(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
側鎖にカルボキシル基を有する、ヒアルロン酸以外の多糖類のカルボキシル基に両親媒性の側鎖が結合した多糖類と、カルシウムイオン以外の無機イオン類と、水とを含んでなるハイドロゲル。
【請求項２】
カルシウムイオン以外の無機イオン類が、少なくともナトリウムイオンを含むものである、請求項１に記載のゲル。
【請求項３】
両親媒性の側鎖が結合した多糖類が、ホスファチジルエタノールアミンが結合した多糖類である、請求項１または２に記載のゲル。
【請求項４】
両親媒性の側鎖が−ＮＨ−Ｘ−ＣＯ−Ｙ−Ｚである、請求項１または２に記載のゲル。
ここで、Ｘは炭素数１〜１０の２価の炭化水素基であり、Ｙは両末端に酸素原子を有する２価のポリアルキレンオキシド類であり、Ｚは炭素数１〜２４の炭化水素基もしくは−ＣＯ−Ｒ１（Ｒ１は炭素数１〜２３の炭化水素基である）である。
【請求項５】
水溶性の高分子をさらに含む、請求項１から４のいずれかに記載のゲル。
【請求項６】
カルボキシル基を有する、ヒアルロン酸以外の多糖類がカルボキシメチルセルロースである請求項１から５のいずれかに記載のゲル。
【請求項７】
ホスファチジルエタノールアミンの置換度が０．３〜２．０モル％／糖残基である請求項３に記載のゲル。
【請求項８】
側鎖にカルボキシル基を有する、ヒアルロン酸以外の多糖類のカルボキシル基に両親媒性の側鎖が結合した多糖類の水溶液と、カルシウムイオン以外の無機イオン類を含む水溶液の２液から構成される、ハイドロゲル調製用キット。
【請求項９】
側鎖にカルボキシル基を有する、ヒアルロン酸以外の多糖類のカルボキシル基に両親媒性の側鎖が結合した多糖類の水溶液と、カルシウムイオン以外の無機イオン類の水溶液を混合する工程を含む、ハイドロゲルの調製方法。
【請求項１０】
側鎖にカルボキシル基を有する、ヒアルロン酸以外の多糖類のカルボキシル基に両親媒性の側鎖が結合した多糖類を、カルシウムイオン以外の無機イオン類の水溶液に溶解する工程を含む、ハイドロゲルの調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、側鎖にカルボキシル基を有する多糖類のカルボキシル基に両親媒性の側鎖が結合した多糖類と、無機塩の水溶液よりなるゲルである。流動性および粘弾性に優れるため、医療材料などに利用される。
【背景技術】
【０００２】
多糖類の側鎖にさまざまな官能基を導入することにより、多糖類そのものの物性や多糖水溶液の流動性の改質、ハイドロゲルの形成など、その物性や形状を改良することが知られており、これまでに様々な多糖類誘導体やその改質方法が報告されている。それらの中には、側鎖にカルボキシル基を有する多糖類にリン脂質を結合した多糖類がある。
特開２００６−２９６９１６号公報には、ヒアルロン酸とホスファチジルエタノールアミンの反応生成物よりなる癒着防止材が記載されている。また、ＷＯ２００７／０１５５７９号明細書には、カルボキシメチルセルロースとホスファチジルエタノールアミンの反応生成物よりなる癒着防止材が記載されている。
しかし、いずれの文献も、本明細書で開示しているハイドロゲルについては記載されておらず、示唆もされていない。
無機イオン類によりゲル化する多糖類は知られているが、アルギン酸ナトリウムやペクチン水溶液のように２価カチオンたるカルシウムイオンでゲル化するものが知られているのみである。たしかに、カルシウムイオンでゲル化する多糖類はゲル形成能に優れているものの、カルシウムイオンが神経伝達をつかさどる因子であり、また血液凝固因子を活性化するなどの多くの生理作用を有するために、医療用ゲルとしての利用には制限がある。
これに対し、ナトリウムイオンのような１価のカチオンでゲル化する多糖類は知られていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明が解決しようとする課題は、カルシウムイオンを用いることなく、生体に用いるのに適した複素弾性率を有し、安全性や取り扱い性に優れたハイドロゲルを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の発明者らは、上記目的のもとで鋭意研究した結果、特定の多糖類誘導体であれば、カルシウムイオンを用いることなくゲル化できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は側鎖にカルボキシル基を有する多糖類のカルボキシル基に両親媒性の側鎖が結合した多糖類（以下、「成分１」ともいう）と、カルシウムイオン以外の無機イオン類（以下、「成分２」ともいう）と、水とを含んでなるハイドロゲルである。
また、本発明は成分１の水溶液と成分２の水溶液の２液から構成される、ハイドロゲル調製用キットである。
また、本発明は成分１の水溶液と成分２の水溶液を混合する工程を含む、ハイドロゲルの調製方法である。
さらに、本発明は成分１を成分２の水溶液に溶解する工程を含む、ハイドロゲルの調製方法である。
【発明の効果】
【０００５】
本発明のハイドロゲルは、高粘弾性のゲルであり、例えば注射器などを用いて注入できるインジェクタブルゲルとして用いられるなど、医用材料として好ましく用いられる。本発明のハイドロゲルは、カルシウムによらずにゲル化されている点で、生体内で用いるのに適している。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
本発明のハイドロゲルにおける成分１は、側鎖にカルボキシル基を有する多糖類のカルボキシル基に両親媒性の側鎖が結合した多糖類である。
ここで、側鎖にカルボキシル基を有する多糖類とは、アルギン酸、ヒアルロン酸、ペクチンなどカルボキシル基を有する単糖類を主鎖に有する多糖類、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルキチン、カルボキシメチルプルラン、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルスターチ、カルボキシエチルセルロース、カルボキシメチルキトサンなどのカルボキシアルキル化多糖類、キトサンと無水コハク酸とが反応したＮ−サクシニルキトサンなど多糖類と環状無水カルボン酸との反応物を挙げることができる。これらの多糖類のカルボキシル基は、ナトリウム、カリウム、リチウムなどのアルカリ金属類と塩を形成してもよい。
カルボキシアルキル化多糖類の場合、カルボキシアルキル基の置換度や置換位置については特に制限はないが、好ましくは置換度が０．６〜１．０、置換位置はＣ−６位の１級水酸基が置換されている誘導体である。
多糖類の分子量は特に制限はないが、重量平均分子量で１万〜２００万のものが好ましく、より好ましくは２万〜１５０万、さらに好ましくは３万〜１００万である。
これら多糖類の中では、無機塩、とりわけナトリウム塩類と混合したときのゲル化しやすさから、カルボキシメチルセルロースやヒアルロン酸が好ましく用いられる。
カルボキシル基に結合する両親媒性の側鎖としては、親水性の官能基と疎水性の官能基の双方を有する官能基であれば特に制限はないが、好ましい例として、リン脂質の一種であるホスファチジルエタノールアミンの構造を有する側鎖を挙げることができる。特に、多糖類のカルボキシル基とホスファチジルエタノールアミンの１級のアミノ基とが直接アミド結合で結合しているものが好ましい。
ホスファチジルエタノールアミンの具体的な化合物としては、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジアラキドイルホスファチジルエタノールアミン、ジベヘノイルホスファチジルエタノールアミン、ラウロオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ミリストオレオイルホスファチジルエタノールアミン、パルミトオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジリノレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジリノレノイルホスファチジルエタノールアミン、ジアラキドノイルホスファチジルエタノールアミン、ジドコサヘキサエノイルホスファチジルエタノールアミンを挙げることができるが、これらの中ではホスファチジルエタノールアミンジオレオイルが好ましく用いられる。
もう一つの好ましい両親媒性の側鎖としては、直鎖状で、以下の構造式のものを挙げることができる。
（構造式）  多糖類−ＣＯ−ＮＨ−Ｘ−ＣＯ−Ｙ−Ｚ
ここで、ＣＯは多糖類のカルボキシル基由来であり、
Ｘは炭素数１〜１０の２価の炭化水素基であり、
Ｙは両末端に酸素原子を有する２価のポリアルキレンオキシド類であり、
Ｚは炭素数１から２４の炭化水素基、もしくは−ＣＯ−Ｒ１（Ｒ１は炭素数１〜２３の炭化水素基）である。
式中のＸは、炭素数１〜１０の２価の炭化水素基であり、具体的にはメチレン基、エチレン基、ｎ−プロピレン基、イソプロピレン基、ｎ−ブチレン基、イソブチレン基などが挙げられる。好ましくはメチレン基であり、この場合、カルボニル基とアミノ基に隣接するため、グリシンを用いた結合ユニットとなる。
Ｙは、両末端に酸素原子を有する２価のポリアルキレンオキシド類である。２価のポリアルキレンオキシド類とは、具体的にはポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコールなどで例示されるポリアルキレンエーテル類を意味する。両末端に酸素原子を有するとは、ポリアルキレンエーテルの両末端の水酸基が隣接する官能基との結合に関与している構造をいう。具体的には−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２（ＣＨ３）−）ｎ−Ｏ−で表される１，２−ポリプロピレングリコール類、−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）ｎ−Ｏ−で表される１，３−ポリプロピレングリコール類、−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−）ｎ−Ｏ−で表されるポリエチレングリコール類などが挙げられる。また、上記ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体、例えばＰＥＯ−ＰＰＯなどで表される共重合体であってもよい。ここでｎは繰り返し単位数を表す。
これらの中では、ポリエチレングリコールを主たる繰り返し単位とする構造が好ましく、具体的にはポリエチレングリコールユニットが８０モル％以上含み、より好ましくは９０モル％以上含むものである。繰り返し単位数ｎは、好ましくは２〜１００の間であり、さらに好ましくは３〜７０である。
Ｚは、炭素数１から２４の炭化水素基もしくは−ＣＯ−Ｒ１（Ｒ１は炭素数１〜２３の炭化水素基）である。
Ｚの炭素数１から２４の炭化水素基としては、具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、ノニル基、ラウリル基、ステアリル基などの直鎖状アルキル基、シクロヘキシル基、シクロペンチル基、シクロヘキシルノニル基、コレステリル基などの環状構造を有するアルキル基、オレイル基などの不飽和アルキル基、フェニル基、ナフチル基、ベンジル基などの芳香族炭化水素基が例示できる。これらの中ではステアリル基、オレイル基などが好ましい。
Ｒ１は、炭素数１〜２３の炭化水素基である。
Ｒ１の具体例としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、ノニル基、ヘプタデカ基、ヘプタデセニル基、ラウリル基、ステアリル基などの直鎖状アルキル基、シクロヘキシル基、シクロペンチル基、シクロヘキシルノニル基、コレステリル基などの環状構造を有するアルキル基、オレイル基などの不飽和アルキル基、フェニル基、ナフチル基、ベンジル基などの芳香族炭化水素基が例示できる。これらの中ではヘプタデカ基、ヘプタデセニル基などが好ましい。
Ｒ１が脂肪族アルキル基の場合、−ＣＯ−Ｒ１は脂肪酸に由来するアシル基となる。その好ましい具体例としては、ラウロイル基、パルミトイル基、ステアロイル基、オレオイル基が挙げられる。Ｒ１が芳香族基のときは、−ＣＯ−Ｒ１は芳香族脂肪酸に由来するアシル基となり、その具体例としては、ベンゾイル基、ナフトイル基などを例示することができる。これらの中では、ステアロイル基、オレオイル基が好ましい。
−ＮＨ−Ｘ−ＣＯ−Ｙ−Ｚで表される両親媒性側鎖の好ましい例としては、以下のものを挙げることができる。
−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）７−Ｏ−Ｃ１８Ｈ３７
−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）７−Ｏ−Ｃ１８Ｈ３７
等の、親水部にポリエチレングリコール基、疎水部にアルキル基を有する側鎖化合物群；
−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）７−Ｏ−Ｃ１８Ｈ３５
−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）２０−Ｏ−Ｃ１８Ｈ３５
等の、親水部にポリエチレングリコール基、疎水部にアルケニル基を有する側鎖化合物群；
−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）２０−Ｏ−ＣＯ−Ｃ１７Ｈ３５
等の、親水部にポリエチレングリコール基、疎水部に直鎖状の脂肪酸エステルを有する側鎖化合物群；
−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）７−Ｏ−コレステリル
等の、親水部にポリエチレングリコール基、疎水部にコレステリル基を有する側鎖化合物群
多糖類のカルボキシル基と両親媒性側鎖との結合は、例えばカルボジイミド類などの縮合剤を用いて結合させることができる。カルボジイミド類としては、１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドやその塩酸塩、ジイソプロピルカルボジイミド、ジシクロヘキシルカルボジイミドやＮ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドなどが挙げられる。これらの中では、１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドの塩酸塩を用いるのが好ましい。
多糖類のカルボキシル基を活性化するために、カルボキシル活性化剤が好ましく用いられる。カルボキシル活性化剤としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロフェノール、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシピペリジン、Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド、２，４，５−トリクロロフェノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンなどが挙げられる。これらの中では、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールが好ましい。
反応溶媒は水だけで実施しても、水と相溶する有機溶媒を混合してもよく、水と相溶しない有機溶媒を用いた２層系の反応で行ってもよい。水と相溶する有機溶媒としては、メタノール、エタノールなどのアルコール類やテトラヒドロフラン、ジオキサンなどの環状エーテル類、ポリエチレンオキシド化合物などのエーテル類、ジメチルホルムアミドやジメチルアセトアミドなどのアミド類、ピリジンやピペリジンなどのアミン類、ジメチルスルホキシドなどのジアルキルスルホン類、アセトンなどのケトン類を挙げることができる。好ましくは、水および水と相溶する有機溶媒を混合した均一な反応系で、カルボキシメチルセルロースとリン脂質との反応を行う。水と相溶する有機溶媒としてはテトラヒドロフランが好ましい。
カルボジイミドを用いる反応の温度は、好ましくは０〜６０℃である。副生成物を抑えるためには、反応を０〜１０℃に行うのがより好ましい。反応環境は弱酸性下が好ましく、さらに好ましくはｐＨ６〜７である。
両親媒性の側鎖がリン脂質の場合、その置換度は０．３〜２．０モル％／糖残基であることが好ましい。これよりも置換度が低いとゲルとしての十分な粘弾性が得られず、これよりも高いと水に対して不溶性の固いゲルを形成しやすくなる。より好ましくは０．６〜１．９、さらに好ましくは０．７〜１．７モル％／糖残基である。
もっとも、かかる好適な置換度は、用いる多糖類の種類や分子量、カルボキシル基の置換度や置換位置、両親媒性側鎖の種類、カルシウムイオン以外の無機イオン類の組成や濃度、ハイドロゲルの最終濃度などにより変動しうる。しかし、置換度が高すぎれば不溶性の固いゲルを形成しやすくなることを念頭においた当業者であれば、後述する実施例での具体例を参考に、試行により、個別の条件における置換度の好適範囲を容易に決定することができよう。
成分１の水溶液を調製する場合、水１００重量部に対し、好ましくは成分１を０．１〜３．０重量部、より好ましくは０．３〜２．０重量部、さらに好ましくは０．５〜１．０重量部含む。
成分１に混在することがある成分としては、合成に用いた縮合剤類、縮合剤が所定の化学反応を経由することで生成するウレアなどの副産物類、カルボキシル活性化剤、未反応のアミン類、反応の各段階で混入する可能性のある異物、ｐＨの調整に用いたイオン類などがあるが、これらの成分はいずれの化合物も、生体内に入れたときに異物反応として認識されない程度の含有量以下の低いレベルに抑えてあることが好ましい。もっとも、これらの成分が混在しているものも本発明の範囲に含まれる。
成分１の水溶液を調製する場合、かかる水溶液には所望により他の多糖類や水溶性の高分子類、単糖やオリゴ糖類、アミノ酸類などを含んでいてもよい。さらには、所望により生理活性を有する低分子医薬品やペプチド類、タンパク質類を含んでいてもよい。
成分２の無機塩類はカチオン成分とアニオン成分の双方を含む塩であり、カチオン成分とアニオン成分は等モル含まれるものが好ましい。かかるカチオン成分としてはナトリウム、リチウム、カリウムなどのアルカリ金属類のイオン、アンモニウムイオンを挙げることができるが、リン酸水素ナトリウムなどのように、プロトンを含む場合もある。これらの中では生体内に多く含まれるナトリウムイオンを有する塩が好ましく用いられる。
アニオン成分としては、特に制限はないが、塩化物イオンや臭化物イオンなどのハロゲンイオン、リン酸イオン、硫酸イオンなどのイオン類、酢酸、クエン酸、シュウ酸などのカルボン酸類のアニオンなどを挙げることができる。
成分２の無機塩類の具体例としては、塩化ナトリウム、フッ化ナトリウム、臭化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、リン酸水素１ナトリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、シュウ酸ナトリウムなどのアルカリ金属塩類、酒石酸ナトリウム、酒石酸ナトリウムカリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムなどを挙げることができる。
これらの塩類の中では、塩化ナトリウムが安全性の点から好ましい。塩化ナトリウムの濃度としては、０．１〜１０％の範囲がよいが、より好ましくは０．５〜５％、さらに好ましくは１〜３％である。
また、細胞の生存を維持させることを主たる目的とする場合は、生理的な塩濃度に調整されるようイオンの種類や量が選択される。この場合、生理的塩類溶液である生理的食塩水（０．９％ＮａＣｌ水溶液）、リンガー液、ロック液などの組成や濃度を用いるのが好ましい。
成分２の水溶液には、さらに水溶性の高分子類を含むことが好ましい。かかる水溶性高分子類としては、固形物たる成分１、もしくは粘弾性を有する成分１の水溶液と混合する際の混合のしやすさや、使用する際の使い勝手によって適当な粘度のものを選択することが好ましい。
かかる水溶性高分子の具体例としては、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、ペクチン、カラギーナン、でんぷん、デキストリン、デキストラン、プルラン、ヘパリン、キトサンなどの水溶性多糖類、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルデキストリン、カルボキシメチルプルラン、カルボキシエチルセルロースなどの水溶性多糖類誘導体、ゼラチン、コラーゲン、アルブミン、フィブリノーゲン、トロンビン、フィブロインなどのタンパク質類、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸類、ポリエチレングリコールおよびその共重合体、ポリビニルアルコールやその共重合体、ポリアリルアミンやその共重合体などのポリカチオン類、ポリアクリル酸ナトリウムやその共重合体などのポリアニオン類などの合成高分子を挙げることができる。
これらの中でも、医療材料としては、特にヒアルロン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリエチレングリコールやその共重合体が好ましく用いられる。
成分２の水溶液には、所望により他の単糖やオリゴ糖類、アミノ酸類などを含んでいてもよい。さらには、所望により生理活性を有する低分子医薬品やペプチド類、タンパク質類を含んでいてもよい。
本発明のハイドロゲルの好ましい複素弾性率としては、両親媒性の側鎖がリン脂質の場合、水中におけるポリマー濃度が１．０重量％、温度３７℃の条件で、レオメーターとよばれる動的粘弾性測定装置で角速度１０ｒａｄ／ｓｅｃにて測定したときに、２０〜１０００Ｎ／ｍ２であり、より好ましくは２５〜５００Ｎ／ｍ２、さらに好ましくは３０〜２００Ｎ／ｍ２である。ここで複素弾性率とは、弾性体の応力とひずみの比を表す定数のことである。
本発明のハイドロゲルは２つの成分を混合することにより有意に粘弾性が高まるため、体内の特定の箇所に留ませることが可能で、傷口の保護や、臓器間の物理的な隔離バリアーの形成が期待できるものがある。
また、本発明のハイドロゲルには、それに薬物を含浸させることで、局所的なドラッグデリバリーシステムとなるものがある。
また、本発明のハイドロゲルは、生体内に注入すると、いずれは分解または吸収されてしまう特性があり、外科手術時に用いる注入用ゲル材や再生医療の足場材料などに利用できるものがある。
本発明のハイドロゲルは、このほか医用材料を含めた医療用途、ヘアケア製品や肌の保湿剤などの日用品用途、化粧品用途などに使用できるものがある。
また、本発明のハイドロゲルには注射器を通して注入可能なものが含まれ、これは低侵襲医療用途に用いることができる。特に再生医療のための細胞の担体、成長因子などの液性因子を保持・徐放する担体、医薬品として利用できる低分子化合物を保持・徐放する担体、癒着防止材やシーラントなどの医用材料として利用できるものがある。
さらには、細胞培養担体、微生物の培養担体、歯科用のインプラント材料などにも用いられるものがある。
本発明のハイドロゲルは、公知の滅菌方法で滅菌処理することができる。好ましい滅菌方法は、電子線照射やエチレンオキシドによるガス滅菌、高圧蒸気滅菌である。
なお、本発明のハイドロゲルに関して上述したこと、例えば好適な成分１や成分２、あるいはそれらの水溶液について述べたことは、本発明のキットや本発明方法においてもそのまま妥当する。
本発明には、上述した本発明のゲルの製造方法も含まれる。具体的には、成分１の水溶液と、成分２の水溶液を混合する工程を含む、ハイドロゲルの調製方法（製造方法１）であり、成分１を、成分２の水溶液に溶解する工程を含む、ハイドロゲルの調製方法（製造方法２）である。
製造方法１における成分１の水溶液は、上述したように、水溶性高分子等の他の成分を含んでいてもよいが、イオンを含まない水に溶解したものでもよい。
一方、製造方法２では成分１の固形物を成分２の水溶液に溶解することになるため、溶解速度の観点から、その形状の適正化を図ることが好ましい。例えば、成分１を粉状としてから溶解するなどである。
【実施例】
【０００７】
（１）実施例に使用した材料は以下の通りである。
（ｉ）ＣＭＣＮａ：カルボキシメチルセルロースナトリウム（第一工業製薬（株）製、セロゲンＰＭ−２５０Ｌ、カルボキシメチル基の置換度；０．７３）、
（ｉｉ）ＣＭＣＮａ：カルボキシメチルセルロースナトリウム（第一工業製薬（株）製、Ｐ−６０３Ａ、置換度０．６９）、
（ｉｉｉ）ＣＭＣＮａ：カルボキシメチルセルロースナトリウム（日本製紙ケミカル（株）製、置換度０．６９）、
（ｉｖ）ＨＡＮａ：ヒアルロン酸ナトリウム（紀文フードケミファ（株）製、ＦＣＨ−８０ＬＥ）、
（ｖ）テトラヒドロフラン（和光純薬工業（株）製）、
（ｖｉ）０．１Ｍ  ＨＣｌ（和光純薬工業（株）製）、
（ｖｉｉ）０．１Ｍ  ＮａＯＨ（和光純薬工業（株）製）、
（ｖｉｉｉ）ＥＤＣ：  １−Ｅｔｈｙｌ−３−［３−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ］−ｃａｒｂｏｄｉ−ｉｍｉｄｅ・ＨＣｌ（（株）大阪合成有機化学研究所製）、
（ｉｘ）ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ：  １−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ，ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ（（株）大阪合成有機化学研究所製）、
（ｘ）ＤＭＴ−ＭＭ：  ４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（国産化学（株）製）
（ｘｉ）Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＭＥ−８１８１、日本油脂（株）製）、
（ｘｉｉ）エタノール（和光純薬工業（株）製）、
（ｘｉｉｉ）ＮａＣｌ（和光純薬工業（株）製）、
（ｘｉｖ）ＫＣｌ（和光純薬工業（株）製）、
（ｘｖ）注射用蒸留水（大塚製薬（株）製）
（２）セルロース誘導体中のリン脂質含量の測定
セルロース誘導体中のリン脂質の割合は、バナドモリブデン酸吸光光度法による全リン含量の分析により求めた。
（３）ハイドロゲルの複素弾性率の測定
ハイドロゲルの複素弾性率は、動的粘弾性測定装置であるＲｈｅｏｍｅｔｅｒ  ＲＦＩＩＩ（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を使用し、３７℃、角速度１０ｒａｄ／ｓｅｃで測定した。複素弾性率とは弾性体の応力とひずみの比を表す定数のことである。
実施例１
ＣＭＣＮａ（第一工業製薬（株）製、ＰＭ−２５０Ｌ、置換度０．７３）１５００ｍｇを水  ３００ｍＬに溶解し、さらにテトラヒドロフラン  ３００ｍＬを加えた。この溶液に、Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン  ７０９．７ｍｇ、縮合剤としてＤＭＴ−ＭＭ  ２９０．４ｍｇを添加した後、終夜攪拌を行った。攪拌後、エタノール中に加え、沈殿させた。ろ過によりエタノールを除き、再度エタノールにて洗浄し、ろ物を真空乾燥することでセルロース誘導体を得て、そのリン脂質含量を測定した。リン脂質含量を用いて計算によりホスファチジルエタノールアミンの置換度を求めたところ、０．７１ｍｏｌ％／糖残基であった。
得られたセルロース誘導体  ２０ｍｇを注射用蒸留水  １８００ｍｇに溶解後、最終濃度が０．９％となるように９％ＮａＣｌを２００ｍｇ添加し、最終濃度１．０重量％のハイドロゲルを調製した。得られたハイドロゲルは、容器を傾けても流れることはなかった。ハイドロゲルの複素弾性率を測定した結果、２４９．１±２８．３Ｎ／ｍ２（平均値±標準偏差）であった。
比較例１
９％のＮａＣｌの代わりに注射用蒸留水  ２００ｍｇを添加したこと以外、実施例１と同様の操作を行い、ハイドロゲルを調製した。得られたハイドロゲルは、容器を傾けるとゆっくり流れ、液面が水平に移動する傾向が観察された。ハイドロゲルの複素弾性率を測定した結果、３６．６±０．４３Ｎ／ｍ２（平均値±標準偏差）であった。
実施例２
セルロース誘導体４０ｍｇを注射用蒸留水  １８００ｍｇに溶解後、最終濃度が０．９％となるように９％ＮａＣｌを２００ｍｇ添加し、最終濃度を２．０重量％にした以外、実施例１と同様の操作を行い、ハイドロゲルを調製した。得られたハイドロゲルの複素弾性率を測定した結果、９５５．９±３２．０Ｎ／ｍ２（平均値±標準偏差）であった。
実施例３
Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン  １４２１．０ｍｇ、縮合剤としてＤＭＴ−ＭＭ  ５８１．４ｍｇを反応系に添加した以外、実施例１と同様の方法でセルロース誘導体を得て、そのリン脂質含量を測定した。置換度は２．２ｍｏｌ％／糖残基であった。
セルロース誘導体  ２０ｍｇを注射用蒸留水  １８００ｍｇに溶解後、最終濃度が０．９％となるように９％ＮａＣｌを２００ｍｇ添加し、最終濃度１．０重量％のハイドロゲルを調製した。その結果、水に対しても不溶であり、やや白濁した固いハイドロゲルが得られた。その複素弾性率は、ゲルが固く、レオメーターの測定表面とのすべりが大きいため正確な値は測定できなかった。
以上より、置換度が０．７５ｍｏｌ％／糖残基程度のセルロース誘導体から調製されたハイドロゲルでは、生体内と同程度の０．９重量％となるようＮａＣｌを添加することで複素弾性率が著しく増加することが確認された。一方、置換度が２．２ｍｏｌ％／糖残基のセルロース誘導体から調製されたハイドロゲルでは、０．９重量％となるようＮａＣｌを添加することにより、水に対しても不溶性の固いゲルを得ることができた。以上の結果から、生体内と同程度の塩化ナトリウム濃度において固まる特性を有するハイドロゲルが得られたことがわかる。
実施例４
ＣＭＣＮａ（日本製紙ケミカル（株）製、Ｆ６００ＭＣ、置換度０．６９）３０００ｍｇを水  ６００ｍＬに溶解し、さらにテトラヒドロフラン  ６００ｍＬを加えた。この溶液に、Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン  ２８３９ｍｇ、縮合剤としてＥＤＣを８０７ｍｇと、ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ  ６４３ｍｇを添加した後、終夜攪拌を行った以外、実施例１と同様に合成した。得られた多糖誘導体のホスファチジルエタノールアミンの置換度は０．８ｍｏｌ％／糖残基であった。
得られたセルロース誘導体  ２０ｍｇを注射用蒸留水  １８００ｍｇに溶解後、最終濃度が０．９％となるように９％ＮａＣｌを２００ｍｇ添加し、最終濃度１．０重量％のハイドロゲルを調製した。得られたハイドロゲルは、容器を傾けても流れることはなく、その複素弾性率は３１３．４Ｎ／ｍ２であった。
比較例２
９％のＮａＣｌの代わりに注射用蒸留水  ２００ｍｇを添加した以外、実施例４と同様の操作を行い、ハイドロゲルを調製した。得られたハイドロゲルの複素弾性率は１２１．３Ｎ／ｍ２であった。
実施例５
９％ＮａＣｌの水溶液中に、ＣＭＣＮａ（日本製紙ケミカル（株）製、Ｆ３０ＭＣ）が１．０重量％含まれている以外は、実施例４で得られた多糖類誘導体を用いて実施例４と同様にハイドロゲル調製した。得られたハイドロゲルの複素弾性率は３４３．０Ｎ／ｍ２であった。
実施例６
９％ＮａＣｌの水溶液中に、ポリエチレングリコール（和光純薬工業（株）製、分子量２万）が３％含まれている以外は、実施例４で得られた多糖類誘導体を用いて実施例４と同様にハイドロゲル調製した。得られたハイドロゲルの複素弾性率は３９３．６Ｎ／ｍ２であった。
実施例７
カルボキシメチルセルロースとして日本製紙ケミカル（株）製のＦ３０ＭＣ（カルボキシメチル基の置換度０．６９）を用いた以外は実施例１と同様に多糖類誘導体を合成した。得られた多糖誘導体のホスファチジルエタノールアミンの置換度は、０．８ｍｏｌ％／糖残基であった。
この多糖誘導体  ２０ｍｇを注射用蒸留水  １８００ｍｇに溶解後、最終濃度が０．９％となるように９％ＮａＣｌを２００ｍｇ添加し、最終濃度１．０重量％のハイドロゲルを調製した。得られたハイドロゲルの複素弾性率は１８１Ｎ／ｍ２であった。
実施例８
９％ＫＣｌの水溶液を用いた以外は、実施例７と同様にハイドロゲルを調製した。得られたハイドロゲルの複素弾性率は１８０Ｎ／ｍ２であった。
比較例３
９％のＮａＣｌの代わりに注射用蒸留水  ２００ｍｇを添加した以外、実施例７と同様の操作を行い、ハイドロゲルを調製した。得られたハイドロゲルの複素弾性率を測定した結果、１５．３Ｎ／ｍ２であった。
実施例９
ヒアルロン酸ナトリウム（紀文フードケミファ（株）製、ＦＣＨ−８０ＬＥ）１５００ｍｇを水  ３００ｍＬに溶解し、さらにテトラヒドロフラン  ３００ｍｌを加えた。この溶液に、Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン  １１１３ｍｇ（０．０１４９６ｍｏｌ）（ＨＡ−Ｎａのカルボキシル基１００当量に対し４０当量）、ＥＤＣ  ３１６ｍｇ（０．０１６４５ｍｏｌ）、ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ  ２５１．８ｍｇ（０．０１６４５６ｍｏｌ）を７５ｍＬのテトラヒドロフラン／水＝１／１に溶解したものを添加した後、終夜攪拌を行った。攪拌後、テトラヒドロフランを除去し、水をある程度蒸発させたところでエタノール中に加え、沈殿させた。ろ過によりエタノールを除き、再度エタノールにて洗浄し、ろ物を真空乾燥することでヒアルロン酸誘導体を得た。
得られたヒアルロン酸誘導体  ２０ｍｇを注射用蒸留水  １８００ｍｇに溶解後、最終濃度が０．９％となるように９％ＮａＣｌを２００ｍｇ添加し、最終濃度１．０重量％のハイドロゲルを調製した。得られたハイドロゲルは、容器を傾けても流れることはなかった。ハイドロゲルの複素弾性率を測定した結果、１３９．４±１６．４Ｎ／ｍ２（平均値±標準偏差）であった。
比較例４
９％のＮａＣｌの代わりに注射用蒸留水  ２００ｍｇを添加したこと以外、実施例９と同様の操作を行い、ハイドロゲルを調製した。得られたハイドロゲルの複素弾性率を測定した結果、５６．９±９．１Ｎ／ｍ２（平均値±標準偏差）
実施例１０
Ｈ２Ｎ−ＣＨ２−ＣＯ−（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）７−Ｏ−Ｃ１８Ｈ３５の合成
オレイルアルコールポリエチレングリコールエーテル（Ｈ−（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）７−Ｏ−Ｃ１８Ｈ３５、和光純薬（株）製）１ｍｍｏｌに対し、Ｎ−ブチルオキシカルボニルグリシン（Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、和光純薬（株）製）１ｍｍｏｌをジクロロメタンに溶解し、縮合剤としてジシクロヘキシルカルボジイミド（和光純薬（株）製）１ｍｍｏｌを含むジクロロメタン溶液を室温で滴下した。反応液をろ過して副生成物であるジシクロヘキシルウレアを取り除き、濃縮、乾燥させ、アミノ基が保護された中間体（Ｂｏｃ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯ−（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）７−Ｏ−Ｃ１８Ｈ３５）を得た。
この中間体に、１〜２ｍＬ程度のトリフルオロ酢酸（和光純薬（株）製）を加え、酸処理による脱Ｂｏｃ反応を室温で２時間行った。反応の進行はＴＬＣで確認した。反応液を減圧濃縮し、過剰のトリフルオロ酢酸を取り除き、目的物であるアミン化合物のトリフルオロ酢酸塩を得た。生成物は、１Ｈ−ＮＭＲで確認した。
実施例１１
カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ−Ｎａ）と、Ｈ２Ｎ−ＣＨ２−ＣＯ−（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）７−Ｏ−Ｃ１８Ｈ３５とのカップリング
ＣＭＣ−Ｎａ（日本製紙ケミカル（株）製、Ｆ６００ＭＣ、置換度０．６９）１５００ｍｇを水  ３００ｍｌに溶解し、さらにテトラヒドロフラン  ３００ｍｌを加えて混合し、均一な溶液を得た。この溶液に、実施例１０で合成したＨ２Ｎ−ＣＨ２−ＣＯ−（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）７−Ｏ−Ｃ１８Ｈ３５のトリフルオロ塩酸塩を、ＣＭＣ−Ｎａのカルボキシル基１当量に対して０．２当量を加え、混合した。
縮合剤としてＤＭＴ−ＭＭを、Ｈ２Ｎ−ＣＨ２−ＣＯ−（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）７−Ｏ−Ｃ１８Ｈ３５に対して１．１当量、３０ｍｌのテトラヒドロフラン／水＝１／１に溶解し、反応系に添加した後、終夜攪拌した。攪拌後、反応液をロータリーエバポレーターで濃縮することによりテトラヒドロフランを除去し、水を蒸発させ、全体量を約１／３にまで濃縮したところでエタノール中に反応溶液を加え、沈殿を形成させた。沈殿をろ別し、その沈殿物をエタノール中に懸濁させて２４時間攪拌し、沈殿物を回収して真空乾燥することでセルロース誘導体を得た。得られたセルロース誘導体の元素分析を行い、炭素と窒素の比率から置換度を算出した。その結果、置換度は１３ｍｏｌ％／糖残基であった。
実施例１２
実施例１１で得られた誘導体  ２０ｍｇを注射用蒸留水  １８００ｍｇに溶解後、最終濃度が０．９％となるように９％ＮａＣｌを２００ｍｇ添加し、最終濃度１．０重量％のハイドロゲルを調製した。得られたハイドロゲルは、容器を傾けても流れることはなかった。ハイドロゲルの複素弾性率を測定した結果、１４４８．４Ｎ／ｍ２であった。
比較例５
９％のＮａＣｌの代わりに注射用蒸留水  ２００ｍｇを添加したこと以外、実施例１２と同様の操作を行い、ハイドロゲルを調製した。ハイドロゲルの複素弾性率を測定した結果、７２９．７Ｎ／ｍ２であった。
実施例１３
ＣＭＣＮａ（第一工業製薬（株）製、Ｐ−６０３Ａ、置換度０．６９）３０００ｍｇを水  ２００ｍＬに溶解し、さらにテトラヒドロフラン  ２００ｍＬを加えた。この溶液に、Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン  ３４９ｍｇ、縮合剤としてＤＭＴ−ＭＭ  ６４６ｍｇを添加した後、終夜攪拌を行った。攪拌後、エタノール中に加え、沈殿させた。ろ過により、エタノールを除き、再度エタノールにて洗浄し、ろ物を真空乾燥することでセルロース誘導体を得て、そのリン脂質含量を測定した。リン脂質含量を用いて計算によりホスファチジルエタノールアミンの置換度を求めたところ、１．３１ｍｏｌ％／糖残基であった。
得られたセルロース誘導体  ３０ｍｇを注射用蒸留水  ２７００ｍｇに溶解後、最終濃度がＮａＣｌ：０．８％、ＮａＨ２ＰＯ４：０．０３５％、Ｎａ２ＨＰＯ４：０．１２８％となるように１０倍濃度のＰＢＳ（−）水溶液（ＮａＣｌ：８％、ＮａＨ２ＰＯ４：０．３５％、Ｎａ２ＨＰＯ４：１．２８％）を２７０ｍｇ添加し、最終濃度１．０重量％のハイドロゲルを調製した。得られたハイドロゲルは、容器を傾けても流れることはなかった。ハイドロゲルの複素弾性率を測定した結果、１０１．６±３．４Ｎ／ｍ２（平均値±標準偏差）であった。
実施例１４
実施例１３に記載の方法で合成したセルロース誘導体４０ｍｇをＰＢＳ（−）水溶液（ＮａＣｌ：０．８％、ＮａＨ２ＰＯ４：０．０３５％、Ｎａ２ＨＰＯ４：０．１２８％）３９６０ｍｇに溶解させ、最終濃度１．０重量％のハイドロゲルを調製した。得られたハイドロゲルは、容器を傾けても流れることはなかった。ハイドロゲルの複素弾性率を測定した結果、７０．９±１．５Ｎ／ｍ２（平均値±標準偏差）であった。
実施例１５
実施例１３に記載の方法で合成したセルロース誘導体３０ｍｇを、リン酸水素ナトリウム水溶液（０．１７％）２９７０ｍｇに溶解させ、最終濃度１．０重量％のハイドロゲルを調製した。得られたハイドロゲルは、容器を傾けても流れることはなかった。ハイドロゲルの複素弾性率を測定した結果、１６．９±０．４Ｎ／ｍ２（平均値±標準偏差）であった。
実施例１６
実施例１３に記載の方法で合成したセルロース誘導体３０ｍｇを、リン酸水素ナトリウム（０．１７％）と塩化ナトリウム（０．２７％）の水溶液２９７０ｍｇに溶解させ、最終濃度１．０重量％のハイドロゲルを調製した。得られたハイドロゲルは、容器を傾けても流れることはなかった。ハイドロゲルの複素弾性率を測定した結果、７２．７±４．１Ｎ／ｍ２（平均値±標準偏差）であった。
実施例１７
実施例１３に記載の方法で合成したセルロース誘導体３０ｍｇを、リン酸水素ナトリウム（０．１７％）と塩化ナトリウム（０．５３％）の水溶液２９７０ｍｇに溶解させ、最終濃度１．０重量％のハイドロゲルを調製した。得られたハイドロゲルは、容器を傾けても流れることはなかった。ハイドロゲルの複素弾性率を測定した結果、９１．５±０．５Ｎ／ｍ２（平均値±標準偏差）であった。
実施例１８
実施例１３に記載の方法で合成したセルロース誘導体３０ｍｇを、リン酸水素ナトリウム（０．１７％）と塩化ナトリウム（０．８％）の水溶液２９７０ｍｇに溶解させ、最終濃度１．０重量％のハイドロゲルを調製した。得られたハイドロゲルは、容器を傾けても流れることはなかった。ハイドロゲルの複素弾性率を測定した結果、８７．６±３．１Ｎ／ｍ２（平均値±標準偏差）であった。
比較例６
実施例１３に記載の方法で合成したセルロース誘導体３０ｍｇを、注射用蒸留水２９７０ｍｇに溶解させ、最終濃度１．０重量％のハイドロゲルを調製した。得られたハイドロゲルは、容器を傾けるとゆっくり流れ、液面が水平に移動する傾向が観察された。ハイドロゲルの複素弾性率を測定した結果、１５．０±０．１４Ｎ／ｍ２（平均値±標準偏差）であった。
実施例１９
ＣＭＣＮａ（第一工業製薬（株）製、ＰＭ−２５０Ｌ、置換度０．７３）３０００ｍｇを水６００ｍＬに溶解し、さらにテトラヒドロフラン６００ｍＬを加えた。この溶液に、Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン１４０５ｍｇ、縮合剤としてＤＭＴ−ＭＭ  ５７５ｍｇを添加した後、終夜攪拌を行った。攪拌後、テトラヒドロフランを減圧留去し、残渣をエタノール中に加え、沈殿させた。ろ過により、エタノールを除き、再度エタノールにて洗浄し、ろ物を真空乾燥することでセルロース誘導体を得て、そのリン脂質含量を測定した。リン脂質含量を用いて計算によりホスファチジルエタノールアミンの置換度を求めたところ０．７８ｍｏｌ％／糖残基であった。
得られたセルロース誘導体  ３０ｍｇをエチレンオキサイドガス滅菌し、注射用蒸留水５９７０ｍｇに溶解した（濃度０．５０重量％）。この溶液１０７５ｍｇに、次表の試薬を１リットルの蒸留水に溶解させた擬似体液のうち３５９ｍｇを加えた。
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得られたハイドロゲルは、容器を傾けても流れることはなかった。ハイドロゲルの複素弾性率を測定した結果、２３．８±３．３Ｎ／ｍ２（平均値±標準偏差）であった。
比較例７
実施例１９において、擬似体液を加える前のハイドロゲルの複素弾性率を測定した結果、１４．８±３．２Ｎ／ｍ２（平均値±標準偏差）であった。
【産業上の利用可能性】
【０００８】
本発明は、例えば手術用の医療材料を供給する産業において利用できる。