(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
身体内のある箇所に、骨形成タンパク質の液体製剤として送達するのに使用される等張性液状組成物において、０．１〜０．２ｍｇ／ｍＬのＧＤＦ−５タンパク質と４．２〜５．３のｐＨを有する、５〜１０ｍMの酢酸緩衝液とを含み、前記組成物が、トレハロース、スクロース、ラフィノース、グルコース、マンニトール、ＴＭＡＯ、ＴＥＡ−ＨＣｌ、タウリン、β−アラニン、ベタイン、エクトイン、ＨＯ−エクトイン、ＧＡＢＡ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１種以上の賦形剤を更に含む、組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物において、前記賦形剤がトレハロースである、組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の組成物において、前記賦形剤がスクロースである、組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の組成物において、ＴＭＡＯ、ＴＥＡ−ＨＣｌ、タウリン、β−アラニン、ベタイン、エクトイン、ＨＯ−エクトイン、ＧＡＢＡ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される賦形剤を更に含む、組成物。
【請求項５】
請求項１または４に記載の組成物において、前記組成物中の前記賦形剤の全量が０．０１〜０．５重量％である、組成物。
【請求項６】
身体内のある箇所に、骨形成タンパク質の液体製剤として送達するのに使用されるＧＤＦ−５タンパク質の等張溶液を安定化する方法において、当該溶液が、
ａ．０．１〜０．２ｍｇ／ｍＬのＧＤＦ−５タンパク質のサンプルを提供する工程と、
ｂ．４．２〜５．３のｐＨを有する、５〜１０ｍMの緩衝酢酸溶液を添加し、それによりＧＤＦ−５の安定化溶液を提供する工程と、
を含み、
前記方法が、トレハロース、スクロース、ラフィノース、グルコース、マンニトール、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１種以上の賦形剤を添加する工程を更に含む、
方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法において、前記賦形剤がトレハロースである、方法。
【請求項８】
請求項６に記載の方法において、前記賦形剤がスクロースである、方法。
【請求項９】
請求項６に記載の方法において、ＴＭＡＯ、ＴＥＡ−ＨＣｌ、タウリン、β−アラニン、ベタイン、エクトイン、ＨＯ−エクトイン、ＧＡＢＡ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１種以上の賦形剤を添加する工程を更に含む、方法。
【請求項１０】
請求項６または８に記載の方法において、前記溶液中の前記賦形剤の全量が０．０１〜０．５重量％の量存在する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、米国特許仮出願第６１／０４４，５１８号の非暫定出願である。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、安定性、操作性、及び保存性を改善するための骨形成タンパク質の液体製剤に関する。より具体的には、本発明は、体温での操作中及び送達中のタンパク質安定性が改善された、ｐＨが約４．０〜約５．５の生物学的等張酸性溶液中にＧＤＦ−５を含む液体製剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＧＤＦ−５は、タンパク質のＴＧＦ−βスーパーファミリーのサブクラスである、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）のメンバーである。ＧＤＦ−５は、Ｌｅｅ（米国特許第５，８０１，０１４号）により、最初にマウスから単離されたｍＧＤＦ−５を含む、数種の変異体及び突然変異体を含む。他の変異体としては、ｈＧＤＦ−５、及びＬＡＰ−４としても知られている（Ｔｒｉａｎｔｆｉｌｏｕ，ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２，３３８〜３４５（２００１））、ＧＤＦ−５のヒト型の特許名（国際公開第９５／０４８１９号）であるＭＰ５２；また、ｈＧＤＦ−５の対立遺伝子タンパク質変異体である、ＣＤＭＰ−１（国際公開第９６／１４３３５号）；また、細菌で製造される組換えヒト型である、ｒｈＧＤＦ−５（欧州特許第０９５５３１３号）；また、ｒｈＧＤＦ−５の単量体変異体である、ｒｈＧＤＦ−５−Ａｌａ８３；また、ｈＧＤＦ−５／ＣＤＭＰ−１様タンパク質の総称である、ＢＭＰ−１４；また、世界保健機関により指定された国際非専売名であるＲａｄｏｔｅｒｍｉｎ；また、ＭＰ５２の高分子量タンパク質変異体である、ＨＭＷ  ＭＰ５２；また、分子間架橋に関与するシステイン残基がアラニンで置換されている単量体バージョンである、Ｃ４６５Ａ；また、Ｎ４４５Ｔ、Ｌ４４１Ｐ、Ｒ４３８Ｌ、及びＲ４３８Ｋを含む、他の活性モノマー及び単一アミノ酸置換突然変異体が挙げられる。本出願の目的に関して、用語「ＧＤＦ−５」は、ＧＤＦ−５タンパク質の全ての変異体及び突然変異体を含むことを意味し、ｒｈＧＤＦ−５は、１１９個のアミノ酸を有するその代表的なメンバーである。
【０００４】
ＢＭＰファミリーの全てのメンバーは、カルボキシ末端活性ドメインを含む共通構造特性を共有し、３つの分子内ジスルフィド結合と１つの分子間ジスルフィド結合を生じさせるシステイン残基の高度に保存されたパターンを共有する。活性型は、単一のファミリーメンバーのジスルフィド結合ホモ二量体、又は２種の異なるメンバーのヘテロ二量体のいずれであってもよい（Ｍａｓｓａｇｕｅ，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６：９５７（１９９０）；Ｓａｍｐａｔｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６５：１３１９８（１９９０）；Ｃｅｌｅｓｔｅ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  ８７：９８４３−４７（１９９０）；米国特許第５，０１１，６９１号、及び米国特許第５，２６６，６８３号参照）。ＧＤＦ−５タンパク質の適切な折り畳み、及びこれらのジスルフィド結合の形成は、生物学的機能に必須であり、誤った折り畳みがあると、不活性凝集体及び切断断片が生じる。
【０００５】
遺伝的に改変された細菌からのＢＭＰ産生、具体的にはＧＤＦ−５産生には、プラスミドベクターを利用して、大腸菌が高収率で単量体ＧＤＦ−５タンパク質を産生するように形質転換する（例えば、米国特許第６，７６４，９９４号（Ｈｏｔｔｅｎ）及び米国特許第７，２３５，５２７号（Ｍａｋｉｓｈｉｍａ）参照）。この単量体は封入体から得られ、これを精製、及びＧＤＦ−５タンパク質のホモ二量体に再折り畳みして、生物学的活性を有するＧＤＦ−５タンパク質の二量体を生成する。これに至る工程では、ＧＤＦ−５タンパク質の分離及び精製を可能にするために、製薬上受容されない種々の物質を利用して溶解度を調節する。
【０００６】
一般にタンパク質の分解については数多くの文献に記述されているが、骨形成タンパク質、特にＧＤＦ−５の保存性及び溶解度についてはあまり記述されていない。ＢＭＰ−２は、ｐＨが６未満のとき１ｍｇ／ｍＬを上回る濃度で容易に溶解でき、ｐＨが６を上回る場合は、１ＭＮａＣｌ、３０％イソプロパノール、又は０．１ｍＭヘパリンを加えることによって溶解度を高めることができる（Ｒｕｐｐｅｒｔ，ｅｔ  ａｌ  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２３７，２９５〜３０２（１９９６））。ＧＤＦ−５の溶解度はＢＭＰ−２の溶解度より遥かにより限定されており、ＧＤＦ−５は生理学的ｐＨ範囲及び緩衝液でほぼ不溶性である。ＧＤＦ−５は、極端なｐＨでのみ水に可溶性である（Ｈｏｎｄａ，ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ８９（６），５８２〜５８９（２０００））。ＧＤＦ−５は、約９．５〜１２．０のアルカリ性ｐＨで可溶性であるが、この条件下ではタンパク質が急速に分解するため、ＧＤＦ−５タンパク質の調製には酸性条件が使用される。
【０００７】
骨形成タンパク質の使用は、ＢＭＰ−２及び骨の成長の場合において数多く報告されている。ＧＤＦ−５は、筋骨格発達の他の分野において、実際細胞生化学及び細胞制御の他の分野においてＢＭＰ−２より活発に研究されている。これら他の分野におけるＧＤＦ−５の使用は、種々の疾患及び病状の潜在的治療法に格好の材料を提示する。保存、操作性、及び標的組織への送達に関する大きな課題は、ＧＤＦ−５タンパク質分子の安定性である。タンパク質を分解から保護するために、バルクＧＤＦ−５タンパク質は典型的には、氷点下の温度で保存され、凍結乾燥製品は２〜８℃で保存されるが、多くの用途で液体製剤が必要とされており、例えば、植え込み型薬物送達ポンプにおける液体製品の送達が挙げられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
過去に、我々は、６０％トレハロースのような多量の賦形剤を用いて、長期間体温でＧＤＦ−５タンパク質を保護できることを示した。しかしながら、これらの処方は等張ではなかったため、注入部位に達する前に希釈しなければならなかった。ＧＤＦ−５タンパク質の生体適合性製剤は、ＧＤＦ−５タンパク質に妥当な溶解度と同時に安定性を付与するという大きな問題を抱えている。したがって、ＧＤＦ−５タンパク質溶液を保存、操作、及び送達するための改善された製剤が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ＧＤＦ−５タンパク質分子に安定性を付与するための、体温において改善された保存性及び操作性特性を有する緩衝等張ＧＤＦ−５タンパク質溶液の製剤を目的とする。本発明の好ましい実施形態は、３７℃で３２日間保存した後のＧＤＦ−５タンパク質保持率が約９０％である、賦形剤として１０％トレハロースを含む、ｐＨ４．５〜５の５〜１０ｍＭ酢酸緩衝液中の０．１ｍｇ／ｍＬのｒｈＧＤＦ−５を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＨＰＬＣにより証明した、３７℃で３２日間保存した後の、ｐＨ４．５の５ｍＭ酢酸緩衝溶液中の０．１ｍｇ／ｍＬのｒｈＧＤＦ−５の安定性。
【図２】ＨＰＬＣにより証明した、１０％トレハロースを含む、ｐＨ４．５の５ｍＭ酢酸緩衝溶液中の０．１ｍｇ／ｍＬのｒｈＧＤＦ−５の安定性。
【図３】ＨＰＬＣにより証明した、３７℃で３２日間保存した後の、１０％トレハロース及び０．１％ＨＯ−エクトインを含む、ｐＨ４．５の５ｍＭ酢酸緩衝溶液中の０．１ｍｇ／ｍＬのｒｈＧＤＦ−５の安定性。
【図４】ＨＰＬＣにより証明した、３７℃で３２日間保存した後の、１０％トレハロース及び０．１％エクトインを含む、ｐＨ４．５の５ｍＭ酢酸緩衝溶液中の０．１ｍｇ／ｍＬのｒｈＧＤＦ−５の安定性。
【図５】ＨＰＬＣにより証明した、３７℃で３２日間保存した後の、１０％トレハロースを含む、ｐＨ５．０の５ｍＭ酢酸緩衝溶液中の０．１ｍｇ／ｍＬのｒｈＧＤＦ−５の安定性。
【図６】ＨＰＬＣにより証明した、３７℃で３２日間保存した後の、１０％トレハロース及び０．１％  ＧＡＢＡを含む、ｐＨ５．０の５ｍＭ酢酸緩衝溶液中の０．１ｍｇ／ｍＬのｒｈＧＤＦ−５の安定性。
【図７】ＨＰＬＣにより証明した、３７℃で３２日間保存した後の、１０％トレハロース、０．１％タウリン、及び０．０１％  ＴＥＡ−ＨＣｌを含む、ｐＨ５．０の５ｍＭ酢酸緩衝溶液中の０．１ｍｇ／ｍＬのｒｈＧＤＦ−５の安定性。
【図８】ＨＰＬＣにより証明した、３７℃で３２日間保存した後の、１０％トレハロース、０．１％ベタイン、及び０．１％エクトインを含む、ｐＨ５．０の５ｍＭ酢酸緩衝溶液中の０．１ｍｇ／ｍＬのｒｈＧＤＦ−５の安定性。
【図９】ＨＰＬＣにより証明した、３７℃で３２日間保存した後の、１０％トレハロースを含む、ｐＨ４．５の１０ｍＭ酢酸緩衝溶液中の０．１ｍｇ／ｍＬのｒｈＧＤＦ−５の安定性。
【図１０】ＨＰＬＣにより証明した、３７℃で３２日間保存した後の、０．０１％  ＴＥＡ−ＨＣｌ及び０．１％ベタインを含む、ｐＨ４．５の１０ｍＭ酢酸緩衝溶液中の０．１ｍｇ／ｍＬのｒｈＧＤＦ−５の安定性。
【図１１】９０％の主ピーク保持率により証明した、３７℃で３２日間保存した後の、１０％トレハロースを含む、ｐＨ５の１０ｍＭ酢酸緩衝溶液中の０．１ｍｇ／ｍＬのｒｈＧＤＦ−５の安定性を表すＨＰＬＣクロマトグラム。
【図１２】＜７０％の主ピーク保持率により証明した、３７℃で３２日間保存した後の、１０％トレハロースを含む、ｐＨ４．５の５ｍＭマレイン酸緩衝溶液中の０．１ｍｇ／ｍＬのｒｈＧＤＦ−５の分解を表すＨＰＬＣクロマトグラム。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本願の目的のために、請求する本発明の対象を明らかにかつ簡潔に示すために以下の用語の定義が有用である。本明細書で使用するとき、用語「増殖及び分化因子５」（本明細書では「ＧＤＦ−５」と称する）は、ＧＤＦ−５、ｍＧＤＦ−５、ｈＧＤＦ−５、ＭＰ−５２、ＬＡＰ−４、ラドテルミン、ＣＤＭＰ−１、Ｃ４６５Ａ、及びｒｈＧＤＦ−５（ｒｈＧＤＦ−５は、この群の代表的なメンバーである）が挙げられるが、これらに限定されない、ＧＤＦ−５タンパク質分子の同義語、異形、及び突然変異を全て含むと理解される。それはまた、生物学的に活性であることが示されている単量体ＧＤＦ−５タンパク質も含むと理解される。
【００１２】
用語「室温」は、本明細書において「ＲＴ」又は「Ｒ．Ｔ．」と略され、普通のオフィス又は実験室の周囲温度を意味するものと理解され、約１８〜２５℃である。本明細書で使用するとき、用語「体温」は、約３４〜約４０℃であり、ヒトでは約３７℃であると一般に認められている、哺乳類の平均体温を意味すると理解される。
【００１３】
本明細書で使用するとき、用語「バルク」は、「バルクタンパク質」又は「バルク溶液」として記述されるとき、約１〜約１０ｍＭ  ＨＣｌ中のＧＤＦ−５の精製溶液で、約−８０℃で保存されたものを意味すると理解され、用語「ストック」、「ストックタンパク質」、及び「ストック溶液」と同義である。
【００１４】
用語「緩衝剤」は名詞としては、液体に酸又は塩基を添加しても安定なｐＨを維持する能力を付与する酸及び共役塩基対であるという、文献中における一般的な意味を有すると理解され、動詞としての用語「緩衝する」は、緩衝剤の添加により溶液のｐＨを維持する作用を説明するものと理解される。代表的な緩衝共役塩基としては、酢酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、クエン酸塩、及びこれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されず、酢酸塩がこの群の代表的なメンバーである。
【００１５】
本明細書で使用するとき、用語「等張」、「等張性」、及び「生物学的等張性」は、文献中における一般的な意味を有し、ヒトの血漿と等しい浸透圧モル濃度である、又はそれを有する溶液を指し、約２９０ｍｏｓｍ／Ｌ±２０ｍｏｓｍ／Ｌの範囲である。
【００１６】
本明細書で使用するとき、用語「賦形剤」は、タンパク質組成物に添加される緩衝剤以外の任意の追加成分又は添加剤を意味すると理解される。代表的な賦形剤としては、トレハロース、スクロース、ラフィノース、グルコース、マンニトール、ＴＭＡＯ、ＴＥＡ−ＨＣｌ、タウリン、β−アラニン、ベタイン、エクトイン、ＨＯ−エクトイン、ＧＡＢＡ、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【００１７】
本明細書で使用するとき、用語「ＴＭＡＯ」は、トリメチルアミンオキシドを意味すると理解され、本明細書で使用するとき、用語「ＴＥＡ−ＨＣｌ」は、トリエチルアミンヒドロクロリドを意味すると理解され、本明細書で使用するとき、用語「ＧＡＢＡ」は、γ−アミノ酪酸を意味すると理解される。
【００１８】
本明細書で使用するとき、用語「張度調整剤」は、溶液を等張にする目的のために、タンパク質溶液に添加される溶質を意味すると理解される。溶質はまた、溶液の張度調節に加えて、他の化学的又は生物学的性質を有していてもよい。代表的な張度調整剤としては、ＮａＣｌ等の塩類、並びにトレハロース、スクロース、ラフィノース、グルコース、及びマンニトールが挙げられるがこれらに限定されない特定の炭水化物が挙げられる。これら張度調整剤は、賦形剤とも見なされ得ることに留意すべきであるが、全ての賦形剤が張度調整剤として有用である訳ではない。張度に影響を与えるために添加する必要がある幾つかの賦形剤の量は、他の望ましくない効果を生じさせるため、張度調整剤としての有用性が否定される。しかしながら、非常に少量である場合、これら他の賦形剤物質は、溶液の張度に実質的に影響を及ぼすことなく有用かつ所望の特性を付与する。
【００１９】
本明細書で使用するとき、用語「ＨＰＬＣ」は、高圧液体クロマトグラフィーの一般的な意味を有すると理解され、高性能液体クロマトグラフィーとしても知られ、また用語「逆相ＨＰＬＣ」又は「ｒｐ  ＨＰＬＣ」も含む。
【００２０】
ＧＤＦ−５の発見及びそれ以降の組換えヒト型の開発以来、ＧＤＦ−５は、ＧＤＦ−５タンパク質構造を保存するため、−８０℃において１０ｍＭ  ＨＣｌ溶媒系中に保存されてきた。ＧＤＦ−５は、ＢＭＰ−２などの他のＢＭＰよりも溶解度が低い（ＢＭＰ−２については数多くの科学文献によって対象とされている）。ＧＤＦ−５の溶解度及び安定性について入手できる報告はあるとしてもほんのわずかである。ＧＤＦ−５単量体タンパク質を調製及び単離し、次に、再折り畳みにより二量体にすることは、生理活性を有する二量体の操作及び保存とは異なる、一連の課題及び問題を提示する。生体適合性製剤において成熟した二量体ＧＤＦ−５タンパク質を取扱う際は、別の一連の問題が生じ、文献ではそのＧＤＦ−５二量体タンパク質の溶解度及び安定性に関する物理化学的情報はほとんど明らかにされていない。
【００２１】
筋骨格発達におけるＧＤＦ−５の活性の広域スペクトル及び種々の組織におけるＧＤＦ−５受容体の発現は、療法及び治療の有意義な機会を提示する。治療にＧＤＦ−５を用いることの主な欠点の１つは、タンパク質の脆弱性である。我々は、保存、操作、及び送達中のＧＤＦ−５タンパク質溶液の安定性を改善するために、多数の異なる緩衝剤系及び賦形剤の使用について研究し、このタンパク質と共に機能する有用な製剤を本明細書に記載する。
【００２２】
過去に我々は、６０％トレハロースのような多量の賦形剤を用いて、長期間体温でＧＤＦ−５タンパク質を保護することができることを示した。しかしながら、これら処方は等張ではなく、使用前に希釈を必要としていた。更に、これら溶液はかなり粘性が高く、操作性に潜在的に問題があった。
【００２３】
我々は、種々のＧＤＦ−５溶液について幾つかの研究を試みて、特に体温で、生物学的等張性及び安定性を有するＧＤＦ−５タンパク質溶液の保存性及び操作性を改善するための緩衝剤系及び賦形剤について調べた。ＧＤＦ−５タンパク質の安定性を逆相ＨＰＬＣ（本明細書では単に「ＨＰＬＣ」と称する）により決定し、主ピークの保持率をＧＤＦ−５タンパク質の安定性又は分解の指標として用いた。我々の過去の結果は、これがＧＤＦ−５タンパク質分子の安定性を測定する信頼できる方法であることを示しており、ＧＤＦ−５タンパク質の分解は、主ピークの減少、並びに酸化、脱アミド化、凝集、切断、及び断片化による異質ピークの出現により容易に観察される。これらの結果はまた、本実験でも確認された。
【００２４】
例えば、図１１は、３７℃で３２日間保存した後の、ｐＨ５．０の１０ｍＭ酢酸緩衝溶液中の０．１ｍｇ／ｍＬのｒｈＧＤＦ−５のＨＰＬＣクロマトグラムを示し、９０％の主ピーク保持率を示し、小さな追加ピークも存在する。対照的に、図１２は、３７℃で３２日間保存した後の、１０％トレハロースを含む、ｐＨ４．５の５ｍＭマレイン酸緩衝溶液中の０．１ｍｇ／ｍＬのｒｈＧＤＦ−５の分解を示し、わずか６６％の主ピーク保持率を示し、追加ピークが存在する。我々はまた、溶液の視覚的透明度に基づいて溶液を評価し、曇り又は濁り溶液はＧＤＦ−５タンパク質の低溶解度及び／又は凝集の証拠である。
【００２５】
多くの化合物が他のタンパク質製剤で有用であることが示されており、例えば、酢酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、リン酸塩、及び酒石酸塩の緩衝剤系、並びにトレハロース、マンニトール、スクロース、ラフィノース、トリメチルアミンオキシド、トリメチルアミンヒドロクロリド、トリエチルアミンヒドロクロリド、ベータ−アラニン、アラニン、グリシン、タウリン、ベタイン、エクトイン、ＨＯ−エクトイン、Ｌ−プロリン、アスパラギン酸カリウム、アスパラギン酸ナトリウム、熱ショックタンパク質、デキストラン、シクロデキストラン、グリシン、アルギニン、ＰＥＧ、プルロニック、脂質、リン脂質、ジアシルグリセロール、ビタミンＥ−酢酸塩、及びＰＥＧ−ビタミンＥコハク酸塩等の他の賦形剤が挙げられる。しかしながら、これら賦形剤とＧＤＦ−５を共に使用すること若しくはその効果を示す既知の証拠又は文献は存在しない。
【００２６】
我々の実験は、ＧＤＦ−５タンパク質分子の溶解度及び安定性を更に維持する目的で等張溶液を設計した。全ての実験に０．１ｍｇ／ｍＬのＧＤＦ−５タンパク質濃度を用いた。結果は、ｐＨ４．５の５ｍＭ酢酸緩衝溶液を用いて、３７℃で３２日間保存した後、約９０％というＧＤＦ−５タンパク質のＨＰＬＣ主ピーク保持率（安定性）を示す透明な液体を維持できることを示した（図１参照）。
【００２７】
他の賦形剤の添加は、研究した実験条件下でＧＤＦ−５タンパク質の安定性を高めない、又は低下させないが、これら追加賦形剤は、他の条件下で他の効果を与え得る。したがって、最高０．２％、又は場合により更に最高約０．５％のこれら他の賦形剤を添加することは、本研究条件下におけるタンパク質の安定性にほとんど影響を与えることはできないが、他の条件下においては、タンパク質の溶解度又は安定性を高めることができる。酢酸緩衝液のｐＨを５．０に上げても、ＧＤＦ−５タンパク質の安定性は低下しなかった（表２参照）。したがって、ｐＨ約４．２〜約５．３であり、１０％トレハロースを添加して張度を調整した５ｍＭの酢酸緩衝液と、０．１重量％のタウリン、ベタイン、ｂ−アラニン、ＴＭＡＯ、ＧＡＢＡ、エクトイン、ＨＯ−エクトイン、０．０１重量％のＴＭＡＯ又はＴＥＡ−ＨＣｌ、及びこれらの種々の組み合わせの１種以上の賦形剤との製剤は、３７℃で３２日間保存した後もＧＤＦ−５タンパク質を保護した（表１及び２、図１〜８参照）。
【００２８】
次いで、我々は、ｐＨ５．５で製剤及び賦形剤の類似のシリーズについて試験したが、これらサンプルは全て曇っており、これはＧＤＦ−５タンパク質の低溶解度及び／又は凝集を示した（表３参照）。これらのサンプルに対して、ＨＰＬＣスキャンは実施しなかった。
【００２９】
我々はまた、ｐＨ３．９〜５．０の範囲の幾つかの５ｍＭグリシン−ＨＣｌ緩衝液中の、０．１ｍｇ／ｍＬのＧＤＦ−５タンパク質溶液の安定性についても試験した。張度を調整するために１０％トレハロースを含む又は含まない、またタウリン、ベタイン、ｂ−アラニン、及びＴＥＡ−ＨＣｌの種々の賦形剤の組み合わせを含むサンプルを試験した。これらのサンプル全てから曇っている溶液が生じたため（表４参照）、ＨＰＬＣで更には試験しなかった。同様に、我々は、１０％トレハロースを含むｐＨ４．４の５ｍＭクエン酸緩衝液、１０％トレハロースを含むｐＨ３．５の０．２５ｍＭ  ＨＣｌ溶液、及びトレハロースを含まないｐＨ３．５の０．２５ｍＭ  ＨＣｌ溶液を含む、他の緩衝剤系中の０．１ｍｇ／ｍＬのＧＤＦ−５タンパク質溶液の安定性についても試験した。これらの溶液は全て曇っていて、これはＧＤＦ−５タンパク質の低溶解度及び／又は凝集を示すため、これらのサンプルに対してＨＰＬＣスキャンは実施しなかった（表４参照）。したがって、高ｐＨにおける酢酸緩衝剤系は、低ｐＨがＧＤＦ−５の安定性を高めることが知られているとき、低ｐＨにおける生体適合性製剤に用いられている他の一般的に知られている緩衝剤より、ＧＤＦ−５タンパク質分子に優れた安定性及び保護を提供することができる。
【００３０】
次いで、我々は、賦形剤の選択された組み合わせを含む、ｐＨ４．５及びｐＨ５．０の１０ｍＭ酢酸緩衝剤系中の０．１ｍｇ／ｍＬのＧＤＦ−５タンパク質溶液の安定性について更に試験した。これらの溶液は全て透明であり、３７℃で保存した後の試験は、３７℃で３２日間保存した後の主ピーク保持率が約８５％であることにより証明されるように、これらの製剤がＧＤＦ−５タンパク質分子を保護することを示した（表５及び６参照）。張度調整剤としてトレハロースの代わりに１０％スクロース、及び種々の他の賦形剤を添加したｐＨ５．０の１０ｍＭ酢酸緩衝液について更に試験したところ、正の結果が得られ、ＨＰＬＣによる主ピーク保持率は約９０％であった（表７参照）。
【００３１】
試験した賦形剤及び賦形剤の組み合わせの多くが、試験した時間、温度、ｐＨ、及び浸透圧モル濃度の研究条件下で優れた結果を示さなかったが、ＧＤＦ−５タンパク質の安定性に対して有害な効果も示さなかった。したがって、それらは、特定の生体組織、器官、若しくは細胞種、又は長期間、又は他の温度等の他の系、方法、又は条件において効果を示す可能性もある。
【００３２】
本発明の目的は、ＨＰＬＣの主ピークが少なくとも８０％保持されることにより証明されるように、体温で操作及び保存中改善されたタンパク質安定性を提供する、生体適合性緩衝剤系中のＧＤＦ−５タンパク質製剤を提供することである。本発明の別の目的は、ＨＰＬＣの主ピークが少なくとも８０％保持されることにより証明されるように、体温で操作及び保存中安定であるＧＤＦ−５タンパク質の等張溶液を提供することである。本発明の別の目的は、ｐＨが約４．３〜約５．２である酢酸緩衝液を有し、更にトレハロース、スクロース、ラフィノース、グルコース、マンニトール、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される張度調整剤を１０重量％有するＧＤＦ−５タンパク質の等張溶液であって、ＨＰＬＣの主ピークが少なくとも８０％保持されることにより証明されるように、体温で操作及び保存中安定である溶液を提供することである。
【００３３】
本発明の別の目的は、生物学的等張性を有し、ｐＨが約４．３〜約５．２である酢酸緩衝溶媒系を提供することによりＧＤＦ−５タンパク質溶液を保存する方法であって、そのＧＤＦ−５タンパク質が、ＨＰＬＣの主ピークが少なくとも８０％保持されることにより証明されるように、最高３２日間３７℃以下の体温で操作及び保存中ＧＤＦ−５タンパク質を安定化させる方法を提供することである。
【００３４】
下記の実施例は、本発明の性質を説明するための例に過ぎず、範囲を制限するものではない。当業者であれば、本発明の範囲内と見なされ得る他の実施形態が容易に想起されるであろう。
【実施例】
【００３５】
（実施例１）
バルク凍結ｒｈＧＤＦ−５タンパク質溶液を一晩解凍させた。ストック溶液の一部をｐＨ４．５の５ｍＭ酢酸緩衝液に用い、溶液の張度を等張に調整するための１０％トレハロース、及び種々の他の賦形剤を用いて試験し、溶液の透明度及びＨＰＬＣ分析の主ピークにより証明されるように、ＧＤＦ−５タンパク質の安定性を評価した。３７℃で５、１１、２２、及び３２日間保存した後、データを収集した。緩衝剤のみを含む対照サンプル及び緩衝剤と１０％トレハロースとを含むサンプルも実験に含まれていた。この結果を以下の表１に示す。驚くべきことに、緩衝剤のみでも他のサンプルと比べてＧＤＦ−５タンパク質はほぼ同程度保護された。試験した他の賦形剤はいずれも、ＧＤＦ−５タンパク質の安定性の顕著な改善又は低下のどちらも見られなかった。図１は、ｐＨ４．５の酢酸緩衝液のみを含む対照サンプルのＨＰＬＣの主ピーク（％）及び濃度回復率（％）のグラフを示し、これは３７℃で５、１１、２２、及び３２日後にＧＤＦ−５タンパク質が約９０％保持されていた（安定である）ことを示す。図２は同様に、ｐＨ４．５の酢酸緩衝液及び１０％トレハロースを含むサンプルのＨＰＬＣの主ピーク（％）及び濃度回復率（％）のグラフを示し、これもまた、３７℃で３２日後にＧＤＦ−５タンパク質が約９０％保持されていたことを示す。図３及び図４は同様に、１０％トレハロースと、それぞれ０．１％ＨＯ−エクトイン又は０．１％エクトインとを含むサンプルのＨＰＬＣの主ピーク（％）及び濃度回復率（％）のグラフを示し、これもまた、３７℃で３２日後にＧＤＦ−５タンパク質が約９０％保持されていたことを示す。試験した賦形剤の種々の組み合わせ及び得られた結果の完全な一覧については以下の表１参照。全ての値がほぼ等価であることに留意すべきであり、これはｐＨ４．５の酢酸緩衝液が、他の賦形剤が存在しようとしまいと、約９０％のＧＤＦ−５タンパク質の安定性を維持できることを示す。
【表１】
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【００３６】
（実施例２）
この実施例では、ｒｈＧＤＦ−５を５ｍＭ酢酸緩衝液中約０．１ｍｇ／ｍＬで配合したが、実施例１のｐＨ４．５の代わりにｐＨ５．０とした。１０％トレハロースを添加して張度を調整し、種々の他の賦形剤を表２に指示するように添加した。これらの配合もまた、表２に示すように３２日間３７℃で安定であった。図５は、ｐＨ５．０の５ｍＭ酢酸緩衝液及び１０％トレハロースを含むサンプルのＨＰＬＣの主ピーク（％）及び濃度回復率（％）のグラフを示し、これは３７℃で３２日間保存した後のＧＤＦ−５タンパク質が約９０％保持されていたことを示す。図６は、ｐＨ５．０の酢酸緩衝液、１０％トレハロース及び０．１％ＧＡＢＡを含むサンプルのＨＰＬＣの主ピーク（％）及び濃度回復率（％）のグラフを示し、これもまた３７℃で３２日間保存した後のＧＤＦ−５タンパク質が約９０％保持されていたことを示す。図７は、ｐＨ５．０の酢酸緩衝液、１０％トレハロース、０．１％タウリン、及び０．０１％ＴＥＡ−ＨＣｌを含むサンプルのＨＰＬＣの主ピーク（％）及び濃度回復率（％）のグラフを示し、これもまた３７℃で３２日間保存した後のＧＤＦ−５タンパク質が約９０％保持されていたことを示す。図８は、ｐＨ５．０の酢酸緩衝液、１０％トレハロース、０．１％ベタイン、及び０．１％エクトインを含むサンプルのＨＰＬＣの主ピーク（％）及び濃度回復率（％）のグラフを示し、これもまた３７℃で３２日間保存した後のＧＤＦ−５タンパク質が約９０％保持されていたことを示す。
【表２】
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【００３７】
（実施例３）
実施例１及び２と同様に、ｒｈＧＤＦ−５を１０％トレハロース及び他の賦形剤を含むｐＨ５．５の５ｍＭ酢酸緩衝液中０．１ｍｇ／ｍＬで配合したところ、これらタンパク質溶液は全て曇っていた（表３参照）。更に、ｐＨ４．５の５ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ４．５のグリシン−ＨＣｌ緩衝液、及び０．２５ｍＭのＨＣｌ溶媒も評価した。これらの配合も表４に示すように曇っていることが観察された。
【表３】
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【００３８】
（実施例４）
ｒｈＧＤＦ−５を、１０％トレハロース及び他の賦形剤を含む種々のｐＨのグリシン及びクエン酸緩衝液中０．１ｍｇ／ｍＬで配合したところ、これらタンパク質溶液は全て曇っていた（表４参照）。
【表４】
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【００３９】
（実施例５）
実施例１及び２と同様に、ｒｈＧＤＦ−５を０．１ｍｇ／ｍＬで配合したが、実施例５では、ｐＨ４．５の１０ｍＭ酢酸緩衝液を用いた。サンプルは、張度を調整するために１０％トレハロースを添加し、種々の他の賦形剤と共に試験した。これらの配合もまた、表５に示すように３２日間３７℃で安定であった。図９は、ｐＨ４．５の１０ｍＭ酢酸緩衝液及び１０％トレハロースを含むサンプルのＨＰＬＣの主ピーク（％）及び濃度回復率（％）のグラフを示し、これは３７℃で３２日間保存した後のＧＤＦ−５タンパク質が約８７％保持されていたことを示す。図１０は、ｐＨ４．５の１０ｍＭ酢酸緩衝液、０．０１％のＴＥＡ−ＨＣｌ、及び０．１％ベタインを含むサンプルのＨＰＬＣの主ピーク（％）及び濃度回復率（％）のグラフを示し、これもまた３７℃で３２日間保存した後のＧＤＦ−５タンパク質が約８７％保持されていたことを示す。
【表５】
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【００４０】
（実施例６）
実施例５と同様に、ｒｈＧＤＦ−５を１０ｍＭ酢酸緩衝液中０．１ｍｇ／ｍＬで配合したが、実施例６ではｐＨを５．０とした。サンプルは張度を調整するために１０％トレハロースを添加し、種々の他の賦形剤と共に試験した。これらの配合もまた、表６に示すように３２日間３７℃で安定であった。
【表６】
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【００４１】
（実施例７）
実施例６と同様に、ｒｈＧＤＦ−５をｐＨ５．０の１０ｍＭ酢酸緩衝液中０．１ｍｇ／ｍＬで配合した。実施例７のサンプルは、張度を調整するためにトレハロースの代わりに１０％スクロースを添加した。全てのサンプルから透明な溶液が得られ、ＨＰＬＣにより主ピークは約９０％保持されていた（表７参照）。
【表７】
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【００４２】
（実施例８）
実施例２と同様に、１０％トレハロースを含むｐＨ５の５ｍＭ又は１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中に高濃度の０．２ｍｇ／ｍＬのｒｈＧＤＦ−５製剤を調製した。配合を３７、４０、及び５℃を含む異なる保存温度下で試験した。安定性の結果を表８に表す。
【表８】
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【００４３】
全てのサンプルから透明な溶液が得られた。３７℃で３４日間で保存したサンプルは、ＨＰＬＣにより決定したとき、約９０％のｒＨＧＤＦ−５タンパク質が更に保持されていた。４０℃からのｒＨＧＤＦ−５タンパク質の回復率は、約８５％の回復率とわずかに低かった。少なくとも７ヶ月間５℃のサンプルで著しい変化は見られなかった。
【００４４】
結果は、他の賦形剤があってもなくても酢酸緩衝液中に配合されたｒｈＧＤＦ−５を５℃で長期間保存できることを示す。配合は１ヶ月以上体温下で送達されることができた。等張液ｒｈＧＤＦ−５製剤は、既に示されていたよりも５℃及び３７℃の高温でより安定である。
【００４５】
〔実施の態様〕
（１）  約４．２〜約５．３のｐＨを有する酢酸緩衝液中のＧＤＦ−５タンパク質溶液を含む、組成物。
（２）  トレハロース、スクロース、ラフィノース、グルコース、マンニトール、ＴＭＡＯ、ＴＥＡ−ＨＣｌ、タウリン、β−アラニン、ベタイン、エクトイン、ＨＯ−エクトイン、ＧＡＢＡ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１種以上の賦形剤を更に含む、実施態様１に記載の組成物。
（３）  前記溶液が等張である、実施態様２に記載の組成物。
（４）  前記賦形剤がトレハロースである、実施態様２に記載の組成物。
（５）  前記賦形剤がスクロースである、実施態様２に記載の組成物。
（６）  ＴＭＡＯ、ＴＥＡ−ＨＣｌ、タウリン、β−アラニン、ベタイン、エクトイン、ＨＯ−エクトイン、ＧＡＢＡ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される賦形剤を更に含む、実施態様２に記載の組成物。
（７）  前記賦形剤が約０．０１〜約０．５重量％の量存在する、実施態様６に記載の組成物。
（８）  ａ．ＧＤＦ−５タンパク質のサンプルを提供する工程と、
ｂ．約４．２〜約５．３のｐＨを有する緩衝酢酸溶液を添加し、それによりＧＤＦ−５の安定化溶液を提供する工程と、
を含む、ＧＤＦ−５タンパク質の溶液を安定化する方法。
（９）  トレハロース、スクロース、ラフィノース、グルコース、マンニトール、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１種以上の賦形剤を添加する工程を更に含む、実施態様７に記載の方法。
（１０）  前記賦形剤が前記タンパク質溶液を等張にするのに十分な量添加される、実施態様９に記載の方法。
【００４６】
（１１）  前記賦形剤がトレハロースである、実施態様９に記載の方法。
（１２）  前記賦形剤がスクロースである、実施態様９に記載の方法。
（１３）  ＴＭＡＯ、ＴＥＡ−ＨＣｌ、タウリン、β−アラニン、ベタイン、エクトイン、ＨＯ−エクトイン、ＧＡＢＡ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１種以上の賦形剤を添加する工程を更に含む、実施態様９に記載の方法。
（１４）  前記賦形剤が約０．０１〜約０．５重量％の量存在する、実施態様１３に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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