(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管内皮性増殖因子(ＶＥＧＦ)アンタゴニストによる治療に抵抗性である腫瘍を有するヒト被検体の腫瘍を治療するための医薬であって、抗Ｂｖ８抗体またはその抗原結合断片の有効量と抗ＶＥＧＦ抗体またはその抗原結合断片の有効量とを含有してなる医薬。
【請求項２】
抗ＶＥＧＦ抗体がベバシズマブである、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
抗Ｂｖ８抗体またはその抗原結合断片がキメラ、ヒト化型、又はヒト型である、請求項１に記載の医薬。
【請求項４】
さらに、前記ヒト被検体に化学療法又は放射線療法を行うことを含む、請求項１に記載の医薬。
【請求項５】
ヒト被検体がＶＥＧＦアンタゴニストによる単独療法に抵抗性である腫瘍を有する、請求項１に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して炎症細胞媒介性の脈管形成の阻害に関する。特に、本発明は、抗Ｂｖ８抗体などのＢｖ８アンタゴニストを用いた腫瘍血管形成の防止又は治療と腫瘍発達の阻害に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管形成が腫瘍発達および転移において重要な役割を果たすこと、抗血管形成が臨床的に有効な抗癌方策を示すことは定着している(Folkman, J., Nat Med 1, 27-31 (1995)；Ferrara, N and Kerbel, R.S., Nature 438, 967-974 (2005)；Carmeliet, P., Nat Med 9, 653-660 (2003))。また、血管形成は、加齢性黄斑変性(ＡＭＤ)を含む様々な他の疾患において重要な病原上の役割を果たす。脈絡叢血管形成は、好中球浸潤に少なくともある程度依存していることが報告された(Zhou et al., Mol Vis 11:414-424 (2005))。腫瘍細胞は以前から、血管形成のメディエータの主要な供与源であると考えられている(Folkman, J., N Engl J Med 385, 1182-1186 (1971))。実際、多くの研究により、癌細胞が血管内皮増殖因子-Ａ(ＶＥＧＦ−Ａ)、アンギオポイエチン、肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)および塩基性線維芽細胞増殖因子(ｂＦＧＦ)を含む様々な血管形成因子を生産し得、癌遺伝子又は腫瘍サプレッサー遺伝子の様々な突然変異により少なくともこれらの因子のいつかの生産が増加しうることが示されている(Rak, J., et al., Cancer Res 55, 4575-4580 (1995)；Wizigmann, et al., Cancer Res 55, 1358-1364 (1995))。しかしながら、現在、線維芽細胞、周皮細胞、間充織幹細胞および炎症性免疫細胞からなる間質と内皮前駆体が血管形成因子の分泌並びに免疫系の調節によって腫瘍成長に関与するという考えを説得力のある所見が裏づけている(Hanahan, D. and Weinberg, R. A., Cell 100, 57-70 (2000)；Coussens, L.M. and Werb, Z., Nature 420, 860-867 (2002)；Blankenstein T., Curr Opin Immunol 17:180-186 (2005)；Karnoub et al., Nature 449:557-563 (2005)；Orimo et al., Cell Cycle 5:1497-1601 (2006)；及びRafii, S. et al., Nat Rev Cancer 2, 826-835 (2002))。場合によって、これらのいくつかの細胞は免疫監視機構メカニズムによって腫瘍成長を阻害しうるが、白血球および腫瘍の他の炎症細胞による著しい浸潤により予後が不良になることを多くの所見が示している(上掲のCoussens, et al.)。 
【０００３】
最近の研究は、腫瘍血管形成の調節における骨髄系細胞の異なる集団(Da Palma, M., et al., Nat Med 9, 789-795 (2003)；Yang, L. et al., Cancer Cell 6, 409-421 (2004)；De Palma M., et al., Cancer Cell 8, 211-226 (2005))と、成人のＶＥＧＦ誘導性血管形成(Grunewald, M. et al., Cell 124, 175-189 (2006))を直接関連づけた。非常に新しい研究は、いくつかの腫瘍モデル(Shojaei, F. et al., Cell 124, 175-189 (2006))での抗ＶＥＧＦ療法への不応性を媒介する際のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋骨髄系細胞の役割に関する所見を示した。複数の段階の発癌のトランスジェニックモデルにおける血管形成スイッチを開始する際の好中球の役割は記述されている(Nozawa, H. et al., Proc Natl Acad Sci USA 103, 12493-12498 (2006))。骨髄系細胞は局所的に血管形成因子を分泌してもよいし、基質メタロプロテイナーゼ-９のようなプロテアーゼを生産してもよい(上掲のYang, L., et al.；上掲のNozawa et al.；van Kempen, L.C. et al., Eur J Cancer 42, 728-734 (2006))。その次に、腫瘍微小環境(Bergers G., et al., Nat Cell Biol 2, 737-744 (2000))においてＶＥＧＦ−Ａの生物学的利用能および活性を増やすことによって血管形成を促しうる。しかしながら、骨髄系細胞がＢＭから動員され腫瘍形成を促すメカニズムについての我々の知識は完全ではない。
Ｂｖ８およびＥＧ-ＶＥＧＦは２つの非常に関連した分泌タンパク質であり、プロキネチシン-１および-２と称され、構造的に、コリパーゼホールドと称される５つのジスルフィド架橋モチーフによって定められるペプチドの大きなクラスに属する(DeCouter, J. et al., Nature 420, 860-867 (2002)；LeCouter, J. et al., Proc Natl Acad Sci USA 100, 2685-2690 (2003)；Li, M. et al., Mol Pharmacol 59, 692-698 (2001))。Ｂｖ８は初めに、カエルボンビナ・バリーゲートの皮膚から分泌されたタンパク質として同定された(Mollay, C. et al., Eur J Pharmacol 374, 189-196 (1999))。Ｂｖ８のクローニングおよび発現は、２００３年３月１３日に公開の国際公開０３／０２０８９２において記述される。Ｂｖ８およびＥＧ-ＶＥＧＦは、２つの非常に関連したＧプロテイン結合レセプター(ＧＰＣＲ)、ＥＧ-ＶＥＧＦ／ＰＫＲ-１(Ｒ1)およびＥＧ-ＶＥＧＦ／ＰＫＲ-２(Ｒ2)を結合する(Masuda, Y et al., Biochem Biophys Res Commun 293, 496-402 (2002)；Lin, D.C. et al., J Biol Chem 277, 19276-19280 (2002))。ＥＧ-ＶＥＧＦおよびＢｖ８は特定の内皮細胞種のための選択的な分裂促進因子としての特徴を有した(上掲のLeCouter, J. et al., (2001) and (2003))。他の活性は、痛覚(上掲のMollay, C. et al.)、胃腸管運動性(上掲のLi, M. et al.)、概日性運動リズムの調節(Cheng, M.Y., et al., Nature 417, 405-410 (2002))および嗅球神経形成(Matsumoto, S., et al., Proc Natl Acad Sci USA 103, 4140-4145 (2006))を含む、このファミリーによるものであった。さらに、Ｂｖ８又はＥＧ-ＶＥＧＦはインビトロで顆粒球および単核球性コロニーの産生を刺激した(上掲のLeCouter, J. et al., (2003)；Dorsch, M. et al., J. Leukoc Biol 78(2), 426-34 (2005))。Ｂｖ８は、マクロファージの化学誘引物質としての特徴を有していた(LeCouter et al., Proc Natl Acad Sci USA 101, 16813-16919 (2004))。
【０００４】
病的状態における血管形成の一次調節因子としての血管内皮増殖因子(ＶＥＧＦ)を認識することでＶＥＧＦ活性をブロックする多くの試みがなされている。ＶＥＧＦは、最も特徴的かつ強力な血管形成のポジティブ調節因子の一つである。例としてFerrara, N. & Kerbel, R.S. Angiogenesis as a therapeutic target. Nature 438:967-74 (2005)を参照。血管形成および脈管形成において血管形成因子であることに加えて、多形質発現の増殖因子としてのＶＥＧＦは、内皮細胞生存、脈管透過性および血管拡張、単球走化性およびカルシウム流入などの他の生理学的過程において複数の生物学的な影響を示す。Ferrara and Davis-Smyth (1997) Endocrine Rev. 18: 4-25。さらに、いくつかの研究は、網膜色素上皮細胞、膵管細胞およびシュワン細胞などのいくつかの内皮細胞種類に対するＶＥＧＦの分裂促進効果を報告している。例としてGuerrin et al. J. Cell Physiol. 164:385-394 (1995)；Oberg-Welsh et al. Mol. Cell. Endocrinol. 126:125-132 (1997)；及びSondell et al. J. Neurosci. 19:5731-5740 (1999)を参照。
病的状態における血管形成の一次調節因子としての血管内皮増殖因子(ＶＥＧＦ)を認識することでＶＥＧＦ活性をブロックする多くの試みがなされている。阻害性抗ＶＥＧＦレセプター抗体、可溶性レセプターコンストラクト、アンチセンス方策、ＶＥＧＦに対するＲＮＡアプタマーおよび低分子量ＶＥＧＦレセプターチロシンキナーゼ(ＲＴＫ)インヒビターはすべてＶＥＧＦシグナル伝達に干渉するために提案されている。例としてSiemeister et al. Cancer Metastasis Rev. 17: 241-248 (1998)を参照。抗ＶＥＧＦ中和抗体は、ヌードマウスにおいて様々なヒト腫瘍細胞株の増殖を抑制すること(Kim et al. Nature 362:841-844 (1993); Warren et al. J. Clin. Invest. 95:1789-1797 (1995)；Borgstr?m et al. Cancer Res. 56: 4032-4039 (1996)；及びMelnyk et al. Cancer Res. 56: 921-924 (1996))、更に、虚血性網膜疾患のモデルにおいて眼内血管形成を阻害すること(Adamis et al. Arch. Ophthalmol. 114:66-71 (1996))が示されている。実際、ヒト化抗ＶＥＧＦ抗体であるベバシズマブ(ＡＶＡＳＴＩＮ(登録商標)、Genentech, South San Francisco, CA)は、結腸又は直腸の転移性カルチノーマを有する患者の第一又は第二治療のための静脈内５-フルオロウラシルベースの(５−ＦＵ)化学療法との併用が、そして、切除不能な局所的に進行した再発性又は転移性の非扁平上皮非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)患者の第一治療のためのカルボプラチンおよびパクリタキセルとの併用が米国ＦＤＡによって承認されている。例としてFerrara et al., Nature Reviews Drug Discovery, 3:391-400 (2004)を参照。
【０００５】
しかしながら、治療的化合物の腫瘍成長への長期の干渉能は、薬剤耐性の発達によって制限されることが多い。様々な細胞障害性化合物に対する耐性のいくつかのメカニズムは、主に単細胞の腫瘍モデルにおいて同定され、機能的に特徴が示された。例としてLongley, D.B. & Johnston, P.G. Molecular mechanisms of drug resistance. J Pathol 205:275-92 (2005)を参照。さらに、宿主間質性腫瘍細胞相互作用は、薬剤耐性表現型に関与しうる。間質細胞は、様々な血管形成誘発因子を分泌し、腫瘍細胞と同じ遺伝的不安定性および突然変異率の増加を示すものではない(Kerbel, R.S. Inhibition of tumor angiogenesis as a strategy to circumvent acquired resistance to anti-cancer therapeutic agents. Bioessays 13:31-6 (1991)。Ferrara & Kerbel and Hazlehurst et al. in Ferrara, N. & Kerbel, R.S. Angiogenesis as a therapeutic target. Nature 438:967-74 (2005)；及び、Hazlehurst, L.A., Landowski, T.H. & Dalton, W.S. Role of the tumor microenvironment in mediating de novo resistance to drugs and physiological mediators of cell death. Oncogene 22:7396-402 (2003)によって概説される。
【０００６】
臨床前モデルにおいて、ヒト化モノクローナル抗体ベバシズマブ(ＡＶＡＳＴＩＮ(登録商標)、Genentech, South San Francisco, CA)又はベバシズマブへのマウスの前駆体(Ａ４.６.１(１９９１年３月２９日に寄託されたＡ４.６.１を産生するハイブリドーマ細胞株、ＡＴＣＣ ＨＢ−１０７０９))によるＶＥＧＦシグナル伝達ブロックは、腫瘍成長を有意に阻害し、試験したほとんどの異種移植モデルにおいて腫瘍血管形成を低減した(Gerber & Ferrara in Gerber, H.P. & Ferrara, N. Pharmacology and pharmacodynamics of bevacizumab as monotherapy or in combination with cytotoxic therapy in preclinical studies. Cancer Res 65:671-80 (2005)により概説される)。単剤の抗ＶＥＧＦ治療の薬理学的効果は、腫瘍増殖の初期の治療が開始された時に最も顕著であった。腫瘍が定着するまで治療を遅らせた場合、阻害作用は一般的に一過性であり、腫瘍は最終的に耐性を発達させた。例としてKlement, G. et al. Differences in therapeutic indexes of combination metronomic chemotherapy and an anti-VEGFR-2 antibody in multidrug-resistant human breast cancer xenografts. Clin Cancer Res 8:221-32 (2002)を参照。抗ＶＥＧＦ治療に対するこのような耐性の基礎をなしている細胞及び分子現象は複雑である。例としてCasanovas, O., Hicklin, D.J., Bergers, G. & Hanahan, D. Drug resistance by evasion of antiangiogenic targeting of VEGF signaling in late-stage pancreatic islet tumors. Cancer Cell 8:299-309 (2005)；及び、Kerbel, R.S. et al. Possible mechanisms of acquired resistance to anti-angiogenic drugs: implications for the use of combination therapy approaches. Cancer Metastasis Rev 20:79-86 (2001)を参照。様々な因子が関与しうる。例えば、ＶＥＧＦおよび線維芽細胞増殖因子(ＦＧＦ)シグナル伝達を標的とする化合物との併用治療は、有効性を改善し、膵島発癌の遺伝子モデルの後期段階の腫瘍において耐性の発生を遅らせた。Casanovas, O., Hicklin, D.J., Bergers, G. & Hanahan, D. Drug resistance by evasion of antiangiogenic targeting of VEGF signaling in late-stage pancreatic islet tumors. Cancer Cell 8, 299-309 (2005)を参照。他の研究者は、腫瘍浸潤性間質性線維芽細胞を代替血管形成誘発因子の強力な供与源として同定した。例としてDong, J. et al. VEGF-null cells require PDGFR alpha signaling-mediated stromal fibroblast recruitment for tumorigenesis. Embo J 23:2800-10 (2004)；及び、Orimo, A. et al. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell 121:335-48 (2005)を参照。
【０００７】
炎症細胞は、炎症性サイトカインを分泌することによって血管形成に関与し得、これは、内皮細胞活性化、増殖、移動及び生存に影響しうる(Albini et al. and Balkwill et al. in Albini, A., Tosetti, F., Benelli, R. & Noonan, D.M. Tumor inflammatory angiogenesis and its chemoprevention. Cancer Res 65:10637-41 (2005)；及び、Balkwill, F., Charles, K.A. & Mantovani, A. Smoldering and polarized inflammation in the initiation and promotion of malignant disease. Cancer Cell 7:211-7 (2005)において概説される)。単球／マクロファージ(例としてDe Palma, M. et al. Tie2 identifies a hematopoietic lineage of proangiogenic monocytes required for tumor vessel formation and a mesenchymal population of pericyte progenitors. Cancer Cell 8:211-26 (2005)；及び、Yang, L. et al. Expansion of myeloid immune suppressor Gr+CD11b+ cells in tumor-bearing host directly promotes tumor angiogenesis. Cancer Cell 6:409-21 (2004)を参照)、Ｔ−及びＢ−リンパ球(例としてFreeman, M.R. et al. Peripheral blood T lymphocytes and lymphocytes infiltrating human cancers express vascular endothelial growth factor: a potential role for T cells in angiogenesis. Cancer Res 55:4140-5 (1995)を参照)、血管性白血球(例としてConejo-Garcia, J.R. et al. Vascular leukocytes contribute to tumor vascularization. Blood 105:679-81 (2005)を参照)、樹状細胞(例としてConejo-Garcia, J.R. et al. Tumor-infiltrating dendritic cell precursors recruited by a beta-defensin contribute to vasculogenesis under the influence of Vegf-A. Nat Med 10:950-8 (2004)を参照)、好中球(例としてCoussens, L.M., Tinkle, C.L., Hanahan, D. & Werb, Z. MMP-9 supplied by bone marrow-derived cells contributes to skin carcinogenesis. Cell 103:481-90 (2000)を参照)及び、マスト細胞(例としてCoussens, L.M. et al. Inflammatory mast cells up-regulate angiogenesis during squamous epithelial carcinogenesis. Genes Dev 13:382-97 (1999)；及び、de Visser and Coussens in de Visser, K.E., Eichten, A. & Coussens, L.M. Paradoxical roles of the immune system during cancer development. Nat Rev Cancer 6:24-37 (2006)において概説される)を含め、いくつかの腫瘍浸潤性炎症細胞は血管形成誘発因子を分泌する。骨髄由来の内皮始原細胞(ＥＰＣ(例としてLyden, D. et al. Impaired recruitment of bone-marrow-derived endothelial and hematopoietic precursor cells blocks tumor angiogenesis and growth. Nat Med 7, 1194-201 (2001)を参照)及び、血管周囲始原細胞(例としてSong, S., Ewald, A.J., Stallcup, W., Werb, Z. & Bergers, G. PDGFRbeta+ perivascular progenitor cells in tumours regulate pericyte differentiation and vascular survival. Nat Cell Biol 7:870-9 (2005)を参照)は、腫瘍成長のいくつかの実験モデルにおいて脈管形成に関与することが示唆された(Rafii et al.in Rafii, S., Lyden, D., Benezra, R., Hattori, K. & Heissig, B. Vascular and haematopoietic stem cells: novel targets for anti-angiogenesis therapy? Nat Rev Cancer 2:826-35 (2002)において概説される)。腫瘍関連マクロファージ(ＴＡＭ)を含む、骨髄系統造血細胞は、血管形成因子を分泌することによって直接的に又は細胞外基質分解性プロテアーゼを生産することによって間接的に、血管形成を刺激し、その次に隔離されていた血管形成因子を放出することが示された(Lewis, C.E. & Pollard, J.W. Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments. Cancer Research 66:605-612 (2006)；及び、Naldini, A. & Carraro, F. Role of inflammatory mediators in angiogenesis. Curr Drug Targets Inflamm Allergy 4:3-8 (2005)において概説される)。骨髄系細胞系統の中で、腫瘍保持マウスの脾臓から単離されたＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋前駆細胞は、腫瘍細胞と共に注入した場合に血管形成を促進し(例としてYang, L. et al. Expansion of myeloid immune suppressor Gr+CD11b+ cells in tumor-bearing host directly promotes tumor angiogenesis. Cancer Cell 6:409-21 (2004)を参照)、そして、腫瘍浸潤性マクロファージの数はいくつかのヒト腫瘍の予後不良と相関していた(Balkwill et al. in Balkwill, F., Charles, K.A. & Mantovani, A. Smoldering and polarized inflammation in the initiation and promotion of malignant disease. Cancer Cell 7:211-7 (2005)において概説される)。しかしながら、他の研究では、マクロファージはマウスの実験的腫瘍の成長を阻害したことから、抗癌療法としての可能性が示唆される。例としてKohchi, C. et al. Utilization of macrophages in anticancer therapy: the macrophage network theory. Anticancer Res 24:3311-20 (2004)を参照。Shojaei, F.Wu, et al.  Tumor refractoriness to anti-VEGF treatment is mediated by CD11b(+)Gr1(+) myeloid cells. Nat Biotechnology 2007 25(8): 911-20は、抗ＶＥＧＦ抗体による治療に対する腫瘍の耐性におけるＣＤ１１ｂ(＋)Ｇｒ１(＋)骨髄系細胞の役割について報告した。同種の所見は、２００７年３月２８日に出願の同時継続米国特許公開第１１／６９２６８１号において開示される。
【０００８】
相対的に多くの量の骨髄系細胞とその血管形成誘発因子産生能にもかかわらず、抗ＶＥＧＦ治療に対する腫瘍耐性における役割はわかっていない。骨髄系細胞の生物学的機能、耐性腫瘍およびそれらが生産する因子を発見し理解する必要がある。以下の開示内容に明らかであるように、本発明はこれらおよび他の必要性を解決するものである。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、Ｂｖ８が腫瘍発達の間に骨髄(ＢＭ)からＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の動員を制御し、腫瘍血管形成を促すことを示す実験データに少なくともある程度基づいている。ゆえに、本発明は、ＶＥＧＦアンタゴニストによる治療に抵抗性がある腫瘍を診断及び治療するための方法及び組成物を提供する。
一態様では、本発明は、既に血管内皮増殖因子(ＶＥＧＦ)アンタゴニストにて治療された腫瘍を有する哺乳類の被検体(例えばヒト被検体)にＢｖ８アンタゴニストの有効量を投与することを含む、腫瘍の治療方法に関する。ヒト被検体は、ＶＥＧＦアンタゴニストによる治療に抵抗性であってよいが、抵抗性であることが必要ではない。
一実施態様では、ＶＥＧＦアンタゴニストは抗ＶＥＧＦ抗体ないしはその断片であり、この抗ＶＥＧＦ抗体は、例えばベバシズマブないしはその断片又は変異体であってもよい。
他の実施態様では、Ｂｖ８アンタゴニストは抗Ｂｖ８又は抗Ｂｖ８レセプターモノクローナル抗体ないしはその断片であり、このＢｖ８レセプターはＰＫＲ−１／ＥＧ−ＶＥＧＦＲ１又はＰＫＲ−２／ＥＧ−ＶＥＧＦＲ２であってもよい。抗体が結合するＢｖ８は、治療される哺乳動物の天然配列のＢｖ８ポリペプチドである。同様に、抗体が結合するＢｖ８レセプターは、治療される哺乳動物の天然配列のＢｖ８レセプターである。
抗体又は抗体断片は、キメラでも、ヒト化でも、ヒトでもよい。
【００１０】
さらなる態様では、被検体は抗ＶＥＧＦ抗体をさらに投与され、このＶＥＧＦは、具体的には１６５-アミノ酸の血管内皮細胞増殖因子、及び関連の１２１-、１４５-、１８９-および２０６-アミノ酸の血管内皮細胞増殖因子を含むがこれらに限定されない任意のＶＥＧＦ分子と、その天然に生じる対立遺伝子型及びプロセシング型であってもよい。
特定の実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体はベバシズマブないしはその断片又は変異体である。
他の実施態様では、Ｂｖ８アンタゴニストおよび場合によってＶＥＧＦアンタゴニストの投与に加えて、ヒト患者などの哺乳類の被検体は、一又は複数の更なる骨髄系細胞低減剤、例えばＧｒ１アンタゴニスト、エラスターゼインヒビター、ＭＣＰ−１アンタゴニストおよび／またはＭＩＰ−１αアンタゴニストによって治療される。
さらに他の実施態様では、ヒト被検体などの治療される哺乳類の被検体は、化学療法および／または放射線療法を受け、この化学療法は、例えば、細胞障害性剤の投与を含んでもよい。好ましくは、付加的な治療は、標的とされる特定の腫瘍の治療についての「標準的な治療」として知られている治療である。
腫瘍は、限定するものではないが、腺癌、リンパ腫、芽細胞腫、メラノーマ、肉腫および白血病を含むカルチノーマなどの任意の種類の良性又は癌性の腫瘍であってよい。本明細書中で好適な癌は、大腸癌、直腸癌、肺癌および乳癌、特に大腸又は直腸の転移性カルチノーマ、又は非扁平上皮非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)である。
特定の実施態様では、上記の方法はさらに、治療前の数又は頻度と比較して、ヒトなどの哺乳類の被検体から得た生体試料における、循環及び／又は骨髄のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の数及び／又は頻度を決定することによって、治療の有効性をモニタリングする工程を含む。
【００１１】
他の態様では、本発明は、腫瘍の治療方法であり、
(ａ) 腫瘍を有する哺乳類の被検体、例えばヒトに、Ｂｖ８アンタゴニストの有効量を投与する、
(ｂ) 治療前の数又は頻度と比較して、ヒトなどの哺乳類の被検体から得た生体試料における、循環及び／又は骨髄のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の数及び／又は頻度を決定することによって、該治療の有効性をモニタリングし、このとき数又は頻度の減少が治療が有効であることを示す、
ことを含む方法に関する。
更なる態様では、本発明は、ヒトなどの哺乳類の被検体における炎症細胞が媒介する血管形成の阻害方法であって、被検体にＢｖ８アンタゴニストの有効量を投与することを含む方法に関する。
アンタゴニストは、例えば、抗Ｂｖ８又は抗Ｂｖ８レセプターモノクローナル抗体ないしはその断片であってよく、それはキメラでも、ヒト化でも、ヒトでもよい。抗体が結合するＢｖ８は、治療される哺乳動物の天然配列のＢｖ８ポリペプチドである。同様に、抗体が結合するＢｖ８レセプターは、治療される哺乳動物の天然配列のＢｖ８レセプターである。
この方法はさらに、治療前の数又は頻度と比較して、ヒトなどの哺乳類の被検体から得た生体試料における、循環及び／又は骨髄のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の数及び／又は頻度を決定することによって、治療の有効性をモニタリングする工程を含む。
他の実施態様では、方法はさらに、血管形成の更なるインヒビター、例えば血管形成因子に対する抗体の投与を含んでもよい。
血管形成因子の例には、限定するものではないが、血管内皮増殖因子(ＶＥＧＦ)、アンギオポイエチン、肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)および塩基性線維芽細胞成長因子(ｂＦＧＦ)が含まれる。
【００１２】
さらに他の態様では、本発明は、Ｂｖ８アンタゴニストによる治療のための腫瘍保持ヒト被検体の識別方法であって、被検体がＶＥＧＦアンタゴニストによる治療に抵抗性であることを決定することを含む方法に関する。
なお更なる態様では、本発明は、Ｂｖ８アンタゴニスト単独、又はＧ−ＣＳＦアンタゴニストと組み合わせて投与することによって刺激される好中球動員の阻害に関する。
本発明はさらに、Ｂｖ８アンタゴニストによる骨髄系統の細胞のＢｖ８媒介性移動の阻害に関する。
本発明はさらに、Ｂｖ８アンタゴニストを投与することによって、腫瘍発達および／または成長を阻害するための、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋骨髄系細胞の枯渇に関する。
【００１３】
他の態様では、本発明は、腫瘍保持ヒト被検体にＧ−ＣＳＦアンタゴニストの有効量を投与することを含む腫瘍の治療方法に関する。
特定の実施態様では、Ｇ−ＣＳＦアンタゴニストは、抗Ｇ−ＣＳＦ抗体又は抗体断片である。抗体又は抗体断片は、キメラでも、ヒト化でも、ヒトでもよい。場合によって、Ｇ−ＣＳＦアンタゴニストは、Ｂｖ８アンタゴニストおよび／またはＶＥＧＦアンタゴニスト、例えば抗Ｂｖ８抗体および／または抗ＶＥＧＦ抗体と組み合わせて投与される。 
他の実施態様では、Ｇ−ＣＳＦアンタゴニストは、異なる抗腫瘍剤および／または治療投薬計画、例えば化学療法および／または放射線療法と組み合わせて投与される。
さらに他の態様では、本発明は、ヒト被検体における好中球移動の阻害方法であって、被検体にＢｖ８アンタゴニストの有効量を投与することを含む方法に関する。
更なる態様では、本発明は、抗血管形成療法から利益を得る非腫瘍性状態の治療方法であって、既に非腫瘍性状態と診断されて、血管内皮増殖因子(ＶＥＧＦ)アンタゴニストにて治療されたヒト被検体に、Ｂｖ８アンタゴニストの有効量を投与することを含む方法に関する。
一実施態様では、非腫瘍性状態は、ＶＥＧＦアンタゴニストによる治療に抵抗性である。
非腫瘍性状態は、例えば、望ましくない又は異常な肥大、関節炎、関節リウマチ(ＲＡ)、乾癬、乾癬のプラーク、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化、アテローム硬化性プラーク、心筋梗塞の浮腫、糖尿病性及び他の増殖性網膜症、後水晶体線維増殖症、血管形成性緑内障、加齢性黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫、角膜血管形成、角膜移植片血管形成、角膜移植片拒絶反応、網膜／脈絡叢血管形成、アングルの血管形成(ルベオーシス)、眼性血管形成疾患、血管性再狭窄、動静脈奇形(ＡＶＭ)、髄膜腫、血管腫、血管線維腫、甲状腺の過形成(甲状腺機能亢進症を含む)、角膜及び他の組織移植、慢性炎症、肺炎症、急性の肺損傷／ＡＲＤＳ、敗血症、原発性肺高血圧症、悪性の肺滲出、大脳浮腫(例えば、急性の脳卒中／非開放性頭部損傷／外傷と関係するもの)、滑液の炎症、ＲＡのパンヌス形成、骨化性筋炎、肥大性骨形成、骨関節炎(ＯＡ)、難治性腹水、多嚢胞性卵巣疾患、子宮内膜症、第３区画の体液疾患(膵炎、区画症候群、熱傷、腸疾患)、子宮類線維腫、早産、ＩＢＤ(クローン病および潰瘍性大腸炎)のような慢性炎症、腎臓同種異系移植片拒絶反応、炎症性腸疾患、ネフローゼ症候群、望ましくない又は異常な組織塊成長(非癌)、肥満、脂肪組織塊成長、血友病関節、肥大性瘢痕、体毛成長の阻害、オスラー・ウェーバー症候群、化膿肉芽腫後水晶体線維増殖症、強皮症、トラコーマ、血管性接着、関節滑膜炎、皮膚炎、子癇前症、腹水、心嚢貯留液および胸水からなる群から選択されうる。
【００１４】
なお更なる態様では、本発明は、中和性抗Ｂｖ８抗体及び、このような抗体を含む組成物に関する。
特定の実施態様では、中和抗体は、マウス抗Ｂｖ８抗体３Ｆ１又は２Ｂ９として、同じエピトープ、又は基本的に同じエピトープに結合する。前記の通り、抗体は、抗体断片であってもよいし、キメラでも、ヒト化でも、ヒトでもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
明細書において、ＢＭ＝骨髄、及びＰＢ＝末梢血。
【図１】ＢＭ細胞でのＢｖ８発現及び活性の調節。ａ．腫瘍はＢＭ中でのＢｖ８タンパク質の発現を誘導する。ベージュヌードマウスにＡ６７３又はＨＭ７腫瘍細胞を移植した。特異的ＥＬＩＳＡは、６日後にマトリゲルＴＭ−移植マウスに対して腫瘍移植マウスのＢＭＭＮＣ中のＢｖ８の高い（ｐ＜０．０５）レベルを示した。ｂ．Ｂｖ８の発現は、ＢＭ細胞のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋サブセットにおいて特異的にアップレギュレートされている。ベージュヌードマウスにＡ６７３、ＨＭ７、ＨＰＡＣ、Ｃａｌｕ−６及びＪｕｒｋａｔ細胞を移植した。１０日後、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋骨髄細胞をマウスのＢＭから単離し、分析により骨髄及び非骨髄（ＣＤ１１ｂ−Ｇｒ１−）サブセット中でのＢｖ８発現を測定した。星印は、各腫瘍中のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋と対応するＣＤ１１ｂ−Ｇｒ１−集団を比較した場合の有意差（ｐ＜０．０５）を示している。ｃ．Ｇ−ＣＳＦはＢｖ８発現の主要な誘導因子である。ＢＭＭＮＣは未処置のマウスから単離し、一連のサイトカイン及びケモカインと共にインキュベートし、Ｂｖ８発現を、方法に記載したようにして、ＴａｑｍａｎＴＭによって評価した。ｄ．Ｇ−ＣＳＦはＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞中のＢｖ８の主要な誘導因子である。ＢＭＭＮＣはＢａｌｂ−ｃマウスから単離し、ＦＡＣＳによってＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋及びＣＤ１１ｂ−Ｇｒ１−サブセットに選別した。全ＢＭ、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋及びＣＤ１１ｂ−Ｇｒ１−集団を、方法に記載したようにして、ＳＤＦ１α、Ｇ−ＣＳＦ及びＧＭ−ＣＳＦで処理した。ｅ．低酸素は骨髄細胞中のＧ−ＣＳＦによってＢｖ８のアップレギュレーションを亢進する。ＢＭ ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋を正常酸素圧又は低酸素（１％Ｏ２）の何れかの条件下で４時間、２０又は２５００ｐｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦと共にインキュベートした。ｆ．Ｂｖ８レベルはＧ−ＣＳＦの注入後、ＢＭにおいて有意に増加している。Ｂａｌｂ−ｃマウスに０日目とついで８日間毎日Ｇ−ＣＳＦを皮下注射した。ＢＭ試料を１、３、６及び８日目に採取し、Ｂｖ８タンパク質のレベルを記載されているようにして測定した。ｇ．抗Ｇ−ＣＳＦでの処置は、Ｂｖ８のＧ−ＣＳＦ誘導アップレギュレーションを阻害する。新鮮に単離したＢＭＭＮＣをＨＭ７腫瘍可溶化物及び示した様々な濃度の抗Ｇ−ＣＳＦと共にインキュベートした。ＢＭＭＮＣ中のＢｖ８の発現をＴａｑｍａｎＴＭによってモニターした。ｈ．抗Ｇ−ＣＳＦは非腫瘍担持マウスのＢＭ中のＢｖ８のレベルを低減させる。Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスをＰＢＳ、コントロールＩｇＧ及び抗Ｇ−ＣＳＦで処置し、ＢＭＭＮＣ中のＢｖ８のレベルを、方法に記載したようにしてＥＬＩＳＡによって測定した。ｉ．抗Ｇ−ＣＳＦは、ＨＭ７腫瘍を持つマウスのＢＭ中のＢｖ８のレベルを低減させる。詳細は方法を参照のこと。腫瘍又はマトリゲルＴＭの移植から４８時間後に、Ｂｖ８タンパク質のレベルを、記載されているようにしてＢＭＭＮＣ中で測定した。ｊ．Ｂｖ８は、Ｇ−ＣＳＦによって誘導される好中球動員において所定の役割を担っている。Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスを、方法に記載されているようにして、抗Ｇ−ＣＳＦ、抗Ｂｖ８、コントロールＭａｂ及びコントロールＩｇＧ抗体を含む幾つかの薬剤を用いて１２時間で２回腹腔内処置した。全てのマウスは最後の注射から６時間後に出血させ、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の頻度を、記載されているようにＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Becton Dickinson）で決定した。
【図２】ヌードマウスに移植された腫瘍細胞株の増殖に対する抗Ｂｖ８抗体の効果。Ａ６７３（ａ）、ＨＭ７（ｂ）、ＨＰＡＣ（ｃ）及びＪｕｒｋａｔ（ｄ）腫瘍細胞を、明細書に記載されたように、Ｂａｌｂ−ｃヌードマウスに移植した。コントロール（抗ブタクサ）、抗Ｂｖ８又は抗ＶＥＧＦ−Ａ Ｍａｂ（ｎ＝１０）での処置を、腫瘍細胞接種から２４−４８時間後に開始した。腫瘍体積を毎週２回測定した。腫瘍重さは実験の終わりに決定した。示したデータは平均±ＳＥＭである。星印は、コントロール処置群と比較した抗Ｂｖ８又は抗ＶＥＧＦにおける有意差（ｐ＜０．０５）を示している。ｅ．抗Ｂｖ８及び抗ＶＥＧＦは、抗ＶＥＧＦ耐性腫瘍における腫瘍増殖を阻害する相加的な効果を有している。ベージュヌードマウスにＴＩＢ４２細胞を移植し、コントロール、抗Ｂｖ８、抗ＶＥＧＦ及び抗Ｂｖ８プラス抗ＶＥＧＦ抗体で処置した。挿入図は４つの全処置における最終腫瘍重さを示している。Ｃ：コントロール、ＡＶ：抗ＶＥＧＦ、ＡＢ：抗Ｂｖ８。
【図３】抗Ｂｖ８処置はＰＢ及び幾つかのモデルの腫瘍中におけるＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞を低減させる。ａ＆ｂ．ヌードマウス（ｎ＝５）にＡ６７３、Ｃａｌｕ６、ＨＭ７、ＨＰＡＣ及びＪｕｒｋａｔ細胞を移植した。ついで、方法に記載されているようにして、マウスを抗Ｂｖ８又はコントロールＭａｂで処置した。分析を腫瘍移植から１０日後に実施し、ＣＤ１１ｂ＋、Ｇｒ１＋及びＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の頻度を、記載されたように、ＰＢ（ａ）、及び腫瘍（ｂ）中で測定した。挿入図はマトリゲルＴＭマウスにおけるＣＤ１１ｂ＋、Ｇｒ１＋及びＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の頻度を部分的に示している。ｃ＆ｄ．ＢＭ ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋の腫瘍内注射は、抗Ｂｖ８処置による腫瘍増殖阻害を無効化しうる。ヌードマウスにＡ６７３（ｃ）及びＨＭ７（ｄ）腫瘍を移植し、抗Ｂｖ８又はコントロールＭａｂで処置した。７日目（矢印で示す）に、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞を、ＣＤ１１ｂ＋ビーズを使用して、Ａ６７３及びＨＭ７腫瘍で刺激したマウスのＢＭから単離した。精製した集団を腫瘍を持つマウスに直接注射し、記載されたように処置を継続した。
【図４】Ｂｖ８は腫瘍血管新生を調節する。記載されたように免疫不全マウスに５×１０６ＨＭ７細胞を移植した。移植から５日後に、マウスに１０７ｐｆｕのＡｖ−Ｂｖ８、Ａｖ−ＶＥＧＦ又はＡｖ−ＬａｃＺを注射した。ａ．全ての処置における最終の腫瘍体積測定は、Ａｖ−ＬａｃＺ腫瘍と比較してＡｖ−Ｂｖ８及びＡｖ−ＶＥＧＦにおける腫瘍体積の有意差を示していた。ｂ．末梢血（ＰＢ）中のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の頻度は、Ａｖ−ＶＥＧＦ及びＡｖ−ＬａｃｚＺ動物と比較してＡｖ−Ｂｖ８処置マウスにおいてより大きかった。ｃ＆ｄ．マイクロＣＴ分析は、ＬａｃＺ注射マウスに比較してＢｖ８−及びＶＥＧＦ−アデノウイルスを注射したマウスにおいて、増加した血管体積（ｃ）を明らかにした。ｅ．Ａｖ−ＬａｃＺ、Ａｖ−ＶＥＧＦ及びＡｖ−Ｂｖ８を注射した腫瘍の代表的な画像を示す。血管網及び腫瘍はそれぞれ赤色及び灰色で示されている。ｆ．抗Ｂｖ８Ｍａｂでの処置は、腫瘍脈管構造に影響を及ぼすことによって腫瘍増殖を阻害する。ヌードマウスにＨＭ７細胞を移植し、抗Ｂｖ８、抗ＶＥＧＦ又はコントロール抗体で処置した。図２ｂのデータと一致して、抗Ｂｖ８及び抗ＶＥＧＦでの処置は共にコントロールと比較して有意な腫瘍増殖阻害を生じている。ｇ．抗Ｂｖ８処置は、抗ＶＥＧＦ及びコントロールと比較してＰＢ中の循環ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋の頻度を低減させる。ｈ＆ｉ．上に記載されたマイクロＣＴアプローチは、抗Ｂｖ８対コントロール処置マウスにおいて、血管体積（ｈ）及び血管密度（ｉ）の有意な減少を示した。阻害の程度は、抗ＶＥＧＦ処置によってもたらされるものと同様である。ｊ．代表的なマイクロＣＴ血管造影データを、抗Ｂｖ８、抗ＶＥＧＦ及びコントロール処置に対して示す。血管網及び腫瘍はそれぞれ赤色及び灰色で示している。
【図５】抗ＶＥＧＦはＢｖ８発現を誘導する。ａ−ｄ．ヌードマウスにＨＭ７細胞を移植し、記載されているように、抗ＶＥＧＦ又はコントロールＭａｂで処置した。Ｂｖ８タンパク質濃度を腫瘍移植から１、３、６、９、１２及び１５日にＢＭ（ａ）、ＰＢ（ｂ）、脾臓（ｃ）及び腫瘍（ｄ）で測定した。全ての実験は、マトリゲルＴＭ−移植及び未処置マウスを用いて平行して実施した。ｅ．Ａ６７３及びＨＭ７移植動物における好中球の浸潤を更に確認するためのＩＨＣデータ。Ａ６７３又はＨＭ７を有するマウスからホルマリン固定切片を提供し、１５日間、コントロール、抗Ｂｖ８又は抗ＶＥＧＦ抗体で処置した。切片を「方法」に記載したようにして抗Ｇｒ１抗体で染色した。ｆ．ＣＤ１１ｂ＋細胞は腫瘍中のＢｖ８の主要な供給源である。ベージュヌードマウスにＡ６７３、Ｃａｌｕ−６、ＨＭ７、ＨＰＡＣ及びＪｕｒｋａｔ細胞を移植し、腫瘍細胞移植から１０日後にそれらを安楽死させた。ＣＤ１１ｂ＋を富ませた細胞の集団を、記載されたようにＣＤ１１ｂマイクロビーズを使用して単離した。Ｂｖ８の発現は、マウスＢｖ８転写産物に特異的なＴａｑｍａｎＴＭプライマーを使用して分析した。データはマウスＧＡＰＤＨを使用して正規化した。
【図６】抗Ｂｖ８は抗ＶＥＧＦ又は細胞傷害性化学療法と相加効果を有する。ａ＆ｂ．抗Ｂｖ８処置は、腫瘍発達の早期に処置を開始した場合に大部分は効果的である。ヌードマウスにＨＭ７（ａ）及びＡ６７３（ｂ）腫瘍を移植し、腫瘍が〜４００ｍｍ３に達するまで如何なる処置も受けなかった。ついで、マウスを、コントロール、抗Ｂｖ８、抗ＶＥＧＦ又は抗体の組合せ（抗ＶＥＧＦプラス抗Ｂｖ８）で処置した。腫瘍体積を記載されたようにして測定した。＊は併用療法対抗ＶＥＧＦ単独療法の間の腫瘍体積の有意差（ｐ＜０．０５）を示している。ｃ＆ｄ．抗Ｂｖ８は、抗ＶＥＧＦと併用して使用される場合、抗ＶＥＧＦ耐性腫瘍において相加的な効果を有している。ヌードマウス（ｃ）及びＣ５７Ｂｌ／６（ｄ）マウスにＥＬ４細胞を移植し、コントロール、抗Ｂｖ８、抗ＶＥＧＦ又は併用での処置を行った。腫瘍体積と最終腫瘍重さを記載されたようにして測定した。＊はコントロール対各単独療法又は併用療法における腫瘍体積の有意差（ｐ＜０．５）を示している。腫瘍体積における差はまた併用対各単独療法を比較した場合に有意である。ｅ．シスプラチン及び抗ＶＥＧＦ処置は、血清中のＢｖ８濃度を増加させる。ベージュヌードマウスにＡ６７３細胞を移植し、ＰＢＳ、シスプラチン（５ｍｇ／ｋｇ）プラスコントロール抗体、シスプラチンプラス抗Ｂｖ８、又はシスプラチンプラス抗ＶＥＧＦ又はシスプラチン、抗Ｂｖ８及び抗ＶＥＧＦの併用で処置した。Ｂｖ８タンパク質血清濃度はＥＬＩＳＡによって測定した。ｆ．化学療法プラス抗ＶＥＧＦ及び抗Ｂｖ８は樹立されたＡ６７３腫瘍の腫瘍増殖を効果的に抑制することができる。ベージュヌードマウスにＡ６７３細胞を注射し、腫瘍細胞移植から１３日後に上述した処置を受けさせた。＊は、併用療法対シスプラチンプラスコントロール間の有意差（ｐ＜０．０５）を示している。
【図７】ヒトＢｖ８ホモログをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）。太字と下線でまた示しているのは各開始及び終止コドンの位置である。
【図８】配列番号１のコード配列から誘導されたヒトＢｖ８ホモログポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号２）。推定シグナル配列はアミノ酸１から２１からなる。
【図９】ヒトＢｖ８ホモログの選択的スプライシング型をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号３）。太字と下線でまた示しているのは各開始及び終止コドンの位置である。
【図１０】配列番号３のコード配列から誘導されたヒトＢｖ８ホモログポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号４）。
【図１１】マウスＢｖ８ホモログのヌクレオチド配列（配列番号５）。太字と下線でまた示しているのは各開始及び終止コドンの位置である。
【図１２】配列番号５のコード配列から誘導されたマウスＢｖ８ホモログポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号６）。
【図１３】マウス（配列番号３７）及びヒト（配列番号２）Ｂｖ８ホモログのアラインメント。潜在的なヘパリン結合ドメインをボックスで囲む。示されているように、このドメインは選択的スプライシング転写産物には存在していない。マウス及びヒトＢｖ８ホモログはおよそ９６％同一である。
【図１４】精製されたヒト血液細胞及び新鮮な骨髄細胞を使用するインビトロでのＢｖ８発現の調節。ＲＮＡ抽出及びＢｖ８発現のためのＴａｑｍａｎ分析を施す前に細胞を、１０ｎｇ／ｍｌの様々なサイトカイン又はケモカインで４時間処置した。未処理試料を１として倍数変化として内部コントロール遺伝子ＲＰＬ１９に対して、全てのデータを更に正規化した。材料と方法に記載されたようにして、薬物適用をしていない２０名の異なったヒトのドナーを研究に使用した。精製された細胞及びＦＡＣＳによるそのマーカー発現の代表的な画像を右に示す。（Ａ）新鮮な骨髄細胞、（Ｂ）好中球、（Ｃ）単球、（Ｄ）リンパ球。＊＊＊ｐ＜０．０１対未処置コントロール。
【図１５】ヒト骨髄細胞及び好中球における様々なＧ−ＣＳＦ関連サイトカインによるＢｖ８レセプターＰＫＲ２／ＥＧ−ＶＥＧＦＲ２発現の調節。（Ａ）新鮮に単離された好中球又は（Ｂ）骨髄細胞を様々なＧ−ＣＳＦ関連サイトカインで処置した。４時間のインキュベーション後、インビトロ細胞を集め、ＴａｑｍａｎによるＰＫＲ２／ＥＧ−ＶＥＧＦＲ２の発現のためにＲＮＡを抽出した。ＲＰＬ１９を正規化のための内部コントロール遺伝子として使用した。実験は３名の独立した健常なドナーを使用して実施した。各個々のドナーからのサイトカインへの応答を示し、ついで３名の全ドナーからの平均発現レベルを挿入したパネルにプロットした。＊＊＊ｐ＜０．０１対未処置コントロール。
【図１６】Ｂｖ８及びＰＫＲ２／ＥＧ−ＶＥＧＦＲ２はＧ−ＣＳＦ処置ドナーからの単核細胞においてアップレギュレートされている。Ｇ−ＣＳＦ処置（ｎ＝１２）及び未処置の個体（ｎ＝１１）（不対）からの白血球細胞を簡単に洗浄し、ＲＮＡ抽出又はプロテイナーゼ阻害剤を含むＲＩＰＡバッファー中への溶解前にペレット化した。Ｂｖ８（Ａ）、ＰＫＲ２／ＥＧ−ＶＥＧＦＲ２発現（Ｃ）のＴａｑｍａｎ分析及び特異的ヒトＢｖ８ ＥＬＩＳＡ（Ｂ）を実施した。データを、ＴａｑｍａｎのＲＰＬ１９発現、ＥＬＩＳＡの全タンパク質濃度に対して正規化した。＊＊＊ｐ＜０．０１対未処置コントロール。
【図１７】ヒト好中球によって生産されるＢｖ８タンパク質の特徴付け。（Ａ）材料と方法に記載されているようにして、ヒト好中球を単離し、溶解させた。可溶化物を記載されているようにヘパリン−セファロースに充填した。画分９、１０及び１１が〜０．４ＭのＮａＣｌの存在下で溶出し、最高のＢｖ８レベルを有していた。ここに示すデータは３つの独立した単離を代表する。（Ｂ）ヒト好中球由来の精製したヒトＢｖ８の生物学的活性。ＰＫＲ１／ＥＧ−ＶＥＧＦＲ１が形質移入されたＧｅｎｅＢＬＡｚｅｒ ＮＦＡＴ−ＣＨＯ細胞を、Ｇプロテイン結合レセプターシグナル伝達経路の下流のＢｖ８誘導活性化を検出するために用いた。組換えヒトＢｖ８をポジティブコントロールとするために２０ｎｇ／ｍｌで使用し、ヒトＶＥＧＦをネガティブコントロールとして２００ｎｇ／ｍｌで使用した。未処理ウェルを１として倍数変化としてデータを更に正規化した。＊＊＊ｐ＜０．０１対未処置又はバッファーコントロール。３回の独立した実験を実施した。
【図１８】Ｂｖ８に応答する好中球の遊走。０．２％ＢＳＡを含むＨＢＳＳに懸濁させた１０６の好中球を、５μｍの孔径のトランスウェルインサート中に入れた。下方チャンバーに、培地単独又は精製組換えヒトＢｖ８（０．２ｐＭ−２０ｎＭ）又は他の既知の走化性因子、例えばＳＤＦ−１αを様々な濃度（２０ｎＭまで）で伴う培地を加えた。３７℃で３時間後、下方チャンバー中の細胞を計数し、未処理試料を１として倍数変化としてデータを更に正規化した。実験は６名の健常なドナーについて実施した。
【図１９】追加の図１。ＢＭＭＮＣによって生産されたＢｖ８タンパク質の特徴付け。ａ．マウス骨髄由来単核細胞（ＢＭＭＮＣ）を、実施例１の材料と方法のセクションに記載されているようにして単離し溶解させた。可溶化物を、２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．２、５０ｍＭのＮａＣｌで前もって平衡にしたヘパリン−セファロース（商標）カラムに充填した。材料と方法に記載されているようにして、カラムをＮａＣｌ勾配を用いて溶出させた。各画分中のＢｖ８濃度はＥＬＩＳＡによって測定した。画分１３及び１４が約０．４ＭのＮａＣｌの存在下で溶出し、最も高いＢｖ８レベルを有していた。ｂ．ＥＬＩＳＡデータと一致して、ウェスタンブロット分析は、Ｂｖ８が画分１３及び１４において高度にリッチ化されていることを示している。
【図２０】追加の図２。Ｇ−ＣＳＦは正常なマウス及び腫瘍を持つマウスにおけるＢｖ８の発現の重要な調節因子である。ａ．Ｂｖ８レベルはＧ−ＣＳＦの注射後に血清中で有意に増加している。Ｂａｌｂ−ｃヌードマウスに０日目とついで８日間毎日Ｇ−ＣＳＦを腹腔内注射した。試料は１、３、６及び８日に採取した。ｂ．上記実験からの好中球のカウントは、Ｇ−ＣＳＦ処置マウスの循環好中球の数が増加したことを示している。ｃ＆ｄ．Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスをＰＢＳ、コントロールＩｇＧ及び抗Ｇ−ＣＳＦで連続した８日間処置し、末梢血（ＰＢ）（ｃ）及びＢＭ（ｄ）中のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の頻度を、記載されたようにして、ＦＡＣＳ染色法を使用して決定した。ｅ＆ｆ．Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスを、腫瘍−マトリゲルＴＭ移植の１２時間前に抗Ｇ−ＣＳＦ又はコントロールＩｇＧ抗体で事前に処置した。マトリゲルＴＭ及び腫瘍を有するマウスを連続する２日間、抗Ｇ−ＣＳＦ又はコントロールＩｇＧで処置した。最終分析時に、ＰＢ（ｅ）及びＢＭ（ｆ）中のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋の頻度を、ＦＡＣＳを使用して調査した。
【図２１】追加の図３。ａ．Ｂｖ８はＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋骨髄細胞のトランスウェル遊走を誘導する。コントロールはＰＢＳ又は培地単独であった。ｂ＆ｃ．ＢＭＭＮＣ中でのＢｖ８レセプターの発現。ベージュヌードマウスに、記載されたようにして、Ａ６７３、ＨＭ７、ＨＰＡＣ又はＣａｌｕ−０６細胞を移植した。１０日後、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋骨髄細胞をＢＭから単離し、ＴａｑｍａｎＴＭ分析を実施して、腫瘍対マトリゲルＴＭ移植マウスの骨髄及び非骨髄（ＣＤ１１ｂ−Ｇｒ１−）サブセットにおけるＥＧ−ＶＥＧＦＲの発現を調査した。このような分析は、（ｂ）ＢＭＭＮＣ中における、ＥＧ−ＶＥＧＦ／ＰＫ−Ｒ１よりもＥＧ−ＶＥＧＦ／ＰＫ−Ｒ２（ｃ）の高い発現を明らかにする。ｄ．Ｂｖ８は骨髄細胞（ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋）に対する前駆細胞集団の運命を変え、またＬｉｎ−集団における細胞死を阻害する。ベージュヌードマウスのＢＭＭＮＣから単離されたＬｉｎ−画分を、Ｂｖ８と共に５日間インキュベートし、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の頻度をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ機で評価した。また、７ＡＡＤ染色を用いて、各処理における死細胞数を測定した。ｅ．Ｂｖ８は前駆体細胞のクローン形成能を誘導する。Ｌｉｎ−集団をＢｖ８又はＰＢＳで５日間処理し、メチルセルロース上に播種し（ウェル当たり７５００細胞）、５％のＣＯ２及び３７℃で１５日間インキュベートした。差次的及び全コロニー数はＢｖ８処置細胞のより大きなクローン形成能を明らかにした。ｆ．Ｂｖ８は骨髄集団の生存因子である。ベージュ／ヌードマウスのＢＭＭＮＣから単離したＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞を培地中で培養し、Ｂｖ８（３００ｎｇ／ｍｌ）で５日間処理した。細胞死を、７ＡＡＤ染色を使用して、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ機で測定した。ｇ＆ｈ．抗Ｂｖ８処理を中止すると、急速な腫瘍増殖を生じる。マウスにＡ６７３（ｅ）又はＨＭ７（ｆ）腫瘍を移植し、記載されたようにして、抗Ｂｖ８又はコントロール抗体で処理した。図中に矢印で示したように、移植から７日後に処理を停止させた。ｉ＆ｊ．抗Ｂｖ８処理の中止は、Ａ６７３（ｉ）及びＨＭ７（ｊ）腫瘍へのＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞のリバウンドを生じる。
【図２２】追加の図４。非腫瘍保有マウスにおける造血発生に対する抗Ｂｖ８抗体の効果。Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスを、治療用量で３週間、ＰＢＳ、コントロール抗体又は抗Ｂｖ８抗体で処理した。体重（ａ）、臓器重量（ｂ）、また骨髄及びリンパ球細胞の系統もＢＭ（ｃ）、脾臓（ｄ）及びＰＢ（ｅ）において分析した。
【図２３】追加の図５。抗Ｂｖ８抗体での処置は、Ａ６７３モデルにおいて、ＰＢ及び腫瘍中のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の数を減少させる。ベージュ／ヌードマウスに５×１０６のＡ６７３細胞を移植し、移植から４８時間後に開始し、その後毎週二回、抗Ｂｖ８処置を施した。ＣＤ１１ｂ＋（データ示さず）、Ｇｒ１＋（データ示さず）及びＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の動態を、抗Ｂｖ８及びコントロール処置マウスにおいて異なった時点で（つまり、移植後５日、１０日、１９日及び２９日目に）モニターした。ａ．ＢＭＭＮＣを各処置群から単離し、実施例１の材料と方法セクションに記載されたような染色手順を施した。ｂ．各時点でマウスから採血し、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋の頻度を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを使用して測定した。ｃ．腫瘍細胞を個々に計数し、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の数を、これらの細胞の頻度に腫瘍細胞の全数を乗じることによって計算した。星印は、抗Ｂｖ８処理マウス対対応するコントロール処理集団を比較した場合の各時点での有意差（ｐ＜０．０５）を示している。
【図２４】追加の図６。腫瘍を有するマウスにおけるＣＤ１１ｂ、Ｇｒ１及びＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の集団の代表的なＦＡＣＳプロファイル。ベージュヌードマウス（ｎ＝５）に、５×１０６のＡ６７３、Ｃａｌｕ６、ＨＭ７、ＨＰＡＣ又はＪｕｒｋａｔ細胞を移植した。マウスを、実施例１の材料と方法セクションに記載されたように抗Ｂｖ８又はコントロールＭａｂで処置した。マウスを腫瘍移植の１０日後に分析し、ＣＤ１１ｂ＋、Ｇｒ１＋、及びＣＤｂ１１＋Ｇｒ１＋細胞の頻度を、記載されたようにして、ＢＭ、ＰＢ、腫瘍及び脾臓において測定した。
【図２５】追加の図７。腫瘍移植は、ＢＭ及び脾臓におけるＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋の頻度を増加させる。ベージュヌードマウス（ｎ＝５）に５×１０６のＡ６７３、Ｃａｌｕ６、ＨＭ７、ＨＰＡＣ又はＪｕｒｋａｔ細胞を移植した。マウスを、材料と方法に記載されているように、抗Ｂｖ８コントロールＭａｂで処理し、ついで、ＢＭ又は脾臓細胞を腫瘍を持つマウスから単離し、抗Ｇ１１及び抗ＣＤ１１ｂで染色した。グラフは、ＢＭ（ａ）及び脾臓（ｂ）中におけるＣＤ１１ｂ＋、Ｇｒ１＋、及びＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の割合を表している。上部右の挿入図は、マトリゲルＴＭ移植マウスにおけるＣＤ１１ｂ＋、Ｇｒ１＋、及びＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の頻度を示している。ｃ．抗Ｂｖ８処置はＢＭＭＮＣ及び脾細胞のクローン形成能を低減させる。ヌードマウスにＡ６７３及びＨＭ７細胞を移植し、ついで記載されたようにして抗Ｂｖ８又はコントロール抗体で処置した。ＢＭＭＮＣ及び脾細胞を、腫瘍移植から１０日で腫瘍を持つマウスから収集し、ＣＦＵアッセイのために播種した。
【図２６】追加の図８。Ｂｖ８はＴＡＥＣにおける管形成を促進し、腫瘍細胞の増殖の刺激に失敗する。ａ．Ｂｖ８は内皮細胞においてインビトロで管形成を誘導する。マトリゲルＴＭをコートしたプレートにＴＥＡＣＳを播種した後、何れかの基本培地（実施例１に材料と方法セクションに記載されたような抗Ｂｖ８を伴うか伴わない、コントロール、Ｂｖ８又はＶＥＧＦ−Ａ）と共にインキュベートした。写真（位相差；元の倍率２０×）は３６時間のインキュベーション後の内皮管の出現を示している。ｂ．ＴＡＥＣは一般的な内皮細胞のマーカーを発現する。これらの実験で使用されたＴＡＥＣの同一性は、ＴＡＥＣ、皮膚内皮細胞（ＳｋＥＣ）、上皮細胞及び線維芽細胞中のＣＤ３１、ＶＥＧＦＲ２、ＴＩＥ２、ＶＥ−ＣＡＤＨ、ＣＫ８及びＥ−ＣＤＨを使用してＲＴ−ＰＣＲ及びフローサイトメトリー（データは示さず）によって確認した。ＧＡＰＤＨは内部コントロールとして使用した。ｃ．ＴＡＥＣは、Ｂｖ８刺激に応答してＭＡＰＫシグナル伝達を活性化する。細胞を３７℃で５、１０及び２０分間、Ｂｖ８（２００ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（ポジティブコントロール；４０ｎｇ／ｍｌ）、完全培地（ＣＭ）又はモック（０．５％ＤＳＡ）で処理した。実施例１の材料と方法セクションに記載されたウェスタンブロット分析は、Ｂｖ８処理ウェルにおいてリン酸化ＭＡＰＫ（Ｐ−ＭＡＰＫ）を検出したが、モック（ＰＢＳ）処理はＰ−ＭＡＰＫ活性化を誘導しなかった。ｄ．Ｂｖ８は、腫瘍細胞の増殖を誘導しない。Ａ６７３、Ｃａｌｕ−６、ＨＭ７及びＨＰＡＣ細胞を異なった濃度の組換えＢｖ８で処理した後、ＢｒｄＵでパルスした。増殖をＢｒｄＵ取り込みによって定量した。
【図２７】追加の図９。ａ．Ｂｖ８は腫瘍血管新生を促進する。ＨＭ７腫瘍を持つマウスに、腫瘍移植から５日目にＡｄ−ＬａｃＺ、Ａｖ−Ｂｖ８低力価、Ａｖ−Ｂｖ８高力価、及びＡｖ−ＶＥＧＦの単一腫瘍内用量を投与した。腫瘍切片のＭＥＣＡ−３２染色を使用してアデノウイルスデリバリーの４日後に小胞表面積を測定した。ｂ．抗Ｂｖ８処理は腫瘍血管新生の阻害を生じる。ベージュヌードマウスにＪｕｒｋａｔ細胞を移植し、コントロール（パネルａ−ｃ）、抗Ｂｖ８（パネルｄ−ｆ）及び抗ＶＥＧＦ（パネルｇ−ｉ）抗体で処理した。抗Ｂｖ８又は抗ＶＥＧＦ処理による腫瘍血管新生の顕著な抑制に留意のこと。パネル１、ｂ、ｓ、ｅ、ｇ、ｈはＨ＆Ｅ染色であり、パネルｃ、ｆ、ｔはＭＥＣＡ−３２染色である（腫瘍領域は星印で示す）。
【図２８】追加の図１０。腫瘍増殖におけるＢｖ８の役割。腫瘍細胞及び腫瘍関連ストロマは、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６及びＳＤＦ−１のようなケモカイン及びサイトカインの放出を介してＢＭ中のＢｖ８のアップレギュレーションのシグナルを発する。Ｂｖ８は自己分泌及びパラ分泌機構によりＧ−ＣＳＦによって誘発される骨髄細胞動員を増幅しうる。腫瘍壊死は骨髄細胞浸潤を促進することが知られている。様々な機構による腫瘍中の骨髄細胞ホーミングは局所的にＢｖ８を生産し得、これがついで内皮細胞増殖及び血管新生を直接刺激する。サイトカイン、低酸素及び抗ＶＥＧＦ治療法は、腫瘍微小環境内の骨髄細胞によりＢｖ８の発現増加を生じうる。腫瘍浸潤性骨髄細胞によって生産されるＢｖ８はＢＭにまたシグナルを送り、骨髄細胞の腫瘍への動員、経内皮遊走及びホーミングを促進しうる。
【図２９】追加の表１。単離され異種移植片から培養されたヒト腫瘍細胞又は腫瘍関連マウス線維芽細胞からの条件培地中のサイトカインレベル。
【図３０】追加の表２。様々な細胞株を１０ｎｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦで４時間処理した。つづいてＲＮＡを抽出し、正規化のためのハウスキーピング遺伝子としてＲＰＬ１９を使用してＴａｑｍａｎ分析を施した。倍数変化は未処置を１として示した。＊＊＊ｐ＜０．０１対未処置コントロール。３回の独立した実験を実施した。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（発明の詳細な説明）
詳細に本発明を記述する前に、本発明が特定の組成物又は生物系に限定されるものではなく、当然のことながら変化しうることは理解されるであろう。また、本明細書において用いられる用語は実施態様のみを記述するためのものであって、限定するためのものでないことも理解されるであろう。本明細書中及び添付の特許請求の範囲に用いられる単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、明らかな記載がない限り複数形も含まれる。ゆえに、例えば、「分子」を指す言葉は、場合によって２以上の該分子の組み合わせなどを含む。
【００１７】
Ａ．定義
「Ｂｖ８」、「Ｂｖ８ホモログ」、「プロキネチシン-２(別名「ＰＫ２」、「ＫＡＬ４」及び「ＭＩＴ１」)なる用語は、交換可能に本明細書中で用いられ、本明細書中で定義される天然配列、Ｂｖ８ポリペプチド、Ｂｖ８変異体およびキメラＢｖ８を指す。
Ｂｖ８核酸は上述したようなＢｖ８ポリペプチドをコードするＲＮＡ又はＤＮＡであるか、あるいはこのようなＤＮＡ又はＲＮＡにハイブリダイズし、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でそれに安定に結合したままであって約１０ヌクレオチド長より長い。ストリンジェントな条件は、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、５０℃において０．１５ＭのＮａＣｌ／０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウム(ＮａＤｏｄＳＯ４)を用いるもの、又は（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤、例えば、４２℃において５０％（vol/vol）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファーを７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウムと共に用いるものである。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係に置かれたときに作用可能に結合している。Ｂｖ８核酸は特定の宿主生物において発現されうるようにベクター中において他の核酸配列と作用可能に結合されうる。これは当該分野においてよく知られた方法によってなされうる。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されるならば、ポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード化配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、それが翻訳を容易にするような位置にあるならば、コード化配列と作用可能に結合している。一般に、「作用可能に結合している」とは、結合しているＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合には、常法に従って、合成のオリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【００１８】
「天然配列Ｂｖ８」は、その調製態様にかかわらず、天然由来のＢｖ８と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでなる。しかして、天然配列Ｂｖ８は、天然に生じるヒトＢｖ８、マウスＢｖ８、あるいは他の哺乳動物種由来のＢｖ８のアミノ酸配列を有し得る。例えば、完全長天然配列ヒトＢｖ８アミノ酸配列は図８（配列番号：２）に示されている。第二の完全長天然配列ヒトＢｖ８は図１０（配列番号：４）に示されている。これらの二つの配列は限界(canonical)ヘパリン結合ドメインをコードするエキソンの選択的スプライシングの結果である。よって、アミノ酸配列が図８（配列番号：２）に示されている天然配列ヒトＢｖ８はヘパリン結合ドメインを含む一方、図１０（配列番号：４）に示された天然配列Ｂｖ８は含まない。天然配列マウスＢｖ８アミノ酸配列は図１２（配列番号：６）に示される。ヒト及びマウスＢｖ８配列はまた例えばWechselberger等（FEBS Lett. 462:177-181 (1999)）及びLi等（Mol. Pharm. 59:692-698 (2001)）に開示されている。そのような天然配列Ｂｖ８は天然から単離することができるか又は組換え及び／又は合成手段によって生産することができる。「天然配列Ｂｖ８」なる用語は、Ｂｖ８の天然に生じるプレプロ、プロ及び成熟型及び切断型、天然に生じる変異体型（例えば選択的スプライシング型、例えば図１０（配列番号：４）に示されるもの）、及び天然に生じる対立遺伝子変異体を特に包含する。好ましい天然配列Ｂｖ８は図８（配列番号：２）に示されるような完全長天然配列ヒトＢｖ８である。
【００１９】
「Ｂｖ８変異体」とは、天然配列中の一又は複数のアミノ酸残基の挿入、欠失、修飾及び／又は置換によって、ヒト及びマウスＢｖ８に対して図８、１０及び１２（配列番号：２、４及び６）に示されるもののように、天然配列Ｂｖ８ポリペプチドの配列とは異なるアミノ酸配列を有する生物学的に活性なＢｖ８ポリペプチドである。Ｂｖ８変異体は一般には図８（配列番号：２）のヒトＢｖ８のような、天然配列Ｂｖ８と１００％より少ない配列同一性を有する。しかしながら、通常は、生物学的に活性なＢｖ８変異体は、図８（配列番号：２）のヒトＢｖ８のような天然に生じるＢｖ８のアミノ酸配列と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％、更により好ましくは少なくとも約８５％、更により好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有し、少なくとも約９５％から少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性まで１％の増加率で好適度が増大するアミノ酸配列を有する。Ｂｖ８変異体には、対応する天然配列Ｂｖ８ポリペプチドの生物学的活性を保持する少なくとも５のアミノ酸のペプチド断片が含まれる。Ｂｖ８変異体にはまた天然Ｂｖ８配列のＮ末端又はＣ末端に、あるいは配列の内部に一又は複数のアミノ酸残基が付加されたＢｖ８ポリペプチドが含まれる。Ｂｖ８変異体には、多くのアミノ酸残基が欠失され、場合によっては一又は複数のアミノ酸残基によって置換されたＢｖ８ポリペプチドが含まれる。また、Ｂｖ８変異体は例えば天然に生じるアミノ酸以外の部分との置換によって、又はアミノ酸を改変して非天然のアミノ酸をつくり出すことによって、共有結合的修飾をされていてもよい。Ｂｖ８変異体はヘパリン結合ドメインを含みうる。
【００２０】
通常、ポリペプチド「変異体」(すなわち本明細書において開示される任意のポリペプチドの変異体)は、対応する天然配列のポリペプチドと少なくともおよそ８０％のアミノ酸配列同一性を有する生物学上活性なポリペプチドを意味する。このような変異体は、例えば、ポリペプチドのＮ−および／またはＣ末端で、一又は複数のアミノ酸(天然に生じるアミノ酸および／または天然に生じないアミノ酸)残基が付加又は欠失しているポリペプチドを含む。通常、変異体は、天然配列のポリペプチドと少なくともおよそ８０％のアミノ酸配列同一性、又は少なくともおよそ９０％のアミノ酸配列同一性、又は少なくともおよそ９５％以上のアミノ酸配列同一性を有する。また、変異体は、一般的に生物学上活性な天然配列のポリペプチド断片(例えば部分配列、切断配列など)を含む。
【００２１】
本明細書での「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとして、選択した配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGIN-2又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較プログラムALIGN-2を使用することによって以下に記載のように得られる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、米国著作権事務所, ワシントンD.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録され、ジェネンテク社、サウス サン フランシスコ, カリフォルニアから好適に入手可能でありる。ALIGN-2プログラムは、UNIX（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX（登録商標） V4.０Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
ここでの目的のために、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
【００２２】
「キメラＢｖ８」分子は、完全長Ｂｖ８を含むかその一又は複数のドメインが異種ポリペプチドに融合あるいは結合したポリペプチドである。キメラＢｖ８分子は、一般に、天然に生じるＢｖ８と共通する少なくとも一つの生物学的性質を共有している。キメラＢｖ８分子の例は精製のためにエピトープタグを付加したものである。他のキメラＢｖ８分子はＢｖ８イムノアドヘシンである。
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したＢｖ８を含むキメラポリペプチドを意味する。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープを提供するに十分な残基を有しているが、その長さはＢｖ８の生物学的活性を阻害しないように充分に短いものである。タグポリペプチドは、好ましくは、該タグポリペプチドに対する抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり特異的である。好適なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８−５０のアミノ酸残基（好ましくは約９−３０の残基）を有する。好ましいものは、ニッケルに結合し、タグ付加タンパク質を、記載されているように（例としてLindsay等 Neuron 17:571-574 (1996)を参照）、Ｎｉ-ＮＴＡクロマトグラフィーで分離することを可能にするポリ-ヒスチジン配列である。
【００２３】
「単離されたＢｖ８」とは、Ｂｖ８源から精製されたか、あるいは組換えもしくは合成法によって調製され、精製されたＢｖ８を意味する。精製Ｂｖ８は実質的に他のポリペプチド又はペプチドを含んでいない。ここで「実質的に含んでいない」とは、他の供給源タンパク質の汚染が約５％未満、好ましくは約２％未満、より好ましくは約１％未満、更により好ましくは約０．５％未満、最も好ましくは約０．１％未満であることを意味する。
「本質的に純粋な」タンパク質とは、組成物の全重量基準で少なくとも約９０重量％、好ましくは少なくとも約９５重量％、より好ましくは少なくとも約９０重量％、更により好ましくは少なくとも約９５重量％のタンパク質を含む組成物(composition：構成物)を意味する。「本質的に均質な」タンパク質とは、組成物の全重量に対して少なくとも約９９重量％のタンパク質を含む組成物を意味する。
【００２４】
本明細書中で用いられる「アンタゴニスト」なる用語は、リガンドの場合には一又は複数のレセプターへの結合、又はレセプターの場合には一又は複数のリガンドへの結合を含む、本発明のタンパク質の活性を中和、遮断(ブロック)、阻害、抑止、低減又は干渉することができる分子を指す。アンタゴニストには、抗体及びその抗原結合断片、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖類、オリゴ糖類、核酸、バイオ有機分子、ペプチド模倣薬、製薬的薬剤及びその代謝物、転写及び翻訳制御配列などが含まれる。また、アンタゴニストには、本発明のタンパク質の小分子インヒビター、及び融合タンパク質、タンパク質に特異的に結合することによってその標的への結合を隔離するレセプター分子及び誘導体、タンパク質のアンタゴニスト変異体、本発明のタンパク質に対するアンチセンス分子、ＲＮＡアプタマー、及び本発明のタンパク質に対するリボザイムが含まれる。
「遮断(ブロック)」抗体又は「アンタゴニスト」抗体は、結合する抗原の生物学的活性を阻害するか又は低減させるものである。特定の遮断抗体ないしアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を実質的に又は完全に阻害する。
【００２５】
本明細書中で用いられる「Ｂｖ８アンタゴニスト」なる用語は、天然配列のＢｖ８の能力を部分的ないしは完全にブロック、阻害又は中和して、骨髄系動員を調節する及び／又は腫瘍発達の間の血管形成を促進する任意の分子を指す。適切なアンタゴニスト分子は、具体的に、アンタゴニスト抗体ないしはその抗原結合断片、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖類、オリゴ糖、核酸、生物有機物分子、ペプチド模倣物、薬物およびその代謝産物、転写および翻訳調節配列などを含む。また、アンタゴニストは、Ｂｖ８の小分子インヒビター、および融合タンパク質、Ｂｖ８に特異的に結合することによって標的への結合を隔離するレセプター分子および誘導体、Ｂｖ８のアンタゴニスト変異体、Ｂｖ８に対するアンチセンス分子、ＲＮＡアプタマー、およびＢｖ８に対するリボザイムを含む。
特に、Ｂｖ８アンタゴニストは、限定するものではないが、天然配列のＢｖ８ポリペプチドに特異的に結合する抗体及び抗体断片、又は天然配列のＢｖ８レセプター(ＰＫＲ−１／ＥＧ−ＶＥＧＦＲ１又はＰＫＲ−２／ＥＧ−ＶＥＧＦＲ２)ポリペプチドを含む。Ｂｖ８ポリペプチドのアンタゴニストの同定方法は、候補アンタゴニスト分子とＢｖ８ポリペプチドとを接触させ、骨髄系細胞動員を調節するおよび／または腫瘍血管形成を促進するＢｖ８の能力における検出可能な変化を測定することを含んでもよい。
【００２６】
ここでの目的のために、Ｂｖ８又はＧ−ＣＳＦとの関連において「活性な」又は「活性」とは、天然又は自然に生じるＢｖ８又はＧ−ＣＳＦの生物学的及び／又は免疫学的活性を保持しているＢｖ８又はＧ−ＣＳＦの形態を意味し、ここで「生物学的」活性とは、天然又は自然に生じるＢｖ８又はＧ−ＣＳＦによって引き起こされる（阻害性又は刺激性の）生物学的機能であって、天然又は自然に生じるＢｖ８又はＧ−ＣＳＦが有する抗原性エピトープに対する抗体の生産を誘導する能力を除くものを意味し、「免疫学的」活性とは、天然又は自然に生じるＢｖ８又はＧ−ＣＳＦが有する抗原性エピトープに対する抗体の生産を誘導する能力を意味する。好適なＢｖ８生物学的活性は、骨髄系細胞動員を調節する及び／又は腫瘍血管形成を促進する能力である。
「Ｂｖ８レセプター」はＢｖ８が結合し、Ｂｖ８の生物学的性質を媒介する分子である。それ故に、「Ｂｖ８レセプター」なる用語は、ＰＫＲ１／ＥＧ−ＶＥＧＦレセプター-１及びＰＫＲ２／ＥＧ−ＶＥＧＦレセプター-２を意味するものを含む(LeCouter等, 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:2685-2690；Lin等, 2002, J. Biol. Chem., 277:19276-19280；Masuda等, 2002, Biochem. Biophys. Res. Commun., 293:396-402)。
【００２７】
本明細書中で用いられる「ＶＥＧＦ」なる用語は天然配列の血管内皮性増殖因子及びその変異体を指す。
本明細書中で用いる「ＶＥＧＦ」又は「ＶＥＧＦ-Ａ」なる用語は、Leung等 Science, 246:1306 (1989)、Houck等 Mol. Endocrin., 5:1806 (1991)、及びRobinson & Stringer, Journal of Cell Science, 144(5): 853-865 (2001)によって記載されているように、天然配列の１６５アミノ酸の血管内皮細胞増殖因子と、関連した１２１-、１４５-、１８３-、１８９-、及び２０６-アミノ酸の血管内皮細胞増殖因子、並びにそれらの天然に生じる対立遺伝子型及びプロセシング型、並びにその変異体を意味する。ＶＥＧＦ-Ａは、ＶＥＧＦ-Ｂ、ＶＥＧＦ-Ｃ、ＶＥＧＦ-Ｄ、ＶＥＧＦ-Ｅ、ＶＥＧＦ-Ｆ及びＰｌＧＦを含む遺伝子ファミリの一部である。ＶＥＧＦ-Ａは、ＶＥＧＦＲ-１(Ｆｌｔ-１)及びＶＥＧＦＲ-２(Ｆｌｋ-１／ＫＤＲ)の２つの高親和性レセプターチロシンキナーゼに主に結合する。この後者はＶＥＧＦ-Ａの血管内皮細胞分裂促進シグナルの主な伝達物質である。また、「ＶＥＧＦ」又は「ＶＥＧＦ-Ａ」なる用語は、マウス、ラット又は霊長類などの非ヒト動物腫由来のＶＥＧＦも意味する。特定の種由来のＶＥＧＦは、ヒトＶＥＧＦはｈＶＥＧＦ、マウスＶＥＧＦはｍＶＥＧＦなどの用語で表されることが多い。また、「ＶＥＧＦ」なる用語は、１６５アミノ酸のヒト血管内皮細胞増殖因子のアミノ酸８〜１０９、又は１〜１０９を含むポリペプチドの切断型ないしはその断片を意味する。そのようなＶＥＧＦ型を指すときは、本明細書では、例えば、「ＶＥＧＦ(８−１０９)」、「ＶＥＧＦ(１−１０９)」又は「ＶＥＧＦ１６５」と表す。「切断した(切断型の)」天然のＶＥＧＦのアミノ酸位置は、天然のＶＥＧＦ配列に示される数で示す。例えば、切断型の天然ＶＥＧＦのアミノ酸位置１７(メチオニン)は、天然のＶＥＧＦ中の位置１７(メチオニン)でもある。切断型の天然ＶＥＧＦは天然配列のＶＥＧＦに匹敵するＫＤＲ及びＦｌｔ−１レセプター結合親和性を有する。
【００２８】
「ＶＥＧＦアンタゴニスト」は、一又は複数のＶＥＧＦレセプターへの結合を含む、天然配列ＶＥＧＦの活性を中和、遮断、阻害、抑止、低減又は干渉することができる分子(ペプチジル又は非ペプチジル)を指す。ＶＥＧＦアンタゴニストには、抗ＶＥＧＦ抗体及びその抗原結合性断片、ＶＥＧＦに特異的に結合することによって一又は複数のレセプターへの結合を隔離するレセプター分子及び誘導体(例えば、可溶性ＶＥＧＦレセプタータンパク質、又はそのＶＥＧＦ結合断片、又はキメラＶＥＧＦレセプタータンパク質)、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼの小分子インヒビターなどの抗ＶＥＧＦレセプター抗体及びＶＥＧＦレセプターアンタゴニスト、及び融合タンパク質、例として、ＶＥＧＦ-Ｔｒａｐ(Regeneron)、ＶＥＧＦ１２１-ゲロニン(Peregine)が含まれる。また、ＶＥＧＦアンタゴニストには、ＶＥＧＦのアンタゴニスト変異体、ＶＥＧＦに対するアンチセンス分子、ＲＮＡアプタマー、及びＶＥＧＦないしはＶＥＧＦレセプターに対するリボザイムが含まれる。さらに、本発明の方法に有用なＶＥＧＦアンタゴニストには、ＶＥＧＦを特異的に結合するペプチジルないしは非ペプチジル化合物、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体ないしその抗原結合性断片、ポリペプチド、又はＶＥＧＦに特異的に結合するその断片；ＶＥＧＦポリペプチドをコードする核酸分子の少なくとも断片に相補性があるアンチセンス核酸塩基のオリゴマー；ＶＥＧＦポリペプチドをコードする核酸分子の少なくとも断片に相補性がある小ＲＮＡ；ＶＥＧＦを標的とするリボザイム；ＶＥＧＦに対するペプチボディ；及び、ＶＥＧＦアプタマーが含まれる。一実施態様では、ＶＥＧＦアンタゴニストは、ＶＥＧＦの発現レベル又は生物学的活性を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上低減するか、又は阻害する。他の実施態様では、ＶＥＧＦアンタゴニストによって阻害されるＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ(８−１０９)、ＶＥＧＦ(１−１０９)又はＶＥＧＦ１６５である。
【００２９】
「抗ＶＥＧＦ抗体」又は「ＶＥＧＦに結合する抗体」なる用語は、抗体がＶＥＧＦを標的とした診断上の薬剤及び／又は治療上の薬剤として有用であるために十分な親和性と特異性を有してＶＥＧＦに結合することができる抗体を指す。例えば、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦ活性が関与する疾患及び症状を標的とし、干渉する際の治療上の薬剤として有用でありうる。例として米国特許第６５８２９５９号、同第６７０３０２０号；国際公開第９８／４５３３２号；国際公開第９６／３００４６号；国際公開第９４／１０２０２号、国際公開第２００５／０４４８５３号；;欧州特許第０６６６８６８号Ｂ１；米国特許公開第２００３０２０６８９９号、同第２００３０１９０３１７号、同第２００３０２０３４０９号、同第２００５０１１２１２６号、同第２００５０１８６２０８号及び同第２００５０１１２１２６号；Popkov等, Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004)；及び国際公開第２００５０１２３５９号を参照のこと。選択した抗体は通常、ＶＥＧＦに対して十分に強い結合親和性を有する。例えば、抗体は１００ｎＭ−１ｐＭの間のＫｄ値でｈＶＥＧＦを結合しうる。抗体親和性は、例えば、表面プラスモン共鳴をベースとしたアッセイ(ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ２００５／０１２３５９に記載のあるＢＩＡｃｏｒｅアッセイなど)；酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)；及び、競合アッセイ(例えばＲＩＡのもの)によって決定されうる。例えば治療としての有効性を評価するために、抗体を他の生物学的な活性アッセイに用いてもよい。このようなアッセイは当分野で公知であり、標的抗原と抗体の使用目的に依存する。例として、ＨＵＶＥＣ阻害アッセイ；腫瘍細胞増殖阻害アッセイ(例えば国際公開第８９／０６６９２号に記載のもの)；抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)及び補体媒介性細胞障害(ＣＤＣ)アッセイ(米国特許第５５００３６２号)；及び、アゴニスト活性又は造血アッセイ(国際公開第９５／２７０６２号を参照)などがある。抗ＶＥＧＦ抗体は通常、ＶＥＧＦ-Ｂ、ＶＥＧＦ-Ｃ、ＶＥＧＦ-Ｄ又はＶＥＧＦ-Ｅなどの他のＶＥＧＦホモログにも、ＰｌＧＦ、ＰＤＧＦ又はｂＦＧＦなどの他の増殖因子にも結合しないだろう。一実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体には、ハイブリドーマＡＴＣＣ ＨＢ １０７０９によって産生されるモノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体Ａ４.６.１と同じエピトープに結合するモノクローナル抗体；Presta等 (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599に従って産生される組み換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体であり、限定するものではないが「ベバシズマブ(ＢＶ)」とも「ｒｈｕＭＡｂ ＶＥＧＦ」又は「ＡＶＡＳＴＩＮ(登録商標)」としても知られる抗体が含まれる。ベバシズマブは、ヒトＶＥＧＦのそのレセプターへの結合をブロックするマウスの抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体Ａ.４.６.１から、変異したヒトのＩｇＧ１フレームワーク領域と抗原結合性相補性決定領域を含む。フレームワーク領域のほとんどを含め、ベバシズマブのアミノ酸配列のおよそ９３％は、ヒトのＩｇＧ１に由来し、配列のおよそ７％はマウスの抗体Ａ４.６.１に由来する。ベバシズマブは、およそ１４９０００のダルトンの分子量を有し、グリコシル化されている。ベバシズマブ及び他のヒト化抗ＶＥＧＦ抗体は、��００５年２月２６日に発行の米国特許第６８８４８７９号にさらに記載されている。ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ２００５／０１２３５９に記載のあるように、更なる好適な抗体には、Ｇ６又はＢ２０系列抗体(例えば、Ｇ６-２３、Ｇ６-３１、Ｂ２０-４.１)が含まれる。さらに好適な抗体については、米国特許第７０６０２６９号、同第６５８２９５９号、同第６７０３０２０号；同第６０５４２９７号；国際公開第９８／４５３３２号；国際公開第９６／３００４６号；国際公開第９４／１０２０２号；欧州特許第０６６６８６８号Ｂ１；米国特許公開第２００６００９３６０号、同第２００５０１８６２０８号、同第２００３０２０６８９９号、同第２００３０１９０３１７号、同第２００３０２０３４０９号、及び同第２００５０１１２１２６号；及び、Popkov等, Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004)を参照のこと。
【００３０】
本発明に係る「Ｇ６系列抗体」は、ＰＣＴ出願公開第２００５/０１２３５９号の図７、２４−２６及び３４−３５のいずれか一によるＧ６由来の抗体又はＧ６抗体の配列に由来する抗ＶＥＧＦ抗体である。
「造血幹／始原細胞(前駆細胞)」又は「原始的造血細胞」は、より関係しているか、又は成熟した血液細胞種を形成するように分化することができるものである。「リンパ系の血液細胞系統」は、リンパ球(Ｂ細胞又はＴ細胞)を形成するように分化することができるそれらの造血前駆細胞である。同様に「リンパ球新生」はリンパ球の形成である。「赤血球血液細胞系統」は、赤血球(erythrocytes、red blood cells)を形成するように分化することができるそれらの造血前駆細胞であり、「赤血球新生」は赤血球の形成である。 
本明細書中の目的のために、「骨髄血液細胞系統」なる表現は、上記のリンパ系及び赤血球血液細胞系統以外の、すべての造血始原細胞を包含し、「骨髄造血」は血液細胞(リンパ球及び赤血球以外の)の形成を伴う。
骨髄細胞群は、Ｇｒ１＋／ＣＤ１１ｂ＋(又はＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋)又はＧｒ１＋／Ｍａｃ-１＋である骨髄免疫細胞が豊富でありうる。これらの細胞は、マクロファージ系統の骨髄性細胞用のマーカーであるＣＤ１１ｂと、顆粒球用のマーカーであるＧｒ１を発現する。Ｇｒ１＋／ＣＤ１１ｂ＋は、例えばＧｒ１＋に対する抗体による免疫吸着パニングによって選択されてもよい。
【００３１】
「骨髄系細胞減少薬剤」又は「骨髄性細胞減少剤」は、骨髄性細胞群を減少させるか又は除去する薬剤を指す。一般的に、骨髄性細胞減少剤は、骨髄性細胞、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋、単球、マクロファージなどを減少させるか又は除去する。骨髄性細胞減少薬剤の例には、限定するものではないが、Ｇｒ１＋アンタゴニスト、ＣＤ１１ｂアンタゴニスト、ＣＤ１８アンタゴニスト、エラスターゼインヒビター、ＭＣＰ-１アンタゴニスト、ＭＩＰ-１αアンタゴニストなどが含まれる。
本明細書中で用いられる「Ｇｒ１アンタゴニスト」なる用語は、Ｇｒ１に結合して、Ｇｒ１の生物学的な活性を阻害するか又は実質的に減少させる分子を指す。Ｇｒ１アンタゴニストの非限定的な例には、抗体、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖類、オリゴ糖類、核酸、バイオ有機分子、ペプチド模倣薬、製薬的薬剤及びその代謝物、転写及び翻訳制御配列などが含まれる。本発明の一実施態様では、Ｇｒ１アンタゴニストは、抗体、特にヒトのＧｒ１を結合する抗Ｇｒ１抗体である。
【００３２】
本明細書中で用いられる「ＣＤ１１ｂアンタゴニスト」なる用語は、ＣＤ１１ｂに結合して、ＣＤ１１ｂの生物学的活性を阻害するか又は実質的に減少させる分子を指す。通常、アンタゴニストは、細胞表面にＣＤ１１ｂサブユニットを発現する細胞(例えば未成熟骨髄系細胞)が持つ内皮へ結合する能力を(部分的にないしは完全に)ブロックするであろう。ＣＤ１１ｂアンタゴニストの非限定的な例には、抗体、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖類、オリゴ糖類、核酸、バイオ有機分子、ペプチド模倣薬、製薬的薬剤及びその代謝物、転写及び翻訳制御配列などが含まれる。本発明の一実施態様では、ＣＤ１１ｂアンタゴニストは、抗体、特にヒトのＣＤ１１ｂを結合する抗ＣＤ１１ｂ抗体である。例示的なＣＤ１１ｂ抗体には、ＭＹ９０４ (米国特許第４８４０７９３号)；１Ｂ６ｃ(Zhang等, Brain Research 698:79-85 (1995)を参照)；ＣＢＲＮ１／５及びＣＢＲＭ１／１９(国際公開第９４／０８６２０号)が含まれる。
本明細書中で用いられる「ＣＤ１８アンタゴニスト」なる用語は、ＣＤ１８(好ましくはヒトのＣＤ１８)に結合して、ＣＤ１８の生物学的活性を阻害するか又は実質的に減少させる分子を指す。通常、アンタゴニストは、細胞表面にＣＤ１８サブユニットを発現する細胞(例えば好中球)が持つ内皮へ結合する能力を(部分的にないしは完全に)ブロックするであろう。ＣＤ１８アンタゴニストの非限定的な例には、抗体、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖類、オリゴ糖類、核酸、バイオ有機分子、ペプチド模倣薬、製薬的薬剤及びその代謝物、転写及び翻訳制御配列などが含まれる。本発明の一実施態様では、ＣＤ１８アンタゴニストは抗体である。
抗ＣＤ１８抗体の例には、ＭＨＭ２３ (Hildreth等, Eur. J. Immunol. 13:202-208 (1983))；Ｍ１８／２(ＩｇＧ２ａ；Sanches-Madrid等, J. Exp. Med.158: 586-602 (1983))；Ｈ５２(アメリカ培養細胞系統保存機関(ＡＴＣＣ)寄託ＨＢ  １０１６０)；Ｍａｓ１９１ｃ及びｌＯＴ１８ (Vermot Desroches等, Scand. J. Immunol. 33:277-286 (1991))；及び、ＮＡ-８(国際公開第９４／１２２１４号)が含まれる。一実施態様では、抗体は、ＭＨＭ２３又はＨ５２が結合するＣＤ１８エピトープに結合するものである。本発明の一実施態様では、抗体はＣＤ１８ポリペプチドに対して高親和性を有する。ある実施態様では、抗体は、ＣＤ１１ｂと結合するＣＤ１８の細胞外ドメインの領域に結合してもよいし、抗体は、ａ及びＰ鎖を解離してもよい(例えば、抗体は、ＭＨＭ２３抗体の場合のようにＣＤ１１ｂとＣＤ１８との複合体を解離してもよい)。
【００３３】
単球走化性タンパク質(ＭＣＰ-１)は、自然免疫及びＴｈ２エフェクター応答及びＣＤ４＋Ｔ細胞分化に関与するケモカインである。例として、Paul, W. E., Fundamental Immunology, 5th Edition, Lippincott Williams & Wilkins, (Philadelphia, 2003) at pages 801-840を参照。
本明細書中で用いられる「ＭＣＰ-１アンタゴニスト」なる用語は、ＭＣＰ-1に結合して、ＭＣＰ-1の生物学的活性を阻害するか又は実質的に低減させる分子を指す。ＭＣＰ-1アンタゴニストの非限定的な例には、抗体、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖類、オリゴ糖類、核酸、バイオ有機分子、ペプチド模倣薬、製薬的薬剤及びその代謝物、転写及び翻訳制御配列などが含まれる。本発明の一実施態様では、ＭＣＰ-１アンタゴニストは、抗体、特にヒトのＭＣＰ-１を結合する抗ＭＣＰ-１抗体である。
【００３４】
マクロファージ炎症性タンパク質α及びβ(ＭＩＰ-１α及びβ)は公知のケモカインである。ＭＩＰ-１αは、自然免疫及びＴｈ１エフェクター応答及びＣＤ４＋Ｔ細胞分化に関与する。例として、Paul, W. E., Fundamental Immunology, 5th Edition, Lippincott Williams & Wilkins, (Philadelphia, 2003) at pages 801-840を参照。
本明細書中で用いられる「ＭＩＰ-１αアンタゴニスト」なる用語は、ＭＩＰ-１αに結合して、ＭＩＰ-１αの生物学的活性を阻害するか又は実質的に低減させる分子を指す。ＭＩＰ-１αアンタゴニストの非限定的な例には、抗体、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖類、オリゴ糖類、核酸、バイオ有機分子、ペプチド模倣薬、製薬的薬剤及びその代謝物、転写及び翻訳制御配列などが含まれる。本発明の一実施態様では、ＭＩＰ-１αアンタゴニストは、抗体、特にヒトのＭＩＰ-１αを結合する抗ＭＩＰ-１α抗体である。
【００３５】
「ＵＲＣＧＰ」は、抗ＶＥＧＦ耐性腫瘍のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ＋１細胞において上方制御されるタンパク質を指す。ＵＲＣＧＰには、限定するものではないが、好中球エラスターゼ、ＣＤ１４、ｅｘｐｉ、Ｉｌ-１３Ｒ、ＬＤＬＲ、ＴＬＲ-１、ＲＬＦ、Ｅｎｄｏ-Ｌｉｐ、ＳＯＣＳ１３、ＦＧＦ１３、ＩＬ-４Ｒ、ＩＬ-１１Ｒ、ＩＬ-１ＲＩＩ、ＩＦＮ ＴＭ１、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＷＮＴ５Ａ、分泌キャリア膜１、ＨＳＰ８６、ＥＧＦＲ、ＥｐｈＲＢ２、ＧＰＣＲ２５、ＨＧＦ、アンギオポエチン様-６、Ｅｐｈ-ＲＡ７、セマフォリンＶｌｂ、ニューロトロフィン５、クローディン-１８、ＭＤＣ１５、ＥＣＭ及びＡＤＡＭＴＳ７Ｂが含まれる。ある実施態様では、ＵＲＣＧＰは、ＩＬ-１３Ｒ、ＴＬＲ-１、Ｅｎｄｏ-Ｌｉｐ、ＦＧＦ１３及び／又はＩＬ-４Ｒを指す。
「ＤＲＣＧＰ」は、抗ＶＥＧＦ耐性腫瘍のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞において下方制御されるタンパク質を指す。ＤＲＣＧＰには、限定するものではないが、ＴＨＢＳ１、Ｃｒｅａ７、アクアポリン-１、溶質キャリアファミリタンパク質(ＳＣＦ３８)、アポリポタンパクＥ(ＡＰＯＥ)、脂肪酸結合タンパク質(ＦＡＢＰ)、ＮＣＡＭ-１４０、フィブロネクチンＩＩＩ型、ＷＩＰ、ＣＤ７４、ＩＣＡＭ-２、Ｊａｇｇｅｄ１、ｌｔｇａ４、ＩＴＧＢ７、ＴＧＦ-ＢＩＩ-Ｒ、ＴＧＦｂ ＩＥＰ、Ｓｍａｄ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＣＤ８３、Ｄｅｃｔｉｎ-１、ＣＤ４８、Ｅ-セレクチン、ＩＬ-１５、サイトカインシグナル伝達４のサプレッサー、Ｃｙｔｏｒ４及びＣＸ３ＣＲ１が含まれる。ある実施態様では、ＤＲＣＧＰはＴＨＢＳ１及び／又はＣｒｅａ７を指す。
【００３６】
「ＵＲＲＴＰ」は、抗ＶＥＧＦ耐性腫瘍において上方制御されるタンパク質を指す。ＵＲＲＴＰには、限定するものではないが、Ｎｏｔｃｈ２、ＤＭＤ８、ＭＣＰ-１、ＩＴＧＢ７、Ｇ-ＣＳＦ、ＩＬ-８Ｒ、ＭＩＰ２、ＭＳＣＡ、ＧＭ-ＣＳＦ、ＩＬ-１Ｒ、Ｍｅｇ-ＳＦ、ＨＳＰ１Ａ、ＩＬ-１Ｒ、Ｇ-ＣＳＦＲ、ＩＧＦ２、ＨＳＰ９Ａ、ＦＧＦ１８、ＥＬＭ１、Ｌｅｄｇｆａ、スカベンジャーレセプタータイプＡ、マクロファージＣ-タイプレクチン、Ｐｉｇｒ３、マクロファージＳＲＴ-１、Ｇプロテイン-結合レセプター、ＳｃｙＡ７、ＩＬ-１Ｒ２、ＩＬ-１誘導型タンパク質、ＩＬ-１β、及びＩＬＩＸ前駆物質が含まれる。ある実施態様では、ＵＲＲＴＰはＭＳＣＡ、ＭＩＰ２、ＩＬ-８Ｒ及び／又はＧ-ＣＳＦを指す。
「ＤＲＲＴＰ」は、抗ＶＥＧＦ耐性腫瘍において下方制御されるタンパク質を指す。ＵＲＲＴＰには、限定するものではないが、ＩＬ１０-Ｒ２、Ｅｒｂ-２.１、カベオリン３、Ｓｅｍｃａｐ３、ＩＮＴＧ４、ＴＨＢＳＰ-４、ＥｒｂＢ３、ＪＡＭ、Ｅｎｇ、ＪＡＭ、Ｅｎｇ、ＪＡＭ-２、Ｐｅｃａｍ１、Ｔｌｒ３、ＴＧＦ-Ｂ、ＦＩＺＺ１、Ｗｆｓ１、ＴＰ１４Ａ、ＥＭＡＰ、ＳＵＬＦ-２、細胞外基質２、ＣＴＦＧ、ＴＦＰＩ、ＸＣＰ２、Ｒａｍｐ２、ＲＯＲ-α、エフリンＢ１、ＳＰＡＲＣ-様１及びセマフォリンＡが含まれる。ある実施態様では、ＤＲＲＴＰはＩＬ１０-Ｒ２、ＴＨＢＳＰ-４及び／又はＪＡＭ-２を指す。
【００３７】
「検出する」なる用語は広義の意味で用いられ、標的分子の定性的及び定量的測定値を含む。 
「生物学的試料(生体試料)」なる用語は、任意の動物からの身体試料を指すが、好ましくは哺乳動物からのもの、より好ましくはヒトからのものである。このような試料は、血液、血清、血漿、骨髄、硝子体体液、リンパ体液、関節液、濾胞液、精液、羊水、乳汁、全血液、尿、脳脊髄液、唾液、痰、涙、汗、粘液および組織培養液のような体液、並びにホモジナイズした組織のような組織抽出物、及び細胞抽出物を含む。本明細書において好適な生体試料は、血清、血漿、尿又は骨髄試料である。
【００３８】
「抗体」という用語は最も広義に使用され、モノクローナル抗体(完全長又は無傷のモノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体、多価抗体、少なくとも２つのインタクト抗体から形成される多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、及びそれらが所望の生物活性を示す限り抗体断片(以下を参照)を具体的に包含する。
特に断らない限りは、本明細書全体を通して「多価抗体」という表現は３又はそれ以上の抗原結合部位を含む抗体を指すために使用される。多価抗体は典型的には３又はそれ以上の抗原結合部位を持つように遺伝子操作されたもので、一般には天然配列ＩｇＭ又はＩｇＡ抗体ではない。
「抗体断片」は、一般には無傷の抗体の抗原結合を含み、よって抗原に結合する能力を保持している無傷の抗体の一部のみを含む。本定義に包含される抗体断片の例には、(i)ＶＬ、ＣＬ、ＶＨ及びＣＨ１ドメインを持つＦａｂ断片；(ii)ＣＨ１ドメインのＣ末端に一又は複数のシステイン残基を持つＦａｂ断片であるＦａｂ'断片；(iii)ＶＨ及びＣＨ１ドメインを持つＦｄ断片；(iv)ＣＨ１ドメインのＣ末端に一又は複数のシステイン残基とＶＨ及びＣＨ１ドメインを持つＦｄ'断片；(v)抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインを持つＦｖ断片；(vi)ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片(Ward等, Nature 341, 544-546 (1989))；(vii)単離されたＣＤＲ領域；(viii)ヒンジ領域でのジスルフィド架橋によって結合された２つのＦａｂ'断片を含む二価断片であるＦ(ａｂ')２断片；(ix)単鎖抗体分子(例えば単鎖Ｆｖ；ｓｃＦｖ)(Bird等, Science 242:423-426 (1988)；及びHuston等, PNAS (USA) 85:5879-5883 (1988))；(x)同一のポリペプチド鎖中で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に結合した重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を含む、２つの抗原結合部位を持つ「ダイアボディー(diabodies)」(例えば、欧州特許公報第４０４０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)を参照)；(xi)相補的軽鎖ポリペプチドと共に一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント(ＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ-ＣＨ１)を含む「線形抗体」(Zapata等, Protein Eng. 8(10):1057-1062(1995)；及び米国特許第５６４１８７０号)が含まれる。
【００３９】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が、少量で存在しうる天然に生じる突然変異等の可能性のある突然変異を除いて、同一である。したがって、「モノクローナル」なる修飾語は、別の抗体の混合ではない抗体の性質を示す。モノクローナル抗体は非常に特異的で、単一抗原に対するものである。ある実施態様では、モノクローナル抗体は、一般に、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を包含しており、この場合の標的に結合するポリペプチドは、複数のポリペプチド配列から単一の標的結合ポリペプチド配列を選択することを含むプロセスによって得られたものである。例えば、このような選択プロセスは、複数のクローン、例えばハイブリドーマクローン、ファージクローン又は組換えＤＮＡクローンのプールからの、独特のクローンの選択であり得る。選択された標的結合配列を更に変化させることにより、例えば標的に対する親和性を向上させる、標的結合配列をヒト化する、細胞培養液中でのその産生を向上させる、インビボでのその免疫原性を低減する、多特異性抗体を作製する等が可能であること、並びに、変化させた標的結合配列を含む抗体も本発明のモノクローナル抗体であることを理解されたい。一般に異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物と比べて、各モノクローナル抗体は、１の抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、通常他の免疫グロブリンによって汚染されない点で有利である。
「モノクローナル」との修飾詞は、ほぼ均一な抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示し、抗体を何か特定の方法で生成しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は様々な技術によって作ることができ、それらの技術には例えばハイブリドーマ法（例えば、Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)；Hongo等, Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow等, Antibodies: A loboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第２版 1988)；Hammerling等: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981)）、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第4,816,567号参照）、ファージディスプレイ法（例えば、Clarkson等, Nature, 352:624-628 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)；Sidhu等, J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004)；Lee等, J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093 (2004)；Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)；及びLee等, J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004)参照）、及びヒト免疫グロブリン座位又はヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部又は全部を有する動物においてヒト又はヒト様抗体を産生する技術（例えば、WO1998/24893; WO1996/34096；WO1996/33735；WO1991/10741；Jackobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature, 362:255-258 (1993)；Bruggemann等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第5,545,807号；同第5,545,806号；同第5,569,825号；同第5,625,126号；同第5,633,425号；及び同第5,661,016号；Marks等, Bio/Technology, 10:779-783 (1992)；Longerg等, Nature, 368:856-859 (1994)；Morrison, Nature, 368:812-813 (1994)；Fishwild等, Nature Biotechnology, 14:845-851 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology, 14:826 (1996)；及びLongerg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995)）が含まれる。
【００４０】
ここに記載のモノクローナル抗体は、特に、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種から由来するか、特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一か相同である一方、鎖の残りが、他の種から由来するか、他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一か相同である「キメラ」抗体、並びにそれらが所望の生物活性を示す限りはそのような抗体の断片を含む(米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。
【００４１】
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域からの残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種の高頻度可変領域からの残基(ドナー抗体)によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいは実質的に全てのＦＲｓがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部をまた含む。更なる詳細については、Jones等, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature 332:323-329 (1988);及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。また例として、Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)；Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)；Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)；及び米国特許第 6,982,321号及び同第7,087,409号を参照。また、van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001)も参照のこと。抗原刺激に応答して抗体を産生するように修飾されているが、その内在性遺伝子座が無効になっているトランスジェニック動物、例えば免疫化ゼノマウスに抗原を投与することによってヒト抗体を調製することができる(例として、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術に関する米国特許第６０７５１８１号及び同第６１５０５８４号を参照)。また、例えば、ヒトのＢ細胞ハイブリドーマ技術によって生成したヒト抗体に関するLi等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)も参照のこと。
【００４２】
「ヒト抗体」は、ヒトによって生産される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するもの、及び／又はここで開示されたヒト抗体を製造するための何れかの技術を使用して製造されたものである。ヒト抗体のこの定義は、特に非ヒト抗原結合残基を含んでなるヒト化抗体を除く。ヒト抗体は、当該分野で知られている様々な技術を使用することによって生産することが可能である。一実施態様では、ヒト抗体はファージライブラリーから選択され、ここでファージライブラリーがヒト抗体を発現する(Vaughan等, Nature Biotechnology 14:309-314 (1996):Sheets等, PNAS, (USA)95:6157-6162(1998)；Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991))。また、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的又は完全に不活性化されたマウス中に導入することにより産生することができる。暴露時に、遺伝子再構成、アセンブリ及び抗体レパートリーを含む、あらゆる点でヒトに見られるものと密接に類似しているヒト抗体の産生が観察される。このアプローチ法は、例えば米国特許第５５４５８０７号；第５５４５８０６号；第５５６９８２５号；第５６２５１２６号；第５６３３４２５号；第５６６１０１６号、及び次の科学文献：Marks等, Bio/Technology 10:779-783 (1992)；Lonberg等, Nature 368: 856-859 (1994)；Morrison等, Nature 368: 812-13 (1994)；Fishwild等, Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)に記載されている。あるいは、ヒト抗体は、標的抗原に対して抗体を生産するヒトＢリンパ球の不死化によって調製されてもよい(そのようなＢリンパ球は、個体から回収されてもよいし、インビトロで免疫化されていてもよい)。例えば、Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)；Boerner等, J. Immunol., 147(1)：86-95(1991)；及び米国特許第５７５０３７３号を参照のこと。
【００４３】
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の高頻度可変領域と呼ばれる３つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、３つの高頻度可変領域により連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲをそれぞれ含んでいる。各鎖の高頻度可変領域は、ＦＲによって近接して結合され、他の鎖の高頻度可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabat等, Sequence of Proteins ofImmunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, BEthesda, MD. (1991))。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞毒性への抗体の関与を示す。
ここで使用される「高頻度可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」なる用語は、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。例えば、高頻度可変領域は、配列において高頻度可変であり、及び／又は構造的に定まったループを形成する抗体可変ドメインの領域を意味する。一般に、抗体は６つのＨＶＲを含み；ＶＨに３つ(Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３)、ＶＬに３つ(Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３)である。天然の抗体では、Ｈ３及びＬ３は６つのＨＶＲのうちで最も高い多様性を示す、特にＨ３は抗体に良好な特異性を与える際に特有の役割を果たすように思われる。例として、Xu等 (2000) Immunity 13:37-45；Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ)のJohnson and Wu (2003)を参照。実際、重鎖のみからなる天然に生じるラクダ科の抗体は機能的であり、軽鎖が無い状態で安定である。Hamers-Casterman等 (1993) Nature 363:446-448；Sheriff等 (1996) Nature Struct. Biol. 3:733-736。
【００４４】
多数のＨＶＲの描写が使用され、ここに含まれる。カバット相補性決定領域(ＣＤＲ)は配列変化に基づいており、最も一般的に使用されている(Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。Chothiaは、代わりに構造的ループの位置に言及している(Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。ＡｂＭ ＨＶＲは、カバットＨＶＲとChothia構造的ループの間の妥協を表し、Oxford MolecularのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用される。「接触」ＨＶＲは、利用できる複合体結晶構造の分析に基づく。これらＨＶＲのそれぞれからの残基を以下に示す。
ループ  カバット    ＡｂＭ      Chothia     接触
L1      L24-L34     L24-L34     L26-L32     L30-L36
L2      L50-L56     L50-L56     L50-L52     L46-L55
L3      L89-L97     L89-L97     L91-L96     L89-L96
H1      H31-H35B    H26-H35B    H26-H32     H30-H35B  (カバット番号付け)
H1      H31-H35     H26-H35     H26-H32     H30-H35   (Chothia番号付け)
H2      H50-H65     H50-H58     H53-H55     H47-H58
H3      H95-H102    H95-H102    H96-H101    H93-H101
【００４５】
ＨＶＲは、次のような「拡大ＨＶＲ」を含むことができる、即ち、ＶＬの２４−３６又は２４−３４(Ｌ１)、４６−５６又は５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７又は８９−９６(Ｌ３)と、ＶＨの２６−３５(Ｈ１)、５０−６５又は４９−６５(Ｈ２)及び９３−１０２、９４−１０２、又は９５−１０２(Ｈ３)である。可変ドメイン残基には、これら各々を規定するために、Kabat等, 上掲に従って番号を付した。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、ここで定義する高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００４６】
「カバット(Kabat)による可変ドメイン残基番号付け」又は「カバットに記載のアミノ酸位番号付け」なる用語及びその異なる言い回しは、上掲のKabat 等の抗体の編集の軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメインに用いられる番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを用いると、実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＨＶＲ内の短縮又は挿入に相当する２、３のアミノ酸又は付加的なアミノ酸を含みうる。例えば、重鎖可変ドメインには、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基(例えばカバットによる残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃなど)と、Ｈ２の残基５２の後に単一アミノ酸の挿入(Kabatによる残基５２ａ)を含んでもよい。残基のKabat番号は、「標準の」カバット番号付け配列によって抗体の配列の相同領域でアライメントすることによって与えられる抗体について決定してもよい。
本明細書及び特許請求の範囲すべてにわたって、一般的に、可変ドメインの残基を指す場合にはカバット番号付けシステムを用いる(およそ、軽鎖の残基１−１０７と重鎖の残基１−１１３)(例として、Kabat 等, Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。一般的に、イムノグロブリン重鎖定常領域内の残基を指す場合には、「ＥＵ番号付けシステム」又は「ＥＵインデックス」を用いる(ＥＵインデックスはKabat 等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)において報告されており、出典明記によって本明細書中に特別に組み込まれる)。本明細書中で特に述べない限り、抗体の可変ドメイン内の残基の数の参照は、カバット番号付けシステムによって番号付けした残基を意味する。本明細書中で特に述べない限り、抗体の定常ドメイン内の残基の数の参照は、ＥＵ番号付けシステムによって番号付けした残基を意味する(例として、米国特許仮出願第６０／６４０３２３号、ＥＵ番号付けについての図を参照)。
【００４７】
イムノグロブリンの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、抗体(イムノグロブリン)は異なるクラスが割り当てられる。イムノグロブリンには５つの主なクラスがある：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、更にそれらは、ＩｇＧ１(非Ａ及びＡアロタイプを含む)、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２等のサブクラス(アイソタイプ)に分かれる。イムノグロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。イムノグロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配位はよく知られており、一般に、例えばAbbas等 Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (W.B. Saunders, Co., 2000)に記載されている。抗体は、抗体と一又は複数の他のタンパク質ないしペプチドとの共有的ないしは非共有的結合によって形成される大きな融合分子の一部であってもよい。
【００４８】
任意の脊椎動物種からの抗体(イムノグロブリン)の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる２つの明確に区別される型の一つが割り当てられる。
「Ｆｃ領域」なる用語は、インタクト抗体のパパイン消化によって生成されうる免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。Ｆｃ領域は天然配列Ｆｃ領域又は変異形Ｆｃ領域であってもよい。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化するかも知れないが、通常、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はおよそＣｙｓ２２６の位置又はおよそＰｒｏ２３０からの位置のアミノ酸残基からＦｃ領域のカルボキシル末端まで伸長すると定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン(ＥＵ番号付けシステムによれば残基４４７)は、例えば、抗体の産生又は精製中に、又は抗体の重鎖をコードする核酸を組み換え遺伝子操作することによって取り除かれてもよい。したがって、インタクト抗体の組成物は、すべてのＫ４４７残基が除去された抗体群、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体群、及びＫ４４７残基を有する抗体と有さない抗体の混合を含む抗体群を含みうる。免疫グロブリンのＦｃ領域は一般に、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの２つの定常ドメインを含み、場合によってＣＨ４ドメインを含む。
【００４９】
特に明記しない限り、本明細書中の免疫グロブリン重鎖の残基の番号付けは、出典明記によって本明細書中に特別に援用される上掲のKabat等のＥＵインデックスのものである。「KabatのＥＵインデックス」はヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基番号を指す。
本明細書中の「Ｆｃ領域鎖」は、Ｆｃ領域の２つのポリペプチド鎖の１つを意味する。
ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」(「Ｃｇ２」ドメインとも呼ばれる)は、通常、約２３１位のアミノ酸残基から約３４０位のアミノ酸残基まで延びている。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと親密な対にならないという点で独特である。代わりに、２つのＮ結合分岐炭水化物鎖が、無傷の天然IgG分子の２つのＣＨ２ドメインの間に挿入される。炭水化物はドメイン−ドメイン対の代替物を提供し、ＣＨ２ドメインの安定化を助けることができると推測される。BurtonによるMolec. Immunol. 22:161-206 (1985)を参照のこと。ここで、ＣＨ２ドメインは天然配列のＣＨ２ドメイン又は変異体ＣＨ２ドメインとすることができる。
「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域におけるＣ末端からＣＨ２ドメインまでの範囲(つまり、ＩｇＧの約３４１位のアミノ酸から約４４７位のアミノ酸)を含む。ここでは、ＣＨ３領域は、天然配列のＣＨ３ドメインか、又は変異体ＣＨ３ドメイン(例えば、その一鎖に「protroberance」が導入され、それに対応して他の鎖に「空洞」が導入されたＣＨ３ドメイン：出典明記によって特別に本明細書中に援用される米国特許第５８２１３３３号参照)とすることができる。このような変異体ＣＨ３ドメインを使用して本明細書に開示する多重特異性(例えば二重特異性)抗体をつくることができる。
【００５０】
「ヒンジ領域」は、通常、ヒトＩｇＧ１の約Ｇｌｕ２１６又は約Ｃｙｓ２２６から約Ｐｒｏ２３０まで延びていると定義される(Burton, Molec. Immunol.22:161-206, 1985)。他のＩｇＧイソタイプのヒンジ領域は、同じ位置に内部重鎖Ｓ−Ｓ結合を形成する最初と最後のシステイン残基を配置することによりIgG1と整列させることができる。本明細書のヒンジ領域は、天然配列のヒンジ領域か、又は変異体ヒンジ領域とすることができる。変異体ヒンジ領域の２つのポリペプチド鎖は、通常、１つのポリペプチド鎖につき少なくとも１つのシステイン残基を保持しており、よって２つの変異体ヒンジ領域のポリペプチド鎖は２つの鎖の間にジスルフィド結合を形成することができる。本発明の好ましいヒンジ領域は、天然配列のヒトヒンジ領域、例えば天然配列のヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。
「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の少なくとも１つの「作動体機能」を有する。例示的「作動体機能」には、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞障害作用(ＣＤＣ)、Ｆｃレセプター結合、抗体依存性細胞媒介性細胞障害作用(ＡＤＣＣ)、食作用、細胞表面レセプター(例えばＢ細胞レセプター； ＢＣＲ)の下方制御などが含まれる。そのような作動体機能は、通常、Ｆｃ領域が結合ドメイン(例えば、抗体可変ドメイン)と組み合わさることを必要とし、そのような抗体の作動体機能を評価するための当技術分野で既知の様々なアッセイを使用して評価される。
「天然配列のＦｃ領域」は、天然に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を包含する。天然配列のヒトＦｃ領域は、天然配列のヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域(非Ａ-及びＡ-アロタイプ)；天然配列のヒトＩｇＧ２Ｆｃ領域；天然配列のヒトＩｇＧ３Ｆｃ領域；及び天然配列のヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域；並びに、これらの自然に生じる変異体が含まれる。
【００５１】
「インタクトな」抗体は、抗原-結合可変領域、並びに軽鎖定常ドメイン(ＣＬ)及び重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含むものである。定常ドメインは天然配列定常ドメイン(例えば、ヒト天然配列定常ドメイン)又はそれらのアミノ酸配列変異体であってよい。好ましくは、インタクトな抗体は一又は複数のエフェクター機能を有する。
「親抗体」又は「野生型」抗体は、本明細書中で開示する抗体変異体と比較して一又は複数のアミノ酸配列の変更が無いアミノ酸配列を含む抗体である。ゆえに、一般に親抗体は、本明細書中で開示する抗体変異体の対応する高頻度可変領域のアミノ酸配列とはアミノ酸配列が異なる少なくとも一の高頻度可変領域を有する。親抗体は、天然の配列(すなわち、天然に生じる)抗体(天然に生じる対立変異体を含む)、又は天然に生じる配列の既存のアミノ酸配列修飾(例えば挿入、欠失及び／又は他の変更)を有してもよい。開示内容全体を通して、「野生型」、「ＷＴ」、「ｗｔ」、及び「親」ないしは「親の」抗体は交換可能に用いられる。
ここで用いる「抗体変異体」又は「変異抗体」は、親抗体のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する抗体を指す。好ましくは、抗体変異体は、天然に見られないアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメインを含む。このような変異体は、必然的に親抗体と１００％未満の配列同一性又は類似性がある。好適な実施態様では、抗体変異体は、親抗体の重鎖又は軽鎖の可変ドメインの何れかのアミノ酸配列と、およそ７５％から１００％未満、より好ましくはおよそ８０％から１００％未満、より好ましくはおよそ８５％から１００％未満、より好ましくはおよそ９０％から１００％未満、最も好ましくはおよそ９５％から１００％未満のアミノ酸配列同一性又は類似性があるアミノ酸配列を有するであろう。抗体変異体は一般に、一又は複数の高頻度可変領域内又は該領域に隣接して一又は複数のアミノ酸変更を有するものである。
【００５２】
「変異体Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾により、天然配列のＦｃ領域とは異なるアミノ酸配列を包含するものである。ある実施態様では、変異体Ｆｃ領域は、天然配列のＦｃ領域もしくは親ポリペプチドのＦｃ領域と比較した場合、少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、天然配列のＦｃ領域又は親のポリペプチドのＦＣ領域におよそ１からおよそ１０のアミノ酸置換、好ましくはおよそ１からおよそ５のアミノ酸置換を有する。本明細書中の変異体Ｆｃ領域は、典型的には、天然配列のＦｃ領域及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域と、例えば少なくともおよそ８０％の同一性を有するか、又は少なくともおよそ９０％の配列同一性を、又は少なくともおよそ９５％の配列又はそれ以上の同一性を有するものであろう。
抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域(天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域)に帰する生物学的活性を意味し、抗体のアイソタイプにより変わる。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害(ＣＤＣ)；Ｆｃレセプター結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ＡＤＣＣ)；貪食作用；細胞表面レセプター(例えば、Ｂ細胞レセプター)のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化が含まれる。
【００５３】
「抗体依存性細胞媒介性細胞障害」又は「ＡＤＣＣ」とは、ある種の細胞障害細胞(例えば、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、好中球及びマクロファージ)上に存在するＦｃレセプター(ＦｃＲｓ)と結合した分泌Ｉｇにより、これらの細胞障害エフェクター細胞が抗原-担持標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒により標的細胞を死滅させることを可能にする細胞障害性の形態を意味する。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞ＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991) の４６４頁の表３に要約されている。対象の分子のＡＤＣＣ活性をアッセイするために、米国特許第５５００３６２号又は同第５８２１３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイを実施することができる。このようなアッセイにおいて有用なエフェクター細胞には、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー細胞(ＮＫ細胞)が含まれる。代わりとして、もしくは付加的に、対象の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Clynes等, (USA) 95:652-656 (1998)において開示されているような動物モデルにおいて、インビボで評価することが可能である。
「ヒトエフェクター細胞」とは、一又は複数のＦｃＲｓを発現し、エフェクター機能を実行する白血球のことである。ある実施態様では、その細胞が少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例として、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、単球、細胞障害性Ｔ細胞及び好中球が含まれるが、ＰＢＭＣとＮＫ細胞が一般的に好まれる。エフェクター細胞はその天然源、例えば本明細書中に記載の血液又はＰＢＭＣから単離してもよい。
【００５４】
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記載するものである。いくつかの実施態様では、ＦｃＲは天然ヒトＦｃＲである。いくつかの実施態様では、ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体(ガンマレセプター)と結合するもので、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターを含み、これらのレセプターの対立遺伝子変異体、選択的にスプライシングされた形態のものも含まれる。ＦｃγＲＩＩレセプターには、ＦｃγＲＩＩＡ(「活性型レセプター」)及びＦｃγＲＩＩＢ(「阻害型レセプター」)が含まれ、主としてその細胞質ドメインは異なるが、類似のアミノ酸配列を有するものである。活性型レセプターＦｃγＲＩＩＡは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター活性化モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based activation motif ;ＩＴＡＭ)を含んでいる。阻害型レセプターＦｃγＲＩＩＢは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター阻害性モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif ;ＩＴＩＭ)を含んでいる(例としてDaeron, Annu. Rev. immunol. 15:203-234 (1997)を参照)。ＦｃＲsに関しては、 例えばRavetch and Kinet, Annu.Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)；Capel等, Immunomethods 4:25-34 (1994)；及びde Haas等, J.Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) に概説されている。将来的に同定されるものも含む他のＦｃＲsはここでの「ＦｃＲ」という言葉によって包含される。
また、「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」なる用語には、母性ＩｇＧの胎児への移送(Guyer等, J. Immunol. 117:587 (1976) Kim等, J. Immunol.24:249 (1994))と、免疫グロブリンのホメオスタシスの調節を担う新生児性レセプターＦｃＲｎも含まれる。ＦｃＲｎへの結合の測定方法は公知である(例としてGhetie and Ward, Immunol. Today 18: 592-8 (1997)；Ghetie等, Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997)；Hinton等, J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004)；国際公開第2004/92219号 (Hinton等)を参照)。
インビボでのヒトＦｃＲｎへの結合とヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えばヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウス又は形質転換されたヒト細胞株、又は変異形Ｆｃ領域を有するポリペプチドを投与された霊長類動物においてアッセイすることができる。国際公開公報２０００／４２０７２(Presta) にＦｃＲへの結合を向上又は減弱させた抗体変異型が述べられている。例としてShields等, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)も参照のこと。
【００５５】
「補体依存性細胞障害」もしくは「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解することを意味する。典型的な補体経路の活性化は補体系(Ｃｌｑ)の第１補体が、同族抗原と結合した(適切なサブクラスの)抗体に結合することにより開始される。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているように実施することができる。Ｆｃ領域アミノ酸配列を変更してＣ１ｑ結合能力が増大又は減少したポリペプチド変異体(変異形Ｆｃ領域を有するポリペプチド)は、米特許第６１９４５５１号Ｂ１及び国際公開第１９９９／５１６４２号に記述される。また例としてIdusogie 等 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)も参照のこと。
「親和性成熟」抗体は、その１つ以上のＣＤＲに１つ以上の変更を有する抗体であって、そのような変更を有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性を向上させる。一実施態様では、親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル単位の、さらにはピコモル単位の親和性を有する。親和成熟抗体は、当技術分野において既知の方法により生産できる。Marks他は、Bio/Technology, 10:779-783(1992年)において、ＶＨドメインとＶＬドメインのシャフリングによる親和成熟を開示している。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダムな突然変異誘発が、Barbas他、Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813(1994)；Schier他、Gene, 169:147-155 (1995)；Yelton他、J. Immunol., 155:1994-2004 (1995)；Jackson他, J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995)；及びHawkins他, J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)に開示されている。
【００５６】
ここでの「可動(フレキシブル)リンカー」とはペプチド結合によって結合した２又はそれ以上のアミノ酸残基を含むペプチドを意味し、それによって結合された(例えば２つのＦｄ領域のような)２つのポリペプチドに対してより大なる回転自由度を提供する。そのような回転自由度により、可動リンカーによって結合された２又はそれ以上の抗原結合部位がそれぞれより効率的に標的抗原(一又は複数)に接近できるようになる。適切な可動リンカーペプチド配列の例には、gly-ser、gly-ser-gly-ser(配列番号：３４)、ala-ser、及びgly-gly-gly-ser(配列番号：３５)が含まれる。
「二量体化ドメイン」は少なくとも２つのアミノ酸残基(一般にはシステイン残基)又は少なくとも２つのペプチド又はポリペプチド(これは同じか異なったアミノ酸配列を持ちうる)の結合(association)によって形成される。ペプチド又はポリペプチドは共有的及び／又は非共有的結合(一又は複数)によって互いに相互作用しうる。ここでの二量体化ドメインの例には、Ｆｃ領域；ヒンジ領域；ＣＨ３ドメイン；ＣＨ４ドメイン；ＣＨ１-ＣＬ対；出典明示によりここに取り込まれる米国特許第５８２１３３３号に記載されたような、遺伝子操作された「ノブ(knob)」及び／又は「隆起(protruberance)」を持つ「インターフェース」；ロイシンジッパー(例えば、ｊｕｎ／ｆｏｓロイシンジッパー、Kostelney等, J. Immunol., 148:1547-1553 (1992)を参照；又は酵母ＧＣＮ４ロイシンジッパー)；イソロイシンジッパー；レセプター二量体対(例えばインターロイキン-８レセプター(ＩＬ-８Ｒ)；及びインテグリンヘテロ二量体、例えばＬＦＡ-１及びＧＰＩＩＩｂ／ＩＩＩａ)、又はその二量体化領域(一又は複数)；二量体リガンドポリペプチド(例えば、神経成長因子(ＮＧＦ)、ニューロトロフィン-３(ＮＴ-３)、インターロイキン-８(ＩＬ-８)、血管内皮細胞成長因子(ＶＥＧＦ)、ＶＥＧＦ-Ｃ、ＶＥＧＦ-Ｄ、ＰＤＧＦメンバー、及び脳由来神経栄養因子(ＢＤＮＦ)；Arakawa等, J. Biol. Chem. 269(45): 27833-27839 (1994)及びRadziejewski等 Biochem. 32(48): 1350 (1993)を参照)、又はその二量体化領域(一又は複数)；ジスルフィド結合を形成可能なシステイン残基対；ペプチド又はポリペプチドの間にジスルフィド結合が形成可能なようにそれぞれが少なくとも一つのシステイン残基(例えば約１、２又は３から約１０のシステイン残基)を有するペプチド又はポリペプチドの対(以下、「合成ヒンジ」)；及び抗体可変ドメインが含まれる。ここでの最も好適な二量体化ドメインはＦｃ領域又はヒンジ領域である。
【００５７】
抗体の「機能的抗原結合部位」は標的抗原に結合可能なものである。抗原結合部位の抗原結合親和性は、抗原結合部位が由来する親抗体と必ずしも同じほどは強くはないが、抗原に結合する能力は、抗原に結合する抗体を評価するために知られている既知の様々な方法の何れか一つを使用して測定できるものでなければならない。更に、ここの多価抗体の抗原結合部位の各々の抗原結合親和性は定量的に同じである必要はない。ここの多量体抗体に対して、機能的抗原結合部位の数は超遠心分離分析法を使用して評価することができる。この分析法によれば、多量体抗体に対する標的抗原の異なった比を組み合わせ、複合体の平均分子量を、機能的結合部位の異なった数を仮定して算定する。これらの理論値を、機能的結合部位の数を評価するために得られた実際の実権値と比較する。
指定された抗体の「生物学的特性」を有する抗体は同じ抗原に結合する他の抗体とは区別されるその抗体の生物学的特性の一又は複数を保有するものである。
対象の抗体が結合する抗原上のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に記載のものなどの常套的な交差遮断(cross-blocking)アッセイを行ってもよい。
【００５８】
「エピトープ」という用語は、タンパク質抗原上の（モノクローナル又はポリクローナル）抗体との結合部位を指すために使用される。
「Ｂｖ８アンタゴニスト抗体」とは、先に定めたような、Ｂｖ８アンタゴニストであり、したがってＢｖ８の能力を部分的ないしは完全にブロック、阻害又は中和して、骨髄系動員を調節する及び／又は腫瘍発達の間の血管形成を促進する抗体を意味する。
「Ｂｖ８イムノアドヘシン」なる用語は、「Ｂｖ８免疫グロブリンキメラ」なる用語と交換可能に用いられ、それぞれＢｖ８分子（天然又は変異体）の少なくとも一部を免疫グロブリン配列と組合わせるキメラ分子を意味する。免疫グロブリン配列は、好ましくは免疫グロブリン定常ドメインであるが、必ずしもそうでなければならないものではない。イムノアドヘシンはヒト抗体の多くの貴重な化学的及び生物学的性質を有しうる。イムノアドヘシンは適切なヒト免疫グロブリンヒンジ及び定常ドメイン（Ｆｃ）配列に結合した所望の特異性を有するヒトタンパク質配列から構築することができるので、対象の結合特異性は完全にヒトの成分を使用して達成することができる。かかるイムノアドヘシンは患者には最小に免疫原性であり、慢性的な又は繰り返しの使用に対して安全である。
【００５９】
治療用途として記載されているホモ多量体イムノアドヘシンの例には、ＨＩＶの細胞表面ＣＤ４への結合を阻止するＣＤ４-ＩｇＧイムノアドヘシンが含まれる。ＣＤ４-ＩｇＧを妊娠中の女性に分娩直前に投与したPhase Iの臨床治験から得られたデータは、このイムノアドヘシンがＨＩＶの母子移行の防止において有用であることを示唆している（Ashkenazi等, Intern. Rev. Immunol. 10: 219-227 (1993)）。また、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に結合するイムノアドへシンも開発されている。ＴＮＦは、敗血性ショックの主要なメディエータであることが分かっている炎症誘発性サイトカインである。敗血性ショックのマウスモデルに基づいて、ＴＮＦレセプターイムノアドヘシンは、敗血性ショックの治療において臨床的に用いるための候補として有望であることが示されている（Ashkenazi, A.等 (1991) PNAS USA 88:10535-10539）。ＩｇＧ Ｆｃ領域に融合したＴＮＦレセプター配列を含んでなるイムノアドヘシンであるＥＮＢＲＥＬ(登録商標)(エタネルセプト)は、慢性関節リウマチの治療に対して１９９８年１１月２日に米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認された。慢性関節リウマチの治療におけるＥＮＢＲＥＬ(登録商標)の新しく拡大した用途が２０００年６月６日にＦＤＡによって承認された。ＥＮＢＲＥＬ(登録商標)を含む、ＴＮＦ阻害薬に関する最近の情報については、Lovell等, N. Engl. J. Med. 342: 763-169 (2000)、及び８１０−８１１頁の添付の論説；及びWeinblatt等, N. Engl. J. Med. 340: 253-259 (1999)；Maini及びTaylor, Annu. Rev. Med. 51: 207-229 (2000)の概説を参照のこと。
イムノアドヘシン構造の二つの腕が異なる特異性を持つ場合、このイムノアドヘシンは二重特異的抗体に倣って「二重特異的イムノアドヘシン」と呼ばれる。Dietsch等, J. Immunol. Methods 162:123 (1993)は、アドヘシン分子の細胞外ドメイン、Ｅ-セレクチン及びＰ-セレクチンを組み合わせた、このような二重特異的イムノアドヘシンを記載しており、そのセレクチンの各々は天然では異なる細胞型中で発現される。結合実験により、そのように形成された二重特異的免疫グロブリン融合タンパク質が、それ由来の単一特異的イムノアドヘシンと比較して骨髄細胞株に結合する向上した能力を有していることが示された。
【００６０】
「ヘテロアドヘシン」なる用語は「キメラヘテロ多量体アドヘシン」なる表現と交換可能に使用され、各キメラ分子がヘテロ多量体レセプターモノマーの各々の細胞外ドメインのような生物学的に活性な部分を多量体化ドメインと組み合わせているキメラ分子（アミノ酸配列）の複合体を意味する。「多量体化ドメイン」はヘテロ多量体複合体内のキメラ分子の安定な相互作用を促進する。多量体化ドメインは、免疫グロブリン配列、ロイシンジッパー、疎水性領域、親水性領域、又はキメラヘテロ多量体のキメラ分子間に細胞間ジスルフィド結合を形成する遊離チオールを介して作用しうる。多量体化ドメインは免疫グロブリン定常領域を含みうる。加えて、多量体化領域は、立体的相互作用が安定な相互作用を促進するばかりでなく、モノマー混合物からホモ二量体よりもヘテロ二量体の生成を更に促進するように、操作されうる。「隆起(protuberances)」は、第一のポリペプチドの接合点からの小アミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）と置き換えることにより構築される。隆起に対する同一又は類似のサイズの代償的「空洞(cavities)」は、場合によっては、大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの（例えばアラニン又はスレオニン）と置き換えることにより第二のポリペプチドの接合点上につくり出される。免疫グロブリン部分は、必ずではないが好ましくは、免疫グロブリン定常ドメインである。本発明のキメラの免疫グロブリン部分はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭから得ることができるが、好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ３から得ることができる。
【００６１】
ここで使用される場合、「治療」とは、有益な又は所望される臨床結果を得るためのアプローチ法である。この発明の目的において、有益な又は所望される臨床結果には、限定されるものではないが、検出可能か検出不可能かにかかわらず、症状の緩和、疾病範囲の減少、疾病の安定した（つまり、悪くならない）状態、病気進行の遅延又は減速、疾病状態の回復又は緩和、及び沈静化（部分的又は全体的にかかわらず）が含まれる。「治療」はまた治療を受けない場合に予測される生存性に比較した延命を意味し得る。「治療」は、疾患の病状の進行又は変化を防止する意図で実施される介入である。従って、「治療」は、治療的処置及び予防的又は防止的手段の両方を意味する。治療が必要な者には、既に疾患を有する者並びに疾患が防止されるべき者が含まれる。すなわち、治療は、細胞変性又は損傷の病理状態、例えば骨髄系細胞の動員及び／又は腫瘍血管形成と関連する疾患又は症状の病理状態を直接的に防止し、遅延させ又は減少等させうるか、あるいは他の療法剤による治療に細胞をより感受性にしうる。
【００６２】
「有効量」又は「治療的有効量」という用語は、哺乳類の疾病や疾患の治療のために有効な薬剤の量に相当する。癌の場合は、有効量の薬剤により、癌細胞の数を減少させ；腫瘍の大きさを小さくし；癌細胞の周辺器官への浸潤を阻害(すなわち、ある程度に遅く、典型的には止める)し；腫瘍の転移を阻害(すなわち、ある程度に遅く、典型的には止める)し；腫瘍の成長をある程度阻害し；耐性腫瘍の治療を可能にする；及び／又は疾患に関連する一又は複数の症状をある程度和らげることが可能である。ある程度、薬剤は、成長を妨げ及び／又は現存の癌細胞を殺すことが可能で、細胞分裂停止性及び／又は細胞障害性である。癌治療に対しては、インビボにおける効力は、例えば生存期間、病状の進行時間(ＴＴＰ)、応答速度(ＲＲ)、応答期間、及び／又は生活の質の測定により測定される。大腸腺腫の場合、治療的有効量の薬剤により、例えば、腺腫細胞数の減少；腺腫サイズの減少；腺腫数の減少；腺腫の成長のある程度の阻害；及び／又は本疾患に関係する一又は複数の症状のある程度の軽減しうる。
【００６３】
「慢性」投与とは、急性態様とは異なり、初期の治療効果（活性）を長時間にわたって維持するようにする、連続的な態様での薬剤の投与を意味する。「間欠」投与とは、中断なく連続的になされるのではなく、むしろ周期的になされる性質の治療である。
治療目的たる「哺乳動物」は、ヒト、他の高等霊長類、齧歯類、家庭及び酪農用動物、及び動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばマウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ等々を含む哺乳類に分類されるあらゆる動物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
ここで用いられる「腫瘍」は、悪性又は良性に関わらず、全ての腫瘍形成細胞成長及び増殖、及び全ての前癌性及び癌性細胞及び組織を意味する。
【００６４】
「癌」及び「癌性」なる用語は、、一般的に調節されない細胞増殖に特徴がある哺乳動物の生理学的状態を指すか又は記述する。癌の例には、限定するものではないが、カルチノーマ、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病又はリンパ性悪性腫瘍が含まれる。このような癌のより具体的な例には、腎臓又は腎性癌、乳癌、大腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、肺癌、例として小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌、扁平細胞癌(例えば上皮の扁平細胞癌)、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、肝癌、膀胱癌、腹膜の癌、肝細胞性癌、胃腸癌を含む胃(gastric、stomach)癌、消化管間質腫瘍(ＧＩＳＴ)、膵癌、頭頸部癌、神経膠芽腫、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、莢膜細胞腫、男化腫瘍、肝細胞癌、非ホジキンリンパ腫を含む血液悪性腫瘍(ＮＨＬ)、多発性骨髄腫及び急性の血液系悪性腫瘍、子宮内膜ないし子宮カルチノーマ、子宮内膜症、線維肉腫、絨毛膜癌、唾液腺カルチノーマ、外陰部癌、甲状腺癌、食道カルチノーマ、肝癌、肛門部のカルチノーマ、陰茎カルチノーマ、上咽頭癌、喉頭のカルチノーマ、カポシ肉腫、メラノーマ、皮膚カルチノーマ、シュワン腫、乏突起細胞腫、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨原性肉種、平滑筋肉腫、尿路カルチノーマ、甲状腺カルチノーマ、ウィルムス腫瘍、並びにＢ細胞リンパ腫(例えば低グレード／濾胞性非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)；小リンパ球性(ＳＬ)ＮＨＬ；中間グレード／濾胞性ＮＨＬ；中間グレード広汎性ＮＨＬ；高グレード免疫芽細胞ＮＨＬ；高グレードリンパ芽球ＮＨＬ；高グレード小型非分割細胞ＮＨＬ；巨大腫瘤病変(bulky disease)ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；エイズ関連のリンパ腫；及び、 ワルデンシュトレームマクログロブリン血症)；慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)；急性リンパ芽球性白血病(ＡＬＬ)；線毛細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；及び、移植後のリンパ増殖性疾患(ＰＴＬＤ)、並びに母斑症、浮腫(脳腫瘍と関係しているものなど)及びメイグス症候群と関係している異常な血管性増殖が含まれる。本明細書中で用いられる「腫瘍」は、悪性又は良性のいずれであっても、すべての腫瘍性細胞成長及び増殖、及びすべての前癌性及び癌性の細胞及び組織を指す。 
【００６５】
「耐性腫瘍」なる用語は、少なくともＶＥＧＦアンタゴニストを含む癌治療に対して癌治療の間を通して十分に反応しない、又は反応がない、ないしは反応が低減している癌、癌細胞又は腫瘍を指す。また、耐性腫瘍は、本明細書中において耐性があると診断された腫瘍(また、本明細書中では「抗ＶＥＧＦ耐性腫瘍」と称される)を指す。ある実施態様では、少なくともＶＥＧＦアンタゴニストを含む療法に感受性がある腫瘍と比較して、耐性腫瘍ではＣＤ11ｂ＋Ｇｒ1＋細胞の増加がある。
【００６６】
「抗新生物性組成物」なる用語は、少なくとも一の活性な治療剤、例えば「抗癌剤」を含む癌の治療に有用な組成物を指す。治療剤(抗癌剤)の例には、限定するものではないが、例えば化学療法剤、増殖阻害剤、細胞障害性剤、放射線療法において使用する薬剤、抗血管新生剤、アポトーシス剤、抗チューブリン剤、毒素、及び癌を治療するための他の薬剤、例えば抗ＶＥＧＦ中和抗体、ＶＥＧＦアンタゴニスト、抗ＨＥＲ-２、抗ＣＤ２０、上皮性増殖因子レセプター(ＥＧＦＲ)アンタゴニスト(例えば、チロシンキナーゼインヒビター)、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲインヒビター、エルロチニブ、ＣＯＸ-２インヒビター(例えば、セレコキシブ)、インターフェロン、サイトカイン、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４又はＶＥＧＦレセプターの一又は複数に結合するアンタゴニスト(例えば、中和抗体)、血小板由来増殖因子(ＰＤＧＦ)及び／又は幹細胞因子(ＳＣＦ)に対するレセプターチロシンキナーゼのインヒビター(例えば、メシル酸イマチニブ(Ｇｌｅｅｖｅｃ(登録商標) Novartis))、ＴＲＡＩＬ/Ａｐｏ２、及び他のバイオ活性がある有機化学的薬剤などが含まれる。それらの組合せも本発明に包含される。
【００６７】
ここで用いられる「細胞障害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を指す。この用語は、放射性同位体(例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体)、化学治療薬、及び毒素、例えばその断片及び／又は変異体を含む小分子毒素又は細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素を含むように意図されている。
ここで用いられる際の「増殖阻害剤」は、細胞の増殖をインビトロ及び／又はインビボで阻害する化合物又は組成物を意味する。よって、増殖阻害剤は、Ｓ期で細胞の割合を有意に減少させるものである。増殖阻害剤の例は、細胞周期の進行を(Ｓ期以外の位置で)阻害する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、タキソール(登録商標)、及びトポＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。またＧ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びアラ-Ｃである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakami等, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。
【００６８】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びCYTOXAN(登録商標)シクロホスファミドのようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(特にブラタシン及びブラタシノン)；デルタ−９−テトラヒドロカナビノール(ドロナビノール、MARINOL(登録商標)；βラパチョーネ；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン(合成アナログトポテカン(HYCAMTIN(登録商標)、CPT-11(イリノテカン、CAMPTOSAR(登録商標))、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン(scopolectin)及び９−アミノカンプトテシンを含む)；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成アナログを含む)；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；テニポシド；クリプトフィシン(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８)；ドラスタチン；ドゥオカルマイシン(合成アナログ、ＫＷ-２１８９及びＣＢ１-ＴＭ１を含む)；エロイテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンギスタチン；クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；抗生物質、例えばエネジイン抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンωＩ１(例えばAgnew Chem Intl. Ed. Engl. 33:183-186(1994)参照)；ダイネマイシン(dynemicin)Ａを含むダイネマイシン；エスペラマイシン；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパクエネジイン抗生物質発色団)、アクラシノマイシン類(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorbicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ドキソルビシン(ADRIAMYCIN(登録商標)、モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣＩリポソーム注射剤(DOXIL(登録商標))及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣのようなマイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；代謝拮抗剤、例えばメトトレキセート、ゲムシタビン(gemcitabine) (GEMZAR(登録商標))、テガフル(tegafur) (UFTORAL(登録商標))、カペシタビン(capecitabine) (XELODA(登録商標))、エポチロン(epothilone)、及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)；葉酸アナログ、例えばデノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)；プリンアナログ、例えばフルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)；アンドロゲン類、例えばカルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸リプレニッシャー(replenisher)、例えばフロリン酸(frolinic acid)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)；メイタンシノイド(maytansinoid)類、例えばメイタンシン(maytansine)及びアンサミトシン(ansamitocine)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類(特にＴ-２毒素、ベラクリン(verracurin)Ａ、ロリジン(roridine)Ａ及びアングイジン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン(ELDISINE(登録商標)、FILDESIN(登録商標))；ダカーバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ａｒａ-Ｃ」)；チオテパ；タキソイド類、例えばパクリタキセル(TAXOL(登録商標))、パクリタキセルのクレモフォー無添加アルブミン操作ナノ粒子製剤(ABRAXANETM)、及びドキセタキセル(TAXOTERE(登録商標))；クロランブシル；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；プラチナアナログ、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン(VELBAN(登録商標))；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６)；イホスファミド；マイトキサントロン；ビンクリスチン(ONCOVIN(登録商標))；オキサリプラチン；ロイコボビン(leucovovin)；ビノレルビン(ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ(登録商標))；ノバントロン(novantrone)；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロナート(ibandronate)；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸のようなレチノイド；上述したもののいずれかの薬学的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体：並びに上記のうち２以上の組み合わせ、例えば、シクロフォスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニソロン併用療法の略称であるＣＨＯＰ、及び５-ＦＵ及びロイコボビン(leucovovin)とオキサリプラチン(ELOXATINTM)を組み合わせた治療法の略称であるFOLFOXが含まれる。
【００６９】
またこの定義に含まれるものには、癌の増殖を助けるホルモンの作用を調節、低減、遮断又は阻害するように働き、多くの場合全身処置の形態で使用される抗ホルモン剤がある。それらはそれ自体がホルモンであってもよい。それらは例えば抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体モジュレータ(ＳＥＲＭ)を含み、例えば、タモキシフェン(NOLVADEX(登録商標)タモキシフェンを含む)、ラロキシフェン(raloxifene)(EVISTA(登録商標))、ドロロキシフェン、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びトレミフェン(FARESTON(登録商標))；抗プロゲステロン；エストロゲンレセプター下方調節剤(ERD)；卵巣を抑止又は停止させる機能がある作用剤、黄体形成ホルモン放出ホルモン(LHRH)アゴニスト、例えば酢酸リュープロリド(LUPRON(登録商標)及びELIGARD(登録商標))、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリン及びトリプテレリン(tripterelin)；その他抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド；並びに副腎のエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば４(５)-イミダゾール、アミノグルテチミド、酢酸メゲストロール(MEGASE(登録商標))、エキセメスタン(AROMASIN(登録商標))、フォルメスタニー(formestanie)、ファドロゾール、ボロゾール(RIVISOR(登録商標))、レトロゾール(FEMARA(登録商標))、及びアナストロゾール(ＡＲＩＭＩＤＥＸ(登録商標))である。加えて、このような化学療法剤の定義には、クロドロネート(例えばBONEFOS(登録商標)又はOSTAC(登録商標))、エチドロン酸(DIDROCAL(登録商標))、NE-58095、ゾレドロン酸／ゾレドロネート(ZOMETA(登録商標))、アレンドロネート(FOSAMAX(登録商標))、パミドロン酸(AREDIA(登録商標))、チルドロン酸(SKELID(登録商標))、又はリセドロン酸(ACTONEL(登録商標))、並びにトロキサシタビン(troxacitabine)(１,３-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に接着細胞の増殖に結びつくシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ-α、Ｒａｆ、及びＨ-Ｒａｓ、及び上皮増殖因子レセプター(ＥＧＦ-Ｒ)；THERATOPE(登録商標)ワクチン及び遺伝子治療ワクチン等のワクチン、例えばALLOVECTIN(登録商標)ワクチン、LEUVECTIN(登録商標)ワクチン、及びVAXID(登録商標)ワクチン；トポイソメラーゼ１阻害剤(例えばLURTOTECAN(登録商標))；ｒｍＲＨ(例えばABARELIX(登録商標))；ラパチニブ(lapatinib ditosylate)(GW572016としても知られるＥｒｂＢ-２及びＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼ小分子阻害剤)；セレコシブ(celecoxib)などのＣＯＸ-２阻害剤(CELEBREX(登録商標)；４-(５-(４-メチルフェニル)-３-(トリフルオロメチル)-１Ｈ-ピラゾル-１-イル)ベンゼンスルホンアミド；及び上記のもののいずれかの製薬的に許容される塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
【００７０】
「サイトカイン」という用語は、一つの細胞集団から放出されるタンパク質であって、他の細胞に対して細胞間メディエータとして作用するものの包括的な用語である。そのようなサイトカインの例は、リンフォカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインには、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラクシン；プロリラクシン；卵胞刺激ホルモン(ＦＳＨ)、甲状腺刺激ホルモン(ＴＳＨ)、及び黄体形成ホルモン(ＬＨ)のような糖タンパク質ホルモン；肝増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子-α及び-β；ミューラー阻害物質；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子(例えばＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ-Ｂ、ＶＥＧＦ-Ｃ、ＶＥＧＦ-Ｄ、ＶＥＧＦ-Ｅ)；胎盤由来の増殖因子(ＰｌＧＦ)；血小板由来成長因子(ＰＤＧＦ、例えばＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＣ、ＰＤＧＦＤ)；インテグリン；トロンボポエチン(ＴＰＯ)；神経成長因子、例えばＮＧＦ-α；血小板増殖因子；ＴＧＦ-α及びＴＧＦ-βのようなトランスフォーミング成長因子(ＴＧＦ)；インスリン様成長因子I及びII；エリスロポイエチン(ＥＰＯ)；オステオインダクティブ因子；インターフェロン、例えばインターフェロン−α、−β、−γ；コロニー刺激因子(ＣＳＦ)、例えばマクロファージ-ＣＳＦ(Ｍ-ＣＳＦ)；顆粒球-マクロファージ-ＣＳＦ(ＧＭ-ＣＳＦ)；及び顆粒球-ＣＳＦ(Ｇ-ＣＳＦ)；ＩＬ-１、ＩＬ-１α、ＩＬ-１β、ＩＬ-２、ＩＬ-３、 ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、 ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１０、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２、ＩＬ-１３、ＩＬ-１４、ＩＬ-１５、ＩＬ-１６、ＩＬ-１７、ＩＬ-１８、ＩＬ-１９、ＩＬ-２０、ＩＬ-３０のインターロイキン(ＩＬ)；セクレトグロビン／ウテログロビン；オンコスタチンＭ(ＯＳＭ)；ＴＮＦ-α又はＴＮＦ-βなどの腫瘍壊死因子；及びＬＩＦ及びキットリガンド(ＫＬ)を含む他のポリペプチド因子が含まれる。ここで使用される場合は、サイトカインなる用語は天然源由来あるいは組換え細胞培養由来のタンパク質及び天然配列サイトカインの生物的に活性な等価物を含む。
【００７１】
この出願で用いられる用語「プロドラッグ」は、親薬剤に比較して腫瘍細胞に対する細胞障害性が低く、酵素的に活性化又はより活性な親形態に変換される製薬的活性物質の前駆体又は誘導体形態を意味する。例えば、Wilman, 「Prodrugs in Cancer Chemotherapy」, Biochemical Society Transactions, 14, :375-382, 615th Meeting, Belfast (1986)、及びStella 等, 「Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery」、Directed Drug Delivery, Borchardt等(編), 247-267項, Humana Press (1985)参照。本発明のプロドラッグは、限定するものではないが、ホスファート含有プロドラッグ、チオホスファート含有プロドラッグ、スルファート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ-アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β-ラクタム含有プロドラッグ、任意に置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ又は任意に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、より活性のある細胞毒のない薬剤に転換可能な５-フルオロシトシン及び他の５-フルオロウリジンプロドラッグを含む。限定はしないが、本発明で使用されるプロドラッグ形態に誘導体化可能な細胞障害性剤の例には、前記の化学療法剤が含まれる。
【００７２】
「血管新生因子又は薬剤」は、血管の発達を刺激する、例えば、血管新生、血管内皮細胞増殖、血管及び／又は脈管形成の安定性などを促進する増殖因子である。例えば、血管新生因子には、限定するものではないが、例えば、ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦファミリのメンバー、ＰｌＧＦ、ＰＤＧＦファミリ、線維芽細胞増殖因子ファミリ(ＦＧＦ)、ＴＩＥリガンド(アンギオポイエチン)、エフリン、ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ４などが含まれる。また、創傷治癒を促す因子、例として、成長ホルモン、インスリン様成長因子-Ｉ(ＩＧＦ-Ｉ)、ＶＩＧＦ、上皮細胞増殖因子(ＥＧＦ)、ＣＴＧＦ、及びそのファミリのメンバー、及びＴＧＦ-α及びＴＧＦ-βが含まれる。例としてKlagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53:217-39 (1991)；Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003)；Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12): 1359-1364 (1999)；Tonini等, Oncogene, 22:6549-6556 (2003)(例えば、血管新生因子を列挙する表１)；及びSato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003)を参照。
「抗血管新生剤」又は「血管新生インヒビター」は、小分子量物質、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、単離されたタンパク質、組換えタンパク質、抗体、又はこれらのコンジュゲートないし融合タンパク質を指し、直接又は間接的に、血管新生、脈管形成又は望ましくない血管透過を阻害するものである。例えば、抗血管新生剤は、上記に定義するように、血管新生剤に対する抗体又は他のアンタゴニスト、例えばＶＥＧＦに対する抗体、ＶＥＧＦレセプターに対する抗体、ＶＥＧＦレセプターシグナル伝達を遮断する小分子(例えばＰＴＫ７８７／ＺＫ２２８４、ＳＵ６６６８、ＳＵＴＥＮＴ／ＳＵ１１２４８(リンゴ酸スニチニブ)、ＡＭＧ７０６)である。また抗血管新生剤には、天然の血管新生インヒビター、例えばアンジオスタチン、エンドスタチンなどが含まれる。例としてKlagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53:217-39 (1991)；Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003)(例えば、悪性メラノーマの抗血管新生療法を列挙する表３)；Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12): 1359-1364 (1999)；Tonini等, Oncogene, 22:6549-6556 (2003)(例えば、抗血管新生因子を列挙する表２)；及び、Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003)(例えば、臨床試験で用いられる抗血管新生剤を挙げる表１)を参照。
【００７３】
本明細書中で用いる「免疫抑制剤」なる用語は、本明細書において治療される哺乳動物の免疫系を抑制するか又は隠すために作用する物質を指す。これには、サイトカイン産生を抑制する物質、自己抗原発現を下方制御は又は抑制する物質、又は、ＭＨＣ抗原をマスキングする物質が含まれる。このような薬剤の例には、２-アミノ-６-アリル-５-置換ピリミジン(米国特許第４６６５０７７号を参照)；非ステロイド性抗炎症薬(ＮＳＡＩＤ)；ガンシクロビル、タクロリムス、糖質コルチコイド、例として、コルチゾール又はアルドステロン、抗炎症剤、例として、シクロオキシゲナーゼインヒビター、５-リポキシゲナーゼインヒビター又はロイコトリエンレセプターアンタゴニスト；プリンアンタゴニスト、例として、アザチオプリン又はミコフェノール酸モフェチル(ＭＭＦ)；アルキル化剤、例として、シクロホスファミド；ブロモクリプチン；ダナゾール；ダプソン；グルタールアルデヒド(ＭＨＣ抗原をマスキングするもの、米国特許第４１２０６４９号に記載)；ＭＨＣ抗原及びＭＨＣ断片に対する抗イディオタイプ抗体；シクロスポリンＡ；ステロイド、例として、副腎皮質ステロイド又は糖質副腎皮質ステロイド又は糖質コルチコイド類似体、例えばプレドニゾン、メチルプレドニゾロン及びデキサメサゾン；ジヒドロ葉酸レダクターゼインヒビター、例えばメトトレキセート(経口又は皮下)；ヒドロキシクロロキン；スルファサラジン；レフルノミド；サイトカインないしはサイトカインレセプター抗体、例えば抗インターフェロン-α、-β又は-γ抗体、抗腫瘍壊死因子-α抗体(インフリキシマブ又はアダリムマブ)、抗ＴＮＦ-αイムノアドヘシン(エタネルセプト)、抗腫瘍壊死因子-β抗体、抗インターロイキン２抗体及び抗ＩＬ-２レセプター抗体；抗ＣＤ１１ａ及び抗ＣＤ１８抗体を含む抗ＬＦＡ-１抗体；抗Ｌ３Ｔ４抗体；異種性の抗リンパ球グロブリン；パン-Ｔ抗体、好ましくは抗ＣＤ３又は抗ＣＤ４／ＣＤ４ａ抗体；ＬＦＡ-３結合ドメインを含む可溶性ペプチド(１９９０年７月２６日に発行の国際公開第１９９０／０８１８７号)；ストレプトキナーゼ；ＴＧＦ-β；ストレプトドルナーゼ；宿主のＲＮＡ又はＤＮＡ；ＦＫ５０６；ＲＳ-６１４４３；デオキシスペルグアリン；ラパマイシン；Ｔ細胞レセプター(Cohen等、米国特許第５１１４７２１号)；Ｔ細胞レセプター断片(Offner等, Science, 251: 430-432 (1991)；国際公開第１９９０／１１２９４号；Ianeway, Nature, 341: 482 (1989)；及び国際公開第１９９１／０１１３３号)；及び、Ｔ細胞レセプター抗体(欧州特許第３４０１０９号)、例えばＴ１０Ｂ９が含まれる。
「非ステロイド系抗炎症薬」又は「ＮＳＡＩＤ」の例は、アセチルサリチル酸、イブプロフェン、ナプロキセン、インドメタシン、スリンダク、トルメチン、これらの塩類及び誘導体などが含まれる。
【００７４】
疾患の「病理状態」には、患者の健康を損なうあらゆる現象が含まれる。癌の場合には、これに限定されるものではないが、異常又は制御不能な細胞成長、転移、隣接細胞の正常機能の阻害、サイトカイン又は他の分泌産物の異常なレベルでの放出、炎症又は免疫反応の抑制又は悪化等々が含まれる。
一又は複数の更なる治療薬「と組み合わせて(と併用して)」の投与は、同時（一時）及び任意の順序での連続投与を含む。
【００７５】
ここで用いられる「担体」には、製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤が含まれ、用いられる用量及び濃度でそれらに曝露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例には、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮＴＭ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭが含まれる。
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小胞体であり、哺乳動物への薬物（Ｂｖ８ポリペプチド又はその抗体など）の輸送に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質構造に類似する二層形成体として配される。
「小分子」とは、ここで、約５００ダルトン未満の分子量を持つものと定義される。
【００７６】
「アミノ酸変更」は、既定のアミノ酸配列のアミノ酸配列内の変化を指す。例示的な変更には、挿入、置換及び欠失が含まれる。「アミノ酸置換」とは、既定のアミノ酸配列内の既存のアミノ酸残基の他の異なるアミノ酸残基への置換を指す。
「置換」アミノ酸残基は、アミノ酸配列内の他のアミノ酸残基を置き換える、又は置換するアミノ酸残基を指す。置換残基は天然に生じるアミノ酸残基でも天然に生じないアミノ酸残基であってもよい。
「アミノ酸挿入」とは、既定のアミノ酸配列の中に一又は複数のアミノ酸を取り込ませることを指す。アミノ酸挿入は、ペプチド結合によって結合された２以上のアミノ酸残基を含むペプチドが既定のアミノ酸配列内に導入される場合に「ペプチド挿入」を含みうる。アミノ酸挿入がペプチドの挿入を伴う場合、挿入されたペプチドは、天然に存在しないアミノ酸配列を有するようにランダム突然変異誘発によって生成されてもよい。「高頻度可変領域に隣接する」アミノ酸変更とは、高頻度可変領域のＮ末端及び／又はＣ末端での一又は複数のアミノ酸残基の導入ないしは置換を指し、この挿入ないしは置換アミノ酸残基(一又は複数)の少なくとも一により、対象の高頻度可変領域のＮ末端又はＣ末端のアミノ酸残基とペプチド結合が形成される。
【００７７】
「天然に生じるアミノ酸残基」は遺伝コードによってコードされるものであり、一般に、アラニン(Ａｌａ)；アルギニン(Ａｒｇ)；アスパラギン(Ａｓｎ)；アスパラギン酸(Ａｓｐ)；システイン(Ｃｙｓ)；グルタミン(Ｇｌｎ)；グルタミン酸(Ｇｌｕ)；グリシン(Ｇｌｙ)；ヒスチジン(Ｈｉｓ)；イソロイシン(Ｉｌｅ)：ロイシン(Ｌｅｕ)；リジン(Ｌｙｓ)；メチオニン(Ｍｅｔ)；フェニルアラニン(Ｐｈｅ)；プロリン(Ｐｒｏ)；セリン(Ｓｅｒ)；スレオニン(Ｔｈｒ)；トリプトファン(Ｔｒｐ)；チロシン(Ｔｙｒ)；及び、バリン(Ｖａｌ)からなる群から選択されうる。
「非天然に生じる(天然に生じない)アミノ酸残基」は、上記に挙げる天然に生じるアミノ酸残基以外の、ポリペプチド鎖内の隣接したアミノ酸残基(一又は複数)を共有結合することができるアミノ酸残基を指す。非天然に生じるアミノ酸残基の例には、例えば、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン及び、例えば、Ellman等 Meth. Enzym. 202:301-336 (1991)に記載のものなどの他のアミノ酸残基アナログが含まれる。非天然のアミノ酸残基を産生するためには、Noren 等 Science 244:182 (1989)および上掲のEllman 等の方法を利用することができる。要するに、これらの方法はインビトロにおけるＲＮＡの転写及び翻訳に先立って非天然に生じるアミノ酸残基にてサプレッサーｔＲＮＡを化学的に活性化することを伴う。
【００７８】
本明細書中で用いる、「高い親和性」を有する抗体とは、ナノモル(ｎＭ)の範囲かそれより良好なＫＤ又は解離定数を有する抗体である。「ナノモル範囲かそれより良好な」ＫＤは、ＸｎＭで表してもよく、このＸはおよそ１０未満の数である。
「繊維状ファージ」なる用語は、その表面上に異種性のポリペプチドをディスプレイすることが可能なウイルス粒子を指し、ｆ1、ｆｄ、Ｐｆ1およびＭ13が挙げられるが、これらに限定されるものではない。繊維状ファージは、テトラサイクリン(例えば「ｆｄ  ｔｅｔ」)などの選択可能なマーカーを含みうる。様々な繊維状ファージディスプレイシステムは当業者に周知である(例えば、Zacher et al. Gene 9: 127-140 (1980)（Smith et al. Science 228: 1315-1317 (1985)；及びParmley and Smith Gene 73: 305-318 (1988)を参照)。
「パニング」なる用語は、標的に対して高親和性および特異性を有する、抗体などの化合物保持するファージの同定および単離におけるスクリーニング工程の複数のラウンドを指すために用いる。
【００７９】
「短い干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)」なる用語は、遺伝子発現を干渉する小さい二本鎖ＲＮＡを指す。ｓｉＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡが相同遺伝子を沈黙(サイレンシング)させる工程であるＲＮＡ干渉の中間生成物である。ｓｉＲＮＡは典型的に、二本鎖を形成するおよそ１５−２５長のヌクレオチドの２つの一本鎖ＲＮＡからなり、一本鎖オーバーハングを含みうる。酵素複合体、例えばポリメラーゼによる二本鎖ＲＮＡのプロセシングにより、二本鎖ＲＮＡの切断が生じ、ｓｉＲＮＡが生成される。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖はＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)サイレンシング複合体に用いられ、ｍＲＮＡ切断が導かれ、これによってｍＲＮＡ分解が促される。例えば哺乳動物細胞において特定の遺伝子をｓｉＲＮＡを用いて沈黙させるために、塩基対領域を、無関係なｍＲＮＡに偶然に相補性を持たないように選択する。例えばFire et al., Nature 391:806-811 (1998)およびMcManus et al., Nat. Rev. Genet. 3(10): 737-47 (2002)にあるように、ＲＮＡｉサイレンシング複合体は、当分野において同定されている。
「干渉ＲＮＡ(ＲＮＡｉ)」なる用語は、特定のｍＲＮＡの触媒的分解をもたらす二本鎖ＲＮＡを指すために本明細書において用い、したがって特定の遺伝子の発現を阻害／低減するために用いられうる。
「有効量」は、有益な又は所望の治療的(防止的なものを含む)結果を生じさせるために十分な量である。有効量は、一又は複数の投与で投与されてもよい。
【００８０】
本明細書中で用いる「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」なる表現は相互に交換可能に用いられ、かかる標記は子孫を含む。よって、「形質転換体」や「形質転換細胞」のような用語には、初代対象細胞と何世代移行したかを問わずそれから由来した培養物とを含む。全ての子孫が、意図的な突然変異あるいは意図せざる突然変異のため、正確に同一のＤＮＡ内容であるわけではないことも理解される。「子孫」なる用語は、最初に形質転換された細胞又は細胞株に続くすべての世代のいずれか及びすべての子孫を指す。最初に形質転換された細胞に対してスクリーニングされたものと同じ機能あるいは生物的活性を有する突然変異子孫も含まれる。区別しての標記を意図している場合は、文脈から明らかなはずである。
【００８１】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングに必要な温度が高くなり、プローブが短くなるとそれに必要な温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは、一般的に、相補鎖がその融点より低い環境に存在する場合に、変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイゼーション配列の間で所望される同一性の程度が高くなればなるほど、用いることができる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をよりストリンジェントにすることになり、低い温度はストリンジェントを低下させることになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの更なる詳細及び説明については、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology(Wiley Interscience Publishers, 1995)を参照のこと。
【００８２】
ここで定義される「高度なストリンジェンシー条件」は、(１)洗浄に低イオン強度及び高温度を用いる、５０℃で、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウム；(２)ハイブリダイゼーション中に変性剤を用いる、４２℃で、５０％(ｖ／ｖ)ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム；又は(３)４２℃で、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ(０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム)、５０ｍＭのリン酸ナトリウム(ｐＨ６．８)、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハード液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ(５０μｇ／ｍｌ)、０．１％ＳＤＳ、及び１０％の硫酸デキストラン溶液を用いて、４２℃の０．２×ＳＳＣ(塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム)中と５５℃の５０％ホルムアミドにて洗浄し、ついで５５℃で、ＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄を行うものによって同定される。
【００８３】
「中程度のストリンジェント条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Press, 1989)に記載されているように同定され、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ(１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム)、５０ｍＭリン酸ナトリウム(ｐＨ７．６)、５×デンハード液、１０％硫酸デキストラン、及び２０ｍｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中にて３７℃で終夜インキュベーションし、次いで１×ＳＳＣ中にて約３７−５０℃でフィルターを洗浄することを含む。当業者であれば、プローブ長などの因子に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかは理解されるであろう。
【００８４】
Ｂ． 詳細な説明  
本発明は、抗ＶＥＧＦ抗体などの少なくとも一のＶＥＧＦアンタゴニストの投与を含む治療に対する耐性を腫瘍に引き起こす細胞及び分子の事象においてＢｖ８が重要な役割を果たすという認識に少なくともある程度基づく。本発明はさらに、Ｂｖ８発現がきわめてＧ−ＣＳＦに反応し、ゆえに、好中球分化および産生の調節に関与する主要な恒常性メカニズムと関連しているという認識に基づく。
出典明記によって本明細書中に特別に援用される、２００７年３月２８日に出願の同時継続出願番号１１／６９２６８１号には、造血性骨髄由来細胞の動員と抗ＶＥＧＦ治療に対する腫瘍耐性の発達との間の相関性が記述されている。免疫系は、赤血球、リンパ球および骨髄系統の細胞を含む造血性細胞を含む。これらすべての細胞型は同じ多能性幹細胞に由来する。成人では、幹細胞が分裂してまれにより多くの幹細胞(自己複製)および様々な関連の前駆細胞を生産している骨髄において、造血が生じる。特定の調節因子に反応して造血性細胞を生産するのは関連の前駆細胞である。これらの調節因子は、主に周囲の間質細胞によって産生され、他の組織に存在するもので、例えば、コロニー刺激因子(ＣＳＦ)、エリスロポイエチン(ＥＰＯ)、インターロイキン３(ＩＬ３)、顆粒球／マクロファージＣＳＦ(ＧＭ-ＣＳＦ)、顆粒球ＣＳＦ(Ｇ−ＣＳＦ)、マクロファージＣＳＦ(Ｍ-ＣＳＦ)およびＳＴＥＥＬ因子を含む。癌患者の免疫系における変化は、癌に対する成功裏な攻撃を増加させる免疫系の能力を不能または低減することに寄与し、それによって腫瘍成長を進行させることが示唆されている。例としてGabrilovich et al., Antibodies to Vascular Endothelial Growth Factor Enhances the Efficacy of Cancer Immunotherapy by Improving Endogenous Dendritic Cell Function, Clinical Cancer Research 5:2963-2970 (1999)を参照。腫瘍によって生産される因子は、異常な骨髄造血を引き起こすこともあるし、腫瘍に対する免疫応答を抑制することもありうる。例としてKusmartsev and Gabrilovich, Immature myeloid cells and cancer-associated immune suppression. Caner Immunol Immunothera. 51:293-298 (2002)を参照。
【００８５】
新しい研究は、抗ＶＥＧＦ療法への不応状態の媒介にＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋骨髄系細胞を直接関連づけた。(Shojaei, F., et al.., Nature Biotechnol 25:911-20 (2007))および同時係属出願出願番号１１／６９２６８１。ＣＤ１１／ＣＤ１８ファミリーは、構造的及び遺伝学的に、細胞接着相互作用を調整するレセプターのより大きなインテグリンファミリーに関連があり、胚発生、細胞外基質に対する接着、及び細胞分化を含む(Hynes, R. O., Cell 48: 549-554 (1987)；Kishimoto et al., Adv. Immunol. 46: 149-182 (1989)；Kishimoto et al., Cell 48: 681-690 (1987)；及び、Ruoslahti et al., Science 238: 491-497 (1987))。インテグリンは、βサブユニットと非共有的に結合したαサブユニットを含む膜貫通ヘテロ二量体の種類である。βサブユニットは一般に複数のαサブユニットと結合することができ、共通のβサブユニットを共有しているヘテロ二量体はインテグリン集団内のサブファミリーとして分類される(Larson and Springer, Structure and function of leukocyte integrins, Immunol. Rev. 114: 181-217 (1990))。
【００８６】
ＣＤ１１／ＣＤ１８ファミリーのインテグリン分子およびその細胞性リガンドは、様々な細胞間相互作用、特に炎症を媒介することが明らかとされた。これらのタンパク質は、免疫系における接着機能に重要であることが示された(Kishimoto et al., Adv. Immunol. 46: 149-182 (1989))。ＬＦＡ-１に対するモノクローナル抗体は、内皮細胞への白血球接着をブロックすること(Dustin et al., J. Cell. Biol. 107: 321-331 (1988)；Smith et al., J. Clin. Invest. 83: 2008-2017 (1989))そして、Ｔ細胞活性化(Kuypers et al., Res. Immunol., 140: 461 (1989))、抗原特異的なＣＴＬ殺傷に必要なコンジュゲート形成(Kishimoto et al., Adv. Immunol. 46: 149-182 (1989))、Ｔ細胞増殖(Davignon et al., J. Immunol. 127: 590-595 (1981))およびＮＫ細胞殺傷(Krensky et al., J. Immunol. 131: 611-616 (1983))を阻害することが知られている。
接着レセプター分子のＣＤ１１／ＣＤ１８ファミリーは、４つの非常に関連した細胞表面糖タンパク質、ＬＦＡ-１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、Ｍａｃ-１(ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８)、ｐ１５０.９５(ＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８)及び(ＣＤ１１ｄ／ＣＤ１８)を含む。これらのヘテロ二量体の各々は、固有のα-鎖(ＣＤ１１ａ、ｂ、ｃ又はｄ)および変化しないβ-鎖(ＣＤ１８)を有する。白血球上に位置するＣＤ１８インテグリンは、脈管内皮および他の細胞で発現される細胞間接着分子-１(ＩＣＡＭ-１)と結合し、それによって、白血球接着および経内皮移動を媒介しうる。ＬＦＡ-１は、マクロファージのサブセットを除くすべての成熟白血球の表面上に存在し、主要なリンパ系のインテグリンと考えられる。Ｍａｃ−１、ｐ１５０.９５およびＣＤ１１ｄ／ＣＤ１８の発現は主に、骨髄系統の細胞(好中球、単球、マクロファージおよびマスト細胞を含む)に限定される。また、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋は、骨髄系細胞上にも見られるマーカーである。成熟骨髄系細胞と未成熟骨髄系細胞とのバランスが癌の指標であり、進行性腫瘍成長ではそのバランスが未成熟骨髄系細胞へと移行し、樹状細胞の機能が減少することが示されている。例としてKusmartsev and Gabrilovich, Immature myeloid cells and cancer-associated immune suppression. Caner Immunol Immunothera. 51:293-298 (2002)を参照。例えば腫瘍保持マウスにおいて未成熟骨髄系細胞を分化させることによってバランスを変化させると、癌ワクチンの効果が改善された。Kusmartsev et al., All-trans-Retinoic Acid Eliminates Immature Myeloid Cells from Tumor-bearing Mice and Improves the Effect of Vaccination. Cancer Research 63:4441-4449 (2003)を参照。また、癌患者では、循環中のＶＥＧＦのレベルが未成熟骨髄系細胞の数の増加と相関していたことが観察された。Almand et al., Clinical significance of defective dendritic cells differentiation in cancer. Clin. Cancer Res. 6: 1755 (2000)を参照。
【００８７】
ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋骨髄系細胞の動員および活性化により抗ＶＥＧＦ治療に耐性が生じうることが示された。また、腫瘍保持マウスから単離された骨髄由来のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋骨髄系細胞は、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の移動を刺激した抗ＶＥＧＦ耐性(抗ＶＥＧＦ感受性でない腫瘍)からの条件培地において、抗ＶＥＧＦ治療に対する耐性を腫瘍に与えうることが示されている。 
本明細書において開示される実験データは、Ｂｖ８が腫瘍発達を支配する骨髄のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の動員を制御して、更に局所的に腫瘍血管形成を促進することを示す。したがって、Ｂｖ８は、ＶＥＧＦアンタゴニストによる治療に耐性がある腫瘍の治療のための有望な標的である。
また、本明細書において開示されるデータは、Ｂｖ８発現はきわめてＧ−ＣＳＦに応答し、ゆえに、好中球分化および産生の調節に関与する主要な恒常性メカニズムと関連していることも示す。非腫瘍タイプの炎症細胞媒介性の血管形成の病因においてＢｖ８が広く役割を果たすので、Ｂｖ８は、一般に、望ましくない炎症細胞媒介性の血管形成の阻害のための標的であることが期待される。
【００８８】
Ｃ．腫瘍血管形成のインヒビターとして作用する抗Ｂｖ８抗体の作製
本発明の結合および活性のアッセイによって同定される抗体は、組換えＤＮＡ技術の技術を含む公知の方法によって製造されうる。
i) 抗原調製 
場合によって他の分子にコンジュゲートした可溶性抗原ないしはその断片は、抗体を生成するための免疫原として用いられうる。レセプターなどの膜貫通分子のために、その断片(例えばレセプターの細胞外ドメイン)が免疫原として用いられうる。あるいは、膜貫通分子を発現する細胞を免疫源として用いてもよい。このような細胞は、天然の供与源(例えば癌細胞株)から得られてもよいし、膜貫通分子を発現するように組換え体技術によって形質転換されている細胞であってもよい。抗体を調製するために有用な他の抗原及びその形態は当分野の技術者に明らかであろう。 
【００８９】
ii) ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、関連する抗原とアジュバントを複数回の皮下(sc)又は腹腔内(ip)注射することにより、動物に産生されることが好ましい。それは、免疫化されるべき種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターへ、二重官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介する抱合)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基を介する抱合)、グルタルアルデヒド、及び無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲ及びＲ１が異なるアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲへ、関連する抗原をコンジュゲートさせるために有用である。
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ(それぞれウサギ又はマウスの場合)を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫する。１ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。好ましくは、動物を、同じ抗原であるが異なるタンパク質にコンジュゲートさせた、及び／又は異なる架橋剤によってコンジュゲートさせたコンジュゲートにより追加免疫する。コンジュゲートはまた、タンパク融合として組換え細胞培養中で調製することができる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。
【００９０】
iii) モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第４８１６５６７号)によって作成することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスター又はマカクザルを上記のように免疫し、免疫化に用いられたタンパク質と特異的に結合する抗体を産生する、又は産生することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次いで、リンパ球をポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ−欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含有するであろう(ＨＡＴ培地)。
【００９１】
好適な骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの発現を支援し、ＨＡＴ培地などの培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫株化細胞は、マウス骨髄腫ライン、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、ＵＳＡより入手し得るＭＯＰＣ-２１及びＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及び、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビル、メリーランド、ＵＳＡより入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞から誘導されるものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている(Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51-63頁、(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について検定する。好ましくはハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定する。
【００９２】
所望の特異性、親和性、及び／又は活性な抗体を産生するハイブリドーマ細胞が確定された後、そのクローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地は、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地を包含する。また、このハイブリドーマ細胞は、動物の腹水症腫瘍として、インビボで増殖させることができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティクロマトグラフィーのような常套的なイムノグロブリン精製法によって、培地、腹水、又は血清から上手く分離される。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常法を用いて(例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)即座に分離されて、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好適な供給源となる。ひとたび分離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、この状況以外ではイムノグロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入し、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を獲得することができる。抗体の組み換え産生を以下に詳細に記載する。
【００９３】
更なる実施態様では、抗体又は抗体断片は、McCafferty等, Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリから分離することができる。
Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)及び Marks等, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリを使用したマウス及びヒト抗体の分離を記述している。続く刊行物は、鎖シャフリングによる高親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の生成(Marks等, Bio/Technology, 10:779-783[1992])、並びに非常に大きなファージライブラリを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouse等, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266[1993])を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の分離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。
また、ＤＮＡは、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメイン(ＣＨ及びＣＬ)のコード配列を、相同的マウス配列に代えて置換することによって(米国特許第４８１６５６７号；Morrison等, Proc.Nat.Acad.Sci., USA, 81:6851(1984))、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部又は一部を共有結合させることによって修飾することができる。
典型的には、前記の非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインと置き代わることができるか、又は抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインが置換されて、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
【００９４】
iv) ヒト及びヒト化抗体
ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的にウィンター(Winter)及び共同研究者［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第４８１６５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方のヒト可変ドメインの選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のヒトフレームワーク(ＦＲ)として受け入れる(Sims等, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothia等, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta等, J. Immunol., 151:2623(1993))。
【００９５】
更に、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好適な方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、ＣＤＲ残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
あるいは、現在では、免疫化することで、内因性免疫グロブリンの産生がなく、ヒト抗体の全レパートリーを産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子のホモ接合体欠失によって、結果として内因性抗体産生の完全な阻害が起こることが説明されてきた。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子配列の、このような生殖細胞系突然変異体マウスへの転移によって、結果として抗原投与時にヒト抗体の産生がおこる。Jakobovits等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature 362:255-258 (1993); Bruggeman等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；及びDuchosal等 Nature 355:258 (1992)を参照されたい。また、ヒト抗体はファージディスプレイライブラリからも得られる(Hoogenboom等, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)；Vaughan等 Nature Biotech 14:309 (1996))。抗体ファージディスプレイライブラリからのヒト抗体の生成は以下に更に記載する。
【００９６】
v) 抗体断片
抗体断片を産生するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化によって誘導された(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は、現在は組換え宿主細胞により直接産生することができる。例えば、抗体断片は、上で論じた抗体ファージライブラリから単離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合させてＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。以下の実施例に記載のような他の実施態様では、Ｆ(ａｂ')２は、Ｆ(ａｂ')２分子のアセンブリを促すように、ロイシンジッパーＧＣＮ４を用いて形成される。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。抗体断片を生成するのための他の方法は、当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択する抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦｖ)である。国際公開９３／１６１８５号を参照のこと。
【００９７】
vi) 多重特異性抗体
多重特異性抗体は、通常異なる抗原に由来する少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する。このような分子は通常２つの異なるエピトープを結合するだけであるが(すなわち二重特異性抗体、ＢｓＡｂ)、本明細書中で用いられる場合には三重特異性抗体などの更なる特異性を有する抗体がこの表現に包含される。ＢｓＡｂの例には、Ｂｖ８に対する一アームと、ＶＥＧＦ又はＥＧ−ＶＥＧＦに対する他のアームとを有するものが含まれる。
二重特異性抗体を作成する方法は当該分野において既知である。完全長二重特異性抗体の伝統的な産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの鎖は異なる特異性を持っている(Millstein等, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公開第９３／０８８２９号及びTraunecker等, EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原-抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むイムノグロブリン重鎖定常ドメインである。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時トランスフェクトする。これにより、組立に使用される３つのポリペプチド鎖の等しくない比率が抗体の最適な収率をもたらす態様において、３つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな(フレキシビリティ)が与えられる。しかし、少なくとも２つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率があまり影響がないときは、２又は３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【００９８】
この手法の好適な実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公開第９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
国際公開第９６／２７０１１号に記載された他の手法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体の定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【００９９】
二重特異性抗体には、交差結合又は「ヘテロコンジュゲート」抗体が含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲートの一抗体はアビジンにカップリングし、他方の抗体はビオチンにカップリングしていてもよい。例えば、このような抗体は、望ましくない細胞へ免疫系細胞を標的化するため(米国特許第４６７６９８０号)、そしてＨＩＶ感染の治療のため(国際公開９１／００３６０、国際公開９２／２００３７３)に提唱されている。ヘテロコンジュゲート抗体は従来のいずれかの交差結合法を用いて作製されてもよい。好適な交差結合剤は当分野で周知であり、多くの交差結合技術と共に米国特許第４６７６９８０号に開示されている。
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤、亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に変換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再変換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
【０１００】
Ｆａｂ'-ＳＨ断片は、大腸菌から直接回収することもできるし、化学的に結合して二重特異性抗体を形成させることもできる。Shalaby等,J.Exp.Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な技術もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生成されている。Kostelny等, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生成に対して使用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、よって２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruber等, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等 J.Immunol. 147:60(1991)。
【０１０１】
vii) エフェクター機能の加工
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、抗体の有効性を向上させることは望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成するようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上したインターナリゼーション能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体−依存細胞性細胞障害性(ＡＤＣＣ)を有する可能性がある。Caron等, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes,  B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。また、向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体は、Wolff等, Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)に記載されている異種二官能性架橋を用いて調製することができる。あるいは、抗体は、２つのＦｃ領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させることもできる。Stevenson等, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照。
【０１０２】
viii) 抗体−サルベージレセプター結合エピトープ融合
本発明のある実施態様では、例えば腫瘍浸透性を増大させるためにインタクト抗体よりも抗体断片を使用することが望ましい。この場合、その血清半減期を増大させるために抗体断片を改変することが望ましい。これは、例えば、抗体断片にサルベージレセプター結合エピトープを組み込むことにより(例えば、抗体断片中の適当な領域の突然変異により、あるいはついで抗体断片の何れかの末端又は中央に、例えばＤＮＡ又はペプチド合成により融合されるペプチドタグ内にエピトープを組み込むことにより)、達成しうる。
サルベージレセプター結合エピトープは、好ましくは、Ｆｃドメインの一又は二のループ由来の一又は複数の任意のアミノ酸残基が抗体断片の類似位置に転移している領域を構成する。更により好ましくは、Ｆｃドメインの一又は二のループ由来の３以上の残基が転移する。またより好ましくは、エピトープはＦｃ領域の(例えばＩｇＧの)ＣＨ２ドメインから得られ、抗体のＣＨ１、ＣＨ３、又はＶＨ領域、又はそのような領域の一より多くに転移する。あるいは、エピトープは、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインから得られ、抗体断片のＣＬ領域又はＶＬ領域、又はその両方に転移する。
【０１０３】
ix) 抗体の他の共有的修飾
抗体の共有的修飾は本発明の範囲内にある。それらは、適当であれば、化学合成により、又は抗体の酵素的又は化学的切断によりなされうる。抗体の共有的修飾の他のタイプは、選択される側鎖又はＮないしＣ末端の残基と反応できる有機誘導体化剤と抗体の標的とするアミノ酸領域を反応させることにより分子中に導入される。共有的修飾は米国特許第５５３４６１５号に記載されており、出典明記によって特別に本明細書中に援用される。抗体の共有結合的修飾の好適なタイプは、ポリペプチドを、種々の非タンパク質様ポリマーの一つ、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンへ、米国特許第４６４０８３５号；第４４９６６８９号；第４３０１１４４号；第４６７０４１７号；第４７９１１９２号又は第４１７９３３７号に記載された方法で結合させることを含む。
【０１０４】
また、本発明は、化学療法薬、毒素(例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片)などの細胞障害性剤、あるいは放射性同位体(即ち、放射性コンジュゲート)とコンジュゲートしている本明細書中に記載の抗体を含むイムノコンジュゲートに関する。例には、限定するものではないがＢｉ２１２、Ｉ１３１、Ｉｎ１３１、Ｙ９０、及びＲｅ１８６が含まれる。
このようなイムノコンジュゲートの生成に有用な化学療法薬は上記した。例えば、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン、５-フルオロウラシル、米国特許第５０５３３９４号、同５７７０７１０号に記載されており、集合的にＬＬ-Ｅ３３２８８複合体として公知の薬剤のファミリー、並びにエスペラマイシン(esperamicine)(米国特許第５８７７２９６号)など(本明細書中の「化学療法薬」の定義も参照のこと)が本発明の抗体ないしその断片にコンジュゲートされうる。
腫瘍を選択的に破壊するため、抗体は高い放射性を有する原子を含有してよい。放射性コンジュゲートした抗体ないしその断片を生成するために、種々の放射性同位体が利用される。例には、限定するものではないがＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、Ｉｎ１１１及びＬｕの放射性同位体などが含まれる。コンジュゲートが診断用に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴(ＮＭＲ)映像(磁気共鳴映像、ＭＲＩとしても公知)用のスピン標識、例えばヨウ素-１２３、ヨウ素-１３１、インジウム-１１１、フッ素-１９、炭素-１３、窒素-１５、酸素-１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。
放射-又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素-１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-９０はリジン残基を介して結合可能である。IODOGEN法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80：49-57)は、ヨウ素-１２３の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、例として「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
【０１０５】
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日公開の国際公開第９３／２１２３２号を参照のこと。
抗体と細胞障害性剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは細胞中の細胞障害性剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」であってよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る(Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)；米国特許第５２０８０２０号)。
別法として、抗ＶＥＧＦ及び／又は本発明の抗体の抗たんぱく質と細胞障害性剤を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製される。ＤＮＡの長さは、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの２つの部分をコードする領域をそれぞれ含有する。
ある実施態様において、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)に抗体をコンジュゲートし、ここで抗体-レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて清澄剤を使用し、循環から未結合コンジュゲートを除去し、細胞障害性剤(例えばラジオヌクレオチド)にコンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。ある実施態様では、イムノコンジュゲートは抗体と核酸溶解活性を有する化合物(例えばリボヌクレアーゼ又はデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮアーゼなどのＤＮＡエンドヌクレアーゼ)との間で形成される。
【０１０６】
本発明は、一又は複数のメイタンシノイド分子にコンジュゲートしている本発明の抗体を提供する。メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第３８９６１１１号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びＣ-３メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第４１５１０４２号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第４１３７２３０号；同４２４８８７０号；同４２５６７４６号；同４２６０６０８号；同４２６５８１４号；同４２９４７５７号；同４３０７０１６号；同４３０８２６８号；同４３０８２６９号；同４３０９４２８号；同４３１３９４６号；同４３１５９２９号；同４３１７８２１号；同４３２２３４８号；同４３３１５９８号；同４３６１６５０号；同４３６４８６６号；同４４２４２１９号；同４４５０２５４号；同４３６２６６３号；及び同４３７１５３３号に開示されている。
本発明の抗体は、抗体又はメイタンシノイド分子のいずれの生物学的活性もほとんど低減することなく、メイタンシノイド分子にコンジュゲートすることができる。１分子の毒素／抗体は、ネイキッド抗体の使用において細胞障害性を高めることが予期されているが、抗体分子当たり、平均３−４のメイタンシノイド分子が結合したものは、抗体の機能又は溶解性に悪影響を与えることなく、標的細胞に対する細胞障害性を向上させるといった効力を示す。メイタンシノイドは当該技術分野でよく知られており、公知の技術で合成することも、天然源から単離することもできる。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第５２０８０２０号、及び他の特許、及び上述した特許ではない刊行物に開示されている。一実施態様では、メイタンシノイドは、メイタンシノール、及び種々のメイタンシノールエステル等の、メイタンシノール分子の芳香環又は他の位置が修飾されたメイタンシノール類似体である。
例えば、米国特許第５２０８０２０号又は欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号、及びChari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)に開示されているもの等を含む、抗体-メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該技術で公知の多くの結合基がある。結合基には、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれるが、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。
【０１０７】
抗体とメイタンシノイドとのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トルエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。典型的なカップリング剤には、ジスルフィド結合を提供するためのＮ-スクシンイミジル-４-(２-ピリジルチオ)ペンタノアート(ＳＰＰ)及びＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)(Carlsson等, Biochem. J. 173：723-737[1978])が含まれる。
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するＣ-３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ-１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ-１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ-２０位で生じる。結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のＣ-３位で形成される。
【０１０８】
対象の他の免疫コンジュゲートには、一又は複数のカリケアマイシン分子とコンジュゲートした本発明の抗体が含まれる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ-ピコモルの濃度で二重鎖ＤＮＡ破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第５７１２３７４号、同５７１４５８６号、同５７３９１１６号、同５７６７２８５号、同５７７０７０１号、同５７７０７１０号、同５７７３００１号、同５８７７２９６号(全て、American Cyanamid Company)を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ-アセチル-γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ１(Hinman等, Cancer Research, 53：3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58：2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡは双方共、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。
【０１０９】
(x) 合成抗体ファージライブラリからの抗体の産生
ある好適な実施態様では、本発明は特有のファージディスプレイアプローチ法を使用して新規な抗体を産生し選択する方法を提供する。該アプローチ法は、単一フレームワーク鋳型に基づく合成抗体ファージライブラリの産生、可変ドメイン内の十分な多様性の設計、多様化した可変ドメインを有するポリペプチドのディスプレイ、抗原を標的とする高親和性を持つ候補抗体の選択、及び選択された抗体の単離を含む。
ファージディスプレイ法の詳細は例えば２００３年１２月１１日公開の国際公開第０３／１０２１５７号に見出すことができ、この開示内容の全体は出典明記によって特別に本明細書中に援用される。
【０１１０】
一態様では、本発明において使用される抗体ライブラリは抗体可変ドメインの少なくとも一のＣＤＲにおいて溶媒接近可能な及び／又は高度に多様性の位置を変異させることによってつくることができる。ＣＤＲの幾らか又は全てをここに提供した方法を使用して変異させることができる。ある実施態様では、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３中の位置に変異を施して単一のライブラリを形成するか、又はＣＤＲＬ３及びＣＤＲＨ３中の位置に変異を施して単一のライブラリを形成するか、又はＣＤＲＬ３及びＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３中の位置に変異を施して単一のライブラリを形成することにより、多様な抗体ライブラリをつくることが好ましい。
例えばＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３の溶媒接近可能な及び／又は高度に多様性の位置に変異を有する抗体可変ドメインのライブラリをつくることができる。ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３に変異を有する他のライブラリをつくることができる。これらのライブラリは所望の親和性の結合体をつくるために互いに関連させて使用することもできる。例えば、標的抗原への結合についての重鎖ライブラリの一又は複数回の選択後に、軽鎖ライブラリを結合体の親和性を増加させるために更なる選択回数に対して重鎖結合体の集団中に置き換えることができる。
【０１１１】
好ましくは、ライブラリは重鎖配列の可変領域のＣＤＲＨ３領域における変異アミノ酸での元のアミノ酸の置換によりつくられる。得られたライブラリは複数の抗体配列を含み得、ここで配列多様性は主として重鎖配列のＣＤＲＨ３領域にある。
一態様では、ライブラリはヒト化抗体４Ｄ５配列、又はヒト化抗体４Ｄ５配列のフレームワークアミノ酸の配列の態様でつくり出す。好ましくは、ライブラリはＤＶＫコドンセットによってコードされるアミノ酸で重鎖の少なくとも残基９５−１００ａを置換することによりつくられ、ここでＤＶＫコドンセットはこれらの位置の各一に対して変異アミノ酸セットをコードするために使用される。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの一例は配列(ＤＶＫ)７を含む。ある実施態様では、ライブラリはＤＶＫとＮＮＫの双方のコドンセットによってコードされるアミノ酸で残基９５−１００ａを置換することによりつくられる。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの例は配列(ＤＶＫ)６(ＮＮＫ)を含む。他の実施態様では、ライブラリはＤＶＫとＮＮＫの双方のコドンセットによってコードされるアミノ酸で少なくとも残基９５−１００ａを置換することによりつくられる。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの例は配列(ＤＶＫ)５(ＮＮＫ)を含む。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの他の例は配列(ＮＮＫ)６を含む。好適なオリゴヌクレオチド配列の他の例はここに記載された基準に従って当業者によって決定することができる。
【０１１２】
他の実施態様では、異なったＣＤＲＨ３設計を使用して高親和性結合体を単離し様々なエピトープに対して結合体を単離する。このライブラリにおいて産生されたＣＤＲＨ３の長さの範囲は１１から１３アミノ酸であるが、これとは異なった長さも産生することができる。Ｈ３多様性はＮＮＫ、ＤＶＫ及びＮＶＫコドンセットを使用し、並びにＮ及び／又はＣ末端での多様性をより制限して、拡張することができる。
多様性をＣＤＲＨ１及びＣＤＲＨ２においてまた生じさせることができる。ＣＤＲ-Ｈ１及びＨ２多様性の設計は、過去の設計よりも天然の多様性により密に適合する多様性に焦点を当てる変更をした上で、上述の天然抗体レパートリーを模倣するターゲティング方策に従う。
【０１１３】
ＣＤＲＨ３での多様性に対しては、複数のライブラリを、異なった長さのＨ３と別個に構築し、ついで、標的抗原に対する結合体を選択するために組み合わせる。複数のライブラリをプールし、過去に記載され以下に記載されたような固体支持体選別及び溶液選別方法を使用して選別することができる。複数の選別方策を用いることができる。例えば、一つの変異は固体に結合した標的での選別を含み、融合ポリペプチド上に存在しうるタグ(例えば抗ｇＤタグ)の選別が続く。別法として、ライブラリは固体表面に結合した標的で先ず選別することができ、溶出した結合体がついで標的抗原の濃度を減少させた溶液相結合を使用して選別される。異なった選別法を併用することにより高度に発現した配列のみの選択の最小化がもたらされ、多くの異なった高親和性クローンの選択をもたらす。
標的抗原に対する高親和性結合体はライブラリから単離することができる。Ｈ１／Ｈ２領域における多様性の制限は約１０４から１０５倍縮重を減少させ、より多くのＨ３多様性を許容することによりより多くの高親和性結合体をもたらす。ＣＤＲＨ３において異なったタイプの多様性を持つライブラリを利用することにより(例えばＤＶＫ又はＮＶＴを利用して)標的抗原の異なったエピトープに結合しうる結合体の単離をもたらす。
【０１１４】
上述のプールされたライブラリから単離された結合体において、軽鎖において制限された多様性を提供することによって親和性を更に改善することができることが発見された。軽鎖多様性はこの実施態様では以下のように生成される。ＣＤＲＬ１においては：アミノ酸位置２８がＲＤＴによってコードされる；アミノ酸位置２９がＲＫＴによってコードされる；アミノ酸位置３０がＲＶＷによってコードされる；アミノ酸位置３１がＡＮＷによってコードされる；アミノ酸位置３２がＴＨＴによってコードされる；場合によっては、アミノ酸位置３３がＣＴＧによってコードされる；ＣＤＲＬ２においては：アミノ酸位置５０がＫＢＧによってコードされる；アミノ酸位置５３がＡＶＣによってコードされる；場合によっては、アミノ酸位置５５がＧＭＡによってコードされる；ＣＤＲＬ３においては：アミノ酸位置９１がＴＭＴ又はＳＲＴ又はその両方によってコードされる；アミノ酸位置９２がＤＭＣによってコードされる；アミノ酸位置９３がＲＶＴによってコードされる；アミノ酸位置９４がＮＨＴによってコードされる；アミノ酸位置９６がＴＷＴ又はＹＫＧ又は両方によってコードされる。
【０１１５】
他の実施態様では、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３領域に多様性を持つライブラリ又はライブラリ群が作製される。この実施態様では、ＣＤＲＨ３における多様性は様々な長さのＨ３領域を用い、主にコドンセットＸＹＺ及びＮＮＫ又はＮＮＳを用いてつくり出される。ライブラリは個々のオリゴヌクレオチドを使用して形成しプールすることができ、又はオリゴヌクレオチドをプールしてライブラリのサブセットを形成することができる。この実施態様のライブラリは固体に結合した標的に対して選別することができる。多重選別から単離されたクローンをＥＬＩＳＡアッセイを使用して特異性及び親和性についてスクリーニングすることができる。特異性については、クローンを所望の標的抗原並びに他の非標的抗原に対してスクリーニングすることができる。標的ＮＲＰ１抗原に対する結合体をついで溶液結合競合ＥＬＩＳＡアッセイ又はスポット競合アッセイでの親和性についてスクリーニングすることができる。高親和性結合体は上に記載したようにして調製されたＸＹＺコドンセットを使用してライブラリから単離することができる。これらの結合体は抗体又は抗原結合断片として細胞培養物中に高収量で直ぐに産生されうる。
ある実施態様では、ＣＤＲＨ３領域の長さに大なる多様性を持つライブラリを作成することが望まれる場合がある。例えば、約７から１９アミノ酸の範囲のＣＤＲＨ３領域を持つライブラリを作成することが望ましい場合がある。
【０１１６】
これらの実施態様のライブラリから単離された高親和性結合体は細菌及び真核生物細胞培養で高収量で直ぐに産生される。ベクターはｇＤタグ、ウイルスコートタンパク質成分配列のような配列を直ぐに除去し、及び／又は定常領域配列に加えて完全長抗体又は抗原結合断片を高収量で生産するように設計することができる。
ＣＤＲＨ３での変異を持つライブラリを、例えばＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１及び／又はＣＤＲＨ２のような他のＣＤＲの変異型を含むライブラリと組み合わせることができる。よって、例えば、一実施態様では、ＣＤＲＨ３ライブラリは予め定まったコドンセットを使用して位置２８、２９、３０、３１、及び／又は３２に変異アミノ酸を持つヒト化４Ｄ５抗体配列の形態において作りだしたＣＤＲＬ３ライブラリと組み合わせられる。他の実施態様では、ＣＤＲＨ３に対する変異のライブラリは変異ＣＤＲＨ１及び／又はＣＤＲＨ２重鎖可変ドメインを含むライブラリと組み合わせることができる。一実施態様では、ＣＤＲＨ１ライブラリは位置２８、３０、３１、３２及び３３に変異アミノ酸を持つヒト化抗体４Ｄ５配列を用いてつくり出される。ＣＤＲＨ２ライブラリは予め定まったコドンセットを使用して位置５０、５２、５３、５４、５６及び５８に変異アミノ酸を持つヒト化抗体４Ｄ５の配列を用いてつくり出すことができる。
【０１１７】
(xi) 抗体変異体
ファージライブラリから生成される新規の抗体は、さらに修飾して、親抗体よりも改善した物理学的、化学的及び／又は生物学的特性を有する抗体変異体を生成することができる。使用するアッセイが生物学的活性アッセイである場合、抗体変異体は、選択したアッセイにおいて、該アッセイにおける親抗体の生物学的活性よりも少なくともおよそ１０倍良好な、好ましくは少なくともおよそ２０倍良好な、より好ましくは少なくともおよそ５０倍良好な、時には少なくともおよそ１００倍又は２００倍良好な生物学的活性を有する。例えば、抗Ｂｖ８抗体変異体は、親抗体の結合親和性より、少なくともおよそ１０倍強力な、好ましくは少なくともおよそ２０倍強力な、より好ましくは少なくともおよそ５０倍強力な、時には少なくともおよそ１００倍又は２００倍強力な、Ｂｖ８に対する結合親和性を有することが好ましい。
抗体変異体を産生するためには、親抗体の高頻度可変領域の一又は複数中に一又は複数のアミノ酸修飾(例えば置換)が導入される。別法として、又は加えて、フレームワーク領域残基の一又は複数の修飾(例えば置換)を親抗体に導入することができ、これらにより第二の哺乳動物種由来の抗原に対する抗体変異体の結合親和性が改善される。修飾するためのフレームワーク領域残基の例には、抗原に非共有的に結合するもの(Amit等, Science 233:747-753 (1986))；ＣＤＲと相互作用し／そのコンホメーションに影響を及ぼすもの(Chothia等 J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))；及び／又はＶＬ−ＶＨ界面に関与するもの(欧州特許第２３９４００号Ｂ１)が含まれる。ある実施態様では、そのようなフレームワーク領域残基の一又は複数の修飾により第二の哺乳動物種由来の抗原に対する抗原の結合親和性が向上する。例えば、約１から約５のフレームワーク残基を本発明のこの実施態様において修飾することができる。しばしば、これは、高頻度可変領域が何ら改変されていない場合でさえ、前臨床試験に使用するのに適した抗体変異体を生じるのに十分でありうる。しかしながら、通常は、抗体は更なる高頻度可変領域の改変を含む。
【０１１８】
改変される高頻度可変領域残基は、特に親抗体の出発結合親和性が、無作為に生産された抗体変異体を直ぐにスクリーニングすることができるものである場合には、無作為に変化させることができる。
そのような抗体変異体を産生するための一つの有用な方法は、「アラニンスキャンニング突然変異誘発法」(Cunningham及びWells Science 244:1081-1085 (1989))と呼ばれる。ここで、高頻度可変領域残基の一又は複数が、第二の哺乳動物種由来の抗原とのアミノ酸の相互作用に影響を及ぼすためにアラニン又はポリアラニンによって置換される。ついで置換に対する機能的感受性を示す高頻度可変領域残基は、置換部位において又はそれに対して更なる又は他の置換を導入することにより洗練される。従って、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、変異の種類自体は予め決める必要はない。このようにして産生されるａｌａ変異体をここに記載したその生物活性についてスクリーニングされる。
通常は、「好ましい置換」の項目名で以下に示されているもののような保存的置換で始める。そのような置換が生物活性(例えば結合親和性)の変化を生じるならば、次の表において「例示的置換」と命名され、又はアミノ酸クラスを参照して以下に更に記載されるより実質的な変化が導入され、産物がスクリーニングされる。
【０１１９】
好適な置換：
0005615709.tif 000002
【０１２０】
抗体の生物学的性質の更により実質的な修飾は、(ａ)置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋コンホメーション、(ｂ)標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は(ｃ)側鎖の嵩を維持して、それらの効果において有意に異なる置換基を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいてグループ分けすることができる：
(１)疎水性：ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile；
(２)中性の親水性：cys, ser, thr；
(３)酸性：asp, glu；
(４)塩基性：his, lys, arg；
(５)鎖配向に影響する残基：gly, pro；及び
(６)芳香族：trp, tyr, phe。
非保存的置換は、これらのクラスの一つのメンバーを他のクラスと交換することを必要とする。
他の実施態様では、修飾のために選択された部位がファージディスプレイを使用して亜親和性成熟される(上を参照)。
【０１２１】
アミノ酸配列変異体をコードしている核酸分子は当該分野で知られている様々な方法により調製される。これらの方法は、限定されるものではないが、親抗体の先に調製された変異体又は非変異体型のオリゴヌクレオチド媒介(又は部位特異的)突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発を含む。変異体を作製するための好ましい方法は部位特異的突然変異誘発(例えばKunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488 (1985)を参照)である。
ある実施態様では、抗体変異体は単一の高頻度可変領域残基が置換されたものである。他の実施態様では、親抗体の高頻度可変領域残基の２又はそれ以上が置換され、例えば約２から約１０の高頻度可変領域置換である。
【０１２２】
通常、改善された生物学的性質を有する抗体変異体は親抗体の重鎖又は軽鎖の何れかの可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を有する。この配列に対する同一性又は類似性は、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入し最大の配列同一性パーセントを達成した後に親抗体残基と同一(つまり同じ残基)又は類似(つまり共通の側鎖特性に基づく同じグループのアミノ酸残基、上を参照)である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセントとしてここで定義される。可変ドメインの外側の抗体配列中へのＮ末端、Ｃ末端、又は内部の伸展、欠失、又は挿入は何れも配列同一性又は類似性に影響を及ぼすものとはみなされない。
抗体変異体の産生後に、親抗体に対するその分子の生物活性が決定される。上に述べたように、これは抗体の結合親和性及び／又は他の生物活性を決定することを含みうる。本発明の好適な実施態様では、抗体変異体のパネルを調製し、抗原ないしその断片に対する結合親和性についてスクリーニングする。この最初のスクリーニングから選択される抗体変異体の一又は複数は場合によっては一又は複数の更なる生物活性アッセイにかけて、結合親和性が向上した抗体変異体が例えば前臨床研究に確かに有用であることが確認される。
【０１２３】
このように選択された抗体変異体は、しばしば抗体の意図される用途に応じて更なる修飾を受けることができる。そのような修飾は以下に詳細を記載したもののようなアミノ酸配列の更なる改変、異種ポリペプチドに対する融合及び／又は共有的修飾を含む。アミノ酸配列改変については例示的な修飾を上に詳細に説明した。例えば、抗体変異体の正しいコンホメーションを維持することに関与しない任意のシステイン残基はまた一般にはセリンで置換して、分子の酸化安定性を改善し異常な架橋を防止することができる。逆に、システイン結合を抗体に加えてその安定性をかいぜんすることができる(特に抗体がＦｖ断片のような抗体断片である場合)。他のタイプのアミノ酸変異体は改変されたグリコシル化パターンを有する。これは抗体に見出される一又は複数の糖鎖部分を欠失させ、及び／又は抗体中に存在していない一又は複数のグリコシル化部位を加えることによって達成することができる。抗体のグリコシル化は典型的にはＮ結合又はＯ結合の何れかである。Ｎ結合とはアスパラギン残基の側鎖への糖鎖部分の付着を意味する。トリペプチド配列アスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニン(ここで、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である)がアスパラギン側鎖への糖鎖部分の酵素的付着に対する認識配列である。よって、ポリペプチドにおいてこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると潜在的なグリコシル化部位をつくる。Ｏ結合グリコシル化はヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニン(但し５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンもまた使用できる)への糖Ｎ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つの付着を意味する。抗体へのグリコシル化部位の付加は、それが上述のトリペプチド配列(Ｎ結合グリコシル化部位に対する)の一又は複数を含むようにアミノ酸配列を改変することにより簡便に達成される。改変はまた元の抗体の配列への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加又は置換によって行うこともできる(Ｏ結合グリコシル化部位の場合)。
抗体がＦｃ領域を含有する場合、それに接着する炭水化物を変更してもよい。例えば、抗体のＦｃ領域に接着するフコースを欠損する成熟炭水化物構造の抗体は、米国公開特許第２００３／０１５７１０８号(Presta, L.)に記載される。米国公開特許第２００４／００９３６２１号(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.)も参照のこと。抗体のＦｃ領域に接着した炭水化物内のＮ-アセチルグルコサミン(ＧｌｃＮＡｃ)を二分する抗体は、国際公報第０３／０１１８７８号、Jean-Mairet 等、及び米国特許第６６０２６８４号、Umana 等に参照されている。抗体のＦｃ領域に接着するオリゴサッカライド内の少なくとも一のガラクトース残基を有する抗体は、国際公報第９７／３００８７号、Patel 等に報告される。また、抗体のＦｃ領域に接着する変更された炭水化物を有する抗体については、国際公報第９８／５８９６４号(Raju, S.)及び国際公報第９９／２２７６４号(Raju, S.)も参照のこと。また、修飾されたグリコシル化を有する抗原結合分子については、米国公開特許第２００５／０１２３５４６号(Umana 等)を参照。
【０１２４】
本明細書中の好適なグリコシル化変異体はＦｃ領域を含有し、Ｆｃ領域に接着される炭水化物構造はフコースを欠いている。このような変異形は改善されたＡＤＣＣ機能を有する。場合によって、Ｆｃ領域は、更にＡＤＣＣを改善する一つ以上のアミノ酸置換、例えばＦｃ領域の位置２９８、３３３及び／又は３３４の置換(Ｅｕ残基番号付け)を更に含む。「脱フコース化」又は「フコース欠失」抗体に関する文献の例には以下のものを含む：米国公開番号２００３／０１５７１０８；国際公報２０００／６１７３９；国際公報２００１／２９２４６；米国公開番号２００３／０１１５６１４；米国公開番号２００２／０１６４３２８；米国公開番号２００４／００９３６２１；米国公開番号２００４／０１３２１４０；米国公開番号２００４／０１１０７０４；米国公開番号２００４／０１１０２８２；米国公開番号２００４／０１０９８６５；国際公報２００３／０８５１１９；国際公報２００３／０８４５７０；国際公報２００５／０３５５８６；国際公報２００５／０３５７７８；；国際公報２００５／０５３７４２；Okazaki 等 J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)；及びYamane-Ohnuki 等 Biotech. Bioeng.87: 614 (2004)。脱フコース化抗体を産生する細胞株の例として、タンパク質フコース化欠失Ｌｅｃ１３ ＣＨＯ細胞 (Ripka 等 Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；米国公開番号２００３／０１５７１０８, Presta, L；及び国際公報２００４／０５６３１２, Adams 等, 特に実施例１１)、及びノックアウト細胞株、例としてα-１,６-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８,-ノックアウトＣＨＯ細胞 (Yamane-Ohnuki 等 Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004))などがある。
【０１２５】
(xii) 抗体の組換え製造
抗体の組換え製造のために、それをコードする核酸が単離され、さらなるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために、複製可能なベクター中に挿入される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは直ぐに単離され、従来の手法を用いて(例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドを使用することによって)配列決定される。多くのベクターが公的に入手可能である。ベクター成分には、一般に、これらに制限されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる：シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列である(例えば米国特許第５５３４６１５号に記載されており、出典明記によって特別に本明細書中に援用される)。
ここに記載のベクター中のＤＮＡをクローニングあるいは発現させるために適切な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びに桿菌、例えば枯草菌及びバシリ・リチェフォルミス(licheniformis)(例えば、１９８９年４月１２日に公開された ＤＤ２６６７１０に開示されたバシリ・リチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。一つの好適な大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４(ＡＴＣＣ３１４４６)であるが、他の大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ３１５３７)及び大腸菌Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ２７３２５)のような株も好適である。これらの例は限定するものではなく例示的なものである。
【０１２６】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア、又は一般的なパン酵母は下等真核生物宿主微生物のなかで最も一般的に用いられる。しかしながら、多数の他の属、種及び菌株も、一般的に入手可能でここで使用できる、例えば、シゾサッカロマイセスポンベ；クルイベロマイセス宿主、例えばＫ.ラクティス、Ｋ．フラギリス(ＡＴＣＣ１２４２４)、Ｋ.ブルガリカス(ＡＴＣＣ１６０４５)、Ｋ．ウィッケラミイ(ＡＴＣＣ２４１７８)、Ｋ.ワルチイ(ＡＴＣＣ５６５００)、Ｋ．ドロソフィラルム(ＡＴＣＣ３６９０６)、Ｋ．サーモトレランス、及びＫ．マルキシアナス；ヤローウィア(ＥＰ４０２２２６)；ピチアパストリス(ＥＰ１８３０７０)；カンジダ；トリコデルマ・リーシア(ＥＰ２４４２３４)；アカパンカビ；シュワニオマイセス、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス；及び糸状真菌、例えばパンカビ属、アオカビ属、トリポクラジウム、及びコウジカビ属宿主、例えば偽巣性コウジ菌及びクロカビが使用できる。
グリコシル化抗体の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウィルス株及び変異体及び対応する許容可能な昆虫宿主細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ(毛虫)、アエデス・アエジプティ(蚊)、アエデス・アルボピクトゥス(蚊)、ドゥロソフィラ・メラノガスター(ショウジョウバエ)、及びボンビクス・モリが同定されている。トランスフェクションのための種々のウィルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ-１変異体とボンビクス・モリ ＮＰＶのＢｍ-５株が公に利用でき、そのようなウィルスは本発明においてここに記載したウィルスとして使用でき、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞の形質転換に使用できる。綿花、コーン、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコのような植物細胞培養を宿主として利用することができる。
【０１２７】
しかしながら、脊椎動物細胞におけるものが最も興味深く、培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (ＣＯＳ-７, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１)；ヒト胚腎臓株(２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977))；ハムスター乳児腎細胞(ＢＨＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ, Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980))；マウスのセルトリ細胞(ＴＭ４, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980))；サルの腎細胞 (ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０)；アフリカミドリザルの腎細胞(ＶＥＲＯ-７６, ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７)；ヒト子宮頸癌細胞 (ＨＥＬＡ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ２)；イヌ腎細胞 (ＭＤＣＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４)；バッファローラット肝細胞 (ＢＲＬ３Ａ, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２)；ヒト肺細胞 (Ｗ１３８, ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５)；ヒト肝細胞 (Ｈｅｐ Ｇ２, ＨＢ８０６５)；マウス乳房腫瘍細胞 (ＭＭＴ０６０５６２, ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞(Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982))；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株(ＨｅｐＧ２)である。
宿主細胞は、抗体生産のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された常套的栄養培地で培養される。
【０１２８】
本発明の抗体を産生するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ｈａｍ)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地((ＭＥＭ),(シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((ＤＭＥＭ),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979)、Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980)、米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国再発行特許第３０９８５号に記載された何れの培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地には何れもホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【０１２９】
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内、細胞膜周辺腔に生成され、又は培地内に直接分泌される。抗体が細胞内に生成された場合、第１の工程として、宿主細胞か溶解された細胞の何れにしても、粒子状の細片が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。抗体が培地に分泌された場合は、そのような発現系からの上清を、一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＰｅｌｌｉｃｏｎの限外濾過装置を用いて濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めて、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製でき、アフィニティクロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる(Lindmark等, J. immunol. Meth. 62: 1-13 (1983))。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている(Guss等, EMBO J. 5: 16571575 (1986))。アフィニティーリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸＴＭ樹脂(J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂上でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭクロマトグラフィー(ポリアスパラギン酸カラム)、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿法も、回収される多価抗体に応じて利用可能である。
【０１３０】
Ｄ． Ｂｖ８アンタゴニストの使用  
本発明のＢｖ８アンタゴニストは、単独で又は、血管形成、特に炎症細胞依存性血管形成および／または腫瘍形成の阻害のための他の治療薬(一又は複数)と組み合わせて、使われてもよい。
本発明の治療方法のための一次標的は、ＶＥＧＦアンタゴニスト、特に抗ＶＥＧＦ抗体による治療に抵抗力があることを示すか又はそのことが既知である腫瘍である。
本発明の方法によって治療されるための疾患及び疾病の例は、腫瘍性疾患、例えば、「癌」及び「癌性」なる用語の下に本明細書中で記載されるものを含む。
本発明のアンタゴニストによる治療に敏感に反応する非腫瘍性状態は、限定するものではないが、例として、望ましくない又は異常な肥大、関節炎、関節リウマチ(ＲＡ)、乾癬、乾癬のプラーク、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化、アテローム硬化性プラーク、心筋梗塞からの浮腫、未熟児の網膜症を含む他の増殖性及び糖尿病性の網膜症、後水晶体繊維増殖症、血管形成緑内障、加齢性黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫、角膜血管形成、角膜移植片血管形成、角膜移植片拒絶、網膜／脈絡叢血管形成、アングルの血管形成(ルベオーシス)、眼性血管形成疾患、血管性再狭窄、動静脈奇形(ＡＶＭ)、髄膜腫、血管腫、血管線維腫、甲状腺の過形成(グレーブス病を含む)、角膜及び他の組織移植、慢性炎症、肺炎症、急性の肺損傷／ＡＲＤＳ、敗血症、原発性肺高血圧症、悪性の肺滲出、大脳浮腫(例えば、急性の脳卒中／非開放性頭部損傷／外傷と関係するもの)、滑液炎症、ＲＡのパンヌス形成、骨化性筋炎、肥大性骨形成、骨関節炎(ＯＡ)、抵抗性腹水、多嚢胞性卵巣疾患、子宮内膜症、第３区画の体液疾患(膵炎、区画症候群、熱傷、腸疾患)、子宮類線維腫、早産、ＩＢＤ(クローン病および潰瘍性大腸炎)のような慢性炎症、腎臓同種異系移植片拒絶反応、炎症性腸疾患、ネフローゼ症候群、望ましくない又は異常な組織塊成長(非癌)、肥満、脂肪組織質量成長、血友病関節、肥大性瘢痕、体毛成長の阻害、オスラー・ウェーバー症候群、化膿肉芽腫後水晶体線維増殖症、強皮症、トラコーマ、血管性接着、関節滑膜炎、皮膚炎、子癇前症、腹水、心嚢貯留液(心外膜炎と関係しているものなど)および胸水を含む。
【０１３１】
本発明は、本発明のＢｖ８アンタゴニストが他の療法と組み合わせて投与される併用療法を提供する。組合せ治療は具体的に、抗ＶＥＧＦ抗体などのＶＥＧＦアンタゴニストと組み合わせた、本明細書中のＢｖ８アンタゴニストの投与を含む。さらに、または、あるいは、本明細書中のＢｖ８アンタゴニストは、様々な腫瘍性又は非腫瘍性の状態、例えば炎症細胞依存性血管形成又は腫瘍形成を治療するために、一又は複数の更なる薬剤、例えば骨髄系細胞減少薬剤、抗癌剤ないしは治療法、抗血管形成剤、又は抗血管形成治療法と組み合わせて投与されてもよい。
一実施態様では、腫瘍性又は非腫瘍性の状態は、ＶＥＧＦアンタゴニスト治療に抵抗力がある、異常であるか望ましくない血管形成と関係している病理学的疾患に特徴を有する。本発明のアンタゴニストは、同じ組成物で又は異なる組成物として、目的のために有効である他の薬剤と連続して、又は組み合わせて投与されうる。あるいは、又は、さらに、本発明の複数のアンタゴニスト、薬剤および／またはアゴニストが投与されてもよい。
アンタゴニストおよび／または薬剤の投与は、例えば単一の組成物として、または、同じか異なる投与ルートを使用した２以上の異なる組成物として、同時に行われてもよい。あるいは、又は、さらに、投与はいずれの順序で連続して行われてよい。ある実施態様では、２以上の組成物の投与の間に分から日、週、月の間隔が存在してもよい。例えば、ＶＥＧＦアンタゴニストが第一に投与され、その後、本発明の異なるアンタゴニスト又は薬剤、例えば骨髄系細胞減少薬剤(ＶＥＧＦアンタゴニスト以外のもの)が投与されてよい。しかしながら、本発明の異なるアンタゴニスト又は薬剤の同時投与又は投与が第一に考慮される。
【０１３２】
投与される治療薬の有効量は医師又は獣医の裁量である。治療される症状を最大限管理するために用量投与及び調整がなされる。用量は、さらに、使用される治療薬の種類及び治療される特定の患者などの因子に依存するであろう。ＶＥＧＦアンタゴニストの好適な用量は現在用いられているものであり、ＶＥＧＦアンタゴニスト及び本発明の異なるアンタゴニストの組合せ作用(相乗作用)のために低くてもよい。ある実施態様では、阻害薬の組合せは単一の阻害薬の有効性を増強する。「増強」なる用語は、その一般的又は認可された用量での治療薬の有効性の改善を指す。本明細書中の「製薬的組成物」と題した項目も参照のこと。
癌との関連の抗血管新生療法は、腫瘍増殖を支える栄養分の供給に必要な腫瘍血管の発達を阻害することを目的とした癌治療方略である。血管新生が原発性腫瘍増殖と転移の療法に伴うので、本発明によって提供される抗血管新生療法は、原発部位での腫瘍の新生物性増殖の阻害と二次部位での腫瘍の転移の予防が可能であり、ゆえに他の療法によって腫瘍の攻撃がなされる。本発明の一実施態様では、抗癌剤又は膠癌療法は抗血管新生剤である。他の実施態様では、抗癌剤は化学療法剤である。
【０１３３】
多くの抗血管新生剤が同定されており、当分野で公知であり、本明細書中に挙げるもの、例えば定義の項目に挙げるもの、例えばCarmeliet and Jain, Nature 407:249-257 (2000)；Ferrara等, Nature Reviews:Drug Discovery, 3:391-400 (2004)；及びSato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003)に挙げるものなどがある。また、米国特許公開第２００３００５５００６号を参照。ある実施態様では、本発明のアンタゴニストは、抗ＶＥＧＦ中和抗体(又は断片)及び／又は他のＶＥＧＦアンタゴニストないしはＶＥＧＦレセプターアンタゴニスト、例として、限定するものではないが、例えば、可溶性ＶＥＧＦレセプター(例えば、ＶＥＧＦＲ-１、ＶＥＧＦＲ-２、ＶＥＧＦＲ-３、ニューロピリン(例えば、ＮＲＰ１、ＮＲＰ２))断片、ＶＥＧＦないしはＶＥＧＦＲを遮断することができるアプタマー、中和抗ＶＥＧＦＲ抗体、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ(ＲＴＫ)の低分子量インヒビター、ＶＥＧＦのアンチセンス方略、ＶＥＧＦないしはＶＥＧＦレセプターに対するリボザイム、ＶＥＧＦのアンタゴニスト変異体、及びこれらのいずれかの組み合わせと組み合わせて用いられる。あるいは又はさらに、２つ以上の血管新生インヒビターは、場合によってＶＥＧＦアンタゴニストと本発明の他の薬剤に加えて患者に同時に投与されてもよい。ある実施態様では、一又は複数の更なる治療薬、例えば抗癌剤は、本発明の薬剤、ＶＥＧＦアンタゴニスト及び／又は抗血管新生剤と組み合わせて投与されてもよい。
本発明のある態様では、本発明のＢｖ８アンタゴニストによる併用腫瘍療法に有用な他の治療剤には、他の癌療法(例えば、外科的治療、放射線処置(例えば、放射活性物質の照射又は投与を伴う)、化学療法、本明細書中に挙げる抗癌剤及び当分野で公知の抗癌剤、又はこれらの組み合わせ)が含まれる。あるいは又はさらに、本明細書中に開示した同じ又は２以上の異なる抗原を結合する２以上の抗体が患者に同時に投与されてもよい。また、患者に一又は複数のサイトカインを投与することが有益であることもある。
【０１３４】
ある態様では、本発明は、有効量のＶＥＧＦのアンタゴニスト及び本発明のアンタゴニストと一又は複数の化学療法剤を、癌に罹りやすい患者又は癌と診断された患者に投与することによって、耐性腫瘍増殖又は癌細胞の増殖を遮断する又は低減する方法を提供する。様々な化学療法剤が本発明の併用治療方法で用いられてもよい。考慮する化学療法剤の例示的及び非限定的リストを本明細書中の「定義」の項目に示す。
当業者によって理解されるように、化学療法剤の適切な用量は、一般的に、化学療法剤が単独ないしは他の化学療法剤と組み合わせて投与される臨床治療に既に用いられる用量の程度であろう。用量の変更はおそらく治療する症状に応じて行うであろう。治療を行う医師は、個々の被検体ごとに適当な用量を決定することが可能であろう。
【０１３５】
また、本発明は、再発性腫瘍増殖又は再発性癌細胞増殖を阻害するか又は予防するための方法及び組成物を提供する。再発性腫瘍増殖又は再発性癌細胞増殖は、一又は複数の現在利用可能な治療法(例えば、癌治療、例として化学療法、放射線療法、外科治療、ホルモン療法及び／又は生物学的療法／免疫療法、抗ＶＥＧＦ抗体療法、特に特定の癌のための標準的な治療投薬計画)を施されている患者ないしはこれらによって治療された患者が臨床的に治療に不十分であるか、又は患者がこのような治療からもはやいかなる有用な効果を得ておらず更なる有効な治療を求める場合の症状を表すために用いられる。本明細書中で用いるように、この表現も「非応答性／再発性の」患者の症状を指すものであり、例えば、副作用に苦しむ治療に応答する患者、耐性を生じる患者、治療に応答しない患者、治療に満足に応答しない患者などを表す。様々な実施態様では、癌は、癌細胞の数が有意に低減しなかった、又は増加した、又は腫瘍の大きさが有意に減少しなかった、又は大きくなった、又は癌細胞のサイズないしは数に何らかの減少が生じなかった、再発性腫瘍増殖又は再発性癌細胞増殖である。癌細胞が再発性腫瘍増殖であるか再発性癌細胞増殖であるかの決定は、文脈上で「再発」又は「難治性」又は「非応答性」の当分野で容認される意味を用いて、癌細胞に対する治療の有効性をアッセイするための当分野で公知の任意の方法によってインビトロないしはインビボでなされうる。再発性腫瘍増殖のある例は抗ＶＥＧＦ治療に耐性のある腫瘍である。
【０１３６】
本発明は、一又は複数の本発明のアンタゴニストを投与して、被検体の再発性腫瘍増殖又は再発性癌細胞増殖を遮断又は低減することによって、被検体の再発性腫瘍増殖又は再発性癌細胞増殖を遮断又は低減する方法を提供する。ある実施態様では、アンタゴニストは癌治療剤に続いて投与されてもよい。ある実施態様では、本発明のアンタゴニストは癌療法、例えば化学療法と同時に投与される。あるいは又はさらに、アンタゴニスト療法は他の癌療法と交互に行い、いずれの順序でも実施可能である。また、本発明は、癌を有する傾向にある患者の癌の発症や再発を予防するために一又は複数の阻害性抗体を投与するための方法も包含する。通常、被検体は、癌療法を施されたか同時に施されている。一実施態様では、癌療法は、抗血管新生剤、例えばＶＥＧＦアンタゴニストによる治療である。抗血管新生剤は当分野で公知のものや本明細書中の定義の項目に見られるものなどがある。一実施態様では、抗血管新生剤は、抗ＶＥＧＦ中和抗体ないしは断片(例えば、ヒト化Ａ４.６.１、アバスチン(登録商標)(Genentech, South San Francisco, CA)、Ｙ０３１７、Ｍ４、Ｇ６、Ｂ２０、２Ｃ３など)である。例として、米国特許第６５８２９５９号、同第６８８４８７９号、同第６７０３０２０号、国際公開第９８／４５３３２号、同第９６／３００４６号、同第９４／１０２０２号、欧州特許第０６６６８６８号Ｂ１、米国公開特許第２００３０２０６８９９号、同第２００３０１９０３１７号、同第２００３０２０３４０９号、同第２００５０１１２１２６号、Popkov等, Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004)、及び国際公開第２００５０１２３５９号を参照。更なる薬剤は、再発性腫瘍増殖又は再発性癌細胞増殖を遮断又は低減するために、ＶＥＧＦアンタゴニスト及び本発明のアンタゴニストと組み合わせて投与することができる。例として本明細書中の「併用療法」と題する項目を参照のこと。
【０１３７】
一実施態様では、本発明のＢｖ８アンタゴニストは、一又は複数の骨髄系細胞減少薬剤、例えば限定するものではないが、Ｇｒ１、好中球エラスターゼ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＵＲＣＧＰ又はＵＲＲＴＰの発現を低減する治療法と組み合わせて投与されうる。本発明のＢｖ８アンタゴニストと組み合わせて使用する骨髄系細胞減少薬剤は、具体的に、Ｇｒ１アンタゴニスト、Ｃｄ１１Ｂアンタゴニスト、ＣＤ１８アンタゴニスト、エラスターゼインヒビター、ＭＣＰ−１アンタゴニスト、ＭＩＰ−１αアンタゴニスト、クロドロネートを単独又はいずれかの組合せで含む。
さらに、本発明のＢｖ８アンタゴニストは、ホルモン剤、放射線剤及び化学療法剤と組み合わせて投与され、これによって癌細胞を一又は複数の薬剤に対して再感作してもよい。この一又は複数の薬剤は転移の阻害を含め、癌の治療又は管理をするために次いで投与されうる(又は投与され続ける)。
ＶＥＧＦアンタゴニストによる治療に対する腫瘍感度は、ＵＲＣＧＰ、ＤＲＣＧＰ、ＵＲＲＴＰ又はＤＲＲＴＰをコードする核酸に相同な一又は複数の核酸配列を発現することが可能な細胞を含む被検体から一又は複数の試験細胞集団を提供することによって評価されてもよい。配列の発現は参照細胞集団と比較される。参照細胞集団中の細胞のＶＥＧＦアンタゴニスト感受性状態が知られている限り、いずれの参照細胞集団が使われてもよい。比較は、同時又は時間的に異なる時に測定される試験及び参照試料について行われてよい。後者の例は収集された発現情報、例えば配列データベースの使用であり、この配列データベースは感受性の状態が既知である細胞における既知の配列の発現レベルについての情報を集めたものである。本発明の特定の実施態様では、参照細胞集団は、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋骨髄系細胞について濃縮されている。本発明の特定の実施態様では、参照細胞集団は、腫瘍細胞について濃縮されている。
【０１３８】
また、ＶＥＧＦアンタゴニストによる治療に抵抗力がある腫瘍は、２００７年３月２８日に出願の同時係属出願番号１１／６９２６８２号において提供される診断用マーカー群を使用して同定されてもよい。例えば、一マーカー群は、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、２０以上、又はすべての群の分子を含んでもよい。分子は、タンパク質又は発現および／または活性の変化を有するタンパク質をコードする核酸であって、Ｎｏｔｃｈ２、ＤＭＤ８、ＭＣＰ-１、ＩＴＧＢ７、Ｇ-ＣＳＦ、ＩＬ-８Ｒ、ＭＩＰ２、ＭＳＣＡ、ＧＭ-ＣＳＦ、ＩＬ-１Ｒ、Ｍｅｇ-ＳＦ、ＨＳＰ１Ａ、ＩＬ-１Ｒ、Ｇ-ＣＳＦＲ、ＩＬ１０-Ｒ１、Ｅｒｂ-２.１、カベオリン３、Ｓｅｍｃａｐ３、ＩＮＴＧ４、ＴＨＢＳＰ-４、ＥｒｂＢ３、ＪＡＭ、Ｅｎｇ、ＪＡＭ、Ｅｎｇ、ＪＡＭ-２、Ｐｅｃａｍ１、Ｔｌｒ３、好中球エラスターゼ、ＣＤ１４、ｅｘｐｉ、Ｉｌ-１３Ｒ、ＬＤＬＲ、ＴＬＲ-１、ＲＬＦ、Ｅｎｄｏ-Ｌｉｐ、ＳＯＣＳ１３、ＦＧＦ１３、ＩＬ-４Ｒ、ＴＨＢＳ１、Ｃｒｅａ７、アクアポリン-１、ＳＣＦ３８、ＡＰＯＥ、ＦＡＢＰ、ＩＬ-１１Ｒ、ＩＬ-１ＲＩＩ、ＩＦＮ ＴＭ１、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＷＮＴ５Ａ、分泌型キャリア膜１、ＨＳＰ８６、ＥＧＦＲ、ＥｐｈＲＢ２、ＧＰＣＲ２５、ＨＧＦ、アンギオポイエチン様-６、Ｅｐｈ-ＲＡ７、セマフォリンＶｌｂ、ニューロトロフィン５、Ｃｌａｕｄｉｎ-１８、ＭＤＣ１５、ＥＣＭ、ＡＤＡＭＴＳ７Ｂ、ＮＣＡＭ-１４０、フィブロネクチンタイプＩＩＩ、ＷＩＰ、ＣＤ７４、ＩＣＡＭ-２、Ｊａｇｇｅｄ１、ｌｔｇａ４、ＩＴＧＢ７、ＴＧＦ-ＢＩＩ-Ｒ、ＴＧＦｂ ＩＥＰ、Ｓｍａｄ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＣＤ８３、Ｄｅｃｔｉｎ-１、ＣＤ４８、Ｅ-セレクチン、ＩＬ-１５、サイトカインシグナル伝達４のサプレッサー、Ｃｙｔｏｒ４、ＣＸ３ＣＲ１、ＩＧＦ２、ＨＳＰ９Ａ、ＦＧＦ１８、ＥＬＭ１、Ｌｅｄｇｆａ、スカベンジャーレセプタータイプＡ、マクロファージＣ-タイプレクチン、Ｐｉｇｒ３、マクロファージＳＲＴ-１、Ｇプロテイン-結合レセプター、ＳｃｙＡ７、ＩＬ-１Ｒ２、ＩＬ-１誘導タンパク質、ＩＬ-１β、ＩＬＩＸ  Ｐｒｅｃｕｒｏｒ、ＴＧＦ-Ｂ、ＦＩＺＺ１、Ｗｆｓ１、ＴＰ １４Ａ、ＥＭＡＰ、ＳＵＬＦ-２、細胞外マトリックスｓ２、ＣＴＦＧ、ＴＦＰＩ、ＸＣＰ２、Ｒａｍｐ２、ＲＯＲ-α、エフリンＢ１、ＳＰＡＲＣ-様１及びセマフォリンＡから選択される。本発明の一実施態様では、タンパク質を検出する抗体が提供される。一実施態様では、分子は、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞から得られ、例えば、ＩＬ−１３Ｒ、ＴＬＲ-１、Ｅｎｄｏ−Ｌｉｐ、ＦＧＦ１３、ＩＬ−４Ｒ、ＴＨＢＳ１およびＣｒｅａ７を含む。他の実施態様では、分子は、耐性腫瘍から得られ、例えば、ＭＳＣＡ、ＭＩＰ２、ＩＬ−８Ｒ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ１０-Ｒ２、ＴＨＢＳＰ-４およびＪＡＭ−２を含む。
【０１３９】
Ｅ．薬学的組成物及び投与
単独又は他の治療薬と組み合わせた本発明のＢｖ８アンタゴニスト、例えば抗Ｂｖ８抗体は、ヒト患者に、周知の方法、例えば、ボーラスとして又は所定時間に渡る連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹膜内、脳脊髄内、皮下、関節間、滑膜内、鞘内、経口、局所、又は吸入経路、及び／又は皮下投与などにより投与される。
ある実施態様では、本発明の治療はＢｖ８アンタゴニストとＶＥＧＦアンタゴニスト及び／又は一又は複数の骨髄系細胞減少剤ないし化学療法剤との併用投与を伴う。一実施態様では、付加的な抗癌剤、例えば、一又は複数の異なる抗血管新生剤、一又は複数の化学療法剤などが存在する。また、本発明は、複数のインヒビター、例えば同じ抗原に対する複数の抗体又は本発明の異なるタンパク質に対する複数の抗体の投与を考慮する。一実施態様では、異なる化学療法剤の混合物が、本明細書中のＢｖ８アンタゴニストと投与される。併用投与は、別々の製剤又は単一の製薬的製剤による同時投与、及び／又はいずれかの順序での連続投与が含まれる。例えば、ＶＥＧＦアンタゴニストは、Ｂｖ８アンタゴニストの投与の前、後、交互に行われるか、又はこれらと同時になされうる。一実施態様では、両方(又はすべて)の活性剤が同時にその生物学的活性を及ぼす一定時間がある。
疾患の予防又は治療のために、本発明の薬剤の好適な用量は、上記に定義した治療する疾患のタイプ、疾患の重症度及び経過、抗体を予防目的で投与するか治療目的で投与するか、以前の治療法、患者の病歴及びインヒビターへの応答性、及び担当医師の判断に依存するであろう。インヒビターは一時的又は一連の治療にわたって好適に患者に投与される。併用療法投与計画では、本発明の組成物は治療的有効量又は治療的相乗作用量で投与される。本明細書中で用いられるように、治療的有効量は、本発明の組成物の投与及び／又はＶＥＧＦアンタゴニスト及び一又は複数の他の治療剤の同時投与により標的とする疾患又は症状が減少又は阻害される量である。薬剤の組み合わせの投与効果は付加的であってもよい。一実施態様では、投与の結果は相乗効果である。治療的相乗作用量は、特定の疾患に関係する状態又は症状を相乗作用的に又は有意に減少ないし除去するために必要な、ＶＥＧＦアンタゴニストと一又は複数の他の治療剤、例えばＢｖ８アンタゴニスト及び場合によって骨髄系細胞減少剤、化学療法剤及び／又は抗癌剤の量である。
【０１４０】
疾患のタイプ及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ(例えば０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ)のＢｖ８アンタゴニスト、ＶＥＧＦアンタゴニスト、骨髄系細胞減少剤、化学療法剤、又は抗癌剤が、例えば一以上の分割投与又は連続注入による患者投与の初期候補用量である。ある典型的な１日量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であろう。症状に応じて、数日間以上にわたる繰り返し投与は、所望の疾患症状の抑制が得られるまで持続する。しかしながら他の用量処方が有用であるかもしれない。典型的には、臨床医は、必要とされる生物学的な効果が生じる用量(一又は複数)が達成されるまで本発明の分子(一又は複数)を投与するであろう。本発明の治療の経過は従来の技術及びアッセイにより用意にモニターされる。
例えば、血管新生インヒビター、例えばアバスチン(登録商標)(Genentech)などの抗ＶＥＧＦ抗体の調製及び投与計画は製造者の指示に従って用いられても、当業者によって経験的に決定されてもよい。他の例では、このような化学療法剤の調製及び投与計画は製造者の指示に従って用いられても、当業者によって経験的に決定されてもよい。化学療法の調製及び投与計画はChemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)にも記載される。
【０１４１】
本発明の治療の有効性は、新生物ないし非新生物疾患を治療する際に共通に用いられる様々なエンドポイントによって決定することができる。例えば、癌治療は、限定するものではないが、腫瘍再発、腫瘍重量ないしサイズの収縮、進行時間、生存期間、進行がない生存、全体の応答速度、応答の継続期間、生活の質、タンパク質の発現及び／又は活性などで評価されてもよい。本明細書に記載の抗血管新生剤は腫瘍の血管をターゲットとするのであって、新生物細胞自体をターゲットとする必要はないので、抗癌剤の特定のクラスを示し、それゆえに薬剤に対する臨床応答の特定の測定と定義を必要としうる。例えば、二次元分析において５０％より大きい腫瘍の収縮は応答を示す標準のカットオフである。しかし、本発明のインヒビターは原発性腫瘍を収縮することなく転移の拡がりを阻害するか、又は単に腫瘍抑制(tumouristatic)効果を及ぼしうる。したがって、例えば血管新生の血漿又は尿路マーカーの測定及び放射線画像法による応答の測定などの、治療の有効性を決定する手法が用いられうる。
【０１４２】
本発明の他の実施態様では、上記の疾病の治療又は診断に有用な材料を具備する製造品が提供される。該製造品は容器、ラベル及びパッケージ挿入物を具備する。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等々が含まれる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックから形成されうる。一実施態様では、容器は、症状を治療するのに有効な組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有しうる(例えば、容器は皮下注射針が貫通可能なストッパーを有するバイアル又は静脈内投与溶液バッグでありうる)。組成物中の少なくとも一つの活性剤はＶＥＧＦモジュレーターであり、少なくとも２つ目の活性剤は骨髄性細胞減少剤及び／又は化学療法剤である。容器に添付又は付属するラベルは、組成物が選択した症状の治療に使用されることを示す。さらに製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えばリン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第二の容器を更に具備してもよい。
【０１４３】
本発明の更なる詳細は以下の非限定的な実施例によって例示される。
【実施例】
【０１４４】
実施例１
材料と方法
ＴａｑｍａｎＴＭによる遺伝子発現解析
ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（登録商標）（Qiagen）を使用して組織又は細胞由来のＲＮＡを調製した。一反応当たり５０ｎｇの全ＲＮＡをリアルタイムＰＣＲ（ＴａｑｍａｎＴＭ）分析に使用した。マウス／ヒトＢｖ８及びＥＧ−ＶＥＧＦ／Ｂｖ８レセプター１（ＰＫＲ−１／ＥＧ−ＶＥＧＦＲ１、Ｒ−１）に対して、精巣ＲＮＡ（BD Biosciences）をコントロールとした。マウス／ヒトＥＧ−ＶＥＧＦ／Ｂｖ８レセプター２（ＰＫＲ−２／ＥＧ−ＶＥＧＦＲ２、Ｒ２）に対して、視床下部又は全脳（BD Biosciences）をコントロール組織とした。反応は、７５００リアル（Perkin Elmer）タイムＰＣＲシステム（Applied Biosystems）の９６００Ｅｍｕｌａｔｉｏｎモードで操作し、標準曲線を用いた絶対的定量化をＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＳＤＳ）ソフトウェアと共に使用した。各遺伝子の発現レベルを、同じ試料中のハウスキーピング遺伝子ＲＰＬ１９に対して更に定量した。腫瘍関連内皮細胞中でのＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＥＧ−ＶＥＧＦ／Ｂｖ８ Ｒ１及びＥＧ−ＶＥＧＦ／Ｂｖ８ Ｒ２の発現を確認するために、Ｔｉｔａｎ Ｏｎｅ ＴｕｂｅＴＭＲＴ−ＰＣＲシステム（Roche）を使用して標準的なＲＴ−ＰＣＲを実施し、最終産物の正しいサイズを２％アガロースゲル（Invitrogen）でチェックした。ＴａｑｍａｎＴＭプライマーの配列は次の通りである：
マウスＢｖ８順方向：ＧＣＡ  ＴＧＡ  ＣＡＧ  ＧＡＧ  ＴＣＡ  ＴＣＡ  ＴＴＴ  Ｔ（配列番号７）、逆方向：ＡＡＡ  ＴＧＧ  ＣＡＧ  ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＡＧＧ  ＡＡＡ（配列番号８）、プローブ：ＡＡＡ  ＣＴＴ  ＴＡＴ  ＴＴＧ  ＴＡＡ  ＣＣＣ  ＡＡＡ  ＧＧＴ  ＣＴＡ  ＡＴＧ  ＴＡＡ  ＡＴＧ  ＧＡ（配列番号９）；
ヒトＢｖ８順方向：ＡＴＧ  ＧＣＡ  ＣＧＧ  ＡＡＧ  ＣＴＡ  ＧＧＡ（配列番号１０）、逆方向：ＧＣＡ  ＧＡＧ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＴＣＣ  ＴＣＴ  ＴＧＡ（配列番号１１）、プローブ：ＴＧＣ  ＴＧＣ  ＴＧＧ  ＡＣＣ  ＣＴＴ  ＣＣＴ  ＡＡＡ  ＣＣＴ（配列番号１２）；
マウスＢｖ８ Ｒ１順方向：ＣＡＧ  ＣＧＣ  ＡＣＡ  ＴＧＡ  ＡＧＡ  ＣＴＴ  Ｇ（配列番号１３）、逆方向：ＧＴＣ  ＡＴＣ  ＴＴＣ  ＧＧＴ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＡＧＴ（配列番号１４）、プローブ：ＴＣＣ  ＡＧＧ  ＣＡＧ  ＣＡＣ  ＣＣＣ  ＴＧＡ  ＴＧ（配列番号１５）；
マウスＢｖ８ Ｒ２順方向：ＧＡＡ  ＣＴＣ  ＣＡＣ  ＧＴＧ  ＡＧＣ  ＧＣＡ（配列番号１６）、逆方向：ＧＧＧ  ＴＣＣ  ＣＡＴ  ＧＴＴ  ＧＡＴ  ＧＡＴ  ＧＣ（配列番号１７）、プローブ：ＣＴＣ  ＣＣＴ  ＧＡＴ  ＡＣＡ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＣＣＣ  ＡＣＣ  ＴＧ（配列番号１８）；
ヒトＢｖ８ Ｒ１順方向：ＣＴＧ  ＧＡＡ  ＧＧＣ  ＴＴＣ  ＴＴＡ  ＣＡＡ  ＴＧＧ（配列番号１９）、逆方向：ＧＧＣ  ＡＴＣ  ＣＣＡ  ＡＴＴ  ＧＴＣ  ＴＴＧ  Ａ（配列番号２０）、プローブ：ＴＣＣ  ＡＧＧ  ＴＣＴ  ＧＣＡ  ＣＴＧ  ＧＡＣ  ＴＴＡ  ＣＣＧ（配列番号２１）；
ヒトＢｖ８ Ｒ２順方向：ＴＣＡ  ＣＣＡ  ＴＣＧ  ＴＴＣ  ＧＴＧ  ＡＣＴ  ＴＣ（配列番号２２）、逆方向：ＡＧＡ  ＡＧＧ  ＣＡＧ  ＴＧＡ  ＧＧＴ  ＡＧＴ  ＧＣＴ  Ｔ（配列番号２３）、プローブ：ＴＣＣ  ＴＴＣ  ＡＣＧ  ＡＡＣ  ＡＣＡ  ＧＴＧ  ＧＧＧ  ＡＡ（配列番号２４）；
マウスＲＰＬ１９順方向：ＡＧＧ  ＴＣＡ  ＡＡＧ  ＧＧＡ  ＡＴＧ  ＴＧＴ  ＴＣＡ  ＡＡ（配列番号２５）、逆方向：ＣＣＴ  ＴＧＴ  ＣＴＧ  ＣＣＴ  ＴＣＡ  ＧＣＴ  ＴＧＴ（配列番号２６）、プローブ：ＡＣＡ  ＡＧＣ  ＧＣＡ  ＴＣＣ  ＴＣＡ  ＴＧＧ  ＡＧＣ  ＡＣＡ  ＴＣ（配列番号２７）；
ヒトＲＰＬ１９順方向：ＣＧＣ  ＡＡＧ  ＣＧＣ  ＣＧＴ  ＧＡＡ（配列番号２８）、逆方向：ＧＧＴ  ＣＴＣ  ＴＴＣ  ＣＴＣ  ＣＴＴ  ＧＧＡ  ＴＡＡ  ＡＧＴ  Ｃ（配列番号２９）、プローブ：ＣＣＡ  ＧＧＣ  ＣＡＡ  ＧＡＡ  ＧＧＡ  ＧＧＡ  ＧＡＴ  ＣＡＴ  ＣＡ（配列番号３０）；  
【０１４５】
フローサイトメトリー
ＢＭ単核細胞（ＢＭＭＮＣｓ）、ＰＢ及び腫瘍細胞を、数種の腫瘍型を移植したマウスから収集した。赤血球細胞を、Ａｃｋ（Cambrax, MA）溶解バッファーを使用して溶解した後、ＡＰＣに結合させたラット抗マウスＣＤ１１ｂ（Myletnyi Biotech, CA）及びＰＥに結合させたラット抗マウスＧｒ１（BD Biosciences, CA）を用いて染色した。死滅細胞を排除するために、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ機でのデータ獲得前に７ＡＡＤ（アミノアクチノマイシンＤ； BD Biosciences CA）を全試料に加えた。
【０１４６】
遊走アッセイ
ＢＭＭＮＣを未処置のベージュヌードマウスから単離し、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋集団を、製造者によって提供されたプロトコルに従ってＣＤ１１ｂマイクロビーズ（Miltenyi Biotech、CA）を使用して選別した。選別した細胞のアリコートを抗ＣＤ１１ｂＡＰＣ及び抗Ｇｒ１−ＰＥで染色してＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の純度（１００％）を確保した。遊走アッセイでは、２．０×１０５細胞をトランスウェル（Corning Incorporated, NY）のトップチャンバーに蒔いた。ボトムチャンバーは６００ｍＬの培地（別個のウェルにヒトＢｖ８、コントロール抗体、及びマウス組換えＶＥＧＦを含むＢＩＴ（Stem Cell Technologies, BC, Canada）が補填されたＩＭＤＭ（Gibco BRL, CA））を含んでいた。細胞を３７℃、５％ＣＯ２中で９時間インキュベートし、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の遊走を、ボトムチャンバー中の細胞を計数することによって評価した。
【０１４７】
培養したＢＭＭＮ細胞中でのＢｖ８遺伝子発現の調節
組換えマウスＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−２、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＤＦ−１及びＴＮＦαをＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Minneapolis, MN）から購入した。組換えマウスＫＣ、ＩＦＮｇ、Ｂｖ８（プロキネチシン−２）、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＴＧＦ−ｂはＰｅｐｒｏＴｅｃｈ Ｉｎｃ．（Rocky Hill, New Jersey）から購入した。全てのサイトカインは、５０ｎｇ／ｍｌで試験したＶＥＧＦ及びＢｖ８を除いて、１０ｎｇ／ｍｌで使用した。１：３希釈の条件培地を使用した（最終ＦＢＳ濃度は０．１７％であった）。データは全細胞数に対して正規化した。１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭを用いてマウス脚骨からＢＭ細胞をフラッシングした。細胞を１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、０．２％のＢＳＡを含むＨＢＳＳ培地（低エンドトキシン、Serologicals Corp.Norcross, GA）に再懸濁させた。二百万の細胞を、５％のＣＯ２インキュベーター中において３７℃で４時間、様々なサイトカインと共に２４ウェルプレートでインキュベートした。ついで、細胞をエッペンドルフ管に移し、遠心分離し、ＲＮＡ溶解バッファー（Qiagen, Valencia, CA）によって溶解させた。Ｂｖ８の発現を内部コントロール遺伝子としてＲＰＬ１９（リボソームタンパク質Ｌ１９）を用いてＴａｑｍａｎＴＭによって評価した。ある場合には、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋又はＣＤ１１ｂ−Ｇｒ１−ＢＭ細胞を、ＦＡＣＳ分取法を使用して得た。
腫瘍環境によって誘導されるＢｖ８遺伝子発現に対する抗Ｇ−ＣＳＦ抗体の効果を試験するために、Ｂａｌｂｃ／ヌードマウスから単離したＢＭＭＮＣを、２４−３６時間の間マウスに移植されているＨＭ７腫瘍の可溶化物か又はコントロールバッファーで４時間処理した。腫瘍可溶化物を、ＢＭＭＮＣに加える前に、様々な濃度のヤギ抗Ｇ−ＣＳＦ中和ポリクローナルＩｇＧ（ＡＦ−４１４−ＮＡ、R&D Systems）又はコントロールヤギＩｇＧ（R&D Systems）と共に４５分間プレインキュベートした。マウス及びヒトＧ−ＣＳＦをブロックする抗Ｇ−ＣＳＦ ＩｇＧの能力を実証した。ついで、ＢＭＭＮＣ中のＢｖ８の発現を、ＴａｑｍａｎＴＭ分析を使用して評価した。９匹の動物を研究に使用し、データを３回の独立した実験から分析した。
【０１４８】
腫瘍細胞によって馴化された培地の収集
Ａ６７３、ＨＭ７、ＨＰＡＣ及びＣａｌｕ６細胞を、それらが〜９０％の培養密度に達するまで、増殖培地で培養した。ついで、増殖培地を、０．５％のＦＢＳ含有ＤＭＥＭ：Ｆ１２（５０：５０）培地に変えた。５×１０５／ｍｌの密度で指数関数的に増殖しているＴＩＢ４２細胞を、０．５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ：Ｆ１２培地に切り替えた。３日間のインキュベーション後、条件培地を集めた。細胞生存率及び全細胞数を、Ｖｉ−ＣｅｌｌTMＸＲ細胞生存率アナライザー（Beckman Coulter）を用いて測定した。
【０１４９】
腫瘍細胞増殖アッセイ
Ａ６７３、ＨＭ７、ＨＰＡＣ及びＣａｌｕ６細胞をトリプシン処理し、９６ウェルブラックＶｉｅｗｐｌａｔｅ（Packard Bioscience Company, Meriden, CT）中に播種する前に０．５％のＦＢＳを含む培地で洗浄した。細胞を３日間、様々な量のＢｖ８（PeproTech Inc., Rocky Hill, NJ）と共にインキュベートした。１０％ＦＢＳ含有培地はポジティブコントロールとした。細胞増殖は、細胞増殖ＥＬＩＳＡキット（Roche）を使用してＢｒｄＵ取り込みによって評価した。
【０１５０】
インビボＧ−ＣＳＦ及び抗Ｇ−ＣＳＦ研究
８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスに毎日連続して８日間、１０ｍｇの組換えヒトＧ−ＣＳＦ（Neupogen, Amgen）を皮下注射した。コントロール動物にはＰＢＳを与えた。実験の終わりに、分析のためにＢＭ、全血及び脾臓試料を採取した。一グループの動物はＧ−ＣＳＦ中断後２日間維持した。自動化高分解能フローサイトメトリーベースの血液アナライザー（CellDyn 3000）を使用して、好中球の計数を行った。血清及びＢＭのＢｖ８レベルはＥＬＩＳＡによって測定した。
ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞のＧ−ＣＳＦ誘導動員におけるＢｖ８の役割を決定するために、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスに１２時間あけて２用量の抗Ｂｖ８抗体（５＋５ｍｇ／ｋｇ）を投与し、ついでＭａｂの二回目の投薬から４時間後にマウスＧ−ＣＳＦ（R&D Systems；２μｇ／マウス）を投与した。ポジティブコントロールとして、我々はラット抗マウスＧ−ＣＳＦ Ｍａｂ（Ｍａｂ４１４、R&D Systems；１０μｇ／マウス）を使用し、抗Ｂｖ８と同じ間隔で投与し、ついでマウスＧ−ＣＳＦを投与した。６時間後、マウスから血を採り、記載されたようにして、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の頻度を決定した。腫瘍のない状態でのＢｖ８発現の調節におけるＧ−ＣＳＦの役割を決定するために、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスに連続して８日間、毎日、コントロールラットＩｇＧ（Genentech）又はラット抗Ｇ−ＣＳＦ Ｍａｂ（Ｍａｂ４１４、R&D Systems、１０μｇ／マウス）の腹腔内注射した。動物を安楽死させ、全タンパク質をＢＭＭＮＣから抽出した。Ｂｖ８レベルは、記載されたようにしてＥＬＩＳＡによって測定した。腫瘍中でのＢｖ８発現の調節におけるＧ−ＣＳＦの重要性を評価するために、上述のようにＢａｌｂ／ｃヌードマウスを１０μｇのラット抗Ｇ−ＣＳＦ Ｍａｂ又はラットＩｇＧで前処理し、続いて１２時間後にＨＭ７細胞（マウス当たり５×１０６）を移植した。コントロールには空のマトリゲルＴＭを移植した。ついで、動物に抗体を２日間毎日投与した。マトリゲルＴＭ又は腫瘍の移植から４８時間後に、マウスを安楽死させ、ＢＭＭＮＣ中のＢｖ８レベルを上述のようにして測定した。
【０１５１】
抗Ｂｖ８中和抗体の生産とスクリーニング
組換えヒトＢｖ８タンパク質に対するマウスモノクローナル抗体を産生した。二つの独立したアッセイを使用して抗体をスクリーニングした。一つのアッセイは、記載されているような（LeCouter等，2003, 上掲）、ウシ副腎皮質由来内皮細胞の増殖を誘導するＢｖ８タンパク質の能力に基づくものであった。第二のアッセイは、そのレセプターのそれぞれを安定に発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞においてシグナル伝達カスケードを誘導するＢｖ８の能力に依存している。簡潔に述べると、ＮＦＡＴプロモーター（Invitrogen）下でベータラクタマーゼ遺伝子を安定に発現するＣＨＯ細胞を、１０％の仔ウシ血清を補填したＤＭＥＭ中で増殖させた。ｐＭＳＣＶ−ハイグロマイシン中のヒトＰＫＲ１又はＰＫＲ２ ｃＤＮＡ（Masuda, Y.等，上掲及びLin, D.C.等，上掲）を形質導入した。導入遺伝子を発現する細胞を２週間の間、５００ｍｇ／ｍｌハイグロマイシン中で選択した。続いて、レスポンダー細胞を、製造者によって示唆されたようにｈＢｖ８での１６時間の刺激後にＦＲＥＴベースの蛍光基質ＣＣＦ４を切断するその能力のためにＦＡＣＳ分取によって単離した。Ｂｖ８誘導ベータラクタマーゼ発現をブロックするその能力について中和抗体を同定した。ＣＨＯ−ＮＦＡＴベータラクタマーゼＰＫＲ１又はＰＫＲ２は、様々な濃度の精製されたマウスモノクローナル抗Ｂｖ８抗体の存在下又は不在下で１６時間、１００−２００ｎｇ／ｍｌのｈＢｖ８によって刺激した。刺激後、細胞を１時間ＣＣＦ４と共にインキュベートし、９６ウェルプレートリーダーＥｎｖｉｓｉｏｎＴＭ（Perkin Helmer）を用いて蛍光を測定した。
【０１５２】
腫瘍形成中のＢｖ８の役割を直接確立するために、我々は中和抗Ｂｖ８モノクローナル抗体（Ｍａｂ）を使用した。マウス及びヒトＢｖ８と交差反応するマウスＭａｂ ３Ｆ１及び２Ｂ９を用いた。これらのＭａｂは、Ｂｖ８刺激副腎皮質内皮細胞増殖を阻害し（LeCouter等，Nature 412:877-884(2001)）、Ｂｖ８ＧＰＣＲが形質移入されたＣＨＯ細胞におけるシグナル伝達を阻害するその能力に従って選択した。Ｍａｂ ２Ｂ９はヒト又はマウスＢｖ８タンパク質の分裂促進効果の最大〜７０％を阻害する一方、Ｍａｂ ３Ｆ１は５０％程を阻害した。しかしながら、各々５−１０μｇ／ｍｌの濃度での２つのＭａｂの組合せは、１００ｎｇ／ｍｌのヒト又はマウスＢｖ８によって誘発される分裂促進効果を完全に阻害した。単独で又は組み合わせて試験された抗体は、基本条件下で又は構造的に無関係のＶＥＧＦ−Ａ又は関連したＥＧ−ＶＥＧＦでの刺激後に内皮細胞増殖について効果はなかった。また、抗Ｂｖ８ ＭａｂもＢｖ８自体の何れも、広い範囲の濃度にわたって、この実験で試験した腫瘍細胞株の増殖に対する検出可能な効果は持たなかった（データは示さず）。
【０１５３】
最も効果的なインビボでの治療計画を決定するために、最初の実験において、我々はＡ６７３モデルにおいて、個々にＭａｂ ３Ｆ１及び２Ｂ９を用いて、また併用して、用量依存的実験を実施した。インビトロデータによって予測されるように、二つのＭａｂの組合せは単一のＭａｂよりも効果的であった。週二回の５ｍｇ／ｋｇの各Ｍａｂの投与は腫瘍増殖について最大の阻害効果を達成した。従って、このレジメンを引き続く全ての実証実験において使用した。Ａ６７３横紋筋肉腫に加えて、我々は、ヒトＨＭ−７、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＰＡＣ及びＣａｌｕ−６細胞株及びマウスＥＬ−４及びＴＩＢ４２リンパ腫を含む更なるモデルを試験した。
【０１５４】
インビトロ腫瘍実験
ヒト腫瘍細胞株Ｃａｌｕ−６、Ａ−６７３、ＪＵＲＫＡＴ、ＨＰＡＣ及びＨＭ７並びにマウスリンパ腫株ＥＬ４及びＴＩＢ４２を、１０％ｖ／ｖのＦＢＳ、１％ｖ／ｖのペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−Ｇｌｎ及び１μｇ／ｍｌのＦｕｎｇｉｚｏｎｅＴＭ（Invitrogen, CA）を補填したハムのＦ１２、低グルコースＤＭＥＭ１：１において増殖させた。細胞を９５％空気／５％ＣＯ２の雰囲気下、３７℃でインキュベートした。マウス異種移植実験では、腫瘍細胞を１×１０８細胞／ｍｌの濃度で懸濁させ、Ｂａｌｂ−ｃ又はベージュヌードＸＩＤ免疫不全マウス（Harlan Sprague Dawley, IN）の何れかの背側腹部に皮下注射した（１００ｍｌ／マウス）。腫瘍細胞接種後２４又は４８時間の時点で、抗Ｂｖ８ ｍＡｂ ２Ｂ９及び３Ｆ１の腹腔内投与を、１０ｍｇ／ｋｇ（５ｍｇ／ｋｇの各Ｍａｂ）（ｎ＝１０）の全用量で開始した。コントロールとして、我々は抗ブタクサＭａｂ及び抗ＶＥＧＦ Ｍａｂ Ｇ６．３１又はＢ２０（Liang, W.C.等，J Biol Chem 281, 951-961(2006)）を用いた。その後、マウスを毎週２回処理した。腫瘍体積を、楕円体体積式（６×Ｌ×Ｗ×Ｈ、ここで、Ｌ＝長さ、Ｗ＝幅、及びＨ＝高さ）（Tomayko, M.M.及びReynolds, C.P., Cancer Chemother Pharmacol 24, 148-154(1989)）を使用して二日毎に計算した。グループ間の差の統計的解析のために、一方向ＡＮＯＶＡの後にＴｕｋｅｙ ＨＳＤペアワイズ解析を、ＪＭＰソフトウェア（SAS Institute Inc.）を使用して実施した。＜０．００５のｐ値を有意と考えた。
【０１５５】
組織学的解析及び免疫組織化学検査
腫瘍を、パラフィン包埋前に２４時間かけて中性緩衝ホルマリンに固定した。Ｈ＆Ｅ染色と免疫組織化学検査を過去に記載されているようにして（ｒｅｆ）実施した。簡潔に述べると、ラット抗マウスＰＬＶＡＰモノクローナルＭＥＣＡ−３２（BD-Pharmingen）を用いた免疫組織化学染色を、９９℃とついで室温でそれぞれ２０分間、標的抗原回収液（ＤＡＫＯ）を使用して実施した。一次抗体を、ビオチン化二次抗体（Vector）及びＶｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣ ＥｌｉｔｅＴＭ試薬を使用して順次検出した。反応産物は金属増強ＤＡＢ（Pierce Chemical, IL）を使用して生成させた。切片をヘマトキシリンで軽く対比染色し、脱水し、カバーガラスをした。
【０１５６】
アデノウイルスベクターの構築
ＬａｃＺ及びｍＶＥＧＦ１６４をコードするアデノウイルスベクターは過去に記載されている（LeCouter等, 2001, 上掲）。アデノウイルスｍＢｖ８を、ＡｄＥａｓｙ ＸＬＴＭアデノウイルスベクター系（Stratagene）を使用して生成した。アデノウイルスｍＢｖ８を、ＡｄＥａｓｙ ＸＬＴＭアデノウイルスベクター系（Stratagene）を使用して生成した。そのＣ末端に６ｘＨｉｓタグを有するｍＢＶ８のｃＤＮＡ（配列番号３６）をｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶベクターのＸｈｏＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩ部位間にクローニングした。得られたｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶ−ｍＢＶ８プラスミドを、アデノウイルスバックボーンで事前に形質転換された電気穿孔コンピテント株であるＢＪ５１８３−ＡＤ−１中でｐＡｄＥａｓｙ−１ＴＭを用いて組換えた。ついで、組換えアデノウイルスＢｖ８プラスミドを、ウイルス粒子のパッケージングのためにＡＤ−２９３細胞中に形質移入した。アデノウイルスストックをＣｓＣｌ勾配によって精製した。Ａｄｅｎｏ−Ｘ ｒａｐｉｄＴＭ力価キット（Clontech）を使用してアデノウイルスの力価を測定した。
【０１５７】
腫瘍関連内皮細胞の単離及び特徴付け
腫瘍関連内皮細胞（ＴＡＥＣ）を、本質的に過去に記載されたようにして（Hida 等，Cancer Res 64:8249-8255(2004)）、磁気ビーズ選別システム（Miltenyi Biotech）を使用して単離した。簡潔に述べると、ＴＩＢ４２マウスリンパ腫細胞を雌のベージュヌードマウスの背側腹部に注射した。腫瘍が〜１０００ｍｍ３の直径に達したときに、それを切除し、刻み、ついでコラゲナーゼＩＩ（Worthington Biochemical Corporation）で消化させた。ついで、細胞懸濁液を、１００μｍから４０μｍのメッシュを使用して濾過した。最後に、ＣＤ３１＋細胞を、製造者の指示に従ってＦＩＴＣ−ＣＤ３１抗体（BD Biosciences）を使用して選別した。ＥＧＭ−２ＭＶ培地（Cambrex）の存在下でゼラチン被覆プレートにＣＤ３１＋細胞を播種した。培養の２４時間後、ＣＤ３１＋非接着細胞を、ＰＢＳで数回洗浄することによって除去した。
【０１５８】
ＲＴ−ＰＣＲでは、ＲＮｅａｓｙＴＭミニキット（QIAGEN）を使用してＲＮＡを培養細胞から抽出した。示した実験では、８０ｎｇのＲＮＡを各５０ｕｌの反応に使用し、ｃＤＮＡを２８サイクルで増幅させた。プライマー配列は要求に応じて入手可能である。
ＴＩＢ４２−ＴＡＥＣ細胞を、０．５％のＢＳＡを補填した基本培地中で６時間飢えさせた。ついで、細胞をヒト組換えＢｖ８（２００ｎｇ／ｍｌ；PeproTech）、完全培地（ＣＭ）、ＶＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ；PeproTech）又はＢＳＡ（０．５％）で刺激した。標示された時点で細胞抽出物を集めた。ＴＩＢ４２−ＴＡＥＣ細胞からの抽出物のウェスタンブロット分析を、ＰｈｏｓｐｈｏＰｌｕｓ ｐ４４／４２ ＭＡＰＫＴＭ抗体キット（Ｃell signaling）を使用して実施した。この結果の一貫性及び再現性を評価するために、各条件を二回試験し、実験を三回実施して、同様の結果を得た。
【０１５９】
インビトロ管形成では、無血清培地中で５時間、ＴＩＢ４２−ＴＡＥＣ細胞（継代６−８）を飢えさせた。この後、細胞を集め、５％のＢＳＡを補填した無血清培地に再懸濁させ、ＶＥＧＦ−Ａ（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｂｖ８（２００ｎｇ／ｍｌ）又は無添加（コントロール）で処理した。特異性試験では、Ｂｖ８を、抗Ｂｖ８ Ｍａｂ（１０ｍｇ／ｍｌ）の存在下でインキュベートした。５×１０５細胞を、マトリゲルＴＭ（BD Biosciences）を予めコートした２４ウェルの各ウェルに播種し、３６時間後に管形成を評価した。
【０１６０】
マイクロコンピュータ断層撮影血管造影
ＨＭ７腫瘍を持つ動物に、二酸化炭素の吸入による安楽死の１０分前に５０ｕｌの腹腔内注射を行った。胸腔を開け、心臓尖部に切開をし、ポリエチレンカニューレ（内径０．５８ｍｍ、外径０．９６ｍｍ）を左心室に通し、５−０の絹の縫合を用いて上行大動脈に取り付けた。０．９％の生理食塩水中の０．１ｍＭのニトロプルシドナトリウムの１７ｍｌ溶液を６ｍｌ／分の流量で灌流して、最大の血管拡張状態を提供し血液を除去した。市販されているクロム酸鉛ラテックスであるＭＩＣＲＯＦＩＬ（登録商標）（Carver, MA）を製造者によって推奨されたようにして調製し、１７ｍｌについて２ｍｌ／分の流量で灌流した。対象の組織の切開前に、注入したラテックス混合物を室温で６０分間重合させた。切開した腫瘍を１０％の中性緩衝ホルマリンに浸漬した。
ついで、腫瘍を、μＣＴ４０ＴＭ（SCANCO Medical, Basserdorf, Switzerland）Ｘ線マイクロコンピュータ断層撮影（マイクロＣＴ）システムを用いて画像化した。腫瘍は背景培地として大豆油を用いて画像化した。マイクロＣＴ画像を、４５ｋＶのエネルギーレベル、１７７ｍＡの電流及び３００ミリ秒の積分時間でＸ線管を操作することによって画像を生成した。軸方向の画像を１６μｍの等方性分解能で得られた。
【０１６１】
血管網及び腫瘍を、一連の画像処理工程によって抽出した。１１９５ Ｈｏｕｎｄｓｆｉｅｌｄ単位（ＨＵ）の強度閾値及び形態学的フィルタリング（浸食及び拡張）を容積マイクロＣＴ画像データに適用して血管体積（ＶＶ）を抽出した。腫瘍体積（ＴＶ）は、−８ＨＵの強度閾値で同様な形でバックグラウンドから抽出した。血管密度（ＶＶ／ＴＶ）をＴＶに対するＶＶの比から決定した。血管及び腫瘍強度閾値は、試料のサブセットからのセグメント化の結果の視覚検査によって決定した。ＡＶＷ画像処理ソフトウェアライブラリー（AnalyzeDirect Inc., Lenexa, KS）を用いたＣ＋＋及びＰｙｔｈｏｎで書かれたインハウス画像解析アルゴリズムによって計算を実施した。三次元（３Ｄ）表面レンダリングを、画像解析ソフトウェアパッケージであるＡｎａｌｙｚｅ６．０（AnalyzeDirect Inc., Lenexa, KS）を使用してマイクロＣＴデータからつくり出した。統計的解析をＪＭＰ統計ソフトウェアパッケージ（SAS Institute Inc., Cary, NC, USA）を用いて実施した。マイクロＣＴ測定基準（ＶＶ、ＴＶ、ＶＶ／ＴＶ）のためのグループ比較を多重比較のＤｕｎｎｅｔｔ検定を用いて評価した。０．０５未満のＰ値は有意であると考えた。
【０１６２】
Ｂｖ８タンパク質の部分的精製及びＢＭＭＮＣ可溶化物のウェスタンブロット分析。
４日間毎日、Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝２０）にヒトＧ−ＣＳＦ（１０μｇ／日、Ａｍｇｅｎ）を皮下注射し、ｍＧＭ−ＣＳＦ（０．５μｇ／日、PeproTech）を腹腔内注射して、ＣＤ１１ｂ＋ｇｒ１＋集団を拡大させた。５日目に、ＢＭ細胞を単離し、細胞ペレットを２ｍｌの０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ＴＭに再懸濁させた。ついで、細胞可溶化物を２５ゲージ針に４回強制的に通し、塩濃度を５０ｍＭのＮａＣｌに調節した。粗抽出物を、２０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．２、５０ｍＭのＮａＣｌで事前に平衡にしたヘパリン−セファロース（登録商標）カラム（Ｈｉ−Ｔｒａｐ、１ｍｌ）に充填した。２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．２中５０ｍＭから１ＭのＮａＣｌと、続く１Ｍから２ＭのＮａＣｌの二段階の線形勾配を使用してカラムを溶出させた。流量は１ｍｌ／分であった。２８０ｎｍでの吸光度をモニターした。１ｍｌの画分を集め、ＥＬＩＳＡとウェスタンブロットを使用してｍＢｖ８についてアッセイした。ウェスタンブロット分析では、１００μｌの画分を、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ−３（登録商標）スピンカラム（MILLIPORE）を使用して４倍に濃縮した後、４−２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Invitrogen）に充填した。ブロッキングバッファー（ＰＢＳＴ、ＰＢＳ中の０．１％Ｔｗｅｅｎ２０及び５％脱脂粉乳）中１０μｇ／ｍｌの全濃度でｍＢｖ８に対する３種のハムスター抗体（２Ｄ３、３Ｂ８及び４Ｅ１０）の組合せを使用してブロットを一晩染色した。３回の洗浄後、ブロットを西洋わさびペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ハムスターＩｇＧ（ImmunoResearch Laboratories）と共にインキュベートし、ついで増強ルミネッセンスプラスＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＳｙｓｔｅｍＴＭ（GE Healthcare Bio-Science）を使用して展開した。
【０１６３】
マウスＢｖ８ ＥＬＩＳＡ
ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）９６ウェルマイクロウェルプレート（Nalge NuncInternational, Rochester, NY）に、４℃で一晩、５０ｍＭの炭酸塩バッファー、ｐＨ９．６中の１．０ｍｇ／ｍｌの３Ｆ１抗体（マウスＢｖ８にも結合するマウス抗ヒトＢＶ８抗体）を被覆した。プレートを、０．０５％のポリソルベート２０を含むＰＢＳで洗浄し、室温で１時間、ＰＢＳ中の０．５％のウシ血清アルブミン、１０ｐｐｍのＰｒｏｃｌｉｎ３００（登録商標）（Supelco, Bellefonte, PA）でブロックした。プレートを洗浄後、０．５％のウシ血清アルブミン、０．０５％のポリソルベート２０、１０ｐｐｍのＰｒｏｃｌｉｎ３００（登録商標）（Supelco, Bellefonte, PA）及び０．３５ＮのＮａＣｌを含むＰＢＳ（サンプルバッファー）中のマウスＢＶ８標準（２倍連続希釈での０．０３９−２．５０、Genentech）及び試料（最小１：１０希釈）をプレートに加えた。プレートを室温で２時間インキュベートした。未結合抗体を洗浄工程によって除いた。プレートに結合した抗体は、ビオチン化４Ｅ１０抗体（ハムスター抗マウスＢＶ８抗体、Genentech）と、ついで基質としてストレプトアビジン−ＨＲＰ（GE Healthcare, Buckinghamshire, United Kingdom）と３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD）を加えることによって検出した。１Ｍのリン酸を加えることによって反応を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をＴｉｔｅｒｔｅｋＴＭスタッカーリーダー（ICN, Costa Mesa, CA）で読み取った。４パラメーター回帰曲線適合化プログラム（Genentech）を使用して標準の滴定曲線を適合化させた。標準曲線の範囲に入るデータポイントを、試料中のマウスＢＶ８濃度を計算するために使用した。
【０１６４】
このアッセイは１０％のマウス血清及び１０％の溶解バッファーを許容し、血清及び組織可溶化物試料に対して０．３９ｎｇ／ｍｌの感度を有している。それはＢＶ８に特異的である。３０ｍｇ／ｍｌまでの抗ＶＥＧＦ Ｇ６−３１ ヒトＩｇＧ１、ヒトＧ−ＣＳＦ及びヒトＶＥＧＦ、又は５ｍｇ／ｍｌまでのヒトＥＧ−ＶＥＧＦだけがバックグラウンドシグナルを与えた。このＥＬＩＳＡはまたヒトＢＶ８を検出するが、効率は２６％又はそれ以下である。１４ｎｇ／ｍｌまでの抗ＢＶ８ ３Ｆ１及び１２４ｎｇ／ｍｌまでの抗ＢＶ８ ２Ｂ９の存在はサンプルバッファー中の０．５ｎｇ／ｍｌのＢＶ８の検出には有意に影響を及ぼさなかった。
【０１６５】
結果
ＢＭ中でのＢｖ８の発現が遠い部位の腫瘍増殖によって影響されるかどうかを決定するために、Ａ６７３及びＨＭ７腫瘍細胞を免疫不全マウスに移植した。図１ａに示されているように、双方の腫瘍の移植は空のマトリゲルＴＭ移植と比較してＥＬＩＳＡによってＢＭ中のＢｖ８レベルに有意な増加を生じさせた。
ＢＭ中で生産されるＢｖ８タンパク質を特徴付け、ＥＬＩＳＡを検証するために、マウス骨髄単核細胞（ＢＭＭＮＣ）可溶化物にヘパリン−セファロースアフィニティークロマトグラフィーを施した。追加の（以下Ｓ）図１ａに示されているように、Ｂｖ８はカラムに強く結合し、〜０．４ＭのＮａＣｌの存在下で単一ピークとして溶出された。これは、免疫反応性画分に予想される〜９ｋＤａのバンドの存在を裏付けたウェスタンブロット分析によって確認した（Ｓ図１ｂ）。
ＢＭＭＮＣは、主として骨髄及びリンパ球系統の細胞の幾つかのサブセットからなる。ＢＭＭＮＣのどのサブセットがＢｖ８に富んでいるかを解明するために、Ａ６７３、Ｃａｌｕ−６、ＨＭ７、ＨＰＡＣ及びＪｕｒｋａｔを含む幾つかの腫瘍細胞株をマウスに移植した。ＴａｑｍａｎＴＭ解析は、ＣＤ１１ｂ−Ｇｒ１−細胞（殆どが非骨髄サブセット）と比較して、Ｂｖ８がＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋骨髄細胞（主に好中球からなるが、マクロファージ系統の細胞も含む（Yang等, Cancer Cell 6:409-421(2004)； Dahl等, Nat Immunol 4:1029-1036(2003)；Lagasse及びWeissman, J Immunol Methods 197:139-150(1996)）において高度に発現されたことを示していた（図１ｂ）。
【０１６６】
Ｂｖ８発現の調節に潜在的に関与する分子を同定するために、ＴａｑｍａｎＴＭによって非選別ＢＭＭＮＣ中でＢｖ８の発現を誘導するサイトカイン／ケモカインのパネルの能力を調べた。サイトカインの殆どはＢＭＭＮＣ中でＢｖ８の有意なアップレギュレーションは誘導しなかった（図１ｃ）。しかしながら、Ｇ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）はＢｖ８の劇的なアップレギュレーションを生じさせた（＞２７倍、図１ｃ）。試験したサイトカインは何れもＶＥＧＦ−Ａの顕著なアップレギュレーションは生じさせなかった（データは示さず）。
ＢＭＭＮＣの異なったサブセットの分析は、Ｇ−ＣＳＦが、精製されたＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞においてバックグラウンドの１００倍を超えるＢｖ８のアップレギュレーションを生じることを明らかにした（図１ｄ）。大幅に低いＢｖ８のＧ−ＣＳＦ媒介アップレギュレーションが全ＢＭ又はＣＤ１１ｂ−Ｇｒ１画分において検出された。意外にも、ＧＭ−ＣＳＦはＢｖ８の発現に効果を有しておらず（図１ｃ＆ｄ）、よってこの因子の高度に選択的な性質を強調している。興味深いことに、ＩＬ−６及びＳＤＦ−１は、非選別ＢＭ細胞で試験したときは有意な刺激を示さなかったが、精製されたＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞で試験したときはＢｖ８の有意な２−３倍のアップレギュレーションを生じた（図１ｃ＆ｄ）。
【０１６７】
ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞中でのＧ−ＣＳＦに対する応答を更に特徴付けるために、我々は、低く生理学的に関連する濃度のサイトカインがＢｖ８の発現を誘導しうるかを試験した。また、過去の研究では、Ｂｖ８遺伝子の発現が低酸素によって増加されうる（LeCouter等, 2003, 上掲）ことが示されており、よって我々は、低酸素がＧ−ＣＳＦに対するＢｖ８の応答を調節しうるかを試験することを望んだ。図１ｅに示されるように、２０ｐｇ／ｍｌと少ないＧ−ＣＳＦが低酸素条件下で〜１０倍のＢｖ８の発現の刺激を生じた。この刺激は正常酸素圧条件下で検出されたもの（〜５倍）よりも顕著に高かった。インビトロ研究に加えて、Ｇ−ＣＳＦによるＢｖ８のアップレギュレーションをインビボで実証した。Ｂａｌｂ／ｃマウスへの組換えＧ−ＣＳＦの投与は、末梢血（ＰＢ）好中球における増加と同時に（図２ｂ）、ＢＭ中（図１ｆ）及び血清中（図２ａ）において、Ｂｖ８タンパク質レベルの時間及び用量依存的な増加を生じた。同様な結果がＢａｌｂ−ｃヌードマウスで得られた（データは示さず）。顕著なことに、Ｇ−ＣＳＦ投与から２４時間と早く、ＢＭ中のＢｖ８レベルがバックグラウンドを超えて〜３０倍増加した。血清レベルもまた劇的に増加した。ＢＭ及び血清Ｂｖ８は、Ｇ−ＣＳＦの中断後４８時間以内に略ベースラインレベルまで戻ったが、これは、、Ｂｖ８がＢＭ中のＧ−ＣＳＦによって密に調節されていることを示している。しかしながら、Ｇ−ＣＳＦ投与は、腎臓、脳及び肝臓中のＢｖ８レベルに効果を持たなかった（データは示さず）。
【０１６８】
Ｇ−ＣＳＦは、骨髄／顆粒球前駆体を好中球に分化させる顆粒球生成の主要な調節因子である。Ｇ−ＣＳＦはまた様々な環境ストレスに応答してのＢＭからの好中球の動員に所定の役割を担っており、内皮細胞及び線維芽細胞を含む幾つかの細胞型によって分泌される（Christopher, M.J.及びLink, D.C., Curr Opin Hematol 14, 3-8(2007)）。更に、Ｇ−ＣＳＦは、ＩＬ−６及びＳＤＦ−１を含む他の，造血性サイトカインと共に、悪性腫瘍の腫瘍及び／又は間質細胞によって構成的に発現される（Mueller, M.M.及びFusenig, N.E., Differentiation 70, 486-497(2002)で概説）。Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６又はＳＤＦ−１が我々の腫瘍モデルで発現されるかどうかを試験するために、これらのサイトカインのレベルを腫瘍細胞又は腫瘍関連線維芽細胞によって条件化された培地において測定した。Ｓ表１に示されるように、それらは双方のコンパートメントにおいて異なった濃度にも拘わらず、検出可能であった。よって、ＢＭ中でのＢｖ８のＧ−ＣＳＦ（及び／又は他のサイトカイン）媒介アップレギュレーションは骨髄細胞の動員に寄与しうる。腫瘍におけるこれらの細胞の続くホーミングは更なるサイトカインによって、また潜在的には腫瘍関連骨髄細胞によって分泌されるＢｖ８によって調節されうる。
【０１６９】
腫瘍微小環境内でのＢｖ８発現の調節におけるＧ−ＣＳＦの潜在的役割を定めるために、培養したＢＭＭＮＣを、抗Ｇ−ＣＳＦ又はコントロール抗体の存在下でＨＭ７腫瘍からの可溶化物のアリコートと共にインキュベートした（図１ｇ）。Ｂｖ８転写産物の分析は、コントロールＩｇＧ処理ウェルと比較して、抗Ｇ−ＣＳＦで処理されたＢＭＭＮＣにおいてＢｖ８の発現の有意な用量依存的な減少を証明した。興味深いことに、抗Ｇ−ＣＳＦの存在下で、Ｂｖ８の発現レベルは非刺激レベル以下であり、腫瘍モホジネート中に存在するＢｖ８発現阻害剤の対立しない作用を示唆している。インビボ実験では、Ｂｖ８の発現の調節におけるＧ−ＣＳＦの重要な役割が確認された。Ｂｖ８タンパク質はコントロールと比較して抗Ｇ−ＣＳＦで処理された非腫瘍担持マウスにおいて有意に減少した（図１ｈ）。
【０１７０】
ついで、Ｇ−ＣＳＦが、腫瘍を持つマウスのＢＭにおいてＢｖ８アップレギュレーションを媒介する役割を果たすかどうかを試験した。図１ｉに示されるように、コントロールＩｇＧは作用しなかったが、モノクローナル抗Ｇ−ＣＳＦ抗体は、腫瘍移植の直ぐ後にＢＭ中に生じるＢｖ８タンパク質のピークを実際に消滅させた。非常に類似した結果がポリクローナルヤギ抗Ｇ−ＣＳＦ ＩｇＧで得られた（データは示さず）。抗Ｇ−ＣＳＦ処理はまた非腫瘍及び腫瘍を持つマウスにおける循環、並びにＢＭ−ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の有意な減少を生じさせた（Ｓ図２ｃ−ｆ）。従って、我々は更なる因子の関与を除外しないが、我々の知見は、Ｂｖ８の発現がインビトロとインビボの双方でＧ−ＣＳＦに依存することを示している。
【０１７１】
Ｇ−ＣＳＦによるＢｖ８の強いアップレギュレーションが分かったところで、我々は、組換えＧ−ＣＳＦによって誘導される好中球の動員にＢｖ８が寄与しうるかどうかを決定することを望んだ（図１ｊ）。最大用量以下のＧ−ＣＳＦ（２μｇ）は、マウスの末梢血へのＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋の有意な動員を６時間以内に誘導した。Ｇ−ＣＳＦの効果は抗Ｇ−ＣＳＦ抗体によって完全にブロックされた。抗Ｂｖ８抗体（以下、抗Ｂｖ８）はまたＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞のＧ−ＣＳＦ媒介動員を阻害した（図１ｊ）。しかしながら、抗Ｂｖ８は、Ｇ−ＣＳＦの最大用量（１０μｇ）によって誘導された動員には殆ど効果がなかった。従って、Ｂｖ８はＧ−ＣＳＦによって刺激される好中球動員を調節し又は増強するように機能しうる。
【０１７２】
インビトロで、Ｂｖ８は、ＳＤＦ−１に匹敵する度合いで、トランスウェルアッセイにおいてＢＭ ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の遊走を促進した（Ｓ図３ａ）。抗Ｂｖ８は、骨髄細胞のＢｖ８刺激遊走を完全に阻害したが、ＳＤＦ−１誘導遊走には効果を持たず、よって効果の特異性を確認した。ＢＭ中におけるＢｖ８レセプターのＲ１及びＲ２のＴａｑｍａｎＴＭ分析は（Ｓ図３ｂ＆ｃ）は、Ｒ１と比較してＲ２の高い発現を明らかにした。しかしながら、ＢＭＭＮＣ中におけるＢｖ８シグナル伝達の媒介におけるＲ１対Ｒ２の精確な貢献は尚も決定されなければならない。これらの知見は、Ｂｖ８及びそのレセプターの細胞型特異的アップレギュレーションは腫瘍移植後の骨髄遺伝子活性化の一部であることを示唆している。造血系の細胞に対するＢｖ８の効果を更に特徴付けるために、枯渇系統（ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞を欠くＬｉｎ−）及びＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の双方を未処置マウスのＢＭから単離し、組換えＢｖ８で処理した。Ｌｉｎ−集団の分析は、コントロールと比較してＢｖ８処理細胞におけるＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞のより高い発現を示しており、これは、Ｂｖ８が骨髄系統の細胞への前駆体集団の運命を変えることを示唆している（Ｓ図３ｄ）。更に、細胞生存率の分析は、Ｂｖ８処理ウェル中の死細胞の数がコントロールよりも有意に低かったことを示しており、これは、Ｂｖ８が原始造血細胞に対する潜在的な生存因子であることを示している（Ｓ図３ｄ）。Ｌｉｎ−細胞に対するＢｖ８の効果を機能的に評価するために、我々はＢｖ８処理細胞のＣＦＵ分析を実施したが、これは、コントロール処理細胞と比較して多くの数（ｐ＜０．０５）のコロニーを示した（Ｓ図３ｅ）。ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の分析は、Ｂｖ８処理細胞はコントロールと比較してより少ない死細胞を含んでいたので、生存因子としてのＢｖ８の役割を更に支持している（Ｓ図３ｆ）。最後に、Ｂｖ８でのＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の処理は、時間依存的な形でＭＡＰＫ経路の活性化を生じた（データは示さず）。
正常な造血におけるＢｖ８の役割を解明するために、抗Ｂｖ８又は抗ブタクサ（以下、コントロール）抗体を非腫瘍担持マウスにおいて試験した。抗Ｂｖ８もコントロールもＢａｌｂ／ｃヌードマウスにおいて正常な造血及び血液学的パラメータに対して有意な効果を示さなかった（Ｓ図４）。これらのデータは、定常状態の生理学的条件下では、Ｂｖ８は造血の調節に非常に限られた役割を果たしていることを示唆している。
【０１７３】
インビボでの腫瘍増殖におけるＢｖ８の重要性を調査するために、我々は、抗Ｂｖ８又はコントロール抗体の投与が、免疫不全マウスに移植した幾つかの腫瘍細胞株の増殖に影響を及ぼしうるかどうかを試験した。図２に示されているように、抗Ｂｖ８の投与は、試験した全ての主要モデルにおいて、コントロール処理動物と比較して腫瘍体積及び最終腫瘍重さの有意な減少を生じさせた。Ａ６７３モデルでは、増殖阻害は〜８０％であり、マウス及びヒトＶＥＧＦ−Ａを阻害する（Liang 等, J Biol Chem 281:951-961(2006)）抗ＶＥＧＦ Ｍａｂ Ｇ６．３１（以下、抗ＶＥＧＦ）又はＢ２０で達成されたもの（データは示さず）に近づいた（図２ａ）。ＨＭ７腫瘍モデルはまた抗Ｂｖ８処理による顕著な増殖阻害を証明した（図２ｂ）。有意な阻害はまたヒトＨＰＡＣ（図２ｃ）及びＪｕｒｋａｔ（図２ｄ）細胞株から取り出された腫瘍においても観察された。示された腫瘍移植実験はＢａｌｂ／ｃヌードマウスで実施された。同様な結果がベージュヌードマウスにおいても得られた（データは示さず）。ヒト異種移植片に加えて、抗Ｂｖ８単独又は抗ＶＥＧＦ抗体との併用は、ＴＩＢ−４２抗ＶＥＧＦ不応性腫瘍において腫瘍体積を低減させるのに効果的であることが分かった（図２ｅ）。治療の中断は、Ａ６７３（Ｓ図３ｇ）及びＨＭ７腫瘍（Ｓ図３ｈ）を持つマウスにおいて急速な腫瘍増殖を生じた。また、腫瘍の分析は浸潤ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の数の増加を明らかにした（Ｓ図３ｉ＆ｊ）。
【０１７４】
腫瘍形成の異なった段階での骨髄細胞をモニターするために、我々は、異なった時点でのＡ６７３モデルにおけるＢＭ、ＰＢ及び腫瘍中のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の動態を調べた（Ｓ図５）。ＢＭ分析は、抗Ｂｖ８及びコントロール処理マウス間でのＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の頻度における有意な差を明らかにしなかった（Ｓ図５ａ）。しかしながら、試験した全ての時点においてコントロール処理マウスと比較して抗Ｂｖ８処理マウスにおいてＰＢ中のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の数（データは示さず）及び頻度に有意な減少があった（Ｓ図５ｂ）。また、我々は、コントロールと比較して抗Ｂｖ８処理腫瘍において幾つかの時点でＡ６７３腫瘍中におけるＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の数の有意な減少を見出した（Ｓ図５ｃ）。フローサイトメトリー（代表的なＦＡＣＳプロファイルはＳ図６に示す）を使用して、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋集団の動態を、Ｃａｌｕ−６、ＨＭ７、ＨＰＡＣ及びＪｕｒｋａｔ細胞を移植したマウスのＰＢ、腫瘍、ＢＭ及び脾臓において調べた（図３ａ＆ｂとまたＳ図７ｄ＆ｅ）。Ａ６７３腫瘍における時間経過研究と一致して、抗Ｂｖ８での処理は、上述した全ての腫瘍モデルにおいてもＰＢ中のにおいてもＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の頻度を有意に減少させた（図３ａ）。抗Ｂｖ８処理動物の腫瘍におけるＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋の数の有意な減少もまた観察された（図３ｂ）。これらの知見は、Ｂｖ８が腫瘍へのＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の動員及び潜在的なホーミングを調節することを示している。また、好中球（Ｇｒ１の発現によって主として同定される（Okazaki, T.等, Int Immunol 18, 1-9(2006)）が抗Ｂｖ８処理によって影響を受ける主要な集団であると思われる。
【０１７５】
過去の研究は、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞を含む骨髄細胞の移植は腫瘍増殖を亢進する一方、その枯渇はそれを低減させうることを示していた。Ｂｖ８調節腫瘍増殖における骨髄サブセットの役割を直接評価するために、我々は、腫瘍移植の７日後にＡ６７３又はＨＭ７腫瘍を持つマウスからＢＭ ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞を単離し、それらを腫瘍に注入した。これにより、抗Ｂｖ８処理動物においてより急速な腫瘍増殖が生じた（図３ｃ＆ｄ）。従って、過剰のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞は抗Ｂｖ８処理によって誘発される腫瘍増殖阻害を無効化しうる。骨髄及び腫瘍における骨髄サブセットを更に特徴付けるために、我々は、ＣＤ１１ｂサブセット中における浸潤マクロファージのマーカーとしてＦ４８０を使用した。我々は、抗Ｂｖ８での処理がＡ６７３移植マウスの骨髄と腫瘍内の双方においてマクロファージ（ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４８０＋）の数の少ない減少を生じることを見出した（データは示さず）。従って、抗Ｂｖ８は、腫瘍における主に顆粒、より穏和な度合いでマクロファージサブセットに影響を及ぼすように思われる。
【０１７６】
ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋の頻度における有意な増加は、マトリゲルＴＭ移植マウスと比較して腫瘍を持つマウスのＢＭと脾臓において観察された（Ｓ図７ａ＆ｂ）、しかしながら、ＰＢ及び腫瘍で観察された減少とは異なり、抗Ｂｖ８処理は、ＢＭ及び脾臓におけるＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の頻度に顕著に影響を及ぼすことはなかった。Ａ６７３及びＨＭ７腫瘍を持つマウスから単離されたＢＭ及び脾細胞のＣＦＵ解析（Ｓ図７ｃ）は、抗Ｂｖ８処理マウスにおけるコロニー数がコントロール処理マウスと比較して有意に低減したことを示している。これらの知見は、インビボでのＢｖ８中和が脾細胞及びＢＭ細胞の分化しコロニーを形成する能力をインビトロで損なわしめることを示唆している。
【０１７７】
抗Ｂｖ８抗体の抗腫瘍効果の大きさは、ＭＭＰ−９及びＶＥＧＦ−Ａの減少レベルを生じることが予想される（Yan等, Cancer Cell 6:409-421(2004)；Nozawa等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 12493-12498 (2006)）腫瘍におけるＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の数の減少によってだけ説明されることはないと思われる。Ｂｖ８活性の局所的な中和は抗Ｂｖ８の抗腫瘍効果の主要な機構であると思われる。Ｂｖ８及び関連ＥＧ−ＶＥＧＦは特定の内皮細胞型に対して選択的な分裂促進因子として特徴付けられている。Bergers, G.等, Nat Cell Biol 2, 737-744(2000)；Lin, R.等, J Biol Chem 277, 8724-8729(2002))。従って、我々は、Ｂｖ８が腫瘍脈管構造に影響を及ぼすかどうかを決定することを探求した。我々は異種移植腫瘍から腫瘍関連内皮細胞（ＴＡＥＣ）の培養物を樹立し特徴付けた。ＴＡＥＣはＶＥＧＦ−Ａに応答してマトリゲルＴＭにおいて管を形成する一方、コントロールウェルは管形成の証拠は殆ど又は全く示さなかった（Ｓ図８ａ）。Ｂｖ８タンパク質の添加は、ＶＥＧＦ−Ａによって誘導されるものに匹敵する度合いで管形成を促進した（Ｓ図８ａ）。抗Ｂｖ８抗体は、Ｂｖ８誘導管形成をブロックしたが、ＶＥＧＦによって誘導される管形成を阻害しなかった。これらの知見は効果の特異性を確認しており、またＢｖ８とＶＥＧＦがＴＡＥＣで管形成を誘導するために異なった経路を用いていることを示唆している。ＰＣＲ分析は、ＴＡＥＣの内皮性を証明するＴＡＥＣのＣＤ３１、ＶＥＧＦＲ２及びＴｉｅ２のような上皮細胞ではなく、内皮細胞のマーカーの発現を確認した（Ｓ図８ｂ）．これらの知見と一致して、Ｂｖ８又はＶＥＧＦ−ＡはＴＡＥＣにおいてＭＡＰキナーゼの強い誘導を生じた（Ｓ図８ｃ）。ＴａｑｍａｎＴＭ解析は、ＴＡＥＣにおけるＥＧ−ＶＥＧＦ／ＰＫＲ−１及び−２の双方の発現を示した（データは示さず）。しかしながら、組換えＢｖ８は、インビトロで幾つかの腫瘍細胞株の増殖を刺激するのに失敗したが（Ｓ図８ｄ）、これは、Ｂｖ８が腫瘍環境において主として内皮細胞を標的としているという仮説を更に裏付けている。
【０１７８】
Ｂｖ８が腫瘍血管新生を局所的に促進しうるという仮説を実証するために、ｍＢｖ８をコードする組換えアデノウイルス（Ａｖ−Ｂｖ８）を、ＨＭ７腫瘍を持つマウス中に腫瘍内送達させた。Ａｖ−ＬａｃＺ及びＡｖ−ＶＥＧＦはそれぞれネガティブ及びポジティブコントロールとなった。組換えタンパク質の全身性効果を最小にするために、我々は低力価のウイルス（１０７ｐｆｕ）を投与した。コントロールＡｖ−ＬａｃＺと比較して、Ａｖ−Ｂｖ８は、Ａｖ−ＶＥＧＦによって誘導されるものに匹敵する腫瘍体積の増加を生じた（図４ａ）。インビトロでの観察と一致して、Ａｖ−Ｂｖ８の投与は、Ａｖ−ＬａｃＺ及びＡｖ−ＶＥＧＦと比較して亢進されたＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋の動員を生じた（図４ｂ）。より高い力価（１０９ｐｆｕ）のＡｖ−Ｂｖ８がまた腫瘍増殖を亢進させ、ＰＢ及び腫瘍におけるＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞のより高い動員を生じた（データは示さず）。
【０１７９】
腫瘍脈管構造を評価するために、Ｘ線マイクロコンピュータ断層撮影（マイクロＣＴ）を用いた（Garcia-Sanz, A.等, Hypertension 31, 440-444(1998)； Maehara, N., Eur radiol 13, 1559-1565(2003)；Kwon, H.M.等, J Clin Invest 101, 1551-1556(1998)）。マイクロＣＴは腫瘍全体の腫瘍脈管構造の全体解析をもたらし、よって、免疫組織化学検査（ＩＨＣ）のような幾らかの他のアプローチに固有の制約を克服しうる。かかる解析は、双方ともＡｖ−ＬａｃＺ群と比較して血管体積の増加（ｐ＜０．０５）を生じるので（図４ｃ）、Ａｖ−Ｂｖ８及びＡｖ−ＶＥＧＦが殆ど区別できない効果を有していたことを証明している。各処理群からの全腫瘍塊の代表的な画像が図４５ｅに示される。抽出された血管網（赤色）及び腫瘍（灰色）の表面レンダリングは、解析に用いられた体積領域を定める画像処理アルゴリズムによって作成される。ＭＥＣＡ−３２に対するＩＨＣは、コントロールＡｖ−ＬａｃＺに対して、Ａｖ−Ｂｖ８投与後のＨＭ７腫瘍における血管表面積の有意な増加を確認した（Ｓ図９ａ）。
【０１８０】
機能欠失アプローチを使用して腫瘍血管新生におけるＢｖ８の役割を更に調査するために、我々は、抗Ｂｖ８、抗ＶＥＧＦ又はコントロール抗体で処理したＨＭ７腫瘍における腫瘍脈管構造を解析した。図２に示された実験と一致して、抗Ｂｖ８処理は、コントロール処理マウスと比較して、腫瘍体積（図４ｆ）及び循環ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞（図４ｇ）の有意な減少を生じさせた。上述したものと同じマイクロＣＴ血管造影アプローチを使用して、腫瘍脈管構造の解析は、コントロール処理腫瘍に対して抗Ｂｖ８及び抗ＶＥＧＦ群双方において血管体積の有意な減少を明らかにしている（図４ｈ）。血管密度（ＶＶ／ＴＶ）もまたコントロールに対して抗Ｂｖ８及び抗ＶＥＧＦ群において有意に減少している（図４ｉ）。マイクロＣＴデータは、抗Ｂｖ８処理マウスにおける腫瘍増殖の阻害が腫瘍血管発生の阻害の結果であるという仮説を裏付けている。腫瘍全体の塊の代表的な画像は図４ｊに示す。従って、機能の得失アプローチを使用して、我々のデータは、Ｂｖ８が腫瘍血管新生の誘導を主として通じて腫瘍増殖を促進することを示している。組織検査はまた腫瘍血管新生の促進におけるＢｖ８の役割に一致していた（Ｓ図９ｂ）。Ｊｕｒｋａｔ腫瘍の内皮細胞の分析は、抗ＶＥＧＦと同様に、抗Ｂｖ８抗体の投与が腫瘍血管新生を顕著に阻害することを示している。
【０１８１】
時間依存的な形で様々な組織におけるＢｖ８の発現を特徴付けるために（図５）、我々は、ＨＭ７腫瘍を有し、コントロール又は抗ＶＥＧＦで処置されたマウスにおけるＢＭ（図５ａ）、ＰＢ（図５ｂ）、脾臓（図５ｃ）及び腫瘍（図５ｄ）中のＢｖ８タンパク質レベルを測定した。コントロール処理マウスにおけるＢｖ８タンパク質レベルの解析は、ＢＭ、ＰＢ及び脾臓への腫瘍移植の直ぐ後のピークを明らかにした。しかしながら、抗ＶＥＧＦ処理マウスは、おそらくは処置によって誘発された効果的な腫瘍抑制のために、かかる初期段階では、最小のＢｖ８の発現を示した。しかしながら、後の時点では、ＶＥＧＦ独立の腫瘍増殖の始まりと一致して、Ｂｖ８レベルは抗ＶＥＧＦ処理マウス、特にＰＢ、脾臓及び腫瘍において有意に増加した（図５ｂ−ｄ）。これらの知見と一致して、１５又は２１日の間、抗ＶＥＧＦで処置されたＡ６７３−及びＨＭ７−腫瘍の壊死領域におけるＧｒ１＋細胞の大きな浸潤が観察された（図５ｅ）。可能な説明は、抗ＶＥＧＦによって誘発された腫瘍壊死及び／又は長期の低酸素がＢＭ活性化及び好中球補充を惹起するというものである。これらの知見は、幾つかのマウス腫瘍モデルにおいて、抗ＶＥＧＦ処置がＢｖ８ｍＲＮＡのアップレギュレーションを生じることを示す初期の実験と一致しており、Ｂｖ８が抗ＶＥＧＦ療法に対する耐性に寄与するかもしれないことを示唆している（データは示さず）。腫瘍におけるＢｖ８の供給源を更に定めるために、我々は、Ａ６７３、Ｃａｌｕ−６、ＨＭ７、ＨＰＡＣ及びＪｕｒｋａｔ腫瘍中の細胞集団をＣＤ１１ｂ＋及びＣＤ１１ｂ−画分に細分画した。ＴａｑｍａｎＴＭ解析は、負の画分と比較して、ＣＤ１１ｂ＋コンパートメントにおいてｍＢｖ８転写物の有意なアップレギュレーションを示した（図５ｆ）。しかしながら、ヒトＢｖ８プライマーを使用して、ＰＣＲは何れの集団（図５ｆ）においても、ヒトＢｖ８、つまり腫瘍関連ＣＤ１１ｂ＋及びＣＤ１１ｂ−は同定されず、腫瘍間質、特に骨髄細胞が試験された全ての腫瘍におけるＢｖ８の主要な供給源であることを示唆している。これらの知見と一致して、試験された腫瘍細胞株は何れもＥＬＩＳＡによるインビトロのＢｖ８タンパク質の検出可能なレベルを生じさせなかった（データは示さず）。
【０１８２】
従って、抗Ｂｖ８処理は、抗ＶＥＧＦと組み合わせた場合に最も効果的であるかもしれない。この仮説を試験するために、我々はマウスにＨＭ７（図６ａ）又はＡ６７３細胞（図６ｂ）を移植し、腫瘍が〜４００ｍｍ３体積に達した後に処置を開始した。低い腫瘍内Ｂｖ８レベルの存在と一致して、抗Ｂｖ８処置は、初期段階の処置と比較して、ＨＭ７及びＡ６７３腫瘍の双方において腫瘍増殖阻害について効果が少なかった（図２）。抗ＶＥＧＦはより完全な阻害をもたらしたが、腫瘍は最終的に逃げた。しかしながら、抗ＶＥＧＦ及び抗Ｂｖ８処置の組合せは、各単独療法と比較して有意に（ｐ＜０．０５）腫瘍増殖を阻害した。同様に、併用療法は、その双方が抗ＶＥＧＦ処置に対して不応性であるＴＩＢ４２（図２ｅ）及びＥＬ４マウスリンパ腫（図６ｃ）において腫瘍体積及び重さの有意な減少を生じた。従って、我々のデータは、抗Ｂｖ８処置が、抗ＶＥＧＦ処置に対して不応性である腫瘍における併用療法に対して潜在性を有していることを示唆している。
【０１８３】
抗Ｂｖ８の効果が免疫不全マウスに限定されないことを証明するために、我々は、マウス抗ＶＥＧＦ耐性ＥＬ４細胞株を免疫不全及び免疫適格双方のマウスに移植し、抗Ｂｖ８又は抗ＶＥＧＦ単独療法、並びに併用の効果を試験した。図６、ｃ＆ｄに示されるように、かかる処置の効果は二つの株において殆ど識別不能であった。これらの知見は、抗Ｂｖ８が未処置の免疫系の存在下でさえ腫瘍増殖を抑制しうることを示している。この結論の更なる裏付けにおいて、抗Ｂｖ８処置は免疫適格マウスにおけるＲｉｐ−Ｔａｇ多段階発癌モデルでの血管新生スイッチを阻害する（未公開観察）。
【０１８４】
細胞傷害剤はＢＭからの造血細胞の動員を生じることが知られている（Neben, S.等, Blood 81, 1960-1967(1993)）。更に、化学療法により誘導された腫瘍壊死は、Ｇ−ＣＳＦのようなケモカインの放出と、続く好中球生産における代償性増加を生じせしめうる（Kavgaci, H.等, J Exp Clin Cancer Res 21, 475-479(2002)）。従って、我々は、単独で又は抗ＶＥＧＦとの併用での細胞傷害剤での処置が、抗Ｂｖ８処置の効果に影響を及ぼしうるかどうかを調査探求した。この目的のために、マウスにＡ６７３細胞を移植し、シスプラチン単独で、又は抗Ｂｖ８、抗ＶＥＧＦとの併用で又は二つの治療の併用で、処置した。血清中のＢｖ８レベルは、シスプラチン単独又は抗ＶＥＧＦとの併用で処置されたマウスにおいて有意に（ｐ＜０．０５）増加した（図６ｅ）。抗Ｂｖ８及び抗ＶＥＧＦの双方がシスプラチンの抗腫瘍活性を亢進させた。しかしながら、シスプラチンプラス抗ＶＥＧＦ及び抗Ｂｖ８の組合せは、Ａ６７３の腫瘍増殖の略完全な阻害を生じた（ｐ＜０．０５；図６ｆ）。従って、抗Ｂｖ８処置は、抗ＶＥＧＦ又は細胞傷害剤と併用される相加薬剤として使用されるかも知れない。Ｓ図８は腫瘍形成におけるＢｖ８の役割に対するモデルを示す。
【０１８５】
増加する証拠が、骨髄細胞の腫瘍動員又は血管新生特性の何れかに影響を及ぼすことは新規な抗癌方策となりうることを示唆している（Shojaei, F.等, Nature Biotechnol 25:911-20(2007)）。しかしながら、この目標を達成する際の進歩はメディエーターの複雑さと潜在的な重複性によって妨げられてきた。我々の知見は、かかる複雑性にも拘わらず、単一のサイトカインＢｖ８の作用の阻害が複数の腫瘍型の増殖に対して有意なインパクトを有していることを示している。よって、これらのデータは、Ｂｖ８又はそのレセプターが未来の抗血管新生療法のための治療標的となる可能性を提起する。異なった腫瘍型及び腫瘍進行の異なった段階におけるこのシグナル伝達系の役割を更に定めるために更なる研究が必要とされる。興味深いことに、最近の研究は、Ｇ−ＣＳＦの投与が腫瘍増殖を加速させうることを示している（Okazaki, T.等，上掲； Hirbe, A.C.等,Blood 109, 3424-3431(2007)）。Ｂｖ８のアップレギュレーションがかかる効果に寄与するかどうかは、更なる研究に値する興味深い可能性である。逆に、抗Ｇ−ＣＳＦ抗体は、Ｂｖ８の発現を減少させることによって、腫瘍増殖を阻害するかもしれない。我々の研究室はこの可能性を研究している。
【０１８６】
最後に、Ｂｖ８の発現がＧ−ＣＳＦにかかる精巧に応答性であるという知見は、好中球分化及び生産の調節に関与する主要な恒常性機序にＢｖ８を関係づける。従って、Ｂｖ８が、炎症性細胞媒介血管新生の非腫瘍タイプを含む、より広い病態生理学的役割を担っているという可能性がある。
【０１８７】
実施例２
材料と方法
新鮮な骨髄採取物からの全ヒト骨髄細胞の単離
新鮮な骨髄試料をＡＬＬＣＥＬＬＳ（Emeryville, CA）から得た。その骨髄を最初に１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで希釈し、ついで４０μｍの細胞ストレーナー（BD Biosciences, Bedford, MA）に通して組織片を除去した。細胞を１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、赤血球細胞を、氷冷の０．２％ＮａＣｌの存在下で３０秒間溶解させた後、氷冷の１．６％ＮａＣｌを加えた。
【０１８８】
末梢血からの好中球、単球及びリンパ球の単離
単離手順は過去に記載された通りである（Kulczycki A, Jr.J Immunol 133:849-854(1984)）が、些細な変更を行った。簡潔に述べると、新鮮にヘパリン処理された健康なヒト血液（Health Services, Genentech Inc.）をＣＡＰＰＥＬ ＬＳＭリンパ球分離培地（MP Biomedicals, Solon, Ohio）に適用した。ブレーキなしで３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、血漿を除き、単球を静止期に集めた。Ｍｏｎｏｃｙｔｅ単離キットＩＩ（Miltenyi Biotec, Auburn, CA）及びＦＡＣＳ選別法を使用して単球を更に精製した。細胞集団の純度はＣＤ１４＋ＣＤ１６−発現によってＦＡＣＳで評価した。カラムに結合する細胞を集めることによってリンパ球を収集し、その純度を、Ｔリンパ球ではＣＤ３の発現により、Ｂリンパ球についてはＣＤ１９の発現により、検査した。好中球は、赤血球細胞の直ぐ上の層を注意して除去し、ついで０．９％ＮａＣｌで調製したＨＢＳＳ（Ｃａ２＋及びＭｇ２＋のない）及び６％デキストラン５００（GE Healthcare Bio-sciences AB, Sweden）を添加することによって収集した。赤血球細胞を室温で３０−６０分静置させた後、上清中の好中球を除去した。残留している赤血球細胞は、その＞９−％が除去されるまで、更に除去した。細胞の純度は、ＣＤ１５＋ＣＤ１６＋集団としてＦＡＣＳ分析によって評価した。末梢血からの３種の集団全て（好中球、単球及びリンパ球）は、ＦＡＣＳ及び形態分析により＞９５％の純度であった。細胞をついで０．２％のＢＳＡを含むＨＢＳＳ（低エンドトキシン、Serologicals, Corp.Norcross, GA）で使用前に一回洗浄した。
【０１８９】
Ｔａｑｍａｎによる遺伝子発現解析
ＲＮｅａｓｙＴＭミニキット（Qiagen）を使用してＲＮＡを調製した。一反応当たり５０ｎｇの全ＲＮＡをリアルタイムＰＣＲ（Taqman）分析に使用した。ヒトＢｖ８に対して、精巣ＲＮＡ（BD Biosciences）をコントロールとした。反応は、７５００リアルタイムＰＣＲシステム（Applied Biosystems, Foster City, CA）の９６００Ｅｍｕｌａｔｉｏｎモードで操作し、標準曲線を用いた絶対的定量化をＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＳＤＳ）ソフトウェアと共に使用した。各遺伝子の発現レベルを、同じ試料中のハウスキーピング遺伝子ＲＰＬ１９に対して更に定量した。Ｔａｑｍａｎプライマーの配列は次の通りである：ヒトＢｖ８順方向：ＡＴＧ  ＧＣＡ  ＣＧＧ  ＡＡＧ  ＣＴＡ  ＧＧＡ（配列番号１０）、逆方向：ＧＣＡ  ＧＡＧ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＴＣＣ  ＴＣＴ  ＴＧＡ（配列番号１１）、プローブ：ＴＧＣ  ＴＧＣ  ＴＧＧ  ＡＣＣ  ＣＴＴ  ＣＣＴ  ＡＡＡ  ＣＣＴ（配列番号１２）；  ヒトＲＰＬ１９順方向：ＣＧＣ  ＡＡＧ  ＣＧＣ  ＣＧＴ  ＧＡＡ（配列番号２８）、逆方向：ＧＧＴ  ＣＴＣ  ＴＴＣ  ＣＴＣ  ＣＴＴ  ＧＧＡ  ＴＡＡ  ＡＧＴ  Ｃ（配列番号２９）、プローブ：ＣＣＡ  ＧＧＣ  ＣＡＡ  ＧＡＡ  ＧＧＡ  ＧＧＡ  ＧＡＴ  ＣＡＴ  ＣＡ（配列番号３０）．ヒト特異的ＶＥＧＦ順方向：ＡＡＴ  ＧＡＣ  ＧＡＧ  ＧＧＣ  ＣＴＧ  ＧＡＧ  Ｔ（配列番号３１）、逆方向：ＴＴＧ  ＡＴＣ  ＣＧＣ  ＡＴＡ  ＡＴＣ  ＴＧＣ  ＡＴＧ（配列番号３２）、プローブ：ＴＧＴ  ＧＣＣ  ＣＡＣ  ＴＧＡ  ＧＧＡ  ＧＴＣ  ＣＡＡ  ＣＡＴ  ＣＡ（配列番号３３）。
ヒトＰＫＲ１／ＥＧ−ＶＥＧＦＲ１及びＰＫＲ２／ＥＧ−ＶＥＧＦＲ２に対するＴａｑｍａｎ試薬はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから得られた。
【０１９０】
培養した血液細胞中でのＢｖ８遺伝子発現の調節
組換えヒトＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−２、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＤＦ−１ａ、Ｍ−ＣＳＦ、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）及びＴＮＦαをＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Minneapolis, MN）から購入した。組換えヒトＩＬ−８、ＩＦＮｇ、Ｂｖ８（プロキネチシン−２）、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＴＧＦ−ｂはＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社（Rocky Hill, New Jersey）から購入した。ＳＣＦ（幹細胞因子）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ（Carlsbad, CA）からであった。ある場合には、ＡｍｇｅｎからのＧ−ＣＳＦ（Neupogen/Filgrastim）を使用した。全てのサイトカインは、１０ｎｇ／ｍｌで使用した。新鮮に精製した細胞を洗浄し、０．２％のＢＳＡを含むＨＢＳＳ培地（低エンドトキシン、Serologicals Corp.Norcross, GA）に再懸濁させた。二百万の細胞を、５％のＣＯ２インキュベーター中において３７℃で４時間、様々なサイトカイン及びケモカインと共に２４ウェルプレートでインキュベートした。ついで、細胞をエッペンドルフ管に移し、遠心分離し、ＲＮＡ溶解バッファー（Qiagen, Valencia, CA）によって溶解させた。Ｂｖ８の発現を内部コントロール遺伝子としてＲＰＬ１９（リボソームタンパク質Ｌ１９）を用いてＴａｑｍａｎによって評価した。
【０１９１】
末梢血好中球からのＢｖ８タンパク質の部分的精製
５００ｍｌの新鮮なヒト血液からの好中球を、上述のようにして単離した。細胞ペレットをプロテイナーゼ阻害剤（Roche）と共に１０ｍｌの０．５％トリトンＸ−１００中に懸濁させ、４℃でシェイカーにて１０分間溶解させた。ついで、細胞可溶化物を２５ゲージ針に２回強制的に通し、塩濃度を５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．３）に調節した。粗抽出物を、２０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．２、５０ｍＭのＮａＣｌ及び０．５％のトリトンＸ−１００で事前に平衡にしたヘパリン−セファロースカラム（Amersham Biosciences, Sweden）に充填した。０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の存在下で２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．３中５０ｍＭから２０ｍＭのＴｒｉｓの線形勾配を使用してカラムを溶出させた。流量は１ｍｌ／分であった。２８０ｎｍでの吸光度をモニターした。１ｍｌの画分を集め、ＥＬＩＳＡによってヒトＢｖ８についてアッセイした。ピークＢｖ８画分及び幾つかのオフピーク画分をついでプール化し、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｕｌｔｒａｃｅｌ ＹＭ−３（Millipore, Bedford, MA）を使用して１０倍まで濃縮し、その生物学的活性について試験した。
【０１９２】
ヒトＢｖ８ＥＬＩＳＡ
ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）９６ウェルマイクロウェルプレート（Nalge NuncInternational, Rochester, NY）に、４℃で一晩、５０ｍＭの炭酸塩バッファー、ｐＨ９．６中の１．０μｇ／ｍｌの３Ｆ１マウスモノクローナル抗体（Genentech Inc.）を被覆した。プレートを、０．０５％のポリソルベート２０を含むＰＢＳで洗浄し、室温で１時間、ＰＢＳ中の０．５％のウシ血清アルブミン、１５ｐｐｍ（百万分率）のＰｒｏｃｌｉｎ３００（Supelco, Bellefonte, PA）でブロックした。プレートを洗浄後、０．５％のウシ血清アルブミン、０．０５％のポリソルベート２０、１５ｐｐｍのＰｒｏｃｌｉｎ３００（Supelco, Bellefonte, PA）及び０．３５ＮのＮａＣｌを含むＰＢＳ（サンプルバッファー）中のヒトＢｖ８標準（２倍連続希釈での０．０２０−２．５ｎｇ／ｍｌ、PeproTech, Rocky Hill, NJ）及び試料（最小１：１０希釈）を連続希釈し各ウェルに加えた。プレートを室温で２時間インキュベートした後、洗浄工程を続けた。結合したＢｖ８は、二次抗体、ビオチン化ハムスター抗Ｂｖ８抗体クローン３Ｂ８（Genentech Inc.）と、ついで基質としてストレプトアビジン−ＨＲＰ（GE Healthcar, Buckinghamshire, United Kingdom）と３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD）を加えることによって検出した。１Ｍのリン酸を加えることによって反応を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をＴｈｅｒｍｏＭａｘマイクロプレートリーダー（Molecular Devices, Menlo Park, CA）で読み取った。４パラメーター回帰曲線適合化プログラム（Genentech Inc）を使用して標準の滴定曲線を計算した。ヒトＢｖ８濃度は、標準曲線におけるデータ範囲に試料の光学密度値を外挿することによって計算した。Ｂｖ８ＥＬＩＳＡは、１０％の溶解バッファーまで測定することができ、組織可溶化物中の０．２０ｎｇ／ｍｌと少ないＢｖ８を検出する感度を有していた。ＥＬＩＳＡを特に開発し、Ｂｖ８に対して最適化したのは、３０μｇ／ｍｌまでのヒトＥＧ−ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃ及びＧ−ＣＳＦ（R&D Systems, Minneapolis, MN）だけがバックグラウンドシグナルを与え；３０μｇ／ｍｌまでのこれらの分子及び抗ＶＥＧＦ（Genentech Inc.）の存在がサンプルバッファー中１００ｐｇ／ｍｌのヒトＢｖ８の検出に影響を及ぼさなかったためである。このＥＬＩＳＡはマウスＢｖ８もまた検出できたが、７％未満の感度であった。
【０１９３】
Ｂｖ８生物活性アッセイ
ＧｅｎｅＢＬＡｚｅｒ（登録商標）ＮＦＡＴ−ＣＨＯ細胞をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Carlsbad, CA）から得た。細胞にＰＫＲ１／ＥＧ−ＶＥＧＦＲ１を安定に形質移入し、１０％の透析血清、０．１ｍＭのＮＥＡＡ、２ｍＭのＧｌｕｔａＭａｘＴＭ（Gibco）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０μｇ／ｍｌのＺｅｏｃｉｎ、５００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含むＤＭＥＭ（高グルコース）中で増殖させた。５％ＣＯ２、３７℃で、細胞を９６ウェルＶｉｅｗｐｌａｔｅ（Packard）に１％のＤＭＥＭ中８０ｍｌ／ウェル中、２．５×１０４で一晩かけて播種した。次の日に、細胞を、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅからのＭｉｃｒｏｃｏｎ遠心フィルター装置（Ultracel YM-3）で濃縮した様々なカラム画分で処理した。１％のＤＭＥＭ中で調製した０．２−０．０２ｎｇ／ｍｌのｈＢｖ８（Peprotech Inc.）をポジティブコントロールとして用いた。１時間後、培地を取り除き、０．１％のＢＳＡを含む８０ｍｌのハンクス液及び１ｍＭのＣＣＦ４（Invitrogen Corporation）を含む６×の充填バッファーと置き換えた。プレートを暗所で室温で１．５時間インキュベートし、４１０ｎｍの励起波長と４５０／５２０ｎｍの発光波長にてＷａｌｌａｃプレートリーダーで読み取った。ネガティブコントロールはリガンドを添加していない細胞であり、コントロールは培地単独であった。ＣＨＯ細胞を、β−ラクタマーゼ基質ＣＣＦ４を添加する前に１時間、組換えヒトＢｖ８又はプール化画分で刺激した。カラム画分の特異性を評価するために、抗Ｂｖ８抗体２Ｂ９及び３Ｆ１を２０ｍｇ／ｍｌで加えた。
【０１９４】
Ｇ−ＣＳＦ処理ドナーからの白血球細胞の分析
末梢白血球細胞は、アフェレーシス収集物（Cellular Therapy and Cell Processing Facilities, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA）によるＧ−ＣＳＦ処理の４−５日後に正常なドナーから得た。未処置個体からの白血球細胞を同じ手順で集め、不対コントロールとした。ついで、細胞を濃縮し、ヒト血清アルブミンと１０％のＤＭＳＯを含む凍結保護培地中に再懸濁させた。３７℃の水浴での解凍後、細胞生存率は、トリパンブルー排除試験で＞９５％であった。０．２％のＢＳＡを含むＨＢＳＳバッファーで細胞を簡単に洗浄し、ＲＮＡ抽出又はタンパク質測定のために、ＲＮＡ溶解バッファー（Qiagen）又はプロテイナーゼ阻害剤含有ＲＩＰＡバッファー（Roche）の何れかに溶解させた。
【０１９５】
末梢血好中球の化学走性
１０６細胞を、５μｍの孔径を有するトランスウェルインサート（Corning Incorporated, Lowell, MA）中に入れる前に、０．２％のＢＳＡを含むＨＢＳＳで洗浄した。下方のチャンバーに、培地単独又は様々なサイトカインを様々な濃度（最大２００ｎｇ／ｍｌ）で含む培地を添加した。３７℃で３時間後、下方チャンバー内の細胞を移し、９ｍｌのＺＰＡＫ溶液と混合し、Ｚ２Ｃｏｕｌｔｅｒ粒子カウント及びサイズアナライザー（Beckman Coulter, Fullerton, CA）でカウントした。
【０１９６】
ヒト白血病細胞の培養
Ｕ９３７、ＨＬ−６０、ＴＨＰ−１、Ｈｅｌ９２．１．７、ＫＧ−１、Ｋ５６２、Ｊｕｒｋａｔ細胞をＡＴＣＣ（登録商標）（Manassas, VA）から得た。殆どの細胞は１０％のＦＢＳを含有するＲＰＭＩ中で増殖させた。ＫＧ−１細胞は、２０％のＦＢＳを含有するＩｓｃｏｖｅの変法ダルベッコ培地で増殖させた。ＴＨＰ−１細胞では、１０％のＦＢＳを含有するＲＰＭＩを、ピルビン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ及びβ−メルカプトエタノールと共に使用した。調節の研究では、９５％より高い生存率の百万の細胞を使用した。調節研究は、０．２％のＢＳＡを含む１ｍｌのＨＢＳＳ培地中で４時間、正常酸素圧及び低酸素の双方の条件下で実施した。
【０１９７】
統計解析
スチューデントｔ検定を使用して統計的有意性を計算した。
【０１９８】
結果
ヒト骨髄及び様々な血液細胞におけるＢｖ８の調節
Ｇ−ＣＳＦが、マウス骨髄細胞及び末梢好中球におけるＢｖ８発現の劇的なアップレギュレーション（＞３０倍）を生じせしめることが過去に報告されている（Shojaei等 Nature 450:825-831(2007)及び実施例１）。
本研究では、Ｇ−ＣＳＦがまた単離されたヒト末梢好中球及び全骨髄細胞におけるＢｖ８の発現の誘導因子であるかどうかが評価された。１０ｎｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦが４時間以内にＢｖ８の発現の平均７倍（６−１２の範囲）の誘導を生じさせた。マウス好中球と比較して低い倍率の増加は、少なくとも部分的には、ヒト細胞におけるＢｖ８のより高い基礎発現のためでありうる（データは示さず）。時間経過研究は、Ｇ−ＣＳＦがＢｖ８ｍＲＮＡを４時間以内に誘導し、効果が２４時間まで維持された（データは示さず）ことを示している。我々はヒト骨髄細胞及び好中球におけるＢｖ８の発現の更なるポジティブな調節因子としてＧＭ−ＣＳＦを同定した（図１４Ａ及びＢ）。Ｂｖ８の発現における有意な〜２．５倍の増加が１０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦで観察された。これは、ＧＭ−ＣＳＦによるＢｖ８誘導を示さないマウス好中球とは異なる。ＩＬ−６、ＩＬ−１β、及びＥＰＯ（エリスロポイエチン）を含む試験した他のサイトカインは、好中球又は骨髄細胞中でのヒトＢｖ８の発現に対して刺激効果を有していなかった。
【０１９９】
好中球とは異なり、単球及びリンパ球はＧ−ＣＳＦに応答したＢｖ８発現の変化を示さなかった（図１４Ｃ及びＤ）。驚いたことに、ＧＭ−ＣＳＦはヒト単球においてＢｖ８の発現を低下させ、４時間の処理で約７５％の阻害であった。ＩＬ−１０は単球及びリンパ球においてＢｖ８の発現をアップレギュレートしたが、ＳＤＦ−１αは単球にのみ有意な刺激効果を示した（図１４Ｃ及びＤ）。好中球又は骨髄細胞中のものと比較して低い基底レベルのＢｖ８の発現が単球及びリンパ球において見出された（データは示さず）。
結論としては、好中球におけるＢｖ８遺伝子発現に対するＧ−ＣＳＦ及びＧＭ−ＣＳＦの効果は、Ｍ−ＣＳＦとＳＣＦの二つの関連するサイトカインが効果を持たないので、全くユニークであった。
【０２００】
ヒト骨髄細胞及び好中球におけるＢｖ８レセプターの調節
ＰＫＲ１／ＥＧ−ＶＥＧＦＲ１とＰＫＲ２／ＥＧ−ＶＥＧＦＲ２の双方を発現するマウス好中球とは異なり、単離されたヒト好中球は、ＰＫＲ２／ＥＧ−ＶＥＧＦＲ２のみを検出可能なレベルで発現する。インビトロでの４時間のインキュベーション後に、Ｇ−ＣＳＦではなくＧＭ−ＣＳＦがＰＫＲ２／ＥＧ−ＶＥＧＦＲ２発現の有意なアップレギュレーション（平均４倍の誘導）を誘発した（図１５Ａ）。ヒト骨髄において、Ｇ−ＣＳＦとＧＭ−ＣＳＦの双方が有意なレベルでＰＫＲ２／ＥＧ−ＶＥＧＦＲ２を調節すると思われる（図１５Ｂ）。
【０２０１】
Ｇ−ＣＳＦで処理したドナーからの動員された末梢単核細胞におけるＢｖ８及びＰＫＲ２／ＥＧ−ＶＥＧＦＲ２のアップレギュレーション
１１名の未処置及び１２名のＧ−ＣＳＦ処置個体からの末梢血単核細胞をアフェレーシス収集を介して得た。我々はＴａｑｍａｎによってＢｖ８の遺伝子発現を調べ、またＥＬＩＳＡによってＢｖ８タンパク質レベルを測定した。Ｂｖ８の発現の約４．５倍の増加とタンパク質レベルの１０倍の増加が、未処置ドナーからの単核細胞と比較してＧ−ＣＳＦ動員単核細胞において検出された（図１６）。同様に、ＰＫＲ１／ＥＧ−ＶＥＧＦＲ１ではなくＰＫＲ２／ＥＧ−ＶＥＧＦＲ２が、患者が４−５日間、Ｇ−ＣＳＦで処置された場合に臨床的に収集された白血球細胞中で検出可能であった。Ｇ−ＣＳＦ処置個体からの単核細胞は、未処置コントロール試料と比較して、ＰＫＲ２／ＥＧ−ＶＥＧＦＲ２発現の有意な誘導（〜２倍）を示した（図１６Ｂ）。
【０２０２】
ヒト好中球によって生産されるＢｖ８は生物学的に活性である
Ｂｖ８タンパク質を特徴付けるために、我々は、０．５％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００中に末梢ヒト好中球ペレットを溶解させた。ついで、好中球可溶化物に、材料と方法に記載されたようにして、ヘパリン−セファロースアフィニティークロマトグラフィーを施した。図１４Ａに示されているように、マウスＢｖ８タンパク質と同様に、Ｂｖ８はカラムに結合し、〜０．４ＭのＮａＣｌの存在下で溶出した。ＥＬＩＳＡは更に画分９、１０及び１１におけるＢｖ８の存在を確認した（図１７Ａ）。
微量のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００でさえ増殖アッセイにおいて内皮細胞に有意に細胞毒性であることが見出されているので、我々は、より短い刺激時間を必要とするアッセイにおいて好中球誘導Ｂｖ８タンパク質の活性を試験した。我々は、材料と方法に記載されているように、ＰＫＲ１／ＥＧ−ＶＥＧＦＲ１が安定して形質移入されたＣＨＯ細胞を利用した。予想されたように、組換えヒトＢｖ８（０．２−２００ｎｇ／ｍｌ）は用量依存的な刺激を誘発した（データは示さず）。図１７Ｂに示されるように、免疫反応性Ｂｖ８を含むカラム画分は、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００バッファーコントロールと比較して有意な刺激を示した。しかしながら、免疫反応性Ｂｖ８を含まない副画分は刺激効果を示さなかった。また、抗Ｂｖ８抗体はプールされたＢｖ８含有画分による刺激をブロックした。２００ｎｇ／ｍｌまで試験されたＶＥＧＦ−Ａは、反応を誘発せず、効果の特異性を更に確認した。
【０２０３】
好中球遊走に対するＢｖ８の効果
我々は、Ｂｖ８がヒト好中球に対して化学走性を有しうる可能性を試験した。図１８に示されるように、Ｂｖ８は、最大コントロールの〜３倍の効果で、化学走性の有意な刺激を誘導した。興味深いことに、最大の刺激は非常に低いＢｖ８濃度（〜２ｐＭ）で生じた。同様なパターンが６名の独立したドナーで観察された（図１８）。ＳＤＦ−１α、ＩＬ−８及びＧ−ＣＳＦのような他の化学走性因子は、好中球遊走を刺激するためにより高い濃度（２０ｎＭ）を必要とした。ＶＥＧＦ及びＭＣＰ−１は試験した全ての濃度で効果を示さなかった（データは示さず）。
【０２０４】
様々なヒト白血病細胞株におけるＢｖ８の発現とＧ−ＣＳＦによる調節
Ｂｖ８が白血病細胞によって発現されるかどうかを決定するために、我々はヒト細胞株のパネルを試験した。Ｂｖ８の発現は、Ｊｕｒｋａｔ及びＫ５６２細胞株では検出可能ではなかった（データは示さず）。しかしながら、検出可能なＢｖ８ｍＲＮＡレベルが、ＨＬ−６０、ＫＧ−１、Ｈｅｌ９２．１．７及びＵ９３７細胞株で見出された。１０ｎｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦが、幾つかの細胞株においてＢｖ８の発現の増加（２−３倍）を誘導した（追加の表２）。しかしながら、試験された細胞株の何れにおいてもＧＭ−ＣＳＦによる有意な誘導は観察されなかった。Ｇ−ＣＳＦもＧＭ−ＣＳＦも急性前骨髄球性白血病細胞株ＨＬ−６０中でのＢｖ８の発現に影響しなかった。
【０２０５】
考察
好中球及び他の骨髄細胞は自然免疫におけるその役割が最もよく知られており、病原に対する第一線の保護を与える（Bendelac及びFearon, Curr Opin Immunol 9:1-3(1997)。また、様々な急性及び慢性炎症性過程へのこれら細胞の参加はよく確立されている（O'Shea及びMurray, Immunity 28:477-487(2008)。更に、炎症性細胞と癌の間の関連は、元々は１９世紀に提案されていたが、最近広い実験的及び臨床的裏付けが得られた（Coussens及びWerb, Nature 420:860-867(2002)；Lin及びKarin, J Clin Invest 117:1175-1183(2007)で概説）。様々な炎症誘発性サイトカイン及びケモカインの分泌腫瘍増殖及び血管新生を直接促進しうる。更に、腫瘍浸潤骨髄細胞は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞を含むＴ細胞のサブタイプ、よって、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の少なくともサブセットに対する骨髄誘導サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の種類における免疫応答をダウンレギュレートするその能力によって腫瘍増殖を容易にしうる（Talmadge JE, Clin Cancer Res 3:5243-5248(2007)で概説）。
【０２０６】
最近の研究は、骨髄細胞がまた腫瘍モデルにおいてＶＥＧＦ阻止剤に対して不応性を媒介するのに所定の役割を担っているという仮説を試験している（Shojaei等, Nature Biotechnology 25:911-920(2007))。抗ＶＥＧＦ不応性腫瘍には、感受性のものと比較して、腫瘍浸潤ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の頻度の有意な増加が伴っていた（Shojaei等，上掲）。ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞によって媒介されるＶＥＧＦ独立血管新生の機構の評価において、分泌されたタンパク質Ｂｖ８のオルソログを重要な調節因子として同定した（Shojaei等, Nature 450:825-831(2007)）。実施例１に提供されたデータを含むこれらの研究は、Ｂｖ８が、異種移植片においてばかりではなく（Shojaei等, Nature, 2007, 上掲）、癌進行のトランスジェニックマウスモデルにおいても（Shojaei等, ProcNatl Acad Sci USA 105:2640-2645(2008)）、腫瘍発達中の骨髄細胞動員及び血管新生のメディエーターであるという証拠を与えた。
【０２０７】
現在の研究はヒト骨髄及び成熟血液細胞におけるＢｖ８の発現を特徴付けることを目的としている。我々の解析は、様々なサイトカインによるヒト血液細胞中におけるＢｖ８の発現の調節が細胞型特異的であることを示している。マウスと同様に、最も高いＢｖ８の発現は骨髄細胞と好中球にある一方、低いレベルは単球とリンパ球で検出された。Ｂｖ８タンパク質が生物学的に活性であることを証明するために、Ｂｖ８をヒト好中球から部分的に精製し、その活性をバイオアッセイで文献化した。更に、本研究では、インビトロで非常に低い濃度で好中球の遊走を促進する能力というＢｖ８の新規な活性を同定したが、これは、潜在的には好中球以外の供給源からのＢｖ８が好中球遊走を生理学的に調節しうることを示唆している。また、本結果は、Ｂｖ８の二つのレセプターの中で、ＰＫＲ２／ＥＧ−ＶＥＧＦＲ２のみが単離されたヒト好中球及びＧ−ＣＳＦ動員細胞の双方において発現されたことを示しており、これが確かにＢｖ８の造血効果に関与する主要なレセプターであることを示唆している。
【０２０８】
Ｇ−ＣＳＦは、単球とリンパ球に効果を有していなかったが、好中球と骨髄細胞におけるＢｖ８発現の主要な誘導因子であった。重要なことには、Ｂｖ８アップレギュレーションは、Ｇ−ＣＳＦ処置ドナーからの末梢血中での発現増加によって評価されるようにインビボで証明できた。Ｇ−ＣＳＦは、腫瘍微細環境内の間質細胞、線維芽細胞及び内皮細胞によって生産されうる。ＧＭ−ＣＳＦによるヒト好中球及び骨髄細胞中でのＢｖ８のアップレギュレーションは興味深いが、その理由は、この因子がマウス単核細胞においてそのような効果を誘発しなかったためである。確かに、Ｇ−ＣＳＦとＧＭ−ＣＳＦの双方が、骨髄からの好中球及び単球の増殖、分化、生存及び成熟を調節することが知られている。また、双方の因子は、線維芽細胞、内皮細胞、ケラチノサイト及び腫瘍細胞を含む様々な非造血系細胞によって生産されうる。更に、幾つかのレポートは、少なくとも実験系において、コロニー刺激因子が悪性腫瘍増殖を促進しうることを示唆している（Karcher 等, Int J Cancer 118:2182-2189(2006)；Morales-Arias等, Cancer 110:1568-1577(2007)；Okazaki等, International Immunology 18:1-9(2006)）。
【０２０９】
ＩＬ−１０とＳＤＦ−１αの双方がヒト単球においてＢｖ８の発現を有意にアップレギュレートした。リンパ球では、ＩＬ−１０がＢｖ８の発現の主要な誘導因子であった。興味深いことに、多くの証拠が、ＶＥＧＦのような血管新生因子の分泌における腫瘍浸潤マクロファージ及びリンパ球に対する役割を裏付けている（Freeman等, Cancer Res 55:4140-4145(1995)；Lewis及びMurdoch, Am J Pathol 167-627-635(2005)）。従って、これらの細胞型によって生産されるＢｖ８は血管新生に寄与し得、定められる必要が残っている更なる調節的役割をまた有しているかも知れない。Ｔヘルパー２（Ｔｈ２）細胞によって生産されるサイトカインとして元々は記載されているが（Boyman等, Curr Opin Immunol 19:320-326(2007)）、ＩＬ−１０はまた血管新生に関連していた（Silvestre等, Circ Res. 87:448-452(2000)；Sakamoto等, Int J Cancer 118:1909-1914(2006））。
【０２１０】
結論を述べると、我々の研究は、ヒト造血系細胞におけるＢｖ８の発現及び調節はマウスに対して実質的に保存されていることを証明しており、ヒト腫瘍及び炎症性疾患におけるＢｖ８の病態生理学的役割の更なる調査及びＢｖ８阻害剤の治療的応用に対する基礎を提供する。
【０２１１】
明細書を通して引用した全ての文献はその全体を出典明示によりここに明示的に援用する。
本発明を特定の実施態様であると考えられるものを参照して説明したが、発明はかかる実施態様に限定されないことが理解されなければならない。それどころか、発明は、添付の特許請求の範囲の精神及び範囲内に含まれる様々な変形及び均等物をカバーするものである。
特許請求の範囲を含む本願の全体を通して、「含む（comprising）」なる用語は、更なる記載されていない要素又は方法工程を排除しない包括的でオープンな連結語句として使用される。
【図１Ａ】
0005615709.tif 000003
【図１Ｂ】
0005615709.tif 000004
【図１Ｃ】
0005615709.tif 000005
【図１Ｄ】
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【図１Ｅ−Ｆ】
0005615709.tif 000007
【図１Ｇ】
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【図１Ｈ−Ｉ】
0005615709.tif 000009
【図１Ｊ】
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【図２Ａ−Ｂ】
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【図２Ｃ−Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ−Ｄ】
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【図４Ａ−Ｅ】
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【図４Ｆ−Ｊ】
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【図５Ａ−Ｂ】
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【図５Ｃ−Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ−Ｂ】
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【図６Ｃ−Ｄ】
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【図６Ｅ−Ｆ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ−Ｂ】
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【図１８Ｃ−Ｄ】
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【図１８Ｅ−Ｆ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ−Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２０Ｆ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ−Ｆ】
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【図２１Ｇ】
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【図２１Ｈ】
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【図２１Ｉ−Ｊ】
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【図２２Ａ−Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｅ】
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【図２３Ａ−Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２６Ａ−Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２７Ａ−Ｂ】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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