(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペスチウイルスの自己プロテアーゼＮｐｒｏの自己タンパク質分解機能を有する第１ポリペプチドと該第１ポリペプチドのＣ末端において該第１ポリペプチドに結合した第２ポリペプチドとを含む融合タンパク質をコードする核酸分子であって、該第２ポリペプチドは異種ポリペプチドであり、細菌宿主細胞内において該第１ポリペプチドの自己タンパク質分解活性により、該融合タンパク質から切断されて均一なＮ末端を有することを特徴とする該核酸分子。
【請求項２】
該ペスチウイルスが、ＣＳＦＶ、ＢＤＶおよびＢＶＤＶよりなる群から選ばれる請求項１記載の核酸分子。
【請求項３】
該ペスチウイルスがＣＳＦＶである請求項２記載の核酸分子。
【請求項４】
該第１ポリペプチドがアミノ酸配列：
【化１】
0005480458.tif 000010
または自己タンパク質分解活性を有し且つアミノ酸２−２１の領域内の１以上のアミノ酸が欠失し又は置換されたＮ末端領域を有する誘導体のアミノ酸配列を含む請求項３記載の核酸分子。
【請求項５】
該第１ポリペプチドがＣＳＦＶの自己プロテアーゼＮｐｒｏのアミノ酸配列Ｇｌｕ２２−Ｃｙｓ１６８または自己タンパク質分解活性を有し且つアミノ酸２−２１の領域内の１以上のアミノ酸が欠失し又は置換されたＮ末端領域を有する誘導体を含み、該第１ポリペプチドが更にＭｅｔをＮ末端として有し、該異種ポリペプチドがＣＳＦＶの自己プロテアーゼＮｐｒｏのアミノ酸Ｃｙｓ１６８に直接結合している請求項３記載の核酸分子。
【請求項６】
該第１ポリペプチドがＣＳＦＶの自己プロテアーゼＮｐｒｏのアミノ酸配列Ｐｒｏ１７−Ｃｙｓ１６８または自己タンパク質分解活性を有し且つアミノ酸２−２１の領域内の１以上のアミノ酸が欠失し又は置換されたＮ末端領域を有する誘導体を含み、該第１ポリペプチドが更にＭｅｔをＮ末端として有し、該異種ポリペプチドがＣＳＦＶの自己プロテアーゼＮｐｒｏのアミノ酸Ｃｙｓ１６８に直接結合している、請求項３記載の核酸分子。
【請求項７】
該核酸分子がＤＮＡ分子である、請求項１〜６のいずれか１項記載の核酸分子。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項記載の核酸分子と少なくとも１つの発現制御配列とを含んでなる、所定の細菌宿主細胞に和合性の発現ベクター。
【請求項９】
該細菌宿主細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である請求項８記載の発現ベクター。
【請求項１０】
該発現ベクターがプラスミドである請求項８または９記載の発現ベクター。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれか１項記載のベクターを含んでなる細菌宿主細胞。
【請求項１２】
該宿主細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である請求項１１記載の細菌宿主細胞。
【請求項１３】
（ｉ）請求項１１または１２記載の細菌宿主細胞を培養すること、該培養は、該融合タンパク質の発現と、該第１ポリペプチドの自己タンパク質分解活性による該宿主細胞内での該融合タンパク質からの該異種ポリペプチドの自己タンパク質分解切断とを引き起こす条件下で行い、
（ｉｉ）切断された異種ポリペプチドを単離すること、を含んでなる所望の異種ポリペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】  本発明は、明らかに定められた均一なＮ末端を有する所望の異種ポリペプチドの、細菌宿主細胞内での製造方法であって、ペスチウイルスの自己プロテアーゼ（ａｕｔｏｐｒｏｔｅａｓｅ）Ｎｐｒｏの自己タンパク質分解活性を有するペプチドと該異種ポリペプチドとを含む初めに発現された融合タンパク質から所望の異種ポリペプチドを該Ｎｐｒｏ自己タンパク質分解活性により自己タンパク質分解的に切断することを特徴とする製造方法に関する。
【０００２】  異種生物における組換えタンパク質の製造、例えば、細菌細胞内でのヒトまたは他の真核生物のタンパク質の発現においては、１００％に可能な限り近く均一な明らかに定められたＮ末端を得ることは困難な場合が多い。これは、ヒト／動物に天然で存在するアミノ酸配列と多くの場合に同一であるべきアミノ酸配列を有する組換え医薬タンパク質の場合に特に言えることである。
【０００３】  例えばヒトにおける天然発現に際しては、用いられた多数の医薬タンパク質は細胞外腔内に輸送され、この目的のために前駆体タンパク質内に存在するシグナル配列の切断は、明らかに定められたＮ末端を与える。いくつかの理由により、そのような均一なＮ末端は、例えば細菌細胞内では常に容易に生成されるわけではない。
【０００４】  原核性または真核性シグナル配列による細菌ペリプラズム内への輸出が適当なのは、稀な場合にすぎない。なぜなら、細菌輸出装置の低い輸送能のため、通常は、この場合には非常に少量の産物だけしか蓄積することができないからである。
【０００５】  しかし、該細菌細胞質は真核生物の細胞外腔とはかなり異なる。一方においては、そこには還元条件が存在し、他方においては、Ｎ末端リーダー配列を切断して成熟タンパク質を形成するメカニズムが存在しない。すべての細胞質タンパク質の合成は、適当な開始コドン（ＡＴＧ＝翻訳の開始）により特定されるメチオニンから開始する。このＮ末端メチオニンは多数のタンパク質内に保持されているが、他のタンパク質においては、それは、細胞質内に存在する該宿主に固有のメチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）により切断される。該切断の効率は、以下の２つのパラメーターに実質的に左右される：１．後続のアミノ酸の性質、および２．該タンパク質の三次元構造におけるＮ末端の位置。Ｎ末端メチオニンは、後続のアミノ酸がセリン、アラニン、グリシン、メチオニンまたはバリンである場合、およびＮ末端が露出している場合（すなわち、該タンパク質内に「隠れて」いない場合）に優先的に欠失する。一方、後続のアミノ酸が、異なるアミノ酸、特に荷電アミノ酸（グルタミン酸、アスパラギン酸、リシン、アルギニン）である場合、またはＮ末端が該タンパク質の内部に位置する場合には、ほとんどの場合、Ｎ末端メチオニンの切断は生じない（Ｋｎｉｐｐｅｒｓ，Ｒｏｌｆ（１９９５）Ｍｏｌｅｋｕｌａｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｋ，第６版，Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．ＩＳＢＮ  ３−１３−１０３９１６−７）。
【０００６】  該切断を促進するアミノ酸が２位に存在する場合であっても、該切断はめったに完全ではない。かなりの割合（１〜５０％）がＭＡＰにより影響されないままであるのが普通である。
【０００７】  細菌細胞内での組換え医薬タンパク質の製造の初期においては、その方法は、単に、メチオニンコード化ＡＴＧ開始コドンを成熟（すなわち、シグナル配列も他のＮ末端伸長も有さない）タンパク質のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の前に配置するだけであった。したがって、発現されるタンパク質は配列Ｈ２Ｎ−Ｍｅｔ−標的タンパク質を有していた。該宿主に固有のＭＡＰによるＮ末端メチオニンの完全な切断が達成されうるのは、少数の場合にすぎない。したがって、このようにして製造されたタンパク質のほとんどはＮ末端に関して不均一であるか（Ｍｅｔ形態と無Ｍｅｔ形態との混合物）、またはそれらのすべてはＮ末端に追加的な外来アミノ酸（Ｍｅｔ）を有する（Ｍｅｔ形態のみ）。
【０００８】  しかし、この不均一性または天然配列からの逸脱は、多くの場合には許容されない。なぜなら、これらの産物は、しばしば、異なる免疫学的（例えば、抗体生成の誘導）および薬理学的（半減期、薬物動力学）特性を示すからである。これらの理由により、ほとんどの場合には、天然と同一の産物（Ｎ末端において均一であり外来アミノ酸を有さないもの）を製造することが現在必要とされている。細胞質発現の場合には、ここでのほとんどの場合の対処法は、特異的エンドペプチドダーゼ（例えば、因子Ｘａ、エンテロキナーゼ、ＫＥＸエンドペプチダーゼ、ＩｇＡプロテアーゼ）またはアミノペプチダーゼ（例えば、ジペプチジルアミノペプチダーゼ）の切断配列（リーダー）を標的タンパク質のＮ末端に融合させることである。しかし、これは、経費および材料の出費を伴う、該産物の更なる後処理（いわゆる下流プロセシング）中の追加的な工程を必要とする。
【０００９】  したがって、複雑な追加的なインビトロ工程（リフォールディング、精製、プロテアーゼ切断、回復精製など）を伴うことなく均一の所望のＮ末端を有する標的タンパク質が製造されうることを意図した、細菌細胞内での標的タンパク質の製造方法が必要とされている。ペスチウイルス由来のウイルス自己プロテアーゼＮｐｒｏを使用するそのような方法を、本発明の範囲内で開発した。
【００１０】  ペスチウイルスは、世界中でブタおよび反芻動物において深刻な経済的損失を引き起こす一群の病原体を構成する。届出伝染病の病原体として、古典的豚コレラウイルス（ＣＳＦＶ）は特に重要である。牛ウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）により引き起こされる損害（特に、胎仔の子宮内感染の定常的発生によるもの）も著しい。
【００１１】  ペスチウイルスは、ｍＲＮＡとして直接作用する１２．３ｋｂのサイズのゲノムを有する、エンベロープを有する小さなウイルスであり、該ウイルス遺伝子産物は細胞質内で該ゲノムから転写される。これは、約４０００アミノ酸を含みウイルスプロテアーゼおよび細胞プロテアーゼの両方により約１２個の成熟タンパク質に分解される単一のポリタンパク質の形態で生じる。
【００１２】  現在までに、ペスチウイルスにおいては２つのウイルスコード化プロテアーゼ（自己プロテアーゼＮｐｒｏおよびセリンプロテアーゼＮＳ３）が同定されている。Ｎ末端プロテアーゼＮｐｒｏはポリタンパク質のＮ末端に位置し、２３ｋｄの見掛け分子量を有する。それは、それ自身のＣ末端（Ｃｙｓ１６８）とヌクレオカプシドプロテインＣのＮ末端（Ｓｅｒ１６９）との間で生じる切断を触媒する（Ｒ．Ｓｔａｒｋら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７（１９９３），７０８８−７０９５）。また、細胞病原性ＢＶＤＶウイルスにおけるＮｐｒｏ遺伝子の重複が記載されている。これらにおいては、同様に重複したＮＳ３プロテアーゼのＮ末端にＮｐｒｏの第２のコピーが存在する。この場合にも、該Ｎｐｒｏ‐ＮＳ３タンパク質の自己タンパク質分解切断が観察される（Ｒ．Ｓｔａｒｋら，前記を参照されたい）。
【００１３】  Ｎｐｒｏは、１６８アミノ酸の長さおよび約２０，０００ｄの見掛けＭｒ（インビボ）を有する自己プロテアーゼである。それはペスチウイルス（例えば、ＣＳＦＶ、ＢＤＶ（ボーダー病ウイルス）またはＢＶＤＶ）のポリタンパク質における最初のタンパク質であり、後続のヌクレオカプシドプロテインＣからの自己タンパク質分解切断を受ける（Ｍ．Ｗｉｓｋｅｒｃｈｅｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５（１９９１），４５０８−４５１４；Ｓｔａｒｋら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７（１９９３），７０８８−７０９５）。この切断は、Ｎｐｒｏの配列内の最後のアミノ酸Ｃｙｓ１６８の後で生じる。
【００１４】  驚くべきことに、本発明において、ペスチウイルスの自己プロテアーゼＮｐｒｏの自己タンパク質分解機能が細菌発現系において（特に異種タンパク質の発現の際に）保有されることが、本発明の範囲内で見出された。したがって、本発明は、明らかに定められた均一なＮ末端を有する所望の異種ポリペプチドの、細菌宿主細胞内での製造方法であって、ペスチウイルスの自己プロテアーゼＮｐｒｏの自己タンパク質分解活性を有するペプチドと該異種ポリペプチドとを含む初めに発現された融合タンパク質から所望の異種ポリペプチドを該Ｎｐｒｏ自己タンパク質分解活性により切断することを特徴とする製造方法に関する。本発明は更に、本発明の製造方法において用いるクローニング手段に関する。
【００１５】  ペスチウイルスの自己プロテアーゼＮｐｒｏの自己タンパク質分解活性を有するポリペプチド、またはペスチウイルスの自己プロテアーゼＮｐｒｏの自己タンパク質分解機能を有するポリペプチドは、特に、ペスチウイルスの自己プロテアーゼＮｐｒｏ、または自己タンパク質分解活性を有するその誘導体である。
【００１６】  本発明の範囲内においては、「異種ポリペプチド」は、天然に生じる融合タンパク質またはポリタンパク質からペスチウイルスの自己プロテアーゼＮｐｒｏにより天然では切断されないポリペプチドを意味する。異種ポリペプチドの具体例としては、産業用酵素（プロセス酵素）、または医薬活性、特にヒト用医薬活性を有するポリペプチドである。
【００１７】  ヒト用医薬活性を有する好ましいポリペプチドの具体例としては、サイトカイン、例えばインターロイキン（例えばＩＬ−６）、インターフェロン、例えば白血球インターフェロン、例えばインターフェロンα２Ｂ、増殖因子、特に造血系または創傷治癒増殖因子、例えばＧ−ＣＳＦ、エリトロポエチンまたはＩＧＦ、ホルモン、例えばヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、抗体またはワクチンが挙げられる。
【００１８】  したがって、１つの態様において、本発明は、ペスチウイルスの自己プロテアーゼＮｐｒｏの自己タンパク質分解機能を有する第１ポリペプチドと該第１ポリペプチドのＣ末端において該第１ポリペプチドに結合した第２ポリペプチドとを含む融合タンパク質をコードする核酸分子であって、該第２ポリペプチドが該第１ポリペプチドの自己タンパク質分解活性により該融合タンパク質から切断されうること、および該第２ポリペプチドが異種ポリペプチドであることを特徴とする核酸分子に関する。
【００１９】  この目的のためのペスチウイルスは、好ましくは、ＣＳＦＶ、ＢＤＶおよびＢＶＤＶよりなる群から選ばれ、ＣＳＦＶが特に好ましい。
【００２０】  本発明の好ましい核酸分子は、該融合タンパク質の第１ポリペプチドがＣＳＦＶの自己プロテアーゼＮｐｒｏのアミノ酸配列：
【００２１】
【化２】
0005480458.tif 000002
または自己タンパク質分解活性を有するその誘導体のアミノ酸配列を含むものである（ＥＭＢＯデータベースアクセッション番号Ｘ８７９３９も参照されたい）（Ｎ末端からＣ末端への方向に読み取った場合にアミノ酸１−１６８）。
【００２２】  ペスチウイルスの自己プロテアーゼＮｐｒｏの自己タンパク質分解活性を有する誘導体は、突然変異誘発、特にアミノ酸の置換、欠失、付加および／またはアミノ酸の挿入により得られた自己プロテアーゼＮｐｒｏである。ただし、これは、特に、均一のＮ末端を有する所望のタンパク質の生成に要求される自己タンパク質分解活性が保有されている場合に限られる。そのような誘導体を得るための方法は当業者によく知られている。自己プロテアーゼＮｐｒｏの活性を、例えば、切断される種々の異種タンパク質に関して最適化することは、そのような突然変異により可能である。天然に存在する自己プロテアーゼＮｐｒｏと比較して１以上の突然変異を示す自己プロテアーゼＮｐｒｏ誘導体を所望の異種タンパク質の他に含む融合タンパク質をコードする核酸の製造後、該自己タンパク質分解活性を発現系内で測定することにより、その要求される機能が存在するか否かを確認する。
【００２３】  該自己タンパク質分解活性は、例えば、最初はインビトロ系により検出することができる。この目的には、該ＤＮＡ構築物をＲＮＡに転写し、インビトロ翻訳キットによりタンパク質に翻訳する。場合によっては、該感度を増加させるために、得られたタンパク質を放射性アミノ酸の取込みにより標識する。得られたＮｐｒｏ‐標的タンパク質融合タンパク質は翻訳時および／または翻訳後自己触媒切断を受け、Ｎ末端Ｎｐｒｏ部分が、その自己タンパク質分解活性により、後続の標的タンパク質から正しく切断される。得られた切断産物は容易に検出することができ、該混合物をインビトロ翻訳反応の完了直後に後処理することができる。ついで該混合物をタンパク質ゲル（例えばＬａｍｍｌｉ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上にローディングし、電気泳動に付す。ついで該ゲルを適当な色素で染色し、またはオートラジオグラフィーに付す。後続の免疫染色を伴うウエスタンブロットも可能である。該融合タンパク質の切断効率は、得られたタンパク質のバンドの強度に基づいて評価することができる。
【００２４】  もう１つの工程においては、該融合タンパク質用の核酸断片を細菌発現ベクター内にクローニングし（インビトロ翻訳に関してこれが未だ生じていない場合）、後者を適当な宿主（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））内に形質転換することができる。得られた発現株は、構成的に又は誘導物質の添加後に該融合タンパク質を発現する。後者の場合、十分な力価の該産物を得るために、該誘導物質の添加後に更に１時間以上培養する必要がある。ついで、得られる切断断片が、該Ｎｐｒｏ自己プロテアーゼ自体、および定められたＮ末端を有する標的タンパク質となるよう、該Ｎｐｒｏ自己プロテアーゼが、翻訳時または翻訳後、発現された融合タンパク質から自己を切断する。この切断反応の効率を評価するために、培養または誘導期の終了後、サンプルを採取し、前記のとおりにＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。
【００２５】  前記融合タンパク質の好ましい自己Ｎｐｒｏプロテアーゼ誘導体は、例えば、アミノ酸２−２１の領域内の１以上のアミノ酸が欠失し又は置換されたＮ末端領域を有する。ただし、これは、得られた誘導体が、自己プロテアーゼＮｐｒｏの自己タンパク質分解機能を望ましい程度で示し続けている場合に限られる。本発明の場合、該融合タンパク質において好ましい自己プロテアーゼＮｐｒｏ誘導体は、例えば、アミノ酸２−１６または２−２１の欠失を有するＣＳＦＶの自己プロテアーゼＮｐｒｏのアミノ酸配列を含む。また、例えば、精製を補助するアミノ酸配列を導入するために、アミノ酸配列を交換または導入することがアミノ酸の置換または付加により可能である（実施例を参照されたい）。
【００２６】  本発明の特に好ましい核酸分子は、該第１ポリペプチドがＣＳＦＶの自己プロテアーゼＮｐｒｏのアミノ酸配列Ｇｌｕ２２−Ｃｙｓ１６８または自己タンパク質分解活性を有するその誘導体を含み、該第１ポリペプチドが更にＭｅｔをＮ末端として有し、該異種ポリペプチドがＣＳＦＶの自己プロテアーゼＮｐｒｏのアミノ酸Ｃｙｓ１６８に直接結合しているものである。
【００２７】  本発明の同様に好ましい核酸分子は、該第１ポリペプチドがＣＳＦＶの自己プロテアーゼＮｐｒｏのアミノ酸配列Ｐｒｏ１７−Ｃｙｓ１６８または自己タンパク質分解活性を有するその誘導体を含み、該第１ポリペプチドが更にＭｅｔをＮ末端として有し、該異種ポリペプチドがＣＳＦＶの自己プロテアーゼＮｐｒｏのアミノ酸Ｃｙｓ１６８に直接結合しているものである。
【００２８】  本発明の核酸分子は、特に、ＤＮＡ分子の形態である。
【００２９】  本発明は更に、本発明の核酸分子を含んでなるクローニング要素、特に発現ベクターおよび宿主細胞に関する。したがって、本発明は更に、本発明の核酸分子と少なくとも１つの発現制御配列とを含んでなる、所定の宿主細胞に和合性の発現ベクターに関する。発現制御配列としては、特に、プロモーター（例えば、ｌａｃ、ｔａｃ、Ｔ３、Ｔ７、ｔｒｐ、ｇａｃ、ｖｈｂ、ラムダｐＬまたはｐｈｏＡ）、リボソーム結合部位（例えば、前記プロモーターに属する天然リボソーム結合部位、ｃｒｏ、または合成リボソーム結合部位）、または転写ターミネー夕ー（例えば、ｒｒｎＢ  Ｔ１Ｔ２またはｂｌａ）が挙げられる。前記宿主細胞は、好ましくは、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の細菌細胞、特に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。しかし、他の細菌細胞を使用することも可能である（後記を参照されたい）。好ましい実施形態においては、本発明の発現ベクターはプラスミドである。
【００３０】  本発明は更に、本発明の発現ベクターを含んでなる細菌宿主細胞に関する。そのような細菌宿主細胞は、例えば、以下の微生物の群から選ばれうる：グラム陰性菌、例えばエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、または他のグラム陰性菌、例えばシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、例えばシュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、またはカウロバクター（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ）種、例えばカウロバクター・クレセンツス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、あるいはグラム陽性菌、例えばバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、特にバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）。宿主細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が特に好ましい。
【００３１】  本発明は更に、所望の異種ポリペプチドの製造方法であって、
（ｉ）本発明の核酸分子を含む本発明の発現ベクターを含む本発明の細菌宿主細胞を培養すること、該培養は、該融合タンパク質の発現と、更には該第１ポリペプチドの自己タンパク質分解活性による該宿主細胞内での該融合タンパク質からの該異種ポリペプチドの自己タンパク質分解切断とを引き起こす条件下で行い、（ｉｉ）切断された異種ポリペプチドを単離することを含んでなる製造方法に関する。
【００３２】  本発明の方法は、原則として、自体公知の微生物学的慣例に従い、該細菌宿主細胞、すなわち該発現株を最初に培養することにより行う。該株は、一般には、単コロニーから成長させるが、凍結保存細胞懸濁液（細胞バンク）を使用することも可能である。更なる使用のための十分なバイオマスを得るために、一般には、該株を多段階方法で培養する。
【００３３】  小規模の場合には、これを振とうフラスコ内で行い、ほとんどの場合には、複合培地（例えばＬＢブロス）を使用することが可能である。しかし、規定培地（例えばクエン酸培地）を使用することも可能である。該培養には、該宿主株（単コロニーまたは凍結培養由来の細胞懸濁液で接種したもの）の小容積の予備培養を行う。この培養の温度は、一般には、後続の発現結果に対して決定的なものではなく、通常は、比較的高い温度（例えば３０℃または３７℃）で実施することが可能である。主培養は、大容積（例えば５００ｍｌ）で準備し、この場合、良好な通気（内容物の容積と比較して大きな容積のフラスコ、高速の回転）を確保することが特に必要である。発現は可溶性形態で生じると意図されるため、該主培養は、ほとんどの場合、それよりいくらか低い温度（例えば２２または２８℃）で行うことも可能である。誘導系（例えば、ｔｒｐ、ｌａｃ、ｔａｃまたはｐｈｏＡプロモーターによるもの）および構成系の両方が、可溶性タンパク質の製造に適している。後期対数期（通常は振とうフラスコ内で０．５〜１．０の光学密度）に達した後、誘導系では誘導物質（例えばインドールアクリル酸、イソプロピルβ‐Ｄ‐チオガラクトピラノシド＝ＩＰＴＧ）を加え、インキュベーションを１〜５時間継続する。この場合、厳密な発現を可能にするために、該誘導物質の濃度は下限に選択される傾向にあるであろう。この時間中に、該Ｎｐｒｏ−標的タンパク質融合タンパク質のほとんどが生成し、それらの２つの切断部分が該培養の終了後に別々に存在するように該Ｎｐｒｏ部分の翻訳時または翻訳後切断が生じる。得られた細胞を集め、更に加工することができる。
【００３４】  大規模の場合には、該多段階系は、複数のバイオリアクター（発酵槽）よりなり、この場合には、該方法のプロセス工学制御を改善するために、規定栄養培地を使用することが好ましい。また、特に栄養を計量供給することにより（フェド・バッチ）、著しくバイオマスおよび産物の生成を増加させることが可能である。その他の点では、該方法は該振とうフラスコの場合と同様である。例えば、予備段階の発酵槽および主段階の発酵槽を使用し、該培養温度は該振とうフラスコの場合と同様に選択する。該予備段階の発酵槽には、振とうフラスコ内の凍結培養または単コピーから一般に増殖させたいわゆる接種物を接種する。該発酵槽においては及び特にその主段階においては、良好な通気および十分な誘導物質濃度も確保されなければならない。しかし、いくつかの場合には、該誘導期を、該振とうフラスコの場合より著しく長く行わなければならない。得られた細胞をもう一度、更なる加工に付す。
【００３５】  ついで、該融合タンパク質から切断された異種標的タンパク質を、当業者に公知のタンパク質精製方法により単離することができる（例えば、Ｍ．Ｐ．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，（１９９０），３０９−３９２）を参照されたい）。一連の精製は、一般には、細胞破壊工程、清澄化工程（遠心分離または精密濾過）および種々のクロマトグラフィー工程、濾過および沈殿を含む。
【００３６】  以下の実施例は本発明を例示するものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【００３７】 実施例
実施例１：細菌宿主内でのＮｐｒｏ−Ｃ融合タンパク質の発現およびインビボ切断
細菌宿主内でのＮｐｒｏ−Ｃ融合タンパク質の発現のために、ＮＰＣ−ｐＥＴを構築する。使用する発現ベクターはｐＥＴ１１ａ（Ｆ．Ｗ．Ｓｔｕｄｉｅｒら，Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５（１９９０），６０−８９）である。該Ｎｐｒｏ−Ｃ融合タンパク質用の天然構造遺伝子（ＣＳＦＶ  ＲＮＡゲノム由来のもの）をこの発現ベクター内にクローニングする。この融合タンパク質用の構造遺伝子は、ｃＤＮＡに転写され（ベクター内にクローニングされ）たウイルスゲノムからＰＣＲ増幅により得られる。さらに、該天然Ｎｐｒｏ−配列の最初の１６アミノ酸（ＭＥＬＮＨＦＥＬＬＹＫＴＳＫＱＫ）を１０アミノ酸長のオリゴーヒスチジン精製補助体（ＭＡＳＨＨＨＨＨＨＨ）により置換する。得られた構築物はＮＰＣ−ｐＥＴと称される。該ＮＰＣ−ｐＥＴ上にコードされる該Ｎｐｒｏ−部分の配列および該Ｎｐｒｏ−Ｃ融合タンパク質の自己タンパク質切断部位は以下の構造を有し、該切断部位は、アミノ酸Ｃｙｓ１６８とＳｅｒ（１６９）との間に位置する：
【００３８】
【化３】
0005480458.tif 000003
【００３９】  該配列において、該天然Ｎｐｒｏ配列のプロリン１７（該融合タンパク質の２位）は斜字体で示されており、該Ｃ配列の出発部分は太字で示されている。該融合タンパク質は約３２ｋｄのＭｒを有し、該Ｎｐｒｏ部分が１８ｋｄを占め、該Ｃ部分が１４ｋｄを占める（自己タンパク質切断後）。
【００４０】  該切断部位の最初のアミノ酸Ｃ末端の重要性を評価するために、それにおいて天然に存在するセリン１６９を、標的化突然変異誘発により、１９個の他の天然に存在するアミノ酸により置換する。それにより得られた構築物はＮＰＣ−ｐＥＴ−Ａｌａ、ＮＰＣ−ｐＥＴ−Ｇｌｙなどと称される。これらのプラスミドを使用して、該発現株を得る。
【００４１】  大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）を、該Ｎｐｒｏ−Ｃ融合タンパク質の発現のための大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）宿主株として使用する。この株は以下の表現型を有する：
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＦ−  ｄｃｍ  ｏｍｐＴ  ｈｓｄＳ（ｒｂ−ｍｂ−）ｇａｌλ（ＤＥ３）。
【００４２】  該株は、コンピテント細胞の形態でＳｔｒａｔａｇｅｎｅから商業的に入手可能である。それは、ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下でＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの遺伝子を含むゲノム内に溶原性ラムダファージを保持する。したがって、該Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの産生およびそれに続く該標的タンパク質の産生は、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により誘導されうる。この２段階の系は、多数の標的タンパク質の、非常に高い特異的で完全な発現レベルの達成を可能にする。
【００４３】  発現株ＢＬ２１（ＤＥ３）［ＭＰＣ−ｐＥＴ］、ＢＬ２１（ＤＥ３）［ＭＰＣ−ｐＥＴ−Ａｌａ］などは、それぞれの発現プラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）内に形質転換することにより得る。該形質転換は、該コンピテント細胞の製造業者（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅまたはＮｏｖａｇｅｎ）の説明書に従い行う。該形質転換混合物を、１００ｍｇ／Ｌ  アンピシリンと共にルリア寒天プレート上にプレーティングする。この形質転換は、３７℃でのインキュベーション（一晩）後、それぞれの場合に多数のクローンを与える。
【００４４】  明瞭な縁を有する中等度のサイズのコロニーを拾う。それは適当な発現株の基礎となる。該クローンを培養し、凍結アンプル内で−８０℃で保存する（マスター細胞バンクＭＣＢ）。日常的な使用のために、該株をルリア寒天プレート（アンピシリンを含有するもの）上にストリークする。
【００４５】  寒天プレート上で継代培養した単コロニーからの振とうフラスコ内の予備培養をインキュベートするために、個々の株を使用する。該予備培養のアリコートを使用して、主培養（振とうフラスコ内の１０〜２００ｍｌ）に接種し、該ＯＤ６００が０．５〜１．０になるまでそれをリンスする。ついで該融合タンパク質の産生を１．０ｍＭ  ＩＰＴＧ（最終濃度）で誘導する。該培養物を更に２〜４時間培養すると、約１．０〜２．０のＯＤ６００に達する。該培養温度は３０℃＋／−２℃であり、使用する培地はＬＢ培地＋２ｇ／Ｌ  グルコース＋１００ｍｇ／Ｌ  アンピシリンである。
【００４６】  誘導前および種々の誘導後時点において、サンプルを該培養から採取し、遠心分離し、該ペレットを変性サンプルバッファー中で煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブルー染色またはウエスタンブロットにより分析する。該サンプルは標準的条件下で採取し、該培養の密度の相違を、再懸濁に使用するサンプルローディングバッファーの容積により埋め合わせる。
【００４７】  誘導後に出現するバンドは、２０ｋｄの少し上（Ｎｐｒｏ）および約１４ｋｄ（Ｃ）に位置する。各構築物での該融合タンパク質の切断効率を、クーマシー染色ゲル内およびウエスタンブロット内のバンドの強度に基づき評価する。これより、ほとんどのアミノ酸が該切断部位の直ぐＣ末端（すなわち、該標的タンパク質のＮ末端）に認められること、すなわち、非常に効率的な自己タンパク質分解切断が生じることが判明している。
【００４８】  これらのデータは、原則として、細菌宿主細胞内での組換え融合タンパク質の特異的切断のために自己プロテアーゼＮｐｒｏの自己タンパク質分解活性を成功裏のうちに用いることが可能であることを示している。
【００４９】 実施例２：Ｎｐｒｏとヒトインターロイキン６（ｈＩＬ６）との融合タンパク質の発現およびインビボ切断による均一な成熟ｈＩＬ６の製造
Ｎｐｒｏ−ｈＩＬ６融合タンパク質の発現のために、プラスミドＮＰ６−ｐＥＴを構築する。ｐＥＴ１１ａ（Ｆ．Ｗ．Ｓｔｕｄｉｅｒら，Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５（１９９０），６０−８９）を発現ベクターとして使用する。まず、ＮｐｒｏとＣＳＦＶヌクレオカプシドタンパク質とよりなる融合タンパク質を、この発現ベクター内にクローニングする（実施例１を参照されたい）。この融合タンパク質の構造遺伝子はＰＣＲにより得られる。これにより、天然Ｎｐｒｏ配列の最初の１６アミノ酸（ＭＥＬＮＨＦＥＬＬＹＫＴＳＫＱＫ）が１０アミノ酸長のオリゴ−ヒスチジン精製補助体（ＭＡＳＨＨＨＨＨＨＨ）により置換される。
【００５０】  得られた発現プラスミド内のＮｐｒｏとヌクレオカプシドタンパク質との間の結合部に、標的化突然変異誘発により、ＳｐｅＩ切断部位を導入する。これは、５’末端（該タンパク質のＮ末端に対応する）におけるＳｐｅＩでの及び３’末端（該タンパク質のＣ末端に対応する）におけるＸｈｏＩでの制限酵素処理による該ベクターからの該ヌクレオカプシドタンパク質の構造遺伝子の欠失を可能にする。対応する線状化Ｎｐｒｏ−ｐＥＴ１１ａベクターを、分取ゲル電気泳動により該ヌクレオカプシド遺伝子断片から取り出す。ついで、「付着」ＳｐｅＩおよびＸｈｏＩ末端を介してｈＩＬ６構造遺伝子を導入することが可能である。
【００５１】  このためには以下の予備的研究が必要である。該構造遺伝子を、Ｃ１０−ＭＪ２細胞から得られうるｈＩＬ６  ｃＤＮＡクローンから高精度ＰＣＲ（例えば、Ｒｏｃｈｅ  ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓのＰｗｏ系；手順は該製造業者により記載されているとおり）により増幅する。この目的には、以下のオリゴヌクレオチドを使用する：
【００５２】
【化４】
0005480458.tif 000004
【００５３】  ＳｐｅＩ切断部位を５’末端に、ＸｈｏＩ切断部位を３’末端に、使用するオリゴヌクレオチドを介して導入する。また、翻訳の効率的な終結のために、二重ｏｃｈｒｅ終結コドン（ＴＡＡＴＡＡ）を該構造遺伝子の３’末端に導入する。前端のＳｐｅＩ切断部位は、前記のＮｐｒｏ−ｐＥＴ１１ａベクターとリーディングフレームが合った連結を可能にする。後端のＸｈｏＩ切断部位は定方向のクローニングを可能にする。
【００５４】  ｈＩＬ６の構造遺伝子を有するＰＣＲ断片（５９３ｂｐ）の配列を以下に示す（Ｎ末端からＣ末端への方向に読まれる）。該制限切断部位は下線で示されており、ｈＩＬ６の最初のコドン（Ａｌａ）および終結コドンは太字で示されている。
【００５５】
【化５】
0005480458.tif 000005
【００５６】  Ｎｐｒｏ−ｐＥＴ１１ａプラスミドとの連結により得られた構築物はＮＰ６−ｐＥＴと称される。
【００５７】  ＮＰ６−ｐＥＴ上にコードされるＮｐｒｏ−ｈＩＬ６融合タンパク質（これは３４７アミノ酸を有し、そのうちの１６２アミノ酸はＮｐｒｏ部分に、１８５アミノ酸はｈＩＬ６部分に対応する）の配列を以下に示す。該ｈＩＬ６配列は太字で示されている。
【００５８】
【化６】
0005480458.tif 000006
【００５９】  該融合タンパク質は還元状態では３９，３０３．７６ｄのＭｒを有し、可能な切断の後では、Ｎｐｒｏ部分（還元型）は１８，３３８．３４ｄのＭｒを、ｈＩＬ６部分（還元型）は２０，９８３．６３ｄを有するであろう。Ｎｐｒｏは６個のシステインを有し、ｈＩＬ６は４個のシステインを有する。これらのシステインの大部分は細菌細胞質内では還元型であると考えられる。後続のプロセシング中に、おそらく、ジスルフィド架橋の少なくとも部分的な形成が生じるのであろう。該融合タンパク質内（またはＮｐｒｏ部分内）のＮ末端メチオニンは、主として、該宿主に固有のメチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）により切断され、それは各場合においてＭｒを約１３１減少させて３９，１７２．７６ｄ（融合タンパク質）および１８，２０７．１３ｄ（Ｎｐｒｏ）にすると予想されるに違いない。
【００６０】  Ｎｐｒｏ−ｈＩＬ６融合タンパク質を発現させるための大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ）宿主株は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）である（実施例１を参照されたい）。
【００６１】  発現株ＢＬ２１（ＤＥ３）［ＭＰ６−ＥＴ］は、実施例１に記載のとおりに、前記の発現プラスミドＭＰ６−ｐＥＴをＢＬ２１（ＤＥ３）内に形質転換することにより得る。
【００６２】  株ＢＬ２１（ＤＥ３）［ＭＰ６−ｐＥＴ］を寒天プレート上の単コロニーから継代培養し、ついでこれを使用してルリアブロス＋１００ｍｇ／Ｌ  アンピシリン（１Ｌのバッフルフラスコ内の２００ｍｌ）内の予備培養に接種する。該予備培養を２５０ｒｐｍ、３０℃で１４時間振とうすると、この間に約１．０のＯＤ６００に達する。ついで予備培養の１０ｍｌ部分を使用して該主培養（それぞれ１Ｌのバッフルフラスコ内の３３０ｍｌのルリアブロス）（３％  接種物）に接種する。該ＯＤ６００が０．８に増加するまで該主培養を３０℃（２５０ｒｐｍ）で行い、ついで核融合タンパク質の産生を０．５または１．０ｍＭ  ＩＰＴＧ（最終濃度）で誘導する。該培養物を更に、３０℃、２５０ｒｐｍで３時間培養すると、該ＯＤ６００は約１．０〜２．０に達する。
【００６３】  該培養物を無菌５００ｍｌ遠心ボトルに移し、１０，０００ｇで３０分間遠心分離する。該遠心分離上清を完全に廃棄し、該ペレットを更なる加工まで−８０℃で凍結する。
【００６４】  その完全なライセートにおける新たなタンパク質バンドの出現は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のクーマシー染色により容易に検出することができる。約１９ｋｄ、２１ｋｄおよび４０ｋｄの見掛け分子量を有するバンドが、ＢＬ２１（ＤＥ３）［ＭＰ６−ｐＥＴ］のライセートにおいて出現する。特異的抗ｈＩＬ６抗体を使用するこの発現の分析は、クーマシー染色後に得られた結果を実質的に証明している。
【００６５】  該Ｎｐｒｏ−ｈＩＬ６切断を最適化するために、誘導を種々の温度およびＩＰＴＧ濃度で行い、染色ゲルおよびウエスタンブロットの両方において再分析する。Ｎｐｒｏ−ｈＩＬ６のほぼ完全な切断は、２２℃の培養温度で認められる。
【００６６】  この実験は、異種タンパク質も細菌発現系内でＮｐｒｏのＣ末端に融合されうること、および非常に効率的な切断が生じることを示している。また、後続のタンパク質のＮ末端アミノ酸の変化（セリンの代わりにアラニン）は悪影響を及ぼさない。したがって、この系は、本発明において、更なる加工工程を伴わない均一な真正なＮ末端を有する組換えタンパク質の製造（特に、細菌発現系などの異種発現系におけるもの）に適している。
【００６７】 実施例３：Ｎｐｒｏとヒトインターフェロンα２Ｂ（ＩＦＮα２Ｂ）とから構成される融合タンパク質の発現およびインビボ切断による均一な成熟ＩＦＮα２Ｂの製造
ベクターＮＰＩ−ｐＥＴを得るためのＩＦＮα２Ｂのクローニング方法は、実施例２にｈＩＬ６に関して記載されている方法に対応している。該構造遺伝子を、高精度ＰＣＲ（例えば、Ｒｏｃｈｅ  ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓのＰｗｏ系；手順は該製造業者により記載されているとおり）により増幅する。使用する鋳型は、当業者に公知の標準的な方法によりヒト白血球から得たＩＦＮα２Ｂ−ｃＤＮＡクローンである。また、もう１つの可能性は、該遺伝子の完全な合成を行うことである。該構造遺伝子の配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースを介してアクセッション番号Ｖ００５４８で電子形態で入手可能である。以下のオリゴヌクレオチドを該増幅に使用する：
【００６８】
【化７】
0005480458.tif 000007
【００６９】  ＩＦＮα２Ｂの構造遺伝子を有するＰＣＲ断片（５３３ｂｐ）の配列を以下に示す。制限切断部位は下線で示されており、ＩＦＮα２Ｂの最初のコドン（Ｃｙｓ）および終結コドンは太字で示されている。
【００７０】
【化８】
0005480458.tif 000008
【００７１】  Ｎｐｒｏ−ｐＥＴ１１ａプラスミドへの連結により得られる構築物はＮＰＩ−ｐＥＴと称される。
【００７２】  ＮＰＩ−ｐＥＴ上にコードされるＮｐｒｏ−ＩＦＮα２Ｂ融合タンパク質（これは３２７アミノ酸を有し、そのうちの１６２アミノ酸はＮｐｒｏに対応し、１６５アミノ酸はＩＦＮα２Ｂに対応する）の配列を以下に示す（Ｎ末端からＣ末端への方向に示されている）。ＩＦＮα２Ｂ配列は太字で示されている。
【００７３】
【化９】
0005480458.tif 000009
【００７４】  核融合タンパク質は還元状態では３７，５９１．４４ｄのＭｒを有し、可能な切断の後では、Ｎｐｒｏ部分（還元型）は１８，３３８．３４ｄのＭｒを、ＩＦＮα２Ｂ部分（還元型）は１９，２７１．０９ｄを有するであろう。Ｎｐｒｏは６個のシステインを有し、ＩＦＮα２Ｂは４個のシステインを有する。これらのシステインの大部分は細菌細胞質内では還元型であると考えられる。後続のプロセシング中に、おそらく、ジスルフィド架橋の少なくとも部分的な形成が生じるのであろう。該融合タンパク質内（またはＮｐｒｏ部分内）のＮ末端メチオニンは、主として、該宿主に固有のメチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）により切断され、それは各場合においてＭｒを約１３１減少させて３７，４６０．２３ｄ（融合タンパク質）および１８，２０７．１３ｄ（Ｎｐｒｏ）にすると予想されるに違いない。
【００７５】  Ｎｐｒｏ−ＩＦＮα２Ｂ融合タンパク質を発現させるための大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ）宿主株は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）である（実施例１を参照されたい）。
【００７６】  発現株ＢＬ２１（ＤＥ３）［ＮＰＩ−ｐＥＴ］は、実施例１に記載のとおりに、前記の発現プラスミドＮＰＩ−ｐＥＴをＢＬ２１（ＤＥ３）内に形質転換することにより得る。
【００７７】  株ＢＬ２１（ＤＥ３）［ＮＰＩ−ｐＥＴ］を寒天プレート上の単コロニーから継代培養し、これを使用してルリアブロス＋１００ｍｇ／Ｌ  アンピシリン（１Ｌのバッフルフラスコ内の２００ｍｌ）内の予備培養に接種する。該予備培養を２５０ｒｐｍ、３０℃で１４時間振とうすると、この間に約１．０のＯＤ６００に達する。ついで予備培養の１０ｍｌ部分を使用して該主培養（それぞれ１Ｌのバッフルフラスコ内の３３０ｍｌのルリアブロス）（３％  接種物）に接種する。該ＯＤ６００が０．８に増加するまで該主培養を３０℃（２５０ｒｐｍ）で行い、ついで該融合タンパク質の産生を０．５または１．０ｍＭ  ＩＰＴＧ（最終濃度）で誘導する。該培養物を更に、３０℃、２５０ｒｐｍで３時間培養すると、その間に該ＯＤ６００は約１．０〜２．０に達する。
【００７８】  該培養物を無菌５００ｍｌ遠心ボトルに移し、１０，０００ｇで３０分間遠心分離する。該遠心分離上清を完全に廃棄し、該ペレットを更なる加工まで−８０℃で凍結する。
【００７９】  その完全なライセートにおける新たなタンパク質バンドの出現は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のクーマシー染色により容易に検出することができる。約３８ｋｄおよび約１９ｋｄの分子量が、ＢＬ２１（ＤＥ３）［ＭＰ６−ｐＥＴ］のライセートにおいて出現する。該ＩＦＮα２Ｂバンドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは該Ｎｐｒｏバンドから分離することができない。
【００８０】  特異的抗ＩＦＮα２Ｂ抗体を使用するこれらのサンプルの分析は、切断されたＩＦＮα２Ｂのバンドの存在を証明している。
【００８１】  この場合においても、該Ｎｐｒｏ−ＩＦＮα２Ｂ切断を最適化するために、誘導を種々の温度およびＩＰＴＧ濃度で行い、染色ゲルおよびウエスタンブロットの両方において再分析する。この場合においても、低下した温度（２２〜３０℃）で、最適な切断が生じることが判明している。