(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体サンプルの部位を拡大する対物レンズと、
上記対物レンズにより拡大される部位を結像する撮像素子と、
上記生体サンプルの対象とすべき部位の厚さ方向に上記対物レンズの焦点を移動させると同時に、上記撮像素子に結像される上記対物レンズにより拡大される部位の像を面方向に移動させる移動制御部と、
上記移動制御部が移動させる間、上記撮像素子を露光させることにより上記部位の生体サンプル像を取得する生体サンプル像取得部と
を具える生体サンプル像取得装置。
【請求項２】
上記移動制御部は、
上記生体サンプルの対象とすべき部位の厚さ方向に上記対物レンズの焦点を移動させると同時に、上記生体サンプルと上記撮像素子との相対位置を面方向に移動させる
請求項１に記載の生体サンプル像取得装置。
【請求項３】
上記生体サンプル像取得部により取得された像において、上記移動制御部により移動されたことに基づくぶれの有無に応じてノイズを除去した上記生体サンプルの像を抽出する抽出部
をさらに具える請求項２に記載の生体サンプル像取得装置。
【請求項４】
上記移動制御部は、
上記生体サンプルの対象とすべき部位の厚さ方向に上記対物レンズの焦点を移動させる間に、上記生体サンプルと上記撮像素子との相対位置を面方向に移動速度が変化するように移動させる
請求項２に記載の生体サンプル像取得装置。
【請求項５】
上記移動制御部は、
上記生体サンプルの対象とすべき部位の厚さ方向に上記対物レンズの焦点を移動させる間に、上記生体サンプルと上記撮像素子との相対位置を面方向に移動方向が変化するように移動させる
請求項２に記載の生体サンプル像取得装置。
【請求項６】
上記移動制御部は、
上記生体サンプルの対象とすべき部位の厚さ方向に上記対物レンズの焦点を移動させる間に、上記生体サンプルと上記撮像素子との相対位置を面方向に円運動させる
請求項５に記載の生体サンプル像取得装置。
【請求項７】
上記対物レンズと上記撮像素子との間に設けられ、上記移動制御部の制御に基づいて、上記撮像素子に結像される上記部位の像の向きを変化させることなく円運動させる結像位置移動部
をさらに具える請求項１に記載の生体サンプル像取得装置。
【請求項８】
上記結像位置移動部は、
上記対物レンズと上記撮像素子と間の光軸に平行に配される軸と、
上記軸を回転させる駆動部と、
上記軸に対して所定角度に傾いて固定され、一部が上記対物レンズと上記撮像素子との間に配され、上記対物レンズにより拡大される部位の像を透過する平行板と
を具える請求項７に記載の生体サンプル像取得装置。
【請求項９】
上記対物レンズと上記撮像素子との間に設けられ、上記対物レンズにより拡大される部位の像を透過し、該部位の像以外の光を遮断するエミッションフィルタをさらに具え、
上記結像位置移動部は、
上記エミッションフィルタを移動させることにより、上記対物レンズにより拡大される部位の像の向きを変化させることなく円運動させる
請求項７に記載の生体サンプル像取得装置。
【請求項１０】
ターゲットに標識される蛍光マーカを励起する光を、該蛍光マーカが染色された生体サンプルに対して照射する光源と、
上記生体サンプル像における、上記ターゲットに標識される蛍光マーカが発する蛍光の像を輝点として抽出し、抽出した輝点の傾きを算出した後、該輝点の傾きに基づいて、該輝点に対応する蛍光マーカの厚さ方向の位置を算出する算出部と
を具える請求項６に記載の生体サンプル像取得装置。
【請求項１１】
上記移動制御部は、
上記生体サンプルの対象とすべき部位の厚さ方向にだけ上記対物レンズの焦点を移動させ、また上記生体サンプルの対象とすべき部位の厚さ方向に上記対物レンズの焦点を移動させる間に、上記生体サンプルと上記撮像素子との相対位置を面方向に、上記対物レンズの焦点を厚さ方向にだけ移動させた際の位置を中心として円運動させ
上記算出部は、
上記移動制御部が上記対物レンズの焦点を厚さ方向にだけ移動させた際に取得した生体サンプル像と、上記移動制御部が上記対物レンズの焦点を厚さ方向に移動させる間に円運動させた際に取得した生体サンプル像とに基づいて上記輝点の傾きを算出する
請求項１０に記載の生体サンプル像取得装置。
【請求項１２】
対物レンズにより拡大された生体サンプルの対象とすべき部位の厚さ方向に該対物レンズの焦点を移動させると同時に、所定の撮像素子に結像される上記対物レンズにより拡大される部位の像を面方向に移動させる移動制御ステップと、
上記移動制御ステップで移動させる間、上記撮像素子を露光させることにより上記部位の生体サンプルを取得する生体サンプル像取得ステップと
を具える生体サンプル像取得方法。
【請求項１３】
コンピュータに対して、
対物レンズにより拡大された生体サンプルの対象とすべき部位の厚さ方向に該対物レンズの焦点を移動させると同時に、所定の撮像素子に結像される上記対物レンズにより拡大される部位の像を面方向に移動させる移動制御ステップと、
上記移動制御ステップで移動させる間、上記撮像素子を露光させることにより上記部位の生体サンプルを取得する生体サンプル像取得ステップと
を実行させる生体サンプル像取得プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体サンプル像取得装置、生体サンプル像取得方法及び生体サンプル像取得プログラムに関し、例えば生体サンプルを拡大して観察する分野に適用して好適なものである。
【背景技術】
【０００２】
生体サンプルは、組織切片等をスライドガラスに固定し、必要に応じて染色を施した後に保管される。一般に、保管期間が長期間となると、組織切片の劣化や退色等により生体サンプルに対する顕微鏡での視認性が悪くなる。また、生体サンプルは、作成された病院等の施設以外の施設で診断されることもあるが、該生体サンプルの受け渡しは一般に郵送であり、一定の時間を要する。
【０００３】
このような実情等に鑑み、生体サンプルを画像データとして保存する装置が提案されている（例えば特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−２２２８０１公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、この種の装置では、蛍光染色された生体サンプルの厚さ方向に所定間隔ごとに焦点を移動させて画像データを取得することにより、例えば１つの細胞核に存在する蛍光マーカの数を検出する方法がある。しかしながら、この方法では、複数枚の画像データを保存させなくてはならず、データ容量が大きくなってしまう。
【０００６】
そこで、生体サンプルの厚さ方向に焦点を移動させる間、撮像素子を露光させて１つの画像データを取得する方法が考えられる。この方法では、取得された画像データにおいて蛍光マーカに焦点がきちんと合っていないものの該蛍光マーカの有無を確認することができるので、蛍光マーカの数を検出することができる。
【０００７】
しかしながらこのような方法では、取得された画像データに信号ノイズやバックグラウンドノイズ等のノイズが発生した際、蛍光マーカが発光することにより得られる輝点と該ノイズにより発生する輝点とを区別することができない場合があり、検出精度が悪くなるといった問題があった。
【０００８】
本発明は以上の点を考慮してなされたもので、検出精度を向上し得る生体サンプル像取得装置、生体サンプル像取得方法及び生体サンプル像取得プログラムを提案しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
かかる課題を解決するため本発明においては、生体サンプルの部位を拡大する対物レンズと、対物レンズにより拡大される部位を結像する撮像素子と、生体サンプルの対象とすべき部位の厚さ方向に対物レンズの焦点を移動させると同時に、撮像素子に結像される対物レンズにより拡大される部位の像を面方向に移動させる移動制御部と、移動制御部が移動させる間、撮像素子を露光させることにより部位の生体サンプル像を取得する生体サンプル像取得部とを設けるようにした。
【００１０】
また本発明においては、対物レンズにより拡大された生体サンプルの対象とすべき部位の厚さ方向に該対物レンズの焦点を移動させると同時に、所定の撮像素子に結像される対物レンズにより拡大される部位の像を面方向に移動させる移動制御ステップと、移動制御ステップで移動させる間、撮像素子を露光させることにより部位の生体サンプルを取得する生体サンプル像取得ステップとを設けるようにした。
【００１１】
さらに本発明においては、コンピュータに対して、対物レンズにより拡大された生体サンプルの対象とすべき部位の厚さ方向に該対物レンズの焦点を移動させると同時に、所定の撮像素子に結像される対物レンズにより拡大される部位の像を面方向に移動させる移動制御ステップと、移動制御ステップで移動させる間、撮像素子を露光させることにより部位の生体サンプルを取得する生体サンプル像取得ステップとを実行させるようにした。
【００１２】
これにより、生体サンプルの部位を撮像する際に対物レンズの焦点を厚さ方向に移動させると共に該部位の像を面方向に移動させるので、移動されたことに基づく生体サンプルの像と、移動の影響を受けないノイズとをその形状に基づいて区別することができる。
【発明の効果】
【００１３】
以上のように本発明によれば、生体サンプルの部位を撮像する際に対物レンズの焦点を厚さ方向に移動させると共に該部位の像を面方向に移動させるので、移動されたことに基づく生体サンプルの像と、移動の影響を受けないノイズとをその形状に基づいて区別することができ、かくして検出精度を向上し得る生体サンプル像取得装置、生体サンプル像取得方法及び生体サンプル像取得プログラムを実現できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】第１〜第３の実施の形態における生体サンプル像取得装置を示す略線図である。
【図２】厚さ方向の生体サンプルを示す略線図である。
【図３】データ処理装置の構成を示す略線図である。
【図４】第１〜第３の実施の形態におけるデータ取得処理を実行するＣＰＵの機能的構成を示す略線図である。
【図５】生体サンプルに対する領域ごとの画像の取得を示す略線図である。
【図６】厚さ方向のみの焦点面の移動、及びそのときの蛍光マーカ像、輝点の様子を示す略線図である。
【図７】第１の実施の形態における焦点面の移動、及びそのときの蛍光マーカ像、輝点の様子を示す略線図である。
【図８】生体サンプル像補正表示処理手順の説明に供するフローチャートである。
【図９】輝点補正の様子を示す略線図である。
【図１０】第２の実施の形態における焦点面の移動、及びそのときの蛍光マーカ像、輝点の様子を示す略線図である。
【図１１】第３の実施の形態における焦点面の移動の様子を示す略線図である。
【図１２】第３の実施の形態における蛍光マーカ像、輝点の様子を示す略線図である。
【図１３】耐性獲得モデルを示す略線図である。
【図１４】第４の実施の形態における生体サンプル像取得装置を示す略線図である。
【図１５】第４の実施の形態におけるデータ取得処理を実行するＣＰＵの機能的構成を示す略線図である。
【図１６】Ｚ軸方向のみの移動による焦点面の移動、生体サンプル像及び鮮明化像を示す略線図である。
【図１７】焦点面及び透明板の移動の様子を示す略線図である。
【図１８】Ｚ軸方向及び透明板の移動により取得された楕円像を示す略線図である。
【図１９】データ取得処理手順の説明に供するフローチャートである。
【図２０】Ｚ軸方向に距離が異なる蛍光マーカの輝点の様子を示す略線図である。
【図２１】他の実施の形態における生体サンプル像取得装置を示す略線図である。
【図２２】他の実施の形態における結像位置移動部の構成を示す略線図である。
【図２３】蛍光マーカが円弧の像として写る生体サンプル像を示す略線図である。
【図２４】実験サンプルを示す略線図である。
【図２５】サンプル像を示す略線図である。
【図２６】可動ステージをＺ軸方向にだけ移動させた際の生体サンプル像、及び可動ステージをＺ軸方向に移動させながらＸＹ軸平面に円運動させた際の生体サンプル像を示す略線図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、発明を実施するための形態について説明する。なお、説明は以下の順序とする。
１．第１の実施の形態
２．第２の実施の形態
３．第３の実施の形態
４．第４の実施の形態
５．他の実施の形態
【００１６】
＜１．第１の実施の形態＞
［１−１．生体サンプル像取得装置の構成］
図１において、本一実施の形態による生体サンプル像取得装置１を示す。この生体サンプル像取得装置１は、顕微鏡１０と、データ処理部２０とを含む構成とされる。
【００１７】
顕微鏡１０は、組織切片、細胞又は染色体等の生体高分子でなる生体サンプルＳＰＬを配置可能な面をもち、その面に対して平行方向及び直交方向（ＸＹＺ軸方向）に移動可能なステージ（以下、これを可動ステージとも呼ぶ）１１を有する。
【００１８】
生体サンプルＳＰＬは、図２に示すように、厚さ（深部）方向に約４〜８［μｍ］の厚さを有し、スライドガラスＳＧ及びカバーガラスＣＧに挟まれるようにして所定の固定手法により固定され、必要に応じて染色が施される。この染色には、ＨＥ（ヘマトキシリン・エオジン）染色、ギムザ染色又はパパニコロウ染色等に代表される一般染色のみならず、ＦＩＳＨ(Fluorescence In-Situ Hybridization)や酵素抗体法等の蛍光染色が含まれる。
【００１９】
可動ステージ１１の一方の面側には光学系１２が配され、該可動ステージ１１の他方の面側には照明灯１３が配される。照明灯１３の光は、可動ステージ１１に対して穿設される開口から、該可動ステージ１１の一方の面に配される生体サンプルＳＰＬに対する照明光として到達する。
【００２０】
顕微鏡１０は、この照明光で得られる生体サンプルＳＰＬにおける一部の像を、光学系１２の対物レンズ１２Ａ及び結像レンズ１２Ｂによって所定の倍率に拡大する。そして顕微鏡１０は、これら対物レンズ１２Ａ及び結像レンズ１２Ｂにより拡大される像を、撮像素子３０の撮像面に結像するようになされている。
【００２１】
一方、この顕微鏡１０の所定位置には、光源１４及び励起フィルタ１２Ｅが設けられる。顕微鏡１０は、光源１４から光が照射された場合、該光のうちの蛍光染色に対する励起波長のみを励起フィルタ１２Ｅで透過させた励起光を、対物レンズ１２Ａ及び結像レンズ１２Ｂ間に設けられるダイクロイックミラー１２Ｃで反射させて対物レンズ１２Ａに導く。そして顕微鏡１０は、この励起光を、対物レンズ１２Ａによって可動ステージ１１に配される生体サンプルＳＰＬに集光する。
【００２２】
スライドガラスＳＧに固定される生体サンプルＳＰＬに対して蛍光染色が施されていた場合、励起光により蛍光色素が発光する。この発光によって得られる光（以下、これを発色光とも呼ぶ）は対物レンズ１２Ａを介してダイクロイックミラー１２Ｃを透過する。そしてこの発色光は、ダイクロイックミラー１２Ｃ及び結像レンズ１２Ｂ間に設けられるエミッションフィルタ１２Ｄを介して、該結像レンズ１２Ｂに到達する。
【００２３】
顕微鏡１０は、発色光の像を対物レンズ１２Ａによって拡大し、該発色光以外の光（以下、これを外光とも呼ぶ）をエミッションフィルタ１２Ｄによって吸収する。そして顕微鏡１０は、外光が喪失された発色光の像を、結像レンズ１２Ｂによって拡大し、撮像素子３０の撮像面に結像するようになされている。
【００２４】
一方、データ処理部２０は、撮像素子３０を用いて、生体サンプルＳＰＬ全体の像（以下、これを生体サンプル像とも呼ぶ）を生成し、これを所定形式のデータ（以下、これをサンプルデータとも呼ぶ）として保存するようになされている。
【００２５】
このようにこの生体サンプル像取得装置１は、スライドガラスＳＧに配される生体サンプルＳＰＬを、鏡検状態の画像として保存することができるようになされている。したがってこの生体サンプル像取得装置１は、スライドガラスＳＧ自体を保存する場合に比して、固定や染色等の状態を劣化させることなく長期にわたって生体サンプルＳＰＬを保存することが可能となる。
【００２６】
［１−２．データ処理部の構成］
次に、データ処理部２０の構成について説明する。このデータ処理部２０は、図３に示すように、制御を司るＣＰＵ(Central Processing Unit)２１に対して各種ハードウェアを接続することにより構成される。
【００２７】
具体的にはＲＯＭ(Read Only Memory)２２、ＣＰＵ２１のワークメモリとなるＲＡＭ(Random Access Memory)２３、ユーザの操作に応じた命令を入力する操作入力部２４、インターフェイス２５、表示部２６及び記憶部２７がバス２８を介して接続される。
【００２８】
ＲＯＭ２２には、各種の処理を実行するためのプログラムが格納される。インターフェイス２５には、可動ステージ１１、光源１４及び撮像素子３０（図１）がそれぞれ接続される。
【００２９】
表示部２６には、液晶ディスプレイ、ＥＬ（Electro Luminescence）ディスプレイ又はプラズマディスプレイ等が適用される。また記憶部２７には、ＨＤ（Hard Disc）に代表される磁気ディスクもしくは半導体メモリ又は光ディスク等が適用される。
【００３０】
ＣＰＵ２１は、ＲＯＭ２２に格納される複数のプログラムのうち、操作入力部２４から与えられる命令に対応するプログラムをＲＡＭ２３に展開し、該展開したプログラムにしたがって、表示部２６及び記憶部２７を適宜制御する。
【００３１】
またＣＰＵ２１は、展開したプログラムにしたがって、インターフェイス２５を介して可動ステージ１１、光源１４及び撮像素子３０を適宜制御するようになされている。
【００３２】
［１−３．データ取得処理］
ＣＰＵ２１は、蛍光染色された生体サンプルＳＰＬの像の取得命令を操作入力部２４から受けた場合、該取得命令に対応するプログラムにしたがって、図４に示すように、ステージ移動制御部４１、生体サンプル像取得部４２、データ記録部４３として機能する。
【００３３】
ステージ移動制御部４１は、生体サンプルＳＰＬの対象とすべき部位（以下、これをサンプル部位とも呼ぶ）が撮像範囲ＡＲに位置するように、可動ステージ１１を順次移動させ、例えば図５に示すように、該撮像範囲ＡＲに対して生体サンプルＳＰＬを割り当てる。この図５では、撮像範囲ＡＲに割り当てるべき生体サンプルＳＰＬの領域が重ならない態様となっているが、隣接する領域の一部が重なる態様であってもよい。
【００３４】
そしてステージ移動制御部４１は、対象とすべきサンプル部位が撮像範囲ＡＲに移動されるごとに、可動ステージ１１をＺ軸方向（光軸方向）に移動させると同時に、該Ｚ軸方向とは直交するＸＹ平面の面方向に移動させる。
【００３５】
ところで顕微鏡１０は、図６（Ａ）に示すように、生体サンプルＳＰＬのＺ軸方向だけに対物レンズ１２Ａの焦点面ＦＰをカバーガラスＣＧ側からスライドガラスＳＧ側へ移動させる間、撮像素子３０を露光して１つの画像データを取得する方法が考えられる。
【００３６】
この方法では、特定の遺伝子に結合した蛍光マーカＥＭに対して対物レンズ１２Ａの焦点が合っていない状態から徐々に合い、その後また焦点が合わなくなる。
【００３７】
従って撮像素子３０には、図６（Ｂ）に示すように、蛍光マーカＥＭから発光される発色光の像（以下、これを蛍光マーカ像とも呼ぶ）ＥＭＦがぼやけた大きな状態から、はっきりとした小さな状態に変化していき、その後またぼやけた大きな状態に変化する。
【００３８】
そのため撮像することにより得られる生体サンプルの像には、図６（Ｃ）に示すように、蛍光マーカＥＭから発光された発色光が略円形の輝点ＢＰとして写る。
【００３９】
ところで顕微鏡１０では、生体サンプルＳＰＬを撮像する場合、画面のちらつきやバックグラウンドノイズ等のノイズが発生した場合、生体サンプルＳＰＬを撮像することによって得られる像にノイズに基づく輝点が写ることがある。
【００４０】
このとき、このような方法では、蛍光マーカＥＭに基づく輝点ＢＰとノイズに基づく輝点とを区別することができないため、例えば１つの細胞核当たりの輝点の数などを精度よく検出することができなくなる。
【００４１】
そこで本発明では、可動ステージ１１をＺ軸方向に移動させると同時に、該Ｚ軸方向とは直交するＸＹ平面の面方向に移動させる。
【００４２】
具体的にステージ移動制御部４１は、対物レンズ１２Ａの焦点面ＦＰが生体サンプルＳＰＬのカバーガラスＣＧ側からスライドガラスＳＧ側へ移動するように、可動ステージ１１を対物レンズ１２Ａに近づくようにＺ軸方向に等速で移動させる。これと同時にステージ移動制御部４１は、ＸＹ平面における面方向である例えばＸ軸方向に可動ステージ１１を等速で移動させる。
【００４３】
このとき対物レンズ１２Ａの焦点面ＦＰは、図７（Ａ）に示すように、生体サンプルＳＰＬのカバーガラスＣＧ側からスライドガラスＳＧ側へＺ軸方向に移動されると同時に、面方向であるＸ軸方向に等速で移動される。
【００４４】
生体サンプル像取得部４２は、可動ステージ１１がＺ軸方向及びＸ軸方向に移動されている間、撮像素子３０を露光させ、対象とすべきサンプル部位を撮像素子３０に撮像させ、この結果得られる各サンプル部位の像を連結して生体サンプル像を生成する。
【００４５】
これにより撮像素子３０には、図７（Ｂ）に示すように、蛍光マーカ像ＥＭＦが、ぼやけた大きな状態から、はっきりとした小さな状態に変化していき、その後またぼやけた大きな状態に変化する間に、Ｘ軸方向に等速で移動されながら撮像される。そのため得られる生体サンプル像には、図７（Ｃ）に示すように、蛍光マーカＥＭから発光された発色光が略楕円形の輝点ＢＰとして写る。
【００４６】
ここで光学系１２の拡大倍率が２０倍、撮像素子３０の画素ピッチが約６［μｍ］、焦点が合っている状態で発色光が撮像された場合の輝点ＢＰの直径が約２．１［μｍ］、生体サンプルＳＰＬの厚さが８［μｍ］である場合について具体例を挙げる。
【００４７】
ステージ移動制御部４１は、可動ステージ１１をＺ軸方向に１［μｍ］移動させる間に、該可動ステージ１１をＸ軸方向に１［μｍ］移動させる。よってステージ移動制御部４１は、可動ステージ１１を、生体サンプルＳＰＬの厚さ分である８［μｍ］移動させる間にＸ軸方向に８［μｍ］移動させる。
【００４８】
このとき撮像素子３０には、蛍光マーカＥＭから発光された発色光が、長軸の長さが約１０［pix］（６０［μｍ］）でかつ短軸の長さが約７［pix］（４２［μｍ］）でなる略楕円形の輝点ＢＰとして撮像される。すなわち生体サンプル像には、長軸及び短軸の長さの比（以下、これを長軸／短軸比とも呼ぶ）が約１．４３となる略楕円形の輝点ＢＰが写される。
【００４９】
データ記録部４３は、生体サンプル像が生成された場合、該生体サンプル像の全部又は生体サンプル像の復元可能な一部を示す画素情報を含むサンプルデータを生成する。
【００５０】
そしてデータ記録部４３は、このサンプルデータに対して、生体サンプル像に関する識別情報を示すデータを付加し、該データが付加されたサンプルデータを記憶部２７に記録する。
【００５１】
この識別情報は、例えば、生体サンプルＳＰＬの採取者名、採取者性別、採取者年齢及び採取日付等といった情報である。データ記録部４３は、この識別情報を入力すべきことを、生体サンプルＳＰＬのデータ保存命令が与えられたタイミングや、スライドガラスＳＧをセットすべきタイミング等といった所定のタイミングで通知するようになされている。
【００５２】
またデータ記録部４３は、サンプルデータが生成されたときに識別情報が得られていない場合には、該識別情報を入力すべきことを警告するようになされている。ちなみに、識別情報を入力すべきことの通知又は警告は、例えば音声や、ＧＵＩ（Graphical User Interface）画面等により実行される。
【００５３】
［１−４．生体サンプル像補正表示処理］
次にデータ取得処理で取得された生体サンプル像を表示部２６に表示する生体サンプル像補正表示処理について説明する。ここで生体サンプル像補正表示処理においては、図８及び図９を用いながら説明する。
【００５４】
ＣＰＵ２１は、操作入力部２４から生体サンプル像の表示命令が与えられた場合、該表示命令に対応するプログラムにしたがって、図８に示す生体サンプル像補正表示処理を実行し、生体サンプル像を表示部２６に表示する。
【００５５】
因みに、この生体サンプル像補正表示処理は、細胞核内輝点抽出処理、輝点補正処理及び生体サンプル像補正表示処理に分割することができる。
【００５６】
具体的にＣＰＵ２１は、開始ステップから入ってステップＳＰ１に移り、細胞核内輝点抽出処理を実行し、表示すべき生体サンプル像に対応するサンプルデータが指定された場合、該サンプルデータを記憶部２７から読み出す。
【００５７】
そしてＣＰＵ２１は、読み出されたサンプルデータに基づく生体サンプル像から所定閾値以上の輝度値である複数の画素のまとまりを輝点ＢＰとして抽出し（図９（Ａ））、次のステップＳＰ２に移る。
【００５８】
ステップＳＰ２においてＣＰＵ２１は、例えば抽出された輝点ＢＰの輪郭を楕円形とみなし、該楕円形の長軸／短軸比を算出し、該長軸／短軸比が所定の閾値（例えば、１．３）以上であるか否かを判断する。ここで肯定結果が得られると、このことは、この輝点ＢＰが蛍光マーカＥＭから発光された発色光に基づくものであることを意味し、ＣＰＵ２１は次のステップＳＰ３に移る。
【００５９】
ステップＳＰ３においてＣＰＵ２１は、細胞核が染色されている場合、輝点ＢＰの周辺画素ＳＰの色成分を検出し（図９（Ｂ））、該色成分が細胞核染色色成分であるか否かを判断する。
【００６０】
ここで肯定結果が得られると、このことは、この輝点ＢＰが細胞核内に存在する蛍光マーカＥＭから発光された発色光に基づくものであることを意味し、このときＣＰＵ２１は次のステップＳＰ４に移る。
【００６１】
一方、ステップＳＰ２において否定結果が得られると、このことは抽出された輝点ＢＰの長軸／短軸比が所定の閾値未満であることを意味する。この輝点ＢＰは、可動ステージ１１の移動に伴って撮像されたものでないことから、ＣＰＵ２１はこれをノイズとして認識し、ステップＳＰ１０に移る。
【００６２】
またステップＳＰ３において否定結果が得られると、このことは、この輝点ＢＰが細胞核内に存在せず、かつ略楕円形であることから可動ステージ１１の移動に伴って撮像された光であることを意味する。このような輝点ＢＰは、例えば洗い残された蛍光マーカＥＭが発光した発色光に基づくものであり、ＣＰＵ２１はこれをノイズと認識し、ステップＳＰ１０に移る。
【００６３】
このようにしてＣＰＵ２１は、ステップＳＰ１〜ＳＰ３の細胞核内輝点抽出処理を実行し、細胞核内に存在する蛍光マーカＥＭから発光された発色光に基づく輝点ＢＰのみを抽出し、それ以外の輝点ＢＰをノイズとして認識する。
【００６４】
続いてＣＰＵ２１は、ステップＳＰ４に入って輝点補正処理を実行し、細胞核内の長軸／短軸比が閾値以上である輝点ＢＰに対して、例えばＹ軸方向の所定間隔ごとにＸ軸方向の最も明るい画素を中心位置ＣＰとして検出し（図９（Ｃ））、次のステップＳＰ５に移る。
【００６５】
ステップＳＰ５においてＣＰＵ２１は、検出された中心位置ＣＰの各点を直線近似することにより長軸方向の直線ＳＬ１を算出し（図９（Ｄ））、次のステップＳＰ６に移る。
【００６６】
ステップＳＰ６においてＣＰＵ２１は、輝点ＢＰの輪郭と長軸方向の直線ＳＬ１との交点の中心を重心ＣＴとして算出し（図９（Ｅ））、次のステップＳＰ７に移る。
【００６７】
ステップＳＰ７においてＣＰＵ２１は、重心ＣＴを通り、ステップＳＰ５において算出された長軸方向の直線ＳＬ１に直交する短軸方向の直線ＳＬ２を算出し（図９（Ｆ））、次のステップＳＰ８に移る。
【００６８】
ステップＳＰ８においてＣＰＵ２１は、ステップＳＰ７において算出された短軸方向の直線ＳＬ２上の輝点ＢＰの輝度分布に基づいて、該輝点ＢＰの直径ＤＭを求め（図９（Ｇ））、次のステップＳＰ９に移る。
【００６９】
ステップＳＰ９においてＣＰＵ２１は、重心ＣＴを中心としてステップＳＰ８において算出した直径ＤＭ及び輝度分布となるように輝点ＢＰを円形に変形する（図９（Ｈ））。このときＣＰＵ２１は、略楕円形を円形に変形することにより輝点ＢＰでなくなった部分を背景色に置換し、次のステップＳＰ１１に移る。
【００７０】
これに対してステップＳＰ２又はＳＰ３において否定結果が得られた場合、ＣＰＵ２１は、ステップＳＰ１０に入って、例えばノイズとして認識した輝点ＢＰを周辺の背景色に置換するようなノイズ除去処理を施し、次のステップＳＰ１１に移る。
【００７１】
このようにしてＣＰＵ２１は、ステップＳＰ４〜ＳＰ１０の輝点補正処理を実行し、細胞核内の輝点ＢＰを円形に変形すると共に、ノイズとして認識した輝点ＢＰを例えば背景色に置換することにより除去する。
【００７２】
そしてＣＰＵ２１は、ステップＳＰ１１に移り、生体サンプル像における全ての輝点ＢＰに対してステップＳＰ１〜ＳＰ１０を施した後、表示部２６に該生体サンプル像を表示し、次のステップに移って処理を終了する。これにより生体サンプル像取得装置１は、特定の遺伝子に結合された蛍光マーカＥＭから発光される発色光に基づく輝点ＢＰのみを円形として提示することができる。
【００７３】
［１−５．動作及び効果］
以上の構成において、生体サンプル像取得装置１は、生体サンプルＳＰＬを撮像する際、対物レンズ１２Ａの焦点面ＦＰを該生体サンプルＳＰＬの厚さ方向に移動させると同時に面方向に移動させる。
【００７４】
そして生体サンプル像取得装置１は、焦点面ＦＰを生体サンプルＳＰＬの厚さ方向及び面方向に移動させている間、撮像素子３０を露光させて生体サンプル像を取得する。
【００７５】
従って生体サンプル像取得装置１は、移動させることにより蛍光マーカＥＭに基づく輝点ＢＰがぶれて略楕円形になることから、蛍光マーカＥＭに基づく輝点ＢＰと、移動に影響を受けないノイズに基づく輝点ＢＰとをその形状に基づいて区別することができる。
【００７６】
これにより生体サンプル像取得装置１は、取得された生体サンプル像からノイズに基づく輝点を取り除くことができ、検出精度を向上することができる。
【００７７】
また生体サンプル像取得装置１は、細胞核が染色されている場合、蛍光マーカＥＭに基づく輝点ＢＰの周辺画素の色成分を検出し、細胞核染色色成分であるか否かを判断することにより、細胞核内に存在する蛍光マーカＥＭに基づく輝点ＢＰを抽出することができる。
【００７８】
これにより生体サンプル像取得装置１は、細胞核内に存在する蛍光マーカＥＭに基づく輝点ＢＰだけを抽出することになり、例えば細胞核内に存在する輝点ＢＰの数を検出するような場合、より精度よく検出することができる。
【００７９】
以上の構成によれば、生体サンプルＳＰＬの厚さ方向に対物レンズ１２Ａの焦点面ＦＰを移動させると同時に、生体サンプルＳＰＬ及び撮像素子３０の相対位置を面方向に移動させ、その間、撮像素子３０を露光させて生体サンプル像を取得する。これにより移動に基づく像とノイズとを区別することができるので、検出精度を向上することができる。
【００８０】
＜２．第２の実施の形態＞
第２の実施の形態においては、第１の実施の形態とは、データ取得処理において可動ステージ１１の移動制御が異なる。また生体サンプル像補正表示処理において生体サンプル像に対する処理の一部が異なる。なお、生体サンプル像取得装置１の構成については、第１の実施の形態と同様であるためその説明を省略する。
【００８１】
［２−１．データ取得処理］
ＣＰＵ２１は、第１の実施の形態と同様に、蛍光染色された生体サンプル像の取得命令を操作入力部２４から受けた場合、ステージ移動制御部４１、生体サンプル像取得部４２、データ記録部４３として機能する。
【００８２】
ステージ移動制御部４１は、対物レンズ１２Ａの焦点面ＦＰが生体サンプルＳＰＬのカバーガラスＣＧ側からスライドガラスＳＧ側へ移動するように、可動ステージ１１を対物レンズ１２Ａに近づくようにＺ軸方向に等速で移動させる。これと同時にステージ移動制御部４１は、可動ステージ１１をＸＹ平面における面方向である例えばＸ軸方向に移動速度が変化するように加速又は減速させながら移動させる。
【００８３】
例えば可動ステージ１１をＸ軸方向に減速させた場合、対物レンズ１２Ａの焦点面ＦＰは、図１０（Ａ）に示すように、生体サンプルＳＰＬのカバーガラスＣＧ側からスライドガラスＳＧ側へＺ軸方向に移動されると同時に、Ｘ軸方向に減速されながら移動される。
【００８４】
生体サンプル像取得部４２は、ステージ移動制御部４１により可動ステージ１１がＺ軸方向及びＸ軸方向に移動させている間、撮像素子３０を露光させ、対象とすべきサンプル部位を撮像素子３０に撮像させ、この結果得られる各サンプル部位の像を連結して生体サンプル像を生成する。
【００８５】
これによりカバーガラスＣＧに近い位置にある蛍光マーカＥＭは、図１０（Ｂ）に示すように、その蛍光マーカ像ＥＭＰがＸ軸方向に早い速度で移動するように撮像素子３０で撮像されるので、長軸が長い略楕円形の輝点ＢＰとして生体サンプル像に写る。
【００８６】
これに対してスライドガラスＳＧに近い位置にある蛍光マーカＥＭは、図１０（Ｃ）に示すように、その蛍光マーカ像ＥＭＰがＸ軸方向に遅い速度で移動するように撮像素子３０で撮像されるので、長軸が短い略楕円形の輝点ＢＰとして生体サンプル像に写る。
【００８７】
データ記録部４３は、生体サンプル像が生成された場合、該生体サンプル像の全部又は生体サンプル像を復元可能な一部を示す画素情報を含むサンプルデータを生成する。
【００８８】
そしてデータ記録部４３は、このサンプルデータに対して、生体サンプル像に関する識別情報を示すデータを付加し、該データが付加されたサンプルデータを記憶部２７に記録する。
【００８９】
［２−２．生体サンプル像補正表示処理］
ＣＰＵ２１は、第１の実施の形態と同様に、生体サンプル像補正表示処理手順（図８）に従って処理を実行するが、例えば細胞核内輝点抽出処理と輝点補正処理との間で、長軸／短軸比が閾値以上である輝点ＢＰの厚さ方向の位置を算出する。
【００９０】
具体的にＣＰＵ２１は、細胞核内輝点抽出処理において抽出された輝点ＢＰの長軸／短軸比と、ステージ移動制御部４１により移動された可動ステージ１１のＸ軸方向の移動速度とに基づいて、所定の基準位置からのＺ軸方向の位置を算出する。このＺ軸方向の位置を算出する方法としては、例えば、予め輝点ＢＰの長軸／短軸比とＺ軸方向の位置とが対応付けられたテーブルを記憶部２７に保持し、ＣＰＵ２１が該テーブルを参照することにより算出するようにしてもよく、またこれに限るものでもない。
【００９１】
そしてＣＰＵ２１は、第１の実施の形態と同様に、輝点補正処理を実行し、ステップＳＰ１１において、生体サンプル像を表示部２６に表示する際、円形に変形された輝点ＢＰについて、例えばＺ軸方向の位置と共に表示する。
【００９２】
これにより生体サンプル像取得装置１は、特定の遺伝子に結合された蛍光マーカＥＭから発光される発色光に基づく輝点ＢＰのみを円形で提示することができると共に、該輝点ＢＰの厚さ方向の位置も同時に提示することができる。
【００９３】
［２−３．動作及び効果］
以上の構成において、生体サンプル像取得装置１は、対物レンズ１２Ａの焦点面ＦＰを生体サンプルＳＰＬの厚さ方向に移動させると同時に、厚さ方向に移動させるにつれて面方向の速度が変化するように加速又は減速させながら移動させる。
【００９４】
そして生体サンプル像取得装置１は、焦点面ＦＰを生体サンプルＳＰＬの厚さ方向及び面方向に移動させている間、撮像素子３０を露光させて生体サンプル像を取得する。
【００９５】
従って生体サンプル像取得装置１は、移動させることにより蛍光マーカＥＭに基づく輝点ＢＰがぶれて略楕円形になることから、蛍光マーカＥＭに基づく輝点ＢＰと、移動に影響を受けないノイズに基づく輝点ＢＰとをその形状に基づいて区別することができる。
【００９６】
これにより生体サンプル像取得装置１は、取得された生体サンプル像からノイズに基づく輝点を取り除くことができ、検出精度を向上することができる。
【００９７】
また生体サンプル像取得装置１は、細胞核が染色されている場合、蛍光マーカＥＭに基づく輝点ＢＰの周辺画素の色成分を検出し、細胞核染色色成分であるか否かを判断することにより、細胞核内に存在する蛍光マーカＥＭに基づく輝点ＢＰを抽出することができる。
【００９８】
これにより生体サンプル像取得装置１は、細胞核内に存在する蛍光マーカＥＭに基づく輝点ＢＰだけを抽出することになり、例えば細胞核内に存在する輝点ＢＰの数を検出するような場合、より精度よく検出することができる。
【００９９】
さらに生体サンプル像取得装置１は、焦点面を面方向に移動させる際、厚さ方向に移動させるにつれて面方向の速度が変化するように加速又は減速させながら移動させる。従って生体サンプル像取得装置１では、厚さ方向の位置に応じて輝点ＢＰの長軸／短軸比が異なることになり、該輝点ＢＰの厚さ方向の位置を検出することができる。
【０１００】
これにより生体サンプル像取得装置１は、厚さ方向に細胞核が重なっている場合でも、輝点ＢＰの厚さ方向の位置を検出することができるので、どちらの細胞核内に存在する蛍光マーカＥＭであるかを判断することができるので、検出精度をより向上することができる。
【０１０１】
以上の構成によれば、生体サンプルＳＰＬの厚さ方向に対物レンズ１２Ａの焦点面ＦＰを移動させると同時に、生体サンプルＳＰＬ及び撮像素子３０の相対位置を面方向に移動させ、その間、撮像素子３０を露光させて生体サンプル像を取得する。これにより移動に基づく像とノイズに基づく像とを区別することができるので、検出精度を向上することができる。
【０１０２】
＜３．第３の実施の形態＞
第３の実施の形態においては、第１の実施の形態とは、データ取得処理において可動ステージ１１の移動制御が異なる。また生体サンプル像補正表示処理において生体サンプル像に対する処理の一部が異なる。なお、生体サンプル像取得装置１の構成については、第１の実施の形態と同様であるためその説明を省略する。
【０１０３】
［３−１．データ取得処理］
ＣＰＵ２１は、第１の実施の形態と同様に、蛍光染色された生体サンプル像の取得命令を操作入力部２４から受けた場合、ステージ移動制御部４１、生体サンプル像取得部４２、データ記録部４３として機能する。
【０１０４】
ステージ移動制御部４１は、対物レンズ１２Ａの焦点面ＦＰが生体サンプルＳＰＬのカバーガラスＣＧ側からスライドガラスＳＧ側へ移動するように、可動ステージ１１を対物レンズ１２Ａに近づくようにＺ軸方向に等速で移動させる。
【０１０５】
これと同時にステージ移動制御部４１は、可動ステージ１１がＺ軸方向に移動される間にＸＹ平面において等速で半円を描くようにＸ軸方向及びＹ軸方向に移動させる。すなわちステージ移動制御部４１は、可動ステージ１１をＺ軸方向に螺旋を描くように移動させる。
【０１０６】
このとき対物レンズ１２Ａの焦点面ＦＰは、図１１に示すように、生体サンプルＳＰＬのカバーガラスＣＧ側からスライドガラスＳＧ側へＺ軸方向に等速で移動されると同時に、ＸＹ軸平面で半円を描くように移動される。
【０１０７】
これにより生体サンプルＳＰＬの中央付近に位置する蛍光マーカＥＭは、図１２（Ａ）に示すように、その蛍光マーカ像ＥＭＰがＸ軸方向にほぼ停止し、Ｙ軸方向に移動するように撮像素子３０で撮像される。従ってこの蛍光マーカＥＭは、長軸がＹ軸方向を向いた略楕円形の輝点ＢＰとして生体サンプル像に写る。
【０１０８】
またスライドガラスＳＧに近い位置にある蛍光マーカＥＭは、図１２（Ｂ）に示すように、その蛍光マーカ像ＥＭＰがＸ軸方向及びＹ軸方向に減速しながら移動するように撮像素子３０で撮像される。従ってこの蛍光マーカＥＭは、Ｘ軸及びＹ軸に対して長軸が傾いた略楕円形の輝点ＢＰとして生体サンプル像に写る。
【０１０９】
このように生体サンプル像では、蛍光マーカＥＭがＺ軸方向の位置に応じた角度に傾いた略楕円形の輝点ＢＰとして写る。
【０１１０】
生体サンプル像取得部４２は、ステージ移動制御部４１により可動ステージ１１がＺ軸方向及び面方向に移動させている間、撮像素子３０を露光させ、対象とすべきサンプル部位を撮像素子３０に撮像させ、この結果得られる各サンプル部位の像を連結して生体サンプル像を生成する。
【０１１１】
データ記録部４３は、生体サンプル像が生成された場合、該生体サンプル像の全部又は生体サンプル像を復元可能な一部を示す画素情報を含むサンプルデータを生成する。
【０１１２】
そしてデータ記録部４３は、このサンプルデータに対して、生体サンプル像に関する識別情報を示すデータを付加し、該データが付加されたサンプルデータを記憶部２７に記録する。
【０１１３】
［３−２．生体サンプル像補正表示処理］
ＣＰＵ２１は、第１の実施の形態と同様に、生体サンプル像補正表示処理手順（図１１）に従って処理を実行するが、例えば細胞核内輝点抽出処理と輝点補正処理との間で、長軸／短軸比が閾値以上である輝点ＢＰの厚さ方向の位置を算出する。
【０１１４】
具体的にＣＰＵ２１は、例えば抽出された輝点ＢＰの長軸とＸ軸とのなす角を算出し、ステージ移動制御部４１により移動された可動ステージ１１のＸＹ平面を移動方向とに基づいて、所定の基準位置からのＺ軸方向の位置を算出する。このＺ軸方向の位置を算出する方法としては、例えば、予め輝点ＢＰの長軸及びＸ軸のなす角とＺ軸方向の位置とが対応付けられたテーブルを記憶部２７に保持し、ＣＰＵ２１が該テーブルを参照することにより算出するようにしてもよく、またこれに限るものでもない。
【０１１５】
そしてＣＰＵ２１は、第１の実施の形態と同様に、輝点補正処理を実行し、ステップＳＰ１１において、生体サンプル像を表示部２６に表示する際、円形に変形された輝点ＢＰについて、例えばＺ軸方向の位置を共に表示する。
【０１１６】
これにより生体サンプル像取得装置１は、特定の遺伝子に結合された蛍光マーカＥＭから発光される発色光に基づく輝点ＢＰのみを円形で提示することができると共に、該輝点ＢＰの厚さ方向の位置も同時に提示することができる。
【０１１７】
［３−３．動作及び効果］
以上の構成において、生体サンプル像取得装置１は、対物レンズ１２Ａの焦点面ＦＰを生体サンプルＳＰＬの厚さ方向に移動させると同時に、厚さ方向に移動させるにつれて面方向の移動方向が変化するように移動させる。
【０１１８】
そして生体サンプル像取得装置１は、焦点面ＦＰを生体サンプルＳＰＬの厚さ方向及び面方向に移動させている間、撮像素子３０を露光させて生体サンプル像を取得する。
【０１１９】
従って生体サンプル像取得装置１は、移動させることにより蛍光マーカＥＭに基づく輝点ＢＰがぶれて略楕円形になることから、蛍光マーカＥＭに基づく輝点ＢＰと、移動に影響を受けないノイズに基づく輝点ＢＰとをその形状に基づいて区別することができる。
【０１２０】
これにより生体サンプル像取得装置１は、取得された生体サンプル像からノイズに基づく輝点を取り除くことができ、検出精度を向上することができる。
【０１２１】
また生体サンプル像取得装置１は、細胞核が染色されている場合、蛍光マーカＥＭに基づく輝点ＢＰの周辺画素の色成分を検出し、細胞核染色色成分であるか否かを判断することにより、細胞核内に存在する蛍光マーカＥＭに基づく輝点ＢＰを抽出することができる。
【０１２２】
これにより生体サンプル像取得装置１は、細胞核内に存在する蛍光マーカＥＭに基づく輝点ＢＰだけを抽出することになり、例えば細胞核内に存在する輝点ＢＰの数を検出するような場合、より精度よく検出することができる。
【０１２３】
さらに生体サンプル像取得装置１は、生体サンプルＳＰＬ及び撮像素子３０を面方向に移動させる際、厚さ方向に移動させるにつれて面方向の移動方向が変化するように移動させる。従って生体サンプル像取得装置１では、厚さ方向の位置に応じて面方向の輝点ＢＰの傾きが変化することになり、該輝点ＢＰの厚さ方向の位置を検出することができる。
【０１２４】
これにより生体サンプル像取得装置１は、厚さ方向に細胞核が重なっている場合でも、輝点ＢＰの厚さ方向の位置を検出することができるので、どちらの細胞核内に存在する蛍光マーカＥＭであるかを判断することができるので、検出精度をより向上することができる。
【０１２５】
以上の構成によれば、生体サンプルＳＰＬの厚さ方向に対物レンズ１２Aの焦点面ＦＰを移動させると同時に、生体サンプルＳＰＬ及び撮像素子３０の相対位置を面方向に移動させ、その間、撮像素子３０を露光させて生体サンプル像を取得する。これにより移動に基づく像とノイズに基づく像とを区別することができるので、検出精度を向上することができる。
【０１２６】
＜４．第４の実施の形態＞
ところで、細胞膜を貫通して存在する上皮成長因子受容体（Epidermal Growth Factor Receptor : ＥＧＦＲ）は、過剰発現、変異などにより発癌、癌の増殖、転移などに関与する。
【０１２７】
ＥＧＦＲ変異を有する非小細胞肺癌患者に対してＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（EGFR-TKI）であるゲフィニチブ（Gefitinib）又はエルロチニブ（Erlotinib）を投与することにより、ＰＩ３‐Ｋ／Ａｋｔ経路のシグナル伝達が阻害され、癌細胞がアポトーシスを起こして腫瘍縮小効果を示すことが知られている（図１３（Ａ））。しかしながらＥＧＦＲにＥｒｂＢ３が近接している場合、ゲフィニチブ及びエルロチニブが効かず、癌細胞が生き残る（図１３（Ｂ））ことが検証された。（Lynch TJ, et al. “Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib.” New England Journal of Medicine, Vol.350, No.21, 2004, p.p. 2129-2139.）
【０１２８】
またゲフィニチブ及びエルロチニブに対して耐性ができた変異ＥＧＦＲが発現する（図１３（Ｃ））ことが検証された。（Kobayashi S, et al. “EGFR Mutation and Resistance of Non-Small-Cell Lung Cancer to Gefitinib.” New England Journal of Medicine, Vol.352, No.21, 2004, p.p. 786-2139.）
【０１２９】
さらにゲフィニチブ感受性である肺癌細胞株にＭＥＴ（Mesenchymal-epithelial Transition Factor）が局所的に増幅された後、ＭＥＴがＥｒｂＢ３に依存してゲフィチニブ抵抗を示す（図１３（Ｄ））ことが検証された。（Engelman JA, et al. “MET Amplification Leads to Gefitinib Resistance in Lung Cancer by Activating ERBB3 Signaling.” Science, Vol.361, No.5827, 2007, p.p. 1039-1043.）
【０１３０】
さらに肝細胞成長因子（ＨＧＦ）がＥＧＦＲ又はＥｒｂＢ３ではなく、ＭＥＴによりＰＩ３‐Ｋ／Ａｋｔ経路でシグナルを伝達する（図１３（Ｅ））ことが検証された。（Yano S, et al. “Hepatocyte Growth Factor Induces Resistance of Lung Adenocarcinoma with Epidermal Growth Factor Receptor-Activating Mutations” New Cancer Research, Vol.68, No.22, 2008, p.p. 9479-9487.）
【０１３１】
このように、特定の蛋白質又は遺伝子間の距離により薬剤や阻害剤などの効果が大きく異なってしまうことがあり、該蛋白質又は遺伝子間の距離を正確に測定することが重要である。
【０１３２】
そこで第４の実施の形態においては、ターゲットとなる蛋白質又は遺伝子間の距離を正確に測定する。因みに、第４の実施の形態においては、例えばＥＧＦＲとＥｒｂＢ３のように異なる蛋白質又は遺伝子に対して異なる波長の光（色）を発する蛍光マーカＥＭ１及びＥＭ２が染色された生体サンプルＳＰＬの像の取得について説明する。
【０１３３】
［４−１．生体サンプル像取得装置の構成］
図１との対応部分に同一符号を付した図１４において第４の実施の形態における生体サンプル像取得装置１００を示す。この生体サンプル像取得装置１００は、顕微鏡１１０及びデータ処理部２０を含む構成とされる。
【０１３４】
顕微鏡１１０は、モータ１１１、回転軸１１２、傾斜台座１１３及び透明板１１４からなる結像位置移動部１１５が設けられる。
【０１３５】
モータ１１１は、データ処理部２０の制御に基づき、回転軸１１２を介して透明板１１４を回転させる。
【０１３６】
傾斜台座１１３は、回転軸１１２の外周に設けられ、該回転軸１１２に対して透明板１１４を所定の傾斜角度に傾けさせる。
【０１３７】
透明板１１４は、空気とは異なる屈折率の透明なガラスやプラスチック材により上面及び下面が平行な所定厚さの円板に形成され、その中心に回転軸１１２が挿通されて固定される。
【０１３８】
結像位置移動部１１５は、回転軸１１２が結像レンズ１２Ｂとエミッションフィルタ１２Ｄとの間の光軸と平行になるように配置される。また結像位置移動部１１５は、透明板１１４の一部が結像レンズ１２Ｂとエミッションフィルタ１２Ｄとの間に位置するように顕微鏡１１０の所定位置に固定される。
【０１３９】
従って顕微鏡１１０では、モータ１１１が回転されて該モータ１１１の回転に従って透明板１１４が回転すると、透明板１１４が結像レンズ１２Ｂとエミッションフィルタ１２Ｄとの間の光軸方向に対してその角度を変化させながら上下に移動する。
【０１４０】
顕微鏡１１０では、光源１４から励起光が生体サンプルＳＰＬに照射された場合、該生体サンプルＳＰＬに染色された蛍光マーカＥＭ１及びＥＭ２から発色光が発せられる。この発した発色光は、対物レンズ１２Ａ、ダイクロイックミラー１２Ｃ及びエミッションフィルタ１２Ｄを介して透明板１１４に到達する。
【０１４１】
透明板１１４に到達した発色光は、該透明板１１４の下面及び上面で屈折して透過し、結像レンズ１２Ｂを介して撮像素子３０に集光される。
【０１４２】
透明板１１４が回転している場合、透明板１１４に到達した発色光は、結像レンズ１２Ｂとエミッションフィルタ１２Ｄとの間における透明板１１４の傾斜角度に応じて屈折する方向が変化される。従って透明板１１４を透過した発色光の光軸は、透明板１１４に入射する前の光軸を中心として円を描くように移動される。
【０１４３】
顕微鏡１１０は、発色光の像を、対物レンズ１２Ａによって拡大し、透明板１１４により結像位置を移動した後、結像レンズ１２Ｂによって集光し、撮像素子３０の撮像面に結像するようになされている。
【０１４４】
［４−２．データ取得処理］
ＣＰＵ２１は、蛍光染色された生体サンプルＳＰＬの像の取得命令を操作入力部２４から受ける。このときＣＰＵ２１は、該取得命令に対応するプログラムにしたがって、図１５に示すように、ステージ移動制御部４１、生体サンプル像取得部４２、データ記録部４３、結像位置移動制御部４４、距離算出部４５及び表示制御部４６として機能する。なおＣＰＵ２１は、プログラムを実行すると光源１４から励起光を出射させる。
【０１４５】
ステージ移動制御部４１は、生体サンプルＳＰＬの対象とすべきサンプル部位が撮像範囲ＡＲに位置するように、可動ステージ１１を移動させる。
【０１４６】
ステージ移動制御部４１は、図１６（Ａ）に示すように、対物レンズ１２Ａの焦点面ＦＰが生体サンプルＳＰＬのカバーガラスＣＧ側からスライドガラスＳＧ側へ移動するように、可動ステージ１１を対物レンズ１２Ａに近づくようにＺ軸方向に等速で移動させる。
【０１４７】
生体サンプル像取得部４２は、ステージ移動制御部４１により可動ステージ１１がＺ軸方向に移動させている間、撮像素子３０を露光させ、対象とすべきサンプル部位を撮像素子３０に撮像させ、この結果得られる蛍光像を取得する。
【０１４８】
生体サンプル像取得部４２は、図１６（Ｂ）に示すように、各撮像範囲ＡＲに割り当てられる蛍光像を順次取得して連結することによって生体サンプル像ＳＩＭ１を生成する。
【０１４９】
このようにして取得された生体サンプル像ＳＩＭ１には、生体サンプルＳＰＬに染色された蛍光マーカＥＭ１及びＥＭ２が点拡がり関数（ＰＳＦ（Point Spread Function））に応じてぼけた輝点ＢＰ１及びＢＰ２として写る。
【０１５０】
そこで生体サンプル像取得部４２は、生体サンプル像ＳＩＭ１から輝点ＢＰ１及びＢＰ２をその輝度値を基に検出し、該輝点ＢＰ１及びＢＰ２の点拡がり関数を算出する。そして生体サンプル像取得部４２は、算出した点拡がり関数の逆関数（点拡がり逆関数）を用いて輝点ＢＰ１及びＢＰ２を鮮明化する。
【０１５１】
データ記録部４３は、輝点ＢＰ１及びＢＰ２が鮮明化された生体サンプル像（以下、これを鮮明化像とも呼ぶ）ＳＩＭ２（図１６（Ｃ））のデータを鮮明化像データとして記憶部２７に記憶する。
【０１５２】
次にステージ移動制御部４１は、再び対物レンズ１２Ａの焦点面ＦＰが生体サンプルＳＰＬのカバーガラスＣＧ側からスライドガラスＳＧ側へ移動するように、可動ステージ１１を対物レンズ１２Ａに近づくようにＺ軸方向に等速で移動させる。
【０１５３】
結像位置移動制御部４４は、焦点面ＦＰが生体サンプルＳＰＬのカバーガラスＣＧ側からスライドガラスＳＧ側へ移動する間にモータ１１１を介して透明板１１４を等速に半回転させる。
【０１５４】
具体的に、結像位置移動制御部４４は、図１７（Ａ）〜（Ｃ）に示すように、焦点面ＦＰがカバーガラスＣＧ側に位置するときに、結像レンズ１２Ｂとエミッションフィルタ１２Ｄとの間の透明板１１４部分が最下点に位置する（図１７（Ａ））。なお図１７（Ａ）においては、回転軸１１２及び透明板１１４以外の構成を説明の便宜上省略する。
【０１５５】
そして結像位置移動制御部４４は、焦点面ＦＰがカバーガラスＣＧとスライドガラスＳＧとの中間位置に移動されたときに、結像レンズ１２Ｂとエミッションフィルタ１２Ｄとの間の透明板１１４部分が最下点と最上点との中間位置に位置するよう回転させる（図１７（Ｂ））。
【０１５６】
結像位置移動制御部４４は、焦点面ＦＰがスライドガラスＳＧに移動されたときに、結像レンズ１２Ｂとエミッションフィルタ１２Ｄとの間の透明板１１４部分が最上点に位置するよう回転させる（図１７（Ｃ））。
【０１５７】
これにより生体サンプルＳＰＬに染色された蛍光マーカＥＭ１及びＥＭ２から発せられる発色光の像は、移動する透明板１１４の位置に応じて屈折する方向が変化され、撮像素子３０の結像面において向きを変化させることなく半円を描くように移動される。
【０１５８】
生体サンプル像取得部４２は、ステージ移動制御部４１により可動ステージ１１がＺ軸方向に移動され、透明板１１４が半回転されている間、撮像素子３０を露光させ、対象とすべきサンプル部位を撮像素子３０に撮像させて蛍光像を取得する。
【０１５９】
生体サンプル像取得部４２は、各撮像範囲ＡＲに割り当てられるサンプル部位の蛍光像を連結することによって生体サンプル像（以下、これを楕円像とも呼ぶ）ＥＩＭ（図１８（Ｂ））を生成する。楕円像ＥＩＭでは、輝点ＢＰが生体サンプルＳＰＬの厚さ方向の位置に応じた傾きの楕円形に写る。
【０１６０】
距離算出部４５は、記憶部２７に記憶された鮮明化像データを読み出し、鮮明化像ＳＩＭ２から輝度値を基に蛍光マーカＥＭ１及びＥＭ２にそれぞれ対応する輝点ＢＰ１及びＢＰ２を抽出する。
【０１６１】
距離算出部４５は、輝点ＢＰ１及びＢＰ２のＸＹ平面上での距離ΔＸＹ（図１６（Ｃ））を、鮮明化像ＰＩＭ２に写る全ての輝点ＢＰ１及びＢＰ２の組み合わせについて、撮像倍率及び撮像素子３０の画素サイズに基づいて算出する。
【０１６２】
距離算出部４５は、算出された輝点ＢＰ１及びＢＰ２の距離ΔＸＹと閾値と比較し、該距離ΔＸＹが閾値より小さい値であった場合、輝点ＢＰ１及びＢＰ２がＸＹ平面上で近いとしてＺ軸方向の距離を算出する。この閾値は、輝点ＢＰ１及びＢＰ２にそれぞれ対応する蛍光マーカＥＭ１及びＥＭ２が同一細胞内に存在するとされる距離、所定の薬剤や阻害剤などの効果が示される距離等に設定される。
【０１６３】
距離算出部４５は、楕円像ＥＩＭ（図１８（Ｂ））から輝度値を基に蛍光マーカＥＭ１及びＥＭ２にそれぞれ対応する輝点ＢＰ３及びＢＰ４を楕円形として抽出し、該抽出した輝点ＢＰ３及びＢＰ４の楕円形の長軸とＸ軸とのなす角θ１及びθ２を算出する。因みに、鮮明化像ＳＩＭ２の輝点ＢＰ１と楕円像ＥＩＭの輝点ＢＰ３とは同一の蛍光マーカＥＭ１から発せられる発色光の像であり、同様に輝点ＢＰ２とＢＰ４とは同一の蛍光マーカＥＭ２から発せられる発色光の像である。
【０１６４】
距離算出部４５は、算出したなす角θ１及びθ２を用いて、ＸＹ平面上の距離ΔＸＹが閾値未満の間隔である輝点ＢＰ３及びＢＰ４の組み合わせについて、輝点ＢＰ３及びＢＰ４にそれぞれ対応する蛍光マーカＥＭ１及びＥＭ２のＺ軸方向の距離ΔＺを次式
【０１６５】
【数１】
0005499732.tif 000002
【０１６６】
により算出する。ここでＺｒは、透明板１１４が１回転する間に可動ステージ１１がＺ軸方向に移動する移動量を示す。
【０１６７】
例えば可動ステージ１１がＺ軸方向に４［μｍ］移動する間に、透明板１１４が半回転するように設定され、なす角θ１及びθ２の差が例えば０．５π［rad］であった場合、蛍光マーカＥＭ１及びＥＭ２のＺ軸方向の距離ΔＺは２［μｍ］となる。
【０１６８】
距離算出部４５は、蛍光マーカＥＭ１及びＥＭ２のＸＹ平面上の距離ΔＸＹと、Ｚ軸方向の距離ΔＺとを用いて、該蛍光マーカＥＭ１及びＥＭ２の実際の距離Δを次式
【０１６９】
【数２】
0005499732.tif 000003
【０１７０】
により算出する。
【０１７１】
データ記録部４３は、鮮明化像ＳＩＭ２のデータである鮮明化像データに対して、算出した蛍光マーカＥＭ１及びＥＭ２の実際の距離Δの情報（以下、これを間隔情報とも呼ぶ）を対応付けてとして記憶部２７に記憶する。
【０１７２】
表示制御部４６は、操作入力部２４を介して鮮明化像ＳＩＭ２の表示命令を受けた場合、記憶部２７から鮮明化像データと、該鮮明化像データに対応付けられた間隔情報とを読み出す。
【０１７３】
そして表示制御部４６は、読み出した鮮明化像データの鮮明化像ＳＩＭ２に対して、蛍光マーカＥＭ１及びＥＭ２に対応する輝点ＢＰ１及びＢＰ２間に間隔情報に基づいた実際の距離Δを付加して表示部２６に表示する。
【０１７４】
［４−３．データ取得処理手順］
上述したデータ取得処理の手順について図１９に示すフローチャートを用いて説明する。
【０１７５】
実際上、ＣＰＵ２１は、ルーチンＲＴ２の開始ステップから入って次のステップＳＰ２１へ移る。ステップＳＰ２１においてＣＰＵ２１は、焦点面ＦＰが生体サンプルＳＰＬのカバーガラスＣＧ側からスライドガラスＳＧ側へ移動するように、可動ステージ１１をＺ軸方向に等速で移動させる。ＣＰＵ２１は、可動ステージ１１が移動している間、撮像素子３０を露光させて蛍光像を取得し、各撮像範囲ＡＲに割り当てられたサンプル部位の蛍光像を連結することによって生体サンプル像ＳＩＭ１を生成し、次のステップＳＰ２２に移る。
【０１７６】
ステップＳＰ２２においてＣＰＵ２１は、生体サンプル像ＳＩＭ１から輝点ＢＰ１及びＢＰ２を検出し、該輝点ＢＰ１及びＢＰ２を点拡がり逆関数を用いて鮮明化する。次のステップＳＰ２３でＣＰＵ２１は、輝点ＢＰ１及びＢＰ２が鮮明化された鮮明化像ＳＩＭ２の鮮明化像データを記憶部２７に記憶し、次のステップＳＰ２４に移る。
【０１７７】
ステップＳＰ２４においてＣＰＵ２１は、焦点面ＦＰが生体サンプルＳＰＬのカバーガラスＣＧ側からスライドガラスＳＧ側へ移動するように、可動ステージ１１をＺ軸方向に等速で移動させると共に、透明板１１４を半回転させる。ＣＰＵ２１は、可動ステージ１１が移動している間、撮像素子３０を露光させて蛍光像を取得し、各撮像範囲ＡＲに割り当てられたサンプル部位の蛍光像を連結することによって楕円像ＥＩＭを生成し、次のステップＳＰ２５に移る。
【０１７８】
ステップＳＰ２５においてＣＰＵ２１は、鮮明化像ＳＩＭ２から輝点ＢＰ１及びＢＰ２を検出し、該輝点ＢＰ１及びＢＰ２のＸＹ平面上での距離ΔＸＹを算出する。次のステップＳＰ２６でＣＰＵ２１は、距離ΔＸＹが閾値未満か否かを判断し、肯定結果が得られるとステップＳＰ２７に移る。
【０１７９】
一方、ステップＳＰ２６において否定結果が得られると、このことは、閾値に設定された距離よりも近い蛍光マーカＥＭ１及びＥＭ２のペアが存在しないことを意味し、このときＣＰＵ２１は、ステップＳＰ３１に移る。
【０１８０】
ステップＳＰ２７においてＣＰＵ２１は、楕円像ＥＩＭから、ステップＳＰ２５で閾値未満の距離ΔＸＹとされた蛍光マーカＥＭ１及びＥＭ２にそれぞれ対応する輝点ＢＰ３及びＢＰ４を検出する。そしてＣＰＵ２１は、検出した楕円形の輝点ＢＰ３及びＢＰ４の長軸とＸ軸とのなす角θ１及びθ２を算出し、次のステップＳＰ２８に移る。
【０１８１】
ステップＳＰ２８においてＣＰＵ２１は、算出したなす角θ１及びθ２を式（１）に代入することにより、輝点ＢＰ３及びＢＰ４に対応する蛍光マーカＥＭ１及びＥＭ２のＺ軸方向の距離ΔＺを算出し、次のステップＳＰ２９に移る。
【０１８２】
ステップＳＰ２９においてＣＰＵ２１は、ステップＳＰ２５で算出した距離ΔＸＹと、ステップＳＰ２８で算出した距離ΔＺを式（２）に代入することにより、蛍光マーカＥＭ１及びＥＭ２の実際の距離Δを算出し、次のステップＳＰ３０に移る。
【０１８３】
ステップＳＰ３０においてＣＰＵ２１は、算出した蛍光マーカＥＭ１及びＥＭ２の実際の距離Δを間隔情報として鮮明化像データに対応付けて記憶し、次のステップＳＰ３１に移る。
【０１８４】
ステップＳＰ３１においてＣＰＵ２１は、操作入力部２４を介して鮮明化像ＳＩＭ２の表示命令を受けた場合、鮮明化像データ及び間隔情報を記憶部２７から読み出す。そしてＣＰＵ２１は、鮮明化像ＳＩＭ２に対して、蛍光マーカＥＭ１及びＥＭ２に対応する輝点ＢＰ１及びＢＰ２間に間隔情報に基づいた実際の距離Δを付加して表示部２６に表示し、次のステップに移って処理を終了する。
【０１８５】
［４−４．動作及び効果］
以上の構成において生体サンプル像取得装置１００は、撮像素子３０に対して生体サンプルＳＰＬの像の向きを変化させることなく円運動させる結像位置移動部１１５が設けられる。
【０１８６】
結像位置移動部１１５は、対物レンズ１２Ａと撮像素子３０との間の光軸に対して平行に配されてモータ１１１により回転される回転軸１１２に対して所定角度に傾いて透明板１１４が固定される。
【０１８７】
透明板１１４は、その一部が結像レンズ１２Ｂとエミッションフィルタ１２Ｄとの間に位置する。従って透明板１１４は、モータ１１１により回転軸１１２を介して回転されると、対物レンズ１２Ａにより拡大された生体サンプルＳＰＬの像を、その向きを変化させることなく撮像素子３０の撮像面で円運動させる。
【０１８８】
生体サンプル像取得装置１００は、可動ステージ１１をＺ軸方向に移動させながら透明板１１４を回転させ、その間、撮像素子３０を露光することにより楕円像ＥＩＭを取得するようにした。
【０１８９】
従って生体サンプル像取得装置１００により取得された楕円像ＥＩＭには、図２０（Ａ）に示すように、蛍光マーカＥＭ１及びＥＭ２がＸＹ平面上で近くかつＺ軸方向に離れている場合、対応する輝点ＢＰ３及びＢＰ４の傾きが大きく異なる。一方、図２０（Ｂ）に示すように、蛍光マーカＥＭ１及びＥＭ２がＸＹ平面上で近くかつＺ軸方向に近い場合、対応する輝点ＢＰ３及びＢＰ４の傾きがほぼ同一になる。
【０１９０】
このように生体サンプル像取得装置１００は、生体サンプルＳＰＬにおける蛍光マーカＥＭの厚さ方向（Ｚ軸方向）の位置に応じて略楕円形状に写る輝点ＢＰの傾きが変化する楕円像ＥＩＭを取得することができる。
【０１９１】
従って生体サンプル像取得装置１００は、略楕円形状に写る輝点ＢＰの傾きからＺ軸方向の位置を検出することにより、生体サンプルＳＰＬにおける蛍光マーカＥＭの３次元的な位置を検出することができ、かくして検出精度をより向上することができる。
【０１９２】
また生体サンプル像取得装置１００は、第３の実施の形態のように可動ステージ１１をＺ軸方向に移動させながらＸＹ平面に移動させる場合と比して、可動ステージ１１をＺ軸方向に移動させながら透明板１１４を回転させるだけでよく容易に制御することができる。
【０１９３】
生体サンプル像取得装置１００は、可動ステージ１１をＺ軸方向に移動させながら撮像素子３０を露光することにより撮像された鮮明化像ＰＩＭ２から輝点ＢＰ１及びＢＰ２のＸＹ平面上の距離ΔＸＹを算出する。
【０１９４】
また生体サンプル像取得装置１００は、可動ステージ１１をＺ軸方向に移動させながら透明板１１４を回転させ、その間、撮像素子３０を露光することにより撮像された楕円像ＥＩＭから輝点ＢＰ３及びＢＰ４のＺ軸方向の距離ΔＺを算出する。
【０１９５】
そして生体サンプル像取得装置１００は、算出した距離ΔＸＹ及び距離ΔＺからターゲットとなる蛋白質又は遺伝子に標識された蛍光マーカＥＭ１及びＥＭ２の実際の距離Δを算出するようにした。
【０１９６】
これにより生体サンプル像取得装置１００は、ターゲットとなる蛋白質又は遺伝子間の距離を正確に測定することができる。
【０１９７】
以上の構成によれば、生体サンプルＳＰＬの厚さ方向に対物レンズ１２Ａの焦点面ＦＰを移動させると同時に、生体サンプルＳＰＬの像を向きを変化させることなく撮像素子３０の撮像面で円運動させ、その間、撮像素子３０を露光させて生体サンプル像（楕円像ＥＩＭ）を取得する。これによりターゲットとなる蛋白質又は遺伝子に標識された蛍光マーカＥＭ間の距離を正確に測定することができるので、検出精度を向上することができる。
【０１９８】
＜５．他の実施の形態＞
なお上述した第１〜第４の実施の形態においては、Ｚ軸方向に可動ステージ１１を動かすことによって焦点面ＦＰを生体サンプルＳＰＬに対してＺ軸方向に移動させるようにした。本発明はこれに限らず、例えば対物レンズ１２ＡをＺ軸方向に可動させ得る移動機構を設け、該対物レンズ１２ＡをＺ軸方向に移動させることによって焦点面ＦＰを生体サンプルＳＰＬに対してＺ軸方向に移動させるようにしてもよい。
【０１９９】
また上述した第１〜第３の実施の形態においては、ＸＹ平面における面方向に可動ステージ１１を動かすことによって焦点面ＦＰを面方向に動かすようにした。本発明はこれに限らず、例えば撮像素子３０をＸＹ平面の面方向に可動させ得るステージを設け、該ステージを介して撮像素子３０を面方向に移動させることによって生体サンプルＳＰＬと撮像素子３０との相対位置を面方向に移動させるようにしてもよい。
【０２００】
さらに上述した第１〜第３の実施の形態においては、撮像素子３０により撮像された生体サンプル像をそのままサンプルデータとして記憶するようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、撮像素子３０により撮像された生体サンプル像に対して細胞核内輝点抽出処理及び輝点補正処理を施した後、サンプルデータに記憶するようにしてもよい。
【０２０１】
さらに上述した第２及び第３の実施の形態においては、生体サンプル像補正表示処理において、撮像素子３０により撮像された生体サンプル像における輝点ＢＰの厚さ方向の位置を算出するようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、データ取得処理において、撮像素子３０により撮像された生体サンプル像に対して、輝点ＢＰの厚さ方向の位置を算出し、該輝点ＢＰ及び厚さ方向の位置を対応付けて識別情報に記憶するようにしてもよい。
【０２０２】
さらに上述した第１の実施の形態においては、生体サンプル像に映し出させる輝点ＢＰの長軸／短軸比が例えば１．４３となるようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、第１及び第３の実施の形態においては、輝点ＢＰの長軸／短軸比が１．３〜１．５程度となるように可動ステージ１１をＺ軸方向及び面方向に移動させるようにすればよい。また第２の実施の形態においては、輝点ＢＰの長軸／短軸比が１．３〜１．５程度の範囲の中で可動ステージ１１を面方向にその移動速度が変化するように移動させればよい。
【０２０３】
さらに上述した第１及び第２の実施の形態においては、面方向としてＸ軸方向に可動ステージ１１を移動させるようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、面方向に一定であれば、Ｙ軸方向でもよいし、またＸ軸又はＹ軸に所定の傾きを持った方向でもよい。
【０２０４】
さらに上述した第１〜第４の実施の形態においては、２つの対物レンズ１２Ａ及び結像レンズ１２Ｂが設けられている場合について述べた。本発明はこれに限らず、対物レンズが１つであってもよい。また各対物レンズ１２Ａ及び結像レンズ１２Ｂをレボルバー等を適用して倍率が可変できるようにしてもよい。
【０２０５】
さらに上述した第１〜第４の実施の形態においては、生体サンプル取得処理により得られたサンプルデータは記憶部２７に保存された。記憶部２７は、データ処理部２０内に設ける場合に限定されるものではなく、該データ処理部２０の外部としてもよい。また記憶部２７に対するデータの通信媒体はバス２８に限定されるものではなく、例えば、ローカルエリアネットワークやインターネット、ディジタル衛星放送等の有線又は無線の通信媒体としてもよい。
【０２０６】
さらに上述した第４の実施の形態においては、透明板１１４を回転させることにより撮像素子３０に結像される生体サンプルＳＰＬの像を、傾きを変化させることなく円移動させるようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、エミッションフィルタ１２Ｄを移動させることにより撮像素子３０に結像される生体サンプルＳＰＬの像を、傾きを変化させることなく円移動させるようにしてもよい。
【０２０７】
具体的に、図１４との対応部分に同一符号を付した図２１に示すように、生体サンプル像取得装置１２０は、エミッションフィルタ１２Ｄを移動させて撮像素子３０に結像される像の結像位置を移動させる結像位置移動部１２１が設けられる。
【０２０８】
結像位置移動部１２１は、図２２に示すように、保持部１２２、支持部１２３、アクチュエータ１２４、１２５及びばね１２６、１２７により構成される。
【０２０９】
保持部１２２は、エミッションフィルタ１２Ｄを保持する扁平の略直方体に形成され、その一端を支持する支持部１２３により支持される。また保持部１２２は、支持部１２３に支持された一端に対して隣り合う２つの端にアクチュエータ１２４及び１２５が設けられる。さらに保持部１２２は、支持部１２３とアクチュエータ１２４及び１２５とにそれぞれ支持された端を結ぶ辺の中心にばね１２６及び１２７が設けられる。
【０２１０】
アクチュエータ１２４及び１２５は、データ処理部２０の結像位置移動制御部４４の制御に基づき上下に移動することにより、保持部１２２を介してエミッションフィルタ１２Ｄを移動させる。
【０２１１】
ばね１２６及び１２７は、一端が保持部１２２に連結され、他端が所定位置に固定されており、付勢力により保持部１２２を介してエミッションフィルタ１２ＤをＺ軸方向に付勢する。
【０２１２】
ＣＰＵ２１は楕円像ＥＩＭを取得する際、ステージ移動制御部４１により焦点面ＦＰが生体サンプルＳＰＬのカバーガラスＣＧ側からスライドガラスＳＧ側へ移動するように、可動ステージ１１をＺ軸方向に等速で移動させる。
【０２１３】
結像位置移動制御部４４は、可動ステージ１１が移動している間に撮像素子３０に結像される像を傾きが変化することなく半回転だけ円運動するように、アクチュエータ１２４及び１２５を次式。
【０２１４】
【数３】
0005499732.tif 000004
【０２１５】
の関数で移動させる。因みに、Ｚ１はアクチュエータ１２４に支持される端のＺ軸方向の位置を示し、Ｚ２はアクチュエータ１２５に支持される端のＺ軸方向の位置を示し、Ａは振幅を示し、ωは角速度を示し、Ｔは時刻を示す。振幅Ａ、角速度ω、Ｚ１及びＺ２の位相差は適宜設定される。
【０２１６】
生体サンプル像取得装置１２０は、生体サンプル像取得装置１００で取得される楕円像ＥＩＭと同様に、生体サンプルＳＰＬにおける蛍光マーカＥＭのＺ軸方向の位置に応じて対応する略楕円形状の輝点ＢＰのなす角が変化する楕円像ＥＩＭを取得することができる。
【０２１７】
ここで現状の顕微鏡では、ダイクロイックミラー１２Ｃ、エミッションフィルタ１２Ｄ及び励起フィルタ１２Ｅがユニット単位として交換可能になされたものがある。従ってこれらの顕微鏡に上述した結像位置移動部１２１が設けられたエミッションフィルタ１２Ｄを含むユニットに交換させるだけで、楕円像ＥＩＭを取得させることができる。
【０２１８】
上述した第３の実施の形態においては、可動ステージ１１をＺ軸方向に等速で移動させながらＸＹ軸平面で半円を描くように移動させ、その間、撮像素子３０を露光して生体サンプル像を取得する。そして、取得した生体サンプル像から楕円形の輝点ＢＰを抽出し、該抽出した輝点ＢＰの長軸とＸ軸とのなす角を算出し、なす角に基づいてＺ軸方向の位置を算出するようにした。本願発明はこれに限らない。
【０２１９】
例えば、可動ステージ１１をＺ軸方向に等速で移動させながらＸＹ軸平面に円移動させ、その間露光していた撮像素子３０により撮像された生体サンプル像には、図２３に示すように、蛍光マーカＥＭが円弧の像である輝点として写る場合がある。
【０２２０】
この場合、円弧の像における輝度レベルが最も高い位置が蛍光マーカＥＭに対して対物レンズ１２Ａの焦点が合っている位置である。従ってＣＰＵ２１は、生体サンプル像における円弧の像を輝点として抽出し、該輝点における円弧の両端を結ぶ直線の中点と円弧の中点とを結ぶ直線を算出する。
【０２２１】
そしてＣＰＵ２１は、算出した直線とＸ軸とのなす角を算出し、該なす角に基づいて蛍光マーカＥＭのＺ軸方向の位置を算出する。
【０２２２】
このように生体サンプル像取得装置１は、生体サンプル像に蛍光マーカＥＭが円弧の像として写る場合、厚さ方向の位置に応じて円弧の像の輝度レベルの分布が変化するので、円弧の像から蛍光マーカＥＭの厚さ方向の位置を検出することができる。
【０２２３】
ここで図２４に示すように、深さ１［μｍ］の溝が形成されたガラス台ＧＳの溝の上と下にそれぞれ蛍光マーカＥＭが配置されたサンプルを用いて、溝の上と下に配置された蛍光マーカＥＭのＺ軸方向の距離を測定した実験結果を示す。
【０２２４】
この実験では、サンプルが配置された可動ステージをＺ軸方向に０．２３［μｍ／ｓ］で移動させながらＸＹ軸平面に半径８［μｍ］、３６秒で１周する速度（毎秒１０［deg］の角速度）で円運動させた。また撮像素子の露光時間は３０［ｓ］とした。
【０２２５】
この実験で撮像された図２５に示すサンプル像において、溝の上に配置された蛍光マーカＥＭの輝点のなす角と、溝の下に配置された蛍光マーカＥＭの輝点のなす角との角度差は４４．５［deg］となった。
【０２２６】
４４．５［deg］の角度差は、ステージが毎秒１０［deg］の角速度で移動しているので４．４５［ｓ］の時間差に相当する。また焦点面はＺ軸方向に０．２３［μｍ／ｓ］で移動しているので、４．４５［ｓ］の時間差は１．０４［μｍ］に相当する。
【０２２７】
従って、溝の上と下に配置された蛍光マーカＥＭ間のＺ軸方向の距離は１．０４［μｍ］であると算出された。これによりこの算出方法の正確性が実証された。
【０２２８】
因みに、生体サンプル像に蛍光マーカＥＭが円弧の像として写った場合であっても、輝度レベルの高い部分だけを抽出することにより楕円像を抽出することができるので、これにより楕円像からＺ軸方向の位置が算出できるものである。
【０２２９】
なお第４の実施の形態においても、生体サンプル像に蛍光マーカＥＭが円弧の像として写った場合には、この方法が適応できる。
【０２３０】
また、生体サンプル像における円弧の像からＺ軸方向の位置を算出する際、Ｚ軸方向にだけ可動ステージ１１を移動させて撮像した生体サンプル像を用いることで、より精度よく蛍光マーカＥＭのＺ軸方向の位置を算出することができる。
【０２３１】
具体的には、ステージ移動制御部４１は、可動ステージ１１をＺ軸方向だけに移動させる。生体サンプル像取得部４２は、可動ステージ１１が移動している間、撮像素子３０を露光して図２６（Ａ）に示すような生体サンプル像ＳＩＭ３を取得する。
【０２３２】
またステージ移動制御部４１は、可動ステージ１１をＺ軸方向にだけ移動させて生体サンプル像ＳＩＭ３を取得した際のＸＹ軸平面の位置を基準位置として、可動ステージ１１をＺ軸方向に移動させながらＸＹ軸平面で基準位置を中心として半円を描くように移動させる。生体サンプル像取得部４２は、可動ステージ１１が移動している間、撮像素子３０を露光して図２６（Ｂ）に示すような生体サンプル像ＳＩＭ４を取得する。
【０２３３】
生体サンプル像ＳＩＭ３及びＳＩＭ４において、輝点ＢＰ１０とＢＰ１２とは同一の蛍光マーカＥＭの像であり、輝点ＢＰ１１とＢＰ１３とは同一の蛍光マーカＥＭの像である。
【０２３４】
また生体サンプル像ＳＩＭ１４を取得する際、可動ステージ１１が生体サンプル像ＳＩＭ３を取得した際のＸＹ軸平面の位置を中心としてＸＹ軸平面を円運動するので、生体サンプル像ＳＩＭ１３における輝点ＢＰ１２の中心（円弧の中心）は、輝点ＢＰ１０の中心と同一位置となる。
【０２３５】
従ってＣＰＵ２１は、生体サンプル像ＳＩＭ３における円形の輝点ＢＰ１０及びＢＰ１１の中心位置（生体サンプル像ＳＩＭ３における座標）を算出する。そしてＣＰＵ２１は、生体サンプル像ＳＩＭ３における算出した中心位置に対応する生体サンプル像ＳＩＭ４の位置（同一座標）を円弧の像である輝点ＢＰ１２及びＢＰ１３の中心に設定する。
【０２３６】
そしてＣＰＵ２１は、輝点ＢＰ１２及びＢＰ１３の輝度レベルが最も高い位置（座標）を算出し、中心と輝度レベルが最も高い位置とを結ぶ直点とＸ軸とのなす角を算出し、該なす角に基づいて蛍光マーカＥＭのＺ軸方向の位置を算出する。
【０２３７】
これにより、Ｚ軸方向にだけ可動ステージ１１を移動させて撮像された生体サンプル像ＳＩＭ３を用いない場合と比して、円弧の像の中心位置を検出するので、より精度よくＺ軸方向の位置を検出することができる。
【０２３８】
さらに上述した第４の実施の形態においては、可動ステージ１１をＺ軸方向に等速で移動させると共に、透明板１１４を半回転させて撮像された楕円像ＥＩＭを用いて、蛍光マーカＥＭ１及びＥＭ２のＺ軸方向の距離ΔＺを算出するようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、可動ステージ１１をＺ軸方向に等速で移動させると共に、透明板１１４を１回転させて撮像された楕円像を用いて、蛍光マーカＥＭ１及びＥＭ２のＺ軸方向の距離ΔＺを算出するようにしてもよい。
【０２３９】
具体的にＣＰＵ２１は、データ取得処理において、鮮明化像ＳＩＭ２を生成してＸＹ平面上の距離ΔＸＹを算出し、楕円像ＥＩＭを撮像してＺ軸方向の距離ΔＺを算出した後、蛍光マーカＥＭ１及びＥＭ２の実際の距離Δを算出する。
【０２４０】
そしてＣＰＵ２１は、例えば、より精度よく実際の距離を測定すべきとされる値に設定された閾値より算出した実際の距離Δが小さかった場合、可動ステージ１１をＺ軸方向に等速で移動させると共に、透明板１１４を１回転させて楕円像を取得する。
【０２４１】
具体的にＣＰＵ２１は、ステージ移動制御部４１により対物レンズ１２Ａの焦点面ＦＰが生体サンプルＳＰＬのカバーガラスＣＧ側からスライドガラスＳＧ側へ移動するように、可動ステージ１１を対物レンズ１２Ａに近づくようにＺ軸方向に等速で移動させる。
【０２４２】
結像位置移動制御部４４は、焦点面ＦＰが生体サンプルＳＰＬのカバーガラスＣＧ側からスライドガラスＳＧ側へ移動する間にモータ１１１を介して透明板１１４を等速に１回転させる。
【０２４３】
生体サンプル像取得部４２は、ステージ移動制御部４１及び結像位置移動制御部４４により可動ステージ１１及び透明板１１４が移動されている間、撮像素子３０を露光させて蛍光像を取得し、サンプル部位の蛍光像を連結することによって楕円像を生成する。
【０２４４】
距離算出部４５は、上述した楕円像ＥＩＭにおけるＺ軸方向の距離ΔＺを算出した場合と同様の演算を行うことにより、透明板１１４を１回転させて撮像された楕円像からＺ軸方向の距離ΔＺ’を算出する。そして距離算出部４５は、ＸＹ平面上の距離ΔＸＹ及び算出したＺ軸方向の距離ΔＺ’を用いて蛍光マーカＥＭ１及びＥＭ２間の実際の距離Δ’を算出する。
【０２４５】
これにより生体サンプル像取得装置１００は、より精度よく蛍光マーカＥＭ１及びＥＭ２の実際の距離ΔＺ’を算出することができる。
【０２４６】
因みに、透明板１１４を１回転させて撮像された楕円像では、Ｚ軸方向に生体サンプルＳＰＬの半分の厚さ分離れた蛍光マーカＥＭ同士は同一のなす角θを有する輝点ＢＰとして写る。
【０２４７】
そこで生体サンプル像取得部４２は、透明板１１４を１回転する間に、該透明板１１４が半回転したところで撮像素子３０の露光を終了させて蛍光像を取得し、透明板１１４が残りの半回転する間、撮像素子３０を露光させて蛍光像を取得するようにすればよい。
【０２４８】
この場合、２つの蛍光像それぞれにおいては、Ｚ軸方向の位置が異なる蛍光マーカＥＭが同一のなす角θを有する輝点ＢＰとして楕円像に写ることを防止することができる。
【０２４９】
さらに上述した第４の実施の形態では、Ｚ軸方向にだけ可動ステージ１１を移動させて撮像された鮮明化像ＰＩＭを取得し、該鮮明化像ＰＩＭから輝点ＢＰ１及びＢＰ２のＸＹ平面上の距離ΔＸＹを算出するようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、鮮明化像ＰＩＭを取得せず、楕円像ＥＩＧだけからＸＹ平面上の距離ΔＸＹ及びＺ軸方向の間隔ΔＺを算出するようにしてよい。
【０２５０】
さらに上述した第１〜第４の実施の形態においては、対物レンズとして対物レンズ１２Ａ、撮像素子として撮像素子３０、移動制御部としてステージ移動制御部４１、生体サンプル像取得部として生体サンプル像取得部４２が設けられるようにした場合について述べた。しかしながら本発明は、その他種々の構成でなる対物レンズ、撮像素子、移動制御部及び生体サンプル像取得部を設けるようにしても良い。
【産業上の利用可能性】
【０２５１】
本発明は、生物実験、医薬の創製又は患者の経過観察などのバイオ産業上において利用可能である。
【符号の説明】
【０２５２】
１、１００……生体サンプル像取得装置、１０、１１０、１２０……顕微鏡、１１……可動ステージ、１２……光学系、１２Ａ、１２Ｂ……対物レンズ、１２Ｃ……ダイクロイックミラー、１２Ｄ……エミッションフィルタ、１２Ｅ……励起フィルタ、１３……照明灯、１４……光源、２０……データ処理部、２１……ＣＰＵ、２２……ＲＯＭ、２３……ＲＡＭ、２４……操作入力部、２５……インターフェイス、２６……表示部、２７……記憶部、３０……撮像素子、１１１……モータ、１１２……回転軸、１１３……傾斜台座、１１４……透明板、１１５、１２１……結像位置移動部、１２２……保持部、１２３……支持部、１２４、１２５……アクチュエータ、１２６、１２７……ばね、ＣＧ……カバーガラス、ＳＧ……スライドガラス、ＳＰＬ……生体サンプル。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２４】
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【図２６】
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【図２３】
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【図２５】
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