(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イヌの房室結節領域に電極カテーテルを挿入し、前記電極カテーテルから前記房室結節領域に高周波を通電して前記房室結節を破壊し、房室伝導をブロックさせて心房を肥大拡大させる心房肥大拡大化工程と、
肥大拡大化した前記心房をペーシングする心房ペーシング工程とを含み、
前記心房ペーシング工程が、５５０ｂｐｍ〜６５０ｂｐｍで６週間以上ペーシングし、ペーシングリードを植え込む位置が、左房中のバックマン束領域であることを特徴とする持続性心房細動モデルの製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載の持続性心房細動モデルの製造方法により製造され、
心房細動が少なくとも１週間持続することを特徴とする持続性心房細動モデル。
【請求項３】
請求項２に記載の持続性心房細動モデルに被験物質を投与する投与工程と、
前記投与工程後、前記持続性心房細動モデルの心房細動を抑制した前記被験物質を心房細動抑制剤としてスクリーニングするスクリーニング工程と、
を含むことを特徴とする心房細動抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項４】
スクリーニング工程で心房細動が抑制された持続性心房細動モデルの心房をペーシングし、心房細動を再誘発する心房細動再誘発工程を更に含む請求項３に記載の心房細動抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項５】
心房細動再誘発工程が、心房細動が抑制されてから１週間以内に持続性心房細動モデルの心房を５００ｂｐｍ〜７００ｂｐｍで少なくとも１週間ペーシングする請求項４に記載の心房細動抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項６】
持続性心房細動モデルに被験物質を投与する投与工程と、
前記投与工程後、前記持続性心房細動モデルの心房細動を抑制した前記被験物質を心房細動抑制剤としてスクリーニングするスクリーニング工程と、
前記スクリーニング工程で心房細動が抑制された持続性心房細動モデルの心房をペーシングし、心房細動を再誘発する心房細動再誘発工程とを含み、
前記投与工程における持続性心房細動モデルが、
イヌの房室結節領域に電極カテーテルを挿入し、前記電極カテーテルから前記房室結節領域に高周波を通電して前記房室結節を破壊し、房室伝導をブロックさせて心房を肥大拡大させる心房肥大拡大化工程と、
肥大拡大化した前記心房をペーシングする心房ペーシング工程とを含み、
前記心房ペーシング工程が、５００ｂｐｍ〜７００ｂｐｍで４週間以上ペーシングする持続性心房細動モデルの製造方法により製造されたものであることを特徴とする心房細動抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項７】
心房細動再誘発工程が、心房細動が抑制されてから１週間以内に持続性心房細動モデルの心房を５００ｂｐｍ〜７００ｂｐｍで少なくとも１週間ペーシングする請求項６に記載の心房細動抑制剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、持続性心房細動モデル及びその製造方法、並びに、前記持続性心房細動モデルを用いた心房細動抑制剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
心房細動は、洞結節と呼ばれる心臓のペースメーカが機能障害に陥り、正常な心房の電気興奮が開始されず、心房の筋肉が１分間に３００回〜５００回と正常の５倍以上の速さで不規則に細かく震え、心房の補助ポンプとしての収縮や拡張がなくなる不整脈の一つである。
心房細動は、臨床上最も遭遇しやすい不整脈であり、加齢に伴って発生しやすく、日本においては、６０歳代では２％〜４％、７０歳代では５％〜６％、８０歳代では８％〜１０％が発症しているといわれている。
【０００３】
心房細動が生じると、心房収縮がなくなり拡張期に心室が十分血液で満たされないために心臓の働きは低下し、心臓から出る血液量が減少する。また、心房は、心室が収縮して小さくなる際に逆に大きくなり血液を一時的に蓄え、次の心室充満のときに役立てるリザーバー機能を有するが、心房細動ではこの働きが低下する。
更に、心房細動は、心房内鬱血により血液凝集塊（血栓）が生成しやすく、この血栓が心臓から流れ出し、脳梗塞をはじめとする全身臓器の血栓や塞栓症を引き起こす。
したがって、心房細動は、致死性の不整脈ではないものの、その合併症が問題である。
【０００４】
心房細動の種類としては、何らかの原因で心房細動が生じても原因を除去するとそれ以上は心房細動を生じない一過性心房細動や、心房細動の自然停止が得られるが反復して心房細動が生じる発作性心房細動等の突発性心房細動と、心房細動が持続するが、薬物や電気的な刺激により除細動でき洞調律に復帰する持続性心房細動や、心房細動が持続し、薬物や電気的な刺激によっても除細動できない永続性心房細動等の慢性心房細動とに分類される。
一般に、心房細動は、一過性心房細動、発作性心房細動、持続性心房細動、永続性心房細動の順に進行し、永続性心房細動になると、現在のところその治療方法がないため、持続性心房細動の段階でその進行を止めることが望まれている。
【０００５】
心房細動の治療方法としては、電気的治療法、薬物治療法などが挙げられる。
前記電気的治療法は、迅速で効果が高いものであるが、全身麻酔下で電気ショックをかけるものであり、患者に対する負担が大きく、また、特別な設備を必要とし、専門家によらなければ治療を施すことができない点で問題である。
【０００６】
電気的治療法と比較して、薬物治療法は、患者自身の投薬により治療でき、簡便である点で有利である。
現在、心房細動に対する予防薬としては、抗血栓予防薬ワルファリンが使用されており、また、治療薬としては、Ｖａｕｇａｈａｎ  Ｗｉｌｌｉａｍｓの分類のＩａ群薬（ジソピラミド、シベンゾリンなど）及びＩｃ群薬（フレニカイニド、ピルジカイニドなど）が主に使用され、肥大型心筋症に伴う心房細動にはＩＩＩ群薬（アミオダロン、ソタロール、ニフェカラントなど）が使用されている。
しかし、これらの薬物には副作用がある点で問題である。例えば、Ｉａ群薬であるジソピラミドには、陰性変力作用があり、心不全や左室機能障害の患者への使用には不向きであり、また、ＱＲＳ及びＱＴの延長、催不整脈作用などが生じることがある点で問題である。Ｉｃ群薬であるフレニカイニドやピルジカイニドなどは、循環系への副作用が多い点で問題である。ＩＩＩ群薬であるアミオダロンは、肺、甲状腺、眼などの心臓以外への副作用がある点で問題である。
これらの現在臨床で用いられている心房細動の予防薬又は治療薬は、経験則に基づいて投薬されているものであり、心房細動に関する何らかの評価試験に基づいて選択されたものではなく、また、その評価試験系もない点で問題である。
【０００７】
既存の抗不整脈薬の心房細動に対する有効性の再評価に用いられる評価試験や、新たな心房細動抑制剤のスクリーニングには、臨床における心房細動に近い試験系を用いることが望ましく、そのような試験系としては、臨床における心房細動を反映した心房細動モデルを用いる方法が挙げられ、動物への負荷が少なく確実な評価を行うことができるモデルは非常に有用性が高い。
【０００８】
心房細動モデルとしては、例えば、アコニチンを心耳に局所投与することによって局所起源の心房細動を起こしたアコニチンモデルが提案されている（非特許文献１参照）。
しかし、アコニチンモデルは、臨床における心房細動とは直接関係がないため、心房細動抑制剤のスクリーニングへの使用には不向きであるという問題がある。
また、心房筋表面にタルクパウダを無菌的に散布し、心膜炎を起こすことによって心房性不整脈を誘発し易くした無菌性心膜炎モデルが提案されており（非特許文献２参照）、心房細動の発生機序を検討するために用いられている。
しかし、無菌性心膜炎モデルは、心膜炎による心房細動であるため、心臓手術後に発生する臨床におけるごく限られた心房細動を反映した方法に過ぎず、慢性心房細動に対する心房細動抑制剤のスクリーニングへの使用には不向きであるという問題がある。
また、ヤギの心房細動の頻回刺激を加えて心房細動を誘発した頻回刺激誘発モデルが提案されている（非特許文献３参照）。
しかし、ヤギは、実験動物としてサイズが大きく、世界的にも使用できる施設が限られることや、ヤギを扱うことができる研究者も少ないことから、心房細動抑制剤のスクリーニングへの使用には不向きであるという問題がある。
【０００９】
したがって、心房細動を含む不整脈に対して優れた抑制作用を有し、副作用が少なく安全性の高い抗不整脈剤、心房細動抑制剤、該心房細動抑制剤のスクリーニングに好適に利用できる持続性心房細動モデル及びその製造方法、並びに、前記持続性心房細動モデルを用いて心房細動抑制剤を効率よく簡便にスクリーニングできる心房細動抑制剤のスクリーニング方法の提供が強く望まれているのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｍｏｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９５９，  Ａｍ．Ｈｅａｒｔ．Ｊ．  ５８，  ５９−７０
【非特許文献２】Ｐａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６，  Ｊ．Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．，  ８，  ８７２−８７９
【非特許文献３】Ｍａｕｒｉｔｓ  Ｃ．Ｅ．Ｆ．  Ｗｉｊｆｆｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，  ９２，  １９５４−１９６８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、心房細動を含む不整脈に対して優れた抑制作用を有し、副作用が少なく安全性の高い抗不整脈剤、心房細動抑制剤、該心房細動抑制剤のスクリーニングに好適に利用できる持続性心房細動モデル及びその製造方法、並びに、前記持続性心房細動モデルを用いて心房細動抑制剤を効率よく簡便にスクリーニングできる心房細動抑制剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。
即ち、下記構造式（Ｉ）から（ＶＩ）のいずれかで表される化合物又はその薬理学的に許容し得る塩を含有し心房細動を抑制する心房細動抑制剤は、心房細動に対して優れた抑制作用を有し、副作用がなく安全性が高いことを知見し、本発明の完成に至った。
【化１】
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【化２】
0005615868.tif 000003
【化３】
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ただし、前記構造式（ＩＩＩ）において、Ｇｌｕｃは、グルクロン酸を表す。
【化４】
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【化５】
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【化６】
0005615868.tif 000007
【００１３】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  下記構造式（Ｉ）から（ＶＩ）のいずれかで表される化合物又はその薬理学的に許容し得る塩を含有し心房細動を抑制することを特徴とする心房細動抑制剤である。
【化７】
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【化８】
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【化９】
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ただし、前記構造式（ＩＩＩ）において、Ｇｌｕｃは、グルクロン酸を表す。
【化１０】
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【化１１】
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【化１２】
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＜２＞  心房細動が突発性心房細動及び慢性心房細動のいずれかである前記＜１＞に記載の心房細動抑制剤である。
＜３＞  イヌの房室結節領域に電極カテーテルを挿入し、前記電極カテーテルから前記房室結節領域に高周波を通電して前記房室結節を破壊し、房室伝導をブロックさせて心房を肥大拡大させる心房肥大拡大化工程と、肥大拡大化した前記心房をペーシングする心房ペーシング工程と、を含むことを特徴とする持続性心房細動モデルの製造方法である。
＜４＞  心房ペーシング工程が、５００ｂｐｍ〜７００ｂｐｍで４週間以上ペーシングする前記＜３＞に記載の持続性心房細動モデルの製造方法である。
＜５＞  前記＜３＞から＜４＞のいずれかに記載の持続性心房細動モデルの製造方法により製造されたことを特徴とする持続性心房細動モデルである。
＜６＞  心房細動が少なくとも１週間持続する前記＜５＞に記載の持続性心房細動モデルである。
＜７＞  前記＜５＞から＜６＞のいずれかに記載の持続性心房細動モデルに被験物質を投与する投与工程と、前記投与工程後、前記持続性心房細動モデルの心房細動を抑制した前記被験物質を心房細動抑制剤としてスクリーニングするスクリーニング工程と、を含むことを特徴とする心房細動抑制剤のスクリーニング方法である。
＜８＞  スクリーニング工程で心房細動が抑制された持続性心房細動モデルの心房をペーシングし、心房細動を再誘発する心房細動再誘発工程を更に含む前記＜７＞に記載の心房細動抑制剤のスクリーニング方法である。
＜９＞  心房細動再誘発工程が、心房細動が抑制されてから１週間以内に持続性心房細動モデルの心房を５００ｂｐｍ〜７００ｂｐｍで少なくとも１週間ペーシングする前記＜８＞に記載の心房細動抑制剤のスクリーニング方法である。
＜１０＞  下記構造式（Ｉ）から（ＶＩ）のいずれかで表される化合物又はその薬理学的に許容し得る塩を含有し不整脈を抑制することを特徴とする抗不整脈剤である。
【化１３】
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【化１４】
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【化１５】
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ただし、前記構造式（ＩＩＩ）において、Ｇｌｕｃは、グルクロン酸を表す。
【化１６】
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【化１７】
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【化１８】
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【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、心房細動を含む不整脈に対して優れた抑制作用を有し、副作用が少なく安全性の高い抗不整脈剤、心房細動抑制剤、該心房細動抑制剤のスクリーニングに好適に利用できる持続性心房細動モデル及びその製造方法、並びに、前記持続性心房細動モデルを用いて心房細動抑制剤を効率よく簡便にスクリーニングできる心房細動抑制剤のスクリーニング方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】図１Ａは、正常なビーグル犬の心臓のＭＲＩ像の一例を示す図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、心房肥大拡大化工程後のビーグル犬（慢性房室ブロックモデル）の心臓のＭＲＩ像の一例を示す図である。
【図２Ａ】図２Ａは、正常なビーグル犬の心エコー像の一例を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、心房肥大拡大化工程後のビーグル犬（慢性房室ブロックモデル）の心エコー像の一例を示す図である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、心房肥大拡大化工程後のビーグル犬（慢性房室ブロックモデル）の心エコー像の一例を示す図である。
【図３】図３は、製造例１におけるビーグル犬（持続性心房細動モデル）の心房ペーシング工程における心電図の一例を示す図である。
【図４】図４は、比較製造例１におけるビーグル犬の心房ペーシング工程における心電図の一例を示す図である。
【図５Ａ】図５Ａは、試験例１におけるオセルタミビル投与群のオセルタミビルの投与開始前−１分３３秒の心電図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、試験例１におけるオセルタミビル投与群のオセルタミビルの投与開始後＋２分４９秒の心電図である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、試験例１におけるオセルタミビル投与群のオセルタミビルの投与開始後＋５分５０秒の心電図である。
【図６Ａ】図６Ａは、試験例１におけるジソピラミド投与群のジソピラミド投与開始後＋６分００秒〜＋１４分００秒の心電図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、試験例１におけるジソピラミド投与群のジソピラミドの投与開始前−２２分５４秒の心電図である。
【図６Ｃ】図６Ｃは、試験例１におけるジソピラミド投与群のジソピラミドの投与開始後＋１２分１５秒の心電図である。
【図７】図７は、試験例３におけるオセルタミビル投与群の結果を示す図である。
【図８】図８は、試験例３におけるピルジカイニド投与群の結果を示す図である。
【図９】図９は、試験例３におけるジソピラミド投与群の結果を示す図である。
【図１０】図１０は、試験例３におけるメキシレチン投与群の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（心房細動抑制剤、抗不整脈剤）
本発明の心房細動抑制剤は、下記構造式（Ｉ）から（ＶＩ）のいずれかで表される化合物又はその薬理学的に許容し得る塩を少なくとも含有し、必要に応じて更にその他の成分を含有する。
本発明の抗不整脈剤は、下記構造式（Ｉ）から（ＶＩ）のいずれかで表される化合物又はその薬理学的に許容し得る塩を少なくとも含有し、必要に応じて更にその他の成分を含有する。
以下、本発明の前記心房細動抑制剤の説明と併せて、本発明の前記抗不整脈剤について説明する。
【００１７】
これらの中でも、前記心房細動抑制剤又は前記抗不整脈剤は、心房筋細胞に選択性の高いナトリウムイオン（Ｎａ＋）チャネルを阻害する化合物であることが好ましく、下記構造式（Ｉ）で表される化合物又はその薬理学的に許容し得る塩が特に好ましい。なお、前記心房細動抑制剤又は前記抗不整脈剤が心房筋Ｎａ＋チャネル阻害作用を有することは、該心房筋Ｎａ＋チャネル阻害作用を反映する指標である心電図Ｐ波幅で確認することができる。
【化１９】
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【化２０】
0005615868.tif 000021
【化２１】
0005615868.tif 000022
前記構造式（ＩＩＩ）において、Ｇｌｕｃは、グルクロン酸を表す。また、前記構造式（ＩＩＩ）で表される化合物は、前記構造式（Ｉ）で表される化合物のグルクロン酸抱合体を表す。
【化２２】
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【化２３】
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【化２４】
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【００１８】
なお、前記構造式（Ｉ）で表される化合物は、抗インフルエンザウイルス活性を有する化合物として知られているオセルタミビルと呼ばれる化合物であり、市販品では、商品名：タミフル（登録商標）（中外製薬株式会社製）として販売されている。
【００１９】
前記心房細動抑制剤中又は前記抗不整脈剤中の、前記構造式（Ｉ）から（ＶＩ）のいずれかで表される化合物又はその薬理学的に許容し得る塩の構造や含有量を確認する方法としては、特に制限はなく、各種の分析方法の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、元素分析法、質量分析法、プロトン核磁気共鳴分析法、炭素１３核磁気共鳴分析法、赤外線吸収分析法などが挙げられる。
【００２０】
前記心房細動抑制剤又は前記抗不整脈剤における前記構造式（Ｉ）から（ＶＩ）のいずれかで表される化合物又はその薬理学的に許容し得る塩の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記心房細動抑制剤又は前記抗不整脈剤は、前記構造式（Ｉ）から（ＶＩ）のいずれかで表される化合物又はその薬理学的に許容し得る塩そのものであってもよい。
【００２１】
−構造式（Ｉ）から（ＶＩ）のいずれかで表される化合物又はその薬理学的に許容し得る塩の製造方法−
前記構造式（Ｉ）から（ＶＩ）のいずれかで表される化合物又はその薬理学的に許容し得る塩は、市販品を用いてもよく、化学合成により得てもよい。
前記構造式（Ｉ）から（ＶＩ）のいずれかで表される化合物又はその薬理学的に許容し得る塩の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、特表２０００−５１７３０６号公報の式１１６の化合物の合成方法を好適に用いることができる。
【００２２】
具体的には、下記スキーム１及び２のプロセスＡＡ、ＡＢ、ＡＣ、ＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＨ、ＡＩ、ＡＪ、及びＡＫのうちのいずれか１つ、又はそれらの系列的な組み合わせ、下記スキーム３のプロセスＡＬ、ＡＭ、ＡＮ、ＡＯ、及びＡＰのうちのいずれか１つ、又はそれらの系列的な組み合わせを含むことが好ましい。
本発明において、「系列的な組み合わせ」とは、１つより多いプロセスであって、個別のプロセスが所望の順序で順次行われるプロセスを意味する。
また、単離、分離、精製などが行われてもよく、単離、分離、精製などを行う段階としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、いずれの個別のプロセスの前に行われてもよく、後に行われてもよい。
なお、下記スキーム１〜３において、「Ｅｔ」は、エチル基を表し、「Ｍｓ」は、メシル基を表し、「Ａｃ」は、アセチル基を表す。
【００２３】
【化２５】
0005615868.tif 000026
【００２４】
【化２６】
0005615868.tif 000027
【００２５】
より具体的には、式１１０の化合物をアジ化ナトリウムで処理して、式１１１の化合物を生成し、該式１１１の化合物を還元試薬で処理して式１１３の化合物を生成し、該式１１３の化合物をアジ化ナトリウムで処理して式１１４の化合物を生成し、該式１１４の化合物をアセチル化試薬で処理して式１１５の化合物を生成し、該式１１５の化合物を接触水素化に供して前記構造式（Ｉ）で表される化合物を合成することができる。
【００２６】
下記スキーム３は、代替の窒素求核試薬（Ｍａｒｃｈ，「Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，」第４版、第４２５頁〜第４２７頁）を用いてエポキシド２０１を開環することによる、前記構造式（Ｉ）で表される化合物２０６（Ｒ＝Ｈ２）の合成を示す。アジドアルコール２０２の酸化によりケトン２０３が得られ（Ｌａｒｏｃｋ，「Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ」、第６０４頁〜第６１４頁）、ここでβアキシャルＮＲ基は、異性体化されてαエクアトリアル立体配置を有するケトン２０４となる。ケトン２０４の還元的アミノ化（Ｌａｒｏｃｋ（前掲）、第４２１頁〜第４２５頁）により、βエクアトリアルアミン２０５が得られ、これをアセチル化して化合物２０６を得る。Ｒ部分の開裂（Ｇｒｅｅｎｅ、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、第２１８頁〜第２８７頁）によりＲ＝Ｈ２の前記構造式（Ｉ）で表される化合物が得られる。
【化２７】
0005615868.tif 000028
【００２７】
より具体的には、式２０１の化合物をアミン試薬で処理して式２０２の化合物を生成し、該式２０２の化合物を酸化試薬で処理して式２０３の化合物を生成し、該式２０３の化合物を塩基で処理して式２０４の化合物を生成し、該式２０４の化合物を還元的アミノ化試薬で処理して式２０５の化合物を生成し、該式２０５の化合物をアセチル化試薬で処理して前記構造式（Ｉ）で表される化合物を合成する方法などが挙げられる。
【００２８】
前記スキーム１〜３の各々において、各工程又は一連の工程の所望の生成物又は出発物質を互いに分離及び／又は精製することが好ましい。
前記分離及び／又は精製の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、多相抽出法、溶媒又は溶媒混合物からの結晶化、蒸留、昇華、クロマトグラフィー等を行う方法などが挙げられる。
【００２９】
前記クロマトグラフィーとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高圧クロマトグラフィー、中圧クロマトグラフィー、低圧液体クロマトグラフィー、小規模及び分取の薄層又は厚層クロマトグラフィー、小規模な薄層及びフラッシュクロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００３０】
前記分離及び／又は精製は、所望の生成物、未反応の出発物質、反応副生成物等に結合するように選択された試薬、あるいは他の方法で分離及び／又は精製し得る試薬で混合物を処理する方法であってもよい。
このような試薬としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、活性炭、モレキュラーシーブ、イオン交換媒体等の吸着剤又は吸収剤；分離及び／又は精製の対象が塩基性物質の場合に好ましく用いられる酸；分離及び／又は精製の対象が酸性物質の場合に好ましく用いられる塩基；抗体、結合タンパク質等の結合試薬；クラウンエーテル等の選択的錯形成剤；液／液イオン抽出試薬（ＬＩＸ）などが挙げられる。
【００３１】
前記スキーム１及び２についてより詳細に説明する。
前記式１００の化合物（ラクトン）は、キニン酸（２０ｋｇ、１０４ｍｏｌ；［α］Ｄ−４３．７゜（ｃ＝１．１２、水）；「ＭｅｒｃｋＩｎｄｅｘ第１１版」、８０７１：［α］Ｄ−４２゜〜−４４゜（水））、２，２−ジメトキシプロパン及びｐ−トルエンスルホン酸一水和物のアセトン中の溶液を２時間加熱還流し、次いでエタノール中のナトリウムエトキシドを加えて反応をクエンチし、そして溶媒の大部分を減圧蒸留する。得られた残渣を酢酸エチルと水との間で分配し、水層を酢酸エチルで逆抽出し、そして合わせた有機層を重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄し、酢酸エチルの大部分を減圧蒸留することにより、淡黄色の固体残渣として前記式１００の化合物を得ることができる。
【００３２】
前記式１０１の化合物（ヒドロキシエステル）は、前記式１００の化合物の無水エタノール中の溶液をエタノール中のナトリウムエトキシドで処理し、室温で２時間後、酢酸を加え、そして溶媒を減圧蒸留する。ここに酢酸エチルを加え、ほぼ乾固するまで蒸留を続け、黄褐色の固体残渣を得、これを酢酸エチルに還流下溶解し、そしてヘキサンを加え、冷却すると、白色結晶性固体が形成され、これを濾過により単離することにより、前記式１０１の化合物と前記式１００の化合物との混合物を得ることができる。
【００３３】
前記式１０２の化合物（メシルエステル）は、前記式１０１の化合物及び前記式１００の化合物の混合物をジクロロメタン中に懸濁した溶液を０℃〜１０℃に冷却し、そして塩化メタンスルホニルで処理し、次にトリエチルアミンをゆっくりと加え、次いで塩化メタンスルホニルを追加する。１時間後、水及び塩酸を加え、層分離させ、そして有機層を水で洗浄し、次に減圧蒸留することにより、前記式１０２の化合物と前記式１０３の化合物（メシルラクトン）との混合物である半固体残渣を得ることができる。この残渣を酢酸エチルに溶解し、−１０℃〜−２０℃に２時間かけて冷却し、前記式１０３の化合物を結晶化させ、これを濾過により分離し、そして冷酢酸エチルで洗浄し、濾液を濃縮して、前記式１０２の化合物をオレンジ色の樹脂として得ることができる。
【００３４】
前記式１０４の化合物（メシルアセトニド）は、前記式１０２の化合物及びピリジンのジクロロメタン中の溶液を−２０℃〜−３０℃に冷却し、そして塩化スルフリルで一滴ずつ処理し、発熱反応が鎮静した後、得られたスラリーをエタノールでクエンチし、０℃に加温し、そして硫酸、水、及び重炭酸ナトリウム水溶液で順次洗浄する。得られた有機層は、前記式１０４の化合物、前記式１０５の化合物（アリル性メシレート）、及び前記式１０６の化合物の混合物であり、これを減圧濃縮し、そして酢酸エチルを加え、前記式１０５の化合物を、ピロリジン及びテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）の酢酸エステル溶液で周囲温度にて５時間処理し、次に硫酸で洗浄することによって選択的に除去する。有機層をシリカゲルのパッドを通して濾過し、そして酢酸エチルで溶出し、濾液を減圧濃縮すると、前記式１０４の化合物及び前記式１０６の化合物の混合物からなる濃厚なオレンジ色の油状物が残る。この残渣を酢酸エチル中に還流下溶解し、そしてヘキサンを加え、冷却すると、前記式１０４の化合物が結晶化し、そしてこれを濾過により分離し、そしてヘキサン中の酢酸エチルで洗浄し、減圧乾燥の後、前記式１０４の化合物が淡黄色針状物として得られる。
【００３５】
前記式１０７の化合物（ペンチルケタール）は、前記式１０４の化合物、３−ペンタノン、及び過塩素酸の溶液を１８時間攪拌し、揮発性物質を周囲温度で減圧蒸留し、そして新しい３−ペンタノンを蒸留が進行するにつれ徐々に加え、次いで反応混合物を濾過し、トルエンを加え、そして得られた溶液を重炭酸ナトリウム水溶液、水、及び食塩水で順次洗浄する。次いで、有機層を減圧濃縮し、そしてトルエンを蒸留が進行するにつれ徐々に加え、蒸留がそれ以上できなくなった時点で、オレンジ色の油状物の残渣として式１０７の化合物が得られる。
【００３６】
前記式１０８の化合物（ペンチルエーテル）は、前記式１０７の化合物のジクロロメタン中の溶液を−３０℃〜−２０℃に冷却し、そしてボラン−メチルスルフィド錯体、及びトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリルで処理し、１時間後、重炭酸ナトリウム水溶液をゆっくりと加え、混合物を周囲温度まで加温し、そして１２時間攪拌する。得られた有機層を濾過し、そして減圧濃縮すると、前記式１０８の化合物と前記式１０９の化合物との混合物が灰色のろう状固体として得られる。
【００３７】
前記式１１０の化合物（エポキシド）は、前記式１０８の化合物及び前記式１０９の化合物の混合物のエタノール溶液を水中の炭酸水素カリウムの溶液で処理し、５５℃〜６５℃に２時間加熱した後、溶液を冷却し、そして２回ヘキサンで抽出すると、未反応の式１０９の化合物が水性エタノール層中に残留する。合わせたヘキサン抽出物を濾過し、そして減圧濃縮すると、式１１０の化合物が羊毛状の白色結晶固体として得られる。
【００３８】
前記式１１１の化合物（ヒドロキシアジド）は、水及びエタノール中の式１１０の化合物、アジ化ナトリウム、及び塩化アンモニウムの混合物を７０℃〜７５℃に８時間加熱し、重炭酸ナトリウム水溶液を加え、そしてエタノールを減圧蒸留した。水性残渣を酢酸エチルで抽出し、そして抽出物を水で洗浄し、この水洗浄物を酢酸エチルで逆抽出する。合わせた有機抽出物を食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過及び減圧濃縮すると、前記式１１１の化合物と前記式１１２の化合物との混合物が、暗褐色の油状物として得られる。
【００３９】
前記式１１３の化合物（アジリジン）は、前記式１１１の化合物と前記式１１２の化合物との混合物を減圧下３回、無水アセトニトリルから共蒸発させ、次に無水アセトニトリル中に溶解し、無水テトラヒドロフラン及び無水アセトニトリル中の無水トリフェニルホスフィンの溶液を２時間かけて一滴ずつ加え、この混合物を６時間還流加熱し、次に減圧下濃縮すると、前記式１１３の化合物と、トリフェニルホスフィンオキシドと、微量のトリフェニルホスフィンからなる金色のペーストが得られる。このペーストをジエチルエーテルで粉末化し、不溶のトリフェニルホスフィンオキシドの大部分を濾過により除去し、そしてジエチルエーテルで洗浄する。濾液を減圧下濃縮すると、暗褐色の油状物が残り、これを水性メタノール水溶液に溶解し、そしてヘキサで３回抽出して、トリフェニルホスフィンを除去する。ヘキサン抽出物を水性メタノール水溶液で抽出し、そして合わせた水性メタノール層を減圧下濃縮する。残渣を無水アセトニトリルから減圧下２回共蒸発すると、暗褐色の油状物として前記式１１３の化合物及びトリフェニルホスフィンオキシドからなる混合物が得られる。
【００４０】
前記式１１５の化合物（アセトアミドアジド）は、式１１３の化合物、トリフェニルホスフィンオキシド、アジ化ナトリウム、及び塩化アンモニウムのジメチルホルムアミド中の混合物を８０℃〜８５℃に５時間加熱する。ここに重炭酸ナトリウム及び水を加え、前記式１１４の化合物を反応混合物からヘキサンで６回抽出することによって単離する。合わせたヘキサン抽出物を減圧下濃縮し、そしてジクロロメタンを加え、次いで重炭酸ナトリウム水溶液を加え、更に無水酢酸を加える。周囲温度で１時間攪拌した後、水層を捨て、有機相を減圧下濃縮し、これを還流下酢酸エチルに溶解し、冷却すると、前記式１１５の化合物が結晶化し、これを濾過によって単離することができる。ヘキサン中の冷酢酸エチルで洗浄し、そして減圧下周囲温度で乾燥した後、純粋な前記式１１５の化合物をオフホワイト色の結晶として得ることができる。
【００４１】
前記構造式（Ｉ）で表される化合物は、前記式１１５の化合物及びリンドラー触媒の無水エタノール中の混合物を１８時間攪拌し、その間、水素（１気圧）を、前記混合物を通してバブリングし、次いでセライトを通して濾過し、そして濾液を減圧濃縮して、前記構造式（Ｉ）で表される化合物を泡状物として得ることができる。なお、この泡状物は、放置すると固化する。
【００４２】
前記構造式（Ｉ）で表される化合物のリン酸塩は、前記構造式（Ｉ）で表される化合物のアセトン中の溶液を還流し、これを無水エタノール中のリン酸で処理すると、即時に結晶化が開始し、そして０℃で１２時間冷却した後、沈殿を濾過により採取することにより、無色針状物として得ることができる。
【００４３】
前記構造式（Ｉ）で表される化合物の塩酸塩は、前記構造式（Ｉ）で表される化合物のアセトン中の溶液の無水エタノール中の溶液を、エタノール中塩化水素で処理し、次いでエタノールの大部分を減圧下蒸発させ、そして油状残渣を酢酸エチルと共に固体が形成されるまで攪拌する。ヘキサンを攪拌した混合物に徐々に加える。周囲温度で１時間後、固体を濾過により採取し、ジエチルエーテルで洗浄し、そして減圧下乾燥する。これによりオフホワイト色の固体として構造式（Ｉ）で表される化合物の塩酸塩を得ることができる。
【００４４】
前記構造式（ＩＩ）から（ＶＩ）のいずれかで表される化合物又はその薬理学的に許容し得る塩の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。なお、前記構造式（ＩＩ）から（ＶＩ）のいずれかで表される化合物又はその薬理学的に許容し得る塩は、前記構造式（Ｉ）で表される化合物又はその薬理学的に許容し得る塩の代謝産物であることが知られている（タミフル（登録商標）医薬品インタビューフォーム、２００５年１２月（改定第１６版）参照）。
【００４５】
＜その他の成分＞
前記心房細動抑制剤又は前記抗不整脈剤における前記その他の成分としては、薬理学的に許容されるものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知の添加剤、補助剤、水などが挙げられる。
前記添加剤又は前記補助剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、殺菌剤、保存剤、粘結剤、増粘剤、固着剤、結合剤、着色剤、安定化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、等張化剤、溶剤、酸化防止剤、紫外線防止剤、結晶析出防止剤、消泡剤、物性向上剤、防腐剤などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００４６】
前記殺菌剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム等のカチオン性界面活性剤などが挙げられる。
【００４７】
前記保存剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、クレゾールなどが挙げられる。
【００４８】
前記粘結剤、増粘剤、固着剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、澱粉、デキストリン、マルチトール、セルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルデンプン、プルラン、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸アンモニウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、グアーガム、ローカストビーンガム、アラビアゴム、キサンタンガム、ゼラチン、カゼイン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド、ポリエチレングリコール、エチレン・プロピレンブロックポリマー、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【００４９】
前記結合剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ステアリン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【００５０】
前記着色剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。
【００５１】
前記安定化剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチン、ピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。
【００５２】
前記ｐＨ調整剤及び前記緩衝剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００５３】
前記等張化剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。
【００５４】
前記心房細動抑制剤又は前記抗不整脈剤における前記その他の成分の含有量としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００５５】
＜併用＞
前記心房細動抑制剤又は前記抗不整脈剤は、１種単独で使用してもよく、他の成分を有効成分とする薬物と併用してもよい。また、他の成分を有効成分とする薬物に配合されていてもよい。
他の成分を有効成分とする薬物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、臨床で心房細動の予防薬又は治療薬として用いられている薬物などが挙げられ、具体例としては、ジソピラミド、アプリンジン、シベンゾリン、ピルジカイニドなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよいが、心房細動を停止させた後、心房細動が再発しにくい点で、前記心房細動抑制剤又は前記抗不整脈剤と前記その他の薬物とを併用することが好ましく、ピルジカイニドと併用することが特に好ましい。
【００５６】
＜剤形＞
前記心房細動抑制剤又は前記抗不整脈剤の剤形としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、固形剤、半固形剤、液剤などが挙げられる。
前記心房細動抑制剤又は前記抗不整脈剤は、前記剤形などに応じて、公知の方法により製造することができる。
【００５７】
−固形剤−
前記固形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、錠剤、チュアブル錠、発泡錠、口腔内崩壊錠、トローチ剤、ドロップ剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、ドライシロップ剤、浸剤、坐剤、パップ剤、プラスター剤などが挙げられる。
【００５８】
−半固形剤−
前記半固形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、舐剤、チューインガム剤、ホイップ剤、ゼリー剤、軟膏剤、クリーム剤、ムース剤、インヘラー剤、ナザールジェル剤などが挙げられる。
【００５９】
−液剤−
前記液剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、注射剤、シロップ剤、ドリンク剤、懸濁剤、酒精剤、液剤、点眼剤、エアゾール剤、噴霧剤などが挙げられる。これらの中でも、注射剤が特に好ましい。
【００６０】
前記心房細動抑制剤又は前記抗不整脈剤の製造方法としては、特に制限はなく、剤形などに応じて、公知の方法の中から適宜選択することができる。
【００６１】
＜投与＞
前記心房細動抑制剤又は前記抗不整脈剤の投与方法、投与量、投与時期、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００６２】
前記投与方法としては、例えば、経口投与法、非経口投与法、局所投与法、経腸投与などが挙げられる。これらの中でも、非経口投与法が好ましく、注射による投与法が特に好ましい。
【００６３】
前記投与量としては、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする薬物の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができるが、有効成分としての前記構造式（Ｉ）から（ＶＩ）のいずれかで表される化合物又はその薬理学的に許容し得る塩の１日あたりの合計投与量が、３ｍｇ／ｋｇ以上が好ましく、１０ｍｇ／ｋｇ以上がより好ましく、２０ｍｇ／ｋｇ以上が更に好ましく、２５ｍｇ／ｋｇ以上が更により好ましく、３０ｍｇ／ｋｇ以上が特に好ましい。
また、前記投与量の上限値としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２，０００ｍｇ／ｋｇ以下が好ましく、１，０００ｍｇ／ｋｇ以下がより好ましく、１００ｍｇ／ｋｇ以下が特に好ましい。
前記投与量の下限値と上限値としては、適宜組み合わせることができ、これらを組み合わせた投与量としては、３ｍｇ／ｋｇ〜２，０００ｍｇ／ｋｇが好ましく、１０ｍｇ／ｋｇ〜１，０００ｍｇ／ｋｇがより好ましく、２０ｍｇ／ｋｇ〜１，０００ｍｇ／ｋｇが更に好ましく、２５ｍｇ／ｋｇ〜１，０００ｍｇ／ｋｇが更により好ましく、３０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇが特に好ましい。
前記投与回数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、１日１回の投与でもよく、複数回に分けて投与してもよい。
【００６４】
前記投与対象となる動物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、トリなどが挙げられるが、これらの中でもヒトに好適に用いられる。
【００６５】
＜用途＞
本発明の前記心房細動抑制剤又は前記抗不整脈剤は、優れた不整脈抑制作用、特に心房細動に対して優れた抑制作用を有し、副作用が少なく安全性が高いものであるため、心房細動を含む不整脈の予防薬又は治療薬として好適に利用可能である。更に、前記心房細動抑制作用は、突発性心房細動（発作性心房細動）及び持続性心房細動のいずれの心房細動に対しても有効である点で有利である。ここで、本発明において、心房細動抑制作用とは、少なくとも心房細動を抑制する作用であればよく、除細動も含む。前記除細動とは、心房細動を停止させ、洞調律に復帰することを意味する。
前記心房細動抑制剤は、持続性心房細動に対して有効であるため、永続性心房細動への進行を防ぐことができ、更に脳梗塞をはじめとする全身臓器の血栓や塞栓症等の合併症の予防薬としても好適に利用可能である。
【００６６】
（持続性心房細動モデル及びその製造方法）
本発明の持続性心房細動モデルの製造方法は、心房肥大拡大化工程と、心房ペーシング工程と、を少なくとも含み、必要に応じて、更にその他の工程を含む。
本発明の持続性心房細動モデルは、本発明の前記持続性心房細動モデルの製造方法により製造されたモデルである。
以下、持続性心房細動モデルの製造方法の説明と併せて、持続性心房細動モデルについても詳細に説明する。
【００６７】
＜心房肥大拡大化工程＞
前記心房肥大拡大化工程は、イヌの房室結節領域に電極カテーテルを挿入し、前記電極カテーテルから前記房室結節領域に高周波を通電して前記房室結節を破壊し、房室伝導をブロックさせて心房を肥大拡大させる工程である。前記心房肥大拡大化工程は、特開２００６−６７９５０号公報に記載の方法を用いることもできる。
本発明において、心房の「肥大」とは、心房壁の厚みが厚くなることをいい、心房の「拡大」とは、心房壁で囲まれた内部の体積が大きくなることをいう。したがって、前記心房肥大拡大化工程を経たイヌは、心房壁の厚みが厚くなり、且つ心房の内部の体積が大きくなった状態となる。
【００６８】
前記持続性心房細動モデルの製造方法の対象であるイヌの種類、大きさ、年齢、性別などとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、実験動物としての実績があるビークル犬が取扱い易さの点で好ましく、体重１０ｋｇ程度の１歳〜２歳のビーグル犬がより好ましい。
【００６９】
前記イヌを用いて心房肥大拡大化工程を行う際は、イヌに麻酔をかけて行うことが好ましい。
麻酔薬の種類としては、特に制限はなく、公知のものの中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ペントバルビタール、ハロセンなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
前記麻酔薬を投与する量としては、特に制限はなく、対象であるイヌの種類、大きさ、年齢、性別などに応じて適宜選択することができる。
【００７０】
また、前記イヌを用いて心房肥大拡大化工程を行う際は、麻酔をかけた後、呼吸を安定させる目的で挿管して人工呼吸器等の酸素乃至大気供給手段から一定量の酸素乃至大気を供給することが好ましい。
前記酸素乃至大気の供給量としては、特に制限はなく、対象個体の体重などに応じて適宜選択することができるが、１５ｍＬ／ｋｇ〜２５ｍＬ／ｋｇが好ましい。
【００７１】
電極カテーテルの材質、形状、直径、長さなどとしては、特に制限はなく、公知の電極カテーテルの中から、目的に応じて適宜選択することができるが、電極が先端部に取り付けられたカテーテルであることが好ましい。前記電極が先端部に取り付けられたカテーテルは、市販品を用いることができ、例えば、カタログ番号：Ｄ７−ＤＬ−２５２（４ｍｍチップ電極、コーディス・ウェブスター社製）などが挙げられる。
【００７２】
イヌの房室結節領域に電極カテーテルを挿入する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、電極カテーテルを大腿静脈から房室結節領域に挿入する方法が好ましく、電極カテーテルの先端部の電極を所定位置に固定することがより好ましい。
前記電極カテーテルの先端部の電極を固定する位置としては、ヒス束心電図（ＡＶ）が最大に記録できる部位を探した後、心房の電気興奮を表すＡ波と、心室の電気興奮を表すＶ波との比（Ａ波：Ｖ波）が２：１以上となる領域で固定することが好ましい。このような部位としては、房室結節領域などが挙げられる。
【００７３】
前記房室結節領域に通電する際の周波数としては、高周波であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、目的とする部位を焼灼できる周波数であることが好ましく、４５０ｋＨｚ〜５５０ｋＨｚがより好ましく、５００ｋＨｚが特に好ましい。前記周波数が、４５０ｋＨｚ未満であると、房室結節を破壊できないことがあり、５５０ｋＨｚを超えると、房室結節を焼灼しすぎ、不要な部位まで破壊されてしまうことがある。
また、前記房室結節領域に通電する際の電力としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１８Ｗ〜２２Ｗが好ましく、２０Ｗがより好ましい。前記周波数が、１８Ｗ未満であると、房室結節を破壊できないことがあり、２２Ｗを超えると、房室結節を焼灼しすぎ、不要な部位まで破壊されてしまうことがある。
通電時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００７４】
前記房室結節を破壊した後のイヌは、心房を肥大拡大化させるために、４週間以上おくことが好ましく、４週間〜６週間おくことがより好ましい。
心房が肥大拡大化したことは、例えば、ＭＲＩ（核磁気共鳴画像）、心エコー、Ｘ線写真、圧付加や容量負荷の測定などにより確認することができる。
【００７５】
前記心房肥大拡大化工程により、房室伝導が完全にブロックされた慢性房室ブロックモデルが作製される。前記慢性房室ブロックモデルは、洞結節のペースメーカとしての機能が停止されるため、右心室及び左心室は、以後、ヒス束のリズムによって血液のポンプ機能を果たすことになる。そのため心臓から血液を送り出すポンプ機能が低下すると共に心拍数も大幅に減少して心臓に負担が掛かり、結果として心臓の重量が約２倍程度に増加する。
【００７６】
＜心房ペーシング工程＞
前記心房肥大拡大化工程で肥大拡大化した心房をペーシングする工程である。
本発明において、「ペーシング」とは、電気刺激により人為的に心筋細胞の電気興奮を作り出し、この電気興奮の伝播により心収縮を引き起こす事象を意味する。
ペーシングする方法としては、前記肥大拡大化した心房をペーシングすることができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ペーシングリードを有するペースメーカを所定の位置に植え込みペーシングする方法などが挙げられる。
【００７７】
前記ペーシングリード及びペースメーカの材質、形状、大きさなどとしては、特に制限はなく、公知のペースメーカの中から、目的に応じて適宜選択することができる。市販品のペーシングリードとしては、例えば、ＯＳＣＯＲ社製のリードなどが挙げられる。市販品のペースメーカとしては、例えば、大正医科機械株式会社製のカタログ番号：ＴＮＴ−００２などが挙げられる。
【００７８】
前記ペーシングリードを植え込む位置としては、前記肥大拡大化した心房をペーシングすることができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、左房中のバックマン（Ｂａｃｈｍａｎｎ）束領域が、持続性心房細動モデルの作製効率が高い点で好ましい。
前記ペースメーカを植え込む位置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、臀部皮下などが挙げられる。
【００７９】
ペースメーカの植え込み後、心房に振動を付与するまでは、動物への負荷を少なくする点で、４週間以上おくことが好ましく、４週間〜６週間おくことがより好ましい。
【００８０】
ペーシングの速度としては、特に制限はなく、対象個体の特性などに応じて適宜選択することができるが、５００ｂｐｍ〜７００ｂｐｍが好ましく、５５０ｂｐｍ〜６５０ｂｐｍがより好ましく、６００ｂｐｍが特に好ましい。前記ペーシングの速度が、５００ｂｐｍ未満であると、持続性心房細動モデルを作製することができないことがあり、７００ｂｐｍを超えると、永続性心房細動が発生することがある。
【００８１】
ペーシングの期間としては、特に制限はなく、対象個体の特性などに応じて適宜選択することができるが、４週間以上が好ましく、６週間以上がより好ましく、６週間〜１２週間が特に好ましい。前記ペーシングの期間が、４週間未満であると、持続性心房細動モデルを作製できないことがあり、１２週間を超えると、永続性心房細動が発生することがある。
【００８２】
前記持続性心房細動モデルが作製できたこと、即ち、心房細動が持続しているか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、心電図で確認する方法などが挙げられる。
なお、本発明において、心房細動の持続とは、前記心房ペーシング工程終了後、即ちペーシングを止めた後においても、心房が３００ｂｐｍ以上で不規則に振動し続けてしていることを意味する。
【００８３】
＜持続性心房細動モデル＞
本発明の前記持続性心房細動モデルは、心房が肥大拡大化しており、かつ心房細動が持続しており、これにより血栓も生じ易いモデルである。したがって、臨床においてヒトで生じる持続性心房細動に非常に近い状態にあるモデルである点で有利である。
前記持続性心房細動モデルにおける心房細動の持続時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１分間以上が好ましく、１時間以上がより好ましく、２４時間以上が更に好ましく、１週間以上が特に好ましい。
なお、心房細動が抑制又は除細動された後の前記持続性心房細動モデルに対して、前記心房ペーシング工程を行うことで、再度、心房細動が生じ、持続性心房細動モデルを作製することができる。
【００８４】
＜用途＞
本発明の持続性心房細動モデル及びその製造方法は、臨床における持続性心房細動に近いモデルであり、心房細動を持続することができ、更に心房細動を薬物等で心房細動を抑制又は除細動できるため、心房細動抑制剤のスクリーニングや、既存の抗不整脈薬の有効性の再評価などに好適に利用可能である。また、前記持続性心房細動モデルは、心房細動の発生機序等の病態の検討にも好適に利用可能である。
【００８５】
（心房細動抑制剤のスクリーニング方法）
本発明の心房細動抑制剤のスクリーニング方法は、投与工程と、スクリーニング工程と、を少なくとも含み、必要に応じて、更に心房細動再誘発工程などのその他の工程を含む。
【００８６】
＜投与工程＞
前記投与工程は、本発明の前記持続性心房細動モデルに被験物質を投与する工程である。
前記被験物質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化合物、核酸、タンパク質などが挙げられる。また、臨床で用いられている心房細動の予防薬又は治療薬、新たに開発した製薬、公知の医薬品、薬物などを用いることもできる。
【００８７】
前記被験物質を投与する方法としては、特に制限はなく、前記被験物質の種類や状態などに応じて適宜選択することができ、例えば、経口投与法、非経口投与法、局所投与法、経腸投与などが挙げられる。
前記被験物質の投与量としては、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質、などに応じて適宜選択することができる。
【００８８】
＜スクリーニング工程＞
前記スクリーニング工程は、前記投与工程後、前記持続性心房細動モデルの心房細動を抑制した被験物質を心房細動抑制剤としてスクリーニングする工程である。
【００８９】
前記心房細動を抑制したか否かを判断する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記投与工程における前記被験物質の投与前と、前記被験物質の投与後との心電図の変化、特にＰ波により判断する方法が好ましく、前記被験物質の投与前、投与中、及び投与後にわたって継続してその変化を観察することがより好ましい。
前記心電図を測定する方法としては、特に制限はなく、公知の装置（例えば、長時間心電図記録解析装置、商品名：ＨＳ１０００システム、フクダ  エム・イー工業株式会社製）を用いて測定することができる。
【００９０】
前記持続性心房細動モデルは、心房細動が持続しているため、投与前の心電図は、Ｐ波が心房細動に応じた不規則な波形を示す。
これに対し、前記被験物質を投与後、心電図におけるＰ波が洞調律に近づく、あるいは洞調律に復帰した場合、心房細動の抑制作用を有する物質であると判断することができ、心房細動抑制剤としてスクリーニングされる。
一方、前記被験物質を投与後、Ｐ波に変化がない（心房細動に変化がない）、あるいはＰ波の波形が更に不規則に及び／又は細かくなる（心房細動が促進される）場合は、心房細動を抑制しない物質と判断することができる。
なお、心房細動抑制剤としてスクリーニングされた物質であっても、心室に不整脈が生じるなどの副作用を引き起こす物質は、臨床応用には不向きであるため、スクリーニング後、臨床応用のための試験において除外することが好ましい。
【００９１】
＜心房細動再誘発工程＞
前記心房細動再誘発工程は、前記スクリーニング工程で心房細動が抑制された持続性心房細動モデルの心房をペーシングし、心房細動を再誘発する工程である。前記心房細動再誘発工程により、１個体の持続性心房細動モデルを、繰り返しスクリーニングに用いることができる点で好ましい。
また、前記持続性心房細動モデルの製造方法における前記心房肥大拡大化工程を行うことなく心房細動を再誘発できるため、操作が簡便である点で有利である。
【００９２】
前記心房細動再誘発工程において、前記心房細動が抑制された持続性心房細動モデルの心房をペーシングする方法としては、前記心房ペーシング工程と同様の方法を用いることができる。
前記心房細動再誘発工程において、前記心房細動が抑制された持続性心房細動モデルの心房をペーシングする速度としては、特に制限はなく、対象個体の特性などに応じて適宜選択することができるが、５００ｂｐｍ〜７００ｂｐｍが好ましく、５５０ｂｐｍ〜６５０ｂｐｍがより好ましく、６００ｂｐｍが特に好ましい。前記ペーシングの速度が、５００ｂｐｍ未満であると、心房細動を再誘発できないことがある。
【００９３】
前記心房細動再誘発工程を行うタイミングとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、心房細動が抑制されてから（洞調律に復帰してから）１週間以内に行うことが好ましい。心房細動が抑制されてから１週間を超えると、心房細動を再誘発できないことがある。
【００９４】
前記心房細動再誘発工程で心房細動が再誘発された個体は、再度、前記投与工程及び前記スクリーニング工程に供することができ、これにより、１個体の持続性心房細動モデルを、繰り返しスクリーニングに用いることができる点で有利である。
【００９５】
なお、前記心房細動再誘発工程で心房細動を再誘発できなかった場合は、前記心房細動が抑制された持続性心房細動モデルを、前記持続性心房細動モデルの作製方法と同様の方法に供し、心房肥大拡大化工程及び心房ペーシング工程を経ることで、再度持続性心房細動モデルを作製することもできる。
【００９６】
＜用途＞
本発明の心房細動抑制剤のスクリーニング方法は、ヒトで生じる心房細動と同様のメカニズムを有しているイヌの持続性心房細動モデルを用いているため、心房細動のｉｎ  ｖｉｖｏ評価系として優れており、心房細動の予防や治療のために用いられる新たな心房細動抑制剤のスクリーニングや、ピルジカイニドやジソピラミド等の心房細動の治療薬として長年臨床で使用されている既存の薬物の再評価に有効かつ効率的に利用可能である。
なお、本発明の前記心房細動抑制剤のスクリーニング方法は、抗不整脈剤のスクリーニング方法としても好適に利用可能である。
また、薬物による不整脈の増悪効果の評価モデル、薬物を投与した時の心拍数や血圧、心電図の変化等の観察にも好適に利用可能である。
【実施例】
【００９７】
以下に本発明の実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００９８】
（製造例１）
−心房肥大拡大化工程−
ビーグル犬（ｎ＝６、生後約１年、体重約１０ｋｇ、雌、北山ラベス株式会社）にペントバルビタール（田辺三菱製薬株式会製）３０ｍｇ／ｋｇを静脈注射で投与し、同時に気管に人工呼吸器（ＳＮ−４８０−３、株式会社シナノ製作所製）を挿管して２０ｍＬ／ｋｇの酸素を供給して人工呼吸させた。
大腿部を剃毛し、アルコール綿で消毒してから、大腿静脈にガイドワイヤを挿入し、更にペーシング電極が先端部に取り付けられた電極カテーテル（カタログ番号：Ｄ７−ＤＬ−２５２、４ｍｍチップ電極、コーディス・ウェブスター社製）を大腿静脈から右心室まで挿入した。次いで、ホルター心電図（長時間心電図記録解析装置、商品名：ＨＳ１０００システム、フクダ  エム・イー工業株式会社製）の電極を、標準四肢第ＩＩ誘導法に基づいて装着し、ヒス束心電図（ＡＶ）が最大に記録できる部位を探した後、心房の電気興奮を表すＡ波と、心室の電気興奮を表すＶ波との比（Ａ波：Ｖ波）が２：１以上となる領域に、先端の電極を逢着して固定した。次いで、電極カテーテルの先端電極から房室結節領域に５００ｋＨｚ、２０Ｗで１０秒間通電して房室結節を破壊して房室伝導をブロックした後、４週間飼育した。
【００９９】
−−心房肥大拡大化の確認−−
４週間飼育後、心房が肥大拡大化したことは、磁気共鳴断層撮影装置（ＭＲＩ）及び心臓超音波（心エコー）により確認した。ＭＲＩは、シグナプロファイル（ゼネラルエレクトリック社製、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，  ＷＩ）で測定した。心エコーは、ＳＳＡ−４００（東芝メディカルシステムズ株式会社製）で測定した。
正常なビーグル犬の心臓のＭＲＩ像を図１Ａに、心房肥大拡大化工程後のビーグル犬の心臓のＭＲＩ像を図１Ｂに示す。また、正常なビーグル犬の心エコー像を図２Ａに、心房肥大拡大化工程後のビーグル犬の心エコー像を図２Ｂ及びＣに示す。
図１Ａ及びＢ、並びに、図２Ａ〜Ｃにおいて、ＲＡは、右心房、ＲＶは、右心室、ＬＡは、左心房、ＬＶは、左心室、Ａｏは、大動脈、ＰＶは、肺静脈、ＩＶＣは、下大動脈を表す。
図１Ａ及びＢ、並びに、図２Ａ〜Ｃより、心房肥大拡大化工程により左心房（ＬＡ）が肥大拡大化していることが確認され、更に、図２Ｃでは、僧帽弁逆流ジェット（ＭＲ  ｊｅｔ）が観察された。これにより、慢性房室ブロックモデルが作製できたことが確認された。
【０１００】
−心房ペーシング工程−
前記心房肥大拡大化工程を経たビーグル犬に、ペントバルビタール（田辺三菱製薬株式会製）３０ｍｇ／ｋｇを静脈注射で投与し、同時に気管に人工呼吸器を挿管して２０ｍＬ／ｋｇの酸素を供給して人工呼吸させた。
臀部を剃毛し、アルコール綿で消毒してから、ペーシングリード（ＯＳＣＯＲ社製）を接続したペースメーカ（カタログ番号：ＴＮＴ−００２、大正医科機械株式会社製）を臀部に植え込んだ。ペーシングリードは、皮下トンネルを介して胸部まで走行させ、先端の電極を、開胸して左房のバックマン束領域に逢着して固定した。ペースメーカ及びペーシングリードの植え込み後、４週間飼育した。
次いで、ペースメーカを６００ｂｐｍで動作させ、６週間心房に振動を付与した。このとき、ペースメーカを６００ｂｐｍで動作させると、ペースメーカによる電気刺激（Ａ）に対して、心房筋の収縮反応（Ｂ）は、Ａ：Ｂ＝１：１であった。この様子を、ホルター心電図（長時間心電図記録解析装置、商品名：ＨＳ１０００システム、フクダ  エム・イー工業株式会社製）の電極を、標準四肢第ＩＩ誘導法に基づいて装着して測定した結果を図３に示す。なお、このときの心室の拍動は、３１ｂｐｍであった。
【０１０１】
６週間後、ペースメーカによる電気刺激を止め、心電図を観察したところ、製造例１におけるビーグル犬は、６個体中６個体に心房細動が確認され、持続性心房細動モデルが作製できたことが確認された。また、６個体中６個体とも１週間以上の心房細動の持続が確認された。
【０１０２】
（製造例２）
製造例１において、心房ペーシング工程で心房に振動を付与する期間を、６週間から４週間に変えたこと以外は、製造例１と同様の処理をビーグル犬（ｎ＝４）に施した。
【０１０３】
４週間後、ペースメーカによる電気刺激を止め、心電図を観察したところ、製造例２におけるビーグル犬は、４個体中４個体とも心房細動が確認され、持続性心房細動モデルが作製できたことが確認された。しかし、４個体中４個体とも、心房細動の持続時間は、２４時間〜１週間であり、その後、心房細動は、自然停止して洞調律に復帰した。
【０１０４】
（比較製造例１）
製造例１において、心房ペーシング工程でペースメーカのペーシング速度を、６００ｂｐｍから４００ｂｐｍに変えたこと以外は、製造例１と同様の処理をビーグル犬（ｎ＝６）に施した。この様子をホルター心電図（長時間心電図記録解析装置、商品名：ＨＳ１０００システム、フクダ  エム・イー工業株式会社製）で測定した結果を図４に示す。なお、このときの心室の拍動は、３５ｂｐｍであった。
【０１０５】
６週間後、ペースメーカによる電気刺激を止め、心電図を観察したところ、比較製造例１におけるビーグル犬は、６個体中６個体とも心房細動が確認されず、ペースメーカよる電気刺激を止めた後は、洞調律に復帰した。したがって、持続性心房細動モデルを作製することはできなかった。
【０１０６】
（比較製造例２）
製造例１において、心房ペーシング工程でペーシングリードの先端の電極の固定位置を、左房中のバックマン束領域から右房中のバックマン束領域に変えたこと以外は、製造例１と同様の処理をビーグル犬（ｎ＝４）に施した。なお、ペースメーカを６００ｂｐｍで動作させると、ペースメーカによる電気刺激（Ａ）に対して、心房筋の収縮反応（Ｂ）は、Ａ：Ｂ＝２：１であった。
【０１０７】
６週間後、ペースメーカによる電気刺激を止め、心電図を観察したところ、比較製造例２におけるビーグル犬は、４個体中４個体とも心房細動が確認されず、ペースメーカよる電気刺激を止めた後は、洞調律に復帰した。したがって、持続性心房細動モデルを作製することはできなかった。
【０１０８】
（比較製造例３）
比較製造例２において、心房ペーシング工程でペースメーカのペーシング速度を、６００ｂｐｍから４００ｂｐｍに変えたこと以外は、比較製造例２と同様の処理をビーグル犬（ｎ＝４）に施した。なお、ペースメーカを４００ｂｐｍで動作させると、ペースメーカによる電気刺激（Ａ）に対して、心房筋の収縮反応（Ｂ）は、Ａ：Ｂ＝１：１であった。
【０１０９】
６週間後、ペースメーカによる電気刺激を止め、心電図を観察したところ、比較製造例３におけるビーグル犬は、４個体中４個体とも心房細動が確認されず、ペースメーカよる電気刺激を止めた後は、洞調律に復帰した。したがって、持続性心房細動モデルを作製することはできなかった。
【０１１０】
（試験例１：心房細動抑制剤のスクリーニング）
製造例１で作製した持続性心房細動モデルに対し、生理食塩水を用いて表１に示す投与量となるように調製した、オセルタミビル（リン酸オセルタミビル、商品名：タミフル（登録商標）、中外製薬株式会社製；構造式（Ｉ）で表される化合物のリン酸塩）、ジソピラミド（商品名：リスモダン（登録商標）、サノフィ・アベンティスファーマ株式会社製）、アプリンジン（アプリンジン塩酸塩、商品名：アスペノン（登録商標）、バイエル薬品工業株式会社製）、シベンゾリン（シベンゾリンコハク酸塩、商品名：シベノール（登録商標）アステラス製薬株式会社製）、及びピルジカイニド（塩酸ピルジカイニド、商品名：サンリズム（登録商標）、第一三共株式会社製）のいずれかを下記表１に示す投与量で静脈注射により１０分間かけて投与した。なお、下記表１に示す投与量は、有効成分の純分換算した量を示す。
投与前から投与後にかけて、ホルター心電図（長時間心電図記録解析装置、商品名：ＨＳ１０００システム、フクダ  エム・イー工業株式会社製）の電極を、持続性心房細動モデルに標準四肢第ＩＩ誘導法に基づいて装着して測定し、投与後に心房細動停止頻度を求めた。ここで、心房細動停止頻度とは、下記式（１）で表される。また、前記心房細動停止頻度から、下記式（２）より除細動率を算出した。結果を併せて下記表１に示す。
心房細動停止頻度＝Ｘ／Ｙ  ・・・式（１）
除細動率（％）＝Ｘ／Ｙ×１００  ・・・式（２）
ただし、前記式（１）及び前記式（２）において、「Ｘ」は、薬物の投与後に心房細動が停止した持続性心房細動モデルの個体数を表し、「Ｙ」は、試験に供した持続性心房細動モデルの個体数を表す。
【０１１１】
【表１】
0005615868.tif 000029
【０１１２】
表１の結果より、これまで臨床で心房細動に用いられてきた薬物を投与した群では、心房細動停止頻度及び除細動率が非常に低かったことに対して、オセルタミビル投与群は、非常に高い確立で除細動できることがわかった。
また、ジソピラミド投与群の６個体中１個体にＴｄＰ（ｔｏｒｓａｄｅｓ  ｄｅ  ｐｏｉｎｔｅｓ：非持続性多形性心室頻拍）が認められた（図６Ａ参照）。
【０１１３】
また、図５Ａ〜Ｃに、薬物の投与により心房細動が停止し、洞調律に復帰した一例として、オセルタミビル投与群のうちの１個体における心電図を、図６Ａ〜Ｃに、薬物の投与により心房細動が停止しなかった一例として、ジソピラミド投与群のうちの１個体における心電図を示す。図５Ａ〜Ｃにおいて、各薬物の投与開始時の時間を０分とし、この０分を基準として、投与開始前の時間を「−」、投与開始後の時間を「＋」で表す。
【０１１４】
図５Ａは、オセルタミビルの投与開始前−１分３３秒の心電図であり、図５Ｂは、オセルタミビルの投与開始後＋２分４９秒の心電図であり、図５Ｃは、オセルタミビルの投与開始後＋５分５０秒の心電図である。この結果より、オセルタミビルの投与開始後＋５分５０秒で心房細動が停止したことが確認された。
【０１１５】
また、図６Ａは、ジソピラミドの投与開始後＋６分〜＋１４分の心電図であり、図６Ｂは、ジソピラミドの投与開始前−２２分５４秒の心電図である。図６Ｃは、ジソピラミドの投与開始後＋１２分１５秒の心電図であり、図６Ａの四角で囲んだ部分を拡大した図である。この結果より、ジソピラミドは心房細動を停止することができなかった。更に、図６Ａより、心室細動が発生し、ジソピラミドを投与した持続性心房細動モデルの死亡が確認された。
【０１１６】
試験例１の結果より、オセルタミビルは、除細動に優れる薬物であり、かつ心室にも影響がなく、安全性が高いため、心房細動抑制剤として好適に利用できることがわかった。
また、本発明の心房細動抑制剤のスクリーニング方法は、新たな心房細動の治療薬を、簡便かつ正確にスクリーニングでき、更に臨床で使用される心房細動の治療薬の再評価にも好適に利用できることがわかった。
【０１１７】
（試験例２：オセルタミビルの投与量及び併用の検討）
次に、心房細動抑制剤としてのオセルタミビルの投与量について検討を行った。
製造例１で作製した持続性心房細動モデルに対し、生理食塩水を用いて表２に示す投与量となるように調製したオセルタミビル（リン酸オセルタミビル、商品名：タミフル（登録商標）、中外製薬株式会社製；構造式（Ｉ）で表される化合物のリン酸塩）及び／又はピルジカイニド（塩酸ピルジカイニド、商品名：サンリズム（登録商標）、第一三共株式会社製）を下記表２に示す投与量で静脈注射により１０分間かけて投与した。また、生理食塩水のみを投与した個体を対照とした。なお、下記表２に示す投与量は、有効成分の純分換算した量を示す。
【０１１８】
投与前から投与後にかけて、試験例１と同様の方法で心電図を測定し、試験例１と同様の方法で心房細動停止頻度及び除細動率を算出した。また、心房細動が停止した個体について、心房細動が停止してから２４時間、心電図の経過観察を行い、心房細動が再発するか否かについて観察した。結果を併せて下記表２に示す。
【０１１９】
【表２】
0005615868.tif 000030
【０１２０】
表２の結果より、オセルタミビルは、３０ｍｇ／ｋｇ以上投与することが好ましいことがわかった。また、オセルタミビル高用量＋ピルジカイニド投与群の結果より、オセルタミビルとピルジカイニドとの併用も心房細動を抑制することが確認された。
更に、オセルタミビル高用量＋ピルジカイニド投与群は、オセルタミビル高用量投与群に比べて心房細動再発頻度が低いことが確認された。
【０１２１】
（試験例３：オセルタミビルのＱＴ延長への影響の検討）
試験例３は、Ｈｉｒｏｓｈｉ  Ｙｏｓｈｉｄａ，  ＭＤ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃ  Ｊ  ２００２，  Ｖｏｌ．６６，  ８５７−８６２、Ａ．Ｓｕｇｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，  ２００３，  Ｖｏｌ．４６６，  １３７−１４６などに記載の方法で行われた。具体的な方法を以下に示す。
正常なビーグル犬（生後約１年、体重約１０ｋｇ、雌、北山ラベス株式会社）にペントバルビタール（田辺三菱製薬株式会製）３０ｍｇ／ｋｇを静脈注射で投与し、同時に気管に人工呼吸器（ＳＮ−４８０−３、株式会社シナノ製作所製）を挿管して２０ｍＬ／ｋｇの酸素を供給して人工呼吸させた。次いで、ページング用のカテーテル電極（カタログ番号：１６７５Ｐ、ＥＰテクノロジー社製）を大腿静脈から右心室内に挿入し右心室内の心室内中隔の心内膜にカテーテル先端の電極を逢着して固定した。
【０１２２】
このビーグル犬に対し、生理食塩水を用いて表３に示す投与量となるように調製したオセルタミビル（リン酸オセルタミビル、商品名：タミフル（登録商標）、中外製薬株式会社製；構造式（Ｉ）で表される化合物のリン酸塩）、ピルジカイニド（塩酸ピルジカイニド、商品名：サンリズム（登録商標）、第一三共株式会社製）、ジソピラミド（商品名：リスモダン（登録商標）、サノフィ・アベンティスファーマ株式会社製）、及びメキシレチン（メキシレチン塩酸塩、商品名：メキシチール（登録商標）、日本べーリンガーインゲルハイム社製）のいずれかを下記表３に示す投与量及び投与時間で静脈注射により投与した。なお、各薬物は、下記表３に示す投与スケジュールで投与した。即ち、各個体について最初に下記表３中の最も低濃度で投与し、その後３０分間経過ごとに下記表３に示す濃度に上げて投与した。なお、下記表３に示す投与量は、有効成分の純分換算した量を示す。
また、各薬物投与群に対する対照群として、各薬物の投与時間及び投与スケジュールと同様の方法で生理食塩水を投与した群を用いた。
【０１２３】
【表３】
0005615868.tif 000031
【０１２４】
前記ビーグル犬に、ホルター心電図（長時間心電図記録解析装置、商品名：ＨＳ１０００システム、フクダ  エム・イー工業株式会社製）の電極を、持続性心房細動モデルに標準四肢第ＩＩ誘導法に基づいて装着し、投与前から投与後にかけて、洞調律時におけるＱＴ間隔（ｍｓ）、ＰＲ間隔（ｍｓ）、Ｐ波（ｍｓ）、ＱＲＳ波（ｍｓ）、ＭＡＰ９０（ｓｉｎｕｓ）、ＡＨ間隔、及びＨＶ間隔を測定した。
なお、Ｐ波（Ｐ  ｄｕｒａｔｉｏｎ）は、心房の電気興奮を表し、ＱＲＳ波は、心室の電気興奮を表し、ＡＨは、心房性ヒス束間隔を表し、ＨＶは、房室結節伝導時間を表し、ＭＡＰ９０（ｓｉｎｕｓ）は、洞調律下で活動電位振幅が最大値の９０％まで再分極する時間を表す。
【０１２５】
また、ＭＡＰ（Ｍｏｎｏｐｈａｓｉｃ  ａｃｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ：単相性活動電位）をＤＣプレアンプ（カタログ番号：３００、ＥＰテクノロジー社製）で増幅して測定した。心臓のペーシングは、カーディアックスティムレータ（カタログ番号：ＳＥＣ−３１０２、日本光電株式会社製）を用い、刺激閾値の約２倍に相当する１Ｖ〜２Ｖで心室を刺激した。
周期長３００ｍｓｅｃで心室をペーシングし、ＭＡＰ９０（ＣＬ３００）を測定し、周期長４００ｍｓｅｃで心室をペーシングし、ＭＡＰ９０（ＣＬ４００）を測定した。
また、心室を、周期長４００ｍｓｅｃで８回ペーシングした後、９回目に早期刺激を加え、この早期刺激の連結期を５ｍｓ〜１０ｍｓずつ短縮していき、ＥＲＰ（Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｐｅｒｉｏｄ：有効不応期）（ＣＬ４００）を測定した。ここで、「早期刺激」とは、周期長４００ｍｓｅｃより早い周期長を意味する。また、「早期刺激の連結期」とは、ペーシングの８回目（周期長４００ｍｓｅｃでの最後の刺激）と、９回目（早期刺激）との間の時間を意味する。
なお、周期長３００ｍｓｅｃで心室をペーシングした場合の心室の心拍数は、２００ｂｐｍであり、周期長４００ｍｓｅｃで心室をペーシングした場合の心室の心拍数は、１５０ｂｐｍであった。
【０１２６】
また、ＱＴｃ（補正ＱＴ間隔）（ｍｓ）を下記に示すＢａｚｅｔｔの公式（１９２０）により算出し、ＴＲＰ（Ｔｏｒｓａｄｅｓ  ｄｅ  Ｐｏｉｎｔｓ：活動電位終末期）（ｍｓ）を下記式より算出した。
ＱＴｃ＝ＱＴ／√ＲＲ  ・・・Ｂａｚｅｔｔの公式
ＴＲＰ＝ＭＡＰ９０（ＣＬ４００）−ＥＲＰ
【０１２７】
オセルタミビル投与群の結果を図７に、ピルジカイニド投与群の結果を図８に、ジソピラミド投与群の結果を図９に、メキシレチン投与群の結果を図１０に示す。図７〜１０において、黒塗りで示すプロット（●、■、又は▲）は、統計によりｐ＜０．０５の有意差が認められたことを示す。
図７〜１０の結果より、オセルタミビル投与群では、ＱＴ及びＱＴｃの延長は小さく、安全なＱＴ延長パターンを示していた。これより、オセルタミビルは、大量投与できることが示唆された。一方、ピルジカイニド投与群、ジソピラミド投与群、及びメキシレチン投与群は、オセルタミビル投与群と比較して、ＱＴ及びＱＴｃの延長が大きく、危険なＱＴ延長パターンを示していた。ＱＴ間隔は、心筋細胞の活動電位持続時間を推定する指標であり、過度のＱＴ間隔の延長は、致死性心室不整脈であるＴｄＰ（Ｔｏｒｓａｄｅｓ  ｄｅ  Ｐｏｉｎｔｅｓ）を誘発することが知られており、ＱＴ間隔の延長が大きいほどＴｄＰの発生リスクが増大する。
また、オセルタミビル投与群では、ＭＡＰ９０（ＣＬ３００）、即ち心拍数が２００ｂｐｍのときの延長が、ＭＡＰ９０（ＣＬ４００）、即ち心拍数が１５０ｂｐｍのときの延長に比べて大きく、安全なＭＡＰ延長パターンを示していた。一方、ピルジカイニド投与群及びジソピラミド投与群は、ＭＡＰ９０（ＣＬ４００）、即ち心拍数が１５０ｂｐｍのときの延長が、ＭＡＰ９０（ＣＬ３００）、即ち心拍数が２００ｂｐｍのときの延長に比べて大きく、危険なＭＡＰ延長パターンを示していた。
更に、オセルタミビル投与群では、Ｐ波の延長が大きく、心房に対する選択性が高いことが示唆された。また、オセルタミビル投与群では、心房筋Ｎａ＋チャネル阻害作用を反映する指標である心電図Ｐ波幅を他のイオンチャネルの指標より延長させた（図７左上段）。
【０１２８】
これらの結果より、オセルタミビルは、これまで臨床で心房細動を含む不整脈の予防薬又は治療薬として使用されてきた薬物と比較して、心房細動の抑制作用あるいは除細動に非常に優れ、更に副作用が少なく安全性が高いことがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１２９】
本発明の心房細動抑制剤及び抗不整脈剤は、心房細動を含む不整脈に対して優れた抑制作用を有し、副作用が少なく安全性が高いため、心房細動を含む不整脈の予防薬や治療薬として好適に利用可能である。また、前記心房細動抑制剤及び前記抗不整脈剤は、持続性心房細動に対して有効であるため、永続性心房細動への進行を防ぐことができ、更に脳梗塞をはじめとする全身臓器の血栓や塞栓症等の合併症の予防薬としても好適に利用可能である。
本発明の持続性心房細動モデル及びその製造方法は、臨床における持続性心房細動に近いモデルであり、心房細動を持続することができ、更に該心房細動を薬物等で心房細動を抑制又は除細動できるため、心房細動抑制剤のスクリーニングに好適に利用可能である。
本発明の心房細動抑制剤のスクリーニング方法は、ヒトで生じる心房細動と同様のメカニズムを有しているイヌの持続性心房細動モデルを用いているため、心房細動のｉｎ  ｖｉｖｏ評価系として優れており、心房細動の予防又は治療に用いられる新たな心房細動抑制剤のスクリーニングや、既存の心房細動の治療薬の再評価に有効かつ効率的に利用可能である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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