(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の化学式１で表される化合物からなるリボヌクレアーゼ活性阻害剤。
［化学式１］
0005514307.tif 000016
（前記の化学式１中、Ａは、ＣＨまたはＮであり、Ｒ１が、１〜３個の（Ｃ１−Ｃ７）アルキルが置換または非置換の（Ｃ６−Ｃ２０）アリールまたは（Ｃ５−Ｃ１５）ヘテロアリールであり、Ｒ２が、
0005514307.tif 000017
であり、Ｒ３が、直鎖または分岐鎖の（Ｃ１−Ｃ７）アルキルである。）
【請求項２】
化学式１で表される化合物が、以下の化学式５で表される化合物である、請求項１に記載のリボヌクレアーゼ活性阻害剤。
［化学式５］
0005514307.tif 000018
（化学式５中、Ｒ４１またはＲ４２が、互いに独立して、水素、メチル、エチル、ｎ−プロピルまたはｉ−プロピルである。）
【請求項３】
化学式５で表される化合物が、以下の構造式で表される化合物である、請求項２に記載のリボヌクレアーゼ活性阻害剤。
0005514307.tif 000019
【請求項４】
リボヌクレアーゼがエンドリボヌクレアーゼであることを特徴とする請求項１に記載のリボヌクレアーゼ活性阻害剤。
【請求項５】
エンドリボヌクレアーゼ が、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮＡｓｅ Ｈ、ＲＮＡｓｅ Ｉ、ＲＮａｓｅ III、ＲＮａｓｅ Ｌ、ＲＮａｓｅ Ｐ、ＲＮａｓｅ ＰｈｙＭ、ＲＮａｓｅ Ｔ１、ＲＮａｓｅ Ｔ２、ＲＮａｓｅ Ｕ２、ＲＮａｓｅ Ｖ１及びＲＮａｓｅ Ｖからなる群から選択されるエンドリボヌクレアーゼまたはこれらの混合物であることを特徴とする請求項４に記載のリボヌクレアーゼ活性阻害剤。
【請求項６】
リボヌクレアーゼ活性阻害用化合物が、水、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、（Ｃ１−Ｃ５）の低級アルコールまたはこれらの混合溶媒から選択される１種以上に溶解されることを特徴とする請求項５に記載のリボヌクレアーゼ活性阻害剤。
【請求項７】
動物組織、植物組織、微生物、全血、プラズマ細胞、血清、培養細胞、並びに組み換え遺伝子で形質転換した動物組織、植物組織、微生物、プラズマ細胞、及び培養細胞から選択される試料においてリボヌクレアーゼの活性を阻害することを特徴とする請求項１に記載のリボヌクレアーゼ活性阻害剤。
【請求項８】
請求項１に記載のリボヌクレアーゼ活性阻害剤を含む、試料保存中にリボヌクレアーゼに露出されることにより容易に分解されるリボ核酸を安定して保存するための、リボ核酸試料保存容器。
【請求項９】
リボヌクレアーゼ活性阻害剤が容器の内壁に塗布されることを特徴とする請求項８に記載のリボ核酸試料保存容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抽出したリボ核酸の分解を促進するリボヌクレアーゼの活性を効果的に阻害するためのリボヌクレアーゼ活性阻害用化合物及びこれを含む試料保存容器に関し、より詳細には、生体からのリボ核酸の抽出過程、抽出したリボ核酸試料保存に使用できるリボヌクレアーゼ活性阻害用化合物及びこれを含むリボ核酸試料保存容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
リボ核酸は、核酸の一種であって、デオキシリボ核酸と比較すると、構造的にデオキシリボースの代わりにリボースを有しており、塩基はチミンの代わりにウラシルを有している。また、構造と機能に応じて、リボソームを構成するリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）と、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）から伝達されたタンパク質を合成する遺伝情報を有している伝令（メッセンジャー）ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と、伝令ＲＮＡのコドンに対応するアミノ酸を伝達する転移（トランスファー）ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）とに分けられる。これらリボ核酸は、使用用途と時期に応じて分解され再度合成されるが、この過程にリボヌクレアーゼが関わる。
【０００３】
リボヌクレアーゼは、デオキシリボヌクレアーゼと異なりその活性が容易に阻害されず、試料を収集する過程から試料からリボ核酸を抽出する過程のうち何れの過程でも汚染されやすいという問題があり、これらリボヌクレアーゼは、生物試料から純粋なリボ核酸を単離する過程において収率低下及び純度低下の要因として作用する恐れがあるため、必ずその活性を阻害する必要がある。
【０００４】
通常、リボ核酸は、一本鎖であるため、デオキシリボ核酸より容易に分解される特徴を有している。Ｃ型肝炎ウイルスを診断する場合、収集した血液サンプル内のＣ型肝炎ウイルスのリボ核酸がリボヌクレアーゼによって分解される前にＣ型肝炎ウイルスのリボ核酸を抽出しなければならず、その存在有無を確認する実験を実行しなければならない。この際、血液中のリボヌクレアーゼによって既にＣ型肝炎ウイルスのリボ核酸が分解された場合、Ｃ型肝炎ウイルス感染者であるにもかかわらず非感染者と判定されるという深刻な状況をまねく可能性がある。
【０００５】
従って、生物試料からリボ核酸を抽出する過程中に露出されるリボヌクレアーゼの活性を阻害することも重要であるが、生物試料を保存し始めてからリボヌクレアーゼに露出されることを効果的に遮断することが最も重要であると言える。
【０００６】
一方、血液や動物、植物の組織、培養細胞などから純粋なリボ核酸を抽出するには、大きく二つの方法、即ち、フェノールを使用する方法と、カオトロピック塩を使用する方法とがある。
【０００７】
フェノールは、公知のとおり、強力な有機溶媒であって、タンパク質及び細胞構成成分を溶解する特性を有しており、細胞が溶離される瞬間、リボヌクレアーゼが活性を発現する前にリボヌクレアーゼを分解することにより、リボ核酸の分解を根本的に遮断できるという長所を有する。しかし、フェノールは、人間に有害な物質であるという短所があり、有機溶媒が完全に除去されなかった場合、後続作業に深刻な影響を及ぼす恐れがある。
【０００８】
グアニジン塩のようなカオトロピック塩は、強力なタンパク質変性作用によりリボヌクレアーゼを変性させてその活性を阻害する性質を有している。また、カオトロピック塩は、シリカ表面にリボ核酸を付着する機能も有しているため、有機溶媒を使用しなくても容易にリボ核酸を分離／精製できるという長所を有している。
【０００９】
しかし、これらの方法は、生物試料からリボ核酸を分離する過程中に露出されるリボヌクレアーゼの活性を阻害する方法であって、生物試料を保存する間、既にリボヌクレアーゼに露出された場合、いくらリボ核酸分離過程中にリボヌクレアーゼの活性を阻害しても全くその効果が現れない。
【００１０】
ヒトの胎盤から抽出したリボヌクレアーゼ阻害酵素は、リボ核酸と１：１の複合体を形成して非拮抗阻害に使用されることができると公知され、広く使用されている（Ｐｅｔｅｒ  Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ  ｅｔ．ａｌ．，ＪＢＣ，２５２：５９０４−５９１０（１９７７））。ヒトの胎盤から抽出したこのリボヌクレアーゼ阻害酵素は、酵素の特性上、スルフヒドリル試薬であるｐ−メルクリ安息香酸やＮ−エチルマレイミドを処理する場合、リボヌクレアーゼとリボヌクレアーゼ阻害酵素混成体が分解されて不活性化される短所があるため、これを克服するために必ず過剰量のジチオトレイトール（ＤＤＴ）を共に使用しなければならない。
【００１１】
動物組織の試片などを保存する場合、５０％以上のアルコール溶液に保存したり、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの溶液に保存することにより、組織片が水分に接触しないようにしてリボヌクレアーゼによる分解を防止する方法も報告されているが、これは染色法に組織片の観察などの実験に限定されるものであるため、広く利用されるには限界があると言える（ＵＳＰ  ７，２５０，２７０）。
【００１２】
バナジルクロライド（Ｖａｎａｄｙｌ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ）は、リボヌクレアーゼと混成体を形成することにより、分解酵素の活性を阻害する効果を有しているが、リボ核酸ポリメラーゼなどの作用も阻害する傾向があるため、リボ核酸の抽出過程中に必ず完全に除去されなければならないという短所を有している（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。
【００１３】
現在用いられているリボヌクレアーゼ活性阻害用化合物は、上記資料に基づき、ヒトの胎盤から分離したリボヌクレアーゼ阻害酵素を主材料に使用する製品群、５０％以上のアルコールを含んで試料が水でないアルコールに露出されてリボ核酸の分解を防止する方法を使用する製品群、高濃度の塩を使用することによりリボヌクレアーゼの活性を阻害する方法を使用する製品群などがあるが、それぞれ効果的にその活性を阻害できるリボヌクレアーゼの種類が限定されているだけでなく、リボヌクレアーゼの活性阻害能を持続するために補助剤及び安定剤を添加しなければならないという短所を有している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第７，２５０，２７０号
【００１５】
【非特許文献１】Ｐｅｔｅｒ  Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ  ｅｔ．ａｌ．，ＪＢＣ，２５２：５９０４−５９１０（１９７７）
【非特許文献２】Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、リボ核酸を分解するリボヌクレアーゼに対して強力な活性阻害能を有するリボヌクレアーゼ活性阻害用化合物を提供することを目的とし、試料保存中にリボヌクレアーゼに露出されることにより容易に分解されるリボ核酸を安定して保存するための本発明によるリボヌクレアーゼ活性阻害用化合物を含むリボ核酸保存容器を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記のような目的を果たすために、本発明は、抽出したリボ核酸の分解を促進するリボヌクレアーゼの活性を効果的に阻害するためのリボヌクレアーゼ活性阻害用化合物を提供し、下記の化学式１及び化学式２の構造の化合物を含む。
【００１８】
［化学式１］
0005514307.tif 000002
【００１９】
［化学式２］
0005514307.tif 000003
【００２０】
上記の化学式１または化学式２中、Ａは、ＣＨまたはＮであり、Ｒ１は、１〜３個の（Ｃ１−Ｃ７）アルキルが置換または非置換の（Ｃ６−Ｃ２０）アリールまたは（Ｃ５−Ｃ１５）ヘテロアリールであり、Ｒ２またはＲ４は、互いに独立して、
0005514307.tif 000004
または
0005514307.tif 000005
であり、Ｒ３は、直鎖または分岐鎖の（Ｃ１−Ｃ７）アルキルであり、前記置換体Ｒ２またはＲ４中、Ｂは、
0005514307.tif 000006
または
0005514307.tif 000007
であり、Ｒ５〜Ｒ９は、互いに独立して、水素、直鎖または分岐鎖の（Ｃ１−Ｃ７）アルキル、カルボン酸、ハロゲン原子、シアノ、アミノ、モノまたはジ（Ｃ１−Ｃ７）アルキルアミノ、グアニジン、ウレアまたはホルミルであり、Ｒ１１、Ｒ１２またはＲ１３は、互いに独立して、水素、直鎖または分岐鎖の（Ｃ１−Ｃ７）アルキル、（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキル、（Ｃ３−Ｃ１０）シクロアルキル（Ｃ１−Ｃ７）アルキル、カルボン酸、ハロゲン原子、シアノ、ニトロ、アミノ、モノまたはジ（Ｃ１−Ｃ７）アルキルアミノ、（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキルアミノ、モルホリン、モルホリンオキシド、ピペラジン、ピペラジンオキシド、グアニジン、ウレア、ベンジル、ベンジルオキシまたはホルミルであり、Ｒ２１は、水素または直鎖または分岐鎖の（Ｃ１−Ｃ７）アルキル基であり、Ｄは、Ｏ、Ｓまたは−ＮＲ２２であり、Ｒ２２は、水素または（Ｃ１−Ｃ７）アルキルである。
【００２１】
より具体的には、本発明による上記の化学式１及び化学式２の化合物は、下記の化学式３〜化学式６で表される化合物を含む。
【００２２】
［化学式３］
0005514307.tif 000008
【００２３】
［化学式４］
0005514307.tif 000009
【００２４】
［化学式５］
0005514307.tif 000010
【００２５】
［化学式６］
0005514307.tif 000011
【００２６】
化学式３〜化学式６中、Ｒ４１またはＲ４２は、互いに独立して、水素、メチル、エチル、ｎ−プロピルまたはｉ−プロピルであり、Ｒ４３またはＲ４４は、互いに独立して、水素、メチル、エチル、ｎ−プロピル、i−プロピル、カルボン酸またはニトロであり、Ｒ４５またはＲ４６は、互いに独立して、水素、メチル、エチル、ｎ−プロピル、i−プロピルまたはカルボン酸であり、Ｒ４７またはＲ４８は、互いに独立して、水素、メチル、エチル、シアノまたはアミノである。
【００２７】
上記の化学式５の化合物は、エノール−ケト形の互変異性体であってもよい。
0005514307.tif 000012
【００２８】
本発明によるリボヌクレアーゼ活性阻害用化合物は、具体的には、下記構造を含むことを特徴とする化合物を含む。
0005514307.tif 000013
【００２９】
上記化合物３は、エノール−ケト形の互変異性体であってもよい。
0005514307.tif 000014
【００３０】
リボヌクレアーゼは、エンドリボヌクレアーゼであることが好ましく、前記エンドリボヌクレアーゼは、具体的には、ＲＮａｓｅ  Ａ、ＲＮＡｓｅ  Ｈ、ＲＮＡｓｅ  I、ＲＮａｓｅ  III、ＲＮａｓｅ  Ｌ、ＲＮａｓｅ  Ｐ、ＲＮａｓｅ  ＰｈｙＭ、ＲＮａｓｅ  Ｔ１、ＲＮａｓｅ  Ｔ２、ＲＮａｓｅ  Ｕ２、ＲＮａｓｅ  Ｖ１及びＲＮａｓｅ  Ｖを含む。
【００３１】
本発明で使用されるリボ核酸は、リボソームＲＮＡ（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ）、伝令ＲＮＡ（ｍａｓｓａｎｇｅｒ  ＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔｒａｎｓｆｅｒ  ＲＮＡ）などを含み、本発明によるリボヌクレアーゼ活性阻害用化合物によって活性が阻害される好ましいリボヌクレアーゼは、エンドリボヌクレアーゼであり、具体的には、ＲＮａｓｅ  Ａ、ＲＮａｓｅ  Ｈ、ＲＮａｓｅ  I、ＲＮａｓｅ  III、ＲＮａｓｅ  Ｌ、ＲＮａｓｅ  Ｐ、ＲＮａｓｅ  ＰｈｙＭ、ＲＮａｓｅ  Ｔ１、ＲＮａｓｅ  Ｔ２、ＲＮａｓｅ  Ｕ２、ＲＮａｓｅ  Ｖ１、ＲＮａｓｅ  Ｖであり、その他にエクソリボヌクレアーゼとして、ＰＮＰａｓｅ（Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）、ＲＮａｓｅ  ＰＨ、ＲＮａｓｅ  II、ＲＮａｓｅ  Ｒ、ＲＮａｓｅ  Ｄ、ＲＮａｓｅ  Ｔ、Ｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ、Ｅｘｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ、Ｅｘｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  IIなどを含む。
【００３２】
本発明によるリボヌクレアーゼ活性阻害用化合物を容易に使用するために、水、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、炭素数１〜５の低級アルコール（例えば、メチルアルコール、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、ブタノールなど）またはこれらの混合溶媒から選択される１種以上に溶解してもよい。
【００３３】
上記リボ核酸は、動物組織、植物組織、微生物、血液、プラズマ細胞、血清、培養細胞、並びに動物組織、植物組織、微生物、プラズマ細胞、培養細胞を組み換え遺伝子で形質転換した試料を含む。
【００３４】
本発明は、試料保存中にリボヌクレアーゼに露出されることにより容易に分解されるリボ核酸を安定して保存するための本発明によるリボヌクレアーゼ活性抑阻害化合物を含むリボ核酸試料保存容器を含み、前記リボ核酸試料保存容器は、リボヌクレアーゼ活性阻害用化合物が容器内壁に塗布されることを特徴とする。
【発明の効果】
【００３５】
本発明によるリボヌクレアーゼ活性阻害用化合物は、リボ核酸を抽出するために収集した試料を保存する間、エンドリボヌクレアーゼ及びエクソリボヌクレアーゼの影響を受けてリボ核酸が分解されることを効果的に阻害することができ、リボヌクレアーゼ活性阻害用化合物の処理が施された生物試料保存容器は、生物試料の保存及び移送中に発生し得るリボ核酸の分解を効果的に阻害して病院及び学校、研究所の診断業務及び実験業務に効果的に使用されることができるという効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】培養細胞から抽出したリボ核酸にヒト血清を施した後、リボヌクレアーゼ活性阻害用化合物を施したものと施していないものとをアガロースゲルに電気泳動して分離した写真を示すものである。
【図２】本発明のリボヌクレアーゼ活性阻害用化合物が施されたリボ核酸を利用して逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を実行した反応物をアガロースゲルに電気泳動した結果を示すものである。
【図３】本発明のリボヌクレアーゼ活性阻害用化合物が施されたリボ核酸を利用してリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を実行した結果を示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
以下、本発明を具体的な実施例を参照してより詳細に説明する。しかし、本発明の製造方法は好ましい一実施例の方法に過ぎず、本発明が前記製造方法に限定されるものではなく、これは本発明の分野において通常の知識を有した者であれば容易に理解できることは自明であろう。
【００３８】
他に定義されない限り、技術的または科学的な用語を含んでここで用いられる全ての用語は、本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者によって一般的に理解されるものと同一の意味を有する。なお、従来と同一の技術的構成及び作用に対して重複される説明は省略する。
【００３９】
本発明による化合物は、インターバイオスクリーン社（アメリカ）、スペックス社（オランダ）、アシネックス社（ロシア）の化合物ライブラリーから得られるものである。
【実施例１】
【００４０】
リボヌクレアーゼ活性阻害用化合物の処理がリボ核酸の分解酵素活性に及ぼす影響
（１）リボヌクレアーゼ活性阻害用組成物の製造
本発明で使用されたリボヌクレアーゼ活性阻害用化合物は、オランダのスペックス社から購入して使用しており、各化合物の特性を表１に示す。
【００４１】
【表１】
0005514307.tif 000015
【００４２】
上記化合物をそれぞれ２ｍｇずつ取ってＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ、Ｆ．Ｗ  ７８．１３，Ｓｉｇｍａ，Ｄ２６５０）１ｍｌに溶解した後、暗ビンに入れて保存した。
【００４３】
（２）リボヌクレアーゼの準備
普通のヒトの場合、ヒトの血清１ｍｌ当たり１２０ｕｎｉｔ程度のリボヌクレアーゼを有しており、これらリボヌクレアーゼは、常温でも非常に安定した構造を有しているため、様々な実験において使用されていると公知されている（Ｋ．Ｋ．Ｒｅｄｄｉ  ｅｔ．ａｌ．，ＰＮＡＳ，７３：２３０８−２３１０（１９７６））。
【００４４】
ヒト血清内に存在する様々なエンドリボヌクレアーゼに対して高い活性阻害力を有する物質をスクリーニングするために、アメリカのイノベイティブリサーチ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）社からｐｏｏｌｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｓｅｒｕｍ（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＩＰＬＡ−５、ＬｏｔＮｏ．ＩＲ０７−０１０）を購入し、殺菌したＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）ｂｕｆｆｅｒを利用して１０倍希釈したものを実験に使用した。
【００４５】
（３）リボヌクレアーゼ活性阻害状況確認
全リボ核酸（ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ）は、（株）バイオニアのＡｃｃｕＺｏｌＴＭ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｋ−３０９０）と実験方法に従ってＨｅＬａ細胞（１×１０６  ｃｅｌｌｓ／ｒｘｎ）から抽出した。
【００４６】
全リボ核酸の抽出過程を簡単に説明すると次のとおりである。先ず収集されたＨｅＬａ細胞（１×１０６  ｃｅｌｌｓ）に１ｍｌのＡｃｃｕＺｏｌＴＭ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを入れてよく混合した後、２００μｌのクロロホルムを入れて１５秒間よく混合する。氷上で１５分間放置した後、１２，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離する。遠心分離が終了したチューブから上澄液のみをゆっくり新しいチューブに入れ替えて同量のイソプロピルアルコールを入れてよく混合する。−２０℃で１０分間放置した後、１２，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離して全リボ核酸のみを沈ませる。１ｍｌの８０％エチルアルコールを用いてチューブ内壁の有機溶媒の残渣や塩等を洗浄した後、１２，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離して純粋な全リボ核酸のみをチューブ底に沈ませる。エチルアルコールの残渣が全て除去されるようにチューブを常温で乾燥し、リボヌクレアーゼが汚染されないようにＤＥＰＣ（Ｄｉｅｔｈｙｌｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ、Ｓｉｇｍａ、Ｄ５７５８）の処理が施された二回蒸留した脱イオン水（純水）を用いて全リボ核酸を溶解した後、−８０℃で保存する。
【００４７】
抽出した全リボ核酸は、Ｐｉｃｏ−ｄｒｏｐ装備を利用して吸光度を測定し、これにより全収率と純度を確認した。５μｇのヒト全リボ核酸を１．５ｍｌチューブに入れて前記で準備した４種の物質を各５μｌ（１０μｇ）ずつ入れた後、よく混合する。前記で準備したヒト血清５μｌを入れた後、３７℃の培養器で５分間培養する。培養の終了次第にＡｃｃｕＺｏｌＴＭ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（バイオニア、Ｋ−３０９０）を用いてヒト血清を精製し、リボ核酸は最終的に１０μｌのＤＥＰＣ（Ｄｉｅｔｈｙｌ  ｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ、Ｓｉｇｍａ、Ｄ５７５８）処理が施された殺菌した水に溶解した。リボ核酸用アガロースゲルで電気泳動してヒト血清内のリボ核酸の分解状況を確認した（図２）。
【００４８】
その結果、ヒト血清処理していない対照群（レーン１）は、３７℃で５分間反応させた後にもリボ核酸がそのまま保存されており、ヒト血清処理をしたが、リボヌクレアーゼ活性阻害物質で処理していない対照群（レーン２）は、リボ核酸が全て分解されていることが確認できた。市販中のリボヌクレアーゼ活性阻害物質で処理された対照群（レーン３）は、リボ核酸が分解されていない状態で保存されており、本発明から選択されたリボヌクレアーゼ活性阻害物質で処理された実験群（レーン４、５、６、７）は、全てのリボ核酸が分解されていない状態でそのまま保存されていることが確認できた。
【実施例２】
【００４９】
リボヌクレアーゼ活性阻害用化合物の処理が他の実験に及ぼす影響
リボヌクレアーゼ活性阻害用化合物で処理することが他の分子生物学的実験に影響を及ぼすと、その化合物がいくらリボヌクレアーゼ阻害効果に優れているとしても使用できないため、このような副作用（ｓｉｄｅ−ｅｆｆｅｃｔ）を確認するためにリボ核酸阻害物質で処理が施されたリボ核酸を利用して逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）とリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ）を実行した。
【００５０】
（１）逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）の阻害状況の確認
リボヌクレアーゼ活性阻害化合物で処理されたリボ核酸をテンプレート鎖にしてヒトのＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）遺伝子部位を増幅できるプライマセットとＡｃｃｕＰｏｗｅｒＲＴ−ＰＣＲ  ｐｒｅｍｉｘ（バイオニア、Ｋ−２０５５）を用いて逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を実行した。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応の条件は次のとおりである。４２℃で６０分間反応して一本鎖のｃＤＮＡ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ）を合成し、９４℃で５分間逆転写酵素不活性化過程を経た後、ポリメラーゼ連鎖反応を実行した。ポリメラーゼ連鎖反応は、デオキシリボ核酸変性のために９４℃で２０秒間、各プライマの標的部位に付着するために６０℃で２０秒間、相補鎖の合成による二重鎖デオキシリボ核酸の製造のために７２℃で３０秒間の過程を３０回繰り返して実行した。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応の反応生成物は１％のアガロースゲルで電気泳動してその大きさを確認した（図２）。
【００５１】
その結果、選択された４個のリボヌクレアーゼ活性阻害用化合物のうち一つ（レーン４）でのみ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応において微弱な反応阻害効果を示し、その他の３個のリボヌクレアーゼ活性阻害用化合物は逆転写ポリメラーゼ連鎖反応において反応阻害効果を全く示さないことが確認された（レーン１、２、３）。
【００５２】
（２）リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ）の阻害状況の確認
ヒトのＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）遺伝子部位をターゲットにしてプライマセットと５´−末端にＦＡＭ、３´−末端にＢＨＱが付着されたプローブを製造し、リボヌクレアーゼ阻害物質で処理が施されたリボ核酸をテンプレート鎖にしたリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を実行した。前記逆転写ポリメラーゼ連鎖反応は４５℃で１５分間反応して一本鎖のｃＤＮＡ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ）を合成し、９４℃で５分間逆転写酵素不活性化過程を行った。このようなリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応は、デオキシリボ核酸変性のために９４℃で５秒間、各プライマの標的部位の付着と相補鎖の合成による二重鎖デオキシリボ核酸の製造のために５５℃で５秒間の過程を含む一連の操作を４５回繰り返して実行した。リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応のための装置は、バイオニア社製のＥｘｉＣｙｃｌｅｒＴＭ９６  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｂｌｏｃｋを使用し、逆転写酵素及びポリメラーゼは、バイオニア社製のＭ−ＭＬＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｅ−３１２１）、Ｔｏｐ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｅ−３１００）を使用した。
【００５３】
その結果、選択された４個のリボヌクレアーゼ活性阻害用化合物のうち、ただ一つ（レーン４）でのみリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応において反応阻害効果を示し、その他の３個のリボヌクレアーゼ活性阻害用化合物はリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応において反応阻害効果を全く示さないことが確認された（レーン１、２、３）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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