(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種の鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼを用いる等温核酸増幅反応に適した第一及び第二のオリゴヌクレオチドプライマーの設計方法であって、前記プライマーは第一及び第二の配列Ｘを含む鋳型核酸又はその一部を増幅するのに適しており、前記第一及び第二の配列Ｘは、連続する４塩基以上の２つの同一配列を有し、かつ鋳型核酸又はその断片の２００塩基以内に存在し、第一の配列Ｘは、第二の配列Ｘの５’に存在し、プライマーは以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかの要件を満たす、上記の設計方法。
（ａ）連続した４塩基以上の配列Ｘが２００塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計し、かつ、第一のオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な配列の５’側に第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計する；
（ｂ）連続した４塩基以上の配列Ｘが２００塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’側１００塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計する；
（ｃ）連続した４塩基以上の配列Ｘが２００塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’側１００塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを３’側の配列Ｘの３’側１００塩基以内の領域の相補鎖に対して設計する：
【請求項２】
配列Ｘ、及び配列Ｘに相補的な配列Ｘｃが連続した５塩基以上の配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
配列Ｘ、及び配列Ｘに相補的な配列Ｘｃが連続した７塩基以上の配列である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
オリゴヌクレオチドプライマーが前記鋳型核酸断片の一部と相補的である、請求項１から３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端領域のみが前記鋳型核酸断片と相補的である、請求項１から４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドプライマーが、前記鋳型核酸断片と連続した一箇所でのみ相補的である、請求項１から５の何れかに記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１種の鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼが、バチルス ステアロサーモフィラス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｓｔ．ＤＮＡポリメラーゼ、及びバチルスカルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｃａＤＮＡポリメラーゼ 、サーモコッカス リトラリス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｖｅｎｔ．ＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択されるポリメラーゼである、請求項１から６の何れかに記載の方法。
【請求項８】
等温核酸増幅反応が、室温以上１００℃以下の等温で行われる、請求項１から７の何れかに記載の方法。
【請求項９】
請求項１から８の何れかに記載の設計方法を行うことにより第一及び第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計すること、及び
少なくとも１種のデオキシヌクレオチド３リン酸、少なくとも１種の鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼ、第一及び第二のオリゴヌクレオチドプライマー、及び鋳型となる核酸断片を含む反応溶液をインキュベートすることによって前記プライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ反応を行い、該核酸断片を増幅すること：
含む核酸の増幅方法。
【請求項１０】
反応溶液が少なくとも０．０５％以上の界面活性剤を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
界面活性剤が非イオン性界面活性剤である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系、ポリオキシエチレンアルキルフェノールエーテル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系から選ばれることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
反応溶液が、少なくとも２価の陽イオンを含む、請求項９から１２の何れかに記載の方法。
【請求項１４】
反応溶液が、融解温度調整剤をさらに含む、請求項９から１３の何れかに記載の方法。
【請求項１５】
融解温度調整剤が、ジメチルスルホキシド、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの２種以上の混合物である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
反応溶液が、各々１．０ｍＭ以上１００ｍＭ以下のデオキシヌクレオチド３リン酸を含む、請求項９から１５の何れかに記載の方法。
【請求項１７】
反応溶液が、各々１μＭ以上１００μＭ以下のオリゴヌクレオチドプライマーを含む、請求項９から１６の何れかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の増幅方法に関する。より詳細には、本発明は、ＤＮＡポリメラーゼを用いて反応溶液をインキュベートすることによってポリメラーゼ反応を行うことを特徴とする核酸の増幅方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子生物学の研究においては、核酸の増幅は、一般的には、ＤＮＡポリメラーゼを利用した酵素的方法で行われている。核酸の増幅方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が広く知られている。ＰＣＲ法では、目的とする標的核酸配列を増幅させるために、鋳型である二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに変性する工程（変性工程）、一本鎖ＤＮＡにプライマーをアニーリングさせる工程（アニーリング工程）、及びプライマーを起点として相補鎖を伸長する工程（伸長工程）の３つの工程から構成される。通常のＰＣＲ法においては、サーマルサイクラーを使用して、変性工程、アニーリング工程、伸長工程はそれぞれ異なる温度で行われている。しかし、３種類の異なる温度で核酸増幅反応を行うことは、温度制御が煩雑であり、またサイクル数に比例して時間のロスも増大していくという問題があった。
【０００３】
そこで、等温状態で実施することが可能な核酸増幅方法が開発されている。例えば、RCA（Rolling Circle Amplification:Proc.Natl.Acad.Sci,vol.92,4641-4645(1995)）、 ICAN(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids)、LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification of DNA；Bio Industry,第18巻、2号（2001）)、NASBA(Nucleic acid Sequence-based Amplification method;Nature,350,91〜(1991))、TMA(Transcription mediated amplification method;J.Clin Microbiol.第31巻、3270〜（1993）)等が挙げられる。
【０００４】
SDA法（特開平５−１３０８７０号）は、エクソヌクレアーゼを用いたサイクリングアッセイ法であり、ポリメラーゼ伸長反応を利用したターゲット核酸断片の目的部位の増幅法の一つである。この方法はターゲット核酸断片の目的部位に特異的にハイブリダイゼーションしたプライマーを起点とした、ポリメラーゼ伸長反応とともに、５’→３’エクソヌクレアーゼを作用させて、プライマーを逆方向から分解する方法である。分解したプライマーの代わりに新たなプライマーがハイブリダイゼーションし、再度ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が進行する。このポリメラーゼによる伸長反応と、この先に伸長した鎖を外すエクソヌクレア−ゼによる分解反応が順次、周期的に繰り返される。ここで、ポリメラーゼによる伸長反応とエクソヌクレア−ゼによる分解反応は等温条件で実施することが可能である。しかしながら、ポリメラーゼと共にエクソヌクレアーゼを用いる必要があり、コストがかかると共に、プライマーの設計を工夫する必要があった。
【０００５】
LAMP法は、近年開発されたターゲット核酸断片の目的部位の増幅法である。この方法は、ターゲット核酸断片の少なくとも6箇所の特定部位を相補的に認識する少なくとも4種のプライマーと、5’→3’方向へのヌクレアーゼ活性がなく、かつ鋳型上の２本鎖DNAを１本鎖DNAとして遊離させながら伸長反応を触媒する鎖置換型のBst DNAポリメラーゼを使用することで、等温条件でターゲット核酸断片の目的部位を、特別な構造として増幅する方法である。しかしながら、6箇所の特定部位を認識する少なくとも4種のプライマーを用いる必要があり、プライマー設計が非常に困難であった。
【０００６】
ICAN法も、近年開発されたターゲット核酸断片の目的部位の増幅法である。RNA-DNAキメラプライマー、鎖置換活性と鋳型交換活性を有するDNAポリメラーゼ、RNaseHを用いる等温の遺伝子増幅方法である。キメラプライマーが鋳型と結合した後、DNAポリメラーゼにより相補鎖が合成される。その後,RNaseHがキメラプライマー由来のRNA部分を切断し、切断部分から鎖置換反応と鋳型交換反応を伴った伸長反応が起きるこの反応が繰り返し起こることにより遺伝子が増幅される。しかしながら、この方法もキメラプライマーという特殊なプライマーを用いる必要がありプライマー設計が非常に困難である。
【０００７】
特表平１１−５０９４０６号公報には、鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼ存在下、少なくとも１組のオリゴヌクレオチドプライマーにより目的とする領域のＤＮＡを等温における反応によって増幅する方法が記載されている。しかしながら、特表平１１−５０９４０６号公報に記載の方法では比較的長い反応時間が必要であるなどの問題がある。つまり、ＰＣＲ法のように簡単なプライマー設計で等温にて簡便に実施が可能な核酸増幅方法の開発が望まれていた。
【０００８】
【非特許文献１】Proc.Natl.Acad.Sci,vol.92,4641-4645(1995)
【非特許文献２】Bio Industry,第18巻、2号（2001）
【非特許文献３】Nature,350,91〜(1991)
【非特許文献４】J.Clin Microbiol.第31巻、3270〜（1993）
【特許文献１】特開平５−１３０８７０号公報
【特許文献２】特表平１１−５０９４０６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、オリゴヌクレオチドプライマーとＤＮＡポリメラーゼとを用いて実施可能な核酸の増幅方法を提供することを解決すべき課題とした。本発明はさらに、短時間で標的核酸配列を高い効率で増幅することができ、かつ標的核酸配列を特異的に増幅することができる核酸の増幅方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、以下の条件のいずれかを満たすように第一のオリゴヌクレオチドプライマーと第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計することによって、核酸断片を高い効率で特異的に増幅できることを見出し、本発明を完成するに至った。
（１）  連続した４塩基以上の配列Ｘが２００塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計し、かつ、第一のオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な配列の５’側に第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。
（２）  連続した４塩基以上の配列Ｘが２００塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’側１００塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計する。
（３）  連続した４塩基以上の配列Ｘが２００塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’側１００塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを３’側の配列Ｘの３’側１００塩基以内の領域の相補鎖に対して設計する。
【００１１】
即ち、本発明によれば、少なくとも１種のデオキシヌクレオチド３リン酸、少なくとも１種の鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも２種のオリゴヌクレオチドプライマー、及び鋳型となる核酸断片を含む反応溶液をインキュベートすることによって前記プライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ反応を行い、該核酸断片を増幅することを含む核酸の増幅方法であって、連続した４塩基以上の配列Ｘが２００塩基以内に２箇所以上存在する領域又はその一部を増幅できるように、第一のオリゴヌクレオチドプライマー及び第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計することを特徴とする、核酸の増幅方法が提供される。
【００１２】
好ましくは、本発明は以下の何れかを特徴とする。
（１）  連続した４塩基以上の配列Ｘが２００塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計し、かつ、第一のオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な配列の５’側に第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。
（２）  連続した４塩基以上の配列Ｘが２００塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’側１００塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計する。
（３）  連続した４塩基以上の配列Ｘが２００塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’側１００塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを３’側の配列Ｘの３’側１００塩基以内の領域の相補鎖に対して設計する。
【００１３】
本発明において、ある領域Ａに対してオリゴヌクレオチドプライマーを設計するとは、領域Ａと実質的に同一の配列を有するオリゴヌクレオチドを設計することを言う。
別の表現をすれば、ある領域Ａに対してオリゴヌクレオチドプライマーを設計するとは、領域Ａの相補鎖に対してアニールするように、即ち領域Ａの相補鎖と実質的に相補的となるようにオリゴヌクレオチドプライマーを設計することを言う。
【００１４】
本発明において、配列Ｘの５’側１００塩基以内の領域とは、配列Ｘの1塩基分５’側に存在する塩基の位置、及び、配列Ｘの１００塩基分５’側に存在する塩基の位置、及び、両者に挟まれる領域を意味する。
同様に、本発明において、配列Ｘの３’側１００塩基以内の領域とは、配列Ｘの1塩基分３’側に存在する塩基の位置、及び、配列Ｘの１００塩基分３’側に存在する塩基の位置、及び、両者に挟まれる領域を意味する。
【００１５】
好ましくは、配列Ｘ、及び配列Ｘに相補的な配列Ｘｃは連続した５塩基以上の配列である。
好ましくは、配列Ｘ、及び配列Ｘに相補的な配列Ｘｃは連続した７塩基以上の配列である。
【００１６】
好ましくは、反応溶液は、少なくとも０．０５％以上の界面活性剤をさらに含む。
好ましくは、界面活性剤は非イオン性界面活性剤である。
好ましくは、非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系、ポリオキシエチレンアルキルフェノールエーテル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系から選ばれることを特徴とする。
【００１７】
好ましくは、反応溶液は２価の陽イオンをさらに含む。
好ましくは、２価の陽イオンはマグネシウムイオンである。
好ましくは、反応溶液は、融解温度調整剤をさらに含む。
好ましくは、融解温度調整剤は、ジメチルスルホキシド、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの２種以上の混合物である。
【００１８】
好ましくは、反応溶液は各々１．０ｍＭ以上１００ｍＭ以下のデオキシヌクレオチド３リン酸を含む。
好ましくは、反応溶液は、１μＭ以上１００μＭ以下のオリゴヌクレオチドプライマーを含む。
【００１９】
好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーは前記鋳型核酸断片の一部と実質的に相補的である。
好ましくは、前記オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端領域のみが前記鋳型核酸断片と実質的に相補的である。
好ましくは、前記オリゴヌクレオチドプライマーは、前記鋳型核酸断片と連続した一箇所でのみ実質的に相補的である。
【００２０】
好ましくは、少なくとも１種の鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼは、バチルス  ステアロサーモフィラス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｓｔ．ＤＮＡポリメラーゼ、及びバチルスカルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｃａ  ＤＮＡポリメラーゼ  、サーモコッカス  リトラリス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｖｅｎｔ．ＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択されるポリメラーゼである。
好ましくは、核酸を増幅する工程は実質的に等温で行われる。
好ましくは、核酸を増幅する工程は室温以上１００℃以下で行われる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、増幅産物が次々に伸長されるため、標的核酸配列を非常に高い増幅効率で増幅することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明による核酸の増幅方法は、少なくとも１種のデオキシヌクレオチド３リン酸、少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも２種のオリゴヌクレオチドプライマー、及び鋳型となる核酸断片を含む反応溶液をインキュベートすることによって前記プライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ反応を行い、該核酸断片を増幅することを含む核酸の増幅方法であって、連続した４塩基以上の配列Ｘが２００塩基以内に２箇所以上存在する領域又はその一部を増幅できるように、第一のオリゴヌクレオチドプライマー及び第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計することを特徴とする。さらに具体的には、本発明による核酸の増幅方法は、以下の条件のいずれかを満たすように第一のオリゴヌクレオチドプライマーと第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計することを特徴とする。
（１）  連続した４塩基以上の配列Ｘが２００塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計し、かつ、第一のオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な配列の５’側に第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計する（図１３を参照）。
（２）  連続した４塩基以上の配列Ｘが２００塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’側１００塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計する（図１５を参照）。
（３）  連続した４塩基以上の配列Ｘが２００塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’側１００塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを３’側の配列Ｘの３’側１００塩基以内の領域の相補鎖に対して設計する（図１７を参照）。
【００２３】
好ましくは、以下の条件のいずれかを満たすように第一のオリゴヌクレオチドプライマーと第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計することを特徴とする。
（１）  連続した４塩基以上の配列Ｘが１００塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計し、かつ、第一のオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な配列の５’側に第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。
（２）  連続した４塩基以上の配列Ｘが１００塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’側１００塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計する。
（３）  連続した４塩基以上の配列Ｘが１００塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’側１００塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを３’側の配列Ｘの３’側１００塩基以内の領域の相補鎖に対して設計する。
【００２４】
好ましくは、以下の条件のいずれかを満たすように第一のオリゴヌクレオチドプライマーと第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計することを特徴とする。
（１）  連続した４塩基以上の配列Ｘが６０塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計し、かつ、第一のオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な配列の５’側に第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。
（２）  連続した４塩基以上の配列Ｘが６０塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’側１００塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計する。
（３）  連続した４塩基以上の配列Ｘが６０塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’側１００塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを３’側の配列Ｘの３’側１００塩基以内の領域の相補鎖に対して設計する。
【００２５】
本発明による核酸の増幅方法の上記（１）の概要を図１３及び図１４に示す。鋳型となる核酸断片に対して第一のオリゴヌクレオチドプライマーと第二のオリゴヌクレオチドプライマーとがアニーリングして、当該オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ反応が進行する。その際、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを起点とするポリメラーゼ反応の増幅産物として、配列Ｘを３’末端に含む増幅核酸断片（これを核酸断片Ａとする）が得られる。
【００２６】
同様に、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを起点とするポリメラーゼ反応の増幅産物として、配列Ｘと相補的な配列Ｘcを３’末端に含む増幅核酸断片（これを核酸断片Ｂとする）が得られる。
【００２７】
次に、上記で得られた増幅核酸断片Ａと増幅核酸断片Ｂとがハイブリッドを形成し、伸長が開始する。これにより、高分子の増幅核酸断片が合成されることになる。
【００２８】
または、上記で得られた増幅核酸断片Ａと鋳型となる核酸断片とが配列Ｘ（配列Ｘc）を介してハイブリッドを形成し、伸長が開始することによって、高分子の増幅核酸断片が合成されうる。
【００２９】
または、上記で得られた増幅核酸断片Ｂと鋳型となる核酸断片とが配列Ｘ（配列Ｘc）を介してハイブリッドを形成し、伸長が開始することによって、高分子の増幅核酸断片が合成されうる。
【００３０】
核酸断片Ａ、核酸断片Ｂ、及び、高分子の増幅核酸断片は、第一のオリゴヌクレオチドプライマーまたは第二のオリゴヌクレオチドプライマーもしくはその両方がアニーリングすることができ、３’末端を起点としたポリメラーゼ反応が進行し、核酸断片の複製反応が継続的に起こる。結果として、鋳型となる核酸断片が検出可能なレベルまで増幅される。
【００３１】
本発明による核酸の増幅方法の上記（２）の概要を図１５及び１６に示す。鋳型となる核酸断片に対して第一のオリゴヌクレオチドプライマーと第二のオリゴヌクレオチドプライマーとがアニーリングして、当該オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ反応が進行する。その際、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを起点とするポリメラーゼ反応の増幅産物として、配列Ｘを３’末端側に少なくとも２箇所含む増幅核酸断片（これを核酸断片Ａとする）が得られる。
【００３２】
同様に、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを起点とするポリメラーゼ反応の増幅産物として、配列Ｘと相補的な配列Ｘcを３’末端に含む増幅核酸断片（これを核酸断片Ｂとする）が得られる。
【００３３】
次に、上記で得られた増幅核酸断片Ａと増幅核酸断片Ｂとがハイブリッドを形成し、伸長が開始する。これにより、高分子の増幅核酸断片が合成されることになる。
【００３４】
または、上記で得られた増幅核酸断片Ａと鋳型となる核酸断片とが配列Ｘ（配列Ｘc）を介してハイブリッドを形成し、伸長が開始することによって、高分子の増幅核酸断片が合成されうる。
【００３５】
核酸断片Ａ、核酸断片Ｂ、及び、高分子の増幅核酸断片は、第一のオリゴヌクレオチドプライマーまたは第二のオリゴヌクレオチドプライマーもしくはその両方がアニーリングすることができ、３’末端を起点としたポリメラーゼ反応が進行し、核酸断片の複製反応が継続的に起こる。結果として、鋳型となる核酸断片が検出可能なレベルまで増幅される。
【００３６】
本発明による核酸の増幅方法の上記（３）の概要を図１７及び１８に示す。鋳型となる核酸断片に対して第一のオリゴヌクレオチドプライマーと第二のオリゴヌクレオチドプライマーとがアニーリングして、当該オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ反応が進行する。その際、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを起点とするポリメラーゼ反応の増幅産物として、配列Ｘを３’末端側に少なくとも２箇所含む増幅核酸断片（これを核酸断片Ａとする）が得られる。
【００３７】
同様に、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを起点とするポリメラーゼ反応の増幅産物として、配列Ｘと相補的な配列Ｘcを３’末端に少なくとも２箇所含む増幅核酸断片（これを核酸断片Ｂとする）が得られる。
【００３８】
次に、上記で得られた増幅核酸断片Ａと増幅核酸断片Ｂとがハイブリッドを形成し、伸長が開始する。これにより、高分子の増幅核酸断片が合成されることになる。
【００３９】
または、上記で得られた増幅核酸断片Ａと鋳型となる核酸断片とが配列Ｘ（配列Ｘc）を介してハイブリッドを形成し、伸長が開始することによっても、高分子の増幅核酸断片が合成されうる。
【００４０】
または、上記で得られた増幅核酸断片Ｂと鋳型となる核酸断片とが配列Ｘ（配列Ｘc）を介してハイブリッドを形成し、伸長が開始することによっても、高分子の増幅核酸断片が合成されうる。
【００４１】
核酸断片Ａ、核酸断片Ｂ、及び、高分子の増幅核酸断片は、第一のオリゴヌクレオチドプライマーまたは第二のオリゴヌクレオチドプライマーもしくはその両方がアニーリングすることができ、３’末端を起点としたポリメラーゼ反応が進行し、核酸断片の複製反応が継続的に起こる。結果として、鋳型となる核酸断片が検出可能なレベルまで増幅される。
【００４２】
以下、本発明で用いる成分について説明する。
（１）デオキシヌクレオチド３リン酸
伸長反応の基質として、デオキシヌクレオチド３リン酸を用いる。具体的には、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの混合物を使用することが好ましい。デオキシヌクレオチド３リン酸としては、ｄＮＴＰのアナログ（例えば、７−デアザ−ｄＧＴＰ等）が含まれていてもよい。
【００４３】
また、デオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ混合物）は、最終濃度で、それぞれ０．１ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは０．７５ｍＭ〜３．０ｍＭ、さらに好ましくは１．０ｍＭから２．０ｍＭ、特に好ましくは１．０ｍＭから１．５ｍＭの範囲である。
【００４４】
（２）ＤＮＡポリメラーゼ
本発明においては、ＤＮＡポリメラーゼを用いる。ＤＮＡポリメラーゼとしては、好ましくは、鎖置換能を有するポリメラーゼを用いることができる。本明細書において「鎖置換能」とは、鋳型となる核酸配列に従ってＤＮＡ複製を行う際、ＤＮＡ鎖を置き換えながら進行し、鋳型鎖にアニーリングしている相補鎖を遊離させる、即ち鎖置換（strand displacement）することができる活性のことをいう。鎖置換能を有するポリメラーゼの具体例としては、バチルス  ステアロサーモフィラス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｓｔ．ＤＮＡポリメラーゼ、及びバチルスカルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｃａ  ＤＮＡポリメラーゼ  、サーモコッカス  リトラリス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｖｅｎｔ．ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。鎖置換能を有するポリメラーゼは、天然由来のものでもよいし、遺伝子工学的に製造した組み換え蛋白質でもよい。
【００４５】
（３）２価の陽イオン
本発明では、使用する酵素の金属要求性等に２価の陽イオンを用いる。２価の陽イオンとしては、マグネシウム塩やその他の金属塩を使用することができ、例えば、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウムなどを使用できる。２価の陽イオンの濃度は最終濃度で、好ましくは１ｍＭ〜２０ｍＭであり、さらに好ましくは２ｍＭ〜１０ｍＭの範囲である。
【００４６】
（４）界面活性剤
本発明では、反応溶液中に界面活性剤を添加してもよい。界面活性剤を使用することにより、非特異的な核酸の増幅を防止するという有利な効果を達成することができる。本発明で使用できる界面活性剤の種類は、特には限定されないが、アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、スルホコハク酸オクチルエステル塩、ステアリン酸石けんなどの陰イオン（アニオン）性界面活性剤、しょ糖脂肪酸エステルソルビタン脂肪酸エステル、ＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ20、Ｔｗｅｅｎ40、Ｔｗｅｅｎ60、Ｔｗｅｅｎ80等）、脂肪酸アルカノールアミド、ＰＯＥアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ35、Ｂｒｉｊ58、等）、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル（ＴｒｉｔｏｎX-100、ＴｒｉｔｏｎX-114、Nonidet P40、等）、ノニルフェノール、ラウリルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ＰＯＥアルキルアミン、ＰＯＥ脂肪酸ビスフェニルエーテルなどの非イオン（ノニオン）性界面活性剤、そしてセチルピリジニウムクロライド、ラウリルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、ステアリルトリメチルアンモニウムクロライドのような陽イオン（カチオン）性界面活性剤などを使用できる。界面活性剤の使用量は本発明の効果が達成できる限り特に限定されないが、好ましくは０．０１％以上、より好ましくは０．０５％以上、より好ましくは０．１％以上である。界面活性剤の使用量の上限は特に限定されないが、通常は１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは１％以下である。
【００４７】
界面活性剤の中でも、非イオン性界面活性剤を使用することが特に好ましい。非イオン性界面活性剤の中でも、親水性がより強い界面活性剤が好ましく、ＨＬＢ価で示すと１２以上が好ましい。より好ましくは１４以上であり、上限は２０まで好ましく用いることができる。さらに好ましくは１７以下であり、より好ましくは１４以上１７以下である。構造的には、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系から選ばれることが好ましい。さらに、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの中でも、脂肪酸エステルが一つだけのものが好ましい。例えば、以下の構造式で表すことができる。
【００４８】
【化１】
0005393077.tif 000002
（式中、x + y + z + w = 20  であり、R：炭素数が12〜18のアルキル基であることを示す。）
【００４９】
アルキル基の位置は特に限定されず、以下のような構造でも好ましく用いることができる。
【化２】
0005393077.tif 000003
【００５０】
このような界面活性剤として、物質名でポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系の非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート等が挙げられる。（商品名：Tween20、Tween40、Tween60、Tween80等）の界面活性剤が挙げられる。また、使用量も特に限定されないが、好ましくは０．０１％以上、より好ましくは０．０５％以上、より好ましくは０．１％以上である。
【００５１】
（５）オリゴヌクレオチドプライマー
本発明で使用するオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型ＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列を有し、その３'末端よりＤＮＡ鎖の伸長が可能なものである。オリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型ＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列を有することにより、鋳型となるＤＮＡにアニーリングすることができる。本発明で使用されるオリゴヌクレオチドプライマーとしては、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドで構成されたものを使用することができ、さらに、修飾リボヌクレオチドあるいは修飾デオキシリボヌクレオチドを含有するものでもよい。
【００５２】
さらに、前記、オリゴヌクレオチドプライマーは、従来の等温増幅反応で用いられるような複雑な設計を必要としない。通常のＰＣＲ反応で用いられる少なくとも一組以上のプライマーを用いて等温増幅反応を行うことを可能にしたことが、本発明の大きな特徴である。詳細には、これらのプライマーは、ＬＡＭＰ法等で用いられるような５’末端が３’末端より伸長した部分と相補的になるループ構造を形成するような構造を持っていない。つまり、プライマーの3'末端の連続した領域が鋳型核酸と相補的である。さらに、ＳＤＡ法やＩＣＡＮ法で用いられるように、反応途上でプライマーが切断され、切断された３‘末端が新たな合成起点になるようなるような複雑な仕組みを持たない。
【００５３】
前記オリゴヌクレオチドプライマーは、以下の条件のいずれかを満たすように設計する。
（１）  連続した４塩基以上の配列Ｘが２００塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計し、かつ、第一のオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な配列の５’側に第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。
（２）  連続した４塩基以上の配列Ｘが２００塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’側１００塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計する。
（３）  連続した４塩基以上の配列Ｘが２００塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’側１００塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを３’側の配列Ｘの３’側１００塩基以内の領域の相補鎖に対して設計する。
【００５４】
好ましくは、前記オリゴヌクレオチドプライマーは、以下の条件のいずれかを満たすように設計する。
（１）  連続した４塩基以上の配列Ｘが１００塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計し、かつ、第一のオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な配列の５’側に第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。
（２）  連続した４塩基以上の配列Ｘが１００塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’側１００塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計する。
（３）  連続した４塩基以上の配列Ｘが１００塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’側１００塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを３’側の配列Ｘの３’側１００塩基以内の領域の相補鎖に対して設計する。
【００５５】
好ましくは、前記オリゴヌクレオチドプライマーは、以下の条件のいずれかを満たすように設計する。
（１）  連続した４塩基以上の配列Ｘが６０塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計し、かつ、第一のオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な配列の５’側に第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。
（２）  連続した４塩基以上の配列Ｘが６０塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’側１００塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計する。
（３）  連続した４塩基以上の配列Ｘが６０塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’側１００塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを３’側の配列Ｘの３’側１００塩基以内の領域の相補鎖に対して設計する。
【００５６】
好ましくは、配列Ｘ及びＸｃは連続した５塩基以上の配列である。
好ましくは、配列Ｘ及びＸｃは連続した７塩基以上の配列である。
【００５７】
連続した４塩基以上の配列Ｘは必ずしも完全に一致していなくてもよい。例えば、５塩基中の４塩基以上、６塩基中の５塩基以上、７塩基中の５塩基以上、８塩基中の６塩基以上、９塩基中の７塩基以上、１０塩基中の７塩基以上が一致していれば、同様の機構で増幅することができる。
【００５８】
オリゴヌクレオチドプライマーの長さは、特に限定されないが、一般的には、１０〜１００ヌクレオチド程度の長さであり、好ましくは１５〜５０ヌクレオチド程度の長さであり、さらに好ましくは１５〜４０ヌクレオチド程度の長さである。
【００５９】
オリゴヌクレオチドプライマーは、市販のＤＮＡ合成機（例えば、アプライド バイオシステムズ社（Applied Biosystem Inc.）のＤＮＡシンセサイザー３９４型など）を用いて、ホスホアミダイト法により合成できる。
【００６０】
オリゴヌクレオチドプライマーの使用量は、反応溶液中において０．１μＭ以上が好ましく、１μＭ以上がさらに好ましく、１．５μＭ以上が特に好ましい。
【００６１】
（６）鋳型となる核酸断片
本発明において鋳型となる核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、全ＲＮＡのいずれでもよい。鋳型となる核酸を含む可能性のある試料から調製した核酸を使用してもよいし、鋳型となる核酸を含む可能性のある試料をそのまま直接使用してもよい。鋳型となる核酸を含む試料の種類は特に限定されず、例えば、体液（例えば、全血、血清、尿、脳脊髄液、精液、唾液など）、組織（例えば、癌組織など）、細胞培養物のような生体由来試料、ウイルス、細菌、カビ、酵母、植物及び動物のような核酸含有試料、微生物が混入している可能性のある試料（例えば、食品など）、あるいは土壌、排水のような環境中の試料が挙げられる。上記したような試料から核酸を調製する場合、その調製方法は特に限定されず、例えば、界面活性剤による処理、超音波処理、ガラスビーズを用いた精製など当業者に公知の方法を用いることができる。核酸の試料からの精製は、フェノール抽出、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動または密度勾配遠心分離などにより行うことができる。
【００６２】
ＲＮＡ由来の配列を有する核酸を増幅したい場合には、当該ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応によって合成されたｃＤＮＡを鋳型として本発明の方法を実施することができる。逆転写反応に使用されるプライマーは、特定の鋳型ＲＮＡに相補的な塩基配列を有するプライマーでもよいし、オリゴｄＴプライマーやランダムな配列を有するプライマーでもよい。逆転写用プライマーの長さは好ましくは６から１００ヌクレオチド程度であり、更に好ましくは９から５０ヌクレオチド程度である。逆転写反応に使用される酵素としては、ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡ合成活性を有するものであれば特に限定はなく、例えばトリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素（ＡＭＶ ＲＴａｓｅ）、モロニーネズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶ ＲＴａｓｅ）、ラウス関連ウイルス２逆転写酵素（ＲＡＶ−２ ＲＴａｓｅ）などを使用することができる。また、逆転写活性を併せ持つ鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを使用することもできる。
【００６３】
本発明においては、ゲノムＤＮＡや核酸増幅断片のような二本鎖ＤＮＡ、およびＲＮＡから逆転写反応で調製されたｃＤＮＡのような一本鎖ＤＮＡを、鋳型ＤＮＡとして使用できる。上記二本鎖ＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡに変性してから本発明の方法に使用してもよいし、このような変性を行うことなく本発明の方法に使用することもできる。
【００６４】
（７）融解温度調整剤
本発明における反応溶液には、融解温度調整剤を添加することができる。融解温度調整剤の具体例としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、テトラアルキルアンモニウム塩、またはこれらの２種以上の混合物を挙げることができる。融解温度調整の使用量は特に限定されないが、ＤＭＳＯやホルムアミド、グリセロールの場合、通常は反応溶液中に１０％以下の量で含めることができる。
ベタインやテトラアルキルアンモニウム塩は、０．２〜３．０Ｍ、好ましくは０．５〜１．５Ｍ程度添加することができる。
【００６５】
（８）緩衝成分
本発明における反応溶液には、緩衝成分を含めることができる。緩衝成分としては、特に限定はないが、例えば、ビシン、トリシン、ヘペス、トリス、リン酸塩（リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等）などを使用することができる。緩衝成分の最終濃度は５ｍＭ〜１００ｍＭの範囲、特に好ましくは１０ｍＭ〜５０ｍＭの範囲であり、またｐＨは、増幅反応に用いられる酵素の至適ｐＨにもよるが、一般的には６．０〜９．０、特に好ましくはｐＨ７．０〜９．０のものを使用できる。
【００６６】
（９）本発明による核酸の増幅方法
次に、本発明による核酸の増幅方法について説明する。本発明では、少なくとも１種のデオキシヌクレオチド３リン酸、少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼ、２価の陽イオン、少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドプライマー、及び鋳型となる核酸断片を含む反応溶液をインキュベートする。これにより、前記プライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ反応を行い、該核酸断片を増幅することができる。本発明では、好ましくは、核酸を増幅する工程を実質的に等温で行うことができる。反応溶液をインキュベートする際の温度は好ましくは室温以上であり、より好ましくは５０℃以上であり、さらに好ましくは、５５℃以上であり、例えば、６０℃程度でインキュベートすることができる。好ましい温度範囲は、例えば、約５０℃から約７０℃であり、さらに好ましくは約５５℃から約６５℃である。この場合、プライマーの非特異的なアニーリングが抑制され、ＤＮＡ増幅の特異性が向上し、また鋳型ＤＮＡの二次構造が解消されることによりＤＮＡポリメラーゼの伸長性も向上する。本発明による核酸の増幅方法は、実質的に等温において実施すことができる。本発明において等温とは、各工程の反応温度を大きく変化することなく、各工程が実質的に一定の温度で行われることを意味する。
【００６７】
本発明において、反応溶液を実質的に等温でインキュベートする時間は、標的核酸断片が増幅できる限り特に限定されない。インキュベートする時間は、例えば、５分以上１２時間以内とすることができる。インキュベートする時間は、好ましくは、５分以上２時間以内であり、より好ましくは５分以上６０分以内であり、さらに好ましくは５分以上３０分以内であり、５分以上１５分以内とすることもできる。
【００６８】
核酸を増幅する工程を実質的に等温で行う場合は、温度を上昇させたり低下させたりする必要がないことが利点の一つになる。従来のＰＣＲ法では温度を上下させる必要があり、例えばサーマルサイクラーのような反応装置が必要であったが、核酸を増幅する工程を実質的に等温で行う場合は、一定温度を保持できる装置のみで実施が可能である。
【００６９】
（１０）本発明による核酸の増幅方法の利用
本発明による核酸の増幅方法は、核酸の検出、標識、塩基配列の決定、塩基の変異の検出（一塩基多型の検出などを含む）などに使用することができる。本発明の核酸の増幅方法には温度調節が可能な反応装置を使用する必要がないため、多量の反応液を使用して増幅反応を実施することができる。
【００７０】
本発明の核酸の増幅方法により得られる増幅物は、当業者に公知の方法により検出できる。例えば、ゲル電気泳動によれば、エチジウムブロマイドでゲルを染色することによって特定サイズの反応産物を検出することができる。増幅産物を検出するための検出系は、蛍光偏光、イムノアッセイ、蛍光エネルギー転移、酵素標識（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、蛍光標識（例えば、フルオレセイン、ローダミンなど）、ケミルミネッセンス、又はバイオルミネッセンスなどを用いることができる。ビオチンなどで標識した標識ヌクレオチドを使用することによって増幅物を検出することもできる。この場合、増幅産物中のビオチンは、蛍光標識アビジン又は酵素標識アビジンなどを用いて検出することができる。
【００７１】
本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００７２】
＜実施例１＞核酸の増幅反応
（１）ターゲット核酸断片を含む核酸試料液の調製
ＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）３．０ｎｇを９８℃で３ｍｉｎ．加熱を行い、１本鎖にしたのち、β−アクチン遺伝子中の配列の増幅を以下の条件で行った。
【００７３】
＜プライマー＞
プライマーは、βアクチン遺伝子を標的に設計を行った。各プライマーの配列を以下に示す。
【００７４】
プライマー(1)(Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ)：
５'−GGGCATGGGTCAGAAGGATT−３'（配列番号１）
プライマー(2)(Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ):
５'−CCTCGTCGCCCACATAG−３'（配列番号２）
【００７５】
上記プライマーのβアクチン遺伝子に対する位置関係の詳細を図１に示した。
ここで、配列Ｘは「5'-CCCAG-3'」であり、54塩基離れた位置に存在する。プライマー（１）は５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域に対して設計されており、プライマー（２）は５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計されている。
【００７６】
(２)核酸増幅反応
以下に示す反応液の組成で、６０℃、６０分反応させることで増幅反応を実施した。酵素は、ＮＥＢ社のBst.DNA polymeraseを使用した。
＜反応液の組成＞
10×Bst Buffer(DF)                           １．０μＬ
100mM MgSO4                                  ０．６μＬ
10%(v/v) Tween20                             ０．１μＬ
100% DMSO                                    ０．５μＬ
25mM dNTP each                               ０．５６μＬ
SYBR Green I（2000倍）                       ０．２μＬ
50μM primer(1)                              ０．６４μＬ
50μM primer(2)                              ０．６４μＬ
Bst. Polymerase                              ０．４μＬ
１）で得た核酸断片試料液(３．０ｎｇ)         ０．４μＬ
精製水                                       ４．９６μＬ      
１０．０μＬ
【００７７】
（３）増幅産物の検出
前記（２）における増幅反応を、リアルタイム蛍光検出装置（Ｍｘ３０００ｐ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて蛍光検出を行った。結果を図２に示す。
【００７８】
Ｍｘ３０００ｐの解析ソフトを用いて、上記のグラフにおいて蛍光量が２５０に到達したときの時間（Ct値）を算出した。Ct値は37.6±1.1分であった。
【００７９】
【表１】
0005393077.tif 000004
【００８０】
＜実施例２＞増幅産物の電気泳動
３ｗｔ％のアガロースゲル、０．５ｘTBEバッファー（50mM Tris, 45mM Boric acid、0.5mM EDTA, pH8.4）を用い、100Vで60分の電気泳動を行った。結果を図３に示す。電気泳動パターンはN=6でほぼ均一であり、増幅産物は同一の反応機構により得られていることがわかった。
【００８１】
＜実施例3＞増幅産物のクローニング
電気泳動を実施後、200bp以下の領域のゲルを切り出し、QIAEXII（Qiagen製）を用いてゲル中のDNAを回収した。
回収したDNAをTOPO TA Cloning Kit（Invitrogen製）を用いてベクターに組み込み、該ベクターにより大腸菌を形質転換した。形質転換した大腸菌を、アンピシリンを加えたLB培地中で培養した。
QIAprep Miniprep（Qiagen製）を使用して培養した大腸菌からプラスミドDNAを回収した。
回収したプラスミドDNAに対してシークエンスを行い、塩基配列を調べた。プライマーにはM13 Reverse Primerを使用した。
【００８２】
M13 Reverse Primer
５'−CAGGAAACAGCTATGAC−３'（配列番号３）
【００８３】
シークエンスの結果、次の３種類の増幅産物が存在することがわかった。
（１）
5'-GGGCATGGGT CAGAAGGATT CCTATGTGGG CGACGAGG-3'
3'-CCCGTACCCA GTCTTCCTAA GGATACACCC GCTGCTCC-5'
38塩基対（配列番号４）
【００８４】
（２）
5'-GGGCATGGGT CAGAAGGATT CCTATGTGGG CGACGAGGCC CAGGGCGTGA-3'
3'-CCCGTACCCA GTCTTCCTAA GGATACACCC GCTGCTCCGG GTCCCGCACT-5'
5'-TGGTGGGCAT GGGTCAGAAG GATTCCTATG TGGGCGACGA GG-3'
3'-ACCACCCGTA CCCAGTCTTC GTAAGGATAC ACCCGCTGCT CC-5'
92塩基対（配列番号５）
【００８５】
（３）
5'-GGGCATGGGT CAGAAGGATT CCTATGTGGG CGACGAGGCC CAGGGCGTGA-3'
3'-CCCGTACCCA GTCTTCCTAA GGATACACCC GCTGCTCCGG GTCCCGCACT-5'
5'-TGGTGGGCAT GGGTCAGAAG GATTCCTATG TGGGCGACGA GGACCAGGGC-3'
3'-ACCACCCGTA CCCAGTCTTC CTAAGGATAC ACCCGCTGCT CCTGGTCCCG-5'
5'-GTGATGGTGG GCATGGGTCA GAAGGATTCC TATGTGGGCG ACGAGG-3'
3'-CACTACCACC CGTACCCAGT CTTCCTAAGG ATACACCCGC TGCTCC-5'
146塩基対（配列番号６）
【００８６】
シークエンスで得られた増幅産物の鎖長は、図２の電気泳動結果とも一致した。
（１）の増幅産物は、２つのプライマーに挟まれる領域である。
（２）の増幅産物は、それぞれのプライマーによって増幅された産物が、配列Ｘ（CCCAG）及び配列Ｘｃ（CTGGG）を介して結合し、さらに増幅した産物である。
（３）の増幅産物は、（２）の増幅産物と２つのプライマーのどちらかによって増幅された産物が、配列Ｘ（CCCAG）及び配列Ｘｃ（CTGGG）を介して結合し、さらに増幅した産物である。
【００８７】
＜実施例４＞核酸の増幅反応
（１）ターゲット核酸断片を含む核酸試料液の調製
ＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）３．０ｎｇを９８℃で３ｍｉｎ．加熱を行い、１本鎖にしたのち、β3AR遺伝子中の配列の増幅を以下の条件で行った。
【００８８】
＜プライマー＞
プライマーは、β3ＡＲ遺伝子を標的に設計を行った。各プライマーの配列を以下に示す。
【００８９】
プライマー(1)(Ｆｏｒｗａｒｄ)：
５'−ATCGTGGCCATCGCCT−３'（配列番号７）
プライマー(2)(Ｒｅｖｅｒｓｅ):
５'−CCAGCGAAGTCACGAAC−３'（配列番号８）
【００９０】
上記プライマーのβ3ＡＲ遺伝子に対する位置関係の詳細を図4に示した。
ここで、配列Ｘは「5'-GCTGGCC-3'」であり、90塩基離れた位置に存在する。プライマー（１）は５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域に対して設計されており、プライマー（２）は５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計されている。
【００９１】
(２)核酸増幅反応
以下に示す反応液の組成で、６０℃、６０分反応させることで増幅反応を実施した。酵素は、ＮＥＢ社のBst.DNA polymeraseを使用した。
＜反応液の組成＞
10×Bst Buffer(DF)                           １．０μＬ
100mM MgSO4                                  ０．６μＬ
10%(v/v) Tween20                             ０．１μＬ
100% DMSO                                    ０．５μＬ
25mM dNTP each                               ０．５６μＬ
SYBR Green I（2000倍）                       ０．２μＬ
50μM primer(1)                              ０．６４μＬ
50μM primer(2)                              ０．６４μＬ
Bst. Polymerase                              ０．４μＬ
１）で得た核酸断片試料液(３．０ｎｇ)         ０．４μＬ
精製水                                       ４．９６μＬ      
１０．０μＬ
【００９２】
（３）増幅産物の検出
前記（２）における増幅反応を、リアルタイム蛍光検出装置（Ｍｘ３０００ｐ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて蛍光検出を行った。結果を図５に示す。
Ｍｘ３０００ｐの解析ソフトを用いて、上記のグラフにおいて蛍光量が２５０に到達したときの時間（Ct値）を算出した。Ct値は41.2±0.5分であった。
【００９３】
【表２】
0005393077.tif 000005
【００９４】
＜実施例５＞増幅産物の電気泳動
３ｗｔ％のアガロースゲル、０．５ｘTBEバッファー（50mM Tris, 45mM Boric acid、0.5mM EDTA, pH8.4）を用い、100Vで60分の電気泳動を行った。結果を図６に示す。電気泳動パターンはN=4でほぼ均一であり、増幅産物は同一の反応機構により得られていることがわかった。
【００９５】
＜実施例6＞増幅産物のクローニング
電気泳動を実施後、200bp以下の領域のゲルを切り出し、QIAEXII（Qiagen製）を用いてゲル中のDNAを回収した。
回収したDNAをTOPO TA Cloning Kit（Invitrogen製）を用いてベクターに組み込み、該ベクターにより大腸菌を形質転換した。形質転換した大腸菌を、アンピシリンを加えたLB培地中で培養した。
QIAprep Miniprep（Qiagen製）を使用して培養した大腸菌からプラスミドDNAを回収した。
回収したプラスミドDNAに対してシークエンスを行い、塩基配列を調べた。プライマーにはM13 Reverse Primerを使用した。
【００９６】
M13 Reverse Primer
５'−CAGGAAACAGCTATGAC−３'（配列番号３）
【００９７】
シークエンスの結果、次の３種類の増幅産物が存在することがわかった。
（１）
5'-ATCGTGGCCA TCGCCTGGAC TCCGAGACAC CAGACCATGA CCAACGTGTT-3'
3'-TAGCACCGGT AGCGGACCTG AGGCTCTGTG GTCTGGTACT GGTTGCACAA-5'
5'-CGTGACTTCGCTGG-3'
3'-GCACTGAAGCGACC-5'
64塩基対  （配列番号９）
【００９８】
（２）
5'-ATCGTGGCCA TCGCCTGGAC TCCGAGACAC CAGACCATGA CCAACGTGTT-3'
3'-TAGCACCGGT AGCGGACCTG AGGCTCTGTG GTCTGGTACT GGTTGCACAA-5'
5'-CGTGACTTCG CTGGGCACCG TGGGAGGCAA CCTGCTGGTC ATCGTGGCCA-3'
3'-TCACTGAAGC GACCCGTGGC ACCCTCCGTT GGACGACCAG TAGCACCGGT-5'
5'-TCGCCTGGAC TCCGAGACAC CAGACCATGA CCAACGTGTT CGTGACTTCG-3'
3'-AGCGGACCTG AGGCTCTGTG GTCTGGTACT GGTTGCACAA GCACTGAAGC-5'
5'-CTG-3'
3'-GAC-5' 
153塩基対（配列番号１０）
【００９９】
シークエンスで得られた増幅産物の鎖長は、図６の電気泳動結果とも一致した。
（１）の増幅産物は、２つのプライマーに挟まれる領域である。
（２）の増幅産物は、それぞれのプライマーによって増幅された産物が、配列Ｘ（GCTGGCC）及び配列Ｘｃ（GGCCAGC）を介して結合し、さらに増幅した産物である。
【０１００】
＜実施例７＞
核酸の増幅反応
（１）ターゲット核酸断片を含む核酸試料液の調製
ＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）３．０ｎｇを９８℃で３ｍｉｎ．加熱を行い、１本鎖にしたのち、７番染色体中の配列の増幅を以下の条件で行った。
【０１０１】
＜プライマー＞
プライマーは、７番染色体中の配列を標的に設計を行った。各プライマーの配列を以下に示す。
【０１０２】
プライマー(5)(Ｆｏｒｗａｒｄ)：
５'−CATTGCTCAGGGGTCTTC−３'（配列番号１１）
プライマー(6)(Ｒｅｖｅｒｓｅ):
５'−ATTTCGGCTCCCTTGG−３'（配列番号１２）
【０１０３】
上記プライマーの７番染色体中の配列に対する位置関係の詳細を図７に示した。
ここで、配列Ｘは「5'-GCCGGG-3'」であり、32塩基離れた位置に存在する。プライマー（5）は５’側の配列Ｘの５’側１００塩基以内の領域に対して設計されており、プライマー（6）は５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計されている。
【０１０４】
(２)核酸増幅反応
以下に示す反応液の組成で、６０℃、６０分反応させることで増幅反応を実施した。酵素は、ＮＥＢ社のBst.DNA polymeraseを使用した。
＜反応液の組成＞
10×Bst Buffer(DF)                           １．０μＬ
100mM MgSO4                                  ０．６μＬ
10%(v/v) Tween20                             ０．１μＬ
100% DMSO                                    ０．５μＬ
25mM dNTP each                               ０．５６μＬ
SYBR Green I（2000倍）                       ０．２μＬ
50μM primer(5)                              ０．６４μＬ
50μM primer(6)                              ０．６４μＬ
Bst. Polymerase                              ０．４μＬ
１）で得た核酸断片試料液(３．０ｎｇ)         ０．４μＬ
精製水                                       ４．９６μＬ      
１０．０μＬ
【０１０５】
（３）増幅産物の検出
前記（２）における増幅反応を、リアルタイム蛍光検出装置（Ｍｘ３０００ｐ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて蛍光検出を行った。結果を図８に示す。
Ｍｘ３０００ｐの解析ソフトを用いて、上記のグラフにおいて蛍光量が２５０に到達したときの時間（Ct値）を算出した。Ct値は50.1±0.4分であった。
【０１０６】
【表３】
0005393077.tif 000006
【０１０７】
＜実施例８＞増幅産物の電気泳動
３ｗｔ％のアガロースゲル、０．５ｘTBEバッファー（50mM Tris, 45mM Boric acid、0.5mM EDTA, pH8.4）を用い、100Vで60分の電気泳動を行った。結果を図９に示す。電気泳動パターンはN=2でほぼ均一であり、増幅産物は同一の反応機構により得られていることがわかった。
【０１０８】
＜実施例９＞
核酸の増幅反応
（１）ターゲット核酸断片を含む核酸試料液の調製
ＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）３．０ｎｇを９８℃で３ｍｉｎ．加熱を行い、１本鎖にしたのち、７番染色体中の配列の増幅を以下の条件で行った。
【０１０９】
＜プライマー＞
プライマーは、７番染色体中の配列を標的に設計を行った。各プライマーの配列を以下に示す。
【０１１０】
プライマー(5)(Ｆｏｒｗａｒｄ)：
５'−CATTGCTCAGGGGTCTTC−３'（配列番号１１）
プライマー(7)(Ｒｅｖｅｒｓｅ):
５'−GGGCTCATAAGGTGCGTG−３'（配列番号１３）
【０１１１】
上記プライマーの７番染色体中の配列に対する位置関係の詳細を図１０に示した。
ここで、配列Ｘは「5'-GCCGGG-3'」であり、32塩基離れた位置に存在する。プライマー（5）は５’側の配列Ｘの５’側１００塩基以内の領域に対して設計されており、プライマー（7）は３’側の配列Ｘの３’側１００塩基以内の領域の相補鎖に対して設計されている。
【０１１２】
(２)核酸増幅反応
以下に示す反応液の組成で、６０℃、６０分反応させることで増幅反応を実施した。酵素は、ＮＥＢ社のBst.DNA polymeraseを使用した。
＜反応液の組成＞
10×Bst Buffer(DF)                           １．０μＬ
100mM MgSO4                                  ０．６μＬ
10%(v/v) Tween20                             ０．１μＬ
100% DMSO                                    ０．５μＬ
25mM dNTP each                               ０．５６μＬ
SYBR Green I（2000倍）                       ０．２μＬ
50μM primer(5)                              ０．６４μＬ
50μM primer(7)                              ０．６４μＬ
Bst. Polymerase                              ０．４μＬ
１）で得た核酸断片試料液(３．０ｎｇ)         ０．４μＬ
精製水                                       ４．９６μＬ      
１０．０μＬ
【０１１３】
（３）増幅産物の検出
前記（２）における増幅反応を、リアルタイム蛍光検出装置（Ｍｘ３０００ｐ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて蛍光検出を行った。結果を図１１に示す。
Ｍｘ３０００ｐの解析ソフトを用いて、上記のグラフにおいて蛍光量が２５０に到達したときの時間（Ct値）を算出した。Ct値は49.0±5.0分であった。
【０１１４】
【表４】
0005393077.tif 000007
【０１１５】
＜実施例１０＞増幅産物の電気泳動
３ｗｔ％のアガロースゲル、０．５ｘTBEバッファー（50mM Tris, 45mM Boric acid、0.5mM EDTA, pH8.4）を用い、100Vで60分の電気泳動を行った。結果を図１２に示す。電気泳動パターンより、N=2でほぼ同一の増幅産物が得られていることがわかった。これより、増幅産物は同一の反応機構により得られていることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】図１は、実施例で用いたプライマーのβアクチン遺伝子に対する位置関係の詳細を示す。
【図２】図２は、本発明による増幅反応で得られた増幅産物についての蛍光検出の結果を示す。
【図３】図３は、本発明による増幅反応で得られた増幅産物の電気泳動の結果を示す。
【図４】図４は、実施例で用いたプライマーのβ３ＡＲ遺伝子に対する位置関係の詳細を示す。
【図５】図５は、本発明による増幅反応で得られた増幅産物についての蛍光検出の結果を示す。
【図６】図６は、本発明による増幅反応で得られた増幅産物の電気泳動の結果を示す。
【図７】図７は、実施例で用いたプライマーの７番染色体に対する位置関係の詳細を示す。
【図８】図８は、本発明による増幅反応で得られた増幅産物についての蛍光検出の結果を示す。
【図９】図９は、本発明による増幅反応で得られた増幅産物の電気泳動の結果を示す。
【図１０】図１０は、実施例で用いたプライマーの７番染色体に対する位置関係の詳細を示す。
【図１１】図１１は、本発明による増幅反応で得られた増幅産物についての蛍光検出の結果を示す。
【図１２】図１２は、本発明による増幅反応で得られた増幅産物の電気泳動の結果を示す。
【図１３】図１３は、本発明の核酸の増幅方法の第一の態様の概要（前半）を示す。
【図１４】図１４は、本発明の核酸の増幅方法の第一の態様の概要（後半）を示す。
【図１５】図１５は、本発明の核酸の増幅方法の第二の態様の概要（前半）を示す。
【図１６】図１６は、本発明の核酸の増幅方法の第二の態様の概要（後半）を示す。
【図１７】図１７は、本発明の核酸の増幅方法の第三の態様の概要（前半）を示す。
【図１８】図１８は、本発明の核酸の増幅方法の第三の態様の概要（後半）を示す。
【図１】
0005393077.tif 000008
【図２】
0005393077.tif 000009
【図３】
0005393077.tif 000010
【図４】
0005393077.tif 000011
【図５】
0005393077.tif 000012
【図６】
0005393077.tif 000013
【図７】
0005393077.tif 000014
【図８】
0005393077.tif 000015
【図９】
0005393077.tif 000016
【図１０】
0005393077.tif 000017
【図１１】
0005393077.tif 000018
【図１２】
0005393077.tif 000019
【図１３】
0005393077.tif 000020
【図１４】
0005393077.tif 000021
【図１５】
0005393077.tif 000022
【図１６】
0005393077.tif 000023
【図１７】
0005393077.tif 000024
【図１８】
0005393077.tif 000025
【配列表】
0005393077000001.app