(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
指標物質のアクチゲニンを１．２〜１２質量％含むように精製及び濃縮した絡石藤乾燥抽出物の酢酸エチル分画物を有効成分として含有する炎症性疾患の予防及び治療用組成物。
【請求項２】
前記絡石藤乾燥抽出物が、メタノールまたはエタノールを用いて抽出して乾燥することにより製造したものであることを特徴とする請求項１に記載の炎症性疾患の予防及び治療用組成物。
【請求項３】
前記絡石藤乾燥抽出物は、２０〜９９．９％（ｖ／ｖ）のエタノールを用いて抽出して乾燥することにより製造したものであることを特徴とする請求項１に記載の炎症性疾患の予防及び治療用組成物。
【請求項４】
前記絡石藤乾燥抽出物の酢酸エチル分画物は、アクチインを６〜２０質量％含むことを特徴とする請求項１に記載の炎症性疾患の予防及び治療用組成物。
【請求項５】
（ａ）絡石藤乾燥抽出物を水に溶解し、前記溶解物に酢酸エチルを混合して水層と酢酸エチル層を分離するステップと、
（ｂ）前記酢酸エチル層を分離及び回収するステップと、
（ｃ）前記回収された酢酸エチル層から溶媒を除去し、指標物質のアクチゲニンの含量が１．２〜１２質量％になるように濃縮し、絡石藤乾燥抽出物の酢酸エチル分画物を得るステップと、
を含むことを特徴とする請求項１〜４いずれか１項記載の組成物の製造方法。
【請求項６】
前記（ａ）ステップで分離した水層に酢酸エチルを混合して水層と酢酸エチル層を分離し、前記酢酸エチル層を分離及び回収した後、前記分離及び回収ステップを２〜５回繰り返し、前記回収された酢酸エチル層から溶媒を除去し、指標物質のアクチゲニンの含量が１．２〜１２質量％になるように濃縮することを特徴とする請求項５に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、絡石藤乾燥抽出物の酢酸エチル分画物を有効成分として含有する炎症性疾患の予防及び治療用薬剤学的組成物とその分画物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
通常、関節炎は、医学的に細菌や外傷などの原因により関節内に生じた炎症性変化に関連する疾病の総称である。このような関節炎は、炎症の持続期間に応じて大きく急性関節炎と慢性関節炎の２つに分類される。
【０００３】
急性関節炎は次のように分類する（斗山百科事典参照）。
漿液性関節炎は、通常外傷により生じるが、原因不明なものもあり、一般的に１つの関節だけに起きる。
漿液線維素性関節炎は、急性関節リウマチ関節炎と同時に起き、関節腔内に混濁した滲出液が溜まる。一般的に線維素の偽膜の生成により炎症が治まっても深刻な運動障害を引き起こし得る。
化膿性関節炎は、関節の開放創、または淋病、腸チフス、しょう紅熱及び敗血症のような伝染病で多発性関節炎が起きる。生後１〜２ケ月の乳児は、治療不能の骨の損傷により脱臼に発展し得る。成人はしばしば、化膿部がつぶれて膿が関節に入り骨膜骨髄炎に発展するが、これを２次化膿関節炎という。
【０００４】
慢性関節炎は次のように分類する。
特殊性炎症は、結核性関節炎、梅毒性関節炎、あるいは中年単性に多く発生する尿酸の代謝障害により起こる通風性関節炎であり、多発性関節炎は、慢性関節リウマチが大部分であり、急性漿液性関節炎から移行したり、結核、梅毒、淋病の過程で多発性関節炎として起こったり、または敗血症の１種であることもある。
その他に、スティル病もこの範疇に属する。
変形性骨関節炎は、骨や関節の老化過程または外傷により起き、血友病性関節炎は、血友病患者のうち関節内の出血により発生する。
上記のような関節炎に代表される炎症性疾患の治療に使用するために多くの薬剤が開発されている。
【０００５】
絡石藤（Ｔｒａｃｈｅｌｏｓｐｅｒｍｉ  ｃａｕｌｉｓ）は、キョウチクトウ科に属するテイカカズラ、及びツキヌキニンドウとも呼ばれ、５メートルの高さまで育つ。花びらは５つに深く分岐し、５〜６月に風車の形をした白い花が咲き、とても良い香りを持つ。果実は９〜１１月頃に実り、２つの長い果実は漢字の人という字を想像させ、しばしば腕輪のように丸い円形を作る。実際、絡石藤は韓国の南部地方の海岸、山麓、または荒地に育ち、特に、岩石、壁、またはその他の木や植物に巻きつきながら育つ。絡石藤が多い所では、その他の種類の草が育つことができず、四方が絡石藤で覆われている所もある。北朝鮮で発行された「東洋医学辞典」によると、絡石藤はテイカカズラの茎と葉を乾かしたものである。味は苦く、東洋医学の観点からその性質は冷たい。心経絡、肝経絡、及び腎経絡に作用する。病原因子と混ざり合った風湿を排除し、経絡をスムーズに通すようにする。一方、麻痺症候群、四肢痙攣、腰痛、関節痛、扁桃炎、及び発疹を治療するのに有用である。約５〜１０ｇの絡石藤を煎じて経口投与する。
【０００６】
更に、病原因子と混ざり合った風湿による四肢麻痺、筋肉麻痺、屈伸がうまくできない症状の治療に、五加皮（Acanthopanax sessiliflorus（Rupr. et Max.）の乾燥根皮、イノコズチ（Achyranthes bidentata Bl.）の乾燥根を加えたものを使用する。血を冷やすことで、水を用いて煎じた後、経口投与を通して咽喉炎、腫れ物の治療に使用される。絡石藤の果実は医薬目的として使用する。絡石藤の果実を絡石果といい、７月ごろに成熟した果実を採集して、筋骨痛の治療のために６〜１２ｇを煎じて経口投与する。葉及び茎が主に使用される。これらは季節に関わらずいつでも採集することができ、日光で乾燥して細かく刻んだ後、使用する。
【０００７】
中国の湖南医学誌（Chinese Honam medicine paper）によると、アルコール飲料に絡石藤３７〜７４ｇを浸して作られた絡石藤の経口投与により筋骨痛を治療することが記されている。Kangseo herbal medicineによると、テイカカズラ３７ｇ、五加皮の外皮３７ｇ及びヒソップ１８．５ｇを水に混合した混合液を白酒と共に煎じて作られた液体生薬を経口投与することで関節炎を治療することが記されている。乾燥させた絡石藤８〜１２ｇを２００ｍＬの水に入れて、体積が約３分の２まで減るまで煎じて液体の生薬を製剤することが好ましい。更に、アルコール飲料に浸けたり、粉末形態にした後、服用することができる。外用時、絡石藤を粉末に粉砕した後、患部に塗ったり、貼ったり、絡石藤の生葉を搗いて作ったエキスで患部を洗う。絡石藤は、キョウチクトウ科の植物であり、腰痛を治療し、筋骨を丈夫にし、関節をスムーズに動かせる作用がある。絡石藤にはトラケロサイド（ｔｒａｃｈｅｌｏｓｉｄｅ）、アクチイン（ａｒｃｔｉｉｎ）、マテレシノサイド（ｍａｔａｉｒｅｓｉｎｏｓｉｄｅ）、アクチゲニン（ａｒｃｔｉｇｅｎｉｎ）、ノトラケロサイド（ｎｏｔｒａｃｈｅｌｏｓｉｄｅ）などが含まれていることが知られている。
【０００８】
絡石藤は、東医宝鑑、郷薬集成方、広済秘笈などの薬草書に簡単な処方が記載されている。しかし、このような処方は、絡石藤を外見で識別する方法、東方医学的薬効、及び煎じ薬を製剤する方法を簡潔に言及しているだけである。即ち、絡石藤の有効成分に関する教示はなかった。
【０００９】
本発明者は「絡石藤抽出物を含有した炎症性疾患の予防及び治療用薬剤」という発明の名称で出願して特許文献１の登録を受けたことがある。
しかしながら、一般的に天然抽出物は、その効能を発揮するための有効容量が高く、様々な成分を含有しているため、製剤学の観点から医薬品に適用し難い問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】韓国特許第０８４７４３９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、絡石藤乾燥抽出物から抗炎活性に最も優れた組成に精製・濃縮した絡石藤乾燥抽出物の酢酸エチル分画物の製造方法を提供することである。
また、他の目的は、前記絡石藤乾燥抽出物の酢酸エチル分画物を有効成分として含有した炎症性疾患の予防及び治療用薬剤学的組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記のような問題点を解決するために、本発明は、絡石藤乾燥抽出物の酢酸エチル分画物（ｐａｒｔｉｔｉｏｎ）であって、指標物質のアクチゲニンを０．０５〜１２質量％含むように精製及び濃縮した抽出物を有効成分として含有する炎症性疾患の予防及び治療用薬剤学的組成物を提供する。
【００１３】
また、他の目的を達成するために本発明は、
（ａ）絡石藤乾燥抽出物を水に溶解し、前記溶解物に酢酸エチルを混合して水層と酢酸エチル層を分離するステップと、
（ｂ）前記酢酸エチル層を分離及び回収するステップと、
（ｃ）前記回収された酢酸エチル層から溶媒を除去し、指標物質のアクチゲニンの含量が０．０５〜１２質量％になるように濃縮して抗炎活性分画物を得るステップと、
を含む絡石藤乾燥抽出物の酢酸エチル分画物の製造方法を提供する。
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の説明において、技術用語及び科学用語に対して他の定義がない限り、この発明が属する技術分野で通常の知識を有する者が一般に理解していることを意味する。
また、従来と同一の技術的構成及び作用に対する説明は省略する。
【００１５】
本発明は、従来の絡石藤乾燥抽出物が有する抗炎症効果を顕著に改善させた絡石藤乾燥抽出物の酢酸エチル分画物（以下、絡石藤酢酸エチル分画物）及びこの製造方法を開発して薬剤学的組成物に適用したものである。
【００１６】
本発明において、絡石藤酢酸エチル分画物は、絡石藤乾燥抽出物に溶媒を加えて分画（ｐａｒｔｉｔｉｏｎ）及び濃縮して得られた物質である。この時、絡石藤乾燥抽出物は、分画前に絡石藤を水または有機溶媒で抽出して乾燥したものである。
【００１７】
本発明で絡石藤の抽出及び分画に使用する溶媒としては、水またはメタノール、エタノール、ブタノールなどから選択されたアルコール類が好ましい。これら水とアルコール類は大韓薬典などに規定されている。
【００１８】
絡石藤酢酸エチル分画物を精製する場合、クロマトグラフィー（ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を行うことが好ましい。具体的に、極性移動相と非極性固定相、または非極性移動相と極性固定相に分離する方法を用いることが好ましい。より具体的には、順相（ｎｏｒｍａｌ  ｐｈａｓｅ）と逆相（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｈａｓｅ）のクロマトグラフィーを繰り返し行って精製度を一層高めることが好ましい。
【００１９】
順相クロマトグラフィーはシリカゲルベースの固定相であり、逆相クロマトグラフィーはＯＤＳ（Ｏｃｔａｒ−ｄｅｓｉｌ−ｓｉｌｉｃａ）ベースの固定相、具体的にはＣ−１８ＯＤＳなどである。この時、移動相溶媒と固定相溶媒として使用される溶媒は、当業者にとって自明な事項であり、具体的な説明は省略する。
【００２０】
本発明でアクチゲニン（ａｒｃｔｉｇｅｎｉｎ）は、分子式Ｃ21Ｈ24Ｏ6の分子量３７２からなる物質であって、ジベンジルブチロラクトンリガンド（Ｄｉｂｅｎｚｙｌｂｕｔｙｒｏａｃｔｏｎｅ  ｌｉｇａｎｄ）であり、様々な植物、特にキク科において、生理活性に関して活発に研究される物質の１つである。また、アクチイン（ａｒｃｔｉｉｎ）は、分子式Ｃ27Ｈ34Ｏ11の分子量５３４からなる物質であって、様々な植物から発見され、アクチゲニンがグリコシド結合された形態の物質である。
【００２１】
本発明は、絡石藤乾燥抽出物の酢酸エチル分画物（ｐａｒｔｉｔｉｏｎ）であって、指標物質のアクチゲニンを０．０５〜１２質量％含むが、これは０．０５質量％未満であれば薬効の上昇効果が低減し、１２質量％を超えると工程が増えて生産コストが増加する反面、薬効の増加は微々たるものであるため、上述した指標物質の含量範囲を製造工程に適用することが好ましい。通常、製造コスト及び工程の単純化のために、指標物質のアクチゲニンの含量を０．４〜３．０質量％に規格化して使用することがより好ましい。また、本発明の分画物の他の指標物質としてアクチインを６〜２０質量％含むことがより好ましい。
【００２２】
本発明により抽出精製した絡石藤酢酸エチル分画物はそれ自体を使用してもよいが、薬学的に許容される担体（ｃａｒｒｉｅｒ）、賦形剤（ｆｏｒｍｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、希釈剤（ｄｉｌｕｔｅ）などと混合し、粉末、顆粒、カプセル、軟膏剤、経皮剤または注射剤などに製造可能である。また、本発明の絡石藤分画物は食用及び薬用として使用されてきた。投与容量に特別な制限はないが、体内吸収度、体重、患者の年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率、疾患の重傷度などにより異なり得る。しかし、効能的側面で絡石藤の酢酸エチル分画物は成人を基準（６０ｋｇ基準）として１００〜１０００ｍｇ／１日を投与することが好ましい。本発明による絡石藤酢酸エチル分画物は、一般の絡石藤抽出物の効能に比べて約２０〜３００％程度優れた効果を奏するため、これを用いて容量を設定して投与することができる。
【００２３】
したがって、本発明の有効成分を含む薬剤学的組成物は有効量範囲を考慮して製造しなければならず、このように剤形化された単位投与製剤は、必要に応じて薬剤の投与が監視される。さらに、特別な投与は専門家の判断と患者の要求に応じて専門化された投薬法が使用されるか、一定間隔で数回投与され得る。
【００２４】
本発明で炎症性疾患は、急性炎症疾患、慢性炎症疾患、自己免疫反応によるリウマチ性炎症疾患、退行性炎症疾患などがある。
【００２５】
以下、本発明による絡石藤抽出物または分画物の精製方法を工程別に説明する。
［第１工程］酢酸エチル分画物の収得工程
本工程は、絡石藤乾燥抽出物を水に溶解し、前記溶解物に酢酸エチルを混合して水層と酢酸エチル層を分離する。
次に、前記分離された酢酸エチル層から溶媒を除去し、指標物質のアクチゲニンの含量が０．０５〜１２質量％になるように濃縮して抗炎効能に優れた酢酸エチル分画物を得る。
これは絡石藤抽出物に、相対的に非極性の特性を有する酢酸エチルを加えて分画することにより、抽出効率が向上するからである。
また、本発明では、酢酸エチルに関連した抽出効率と安全性を考慮して絡石藤抽出物をアルコール類で抽出することが好ましく、具体的にはエタノール、メタノールまたはブタノールで抽出して乾燥したものを使用することが好ましい。これはアルコール類で抽出することにより、水との反応で可溶性に優れ、酢酸エチルを加えて分画する時、活性成分を水から分離させる効率に優れたからである。より具体的には２０〜９９．９％（ｖ／ｖ）のエタノールを用い、より好ましくは３０〜９５％（ｖ／ｖ）のエタノールを用いる。エタノールが２０％未満であれば、活性成分の抽出効率が低下し、９９．９％以上であれば、生産コストが増加して抽出効率性と効能が向上しない。しかし、本発明では、絡石藤抽出物がアルコール類に限定されることはなく、活性成分が多く得られる溶媒で、薬典に収録されているか、人体に安全なものであれば、いずれの溶媒を用いて抽出してもよい。
以下、第２工程と第３工程は、薬効の効能や有効濃度、抽出物の物理的特性などに応じて選択的に行うことができる。
【００２６】
［第２工程］精製工程
本工程は、前記第１工程で分離した酢酸エチル層をクロマトグラフィーを用いて活性分画を得る。この時、本発明では、具体的に順相（ｎｏｒｍａｌ  ｐｈａｓｅ）、逆相（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｈａｓｅ）、または順相と逆相クロマトグラフィーを行ってさらに精製された活性分画を得ることが好ましい。順相または逆相クロマトグラフィーに用いられる様々な移動相または固定相溶媒は、本発明の分野で通常の知識を有する者であれば自明な事項であるため、具体的な説明は省略する。
【００２７】
［第３工程］抽出精製物の収得工程
本工程は、前記第２工程を行って精製度を高めた活性分画を得た後、これを乾燥または濃縮して抽出精製物を得る。
【発明の効果】
【００２８】
本発明による絡石藤酢酸エチル分画物は、従来方法による絡石藤抽出物に比して、抗炎効果が顕著に改善され、炎症性疾患の予防及び治療用薬剤学的組成物や機能性食品として開発することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明による絡石藤抽出物及び分画物のＴＬＣ展開パターンの結果を示した写真［ａ：実施例２、ｂ：実施例３、ｃ：実施例１、ｄ：実施例４］である。
【図２ａ】本発明による絡石藤抽出物及び分画物（実施例１、４）のアクチゲニンのクロマトグラムである。
【図２ｂ】本発明による絡石藤抽出物及び分画物（実施例１、４）のアクチインのクロマトグラムである。
【図３】本発明による酢酸エチル分画物のカラム分画（ｆｒａｃｔｉｏｎｓ）を順相クロマトグラフィーで分離し、これをＴＬＣで分離して示す写真である。
【図４】本発明による絡石藤酢酸エチル分画物のカラム分画のＩＬ−１β、ＴＮＦ−α発生の抑制効果を示すグラフである。
【図５】本発明による絡石藤酢酸エチル分画物（実施例３）により、関節炎滑膜組織細胞（ＦＬＳ）でＴＮＦ−αにより刺激されて発現したＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３の発現が減少すること示す写真である。
【図６】関節炎が誘発されたマウスモデルを用いた関節炎・炎症の浮腫評価試験を行って絡石藤分画物（実施例３）の関節炎抑制効果を示す写真である。
【図７】本発明により絡石藤分画物（実施例３）のＣＩＡマウス関節のＨ＆Ｅ染色結果を示す写真である。
【図８】関節炎誘導マウスの関節における絡石藤分画物（実施例３）のＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＭＰ−３ｍＲＮＡ発現の抑制効果を示す写真である。
【図９】本発明により絡石藤分画物（実施例３）の関節炎モデル動物の関節組織におけるＭＭＰ−１、３蛋白質発現の抑制効果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下、本発明を具体的な実施例により詳細に説明する。また、本発明は、下記実施例により限定されるものではなく、本発明の思想と範囲内で様々な変形または修正が可能であることは当業者にとって明らかである。
【００３１】
実施例１：絡石藤９５％エタノール抽出物の製造
清浄な精製水で洗浄して乾燥させた絡石藤２０ｋｇに、９５％エタノール水溶液を生薬の重量に対して約５〜１０倍の量を加えて攪拌しながら約８０℃付近で５時間にかけて抽出した。前記抽出物を室温まで徐々に冷却・濾過して不純物を除去した後、濾液を混合して減圧状態でエタノール溶媒を蒸発濃縮して絡石藤エタノール抽出物１ｋｇを得た（収率約５％）。
【００３２】
実施例２：絡石藤３０％エタノール抽出物の製造
清浄な精製水で洗浄して乾燥させた絡石藤４０ｋｇに、３０％エタノール水溶液を生薬の重量に対して約５〜８倍の量を加えて攪拌しながら２時間単位で２回熱湯抽出をした。前記抽出物質を室温まで徐々に冷却し、遠心濾過を行って不純物を除去した。濾液を混合して６０〜８０℃で減圧濃縮した。
前記エタノール分画から回収されたエタノールを前記濃縮物に加えた後、濃縮物を十分に懸濁させ、１０００ｒｐｍで遠心濾過した濾液を再び減圧濃縮し、６０℃、０．０８ｐａの条件で真空乾燥させた後、８０メッシュの粉砕過程により滅菌して粉末状の絡石藤エタノール抽出物１ｋｇを得た（収率２．５％）。
【００３３】
実施例３：絡石藤酢酸エチル分画物の製造
前記実施例２で製造した３０％エタノール抽出物１００ｇを約０．８Ｌの水と攪拌して溶かし、同量〜２倍の量の酢酸エチル（３３０ｍＬ×５）を混合した後、分画して酢酸エチル可溶性分画物を得た。酢酸エチル可溶性分画物に適当量（約１２５ｇ）のチオ硫酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  ｔｈｉｏｓｕｌｆａｔｅ）を添加し、分画物の水分子を吸収させて濾過（ｆｉｌｔｅｒ）して酢酸エチル可溶性分画物を精製した。精製された分画物は減圧濾過装置を用いて濃縮させ、約１１ｇの絡石藤酢酸エチル分画物を得た。
【００３４】
実施例４：絡石藤酢酸エチル分画物の製造
前記実施例１で製造した９５％エタノール抽出物１００ｇを約０．８〜２Ｌの水と攪拌して溶かし、同量〜２倍の量の酢酸エチルを混合した後、分画して酢酸エチル可溶性分画物を得た。酢酸エチル可溶性分画物に適当量（約１２５ｇ）のチオ硫酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  ｔｈｉｏｓｕｌｆａｔｅ）を添加し、分画物の水分子を吸収させて濾過（ｆｉｌｔｅｒ）して酢酸エチル可溶性分画物を精製した。精製された分画物は減圧濾過装置を用いて濃縮させ、約１６．７ｇの絡石藤酢酸エチル分画物を得た。
【００３５】
実施例５：絡石藤酢酸エチル分画物のＴＬＣ確認
前記実施例１〜４で製造したそれぞれの絡石藤抽出物及び分画物を、約１ｍｇ／５ｍＬのメタノールでそれぞれ少量ずつ溶かしてＴＬＣ展開用として準備し、Ｓｉｌｉｃａ  ＴＬＣ（順相）にメタノールで溶かした絡石藤酢酸エチル分画物を毛細管から滴下してロードし、完全に乾燥した後、互いに異なる移動相溶媒を用いて密閉されたＴＬＣタンク内で展開し、これを発色試薬を用いて図１にその結果を示した。この時、移動相は（Ａ）酢酸エチル６６％、エタノール１９％、水１５％、（Ｂ）クロロホルム８０％、メタノール１５％、水５％であった。
絡石藤エタノール抽出物（ａ、ｃ）と絡石藤酢酸エチル分画物（ｂ、ｄ）を比較すると、ＴＬＣ展開出発点から異なることがわかった。すなわち、酢酸エチル分画物により精製されたことを明確に観察でき、これは出発点から展開される構成成分の差が、酢酸エチルの分画により相当量減少し、特定の部分のみ酢酸エチル分画物で精製されたことを確認した。
【００３６】
実施例６：絡石藤指標成分の高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の分析
前記実施例２の絡石藤抽出物と実施例３の絡石藤分画物の指標成分アクチイン（Ａｒｃｔｉｉｎ）の含量を高性能液体クロマトグラフィー装置を用いて分析した。
［アクチインの分析条件］
１）使用機器：Ｗａｔｅｒｓ  ＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ
２）移動相：５０％メタノール
３）分析時間：３０分
３）流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
４）カラム：ＹＭＣ−ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８  ＲＳ（２５０×４．６ｍｍ  ＩＤ．  ５ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）
５）検出器：ＵＶ２８０ｎｍ
６）標準品のアクチイン：Ｈｕｎａｎ  Ｇｕｏｈｕａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｌｔｄ、Ｃｈｉｎａ社提供
前記実施例２でアクチインの含量は約３質量％であることを確認し、前記実施例３のアクチインの含量は分画するごとに変化した。すなわち、１回目の酢酸エチル分画に約１９％のアクチインが含まれて最も多く検出され、分画回数２回目から５回目までのそれぞれのアクチインの含量は、順次減って約６％の含量を示した。５回分画された酢酸エチル分画物には平均約１２〜１５％の含量が分析された。
また、実施例１の絡石藤抽出物と実施例４の絡石藤分画物のアクチインとアクチゲニン（Ａｒｃｔｉｇｅｎｉｎ）の含量を高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて分析した。アクチインの分析方法は、前記実施例２、３の分析方法と同様であり、アクチゲニンの分析条件は次の通りである。
［アクチゲニンの分析条件］
１）使用機器：Ｗａｔｅｒｓ  ＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ
２）移動相：４０％アセトニトリル（ＣＨ3ＣＮ）
３）分析時間：３０分
３）流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
４）カラム：ＹＭＣ−ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８  ＲＳ（２５０×４．６ｍｍ  ＩＤ．  ５ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）
５）検出器：ＵＶ２８０ｎｍ
６）標準品：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社の製品番号Ａ１８５４．（Ｌｏｔ．０７４Ｋ４７０１、Ｇｅｒｍａｎｙ）
実施例１でアクチインの含量は約２質量％、アクチゲニンの含量は約０．５質量％であり、実施例４でアクチインの含量は、３回分画時に、約６質量％、アクチゲニンの含量は約１．２質量％であることを測定した。
アクチインとアクチゲニンのクロマトグラムは図２に示した。
【００３７】
実施例７：絡石藤酢酸エチル分画物から順相カラムの分画
前記実施例３で得られた絡石藤酢酸エチル分画物を、メチレンクロリド：メタノール（１０００：５〜９５：５）で構成された段階濃度勾配（Ｓｔｅｐ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）の溶媒システムを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより活性分画を分離した。
すなわち、絡石藤酢酸エチル分画物を約１２倍のシリカゲルを移動相のメチレンクロリド１０００：メタノール５の比率で懸濁させ、ガラスカラムに精密に積み上げた後、約１０ｇの絡石藤酢酸エチル分画物を、約０．５〜１倍のシリカゲルに懸濁させて減圧濃縮で吸着させて積み上げたカラムに注入した。シリカゲル容量の約５倍単位で、濃度勾配をメチレンクロリド９５：メタノール５の比率に段階的に変化させて分画物をシリカゲルカラムの容量（約１００ｍＬ単位）にし、得られたそれぞれの分画物は前記実施例５の方法と同様にシリカゲルＴＬＣにより分離度を確認した（図３参照）。この時、移動相はメチレンクロリド９５％、メタノール５％またはクロロホルム８０％、メタノール１５％、水５％であった。
【００３８】
試験例
本試験例では、本発明による分画物の抗炎効果を確認するために、抽出物及び分画物に対する細胞内の酸化窒素（Ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ）とサイトカイン（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ）の反応効果を比較分析した。また、関節炎が誘発されたマウスを用いて抽出物の浮腫、炎症の抑制反応を動物実験を通して分析し、動物モデルの関節生体試料を用いて組織染色、関節炎因子のｍＲＮＡ、蛋白質の抑制効果を分析した。
【００３９】
１．細胞培養及び抽出精製物の処理
マウス由来の大食細胞であるＲＡＷ２６４．７（ＡＴＣＣ、＃ＴＩＢ−７１）細胞を５％ＣＯ2、３７℃でＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、ペニシリン（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）、及び硫酸ストレプトマイシン（１００ｇ／ｍｌ）を用いて培養した。それぞれの分析のために、ＲＡＷ２６４．７細胞は、９６ウェルプレートに２×１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌでシード（ｓｅｅｄｉｎｇ）し、２４時間後にＬＰＳ３００ｎｇ／ｍｌと分画物を濃度別に処理した。
【００４０】
２．細胞毒性（Ｃｅｌｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）の測定
細胞毒性はＴＡＣＳ  ＸＴＴ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ／Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ．４８９１−０２５−Ｋ）を用いて４時間培養（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）し、ＯＤ490nmで測定した。
【００４１】
３．統計処理
各実験群に対する統計的有意性検証は次の方法で行った。各実験群で得られた資料に対してＬｅｖｅｎｅ検定を施行して分散同質性（ｖａｒｉａｎｃｅ  ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ）があるか否かを確認し、分散が同質性を有する場合、ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡを施行してｐ＝０．０５の水準で有意性が認められる場合、Ｄｕｎｎｅｔｔのｔ検定により実験群間の差を比較した。
【００４２】
試験例１：酸化窒素の測定（ＮＯ  ａｓｓａｙ）
各培養の上清に４０ｍｇ／ｍｌグリース試薬（Ｓｉｇｍａ、Ｇ４４１０）を同量（１００μｌ）入れて混合し、室温で３０分反応させた後、ＯＤ540nmで吸光度を測定した。分析結果、ＬＰＳ刺激だけ加えた処理群（対照群）を基準に相対的な百分率で表記し（％ｏｆ  ＬＰＳ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ）、５０％阻害効果を示す濃度の単位ＩＣ50または阻害率を次の表１、表２に示した。
【表１】
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前記表１は絡石藤３０％エタノール抽出物（実施例２）と絡石藤酢酸エチル抽出物（実施例３）のＮＯ生成の抑制効果をＩＣ50に変換して比較した結果である。５０％を阻害する濃度の範囲が実施例２では１１８０μｇ／ｍｌ、実施例３ではさらに精製されて３７９μｇ／ｍｌとなり、さらに効果的になった。
また、絡石藤抽出物及び分画物（実施例１、実施例４）のＮＯ生成抑制率を上記のような方法で比較分析した。実施例１と４の細胞毒性のない最高濃度３２０μｇ／ｍｌで実施例１のエタノール抽出物のＮＯ生成抑制率は６８％で、効果的であった。これに比して、酢酸エチル抽出物の実施例４は、より高い８０％の抑制率を示し、さらに効果的であることが分かった［表２］。
【表２】
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【００４３】
試験例２：サイトカイン分析
培養液に存在するＩＬ−１β、ＴＮＦ−αの水準はＩＬ−１β分析キット（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ．ＭＬＢ００Ｂ）、ＴＮＦ−α  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ．ＭＴＡ００）を用いてＥＬＩＳＡ方法で測定し、吸光度はＯＤ450nm  ＵＶでマイクロプレートリーダー（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ）を用いて測定した。分析結果はＬＰＳ刺激だけ加えた処理群を基準に相対的な百分率で表記した。
サイトカイン分析において、試料の処理濃度は、細胞毒性の実験結果、細胞毒性が現れない濃度範囲に基づいて実施した。
３０％エタノール絡石藤抽出物（実施例２）と絡石藤酢酸エチル分画物（実施例３）の比較分析の試験結果は次の表３に示した。ＩＬ−１βとＴＮＦ−αの場合、実施例３でそれぞれ３８％、４２％の抑制率を示し、実施例２よりも高い抑制効能であった［表３］。これは細胞毒性が全く現れない最高毒性範囲（実施例２：６４０μｇ／ｍｌ、実施例３：１６０μｇ／ｍｌ）で分析した値である。
【表３】
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前記結果、絡石藤エタノール抽出物と絡石藤酢酸エチル分画物を比較した時、相対的に酢酸エチル分画物が、炎症性サイトカインとして分類されるＴＮＦ−α、ＩＬ−βの抑制効果に優れた。その有効成分がエタノール抽出物に比して非極性溶媒に親和的であることと、有効物質の酢酸エチル可溶性により精製されたことが分かる。
さらに、追加精製試験を行い、前記実施例７で精製された分画物（ｆｒａｃｔｉｏｎｓ）２、５、６のサイトカイン分析結果を図４に示した。ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α抑制効果は、低濃度で高抑制効能を示し、より精製された形態であることが分かる。
したがって、本発明による抽出精製物は、従来の抽出物に比べて薬剤学的に抗炎効果が非常に優れたものと判断される。
【００４４】
試験例３：滑膜組織から滑膜細胞（ＦＬＳ：Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｌｉｋｅ  ｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅ）の分離及び培養
関節炎患者から由来した滑膜組織（ｓｙｎｏｖｉｕｍ  ｔｉｓｓｕｅ）をはさみで約１×１×１ｍｍに切った後、１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼが溶かされているＨＢＳＳバッファで３７℃で２時間培養した。７０μｍのナイロンセルストレーナー（ｎｙｌｏｎ  ｃｅｌｌ  ｓｔｒａｉｎｅｒ）（ＢＤ、ＮＪ、ＵＳＡ）を用いて上清だけ細胞を分離した。分離した細胞は１５００ｒｐｍで１０分間２回遠心分離して洗浄した。上清を除去した後、ペレットにα−ＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ、１％Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を添加し、Ｔ７５−フラスコに移し、３７℃、ＣＯ2培養器で２〜３時間培養した後、２回洗浄して培養した。３〜６回継代した時、９５％以上のＦＬＳが得られ（＞９５％  ｓｕｒｆａｃｅ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ（ＣＤ９０＋）、＜１％ＣＤ３＋、＜１％ＣＤ１１ｂ、＜１％ＦｃγＲｅｃｅｐｔｏｒ  ＩＩ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ）、これを実験に用いた。
【００４５】
試験例４：免疫ブロット分析
前記試験例３で得られたＦＬＳを、２×１０5／ｗｅｌｌずつ６ウェルプレートに分注した。３日間培養後、培養液をｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅα−ＭＥＭ（１％Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎ、１％ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）に交換した後、絡石藤分画物（実施例３）を１０、２５、５０μｇ／ｍｌの濃度で処理し、３０分後にＴＮＦ−α２０ｎｇ／ｍｌを処理して２４時間後にそれぞれの培養液だけ分離抽出した。分離抽出された培養液は１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いて免疫ブロット分析法（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を行った。抗体ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３を用いてＦＬＳから分泌されるＭＭＰに及ぼす影響を確認して図５に示した。図５に示すように、実施例３の絡石藤分画物の１０、２５、５０μｇ／ｍｌの濃度依存的にＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３の有意的な減少を確認した。
【００４６】
試験例５：ＣＩＡ（Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）マウスモデル
実験動物は５週齢の雄ＤＢＡ／１Ｊマウスを購入して２週間純化させた後、７週齢になった時に実験を実施した。１００μｇの牛由来のＩＩ型コラーゲン（ｉｎ  ０．０５Ｍ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）を同量のフロイント完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ  Ｉｎｃ．、Ｒｅｄｍｏｎｄ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ））に混合してしっぽの筋肉に注入（１ｓｔ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）した。２１日後、５０μｌ（２ｍｇ／ｍｌ）の牛由来のＩＩ型コラーゲンを再び腹腔注射法（ｉ．ｐ）で注入した（第２免疫：２ｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）。第２免疫と共に蒸留水（ｖｅｈｉｃｌｅ）、ＩＮＤ（ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ）、絡石藤分画物（実施例３）を５％アラビアガムにより懸濁液にして毎日経口注入した。
【００４７】
関節炎スコア（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｓｃｏｒｅ）は、３日ごとに目視評価し、それぞれ評価者（６人）はブラインドテストを行った。
前脚及び後脚を全て測定し、０：正常（ｎｏｒｍａｌ）、１：良好（ｍｉｌｄ、ａｐｐａｒｅｎｔ  ｓｗｅｌｌｉｎｇ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｄｉｇｉｔｓ）、２：普通（ｍｏｄｅｒａｔｅ、ｒｅｄｎｅｓｓ  ａｎｄ  ｓｗｅｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｋｌｅ）、３：やや不良（ｒｅｄｎｅｓｓ  ａｎｄ  ｓｗｅｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｗ  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｄｉｇｉｔｓ）、４：不良（ｍａｘｉｍａｌｌｙ  ｉｎｆｌａｍｅｄ  ｌｉｍｂ  ｗｉｔｈ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｊｏｉｎｔｓ）の評価基準で関節炎スコアを評価した。評価は、第２免疫（２ｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）の開始日から１８日目まで測定した。図６は、ＣＩＡ試験の目視評価の結果を示した。
【００４８】
図７は、組織評価写真（Ｈ＆Ｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）の評価結果を示した。第１免疫（ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）の後、３８日目に犠牲死させたＣＩＡ動物モデルの後脚を摘出して固定液（４％  ｐａｒａｆｏｒｍ−ａｌｅｈｙｄｅ  ｉｎ  ＰＢＳ）にＣＩＡ固定させた後、脱灰液（１０％  ＥＤＴＡ、４％  ｐａｒａｆｏｒｍ−ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｉｎ  ＰＢＳ）を用いて４週間の脱灰過程を行った。次に、パラフィン処理して５μｍ厚さで分割（ｓｅｃｔｉｏｎ）してＨ＆Ｅ（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ａｎｄ  ｅｏｓｉｎ）染色を実施し、軟骨損傷（Ｃａｒｉｌａｇｅ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）、骨の腐食（ｅｒｏｓｉｏｎ）、免疫細胞の浸潤（Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、パンヌス（Ｐａｎｎｕｓ）の形成程度などを測定した。
測定機準は、０：正常、１：免疫細胞の浸潤、２：滑膜の過形成、パンヌスの形成、３：骨の腐食、崩壊とし、３人以上がブラインドテストを実施した。
【００４９】
試験例６：実験動物組織からｍＲＮＡ抽出分離
ＣＩＡ実験動物（試験例５）から採取した前脚（ｐａｗ）、後脚（ｈｉｎｄ  ｌｅｇ）の組織を液体窒素で凍らせ、モルタルを用いて粉砕した後、ＲＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｉｎｔｒｏｎ、Ｋｏｒｅａ）を用いて総ＲＮＡを分離抽出した。ＲＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｌｙｓｉｓバッファの添加後、３０分間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）し、クロロホルム２００μｌを添加して１３，０００ｒｐｍ、４℃、３０分間遠心分離後、上清を得てＲＮＡ分離フィルタを用いて総ＲＮＡを抽出した。分離抽出した総ＲＮＡは、分光光度計（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎ）を用いて定量した。
【００５０】
試験例７：ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）
試験例６で抽出した総ＲＮＡの１μｇをＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。総ＲＮＡ１μｇとＯｌｉｇｏｄＴ  １８ｍｅｒ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）を７２℃で５分間反応させ、ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  Ｍｉｘ（３ｍＭ  ＭｇＣｌ2、各０．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、５ｘ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ、２０Ｕ  ｒｉｂｏｎｕｃｌａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、１μｌ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）を添加した後、２５℃で５分間、４２℃で１時間、７２℃で５分間反応させた。このように生産した鋳型をＰＣＲ反応に用いた。ＰＣＲ反応でＩＬ−１βは９４℃で２分、９４℃で２０秒、６０℃で１０秒（ＲＡＮＴＥＳ、ＭＭＰ−３、ＧＡＰＤＨ：５０℃）、７２℃で４０秒間３３サイクル（ＩＬ−６：３５ｃｙｃｌｅｓ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＭＰ−３：３５ｃｙｃｌｅｓ）行い、最後に７２℃で５分間反応して実験を行った。このように得られた生産物は、２％アガロースゲルで電気泳動を行ってエチジウムブロマイド（ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）で染色した後、ＵＶシステムで確認して図８に示した。各ＰＣＲプライマー配列は次の表４に示した。
【表４】
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【００５１】
試験例８：実験動物の組織から蛋白質の抽出分離
ＣＩＡ実験動物（試験例５）から採取した前脚（ｐａｗ）、後脚（ｈｉｎｄ  ｌｅｇ）の組織は液体窒素で凍らせ、モルタルを用いて粉砕した後、ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  ｐ−４０、１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、６０ｍＭ  ｏｃｔｙｌβ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ、１０ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  Ｎａ3ＶＯ4、１ｍＭ  ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ、２．５ｍＭ  ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ、０．７μｇ／ｍｌ  ｐｅｐｓｔａｔｉｎ、ａｎｄ  ａ  ｐｒｏｔｅａｓｅ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ  ｔａｂｌｅｔ）を添加して総蛋白質を分離抽出した。分離抽出した蛋白質はＢｒａｄ−ｆｏｒｄ  ａｓｓａｙ方法で定量し、免疫ブロット分析法を行った。
蛋白質水準でＣＩＡ実験動物から採取した前脚、後脚の組織内でＭＭＰ−１とＭＭＰ−３の発現は絡石藤分画物（実施例３）により阻害効果を確認し、図９に示した。
【００５２】
製造例１：錠剤の製造
本発明の絡石藤酢酸エチル分画水を用いて次のような組成で経口投与用錠剤を湿式顆粒法及び乾式顆粒法を用いて製造した。
［組成］
絡石藤酢酸エチル分画物２００ｍｇ、硬質無水ケイ酸１０ｍｇ、ステアリン酸マグネシウム２ｍｇ、微細結晶セルロース５０ｍｇ、デンプングリコール酸ナトリウム２５ｍｇ、乳糖１０１ｍｇ、ポビドン１２ｍｇ、無水エタノール適量。
【００５３】
製造例２：軟膏剤の製造
本発明の絡石藤酢酸エチル分画物を用いて次のような組成に軟膏剤を製造した。
［組成］
絡石藤酢酸エチル分画物５ｇ、パルミチン酸セチル２０ｇ、セタノール４０ｇ、ステアリルアルコール４０ｇ、ミリスチン酸イソプロピル８０ｇ、モノステアリン酸ソルビタン２０ｇ、ポリソルベート６０ｇ、パラオキシ安息香酸プロピル１ｇ、パラオキシ安息香酸メチル１ｇ、リン酸及び精製水適量。
【００５４】
製造例３：注射剤の製造
本発明の絡石藤酢酸エチル分画物の用いて次のような組成に注射剤を製造した。
［組成］
絡石藤酢酸エチル分画物１００ｍｇ、マンニトール１８０ｍｇ、リン酸一水素ナトリウム２５ｍｇ、注射用精製水２９７４ｍｇ
【００５５】
製造例４：経皮剤の製造
本発明の絡石藤酢酸エチル分画物の用いて次のような組成で経皮剤を製造した。
［組成］
絡石藤酢酸エチル分画物０．４ｇ、ポリアクリル酸ナトリウム１．３ｇ、グリセリン３．６ｇ、酸化アルミニウム０．００４ｇ、メチルパラベン０．２ｇ、アクリル系粘着溶液１４ｍｌ
【００５６】
配列リスト  Ｆｒｅｅ  Ｔｅｘｔ
ａｐｐファイルで、電子出願書ＰＣＴ−ＳＡＦＥ−ＦＭに添付した。
【図２ａ】
0005514216.tif 000006
【図２ｂ】
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【図４】
0005514216.tif 000008
【図１】
0005514216.tif 000009
【図３】
0005514216.tif 000010
【図５】
0005514216.tif 000011
【図６】
0005514216.tif 000012
【図７】
0005514216.tif 000013
【図８】
0005514216.tif 000014
【図９】
0005514216.tif 000015
【配列表】
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