶλ断片（各およそ３５０ｂｐ）を標準的なプロトコールに従って単離した。１２００ｎｇのベクター断片を各２００ｎｇのＶκおよびＶλ断片両方の混合と連結した。連結反応物をエレクトロポレーション（２．５ｋＶ、０．２ｃｍギャップキュベット、２５ｍＦ、２００  Ｏｈｍ）により３００μＬのエレクトロコンピテント(electrocompetent)大腸菌ＸＬ１  Ｂｌｕｅ株に形質転換して、１．２×１０8の独立したクローンからなる全ｓｃＦｖライブラリーサイズを得た。
【０１４４】
表現型発現およびカルベニシリンへの緩やかな適応の後、抗体ライブラリーをＳＢ−カルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）選択培地へ移した。次に、抗体ライブラリーを感染量の１×１０12粒子のヘルパーファージＶＣＳＭ１３で感染させ、その結果、繊維状のＭ１３ファージの産生および分泌が得られ、この各ファージ粒子は半ヒトｓｃＦｖ−断片をコードする一本鎖ｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓ−ＤＮＡを含み、ファージコートタンパク質ＩＩＩへの翻訳融合として対応するｓｃＦｖ−タンパク質を提示した。
【０１４５】
６．ヒトＶＬのファージディスプレイ選択
ｓｃＦｖ−レパートリーを有するファージ粒子をＰＥＧ８０００／ＮａＣｌ沈殿および遠心分離により培養上清から回収した。次に、約１×１０11〜１×１０12ｓｃＦｖファージ粒子を０．５ｍＬのＴＢＳ／１％ ＢＳＡに再懸濁し、ストレプトアビジンコートされたＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）のウェル中で１時間固定されたビオチン化可溶性ＣＥＡとともにインキュベートした。抗原１０μg／ｍｌのＰＢＳ溶液（５０μｌ）をストレプトアビジンコートされたウェル中で４℃にて一晩インキュベートし、水で１回洗浄し、それに続いてＴＢＳ中２００μｌの３％ ＢＳＡで３７℃にて１時間ブロッキングし、それをインキュベーション後に取り除いた。
【０１４６】
標的抗原と特異的結合しなかったｓｃＦｖファージをＴＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎでの洗浄段階により除去した。この洗浄手順は、さらなるラウンドで１０回まで繰り返された。
【０１４７】
洗浄後、ＨＣｌ−グリシン、ｐＨ ２．２を用いることにより結合体を溶出した。２Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ １２での中和後、溶出液を新鮮な非感染大腸菌ＸＬ１  Ｂｌｕｅ培養株の感染に用いた。
【０１４８】
残っている高結合体を溶出するため、５０μｌの新鮮な大腸菌ＸＬ１  ｂｌｕｅ培養株（ＯＤ６００≧０．５）をウェルに添加し、１５分間インキュベートした。次に、両方の培養物を混合し、ヒトｓｃＦｖ−断片をコードするファージミドコピーで首尾よく形質導入した細胞を再びカルベニシリン抵抗性について選択し、その後にＶＣＭＳ１３ヘルパーファージで感染させて、抗体提示およびインビトロでの選択の第２のラウンドを開始した。
【０１４９】
４ラウンドのパニングに対応するプラスミドＤＮＡを大腸菌培養物から単離した。可溶性ｓｃＦｖ−タンパク質の産生のため、ＶＨ−ＶＬ−ＤＮＡ断片をプラスミドから切り出し（Ｘｈｏ  Ｉ−ＳｐｅＩ）、プラスミドｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＦＩａｇ／Ｈｉｓ中の同じ制限部位を介してクローニングし、その発現構築物（例えばｓｃＦｖ）は、ｓｃＦｖとＨｉｓ６タグとの間にＦｌａｇタグ（ＴＧＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号９９）を含み、さらなるファージタンパク質が欠失している。
【０１５０】
連結後、各プール（異なるラウンドのパニング）のプラスミドＤＮＡを１００μＬ熱ショックコンピテント大腸菌ＴＧ１に形質転換し、カルベニシリンＬＢ寒天上にプレーティングした。単一のコロニーを選定し、９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）中の１２０μＬのＬＢカルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）１％ グルコースに播種した。ウェルを半透膜（Ｇｒｅｉｎｅｒ）で密封し、振盪インキュベータでプレートを３７℃にて一晩インキュベートした（マスタープレート）。次に、１０μｌのマスタープレート培養物を、ウェルあたり９０μＬ ＬＢカルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）０．１％ グルコースを含有する第２の９６ウェルプレート（ワーキングプレート）に移した。３７℃の振盪インキュベータ中で４時間のインキュベーションの後、２０μＬ ＬＢカルベニシリン、６ｍＭ ＩＰＴＧを各ウェルに添加することによりｓｃＦｖ生成を誘導した。振盪しながら３０℃にて一晩の別のインキュベーション段階の後、細胞を、４０μＬ 溶解緩衝液（４００ｍＭ ホウ酸、３２０ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８、２．５ｍｇ／ｍｌ リゾチーム）での室温にて１時間のインキュベーションで溶解した。残りの細胞および細胞片を１．９００×ｇで１２分間の遠心分離により分離した（Ｈｅｔｔｉｃｈ）。
【０１５１】
次に、ｓｃＦｖ分子を含有する上清を、フローサイトメトリー結合アッセイで結合について試験した。ヒトＣＥＡでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞をＣＥＡ陽性細胞株として用いた。最初に１００，０００〜２００，０００個の細胞をヒトｓｃＦｖまたは関連する対照を含有する周辺質調製物とともにインキュベートすることにより細胞結合アッセイを行った。インキュベーション後、細胞をＰＢＳ／１％ ＦＣＳ（ウシ胎児血清）中で洗浄し、さらに５〜１０μｇ／ｍｌの抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ）とともにインキュベートした。細胞を再び洗浄した後、それらをポリクローナル、ＰＥ標識抗マウス抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）とともにインキュベートし、その後フローサイトメトリーにより分析した。およそ６００個のクローンをＣＥＡ陽性のＣＨＯ細胞で結合シグナルについて試験した。２７個の陽性クローンが得られた。それぞれのｓｃＦｖ  ＤＮＡを配列決定した後、合計９個の異なる配列が得られた。
【０１５２】
図１２は、フローサイトメトリー分析により測定される、９個の様々な半ヒトｓｃＦｖ（すなわち、マウスＡ５Ｂ７  ＶＨ−ヒトＶＬ）構築物と多様な細胞株の結合を示す。前記図は複数の図表を含み、１つが試験された各構築物を表す。任意の所与図表中、黒色の分布は、いずれの構築物も不在下であるが、ｓｃＦｖの検出に用いられるあらゆる適切な検出剤を含むＰＢＳ単独でインキュベートした細胞の蛍光強度を示す。このようにして、観察されるいずれの蛍光シフトも間違いなく検出剤または緩衝液よりもｓｃＦｖ構築物に起因し得る。構築物とそれぞれの細胞株との結合の指標である蛍光のシフトは、各図表中灰色の線で示される。一般に、（黒色の）対照から離れてより高い強度のシフト、すなわち対照よりもはるかに遠いシフトはより強い結合を示し、一方、（黒色の）対照から離れてより低い強度のシフト、すなわち対照により近いシフトはより弱い結合を示す。
【０１５３】
図１２から、構築物Ａ−１２１、Ａ−１８３、Ａ−２４０、Ａ−３１３、Ａ−２９０、Ａ−３１５、Ａ４−３５、Ａ４−５２、ＭＰ２−Ａ５は、それぞれの対照と比較して、蛍光強度において明らかに識別できるシフトを示し、ｓｃＦｖとＣＨＯ標的細胞上の膜結合ＣＥＡとの結合を示すことが分かる。以下で、ｓｃＦｖ  Ａ−２４０（配列番号４８）のヒトＶＬ領域を選択し、ヒトＶＨ領域の単離に用いた。前記ヒトＶＬ領域は、配列番号６３（核酸配列）および配列番号６４（アミノ酸配列）に示される。
【０１５４】
実施例７：可溶性ＣＥＡ抗原に対して抵抗性のあるヒトＶＨ領域の抗体ライブラリーの構築およびファージディスプレイ選択
以下の実験の目的は、実施例６に記載されるように選択される、ｓｃＦｖ  Ａ−２４０のヒトＶＬ領域と対となる可溶性ＣＥＡ抗原に対して抵抗性のある一連のヒトＶＨ領域の選択である。前記ヒトＶＬ領域は、配列番号６３（核酸配列）および配列番号６４（アミノ酸配列）に示される。
【０１５５】
１．末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＲＮＡの単離
１００ｍＬの血液を５名の健康なヒトドナーから採取した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、標準的な方法に従ってフィコール勾配により単離した。全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を製造業者の説明書に従って用いてＰＢＭＣから単離した。ｃＤＮＡを標準的な方法に従って合成した（Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, 2001）。
【０１５６】
２．可変重鎖領域（ＶＨ領域）のＰＣＲ増幅
ＶＨライブラリーを構築し、Ｌｉｂ  １３４−ＶＨと名付けた。このＶＨ−ライブラリーは、その後にヒトＦＲ４生殖系列配列が続く母親由来の抗体のＶＨＣＤＲ３と作動可能なように連結された、ＰＣＲ増幅された上記のＰＢＭＣプールのＶＨ領域由来のＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３のヒトレパートリーで構成される。
【０１５７】
ヒト鋳型ＶＨ領域の単離のため、５’−ＶＨ特異的プライマーセット（５’−ｈｕＶＨ１，３，５−Ｘｈｏ  Ｉ−２００１（５’−ＡＧＧ  ＴＧＣ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  ＴＣＧ  ＡＧＴ  ＣＴＧ  Ｇ−３’）（配列番号１００）、５’−ｈｕＶＨ４−Ｘｈｏ  Ｉ−２００１（５’−ＣＡＧ  ＧＴＧ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＴＣＧ  ＧＧ−３’）（配列番号１０１）、５’−ｈｕＶＨ４Ｂ−Ｘｈｏ  Ｉ−２００１（５’−ＣＡＧ  ＧＴＧ  ＣＡＧ  ＣＴＡ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＴＧＧ  ＧＧ−３’）（配列番号１０２））および２つの３’−ＶＨ特異的プライマーセット（３’−ｈｕ−ＶＨ−ＢｓｔＥＩＩ−２００１（５’−ＣＴＧ  ＡＧＧ  ＡＧＡ  ＣＧＧ  ＴＧＡ  ＣＣ−３’）（配列番号１０３）、３’−ｈｕ−ＶＨ−Ｊ３−ＢｓｔＥＩＩ−２００１（５’−ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＡＧＡ  ＣＧＧ  ＴＧＡ  ＣＣ−３’）（配列番号１０４））を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。１回のＰＣＲ反応につき、１個の５’−プライマーを１個の３’−プライマーと組み合わせた；異なるＰＣＲ反応の数は、５’−および３’−プライマーの可能な組み合わせの数により決定した。５つのドナーのＰＢＭＣ  ｃＤＮＡを、ＶＨ遺伝子の供給源として用いた。次のＰＣＲプログラム：９４℃にて１５秒間の変性、５２℃にて５０秒間のプライマーアニーリングおよび７２℃にて６０秒間のプライマー伸張を４０サイクル以上行い、それに続いて７２℃にて１０分間の最終伸張、を増幅に用いた。約３５０ｂｐのサイズの増幅産物を標準的な方法に従って単離した。
【０１５８】
Ｌｉｂ  １３４−ＶＨ領域の単離のため、ＲＴ−ＰＣＲを二段階で行った。最初に、ヒト重鎖ＶＨ−セグメント（ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３）を、上記と同じ５’−ＶＨ特異的プライマーセット（５’−ｈｕＶＨ１，３，５−Ｘｈｏ  Ｉ−２００１、５’−ｈｕＶＨ４−Ｘｈｏ  Ｉ−２００１、５’−ｈｕＶＨ４Ｂ−Ｘｈｏ  Ｉ−２００１；配列番号１００〜１０２）および３’−特異的プライマーセット（３’−Ａ１３４−ＶＨ１Ａ（５’−ＧＴＡ  ＧＴＣ  ＡＡＡ  ＧＴＡ  ＧＡＡ  ＣＣＧ  ＴＡＧ  ＣＣＣ  ＣＣＴ  ＡＴＣ  ＴＣＴ  ＹＧＣ  ＡＣＡ  ＧＴＡ  ＡＴＡ  ＣＡＣ  ＧＧＣ−３’）（配列番号１０５）、３’−Ａ１３４−ＶＨ１Ｂ（５’−ＧＴＡ  ＧＴＣ  ＡＡＡ  ＧＴＡ  ＧＡＡ  ＣＣＧ  ＴＡＧ  ＣＣＣ  ＣＣＴ  ＡＴＣ  ＴＣＴ  ＹＧＣ  ＡＣＡ  ＧＴＡ  ＡＴＡ  ＣＡＹ  ＲＧＣ−３’）（配列番号１０６）、３’−Ａ１３４−ＶＨ３Ａ（５’−ＧＴＡ  ＧＴＣ  ＡＡＡ  ＧＴＡ  ＧＡＡ  ＣＣＧ  ＴＡＧ  ＣＣＣ  ＣＣＴ  ＡＴＣ  ＴＣＴ  ＴＧＹ  ＡＣＡ  ＧＴＡ  ＡＴＡ  ＣＡＣ  ＲＧＣ−３’）（配列番号１０７）（示される「Ｔ」は「Ａ」、「Ｃ」または「Ｇ」にも置き換えられる）、３’−Ａ１３４−ＶＨ３Ｂ（５’−ＧＴＡ  ＧＴＣ  ＡＡＡ  ＧＴＡ  ＧＡＡ  ＣＣＧ  ＴＡＧ  ＣＣＣ  ＣＣＴ  ＡＴＣ  ＴＣＴ  ＴＧＣ  ＡＣＡ  ＧＴＡ  ＡＴＡ  ＣＡＡ  ＲＧＣ−３’）（配列番号１０８）（示される「Ｔ」は「Ａ」、「Ｃ」または「Ｇ」にも置き換えられる）、３’−Ａ１３４−ＶＨ４（５’−ＧＴＡ  ＧＴＣ  ＡＡＡ  ＧＴＡ  ＧＡＡ  ＣＣＧ  ＴＡＧ  ＣＣＣ  ＣＣＴ  ＡＴＣ  ＴＣＴ  ＳＧＣ  ＡＣＡ  ＧＴＡ  ＡＴＡ  ＣＡＣ  ＲＧＣ−３’）（配列番号１０９））を、ＦＲ３の非常に末端の領域で一致するヒトＶＨサブファミリー１、３および４に対して用いて、単離された鋳型ＶＨ断片からＰＣＲ増幅した。
【０１５９】
次のプライマーの組み合わせを用いた。
ａ）５’−ｈｕＶＨ１，３，５−Ｘｈｏ  Ｉ−２００１  ×  ３’−Ａ１３４−ＶＨ１Ａ
ｂ）５’−ｈｕＶＨ１，３，５−Ｘｈｏ  Ｉ−２００１  ×  ３’−Ａ１３４−ＶＨ１Ｂ
ｃ）５’−ｈｕＶＨ１，３，５−Ｘｈｏ  Ｉ−２００１  ×  ３’−Ａ１３４−ＶＨ３Ａ
ｄ）５’−ｈｕＶＨ１，３，５−Ｘｈｏ  Ｉ−２００１  ×  ３’−Ａ１３４−ＶＨ３Ｂ
ｅ）５’−ｈｕＶＨ４−Ｘｈｏ  Ｉ−２００１  ×  ３’−Ａ１３４−ＶＨ４
ｆ）５’−ｈｕＶＨ４Ｂ−Ｘｈｏ  Ｉ−２００１  ×  ３’−Ａ１３４−ＶＨ４
【０１６０】
１回のＰＣＲ反応につき、１個の５’−プライマーを１個の３’−プライマーと組み合わせた；異なるＰＣＲ反応の数は、５’−および３’−プライマーの可能な組み合わせの数により決定した。次のＰＣＲプログラム：９４℃にて１５秒間の変性、５２℃にて５０秒間のプライマーアニーリングおよび７２℃にて９０秒間のプライマー伸張を４０サイクル以上行い、それに続いて７２℃にて１０分間の最終伸張、を増幅に用いた。このＰＣＲ段階およびそれぞれの３’−プライマー配列によって、ヒトＶＨセグメントが母親由来のＶＨ  ＣＤＲ３の一部分について延長された。それは言い換えると次の２番目の段階のＰＣＲ３’−プライマーのプライミングサイトである。
【０１６１】
これらのＶＨ−（ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３）ＤＮＡ断片を、次に、それぞれの５’ＶＨ特異的プライマーと、増幅されたＤＮＡ断片の普遍的な３’−末端に一致する普遍的な３’プライマー（３’Ａ１３４−ＪＨ６−ＢｓｔＥＩＩ、５’−ＣＧＡ  ＧＡＣ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＣＧＴ  ＧＧＴ  ＣＣＣ  ＴＴＧ  ＧＣＣ  ＣＣＡ  ＧＴＡ  ＧＴＣ  ＡＡＡ  ＧＴＡ  ＧＡＡ  ＣＣＧ  ＴＡＧ  ＣＣ−３’）（配列番号１１０）を再び用いる２番目のＰＣＲ反応の鋳型として用いた。
【０１６２】
次のＰＣＲプログラム：
９４℃にて１５秒間の変性、５２℃にて５０秒間のプライマーアニーリングおよび７２℃にて６０秒間のプライマー伸張を４０サイクル以上行い、それに続いて７２℃にて１０分間の最終伸張、を増幅に用いた。ＤＮＡ  Ｖ断片を標準的なプロトコールに従って単離した。
【０１６３】
３．ライブラリー構築−ヒトＶＨプールのクローニング
前述の方法の第２ラウンドでは、１回目の前の選択（実施例６参照）で同定されたｓｃＦｖ  Ａ−２４０のヒトＶＬを選択し、それに続いてヒトｓｃＦｖを作製する目的でヒトＶＨ断片のライブラリーと合成した。ファージディスプレイライブラリーは、概して、例えば「Phage Display: A Laboratory Manual」;Ed. Barbas, Burton, Scott & Silverman; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001に開示されるような標準的な手順に基づいて構築された。
【０１６４】
異なるＰＣＲ増幅からの重鎖ＤＮＡ断片を各連結について次のように秤量した。
ａ：ｂ：ｃ：ｄ：ｅ：ｆ＝３：１：３：１：１：１、ここでａ〜ｆは次の意味：
ａ）５’−ｈｕＶＨ１，３，５−Ｘｈｏ  Ｉ−２００１  ×  ３’−Ａ１３４−ＶＨ１Ａ
ｂ）５’−ｈｕＶＨ１，３，５−Ｘｈｏ  Ｉ−２００１  ×  ３’−Ａ１３４−ＶＨ１Ｂ
ｃ）５’−ｈｕＶＨ１，３，５−Ｘｈｏ  Ｉ−２００１  ×  ３’−Ａ１３４−ＶＨ３Ａ
ｄ）５’−ｈｕＶＨ１，３，５−Ｘｈｏ  Ｉ−２００１  ×  ３’−Ａ１３４−ＶＨ３Ｂ
ｅ）５’−ｈｕＶＨ４−Ｘｈｏ  Ｉ−２００１  ×  ３’−Ａ１３４−ＶＨ４
ｆ）５’−ｈｕＶＨ４Ｂ−Ｘｈｏ  Ｉ−２００１  ×  ３’−Ａ１３４−ＶＨ４
を有する。
【０１６５】
４００ｎｇのヒトＬｉｂ  １３４−ＶＨ断片プール（Ｘｈｏ  Ｉ-ＢｓｔＥＩＩ消化）および１２００ｎｇのプラスミドｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓ／Ａ−２４０  ＶＬ（ｓｃＦｖ  Ａ−２４０のＶＬ領域をコードするＤＮＡを、制限部位ＳａｃＩおよびＳｐｅＩを介して標準手順に従ってｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓにクローニングした）で構成される、１回の連結反応を設定した。得られる抗体ヒトＶＨプールを、次に、３００μＬのエレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１  Ｂｌｕｅ株にエレクトロポレーション（２．５ｋＶ、０．２ｃｍギャップキュベット、２５ｍＦ、２００  Ｏｈｍ、Ｂｉｏｒａｄ  ｇｅｎｅ−ｐｕｌｓｅｒ）により形質転換し、合計で０．８×１０8の独立したクローンからなるライブラリーサイズを得た。
【０１６６】
エレクトロポレーション後、アッセイをＳＯＣ培養液（Ｆｌｕｋａ）中で表現型発現のためにインキュベートした。次に培養物を、５０μｇ／ｍｌ カルベニシリンおよび２％ ｖ／ｖ グルコースを含有する５００ｍＬのＳＢ選択培地中で一晩それぞれインキュベートした。翌日、培養物の細胞を遠心分離により回収し、市販のプラスミド調製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミド調製を行ってＤＮＡライブラリーを保存した。
【０１６７】
それぞれのｓｃＦｖプールをコードする、１．５μｇのこのプラスミドプールを、次に、大腸菌ＸＬ１  ｂｌｕｅ（２．５ｋＶ、０．２ｃｍギャップキュベット、２５ｍＦ、２００  Ｏｈｍ、Ｂｉｏｒａｄ  ｇｅｎｅ−ｐｕｌｓｅｒ）に電気穿孔して合計で２．４×１０9の独立したクローンからなるライブラリーサイズを得た。表現型発現およびカルベニシリンへの緩やかな適応の後、抗体ライブラリーをＳＢ−カルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）選択培地へ移した。次に、抗体ライブラリーを感染量の１×１０12粒子のヘルパーファージＶＣＳＭ１３で感染させ、その結果、繊維状のＭ１３ファージの産生および分泌が得られ、この各ファージ粒子はヒトｓｃＦｖ−断片をコードする一本鎖ｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓ−ＤＮＡを含み、ファージコートタンパク質ＩＩＩへの翻訳融合として対応するｓｃＦｖ−タンパク質を提示した。
【０１６８】
４．ヒトＶＨのファージディスプレイ選択
ヒトｓｃＦｖ−レパートリーを有するファージ粒子をＰＥＧ８０００／ＮａＣｌ沈殿および遠心分離により培養上清から回収した。次に、約１×１０11〜１×１０12ｓｃＦｖファージ粒子を０．５ｍＬのＴＢＳ／１％ ＢＳＡに再懸濁し、ストレプトアビジンコートされたＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）のウェル中で１時間固定されたビオチン化可溶性ＣＥＡとともにインキュベートした。抗原１０μg／ｍｌのＰＢＳ溶液（５０μｌ）をストレプトアビジンコートされたウェル中で４℃にて一晩インキュベートし、水で１回洗浄し、それに続いてＴＢＳ中２００μｌの３％ ＢＳＡで３７℃にて１時間ブロッキングし、それをインキュベーション後に取り除いた。
【０１６９】
標的抗原と特異的結合しなかったｓｃＦｖファージをＴＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎでの洗浄段階により除去した。この洗浄手順は、さらなるラウンドで１０回まで繰り返された。
【０１７０】
洗浄後、ＨＣｌ−グリシン、ｐＨ ２．２を用いることにより結合体を溶出した。２Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ １２での中和後、溶出液を新鮮な非感染大腸菌ＸＬ１  Ｂｌｕｅ培養株の感染に用いた。
【０１７１】
残っている高結合体を溶出するため、５０μｌの新鮮な大腸菌ＸＬ１  ｂｌｕｅ培養株（ＯＤ６００≧０．５）をウェルに添加し、１５分間インキュベートした。次に、両方の培養物を混合し、ヒトｓｃＦｖ−断片をコードするファージミドコピーで首尾よく形質導入した細胞を再びカルベニシリン抵抗性について選択し、その後にＶＣＭＳ１３ヘルパーファージで感染させて、抗体提示およびインビトロでの選択の第２のラウンドを開始した。
【０１７２】
４ラウンドのパニングに対応するプラスミドＤＮＡを大腸菌培養物から単離した。可溶性ｓｃＦｖ−タンパク質の産生のため、ＶＨ−ＶＬ−ＤＮＡ断片をプラスミドから切り出し（ＸｈｏＩ−ＳｐｅＩ）、プラスミドｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＦｌａｇ／Ｈｉｓ中の同じ制限部位を介してクローニングし、その発現構築物（例えばｓｃＦｖ）は、ｓｃＦｖとＨｉｓ６タグとの間にＦｌａｇタグ（ＴＧＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号９９）を含み、さらなるファージタンパク質が欠失している。
【０１７３】
連結後、各プール（異なるラウンドのパニング）のプラスミドＤＮＡを１００μＬ熱ショックコンピテント大腸菌ＴＧ１に形質転換し、カルベニシリンＬＢ寒天上にプレーティングした。単一のコロニーを選定し、９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）中の１２０μＬのＬＢカルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）１％ グルコースに播種した。ウェルに半透膜（Ｇｒｅｉｎｅｒ）で密封し、インキュベータでプレートを３７℃にて一晩インキュベートした（マスタープレート）。次に、１０μｌのマスタープレート培養物を、ウェルあたり９０μＬ ＬＢカルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）０．１％ グルコースを含有する第２の９６ウェルプレート（ワーキングプレート）に移した。３７℃の振盪インキュベータ中で４時間のインキュベーションの後、２０μＬ ＬＢカルベニシリン、６ｍＭ ＩＰＴＧを各ウェルに添加することによりｓｃＦｖ生成を誘導した。振盪しながら３０℃にて一晩の別のインキュベーション段階の後、細胞を、４０μＬ 溶解緩衝液（４００ｍＭ ホウ酸、３２０ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＥＤＴＡ  ｐＨ８、２．５ｍｇ／ｍｌ リゾチーム）での室温にて１時間のインキュベーションで溶解した。残りの細胞および細胞片は１，９００×ｇで１２分間の遠心分離により分離した（Ｈｅｔｔｉｃｈ）。
【０１７４】
次に、ｓｃＦｖ分子を含有する上清を、フローサイトメトリー結合アッセイで結合について試験した。
【０１７５】
ヒトＣＥＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞をＣＥＡ陽性細胞株として用いた。最初に１００，０００〜２００，０００個の細胞をヒトｓｃＦｖまたは関連する対照を含有する周辺質調製物とともにインキュベートすることにより細胞結合アッセイを行った。インキュベーション後、細胞をＰＢＳ／１％ ＦＣＳ（ウシ胎児血清）中で洗浄し、さらに５〜１０μｇ／ｍｌの抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体とともにインキュベートした。細胞を再び洗浄した後、それらをポリクローナル、ＰＥ標識抗マウス抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）とともにインキュベートし、その後フローサイトメトリーにより分析した。４６個のクローンをＣＥＡ陽性のＣＨＯ細胞で結合シグナルについて試験した。それらの全てが陽性のシグナルを示した。それぞれのｓｃＦｖ  ＤＮＡを配列決定した後、合計９個の異なる配列が得られ、そのうちの８個が高度の相同性を示した。ヒト構築物ＭＰ５１０＿３Ａ−５．３（ＭＰ５１０−Ａ５；配列番号５０）、ＭＰ５１０＿３−Ｂ９．１（ＭＰ５１１−Ｂ９；配列番号５２）、ＭＰ５１０＿３−Ｄ８．１（ＭＰ５１１−Ｄ８；配列番号５４）が、さらなる特性決定のために選択された。対応するアミノ酸配列を配列表に示す。
【０１７６】
前記ヒト構築物ＭＰ５１０−Ａ５、ＭＰ５１１−Ｂ９、ＭＰ５１１−Ｄ８ならびに半ヒト構築物Ａ−２４０  Ｖλ．３（マウスＶＨ  Ａ５Ｂ７／ヒトＶＬＡ２４０；配列番号４８）の周辺質抽出物を、ＣＥＡ陽性および陰性の細胞株でのフローサイトメトリー実験でさらに分析した。図１３から、ヒト構築物ＭＰ５１０−Ａ５（配列番号５０）、ＭＰ５１１−Ｂ９（配列番号５２）、ＭＰ５１１−Ｄ８（配列番号５４）は、それぞれの半ヒト対照Ａ−２４０  Ｖλ．３（マウスＶＨ  Ａ５Ｂ７/ヒトＶＬＡ２４０；配列番号４８）と比較して、明らかに識別できるシフトを蛍光強度で示すことが分かる。従って、ヒトｓｃＦｖ構築物は、膜結合ヒトＣＥＡに対して半ヒト構築物Ａ−２４０  Ｖλ．３よりも強い結合活性を示す。さらに、全てのヒト構築物は、ＣＥＡ陽性のヒトＫＡＴＯ  ＩＩＩ細胞（ヒト胃癌細胞株）との明確な結合を示したのに対し、それらのどれもがＣＥＡ陰性の非トランスフェクトＣＨＯ細胞ならびにＣＥＡ陰性のヒトＮＡＬＭ６細胞（ヒトＢ細胞株）との結合を示さなかった（データは示さず）。
【０１７７】
実施例８：ヒトＣＥＡｘＣＤ３二重特異性一本鎖抗体の作製および細胞障害活性
１．配置
次の段階では、ヒト二重特異性一本鎖抗体分子の様々なドメイン配置が作製された。これらの分子はヒト抗ＣＥＡ結合ドメイン（その作製は上記実施例７に記載されている）を含み、配列番号７７ＶＨＶＬに示されるヒトＣＤ３抗原に対して特異性を有する脱免疫化結合ドメインは表１に示されるように設計された；上記実施例２も参照。本明細書に記載されるヒト抗ＣＥＡ結合ドメインを含む二重特異性一本鎖抗体構築物はＥＬＩＳＡプレート上に固定化された可溶性ＣＥＡ抗原で４ラウンドのファージディスプレイ選択後に単離されているので、それらはすべて（明白に）可溶性ヒトＣＥＡ抗原と結合する。
【０１７８】
特に、次の配置が作製された。
（ａ）Ｎ末端に位置するヒト抗ＣＥＡ部分：
（ｉ）ＶＨ−ＶＬ配向の抗ＣＥＡ：
Ａ５ＶＨ−Ａ２４０ＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号２４）、
Ａ５ＶＨ−Ａ２４０ＶＬ＃ｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号１２６）、
Ｂ９ＶＨ−Ａ２４０ＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号３２）、
Ｂ９ＶＨ−Ａ２４０ＶＬ＃ｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号１３０）、
Ｄ８ＶＨ−Ａ２４０ＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号４０）
Ｄ８ＶＨ−Ａ２４０ＶＬ＃ｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号１３４）、および
ＣＥＡＩ  ＶＨ−Ａ２４０ＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号１６）。
（ｉｉ）ＶＬ−ＶＨ配向の抗ＣＥＡ：
Ａ２４０ＶＬ−Ａ５ＶＨｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号２６）、
Ａ２４０ＶＬ−Ｂ９ＶＨｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号３４）、
Ａ２４０ＶＬ−Ｄ８ＶＨｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号４２）、
およびＡ２４０ＶＬ−ＣＥＡＩ  ＶＨｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号１８）。
【０１７９】
（ｂ）Ｃ末端に位置するヒト抗ＣＥＡ部分：
（ｉ）ＶＨ−ＶＬ配向の抗ＣＥＡ：
配列番号７７ＶＨＶＬｘＡ５ＶＨ−Ａ２４０ＶＬ（配列番号３０）、
配列番号７７ＶＨＶＬｘＡ５ＶＨ−Ａ２４０ＶＬ＃（配列番号１２８）、
配列番号７７ＶＨＶＬｘＢ９ＶＨ−Ａ２４０ＶＬ（配列番号３６）、
配列番号７７ＶＨＶＬｘＥ１２ＶＨ−Ａ２４０ＶＬ（配列番号１４３）、
配列番号７７ＶＨＶＬｘＢ９ＶＨ−Ａ２４０ＶＬ＃（配列番号１３２）、配列番号７７ＶＨＶＬｘＤ８ＶＨ−Ａ２４０ＶＬ（配列番号４４）、
配列番号７７ＶＨＶＬｘＤ８ＶＨ−Ａ２４０ＶＬ＃（配列番号１３６）、
および配列番号７７ＶＨＶＬｘＣＥＡＩ  ＶＨ−Ａ２４０ＶＬ（配列番号２０）。
（ｉｉ）ＶＬ−ＶＨ配向の抗ＣＥＡ：
配列番号７７ＶＨＶＬｘＡ２４０ＶＬ−Ａ５ＶＨ（配列番号２８）、
配列番号７７ＶＨＶＬｘＡ２４０ＶＬ−Ｂ９ＶＨ（配列番号３８）、
配列番号７７ＶＨＶＬｘＡ２４０ＶＬ−Ｄ８ＶＨ（配列番号４６）、および
配列番号７７ＶＨＶＬｘＡ２４０ＶＬ−ＣＥＡＩ  ＶＨ（配列番号２２）。
【０１８０】
ＣＥＡＩ  ＶＨ（配列番号５６）は、マウスｍＡｂ  Ａ５Ｂ７に由来するＶＨ領域を意味し、一方、ＣＥＡＩ  ＶＨＶＬまたはＣＥＡＩ  ＶＬＶＨは、ｍＡｂ  Ａ５Ｂ７に由来するＶＨ−ＶＬドメインおよびＶＬ−ＶＨドメインをそれぞれ指す。Ａ２４０はヒトＶＬ領域に相当する（配列番号６４および実施例７参照）。従って、例えば、ＣＥＡＩ  ＶＨ−Ａ２４０ＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号１６）は、ｍＡｂ７由来のマウスＶＨ領域およびヒトＶＬ領域Ａ２４０を有する半ヒトＣＥＡ結合ドメインを含む二重特異性構築物に相当する。ヒト抗体ライブラリーのクローニングのため、Ａ２４０ＶＬ領域の元のＮ末端をコードする核酸配列は制限部位へ変換する必要があった。Ａ５ＶＨ−Ａ２４０ＶＬ＃ｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号１２６）、配列番号７７ＶＨＶＬｘＡ５ＶＨ−Ａ２４０ＶＬ＃（配列番号１２８）、Ｂ９ＶＨ−Ａ２４０ＶＬ＃ｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号１３０）、配列番号７７ＶＨＶＬｘＢ９ＶＨ−Ａ２４０ＶＬ＃（配列番号１３２）、Ｄ８ＶＨ−Ａ２４０ＶＬ＃ｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号１３４）、および配列番号７７ＶＨＶＬｘＤ８ＶＨ−Ａ２４０ＶＬ＃（配列番号１３６）において、元のＮ末端が再導入された。
【０１８１】
二重特異性一本鎖抗体構築物である配列番号７７ＶＨＶＬｘＥ１２ＶＨ−Ａ２４０ＶＬ（配列番号１４３）は、配列番号７７ＶＨＶＬｘＢ９ＶＨ−Ａ２４０ＶＬ（配列番号３６）構築物とただ１つのアミノ酸残基が異なる。Ｅ１２ＶＨではＣＤＲ−Ｈ２配列は「ＦＩＬＮＫＡＮＧＧＴＴＥＹＡＡＳＶＫＧ」（配列番号１４５）と読まれるが、Ｂ９ＶＨではそれは「ＦＩＲＮＫＡＮＧＧＴＴＥＹＡＡＳＶＫＧ」（配列番号６７）と読まれる。ヒトＥ１２ＶＨ領域を実施例７に示すように単離した。
【０１８２】
２．発現、精製およびフローサイトメトリー分析
これらのヒトＣＥＡｘＣＤ３二重特異性一本鎖抗体の発現、精製およびフローサイトメトリー分析は、上記実施例２に記載される方法により実行された。
【０１８３】
３．結合活性
図１４に例示されるように、ヒト二重特異性一本鎖抗体構築物Ａ５ＶＨ−Ａ２４０ＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号２４）、Ｂ９ＶＨ−Ａ２４０ＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号３２）、Ｄ８ＶＨ−Ａ２４０ＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号４０）およびＣＥＡＩ  ＶＨ−Ａ２４０ＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号１６）は、ＣＥＡ陽性ヒトＫａｔｏＩＩＩ細胞と結合し、かつＣＤ３陽性ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞と結合する。
【０１８４】
４．可溶性ＣＥＡ抗原の不在下での細胞障害活性
ＣＨＯ−ＣＥＡ＋標的細胞に対する細胞障害活性を、ヒト二重特異性一本鎖抗体の次のドメイン配置について実証した。
【０１８５】
Ｎ末端に位置する抗ＣＥＡ部分を含む構築物と抗ＣＥＡ部分のＶＨ−ＶＬ配向について、図１５は、Ａ５ＶＨ−Ａ２４０ＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号２４）、Ｂ９ＶＨ−Ａ２４０ＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号３２）、Ｄ８ＶＨ−Ａ２４０ＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号４０）およびＣＥＡＩ  ＶＨ−Ａ２４０ＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号１６）の細胞障害活性を示す。図１６は、Ａ２４０ＶＬ−Ａ５ＶＨｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号２６）、Ａ２４０ＶＬ−Ｂ９ＶＨｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号３４）、Ａ２４０ＶＬ−Ｄ８ＶＨｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号４２）、およびＡ２４０ＶＬ−ＣＥＡＩ  ＶＨｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号１８）に関する抗ＣＥＡドメイン（Ｎ末端に位置する）のＶＬ−ＶＨ配向に対する細胞障害活性を示す。
【０１８６】
Ｃ末端に位置する抗ＣＥＡ部分を含む構築物と抗ＣＥＡ部分のＶＨ−ＶＬ配向について、図１７は、配列番号７７ＶＨＶＬｘＡ５ＶＨ−Ａ２４０ＶＬ（配列番号３０）、配列番号７７ＶＨＶＬｘＢ９ＶＨ−Ａ２４０ＶＬ（配列番号３６）、配列番号７７ＶＨＶＬｘＤ８ＶＨ−Ａ２４０ＶＬ（配列番号４４）、および配列番号７７ＶＨＶＬｘＣＥＡＩ  ＶＨ−Ａ２４０ＶＬ（配列番号２０）に関するＣＥＡ＋標的細胞に対する細胞障害性を提示する。配列番号７７ＶＨＶＬｘＣＥＡＩ  ＬＨを陽性対照として用いた。図１８は、抗ＣＥＡドメイン（Ｃ末端に位置する）のＶＬ−ＶＨ配向を含む構築物の配列番号７７ＶＨＶＬｘＡ２４０ＶＬ−Ａ５ＶＨ（配列番号２８）、配列番号７７ＶＨＶＬｘＡ２４０ＶＬ−Ｂ９ＶＨ（配列番号３８）、配列番号７７ＶＨＶＬｘＡ２４０ＶＬ−Ｄ８ＶＨ（配列番号４６）、および配列番号７７ＶＨＶＬｘＡ２４０ＶＬ−ＣＥＡＩ  ＶＨ（配列番号２２）に関する細胞障害活性を示す。配列番号７７ＶＨＶＬｘＣＥＡＩ  ＬＨ（配列番号２）を陽性対照として用いた。
【０１８７】
図２１は、ヒトＢ９ＶＨ領域とヒトＡ２４０ＶＬ領域を異なる配置で含む二重特異性一本鎖抗体構築物の細胞障害活性を示す。Ａ２４０ＶＬ−Ｂ９ＶＨｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号３４）、配列番号７７ＶＨＶＬｘＡ２４０ＶＬ−Ｂ９ＶＨ（配列番号３８）、配列番号７７ＶＨＶＬｘＢ９ＶＨ−Ａ２４０ＶＬ（配列番号３６）、およびＢ９ＶＨ−Ａ２４０ＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号３２）は、ヒトＣＥＡトランスフェクトＣＨＯ細胞に対する細胞障害活性を示した。
【０１８８】
５．ヒトＣＥＡｘＣＤ３二重特異性一本鎖抗体の可溶性ＣＥＡ抗原に対する抵抗性
可溶性ヒトＣＥＡ抗原の存在下、ヒト二重特異性一本鎖抗体についての競合アッセイを上記実施例５に示すように行った。図１９および２０は、構築物Ａ５ＶＨ−Ａ２４０ＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号２４）、Ｂ９ＶＨ−Ａ２４０ＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号３２）、Ｄ８ＶＨ−Ａ２４０ＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号４０）およびＣＥＡＩ  ＶＨ−Ａ２４０ＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号１６）に例示されるように、ヒト構築物についても、細胞障害活性の可溶性ＣＥＡ抗原に対する抵抗性を実証する；マウス由来二重特異性一本鎖抗体の可溶性ＣＥＡに対する抵抗性については、実施例５参照。さらに、図２２は、ＣＥＡ反応性の二重特異性一本鎖構築物Ａ２４０ＶＬ−Ｂ９ＶＨｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号３４）が、漸増量の可溶性ＣＥＡ抗原の存在下でＴ細胞を再指向してＣＨＯ−ＣＥＡ＋細胞を溶解させたことを示す。この実験は、Ａ２４０ＶＬ−Ｂ９ＶＨｘ配列番号７７ＶＨＶＬに媒介される細胞障害活性も可溶性ＣＥＡに対して抵抗性であることを実証する。最後に、図２７から導かれるように、二重特異性一本鎖構築物である配列番号７７ＶＨＶＬｘＥ１２ＶＨ−Ａ２４０ＶＬ（配列番号１４３）に媒介される細胞障害活性は、可溶性ＣＥＡに対して抵抗性である。
【０１８９】
従って、本発明は、高いレベルの可溶性ＣＥＡ抗原の存在下でさえ細胞障害性抗腫瘍活性を有する医薬組成物を提供する。上に述べたように、上皮性腫瘍患者において血清ＣＥＡ濃度が高いと、抗ＣＥＡ抗体に基づく治療法の成功が低下する。従って、本発明の医薬組成物は、患者の血清／血漿中の高い可溶性ＣＥＡ抗原濃度を特徴とする、進行性上皮性腫瘍（例えば、原発腫瘍の外科切除後の続発性、転移性腫瘍）、悪性上皮性腫瘍、高い（上皮性）腫瘍量および後期上皮性腫瘍の患者の治療に特に適している。さらに、本発明の医薬組成物はまた、低い投薬量で投与されることが予期される。それに加えて、前記医薬組成物は、本発明の医薬組成物中の二重特異性一本鎖抗体のヒト起源の抗ＣＥＡ部分と脱免疫化された抗ＣＤ３部分に起因して、患者に投与された場合に免疫原性となる可能性は低い。さらに、本発明の医薬組成物は、低分子量および小型の二重特異性一本鎖構築物に起因して、高い腫瘍浸透をもたらすことが予期される。その上、腫瘍治療のためには、該分子の高い細胞障害活性のために少量の二重特異性一本鎖抗体が用いられる。患者には少量が投与されると予期されるため、患者に対する有害作用は低減されるとも予期される。最後に、可溶性ＣＥＡに対する抵抗性のない二重特異性一本鎖抗体は、上に説明したように、それらは低い濃度で投与されるため、腫瘍患者の血漿中の低い濃度の可溶性ＣＥＡ抗原にさえも非常に感受性が高い。この問題もまた、本発明の医薬組成物により回避される。
【０１９０】
実施例９：高分解能陽イオン交換クロマトグラフィーによるＡ２４０ＶＬ−Ｂ９ＶＨｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号３４）の精製モノマーのタンパク質の同質性評価
精製されたＡ２４０ＶＬ−Ｂ９ＶＨｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号３４）構築物の同質性をさらに特性決定するため、単離モノマー画分を高分解能陽イオン交換クロマトグラフィーに付した。クロマトグラフィーは、２０ｍＭ ＭＥＳバッファーｐＨ５．５で平衡化したＭｉｎｉＳカラム（Ｍｉｎｉ  Ｓ  ＰＥ  ４．６／５０  ＣａｔＸ  ０．８ｍｌ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  １７−５００５−０１）で行われた。カラムに充填する前にサンプルを同じバッファーで１：３希釈した。結合したタンパク質を、６０カラム量中に１Ｍ ＮａＣｌを０〜３０％含有する平衡バッファー勾配を用いて溶出させた。残りのタンパク質を３カラム量の１Ｍ ＮａＣｌで溶出した。結果として得られるクロマトグラムは図２３に示され、単一の主ピークを有する同質のタンパク質画分を提示する。
【０１９１】
実施例１０：Ａ２４０ＶＬ−Ｂ９ＶＨｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号３４）の血漿安定性
Ａ２４０ＶＬ−Ｂ９ＶＨｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号３４）構築物の血漿安定性を、様々なインキュベーション条件下で、続いて実施例４に記載の標準的な５１クロム放出に基づく細胞障害性アッセイにより試験した。
【０１９２】
５名の健康なドナーの血液を含むヒト血漿プールを、ＥＤＴＡコートされたシリンジに血液を採取することにより作製した。細胞成分を遠心分離により取り除き、上部の血漿相を回収し、その後プールした。Ａ２４０ＶＬ−Ｂ９ＶＨｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号３４）構築物を、血漿の存在下または不在下、３７℃または４℃にてインキュベートした。対照として、構築物を細胞障害性アッセイの直前に血漿またはＲＰＭＩ１６４０培地にそれぞれ希釈した。ＣＨＯ−ＣＥＡ＋は標的細胞の役割を果たし；刺激を受けたＣＤ８＋Ｔ細胞をエフェクター細胞として用いた。効果：標的（Ｅ：Ｔ）比は１０：１であった。このアッセイの持続時間は１８時間であった。
【０１９３】
図２４に示されるように、ＣＥＡ反応性の二重特異性一本鎖構築物Ａ２４０ＶＬ−Ｂ９ＶＨｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（配列番号３４）は、極めて安定性であることが実証された；３７℃にて２４時間ヒト血漿中でのインキュベーションの後、細胞障害活性の損失は検出することができなかった。
【０１９４】
実施例１１：高分解能陽イオン交換クロマトグラフィーによる配列番号７７ＶＨＶＬｘＥ１２ＶＨ−Ａ２４０ＶＬ（配列番号１４３）の精製モノマーのタンパク質同質性評価
この実験は、配列番号７７ＶＨＶＬｘＥ１２ＶＨ−Ａ２４０ＶＬ（配列番号１４３）を分析することを除いて実施例９と同様に行った。結果として得られるクロマトグラムは図２５に示され、単一の主ピークを有する同質のタンパク質画分を提示する。
【０１９５】
実施例１２：配列番号７７ＶＨＶＬｘＥ１２ＶＨ−Ａ２４０ＶＬ（配列番号１４３）の血漿安定性
この実験は、配列番号７７ＶＨＶＬｘＥ１２ＶＨ−Ａ２４０ＶＬ（配列番号１４３）を分析することを除いて実施例１０と同様に行った。図２６に示されるように、ＣＥＡ反応性の二重特異性一本鎖構築物である配列番号７７ＶＨＶＬｘＥ１２ＶＨ−Ａ２４０ＶＬ（配列番号１４３）は極めて安定性であることが実証された；３７℃にて２４時間ヒト血漿中でのインキュベーションの後、細胞障害活性の損失は検出することができなかった。
【図面の簡単な説明】
【０１９６】
【図１】様々なヒトＣＥＡ反応性の二重特異性一本鎖構築物とヒトＣＥＡトランスフェクトＣＨＯ細胞およびＣＤ３陽性ＨＰＢ−ＡＩＩ細胞とのそれぞれのＦＡＣＳ結合分析。ＣＥＡ結合の陽性対照として、モノクローナル抗体ＣｏＩ−１を使用した。ヒトＣＤ３結合の陽性対照には、ＷＯ  ９９／０５４４４０号に記載のＣＤ１９ｘＣＤ３二重特異性一本鎖構築物を使用した。この陽性対照では、太い線は、１０μｇ／ｍｌの精製ＣＤ１９ｘＣＤ３二重特異性一本鎖抗体とともにインキュベートし、その後に抗Ｈｉｓ抗体および検出抗体とともにインキュベートした細胞を表す。細い柱状グラフ線は、陰性対照：抗Ｈｉｓ抗体および検出抗体とともにインキュベートした細胞を反映する。ヒト（膜結合）ＣＥＡおよびヒトＣＤ３の結合活性は、ＣＥＡＩ  ＶＨＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ、ＣＥＡＩ  ＶＬＶＨｘ配列番号７７ＶＨＶＬ、ＣＥＡＩＩ  ＶＨＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ、ＣＥＡＩＩＩ  ＶＬＶＨｘ配列番号７７ＶＨＶＬおよびＣＥＡＩＩＩ  ＶＨＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬについて検出可能であった。本発明に記載される二重特異性一本鎖抗体に対応するそれぞれの柱状グラフにおいて、細い線は陰性対照を表し、太い輝線は培養上清とともにインキュベートした細胞を表し、一方、太い暗線（大部分が右側）は、１０μｇ／ｍｌの精製二重特異性一本鎖抗体とともにインキュベートした細胞を表す。
【図２】直接ＥＬＩＳＡにより検出された、可溶性ＣＥＡに対する二重特異性一本鎖抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３抗体ＣＥＡＩ  ＶＨＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ、ＣＥＡＩＩ  ＶＨＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬおよびＣＥＡＩＩＩ  ＶＨＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬならびに抗ＣＥＡ抗体Ｃｏｌ−１の結合シグナル。ＣＥＡＩ  ＶＨＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（ｍＡｂ  Ａ５Ｂ７に由来する抗ＣＥＡ結合ドメイン）、ＣＥＡＩＩ  ＶＨＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（ｍＡｂ  Ｔ８４．６６に由来する抗ＣＥＡ結合ドメイン）、およびＣＥＡＩＩＩ  ＶＨＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（ｍＡｂ  ＭＦＥ−２３に由来する抗ＣＥＡ結合ドメイン）二重特異性一本鎖抗体ならびにマウスモノクローナル抗体Ｃｏｌ−１は、固定化された可溶性ヒトＣＥＡと特異的に結合した。可溶性ＣＥＡ抗原（ＰＢＳ対照）の不在下で結合シグナルは観察されなかった。
【図３】示されるＣＥＡ反応性の二重特異性一本鎖構築物は、可溶性ＣＥＡの不在下で、Ｔ細胞を再指向してＣＥＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を溶解させた。刺激を受けたヒトＣＤ８陽性ＣＴＬをエフェクター細胞として用いた。再指向による溶解（redirected lysis）の特異性を実証するため、非ＣＥＡ反応性の二重特異性一本鎖構築物を陰性対照として含めた。ヒトＣＥＡトランスフェクト標的細胞（ＣＨＯ−ＣＥＡ+細胞）に対する細胞障害活性は、様々なドメイン配置、すなわち、配列番号７７ＶＨＶＬｘＣＥＡＩ  ＶＨＶＬおよび配列番号７７ＶＨＶＬｘＣＥＡＩ  ＶＬＶＨ（両構築物は抗ＣＤ３結合ドメインをＮ末端に含む）、ならびにＣＥＡＩ  ＶＬＶＨｘ配列番号７７ＶＨＶＬおよびＣＥＡＩ  ＶＨＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ（抗ＣＤ３結合ドメインをＣ末端に含む）について示すことができた。非トランスフェクトＣＨＯ細胞（ヒトＣＥＡを欠く）を陰性対照として用いた。
【図４】示されるＣＥＡ反応性の二重特異性一本鎖構築物は、可溶性ＣＥＡの不在下で、Ｔ細胞を再指向してＣＥＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を溶解させた。再指向による溶解の特異性を実証するため、非トランスフェクトＣＨＯ細胞を陰性対照として含めた。刺激を受けたヒトＣＤ８陽性ＣＴＬをエフェクター細胞として用いた。ＣＥＡＩ−ＨＬ（ＣＥＡＩ  ＶＨＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ）、ＣＥＡＩＩＩ−ＬＨ（ＣＥＡＩＩＩ  ＶＬＶＨｘ配列番号７７ＶＨＶＬ）、ＣＥＡＩＩＩ−ＨＬ（ＣＥＡＩＩＩ  ＶＨＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ）、およびＣＥＡＩＩ  ＨＬ（ＣＥＡＩＩ  ＶＨＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ）は、ヒトＣＥＡトランスフェクトＣＨＯ細胞に対する細胞障害活性を示した。非トランスフェクトＣＨＯ細胞（ヒトＣＥＡを欠く）をＣＥＡＩ−ＬＨ（ＣＥＡＩ  ＶＬＶＨｘ配列番号７７ＶＨＶＬ）、ＣＥＡＩＩＩ−ＨＬ（ＣＥＡＩＩＩ  ＶＨＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ）およびＣＥＡＩＩ−ＨＬ（ＣＥＡＩＩ  ＶＨＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ）の陰性対照として用いた。ＣＥＡＩは、マウスｍＡｂ  Ａ５Ｂ７に由来する可変領域を意味し、ＣＥＡＩＩは、マウスｍＡｂ  Ｔ８４.６６に由来する可変領域であり、ＣＥＡＩＩＩは、マウスｍＡｂ  ＭＦＥ−２３由来の可変領域を指す。
【図５】示されるＣＥＡ反応性の二重特異性一本鎖構築物は、可溶性ヒトＣＥＡの存在下で、Ｔ細胞を再指向してＣＥＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を溶解させた。刺激を受けたヒトＣＤ８陽性ＣＴＬをエフェクター細胞として用いた。ＣＥＡＩ  ＶＬＶＨｘ配列番号７７ＶＨＶＬおよびＣＥＡＩ  ＶＨＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬに媒介される細胞障害活性は、１μｇ／ｍｌまでの漸増量の可溶性ヒトＣＥＡにより阻害されない。ＣＥＡＩは、マウスｍＡｂ  Ａ５Ｂ７に由来する可変領域である。
【図６】示されるＣＥＡ反応性の二重特異性一本鎖構築物は、可溶性ヒトＣＥＡの存在下で、Ｔ細胞を再指向してＣＥＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を溶解させた。刺激を受けたヒトＣＤ８陽性ＣＴＬをエフェクター細胞として用いた。配列番号７７ＶＨＶＬｘＣＥＡＩ  ＶＨＶＬおよび配列番号７７ＶＨＶＬｘＣＥＡＩ  ＶＬＶＨに媒介される細胞障害活性は、１μｇ／ｍｌまでの漸増量の可溶性ヒトＣＥＡにより阻害されない。ＣＥＡＩは、マウスｍＡｂ  Ａ５Ｂ７に由来する可変領域である。
【図７】示されるＣＥＡ反応性の二重特異性一本鎖構築物は、可溶性ヒトＣＥＡの存在下で、Ｔ細胞を再指向してＣＥＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を溶解させた。刺激を受けたヒトＣＤ８陽性ＣＴＬをエフェクター細胞として用いた。ＣＥＡＩＩ  ＶＨＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬの細胞障害活性は、漸増量の可溶性ＣＥＡにより阻害された。ＣＥＡＩＩ  ＶＨＶＬは、ｍＡｂ  Ｔ８４．６６に由来する。
【図８】示されるＣＥＡ反応性の二重特異性一本鎖構築物は、可溶性ヒトＣＥＡの存在下で、Ｔ細胞を再指向してＣＥＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を溶解させた。刺激を受けたヒトＣＤ８陽性ＣＴＬをエフェクター細胞として用いた。ＣＥＡＩ  ＶＨＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬに媒介される細胞障害性が可溶性ＣＥＡ抗原による阻害に抵抗性であるのに対して、ＣＥＡＩＩＩ  ＶＨＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬに媒介される細胞障害活性は、少量の可溶性ＣＥＡにさえも阻害される。ＣＥＡＩＩＩ  ＶＨＶＬは、ｍＡｂ  ＭＦＥ−２３に由来するのに対し、ＣＥＡＩは、マウスｍＡｂ  Ａ５Ｂ７に由来する可変領域である。
【図９】示されるＣＥＡ反応性の二重特異性一本鎖構築物は、漸増量の可溶性ＣＥＡ抗原の存在下で、Ｔ細胞を再指向してＫａｔｏＩＩＩ細胞を溶解させた。未変性のヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として用いた。ＣＥＡＩＩ  ＶＨＶＬｘ配列番号７７に媒介される細胞障害活性は、可溶性ＣＥＡに対して抵抗性でない。ＣＥＡＩＩ  ＶＨＶＬは、ｍＡｂ  Ｔ８４．６６に由来する。
【図１０】示されるＣＥＡ反応性の二重特異性一本鎖構築物は、漸増量の可溶性ＣＥＡ抗原の存在下で、Ｔ細胞を再指向してＫａｔｏＩＩＩ細胞を溶解させた。刺激を受けたヒトＣＤ８陽性ＣＴＬをエフェクター細胞として用いた。ＣＥＡＩ  ＶＨＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬに媒介される細胞障害性は、可溶性ＣＥＡに対して抵抗性である。対照的に、ＣＥＡＩＩ  ＶＨＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬに媒介される細胞障害活性は、漸増量の可溶性ＣＥＡにより阻害される。ＣＥＡＩＩ  ＶＨＶＬは、ｍＡｂ  Ｔ８４．６６に由来するのに対し、ＣＥＡＩは、マウスｍＡｂ  Ａ５Ｂ７に由来する可変領域である。
【図１１】示されるＣＥＡ反応性の二重特異性一本鎖構築物は、漸増量の可溶性ＣＥＡ抗原の存在下で、Ｔ細胞を再指向してＣＥＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を溶解させた。刺激を受けたヒトＣＤ８陽性ＣＴＬをエフェクター細胞として用いた。ＣＥＡＩＩ  ＶＨＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬに媒介される細胞障害活性は、漸増量の可溶性ＣＥＡにより阻害される。ＣＥＡＩＩ  ＶＨＶＬは、ｍＡｂ  Ｔ８４．６６に由来する。
【図１２】Ｆｌａｇがタグされた、選択されたクローン由来のｓｃＦｖタンパク質断片を含有する周辺質調製物のフローサイトメトリー分析を示す。可溶性ｓｃＦｖタンパク質断片の周辺質調製物を１００，０００〜２００，０００個のＣＥＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に添加した。検出のため、モノクローナル抗Ｆｌａｇ抗体を用い、その後にＰＥ標識ポリクローナル抗マウス抗体を用いた。細胞と結合しているＳｃＦｖを、蛍光強度を増加させて、ＰＢＳのみでインキュベートした細胞と比較して測定した。蛍光強度をＸ軸にブロットし、イベントの数をＹ軸にブロットした。陰性対照（ＰＢＳおよび検出試薬）は黒く塗られた曲線で示し、個別のｓｃＦｖは灰色の線で示す。右への移動は細胞との正の結合を示す。全てのｓｃＦｖ、すなわち、Ａ−１２１、Ａ−１８３、Ａ２４０、Ａ−３１３、Ａ−２９０、Ａ−３１５、Ａ４−３５、Ａ４−５２およびＭＰ２−Ａ５は、ＣＨＯ細胞上で膜と結合したＣＥＡと結合する。ｓｃＦｖの各々は、実施例６に記載されるように、マウスＡ５Ｂ７ＶＨ領域とヒトＶＬ領域からなる。
【図１３】Ｆｌａｇがタグされた、選択されたクローン由来のｓｃＦｖタンパク質断片を含有する周辺質調製物のフローサイトメトリー分析を示す。可溶性ｓｃＦｖタンパク質断片の周辺質調製物を１００，０００〜２００，０００個のＣＥＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に添加した。モノクローナル抗Ｆｌａｇ抗体、続いてＰＥ標識ポリクローナル抗マウス抗体で検出を行った。細胞と結合しているＳｃＦｖを、蛍光強度を増加させて、ＰＢＳのみでインキュベートした細胞と比較して測定した。蛍光強度をＸ軸にブロットし、イベントの数をＹ軸にブロットした。陰性対照（ＰＢＳおよび検出試薬）は黒く塗られた曲線で示し、個別のｓｃＦｖは灰色の線で示す。右への移動は細胞との正の結合を示す。完全ヒト化ｓｃＦｖ構築物ＭＰ５１０＿３Ａ５．３、ＭＰ５１０＿３−Ｂ９．１、およびＭＰ５１０＿３−Ｄ８．１はＣＨＯ細胞上で膜と結合したＣＥＡと結合する。これらのｓｃＦｖの各々は、実施例７に記載されるように、ヒトＶＨ領域とヒトＶＬ領域Ａ２４０からなる。２４０Ｖλ.３は、マウスＡ５Ｂ７  ＶＨ領域とヒトＶＬ  Ａ−２４０領域からなるｓｃＦｖである。この構築物はまた、ＣＥＡ結合活性を示す。
【図１４】様々なヒトＣＥＡ反応性の二重特異性一本鎖構築物とＫａｔｏＩＩＩ細胞およびＨＰＢ−ＡＩＩ細胞とのそれぞれのＦＡＣＳ結合分析。太い線は、抗Ｈｉｓ抗体および検出抗体とともにインキュベートした、トランスフェクトＣＨＯ細胞の細胞培養上清でインキュベートした細胞を表す。細い柱状グラフ線は、陰性対照：抗Ｈｉｓ抗体および検出抗体とともにインキュベートした細胞を反映する。ヒト二重特異性一本鎖抗体構築物Ａ５ＶＨ−Ａ２４０ＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ、Ｂ９ＶＨ−Ａ２４０ＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ、およびＤ８ＶＨ−Ａ２４０ＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬは、Ｋａｔｏ細胞上でヒトＣＥＡと、ＨＰＢ−ＡＩＩ細胞上でヒトＣＤ３と結合する。ｍＡｂ  Ａ５Ｂ７に由来するＣＥＡ結合ドメインのＶＨ領域を含むＣＥＡＩ  ＶＨ−Ａ２４０ＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬは、同じ結合活性を示す。
【図１５】可溶性ＣＥＡの不在下で、ＣＥＡでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に再指向された、示されたＣＥＡ反応性の二重特異性一本鎖構築物の細胞障害性アッセイ。刺激を受けたヒトＣＤ８陽性ＣＴＬをエフェクター細胞として用いた。細胞障害活性は、構築物Ａ５ＶＨ−Ａ２４０ＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ、Ｂ９ＶＨ−Ａ２４０ＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ、Ｄ８ＶＨ−Ａ２４０ＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬおよびＣＥＡＩ  ＶＨ−Ａ２４０ＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬについて検出することができた。ＣＥＡＩ  ＶＨはｍＡｂ  Ａ５Ｂ７に由来するＶＨ領域である。
【図１６】可溶性ＣＥＡの不在下で、ＣＥＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に再指向された、示されたＣＥＡ反応性の二重特異性一本鎖構築物の細胞障害性アッセイ。刺激を受けたヒトＣＤ８陽性ＣＴＬをエフェクター細胞として用いた。この図は、Ａ２４０ＶＬ−Ａ５ＶＨｘ配列番号７７ＶＨＶＬ、Ａ２４０ＶＬ−Ｂ９ＶＨｘ配列番号７７ＶＨＶＬ、Ａ２４０ＶＬ−Ｄ８ＶＨｘ配列番号７７ＶＨＶＬ、およびＡ２４０ＶＬ−ＣＥＡＩ  ＶＨｘ配列番号７７ＶＨＶＬの細胞障害活性を実証する。
【図１７】可溶性ＣＥＡの不在下で、ＣＥＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に再指向された、示されたＣＥＡ反応性の二重特異性一本鎖構築物の細胞障害性アッセイ。刺激を受けたヒトＣＤ８陽性ＣＴＬをエフェクター細胞として用いた。ＣＥＡ＋標的細胞に対する細胞障害性は、配列番号７７ＶＨＶＬｘＡ５ＶＨ−Ａ２４０ＶＬ、配列番号７７ＶＨＶＬｘＢ９ＶＨ−Ａ２４０ＶＬ、配列番号７７ＶＨＶＬｘＤ８ＶＨ−Ａ２４０ＶＬ、配列番号７７ＶＨＶＬｘＣＥＡＩ  ＶＨ−Ａ２４０ＶＬおよび配列番号７７ＶＨＶＬｘＣＥＡＩ  ＶＬＶＨについて示される。
【図１８】可溶性ＣＥＡの不在下で、ＣＥＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に再指向された、示されたＣＥＡ反応性の二重特異性一本鎖構築物の細胞障害性アッセイ。刺激を受けたヒトＣＤ８陽性ＣＴＬをエフェクター細胞として用いた。細胞障害活性は、配列番号７７ＶＨＶＬｘＡ２４０ＶＬ−Ａ５ＶＨ、配列番号７７ＶＨＶＬｘＡ２４０ＶＬ−Ｂ９ＶＨ、配列番号７７ＶＨＶＬｘＡ２４０ＶＬ−Ｄ８ＶＨ、および配列番号７７ＶＨＶＬｘＡ２４０ＶＬ−ＣＥＡＩ  ＶＨおよび配列番号７７ＶＨＶＬｘＣＥＡＩ  ＶＬＶＨついて示される。
【図１９】漸増量の可溶性ＣＥＡ抗原の存在下で、ＣＥＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に再指向された、示されたＣＥＡ反応性の二重特異性一本鎖構築物の細胞障害性アッセイ。刺激を受けたヒトＣＤ８陽性ＣＴＬをエフェクター細胞として用いた。この図は、Ａ５ＶＨ−Ａ２４０ＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬおよびＢ９ＶＨ−Ａ２４０ＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬについて例証されるように、可溶性ＣＥＡ抗原に対するヒト二重特異性一本鎖抗体構築物の細胞障害活性の抵抗性を実証する。
【図２０】漸増量の可溶性ＣＥＡ抗原の存在下で、ＣＥＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に再指向された、示されたＣＥＡ反応性の二重特異性一本鎖構築物の細胞障害性アッセイ。刺激を受けたヒトＣＤ８陽性ＣＴＬをエフェクター細胞として用いた。ヒト二重特異性一本鎖抗体構築物Ｄ８ＶＨ−Ａ２４０ＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬおよびＣＥＡＩ  ＶＨ−Ａ２４０ＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬもまた、可溶性ＣＥＡ抗原に対する抵抗性を示す。
【図２１】示されるＣＥＡ反応性の二重特異性一本鎖構築物は、可溶性ＣＥＡの不在下で、Ｔ細胞を再指向してＣＥＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を溶解させた。再指向による溶解の特異性を実証するため、非トランスフェクトＣＨＯ細胞を陰性対照として含めた。刺激を受けたヒトＣＤ８陽性ＣＴＬをエフェクター細胞として用いた。Ａ２４０ＶＬ−Ｂ９ＶＨｘ配列番号７７ＶＨＶＬ、配列番号７７ＶＨＶＬｘＡ２４０ＶＬ−Ｂ９ＶＨ、配列番号７７ＶＨＶＬｘＢ９ＶＨ−Ａ２４０ＶＬ、Ｂ９ＶＨ−Ａ２４０ＶＬｘ配列番号７７ＶＨＶＬ、および配列番号７７ＶＨＶＬｘＣＥＡＩ  ＶＨＶＬは、ヒトＣＥＡトランスフェクトＣＨＯ細胞に対する細胞障害活性を示した。
【図２２】示されるＣＥＡ反応性の二重特異性一本鎖構築物は、漸増量の可溶性ＣＥＡ抗原の存在下で、Ｔ細胞を再指向してＣＨＯ−ＣＥＡ＋細胞を溶解させた。刺激を受けたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞をエフェクター細胞として用いた。Ａ２４０ＶＬ−Ｂ９ＶＨｘ配列番号７７ＶＨＶＬに媒介される細胞障害活性は、可溶性ＣＥＡに対して抵抗性である。
【図２３】二重特異性一本鎖構築物Ａ２４０ＶＬ−Ｂ９ＶＨｘ配列番号７７ＶＨＶＬの高分解能陽イオン交換クロマトグラム、青色の線（上側の曲線）は、タンパク質の全体的な電荷イソ型を示す。構築物の高同質性を示す、１つの単一ピークが検出された。
【図２４】ヒト血漿における２４時間のインキュベーション後の細胞障害性の評価に基づくタンパク質安定性アッセイ。ＣＥＡ反応性の二重特異性一本鎖構築物は、可溶性ＣＥＡの不在下で、ＣＥＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に再指向された。刺激を受けたヒトＣＤ８陽性ＣＴＬをエフェクター細胞として用いた。この図は、ヒト血漿中の二重特異性一本鎖構築物Ａ２４０ＶＬ−Ｂ９ＶＨｘ配列番号７７ＶＨＶＬの血漿安定性を実証する。構築物の細胞障害活性は、生理的条件下で、血漿タンパク質の影響を受けない。
【図２５】二重特異性一本鎖構築物である配列番号７７ＶＨＶＬｘＥ１２ＶＨ−Ａ２４０ＶＬの高分解能陽イオン交換クロマトグラム、青色の線（上側の曲線）は、タンパク質の全体的な電荷イソ型を示す。この図は、二重特異性一本鎖構築物である配列番号７７ＶＨＶＬｘＥ１２ＶＨ−Ａ２４０ＶＬの同質性を実証する。
【図２６】ヒト血漿における２４時間のインキュベーション後の細胞障害性の評価に基づくタンパク質安定性アッセイ。ＣＥＡ反応性の二重特異性一本鎖構築物は、可溶性ＣＥＡの不在下で、ＣＥＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に再指向された。刺激を受けたヒトＣＤ８陽性ＣＴＬをエフェクター細胞として用いた。この図は、ヒト血漿中の二重特異性一本鎖構築物である配列番号７７ＶＨＶＬｘＥ１２ＶＨ−Ａ２４０ＶＬの血漿安定性を実証する。構築物の細胞障害活性は、生理的条件下で、血漿タンパク質の影響を受けない。
【図２７】示されるＣＥＡ反応性の二重特異性一本鎖構築物は、漸増量の可溶性ＣＥＡ抗原の存在下で、Ｔ細胞を再指向してＣＨＯ−ＣＥＡ＋細胞を溶解させた。刺激を受けたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞をエフェクター細胞として用いた。二重特異性一本鎖構築物である配列番号７７ＶＨＶＬｘＥ１２ＶＨ−Ａ２４０ＶＬは、可溶性ＣＥＡに対して抵抗性である細胞障害活性を媒介した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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