(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：７、１１または１２から選択されるアミノ酸配列に特異的に結合することができる１つ以上のポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化もしくはヒトＮＩＫ抗体および／またはその断片を含有する調製物。
【請求項２】
前記抗体がＩｇＧ抗体である請求項１記載の抗体調製物。
【請求項３】
前記抗体または抗体断片がマウス由来である請求項１記載の抗体調製物。
【請求項４】
前記抗体断片が、単鎖Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2およびＣＤＲからなる群より選択される請求項１記載の抗体調製物。
【請求項５】
（ａ）ウエスタンイムノブロッティング解析；
（ｂ）ＥＬＩＳＡ；または
（ｃ）免疫沈降
によってＮＩＫを特異的に検出することができる請求項１〜４のいずれかに記載の抗体調製物。
【請求項６】
前記抗体が、非ヒト哺乳動物を、配列番号：７、１１または１２に記載のアミノ酸配列を含むペプチドで免疫化することによって調製される請求項１〜５のいずれかに記載の調製物。
【請求項７】
マウスＮＩＫを検出することができる請求項６記載の調製物。
【請求項８】
齧歯類を免疫化することにより調製される請求項６記載の調製物。
【請求項９】
非ヒト哺乳動物を、ＮＩＫのアミノ酸配列の部分であって配列番号：７、１１または１２であるペプチドで免疫化することを含むモノクローナル抗ＮＩＫ抗体の調製方法。
【請求項１０】
請求項９記載の方法により得られ得るモノクローナル抗ＮＩＫ抗体。
【請求項１１】
ＮＩＫのアミノ酸配列の部分であって配列番号：７、１１または１２であるアミノ酸配列に特異的に結合するモノクローナル抗ＮＩＫ抗体。
【請求項１２】
ＣＮＣＭに番号Ｉ−３０９２で寄託されたハイブリドーマクローンＰｅｐ７−８１．１により生成される請求項１１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１３】
ＣＮＣＭに番号Ｉ−３０９２で寄託されたハイブリドーマクローン。
【請求項１４】
ＣＮＣＭに番号Ｉ−３０９３で寄託されたハイブリドーマクローンＰｅｐ１１−３５５．８により生成される請求項１１記載のモノクローナル抗体。
【請求項１５】
ＣＮＣＭに番号Ｉ−３０９３で寄託されたハイブリドーマクローン。
【請求項１６】
ＣＮＣＭに番号Ｉ−３０９４で寄託されたハイブリドーマクローンＰｅｐ１２−６２９−６２−１８により生成される請求項１１記載のモノクローナル抗体。
【請求項１７】
ＣＮＣＭに番号Ｉ−３０９４で寄託されたハイブリドーマクローン。
【請求項１８】
配列番号：７、１１または１２のアミノ酸配列で免疫化した非ヒト哺乳動物由来の脾臓細胞および同型遺伝子型または異型遺伝子型のリンパ球様細胞を含有するクローン化ハイブリドーマを、液体培地または非ヒト哺乳動物の腹部内で増殖させ、ハイブリドーマにモノクローナル抗体を産生および蓄積させることを含むモノクローナル抗ＮＩＫ抗体の調製方法。
【請求項１９】
前記抗体がＩｇＧ抗体である請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体または抗体断片がマウス由来である請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体断片が、単鎖Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2およびＣＤＲからなる群より選択される請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
ＮＩＫおよびＮＩＫ結合性タンパク質を含有する試料を、請求項１〜８のいずれかに記載の抗体調製物または請求項１０〜１２、１４または１６のいずれかに記載の抗体と接触させること、ＮＩＫおよびＮＩＫ結合性タンパク質を免疫共沈降させること、生成した免疫複合体を洗浄すること、およびＮＩＫ結合性タンパク質を免疫複合体からＮＩＫ由来のペプチドとの競合を用いて回収することを含むＮＩＫ結合性タンパク質のインビトロ精製方法。
【請求項２３】
試料が、体液、細胞抽出物およびＤＮＡ発現ライブラリーから選択される請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
ＥＬＩＳＡアッセイの開発のための、請求項１〜８のいずれかに記載の抗体調製物または請求項１０〜１２、１４または１６のいずれかに記載の抗体の使用。
【請求項２５】
ＮＩＫの免疫精製のための、請求項１〜８のいずれかに記載の抗体調製物または請求項１０〜１２、１４または１６のいずれかに記載の抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫調節分子に関する。より詳しくは、本発明は、ＮＦ−κＢ誘導性キナーゼ（ＮＩＫ）／ＭＡＰ３Ｋ１４またはその特定の部分に特異的に結合することができる抗体または抗体断片および、それにより、ＮＩＫの生化学的活性を調節するため、および／またはＮＩＫまたはその特定の部分の検出を可能にするための抗体または抗体断片に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＮＦ−κＢ分子の無規制な活性と関連する非常に多くの致死的および／または高度に衰弱性の疾患（悪性疾患ならびに自己免疫、アレルギー性、炎症性および移植に関連する疾患などの病的免疫応答と関連する疾患など）のための治療は存在しないか、または満足のいく治療が存在しない。
【０００３】
ＮＦ−κＢファミリー分子は、免疫応答の調節、細胞増殖、および生存に必須の真核生物の転写因子複合体であり（Ghosh S.ら，1998. Annu Rev Immunol. 16: 225-60）、これは、ほとんどすべてのＴＮＦ／ＮＧＦ受容体ファミリーの構成員によって誘導的に活性化される。ＮＦ−κＢ分子は、通常、ＩκＢと称する細胞質アンキリン高含有抑制因子の一ファミリー（ＩκＢαおよび関連タンパク質を含む（Baldwin AS. Jr., 1996. Annu Rev Immunol. 14: 649-83））との物理的会合によって細胞質画分内に封鎖されている。サイトカイン、マイトジェンおよびある種のウイルス系遺伝子産物などの多様な刺激に応答し、ＩκＢは、Ｓｅｒ３２およびＳｅｒ３６が速やかにリン酸化され、ユビキチン化され、続いて、２６Ｓプロテアソームによって分解される。これにより、放出されたＮＦ−κＢが、核に移動し、標的遺伝子のトランス活性化に関与するのが可能になる（Mercurio F.およびManning A. M., 1999. Curr Opin Cell Biol. 11: 226-32;Pahl, H. L., 1999. Oncogene 18: 6853-66）。最近の分子クローニング研究により、ＮＦ−κＢの抑制因子であるＩκＢのシグナル誘導型リン酸化を媒介するマルチサブユニットＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）複合体が同定された。ＩＫＫ複合体は、２つの触媒性サブユニットＩＫＫαおよびＩＫＫβ、ならびに調節性サブユニットＩＫＫγ（ＮＥＭＯ）から構成される。ＩＫＫαおよびＩＫＫβ両者の触媒性活性は、多数の異なるＮＦ−κＢインデューサー（たとえば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ならびにインターロイキン（ＩＬ）−１、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）およびＴ細胞同時刺激タンパク質、ＣＤ２８などの炎症性サイトカインが挙げられる）によって活性化され得る（Karin, M. および Ben-Neriah, Y., 2000. Annu Rev Immunol. 18: 621-63）。
【０００４】
ＮＦ−κＢ誘導性キナーゼ（ＮＩＫ）／ＭＡＰ３Ｋ−１４（本発明者らに対するＷＩＰＯ公開公報ＷＯ９７３７０１６Ａ１）は、ＮＦ−κＢの活性化に必須である。たとえば、ＮＩＫの過剰発現は、劇的なＮＦ−κＢの活性化をもたらすことが示されており（Wallach D.ら, 2002. Arthritis Res. 4 Suppl 3: S189-96に概説）、触媒的に不活性なＮＩＫ変異体の発現は、多様な公知のＮＦ−κＢアクチベーター（たとえば、ＬＭＰ１、ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）−ｌ、ＴＮＦＲ−２、ＲＡＮＫ、ヒトＴｏｌｌ受容体、ＣＤ３／ＣＤ２８、ＩＬ−１受容体（ＩＬ−１Ｒ）、ヒトＴリンパ球ウイルス（ＨＴＬＶ）−１  Ｔａｘタンパク質およびリポ多糖（ＬＰＳ）など）に応答してＮＦ−κＢ活性化の有効な阻害をもたらすことが示されている（Malinin, N. L.ら, 1997. Nature 385: 540-4;Sylla, B. S.ら, 1998. Proc Natl Acad Sci U S A. 95: 10106-11;Darnay, B. G.ら, 1999. J Biol Chem. 274: 7724-31;Lin, X.ら, 1999. Immunity 10: 271-80;Geleziunas, R.ら, 1998. Mol Cell Biol. 18: 5157-65）。ＮＩＫ遺伝子の標的化破壊（Yin, L.ら, 2001. Science 291: 2162-5）、およびＮＩＫにおいて天然Ｇｌｙ８５５Ａｒｇミスセンス点変異を有する「リンパ組織形成不全症」（ａｌｙ）マウス系統の研究（Shinkura, R.ら, 1999. Nat Genet. 22: 74-7）により、ＮＩＫは、リンパ器官の発達において本質的な役割を有することが明らかにされた。ａｌｙ／ａｌｙおよびＮＩＫノックアウトマウスは、ともに、リンパ節およびパイエル班の全身性欠如、無秩序な脾臓構造および胸腺構造ならびに免疫不全を示し、その最も回復力のある特徴は、低血清免疫グロブリンレベルおよび移植片拒絶の欠如である（Shinkura, R.ら, 1999. Nat Genet. 22: 74-7）。これらの異常は、明白に、多様な受容体による異常型シグナル伝達を反映する。ＮＩＫ変異型マウスの発育不全は、ＬＴ−β受容体（ＬＴ−βＲ）欠損マウスにおいて見られるものと類似し、ＮＩＫもまた、この特定の受容体によるシグナル伝達に関与することを示す。ａｌｙ／ａｌｙマウスにおける障害Ｂ細胞の増殖能により、ＬＰＳおよびＣＤ４０リガンドに対するこれらの細胞の不完全な応答との相関を示すことができ（CD40L;Garceau, N.ら, 2000. J Exp Med. 191: 381-6）、マウスの腹腔における過剰量のＢ１細胞の存在は、二次リンパ球様組織における不完全なケモカイン受容体シグナル伝達の結果としての腸関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）系への腹膜細胞のホーミングの欠陥に起因し得る（Fagarasan, S.ら, 2000. J Exp Med. 191: 1477-86）。
【０００５】
サイトカイン受容体シグナル伝達におけるＮＩＫの重要かつ一般的な役割が、ＩＬ−２受容体γ鎖またはシグナル伝達成分である「共通γ鎖」であるツーハイブリッド系を用い、ＩＬ−２、−４、−７、ＩＬ−９、−１３、−１５および−２１の受容体がＮＩＫと特異的に会合することを示した（ＰＣＴ／ＩＬ０３／００３１７）Ｗａｌｌａｃｈらが行なった研究において、最近、示された。共通γ鎖の過剰発現はＮＩＫによって媒介されるＮＦ−κＢ活性化を増強することがわかっており、ＩＬ−２またはＩＬ−１５刺激を受けると、ＮＩＫおよびシグナル伝達複合体成分は、共通γ鎖に結合することがわかった。したがって、これらの結果は、シグナル伝達サブユニットとして共通γ鎖を含有する多種多様なサイトカイン受容体によるシグナル伝達におけるＮＩＫの関与を示す。
【０００６】
免疫系の発達および機能の調節に対するこれらおよび他の寄与とは別に、ＮＩＫはまた、種々の非免疫機能の調節にも関与する。ａｌｙ／ａｌｙ（ＮＩＫノックアウトではない）マウスは、不完全な乳腺発達を示す（Miyawaki, S.ら, 1994. Eur J Immunol. 24: 429-34）。さらに、インビトロ試験では、シグナル伝達においてＮＩＫが、骨格筋細胞分化をもたらすこと（Canicio, J.ら, 2001. J Biol Chem. 276: 20228-33）、およびニューロンの生存および分化をもたらすこと（Foehr, E. D.ら, 2000. J Biol Chem. 275: 34021-4）が示された。
【０００７】
ＮＦ−κＢ活性化のメディエーターとしてのＮＩＫの示唆される役割と一致し、ａｌｙ／ａｌｙおよびＮＩＫノックアウトマウス由来の線維芽細胞は、ＬＴ−βＲ活性化に応答してＮＦ−κＢを活性化することができない。さらに、ＶＣＡＭ−１のＬＴ−βＲのアップレギュレーション（これは、ＮＦ−κＢ活性化により起こる）は、ａｌｙ／ａｌｙマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）において異常である（Matsumoto, M.ら, 1999. J Immunol. 163: 1584-91）。ＩκＢの不完全なリン酸化は、ａｌｙ／ａｌｙ  Ｂリンパ球のＣＤ４０連結への応答において認められた。対照的に、これらのマウスの樹状細胞では、ＩκＢのＣＤ４０誘導型リン酸化は正常のようであった（Garceau, N.ら, 2000. J Exp Med. 191: 381-6）。また、ａｌｙ／ａｌｙ腹膜細胞は、ケモカインＳＬＣに応答することができず、ＮＦ−κＢ活性は増大する（Fagarasan, S.ら, 2000. J Exp Med. 191: 1477-86）。
【０００８】
ａｌｙ／ａｌｙマウスのリンパ器官における発現されたＮＦ−κＢ種のパターンの評価により、Ｒｅｌタンパク質（Ａ＋ｐ５０）およびＩκＢから構成されるＮＦ−κＢ複合体（１種または複数）の調節における役割とは別に、ＮＩＫはまた、他のＮＦ−κＢ種の発現／活性化の制御に関与することが示された。最も注目すべきことは、ａｌｙ／ａｌｙのリンパ球は、ｐ５２（不活性前駆体であるｐ１００（ＮＦ−κＢ２）のタンパク質溶解性プロセッシングにより、成熟Ｂリンパ球において特異的に形成されるＮＦ−κＢ種）が欠損し、これは、ｐ１００のｐ５２への変換の欠損を示す（Yamada, T.ら, 2000. J Immunol. 165: 804-12）。実際、ＮＩＫは、ｐ１００の部位特異的リン酸化に関与することが示されている。両者は、直接、ＩＫＫαのリン酸化をもたらし、これが、今度は、ｐ１００をリン酸化する。このリン酸化は、ｐ５２を形成するためのｐ１００のユビキチン化および活性プロセッシングの分子性誘因としての機能を果たす。このｐ１００プロセッシング活性は、ａｌｙ変異により消去されることがわかった（Xiao, G.ら, 2001. Mol Cell 7: 401-9;Senftleben, U.ら, 2001. Science 293: 1495-9）。
【０００９】
ＮＩＫのＭＡＰ３Ｋに対する構造的相同性に鑑み、ＮＩＫのＥＲＫ、ＪＮＫおよびｐ３８カスケード（ＭＡＰ３Ｋを伴う３つの他の主なタンパク質キナーゼカスケード）における関与を検討するためのいくつかの試みがなされた（Akiba, H.ら, 1998. J Biol Chem. 273: 13353-8）。ＮＩＫは、ＰＣ１２褐色細胞腫細胞におけるＥＲＫカスケードに関与することが示されている（Foehr, E. D.ら, 2000. J Biol Chem. 275: 34021-4）。ある種の細胞において、ＮＩＫは、ＪＮＫカスケードの下流標的であるＪｕｎのリン酸化のためのシグナル伝達に、この特定のカスケードとは独立して関与し得ることを示す証拠もある（Akiba, H.ら, 1998. J Biol Chem. 273: 13353-8;Natoli, G.ら, 1997. J Biol Chem. 272: 26079-82）。全体として、これらの所見は、ＮＩＫが、実際、ＮＦ−κＢ活性化のメディエーターとしての機能を果たすが、他の機能も果たし得ること、およびこれらの機能を細胞特異的および受容体特異的に発揮することを示す。
【００１０】
他のＭＡＰ３Ｋと同様、ＮＩＫは、ＮＩＫ分子内の「活性化ループ」のリン酸化の結果として活性化され得る。実際、このループ内のリン酸化部位（Ｔｈｒ５５９）の変異は、ＮＩＫ過剰発現時のＮＦ−κＢの活性化を抑制する（Lin, X.ら, 1999. Immunity 10: 271-80）。また、ＮＩＫの活性は、そのキナーゼモチーフの上流および下流の領域が互いに結合できる能力により調節されるようである（Linら Molec. Cell Biol. (18) 10 5899-5907 1998）。ＮＩＫのそのキナーゼ部分の下流のＣ末端領域は、ＩＫＫα（Regnier, C. H.ら, 1997. Cell 90: 373-83）ならびにｐ１００（Xiao, G. および Sun, S. C., 2000. J Biol Chem. 275: 21081-5）およびＴＲＡＦ２（Malinin, N. L.ら, 1997. Nature 385: 540-4）に直接結合できることが示されている。かかる相互作用は、明らかに、ＮＦ−κＢシグナル伝達におけるＮＩＫ機能に必要とされる。ＮＩＫのＮ末端領域は、塩基性モチーフ（ＢＲ）およびプロリン高含有リピートモチーフ（ＰＲＲ）から構成される負の調節性ドメイン（ＮＲＤ）を含む（Xiao, G.ら, 2001. Mol Cell 7: 401-9）。明らかに、Ｎ末端ＮＲＤは、ＮＩＫのＣ末端領域とｃｉｓで相互作用し、それにより、ＮＩＫのその基質（ＩＫＫαおよびｐ１００）への結合を阻害する。正常でない位置に発現されたＮＩＫは、各ＮＩＫ分子におけるＮ末端領域のＣ末端領域へのこれらの結合が明らかに破壊されたオリゴマーを自発的に形成するようであり、高レベルの構成的活性を示す（Lin, X.ら, 1999. Immunity 10: 271-80）。ＮＩＫのＣ末端領域のＴＮＦ受容体結合アダプタータンパク質ＴＲＡＦ２への、および他のＴＲＡＦへの結合（Malinin, N. L.ら, 1997. Nature 385: 540-4;Rothe, M.ら, 1994. Cell 78: 681-92;Takeuchi, M.ら, 1996. J Biol Chem. 271: 19935-42）は、おそらく、ＮＩＫによるＮＦ−κＢの活性化に関与している。
【００１１】
ＮＩＫは、そのＣ末端領域のＩＫＫαへの結合により、ＩＫＫ複合体を活性化し得ることを示す証拠がある。これは、ＩＫＫαの活性化ループにおいてＳｅｒ１７６をリン酸化でき、それにより、この分子を活性化することが示されている（Ling, L.ら, 1998. Proc Natl Acad Sci U S A. 95: 3792-7）。一貫して、かかる活性化様式により、ａｌｙ／ａｌｙ  ＭＥＦにおけるＬＴ−βＲによるＮＦ−κＢ活性化の欠損を説明する機構に関する研究により、ＮＩＫ変異は、ＩＫＫシグナル伝達複合体の活性化を消去し、その結果としてＩκＢのリン酸化を消去することが示された（Matsushima, A.ら, 2001. J Exp Med. 193: 631-6）。ＮＩＫがｐ１００に直接、そのＣ末端領域を介して結合し、これをリン酸化する能力は、ｐ１００が直接ＮＩＫの基質としての機能を果たすことを示す（Xiao, G. および Sun, S. C., 2000. J Biol Chem. 275: 21081-5）。それにもかかわらず、最近の研究では、ＮＩＫが、ＩＫＫαのリン酸化、したがって活性化（ＩＫＫαが、こんどはｐ１００をリン酸化する）を介して間接的にｐ１００リン酸化を媒介することが示された（Senftleben, U.ら, 2001. Science 293: 1495-9）。
【００１２】
したがって、ＮＩＫによるＮＦ−κＢ分子の活性化は、ＮＦ−κＢ活性の調節のための必須の制御点を示す。
【００１３】
上記のように、無規制なＮＦ−κＢ活性は、種々の主要なヒト疾患（たとえば、非常に多くの悪性疾患および病的免疫応答と関連する疾患など）の病因と関連する（Yamamoto および Gaynor, 2001. J Clin Invest. 107: 135-142に概説）。たとえば、ＮＦ−κＢ経路の活性化は、喘息および関節リウマチなどの慢性炎症性疾患（Tak および Firestein, 2001. J Clin Invest. 107: 7-11;Karin, M. および Ben-Neriah, Y., 2000. Annu Rev Immunol. 18: 621-63）および炎症性腸疾患の病因と顕著に関与する。また、改変されたＮＦ−κＢ調節は、炎症性応答が少なくとも部分的に関与する他の疾患、たとえば、動脈硬化（Collins および Cybulsky, 2001. J Clin Invest. 107: 255-64;Leonard, W. J.ら, 1995. Immunol Rev. 148: 97-114）およびアルツハイマー病（Mattson および Camandola, 2001. J Clin Invest. 107: 247-54;Lin, X.ら, 1999. Immunity 10: 271-80）などの病因に関与するようである。
【００１４】
サイトカイン遺伝子のＮＦ−κＢ活性化は、肺における炎症性細胞の浸潤ならびに多くのサイトカインおよびケモカインの無規制さを特徴とする喘息の病因の重要な寄与因子であることを示す証拠が幾通りかある（Ling, L.ら, 1998. Proc Natl Acad Sci U S A. 95: 3792-7）。ＮＦ−κＢを活性化するＴＮＦなどのサイトカインは、関節リウマチの患者の滑液中において上昇しており、これらの患者の関節において見られる慢性炎症性変化および滑膜過形成に寄与する（Malinin, N. L.ら, 1997. Nature 385: 540-4）。ＴＮＦまたはＴＮＦに結合する切断型ＴＮＦ受容体に対して志向される抗体の投与は、関節リウマチの患者の症状を著しく改善し得る。
【００１５】
また、リンパ球およびマクロファージの両者によるプロ炎症性サイトカインの産生の増加は、炎症性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎など）の病因に関与している（Matsumoto, M.ら, 1999. J Immunol. 163: 1584-91）。ＮＦ−κＢ活性化は、活性クローン病患者および潰瘍性大腸炎患者由来の粘膜生検材料試験片において見られる。炎症性腸疾患を患う患者のステロイド類による治療は、生検材料試験片においてＮＦ−κＢ活性を減少させ、臨床症状を低減する。これらの結果は、ＮＦ−κＢ経路の刺激が、これらの疾患と関連する炎症性応答の増大に関与することを示す。
【００１６】
アテローム性動脈硬化は、損傷された血管壁の内皮および平滑筋に対する非常に多くの傷害により誘発される（Matsushimaら, 2001）。内皮細胞、平滑筋、マクロファージおよびリンパ球から放出される多数の成長因子、サイトカインおよびケモカインが、この慢性炎症性線維増殖性プロセスに関与する（Matsushima, A.ら, 2001. J Exp Med. 193: 631-6）。炎症性応答および細胞増殖制御に関与する遺伝子のＮＦ−κＢ調節は、アテローム性動脈硬化の起始および進行にある重要な役割を果たすものとして広く理解されている。
【００１７】
上記のように、ＮＦ−κＢ経路の調節における異常は、アルツハイマー病の病因に関与することが示されている。たとえば、ＮＦ−κＢ免疫反応性は、主に、アルツハイマー病の初期老人班型内およびその周囲に見られるが、成熟班型は、非常に低下したＮＦ−κＢ活性を示す（Mercurio F. および Manning A. M., 1999. Curr Opin Cell Biol. 11: 226-32）。したがって、ＮＦ−κＢ活性化は、アルツハイマー病の初期段階の際の老人班およびニューロンアポトーシスの開始である。これらのデータは、したがって、ＮＦ−κＢ経路の活性化が、その病因に関与する炎症性成分を有するいくつかの疾患において、ある役割を果たすことを示す。
【００１８】
無規制な免疫応答と関連する疾患の病因における役割に加え、ＮＦ−κＢ経路の過活性化または構成的活性化もまた、種々のヒト癌の病因に関与している。ＮＦ−κＢ経路の異常に高度な、および／または構成的活性化は、多様なヒト悪性腫瘍（白血病、リンパ腫および充実性腫瘍など）に頻繁に見られる（Miyawaki, S.ら, 1994. Eur J Immunol. 24: 429-34）。これらの異常は、様々な腫瘍（乳癌、卵巣癌、前立腺癌および結腸癌）の核内において、異常および／または構造的に高レベルのＮＦ−κＢをもたらす。これらの変化の大部分は、おそらく、ＮＦ−κＢ経路の活性化をもたらすシグナル伝達経路を活性化する調節タンパク質における改変によるものである。しかしながら、ＩκＢタンパク質を不活化する変異は、ＮＦ−κＢファミリー構成員をコード化する遺伝子の増幅および再編成に加え、いくつかの腫瘍で見られるＮＦ−κＢの核レベルの上昇をもたらし得る（Emmerichら Blood Nov 1;94 (9): 3129-34,1999）。
【００１９】
上記のように、ＮＩＫはＮＦ−κＢの活性化に必須であるため、ＮＦ−κＢの活性化を調節し、それにより、無規制なＮＦ−κＢ活性と関連する疾患を治療するための潜在的に有力なストラテジーの一例は、ＮＩＫまたはその特定の部分に特異的に結合することができ、それにより、ＮＩＫによるＮＦ−κＢの活性化を抑制または阻害することができる抗体を同定することを伴う。ＮＩＫまたはその特定の部分の特異的検出が可能であるおかげで、かかる抗体は、さらに、ＮＩＫまたはその特定の部分を伴う正常／病理学的な生物学的／生化学的なプロセス／状態の態様の特徴付けを可能にし得る。
【００２０】
ＮＩＫに特異的に結合させるために抗体の使用を試みる種々の従来技術のアプローチが提案されている（表２を参照のこと）。
【００２１】
アプローチの１つでは、ＮＩＫポリペプチドのカルボキシ末端領域のアミノ酸残基７００〜９４７に特異的に結合させるためにマウスモノクローナルＩｇＧ抗体の使用を試みた。
【００２２】
別のアプローチでは、ＮＩＫタンパク質のアミノ末端領域に特異的に結合させるためにヤギポリクローナル抗体の使用を試みた。
【００２３】
さらに別のアプローチでは、ＮＩＫポリペプチドのカルボキシ末端領域のアミノ酸残基７００〜９４７または９３１〜９４７に特異的に結合させるためにウサギポリクローナル抗体の使用を試みた。
【００２４】
しかしながら、前述のアプローチはすべて、重大な不都合点をもつ。従来技術の抗体は、ＮＩＫまたはその特定の部分に、最適な親和性、特異性および／または多様性を伴って結合できない。たとえば、従来技術のＮＩＫ結合性抗体は、ＮＩＫのキナーゼドメインの任意の部分に特異的に結合することができないか、またはカルボキシおよびアミノ末端領域の数多くの部分（たとえば、ＮＩＫ活性に関与する部分）に特異的に結合することができない。このように、ＮＦ−κＢの活性化はＮＩＫ媒介性リン酸化事象を伴うため、従来技術の抗体は、ＮＩＫのキナーゼ活性の抑制または阻害に適さない。従来技術のポリクローナル抗体調製物は、次善的に大きなＮＩＫセグメントに対して生成させたことにより、およびそれによって次善的に広範囲のエピトープに特異的な抗体を含むことにより、さらに障害を受ける（たとえば、以下の表２を参照）。さらにまた、従来技術の非マウス由来／抗アミノ末端領域抗体は、抗体系検出アッセイにおける使用に最も広範に使用される型の二次標識用試薬を構成する抗マウス抗体リガンドによって特異的に結合され得ない。このため、従来技術の抗アミノ末端領域抗体は、ＮＩＫのアミノ末端領域の検出に次善的である。
【００２５】
したがって、従来技術のアプローチでは、すべて、ＮＩＫまたはその特定の部分に、ＮＩＫ活性（したがってＮＦ−κＢ活性）の最適な調節を可能にし、および／またはＮＩＫの最適な検出を可能にする親和性、特異性および／または多様性を伴って結合することができる抗体を提供することができていない。
【００２６】
したがって、上記の制限のない抗体の必要性が広く認識されており、これを有することが非常に好都合であり得る。
【発明の開示】
【００２７】
本発明は、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１８、１９、２０または２２、および／または１５、好ましくは配列番号：７、１１、１２、１３および／または１５などのアミノ酸配列または該アミノ酸配列の部分および／またはＮＩＫキナーゼドメインの隣接領域内に位置するアミノ酸配列に特異的に結合することができる１つ以上のポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、ヒトもしくは抗−抗イディオタイプ抗体および／またはその断片を含む抗体または抗体調製物に関する。
【００２８】
一実施形態において、該抗体は、ＩｇＧクラスのものおよび／または単鎖Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＣＤＲなどの抗体断片である。
【００２９】
本発明の一態様において、該抗体または抗体調製物は、さらに、ＮＩＫまたはそのムテイン、機能性誘導体、活性分画、円順列変異誘導体、塩もしくは部分に、たとえば、ウエスタンイムノブロテッィング解析、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降により特異的に検出することができる、および／またはＮＩＫ分子の生化学的活性を調節することができる。
【００３０】
さらなる実施形態において、該抗体および／または抗体調製物は、ＮＩＫ分子の生化学的活性を調節することができる。
【００３１】
さらなる実施形態において、本発明は、ＮＩＫまたはそのムテイン、機能性誘導体、活性分画、円順列変異誘導体もしくは塩に特異的に結合することができる１つ以上のポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、ヒトもしくは抗−抗イディオタイプ抗体および／またはその断片であって、哺乳動物を、配列番号：７に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の部分を含むペプチドで免疫化することによって調製される該抗体、好ましくは、マウスＮＩＫなどの他のＮＩＫ種を検出および／または阻害することができる該抗体を含有する調製物に関する。
【００３２】
本発明の一実施形態は、ＣＮＣＭに番号Ｉ−３０９２で寄託されたハイブリドーマクローンＰｅｐ  ７−８１．１により、またはＣＮＣＭに番号Ｉ−３０９３で寄託されたハイブリドーマクローンＰｅｐ  １１−３５５．８により、ＣＮＣＭに番号Ｉ−３０９４で寄託されたハイブリドーマクローンＰｅｐ  １２−６２９−６２−１８により生成されるモノクローナル抗体、および該抗体を産生するそれぞれのハイブリドーマに関する。
【００３３】
本発明の一実施形態は、薬学的に許容され得る担体および、活性成分として、本発明による抗体調製物または抗体を含有してなる医薬組成物を提供する。
【００３４】
本発明のさらなる実施形態は、ＮＩＫ分子を、本発明による抗体または抗体断片の調製物と接触させる方法を含む、ＮＩＫ分子の生化学的活性の調節方法を教示する。
【００３５】
さらなる実施形態において、本発明は、標的抗原に特異的に結合することができる抗体または抗体断片を選択的に捕捉するための、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１８、１９、２０または２２に記載されたアミノ酸配列または該アミノ酸配列の部分を含むポリペプチドに共有結合させた基質（たとえば、アフィニティークロマトグラフィー充填剤、炭水化物（たとえば、アガロース、セファロースおよびセルロース）、ビーズ、樹脂またはプラスチック表面）を含有してなる物質の組成物に関する。
【００３６】
別のさらなる実施形態において、本発明は、本発明による抗体または調製物を、必要とする個体に投与することを含む、ＮＩＫの活性によって引き起こされるか、または悪化する疾患の治療方法に関する。
【００３７】
別のさらなる実施形態において、本発明は、ＮＩＫの活性によって引き起こされるか、または悪化する疾患の治療のための医薬の製造における、本発明による抗体または調製物の使用に関する。
【００３８】
別のさらなる実施形態において、本発明は、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１８、１９、２０または２２から選択されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列の部分で免疫化した哺乳動物由来の脾臓細胞および同型遺伝子型または異型遺伝子型のリンパ球様細胞を含有するクローン化ハイブリドーマを、液体培地または哺乳動物の腹部内で増殖させ、ハイブリドーマにモノクローナル抗体を産生および蓄積させることを含む、本発明によるモノクローナル抗体の調製方法に関する。
【００３９】
別の実施形態において、本発明は、哺乳動物を、ＮＩＫのアミノ酸配列の部分であって配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１８、１９、２０または２２から選択されるペプチドで免疫化することを含む、モノクローナル抗体の調製方法に関する。
【００４０】
別の実施形態において、本発明は、ＮＩＫおよびＮＩＫ結合性タンパク質を含有する試料を抗体または抗体調製物と接触させること、ＮＩＫおよびＮＩＫ結合性タンパク質を免疫共沈降させること、生成した免疫複合体を洗浄すること、およびＮＩＫ結合性タンパク質を免疫複合体からＮＩＫ由来のペプチドとの競合を用いて回収することを含む、ＮＩＫ結合性タンパク質の精製方法に関する。
【００４１】
別の実施形態において、本発明は、ＮＩＫまたはそのムテイン、機能性誘導体、活性分画、円順列変異誘導体もしくは塩の免疫精製のための、本発明による抗体調製物または抗体の使用を教示する。
【００４２】
本発明を、添付の図面を参照しながら、例示のためのみで本明細書において記載する。図面に対する詳細な以下の具体的な言及により、示される特定の内容は、例示のため、および本発明の好ましい実施形態の実例の検討を目的とするにすぎず、本発明の原理および概念的態様の最も有用かつ容易に理解される記載と考えられるものを提供する過程において示されたことを強調する。これに関連し、本発明の構造的詳細を、本発明の基本的な理解に必要とされる以上に詳細に示す試みはしておらず、本記載内容は、図面と合わせると、本発明のいくつかの形態がどのようにして実際に具現化され得るかが当業者に自明となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
ＮＩＫまたはその特定の部分を伴う正常／病理学的な生物学的／生化学的なプロセス／状態の態様の特徴付けも可能である。
【００４４】
本発明を実施した際、（ｉ）ＮＩＫもしくはその特定の部分（たとえば、キナーゼ領域もしくはその特定の部分）またはアミノもしくはカルボキシ末端領域の特定の部分に特異的に結合する；または（ii）ＮＩＫもしくはその特定の部分（たとえば、キナーゼ領域もしくはその特定の部分）またはアミノもしくはカルボキシ末端領域の特定の部分に最適に特異的に結合することができる抗体調製物が予期せず作製された。本発明の抗体調製物の、完全なキナーゼ領域または任意のその特定の部分に特異的に結合できる能力、またはＮＩＫのアミノもしくはカルボキシ末端領域の任意の種々の特定の部分に特異的に結合できる能力は、すべての従来技術の抗体と比べると、特有のものである。
【００４５】
したがって、従来技術の抗体とは著しく対照的に、本発明の抗体調製物は、生化学的活性（たとえば、ＮＩＫまたはその特定の部分のキナーゼ活性など）を最適に調節するため、およびＮＩＫまたはその特定の部分を最適に検出するために使用することができる。本発明の抗体はまた、ＮＩＫに結合する調節性因子を免疫共沈降させ、単離するために使用することができる。
【００４６】
本発明のものなどの抗体調製物は、未処理抗体調製物のものと本質的に同一の抗原結合特性を有する１つ以上の型の抗体断片の調製物が作製されるように、標準的な方法を用いて、たとえば、本明細書に以下に記載のようにして処理し得ることは、当業者に理解されよう。
【００４７】
したがって、本発明の一態様によれば、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１８、１９、２０または２２に記載されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列の部分に特異的に結合することができる抗体または抗体断片の調製物が提供される。
【００４８】
好ましくは、配列番号：７、８、１１、１２、１３および／または１５に記載されるアミノ酸配列またはその部分のペプチドの部分に結合する。より好ましくは、配列番号：７、１１および１２に記載されるアミノ酸配列のペプチドの部分に結合する。
【００４９】
用語「ペプチドの部分」は、配列番号：２２の少なくともトリペプチドと規定する。
【００５０】
配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１８、１９、２０または２２に記載されるアミノ酸配列またはかかるアミノ酸配列の部分を、以下、本明細書において「標的抗原」という。
【００５１】
本明細書に以下に記載のように、該調製物は、ＮＦ−κＢ誘導性キナーゼ（NF-κB-inducing kinase）（ＮＩＫ）／ＭＡＰ３Ｋ１４の生化学的活性（たとえば、キナーゼ活性など）を最適に調節するために使用することができ、したがって、ＮＦ−κＢの活性化を最適に調節するために使用することができ、それにより、ＮＦ−κＢ活性の無規制さと関連する疾患を最適に治療するために使用することができる。さらにまた、該調製物は、ＮＩＫのキナーゼ領域またはその任意の種々の特定の部分を検出するために特有の様式で使用することができ、ＮＩＫのアミノまたはカルボキシ末端領域の任意の種々の特定の部分を最適に検出するために使用することができる。このように、該調製物は、ＮＩＫまたはその特定の部分を伴う正常／病理学的な生物学的／生化学的なプロセス／状態の態様を最適に特徴付けするために利用することができる。
【００５２】
本明細書において使用する場合、用語「治療する」は、疾患に関する場合、疾患の発症の予防、疾患の軽減、疾患の症状の緩和もしくは解消、疾患の進行の遅延もしくは逆転、または疾患の治癒をいう。
【００５３】
適用および目的に応じて、本発明の調製物は、好都合には、抗体または抗体断片の集団の任意の種々の組み合わせを含有するのがよく、好都合には、構造的および／または機能的特徴の任意の種々の組み合わせを特徴とする抗体または抗体断片を含有するのがよい。たとえば、該調製物は、好都合には、（ｉ）任意の種々の組み合わせの本発明の標的抗原に特異的に結合することができる抗体および／または抗体断片の集団；（ii）配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１８、１９または２０に記載のアミノ酸配列の任意の種々の特定の部分に特異的に結合することができる抗体または抗体断片；および／または（iii）任意の種々の結合可能な分子に結合させた抗体または抗体断片を含有するのがよい。
【００５４】
本明細書において使用する場合、用語「抗体」は、実質的に完全なまたはインタクトな抗体分子をいう。
【００５５】
本明細書において使用する場合、語句「抗体断片」は、抗原、抗原決定基またはエピトープに特異的に結合することができる抗体の部分を含有する分子をいう。
【００５６】
以下の実施例の項に記載するように、
（ｉ）  配列番号：１、２、３、４、５または６に記載されるアミノ酸配列は、それぞれ、ヒトＮＩＫのアミノ酸残基６０〜７６、８６〜９９、１３５〜１５０、２１５〜２２８、３６３〜３７８または３８５〜３９８を表し、ヒトＮＩＫのアミノ末端領域内に位置する；
（ii）  配列番号：２２に記載されるアミノ酸配列は、ヒトＮＩＫのアミノ酸残基４０１〜６８１を表し、ヒトＮＩＫのキナーゼ領域および該キナーゼ領域付近に対応する；
（iii）  配列番号：７、８、９、１０、１１または１２は、それぞれ、ヒトＮＩＫのアミノ酸残基４０５〜４２０、４２７〜４４１、５０９〜５２３、６０５〜６１９、６３５〜６５０または６６６〜６８１を表し、ヒトＮＩＫのキナーゼ領域内または該キナーゼ領域付近に位置する；および
（iv）  配列番号：１２、１３、１５、１７、１８、１９または２０は、それぞれ、ヒトＮＩＫのアミノ酸残基６９６〜７１２、７５２〜７６７、８３６〜８５１、８７１〜８８５または９０４〜９１７を表し、ヒトＮＩＫのカルボキシ末端領域内に位置する。
【００５７】
好ましくは、該調製物は、標的抗原に最大の親和性で結合することができる。
【００５８】
本発明を実施したとき、以下の特性を有する異なる抗体調製物が、予期せず作製された。
【００５９】
「ＮＩＫキナーゼドメインの隣接領域」、たとえばキナーゼドメインのＮ末端領域のペプチド、好ましくはペプチド４０５〜４２０（配列番号：７）に対する結合能力を有する抗体、およびキナーゼドメインのＣ末端領域またはその付近のペプチド、好ましくはペプチド６３５〜６５０（配列番号：１１）および６６６〜６８１（配列番号：１２）に対する結合能力を有するか、またはかかるペプチドの部分に対する結合能力を有する抗体は、ウエスタンイムノブロテッィング解析によりＮＩＫを効率的に検出することができる。
【００６０】
ＮＩＫのＡＴＰ結合性領域内のペプチド、好ましくはペプチド４２７〜４４１（配列番号：８）に対する結合能力を有する抗体、またはかかるペプチドの部分に対する結合能力を有する抗体は、ＥＬＩＳＡによりＮＩＫを効率的に検出することができる。
【００６１】
Ｃ末端領域の先頭付近または先頭部分、たとえば残基６３５〜７６７内のペプチド、好ましくはペプチド６３５〜６５０（配列番号：１１および６６〜６８１（配列番号：１２）、６９６〜７１２（配列番号：１３）および７５２〜７６７（配列番号：１５）に対する結合能力を有する抗体、またはかかるペプチドの部分に対する結合能力を有する抗体は、ＮＩＫを効率的に免疫沈降させることができる。
【００６２】
キナーゼドメインのＣ末端領域の先頭部分または先頭付近のペプチド、好ましくはペプチド６３５〜６５０（配列番号：１１）および６６６〜６８１（配列番号：１２）に対する結合能力を有する抗体、またはかかるペプチドの部分に対する結合能力を有する抗体は、ウエスタンイムノブロテッィング解析および免疫沈降の両方によりＮＩＫを効率的に検出することができる。
【００６３】
一般に、最大の親和性を伴って標的抗原に結合することができる本発明の調製物は、標的抗原により媒介されるか、またはこれと関連する生化学的活性の最適なダウンレギュレーションを可能にする。同様に、最大の親和性を伴って標的抗原に特異的に結合することができる本発明の調製物は、一般的に、最適な感度を伴った標的抗原の検出を可能にする。
【００６４】
本発明の標的抗原に特異的に結合する該調製物の前記能力のおかげで、特に、ＮＩＫの機能性領域内に位置する本発明の標的抗原に特異的に結合する該調製物の特有の能力のおかげで、該調製物を、ＮＩＫの生化学的活性をダウンレギュレーションするために使用することができる。特に、ＮＩＫのキナーゼ領域内に位置する本発明の標的抗原に特異的に結合する該調製物の前記の特有の能力のおかげで、該調製物を、ＮＩＫのキナーゼ活性を最適にダウンレギュレーションするために使用することができる。上記のように、かかるキナーゼ活性は核因子（ＮＦ）−κＢの活性化に非常に重要であるため、かかるキナーゼ活性を最適にダウンレギュレーションすることができる本発明の調製物を、ＮＦ−κＢの活性を最適にダウンレギュレーションするために使用することができることは認識されよう。
【００６５】
ＮＦ−κＢタンパク質は、３００アミノ酸のドメインである「Ｒｅｌ相同性ドメイン」を共有するタンパク質のファミリーである。Ｒｅｌ相同性ドメインは、ＤＮＡ結合、二量体化およびＮＦ−κＢタンパク質の核輸送を媒介する。Ｒｅｌ相同性ドメインに加え、ＮＦ−κＢ  ファミリーのいくつかの構成員はまた、トランス活性化ドメイン（たとえば、ｃ−Ｒｅｌ、ＲｅｌＢおよびｐ６５）を含む。ＮＦ−κＢ構成員であるｐ５０およびｐ５２は、それぞれ、不活性前駆体ｐ１０５およびｐ１００の溶解による活性化時に生成される。Ｐ５０およびｐ５２ｃは、ＤＮＡ結合性二量体化特性を有するが、強いトランス活性化ドメインは有さない。ＮＦ−κＢ経路を活性化する多様な効果に寄与するのは、これらのタンパク質の差別的生成、異なるファミリー構成員とともにヘテロ二量体化するその能力、およびこれらのタンパク質と転写組織の異なる成分との相互作用である。ＮＩＫは、すべてのＮＦ−κＢ種に影響するわけではなく、特定のＮＦ−κＢ種にのみ影響し、たとえば、これは、特異的インデューサー（たとえばリンホトキシン）に応答してｐ１００の分解およびｐ５２ｃの生成を誘導する。したがって、たとえば本発明の抗体を用いるＮＩＫのモジュレーションは、病理学的暗示のＮＦ−κＢ活性化の特定の態様に影響するようである。これは、ＮＦ−κＢの一般的な非特異的阻害が危険である（たとえば、肝臓において広範なアポトーシスをもたらし得る）ため、利点である。
【００６６】
本明細書において使用する場合、語句「ダウンレギュレーションする」は、生化学的活性に関する場合、かかる生化学的活性を抑制、低減または阻害することをいう。
【００６７】
ＮＩＫの生化学的活性を阻害するために用いられる場合、該調製物は、好ましくは、かかる生化学的活性と関連するＮＩＫの部分内の最大数の標的抗原に特異的に結合することができる。特にＮＩＫのキナーゼ活性を阻害するために用いられる場合、該調製物は、好ましくは、配列番号：７、８、９、１０、１１、１２、１３および１５に記載されるＮＩＫキナーゼ領域アミノ酸配列内に位置する最大数の標的抗原に特異的に結合することができ、より好ましくは、配列番号：７、１１および１２に記載されるＮＩＫキナーゼ領域アミノ酸配列内に位置する最大数の標的抗原に特異的に結合することができる。ＮＩＫの機能性領域（たとえば、キナーゼ領域）内に位置する１つだけの標的抗原に特異的に結合することができる本発明の調製物を、かかる機能性領域と関連するＮＩＫの生化学的機能（たとえば、キナーゼ活性など）を効率的に阻害するために使用し得るが、かかる機能性領域内に位置する最大数の標的抗原に特異的に結合することができる調製物は、機能性領域内の最大数の機能性エピトープを干渉するおかげで、キナーゼ活性をより効果的にダウンレギュレーションする。
【００６８】
あるいはまた、ＮＩＫのキナーゼ活性を阻害するために、該調製物は、好都合には、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１８、１９および２０に記載のアミノ酸配列内に位置する最大数の標的抗原に特異的に結合することができるものであり得る。
【００６９】
本発明の標的抗原に特異的に結合する該調製物の前記能力のおかげで、該調製物を、ＮＩＫを従来技術の方法と比べて最適な感度を伴って特異的に検出するために使用することができ、ＮＩＫおよびまたは本発明の標的抗原（たとえば、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１８、１９または２０に記載のアミノ酸配列）を特異的に検出するために特有の様式で使用することができる。
【００７０】
該調製物は、本発明の標的抗原に最適な親和性を伴って結合することができる試薬の恩恵を被る本質的に任意の適用に使用することができる。かかる適用としては、たとえば、ＮＩＫの特異的リガンドのアフィニティー精製、したがって、同定および特徴付けが挙げられる。
【００７１】
以下に続く実施例の項で記載および説明するように、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１８、１９または２０に記載のアミノ酸配列に特異的に結合することができる本発明の調製物は、本明細書に示す手引きにしたがって、それぞれ、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１８、１９または２０に記載されるアミノ酸配列を特異的に検出するために使用することができる。
【００７２】
好ましくは、本発明の標的抗原に特異的に結合することができる本発明の調製物は、かかる標的抗原で免疫化された動物の血清（以下、「抗血清」という）に由来する。以下の実施例の項で記載および説明するように、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１８、１９または２０に記載されるアミノ酸配列に特異的に結合することができる本発明の抗血清は、本明細書に示すプロトコルにしたがって哺乳動物を標的抗原で免疫化することによって生成され得る。哺乳動物の免疫化によって調製物を作製するためのさらなる手引きは、本明細書において以下に提供する。
【００７３】
標的抗原などのポリペプチドを得るための手引きは、本明細書において以下に提供する。
【００７４】
本発明の一組の異なる標的抗原に特異的に結合することができる本発明の調製物は、該一組の標的抗原の各標的抗原に集合的に特異的に結合することができる本発明の一組の調製物をプールすることにより得られ得、この場合、該プールの各調製物は、該一組の標的抗原の単一の標的抗原で免疫化した動物の血清由来である。あるいはまた、該一組の標的抗原に特異的に結合することができる調製物は、該一組の標的抗原の各標的抗原に集合的に特異的に結合することができる本発明の一組の調製物をプールすることにより得られ得、この場合、プールされた調製物の少なくとも１つは、該一組の標的抗原の少なくとも２種類の標的抗原で免疫化した動物の血清由来である。たとえば、本発明の一組の標的抗原に特異的に結合することができる本発明の調製物は、該一組の標的抗原のすべての標的抗原で簡便に同時に免疫化した動物の血清由来であり得る。
【００７５】
適用および目的に応じて、該調製物は、好都合には未精製抗血清の形態で用いられるのがよく、または使用前に種々の方法で精製してもよい。たとえば、該調製物は、精製された（ｉ）特異的イソタイプまたは一組のイソタイプの抗体の調製物；（ii）配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１８、１９または２０に記載のアミノ酸配列の特定の部分に特異的に結合することができる抗体または抗体断片の調製物；および／または（ii）所望の親和性で本発明の標的抗原に結合することができる抗体または抗体断片の調製物の形態で使用され得る。
【００７６】
未精製抗血清の形態の本発明の調製物は、種々の適用における使用のために簡便かつ満足のいくものであり得る。たとえば、以下の実施例の項で記載および説明するように、本発明の未精製抗血清、特に、配列番号：７または１１に記載のアミノ酸配列で免疫化することによって生成される未精製抗血清は、ウエスタンイムノブロッティング解析によってＮＩＫを効率的に検出するために使用することができ、配列番号：８に記載のアミノ酸配列で免疫化することによって生成される未精製抗血清は、ＥＬＩＳＡ解析によってＮＩＫを効率的に検出するために使用することができる。一般に、本発明の標的抗原にある範囲の親和性／特異性を伴って結合することができる本発明の調製物の恩恵を被ることが望ましい適用には、本発明の抗血清などの本発明の未精製調製物は好都合である。かかる未精製調製物は、これに含まれる不均質なポリクローナル抗体または抗体断片混合物が、しばしば、標的抗原に対して充分な結合親和性／特異性を有する１つ以上の抗体または抗体断片を含むため、多くの場合、所与の適用に充分であり得る。
【００７７】
あるいはまた、本発明の精製された抗体または抗体断片は、好都合には、個体に対する該抗体または抗体断片の投与を伴うもの、および最適な感度での標的抗原の検出が望ましいものなどの適用に用いられ得る。
【００７８】
本明細書において使用する場合、用語「個体」は、ヒトをいう。
【００７９】
たとえば、本発明のＩｇＧ抗体調製物は、好都合には、プロテインＧアフィニティー精製を用いて、好ましくは、プロテインＧ免疫沈降によって、本発明の抗血清から精製され得る。以下に続く実施例の項で記載および説明するように、本明細書に示すプロトコルにしたがって、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１８、１９または２０に記載のアミノ酸配列で免疫化した動物に由来し、かつプロテインＧ免疫沈降によって精製した本発明の抗血清は、ウエスタンイムノブロッティング解析により、それぞれ配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１８、１９または２０に記載のアミノ酸配列を最適な感度で検出するために使用することができる。
【００８０】
標的抗原に特異的に結合することができる本発明の精製された抗体または抗体断片は、好都合には、最適な特異性を伴って、標的抗原と関連するＮＩＫの生化学的活性を調節するため、および最適な特異性を伴って標的抗原を検出するために使用することができる。特に、配列番号：７、８、９、１０、１１、１２、１３および１５に記載のアミノ酸配列内に含まれる本発明の標的抗原に特異的に結合することができる本発明の精製された抗体または抗体断片は、好都合には、ＮＩＫのキナーゼ活性を最適な特異性を伴って調節するために使用することができる。一般に、最適な再現性、標準化または精密化の恩恵を被る適用には、標的抗原に特異的に結合することができる本発明の精製された抗体または抗体断片は、本発明の未精製調製物と比べ、一般的に最適である。
【００８１】
標的抗原に特異的に結合することができる抗体または抗体断片の精製は、たとえば、本発明の未精製抗血清などの本発明の調製物を、標的抗原を共有結合させた基質を用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製することによりなされ得る。かかる基質結合標的抗原は、標準的なアフィニティークロマトグラフィー方法論にしたがって、標的抗原に特異的に結合することができる抗体または抗体断片を選択的に捕捉するために使用することができる。
【００８２】
該基質は、好ましくは、アフィニティークロマトグラフィー充填剤である。アフィニティークロマトグラフィー充填剤は、アフィニティークロマトグラフィーを行なうのに最適化された基質であり、好都合には、最適なアフィニティー精製を達成するために用いられ得る。
【００８３】
種々の構造的および化学的特徴を有する基質が、精製を行なうために使用され得る。
【００８４】
好ましくは、基質は、炭水化物またはその誘導体を含む。好ましくは、炭水化物は、アガロース、セファロースまたはセルロースである。
【００８５】
好ましくは、基質は、ビーズ、樹脂またはプラスチック表面である。
【００８６】
アガロース、セファロースまたはセルロースなどの炭水化物を含有するビーズ、樹脂またはプラスチック表面などの基質は、当該技術分野においてアフィニティークロマトグラフィーを行なうために常套的に使用されている。
【００８７】
アフィニティークロマトグラフィー（かかる基質を用いるものなどの）を行なうための充分な手引きは、当該技術分野の文献（たとえば、Wilchek M.および Chaiken I., 2000. Methods Mol Biol. 147: 1-6;Jack GW. Immunoaffinity chromatography. Mol Biotechnol 1,59-86;Narayanan SR., 1994. Journal of Chromatography A 658: 237-258;Nisnevitch M.および Firer MA., 2001. J Biochem Biophys Methods 49: 467-80;Janson JC. & Kristiansen T.の“Packings and Stationary Phases in Chromatography Techniques” (Unger, KK.編) pp.747 (Marcel Dekker, New York, 1990);Clonis, Y. D.の“HPLC of Macromolecules: A Practical Approach”, pp.157 (IRL Press, Oxford, 1989);Nilsson J.ら, 1997. Protein Expr Purif. 11: 1-16を参照）に提供されている。
【００８８】
あるいはまた、本発明の調製物は、多様な標準的なタンパク質精製手法、たとえば、限定されないが、イオン交換クロマトグラフィー、濾過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コナカバリンＡクロマトグラフィー、クロマトフォーカシングおよび差別的可溶化を用いて精製することができる。
【００８９】
本発明の標的抗原に所望の親和性で特異的に結合することができる本発明の抗体または抗体断片は、好都合には、標的抗原と関連するＮＩＫの生化学的活性の所望のレベルの調節を達成するために使用することができ、好都合には、標的抗原を所望の感度で検出するために使用することができる。特に、最大の親和性を伴ってＮＩＫのキナーゼ領域に含まれる本発明の標的抗原に特異的に結合することができる本発明の抗体または抗体断片は、好都合には、ＮＩＫのキナーゼ活性を最適にダウンレギュレーションするために使用することができる。同様に、最大の親和性を伴って標的抗原に特異的に結合することができる本発明の抗体または抗体断片は、好都合には、標的抗原を最適な感度で検出するために使用することができる。
【００９０】
本発明の調製物（たとえば、本発明の未精製抗血清など）からの、標的抗原に所望の親和性で結合することができる抗体または抗体断片の精製は、たとえば、標的抗原をアフィニティーリガンドとして使用することにより、未精製の、またはより好ましくはプロテインＧ精製された本発明の抗血清のアフィニティークロマトグラフィー精製によって、および制御されたストリンジェンシー条件下（たとえば、制御されたｐＨおよび／または塩濃度の条件下）での基質結合抗体または抗体断片の選択的溶出によって達成され得る。特に、最大のアフィニティーで標的抗原に結合することができる本発明の抗体または抗体断片は、効果的に最大のストリンジェンシー条件下（たとえば、効果的に最大または最小のｐＨおよび／または最大の塩濃度の条件下）での溶出によって簡便に得られ得る。典型的には、抗体または抗体断片は、基質に結合させたそのコグネイト抗原に生理学的ｐＨおよび塩濃度の条件下で結合し得、かかる抗体または抗体断片は、典型的には、ｐＨを２．５以下に低下させるか、またはｐＨを１１以上に上げることによって基質から溶出され得る。
【００９１】
コグネイト抗原に対して１０-12までの解離定数を特徴とする親和性を有する抗体または抗体断片は、一般的な当該技術分野の手法を用いて得られ得ることは、当業者に認識されよう。
【００９２】
本明細書において上記のように、該調製物は、好都合には、任意の種々の型の検出可能な分子に結合させた抗体または抗体断片を含有し得る。
【００９３】
検出可能な分子に結合させた抗体または抗体断片を含有する本発明の調製物は、該抗体または抗体断片により特異的に結合される標的抗原を検出するために使用することができる。
【００９４】
該調製物は、適用および目的に応じて、任意の非常に多くの型の検出可能な分子に結合させた抗体または抗体断片を含み得る。
【００９５】
たとえば、適用および目的に応じて、検出可能な分子は、好都合には、フルオロフォア、酵素、発光分子または放射性同位体であり得る。
【００９６】
好ましくは、検出可能な分子は酵素である。
【００９７】
酵素は、好都合には、任意の種々の酵素系の検出方法による標的抗原の検出を可能にするために利用され得る。かかる方法の例としては、限定されないが、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ；たとえば、溶液中の標的抗原を検出するため）、固相酵素化学発光分析（たとえば、電気泳動によって分離されたタンパク質混合物中の複合体を検出するため）、および固相酵素組織化学的アッセイ（たとえば、固定組織中の複合体を検出するため）が挙げられる。
【００９８】
以下の実施例の項で記載および説明するように、酵素に結合させた抗体を含有する本発明の調製物は、ＮＩＫをウエスタンイムノブロッティング解析またはＥＬＩＳＡによって効率的に検出するために使用することができる。
【００９９】
非常に多くの型の酵素が、適用および目的に応じて、標的抗原を検出するために用いられ得る。
【０１００】
好適な酵素の例としては、限定されないが、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＰＲ）、β−ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼ（ＡＰ）が挙げられる。
【０１０１】
第２版， Stanford C.および Horton R.（編），Oxford University Press, UK. (2001);Targesome, Inc. に対する米国特許第６，３５０，４６６号］。
【０１０２】
好適な発光分子の例としては、ルミノールが挙げられる。
【０１０３】
好適な放射性同位体の例としては、［１２５］ヨウ素、［３５］イオウ、［３］水素、［３２］リンなどが挙げられる。
【０１０４】
検出可能な分子は、抗体または抗体断片に、適用および目的に応じて、および関与する分子の性状に応じて種々の方法で結合させ得る。検出可能な分子を抗体または抗体断片に結合させるための充分な手引きは、当該技術分野の文献に提供されている［たとえば、“Using Antibodies: A Laboratory Manual”, Ed Harlow, David Lane (編), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999)を参照のこと；また、The American Chemical Societyにより、たとえば、http://www. chemistry. org/portal/Chemistry で提供される広範な手引きを参照のこと］。化学者などの当業者は、かかる化学的合成手法を好適に実施するために必要とされる専門知識を有する。
【０１０５】
したがって、検出可能な分子に結合させた抗体または抗体断片を含有する本発明の調製物は、本質的に任意の状況において、効率的にかつ特有の様式で標的抗原を検出するために使用することができる。
【０１０６】
本発明の抗体調製物は、ＮＩＫまたはその部分の免疫精製のために使用することができ、好ましくは、効率的にＮＩＫを免疫沈降させることができる本発明の抗体であり得る。
【０１０７】
好ましい一実施形態において、本発明の抗体は、ＮＩＫまたはその部分の精製における捕捉工程に使用することができる。
【０１０８】
適用および目的に応じて、該調製物は、好都合には、任意の種々の型の抗体断片の調製物であり得る。
【０１０９】
抗体断片は、好ましくは、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、またはより好ましくは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2またはＣＤＲである。
【０１１０】
抗体断片は、これが由来する親抗体と実質的に同一の標的抗原結合特異性、または結合特異性と結合親和性の両方を維持しつつ、親抗体よりも小さいという利点を有する。したがって、抗体断片は、親抗体よりも小さいおかげで、それにより、一般的に、後者よりも卓越した生体分散性および拡散性（たとえば、インビボで全身で、または単離された組織内）を有する。Ｆｃ領域（たとえば、単鎖Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2またはＣＤＲなど）を実質的に欠く抗体断片は、かかるＦｃ領域に特異的に結合することができる分子に該調製物を曝露することを伴い、かつかかる結合が望ましくない適用に好都合である。典型的には、これは、コグネイトＦｃ受容体またはＦｃ結合性相補成分（たとえば、血清中に存在する相補成分Ｃｌｑ）に曝露されたＦｃ領域への所望されない結合を伴い得る。Ｆｃ受容体は、非常に多くの免疫細胞型（樹状細胞などのプロフェッショナルＡＰＣ；Ｂリンパ球；ならびに好中球、好塩基球、好酸球、単球、マクロファージおよびマスト細胞などの顆粒球が挙げられる）の表面上に示される。したがって、抗体断片のＦｃ領域の非存在は、特に、該調製物をインビボで個体に投与する場合、所望されないＦｃ受容体媒介性免疫細胞活性化または相補成分媒介性相補カスケードを回避するために特に好都合であり得る。
【０１１１】
Ｆ（ａｂ’）2は、抗体分子の二価抗原結合性部分を含有する抗体分子の断片である。
【０１１２】
本発明のＦ（ａｂ’）2調製物は、標準的な当該技術分野の方法を用い、本発明の抗血清などの本発明の調製物を酵素ペプシンで処理することにより簡便に得られ得る。得られるＦ（ａｂ’）2生成物は５Ｓ粒子である。
【０１１３】
ＦａｂまたはＦａｂ’は、抗体の一価の抗原結合性部分を含有する抗体分子の断片である。
【０１１４】
ＣＤＲは、抗体の相補性決定領域であり、その抗体が抗原と接触する領域である。
【０１１５】
本発明のＦａｂ’調製物は、標準的な当該技術分野の方法を用い、本発明の抗血清などの本発明の調製物を酵素ペプシンで処理した後、得られたＦ（ａｂ’）2を縮小することにより、簡便に得られ得る。かかる縮小は、チオール還元剤を使用し、任意に、ジスルフィド結合の切断により生じるスルフヒドリル基の保護基を使用することにより行ない得る。かかる処理により、２つの一価の３．５Ｓ  Ｆａｂ’のＦｃ断片が生成する。
【０１１６】
Ｆａｂ調製物は、標準的な当該技術分野の方法を用い、本発明の抗血清などの本発明の調製物を酵素パパインで処理し、インタクトな軽鎖および可変とＣH１ドメインから構成される重鎖の部分を得ることにより簡便に得られ得る。
【０１１７】
ＣＤＲは、たとえば、ＥＰ０５８５９３９に記載のようにして、またはStrandbergら（Protein Eng. 2001 Jan;14 (1):67-74）に記載のようにして作製され得る。本発明によるＣＤＲは、ＮＩＫのモジュレーションに対して増大した効果を有する修飾ＣＤＲであり得る。活性ペプチドの修飾方法の一例は、Sawaら 1999 （J. Med. Chem. 42, 3289-3299）に記載されている。
【０１１８】
抗体の酵素的処理により抗体断片を作製するための充分な手引きは、当該技術分野の文献に提供されている（たとえば、Goldenbergの米国特許第４，０３６，９４５号および同第４，３３１，６４７号；Porter RR., 1959. Biochem J. 73: 119-126を参照のこと）。
【０１１９】
単鎖Ｆｖ（当該技術分野において「ｓｃＦｖ」とも呼ばれる）は、適当なポリペプチドリンカーによって連結された軽鎖の可変領域と重鎖可変領域を含む単鎖分子である。
【０１２０】
本発明のＦ（ａｂ’）2、Ｆａｂ’、Ｆａｂまたは単鎖Ｆｖの調製物は、組換え技術を用いて得られ得る。
【０１２１】
好ましくは、組換え抗体断片を得ることは、標的抗原で免疫化した動物のＢリンパ球のｍＲＮＡを単離し、ｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによりｃＤＮＡを作製し、該ｃＤＮＡを用いて抗体断片ファージディスプレーライブラリーを構築することにより行なわれる。Ｂリンパ球は、脾臓から、あるいはまた、免疫化した動物の血液、骨髄もしくはリンパ節から簡便に単離することができる。
【０１２２】
所望の標的抗原結合特性を有する抗体断片をディスプレイする組換えファージは、ライブラリーから、かかる結合特性を有するファージを大過剰の非結合クローンから逐次富化することにより選択され得る。この選択は、任意の種々の技術（固定された標的抗原上でのパニング；特異的溶出を用いるパニング；ビオチン化抗原の使用；カラム上でのアフィニティー精製；または細胞上での直接パニングが挙げられる）を用いてなされ得る。選択後、非特異的抗体断片をディスプレイするファージを洗浄により除去するのがよく、所望の標的抗原結合特性を示すｓｃＦｖを有する結合したファージを溶出し、大腸菌の感染により増幅させる。所望の標的抗原結合特性を有する抗体断片ディスプレイする組換えファージをいったん単離したら、該抗体断片の可変領域をコードするポリヌクレオチド配列をファージディスプレイパッケージから回収することができ、標準的な方法論［たとえば、“Current Protocols in Molecular Cloning”, Ausubelら（編）， Greene Publishing and Wiley Interscience, New York, N. Y. (1989);Sambrookら、下記および関連する参考文献を参照のこと］を用い、組換え原核生物または真核生物発現ベクター内にクローン化することができる。かかる原核生物発現ベクターは、精製組換え抗体断片を大腸菌内で作製するために使用することができる（たとえば、Studierら, 1990. Methods in Enzymol. 185: 60-89を参照のこと）。かかる真核生物発現ベクターは、組換え抗体断片の発現のために真核生物細胞を遺伝子工学的に形質転換するために使用することができる。
【０１２３】
Ｂリンパ球ｍＲＮＡから抗体断片ファージディスプレイライブラリーを得るため、および利用するための充分な手引きは、当該技術分野の文献に提供されている［たとえば、Hoogenboomら, 1998. Immunotechnology 4: 1-20;Kandら， 1991. Proc Natl Acad Sci U S A. 88: 4363;Barbasら 1991. Proc Natl Acad Sci U S A. 88: 7978;Garrardら, 1991. Biotechnology 9: 1373-1377;Hoogenboomら, 1991. Nucleic Acids Res. 19: 4133-4137;Sharonら, 2000. Combinational Chemistry and High Throughput Screening 3: 185-196；米国特許第５，６９８，４２６号、同第５，６５８，７２７号、同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５８０，７１７号、同第５，４２７，９０８号、同第５，７５０，７５３号、同第５，８２１，０４７号、同第５，５７１，６９８号、同第５，４２７，９０８号、同第５，５１６，６３７号、同第５，７８０，２２５号、同第５，６５８，７２７号、同第５，７３３，７４３号および同第５，９６９，１０８号；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ公開公報ＷＯ  ９０／０２８０９、ＷＯ  ９１／１０７３７、ＷＯ  ９２／０１０４７、ＷＯ  ９２／１８６１９、ＷＯ  ９３／１１２３６、ＷＯ  ９５／１５９８２およびＷＯ  ９５／２０４０１；Brinkmanら， 1995. J. Immunol. Methods 182: 41-50;Amesら, 1995. J. Immunol. Methods 184: 177-186;Kettleboroughら, 1994. Eur. J. Immunol. 24: 952-958;Persicら, 1997. Gene 187 9-18;ならびに Burtonら, 1994. Advances in Immunology 57: 191-280;Pluckthun :“The Pharmacology of Monoclonal Antibodies”, 第113巻, Rosenburg および Moors (編), Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994);Hoogenboomら, 1998. Immunotechnology 4: 1-20を参照のこと］。
【０１２４】
前記方法論は、本質的に任意の所望の標的抗原結合親和性および／または特異性を有する本発明のモノクローナル抗体断片調製物を得るために使用することができることは認識されよう。かかる調製物は、かかる規定の標的抗原結合特性を有する標的抗原に結合することができる試薬の恩恵を被る種々の適用において利用され得る。
【０１２５】
Ｆａｂ’は構造においてＦａｂと本質的に類似するため、Ｆａｂ’を含有する本発明の調製物は、Ｆａｂを含有するものと本質的に互換的に使用され得、この場合、かかるＦａｂ’およびＦａｂは、本質的に同じ重鎖および軽鎖の可変領域を含有する。標的抗原に最大の親和性を伴って結合することができる抗体断片を含有する本発明の調製物の恩恵を被る適用では、よくあることだが、本発明のＦ（ａｂ’）2調製物は、かかる一価の抗体断片の結合価が一価であるのに対してＦ（ａｂ’）2は標的抗原に対して結合価が二価であるため、本発明のＦａｂ、Ｆａｂ’またはｓｃＦｖ調製物よりも卓越したものであり得る。
【０１２６】
前記のように、適用および目的に応じて、抗体または抗体断片の調製物は、任意の種々の哺乳動物種を起源とし得る。
【０１２７】
所望の種を起源とする本発明の抗体または抗体断片調製物は、標的抗原で免疫化されたかかる種の動物の血清に由来し得る。
【０１２８】
かかる抗体は、一価、二価または多価であり得、架橋活性を有していても有しなくてもよい。本発明にしたがって使用される抗体は、ポリクローナル（ウサギにおいて産生される抗体など）またはモノクローナル抗体であり得る。
【０１２９】
好ましくは、本発明は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、ヒトもしくは抗−抗イディオタイプ抗体またはその断片からなる群より選択される抗体調製物の使用に関する。好ましくは、抗体または抗体断片はマウス起源のものである。
【０１３０】
用語「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）は、可溶性または結合形態で標識され得るモノクローナル抗体、キメラ、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗イディオタイプ抗体に対する抗体（抗−抗Ｉｄ抗体）および任意の公知の手法（たとえば、限定されないが、酵素的切断、ペプチド合成または組換え技術）により得られるその断片を含むことを意図する。
【０１３１】
モノクローナル抗体は、抗原に対して特異的な抗体の実質的に均一な集団を含み、該集団は、実質的に類似したエピトープ結合性部位を含む。ｍＡｂは、当業者に既知の方法により得られ得る。たとえば、Kohler および Milstein, Nature, 256: 495-497 (1975)；米国特許第を参照のこと。
【０１３２】
モノクローナル抗体は、これが、分子と特異的に反応することができ、それにより、該分子が抗体に結合する場合、分子に「結合することができる」といえる。用語「エピトープ」は、任意の分子の抗体によって結合され得、また該抗体によって認識され得る部分を指すことを意図する。エピトープまたは「抗原決定基」は、通常、化学的に活性な表面分子（たとえば、アミノ酸または糖側鎖など）の集団からなり、特異的な三次元の構造的特徴および特異的な帯電特性を有する。
【０１３３】
「抗原」は、抗体によって結合され得る分子または分子の部分であり、加えて、該抗原は、動物に、該抗原のエピトープに結合することができる抗体の産生を誘導することができる。抗原は、１つまたは１つより多いエピトープ有し得る。上記の特異的反応は、抗原が、その対応する抗体上のエピトープと高度に選択的な様式で反応するが、他の抗原によって誘発され得る多数の他の抗体とは反応しないことを示すものとする。
【０１３４】
４，３７６，１１０号；Ausubelら編， Harlow および Lane ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory (1988);および Colliganら編， Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience N. Y., (1992-1996)。かかる抗体は、任意の免疫グロブリンクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭが挙げられる）のものであり得る。
【０１３５】
抗−イディオタイプ（抗−ｉｄ）抗体は、一般的に抗体の抗原結合性部位と関連する特有の決定基を認識する抗体である。Ｉｄ抗体は、それに対する抗Ｉｄが調製されるｍＡｂの供給源と同じ種および遺伝子型（たとえば、マウス系統）の動物を免疫化することによって調製され得る。
【０１３６】
免疫化された動物は、免疫化抗体のイディオタイプ決定基を認識し、これらのイディオタイプ決定基に対する抗体（抗Ｉｄ抗体）を産生することにより、これに応答する。たとえば、米国特許第４，６９９，８８０号を参照のこと。
【０１３７】
また、抗Ｉｄ抗体は、さらに別の動物において免疫応答を誘導し、いわゆる抗−抗Ｉｄ抗体を産生させるための「免疫原」として使用され得る。抗−抗Ｉｄは、抗−ｉｄを誘導した元のｍＡｂとエピトープが同一であり得る。したがって、ＭＡｂのイディオタイプ決定基に対する抗体を使用することにより、同一の特異性の抗体を発現する他のクローンを同定することが可能である。
【０１３８】
したがって、ＮＩＫ断片に対して生成されるｍＡｂは、抗Ｉｄ抗体を、ＢＡＬＢ／ｃマウスなどの適当な動物内で誘導するために使用され得る。かかる免疫化マウス由来の脾臓細胞を用い、抗ＩｄｍＡＢを分泌する抗Ｉｄハイブリドーマを作製する。さらに、抗−ｉｄｍＡｂは、スカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）などの担体に結合させ、さらなるＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化するために使用され得る。これらのマウス由来の血清は、ＮＩＫのエピトープまたは断片に特異的な元のｍＡｂの結合特性を有する抗−抗Ｉｄ抗体を含む。
【０１３９】
抗ＩｄｍＡｂは、このように、その独自のイディオタイプエピトープ、または評価対象のエピトープと構造的に類似した「イディオトープ」を有する。
【０１４０】
ヒト抗体もしくはヒト化抗体または抗体断片の本発明の調製物は、該調製物の個体への投与を伴う適用に好ましいものであり得る。たとえば、ヒト抗体もしくはヒト化抗体または抗体断片は、一般的に、免疫学的に最適に耐容性である傾向にあり、したがって、ヒトにおいてインビボで最適な半減期が示され、それにより、最適な有効性が示される。ヒト抗体またはヒト化抗体の作製および利用に関するさらなる手引きは、以下に提供する。
【０１４１】
本発明において有用な抗体（抗体の断片を含む）は、試料中のＮＩＫまたはそのムテイン、機能性誘導体、活性分画、円順列変異誘導体、塩もしくは部分を定量的または定性的に検出するため、またはＮＩＫまたはそのムテイン、機能性誘導体、活性分画、円順列変異誘導体、塩もしくは部分を発現する細胞の存在を検出するために使用され得る。これは、蛍光顕微鏡使用により結合させた蛍光標識抗体を用いる免疫蛍光手法、フローサイトメトリーによる検出または蛍光分析による検出によってなされ得る。
【０１４２】
本発明の抗体（またはその断片）は、本発明のＮＩＫまたはその部分のインサイチュ検出のために、免疫蛍光または免疫電子顕微鏡検査の場合のように、組織学的に用いられ得る。インサイチュ検出は、患者から組織学的試験片を取り出し、かかる試験片に本発明の標識抗体を提供するによりなされ得る。抗体（または断片）は、好ましくは、標識抗体（または断片）を、生物学的試料に適用することにより、またはこの上に重層することにより提供される。かかる手順に使用により、ＮＩＫまたはその部分の存在だけでなく、試験した組織上での分布もまた調べることが可能である。本発明を用い、当業者には、かかるインサイチュ検出を達成するために、任意の多種多様な組織学的方法（染色手順など）を変形し得ることが容易にわかるだろう。
【０１４３】
生物学的試料は、固相支持体もしくは担体（たとえば、ニトロセルロースなど）または細胞、細胞粒子もしくは可溶性タンパク質を固定化することができる他の固体支持体もしくは担体に結合させ得る。該支持体または担体を、次いで、適当なバッファーで洗浄した後、上記のようにして、本発明による標識抗体で処理し得る。固相支持体または担体を、次いで、該バッファーでの２回目の洗浄を行ない、未結合抗体を除去する。次いで、前記固体支持体または担体上の結合標識の量を、慣用的な手段により検出し得る。
【０１４４】
「固相支持体」、「固相担体」、「固体支持体」、「固体担体」、「支持体」または「担体」は、抗原または抗体結合することができる任意の支持体または担体を意図する。周知の支持体または担体としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロンアミラーゼ、天然および改質セルロース、ポリアクリルアミド、斑レイ岩ならびにマグネタイトが挙げられる。担体の性状は、本発明の目的のために、ある程度可溶性のあるもの、または不溶性であり得る。支持体材料は、結合された分子が抗原または抗体に結合することができるものであれば、事実上任意の可能な構造的構成を有し得る。したがって、支持体または担体の構成は、ビーズのような球状、テストチューブの内側表面または棒状物の外側表面のような円柱であり得る。あるいはまた、表面は、シート、試験細片などの平坦なものであってもよい。好ましい支持体または担体としては、ポリスチレンビーズが挙げられる。当業者には、抗体または抗原に結合させるための他の好適な担体がわかるだろうし、または常套的な実験法の使用により、これを確認することができるだろう。
【０１４５】
本発明の所与の多くの抗体の結合活性は、上記のように、周知の方法にしたがって測定され得る。当業者は、常套的な実験法を用いることによる各測定のための作業条件および最適なアッセイ条件を決定することができよう。
【０１４６】
通例、または特定の状況に必要であるように、洗浄、攪拌、振とう、濾過など他の工程をアッセイに追加してもよい。
【０１４７】
本発明による抗体が標識され得る方法の１つは、これを酵素に連結することによるものであり、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）において使用され得る。この酵素は、今度は、後に適切な基質に曝露した場合、たとえば分光測光的手段、蛍光分析的手段により、または可視化手段により検出可能な化学的部分を生じるような様式で基質と反応する。抗体検出可能に標識するために使用することができる酵素としては、限定されないが、マレエートデヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌のヌクレアーゼ、δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。検出は、酵素用の発色性基質を用いる比色分析方法によってなされ得る。検出はまた、同様に調製された標準品との比較した基質の酵素的反応の程度の視覚による比較によってもなされ得る。
【０１４８】
検出は、任意の多様な他のイムノアッセイを用いてなされ得る。たとえば、抗体または抗体断片を放射能で標識することにより、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）の使用によってＲ−ＰＴＰアーゼを検出することが可能である。ＲＩＡの充分な記載は、Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology,(Work, T. S.らによる), North Holland Publishing Company, NY (1978)（具体的な記載は、Chard, T.による表題“An Introduction to Radioimmne Assay and Related Techniques”の章になされている）に見出され得、引用により本明細書に組み込まれる。放射性同位体は、ｇカウンターもしくはシンチレーションカウンターの使用などの手段によって、またはオートラジオグラフィーによって検出することができる。
【０１４９】
本発明による抗体を蛍光化合物で標識することも可能である。蛍光により標識された抗体を適切な波長の光に曝露すると、その存在が、蛍光によって検出され得る。中でも、最も一般的に使用される蛍光標識化合物は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、ピコシアニン、アロピコシアニン、ｏ−フタルアルデヒドおよびフルオレサミンである。
【０１５０】
該抗体はまた、１５２Ｅなどの蛍光発光性金属、またはランタノイド系の他のものを用いて検出可能に標識することもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＥＴＰＡ）などの金属キレート形成基を用いて抗体に結合させることができる。
【０１５１】
該抗体はまた、化学発光化合物に結合させることによって検出可能に標識することもできる。次いで、化学発光タグ化抗体の存在を、化学的反応の過程で生じる発光の存在を検出することによって調べる。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、セロマティックアクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルが挙げられる。
【０１５２】
同様に、生物発光化合物も、本発明の抗体を標識するために使用され得る。生物発光は、触媒性タンパク質が化学発光反応の効率を増大させる生物学的な系において見られる化学発光の１種である。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することによって調べる。標識の目的に重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。
【０１５３】
本発明の抗体調製物は、イムノメトリックアッセイ（「２部位」または「サンドイッチ」アッセイとしても知られる）における利用に適合したものであり得る。典型的なイムノメトリックアッセイでは、ある量の非標識抗体（または抗体の断片）を固体支持体または担体に結合させ、ある量の検出可能に標識された可溶性抗体を添加して、固相抗体、抗原および標識抗体間で形成される三元複合体の検出および／または定量を可能にする。
【０１５４】
典型的かつ好ましいイムノメトリックアッセイとしては、「フォワード」アッセイ（これは、固相に結合させた抗体をまず試験対象試料と接触させ、抗原を試料から二元固相抗体−抗原複合体の形成によって抽出する）が挙げられる。適当なインキュベーション期間後、固体支持体または担体を洗浄し、未反応抗原（あれば）を含む試料液の残余を除去し、次いで、未知量の標識抗体（これは「レポーター分子」としての機能を果たす）を含む溶液と接触させる。標識抗体が、非標識抗体により固体支持体または担体に結合した抗原と複合体形成するのを可能にするための第２のインキュベーション期間後、固体支持体または担体に２回目の洗浄を行ない、未反応標識抗体を除去する。
【０１５５】
別の型の「サンドイッチ」アッセイ（これもまた本発明の抗原について有用であり得る）において、いわゆる「同時」および「リバース」アッセイが使用される。同時アッセイは、固体支持体または担体に結合させた抗体および標識抗体の両方が試験対象試料に同時に添加されるため、単一のインキュベーション工程を伴う。インキュベーションが完了した後、固体支持体または担体を洗浄し、試料液の残余および非複合体化標識抗体を除去する。次いで、固体支持体または担体に結合した標識抗体の存在を、慣用的な「フォワード」サンドイッチアッセイのようにして調べる。
【０１５６】
「リバース」アッセイでは、まず標識抗体溶液の試料液への添加、続いて、適当なインキュベーション期間後での固体支持体または担体に結合した非標識抗体の添加の段階的添加を用いる。第２のインキュベーション後、固相を慣用的な様式で洗浄し、試験対象試料の残余および未反応標識抗体溶液を除く。次いで、固体支持体または担体に結合した標識抗体の測定を、「同時」および「フォワード」アッセイのようにして調べる。
【０１５７】
該調製物は、それ自体を使用してもよく、または医薬組成物中の活性成分として配合することができる。
【０１５８】
したがって、本発明により、薬学的に許容され得る担体および、活性成分として本発明の抗体または抗体断片を含有する医薬組成物が提供される。
【０１５９】
本発明の抗体または抗体断片を活性成分として医薬組成物中に配合する方法およびかかる医薬組成物の利用方法は、本明細書に以下に記載のとおりである。
【０１６０】
本明細書において上記のように、ＮＩＫの機能性領域などの領域に特異的に結合する能力のおかげで、本発明の抗体または抗体断片は、かかる機能性領域と関連するＮＩＫ分子の生化学的活性を調節するために使用することができる。
【０１６１】
したがって、本発明のさらに別の態様によれば、ＮＩＫ分子の生化学的活性の調節方法が提供される。該方法は、ＮＩＫ分子を本発明の抗体または抗体断片と接触させることにより行なわれる。
【０１６２】
好ましくは、該方法は、ヒトＮＩＫ分子において該生化学的活性を調節するために使用される。
【０１６３】
また、本発明は、ＮＩＫの活性によって引き起こされるか、または悪化する疾患の治療のための医薬の製造における、配列番号：１、２、３、４、５、６、１３、１５、１８、１９、２０および／または２２に記載されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列の部分に特異的に結合することができる抗体または抗体断片の調製物の使用に関する。
【０１６４】
本発明の別の態様は、配列番号：１、２、３、４、５、６、１３、１５、１８、１９、２０および／または２２に記載されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列の部分に特異的に結合することができる抗体または抗体断片の調製物を、必要とする個体に投与することを含む、ＮＩＫの活性によって引き起こされるか、または悪化する疾患の治療方法に関する。
【０１６５】
本明細書において上記のように、本発明の抗体または抗体断片は、ＮＩＫキナーゼ活性をダウンレギュレーションするようにＮＩＫのキナーゼ領域に特異的に結合することができるため、およびかかる活性がＮＦ−κＢの活性化に必要とされるため（前記「発明の分野および背景」の項に広範に詳細に示す）、該方法を、ＮＦ−κＢ活性を最適にダウンレギュレーションするために使用することができる。
【０１６６】
したがって、ＮＦ−κＢ活性の最適なダウンレギュレーションが可能なおかげで、該方法を、個体において、無規制なＮＦ−κＢ活性、特に過剰または構造的ＮＦ−κＢ活性と関連する疾患を最適に治療するために使用することができる。
【０１６７】
個体において該疾患を治療するために本発明のこの態様にしたがって該方法を使用する場合、ＮＩＫ分子を抗体または抗体断片と接触させることは、好都合には、抗体または抗体断片を個体に投与することによって行なわれ得る。
【０１６８】
好ましくは、抗体または抗体断片の投与は、本発明の抗体または抗体断片活性成分として含有する本発明の医薬組成物の投与により行なわれる。
【０１６９】
抗体または抗体断片は、好ましくは、生化学的活性の所望の調節が達成されるように、充分なレベルの抗体断片の標的抗原への結合が達成されるように投与される。
【０１７０】
また、本発明によるモノクローナル抗体の調製方法を提供する。該方法は、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１８、１９、２０または２２に記載されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列の部分で免疫化した哺乳動物由来の脾臓細胞および同型遺伝子型または異型遺伝子型のリンパ球様細胞を含有するクローン化ハイブリドーマを、液体培地または哺乳動物の腹部内で増殖させ、ハイブリドーマにモノクローナル抗体を産生および蓄積させることを含む。
【０１７１】
モノクローナル抗体の調製物に使用されるハイブリドーマの例は、ハイブリドーマクローンＰｅｐ  ７−８１．１、Ｐｅｐ  １１−３５５．８、ＰｅＰ  １２−６２９−６２−１８（ＣＮＣＭに、それぞれ、番号Ｉ−３０９２、番号Ｉ−３０９３および番号Ｉ−３０９４で寄託されている）である。
【０１７２】
医師（より好ましくは、該疾患の専門医）などの当業者は、本発明の教示にしたがって効果的に該疾患を治療するために、好適な治療プロトコル（たとえば、好適な投与経路および抗体または抗体断片の好適な用量）を決定するために必要とされる専門知識を有する。
【０１７３】
ＮＩＫは、通常、細胞内分子であり、したがって、抗体または抗体断片をＮＩＫ分子と細胞（たとえば、無規制なＮＦ−κＢ活性を特徴とする細胞）内において最適に接触させるため、該方法は、好ましくは、細胞内での抗体または抗体断片のＮＩＫ分子との接触を容易にするような方法で実施する。
【０１７４】
かかる細胞内接触は、適用および目的に応じて、種々の方法で容易にし得る。
【０１７５】
たとえば、かかる細胞内接触は、細胞を、抗体または抗体断片に、抗体または抗体断片の細胞の内部への浸透を容易にすることができる脂質系担体の補助を伴って接触させることにより行なわれ得る。
【０１７６】
あるいはまた、かかる細胞内接触は、細胞を、本発明の抗体断片を細胞内で発現することができる発現ベクターで遺伝子工学的に形質転換することによって行なわれ得る。
【０１７７】
抗体または抗体断片の細胞内への進入を容易にするための脂質担体の好適な類型としては、リポソームおよびイムノリポソームが挙げられる。イムノリポソームは、分子の細胞型特異的送達を可能にするおかげで、好都合には、抗体または抗体断片を、疾患に罹患した細胞（かかる細胞は、特徴的な表面抗原、たとえば、病的免疫応答を示す細胞内の炎症のマーカー（たとえば、活性化されたＴリンパ球におけるＣＤ２５またはＣＤ６９）、または悪性細胞における腫瘍関連抗原（たとえば、腺癌細胞におけるＨＥＲ−２、黒色腫細胞におけるＭＡＧＥ−１など）を発現する）内に選択的に送達するために用いられ得る。
【０１７８】
かかる脂質系担体を、治療用分子（たとえば、本発明の抗体または抗体断片など）の疾患細胞への細胞内送達に使用するための充分な手引きは、当該技術分野の文献に提供されている（たとえば、Abra RM.ら, 2002. J Liposome Res. 12: 1-3;Park JW., 2002. Breast Cancer Res.;4 (3): 95-9;Bendas G., 2001. BioDrugs 15: 215-24;Maruyama K., 2000. Biol Pharm Bull. 23: 791-9;Hong K.ら, 1999. Ann N Y Acad Sci. 886: 293-6;Margalit R., 1995. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 12: 233-61;Storm G. および Crommelin DJ., 1997. Hybridoma 16: 119-25;Park JW.ら, 1997. Adv Pharmacol. 40: 399-435を参照のこと）。
【０１７９】
組換え抗体断片（たとえば、本発明の組換え抗体断片）を細胞内で産生させることは、当該技術分野において常套的に行なわれている。細胞内で発現された組換え抗体断片は、当該技術分野において「イントラボディ」とよばれることがある。生体分子に特異的に結合することができる組換え抗体断片の細胞内発現を、細胞内の生体分子の生化学的活性（たとえば、酵素活性など）を調節するために使用するための充分な手引きは、当該技術分野の文献に提供されている（たとえば、Mhashilkar AM.ら, 2002. Gene Ther. 9: 307-19;Arafat W.ら, 2000. Cancer Gene Ther. 7: 1250-6;Cohen PA.ら, 1998. Oncogene 17: 2445-56;Hassanzadeh Gh G.ら, 1998. FEBS Lett. 437: 81-6;Richardson JH.ら, 1998. Gene Ther. 5: 635-44を参照のこと；組換え抗体断片を細胞内において発現させるための一般的な手引きについては、たとえば、der Maur AA.ら, 2002. J Biol Chem. 277: 45075-85;Zhu Q.ら, 1999. J Immunol Methods. 231: 207-22;Wirtz P. および Steipe B., 1999. Protein Sci. 8: 2245-50;Ohage E. および Steipe B., 1999. J Mol Biol. 291: 1119-28を参照のこと）。
【０１８０】
哺乳動物細胞を発現ベクターで遺伝子工学的に形質転換することは、任意の種々の一般的に行なわれている当該技術分野の方法（たとえば、安定または一過性トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーションおよび組換えウイルス系ベクターによる感染など）を用いて行なわれる。かかる方法を行なうための充分な手引きは、当該技術分野の文献に提供されている［たとえば、Sambrookら、下記および関連する参考文献；“Somatic Gene Therapy”のChangら, CRC Press, Ann Arbor, MI (1995);“Gene Targeting”のVegaら, CRC Press, Ann Arbor MI. (1995);Vectors, A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston MA (1988);Gilboaら, 1986. Biotechniques 4: 504-512を参照のこと；中枢神経系に関連するベクターについては、たとえば、米国特許第４，８６６，０４２号を参照のこと；相同組換えを誘導するための陽性／陰性選択方法については、たとえば、米国特許第５，４６４，７６４号および同第５，４８７，９９２号を参照のこと］。
【０１８１】
本発明の抗体断片を細胞内で発現させるための発現ベクターの作製および利用に関するさらなる手引きは、以下に提供する。
【０１８２】
本明細書において上記のように、本発明のこの態様による方法は、無規制なＮＦ−κＢ活性と関連する疾患を最適に治療するために使用することができる。ＮＦ−κＢ活性は、一般的に、非常に広範な免疫応答（たとえば、リンパ球抗原受容体、リンパ球共刺激受容体、ＴＮＦ受容体、インターロイキン受容体、ＬＭＰ１、ＲＡＮＫ、ヒトＴｏｌｌ受容体およびリポ多糖（ＬＰＳ）により惹起されるもの）の活性化に関与する。かかる受容体は、非常に広範な型の免疫応答の媒介に関与するため、本発明のこの態様による方法は、その病因がかかる免疫応答と関連する非常に多くの疾患を治療するため使用することができる。かかる疾患としては、自己免疫疾患、炎症性疾患、移植関連疾患およびアレルギー性疾患が挙げられる。たとえば、ＮＦ−κＢは、かかる疾患の多様な例（たとえば、アレルギー性疾患（たとえば、喘息）、自己免疫疾患（たとえば、関節リウマチ）、炎症性疾患（たとえば、炎症性腸疾患）、アテローム性動脈硬化およびアルツハイマー病、ならびに移植に関連する疾患（たとえば、移植片拒絶）など）の病因に関与することが示されている。さらにまた、無規制なＮＦ−κＢシグナル伝達は、種々の悪性疾患と関連することが示されている。
【０１８３】
したがって、本発明のこの態様による方法は、自己免疫疾患、炎症性疾患、移植関連疾患、アレルギー性疾患および悪性疾患などの疾患を効果的に治療するために使用することができる。
【０１８４】
本発明のこの態様にしたがって治療され得る疾患の具体例は、以下に列挙する。
【０１８５】
本明細書において上記のように、ポリペプチドである標的抗原は、種々の方法で得られ得る。
【０１８６】
好ましくは、標的抗原は、標準的な化学的合成方法論によって得られる。
【０１８７】
あるいはまた、標的抗原は、天然で発現されたＮＩＫのタンパク質溶解性切断により得られ得るか、またはインビトロ発現系（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、下記および関連する参考文献を参照のこと）を用いる標準的な組換え技術により得られ得る。
【０１８８】
標的抗原は、たとえば、標準的な固相技術を用いて化学的に合成され得る。かかる技術としては、排他的固相合成、部分固相合成方法、断片縮合、古典的溶液合成が挙げられる。固相ポリペプチド合成手順は、当該技術分野において周知である［たとえば、“Solid Phase Peptide Synthesis”, 第２版, Pierce Chemical Company, (1984)のStewartらを参照のこと］。
【０１８９】
合成ポリペプチドは、Creighton T. [Proteins, structures and molecular principles, W. H. Freeman and Co. N. Y. (1983)］に記載のものなどの分取用高速液体クロマトグラフィー手順によって精製することができ、そのアミノ酸配列は、標準的なアミノ酸配列決定手順により確認し得る。
【０１９０】
本明細書において上記のように、該調製物は、好ましくは、哺乳動物を標的抗原で免疫化することにより誘導される。
【０１９１】
該調製物のインビボでの作製は、好都合には、血清中で抗体の産生を刺激する計画にしたがい、アジュバントの存在下での標的抗原の哺乳動物への反復注射により行なわれ得る。標的抗原が、充分な免疫原性応答を惹起するには小さすぎる場合（当該技術分野において「ハプテン」という）、このハプテンを、スカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）または血清アルブミンなどの抗原性的に中性の担体に結合させ得る［たとえば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）］担体（たとえば、米国特許第５，１８９，１７８号および同第５，２３９，０７８号を参照のこと）。ハプテンの担体への結合は、当該技術分野において周知の種々の方法を用いて行い得る。たとえば、アミノ基への直接結合を行ない、任意に、その後、形成されたイミノ結合の還元を行ない得る。あるいはまた、担体を、ジシクロヘキシルカルボジイミドまたは他のカルボジイミド脱水剤などの縮合剤を用いて結合させ得る。また、リンカー化合物を該結合を行なうために使用することができる。ホモ二機能性およびヘテロ二機能性リンカーは、ともに、Pierce Chemical Company, Rockford, Illから入手可能である。得られた免疫原性複合体を、次いで、好適な哺乳動物被験体（たとえば、マウス、ウサギなど）に注射し得る。抗体のインビボ作製後、宿主哺乳動物におけるその血清価は、当該技術分野において周知のイムノアッセイ手順を用いて容易に測定され得る。
【０１９２】
本明細書において上記のように、該調製物は、好都合には、ヒト化抗体または抗体断片を含有し得る。
【０１９３】
キメラ抗体およびその作製方法は当該技術分野において公知である（Cabilly ら, 欧州特許出願第１２５０２３号（１９８４年１１月１４日に公開）；Taniguchiら, 欧州特許出願第１７１４９６号（１９８５年２月１９日に公開）；Morrisonら, 欧州特許出願第１７３４９４号（１９８６年３月５日に公開）；Neubergerら, ＰＣＴ出願ＷＯ  ８６０１５３３（１９８６年３月１３日に公開）；Kudoら, 欧州特許出願第１８４１８７号（１９８６年６月１１日に公開）；Robinsonら, 国際特許出願番号Ｗ０８７０２６７１（１９８７年５月７日に公開）；Riechmannら、ならびにHarlow および Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL（前出）。
【０１９４】
「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリンの可変および定常領域の両方を含有する分子である。完全なヒト抗体は、抗イディオタイプ免疫原性が有意に低減されているか、または理想的には存在しないはずであるため、治療用途に特に好適である。完全なヒト抗体の調製のための方法の１つは、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座を、内在性Ｉｇ遺伝子が不活化されているマウスに導入することによるマウス体液性免疫系の「ヒト化」、すなわちヒトＩｇを産生することができるマウス系統（ゼノマウス）の作製からなる。Ｉｇ遺伝子座は、物理的構造と、最終的に広い免疫応答を生じるのに必要とされる遺伝子再編成および発現プロセスとの両方の点で、きわめて複雑である。抗体の多様性は、主に、Ｉｇ遺伝子座内に存在する異なるＶ、ＤおよびＪ遺伝子間の再編成の組み合わせにより生じる。これらの遺伝子座はまた、抗体発現、対立遺伝子排除、クラススイッチおよび親和性成熟を制御する散在性調節性エレメントを含む。非再編成ヒトＩｇ導入遺伝子のマウスへの導入により、このマウス組換え機構は、ヒト遺伝子に適合性があることが示されている。さらにまた、種々のイソタイプの抗原特異的ｈｕ−ｍＡｂを分泌するハイブリドーマは、該抗原でのゼノマウス免疫化によって得られ得る。
【０１９５】
完全なヒト抗体およびその作製方法は、当該技術分野において公知である（Mendezら (1997);Buggemannら (1991);Tomizukaら, (2000) Patent W098/24893）。
【０１９６】
本明細書において使用する場合、用語「ムテイン」は、得られる生成物の活性を元のＮＩＫと比べて大幅に変化させることなく、ＮＩＫの天然に存在する成分のアミノ酸残基の１個以上が異なるアミノ酸残基で置き換わっているか、もしくは欠損しているか、または１個以上のアミノ酸残基がＮＩＫの元の配列に付加されているＮＩＫのアナログをいう。これらのムテインは、公知の合成により、および／または部位特異的突然変異誘発技術、あるいは、これに適当な任意の他の公知の手法により調製される。
【０１９７】
本発明によるムテインとしては、ＮＩＫをコードする本発明によるＤＮＡまたはＲＮＡにストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）にコードされるタンパク質が挙げられる。用語「ストリンジェント条件」は、当業者が慣用的に「ストリンジェント」とよぶハイブリダイゼーションおよびその後の洗浄条件をいう。Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology(前出), Interscience, N. Y., §§6.3 および 6.4 (1987,1992), ならびに Sambrookら (Sambrook, J. C., Fritsch, E. F., および Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）を参照のこと。
【０１９８】
限定されないが、ストリンジェント条件の例としては、研究対象のハイブリッドの計算値Ｔｍより１２〜２０℃低く、たとえば、２×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳで５分間、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで１５分間；０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳで３７℃で３０〜６０分間、次いで、０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳで６８℃で３０〜６０分間における洗浄条件が挙げられる。当業者は、ストリンジェンシー条件がまた、ＤＮＡ配列、オリゴヌクレオチドプローブ（１０〜４０塩基など）または混合オリゴヌクレオチドプローブの長さに依存することを理解している。混合プローブを使用する場合、ＳＳＣの代わりにテトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）を使用することが好ましい。Ａｕｓｕｂｅｌ（前出）を参照のこと。
【０１９９】
任意のかかるムテインは、好ましくは、ＮＩＫに実質的に類似またはより良好でさえある活性を有するように、ＮＩＫのものと充分に重複性のアミノ酸配列を有する。
【０２００】
好ましい実施形態において、任意のかかるムテインは、ＮＩＫのアミノ酸配列と少なくとも４０％の同一性または相同性を有する。より好ましくは、該配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または最も好ましくは、少なくとも９０％の同一性または相同性を有する。
【０２０１】
同一性は、配列の比較により調べる２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係を反映する。一般に、同一性は、比較対象の配列の長さに関して、それぞれ、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチドの配列の正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の一致をいう。
【０２０２】
正確な一致がない配列の場合、「同一性の割合」を決定し得る。一般に、比較対象の２つの配列をアラインメントし、配列間の最大相関関係を得る。これは、配列のいずれか一方または両方に「ギャップ」を挿入し、アラインメントの程度を向上させることを含み得る。同一性の割合は、比較対象の配列の各々の完全な長さに関して（いわゆる全体アラインメント）（同じまたは非常に類似した長さの配列に特に好適である）、またはより短い規定の長さに関して（いわゆる局所アラインメント）（長さが同じでない配列により適する）決定し得る。
【０２０３】
２つ以上の配列の同一性および相同性を比較するための方法は、当該技術分野において周知である。このため、たとえば、Wisconsin Sequence Analysis Package, version 9.1 (Devereux Jら 1984, Nucleic Acids Res. 1984 Jan 11;12 (1 Pt 1): 387-95.)で入手可能なプログラム、たとえば、プログラム ＢＥＳＴＦＩＴ  ａｎｄ  ＧＡＰ が、２つのポリヌクレオチド間の同一性％ならびに２つのポリペプチド配列間の同一性％および相同性％を決定するために使用され得る。ＢＥＳＴＦＩＴは、Smith and Waterman (J Theor Biol. 1981 Jul 21;91 (2): 379-80 and J Mol Biol. 1981 Mar 25;147 (1):195-7. 1981）の「局所相同性」アルゴリズムを使用し、２つの配列間の類似性の最大の単一の領域を見出す。配列間の同一性および／または類似性を決定するための他のプログラムもまた当該技術分野において公知である（たとえば、ＢＬＡＳＴ  ファミリーのプログラム (Altschul S F ら, 1990 J Mol Biol. 1990 Oct 5;215 (3): 403-10, Proc Natl Acad Sci U S A. 1990 Ju1;87 (14): 5509-13, Altschul S Fら, Nucleic Acids Res. 1997 Sep 1;25 (17): 3389-402, NCBIのホームページからwww. ncbi. nlm. nih. govでアクセス可能）および  ＦＡＳＴＡ(Pearson W R, Methods Enzymol. 1990;183: 63-98. Pearson J Mol Biol. 1998 Feb 13;276 (1):71-84))。
【０２０４】
本発明にしたがって使用され得るＮＩＫのムテイン、またはこれをコードする核酸としては、本明細書に記載の教示および手引きに基づき、必要以上の実験をせずに、当業者により常套的に得られ得る置換ペプチまたはポリヌクレオチドに実質的に対応する有限な一群の配列が挙げられる。
【０２０５】
本発明によるムテインに対する好ましい変化は、「保存的」置換として知られるものである。ＮＩＫの保存的アミノ酸置換には、充分に類似した物理化学的特性を有し、かつ群の構成員間での置換が分子の生物学的機能を保存している一群内の同義アミノ酸が含まれ得る。特に、挿入または欠失が数個のアミノ酸（たとえば３０個未満、好ましくは１０個未満）のみを伴い、かつ機能的コンホメーションに必須のアミノ酸（たとえば、システイン残基）が除去または置換されない場合、アミノ酸の挿入および欠失もまた、その機能を改変することなく前記規定配列において行なわれ得ることは明白である。かかる欠失および／または挿入によって生じるタンパク質およびムテインは、本発明の範囲に含まれる。
【０２０６】
好ましくは、同義アミノ酸群は表Ａに規定されるものである。より好ましくは、同義アミノ酸群は表Ｂに規定されるものであり、最も好ましくは、同義アミノ酸群は表Ｃに規定されるものである。
【０２０７】
【表１】
0005599549.tif 000002
【０２０８】
【表２】
0005599549.tif 000003
【０２０９】
【表３】
0005599549.tif 000004
【０２１０】
本発明における使用のために、ＮＩＫのムテインを得るのに使用され得るタンパク質内のアミノ酸置換の生成の例としては、任意の公知の方法の工程（たとえば、Markらに対する米国特許第４，９５９，３１４号、同第４，５８８，５８５号および同第４，７３７，４６２号；Kothsらに対する同第５，１１６，９４３号、Namenらに対する同第４，９６５，１９５号；Chongらに対する同第４，８７９，１１１号；およびLeeらに対する同第５，０１７，６９１号に示されるものなど）ならびに米国特許第４，９０４，５８４号（Shawら）に示されたリシン置換タンパク質が挙げられる。
【０２１１】
「機能性誘導体」は、本明細書で使用する場合、残基の側鎖として存在するか、または当該技術分野において公知の手段によりＮまたはＣ末端基に付加された機能性基から調製され得るＮＩＫの誘導体およびそのムテインを包含し、薬学的に許容され得る状態を維持している（すなわち、ＮＩＫの活性に実質的に類似したタンパク質の活性を破壊せず、かつこれを含有する組成物に対して毒性を付与しない）限り、本発明に含まれる。
【０２１２】
本発明による「活性分画」は、たとえば、ＮＩＫの断片であり得る。断片という用語は、分子の任意の部分集団、すなわち、所望の生物学的活性を維持したより短いペプチドをいう。断片は、ＮＩＫ分子のいずれかの末端からアミノ酸を除去し、得られた断片をその活性について試験することにより容易に調製され得る。ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかから１度に１個のアミノ酸を除去するためのプロテアーゼは公知であり、所望の生物学的活性を維持している断片の測定は、常套的な実験法を伴うに過ぎない。
【０２１３】
ＮＩＫの活性分画、そのムテインおよび融合タンパク質として、本発明は、タンパク質分子のポリペプチド鎖の任意の断片または前駆体（単独のもの、または分子と会合したもの、または残基（たとえば、糖残基またはリン酸残基）に結合したもの）またはタンパク質分子同士または糖残基との凝集体をさらに包含する。ただし、前記断片はＮＩＫと実質的に類似の活性を有するものとする。
【０２１４】
本明細書において、用語「塩」は、ＮＩＫ分子またはそのアナログのカルボキシル基の塩およびアミノ基の酸付加塩の両方をいう。カルボキシル基の塩は、当該技術分野において公知の手段により形成され得、無機塩（たとえば、ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄または亜鉛の塩など）、および有機塩基との塩（たとえば、トリエタノールアミンなどのアミン、アルギニンまたはリシン、ピペリジン、プロカインなどと形成されるものなど）が挙げられる。酸付加塩としては、たとえば、無機酸（たとえば、塩酸または硫酸など）との塩および有機酸（たとえば、酢酸またはシュウ酸など）との塩が挙げられる。もちろん、任意のかかる塩は、ＮＩＫの生物学的活性を維持していなければならない。
【０２１５】
用語「円順列変異」は、本明細書で使用する場合、末端同士を直接またはリンカーを介してのいずれかで互いに結合して環状分子を作製し、次いで該環状分子を別の位置で開裂して末端が元の分子の末端と異なる新たな線状分子が作製された線状分子をいう。円順列変異をおこしたものとしては、その構造が、環化した後開裂された分子に相当する分子が挙げられる。したがって、円順列変異させた分子は、線状分子として最初から合成され、環化工程および開裂工程を経ないものであってもよい。分子の特定の円周方向の並べ替えは、両者間のペプチド結合が除かれたアミノ酸残基を含む区画によりにより指定される。円順列変異させた分子（ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質を含み得る）は、正常な末端同士の融合を有し（しばしば、リンカーにより）、別の位置に新たな末端を含む単鎖分子である。Goldenberg,ら J. Mol. Biol., 165: 407-413 (1983) および Panら Gene 125: 111-114 (1993)（ともに、引用により本明細書に具体的に組み込まれる）を参照のこと。円周方向の並べ替えは、ある直線鎖分子を採用し、末端を融合して環状分子を形成し、次いで、環状分子を異なる位置で切断して異なる末端を有する新たな直線鎖分子を形成することと機能的に等価である。円順列変異させたものは、したがって、異なる位置に新たな末端を生成しつつ、タンパク質のアミノ酸の配列および同一性を本質的に保存する効果を有する。
【０２１６】
ヒト化抗体または抗体断片は、非ヒト抗体由来の（好ましくは、最小限の）部分を有する遺伝子操作されたキメラ抗体または抗体断片である。ヒト化抗体としては、ヒト抗体（レシピエント抗体）の相補性決定領域が、所望の機能性を有する非ヒト種（たとえば、マウス、ラットまたはウサギなど）（ドナー抗体）の相補性決定領域由来の残基と置き換えられた抗体が挙げられる。場合によっては、ヒト抗体のＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基と置き換えられる。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体においても外来性相補性決定領域またはフレームワーク配列においても見られない残基を含有し得る。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含有し、ここで、相補性決定領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト抗体のものに対応し、フレームワーク領域のすべてまたは実質的にすべてが関連するヒトコンセンサス配列のものに対応する。また、最適には、ヒト化抗体は、典型的にはヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくともの一部分、たとえば、Ｆｃ領域などを含む（たとえば、Jonesら, 1986. Nature 321: 522-525;Riechmannら, 1988. Nature 332: 323-329;および Presta, 1992. Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596を参照のこと）。非ヒト抗体または抗体断片のヒト化のための方法は、当該技術分野において周知である。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された１個以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば外来性残基とよばれ、典型的には、外来性可変ドメインから採用される。本質的に、ヒト化は、記載（たとえば、Jonesら, 1986. Nature 321: 522-525;Riechmannら, 1988. Nature 332: 323-327;Verhoeyenら, 1988. Science 239: 1534-1536；米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）のようにして、ヒト相補性決定領域を対応する齧歯類の相補性決定領域で置き換えることにより行なわれ得る。したがって、かかるヒト化抗体はキメラ抗体であり、インタクトなものより実質的に短いヒト可変ドメインが、非ヒト種由来の対応する配列で置き換えられている。実際面では、ヒト化抗体は、典型的にはいくつかの相補性決定領域残基、場合によってはいくつかのフレームワーク残基が、齧歯類抗体内の類似部位由来の残基で置き換えられたヒト抗体であり得る。ヒト抗体または抗体断片はまた、ファージディスプレイライブラリーなどの当該技術分野において公知の種々の手法を用いて作製することができる［たとえば、Hoogenboom および Winter, 1991. J. Mol. Biol. 227: 381;Marksら, 1991. J. Mol. Biol. 222: 581;Coleら,“Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy”, Alan R. Liss, pp. 77 (1985);Boernerら, 1991. J. Immunol. 147: 86-95を参照のこと）。ヒト化抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をコードする配列を、内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的にまたは完全に不活化されているトランスジェニック動物（たとえば、マウス）に導入することにより作製することができる。抗原投与により、ヒト抗体産生がかかる動物において観察され、これは、ヒトにおいて見られるものと、すべての点（遺伝子再編成、鎖合成および抗体レパートリーなど）において非常に類似する。かかるアプローチを行なうための充分な手引きは、当該技術分野の文献に提供されている（たとえば、米国特許第５，５４５，８０���号、同第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号および同第５，６６１，０１６号；Marksら， 1992. Bio/Technology 10: 779-783;Lonbergら, 1994. Nature 368: 856-859;Morrison, 1994. Nature 368: 812-13;Fishwildら, 1996. Nature Biotechnology 14: 845-51;Neuberger, 1996. Nature Biotechnology 14: 826;Lonberg および Huszar, 1995. Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93を参照のこと）。
【０２１７】
本明細書において上記のように、本発明の抗体断片は、好都合には、たとえば発現ベクターを用いて細胞内で発現され得る。
【０２１８】
発現ベクターにより個体の細胞を遺伝子工学的に改変するための好ましいアプローチは、ウイルスベクターの使用である。ウイルスベクターは、高効率の形質転換、および特定の細胞型への標的化、および特定の細胞型内での増殖などのいくつかの利点をもたらす。ウイルスベクターはまた、特異的細胞受容体（たとえば、癌細胞受容体など）を介する標的特異性を改変するために特異的受容体またはリガンドで修飾し得る。かかる標的化能力は、無規制なＮＦ−κＢ活性を特徴とする細胞内で本発明の抗体または抗体断片の発現を指向するために使用することができる。
【０２１９】
レトロウイルスベクターは、本発明での使用に好適なベクターの類型の１つを示す。欠損レトロウイルスは、哺乳動物細胞（たとえば、上皮細胞、内皮細胞、リンパ球、筋芽細胞、肝細胞および骨髄細胞など）を遺伝子工学的に改変し、組換えタンパク質を発現させるためのベクターとして常套的に使用されている。レトロウイルスゲノムの一部分を除去してレトロウイルスを複製欠損とし、該複製欠損レトロウイルスを、次いで、ビリオン内にパッケージングし得、これを、ヘルパーウイルスの使用により、標準的な技術を用いて標的細胞を感染させるために使用することができる。組換えタンパク質を哺乳動物細胞内で発現させることができるレトロウイルスベクターを作製するための充分な手引きは、当該技術分野の文献に提供されている（たとえば、Miller, A. D., 1990. Blood 76: 271;Sambrookら、下記および関連する参考文献を参照のこと）。
【０２２０】
別の好適な発現ベクターは、アデノウイルスベクターであり得る。アデノウイルスベクターは、広く研究されており、常套的に使用されている遺伝子導入ベクターである。アデノウイルスベクターの重要な利点としては、分裂細胞および静止細胞の比較的高形質導入効率、広範な上皮組織への天然向性および高力価の容易な生成が挙げられる。アデノウイルスＤＮＡは、核に輸送されるが、これに組み込まれない。したがって、アデノウイルスベクターによる突然変異誘発のリスクは最小限である。疾患を治療するためのアデノウイルスベクターの作製および利用のための充分な手引きは、当該技術分野の文献に提供されている［たとえば、Russel, W. C., 2000. J. Gen. Virol. 81: 57-63を参照のこと；癌治療でのアデノウイルスベクターの使用に関する手引きについては、たとえば、Ｐ. Seth(編) Adenoviruses: Basic biology to Gene Therapy, Landes, Austin, TX, pp. 103-120 (1999)のSethら, Adenoviral vectors for cancer gene therapy.を参照のこと］。
【０２２１】
好適なアデノウイルスベクターの具体例は、アデノウイルス由来ベクターＡｄ−ＴＫである。このベクターは、陽性または陰性いずれかの選択のためにヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子を発現し、所望の組換え配列のための発現カセットを含む。このベクターは、ほとんどの上皮起源の癌を含むアデノウイルス受容体を有する細胞感染させるために使用することができる（Sandmairら, 2000. Hum. Gene. Ther. 11: 2197-2205）。
【０２２２】
また、好適なウイルス系発現ベクターは、レトロウイルス系成分およびアデノウイルス系成分を兼ね備えたキメラアデノウイルス／レトロウイルスベクターであり得、これは、伝統的な発現ベクターよりも効率がよいことが示されている。かかるベクターの作製および利用のための充分な手引きは、当該技術分野の文献に提供されている（たとえば、Panら, 2002. Cancer Letters 184: 179-188を参照のこと）。
【０２２３】
発現ベクターは、種々の方法で投与され得る。ウイルスベクターを用いる場合、手順は、その標的特異性を利用することができ、その結果として、疾患に罹患した解剖学的部位にかかるベクターを局所的に投与する必要がないことがある。しかしながら、局所投与は、より速くより効果的な治療をもたらし得る。また、ウイルスベクターの投与は、たとえば、個体への静脈内または皮下注射により行なわれ得る。注射後、ウイルスベクターは、感染のための適切な標的特異性を有する宿主細胞を認識するまで循環する。
【０２２４】
本明細書において上記のように、本発明は、本発明の抗体または抗体断片活性成分として含有する医薬組成物を提供する。
【０２２５】
本明細書において使用する場合、語句「医薬組成物」は、本明細書に記載の１種類以上の活性成分と他の化学的成分（たとえば、生理学的に好適な担体および賦形剤など）との調製物をいう。医薬組成物の目的は、活性成分の生物体への投与を容易にすることである。
【０２２６】
本明細書において、用語「活性成分」は、生物学的効果を担い得る本発明の抗体または抗体断片をいう。
【０２２７】
以下、語句「生理学的に許容され得る担体」および「薬学的に許容され得る担体」は、互換的に使用され得、生物体に対して有意な刺激を引き起こさず、かつ投与された活性成分の生物学的活性および特性を無効にしない担体または希釈剤をいう。アジュバントは、これらの語句に含まれる。
【０２２８】
本明細書において、用語「賦形剤」は、活性成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質をいう。賦形剤の限定されない例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の類型の糖類およびデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが挙げられる。
【０２２９】
薬物の製剤化および投与のための手法は、“Remington's Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Co., Easton, PA, 最新版（引用により本明細書に具体的に組み込まれる）に見られ得る。
【０２３０】
医薬組成物の投与の好適な経路としては、たとえば、経口、経直腸、経粘膜、特に経皮、腸または非経口送達（筋肉内、皮下および髄内注射など）ならびに鞘内、直接脳質内、静脈内、腹腔内、鼻腔内または眼球内注射が挙げられ得る。
【０２３１】
あるいはまた、医薬組成物は、全身性様式でなく局所において、たとえば、個体の組織領域内への直接の医薬組成物の注射によって投与され得る。
【０２３２】
本発明の医薬組成物は、当該技術分野において周知の方法によって、たとえば、慣用的な混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、微粒化、乳化、カプセル封入、内包または凍結乾燥方法によって製造され得る。
【０２３３】
したがって、本発明にしたがう使用のための医薬組成物は、慣用的な様式で、１種類以上の生理学的に許容され得る担体（活性成分の薬学的に許容され得る調製物への加工処理を容易にする賦形剤および補助剤）を用いて製剤化され得る。適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。
【０２３４】
注射のためには、医薬組成物の活性成分は、水溶液中、好ましくは生理学的に適合性のある緩衝液（たとえば、ハンクス溶液、リンゲル溶液または生理食塩緩衝液）中に製剤化され得る。経粘膜投与のためには、障壁を透過するのに適当な浸透剤を製剤中に使用する。かかる浸透剤は、一般的に、当該技術分野において公知である。
【０２３５】
経口投与のためには、医薬組成物は、活性成分を当該技術分野において周知の薬学的に許容され得る担体と組み合わせることによって容易に製剤化され得る。かかる担体は、医薬組成物が、患者による経口摂取のための錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル剤、シロップ、スラリー剤、懸濁剤などに製剤化されるのを可能にする。経口使用のための薬理学的調製物は、固体賦形剤を用い、任意に、得られた混合物を磨砕し、所望により適当な補助剤を添加した後、顆粒混合物に加工処理して錠剤または糖衣錠コアを得ることにより作製され得る。好適な賦形剤は、特に、充填剤（たとえば、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールなどの糖類など）；セルロース調製物（たとえば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、イモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど）；および／または生理学的に許容され得るポリマー（たとえば、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）など）である。所望により、たとえば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（たとえば、アルギン酸など）などの崩壊剤を添加してもよい。
【０２３６】
糖衣錠コアには適当なコーティングが施される。この目的のため、任意にアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールジェル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および適当な有機溶媒または溶媒混合物を含み得る濃縮糖溶液が使用され得る。異なる組み合わせの活性成分投薬量を識別または特徴付けるため、染料または顔料を錠剤または糖衣錠コーティングに添加してもよい。
【０２３７】
経口で使用することができる医薬組成物としては、ゼラチン製の押し込み型カプセルならびにゼラチンおよび可塑剤（たとえば、グリセロールまたはソルビトールなど）で作製された軟質密封カプセルが挙げられる。押し込み型カプセルは、活性成分を、充填剤（たとえば、ラクトース）、結合剤（たとえば、デンプンなど）、滑剤（たとえば、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）および任意に可塑剤などと混合した状態でを含み得る。軟質カプセルでは、活性成分を、適当な液体（たとえば、脂肪油、液状パラフィンまたは液状ポリエチレングリコールなど）中に溶解または懸濁させ得る。また、可塑剤を添加してもよい。経口投与のためのすべての製剤は、選択した投与経路に適した用量であるべきである。
【０２３８】
口腔投与のためには、組成物は、慣用的な様式で製剤化される錠剤またはトローチ剤の形態をとり得る。
【０２３９】
鼻腔吸入による投与のためには、本発明による使用のための活性成分は、加圧パックからのエアロゾル噴霧提示または好適なプロペラント（たとえば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）の使用を伴うネブライザーの形態で簡便に送達される。加圧エアロゾルの場合、投薬単位は、定量を到達するためのバルブを設けることにより決定され得る。ディスペンサーにおける使用のために、活性成分の粉末ミックスおよび適当な粉末基剤（たとえば、ラクトースまたはデンプンなど）を含む、たとえばゼラチン製のカプセルおよびカートリッジが製剤化され得る。
【０２４０】
本明細書に記載の医薬組成物は、たとえば、ボーラス注射または連続輸液により、非経口投与用に製剤化され得る。注射用の製剤は、単位投薬形態で、たとえば、任意に保存料を添加したアンプルまたは反復投与容器にて提示され得る。該組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁剤、液剤またはエマルジョンであり得、製剤用剤（たとえば、懸濁剤、安定剤および／または分散剤など）を含み得る。
【０２４１】
非経口投与用の医薬組成物としては、水溶性形態の活性調製物の水溶液が挙げられる。加えて、活性成分の懸濁液は、適切な油性または水系注射懸濁剤として調製され得る。好適な親油性の溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油などの脂肪油、または合成脂肪酸エステル（たとえば、オレイン酸エチル、トリグリセリドもしくはリポソームなど）が挙げられる。水性注射用懸濁剤は、該懸濁剤の粘度を増加させる物質、たとえば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含み得る。任意に、懸濁剤はまた、好適な可塑剤、または高度に濃縮された溶液の調製を可能にするために活性成分の溶解度を増加させる薬剤を含み得る。
【０２４２】
あるいはまた、活性成分は、使用前に好適なビヒクル（たとえば、発熱物質無含有の滅菌水系溶液）で構築するための粉末形態であり得る。
【０２４３】
本発明の医薬組成物また、たとえば、慣用的な坐剤用基剤（たとえば、ココアバターまたは他のグリセリドなど）を用い、経直腸組成物（たとえば、坐剤または停留浣腸など）に製剤化され得る。
【０２４４】
本発明の状況における使用のために好適な医薬組成物としては、活性成分が意図した目的を達成するのに有効な量で含まれる組成物が挙げられる。より詳細には、治療有効量は、疾患の症状を予防、緩和もしくは改善することができるか、または治療対象の個体の生存を延長することができる活性成分（本発明の抗体または抗体断片）の量を意味する。
【０２４５】
治療有効量の決定は、特に、本明細書に提供された詳細な開示内容を考慮すると、充分、当業者の能力の範囲内である。
【０２４６】
本発明の方法において使用される任意の調製物について、治療有効量または治療投薬量は、まず、インビトロ細胞培養アッセイから概算され得る。たとえば、所望の濃度または力価を達成する投薬量が動物モデルにおいて策定され得る。かかる情報を用い、ヒトにおいて有用な投薬量をより正確に決定することができる。
【０２４７】
本明細書に記載の活性成分の毒性または治療的効能は、標準的なインビトロ製薬手順により、細胞培養物または実験動物において測定され得る。これらのインビトロ細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータを、ヒトにおける使用のための用量範囲を策定するために使用することができる。該用量は、使用した投薬形態および用いた投与経路に応じて異なり得る。正確な製剤、投与経路および用量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択され得る（たとえば、“The Pharmacological Basis of Therapeutics”, 第１章 p.lのFinglら, 1975 を参照のこと）。
【０２４８】
投薬の量および間隔は、所望の治療効果（最小有効濃度ＭＥＣ）を奏するのに充分な活性成分の血漿レベルまたは脳レベルをもたらすために個々に調整し得る。ＭＥＣは、各調製物で異なるが、インビトロデータから概算し得る。ＭＥＣを達成するのに必要な用量は、個体の特徴および投与経路に依存する。血漿濃度を測定するために、検出アッセイを使用することができる。
【０２４９】
治療対象の状態の重篤度および応答性に応じて、投薬は、１回、または数日間から数週間持続する治療過程をともなって、または治癒するまで、もしくは疾患状態の減退が達成されるまでの複数回の投与であり得る。
【０２５０】
投与される組成物の量は、もちろん、治療対象の個体、苦痛の重篤度、投与様式、処方する医師の判断などに依存性である。
【０２５１】
本発明の組成物は、所望により、活性成分を含有する単位投薬形態を１つ以上含み得るパックまたはディスペンサーデバイス（たとえば、ＦＤＡ承認など）にて提示され得る。パックは、たとえば、金属またはプラスチックのホイル（たとえば、ブリスターパック）を含み得る。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための指示書が添付されてもよい。パックまたはディスペンサーにはまた、政府機関による医薬品の製造、使用または販売規制により指示された形態の容器に関連する通知が添付されてもよく、該通知は、組成物の形態またはヒト用もしくは獣医用投与の該機関による承認を反映する。かかる通知は、たとえば、処方薬について米国食品医薬品局により承認されたラベル表示、または承認製品挿入物であり得る。適合性のある医薬用担体内に製剤化された本発明の抗体または抗体断片を含有する組成物はまた、適切な容器内で調製および配置され、先にさらに詳述したように、適応症状の治療のためにラベル表示される。
【０２５２】
本明細書において上記のように、本発明は、病的免疫応答と関連する疾患を治療するために使用され得る。
【０２５３】
かかる疾患の例としては、Ｉ型（即時型またはＩｇＥ媒介性）過敏症と関連する疾患、II型（抗体媒介性）過敏症と関連する疾患、IV型（Ｔリンパ球媒介性）過敏症と関連する疾患、遅延型過敏症（ＤＴＨ）と関連する疾患、自己免疫疾患および移植片の移植と関連する疾患が挙げられる。
【０２５４】
過敏症と関連する疾患のさらなる例としては、たとえば、III型（免疫複合体媒介性）過敏症と関連する疾患、炎症と関連する疾患、感染と関連する疾患および特発性過敏症と関連する疾患が挙げられる。
【０２５５】
Ｉ型過敏症の例としては、限定されないが、喘息、蕁麻疹性丘疹、蕁麻疹、花粉アレルギー、チリダニアレルギー、毒液アレルギー、化粧品アレルギー、ラテックスアレルギー、化学物質アレルギー、薬物アレルギー、虫刺されアレルギー、動物鱗屑アレルギー、刺棘植物アレルギー、ツタウルシアレルギーおよび食物アレルギーなどのアレルギー性疾患が挙げられる。
【０２５６】
II型過敏症の例としては、限定されないが、以下のものが挙げられる：リウマチ様疾患、リウマチ様自己免疫疾患、関節リウマチ（Krenn V.ら, 2000. Histol Histopathol. 15: 791）、脊椎炎、強直性脊椎炎（Jan Voswinkelら, 2001. Arthritis Res. 3: 189）、全身性疾患、全身性自己免疫疾患、全身エリテマトーデス（Erikson J.ら, 1998. Immunol Res. 17: 49）、硬化症、全身硬化症（Renaudineau Y.ら, 1999. Clin Diagn Lab Immunol. 6: 156）；Chan OT.ら, 1999. Immunol Rev. 169: 107）、腺疾患、腺自己免疫疾患、膵臓自己免疫疾患、糖尿病、Ｉ型糖尿病（Zimmet P. 1996. Diabetes Res Clin Pract. 34 Suppl: S125）、甲状腺疾患、自己免疫性甲状腺疾患、グレーヴス病（Orgiazzi J. 2000. Endocrinol Metab Clin North Am. 29: 339）、甲状腺炎、自発性自己免疫性甲状腺炎（Braley-Mullen H. および Yu S. 2000. J Immunol. 165 (12): 7262）、橋本甲状腺炎（Toyoda N.ら, Nippon Rinsho 1999.57 (8): 1810）、粘液水腫、特発性粘液水腫（Mitsuma T. Nippon Rinsho. 1999.57 (8): 1759）；自己免疫性生殖器疾患、卵巣疾患、卵巣自己免疫（Garza KM.ら J Reprod Immunol. 1998. 37 (2): 87）、自己免疫性抗精子不妊（Diekman AB.ら, Am J Reprod Immunol. 2000.43 (3): 134）、反復性流産（Tincani A.ら, Lupus 1998.7 Suppl 2: S107-9）、神経変性疾患、神経系疾患、神経系自己免疫疾患、多発性硬化症（Cross AH.ら, J Neuroimmunol. 2001. 112 (1-2): 1）、アルツハイマー病（Oron L.ら, J Neural Transm Suppl. 1997.49:77）、重症筋無力症（Infante AJ. および Kraig E. Int Rev Immunol. 1999.18 (1-2): 83）、運動神経障害（Kornberg AJ. J Clin Neurosci. 2000.7 (3): 191）、ギラン・バレー症候群、神経障害および自己免疫性神経障害（Kusunoki S. Am J Med Sci. 2000.319 (4): 234）、無筋力症疾患、ランバート・イートン無筋力症候群（Takamori M. Am J Med Sci. 2000.319 (4): 204）、腫瘍随伴性神経系疾患、小脳萎縮、腫瘍随伴性小脳萎縮、非腫瘍随伴性スティフマン症候群、小脳萎縮症、進行性小脳萎縮症、脳炎、ラスムッセン脳炎、筋萎縮性側索硬化症硬化症、シドナム舞踏病、ジル・ド・ラ・トゥレット症候群、多発性内分泌腺症、自己免疫性多発性内分泌腺症（Antoine JC. および Hoimorat J. Rev Neurol (Paris) 2000.156 (1):23）；神経障害、免疫異常神経障害（Nobile-Orazio E.ら, Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl. 1999.50:419）；神経性筋強直症、後天性神経性筋緊張症、先天性多発性関節拘縮症（Vincent A.ら, Ann N Y Acad Sci. 1998.841:482）、心臓血管疾患、心臓血管自己免疫疾患、アテローム性動脈硬化（Matsuura E.ら, Lupus. 1998.7 Suppl 2: S135）、心筋梗塞（Vaarala O. Lupus. 1998.7 Suppl 2: S132）、血栓症（Tincani A.ら, Lupus 1998.7 Suppl 2: S107-9）、肉芽腫症、ウェゲナー肉芽腫症、動脈炎、高安動脈炎および川崎病（Praprotnik S.ら Wien Klin Wochenschr 2000.112 (15-16): 660）；抗第VIII因子自己免疫疾患（Lacroix-Desmazes S.ら, Semin Thromb Hemost. 2000.26 (2): 157）；脈管炎、壊死性小管脈管炎、顕微鏡的多発血管炎、チャーグ−ストラウス症候群、糸球体腎炎、少免疫焦点性壊死性糸球体腎炎、半月形糸球体腎炎（Noel LH. Ann Med Interne (Paris). 2000.151 (3): 178）；抗リン脂質症候群（Flamholz R.ら, J Clin Apheresis 1999.14 (4): 171）；心不全、心不全におけるアゴニスト様β−アデノレセプター抗体（Wallukat G.ら, Am J Cardiol. 1999.83 (12A): 75H）、血小板減少性紫斑病（Moccia F. Ann Ital Med Int. 1999.14 (2): 114）；溶血性貧血、自己免疫溶血性貧血（Efremov DG.ら, Leuk Lymphoma 1998. 28 (3-4): 285）、胃腸疾患、胃腸管の自己免疫疾患、腸疾患、慢性炎症性腸疾患（Garcia Herola A.ら Gastroenterol Hepatol. 2000 Jan;23 (1):16）、セリアック病（Landau YE. および Shoenfeld Y. Harefuah 2000.138 (2): 122）、筋系の自己免疫疾患、筋炎、自己免疫筋炎、シェーグレン症候群（Feist E.ら, Int Arch Allergy Immunol. 2000.123 (1):92）；平滑筋自己免疫疾患（Zauli D.ら, Biomed Pharmacother. 1999.53 (5-6): 234）、肝臓疾患、肝臓自己免疫疾患、自己免疫肝炎（Manns MP. J Hepatol. 2000.33 (2): 326) および 原発性胆汁性肝硬変(Strassburg CP.ら., Eur J Gastroenterol Hepatol. 1999.11 (6): 595）。
【０２５７】
III型過敏症の例としては、限定されないが、Ｆｃ受容体（たとえば、Ｆｃγ受容体）によりたとえば免疫複合体活性化された免疫エフェクター細胞（好中球またはマクロファージなど）により媒介される疾患が挙げられる。
【０２５８】
IV型過敏症の例としては、限定されないが、リウマチ様疾患、関節リウマチ（Tisch R and McDevitt HO. Proc Natl Acad Sci USA 1994.91 (2): 437）、全身疾患、全身自己免疫疾患、全身エリテマトーデス（Datta SK., Lupus 1998. 7 (9): 591）、腺疾患、腺自己免疫疾患、膵臓疾患、膵臓自己免疫疾患、Ｉ型糖尿病（Castano L. および Eisenbarth GS. Ann. Rev. Immunol. 8: 647）；甲状腺疾患、自己免疫性甲状腺疾患、グレーヴス病（Sakata S.ら, Mol Cell Endocrinol. 1993.92 (1):77）；卵巣疾患（Garza KM.ら, J Reprod Immunol. 1998.37 (2): 87）、前立腺炎、自己免疫前立腺炎（Alexander RB.ら, Urology 1997.50 (6): 893）、多発腺症候群、自己免疫多発腺症候群、Ｉ型自己免疫多発腺症候群（Hara T.ら, Blood 1991.77 (5): 1127）、神経系疾患、自己免疫神経系疾患、多発性硬化症、神経炎、視神経炎（Soderstrom M.ら, J Neurol Neurosurg Psychiatry 1994.57 (5): 544）、重症筋無力症（Oshima M.ら Eur J Immunol. 1990.20 (12): 2563）、スティッフマン症候群（Hiemstra HS.ら, Proc Natl Acad Sci USA 2001.98 (7): 3988）、心臓血管疾患、シャーガス病における心臓自己免疫（Cunha-Neto E.ら, J Clin Invest. 1996.98 (8): 1709）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（Semple JW.ら, Blood 1996.87 (10): 4245）、抗ヘルパーＴリンパ球自己免疫（Caporossi AP.ら, Viral Immunol. 1998.11 (1):9）、溶血性貧血（Sallah S.ら, Ann Hematol. 1997.74 (3): 139）、肝臓疾患、肝臓自己免疫疾患、肝炎、慢性活性肝炎（Franco A.ら, Clin Immunol Immunopathol. 1990. 54 (3): 382）、胆汁性肝硬変、原発性胆汁性肝硬変（Jones DE. Clin Sci (Colch) 1996.91 (5): 551）、腎臓疾患、腎臓自己免疫疾患、腎炎、間質性腎炎（Kelly CJ. J Am Soc Nephrol. 1990.1 (2): 140）、結合組織疾患、耳の疾患、自己免疫結合組織疾患、自己免疫性の耳の疾患（Yoo TJ.ら, Cell Immunol. 1994.157 (1):249）、内耳の疾患（Gloddek B.ら, Ann NY Acad Sci. 1997.830:266）、皮膚病、皮膚疾患、真皮疾患、水疱型皮膚疾患、尋常性天疱瘡、水疱型天疱瘡様および落葉状天疱瘡が挙げられる。
【０２５９】
遅延型過敏症と関連する疾患の例としては、限定されないが、接触皮膚炎および薬疹が挙げられる。
【０２６０】
自己免疫疾患の例としては、限定されないが、心臓血管疾患、リウマチ様疾患、腺疾患、胃腸疾患、皮膚疾患、肝臓疾患、神経系疾患、筋疾患、腎臓疾患、生殖に関連する疾患、結合組織疾患および全身疾患が挙げられる。
【０２６１】
自己免疫心臓血管疾患の例としては、限定されないが、アテローム性動脈硬化（Matsuura E.ら, Lupus. 1998 7 Suppl 2: S135）、心筋梗塞（Vaarala O. Lupus. 1998.7 Suppl 2: S132）、血栓症（Tincani A.ら, Lupus 1998.7 Suppl 2: S107-9）、ウェゲナー肉芽腫症、高安動脈炎、川崎病（Praprotnik S.ら, Wien Klin Wochenschr. 2000.112 (15-16): 660）、抗第ＶＩＩＩ因子自己免疫疾患（Lacroix-Desmazes S.ら, Semin Thromb Hemost. 2000.26 (2): 157）、壊死性小管脈管炎、顕微鏡的多発血管炎、チャーグ−ストラウス症候群、少免疫焦点性壊死性および半月形糸球体腎炎（Noel LH. Ann Med Interne (Paris). 2000.151 (3): 178）、抗リン脂質症候群（Flamholz R.ら, J Clin Apheresis 1999.14 (4): 171），抗体誘導型心不全（Wallukat G.ら, (1999) Am J Cardiol. 83 (12A): 75H）、血小板減少性紫斑病（Moccia F. Ann Ital Med Int. 1999. 14 (2): 114;Semple JW.ら, Blood 1996.87 (10): 4245）、自己免疫溶血性貧血（Efremov DG.ら Leuk Lymphoma 1998 28 (3-4): 285;Sallah S.ら, Ann Hematol. 1997.74 (3): 139）、シャーガス病における心臓自己免疫（Cunha-Neto E.ら, J Clin Invest. 1996.98 (8): 1709）および抗ヘルパーＴリンパ球自己免疫（Caporossi AP.ら, Viral Immunol. 1998.11 (1):9）が挙げられる。
【０２６２】
自己免疫リウマチ様疾患の例としては、限定されないが、関節リウマチ（Krenn V.ら, (2000) Histol Histopathol. 15 (3): 791;Tisch R, McDevitt HO. (1994) Proc Natl Acad Sci USA. 91 (2): 437）および強直性脊椎炎（Jan Voswinkelら, (2001) Arthritis Res. 3 (3): 189）が挙げられる。
【０２６３】
自己免疫腺疾患の例としては、限定されないが、膵臓疾患、Ｉ型糖尿病、甲状腺疾患、グレーヴス病、甲状腺炎、自発性自己免疫性甲状腺炎、橋本甲状腺炎、特発性粘液水腫、卵巣自己免疫、自己免疫抗精子不妊、自己免疫前立腺炎およびＩ型自己免疫多発腺症候群疾患、膵臓の自己免疫疾患、Ｉ型糖尿病（Castano L. および Eisenbarth GS. 1990. Ann. Rev. Immunol. 8: 647;Zimmet P. Diabetes Res Clin Pract. 1996.34 Suppl:S125）、自己免疫性甲状腺疾患、グレーヴス病（Orgiazzi J. Endocrinol Metab Clin North Am. 2000.29 (2): 339;Sakata S.ら, Mol Cell Endocrinol. 1993. 92 (1):77）、自発性自己免疫性甲状腺炎（Braley-Mullen H. および Yu S, J Immunol. 2000.165 (12): 7262)、橋本甲状腺炎 (Toyoda N.ら Nippon Rinsho 1999.57 (8): 1810）、特発性粘液水腫（Mitsuma T. Nippon Rinsho. 1999. 57 (8): 1759）、卵巣自己免疫（Garza KM.ら, J Reprod Immunol. 1998. 37 (2): 87）、自己免疫抗精子不妊（Diekman AB.ら, Am J Reprod Immunol. 2000.43 (3): 134)、自己免疫前立腺炎 (Alexander RB.ら, Urology 1997,50 (6): 893）およびＩ型自己免疫多発腺症候群（Hara T.ら, Blood. 1991.77 (5): 1127）が挙げられる。
【０２６４】
自己免疫胃腸疾患の例としては、限定されないが、慢性炎症性腸疾患（Garcia Herola A.ら, Gastroenterol Hepatol. 2000.23 (1):16）、セリアック病（Landau YE. および Shoenfeld Y. Harefuah 2000. 138 (2): 122）、大腸炎、回腸炎およびクローン病が挙げられる。
【０２６５】
自己免疫皮膚疾患の例としては、限定されないが、自己免疫水疱型皮膚疾患（たとえば、限定されないが、尋常性天疱瘡、水疱型天疱瘡様および落葉状天疱瘡など）が挙げられる。
【０２６６】
自己免疫肝臓疾患の例としては、限定されないが、肝炎、自己免疫慢性活性肝炎（Franco A.ら, Clin Immunol Immunopathol. 1990.54 (3): 382)、原発性胆汁性肝硬変 (Jones DE. Clin Sci (Colch) 1996.91 (5): 551;Strassburg CP.ら, Eur J Gastroenterol Hepatol. 1999.11 (6):595）および自己免疫肝炎（Manns MP. J Hepatol. 2000.33 (2): 326）が挙げられる。
【０２６７】
自己免疫神経系疾患の例としては、限定されないが、多発性硬化症（Cross AH.ら, J Neuroimmunol. 2001.112 (1-2): 1）、アルツハイマー病（Oron L.ら, J Neural Transm Suppl. 1997.49:77）、重症筋無力症（Infante AJ. および Kraig E, Int Rev Immunol. 1999.18 (1-2): 83;Oshima M.ら Eur J Immunol. 1990.20:2563）、神経障害、運動神経障害（Kornberg AJ. J Clin Neurosci. 2000.7:191）；ギラン・バレー症候群および自己免疫性神経障害（Kusunoki S. Am J Med Sci. 2000.319 (4): 234）、筋無力症、ランバート・イートン無筋力症候群（Takamori M. Am J Med Sci. 2000.319 (4): 204）；腫瘍随伴性神経系疾患、小脳萎縮、腫瘍随伴性小脳萎縮およびスティッフマン症候群（Hiemstra HS.ら, Proc Natl Acad Sci USA 2001.98 (7): 3988）；非腫瘍随伴性スティッフマン症候群、進行性小脳萎縮症、脳炎、ラスムッセン脳炎、筋萎縮性側索硬化症硬化症、シドナム舞踏病、ジル・ド・ラ・トゥレット症候群および自己免疫性多発性内分泌腺症（Antoine JC. および Honnorat J. Rev Neurol. (Paris) 2000.156 (1):23);免疫異常神経障害 (Nobile-Orazio E.ら, Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl. 1999.50:419);後天性神経性筋緊張症、先天性多発性関節拘縮症(Vincent A.ら, Ann NY Acad Sci. 1998.841:482）、神経炎、視神経炎（Soderstrom M.ら, J Neurol Neurosurg Psychiatry 1994.57 (5): 544）および神経変性疾患が挙げられる。
【０２６８】
自己免疫筋疾患の例としては、限定されないが、筋炎、自己免疫筋炎および原発性シェーグレン症候群（Feist E.ら, Int Arch Allergy Immunol. 2000.123 (1):92) および平滑筋自己免疫疾患 (Zauli D.ら, Biomed Pharmacother. 1999.53 (5-6): 234）が挙げられる。
【０２６９】
自己免疫腎臓疾患の例としては、限定されないが、腎炎および自己免疫間質性腎炎（Kelly CJ. J Am Soc Nephrol. 1990. 1 (2): 140）が挙げられる。
【０２７０】
生殖に関連する自己免疫疾患の例としては、限定されないが、反復性流産（Tincani A.ら, Lupus 1998.7 Suppl 2: S107-9）が挙げられる。
【０２７１】
自己免疫結合組織疾患の例としては、限定されないが、耳の疾患、自己免疫性の耳の疾患（Yoo TJ.ら, Cell Immunol. 1994. 157 (1):249）および内耳の自己免疫疾患（Gloddek B.ら, Ann NY Acad Sci. 1997.830:266）が挙げられる。
【０２７２】
自己免疫全身疾患の例としては、限定されないが、全身エリテマトーデス（Erikson J.ら, Immunol Res. 1998.17 (1-2): 49) および全身硬化症 (Renaudineau Y.ら, Clin Diagn Lab Immunol. 1999.6 (2): 156);Chan OT.ら, Immunol Rev. 1999.16:107）が挙げられる。
【０２７３】
感染性疾患の例としては、限定されないが、慢性感染性疾患、亜急性感染性疾患、急性感染性疾患、ウイルス系疾患、細菌性疾患、原生動物疾患、寄生虫性疾患、真菌性疾患、マイコプラズマ疾患およびプリオン疾患が挙げられる。
【０２７４】
移植に関連する疾患の例としては、限定されないが、移植片拒絶、慢性移植片拒絶、亜急性移植片拒絶、超急性移植片拒絶、急性移植片拒絶および移植片対宿主病が挙げられる。
【０２７５】
移植片の例としては、同系移植片、同種移植片、異種移植片、細胞性移植片、組織移植片、器官移植片および付属器移植片が挙げられる。
【０２７６】
細胞性移植片の例としては、限定されないが、幹細胞移植片、前駆細胞移植片、造血細胞移植片、胚細胞移植片および神経細胞移植片が挙げられる。
【０２７７】
組織移植片の例としては、限定されないが、皮膚移植片、骨移植片、神経移植片、腸移植片、角膜移植片、軟骨移植片、心臓組織移植片、心臓弁移植片、歯科用移植片、毛包移植片および筋肉移植片が挙げられる。
【０２７８】
器官移植片の例としては、限定されないが、腎臓移植片、心臓移植片、皮膚移植片、肝臓移植片、膵臓移植片、肺移植片および腸移植片が挙げられる。
【０２７９】
付属器移植片の例としては、限定されないが、腕移植片、脚移植片、手移植片、足移植片、指移植片、足指移植片および生殖器移植片が挙げられる。
【０２８０】
炎症性疾患の例としては、限定されないが、創傷、神経変性疾患、潰瘍、人工装具インプラントと関連する炎症、月経、敗血症ショック、アナフィラキシーショック、毒素性ショック症候群、悪液質、壊死、壊疽、筋骨格炎症および特発性炎症が挙げられる。
【０２８１】
人工装具インプラントの例としては、限定されないが、乳房インプラント、シリコーンインプラント、歯科用インプラント、陰茎インプラント、心臓インプラント、人工関節、骨折修復装置、骨置換インプラント、薬物送達インプラント、カテーテル、ペースメーカー、呼吸器用チューブおよびステントが挙げられる。
【０２８２】
潰瘍の例としては、限定されないが、皮膚潰瘍、床擦れ、胃潰瘍、消化性潰瘍、口内の潰瘍、鼻咽頭の潰瘍、食道の潰瘍、十二指腸潰瘍、潰瘍性大腸炎および胃腸の潰瘍が挙げられる。
【０２８３】
創傷の例としては、限定されないが、擦過傷、打撲傷、切り傷、刺し傷、裂傷、衝撃による創傷、振とう症、挫傷、熱傷、凍傷、化学的熱傷、日焼け、乾燥、放射線熱傷、放射能熱傷、気道熱傷、筋肉裂傷、筋肉内障、腱裂傷、腱内障、靭帯内障、靭帯裂傷、過伸展、軟骨裂傷、骨折、ピンチナーブおよび射創が挙げられる。
【０２８４】
筋骨格炎症の例としては、限定されないが、筋肉炎症、筋炎、腱炎症、腱炎、靭帯炎症、軟骨炎症、関節炎症、滑膜炎症、手根管症候群および骨炎症が挙げられる。
【０２８５】
本明細書において使用する場合、用語「約」は±１０パーセントをいう。
【０２８６】
本特許の存続期間において、多くの関連する医学的診断技術が開発されることが予測されるが、用語「検出する」の範囲は、標的抗原に関する場合、演繹的にかかる新規な技術をすべて含むことを意図する。
【０２８７】
本発明のさらなる目的、利点および新規特徴は、以下の限定を意図しない実施例の試験時に当業者に自明となろう。加えて、上記に示し、かつ以下の特許請求の範囲に請求した本発明の種々の実施形態および態様の各々について、以下の実施例において、実験的裏づけが見出されよう。
【実施例】
【０２８８】
次に、上記の記載とともに非限定的に本発明を説明する以下の実施例について言及する。
【０２８９】
一般的に、本明細書において使用される命名法および本発明において用いられる実験手順は、分子的、生化学的、微生物学的および組換えＤＮＡ技術を含む。かかる技術は、文献に充分に説明されている。たとえば、“Molecular Cloning: A laboratory Manual” Sambrookら, (1989); “Current Protocols in Molecular Biology” 第I〜III巻 Ausubel, R. M.編 (1994);Ausubelら, “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989);Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, New York (1988);Watsonら, “Recombinant DNA”, Scientific American Books, New York;Birrenら, (編) “Genome Analysis: A Laboratory Manual Series”, １〜４巻, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)；米国特許第４，６６６，８２８号；同第４，６８３，２０２号；同第４，８０１，５３１号；同第５，１９２，６５９号および同第５，２７２，０５７号に記載の方法論； “Cell Biology: A Laboratory Handbook”, I〜III巻 Cellis, J. E.編 (1994); “Current Protocols in Immunology” I〜III巻 Coligan J. E.編 (1994);Stitesら, (編), “Basic and Clinical Immunology” (第８版), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994);Mishell および Shiigi (編), “Selected Methods in Cellular Immunology”, W. H. Freeman and Co., New York (1980) を参照のこと；利用可能なイムノアッセイは特許および科学文献にさらに記載されている。たとえば、米国特許第３，７９１，９３２号；同第３，８３９，１５３号；同第３，８５０，７５２号；同第３，８５０，５７８号；同第３，８５３，９８７号；同第３，８６７，５１７号；同第３，８７９，２６２号；同第３，９０１，６５４号；同第３，９３５，０７４号；同第３，９８４，５３３号；同第３，９９６，３４５号；同第４，０３４，０７４号；同第４，０９８，８７６号；同第４，８７９，２１９号；同第５，０１１，７７１号；および同第５，２８１，５２１号； “Oligonucleotide Synthesis” Gait, M. J.編 (1984); “Nucleic Acid Hybridization” Hames, B. D., および Higgins S. J.編 (1985); “Transcription and Translation” Hames, B. D.および Higgins S. J.編 (1984);“Animal Cell Culture” Freshney, R. I.編 (1986); “Immobilized Cells and Enzymes” IRL Press, (1986); “A Practical Guide to Molecular Cloning” Perbal, B., (1984) および “Methods in Enzymology” 1-317巻, Academic Press ; “PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications”, Academic Press, San Diego, CA (1990);Marshakら, “Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual” CSHL Press (1996)を参照のこと；これらのすべては、引用により、本明細書に完全に記載されたかのように本明細書に組み込まれる。他の一般的な参考文献は、本明細書中に提供されている。本発明における手順は、当該技術分野において周知であると考え、読み手の便益のために提供する。
【０２９０】
特に記載のない限り、本明細書において使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または等価な方法および材料を本発明の実施および試験において使用することができるが、好適な方法および材料は以下に記載するものである。
【０２９１】
実施例１
ヒトＮＩＫに最適な親和性／特異性で結合することができるモノクローナル抗体の作製
上記のように、無規制なＮＦ−κＢ活性と関連する非常に多くの疾患（悪性疾患および病的免疫応答と関連する疾患（たとえば、自己免疫、アレルギー性、炎症性、移植に関連する疾患など）が挙げられる）について、治療は存在しないか、または満足のいく治療はない。ＮＩＫは、ＮＦ−κＢの必須のアクチベーターであるため、かかる疾患を治療するための潜在的に有力なストラテジーの一例は、ＮＩＫに特異的に結合することができ、それにより、ＮＩＫによるＮＦ−κＢの活性化を抑制または阻害することができる抗体を同定することを伴う。かかる抗体はまた、ＮＩＫを伴う生物学的および生化学的なプロセスの正常な様相および病理学的様相の特徴付けを可能にする検出試薬としての有用性を有し得る。しかしながら、従来技術では、かかる目的に好適な、または最適に好適な抗体を提供することができなかった。本発明を実施すると、かかる抗体が予期せず同定され、それにより、以下に記載のような従来技術の制限が克服された。
【０２９２】
材料および方法：
抗体産生：マウス抗ＮＩＫ免疫血清を、ＳＪＬマウスのＮＩＫ由来ペプチドでの免疫化により、以前に報告されたようにして作製した［Eshhar Z.の“Hybridoma Technology in the Biosciences and Medicine”, 第１章, Springer TA. (編) Timothy A., Plenum Publishing Corp., New York (1985)］。
【０２９３】
表１に示す重複しない組のＮＩＫ由来ペプチドの各々を、複数群のマウスの免疫化に使用した。ＮＩＫポリペプチドのドメインに対する免疫化用ペプチドの位置、および免疫化用ペプチドの位置を示すヒトＮＩＫの完全なアミノ酸配列を、それぞれ、図１および２に示す。
【０２９４】
【表４】
0005599549.tif 000005
【０２９５】
組換えヒトＮＩＫの作製：  ｍｙｃ（ｍｙｃ−ＮＩＫ）またはポリヒスチジン（Ｈｉｓ−ＮＩＫ）アフィニティータグに融合させた組換えヒトＮＩＫ融合の発現のため、それぞれ５×１０6または２×１０6  ２９３−Ｔ細胞を、それぞれ、ｍｙｃタグ化ＮＩＫ（ＷＯ９７３７０１６のＮＩＫの配列など）をコードする発現ベクターＰＣＳ３ＭＴＮＩＫまたはＨｉｓタグ化ＮＩＫをコードするｐｃＨｉｓ−ＮＩＫでトランスフェクトした。細胞を、リン酸カルシウム［Ｃａ3（ＰＯ4）2］法により、１０ｃｍ直径の培養皿内で、２０μｇの発現ベクターＤＮＡを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、ＰＣＳ３ＭＴＮＩＫまたはｐｃＨｉｓ−ＮＩＫトランスフェクト細胞を回収し、ペレット化し、それぞれ、１．５ｍｌまたは１ｍｌの１％ＮＰ−４０タンパク質溶解バッファー中で溶解した。
【０２９６】
免疫沈降：  免疫血清を用いたトランスフェクタントタンパク質ライセートからの組換えＮＩＫ融合タンパク質の免疫沈降のため、１．５μｌの免疫血清を、２５μｌのプロテインＧ結合ビーズおよび５０μｌのライセートと混合し、容量を、溶解バッファーで７５０μｌに仕上げた。混合物を４℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後、ビーズを３回、溶解バッファーで洗浄し、３０μｌの試料バッファー中で煮沸し、１５，０００ｒｐｍで２分間マイクロ遠心分離した。上清み（免疫沈降物）を回収し、ヒトＮＩＫの存在について１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。
【０２９７】
ウエスタンイムノブロテッィング解析：  ２０ウェルスロットブロット（マルチスクリーンＢｉｏｒａｄ）で、ＰＣＳ３ＭＴＮＩＫトランスフェクト２９３−Ｔ細胞由来のライセートの１８０μｌのアリコートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分取用ゲルにより解析した。陽性コントロールとして、抗ｍｙｃ抗体を１：１０００希釈で用いた。
【０２９８】
ＥＬＩＳＡ：  ｐｃＨｉｓ−ＮＩＫトランスフェクト細胞由来のライセートを、結合バッファー中で２５倍希釈し、５０μｌ／ウェルを、ＥＬＩＳＡプレートウェルのコーティングに使用した。コートされたＮＩＫまたはＢＳＡ結合ペプチドの検出を、１：１００希釈の抗ＮＩＫ免疫血清を用いて行い、アッセイは、ＨＲＰ結合ヒツジ抗マウス抗体を用い、ＡＢＴＳを酵素基質として開発した。試料のＯＤ405を、２０分の反応時間後に測定した。
【０２９９】
実験結果：
市販の抗ＮＩＫ抗体のＮＩＫ検出能力を、ＰＣＳ３ＭＴＮＩＫトランスフェクト２９３−Ｔ細胞のタンパク質ライセートにおけるｍｙｃ−ＮＩＫの免疫沈降／ウエスタンイムノブロテッィングアッセイにより評価した。表２に見られるように、試験した市販の抗体では、いずれも、組換えＮＩＫの最適な検出が可能ではない。
【０３００】
【表５】
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【０３０１】
ＮＩＫ由来ペプチドで免疫化したマウス由来の血清のＮＩＫ検出能力を、ウエスタンイムノブロテッィング解析単独により、またはＰＣＳ３ＭＴＮＩＫトランスフェクト細胞由来ライセートのプロテインＧ免疫沈降により解析した。図３に示すように、ペプチド４０５〜４２０、６３５〜６５０、６６６〜６８１または６９６〜７１２で免疫化したマウス由来の抗血清は、ウエスタンイムノブロテッィング解析によってＮＩＫを有効に検出できることがわかった。それぞれ、ＮＩＫキナーゼドメインのアミノおよびカルボキシ末端側終端由来のペプチド４０５〜４２０および６３５〜６５０は、ウエスタンイムノブロテッィング解析のための優れた抗体を生成させるのに非常に有効であることがわかった。また、ＮＩＫキナーゼドメインのカルボキシ末端側終端由来ペプチド６６６〜６８１およびＣ末端領域由来の６９６〜７１２は、それぞれ、ウエスタンイムノブロテッィング解析に好適な抗体を調製するのに適切であることがわかった（図１および２ならびに表３）。
【０３０２】
図４ａ〜ｄに示されるように、Ｍｙｃ−ＮＩＫを、ウエスタンイムノブロテッィング解析（ウエスタンイムノブロテッィング解析における検出のために抗Ｍｙｃを用いる）の前にライセートから調製した種々の抗体の各々で免疫沈降させた場合、ペプチド６０〜７６、８６〜９９、１３５〜１５０もしくは２１５〜２２８（図４ａ）；３６３〜３７８、３８５〜３９８もしくは４０５〜４２０（図４ｂ）；４２７〜４４１、５０９〜５２３、６０５〜６１９、６３５〜６５０、６６６〜６８１もしくは６９６〜７１２（図４ｃ）；または７５２〜７６７もしくは８０７〜８２２（図４ｄ）で免疫化したマウス由来の抗血清は、各々が、ＮＩＫを免疫沈降させる能力を有することがわかった（矢印で示す）。また、免疫血清のＮＩＫ検出能力を、ｐｃＨｉｓ−ＮＩＫトランスフェクト細胞由来のライセートにおけるＥＬＩＳＡによっても解析した。
【０３０３】
キナーゼドメインのＣ末端部分領域６３５〜６５０、またはＮＩＫのＣ末端ドメイン６６６〜６８１、６９６〜７１２および７５２〜７６７由来のペプチドを用いて調製した抗体は、ＮＩＫの免疫沈降にきわめて効率的であることがわかった（表３）。図５に示すように、ペプチド４２７〜４４１で免疫化したマウス由来の血清は、ＥＬＩＳＡによりＮＩＫを非常に高い感度で特異的に検出できることがわかった。また、ペプチド６０〜７６、８６〜９９、１３５〜１５０、２１５〜２２８、３６３〜３７８、３８５〜３９８、４０５〜４２０、５０９〜５２３、６０５〜６１９、６３５〜６５０、６６６〜６８１、６９６〜７１２、７５２〜７６７、８３６〜８５１、８７１〜８８３または９０４〜９１７で免疫化したマウス由来の血清は、ＥＬＩＳＡによりＮＩＫを明確に検出できることがわかった。
【０３０４】
したがって、表３にまとめるように、ここに記載の抗体は、ウエスタンイムノブロテッィング解析、ＩＰ／ウエスタンイムノブロテッィングアッセイおよび／またはＥＬＩＳＡによりヒトＮＩＫまたはその特定の部分を効率的に検出する能力を有する。
【０３０５】
ＮＩＫキナーゼのＣ末端部分領域を用いて調製される抗体は、ＮＩＫのウエスタンイムノブロテッィング解析ブロットおよび免疫沈降の両方おいて、卓越したものであることがわかった。
【０３０６】
重要なことは、ここに記載の抗体の：
（ｉ）  ＮＩＫのアミノ末端領域のアミノ酸配列６０〜７６（配列番号：１）、８６〜９９（配列番号：２）、１３５〜１５０（配列番号：３）、２１５〜２２８（配列番号：４）、３６３〜３７８（配列番号：５）もしくは３８５〜３９８（配列番号：６）；
（ii）  ＮＩＫのアミノ酸配列４０１〜６８１（配列番号：２２）（これは、完全なキナーゼ領域（アミノ酸残基４０１〜６８１）を含有する）；
（ii）  ＮＩＫのキナーゼ領域のアミノ酸配列４０５〜４２０（配列番号：７）、４２７〜４４１（配列番号：８）、５０９〜５２３（配列番号：９）、６０５〜６１９（配列番号：１０）もしくは６３５〜６５０（配列番号：１１）；または
（iv）  ＮＩＫのカルボキシ末端領域のアミノ酸残基６６６〜６８１（配列番号：１２）、６９６〜７１２（配列番号：１３）、７５２〜７６７（配列番号：１５）、８０７〜８２２（配列番号：１７）、８３６〜８５１（配列番号：１８）、８７１〜８８５（配列番号：１９）もしくは９０４〜９１７（配列番号：２０）
に特異的結合する能力は、従来技術の抗ＮＩＫ抗体と比べると、特有のものである（表２で比較）。
【０３０７】
【表６】
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【０３０８】
さらなる実験後、各々、高度に特異的なＮＩＫエピトープ（たとえば、キナーゼ、アミノ末端またはカルボキシ末端領域のエピトープなど）に最適に結合することができる数多くの抗体調製物が、予期せず作製された。注目すべきことには、ここに記載の抗体調製物の、ＮＩＫのキナーゼ領域に特異的に結合する能力、またはキナーゼの任意の種々の特定の部分またはＮＩＫのアミノもしくはカルボキシ末端領域に特異的に結合する能力は、すべての従来技術ＮＩＫ結合性抗体と比べて特有のものである。ウエスタンイムノブロテッィング解析においてＮＩＫの有効な検出が可能である卓越した抗体は、ＮＩＫのキナーゼドメインのＮ末端またはＣ末端の部分領域を用いて調製し、またはＥＬＩＳＡによるＮＩＫの有効な検出が可能である卓越した抗体は、キナーゼドメイン４２７〜４４１のペプチドを用いて調製し、免疫沈降によるＮＩＫの有効な検出が可能である卓越した抗体は、キナーゼドメインのＣ末端部分領域を含むＮＩＫのＣ末端ドメイン由来のペプチドを用いて調製した（表３参照）。したがって、ここに記載の抗体は、ＮＩＫの生化学的活性（たとえば、キナーゼ活性など）を調節するために使用することができる。かかる活性はＮＦ−κＢの活性化に必要とされるため、ここに記載の抗体調製物はＮＦ−κＢの活性化を最適に調節するために使用することができ、ＮＦ−κＢ活性の無規制さは、数多くの疾患（たとえば、病的免疫応答と関連するものなど）の病因、および種々の悪性疾患の病因と関連するため、ここに記載の抗体調製物は、かかる疾患を最適に治療するために使用することができる。その上、（ｉ）ＮＩＫのキナーゼ領域またはＮＩＫのキナーゼ領域の部分の特有かつ効率的な検出が可能であること、および（ｉｉ）ＮＩＫまたはＮＩＫのカルボキシまたはアミノ末端領域の任意の種々の特定の部分の検出または最適な検出が可能であることのおかげで、ここに記載の抗体調製物は、ＮＩＫまたはその特定の部分を伴う正常／病理学的な生物学的／生化学的なプロセス／状態の様相を特徴付けする、または最適に特徴付けするために利用することができる。
【０３０９】
モノクローナル抗体の調製
モノクローナル抗体は、Eshhar Z.の“Hybridoma Technology in the Biosciences and Medicine”, 第１章, Springer TA. (編) Timothy A., Plenum Publishing Corp., New York (1985)］に記載のようにして、融合のためにキナーゼＮおよびＣ末端の配列番号：７、１１および１２のペプチドでチャレンジした陽性マウスの脾臓を用いて調製した。
【０３１０】
キナーゼＮおよびＣ末端の番号：７、１１および１２に対して生成させた３種類のハイブリドーマ（Ｐｅｐ  ７  ８１．１、Ｐｅｐ  １１  ３５５．８およびＰｅｐ  １２  ６２９  ６２  １８）（ｐｅｐ  １２はＣ末端の先頭）の培養上清みを、ウエスタンイムノブロッティング解析により試験した。したがって、１．５×１０6  ２９３−Ｔ細胞を、１０ｃｍプレート上に播種し、２４時間後、ｐＣＳ３ＭＴＮＩＫ（ｍｙｃタグ化ＮＩＫ）でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を回収し、１ｍｌの１％ＮＰ４０溶解バッファー中で溶解した。４０μｌのライセートをレーンごとに負荷し、コントロールとしてのｐｃＤＮＡ３トランスフェクト細胞ライセートとともに１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に負荷した。ウエスタンブロットを、それぞれのハイブリドーマ培養上清み（１：５００希釈）でプローブした。図６にまとめた結果は、キナーゼＮおよびＣ末端の番号：７、１１および１２のペプチドに対して生成させたモノクローナル抗体は、対応するポリクローナル抗体と同様、ウエスタンイムノブロテッィング解析においてＮＩＫを特異的に検出できることを示す。
【０３１１】
また、ｍｙｃタグ化ＮＩＫタンパク質を発現する２９３−Ｔライセートを、同じ３種類のモノクローナル抗ＮＩＫ抗体（Ｐｅｐ  ７  ８１．１、Ｐｅｐ  １１  ３５５．８およびＰｅｐ  １２  ６２９  ６２  １８）の免疫沈降能力を試験するために使用した。５０μｌのプロテインＧビーズを５００ｕｌのハイブリドーマ培養上清みと混合し、約２２℃で１時間インキュベートした。ビーズを１％ＮＰ−４０溶解バッファーで３回洗浄し、免疫沈降に使用した。免疫沈降（ＩＰ）は、２時間、＋４℃で行なった。ＩＰ後、ビーズを３回洗浄し、５０μｌのＬａｅｍｌｉバッファーで煮沸し、２５μｌの上清みを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に負荷した（図７）。
【０３１２】
図７にまとめた結果は、試験したモノクローナル抗体は、陰性コントロールＩｇＧを除くすべてがＮＩＫを免疫沈降させることができたことを示す（図７ライン７）。腹水からアフィニティー精製した抗体は、ハイブリドーマ上清みから精製した抗体よりも優れていた（図７においてライン１と４を比較）。
【０３１３】
内在性ＮＩＫの検出
内在性ＮＩＫを検出できる可能性を検討するため、Ｒａｍｏｓ細胞（２〜４×１０8；１×１０8細胞／ｍｌ）を溶解し、ＮＩＫを、プロテインＧ−セファロースビーズに結合させた（上記のようにして結合）精製ＮＩＫ−８１抗体（すなわち、Ｐｅｐ７  ８１．１モノクローナル抗体）を含むアフィニティー精製マウスＮＩＫ腹水で免疫沈降させた。ＮＩＫ−８１抗体を、マウス腹水液からアフィニティーカラムにて精製した。なお、該カラムには、該抗体を調製するために使用したペプチド（配列番号：７）を結合させた。
【０３１４】
抗体を、腹水液から、ＢＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔ  ７７１１６）で架橋させ、かつマウス免疫化に使用した合成ペプチド（配列番号：７のペプチド）に結合させたアフィゲルビーズ（アフィゲル１５  Ｂｉｏｒａｄ）を用いるアフィニティー精製によって精製した。１ｍｌのアフィゲル１５を、二重希釈（double diluted）冷水で３回、各々１０ｍｌで洗浄した。洗浄したアフィゲルを、１ｍｌのＢＳＡ結合ペプチドと、４度で１２〜１６時間、反応器内で混合した。反応器内で、エステルのブロッキングを１００マイクロリットルの１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．０）／ｍｌゲルの添加により行ない、１時間、４度でインキュベートした。
【０３１５】
抗体精製のため、５０％硫酸アンモニウムで沈降させた腹水を、ＰＢＳに対して１６３０時間、４℃で透析した。透析後、アリコートを、１ｍｌの処理アフィゲル−ＢＳＡ−ペプチドビーズで１２〜１６時間、４℃とともにインキュベートし、予備インキュベートしたビーズを用いて１ｍｌ容カラムを充填した。最初にカラムを１０ｍｌのＰＢＳで洗浄した後、１Ｍ  ＮａＣｌを含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）での洗浄およびＰＢＳでの洗浄を行なった。抗体をカラムから、１００ｍＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．７）および０．５Ｍ  ＮａＣｌを含有する溶液を用いて溶出した。１ｍｌ画分を、溶出液中和用のＴｒｉｓ塩基４０μｌを含むチューブ内に回収した。２５ｍｌの腹水から、約５〜１３．６ｍｇの精製抗体を得た。
【０３１６】
免疫沈降タンパク質を、ＮＩＫ−８１抗体およびSuperSignal West Femto Chemiluminescent Detection Kit (Pierce)を用いたウエスタンブロテッィング解析により検出した。ＮＩＫ（および比較のためのＩＫＫ１）を、ＮＩＫ欠損Ｒａｍｏｓ細胞（レンチウイルスｐＳＵＰＥＲ−ＮＩＫを構成的に発現する）、および内在性ＮＩＫを含有するＲａｍｏｓ細胞（レンチウイルスＧＦＰで形質導入）においてモニターした。得られた結果（図８）は、ＮＩＫ−８１抗体が、内在性ＮＩＫを効率的に免疫沈降させ、かつウエスタンイムノブロテッィング解析において検出できることを示す。
【０３１７】
ＮＩＫ−８１抗体によるマウスＮＩＫの検出
マウス抗体は、インビボ研究のための（特にマウスモデルにおける）有益なツールであるため、モノクローナル抗体ＮＩＫ８１がマウスＮＩＫを検出することができるか否かを検討した。この目的のため、Ｈｅｌａ細胞（１．２×１０6細胞を９ｃｍペトリ皿内に播種）を、ヒト（ｈＮＩＫ）もしくはマウスＮＩＫ（ｍＮＩＫ）またはそれぞれのその断片（ｈＮＩＫ  １８８−９４７およびｍＮＩＫ  ８７−９４２）をコードする５ｍｃｇプラスミド、またはコントロールの空のプラスミド（ｐｃＨＩＳ）で、リン酸カルシウム沈殿法によりトランスフェクトした。
【０３１８】
トランスフェクションの２４時間後、全細胞ライセートを、一過的に過剰発現されたヒトまたはマウスＮＩＫについて、ウエスタンイムノブロテッィング解析により抗ＮＩＫ８１抗体（１：５０００希釈の腹水液）を用いて解析した。
【０３１９】
図９にまとめた結果は、モノクローナル抗体である抗ＮＩＫ８１がヒトＮＩＫ、マウスＮＩＫおよびその断片に結合でき、かつこれらを検出できることを示す。
【０３２０】
本発明を、その具体的な実施形態とともに記載したが、多くの代替、改良および変形が当業者に自明であることは明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および広い範囲内に含まれるすべてのかかる代替、改良および変形が包含されることを意図する。本明細書に記載されたすべての刊行物、特許および特許出願ならびに受託番号により特定される配列は、個々の刊行物、特許もしくは特許出願または受託番号により特定される配列が、具体的に個々に示されて引用により本明細書に組み込まれたかのように、同程度に、引用によりその全体が本明細書に具体的に組み込まれる。また、本出願におけるいずれの参考文献の引用または特定は、かかる参考文献が本発明に対する従来技術として有効であることの許可と解釈されないものとする。
【０３２１】
ハイブリドーマクローンＰｅｐ  ７−８１．１、Ｐｅｐ  １１−３５５．８およびＰｅＰ  １２−６２９−６２−１８は、２００３年１０月２日にCollection Nationale de Culture de Microorganismes (ＣＮＣＭ), Institut Pasteur（パリ）に、ブダペスト条約に基づいて寄託され、それぞれ、受託番号Ｉ−３０９２、Ｉ−３０９３、Ｉ−３０９４が付与された。
【図面の簡単な説明】
【０３２２】
【図１】ＮＩＫポリペプチド、その領域および免疫化に使用したＮＩＫ由来ペプチドの位置を示す模式図を示す。
【図２】ヒトＮＩＫのアミノ酸配列（配列番号：２１）を示す配列図表を示す。免疫化に使用したＮＩＫ由来ペプチドに下線を施す（注：Ｃｙｓ残基をＮ末端に有さない図示のペプチドは、Ｃｙｓ残基をＮ末端に付加して合成し、そのまま免疫化に使用した。
【図３】表示したＮＩＫ由来ペプチドで免疫化したマウス由来の血清の、ＰＣＳ３ＭＴＮＩＫトランスフェクト細胞由来のタンパク質ライセートにおいて効率的にＮＩＫを検出する能力を示すウエスタンイムノブロテッィング解析の写真を示す。抗ｍｙｃタグ抗体を陽性コントロールとして用いた。
【図４】ａ〜ｄは、表示したＮＩＫ由来ペプチドで免疫化したマウス由来の血清の、プロテインＧで免疫沈降させたＰＣＳ３ＭＴＮＩＫトランスフェクト細胞由来のタンパク質ライセートにおいてＮＩＫ非常に高い感度で検出する能力を示すウエスタンイムノブロテッィング解析の写真を示す。ａ〜ｄに示すアッセイは、パラレルで行ない、抗ｍｙｃタグ抗体を陽性コントロールとして用いた（ｄ）。
【図５】表示したＮＩＫ由来ペプチドで免疫化したマウス由来の血清の、ＥＬＩＳＡによりｐｃＨｉｓ−ＮＩＫトランスフェクト細胞由来のタンパク質ライセートにおいてＮＩＫを検出する能力を示すヒストグラムを示す。抗Ｈｉｓタグ抗体を陽性コントロールとして用いた。矢印は、ＮＩＫ−ｍｙｃ融合タンパク質を示す。
【図６】ハイブリドーマ上清みの、ＰＣＳ３ＭＴＮＩＫトランスフェクト細胞由来のタンパク質ライセートにおいてＮＩＫを検出する能力を示すウエスタンイムノブロテッィング解析の写真を示す。３種類のハイブリドーマＰｅｐ  ７−８１．１、Ｐｅｐ  １１−３５５．８、Ｐｅｐ  １２−６２９−６２−１８の培養上清みをウエスタンイムノブロテッィング解析により試験し、ｍｙｃタグ化ＮＩＫを検出した。ウエスタンブロットは、表示したハイブリドーマ培養上清み（１：５００希釈）でプローブした。
【図７】モノクローナル抗体Ｐｅｐ  ７−８１．１、Ｐｅｐ  １１−３５５．８、Ｐｅｐ  １２−６２９−６２−１８の、ＰＣＳ３ＭＴＮＩＫトランスフェクト細胞由来のプロテインＧ免疫沈降タンパク質ライセートにおいてＮＩＫを検出する能力を示すウエスタンイムノブロテッィング解析の写真を示す。免疫沈降：ｍｙｃタグ化ＮＩＫタンパク質を発現する２９３−Ｔライセートを、表示したモノクローナル抗体の免疫沈降能力を試験するための基質として用いた。レーン１：腹水液由来のアフィニティー精製ｐｅｐ７−８１抗体。レーン２．Ｐｅｐｌ２−６２９．６２．１８抗体  レーン３．Ｐｅｐｌｌ  ３５５．８抗体、レーン４．Ｐｅｐ７  ８１．１抗体、レーン５  抗ｍｙｃ、レーン６  腹水由来ｐｅｐｌ２  ６２９．６２．２５抗体、レーン７  マウスＩｇＧコントロール。
【図８】モノクローナル抗体である抗ＮＩＫ８１による、Ｒａｍｏｓ細胞における内在性ＮＩＫの検出を示す。
【図９】モノクローナル抗体である抗ＮＩＫ８１による、Ｈｅｌａ細胞において過剰発現されたマウスＮＩＫの検出を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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