(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分子の標的集団の第一の亜集団を選択的に増幅する方法であって、オリゴヌクレオチドの集団を使用して、核酸分子のより大きな標的集団内の核酸分子の第一の亜集団の増幅を開始する工程を含み、前記核酸分子の標的集団が生物試料からの全ＲＮＡを含み、
（ａ）各オリゴヌクレオチドがハイブリダイズ部分を含み、前記ハイブリダイズ部分が６個のヌクレオチドからなり、及び
（ｂ）オリゴヌクレオチドの集団が、所定の条件下で標的核酸集団の第一の亜集団にハイブリダイズするが、前記所定の条件下で標的核酸集団の第二の亜集団にハイブリダイズしないように選択され、
前記第二の亜集団が、グロビンｍＲＮＡ及び／又はｒＲＮＡ分子を含み、前記オリゴヌクレオチドの集団のハイブリダイズ部分が配列番号１〜９３３に記載の配列の少なくとも９０％を含む、方法。
【請求項２】
各オリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズ部分に対して５’に位置する所定の配列部分をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
所定の配列部分が転写プロモーターを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
所定の配列部分がＰＣＲ増幅用のプライマー結合部位を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
核酸分子の標的集団が哺乳動物の血液細胞から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
哺乳動物の血液細胞が、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球、赤血球及び血小板からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
核酸分子の標的集団が哺乳動物の血液細胞から得られるｍＲＮＡ分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
標的核酸集団の第二の亜集団が、核酸分子の標的集団中の最も豊富に表現された核酸分子から実質的になり、前記最も豊富に表現された核酸分子の各々が、核酸分子の標的配列に存在する全てのｍＲＮＡの少なくとも０．１％を構成する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
標的核酸集団の第二の亜集団が、リボソームＲＮＡ、リボソームＤＮＡ，グロビンＤＮＡ及びグロビンＲＮＡ、又はこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
核酸分子の標的集団の増幅が、核酸分子の標的集団を逆転写することに続き、ＲＮＡ分子を生成するためのインビトロ転写の工程を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
標的集団の増幅が、核酸分子の標的集団を逆転写することに続き、二本鎖ＤＮＡ分子を生成するためのＰＣＲ増幅の工程をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
逆転写工程がｄＮＴＰの存在下で実施され、ｄＮＴＰ濃度が５０〜５０００マイクロモルの範囲を含む、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
ｄＮＴＰ濃度が１０００〜２０００マイクロモルの範囲を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
所定のハイブリダイゼーション条件が４０℃〜５０℃の範囲のアニーリング温度を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
スペーサー部分が、各オリゴヌクレオチドの所定の配列部分とハイブリダイズ部分との間に配置されている、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
核酸分子の標的集団の第一の亜集団を選択的に増幅する方法であって、オリゴヌクレオチドの集団を使用して、核酸分子のより大きな標的集団内の核酸分子の第一の亜集団の増幅を開始する工程を含み、前記核酸分子の標的集団が生物試料からの全ＲＮＡを含み、
（ａ）各オリゴヌクレオチドがハイブリダイズ部分を含み、前記ハイブリダイズ部分が６個のヌクレオチド及び前記ハイブリダイズ部分に対して５’に位置する所定の配列部分からなり、並びに
（ｂ）オリゴヌクレオチドの集団が、所定の条件下で標的核酸集団の第一の亜集団にハイブリダイズするが、前記所定の条件下で標的核酸集団の第二の亜集団にハイブリダイズしないように選択され、
前記第二の亜集団がグロビンｍＲＮＡ及び／又はｒＲＮＡ分子を含み、前記オリゴヌクレオチドの集団のハイブリダイズ部分が、配列番号１〜９３３に記載の配列の少なくとも９０％を含む、方法。
【請求項１７】
所定の配列部分がインビトロ転写に適した転写プロモーターを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
所定の配列部分がＰＣＲ増幅用のプライマー結合部位を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
標的細胞から得られた核酸分子の標的集団の第一の亜集団を選択的に増幅する方法であって、オリゴヌクレオチドの集団を使用して、核酸分子のより大きな集団内の核酸分子の第一の亜集団の増幅を開始する工程を含み、前記核酸分子の標的集団が生物試料からの全ＲＮＡを含み、前記オリゴヌクレオチドの集団内の各オリゴヌクレオチドがハイブリダイズ部分及び前記ハイブリダイズ部分に対して５’に位置する所定の配列部分を含み、前記ハイブリダイズ部分が６個のヌクレオチドからなり、前記ハイブリダイズ部分が前記標的細胞から得られたｍＲＮＡ核酸分子に所定の条件下でハイブリダイズするが、前記標的細胞から得られたリボソームＲＮＡ、リボソームＤＮＡ、グロビンＤＮＡ又はグロビンＲＮＡの少なくとも１つには前記所定の条件下でハイブリダイズしないように選択され、前記オリゴヌクレオチドの集団のハイブリダイズ部分が、配列番号１〜９３３に記載の配列の少なくとも９０％を含む、方法。
【請求項２０】
所定の配列部分がインビトロ転写に適した転写プロモーターを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
核酸分子の標的集団の第一の亜集団を選択的に増幅する方法であって、前記核酸分子の標的集団が生物試料からの全ＲＮＡを含み、
（ａ）オリゴヌクレオチドの集団（各オリゴヌクレオチドはハイブリダイズ部分及び前記ハイブリダイズ部分に対して５’に位置する転写プロモーター部分を含み、前記ハイブリダイズ部分は６個のヌクレオチドからなり、前記オリゴヌクレオチドの集団が、所定の条件下で標的核酸集団の第一の亜集団にハイブリダイズするが、前記所定の条件下で標的核酸集団の第二の亜集団にハイブリダイズしないように選択され、前記第二の亜集団がグロビンｍＲＮＡ及び／又はｒＲＮＡ分子を含み、前記オリゴヌクレオチドの集団のハイブリダイズ部分が配列番号１〜９３３に記載の配列の少なくとも９０％を含む）を準備する工程と；
（ｂ）哺乳動物対象から単離されたｍＲＮＡを含む試料に、前記オリゴヌクレオチドの集団をアニールする工程と；
（ｃ）逆転写酵素を用いて、前記ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成する工程と；及び
（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼを用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成する工程と、
を含む、方法。
【請求項２２】
核酸分子の標的集団の第一の亜集団を選択的に増幅する方法であって、前記核酸分子の標的集団が生物試料からの全ＲＮＡを含み、
（ａ）オリゴヌクレオチドの第一の集団（各オリゴヌクレオチドはハイブリダイズ部分、前記ハイブリダイズ部分に対して５’に位置する第一のＰＣＲプライマー結合部位、及び前記第一ＰＣＲプライマー結合部位と前記ハイブリダイズ部分との間に配置されたスペーサー部分を含み、前記ハイブリダイズ部分は６個のヌクレオチドからなり、前記オリゴヌクレオチドの集団が、所定の条件下で標的核酸集団の第一の亜集団にハイブリダイズするが、前記所定の条件下で標的核酸集団の第二の亜集団にハイブリダイズしないように選択され、前記第二の亜集団がグロビンｍＲＮＡ及び／又はｒＲＮＡ分子を含み、前記オリゴヌクレオチドの集団のハイブリダイズ部分が配列番号１〜９３３に記載の配列の少なくとも９０％を含む）を準備する工程と；
（ｂ）哺乳動物対象から単離されたｍＲＮＡを含む試料に、前記オリゴヌクレオチドの集団をアニールする工程と；
（ｃ）逆転写酵素を用いて、前記ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成する工程と；
（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ及びオリゴヌクレオチドの第二の集団（各オリゴヌクレオチドは、ランダムなハイブリダイズ部分及び前記ハイブリダイズ部分に対して５’に位置する第二のＰＣＲ結合部位を含む）を用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成する工程と；並びに
（ｅ）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、第一のＰＣＲプライマー結合部位に結合する第一のＰＣＲプライマー及び第二のＰＣＲプライマー結合部位に結合する第二のＰＣＲプライマーを用いて、二本鎖ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅して、増幅された二本鎖ＤＮＡを生成させる工程と、
を含む、方法。
【請求項２３】
スペーサー部分が、１〜６ヌクレオチド長を有する、請求項１５又は２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸分子の増幅を開始するのに有用なオリゴヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子発現分析では、しばしば、出発核酸分子を増幅する。核酸分子の増幅は、逆転写（ＲＴ）、インビトロ転写（ＩＶＴ）又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）単独で、又はこれらの組み合わせによって、達成され得る。出発核酸分子は、ｍＲＮＡ分子であり得、ｍＲＮＡは、まず、相補的なｃＤＮＡ分子を合成し、次いで、第一のｃＤＮＡ分子に対して相補的である第二のｃＤＮＡ分子を合成し、これにより、二本鎖ｃＤＮＡ分子を作製することによって増幅される。第一鎖ｃＤＮＡの合成は、典型的には、逆転写酵素を用いて達成され、第二鎖ｃＤＮＡの合成は、典型的には、ＤＮＡポリメラーゼを用いて達成される。二本鎖ｃＤＮＡ分子は、ＲＮＡポリメラーゼを用いて相補的ＲＮＡ分子を作製するために使用することができ、元の出発ｍＲＮＡ分子の増幅がもたらされる。ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡ合成の開始を誘導するためにプロモーター配列を必要とする。相補的ＲＮＡ分子は、例えば、さらなる相補的ＤＮＡ分子を作製するためのテンプレートとして使用され得る。
【０００３】
核酸分子の増幅は、出発材料中の１つ又はそれ以上の標的核酸分子へ特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーの使用を必要とする。各オリゴヌクレオチドプライマーは、標的核酸分子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドのハイブリダイズ部分に対して５’に位置するプロモーター配列を含み得る。オリゴヌクレオチドのハイブリダイズ部分が短すぎる場合には、オリゴヌクレオチドは、標的核酸分子に安定的にハイブリダイズせず、増幅反応の開始、及びその後の増幅が起こらない。また、オリゴヌクレオチドのハイブリダイズ部分が短すぎる場合には、オリゴヌクレオチドは、標的核酸分子の１つ又は少数に特異的にハイブリダイズせず、多数の標的核酸分子に非特異的にハイブリダイズする。
【０００４】
異なる標的核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ分子）の複雑な混合物の増幅は、典型的には、異なる核酸配列を有する多数のオリゴヌクレオチドの集団の使用を必要とする。オリゴヌクレオチドの費用は、オリゴヌクレオチドの長さとともに増大する。コストを抑制するためには、オリゴヌクレオチドの標的配列への特異的ハイブリダイゼーションを確保するために必要とされる最小長より長くないオリゴヌクレオチドプライマーを作製することが好ましい。
【０００５】
しばしば、高度に発現されているＲＮＡ（例えば、リボゾームＲＮＡ）を増幅することは望ましくない。例えば、血液細胞中の遺伝子の発現を分析する遺伝子発現実験では、豊富に存在するグロビンｍＲＮＡ又はリボソームＲＮＡの多数コピーを増幅することによって、稀なｍＲＮＡのレベルの僅かな変化が不明確になり得る。従って、核酸分子の集団内の所望の核酸分子を選択的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマーの集団（例えば、最も高度に発現されているｍＲＮＡを除く、細胞中に発現されている全てのｍＲＮＡを選択的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマー）に対する需要が存在する。オリゴヌクレオチドの集団を合成するコストを低下させるために、各オリゴヌクレオチドのハイブリダイズ部分は、所定の条件下で、所望の標的配列への特異的ハイブリダイゼーションを確保するために必要とされるより長くすべきではない。
【発明の開示】
【０００６】
（発明の概要）
一態様において、本発明は、核酸分子の標的集団（例えば、最も高度に発現されているｍＲＮＡ種を除く、細胞種に発現されている全てのｍＲＮＡ分子）を選択的に増幅するための方法を提供する。本発明の本態様の方法は、それぞれ、核酸分子のより大きな集団内の核酸分子の標的集団の増幅を開始するためのオリゴヌクレオチドの集団を使用する工程を含む。オリゴヌクレオチドの集団は、所定の条件下で標的核酸集団の第一の亜集団にハイブリダイズするが、前記所定の条件下で標的核酸集団の第二の亜集団にハイブリダイズしないその能力に基づいて選択される。
【０００７】
別の態様において、本発明は、配列番号１から９３３に示されている核酸配列などのオリゴヌクレオチドの集団を提供する。これらのオリゴヌクレオチドは、例えば、グロビンｍＲＮＡ又はリボソームＲＮＡ分子に対して相補的なｃＤＮＡ分子の合成を開始せずに、哺乳動物の血液から単離されたｍＲＮＡ分子に対して相補的なｃＤＮＡ分子の合成を開始するために使用することが可能である。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの集団中の各オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズ部分に対して５’に位置する所定の配列部分をさらに含む。一実施形態において、所定の配列部分は、ＰＣＲ増幅における、又はインビトロ転写のためのプライマー結合部位として使用され得る転写プロモーターを含む。別の実施形態において、所定の配列部分は、転写プロモーターでないプライマー結合部位を含む。例えば、幾つかの実施形態において、本発明は、転写プロモーター（Ｔ７配列（配列番号９３４）など）が配列番号１から９３３に記されている配列を有するオリゴヌクレオチドの集団のメンバーに対して５’に位置する、オリゴヌクレオチドの集団を提供する。従って、幾つかの実施形態において、本発明は、各オリゴヌクレオチドが配列番号１から９３３に記されている配列を有するオリゴヌクレオチドの集団の異なるメンバーに対して５’に位置するＴ７プロモーター（配列番号９３４）からなる、オリゴヌクレオチドの集団を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、所定の配列部分がＰＣＲ合成反応を開始するのに有用であり、及びＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含まない少なくとも１つのプライマー結合部位を含む、オリゴヌクレオチドの集団を提供する。このような実施形態において使用するための所定の配列部分の代表例は、５’ＣＣＧＡＡＣＴＡＣＣＣＡＣＴＴＧＣＡＴＴ３’（配列番号９５６）として与えられ、これは、好ましくは、配列番号１から９３３に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドの集団のメンバーに対して５’に位置する。
【０００８】
別の態様において、本発明は、核酸分子の標的集団（例えば、最も高度に発現されているｍＲＮＡ種を除く、細胞種中で発現されている全てのｍＲＮＡ分子）を選択的に増幅するための試薬を提供する。本発明の本態様の試薬は、核酸分子の標的集団の増幅を開始するためのオリゴヌクレオチドの集団を含み、各ヌクレオチドは、６個、７個又は８個のヌクレオチドからなるハイブリダイズ部分を含む。幾つかの実施形態において、本発明は、ハイブリダイズ部分が配列番号１から９３３に記されている配列を有するオリゴヌクレオチドの集団のメンバーである、オリゴヌクレオチドの集団を含む試薬を提供する。従って、幾つかの実施形態において、本発明は、配列番号１から９３３に記されている配列の少なくとも１０％（少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％など）を含むオリゴヌクレオチドの集団を含む試薬を提供する。別の実施形態において、本発明は、転写プロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター（配列番号９３４））又はプライマー結合部位（例えば、配列番号９５６）などの所定の配列部分が配列番号１から９３３に記されている配列を有するオリゴヌクレオチドの集団のメンバーに対して５’に位置する、オリゴヌクレオチドの集団を含む試薬を提供する。従って、幾つかの実施形態において、本発明は、各オリゴヌクレオチドが配列番号１から９３３に記されている配列を有するオリゴヌクレオチドの集団の異なるメンバーに対して５’に位置するＴ７プロモーター（配列番号９３４）からなる、オリゴヌクレオチドの集団を含む試薬を提供する。
【０００９】
さらなる態様において、本発明は、核酸分子の標的集団（例えば、最も高度に発現されているｍＲＮＡ種を除く、細胞種中で発現されている全てのｍＲＮＡ分子）を選択的に増幅するためのキットを提供する。本発明の本態様のキットは、核酸分子の標的集団の増幅を開始するためのオリゴヌクレオチドの集団を含む試薬を含み、各オリゴヌクレオチドは、６個、７個又は８個のヌクレオチドからなるハイブリダイズ部分を含む。幾つかの実施形態において、本発明は、ハイブリダイズ部分が配列番号１から９３３に記されている配列を有するオリゴヌクレオチドの集団のメンバーであるオリゴヌクレオチドの集団を含む試薬を含むキットを提供する。従って、幾つかの実施形態において、本発明は、配列番号１から９３３に記されている配列の少なくとも１０％（少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％など）を含むオリゴヌクレオチドの集団を含む試薬を含むキットを提供する。別の実施形態において、本発明は、転写プロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター（配列番号９３４））などの所定の配列部分が配列番号１から９３３に記されている配列を有するオリゴヌクレオチドの集団のメンバーに対して５’に位置する、オリゴヌクレオチドの集団を含む試薬を含むキットを提供する。従って、幾つかの実施形態において、本発明は、各オリゴヌクレオチドが配列番号１から９３３に記されている配列を有するオリゴヌクレオチドの集団の異なるメンバーに対して５’に位置するＴ７プロモーター（配列番号９３４）からなるオリゴヌクレオチドの集団を含む試薬を含むキットを提供する。
【００１０】
別の態様において、本発明は、増幅されたＲＮＡ分子を生成させるために、核酸分子の標的集団を選択的に増幅する方法を提供する。本方法は、（ａ）オリゴヌクレオチドの集団を準備すること（各オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズ部分及び該ハイブリダイズ部分に対して５’に位置する転写プロモーター部分を含み、前記ハイブリダイズ部分は配列番号１から９３３を含むオリゴヌクレオチドの集団のメンバーである。）、（ｂ）哺乳動物対象から単離されたｍＲＮＡを含む試料に、オリゴヌクレオチドの前記集団をアニールすること、（ｃ）逆転写酵素を用いて、前記ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成すること、（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼを用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成すること、及び（ｅ）増幅されたＲＮＡを生成させるために、各オリゴヌクレオチドの転写プロモーター部分に結合するＲＮＡポリメラーゼを用いて、二本鎖ｃＤＮＡをＲＮＡへ転写すること、を含む。
【００１１】
別の態様において、本発明は、増幅されたＤＮＡ分子を生成させるために、核酸分子の標的集団を選択的に増幅する方法を提供する。本方法は、（ａ）オリゴヌクレオチドの第一の集団を準備すること（各オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズ部分及び該ハイブリダイズ部分に対して５’に位置する第一のＰＣＲプライマー結合部位を含み、前記ハイブリダイズ部分は、配列番号１から９３３を含むオリゴヌクレオチドの集団のメンバーである。）、（ｂ）哺乳動物対象から単離されたｍＲＮＡを含む試料に、オリゴヌクレオチドの前記集団をアニールすること、（ｃ）逆転写酵素を用いて、前記ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成すること、（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ及びオリゴヌクレオチドの第二の集団を用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成すること（各オリゴヌクレオチドは、ランダムなハイブリダイズ部分及び該ハイブリダイズ部分に対して５’に位置する第二のＰＣＲ結合部位を含む。）、並びに（ｅ）増幅された二本鎖ＤＮＡを生成させるために、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、第一のＰＣＲプライマー結合部位に結合する第一のＰＣＲプライマー及び第二のＰＣＲプライマー結合部位に結合する第二のＰＣＲプライマーを用いて、二本鎖ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅すること、を含む。
【００１２】
添付の図面と合わせて、以下の詳細な記述を参照することによって、先述の態様及び本発明に伴う利点の多くがよりよく理解されるので、先述の態様及び本発明に伴う利点の多くがより容易に理解される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本明細書に具体的に定義されていなければ、本明細書中で使用される全ての用語は、本発明の分野における当業者に対する意味と同一の意味を有する。本分野の定義及び用語に関しては、当業者は、特に、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｐｌａｉｎｓｖｉｅｗ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ４７），  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９９」を参照されたい。
【００１４】
一態様において、本発明は、核酸分子の標的集団を選択的に増幅するための方法を提供する。本発明の本態様の方法は、それぞれ、核酸分子のより大きな集団内の核酸分子の標的集団の（例えば、逆転写、インビトロ転写若しくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又はこれらの組み合わせによる）増幅を開始するためのオリゴヌクレオチドの集団を使用する工程を含み、（ａ）各オリゴヌクレオチドは、６ヌクレオチド又は７ヌクレオチド又は８ヌクレオチドからなるハイブリダイズ部分を含み、及び（ｂ）所定の条件下で標的核酸集団の第一の亜集団へハイブリダイズするが、前記所定の条件下で標的核酸集団の第二の亜集団にハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドの集団が選択される。オリゴヌクレオチドの集団が、ハイブリダイズ部分の５’に位置する所定の配列部分も含み得る。一実施形態において、所定の配列部分は、転写プロモーターを含み、転写プロモーターはプライマー結合部位としても使用することができる。従って、本発明の本態様のある種の実施形態において、オリゴヌクレオチドの集団の各オリゴヌクレオチドは、６ヌクレオチド又は７ヌクレオチド又は８ヌクレオチドからなるハイブリダイズ部分、及び該ハイブリダイズ部分に対して５’に位置している転写プロモーター部分を含む。別の実施形態において、所定の配列部分は、ＰＣＲ増幅反応において使用するための第一のプライマー結合部位を含み、第一のプライマー結合部位は、場合によって、転写プロモーターを含み得る。例として、本発明によって提供されるオリゴヌクレオチドの集団は、本発明の本態様の方法の実施において有用である。
【００１５】
例えば、本発明の一実施形態において、哺乳動物の血液細胞由来の全て又は実質的に全てのｍＲＮＡ分子の増幅を開始するためのプライマーとして使用することが可能であるが、哺乳動物の血液細胞由来のグロビンｍＲＮＡ又はリボソームＲＮＡの増幅を開始しない、それぞれが６ヌクレオチドの長さを有するオリゴヌクレオチドの集団（配列番号１から９３３）が同定された。オリゴヌクレオチドの同定された集団（配列番号１から９３３）は、さほどランダムでない（ＮＳＲ）プライマーと称される。従って、哺乳動物の血液細胞から単離されたｍＲＮＡ分子の出発集団を代表するが、グロビンｍＲＮＡ又はリボソームＲＮＡに対応するｃＤＮＡ分子の多数を含まない核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ）の集団の合成を開始するために、オリゴヌクレオチドのこの集団（配列番号１から９３３）を使用することが可能である。本発明は、Ｔ７プロモーター（配列番号９３４）などの所定の配列が配列番号１から９３３に記されている配列を有するオリゴヌクレオチドの集団のメンバーに対して５’に位置する、オリゴヌクレオチドの集団も提供する。従って、各オリゴヌクレオチドは、標的核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ）にハイブリダイズするハイブリダイズ部分（配列番号１から９３３から選択される。）及びハイブリダイズ部分に対して５’に位置するプロモーター配列を含み得る。プロモーター配列は、（Ｔ７プロモーターを含む）オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて増幅されたＤＮＡ分子中に取り込まれ得、その後、ＤＮＡ分子からの転写を促進することが可能である。あるいは、転写プロモーターなどの所定の配列部分は、例えば、ＤＮＡリガーゼ酵素によって、ｃＤＮＡ分子へ共有結合され得る。
【００１６】
標的核酸集団の第一の亜集団は、例えば、例えば、最も豊富に発現されているｍＲＮＡなど、ｍＲＮＡの選択された群を除く、細胞又は組織中で発現されている全てのｍＲＮＡを含み得る。豊富に発現されているｍＲＮＡは、典型的には、細胞又は組織中に発現されている全てのｍＲＮＡの少なくとも０．１％を占める（及び、例えば、細胞又は組織中に発現されている全てのｍＲＮＡの５０％超又は６０％超又は７０％超を占め得る。）。豊富に発現されているｍＲＡＮの例は、ある種の血液細胞中のグロビンｍＲＮＡである。有用な転写プロモーター配列としては、Ｔ７プロモーター（５’ＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ３’）（配列番号９３４））、ＳＰ６プロモーター（５’ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＧＮＧ３’（配列番号９３５））及びＴ３プロモーター（５’ΑＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＧＡ３’（配列番号９３６））が挙げられる。
【００１７】
本発明の方法は、例えば、高度に発現されているＲＮＡ（例えば、グロビンｍＲＮＡ又はリボゾームＲＮＡ）などの増幅された試料から（ＮＳＲプライマーにハイブリダイズしない）ｍＲＮＡの群の存在を低下させることが望ましい、全血などの生物試料中の全ＲＮＡのトランスクリプトームのプロファイリングに有用である。幾つかの実施形態において、本発明の方法は、ＮＳＲプライマーにハイブリダイズする増幅された核酸分子の量に比べて、ｍＲＮＡ試料に由来する増幅された核酸中のＮＳＲプライマーにハイブリダイズしない核酸分子の群の量を、少なくとも２倍、最大１０００倍（少なくとも１０倍、５０倍、１００倍、５００倍又はそれ以上など）低下させるために使用され得る。
【００１８】
本発明の本態様の方法を実施するために使用されるオリゴヌクレオチドの集団は、オリゴヌクレオチドのより大きな集団内から選択され、（ａ）オリゴヌクレオチドの亜集団は、所定の条件下で標的核酸集団の第一の亜集団へハイブリダイズするが、前記所定の条件下で標的核酸集団の第二の亜集団にハイブリダイズしない能力に基づいて選択され；及び（ｂ）オリゴヌクレオチドの集団は、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド又は８ヌクレオチドの長さを有する全ての可能なオリゴヌクレオチドを含む。
【００１９】
オリゴヌクレオチドの集団の組成。オリゴヌクレオチドの集団は、６ヌクレオチド又は７ヌクレオチド又は８ヌクレオチドの長さを有する全ての可能なオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドの集団は、６ヌクレオチドの長さを有する全ての可能なオリゴヌクレオチド、又は７ヌクレオチドの長さを有する全ての可能なオリゴヌクレオチド、又は８ヌクレオチドの長さを有する全ての可能なオリゴヌクレオチドのみを含み得る。場合によって、オリゴヌクレオチドの集団は、６ヌクレオチドの長さを有する全ての可能なオリゴヌクレオチド、又は７ヌクレオチドの長さを有する全ての可能なオリゴヌクレオチド、又は８ヌクレオチドの長さを有する全ての可能なオリゴヌクレオチドに加えて、他のオリゴヌクレオチドを含み得る。典型的には、オリゴヌクレオチドの集団の各メンバーは、３０ヌクレオチド長以下である。
【００２０】
オリゴヌクレオチドの集団の配列。６ヌクレオチドの長さを有する４，０９６の可能なオリゴヌクレオチドが存在する。７ヌクレオチドの長さを有する１６，３８４の可能なオリゴヌクレオチドが存在する。８ヌクレオチドの長さを有する６５，５３６の可能なオリゴヌクレオチドが存在する。オリゴヌクレオチドの集団を構成するオリゴヌクレオチドの配列は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｏｒｄなどのコンピュータプログラムによって容易に生成させることができる。
【００２１】
オリゴヌクレオチドの亜集団の選択。オリゴヌクレオチドの亜集団は、オリゴヌクレオチドの亜集団のメンバーが、所定の条件下で、標的核酸集団の第一の亜集団へハイブリダイズするが、同一の所定の条件下で標的核酸集団の第二の亜集団のメンバーのかなりの数にハイブリダイズしない能力に基づいて、オリゴヌクレオチドの集団から選択される。標的核酸集団は、増幅されたＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡを産生するために（例えば、逆転写、インビトロ転写、ポリメラーゼ連鎖反応又はこれの組み合わせを用いて）増幅されるべき核酸分子を含み、及び増幅されるべきでない核酸分子も含む核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ又はＤＮＡ分子）の集団である。オリゴヌクレオチドの亜集団は、各々が、所定の条件下で、増幅されるべき核酸分子の集団全体に分配された配列にハイブリダイズするが、同一の所定の条件下で、増幅されるべきでない核酸分子の多く（又は全て）にハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドから構成される。オリゴヌクレオチドの亜集団は、所定の条件下で、意図的に回避されたもの以外の標的核酸配列にハイブリダイズする。
【００２２】
例えば、哺乳動物の血液細胞（例えば、ヒト血液細胞）中で発現された全てのｍＲＮＡ分子の集団は、核酸分子の標的集団とすることが可能である。この標的集団は、グロビンタンパク質をコードする多くのｍＲＮＡ分子を含有する。この標的集団は、多くのリボソームＲＮＡ分子（例えば、５Ｓ、１８Ｓ及び２８ＳリボソームＲＮＡ）も含有する。典型的には、グロビンｍＲＮＡ又はリボソームＲＮＡを増幅することは望ましくない。例えば、血液細胞中の遺伝子の発現を分析する遺伝子発現実験では、豊富なグロビンｍＲＮＡ又はリボソームＲＮＡの多数コピーの増幅は、より豊富でないｍＲＮＡのレベルの僅かな変化を不明確にし得る。その結果、本発明の実施において、所定の条件下で、多くの（又は全ての）グロビンｍＲＮＡ又は多くの（又は全ての）リボソームＲＮＡにハイブリダイズしないが、同一の所定の条件下で、血液細胞中で発現されている他のｍＲＮＡ分子の多く（好ましくは全て）にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの亜集団が選択される。血液細胞の例には、白血球（例えば、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球及び単球）、赤血球及び血小板が含まれる。
【００２３】
所定の条件下で、標的核酸集団の第一の亜集団にハイブリダイズするが、前記所定の条件下で、前記標的核酸集団の第二の亜集団にハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドの亜集団を選択するためには、標的核酸集団の第二の亜集団のメンバーの完全な又は実質的に完全な核酸配列を知ることが必要である。従って、例えば、第二の亜集団がグロビンｍＲＮＡ及びリボソームＲＮＡを含む場合には、グロビンｍＲＮＡ（又は代表的なグロビンｍＲＮＡ）並びに５Ｓ、１８Ｓ及び２８ＳリボソームＲＮＡ（又はリボソームＲＮＡの前記クラスの各々の代表的メンバー）の核酸配列を知ることが必要である。
【００２４】
次いで、グロビンｍＲＮＡ及びリボソームＲＮＡの配列と、オリゴヌクレオチド集団中の全オリゴヌクレオチドの配列（例えば、全ての可能な６核酸オリゴヌクレオチドの集団）を比較して、何れのオリゴヌクレオチドが、所定のハイブリダイゼーション条件下で、グロビンｍＲＮＡ及びリボソームＲＮＡの何れかの部分にハイブリダイズするかを決定するために、適切なソフトウェアプログラムが使用される。所定のハイブリダイゼーション条件下で、グロビンｍＲＮＡ及びリボソームＲＮＡの何れの部分にもハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドのみが選択される。核酸配列の比較及び所定のハイブリダイゼーション条件下で互いにハイブリダイズする配列の同定を可能とするパールスクリプトを容易に記述し得る。
【００２５】
従って、例えば、実施例１により完全に記載されているように、何れかのリボソームＲＮＡ配列の何れかの部分に対して正確に相補的でなく、又はグロビンｍＲＮＡ配列の何れかの部分に正確に相補的でない全ての可能な６核酸オリゴヌクレオチドの亜集団が同定された。一般的に、（所定の条件下で、標的核酸集団の第一の亜集団にハイブリダイズするが、前記所定の条件下で、前記標的核酸集団の第二の亜集団にハイブリダイズしない）オリゴヌクレオチドの亜集団は、標的核酸集団中の全て又は実質的に全ての核酸分子にハイブリダイズするのに十分な異なるオリゴヌクレオチド配列を含有しなければならない。本明細書の実施例２は、配列番号１から９３３に記載されている核酸配列を有するオリゴヌクレオチドの集団が、ＲｅｆＳｅｑと称される公に閲覧可能なデータベース中に格納されている遺伝子転写物の集団内の全て又は実質的に全ての核酸配列にハイブリダイズすることを示している。
【００２６】
さらなる所定の核酸配列部分。オリゴヌクレオチドの選択された亜集団（例えば、配列番号１から９３３）は、核酸分子の標的集団の増幅を開始するために使用することが可能である。あるいは、各オリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの選択された亜集団の１つのメンバーの配列を含み、さらなる所定の核酸配列も含むオリゴヌクレオチドの集団をプライマーとして使用することが可能である。さらなる所定の核酸配列は、典型的には、オリゴヌクレオチドの選択された亜集団のメンバーの配列に対して５’に位置している。典型的には、オリゴヌクレオチドの集団は、オリゴヌクレオチドの選択された亜集団の全てのメンバーの配列を含む（例えば、オリゴヌクレオチドの集団は、配列番号１から９３３に示されている配列の全てを含むことができる。）。
【００２７】
さらなる所定の核酸配列は、相補的標的配列に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特異性に影響を与えないように選択される。例えば、図１Ｃに記載されているように、各オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの選択された亜集団のメンバーの配列に対して５’に位置した転写プロモーター配列を含むことが可能である。プロモーター配列は、従って、ＲＮＡの合成用テンプレートとして使用することができる増幅された核酸分子中に取り込まれ得る。オリゴヌクレオチドの集団の所定の配列部分中には、あらゆるＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含めることが可能である。代表的な例としては、Ｔ７プロモーター（配列番号９３４）、ＳＰ６プロモーター（配列番号９３５）及びＴ３プロモーター（配列番号９３６）が挙げられる。
【００２８】
別の例において、図１Ｄに記載されているように、各オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの選択された亜集団のメンバーの配列に対して５’に位置するプライマー結合部位を含む所定の配列を含むことが可能である。プライマー結合部位は、増幅された核酸中に取りこまれ、次いで、増幅された核酸は、ｃＤＮＡから二本鎖の増幅されたＤＮＡ産物を作成するためのＰＣＲプライマー結合部位として使用することができる。プライマー結合部位は、例えば、表３５中に示されているように、転写プロモーター配列の一部であり得る。あるいは、プライマー結合部位は、転写プロモーター配列の一部（例えば、実施例１１に記載されているような、配列番号９５６）を含まない場合があり得る。
【００２９】
例えば、本発明の一実施形態は、オリゴヌクレオチドの集団を提供し、該集団の各オリゴヌクレオチドは、（ａ）オリゴヌクレオチドの亜集団のメンバーである６核酸オリゴヌクレオチドの配列（配列番号１から９３３）（オリゴヌクレオチドの亜集団は、哺乳動物の血液細胞中で発現されている全て又は実質的に全てのｍＲＮＡにハイブリダイズしないが、グロビンｍＲＮＡ又はリボソームＲＮＡにハイブリダイズしない。）；及び（ｂ）６核酸オリゴヌクレオチドの配列に対して５’に位置するＴ７転写プロモーター配列（配列番号９３４）を含む。一実施形態において、オリゴヌクレオチドの集団は、配列番号１から９３３に記されている６ヌクレオチド配列の全てを含む。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドの集団は、配列番号１から９３３に記されている６ヌクレオチド配列の少なくとも１０％（少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％など）を含む。
【００３０】
場合によって、スペーサー部分は、所定の配列部分及びハイブリダイズ部分の間に位置する。スペーサー部分は、典型的には、１から１２ヌクレオチド長（例えば、１から６ヌクレオチド長）であり、ヌクレオチドのあらゆる組み合わせを含むことができる。スペーサー部分は、例えば、ヌクレオチドのランダムな選択から構成され得る。スペーサー部分の全部又は一部は、ハイブリダイズ部分と同一の標的核酸配列にハイブリダイズし得、又はハイブリダイズし得ない。スペーサー部分の全部又は一部がハイブリダイズ部分と同一の標的核酸配列にハイブリダイズすれば、効果は、ハイブリダイズ部分及びハイブリダイズするスペーサー部分を含むオリゴヌクレオチドによって開始されるｃＤＮＡ合成の効率を増強させることである。
【００３１】
ハイブリダイゼーション条件。本発明の実施において、オリゴヌクレオチドの亜集団は、オリゴヌクレオチドの亜集団のメンバーが、所定の条件下で、標的核酸集団の第一の亜集団にハイブリダイズするが、同一の所定の条件下で標的核酸集団の第二の亜集団にハイブリダイズしない能力に基づいて、オリゴヌクレオチドの集団から選択される。所定のハイブリダイゼーション条件は、グロビンｍＲＮＡ又はリボソームＲＮＡを除く、試料中に存在する全ての核酸分子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを許容する。典型的には、ハイブリダイゼーション条件は、未変性二重鎖の融解温度（Ｔｍ）より２５℃から３０℃（例えば、１０℃）以下である。約１００塩基より多い核酸分子に対するＴｍは、式Ｔｍ＝８１．５＋０．４１％（Ｇ＋Ｃ）−ｌｏｇ（Ｎａ＋）（（Ｇ＋Ｃ）は、核酸分子のグアノシン及びシトシン含量である。）によって計算することが可能である。１００塩基長未満のオリゴヌクレオチド分子の場合、典型的なハイブリダイゼーション条件は、Ｔｍより５から１０℃低い。平均して、短いオリゴヌクレオチド二重鎖のＴｍは、約（５００／オリゴヌクレオチド長）℃だけ低下する。本発明の幾つかの実施形態において、ハイブリダイゼーション温度は、４０℃から５０℃の範囲である。適切なハイブリダイゼーション条件は、過度の実験操作なしに、経験的にも同定され得る。
【００３２】
増幅条件。本発明の実施において、標的核酸集団の第一の亜集団の増幅は、所定の増幅条件下で起こる。ハイブリダイゼーション条件は、上記のように選択することが可能である。典型的には、所定の増幅条件としては、逆転写酵素を用いた第一鎖ｃＤＮＡ合成が挙げられる。逆転写反応は、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）の所定の濃度の存在下で行われる。幾つかの実施形態において、ｄＮＴＰ濃度は、実施例５から９に記載されているように、標的遺伝子に対して増幅された産物を濃縮するために、約１０００から約２０００μＭの範囲である。
【００３３】
オリゴヌクレオチドの組成及び合成。本発明の実施において有用なオリゴヌクレオチドプライマーは、所望の反応をなお開始することができる限り、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、キメラ混合物又はこれらの誘導体若しくは修飾された様式とすることが可能である。オリゴヌクレオチドプライマーは、塩基部分、糖部分又はホスファート骨格において修飾することが可能であり、所望の増幅反応をなお開始させることができる限り、他の付加基又は標識を含み得る。
【００３４】
例えば、オリゴヌクレオチドプライマーは、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５Ｎ−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸、シュードウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル及び２，６−ジアミノプリンを含む（但し、これらに限定されない。）群から選択される少なくとも１つの修飾された塩基部分を含み得る。
【００３５】
同じく、例として、オリゴヌクレオチドプライマーは、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース及びヘキソースを含む（但し、これらに限定されない。）群から選択される少なくとも１つの修飾された糖部分を含むことができる。
【００３６】
さらなる例として、オリゴヌクレオチドプライマーには、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホルアミドチオアート、ホスホルアミダート、ホスホルジアミダート、メチルホスホナート、アルキルホスホトリエステル及びフォルムアセタール又はこれらの類縁体からなる群から選択される少なくとも１つの修飾されたホスファート骨格を含むことができる。
【００３７】
本発明の方法において使用するためのオリゴヌクレオチドプライマーは、非特異的な核酸切断化学若しくは酵素、又は部位特異的な制限エンドヌクレアーゼを用いたより大きな核酸断片の切断によって、又は本分野において公知の標準的な方法よる合成、例えば、自動化されたＤＮＡ合成装置（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどから市販されているものなど）及び標準的なホスホルアミダイト化学の使用による合成によって誘導され得る。例として、ホスホロチオアートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎら（Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．７５：３２０９−３２２１，１９８８）の方法によって合成され得、メチルホスホナートオリゴヌクレオチドは、制御された孔ガラスポリマー支持体の使用によって調製することができる（Ｓａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．５５：７４４８−７４５１，１９８８）。
【００３８】
所望のオリゴヌクレオチドが合成されたら、その上で合成された固相支持体からオリゴヌクレオチドを切除し、存在する全ての保護基を除去するために、本分野で公知の方法によって処理される。次いで、抽出及びゲル精製などの本分野で公知の何れかの方法によって、オリゴヌクレオチドを精製し得る。オリゴヌクレオチドの濃度及び純度は、アクリルアミドゲル上で分離されたオリゴヌクレオチドを調べることによって、又は分光光度計中で２６０ｎｍでの光学密度を測定することによって測定し得る。
【００３９】
本発明の本態様の方法は、例えば、ｍＲＮＡのコード領域、イントロン、遺伝子の選択的にスプライスされた形態のコード領域及び遺伝子発現を制御する非コードＲＮＡを選択的に増幅するために使用することが可能である。
【００４０】
別の実施形態において、本発明は、配列番号１から９３３に記されている核酸配列の少なくとも１０％（少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％など）を含むオリゴヌクレオチドの集団を提供する。例えば、これらのオリゴヌクレオチド（配列番号１から９３３）は、グロビンｍＲＮＡ又はリボソームＲＮＡ分子に対して相補的なｃＤＮＡ分子の合成を開始させずに、哺乳動物の血液から単離されたｍＲＮＡ分子に対して相補的なｃＤＮＡ分子の合成を開始させるために使用することが可能である。実際、例えば、これらのオリゴヌクレオチド（配列番号１から９３３）は、グロビンｍＲＮＡ又はリボソームＲＮＡの有意な量を増幅させずに、ｍＲＮＡ分子の全ての集団をテンプレートとして用いて、ｃＤＮＡの合成を開始させるために使用することが可能である。例えば、本発明は、転写プロモーター（Ｔ７プロモーター（配列番号９３４）など）などの所定の配列部分が、配列番号１から９３３に記されている配列を有するオリゴヌクレオチドの集団のメンバーに対して５’に位置する、オリゴヌクレオチドの集団を提供する。従って、幾つかの実施形態において、本発明は、各オリゴヌクレオチドが配列番号１から９３３に記されている配列を有するオリゴヌクレオチドの集団の異なるメンバーに対して５’に位置するＴ７プロモーター（配列番号９３４）からなるオリゴヌクレオチドの集団を提供する。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの集団は、配列番号１から９３３に記されている６ヌクレオチド配列の少なくとも１０％（２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％など）を含む。
【００４１】
別の態様において、本発明は、核酸分子の標的集団を選択的に増幅するための試薬を提供する。例えば、本試薬は、グロビンｍＲＮＡ又はリボソームＲＮＡ分子に対して相補的なｃＤＮＡ分子の合成を開始させずに、哺乳動物の血液細胞から単離されたｍＲＮＡ分子に対して相補的なｃＤＮＡ分子の合成を開始させるために使用することが可能である。本発明の試薬は、配列番号１から９３３に示されている核酸配列の少なくとも１０％を含むオリゴヌクレオチドの集団を含む。幾つかの実施形態において、本発明は、配列番号１から９３３に記されている６ヌクレオチドの配列の少なくとも１０％（２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％など）を含むオリゴヌクレオチドの集団を含む試薬を提供する。幾つかの実施形態において、グロビンｍＲＮＡ又はリボソームＲＮＡを除く、試料中に存在する実質的に全ての核酸分子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの集団が選択される。他の実施形態において、試料中に存在する核酸分子の亜群にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの集団が選択され、核酸分子の前記亜群は、グロビンｍＲＮＡ又はリボソームＲＮＡを含まない。
【００４２】
別の実施形態において、本発明は、転写プロモーター（Ｔ７プロモーターなど）を含む所定の配列部分が配列番号１から９３３に記されている配列を有するオリゴヌクレオチドの集団のメンバーに対して５’に位置する、オリゴヌクレオチドの集団を含む試薬を提供する。従って、幾つかの実施形態において、本発明は、各オリゴヌクレオチドが配列番号１から９３３に記されている配列を有するオリゴヌクレオチドの集団の異なるメンバーに対して５’に位置するＴ７プロモーター（配列番号９３４）からなるオリゴヌクレオチドの集団を含む試薬を提供する。
【００４３】
別の実施形態において、本発明は、プライマー結合部位を含む所定の配列部分が配列番号１から９３３に記されている配列を有するオリゴヌクレオチドの集団のメンバーに対して５’に位置する、オリゴヌクレオチドの集団を含む試薬を提供する。従って、幾つかの実施形態において、本発明は、各オリゴヌクレオチドが配列番号１から９３３に記されている配列を有するオリゴヌクレオチドの集団の異なるメンバーに対して５’に位置するプライマー結合部位（配列番号９５６）からなるオリゴヌクレオチドの集団を含む試薬を提供する。本発明の試薬は、水溶液又は水が除去された水溶液又は凍結乾燥された固体として提供することができる。
【００４４】
さらなる実施形態において、本発明の試薬は、二本鎖ｃＤＮＡを産生するための以下の成分：逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＲＮアーゼＨ酵素、Ｔｒｉｓ緩衝液、カリウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩、還元剤、デキシヌクレシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、β−ニコチンアミドアデニン二ヌクレオチド（β−ＮＡＤ＋）及びリボヌクレアーゼ阻害剤の１つ又はそれ以上を含み得る。例えば、試薬は、低下したＲＮアーゼＨ活性及び増加した熱安定性を有する逆転写酵素（例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩＩＲｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び５０から５０００μＭの範囲、又はより好ましくは、１０００から２０００μＭの範囲のｄＮＴＰの最終濃度など、第一鎖ｃＤＮＡ合成に対して最適化された成分を含み得る。
【００４５】
別の態様において、本発明は、核酸分子の標的集団を選択的に増幅するためのキットを提供する。幾つかの実施形態において、キットは、転写プロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター）などの所定の配列部分が配列番号１から９３３に記されている配列を有するオリゴヌクレオチドの集団のメンバーに対して５’に位置する、オリゴヌクレオチドの集団を含む試薬を含む。従って、幾つかの実施形態において、本発明は、各オリゴヌクレオチドが配列番号１から９３３に記されている配列を有するオリゴヌクレオチドの集団の異なるメンバーに対して５’に位置するＴ７プロモーター（配列番号９３４）からなる、オリゴヌクレオチドの集団を含む試薬を含有するキットを提供する。本実施形態に係るキットは、さほどランダムでない本発明のプライマーを用いて作製されたｃＤＮＡから、インビトロで転写されたＲＮＡを製造するのに有用である。
【００４６】
幾つかの実施形態において、キットは、各オリゴヌクレオチドが配列番号１から９３３に記されている配列を有するオリゴヌクレオチドの集団の異なるメンバーに対して５’に位置するプライマー結合部位として使用するのに適した所定の配列からなる、オリゴヌクレオチドの集団を含む試薬を含有する。本実施形態に係るキットは、本発明のさほどランダムでないプライマーを用いて作製されたｃＤＮＡのＰＣＲ増幅から生成された二本鎖ＤＮＡを製造するのに有用である。
【００４７】
本発明のキットは、本明細書に記載されている方法に従って、標的核酸集団の何れかの亜集団、例えば、最も豊富に発現されたｍＲＮＡを除く、細胞又は組織中に発現されている全てのｍＲＮＡを検出するために設計され得る。哺乳動物のｍＲＮＡ標的分子の非限定的な例として、哺乳動物の血液細胞由来のｍＲＮＡ分子の全て又は実質的に全てが挙げられる。典型的なオリゴヌクレオチドプライマーの非限定的な例として、配列番号１から９３３が挙げられる。転写プロモーターの非限定的な例は、配列番号９３４から９３６に記載されている。プライマー結合領域の非限定的な例は、配列番号９４６、９５５及び９５６として記載されている。
【００４８】
スペーサー部分には、標的ｍＲＮＡにハイブリダイズするヌクレオチドなど、ヌクレオチドのあらゆる組み合わせが含まれ得る。
【００４９】
ある種の実施形態において、キットは、６個、７個又は８個のヌクレオチドのハイブリダイズ部分を有するオリゴヌクレオチドプライマーを含む試薬を含む。
【００５０】
ある種の実施形態において、キットは、哺乳動物のｍＲＮＡ標的の複数を検出するために使用され得るオリゴヌクレオチドプライマーの集団を含む試薬を含む。
【００５１】
ある種の実施形態において、キットは、４０℃から５０℃の温度範囲でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。
【００５２】
別の実施形態において、キットは、ｒＲＮＡ又はグロビンｍＲＮＡを検出しないオリゴヌクレオチドの亜集団を含む。キットの本実施形態に従って使用するための典型的なオリゴヌクレオチドは、配列番号１から９３３に提供されている。
【００５３】
幾つかの実施形態において、キットは、配列番号１から９３３に記されている６ヌクレオチド配列の少なくとも１０％（少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％など）を含むオリゴヌクレオチドの集団を含む試薬を含む。
【００５４】
ある種の実施形態において、キットは、転写プロモーターがＴ７プロモーター（配列番号９３４）、ＳＰ６プロモーター（配列番号９３５）又はＴ３プロモーター（配列番号９３６）を含む、オリゴヌクレオチドを含む。
【００５５】
別の実施形態において、キットは、ヌクレオチドのあらゆる組み合わせを含む１から１２個のヌクレオチドのスペーサー部分を有するオリゴヌクレオチドを含み得る。
【００５６】
本発明の幾つかの実施形態において、キットは、ｃＤＮＡを産生するための以下の成分：逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ酵素、ＤＮＡリガーゼ酵素、ＲＮアーゼＨ酵素、Ｔｒｉｓ緩衝液、カリウム塩（例えば、塩化カリウム）、マグネシウム塩（例えば、塩化マグネシウム）、アンモニウム塩（例えば、硫酸アンモニウム）、還元剤（例えば、ジチオスレイトール）、デキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、β−ニコチンアミドアデニン二ヌクレオチド（β−ＮＡＤ＋）及びリボヌクレアーゼ阻害剤の１つ又はそれ以上をさらに含み得る。例えば、キットは、低下したＲＮアーゼＨ活性及び増加した熱安定性を有する逆転写酵素（例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩＩＲｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び５０から５，０００μＭの範囲、又はより好ましくは、１０００から２０００μＭの範囲のｄＮＴＰの最終濃度を与えるためのｄＮＴＰ原溶液など、第一鎖ｃＤＮＡ合成に対して最適化された成分を含み得る。
【００５７】
様々な実施形態において、キットは、ＰＣＲ増幅工程中に二本鎖ＤＮＡに優先的に又は排他的に結合するＳＹＢＲグリーン色素又はＢＥＢＯ色素などの検出試薬を含み得る。他の実施形態において、キットは、ＰＣＲ増幅産物の量を測定するために蛍光発光体及び消光物質を含むフォワード及び／又はリバースプライマーを含み得る。
【００５８】
本発明のキットは、増幅されたｃＤＮＡのインビトロ転写のための試薬も提供し得る。例えば、幾つかの実施形態において、キットは、以下の成分−ＲＮＡポリメラーゼ酵素、ＩＰＰアーゼ（イノシトールポリホスファート１−ホスファターゼ）酵素、転写緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）、マグネシウム塩（例えば、塩化マグネシウム）、スペルミジン、還元剤（例えば、ジチオスレイトール）、ヌクレオシド三リン酸（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ）及びアミノアリルＵＴＰの１つ又はそれ以上をさらに含み得る。
【００５９】
別の実施形態において、キットは、標識されたｃＤＮＡ試料をマイクロアレイにハイブリダイズさせる際に使用するために、インビトロ転写産物をＣｙ３又はＣｙ５色素で標識するための試薬を含み得る。
【００６０】
キットは、場合によって、ｍＲＮＡ標的の選択的増幅においてキットを使用するための指示書を含む。キットには、増幅されたｃＤＮＡ分子のインビトロ転写のための指示書並びにインビトロ転写産物を標識し、及びマイクロアレイにハイブリダイズさせるための指示書を場合によって提供することも可能である。
【００６１】
別の態様において、本発明は、増幅されたＲＮＡ分子を生成するために、核酸分子の標的集団を選択的に増幅する方法を提供する。本方法は、（ａ）オリゴヌクレオチドの集団を準備すること（各オリゴヌクレオチドはハイブリダイズ部分及び該ハイブリダイズ部分に対して５’に位置する転写プロモーター部分を含み、前記ハイブリダイズ部分は配列番号１から９３３を含むオリゴヌクレオチドの集団のメンバーである。）；（ｂ）哺乳動物対象から単離されたｍＲＮＡを含む試料に、前記オリゴヌクレオチドの集団をアニールすること；（ｃ）逆転写酵素を用いて、前記ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成すること；（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼを用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成すること；及び（ｅ）増幅されたＲＮＡを生成するために、各オリゴヌクレオチドの転写プロモーター部分に結合するＲＮＡポリメラーゼを用いて、二本鎖ｃＤＮＡをＲＮＡへ転写すること、を含む。図１Ｃは、本発明の本態様に係る本方法の代表的実施形態を示している。本明細書に記載されている方法及び試薬は、本発明の本態様の実施において有用である。
【００６２】
別の態様において、本発明は、増幅されたＤＮＡ分子を生成するために、核酸分子の標的集団を選択的に増幅する方法を提供する。本方法は、（ａ）オリゴヌクレオチドの第一の集団を準備すること（各オリゴヌクレオチドはハイブリダイズ部分及び該ハイブリダイズ部分に対して５’に位置する第一のＰＣＲプライマー結合部位を含み、前記ハイブリダイズ部分は配列番号１から９３３を含むオリゴヌクレオチドの集団のメンバーである。）、（ｂ）哺乳動物対象から単離されたｍＲＮＡを含む試料に、前記オリゴヌクレオチドの集団をアニールすること、（ｃ）逆転写酵素を用いて、前記ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成すること、（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ及びオリゴヌクレオチドの第二の集団を用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成すること（各オリゴヌクレオチドは、ランダムなハイブリダイズ部分及び該ハイブリダイズ部分の５’に位置する第二のＰＣＲ結合部位を含む。）、並びに（ｅ）増幅された二本鎖ＤＮＡを生成するために、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、第一のプライマー結合部位に結合する第一のＰＣＲプライマー及び第二のＰＣＲプライマー結合部位に結合する第二のＰＣＲプライマーを用いて、二本鎖ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅すること、を含む。図１Ｄは、本発明の本態様の本方法の代表的実施形態を示している。
【００６３】
本発明の本態様に従って、第一鎖ｃＤＮＡから第二鎖ＤＮＡ分子を合成するために、あらゆるＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用し得る。例えば、第二鎖ＤＮＡ分子を合成するために、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｒｅｎｏｗ断片を使用することが可能である。第二鎖ＤＮＡ分子の合成は、６から９個のランダムなヌクレオチドからなるハイブリダイズ部分を含み、及び該ハイブリダイズ部分に対して５’に位置する所定の配列部分をさらに含むオリゴヌクレオチドの第二の集団を用いて開始される。所定の配列部分は、配列がオリゴヌクレオチドの第一の集団中に含有される所定の配列と異なっていれば、あらゆる適切な配列を含み得る。プライマー配列の選択に応じて、これらの所定の配列部分は、例えば、第二のＤＮＡ分子からＤＮＡ依存性ＲＮＡ合成を選択的に誘導するために、及び／又はＤＮＡ依存性ＤＮＡ合成を介して二本鎖ｃＤＮＡテンプレートを増幅するために使用することが可能である。
【００６４】
二本鎖ＤＮＡ分子の精製：第二のＤＮＡ分子の合成は、図１Ｄに示されているように、第一のＤＮＡ分子が第二のＤＮＡ分子にハイブリダイズされる二本鎖ＤＮＡ分子の集団を与える。典型的には、二本鎖ＤＮＡ分子は、第二のプライマーの全て又は実質的に全て（すなわち、典型的には、９９％超）など、５０塩基対より短い実質的に全ての核酸分子を除去するために精製される。好ましくは、精製方法は、実質的に二本鎖であるＤＮＡ分子を選択的に精製し、対を形成していない実質的に全ての一本鎖核酸分子（一本鎖プライマーなど）を除去する。精製は、サイズ分画カラムを通じた溶出によるなど、本分野で認められたあらゆる手段によって達成することが可能である。次いで、精製された第二のＤＮＡ分子は、例えば、沈殿させ、本発明の本態様の方法の次の段階のために適切な緩衝液中に再溶解させることができる。
【００６５】
二本鎖ＤＮＡ分子の増幅。本発明の本態様の方法の実施において、二本鎖ＤＮＡ分子は、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて酵素的に増幅されたテンプレートとして使用される。ポリメラーゼ連鎖反応を開始させるために、あらゆる適切なプライマーを使用することが可能である。典型的には、２つのプライマーが使用され、一方のプライマーは第一のプライマー配列の所定の部分（又はその相補物）にハイブリダイズし、他方のプライマーは第二のプライマー配列の所定の部分（又はその相補物）にハイブリダイズする。
【００６６】
ＰＣＲ増幅条件。一般的に、ポリメラーゼ連鎖反応中の増幅サイクルの数が多くなるほど、得られる増幅されたＤＮＡの量は多くなる。他方で、増幅サイクルが多すぎると、二本鎖ＤＮＡのランダムに偏った増幅がもたらされ得る。従って、幾つかの実施形態において、増幅サイクルの望ましい数は、１０から３０増幅サイクルなどの５から３５増幅サイクルなど、５と４０増幅サイクルの間である。
【００６７】
温度条件に関しては、典型的には、サイクルは、９５℃などの融解温度；約４０℃から７０℃までを変動するアニーリング温度及び典型的には約７２℃である伸長温度を含む。アニーリング温度に関しては、幾つかの実施形態において、アニーリング温度は、約５５℃から６５℃、より好ましくは６０℃である。
【００６８】
一実施形態において、本発明の本態様において使用するための増幅条件は、（９５℃、３０秒；６０℃、３０秒；７２℃、６０秒）の１０サイクル、次いで、（９５℃、３０秒；６０℃、３０秒、７２℃、６０秒の２０サイクル（各サイクルごとに、伸長工程に＋１０秒が付加される。））を含む。
【００６９】
本発明の本態様の方法において使用するためのＰＣＲ反応成分に関して、ｄＮＴＰは、典型的には、５０μＭから２０００μＭ、より好ましくは８００から１０００μＭのｄＮＴＰの範囲で反応中に存在し、ＭｇＣｌ２は、典型的には、０．２５ｍＭから１０ｍＭ、より好ましくは約４ｍＭの範囲で反応中に存在する。フォワード及びリバースＰＣＲプライマーは、典型的には、約５０ｎＭから２０００ｎＭで反応中に存在し、より好ましくは、約１０００ｎＭの濃度で存在する。
【００７０】
ＤＮＡ標識。ハイブリダイゼーション実験中におけるプローブ（ＤＮＡチップをスクリーニングするために使用されるプローブなど）としての使用を容易にするために、増幅されたＤＮＡ分子は、場合によって、色素分子で標識することが可能である。蛍光発光体及び化学発光などのあらゆる適切な色素分子を使用することが可能である。増幅されたＤＮＡ分子に色素分子を付着させるための典型的な方法は、実施例１５に記載されている。
【００７１】
本発明の本態様に係る方法は、例えば、全ＲＮＡを含有する生物試料（全血など）中でのトランスクリプトームプロファイリグのために使用され得る。幾つかの実施形態において、本発明の本態様の方法に従って産生された、増幅されたＤＮＡは、遺伝子発現実験において使用するために標識され、これにより、ＮＳＲによって開始されたｃＤＮＡから生成された、増幅されたＲＮＡより低いバッグラウンドレベルを典型的に生じるハイブリダイゼーションベースの試薬を提供する。
【００７２】
本発明の本態様の幾つかの実施形態において、第一及び／又は第二のプライマー結合領域の所定の配列部分は、１つ又はそれ以上の制限酵素部位を含み、これにより、増幅された部分に隣接する１つ又はそれ以上の制限酵素部位を有する増幅された二本鎖ＤＮＡ産物の集団を生成する。これらの増幅された産物は、配列分析のために直接使用し得、又は、制限酵素での消化によって放出させ、さらなる分析のための発現ベクターなどのあらゆる所望のベクター中にサブクローニングし得る。
【００７３】
以下の実施例は、本発明を実施するために、現在想定される最良の様式を例示するものに過ぎず、本発明を限定するものと解釈すべきではない。
【実施例１】
【００７４】
本実施例は、血液細胞中で発現されている全て又は実質的に全てのｍＲＮＡ分子にハイブリダイズするが、グロビンｍＲＮＡ又はリボソームＲＮＡにハイブリダイズしない９３３個の６マーオリゴヌクレオチド（配列番号１から９３３）の集団の選択について記載する。
【００７５】
各ヌクレオチドがＡ、Ｔ（又はＵ）、Ｃ又はＧである、全４０９６個の可能な６マーオリゴヌクレオチドを計算した。各６マーオリゴヌクレオチドの逆相補物を、１８Ｓ及び２８ＳｒＲＮＡのヌクレオチド配列、及び血液試料中の発現の高いレベルに基づいて選択された以下の６つのヘモグロビン遺伝子のヌクレオチド配列と比較した。
【００７６】
【表１】
0005409005.tif 000002
【００７７】
８つの転写物配列の何れかと完璧な合致を有する逆相補６マーオリゴヌクレオチドを除去した。９３３個の６マー（配列番号１から９３３）の逆相補物は、グロビン又はｒＲＮＡ転写物の何れの部分とも完璧に合致しなかった。グロビン又はｒＲＮＡ遺伝子の何れの部分とも完全に合致しない９３３個の６マーオリゴヌクレオチド（配列番号１から９３３）を、「さほどランダムでない（ＮＳＲ；Ｎｏｔ−Ｓｏ−Ｒａｎｄｏｍ）」プライマーと称する。
【実施例２】
【００７８】
本実施例は、配列番号１から９３３に記されている核酸配列を有するオリゴヌクレオチドの集団が、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ），Ｕ．Ｓ．  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ８６００  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  Ｐｉｋｅ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ  ２０８９４，  Ｕ．Ｓ．Ａ．のウェブサイトで閲覧可能なＲｅｆＳｅｑデータベース内の核酸配列上の４ないし５ヌクレオチドごとにハイブリダイズすることを示している。ＮＣＢＩの基準配列転写物データベース（ＲｅｆＳｅｑ）は、ヒトタンパク質コード転写物の黄金標準と考えられるものを含有している。
【００７９】
図１Ａに示されているように、ランダムな６マー（Ｎ６）は、ＲｅｆＳｅｑデータベースから得られる転写物配列（「ヌクレオチド配列」と表される。）上の全てのヌクレオチド位置においてアニールすることができる。その逆相補物がリボソームＲＮＡ及びグロビンｍＲＮＡに完全な合致する６マーを差し引いた後、残りのＮＳＲオリゴヌクレオチド（配列番号１から９３３）は、図１Ｂに示されているように、ＲｅｆＳｅｑデータベース内の核酸配列（「ヌクレオチド配列」と表される。）上の４ないし５ヌクレオチドごとに完全な合致を示す。図２に示されているように、ＮＳＲオリゴヌクレオチド結合部位は、ヘモグロビン遺伝子中には存在しない（図２には、「Ａ」として表されている。）。３つの遺伝子（ＬＣＥ１Ａ、ＣＬＥ１Ｄ、ＬＣＥ１Ｆ）からなる１つの非典型的な遺伝子ファミリー（図２中では、「Ｂ」として表されている。）は、１００ヌクレオチド当たり僅かに４つのＮＳＲ６マー結合部位を含有する。しかしながら、ＲｅｆＳｅｑ転写物は、通例、１００ヌクレオチド当たりの５ないし３０個のＮＳＲオリゴヌクレオチド（配列番号１から９３３）結合部位を全ての場所に有しており、多くの転写物は、１００ヌクレオチド当たり１５から２０個のＮＳＲ結合部位（図２では、「Ｃ」として表されている。）を有する。
【００８０】
従って、９３３個の６マー（配列番号１から９３３）の集団は、１８Ｓ、２８Ｓ及びヘモグロビン転写物を除く全ての転写物を増幅することができる。
【実施例３】
【００８１】
本実施例は、（各々が、５’末端に共有結合されたＴ７プロモーター（配列番号９３４）を有する）９３３個の６マー（配列番号１から９３３）を用いた、アクチンレポーターｍＲＮＡのＰＣＲ増幅が、グロビンｍＲＮＡ及びｒＲＮＡの増幅開始を選択的に低下させることを示している。
【００８２】
製造業者の指示書に従って、ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｉｎｃ．，  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  ＣＡ）を用いて、ヒト全血の各ドナーから全ＲＮＡを抽出した。５’末端に共有結合されたＴ７プロモーターを有する５μＭの６マー（配列番号１から９３３）（Ｔ７−ＮＳＲ６）又はランダムな９マー（Ｔ７−Ｎ９）を用いて、テンプレートＲＮＡ１００ｎｇからｃＤＮＡを合成するために、ＭＭＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）逆転写酵素（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用した。逆転写の前に、プライマー及びテンプレートを含有する水５μＬを６５℃で５分間変性させ、４℃で瞬間冷却し、２３℃に平衡化させた。逆転写のために、水１μＬ、５×Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒ（２５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３；３７５ｍＭＫＣｌ；１５ｍＭＭｇＣｌ２；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）、１００ｍＭＤＴＴ０．５μＬ、１０ｍＭｄＮＴＰ０．５μＬ及びＭＭＬＶ逆転写酵素１．０μＬ（５０単位／μＬ）を含有するＲＴマスター混合物５μＬを、試料混合物に添加した。４０℃で１２０分間、９５℃で５分間、１０μＬの反応物を温置し、室温まで冷却し、水で５倍希釈した。
【００８３】
逆転写後に、７９００ＨＴＰＣＲ機器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）を使用して、３８４ウェル光学ＰＣＲプレート中での定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって、１０μＬの最終反応容量中で、ｃＤＮＡ２μＬの２つ組みの測定を行った。ｑＰＣＲは、製造業者の推奨される条件を用いて、ＡＢＩＴａｑＭａｒ（Ｒ）アッセイ（真核生物の１８ＳｒＲＮＡ、ＡＢＩカタログ番号Ｈｓ９９９９９９０１ｓ１；ヒトβアクチン、ＡＢＩカタログ番号４３１０８８１Ｅ；ヒトβヘモグロビン、ＡＢＩカタログ番号Ｈｓ００７４７２２３ ｇ１；ＡＢＩ  Ａｓｓａｙ−ｂｙ−Ｄｅｓｉｇｎαグロビン；（フォワード５’−ＧＣＡＣＧＣＧＣＡＣＡＡＧＣＴ−３’（配列番号９３７）、リバース５’−ＧＧＧＴＣＡＣＣＡＧＣＡＧＧＣＡ−３’（配列番号９３８）、ＦＡＭプローブ５’−ＡＣＴＴＣＡＡＧＣＴＣＣＴＡＡＧＣＣＡＣ−３’（配列番号９３９）を使用して行った。ＰＣＲ後に、結果の表をＥｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｃｏｒｐ．，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ）に出力し、試料に対する定量的分析を生データから回帰した（存在量＝１０[（Ｃｔ−５）／−３．４]）。
【００８４】
９３３個のＮＳＲ６マー（配列番号１から９３３）を用いたヒト全血の全ＲＮＡの逆転写は、ｑＰＣＲによって測定されたところによると、ｃＤＮＡ中のグロビン及びｒＲＮＡ含量の著しい低下をもたらした。具体的には、Ｔ７−ＮＳＲ６によって開始されたｃＤＮＡは、ランダムな９マー（Ｔ７−Ｎ９）を用いて生成されたｃＤＮＡと比べて、αグロビン（５８％低下）、βグロビン（８５％低下）及び１８ＳｒＲＮＡ（７５％低下）の低下した存在量を示した。
【００８５】
表２中で以下に示されているように、Ｔ７−ＮＳＲ６によって開始されたｃＤＮＡは、ランダムな９マーを用いて生成されたｃＤＮＡと比べて、βグロビン（ＨＢＢ）（９４％低下）及び１８ＳｒＲＮＡ（９１％低下）の低下した存在量を示した。これに対して、２つのプライマープール（Ｔ７−Ｎ９及びＴ７−ＮＳＲ６）に対するβアクチンのｃＤＮＡレベルは、ＲＮＡの増幅後に同等であり、これは、３つの独立したドナーを用いて確認された結果である（データは示さず。）。
【００８６】
【表２】
0005409005.tif 000003
【実施例４】
【００８７】
本実施例は、（各々が、５’末端に共有結合されたＴ７プロモーター（配列番号９３４）を有する）９３３個の６マー（配列番号１から９３３）が、トランスクリプトームの相当な割合の増幅を開始することを示している。
【００８８】
ｃＤＮＡの複雑性を評価するために、９３３個の６マー（配列番号１から９３３）を使用して、２段階の逆転写及びインビトロ転写（ＩＶＴ）アプローチを用いて、２つの異なる細胞株（Ｊｕｒｋａｔ及びＫ５６２）由来の全ＲＮＡを増幅した。増幅産物を標識し、Ｊｕｒｋａｔ又はＫ５６２細胞の何れかの中で発現されていることが知られている約５０００個のヒト転写物に対するプローブを含有するＤＮＡマイクロアレイにハイブリダイズした。転写物のほぼ８２％（４２４４／５１９８）が、何れかの細胞株中で、バックグラウンドシグナル強度を上回るシグナル強度（ｌｏｇ強度＞−１．５）を報告した。さらに、９３３個の６マー（配列番号１から９３３）を用いて増幅されたＲＮＡから得られたＪｕｒｋａｔ／Ｋ５６２発現プロファイルは、ランダムに開始されたＪｕｒｋａｔ及びＫ５６２ｍＲＮＡから増幅された対照プロファイルに対して類似性の高い程度を示した（何れかの実験において、ｐ値＜０．０１を有するプローブに対して：相関係数＝０．７２）。
【００８９】
増幅実験は、以下のように実施した。細胞株Ｊｕｒｋａｔ（Ｔリンパ球、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＴＩＢ−１５２）及びＫ５６２（慢性骨髄性白血病、ＡＴＣＣＮｏ．ＣＣＬ−２４３）に対して、Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）から全ＲＮＡ及びｍＲＮＡを入手した。マイクロアレイハイブリダイゼーションのために増幅されたＲＮＡ（ａＲＮＡ）を生成させるために、逆転写及びインビトロ転写を用いた２段階増幅アプローチを使用した。実施例３に記載されているように、２０μＬの反応容量中で、全ＲＮＡ１μｇ及び５μＭプライマーからＮＳＲｃＤＮＡを合成したが、４０℃で６時間の延長された温置段階を用いた。実施例３に記載されているように、２０μＬの反応容量中で１０μＭのランダム９マーを用いて、ｍＲＮＡ１００ｎｇからｃＤＮＡを合成した。９３３個の６マー（配列番号１から９３３）及びランダムな９マーの５’末端に、Ｔ７プロモーター配列（配列番号９３４）を共有結合した。
【００９０】
インビトロ転写のために、５×Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ１６μＬ（０．２ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、５０ｍＭＮａＣｌ、３０ｍＭＭｇＣｌ２及び１０ｍＭスペルミジン；Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、１００ｍＭＤＴＴ６μＬ、２００ｍＭＭｇＣｌ２３．３μＬ、ＮＴＰ（２５ｍＭＡＴＰ、２５ｍＭＣＴＰ、２５ｍＭＧＴＰ、６ｍＭＵＴＰ）８μＬ、７５ｍＭアミノアリル−ＵＴＰ２μＬ、ＩＰＰアーゼ０．６μＬ（２Ｕ／μＬ）、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ０．０８μＬ（２．５ｋＵ／μＬ）、水２４μＬを含有するＩＶＴプレミックス６０μＬに、２０μＬのＲＴ反応物を添加し、４０℃で１６時間、７０℃で５分間温置し、室温まで冷却した。１Ｍバイカルボナート緩衝液中で１時間、最終産物をＣｙ３又はＣｙ５色素に結合させた。４Ｍヒドロキシルアミンの添加で反応を終了させた後、ＲＮＡｅａｓｙＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎを用いて精製した。分光光度計により、パーセント色素取り込み及び総ｃＤＮＡ収率を測定した。以前に記載されているとおり、Ｃｙ３／Ｃｙ５標識されたｃＤＮＡ試料の対を合わせて、マイクロアレイにハイブリダイズさせた（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｉｒｃｕｉｔｒｙ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ＭＡＰＫ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  Ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ａ  Ｍａｔｒｉｘ  ｏｆ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｆｉｌｅｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：８７３−８８０，２０００）。４８時間、アレイをハイブリダイズさせた後、洗浄し、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ上で走査した。
【００９１】
Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ）から、特注の高密度オリゴヌクレオチドアレイを入手した。以前に記載された実験から得たアレイプローブデザインに対して、計５１９８個の転写物を選択した（Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｆａｂｒｉｃａｔｅｄ  ｂｙ  ａｎ  ｉｎｋ−ｊｅｔ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ，”Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９（４）：３４２−３４７，２００１）。ヌクレオチド組成及びクロスハイブリダイゼーション能に基づいて、プローブ配列（６０マー）を選択し、各転写物に対する既知のポリアデニル化部位の少なくとも５００ｂｐ上流に配置した。データ解析は、以前に記載されているとおりに実施した（Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，上記）。
【実施例５】
【００９２】
本実施例は、第一鎖合成反応中のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）の濃度を増加させることによって、グロビンｍＲＮＡ及びｒＲＮＡに比べて、（各々が、５’末端に共有結合されたＴ７プロモーター（配列番号９３４）を有する）ＮＳＲプライマー（配列番号１から９３３を含む。）を用いたＩＧＦ１Ｒ及びＧＡＰＤＨレポーターｍＲＮＡの増幅を増加させることを示している。
【００９３】
方法：
本実施例では、以下のように、ＮＳＲプライマーを使用した。
【００９４】
６マー配列とＴ７プロモーター（配列番号９３４）の間に挿入された単一のランダムヌクレオチドを加えた９３３個の６マー（配列番号１から９３３）、「ＮＳＲ７」と称される。
【００９５】
実施例３に記載されているように、ヒト全血から全ＲＮＡを抽出した。１０μＭの６マー（配列番号１から９３３）又はランダム８マー（Ｎ８）を用いて、テンプレートＲＮＡ２００ｎｇからｃＤＮＡを合成するために、ＭＭＬＶ逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩＴＭ（“ＳＳＩＩＩ”）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用した。反応容量が２０μＬであったこと、２μＬのＳＳＩＩＩ逆転写酵素（２００単位／μＬ）を反応混合物に添加したこと、及びｄＮＴＰの濃度が５００から５，０００μＭまでを変動したことを除き、第一鎖合成は、実施例３に記載されているとおりに行った。４０℃で１２０分間、７０℃で１５分間、反応物を温置し、室温まで冷却し、１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．６、０．１ｍＭＥＤＴＡで、２倍希釈した。
【００９６】
レポーターとしてのヒトβアクチンを、ヒトインシュリン成長因子１受容体（ＩＧＦＲ１Ｒ）（ＡＢＩカタログ番号Ｈｓ００１８１３８５）及びヒトグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）（ＡＢＩカタログ番号４３１００８８４Ｅ−０５０７０２８）に対するＡＢＩＴａｑＭａｎアッセイに置き換えたことを除き、逆転写後、実施例３に記載されているとおりにｑＰＣＲを行った。ＰＣＲ後に、結果の表をＥｘｃｅｌに出力し、実施例３に記載されているように、試料に対する定量的分析を生データから回帰した。
【００９７】
（配列番号１から９３３を含む）ＮＳＲ７プライマー及びｄＮＴＰの漸増濃度を用いたヒト全血の全ＲＮＡの逆転写は、ＮＳＲ７で開始された反応の増加した特異性をもたらした。２つの独立した実験から得られたデータは、下表１から５に示されている。１０の（Ｃｔｓ×ｌｏｇ１０（１／２）＋１０）乗として表された生の存在量値（表３及び４）を、所定の標的遺伝子に対する最高のＮ８値に対して標準化した（表５及び６）。
【００９８】
【表３】
0005409005.tif 000004
【００９９】
【表４】
0005409005.tif 000005
【０１００】
【表５】
0005409005.tif 000006
【０１０１】
【表６】
0005409005.tif 000007
【０１０２】
次いで、１８ＳｒＲＮＡ、２８ＳｒＲＮＡ、αグロビン（ＨＢＡ）及びβグロビン（ＨＢＢ）バックグラウンド値に対するＩＧＦ１Ｒ及びＧＡＰＤＨレポーターの比である、バックグラウンドに対するレポーターの比（レポーター／バックグラウンド）を、ＮＳＲ７及びＮ８プライマープールに対して計算した。表７及び８に示されているように、ｄＮＴＰ濃度が増加するにつれて、ＮＳＲ７で開始されたレポーター／バックグラウンド比が劇的に増加した。
【０１０３】
【表７】
0005409005.tif 000008
【０１０４】
【表８】
0005409005.tif 000009
【０１０５】
比率の比は、ＮＳＲ７及びＮ８プライマープールに対するレポーター／バックグラウンド比の比較であり、ＮＳＲによって開始された反応の特異性の指標である。表９及び表１０に示されているように、比率の比は、より高いｄＮＴＰ濃度で劇的に増加した。
【０１０６】
【表９】
0005409005.tif 000010
【０１０７】
【表１０】
0005409005.tif 000011
【０１０８】
収率比は、Ｎ８によって開始されたｃＤＮＡ変換の出力と比較して、ＮＳＲ７によって開始されたｃＤＮＡ変換の出力を測定し、パーセントとして表されている（ＮＳＲをＮ８で除した。）。表１１及び表１２に示されているように、Ｎ８に対するＮＳＲの収率比は、ｒＲＮＡ及びグロビンｍＲＮＡに比べて、ＩＧＦ１Ｒ及びＧＡＰＤＨレポーターに対して大幅に高かった。比は、ＩＧＦ１Ｒ及びＧＡＰＤＨレポーターについては、ｄＮＴＰ濃度にわたって相対的に一定であったが、ｒＲＮＡ及びグロビン遺伝子については、ｄＮＴＰ濃度が増加するにつれて減少し、より高いｄＮＴＰ濃度でのレポーターの濃縮と合致していた。
【０１０９】
【表１１】
0005409005.tif 000012
【０１１０】
【表１２】
0005409005.tif 000013
【０１１１】
要約すると、本実施例は、（配列番号１から９３３を含む）ＮＳＲ７プライマーを用いて開始されたｃＤＮＡの絶対収率が低いｄＮＴＰ濃度において最も高かったのに対して、ランダムな８マーに比べた特異性は、より高いｄＮＴＰ濃度で増加したことを示している。このデータに基づくと、高い収率及び高い特異性を達成するためのｄＮＴＰの最適な濃度は、約１０００から約２０００μＭｄＮＴＰの範囲にあると思われる。
【実施例６】
【０１１２】
本実施例は、テンプレートＲＮＡの少量が逆転写され、インビトロ転写（ＩＶＴ）によって増幅されたときに、各々が５’末端に共有結合されたＴ７プロモーター（配列番号９３４）を有するＮＳＲプライマー（配列番号１から９３３を含む。）が、特異性を維持することを示している。
【０１１３】
最初の実験において、テンプレートＲＮＡの少量が使用された場合には、第二鎖合成及びＩＶＴ増幅工程の間に、ＮＳＲ７によって開始された特異性が失われることが決定された。ＩＶＴ増幅工程は、上に開示されているマイクロアレイ実験に対して十分なＲＮＡを産生するために必要とされる。
【０１１４】
以下のように、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＲＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｌ１０１６−０１）を使用することによって、テンプレートＲＮＡの少量から得られる、ＮＳＲ７によって開始された特異性が改善されることが観察された。
【０１１５】
方法：第一鎖ｃＤＮＡ合成は、ＮＳＲ７プライマープールとともに、１０００μＭｄＮＴＰ並びに全血全ＲＮＡテンプレート５０ｎｇ、１００ｎｇ及び２００ｎｇを用いて、実施例５に記載されているように実施した。各々が、５’末端に共有結合されたＴ７プロモーター（配列番号９３４）を有するランダムな７マー（Ｔ７−Ｎ７）及びランダムな８マー（Ｎ８）プライマーとともに、ＲＮＡテンプレート１００ｎｇを使用した。第二鎖ｃＤＮＡ合成のために、水９１μＬ、５×Ｓｅｃｏｎｄ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．９）、４５０ｍＭＫＣｌ、２３ｍＭＭｇＣｌ２、０．７５ｍＭβ−ＮＡＤ＋、５０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４）、１０ｍＭｄＮＴＰ３μＬ、ＤＮＡポリメラーゼＩ（１０単位／μＬ）４μＬ、ＤＮＡリガーゼ（１０単位／μＬ）１μＬ及びＲＮアーゼＨ（２単位／μＬ）１μＬを含有する第二鎖混合物１３０μＬに、第一鎖反応産物２０μＬを添加した。１６℃で１２０分間、反応を温置した。ＳｐｉｎＣａｒｔｒｉｄｇｅ及びキット中に供給されている緩衝液を用いて、二本鎖ｃＤＮＡを精製し、低度の熱ないし中程度の熱を加えながら、真空下での遠心によって、溶出されたｃＤＮＡの容量を２０μＬ未満まで減少させた。
【０１１６】
元のｍＲＮＡ標的に対して相補的なアンチセンスＲＮＡ（ａＲＮＡ）を転写するために、Ｔ７ポリメラーゼを用いたインビトロ転写によって、二本鎖ｃＤＮＡテンプレートを増幅した。ＩＶＴのために、精製されたｃＤＮＡの前記容量を２３μＬになるように水で調整し、１０×Ｔ７Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）４μＬ、Ｔ７ＥｎｚｙｍｅＭｉｘ（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを含む。）７μＬ、ＮＴＰ（それぞれ２５ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ及びＵＴＰ）を含有するＩＶＴ反応混合物１７μＬに添加し、６から１６時間、３７℃で温置した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって供給された、Ｓｐｉｎ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ及びａＲＮＡ  Ｂｉｎｄｉｎｇ及びＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒを用いて、得られた増幅されたａＲＮＡを精製し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓを用いて、ａＲＮＡの収率を定量した。
【０１１７】
一本鎖ｃＤＮＡを作製するために、ランダムな８マー（Ｎ８）を用いてａＲＮＡを逆転写した。逆転写のために、５×第一鎖緩衝液（２５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３；３７５ｍＭＫＣｌ；１５ｍＭＭｇＣｌ２）４μＬ、１０ｍＭｄＮＴＰ２μＬ、１００ｍＭＤＴＴ１μＬ、ＲＮＡｓｅＯＵＴＴＭ１μＬ（４０単位／μＬ）、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（２００単位／μＬ）２μＬを含有するＲＴ混合物２０μＬに、ａＲＮＡ５００ｎｇ又は１０００ｎｇを添加し、４０℃で６０分間、７０℃で１０分間温置し、氷上で冷却した。
【０１１８】
逆転写後に、ＩＧＦＲ１（カタログ番号Ｈｓ００１８１３８５）、ＧＡＰＤＨ（カタログ番号４３１００８８４Ｅ−０５０７０２８）、ＧＵＳＢ（カタログ番号４３１０８８８Ｅ）、ＡＣＴＩＮ（カタログ番号４３１０８８１Ｅ）、真核生物の１８ＳｒＲＮＡ（カタログ番号Ｈｓ９９９９９９０１ｓ１）及びヒトヘモグロビンβ（ＨＢＢ）（カタログ番号Ｈｓ００７４７２２３ｇ１）に対してＡＢＩ  Ｔａｑｍａｎ（Ｒ）アッセイを用いて、実施例３に記載されているように、ｑＰＣＲを行った。
【０１１９】
真核生物の２８ＳｒＲＮＡ及びヒトヘモグロビンα（ＨＢＡ）に対して、特注プライマー及びプローブ（５’−ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）レポーター色素及び無蛍光消光物質（ＮＦＱ；ｎｏ  ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ  ｑｕｅｎｃｈｅｒ）を、プローブの３’末端に含有する。）を以下のように使用した。
【０１２０】
真核生物の２８ＳｒＲＮＡ：
フォワードプライマー：５’ＡＣＧＧＴＧＧＣＣＡＴＧＧＡＡＧＴＣ３’（配列番号９４０）；
リバースプライマー：５’ＴＣＧＧＣＡＧＧＴＧＡＧＴＴＧＴＴＡＣＡＣ３’（配列番号９４１）；
ＦＡＭプローブ：５’ＡＣＴＣＣＴＴＡＧＣＧＧＡＴＴＣＣ３’（配列番号９４２）
【０１２１】
ヒトヘモグロビンα（ＨＢＡ）：
フォワードプライマー：５’ＧＣＡＣＧＣＧＣＡＣＡＡＧＣＴ３’（配列番号９４３）
リバースプライマー：５’ＧＧＧＴＣＡＣＣＡＧＣＡＧＧＣＡ３’（配列番号９４４）；
ＦＡＭプローブ：５’ＡＣＴＴＣＡＡＧＣＴＣＣＴＡＡＧＣＣＡＣ３’（配列番号９４５）
【０１２２】
（配列番号１から９３３を含む）ＮＳＲ７を用いたヒト全血の全ＲＮＡの逆転写に続くＩＶＴによって、図３に示されているように、入力ＲＮＡテンプレートの量に正比例するａＲＮＡの高い収率が生じた。
【０１２３】
ＲＮＡテンプレートの変動する量から得られたｃＤＮＡ及び逆転写されたＩＶＴ産物（ＩＶＴ−ＲＴ）の定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析が、表１３（生のＣｔ値）及び表１４（絶対的存在量）に示されている。プライマープールは、第一鎖ｃＤＮＡ合成のために使用されたプライマーを示している。産物は、ｃＤＮＡ又はＩＶＴ−ＲＴ産物の何れかがｑＰＣＲに対するテンプレートであったことを示している。
【０１２４】
【表１３】
0005409005.tif 000014
【０１２５】
【表１４】
0005409005.tif 000015
【０１２６】
バックグラウンドＲＮＡに対するレポーターの比が、表１５に示されている。最初の第一鎖ｃＤＮＡ工程（左列）の間に観察されたＴ７−Ｎ７に比べて、実質的なＮＳＲ７の特異性は、ほとんど存在しなかった。重要なことには、第一鎖合成工程からＩＶＴ工程（右列）に進むにつれて、ＮＳＲ７及びＴ７−Ｎ７両プライマーに対して、バックグラウンドＲＮＡに対するレポーターの比が増加した（Ｎ８に対して、データを標準化した。）。
【０１２７】
【表１５】
0005409005.tif 000016
【０１２８】
ＮＳＲ７によって開始されたｃＤＮＡから生成されたＩＶＴ産物の定量的ＰＣＲ分析は、各試料の組成が、３つの異なる全ＲＮＡ入力濃度（５０ｎｇ、１００ｎｇ及び２００ｎｇ）で、概ね同一であることを示した。組成は、レポーター及びバックグラウンドＩＶＴ産物の標準化された収率を表している。表１６に示されているように、標準化された収率は、入力ＲＮＡの４倍の範囲にわたって、レポーター及びバックグラウンド遺伝子の両方に対して極めて似通っていた。このデータは、ＩＶＴ産物が適切な標的ＲＮＡから増幅され、反応が非特異的な転写物材料によって凌駕されなかったことを示唆している。
【０１２９】
【表１６】
0005409005.tif 000017
【実施例７】
【０１３０】
本実施例は、各々が５’末端に共有結合されたＴ７プロモーター（配列番号９３４）を有するＮＳＲ７プライマー（配列番号１から９３３を含む。）を高いｄＮＴＰ濃度と組み合わせると、高い特異性で第一鎖ＲＴ産物が生成されること、及び標的遺伝子に関して大幅に濃縮されたＩＶＴ産物の高い収率を与えるために、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭＲＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でこれらの産物を増幅できることを示している。
【０１３１】
方法：
実施例５に記載されているように、４０μＬの反応容量でＮＳＲ７、Ｔ７−Ｎ７及びＮ８プライマーを用いて、全血全ＲＮＡ４００ｎｇを逆転写した。ｑＰＣＲによって、ＩＧＦ１Ｒ、ＧＡＰＤＨ、ｒＲＮＡ及びグロビンの存在量を評価するために、２０μＬ（２００ｎｇ全血全ＲＮＡ）を使用し、次いで、最も成績が優れているプライマーの組をＩＶＴに供した。２つのプライマー濃度（１０μＭ及び２５μＭ）及び２つのｄＮＴＰ濃度（１０００μＭ及び２５００μＭ）を評価した。第一鎖逆転写後の生のＣｔ及び絶対的存在量の値が、表１７及び表１８に示されている。
【０１３２】
実施例６に記載されているように、ＩＶＴ反応から得られたａＲＮＡの１μｇを、ｑＰＣＲ分析のために、逆転写によってｃＤＮＡに戻した。図４は、レポーター遺伝子ＩＧＦ１Ｒ及びＧＡＰＤＨの比活性が、高ｄＮＴＰ濃度の存在下で増加したのに対して、バックグラウンドｒＲＮＡの比活性及びグロビンｍＲＮＡは、高ｄＮＴＰ濃度の存在下で減少したことを示している。
【０１３３】
ＩＶＴ−ＲＴ反応産物のｑＰＣＲ後に生のＣｔ及び存在量の値は、表１９及び２０に示されている。第一鎖ＮＳＲ７及びＩＶＴ−ＲＴに対するレポーター／バックグラウンド比が、表２１に示されている。
【０１３４】
比率の比のデータによって、ｃＤＮＡへの変換及びｑＰＣＲ後に、第一鎖合成収率をＩＶＴ収率と比較することが可能となる。レポーター／バックグラウンド比及びＮＳＲ７／Ｎ８比の比較は、表２２に示されているように、ｄＮＴＰ濃度を１０００ｍＭから２５００ｍＭまで増加させることによって、ＮＳＲ７によって媒介される特異性の顕著な増加をもたらしたことを示している。プライマー濃度は、ＮＳＲ７によって媒介された特異性に対して、より目立たない影響を有していた。さらに、ＮＳＲ７によって開始されたｃＤＮＡ合成の収率／ＩＶＴ収率の比率を比較することによって、ｒＲＮＡ（１８Ｓ及び２８Ｓ）の劇的な相対的低下が示され、逆転写の第一巡目に観察されたｒＲＮＡｃＤＮＡは、ＩＶＴ中に転写されないことを示唆している（表２３）。第一鎖合成とＩＶＴの間でのバックグラウンドグロビンｍＲＮＡ収率の相対的低下は、ＮＳＲ７プライマーでは観察されなかった。ランダムな８マーで、第一鎖合成が開始された場合には、ＩＶＴ後に、ｒＲＮＡ及びグロビンｍＲＮＡの両者と比べて、レポーター遺伝子ＩＧＦ１Ｒ及びＧＡＰＤＨが濃縮された（表２４）。
【０１３５】
要約すると、本実施例は、（配列番号１から９３３を含む）ＮＳＲ７プライマーと組み合わせた高ｄＮＴＰ濃度は、高いＮＳＲ７特異性で第一鎖逆転写産物を与える。次いで、標的遺伝子が大幅に濃縮されているＩＶＴ産物の高い収率を与えるために、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＲＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、第一鎖産物を増幅することができる。
【０１３６】
【表１７】
0005409005.tif 000018
【０１３７】
【表１８】
0005409005.tif 000019
【０１３８】
【表１９】
0005409005.tif 000020
【０１３９】
【表２０】
0005409005.tif 000021
【０１４０】
【表２１】
0005409005.tif 000022
【０１４１】
【表２２】
0005409005.tif 000023
【０１４２】
【表２３】
0005409005.tif 000024
【０１４３】
【表２４】
0005409005.tif 000025
【実施例８】
【０１４４】
本実施例は、ｄＮＴＰの高濃度とともに、各々が５’末端に共有結合されたＴ７プロモーター（配列番号９３４）を有する（配列番号１から９３３を含む）ＮＳＲ７プライマーを使用すると、全血全ＲＮＡテンプレート濃度の幅広い範囲にわたって、ｒＲＮＡ及びグロビンｍＲＮＡに対してＩＧＦ１Ｒ及びＧＡＰＤＨレポーターｍＲＮＡの選択的な増強が起こることを示している。
【０１４５】
実施例５に記載されているように、ヒト全血全ＲＮＡを逆転写し、ｑＰＣＲによって分析した。テンプレートＲＮＡの量は、２０ｎｇ、５０ｎｇ、１００ｎｇ、５００ｎｇ、１０００ｎｇ、２０００ｎｇ及び５０００ｎｇであった。ｒＲＮＡ及びグロビンｍＲＮＡに対する、ＮＳＲ７媒介性のＩＧＦ１Ｒ及びＧＡＰＤＨレポーターの濃縮（ＮＳＲ７対Ｎ８に対する比率の比によって求めた。）は、全てのテンプレート量で観察される（表２５及び表２６）。ＮＳＲ対Ｎ８に対するレポーター／バックグラウンド比率の比は、より高いテンプレート量で増加するが、第一鎖ｃＤＮＡ産物の総合的な収率は損なわれる（表２７）。入力テンプレートＲＮＡの１μｇ（１０００ｎｇ）は、ｃＤＮＡ収率とＮＳＲ７媒介性増幅の特異性の間の最適な妥協点に相当する。より高いＲＮＡテンプレート量（２０００ｎｇ及び５０００ｎｇ）では、逆転写反応は、ＲＮＡを完全にｃＤＮＡへ転化させることができなかった。表２８中のｃＤＮＡの収率は、（表２９から得られる）産物の絶対収率に、テンプレートＲＮＡ５０００ｎｇに対する希釈因子を乗じた後、一貫して最も高い収率値を与えたテンプレートＲＮＡ２０ｎｇから得られたＮ８収率に対して標準化することによって求めた。ＩＧＦ１Ｒ及びＧＡＰＤＨの標準化されたｃＤＮＡ収率は、ＮＳＲ７及びＮ８の両方に対して、全てのテンプレート量にわたって類似しており、最高のＲＮＡテンプレート濃度で収率は減少した。これに対して、１８Ｓ、２８Ｓ、αグロビン及びβグロビン産物の収率は、ＮＳＲ７で開始された場合より、Ｎ８で開始された場合に、大幅により高かった。
【０１４６】
要約すると、「ＮＳＲ効果」（（配列番号１から９３３を含む）ＮＳＲ７プライマーによるレポーターｍＲＮＡのｃＤＮＡへの転化のパーセントは、Ｎ８に比べて高いが、ＮＳＲ７プライマーによるバックグラウンドＲＮＡのｃＤＮＡへの転化のパーセントは、Ｎ８に比べて低いこととして定義される。）は、検査した全てのテンプレート濃度にわたって保存される。これは、テンプレート量に対して反応条件を特別に調整する必要がないという利点を与える。
【０１４７】
【表２５】
0005409005.tif 000026
【０１４８】
【表２６】
0005409005.tif 000027
【０１４９】
【表２７】
0005409005.tif 000028
【０１５０】
【表２８】
0005409005.tif 000029
【０１５１】
【表２９】
0005409005.tif 000030
【０１５２】
【表３０】
0005409005.tif 000031
【実施例９】
【０１５３】
本実施例は、各々が５’末端に共有結合されたＴ７プロモーター（配列番号９３４）を有するＮＳＲ７プライマー（配列番号１から９３３を含む。）が、高ＮＴＰ濃度と組み合わされると、ランダムな７マー（Ｔ７−Ｎ７）と比較したときに、増加した特異性を示すこと、及びＲＮＡテンプレート量の幅広い範囲にわたって、この特異性が維持されることを示している。
【０１５４】
実施例６に記載されているように、第一鎖ｃＤＮＡ合成、第二鎖合成、ＩＶＴ、ＩＶＴの逆転写及びａＲＮＡのｑＰＣＲを行った。ＲＮＡテンプレート量は、全血全ＲＮＡの１００ｎｇ、２００ｎｇ、５００ｎｇ及び１０００ｎｇであった。反応容量は４０μＬであり、４０℃で１８０間、７０℃で１０分間、反応物を温置し、氷上で冷却した。ｄＮＴＰ濃度は、２０００μＭであった。第二鎖合成反応は、１６℃で１２０分間であった。
【０１５５】
第一鎖合成から得られたデータは、ＮＳＲ７プールで開始された場合のｒＲＮＡ及びグロビンバックグラウンド遺伝子に比べて、高ｄＮＴＰ濃度はＩＧＦ１Ｒ及びＧＡＰＤＨレポーターの増加したレベルをもたらすが、Ｔ７−Ｎ７プールで開始した場合にはもたらさないことを示した（データは、Ｎ８に対して標準化されている。）（表３０）。図５を参照されたい。さらに、表３１中のデータは、ＮＳＲ７によって開始されたｃＤＮＡのインビトロ転写後にバックグラウンドに比したレポーターの濃縮も観察されること、グロビンｍＲＮＡに比べて、リボソームｒＲＮＡに対して、濃縮がより顕著な傾向があること、及び入力ＲＮＡテンプレート量の幅広い範囲にわたって、濃縮が観察されたことを示している。比率の比は、第一鎖及びＩＶＴ反応の両者について、ＮＳＲ７をＴ７−Ｎ７と比較したときに、レポーターがバックグラウンドに比べて濃縮されていること、並びにこの効果は、検査された全てのＲＮＡ入力量で観察されたことを示している（表３２）。表３３は、ＮＳＲ７、Ｔ７−Ｎ７及びＮ８開始された第一鎖ｃＤＮＡ及びＩＶＴ−ＲＴ反応から得られた生のｑＰＣＲデータを示している。表３４は、ＮＳＲ７、Ｔ７−Ｎ７及びＮ８開始された第一鎖ｃＤＮＡ及びＩＶＴ−ＲＴ反応から得られた生の存在量データを示している。
【０１５６】
図５は、入力ＲＮＡテンプレートの量の関数として、Ｔ７−ＮＳＲによって開始された及びＴ７−Ｎ７によって開始されたｃＤＮＡから増幅されたＲＮＡの収率を示すヒストグラムプロットである。検査された入力ＲＮＡの量は、１００ｎｇ、２００ｎｇ、５００ｎｇ及び１０００ｎｇの範囲であった。図６は、インビトロ転写（ＩＶＴ）による増幅後における、Ｔ７−ＮＳＲ開始された及びＴ７−Ｎ７開始されたｃＤＮＡ（Ｎ８に対して標準化されている。）の相対組成を示す直線目盛りでのヒストグラムプロットである。図５及び６に示されているように、ＮＳＲによって開始されたＩＶＴ産物の組成は、Ｎ８によって開始されたｃＤＮＡの組成と大幅に異なっている。図６に示されているように、ＮＳＲプライマープールを用いたＩＶＴ後に、ＩＧＦ１Ｒ及びＧＡＰＤＨレポーターは増加し、ｒＲＮＡ及びグロビンバックグラウンドは減少した。これに対して、Ｔ７−Ｎ７プライマープールから得られたＩＶＴ産物は、Ｎ８によって開始されたｃＤＮＡに対して標準化されたときに、出発材料と大幅に異ならなかった。
【０１５７】
図７は、インビトロ転写による増幅後における、Ｔ７−ＮＳＲ開始された及びＴ７−Ｎ７開始されたｃＤＮＡ（Ｎ８に対して標準化されている。）の相対組成を示す対数目盛りでのヒストグラムプロットである。図８は、ＲＮＡテンプレート量の関数として、Ｔ７−ＮＳＲによって開始されたｃＤＮＡからのインビトロ転写産物の相対的な存在量を示すヒストグラムプロットである。図９は、ＲＮＡテンプレート量の関数として、Ｔ７−Ｎ７によって開始されたｃＤＮＡからのインビトロ転写産物の相対的な存在量を示すヒストグラムプロットである。
【０１５８】
図７及び図８に示されているように、ＮＳＲによって開始されたＩＶＴ産物の場合、より高いＲＮＡテンプレート量を用いると、より高い特異性に対する傾向が存在する（ｒＲＮＡ及びグロビンａＲＮＡの対応する減少を伴う、ＩＧＦ１Ｒ及びＧＡＰＤＨの増加）。図９に示されているように、Ｔ７−Ｎ７によって開始されたＩＶＴ産物の場合、ＲＮＡテンプレートが増加するにつれて、ＩＧＦ１Ｒ、ＧＡＰＤＨ及びグロビンレベルは増加したが、ｒＲＮＡは僅かに低下した。これらの結果は、ＮＳＲによって開始されたＩＶＴ産物が、ＲＮＡ入力の１０倍の範囲にわたって、かなり均一であることを示している。
【０１５９】
要約すると、ＮＳＲプライマーと組み合わせた高いｄＮＴＰ濃度は、第一鎖ｃＤＮＡ合成及びＩＶＴ後に、ＲＮＡテンプレート量の幅広い範囲にわたって、増加したレポーターレベルと減少したバックグラウンドレベルをもたらす。ＮＳＲで開始された場合に、ＩＧＦ１Ｒ及びＧＡＰＤＨレベルが増加する一方、ｒＲＮＡ及びグロビンレベルは減少するが、Ｔ７−Ｎ７で開始された場合には、Ｎ８開始された出発材料とは大幅に異ならないように、ＮＳＲによって開始されたＩＶＴ産物の組成は、Ｔ７−Ｎ７及びＮ８によって開始された産物とは実質的に異ならない。最後に、ＮＳＲによって開始されたＩＶＴ産物の組成は、ＲＮＡテンプレート量の幅広い範囲にわたって、比較的均一であった。
【０１６０】
【表３１】
0005409005.tif 000032
【０１６１】
【表３２】
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【０１６２】
【表３３】
0005409005.tif 000034
【０１６３】
【表３４】
0005409005.tif 000035
【実施例１０】
【０１６４】
本実施例は、マイクロアレイ試料の調製のために、ＮＳＲによって開始された第一鎖逆転写後に第二鎖合成及びインビトロ転写を使用する典型的な方法について記載する。
【０１６５】
方法：
第一鎖逆転写
以下のように、第一鎖逆転写を実施する。
【０１６６】
混合：
・全ＲＮＡテンプレート１μｇ
・１００μＭ原ＮＳＲプライマー２μＬ
・１０μＬの最終容量になる水ｘμＬ
・混合し、６５℃で５分間温置し、氷上で瞬間凍結。
【０１６７】
以下のものを含有するＲＴカクテル１０μＬ（氷上で調製）を添加：
・５×ＦＳ緩衝液４μＬ
・２５ｍＭｄＮＴＰ１．６μＬ
・水１．４μＬ
・原ＤＴＴ１μＬ
・ＲＮＡｓＯＵＴ１μＬ
・ＳＳＩＩＩ１μＬ
試料を混合し、遠心し、（「ホットスタート」を与えるために）予め加温された４０℃のサーマルサイクラーに移し、４０℃で３時間、７０℃で１０分間、試料を温置し、４℃まで冷却した。
【０１６８】
第二鎖合成
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＲＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｌ１０１６−０１）の成分を使用して、以下のように、第二鎖合成カクテルを調製する。
【０１６９】
・ＤＥＰＣ処理された水９１μＬ
・５×第二鎖緩衝液３０μＬ
・１０ｍＭｄＮＴＰＭｉｘ３μＬ
・ＤＮＡポリメラーゼＩ（１０単位／μＬ）４μＬ
・ＤＮＡリガーゼ（１０単位／μＬ）１μＬ
・ＲＮＡｓｅＨ（２単位／μＬ）１μＬ
第二鎖合成カクテル１３０μＬを、上記第一鎖反応２０μＬに添加し、混合し、１６℃で２時間、試料を温置する。
【０１７０】
二本鎖ｃＤＮＡの精製
１．ｃＤＮＡＬｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ５００μＬを、第二鎖ｃＤＮＡ合成から得た反応チューブに添加する。チューブ内の総容量は、６５０μＬとすべきである。ピペット操作で上下させることによって、完全に混合する。
２．各Ｓｐｉｎ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅを、コレクションチューブ中に予め挿入する。ＳｐｉｎＣａｒｔｒｉｄｇｅ上に直接ｃＤＮＡ／緩衝溶液を載せる。
３．１２，０００×ｇ、室温で、微小遠心管中において、１分間遠心する。コレクションチューブを取り出し、フロースルーを廃棄する。
４．同じコレクションチューブ中にＳｐｉｎＣａｒｔｒｉｄｇｅを置き、ｃＤＮＡ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ７００μＬを添加する。
５．１２，０００×ｇ、室温で、２分間遠心する。コレクションチューブを取り出し、フロースルーを廃棄する。
６．同じコレクションチューブ中にＳｐｉｎＣａｒｔｒｉｄｇｅを置き、１２，０００×ｇ、室温で、さらに４分間遠心する。コレクションチューブを取り出し、フロースルーを廃棄する。
７．新しいＲｅｃｏｖｅｒｙ  Ｔｕｂｅ中にＳｐｉｎＣａｒｔｒｉｄｇｅを置く。
８．Ｓｐｉｎ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅの中心にＤＥＰＣ処理された水２８μＬを添加し、室温で２日間温置する。
９．１２，０００×ｇで、室温で、１分間遠心する。
１０．ｃＤＮＡをカラム上に、ピペットで戻し、１分間放置し、再度遠心する。
【０１７１】
インビトロ転写反応
以下のように、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｃｏｃｋｔａｉｌを調製する（１８μＬの容量）  
・１００ｍＭＡＴＰ  １．５μＬ
・１００ｍＭＣＴＰ  １．５μＬ
・１００ｍＭＧＴＰ  １．５μＬ
・１００ｍＭＵＴＰ  ０．７５μＬ
・アミノ−アリルＵＴＰ（５０ｍＭ）  １．７５μＬ
・１０×Ｔ７Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ４．０μＬ
・Ｔ７ＥｎｚｙｍｅＭｉｘ  ７．０μＬ
カクテルに、精製されたｃＤＮＡ２２μＬを添加し、３７℃で一晩、試料を温置する。
【０１７２】
ａＲＮＡの精製
ａＲＮＡを精製するために、以下の手順を使用する。
【０１７３】
１．ａＲＮＡ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ１６０μＬを反応チューブに添加する。総容量は、２００μＬとすべきである。ピペット操作で上下させることによって、完全に混合する。
２．１００％エタノール１００μＬを反応チューブに添加する。ピペット操作で上下させることによって、完全に混合する。
３．各Ｓｐｉｎ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅを、コレクションチューブ中に予め挿入する。ＳｐｉｎＣａｒｔｒｉｄｇｅ上に直接、全てのａＲＮＡ／緩衝溶液を載せる。
４．１２，０００×ｇで、微小遠心管中において、１５秒間、室温で遠心する。コレクションチューブを取り出し、フロースルーを廃棄する。
５．同じコレクションチューブ中にＳｐｉｎＣａｒｔｒｉｄｇｅを置き、ａＲＮＡ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ５００μＬを添加する。
６．１２，０００×ｇで、１５秒間、室温で遠心する。コレクションチューブを取り出し、フロースルーを廃棄する。
７．工程５から６を繰り返す。
８．同じコレクションチューブ中にＳｐｉｎＣａｒｔｒｉｄｇｅを置き、カラムを乾燥させるために、さらに２分間、全速で遠心する。コレクションチューブを取り出し、フロースルーを廃棄する。
９．新しいＲｅｃｏｖｅｒｙ  Ｔｕｂｅ中にＳｐｉｎＣａｒｔｒｉｄｇｅを置く。
１０．Ｓｐｉｎ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅの中心にＤＥＰＣ処理された水１００μＬを添加し、室温で１分間温置する。
１１．溶出液中の精製されたａＲＮＡを集めるために、１２，０００×ｇで、２分間、室温で遠心する。
１２．Ｎａｎｏｄｒｏｐを用いて、ａＲＮＡの収率を定量する。
【実施例１１】
【０１７４】
本実施例は、（共有結合されたＴ７プロモーター（配列番号９３４）あり又はなしの９３３個の６マー（配列番号１から９３３））を用いて作製されたｃＤＮＡを、ＰＣＲによって、ａＤＮＡへ転化させ得ることを示している。
【０１７５】
方法：本実施例では、以下のように、ＮＳＲプライマーを使用した。
【０１７６】
６マー配列とＴ７プロモーター（配列番号９３４）の間に挿入された単一のランダムヌクレオチドを加えた９３３個の６マー（配列番号１から９３３）、「ＮＳＲ７」と称される。
【０１７７】
Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ，  ＴＸ）から、細胞株Ｊｕｒｋａｔ（Ｔリンパ球、ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−１５２）に対する全ＲＮＡを入手した。
【０１７８】
プロトコールは、３段階の増幅アプローチを含む。（１）第一のプライマー結合部位を含むＮＳＲプライマーを用いて開始されて、ＮＳＲによって開始された第一鎖ｃＤＮＡを生成する逆転写を用いて、第一鎖ｃＤＮＡをＲＮＡから生成し、（２）第二のプライマー結合部位を含むランダムなプライマー（例えば、９マー）を用いて開始される第二鎖ｃＤＮＡ合成；及び（３）増幅されたＤＮＡ（ａＤＮＡ）を生成させるための、第一及び第二のプライマー結合部位に結合するフォワード及びリバースプライマーを用いて開始されるｃＤＮＡのＰＣＲ増幅。
【０１７９】
【表３５】
0005409005.tif 000036
0005409005.tif 000037
0005409005.tif 000038
【０１８０】
注：以下に記載されているプロトコールは、上で表３５中に示されている全てのプライマーを用いて実施されたが、３つの方法の工程を明瞭に記載するために、プライマーの組１に関連して、簡潔に記載されている。
【０１８１】
第一鎖ｃＤＮＡ合成：Ｔ７プロモーター（配列番号９３４）に加えて、１つのランダムヌクレオチド（Ｎ）と９３３個の６マー（配列番号１から９３３）を含むＮＳＲ７プライマープールを用いて開始された。
【０１８２】
第二鎖ｃＤＮＡ合成：以下のプライマープールを用いて行った。
【０１８３】
５’ＴＧＣＡＴＴＧＡＧＡＧＧＧＴＧＴＡＡＴＴＴＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮ３’（配列番号９４７）
（ランダムな９マーに加えて、第二のＰＣＲプライマー結合部位、すなわち「尾部」を含むＲＲＴ１と称される。）。
【０１８４】
以下のＰＣＲプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅を開始した。
【０１８５】
フォワードＰＣＲ１：５’ＣＧＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ３’（配列番号９４６）（Ｔ７プロモーター（第一のプライマー結合部位）に結合する。）
リバースプＰＣＲ１：５’ＴＧＣＡＴＴＧＡＧＡＧＧＧＴＧＴＡＡＴＴＴＧ３’（配列番号９４７）
（第二のＰＣＲプライマー結合部位に結合する。）
【０１８６】
ａＤＮＡを生成するために有用なさらなるプライマーの組：
表３５に上記されているプライマーの組は、Ｔ７プロモーターを含むＮＳＲ７とともに使用されるが、ａＤＮＡを作製する方法は、少なくとも１つのプライマー結合配列を含有する何れかの所定の配列が尾部に付着されたさほどランダムでないプライマー（ＮＳＲ）のプールを用いて実施され得ることが理解される。例えば、９３３個の６マー（配列番号１から９３３）に加えて、６マーの配列と第一のプライマー結合配列（配列番号：９５６：５’ＣＣＧＡＡＣＴＡＣＣＣＡＣＴＴＧＣＡＴＴ３’）の間に挿入された単一のランダムなヌクレオチドを含むＮＳＲプライマーのプールを含むプライマープールを使用した。
【０１８７】
第一のプライマー結合配列（配列番号９５６）に加えて、１つのランダムヌクレオチド（Ｎ）及び９３３個の６マー（配列番号１から９３３）を含むＮＳＲプライマープールを用いて、第一鎖合成を実施した。
【０１８８】
以下のプライマープール：
５’ＣＣＡＣＴＣＣＡＴＴＴＧＴＴＣＧＴＧＴＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮ３’（配列番号９５７）を用いて、第二鎖合成を実施した。
【０１８９】
（ランダムな９マーに加えて、第二のＰＣＲプライマー結合部位を含む。）
次いで、以下のＰＣＲプライマーを用いて、二本鎖ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を実施した。
【０１９０】
フォワードＰＣＲプライマー：５’ＣＣＧＡＡＣＴＡＣＣＣＡＣＴＴＧＣＡＴＴ３’（配列番号９５８）
（第一のＰＣＲプライマー結合部位に結合する。）
リバースＰＣＲプライマー：５’ＣＣＡＣＴＣＣＡＴＴＴＧＴＴＣＧＴＧＴＧ３’（配列番号９５９）
（第二のＰＣＲプライマー結合部位に結合する。）
【０１９１】
詳細な方法
検査試料：上で表３５中に示されているプライマーの組を用いて、試験試料１から８を実施し、以下のプライマーの組＃１について記載したように、平行して検査した。
【０１９２】
以下のようにして、対照試料を含めた。
【０１９３】
１．第二鎖Ｋｌｅｎｏｗへの第一鎖逆転写酵素反応後に（但し、Ｎ９プライマーなし）、ＰＣＲ増幅。
２．第一鎖逆転写酵素反応後に（第二鎖Ｋｌｅｎｏｗなし）、ＰＣＲ増幅。
【０１９４】
第一鎖逆転写：
以下のように、第一鎖逆転写を実施した。
【０１９５】
混合：
・（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）から入手した）１μｇ／μＬのＪｕｒｋａｔ全ＲＮＡテンプレート１μＬ
・１００μＭ原ＮＳＲ７プライマープール２μＬ
・１０μＬの最終容量になるようにＨ２Ｏ７μＬ
・混合し、６５℃で５分間温置し、氷上で瞬間凍結。
【０１９６】
以下のものを含有するＲＴカクテル１０μＬ（氷上で調製）を添加：
・５×Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒ（２５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３、３７５ｍＭＫＣｌ、１５ｍＭＭｇＣｌ２）４μＬ
・２０ｍＭｄＮＴＰ２μＬ
・Ｈ２Ｏ１μＬ
・０．１ＭＤＴＴ１μＬ
・ＲＮＡｓｅＯＵＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１μＬ
・ＭＭＬＶ逆転写酵素（２００単位／μＬ）（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩＴＭ（ＳＳＩＩＩ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）１μＬ
試料を混合し、（「ホットスタート」を与えるために）予め加温された４０℃のサーマルサイクラーに移し、次いで、４０℃で２時間、７０℃で１０分間、試料を温置し、４℃まで冷却した。
【０１９７】
次いで、ＲＮＡｓｅＨ（１から４単位／μＬ）１μＬを添加し、３７℃で２０分間、試料を温置し、次いで、９５℃まで５分間加熱し、４℃で瞬間凍結した。
【０１９８】
第二鎖合成
第二鎖合成カクテルを以下のように調製した。
【０１９９】
・１０×Ｋｌｅｎｏｗ  Ｂｕｆｆｅｒ１０μＬ
・Ｎ９ＲｅｖｅｒｓｅＲＴ１プライマー（配列番号９４７）１０μＬ
・２０ｍＭｄＮＴＰ２．５μＬ
・Ｈ２Ｏ５７．５μＬ
・Ｋｌｅｎｏｗ酵素（ＮＥＢｅｘｏ−５０Ｕ／μＬ）０．３３μＬ
第二鎖合成カクテル８０μＬを、第一鎖テンプレート反応混合物２０μＬに添加し、混合し、３７℃で３０分間温置する。
【０２００】
ｃＤＮＡ精製
製造業者の指示に従って、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手したＳｐｉｎＣａｒｔｒｉｄｇｅｓ及びキット中に供給されていた緩衝液を用いて、得られた二本鎖ｃＤＮＡを精製した。３０μＬの総容量がカラムから溶出され、このうち２０μＬを、後続のＰＣＲのために使用した。
【０２０１】
ＰＣＲ増幅
精製されたｃＤＮＡテンプレート２０μＬに以下の混合物を添加した。
【０２０２】
・５×Ｒｏｃｈｅ  Ｅｘｐａｎｄ  Ｐｌｕｓ  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ２０μＬ
・２０ｍＭｄＮＴＰＳ２．５μＬ
・フォワードＰＣＲプライマー（１０ｍＭ原液）（配列番号９４６）４μＬ
・リバースＰＣＲプライマー（１０ｍＭ原液）（配列番号９４７）４μＬ
・ＥｘｐａｎｄＥｎｚｙｍｅ（５Ｕ／μＬ）（Ｒｏｃｈｅ）１μＬ
・Ｈ２Ｏ４０μＬ
・２５ｍＭＭｇＣｌ２１０μＬ
ＰＣＲ増幅条件：
計２５のＰＣＲサイクル：
１０サイクル：
・９４℃、３０秒間
・５５℃又は６０℃、３０秒間
・７２℃、１分間
１５サイクル：
・９４℃、３０秒間
・５５℃又は６０℃、３０秒間
・７２℃、１分間（各サイクルについて、伸長工程に１０秒を付加した。）
・仕上げのために７２℃、７分間、４℃で冷却。
【０２０３】
結果：（１）ｑＰＣＲによる選択されたレポーター遺伝子の増幅のレベルを測定する、（２）増幅されたＤＮＡ「ａＤＮＡ」の収率を測定する、及び（３）ｃＤＮＡ中の種の集団が等しく代表されていることを確認するために、アガロースゲル上のａＤＮＡの分取試料を評価する観点で、結果を分析した。
【０２０４】
表３６中のデータは、試料１から１０に対する二本鎖ｃＤＮＡ及びａＤＮＡ産物のｑＰＣＲ後における、レポーター遺伝子ＧＡＰＤＨ、ＧＵＳＢ、ｈＰＯ及びアクチンに対する生の存在量値（希釈に対して調整）を示している。
【０２０５】
【表３６】
0005409005.tif 000039
【０２０６】
次いで、以下の増幅係数に基づいて、表３６中で上に示されている生のデータを調整した。
【０２０７】
（ＰＣＲ／ｃＤＮＡ）＊（ｃＤＮＡ／平均ｃＤＮＡ）
良好でないｃＤＮＡ及びＰＣＲ収率を有するが、ＰＣＲ増幅に対するｃＤＮＡの高いレベルを有する試料（例えば、試料７）により、強固なｃＤＮＡ合成レベル及び強固なＰＣＲ収率（例えば、試料２）を有する試料を優先して増幅を重み付けするために、この増幅係数を導入した。上記増幅係数に基づいて調整された存在量の値は、以下で表３７中に示されている。
【０２０８】
【表３７】
0005409005.tif 000040
【０２０９】
上で表３７に示されているように、総じて、ＰＣＲ収率は良好であり、特に、プライマーの組１及び２では良好であった。検査された全てのレポーター遺伝子に対して、増幅が観察された。試料１から８及び対照１から２から得たａＤＮＡの分取試料を１．６％アガロースゲル上に泳動させ（データは示さず。）、各検査試料が増幅された材料の塗抹を示したので、増幅された産物が最初の全ＲＮＡ中に存在するｍＲＮＡ種を代表していることを示唆している。
【０２１０】
上記の方法を使用したが、ＰＣＲの計３０サイクルを用い、ＰＣＲアニーリング温度を６０℃まで上昇させて、反応の第二の組を同じ試料とともに泳動した。Ｊｕｒｋａｔ細胞中で高度に発現されることが知られている、表３８中に示された８つのレポーター遺伝子に対するｑＰＣＲを用いて、得られたａＤＮＡに対してｑＰＣＲを行った。
【０２１１】
【表３８】
0005409005.tif 000041
【０２１２】
表３９中に示されているように、検査した８つのプライマーの組のうち７つのプライマーにおいて、ＰＣＲ増幅中に６０℃のアニーリング温度を用いて得られたａＤＮＡの総収率は、５５℃で得られた総収率より高い。
【０２１３】
【表３９】
0005409005.tif 000042
【０２１４】
【表４０】
0005409005.tif 000043
【０２１５】
表４０に示されているように、５５℃又は６０℃でアニールされたＰＣＲ反応由来のａＤＮＡの定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析は、ａＤＮＡ／ｃＤＮＡの比率によって測定した場合に、６０℃のアニーリング温度でのプライマー対１が最高のＰＣＲ特異性を与えることを示した。レポーター遺伝子の比活性は、検査されたＰＣＲサイクルの範囲にわたって（４サイクルから２４サイクル）、ａＤＮＡの収率と緊密に連関していた（データは示さず。）。
【実施例１２】
【０２１６】
本実施例は、実施例１１に記載されているように、９３３個の６マー（配列番号１から９３３）を用いて作製された二本鎖ｃＤＮＡテンプレートから増幅されたａＤＮＡが、二本鎖ｃＤＮＡテンプレート中に観察された発現比を保持したことを示している。
【０２１７】
方法：
ＮＳＲ７プライマープールとともに、Ｊｕｒｋａｔ又はＫ５６２細胞（Ａｍｂｉｏｎ、Ｉｎｃ．ＡｕｓｔｉｎＴＸから入手）から得た全ＲＮＡテンプレート１μｇを用いて、実施例１１に記載されているように、第一鎖ｃＤＮＡ合成を実施した。２つのＪｕｒｋａｔ試料を平行して泳動した。第二鎖合成及びｃＤＮＡ精製についても、実施例１１に記載されているように実施した。
【０２１８】
ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅
ＰＣＲ反応中で使用する前に、ｃＤＮＡテンプレートを１０倍及び１００倍希釈し、精製されたｃＤＮＡ１０μＬ又は希釈されたｃＤＮＡ１０μＬの何れかを使用した。
【０２１９】
ｃＤＮＡテンプレート１０μＬへ添加：
・５×Ｒｏｃｈｅ  Ｅｘｐａｎｄ  Ｐｌｕｓ  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ２０μＬ
・１０ｍＭｄＮＴＰＳ２．０μＬ
・フォワードＰＣＲプライマー（１０ｍＭ原液）（配列番号９４６）４μＬ
・リバースＰＣＲプライマー（１０ｍＭ原液）（配列番号９４７）４μＬ
・ＥｘｐａｎｄＥｎｚｙｍｅ（５Ｕ／μＬ）（Ｒｏｃｈｅ）１μＬ
・Ｈ２Ｏ６０μＬ
・２５ｍＭＭｇＣｌ２１０μＬ
ＰＣＲ増幅条件：
計３０のＰＣＲサイクルを実施：
１０サイクル：
・９４℃、３０秒間
・６０℃、３０秒間
・７２℃、１分間
２０サイクル：
・９４℃、３０秒間
・６０℃、３０秒間
・７２℃、１分間（各サイクルについて、伸長工程に１０秒を付加した。）
・仕上げのために７２℃、７分間、４℃で冷却。
【０２２０】
ＰＣＲ後の精製：５００μＬの緩衝液を用いて、１００μＬのＰＣＲ反応を希釈し、製造業者の指示に従って、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから取得したＳｐｉｎＣａｒｔｒｉｄｇｅｓ及びキット中に供給された緩衝液を用いて精製した。５５μＬの総容量をカラムから溶出した。
【０２２１】
結果：予想された塗抹の存在（トランスクリプトーム中の実質的に全ての種の増幅を示唆する。）を確認するためのアガロースゲル上のａＤＮＡの総ａＤＮＡ収率評価の観点から、及びｑＰＣＲによってレポーター遺伝子のパネルを測定することによって、結果を分析した。
【０２２２】
【表４１】
0005409005.tif 000044
【０２２３】
結果：表４１に示されているように、テンプレート入力の範囲にわたって、ａＤＮＡの収率は一貫していた。これらの結果は、ＰＣＲ反応がより低いテンプレート入力で飽和されたことを示唆している。アガロースゲル分析は、予測された塗抹を示し、トランスクリプトソーム全体にわたる優れた増幅を示唆している（図示せず。）。
【０２２４】
ｃＤＮＡから生成されたａＤＮＡが、ｃＤＮＡ中に存在する標的遺伝子発現レベルを保持したかどうかを決定するために、５４個のランダムに選択されたＴａｑＭａｎ試薬を用いて定量的ＰＣＲ分析を実施し、遺伝子特定番号１から３４を検出した。表４２に示されているように、ランダムに選択された５４個の標的遺伝子のうち、標的遺伝子から生成された、ＮＳＲ７によって開始されたｃＤＮＡ及びａＤＮＡ（１０μＬのｃＤＮＡテンプレート入力から得られた。）の両者で、３４個の遺伝子に対して測定可能なシグナルが測定された。以下で表４２に示されている遺伝子発現シグナルは、（１０（ｌｏｇ１０（１／２）＊Ｃｔ＋１０））乗として計算された。
【０２２５】
【表４２】
0005409005.tif 000045
0005409005.tif 000046
【０２２６】
表４２に示されているように、Ｊｕｒｋａｔ及びＫ５６２実験の結果は、ｃＤＮＡとｃＤＮＡから得られたａＤＮＡとの間の発現比に良好な相関を示している。図１０は、ｃＤＮＡ（ｘ軸）対ａＤＮＡ（ｙ軸）中で測定された、表４２から得られる発現値のプロットを示している。重要なことに、図１０に示されている結果は、その発現が高いか、又は低いかに関わらず、遺伝子ｘがＮＳＲ−ＰＣＲによってｙ倍増幅されるように、実際の試料（ａＤＮＡ）／ＰＣＲ増幅された材料（ａＤＮＡ）から得られる発現比が保持されることを示している。総合すると、これらの実験は、発現比を保持しながら、全ＲＮＡをａＤＮＡへ増幅するために、ＮＳＲＰＣＲａＤＮＡを使用し得ることを示している。
【実施例１３】
【０２２７】
本実施例は、実施例１１に記載されているように、９３３個の６マー（配列番号１から９３３）を用いて作製された二本鎖ｃＤＮＡテンプレートから増幅されたａＤＮＡが、ｒＲＮＡ及びグロビンに対して標的遺伝子の濃縮を保持したことを示している。
【０２２８】
原理：ＮＳＲ−プライマーｃＤＮＡから生成されたインビトロ転写産物から以前に観察された、ｒＲＮＡ及びグロビンに対する標的遺伝子の濃縮が、ＮＳＲによって開始されたｃＤＮＡのＰＣＲ増幅から生じた生成された増幅されたＤＮＡ産物において保持されているかどうかを決定すること。
【０２２９】
方法：ＮＳＲ−プライマーｃＤＮＡから生成されたインビトロ転写産物から以前に観察された、ｒＲＮＡ及びグロビンに対する標的遺伝子の濃縮が、ＮＳＲによって開始されたｃＤＮＡのＰＣＲ増幅から生じた生成された増幅されたＤＮＡ産物において保持されているかどうかを決定することために、ＮＳＲ７プライマーを用いて生成されたｃＤＮＡから取得された、増幅されたａＤＮＡ産物を、以下の実験で、ランダムな８マーを用いて生成されたｃＤＮＡから取得された、増幅されたａＤＮＡ産物と比較した。
【０２３０】
（１）各々が５’末端に共有結合されたＴ７プロモーター（発現番号９３４）を有する、配列番号１から９３３を含む）ＮＳＲ７プライマープール；又は（２）５’末端に共有結合されたＴ７プロモーター（配列番号９３４）を有するランダムな８マー（Ｎ８）プライマープールの何れかで生成された二つ組み試料を用いて、実施例１１に記載されているように、全血から単離された全ＲＮＡ１μｇに対して第一鎖ｃＤＮＡ合成を行った。
【０２３１】
ＮＳＲ７によって開始された試料及びランダムな８マー（Ｎ８）によって開始された試料の両方に対して何れかの配列番号９４７を用いて、実施例１１に記載されているように二本鎖合成及びｃＤＮＡ精製を行った。
【０２３２】
ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅
以下のように、後続のＰＣＲ反応において、１μＬ＋９μＬのＨ２Ｏ又は１０μＬのｃＤＮＡテンプレートの何れかを使用した。
【０２３３】
ｃＤＮＡテンプレート１０μＬへ添加：
・５×Ｒｏｃｈｅ  Ｅｘｐａｎｄ  Ｐｌｕｓ  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ２０μＬ（１．５ｍＭＭｇＣｌ２を含む。）
・２０ｍＭｄＮＴＰＳ１．０μＬ
・フォワードＰＣＲプライマー（１０ｍＭ原液）（配列番号９４９）４μＬ
・リバースＰＣＲプライマー（１０ｍＭ原液）（配列番号９４８）４μＬ
・ＥｘｐａｎｄＥｎｚｙｍｅ（５Ｕ／μＬ）（Ｒｏｃｈｅ）１μＬ
・Ｈ２Ｏ６０μＬ
ＰＣＲ増幅条件：
計２０のＰＣＲサイクルを実施：
１０サイクル：
・９４℃、３０秒間
・６０℃、３０秒間
・７２℃、１分間
１０サイクル：
・９４℃、３０秒間
・６０℃、３０秒間
・７２℃、１分間（各サイクルについて、伸長工程にを付加した。）
・仕上げのために７２℃７分間、４℃で冷却。
【０２３４】
ＰＣＲ後の精製：５００μＬの緩衝液を用いて、１００μＬのＰＣＲ反応を希釈し、製造業者の指示に従って、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから取得したＳｐｉｎＣａｒｔｒｉｄｇｅｓ及びキット中に供給された緩衝液を用いて精製した。５０μＬの総容量をカラムから溶出した。
【０２３５】
結果：表４３のデータは、以下のレポーター遺伝子に関して、ＮＳＲによって開始されたｃＤＮＡに対するｑＰＣＲ存在量値／Ｎ８によって開始されたｃＤＮＡに対するｑＰＣＲ存在量値の比を示している（希釈に対して調整されている。）。１８Ｓ、２８Ｓ、ＨＢＡ１、ＨＢＡ２又はＨＢＢに対して測定されたバックグラウンド遺伝子発現と比較されたＡ＝ＩＧＦ１Ｒ；Ｂ＝ＧＡＰＤＨ、Ｃ＝ＳＴＭＮ１及びＤ＝ＣＤＣＡ７。
【０２３６】
【表４３】
0005409005.tif 000047
【０２３７】
上で表４３に示されているデータは、ＮＳＲ７によって開始されたｃＤＮＡから増幅されたａＤＮＡ中のバックグラウンド発現に対する標的遺伝子の劇的な濃縮を示している。観察された濃縮は、より低いテンプレート入力を用いると、一貫してより良好である。総合すると、実施例１１に記載された３段階増幅法（ＮＳＲ−ＰＣＲ）は、ｒＲＮＡ及びグロビンに対する標的遺伝子の著しい濃縮を与えることが明瞭である。従って、実施例１１に記載されているＮＳＲ−ＰＣＲ法は、全血などの生物試料中の全ＲＮＡの完全なトランスクリプトームプロファイリグのために使用することができる。
【実施例１４】
【０２３８】
本実施例は、ＰＣＲ反応において、プライマー、ｄＮＴＰ及びＭｇＣｌ２の上昇した濃度の使用を通じて、増幅されたＤＮＡの収率を増加させることが可能であり、これにより、高処理量の用途において、ＮＳＲ−ＰＣＲが実施できることを示している。
【０２３９】
原理：以下のように、２つの異なるｄＮＴＰ及びＭｇ＋＋濃度でのプライマー入力濃度の関数として、ｃＤＮＡテンプレートを用いたＰＣＲ反応から得られる総ａＤＮＡ収率を測定するために、実験を実施した。
【０２４０】
方法：
テンプレート：実施例１３に記載されているように、ＮＳＲ７プライマーを用いてＪｕｒｋａｔ全ＲＮＡからｃＤＮＡを調製した。
【０２４１】
ＰＣＲプライマー：
フォワード：配列番号９４９；リバース：配列番号９４８
検査したプライマー濃度：２００、４００、６００、８００及び１０００ｎＭ
検査したｄＮＴＰ濃度：２００μＭ、１．５ｍＭ
検査したＭｇ＋＋濃度：５００μＭ、４ｍＭ
実施例１３に記載されているように、ＰＣＲ反応を調製した。
【０２４２】
ＰＣＲ増幅条件：
計３０のＰＣＲサイクルを実施：
１０サイクル：
・９４℃、３０秒間
・６０℃、３０秒間
・７２℃、１分間及び
２０サイクル：
・９４℃、３０秒間
・６０℃、３０秒間
・７２℃、１分間（各サイクルについて、伸長工程に１０秒を付加した。）
・仕上げのために７２℃７分間、４℃で冷却。
【０２４３】
ＰＣＲ後の精製：５００μＬの緩衝液を用いて、１００μＬのＰＣＲ反応を希釈し、製造業者の指示に従って、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから取得したＳｐｉｎＣａｒｔｒｉｄｇｅｓ及びキット中に供給された緩衝液を用いて精製した。５０μＬの総容量をカラムから溶出した。
【０２４４】
【表４４】
0005409005.tif 000048
【０２４５】
上で表４４に示されている結果は、８００ｎＭプライマー、５００μＭｄＮＴＰ及び４ｍＭＭｇ＋＋でのａＤＮＡの収率が、１０μｇ／１００μＬＰＣＲ反応物に近づくことを示している。アガロースゲルによって、ａＤＮＡも分析し、増幅された材料の塗抹を含有していることが確認され、増幅された産物が最初の全ＲＮＡ中に存在するｍＲＮＡ種を代表していることを示している。
【０２４６】
非特異的材料の増幅と比較して、増幅された完全な転写物材料の存在をさらに評価するために、表３８に示されている遺伝子１から８のパネルをｑＰＣＲによって分析した。対照試料９は１８ＳｒＲＮＡであり、対照試料１０は２８ＳｒＲＮＡであった。
【０２４７】
図１１は、各遺伝子のｌｏｇ１０発現としてプロットされたｑＰＣＲの結果を示している。図示されているように、８００ｎＭプライマー、５００μＭｄＮＴＰ及び４μＭＭｇＣｌ２を有するＰＣＲ反応中で産生された、増幅されたａＤＮＡの収率は、より低いプライマー、ｄＮＴＰ及びＭｇ＋＋濃度で産生されたａＤＮＡと同じ遺伝子特異的活性を有する。図１１に示されている対照試料９（１８ＳｒＲＮＡ）及び試料１０（２８ＳｒＲＮＡ）の値はレポーター遺伝子の幾つかより高いが、これらの値（１８Ｓ及び２８ＳＲＮＡ）は、ランダムに開始された（例えば、ＮＳＲプライマーを用いて開始されていない）試料中に存在するｒＲＮＡの量と比べて、実際に、約９９倍低下していたことに注目することが重要である。ｒＲＮＡは全ＲＮＡの約９８％を占めるので、ｒＲＮＡの存在量が元の値の１％まで低下した場合でさえ、存在する全量は、なお、試料中のＲＮＡの約１／３に相当する。重要なことに、本発明の方法に従って治療された試料中に観察されたこのｒＲＮＡの９９％の減少は、ランダムに開始された試料中で通例観察されるｒＲＮＡによって不明瞭化されたシグナル（すなわち、「クロストーク」）の問題を除去するのに十分過ぎるものであることが、本発明者らによって観察されている（データは図示せず。）。
【０２４８】
これらのデータは、最適化されたＰＣＲ条件を用いて作製されたａＤＮＡの高い収率が、増幅された完全な転写物材料を含有しており、増加された収率が、増幅反応時に生成された非特異的材料の存在によるものではないことを示している。
【実施例１５】
【０２４９】
本実施例は、遺伝子発現モニタリング用途においてその後使用するためにａＤＮＡＰＣＲ産物を標識するのに有用である方法について記載する。
【０２５０】
１．ＰＣＲ産物への蛍光標識の直接的な化学的カップリング
Ｃｙ３及びＣｙ５直接標識キットは、Ｍｉｎｉｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ｋｉｔ  ＭＩＲ製品番号３６２５及び３７２５）から入手した。
【０２５１】
実施例１１に記載されているようにして得られたＰＣＲ産物（ａＤＮＡ）１０μｇを、製造業者によって記載されているとおりに、標識試薬とともに温置した。標識試薬は、Ｃｙ３又はＣｙ５を核酸試料に共有結合させ、その後、核酸試料は、遺伝子発現モニタリングなどのほぼあらゆる分子生物学的用途において使用することができる。次いで、標識されたａＤＮＡを精製し、初発の標識と比較したその蛍光を測定した。
【０２５２】
結果：上記のように４つのａＤＮＡ試料を標識し、蛍光を測定した。４つの標識されたａＤＮＡ試料にわたって、保持された標識の０．９から１．５％の範囲を観察した（０．９から１．５％の標識効率とも称される。）。これらの結果は、ａａＵＴＰ標識され、インビトロ翻訳され、増幅されたＲＮＡに対して典型的に観察される１％から３％の標識効率に収まる。
【０２５３】
２．ａａ標識された一本鎖ａＤＮＡを得るために、１つのプライマー（フォワード又はリバース）を使用する、ａＤＮＡテンプレートを用いたＰＣＲの際のアミノアリル修飾されたｄＵＴＰ（ａａｄＵＴＰ）の取り込み。
【０２５４】
方法：実施例１１に記載されているＮＳＲ７プライマープールを用いて作製されたａＤＮＡＰＣＲ産物１μｇを、以下のように、ＰＣＲ反応混合物に添加する。
【０２５５】
・１００から１０００μＭのａａｄＵＴＰ＋ｄＣＴＰ＋ｃＡＴＰ＋ｄＧＴＰ＋ｄＵＴＰ（ｄＵＴＰに対するａａｄＵＴＰの最適なバランスは、定型的な実験操作を用いて経験的に決定され得る。）
・４ｍＭＭｇＣｌ２
・フォワードプライマーのみ又はリバースプライマーのみ４００から１０００ｎＭ（例えば、フォワード：配列番号９４９；又はリバース配列番号９４８）、但し、両者ではない。
【０２５６】
ＰＣＲ反応：ＰＣＲの５から２０サイクル（９４０Ｃ３０秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒）、この時間中、二本鎖ＰＣＲテンプレートの１つの鎖のみが合成される。ＰＣＲの各サイクルは、ａａ標識された一本鎖ａＤＮＡの１コピーを産生すると予測される。次いで、このＰＣＲ産物が精製され、標準的な化学カップリングによって、Ｃｙ３又はＣｙ５標識が取り込まれる。
【０２５７】
３．ａａ標識された二本鎖ａＤＮＡを得るために、ａＤＮＡテンプレートを用い、フォワード及びリバースプライマーを使用するＰＣＲの際のアミノアリル修飾されたｄＵＴＰ（ａａｄＵＴＰ）の取り込み。
【０２５８】
方法：実施例１１に記載されているようにＮＳＲ７プライマープールを用いて作製されたａＤＮＡＰＣＲ産物１μｇを、以下のように、ＰＣＲ反応混合物に添加する。
【０２５９】
・１００から１０００μＭのａａｄＵＴＰ＋ｄＣＴＰ＋ｃＡＴＰ＋ｄＧＴＰ＋ｄＵＴＰ（ｄＵＴＰに対するａａｄＵＴＰの最適なバランスは、定型的な実験操作を用いて経験的に決定され得る。）
・４ｍＭＭｇＣｌ２
・フォワードプライマー及びリバースプライマー４００から１０００ｎＭ（例えば、フォワード：配列番号９４９；又はリバース配列番号９４８）
ＰＣＲ反応：ＰＣＲの５から２０サイクル（９４０Ｃ３０秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒）、この時間中、二本鎖ＰＣＲテンプレートの両鎖が合成される。次いで、二本鎖のａａ標識されたａＤＮＡＰＣＲ産物が精製され、標準的な化学カップリングによって、Ｃｙ３又はＣｙ５標識が取り込まれる。
【０２６０】
本発明の好ましい実施形態を例示し、記載してきたが、本発明の範囲を逸脱せずに、本発明に様々な変更を施し得ることが理解される。
【０２６１】
排他的な財産権又は特権が主張される本発明の実施形態が、以下のように定義される。
【図面の簡単な説明】
【０２６２】
【図１Ａ】図１Ａは、実施例２に記載されているヒトＲｅｆＳｅｑ転写物データベース中のヌクレオチド配列に対する、ランダムな６マー（Ｎ６）オリゴヌクレオチドの正確な合致の数を示している。
【図１Ｂ】図１Ｂは、実施例２に記載されているヒトＲｅｆＳｅｑ転写物データベース中のヌクレオチド配列に対する、さほどランダムでない（ＮＳＲ；Ｎｏｔ−Ｓｏ−Ｒａｎｄｏｍ）６マーオリゴヌクレオチドの正確な合致の数を示している。
【図１Ｃ】図１Ｃは、実施例４に記載されているＮＳＲ６マーオリゴヌクレオチドの混合物を用いて、増幅されたＲＮＡ分子の調製物を合成するための本発明の方法の代表的実施形態を示している。
【図１Ｄ】図１Ｄは、実施例１２に記載されているＮＳＲ６マーオリゴヌクレオチドの混合物を用いて、増幅されたＤＮＡ分子の調製物を合成するための本発明の方法の代表的実施形態を示している。
【図２】図２は、実施例２に記載されているヒトＲｅｆＳｅｑ転写物データベース中に存在する１００個のヌクレオチド当りのＮＳＲ６マー結合部位の数を示すヒストグラムプロットである。
【図３】図３は、実施例６に記載されているように、入力ＲＮＡテンプレート量の関数として、Ｔ７−ＮＳＲ６マーによって開始されたｃＤＮＡから増幅されたＲＮＡの収率を示すヒストグラムプロットである。
【図４】図４は、Ｔ７−ＮＳＲ６マー及びＴ７−Ｎ８によって開始された、レポーター及びバックグラウンド遺伝子に対するｃＤＮＡから増幅されたＲＮＡの収率を、実施例７に記載されているようにプライマー及びｄＮＴＰ濃度の関数として示すヒストグラムプロットである。
【図５】図５は、実施例９に記載されているように、入力ＲＮＡテンプレートの量の関数として、Ｔ７−ＮＳＲ及びＴ７−Ｎ７によって開始されたｃＤＮＡから増幅されたＲＮＡの収率を示すヒストグラムプロットである。
【図６】図６は、実施例９に記載されているように、インビトロ転写による増幅後における、Ｔ７−ＮＳＲ及びＴ７−Ｎ７によって開始されたｃＤＮＡ（Ｎ８に対して標準化されている。）の相対組成を示す線形目盛りでのヒストグラムプロットである。
【図７】図７は、実施例９に記載されているように、インビトロ転写による増幅後における、Ｔ７−ＮＳＲ及びＴ７−Ｎ７によって開始されたｃＤＮＡ（Ｎ８に対して標準化されている。）の相対組成を示す対数目盛りでのヒストグラムプロットである。
【図８】図８は、実施例９に記載されているように、ＲＮＡテンプレート量の関数としての、Ｔ７−ＮＳＲによって開始されたｃＤＮＡからのインビトロ転写産物の相対的存在量のヒストグラムプロットである。
【図９】図９は、実施例９に記載されているように、ＲＮＡテンプレート量の関数としての、Ｔ７−Ｎ７によって開始されたｃＤＮＡからのインビトロ転写産物の相対的存在量のヒストグラムプロットである。
【図１０】図１０は、実施例１２に記載されているように、Ｔ７−ＮＳＲによって開始されたｃＤＮＡ（ｘ軸）とＴ７−ＮＳＲによって開始されたｃＤＮＡから生成された、増幅されたＤＮＡ（ａＤＮＡ）（ｙ−軸）の定量的ＰＣＲによって測定された、３４のレポーター遺伝子のパネルから得られた発現値の相関をグラフ的に示している。
【図１１】図１１は、プライマー濃度の範囲を用いて生成された、増幅されたＤＮＡの定量的ＰＣＲによって測定された、１０個のレポーター遺伝子のパネルの遺伝子特異的活性のヒストグラムプロットである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
0005409005.tif 000061
【図１１】
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【配列表】
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