(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのαβへテロ二量体Ｔ細胞レセプター(TCR)を提示し、TCRα鎖及びβ鎖の各々が膜貫通配列を含んでなり、該膜貫通配列はＮ末端で細胞外定常ドメイン配列に融合し、次に該細胞外定常ドメイン配列はＮ末端で可変領域配列に融合し、該TCRが膜貫通配列により膜に固着し、該TCRがα及びβの細胞外定常ドメイン残基間の、天然型TCRには存在しないジスルフィド結合を含んでなり、該ジスルフィド結合は
TRAC*01のエキソン１のThr48及びTRBC1*01又はTRBC2*01のエキソン１のSer57から置換されたシステイン残基間；又は
TRAC*01のエキソン１のThr45及びTRBC1*01又はTRBC2*01のエキソン１のSer77から置換されたシステイン残基間；又は
TRAC*01のエキソン１のTyr10及びTRBC1*01又はTRBC2*01のエキソン１のSer17から置換されたシステイン残基間；又は
TRAC*01のエキソン１のThr45及びTRBC1*01又はTRBC2*01のエキソン１のAsp59から置換されたシステイン残基間；又は
TRAC*01のエキソン１のSer15及びTRBC1*01又はTRBC2*01のエキソン１のGlu15から置換されたシステイン残基間にある、Ｔ細胞。
【請求項２】
少なくとも、TCRα鎖及びβ鎖の可変領域の相補性決定領域以外の配列がヒトTCRα及びβの配列に対応する請求項１に記載のＴ細胞。
【請求項３】
複数のTCRをディスプレイしている請求項１又は２に記載のＴ細胞。
【請求項４】
前記TCRにおいて、天然型TCRに存在する鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基が非システイン残基で置換されている請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項５】
前記TCRにおいて、天然型TCRβ鎖に存在する未対合のシステイン残基が存在しない請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に規定されたTCRをコードする発現ベクターを有する宿主細胞を、該TCRの発現を引き起こす条件下でインキュベートすることを含んでなる請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞の取得方法。
【請求項７】
標的細胞に特異的な請求項１〜５のいずれか１項に規定のTCRをコードする発現ベクターでの、患者から単離したＴ細胞集団のインビトロトランスフェクションを含んでなる請求項１〜５のいずれか１項に記載の複数の細胞を製造する方法。
【請求項８】
トランスフェクトした細胞のインビトロ増殖を更に含んでなる請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の複数のＴ細胞を医薬的に許容されるキャリアと共に含んでなる注入又は注射可能な医薬組成物。
【請求項１０】
ガン、GVHD、感染、臓器拒絶、又は自己免疫疾患の治療用医薬の製造における請求項１〜５のいずれか１項に記載の複数の細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変Ｔ細胞レセプター(TCR)を発現する細胞(特にＴ細胞)、その製造、及び治療におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
天然型TCR
例えばWO99/60120に記載されているように、TCRは、Ｔ細胞による特異的な主要組織適合性複合体(MHC)-ペプチド複合体の認識を媒介し、そしてそれ自体、免疫系の細胞性因子(arm)の機能化に必須である。
【０００３】
抗体及びTCRは、特異的な様式で抗原を認識する唯二つの分子型であり、したがってTCRは、MHCにおいて提示される特定ペプチド抗原(この外来ペプチドは、細胞内での異常の唯一の徴候であることが多い)の唯一のレセプターである。Ｔ細胞認識は、Ｔ細胞と抗原提示細胞(APC)とが直接に物理的接触をしているときに起こり、抗原特異的TCRとpMHC複合体との連結により開始する。
【０００４】
天然型(native)TCRは、シグナル伝達の媒介に関与するCD3複合体の不変タンパク質と会合する、免疫グロブリンスーパーファミリーのヘテロ二量体細胞表面タンパク質である。TCRはαβ形態及びγδ形態で存在し、これらは、構造的に類似するが、全く異なる解剖学的所在及びおそらくは全く異なる機能を有する。MHCクラスＩ及びクラスIIリガンドもまた、免疫グロブリンスーパーファミリータンパク質であるが、APC細胞表面で多様な一連(array)の短いペプチドフラグメントを提示することを可能にする高度に多形性のペプチド結合部位を有して抗原提示に特化している。
【０００５】
２つのさらなるクラスのタンパク質が、TCRリガンドとして機能し得ることが知られている。（１）CD1抗原は、その遺伝子が古典的なMHCクラスＩ及びクラスIIの抗原とは異なる染色体に位置するMHCクラスＩ関連分子である。CD1分子は、従来のクラスＩ及びクラスII-MHC−pep複合体と同様の様式で、ペプチド部分及び非ペプチド部分(例えば、脂質、糖脂質)をＴ細胞に提示することができる(例えば、Barclayら(1997) The Leucocyte Antigen Factsbook 第２版，Academic Press、及びBauer(1997) Eur J Immunol 27(6) 1366-1373を参照)。（２）細菌性スーパー抗原は、クラスII MHC分子とTCRのサブセットとの両方に結合できる可溶性毒素である(Fraser(1989) Nature 339 221-233)。多くのスーパー抗原が１又は２のVβセグメントに対して特異性を示す一方、より無差別な結合を示すものもある。ともかく、スーパー抗原は、多クローン性様式でＴ細胞のサブセットを刺激する能力により、増強した免疫応答を誘発することができる。
【０００６】
天然型ヘテロ二量体αβTCR及びγδTCRの細胞外部分は２つのポリペプチドからなり、その各々が、膜近位の細胞外定常ドメイン及び膜遠位の可変領域を有する。細胞外定常ドメイン及び可変領域の各々が、鎖内ジスルフィド結合を含む。可変領域は、抗体の相補性決定領域(CDR)と同様な高度多形性ループを含む。αβTCRのCDR3はMHCが提示するペプチドと相互作用し、αβTCRのCDR1及びCDR2はそのペプチド及びMHCと相互作用する。TCR配列の多様性は、連結される可変(Ｖ)遺伝子、多様性(Ｖ)遺伝子、連結(Ｊ)遺伝子及び定常遺伝子(これらの遺伝子産物は可変領域を作り上げる)の体細胞再編成(somatic rearrangement)を介して生じる。
【０００７】
機能的なα鎖及びγ鎖のポリペプチドは、再編成されたＶ−Ｊ−Ｃドメインにより形成
される一方、β鎖及びδ鎖はＶ−Ｄ−Ｊ−Ｃドメインからなる(図１参照)。各機能的TCRは、各ドメインの可能な変形の１つを有する。(TCRα鎖及びβ鎖の全ての公知のTCR Ｃドメイン及びＶドメインのDNA配列についてはそれぞれ図７及び８を参照。全ての公知のTCRドメインのDNA配列及びアミノ酸配列の完全な一覧表についてはLeFrancら、(2001) The T
cell receptor Factsbook, Academic Pressもまた参照)。短縮化TCRドメインのインビボ組換えにより更なるレベルの多様性がαβTCRに導入される。細胞外定常ドメインは、膜近位モチーフ及び免疫グロブリンモチーフを有する。単一のα鎖定常ドメイン及びδ鎖定常ドメイン(それぞれTRAC及びTRDCとして知られる)が存在する。β鎖定常ドメインは２つの異なるβ定常ドメイン(TRBC1及びTRBC2として知られる)の一方から構成される(IMGT命名法)。これらβ定常ドメイン間には４つのアミノ酸変化が存在し、そのうちの３つは、TRBC1及びTRBC2のエキソン１にあり(N4K5→K4N5及びF37→Ｙ)、２つのTCRβ鎖定常領域間の最後のアミノ酸変化は、TRBC1及びTRBC2のエキソン３にある(V1→Ｅ)(IMGT番号付法、差異TRBC1→TRBC2)。定常γドメインは、TRGC1、TRGC2(２×)、又はTRGC3(３×)のいずれか１つから構成される。２つのTRGC2定常ドメインは、この遺伝子のエキソン２によりコードされるアミノ酸の、存在するコピー数のみが異なる。TCR定常ドメインは膜貫通配列を含み、そのアミノ酸はTCR鎖を細胞表面膜に固着する。46の異なるTRAVドメイン及び56のTRBVドメインが存在する。52の異なる機能的遺伝子がTRAJドメインをコードする一方、12〜13の機能的遺伝子がTRBJドメインをコードする。２つの異なる機能的遺伝子がTRBDドメインをコードする。
【０００８】
膜貫通配列により境界されるTCR細胞外定常ドメインの各々の範囲はいくらか変化し得る。しかし、当業者は、The T Cell Receptor Facts Book，Lefranc & Lefranc，Academic Press発行，2001のような参考文献を使用して、ドメイン境界の位置を容易に決定できる。
【０００９】
免疫療法
免疫療法は、ガン細胞又は感染細胞に対する患者の免疫応答を増強することを含む。能動免疫療法は腫瘍を有する患者の内因性免疫系の刺激により行われる。受動(又は養子)免疫療法は、患者に免疫応答性細胞を移入することを含む(Paul (2002) Curr Gene Therapy
2 91-100)。養子免疫療法に対しては、転移性疾患の治療のために医院で適用されてきた３つの広いアプローチがある；リンホカイン活性化キラー(LAK)細胞、自己リンパ球療法(ALT)及び腫瘍浸潤リンパ球(TIL)(Paul (2002) Curr Gene Therapy 2 91-100)。
【００１０】
Ｔ細胞養子療法の最近提案された変法は、ガン患者のＴ細胞へ既知のガン特異的MHC-ペプチド複合体に特異的なTCRを導入するための遺伝子治療技術の使用である。例えば、WO 01/55366は、異種TCRで好ましくはＴ細胞をトランスフェクトするためのレトロウイルスベースの方法を開示する。この文書は、これらトランスフェクトした細胞が、高親和性TCRの同定手段としてのTCR変形体の細胞表面ディスプレイ用にか又は免疫療法用に使用し得ることを述べている。ヒトp53特異的なHLA制限マウスTCRのcDNAの分子クローニング及びヒトＴ細胞へのこのcDNAの移入の方法が、公開米国特許出願第20020064521号に記載されている。この文書は、このマウスTCRの発現の結果、HLA A*0201が提示するp53由来ペプチド149-157でパルスされた腫瘍細胞において発現する内因性にプロセシングされたヒトp53の認識を生じることを述べており、抗ガン養子免疫療法におけるマウスTCRの使用を特許請求している。しかし、トランスフェクトしたＴ細胞の最大半値(half maximal)のＴ細胞刺激を達成するために必要なパルスするペプチドの濃度は、マウスTCRを単独で発現するＴ細胞により必要とされるものの約250倍であった。著者らが気付いているように、「ペプチド感度レベルの差は、トランスフェクト体の系統が、発現した４つ全てのhu TCR鎖及びmu TCR鎖の独立した会合の結果、多数の異なるTCRへテロ二量体を含有していたことから予期され得るものである」。
【００１１】
Ｔ細胞養子療法に関する多くの最近の文献が存在する。或る研究(Rosenberg (1988) N Engl J Med 319 (25) 1676-80)では、メラノーマからのリンパ球がインビトロで拡大され、これら腫瘍浸潤リンパ球が、IL-2との組合せで、養子移入により転移性メラノーマの20人の患者を治療するために使用された。著者らは、以前にインターロイキン２で治療されたことがない15人中９人(60％)の患者及び以前のインターロイキン２での治療に失敗した５人中２人(40％)の患者で、ガンの客観的退行が観察されたと述べている。ガンの退行は、肺、肝臓、骨、皮膚、及び皮下部位で生じ、２〜13ヶ月以上持続した。更なる研究は、抗療性悪性メラノーマの８人の患者への、Melan-A特異的細胞傷害性Ｔ細胞の拡大集団の投与を記載する。これらＴ細胞は、IL-2のs.c.投与を伴って、２週間間隔のi.v.注入により投与された。Ｔ細胞注入は十分に許容され、臨床応答は、８人の患者のうち、１人が部分的であり、１人が或る転移性沈着物の縮小との混合、１人が変化なし(12ヶ月)として気付かれた。この研究で気付くように、Ｔ細胞養子療法に適切な細胞集団の作製のためのＴ細胞のインビトロ刺激に関する最近の進歩は、このアプローチをより実用的にしている(例えば、Oelke (2000) Clin Cancer Res 6 1997-2005及びSzmania (2001) Blood 98 505-12を参照)。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の簡単な説明
本発明は、膜貫通配列により膜に固着(anchored)した少なくとも１つのＴ細胞レセプター(TCR)を提示する細胞に関する。ここで、該TCRは、細胞外定常ドメイン残基間の、天然型TCRに存在しない鎖間ジスルフィド結合を含んでなる。このようなＴ細胞は、Ｔ細胞養子免疫療法における使用に特に適すると予測される。
【００１３】
発明の詳細な説明
本発明は、膜貫通配列により膜に固着した少なくとも１つのＴ細胞レセプター(TCR)を提示する細胞に関し、該TCRは、天然型TCRには存在しない、細胞外定常ドメイン残基間の鎖間ジスルフィド結合を含んでなる。
【００１４】
上記のように天然型TCRはαβ形態及びγδ形態で存在し、本発明は、細胞外定常ドメイン残基間の、天然型TCRには存在しない鎖間ジスルフィド結合を含んでなるこれらTCR形態のいずれを提示する細胞も包含する。
別の実施形態は、α及びβの細胞外定常ドメイン残基間の天然型TCRには存在しないジスルフィド結合を含んでなる、膜貫通配列により膜に固着した少なくとも１つのαβＴ細胞レセプター(TCR)を提示する細胞を提供する。
【００１５】
トランスフェクトしたへテロ二量体TCR(dTCR)鎖における(新規ジスルフィド結合を作る)新規システイン残基の存在は、トランスフェクトしたTCR鎖と会合する天然型TCR鎖を含んでなるTCRより、所望のトランスフェクトしたTCRの製造に好ましい。理論により拘束されることは望まないが、この結果は、２つのトランスフェクトしたTCR鎖が導入システイン残基間の新規鎖間ジスルフィド結合の形成に起因して優先的に自己会合するためであると解釈される。TCR鎖のミスマッチ対(１つは天然型TCRに由来し、１つはトランスフェクトしたTCRに由来する)を含んでなる如何なるTCRの形成も、トランスフェクトした鎖が天然型鎖間ジスルフィド結合の形成に関与するシステイン残基を確実に欠くことによって更に阻害され得る。したがって、そのようなトランスフェクトしたTCR鎖を発現する細胞は、本発明の実施形態を提供する。
本発明に従う単鎖TCR(scTCR)の使用もまた、ミスマッチ対の形成を回避する。
【００１６】
本発明の細胞により提示される、α及びβの細胞外定常ドメイン残基間の天然型TCRには存在しないジスルフィド結合を含んでなるαβTCRは、標的の一部(moiety)である。本
発明のTCRは、TCRリガンド、例えばペプチド-MHC複合体又はCD1-抗原複合体を標的する。そのため、これらTCRの親和性が変更できることが望ましい。例えば、これらTCRが、TCRリガンドに対して、該リガンドに特異的な天然型TCRより高い親和性及び/又はより緩慢なオフレート(off-rate)を有することが望ましい。本発明者らの同時係属中の出願WO 2004/044004は、TCRリガンドに対して、該リガンドに特異的な天然型TCRより高い親和性及び/又はより緩慢なオフレートを有するTCRを製造し、試験する方法を詳述している。
【００１７】
膜固着scTCR及びdTCRを発現し提示するようにトランスフェクトした細胞のTCR機能性(functionality)は、トランスフェクトした細胞が該当するTCRリガンド(pMHC複合体、CD1-抗原複合体、スーパー抗原又はスーパー抗原/pMHC複合体)に結合することを確認することによって試験してもよく、結合すればこの要件を充足する。TCRリガンドへのトランスフェクトした細胞の結合は、多くの方法により検出することができる。これらには、TCRリガンドに検出可能な標識を付着することが含まれる。例えば、方法がpMHC四量体を使用する場合、このpMHCは蛍光標識を含んでもよい。本明細書中のプロトコル６は、MHC-ペプチド複合体への、ジスルフィド連結TCRを発現するようにトランスフェクトした細胞の結合を分析するために必要な方法の詳細な説明を提供する。この方法は、TCR/CD1相互作用の研究に等しく適用可能である。この方法をTCR/CD1相互作用の研究に適用するためには、可溶性形態のCD1が必要であるが、その製造は、Bauer (1997) Eur J Immunol 27 (6) 1366-1373に記載されている。
【００１８】
細胞膜固着dTCR
dTCRの場合、TCRα鎖及びβ鎖は各々、Ｎ末端で細胞外定常ドメイン配列(この配列は、Ｎ末端で可変領域配列に融合する)に融合した膜貫通配列を含み得る。更に、少なくとも、可変領域の相補性決定領域以外のTCRα鎖及びβ鎖の配列は、ヒトTCRα配列及びβ配列に対応し得る。
【００１９】
細胞膜固着scTCR
scTCRの場合、該scTCRは、
(ｉ)α鎖細胞外定常ドメイン配列のＮ末端に融合したα鎖可変領域配列により構成される第１のセグメント、及びβ鎖細胞外定常配列と膜貫通配列との配列のＮ末端に融合したβ鎖可変領域配列により構成される第２のセグメントを含んでなり、リンカー配列が第１のセグメントのＣ末端を第２のセグメントのＮ末端に連結しているか、又は、
(ii)β鎖細胞外定常ドメイン配列のＮ末端に融合したTCRβ鎖可変領域配列により構成される第１のセグメント、及びα鎖細胞外定常配列と膜貫通配列との配列のＮ末端に融合したα鎖可変領域配列により構成される第２のセグメントを含んでなり、リンカー配列が第１のセグメントのＣ末端を第２のセグメントのＮ末端に連結している。
【００２０】
再び、scTCR実施形態でも、可変領域の相補性決定領域以外のTCRα鎖及びβ鎖の配列は、ヒトTCRα配列及びβ配列に対応する。
【００２１】
膜固着scTCRポリペプチド中のリンカー
本発明の細胞提示scTCRに関して、リンカー配列は、ポリペプチド単鎖を形成するために、第１及び第２のTCRセグメントを連結する。リンカー配列は、例えば、式-Ｐ-AA-Ｐ-(式中、Ｐはプロリンであり、AAはアミノ酸がグリシン及びセリンであるアミノ酸配列を表す)を有してもよい。
【００２２】
本発明の細胞提示scTCRがTCRリガンド、例えばMHC-ペプチド複合体又はCD1-抗原複合体に結合するために、第１及び第２のセグメントは、可変領域配列がそのような結合に関して配向するように、対合していなければならない。したがって、リンカーは、第１のセグメントのＣ末端と第２のセグメントのＮ末端との間又はその逆の間の距離を橋渡しするに
十分な長さを有するべきである。他方で、万一にもＮ末端可変領域配列でリンカーの末端部が、scTCRと標的リガンドとの結合を遮断し又は減少させないように、好ましくは、過度なリンカー長は回避すべきである。
【００２３】
例えば、第１のセグメント中に存在する定常領域細胞外配列が、TCRの天然型鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を排除するようにＣ末端で切断された天然型TCRのα鎖及びβ鎖の定常領域に対応し、リンカー配列が第１のセグメントのＣ末端と第２のセグメントのＮ末端を連結する場合、該リンカーは、26〜41アミノ酸、例えば29、30、31又は32アミノ酸からなってもよく、特定のリンカーは、式-PGGG-(SGGGG)5-Ｐ-(式中、Ｐはプロリンであり、Ｇはグリシンであり、Ｓはセリンである)を有する。
【００２４】
細胞膜固着scTCR及びdTCR
上記のように、好ましい実施形態では、dTCR又はscTCRのα鎖配列及びβ鎖配列は、ヒトCDR配列に対応してもしなくてもよい可変領域の相補性決定領域(CDR)を除き、ヒトTCRα配列及びβ配列に対応する。しかし、このような配列間の対応は、アミノ酸レベルで１：１である必要はない。全体として結果的に、それぞれ天然型αβＴ細胞レセプター中と同様であるα可変領域配列及びβ可変領域配列の相互配向を含んでなる細胞膜固着TCRであれば、対応するヒトTCR配列と相対的なＮ若しくはＣの切断並びに/又はアミノ酸の欠失及び/若しくは置換は許容される。特に、定常ドメイン細胞外配列は、細胞膜固着scTCR又はdTCRが結合するリガンドとの接触に直接関与しないので、天然型TCRの細胞外定常ドメイン配列より短くてもよいし、天然型TCRの細胞外定常ドメイン配列と相対的な置換又は欠失を含んでもよい。
【００２５】
図７及び８に開示したものに対応する核酸配列の任意の適切な組合せによりコードされるアミノ酸を含んでなる膜固着TCRを提示する細胞は、本発明の範囲に包含される。当業者に公知のように、TCRはまた、図７及び８に開示された配列の切断型変形体によりコードされるアミノ酸配列の組合せにより製造することができる。このようなTCRは、本発明の更なる実施形態を形成する。これら核酸分子の任意の変形体によりコードされる膜固着TCRもまた、本発明の範囲内に包含される。
【００２６】
通常、本発明に従う細胞は、複数の前記scTCR又はdTCR(外因性TCR)を提示する。複数の前記scTCR又はdTCRの各々は、好ましくは同一であるが、細胞がＴ細胞である場合には、該細胞はまた、当該Ｔ細胞染色体によりコードされる残された幾らかの天然型(内因性)TCRを提示してもよい。
【００２７】
別の好ましい実施形態は、膜固着scTCR若しくはdTCR又は複数のそれらを有するＴ細胞を提供する。更に好ましい実施形態では、これらＴ細胞は細胞傷害性Ｔ細胞である。
別の好ましい実施形態は、膜固着scTCR若しくはdTCR又は複数のそれらを有し、自己免疫応答の細胞性又は炎症誘発性の因子が減少している細胞を提供する。このような細胞の例としては、マクロファージ、γδＴ細胞、Th3 Ｔ細胞、Tr1 Ｔ細胞、NK Ｔ細胞、マクロファージ及び調節性Ｔ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。更に好ましい実施形態では、これら細胞は調節性Ｔ細胞である。
【００２８】
調節性Ｔ細胞はCD4及びCD25の細胞表面発現により特徴付けられる。Bluestone及びTang
Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 101 Suppl 2: 14622-6は、調節性Ｔ細胞の総説を提供している。
本発明の更なる実施形態では、細胞は、α鎖の定常ドメインの免疫グロブリン領域の残基を、β鎖の定常ドメインの免疫グロブリン領域の残基に連結する共有結合性ジスルフィド結合を含有するscTCR又はdTCRを提示する。
【００２９】
本発明の更なる実施形態は、当該TCRにおいて天然型TCR中の鎖間ジスルフィド結合が存在しないscTCR又はdTCRを提示する細胞を提供する。
本発明の更なる実施形態は、当該TCRにおいて天然型鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基が別の残基に置換されているscTCR又はdTCRを提示する細胞を提供する。
【００３０】
本発明の更なる実施形態は、当該TCRにおいて天然型鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基がセリン又はアラニンに置換されているscTCR又はdTCRを提示する細胞を提供する。
本発明の更なる実施形態は、当該TCRにおいて天然型TCRβ鎖中に存在する未対合のシステイン残基が存在しないscTCR又はdTCRを提示する細胞を提供する。
【００３１】
鎖間ジスルフィド結合
本発明の細胞膜固着scTCR及びdTCRを基本的に特徴付ける性状は、dTCRポリペプチド対の定常領域細胞外配列間又はscTCRポリペプチドの第１のセグメントと第２のセグメントとの間のジスルフィド結合である。この結合は、天然型二量体αβTCR中に存在する天然型鎖間ジスルフィド結合に対応してもよいし、天然型TCR中に対応物(counterpart)を有さない、dTCRポリペプチド対の定常領域細胞外配列又はscTCRポリペプチドの第１及び第２のセグメント中に特異的に組み込まれたシステイン間の結合であってもよい。いくつかの場合では、天然型及び非天然型の両方のジスルフィド結合が、望ましくあり得る。
【００３２】
ジスルフィド結合の位置は、dTCRポリペプチド対の可変領域配列又はscTCRポリペプチドの第１及び第２のセグメントが天然型αβＴ細胞レセプター中と実質的に同様に相互に配向するという要件に従属する。
【００３３】
ジスルフィド結合は、第１及び第２のセグメント上の非システイン残基をシステインに変異させ、その変異した残基間にジスルフィド結合を形成させることにより形成してもよい。天然型残基の代わりに導入されたシステイン残基間にジスルフィド結合を形成することができるように、天然型TCR中でそれぞれのβ炭素が約６Å(0.6nm)以下、好ましくは3.5Å(0.35nm)〜5.9Å(0.59nm)の範囲で離れている残基が好ましい。ジスルフィド結合は定常免疫グロブリン領域中の残基間であることが好ましいが、膜近位領域の残基間であり得る。システインを導入してジスルフィド結合を形成することができる好ましい部位は、TCRα鎖についてはTRAC*01の、TCRβ鎖についてはTRBC1*01又はTRBC2*01のエキソン１中の以下の残基である：
【００３４】
【表１】
0005563194.tif 000002
【００３５】
今や、システイン残基に変異させて本発明に従う細胞膜結合dTCR又はscTCR中に新たな鎖間ジスルフィド結合を形成させることができるヒトTCR中の残基が同定されたので、当業者は、他の種のTCRを同じ方法で変異させて、細胞膜結合発現のための種のdTCR又はscTCRを作製することができる。ヒトにおいては、当業者は、単に、それぞれのTCR鎖中の以下のモチーフを探索して変異させるべき残基(影付きの残基がシステインへの変異のための残基である)を同定することのみが必要である。
【００３６】
【化１】
0005563194.tif 000003
【００３７】
【化２】
0005563194.tif 000004
【００３８】
他の種においては、TCR鎖は、上記モチーフに対して100％同一性を有する領域を有さないかもしれない。しかし、当業者は、上記モチーフを使用してTCRα鎖又はβ鎖の等価部分、したがってシステインに変異させるべき残基を同定することができる。整列技法(alignment technique)をこの点に関して使用してもよい。例えば、変異のためのTCR配列の該当部分を位置決めするために、European Bioinformatics Instituteのウェブサイト(http://www.ebi.ac.uk/index.html)で入手可能であるClustalWを使用して上記モチーフと特定のTCR鎖配列を比較することができる。
【００３９】
本発明は、その範囲に、細胞膜結合αβscTCR及びdTCR並びに他の哺乳動物(マウス、ラット、ブタ、ヤギ及びヒツジを含むがこれらに限定されない)のそれらを含む。上記のように、当業者は、システイン残基を導入して鎖間ジスルフィド結合を形成させることが可能である上記のヒト部位と等価な部位を決定することができる。例えば、以下は、マウスCα及びCβの可溶性ドメインのアミノ酸配列を、システインに変異させてTCR鎖間ジスルフィド結合を形成させることができる上記のヒト残基に等価なマウス残基を示すモチーフと共に示す（ここで、該当する残基には影が付されている）。
【００４０】
【化３】
0005563194.tif 000005
【００４１】
膜固着scTCR又はdTCRをコードする配列を含んでなる核酸分子もまた提供され、該核酸分子を含んでなるベクターも同様に提供される。図７及び８に開示されるものに対応する核酸配列の任意の適切な組合せを含んでなる膜固着TCRをコードする核酸配列も、本発明の範囲に包含される。当業者に公知のように、図７及び８に開示される核酸配列の切断型変形体によりコードされるアミノ酸の組合せを含んでなるTCRもまた製造することができ、このような核酸配列は本発明の更なる実施形態を形成する。膜固着TCRをコードするこれら核酸分子の変形体も本発明の範囲に包含される。
【００４２】
本発明のTCRをコードする核酸は、原核生物又は真核生物の宿主細胞での発現に適合された形態で提供されてもよい。適切な宿主細胞としては、細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞又は昆虫細胞が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、宿主細胞はヒトＴ細胞又はヒト造血幹細胞であり得る。
【００４３】
このような適合化した核酸は、それが導入される宿主細胞のコドン嗜好性を反映するように変異される。導入される変異は、コードされる当該ペプチドのアミノ酸配列に影響しないサイレント変異である。GeneArt(Regensburg、Germany)は、適切な核酸最適化サービス(GeneOptimizer(商標))を提供している。GeneArtが所有するWO 2004/059556は、その最適化プロセスの更なる詳細を提供している。任意のそのような適合化した核酸配列又はそれに対応するRNA配列に相補的な核酸もまた、本発明の部分を形成する。更に、当業者に自明であるように、本発明のTCRをコードする核酸はまた、非コード(イントロン)配列を含んでなり得る。
【００４４】
当業者に自明であるように、このような全長TCR鎖DNA配列は、以下の配列をコードする：
リーダー配列、並びに細胞外、膜貫通、及び細胞質のTCR配列。
【００４５】
膜固着scTCR又はdTCRを発現する細胞を得るための方法もまた提供され、該方法は、膜固着scTCR又はdTCRをコードするベクターを有する宿主細胞を、該scTCR又はdTCRの発現を引き起こす条件下でインキュベートすることを含んでなる。
【００４６】
非天然型ジスルフィド鎖間結合を含んでなるTCRを発現する細胞の作製
別の実施形態は本発明の細胞の作製方法を提供し、この方法は、
(ａ)細胞集団、好ましくはＴ細胞集団の単離、
(ｂ)標的細胞に特異的な本発明のTCRをコードする発現ベクターでの該細胞集団のインビトロトランスフェクション、
(ｃ)任意に、トランスフェクトした細胞のインビトロ増殖
を含んでなる。
【００４７】
好ましい実施形態では、細胞集団は、治療すべき患者から、該細胞を標的細胞集団に指向させる方法により単離される。
【００４８】
以下に、Ｔ細胞の単離、形質転換、及び任意選択のインビトロ増殖の詳細を提供する。
【００４９】
Ｔ細胞の単離
Ｔ細胞は、血流及びリンパ系の両方に見出される。一般には、Ｔ細胞の適切なサンプルを得るために、先ず静脈血サンプルを入手する。本発明の好ましい実施形態では、この血液サンプルは、治療を要する患者から入手する。
【００５０】
当業者は、本発明における使用に適切なＴ細胞サンプルを調製することができる。例えば、サンプルは、全血、又は末梢血リンパ球(PBL)若しくは末梢血単核細胞(PBMC)を含む(がこれらに限定されない)血液から調製されたサンプルであり得る。
【００５１】
得られた血液サンプル中のＴ細胞は、次いで、蛍光活性化セルソーティング(FACS)により単離する。簡潔には、これには、Ｔ細胞特異的「マーカー」タンパク質に特異的に結合する蛍光標識の添加、及びこれら標識の有無に基いて細胞を集団に選別することが含まれる。これら蛍光標識は、代表的には、蛍光部(例えばフィコエリトリン(PE))を付着させた抗体又はそのフラグメントを含んでなる。使用する標識の選択により、選別する集団に存在する細胞タイプが決まる：
【００５２】
【表２】
0005563194.tif 000006
【００５３】
標的細胞に特異的なTCRをコードするベクターでのＴ細胞のインビトロトランスフェクション
哺乳動物細胞、例えばヒトＴ細胞のトランスフェクションに適切な多くの当業者に公知の技法が存在する。以下を含む教科書が、関係する方法を記載する実験プロトコルを提供している：Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989；Ausubelら、Current Protocol in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1992；Glover DNA Cloning, I
and II, Oxford Press, Oxford, 1985；B. D. Hames及びS. J. Higgins Nucleic Acid Hybridization 1984；J. H. Miller及びM. P. Calos、Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1987。
【００５４】
上記のように、２つの最近の特許出願がTCRでのＴ細胞のトランスフェクションに関する(WO 01/55366及び米国第20020064521号)。これら出願に開示された方法もまた、天然型TCRに存在しない残基間のジスルフィド結合を含んでなる本発明のTCRでのＴ細胞のトランスフェクションに適用可能である。簡潔には、WO 01/55366は、Ｔ細胞中へ規定された特異性でTCRを導入するためのレトロウイルス法を開示する。この出願は、マウスのクラスＩ MHC H-2Dbにより提示されるヌクレオタンパク質ペプチド(ASNENMDAM)に特異的な高親和性マウスTCRのα鎖及びβ鎖を含有するレトロウイルスベクターの製造方法を記載する。このベクターは次いでヒト胎性腎細胞株で複製され、レトロウイルス上清を集めてＴ細胞トランスフェクションに必要な材料が提供された。米国第20020064521号は、ヒトp53特異的HLA制限マウスTCRのcDNAの分子クローニング及びこのcDNAのヒトＴ細胞への移入の方法を記載する。α鎖及びβ鎖TCR cDNAは別々に哺乳動物発現ベクター中にサブクローニングされた。このベクターが次いで標準的なリポソームトランスフェクション手順を使用してJurkat細胞に移入された。次に、トランスフェクトしたTCRの表面発現がフローサイトメトリにより確証された。
【００５５】
トランスフェクトしたＴ細胞のインビトロ増殖
一旦養子療法に必要なＴ細胞が必要なTCRでトランスフェクトされれば、任意に、Ｔ細胞をインビトロで培養して、標準的な技法を使用して拡大されたＴ細胞集団を提供することができる。
【００５６】
本発明のトランスフェクトしたＴ細胞の拡大のための１つの好ましい方法は、導入したTCRにより認識される特異的TCRリガンドでコートされた磁性ビーズと抗CD28及び抗CD3の組合せとの使用に基づく。簡潔には、これらビーズの使用により、機能的なトランスフェクトしたTCRを保有するＴ細胞の選択的拡大が可能になる。ビーズは、抗ビオチンでコートした形態で市販されており(Miltenyi Biotec, Bisley UK)、このビーズは、次いで、選択したビオチン化リガンドでコートすることができる(本明細書中のプロトコル９に必要な方法が詳述されている)。
【００５７】
一旦Ｔ細胞が上記方法を用いて作製されると、それらは医薬的に許容されるキャリアと共に患者に投与することができる。
【００５８】
トランスフェクトした細胞の患者への投与
本発明は、細胞を患者の標的細胞集団へ指向させる方法を提供する。この方法は表面固着TCRを発現する複数の細胞を患者に投与することを含んでなり、ここで、該TCRは、天然型TCRに存在しない、細胞外定常ドメイン残基間のジスルフィド鎖間結合を含んでなり、この細胞により提示されるTCRは、標的細胞集団のTCRリガンドに特異的である。
【００５９】
本発明はまた、Ｔ細胞応答を患者の標的細胞の表現型に指向させる方法を提供する。この方法は、表面固着TCRを発現する複数のＴ細胞を患者に投与することを含んでなり、ここで、該TCRは、天然型TCRに存在しない、細胞外定常ドメイン残基ジスルフィド鎖間結合を含んでなり、このＴ細胞により提示されるTCRは、標的細胞タイプのTCRリガンドに特異的である。
【００６０】
本発明の別の実施形態では、標的細胞タイプのTCRリガンドは、ペプチド-MHC複合体又はCD1-抗原複合体である。
本発明の更なる実施形態では、投与する細胞は細胞傷害性Ｔ細胞ではない。
本発明の更なる実施形態では、標的細胞はガン細胞又は感染細胞であり、投与する細胞は細胞傷害性Ｔ細胞である。
【００６１】
本発明の更なる実施形態では、TCRリガンドは、１つの組織タイプに、又は身体の或る１つの器官に特徴的である細胞に独特である。
本発明の別の実施形態では、標的細胞は、自己免疫疾患、臓器拒絶又は対宿主性移植片病(GVHD)における自己反応性Ｔ細胞の標的である。具体的な実施形態では、標的細胞は膵島細胞である。
【００６２】
本発明に従うTCRの適切なMHC-ペプチド標的の例としては、ウイルスエピトープ、例えばHTLV-Iエピトープ(例えば、HLA-A2により制限されたTaxペプチド；HTLV-Iは白血病に関連する)、HIVエピトープ、EBVエピトープ、CMVエピトープ；インスリン及び/又はIGRP由来糖尿病エピトープ；メラノーマエピトープ(例えば、MAGE-I HLA-A1制限エピトープ)その他のガン特異的エピトープ(例えば、HLA-A2により制限された腎細胞ガン関連抗原G250)が挙げられるが、これらに制限されない。本発明における使用に適切な更なる疾患関連pMHC標的は、HLA Factsbook (Barclay (Ed) Academic Press)に挙げられており、多くの他のものが特定される。
【００６３】
本発明の更なる実施形態では、Ｔ細胞集団は、治療されるべき患者から単離される。
トランスフェクトしたTCRを発現するＴ細胞は、多くの経路により、患者に投与することができる。例えば、任意にサイトカイン、例えばIL-2の投与を伴う、定期的な間隔でのi.v.注入。
【００６４】
本発明の更なる実施形態は、表面固着TCRを発現する複数の細胞を医薬的に許容されるキャリアと共に含んでなる、注入又は注射可能な医薬組成物を提供する。ここで、該TCRは、天然型TCRには存在しない、α及びβの細胞外定常ドメイン残基間のジスルフィド結合を含んでなる。
【００６５】
非経口投与に適合された医薬組成物には、水性及び非水性の滅菌注射製剤が挙げられ、これは、懸濁剤、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、及び該製剤を意図するレシピエントの血液と実質的に等張とする溶質を含有してもよい。
【００６６】
本発明の細胞の投薬量は、治療すべき疾患又は障害、治療すべき個体の年齢及び症状などに依存して、広範囲に変えることができ、医師が、使用すべき適切な投薬量を最終的に決定する。例えば、有効投薬量は、105〜1010細胞/kg体重で変化し得る。注入による治療
的投与の実際は多くの論文に記載されている。例えば、Rosenberg 1988 New Eng. J Med 319 1676-1680を参照。この投薬量は適切な回数で繰返し得る。副作用が現れれば、通常の臨床実務に従って投薬量及び投薬頻度を減らすことができる。
【００６７】
追加の観点
本発明は、膜貫通配列により膜に固着した少なくとも１つのαβＴ細胞レセプター(TCR)を提示する複数の細胞を投与することを含んでなる、ガン、GVHD、感染、臓器拒絶、又は自己免疫疾患の治療法を提供する。ここで、該TCRは、天然型TCRに存在しない、細胞外定常ドメイン残基間のジスルフィド鎖間結合を含んでなる。自己免疫疾患が慢性関節リウマチ、糖尿病、多発性硬化症、又は反応性関節炎から選択される疾患である具体的実施形態が提供される。
【００６８】
本発明の別の観点は、ガン、GVHD、感染、臓器拒絶、又は自己免疫疾患の治療用医薬の製造における、膜貫通配列により膜に固着した少なくとも１つのαβＴ細胞レセプター(TCR)を提示する細胞の使用により提供される。ここで、該TCRは、天然型TCRに存在しない、細胞外定常ドメイン残基間のジスルフィド鎖間結合を含んでなる。
【００６９】
本発明の方法が有益であり得るガンには、白血病、頭部、頸部、肺、胸部、結腸、子宮頸部、肝臓、膵臓、卵巣、及び精巣が挙げられる。
【００７０】
本発明の方法が有益であり得る自己免疫疾患には、
急性散在性脳炎
副腎不全
アレルギー性脈管炎及び肉芽腫症
アミロイドーシス
強直性脊椎炎
喘息
自己免疫性アディソン病
自己免疫性脱毛症
自己免疫性慢性活動性肝炎
【００７１】
自己免疫性溶血性貧血
自己免疫性好中球減少症
自己免疫性血小板減少性紫斑病
ベーチェット病
小脳変性
慢性活動性肝炎
慢性炎症性脱髄性多発根神経障害
単クローン性高ガンマグロブリン血症を伴う慢性ニューロパシー
古典的結節性多発性動脈炎
【００７２】
先天性副腎過形成
寒冷症
疱疹状皮膚炎
糖尿病
イートン‐ランバート筋無力症症候群
脳脊髄炎
後天性表皮水疱症
結節性紅斑
グルテン過敏性腸症
【００７３】
グッドパスチャー症候群
ギヤン‐バレー症候群
橋本甲状腺炎
甲状腺機能亢進
特発性ヘモクロマトーシス
特発性膜性糸球体腎炎
中枢神経系の孤立性脈管炎(isolated vasculitis)
川崎病
微少変化腎疾患
【００７４】
雑多の脈管炎
混合結合組織病
伝導ブロックを伴う多病巣性運動神経障害(multifocal motor neuropathy)
多発性硬化症
重症筋無力症
眼球クローヌス-筋クローヌス症候群
類天疱瘡
天疱瘡
悪性貧血
【００７５】
多発性筋炎/皮膚筋炎
感染後関節炎
原発性胆汁性硬化症
乾癬
反応性関節炎
ライター病
網膜症
慢性関節リウマチ
硬化性胆管炎
【００７６】
シェーグレン症候群
スティッフマン症候群
亜急性甲状腺炎
全身性エリテマトーデス
全身性壊死性脈管炎
全身性硬化症(強皮症)
高安動脈炎
側頭動脈炎
閉塞性血栓性血管炎
【００７７】
Ｉ型及びII型自己免疫性多内分泌腺症候群
潰瘍性結腸炎
ブドウ膜炎
ヴェーゲナー肉芽腫症
が挙げられる。
【００７８】
本発明の各観点の好ましい特徴は、その他の観点の各々についても、必要な変更を加えてではあるが同様である。本明細書で言及する先行技術文献は、法が許す最大範囲で本明細書中に援用される。
【００７９】
方法
以下では添付図面に言及する。
図１はTCRα鎖及びβ鎖を含んでなるドメインを説明する：ここで、「Ｓ」はシグナルペプチドを指し、「Ｖ」は可変ドメイン指し、「Ｊ」は結合ドメインを指し、「Ｄ」は多様性ドメインを指し、「Ｃ」は膜貫通配列を含有する定常ドメインを指す；
【００８０】
図２は非天然型鎖間ジスルフィド結合を含有する細胞表面TCRの構造を説明する；
図3a及び3bはそれぞれ、システインコドンを導入するように変異した可溶性A6 TCRのα鎖及びβ鎖の核酸配列を示す。影付きは導入されたシステインコドンを示す；
【００８１】
図4aは、新規なジスルフィド鎖間結合を作製するために使用されるT48→Ｃ変異(下線部)を含む、図3aのDNA配列によりコードされるアミノ酸配列を示す。図4bは、新規なジスルフィド鎖間結合を作製するために使用されるS57→Ｃ変異(下線部)を含む、図3bのDNA配列によりコードされるアミノ酸配列を示す；
【００８２】
図５は、鋳型として可溶性ジスルフィド連結A6 Tax TCR及び野生型A6 Tax TCRをコードするDNAを使用する、全長ジスルフィド連結A6 Tax TCRをコードするDNA配列を作製するために必要なPCR反応を図示する；
【００８３】
図6aは、新たなシステインコドンを導入し、天然型鎖間ジスルフィド橋架けの形成に関与するCysをSerに変異させるように変異したA6 TCRの膜固着α鎖の核酸配列及びタンパク質配列を示す。最初の影付きは導入されたシステインコドンを示し；下線を付したSerコドンは、天然型鎖間ジスルフィド連結を形成し得る能力を妨げるCys→Ser変異の位置を示す。
【００８４】
図6bは、新たなシステインコドンを導入し、天然型鎖間ジスルフィド橋架けの形成に関与するCysをSerに変異させるように変異した、天然型定常ドメインTRBC2(LeFrancら、(2001) The T cell receptor Factsbook, Academic Pressに記載されるようなIMGT方式に従う命名法)を使用するA6 TCRの膜固着β鎖の核酸配列及びタンパク質配列を示す。最初の影付きは導入したシステインコドンを示し；下線を付したSerコドンは、天然型鎖間ジスルフィド連結を形成し得る能力を妨げるCys→Ser変異の位置を示す。
【００８５】
図７は、全ての既知のTCRα鎖の定常ドメイン及び可変ドメインのDNA配列を詳述する。
図８は、全ての既知のTCRβ鎖の定常ドメイン及び可変ドメインのDNA配列を詳述する。
【００８６】
図9a及び9bはそれぞれ、新規なシステインコドン(影つきで示す)を導入するように変異した可溶性AH-1.23 TCRのα鎖及びβ鎖のDNA配列を示す。
図10a及び10bはそれぞれ、図9a及び9bのDNA配列から作製したAH-1.23 TCRα鎖及びβ鎖の細胞外アミノ酸配列を示す。
【００８７】
以下のプロトコルは図3a及び3bのDNA配列の作製を記載する。このプロトコルは、非天然型ジスルフィド鎖間結合を含む任意のαβTCRのコード配列の作製に使用可能である。
【００８８】
プロトコル１  −  新規な鎖間ジスルフィド結合の形成に必要なシステイン残基を導入するためのプライマーの設計及びA6 Tax TCRα及びβ鎖の変異誘発
TRAC*01中のエキソン１のA6 Taxスレオニン48をシステインに変異させるために、以下のプライマーを設計した(変異を小文字で示す)：
【化４】
0005563194.tif 000007
【００８９】
TRBC1*01又はTRBC2*01でエキソン１のA6 Taxセリン57をシステインに変異させるために、以下のプライマーを設計した(変異を小文字で示す)：
【化５】
0005563194.tif 000008
【００９０】
PCR変異誘発：
A6 Tax TCRα鎖又はβ鎖の遺伝子を含む発現プラスミドを、それぞれα鎖プライマー又はβ鎖プライマーを使用して、以下のように変異させた。100ngのプラスミドを５μlの10mM dNTP、25μlの10×Pfu緩衝液(Stratagene)、10単位のPfuポリメラーゼ(Stratagene)と混合し、最終容量をH2Oで240μlに調整した。48μlのこのミックスに、50μlの最終反応溶液中で0.2μMの最終濃度が得られるように希釈したプライマーを補充した。95℃にて30秒間の最初の変性工程の後、反応混合物を、Hybaid PCR express PCR装置において、15回の変性(95℃、30秒)、アニーリング(55℃、60秒)及び伸長(73℃、８分)に付した。次いで、産物を10単位のDpnI制限酵素(New England Biolabs)で37℃にて５時間消化した。10μlの消化反応物を、コンピテントE.coli XL1-Blue細菌に形質転換し、37℃にて18時間増殖させた。一つのコロニーを採取し、５mlのTYP＋アンピシリン(16g/l細菌トリプトン、16g/l酵母抽出物、５g/l NaCl、2.5g/l K2HPO4、100mg/lアンピシリン)中で一晩増殖させた。プラスミドDNAを、製造業者の指示に従ってQiagenミニプレップカラムで精製し、配列を自動配列決定により検証した。それぞれの変異した核酸及びアミノ酸配列を、α鎖については図3a及び4aに、β鎖については図3b及び4bに示す。
【００９１】
以下のプロトコルは、図3a及び3bのDNAを伸長してA6 TCRの定常ドメインの残りをコードする配列を付加することを記載する。また、このプロトコルは、任意のαβTCRの対応する可溶性変形体の定常ドメインコード配列の伸長にも使用可能である。
【００９２】
プロトコル２  −  新規な鎖間ジスルフィド結合の形成に必要なシステイン残基を含む細胞表面膜固着A6 Tax TCRの作製に必要なA6 Tax TCRα鎖及びβ鎖の核酸配列の設計
プロトコル１に記載のように作製した可溶性ジスルフィド連結A6 Tax TCR分子のα鎖及びβ鎖をコードする構築物を、新規な鎖間ジスルフィド結合の形成に必要なシステイン残基を含む膜固着A6 Tax TCRのα鎖及びβ鎖をコードする構築物の作製において、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)からのcDNAと共に使用する(含まれる方法の図解については図５を参照)。
【００９３】
フラグメント１(図5aを参照)に対応するTCRα鎖DNAは、野生型TRAV 12-2 TCRをコードするcDNAから、TRAV 12-2 TCRシグナルペプチド及びTRAV 12-2 TCR可変ドメインに特異的な以下のプライマー対(Fwdプライマー及びRevプライマー)：
【化６】
0005563194.tif 000009
を使用するPCRにより増幅する。
【００９４】
フラグメント１(図5aを参照)に対応するTCRβ鎖DNAは、野生型TRBV 6-5 TCRをコードす
るcDNAから、TRBV 6-5 TCRシグナルペプチド及びTRBV 6-5 TCR 可変ドメインに特異的な以下のプライマー対(Fwdプライマー及びRev プライマー)：
【化７】
0005563194.tif 000010
を使用するPCRにより増幅する。
【００９５】
上記プライマーは、プロトコル１で作製した可溶性ジスルフィド連結A6 Tax TCRの可変領域をコードするDNAとの重複部分を組み込むPCR産物を産生するように設計されている。
【００９６】
フラグメント２(図5bを参照)に対応するTCRα鎖DNAは、PBMCのcDNAから、TRACの3'末端に特異的な以下のプライマー対を使用して増幅する。このプライマー対はまた、天然型鎖間ジスルフィド結合の形成を妨げるCysからSerへの変異を導入する：
【化８】
0005563194.tif 000011
【００９７】
フラグメント２(図5bを参照)に対応するTCRβ鎖DNAは、PBMCのcDNAから、TRBC2の3’末端に特異的な以下のプライマー対を使用して増幅する。このプライマー対はまた、天然型鎖間ジスルフィド結合の形成を妨げるCysからSerへの変異を導入する：
【化９】
0005563194.tif 000012
【００９８】
これらプライマーは、プロトコル１で作製した可溶性ジスルフィド連結A6 Tax TCRの定常領域をコードするDNAとの重複部分を組み込むPCR産物を産生するように設計されている。
【００９９】
最後のPCRは、２つのTCR鎖の全体遺伝子を組み立てるために必要である。α鎖用には、フラグメント１及び２を可溶性α鎖をコードするプラスミドと混合して、全長コード領域を、5'Fwd αプライマー及び3'Rev αプライマーを使用して増幅する。該プライマーには、必要なベクター(例えば、レトロウイルスpLXSNベクター、BD Clontech, UK)へのサブクローニングが容易なように、適切な制限部位配列を隣接配列として付加する。このフラグメントが発現ベクター中にサブクローニングされ、配列決定される。
【０１００】
β鎖用には、フラグメント１及び２を可溶性β鎖をコードするプラスミドと混合し、全長コード領域を、5'Fwd βプライマー及び3'Rev βプライマーを使用して増幅する。該プライマーには、必要なベクター(例えば、レトロウイルスpLXSNベクター、BD Clontech, UK)へのサブクローニングが容易なように、適切な制限部位配列を隣接配列として付加する。このフラグメントが発現ベクター中にサブクローニングされ、配列決定される。
【０１０１】
図6a及び6bはそれぞれ、新たなシステインコドンを導入し、天然型鎖間ジスルフィド橋架けの形成に関与するシステイン残基がSerに変異されるように変異したA6 TCRの膜固着
α鎖及びβ鎖の核酸配列及びタンパク質配列を示す。
【０１０２】
上記PCR反応は全て以下の方法を用いて実施する。
100μl反応ミックス用：
１．18MΩ品質のH2Oで100μlにする
２．50pmol順方向(Forward)プライマー
３．50pmol逆方向(Reverse)プライマー
４．２μl 10mM dNTP (dATP、dTTP、dCTP、dGTP  各10mM)
５．10μl 10×緩衝液(クローニング目的にはPfu緩衝液、診断PCRにはTaq緩衝液)
６．５単位の酵素(特定の適用に従ってPfu DNAポリメラーゼ又はTaqポリメラーゼ)
【０１０３】
PCRプログラム：
１．変性工程、ここでサンプルを94°に10分間加熱する
２．以下を含む多数回のサイクル(20〜40)
94°にて１分間の変性工程
45〜60°にて１分間のアニーリング工程(最適なアニーリング温度を確立する必要があれば、PCR-Iにおいて勾配ブロック(gradient block)を使用)
72〜73°にて５〜10分間の伸長工程
３．全ての産物が完全長であることを確実にするための72〜73°にて10分間の最終伸長工程
４．続けて４°の浸漬工程。
【０１０４】
以下のプロトコルは、図9a及び9bのDNA配列の作製を記載する。このプロトコルは、非天然型ジスルフィド鎖間結合を含む任意のαβTCRのコード配列の作製に使用可能である。
【０１０５】
プロトコル３  −  非天然型ジスルフィド鎖間結合を含んでなる可溶性AH-1.23 TCRをコードするDNAの作製
可溶性AH1.23 TCRのTCRα鎖及びTCRβ鎖をコードする合成遺伝子は、注文して製造することができる。このサービスを実施する多くの会社が存在する(例えば、GeneArt (Germany))。
【０１０６】
図9a及び9bはそれぞれ、新規なシステインコドン(影つきで示す)を導入するように変異した可溶性AH-1.23 TCRのα鎖及びβ鎖のDNA配列を示す。
図10a及び10bはそれぞれ、図9a及び9bのDNA配列から作製したAH-1.23 TCRα鎖及びβ鎖の細胞外アミノ酸配列を示す。
図9a及び9bに示されるDNA配列は、次いで、A6 TCRの対応する細胞外部分をコードするDNAに置換するような方法で、それぞれ図3a及び3bのDNA配列を含有する必要なベクター中にサブクローニングすることができる。
【０１０７】
以下のプロトコルは、本発明における使用のために、非天然型ジスルフィド鎖間結合を含有する全長TCRをコードするDNA配列を作製する手段を記載する。好ましくは、DNA配列は、選択したベクター中への該配列の連結を容易にする制限酵素認識部位を含んでなる。このプロトコルは、任意のαβ又はγδTCRの作製に使用可能である。
【０１０８】
プロトコル４  −  新規な鎖間ジスルフィド結合の形成に必要なシステイン残基を含む膜固着TCRの代替のTCRα鎖及びβ鎖をコードする核酸の作製
選択したベクター中に代替のTCRをコードするDNAを組み込むために、必要な全長TCRα鎖及びTCRβ鎖をコードする合成遺伝子(その定常ドメイン中の必要な導入システイン残基をコードするために変更された)は注文して製造することができる。このサービスを実施
する多くの会社が存在する(例えば、GeneArt (Germany))。このDNA配列は、選択したベクター中への作製した配列の連結を容易にする制限酵素認識配列を組み込んで作製することができる。
プロトコル６に従って作製した発現ベクターでの所望の細胞のトランスフェクションには、適切なベクターの選択が必要である：
【０１０９】
プロトコル５  −  新規な鎖間ジスルフィド結合の形成に必要なシステイン残基を含有するTCRをコードするDNAでのＴ細胞のトランスフェクションのためのベクター選択
当業者に自明であるように、一過性トランスフェクション法と安定トランスフェクション法との主たる違いは、ベクターの選択である。以下の表は、新規な鎖間ジスルフィド結合の形成に必要なシステイン残基を含有するTCRをコードするDNAでのＴ細胞の一過性トランスフェクション及び/又は安定トランスフェクションに適切な多くのベクターの要約を提供する：
【０１１０】
【表３】
0005563194.tif 000013
【０１１１】
例えばプロトコル１及び２、又はプロトコル３又は４に記載されるように作製された非天然型ジスルフィド鎖間結合を含有するTCRをコードするDNA配列を所望のベクターに連結する必要がある。これらベクターは、プロトコル５に列挙したベクターの１つであり得る。このプロトコルは、非天然型ジスルフィド鎖間結合を含む任意のαβ又はγδTCRのコード配列の選択したベクターへの連結に使用可能である：
【０１１２】
プロトコル６  −  非天然型ジスルフィド鎖間結合を含有するTCRをコードするDNA配列の所望のベクターへの連結
選択したベクター中へTCR鎖をコードするDNAを所望の配向で挿入することを容易にするために、ベクター、及びTCR鎖をコードするDNAは、それぞれが異なる相補末端の同じ対を有するべきである。このことを達成するために、所望のレシピエントベクター、及びTCR鎖をコードするDNA配列は、異なる制限酵素の適切な同じ対で消化する。次いで、切断したDNA鎖と切断したベクターとを、Rapid DNA Ligationキット(Roche)を製造業者の指示に従って使用して連結する。
【０１１３】
プロトコル７は、本発明に従う細胞を作製する形質転換用のＴ細胞亜集団の単離のための一般的な手順を記載する。
【０１１４】
プロトコル７  −  Ｔ細胞亜集団の単離
PBMCは、静脈血サンプルから、Leucosep(登録商標)チューブ(Greiner Bio-one, Germany)を製造業者の指示に従って使用して単離する。単離したPBMCを洗浄して直ぐに使用する。単離した新鮮なPBMCを10％自家ヒト血清/RPMI(Gibco BRL)中で２回洗浄する。最後に細胞をRPMI培地に再懸濁する。
Ｔ細胞亜集団は、PBMCからFACSにより、下記の表で必要なＴ細胞亜集団について該当する抗体の組合せ及び以下の手順を用いて単離する：
【０１１５】
【表４】
0005563194.tif 000014
【０１１６】
滅菌条件下、該当する蛍光標識した抗体(0.01mg/ml最終濃度)を、37℃、５％CO2にて30分間PBMC(１×107/ml)とインキュベートする。次いで、細胞を培地を用いて洗浄し(37℃)、250×ｇにて10分間遠心分離し、上清を廃棄する。ペレットを再懸濁し、次いで細胞をFACSによりバルク選別する(bulk-sorted)。選択したＴ細胞は、10％自家血清を含有する培地中(インビトロ培養のため)又は10％自家ヒト血清アルブミンを有する適切な注入培地(例えば、ハンクス平衡化緩衝溶液(Sigma, UK))中(直後の治療的使用のため)のいずれかに集める。
【０１１７】
或いは、必要なＴ細胞亜集団は、上記の同じ抗体及び抗体の組合せをコートした磁性ビーズを用いて単離してもよい。Minimacsビーズ(Miltenyi Biotech製)は、Ｔ細胞亜集団の単離における使用に適切であり、製造業者がその使用についての指示を提供している。この方法は、所望のＴ細胞亜集団を「ポジティブ」に選択、単離する。この方法はまた、所望のＴ細胞亜集団を「ネガティブ」に選択することも可能である。これは、PBMC中の必要なＴ細胞亜集団以外は全てに結合する一連の抗体でビーズをコートすることにより達成される。
【０１１８】
プロトコル８は、非天然型ジスルフィド鎖間結合を含有するTCRの発現について単離した細胞を改変するための、本発明に従って使用可能な１つの方法を記載する。
【０１１９】
プロトコル８  −  非天然型ジスルフィド鎖間結合を形成することができる導入システイン残基を含有するTCRでのＴ細胞のレトロウイルス性形質導入
初代Ｔ細胞又はＴ細胞株/クローンを、Clay (1999) J. Immunol 163 507-513及びBunnel (1995) PNAS USA 92 7739に記載の方法に基づくＴ細胞形質導入法に従い、適切なレトロウイルスベクター(例えば、pLXSNレトロウイルス(BD ClonTech, UK))で形質導入する。
【０１２０】
レトロウイルス上清の作製
簡潔には、レトロウイルス上清を作製するために、PG1 3レトロウイルス産生細胞株を、プロトコル２で作製した、新規な鎖間ジスルフィド結合の形成に必要なシステイン残基を含む膜固着A6 Tax TCRのα鎖及びβ鎖をコードするDNAを含有するレトロウイルスベクター(pLXSN, BD Clontech, UK)で形質転換する。次いで、高力価クローンを、当業者に馴染み深い標準的な技法を使用して単離する(例えば、Miller(1991) J. Virol 65 2220を参照)。次いで、高力価クローンを80％コンフルーエントまで増殖させ、次いで上清を採取する。
【０１２１】
レトロウイルス上清でのＴ細胞の形質導入
次いで、Ｔ細胞を、マイクロタイターウェルプレートにおいて、８μg/mlポリブレン及び600IU/mlのIL-2を含有するレトロウイルス上清中に、１×106細胞/mlで再懸濁する。次いで、プレートを1000×ｇにて90分間遠心分離し、湿潤化５％CO2インキュベーターにおいて37℃にて一晩インキュベートする。この形質導入手順を２日後に繰り返す。次いで、Clay (1999) J. Immunol 163 507-513)に記載の形質導入手順を続け、そのことにより、インビトロ試験の準備が整ったトランスフェクトしたＴ細胞が提供される。
【０１２２】
プロトコル９は、本発明に従うＴ細胞集団を富化及び拡大する一般的方法を記載する。この方法はTCRに特異的ではない。
【０１２３】
プロトコル９  −  トランスフェクトしたＴ細胞のインビトロ増殖
プロトコル８に記載のように改変したTCRを発現するようにＴ細胞をトランスフェクトした後、必要であれば、インビトロ評価又は治療的使用のために、これらＴ細胞を以下の方法を使用してインビトロで増殖して富化又は拡大した細胞集団を作製することができる。
【０１２４】
抗ビオチンでコートしたClinimacsビーズ(Miltenyi Biotec, Germany)を、ビオチン化した抗CD28抗体及び抗CD3抗体でコートする。500,000のＴ細胞、及び適切なペプチド(Tax
ペプチド)でパルスした500,000の照射(33 Gy)自家APCを、10〜50U/mlのIL-2及び10％自家血清を含有するRPMI 1640緩衝液に加える。次に、５×106/mlの抗CD28抗体及び抗CD3抗体でコートしたClinimasビーズを細胞に加える。
【０１２５】
次いで、細胞を37℃、５％CO2の滅菌条件下で７日間インキュベートする。このインキュベーション期間の間、緩衝液は３日ごとに代える。次の週に、細胞を、同じ比率のビーズ対Ｔ細胞及び新鮮なペプチドパルスしたAPCで再度刺激することができる。トランスフェクトしたＴ細胞が必要な総数に達したら、Ｔ細胞をインビトロ評価又は治療的使用に適切な緩衝液に再懸濁する。
【０１２６】
プロトコル10は、選択した改変細胞上での所望のTCRの細胞表面発現の成功について試験する１つの方法を記載する。この方法は一般に適用可能であり、任意の特定の細胞表面TCRに限定されない。
【０１２７】
プロトコル10  −  新規な鎖間ジスルフィド結合の形成に必要なシステイン残基を組み込んだA6 Tax TCRを発現するようにトランスフェクトしたＴ細胞への同族ペプチド-MHC複合体の特異的結合を証明する蛍光活性化セルソーティング(FACS)ベースのアッセイ
染色のためのＴ細胞サンプルの作製
トランスフェクトしたＴ細胞を、FACS染色緩衝液(２％ FCS/PBS、37℃)に再懸濁し、計数する。細胞をFACSチューブに等分し、37℃にて５〜10分間プレインキュベートした後に、染色する。
【０１２８】
TCR-pMHC結合を評価するためのHLA-A2 Tax四量体でのＴ細胞の染色
トランスフェクトしたＴ細胞を染色するために、WO 99/60120に記載の方法を使用してHLA-A2 Tax単量体を作製し、O'Callaghan (1999) Anal Biochem 266 9-15に記載の方法により、フィコエリトリン(PE)標識ストレプトアビジンを用いて四量体化する。
以下の蛍光標識した分子もまたコントロールとしてFACSアッセイで使用する：
FITC標識したイソタイプコントロール
PE標識した「無関係の」ペプチド-HLA-A2四量体
【０１２９】
PE標識したHLA-A2 Tax四量体(48μg)を、１×106のトランスフェクトしたＴ細胞及び５μgのFITC標識した抗CD8抗体(又は５μgのFITC標識した抗CD4抗体)と共に20分間37℃にてインキュベートする。次いで、細胞を、FACS緩衝液(37℃)を使用して洗浄し、10分間250×ｇにて遠心分離し、上清を廃棄する。
洗浄後、トランスフェクトしたＴ細胞を0.5mlのPBS中に再懸濁する。次いで、サンプル中に存在するＴ細胞集団を、フローサイトメトリにより分析する。
【０１３０】
PE-HLA-A2 Tax四量体及びFITC標識した抗CD8抗体(又はFITC標識した抗CD4抗体)の両方で二重標識されるＴ細胞が、トランスフェクトしたA6 Tax TCRを発現するCD8+Ｔ細胞(又はCD4+Ｔ細胞)である。
上記のHLA四量体FACs染色法は、所望の外因性TCRについての同族ペプチド-HLAの四量体を使用することにより、Ｔ細胞の表面上での任意の外因性TCRの発現レベルを評価するように適合させることができる。
【０１３１】
外因性TCR発現を評価するための、トランスフェクトしたＴ細胞の抗体での染色
当業者に自明のように、外因性TCRの評価のためには、このようなFACS法又は任意の他の適切な検出方法で利用することができる他の結合物質が存在する。以下の表は、この目的に適切な幾つかの抗体のまとめを提供する：
【０１３２】
【表５】
0005563194.tif 000015
【０１３３】
プロトコル11は、CTLの表面での機能的な外因性TCRの細胞表面発現の成功について試験する１つの方法を記載する。この方法はCTL細胞に特異的であるが、特定のTCRに限定されない。
【０１３４】
プロトコル11  −  膜固着A6 Tax TCRを発現するようにトランスフェクトしたCTL「キラー」Ｔ細胞が標的細胞を特異的に溶解する能力を評価するためのユーロピウム遊離法
以下のアッセイを使用して、膜固着A6 Tax TCRを発現するようにトランスフェクトしたCTLがHLA-A*0201+標的細胞を特異的に溶解する能力を評価する。
【０１３５】
以下の混合物をアッセイのために調製する：
実験ウェル：50μlのトランスフェクトしたCTL、50μlの培地、同族HLA-A2ペプチドでパルスした50μlの標的細胞
陰性コントロールウェル：50μlのトランスフェクトしたCTL(エフェクター細胞)、50μlの培地、無関係のHLA-A2ペプチドでパルスした50μlの標的細胞
バックグランドウェル：APC標的細胞を、最終濃度に希釈後に遠心沈降させ、50μlの上清を100μlの培地に添加する。
自発遊離ウェル：標的細胞単独(エフェクター細胞なし)＋100μlの培地
最大遊離ウェル：自発遊離ウェル＋15μlの10％ Triton(Sigma T-9284)
【０１３６】
簡潔には、エフェクター細胞と標的細胞との上記混合物を２〜４時間インキュベートし、次いでユーロピウム遊離アッセイを、Delfia EuTDA Cytotoxicityキット(Perkin Elmer)と共に供給される指示書に従って実施する。
【０１３７】
プロトコル12は、調節性Ｔ細胞又はCTLの表面での機能的な外因性TCRの細胞表面発現の成功についての１つの試験方法を記載する。この方法は特定のTCRに限定されない。
【０１３８】
プロトコル12  −  膜固着AH1.23 TCRを発現するようにトランスフェクトしたＴ細胞がＴ細胞増殖を特異的に変化させる能力を評価するためのチミジン組込みアッセイ
５×106のPMBCを、AH1.23 TCRについて同族の１μMのペプチドでパルスし、次いでRPMI
1640培地で37℃、５％CO2にて14日間培養する。５×106のPMBCのコントロール群をペプチドでパルスすることなく、37℃、５％CO2にて14日間培養する。３日ごとに、両培養物に40単位/mlの組換えヒトIL-2を供給する。
【０１３９】
次いで、以下を96ウェルプレート中の１×105細胞(上記で調製する両方の培養物)に加える：
１×105の新鮮な照射した(33Gy)自家PBMC、及び前述のプロトコルで記載した方法を用いてAH1.23 TCRでトランスフェクトした種々の量(０細胞、５×104細胞、１×105細胞、２×105細胞、５×105細胞)のＴ細胞。次いで、これら培養物をRPMI 1640培地中で３日間37℃、５％CO2にてインキュベートする。
【０１４０】
次いで、1.85MBq/mlのH3チミジンをこれら培養物に添加し、それらを更に８時間37℃、５％CO2にてインキュベートする。細胞採集器を使用して細胞を採集して、細胞へのチミジン組込みのレベルを、TopCountシンチレーションカウンタを用いて測定する。
【０１４１】
パルスしていないPMBCで見られる組込みと比較して、予めペプチドパルスしたPBMCへのチミジン組込みの低下は、トランスフェクトした調節性Ｔ細胞が細胞増殖のpMHC特異的なダウンレギュレーションを引き起こしていることを示す。
パルスしていないPMBCで見られる組込みと比較して、予めペプチドパルスしたPBMCへのチミジン組込みの増加は、トランスフェクトしたCTLが細胞増殖のpMHC特異的なアップレギュレーションを引き起こしていることを示す。
【０１４２】
プロトコル13は、本発明に従う細胞での患者の治療を記載する。この治療方法は、任意の外因性TCRでトランスフェクトしたＴ細胞について使用することができる。
【０１４３】
プロトコル13  −  新規な鎖間ジスルフィド結合の形成に必要なシステイン残基を含むTCRを発現するようにトランスフェクトしたＴ細胞の患者への注入
新規な鎖間ジスルフィド結合の形成に必要なシステイン残基を含むTCRを発現するトランスフェクトしたＴ細胞を患者に注入するために、Haque (2002) Lancet 360 436-442に記載のような以下の方法を使用する。簡潔には、トランスフェクトしたＴ細胞を、10％の自家ヒト血清アルブミンを有するハンクス平衡化緩衝溶液(Sigma, UK)中で洗浄し、次いで20mlの同じ緩衝溶液中に再懸濁する。次いで、トランスフェクトしたＴ細胞を、治療を必要としている患者に、106細胞/kg体重の用量で15分間にわたってゆっくりと注入する。如何なる毒性効果も検出するように、続く４時間にわたって患者のバイタルサインを定期的に検査する。
【０１４４】
次いで、これら注入を周期的に繰返し、患者の症状を最も適切な方法で評価する。例えば、腫瘍を治療する手段としてトランスフェクトしたTCRを与えられる患者の場合には、これら方法は、以下の触診、ラジオグラフィー、CTスキャン、又は生検の１又はそれ以上を含み得る。注入の投薬量及び頻度は、必要に応じて変わる。最後に、最終の注入の６ヶ月後の時点での治療結果がWHO基準に従って記録される。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】TCRα鎖及びβ鎖を含んでなるドメインを説明する。
【図２】非天然型鎖間ジスルフィド結合を含有する細胞表面TCRの構造を説明する。
【図３】システインコドンを導入するように変異した可溶性A6 TCRのα鎖及びβ鎖の核酸配列を示す。
【図４】新規なジスルフィド鎖間結合を作製するために使用される変異(下線部)を含む、図３のDNA配列によりコードされるアミノ酸配列を示す。
【図５】鋳型として可溶性ジスルフィド連結A6 Tax TCR及び野生型A6 Tax TCRをコードするDNAを使用する、全長ジスルフィド連結A6 Tax TCRをコードするDNA配列を作製するために必要なPCR反応を図示する。
【図６】新たなシステインコドンを導入し、天然型鎖間ジスルフィド橋架けの形成に関与するCysをSerに変異させるように変異したA6 TCRの膜固着α鎖及びβ鎖の核酸配列及びタンパク質配列を示す。
【図７】全ての既知のTCRα鎖の定常ドメイン及び可変ドメインのDNA配列を詳述する。
【図８】全ての既知のTCRβ鎖の定常ドメイン及び可変ドメインのDNA配列を詳述する。
【図９】新規なシステインコドン(影つきで示す)を導入するように変異した可溶性AH-1.23 TCRのα鎖及びβ鎖のDNA配列を示す。
【図１０】図９のDNA配列から作製した、AH-1.23 TCRα鎖及びβ鎖の細胞外アミノ酸配列を示す。
【図１】
0005563194.tif 000016
【図２】
0005563194.tif 000017
【図３ａ】
0005563194.tif 000018
【図３ｂ】
0005563194.tif 000019
【図４ａ】
0005563194.tif 000020
【図４ｂ】
0005563194.tif 000021
【図５】
0005563194.tif 000022
【図６ａ】
0005563194.tif 000023
【図６ｂ】
0005563194.tif 000024
【図７−１】
0005563194.tif 000025
【図７−２】
0005563194.tif 000026
【図７−３】
0005563194.tif 000027
【図７−４】
0005563194.tif 000028
【図７−５】
0005563194.tif 000029
【図７−６】
0005563194.tif 000030
【図７−７】
0005563194.tif 000031
【図７−８】
0005563194.tif 000032
【図８−１】
0005563194.tif 000033
【図８−２】
0005563194.tif 000034
【図８−３】
0005563194.tif 000035
【図８−４】
0005563194.tif 000036
【図８−５】
0005563194.tif 000037
【図８−６】
0005563194.tif 000038
【図８−７】
0005563194.tif 000039
【図８−８】
0005563194.tif 000040
【図８−９】
0005563194.tif 000041
【図８−１０】
0005563194.tif 000042
【図９ａ】
0005563194.tif 000043
【図９ｂ】
0005563194.tif 000044
【図１０】
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