(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＲＩ１(CREBBP/EP300 inhibitory protein 1)遺伝子由来のプロモータであり、配列表の配列番号１０に記載の塩基配列からなり、中皮腫特異的に転写活性を示すことを特徴とする中皮腫特異的プロモータ。
【請求項２】
請求項１に記載の中皮腫特異的プロモータを１〜複数個搭載してなるウイルスベクター。
【請求項３】
請求項１に記載の中皮腫特異的プロモータを４個搭載してなるウイルスベクター。
【請求項４】
ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである請求項２または３に記載のウイルスベクター。
【請求項５】
アデノウイルスが、制限増殖型アデノウイルスである請求項４に記載のウイルスベクター。
【請求項６】
さらに、細胞死誘導遺伝子および／または細胞融解誘導遺伝子をプロモータの下流に搭載してなる請求項３〜５のいずれか１に記載のウイルスベクター。
【請求項７】
請求項３〜６のいずれか１に記載のウイルスベクターからなる遺伝子治療型中皮腫治療用ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の遺伝子治療型中皮腫治療用ベクターを含む中皮腫治療剤。
【請求項９】
さらに、マーカー遺伝子をプロモータの下流に搭載してなる請求項３〜５のいずれか１に記載のウイルスベクター。
【請求項１０】
マーカー遺伝子が、蛍光タンパク質発現遺伝子である請求項９に記載のウイルスベクター。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載のウイルスベクターからなる中皮腫検査用ウイルスベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中皮腫特異的に転写活性を示し、他種癌細胞および中皮を含む正常細胞では転写活性の低いプロモータに関する。さらには、該プロモータの用途に関し、具体的には該プロモータを含む遺伝子治療用ベクターおよび中皮腫治療剤に関する。【０００２】
本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願特願２００８−１０４０７０号優先権を請求する。
【背景技術】
【０００３】
胸部の肺あるいは心臓などの臓器や胃腸・肝臓などの腹部臓器は、それぞれ、胸膜・腹膜・心膜などという膜に包まれている。これらの膜の表面をおおっているのが「中皮」である。中皮腫とは、中皮細胞由来の腫瘍の総称をいい、悪性および良性の双方がある。発生場所は胸膜が多く、他に腹膜や心膜などがあり、それぞれ胸膜中皮腫、腹膜中皮腫、心膜中皮腫という。中皮腫はアスベスト（石綿）との関連で論じられることが多いが、この場合の中皮腫は、ほとんどが悪性胸膜中皮腫のことをいう。【０００４】
中皮腫は、アスベストの曝露が多いほど、また曝露歴が長いほど、リスクが高くなり、アスベストに曝露してから中皮腫が発生するまでの期間が長いのが特徴である。発生までに、早い場合で２０年前後、平均で約４０年程度の時間がかかるといわれている。アスベスト暴露と喫煙のリスクを併せ持つ人の肺癌の罹患率が数倍〜５０倍になることが指摘されているが、中皮種と喫煙の関連はほとんどないといわれている。【０００５】
中皮腫の診断方法としては、画像所見、胸水の細胞診、組織生検および腫瘍マーカーの検出などが挙げられる。画像所見では多くの場合、Ｘ線では胸膜外徴候 (extrapleural sign)や胸水貯留を認める。通常は片側性である。胸部ＣＴでも同様の所見を得ることができる。またFDG-PETでは、集積像を認める。胸水の細胞診では腫瘍細胞を認める場合がある。組織生検はきわめて重要で確定診断をする最大の根拠となる。中皮腫のマーカーとして、ＷＴ１(Wilms' tumor susceptibility gene 1)（非特許文献１〜３）、Calretinin（非特許文献４、５）、Mesothelin（非特許文献５）、ＣＲＩ１(CREBBP/EP300 inhibitory protein 1)（非特許文献６）の発現が認められることが報告されている。 なお、ＣＲＩ１は、CarimらのEST cluster解析によりC15ORF13として同定されたことが報告され（非特許文献７）、Gordonらの解析により中皮腫に有意に発現することが報告されている（非特許文献６）が、病原性に関する報告はない。ＣＲＩ１をコードする遺伝子の配列は、GenBank Accession No. NM_014335に登録されており、別名EP300 interacting inhibitor of differentiation 1（ＥＩＤ１）ともいう。【０００６】
中皮腫の治療方法は、病期、例えば限局型胸膜中皮腫（I期）または進展型胸膜中皮腫（II、III、IV期）によっても異なる。例えば限局型胸膜中皮腫（I期）の場合には、治療は胸膜の１部とその周囲の組織を除去する外科療法が行われる。腫瘍が胸膜のより広い範囲にあれば、治療は症状を軽減するために胸膜とその近傍の組織を取り除く外科療法を行い、場合によっては放射線療法や化学療法を行う場合もある。進展型胸膜中皮腫（II 、III、IV期）の場合は、その病期によっても異なるが、例えば胸部から液体を除去する胸腔穿刺や、外科療法、放射線療法、化学療法が行われる。中皮腫は、臓器転移を起こすことはほとんどないものの、診断時にすでに広範囲に進展し、根治手術が不可能であることが多い。予後はきわめて不良で、１年生存率が５０％、２年生存率が２０％であるといわれている。【０００７】
近年、疾患に対する治療方法の一つとして、遺伝子治療の試みが多くなされている。このような遺伝子治療のために使用可能なベクターについても各種報告があり、抗腫瘍剤として応用されることが期待されている（特許文献１、２）。遺伝子治療に用いられるベクターの１種として、アデノウイルスベクター（「Ａｄベクター」ともいう。）が挙げられる。現在、遺伝子治療用ベクターとして用いられるＡｄベクターは、サブグループＣ(sub-group C)に属した５型（あるいは２型）のヒトＡｄを基盤としている。【０００８】
Ａｄベクターは、その優れた遺伝子導入特性から、遺伝子治療用ベクターとして各種疾患への適用が期待されている。しかしながら、Ａｄベクターを腫瘍局所へ投与した場合、一部のＡｄベクターは腫瘍から全身循環に漏出する場合がある。目的とする疾患部位以外で遺伝子が発現すると、好ましくない副作用が生じることが懸念される。例えば、遺伝子発現細胞に対して毒性を示すような遺伝子を用いる場合は、中皮腫である腫瘍のみならず腫瘍ではない組織に対しても毒性を示してしまう場合がある。目的とする細胞や組織のみで所望の遺伝子を発現させることができれば、副作用を伴うことなく、効果的な遺伝子治療が行うことができると考えられる。
【非特許文献１】Differentiation, 65: 89-96, 1999
【非特許文献２】Cancer Research, 61: 921-925, 2001
【非特許文献３】J. Pathol., 199: 479-487, 2003
【非特許文献４】Human Pathology, 34: 994-1000, 2003
【非特許文献５】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 136-140, 1996
【非特許文献６】Am. J. Pathol., 166: 1827-1840, 2005
【非特許文献７】Cytogenet. Cell Genet., 88: 330-332, 2000
【特許文献１】特開２００７−２０９３２８号公報
【特許文献２】特開２００７−１９００２２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、中皮腫特異的に転写活性を示し、他種癌細胞および中皮を含む正常細胞では転写活性の低いプロモータを提供することを課題とする。さらには、該プロモータの用途に関し、具体的には該プロモータを含む遺伝子治療用ベクターおよび中皮腫治療剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、中皮腫マーカーに着目し、中皮腫マーカーに関するプロモータであって、中皮腫特異的に転写活性を示し、他種癌細胞や中皮を含む正常細胞では転写活性を示さないプロモータを見出すことに成功し、本発明を完成した。【００１１】
すなわち、本発明は以下よりなる。
１．ＣＲＩ１(CREBBP/EP300 inhibitory protein 1)遺伝子由来のプロモータであり、中皮腫特異的に転写活性を示すことを特徴とする新規プロモータ。
２．ＣＲＩ１遺伝子由来のプロモータの配列が、ＣＲＩ１遺伝子の-2586〜+84の領域から選択される配列である、前項１に記載の新規プロモータ。
３．ＣＲＩ１遺伝子由来のプロモータの配列が、配列表の配列番号１〜１１に記載のいずれかである、前項１または２に記載の新規プロモータ。
４．前項１〜３のいずれか１に記載の新規プロモータを搭載してなるウイルスベクター。
５．ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである前項４に記載のウイルスベクター。
６．アデノウイルスが、制限増殖型アデノウイルスである前項５に記載のウイルスベクター。
７．さらに、細胞死誘導遺伝子および／または細胞融解誘導遺伝子をプロモータの下流に搭載してなる前項４〜６のいずれか１に記載のウイルスベクター。
８．前項４〜７のいずれか１に記載のウイルスベクターからなる遺伝子治療型中皮腫治療用ベクター。
９．前項８に記載の遺伝子治療型中皮腫治療用ベクターを含む中皮腫治療剤。
１０．さらに、マーカー遺伝子をプロモータの下流に搭載してなる前項４〜６のいずれか１に記載のウイルスベクター。
１１．マーカー遺伝子が、蛍光タンパク質発現遺伝子である前項１０に記載のウイルスベクター。
１２．前項１０または１１に記載のウイルスベクターからなる中皮腫検査用ウイルスベクター。
１３．前項１２に記載の中皮腫診断用ウイルスベクターを用い、マーカーの発現の有無を観察することによる中皮腫の検査方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の新規プロモータは、中皮腫に有意な転写活性を示し、他種癌細胞および中皮腫を含む正常細胞での活性は低値であった。このことより、当該プロモータを搭載した細胞死誘導型または細胞融解誘導型ベクターを利用することで、効果的に中皮腫特異的に細胞死または細胞融解作用を誘導することができる。また、また、in vivoにおいても、抗腫瘍効果が確認された。in vitroおよびin vivoでの確認の結果、ベクターがＥ１欠損型Ａｄの場合に、本発明のプロモータとともに、Ｅ１領域をコードする遺伝子を導入遺伝子として組み込むことで、中皮腫特異的にＡｄが増殖し、中皮腫を消滅させることができる。上記により、中皮腫にとって効果的な治療剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】各種中皮腫マーカー遺伝子のプロモータ領域の部分を取り出し、ホタルルシフェラーゼ遺伝子と結合した発現コンストラクトを示す図である。（実施例１）
【図２】各種中皮腫マーカー遺伝子由来プロモータの中皮腫または肺癌細胞における転写活性を示す図である。（実施例１）
【図３】各種中皮腫マーカー遺伝子由来プロモータの正常細胞における転写活性を示す図である。（実施例１）
【図４】ＣＲＩ１遺伝子のプロモータ領域の部分を取り出し、ホタルルシフェラーゼ遺伝子と結合した発現コンストラクトを示す図である。（実施例２）
【図５】ＣＲＩ１遺伝子由来各プロモータの各種細胞における転写活性を示す図である。（実施例２）
【図６】本発明のプロモータおよび各導入遺伝子を搭載したＡｄベクターのシェーマを示す図である。（実施例３）
【図７】本発明のＡｄベクターを各種細胞に感染させたときのフローサイトメトリーパターンを示す図である。（実験例１）
【図８】本発明のＡｄベクターを各種細胞に感染させたときの生細胞数測定結果を示す図である。（実験例２）
【図９】本発明のＡｄベクターを、腫瘍モデルマウスに投与したときの腫瘍細胞の体積を示す図である。（実験例３）
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明のＣＲＩ１(CREBBP/EP300 inhibitory protein 1)は、背景技術の欄に示すとおり、非特許文献６および７に報告されたもの (GenBank Accession No. NM_014335)であるが、本発明のＣＲＩ１遺伝子由来のプロモータは、染色体１５ｑ２１(Chromosome 15 q21, GenBank Accession No. NW_925884.1）に示す塩基配列より選択される。【００１５】
具体的には、配列表のGenBank Accession No. NW_925884.1に示す塩基配列のうち、ＣＲＩ１遺伝子の上流部分であり、ＣＲＩ１遺伝子の転写開始点を+1とした場合に、-2586〜+84（配列番号１）の領域より選択される。より詳しくは、-1849〜+84（配列番号２）より選択され、さらには-1674〜+84（配列番号３）より選択され、-1587〜+84（配列番号４）より選択され、-1083〜+84（配列番号５）より選択され、-766〜+84（配列番号６）より選択され、-567〜+84（配列番号７）より選択され、-366〜+84（配列番号８）より選択され、-296〜+84（配列番号９）より選択され、最も好ましくは、-138〜+84で示される塩基配列（配列番号１０）からなるプロモータである。また、-74〜+84（配列番号１１）で示される塩基配列からなるプロモータであってもよい。配列表の配列番号１に示す配列からなるプロモータをＣＲＩ１-2586/+84、配列番号２に示す配列からなるプロモータをＣＲＩ１-1849/+84、配列番号３に示す配列からなるプロモータをＣＲＩ１-1674/+84、配列番号４に示す配列からなるプロモータをＣＲＩ１-1587/+84、配列番号５に示す配列からなるプロモータをＣＲＩ１-1083/+84、配列番号６に示す配列からなるプロモータをＣＲＩ１-766/+84、配列番号７に示す配列からなるプロモータをＣＲＩ１-567/+84、配列番号８に示す配列からなるプロモータをＣＲＩ１-366/+84、配列番号９に示す配列からなるプロモータをＣＲＩ１-296/+84、配列番号１０に示す配列からなるプロモータをＣＲＩ１-138/+84、配列番号１１に示す配列からなるプロモータをＣＲＩ１-74/+84、と表すことができる。【００１６】
本発明の新規プロモータは、中皮腫特異的に転写活性を示すことを特徴とする。本発明のプロモータは、悪性胸膜中皮腫細胞株、例えば２１１Ｈ細胞やＨ２４５２細胞では有意に転写活性を認めるが、肺癌由来細胞株、例えばヒト扁平上皮肺癌由来Ａ５４９細胞、ヒト細気管支肺胞上皮癌由来Ｈ３２２細胞では殆ど転写活性を認めないか、あるいは中皮腫由来細胞株における転写活性に比べて明らかに低いものである。また本発明のプロモータは、正常ヒト肺線維芽細胞（Normal Human Lung Fibroblasts）由来ＮＨＬＦ細胞や正常中皮細胞においても殆ど転写活性を認めないか、あるいは中皮腫由来細胞株における転写活性に比べて明らかに低いものである。【００１７】
本発明の新規プロモータを搭載してなるベクターは、使用の目的に応じて適宜選択することができるが、ウイルスベクターが好適に用いられる。また、ウイルスベクターとしては、アデノウイルス（Ａｄ）ベクターが好適に用いられる。本発明において使用可能なＡｄは、in vivoまたはin vitroでＤＮＡやＲＮＡなどの核酸配列を種々のタイプの細胞へ導入するビヒクルとしての機能を達成しうるものであれば良く、特に限定されない。代表的には、ヒトを宿主とする２型、５型、１１型、３５型の各Ａｄ、ヒト以外を宿主とするサルＡｄ、チンパンジーＡｄ、マウスＡｄ、イヌＡｄ、ヒツジＡｄおよびトリＡｄなどが挙げられる。Ａｄは、特定の細胞でのみ増殖するもの、例えば、Ｅ１欠損型Ａｄや制限増殖型Ａｄであってもよい。Ｅ１欠損型Ａｄは、２９３細胞（細胞内にＥ１を有する）でのみ繁殖することができ、制限増殖型Ａｄは、例えば特定の癌細胞でのみ増殖することができる。【００１８】
本発明のプロモータを、中皮腫特異的に発現させたい遺伝子とともに発現可能なベクターに組み込み、搭載することができる。プロモータの塩基配列は、例えば配列番号１〜１１のいずれかに示す塩基配列からなるもの選択することができる。組み込むプロモータの数は、ベクターに組み込み可能な長さであればよく、特に制限されず、複数個のプロモータを組み込んでも良い。また、本発明において、ベクターに搭載しうる中皮腫特異的に発現させたい遺伝子を、導入遺伝子という。【００１９】
本発明における導入遺伝子として、中皮腫細胞に対して損傷を与える遺伝子が好適であり、例えば、細胞死誘導遺伝子や細胞融解誘導遺伝子が挙げられる。細胞死誘導遺伝子の例として、例えばアポトーシス促進関連遺伝子が挙げられる。アポトーシスを阻害する物質として、ミトコンドリアからのシトクロムｃの放出を部分的に阻止してアポトーシスを阻害するＢｃｌ−２ファミリータンパク質であるＢｃｌ−２やＢｃｌ−ＸＬがあるが、逆にＢａｄは、ファミリーの内、アポトーシスを阻害するタンパク質と結合して不活性化させ、プロカスパーゼの活性化とアポトーシスを促進する。また、ＢａｘやＢａｋは、ミトコンドリアからのシトクロムｃ放出を促進する刺激因子であり、アポトーシスを促進する。ＢａｘとＢａｋは、ＢｉｄなどのＢｃｌ−２ファミリーのアポトーシス促進因子によって活性化される。従って、細胞死誘導遺伝子の例として、具体的にはＢｉｄ遺伝子を例示することができる。例えば、本発明のプロモータとともに、細胞死誘導遺伝子や細胞融解誘導遺伝子をベクターに組み込むことで、中皮腫特異的に細胞死や細胞融解を誘導させることができ、正常細胞には影響を及ぼすことなく、効果的に中皮腫治療に使用することができる。【００２０】
また、ベクターがＥ１欠損型Ａｄの場合には、Ｅ１領域をコードする遺伝子を導入遺伝子とし、本発明のプロモータとともに導入することができる。これにより、中皮腫特異的にＡｄが増殖することで、中皮腫細胞のＡｄ感染により中皮腫細胞を消滅させることができる。【００２１】
本発明のベクターの作製は、作製工程において１または複数の制限酵素の認識配列を各々制限酵素で消化し、導入遺伝子を、シャトルベクターを介して、またはシャトルベクターを介することなく、インビトロライゲーションにより導入することができる。【００２２】
本発明のベクター、例えばＡｄベクターは以下の工程を含む製造方法により作製することができる。
１）導入遺伝子の非翻訳領域に本発明のプロモータ配列を含む発現コンストラクトを構築する工程；
２）上記１）の発現コンストラクトを含むシャトルベクターを構築する工程；
３）Ａｄゲノムを準備する工程；
４）Ａｄゲノムを制限酵素で切断し、２）で作製した遺伝子発現シャトルベクターをＡｄゲノムにライゲーションする工程。【００２３】
本発明は、プロモータを組み込んだベクターにも及び、具体的には該プロモータと、該プロモータの下流に導入遺伝子を搭載してなる組換えベクターにも及ぶ。導入遺伝子とは具体的には、中皮腫細胞に対して損傷を与える遺伝子が好適であり、例えば、細胞死誘導遺伝子や細胞融解誘導遺伝子が挙げられる。細胞死誘導遺伝子の例として、例えばアポトーシス促進関連遺伝子が挙げられる。アポトーシスを阻害する物質として、ミトコンドリアからのシトクロムｃの放出を部分的に阻止してアポトーシスを阻害するＢｃｌ−２ファミリータンパク質であるＢｃｌ−２やＢｃｌ−ＸＬがあるが、逆にＢａｄは、ファミリーの内、アポトーシスを阻害するタンパク質と結合して不活性化させ、プロカスパーゼの活性化とアポトーシスを促進する。また、ＢａｘやＢａｋは、ミトコンドリアからのシトクロムｃ放出を促進する刺激因子であり、アポトーシスを促進する。ＢａｘとＢａｋは、ＢｉｄなどのＢｃｌ−２ファミリーのアポトーシス促進因子によって活性化される。従って、細胞死誘導遺伝子の例として、具体的にはＢｉｄ遺伝子を例示することができる。【００２４】
本発明のプロモータの下流に上記導入遺伝子を搭載したベクターを中皮腫治療剤として利用することができる。本発明は、該導入遺伝子を組み込みこんだ組換えベクターを有効成分とする中皮腫治療剤にも及ぶ。【００２５】
さらに、本発明のプロモータを組み込んだベクターは、中皮腫の検査においても使用することができる。具体的には、マーカー遺伝子を該プロモータの下流に搭載してなるウイルスベクターを用いることによる。本発明のプロモータは中皮腫に有意な転写活性を有することから、中皮腫の存在によりマーカー遺伝子が発現し、中皮腫を検査することができる。マーカー遺伝子としては、検査に使用可能なタンパク質を発現しうるものであれば良く、特に限定されないが、例えば蛍光タンパク質が挙げられ、より具体的にはＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）が挙げられる。本発明は、中皮腫の存在によりマーカー遺伝子が発現しうる中皮腫検査用ウイルスベクターにも及び、該中皮腫検査用ウイルスベクターを用いてマーカーの発現の有無を観察することによる中皮腫の検査方法にも及ぶ。
【実施例】
【００２６】
以下に、本発明のプロモータおよび該プロモータを組み込んだ組換えベクターについて、実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではないことは明らかである。【００２７】
（実施例１）各種プロモータの各種細胞における転写活性の確認
１）各種中皮腫マーカー遺伝子由来プロモータを含む発現コンストラクトの構築
中皮腫マーカーとしてＣＲＩ１、Calretinin、ＷＴ１(Wilms' tumor susceptibility gene 1)およびMesothelinについて、各マーカー遺伝子のプロモータ領域の部分を取り出し、ホタルルシフェラーゼ(Luciferase)遺伝子と結合した発現コンストラクトを構築した。各プロモータを含む発現コンストラクトのシェーマを図１に示した。ここで、Calretinin遺伝子由来プロモータは、染色体１６ｑ２１．１(Chromosome 16 q21.1, GenBank Accession No. NT_010498.15）、ＷＴ１遺伝子由来プロモータは、染色体１１ｐ３(Chromosome 11 p3, GenBank Accession No. NT_079237.17）、Mesothelin遺伝子由来プロモータは、染色体１６(Chromosome 16, GenBank Accession No. NT_037887.4）の各配列から選択される。各マーカー遺伝子の転写開始点を+1としたときの各プロモータ領域の配列は、配列表の配列番号２または１２〜１４のいずれかで表され、具体的には以下に示される。
ＣＲＩ１遺伝子プロモータ：-2586/+84    （配列番号２）
Calretinin遺伝子プロモータ：-2179/+70  （配列番号１２）
ＷＴ１遺伝子プロモータ：-1887/+39      （配列番号１３）
Mesothelin遺伝子プロモータ：-2310/+44  （配列番号１４）【００２８】
２）各プロモータの中皮腫または肺癌細胞における転写活性の確認
ｐＧＬ３ルシフェラーゼレポーターベクター（Promega 社）に、上記各プロモータを挿入した発現コンストラクトを作製した(pGL3 Luciferase Reporter Vectors, Promega社, Technical Manual No.033参照）。悪性胸膜中皮腫細胞株４株（Ｈ２４５２、２１１Ｈ、Ｈ２０５２、Ｈ２８）および肺癌細胞株２種（Ａ５４９、Ｈ３２２）の各細胞を、６ウェルプレートに、細胞数薬４×１０６を３ウェルずつ播種し、各細胞について生着を確認後、形質導入試薬Lipofectin(R)（Invitrogen社）を用いて、各発現コンストラクト２μｇを各細胞に形質導入した。２４時間後に各細胞でのルシフェラーゼアッセイによりルシフェラーゼの発光を測定し、各プロモータの転写活性を確認した。【００２９】
その結果、各マーカー遺伝子由来のプロモータは、中皮腫細胞特異的に転写活性を示し、肺癌細胞には低い転写活性を示す傾向であった。特に、ＣＲＩ１遺伝子プロモータ：-2586/+84の場合は、他のプロモータに比べて、中皮腫細胞特異的に転写活性を認め、肺癌細胞では低い転写活性しか認めなかった（図２）。【００３０】
３）各種中皮腫マーカー遺伝子由来プロモータの正常細胞における転写活性の確認
上記２）と同手法によりｐＧＬ３ルシフェラーゼレポーターベクター（Promega 社）に各プロモータ領域を挿入した各発現コンストラクトを作製した。正常中皮細胞、正常胸膜細胞（ラット胸膜由来の4/4RM-4細胞）および正常ヒト肺線維芽細胞（Normal Human Lung Fibroblasts）由来ＮＨＬＦ細胞の各細胞を上記２）と同様に培養し、各細胞について生着を確認後、各発現コンストラクト２μｇを各細胞に形質導入した。２４時間後に各細胞でのルシフェラーゼアッセイによりルシフェラーゼの発光を測定し、各プロモータの転写活性を確認した。【００３１】
その結果、ＣＲＩ１遺伝子プロモータ：-2586/+84（ＣＲＩ１-2586/+84）の場合は、正常細胞に対して低い転写活性であったが、その他の各マーカー由来のプロモータは、正常細胞でも転写活性を認めた（図３）。【００３２】
以上の結果により、ＣＲＩ１-2586/+84は、正常細胞および肺癌細胞に対しては低い転写活性であったが、中皮腫に対しては高い転写活性を認め、中皮腫特異的に転写活性を発揮することが確認された。【００３３】
（実施例２）ＣＲＩ１遺伝子由来プロモータの各種細胞における転写活性の確認
１）ＣＲＩ１遺伝子由来プロモータを含む発現コンストラクトの構築
ＣＲＩ１遺伝子のプロモータ領域の部分について、長さの異なる各領域を取り出し、ホタルルシフェラーゼ遺伝子と結合した発現コンストラクトを構築した。各プロモータを含む発現コンストラクトのシェーマを図４に示した。
ＣＲＩ１遺伝子の転写開始点を+1としたときの各プロモータは、以下に示す配列番号に示す塩基配列よりなる。
ＣＲＩ１-2586/+84（配列番号１）
ＣＲＩ１-1849/+84（配列番号２）
ＣＲＩ１-1674/+84（配列番号３）
ＣＲＩ１-1587/+84（配列番号４）
ＣＲＩ１-1083/+84（配列番号５）
ＣＲＩ１-766/+84（配列番号６）
ＣＲＩ１-567/+84（配列番号７）
ＣＲＩ１-366/+84（配列番号８）
ＣＲＩ１-296/+84（配列番号９）
ＣＲＩ１-138/+84（配列番号１０）
ＣＲＩ１-74/+84（配列番号１１）【００３４】
２）各プロモータの各細胞における転写活性の確認
上記実施例１と同手法によりｐＧＬ３ルシフェラーゼレポーターベクター（Promega 社）に、ＣＲＩ１遺伝子由来各プロモータを挿入した各発現コンストラクトを作製した。悪性胸膜中皮腫細胞株２株（Ｈ２４５２、ＭＳＴＯ−２１１Ｈ）、肺癌細胞株２種（Ａ５４９、Ｈ３２２）および正常細胞株２種（正常中皮細胞、ＮＨＬＦ）を実施例１と同様に培養し、各細胞について生着を確認後、各発現コンストラクト２μｇを各細胞に形質導入した。２４時間後に各細胞でのルシフェラーゼアッセイによりルシフェラーゼの発光を測定し、各プロモータの転写活性を確認した。【００３５】
その結果、ＣＲＩ１遺伝子由来各プロモータは、全てについて悪性胸膜中皮腫細胞で強い転写活性を認めたのに対し、肺癌細胞および正常細胞では、低い転写活性であった。特に、ＣＲＩ１-296/+84、ＣＲＩ１-138/+84、ＣＲＩ１-74/+84の各プロモータを用いた場合に、より中皮腫特異性が認められ、特にはＣＲＩ１-138/+84において最も中皮腫特異性が認められた（図５）。【００３６】
（実施例３）治療型遺伝子組換えアデノウイルス（Ａｄ）ベクターの作製
導入遺伝子およびその上流にＣＲＩ１遺伝子プロモータ（ＣＲＩ１-138/+84）を搭載したＡｄベクターを作製した。導入遺伝子として、細胞死誘導遺伝子（ＢＩＤ）またはＡｄ初期遺伝子Ｅ１を用いた。【００３７】
１）導入遺伝子の非翻訳領域に本発明のプロモータ配列を含む発現コンストラクトの構築
導入遺伝子として、（Ａ）細胞死誘導遺伝子（ＢＩＤ）およびヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子配列を結合したもの、と（Ｂ）Ａｄ初期遺伝子Ｅ１を用いた。（Ａ）または（Ｂ）の上流領域に、ＣＲＩ１-138/+84を直列で４つ連結したものを結合し、各発現コンストラクトを作製した。【００３８】
２）上記１）の発現コンストラクトを含むシャトルベクターの構築
上記１）で構築した発現コンストラクトを含むシャトルベクターをTong-Chuan Heら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 2509-2514, 1998に記載の方法にしたがって構築した。【００３９】
３）Ａｄベクターの作製
Ｅ１欠損型の５型Ａｄゲノムを準備し、Ａｄゲノムを制限酵素で切断し、２）で作製した遺伝子発現シャトルベクターを、He らの方法に従い相同組換え(homologous recombination) を行うことで、上記各種発現コンストラクトを搭載したＡｄ（Ａｄ−ＣＲＩ１-138 4x/ＨＡ−ＢＩＤ、Ａｄ−ＣＲＩ１-138 4x/Ｅ１Ａ）を得た。本実施例においてＢＩＤ発現コンストラクトにＨＡタグを結合したのは、内在性のＢＩＤと識別するためである。【００４０】
（実験例１）Ａｄ−ＣＲＩ１-138 4x/ＨＡ−ＢＩＤの中皮腫細胞に対する効果
実施例３で得たＡｄ−ＣＲＩ１-138 4x/ＨＡ−ＢＩＤについて中皮腫細胞に対する殺細胞効果を調べた。対照として、同手法にて作製したＧＦＰ(green fluorescent protein)を発現する遺伝子を組み込んだＡｄ−ＣＲＩ１-138 4x/ＧＦＰを用いた。ここでは、いずれのＡｄベクターもＥ１欠損型であり、中皮腫細胞では非増殖型であるが、細胞死誘導遺伝子（ＢＩＤ）を含むか、非毒性のＧＦＰ遺伝子を含む点において相違する。【００４１】
得られた各Ａｄベクターを、悪性胸膜中皮腫細胞株２株（Ｈ２４５２、２１１Ｈ）、肺癌細胞株２種（Ｈ３２２、Ａ５４９）、正常細胞株２種（正常中皮細胞、ＮＨＬＦ）および肺癌以外の癌細胞株２株（肝癌細胞：Ｈｅｐ３Ｂ、乳癌細胞：ＭＣＦ７）に感染させた。Ａｄ感染後の各細胞における細胞死について、プロピジウムヨーダイド（ＰＩ）染色後のフローサイトメトリー法による定量を行った。【００４２】
その結果、図７に示すように、細胞死誘導遺伝子を含むＡｄを感染した悪性胸膜中皮腫細胞株２株（Ｈ２４５２、２１１Ｈ）では、細胞周期Ｇ１とＧ０の間にピークが出現するsubＧ０／Ｇ１ポピュレーションの増加を認め、アポトーシスが起こっていることが確認された。一方、肺癌細胞、正常細胞およびその他の癌細胞では、細胞死誘導遺伝子を含む場合と含まない場合で、フローサイトメトリーのパターンに違いは認められなかった。以上の結果より、Ａｄ−ＣＲＩ１-138 4x/ＨＡ−ＢＩＤは、中皮腫細胞特異的に発現することが確認された。【００４３】
（実験例２）Ａｄ−ＣＲＩ１-138 4x/Ｅ１Ａの中皮腫細胞に対する効果
実施例３で得たＡｄ−ＣＲＩ１-138 4x/Ｅ１Ａについて、中皮腫細胞に及ぼす効果を調べた。実験例１と同様に対照としてＡｄ−ＣＲＩ１-138 4x/ＧＦＰを用いた。ここでは、Ａｄ初期遺伝子Ｅ１を含むＡｄベクターは中皮腫細胞では増殖可能であるが、ＧＦＰ遺伝子を含むＡｄベクターは中皮腫細胞において非増殖型である点において相違する。【００４４】
得られた各Ａｄベクターを、悪性胸膜中皮腫細胞株２株（Ｈ２４５２、ＭＳＴＯ−２１１Ｈ）、および正常細胞株２種（正常中皮細胞、ＮＨＬＦ）に導入し、生存細胞数を測定した。生存細胞の測定は、ＭＴＳアッセイ（生細胞内においてテトラゾリウム塩 (MTS* [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulphophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt]) がホルマザンへ変換される反応に基づき、培養液中に放出された水溶性ホルマザンを490 nmで測定するアッセイ）により行った。【００４５】
その結果、図８に示すようにＡｄ−ＣＲＩ１-138 4x/Ｅ１Ａの感染により、Ａｄ−ＣＲＩ１-138 4x/ＧＦＰの感染やＰＢＳのみの場合に比べて中皮腫細胞は明らかに減少することが確認されたが、正常細胞ではＡｄ−ＣＲＩ１-138 4x/ＧＦＰの感染やＰＢＳの場合と差が認められなかった。以上の結果より、Ａｄ−ＣＲＩ１-138 4x/Ｅ１Ａによっても、中皮腫細胞特異的に殺細胞効果を有することが確認された。【００４６】
（実験例３）Ａｄ−ＣＲＩ１-138 4x/ＨＡ−ＢＩＤまたはＡｄ−ＣＲＩ１-138 4x/Ｅ１Ａの中皮腫(in vivo)に対する効果
実施例３で得たＡｄ−ＣＲＩ１-138 4x/ＨＡ−ＢＩＤまたはＡｄ−ＣＲＩ１-138 4x/Ｅ１Ａについて、in vivoでの中皮腫細胞に対する殺細胞効果を調べた。対照ベクターとして、実験例１および２と同様に、ＧＦＰを発現する遺伝子を組み込んだＡｄ−ＣＲＩ１-138 4x/ＧＦＰを用いた。ここで、細胞死誘導遺伝子（ＢＩＤ）または非毒性のＧＦＰ遺伝子を含むＡｄベクターはＥ１欠損型であり、中皮腫細胞では非増殖型である。また、Ａｄ初期遺伝子Ｅ１を含むＡｄベクターは中皮腫細胞では増殖可能である。【００４７】
中皮腫モデルマウスは、週齢６週の雌BALB/c ヌードマウスの皮下に2.5×106個の２１１Ｈ細胞を接種して作製した。２１１Ｈ細胞接種後８日目の中皮腫モデルマウスに、ＰＢＳ、Ａｄ−ＣＲＩ１-138 4x/ＧＦＰ、Ａｄ−ＣＲＩ１-138 4x/ＨＡ−ＢＩＤまたはＡｄ−ＣＲＩ１-138 4x/Ｅ１Ａ を、5×107 pfu (plaque forming unit)ずつ３日連続局所投与し、接種後５６日間腫瘍の大きさを観察した（各条件についてｎ＝８）。【００４８】
その結果、図９に示すように、Ａｄ−ＣＲＩ１-138 4x/ＨＡ−ＢＩＤまたはＡｄ−ＣＲＩ１-138 4x/Ｅ１Ａの感染により、対照であるＡｄ−ＣＲＩ１-138 4x/ＧＦＰの感染やＰＢＳのみの場合に比べて、抗腫瘍効果が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
以上詳述したように、本発明の新規プロモータは、中皮腫特異的に転写活性を有することが確認された。また、該新規プロモータおよび細胞死誘導遺伝子などを搭載するベクターを細胞に導入することにより、中皮腫特異的にアポトーシスの作用が認められ、殺細胞作用を示すことが確認された。また、in vivoにおいても、抗腫瘍効果が確認された。これらの結果より、本発明の新規プロモータを含むベクターは、中皮腫特異的に何らかの作用をさせたい場合に利用することができ、例えば上述のような細胞死誘導遺伝子や、細胞融解誘導遺伝子とともに細胞に導入することで、中皮腫特異的に細胞に傷害を与えることができる。これらの結果より、本発明の新規プロモータを含むベクターは、効果的な中皮腫治療剤となりうる。さらに、本発明の新規プロモータおよびマーカー遺伝子を含むベクターは、中皮腫の検査においても使用することができる。
【図１】
0005400764.tif 000002
【図２】
0005400764.tif 000003
【図３】
0005400764.tif 000004
【図４】
0005400764.tif 000005
【図８】
0005400764.tif 000006
【図９】
0005400764.tif 000007
【図５】
0005400764.tif 000008
【図６】
0005400764.tif 000009
【図７】
0005400764.tif 000010
【配列表】
0005400764000001.app