(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
３’−ホスホアデノシン５’−ホスホ硫酸またはその塩を有効成分として含有する、オクルディンから成るタイトジャンクション構成タンパク質産生促進およびセラミド産生促進による皮膚保湿剤。
【請求項２】
３’−ホスホアデノシン５’−ホスホ硫酸またはその塩を有効成分として含有する、オクルディンから成るタイトジャンクション構成タンパク質産生促進およびセラミド産生促進による皮膚バリア機能改善剤。
【請求項３】
３’−ホスホアデノシン５’−ホスホ硫酸またはその塩を有効成分として含有する、オクルディンから成るタイトジャンクション構成タンパク質産生促進作用を兼ね備えたセラミド産生促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、優れたタイトジャンクション構成タンパク質産生促進効果およびセラミド産生促進効果を有する皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
種々の皮膚疾患、例えば、アトピー性皮膚炎、乾癬、接触性皮膚炎等に見られる肌荒れ症状においては、皮膚からの水分の消失が、健常な皮膚に比べて盛んであることが知られている。このいわゆる経皮水分蒸散量（Ｔｒａｎｓｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｗａｔｅｒ  Ｌｏｓｓ、以下ＴＥＷＬと略する）の増加には、表皮内において水分の保持やバリアとしての機能を担っていると考えられる成分の減少が関与しているものと考えられてきた。
【０００３】
従来、皮膚疾患や肌荒れに対して改善・予防効果を有する有効成分として、水分保持機能や皮膚バリア機能を担う表皮内成分を皮膚に補充するという観点から、ＮＭＦ（Ｎａｔｕｒａｌ  Ｍｏｉｓｔｕｒｉｚｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ）としてのアミノ酸や尿素、角質細胞間脂質としての脂質類、その他ヒアルロン酸等のムコ多糖あるいはこれらの類似物質が、化粧料や皮膚外用剤に配合されてきた。特に尿素は、保湿効果および角質層軟化効果を有することから、魚鱗せん、アトピー性皮膚炎、老人性乾皮症、足底部亀裂性皮膚炎等の角化性皮膚疾患治療薬に配合されている。
【０００４】
一方で近年、皮膚バリア機能を担う表皮内成分の生合成を活性化させるような特定の物質が、肌荒れに対して改善効果を有するという報告がなされており、注目されている。また、バリア機能に関する研究が精力的に進められ、ＮＭＦや細胞間脂質だけでなく、表皮顆粒層に存在するタイトジャンクションと呼ばれる構造が皮膚のバリア機能に重要な役割を担うことが明らかになった（非特許文献１）。
【０００５】
タイトジャンクションは、隣接する細胞同士を密着させるだけでなく、細胞と細胞の隙間をシールすることで物質の透過を制御する結合装置である。したがって、クローディンやオクルディンなどのタイトジャンクション構成タンパク質が何らかの原因で減少した場合、タイトジャンクションの構造的な破壊が起こり、物質の透過バリアとして機能しなくなることによって、乾燥肌、荒れ肌、アトピー性皮膚炎や各種感染症などの皮膚症状が引き起こされる。
【０００６】
一方、角層細胞間を埋める細胞間脂質の半分以上を占めるのが、セラミドであり、皮膚の保湿機構、バリア機能に重要な役割を果たしている。セラミドはスフィンゴ脂質の一種で、スフィンゴシンと脂肪酸がアミド結合した化合物群の総称であり、乾燥肌、荒れ肌、アトピー性皮膚炎、老人性乾皮症、乾癬等の皮膚疾患においては、セラミドの健全な代謝が妨げられることによって角層中のセラミド量が減少し、皮膚の保湿能やバリア機能の低下等を引き起こしていることが報告されている。
【０００７】
即ち、表皮においてタイトジャンクション構成タンパク質産生を促進し、表皮角化細胞のタイトジャンクション形成を促すことによって、皮膚のバリア機能および水分保持機能を高め、前記皮膚症状を予防または改善することができると考えられる。また、表皮においてセラミドの産生を促進することによって、皮膚のバリア機能および水分保持機能を高め、前記皮膚症状を予防または改善することができると考えられる。
【０００８】
そこで従来、タイトジャンクション構成タンパク質産生促進剤（特許文献１、特許文献２）や、皮膚の減少したセラミドを外部から補給する方法やセラミド産生促進剤が種々検討され、皮膚外用剤への配合が提案されている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００７−１７６８３０号公報
【特許文献２】特開２００７−１７６８３５号公報
【特許文献３】特開２００９−１０７９６５号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５６：１０９９−１１１１（２００２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、従来のタイトジャンクション構成タンパク質産生促進剤やセラミド産生促進剤の効果には限界があり、より効果的なものが望まれているのが現状である。とくに、タイトジャンクション構成タンパク質産生促進効果とセラミド産生促進効果を兼ね備えた成分は知られておらず、そのような成分があれば、皮膚の水分保持機能およびバリア機能を改善できる皮膚外用剤として有用である。
【００１２】
従って、本発明の課題は、タイトジャンクション構成タンパク質産生促進効果およびセラミド産生促進効果を有し、バリア機能および水分保持機能を向上させることができる皮膚外用剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
そこで本発明者らは、このような課題を解決すべく鋭意検討した結果、全く意外にも、生体内における硫酸化反応の硫酸基供与体として知られている３’−ホスホアデノシン５’−ホスホ硫酸（ＰＡＰＳ）が、表皮細胞および皮膚に対する極めて効果の高いタイトジャンクション構成タンパク質産生促進効果およびセラミド産生促進効果を有し、皮膚におけるバリア機能および水分保持機能（保湿機能）を向上させる作用を有することを見出し、本発明を完成させたものである。
【００１４】
すなわち、本発明は、
（１）ＰＡＰＳまたはその塩を有効成分として含有する皮膚外用剤を提供するものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の皮膚外用剤は、有効成分であるＰＡＰＳの働きによって、優れたタイトジャンクション構成タンパク質産生促進効果だけでなく、優れたセラミド産生促進効果を有する。従って、従来の皮膚外用剤に比べて、皮膚のバリア機能や水分保持機能を極めて効果的に発揮させることができるものである。そのため、本発明の皮膚外用剤によれば、例えば、乾燥肌、荒れ肌、アトピー性皮膚炎や各種感染症および老人性乾皮症などの加齢による皮膚性状の変化を予防または改善することができる。また、ＰＡＰＳは、生体内成分であることから、安全性も高い。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の皮膚外用剤は、ＰＡＰＳまたはその塩を有効成分として含有するものである。ここで「含有する」とは、本発明の皮膚外用剤がＰＡＰＳのみからなるものであってもよく、また皮膚外用剤にＰＡＰＳ以外の他の有効成分、製剤補助剤等が含有されていてもよいことを意味する。
【００１７】
また、本発明の皮膚外用剤は、頭部以外の皮膚外用剤としての適用が好ましく、保湿剤、皮膚バリア機能改善剤、タイトジャンクション構成タンパク質産生促進剤、セラミド産生促進剤等、機能や効能の点から命名されたとしても、ＰＡＰＳまたはその塩を有効成分として含有する限り、本発明の皮膚外用剤の範疇に含まれることは明らかである。
【００１８】
有効成分の３’−ホスホアデノシン５’−ホスホ硫酸（ＰＡＰＳ）は、下記式（１）で示される化合物であり、生体内における硫酸化反応の硫酸基供与体として重要な役割を担っており、コンドロイチン硫酸やデルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸といったグリコサミノグリカン、そして各種の硫酸化糖脂質や硫酸化タンパク質などの生合成に不可欠な物質である。しかしながら、ＰＡＰＳは水溶性が高く、また高度な負の電荷を有することから細胞膜を透過するとは考え難く、また、一方で、ＰＡＰＳをドナーとして用いた硫酸転移反応は、細胞内のゴルジ体において起こると考えられることから、細胞の外から添加したＰＡＰＳが各種細胞に生理作用を示すとは当業者の常識では考えられなかった。従って、細胞外から添加したＰＡＰＳがどのような生理作用を示すかに関しては、これまで全く知見がないのが実情であった。
【００１９】
【化１】
0005455248.tif 000002
【００２０】
ＰＡＰＳは、公知の生体内成分であり、酵素法、化学法、いずれの方法で調製したものであってもよく、例えばＰＡＰＳの合成法としては、特許第３０９８５９１号、特許第３０７８０６７号、特許第３０２９９１５号、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，２７，１７１−１７２（１９９２）、ＷＯ２００６−０８０３１３などに記載の方法を挙げることができる。
【００２１】
ＰＡＰＳの塩としては、ナトリウム塩などの金属塩、アンモニウム塩および各種アミン塩、アミノ酸塩、イミダゾール塩等が挙げられる。
【００２２】
本発明の皮膚外用剤中のＰＡＰＳの含有量は、その有効性と安全性から０．００１〜２０％（ｗ／ｖ）とすることが好ましく、０．０１〜１０％（ｗ／ｖ）が特に好ましい。
【００２３】
本発明の皮膚外用剤には本発明の効果を損なわない範囲において、一般に化粧料で用いられ、或いは医薬部外品、医薬品等の皮膚外用剤に用いられる各種任意成分を必要に応じて適宜配合することができる。このような任意成分として、例えば、精製水、エタノール、油性成分、他の保湿剤、増粘剤、防腐剤、乳化剤、他の薬効成分、粉体、紫外線吸収剤、色素、香料、乳化安定剤等を挙げることができる。
【００２４】
本発明の皮膚外用剤の形態は、液状、乳液、軟膏、クリーム、ゲル、エアゾール等の皮膚外用剤とするのが好ましい。また、本発明の皮膚外用剤は、医薬品、医薬部外品または化粧品等の多様な分野において適用可能である。
【００２５】
本発明の皮膚外用剤は、優れたタイトジャンクション構成タンパク質産生促進効果だけでなく、優れたセラミド産生促進効果を有し、バリア機能および水分保持機能を向上させることにより、従来の保湿剤に比べて極めて効果的に発揮させることができる点に特徴がある。
【００２６】
本発明の皮膚外用剤は、１日１〜３回を皮膚に塗布すればよく、その塗布量はＰＡＰＳまたはその塩として１回あたり１〜１００ｍｇが好ましい。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例等により本発明をさらに具体的に説明するが、この実施例等により本発明の技術的範囲が限定的に解釈されるものではない。なお、％はすべて重量％（ｗ／ｖ）を意味する。
【００２８】
（実施例１）  ＰＡＰＳのタイトジャンクション構成タンパク質産生促進効果に対する評価
ヒト表皮角化細胞（ＨＥＫ）を７５ｃｍ２フラスコでヒト表皮角化細胞培地（ＫＧＭ）にて３７℃、５％ＣＯ２下で培養し、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞密度になるようにＫＧＭで希釈した後、直径３５ｍｍシャーレに播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。細胞をサブコンフルエントの状態まで培養した後、ＫＧＭで希釈した試料溶液を各シャーレに２ｍＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で４時間培養した。培養終了後、培地を除き、細胞からＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用して総ＲＮＡを抽出した。
【００２９】
この総ＲＮＡを鋳型として、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を使用し、１０μｌの反応液に２００μｇのＲＮＡが含まれるように逆転写反応液を調製し、逆転写反応液を使用してタイトジャンクション形成タンパク質であるオクルディンおよび内部標準であるβ―アクチンのｍＲＮＡ発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（タカラバイオ社製）を用いて、ＴａＫａＲａ  ＳＹＢＲ  ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ  ＲＴ−ＰＣＴ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）によるリアルタイム２  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ反応により、行った。オクルディンのｍＲＮＡの発現量について、同一サンプルにおけるβ―アクチンの発現量の値で補正を行った後、下記（２）式によりオクルディンのｍＲＮＡ発現促進率（％）を算出した。結果を表１に示す。
【００３０】
【数１】
0005455248.tif 000003
［但し、前記（２）式中、
Ａ：蒸留水添加時の補正値、
Ｂ：０．００３％  ＰＡＰＳ，４Ｎａ添加時の補正値、を表す。］
【００３１】
【表１】
0005455248.tif 000004
【００３２】
実施例１の結果から、ＰＡＰＳは非常に優れたタイトジャンクション構成タンパク質オクルディンの産生促進効果を有することが認められた。
【００３３】
（実施例２）  ＰＡＰＳのセラミド産生促進効果に対する評価
紫外線照射マウスを用いてセラミド産生促進効果を評価した。５週齢の雄性ヘアレスマウス（Ｈｏｓ：ＨＲ−１）（日本ＳＬＣ産）を自由摂餌（固型飼料ＣＥ−２，日本クレア）、自動給水、１２時間明暗サイクルの環境下で２週間予備飼育した後、紫外線照射をおこなった。マウス背部にＦＬ２０ＳＢＬ−Ｂランプ（ＮＥＣ社製）を用いて１．２ｍＷ／ｃｍ２の強度で１日３時間、週５回、１６週間継続して紫外線を照射することにより、紫外線照射マウスを作製し、実験に供した。
【００３４】
紫外線照射マウスに対して、以下に示す４種類の被験物質を各群に１種類ずつ一日１００μＬ、週５回、４週間継続して塗布した。第１群（ｎ＝６）には対照として溶媒（水：エタノール：ＤＭＳＯ＝２：１：１）を、第２群（ｎ＝６）には０．００６％  ＰＡＰＳ・４トリエタノールアミン塩（以下ＰＡＰＳ・４ＴＥｔＡと記す）を、第３群（ｎ＝６）には０．０６％  ＰＡＰＳ・４ＴＥｔＡを、第４群（ｎ＝６）には０．６％  ＰＡＰＳ・４ＴＥｔＡを塗布した。また、上記の４群のほかに、紫外線照射を行わずに通常飼育したマウスに溶媒を塗布した群（以後「非照射群」と称する）も設けた。
【００３５】
塗布期間終了後に過剰量のペントバルビタール麻酔を行ってマウスを安楽死させ、直径８ｍｍ生検トレパンを使用して背部皮膚片を２枚採取した。採取した皮膚片を、２Ｍ  ＮａＢｒに浸漬し、３７℃にて１時間処理した後、ピンセットを用いて表皮組織のみを慎重に剥離し、剥離した表皮組織をＰＢＳにて２回洗浄した後、凍結乾燥させた。その後、凍結乾燥させた皮膚片にクロロホルム：メタノール（２：１）混合溶液を２ｍｌ添加し、超音波処理を１５分間行うことにより、総脂質を抽出した。脂質抽出液をフィルター（ＰＴＦＥ，直径４５μｍ）でろ過した後、窒素ガスバブリングにより脂質を濃縮した。調製した脂質サンプルをクロロホルム：メタノール（２：１）混合溶液に溶解させ、ＴＬＣプレート（２０×２０ｃｍ  Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０  Ｆ２５４、Ｍｅｒｃｋ）に全量スポッティングした。また、スタンダードとして、Ｃｅｒａｍｉｄｅ  II（Ｃｅｒａｍｉｄｅ  ＴＩＣ−００１（高砂香料））、Ｃｅｒａｍｉｄｅ  III（日光ケミカルズ）、Ｃｅｒａｍｉｄｅ  VI（日光ケミカルズ）を１０μｇスポッティングした。スポットが乾燥した後、クロロホルム：メタノール：水（４０：１０：１）の展開溶媒にて原点から１１ｃｍまで展開し、いったん乾燥させた。その後、クロロホルム：メタノール：酢酸（１９０：１０：１）の展開溶媒にて原点から１８．５ｃｍまで展開し、再度乾燥させた。その後、再度クロロホルム：メタノール：酢酸（１９０：１０：１）の展開溶媒にて原点から１８．５ｃｍまで展開した。全体を乾燥後、１０％硫酸銅を含む８％リン酸水溶液をＴＬＣプレート全体に噴霧し、１８０℃のオーブンにて１５分間焼析した。焼析後、ＴＬＣプレートをスキャナにてデジタル画像として取り込み、画像解析ソフト（Ｉｍａｇｅ  Ｊ）を用いてバンドの濃さからセラミド量を算出した。セラミド量について、下記（３）式により各セラミドの産生促進率（％）を算出した。各種セラミドの産生量および産生促進率の結果をそれぞれ表２および表３に示す。
【００３６】
【数２】
0005455248.tif 000005
［但し、前記（２）式中、
Ａ：第１群のセラミド量、
Ｂ：各種濃度のＰＡＰＳ，４ＴＥｔＡ塗布群のセラミド量、を表す。］
【００３７】
【表２】
0005455248.tif 000006
【００３８】
【表３】
0005455248.tif 000007
【００３９】
表３に示すとおり、すべてのＰＡＰＳ塗布群において各種セラミドの産生促進率が上昇した。以上の結果から、ＰＡＰＳはセラミド産生促進効果を有することが認められた。
【００４０】
（実施例３）  ＰＡＰＳのバリア機能改善効果の評価
バリア機能障害モデルマウスを用いてＰＡＰＳのバリア機能改善効果を評価した。４週齢の雄性ヘアレスマウス（Ｈｏｓ：ＨＲ−１）（日本ＳＬＣ産）を自由摂餌（固型飼料ＣＥ−２，日本クレア）、自動給水、１２時間明暗サイクルの環境下で４週間予備飼育した後に以下の試験に使用した。
【００４１】
アセトン：ジエチルエーテル＝１：１で混和した溶液（Ａ／Ｅ溶液）で湿らせた脱脂綿をマウスの背中の皮膚に１５秒間置くこと（以後この操作をＡ／Ｅ処理と称する）により、バリア機能障害を誘導した。Ａ／Ｅ処理は１日に４回、５日間連続で行い、６日目のみ１回おこなった。バリア機能障害モデルマウスに対して、以下に示す５種類の被験物質を各群に１日２回、２回目と４回目のＡ／Ｅ処理の後および６日目のＡ／Ｅ処理の後に１００μＬずつ塗布した。第１群（ｎ＝７）には対照として生理食塩水を、第２群（ｎ＝７）には０．１％ＰＡＰＳ・４Ｎａを、第３群（ｎ＝７）には１％ＰＡＰＳ・４Ｎａを、第４群（ｎ＝７）には１０％ＰＡＰＳ・４Ｎａを、第５群（ｎ＝７）には陽性対照として１０％尿素溶液を塗布した。なお、上記５群のほかに、Ａ／Ｅ処理を行わずに通常飼育したマウスに生理食塩水を塗布した群（以後正常群と称する）も設けた。６日目のサンプル塗布の３時間後に、バリア機能の指標であるＴｒａｎｓｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｗａｔｅｒ  Ｌｏｓｓ（以後ＴＥＷＬと略する）をＡＳ−ＴＷ２（ＡＳＡＨＩ  ＢＩＯＭＥＤ）を用いて測定し、下記（４）式によりバリア機能改善率（％）を算出した。なお、下記（４）式により生理食塩水群のバリア機能改善率を算出すると０％となる。結果を表４および表５に示す。
【００４２】
【数３】
0005455248.tif 000008
［但し、前記（３）式中、
Ａ：正常群のＴＥＷＬ、
Ｂ：各種濃度のＰＡＰＳ，４Ｎａ群および１０％尿素群のＴＥＷＬ、
Ｃ：生理食塩水群のＴＥＷＬ、を表す。］
【００４３】
【表４】
0005455248.tif 000009
【００４４】
【表５】
0005455248.tif 000010
【００４５】
表５に示すとおり、ＰＡＰＳの濃度依存的にバリア機能改善率が上昇し、１０％  ＰＡＰＳ群においては、陽性対照である１０％尿素群よりも優れたバリア機能改善率を示した。以上の結果から、ＰＡＰＳは非常に優れたバリア機能および水分保持機能を向上させる効果を有することが認められた。
【００４６】
（処方例１）
−乳剤−
下記組成に従い、乳剤を常法により製造した。
・１０％ＰＡＰＳ，４Ｎａ水溶液・・・１．００ｇ
・ホホバオイル・・・４．００ｇ
・１，３−ブチレングリコール・・・３．００ｇ
・ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）・・・２．５０ｇ
・オリーブオイル・・・２．００ｇ
・スクワラン・・・２．００ｇ
・セタノール・・・２．００ｇ
・モノステアリン酸グリセリル・・・２．００ｇ
・オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（２０Ｅ．Ｏ．）・・・２．００ｇ
・パラオキシ安息香酸メチル・・・０．１５ｇ
・香料・・・０．０５ｇ
・精製水・・・残部（合計１００．００ｇ）
【００４７】
（処方例２）
−ローション剤−
下記組成に従い、ローション剤を常法により製造した。
・１０％ＰＡＰＳ，４Ｎａ水溶液・・・１．００ｇ
・グリセリン・・・３．００ｇ
・１，３−ブチレングリコール・・・３．００ｇ
・オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（２０Ｅ．Ｏ．）・・・２．００ｇ
・パラオキシ安息香酸メチル・・・０．１５ｇ
・クエン酸・・・０．１０ｇ
・クエン酸ソーダ・・・０．１０ｇ
・香料・・・０．０５ｇ
・精製水・・・残部（合計：１００．００ｇ）
【００４８】
（処方例３）
−クリーム剤−
下記組成に従い、クリーム剤を常法により製造した。
・１０％ＰＡＰＳ，４Ｎａ水溶液・・・１．００ｇ
・スクワラン・・・１０．００ｇ
・１，３−ブチレングリコール・・・６．００ｇ
・流動パラフィン・・・５．００ｇ
・サラシミツロウ・・・４．００ｇ
・セタノール・・・３．００ｇ
・モノステアリン酸グリセリル・・・３．００ｇ
・ラノリン・・・２．００ｇ
・オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（２０Ｅ．Ｏ．）・・・１．５０ｇ
・パラオキシ安息香酸メチル・・・１．５０ｇ
・ステアリン酸・・・１．００ｇ
・香料・・・０．１０ｇ
・精製水・・・残部（合計：１００．００ｇ）