(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イグサからの芳香性を有する抽出物を有効成分として含有することを特徴とする組織型プラスミノーゲン活性化因子分泌促進剤であって、
芳香性を有する抽出物は、抽出溶媒にイグサを浸漬して、抽出溶媒を-10〜15℃の低温に維持して抽出される組織型プラスミノーゲン活性化因子分泌促進剤。
【請求項２】
イグサは、破砕処理を施すことなく抽出溶媒としての水エタノール混合液に浸漬する請求項１に記載の組織型プラスミノーゲン活性化因子分泌促進剤。
【請求項３】
芳香性を有する抽出物は、抽出溶媒に浸漬したイグサの色素が流出し、流出による抽出溶媒の色彩の変化がなくなるまで浸漬したものを抽出原液とし、
組織プラスノーゲン活性化因子分泌促進剤は、30〜70容量％となるように前記抽出原液を含有するものである請求項１又は２に記載の組織型プラスミノーゲン活性化因子分泌促進剤。
【請求項４】
抽出溶媒に浸漬するイグサは、浸漬する前に50〜60℃の低温又は天日干しで乾燥させたものである請求項１ないし３のいずれかに記載の組織型プラスミノーゲン活性化因子分泌促進剤。
【請求項５】
イグサからの芳香性を有する抽出物を有効成分として含有する組織型プラスミノーゲン活性化因子分泌促進剤の製造方法であって、
芳香性を有する抽出物は、抽出溶媒にイグサを浸漬して、抽出溶媒を-10〜15℃の低温に維持して抽出される組織型プラスミノーゲン活性化因子分泌促進剤の製造方法。
【請求項６】
イグサは、破砕処理を施すことなく抽出溶媒としての水エタノール混合液に浸漬する請求項５に記載の組織型プラスミノーゲン活性化因子分泌促進剤の製造方法。
【請求項７】
芳香性を有する抽出物は、抽出溶媒に浸漬したイグサの色素が流出し、流出による抽出溶媒の色彩の変化がなくなるまで浸漬したものを抽出原液とし、
組織プラスノーゲン活性化因子分泌促進剤は、30〜70容量％となるように前記抽出原液を希釈するものである請求項５又は６に記載の組織型プラスミノーゲン活性化因子分泌促進剤の製造方法。
【請求項８】
抽出溶媒に浸漬するイグサは、浸漬する前に50〜60℃の温度又は天日干しで乾燥させたものである請求項５ないし７のいずれかに記載の組織型プラスミノーゲン活性化因子分泌促進剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イグサからの芳香性を有する抽出物を含有する組織型プラスミノーゲン活性化因子活性化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
組織型プラスミノーゲン活性化因子（以下、t-PA(tissue Plasminogen Activator)と称する）は、５２７個のアミノ酸からなる分子量約７万の糖タンパクであり、主として血管内皮細胞で生産され循環血液中に分泌される。t-PAは、アミノ末端からフィンガー領域、EGF領域、２個のクリングル領域及び活性領域から構成され、血液線溶系において重要な働きを有する。すなわち、t-PAは、セリンプロテアーゼ活性を有しており、プラスミノーゲンを限定分解し、プラスミンを生成する。そして、プラスミンは凝固血液中のフィブリンを分解する線溶反応を担う。
【０００３】
t-PAは、虚血性脳血管障害、急性肺塞栓症及び急性冠症候群に対する最も強力な血栓溶解薬として高い有効性が証明されている。例えば、非特許文献１では、遺伝子組み換え組織型プラスミノーゲン活性因子（rt-PA: recombinant tissue-type plasminogen activator）を発症３時間以内の急性期脳梗塞に投与すると、社会生活が自立した患者を優位に増加させることが明らかにされている。この治療法は、rt-PA静注療法と呼ばれている。
【０００４】
上述のように、t-PAは血栓溶解剤として優れた効果を発揮する。t-PAを得るには、チャイニーズハムスター卵巣の樹立細胞株にt-PAをコードする遺伝子を導入してrt-PAを発現、精製する方法が知られている。このようにして製造されるrt-PAは高価な点で問題であった。
【０００５】
一方で、特許文献１ないし４には、種々の植物由来の抽出物が血栓の予防作用等の生体に有用な作用を示すことが記載されているが、特許文献１を除いて、イグサに関する言及はない。特許文献１においては、段落0076にイグサエキスが開示されているものの、イグサエキスの服用によりパネル６名の内の半数が腰痛あるいは肩こりの改善があったことが記載されているに過ぎない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Tissue plasminogen activator for acute ischemic stroke, N. Engl. J.Med., 333, 1581-1587, 1995
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００６-３２８０１４号公報
【特許文献２】特開２００６-３３５７０３号公報
【特許文献３】特開２００７-４５７７１号公報
【特許文献４】特開２００８-３９８４５４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述のように、t-PAを遺伝子工学を利用して生産する方法は、t-PAの調達コストが嵩むという問題がある。また、t-PAは処方せん医薬品に分類されることから、処方せんなしには使用することができないため、血栓の形成を予防するために日常的に使用できるようなものではなかった。
【０００９】
本発明は、t-PAそのものを身体に注射等によって接種する方法に比べて、より安価、簡便、かつ気軽な方法でt-PAを利用することができる組織プラスミノーゲン活性化因子活性化剤及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、イグサ由来の芳香性を有する抽出物にt-PAの分泌を促進する効果があることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、イグサからの芳香性を有する抽出物を有効成分として含有することを特徴とする組織型プラスミノーゲン活性化因子分泌促進剤（以下、t-PA分泌促進剤と称する）及びその製造方法である。前記t-PA分泌促進剤及びその製造方法では、芳香性を有する抽出物は、抽出溶媒にイグサを浸漬して、抽出溶媒を-10〜15℃に維持して抽出される。
【００１１】
上述の通り、芳香性を有する抽出物は、抽出溶媒にイグサを浸漬して、抽出溶媒を-10〜15℃に維持して抽出する。前記温度の範囲に維持して抽出することにより、イグサの芳香成分が揮発して失われることを防止することができる。
【００１２】
t-PA分泌促進剤及びその製造方法においては、芳香性を有する成分を抽出するに際して、イグサは、ホモゲナイズ等の破砕処理を施すことなく抽出溶媒としての水エタノール混合液に浸漬することが好ましい。ホモゲナイズ等の破砕処理を行うことなく抽出溶液に浸漬することで、低分子量の芳香成分を有効成分として抽出溶媒に溶出させることができる。換言すると、破砕処理を行わないことによって分子量の大きい夾雑物が抽出溶媒に多量に溶出することを防ぐことができるので、その後の精製処理を省略することができる。
【００１３】
芳香性を有する抽出物は、抽出溶媒に浸漬したイグサの色素が流出し、流出による抽出溶媒の色彩の変化がなくなるまで浸漬したものを抽出原液とし、組織プラスノーゲン活性化因子分泌促進剤は、30〜70容量％となるように前記原液を含有することが好ましい。抽出物の含有率を前記範囲内とすることでt-PAの分泌が最も高まる。
【００１４】
抽出溶媒に浸漬するイグサは、浸漬する前に50〜60℃の低温又は天日干しで乾燥させたものを使用することが好ましい。これにより、抽出液の原料となるイグサからの芳香成分が揮発することを防止することができる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のt-PA分泌促進剤は、生細胞に適用することでt-PAの分泌を高める効果を発揮する。したがって、本発明のt-PA分泌促進剤は、例えば、マッサージオイルなどの皮膚用塗布剤としてヒトの体に塗って使用することで、ヒトの細胞が発現するt-PAの分泌を高める効果が得られる。また、本発明のt-PA分泌促進剤は、アロマオイルや芳香剤などの吸引投与組成物として使用することができる。アロマオイルとして使用する場合は、t-PA分泌促進剤を耐熱容器に入れて、耐熱容器を適宜の方法によって加熱してイグサの抽出液の芳香成分を揮発させたり、t-PA分泌促進剤を適宜の容器に入れてイグサの抽出液の芳香成分を自然に揮発させたりして使用する。温水を満たした容器にt-PA分泌促進剤を添加して、揮発する芳香成分を吸引してもよい。芳香剤として使用する場合は、容器にt-PA分泌促進剤を入れて、室内に設置して使用する。アロマオイルや芳香剤等の吸引組成物として使用する場合、イグサからの抽出物に含まれる芳香成分が揮発して、呼吸によって肺の静脈から体内に取り込まれる。アロマオイルや芳香剤として使用すれば、芳香成分を嗅ぐだけで体内のt-PAの分泌を高めることができる。
【００１６】
t-PAは血栓溶解作用だけでなく、学習能力の向上や記憶の形成、神経細胞の移動、神経の発達、神経細胞の樹状突起上のスパインの形成等に寄与することが報告されている。したがって、本発明のt-PA分泌促進剤を吸入することで学習能力の向上や記憶力の向上を図る効果が期待される。アロマオイルや芳香剤として使用すれば、簡便に抽出物に含まれる芳香成分を吸入することができるので、学習室や病室の片隅に設置して気軽に使用することができる。後述するように、イグサからの芳香性を有する抽出物を有効成分として含有するt-PA分泌促進剤は、それ自体が血小板の凝集を抑制する効果を有し、t-PA分泌促進剤それ自体が血栓形成防止剤としての効果を有する。したがって、本発明のt-PA分泌促進剤は、線溶反応を促進する効果と血小板凝集を抑制する効果との両面で血栓形成を防止することができる。使用方法も上述の通り簡便なものであり、かつ安価で提供することができるのでt-PAを予防的に積極的に使用することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】t-PA活性の測定結果を示すグラフである。
【図２】血小板凝集の抑制効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、発明を実施するための形態について説明する。
【００１９】
本発明は、イグサからの芳香性を有する抽出物を有効成分として含有することを特徴とする組織型プラスミノーゲン活性化因子分泌促進剤及びその製造方法である。原料として使用できるイグサは、特に限定されず、例えば畳表に使用されるイグサを使用することができる。それらのうち、芳香性が高いものを選択して使用すればよい。畳表の原料として流通するイグサは、収穫後の変色を防ぐ目的で刈り取った後、泥水に浸けられている。泥水に浸漬したイグサは、泥染めイグサと呼ばれているが、本発明では泥染めしない生イグサを使用することが好ましい。
【００２０】
芳香性を有する抽出物を得る際に使用する抽出方法としては、抽出溶媒にイグサを浸漬して、抽出溶媒を-10〜30℃の温度に維持して抽出することが好ましく、−5〜15℃の低温に維持して抽出するとより好ましい。前記温度範囲で抽出することで抽出作業中にイグサ由来の芳香成分が揮発して失われることを防ぐことができる。一方で、上記範囲を超えて低温にすると抽出効率が低下することがある。抽出溶媒には、生体毒性の比較的低い有機溶媒又は有機溶媒と水の混合液を使用することが好ましい。有機溶媒としては、エタノール、プロパノール、イソプロピルアルコール、若しくはブチルアルコールなどのアルコール類又はこれらの内の少なくとも１種以上の混合物を使用することが好ましく、中でも生体毒性の低いエタノールと水との混合液を使用することが好ましい。エタノールは生体毒性が低いため、抽出溶媒を除去せずにt-PA分泌促進剤を人体に適用することができる。抽出溶媒を除去せずに使用に供する場合は、抽出効率及び生体毒性を考慮してエタノールの濃度を10〜70容量％となるように調整することが好ましい。エタノール濃度は、10〜40容量％とすることがより好ましい。
【００２１】
抽出溶媒に上記の乾燥イグサを浸漬する際には、ホモゲナイズ等の破砕処理をすることなく、イグサを5〜10ｍｍ長を目安に切断してから浸漬することが好ましい。浸漬中においては、スターラーなどの撹拌子で撹拌してもよい。抽出溶媒0.7リットルに対して乾燥イグサを10〜40ｇを目安として、乾燥イグサを浸漬するとよい。抽出溶媒に対する乾燥イグサの浸漬量によっても異なるが、上記の混合比で、-10〜30℃の温度で浸漬した場合、一晩浸漬すれば、抽出溶媒にイグサの芳香成分が流出して色彩の変化が起こらなくなり飽和状態に達する。この際、水エタノール混合液の色は、薄黄色に変色している。本発明では、抽出溶媒に浸漬したイグサの色素が流出し、流出による抽出溶媒の色彩の変化がなくなるまで浸漬したものを抽出原液とする。t-PA分泌促進剤は、原液をそのまま使用してもよいが、30〜70容量％となるように抽出原液を含有するように、希釈して使用することが好ましい。より好ましくは、40〜60容量％となるように希釈するとよい。後述するように、この数値範囲において特に、t-PAの分泌の飛躍的な高まりがみられる。
【００２２】
上述の通り、本発明では泥染めしていない生イグサを使用することが好ましい。しかし、時期によっては生イグサを調達できるとは限らない。生イグサを調達できない場合は、生イグサを低温で乾燥したものを使用するとよい。生イグサを低温乾燥することで、イグサ由来の芳香成分を乾燥の過程で損なうことなく維持することが可能になるからである。生イグサの乾燥温度は、50〜60℃の低温とすることが好ましい。乾燥方法は、とくに制限されないが例えば、温水を管内に循環させた管に乾燥した空気を送り込んで温風を作り出し、この温風を乾燥室に満たして、当該乾燥室に生イグサを吊るすことにより行うことができる。乾燥時間は12〜24時間とすることが好ましい。
【００２３】
上述のように、本発明のt-PA分泌促進剤は、マッサージオイルなどの皮膚用塗布剤、アロマオイル又は芳香剤などの吸引投与組成物として使用することができる。その際には、抽出原液をそのまま使用してもよいが、上述のように30〜70容量％となるように抽出原液を含有するように、希釈することが好ましい。より好ましくは、40〜60容量％となるように希釈することが好ましい。希釈液としては、水にアスコルビン酸、トコフェロールなどの酸化防止剤を添加したもの等を使用することができる。
【００２４】
以下、本発明の実施例を挙げてさらに具体的に説明する。
【実施例】
【００２５】
〔イグサの調達〕
12月末頃に苗床に残しておいた種苗を株分けした。株分けは、１株当たり芽が２、３本含まれるようにした。株分けした苗を鉢植用の土を入れたトレイに挿して、本田の片隅においておいた。翌年の３月上旬に根が絡んで新芽が出てきたので畑に植え替えた。８月頃には苗が成長して大きくなったので、苗１株を20株程度に分けて水田（苗床）に手作業で植えた。その後、肥培管理しながら栽培し、その年の11月下旬に株を引き抜いて、株についた泥を落とした後、20センチ×60センチのカセットの中に株を解しながら詰めていった。カセットを20アール分用意したところで、カセットを本田に搬入して、本田に植え替えて、肥培管理しながら栽培した。その後翌年の６月下旬まで栽培して刈り取った。イグサの栽培は全て無農薬で行った。収穫したイグサは泥染めすることなく、そのまま乾燥機に入れて55℃で18時間乾燥させた。この乾燥は天日干しにしてもよい。
【００２６】
〔イグサ抽出液の作製〕
上記の乾燥させたイグサを5〜10mm間隔で切断したイグサ25gと25容量％に調整した水エタノール混合液700mlとを注いだビーカーに入れた後、室温においてスターラーでしばらく撹拌してから、４℃に維持して一晩浸漬した。翌朝にはイグサの色素が水エタノール混合液に流出し、液色が薄黄色になっていたので、イグサを取り除いてこれをイグサ抽出液とした。イグサ抽出液の匂いを確認したところ、イグサの芳香が抽出液に移行していた。同様の方法で作製したイグサ抽出液をもう一晩４℃で浸漬したが、液色に大きな変化は見られず、抽出液のイグサの芳香が強くなることもなかった。
【００２７】
〔細胞培養〕
ヒト由来の培養細胞を使用した。細胞培養液は、10容量％の牛胎児血清（FBS）を含むE-MEM培地を121℃、15分間に設定したオートクレーブに入れて加圧及び加熱処理をし、これを滅菌フィルターでろ過したものを使用した。96ウェルのプレートに細胞が3×104cells/cm2となるように播種して、37℃、5%CO2の条件下でコンフルーエントになるまで培養した。古い培養液を除去した後、培養細胞に新しい培養液56.7μlと上記ようにして調製したイグサ抽出液6.4μlとを加えてさらに24時間培養した。イグサ抽出液は、原液、1/2希釈、1/4希釈、1/8希釈、1/16希釈、1/32希釈又は1/64希釈してから添加した。希釈はいずれも容量比に基づいて超純水を添加して希釈した。比較対象のためにコントロールとして超純水を使用した。
【００２８】
〔t-PA活性の測定〕
t-PA活性の測定には、t-PAに特異性の高い合成アミド基質であるH-D-Ile-Pro-Arg-pNA(S-2288)を使用した。基質濃度は、ジメチルスルホキシド（DMSO）で5×10-3Mに調整した。96ウェルプレートに0.1Mリン酸緩衝液(pH7.4)50μlと前記合成アミド基質10μlを混合して37℃、10分間プレインキュベーションした。さらに前記の各濃度に希釈した培養液を40μl添加して、405nmの吸光度を37℃で10分間測定した。t-PAは下記の式の反応を触媒して、pNA(p-ニトロアラニン)を遊離させる。pNAは吸光度の変化によって定量される。そして、生じたpNA量からt-PA量（unit/ml）を算出した。
[化１]
H-D-Ile-Pro-Arg-pNA→H-D-Ile-Pro-Arg + pNA
【００２９】
t-PA活性の測定結果を図１に示す。上記の各濃度のイグサ抽出液を添加した培養細胞３セットを１組として２ロット用意した。t-PA活性の測定は、この２つのロット（培養細胞１、培養細胞２）の培養細胞のそれぞれについて行った。図１の培養細胞１及び培養細胞２のグラフはそれぞれ、各希釈率における３セット分の測定結果（unit/ml）を平均した数値を示す。原液、1/2希釈（50%）、1/4希釈(25%)、1/8希釈(12.5%)、1/16希釈(6.25%)、1/32希釈(3.13%)又は1/64希釈(1.56%)にしたイグサ抽出液を上述のように培養細胞１又は培養細胞２に添加してt-PA活性を測定したところ、原液を1/2希釈した場合に最も酵素活性が高まることが確かめられた。特に培養細胞２（10919.4unit/ml）では超純水を添加したコントロール(683.3unit/ml)に比べて20倍もt-PA活性が高まること確認された。この酵素活性の高まりは、t-PAの発現量の増大及びそれに伴うt-PAの分泌量の増大に起因するものである。したがって、本発明の組織型プラスミノーゲン活性化因子活性化剤は、組織型プラスミノーゲン活性化因子の生成促進剤あるいは組織型プラスミノーゲン活性化因子の分泌促進剤として捉えることができる。
【００３０】
〔血小板凝集の抑制能〕
次に、上述のようにして得たイグサ抽出液が血小板凝集に与える影響について調べた。ヒトの多血小板血漿（PRR: Platelet Rich Plasma）に上述のようにして得たイグサ抽出液の原液を10μl加えて、これを37℃で、5分間プレインキュベーションした。次に、凝集惹起物質としてコラーゲンを22μl(終濃度4.5μg/ml)又はADPを22μl（終濃度2.5μM）加えた。そして、37℃において5分間、血小板凝集率をアグリゴメーター（PAT-4A）で測定した。測定に際しては、貧血小板血漿の光透過率を100％とした。血小板凝集率の算出は、血小板が凝集していない状態では、血小板が比較的均一に分散していることに起因して光透過率が低いのに対して、血小板が凝集すると、光透過率が高まることを利用している。すなわち、血小板が凝集すると凝集した血小板間の間隙が大きくなり光が透過しやすくなることを利用したものである。比較対照のためにコントロールとして25容量％に調整した水エタノール混合液を使用した。結果を図２に示す。図２から明らかなように、イグサ抽出液には凝集惹起物質であるコラーゲン及びADPのいずれに対しても、血小板の凝集を抑える効果があることが明らかになった。
【００３１】
上述の1/2希釈した抽出液は、そのままマッサージオイルとして肌に塗布して使用することができた。さらに1/2希釈した抽出液は、耐熱皿に入れて当該耐熱皿を加熱することで、アロマオイルとして使用することができた。このアロマオイルは、皿に入れて自然に香気成分を揮発させて使用することもできた。また、1/2に希釈した抽出液を小瓶に詰めて芳香剤として使用することができた。希釈には、酸化防止剤を添加した滅菌水を使用した。
【００３２】
上記の方法でイグサから抽出した抽出物は、イグサをホモゲナイズ等の破砕処理をしておらず、低温の水エタノール混合液に浸漬して抽出したものであるから、水エタノール混合液に溶出した成分は低分子量の芳香成分を主成分とするものである。この芳香成分は鼻や口を経て肺に達して血中に取り込まれるため、本発明のt-PA分泌促進剤を嗅いだり吸引したりするだけで、体内でのt-PAの分泌を促し、t-PA活性を向上させて血栓の形成を予防したり、学習効果を高める効果が得られる。
【要約】
【課題】
t-PAそのものを身体に注射等によって接種する方法に比べて、より安価、簡便、かつ気軽な方法でt-PAを利用することができる組織プラスミノーゲン活性化因子活性化剤及びその製造方法を提供する。
【解決手段】
イグサからの芳香性を有する抽出物を有効成分として含有することを特徴とする組織型プラスミノーゲン活性化因子活性化剤及びその製造方法である。芳香性を有する抽出物は、抽出溶媒にイグサを浸漬して、抽出溶媒を-10〜30℃に維持して抽出することが好ましく、イグサは、破砕処理を施すことなく抽出溶媒としての水エタノール混合液に浸漬することが好ましい。
【選択図】図１【図１】
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【図２】
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