(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２０で示される塩基配列からなるＨｕ／ＮＬＶ／Ｋａｓｈｉｗａ ４７／１９９７／ＪＰ遺伝子。
【請求項２】
配列番号２０で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３】
請求項２に記載のベクターをバキュロウイルスＤＮＡと共に昆虫細胞にトランスフェクションし、得られた組換バキュロウイルスを昆虫細胞に感染させ、ＳＲＳＶの構造タンパク質を発現させることを特徴とする、中空ウイルス粒子の作製方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法により作製された中空ウイルス粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中の小型球形ウイルス（Small Round Structured Virus、以下「ＳＲＳＶ」という）を検出、判別するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＳＲＳＶは、１９７２年に発見されたヒトのウイルス性胃腸炎の原因ウイルスの一つであり、小児期の急性胃腸炎や成人や年長児に食中毒様の集団発生を引き起こすことが知られている。ＳＲＳＶは、細胞培養によってウイルスを増殖させることができず且つ感受性を示す動物モデルもないことから、ＳＲＳＶ抗原及び抗ＳＲＳＶ抗体の入手は困難であり、当該ウイルスの免疫血清学的な検出法の開発は遅れていた。
【０００３】
斯かる状況の下、１９９３年にＳＲＳＶの一つであるノーウォーク（Norwalk）ウイルスの遺伝子クローニングが成功し全ゲノムの塩基配列が解析され（特許文献１）、その後ＲＮＡポリメラーゼ領域の一部を増幅するＰＣＲ法が開発され、これまでに１４種類のＳＲＳＶ関連ウイルスが見出されている。更にこれらのＲＮＡポリメラーゼ領域の約１２０アミノ酸についての分析により、ＳＲＳＶはノーウォークウイルス株をプロトタイプとする遺伝子型Ｉとスノーマウンテン（Snow Mountain）ウイルス株をプロトタイプとする遺伝子型IIの大きく２つの遺伝子型（genogroup）に分類できるとされている。
【０００４】
しかし、ＳＲＳＶ関連ウイルスの遺伝子解析が進むにつれ、同一遺伝子型内でも多くの多様性があることが知られ、実際に各遺伝子型のプロトタイプであるノーウォークウイルス株及びスノーマウンテンウイルス株の遺伝子に対するプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法では、全てのＳＲＳＶを検出できず、ＳＲＳＶを効率良く増幅させるプライマーの構築やＲＴ−ＰＣＲ法の条件の設定は非常に困難であることが明らかとなった。
【０００５】
一方、遺伝子発現により、ノーウォークウイルス株、スノーマウンテンウイルス株等の一部のウイルスについては抗原が作製され、抗体の取得及びこれを用いたＥＬＩＳＡによるＳＲＳＶ検出法も構築されているが、ＳＲＳＶの多様性により胃腸炎を引き起こす全てのＳＲＳＶを確実に検出することができなかった。
他方、わが国では、平成９年にＳＲＳＶが食品衛生法における食中毒原因因子に指定され、ＳＲＳＶによる食中毒が発生した場合にはその感染ルートの特定が必須となり、感染者の便及び食品中のＳＲＳＶを簡便で且つ確実に検出同定する方法が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表平６−５０６８２３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、検体からこれまでに見出されているＳＲＳＶ関連ウイルスを簡易に検出でき、その血清型及び遺伝子型を確実に判別できるキットを提供することに関する。
【０００８】
本発明者らは、斯かる実状に鑑みＳＲＳＶ関連ウイルスについて遺伝学的及び免疫学的に検討したところ、新たに見出された新規ウイルスペプチドを加えた１１種のＳＲＳＶ関連ウイルスペプチドより得られる抗体を組み合わせて用いることにより、検体中の殆どのＳＲＳＶを検出でき、ＳＲＳＶの血清型及び遺伝子型を確実に判別できることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
即ち、本発明は、下記（ａ）〜（ｋ）；
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチド若しくは該アミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するペプチド又はそれらの部分ペプチド、
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するペプチド若しくは該アミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するペプチド又はそれらの部分ペプチド、
（ｃ）配列番号３に示すアミノ酸配列を有するペプチド若しくは該アミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するペプチド又はそれらの部分ペプチド、
（ｄ）配列番号４に示すアミノ酸配列を有するペプチド若しくは該アミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するペプチド又はそれらの部分ペプチド、
（ｅ）配列番号５に示すアミノ酸配列を有するペプチド若しくは該アミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するペプチド又はそれらの部分ペプチド、
（ｆ）配列番号６に示すアミノ酸配列を有するペプチド若しくは該アミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するペプチド又はそれらの部分ペプチド、
（ｇ）配列番号７に示すアミノ酸配列を有するペプチド若しくは該アミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するペプチド又はそれらの部分ペプチド、
（ｈ）配列番号８に示すアミノ酸配列を有するペプチド若しくは該アミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するペプチド又はそれらの部分ペプチド、
（ｉ）配列番号９に示すアミノ酸配列を有するペプチド若しくは該アミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するペプチド又はそれらの部分ペプチド、
（ｊ）配列番号１０に示すアミノ酸配列を有するペプチド若しくは該アミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するペプチド又はそれらの部分ペプチド、
（ｋ）配列番号１１に示すアミノ酸配列を有するペプチド若しくは該アミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するペプチド又はそれらの部分ペプチド、
よりなる群から選択された一つのＳＲＳＶ関連ウイルス構成ペプチドに対する抗体を全て含有することを特徴とするＳＲＳＶ検出キットを提供するものである。
【００１０】
また本発明は、下記ＳＲＳＶ関連ウイルス（ａ）〜（ｄ）；
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチド若しくは該アミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するペプチド又はそれらの部分ペプチド、
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するペプチド若しくは該アミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するペプチド又はそれらの部分ペプチド、
（ｃ）配列番号３に示すアミノ酸配列を有するペプチド若しくは該アミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するペプチド又はそれらの部分ペプチド、
（ｄ）配列番号４に示すアミノ酸配列を有するペプチド若しくは該アミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するペプチド又はそれらの部分ペプチド、
よりなる群から選択された一つのＳＲＳＶ関連ウイルス構成ペプチドに対する抗体を全て含有することを特徴とするＳＲＳＶ遺伝子型判別のためのＳＲＳＶ検出キットを提供するものである。
【００１１】
更に本発明は、下記ＳＲＳＶ関連ウイルス（ｅ）〜（ｋ）；
（ｅ）配列番号５に示すアミノ酸配列を有するペプチド若しくは該アミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するペプチド又はそれらの部分ペプチド、
（ｆ）配列番号６に示すアミノ酸配列を有するペプチド若しくは該アミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するペプチド又はそれらの部分ペプチド、
（ｇ）配列番号７に示すアミノ酸配列を有するペプチド若しくは該アミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するペプチド又はそれらの部分ペプチド、
（ｈ）配列番号８に示すアミノ酸配列を有するペプチド若しくは該アミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するペプチド又はそれらの部分ペプチド、
（ｉ）配列番号９に示すアミノ酸配列を有するペプチド若しくは該アミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するペプチド又はそれらの部分ペプチド、
（ｊ）配列番号１０に示すアミノ酸配列を有するペプチド若しくは該アミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するペプチド又はそれらの部分ペプチド、
（ｋ）配列番号１１に示すアミノ酸配列を有するペプチド若しくは該アミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するペプチド又はそれらの部分ペプチド、
よりなる群から選択された一つのＳＲＳＶ関連ウイルス構成ペプチドに対する抗体を全て含有することを特徴とするＳＲＳＶ遺伝子型判別のためのＳＲＳＶ検出キットを提供するものである。
【００１２】
更にまた、本発明は、配列番号１５、２０、２１及び２２で示される塩基配列又は該塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有するＳＲＳＶ関連ウイルス株遺伝子を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｓｅｔｏ １２４／１９８９／ＪＰ株由来の中空ウイルス粒子の電子顕微鏡写真である（×１００，０００）。
【図２】Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｆｕｎａｂａｓｈｉ ２５８／１９９６／ＪＰ株由来の中空ウイルス粒子の電子顕微鏡写真である（×１００，０００）。
【図３】Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｃｈｉｂａ ４０７／１９８７／ＪＰ株由来の中空ウイルス粒子の電子顕微鏡写真である（×１００，０００）。
【図４】Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｎａｒｉｔａ １０４／１９９７／ＪＰ株由来の中空ウイルス粒子の電子顕微鏡写真である（×１００，０００）。
【図５】Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｓａｎｂｕ ８０９／１９９８／ＪＰ株由来の中空ウイルス粒子の電子顕微鏡写真である（×１００，０００）。
【図６】Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｉｃｈｉｋａｗａ ７５４／１９９８／ＪＰ株由来の中空ウイルス粒子の電子顕微鏡写真である（×１００，０００）。
【図７】Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｃｈｉｔｔａ １８７６／１９９６／ＪＰ株由来の中空ウイルス粒子の電子顕微鏡写真である（×１００，０００）。
【図８】Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｋａｓｈｉｗａ ４７／１９９７／ＪＰ株由来の中空ウイルス粒子の電子顕微鏡写真である（×１００，０００）。
【図９】Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｍｉｅ ７ｋ／１９９４／ＪＰ株由来の中空ウイルス粒子の電子顕微鏡写真である（×１００，０００）。
【図１０】Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｋａｓｈｉｗａ ６４５／１９９９／ＪＰ株由来の中空ウイルス粒子の電子顕微鏡写真である（×１００，０００）。
【図１１】Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｏｓａｋａ １０−２５／１９９９／ＪＰ株由来の中空ウイルス粒子の電子顕微鏡写真である（×１００，０００）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
１．ＳＲＳＶ関連ウイルス
本発明のＳＲＳＶ検出キットは、前記（ａ）〜（ｋ）群の１１種類の特定のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するＳＲＳＶ関連ウイルス構成ペプチドに対する抗体を用いることを特徴とするものである。このうち、（ｄ）群、（ｉ）群、（ｊ）群及び（ｋ）群に属するペプチドは、現在までにジーンバンクに登録されている全てのＳＲＳＶ関連ウイルス株（下記表１）とは異なる新規ペプチドであり、これらに対する抗体を含めて１１種類の抗体を含有したキットすることにより、ＳＲＳＶ関連ウイルスを漏れなく検出することができる。
【００１５】
本発明ＳＲＳＶ関連ウイルス構成ペプチドには、ペプチドとしてそれらと同等の抗原性を有する限り、そのアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加された変異体、又は当該アミノ酸配列をコードする塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された変異体が包含される。
（ａ）群における配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドとしては、例えば日本のＳＲＳＶ感染患者の糞便由来Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｋａｓｈｉｗａ ６４５／１９９９／ＪＰ株のウイルス構成ペプチドが挙げられ、該アミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するペプチドとしては、例えばＤｅｓｅｒｔ  Ｓｈｉｅｌｄ／９０／ＳＡ株（ジーンバンク登録番号：Ｕ０４４６９）由来のもの等が包含される。
（ｂ）群における配列番号２に示すアミノ酸配列を有するペプチドとしては、例えば日本のＳＲＳＶ感染患者の糞便由来Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｓｅｔｏ １２４／１９８９／ＪＰ株のウイルス構成ペプチドが挙げられ、該アミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するペプチドとしては、例えばＫＹ−８９／８９Ｊ株（ジーンバンク登録番号：Ｌ２３８２８）及びＮｏｒｗａｌｋ／６８／ＵＳ株（ジーンバンク登録番号：Ｍ８７６６１１）由来のもの等が包含される。
（ｃ）群における配列番号３に示すアミノ酸配列を有するペプチドとしては、例えば日本のＳＲＳＶ感染患者の糞便由来Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｆｕｎａｂａｓｈｉ ２５８／１９９６／ＪＰ株のウイルス構成ペプチドが挙げられ、該アミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するペプチドとしては、例えばＳｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ／９１／ＵＫ株（ジーンバンク登録番号：Ｌ０７４１８）由来のもの等が包含される。
（ｄ）群における配列番号４に示すアミノ酸配列を有するペプチドとしては、例えば日本のＳＲＳＶ感染患者の糞便由来Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｃｈｉｂａ ４０７／１９８７／ＪＰ株のウイルス構成ペプチドが挙げられる。
斯かる配列番号４に示すアミノ酸配列を有するペプチドは、現在までにジーンバンクに登録されている全てのＳＲＳＶ関連ウイルス株（下記表１）と構造遺伝子（配列番号１５）の相同性が７５％未満であり、これまでに報告のない新規な配列を有するペプチドである。
（ｅ）群における配列番号５に示すアミノ酸配列を有するペプチドとしては、例えば日本のＳＲＳＶ感染患者の糞便由来Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｎａｒｉｔａ １０４／１９９７／ＪＰ株のウイルス構成ペプチドが挙げられ、該アミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するペプチドとしては、例えばＢｒｉｓｔｏｌ／９３／ＵＫ株（ジーンバンク登録番号：Ｘ７６７１６）、Ｌｏｒｄｓｄａｌｅ／９３／ＵＫ（ジーンバンク登録番号：Ｘ８６５５７）、Ｃａｍｂｅｒｗｅｌｌ／９４／ＡＵ株（ジーンバンク登録番号：Ｕ４６５００）由来のもの等が包含される。
（ｆ）群における配列番号６に示すアミノ酸配列を有するペプチドとしては、例えば日本のＳＲＳＶ感染患者の糞便由来Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｓａｎｂｕ ８０９／１９９８／ＪＰ株のウイルス構成ペプチドが挙げられ、該アミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するペプチドとしては、例えばＭｅｘｉｃｏ／８９／ＭＥＸ株（ジーンバンク登録番号：Ｕ２２４９８）、Ａｕｃｋｌａｎｄ株（ジーンバンク登録番号：Ｕ４６０３９１）、Ｔｏｒｏｎｔｏ／７７／ＣＡ株（ジーンバンク登録番号：Ｕ０２０３０）、ＯＴＨ−２５／８９／Ｊ（ジーンバンク登録番号：Ｌ２３８３０）由来のもの等が包含される。
（ｇ）群における配列番号７に示すアミノ酸配列を有するペプチドとしては、例えば日本のＳＲＳＶ感染患者の糞便由来Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｉｃｈｉｋａｗａ ７５４／１９９８／ＪＰ株のウイルス構成ペプチドが挙げられ、該アミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するペプチドとしては、例えばＳｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ／７６／ＵＳ株（ジーンバンク登録番号：Ｕ７００５９）、Ｍｅｌｋｓｈａｍ／８９／ＵＫ株（ジーンバンク登録番号：Ｘ８１８７９）由来のもの等が挙げられる。
（ｈ）群における配列番号８に示すアミノ酸配列を有するペプチドとしては、例えば日本のＳＲＳＶ感染患者の糞便由来Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｃｈｉｔｔａ １８７６／１９９６／ＪＰ株のウイルス構成ペプチドが挙げられ、該アミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するペプチドとしては、例えばＨａｗａｉｉ／７１／ＵＳ株（ジーンバンク登録番号：Ｕ０７６１１）由来のもの等が包含される。
（ｉ）群における配列番号９に示すアミノ酸配列を有するペプチドとしては、例えば日本のＳＲＳＶ感染患者の糞便由来Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｋａｓｈｉｗａ ４７／１９９７／ＪＰ株のウイルス構成ペプチドが挙げられる。
斯かる配列番号９に示すアミノ酸配列を有するペプチドは、現在までにジーンバンクに登録されている全てのＳＲＳＶ関連ウイルス株（下記表１）と構造遺伝子（配列番号２０）の相同性が７５％未満であり、これまでに報告のない新規な配列を有するペプチドである。
（ｊ）群における配列番号１０に示すアミノ酸配列を有するペプチドとしては、例えば日本のＳＲＳＶ感染患者の糞便由来Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｍｉｅ ７ｋ／１９９４／ＪＰ株のウイルス構成ペプチドが挙げられる。
斯かる配列番号１０に示すアミノ酸配列を有するペプチドは、現在までにジーンバンクに登録されている全てのＳＲＳＶ関連ウイルス株（下記表１）と構造遺伝子（配列番号２１）の相同性が７０％未満であり、これまでに報告のない新規な配列を有するペプチドである。
（ｋ）群における配列番号１１に示すアミノ酸配列を有するペプチドとしては、例えば日本のＳＲＳＶ感染患者の糞便由来Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｏｓａｋａ １０−２５／１９９９／ＪＰ株のウイルス構成ペプチドが挙げられる。
斯かる配列番号１１に示すアミノ酸配列を有するペプチドは、現在までにジーンバンクに登録されている全てのＳＲＳＶ関連ウイルス株（下記表１）と構造遺伝子（配列番号２２）の相同性が７０％未満であり、これまでに報告のない新規な配列を有するペプチドである。
【００１６】
【表１】
0005409534.tif 000002
【００１７】
これら（ａ）〜（ｋ）群のＳＲＳＶ関連ウイルス構成ペプチドには、上記ペプチドの他に、当該ペプチド中の特定のアミノ酸配列を有し、当該ペプチドと同等の抗原性を有する部分ペプチドが包含される。
これらのＳＲＳＶ関連ウイルス構成ペプチドは、そのＲＮＡポリメラーゼ領域の約１２０アミノ酸についてのホモロジー解析によれば２つの遺伝子型に分類することができる。即ち、（ａ）〜（ｄ）群のペプチドの属するＩ型と、（ｅ）〜（ｋ）群のペプチドが属するII型に分類される。
【００１８】
２．ＳＲＳＶ関連ウイルス構造遺伝子のクローニング
ＳＲＳＶ感染患者の便よりセチルトリメチルアンモニウムブロマイド法等を用いて、ウイルスＲＮＡを抽出し、オリゴ−ｄＴプライマー及び逆転写酵素によりｃＤＮＡを作製し、これと各ＳＲＳＶ関連ウイルスの構造遺伝子領域を増幅するプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより構造遺伝子断片を増幅する。
斯かる構造遺伝子断片は、一度大腸菌クローニングベクターを用いてＴＡクローニングを行いプラスミドに組み込まれる。
【００１９】
ここで使用可能なクローニングベクターとしては、大腸菌に代表される原核細胞を宿主とするプラスミド及びλファージ等に代表されるバクテリオファージ由来のベクター等公知のものを使用でき、クローニングベクターとその宿主細胞とを適当に組み合わせて使用することが望ましい。クローニングベクターの具体的な例としては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＣＲII等が挙げられる。また、遺伝子の挿入方法は公知の常法に従えばよく、これらのベクターの構築にあたっては、遺伝子操作の容易である大腸菌系を使用することが望ましい。
【００２０】
３．構造遺伝子の発現及び中空ウイルス粒子の作製
上記で得られた（ａ）〜（ｋ）群の各ウイルス構造遺伝子の断片を適当な発現系を用いて発現させるか或いは、該ウイルス構成ペプチドから遺伝子工学的に作製された中空ウイルス粒子を用いることにより、各ウイルスに対する抗体を得ることができる。以下に大腸菌を用いた場合の発現と、中空ウイルス粒子の作製について説明する。
【００２１】
（１）大腸菌による発現
各ＳＲＳＶ関連ウイルスの構造遺伝子領域を組み込んだプラスミドを、構造遺伝子領域を切断しない制限酵素で消化後構造遺伝子領域を回収し、例えば、ｐＧＥＸ（ＧＳＴ融合蛋白発現ベクター；ファルマシア製）、ｐＴｒｃ９９Ａ（大腸菌発現ベクター；ファルマシア製）、ｐＴｒｘＦｕｓ（チオレドキシン融合蛋白発現ベクター；インビトロゲン社製）、ｐＥＴ（ｐＴ７ＲＮＡプロモーターを用いた発現ベクター；ノバゲン社製）、マルトース結合蛋白又はβガラクトシダーゼの融合蛋白発現ベクター等に組み込む。このとき、組み込む構造遺伝子領域は、完全長でもよいし、部分的な領域でもよく、好ましくはＳＲＳＶの抗原エピトープを最低一つ有する部分的な領域である方がよい。このようにして構造遺伝子領域を組み込んだ遺伝子発現ベクターを遺伝子発現に適した大腸菌、例えば、ＢＬ２１株、ＤＨ１０Ｂ株、ＪＭ１０９株、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株等で形質転換する。得られた形質転換体を一般的な培養液、例えばＬ−ｂｒｏｔｈ等で培養することにより遺伝子発現を行うことができる。発現には、遺伝子発現誘導剤、例えばＩＰＴＧ等を添加することや、ＰＬプロモーターを用いた場合、熱ショックを与えることが好ましい。
発現されたペプチドの精製は、一般的な大腸菌を用いた発現蛋白の精製法に従えばよく、例えば、発現蛋白が可溶化していたならばＧＳＴカラム又はマルトース結合蛋白用カラムを用いたアフィニティー精製を行えばよく、発現蛋白が不溶化していたならば、Ｎｉキレートを用いたアフィニティー精製を行えばよい。
【００２２】
（２）ＳＲＳＶ中空ウイルス粒子の作成
ＳＲＳＶ関連ウイルスの構造遺伝子領域を組み込んだプラスミドを、構造遺伝子領域を切断しない制限酵素で消化し構造遺伝子領域を回収し、例えばｐＶＬ１３９３等のバキュロウイルストランスファーベクターに組み込む。斯かるトランスファーベクターと直鎖状で増殖必須遺伝子領域を欠失させてあるバキュロウイルスＤＮＡと共にトランスフェクションし、昆虫細胞内で相同組換えを起こさせることにより目的とする組換えバキュロウイルスを作製することができる。
【００２３】
得られた組換えバキュロウイルスをＳｆ９細胞、Ｔｎ５細胞等の昆虫細胞に感染させ、常法により適当な成育条件下で培養することによりＳＲＳＶの構造蛋白を発現させ、自己集合させることにより中空ウイルス粒子を生産させることができる。生化学的な精製法例えば遠心分離等を用いれば中空ウイルス粒子を分離精製することができる。中空ウイルス粒子が形成されているかどうかは、ウラニル酢酸でネガティブ染色し、電子顕微鏡で検鏡することにより確認することができる。
かくして得られた中空ウイルス粒子は、内部に遺伝子を持たないため感染性はないが、構造がウイルス粒子とほぼ同じ形をしているので、ウイルス粒子と同等な抗原性を持つものである。
【００２４】
４．ＳＲＳＶ関連ウイルスに対する抗体の取得
得られたウイルス構成ポリペプチド又は中空ウイルス粒子を動物に免疫することにより、抗ＳＲＳＶ関連ウイルス抗体を調製することができる。尚、斯かる抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の何れでもよい
例えば、中空ウイルス粒子を用いた場合の免疫抗体の作製は、精製された各ＳＲＳＶ関連ウイルスの中空ウイルス粒子を常法に従ってウサギに免疫し、分離血清より中空ウイルス粒子に対するＩｇＧ抗体（抗ＳＲＳＶ抗体）を取得することができる。尚、抗体の分離精製にはＤＥＡＥセファロースクロマトグラフィー等の手段が用いられる。
かくして得られた（ａ）〜（ｋ）群からなる１１種類の中空ウイルス粒子と対応する抗ＳＲＳＶ抗体を用いてその交差反応性を測定すると、後記表２に示すように各ＳＲＳＶ関連ウイルス間では交差反応は全く示さない。従って、本発明のＳＲＳＶの検出法によれば、ＳＲＳＶの１１種類の血清型を同時に判別することが可能である。また、このことは同時に遺伝子型Ｉと遺伝子型IIの判別が可能であることも示している。
【００２５】
５．ＳＲＳＶ関連ウイルスの検出
上記で得られた各抗ＳＲＳＶ抗体を用いた検体中のＳＲＳＶの検出は、通常用いられる抗原抗体反応を利用した免疫学的測定法、例えばサンドイッチ法によるラジオイムノアッセイや酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）等を用いることができるが、特にＥＬＩＳＡが好ましい。即ち、１１種類の抗ＳＲＳＶ抗体をマイクロプレートに分注してＳＲＳＶスクリーニングプレートを作製し、ＳＲＳＶ感染患者の便から調製した便乳剤の希釈液を当該プレートのウェルに加えて反応させた後、各ウイルスのパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識抗ＳＲＳＶ抗体を加えて反応させる。次いで基質液（過酸化水素を含むＴＭＢ）を加えて反応させた後、０．６Ｎ硫酸を加えて反応を停止させ、ＥＬＩＳＡオートリーダーでウェルの吸光度（４５０ｎｍ／６３０ｎｍ）を測定することによりＳＲＳＶを検出できる。
【００２６】
ここで、検体中のＳＲＳＶの検出のみを行う場合には、１１種類の抗ＳＲＳＶ抗体全てを混合固定化したマイクロプレートを用いたキットとすればよく、ＳＲＳＶの血清型まで判別する場合には、１１種類の抗ＳＲＳＶ抗体全てをそれぞれ別個のプレートに固定化したマイクロプレートを用いたキットとすればよい。
また、遺伝子型の判別は、（ａ）〜（ｄ）群のペプチドに対する抗体を混合固定化したマイクロプレート（Ｉ型プレート）又は（ｅ）〜（ｋ）群のペプチドに対する抗体を混合固定化したマイクロプレート（II型プレート）を用いたキットとすることにより可能となる。
尚、本発明の各抗ＳＲＳＶ抗体をラテックスや磁気ビーズ等の担体を用いて固定化することにより、検体中のＳＲＳＶ関連ウイルスを確実に捕捉することができ、ラテックスならば遠心操作、磁気ビーズならば磁石でＳＲＳＶ捕捉担体を回収することができ、回収後にウイルスＲＮＡを抽出し利用することができる。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例により本発明のＳＲＳＶ検出キットを具体的に説明する。
実施例１  ＳＲＳＶ関連ウイルスの構造遺伝子のクローニング
（１）ｃＤＮＡ合成
ＳＲＳＶ患者の便（０．５〜１．０ｇ）に９ｍＬのＰＢＳと１ｍＬのダイフロンを加え、ホモジナイズした。次いで、３０００ｒｐｍで２０分間遠心してその上清を回収し、１０％便乳剤とした。
この便乳剤１ｍＬを用い、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド法によりＳＲＳＶのＲＮＡを抽出し、最終的に０．１％ジエチルピロカーボネート液３０μＬに浮遊させた。この浮遊液を用いて、Ｏｌｉｇｏ−ｄＴ（１２−１８）プライマー及びＡＭＶ（Avian Myeloblastosis Virus）（生化学工業社製）由来逆転写酵素によりｃＤＮＡを作製した。
【００２８】
（２）構造遺伝子領域の単離
（１）で作製したｃＤＮＡと、以下に示す構造遺伝子領域を増幅するプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ後、アガロースゲル電気泳動法により増幅させた構造遺伝子断片を分離し、ＳｕｐｒｅｃＴＭ−０１（TAKARA）を用いて回収した。
Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｋａｓｈｉｗａ ６４５／１９９９／ＪＰ遺伝子：Ｇ１／Ｆ２（配列番号２３）、Ｏｌｉｇｏ−ｄＴ（３３）（配列番号２４）
Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｓｅｔｏ １２４／１９８９／ＪＰ遺伝子：Ｇ１／Ｆ２（配列番号２３）、Ｇ１／Ｒ０（配列番号２５）
Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｆｕｎａｂａｓｈｉ ２５８／１９９６／ＪＰ遺伝子：Ｇ１／Ｆ２（配列番号２３）、Ｏｌｉｇｏ−ｄＴ（３３）（配列番号２４）
Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｃｈｉｂａ ４０７／１９８７／ＪＰ遺伝子：Ｄ５（配列番号２６）、ＣＶ−Ｕ４（配列番号２７）
Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｎａｒｉｔａ １０４／１９９７／ＪＰ遺伝子：９７ｋ１０４／Ｆ１（配列番号２８）、９７ｋ１０４／Ｒ１（配列番号２９）
Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｓａｎｂｕ ８０９／１９９８／ＪＰ遺伝子：Ｇ２／Ｆ３（配列番号３０）、ＭＶ−Ｒ１（配列番号３１）
Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｉｃｈｉｋａｗａ ７５４／１９９８／ＪＰ遺伝子：Ｇ２／Ｆ３（配列番号３０）、ＳＭＶ−Ｒ１（配列番号３２）
Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｃｈｉｔｔａ １８７６／１９９６／ＪＰ遺伝子：Ｇ２／Ｆ３（配列番号３０）、Ｇ２／Ｒ０（配列番号３３）
Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｋａｓｈｉｗａ ４７／１９９７／ＪＰ遺伝子：９７ｋ１０４／Ｆ１（配列番号２８）、Ｏｌｉｇｏ−ｄＴ（３３）（配列番号２４）
Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｍｉｅ  ７ｋ／１９９４／ＪＰ遺伝子：Ｇ２／Ｆ３（配列番号３０）、Ｏｌｉｇｏ−ｄＴ（３３）（配列番号２４）
Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｏｓａｋａ １０−２５／１９９９／ＪＰ遺伝子：ＧＦＣＲ７（配列番号３４）、Ｏｌｉｇｏ−ｄＴ（３３）（配列番号２４）
【００２９】
（３）構造遺伝子のクローニング
回収した構造遺伝子断片を、大腸菌クローニングベクターｐＣＲII（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にＴＡクローニングを行った。これらのクローンからウイルスの構造遺伝子を組み込むプラスミドｐＣＲII／６４５、ｐＣＲII／１２４、ｐＣＲII／２５８、ｐＣＲII／Ｃｈｉｂａ、ｐＣＲII／１０４、ｐＣＲII／８０９、ｐＣＲII／７５４、ｐＣＲII／７６、ｐＣＲII／４７、ｐＣＲII／７ｋ、ｐＣＲII／１０−２５を得た。
【００３０】
実施例２  塩基配列の決定
Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｋａｓｈｉｗａ ６４５／１９９９／ＪＰ株、Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｓｅｔｏ １２４／１９８９／ＪＰ株、Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｆｕｎａｂａｓｈｉ ２５８／１９９６／ＪＰ株、Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｃｈｉｂａ ４０７／１９８７／ＪＰ株、Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｎａｒｉｔａ １０４／１９９７／ＪＰ株、Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｓａｎｂｕ ８０９／１９９８／ＪＰ株、Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｉｃｈｉｋａｗａ ７５４／１９９８／ＪＰ株、Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｃｈｉｔｔａ １８７６／１９９６／ＪＰ株、Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｋａｓｈｉｗａ ４７／１９９７／ＪＰ株、Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｍｉｅ ７ｋ／１９９４／ＪＰ株及びＨｕ／ＮＬＶ／Ｏｓａｋａ １０−２５／１９９９／ＪＰ株の構造遺伝子の塩基配列の決定は、以下の方法により行った。
【００３１】
はじめに、トランスファーベクターであるｐＶＬ１３９３のポリヘドリンプロモーターの近傍にプライマー（第１プライマー）を設定し、ｄｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ法によりサイクルシークエンシングキットＦＳ（パーキンエルマー社製）を用いてラベリング反応を行った。この際使用したトランスファーベクターのＤＮＡ濃度は０．４μｇ／μＬであり、シークエンシングプライマーの濃度は３．２ｐｍｏｌ／μＬである。更に、反応終了後、セントリプレップスピンカラム（パーキンエルマー社）を用いて過剰量の蛍光色素を除外した。この反応液を真空凍結乾燥機によって完全に乾燥させ、専用のサンプルバッファー（パーキンエルマー社製）２０μｌに浮遊させる。更に、攪拌後遠心沈殿させ９５℃で２分間の加熱操作を行い、急冷後オートシークエンサー（ABI Genetic analyzer 310）で解析した。
【００３２】
次いで、第１プライマーによって決定された塩基配列を用いて、その塩基配列の３’側に新たなシークエンス用のプライマー（第２プライマー）を設定した。この第２プライマーを用いて、前述と同様にサイクルシークエンシングキットでラベリング反応を行った。反応後、前述と同様の操作を行い、オートシークエンサーで塩基配列を解析した。このように、毎回決定した塩基配列の３’側にシークエンス用プライマーを設定し、塩基配列の決定を行った。これを繰り返し、１１種類のＳＲＳＶ関連ウイルス構造遺伝子の５’末端から３’末端まで塩基配列（配列番号１２〜配列番号２２）を決定した。このうち、配列番号１５（Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｃｈｉｂａ ４０７／１９８７／ＪＰ株）、配列番号２０（Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｋａｓｈｉｗａ ４７／１９９７／ＪＰ株）、配列番号２１（Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｍｉｅ ７ｋ／１９９４／ＪＰ株）及び配列番号２２（Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｏｓａｋａ １０−２５／１９９９／ＪＰ株）で示される塩基配列は、これまでに報告されていない新規な配列であることが確認された。
【００３３】
実施例３  中空ウイルス粒子を産生する組換えバキュロウイルスの作製
（１）トランスファーベクターの構築
実施例１（３）で得られた構造遺伝子領域を組み込んだプラスミドを構造遺伝子領域を切断しない制限酵素で消化し、アガロースゲル電気泳動法によって分離後、構造遺伝子領域をＳｕｐｒｅｃＴＭ−０１(TAKARA)により回収した。次いで、回収した遺伝子断片を、同じ制限酵素で消化したバキュロウイルストランスファーベクターｐＶＬ１３９３（INVITROGEN社製）に組み込み、トランスファーベクターを作製した。
【００３４】
（２）組換えバキュロウイルスの作製
０．５μｇのバキュロウイルスＤＮＡ（Baculo-Gold）と１μｇの（１）で得られたトランスファーベクターを８μＬの蒸留水に溶解し、２倍希釈した等量のリポフェクチンと混合して室温で１５分間放置する。昆虫細胞用培地Ｅｘ−ｃｅｌｌ４００に懸濁した１×１０5個のＳｆ９細胞を２６．５℃で３０分間プラスティックシャーレ（直径３．５ｃｍ）内に吸着後、トランスファーベクターとＢａｃｕｌｏ−Ｇｏｌｄ混合液を細胞に滴下し２６．５℃で培養した。２４時間後、培養液を１０％牛胎児血清及び２％ＢＴＢ（GIBCO BRL社製）を含むＴＣ１００（GIBCO BRL社製；以後TC100）培地に交換し、更に培養を継続した。
【００３５】
（３）組換えバキュロウイルスの純化
（２）で得られた組換えバキュロウイルスを５日間培養した後、培養上清をＴＣ１００等の昆虫細胞培養用メディウムを用いて１０倍に希釈した。その０．１ｍＬを取り、直径３．５ｃｍのプラスチックシャーレに培養した３×１０6個のＳｆ９細胞に接種した。２６．５℃、６０分間吸着後１％アガロースＭＥ（低融点アガロース）を含むＴＣ１００培養液２ｍＬを重層し２６．５℃で培養した。更に、培養開始後４日目に０．００５％のニュートラルレッドを含むＴＣ１００１ｍＬを重層して２６．５℃で培養した。翌日出現したプラークをマイクロチップでかき取り、ＴＣ１００培地に懸濁した。
【００３６】
（４）組換えバキュロウイルスのシードの作製と感染力価の測定
（３）で得られた懸濁液を１×１０7個のＳｆ９細胞に接種し、２６．５℃、６０分間吸着後ＴＣ１００を加え、２６．５℃で３から４日間培養した。この培養液を２５００ｒｐｍ、１０分間、４℃で遠心し、培養上清を回収した。この回収した培養上清を、１×１０7個のＳｆ９細胞に接種し、２６．５℃、６０分間吸着後ＴＣ１００を加え、２６．５℃で３から４日間培養した。
次いで、この培養上清を直径３．５ｃｍのプラスチックシャーレに培養した３×１０7個のＳｆ９細胞に接種し、２６．５℃で６０分間吸着後１％アガロースＭＥ（低融点アガロース）を含むＴＣ１００培養液２ｍＬを重層し２６．５℃で培養した。次いで培養開始後４日目に０．００５％のニュートラルレッドを含むＴＣ １００を１ｍＬ重層して２６．５℃で培養した。翌日出現したプラークを計測し、組換えバキュロウイルスの感染力価を算出し、組換えバキュロウイルスシードの感染力価とした。
【００３７】
実施例４  中空ウイルス粒子の作製
（１）組換えバキュロウイルスを用いた構造蛋白の発現
Ｓｆ９昆虫細胞に対して組換えバキュロウイルスをＭ．Ｏ．Ｉ．（Multiplicity of infection）１から１０で感染させた。この時、組換えウイルス液を細胞に滴下させ、静かに振とうさせながら約６０分程度吸着させた。その後、ＴＣ １００昆虫細胞用培地を添加し、２６．５℃、５から６日間培養した。
【００３８】
（２）発現蛋白の同定
組換えウイルス感染培養上清を経時的に採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後をクーマシーブルー染色で検出し、予想される分子量により発現蛋白の妥当性を確認した。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで蛋白を分離後ニトロセルロース膜に転写し、ＳＲＳＶの回復期血清によるウエスターンブロッティング法で発現蛋白を同定した。
【００３９】
（３）中空ウイルス粒子の精製と回収
組換えバキュロウイルスシードをＭ．Ｏ．Ｉ．１から１０で感染させ、約６０分吸着後、Ｅｘ−ｃｅｌｌ４００を添加し、２６．５℃で３日間培養した。次いで、プロテアーゼ阻害剤、例えばペプスタチンＡ及びリューペプチンを培養液に最終濃度１mMになるように加え更に２から３日間培養を続けた。
【００４０】
培養後２５００ｒｐｍ、１０分間、４℃で遠心し、培養上清を回収した。回収した培養液を１００００ｒｐｍで３０分間遠心して組換えバキュロウイルスを取り除いた。この上清をベックマンＳＷ２８ローターで２５０００ｒｐｍ、４時間遠心して中空ウイルス粒子を沈殿させた。次いで、上清を捨てた遠心管を逆さにして、完全に上清を除き、その後プロテアーゼ阻害剤を加えたグレースバッファー又はＰＢＳ（−）０．５ｍＬを各遠心管に加え、４℃一晩静置した。
静置後、加えておいたプロテアーゼ阻害剤入りグレースバッファーで中空ウイルス粒子を懸濁させ回収した。次いで、回収した中空ウイルス粒子に、ＣｓＣｌを３．８ｇ加えたプロテアーゼ阻害剤入りグレースバッファー又はＰＢＳ（−）を加え１３ｍＬとし、１６℃、３５０００ｒｐｍ、２４から４８時間超遠心した。超遠心後、中空ウイルス粒子が集まっている青白いバンドを回収し、プロテアーゼ阻害剤入りグレースバッファーを用いて５倍希釈後、ベックマンＴＬ１００．３ローターで４５０００ｒｐｍ、３時間超遠心して、中空ウイルス粒子を沈殿させた。
【００４１】
沈殿させた中空ウイルス粒子をプロテアーゼ阻害剤入りグレースバッファー又はＰＢＳ（−）で可溶化した。次いで、１０％から５０％のショ糖を含むプロテアーゼ阻害剤入りグレースバッファー溶液を４ＰＡチューブに作り、そこに中空ウイルス粒子可溶化液を重層し、３５０００ｒｐｍ、４時間、４℃でショ糖密度勾配遠心を行った。遠心後、中空ウイルス粒子の青白いバンドを２６Ｇ針付きの１ｍＬシリンジで回収し、精製ＳＲＳＶ中空ウイルス粒子とした。
精製ＳＲＳＶ中空ウイルス粒子をグレースバッファーで適宜希釈して、Bradford法により蛋白量を測定した。
精製ＳＲＳＶ中空ウイルス粒子は、ウラニル酢酸でネガティブ染色し、電子顕微鏡で検鏡し中空ウイルス粒子を形成しているかを確認した（図２〜１２）。
【００４２】
実施例５  中空ウイルス粒子を用いた免疫抗体及び標識抗体の作製
（１）中空ウイルス粒子に対する免疫抗体の作製
Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｋａｓｈｉｗａ ６４５／１９９９／ＪＰ株、Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｓｅｔｏ １２４／１９８９／ＪＰ株、Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｆｕｎａｂａｓｈｉ ２５８／１９９６／ＪＰ株、Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｃｈｉｂａ ４０７／１９８７／ＪＰ株、Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｎａｒｉｔａ １０４／１９９７／ＪＰ株、Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｓａｎｂｕ ８０９／１９９８／ＪＰ株、Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｉｃｈｉｋａｗａ ７５４／１９９８／ＪＰ株、Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｃｈｉｔｔａ １８７６／１９９６／ＪＰ株、Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｋａｓｈｉｗａ ４７／１９９７／ＪＰ株、Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｍｉｅ ７ｋ／１９９４／ＪＰ株及びＨｕ／ＮＬＶ／Ｏｓａｋａ １０−２５／１９９９／ＪＰ株から得られた精製ＳＲＳＶ中空ウイルス粒子５００μｇを含む１ｍＬのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）と１ｍＬのフロインドの不完全アジュバントを混合し、３ｋｇのニュージーランド白色ウサギに常法に従って免疫した。３週間後、０．２５μｇのＳＲＳＶ中空ウイルス粒子を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１ｍＬとフロインドの不完全アジュバント１ｍＬを混合して免疫した（追加免疫）。次いで、３週間後追加免疫と同様に免疫を行い、この約７から１０日間後に全採血し、血清成分を分離した。
【００４３】
分離精製した血清を硫安分画後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）で４℃、一晩透析した。次いで５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）で平衡化したＤＥＡＥセファロースクロマトグラフィーにかけ、ＵＶ波長２８０ｎｍでモニタリングし、Ｏ．Ｄ．のピークを集めて、中空ウイルス粒子に対するＤＥ
ＡＥ精製ＩｇＧ抗体（抗ＳＲＳＶ抗体）とした。
【００４４】
（２）標識抗体の作製
抗ＳＲＳＶ抗体を過ヨウ素酸改良法〔酵素免疫測定法，２：９１（１９８２）〕でＰＯＤ標識した。即ちＰＯＤを４ｍｇ／ｍＬになるように蒸留水で溶解し、０．１Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム０．２ｍＬを加え、室温で約２０分間反応させた。次いで１ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）で一晩透析した。透析後、０．２Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）を０．０２ｍＬ加え、ｐＨ９．５にすると同時に抗ＳＲＳＶ抗体を８ｍｇ加えた。
室温で約２時間反応させ、４ｍｇ／ｍＬ水酸化ホウ素ナトリウムを０．１ｍＬ加え、４℃で約２時間反応させた。反応後、１０ｍＭリン酸バッファーを用いてセファクリルＳ−２００によるゲル濾過を行い、ＵＶ波長２８０ｎｍでモニタリングしてＰＯＤ標識抗ＳＲＳＶ抗体画分を集めた。
【００４５】
（３）抗ＳＲＳＶ抗体固相プレートの作製
抗ＳＲＳＶ抗体を炭酸バッファー（ｐＨ９．５）で各々０．５−１０μｇ／ｍＬ濃度に希釈し、ポリスチレン平型マイクロプレート（ヌンク社製）に１００μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩静置した。１８時間以上静置したマイクロプレートを最終濃度０．０５％ Tween20を含むＰＢＳ２００μＬ／ウェルで３〜４回洗浄後、最終濃度０．５％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）と０．０５％Tween 20を含む１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）２００μＬ／ウェル加えて４℃一晩静置し、抗ＳＲＳＶ抗体固相マイクロプレートを作製した。
【００４６】
実施例６  交差反応性
（１）抗原検出ＥＬＩＳＡ
各精製ＳＲＳＶ中空ウイルス粒子をそれぞれ緩衝液（１０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．２）に最終濃度０．２％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）と０．０５％Tween 20を含む溶液）で４ｎｇ／ｍＬから０．０４ｎｇ／ｍＬまで希釈した。
次いで、希釈した各中空ウイルス粒子（ＶＬＰ）を、それぞれの抗ＳＲＳＶ抗
体固相マイクロプレートのウェルに１００μＬ加え、室温６０分間反応させた。反応後、ウェルの反応液を吸引除去し、最終濃度０．０５％ Tween20を含む１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）をウェルに２００μＬ加え、同様に吸引除去した。この操作を少なくとも３回行った。洗浄後、緩衝液で２００００倍に希釈した各血清型のＰＯＤ標識抗ＳＲＳＶ抗体を１００μＬ／ウェル加え、室温６０分間反応させた。洗浄後、過酸化水素を含むＴＭＢ溶液を１００μＬ／ウェル加え、室温で３０分間反応させた。反応後、０．６Ｎの硫酸を１００μＬ／ウェル加え、ＥＬＩＳＡオートリーダーでウェルの吸光度（４５０ｎｍ／６３０ｎｍ）を測定した。結果を表２に示す。
【００４７】
【表２】
0005409534.tif 000003
【００４８】
表中、６４５はＨｕ／ＮＬＶ／Ｋａｓｈｉｗａ ６４５／１９９９／ＪＰ株、１２４はＨｕ／ＮＬＶ／Ｓｅｔｏ １２４／１９８９／ＪＰ株、２５８はＨｕ／ＮＬＶ／Ｆｕｎａｂａｓｈｉ ２５８／１９９６／ＪＰ株、４０７はＨｕ／ＮＬＶ／Ｃｈｉｂａ ４０７／１９８７／ＪＰ株、１０４はＨｕ／ＮＬＶ／Ｎａｒｉｔａ １０４／１９９７／ＪＰ株、８０９はＨｕ／ＮＬＶ／Ｓａｎｂｕ ８０９／１９９８／ＪＰ株、７５４はＨｕ／ＮＬＶ／Ｉｃｈｉｋａｗａ ７５４／１９９８／ＪＰ株、１８７６はＨｕ／ＮＬＶ／Ｃｈｉｔｔａ １８７６／１９９６／ＪＰ株、４７はＨｕ／ＮＬＶ／Ｋａｓｈｉｗａ ４７／１９９７／ＪＰ株、７ｋはＨｕ／ＮＬＶ／Ｍｉｅ ７ｋ／１９９４／ＪＰ株、１０−２５はＨｕ／ＮＬＶ／Ｏｓａｋａ １０−２５／１９９９／ＪＰ株を示す。
【００４９】
これより、異なる遺伝子型ＩとIIの間で交差反応性は見られなかったことはもちろん同一遺伝子型間においても交差反応は見られず、用いた１１種類のウイスル株の血清型はそれぞれ異なることが確認された。
【００５０】
試験例１  ＳＲＳＶの遺伝型の判別
遺伝子型Ｉに属するＳＲＳＶ（Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｋａｓｈｉｗａ ６４５／１９９９／ＪＰ株、Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｓｅｔｏ １２４／１９８９／ＪＰ株、Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｆｕｎａｂａｓｈｉ ２５８／１９９６／ＪＰ株、Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｃｈｉｂａ ４０７／１９８７／ＪＰ株）の抗ＳＲＳＶ抗体を炭酸バッファー（ｐＨ９．５）で０．５−１０μｇ／ｍＬ濃度に希釈混合し、ポリスチレン平型マイクロプレート（ヌンク社製）に１００μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩静置した。１８時間以上静置したマイクロプレートを最終濃度０．０５％ Tween20を含むＰＢＳ２００μＬ／ウェルで３〜４回洗浄後、最終濃度０．５％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）と０．０５％ Tween20を含む１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）を２００μＬ／ウェル加えて４℃一晩静置し、遺伝子型Ｉの各血清型に対する抗ＳＲＳＶ−ＩｇＧ抗体を混合固相したマイクロプレート（Ｉ型プレート）を作製した。
【００５１】
次いで、遺伝子型IIに属するＳＲＳＶ（Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｎａｒｉｔａ １０４／１９９７／ＪＰ株、Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｓａｎｂｕ ８０９／１９９８／ＪＰ株、Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｉｃｈｉｋａｗａ ７５４／１９９８／ＪＰ株、Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｃｈｉｔｔａ １８７６／１９９６／ＪＰ株、Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｋａｓｈｉｗａ ４７／１９９７／ＪＰ株、Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｍｉｅ ７ｋ／１９９４／ＪＰ株、Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｏｓａｋａ １０−２５／１９９９／ＪＰ株）の抗ＳＲＳＶ抗体を同様に固相してII型プレートを作製した。
【００５２】
ＳＲＳＶ患者の便（０．５〜１．０ｇ）に９ｍＬのＰＢＳと１ｍＬのダイフロンを加え、ホモジナイズした。次いで、１９０００ｇで２０分間遠心してその上清を回収し、１０％便乳剤とし、この１０％便乳剤を緩衝液で等量希釈し、その希釈液をＩ及びII型プレートのウェルに１００μＬ加え、室温６０分間反応させた。反応後、ウェルの反応液を吸引除去し、最終濃度０．０５％ Tween20を含む１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）をウェルに２００μＬ加え、同様に吸引除去した。この操作を少なくとも３回行った。洗浄後、緩衝液で２００００倍に希釈した各血清型のＰＯＤ標識抗ＳＲＳＶ抗体を１００μＬ／ウェル加え、室温６０分間反応させた。洗浄後、過酸化水素を含むＴＭＢ溶液を１００μＬ／ウェル加え、室温で３０分間反応させた。反応後、０．６Ｎの硫酸を１００μＬ／ウェ ル加え、ＥＬＩＳＡオートリーダーでウェルの吸光度（４５０ｎｍ／６３０ｎｍ）を測定した。
【００５３】
その結果、遺伝子型ＩのＳＲＳＶに感染した患者の便検体１５例は、１４例がＩ型プレートにのみ反応しII型プレートに反応しなかった。遺伝子型IIのＳＲＳＶに感染した患者の便検体７例は、６例がＩ型プレートに反応しないでII型プレートにのみ反応し、遺伝子型の判別が実際に可能であることを確認した。
【００５４】
試験例２  ＳＲＳＶの血清型の判別
ＳＲＳＶ（Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｋａｓｈｉｗａ ６４５／１９９９／ＪＰ株、Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｓｅｔｏ １２４／１９８９／ＪＰ株、Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｆｕｎａｂａｓｈｉ ２５８／１９９６／ＪＰ株、Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｃｈｉｂａ ４０７／１９８７／ＪＰ株、Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｎａｒｉｔａ １０４／１９９７／ＪＰ株、Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｓａｎｂｕ ８０９／１９９８／ＪＰ株、Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｉｃｈｉｋａｗａ ７５４／１９９８／ＪＰ株、Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｃｈｉｔｔａ １８７６／１９９６／ＪＰ株、Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｋａｓｈｉｗａ ４７／１９９７／ＪＰ株、Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｍｉｅ ７ｋ／１９９４／ＪＰ株及びＨｕ／ＮＬＶ／Ｏｓａｋａ １０−２５／１９９９／ＪＰ株）の各抗ＳＲＳＶ抗体をそれぞれ単独に炭酸バッファー（ｐＨ９．５）で０．５−１０μｇ／ｍＬ濃度に希釈し、ポリスチレン平型マイクロプレート（ヌンク社製）に１００μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩静置した。１８時間以上静置したマイクロプレートを最終濃度０．０５％ Tween20を含むＰＢＳ２００μＬ／ウェルで３〜４回洗浄後、最終濃度０．５％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）と０．０５％ Tween20を含む１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）を２００μＬ／ウェル加えて４℃で一晩静置し、抗ＳＲＳＶ抗体固相マイクロプレート（血清型別プレート）を作製した。
ＳＲＳＶ患者の便検体に対し、試験例１と同様にＥＬＩＳＡを行った。結果を表３に示す。
【００５５】
【表３】
0005409534.tif 000004
【００５６】
これにより、本発明のＳＲＳＶ検出法によれば、９３％という高い確率でＳＲＳＶを検出でき、且つその血清型を判別できることが明らかとなった。
尚、本発明のキットによりなされた型別は、ＰＣＲ及び塩基配列の解析によりなされた型別と一致した（表４）。
【００５７】
【表４】
0005409534.tif 000005
【００５８】
また、ＳＲＳＶ（Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｋａｓｈｉｗａ ６４５／１９９９／ＪＰ株、Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｓｅｔｏ １２４／１９８９／ＪＰ株、Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｆｕｎａｂａｓｈｉ ２５８／１９９６／ＪＰ株、Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｃｈｉｂａ ４０７／１９８７／ＪＰ株、Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｎａｒｉｔａ １０４／１９９７／ＪＰ株、Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｓａｎｂｕ ８０９／１９９８／ＪＰ株、Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｉｃｈｉｋａｗａ ７５４／１９９８／ＪＰ株、Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｃｈｉｔｔａ １８７６／１９９６／ＪＰ株、Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｋａｓｈｉｗａ ４７／１９９７／ＪＰ株、Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｍｉｅ ７ｋ／１９９４／ＪＰ株及びＨｕ／ＮＬＶ／Ｏｓａｋａ １０−２５／１９９９／ＪＰ株）の各抗ＳＲＳＶ抗体を炭酸バッファー（ｐＨ９．５）で０．５−１０μｇ／ｍＬ濃度に希釈しこれらを全て混合し、又は混合してから希釈してものを用いて同様に抗ＳＲＳＶ抗体固相マイクロプレートを作製した。ＳＲＳＶに感染した患者の便検体２２例に対し、試験例１と同様にＥＬＩＳＡを行ったところ、２０例で検体中のＳＲＳＶを検出できた。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明のＳＲＳＶ検出キットによれば、簡易で且つ確実にこれまでに見出されている殆どのＳＲＳＶ関連ウイルスを検出し、その血清型及び遺伝子型を判別することができる。従って、ＳＲＳＶによる食中毒が発生した場合の感染ルートの特定、感染拡大の防止及び疫学調査等に有用である。
【図１】
0005409534.tif 000006
【図２】
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【図３】
0005409534.tif 000008
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
0005409534.tif 000015
【図１１】
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【配列表】
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