(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多光子励起させるための光を第１光源から照射させることにより蛍光を発する代謝産物であるＨＦＣ（7-Hydroxytrifluoromethylcoumarin）に対して、標体における測定対象とすべき領域の一部分である消光領域に、蛍光を消光させるための波長５００ｎｍ以下の光を第２光源から照射させる照射制御ステップと、
上記消光領域と、上記測定対象とすべき領域における上記消光領域以外の領域である非消光領域とにおける、上記照射制御ステップにおいて上記第２光源から光を照射させ終わった直後からの、基質であるＭＦＣ（7-Methoxy-trifluoromethylcoumarin）が測定対象の酵素であるＣＹＰ４５０によって新たに代謝されて得られる上記代謝産物から発光させる蛍光の程度を測定する測定ステップと、
上記測定ステップにより測定された蛍光の程度に基づいて、上記酵素の酵素活性を算出する算出ステップと
を有する酵素活性測定方法。
【請求項２】
上記算出ステップでは、
上記消光領域及び上記非消光領域それぞれにおける上記酵素の酵素活性を算出し、その平均を取る
請求項１に記載の酵素活性測定方法。
【請求項３】
上記測定対象の酵素は、ＣＹＰ２Ｃ９である
請求項１に記載の酵素活性測定方法。
【請求項４】
上記第１光源は、フェムト秒レーザである
請求項１に記載の酵素活性測定方法。
【請求項５】
上記第２光源は、ピコ秒又はナノ秒パルスレーザである
請求項１に記載の酵素活性測定方法。
【請求項６】
測定対象の酵素であるＣＹＰ４５０によって基質であるＭＦＣ（7-Methoxy-trifluoromethylcoumarin）が代謝されて得られる代謝産物であるＨＦＣ（7-Hydroxytrifluoromethylcoumarin）を多光子励起させるための光を出射する第１光源と、
上記代謝産物が発する蛍光を消光させるための波長５００ｎｍ以下の光を出射する第２光源と、
上記第１光源及び第２光源から光を標体における測定対象とすべき領域の一部分である消光領域に対して照射させる照射制御部と、
上記消光領域と、上記測定対象とすべき領域における上記消光領域以外の領域である非消光領域とにおける、上記第２光源から光を照射させ終わった直後からの、上記基質が上記測定対象の酵素によって新たに代謝されて得られる上記代謝産物から発光させる蛍光の程度を測定する測定部と、
上記測定部により測定された蛍光の程度に基づいて、上記酵素の酵素活性を算出する算出部と
を有する酵素活性測定装置。
【請求項７】
コンピュータに対して、
多光子励起させるための光を第１光源から照射させることにより蛍光を発する代謝産物であるＨＦＣ（7-Hydroxytrifluoromethylcoumarin）に対して、標体における測定対象とすべき領域の一部分である消光領域に、蛍光を消光させるための波長５００ｎｍ以下の光を第２光源から照射させる照射制御ステップと、
上記消光領域と、上記測定対象とすべき領域における上記消光領域以外の領域である非消光領域とにおける、上記照射制御ステップにおいて上記第２光源から光を照射させ終わった直後からの、基質であるＭＦＣ（7-Methoxy-trifluoromethylcoumarin）が測定対象の酵素であるＣＹＰ４５０によって新たに代謝されて得られる上記代謝産物から発光させる蛍光の程度を測定する測定ステップと、
上記測定ステップにより測定された蛍光の程度に基づいて、上記酵素の酵素活性を算出する算出ステップと
を実行させる酵素活性測定プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は酵素活性測定方法、酵素活性測定装置及び酵素活性測定プログラムに関し、例えば生体組織や生細胞内の酵素活性を測定する分野に適用して好適なものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、生体組織や細胞内の酵素活性を測定する酵素活性測定装置は、基質が酵素と反応することにより得られる代謝産物にレーザ光を照射して励起させ、該励起された代謝産物が発する蛍光の強度を検出する。そして酵素活性測定装置は、検出された蛍光の強度に基づいて酵素活性を測定するようになされている（例えば特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００８−２８９４３７公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ところで上述した酵素活性測定装置では、測定対象となる生体組織や細胞に基質を浸透させた後、ある一定の時間が経過してから代謝産物が発する蛍光の強度を検出することになる。
【０００５】
このような場合、蛍光強度の検出を開始する以前に基質と酵素とが反応してしまうため、測定開始時点である一定の蛍光強度を検出し、そこから代謝に従って増加する蛍光強度を基に酵素活性を測定することになる。
【０００６】
従って酵素活性測定装置では、蛍光強度の変化が微小な場合、測定開始時点での蛍光強度に対して時間経過と共に変化する蛍光強度が小さいため、蛍光強度の測定誤差の影響を大きく受けてしまい、酵素活性を精度よく測定することができないという問題があった。
【０００７】
本発明は以上の点を考慮してなされたもので、酵素活性を短時間で精度よく測定し得る酵素活性測定方法、酵素活性測定装置及び酵素活性測定プログラムを提案しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
かかる課題を解決するため本発明においては、多光子励起させるための光を第１光源から照射させることにより蛍光を発する代謝産物であるＨＦＣ（7-Hydroxytrifluoromethylcoumarin）に対して、標体における測定対象とすべき領域の一部分である消光領域に、蛍光を消光させるための波長５００ｎｍ以下の光を第２光源から照射させる照射制御ステップと、消光領域と、測定対象とすべき領域における消光領域以外の領域である非消光領域とにおける、照射制御ステップにおいて第２光源から光を照射させ終わった直後からの、基質であるＭＦＣ（7-Methoxy-trifluoromethylcoumarin）が測定対象の酵素であるＣＹＰ４５０によって新たに代謝されて得られる代謝産物から発光させる蛍光の程度を測定する測定ステップと、測定ステップにより測定された蛍光の程度に基づいて、酵素の酵素活性を算出する算出ステップとを有する。
【０００９】
また本発明においては、測定対象の酵素であるＣＹＰ４５０によって基質であるＭＦＣ（7-Methoxy-trifluoromethylcoumarin）が代謝されて得られる代謝産物であるＨＦＣ（7-Hydroxytrifluoromethylcoumarin）を多光子励起させるための光を出射する第１光源と、代謝産物が発する蛍光を消光させるための波長５００ｎｍ以下の光を出射する第２光源と、第１光源及び第２光源から光を標体における測定対象とすべき領域の一部分である消光領域に対して照射させる照射制御部と、消光領域と、測定対象とすべき領域における消光領域以外の領域である非消光領域とにおける、第２光源から光を照射させ終わった直後からの、基質が測定対象の酵素によって新たに代謝されて得られる代謝産物から発光させる蛍光の程度を測定する測定部と、測定部により測定された蛍光の程度に基づいて、酵素の酵素活性を算出する算出部とを有する。
【００１０】
さらに本発明においては、コンピュータに対して多光子励起させるための光を第１光源から照射させることにより蛍光を発する代謝産物であるＨＦＣ（7-Hydroxytrifluoromethylcoumarin）に対して、標体における測定対象とすべき領域の一部分である消光領域に、蛍光を消光させるための波長５００ｎｍ以下の光を第２光源から照射させる照射制御ステップと、消光領域と、測定対象とすべき領域における消光領域以外の領域である非消光領域とにおける、照射制御ステップにおいて第２光源から光を照射させ終わった直後からの、基質であるＭＦＣ（7-Methoxy-trifluoromethylcoumarin）が測定対象の酵素であるＣＹＰ４５０によって新たに代謝されて得られる代謝産物から発光させる蛍光の程度を測定する測定ステップと、測定ステップにより測定された蛍光の程度に基づいて、酵素の酵素活性を算出する算出ステップとを実行させるようにした。
【００１１】
これにより、代謝産物を消光された直後から新たに得られる代謝産物が多光子励起されることによって発する蛍光の程度を測定し、該蛍光の程度に基づいて酵素活性を算出するので、消光直後における蛍光の程度を小さくして、該消光直後に対する時間の経過と共に変化する蛍光の程度の割合を大きくすることができる。
【発明の効果】
【００１２】
以上のように本発明によれば、代謝産物を消光された直後から新たに得られる代謝産物が多光子励起されることによって発する蛍光の程度を測定し、該蛍光の程度に基づいて酵素活性を算出するので、消光直後における蛍光の程度を小さくして、該消光直後に対する時間の経過と共に変化する蛍光の程度の割合を大きくすることができ、かくして酵素活性を短時間で精度よく測定し得る酵素活性測定方法、酵素活性測定装置及び酵素活性測定プログラムを実現できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】酵素活性測定装置を示す略線図である。
【図２】データ処理部の構成を示す略線図である。
【図３】酵素活性測定処理を実行するＣＰＵの機能的構成を示す略線図である。
【図４】蛍光画像を示す略線図である。
【図５】蛍光値測定グラフを示す略線図である。
【図６】第１の実施の形態における酵素活性測定処理手順の説明に供するフローチャートである。
【図７】従来の酵素活性測定装置における明視野画像及び蛍光画像を示す略線図である。
【図８】従来の酵素活性測定装置における蛍光値測定グラフを示す略線図である。
【図９】第２の実施の形態における酵素活性測定処理手順の説明に供するフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、発明を実施するための形態について説明する。なお、説明は以下の順序とする。
１．第１の実施の形態
２．第２の実施の形態
３．他の実施の形態
【００１５】
＜１．第１の実施の形態＞
［１−１．酵素活性測定装置の構成］
図１において、第１の実施の形態における酵素活性測定装置１を示す。この酵素活性測定装置１は、多光子顕微鏡２及びデータ処理部３を含む構成とされる。
【００１６】
ここで本実施の形態においては、生体組織や生細胞内であるin vivo下における測定対象酵素の酵素活性を測定する場合について説明する。より具体的には、肝臓を標体として用い、測定対象酵素として薬物代謝酵素であるチクトロームＰ４５０（以下、これをＣＹＰ４５０とも呼ぶ）のサブタイプであるＣＹＰ２Ｃ９を用いる場合について説明する。
【００１７】
測定対象酵素がＣＹＰ２Ｃ９の場合、基質として例えばＭＦＣ（7-Methoxy-trifluoromethylcoumarin）が用いられる。このＭＦＣは、そのままでは蛍光を発しないが、ＣＹＰ２Ｃ９によって蛍光物質であるＨＦＣ（7-Hydroxytrifluoromethylcoumarin）に代謝されると、蛍光を発するようになる。
【００１８】
多光子顕微鏡２は、基質又は代謝産物に対して多光子吸収を誘導する光源としてフェムト秒レーザ１１が設けられる。このフェムト秒レーザ１１は、波長６５０[ｎｍ]から１１００[ｎｍ]の範囲で離散的にパルス状のレーザ光を出射し得るようになされており、この範囲から基質又は代謝産物の吸収波長に合わせて波長が選択される。
【００１９】
具体的にはフェムト秒レーザ１１は、波長８３０[ｎｍ]が選択された場合、パルス幅が１００[ｆｓ]以下で、繰り返し周波数が８０[ＭＨｚ]である。また出力安定性が±５％程度であり、平均光出力が２[Ｗ]程度となる。
【００２０】
フェムト秒レーザ１１から出射されたレーザ光は、ビーム径を調節するためのビーム径調整器１２を透過し、ＸＹ平面（標体４における光軸と直交する平面）でレーザ光を走査させるガルバノミラー等でなるＸＹスキャナ１３によって反射される。
【００２１】
このビーム径調整器１２は、例えば２つのレンズにより構成されており、データ処理部３の制御の基に、一方のレンズを光軸方向に移動させることによりレーザ光のビーム径を調節し得るようになされている。
【００２２】
ＸＹスキャナ１３によって反射されたレーザ光は、ラインフィルタ１４、ダイクロイックミラー１５及び１６を透過して焦点位置調整機構１７に取り付けられた例えば６０倍の対物レンズ１８に入射される。
【００２３】
対物レンズ１８は、このレーザ光を標体４の表面から深さ方向に約２[ｍｍ]の位置に集光させる。
【００２４】
この多光子顕微鏡２では、対物レンズ１８によって集光されたレーザ光の焦点を中心としてＸＹ平面に直径が約０．３[μｍ]、Ｚ軸方向（光軸方向）に約１[μｍ]でなる紡錘型の領域で、ＨＦＣが多光子吸収することにより励起される。
【００２５】
このようにフェムト秒レーザ１１から出射されたレーザ光は、短パルス化されており、かつ単一パルスのエネルギーが小さいため、標体４を損傷することがない。また、このレーザ光は、対物レンズ１８によって集光された場合、その焦点付近では非常に高い光子密度となり、ＨＦＣの多光子励起現象が起こる。この多光子励起現象は焦点付近の限られた領域でのみ起こるので、励起される部位が限定的であり、標体４の表面から深部で起こるため、標体４として用いられた肝臓細胞組織だけで励起させることができる。
【００２６】
因みに、対物レンズ１８と標体４との間には、乾燥防止アガロース５が設けられており、該標体４の乾燥を防止する。
【００２７】
対物レンズ１８によって集光されたレーザ光に励起されたＨＦＣの蛍光は、５００〜６３０［ｎｍ］の発光をする。その発光のうち中心波長が約５２０[ｎｍ]で、波長域が５０[ｎｍ]の発光を利用する。この発光によって得られる光（以下、これを蛍光光とも呼ぶ）は、対物レンズ１８及びダイクロイックミラー１６を透過してダイクロイックミラー１５で反射される。
【００２８】
このダイクロイックミラー１５は、例えば波長が６００[ｎｍ]以下の光を反射し、それより大きな波長の光を透過するようになされており、フェムト秒レーザ１１から出射された光ビームを透過し、蛍光光を反射する。
【００２９】
ダイクロイックミラー１５によって反射された蛍光光はショートパスフィルタ１９を透過し、集光レンズ２０によって集光されて光検出器２１に到達する。このショートパスフィルタ１９は、波長が６００[ｎｍ]以下の光を透過する。
【００３０】
光検出器２１は、例えばＰＭＴ（Photomultiplier Tube）でなり、集光された蛍光光を光電効果により電気信号に変換し、蛍光光の強度に応じた蛍光値のデータをデータ処理部３に出力する。
【００３１】
一方、多光子顕微鏡２には、例えば波長が３００[ｎｍ]〜９５０[ｎｍ]でなる光を出射する白色光源２２、コリメータレンズ２３、及び波長が８００[ｎｍ]以上の光を透過するロングパスフィルタ２４からなる落射光学系２５が所定高さ位置に設けられる。
【００３２】
白色光源２２から出射された光は、コリメータレンズ２３により平行光に変換され、ロングパスフィルタ２４を透過した光（以下、これを赤外光とも呼ぶ）が標体４に照射される。
【００３３】
この赤外光が標体４で反射され、該反射された光（以下、これを反射光とも呼ぶ）が対物レンズ１８、ダイクロイックミラー１６及び１５を透過してラインフィルタ１４で反射される。
【００３４】
このラインフィルタ１４は、フェムト秒レーザ１１から出射された例えば波長８３０[ｎｍ]の光ビームを透過し、それ以外の波長でなる光を反射するようになされており、反射光を反射する。
【００３５】
ラインフィルタ１４で反射された反射光は、ロングパスフィルタ２６により例えば波長が８００[ｎｍ]以上の帯域だけ透過され、結像レンズ２７により赤外領域に感度のあるＣＣＤ（Charge Coupled Device）２８に標体４の像として結像される。このＣＣＤ２８は、赤外領域に感度のあるため、赤外光の組織透過性を利用して標体４内部の像を取得することができる。
【００３６】
ＣＣＤ２８は、結像されることにより得られる標体４の像を所定形式のデータ（以下、これを赤外画像データとも呼ぶ）に変換し、該赤外画像データをデータ処理部３に出力する。
【００３７】
ところで多光子顕微鏡２は、フェムト秒レーザ１１からレーザ光が出射されていない場合、ダイクロイックミラー１５、１６及びロングパスフィルタ２４、２６を光路から外せるようになされている。
【００３８】
これにより多光子顕微鏡２は、白色光源２２から出射された光が標体４で反射され、対物レンズ１８、ラインフィルタ１４及び結像レンズ２７を介してＣＣＤ２８に結像されることにより、明視野の標体４の像を取得し得るようになされている。ＣＣＤ２８は、結像されることにより得られる明視野の標体４の像を所定形式のデータ（以下、これを明視野画像データとも呼ぶ）に変換し、該明視野画像データをデータ処理部３に出力する。
【００３９】
多光子顕微鏡２は、これら構成に加えて、例えば１００[Ｗ]の水銀ランプ２９、集光レンズ３０、シャッタ３１及びショートパスフィルタ３２が設けられる。
【００４０】
ＨＦＣが多光子励起されている場合に発する蛍光を消光させるための光（以下、これを消光光とも呼ぶ）が水銀ランプ２９から出射され、集光レンズ３０により平行光に変換され、シャッタ３１に到達する。
【００４１】
シャッタ３１は、データ処理部３の制御に基づいて開閉を行い、開いている時には消光光を透過し、閉じているときには該消光光を遮断する。
【００４２】
シャッタ３１が開いてきるときに透過された消光光は、例えば波長が５００[ｎｍ]以下でなる光を透過するショートパスフィルタ３２を透過してダイクロイックミラー１６で反射され、対物レンズ１８により集光されて標体４に照射されるようになされている。
【００４３】
因みにダイクロイックミラー１６は、例えば波長が５００[ｎｍ]以下でなる光を反射し、それより大きな波長の光を透過するようになされている。
【００４４】
［１−２．データ処理部の構成］
次に、データ処理部３の構成について説明する。このデータ処理部３は、図２に示すように、制御を司るＣＰＵ(Central Processing Unit)４１に対して各種ハードウェアを接続することにより構成される。
【００４５】
具体的にはＲＯＭ(Read Only Memory)４２、ＣＰＵ４１のワークメモリとなるＲＡＭ(Random Access Memory)４３、ユーザの操作に応じた命令を入力する操作入力部４４、インターフェイス部４５、表示部４６及び記憶部４７がバス４８を介して接続される。
【００４６】
ＲＯＭ４２には、各種の処理を実行するためのプログラムが格納される。インターフェイス部４５には、多光子顕微鏡２のフェムト秒レーザ１１、ビーム径調整器１２、ＸＹスキャナ１３、焦点位置調整機構１７、光検出器２１、ＣＣＤ２８及びシャッタ３１などが接続される。
【００４７】
表示部４６には、液晶ディスプレイ、ＥＬ（Electro Luminescence）ディスプレイ又はプラズマディスプレイ等が適用される。また記憶部４７には、ＨＤ（Hard Disc）に代表される磁気ディスクもしくは半導体メモリ又は光ディスク等が適用される。
【００４８】
ＣＰＵ４１は、ＲＯＭ４２に格納される複数のプログラムのうち、操作入力部４４から与えられる命令に対応するプログラムをＲＡＭ４３に展開し、該展開したプログラムに従って、表示部４６及び記憶部４７を適宜制御する。
【００４９】
またＣＰＵ４１は、展開したプログラムに従って、インターフェイス部４５を介してフェムト秒レーザ１１、ビーム径調整器１２、ＸＹスキャナ１３、焦点位置調整機構１７、光検出器２１、ＣＣＤ２８及びシャッタ３１などを適宜制御するようになされている。
【００５０】
[１−３．酵素活性測定処理]
次に、in vivo下で肝臓を標体４とした場合での、ＣＹＰ４５０のサブタイプであるＣＹＰ２Ｃ９の酵素活性を測定する酵素活性測定処理について説明する。
【００５１】
因みに、酵素活性測定処理を実行する前に、ＣＹＰ２Ｃ９の基質であるＭＦＣを例えば２．５[μＭ]の濃度で溶解させた生理食塩水を静脈注射、腹腔内注射、或いは標体４に塗布させることにより被験者に対して予め投与させる。
【００５２】
ＣＰＵ４１は、酵素活性測定処理の実行命令を操作入力部４４から受けた場合、該実行命令に対応するプログラムにしたがって、図３に示すように、画像取得部５１、領域設定部５２、蛍光値測定部５３、照射制御部５４、酵素活性算出部５５として機能する。
【００５３】
画像取得部５１は、ＣＣＤ２８により生成された赤外画像データ又は明視野画像データを取得すると、該赤外画像データ又は明視野画像データに対応する画像を表示部４６に表示する。
【００５４】
このときユーザは、表示部４６に表示された画像を確認しながら、酵素活性を測定する領域（以下、これを測定領域とも呼ぶ）を操作入力部４４を介して特定する。この操作に応じて領域設定部５２は、酵素活性を測定する領域を測定領域として設定し、該測定領域に対物レンズ１８の焦点を移動させる。
【００５５】
蛍光値測定部５３は、フェムト秒レーザ１１を標体４の測定領域に照射させ、ＭＦＣが代謝されて得られるＨＦＣを多光子励起させることにより蛍光を発光させる。そして蛍光値測定部５３は、光検出器２１で測定された蛍光値を所定時間間隔ごとに取得し、取得したときの時刻と対応付けて測定データとして記憶部４７に記憶する。
【００５６】
このとき画像取得部５１は、操作入力部４４の操作に応じて、ＸＹスキャナ１３にレーザ光を走査させ、該レーザ光の走査位置と、光検出器２１で測定された蛍光値とを基に、蛍光画像を生成し得るようになされている。
【００５７】
画像取得部５１は、図４（Ａ）に示すような蛍光画像ＰＧ１を生成して表示部４６に表示することにより、基質であるＭＦＣが標体４に到達していることをユーザに確認させる。
【００５８】
照射制御部５４は、例えば操作入力部４４の操作をトリガとして、シャッタ３１を開き、水銀ランプ２９から出射されてショートパスフィルタ３２を透過した波長５００[ｎｍ]以下の消光光を標体４の測定領域に対して照射する。これにより標体４の測定領域では、蛍光を発していたＨＦＣの光活性機能が消失され、該ＨＦＣが消光する。
【００５９】
照射制御部５４は、シャッタ３１を開くと、蛍光値測定部５３で測定される蛍光値を取得し、標体４の測定領域が消光されたとすべき値に設定された閾値未満に該蛍光値がなったタイミングでシャッタ３１を閉じる。このシャッタ３１が開いている時間としては大よそ０．１[ｓ]から１０[ｓ]の範囲である。
【００６０】
このとき標体４の測定領域は、図４（Ｂ）の蛍光画像ＰＧ２に示すように、消光光が照射されることにより消光している。
【００６１】
蛍光値測定部５３は、照射制御部５４によりシャッタ３１が閉められた時点を回復開始時刻Ｔ０として設定し、光検出器２１で測定された蛍光値を所定時間間隔ごとに取得し、取得したときの時刻と対応付けて測定データとして記憶部４７に記憶する。
【００６２】
このとき標体４の測定領域では、回復開始時刻Ｔ０以降にＣＹＰ２Ｃ９によって新たに代謝されて得られるＨＦＣが多光子吸収することにより蛍光を発する。従って図４（Ｃ）に示すように、回復開始時刻Ｔ０からある一定の時間が経過した後の蛍光画像ＰＧ３では蛍光が回復している。
【００６３】
このようにして蛍光値測定部５３によって測定された測定データを基に、横軸に測定時間、縦軸に蛍光値をとったグラフを図５に示す。このグラフにおいて約１２[ｓ]から１５[ｓ]までの斜線で示した領域では、標体４の測定領域に対して水銀ランプ２９から出射された消光光が照射されていることを示す。
【００６４】
このグラフからもわかるように、測定を開始した時点（０[ｓ]）で既にＣＹＰ２Ｃ９によってＭＦＣが代謝されおり、これによってある一定の蛍光値が検出されている。その後、消光光が照射されることによって蛍光値が大幅に減少する。そして消光光の照射後、新たにＣＹＰ２Ｃ９によってＭＦＣが代謝され、蛍光値の増加が測定される。
【００６５】
酵素活性算出部５５は、蛍光値測定部５３によって測定された測定データから回復開始時刻Ｔ０での蛍光値Ｆ０と、該回復開始時刻Ｔ０から所定時間経過した時刻Ｔでの蛍光値Ｆｔとを読み出す。
【００６６】
そして酵素活性算出部５５は、酵素活性（Ｋ）を次式
【００６７】
Ｋ＝ａ（Ｆｔ−Ｆ０）／（Ｔ−Ｔ０）                      ……（１）
【００６８】
を用いて算出する。ここでａは、補正係数を表し、例えば、ＭＦＣと同時に投与された濃度既存のＣＹＰ酵素によって代謝されない蛍光物質からの蛍光量を基にした検量線から得られる値を用いる。
【００６９】
［１−４．酵素活性測定処理手順］
次に、上述した酵素活性測定処理の手順について、図６に示すフローチャートを用いて説明する。因みに、酵素活性測定処理が実行される前にＭＦＣが被験者に投与される。
【００７０】
実際上、ＣＰＵ４１は、ルーチンＲＴ１の開始ステップから入って次のステップＳＰ１へ移る。ステップＳＰ１においてＣＰＵ４１は、ＣＣＤ２８により生成された赤外画像データ又は明視野画像データを取得すると、該赤外画像データ又は明視野画像データに対応する画像を表示部４６に表示し、次のステップＳＰ２に移る。
【００７１】
ステップＳＰ２においてＣＰＵ４１は、表示部４６に表示された画像を確認させながら操作入力部４４を介して特定された領域を測定領域に設定し、該測定領域に対物レンズ１８の焦点を移動させ、次のステップＳＰ３に移る。
【００７２】
ステップＳＰ３においてＣＰＵ４１は、フェムト秒レーザ１１から出射されたレーザ光を標体４の測定領域に照射させ、ＨＦＣを多光子励起させることにより蛍光を発光させる。そしてＣＰＵ４１は、光検出器２１で測定された蛍光値を所定時間間隔ごとに取得し、取得したときの時刻と対応付けて測定データとして記憶部４７に記憶し、次のステップＳＰ４に移る。
【００７３】
ステップＳＰ４においてＣＰＵ４１は、例えば操作入力部４４の操作をトリガとして、シャッタ３１を開き、水銀ランプ２９から出射された波長が５００[ｎｍ]以下の消光光を標体４の測定領域に対して照射し、次のステップＳＰ５に移る。
【００７４】
ステップＳＰ５においてＣＰＵ４１は、標体４の測定領域の蛍光値が閾値未満になったか否かを判断し、否定結果が得られると、標体４の測定領域の蛍光値が閾値未満になるまでステップＳＰ５を繰り返す。
【００７５】
これに対してステップＳＰ５において肯定結果が得られると、このことは、標体４の測定領域の蛍光値が閾値未満になったことを意味し、このときＣＰＵ４１は次のステップＳＰ６に移る。
【００７６】
ステップＳＰ６においてＣＰＵ４１は、シャッタ３１を閉じて標体４の測定領域に対して消光光を遮断させ、この時点を回復開始時刻Ｔ０として設定し、次のステップＳＰ７に移る。因みにＣＰＵ４１は、ステップＳＰ３において開始した蛍光値の測定をステップＳＰ３からステップＳＰ７まで継続して行うようになされている。
【００７７】
ステップＳＰ７においてＣＰＵ４１は、測定された蛍光値と測定時刻とが対応付けられた測定データを基に、（１）式を用いて酵素活性（Ｋ）を算出し、次のステップＳＰ８に移って処理を終了する。
【００７８】
［１−５．動作及び効果］
以上の構成において酵素活性測定装置１は、水銀ランプ２９から出射された波長５００[ｎｍ]以下の消光光を標体４の測定領域に対して照射させ、該測定領域における代謝産物であるＨＦＣを消光させる。
【００７９】
酵素活性測定装置１は、ＨＦＣを消光させた時点を回復開始時刻Ｔ０に設定し、フェムト秒レーザ１１を標体４の測定領域に照射させ、該測定領域で新たに得られるＨＦＣを多光子励起させて蛍光を発光させ、蛍光の強度を蛍光値として光検出器２１により測定する。
【００８０】
酵素活性測定装置１は、測定された蛍光値と測定時刻とに基づいて、（１）式を用いて酵素活性（Ｋ）を算出する。
【００８１】
これにより酵素活性測定装置１は、消光させた時点（回復開始時刻Ｔ０）からの蛍光値の変化を用いて酵素活性（Ｋ）を算出するので、回復開始時刻Ｔ０における蛍光値が小さくなり、微小な蛍光値の増加でも酵素活性（Ｋ）を精度よく測定することができる。
【００８２】
ここで、従来の酵素活性測定方法について説明する。例えば、図７（Ａ）の赤外画像ＰＧ４に示すような培養肝臓細胞に対してＭＦＣを投与し、測定を開始した時点を測定開始時刻として蛍光値を測定する。
【００８３】
このような酵素活性測定方法では、図７（Ｂ）の蛍光画像ＰＧ５に示すように、代謝産物であるＨＦＣが多く存在する状態で測定開始時刻を設定することになる。
【００８４】
これは、培養肝臓細胞に対してＭＦＣを投与した後、ＣＹＰ２Ｃ９がＭＦＣを代謝し始めるタイミングがわからないので、ある程度の代謝が始まってから蛍光値を測定することになるからである。
【００８５】
そしてこの酵素活性測定方法では、測定開始時刻から例えば所定間隔ごとに蛍光値を測定し、該蛍光値及び測定時刻に基づいて酵素活性（Ｋ）を算出するようになされている。
【００８６】
このような場合、測定開始時刻から１５０[ｓ]後の蛍光画像ＰＧ６を図７（Ｃ）に示すように、測定開始時刻での蛍光画像ＰＧ５（図７（Ｂ））と比較して、ほとんど変化が見られないことが分かる。
【００８７】
この酵素活性測定方法で測定された蛍光値測定グラフを図８に示す。このグラフからも分かるように、測定された蛍光値は、測定開始時刻においてある一定の値であり、時間の経過と共に徐々に増加するが、測定開始時刻における蛍光値に対する変化率が小さい。
【００８８】
したがってこの酵素活性測定方法では、微小な変化に基づいて酵素活性（Ｋ）を算出するので、該酵素活性（Ｋ）の算出誤差が大きくなる恐れがあり、精度よく酵素活性を測定できないといった問題がある。
【００８９】
また、この酵素活性測定方法では、蛍光値の変化が測定開始時の蛍光値に対して微小であるため、酵素活性（Ｋ）の測定精度を上げるためには、測定時間を長くしなくてはならなかった。しかしながら、標体として生体である肝臓を対象とするような場合、測定時間を長くすると、被験者に対して多大な負担を強いることになる。
【００９０】
これに対して本発明の酵素活性測定装置１は、酵素活性を算出する際に用いる蛍光値を測定する前に、標体４の測定領域に対して消光光を照射することによって、ＨＦＣを消光させておく。
【００９１】
従って酵素活性測定装置１は、回復開始時刻Ｔ０における測定領域の蛍光値を、測定領域が消光されたとすべき値に設定された閾値未満に下げる。そして酵素活性測定装置１は、閾値未満に下がった蛍光値からの変化を用いて酵素活性（Ｋ）として算出するので、蛍光値が微小な変化でも短時間で精度よく酵素活性を測定することができる。
【００９２】
また酵素活性測定装置１は、短時間で精度よく酵素活性を測定できるので、生体である肝臓を対象とするような場合でも、被験者に対して負担を大幅に緩和することができる。
【００９３】
以上の構成によれば、消光光を標体４の測定領域に照射させてＨＦＣを消光させ、消光させた時点を回復開始時刻Ｔ０に設定し、新たに代謝されたＨＦＣから発光させる蛍光の強度を蛍光値として測定し、蛍光値と測定時刻とに基づいて酵素活性を算出する。これにより酵素活性測定装置１は、回復開始時刻Ｔ０における蛍光値を小さくして、回復開始時刻Ｔ０に対する時間の経過と共に変化する蛍光値の割合を大きくすることができ、かくして短時間で精度よく酵素活性を測定することができる。
【００９４】
＜２．第２の実施の形態＞
第２の実施の形態において、酵素活性測定装置１の構成については、第１の実施の形態と同様であるためその説明を省略する。
【００９５】
［２−１．酵素活性測定処理］
ＣＰＵ４１は、酵素活性測定処理の実行命令を操作入力部４４から受けた場合、該実行命令に対応するプログラムに従って、画像取得部５１、領域設定部５２、蛍光値測定部５３、照射制御部５４、酵素活性算出部５５（図３）として機能する。
【００９６】
画像取得部５１は、ＣＣＤ２８により生成された赤外画像データ又は明視野画像データを取得すると、該赤外画像データ又は明視野画像データに対応する画像を表示部４６に表示する。
【００９７】
このときユーザは、表示部４６に表示された画像を確認しながら、酵素活性を測定する領域を操作入力部４４を介して特定する。この操作に応じて領域設定部５２は、酵素活性を測定する領域を測定領域として設定し、該測定領域に対物レンズ１８の焦点を移動させる。
【００９８】
またユーザは、酵素活性を測定する領域の中から、消光光を照射させて蛍光を消光させる領域を操作入力部４４を介して特定する。この操作に応じて領域設定部５２は、測定領域のうちの消光光を照射する領域を消光領域として設定すると共に、消光光を照射しない領域を非消光領域として設定する。
【００９９】
蛍光値測定部５３は、フェムト秒レーザ１１を標体４の消光領域及び非消光領域に照射させ、ＭＦＣが代謝されて得られるＨＦＣを多光子励起させることにより蛍光を発光させる。そして蛍光値測定部５３は、光検出器２１で測定された消光領域及び非消光領域における蛍光値を所定時間間隔ごとに取得し、取得したときの時刻と対応付けて測定データとして記憶部４７に記憶する。
【０１００】
画像取得部５１は、蛍光画像ＰＧ１（図４（Ａ））を生成して表示部４６に表示することにより、ユーザにＭＦＣが標体４に到達していることを確認させる。
【０１０１】
照射制御部５４は、例えば操作入力部４４の操作をトリガとして、シャッタ３１を開き、水銀ランプ２９から出射されてショートパスフィルタ３２を透過した波長が５００[ｎｍ]以下の消光光を標体４の消光領域に対してだけ照射する。これにより標体４の消光領域は、ＭＦＣが代謝されて蛍光を発していたＨＦＣが光活性機能を消失して消光する。
【０１０２】
照射制御部５４は、シャッタ３１を開くと、蛍光値測定部５３で測定される蛍光値を取得し、標体４の消光領域が消光されたとすべき値に設定された閾値未満に該蛍光値がなったタイミングでシャッタ３１を閉じる。このとき標体４の測定領域では、消光領域だけが消光し、非消光領域が蛍光を発し続ける。
【０１０３】
蛍光値測定部５３は、照射制御部５４によりシャッタ３１が閉められた時点を回復開始時刻Ｔ０とし、光検出器２１で測定された消光領域及び非消光領域の蛍光値を所定時間間隔ごとに取得し、取得したときの時刻と対応付けて測定データとして記憶部４７に記憶する。
【０１０４】
酵素活性算出部５５は、蛍光値測定部５３によって測定された測定データから回復開始時刻Ｔ０での蛍光値Ｆ０と、該回復開始時刻Ｔ０から所定時間経過後の時刻Ｔでの蛍光値Ｆｔとを読み出す。そして酵素活性算出部５５は、消光領域及び非消光領域における酵素活性（Ｋ）を（１）式を用いて算出する。
【０１０５】
［２−２．酵素活性測定処理手順］
次に、上述した酵素活性測定処理の手順について、図９に示すフローチャートを用いて説明する。因みに、酵素活性測定処理が実行される前にＭＦＣが被験者に投与される。
【０１０６】
実際上、ＣＰＵ４１は、ルーチンＲＴ２の開始ステップから入って次のステップＳＰ１１へ移る。ステップＳＰ１１においてＣＰＵ４１は、ＣＣＤ２８により生成された赤外画像データ又は明視野画像データを取得すると、該赤外画像データ又は明視野画像データに対応する画像を表示部４６に表示し、次のステップＳＰ１２に移る。
【０１０７】
ステップＳＰ１２においてＣＰＵ４１は、表示部４６に表示された画像を確認させながら操作入力部４４を介して特定された蛍光値を測定する領域を測定領域に設定し、該測定領域に対物レンズ１８の焦点を移動させ、次のステップＳＰ１３に移る。
【０１０８】
ステップＳＰ１３においてＣＰＵ４１は、操作入力部４４からの操作に応じて、測定領域のうち、消光光を照射すべき領域を消光領域として設定し、残りの領域を非消光領域として設定し、次のステップＳＰ１４に移る。
【０１０９】
ステップＳＰ１４においてＣＰＵ４１は、フェムト秒レーザ１１を標体４の消光領域及び非消光領域に照射させ、ＨＦＣを多光子励起させることにより蛍光を発光させる。そしてＣＰＵ４１は、光検出器２１で測定された蛍光値を所定時間間隔ごとに取得し、取得したときの時刻と対応付けて測定データとして記憶部４７に記憶し、次のステップＳＰ１５に移る。
【０１１０】
ステップＳＰ１５においてＣＰＵ４１は、例えば操作入力部４４の操作をトリガとして、シャッタ３１を開き、水銀ランプ２９から出射された波長が５００[ｎｍ]以下の消光光を標体４の消光領域に対して照射し、次のステップＳＰ１６に移る。
【０１１１】
ステップＳＰ１６においてＣＰＵ４１は、標体４の消光領域の蛍光値が閾値未満になったか否かを判断し、否定結果が得られると、標体４の消光領域の蛍光値が閾値未満になるまでステップＳＰ１６を繰り返す。
【０１１２】
これに対してステップＳＰ１６において肯定結果が得られると、このことは、標体４の消光領域の蛍光値が閾値未満になったことを意味し、このときＣＰＵ４１は次のステップＳＰ１７に移る。
【０１１３】
ステップＳＰ１７においてＣＰＵ４１は、シャッタ３１を閉じて標体４の消光領域に対して消光光を遮断させ、この時点を回復開始時刻Ｔ０として設定し、次のステップＳＰ１８に移る。因みにＣＰＵ４１は、ステップＳＰ３において開始した蛍光値の測定をステップＳＰ１３からステップＳＰ１８まで継続して行うようになされている。
【０１１４】
ステップＳＰ１８においてＣＰＵ４１は、測定された消光領域及び非消光領域の蛍光値と測定時刻とが対応付けられた測定データを基に、（１）式を用いてそれぞれの領域での酵素活性（Ｋ）を算出し、次のステップＳＰ１９に移って処理を終了する。
【０１１５】
［２−３．動作及び効果］
以上の構成において酵素活性測定装置１は、水銀ランプ２９から出射された波長５００[ｎｍ]以下の消光光を標体４の消光領域に対して照射させ、該消光領域における代謝産物であるＨＦＣを消光させる。
【０１１６】
酵素活性測定装置１は、ＨＦＣを消光させた時点を回復開始時刻Ｔ０に設定し、フェムト秒レーザ１１を標体４の消光領域及び非消光領域に照射させ、ＨＦＣを多光子励起させることにより蛍光を発生させ、該蛍光の強度を蛍光値として光検出器２１により測定する。
【０１１７】
酵素活性測定装置１は、測定された蛍光値とそのときの時刻とに基づいて、（１）式を用いて消光領域及び非消光領域における酵素活性（Ｋ）を算出する。
【０１１８】
これにより酵素活性測定装置１は、消光領域については、消光させた時点（回復開始時刻Ｔ０）からの蛍光値の変化を用いて酵素活性（Ｋ）を算出するので、回復開始時刻Ｔ０における蛍光値が小さくなる。従って酵素活性測定装置１は、微小な蛍光値の変化でも酵素活性（Ｋ）を短時間で精度よく測定することができる。
【０１１９】
また酵素活性測定装置１は、非消光領域については、回復開始時刻Ｔ０において一定の蛍光値である状態からの蛍光値の変化を測定する。
【０１２０】
従って酵素活性測定装置１は、消光領域及び非消光領域での酵素活性（Ｋ）をそれぞれ算出するので、それぞれに算出された酵素活性（Ｋ）を比較し、例えばその平均を取ることにより、さらに精度よく酵素活性（Ｋ）を算出することができる。
【０１２１】
また酵素活性測定装置１は、短時間で精度よく酵素活性を測定できるので、生体である肝臓を対象とするような場合でも、被験者に対して負担を大幅に緩和することができる。
【０１２２】
さらに酵素活性測定装置１は、標体４の測定領域からさらに小さく設定された消光領域にだけ、水銀ランプ２９から出射された波長５００[ｎｍ]以下の消光光を照射するので、被験者に対して負担を大幅に緩和することができる。
【０１２３】
以上の構成によれば、消光光を標体４の消光領域に対して照射させてＨＦＣを消光させ、消光させた時点を回復開始時刻Ｔ０に設定し、ＨＦＣを多光子励起させることにより発光させた蛍光の強度を蛍光値として測定し、測定された蛍光値と測定時刻とを基に基づいて酵素活性を算出する。これにより酵素活性測定装置１は、回復開始時刻Ｔ０における蛍光値を小さくして、回復開始時刻Ｔ０に対する時間の経過と共に変化する蛍光値の割合を大きくすることができ、かくして短時間で精度よく酵素活性を測定することができる。
【０１２４】
＜３．他の実施の形態＞
なお上述した第１及び第２の実施の形態においては、ＣＹＰ４５０のサブタイプであるＣＹＰ２Ｃ９を測定対象の酵素として用いるようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、測定対象の酵素に対して特異的に代謝され、代謝前後で蛍光強度が変化する基質を用いるようにすれば、ＣＹＰ４５０のあらゆる種類のサブタイプを測定対象の酵素として用いることができる。またＣＹＰ４５０に限らず、他の酵素を測定対象の酵素として用いることができる。
【０１２５】
また上述した第１及び第２の実施の形態においては、ＣＹＰ２Ｃ９に特異的に代謝されるＭＦＣを基質として用いるようにした場合について述べた。このＭＦＣは、励起光が照射されても蛍光を発することがなく、代謝されることにより得られる代謝産物であるＨＦＣに励起光が照射されて蛍光を発する。このように第１及び第２の実施の形態においては、代謝前後で蛍光強度が変化するような基質を用いたが、本発明はこれに限らず、代謝前後で蛍光の波長が変化するような基質を用いるようにしてもよい。
【０１２６】
さらに上述した第１及び第２の実施の形態においては、標体４として生体での肝臓を対象とするようにした場合について述べたが、本発明はこれに限らず、皮膚や他の臓器などを対象とするようにしてもよい。
【０１２７】
さらに上述した第１及び第２の実施の形態においては、生体組織や細胞内であるin vivo下での酵素活性を測定するようにした場合について述べたが、本発明はこれに限らず、細胞の一部を取り出す等のin vitro下での酵素活性を測定するようにしてもよい。
【０１２８】
さらに上述した第１及び第２の実施の形態においては、フェムト秒レーザ１１から出射されたレーザ光や、水銀ランプ２９から出射された消光光をダイクロイックミラー１６から空気伝送により対物レンズ１８に導くようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、ダイクロイックミラー１６と対物レンズ１８との間に光ファイバーを設け、該光ファイバーを介してレーザ光や消光光を対物レンズ１８に導くようにしてもよい。
【０１２９】
さらに上述した第１及び第２の実施の形態においては、水銀ランプ２９から出射され、ショートパスフィルタ３２によって例えば波長が５００[ｎｍ]以下でなる消光光によりＨＦＣを消光させるようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、例えば、ピコ秒又はナノ秒パルスレーザにより出射される波長約８３０[ｎｍ]のレーザ光によりＨＦＣを消光させるようにしてもよい。
【０１３０】
さらに上述した第１及び第２の実施の形態においては、シャッタ３１を明けているタイミングとして、消光光を照射してから蛍光値が閾値未満になるまでの時間とするようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、例えば５[ｓ]や１０[ｓ]のように予め設定された時間だけ消光光を照射すべくシャッタ３１を明けるようにしてもよい。
【０１３１】
さらに上述した第１及び第２の実施の形態においては、基質であるＭＦＣを被験者に投与し、該ＭＦＣに特異的に作用する酵素ＣＹＰ２Ｃ９の酵素活性を測定するようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、例えばＣＹＰ２Ｃ９の阻害作用が知りたい道の薬剤（阻害剤）を最適な濃度（数μＭ）で生理的食塩水にＭＦＣと共に溶解させ、上述した酵素活性測定処理に従って酵素活性を算出する。そしてＭＦＣだけを投与した場合における酵素活性と、阻害剤を混合した場合における酵素活性とに基づいて阻害活性を測定するようにしてもよい。
【０１３２】
さらに上述した第１及び第２の実施の形態においては、シャッタ３１が設けられ、照射制御部５４によりシャッタ３１の開閉により消光光を測定領域又は消光領域に照射するようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、シャッタ３１を設けず、照射制御部５４により水銀ランプ２９をオンオフすることにより消光光を測定領域又は消光領域に照射するようにしてもよい。
【０１３３】
さらに上述した第１及び第２の実施の形態においては、シャッタ３１を閉めたタイミングを回復開始時刻Ｔ０として設定するようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、測定領域又は消光領域が消光された直後とされるのであれば、シャッタ３１を閉めたタイミングから所定時間経過後を回復開始時刻Ｔ０として設定するようにしてもよい。
【０１３４】
さらに上述した第１及び第２の実施の形態においては、ＣＰＵ４１がＲＯＭ４２に格納されているプログラムに従い、上述した酵素活性測定処理を行うようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、記憶媒体からインストールしたり、インターネットからダウンロードしたプログラムに従って上述した酵素活性測定処理を行うようにしても良い。またその他種々のルートによってインストールしたプログラムに従って上述した酵素活性測定処理を行うようにしても良い。
【０１３５】
さらに上述した第１及び第２の実施の形態においては、第１光源としてフェムト秒レーザ１１、第２光源として水銀ランプ２９、照射制御部として照射制御部５４、測定部として蛍光値測定部５３及び算出部として酵素活性算出部５５が設けられるようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、その他種々の構成でなる光源、照射制御部、測定部及び算出部を設けるようにしても良い。
【産業上の利用可能性】
【０１３６】
本発明は、生物実験、医薬の創製又は患者の経過観察などのバイオ産業上において利用可能である。
【符号の説明】
【０１３７】
１……酵素活性測定装置、２……多光子顕微鏡、３……データ処理部、４……標体、１１……フェムト秒レーザ、１２……ビーム径調整器、１３……ＸＹスキャナ、１４……ラインフィルタ、１５、１６……ダイクロイックミラー、１７……焦点位置調節機構、１８……対物レンズ、１９、３２……ショートパスフィルタ、２０……集光レンズ、２１……光検出器、２２……白色光源、２３、３０……コリメータレンズ、２４、２６……ロングパスフィルタ、２５……落射光学系、２７……結像レンズ、２８……ＣＣＤ、２９……水銀ランプ、３１……シャッタ、４１……ＣＰＵ、４２……ＲＯＭ、４３……ＲＡＭ、４４……操作入力部、４５……インターフェイス部、４６……表示部、４７……記憶部、４８……バス、５１……画像取得部、５２……領域設定部、５３……蛍光値測定部、５４……照射制御部、５５……酵素活性算出部。
【図１】
0005599184.tif 000002
【図２】
0005599184.tif 000003
【図３】
0005599184.tif 000004
【図５】
0005599184.tif 000005
【図６】
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【図８】
0005599184.tif 000007
【図９】
0005599184.tif 000008
【図４】
0005599184.tif 000009
【図７】
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