(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
感熱性ユニットおよび蛍光性ユニットを含む共重合体を含んでなる温度感受性プローブを細胞内に導入する方法であって、カチオン性ユニットをさらに含む前記共重合体を温度感受性プローブとして用い、かつ、該共重合体を溶媒中で細胞と混合する工程を含んでなり、該共重合体が、式（ＩＶ）：
【化１】
0005514368.tif 000019
［式中、
Ｒ１は、水素原子、メチルおよびエチルから選択され；
Ｒ４は、ｎ−プロピルおよびイソプロピルから選択され、
Ｒ５は水素原子であり、
Ｒ２は、水素原子、メチルおよびエチルから選択され；
Ｗは、芳香環または−Ｘ１−Ｃ（＝Ｏ）−（ここで、Ｑ１に直接結合するのはＸ１である）であり；
Ｘ１は、Ｏ、Ｓ、またはＮ−Ｒ１１であり；
Ｒ１１は、水素原子、Ｃ１−６アルキル、または−Ｑ１−Ｙであり；
Ｑ１は、Ｃ１−２０アルキレンであり、ここで前記アルキレンは、１以上の個所において、Ｏ、Ｓ、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（−ＯＨ）−Ｏ−またはフェニレンが独立に挿入されていてもよく；
Ｙは、独立に、１以上の正電荷を有しうるイオン性官能基であって、−Ｎ＋Ｒ２１Ｒ２２Ｒ２３Ｘｅ−、−Ｃ（＝ＮＲ４１）−ＮＲ４２Ｒ４３、および下式：
【化２】
0005514368.tif 000020
により表される基から選択され；
Ｘｅ−およびＸｆ−はカウンターアニオンであり；
Ｒ２１、Ｒ２２、およびＲ２３は、独立に、Ｃ１−１０アルキルであり、またはＲ２１およびＲ２２は、結合する窒素原子と一緒になって、５〜７員含窒素ヘテロ環を形成してもよく；
Ｒ２４は、Ｃ１−１０アルキルであり；
Ｒ４１、Ｒ４２およびＲ４３は、独立に、水素原子およびＣ１−１０アルキルから選択され、またはＲ４１およびＲ４２は、それぞれが結合する窒素原子および炭素原子と一緒になって、２つの窒素原子を含む５〜７員ヘテロ環を形成してもよく、またはＲ４２およびＲ４３は、結合する窒素原子と一緒になって、５〜７員含窒素ヘテロ環を形成してもよく、
Ｒ３は、水素原子およびＣ１−３アルキルから選択され；
Ｘ２は、Ｏ、またはＮ−Ｒ１２であり；
Ｘ３は、直接結合、Ｏ、Ｎ（−Ｒ１３）、ＣＯＮ（−Ｒ１６）、Ｎ（−Ｒ１６）ＣＯ、またはＮ（−Ｒ１７）ＣＯＮ（−Ｒ１８）であり；
Ｑ２は、Ｃ１−２０アルキレン、Ｃ３−２０アルケニレン、またはＣ３−２０アルキニレンから選択され、ここで前記アルキレンは、１以上の個所において、Ｏ、Ｓまたはフェニレンが独立に挿入されていてもよく；
Ａｒは、下式：
【化３】
0005514368.tif 000021
により表される基から選択される芳香族炭素環基または芳香族ヘテロ環基であり、これらの基は当該環上をハロゲン原子、Ｃ１−６アルコキシ、ニトロ、シアノ、−ＮＲ６Ｒ７、および−ＳＯ２ＮＲ１４Ｒ１５から選択される１以上の置換基により置換されており、さらに、Ｃ１−６アルキルにより置換されていてもよく；
Ｘ１０は、Ｏ、ＳまたはＳｅから選択され；
Ｒ８は、水素原子、Ｃ１−１０アルキル、およびアリールから選択され；
Ｒ６およびＲ７は、独立に、水素原子、Ｃ１−１０アルキル、アリール、Ｃ１−１０アルキルカルボニル、アリールカルボニル、Ｃ１−１０アルキルスルホニル、アリールスルホニル、およびカルバモイルから選択され；または
Ｒ６およびＲ７はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、５〜７員含窒素ヘテロ環を形成し、ここで当該ヘテロ環は、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ニトロ、およびハロゲン原子から選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
Ｒ１２は、水素原子、Ｃ１−６アルキル、または−Ｑ２−Ｘ３−Ａｒであり、ここで当該アルキルは、ヒドロキシおよびハロゲン原子から選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
Ｒ１３は、水素原子、またはＣ１−６アルキルであり、ここで当該アルキルは、ヒドロキシおよびハロゲン原子から選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
Ｒ１４およびＲ１５は、独立に、水素原子、およびＣ１−６アルキルから選択され；またはＲ１４およびＲ１５はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、５〜７員含窒素ヘテロ環を形成し；
Ｒ１６、Ｒ１７およびＲ１８は、独立に、水素原子、およびＣ１−６アルキルから選択され、ここで当該アルキルは、ヒドロキシおよびハロゲン原子から選択される１以上の置換基により置換されていてもよく、
ａ、ｂおよびｃは、式中の各繰り返し単位の比を表す０より大きい数である］
で表され、ａおよびｂの和が１００であり、ｂが２〜１０であり、ｃが０．０５〜２である、方法。
【請求項２】
前記共重合体が、以下の式（ａ）：
【化４】
0005514368.tif 000022
［式中、
Ｒ１は、水素原子、メチルおよびエチルから選択され；
Ｒ４は、ｎ−プロピルおよびイソプロピルから選択され、
Ｒ５は水素原子である］
で表される２種以上の感熱性ユニットを含むものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
式（ＩＶ）：
【化５】
0005514368.tif 000023
［式中、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ２、Ｙ、Ｗ、Ｑ１、Ｒ３、Ｘ２、Ｘ３、Ｑ２およびＡｒは、請求項１で定義したとおりであり、ａ、ｂおよびｃは、式中の各繰り返し単位の比を表す０より大きい数である］
で表される共重合体であって、ａおよびｂの和が１００であり、ｂが２〜１０であり、ｃが０．０５〜２である、共重合体。
【請求項４】
細胞内の温度を測定する方法であって、
（ａ）請求項１または２に記載の方法に従って、温度感受性プローブを細胞内に導入する工程、および
（ｂ）励起光照射下、蛍光強度を測定する工程
を含んでなる、方法。
【請求項５】
（ｃ）異なる２つの蛍光波長領域における蛍光強度の比を算出する工程をさらに含んでなる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
異なる２つの蛍光波長領域が、温度感受性プローブに含まれる蛍光性ユニットを与えるモノマーの常温における水中での蛍光スペクトルを測定した際の最大蛍光強度を示す波長の前後２００ｎｍの範囲から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
細胞内の温度を測定する方法であって、
（ａ）請求項１または２に記載の方法に従って、温度感受性プローブを細胞内に導入する工程、および
（ｂ）励起光照射下、蛍光寿命を測定する工程
を含んでなる、方法。
【請求項８】
請求項１、２および４〜７のいずれか一項に記載の方法を用いて温度を測定するためのキットであって、前記方法に用いられる温度感受性プローブを含んでなる、キット。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の参照】
【０００１】
本特許出願は、先に出願された日本国における特許出願である特願２０１１−２８０２０２号（出願日：２０１１年１２月２１日）に基づく優先権の主張を伴うものである。この先の特許出願における全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、新規な蛍光性ポリマーおよび当該ポリマーを用いた細胞内温度の簡便な測定方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞が栄養源を取り込み、代謝によってエネルギーを取り出す過程で生じる多くの化学反応は、温度に大きく依存している。つまり、細胞の数々の機能や反応は、細胞内外の温度によって制御されている、と言える。例えば、温度という物性を利用した研究は、医療研究に多く見られ、がん細胞での異常な熱発生などが報告されている（非特許文献１：Ｓｃａｎｄ． J．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１９８６年，第３６巻，第３５３〜３５７頁）。代謝活性の高いガン細胞と、そうでない正常細胞の識別に、熱発生を用いることが可能である。これを利用して、熱発生をターゲットにした治療法や創薬等の開発も検討されている。【０００４】
医療研究のみならず、温度制御による細胞の代謝活性制御技術は、発酵などの微生物を利用した食品業界でも重要である。例えば、酒類醸造においては、酵母から発生する熱量とエタノールの産生量に相関があることが研究されている（非特許文献２：Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ． １９８９年，第３４巻，第８６〜１０１頁）。【０００５】
一方で、温度が生物学的な重要な指標になっていることに加え、細胞内の重要な反応の多くは細胞内で行われているにも関わらず、細胞内の温度を測定しようという試みは非常に少ない。それは細胞レベルでの微小領域の温度測定法が確立されていないことが1つの要因であった。しかしながら、近年の研究で、温度の変化に伴って物性が変化する分子の温度センサーとしての使用が検討され始め（非特許文献３：Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．１９９５年，第６２巻，第４１６〜４２５頁；非特許文献４：Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｄ：Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．２００４年，第３７巻，第２９３８〜２９４３頁；非特許文献５：Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００６年，第７８巻，第５０９４〜５１０１頁；非特許文献６：Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．２００５年，第８７巻，第２０１１０２頁；非特許文献７：Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．１９９８年，第７４巻，第８２〜８９頁）、特に最小機能単位を１分子とする高機能な分子温度センサーが開発され、細胞への応用が検討され始めた。【０００６】
分子温度センサーの一例として、感熱性ポリマーであるポリアクリルアミドに環境応答性の蛍光団である２，１，３−ベンゾオキサジアゾリル基を組み込むという原理に基づいた蛍光性温度センサーが既に報告されている（非特許文献８：Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００３年，第７５巻，第５９２６〜５９３５頁）。この蛍光性温度センサーは、主鎖であるポリアクリルアミドの熱による相転移により、水性溶液中で温度上昇に伴って蛍光強度が増加するという特性を有するため、蛍光強度を測定することにより系中の温度の変化を観測することができる。【０００７】
また、ポリマーの製造時に架橋剤を添加して得られる、蛍光団が組み込まれたポリアクリルアミドのマイクロゲルの、蛍光性温度センサーとしての使用についても報告されている（非特許文献９：Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．２００５年，第１５巻，第２７９６〜２８００頁；非特許文献１０：Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００９年，第１３１巻，第２７６６〜２７６７頁）。さらに、イオン性官能基をポリマー内部に入れ込むことによって、凝集を防ぎ、かつ測定温度範囲を広くすることが可能となることが報告されている（特許文献１：国際公開第２００８／０２９７７０号パンフレット）。【０００８】
感熱性応答部位として用いる主鎖のアクリルアミドの側鎖の構造を変えることにより、水溶液中でセンサーが応答する温度領域を自由に変化できることは既に報告されており（非特許文献１１：Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００４年，第７６巻，第１７９３〜１７９８頁）、測定対象の温度領域に応じて、感熱性応答部位に複数のアクリルアミド分子を使用することも可能であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｓｃａｎｄ． J．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１９８６年，第３６巻，第３５３〜３５７頁
【非特許文献２】Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ． １９８９年，第３４巻，第８６〜１０１頁
【非特許文献３】Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．１９９５年，第６２巻，第４１６〜４２５頁
【非特許文献４】Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｄ：Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．２００４年，第３７巻，第２９３８〜２９４３頁
【非特許文献５】Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００６年，第７８巻，第５０９４〜５１０１頁
【非特許文献６】Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．２００５年，第８７巻，第２０１１０２頁
【非特許文献７】Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．１９９８年，第７４巻，第８２〜８９頁
【非特許文献８】Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００３年，第７５巻，第５９２６〜５９３５頁
【非特許文献９】Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．２００５年，第１５巻，第２７９６〜２８００頁
【非特許文献１０】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００９年，第１３１巻，第２７６６〜２７６７頁
【非特許文献１１】Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００４年，第７６巻，第１７９３〜１７９８頁
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２００８／０２９７７０号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
蛍光団が組み込まれた直鎖型または架橋型のポリアクリルアミドを利用する蛍光性温度センサーに関して、既に報告されているポリマーは、細胞内での温度測定を可能にするという利点はあったが、ポリマーの細胞内への導入法には、高い技術を有するマイクロインジェクション法を利用しなければならないという問題を有していた。【００１２】
さらに、細胞内への物質導入法として、マイクロインジェクション法を利用することのできない微生物や植物細胞では、これらポリマーを利用できないという非常に大きな問題を有していた。【００１３】
加えて、細胞内に代表されるような限られた微小空間内の温度を測定する際には、温度に応答するポリマーから発せられる蛍光強度が、ポリマーの置かれている温度に起因するものか、あるいはその微小空間内に存在しているポリマーの濃度に起因するものかわからないという問題を有していた。【００１４】
そして、溶液中ではアクリルアミド分子を変えることによって、温度領域を変化できることはわかっていたが、細胞内ではタンパク質、核酸および脂質など様々な分子とセンサーが相互作用してしまうことも考えられるため、アクリルアミド分子を変える事によって温度領域を自由に変えられるかどうかはわからず、ましてや１つのセンサー内に複数のアクリルアミド分子を用いた場合に、細胞内でセンサーがどのような応答をするのかは全く予想がつかず、実際に細胞内を測定対象とする温度領域のセンサーを自由に作れるかはわからないという問題を有していた。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を進めたところ、ポリマーにカチオン性のユニットを導入することにより、酵母などの微生物、動物細胞、植物細胞などの多くの細胞に適応可能で、かつ、マイクロインジェクションなどの高度な技術を必要としない実用性の高い細胞内蛍光性温度センサーとして利用できることを見出した。さらに、導入したポリマーを用いて得られた複数の波長における蛍光強度の比率から温度を算出することにより、より汎用的かつ正確に細胞内または微小空間内の温度を測定できることを見出した。さらに、蛍光寿命を指標とすることによっても、細胞内または微小空間内の温度を良好に測定できることも確認した。さらに、複数種の感熱性ユニットを１つの分子内に含む共重合体を温度感受性プローブとして用いることにより、細胞内において温度応答領域を細かく設定することが可能であることを見出した。本発明はこれら知見に基づくものである。【００１６】
すなわち、本発明の第一の態様によれば、感熱性ユニットおよび蛍光性ユニットを含む共重合体を含んでなる温度感受性プローブを細胞内に導入する方法が提供され、該方法は、カチオン性ユニットをさらに含む前記共重合体を温度感受性プローブとして用い、かつ、該共重合体を溶媒中で細胞と混合する工程を含む。【００１７】
さらに、本発明によれば、細胞内の温度を測定する方法が提供され、該方法は、（ａ）本発明の第一の態様による方法に従って、温度感受性プローブを細胞内に導入する工程、および（ｂ）励起光照射下、蛍光強度または蛍光寿命を測定する工程を含む。【００１８】
本発明の第二の態様によれば、細胞内の温度を測定する方法が提供され、該方法は、（ａ）感熱性ユニットおよび蛍光性ユニットを含む共重合体を含んでなる温度感受性プローブを細胞内に導入する工程、および（ｂ）励起光照射下、蛍光強度または蛍光寿命を測定する工程を含んでなり、前記共重合体は２種以上の感熱性ユニットを含むものとされる。【００１９】
本発明の第三の態様によれば、感熱性ユニットおよび蛍光性ユニットを含む共重合体を含んでなる温度感受性プローブを用いて温度を測定する方法が提供され、該方法は、（ａ）前記温度感受性プローブを溶解する工程、（ｂ）励起光照射下、蛍光強度を測定する工程、および（ｃ）２つの波長領域における蛍光強度の比を算出する工程を含む。【００２０】
本発明の第四の態様によれば、本発明の第一から第三までの態様による方法を用いて温度を測定するためのキットが提供され、該キットは、前記方法に用いられる温度感受性プローブを含んでなる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明に用いられる共重合体は、カチオン性基を有することにより、特殊な方法を使わずとも細胞内に共重合体が入り込むため、細胞内の温度を測定する蛍光温度センサーとして好適に使用することができる。本発明は、酵母等の微生物、動物細胞、植物細胞など、多種多様な細胞に応用できる。また、共重合体から発せられる蛍光を、ある２領域での蛍光強度の比として算出すること、もしくは蛍光寿命を測定パラメータとすることにより、測定値が温度に特有の値になり、共重合体の濃度に依存しない、より正確な温度測定法を提供することが可能である。さらに、本発明によれば、複数の感熱性ユニットを組み合わせることにより、測定に適した温度領域を自在に設定することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】化合物１〜７と酵母サッカロマイセスセレビシエＳＹＴ００１とを混合し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した（励起波長４７３ｎｍ、蛍光波長５００−６００ｎｍ）ときの写真の一例である。
【図２】化合物２〜６を酵母サッカロマイセスセレビシエＳＹＴ００１と混合し、フローサイトメーターで酵母細胞の蛍光をカウントした（励起光：４８８ｎｍ、蛍光：５１５ｎｍ〜５４５ｎｍ）場合のヒストグラムである。
【図３】化合物１〜７をアガロースゲル電気泳動し、各化合物のイオン強度を定性的に評価した図である。
【図４】化合物２〜６（黒菱形：化合物２、白四角：化合物３、黒丸：化合物４、黒三角：化合物５、白菱形：化合物６）の１５０ｍＭ塩化カリウム水溶液中での蛍光強度の感熱応答性試験結果（０．０１ｗ／ｖ％、励起波長４５６ｎｍ）の一例である。
【図５】０、１５０、２００および２５０ｍＭ塩化カリウム水溶液中における化合物２（いずれも０．０１ｗ／ｖ％、励起波長４５６ｎｍ、蛍光波長５６６ｎｍ）の感熱応答性試験の結果（黒菱形：水中、白丸：１５０ｍＭ  ＫＣｌ中、白三角：２００ｍＭ  ＫＣｌ中、黒四角：２５０ｍＭ  ＫＣｌ中を示す）の一例である。
【図６】ｐＨ４および７の水中における化合物２（いずれも０．０１ｗ／ｖ％、励起波長４５６ｎｍ、蛍光波長５６６ｎｍ）の感熱応答性試験（白丸：ｐＨ４、黒四角：ｐＨ７）の一例である。
【図７】化合物２および３を、水、１Ｍソルビトール、ＰＢＳ、ＹＰＤ（酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコース２％）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ ＫＣｌの６種類の溶液・培地中で酵母サッカロマイセスセレビシエＳＹＴ００１と混合し、フローサイトメーターで酵母細胞の蛍光をカウントした（励起光：４８８ｎｍ、蛍光：５１５ｎｍ〜５４５ｎｍ）場合のヒストグラムである。
【図８】化合物２を、水中で酵母サッカロマイセスセレビシエＳＹＴ００１と混合し、５、１０、２０、３０または６０分間静置した後に、フローサイトメーターで酵母細胞の蛍光をカウントした（励起光：４８８ｎｍ、蛍光：５１５ｎｍ〜５４５ｎｍ）場合のヒストグラムである。
【図９】酵母細胞中における化合物２、３、４および６の蛍光強度の感熱応答性試験の結果の一例である（黒菱形：化合物２、黒四角：化合物３、白三角：化合物４、Ｘ：化合物６）。
【図１０】化合物３を酵母サッカロマイセスセレビシエＳＹＴ００１の細胞内に導入し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した（励起波長４７３ｎｍ、蛍光波長５２０−５６０ｎｍ）ときの写真の一例である。
【図１１】化合物３を酵母サッカロマイセスセレビシエＳＹＴ００１の細胞内に導入し、共焦点レーザー顕微鏡で観察し（励起波長４７３ｎｍ）、蛍光波長５２０−５６０ｎｍの蛍光像（Ｐ１）と蛍光波長５７０−６１０ｎｍの蛍光像（Ｐ２）の比をとることにより得られた蛍光像（Ｐ３）の一例である。
【図１２】蛍光分光光度計を用いて、化合物３を酵母に導入した際の各温度における蛍光スペクトルから蛍光強度比（５２０〜５６０ｎｍ／５７０〜６１０ｎｍ）を算出し、各温度に対する蛍光強度比をプロットして得られた温度応答曲線の一例を示す。
【図１３】蛍光顕微鏡を用いて、化合物３を酵母サッカロマイセスセレビシエＳＹＴ００１の細胞内に導入し、共焦点レーザー顕微鏡で観察し（励起波長４７３ｎｍ）、蛍光波長５２０−５６０ｎｍの蛍光像（Ｐ１）からの蛍光強度と蛍光波長５７０−６１０ｎｍの蛍光像（Ｐ２）からの蛍光強度の比（Ｐ１／Ｐ２）を算出し、各温度に対する蛍光強度比をプロットして得られた温度応答曲線の一例を示す。
【図１４】０．００５％、０．０２５％、０．０５％または０．２５％の濃度の化合物２〜７を、酵母サッカロマイセス属ＳＹＴ００１株と混合・懸濁し、ポリマーを細胞に導入し、ポリマーが導入された酵母を２回水で洗浄し、再度水で懸濁した後、ＹＰＤプレートに１０４、１０３、１０２または１０細胞となるようにスポットして、２日間２５℃で培養した後に撮影したプレートの写真である。
【図１５】ヒト由来胎児腎細胞ＨＥＫ２９３Ｔを、終濃度０．０５％の化合物１、４または７と混合し、共焦点レーザー顕微鏡で観察して得られた蛍光像（励起波長４７３ｎｍ、蛍光波長５００−６００ｎｍ）を示す。
【図１６】マウス由来マクロファージ様前駆細胞ＲＡＷ２６４を、終濃度０．０５％の化合物１、４または７と混合し、共焦点レーザー顕微鏡で観察して得られた蛍光像（励起波長４７３ｎｍ、蛍光波長５００−６００ｎｍ）を示す。
【図１７】化合物４と大腸菌ＤＨ５αとを混合し、２５℃または４１℃の温度条件下において共焦点レーザー顕微鏡で観察した（励起波長４７３ｎｍ、蛍光波長５００−６００ｎｍ）ときの写真の一例である。
【図１８】化合物８と酵母サッカロマイセスセレビシエＳＹＴ００１とを混合し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した（励起波長４７３ｎｍ、蛍光波長５００−６００ｎｍ）ときの写真の一例である。
【図１９】化合物８（黒菱形）の１５０ｍＭ塩化カリウム水溶液中での蛍光強度の感熱応答性試験結果（０．０１ｗ／ｖ％、励起波長４５６ｎｍ）の一例である。
【図２０】酵母細胞中における化合物８の蛍光強度の感熱応答性試験の結果の一例である（黒菱形）。
【図２１】化合物９または１０と酵母サッカロマイセスセレビシエＳＹＴ００１とを混合し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した（励起波長４７３ｎｍ、蛍光波長５００−６００ｎｍ）ときの写真の一例である。
【図２２】化合物２、９および１０（白丸：化合物２、黒丸：化合物９、白三角：化合物１０）の１５０ｍＭ塩化カリウム水溶液中での蛍光強度の感熱応答性試験結果（０．０１ｗ／ｖ％、励起波長４５６ｎｍ）の一例である。
【図２３】酵母細胞中における化合物２、９および１０の蛍光強度の感熱応答性試験の結果の一例である（白丸：化合物２、黒丸：化合物９、白三角：化合物１０）。
【図２４】酵母細胞中における化合物２、９および１０の蛍光寿命の感熱応答性試験の結果の一例である（白丸：化合物２、黒丸：化合物９、白三角：化合物１０）。
【図２５】化合物２と浮遊細胞であるＭＯＬＴ−４細胞とを混合し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した（励起波長４７３ｎｍ、蛍光波長５００−６００ｎｍ）ときの写真の一例である。
【図２６】培養細胞（浮遊細胞であるＭＯＬＴ４）中における化合物２、９および１０の蛍光強度の感熱応答性試験の結果の一例である（白丸：化合物２、黒丸：化合物９、白三角：化合物１０）。
【図２７】培養細胞（浮遊細胞であるＭＯＬＴ４）中における化合物２、９および１０の蛍光寿命の感熱応答性試験の結果の一例である（白丸：化合物２、黒丸：化合物９、白三角：化合物１０）。
【図２８】化合物２、９または１０とＨＥＫ２９３Ｔ細胞とを混合し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した（励起波長４７３ｎｍ、蛍光波長５００−６００ｎｍ）ときの写真の一例である。
【図２９】化合物９をＨＥＫ２９３Ｔ細胞内に導入し、共焦点レーザー顕微鏡で観察し（励起波長４７３ｎｍ）、蛍光波長５００−５５０ｎｍの蛍光像（ＣＨ１）と蛍光波長６００−６５０ｎｍの蛍光像（ＣＨ２）の比をとることにより得られた蛍光像（Ｒａｔｉｏ：ＣＨ１／ＣＨ２）の一例である。
【発明の具体的説明】
【００２３】
本発明の第一の態様において温度感受性プローブとして用いられる共重合体は、感熱性ユニットおよび蛍光性ユニットに加えて、カチオン性ユニットを含む。これにより、該共重合体を溶媒中で細胞と混合することにより、該共重合体を細胞内に導入することが可能となる。このような共重合体は、マイクロインジェクション法等の方法によって細胞内に導入することも可能であるが、そのような高度な技術を利用するまでもなく、細胞と共に混合するだけで細胞内に導入される。また、マイクロインジェクション法を利用することのできない微生物や植物細胞などの多種多様な細胞に簡便に導入できる点も、上記の共重合体の利点である。
【００２４】
本発明に用いられる共重合体に組み込まれるカチオン性ユニットは、１以上の正電荷を有するイオン性官能基を含むモノマーに由来する繰り返し構造であればよく、特に限定されない。このようなモノマーとしては、好ましくは以下の式（ｂ）で表されるモノマーが用いられる：
【化１】
0005514368.tif 000002
［式中、Ｒ２は、水素原子およびＣ１−３アルキルから選択され；
Ｗは、芳香環または−Ｘ１−Ｃ（＝Ｏ）−（ここで、Ｑ１に直接結合するのはＸ１である）であり；
Ｘ１は、Ｏ、Ｓ、またはＮ−Ｒ１１であり；
Ｒ１１は、水素原子、Ｃ１−６アルキル、または−Ｑ１−Ｙであり、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、およびＣ１−６アルキルスルホニルから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
Ｑ１は、独立に、Ｃ１−２０アルキレン、Ｃ３−２０アルケニレン、またはＣ３−２０アルキニレンから選択され、ここで前記アルキレンは、１以上の個所において、Ｏ、Ｓ、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（−ＯＨ）−Ｏ−またはフェニレンが独立に挿入されていてもよく；
Ｙは、独立に、１以上の正電荷を有しうるイオン性官能基であって、−Ｎ＋Ｒ２１Ｒ２２Ｒ２３Ｘｅ−、−Ｃ（＝ＮＲ４１）−ＮＲ４２Ｒ４３、および下式：
【化２】
0005514368.tif 000003
により表される基から選択され；
Ｘｅ−およびＸｆ−はカウンターアニオンであり；
Ｒ２１、Ｒ２２、およびＲ２３は、独立に、Ｃ１−１０アルキル、およびＣ７−１４アラルキルから選択され、またはＲ２１およびＲ２２は、結合する窒素原子と一緒になって、５〜７員含窒素ヘテロ環を形成してもよく；
Ｒ２４は、Ｃ１−１０アルキル、またはＣ７−１４アラルキルであり；
Ｒ４１、Ｒ４２およびＲ４３は、独立に、水素原子およびＣ１−１０アルキルから選択され、またはＲ４１およびＲ４２は、それぞれが結合する窒素原子および炭素原子と一緒になって、２つの窒素原子を含む５〜７員ヘテロ環を形成してもよく、またはＲ４２およびＲ４３は、結合する窒素原子と一緒になって、５〜７員含窒素ヘテロ環を形成してもよい］。
【００２５】
本発明に用いられる共重合体に含まれる感熱性ユニットは、温度に応じてその形状が変化する繰り返し構造であればよく、特に限定されないが、好ましくはアクリルアミドを基本骨格として有するモノマーに由来する繰り返し構造とされる。このようなアクリルアミドを基本骨格として有するモノマーとしては、例えば、以下の式（ａ）で表されるモノマーが挙げられる：
【化３】
0005514368.tif 000004
［式中、Ｒ１は、水素原子およびＣ１−３アルキルから選択され；
Ｒ４およびＲ５は、独立に、水素原子およびＣ１−２０アルキルから選択され、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、およびアリールから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく、またはＲ４およびＲ５はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、４〜８員含窒素ヘテロ環を形成し、ここで当該ヘテロ環は、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ニトロ、ハロゲン原子、Ｃ１−１０アルキルカルボニルアミノおよびアリールカルボニルアミノから選択される１以上の置換基により置換されていてもよい］。
【００２６】
本発明に用いられる共重合体に含まれる蛍光性ユニットは、感熱性ユニットの形状の変化に応じて蛍光強度が変化する繰り返し構造であればよく、特に限定されない。このような繰り返し構造としては、例えば、以下の式（ｃ）で表されるモノマーに由来するものが挙げられる：
【化４】
0005514368.tif 000005
［式中、Ｒ３は、水素原子およびＣ１−３アルキルから選択され；
Ｘ２は、Ｏ、Ｓ、またはＮ−Ｒ１２であり；
Ｘ３は、直接結合、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、Ｎ（−Ｒ１３）、ＣＯＮ（−Ｒ１６）、Ｎ（−Ｒ１６）ＣＯ、Ｎ（−Ｒ１７）ＣＯＮ（−Ｒ１８）、ＳＯ２Ｎ（−Ｒ１９）またはＮ（−Ｒ１９）ＳＯ２であり；
Ｑ２は、Ｃ１−２０アルキレン、Ｃ３−２０アルケニレン、またはＣ３−２０アルキニレンから選択され、ここで前記アルキレンは、１以上の個所において、Ｏ、Ｓまたはフェニレンが独立に挿入されていてもよく；
Ａｒは、６〜１８員芳香族炭素環基、または５〜１８員芳香族ヘテロ環基から選択され、ここで当該芳香族炭素環基および芳香族ヘテロ環基は、含まれる環の１以上が芳香族環である縮合環を含んでいてもよく、当該芳香族炭素環基および芳香族ヘテロ環基に環原子として存在する−ＣＨ２−は−Ｃ（Ｏ）−に置換されていてもよく、さらに当該芳香族炭素環基および芳香族ヘテロ環基は、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、ニトロ、シアノ、Ｃ１−６アルキルカルボニル、Ｃ１−６アルコキシカルボニル、カルボキシ、ホルミル、−ＮＲ６Ｒ７、および−ＳＯ２ＮＲ１４Ｒ１５から選択される１以上の置換基により置換されていてもよく（ここで前記Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、Ｃ１−６アルキルカルボニルおよびＣ１−６アルコキシカルボニルに含まれるアルキルは、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ１−６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、アリール、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよい）；
Ｒ６およびＲ７は、独立に、水素原子、Ｃ１−１０アルキル、アリール、Ｃ１−１０アルキルカルボニル、アリールカルボニル、Ｃ１−１０アルキルスルホニル、アリールスルホニル、カルバモイル、Ｎ−（Ｃ１−１０アルキル）カルバモイル、およびＮ，Ｎ−ジ（Ｃ１−１０アルキル）カルバモイルから選択され、ここで前記Ｃ１−１０アルキル、Ｃ１−１０アルキルカルボニル、Ｃ１−１０アルキルスルホニル、Ｎ−（Ｃ１−１０アルキル）カルバモイル、およびＮ，Ｎ−ジ（Ｃ１−１０アルキル）カルバモイルに含まれるアルキルは、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ１−６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、アリール、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく、さらに前記アリール、アリールカルボニル、およびアリールスルホニルに含まれるアリールは、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；または
Ｒ６およびＲ７はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、４〜８員含窒素ヘテロ環を形成し、ここで当該ヘテロ環は、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ニトロ、ハロゲン原子、Ｃ１−１０アルキルカルボニルアミノおよびアリールカルボニルアミノから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
Ｒ１２は、水素原子、Ｃ１−６アルキル、または−Ｑ２−Ｘ３−Ａｒであり、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、およびＣ１−６アルキルスルホニルから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
Ｒ１３は、水素原子、またはＣ１−６アルキルであり、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、およびＣ１−６アルキルスルホニルから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
Ｒ１４およびＲ１５は、独立に、水素原子、およびＣ１−６アルキルから選択され；またはＲ１４およびＲ１５はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、４〜８員含窒素ヘテロ環を形成し；
Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８およびＲ１９は、独立に、水素原子、およびＣ１−６アルキルから選択され、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、およびＣ１−６アルキルスルホニルから選択される１以上の置換基により置換されていてもよい］。
【００２７】
本発明の好ましい実施態様によれば、本発明に用いられる共重合体は、式（ａ）で表されるモノマー、式（ｂ）で表されるモノマー、および式（ｃ）で表されるモノマーのそれぞれに由来する繰り返し構造を含む共重合体とされる。
【００２８】
本発明のさらに好ましい実施態様によれば、本発明に用いられる共重合体は、式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）：
【化５】
0005514368.tif 000006
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｙ、Ｗ、Ｘ２、Ｘ３、Ｑ１、Ｑ２およびＡｒは、既に定義したとおりである］
で表される繰り返し単位を含む共重合体とされる。
【００２９】
本発明のさらに好ましい実施態様によれば、本発明に用いられる共重合体は、式（ＩＶ）：
【化６】
0005514368.tif 000007
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｙ、Ｗ、Ｘ２、Ｘ３、Ｑ１、Ｑ２およびＡｒは、既に定義したとおりであり、ａ、ｂおよびｃは、式中の各繰り返し単位の比を表す０より大きい数である］
で表される共重合体とされる。この共重合体では、ａおよびｂの和は１００であり、ｂは、好ましくは２〜１０とされ、ｃは、好ましくは０．０５〜２とされる。また、この共重合体は、物質そのものとして本発明の一つの態様をなす。
【００３０】
本発明の好ましい実施態様によれば、前記共重合体は２種以上の感熱性ユニットを含むものとされる。感熱性ユニットには様々な種類のものがあり、その種類に応じて、最も高い温度反応性を示す温度域が異なる。この実施態様では、２種以上の感熱性ユニットを組み合わせることにより、所望の温度域において共重合体の温度反応性が高くなるように調整することができる。本発明のより好ましい実施態様によれば、前記共重合体は、前記式（ａ）で表される２種以上の感熱性ユニットを含むものとされる。また、一つの実施態様では、２種類の感熱性ユニットが用いられる。例えば、動物細胞の一般的な培養温度である３５℃付近の測定では、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド（ＮＮＰＡＭ）とＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）との組み合わせを用いることが好ましい。また、酵母等の微生物の発酵をモニターする等の目的で２５℃以下の温度領域の測定が必要になる場合には、Ｎ―ｔｅｒｔ-ブチルアクリルアミド（ＮＴＢＡＭ）とＮＮＰＡＭとの組み合わせを用いることが好ましい。
【００３１】
式（ＩＶ）におけるaは、感熱性ユニット全体の総和を表すものであり、２種以上の感熱性ユニットを用いた場合には、全ての感熱性ユニットの繰り返し単位数の比率の和を意味する。
【００３２】
本発明の好ましい実施態様によれば、上述の共重合体において、Ａｒは、下式：
【化７】
0005514368.tif 000008
により表される基から選択される芳香族炭素環基または芳香族ヘテロ環基であり、これらの基は当該環上をハロゲン原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、ニトロ、シアノ、Ｃ１−６アルキルカルボニル、Ｃ１−６アルコキシカルボニル、カルボキシ、ホルミル、−ＮＲ６Ｒ７、および−ＳＯ２ＮＲ１４Ｒ１５から選択される１以上の置換基により置換されていてもよく（ここで前記Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、Ｃ１−６アルキルカルボニルおよびＣ１−６アルコキシカルボニルに含まれるアルキルは、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ１−６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、アリール、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよい）；
Ｘ１０は、Ｏ、ＳまたはＳｅから選択され；
Ｒ８は、水素原子、Ｃ１−１０アルキル、およびアリールから選択され、当該アルキルは、
ハロゲン原子、Ｃ１−６アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ１−６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、アリール、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく、さらに前記アリールは、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよい。
【００３３】
本発明のさらに好ましい実施態様によれば、Ａｒは、下式：
【化８】
0005514368.tif 000009
により表される基から選択される芳香族炭素環基または芳香族ヘテロ環基であり、これらの基は当該環上をハロゲン原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、ニトロ、Ｃ１−６アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、シアノ、ホルミル、Ｃ１−６アルキルカルボニル、Ｃ１−６アルコキシカルボニル、カルボキシおよび−ＳＯ２ＮＲ１４Ｒ１５から選択される１以上の置換基により置換されていてもよい。
【００３４】
本明細書において「Ｃ１−３アルキル」とは、炭素数１〜３の直鎖状、分岐鎖状、または環状のアルキル基を意味し、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、シクロプロピルが含まれる。
【００３５】
本明細書において「Ｃ１−６アルキル」とは、炭素数１〜６の直鎖状、分岐鎖状、環状または部分的に環状のアルキル基を意味し、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、３−メチルブチル、２−メチルブチル、１−メチルブチル、１−エチルプロピル、ｎ−ヘキシル、４−メチルペンチル、３−メチルペンチル、２−メチルペンチル、１−メチルペンチル、３−エチルブチル、および２−エチルブチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、およびシクロプロピルメチルなどが含まれ、例えば、Ｃ１−４アルキルおよびＣ１−３アルキルなども含まれる。
【００３６】
本明細書において「Ｃ１−１０アルキル」とは、炭素数１〜１０の直鎖状、分岐鎖状、環状または部分的に環状のアルキル基を意味し、例えば、既に定義したＣ１−６アルキルおよびＣ１−３アルキルなどが含まれる。
【００３７】
本明細書において「Ｃ１−２０アルキル」とは、炭素数１〜２０の直鎖状、分岐鎖状、環状または部分的に環状のアルキル基を意味し、例えば、既に定義したＣ１−１０アルキル、Ｃ１−６アルキルおよびＣ１−３アルキルなどが含まれる。
【００３８】
本明細書において「Ｃ１−６アルコキシ」とは、アルキル部分として既に定義した炭素数１〜６のアルキル基を有するアルキルオキシ基を意味し、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｉ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｓ−ブトキシ、ｉ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ、ｎ−ペントキシ、３−メチルブトキシ、２−メチルブトキシ、１−メチルブトキシ、１−エチルプロポキシ、ｎ−ヘキシルオキシ、４−メチルペントキシ、３−メチルペントキシ、２−メチルペントキシ、１−メチルペントキシ、３−エチルブトキシ、シクロペンチルオキシ、シクロヘキシルオキシ、シクロプロピルメチルオキシなどが含まれ、例えば、Ｃ１−４アルコキシおよびＣ１−３アルコキシなども含まれる。
【００３９】
本明細書において「アリール」とは、６〜１０員芳香族炭素環基を意味し、例えば、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチルなどが含まれる。
【００４０】
本明細書において「Ｃ７−１４アラルキル」とはアリール基を含む炭素数が７〜１４のアリールアルキル基を意味し、例えば、ベンジル、１−フェネチル、２−フェネチル、１−ナフチルメチル、２−ナフチルメチルなどが含まれる。
【００４１】
本明細書においてハロゲン原子としては、例えばフッ素原子、塩素原子、臭素原子およびヨウ素原子などが挙げられる。
【００４２】
本明細書において「Ｃ１−２０アルキレン」とは、炭素数１〜２０の直鎖状、分岐鎖状、環状または部分的に環状のアルキレン基を意味し、例えば、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレンなど、さらにＣ１−１０アルキレンおよびＣ１−６アルキレンなどが含まれる。
【００４３】
本明細書において「Ｃ３−２０アルケニレン」とは、炭素数３〜２０の直鎖状、分岐鎖状、環状または部分的に環状のアルケニレン基を意味し、例えば、プロペニレン、ブテニレンなど、さらにＣ３−１０アルケニレンおよびＣ３−６アルケニレンなどが含まれる。
【００４４】
本明細書において「Ｃ３−２０アルキニレン」とは、炭素数３〜２０の直鎖状、分岐鎖状、環状または部分的に環状のアルキニレン基を意味し、例えば、プロピニレン、ブチニレンなど、さらにＣ３−１０アルキニレンおよびＣ３−６アルキニレンなどが含まれる。
【００４５】
本明細書において「Ｃ１−６アルキルチオ」とは、アルキル部分として既に定義した炭素数１〜６のアルキル基を有するアルキルチオ基を意味し、例えば、メチルチオ、エチルチオ、ｎ−プロピルチオ、ｉ−プロピルチオ、ｎ−ブチルチオ、ｓ−ブチルチオ、ｉ−ブチルチオ、ｔ−ブチルチオなどが含まれる。
【００４６】
本明細書において「Ｃ１−６アルキルスルフィニル」とは、アルキル部分として既に定義した炭素数１〜６のアルキル基を有するアルキルスルフィニル基を意味し、例えば、メチルスルフィニル、エチルスルフィニル、ｎ−プロピルスルフィニル、ｉ−プロピルスルフィニル、ｎ−ブチルスルフィニル、ｓ−ブチルスルフィニル、ｉ−ブチルスルフィニル、ｔ−ブチルスルフィニルなどが含まれる。
【００４７】
本明細書において「Ｃ１−６アルキルスルホニル」とは、アルキル部分として既に定義した炭素数１〜６のアルキル基を有するアルキルスルホニル基を意味し、例えば、メチルスルホニル、エチルスルホニル、ｎ−プロピルスルホニル、ｉ−プロピルスルホニル、ｎ−ブチルスルホニル、ｓ−ブチルスルホニル、ｉ−ブチルスルホニル、ｔ−ブチルスルホニルなどが含まれる。
【００４８】
本明細書において「６〜１８員芳香族炭素環基」とは、例えば、フェニル、ナフチル、アントラセニル、ピレニル、インダニル、テトラリニルなどが含まれる。
【００４９】
本明細書において「５〜１８員芳香族ヘテロ環基」とは、酸素、窒素および硫黄から選択される１以上のヘテロ原子を有する芳香族ヘテロ環であり、例えば、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、ピリジル、インドリル、キノリル、キノキサリニル、キナゾリニル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、ベンゾピラニル、ベンゾクロメニルなどが含まれる。
【００５０】
本明細書において「Ｃ２−６アルケニルスルホニル」とは、アルケニル部分として既に定義したＣ２−６アルケニル基を有するアルケニルスルホニル基を意味し、例えばビニルスルホニル、アリルスルホニルなどが含まれる。
【００５１】
本明細書において「Ｃ２−６アルケニルカルボニル」とは、アルケニル部分として既に定義したＣ２−６アルケニル基を有するアルケニルカルボニル基を意味し、例えばアクリロイル、メタクリロイルなどが含まれる。
【００５２】
本明細書において「Ｃ２−６アルキニルカルボニル」とは、アルキニル部分として既に定義したＣ２−６アルキニル基を有するアルキニルカルボニル基を意味し、例えばエチニルカルボニルなどが含まれる。
【００５３】
本明細書において「Ｃ１−６アルキルカルボニル」とは、基−ＣＯ（Ｃ１−６アルキル）を表し、ここで当該Ｃ１−６アルキルは既に定義したとおりである。
【００５４】
本明細書において「Ｃ１−６アルコキシカルボニル」とは、基−ＣＯ（Ｃ１−６アルコキシ）を表し、ここで当該Ｃ１−６アルコキシは既に定義したとおりである。
【００５５】
本明細書において「Ｃ１−６アルキルカルボニルアミノ」とは、基−ＮＨＣＯ（Ｃ１−６アルキル）を表し、ここで当該Ｃ１−６アルキルは既に定義したとおりである。
【００５６】
本明細書において「Ｃ１−６アリールカルボニルアミノ」とは、基−ＮＨＣＯ（アリール）を表し、ここで当該アリールは既に定義したとおりである。
【００５７】
本明細書における「５〜７員含窒素ヘテロ環」には、例えば、ピロール環、ピロリジン環、ピペリジン環、ホモピペリジン環、ピペラジン環、ホモピペラジン環、モルホリン環、チオモルホリン環など飽和ヘテロ環が含まれる。
【００５８】
本明細書における「４〜８員含窒素ヘテロ環」には、例えば、ピロール環、アゼチジン環、ピロリジン環、ピペリジン環、ホモピペリジン環、ピペラジン環、ホモピペラジン環、モルホリン環、チオモルホリン環など、および５〜７員含窒素ヘテロ環が含まれる。
【００５９】
本明細書における「２つの窒素原子を含む５〜７員ヘテロ環」には、例えば、イミダゾリジン、テトラヒドロピリミジンなどが含まれる。
【００６０】
本明細書において、アルキレンが１以上の個所においてＯが挿入されている場合、当該アルキレン鎖は主鎖中にエーテル結合を含むことになり、当該挿入は安定な構造となるために、−Ｏ−Ｏ−および−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−の構造とならないように行われることは当業者であれば容易に理解するはずである。以上のことはアルキレンへのＳの挿入においても当てはまる。
【００６１】
本明細書において「カウンターアニオン」とは、有機化学の技術分野で有機化合物のカウンターアニオンとして通常用いられるアニオンであれば特に制限されず、例えば、ハロゲン化物アニオン（塩化物イオン、臭化物イオン、フッ化物イオン、ヨウ化物イオン）、有機酸の共役塩基（例えば酢酸イオン、トリフルオロ酢酸イオン）、硝酸イオン、硫酸イオン、炭酸イオンなどが含まれる。本発明のおいて好ましいカウンターアニオンとしては、例えば、塩化物イオン、硝酸イオンなどが挙げられる。
【００６２】
なお、カウンターアニオンが２価以上である場合、それに対応する個数のイオン性官能基とイオン結合を形成することは当業者により容易に理解されるとおりである。
【００６３】
本発明において、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、好ましくは、水素原子およびメチルから選択される。
【００６４】
式（ａ）、式（Ｉ）および（ＩＶ）における−ＮＲ４Ｒ５は、特には限定されないが、例えば、Ｒ４が水素原子であり、Ｒ５はＣ２−１０アルキルであってもよい。また、Ｒ４およびＲ５はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、４〜８員含窒素ヘテロ環を形成する場合、例えば、ピロリジン環、ピペリジン環、ホモピペリジン環、ピペラジン環、ホモピペラジン環、モルホリン環、チオモルホリン環などを形成してもよい。
【００６５】
式（ｂ）、式（ＩＩ）および（ＩＶ）におけるＷは、芳香環および−Ｘ１−Ｃ（＝Ｏ）−（ここで、Ｑ１に直接結合するのはＸ１である）のいずれであってもよい。Ｗにより表される芳香環は、好ましくはＣ６−１８芳香環、より好ましくはベンゼン環とされる。Ｗは、好ましくは−Ｘ１−Ｃ（＝Ｏ）−（ここで、Ｑ１に直接結合するのはＸ１である）とされる。Ｘ1は、好ましくはＯ、ＮＨまたはＮ（Ｃ１−６アルキル）とされる。
【００６６】
式（ｂ）、式（ＩＩ）および（ＩＶ）における−Ｑ1−は、好ましくはＣ２−１０アルキレンとされる。
【００６７】
式（ｃ）、式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）における−Ｘ２−Ｑ２−は、好ましくは、Ｘ２は、Ｏ、ＮＨまたはＮ（Ｃ１−６アルキル）であり、Ｑ２はＣ２−１０アルキレンである。
【００６８】
式（ｃ）、式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）における−Ａｒは、好ましくは、下式（Ｖ）〜（ＸＩＩ）：
【化９】
0005514368.tif 000010
［式中、Ｒ３１は水素原子、ハロゲン原子、ニトロ、シアノ、および−ＳＯ２ＮＲ１４Ｒ１５から選択され；Ｒ３２はＣ１−６アルキルであり；Ｘ１１は、Ｎ−Ｒ３３、ＯまたはＳであり；Ｒ３３は水素原子またはＣ１−６アルキルであり；Ｘ１０、Ｒ１４およびＲ１５は、既に定義したとおりである］
から選択される基である。
【００６９】
式（Ｖ）について好ましいＸ３としては、例えば、直接結合、ＣＯＮ（−Ｒ１６）、Ｎ（−Ｒ１６）ＣＯ、ＳＯ２Ｎ（−Ｒ１９）またはＮ（−Ｒ１９）ＳＯ２が挙げられる。
【００７０】
式（ＶＩ）について好ましいＸ３としては、例えば、Ｎ−Ｒ１３（ここで、好ましいＲ１３としてはメチルなどのＣ１−３アルキルが挙げられる）、またはＳが挙げられる。
【００７１】
式（ＶＩＩ）について好ましいＸ３としては、例えば、直接結合、ＣＯＮ（−Ｒ１６）、Ｎ（−Ｒ１６）ＣＯ、ＳＯ２Ｎ（−Ｒ１９）またはＮ（−Ｒ１９）ＳＯ２が挙げられる。
【００７２】
式（ＶＩＩＩ）について好ましいＸ３としては、例えば、直接結合、ＣＯＮ（−Ｒ１６）、Ｎ（−Ｒ１６）ＣＯ、ＳＯ２Ｎ（−Ｒ１９）またはＮ（−Ｒ１９）ＳＯ２が挙げられる。
【００７３】
式（ＩＸ）について好ましいＸ３としては、例えば、直接結合が挙げられる。
【００７４】
式（Ｘ）について好ましいＸ３としては、例えば、直接結合が挙げられる。
【００７５】
式（ＸＩ）について好ましいＸ３としては、例えば、ＣＯ、ＳＯ２、ＳＯ２Ｎ（−Ｒ１９）またはＣＯＮ（−Ｒ１６）（ここで前記ＳＯ２Ｎ（−Ｒ１９）およびＣＯＮ（−Ｒ１６）は、それぞれ硫黄原子および炭素原子がＡｒに結合する）が挙げられる。
【００７６】
式（ＸＩＩ）について好ましいＸ３としては、例えば、ＣＯ、ＳＯ２、ＳＯ２Ｎ（−Ｒ１９）またはＣＯＮ（−Ｒ１６）（ここで前記ＳＯ２Ｎ（−Ｒ１９）およびＣＯＮ（−Ｒ１６）は、それぞれ硫黄原子および炭素原子がＡｒに結合する）が挙げられる。
【００７７】
本発明において、基−Ｘ３−Ａｒは環境応答性の蛍光団として機能し、例えば、式（Ｖ）または（ＶＩＩ）の蛍光団を使用した場合は温度の上昇に伴い蛍光強度が低下する温度センサーが、式（ＶＩ）または（ＶＩＩＩ）〜（ＸＩＩ）の蛍光団を使用した場合は、温度の上昇に伴い蛍光強度も上昇する温度センサーが得られる。
【００７８】
使用する式（ｂ）のモノマーの量は、例えば、式（ａ）、（ｂ）のモノマーの使用総量に対して、１〜１５モル％の量を使用することができる。
【００７９】
本発明に係る共重合体は、高分子合成の技術分野における通常の知識に基づいて合成することができ、例えば、ラジカル重合によるランダム共重合体として得ることができる。その場合に使用することができるラジカル開始剤としては、特に限定はされないが、過硫酸アンモニウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸カリウムなどの過硫酸塩；２，２'−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩、２，２'−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］二塩酸塩、４，４'−アゾビス（４−シアノ吉草酸）などのアゾ化合物が挙げられる。
【００８０】
反応開始剤の使用量は、使用するモノマーに対して０．０１モル％以上の量であればよく、ラジカル合成が進行する濃度であれば、適量を選択することができる。例えば、０．１モル％以上、好ましくは１モル％以上の反応開始剤を使用することができる。
【００８１】
重合に使用する反応溶媒は、特に限定されないが、例として、アセトニトリル、ジオキサン、ジメチルホルムアミド、メタノールなどが挙げられる。ラジカル重合は、特に限定はされないが、例えば０〜１００℃、好ましくは５０〜７０℃の反応温度、および例えば１〜４８時間、好ましくは２〜１６時間の反応時間で行うことができる。
【００８２】
本発明の共重合体を含む溶液中のｐＨや塩濃度に影響を受けずに温度測定を行うために、当該共重合体に含まれるカチオン性官能基は、広範囲のｐＨにおいてイオン性を維持するという方が望ましい。しかしながら、細胞内温度を測定するという用途に限って言えば、細胞内のｐＨは２〜９、さらに通常の状態、一般的な動物、植物、微生物細胞であればｐＨ４〜８程度である。このｐＨでカチオン性が保たれている官能基であればよい。このような観点から、Ｙは−Ｎ＋Ｒ２１Ｒ２２Ｒ２３Ｘｅ−が好ましい。
【００８３】
本発明の別の態様において、前記式（ａ）、（ｂ）および（ｃ）で表されるモノマーのそれぞれに由来する繰り返し構造を含む共重合体が提供される。ここで、当該共重合体を得るために使用される式（ｂ）で表されるモノマーの量は、前記式（ａ）および（ｂ）で表されるモノマーの合計使用量に対して、例えば、１〜１５モル％であり、好ましくは２〜７．５モル％であり、より好ましくは２．５〜５モル％である。また、使用される式（ｃ）で表されるモノマーの量は、前記式（ａ）および（ｂ）で表されるモノマーの合計使用量に対して、例えば、０．０１〜２０モル％であり、具体的には０．０１〜１０モル％であり、好ましくは０．０５〜２モル％であり、より好ましくは０．５〜１．５モル％である。
【００８４】
また、式（ＩＶ）中のａ，ｂおよびｃは式中の各繰り返し単位の比を表す０より大きい数であり、特に限定されないが、例えば、ａ＋ｂ＝１００、ｃはａとｂの総量（つまり１００）に対する割合であって、ｃは０．０１〜２０であり、具体的には０．０１〜１０であり、好ましくは０．０５〜２であり、より好ましくは０．５〜１．５である。また、ａ＋ｂ＝１００とした場合のｂは、例えば１以上、好ましくは２以上、より好ましくは２．５以上、より好ましくは３以上とされ、例えば１５以下、好ましくは１０以下、より好ましくは７．５以下、より好ましくは６以下、より好ましくは５以下とされる。さらに、ａ＋ｂ＝１００とした場合のｂは、例えば１〜１５であり、好ましくは２〜１０であり、より好ましくは２〜７．５であり、より好ましくは２．５〜６であり、より好ましくは３〜６、より好ましくは３〜５とされる。上述のように、aは感熱性ユニットの総和であり、例えば、２種類の感熱性ユニットを使う場合の感熱性ユニットの比は、ある数ｐを用いて、ｐ：a−ｐとなる。例えば、ａ＋ｂ＝１００とした場合のｂが２．５となるように共重合体を作製し、かつ、２種類の感熱性ユニット（例えば、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミドとＮ−イソプロピルアクリルアミド）を組み合わせて用いる場合には、aは９７．５であり、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミドとＮ−イソプロピルアクリルアミドの比はp：９７．５−ｐで表される。また、本発明のポリマーの重量平均分子量は、特には限定されないが、例えば５０００〜１００００００、好ましくは１００００〜２０００００である。
【００８５】
本発明に用いられる共重合体の感熱応答性による蛍光強度の変化は、通常の蛍光強度測定方法により測定することができる。測定での励起波長および測定する蛍光波長は、特に限定はされないが、例えば、測定試料の励起スペクトルを測定した際の最大励起波長またはその付近の波長を使用することができる。また、測定する蛍光波長も特には限定されないが、例えば、蛍光強度が増加する温度で測定試料の蛍光スペクトルを測定した際の最大蛍光波長またはその付近の波長を使用することができる。
【００８６】
また、本発明に用いられる共重合体の感熱応答性による変化として、蛍光寿命を指標にすることもできる。この変化は通常の蛍光寿命測定法により測定することができる。測定での励起波長は特に限定されないが、例えば、測定試料の励起スペクトルを測定した際の最大励起波長またはその付近の波長を使用することができる。実験によって得られた蛍光減衰曲線から、測定する試料の状態に応じて、１成分近似、２成分近似などの一般的な解析手法を用いることにより、蛍光寿命値を得ることができる。
【００８７】
本発明に用いられる共重合体の感熱応答性による蛍光寿命の変化は、一般的な蛍光寿命測定方法、例えば、単一光子計数法、位相変調法、パルスサンプリング法、励起プローブ法などの手法により測定することができる。このうち、単一光子計数法は、時間軸上の発光強度分布と光子１個の発光確率とが相関関係にあることを利用して蛍光寿命を測定する方法であり、蛍光団を１ｎｓ程度の非常に短い（パルス）光で励起した後、検出される光の発生時刻を測定し、励起を多数回繰り返して得られるヒストグラムを蛍光減衰曲線として指数関数の和で近似して蛍光寿命を決定する。単一光子計数法による蛍光寿命の測定は、市販されている時間相関単一光子計数法蛍光寿命測定装置およびそれに付随している測定・解析プログラムを使用して行うことができる。
【００８８】
本発明における「細胞」とは、一般的な分類である原核細胞と真核細胞から成り、特にその生物の種に依らない。例えば、原核細胞は真正細菌と古細菌に分けられるが、真正細菌はその中でも放線菌門のようなグラム陽性菌とプロテオバクテリア門のようなグラム陰性菌に大きく分けられ、ペプチドグリカン層の厚みなどによって、共重合体が適用できる範囲は制限されない。また真核細胞には、主に真核生物（原生生物、真菌、植物、動物）に属する細胞が当てはまる。例えば、一般的に分子生物学などの研究で利用され、かつ工業的にも利用される酵母は真菌に属する。
【００８９】
本発明の共重合体を細胞に導入する際には、イオン強度の低い溶液（溶媒）に置換することが望ましい。このような溶媒としては、例えば、水（好ましくは純水）およびソルビトール水溶液、グルコース溶液などが挙げられる。
【００９０】
本発明に従って共重合体を細胞に導入するときの共重合体の濃度は、例えば、共重合体の終濃度を０．００１〜１％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０１〜０．１％（ｗ／ｖ）になるように調整し、菌体と混ぜることができる。これは微生物菌体のようなものに限らず、接着細胞などの場合にもあてはまる。
【００９１】
細胞内に代表されるような限られた微小空間内の温度を正確に測定するために、ある独立した２つの蛍光波長における蛍光強度を測定してこれらの比をとり、その蛍光強度比から温度に換算するという方法をとることが望ましい。この手法により、共重合体から発せられる蛍光強度が、微小空間内の共重合体の濃度に起因する可能性を排除し、温度と実験で得られる蛍光強度比を１対１に対応させることが可能である。これにより同一細胞での温度比較だけでなく、同一条件下に置かれた別の細胞の細胞内温度の比較も可能となる。例えば、酵母集団中における個々の細胞温度の違いを測定することにより、各酵母細胞の生理状態を把握することが可能となる。
【００９２】
蛍光強度比の算出法は、特に限定されるものではなく、異なる波長を含んだ２つの領域の蛍光強度からその比を算出することができる。例えば、一方の領域は５５０ｎｍ〜５７０ｎｍとしてその蛍光強度の積分値をＳ１とし、他方の領域は５７０ｎｍ〜５９０ｎｍとしてその蛍光強度の積分値をＳ２とし、Ｓ１／Ｓ２を蛍光強度比としてよい。さらに、Ｓ１およびＳ２の領域は同じ幅でも異なる幅でもよい。例えば、Ｓ１は２０ｎｍ幅の波長領域を含む一方で、Ｓ２は１ｎｍ幅の単独波長でもよい。波長の選択基準も特に限定されるものではないが、得られる蛍光強度を考慮すると、温度感受性プローブに含まれる蛍光性ユニットを与えるモノマー（例えば、式（ｃ）で示される蛍光モノマー）の常温（約２５℃）における水中での励起スペクトルを測定した際の最大蛍光強度を示す波長の前後２００ｎｍ、好ましくは１５０ｎｍ、さらに好ましくは１００ｎｍの範囲から、２つの波長領域（つまりＳ１およびＳ２のための波長領域）を選択するのが望ましい。また、温度感受性プローブに含まれる蛍光性ユニットを与えるモノマー（例えば、式（ｃ）で示される蛍光モノマー）の常温（約２５℃）における水中での蛍光スペクトルを測定した際にベースラインとなる波長領域、つまり蛍光強度が測定機器のノイズの範囲内となる波長領域は、上述の２つの波長領域を選択するときには避けることが望ましい。
【００９３】
実験で得られた蛍光強度比から温度を求める際には、自らが設定した検量線を使用することが可能である。具体的に、どの条件で測定した検量線を使用するかは限定されないが、例えば、細胞内を模倣した塩化カリウム溶液中での、共重合体の感熱応答性による蛍光強度の変化をプロットした曲線、共重合体を導入した細胞集団を蛍光光度計に供し、感熱応答性による蛍光強度の変化をプロットした曲線、あるいは共重合体を導入した細胞集団を蛍光顕微鏡に供し、複数の細胞での感熱応答性による蛍光強度の変化の平均値をプロットした曲線などを用いることができる。さらに具体的には、共重合体を導入した細胞集団を用いて、感熱応答性試験を行い、蛍光強度の変化をプロットする際には、細胞は代謝活動を積極的に行わないような状態、例えば、水中や資化することのできない化合物が含まれた緩衝液中に細胞を懸濁した状態で、特定の温度に一定期間保持し、外部温度と細胞内部温度が平衡状態に達したと考えられる状況下で、蛍光強度を測定する方法などが挙げられる。これら蛍光強度を測定する際には、蛍光強度を測定してもよいが、上述されているような任意の２波長領域の蛍光強度比を用いて検量線を作成することで、より精度の高い検量線を作成することが可能である。
【００９４】
蛍光強度比を用いる上述の温度測定法は、感熱性ユニットおよび蛍光性ユニットを含む共重合体を用いる温度測定に広く適用することができる。また、この温度測定法は、細胞内の温度測定だけでなく、微小空間内の温度測定に広く適用することができる。
【００９５】
細胞内に代表されるような限られた微小空間内の温度を正確に測定するために、蛍光寿命を指標として用いることもできる。蛍光寿命による測定は、波長や蛍光物質の濃度の影響を受けないため、二波長による蛍光強度比による測定と同様の有利な効果を奏する。蛍光寿命による温度測定法は、感熱性ユニットおよび蛍光性ユニットを含む共重合体を用いる温度測定に広く適用することができる。また、この温度測定法は、細胞内の温度測定だけでなく、微小空間内の温度測定に広く適用することができる。
【００９６】
さらに、２種以上の感熱性ユニットを用いる上記の実施態様は、本発明に用いる共重合体を温度感受性プローブとして用いる場合のみならず、感熱性ユニットおよび蛍光性ユニットを含む共重合体を用いる温度測定に広く適用することができる。
【００９７】
以上に説明した方法を実施するために、必要な試薬等をまとめてキットとすることができる。従って、本発明の第四の態様によれば、上述の方法を用いて温度を測定するためのキットが提供され、該キットは、これら方法に用いられる温度感受性プローブを含んでなる。この温度測定用試薬キットは、微小空間内の温度測定、特に細胞内の温度測定に好適に使用することができる。当該試薬キットは、医学・生物学・生物工学等の研究分野、診断・治療等の医療分野において使用することができる。
【００９８】
本発明の一つの実施態様によれば、前記キットは、感熱性ユニット、蛍光性ユニットおよびカチオン性ユニットを含む共重合体を含んでなる温度感受性プローブを含む。
【００９９】
本発明の他の実施態様によれば、前記キットは、感熱性ユニットおよび蛍光性ユニットを含む共重合体を含んでなる温度感受性プローブを含んでなり、前記共重合体は２種以上の感熱性ユニットを含むものとされる。
【０１００】
本発明の方法および温度測定用キットは、様々な研究開発の分野に応用することができる。例えば、生物工学の分野では、微生物を用いた有用物質の発酵生産において、これまで正確な測定が困難であった細胞内温度を解析パラメータに加えることにより、培養条件の検討の効率化が期待される。
【０１０１】
本発明の方法および温度測定用キットは、様々な医療用途に応用することができる。例えば、本発明による温度感受性プローブを患者の組織の一部に対して使用することにより、熱産生量が多いとされているがん細胞と、そうでない正常細胞との識別を行うことも可能である。さらにそれを応用する事でより効果的な温熱治療法の開発などにも使える。あるいは、熱産生量が多い褐色脂肪細胞に本発明による温度感受性プローブを導入し、その細胞に様々な素材を添加することによる温度変化を測定することにより、褐色脂肪細胞を活性化する素材をスクリーニングすることも可能である。
【０１０２】
本発明の方法および温度測定用キットは、様々な生理現象の解明にも応用可能である。例えば、生体外の温度を感知し、生体反応を引き起こす受容体であるＴＲＰチャネルが細胞内の温度とどのように関連しているのかを調べることで今までとは異なるアプローチでのＴＲＰチャネルの活性化が考えられる。また細胞内温度分布と細胞内外で起こる生体反応との関わりを調べる事により、局所的な温度分布が生体反応に及ぼす影響を調べる事が可能で、赤外線レーザーなどを用いた局所的な加熱による細胞のコントロールを行う事なども可能である。
【０１０３】
本発明による温度測定法および温度感受性プローブの細胞導入法は、in vitroおよびin vivoのいずれにおいても行うことができる。一つの実施態様では、これらの方法はin vitroにおいて行われる。
【実施例】
【０１０４】
以下に実施例を示すことにより本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【０１０５】
試薬及びデータ測定
α，α'−アゾビスイソブチロニトリルはメタノールを用いた再結晶により精製して用いた。その他の試薬は購入したものをさらに精製することなく使用した。【０１０６】
１Ｈ−ＮＭＲはＢＲＵＫＥＲ  ＡＶＡＮＣＥ４００スペクトロメーター（４００ＭＨｚ）を使用して測定し、ケミカルシフトはｐｐｍで表示した。数平均分子量、重量平均分子量はＪＡＳＣＯ  ＧＰＣ  ｓｙｓｔｅｍ（ＪＡＳＣＯ  ＰＵ−２０８０ポンプ、ＪＡＳＣＯ  ＲＩ−２０３１示差屈折計、ＪＡＳＣＯ  ＣＯ−２０６０カラムオーブン、Ｓｈｏｄｅｘ  ＧＰＣ  ＫＤ−８０６Ｍカラム）を使用し、ポリスチレン標準試料により得られる較正曲線を用いて算出した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーには、関東化学ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０Ｎ（４０−５０μＭ）を使用した。吸光度の測定には、ＪＡＳＣＯ
Ｖ−５５０紫外可視光分光光度計を使用した。【０１０７】
実施例１：Ｎ−｛２−［（７−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル）−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル］（メチル）アミノ｝エチル−Ｎ−メチルアクリルアミドの合成
【化１０】
0005514368.tif 000011
【０１０８】
４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル−７−フルオロ−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール（９４ｍｇ）をアセトニトリル（５ｍｌ）に溶解し、この溶液をＮ，Ｎ'−ジメチルエチレンジアミン（１．２９ｍｌ）に加えて１５分間室温にて撹拌した。反応終了後、反応溶液を減圧乾固させた後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒としてジクロロメタン：メタノール＝１０：１→５：１を使用）にて精製を行い、Ｎ，Ｎ−ジメチル−７−［メチル｛２−（メチルアミノ）エチル｝アミノ］−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−スルホンアミドを橙色液体（１１３ｍｇ、９４％）として得た。【０１０９】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ７．８７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），６．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），４．１５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），３．３５（３Ｈ，ｓ），２．９４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）２．８７（６Ｈ，ｓ），２．４８（３Ｈ，ｓ）。【０１１０】
Ｎ，Ｎ−ジメチル−７−［メチル｛２−（メチルアミノ）エチル｝アミノ］−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−スルホンアミド（１１３ｍｇ）をアセトニトリル（１０ｍｌ）に溶解し、トリエチルアミン（５０．２μＬ、１ｅｑ）、アクリル酸クロリド（３８．０μＬ、１．３ｅｑ）を０℃にて加えた後、１時間０℃にて撹拌した。反応溶液にＮａ２ＣＯ３（１ｇ）を加えろ過した後、減圧乾固し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒として酢酸エチル−ｎ−ヘキサン＝３：１→４：１を使用）にて精製を行い、表題の化合物を橙色結晶（１０６．１ｍｇ、８０％）として得た。【０１１１】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ７．８８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），６．４８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ，１０．４Ｈｚ），６．２８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ），６．１４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），５．６８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ）４．２７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．００Ｈｚ），３．７４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），３．２９，３．１２（３Ｈ，ｓ），２．８８（６Ｈ，ｓ）。【０１１２】
実施例２：Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミドの合成
ベンゼン（１２５ｍL）にＮ−ｎ−プロピルアミン（８．２ｍL）とトリエチルアミン（１６．７ｍL、１．２ｅｑ）を加え、氷浴中で、攪拌子を用いてよく攪拌した後に、アクリル酸クロリド（９．７ｍＬ、１．２ｅｑ）を１０分おきに３ｍＬずつ添加し、室温に戻した。反応液を濾過し、０．１Ｎの塩酸で分液を行い、上層のベンゼン画分を抽出、無水硫酸ナトリウムを添加した後に、減圧乾固し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒としてジクロロメタン−メタノール＝５０：１を使用）にて1回目の精製を行った。目的化合物を含んだ画分を再度集め、減圧乾固し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒として酢酸エチル−ヘキサン＝１：２を使用）にて２回目の精製を行い、表題の化合物を無色透明液体（３．７４ｇ、３３％）として得た。【０１１３】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ６．２８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ、１．６Ｈｚ），６．０８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ，１０．４Ｈｚ），５．６４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ、１．６Ｈｚ），５．５５（１Ｈ，ｂｒ），３．３０（２Ｈ，ｍ）１．５８（２Ｈ，ｍ），０．９５（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ）。【０１１４】
実施例３：Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド／３−スルホプロピルアクリレート／Ｎ−｛２−［（７−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル）−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル］（メチル）アミノ｝エチル−Ｎ−メチルアクリルアミド共重合体の製造
【化１１】
0005514368.tif 000012
【０１１５】
Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド（２６９ｍｇ、２．３７５ｍｍｏｌ、以下「ＮＮＰＡＭ」とも称する）、３−スルホプロピルアクリレートカリウム塩（２９．０ｍｇ、１２５μｍｏｌ、以下「ＳＰＡカリウム塩」とも称する）、ＤＢＤ−ＡＡ（９．１３ｍｇ、２５μｍｏｌ）、ＡＩＢＮ（４．１３ｍｇ、２５μｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍｌ）に溶解し、３０分間窒アルゴンガスを通じることにより溶存酸素を除去した。その後、６０℃にて１６．５時間反応させ、反応溶液から減圧下ＤＭＦを一部留去したのち、ジエチルエーテル（２００ｍｌ）に注いだ。得られた結晶を濾取し、減圧乾燥した後、純水１０ｍｌに溶かし、直径２８．６ｍｍのヴィスキングチューブ（透析用セルローズチューブ）を使用し、透析外液を１０００ｍｌとして、充分に透析を行い、精製を行った。精製品を凍結乾燥し、表題の共重合体を淡黄色粉末（１６１ｍｇ、５２％）として得た。【０１１６】
数平均分子量１７６０６、重量平均分子量３９１８４で、共重合体中の各ユニットの組成比  ＮＮＰＡＭ：ＳＰＡ：ＤＢＤ−ＡＡ＝９５．０：５．０：１．０１１。なお、共重合体におけるＮＮＰＡＭユニットとＳＰＡユニットの割合は１Ｈ−ＮＭＲ測定における積分値より、ＤＢＤ−ＡＡユニットの割合はメタノール中の吸光度を４−Ｎ，Ｎ−（ジメチルアミノ）−７−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル−２，１，３−ベンゾオキサジアゾールと比較することにより算出した。【０１１７】
実施例４：Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド／（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウム／Ｎ−｛２−［（７−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル）−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル］（メチル）アミノ｝エチル−Ｎ−メチルアクリルアミド共重合体の製造
【化１２】
0005514368.tif 000013
【０１１８】
ＮＮＰＡＭ（２７５ｍｇ、２．４４ｍｍｏｌ）、（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムクロリド（１７．５ｍｇ、６２．５μｍｏｌ、以下「ＡＰＴＭＡクロリド」とも称する）、ＤＢＤ−ＡＡ（９．１３ｍｇ、２５μｍｏｌ）、ＡＩＢＮ（４．０５ｍｇ、２５μｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍｌ）に溶解し、３０分間アルゴンガスを通じることにより溶存酸素を除去した。その後、６０℃にて１９時間反応させ、反応溶液から減圧下ＤＭＦを一部留去したのち、ジエチルエーテル（２００ｍｌ）に注いだ。得られた結晶を濾取し、減圧乾燥させた後、純水１０ｍｌに溶かし、直径２８．６ｍｍのヴィスキングチューブ（透析用セルローズチューブ）を使用し、透析外液を１０００ｍｌとして、充分に透析を行い、精製を行った。精製品を凍結乾燥し、表題の共重合体を淡黄色粉末（２００ｍｇ、６６％）として得た。【０１１９】
数平均分子量１００６１、重量平均分子量２１６３７で、共重合体中の各ユニットの組成比  ＮＮＰＡＭ：ＡＰＴＭＡ：ＤＢＤ−ＡＡ＝９６．７：３．３：０．９３３。なお、共重合体におけるＮＮＰＡＭユニットとＡＰＴＭＡユニットの割合は１Ｈ−ＮＭＲ測定における積分値より、ＤＢＤ−ＡＡユニットの割合はメタノール中の吸光度を４−Ｎ，Ｎ−（ジメチルアミノ）−７−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル−２，１，３−ベンゾオキサジアゾールと比較することにより算出した。【０１２０】
実施例５：Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド／（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウム／Ｎ−｛２−［（７−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル）−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル］（メチル）アミノ｝エチル−Ｎ−メチルアクリルアミド共重合体の製造
実施例４と同様にして合成を行った。ＮＮＰＡＭ（２７０ｍｇ、２．３８ｍｍｏｌ）、ＡＰＴＭＡ（３４．４ｍｇ、１２５μｍｏｌ）、ＤＢＤ−ＡＡ（９．１８ｍｇ、２５μｍｏｌ）、ＡＩＢＮ（４．０９ｍｇ、２５μｍｏｌ）を用いて、表題の共重合体を淡黄色粉末（２２９ｍｇ、７４％）として得た。【０１２１】
数平均分子量８１６６、重量平均分子量１５２１３で、共重合体中の各ユニットの組成比  ＮＮＰＡＭ：ＡＰＴＭＡ：ＤＢＤ−ＡＡ＝９４．３：５．７：０．８８８。算出方法は実施例４の通りである。【０１２２】
実施例６：Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド／（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウム／Ｎ−｛２−［（７−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル）−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル］（メチル）アミノ｝エチル−Ｎ−メチルアクリルアミド共重合体の製造
実施例４と同様にして合成を行った。ＮＮＰＡＭ（２６２ｍｇ、２．３１ｍｍｏｌ）、ＡＰＴＭＡ（５１．９ｍｇ、１８８μｍｏｌ）、ＤＢＤ−ＡＡ（９．２２ｍｇ、２５μｍｏｌ）、ＡＩＢＮ（４．１５ｍｇ、２５μｍｏｌ）を用いて、表題の共重合体を淡黄色粉末（２３８ｍｇ、７６％）として得た。【０１２３】
数平均分子量６５７９、重量平均分子量１１６０３で、共重合体中の各ユニットの組成比  ＮＮＰＡＭ：ＡＰＴＭＡ：ＤＢＤ−ＡＡ＝９０．９：９．１：０．８９６。算出方法は実施例４の通りである。【０１２４】
実施例７：Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド／（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウム／Ｎ−｛２−［（７−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル）−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル］（メチル）アミノ｝エチル−Ｎ−メチルアクリルアミド共重合体の製造
実施例４と同様にして合成を行った。ＮＮＰＡＭ（２１２ｍｇ、１．８８ｍｍｏｌ）、ＡＰＴＭＡ（１７３．６ｍｇ、６２５μｍｏｌ）、ＤＢＤ−ＡＡ（９．１８ｍｇ、２５μｍｏｌ）、ＡＩＢＮ（４．１８ｍｇ、２５μｍｏｌ）を用いて、表題の共重合体を淡黄色粉末（２５１ｍｇ、７０％）として得た。【０１２５】
数平均分子量４０４３、重量平均分子量５４５９で、共重合体中の各ユニットの組成比
ＮＮＰＡＭ：ＡＰＴＭＡ：ＤＢＤ−ＡＡ＝７４．４：２５．６：０．９０２。なお、共重合体におけるＮＮＰＡＭユニットとＡＰＴＭＡユニットの割合は１Ｈ−ＮＭＲ測定における積分値より、ＤＢＤ−ＡＡユニットの割合はメタノール中の吸光度を４−Ｎ，Ｎ−（ジメチルアミノ）−７−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル−２，１，３−ベンゾオキサジアゾールと比較することにより算出した。【０１２６】
実施例８：ジメチルアクリルアミド／（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウム／Ｎ−｛２−［（７−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル）−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル］（メチル）アミノ｝エチル−Ｎ−メチルアクリルアミド共重合体の製造
ジメチルアクリルアミド（２２９ｍｇ、２．３１ｍｍｏｌ、以下「ＤＭＡＭ」とも称する）、ＡＰＴＭＡ（５２．０ｍｇ、１８８μｍｏｌ）、ＤＢＤ−ＡＡ（９．１８ｍｇ、２５μｍｏｌ）、ＡＩＢＮ（４．０７ｍｇ、２５μｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍｌ）に溶解し、３０分間アルゴンガスを通じることにより溶存酸素を除去した。その後、６０℃にて１６時間反応させ、反応溶液から減圧下ＤＭＦを一部留去したのち、ジエチルエーテル（２００ｍｌ）に注いだ。得られた結晶を濾取し、減圧乾燥させた後、純水１０ｍｌに溶かし、直径２８．６ｍｍのヴィスキングチューブ（透析用セルローズチューブ）を使用し、透析外液を１０００ｍｌとして、充分に透析を行い、精製を行った。精製品を凍結乾燥し、表題の共重合体を淡黄色粉末（１８５ｍｇ、６６％）として得た。【０１２７】
数平均分子量５６３３、重量平均分子量８４６８で、共重合体中の各ユニットの組成比
ＤＭＡＭ：ＡＰＴＭＡ：ＤＢＤ−ＡＡ＝７９．６：２０．４：０．８３１。なお、共重合体におけるＤＭＡＭユニットとＡＰＴＭＡユニットの割合は１Ｈ−ＮＭＲ測定における積分値より、ＤＢＤ−ＡＡユニットの割合はメタノール中の吸光度を４−Ｎ，Ｎ−（ジメチルアミノ）−７−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル−２，１，３−ベンゾオキサジアゾールと比較することにより算出した。【０１２８】
実施例９：Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド／Ｎ−｛２−［（７−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル）−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル］（メチル）アミノ｝エチル−Ｎ−メチルアクリルアミド共重合体の製造
【化１３】
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【０１２９】
ＮＮＰＡＭ（１４２ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ）、ＡＩＢＮ（２．０２ｍｇ、１２．５μｍｏｌ）、ＤＢＤ−ＡＡ（４．６２ｍｇ、１２．５μｍｏｌ）をジオキサン（５ｍｌ）に溶解し、３０分間窒素ガスを通じることにより溶存酸素を除去した。その後、６０℃にて８時間反応させ、反応溶液をジエチルエーテル２００ｍｌに注いだ。得られた結晶を濾取し、再沈操作（アセトン２．５ｍｌ―ジエチルエーテル２００ｍｌ）によって精製を行い、表題の共重合体を淡黄色粉末（８７ｍｇ、５８％）として得た。【０１３０】
数平均分子量３６０３３、重量平均分子量９２０４２で、共重合体中の各ユニットの組成比  ＮＮＰＡＭ：ＤＢＤ−ＡＡ＝１００：１．０３１。なお、ＤＢＤ−ＡＡユニットの割合はメタノール中の吸光度を４−Ｎ，Ｎ−（ジメチルアミノ）−７−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル−２，１，３−ベンゾオキサジアゾールと比較することにより算出した。【０１３１】
実施例１０：Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド／ビニルベンジルトリメチルアンモニウム／Ｎ−｛２−［（７−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル）−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル］（メチル）アミノ｝エチル−Ｎ−メチルアクリルアミド共重合体の製造
【化１４】
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【０１３２】
ＮＮＰＡＭ（２６８．７ｍｇ、２．３７５ｍｍｏｌ）、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド（２３．２ｍｇ、１２５μｍｏｌ、以下「ＶＢＴＭＡクロリド」とも称する）、ＤＢＤ−ＡＡ（１．８４ｍｇ、５μｍｏｌ）、ＡＩＢＮ（４．０５ｍｇ、２５μｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍｌ）に溶解し、３０分間アルゴンガスを通じることにより溶存酸素を除去した。その後、６０℃にて１４時間反応させ、ジエチルエーテル（２００ｍｌ）に注いだ。得られた結晶を濾取し、減圧乾燥させた後、純水１０ｍｌに溶かし、直径２８．６ｍｍのヴィスキングチューブ（透析用セルローズチューブ）を使用し、透析外液を１０００ｍｌとして、充分に透析を行い、精製を行った。精製品を凍結乾燥し、表題の共重合体を淡黄色粉末（４１ｍｇ、１４％）として得た。【０１３３】
共重合体中の各ユニットの組成比  ＮＮＰＡＭ：ＶＢＴＭＡ＝９０．６：９．４。なお、共重合体におけるＮＮＰＡＭユニットとＶＢＴＭＡユニットの割合は１Ｈ−ＮＭＲ測定における積分値より算出した。【０１３４】
実施例１１：Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド／Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウム／Ｎ−｛２−［（７−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル）−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル］（メチル）アミノ｝エチル−Ｎ−メチルアクリルアミド共重合体の製造
実施例４と同様にして行った。具体的には、ＮＮＰＡＭ（１３７．５ｍｇ、１．２２ｍｍｏｌ）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（１３７．５ｍｇ、１．２２ｍｍｏｌ、以下「ＮＩＰＡＭ」とも称する）（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムクロリド（１７．５ｍｇ、６２．５μｍｏｌ、以下「ＡＰＴＭＡクロリド」とも称する）、ＤＢＤ−ＡＡ（９．１３ｍｇ、２５μｍｏｌ）、ＡＩＢＮ（４．０５ｍｇ、２５μｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍｌ）に溶解し、３０分間アルゴンガスを通じることにより溶存酸素を除去した。その後、６０℃にて１９時間反応させ、反応溶液から減圧下ＤＭＦを一部留去したのち、ジエチルエーテル（２００ｍｌ）に注いだ。得られた結晶を濾取し、減圧乾燥させた後、純水１０ｍｌに溶かし、直径２８．６ｍｍのヴィスキングチューブ（透析用セルローズチューブ）を使用し、透析外液を１０００ｍｌとして、充分に透析を行い、精製を行った。精製品を凍結乾燥し、表題の共重合体を淡黄色粉末（１５４ｍｇ、５０％）として得た。【０１３５】
数平均分子量１９７３０、重量平均分子量１０３８６で、共重合体中の各ユニットの組成比  ＮＮＰＡＭ：ＮＩＰＡＭ：ＡＰＴＭＡ：ＤＢＤ−ＡＡ＝４９．８：４６．９：３．３：０．８０５。なお、共重合体におけるＮＮＰＡＭユニット，ＮＩＰＡＭユニットとＡＰＴＭＡユニットの割合は１Ｈ−ＮＭＲ測定における積分値より、ＤＢＤ−ＡＡユニットの割合はメタノール中の吸光度を４−Ｎ，Ｎ−（ジメチルアミノ）−７−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル−２，１，３−ベンゾオキサジアゾールと比較することにより算出した。【０１３６】
実施例１２：Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウム／Ｎ−｛２−［（７−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル）−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル］（メチル）アミノ｝エチル−Ｎ−メチルアクリルアミド共重合体の製造
ＮＩＰＡＭ（２７５ｍｇ、２．４４ｍｍｏｌ）、（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムクロリド（１７．５ｍｇ、６２．５μｍｏｌ、以下「ＡＰＴＭＡクロリド」とも称する）、ＤＢＤ−ＡＡ（９．１３ｍｇ、２５μｍｏｌ）、ＡＩＢＮ（４．０５ｍｇ、２５μｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍｌ）に溶解し、３０分間アルゴンガスを通じることにより溶存酸素を除去した。その後、６０℃にて１９時間反応させ、反応溶液から減圧下ＤＭＦを一部留去したのち、ジエチルエーテル（２００ｍｌ）に注いだ。得られた結晶を濾取し、減圧乾燥させた後、純水１０ｍｌに溶かし、直径２８．６ｍｍのヴィスキングチューブ（透析用セルローズチューブ）を使用し、透析外液を１０００ｍｌとして、充分に透析を行い、精製を行った。精製品を凍結乾燥し、表題の共重合体を淡黄色粉末（１３９ｍｇ、４５％）として得た。【０１３７】
数平均分子量２３３１２、重量平均分子量１１７３７で、共重合体中の各ユニットの組成比  ＮＩＰＡＭ：ＡＰＴＭＡ：ＤＢＤ−ＡＡ＝９６．４：３．６：０．８１４。なお、共重合体におけるＮＩＰＡＭユニットとＡＰＴＭＡユニットの割合は１Ｈ−ＮＭＲ測定における積分値より、ＤＢＤ−ＡＡユニットの割合はメタノール中の吸光度を４−Ｎ，Ｎ−（ジメチルアミノ）−７−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル−２，１，３−ベンゾオキサジアゾールと比較することにより算出した。【０１３８】
実施例３、４、５，６，７，８、９、１０、１１および１２で製造した共重合体を、それぞれ以下、化合物１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０と称する。以下表に化合物１〜１０の物質の特徴をまとめた。
【表１】
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【０１３９】
実施例１３：細胞へのポリマー導入試験
酵母サッカロマイセス属ＳＹＴ００１株（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００８年，第７４巻，第２７８７〜２７９６頁）、をＹＰＤ（酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコース２％）培地３ｍＬに植菌し、２５℃で１日間好気振とう培養した。培養液の菌体濃度として６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６００）を測定した後、培養液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）し、水で洗浄を２回行い、充分に洗浄した後、ＯＤ６００が１となるように純水を添加し、懸濁した。菌体懸濁液に、５％の濃度で純水に溶かした化合物１〜７を終濃度が０．０５％となるように添加し、０．５時間、２５℃で静置した。その後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、１分）し、速やかに上清を除き、再度冷水で洗浄を１回行った。洗浄した酵母を再度水に懸濁し、酵母細胞懸濁液をスライドガラス（スーパーフロスト：ＭＡＴＵＮＡＭＩ）に載せ、カバーガラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ）で封をした後、スライドガラスをステージ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）に載せ、共焦点レーザー顕微鏡（ＦＶ１０００、Ｏｌｙｍｐｕｓ）、１００倍油浸対物レンズ（ＵｐｌａｎＳＡｐｏ  Ｎ．Ａ．１．４０，Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて観察した。細胞に４７３ｎｍのレーザー（Ｍｕｌｔｉ  Ａｒレーザー）を当て、５００ｎｍから６００ｎｍまでの蛍光波長に対する蛍光像を観察した。【０１４０】
各化合物を導入した際の蛍光像を図１に示す。ユニット内にＡＰＴＭＡが入っている場合は、微分干渉像と重なるようにして、細胞内部に蛍光強度の高い領域が観察されたが、ＡＰＴＡＭが入っていない場合（化合物７）、そしてアニオン性のユニットであるＳＰＡが含まれている場合（化合物１）には全く蛍光像は観察されなかった。【０１４１】
実施例１４：細胞へのポリマー導入効率の評価
実施例１３のようにして、０．０５％濃度の化合物２〜６を酵母サッカロマイセス属ＳＹＴ００１株と混合し、導入した。化合物を導入した酵母をフローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ，ＢＤ）解析に供した。測定時の条件は以下の通りである。計測細胞数を１００００細胞とし、ＦＳＣ電圧をＥ−１、ＳＳＣ電圧を２０１とし、ＦＬ１電圧を５６６Ｖとし、ＦＳＣ閾値を５２とした。細胞に４８８ｎｍのアルゴンレーザーの励起光を照射した後、各化合物由来の蛍光を５１５ｎｍ〜５４５ｎｍの蛍光検出器（ＦＬ１）で検出した。ＳＳＣ、ＦＳＣで酵母に特有の領域を選択し、横軸に重合体から発せられる蛍光であるＦＬ１のシグナル蛍光強度をとり、縦軸にその蛍光強度を持つ細胞の数をとったヒストグラムを作成し、解析を行った。【０１４２】
評価結果を図２に示す。ヒストグラムの山が右に行けば行く程、ポリマーの細胞への導入量が多いことを示しているが、ＡＰＴＭＡの比率が多くなるにつれ（化合物２〜５）、細胞内蛍光強度が高い細胞が増えていることがわかる。実施例１３で観察できた結果と同様、ＡＰＴＭＡの導入量が多いほど、細胞内にプローブが入りやすくなることが明らかとなった。また、化合物４と化合物６との結果の比較により、それは感熱性ユニットによらないものであることが示された。【０１４３】
実施例１５：各化合物の溶液中のイオン強度の定性的評価
化合物１〜７を純水に５％の濃度で溶解し、１％アガロースＴＡＥゲルで電気泳動（Ｇｅｎｉｕｓ，ＳＫｂｉｏ）を行った。アプライ量は５μｌである。泳動は５０Ｖで１．５時間行った。泳動後のゲルはＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ ４０００（ＧＥＨｅｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、Ｂｌｕｅ Ｅｐｉ ｌｉｇｈｔ (４６０ｎｍ，ＧＥＨｅｌｔｈｃａｒｅ)で励起、Ｙ５１５ｆｉｌｔｅｒ(ＧＥＨｅｌｔｈｃａｒｅ)で励起光、散乱光をカットし、各プローブからの蛍光を検出した。【０１４４】
泳動したゲルの結果を図３に示す。カチオン性基であるＡＰＴＭＡを導入していないプローブでは、アクリルアミドの主鎖自体が負に帯電していることもあり、アプライした地点よりもやや正電荷側に移動していくことがわかった。また、アニオン性ユニットであるＳＰＡを導入したプローブは、正電極側に大きく移動し、ポリマー全体が負に帯電していることが確認できた。一方、カチオン性ユニットを導入したポリマーは、ＡＰＴＭＡの導入率に応じて、負電極側へ大きく移動しており、ＡＰＴＭＡの導入量とカチオン性が相関していることを確認できた。さらにＡＰＴＭＡが９．１％導入されたプローブにおいて、感熱性ユニットであるＮＮＰＡＭ、ＤＭＡＭによる移動度の変化がなかったことから、感熱性ユニットによるカチオン性の変化がないことも確認できた。【０１４５】
実施例１６：感熱応答性試験
化合物２，３，４，５，６の１５０ｍＭ  ＫＣｌ中での感熱応答性試験を以下の手順で行った。ＪＡＳＣＯ  ＦＰ−６５００分光蛍光光度計を使用し、溶媒として、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社のＭｉｌｌｉ−Ｑ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍから得た超純水を用いて、和光純薬より購入したＫＣｌを１５０ｍＭの濃度になるように溶かしたものを用いた。当実験における化合物の初期濃度は０．０１ｗ／ｖ％とし、励起波長は４５６ｎｍとした。
溶液の温度制御にはＪＡＳＣＯ  ＥＴＣ−２７３Ｔ水冷ペルチェ式恒温セルホルダを使用し、付属の熱電対により温度を測定した。溶液温度を２℃刻みで上昇させ、各温度における蛍光強度を測定した。【０１４６】
試験結果を図４に示す。感熱性ユニットにＤＭＡＭを用いた場合は、温度の変化に反応せず、蛍光強度の変化は確認できないが、感熱性ユニットとしてＮＮＰＡＭを用いた場合には、共重合体におけるＡＰＴＭＡのモル比率が９．１％の場合までは温度の変化に鋭敏に反応した蛍光強度の変化が確認された。しかしながら、共重合体におけるＡＰＴＭＡのモル比率が２５．６％になると感熱性ユニットの比率が低くなることに加え、イオン性基の比率が高くなりすぎることで、ポリマー伸縮が静電的作用により阻害されることから、温度に応答した蛍光強度の変化は確認できなかった。実施例１３〜１６の結果をあわせれば、特殊な方法を使用せず、細胞内の温度を感度よく、かつ簡便に測定するためには、ＡＰＴＭＡの比率はＮＮＰＡＭとＡＰＴＭＡの和に対して、投入量のモノマーのモル量換算で２．５％〜７．５％、実際の共重合体に含まれているモル比率で３．３％〜９．１％が好ましいことが明らかとなった。【０１４７】
実施例１７：感熱応答試験における塩化カリウム濃度依存性評価
化合物２の感熱応答性におけるＫＣｌ濃度依存性を以下の手順で試験し、調査した。実験手法は実施例１３と同様であり、ＫＣｌ濃度は０ｍＭ（純水）、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭとなるように溶媒を調製した。【０１４８】
試験結果を図５に示す。一般的に細胞内のカリウム濃度は１５０ｍＭ〜２５０ｍＭと推定されており、特殊な環境変化がない限り、細胞内のカリウム濃度の変化は小さいことがわかっている。この範囲内の塩化カリウム溶液の濃度変化に対する温度応答性の変化はわずかに観測されるものの、細胞内のカリウム濃度変化はこれよりも到底低いレベルにあるために、細胞内の温度を測定する上での影響はほとんどないことが示唆された。【０１４９】
実施例１８：ｐＨ応答性の評価
化合物２の感熱応答性におけるｐＨ依存性を以下の手順で試験し、調査した。溶媒として、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社のＭｉｌｌｉ−Ｑ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍから得た超純水を用いて、塩酸でｐＨを４に調整した。ｐＨ７の溶媒として、超純水をそのまま用いた。実験手法は実施例１３と同様である。【０１５０】
試験結果を図６に示す。一般的な細胞の温度範囲（２０℃〜４０℃）においては、ｐＨ変化による蛍光強度の変化はほとんど観測されなかった。つまり、ｐＨ変化によって温度応答性はほぼ影響を受けないことが明らかとなり、より高感度に蛍光強度がｐＨを反映することがわかった。【０１５１】
実施例１９：細胞へのプローブ導入時の懸濁液の評価
実施例１３のようにして０．０５％濃度の化合物２、３を、酵母サッカロマイセス属ＳＹＴ００１株と混合・懸濁し、酵母へプローブを導入した。化合物と細胞を混合する際の細胞を懸濁する溶液・培地として、水、１Ｍ  Ｓｏｒｂｉｔｏｌ、ＰＢＳ、ＹＰＤ（酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコース２％）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  ＫＣｌの６種類の溶液・培地を用いた。化合物２，３をそれぞれ導入した酵母をフローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ，ＢＤ）解析に供した。測定時の条件および解析方法は実施例１４と同様である。【０１５２】
解析結果を図７に示す。水、１Ｍ  Ｓｏｒｂｉｔｏｌ溶液中では酵母の中に化合物２，３が入ったことによる蛍光強度の高い細胞群が観察されたが、ＹＰＤ培地、およびＰＢＳ緩衝液、ＫＣｌ溶液中では、蛍光強度の高い細胞群は観察されなかった。したがって、本発明のポリマーを細胞に導入する際には、イオン強度の低い溶液に一度置換してから、ポリマーと細胞を混合する必要があることが明らかとなった。【０１５３】
実施例２０：細胞へのプローブ導入時の混合時間の評価
酵母サッカロマイセス属ＳＹＴ００１株を、ＹＰＤ（酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコース２％）培地に植菌し、２５℃で１日間好気振とう培養した。培養液の菌体濃度として６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６００）を測定した後、培養液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）し、水で洗浄を２回行い、充分に洗浄した後、ＯＤ６００が１となるように純水を添加し、懸濁した。菌体懸濁液に、５％の濃度で純水に溶かした化合物２を終濃度が０．０５％となるように添加し、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０分間、２５℃で静置した。その後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、１分）し、速やかに上清を除き、再度冷水で洗浄を１回行った。洗浄した酵母を再度水に懸濁し、酵母をフローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ，ＢＤ）解析に供した。測定時の条件、および解析方法は実施例１４と同様である。【０１５４】
解析結果を図８に示す。導入前の酵母はほとんど蛍光を発しないが、ポリマーと混合して５分後、すぐに蛍光強度の増加が見られた。また、その後、ポリマーと酵母の接触時間を長くしても、導入した酵母の割合に変化がほぼ見られなかった。つまり、本発明のプローブは細胞と接触して速やかに細胞内に導入されるため、長時間のインキュベートなどは必要とせず、簡便に細胞内に取り込ませることが可能であることが示された。【０１５５】
実施例２１：酵母細胞内温度の測定
実施例１３のようにして、０．０５％濃度の化合物２、３、４、６を、酵母サッカロマイセス属ＳＹＴ００１株と混合・懸濁し、ポリマーを細胞に導入した。ポリマーが導入された細胞を水にＯＤ６００＝１の濃度で懸濁し、キュベットに入れ、さらにキュベット内に２ｍｍ直径の球状の攪拌子を入れた。キュベットをＪＡＳＣＯ  ＦＰ−６５００分光蛍光光度計にセットし、約６００ｒｐｍの速度で回転させ、酵母が沈むのを防ぎながら、蛍光スペクトルを測定した。励起波長は４５６ｎｍとした。溶液の温度制御にはＪＡＳＣＯ  ＥＴＣ−２７３Ｔ水冷ペルチェ式恒温セルホルダを使用し、付属の熱電対により温度を測定した。溶液温度を５℃刻みで上昇させ、細胞内部の温度と外部の温度を一定にするよう温度上昇後１０分静置し、各温度における蛍光強度を測定した。【０１５６】
測定結果を図９に示す。なお、結果は５℃における蛍光強度を１とし、縦軸を相対蛍光強度で表した。蛍光波長は各化合物の最大蛍光強度を記録したときの蛍光波長を用いている。実施例１６における１５０ｍＭ  ＫＣｌ中でのポリマーの感熱応答性の結果と同様に、細胞内でも本発明で開発したポリマーは細胞内温度を反映し、温度上昇に伴って、細胞内蛍光強度が上昇した。非感熱応答性であるＤＭＡＭを用いた場合は、上記実施例の結果より、細胞内にプローブは導入されていることは明らかとなっていたが、温度に応答して、蛍光強度が上がらず、予想していた通り、温度を測定するプローブとして使用することができないことは確認できた。【０１５７】
実施例２２：蛍光強度比を求めることによる細胞内温度の正確な測定
実施例１３のようにして、０．０５％濃度の化合物３を、酵母サッカロマイセス属ＳＹＴ００１株と混合・懸濁し、ポリマーを細胞に導入した。ポリマーを導入した酵母を再度水に懸濁し、酵母細胞懸濁液をガラスボトムディッシュ（３５ｍｍ  Ｇｌａｓｓ  Ｂａｓｅ  Ｄｉｓｈ，ＩＷＡＫＩ）に注ぎ、ウォータージャケットステージインキュベータ（ＣＲＹＯ−ＷＪＭＳＩ，ｏｋｏｌａｂ）に載せ、温度を制御しながら、共焦点レーザー顕微鏡（ＦＶ１０００、Ｏｌｙｍｐｕｓ）、１００倍油浸対物レンズ（ＵｐｌａｎＳＡｐｏ  Ｎ．Ａ．１．４０，Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて観察した。細胞に４７３ｎｍのレーザー（Ｍｕｌｔｉ  Ａｒレーザー）を当て、５２０ｎｍから５６０ｎｍまでの蛍光波長に対する蛍光像（Ｐ１）、および５７０ｎｍから６１０ｎｍまで蛍光波長に対する蛍光像（Ｐ２）を観察した。また得られた像をＦＶ１０−ＡＳＷ解析ソフト（Ｏｌｙｍｐｕｓ）内の処理操作により、比をとる（Ｐ１／Ｐ２）ことによって、像を作成した（Ｐ３）。温度を１５℃から４０℃まで５℃刻みで上昇させ、一定の温度になったところで、１０分待った後、観察を行った。【０１５８】
３５℃におけるＰ１の結果を図１０に示す。この結果から明らかなように、単純な蛍光強度からは、蛍光強度と温度が対応しないため、その温度は正確に見積もることができない。具体的には、蛍光強度の高い細胞の温度が高いかというとそうではなく、単純にプローブの導入量が多いだけである可能性もある。これを解消するためには、細胞内のプローブ導入量の定量と同じ測定条件下での本プローブの感熱応答性を評価する必要があるが、特に前者は蛍光強度が温度に依存するため、正確な算出をすることが難しい。そこで１５℃、３５℃におけるＰ１とＰ２の比を取った像Ｐ３を図１１に示す。図１１は比を０．５（黒）〜１．０（白）となるように擬似色で蛍光強度比を示している。また、検量線となる曲線例として実施例２０で測定した化合物３を酵母に導入した際の各温度における蛍光スペクトルから蛍光強度比（５２０〜５６０ｎｍ／５７０〜６１０ｎｍ）を算出し、図１２に温度応答曲線を示した。さらに、各温度における顕微鏡写真より、撮影視野全体を囲み、蛍光強度比（Ｐ１／Ｐ２）と温度をプロットしたところ図１３のようになった。図１２と図１３は近い値を保っており、これより顕微鏡の蛍光強度比（図１１）から、図１２の検量線を用いて、細胞内の温度を算出することができることが明らかとなった。【０１５９】
この結果により、同一細胞での温度比較だけでなく、同一条件下に置かれた別の細胞の細胞内温度の比較も可能となることがわかった。具体的には、例えば酵母集団中における個々の細胞温度の違いにより、細胞の生理状態の把握などに利用することが出来る。【０１６０】
実施例２３：プローブの毒性評価
実施例１３のようにして、０．００５％、０．０２５％、０．０５％、０．２５％の濃度の化合物２〜７を、酵母サッカロマイセス属ＳＹＴ００１株と混合・懸濁し、ポリマーを細胞に導入した。ポリマーが導入された酵母を２回水で洗浄し、再度水で懸濁した後、ＹＰＤプレートに１０４、１０３、１０２、１０細胞となるようにスポットして、２日間２５℃で培養した後、プレートを撮影し、細胞毒性を定性的に評価した。【０１６１】
結果を図１４に示す。共重合体におけるＡＰＴＭＡのモル比率が９．１％を超えたところから添加量に応じて、徐々に毒性が高まることがわかった。特に共重合体におけるＡＰＴＡＭのモル比率が２５．６％になると、導入量によらずかなりの毒性があることがわかる。しかしながら、細胞内導入型の温度測定プローブとして有用な共重合体におけるＡＰＴＡＭのモル比率が３．３％ないしは５．７％の化合物２，３は導入量が０．０５％となった場合でも、毒性はあまり見られず、一方で、実施例１４、図２の結果から、ほぼ全ての細胞にプローブの導入が行われていることが考えられるため、細胞内にプローブが導入しても、細胞毒性は少ないことが示された。【０１６２】
実施例２４：培養細胞への本発明のプローブの応用
ヒト由来胎児腎細胞ＨＥＫ２９３Ｔおよびマウス由来マクロファージ様前駆細胞ＲＡＷ２６４をＤＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ，１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）、３５ｍｍガラスボトムディッシュにて培養した（播種１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）。１日後、化合物１、４，７を終濃度０．０５％となるように添加し、３７℃で培養２時間後、顕微鏡観察時にＰＢＳで洗浄後、ｐｈｅｎｏｌｒｅｄ−ｆｒｅｅ培地に置換し、顕微鏡観察を行った。顕微鏡観察は、共焦点レーザー顕微鏡（ＦＶ１０００、Ｏｌｙｍｐｕｓ）、６０倍油浸対物レンズ（ＵｐｌａｎＳＡｐｏ  Ｎ．Ａ．１．４０，Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて観察した。細胞に４７３ｎｍのレーザー（Ｍｕｌｔｉ  Ａｒレーザー）を当て、５００ｎｍから６００ｎｍまでの蛍光波長に対する蛍光像を観察した。【０１６３】
ＨＥＫ２９３Ｔの結果を図１５に、ＲＡＷ２６４の結果を図１６に示す。図１５、１６ともに、イオン性基のない化合物７では蛍光像でのシグナルは全く観察できないが、カチオン性基ＡＰＴＭＡを導入した化合物４では細胞内部へのシグナル強度の増加がみられ、一方アニオン性基を導入した化合物１でも細胞内へのシグナルはやや見られるが、その数、強度ともに非常に弱く、細胞内へのプローブの導入にはカチオン性基が重要であることが示された。また、本発明のプローブが動物細胞でも応用可能であることが示された。【０１６４】
実施例２５：大腸菌への本発明のプローブの応用
大腸菌ＤＨ５αをＬＢ培地（トリプトン１０ｇ，イーストエキス５ｇ，塩化ナトリウム５ｇ）に植菌し、３７℃で１６時間培養した後、培養液の菌体濃度として６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６００）を測定した後、培養液を遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１分）し、水で洗浄を２回行い、充分に洗浄した後、ＯＤ６００が０．１となるように純水を添加し、懸濁した。菌体懸濁液に、５％の濃度で純水に溶かした化合物４を終濃度が０．０５％となるように添加し、０．５時間、２５℃で静置した。その後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１分）し、速やかに上清を除き、再度冷水で洗浄を１回行った。洗浄した大腸菌を再度水に懸濁し、ガラスボトムディッシュ（３５ｍｍ  Ｇｌａｓｓ  Ｂａｓｅ  Ｄｉｓｈ，ＩＷＡＫＩ）に注ぎ、ウォータージャケットステージインキュベータ（ＣＲＹＯ−ＷＪＭＳＩ，ｏｋｏｌａｂ）に載せ、温度を制御しながら、共焦点レーザー顕微鏡（ＦＶ１０００、Ｏｌｙｍｐｕｓ）、１００倍油浸対物レンズ（ＵｐｌａｎＳＡｐｏ  Ｎ．Ａ．１．４０，Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて観察した。細胞に４７３ｎｍのレーザー（Ｍｕｌｔｉ  Ａｒレーザー）を当て、５００ｎｍから６００ｎｍまでの蛍光波長に対する蛍光像を観察した。観察時の温度は２５℃と４１℃の２点で測定を行った。【０１６５】
結果を図１７に示す。図１７で示されるように大腸菌においても本発明のカチオン性温度プローブは細胞に導入され、温度に応じて蛍光強度が高い細胞が増えていくことが明らかとなった。つまり、大腸菌のような微生物にも本ポリマーは応用可能で、様々な細胞種に適用できることが示された。【０１６６】
実施例２６：細胞へのポリマー導入試験
酵母サッカロマイセス属ＳＹＴ００１株をＹＰＤ（酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコース２％）培地３ｍＬに植菌し、２５℃で１日間好気振とう培養した。培養液の菌体濃度として６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６００）を測定した後、培養液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）し、水で洗浄を２回行い、充分に洗浄した後、ＯＤ６００が１となるように純水を添加し、懸濁した。菌体懸濁液に、５％の濃度で純水に溶かした化合物８を終濃度が０．０５％となるように添加し、０．５時間、２５℃で静置した。その後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、１分）し、速やかに上清を除き、再度冷水で洗浄を１回行った。洗浄した酵母を再度水に懸濁し、酵母細胞懸濁液をスライドガラス（スーパーフロスト：ＭＡＴＵＮＡＭＩ）に載せ、カバーガラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ）で封をした後、スライドガラスをステージ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）に載せ、共焦点レーザー顕微鏡（ＦＶ１０００、Ｏｌｙｍｐｕｓ）、１００倍油浸対物レンズ（ＵｐｌａｎＳＡｐｏ  Ｎ．Ａ．１．４０，Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて観察した。細胞に４７３ｎｍのレーザー（Ｍｕｌｔｉ  Ａｒレーザー）を当て、５００ｎｍから６００ｎｍまでの蛍光波長に対する蛍光像を観察した。【０１６７】
化合物８を導入した際の蛍光像を図１８に示す。ユニット内にＡＰＴＭＡだけではなく、おなじくカチオン性ユニットであるＶＢＴＭＡが入っている場合でも、微分干渉像と重なるようにして、細胞内部に蛍光強度の高い領域が観察された。このことから、細胞導入型のカチオン性ユニットに関しては、ＡＰＴＭＡ以外の物質も利用できることがわかった。【０１６８】
実施例２７：感熱応答性試験
化合物８の１５０ｍＭ  ＫＣｌ中での感熱応答性試験を以下の手順で行った。ＪＡＳＣＯ  ＦＰ−６５００分光蛍光光度計を使用し、溶媒として、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社のＭｉｌｌｉ−Ｑ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍから得た超純水を用いて、和光純薬より購入したＫＣｌを１５０ｍＭの濃度になるように溶かしたものを用いた。当実験における化合物の初期濃度は０．０１ｗ／ｖ％とし、励起波長は４５６ｎｍとした。溶液の温度制御にはＪＡＳＣＯ  ＥＴＣ−２７３Ｔ水冷ペルチェ式恒温セルホルダを使用し、付属の熱電対により温度を測定した。溶液温度を２℃刻みで上昇させ、各温度における蛍光強度を測定した。【０１６９】
試験結果を図１９に示す。カチオン性ユニットとして、ＶＢＴＭＡを用いた場合でも、１５０ｍＭ塩化カリウム溶液中の温度上昇に応答して、蛍光強度の変化が確認できた。温度応答性に関しては全てのユニットにアクリルアミド、メタクリルアミドあるいはアクリル酸が含まれていることが望ましいが、本実施例のように共重合体におけるモル比率が１０％程度であればスチレン基など、一般的なビニル型モノマーがユニット内に含まれていても、温度に十分に応答するプローブとして機能することが明らかとなった。【０１７０】
実施例２８：酵母細胞内温度の測定
実施例１３のようにして、０．０５％濃度の化合物８を、酵母サッカロマイセス属ＳＹＴ００１株と混合・懸濁し、ポリマーを細胞に導入した。ポリマーが導入された細胞を水にＯＤ６００＝１の濃度で懸濁し、キュベットに入れ、さらにキュベット内に２ｍｍ直径の球状の攪拌子を入れた。キュベットをＪＡＳＣＯ  ＦＰ−６５００分光蛍光光度計にセットし、約６００ｒｐｍの速度で回転させ、酵母が沈むのを防ぎながら、蛍光スペクトルを測定した。励起波長は４５６ｎｍとした。溶液の温度制御にはＪＡＳＣＯ  ＥＴＣ−２７３Ｔ水冷ペルチェ式恒温セルホルダを使用し、付属の熱電対により温度を測定した。溶液温度を５℃刻みで上昇させ、細胞内部の温度と外部の温度を一定にするよう温度上昇後１０分静置し、各温度における蛍光強度を測定した。【０１７１】
測定結果を図２０に示す。なお、結果は５℃における蛍光強度を１とし、縦軸を相対蛍光強度で表した。蛍光波長は各化合物の最大蛍光強度を記録したときの蛍光波長を用いている。実施例１６における１５０ｍＭ  ＫＣｌ中でのポリマーの感熱応答性の結果と同様に、細胞内でも本発明で開発したポリマーは細胞内温度を反映し、温度上昇に伴って、細胞内蛍光強度が上昇した。実施例２６〜２８の結果により、ＡＰＴＭＡ以外のカチオン性ユニットを用いたプローブでも、細胞内にプローブを簡便に導入でき、かつ細胞の中で温度上昇に応答して蛍光強度が上昇する機能を持つことが明らかとなった。【０１７２】
実施例２９：化合物９および１０の酵母細胞へのポリマー導入試験
酵母サッカロマイセス属ＳＹＴ００１株をＹＰＤ（酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコース２％）培地３ｍＬに植菌し、２５℃で１日間好気振とう培養した。培養液の菌体濃度として６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６００）を測定した後、培養液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）し、１．２Ｍ ｓｏｒｂｉｔｏｌで洗浄を２回行い、充分に洗浄した後、ＯＤ６００が１となるように１．２Ｍ ｓｏｒｂｉｔｏｌを添加し、懸濁した。菌体懸濁液に、５％の濃度で純水に溶かした化合物９および１０を終濃度が０．０５％となるように添加し、２０分、２５℃で静置した。その後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１分）し、速やかに上清を除き、再度氷冷１．２Ｍ ｓｏｒｂｉｔｏｌ, ５０ｍＭ  ＫＣｌで洗浄を１回行った。洗浄した酵母を再度１．２Ｍ ｓｏｒｂｉｔｏｌに懸濁し、酵母細胞懸濁液をスライドガラス（スーパーフロスト：ＭＡＴＵＮＡＭＩ）に載せ、カバーガラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ）で封をした後、スライドガラスをステージ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）に載せ、共焦点レーザー顕微鏡（ＦＶ１０００、Ｏｌｙｍｐｕｓ）、１００倍油浸対物レンズ（ＵｐｌａｎＳＡｐｏ  Ｎ．Ａ．１．４０，Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて観察した。細胞に４７３ｎｍのレーザー（Ｍｕｌｔｉ  Ａｒレーザー）を当て、５００ｎｍから６００ｎｍまでの蛍光波長に対する蛍光像を観察した。【０１７３】
化合物９および１０を導入した際の蛍光像を図２１に示す。感熱性ユニットにＮＮＰＡＭ以外のものを用いても、プローブを細胞内に導入できることが確認できた。またＮＩＰＡＭとＮＮＰＡＭの２つの感熱性応答ユニットを用いた場合にもプローブを細胞内に導入できることが確かめられた。【０１７４】
実施例３０：感熱応答性試験
化合物２、９および１０の１５０ｍＭ  ＫＣｌ中での感熱応答性試験を実施例１６のようにして行った。溶液温度は２℃刻みで上昇させ、各温度における蛍光強度を測定した。【０１７５】
試験結果を図２２に示す。感熱性応答部位をＮＮＰＡＭからＮＩＰＡＭへと変化させることで、温度応答領域を変更できることが確認できた。またその両方のモノマーを１：１の割合で混ぜて共重合体を合成したＮＮＰＡＭ／ＮＩＰＡＭにおいてはＮＮＰＡＭとＮＩＰＡＭの温度応答領域の中間に位置することがわかり、これら比率を変えることによって、３０℃〜５０℃付近の任意の温度領域に応答する蛍光温度センサーが作れることが確認できた。【０１７６】
実施例３１：感熱性応答ユニットの違いによる酵母細胞内温度の測定範囲の変化
実施例２９のようにして、０．０５％濃度の化合物２、９および１０を、酵母サッカロマイセス属ＳＹＴ００１株と混合・懸濁し、ポリマーを細胞に導入した。ポリマーが導入された細胞をＰＢＳにＯＤ６００＝１の濃度で懸濁し、キュベットに入れ、さらにキュベット内に２ｍｍ直径の球状の攪拌子を入れた。キュベットをＪＡＳＣＯ  ＦＰ−６５００分光蛍光光度計にセットし、約８００ｒｐｍの速度で回転させ、酵母が沈むのを防ぎながら、蛍光スペクトルを測定した。励起波長は４５６ｎｍとした。溶液の温度制御にはＪＡＳＣＯ  ＥＴＣ−２７３Ｔ水冷ペルチェ式恒温セルホルダを使用し、付属の温度計によりセルホルダー内の温度を測定した。溶液温度を５℃刻みで上昇させ、細胞内部の温度と外部の温度を一定にするよう温度上昇後５分静置し、各温度における蛍光強度を測定した。【０１７７】
測定結果を図２３に示す。なお、結果は１０℃における蛍光強度を１とし、縦軸を相対蛍光強度で表した。蛍光波長は各化合物の最大蛍光強度を記録したときの蛍光波長を用いている。感熱性応答部位をＮＮＰＡＭにした場合には２５℃〜３５℃の範囲で蛍光強度が変化し、ＮＮＰＡＭ/ＮＩＰＡＭの場合には３０℃〜４０℃、ＮＩＰＡＭ単独の場合には３５℃以上で蛍光強度が変化していることが明らかとなった。溶液中で温度応答領域を変化できることは図２２からも明らかであったが、細胞内においてもその応答領域を大きく変えることなく、測定したい細胞内温度領域に応じて自由に感熱性応答部位を変えることができることを証明できた。【０１７８】
実施例３２：蛍光寿命変化の感熱応答試験
実施例３１で作製した化合物２、９および１０の入った酵母懸濁液を用いて、蛍光寿命変化の感熱性応答試験を行った。ＦｌｕｏｒｏＣｕｂｅ  ３０００Ｕ（Ｈｏｒｉｂａ  Ｊｏｂｉｎ  Ｙｖｏｎ）時間相関単一光子計数法蛍光寿命測定装置を使用して、励起波長は４５６ｎｍとした。溶液の励起には、ＬＥＤ（ＮａｎｏＬＥＤ−４５６，ＨＯｒｉｂａ）を用いて、パルス繰り返し数１ＭＨｚで測定を行った。溶液の温度制御にはＪＡＳＣＯ  ＥＴＣ−２７３Ｔ水冷ペルチェ式恒温セルホルダを使用し、付属の温度計によりセルホルダー内の温度を測定した。測定前に熱電対により溶液の温度が安定したことを確認した後、各温度における蛍光寿命を蛍光波長５６０ｎｍとして測定した。得られた蛍光減衰曲線を以下に示す式により近似し、２成分の蛍光寿命を得た。【０１７９】
【数１】
0005514368.tif 000017
【０１８０】
得られた蛍光寿命から、以下に示す式を用いて各温度における平均蛍光寿命を算出した。【０１８１】
【数２】
0005514368.tif 000018
【０１８２】
試験結果を図２４に示す。実施例３１の結果と同様に、感熱性応答部位をＮＮＰＡＭにした場合には２５℃〜３５℃の範囲で蛍光寿命が変化し、ＮＮＰＡＭ/ＮＩＰＡＭの場合には３０℃〜４０℃、ＮＩＰＡＭ単独の場合には３５℃以上で蛍光寿命が変化していることが明らかとなった。高温になるにつれて平均蛍光寿命が延長し、温度の変化に鋭敏に反応して平均蛍光寿命が変化することが確認された。【０１８３】
実施例３３：培養細胞（浮遊細胞）へのプローブ導入
ＭＯＬＴ−４（ヒト急性リンパ芽球性白血病(Ｔ−細胞)）をＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＢＳ）、１００ｍｍディッシュにて培養した（播種１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）。１日後、培養液３ｍｌを遠心（１０００ｒｐｍ、１分）し、培地を取り除き、５％グルコースで洗浄後、再度５％グルコース１ｍｌで懸濁し、化合物２を終濃度０．０５％となるように添加した。１５℃、１０分後、遠心し、上清を取り除き、ＰＢＳで洗浄後、ＰＢＳに懸濁し、プローブが導入されているかの確認を顕微鏡観察にて行った。共焦点レーザー顕微鏡（ＦＶ１０００、Ｏｌｙｍｐｕｓ）、６０倍油浸対物レンズ（ＵｐｌａｎＳＡｐｏ  Ｎ．Ａ．１．４０，Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて観察し、細胞に４７３ｎｍのレーザー（Ｍｕｌｔｉ  Ａｒレーザー）を当て、５００ｎｍから６００ｎｍまでの蛍光波長に対する蛍光像を観察した。【０１８４】
結果を図２５に示す。浮遊細胞であるＭＯＬＴ４においてもプローブの導入が確認できた。【０１８５】
実施例３４：培養細胞（浮遊細胞）における化合物９および１０の蛍光強度応答
実施例３３のようにして、ＭＯＬＴ−４へ化合物２、９および１０の導入を行い、ＰＢＳに懸濁した状態でキュベットに入れ、さらにキュベット内に２ｍｍ直径の球状の攪拌子を入れた。キュベットをＪＡＳＣＯ  ＦＰ−６５００分光蛍光光度計にセットし、約８００ｒｐｍの速度で回転させ、細胞が沈むのを防ぎながら、蛍光スペクトルを測定した。励起波長は４５６ｎｍとした。溶液の温度制御にはＪＡＳＣＯ  ＥＴＣ−２７３Ｔ水冷ペルチェ式恒温セルホルダを使用し、付属の温度計によりセルホルダー内の温度を測定した。溶液温度を５℃刻みで上昇させ、細胞内部の温度と外部の温度を一定にするよう温度上昇後５分静置し、各温度における蛍光強度を測定した。【０１８６】
結果を図２６に示す。低温領域側から、ＮＮＰＡＭ，ＮＮＰＡＭ／ＮＩＰＡＭ，ＮＩＰＡＭの順に細胞内でも応答することが明らかとなった。これは実施例３１の酵母の実験結果と同様であり、培養細胞においても目的の測定温度に対応する感熱性応答ユニットを選択し、測定できる事が示された。【０１８７】
実施例３５：培養細胞（浮遊細胞）における化合物９および１０の蛍光寿命応答
実施例３３のようにして作製した化合物２、９または１０が導入されたＭＯＬＴ−４を用いて、蛍光寿命を測定した。ＰＢＳに懸濁した状態で測定し、測定方法は実施例３２と全く同様である。【０１８８】
結果を図２７に示す。図２６と同様に、低温領域側から、ＮＮＰＡＭ，ＮＮＰＡＭ／ＮＩＰＡＭ，ＮＩＰＡＭの順に細胞内でも応答することが明らかとなった。実施例３４の結果とあわせて、培養細胞においても目的の測定温度に対応する感熱性応答ユニットを選択し、測定できる事が強く示された。【０１８９】
実施例３６：顕微鏡観察における化合物９および１０の効果
ＨＥＫ２９３ＴをＤＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ，１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）、３５ｍｍガラスボトムディッシュにて培養した（播種１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）。１日後、培地を５％グルコースに置換し、化合物２、９または１０を終濃度０．０５％となるように添加し、１５℃、１０分後、ＰＢＳで洗浄後、ｐｈｅｎｏｌｒｅｄ−ｆｒｅｅ培地に置換し、顕微鏡観察を行った。顕微鏡観察は、共焦点レーザー顕微鏡（ＦＶ１０００、Ｏｌｙｍｐｕｓ）、６０倍油浸対物レンズ（ＵｐｌａｎＳＡｐｏ  Ｎ．Ａ．１．４０，Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて観察した。細胞に４７３ｎｍのレーザー（Ｍｕｌｔｉ  Ａｒレーザー）を当て、５００ｎｍから６００ｎｍまでの蛍光波長に対する蛍光像を観察した。【０１９０】
結果を図２８に示す。感熱性ユニットにＮＮＰＡＭを用いると、細胞の最適増殖温度である３７℃付近での蛍光強度の上昇はあまり見られないのに対して、ＮＮＰＡＭ／ＮＩＰＡＭを用いることで、３７℃付近での強い蛍光応答が見られることが顕微鏡観察からも明らかとなった。また、ＮＩＰＡＭを用いる事で、さらに高温領域も測定可能になることが予想された。この結果により、顕微鏡観察においても感熱性ユニットの使い分けができることが示された。【０１９１】
実施例３７：顕微鏡観察（蛍光強度比測定）における化合物９の効果
実施例３６のようにしてＨＥＫ２９３Ｔに化合物９を導入したサンプルを用いて、蛍光強度比を測定し、蛍光強度に依らず、温度測定ができるかどうかを調べた。顕微鏡観察は、共焦点レーザー顕微鏡（ＦＶ１０００、Ｏｌｙｍｐｕｓ）、６０倍油浸対物レンズ（ＵｐｌａｎＳＡｐｏ  Ｎ．Ａ．１．４０，Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて観察した。細胞に４７３ｎｍのレーザー（Ｍｕｌｔｉ  Ａｒレーザー）を当て、５００ｎｍから５５０ｎｍまでの蛍光波長に対する蛍光像（ＣＨ１）と６００ｎｍから６５０ｎｍまでの蛍光波長に対する蛍光像（ＣＨ２）、そしてＣＨ１の蛍光強度をＣＨ２の蛍光強度で除したＲａｔｉｏ像を観察した。【０１９２】
結果を図２９に示す。ＣＨ１とＣＨ２だけでは、単純に蛍光強度があがっていないような細胞でもＲａｔｉｏを取る事によりＲａｔｉｏ比が増大していることが明確になり、温度が上昇している事が明確に示された。
【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２６】
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【図２７】
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【図１】
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【図３】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２１】
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【図２５】
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【図２８】
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【図２９】
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