(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された抗ＴｗｅａｋＲ抗体またはその抗原結合性断片であって、配列番号２を発現する固形腫瘍の増殖を阻害又は防止することができ、
１位のＸａａが、Ｓ、Ｎ、またはＫであり、５位のＸａａがＳまたはＮである式ＸａａＹＷＭＸａａ（配列番号１２０）を含むアミノ酸配列によりコードされた重鎖ＣＤＲ１と、
１７位のＸａａがＡまたはＶである式ＥＩＲＬＫＳＤＮＹＡＴＨＹＡＥＳＸａａＫＧ（配列番号１２１）を含むアミノ酸配列によりコードされた重鎖ＣＤＲ２と、
１位のＸａａがＧ、Ｔ、またはＹであり、２位のＸａａがＦまたはＹであり、５位のＸａａがＡ、Ｔ、またはＹであり、６位のＸａａがＦまたはＭである式ＸａａＸａａＡＤＸａａＸａａＤＹ（配列番号１２２）を含むアミノ酸配列によりコードされた重鎖ＣＤＲ３と、
１位のＸａａがＲまたはＫであり、１０位のＸａａがＳまたはＴであり、１５位のＸａａがＨまたはＱである式ＸａａＡＳＱＳＶＳＴＳＸａａＹＳＹＭＸａａ（配列番号１２７）を含むアミノ酸配列によりコードされた軽鎖ＣＤＲ１と、
３位のＸａａがＳまたはＴであり、４位のＸａａがＮまたはＫであり、６位のＸａａがＥまたはＤである式ＹＡＸａａＸａａＬＸａａＳ（配列番号１２８）を含むアミノ酸配列によりコードされた軽鎖ＣＤＲ２と、
６位のＸａａがＩまたはＬである式ＱＨＳＷＥＸａａＰＹＴ（配列番号１２９）を含むアミノ酸配列によりコードされた軽鎖ＣＤＲ３と
を含む、抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項２】
（ｉ）配列番号３を含むＶＨ領域及び配列番号４を含むＶＬ領域、
（ｉｉ）配列番号５を含むＶＨ領域及び配列番号６を含むＶＬ領域、
（ｉｉｉ）配列番号７を含むＶＨ領域及び配列番号８を含むＶＬ領域、又は
（ｉｖ）配列番号９を含むＶＨ領域及び配列番号１０を含むＶＬ領域
のいずれかを含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項３】
前記抗体がヒト又はマウスのＩｇＧ１アイソタイプである請求項１又は２に記載の単離された抗体。
【請求項４】
前記単離された抗体がモノクローナル抗体である請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離された抗ＴｗｅａｋＲ抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項５】
前記単離された抗体がヒト化抗体である請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離された抗ＴｗｅａｋＲ抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項６】
エフェクター部分に連結された請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性断片を含む、結合体化合物。
【請求項７】
エフェクター部分が標識部分である請求項６に記載の結合体化合物。
【請求項８】
標識部分が、放射性化合物、蛍光化合物又は酵素である請求項７に記載の結合体化合物。
【請求項９】
エフェクター部分が治療用部分である請求項６に記載の結合体化合物。
【請求項１０】
治療用エフェクター部分が細胞毒性薬である請求項９に記載の結合体化合物。
【請求項１１】
細胞毒性薬が、毒素、化学療法剤又は放射性同位元素である請求項１０に記載の結合体化合物。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合性断片と、薬学的に許容される担体とを含む、対象における固形腫瘍の治療のための医薬組成物。
【請求項１３】
治療に使用するための請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項１４】
対象における固形腫瘍の治療に使用するための請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合性断片。
【請求項１５】
標的化薬剤、従来の化学療法剤、及びホルモン療法剤からなる群から選択される治療薬をさらに含む請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
固形腫瘍が、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、黒色腫、膵臓癌、卵巣癌、腎癌、頭頚部癌、食道癌、子宮癌、胃癌、子宮頚癌、神経膠芽腫、及び肉腫からなる群から選択される、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
固形腫瘍が、結腸直腸癌、膵臓癌又は乳癌である請求項１６に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２００７年８月３日に出願された出願第６０／９５３，７４５号、および２００８年４月９日に出願された同第６０／６１／１２３，６２３号（これらの内容は、参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
連邦政府によって資金援助された研究についての声明
該当なし。
【背景技術】
【０００３】
ＴＷＥＡＫ受容体（ＴｗｅａｋＲ）は、Ｆｎ１４またはＴＮＦＲＳＦ１２Ａとしても知られており、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーである。ＴＷＥＡＫ受容体は、種々の固形腫瘍に由来する癌細胞の表面で発現される。ＴｗｅａｋＲの発現は、腎臓（ボーマン嚢）、肝臓（肝細胞）を含むいくつかの正常組織、ならびに増殖内皮細胞および繊維芽細胞で検出される場合がある（非特許文献１；および非特許文献２）。ＴｗｅａｋＲの発現は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは成長因子により、ｉｎ  ｖｉｖｏでは組織傷害、再生、および炎症に応答して上方制御される（非特許文献３；非特許文献４；および非特許文献５）。
【０００４】
ＴｗｅａｋＲに対応するＤＮＡおよびアミノ酸配列は報告されている（例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５を参照）。同様に、免疫不全および癌に関連した血管新生を調節するためにＴｗｅａｋＲアンタゴニストおよびアゴニストを作製および使用するための方法は報告されている（例えば、特許文献６、特許文献２、特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２、特許文献１３を参照）。しかしながら、これらの報告のいずれにおいても、ＴｗｅａｋＲに結合し抗腫瘍効果を示すモノクローナル抗体は同定されていない。これらの欠陥は、本明細書中に記述されているように、ＴｗｅａｋＲに結合する抗体を同定しそれらの生物活性を特徴付けることにより対処されている。抗ＴｗｅａｋＲモノクローナル抗体の同定は、固形腫瘍の治療用組成物の開発に結びつき、また、診断に使用するためのスクリーニングツールも提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第６，５３１，４４７号明細書
【特許文献２】米国特許第６，８２４，７７３号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００６／００２５５７４号明細書
【特許文献４】国際公開第９８／５５５０８号パンフレット
【特許文献５】国際公開第９９／６１４７１号パンフレット
【特許文献６】米国特許第６，７２７，２２５号明細書
【特許文献７】米国特許第７，００１，９９２号明細書
【特許文献８】米国特許第７，１６９，３８７号明細書
【特許文献９】米国特許第７，２０８，１５１号明細書
【特許文献１０】米国特許出願公開第２００５／００５４０４７号明細書
【特許文献１１】米国特許出願公開第２００５／０２０８０４６号明細書
【特許文献１２】米国特許出願公開第２００６／００８４１４３号明細書
【特許文献１３】国際公開第００／４２０７３号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｍｅｉｇｈａｎ−Ｍａｎｔｈａら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．（１９９９年）２７４巻：３３１６６〜３３１７６頁
【非特許文献２】Ｊａｋｕｂｏｗｓｋｉら、Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．（２００２年）１１５巻：２６７〜２７４頁
【非特許文献３】Ｆｅｎｇら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．（２０００年）１５６巻：１２５３〜１２６１頁
【非特許文献４】Ｗｉｌｅｙら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００１年）１５巻：８３７〜８４６頁
【非特許文献５】Ｄｅｓｐｌａｔ−Ｊｅｇｏら、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｉｍｍ．（２００５年）１３３巻：１１６〜１２３頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書中に提供されているのは、ヒトＴｗｅａｋＲに結合するモノクローナル抗体およびヒト化抗体またはそれらの抗原結合性断片を含む組成物、およびそれらを癌の治療などの治療に使用するための方法である。
【０００８】
抗ＴｗｅａｋＲモノクローナル抗体またはヒト化抗体は、モノクローナル抗ＴｗｅａｋＲ抗体またはヒト化抗ＴｗｅａｋＲ抗体のポリペプチドをコードする核酸から生成することができ、配列番号３〜１２からなる群から選択されるアミノ酸配列の１つまたは複数と、６５％、７５％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％以上の配列同一性を有する。他の実施形態では、核酸は、配列番号３〜１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗ＴｗｅａｋＲ抗体またはヒト化抗ＴｗｅａｋＲ抗体のポリペプチドをコードする。
【０００９】
他の実施形態では、抗ＴｗｅａｋＲモノクローナル抗体または抗ＴｗｅａｋＲヒト化抗体は、配列番号３〜１２からなる群から選択されるアミノ酸配列の１つまたは複数と、６５％、７５％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％以上の配列同一性を有するポリペプチドに由来していてもよい。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３〜１２からなる群から選択されるアミノ酸配列の１つまたは複数を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、組成物は、抗ＴｗｅａｋＲマウスモノクローナル抗体またはその抗体断片を含み、前記抗体は、配列番号５、７、または９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む成熟重鎖可変領域、および配列番号６、８、または１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む成熟軽鎖可変領域を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、組成物は、抗ＴｗｅａｋＲヒト化抗体またはその抗体断片を含み、前記抗体は、配列番号３および１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む成熟重鎖可変領域、および配列番号４および１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む成熟軽鎖可変領域を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、組成物は、抗ＴｗｅａｋＲモノクローナル抗体もしくは抗ＴｗｅａｋＲヒト化抗体またはそれらの抗体断片を含み、前記抗体は、配列番号１３〜３０および１２０〜１２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域、および配列番号６６〜８３および１２７〜１２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性領域を含む。さらに、組成物は、配列番号３１〜６５および１２３〜１２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖フレームワーク領域、ならびに／または配列番号８４〜１１９および１３０〜１３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖フレームワーク領域を含むことができる。抗体は、本明細書中に開示されている抗ＴｗｅａｋＲ抗体の重鎖および／または軽鎖可変ドメインの相補性決定領域をすべて含むことができ、任意選択で、相補性決定領域を取り囲むフレームワーク領域の１つまたは複数も存在する。いくつかの実施形態では、重鎖および軽鎖可変領域の両方の相補性決定領域が存在する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、抗ＴｗｅａｋＲヒト化抗体、ＰＤＬ１９２により認識されるヒトＴｗｅａｋＲエピトープに結合し、このエピトープは、配列番号２の５６位にＲを含む。ＰＤＬ１９２、および５６位にＲを含むＴｗｅａｋＲエピトープに結合可能な他の抗体は、ＴｗｅａｋＲ発現細胞を死滅させることが可能である。
【００１４】
抗ＴｗｅａｋＲ抗体はこれまでも記述されているが、本明細書中に記述されている抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、ＴｗｅａｋＲを発現する細胞におけるアポトーシスの誘発および／または抗体媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の刺激を含む、多数の有用な特徴を有する。ＴｗｅａｋＲ発現細胞には、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、黒色腫、膵臓癌、頭頚部癌、卵巣癌、胃癌、子宮癌、子宮頚癌、食道癌、腎細胞癌、神経膠芽腫、および肉腫に由来する癌細胞が含まれる。
【００１５】
したがって、本明細書中に記述されている組成物は、増殖を阻害するために、および／またはＴｗｅａｋＲを発現する細胞を死滅させるために使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書中に記述されている組成物は、これらに限定されないが、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、黒色腫、膵臓癌、卵巣癌、腎癌、頭頚部癌、食道癌、子宮癌、胃癌、子宮頚癌、神経膠芽腫、および肉腫を含む癌を患っている個体を治療するために使用することができる。
【００１６】
当業者であれば、本明細書中に記述されている任意の実施形態の１つまたは複数の特定の特徴を、本明細書中に記述されている任意の他の実施形態の１つまたは複数の特徴と組み合わせることができることを理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１Ａは、核酸（配列番号１）を示す図である。図１Ｂは、ＴｗｅａｋＲのアミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。
【図２Ａ】ヒト化抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１９２の重鎖可変領域（配列番号３）および軽鎖可変領域（配列番号４）のアミノ酸配列を示す図である。
【図２Ｂ】マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体１９．２．１の重鎖可変領域（配列番号５）および軽鎖可変領域（配列番号６）のアミノ酸配列を示す図である。
【図２Ｃ】マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体１８．３．３の重鎖可変領域（配列番号７）および軽鎖可変領域（配列番号８）のアミノ酸配列を示す図である。
【図２Ｄ】マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体１３６．１の重鎖可変領域（配列番号９）および軽鎖可変領域（配列番号１０）のアミノ酸配列を示す図である。
【図２Ｅ】ヒト化抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ４００の重鎖可変領域（配列番号１１）および軽鎖可変領域（配列番号１２）のアミノ酸配列を示す図である。
【図３−１】図３Ａは、ヒト化抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１９２（配列番号１３）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体１９．２．１（配列番号１４）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体１３６．１（配列番号１５）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体１８．３．３（配列番号１６）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＩＴＥＭ−３（配列番号１７）、およびマウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＩＴＥＭ−１（配列番号１８）の重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）のアミノ酸配列を示す図である。図３Ｂは、ヒト化抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１９２（配列番号１９）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体１９．２．１（配列番号２０）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体１３６．１（配列番号２１）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体１８．３．３（配列番号２２）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＩＴＥＭ−３（配列番号２３）、およびマウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＩＴＥＭ−１（配列番号２４）の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列を示す図である。図３Ｃは、ヒト化抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１９２（配列番号２５）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体１９．２．１（配列番号２６）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体１３６．１（配列番号２７）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体１８．３．３（配列番号２８）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＩＴＥＭ−３（配列番号２９）、およびマウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＩＴＥＭ−１（配列番号３０）の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す図である。図３Ｄは、ヒト化抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１９２（配列番号３１）、ヒト化抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１９２−２（配列番号３２）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体１９．２．１（配列番号３３）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体１３６．１（配列番号３４）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体１８．３．３（配列番号３５）、ヒト化抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１８３（配列番号３６）、ヒト化抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１８３−２（配列番号３７）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＩＴＥＭ−３（配列番号３８）、およびマウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＩＴＥＭ−１（配列番号３９）の重鎖フレームワーク領域１（ＦＲ１）のアミノ酸配列を示す図である。
【図３−２】図３Ｅは、ヒト化抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１９２（配列番号４０）、ヒト化抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１９２−２（配列番号４１）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体１９．２．１（配列番号４２）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体１３６．１（配列番号４３）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体１８．３．３（配列番号４４）、ヒト化抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１８３（配列番号４５）、ヒト化抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１８３−２（配列番号４６）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＩＴＥＭ−３（配列番号４７）、およびマウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＩＴＥＭ−１（配列番号４８）の重鎖ＦＲ２のアミノ酸配列を示す図である。図３Ｆは、ヒト化抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１９２（配列番号４９）、ヒト化抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１９２−２（配列番号５０）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体１９．２．１（配列番号５１）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体１３６．１（配列番号５２）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体１８．３．３（配列番号５３）、ヒト化抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１８３（配列番号５４）、ヒト化抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１８３−２（配列番号５５）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＩＴＥＭ−３（配列番号５６）、およびマウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＩＴＥＭ−１（配列番号５７）の重鎖ＦＲ３のアミノ酸配列を示す図である。図３Ｇは、ヒト化抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１９２（配列番号５８）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体１９．２．１（配列番号５９）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体１３６．１（配列番号６０）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体１８．３．３（配列番号６１）、ヒト化抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１８３（配列番号６２）、ヒト化抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１８３−２（配列番号６３）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＩＴＥＭ−３（配列番号６４）、およびマウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＩＴＥＭ−１（配列番号６５）の重鎖ＦＲ４のアミノ酸配列を示す図である。
【図４−１】図４Ａは、ヒト化抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１９２（配列番号６６）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体１９．２．１（配列番号６７）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体１３６．１（配列番号６８）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体１８．３．３（配列番号６９）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＩＴＥＭ−３（配列番号７０）、およびマウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＩＴＥＭ−１（配列番号７１）の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列を示す図である。図４Ｂは、ヒト化抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１９２（配列番号７２）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体１９．２．１（配列番号７３）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体１３６．１（配列番号７４）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体１８．３．３（配列番号７５）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＩＴＥＭ−３（配列番号７６）、およびマウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＩＴＥＭ−１（配列番号７７）の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列を示す図である。図４Ｃは、ヒト化抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１９２（配列番号７８）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体１９．２．１（配列番号７９）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体１３６．１（配列番号８０）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体１８．３．３（配列番号８１）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＩＴＥＭ−３（配列番号８２）、およびマウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＩＴＥＭ−１（配列番号８３）の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す図である。図４Ｄは、ヒト化抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１９２（配列番号８４）、ヒト化抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１９２−２（配列番号８５）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体１９．２．１（配列番号８６）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体１３６．１（配列番号８７）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体１８．３．３（配列番号８８）、ヒト化抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１８３（配列番号８９）、ヒト化抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１８３−２（配列番号９０）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＩＴＥＭ−３（配列番号９１）、およびマウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＩＴＥＭ−１（配列番号９２）の軽鎖ＦＲ１のアミノ酸配列を示す図である。
【図４−２】図４Ｅは、ヒト化抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１９２（配列番号９３）、ヒト化抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１９２−２（配列番号９４）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体１９．２．１（配列番号９５）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体１３６．１（配列番号９６）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体１８．３．３（配列番号９７）、ヒト化抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１８３（配列番号９８）、ヒト化抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１８３−２（配列番号９９）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＩＴＥＭ−３（配列番号１００）、およびマウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＩＴＥＭ−１（配列番号１０１）の軽鎖ＦＲ２のアミノ酸配列を示す図である。図４Ｆは、ヒト化抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１９２（配列番号１０２）、ヒト化抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１９２−２（配列番号１０３）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体１９．２．１（配列番号１０４）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体１３６．１（配列番号１０５）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体１８．３．３（配列番号１０６）、ヒト化抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１８３（配列番号１０７）、ヒト化抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１８３−２（配列番号１０８）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＩＴＥＭ−３（配列番号１０９）、およびマウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＩＴＥＭ−１（配列番号１１０）の軽鎖ＦＲ３のアミノ酸配列を示す図である。図４Ｇは、ヒト化抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１９２（配列番号１１１）、ヒト化抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１９２−２（配列番号１１２）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体１９．２．１（配列番号１１３）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体１３６．１（配列番号１１４）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体１８．３．３（配列番号１１５）、ヒト化抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１８３（配列番号１１６）、ヒト化抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１８３−２（配列番号１１７）、マウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＩＴＥＭ−３（配列番号１１８）、およびマウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＩＴＥＭ−１（配列番号１１９）の軽鎖ＦＲ４のアミノ酸配列を示す図である。
【図５】抗ＴｗｅａｋＲ抗体のＣＤＲおよびＦＲコンセンサス配列を示す図である。
【図６】種々の固形腫瘍におけるＴｗｅａｋＲ遺伝子発現の例示的な遺伝子発現プロファイルを示す図である。Ｘ軸は遺伝子チップ上で評価される個々のサンプルを表し、Ｙ軸は各サンプルについてのＴｗｅａｋＲ発現の平均強度を示す。
【図７】抗ＴｗｅａｋＲ抗体２９．Ｔ１０によるＴｗｅａｋＲ発現腫瘍細胞の免疫組織学的染色を示す図である。
【図８Ａ】抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＩＴＥＭ１、ＩＴＥＭ２、ＩＴＥＭ３、ＩＴＥＭ４およびアイソタイプ対照によるＩＬ−８の放出を示す図である。
【図８Ｂ】抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１９２によるＩＬ−８の放出を示す図である。
【図８Ｃ】抗ＴｗｅａｋＲ抗体１８．３．３によるＩＬ−８の放出を示す図である。
【図８Ｄ】抗ＴｗｅａｋＲ抗体１３６．１によるＩＬ−８の放出を示す図である。
【図８Ｅ】抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ４００によるＩＬ−８の放出を示す図である。
【図９】抗ＴｗｅａｋＲ抗体１９．２．１を使用した典型的な抗増殖アッセイを示す図である。
【図１０】カスパーゼ活性化によりアポトーシスを誘導することによって抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１９２（図１０Ａ）および１３６．１（１０Ｂ）が細胞増殖を阻害する例示的な例を示す図である。
【図１１】ＳＮ１２Ｃ腎細胞異種移植モデルにおけるＰＤＬ１９２の抗腫瘍活性を示す図である。
【図１２】頭頚部癌のＡ２５３異種移植モデルにおける１９．２．１を用いた用量設定試験を示す図である。
【図１３】頭頚部癌のＡ２５３モデルにおける長期投与レジメンにおいて１９．２．１を使用した抗腫瘍活性を示す図である。
【図１４】ＨＴ１３７６膀胱異種移植モデルにおけるＰＤＬ１９２の抗腫瘍活性を示す図である。
【図１５】Ａ３７５黒色腫異種移植モデルにおいてＰＤＬ１９２を用いた用量設定試験における抗腫瘍活性を示す図である。
【図１６】ＣＳＯＣ卵巣異種移植モデルにおけるＰＤＬ１９２の抗腫瘍活性を示す図である。
【図１７】Ｐａｎｃ１異種移植モデルにおけるＰＤＬ１９２±ゲムシタビンの抗腫瘍活性を示す図である。
【図１８Ａ】ＨＴ２９異種移植モデルにおけるＰＤＬ１９２±イリノテカン±セツキシマブの抗腫瘍活性を示す図である。
【図１８Ｂ】ＨＴ２９異種移植モデルにおけるＰＤＬ１９２±イリノテカン±セツキシマブの抗腫瘍活性を示す図である。
【図１８Ｃ】ＨＴ２９異種移植モデルにおけるＰＤＬ１９２±イリノテカン±セツキシマブの抗腫瘍活性を示す図である。
【図１８Ｄ】ＨＴ２９異種移植モデルにおけるＰＤＬ１９２±イリノテカン±セツキシマブの抗腫瘍活性を示す図である。
【図１９】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１変異体異種移植片を使用した乳癌モデルにおけるＰＤＬ１９２の抗腫瘍活性および抗転移活性を示す図である。
【図２０Ａ】ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用した、ＴｗｅａｋＲ形質転換体（図２０Ａ）およびＳＮ１２Ｃ腎癌細胞（図２０Ｂ）に対する抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１９２のＡＤＣＣ活性を示す図である。
【図２０Ｂ】ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用した、ＴｗｅａｋＲ形質転換体（図２０Ａ）およびＳＮ１２Ｃ腎癌細胞（図２０Ｂ）に対する抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１９２のＡＤＣＣ活性を示す図である。
【図２０Ｃ】マウス脾細胞をエフェクター細胞として使用した、ＴｗｅａｋＲ形質転換体に対する抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１９２のＡＤＣＣ活性を示す図である。
【図２１Ａ】ＳＮ１２Ｃ腎異種移植モデル（図２１Ａ）およびＡ３７５異種移植片黒色腫異種移植モデル（図２１Ｂ）における、マウスＩｇＧ１アイソタイプ（１９．２．１×Ｇ１）およびマウスＩｇＧ２ａアイソタイプ（１９．２．１）の抗腫瘍活性を示す図である。
【図２１Ｂ】ＳＮ１２Ｃ腎異種移植モデル（図２１Ａ）およびＡ３７５異種移植片黒色腫異種移植モデル（図２１Ｂ）における、マウスＩｇＧ１アイソタイプ（１９．２．１×Ｇ１）およびマウスＩｇＧ２ａアイソタイプ（１９．２．１）の抗腫瘍活性を示す図である。
【図２２】ヒトＴｗｅａｋＲ、ヒトＴｗｅａｋＲ（Ｒ５６Ｐ）およびマウスＴｗｅａｋＲに対する抗ＴｗｅａｋＲ抗体の結合を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
前述の一般的な説明および以下の詳細な説明は、両方とも例示および説明のためだけのものであり、本明細書中に記述されている組成物および方法を限定しないことが理解されるべきである。本出願では、別段明確に述べていない限り単数形の使用は複数形を含む。また、「または」の使用は、別段述べていない限り「および／または」を意味する。同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、限定的であるとは意図されていない。
【００１９】
６．２  定義
本明細書中で使用される場合、以下の用語は以下の意味を有することが意図されている：
本明細書中で使用される場合、「抗体」は、特定の抗原と免疫学的に反応する免疫グロブリン分子への言及を含み、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方を含む。この用語は、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）およびヘテロ結合体（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）抗体（例えば、二重特異性抗体）などの遺伝子操作された形態も含む。「抗体」という用語は、抗原結合能を有する断片（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）．ｓｕｂ．２、Ｆａｂ、Ｆｖ、およびｒＩｇＧ）を含む、抗体の抗原結合形態も含む。Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１９９４〜１９９５年（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、ロックフォード、米国イリノイ州）も参照されたい。例えば、Ｋｕｂｙ，  Ｊ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３版、Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．、ニューヨーク（１９９８年）も参照されたい。この用語は、組換え単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）も指す。抗体という用語は、二価性または二重特異性分子、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、およびテトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）も含む。二価性および二重特異性分子は、例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら（１９９２年）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ１４８巻：１５４７頁、ＰａｃｋおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９２年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３１巻：１５７９頁、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、１９９３年、上記、Ｇｒｕｂｅｒら（１９９４年）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ：５３６８、Ｚｈｕら（１９９７年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ６巻：７８１頁、Ｈｕら（１９９６年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６巻：３０５５頁、Ａｄａｍｓら（１９９３年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３巻：４０２６頁、およびＭｃＣａｒｔｎｅｙら（１９９５年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８巻：３０１頁に記述されている。
【００２０】
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書中で使用される場合、ハイブリドーマ技術により産生された抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、それが産生される方法ではなく、任意の真核生物クローン、原核生物クローン、またはファージクローンを含む、単一クローンに由来する抗体を指す。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、組換え技術、およびファージディスプレイ技術、またはそれらの組合せの使用を含む、当技術分野で公知である多種多様な技術を使用して調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野で公知の技術、および例えばＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９８８年）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」内、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８１年）、５６３  ６８１頁（これらは両方とも、参照によりそれらの全体が本明細書中に組み込まれる）において教示されている技術を含むハイブリドーマ技術を使用して産生することができる。
【００２１】
特定の抗原と免疫学的に反応する抗体は、組換え抗体のライブラリーの選択などの組換え法によりファージまたは類似したベクター中で産生することができ、例えば、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６巻：１２７５〜１２８１頁（１９８９年）；Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ３４１巻：５４４〜５４６頁（１９８９年）；およびＶａｕｇｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４巻：３０９〜３１４頁（１９９６頁）を参照されたく、または抗原もしくは抗原をコードするＤＮＡで動物を免疫することにより産生することができる。ハイブリドーマ技術を使用して特定の抗体を産生およびスクリーニングするための方法は、当技術分野で日常的であり周知である。非限定的な例では、目的の抗原またはそのような抗原を発現する細胞で、マウスを免疫することができる。いったん免疫応答が検出されると、例えば、抗原に特異的な抗体がマウス血清中に検出されると、そのマウス脾臓が回収され、脾細胞が単離される。その後、脾細胞は、周知の技術により任意の好適なミエローマ細胞に融合される。ハイブリドーマは、限界希釈法により選択およびクローン化される。その後、ハイブリドーマクローンは、当技術分野で公知の方法により、抗原に結合可能な抗体を分泌する細胞についてアッセイされる。腹水は、一般的に高レベルの抗体を含有しており、マウスの腹腔内に陽性ハイブリドーマクローンを接種することにより生成することができる。
【００２２】
典型的には、免疫グロブリンは重鎖および軽鎖を有する。各重鎖および軽鎖は、定常領域および可変領域（領域は「ドメイン」としても知られている）を含有している。軽鎖および重鎖可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる３つの超可変領域により分断された４つの「フレームワーク」領域を含有している。様々な軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種の中で比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域は、構成軽鎖および構成重鎖の複合フレームワーク領域であり、ＣＤＲを３次元空間に配置およびアラインする役目を果たす。
【００２３】
ＣＤＲは、抗原のエピトープに結合する主な要因である。各鎖のＣＤＲは、典型的には、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と呼ばれ、Ｎ末端から始めて順番に付番されており、典型的には、特定のＣＤＲが位置する鎖によっても識別される。したがって、ＶＨ  ＣＤＲ３は、それが見出される抗体の重鎖の可変ドメインに位置し、ＶＬ  ＣＤＲ１は、それが見出される抗体の軽鎖の可変ドメインに由来するＣＤＲ１である。
【００２４】
「ＶＨ」への言及は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、またはＦａｂの重鎖を含む抗体の免疫グロブリン重鎖の可変領域を指す。「ＶＬ」への言及は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、またはＦａｂの軽鎖を含む免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指す。
【００２５】
「単一鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」という語句は、従来の２本鎖抗体の重鎖の可変ドメインおよび軽鎖の可変ドメインが連結されて１本鎖を形成している抗体を指す。典型的には、適切な折り畳みおよび活性結合部位の形成を可能にするために、リンカーペプチドが２つの鎖の間に挿入される。
【００２６】
「キメラ抗体」とは、（ａ）抗原結合部位（可変領域）が、異なるかもしくは変更されたクラス、エフェクター機能、および／または種の定常領域と連結するか、またはキメラ抗体に新しい特性を付与するまったく異なる分子、例えば酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物などと連結するように、定常領域またはその一部が変更、置換、または交換されているか、あるいは（ｂ）可変領域またはその一部が、異なるかまたは変更された抗原特異性を有する可変領域に変更、置換、または交換されている免疫グロブリン分子である。本明細書中に記述されている抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、いずれもキメラであり得る。
【００２７】
「ヒト化抗体」または「ヒト化免疫グロブリン」という用語は、ヒトフレームワーク、非ヒト抗体に由来する少なくとも１つの、好ましくはすべての相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、存在する任意の定常領域が、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一である、すなわち少なくとも約８５％、少なくとも９０％、および少なくとも９５％が同一である免疫グロブリンを指す。したがって、ヒト化免疫グロブリンのすべての部分は、恐らくはＣＤＲを除いて、１つまたは複数の天然ヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。多くの場合、ヒトフレームワーク領域のフレームワーク残基は、ＣＤＲ供与体抗体に由来する対応する残基と置換され、抗原結合を変更、好ましくは向上させる。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で周知の方法、例えばＣＤＲとフレームワーク残基との相互作用をモデリングして抗原結合に重要なフレームワーク残基を特定すること、および配列比較をしてある特定の位置において通常ではないフレームワーク残基を特定することにより特定される。例えばＱｕｅｅｎら、米国特許第５，５３０，１０１号；第５，５８５，０８９号；第５，６９３，７６１号；第５，６９３，７６２号；第６，１８０，３７０号（これらの各々は、その全体が参照により組み込まれる）を参照されたい。抗体は、例えば、ＣＤＲ移植（ＥＰ２３９，４００；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；第５，５３０，１０１号、および第５，５８５，０８９号）、ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）または再表面化（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（ＥＰ５９２，１０６；ＥＰ５１９，５９６；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２８巻：４８９  ４９８頁（１９９１年）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔ．  Ｅｎｇ．７巻：８０５  ８１４頁（１９９４年）；Ｒｏｇｕｓｋａら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．９１巻：９６９  ９７３頁（１９９４年）、および鎖シャフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第５，５６５，３３２号）を含む、当技術分野で公知の種々の技術を使用してヒト化することができ、これらすべての文献は本明細書によって参照によりそれらの全体が組み込まれる。本明細書中に記述されている抗ＴｗｅａｋＲ抗体には、マウスヒト化抗体などのヒト化抗体、完全ヒト抗体、およびマウス抗体が含まれる。
【００２８】
「エピトープ」または「抗原決定基」は、抗体が結合する抗原の部位を指す。エピトープは、連続するアミノ酸、またはタンパク質の三次折り畳みにより近接する非連続のアミノ酸の両方から形成されていてもよい。連続するアミノ酸から形成されたエピトープは、変性溶媒に曝露されても典型的には保持されるが、三次折り畳みにより形成されたエピトープは、変性溶媒で処理されると典型的には失われる。エピトープは、典型的には、固有の空間的高次構造に、少なくとも３つ、より通常は少なくとも５つまたは８〜１０個のアミノ酸を含む。エピトープの空間的高次構造を決定する方法には、例えば、Ｘ線結晶解析法および２次元核磁気共鳴法が含まれる。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、６６巻、Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．  Ｍｏｒｒｉｓ編（１９９６年）のＥｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓを参照されたい。
【００２９】
２つの抗体が同一エピトープに実質的に結合するかどうかの決定は、競合アッセイなどの当技術分野で公知の方法により達成される。対照抗体（例えば、本明細書中に記述されている抗ＴｗｅａｋＲ抗体の１つ）と任意の試験抗体との間で抗体競合研究を実施する際は、最初に対照抗体を、ビオチン標識、酵素標識、放射性標識、または蛍光標識などの検出可能な標識で標識し、その後の同定を可能にすることができる。結合標識の強度を測定する。標識抗体が、重複するエピトープに結合することにより非標識抗体と競合する場合、陰性対照非標識抗体による結合と比べて、強度が減少することになる。
【００３０】
「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」という用語は、その天然状態に見出されるような通常それに伴う成分を、実質的にまたは本質的に含まない物質を指す。純度および均質性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技術を使用して決定される。調製物中に存在する主な種であるタンパク質または核酸が、実質的に精製される。特に、単離された核酸は、遺伝子を天然で隣接し、その遺伝子によりコードされたタンパク質以外のタンパク質をコードするいくつかのオープンリーディングフレームから分離される。いくつかの実施形態では、「精製された」という用語は、核酸またはタンパク質が、本質的に１つのバンドを電気泳動ゲルに生じさせることを意味する。いくつかの実施形態では、それは、核酸またはタンパク質が、少なくとも８５％純粋、少なくとも９５％純粋、および少なくとも９９％純粋であることを意味する。他の実施形態では、「精製する」または「精製」は、精製する組成物から、少なくとも１つの夾雑物を除去することを意味する。この意味で、精製は、精製された化合物が均質であること、例えば１００％純粋であることを必要としない。
【００３１】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書中では同義的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマーだけでなく、１つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的模倣体であるアミノ酸ポリマー、修飾された残基を含有するアミノ酸ポリマー、および天然に存在しないアミノ酸ポリマーにも適用される。
【００３２】
「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによりコードされているアミノ酸、ならびに後に修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、ガンマカルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造、例えば、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合しているアルファ炭素を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は、修飾されたＲ基（例えばノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有していてもよいが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持する。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化学化合物を指す。
【００３３】
本明細書中では、アミノ酸は、それらの一般に知られている３文字記号により参照されてもよく、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）により推奨されている１文字記号により参照されてもよい。同様に、ヌクレオチドは、それらの一般的に容認されている１文字コードにより参照されてもよい。
【００３４】
「保存的に改変された変異体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された変異体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードするそれらの核酸を指すか、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は、本質的に同一であるかまたは関連している、例えば天然で連続している配列を指す。遺伝子コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が、ほとんどのタンパク質をコードしている。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵは、すべてアミノ酸アラニンをコードする。したがって、コドンによりアラニンが指定されるあらゆる位置では、コードされたポリペプチドを変更せずに、そのコドンを、記述されている対応するコドンとは別のコドンに変更することができる。そのような核酸変異は「サイレント変異」であり、保存的に改変された変異の一種である。ポリペプチドをコードする本明細書中のあらゆる核酸配列は、核酸のサイレント変異も記述している。当業者であれば、ある状況では、核酸の各コドンを（通常はメチオニン用の唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常はトリプトファン用の唯一のコドンであるＴＧＧを除いて）、機能的に同一の分子を産出するために改変できることを認識するであろう。
【００３５】
アミノ酸配列に関して、当業者であれば、コード配列の単一アミノ酸または少数パーセントのアミノ酸を変更、付加、または欠失する、核酸配列、ペプチド配列、ポリペプチド配列、またはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失、または付加は、変更は、あるアミノ酸を化学的に類似したアミノ酸に置換することに帰着する「保存的に改変された変異」であることを認識するであろう。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野で周知である。そのような保存的に改変された変異体は、追加的であり、本発明の多型変異体、異種間相同体、および対立遺伝子を除外しない。互いに保存的な置換には、典型的には、例えば、１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）が含まれる（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４年）を参照）。
【００３６】
「標識」または「検出可能な部分」は、分光法的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、または他の物理的な手段により検出可能な組成物である。例えば、有用な標識には、蛍光染料、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡで一般的に使用されるような）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテン、および例えばペプチドに放射性標識を組み込むことにより検出可能にすることができるか、またはペプチドと特異的に反応する抗体を検出するために使用することができるタンパク質または他の実体が含まれる。放射性同位元素は、例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、または１２５Ｉであってもよい。いくつかの実施形態では、放射性同位元素は、毒性部分として使用される。
【００３７】
標識は、任意の位置で抗体に組み込むことができる。Ｈｕｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、１４４巻：９４５頁（１９６２年）；Ｄａｖｉｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１３巻：１０１４頁（１９７４年）；Ｐａｉｎら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．、４０巻：２１９頁（１９８１年）；およびＮｙｇｒｅｎ，  Ｊ．、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．、３０巻：４０７頁（１９８２年）に記述されている方法を含む、抗体を標識と結合体化するための、当技術分野で公知の任意の方法が使用できる。放射性標識ペプチドまたは放射性標識抗体組成物の寿命は、放射性標識ペプチドまたは抗体を安定化し、それを分解から防ぐ物質を付加することにより延長することができる。米国特許第５，９６１，９５５号に開示されている物質を含む、放射性標識ペプチドまたは抗体を安定化する任意の物質または物質の組合せが使用できる。
【００３８】
「組換え」という用語は、例えば、細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに関して使用される場合、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターが、異種性の核酸もしくはタンパク質の導入、または天然の核酸もしくはタンパク質の変更により改変されたことを示すか、あるいはその細胞が、そのように改変された細胞に由来することを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、天然（非組換え）形態の細胞内には見出されない遺伝子を発現するか、またはその他の形で異常に発現されるか、低発現、もしくはまったく発現されない天然の遺伝子を発現する。本明細書中では、「組換え核酸」という用語は、一般的に、自然界において通常は見出されない形態での核酸の操作により、例えばポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで独創的に形成される核酸を意味する。このようにして、異なる配列の作動可能な連結が達成される。したがって、直鎖形態の単離された核酸、または通常は連結していないＤＮＡ分子のライゲーションによりｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成された発現ベクターは、両方とも本発明の目的においては組換えであるとみなされる。いったん組換え核酸が作製され、宿主細胞または生物に再導入されると、それは、非組換え的に、すなわちｉｎ  ｖｉｔｒｏ操作ではなく宿主細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ細胞機構を使用して複製されることになることが理解される。しかしながら、いったんそのような核酸が組換え的に産生されれば、その後は非組換え的に複製されるとしても、本発明の目的では依然として組換えであるとみなされる。同様に、「組換えタンパク質」は、組換え技術を使用して、すなわち前述したような組換え核酸の発現を介して作製されたタンパク質である。
【００３９】
「異種性」という用語は、核酸の一部に関して使用される場合、核酸が、自然界において互いに同じ関係性では通常は見出されない複数のサブ配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含むことを示す。例えば、核酸は、典型的には組換えにより産生され、例えば、新しい機能的な核酸を作るように配置された無関係な遺伝子、例えばある供給源に由来するプロモーターおよび別の供給源に由来するコード領域に由来する複数の配列を有する。同様に、異種性タンパク質は、自然界において互いに同じ関係性では見出されない複数のサブ配列を指すことが多くなる（例えば融合タンパク質）。
【００４０】
「プロモーター」は、核酸の転写を指図する一連の核酸制御配列と定義される。本明細書中で使用される場合、プロモーターは、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合はＴＡＴＡエレメントなどの、転写の開始部位付近の必須核酸配列を含む。プロモーターは、任意選択で、転写の開始部位から数千塩基対も離れて位置している場合がある遠位のエンハンサーまたはリプレッサーエレメントも含む。「構成的」プロモーターは、ほとんどの環境的および発生的条件下で活性であるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境的または発生的調節下で活性であるプロモーターである。「作動可能に連結した」という用語は、核酸発現制御配列（プロモーター、または一連の転写因子結合部位など）と第２の核酸配列との間の機能的な連結を指し、この発現制御配列は第２の配列に対応する核酸の転写を指図する。
【００４１】
「発現ベクター」は、宿主細胞の特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを有する、組換えまたは合成により生成される核酸構築体である。発現ベクターは、プラスミド、ウイルス、または核酸断片の一部であり得る。典型的には、発現ベクターは、プロモーターに作動可能に連結した、転写される核酸を含む。
【００４２】
抗体に「特異的に（または選択的に）結合する」または抗体と「特異的に（または選択的に）免疫反応する」という語句は、タンパク質またはペプチドに関する場合、タンパク質および他の生物の異種性集団中で、タンパク質の存在を決定する結合反応を指す。したがって、特定の抗体は、特定のイムノアッセイ条件下で、バックグラウンドの少なくとも２倍で、より典型的にはバックグラウンドの１０倍から１００倍を超えて、特定のタンパク質配列に結合する。
【００４３】
６．３  詳細な説明
本明細書中に記述されている組成物は、アポトーシスの誘発および／またはＴｗｅａｋＲを発現する細胞におけるＡＤＣＣの刺激が可能であるモノクローナル抗ＴｗｅａｋＲ抗体およびヒト化抗ＴｗｅａｋＲ抗体の同定に基づく。特に、これらの抗体には、癌を治療するために使用される医薬組成物における使用が見出される。
【００４４】
６．４  ＴｗｅａｋＲ抗体
本明細書中に記述されている抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、ＴｗｅａｋＲタンパク質に特異的に結合する。本明細書中では、「特異的に結合する」とは、抗体が、少なくとも約１μＭ、少なくとも約０．１μＭまたはそれより良好な、少なくとも約０．０１μＭ、および少なくとも約０．００１μＭまたはそれより良好なＫＤで、タンパク質に結合することを意味する。いくつかの実施形態では、本明細書中に記述されている抗体は、特定の標的には選択的に結合し、関連した配列には結合しないことが可能である。
【００４５】
本明細書中では、「ＴｗｅａｋＲタンパク質」とは、抗ＴｗｅａｋＲ抗体が、配列番号１によりコードされたアミノ酸配列もしくは配列番号１にハイブリダイズできる核酸配列によりコードされたアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質に結合できることを意味する。
【００４６】
本明細書中に記述されている抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、ＴｗｅａｋＲまたはリガンド遺伝子の活性を調節可能である。一般的に、この抗体は、ＴｗｅａｋＲのアゴニストおよびアンタゴニストに関連した特性の少なくとも１つを示す。本明細書中では、「アゴニスト」とは、ＴｗｅａｋＲに関連した１つまたは複数の生物活性を促進可能である抗体を意味する。本明細書中では「アンタゴニスト的」とは、ＴｗｅａｋＲおよび／またはＴｗｅａｋＲリガンド相互作用に関連した１つまたは複数の生物活性を阻害可能な抗体を意味する。ＴｗｅａｋＲに関連した生物学的な特性には、これらに限定されないが、アポトーシス促進性、増殖促進性、遊走促進性、および炎症活性促進性が含まれる。（例えば、Ｗｉｌｅｙら、２００１年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１５巻：８３７〜８４６頁、ＷｉｌｅｙおよびＷｉｎｋｌｅｓ、２００３年、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ＆  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖｉｅｗ、１４巻：２４１〜２４９頁；およびＷｉｎｋｌｅｓら、２００６年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２３５巻（１号）：１１〜７頁を参照）。したがって、ここに記述されている抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、０％から１００％のアゴニスト活性を示すことができる。例えば、いくつかの実施形態では、抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、少なくとも約０％のアゴニスト活性、少なくとも約１０％のアゴニスト活性、少なくとも約２０％のアゴニスト活性、少なくとも約３０％のアゴニスト活性、少なくとも約４０％のアゴニスト活性、少なくとも約５０％のアゴニスト活性、少なくとも約６０％のアゴニスト活性、少なくとも約７０％のアゴニスト活性、少なくとも約８０％のアゴニスト活性、少なくとも約９０％のアゴニスト活性、少なくとも約１００％のアゴニスト活性を示すことができる。いくつかの実施形態では、本明細書中に記述されている抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、１００％を超えるアゴニスト活性を示すことができる。
【００４７】
アゴニスト／アンタゴニスト活性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞増殖アッセイで、サイトカインおよび／またはケモカインの放出を測定することにより決定することができる。例えば、実施例に示されているように、典型的なアッセイでは、細胞を、抗ＴｗｅａｋＲ抗体±ＴＷＥＡＫリガンドと共にｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートする。２４時間後に、ＥＬＩＳＡアッセイまたは市販の蛍光ビーズに基づく複合アッセイ（例えば、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）、Ｕｐｓｔａｔｅ社製）を使用して、サイトカインおよび／またはケモカインの存在について、細胞上清を評価する。
【００４８】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−８放出アッセイを使用して、本明細書中に記述されている種々の抗ＴｗｅａｋＲ抗体のアゴニスト／アンタゴニスト活性を特徴付ける（例えば図８Ａ〜８Ｅおよび実施例２を参照）。ＩＬ−８アッセイから生成されたデータを使用して、パーセントアゴニスト活性を、式：％アゴニスト活性＝（ａ−ｃ）／（ｂ−ｃ）を使用して算出することができる。パーセントアンタゴニスト活性は、式：％アンタゴニスト＝（ｂ−ｄ）／（ｂ−ａ）を使用して計算することができ、式中、ａ＝１０μｇ／ｍｌの抗体で処理された細胞から放出されたＩＬ８の量、ｂ＝３００ｎｇ／ｍｌのＴＷＥＡＫで処理された細胞から放出されたＩＬ８の量、ｃ＝未処理の細胞から放出されたＩＬ８の量、ならびにｄ＝３００ｎｇ／ｍｌのＴＷＥＡＫおよび１０μｇ／ｍｌの抗体で処理された細胞から放出されたＩＬ８の量である。
【００４９】
図８Ａ〜８Ｅは、抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１９２（図８Ｂ）、１８．３．３（図８Ｃ）、１３６．１（図８Ｄ）、ＰＤＬ４００（図８Ｅ）、ならびに以前に同定されている抗ＴｗｅａｋＲ抗体、ＩＴＥＭ１、ＩＴＥＭ２、ＩＴＥＭ３、およびＩＴＥＭ４（図８Ａ；Ｎａｋａｙａｍａら、２００３年、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ、３０６巻：８１９〜８２５頁）を使用した、ＩＬ−８放出の例示的な実施形態を示す。複数の実験の結果に基づき、ＩＴＥＭ１はおよそ２５％のアゴニスト活性を示し、ＩＴＥＭ２はおよそ２８％のアゴニスト活性を示し、ＩＴＥＭ３はおよそ３７％のアゴニスト活性を示し、ＩＴＥＭ４はおよそ１２％のアゴニスト活性を示し、ＰＤＬ１９２はおよそ２５％のアゴニスト活性を示し、１９．２．１はおよそ３９％のアゴニスト活性を示し、１８．３．３はおよそ１４％のアゴニスト活性を示し、１３６．１はおよそ２７８％のアゴニスト活性を示し、およびＰＤＬ４００はおよそ８％のアゴニスト活性を示す。
【００５０】
いくつかの実施形態では、抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、ＴｗｅａｋＲを発現する細胞においてアポトーシスを誘導する。アポトーシスのアッセイは、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ媒介ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰニック末端標識化（ＴＵＮＥＬ）アッセイにより実施してもよい（Ｌａｚｅｂｎｉｋら、Ｎａｔｕｒｅ：３７１巻、３４６頁（１９９４年））。例えば、図１０Ａ〜１０Ｂに例示されているように、抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、アポトーシスの誘導により腫瘍細胞の増殖を阻害可能である。図１０Ａ〜１０Ｂに提供されている例示的な例では、アポトーシスの誘導は、カスパーゼ活性化を介して生じると仮定されている。
【００５１】
いくつかの実施形態では、抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、ＴｗｅａｋＲを発現する細胞において抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を刺激する。典型的には、抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、エフェクター細胞（ナチュラルキラー細胞またはマクロファージなど）の存在下で、標的細胞（ＴｗｅａｋＲを発現する細胞）表面の抗原に結合する。エフェクター細胞のＦｃ受容体は、結合した抗体を認識する。Ｆｃ受容体の架橋は、エフェクター細胞にシグナルを伝達し、細胞崩壊またはアポトーシスにより標的細胞を死滅させる。細胞崩壊は、溶解した細胞からの標識または乳酸デヒドロゲナーゼの放出を検出することにより検出することができる。細胞傷害は、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製（インディアナポリス、米国インディアナ州）の細胞傷害検出キットなどの、当技術分野で公知の検出キットにより直接的に検出することができる。
【００５２】
いくつかの実施形態では、抗体に関連したＡＤＣＣ活性を、原形質膜が損傷すると速やかに放出される乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の上清への放出を測定することによりモニターおよび定量化する。細胞媒介性細胞傷害のパーセントを決定するために、試料の平均吸光度を算出し、以下の式を使用してバックグラウンド対照を差し引く。
【００５３】
【数１】
0005409628.tif 000002
ＳＲは自然放出を指し、ＭＲは最大放出を指す。その開示はその全体が本明細書中に組み込まれる米国特許出願公開第２００５／００２５７６３号中に開示される方法も参照されたい。
【００５４】
いくつかの実施形態では、抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、標的細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、または８０％の細胞傷害を誘導する。本明細書中に記述されている抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、規定のアゴニストおよび／またはアンタゴニスト活性のいずれか１つ、および規定の細胞傷害のいずれか１つを示すことができる。
【００５５】
図２０Ａ〜２０Ｃに提供されている例示的な例では、抗ＴｗｅａｋＲ抗体、ＰＤＬ１９２は、ＳＮ１２Ｃ腎細胞、ならびにヒト末梢血単核細胞またはマウス脾細胞のいずれかをエフェクター細胞として使用したＴｗｅａｋＲ形質移入細胞系統においてＡＤＣＣ活性を誘導する。抗ＴｗｅａｋＲ抗体によるＡＤＣＣの誘導は、ＴｗｅａｋＲを発現しなかった細胞では観察されなかった（データ非表示）。
【００５６】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍細胞の死滅に関連する生物学的な経路には、アポトーシスおよびＡＤＣＣによる細胞の細胞崩壊が含まれる。抗ＴｗｅａｋＲ抗体の抗腫瘍活性に対するアポトーシスおよびＡＤＣＣの寄与は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで異なるＡＤＣＣ活性を有する２つの抗ＴｗｅａｋＲマウス抗体を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏで測定した（データ非表示）。マウス抗ＴｗｅａｋＲ  １９．２．１、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで強力なＡＤＣＣ活性を示すＩｇＧ２ａ抗体は、ＳＮ１２Ｃ腎異種移植モデル（図２１Ａ）およびＡ３７５黒色腫異種移植モデル（図２１Ｂ）において有意な抗腫瘍活性を示した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで弱いＡＤＣＣ活性を示すマウス抗ＴｗｅａｋＲ抗体１９．２．１ｘＧ１は、ＳＮ１２Ｃ腎異種移植モデルでは無視できる程度の抗腫瘍活性を示し（図２１Ａ）、Ａ３７５黒色腫異種移植モデルでは１９．２．１に匹敵する抗腫瘍活性を示した（図２１Ｂ）。したがって、本明細書中に記述されている抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏで癌細胞の死滅に関連する１つまたは複数の生物学的な経路を誘導することにより、腫瘍細胞の増殖を低減または阻害することが可能である。
【００５７】
本明細書中に記述されている組成物および方法に有用な抗体には、ＰＤＬ１９２、１８．３．３、または１３６．１と同じ（１つまたは複数の）エピトープに特異的に結合する抗ＴｗｅａｋＲ抗体が含まれる。本明細書中に記述されている抗体により結合されるエピトープは、同じでもよく、重複していてもよく、または別個であってもよい。例えば、ヒトＴｗｅａｋＲタンパク質に対するＰＤＬ１９２および１９．２．１の特異的結合は、そのアミノ酸配列（配列番号２；図２２Ａおよび２２Ｂを参照）の５６位の単一アミノ酸を変更することにより、すなわちＲ５６Ｐにより排除される。Ｒ５６がＰ５６に変更されても、抗ＴｗｅａｋＲ抗体１８．３．３、ＩＴＥＭ１、およびＩＴＥＭ３抗体は、ヒトＴｗｅａｋＲ配列に依然として結合することが可能である（例えば、図２２Ａを参照）。さらに、抗ＴｗｅａｋＲ抗体１８．３．３、ＩＴＥＭ１、およびＩＴＥＭ３は、そのアミノ酸配列の５６位にプロリンを含むマウスＴｗｅａｋＲタンパク質に結合する。しかしながら、抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１９２および１９．２．１は、マウスＴｗｅａｋＲタンパク質に結合しない（例えば、図２２Ａ〜２２Ｂを参照）。これらの結果は、ＰＤＬ１９２および１９．２．１が、１８．３．３、ＩＴＥＭ１、およびＩＴＥＭ３により結合されるエピトープとは別のエピトープに結合することを示唆する。
【００５８】
本明細書中に記述されている組成物および方法に有用な他の抗体には、これらに限定されないが、配列番号３〜１１９の群から選択される配列と１００％の同一性を共有するか、または実質的に同一である可変領域アミノ酸配列、少なくとも１つのフレームワーク領域アミノ酸配列、または少なくとも１つのＣＤＲアミノ酸配列を含む抗ＴｗｅａｋＲ抗体が含まれる。可変領域、フレームワーク領域、およびＣＤＲの範囲は、当業者に周知である（例えば、Ｋａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、第５版、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、ベセスダ、米国メリーランド州（１９９１年）を参照）。
【００５９】
本明細書中に記述したように、ＴｗｅａｋＲに特異的に結合可能な抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、重鎖および／もしくは軽鎖ＣＤＲ、ならびに／またはフレームワーク領域の種々の組合せを含むことができる。いくつかの実施形態では、抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、重鎖および／または軽鎖可変領域を含む。他の実施形態では、本明細書中に記述されている抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、重鎖および／または軽鎖可変の１つ、２つ、または３つすべてのＣＤＲを含む。他の実施形態では、本明細書中に記述されている抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、１つ、２つ、３つ、または４つすべてのフレームワーク領域を含む。他の実施形態では、抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、重鎖および軽鎖可変領域の両方のＣＤＲを含む。他の実施形態では、抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、重鎖および軽鎖可変領域の両方のＣＤＲおよびフレームワーク領域を含む。前述の記述から明らかなように、本明細書中に記述されている組成物および方法に有用な抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、その結果生じる抗体がＴｗｅａｋＲに特異的に結合し、癌細胞を死滅させることが可能である限り、ＣＤＲおよびフレームワーク領域のあらゆる組合せを含むことができる。抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、モノクローナル、キメラ、ヒト化、または完全ヒトであり得る。
【００６０】
いくつかの実施形態では、抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、配列番号１２０〜１２３および１２７〜１２９からなる群から選択される共通配列を含む重鎖および／または軽鎖可変領域の１つまたは複数のＣＤＲと、配列番号１２３〜１２６および配列番号１３０〜１３３からなる群から選択される共通配列を含む重鎖および／または軽鎖可変領域の１つまたは複数のフレームワーク領域の種々の組合せとを含むことができる。
【００６１】
例えば、抗ＴｗｅａｋＲ抗体またはその抗原結合性断片は、以下からなる群から選択することができる：１位のＸａａが、Ｓ、Ｎ、またはＫであり、５位のＸａａがＳまたはＮである式ＸａａＹＷＭＸａａ（配列番号１２０）を含むアミノ酸配列によりコードされた重鎖ＣＤＲ１；１７位のＸａａがＡまたはＶである式ＥＩＲＬＫＳＤＮＹＡＴＨＹＡＥＳＸａａＫＧ（配列番号１２１）を含むアミノ酸配列によりコードされた重鎖ＣＤＲ２；１位のＸａａがＧ、Ｔ、またはＹであり、２位のＸａａがＦまたはＹであり、５位のＸａａがＡ、Ｔ、またはＹであり、６位のＸａａがＦまたはＭである式ＸａａＸａａＡＤＸａａＸａａＤＹ（配列番号１２２）を含むアミノ酸配列によりコードされた重鎖ＣＤＲ３；１位のＸａａがＲまたはＫであり、１０位のＸａａがＳまたはＴであり、１５位のＸａａがＨまたはＱである式ＸａａＡＳＱＳＶＳＴＳＸａａＹＳＹＭＸａａ（配列番号１２７）を含むアミノ酸配列によりコードされた軽鎖ＣＤＲ１；３位のＸａａがＳまたはＴであり、４位のＸａａがＮまたはＫであり、６位のＸａａがＥまたはＤである式ＹＡＸａａＸａａＬＸａａＳ（配列番号１２８）を含むアミノ酸配列によりコードされた軽鎖ＣＤＲ２；６位のＸａａがＩまたはＬである式ＱＨＳＷＥＸａａＰＹＴ（配列番号１２９）を含むアミノ酸配列によりコードされた軽鎖ＣＤＲ３；３位のＸａａがＱまたはＫであり、５位のＸａａがＥ、Ｖ、またはＧであり、１８位のＸａａがＬまたはＭであり、１９位のＸａａがＲまたはＫであり、２３位のＸａａがＡまたはＶであり、２８位のＸａａがＴまたはＰであり、３０位のＸａａがＳ、Ｎ、またはＴである式ＥＶＸａａＬＸａａＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＸａａＸａａＬＳＣＸａａＡＳＧＦＸａａＦＸａａ（配列番号１２３）を含むアミノ酸配列によりコードされた重鎖ＦＲ１；５位のＸａａがＡまたはＳであり、７位のＸａａがＥまたはＧであり、１３位のＸａａがＶまたはＬである式ＷＶＲＱＸａａＰＸａａＫＧＬＥＷＸａａＡ（配列番号１２４）を含むアミノ酸配列によりコードされた重鎖ＦＲ２；１位のＸａａがＲまたはＫであり、８位のＸａａがＤまたはＮであり、９位のＸａａがＳまたはＡであり、１０位のＸａａがＫまたはＲであり、１１位のＸａａがＮまたはＳであり、１２位のＸａａがＳ、Ｒ、またはＴであり、１３位のＸａａがＬまたはＶであり、１９位のＸａａがＳまたはＮであり、２４位のＸａａがＤまたはＮであり、２６位のＸａａがＡまたはＧであり、２７位のＸａａがＩまたはＶであり、３１位のＸａａがＴ、Ｓ、またはＡであり、３２位のＸａａがＧ、Ｐ、またはＲである式ＸａａＦＴＩＳＲＤＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＹＬＱＭＮＸａａＬＲＡＥＸａａＴＸａａＸａａＹＹＣＸａａＸａａ（配列番号１２５）を含むアミノ酸配列によりコードされた重鎖ＦＲ３；６位のＸａａがＬ、Ｓ、またはＴであり、７位のＸａａがＶまたはＬである式ＷＧＱＧＴＸａａＸａａＴＶＳＳ（配列番号１２６）を含むアミノ酸配列によりコードされた重鎖ＦＲ４；１位のＸａａがＤまたはＥであり、３位のＸａａがＱまたはＶであり、４位のＸａａがＭまたはＬであり、９位のＸａａがＧ、Ｓ、またはＡであり、１２位のＸａａがＳ、Ａ、またはＴであり、１３位のＸａａがＡ、ＬまたはＶであり、１５位のＸａａがＰ、Ｖ、またはＬであり、１７位のＸａａがＤ、Ｅ、またはＱであり、１９位のＸａａがＶまたはＡであり、２２位のＸａａがＴまたはＳである式ＸａａＩＸａａＸａａＴＱＳＰＸａａＳＬＸａａＸａａＳＸａａＧＸａａＲＸａａＴＩＸａａＣ（配列番号１３０）を含むアミノ酸配列によりコードされた軽鎖ＦＲ１；５位のＸａａがＲまたはＫであり、８位のＸａａがＫまたはＱであり、９位のＸａａがＡ、Ｐ、またはＳである式ＷＹＱＱＸａａＰＧＸａａＸａａＰＫＬＬＩＫ（配列番号１３１）を含むアミノ酸配列によりコードされた軽鎖ＦＲ２；２位のＸａａがＶまたはＩであり、４位のＸａａがＳ、Ｄ、またはＡであり、１８位のＸａａがＴまたはＮであり、２０位のＸａａがＳまたはＨであり、２１位のＸａａがＳ、Ｒ、またはＰであり、２２位のＸａａがＬまたはＶであり、２３位のＸａａがＱまたはＥであり、２４位のＸａａがＰまたはＥであり、２７位のＸａａがＦ、Ｔ、またはＡであり、２９位のＸａａがＴまたはＶである式ＧＸａａＰＸａａＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＸａａＩＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＥＤＸａａＡＸａａＹＹＣ（配列番号１３２）を含むアミノ酸配列によりコードされた軽鎖ＦＲ３；および／または３位のＸａａがＧまたはＱであり、６位のＸａａがＫまたはＲであり、７位のＸａａがＶまたはＬである式ＦＧＸａａＧＴＸａａＸａａＥＩＫＲ（配列番号１３３）を含むアミノ酸配列によりコードされた軽鎖ＦＲ４。
【００６２】
別の例としては、抗ＴｗｅａｋＲ抗体は以下を含むことができる：１位のＸａａがＳ、Ｎ、またはＫであり、５位のＸａａがＳまたはＮである式ＸａａＹＷＭＸａａ（配列番号１２０）を含むアミノ酸配列によりコードされた重鎖ＣＤＲ１；１７位のＸａａがＡまたはＶである式ＥＩＲＬＫＳＤＮＹＡＴＨＹＡＥＳＸａａＫＧ（配列番号１２１）を含むアミノ酸配列によりコードされた重鎖ＣＤＲ２；および１位のＸａａがＧ、ＴまたはＹであり、２位のＸａａがＦまたはＹであり、５位のＸａａがＡ、Ｔ、またはＹであり、６位のＸａａがＦまたはＭである式ＸａａＸａａＡＤＸａａＸａａＤＹ（配列番号１２２）を含むアミノ酸配列によりコードされた重鎖ＣＤＲ３。
【００６３】
別の例としては、抗ＴｗｅａｋＲ抗体は以下を含むことができる：１位のＸａａがＲまたはＫであり、１０位のＸａａがＳまたはＴであり、１５位のＸａａがＨまたはＱである式ＸａａＡＳＱＳＶＳＴＳＸａａＹＳＹＭＸａａ（配列番号１２７）を含むアミノ酸配列によりコードされた軽鎖ＣＤＲ１、３位のＸａａがＳまたはＴであり、４位のＸａａがＮまたはＫであり、６位のＸａａがＥまたはＤである式ＹＡＸａａＸａａＬＸａａＳ（配列番号１２８）を含むアミノ酸配列によりコードされた軽鎖ＣＤＲ２、および６位のＸａａがＩまたはＬである式ＱＨＳＷＥＸａａＰＹＴ（配列番号１２９）を含むアミノ酸配列によりコードされた軽鎖ＣＤＲ３。
【００６４】
さらに別の実施形態では、抗ＴｗｅａｋＲ抗体は以下を含むことができる：１位のＸａａが、Ｓ、Ｎ、またはＫであり、５位のＸａａがＳまたはＮである式ＸａａＹＷＭＸａａ（配列番号１２０）を含むアミノ酸配列によりコードされた重鎖ＣＤＲ１、１７位のＸａａがＡまたはＶである式ＥＩＲＬＫＳＤＮＹＡＴＨＹＡＥＳＸａａＫＧ（配列番号１２１）を含むアミノ酸配列によりコードされた重鎖ＣＤＲ２、１位のＸａａがＧ、Ｔ、またはＹであり、２位のＸａａがＦまたはＹであり、５位のＸａａがＡ、Ｔ、またはＹであり、６位のＸａａがＦまたはＭである式ＸａａＸａａＡＤＸａａＸａａＤＹ（配列番号１２２）を含むアミノ酸配列によりコードされた重鎖ＣＤＲ３、１位のＸａａがＲまたはＫであり、１０位のＸａａがＳまたはＴであり、１５位のＸａａがＨまたはＱである式ＸａａＡＳＱＳＶＳＴＳＸａａＹＳＹＭＸａａ（配列番号１２７）を含むアミノ酸配列によりコードされた軽鎖ＣＤＲ１、３位のＸａａがＳまたはＴであり、４位のＸａａがＮまたはＫであり、６位のＸａａがＥまたはＤである式ＹＡＸａａＸａａＬＸａａＳ（配列番号１２８）を含むアミノ酸配列によりコードされた軽鎖ＣＤＲ２、および６位のＸａａがＩまたはＬである式ＱＨＳＷＥＸａａＰＹＴ（配列番号１２９）を含むアミノ酸配列によりコードされた軽鎖ＣＤＲ３。重鎖および／または軽鎖ＣＤＲについて記述されている実施形態に加えて、抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、その結果生じる抗体がＴｗｅａｋＲに特異的に結合し癌細胞を死滅させることが可能である限り、重鎖および／または軽鎖ＣＤＲの他の組合せを含むことができる。
【００６５】
他の実施形態では、抗ＴｗｅａｋＲ抗体は以下を含むことができる：１位のＸａａが、Ｓ、Ｎ、またはＫであり、５位のＸａａがＳまたはＮである式ＸａａＹＷＭＸａａ（配列番号１２０）を含むアミノ酸配列によりコードされた重鎖ＣＤＲ１、１７位のＸａａがＡまたはＶである式ＥＩＲＬＫＳＤＮＹＡＴＨＹＡＥＳＸａａＫＧ（配列番号１２１）を含むアミノ酸配列によりコードされた重鎖ＣＤＲ２；１位のＸａａがＧ、Ｔ、またはＹであり、２位のＸａａがＦまたはＹであり、５位のＸａａがＡ、Ｔ、またはＹであり、６位のＸａａがＦまたはＭである式ＸａａＸａａＡＤＸａａＸａａＤＹ（配列番号１２２）を含むアミノ酸配列によりコードされた重鎖ＣＤＲ３、１位のＸａａがＲまたはＫであり、１０位のＸａａがＳまたはＴであり、１５位のＸａａがＨまたはＱである式ＸａａＡＳＱＳＶＳＴＳＸａａＹＳＹＭＸａａ（配列番号１２７）を含むアミノ酸配列によりコードされた軽鎖ＣＤＲ１、３位のＸａａがＳまたはＴであり、４位のＸａａがＮまたはＫであり、６位のＸａａがＥまたはＤである式ＹＡＸａａＸａａＬＸａａＳ（配列番号１２８）を含むアミノ酸配列によりコードされた軽鎖ＣＤＲ２、６位のＸａａがＩまたはＬである式ＱＨＳＷＥＸａａＰＹＴ（配列番号１２９）を含むアミノ酸配列によりコードされた軽鎖ＣＤＲ３、３位のＸａａがＱまたはＫであり、５位のＸａａがＥ、Ｖ、またはＧであり、１８位のＸａａがＬまたはＭであり、１９位のＸａａがＲまたはＫであり、２３位のＸａａがＡまたはＶであり、２８位のＸａａがＴまたはＰであり、３０位のＸａａがＳ、Ｎ、またはＴである式ＥＶＸａａＬＸａａＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＸａａＸａａＬＳＣＸａａＡＳＧＦＸａａＦＸａａ（配列番号１２３）を含むアミノ酸配列によりコードされた重鎖ＦＲ１；５位のＸａａがＡまたはＳであり、７位のＸａａがＥまたはＧであり、１３位のＸａａがＶまたはＬである式ＷＶＲＱＸａａＰＸａａＫＧＬＥＷＸａａＡ（配列番号１２４）を含むアミノ酸配列によりコードされた重鎖ＦＲ２、１位のＸａａがＲまたはＫであり、８位のＸａａがＤまたはＮであり、９位のＸａａがＳまたはＡであり、１０位のＸａａがＫまたはＲであり、１１位のＸａａがＮまたはＳであり、１２位のＸａａがＳ、Ｒ、またはＴであり、１３位のＸａａがＬまたはＶであり、１９位のＸａａがＳまたはＮであり、２４位のＸａａがＤまたはＮであり、２６位のＸａａがＡまたはＧであり、２７位のＸａａがＩまたはＶであり、３１位のＸａａがＴ、Ｓ、またはＡであり、３２位のＸａａがＧ、Ｐ、またはＲである式ＸａａＦＴＩＳＲＤＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＹＬＱＭＮＸａａＬＲＡＥＸａａＴＸａａＸａａＹＹＣＸａａＸａａ（配列番号１２５）を含むアミノ酸配列によりコードされた重鎖ＦＲ３、および６位のＸａａがＬ、Ｓ、またはＴであり、７位のＸａａがＶまたはＬである式ＷＧＱＧＴＸａａＸａａＴＶＳＳ（配列番号１２６）を含むアミノ酸配列によりコードされた重鎖ＦＲ４。
【００６６】
別の例としては、抗ＴｗｅａｋＲ抗体は以下を含むことができる：１位のＸａａが、Ｓ、Ｎ、またはＫであり、５位のＸａａがＳまたはＮである式ＸａａＹＷＭＸａａ（配列番号１２０）を含むアミノ酸配列によりコードされた重鎖ＣＤＲ１、１７位のＸａａがＡまたはＶである式ＥＩＲＬＫＳＤＮＹＡＴＨＹＡＥＳＸａａＫＧ（配列番号１２１）を含むアミノ酸配列によりコードされた重鎖ＣＤＲ２；１位のＸａａがＧ、Ｔ、またはＹであり、２位のＸａａがＦまたはＹであり、５位のＸａａがＡ、Ｔ、またはＹであり、６位のＸａａがＦまたはＭである式ＸａａＸａａＡＤＸａａＸａａＤＹ（配列番号１２２）を含むアミノ酸配列によりコードされた重鎖ＣＤＲ３、１位のＸａａがＲまたはＫであり、１０位のＸａａがＳまたはＴであり、１５位のＸａａがＨまたはＱである式ＸａａＡＳＱＳＶＳＴＳＸａａＹＳＹＭＸａａ（配列番号１２７）を含むアミノ酸配列によりコードされた軽鎖ＣＤＲ１、３位のＸａａがＳまたはＴであり、４位のＸａａがＮまたはＫであり、６位のＸａａがＥまたはＤである式ＹＡＸａａＸａａＬＸａａＳ（配列番号１２８）を含むアミノ酸配列によりコードされた軽鎖ＣＤＲ２；６位のＸａａがＩまたはＬである式ＱＨＳＷＥＸａａＰＹＴ（配列番号１２９）を含むアミノ酸配列によりコードされた軽鎖ＣＤＲ３、３位のＸａａがＱまたはＫであり、５位のＸａａがＥ、Ｖ、またはＧであり、１８位のＸａａがＬまたはＭであり、１９位のＸａａがＲまたはＫであり、２３位のＸａａがＡまたはＶであり、２８位のＸａａがＴまたはＰであり、３０位のＸａａがＳ、Ｎ、またはＴである式ＥＶＸａａＬＸａａＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＸａａＸａａＬＳＣＸａａＡＳＧＦＸａａＦＸａａ（配列番号１２３）を含むアミノ酸配列によりコードされた重鎖ＦＲ１、５位のＸａａがＡまたはＳであり、７位のＸａａがＥまたはＧであり、１３位のＸａａがＶまたはＬである式ＷＶＲＱＸａａＰＸａａＫＧＬＥＷＸａａＡ（配列番号１２４）を含むアミノ酸配列によりコードされた重鎖ＦＲ２、１位のＸａａがＲまたはＫであり、８位のＸａａがＤまたはＮであり、９位のＸａａがＳまたはＡであり、１０位のＸａａがＫまたはＲであり、１１位のＸａａがＮまたはＳであり、１２位のＸａａがＳ、Ｒ、またはＴであり、１３位のＸａａがＬまたはＶであり、１９位のＸａａがＳまたはＮであり、２４位のＸａａがＤまたはＮであり、２６位のＸａａがＡまたはＧであり、２７位のＸａａがＩまたはＶであり、３１位のＸａａがＴ、Ｓ、またはＡであり、３２位のＸａａがＧ、Ｐ、またはＲである式ＸａａＦＴＩＳＲＤＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＹＬＱＭＮＸａａＬＲＡＥＸａａＴＸａａＸａａＹＹＣＸａａＸａａ（配列番号１２５）を含むアミノ酸配列によりコードされた重鎖ＦＲ３、６位のＸａａがＬ、Ｓ、またはＴであり、７位のＸａａがＶまたはＬである式ＷＧＱＧＴＸａａＸａａＴＶＳＳ（配列番号１２６）を含むアミノ酸配列によりコードされた重鎖ＦＲ４、１位のＸａａがＤまたはＥであり、３位のＸａａがＱまたはＶであり、４位のＸａａがＭまたはＬであり、９位のＸａａがＧ、Ｓ、またはＡであり、１２位のＸａａがＳ、Ａ、またはＴであり、１３位のＸａａがＡ、ＬまたはＶであり、１５位のＸａａがＰ、Ｖ、またはＬであり、１７位のＸａａがＤ、Ｅ、またはＱであり、１９位のＸａａがＶまたはＡであり、２２位のＸａａがＴまたはＳである式ＸａａＩＸａａＸａａＴＱＳＰＸａａＳＬＸａａＸａａＳＸａａＧＸａａＲＸａａＴＩＸａａＣ（配列番号１３０）を含むアミノ酸配列によりコードされた軽鎖ＦＲ１、５位のＸａａがＲまたはＫであり、８位のＸａａがＫまたはＱであり、９位のＸａａがＡ、Ｐ、またはＳである式ＷＹＱＱＸａａＰＧＸａａＸａａＰＫＬＬＩＫ（配列番号１３１）を含むアミノ酸配列によりコードされた軽鎖ＦＲ２、２位のＸａａがＶまたはＩであり、４位のＸａａがＳ、Ｄ、またはＡであり、１８位のＸａａがＴまたはＮであり、２０位のＸａａがＳまたはＨであり、２１位のＸａａがＳ、Ｒ、またはＰであり、２２位のＸａａがＬまたはＶであり、２３位のＸａａがＱまたはＥであり、２４位のＸａａがＰまたはＥであり、２７位のＸａａがＦ、Ｔ、またはＡであり、２９位のＸａａがＴまたはＶである式ＧＸａａＰＸａａＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＸａａＩＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＥＤＸａａＡＸａａＹＹＣ（配列番号１３２）を含むアミノ酸配列によりコードされた軽鎖ＦＲ３、および３位のＸａａがＧまたはＱであり、６位のＸａａがＫまたはＲであり、７位のＸａａがＶまたはＬである式ＦＧＸａａＧＴＸａａＸａａＥＩＫＲ（配列番号１３３）を含むアミノ酸配列によりコードされた軽鎖ＦＲ４。
【００６７】
上述の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲならびにフレームワーク領域の共通配列の種々の組合せを含むことに加えて、本明細書中に記述されている抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、配列番号１３、１９、２５、６６、７２、７８、３１、４０、４９、５８、８４、９３、１０２、および１１１からなる群から選択される重鎖および／または軽鎖ＣＤＲならびにフレームワーク領域の種々の組合せを含むことができる。
【００６８】
限定ではなく例としては、抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、ＳＹＷＭＳ（配列番号１３）を含むアミノ酸配列によりコードされた重鎖ＣＤＲ１、ＥＩＲＬＫＳＤＮＹＡＴＨＹＡＥＳＶＫＧ（配列番号１９）を含むアミノ酸配列によりコードされた重鎖ＣＤＲ２、および式ＹＹＡＤＡＭＤＹ（配列番号２５）を含むアミノ酸配列によりコードされた重鎖ＣＤＲ３を含むことができる。
【００６９】
別の例としては、抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、ＲＡＳＱＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨ（配列番号６６）を含むアミノ酸配列によりコードされた軽鎖ＣＤＲ１、ＹＡＳＮＬＥＳ（配列番号７２）を含むアミノ酸配列によりコードされた軽鎖ＣＤＲ２、および式ＱＨＳＷＥＩＰＹＴ（配列番号７８）を含むアミノ酸配列によりコードされた軽鎖ＣＤＲ３を含むことができる。
【００７０】
他の実施形態では、抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、重鎖および軽鎖の両方からの３つすべてのＣＤＲ、例えば、ＳＹＷＭＳ（配列番号１３）を含むアミノ酸配列によりコードされた重鎖ＣＤＲ１、ＥＩＲＬＫＳＤＮＹＡＴＨＹＡＥＳＶＫＧ（配列番号１９）を含むアミノ酸配列によりコードされた重鎖ＣＤＲ２、式ＹＹＡＤＡＭＤＹ（配列番号２５）を含むアミノ酸配列によりコードされた重鎖ＣＤＲ３、ＲＡＳＱＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨ（配列番号６６）を含むアミノ酸配列によりコードされた軽鎖ＣＤＲ１、ＹＡＳＮＬＥＳ（配列番号７２）を含むアミノ酸配列によりコードされた軽鎖ＣＤＲ２、および式ＱＨＳＷＥＩＰＹＴ（配列番号７８）を含むアミノ酸配列によりコードされた軽鎖ＣＤＲ３を含むことができる。重鎖および／または軽鎖ＣＤＲについて記述されている実施形態に加えて、抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、その結果生じる抗体がＴｗｅａｋＲに結合し癌細胞を死滅させることが可能な限り、重鎖および／または軽鎖ＣＤＲの他の組合せを含むことができる。
【００７１】
別の例としては、抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ（配列番号３１）を含むアミノ酸配列によりコードされた重鎖ＦＲ１、ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡ（配列番号４０）を含むアミノ酸配列によりコードされた重鎖ＦＲ２、ＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＴＧ（配列番号４９）を含むアミノ酸配列によりコードされた重鎖ＦＲ３、およびＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号５８）を含むアミノ酸配列によりコードされた重鎖ＦＲ４を含むことができる。当業者であれば理解するであろうが、配列番号３１、４０、４９、および５８によりコードされた重鎖フレームワーク領域に加えて、本明細書中に記述されている抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、１つまたは複数の重鎖ＣＤＲ配列、例えば配列番号１３、１９、および２５、ならびに／またはもう１つの軽鎖ＣＤＲ配列、例えば配列番号６６、７２、および７８を含むことができる。重鎖および／または軽鎖ＣＤＲについて記述されている実施形態に加えて、その結果生じる抗体がＴｗｅａｋＲに結合し癌細胞を死滅させることが可能である限り。
【００７２】
別の例としては、抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号８４）を含むアミノ酸配列によりコードされた軽鎖ＦＲ１、ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＫ（配列番号９３）を含むアミノ酸配列によりコードされた軽鎖ＦＲ２、ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号１０２）を含むアミノ酸配列によりコードされた軽鎖ＦＲ３、およびＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号１１１）を含むアミノ酸配列によってコードされた軽鎖ＦＲ４を含むことができる。当業者であれば理解するだろうが、配列番号８４、９３、１０２、および１１１によりコードされた軽鎖フレームワーク領域に加えて、本明細書中に記述されている抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、１つまたは複数の重鎖ＣＤＲ配列、例えば配列番号１３、１９、および２５、ならびに／またはもう１つの軽鎖ＣＤＲ配列、例えば配列番号６６、７２、および７８、ならびに／または配列番号３１、４０、４９、および５８によりコードされた１つまたは複数の重鎖フレームワーク領域を含むことができる。したがって、抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、その結果生じる抗体がＴｗｅａｋＲに結合し癌細胞を死滅させることが可能である限り、重鎖および／または軽鎖ＣＤＲならびにフレームワーク領域の他の組合せを含むことができる。
【００７３】
「実質的に同一の」可変領域、定常領域、フレームワーク領域、またはＣＤＲは、アミノ酸配列の少なくとも約８５〜９０％、好ましくは少なくとも９５％が、天然または変更されていない抗体可変領域または定常領域と同一である抗体領域を指す。「同一の」またはパーセント「同一性」という用語は、複数のアミノ酸またはヌクレオチド配列との関連では、以下に記述する初期設定パラメーターを用いてＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを使用するか、または手作業によるアラインメントおよび目視検査により測定して、同一であるか、または特定のパーセントの同一アミノ酸残基もしくはヌクレオチドを有する（すなわち、比較窓または指定領域で最大限に一致させるために比較およびアラインした際に、特定の領域での約６０％の同一性、好ましくは７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の同一性）複数の配列またはサブ配列を指す（例えば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにある全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）のウェブサイトのＢＬＡＳＴの説明を参照）。
【００７４】
同一または実質的に同一の配列には、欠失および／または付加を有する配列、ならびに置換を有する配列、ならびに天然に存在する例えば多型性または対立形質性変異体、および保存的に改変された変異体などの人為的変異体が含まれる。配列同一性を測定するための周知のアルゴリズムは、ギャップなどを考慮することができる。好ましくは、配列同一性は、長さが少なくとも約２５個のアミノ酸またはヌクレオチドである領域に、またはより好ましくは、長さが５０〜１００個のアミノ酸またはヌクレオチドである領域に存在する。
【００７５】
本明細書中に記述されている方法に有用な抗ＴｗｅａｋＲ抗体のアミノ酸配列は、天然抗体に見出される配列に限定されず、周知の組換えＤＮＡ技術を使用して抗体を再設計し、所望の特徴を取得することができる。そのような「遺伝子的に変更された抗体」には、アミノ酸配列が親（すなわち、変更されていない）抗体の配列と異なっている抗体が含まれる。可能な変異は、単に１つまたは少数のアミノ酸の変更から、例えば可変領域または定常領域の完全な再設計にまで及ぶ。部位特異的突然変異による定常領域における変更は、免疫原性、薬物動態特性（例えば、血清半減期）、補体結合、膜との相互作用、および他のエフェクター機能などの治療用抗体の機能的特徴を向上または変更するために行われてもよい。一般的に、抗体可変領域への変更は、抗原結合特性を向上するために行われてもよい。
【００７６】
本明細書中に記述されている抗ＴｗｅａｋＲ抗体およびアミノ酸配列をコードする核酸、ならびに前記核酸配列にハイブリダイズし、抗ＴｗｅａｋＲ抗体、本明細書中に記述されている機能特性を有するそのような抗体をコードする分子を、本明細書中に開示されている方法に使用することができる。
【００７７】
抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、認識されているアイソタイプのいずれであってもよい。いくつかの実施形態では、抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、４つのヒトＩｇＧアイソタイプ、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４の１つ、または４つのマウスＩｇＧアイソタイプ、すなわちマウスＩｇＧ１、マウスＩｇＧ２ａ、マウスＩｇＧ２ｂ、またはマウスＩｇＧ３の１つである。他の実施形態では、抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプである。
【００７８】
別の実施形態では、抗体は、低レベルのフコースを有するか、またはフコースを欠如している。フコースを欠如する抗体は、特に低用量の抗体では、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）活性の増強と相関している。Ｓｈｉｅｌｄｓ，  Ｒ．Ｌ．ら、（２００２年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７７巻：２６７３３〜２６７４０頁；Ｓｈｉｎｋａｗａ，  Ｔ．ら、（２００３年）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７８巻：３４６６頁。フコースが少ない抗体を調製する方法には、ラットミエローマＹＢ２／０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６６２）中での増殖が含まれる。ＹＢ２／０細胞は、低レベルのＦＵＴ８  ｍＲＮＡを発現し、このｍＲＮＡは、ポリペプチドのフコシル化に必要な酵素（α１，６−フコシルトランスフェラーゼ）をコードしている。
【００７９】
ＡＤＣＣ活性を増加させるための代替的な方法には、抗ＴｗｅａｋＲ抗体のＦｃ部分における突然変異、特にＦｃγＲ受容体への抗体親和性を増加させる突然変異が含まれる。ＦｃγＲ結合の増加と変異Ｆｃとの間の相関性は、標的細胞傷害の細胞に基づくアッセイ（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｃｙｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ａｓｓａｙ）を使用して実証されている。Ｓｈｉｅｌｄｓ，  Ｒ．  Ｌ．ら（２００１年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ２７６巻：６５９１〜６６０４頁；Ｐｒｅｓｔａら（２００２年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．  Ｔｒａｎｓ．３０巻：４８７〜４９０頁。ＡＤＣＣ活性を増加させる他の方法には、米国特許出願公開第２００５／００２５７６３号に記述されているような特定のＦｃ領域突然変異の生成が含まれ、その開示はその全体が本明細書中に組み込まれる。
【００８０】
本明細書中に記述されている組成物および方法に使用できる他のタイプの抗体には、これらに限定されないが、抗原に結合する（特異的な抗原−抗体結合をアッセイするための当技術分野で周知のイムノアッセイにより決定されるような、好ましくは免疫特異的に、すなわち非特異的結合に競り勝つ）あらゆる免疫グロブリン分子が含まれる。そのような抗体には、これらに限定されないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二重特異的抗体、多重特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド連結Ｆｖ、およびＶＬまたはＶＨドメインのどちらか一方を含有している断片が含まれ、またはある場合には、Ｆｃ結合ドメインを含有またはＦｃ結合ドメインに融合するように操作された、抗原に特異的に結合する相補性決定領域（ＣＤＲ）も含まれる。
【００８１】
６．５  診断適用のためのＴｗｅａｋＲ配列の検出
正常組織（例えば、障害を起こしてない）、および病変組織（およびある場合には、以下に概説されるように、予後に関する障害の様々な重症度の）における遺伝子の発現レベルを評価して、発現プロファイルを提供する。特定の細胞状態または特定の発生の時点の遺伝子発現プロファイルは、本質的に細胞状態の「フィンガープリント」である。２つの状態が特定の遺伝子を同様に発現している場合があるが、多数の遺伝子を同時に評価することにより、細胞状態を反映する遺伝子発現プロファイルの生成が可能になる。異なる状態にある細胞の発現プロファイルを比較することにより、これらの状態の各々においてどの遺伝子が重要であるかに関する情報（遺伝子の上方制御および下方制御の両方を含む）が取得される。その後、診断を実施または確認して、組織試料が正常組織または病変組織の遺伝子発現プロファイルを示すかどうかを決定する。これにより、関連状態の分子的診断が提供されよう。
【００８２】
本明細書中で使用される場合、「異なる発現」または文法的等価表現は、細胞および組織内ならびに細胞および組織間の、経時的および／または細胞性遺伝子発現パターンの質的または量的な違いを指す。したがって、異なって発現された遺伝子は、例えば、病変組織と比べて正常組織における活性化または不活化を含み、質的にその発現を変更させることができる。遺伝子は、別の状態と比べて特定の状態において活性化または不活化される場合があり、したがって複数の状態の比較を可能にする。質的に調節された遺伝子は、ある状態または細胞型内で、標準的技術により検出可能な発現パターンを示すことになる。いくつかの遺伝子は、１つの状態または細胞型において発現されるが、両方では発現されないだろう。あるいは、発現の違い、例えば発現の増加または減少の違いは量的であってもよく、例えば、遺伝子発現は、上方制御されて転写の増量に帰着するか、または下方制御されて転写の減量に帰着するかのいずれかである。発現の異なる度合いは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）（ＤＮＡマイクロチップアレイ）発現アレイの使用によるなどの、下記で概説されるような標準的特徴付け技術により定量化するのに十分な程度に大きいことが必要なだけである。Ｌｏｃｋｈａｒｔ（１９９６年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４巻：１６７５〜１６８０頁を参照されたい。他の技術には、これらに限定されないが、定量逆転写ＰＣＲ、ノーザン解析、およびＲＮａｓｅプロテクションが含まれる。上記で概説されているように、好ましくは、発現の変化（例えば、上方制御または下方制御）は、少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約１００％、より好ましくは少なくとも約１５０％、より好ましくは少なくとも約２００％であり、３００から少なくとも１０００％までが特に好ましい。
【００８３】
遺伝子転写またはタンパク質レベルについて評価してもよい。遺伝子発現の量は、遺伝子転写のＲＮＡまたはＤＮＡ当量に対する核酸プローブを使用してモニターしてもよく、遺伝子発現レベルまたは代替的には最終遺伝子産物自体（タンパク質）の定量化は、例えばＴｗｅａｋＲタンパク質に対する抗体および標準的イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡなど）または質量分析アッセイ、２Ｄゲル電気泳動アッセイなどを含む他の技術を用いてモニターすることができる。ＴｗｅａｋＲに対応するタンパク質、例えばある疾患表現型に重要であると同定されたものは、疾患診断検査で評価することができる。別の実施形態では、遺伝子発現モニタリングは、多数の遺伝子について同時に実施される。多タンパク質発現モニタリングは、同様に実施することができる。
【００８４】
したがって、いくつかの実施形態では、ＴｗｅａｋＲ核酸プローブは、特定の細胞におけるＴｗｅａｋＲ配列の検出および定量化用のバイオチップに結合されている。このアッセイは、下記の実施例においてさらに説明されている。より高い感度を提供するためには、ＰＣＲ技術を使用することができる。
【００８５】
他の実施形態では、ＴｗｅａｋＲをコードする核酸を検出する。ＴｗｅａｋＲタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを検出することができるが、特に興味深いのは、ＴｗｅａｋＲタンパク質をコードするｍＲＮＡを検出する方法である。ｍＲＮＡを検出するプローブは、そのｍＲＮＡと相補的であり、そのｍＲＮＡにハイブリダイズするヌクレオチド／デオキシヌクレオチドプローブであってよく、これらに限定されないが、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡが含まれる。プローブは、本明細書中で定義されているような検出可能な標識も含有すべきであり、１つの方法では、検討する核酸をナイロン膜などの固体支持体に固定化し、プローブを試料にハイブリダイズした後で、ｍＲＮＡを検出する。洗浄して非特異的に結合したプローブを除去した後で、標識を検出する。別の方法では、ｉｎ  ｓｉｔｕでｍＲＮＡの検出を実施する。この方法では、プローブと標的ｍＲＮＡのハイブリダイズを可能にするのに十分な時間、透過性細胞または組織試料を、検出可能に標識された核酸プローブと接触させる。洗浄して非特異的に結合したプローブを除去した後で、標識を検出する。例えば、ミエローマタンパク質をコードするｍＲＮＡに相補的なジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｙｇｅｎｉｎ）標識リボプローブ（ＲＮＡプローブ）は、ジゴキシゲニンを抗ジゴキシゲニン二次抗体と結合させることにより検出し、ニトロブルーテトラゾリウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイルホスフェート（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を用いて発色させる。
【００８６】
他の実施形態では、ＴｗｅａｋＲタンパク質、抗体、核酸、改変タンパク質、およびＴｗｅａｋＲ配列を含有する細胞を、診断アッセイに使用する。これらのアッセイは、個々の遺伝子または対応するポリペプチドレベルについて実施することができる。１つの実施形態では、発現プロファイルは、好ましくはハイスループットスクリーニング技術と共に使用され、発現プロファイル遺伝子および／または対応するポリペプチドのモニタリングを可能にする。
【００８７】
本明細書中に記述および定義されているように、ＴｗｅａｋＲタンパク質には、これらに限定されないが、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、黒色腫、膵臓癌、頭頚部癌、卵巣癌、胃癌、子宮癌、子宮頚癌、食道癌、腎細胞癌、神経膠芽腫、および肉腫を含む癌性状態の疾患マーカーとしての使用が見出される。さらに、ＴｗｅａｋＲには、予後または診断目的用のマーカーとしての使用が見出される。推定される病変組織および／または循環性腫瘍細胞におけるこれらのタンパク質の検出は、そのような状態の検出、予後、または診断、および治療戦略の選択を可能にする。１つの実施形態では、抗体を使用してＴｗｅａｋＲを検出する。好ましい方法では、ゲル上での電気泳動によりタンパク質を試料から分離する（典型的には、変性および還元性タンパク質ゲルだが、等電点電気泳動ゲルなどを含む別のタイプのゲルでもよい）。タンパク質を分離した後で、例えばＴｗｅａｋＲに対する抗体を用いたイムノブロッティングにより、ＴｗｅａｋＲを検出する。
【００８８】
別の方法では、ＴｗｅａｋＲに対する抗体には、ｉｎ  ｓｉｔｕイメージング技術における使用、例えば組織学における使用が見出される。例えばＡｓａｉら編（１９９３年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（３７巻）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。この方法では、細胞を、（１つまたは複数の）ＴｗｅａｋＲタンパク質に対する１つから多数の抗体に接触させる。洗浄して非特異的抗体結合を除去した後で、（１つまたは複数の）抗体の存在を検出する。１つの実施形態では、抗体は、検出可能な標識を含有する二次抗体と共にインキュベートすることにより検出する。別の方法では、ＴｗｅａｋＲに対する一次抗体は、検出可能な標識、例えば基質に作用できる酵素マーカーを含有する。別の実施形態では、複数の一次抗体の１つ１つは、別々の検出可能な標識を含有する。この方法には、前述した状態の他のマーカーと共に、ＴｗｅａｋＲについての同時スクリーニングにおける使用が特に見出される。本発明により、多くの他の組織学的イメージング技術も提供される。
【００８９】
１つの実施形態では、異なる波長の発光を検出および識別する能力を有する蛍光光度計で、標識を検出する。さらに、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）を、この方法に使用することができる。
【００９０】
別の実施形態では、抗体には、血液、血清、血漿、糞便、および他の試料から癌を診断することにおける使用が見出される。抗体を使用して、ＥＬＩＳＡ、イムノブロッティング（ウェスタンブロッティング）、免疫沈降、およびＢＩＡＣＯＲＥ技術などを含む以前に記述されているイムノアッセイ技術により、ＴｗｅａｋＲを検出することができる。
【００９１】
別の実施形態では、組織アレイに対する標識ＴｗｅａｋＲ核酸プローブのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが行われる。例えば、病変組織および／または正常組織を含む組織試料のアレイが作製される。その後、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、上記を参照）が実施される。個体と標準との間でフィンガープリントを比較する場合、診断、予後、または予測は、その知見に基づくことができる。診断を示す遺伝子は予後を示す遺伝子とは異なる場合があること、および細胞状態の分子プロファイリングは、応答または不応状態間の識別に結びついてもよく、または転帰の予測であってもよいことがさらに理解される。
【００９２】
１つの実施形態では、ＴｗｅａｋＲタンパク質、抗体、核酸、改変タンパク質、およびＴｗｅａｋＲ配列を含有する細胞は、予後アッセイに使用される。上記のように、長期的予後に関して、疾患状態情報、臨床情報、病理学的情報、または他の情報に相関する遺伝子発現プロファイルを生成することができる。繰り返しになるが、これは、タンパク質レベルまたは遺伝子レベルのいずれに対して行ってもよく、遺伝子の使用が好ましい。単一または複数の遺伝子は、種々の組合せに有用であり得る。上記のように、ＴｗｅａｋＲプローブを、組織または患者のＴｗｅａｋＲ配列の検出および定量化用のバイオチップに結合させることができる。このアッセイは、上記で概説したように診断用に行われる。ＰＣＲ法は、より高感度でより正確な定量化を提供することができる。
【００９３】
６．６  癌の治療
本明細書中に記述されている抗体は、異常細胞増殖の予防または治療に使用することができる。本明細書中で使用される場合、異常細胞増殖は、腫瘍または転移として顕在化してもよい。本明細書中で使用される場合、「腫瘍」という用語は、悪性か良性かにかかわらず、すべての新生細胞成長および増殖、ならびにすべての前癌および癌の細胞および組織を指す。「転移」という用語は、もっとも幅の広い意味で本明細書中で使用されており、腫瘍、例えば癌が体内のある部分から別の部分に拡散することを指す。拡散した細胞から形成された腫瘍は、二次腫瘍と呼ばれ、最初の（原発性の）腫瘍と同じタイプの細胞を含有する。したがって、肝臓または骨に転移した前立腺癌は、肝臓癌または骨癌ではなく、それらの位置にかかわらず前立腺癌細胞を依然として含有しているため、むしろ転移前立腺癌である。
【００９４】
このように、いくつかの実施形態では、抗ＴｗｅａｋＲ抗体の投与は、癌細胞の死滅を誘発することができる。癌細胞は、固形腫瘍内、リンパ系内、または血流中に存在することができる。本明細書中で使用される場合、「癌」には、これらに限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病を含むすべての悪性新生物が含まれる。本明細書中で開示されている方法を使用して標的化できる癌の例には、これらに限定されないが、膀胱癌、乳癌、結腸癌、肺癌、黒色腫、膵臓癌、卵巣癌、腎癌、頭頚部癌、食道癌、子宮癌、胃癌、子宮頚癌、神経膠芽腫、および肉腫が含まれる。本明細書中に記述されている治療方法は、通常、ヒト患者に適用されるが、他の哺乳動物に適用することができる。
【００９５】
いくつかの実施形態では、抗ＴｗｅａｋＲ抗体の投与は、ＴｗｅａｋＲを発現する細胞のアポトーシスまたは細胞崩壊を誘導する。いくつかの実施形態では、細胞崩壊の誘導は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）により達成される。例えば、抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、ＴｗｅａｋＲを発現する細胞の１０％から８０％を超える細胞傷害を誘導することができる。いくつかの実施形態では、抗ＴｗｅａｋＲ抗体の投与は、ＴｗｅａｋＲを発現する細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、または８０％以上の細胞傷害を誘導する。
【００９６】
いくつかの実施形態では、抗ＴｗｅａｋＲ抗体の投与は、本明細書中に記述されている抗体の１つまたは複数を用いて癌細胞表面のＴｗｅａｋＲを標的にすることにより、固形腫瘍のサイズを縮小することができる。腫瘍は、原発性腫瘍でもよく、または二次腫瘍でもよい。例としては、抗ＴｗｅａｋＲ抗体の投与は、固形腫瘍のサイズを少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、または８０％以上縮小することができる。他の実施形態では、抗ＴｗｅａｋＲ抗体の投与は、固形腫瘍の成長を完全に阻害または防止することができる。
【００９７】
本明細書中に開示されている抗ＴｗｅａｋＲ抗体に関する、様々な範囲の異なる細胞傷害および様々な範囲の腫瘍サイズの縮小が記述されていることが認識されよう。当業者であれば、抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、記述されている細胞傷害のいずれか１つ、および記述されている腫瘍サイズの縮小のいずれか１つを示すことができることを認識するであろう。
【００９８】
いくつかの実施形態では、本方法は、エフェクター部分と結合体化された抗ＴｗｅａｋＲ抗体を使用することができる。エフェクター部分は、放射性標識または蛍光標識などの標識部分を含む、任意の数の分子であってもよく、または好ましくは治療用部分であってもよい。エフェクター部分（または「エフェクター成分」）は、リンカーまたは化学結合を介して共有結合により、またはイオン結合、ファンデルワールス結合、静電結合、もしくは水素結合を介して非共有結合により、抗ＴｗｅａｋＲ抗体と結合（または連結、または結合体化）することができる。
【００９９】
治療用部分は、活性ＴｗｅａｋＲを調節する低分子であってもよい。別の態様では、治療用部分は、ＴｗｅａｋＲと結合している、またはＴｗｅａｋＲに非常に近接している分子または細胞の活性に影響を与える。例えば、治療用部分は細胞毒性薬であってもよい。「細胞毒性薬」という用語は、本明細書中で使用される場合、細胞の機能を阻害または防止する物質、および／または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。この用語は、放射性同位元素（例えば、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、およびＲｅ１８６）、化学療法剤、および細菌由来、真菌由来、植物由来、または動物由来の酵素活性毒素などの毒素またはそれらの断片を含むことが意図されている。好適な毒素およびそれらの対応する断片には、ジフテリアＡ鎖、菌体外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、クルシン、クロチン、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、およびオーリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）（例えば、オーリスタチンＥ、またはオーリスタチンＦ）などが含まれる。癌細胞の表面に発現したＴｗｅａｋＲに対して治療用部分を標的化することは、罹患部における治療用部分の局所濃度を増加させる役割を果たすだけでなく、治療用部分と関連している可能性のある有害な副作用を低減する役割も果たす。
【０１００】
他の実施形態では、抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、特定の癌を治療するために使用される従来の治療薬と組み合わせて使用することができる。特定の癌についての従来の標準治療は当業者に公知であり、したがって、当業者であれば、本明細書中に記述されている抗ＴｗｅａｋＲ抗体と組み合わせるための、１つまたは複数の治療薬を選択することができよう。例としては、膵臓癌は、現在、エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））と併用してまたは併用せずに、治療薬ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）を使用して治療されている。したがって、抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、ゲムシタビンおよび／またはエルロチニブと組み合わせて使用して、膵臓癌を治療することができる。
【０１０１】
癌を治療するために現在使用されており、したがって本明細書中に記述されている抗ＴｗｅａｋＲ抗体と組み合わせて使用することができる他の治療薬の例には、これらに限定されないが、標的化薬剤（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｇｅｎｔ）、従来の化学療法剤、およびホルモン療法剤が含まれる。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記述されている抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、標的化薬剤と組み合わせて使用することができる。標的化薬剤には、これらに限定されないが、抗血管新生剤（ベバシズマブ、スニチニブ、ソラフェニブ、テムシロリムス、２−メトキシエストラジオールまたは２ＭＥ２、フィナスネート（ｆｉｎａｓｕｎａｔｅ）、ＰＴＫ７８７、およびバンデタニブなど）、ＥＧＦＲ阻害剤（エルロチニブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ゲフィニチブ（ｇｅｆｉｎｉｔｉｂ）、ラパチニブ、およびトラスツズマブなど）、免疫調節剤（リツキシマブ、アレムツズマブ、およびアルデスロイキン（ａｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎｅ）など）、プロテアソーム阻害剤（ボルテゾミブ、ＰＲ−１７１、およびＮＰＩ−０５２など）、インテグリン阻害剤（ナタリズマブ、ボロシキマブ（ｖｏｌｏｃｉｘｉｍａｂ）、エタラシズマブ（ｅｔａｒａｃｉｚｕｍａｂ）、およびシレンギチド（ｃｉｌｅｎｇｉｔｉｄｅ）など）、アポトーシス促進剤（マパツマムマブ（ｍａｐａｔｕｍｕｍａｂ）、レクサツムマブ（ｌｅｘａｔｕｍｕｍａｂ）、ＡＭＧ９５１、ＡＢＴ−７３７、オブリメルセン、およびプリチデプシン（ｐｌｉｔｉｄｅｐｓｉｎ）など）、および他の作用機序に関する薬剤（イマチニブ、ダサチニブ、レナリドミド、サリドマイド、アルデスロイキン、およびインターフェロンアルファなど）が含まれる。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記述されている抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、従来の化学療法剤と組み合わせて使用することができる。従来の化学療法剤には、これらに限定されないが、アルキル化薬（オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、シクロホスファミド、メルファラン、イホスファミド、ウラムスチン、クロラムブシル、メクロエタミン（ｍｅｃｈｌｏｅｔｈａｍｉｎｅ）、チオテパ、ブスルファン、テモゾロミド、およびダカルバジンなど）、抗代謝剤（ゲムシタビン、サイトシンアラビノサイド、Ａｒａ−Ｃ、カペシタビン、５ＦＵ（５−フルオロウラシル）、アザチオプリン、メルカプトプリン（６−ＭＰ）、６−チオグアニン、アミノプテリン、ペメトレキセド，およびメトトレキサート）、植物アルカロイドおよびテルペノイド（ドセタセル、パクリタキセル、タンパク質結合パクリタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン、エトポシド、ＶＰ−１６、テニポシド、イリノテカン、およびトポテカンなど）、および抗腫瘍抗生物質（ダクチノマイシン、ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、ダウノルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、ミトキサントロン、アドリアマイシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシンＣ、カルミノマイシン、およびエスペラミシンなど）が含まれる。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記述されている抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、ホルモン療法剤（アナストロゾール、レトロゾール、ゴセレリン、およびタモキシフェンなど）と組み合わせて使用することができる。
【０１０５】
したがって、本明細書中に記述されている抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、単独療法として、または他の治療薬と組み合わせて使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中に記述されている抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、単独療法薬として、または抗ＥＧＦＲ抗体に耐性となった癌患者の治療のための併用治療計画の一部として有用である。抗ＥＧＦＲ抗体に対する耐性は、ＥＧＦＲを媒介とするシグナル伝達の構成的活性化に帰着する突然変異に関連すると仮定されている（例えば、Ｊｈａｗｅｒら、２００８年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６８巻（６号）：１９５３〜１９６１頁を参照）。いくつかの最近の研究では、Ｋ−Ｒａｓの腫瘍野生型がこの薬剤に対する応答性の向上を示すという、Ｋ−Ｒａｓ突然変異状態とセツキシマブ応答との関連性が示されている（Ｌｉｅｖｒｅら、２００８年、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２６巻（３号）：３７４〜３７９頁）。活性ＰＩＫ３ＣＡ突然変異またはＰＴＥＮ発現の喪失を有する結腸癌細胞系統は、ＰＩＫ３ＣＡ野生型／ＰＴＥＮ発現細胞系統よりセツキシマブにより耐性であることが見出された（Ｊｈａｗｅｒら、２００８年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６８巻（６号）：１９５３〜１９６１頁）。ＲＡＳ／ＲＡＦシグナル伝達経路を活性化する突然変異は、結腸直腸癌患者における予測および予後の指標であることが示された（Ｂｅｎｖｅｎｕｔｉら、２００７年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６７巻（６号）：２６４３〜２６４８頁）。
【０１０６】
ＮＷ２３１（乳腺癌）、ＨＴ２９（結腸直腸腺癌）、Ａ３７５（黒色腫）、Ｃａｌｕ６（肺退形成癌）、Ａ５４９（肺癌）、７８６−０（腎明細胞癌）、およびＨＣＴ１１６（結腸直腸腺癌）を含む、抗ＴｗｅａｋＲ抗体の効能を試験するために使用される異種移植モデルの多くは、ＢＲＡＦ、ＫＲＡＳ、ＰＴＥＮ、およびＰＩＫ３ＣＡ突然変異を保持する。これらのモデルのいくつか、すなわちＮＷ２３１、ＨＴ２９、およびＡ３７５において、抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１９２は、腫瘍成長の低減および／または阻害に有効であり（表２を参照）、抗ＴｗｅａｋＲ抗体が、抗ＥＧＦＲ抗体などのＥＧＦＲ阻害剤に応答しないか、または耐性になっている癌患者を治療するために使用できることを示唆した。
【０１０７】
ＨＴ２９異種移植モデルでは、ＰＤＬ１９２は、ＨＴ２９において、セツキシマブ／イリノテカンの組合せの抗腫瘍活性を増強することが示された（例えば、図１８Ｄを参照）。これらの結果は、抗ＥＧＦＲ抗体などのＥＧＦＲ阻害剤に応答しないか、または耐性になっている患者のための治療計画の一部として、異なる経路を標的とする薬剤と抗ＴｗｅａｋＲ抗体を組み合わせる理論的根拠を提供する。
【０１０８】
したがって、いくつかの実施形態では、抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、セツキシマブおよびパニツムマブなどの抗上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）抗体を用いた治療に応答しないか、または耐性になっている癌患者に投与される。抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、単独で投与してもよく、または、これらに限定されないが、標的化薬剤、従来の化学療法剤、およびホルモン療法剤を含む他の治療薬と組み合わせて投与してもよい。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体に耐性であるか、または応答しない癌患者を、Ｂｅｎｖｅｎｕｔｉら、２００７年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６７巻（６号）：２６４３〜２６４８頁に記述されているように、ＢＲＡＦ、ＫＲＡＳ、ＰＴＥＮ、およびＰＩＫ３ＣＡ突然変異についてスクリーニングする。これらの遺伝子の１つまたは複数に突然変異を有する患者を特定し、抗ＴｗｅａｋＲ抗体単独で、または、これらに限定されないが、標的化薬剤、従来の化学療法剤、およびホルモン療法剤を含む他の治療薬と組み合わせて治療する。
【０１１０】
上記の治療薬の１つまたは複数は、抗ＴｗｅａｋＲ抗体の投与と同時に、投与前に、または投与後に投与することができる。薬剤は、別々に投与してもよく、または混合物と混合して単一組成物として共に投与してもよい。（１つまたは複数の）組成物は、当技術分野で公知である任意の手段により投与することができる。
【０１１１】
抗ＴｗｅａｋＲ抗体と組み合わせて使用することができる他の有用な治療には、放射線療法が含まれる。
【０１１２】
抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、治療有効量で対象に投与される医薬組成物に製剤することができる。本明細書中で使用される場合、「治療有効量」は、癌および／またはその徴候、および／または合併症を治癒するか、緩和するか、弱毒化するか、または少なくとも部分的に停止させるのに十分な医薬製剤または組成物の量を指す。癌治療用の抗ＴｗｅａｋＲ抗体の治療有効量を決定するための臨床的方法は、当業者に周知であり、日常的な実験作業を使用して経験的に決定することができる。例えば、癌治療の関連では、「治療有効量」は、以下の効果の１つまたは複数を引き起こすことが可能な量である：（１）速度低下および完全な成長停止を含む腫瘍成長のある程度の阻害、（２）癌細胞の数の減少；（３）腫瘍サイズの縮小；（４）末梢器官への癌細胞浸潤の阻害（すなわち縮小、速度低下、または完全な停止）；（５）癌細胞転移の阻害（すなわち縮小、速度低下、または完全な停止）；（６）腫瘍の退縮または排除に帰着してもよいが、必ずしもそうである必要はない、抗癌免疫応答の増強；および／または（７）障害に関連した１つまたは複数の徴候のある程度の軽減。
【０１１３】
これらの製剤中の抗体の濃度は、約０．１から１００ｍｇ／ｍｌまで幅広く変動するが、１から２０ｍｇ／ｍｌの範囲であることが多い。疾患治療の目的には、抗体の適切な用量は、疾患の重症度および経過、患者の病歴および応答性、抗体の毒性、ならびに主治医の判断に依存するだろう。抗体は、一回のまたは一連の治療で患者に適切に投与される。適切な用量および治療計画は、当業者に公知である従来技術を使用して治療経過をモニターすることにより確立することができる。
【０１１４】
典型的には、本明細書中に記述されている組成物は、ボーラスとしてまたはある期間にわたる持続点滴により患者の静脈に、または筋肉内、皮下、腹腔内、もしくは脳脊髄内の経路で投与される。非経口投与可能な組成物を調製する方法は、当業者に公知また明白であり、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（第１５版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、イーストン、米国ペンシルバニア州、１９８０年）に、より詳細に記述されており、それは参照により本明細書中に組み込まれる。
【０１１５】
本明細書中に開示されているように、医薬品用途に製剤した組成物は、本明細書中に記述されている抗ＴｗｅａｋＲ抗体の１つまたは複数を含む。組成物は、任意選択で担体をさらに含む。本明細書中に記述されている医薬組成物は、典型的には抗ＴｗｅａｋＲ抗体および医薬担体を含み、一般的にそれらは、許容される担体、好ましくは水性担体に溶解されている抗ＴｗｅａｋＲ抗体の溶液またはその混合物を含む。種々の水性担体、例えば注射用蒸留水（ＷＦＩ）、またはリン酸、クエン酸、酢酸などで典型的には５．０から８．０、もっとも多くの場合は６．０から７．０のｐＨに緩衝されており、かつ／もしくは等張性にするために塩化ナトリウム、塩化カリウムなどの塩を含有している水を使用することができる。担体は、活性タンパク質を保護するために、ヒト血清アルブミン、ポリソルベート８０、糖、またはアミノ酸などの賦形剤も含有することができる。
【０１１６】
上記で示唆した診断適用および研究適用で使用するためのキットも、本明細書中で提供される。診断適用および研究適用では、そのようなキットは、以下の少なくとも１つを含むことができる：アッセイ試薬、緩衝液、ＴｗｅａｋＲ特異的核酸もしくは抗体、ハイブリダイゼーションプローブおよび／もしくはプライマー、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、ドミナントネガティブＴｗｅａｋＲポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、ならびに／またはＴｗｅａｋＲ関連配列の低分子阻害剤。
【０１１７】
加えて、このキットは、本発明の方法を実行するための説明書（例えばプロトコール）を含有する使用説明材を含むことができる。使用説明材には典型的には書面または印刷物が含まれるが、それらはそのようなものに限定されない。そのような説明を収容可能であり、最終使用者に対してそれらを伝達可能な媒体が、本発明により企図される。そのような媒体には、これらに限定されないが、電子記憶装置媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）および視覚的媒体（例えば、ＣＤ  ＲＯＭ）などが含まれる。そのような媒体は、そのような使用説明材を提供するインターネットサイトのアドレスを含むことができる。
【０１１８】
したがって、本明細書中に記述されている抗ＴｗｅａｋＲ抗体および抗原結合性断片、ならびにこれらの抗体および抗原結合性断片を含む組成物およびキットは、治療、特に本明細書中に記述されている疾患のいずれかの治療に使用することができる。
【実施例】
【０１１９】
（実施例１）
原発性腫瘍におけるＴｗｅａｋＲ発現
遺伝子発現プロファイリングを使用して、肺癌、膵癌、腎癌、乳癌および頭頚部癌を含む種々の原発性固形腫瘍におけるＴｗｅａｋＲ  ｍＲＮＡの発現を検出した。様々な癌および３４７個の正常な成人組織からｍＲＮＡを単離し、４６，０００個の遺伝子、ＥＳＴクラスター、および予測されるエクソンに相当する約５９，０００個のプローブセットを備えている特注のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子チップ、Ｅｏｓ  Ｈｕ０３にハイブリダイズさせた。
【０１２０】
４４例の肺腺癌のうち３１例、５６例の肺扁平上皮癌のうち２７例、４７例の膵臓腫瘍のうち３７例、２３例の頭頚部由来の腫瘍のうち１４例、６６例の卵巣癌のうち４８例、２５３例の原発性および転移性結腸直腸癌のうち１９０例、１１例の食道癌のうち１１例、３５例の黒色腫のうち１６例、２０例の腎癌のうち１５例、３９例の胃癌のうち２９例、４３例の子宮癌のうち２５例、１４例の子宮頚癌のうち７例、２６例の肉腫のうち８例、９３例の膀胱癌のうち２３例、および２７例の神経膠芽腫うち１６例（データは示さず）において、顕著なＴｗｅａｋＲ発現が検出された。乳癌において、４５人の患者由来の４７個の原発性腫瘍サンプルのうち２５個が顕著なＴｗｅａｋＲ発現を示し、１０個の脊柱への転移性腫瘍のうち７個がＴｗｅａｋＲを発現した（データは示さず）。
【０１２１】
図６において、膵癌、肺癌（腺癌および扁平上皮癌）、および腎癌におけるＴｗｅａｋＲのｃＤＮＡアレイ発現レベルを、様々な正常な生体組織と比較する。サンプルをＸ軸上に表示し、各サンプルの高さはＴｗｅａｋＲの発現レベルの平均強度を表している。１００の水平な破線より高い発現レベルを有するサンプルをＴｗｅａｋＲ発現陽性であるとみなす。
【０１２２】
また、抗ＴｗｅａｋＲ抗体を使用した免疫組織化学的染色を使用して、肺腺癌、肺扁平上皮癌、および膵癌の固形腫瘍におけるＴｗｅａｋＲ発現も試験した。凍結保存腫瘍標本を、抗ＴｗｅａｋＲ抗体２９．Ｔ１０（５μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合体化二次抗体を添加し、その後ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）で発色させた。
【０１２３】
免疫組織化学的染色は遺伝子チップの結果と一致した。ＴｗｅａｋＲに対する抗体（２９．Ｔ１０、３７４．２、および３４９．２）を使用して、肺腺癌、肺扁平上皮癌、膵腺癌、腎細胞癌、乳管癌、結腸直腸腺癌、卵巣癌、胃腺癌、膀胱癌、および頭頚部由来癌の癌に関して、ＴｗｅａｋＲタンパク質を検出した。図７は、固形腫瘍に対して抗体２９．Ｔ１０を使用した、ＴｗｅａｋＲタンパク質染色の典型例である。
【０１２４】
（実施例２）
抗ＴｗｅａｋＲ抗体の作製および特徴付け
抗ＴｗｅａｋＲ抗体の作製
モノクローナル抗体
マウス３Ｔ１２細胞を過剰発現するヒトＴｗｅａｋＲを用いてＢａｌｂ／ｃマウスを腹腔内で免疫化することによって、モノクローナル抗体を作製した。脾臓を採取し、脾細胞を多発性ミエローマ細胞系統、ＮＳ０と融合させた。アミノプテリンを使用してハイブリドーマを選択した。対象の抗ＴｗｅａｋＲ抗体を発現しているハイブリドーマを数回サブクローニングして個々のクローンを単離した。
【０１２５】
ＰＤＬ１９２を創出するための１９．２．１のヒト化
本質的にＱｕｅｅｎ，Ｃら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６巻：１００２９〜１００３３頁（１９８９年））の手順に従って、１９．２．１のヒト化を行った。まず、１９．２．１ＶＨおよびＶＬアミノ酸配列に高い相同性を有するヒトＶＨおよびＶＬセグメントを、それぞれ特定した。次に、ＣＤＲの構造を維持するために重要なフレームワークアミノ酸と一緒にＣＤＲ配列を、選択したヒトフレームワーク配列中にグラフトした。得られたヒト化モノクローナル抗体（ＰＤＬ１９２）をマウスミエローマ細胞系統ＮＳ０において発現させた。
【０１２６】
１９．２．１可変領域ｃＤＮＡのクローニングおよびシークエンシング
１９．２．１を産生する約５×１０７個のハイブリドーマ細胞から、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ロックビル、米国メリーランド州）を使用して、全ＲＮＡを抽出した。ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用して、供給業者のプロトコールに従って、二本鎖ｃＤＮＡを合成した。重鎖および軽鎖の可変領域ｃＤＮＡを、マウスγ鎖およびκ鎖Ｃ領域にそれぞれアニールする３’プライマー、およびＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔに備えられた５’ユニバーサルプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。ＶＨおよびＶＬｃＤＮＡを、配列決定のためにｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カールズバッド、米国カリフォルニア州）にサブクローニングした。メーカーの使用説明書に従って蛍光ジデオキシチェーンターミネーター（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティ、米国カリフォルニア州）を用いたＰＣＲサイクルシークエンシング反応によって、ＤＮＡシークエンシングを行った。重鎖および軽鎖可変領域の各々について、複数のプラスミドクローンをシークエンシングした。
【０１２７】
ＰＤＬ１９２Ｖ領域の設計
Ｑｕｅｅｎ，Ｃら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６巻：１００２９〜１００３３頁（１９８９年））によって概説されたように、抗体Ｖ領域のヒト化を行った。まず、コンピュータプログラムＡＢＭＯＤおよびＥＮＣＡＤ（Ｌｅｖｉｔｔ，Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６８巻：５９５〜６２０頁（１９８３年））を活用して、１９．２．１可変領域の分子モデルを構築した。次に、ヒト抗体ｃＤＮＡ配列に対する相同性検索に基づいて、ＰＤＬ１９２可変領域のフレームワークを提供するために適切なヒトＶＨ、ＶＬ、およびＪセグメント配列を選択した。
【０１２８】
コンピュータモデルがＣＤＲとの有意な接触を示したフレームワーク位置で、１９．２．１Ｖ領域のアミノ酸を本来のヒトフレームワークアミノ酸と置換した。これは、重鎖の７３、７４、９３、および９４残基で行った。軽鎖では、４９残基で置換を行った。ここで使用される番号付けシステムは、Ｋａｂａｔ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、ゼヘスダ、米国メリーランド州（１９９１年））のものであることに注意されたい。
【０１２９】
ＰＤＬ１９２ＶＨおよびＶＬ遺伝子の構築
各ＰＤＬ１９２ＶＨおよびＶＬ遺伝子をコードするＤＮＡセグメントを、シグナルペプチド、スプライスドナーシグナル、およびその後の哺乳動物発現ベクター中へのクローニングに適した制限酵素部位を含むミニエクソンとして設計した。長さ３３〜４３塩基のオーバーラップ合成オリゴヌクレオチドの伸長およびＰＣＲ増幅によって、１９．２．１ＶＨおよびＶＬミニエクソンを構築した（Ｓｔｅｍｍｅｒら、Ｇｅｎｅ１６４巻：４９〜５３頁（１９９５年））。ＰＣＲ増幅断片を、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製し、適切な制限酵素で消化し、ヒトＩｇＧ１およびκ定常ドメインを含む発現ベクター中にクローニングし、マウスＮＳ０細胞において発現させた。
【０１３０】
ＩＴＥＭ４由来ＰＤＬ４００のヒト化は、コンピュータモデルに基づいて異なるフレームワーク置換を選択したことを除いて、ＰＤＬ１９２について上述したプロセスと同様であった。
【０１３１】
結合親和性
様々なマウスおよびヒト化抗ＴｗｅａｋＲ抗体の相対的な結合親和性を、ヒトＴｗｅａｋＲの細胞外ドメインの可溶性形態を使用してＢｉａｃｏｒｅアッセイにおいて評価した。簡潔に述べると、ヤギ抗マウスＦｃ抗体またはヤギ抗ヒトＦｃをまずバイオセンサー表面に固定化し、続いて試験表面上の抗体を捕捉させる。その後、ヒトＴｗｅａｋＲ細胞外ドメインの可溶性形態をインジェクトして抗体への結合および抗体からの解離を測定する。１９．２．１、１３６．１、および１８．３．３を含む様々なマウス抗体、ならびにＰＤＬ１９２およびＰＤＬ４００を含む様々なヒト化抗体の相対的結合親和性を、表１に示す。
【０１３２】
【表１】
0005409628.tif 000003
表１に示すように、ＰＤＬ１９２の親和性はマウス親抗体１９．２．１の親和性と同様であった。このように、ヒト化プロセスは抗体の結合親和性を有意に変化させなかった。
【０１３３】
アゴニスト／アンタゴニスト活性
ＴｗｅａｋＲのリガンドであるＴＷＥＡＫは、複数のシグナル伝達経路を活性化し、サイトカインおよびケモカイン発現の増加、血管形成の刺激、および癌細胞におけるアポトーシスの誘導を含む多面発現効果を細胞にもたらす。抗ＴｗｅａｋＲ抗体を、ＴＷＥＡＫに起因する生物活性を及ぼす能力について、細胞増殖、血管形成の刺激ならびにサイトカインおよびケモカインの発現に対する抗ＴｗｅａｋＲ抗体の影響を測定するために設計されたいくつかのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを使用して評価した。
【０１３４】
細胞増殖アッセイにおいて、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、冠動脈平滑筋細胞、肺線維芽細胞、または肝細胞を、ＴＷＥＡＫ１００ｎｇ／ｍｌまたはアイソタイプ対照抗体もしくは抗ＴｗｅａｋＲ抗体１９．２．１  １０μｇ／ｍｌの存在下で３日間インキュベートした。細胞生存率はアラマーブルーを使用して評価した。アイソタイプで処理した細胞と比較して、ＨＵＶＥＣの増殖はＴＷＥＡＫまたは１９．２．１によって刺激された（データは示さず）。これらの細胞では、ＴＷＥＡＫは増殖を２〜４倍増大させ、一方１９．２．１は増殖を刺激して１．６倍増加させた。ＴＷＥＡＫも１９．２．１も、冠動脈平滑筋細胞、大動脈平滑筋細胞、肺線維芽細胞または肝細胞の増殖に対しては影響を及ぼさなかった。
【０１３５】
抗ＴｗｅａｋＲ抗体を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで内皮管腔形成を促進する能力について評価した。ＨＵＶＥＣ細胞を、フィブリンマトリックスにおいてＴＷＥＡＫ２００ｎｇ／ｍｌ、アイソタイプ対照抗体１０μｇ／ｍｌまたは１９．２．１  １０μｇ／ｍｌの存在下でインキュベートした。６日後、生じた管腔の長さを数値化した。ＴＷＥＡＫおよび１９．２．１はともに内皮管腔形成を刺激し、ＴＷＥＡＫは約３．５倍の管腔全長の増加を示し、１９．２．１は２．５倍の増加を刺激した（データは示さず）。
【０１３６】
抗ＴｗｅａｋＲ抗体のサイトカインおよびケモカイン発現を刺激する能力を、複数の癌細胞系統ならびに内皮細胞、肝細胞、肺線維芽細胞、および冠動脈平滑筋細胞を含む正常ヒト初代細胞に関して試験した。細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで２４時間、１００ｎｇ／ｍｌのＴＷＥＡＫと共にまたは１０μｇ／ｍｌの抗ＴｗｅａｋＲ抗体と共にインキュベートした。２４時間後、細胞上清を、最高で１５個の異なるサイトカインおよびケモカインの存在について、市販の蛍光ビーズベースのマルチプレックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）、Ｕｐｓｔａｔｅ）アッセイを使用して評価した。
【０１３７】
各細胞型は、ＴＷＥＡＫに反応して特有のサイトカインおよびケモカインのセットを放出した。１９．２．１およびＰＤＬ１９２など抗ＴｗｅａｋＲ抗体の一部は、低濃度ではあるがＴＷＥＡＫとしてサイトカイン／ケモカインの同じサブセット（例えば、ＩＬ−８、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳおよびＩＰ−１０）の分泌を誘導した。ＴＷＥＡＫ、１９．２．１およびＰＤＬ１９２は、試験した細胞型のＩＦＮγ、ＩＮＦα、ＩＦＮβ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、またはＩＬ−１３の放出を刺激しなかった（データは示さず）。
【０１３８】
上記の結果に基づいて、抗ＴｗｅａｋＲ抗体によるＡ３７５黒色腫細胞のＩＬ−８の放出を選択アッセイとして使用して、様々な抗体ならびにＩＴＥＭ１、ＩＴＥＭ２、ＩＴＥＭ３、およびＩＴＥＭ４を含む以前に同定された（Ｎａｋａｙａｍａら、２００３年、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ．、３０６巻：８１９〜８２５頁）抗ＴｗｅａｋＲ抗体のアゴニスト／アンタゴニスト活性を特徴付けした。図８は、ＩＴＥＭ１、ＩＴＥＭ２、ＩＴＥＭ３、およびＩＴＥＭ４（全て１０μｇ／ｍｌで使用）ならびに様々なアイソタイプ対照によるＩＬ−８の放出を示す。図８に示すように、全てのＩＴＥＭ抗体はＡ３７５細胞と共にインキュベートした場合にいくらかのＩＬ−８発現を誘導するので、これらはアゴニスト活性を有する。さらに、全てのＩＴＥＭ抗体は、Ａ３７５細胞をＴＷＥＡＫリガンド（３００ｎｇ／ｍｌ）および抗体と共にインキュベートした場合に放出されるＩＬ−８の量がＴＷＥＡＫ処理のみで観察された場合より少ないので、これらはいくらかのアンタゴニスト活性を有する。純粋なアンタゴニスト活性を有する作用物質であるＴｗｅａｋＲ細胞外ドメインの可溶性形態（ＴｗｅａｋＲ−Ｆｃ）および中和抗ＴＷＥＡＫ抗体を、比較のために示す。
【０１３９】
抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１９２、１８．３．３、１３６．１およびＰＤＬ４００について、代表的なＩＬ−８放出アッセイを図８Ｂ、８Ｃ、８Ｄ、および８Ｅにそれぞれ示す。図８Ｂ〜８Ｅに示すように、アゴニスト／アンタゴニスト活性は本明細書中に記載の抗体間で異なる。例えば、ＰＤＬ１９２（図８Ｂ）および１９．２．１（データは示さず）は、アンタゴニスト活性をほとんど有さず、すなわち、ＴＷＥＡＫにより誘導されるＩＬ−８放出を遮断しない。ＰＤＬ４００（図８Ｅ）および１８．３．３（図８Ｃ）は、アゴニストおよびアンタゴニスト活性を有する。抗ＴｗｅａｋＲ抗体１３６．１（図８Ｄ）は非常に高いアゴニスト活性を有し、このアッセイにおけるアンタゴニスト活性の評価が不可能である。
【０１４０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗腫瘍活性
足場依存性アッセイ（増殖アッセイ）、および足場非依存性アッセイ（コロニー形成アッセイ）の２つのアッセイを利用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの抗ＴｗｅａｋＲ抗体の抗増殖効果を評価した。Ａ３７５黒色腫細胞の１９．２．１を使用した典型的な抗増殖アッセイを、図９に示す。全体的に、ＰＤＬ１９２および１９．２．１はＴｗｅａｋＲ発現癌細胞系統４０個のうち１５個の増殖を減少させ、ＴｗｅａｋＲ発現癌細胞系統３３個のうち９個のコロニー形成能を低下させた（データは示さず）。
【０１４１】
抗ＴｗｅａｋＲ抗体ＰＤＬ１９２、１９．２．１、および１３６．１を、カスパーゼ活性化によりアポトーシスを誘導することによって癌細胞の増殖を減少させるまたは阻害する能力について試験した。ＩＦＮγで処理されたＨＴ２９結腸癌細胞を、３つの抗体のタイトレーションとインキュベートした。抗体処理から１〜２日以内に、細胞をカスパーゼ３／７の活性化について評価した。図１０Ａ〜１０Ｂに示すように、ＰＤＬ１９２および１３６．１は、ＨＴ２９においてカスパーゼ活性化によりアポトーシスを誘導することが可能であった。１９．２．１は同様な効果を有していた（データは示さず）。別の癌細胞系統において、アポトーシスは抗ＴｗｅａｋＲ抗体が増殖を阻害する機構ではないようであったため、これらの細胞において、抗体は長期の７〜１０日間の増殖アッセイにおいて増殖の低下を引き起こす代替の（１つまたは複数の）機構により活性を仲介すると仮定された（データは示さず）。
【０１４２】
（実施例３）
抗ＴｗｅａｋＲ抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ腫瘍活性
ｉｎ  ｖｉｖｏで抗ＴｗｅａｋＲ抗体を用いた処置を、多くの癌細胞系統から作製された異種移植モデルに対して実施した。表２に示すように、抗ＴｗｅａｋＲ抗体は、多くの異なる癌の増殖を低下させ、かつ／または阻害するのに有効であった。
【０１４３】
【表２】
0005409628.tif 000004
重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに、ＳＮ１２Ｃ腎癌細胞を皮下接種した。腫瘍が約１００ｍｍ３に達したときに、動物に１０ｍｇ／ｋｇのＰＤＬ１９２、ＰＤＬ４００、もしくは１９．２．１またはアイソタイプ対照抗体を週に３回、３週間腹腔内投与した。また用量設定試験を使用して、ＳＮ１２ＣモデルにおいてＰＤＬ１９２を用いて有効な用量レベルの範囲を決定した。このモデルにおいて、動物に１０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、または０．１ｍｇ／ｋｇのＰＤＬ１９２または１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照抗体を週に３回、３週間投与した。
【０１４４】
ＳＮ１２Ｃ腎癌異種移植モデルにおいてＰＤＬ１９２は腫瘍退縮を引き起こす。同様の結果が、ＰＤＬ４００および１９．２．１でも観察された（データは示さず）。図１１において示される用量設定試験において、腫瘍退縮は１ｍｇ／ｋｇという低い用量のＰＤＬ１９２で観察される。さらに低い０．３ｍｇ／ｋｇの用量では、退縮は達成されないが、ＰＤＬ１９２の顕著な抗腫瘍活性が観察される。
【０１４５】
重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに、Ａ２５３唾液腺癌細胞を皮下接種した。腫瘍が約１００ｍｍ３に達したときに、動物に１０ｍｇ／ｋｇの１９．２．１、ＰＤＬ１９２、１８．３．３およびＰＤＬ４００、またはアイソタイプ対照抗体を週に３回、３週間腹腔内投与した。また、１９．２．１を用いて頭頚部癌のＡ２５３モデルにおける用量設定試験を使用して、生物活性を示す血中抗体の最低濃度（最低有効血清濃度）を決定した。重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに、Ａ２５３唾液腺癌細胞を皮下接種した。腫瘍が約１００ｍｍ３に達したときに、動物に１０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、または０．５ｍｇ／ｋｇの１９．２．１または１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照抗体を週に３回、３週間腹腔内投与した。
【０１４６】
図１２に示すように、頭頚部癌のＡ２５３モデルにおいて１９．２．１により、１０ｍｇ／ｋｇの用量レベルで顕著な抗腫瘍活性が観察される。同様の結果が、ＰＤＬ１９２、１８．３．３およびＰＤＬ４００でも観察された（データは示さず）。図１２に示す用量設定試験において、頭頚部癌のＡ２５３モデルにおける１９．２．１による最大抗腫瘍活性は５ｍｇ／ｋｇで達成され、最小活性は０．５ｍｇ／ｋｇで観察される。別個の試験において、１９．２．１の血清濃度をこれらの同じ用量レベルで評価した。最大抗腫瘍活性が観察された０．５ｍｇ／ｋｇの用量レベルは、２０〜１２０μｇ／ｍｌの血中抗体濃度と相互関係を示した。０．５ｍｇ／ｋｇの用量レベルで観察された最小生物活性は、１〜７μｇ／ｍｌの抗体濃度と相互関係を示した（データは示さず）。この用量範囲を、抗ＴｗｅａｋＲ抗体についての有力な治療濃度域とみなす。
【０１４７】
重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに、Ａ２５３唾液腺癌細胞を皮下接種した。腫瘍が約１００ｍｍ３に達したときに、動物に５ｍｇ／ｋｇの１９．２．１または１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照抗体を週に３回、３週間（９回用量）または７週間（２２回用量）（１９．２．１のみ）腹腔内投与した。
【０１４８】
頭頚部癌のＡ２５３異種移植モデルにおいて、１９．２．１は腫瘍増殖を顕著に阻害した。３週間にわたって５ｍｇ／ｋｇで９回用量または７週間にわたって５ｍｇ／ｋｇで２２回用量を投与したマウスにおいて、１９．２．１の有効性を評価した（図１３）。両方の投与群で、腫瘍増殖は投与期間中顕著に阻害され、投与後約３週間で完了した（図１３）。この結果は、血中抗体濃度が有効性に必要な最小濃度を下回るまで抗腫瘍活性が維持されることを示唆する。
【０１４９】
重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに、ＨＴ１３７６膀胱癌細胞を皮下接種した。腫瘍が約１００ｍｍ３に達したときに、動物に１０ｍｇ／ｋｇのＰＤＬ１９２、１９．２．１、およびＰＤＬ４００、またはアイソタイプ対照抗体を週に３回、７週間腹腔内投与した。
【０１５０】
ＨＴ１３７６膀胱異種移植モデルにおいて、腫瘍増殖は中程度に阻害された。図１４は、ＰＤＬ１９２処置後の腫瘍増殖の低下を示す。同様の結果が、１９．２．１およびＰＤＬ４００を使用して得られた（データは示さず）。
【０１５１】
重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに、Ａ３７５黒色腫細胞を皮下接種した。腫瘍が約１００ｍｍ３に達したときに、動物に１０ｍｇ／ｋｇのＰＤＬ１９２、１９．２．１、および１８．３．３、またはアイソタイプ対照抗体を週に３回、３週間腹腔内投与した。また用量設定試験を使用して、Ａ３７５モデルにおいてＰＤＬ１９２を用いて有効な用量レベルの範囲を決定した。この試験において、動物に１０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、または０．１ｍｇ／ｋｇのＰＤＬ１９２または１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照抗体を週に３回（３ｑｗ）、３週間投与した。
【０１５２】
３ｑｗ  Ａ３７５黒色腫異種移植モデルにおいて、１０ｍｇ／ｋｇのＰＤＬ１９２を使用して腫瘍増殖を大幅に阻害した（図１５）。同様の結果が、１９．２．１および１８．３．３を使用して得られた（データは示さず）。図１５は、用量設定試験におけるＰＤＬ１９２処置後の腫瘍増殖の低下を示しており、全ての用量レベルにおいて、０．１ｍｇ／ｋｇという低濃度であっても、顕著な抗腫瘍活性が観察された。
【０１５３】
ＰＤＬ１９２の最小および最適生物活性と血中抗体濃度の相互関係を示すために、別個の用量設定試験をＡ３７５異種移植モデルにおいて行った。重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに、Ａ３７５黒色腫細胞を皮下接種した。腫瘍が約１００ｍｍ３に達したときに、動物に５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、または０．１ｍｇのＰＤＬ１９２または５ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照抗体を３日毎に（ｑ３ｄ）、合計８回用量を腹腔内投与した。試験期間中の様々な時間で動物を採血して、血清中のＰＤＬ１９２濃度を測定した。
【０１５４】
ｑ３ｄ  Ａ３７５用量設定試験において、ＰＤＬ１９２は１ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇの用量レベルで最適な抗腫瘍活性を示し（データは示さず）、ＰＤＬ１９２のトラフ血清濃度は２．４および６２μｇ／ｍｌであり、ピーク血清濃度は５．９および８６μｇ／ｍｌであった。最小〜中程度の抗腫瘍活性は、０．１、０．３、および０．６ｍｇ／ｋｇの用量レベルで観察され（データは示さず）、ＰＤＬ１９２のトラフ血清濃度はそれぞれ０．９７ｎｇ／ｍｌ、４．１ｎｇ／ｍｌ、および２７ｎｇ／ｍｌであり、ピーク血清濃度はそれぞれ０．０８７、１．４、および３μｇ／ｍｌであった。この用量範囲を、抗ＴｗｅａｋＲ抗体についての有力な治療濃度域とみなす。
【０１５５】
重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに、ＣＳＯＣ卵巣癌癌細胞を皮下接種した。腫瘍が約１００ｍｍ３に達したときに、動物に１０ｍｇ／ｋｇのＰＤＬ１９２またはアイソタイプ対照抗体を週に３回、３週間腹腔内投与した。
【０１５６】
ＣＳＯＣ卵巣癌異種移植モデルにおいて、ＰＤＬ１９２によって腫瘍増殖は強力に阻害された。図１６は、ＰＤＬ１９２処置後の腫瘍増殖の低下を示す。
【０１５７】
重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに、Ｐａｎｃ１膵癌細胞を皮下接種した。腫瘍が約１００ｍｍ３に達したときに、動物に１０ｍｇ／ｋｇのＰＤＬ１９２、または１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照抗体、または１０ｍｇ／ｋｇのＰＤＬ１９２および６０ｍｇ／ｋｇのゲムシタビン、または１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照抗体および６０ｍｇ／ｋｇのゲムシタビンを腹腔内投与した。動物は、抗体を週に３回、３週間および／またはゲムシタビンを週に２回、５回用量投与された。
【０１５８】
Ｐａｎｃ１異種移植モデルにおいて、ＰＤＬ１９２によって腫瘍増殖は顕著に阻害された。ＰＤＬ１９２およびゲムシタビンの組合せは１００％の腫瘍退縮をもたらした。図１７は、ＰＤＬ１９２±ゲムシタビン処置後の腫瘍増殖の低下を示す。
【０１５９】
重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに、ＨＴ２９直腸結腸癌細胞を皮下接種した。腫瘍が約１００ｍｍ３に達したときに、動物に１０ｍｇ／ｋｇもしくは０．５ｍｇ／ｋｇのＰＤＬ１９２、１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照抗体、１０ｍｇ／ｋｇのセツキシマブ、２５ｍｇ／ｋｇのイリノテカンおよび１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照抗体、２５ｍｇ／ｋｇのイリノテカンおよび１０ｍｇ／ｋｇのセツキシマブ、２５ｍｇ／ｋｇのイリノテカンおよび０．５ｍｇ／ｋｇのＰＤＬ１９２、０．５ｍｇ／ｋｇのＰＤＬ１９２および１０ｍｇ／ｋｇのセツキシマブ、または０．５ｍｇ／ｋｇのＰＤＬ１９２および１０ｍｇ／ｋｇのセツキシマブおよび２５ｍｇ／ｋｇのイリノテカンを腹腔内投与した。動物は、抗体を週に３回、３週間および／またはイリノテカンを週に２回、３週間投与された。
【０１６０】
ＨＴ２９異種移植モデルにおいて、用量レベル１０ｍｇ／ｋｇのＰＤＬ１９２によって腫瘍増殖は強力に阻害された。図１８Ａは、１０ｍｇ／ｋｇのＰＤＬ１９２による腫瘍増殖の阻害を示す。０．５ｍｇ／ｋｇの低用量で、ＰＤＬ１９２は単独で腫瘍増殖を阻害しないが、イリノテカンの抗腫瘍活性を顕著に増強した。図１８Ｂは、ＰＤＬ１９２±イリノテカン処置後の腫瘍増殖の低下を示す。
【０１６１】
ＨＴ２９直腸結腸癌細胞は、Ｂ−ｒａｆの変異体である。ＨＴ２９異種移植モデルにおいて１０ｍｇ／ｋｇのＰＤＬ１９２の強力な抗腫瘍活性とは対照的に、１０ｍｇ／ｋｇのセツキシマブは腫瘍増殖阻害を示さなかった。しかしながら、１０ｍｇ／ｋｇのセツキシマブを０．５ｍｇ／ｋｇの低用量のＰＤＬ１９２と組み合わせると、統計的に有意な腫瘍増殖阻害をもたらした。図１８Ｃは、ＨＴ２９異種移植モデルにおけるセツキシマブ単独での抗腫瘍活性の欠如、およびセツキシマブ／ＰＤＬ１９２の組合せの腫瘍増殖阻害を示す。
【０１６２】
ＨＴ２９異種移植モデルにおいて、セツキシマブおよびイリノテカンの組合せの処置は顕著な腫瘍増殖阻害をもたらした。０．５ｍｇ／ｋｇの低用量で、ＰＤＬ１９２は単独で腫瘍増殖を阻害しないが、セツキシマブ／イリノテカンの組合せの抗腫瘍活性を増強した。図１８Ｄは、セツキシマブ／イリノテカン±ＰＤＬ１９２処置後の腫瘍増殖の低下を示す。
【０１６３】
重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスの乳房脂肪パッドに、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞系統変異体を同所性に接種した。腫瘍が約１００ｍｍ３に達したときに、動物に１０ｍｇ／ｋｇのＰＤＬ１９２もしくは１９．２．１またはアイソタイプ対照抗体を週に３回、３週間腹腔内投与した。また用量設定試験を使用して、このモデルにおいてＰＤＬ１９２を用いて有効な用量レベルの範囲を決定した。この試験において、動物に１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、または０．３ｍｇ／ｋｇのＰＤＬ１９２または１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照抗体を週に３回、３週間投与した。
【０１６４】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１変異体モデルにおいて、ＰＤＬ１９２は原発性腫瘍増殖を顕著に阻害した。図１９Ａは、ＰＤＬ１９２処置後の原発性腫瘍の大きさの縮小を示す。同様の結果が、１９．２．１を使用して得られた（データは示さず）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１変異体モデルは、担癌マウスの肺において転移性増殖を示す。肺転移の定量化によって、処置されたマウスにおいてＰＤＬ１９２が肺転移の確立および増殖を顕著に抑制することが明らかとなった。図１９Ｂは、肺転移の阻害を示す。転移性増殖は、原発性腫瘍の増殖よりもＰＤＬ１９２に対して感受性が高かった。
【０１６５】
（実施例４）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏＡＤＣＣ活性
抗ＴｗｅａｋＲ抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性は、抗体分子のＦｃ部分によって抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を刺激する抗体の能力に一部起因するようである。ＡＤＣＣがＰＤＬ１９２、１９．２．１、ＰＤＬ４００、１３６．１および１８．３．３を含む抗ＴｗｅａｋＲ抗体の抗腫瘍活性に関与したかどうかを決定するために、抗体を１）健常ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の存在下でＴｗｅａｋＲ形質転換体細胞、２）ＰＢＭＣ存在下で癌細胞系統、３）マウス脾細胞の存在下でＴｗｅａｋＲ形質転換体細胞、または４）マウス脾細胞の存在下で癌細胞系統と共にｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートした。
【０１６６】
ＴｗｅａｋＲ形質転換体細胞系統を５１Ｃｒで標識し、ヒトＰＢＭＣと共に、エフェクター細胞：標的細胞の比５０：１で、ＰＤＬ１９２、１９．２．１、ＰＤＬ４００、および１８．３．３、またはアイソタイプ対照抗体のタイトレーションの存在下でインキュベートした。ヒトＰＢＭＣを有するＴｗｅａｋＲ形質転換体に関して、ＡＤＣＣ活性は４つ全ての抗体で観察された。図２０Ａは、ＰＤＬ１９２を使用した典型的な実験を示す。同様の結果が、他の３つの抗体で得られた（データは示さず）。
【０１６７】
ＳＮ１２Ｃ腎癌細胞系統を５１Ｃｒで標識し、ヒトＰＢＭＣと共に、エフェクター細胞：標的細胞の比５０：１で、ＰＤＬ１９２およびＰＤＬ４００、またはアイソタイプ対照抗体のタイトレーションの存在下でインキュベートした。ヒトＰＢＭＣを有するＳＮ１２Ｃ細胞に対して、ＡＤＣＣ活性は両方の抗体で観察された。図２０Ｂは、ＰＤＬ１９２を使用した典型的な実験を示す。同様の結果が、ＰＤＬ４００で得られた（データは示さず）。
【０１６８】
ＴｗｅａｋＲ形質転換体細胞系統を５１Ｃｒで標識し、マウス脾細胞と共に、エフェクター細胞：標的細胞の比５０：１で、ＰＤＬ１９２、１９．２．１、ＰＤＬ４００、１３６．１および１８．３．３、またはアイソタイプ対照抗体のタイトレーションの存在下でインキュベートした。マウス脾細胞を有するＴｗｅａｋＲ形質転換体に関して、ＡＤＣＣ活性は５つ全ての抗体で観察された。図２０Ｃは、ＰＤＬ１９２を使用した典型的な実験を示す。同様の結果が、他の４つの抗体で得られた（データは示さず）。
【０１６９】
（実施例５）
複数の作用機構によるｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性
１９．２．１のＦｃ領域を、マウスＩｇＧ２ａからマウスＩｇＧ１に変更して、１９．２．１×Ｇ１を作製した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、１９．２．１および１９．２．１×Ｇ１はＴｗｅａｋＲ発現細胞と同様な結合を示し、両抗体は用量依存的にＨＴ２９結腸癌細胞を死滅させた。しかしながら、１９．２．１はＴｗｅａｋＲ形質転換体のＡＤＣＣを強力に誘導した一方、１９．２．１×Ｇ１は弱いＡＤＣＣ活性を示した。
【０１７０】
重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに、ＳＮ１２Ｃ腎癌細胞またはＡ３７５黒色腫細胞を皮下接種した。腫瘍が約１００ｍｍ３に達したときに、動物に１０ｍｇ／ｋｇの１９．２．１および１９．２．１×Ｇ１またはマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体を週に３回、３週間腹腔内投与した。
【０１７１】
ＳＮ１２Ｃ腎癌細胞異種移植モデルにおいて、１９．２．１処置によって腫瘍は完全に退縮した。対照的に、１９．２．１×Ｇ１は極めて弱い抗腫瘍活性を示した（図２１Ａ）。Ａ３７５黒色腫異種移植モデルにおいて、１９．２．１のアイソタイプはともに同程度に強力な抗腫瘍活性を示した（図２１Ｂ）。
【０１７２】
本出願において引用された全ての刊行物、特許、特許出願および他の文書は、各個々の刊行物、特許、特許出願または他の文書が全ての目的のために個々に参照により組み込まれることが示されたのと同程度に、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１７３】
様々な具体的な実施形態を例示および説明してきたが、（１つまたは複数の）本発明の精神および範囲を逸脱することなく、様々な変更を行うことができることが理解されるであろう。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【配列表】
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