(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
７，１０−ジヒドロキシ−８（Ｅ）−オクタデセン酸（７，１０−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−８（Ｅ）−ｏｃｔａｄｅｃｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ、ＤＯＤ）をヘキサンと混合する段階と、前記混合物を熱処理する段階と、を含む７，１０−エポキシ−オクタデカ−７，９−ジエン酸（７，１０−ｅｐｏｘｙ−ｏｃｔａｄｅｃａ−７，９−ｄｉｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）の製造方法。
【請求項２】
前記７，１０−ジヒドロキシ−８（Ｅ）−オクタデセン酸が、オレイン酸及びオレイン酸を含む植物性油の少なくともいずれかを基質として利用して、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）微生物によって生産されることを特徴とする請求項１に記載の７，１０−エポキシ−オクタデカ−７，９−ジエン酸（７，１０−ｅｐｏｘｙ−ｏｃｔａｄｅｃａ−７，９−ｄｉｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）の製造方法。
【請求項３】
前記植物性油が、オリーブ油、紅花油、大豆油、トウモロコシ油、ゴマ油、エゴマ油、ブドウ種子油、唐辛子種油、キャノーラ油、ヒマワリ種子油、甜瓜油、菜種油及び米糠油で構成された群から選ばれたことを特徴とする請求項２に記載の７，１０−エポキシ−オクタデカ−７，９−ジエン酸（７，１０−ｅｐｏｘｙ−ｏｃｔａｄｅｃａ−７，９−ｄｉｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）の製造方法。
【請求項４】
前記微生物が、緑膿菌ＰＲ３（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＲ３，ＮＲＲＬ  ｓｔｒａｉｎ  Ｂ−１８６０２）であることを特徴とする請求項２に記載の７，１０−エポキシ−オクタデカ−７，９−ジエン酸（７，１０−ｅｐｏｘｙ−ｏｃｔａｄｅｃａ−７，９−ｄｉｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）の製造方法。
【請求項５】
前記７，１０−ジヒドロキシ−８（Ｅ）−オクタデセン酸１０ｍｇあたり１０μｌから１，０００μｌのヘキサンを混合することを特徴とする請求項１に記載の７，１０−エポキシ−オクタデカ−７，９−ジエン酸（７，１０−ｅｐｏｘｙ−ｏｃｔａｄｅｃａ−７，９−ｄｉｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）の製造方法。
【請求項６】
前記熱処理が、３０℃から１５０℃で１時間から１５０時間で行うことを特徴とする請求項１に記載の７，１０−エポキシ−オクタデカ−７，９−ジエン酸（７，１０−ｅｐｏｘｙ−ｏｃｔａｄｅｃａ−７，９−ｄｉｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フラン脂肪酸の製造方法に関し、より具体的には、７，１０−ジヒドロキシ８（Ｅ）−オクタデセン酸（７，１０−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−８（Ｅ）−ｏｃｔａｄｅｃｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ；以下、「ＤＯＤ」と称することがある。）をヘキサンで熱処理することを含むフラン脂肪酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
フラン脂肪酸（Ｆｕｒａｎ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ；以下、「Ｆ−ａｃｉｄ」と称することがある。）は、フラン環で特定される大規模なグループの脂肪酸であり、一のα−位置で、炭素数９、１１、又は１３を有する分岐していない脂肪酸鎖（ｕｎｂｒａｎｃｈｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｃｈａｉｎ）、及び他のα−位置で、炭素数３又は５を有する短い直線型鎖アルキル基（ｓｔｒａｉｇｈｔ−ｃｈａｉｎ  ａｌｋｙｌ  ｇｒｏｕｐ）を有している（非特許文献１）。通常、前記のフラン環の２つのβ−位置は、１つ又は２つのメチル残基、又は他の基のいずれかに置換される。また、フラン環のβ−位置において何らの置換もないＦ−ａｃｉｄは、Ｅｘｏｃａｒｐｕｓ  ｃｕｐｒｅｓｓｉｆｏｒｍｉｓの種油（ｓｅｅｄ  ｏｉｌ）から発見された。Ｆ−ａｃｉｄは、植物、魚類、両生類、爬虫類、微生物や人間を含む哺乳動物の微量成分（ｔｒａｃｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）として、自然界に広く分布している（非特許文献１−６）。
【０００３】
生物学的システムにおいて、Ｆ−ａｃｉｄの生物学的役割は、完全に知られてはいないが、Ｆ−ａｃｉｄが、抗酸化剤、抗腫瘍剤及び抗血栓剤（ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ）として作用する、多様で重要な生物学的機能に関連していることが知られている（非特許文献７−９）。一部の魚類で、Ｆ−ａｃｉｄは、間脂質（ｌｉｖｅｒ  ｌｉｐｉｄｓ）で２５％まで含まれ、産卵期の間に蓄積されることで、Ｆ−ａｃｉｄと受精過程（ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ）との間の可能な相関関係を示す（非特許文献１０）。Ｆ−ａｃｉｄの豊富な魚類の消費と冠状動脈性心臓病（ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｈｅａｒｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）の死亡率との相関関係は、幾つかの研究で確認された（非特許文献１１）。また、Ｆ−ａｃｉｄは、血小板凝集に対する阻害効果を有し（非特許文献８）、潜在的抗腫瘍活性を有すると報告されている（非特許文献７）。Ｆ−ａｃｉｄは、リノール酸（ｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）の酸化を防止し（非特許文献１２）、植物で抗酸化剤として作用していることが知られている（非特許文献１３）。一部の研究では、Ｆ−ａｃｉｄが、補助基質（ｃｏ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）として、リノール酸が存在する際に、開環（ｒｉｎｇ  ｏｐｅｎｉｎｇ）により酸化して、ダイオクセン（ｄｉｏｘｏｅｎｅｓ）を形成することで（非特許文献１４−１５）、Ｆ−ａｃｉｄが、ラジカルスカベンジャー（ｒａｄｉｃａｌ  ｓｃａｖｅｎｇｅｒ）として作用することを報告している（非特許文献１６−１７）。
【０００４】
Ｆ−ａｃｉｄの生合成は、複雑で、ソースによって非常に異なる。大部分のＦ−ａｃｉｄの生合成の前駆体は、リノール酸として知られている。植物が、Ｆ−ａｃｉｄの基本骨格を合成すると知られている（非特許文献１８）。しかしながら、魚類に放射性−標識された飼料供給（ｆｅｅｄｉｎｇ）で行われた研究によれば、魚類が前記アルキル側鎖と前記Ｆ−ａｃｉｄのフラン環とを合成できないことが分かる（非特許文献１）。よって、魚類で、Ｆ−ａｃｉｄは、食品（ｄｉｅｔ）、特に鳥類（ａｌｇａｅ）から起源していると考えられる。その結果、Ｆ−ａｃｉｄは、野菜類、魚類などの食品を介して人体に流れ込まれる。食品−由来のＦ−ａｃｉｄは、哺乳動物の組織や血液、特にリン脂質に流れ込まれるが（非特許文献１９）、ラジカルスカベンジャーとして作用して、血小板の凝集を阻害することができる（非特許文献８）。
【０００５】
これらの研究は、Ｆ−ａｃｉｄが、哺乳動物のための必須栄養因子（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ｆａｃｔｏｒ）であるため、機能性食品の有効成分として使用できることを示している。しかしながら、Ｆ−ａｃｉｄの生物学的ソースが何であれ、フラン環の形成及び異なるアルキル置換物のために、多段階反応を必要とする。よって、Ｆ−ａｃｉｄの化学合成は、複雑な多段階の反応及び化学触媒が必要であるので、産業上の利用には容易ではなく、多くの生産コストが必要である。
【０００６】
最近、本発明者らは、微生物変換（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）により、オレイン酸（ｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）を含む植物性油からＤＯＤ（７，１０−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−８（Ｅ）ｏｃｔａｄｅｃｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）を製造した（非特許文献２０）。ＤＯＤは、炭素７、１０で２つのヒドロキシル基と炭素８、９との間のトランス二重結合（ｔｒａｎｓ  ｄｏｕｂｌｅ  ｂｏｎｄ）を唯一に伴うジヒドロキシモノエンＣ１８脂肪酸（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ  ｍｏｎｏｅｎｏｉｃ  Ｃ１８  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ）である。独特の構造的特徴に基づいて、化学的又は物理的方法を通じて分子内や分子間相互作用によって、ＤＯＤ分子を変形することが非常に可能であると考えられる。生物学的及び産業上の利用の目的で、ＤＯＤを変換するための努力の一環として、本発明者らは、単一の熱処理過程を介して、ＤＯＤから新規な生物学的活性Ｆ−ａｃｉｄを製造する、簡易な方法を開発した。
【発明の概要】
【０００７】
したがって、本発明の主な目的は、植物性油から微生物生転換によって製造された７，１０−ジヒドロキシ８（Ｅ）−オクタデセン酸を用いて、単一の熱処理過程で新規な生物学的活性フラン脂肪酸を製造する方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記の方法で製造された新規なフラン脂肪酸を提供することにある。
本発明の更に他の目的は、前記のフラン脂肪酸を含む抗酸化剤を提供することにある。
【０００８】
本発明の一様態によれば、本発明は、７，１０−ジヒドロキシ８（Ｅ）−オクタデセン酸（７，１０−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−８（Ｅ）−  ｏｃｔａｄｅｃｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ；以下、「ＤＯＤ」と称することがある。）をヘキサンと混合する段階と、前記混合物を熱処理する段階と、を含むフラン脂肪酸の製造方法を提供する。
前記の７，１０−ジヒドロキシ８（Ｅ）−オクタデセン酸は、下記式１を有する。
【化１】
0005400103.tif 000002
【０００９】
本発明において、前記の７，１０−ジヒドロキシ８（Ｅ）−オクタデセン酸は、化学的に合成したり、微生物により生産されることができるが、好ましくは、オレイン酸（ｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）やオレイン酸（ｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）を含む植物性油を基質として利用して、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）微生物により生産されることを特徴とする。
【００１０】
本発明において、前記微生物は、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に属する何れの菌株も用いることができるが、好ましくは、緑膿菌ＰＲ３（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＲ３、ＮＲＲＬ  ｓｔｒａｉｎ  Ｂ−１８６０２）であることを特徴とする。
【００１１】
前記緑膿菌ＰＲ３は、米国の農産部研究所の微生物保管所（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｐｅｏｒｉａ、ＩＬ、ＵＳＡ）に受託番号ＮＲＲＬ  Ｂ−１８６０２として寄託されている。
【００１２】
本発明において、前記の７，１０−ジヒドロキシ８（Ｅ）−オクタデセン酸は、ヒドロキシ脂肪酸の一種で、炭素数１８の脂肪酸鎖の上に７番炭素と１０番炭素にそれぞれ１つずつ計２つのヒドロキシル基を有し、８番炭素と９番炭素との間に１つのトランス二重結合を含んでいる構造を特徴とする。
【００１３】
本発明において、前記の７，１０−ジヒドロキシ８（Ｅ）−オクタデセン酸を生産するために使用される基質は、オレイン酸やオレイン酸を含む天然植物性油もよいが、好ましくは、オリーブ油、紅花油、大豆油、トウモロコシ油、ゴマ油、エゴマ油、ブドウ種子油、唐辛子種油、キャノーラ油、ヒマワリ種子油、甜瓜油、菜種油、米糠油などが使用できる。
【００１４】
前記の天然植物性油は、従来、天然の植物の種子や実から油を抽出するために多く使われてきた溶媒抽出法や加圧抽出法などの方法でも準備することができ、市場で手軽に購入することもできる。
【００１５】
本発明において、前記フラン脂肪酸（Ｆｕｒａｎ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ；以下、「Ｆ−ａｃｉｄ」と称することがある。）は、フラン環で特定される大規模なグループの脂肪酸で、植物、魚類、両生類、爬虫類、微生物及び人間を含む哺乳動物の微量成分（ｔｒａｃｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）として自然界に広く分布している。前記背景技術で述べたように、フラン脂肪酸の様々な生物学的機能により、フラン脂肪酸は、哺乳動物のための必須栄養因子（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ｆａｃｔｏｒ）で、機能性食品の有効成分として使用できるという事実は、非常に重要である。
【００１６】
本発明に係るフラン脂肪酸は、７，１０−エポキシ−オクタデカ−７，９−ジエン酸（７，１０−ｅｐｏｘｙ−ｏｃｔａｄｅｃａ−７，９−ｄｉｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ；以下、「７，１０−ＥＯＤＡ」と称することがある。）である。以前に知られているフラン脂肪酸の場合、自然界では、主に魚から僅かに発見されているが、ほとんどフラン環にメチル基を１つ又は２つ持っている形態で現れている。側鎖の長さは、多様に示されているが、人の血液中にも少量含まれていることが知られている。しかしながら、メチル基を持っていない形は、自然界ではほとんど知られていないため、リノール酸をリポキシゲナーゼ（ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ）で処理する場合、中間生成物として少量生産され得ると報告されている。しかしながら、この場合に生成されるフラン脂肪酸の構造は、本発明で確認されたものとはフラン環の位置が異なって示されている。つまり、１０番炭素と１３番炭素との間でエポキシ構造をしている。このように、本発明により製造された新たなフラン脂肪酸は、まだ学界に報告されていない新たな物質である。
【００１７】
本発明において、前記ＤＯＤとヘキサンの混合段階では、ＤＯＤとヘキサンの混合比率は、適切に選択可能であるが、ＤＯＤの円滑な混合及び生成反応を円滑にするために使用されたＤＯＤ量の０．００１倍〜１，０００倍に相当するヘキサンを使用することができる。好ましくは、ＤＯＤの１０ｍｇあたり１０μｌ〜１，０００μｌのヘキサンを混合することができる。
【００１８】
本発明のフラン脂肪酸の製造方法では、前記熱処理は３０℃〜１５０℃で１時間〜１５０時間の間に実行されることを特徴とする。好ましくは、８５℃〜９５℃で３６時間〜９６時間行うことができる。本発明の実験結果から、８５℃〜９５℃で、７，１０−ＥＯＤＡ生成率は、７０％〜８０％の範囲で非常に高い。また、反応時間を増やすことは、温度の上昇と同じ結果を示す。このように、７，１０−ＥＯＤＡの形成は、１２時間から９６時間までで開始まり、３６時間から９６時間まででピークを示した（図６及び７を参照）。
【００１９】
本発明の別の様態によれば、本発明は、７，１０−ジヒドロキシ８（Ｅ）−オクタデセン酸（ＤＯＤ）をヘキサンで熱処理することにより、製造される７，１０−エポキシ−オクタデカ−７，９−ジエン酸（７，１０−ＥＯＤＡ）を提供する。
【００２０】
本発明の方法で製造されたフラン脂肪酸は、７，１０−エポキシ−オクタデカ−７，９−ジエン酸（７，１０−ＥＯＤＡ）である。自然界に存在する知られているフラン脂肪酸は、ほとんどフラン環にメチル基を１つ又は２つ持っている形態で示されている一方、本発明のフラン脂肪酸は、メチル基を持っていない。また、本発明の方法で製造されたフラン脂肪酸は、化学的触媒を使用せず、単一の熱処理段階でＤＯＤから新規なフラン脂肪酸を製造するのに十分である。
【００２１】
本発明の実施例によれば、本発明者らは熱処理を行うことにより、ＤＯＤから新規な生理活性の化合物を製造できることを初めて発見した。精製された生成物の化学的分析は、新規なフラン脂肪酸が生成されたことを証明している。フラン脂肪酸は、７，１０−エポキシ−オクタデカ−７，９−ジエン酸（７，１０−ＥＯＤＡ）で確認された（図５及び実験結果２参照）。
【００２２】
本発明の別の様態によれば、本発明は、前記７，１０−エポキシ−オクタデカ−７，９−ジエン酸（７，１０−ＥＯＤＡ）を含む抗酸化剤を提供する。前記背景技術で詳述したように、フラン脂肪酸が抗酸化活性を含んでいることが報告されているので、本発明の７，１０−ＥＯＤＡの抗酸化活性をラジカル消去活性として表すＤＰＰＨ分析を利用して確認し、その結果、７，１０−ＥＯＤＡのラジカル消去活性は、処理用量依存的に増加した。前記の活性が、α−トコフェロール又はアスコルビン酸と比較して相対的に低かったが、７，１０−ＥＯＤＡは、処理容量−依存的に明らかなラジカル消去活性を示した（図８参照）。したがって、本発明に係るフラン脂肪酸は、抗酸化活性を持つ抗酸化剤として様々な産業分野に適用することができる。
【００２３】
以上説明したように、本発明によれば、植物性油から微生物生転換によって製造された７，１０−ジヒドロキシ８（Ｅ）−オクタデセン酸（ＤＯＤ）から、単一の熱処理段階を経て新規な生物学的活性フラン脂肪酸を製造することができる。ペルオキシルラジカル（ｐｅｒｏｘｙｌ  ｒａｄｉｃａｌｓ）による攻撃、少量であることによる自然のフラン脂肪酸を精製する際の難しさ、及び複雑で高コストの化学的合成の短点を考慮すると、本発明は、費用−効率的な方法で大規模に生物学的活性のフラン脂肪酸を製造するのに有効である。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例に基づいて、本発明を更に詳細に説明することにする。これらの実施例は、単に本発明を例示するものであるため、本発明の範囲が、これらの実施例によって制限されるものと解釈されない。
【００２５】
実験材料
オリーブ油（ｅｘｔｒａ  ｖｉｒｇｉｎ  ｇｒａｄｅ）は、国内市場で購入した。ヘプタデカン酸（Ｈｅｐｔａｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ．、Ｃ１７：０）は、Ｎｕ−Ｃｈｅｋ  Ｐｒｅｐ（Ｅｌｙｓｉａｎ  ＭＮ、ＵＳＡ）から購入した。トリメチルシリルイミダゾール（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ＴＭＳＩ）とピリジン（ｐｙｒｉｄｉｎｅ、１：４、ｖ／ｖ）との混合物は、Ｓｕｐｅｌｃｏ（Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ、ＰＡ．ＵＳＡ）から購入した。薄層プリコートされたＫｉｅｓｅｌｇｅｌ  ６０Ｆ２５４プレートは、ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｃｈｅｒｒｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ、ＵＳＡ）から入手した。シリカゲル、ＤａｖｉｓｉｌＴＭ、ｇｒａｄｅ  ６３５、６０−１００ｍｅｓｈ、６０Ａ、９９＋％及び他の化学剤は、特に言及しない限り、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入した。他の全ての化学剤は、試薬級で追加の精製なしに使用された。
【００２６】
実施例１．  ＤＯＤの製造
ＤＯＤ（７，１０−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−８（Ｅ）−  ｏｃｔａｄｅｃｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）は、本発明者の以前の報告書（２１）に基づいて製造した。簡単に説明すると、オリーブ油（１％、ｖ／ｖ）を振とう培養機で２８℃、２００  ｒｐｍで好気性に培養されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＲ３（ＮＲＲＬ  ｓｔｒａｉｎ  Ｂ−１８６０２）の２４時間培養物に基質として添加した後、７２時間の間追加培養した。同量のエチルアセテートで前記培養物を抽出して得られたＤＯＤ粗抽出物（ｃｒｕｄｅ  ＤＯＤ  ｅｘｔｒａｃｔ）を精製するために、シリカゲルカラム（１．５ｃｍ  Ｉ．Ｄ×３０ｃｍ）を使用している。分画は、ヘキサンとエチルアセテートの様々な比率で、２倍カラム容量の溶媒混合物で行われた。
【００２７】
実施例２．熱処理によるＤＯＤからＥＯＤＡの生産
熱処理によるＤＯＤの転換は、１０ｍｇ  ＤＯＤと、溶媒として５００μｌヘキサンを含む４ｍｌのガラスバイアルで行われた。前記混合物を９０℃で２４時間加熱ブロック（ｈｅａｔ  ｂｌｏｃｋ；Ｂａｒｎｓｔｅａｄ  ／  Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ  Ｔｙｐｅ  １７６０００  Ｄｒｉ−Ｂａｔｈ）で反応させた。前記の処理後、窒素フラッシング（ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｆｌｕｓｈｉｎｇ）を利用して溶媒を除去し、反応生成物をクロロホルムとメタノール（１：１、ｖ／ｖ）との混合物に溶かした。時間による（ｔｉｍｅ−ｃｏｕｒｓｅｄ）生成物の分析のために、１０ｍｇのＤＯＤを含むバイアルを９０℃で熱処理し、提示された時間後に回収した。
【００２８】
実施例３．反応生成物の分析
反応生成物は、ＴＬＣで解析され、内部標準（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｓｔａｎｄａｒｄ）であるヘプタデカン酸（ｈｅｐｔａｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）でＧＣ分析して定量された。ＴＬＣ分析は、溶媒システム（ｔｏｌｕｅｎｅ：１，４  ｄｉｏｘａｎｅ：ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ．、７９：１４：７、ｖ／ｖ／ｖ）で行い、スポット（ｓｐｏｔｓ）を５０％硫酸（ｓｕｌｆｕｒｉｃ  ａｃｉｄ）でプレートに噴射し、９５℃で１０分間熱処理することにより可視化した。ＧＣ分析のために、室温で５分間ジアゾメタン（ｄｉａｚｏｍｅｔｈａｎｅ）にメチル化されたサンプルを炎イオン化検出器（ｆｌａｍｅ−ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ）と毛細管カラム（ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｃｏｌｕｍｎ、ＳＰＢ−１ＴＭ、１５ｍｘ０．３２ｍｍ  ｉ．ｄ．、０．２５μｍｔｈｉｃｋｎｅｓｓ、  Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｉｎｃ．、Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ、ＰＡ、ＵＳＡ）を装備されたガスクロマトグラフィー（ＡＣＭＥ  ６１００  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｇａｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｓｙｓｔｅｍ；Ｙｏｕｎｌｉｎ  Ｃｏ．、Ｋｏｒｅａ）で分析した。ＧＣは、１００℃で１５０℃まで２０℃／ｍｉｎ、１５０℃で２００℃まで５℃／ｍｉｎ、及び２００℃で２１０℃まで０．５℃／ｍｉｎの温度勾配で行った後、３００℃で１０分間維持することにより進行した。インジェクターとディテクターの温度は、それぞれ２７０及び２８０℃に設定した。
【００２９】
精製された目的生成物の化学的構造は、ＧＣ／ＭＳ、ＮＭＲ、ＦＴＩＲで決定された。電子衝撃質量分析（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ−ｉｍｐａｃｔ（ＥＩ）ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒａ）は、Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  ５９７２  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｍａｓｓ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒと繋がっているＨｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  ５８９０  ＧＣ（Ａｖｏｎｄａｌｅ、ＰＡ、ＵＳＡ）を得た。コラム排出口は、イオンソースに直接繋がっている。分離は、７０℃から１３０℃まで２０℃／ｍｉｎ、１７０℃で１分間保持、及び２５０℃まで５℃／ｍｉｎの温度勾配に続き、１５分間保持することで、メチルシリコーンカラム（ｍｅｔｈｙｌｓｉｌｉｃｏｎｅ  ｃｏｌｕｍｎ、３０ｍ×０．２５ｍｍ  ｉ．ｄ．、膜厚：０．２５μｍ）で行われた。１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲ  ｓｐｅｃｔｒａは、それぞれ４００及び１００  ＭＨｚの周波数で動作する、Ｖａｒｉａｎ−５００  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて、重水素化されたクロロホルム（ｄｅｕｔｅｒａｔｅｄ  ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）で測定された。精製された生成物のＦＴＩＲ分析は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｆｏｕｒｉｅｒ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ  Ｍｏｄｅｌ  １７５０  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｏａｋｂｒｏｏｋ、ＩＬ、ＵＳＡ）のＫＢｒ上のフィルムで行われた。
【００３０】
抗酸化活性は、以前の研究によってＤＰＰＨ（２，２−Ｄｉｐｈｅｎｙｌ−１−ｐｉｃｒｙｈｙｄｒａｚｙｌ）を用いて分析された（２２）。簡単に説明すると、９６ウェルプレートで５０μｌのサンプル溶液を含むＤＭＳＯに２００μｌの２００μＭ  ＤＰＰＨラジカル溶液を添加した。Ｌ−アスコルビン酸及びα−トコフェロールが対照群として使用された。３７℃で反応３０分後、５１５ｎｍで吸光度を測定した。ＤＰＰＨフリーラジカル消去能は、次の式を用いて計算した：ＤＰＰＨフリーラジカル消去能（％）＝［１−（Ａｓａｍｐｌｅ−Ａｂｌａｎｋ）／（Ａｃｏｎｔｒｏｌ−Ａｂｌａｎｋ）］ｘ１００。ＤＭＳＯは、対照群として使用された。
【００３１】
実験結果１．主生成物の製造と分離
９０℃で２４時間、ヘキサンでＤＯＤの熱処理で得られた一つの主生成物を含んでいる幾つかの混合物は、ＴＬＣ（Ｒｆ＝７．２、図１のＢ）とＧＣ（ｐｅａｋ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ＝８．２−８．４ｍｉｎ、図１のＡ）で分析された。これらの生成物は、シリカゲルカラムを用いて精製された。ターゲット化合物（ｕｎｋｎｏｗｎ）は、ヘキサン：エチルアセテート（８：２、ｖ／ｖ）の分画から得られた。白色の結晶質−類似粉末（ｗｈｉｔｅ  ｃｒｙｓｔａｌ−ｌｉｋｅ  ｐｏｗｄｅｒ）を持つ精製した生成物は、ＧＣ（図２のＡ）により９６％以上の純度を持つ、単一の主なピークとして確認され、ＴＬＣ分析（図２のＢ）で、１つの主なスポットとして示された。
【００３２】
実験結果２．構造決定
精製したターゲットの生成物の構造決定のために、ＧＣ／ＭＳ、ＦＴＩＲ及びＮＭＲが使用された。メチル化された生成物の電子衝撃質量分析（ｅｌｅｃｔｒｏｎ−ｉｍｐａｃｔ  ＧＣ／ＭＳ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ）とそれに伴う構造は、図３に示した。精製された生成物の質量分析は、フラグメントグラム（ｆｒａｇｍｅｎｔｏｇｒａｍ）で６つの主要ピークとして示された。フラン環の両側面でβ切断から９５ｍ／ｚでフラン断片を獲得し、１９３ｍ／ｚ及び２０９ｍ／ｚで強いピーク（ｉｎｔｅｎｓｅ  ｐｅａｋ）を示すイオンは、それぞれメチル及びメチル化されたカルボキシル末端の方向にフラノイド環（ｆｕｒａｎｏｉｄ  ｒｉｎｇ）のβ切断（ｂｅｔａ−ｃｌｅａｖａｇｅ）によって形成された。メトキシ基の消失の証拠は、２７７ｍ／ｚで示された。このようなＧＣ／ＭＳ分析のパターンは、化学的に合成された９，１２−エポキシ−オクタデカ−９，１１−ジエン酸（９，１２−ｅｐｏｘｙ−ｏｃｔａｄｅｃａ−９，１１−ｄｉｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）の場合と非常に類似している（２３）。９，１２−エポキシ−オクタデカ−９，１１−ジエン酸は、７，１０−ＥＯＤＡとは全く異なる物質であるが、７，１０−ＥＯＤＡに比べて、カルボキシル基から離れているフラン環の位置が、２つの炭素分だけ更に遠くに存在する物質である。
【００３３】
前記ＧＣ−ＭＳ分析で得られたスペクトラムを用いて、目標生成物の構造を推定した結果、図３に示すような構造が導出された。つまり、７番炭素と１０番炭素との間で酸素原子で接続されたエポキシ構造を含んでおり、７〜８番炭素間と９〜１０番炭素間に２つの二重結合を持つ形でフラン脂肪酸の構造をしていると推定した。ＧＣ−ＭＳ  スペクトラムのフラグメントパターンが、推定された構造と正確に一致していることが分かる。
【００３４】
フラン脂肪酸の場合、自然界で、主に魚から少量発見されているが、ほとんどフラン環にメチル基を１つ又は２つ持っている形態で示されている。側鎖の長さは、多様に示されており、人の血液中にも少量含まれていることが知られている。しかしながら、メチル基を持たない形は、自然界ではほとんど知られていないため、リノール酸をリポキシゲナーゼで処理する場合、中間生成物として少量生産され得ると報告されている。また、この場合に生成されるフラン脂肪酸の構造は、本発明で確認されたものとはフラン環の位置が異なって示されている。つまり、１０番炭素と１３番炭素との間でエポキシ構造をしている。
【００３５】
以上の結果から、本発明により製造された新たなフラン脂肪酸は、まだ学界に報告されていない新たな物質であることを確認することができた。したがって、新たな生成物の推定の構造を検証するために、ＮＭＲとＦＴＩＲを用いて構造解析を実施した。
【００３６】
ＦＴＩＲ分析は、１７１０（ｃａｒｂｏｎｙｌ）、７８０（ｏｕｔ  ｏｆ  ｐｌａｎｅδＣＨ）、１２５０（ｉｎ  ｐｌａｎｅδＣＨ）、及び１５６７（Ｃ＝Ｃ、ｆｕｒａｎ）で幾つかの特徴的なピーク（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｓ）（ｃｍ−１）を示した（図４）。全体のピークのパターンは、合成フラン分子に対する他の研究者らのデータと非常に類似している（２４）。ＮＭＲ分析で精製した生成物の確認された構造を検証した。共鳴信号（ｐｐｍ）とそれに伴う分子指定（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔｓ）は、次の通りである。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：２．３４（２Ｈ、ＣＨ２ＣＯＯＨ）、５．８４（２Ｈ、ｆｕｒａｎ）、２．５７（４Ｈ、２ｘＣＨ２−ｆｕｒａｎ）、０．８９（３Ｈ、ＣＨ３）、１．２８−１．６１（１８Ｈ、９−ＣＨ２−）、及び１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）は、１０４．８１、１０５．０２、１５４．０９及び１５４．８１（それぞれＣ７、Ｃ８、Ｃ９、及びＣ１０）で、フラン環、１４．１１（Ｃ１８）で、−ＣＨ３、及び１７８．６４（Ｃ１）のカルボキシル炭素（ｃａｒｂｏｘｙｌ  ｃａｒｂｏｎ）の存在が確認された。他の炭素は、３３．７８（Ｃ２）、２４．４５（Ｃ３）、２７．２２（Ｃ４）、２９．７１（Ｃ５）、３３．７８（Ｃ６）、３１．８７（Ｃ１１）、２９．３５（Ｃ１２）、２７．８４（Ｃ１３）、２８．５８（Ｃ１４）、２９．２４（Ｃ１５）、３１．９４（Ｃ１６）、及び２２．６７（Ｃ１７）にあった。ＧＣ−ＭＳ、ＦＴＩＲ及びＮＭＲ解析から得たデータは、精製した生成物が、分子量が２９４（ＧＣ／ＭＳ分析により分子量を確認）である７，１０−ｅｐｏｘｙ−ｏｃｔａｄｅｃａ−７，９−ｄｉｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄであることを確認した（図５）。前記の構造に基づいて、これらの化合物を７，１０−ＥＯＤＡと命名した。
【００３７】
置換基のないフラン脂肪酸の化学的合成は、一部の異性質体Ｃ１８フランを含む脂肪酸が、複雑な段階と複数の触媒を用いてフランから化学的に合成されるということが、Ｌｉｅ  Ｋｅｎ  Ｊｉｅ等によって最初に報告された（２４）。また、Ａｌａｉｚなどは、９，１２−ｅｐｏｘｙ−ｏｃｔａｄｅｃａ−９，１１−ｄｉｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄの化学的触媒で複数の化学的段階を経てリシノル酸（ｒｅｃｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）から合成されることを報告した（２５）。しかしながら、本発明では、化学的触媒は、使用されなかった。代わりに、単一の熱処理段階でＤＯＤから新規なフラン脂肪酸を製造するのに十分であった。これは、熱処理により、ＤＯＤから新規なフラン脂肪酸が単一の段階（ｏｎｅ−ｓｔｅｐ）で混合され得ることを初めて発見したものである。本発明者は、データベース検索（ＮＩＳＴ  ＭＳ  Ｓｅａｒｃｈ  ２．０  ａｎｄ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｓｏｆｔ  Ｃｈｅｍ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｖｅｒ．５）によって、ＥＯＤＡが新たに合成されたフラン脂肪酸であることを確認し、他のＦ−ａｃｉｄと比較して、本発明の化合物についての情報がないことを確認した。
【００３８】
実験結果３．時間による生成物と抗酸化活性
実施例２の方法で反応温度を変化させながら反応温度に応じて生成されるＥＯＤＡ量を図６に示した。図６に示されるように、反応温度が高いほど、反応時間が長くなるほど、ＥＯＤＡの生産量が増加すると示されているが、最大の生成効率は、８０％程度を示した。最大の生成効率を得るためには、反応温度が８５℃以上を維持し、反応時間も４８時間程度を保持しなければならないことがわかった。
【００３９】
したがって、７，１０−ＥＯＤＡの時間による生成は、９０℃で９６時間の間研究された。図７に示されているように、７，１０−ＥＯＤＡの生成は、時間に比例して４８時間まで増加し、その後の上昇が止まった。これらの条件下で、最大の生成収率は、８２％を示した。
【００４０】
フラン脂肪酸が抗酸化活性を含むと報告されているため、７，１０−ＥＯＤＡの抗酸化活性をラジカル消去活性で示すＤＰＰＨ分析を利用して確認し、ＤＯＤと比較した（図８）。７，１０−ＥＯＤＡのラジカル消去活性は、濃度−依存的に増加して試験された最高濃度（１００μｇ／ｍｌ）で２３％を示した一方、ＤＯＤは、いずれの活性も認められなかった。前記の活性がα−トコフェロール又はアスコルビン酸と比較して相対的に低かったが、７，１０−ＥＯＤＡは、濃度−依存的に明白なラジカル消去活性を示した。これらの結果は、Ｆ−ａｃｉｄが抗酸化活性を示すという以前の推定を確認した。フラン脂肪酸は、ヒドロキシルラジカルの強力なスカベンジャーであり、一重項酸素（ｓｉｎｇｌｅｔ  ｏｘｙｇｅｎ）によって誘導される赤血球の溶血（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ）を阻害し、サケのフォスファチジルコリンのｓｎ１の位置のみで発見される（２６）。食品由来のＦ−ａｃｉｄは、哺乳動物の組織や血液、特にリン脂質に供給されるが、部分的に多価不飽和脂肪酸（ＰｏｌｙＵｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄ；ＰＵＦＡ）を取り替える（２７）。このようなＦ−ａｃｉｄの生化学的、生物学的研究に基づいて、Ｆ−ａｃｉｄが、ヒトを含む哺乳動物で決定的に重要な抗酸化物質として作用できると思うのは当然なことである。このため、Ｆ−ａｃｉｄの低コスト−高効率生産のための簡便な方法の新たな発見は、意味がある。
【００４１】
纏めると、本発明は、ジヒドロキシ脂肪酸の前駆体から７，１０−ＥＯＤＡを生産する簡便な方法を提示する。ペルオキシルラジカルによる攻撃、少量であることによる自然のフラン脂肪酸を精製する際の難しさ、及び複雑で高コストの化学的合成の短点を考慮する場合、本発明は、費用−効率的な方法で大規模に生物学的活性のＦ−ａｃｉｄを生産するための有用な情報を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００４２】
【非特許文献１】Ｇｌａｓｓ，Ｒ．Ｌ．；Ｋｒｉｃｋ，Ｔ．Ｐ．；Ｓａｎｄ，Ｄ．Ｍ．；Ｒａｈｎ，Ｃ．Ｈ．；Ｓｃｈｌｅｎｋ，Ｈ．  Ｆｕｒａｎｏｉｄ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｆｉｓｈ  Ｌｉｐｉｄｓ．  Ｌｉｐｉｄｓ，１９７５，１０，６９５７０２．
【非特許文献２】Ｇｌａｓｓ，Ｒ．Ｌ．；Ｋｒｉｃｋ，Ｔ．Ｐ．；Ｅｃｋｈａｒｄｔ，Ａ．  Ｅ．  Ｎｅｗ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｐｉｋｅ（Ｅｓｏｘ  Ｉｎｄｕｓ）．  Ｌｉｐｉｄｓ，１９７４，９，１００４−１００８．
【非特許文献３】Ｇｕｎｓｔｏｎｅ，Ｆ．Ｄ．；Ｗｉｊｅｓｕｎｄｅｒａ，Ｒ．Ｃ．；Ｓｃｒｉｍｇｅｏｕｒ，Ｃ．Ｍ．  Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ａｃｉｄｓ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｍａｒｉｎｅ  ａｎｄ  Ｆｒｅｓｈｗａｔｅｒ  Ｓｐｅｃｉｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｔｏ  Ｆｕｒａｎ−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ａｃｉｄｓ．  Ｊ．  Ｓｃｉ．  Ｆｏｏｄ  Ａｇｒｉｃ．  １９７８，２９，５３９−５５０．
【非特許文献４】Ｈａｎｎｅｍａｎｎ，Ｋ．；Ｐｕｃｈｔａ，Ｖ．；Ｓｉｍｏｎ，Ｅ．；Ｚｉｅｇｌｅｒ，Ｈ．；Ｚｉｅｇｌｅｒ，Ｇ．；Ｓｐｉｔｅｌｌｅｒ，Ｇ．  Ｔｈｅ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｆｕｒａｎ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔｓ．  Ｌｉｐｉｄｓ，１９８９，２４，２９６−２９８．
【非特許文献５】Ｉｓｈｉｉ，Ｋ．；Ｏｋａｊｉｍａ，Ｈ．；Ｏｋａｄａ，Ｙ．；Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｈ．  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  Ｆｕｒａｎ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄｓ  ｏｆ  Ｓａｌｍｏｎ  Ｒｏｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ），１９８８，１０３，８３６−８３９．
【非特許文献６】Ｏｔａ，Ｔ．；Ｔａｋａｇｉ，Ｔ．  Ｆｕｒａｎ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｌｉｐｉｄｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｒｅｓｔｈｅａｄ  Ｆｌｏｕｎｄｅｒ．  Ｎｉｐｐｏｎ  Ｓｕｉｓａｎ  Ｇａｋｋａｉｓｈｉ，１９９２，５８，７２１−７２５．
【非特許文献７】Ｉｓｈｉｉ，Ｋ．；Ｏｋａｊｉｍａ，Ｈ．；Ｏｋａｄａ，Ｙ．；Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｈ．  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｆｕｒａｎ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄ  ｏｎ  Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ．  Ｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｕｌｌ．  １９８９，３７，１３９６−１３９８．
【非特許文献８】Ｇｒａｆｔ，Ｇ．；Ｇｅｌｌｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｌ．；Ｓａｎｄ，Ｄ．Ｍ．；Ｓｃｈｌｅｎｋ，Ｈ．  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｄｉｏｘｏ−ｅｎｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，１９８４，７９９，１４３−１５０．
【非特許文献９】Ｏｋａｄａ，Ｙ．；Ｋａｎｅｋｏ，Ｍ．；Ｏｋａｊｉｍａ，Ｈ．  Ｈｙｄｒｏｘｙ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌｌｙ  Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  Ｆｕｒａｎ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄｓ．  Ｂｉｏｌ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｕｌｌ．  １９９６，１９，１６０７−１６１０．
【非特許文献１０】Ｇｌａｓｓ，Ｒ．Ｌ．；Ｋｒｉｃｋ，Ｔ．Ｐ．；Ｏｌｓｏｎ，Ｄ．Ｌ．；Ｔｈｏｒｓｏｎ，Ｒ．Ｌ．  Ｔｈｅ  Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｕｒａｎ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｓｐａｗｎｉｎｇ  Ｍａｌｅ  Ｆｒｅｓｈｗａｔｅｒ  Ｆｉｓｈ．  Ｌｉｐｉｄｓ，１９７７，１２，８２８−８３６．
【非特許文献１１】Ｓｐｉｔｅｌｌｅｒ，Ｇ．  Ｆｕｒａｎ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ：Ｏｃｃｕｒｅｎｃｅｓ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ．  Ａｒｅ  ｆｕｒａｎ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａ  ｆｉｓｈ  ｄｉｅｔ  Ｌｉｐｉｄｓ，２００５，４０，７５５−７７１．
【非特許文献１２】Ｏｋａｄａ，Ｙ．；Ｏｋａｊｉｍａ，Ｈ．；Ｋｏｎｉｓｈｉ，Ｈ．；Ｔｅｒａｕｃｈｉ，Ｍ．；Ｉｓｈｉｉ，Ｋ．；Ｌｉｕ，Ｉ．Ｍ．；Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｈ．  Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌｌｙ  Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  Ｆｕｒａｎ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄｓ  ｏｎ  Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｎｏｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ｉｎ  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １９９０，６７，８５８−８６２．
【非特許文献１３】Ｂａｔｎａ，Ａ．；Ｓｐｉｔｅｌｌｅｒ，Ｇ．  Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｕｒａｎ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄｓ  ｂｙ  Ｓｏｙｂｅａｎ  Ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ−１  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｌｉｎｏｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｐｈｙｓ．  Ｌｉｐｉｄｓ，１９９４，７０，１７９−１８５．
【非特許文献１４】Ｊａｎｄｋｅ，Ｊ．；Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｊ．；Ｓｐｉｔｅｌｌｅｒ,  Ｇ．ｄａｓ  Ｖｅｒｈａｌｔｅｎ  ｖｏｎ  Ｆ−Ｓａｕｒｅｎ  ｂｅｉ  ｄｅｒ  Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｍｉｔ  Ｌｉｐｏｘｙｄａｓｅ  ｉｎ  Ａｎｗｅｓｅｎｈｅｉｔ  ｖｏｎ  ＳＨ−ｈａｌｔｉｇｅｎ  Ｖｅｒｂｉｎｄｕｎｇｅｎ，ｌｉｅｂｉｇｓ  Ａｎｎ．  Ｃｈｅｍ．１９８８，２９−３４．
【非特許文献１５】Ｓｃｈ，Ｒ．；Ｓｐｉｔｅｌｌｅｒ，Ｇ．  Ｕｂｅｒ  ｄｉｅ  Ｓｔｒｕｋｔｕｒａｕｆｋｌｖｏｎ（Ｈｙｄｒｏｘｙ−ｏｘｏ−ｃｙｃｌｏｐｅｎｔｅｎｙｌ）ａｌｋａｎｓａｕｒｅｎ，ｄｅｎ  Ａｌｄｏｌｋｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎｓｐｒｏｄｕｋｔｅｎ  ｖｏｎ  Ｄｉｏｘｏｅｎ  ｃａｒｂｏｎｓａｕｓ  Ｒｉｎｄｅｒｌｅｂｅｒ．  ＨｅＩｖ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ，１９８５，６８，１６２４−１６３４．
【非特許文献１６】Ｆｕｃｈｓ，Ｃ．；Ｓｐｉｔｅｌｌｅｒ，Ｇ．  Ｉｒｏｎ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｓｉｔｅ  ｏｆ  Ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ，Ｚ．  Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．  ２０００，５５，６４３−６４８
【非特許文献１７】Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ，Ｂ．；Ｇｕｔｔｅｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｍ．Ｃ．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｍｅｔａｌ  Ｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ：  Ａｎ  Ｏｖｅｒｖｉｅｗ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９０，１８６，１−８５．
【非特許文献１８】Ｓｃｈｅｉｎｋｏｎｉｇ，Ｊ．；Ｈａｎｎｅｍａｎｎ，Ｋ．；Ｓｐｉｔｅｌｌｅｒ，Ｇ．  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  β−Ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｕｒａｎ  Ｒｉｎｇ  ｉｎ  Ｆ−ａｃｉｄ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，１９９５，１２５４，７３−７６．
【非特許文献１９】Ｐｕｃｈｔａ，Ｖ．；Ｓｐｉｔｅｌｌｅｒ，Ｇ．；Ｗｅｉｄｉｎｇｅｒ，Ｈ．  Ｆ−Ｓ：  Ｅｉｎｅ  ｂｉｓｈｅｒ  ｕｎｂｅｋａｎｎｔｅ  Ｋｏｍｐｏｎｅｎｔｅ  ｄｅｒ  Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｅ  ｄｅｓ  Ｈｕｍａｎｂｌｕｔｅｓ，Ｌｉｅｂｉｇｓ  Ａｎｎ．  Ｃｈｅｍ．１９８８，２５−２８．
【非特許文献２０】Ｃｈａｎｇ，Ｉ．Ａ．；Ｋｉｍ，Ｉ．Ｈ．；Ｋａｎｇ，Ｓ．Ｃ．；Ｈｏｕ，Ｃ．Ｔ．；Ｋｉｍ，Ｈ．Ｒ．  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ７，１０−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−８（Ｅ）−ｏｃｔａｄｅｃｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｒｏｍ  ｔｒｉｏｌｅｉｎ  ｖｉａ  ｌｉｐａｓｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａ  ｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＲ３．  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７，７４，３０１−３０６．
【００４３】
参考文献
（２）Ｍｏｒｒｉｓ，Ｌ．Ｊ．；Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｍ．Ｏ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｗ．  Ａ  Ｕｎｉｑｕｅ  Ｆｕｒａｎｏｉｄ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄ  ｆｒｏｍ  Ｅｘｏｃａｒｐｕｓ  ｓｅｅｄ  ｏｉｌ．  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  １９６６，１６，４２４９−４２５３．
（２２）Ｔｅｐｅ，Ｂ．；Ｄａｆｅｒｅｒａ，Ｄ．；Ｔｅｐｅ，Ａ．Ｓ．；Ｐｏｌｉｓｓｉｏｕ，Ｐ．；Ｓｏｋｍｅｎ，Ａ．  Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｏｉｌ  ａｎｄ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｅｘｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  Ｎｅｐｅｔａ  ｆｌａｖｉｄａ  Ｈｕｂ−Ｍｏｒ  ｆｒｏｍ  Ｔｕｒｋｅｙ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．  ２００７，１０３，１３５８−１３６４
（２３）Ｌｉｅ  Ｋｅｎ  Ｊｉｅ，Ｍ．Ｓ．Ｆ．；Ｗｏｎｇ，Ｋ．Ｐ．  Ａ  Ｎｏｖｅｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｅｔｈｙｌ  ｇｒｏｕｐ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｆｕｒａｎ  ｒｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ２，５−ｄｉｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  Ｃ１８  ｆｕｒａｎｏｉｄ  ｆａｔｔｙ  ｅｓｔｅｒ  ｖｉａ  ａ  ｍａｌｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｌｉｐｉｄｓ，１９９１，２６，８３７−８４２．
（２４）Ｌｉｅ  Ｋｅｎ  Ｊｉｅ，Ｍ．Ｓ．Ｆ．；Ｌａｍ，Ｃ．Ｈ．  Ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ：  Ｐａｒｔ  ＸＶＩ．  Ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａｌｌ  ｉｓｏｍｅｒｉｃ  Ｃ１８  ｆｕｒａｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ．  Ｃｈｅｍ．  Ｐｈｙｓ．  Ｌｉｐｉｄｓ，１９７８，２１，２７５−２８７．
（２５）Ａｌａｉｚ，Ｍ．；Ｈｉｄａｌｇｏ，Ｆ．Ｊ．；Ｚａｍｏｒａ，Ｒ．；Ｍｉｌｌａｎ，Ｆ．；Ｍａｚａ，Ｍ．Ｐ．；Ｖｉｏｑｕｅ，Ｅ．  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ９，１２−ｅｐｏｘｙ  ｏｃｔａｄｅｃａ−９，１１−ｄｉｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｐｈｙｓ．  Ｌｉｐｉｄｓ，１９８８，４８，２８９−２９２．
（２６）Ｗｈｉｔｅ，Ｄ．Ｃ．；Ｇｅｙｅｒ，Ｒ．；Ｐｅａｃｏｃｋ，Ａ．Ｄ．；Ｈｅｄｒｉｃｋ，Ｄ．Ｂ．；Ｋｏｅｎｉｇｓｂｅｒｇ，Ｓ．Ｓ．；Ｓｕｎｇ，Ｙ．；Ｈｅ，Ｊ．；Ｌｏｆｆｌｅｒ，Ｆ．Ｅ．  Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｆｕｒａｎ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ−８：ｌｉｐｉｄｓ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｔｈａｔ  ｍａｙ  ｐｒｏｔｅｃｔ  Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌｓ．  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００５，８４２６−８４３３．
（２７）Ｗａｈｌ，Ｈ．  Ｇ．；Ｃｈｒｚａｎｏｗｓｋｉ，Ａ．；Ｍｉｌｌｉｅｒ，Ｃ．；ｌｉｅｂｉｃｈ，Ｈ．Ｍ．；Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ａ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｕｒａｎ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍａ  ｂｙ  Ｍｕｌｔｉ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｇａｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．  Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ａ  １９９５，６９７，４５３−４５９．
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、熱処理によるＤＯＤの転換から得た粗抽出物（ｃｒｕｄｅ  ｅｘｔｒａｃｔ）を分析した結果である。分析は、ＧＣ（Ａ）とＴＬＣ（Ｂ）で行った。ＧＣ分析で同定されていない主な生成物は、ＴＬＣ分析で矢印で表示される。レーン１；標準ＤＯＤ、レーン２；熱処理されたＤＯＤの粗抽出物。他の実験条件は、実施例に示した。
【図２】図２は、熱処理によるＤＯＤの転換から得た粗抽出物と同定されていない精製した生成物を分析した結果である。分析は、ＧＣ（Ａ）とＴＬＣ（Ｂ）で行った。上部と下部のＧＣクロマトグラムは、それぞれ粗抽出物と精製されたサンプルを示す。ＧＣ分析で同定されていない主な生成物は、ＴＬＣ分析で矢印で表示される。レーン１；標準ＤＯＤ、レーン２；熱処理されたＤＯＤの粗抽出物、レーン３；同定されていない精製した生成物。他の実験条件は、実施例に示した。
【図３】図３は、図２で同定されていないメチル化された生成物の電子衝撃質量分析（ｅｌｅｃｔｒｏｎ−ｉｍｐａｃｔ  ＧＣ  ／  ＭＳ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ）を行った結果である。主な断片は、矢印で表示した。分析条件は、実施例に示した。
【図４】図４は、精製した７，１０−ＥＯＤＡのＦＴＩＲ分析の結果である。分析条件は、実施例に示した。
【図５】図５は、７，１０−ＥＯＤＡの形成を誘導する熱処理によるＤＯＤの転換についての概略的な経路である。
【図６】図６は、７，１０−ＥＯＤＡの反応温度に応じて生成されるＥＯＤＡ量を示す。
【図７】図７は、７，１０−ＥＯＤＡの時間による生成を示す。実験条件は、実施例に示した。
【図８】図８は、精製した７，１０−ＥＯＤＡのラジカル消去活性を示す。黒い棒と灰色の棒は、それぞれ７，１０−ＥＯＤＡとＤＯＤを示す。分析条件は、実施例に示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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