(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
末端を活性化したポリオキサゾリン（ＰＯＺ）化合物であって、前記ＰＯＺ化合物はその停止末端部に単一の活性官能基を有するＰＯＺ重合体によって構成され、前記官能基は、標的分子の基と反応して標的分子−ＰＯＺ複合体を生成することができ、前記標的分子と前記ＰＯＺ化合物との間の全ての結合は加水分解に安定な結合であり、
前記ＰＯＺ重合体は、一般構造
Ｒ１−［Ｎ（ＣＯＲ７）ＣＨ２ＣＨ２］ｎ−Ｐｐ−Ｑｑ−Ｘ
（Ｘは、標的分子と加水分解に安定な結合を形成して標的分子−ＰＯＺ複合体を形成することができる活性官能基であり、ここで、該活性官能基は、アルデヒド、活性カーボネート、マレイミド、スルホン酸エステル、ヒドラジド、エポキシド、ヨードアセトアミド、アルキン、アジド、イソシアネート、シアン酸塩、イソチオシアン酸塩、チオシアン酸塩、ニトリル、カルボニルジイミダゾール誘導体、ビニルスルホン、カルボン酸ハロゲン化物、活性エステルおよびカルボン酸から成る群から選択され、該活性官能基のいずれも置換されているかまたは置換されていなくてもよく、
Ｐは、−Ｏ−、−Ｓ−、ＮＨ、−ＮＲ１１−、置換されていないヘテロシクリレンからなる群より選択される連結基であり、ここで、Ｒ１１が、水素、置換されていないかまたは置換されているアルキル、アルケニルおよびアラルキル基からなる群より選択され、
Ｑは、置換されていないかまたは置換されているアルキレン基、アルケニレン基、アラルキレン基、ヘテロシクリレン基、アリーレン基、−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）ｍ−、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨＣＯ−（ＣＨ２）ｍ−、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ−、−ＣＯ−Ｃ６Ｈ４−、−ＣＯ−Ｒ８、−（Ｒ1５）ｍ−、−（ＣＲ３Ｒ４）ｍ−からなる群より選択される連結基であり、ここで、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して水素、置換されていないかまたは置換されているアルキル基、アルケニル基またはアラルキル基から選択され、Ｒ１５は、置換されていないかまたは置換されているアルキレン基、アルケニレン基またはアラルキレン基から選択され、Ｒ８は、−Ｃ６Ｈ１０−ＣＨ２−であり、ｍは、１〜１０までの整数であり、
Ｒ１は、水素、置換されていないかまたは置換されているアルキル、アルケニルまたはアラルキル基であり、
Ｒ７は、置換されていないかまたは置換されているアルキル、アルケニルまたはアラルキル基から各反復単位について独立して選択され、
ｎは３〜１０００の整数であり、並びに
ｐおよびｑは、０または１から独立して選択される整数であり、
但し、−Ｐｐ−Ｑｑ−Ｘの構造は、−ＯＯＣ（ＣＨ２）３ＣＯＯＨ又は−（ＣＨ２）２ＣＯＯＨではなく、
Ｒ７がエチルまたはイソプロピルから各反復単位について独立して選択され、かつｐおよびｑの両方が０である場合、Ｘは、−ＣＮ又は−ＣＯＯＨではない）
を有する、化合物。
【請求項２】
ＰＯＺ重合体が、１．２以下の多分散性値を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
活性官能基が保護されており、その保護基が、シリルエーテル、置換されたメチルエーテル、置換されたエチルエーテル、エステル、アミド、イミド、チオエーテル又は置換されたＳ−メチル誘導体である請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ７が、１〜１２個の炭素原子を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ７が、メチル、エチルまたはｎ−プロピルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
活性カーボネートが式−Ｏ−ＣＯ−Ｚで表され、スルホン酸エステルが−ＯＳＯ２−Ｒ２３で表され、活性エステルが−ＣＯ−Ｚで表され、ここで、Ｚは活性化基であり、Ｒ２３は置換されていないかまたは置換されているアルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキルまたはアリール基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
一般式Ａ−Ｂ−ＴＭを有する標的分子ＰＯＺ複合体であって、
式中、Ａは、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＰＯＺ化合物であり、
ＴＭは、ポリペプチド、薬または診断用薬から選択される標的分子であり、並びに
Ｂは、該Ａと該ＴＭとの間に形成される加水分解に安定な結合である、複合体。
【請求項８】
Ｂが、Ａ上のトレシレート基とＴＭ上のＳＨ基との間に形成されるチオエーテル結合である、請求項７に記載の複合体。
【請求項９】
Ｂが、Ａ上のマレイミド基とＴＭ上のＳＨ基との間に形成されるチオエーテル結合である、請求項７に記載の複合体。
【請求項１０】
Ｂが、Ａ上の活性カーボネート基とＴＭ上のＮＨ２基との間に形成されるウレタン結合である、請求項７に記載の複合体。
【請求項１１】
Ｂが、Ａ上の活性エステル基とＴＭ上のＮＨ２基との間に形成されるアミド結合である、請求項７に記載の複合体。
【請求項１２】
Ｂが、Ａ上のアルデヒド基とＴＭ上のＮＨ２基との間に形成されるアミン結合である、請求項７に記載の複合体。
【請求項１３】
請求項１に記載の末端を活性化したポリオキサゾリン化合物を合成する方法であって、
（ａ）ＰＯＺ重合を開始して停止末端に陽イオンを有するＰＯＺ重合体を形成するステップ、および
（ｂ）前記ＰＯＺ重合体を求核試薬で末端停止するステップであって、ここで、該求核試薬が、Ｒ２５Ｓ−Ｄｄ−Ｘ（式中、Ｘは、アルデヒド、活性カーボネート、マレイミド、スルホン酸エステル、ヒドラジド、エポキシド、ヨードアセトアミド、アルキン、アジド、イソシアネート、シアン酸塩、イソチオシアン酸塩、チオシアン酸塩、ニトリル、カルボニルジイミダゾール誘導体、ビニルスルホン、カルボン酸ハロゲン化物、活性エステルおよびカルボン酸から成る群から選択される活性官能基であり、該活性官能基のいずれも置換されているかまたは置換されていなくてもよく、
Ｒ２５は、金属であり、
Ｄは、置換されていないかまたは置換されているアルキレン基、アルケニレン基、ヘテロシクリレン基、アリーレン基、−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）ｂ−、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｂ−ＮＨＣＯ−（ＣＨ２）ｂ−、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｂ−、−ＣＯ−Ｃ６Ｈ４−、−ＣＯ−Ｒ２６、−（ＣＲ２７Ｒ２８）ｂ−からなる群より選択される連結基であり、ここで、Ｒ２７およびＲ２８は、それぞれ独立して水素、または置換されていないかもしくは置換されているアルキル基、アルケニル基またはアラルキル基から選択され、Ｒ２６は−Ｃ６Ｈ１０−ＣＨ２−であり、ｂは１〜１０の整数であり、
ｄは０または１である）
の構造を含む、ステップ
を含む、方法。
【請求項１４】
求核試薬がメルカプチドである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
Ｒ２５はＬｉ、ＮａまたはＫである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
以下の構造、
（ａ）ＣＨ３−［Ｎ（ＣＯＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２］ｎ−ＯＣＯＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２
（ｂ）ＣＨ３−［Ｎ（ＣＯＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２］ｎ−Ｓ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ
（ｃ）ＣＨ３−［Ｎ（ＣＯＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２］ｎ−Ｓ−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ
（ｄ）ＣＨ３−［Ｎ（ＣＯＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２］ｎ−Ｓ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２
（ｅ）ＣＨ３−［Ｎ（ＣＯＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２］ｎ−ＯＣＯＮＨ−ＣＨ２−ＣＨＯ
（ｆ）ＣＨ３−［Ｎ（ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２］ｎ−Ｓ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ
（ｇ）Ｈ−［Ｎ（ＣＯＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２］ｎ−Ｓ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ
【化１】
0005615558.tif 000031
（式中、ｎは３〜１０００から選択される整数である）
を有する、請求項１に記載の末端を活性化したポリオキサゾリン化合物。
【請求項１７】
ＰＯＺ重合体が、１．１以下の多分散性値を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項１８】
ＰＯＺ重合体が、１．０５以下の多分散性値を有する、請求項１に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００７年２月２８日出願の米国特許仮出願第６０／８９２、２１２号の利益を主張する。
【０００２】
本開示は、ポリオキサゾリン誘導体、合成方法およびかかるポリオキサゾリン誘導体の産生において有用な中間化合物、ならびにかかるポリオキサゾリン誘導体を使用して産生される加水分解に安定な標的分子−ポリオキサゾリン複合体に関する。
【背景技術】
【０００３】
重合体で修飾した治療薬は、現代の薬学において非常に有用性が高いことが証明されている。特に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にカップリングされるタンパク質は、現在一連の疾病の治療に非常に重要な多くの治療法を成している。重合体で修飾した治療薬の成功により、とりわけポリエチレングリコールにはない性質を有する重合体を提供するために、かかる用途を有する重合体の範囲を拡大することに関心が高まっている。
【発明の概要】
【０００４】
（定義）
本願で使用する「ＰＯＺ」「ＰＯＺ化合物」または「ＰＯＺ重合体」という用語は、構造−［Ｎ（ＣＯＲ７）ＣＨ２ＣＨ２］ｎ−を有する反復単位を含む２−置換−２−オキサゾリンの重合体を指し、Ｒ７は、各反復単位について、置換されていないかまたは置換されているアルキル、アルケニル、アラルキルまたはヘテロシクリルアルキル基から独立して選択され、ｎは３から１０００であり、一実施形態では、置換されていないかまたは置換されているアルキル、アルケニル、アラルキルまたはヘテロシクリルアルキル基は、１から１０個の炭素原子を含み、さらに具体的な実施形態では、Ｒ７は、メチル、エチルまたはｎ−プロピルである。
【０００５】
本願で使用する「ＰＭＯＺ」という用語は、構造−［Ｎ（ＣＯＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２］ｎ−を有する反復単位を持つＰＯＺを指す。
【０００６】
本願で使用する「ＰＥＯＺ」という用語は、構造−［Ｎ（ＣＯＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２］ｎ−を有する反復単位を持つＰＯＺを指す。
【０００７】
本願で使用する「Ｍ−ＰＯＺ」「Ｍ−ＰＭＯＺ」または「Ｍ−ＰＥＯＺ」という用語は、開始端の窒素がメチルに結合されている上記の重合体を指す。
【０００８】
本願で使用する「ＰＯＺ誘導体」または「ポリオキサゾリン誘導体」という用語は、ＰＯＺ重合体を含む構造を指し、このＰＯＺ重合体は、ＰＯＺ重合体の末端部に単一の活性官能基を有し、この官能基は、標的分子上の化学基と直接または間接に結合を生成することができ、一実施形態では、このＰＯＺ誘導体は一官能性ＰＯＺ誘導体である。
【０００９】
本願で使用する「標的分子」という用語は、治療的、診断的用途もしくは標的機能を有するあらゆる分子を指し、標的分子は、治療的部分（薬を含むがこれに限定しない）、診断的部分、標的部分、有機小分子、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、抗体断片およびタンパク質を含むがこれらに限定されない、本開示のＰＯＺ重合体またはＰＯＺ誘導体の活性官能基と反応することができる。
【００１０】
本願で使用する「加水分解に安定の標的分子−ＰＯＺ複合体」という用語は、ＰＯＺ複合体と標的分子の間のすべての化学結合が加水分解に安定な、本開示のＰＯＺ誘導体と標的分子の複合体を指す。
【００１１】
本願で使用する「加水分解に安定」という用語は、生理学的条件下において水溶液中で安定である結合を指し、一実施形態では、かかる結合は少なくとも１２時間、２４時間、４８時間、９６時間、１９２時間またはそれ以上安定であり、代替の実施形態では、かかる結合は無期限に安定である。
【００１２】
本願で使用する「加水分解に不安定な」という用語は、生理学的条件下において水溶液中で安定でない結合を指す。
【００１３】
本願で使用する「生理学的条件」という用語は、６から８のｐＨおよび３０から４２℃の温度を有する水溶液を指す。
【００１４】
本願で使用する「活性官能基」という用語は、求電子基または求核基に容易に反応するか、または環化付加反応によって容易に反応する基を指し、反応に強力な触媒作用、高温、または実行不可能な反応条件を必要とする基とは対照的である。
【００１５】
本願で使用する「結合する」「結合した」「結合」または「リンカー」という用語は、本願に記載のＰＯＺ誘導体またはその組成物に関して使用される際、通常は化学反応の結果として形成され、典型的には共有結合である、基または結合を指す。
【００１６】
本願で使用する、ヒドロキシル基、アミン基、スルフヒドリル基および他の反応基に関する「保護された」という用語は、本願に記載の手順を使用して付加または除去されることができる、当業者には周知の、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．；Ｗｕｔｓ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，（３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９９）等に記載の保護基を用い、望ましくない反応から保護された、これらの官能基の形成を指す。保護されたヒドロキシル基の例は、ｔ−ブチルジメチル−クロロシラン、トリメチルクロロシラン、トリイソプロピルクロロシラン、トリエチルクロロシランなどを含むがこれらに限定されない試薬を用いたヒドロキシル基の反応などによって得られるシリルエーテル、置換メチルおよびメトキシメチルエーテル、メチチオネチルエーテル、ベンジルオキシメチルエーテル、ｔ−ブトキシメチルエステル、２−メトキシエトキシエチルエーテル、テトラヒドロピラニルエーテル、１−エトキシエチルエーテル、アリルエーテル、ベンジルエーテル等（必ずしもこれらに限定されない）のエチルエーテル、ベンゾイルギ酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、トリクロロ酢酸塩、およびトリフルオロ酢酸塩等（必ずしもこれらに限定されない）のエステル等を含むがこれらに限定されない。保護されたアミン基の例としては、ホルムアミド、アセトアミド、トリフルオロアセトアミド、およびベンズアミドを含む、アミド、フタルイミド、およびジチオスクシンイミドなどのイミド等が挙げられるが、これらに限定されない。保護されたスルフヒドリル基の例としては、Ｓ−ベンジルチオエーテル、およびＳ−４−ピコリルチオエーテルなどのチオエーテル、ヘミチオ、ジチオおよびアミノチオアセタールなどの置換Ｓ−メチル誘導体等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１７】
本願で使用する「アルキル」という用語は、単独でもしくは置換基の一部として使用される場合のどちらも、１から２０個の炭素原子を含む直鎖炭化水素基を含む。したがって、この語句は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル等の直鎖アルキル基を含む。この語句はまた、例として提供される以下のものを含むが、これらに限定されない、直鎖アルキル基の分鎖異性体を含む。−ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）、−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２、−Ｃ（ＣＨ３）３、−Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）３、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２、−ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）３、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）３、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）。この語句はまた、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、およびシクロオクチル等の環状アルキル基を含み、かかる環は上に定義される直鎖および分鎖アルキル基で置換される。この語句はまた、アダマンチルノルボルニルおよび二環状［２．２．２］オクチル等（必ずしもこれらに限定されない）の多環状アルキル基を含み、かかる環は上に定義される直鎖および分鎖アルキル基で置換される。
【００１８】
本願で使用する「アルケニル」という用語は、単独でもしくは置換基の一部として使用される場合のどちらも、任意の２個の隣接する炭素原子の間に少なくとも１つの二重結合を有するアルキル基を含む。
【００１９】
本願で使用する「アルキニル」という用語は、単独でもしくは置換基の一部として使用される場合のどちらも、任意の２個の隣接する炭素原子の間に少なくとも１つの三重結合を有するアルキル基を含む。
【００２０】
本願で使用する「置換されていないアルキル」「置換されていないアルケニル」および「置換されていないアルキニル」という用語は、ヘテロ原子を含まないアルキル、アルケニルおよびアルキニル基を指す。
【００２１】
「置換されているアルキル」「置換されているアルケニル」および「置換されているアルキニル」という語句は、（１つまたはそれ以上の）炭素あるいは（１つまたはそれ以上の）水素への１つ以上の結合が、（必ずしもこれらに限定されないが）以下のような非水素または非炭素原子への結合で置き換えられる、上で定義されるアルキル、アルケニルおよびアルキニル基を指す。アルコキシ基またはアリールオキシ基等の基の酸素原子、アルキルおよびアリールスルフィド基、スルホン基、スルホニル基、およびスルホキシド基などの基の硫黄原子、トリアルキルシリル基、ジアルキルアリルシリル基、アルキルジアリルシリル基、およびトリアリルシリル基などの基のシリコン原子、および種々の基の他のヘテロ原子等。
【００２２】
本願で使用する「置換されていないアリール」という用語は、フェニル、ナフチル、アントラセニル、ビフェニルおよびジフェニル基等（必ずしもこれらに限定されない）の、環部に６個から１２個の炭素原子を有する、ヘテロ原子を含まない単環式または二環式芳香族炭化水素基を指す。「置換されていないアリール」という語句は、ナフタレン等の縮合環を含む基を含むが、トリル等のアリール基は、下に説明するとおり本願では置換されているアリール基と考えられているため、環員のうちの１つに結合するアルキルまたはハロ基などの他の基を有するアリール基は含まない。しかしながら、置換されていないアリール基は、親化合物の１個以上の炭素原子、酸素原子、窒素原子、および／または硫黄原子に結合され得る。
【００２３】
本願で使用する、「置換されているアリール基」という用語は、置換されていないアリール基との関連において、置換されていないアルキル基に関して置換されているアルキル基が有するものと同一の意味を有する。しかしながら、置換されているアリール基はまた、芳香族炭素のうちの１つが、置換されているアルキルに関して上に説明した原子等（必ずしもこれらに限定されない）の、非炭素もしくは非水素原子のうちの１つに結合するアリール基を含み、また、アリール基の芳香族炭素のうちの１つが、本願で定義される置換されているおよび／または置換されていないアルキル、アルケニルまたはアルキニル基に結合するアリール基を含む。これには、アリール基の２個の炭素原子がアルキルまたはアルケニル基の２個の原子に結合して縮合環系（例えば、ジヒドロナフチルまたはテトラヒドロナフチル）を画定する結合配置も含む。したがって、「置換されているアリール」という語句は、とりわけトリル、およびヒドロキシフェニルを含むが、これらに限定されない。
【００２４】
本願で使用する「置換されていないアラルキル」という用語は、置換されていないかまたは置換されているアルキルまたはアルケニル基の水素または炭素結合が、上に定義される置換されているかもしくは置換されていないアリール基への結合に置き換えられる、上で定義される置換されていないアルキルまたはアルケニル基を指す。例えば、メチル（ＣＨ３）は置換されていないアルキル基である。メチルの炭素がベンゼンの炭素に結合される場合等のように、メチル基の水素原子がフェニル基への結合に置き換えられる場合、化合物は置換されていないアラルキル基（すなわち、ベンジル基）である。
【００２５】
本願で使用する、「置換されているアラルキル」という用語は、置換されていないアラルキル基との関連において、置換されていないアリール基に関して置換されているアリール基が有するものと同一の意味を有する。しかしながら、置換されているアラルキル基はまた、基のアルキル部分の炭素または水素結合が非炭素または非水素原子への結合に置き換えられる基を含む。
【００２６】
本願で使用する「置換されていないヘテロシクリル」という用語は、１つ以上がＮ、Ｏ、およびＳ等（必ずしもこれらに限定されない）のヘテロ原子である、３個以上の環原子を含むキヌクリジル等（必ずしもこれらに限定されない）の、単環式、二環式、および多環式の環状化合物を含む芳香族ならびに非芳香族の環状化合物を意味する。「置換されていないヘテロシクリル」という語句は、ベンズイミダゾリルなどの縮合複素環を含むが、２−メチルベンズイミダゾリル等の化合物は上に記載の通り「置換されているヘテロシクリル」基であるため、環原子のうちの１つに結合するアルキルまたはハロ基等の他の基を有するヘテロシクリル基は含まない。ヘテロシクリル基の例としては、ピロリル、ピロリニル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジル、ジヒドロピリジル、ピリミジル、ピラジニル、ピリダジニル、トリアゾリル、テトラゾリル等（必ずしもこれらに限定されない）の１から４個の窒素原子を含む不飽和３員環から８員環、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル等（必ずしもこれらに限定されない）の、１から４個の窒素原子を含む飽和３員環から８員環、インドリル、イソインドリル、インドリニル、インドリジニル、ベンズイミダゾリル、キノリル、イソキノリル、インダゾリル、ベンゾトリアゾリル等（必ずしもこれらに限定されない）の１から４個の窒素原子を含む縮合不飽和複素環基、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル等（必ずしもこれらに限定されない）の１から２個の酸素原子および１から３個の窒素原子を含む不飽和３員環から８員環、モルホリニル等（必ずしもこれに限定されない）の１から２個の酸素原子および１から３個の窒素原子を含む飽和３員環から８員環、例えば、ベンゾオキサゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾオキサジニル（例えば、２Ｈ−１、４−ベンゾオキサジニル等）等の１から２個の酸素原子および１から３個の窒素原子を含む不飽和縮合複素環基、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル（例えば、１、２、３−チアジアゾリル、１、２、４−チアジアゾリル、１、３、４−チアジアゾリル、１、２、５−チアジアゾリル等）等（必ずしもこれらに限定されない）の１から３個の硫黄原子および１から３個の窒素原子を含む不飽和３員環から８員環、チアゾロジニル等（必ずしもこれらに限定されない）の１から２個の硫黄原子および１から３個の窒素原子を含む飽和３員環から８員環、チエニル、ジヒドロジチイニル、ジヒドロジチオニル、テトラヒドロチオフェン、テトラヒドロチオピラン等（必ずしもこれらに限定されない）の１から２個の硫黄原子を含む飽和ならびに不飽和３員環から８員環、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾチアジニル（例えば、２Ｈ−１、４−ベンゾチアジニル等）、ジヒドロベンゾチアジニル（例えば、２Ｈ−３、４−ジヒドロベンゾチアジニル等）等（必ずしもこれらに限定されない）の１から２個の硫黄原子および１から３個の窒素原子を含む不飽和縮合複素環、フリル等（必ずしもこれに限定されない）の酸素原子を含む不飽和３員環から８員環、ベンゾジオキソジル（例えば、１、３−ベンゾジオキソイル等）等の１から２個の酸素原子を含む不飽和縮合複素環、ジヒドロオキサチイニル等（必ずしもこれに限定されない）の１個の酸素原子および１から２個の硫黄原子を含む不飽和３員環から８員環、１、４−オキサチアン等の１から２個の酸素原子および１から２個の硫黄原子を含む飽和３員環から８員環、ベンゾチエニル、ベンゾジチイニル等の１から２個の硫黄原子を含む不飽和縮合環、およびベンゾオキサチイニル等の１個の酸素原子および１から２個の酸素原子を含む不飽和縮合複素環が挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロシクリル基は、環の１個以上のＳ原子が１個または２個の酸素原子に二重結合する、上に説明のもの（スルホキシドおよびスルホン）も含む。例えば、ヘテロシクリル基は、テトラヒドロチオフェン、テトラヒドロチオフェン酸化物、およびテトラヒドロチオフェン、１、１−二酸化物を含む。好ましいヘテロシクリル基は、５つ、または６つの環員を含む。より好ましいヘテロシクリル基は、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ピロリジン、イミダゾール、ピラゾール、１、２、３−トリアゾール、１、２、４−トリアゾール、テトラゾール、チオモルホリン、チオモルホリンのＳ原子が１個以上のＯ原子に結合するチオモルホリン、ピロール、ホモピペラジン、オキサゾリジン−２−オン、ピロリジン−２−オン、オキサゾール、キヌクリジン、チアゾール、イソオキサゾール、フラン、およびテトラヒドロフランを含む。
【００２７】
本願で使用する「置換されているヘテロシクリル」という用語は、置換されていないヘテロシクリル基との関連において、置換されていないアルキル基に関して置換されているアルキル基が有するものと同一の意味を有する。しかしながら、置換されているヘテロシクリル基はまた、炭素のうちの１つが、置換されているアルキルおよび置換されているアリール基に関して上で説明する原子等（必ずしもこれらに限定されない）の非炭素もしくは非水素原子のうちの１つに結合されるヘテロシクリル基を含み、また、ヘテロシクリル基の１個以上の炭素が、本願で定義される置換および／または置換されていないアルキル、アルケニルまたはアリール基に結合されるヘテロシクリル基を含む。これは、ヘテロシクリル基の２個の炭素原子がアルキル、アルケニル、またはアルキニル基の２個の原子に結合して縮合環系を画定する結合配置を含む。例としては、とりわけ２−メチルベンズイミダゾリル、５−メチルベンズイミダゾリル、５−クロロベンズチアゾリル、１−メチルピペラジニル、および２−クロロピリジルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
本願で使用する「置換されていないヘテロシクリルアルキル」という用語は、置換されていないアルキルまたはアルケニル基の水素または炭素結合が、上に定義される置換もしくは置換されていないヘテロシクリル基への結合に置き換えられる、上で定義される置換されていないアルキルまたはアルケニル基を指す。例えば、メチル（ＣＨ３）は置換されていないアルキル基である。メチル基の水素原子がヘテロシクリル基への結合と置き換えられる場合、たとえば、メチルの炭素がピリジンの炭素２（炭素のうちの１個がピリジンのＮに結合される）またはピリジンの炭素３または４に結合される等の場合、化合物は置換されていないヘテロシクリルアルキル基である。
【００２９】
本願で使用する「置換されているヘテロシクリルアルキル」という用語は、置換されていないヘテロシクリルアルキル基との関連において、置換されていないアリール基に関して置換されているアリール基が有するものと同一の意味を有する。しかしながら、置換されているヘテロシクリルアルキル基はまた、非水素原子が、ピペリジニルアルキル基のピペリジン環の中の窒素原子等（必ずしもこれらに限定されない）のヘテロシクリルアルキル基のヘテロシクリル基におけるヘテロ原子に結合する基を含む。
【００３０】
（概略）
ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）は、２−置換−２−オキサゾリンモノマーから調製される重合体である。これらの重合体は水溶性であり、哺乳類のモデル系において無毒性であると報告されている。ＰＯＺは、化学量論的に適切な量の２−アルキル−２−オキサゾリンと、メチルｐ−トルエンスルホナート（または「トシレート」、ＣＨ３−ＯＳＯ２−Ｃ６Ｈ４−ＣＨ３）またはメチルトリフラート（ＣＨ３−ＯＳＯ２−ＣＦ３）、等の求電子性開始剤との反応によって一般的に調製され、続いて水酸化物またはアミン等の求核試薬による末端停止が行われる。産生される重合体は、便宜上、開始基が最も左の基で表され、末端基が最も右の基で表され、２−アルキル−２−オキサゾリン成分が中央に表される省略形で説明される。したがって、この省略型の説明が本願明細書において使用される場合、別様に表されない限り、左側は「開始末端」を表し、右側は「停止末端」を表すことが意図される。
【００３１】
例えば、２−置換−２−オキサゾリンが２−メチル−２−オキサゾリンである場合、メチルトシレートが開始剤として使用され、水酸化物が末端停止剤として使用され、以下の重合体が産生される。
ＣＨ３−［Ｎ（ＣＯＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２］ｎ−ＯＨ
上の重合体は便宜上、Ｍ−ＰＭＯＺ−ＯＨという簡便な表記法で説明され、式中、メチル開始剤は最も左のＭ（開始末端）で表され、ＰＭＯＺは反復単位のメチルがＰＭＯＺのＭで表されるポリメチルオキサゾリンを表し、停止ヒドロキシルは（停止末端における）−ＯＨで表される。重合度合である、ｎは、約３から約１０００の範囲であり得る。
【００３２】
他のよく使用されるモノマーは、２−エチル−２−オキサゾリンであり、そこでメチルトリフラートの開始と水酸化物の停止は、以下のＰＯＺ重合体を提供する。
ＣＨ３−［Ｎ（ＣＯＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２］ｎ−ＯＨ
上の重合体は便宜上、Ｍ−ＰＥＯＺ−ＯＨという簡便な表記法で説明され、メチル開始剤は最も左のＭ（開始末端）で表され、ＰＥＯＺは反復単位のメチルがＰＥＯＺのＥで表されるポリメチルオキサゾリンを表し、停止ヒドロキシルは（停止末端における）−ＯＨで表される。
【００３３】
より複雑な求電子試薬または求核試薬が使用され得る。例えば、２−エチル−２−オキサゾリン重合のベンジル臭化物による開始と、過剰エチレンジアミンによる停止は、以下の重合体を産する。
Ｃ６Ｈ５−ＣＨ２−［Ｎ（ＣＯＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２］ｎ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２
また、同一の重合体に異なるモノマーを使用して、さまざまなランダムまたはブロック共重合体を得ることができる。
【００３４】
重合プロセスは、求電子試薬による開始がオキサゾリニウムカチオンを産出し、これが次に追加的なモノマー単位と連鎖反応を起こし、成長する「リビング」カチオンを産出するので、リビングカチオン重合と称される。
【００３５】
【化１】
0005615558.tif 000002
【００３６】
現実には環状形態が当然最も重要であり、所望の生成物は環の５位への求核攻撃によって産生されるが、末端停止生成物は、リビングカチオンが以下の非環状形態で表されると仮定することによって予測できる。
ＣＨ３−［Ｎ（ＣＯＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２］ｎ−Ｎ（ＣＯＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２＋
本開示において、このカチオンはＭ−ＰＭＯＺ＋と表される。上に記載のとおり、このＰＯＺカチオンは水酸化物またはアミンなどの求核試薬と反応することによって「末端停止」され得る。興味深いことに、弱い求核試薬水による末端停止では、５−攻撃（「熱力学的」生成物）の所望の生成物が得られず、２位の攻撃（「動的」生成物）が得られる。この動的生成物は安定でなく、再配列してエステル生成物をもららすか、またはカチオンに戻り得る（Ｏ．Ｎｕｙｋｅｎ、Ｇ．Ｍａｉｅｒ、Ａ．Ｇｒｏｓｓ、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１９７、８３−８５（１９９６））。
【００３７】
ヒドロキシルで末端停止された重合体をさらに修飾して、所望の誘導体を得ることができる。例えば、Ｚａｌｉｐｓｋｙは末端−ＯＨをグルタル酸無水物と反応させてグルタラート基で末端停止したＰＯＺを得た（Ｍ．Ｃ．Ｗｏｏｄｌｅ、Ｃ．Ｍ．Ｅｎｇｂｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、１９９４、５、４９３−４９６）。
Ｍ−ＰＭＯＺ−Ｏ２Ｃ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ
上の重合体は、スクシニミジルエステルとして活性化され、リン脂質にカップリングされてＰＯＺ修飾されたリポソームの調製に使用された。これらのリポソームは、ＰＥＧ修飾されたリポソームに類似した特性を有することが明らかとなった。
【００３８】
アミンで末端停止された重合体はまた、さらなる誘導体化のための有用な反応基を提供する。例えば、メチルアミンによる末端停止は、活性基−ＮＨＣＨ３で末端停止されたＰＯＺを得る。環状ジアミンピペラジンによる末端停止もまた有用であり得る。
【００３９】
オキサゾリン重合もまた、機能的求核試薬によって開始され得る。例えば、求電子性開始剤であるエチル３−ブロモプロピオン酸塩が、２−エチル−２−オキサゾリン重合の開始に使用されている。水酸化物による末端停止は、以下の重合体を得る。
ＨＯ２Ｃ−ＣＨ２ＣＨ２−［Ｎ（ＣＯＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２］ｎ−ＯＨ
【００４０】
開始末端および停止末端に同一の官能基を有するＰＯＺは、開始末端の基が窒素に付着し、一方停止末端の基が炭素に付着するため、化学的に異なることは、注目すべきである。例えば、以下の２つの重合体はどちらもＰＭＯＺのプロピオン酸誘導体であるが、開始末端のプロピオン酸が窒素に付着し、停止末端のプロピオン酸が炭素に付着する点で異なる（明確にするため、最初または最後のモノマー単位を示す）。
ＨＯＯＣＣＨ２ＣＨ２−Ｎ（ＣＯＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２−ＰＭＯＺ−ＯＨ
Ｍ−ＰＭＯＺ−Ｎ（ＣＯＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ
【００４１】
活性官能基を持つポリオキサゾリンを調製するさらに別の経路としては、２−エチル−２−オキサゾリンなどのモノマーを２位に活性官能基を有するオキサゾリンモノマーで重合するものがある。例えば、Ｊｏｒｄａｎらは２位にアセチレンおよび保護されたアルデヒド、カルボン酸およびアミンを持つオキサゾリンを調製した（Ｆ．Ｃ．Ｇａｅｒｔｎｅｒ、Ｒ．Ｌｕｘｅｎｈｏｆｅｒ、Ｂ．Ｂｌｅｃｈｅｒｔ、Ｒ．Ｊｏｒｄａｎ  ａｎｄ  Ｍ．Ｅｓｓｌｅｒ、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、２００７、１１９、２９１−３００）。２−エチル−２−オキサゾリンとのこれらの官能性モノマーの共重合により、複数のペンダントまたは側鎖活性官能基を持つランダム共重合体を得る。例えば、メチルトリフラートによる２−エチル−２−オキサゾリンと２−ペンチニル−２−オキサゾリンの重合の開始、それに続くピペラジン（ＮＨＣ４Ｈ８ＮＨ）による末端停止は、以下のランダム共重合体を得る。
ＣＨ３−｛［Ｎ（ＣＯＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２］ｎ−［Ｎ（ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＣＣＨ）ＣＨ２ＣＨ２］ｍ｝ｒａｎ−ＮＣ４Ｈ８ＮＨ
下付き文字「ｒａｎ」は、重合体がランダム共重合体であることを示す。ｎの値は典型的には約２０から３０であり、ｍは約２から５である。
【００４２】
ポリペプチド等（必ずしもこれに限定されない）の標的分子にＰＯＺをカップリングするには、活性官能基を標的分子上の基と結合を形成することができる重合体の少なくとも１つの末端に付加することによって、重合体を「活性化」することが必要である。ＰＯＺを標的分子にカップリングするための活性化の研究は、これまでにほとんど行われていない。活性基は、開始（左）端または停止（右）端、または双方に加えられ得る。例えば、標的分子がポリペプチドである場合、ポリペプチドはＰＯＺの活性官能基と反応し得る多数のアミノ基を表面に有し、ＰＯＺのタンパク質への付着の唯一の公開された例において、Ｍｙａｍｏｔｏらは下記のＰＯＺを酵素カタラーゼのアミノ基に付着させた（Ｍ．Ｍｙａｍｏｔｏ、Ｔ．Ｓａｅｇｕｓａ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、１９９０、２３、３２０１−３２０５）。
Ｍ−ＰＭＯＺ−Ｏ２Ｃ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ２−ＮＨＳ
【００４３】
この場合、Ｍ−ＰＭＯＺ−ＯＨはグルタル酸無水物と反応し、得られたカルボン酸はＮ−ヒドロキシスクシンイミドで活性化され、これはＮＨＳで示される。ＮＨＳ活性エステルは、よく使用される活性型のカルボン酸である。この実施例では、ＰＯＺ−カタラーゼ共役は活性であると証明されている。
【００４４】
従来技術では、標的分子に共役することができる末端が活性化された３つのＰＯＺ化合物を記載している。しかしながら、前述のそれぞれのＰＯＺ誘導体には、制限がある。Ｚａｌｉｐｓｋｙは、活性化基が分子の開始末端に付着された活性化されたプロピオン酸ＰＯＺ化合物、ＮＨＳ−ＯＯＣＣＨ２ＣＨ２−ＰＥＯＺ−ＯＨについて記載した（Ｓ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ、Ｃ．Ｂ．Ｈａｎｓｅｎ、Ｊ．Ｍ．Ｏａｋｓ  ａｎｄ  Ｔ．Ｍ．Ａｌｌｅｎ、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、８５、１３３−１３７（１９９６））。ＰＯＺ化合物は、活性化基を含む部分を使用した重合の開始によって作製された。しかしながら、Ｊｏｒｄａｎ、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍらは、異なる活性化基との重合の開始は、最適の反応条件を決定するために大規模な研究を必要とする、大いに異なる反応条件を必要とし得ることを示した。したがって、活性化されたＰＯＺ化合物を作製するための開始剤の方法を選択する場合、それぞれの新しい化合物に適した反応条件を決定するために、予備的な研究を行わなければならない。また、上記の化合物は、アルキル基などの不活性基ではなく、ヒドロキシル基で末端停止されるため、二官能性である。また、以下で述べるとおり、ハロゲン化アルキルとの重合の開始は、リビングカチオン構造によって進行せず、したがって高い多分散性が見られる。
【００４５】
ＮＨＳで活性化されたグルタラート誘導体は、ＭｙａｍｏｔｏおよびＺａｌｉｐｓｋｙによって作製されている。この誘導体は、停止末端活性化基としてＯＨ基を有する一官能性ＰＯＺ重合体（Ｍ−ＰＭＯＺ−ＯＨ）から調製された。しかしながら、グルタラートおよびコハク酸エステル誘導体は、標的分子をＰＯＺ化合物に結合する加水分解に不安定なエステル結合を有する。例えば、ＮＨＳ−活性化されたグルタラート誘導体は、本願ではタンパク質として説明される標的分子と、下記のように反応する。
【００４６】
Ｍ−ＰＭＯＺ−Ｏ２Ｃ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ２−ＮＨＳ＋タンパク質−ＮＨ２−＞
−＞Ｍ−ＰＭＯＺ−Ｏ２Ｃ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯＮＨ−タンパク質
加水分解に不安定なエステル結合の結果として、産生された標的分子−ＰＯＺ複合体は、ヒトや他の哺乳類等の生体系の中において、生理学的条件下で安定せず、加水分解してＰＯＺをタンパク質から開裂する。
Ｍ−ＰＭＯＺ−Ｏ２Ｃ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯＮＨ−タンパク質−＞
−＞Ｍ−ＰＭＯＺ−ＯＨ＋ＨＯ２Ｃ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯＮＨ−タンパク質
【００４７】
さらに、上のスキームにおいて、標的分子−ＰＯＺ複合体が不安定なエステル結合の開裂による加水分解を受ける場合、得られた標的分子は「タグ」または「ハプテン」を含むこととなり、標的分子の免疫原性を招く。
【００４８】
最後に、オルトピリジルジスルフィド（ＯＰＳＳ）誘導体が作製されている（Ｇ．Ｈｓｉｕｅ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２００６，１７，７８１−７８６）。この誘導体は理論的にはタンパク質チオール基にカップリングされ、ジスルフィド結合を得るが、これは、Ｈｓｉｕｅによっては行われておらず、ジスルフィドは不安定であり、血漿中のすばやい減少が起こりやすいことが知られている。
【００４９】
既知のＰＯＺ重合体を標的分子の修飾に使用することを妨げているさらなる問題は、いくつかのＰＯＺ重合体は単一の活性官能基を有せず、すなわち、これらは「単官能性」でないことである。単官能性は、架橋結合およびまたは重合体骨格への複数の標的分子の組み込みを回避したい場合に必要である。例えば、Ｊｏｒｄａｎらは、２−エチル−２−オキサゾリンの官能基を含むオキサゾリンモノマーとの共重合を示す研究を公開した。これらのペンダント官能基は、いくつかの事象においては、ペプチドにカップリングされることが可能である。しかしながら、この手法は一官能性ＰＯＺ重合体を提供するために策定されておらず、骨格に沿ってペンデント基を持つ多官能性化合物を提供する。ＰＯＺ骨格に複数の官能基を有することは、いくつかの事象においては好都合であるが、ポリペプチドおよびタンパク質等（必ずしもこれらに限定されない）の多官能性標的分子にカップリングする場合、架橋結合および凝集体形成につながるであろう。また、重合体にカップリングされた単一の標的分子を所望する際、多官能性ＰＯＺ重合体がこれを可能にしないという場合がある。
【００５０】
上記の官能性ＰＯＺ化合物のいくつかは、タンパク質および小分子の薬物等の標的分子にカップリングされる可能性がある。しかしながら、ポリエチレングリコール修飾された治療薬の研究が示しているように、重合体で修飾した薬剤の商業的開発には、４０、０００Ｄａ以上の分子量（ＭＷ）および１．１未満の分子量配分または多分散度（ＰＤ）の重合体を利用することがしばしば必要である。かなりの量の研究が、従来の技術では、ＰＯＺについて上記の範囲のＭＷおよびＰＤは達成され得ないことを示している。成長するＰＯＺ鎖の分子量が約５、０００Ｄａに達すると、多分散性が認め得るほどに高まることが概して示されている。連鎖移動を含む副反応は、重要性が大きくなる。著しく低い重合温度を数週間の反応時間と組み合わせて使用すると、許容できるＰＤを得ることが示されているが、かかる条件は商業規模の調製にとっては実用的でない（Ｊ．Ｓ．ＰａｒｋおよびＫ．Ｋａｔａｏｋａ、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、３９、６６２２（２００６））。Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、Ｓｃｈｕｂｅｒｔらは、低ＰＤのＰＯＺが、マイクロ波照射を使用することによって調製され得ることを示したが、重ねて、商業規模の重合はこの手法では利用可能ではない（Ｒ．Ｍ．Ｐａｕｌｕｓ、Ｔ．Ｅｒｄｍｅｎｇｅｒ、Ｃ．Ｒ．Ｂｅｃｅｒ、Ｒ．Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｕ．Ｓ．Ｓｃｈｕｂｅｒｔ、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍ．、２８、４８４−４９１（２００７））。一般的に見られる広範な多分散性ゆえに、今日までに説明された官能性ＰＯＺ化合物は、重合体治療学における使用において深刻に制限を受けている。
【００５１】
標的分子の修飾においてＰＯＺ誘導体の使用を妨げるさらに別の問題は、一連の条件下で標的分子と反応することができる一連の適切な活性化されたＰＯＺ分子が入手不可能であるということである。さらに、目下入手可能なＰＯＺ分子は、多官能性であるか、標的分子に共役する際に、加水分解に不安定な結合を含んで、それに関連する不都合を有し、または、開始反応中に活性置換基を加えて、それに関連する不都合を有する。さらに、ペンダント官能基が説明されているが、これらの誘導体は多官能性であり、現在の用途には適さない。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】２−アルキル−２−オキサゾリン（例えば、２−エチル−２−オキサゾリン）重合のリビング陽イオン機構の説明図であり、−ＯＴｆは−ＯＳＯ２−ＣＦ３または「トリフラート」およびＮｕｃは陰性の求核試薬である。
【図２Ａ】従来技術の方法によって調製されたＭ−ＰＥＯＺ−ＯＨ２０００のゲル浸透クロマトグラムを示す図である。
【図２Ｂ】従来技術の方法によって調製されたＭ−ＰＥＯＺ−ＯＨ２０００のゲル浸透クロマトグラムを示す図である。
【図３】ポリオキサゾリン誘導体の重合における、連鎖移動の脱離−二量化機構のしくみを、ここでは２−エチル−２−オキサゾリンとして示す図である。
【図４Ａ】本発明の最適化条件によって調製されたＭ−ＰＥＯＺ−ＯＨ２０００（図４Ａ）およびＭ−ＰＥＯＺ−ＯＨ５０００（図４Ｂ）のゲル浸透クロマトグラムを示す図である。
【図４Ｂ】本発明の最適化条件によって調製されたＭ−ＰＥＯＺ−ＯＨ２０００（図４Ａ）およびＭ−ＰＥＯＺ−ＯＨ５０００（図４Ｂ）のゲル浸透クロマトグラムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
本開示は、広範囲な標的分子に対して多様な反応条件下において一官能性ＰＯＺ誘導体の共役を可能にし、加水分解に安定な標的分子−ＰＯＺ複合体を産生する一連の活性基を有する、１個の標的分子がＰＯＺ誘導体に結合する、一官能性ＰＯＺ誘導体を提供する。異なる反応条件下において、標的分子上の選択される基と反応することができる一連の活性基を持つ一官能性ＰＯＺ誘導体を産生することができる能力は、従来技術に著しい利益を提供する。それは、異なる標的分子は異なる反応条件に敏感であり、ＰＯＺ誘導体の標的分子への共役の最も効率のよい反応条件は、しばしば標的分子およびＰＯＺ誘導体と反応する標的分子の基の性質によってさまざまであるからである。
【００５４】
本開示は、当技術分野で既知でない一連のＰＯＺ誘導体を提供することにより、前述のＰＯＺ重合体の制限に対処する。また、本開示は、当技術分野で既知でない一官能性ＰＯＺ誘導体を提供する。さらに、本開示は、その停止末端に活性官能基を有する一官能性ＰＯＺ誘導体を提供する。またさらに、本開示は、すぐに入手可能で周知の調製化学を使用して得られるヒドロキシル基等（必ずしもこれに限定されない）の停止末端基とともにＰＯＺ分子を利用する本開示のＰＯＺ誘導体の合成方法を提供することより、従来技術の制限に対処する。それにより、小さい活性分子を利用可能な末端基にカップリングすることによって多種多様なＰＯＺ誘導体が段階的に調製され得、ＰＯＺ誘導体上に所望の活性官能基を（本願に記載のとおり）生成することができる。また、本開示は、記載の一官能性ＰＯＺ誘導体の使用を通じて加水分解に安定な標的分子−ＰＯＺ複合体を提供することにより、従来技術の制限に対処する。かかるアプローチは、１つだけの標的分子が各ＰＯＺ誘導体に結合した標的分子−ＰＯＺ複合体を提供するのみならず、標的分子−ＰＯＺ複合体の生体内半減期を増大させ、標的分子の「ハプテンタギング」に関連する免疫原性の問題を低減する。本開示の一官能性ＰＯＺ誘導体、合成方法および得られる加水分解に安定な標的分子−ＰＯＺ複合体は、当技術分野において理解されていない。
【００５５】
したがって、記載の一官能性ＰＯＺ誘導体および合成方法は、当技術分野に内在する問題を回避し、１個の標的分子がＰＯＺ誘導体に結合する、加水分解に安定な標的分子−ＰＯＺ複合体を産生する機構を提供する。
【００５６】
下記に詳述されるように、ＰＭＯＺならびにＰＥＯＺ等（必ずしもこれに限定されない）のあらゆる２−置換−２−オキサゾリン化合物が本開示のＰＯＺ誘導体の産生に使用され得る。ある実施形態においては、ＰＥＯＺもしくはＰＭＯＺは、２−置換−２−オキサゾリンＰＯＺ分子である。当技術分野で周知のとおり、２−アルキル−２−オキサゾリン分子中の異なるアルキル基は、異なる溶解度、薬物動態および膜透過能力を本願に記載のＰＯＺ誘導体に提供し得る。また、ＰＯＺ重合体骨格における反復単位の性質は同一となり、ホモ重合体（ＰＭＯＺならびにＰＥＯＺ等（必ずしもこれらに限定されない））を生成するか、または反復単位のうちの少なくとも１つが異なって、ランダムまたはブロック共重合体等（必ずしもこれらに限定されない）の共重合体を提供することができる。
【００５７】
さらに、本開示は、低い多分散度（ＰＤ）の値を有し、および連鎖移動等（必ずしもこれらに限定されない）の意図しない副反応によって生成される不純物の量を減少させた、ＰＯＺ重合体を合成する新規の方法を提供する。一実施形態では、本開示は、連鎖移動等（必ずしもこれらに限定されない）の意図しない副反応を最小限にして、ＰＤの値が低く、純度を高めたＰＯＺ重合体の産生を可能にする、新規の方法について記載する。一実施形態では、本開示の方法は、低いＰＤ値および高められたＭＷ値とを持つＰＯＺ誘導体を提供する。さらなる実施形態では、不純物の量を減少させたＰＯＺ重合体が産生される。本開示において提供される新規の方法は、従来技術の方法の改良であって、多種多様な標的分子の修飾における使用に適するＰＯＺ重合体の大規模な商業用の調製を提供する。
【００５８】
したがって、本開示はまた、製薬の用途における使用に適する、より高い純度の、ＰＤ値の低いＰＯＺ重合体を提供する。当技術分野で周知のとおり、ＰＤ値はＭＷと共に変化し、概して分子量が増加するとＰＤ値もまた増加する。本開示の方法を使用すると、従来技術の商業的に適用可能な方法を使用して産生され得るよりも、所与のＭＷにおいてより低いＰＤ値を有する、商用規模の、種々のＭＷのＰＯＺ重合体が産生され得る。例えば、本開示の方法を使用すると、２０、０００Ｄａ以下のＭＷを持つＰＯＺ誘導体が、ＰＤ値１．１以下で産生され得る。さらに特定の実施形態では、前述のものが不純物を低減させて産生される。当技術分野で周知のとおり、ならびに本願の実施例において説明されるとおり、従来技術の方法を使用して合成されるＰＯＺ誘導体は、ＧＰＣトレースにおいて高いＭＷのショルダおよび低いＭＷとして見られる特定の不純物を示す。これらの不純物は、少なくとも部分的に、連鎖移動等（必ずしもこれらに限定されない）の意図しない副反応を通じて生成される。その結果、本開示のＰＯＺ誘導体は、多種多様な標的分子の修飾における使用に適する。
【００５９】
本願に記載の方法の使用により、異なる活性官能基を持つ一連の一官能性ＰＯＺ誘導体が提供される。さらに、本開示は、かかる一官能性ＰＯＺ誘導体を効果的な手法で産生する合成方法を提供する。最後に、本願に記載の一官能性ＰＯＺ誘導体の使用により、１個の標的分子がＰＯＺ誘導体に結合する、加水分解に安定な標的分子−ＰＯＺ複合体が産生され得る。
【００６０】
低ＰＤ値のＰＯＺ誘導体の合成方法
２−アリール−ならびに２−アルキル−２−オキサゾリンの重合の現行の従来技術は、Ｋｏｂａｙｓｈｉ、Ｎｕｙｋｅｎ  ａｎｄ  Ｊｏｒｄａｎ（Ｓ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ、Ｅ．Ｍａｓｕｄａ、Ｓ．Ｓｈｏｄａ  ａｎｄ  Ｙ．Ｓｈｉｍａｎｏ、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、１９８９、２２、２８７８−２８８４；Ａ．Ｇｒｏｓｓ、Ｇ．Ｍａｉｅｒ  ａｎｄ  Ｏ．Ｎｕｙｋｅｎ、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．、１９９６、１９７、２８１  １−２８２６、およびＦ．Ｃ．Ｇａｅｒｔｎｅｒ、Ｒ．Ｌｕｘｅｎｈｏｆｅｒ、Ｂ．Ｂｌｅｃｈｅｒｔ、Ｒ．Ｊｏｒｄａｎ  ａｎｄ  Ｍ．Ｅｓｓｌｅｒ、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、２００７、１１９、２９１−３００）の公開に由来する。これらの方法において、重合は、アルキルトシレートまたはアルキルトリフラート等の求電子試薬によって開始され、一実施形態では、メチルトシレートもしくはメチルトリフラートが使用される。これらの強力な求電子試薬は、リビングカチオン構造が理論上では末端停止または連鎖移動反応を得ないため、この構造による重合を助けるために使用される（Ｑ．Ｌｉｕ、Ｍ．Ｋｏｎａｓ  ａｎｄ  Ｊ．Ｓ．Ｒｉｆｆｌｅ、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、１９９３、２６、５５７２−５５７６）（図１参照）。しかしながら、連鎖移動反応は発生し、この反応はリビングカチオン構造によって正確に進行しないことが従来技術によって知られている。ハロゲン化アルキル等（必ずしもこれらに限定されない）の弱い求電子試薬が使用される場合、反応は共有結合構造によって進行し、結果としてＰＤの顕著な増加を伴なう。従来技術の重合方法は、クロロベンゼン、ジクロロベンゼンまたはアセトニトリルを溶媒として使用する。生長相は、約８０℃で約１から３日間実施される。炭酸ナトリウム水溶液で８０から９０℃で加熱することによって、ヒドロキシル末端基を与えるか、またはモルホリンもしくはピペリジン等の第２アミンと反応させることにより、末端第３アミンを得ることにより、末端停止が行なわれる。
【００６１】
これらの典型的な従来技術の方法の使用は、ゲル透過クロマトグラフィにおいて、約５から１０％の高いＭＷのショルダおよび著しく低いＭＷテーリングの出現を招く。かかる結果は、当技術分野において知られている（Ｊ．Ｐａｒｋ  ａｎｄ  Ｋ．Ｋａｔａｏｋａ、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２００６、３９、６６２２−６６３０を参照）。文献において、このＭＷ分布の拡大は、脱離−二量化機構を通じた連鎖移動の進行によるものであると概して説明されているが、このプロセスの構造的な詳細および実験上の裏付けは制限されている（Ｍ．Ｌｉｔｔ、Ａ．Ｌｅｖｙ  ａｎｄ  Ｊ．Ｈｅｒｚ、Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．−Ｃｈｅｍ．、１９７５、Ａ９、７０３−７２７）。連鎖移動反応が発生する限り、かかる反応は正確にはリビング重合であると考慮され得ない。したがって、連鎖移動などの意図しない副反応を低減することは有益となる。
【００６２】
出願人らは脱離−二量化機構の詳細を明らかにし、その機構の実験上の裏付けを提供し、末端停止の手順に関する機構の意義を提案した。この後者の進展は、なぜ特定の停止反応が失敗するかを示し、成功する停止反応の選択に導くため、特に重要である。かかる発見は当技術分野において記載されておらず、意図しない副反応の発生を最小限にし、所望の末端停止された生成物を産する合成方法の作成における手引きを提供する。
【００６３】
本願に記載のとおり、従来技術の方法を使用すると、ＰＯＺ生成物の全質量の約５から１０％の高いＭＷのショルダを含むＰＯＺ生成物を産生した。この高いＭＷのショルダは、従来技術の合成方法を使用して得る許容できないＰＤ値の原因となる。従来技術の方法において観察される高いＭＷのショルダは、少なくとも部分的に、重合および／または停止のステップ中に形成される高ＭＷ二量体から構成される（図３参照）。脱離−二量化機構は、末端停止の手順中に連鎖移動が発生した場合、高ＭＷショルダ中の材料は所望の生成物のＭＷの約二倍となることを予見する。さらに、生長の手順中に連鎖移動が発生した場合、新規の重合鎖が開始され、この段階において単量体濃度が低いため、この重合体のＭＷは重合体のバルクよりも低くなる。また、この新規の重合鎖が連鎖移動に起因するため、メチルではなくプロトンによって開始されなければならず、したがってこの重合体のＭＡＬＤＩスペクトルは、主ピークのそれよりも１４Ｄａ低い一連のピークを示すであろう。
【００６４】
今日までに理解されていない末端停止の手順に関しての含意もある。例えば、強塩基であって弱い求核試薬である、末端停止求核試薬の追加は、著しい除去および二量化という結果をもたらすことが予見される。さらに、オキサゾリニウムカチオンは非局在化された、または「ソフトな」求電子試薬であり、理論では「ソフトな」または非局在化された求核試薬は、塩基としてよりも末端停止求核試薬として機能する傾向が強いことを予見する。例として、「ソフトな」メルカプチドのほうが「ハードな」アルコキシドよりもより効率のよい末端停止剤であると予期するであろう。
【００６５】
上記の予見は、実験的に確認された。一例において、立体障害のエチルジイソプロピルアミン（強塩基、弱求核試薬）が２−エチル−２−オキサゾリン重合の末端停止のために加えられた。この反応は、高ＭＷ二量体生成物の７５％への増加（実施例３参照）という結果となった。ＧＰＣにおける不純物のＭＷのピークは、所望の生成物のＭＷの約２倍であることが確認された。また、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルは、主ピークの一部分が、予期したよりも１４質量単位少ない第２の一連のピークを示したことを確認した。我々は、ＭＷのこの第２の一連のピークは、所望の生成物の２倍よりやや下回ることを認めた。おそらくこれは、重合体が完全に形成され、モノマーが失われる前の生長相の間にいくつかの連鎖移動が行われるために発生し、この場合、生長中に存在する最も強い塩基であるため、その塩基はモノマーでなければならない。
【００６６】
また、ハードな求核試薬として知られるアルコキシドによる末端停止は、所望の求核攻撃からの生成物を伴なわず、著しい量の高ＭＷ二量体をもたらす（実施例５参照）。また、ソフトな求核試薬として知られるメルカプチドによる末端停止は、予見されるとおり、求核攻撃の所望の生成物をもたらす（実施例１１参照）。
【００６７】
前述の観察の結果として、出願人らは、連鎖移動等の意図しない副反応を低減し、従来技術と比較して優れた特性を持つＰＯＺ重合体ならびに誘導体の生成を可能にする新規の合成方法を開発した。この改良された方法は、以下の改良の１つ以上を利用することができる。
【００６８】
一実施形態では、ＰＯＺ重合反応はアルキルトシレートもしくはアルキルトリフラート等（必ずしもこれらに限定されない）の強求電子試薬で開始され、一実施形態では、メチルトシレートもしくはメチルトリフラートが使用される。
【００６９】
脱離−二量化機構はまた、二分子除去は高温によって促進されるため、成長および停止が双方とも低い温度で実施されるべきであることを示唆する。実施例は、高ＭＷ二量体の形成が、生長ならびに停止の双方の温度を下げることによって抑制されるということを示すことにより、この観察を確認する。この予見はまた、Ｋａｔａｏｋａ（Ｊ．Ｐａｒｋ  ａｎｄ  Ｋ．Ｋａｔａｏｋａ、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２００６、３９、６６２２−６６３０参照）によって確認されている。しかしながら、すべての連鎖移動を排除するために十分なほどに温度を下げると、反応の完了に到達するまでに数週間を要し得、ゆえにかかる反応は商業的に実行可能でない。本開示は、以下に商業的に実行可能な方法を記載する。生長の完了またはほぼ完了後に加熱を継続することが、除去−二量化の蓄積を引き起こすことを観察した。本開示は、重合を現行技術の方法よりもずっと早期におよび低い温度で停止させることにより、ＰＯＺ誘導体の質が大いに改善されることを意外にも発見した。また、生長反応の長さは、モノマー消費の完了または実質的な完了（９０％以上）のために必要な最小限の時間である。温度および生長反応の長さは相関することに留意されたい。換言すれば、より短い生長反応時間にはより高い生長温度が使用され得る。反対に、より長い生長反応時間が使用される場合、温度はそれに従って低下されなければならない。
【００７０】
クロロベンゼン等（必ずしもこれに限定されない）の溶剤の使用は、一般的に使用されるアセトニトリル溶剤よりもより早い重合を提供することが見出された、これはＰＯＺ生成物の商業的な、大規模な調製には非常に重要である。従来技術はクロロベンゼンを溶剤として認識しているが、反応速度における改善は認識していない。クロロベンゼンを溶剤として使用した予期せぬ結果は、高ＭＷ二量体生成物の形成を増加させることなく、重合反応のより早期およびより高い温度での停止を可能にするより早い反応時間を提供する。かかる改良は、当技術分野で理解されていなかった。
【００７１】
さらに、ＰＯＺ生成物、特にＯＨ基で末端停止されたもののカチオン交換樹脂を通じた濾過は、ＰＤ値を改善する。かかる濾過は低ＭＷおよび高ＭＷ生成物を除去すると考えられる。濾過の効果は、より大きい分子量ＰＯＺの生成物に特に顕著であり（例えば、１０、０００Ｄａ以上の生成物）。しかしながら、濾過はＭＷに関わらずＰＯＺ誘導体に利益を提供する。この改良の一例を挙げると、未濾過Ｍ−ＰＥＯＺ−ＯＨ１０、０００（本開示の方法によって産生）は、著しく低いＭＷテールのＭｎ７９５０ＤａおよびＰＤ１．２１（ＧＰＣ）を示した。この生成物のカルボキシエチル−セファロースによる濾過では、観察可能な低ＭＷテーリングはなく、わずか２％の高ＭＷショルダ（ＧＰＣで測定）があり、Ｍｎ９１８０ＤａおよびＰＤ１．０５（ＧＰＣより）ならびにＭｎ９７８０およびＰＤ１．０１（ＭＡＬＤＩより）を得た。高ＭＷショルダが粗生成物に対して示されなかった事実は、カチオン交換濾過が高ＭＷおよび低ＭＷの双方の不純物を除去することを示す。
【００７２】
さらに、特定の場合において、ＰＯＺ生成物は末端基としてカルボン酸を含む場合、アニオン交換クロマトグラフィを、所望の生成物を単離し、形成されるあらゆる高分子生成物を除去するために使用することができる。我々は、この実験をＭ−ＰＥＯＺ−Ｓ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ２Ｈに対して実施した。クロマトグラフィ実験が高ＭＷ二量体は中性であると示したことに留意すべきである。それゆえに、主要な二量化生成物は図３のアルケンであると思われる。この実験において、粗生成物は９６００ＤａのＭｎ、１．０９（ＧＰＣ）のＰＤおよび６％の高ＭＷショルダを有した。ＤＥＡＥ−セファロースのアニオン交換クロマトグラフィ後、Ｍｎは９５００Ｄａ、ＰＤは１．０６（ＧＰＣ）であり、高ＭＷショルダは見られなかった。
【００７３】
追加の実施形態において、停止反応が低い温度（一実施形態では８０℃未満、代替の実施形態では１５から４０℃）で、塩基としてよりも、よりよい求核試薬の性質を示す求核試薬を用いて実施された。例示的な求核試薬は、メルカプチド等のソフトな求核試薬を含むがこれらに限定されない。出願人らは、アルコキシドナトリウム化合物の末端停止剤としての使用が、所望の生成物を産生せず、停止されないカチオンが残ったことを見出した。しかしながら、メルカプチドナトリウムおよびＮａＳ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ２Ｅｔ等（必ずしもこれらに限定されない）の関連する化合物を使用して、効果的な末端停止を得、低ＰＤ値等（必ずしもこれに限定されない）の所望の特性を持つＰＯＺ生成物を得た。このエーテルのカルボン酸への加水分解、続いてアニオン交換クロマトグラフィで、低ＰＤ値をもち高ＭＷショルダのない高品質のＰＯＺ生成物を得た。かかる一実施例では、Ｍｎが９６００Ｄａ、ＰＤが１．０９（ＧＰＣ）、およびショルダが６％のＭ−ＰＥＯＺ−Ｓ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ２Ｈが産生された。ＤＥＡＥ−セファロースのアニオン交換クロマトグラフィでは、Ｍｎが９５００、ＰＤが１．０６（ＧＰＣ）で、ショルダピークなしであった。
【００７４】
合成におけるこの新規の改良は、本願に記載のＰＯＺ重合体ならびに誘導体の調製において利用される。当業者には明白であるように、この合成における改良は、種々の組み合わせで使用され得、上記は所定の合成において各改良が使用される必要があるものと解釈すべきではない。
【００７５】
Ｍ−ＰＥＯＺ−ＯＨ２０００の合成には従来技術の方法のうちの２つの方法が使用された。これらのＰＯＺ誘導体の合成の説明は、実施例１（図２Ａ）ならびに実施形態２（図２Ｂ）で提供される。産生したＰＯＺ誘導体を分析した。図２ＡのＰＯＺ誘導体についてＧＰＣはかなりの高ＭＷショルダ（Ｍｎ＝３６００Ｄａ、９％）を持つ単一のピークを示した。主ピークのＭｎは１９８０Ｄａ、ＰＤは１．０８であった。ＮＭＲは予期されたピークを示した（実施例６参照）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳでは、最大２０００Ｄａ、ＰＤ１．０４および９９．１Ｄａ分離の一連のピークを得た。ＭＡＬＤＩスペクトルはまた、９９．１Ｄａ分離の第２の一連のピークを示したが、その各ピークは、主の一連のものより１４Ｄａ低かった。これらの一連のピークは、１６００Ｄａで最大であった。図２ＢのＰＯＺ誘導体について、ＧＰＣはかなりの高ＭＷショルダ（Ｍｎ＝３３００Ｄａ、６％）を持つ単一のピークを示した。主ピークのＭｎは２２００Ｄａ、ＰＤは１．０６であった。ＮＭＲは予期されたピークを示した（実施例６参照）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳでは、最大２３００Ｄａ、９９．１Ｄａ分離の一連のピークを得た。ＭＡＬＤＩスペクトルはまた、９９．１Ｄａ分離の第２の一連のピークを示したが、その各ピークは、主の一連のものより１４Ｄａ低かった。これらの一連のピークは、２１００Ｄａで最大であった。
【００７６】
本開示の方法は、比較のため２つのＰＯＺ誘導体、Ｍ−ＰＥＯＺ−ＯＨ２０００（図４Ａ）ならびにＭ−ＰＥＯＺ−ＯＨ５０００（図４Ｂ）合成に使用された。これらのＰＯＺ誘導体の合成の説明は、実施例６（図３Ａ）ならびに実施例７（図４Ｂ）に提供されている。ＧＰＣクロマトグラムは図４Ａおよび図４Ｂに提供されている。図４Ａおよび図４Ｂは、本開示の合成方法を使用して得られた、大いに改良されたＭ−ＰＥＯＺ−ＯＨ２０００ならびに５０００のＧＰＣを示す。Ｍ−ＰＥＯＺ２０００について、反応条件は（ａ）メチルトリフラートによる開始、クロロベンゼン中で１１０℃、１．５時間の生長、および室温で炭酸塩溶液による停止であった。Ｍｎが１９００Ｄａ（ＭＡＬＤＩおよびＧＰＣより）、ＰＤが１．０７（ＧＰＣ）および１．０３（ＭＡＬＤＩ）であって、高ＭＷショルダならびに低ＭＷテールのないＭ−ＰＥＯＺ２０００誘導体が観察された。Ｍ−ＰＥＯＺ−ＯＨ５０００については、反応条件は（ａ）メチルトリフラートで開始、クロロベンゼン中で４２℃で１時間、次に８０℃で３．７５時間の生長、および室温で炭酸塩溶液での停止であった。Ｍｎが４９００Ｄａ（ＭＡＬＤＩより）、ＰＤが１．０６（ＧＰＣ）および１．０２（ＭＡＬＤＩ）であり、非常にわずかな高ＭＷショルダ（１％）があり、低ＭＷテールのないＭ−ＰＥＯＺ５０００誘導体が観察された。同様の条件下で調製されたＭ−ＰＥＯＺ−ＯＨ１０、０００は、Ｍｎが９７８０Ｄａ（ＭＡＬＤＩ）、ＰＤが１．０１（ＭＡＬＤＩ）および１．０５（ＧＰＣ）であり、非常にわずかな２％の高ＭＷショルダがあった。
【００７７】
要約すると、本開示の出願人らは、従来技術の合成方法を使用した場合に発生する意図しない副反応の性質を同定し、これにより出願人らはかかる副反応の効果を最小限にする反応条件を同定することが可能となった。その結果、本開示の方法は、当技術分野で利用可能なものよりも優れた特性を持つＰＯＺ重合体ならびに誘導体の調製を可能にする。一実施形態では、本開示の方法は低ＰＤ値を持つＰＯＺ重合体ならびに誘導体の調製を可能にし、特定の実施形態では、本開示の方法は高ＭＷ値で低ＰＤ値を持つＰＯＺ重合体ならびに誘導体調製を可能にする。また、本開示の方法は、大規模な生成に適した手法で上記のものを生成することを可能にする。かかる性質を持つかかるＰＯＺ重合体ならびに誘導体、およびこれらを産生する方法は、当技術分野において欠如していた。
【００７８】
一実施形態では、本開示の方法は、ＰＯＺ重合体の合成において、ＰＯＺ合成の開始、重合または末端停止プロセス中に発生する１つ以上の副反応の、完全なまたは部分的な低減を提供することにより、かかる利益を提供する。特定の実施形態では、副反応は連鎖移動プロセスである。連鎖移動プロセス等（必ずしもこれらに限定されない）のかかる意図しない副反応は、ＰＯＺ生成物の製造の現行の従来技術手順における問題である。かかる副反応は、高ＰＤ値等の望ましくない性質を持つＰＯＺ誘導体を提供する。
【００７９】
一官能性ＰＯＺ誘導体の合成方法
本開示は、記載される一官能性ＰＯＺ誘導体を合成する新規の方法を提供する。新規の合成方法は、本願では概してビルディングブロック法と称される。ビルディングブロック法の一実施形態では、１つのステップによる合成方法が開示され、ビルディングブロック法の代替の実施形態では、２つのステップによる方法が開示される。ビルディングブロック法のさらなる代替の実施形態では、リビング重合体合成が説明される。各方法は、以下に詳述される。
【００８０】
ビルディングブロックの１つのステップによる方法
ビルディングブロックのアプローチの第１の実施形態では、１つのステップによる方法が開示される。１つのステップによる方法では、末端が官能基化された単一のＰＯＺ分子と所望の活性基を含む一連の化合物との間の反応を通して、一連の一官能性ＰＯＺ誘導体が単一のステップで生成される。これによると、末端が官能基化された単一のＰＯＺ分子は、一連の活性化された一官能性ＰＯＺ誘導体に変換され得る。このアプローチは、単一の一官能性ＰＯＺ誘導体の生成に、重合化学を最適化することだけを必要とすることを意味する。一連の活性基を提供するこの範囲の反応を可能にするため、ＰＯＺ末端基（下記ではＹ）は注意深く選択される。１つのステップによる方法は、スキーム１中の一般形態として以下のように表され得る。
【００８１】
Ｒ１−ＰＯＺ−Ｙ−＞Ｒ１−ＰＯＺ−Ｐｐ−Ｑｑ−Ｘ            Ｉ
スキーム１
式中、
ＰＯＺは−［Ｎ（ＣＯＲ７）ＣＨ２ＣＨ２］ｎ−であり、
Ｒ７は、置換されていないかまたは置換されているアルキル、アルケニルまたはアラルキル基から各反復単位について独立して選択され、一実施形態では、１個から１２個の炭素を有し、
Ｒ１は、水素、または置換されていないかまたは置換されているアルキル、アルケニルまたはアラルキル基であり、
Ｒ２からＲ４、Ｒ１１およびＲ１４からＲ１５は、それぞれ独立して水素または置換されていないかまたは置換されているアルキル、アルケニルまたはアラルキル基群から選択され、一実施形態では、１個から１０個の炭素を有し、
Ｒ８は、−Ｃ６Ｈ１０−ＣＨ２−（シクロヘキシルメチレン）であり、
Ｒ２３は、置換されていないかまたは置換されているアルキル、アルケニル、アルキニルまたはアラルキル基群であり、一実施形態では、１個から１０個の炭素原子を有し、または置換もしくは置換されていないアリール基であり、
Ｙは、−ＯＨ、−ＳＨ、−Ｓ−（ＣＨ２）ｋ−ＣＯ２Ｈ、ピペラジニル、置換されているピペラジニル、置換されているピペリジニル、または−ＮＨＲ２であり、
Ｐは結合基であり、Ｐはスキーム１に示す結合を形成することができるいかなる基でもあり得、これとともに結合を形成する基の化学的特質によって選択され得、代表的なＰ基には−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＮＲ１１−またはピペラジニル（ＮＣ４Ｈ８Ｎ）等（必ずしもこれらに限定されない）の置換されていないヘテロシクリルを含むがこれらに限定されず、
Ｑは結合基であり、Ｑはスキーム１に示す結合を形成することができるいかなる基でもあり得、これとともに結合を形成する基の化学的特質によって選択され得、代表的なＱ基には、置換されていないかまたは置換されているアルキル、アルケニル、ヘテロシクリルまたはアリール基、−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）ｍ−、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨＣＯ−（ＣＨ２）ｍ、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ−、−ＣＯ−Ｃ６Ｈ４−、または−ＣＯ−Ｒ８、−（Ｒ１５）ｍまたは−（ＣＲ３Ｒ４）ｍを含むがこれらに限定されず、
ｎは、３から１０００までの整数であり、
ｋおよびｍは、１から１０から独立して選択される整数であり、
ｐおよびｑは、０または１から独立して選択される整数であり、
Ｘは、標的分子とともに結合を形成して加水分解に安定な標的分子−ＰＯＺ複合体を産生することができる活性官能基である。
【００８２】
一実施形態では、活性官能基はアルデヒド（−ＣＨＯ）、活性カーボネート（−Ｏ−ＣＯ−Ｚ）、マレイミド、トレシレート（２、２、２−トリフルオロエタンスルホナート）およびメシラート（−０−ＳＯ２−ＣＨ３または−ＯＭｓ）を含むがこれらに限定されないスルホン酸エステル（−ＯＳＯ２−Ｒ２３）、ヒドラジド（−ＣＯＮＨＮＨ２）、エポキシド、ヨードアセトアミド、アルキン、アジド（−Ｎ３）、イソシアネート（−ＯＣＮ）、シアン酸塩（−ＮＣＯ）、イソチオシアン酸塩（−ＳＣＮ）、チオシアン酸塩（−ＮＣＳ）、ニトリル（−ＣＮ）、カルボニルジイミダゾール誘導体、ビニルスルホン、カルボン酸ハロゲン化物、活性エステル（−ＣＯ−Ｚ）およびカルボン酸（−ＣＯ２−Ｈ）の一般的クラスの化合物から選択され、
Ｚは、Ｎ−スクシンイミジルオキシ、塩素、臭素、スルホ−Ｎ−スクシンイミジルオキシ、ｐ−ニトロフェノキシ、１−イミダゾリル、および１−ベンゾトリアゾールイルオキシを含む当技術分野で周知の多くのものがある活性化基である。
【００８３】
活性官能基はまた、当技術分野で周知の方法によって保護された活性官能基を得るために保護され得る。例えば、アセタール［ＣＨ（ＯＲ１４）２］が例示的な保護基であり、これは加水分解されてアルデヒド基を産生することができる。活性官能基は置換されているアルキル基および置換されているおよび置換されていないアルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキルまたはヘテロシクロアルキル基に関連して記載された基で置換され得る。さらに、活性官能基は活性官能基に変換され得る化合物を含む。例えば、Ｘ基は特定の反応条件下（ＰＯＺ誘導体を標的分子に加えるために使用されるもの等）において加水分解しやすい結合で修飾される化合物を含み得、これにより結合を開裂し、活性官能基を曝露して標的分子上の基と反応させる。
【００８４】
スキーム１において、反応物Ｒ１−ＰＯＺ−Ｙは、ＰＯＺの重合の直接生成物であり、Ｙ基は直接、加水分解に安定な標的分子−ＰＯＺ複合体を形成することができる一連の一官能性ＰＯＺ誘導体に変換されることができる。例えば、一実施形態では、Ｙは−ＯＨに等しく、ＰＯＺ重合反応が水酸化物で末端停止されたときに得られる。代替の実施形態では、Ｙは−ＮＨＲ２に等しく、ＰＯＺ重合反応がアミノ基、Ｒ２ＮＨ２を含む化合物で末端停止されたときに得られる。他の有用なＹ基を提供する有用なアミン末端停止剤は、ピペラジンまたは１−ピペラジンプロパノール（Ｈ−ＮＣ４Ｈ８Ｎ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ）等の置換されているピペラジンである。置換されているピペリジンもまたアミンに有用なすばやい末端停止を提供するために有用であり、これらはまた種々の官能基を導入する。市販の置換されているピペリジンは、４−ピペリジン酪酸、３−ピペリジンカルボン酸および４−ピペリジンメタノールを含む。代替の実施形態では、Ｙは−Ｓ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ２Ｈに等しく、ＰＯＺ重合反応がＳ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ２−ＣＨ３で停止されたときに得られる（続いて加水分解が単離せずに行われる）。
【００８５】
Ｒ１−ＰＯＺ−Ｘ誘導体の１つのステップによる方法による調製を説明する、種々の例示的な反応を以下で説明する。以下に示す反応において、Ｒ１およびＲ７はメチルであり、Ｙは−ＯＨまたは−ＮＨＲ２であって、Ｒ２はＣＨ３である。
【００８６】
【化２】
0005615558.tif 000003
【００８７】
上記の構造はスキーム１の説明の中に見つけられる。例えば、上記の活性カーボネートについて（Ｍ−ＰＭＯＺ−ＯＣＯ２−ＮＨＳ）、Ｒ１およびＲ７はメチル、ｐおよびｑはゼロ、Ｘはスクシニミジル炭酸塩である。上記の活性エステル（Ｍ−ＰＭＯＺ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ２ＮＨＳ）について、Ｒ１およびＲ７はメチル、Ｐは−Ｏ−、ｐは１、Ｑは−ＣＨ２−、ｑは１、Ｘは−ＣＯ２ＮＨＳである。
【００８８】
上に記載の活性基を持つ一官能性ＰＯＺ誘導体は、多くの有益で異なる特性を提供し、標的分子の性質および所望の反応条件に基づいて所望の官能性活性基を持つ特定の一官能性ＰＯＺ誘導体を選択することを可能にする。例えば、官能性活性基がアルデヒドである場合、一官能性ＰＯＺ誘導体は規定のｐＨの範囲で標的分子のＮ−端アミンと主に反応してイミン（典型的にホウ化水素で第２アミンに還元される）を形成する。官能性活性基が活性エステルである場合、一官能性ＰＯＺ誘導体は、標的分子上の非末端リジン基を含むがこれらに限定されないアミンと主に反応する。同様に、官能性活性基が活性カーボネートまたはトレシレートである場合、一官能性ＰＯＺ誘導体はアミンと容易に反応するが、活性エステルおよびアルデヒドと異なる反応条件および選択性を持つ。さらに、官能性活性基がビニルスルホンまたはマレイミドである場合、一官能性ＰＯＺ誘導体はチオールと主に反応するが、反応条件はこれらの基によってそれぞれ異なり、一連の標的分子に適した多様な反応条件を提供する。
【００８９】
重要なことには、上記のスキームを使用して形成された一官能性ＰＯＺ誘導体のそれぞれは、加水分解に安定な標的分子−ＰＯＺ複合体を形成することができる。
【００９０】
ビルディングブロックの２つのステップによる方法
代替的な実施形態では、２つのステップによる合成方法が開示される。２つのステップによる方法の第１のステップにおいて、上に記載の重合によって調製された開始重合体生成物（下記のＲ１−ＰＯＺ−Ｙ）は、所望の化合物と反応してＰＯＺ中間物（下記のＲ１−ＰＯＺ−Ｙ’）を産生する。２つのステップによる方法の第２のステップにおいて、ＰＯＺ中間物は種々の官能性活性基を含む種々の化合物とさらに反応して、加水分解に安定な標的分子−ＰＯＺ複合体を形成することができる一連の一官能性ＰＯＺ誘導体（下記のＲ１−ＰＯＺ−Ｘ）を形成する。２つのステップによる合成方法は、２つの反応のみを使用し、単一の開始重合体生成物（Ｒ１−ＰＯＺ−Ｙ）から開始して、種々の一官能性ＰＯＺ誘導体を提供する長所を供し、したがって、複数の重合体生成物の重合の条件の必要を最小限にする。２つのステップによる方法は、１つのステップによる方法によっては入手できない一官能性ＰＯＺ誘導体を提供する。最も一般的な形態において、ビルディングブロック２つのステップによる方法の転換は下記のスキーム２で説明される。
【００９１】
Ｒ１−ＰＯＺ−Ｙ−＞Ｒ１−ＰＯＺ−Ｙ’−＞Ｒ１−ＰＯＺ−Ｘ          ＩＩ
スキーム２
ビルディングブロック２つのステップによる方法は、下記のとおりスキーム３に詳細な形態で表され得る。スキーム３において、Ｙ’は活性エステルおよび活性カーボネートを含むがこれらに限定されない、官能性求核試薬と反応することができ、Ｔ基で表される活性基である。
ステップ１
Ｒ１−ＰＯＺ−Ｙ−＞Ｒ１−ＰＯＺ−Ｐｐ−Ｑｑ−Ｙ’
ステップ２
Ｒ１−ＰＯＺ−Ｐｐ−Ｑｑ−Ｙ’＋Ｔ−Ｕｕ−Ｘ−＞Ｒ１−ＰＯＺ−Ｐｐ−Ｑｑ−Ｗｗ−Ｕｕ−Ｘ                ＩＩＩ
スキーム３
式中、
Ｒ１からＲ４、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１４からＲ１５、Ｒ２３、ＰＯＺ、Ｐ、Ｑ、ｋ、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、Ｙ、およびＸは、上に説明のとおりであり、
Ｕは結合基であり、Ｕはスキーム３に示す結合を形成することができるいかなる基でもあり得、これとともに結合を形成する基の化学的特質によって選択され得、代表的なＵ基は、−（Ｒ１６）ｏ−、−（ＣＲ５Ｒ６）Ｏ−、−ＮＨ−Ｒ２１−ＮＨＣＯ−Ｒ２２−を含むがこれらに限定されず、
ｏは１から１０の整数であり、
ｗおよびｕは、１または０から独立して選択される整数であり、
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ１６、Ｒ２１およびＲ２２は、それぞれ独立して水素または置換されていないかまたは置換されているアルキル、アルケニルまたはアラルキル基群から選択され、一実施形態では、１個から１０個の炭素原子を有し、
Ｒ１７水素または置換されていないかまたは置換されているアルキル、アルケニルまたはアラルキル基群から選択され、一実施形態では、１個から１０個の炭素原子、または置換されているもしくは置換されていないアリール基を有する。
【００９２】
Ｙ’およびＴは、反応して加水分解に安定である結合Ｗを形成する反応対であり、Ｙ’およびＴ反応対ならびに得られたＷ結合は、表１に示す基および結合から選択される。Ｙ’およびＴ基は、Ｗ結合の性質に影響を与えることなく、反転することができる。
【００９３】
【表１】
0005615558.tif 000004
【００９４】
加水分解に安定なＲ１−ＰＯＺ−Ｐｐ−Ｑｑ−Ｗｗ−Ｕｕ−Ｘ誘導体の調製を説明する例示的な反応を下記で説明する。この反応中、Ｒ１は水素、Ｒ７はメチル、Ｙは−ＯＨ、ｐおよびｑはゼロ、Ｕは−ＣＨ２ＣＨ２−、ｕは１、反応対ＴとＹ’はそれぞれ−ＮＨ２と−Ｏ−ＣＯ２−ＮＨＳであり、これはウレタンＷ結合を形成し、ｗは１、Ｘはアセタール（保護されたアルデヒド）であり、
Ｈ−ＰＭＯＺ−ＯＨ−＞Ｍ−ＰＭＯＺ−Ｏ−ＣＯ２−ＮＨＳ
Ｈ−ＰＭＯＺ−Ｏ−ＣＯ２−ＮＨＳ＋ＮＨ２−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ（ＯＥｔ）２−＞
Ｈ−ＰＭＯＺ−ＯＣＯＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ（ＯＥｔ）２、
加水分解後に、
Ｈ−ＰＭＯＺ−ＯＣＯＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨＯを得る。
【００９５】
スキーム３の別の実施例を下記で説明する。この反応において、Ｒ１およびＲ７はメチル、Ｙは−ＯＨ、Ｐは−Ｏ−、ｐは１、Ｑは−ＣＨ２ＣＨ２−、ｑは１、反応対ＴおよびＹ’はそれぞれ−ＮＨ２および−ＣＯ２Ｈであり、これはアミド（−ＣＯＮＨ）Ｗ結合を形成し、ｗは１、Ｕは−ＣＨ２ＣＨ２−、ｕは１、Ｘはアセタール（保護されたアルデヒド）であり、
Ｍ−ＰＭＯＺ−ＯＨ−＞Ｍ−ＰＭＯＺ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ
Ｍ−ＰＭＯＺ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ＋ＮＨ２−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ（ＯＥｔ）２−＞
Ｍ−ＰＭＯＺ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ（ＯＥｔ）２
加水分解後に、
Ｍ−ＰＭＯＺ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨＯを得る。
【００９６】
上に述べるとおり、スキーム３の活性官能基のそれぞれは、標的分子との反応において独自の長所および特異性を有する。さらに、ＴおよびＹ’基の互いに対する反応性は、ＱおよびＵ基の性質を通じて制御され得る。ＱおよびＵ基のサイズを記載のとおり大きくすることによってＴおよびＹ’および／またはＴおよびＸ基の化学的距離を増大することにより、Ｙ’およびＴ基の反応性は変化する。さらに、活性官能基Ｘの標的分子に対する反応性は、同様に変化され得る。
【００９７】
１つのステップによる方法と同じく、上記の２つのステップによる合成式を使用して形成される一官能性ＰＯＺ誘導体のそれぞれは、加水分解に安定な標的分子−ＰＯＺ複合体を形成することができる。
【００９８】
リビング重合体法
本発明のさらに代替的な実施形態では、オキサゾリン重合を末端停止して、標的分子と反応して加水分解に安定な標的分子−ＰＯＺ複合体を形成することができる一官能性ＰＯＺ誘導体を直接提供するために、小さな反応分子が使用され得る。この方法はリビング重合体法と称される。リビング重合体法は、下記のスキーム４において最も一般的に示され得る。
【００９９】
Ｒ１−ＰＯＺ＋＋Ｎｕｃ−Ｑｑ−Ｘ−＞Ｒ１−ＰＯＺ−Ｃ−Ｑｑ−Ｘ        ＩＶ
スキーム４
式中、
Ｒ１からＲ４、Ｒ７、Ｒ８およびＲ１４からＲ１５、Ｒ２３、ＰＯＺ、Ｑ、ｋ、ｍ、ｎ、ｑ、Ｙ、およびＸ上に記載のとおりであり、
ＰＯＺ＋はオキサゾリン重合中に形成されるカチオン−［Ｎ（ＣＯＲ７）ＣＨ２ＣＨ２］ｎ＋を示し、
Ｒ１９は水素または置換されていないかまたは置換されているアルキル、アルケニルまたはアラルキル基群から選択され、一実施形態では１個から１０個の炭素原子を有し、
Ｎｕｃは、末端カチオン−Ｎ（ＣＯＲ７）ＣＨ２ＣＨ２＋と相互に作用することによってリビングＰＯＺ重合反応を末端停止して加水分解に安定な結合Ｃを形成することが可能な求核試薬であり、Ｎｕｃ基および得られたＣ結合は表２に示す基および結合から選択され得る。
【０１００】
【表２】
0005615558.tif 000005
【０１０１】
Ｒ１−ＰＯＺ−Ｃ−Ｑｑ−Ｘ誘導体の調製を説明する例示的な反応を以下に示す。以下に示す反応において、Ｒ１およびＲ７はメチル、Ｎｕｃは−ＮＨ２、Ｃは−ＮＨ−、Ｑは−ＣＨ２−、ｑは１、Ｘは−ＣＯ２Ｈ（メチルエステルは下記の反応中に加水分解されることに留意）である。
ＣＨ３−ＰＭＯＺ＋＋−Ｓ−ＣＨ２−ＣＯ２ＣＨ３−＞ＣＨ３−ＰＭＯＺ−Ｓ−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ
【０１０２】
当技術分野の示唆に反して、本開示は、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ２−ＣＨ３などのアルコキシドによるカチオン捕捉は、所望の生成物をもたらさないことを示す。
【０１０３】
表２に示すとおり、Ｃ結合は、これらの化合物がＮｕｃ基として使用される場合、ピペラジンおよびピペリジン環状構造に組み込まれる。Ｃ結合の例およびピペラジンおよびピペリジンをＮｕｃ基として使用することによって得られる構造を以下に提供する。
【０１０４】
この反応の一実施形態では、オキサゾリン重合を末端停止するためにメルカプチド化合物が使用される。この方法において、オキサゾリン重合は本願に記載のとおりに開始され、ＰＯＺ重合体の停止末端にオキサゾリニウムカチオンを持つＰＯＺ重合体を形成する。反応は求核メルカプチド分子を反応に加えることによって停止し、これによりリビングＰＯＺ重合を末端停止する。メルカプチド分子は、標的分子の基と反応して加水分解に安定な結合を形成することができる活性官能基（この活性官能基は本願に記載のとおりに保護され得る）を含む。
【０１０５】
この方法の具体的な実施形態において、メルカプチドは構造Ｒ２５Ｓ−Ｄｄ−Ｘ、を有し、式中、
Ｘは上記に定義されるとおりであり、
Ｒ２５は金属であり、一実施形態ではＲ２５はＬｉ、Ｎａ、またはＫであり、
Ｄは置換されていないかまたは置換されているアルキル、アルケニル、ヘテロシクリルまたはアリール基、−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）ｂ−、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｂ−ＮＨＣＯ−（ＣＨ２）ｂ、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｂ−、−ＣＯ−Ｃ６Ｈ４−、または−ＣＯ−Ｒ２６または−（ＣＲ２７Ｒ２８）ｂを含むがこれらに限定されない結合基であり、  Ｒ２７およびＲ２８は、それぞれ独立して水素または置換されていないかまたは置換されているアルキル、アルケニルまたはアラルキル基群から選択され、一実施形態では１個から１０個の炭素を有し
Ｒ２６は−Ｃ６Ｈ１０−ＣＨ２−（シクロヘキシルメチレン）であり、
ｄは０または１であり、
ｂは１から１０の整数である。
【０１０６】
一実施形態では、活性官能基は、保護された官能基または活性官能基に変換され得る化合物である。上で説明されるとおり、活性官能基のそれぞれは、標的分子との反応において独自の長所ならびに特異性を有する。上記と同様に、上記の合成式を使用して形成された一官能性ＰＯＺ誘導体のそれぞれは、加水分解に安定な標的分子−ＰＯＺ複合体を形成することができる。
【０１０７】
特定のＰＯＺ誘導体
本開示は、上に記載の方法によって調製され得るさまざまな一官能性ＰＯＺ誘導体について記載する。さらに、本開示は、本開示の一官能性ＰＯＺ誘導体の合成において有用な多くの化合物について記載する。
【０１０８】
一実施形態では、一官能性ＰＯＺ誘導体は一般式（Ｉ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）で説明される。
【０１０９】
Ｒ１−ＰＯＺ−Ｐｐ−Ｑｑ−Ｘ                              （Ｉ）
Ｒ１−ＰＯＺ−Ｐｐ−Ｑｑ−Ｗｗ−Ｕｕ−Ｘ                    （ＩＩＩ）
Ｒ１−ＰＯＺ−Ｃ−Ｑｑ−Ｘ                                （ＩＶ）
一般式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の定義は、スキーム１からスキーム４を参照して上記に提供されるとおりである。
【０１１０】
また、本開示の一官能性ＰＯＺ誘導体の多くの特定の構造を下記に提供する。これらの構造は例示的な目的のみのために列挙され、本願に記載の一官能性ＰＯＺ誘導体の範囲を制限することを意図するものではない。上記と同様、以下を参照すると、上記のスキーム１からスキーム４に提供される定義は、以下の構造に適用可能であり、以下の定義も当てはまるものに適用される。また、以下に提供されるすべての構造について、Ｒ１基は開始剤基（ＰＯＺ基の左）の位置に含まれるものと理解される。
【０１１１】
Ｒ９は、−（Ｒ１６）ｏ−または−ＮＨ−Ｒ２１−ＮＨＣＯ−Ｒ２２−などの結合部分であり、
Ｇは、フルオロアルキル基等（必ずしもこれらに限定されない）の置換されていないかまたは置換されているアリール基または置換もしくは置換されていないアルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり、
Ａｒは置換されていないアリールまたは置換されているアリール基である。
【０１１２】
一実施形態では、本開示は、１つのステップのビルディングブロックによる方法によって作られる一官能性ＰＯＺ誘導体を提供する。この手段によって生成される例示的な構造は、以下の構造を含むがこれらに限定されない。
ＰＯＺ−Ｐ−（ＣＲ３Ｒ４）ｍ−ＣＨ（ＯＲ１４）２
ＰＯＺ−Ｐ−（ＣＲ３Ｒ４）ｍ−ＣＨＯおよびＰＯＺ−ＮＨＣＯ−Ｃ６Ｈ４−ＣＨＯ
ＰＯＺ−Ｐ−（ＣＲ３Ｒ４）ｍ−ＣＯ２Ｈ
ＰＯＺ−Ｐ−（ＣＲ３Ｒ４）ｍ−ＣＯ−Ｚ
ＰＯＺ−Ｐ−（ＣＲ３Ｒ４）ｍ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ２
ＰＯＺ−Ｏ２Ｃ−Ｏ−Ｚ
ＰＯＺ−Ｏ−ＳＯ２−Ｇ
【０１１３】
【化３】
0005615558.tif 000006
ＰＯＺ−Ｐ−ＣＨ２ＣＨ２−ＳＯ２−ＣＨ＝ＣＨ２およびＰＯＺ−ＮＨＣＯ−Ｃ６Ｈ４−ＳＯ２−ＣＨ＝ＣＨ２
ＰＯＺ−ＮＨ−ＣＯ−Ｃ６Ｈ４−ＮＨＣＯ−ＣＨ２−Ｉ
ＰＯＺ−Ｐ−（ＣＲ３Ｒ４）ｎ−ＣＣＨ
【０１１４】
別の実施形態では、本開示は、ＰＯＺスルホン酸エステル（ＰＯＺ−ＯＨに由来する中間物）上の求核置換を使用してビルディングブロック２つのステップによる方法によって作られる一官能性ＰＯＺ誘導体を提供する。
ＰＯＺ−Ｎ３
ＰＯＺ−Ｐ−（ＣＲ３Ｒ４）ｎ−ＣＨ（ＯＲ１４）２
ＰＯＺ−Ｐ−（ＣＲ３Ｒ４）ｎ−ＣＨＯ
ＰＯＺ−ＯＣＮ
ＰＯＺ−ＳＣＮ
ＰＯＺ−ＣＮ
ＰＯＺ−Ｐ−（ＣＲ３Ｒ４）Ｈ−ＣＣＨ
ＰＯＺ−Ｐ−（ＣＲ３Ｒ４）ｎ−ＣＯ２ＨおよびＰＯＺ−Ｐ−（ＣＲ３Ｒ４）ｎ−ＣＯ−Ｚ
ＰＯＺ−Ｐ−Ａｒ−ＣＯ２ＨおよびＰＯＺ−Ｐ−Ａｒ−ＣＯ−Ｚ
【０１１５】
別の実施形態では、本開示は、ＰＯＺ活性カーボネート（ＰＯＺ−ＯＨに由来する中間物）上の求核置換を利用した２つのステップのビルディングブロックによる方法によって作製される一官能性ＰＯＺ誘導体を提供する。
【０１１６】
【化４】
0005615558.tif 000007
ＰＯＺ−ＯＣＯＮＨ−（ＣＲ３Ｒ４）ｎ−ＣＯ２Ｈ
ＰＯＺ−ＯＣＯＮＨ−（ＣＲ３Ｒ４）ｎ−ＣＯ−Ｚ
ＰＯＺ−ＯＣＯＮＨ−Ｃ６Ｈ４−ＣＨＯ
【０１１７】
別の実施形態では、本開示は、上記のうちの任意の活性エステル上の求核置換によって作られたマレイミドを組み込む一官能性ＰＯＺ誘導体を提供する。
【０１１８】
【化５】
0005615558.tif 000008
式中、
ＰＯＺ−Ｌ−ＣＯ−は、本願に記載の任意の活性カルボン酸エステルに由来し、
Ｌは、ＰＯＺをカルボキシル基に結合し、−Ｐ−（ＣＲ３Ｒ３）ｍ−、−Ｐ−Ａｒ−およびピジリニウム−ＮＣ５Ｈ４＋−を含む、上記に示す任意の結合部分である。
【０１１９】
これらのマレイミドは、上記のＰＯＺ−Ｐｐ−Ｑｑ−Ｗｗ−Ｕｕ−Ｘ式に適合すると理解され得、ＬはＰｐ−Ｑｑセグメントから成り、−ＣＯＮＨ−はＷｗセグメントから成り、Ｒ９はＵｕセグメントから成る。
【０１２０】
別の実施形態では、本開示は、２−アルキル−２−オキサゾリンの重合中に生成されるＰＯＺカチオン上の求核攻撃を利用した、リビングカチオン方法によって作られるＰＯＺ誘導体を提供する。
ＰＯＺ−Ｐ−（ＣＲ３Ｒ４）ｎ−ＣＯ２Ｈ
ＰＯＺ−Ｐ−Ａｒ−ＣＯ２ＨおよびＰＯＺ−Ｐ−Ａｒ−ＣＯ−Ｚ
【０１２１】
【化６】
0005615558.tif 000009
【０１２２】
上記のすべてのＰＯＺ誘導体は、標的分子上の基と反応して、標的分子とＰＯ誘導体との間に加水分解に安定な結合を形成する。
【０１２３】
ピペリジンまたはピペラジンによる特定のＰＯＺ誘導体
本願に説明されるように、リビングＰＯＺカチオンは、置換もしくは置換されていないピペリジンまたはピペラジンまたは前述のものの誘導体によって末端停止され得る。置換は、置換されているアルキルおよび置換および置換されていないアルキル、アルケニル、アラルキルまたはヘテロシクロアルキルに関連して記載される基を含むがこれらに限定されない。これらのＰＯＺ誘導体は、スキーム４中でＣと表される結合基が、ピペリジンまたはピペラジン環構造の一部であるため、上記のスキーム１からスキーム４で説明することが困難である。例えば、ＰＯＺカチオンは４−ピペリジンメタノールに捕捉されてＰＯＺアルコールを得、４−ピペリジン酪酸に捕捉されてＰＯＺカルボン酸を得、またはピペラジン自身に捕捉されてＰＯＺアミンを得る。
【０１２４】
【化７】
0005615558.tif 000010
【０１２５】
かかるピペリジンおよびピペラジンによる末端停止は、強力な窒素求核試薬は迅速で問題のない末端停止を行って末端官能性活性基を導入するので有用である。１−ピペラジンプロパノール、４−ピペリジン酪酸、３−ピペリジンカルボン酸および４−ピペリジンメタノールを含む、少なくとも４つのピペリジンおよびピペラジン誘導体が市販されており、その他のものも容易に合成され得る。
【０１２６】
ＰＯＺアルコール、酸またはアミンから調製される、上に記載のいかなるＰＯＺ誘導体も、かかるピペリジン、または窒素を含む環がアルコール、酸またはアミンを提供するピペラジンから調製され得ることを理解されたい。例えば、下の化合物は４−ピペリジンメタノールで末端停止された上記のＰＯＺから調製することができる。
【０１２７】
【化８】
0005615558.tif 000011
【０１２８】
これらの化合物は、次いで、アセタール、マレイミドおよび活性エステルを含む種々の有用な誘導体に変換され得る。
【０１２９】
【化９】
0005615558.tif 000012
【０１３０】
ＰＯＺ誘導体の使用
記載の一官能性ＰＯＺ誘導体は、官能性活性基を介して、加水分解に安定な標的分子−ＰＯＺ複合体を産生するために使用され得る。また、本願に記載の一官能性ＰＯＺ誘導体を使用すると、１つの標的分子は各ＰＯＺ誘導体によって結合される。換言すると、１つの標的分子しか各ＰＯＺ誘導体に結合しない。一官能性ＰＯＺ誘導体に存在する官能性活性基の多様性は、一官能性ＰＯＺ誘導体が、さまざまな反応化学を使用して標的分子上の種々の基にカップリングされることを可能にする。例えば、官能性活性基がアルデヒドである場合、一官能性ＰＯＺ誘導体は主に標的タンパク質分子のＮ−端アミンと規定のｐＨ範囲内で．反応する。官能性活性基が活性エステルである場合、一官能性ＰＯＺ誘導体は、標的分子上のリジン基を含むがこれらに限定されないアミンと主に反応する。同様に、官能性活性が活性カーボネートまたはトレシレートである場合、一官能性ＰＯＺ誘導体はアミンと反応するが、反応条件および選択性は活性エステルおよびアルデヒドとは異なる。さらに、官能性活性基がビニルスルホン、マレイミドまたはヨードアセトアミドである場合、一官能性ＰＯＺ誘導体は主にチオールと反応するが、反応条件はこれらの各基によって異なり、種々の標的分子に適した種々の反応条件を提供する。
【０１３１】
重要なことには、上記の合成式を使用して形成される一官能性ＰＯＺ誘導体のそれぞれは、加水分解に安定な標的分子−ＰＯＺ複合体を形成することができる。
【０１３２】
一実施形態では、標的分子はタンパク質等（必ずしもこれらに限定されない）のポリペプチドである。例えば、一官能性ＰＯＺ誘導体は、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）等（必ずしもこれらに限定されない）の治療的に重要なタンパク質にカップリングされ得る。この例示的な反応を、次の反応によって下に概略的に説明する。
Ｍ−ＰＯＺ−ＯＣＯ−Ｏ−ＮＨＳ＋ＧＣＳＦ−ＮＨ２−＞
Ｍ−ＰＯＺ−ＯＣＯＮＨ−ＧＣＳＦ
この実施形態では、ＧＣＳＦ上に見られるアミンは、利用可能ないくつかのリジン基のうちの１つを示す。
【０１３３】
同様にＧＣＳＦは利用可能なチオール基を含み、適正な条件下で、官能性活性基としてマレイミドを有する一官能性ＰＯＺ誘導体は、このチオール基と反応し得る。
【０１３４】
活性ＰＯＺ誘導体は、ペプチドにもカップリングされ得る。例えば、官能性活性基として活性エステルを有する一官能性ＰＯＺ誘導体は、インスリン上の利用可能なアミノ基にカップリングされ得る。
【０１３５】
Ｍ−ＰＯＺ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ２−ＮＨＳ＋インスリン−ＮＨ２−＞
Ｍ−ＰＯＺ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯＮＨ−インスリン
代替の実施形態では、標的分子は小分子、薬剤または診断用薬である。
【０１３６】
標的分子−ＰＯＺ複合体
本開示は、標的分子と結合を形成して、上に記載のとおり加水分解に安定な標的分子−ＰＯＺ複合体を生成することができる様々な一官能性ＰＯＺ誘導体について記載する。一般的な実施形態では、本開示は、一般式（ＩＶ）を有する加水分解に安定な標的分子−ＰＯＺ複合体
Ａ−Ｂ−ＴＭ                                        （ＩＶ）
を提供し、式中、
Ａは、本願に記載の一官能性ＰＯＺ誘導体であって、ＰＯＺ誘導体の官能性活性基と標的分子上にある結合パートナーとの反応中に除去されるいかなる離脱基も含まず、
ＴＭは、標的分子であり、
Ｂは、本開示の一官能性ＰＯＺ誘導体の官能性活性基と、標的分子上の結合パートナーとの間に形成される加水分解に安定な結合であって、これは加水分解に安定なＢ結合の性質は、一官能性ＰＯＺ誘導体上の活性官能基と、標的分子上の結合パートナーの性質に依存することが理解される。例示的な官能性活性基、結合パートナーおよびＢ結合を以下の表３に提供する。表３に列挙されているものは、網羅的であることを意味せず、本開示の教示を鑑みて他の組み合わせ、および、それにより得られるＢ結合が想定され得る。
【０１３７】
【表３】
0005615558.tif 000013
【実施例】
【０１３８】
試薬
試薬は、ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社またはＡｌｄｒｉｃｈ社より購入し、使用前に蒸留した。クロロベンゼンおよびオキサゾリンは、水酸化カルシウムより蒸留した。ゲル透過クロマトグラフィ（ＧＰＣ）をＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社の機器によって１１００クォータナリポンプとＲＩ検出器を用いて実施した。２つのＰｈｅｎｏｇｅｌ（商標）ＧＰＣカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ製、５μ、５００Ａ°、３００ｘ７．８ｍｍ）をカラムヒーター（６０℃）において順に使用した。移動相は流速ｌｍＬ／分で１００％Ｎ、Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）であった。較正曲線は、ＭＡＬＤＩ（７５０、１Ｋ、２Ｋ、５Ｋおよび１０Ｋ）によって判定される、異なる分子量のＭ−ＰＥＯＺ−ＯＨ試料を用いて作成した。ゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＦＣ）を、同一のシステムで、ＳｈｏｄｅｘＫＷ−８０３カラムを使用して、移動相として１ｍＭのＨＥＰＥＳのｐＨ７．０緩衝液を用いて実施した。２２８ｎｍを監視するためにＵＶ検出器を使用した。ジトラノールをマトリクスとして、Ｂｒｕｋｅｒ社のＭｉｃｒｏｆｌｅｘ（商標）装置を用いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを実施した。ＮＭＲはＶａｒｉａｎ５００ＭＨｚ装置で実施した。
【０１３９】
実施例１．典型的な現行技術のＭ−ＰＥＯＺ−ＯＨ２０００の調製
メチルトリフラート（０．１１３ｍＬ、０．００１ｍｏｌ）をアセトニトリル（３．０ｍＬ、６．７Ｍ）中の２−エチル−２−オキサゾリン（２．０２ｍＬ、０．０２０ｍｏｌ）の溶液に加え、溶液を１０分間攪拌した。反応物を次に８０℃まで加熱し、１８時間攪拌した。炭酸ナトリウム（１．１６７ｇ）および水（１ｍＬ）を加え、得られた混合物を９０℃で一晩加熱した。室温に冷却した後、混合物を塩化メチレン（４０ｍＬ）で希釈し、次に分液漏斗にデカンタした。水（５ｍＬ）および塩水（３ｍＬ）を加えて振とうした。下層を廃棄し、水層を塩化メチレン（２ｘ２０ｍＬ）で２度抽出した。混合された有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、回転蒸発によって濃縮した。この粗油をアセトンに溶解し、ジエチルエーテル（８０ｍＬ）一滴ずつ加えて沈殿させた。得られた粉末を真空で乾燥させた（１．９０ｇ、収率９４％）。
【０１４０】
ＧＰＣでは、感知できる高ＭＷショルダ（Ｍｎ＝３６００Ｄａ、９％）を持つ単一のピークを示した（図２Ａ）。主ピークのＭｎは１９８０Ｄａ、ＰＤは１．１であった。ＮＭＲは、予見されたピーク（実施例６参照）を示した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳでは、最大２０００Ｄａ、ＰＤ１．０４および９９．１Ｄａ分離の一連のピークを得た。ＭＡＬＤＩスペクトルはまた、９９．１Ｄａ分離の第２の一連のピークを示したが、各ピークは、一連の主ピークより１４Ｄａ低かった。この一連のピークの最大は、１６００Ｄａで発生した。
【０１４１】
実施例２．第２の現行技術のＭ−ＰＥＯＺ−ＯＨ２０００の調製
クロロベンゼン（６．９ｍＬ）、アセトニトリル（２．３ｍＬ）とメチルトリフラート（０．１６４ｍＬ、１．５ｍｍｏｌｅ）を窒素下で、周囲温度で混合した。２−エチル−２−オキサゾリン（３．０５ｍＬ、３．０ｇ、３０ｍｍｏｌｅ）を次にゆっくりと攪拌しながら加えた。混合物を７０℃まで加熱し、８時間．攪拌した。反応混合物を次に氷浴に浸して室温に冷却した。メタノール１ｍＬ中の水酸化カリウム（２ｍｍｏｌ）を加え、混合物を１時間攪拌した。混合物を次に塩化メチレン（４０ｍＬ）で抽出した。塩化メチレン層を分離し、水（総量４０ｍＬ）で３回洗浄した。有機層を乾燥させ、濾過し、回転蒸発によって５ｍＬに濃縮した。生成物をジエチルエーテル（１００ｍＬ）に加えることによって沈殿させ、真空下で乾燥させた（収率０．７ｇ）。
【０１４２】
ＧＰＣでは、感知できる高ＭＷショルダ（Ｍｎ＝３３００Ｄａ、６％）（図２Ｂ）を持つ単一のピークを示した。主ピークのＭｎは２２００Ｄａ、ＰＤは１．０７であった。ＮＭＲは、予見されたピーク（実施例６参照）を示した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳでは、最大２３００Ｄａ、および９９．１Ｄａ分離の一連のピークを得た。ＭＡＬＤＩスペクトルはまた、９９．１Ｄａ分離の第２の一連のピークを示したが、各ピークは、一連の主ピークより１４Ｄａ低かった。この一連のピークの最大は、２１００Ｄａで発生した。
【０１４３】
実施例３．Ｍ−ＰＥＯＺ＋末端停止におけるエチルジイソプロピルアミンの効果
メチルトリフラート（０．０５６６ｍＬ、０．５ｍｍｏｌ）をクロロベンゼン（５ｍＬ、２Ｍ）中の２−エチル−２−オキサゾリン（１．０１ｍＬ、１０．０ｍｍｏｌ）の溶液に室温で加え、溶液を１０分間攪拌した。溶液を次に１１０℃まで加熱し、３０分間攪拌した。溶液を０℃に冷却し、ジイソプロピルエチルアミン（０．２６１ｍＬ、１．５ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を５０℃で１８時間攪拌した。混合物を室温に冷却し、ジエチルエーテル（５０ｍＬ）に一滴ずつ加えると、白色沈殿物を得た。固形物を真空下でほぼ定量的収量に乾燥させた。
【０１４４】
ＧＰＣでは、一方が約２０００Ｄａ（２４％）、もう一方が約３８００Ｄａ（７６％）の２つのピークを示した。ＭＡＬＤＩスペクトルは、高ＭＷおよび低ＭＷ生成物の双方の存在を確認した。
【０１４５】
実施例４．Ｍ−ＰＥＯＺ＋末端停止における２、６−ルチジンの効果
メチルトリフラート（０．０４２４ｍＬ、０．３７５ｍｍｏｌ）をクロロベンゼン（３．７５ｍＬ）中の２−エチル−２−オキサゾリン（０．７５８ｍＬ、７．５ｍｍｏｌ）の溶液に室温で加え、溶液を１０分間攪拌した。溶液を次に１１０℃まで加熱し、３０分間攪拌した。溶液を０℃に冷却し、２、６−ルチジン（０．１７０ｍＬ、１．５ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を５０℃で１８時間攪拌した。混合物を室温に冷却し、ジエチルエーテル（２０ｍＬ）に一滴ずつ加え、白色沈殿物を得た。固形物は真空下でほぼ定量的収量に乾燥させた。
【０１４６】
ＧＰＣでは、一方が約２０００Ｄａ（８９％）、もう一方が約４０００Ｄａ（１１％）の、いくらかの二量化と一致する２つのピークを示した。ＮＭＲスペクトルは、末端停止されていないオキサゾリニウムカチオンの存在と一致する４．２および５．０ｐｐｍでピークを示した。
【０１４７】
実施例５．メチルグリコール酸塩を用いたオキサゾリン重合の試行的末端停止
メチルトリフラート（０．４５３ｍＬ、０．００４ｍｏｌ）をクロロベンゼン（５ｍＬ、２Ｍ）中の２−エチル−２−オキサゾリン（４．０４ｍＬ、０．０４０ｍｏｌ）の溶液に室温で加え、溶液を１０分間攪拌した。溶液を次に１１０℃まで加熱し、３０分間攪拌した。溶液を０℃に冷却し、２、６−ルチジン（０．９２９ｍＬ、０．００８ｍｏｌ）およびメチルグリコール酸塩（０．６０９ｍＬ、０．００８ｍｏｌ）を加え、得られた混合物を室温で１８時間攪拌した。混合物を室温に冷却し、ジエチルエーテル（１５００ｍＬ）に一滴ずつ加えると、白色沈殿物を得た。固形物は真空下でほぼ定量的収量に乾燥させた。
【０１４８】
ＮＭＲは、４．４６および４．９９ｐｐｍでピークを示し、オキサゾリニウムイオンと一致し、グリコール酸塩の重合の末端停止の失敗と一致した。
【０１４９】
実施例６．最適条件化におけるＭ−ＰＥＯＺ−ＯＨ２０００の調製
クロロベンゼン（３０ｍＬ）とＭｅＯＴｆ（３４４μＬ、３．０ｍｍｏｌ）を、室温で窒素下で混合し、クロロベンゼン２０ｍＬ中の２−Ｅｔ−２−Ｏｘ（６．０６ｍＬ、６０ｍｍｏｌ）に加えた。混合物を１１０℃まで加熱しながら３５分間攪拌した。混合物を次に０℃に冷却し、次に水４０ｍＬ中の水溶液炭酸ナトリウム（２．１２ｇ）を加え、一晩攪拌した。混合物を分液漏斗に注ぎ入れ、水４０ｍＬを加えた。最下層を除去し、水層を塩化メチレン（３ｘ６０ｍＬ）で抽出した。混合した有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、回転蒸発によって濃縮した。濃い油状の残留物を塩化メチレン７ｍＬに溶解し、ジエチルエーテル（８０ｍＬ）に０℃で一滴ずつ加えた。この沈殿を繰り返すと、白色粉末４．２ｇ（収率８４％）を提供した。
【０１５０】
ＮＭＲ（Ｖａｒｉａｎ製、５００ＭＨｚ、１０ｍｇ／ｍＬ  ＣＤＣｌ３）では、１．１２ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−）、２．３１ｐｐｍ（小さいｓ）および２．４１ｐｐｍ（大きいｓ）（総面積２Ｈ、ＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−）、および３．４７ｐｐｍ（ｓ、４Ｈ、−ＮＣＨ２ＣＨ２Ｎ−）で通常の骨格ピークを示す。開始メチルのピークは、２．９ｐｐｍ（小）および３．０５ｐｐｍ（大）（ＣＨ３−ＮＣＨ２ＣＨ２）で２つの一重項として出現する。末端メチレン（−ＣＨ２−ＯＨ）は、３．８ｐｐｍ（ｓ）で出現する。ＧＰＣでは、高ＭＷショルダおよび感知できるテーリングのない単一のピークを示した。Ｍｎ＝１９００Ｄａ、多分散度（ＰＤ）＝１．０３（図３Ａ）である。ＭＡＬＤＩでは、Ｍｎ＝１９００Ｄａ、９９．１Ｄａ分離の質量単位でスペクトルを得た。算出されたＰＤは１．０３であった。
ｐ−ニトロフェニル炭酸塩の誘導体化
生成物をｐ−ニトロフェニル炭酸塩に変換し、次に０．２ＮのＮａＯＨ溶液（ｐＨ８）存在下で精製し、加水分解した。ｐ−ニトロフェノール（４００ｎｍのＵＶ吸収、ε＝１８、０００Ｍ−１ｃｍ−１）を測定すると、−ＯＨの置換度９９％を得た。
【０１５１】
実施例７．最適条件化におけるＭ−ＰＥＯＺ−ＯＨ５０００の調製
クロロベンゼン（８０ｍＬ）とＭｅＯＴｆ（３５４μＬ、３．２ｍｍｏｌｅ）を、室温で窒素下で２５０ｍＬの丸底一口フラスコ内で混合した。２−Ｅｔ−２−Ｏｘ（１６．４ｍＬ、１６．０ｇ、１６０ｍｍｏｌ）を攪拌しながらフラスコにゆっくりと加えた。混合物はオキサゾリンを加えると混濁した。混合物を４２℃に加熱し、１時間攪拌した。混合物は温度が上がると透明化した。次に混合物を８０度まで加熱し、３．７５時間攪拌した。混合物は次に氷浴に１５分間浸して室温に冷却した。
【０１５２】
重合を水４０ｍＬと炭酸ナトリウム２ｇを加えることによって停止し、続いて３０分間攪拌した。水層を分離し、有機層を水４０ｍＬと炭酸ナトリウム１ｇで再度抽出し、続いて３０分間攪拌した。水層を分離し、最初の水層と合わせ、混合した水溶液を室温で一晩攪拌した。混濁した水層（約８０ｍＬ）を次にｐＨが６（ｐＨ試験紙）未満になるまで０．５ＭのＨＣｌ（約４０ｍＬ）で酸性化し、透明な溶液を得た。
【０１５３】
重合体を次に塩化メチレン（各回２００ｍＬ）で４回抽出し、混合された有機層を無水硫酸マグネシウムで１時間攪拌しながら乾燥させた。塩化メチレン溶液を真空下で蒸発させ、得られた残留物を無水塩化メチレン２５ｍＬに溶解し、エチルエーテル（室温）２５０ｍＬに一滴ずつ加えて沈殿させた。得られた白色固形物を次に真空オーブンで５０℃で一晩乾燥させた。乾燥させた材料は白色粉末（１４．１ｇ、収率８８％）であった。
【０１５４】
ＮＭＲ（Ｖａｒｉａｎ製、５００ＭＨｚ、１０ｍｇ／ｍＬ  ＣＤＣｌ３）では、１．１２ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−）、２．３１ｐｐｍ（小さいｓ）および２．４１ｐｐｍ（大きいｓ）（総面積２Ｈ、ＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−）、および３．４７ｐｐｍ（ｓ、４Ｈ、−ＮＣＨ２ＣＨ２Ｎ−）で通常の骨格ピークを示す。開始メチルのピークは、２．９ｐｐｍ（小）および３．０５ｐｐｍ（大）（ＣＨ３−ＮＣＨ２ＣＨ２）で２つの一重項として出現する。末端メチレン（−ＣＨ２−ＯＨ）は、３．８ｐｐｍ（ｓ）で出現する。ＧＰＣ  ＧＰＣでは、保持期間１３．５分間で単一のピークを示した。Ｍｎ＝４１００Ｄａ、および多分散度（ＰＤ）＝１．０６である。Ｍｎ（理論）＝４９８０Ｄａである。１２．４分での小さいショルダは、約１％の高いＭＷの不純物を示唆し、Ｍｎ＝８９００Ｄａ（図３Ｂ）である。ＭＡＬＤＩでは、Ｍｎ＝４９１０Ｄａ、９９．１Ｄａ分離の質量単位でスペクトルを得た。ＰＤは１．０２であった。
ｐ−ニトロフェニル炭酸塩の誘導体化  生成物をｐ−ニトロフェニル炭酸塩に変換し、次に精製し、０．２ＮのＮａＯＨ溶液（ｐＨ８）存在下で加水分解した。ｐ−ニトロフェノール（４００ｎｍでＵＶ吸収、ε＝１８、０００Ｍ−１ｃｍ−１）を測定すると、９９％の−ＯＨ置換度を得た。
【０１５５】
実施例８．ＰＯＺｐ−ニトロフェニル炭酸塩の合成
【０１５６】
【化１０】
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【０１５７】
アセトニトリル８０ｍＬ中のＭ−ＰＥＯＺ−ＯＨの溶液（１０．０ｇ、１．０ｍｍｏｌ）を、回転蒸発を使用して濃縮した。残留物を塩化メチレン（４０ｍＬ）に溶解し、ｐ−ニトロフェニルクロロギ酸塩（１．６１ｇ、７．９６ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。ピリジン（０．８０ｍＬ、９．９５ｍｍｏｌ）を、一滴ずつ加え、混合物を室温で３時間攪拌した。混合物を回転蒸発を使用して濃縮し、次にジエチルエーテルに加えると、白色沈殿物を得た。溶剤をデカンタし、沈殿物を真空下で乾燥させた。生成物を弱酸性の水に溶解し、２０分間攪拌し、濾過した。生成物を塩化メチレン中で抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。この溶液を回転蒸発によって濃縮し、ジエチルエーテルに加えて沈殿させた。溶剤をデカンタし、生成物を真空下で乾燥させた。収量８．７ｇであった。ＮＭＲ（Ｖａｒｉａｎ製、５００ＭＨｚ、１０ｍｇ／ｍＬ  ＣＤＣｌ３）では、１．１２ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−）、２．３１ｐｐｍ（小さいｍ）および２．４１ｐｐｍ（大きいｓ）（総面積２Ｈ、ＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−）、３．４７ｐｐｍ（ｓ、４Ｈ、−ＮＣＨ２ＣＨ２Ｎ−）、７．３８ｐｐｍ（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝５．２Ｈｚ）、および８．２９ｐｐｍ（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝５．２Ｈｚ）で通常の骨格ピークを示す。開始メチルのピークは、２．９ｐｐｍ（小）および３．０３ｐｐｍ（大）（ＣＨ３−ＮＣＨ２ＣＨ２）で２つの一重項として出現する。末端メチレン（−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−）は、４．４２ｐｐｍ（ｓ）．で出現する。
ｐ−ニトロフェニル炭酸塩の置換  生成物を０．２ＮのＮａＯＨ溶液存在下で加水分解した。遊離ｐ−ニトロフェノール（４００ｎｍでＵＶ吸収、ε＝１７、０００Ｍ−１ｃｍ−１）を測定すると、１００％の−ＯＨ置換度を得た。
【０１５８】
実施例９．Ｍ−ＰＥＯＺアミンの合成
【０１５９】
【化１１】
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【０１６０】
塩化メチレン（２０ｍＬ）中のＭ−ＰＥＯＺ−ＰＮＰＣの溶液（３．６０ｇ、０．６９４ｍｍｏｌ）を０℃に冷却し、エチレンジアミン（２．３３ｍＬ、３４．７ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液をその低温で１時間、次に室温で１８時間攪拌した。混合物を回転蒸発を使用して濃縮し、ｎ−ブチルアルコール（２０ｍＬ）を加えて希釈し、このアルコールを次に回転蒸発によって除去した（ジアミンを共沸的に除去するため）。残留物を塩化メチレン中に溶解し、ジエチルエーテルに加えた。溶剤をデカンタし、白色粉末を塩化メチレン（１００ｍＬ）に溶解した。溶液を１ＮのＮａＯＨ溶液で洗浄した。この水相を塩化メチレン（２ｘ７０ｍＬ）で２回洗浄し、有機層をまとめ、硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶液を濾過し、濃縮してエチルエーテルに加えた。溶剤をデカンタし、白色粉末を真空下で乾燥させた。
ＮＭＲ（Ｖａｒｉａｎ製、５００ＭＨｚ、１０ｍｇ／ｍＬ  ＣＤＣｌ３）では、通常の骨格ピークを１．１２ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−）、２．３１ｐｐｍ（小さいｓ）および２．４１ｐｐｍ（大きいｓ）（総面積２Ｈ、ＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−）、および３．４７ｐｐｍ（ｓ、４Ｈ、−ＮＣＨ２ＣＨ２Ｎ−）で示す。開始メチルのピークは２．９ｐｐｍ（小）および３．０５ｐｐｍ（大）（ＣＨ３−ＮＣＨ２ＣＨ２）で２つの一重項として出現する。末端メチレン（−ＣＨ２−ＯＣＯ−ＮＨ−）は４．２ｐｐｍ（ｂｒｓ、２Ｈ）で出現し、エチレンジアミンに関連するプロトンは２．８２ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２）および３．２３ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２）で出現する。
【０１６１】
実施例１０．ＰＯＺスクシニミジル炭酸塩の合成
Ｍ−ＰＥＯＺ−ＯＨ（０．５ｇ、０．２３ｍｍｏｌ）の溶液を無水ジクロロメタンまたは無水アセトニトリル５ｍＬ中で調製し、回転蒸発によって濃縮した。ジスクシニミジル炭酸塩（０．２４ｇ、０．９ｍｍｏｌ）の懸濁液を無水ジクロロメタンまたは無水アセトニトリル５ｍＬ中で調製した。ピリジン（０．０９４ｍＬ、１．１６ｍｍｏｌ）をこの懸濁液に加えた。Ｍ−ＰＥＯＺ−ＯＨ溶液を上記の懸濁液に一滴ずつ加え、混合物を室温で一晩攪拌した。混合物を濾過し、回転蒸発を使用して濃縮し、次にジエチルエーテルに加えた。溶剤をデカンタし、白色粉末を真空下で乾燥させた。この粉末を乾燥アセトンに溶解し、ジエチルエーテルに加えて沈殿させた。収量０．６ｇであった。ＮＭＲ（Ｖａｒｉａｎ製、５００ＭＨｚ、１０ｍｇ／ｍＬ  ＣＤＣｌ３）は、１．１２ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−）、２．３１ｐｐｍ（小さいｍ）および２．４１ｐｐｍ（大きいｓ）（総面積２Ｈ、ＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−）、３．４７ｐｐｍ（ｓ、４Ｈ、−ＮＣＨ２ＣＨ２Ｎ−）、２．７０ｐｐｍ（ｓ、４Ｈ、ＳＣ基）で通常の骨格ピークを示す。開始メチルのピークは２．９ｐｐｍ（小）および３．０３ｐｐｍ（大）（ＣＨ３−ＮＣＨ２ＣＨ２）で２つの一重項として出現しする。末端メチレン（−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−）は、４．２４ｐｐｍ（ｓ）で出現する。
【０１６２】
実施例１１．Ｍ−ＰＥＯＺ−Ｔ−ＣＯＯＨ２０００の合成
ａ．メチルエーテルの合成
【０１６３】
【化１２】
0005615558.tif 000016
【０１６４】
Ｍ−ＰＥＯＺ＋の１ｍｍｏｌ溶液を、上記のとおりクロロベンゼン中で調製した。溶液を室温に冷却した。メチル３−メルカプトプロピオン酸（０．６５ｍＬ、６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ中のＮａＨ（０．１２ｇ、５ｍｍｏｌ）懸濁液に一滴ずつ０℃で加えた。Ｍ−ＰＥＯＺ＋溶液を次にＴＨＦ溶液にゆっくりと加えた。得られた混合物を室温まで加温し、一晩攪拌した。反応混合物を濾過し、エーテルに加えると白色沈殿物を獲得した。溶剤をデカンタし、固形物を真空下で乾燥すると、白色粉末１．５ｇを得た。
ＮＭＲ（Ｖａｒｉａｎ製、５００ＭＨｚ、１０ｍｇ／ｍＬ  ＣＤＣｌ３）では、１．１２ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−）、２．３１ｐｐｍ（小さいｍ）および２．４１ｐｐｍ（大きいｓ）（総面積２Ｈ、ＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−）、３．４７ｐｐｍ（ｓ、４Ｈ、−ＮＣＨ２ＣＨ２Ｎ−）で通常の骨格ピークを示す。開始メチルのピークは、２．９ｐｐｍ（小）および３．０３ｐｐｍ（大）（ＣＨ３−ＮＣＨ２ＣＨ２）で２つの一重項として出現する。末端メチレン（−ＣＨ２−ＣＯＯ−ＣＨ３）は２．６４ｐｐｍ（ｓ）で出現し、その隣接するメチレン（Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−）は２．８１ｐｐｍ（ｓ）で出現し、硫黄族隣接するメチレン（−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−）は、２．７１ｐｐｍ（ｓ）で出現する。メチルエーテル基（−ＣＨ２−ＣＯＯ−ＣＨ３）は、３．７１ｐｐｍで鋭い一重項として出現する。
チオ酸の合成
メタノール２０ｍＬ中の上記のエステル溶液（８．１ｇ、０．００４ｍｏｌ）を調製し、０．０５ＮのＮａＯＨ溶液（０．０２ｍｏｌ）３０ｍＬと混合した。混合物を室温で４０分間攪拌し、次に５％ＨＣｌで酸性化した。メタノールを回転蒸発で除去し、溶液をジクロロメタンで抽出した。抽出物を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、エーテルに加えることにより沈殿させた。エーテルをデカントし、残留物を真空下で乾燥させた。ＮＭＲスペクトルは、メチルエステルのピークの３．７１ｐｐｍでの消滅を示した。ＧＰＣでは、６％の高ＭＷショルダを示した。主ピークは、Ｍｎは１８７０Ｄａ、ＰＤは１．１５であった。ＤＥＡＥセファロースＦＦの手段を使用したイオン交換クロマトグラフィによって、試料を精製した。生成物のＧＰＣでは、高ＭＷショルダのない単一の主ピークを得、Ｍｎは１９７０ＤａおよびＰＤは１．０８であった。ＭＡＬＤＩでは、Ｍｎ２０９０ＤａおよびＰＤ１．０４であった。
【０１６５】
実施例１２．Ｍ−ＰＥＯＺ−Ｔ−プロピオン酸（Ｍ−ＰＥＯＺ−Ｔ−ＰＡ）１０００の合成
【０１６６】
【化１３】
0005615558.tif 000017
【０１６７】
Ｍ−ＰＥＯＺ＋を、クロロベンゼン（２５ｍＬ）中の２−エチル−２−オキサゾリン（５．０５ｍＬ、５０ｍｍｏｌ）およびメチルトリフラート（０．６３ｍＬ、５．５６ｍｍｏｌ）を使用して、上記のとおり調製した。末端停止試薬を得るため、メチル３−メルカプトプロピオン酸（２．４１ｍＬ、２２．２ｍｍｏｌ）をクロロベンゼン（１０ｍＬ）中のカリウムｔｅｒｔ−ブトキサイド（１．２５ｇ、１１．１ｍｍｏｌ）懸濁液に滴下で０℃で加えた。混合物をその低温で２時間攪拌した後、クロロベンゼン中のＭ−ＰＥＯＺ＋の溶液を滴下で加えた。混合物をその低温で４時間攪拌し、次に１８時間室温で攪拌した。水（５０ｍＬ）を加え、５％のＨＣｌ水溶液を加えて混合物を酸性化した（約ｐＨ３）。クロロベンゼンを含む揮発物を、回転蒸発を使用して除去した。得られた水溶液を、Ｈ２Ｏ（７０ｍＬ）中のＮａＯＨ（１．３３ｇ、３３．３ｍｍｏｌ）溶液で処理した。１時間の攪拌後、混合物を５％のＨＣｌ水溶液で酸性化し、次にジクロロメタンで抽出した。混合した有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、エーテルに加えることにより沈殿した。エーテルをデカントし、残留物を真空下で乾燥させた。ＤＥＡＥセファロースＦＦの手段を使用したイオン交換クロマトグラフィによってさらなる精製を行った。ＧＰＣおよびＧＦＣでは、Ｍｎは９１０Ｄａ、ＰＤは１．０２の単一のピークを示す。ＭＡＬＤＩでは、Ｍｎは１１００Ｄａ、ＰＤは１．０５であった。
【０１６８】
実施例１３．Ｍ−ＰＥＯＺ−Ｔ−プロピオン酸ＮＨＳエーテル（Ｍ−ＰＥＯＺ−Ｔ−ＳＰＡ）の合成
【０１６９】
【化１４】
0005615558.tif 000018
【０１７０】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．４６７ｇ、２．２６ｍｍｏｌ）およびＤＣＣ（０．４６７ｇ、２．２６ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（４４ｍＬ）中の上記の調製による（Ｍｎ９１０Ｄａ、２．０ｇ、２．２０ｍｍｏｌ）Ｍ−ＰＥＯＺ−Ｔ−ＣＯ２Ｈの溶液に０℃で加えた。その低温で２時間攪拌後、混合物を室温まで加温し、一晩攪拌した。混合物をシリンジフィルタを使用して濾過し、濾液をジエチルエーテルに加えると白色粉末を得た。生成物を真空濾過によって採取し、真空下で乾燥させた（２．０ｇ、収率８９％）。１ＨＮＭＲスペクトルは、通常の骨格ピークに加えてスクシニミジルプロトンを２．８６ｐｐｍ（ｓ、２Ｈ）で示し、スクシニミジル基の付加を明らかにした。収率を測定するため、化合物（計算では、Ｍｎ１０２５Ｄａ、０．４ｇ、０．３９ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（４ｍＬ）中のフェニルエチルアミン（０．１５ｍＬ、１．１７ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．１６ｍＬ、１．１７ｍｍｏｌ）で処理した。一晩攪拌した後、混合物を濾過し、ジエチルエーテルに加えた。白色粉末を濾過し、真空を使用して乾燥させた。ゲル浸透クロマトグラフィによると、変換収率は９９％であった。
【０１７１】
実施例１４．メルカプチドを経由したＭ−ＰＥＯＺ−チオ−ＮＨ２の合成
【０１７２】
【化１５】
0005615558.tif 000019
【０１７３】
ｔＢｏｃエーテルの合成
クロロベンゼン（２５ｍＬ）中の２−エチル−２−オキサゾリン（５．０５ｍＬ、０．０５ｍｏｌ）の水溶液に、メチルトリフラート（０．２８３ｍＬ、０．００２５ｍｏｌ）を加えた。室温で１０分間攪拌した後、混合物を１１０℃まで３０分間加熱し、続いて０℃まで冷却した。末端停止試薬を得るために、クロロベンゼン（５ｍＬ）中のカリウムｔｅｒｔ−ブトキサイド（０．５６１ｇ、０．００５ｍｏｌ）懸濁液にＢｏｃ−システアミン（０．８４ｍＬ、０．００７５ｍｏｌ）を滴下で０℃で加えた。その低温で混合物を１時間攪拌して透明な溶液を得た後、クロロベンゼン中のＭ−ＰＥＯＺ＋の溶液を、注射器を使用して滴下で０℃で加えた。混合物をその低温で４時間攪拌し、次に室温で１８時間攪拌した。混合物をジエチルエーテルにゆっくりと加えると、白色沈殿物を得た。エーテルをデカントし、残留物を水に溶解し、続いてジクロロメタンで抽出した。混合された有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、エーテルに加えることにより沈殿させた。混合物を濾過し、得られた白色粉末を真空下で乾燥すると、４．０ｇの標的化合物を収率８７％で得た。
【０１７４】
ＮＭＲ（Ｖａｒｉａｎ製、５００ＭＨｚ、１０ｍｇ／ｍＬ  ＣＤＣｌ３）は、１．１２ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−）、２．３１ｐｐｍ（ｓ）および２．４１（ｓ）（総面積２Ｈ、ＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−）、および３．４７ｐｐｍ（ｓ、４Ｈ、−ＮＣＨ２ＣＨ２Ｎ−）で通常の骨格ピークを示す。開始メチルのピークは、２．９ｐｐｍおよび３．０３ｐｐｍ（ＣＨ３−ＮＣＨ２ＣＨ２）で２つの一重項として出現する。Ｂｏｃシステアミン末端基のピークは、１．４４ｐｐｍ（ｓ、９Ｈ、−ＣＨ２ＮＨＢｏｃ）、２．６７ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、−ＳＣＨ２ＣＨ２ＮＨＢｏｃ）、２．７１ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、−ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ２ＮＨＢｏｃ）、および３．３２ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、−ＳＣＨ２ＣＨ２ＮＨＢｏｃ）である。粗混合物は、ＮＭＲ積分に基づいて約８％のＭ−ＰＥＯＺ−ＯＨ種を含む。ＧＰＣでは、Ｍｎ＝１７９０Ｄａ、ＰＤ＝１．０７の鋭いピークを産生する。
アミンの合成
Ｍ−ＰＥＯＺ−Ｔ−ＮＨ（Ｂｏｃ）（Ｍｎ１８５０Ｄａ、３．２１８ｇ、１．７４ｍｍｏｌ）を含むフラスコ内に塩酸（ジオキサン中の４Ｍ溶液、３４．０ｍＬ）を０℃で激しく攪拌しながら加えた。混合物を室温まで加温し、１時間攪拌した。混合物を回転蒸発によって濃縮し、水（５０ｍＬ）で希釈し、ｐＨを約１３に調整した。得られた水溶液を、ジクロロメタンで３回抽出した。混合された有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮し、エーテル中に沈殿すると白色粉末を得、これを濾過し、真空下で乾燥すると２．５ｇの生成物を得た。ＣＭセファロースＦＦの媒体を使用したイオン交換クロマトグラフィによってさらなる精製が行われた。２つの留分をカラム精製によって採取した。一方の０．２ｇの留分は純アミン重合体を含み、２つ目の２．２ｇの留分は前述の手順から持ち越された８％の不純物（Ｍ−ＰＥＯＺ−ＯＨ）を有するアミン重合体を含んでいた。
【０１７５】
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｖａｒｉａｎ製、５００ＭＨｚ、１０ｍｇ／ｍＬ  ＣＤＣｌ３）では、１．１４ｐｐｍ（ｍ、３Ｈ、ＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−）、２．３２ｐｐｍ（ｍ）および２．４１（ｓ）（総面積２Ｈ、ＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−）、および３．４７ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、−ＮＣＨ２ＣＨ２Ｎ−）で通常の骨格ピークを示した。開始メチルのピークは、２つの一重項として２．９ｐｐｍおよび３．０３ｐｐｍ（ＣＨ３−ＮＣＨ２ＣＨ２）で出現した。末端システアミノ基のピークは、２．６９ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、−ＳＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、および２．９１ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、−ＳＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）であった。Ｂｏｃ基の除去を、１．４４ｐｐｍ（ｓ、９Ｈ、−ＣＨ２ＮＨＢｏｃ）でのピークの消滅によって確認した。ＧＰＣでは、Ｍｎ値は１７００Ｄａ、ＰＤＩは１．１０を示した。
【０１７６】
実施例１５．Ｍ−ＰＥＯＺ−Ｔ−ＳＣＭ（Ｍ−ＰＥＯＺ−Ｓ−ＣＨ２−ＣＯ２−ＮＨＳ）の合成
酸の合成
クロロベンゼン（１００ｍＬ）と２−エチル−２−オキサゾリン（３９．７ｇ、０．４ｍｏｌｅ、５０等量）をアルゴン下で混合し、０℃で３０分間攪拌した。メチルトリフラート（１．３１ｇ、１等量）を攪拌しながらフラスコに加え、０℃で３０分間、２５℃で３０分間、４２℃で１時間、次に８０℃で３．５時間、攪拌を継続した。混合物を室温に冷却した。カリウムｔ−ブトキサイド（２．２５ｇ、５等量）とメチル２−メルカプト酢酸塩（２．９ｇ、６等量）およびクロロベンゼン（１００ｍＬ）を混合して別個のフラスコ内で末端停止混合物を調製し、０℃で１時間攪拌した。重合混合物を末端停止混合物に加え、室温で一晩攪拌した。混合物を塩化メチレン（５０ｍＬ）で希釈し、濾過し、ジエチルエーテル（７５０ｍＬ）に加えた。浮遊物をデカンタし、沈殿物を採取して真空下で１時間乾燥させた。この粉末を０．１ＭのＮａＯＨ１００ｍＬに溶解し、４時間攪拌した。０．５ＭのＨＣｌを２５ｍＬ加えて混合物を酸性化した。この水溶液を塩化メチレン（１５０ｍＬｘ３回）で抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、５０ｍＬに濃縮し、ジエチルエーテル（４００ｍＬ）中に沈殿した。得られた白色粉末を真空下で乾燥させた。
【０１７７】
得られた酸をＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィで精製すると、純粋な酸を得た（ＧＦＣクロマトグラフィが示すとおり）。ＮＭＲは、メチルおよびメチレンのエステルのピークが、それぞれ１．３０と４．１９ｐｐｍで消滅したことを示した。
ＮＨＳエステルの合成
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．１３９ｇ、１．２１ｍｍｏｌ）およびＤＣＣ（０．２４９ｇ、１．２１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（６０ｍＬ）中に溶解したＭ−ＰＥＯＺ−Ｔ−ＣＭ（Ｍ−ＰＥＯＺ−Ｓ−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ、Ｍｎ４９７０Ｄａ、６．０ｇ、１．２１ｍｍｏｌ）を含む溶液に０℃で加えた。この温度で２時間攪拌後、透明で無色の混合物を室温まで加温し、一晩攪拌した。白色沈殿物のある混合物をシリンジフィルタを用いて濾過した。濾液を攪拌しながらジエチルエーテルに加え、白色粉末様の沈殿物を産生した。焼結ガラス漏斗を使用して残留物を採取し、真空下で乾燥させて所望の生成物（収率８５％）５．２ｇを得た。
【０１７８】
Ｈ１−ＮＭＲ：１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、ＰＥＯＺでの通常の骨格ピークに加え、２．８７ｐｐｍ（ｓ、４Ｈ）でスクシニミジルプロトンを示し、ヒドロキシスクシンイミドの付加を確認した。
【０１７９】
変換収率を算出するため、この化合物（計算値Ｍｎ５０７０Ｄａ、０．１００ｇ、０．０１９７ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２ｍＬ）中のフェニチルアミン（０．０１２ｍＬ、０．０９８７ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（０．０１４ｍＬ、０．０９８７ｍｍｏｌ）で処理した。一晩攪拌した後、混合物を濾過し、ジエチルエーテルに加えた。白色粉末を濾過し、真空を用いて乾燥すると、所望のアミドを定量的収量で得た。ＧＦＣによると、変換収率は９５％超であった。
【０１８０】
実施例１６．チオＮＨＳエステルの加水分解速度
チオＮＨＳエステルＭ−ＰＥＯＺ−Ｔ−ＳＣＭ  ５ＫおよびＭ−ＰＥＯＺ−Ｔ−ＳＰＡ  ５Ｋの反応性をｐＨ８のホウ酸塩緩衝剤中で評価した。正確に計量した両エステルの試料を１００ｍＬの容量フラスコに入れ、ｐＨ８ホウ酸塩緩衝剤（０．２Ｍ）に溶解した。各フラスコから、始めは１分毎に、後には１０分毎にアリコートを取り出し、２６０ｎｍのλｍａｘ吸収で紫外分光法を用いて分析した。吸収値の上昇速度を時間に対してプロットした。これらの計算から、最大吸収値５０％の速度が決定された。Ｍ−ＰＥＯＺ−Ｔ−ＳＣＭ  ５ＫとＭ−ＰＥＯＺ−Ｔ−ＳＰＡ  ５Ｋのｔ１／２の計算値はは、それぞれ１分未満および１５分であった。
【０１８１】
実施例１７．Ｍ−ＰＥＯＺ−ＯＣＱ２−ＮＨＳのＧＣＳＦとの共役
以下のとおり、単官能性誘導体Ｍ−ＰＥＯＺ−ＯＣＯ２−ＮＨＳを本実施例ではＧＣＳＦである標的分子に共役した。４ｍｇのＧＣＳＦ（０．２１５μｍｏｌ、ＭＷ＝１８．６ｋＤａ）を０．２Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）１ｍｌに溶解し、ＧＣＳＦの各アミノ基（合計５リジンに加えてα−アミン）につき３等量のＭ−ＰＥＯＺ−ＯＣＯ２−ＮＨＳと室温で６０分間反応させた。これらの反応条件下において、一官能性ＰＯＺ誘導体とＧＣＳＦ上のアミノ基の間の反応は、主としてより曝露した求核アミンにおいて発生する。
【０１８２】
ＧＣＳＦの修飾は、６０％緩衝剤Ａ（ＴＦＡ０．０５％を含むＨＰＬＣグレードのＨ２Ｏ）で平衡し、１％緩衝剤Ｂ／分（ＣＨ３ＣＮ７０％およびＴＦＡ０．０５％）直線傾斜で、流速１ｍｌ／分にて３０分間溶出した分析Ｃｌ８Ａｇｉｌｅｎｔカラムを用いたＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した。溶出した物質を吸収度２８０ｎｍで検出した。ＧＣＳＦ−ＰＯＺ複合体は左右非対称のピークとして保持期間１８．８分間で溶出され、これはＧＣＳＦ分子に共役するＰＯＺ分子の数に関してＧＣＳＦ−ＰＯＺ複合体の不均質性を示唆する。アミノ基含有量のＨａｂｅｅｂアッセイは、タンパク質アミノ基の７０％がもはや遊離でないことを示した。
【０１８３】
いくつかの複合体の形成をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除ＨＰＬＣによって確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ実験をＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｐｈａｓｔ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して実行した。ミニゲル（１２％ポリアクリルアミド）を定電圧（２００Ｖ）で流し、Ｌａｅｍｍｌｉの方法にしたがって調製した。このゲルを染色するタンパク質をクマシーブルー溶液に入れ、一方重合体染色にはヨウ化バリウム溶液が使用された。重合体染色は、ヨウ化バリウム錯体の形成に基づく（Ｋｕｒｆｕｓｔ  Ｍ．Ｍ．、１９９２、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００、２４４−２４８）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥデータはいくつかの帯を示し、化学的に異なる分子のＧＣＳＦ複合体の混合物が得られたことを示唆し、かかる複合体は、１個、２個または３個のＰＯＺ分子から成る。
【０１８４】
分析用Ｂｉｏｓｅｐ  ＳＥＣ  Ｓ２０００カラムを使用して、０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．２Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２、および流速０．５ｍｌ／分の２０％アセトニトリルのアイソクラチック移動相で溶離し、サイズ排除ＨＰＬＣ分析を行った。溶離された材料を２８０ｎｍの吸光度によって検出した。クロマトグラムは、天然タンパク質（９．００分で溶離ピーク）よりも多い分子量に相当する５．７５分で溶離ピークを示し、ＧＣＳＦ−ＰＯＺ複合体が形成されたことを示す。
【０１８５】
実施例１８．リボヌクレアーゼＡとのＭ−ＰＥＯＺ−ＯＣＯ２−ＮＨＳの共役
以下のとおり、一官能性ＰＯＺ誘導体Ｍ−ＰＥＯＺ−ＯＣＯ２−ＮＨＳを、本実施例ではリボヌクレアーゼＡ（ＲＮＡｓｅＡ）である標的分子に共役した。０．２Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）１ｍｌに溶解したＲＮＡｓｅＡ（０．３６μｍｏｌ、ＭＷ１３ＫＤａ）５ｍｇを、ＲＮＡｓｅＡの各アミノ基（合計５リジンに加えてα−アミン）につき、３等量のＭ−ＰＥＯＺ−ＯＣＯ２−ＮＨＳと反応させた。反応は室温で６０分間行った。ＲＮＡｓｅＡ修飾の程度を、８０％緩衝剤Ａ（ＨＰＬＣグレードＨ２Ｏを含む０．０５％ＴＦＡ）で平衡し、１％緩衝剤Ｂ／分（９０％ＣＨ３ＣＮおよび０．０５％ＴＦＡ）の直線傾斜で流速は１ｍｌ／分にて３０分間溶出した分析用Ｃ４Ａｇｉｌｅｎｔカラムを使用したＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した。溶出した物質を吸収度２８０ｎｍで検出した。クロマトグラムは、少量の（＜１０％）非修飾タンパク質を示す。ＰＯＺ修飾タンパク質のピークはかなり広く、ＲＮＡｓｅＡ分子に共役するＰＯＺ分子の数に関してＲＮＡｓｅＡ−ＰＯＺ複合体の不均質性を示唆した。アミノ基含有量のＨａｂｅｅｂアッセイは、ＲＮＡｓｅＡのアミノ基の２６％が修飾されたことを示した。
【０１８６】
いくつかの複合体の形成をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除ＨＰＬＣによって確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ実験をＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｐｈａｓｔ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して実行し、上記の実施例に記載のとおりに染色した。ＧＣＳＦの結果と同様に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥデータはいくつかの帯を示し、いくつかの異なるＲＮＡｓｅＡ−ＰＯＺ複合体を表す。サイズ排除ＨＰＬＣ分析を、上記の実施例に記載のとおりに分析用Ｂｉｏｓｅｐ  ＳＥＣ  Ｓ２０００を使用して行った。クロマトグラムは、、天然タンパク質と比較して、高い分子量に相当する早期の広いピークを示し、ＲＮＡｓｅＡ−ＰＯＺ複合体の形成と一致する。
【０１８７】
実施例１９．Ｍ−ＰＥＯＺ−マレイミドおよびオルトピリジルジスルフィドの調製
本実施例では、一官能性ＰＯＺ誘導体Ｍ−ＰＥＯＺ−マレイミドをＭ−ＰＥＯＺ−ＮＨ２（上記）から調製した。４−マレイミド酪酸１００ｍｇ（０．５５ｍｍｏｌ、３等量）に、無水クロロホルム中のＨＯＢＴ（１．０９ｍｍｏｌ）１２６ｍｇおよびＤＣＣ（１．０９ｍｍｏｌ）２２６ｍｇを加えた。３時間後、これに続いてＭ−ＰＥＯＺ−ＮＨ２１６ｍｇ（０．００２５４ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液を室温で一晩放置した。反応混合物を０．１ＮのＨＣｌで洗浄し、乾燥させ、真空で蒸発させた。エチルエーテルを加え、沈殿物を濾過して採取し、乾燥させた。反応の収率は６５％であった。
【０１８８】
オルトピリジルジスルフィド（ＯＰＳＳ）試薬を、スクシニミジルプロピオン酸ジチオピリジン（ＳＰＤＰ）（３倍過剰）をクロロホルム中でＭ−ＰＥＯＺ−ＮＨ２と５時間室温でトリエチルアミン（３等量）の存在下でカップリングすることにより、同様の手法で調製した。エーテルから沈殿させ、最終生成物を収率６５％で得た。
【０１８９】
実施例２０．Ｍ−ＰＥＯＺ−マレイミド、Ｍ−ＰＥＯＺ−ＯＰＳＳ、ＰＥＧ−マレイミドおよびＰＥＧ−ＯＰＳＳのチオールとの反応の比較
Ｍ−ＰＥＯＺ−マレイミドとＭ−ＰＥＯＺ−ＯＰＳＳの反応性を評価するため、およびＭ−ＰＥＯＺ−マレイミドとＭ−ＰＥＯＺ−ＯＰＳＳ誘導体をそれらの対応するＰＥＧ誘導体の反応性と比較するため、ＰＥＯＺとＰＥＧ重合体をシステインを含むトリペプチドグルタチオンに共役した。グルタチオンとの反応を当技術分野で周知のＥｌｌｍａｎのアッセイで監視した。２０ｍＭのＰＥＯＺまたはＰＥＧ誘導体の溶液と２ｍＭのチオールとをｐＨ＝７、０．１Ｍのリン酸エステル緩衝剤中（５ｍＭのＥＤＴＡを含む）で調製した。アリコート（３０μｌ）を回収して、９２０μｌのｐＨ７の緩衝剤に加えて反応停止した。ＤＴＮＢ５０マイクロリッターを加え、５分後に４２０ｎｍでの吸光度を測定して残留チオールを評価した。表４にシステイン修飾の度合いを報告する。
【０１９０】
【表４】
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【０１９１】
実施例２１．Ｍ−ＰＥＯＺ−ｐ−ニトロフェニル炭酸塩およびＰＥＧ−ｐ−ニトロフェニル炭酸塩の加水分解およびアミノリシス研究
Ｍ−ＰＥＯＺ−ｐ−ニトロフェニル炭酸塩および対応するＰＥＧ−ｐ−ニトロフェニル炭酸塩の加水分解速度を、０．１Ｍ、ｐＨ８のホウ酸塩緩衝剤において４１２ｎｍで室温で放出されるｐ−ニトロフェノールの以下の紫外吸光度またはアミンに対する重合体の反応性を追跡することによって評価した。本実施例では、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ／重合体は１：１の割合）の水溶液を活性化されたＰＥＯＺまたはＰＥＧ溶液に加えた。表５に加水分解およびアミノリシスの速度を半減期として報告する。
【０１９２】
【表５】
0005615558.tif 000021
【０１９３】
実施例２２．Ｍ−ＰＥＯＺ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈの調製
Ｍ−ＰＥＯＺ−ＯＨ（１．５ｇ、０．０００２４モル、１等量）を共沸的にトルエン６０ｍｌ中で蒸留し、３０ｍｌの蒸留液を除去した。反応混合物をゆっくりと室温に冷却し、続いてｔ−ブタノール中のカリウムｔ−ブトキサイド１．０Ｍ溶液０．５ｍｌ（０．５ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で１時間攪拌し、続いてｔ−ブチルブロモ酢酸塩９４ｍｇ（０．４８ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混濁した混合物を還流まで加熱し、冷却して室温で１８時間攪拌した。反応混合物をＣｅｌｉｔｅで濾過し、溶剤を真空下で除去した。残留物をエチルエーテル中に沈殿させた。生成物を４℃で遠心分離し、３回洗浄し、溶剤を除去した。ＮＭＲでのｔ−ブチルのピーク（１．４７ｐｐｍ）と末端メチルピークとの比較は、定量的変換を示した。
【０１９４】
得られたカルボン酸ｔ−ブチルエステルをＣＨ２Ｃｌ２／トリフルオロ酢酸／水（５０ｍｌ／０．１ｍｌ／１００ｍｌ）の混合物に溶解し、溶液を室温で３時間攪拌した。溶剤を真空下で除去してＴＦＡを完全に除去し、続いてエチルエーテル中で遠心分離すると生成物９００ｍｇ（６０％）を得た。ＮＭＲは、ｔ−ブチルピークが除去されていたことを示し、新規のメチレンのピークが４．０８ｐｐｍで観察された。
【０１９５】
アニオン交換クロマトグラフィによってカルボン酸を過剰Ｍ−ＰＥＯＺ−ＯＨから精製した。生成物９００ｍｇを事前に平衡化したカラム（ＱＡＥ５０）に流速１ｍｌ／分で仕込んだ。Ｍ−ＰＥＯＺ−ＯＨが完全に溶離するまで水を使用した定組成溶離を行った。溶剤を０．０１ＮのＮａＣｌに交換し、生成物を採取した。留分をＩ２アッセイによって検査した。留分を真空下で３０ｍｌに濃縮し、ＣＨ２Ｃｌ２（４０ｍｌｘ６）で６回洗浄した。収率は６００ｍｇであった。
【０１９６】
実施例２３．Ｍ−ＰＥＯＺ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ２−ＮＨＳの調製
Ｍ−ＰＥＯＺ−ＣＯＯＨ（６００ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン１５ｍＬに溶解しＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１０４ｍｇ０．９ｍｍｏｌ）およびＤＣＣ（１８５ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を２４時間放置して反応させ、エチルエーテルを加えることにより生成物を沈殿させ、濾過して採取し、乾燥させた。グリシン−グリシンを基質とするアミノ基修飾により、残留ＮＨ２基の判定のためにＴＮＢＳを使用して測定された活性度は８５％であった。
【０１９７】
実施例２４．Ｍ−ＰＥＯＺ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ２−ＮＨＳおよびＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＱ２−ＮＨＳの加水分解およびアミノリシス研究
Ｍ−ＰＥＯＺ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ２−ＮＨＳとＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ２−ＮＨＳの加水分解速度を、室温で０．１Ｍ、ｐＨ８のホウ酸塩緩衝剤中で、２６０ｎｍにおいて、放出されるＮ−ヒドロキシスクシンイミドの紫外吸光度を測定して、評価した。アミンに対する重合体の反応性を評価するため、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ溶液（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ／重合体の割合は１：１）をＭ−ＰＥＯＺ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ２−ＮＨＳとＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ２−ＮＨＳ（当技術分野で周知のとおりに調製）の溶液に比較のために加えた。表６に加水分解およびアミノリシスを半減期として報告する。
【０１９８】
【表６】
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【０１９９】
実施例２５．Ｍ−ＰＥＯＺ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ２−ＮＨＳのＧＣＳＦとの共役
０．２Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）１ｍｌに溶解した、ＧＣＳＦ（０．１３４μｍｏｌ、ＭＷ＝１８．６ＫＤａ）２．５ｍｇを、ＧＣＳＦの各アミノ基（合計５リジンに加えてα−アミン）につき３等量のＭ−ＰＥＯＺ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ２−ＮＨＳと室温で６０分間反応させた。この条件下で、修飾は主としてより曝露した求核アミンで発生する。
【０２００】
ＧＣＳＦの修飾を、分析用Ｃｌ８Ａｇｉｌｅｎｔカラムを使用したＲＰ−ＨＰＬＣで分析した。溶離液Ａは０．０５％ＴＦＡを含むＨ２Ｏであり、溶離液Ｂは０．０５％ＴＦＡを含むアセトニトリルであった。流速は１ｍｌ／分であり、検出は２８０ｎｍで行われた。使用した勾配は、０分で３０％、３０分間で３０から８０％Ｂ、３分間で８０から３０％Ｂであった。クロマトグラムは、遊離タンパク質が存在しないことを示し、これは、遊離ＧＣＳＦよりも後の保持期間で広いピークを示し、複数の型のＧＣＳＦ−ＰＯＺが存在することを示唆している。
【０２０１】
いくつかの複合体の形成をサイズ排除ＨＰＬＣによって確認した。サイズ排除ＨＰＬＣ分析を、０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．２Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ＝７．２のアイソクラチック移動相および２０％アセトニトリルで０．３ｍｌ／分で溶離したＡｇｉｌｅｎｔＧＦ−２５０カラムを使用して行った。クロマトグラムは、天然ＧＣＳＦに対して、より高い分子量のＧＣＳＦ−ＰＯＺ複合体共役に対応する広い溶離ピークを示し、広範囲の共役および質量の増加と一致する。
【０２０２】
実施例２６．Ｍ−ＰＯＺ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ２−ＮＨＳおよびＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ２−ＮＨＳで修飾された酵素の特性の比較
本開示のＰＯＺ誘導体による重合および当技術分野で周知の対応するＰＥＧ重合体による重合の関数としての、酵素特性への異なる効果を評価するため、３つの異なる酵素、すなわち、リボヌクレアーゼＡ、ウリカーゼおよびカタラーゼをＭ−ＰＥＯＺ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ２−ＮＨＳ（６ｋＤａ）およびＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ２−ＮＨＳ（５．５ｋＤａ）で修飾した。比較を容易にするため、重合体対酵素比、緩衝剤、ｐＨおよび反応温度に関して、各酵素は類似の条件下で修飾した。
【０２０３】
上に記載のＰＯＺおよびＰＥＧ重合体による酵素修飾条件は、ホウ酸塩緩衝剤中で０．２Ｍ、ｐＨ８．５であった。修飾に使用されたＰＯＺおよびＰＥＧ重合体の量は、各酵素中の計算された利用可能な総アミノ基に基づいて計算した。例えば、リボヌクレアーゼＡは分子量１３．７ｋＤａで、１１の利用可能なアミノ基を有し、ウリカーゼは分子量１３０ｋＤａで、１００の利用可能なアミノ基を有し、カタラーゼは分子量２４０ｋＤａで、１１２の利用可能なアミノ基を有する。
【０２０４】
３つの酵素溶液（２．５ｍｇ／ｍｌ）に、Ｍ−ＰＯＺ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ２−ＮＨＳまたはＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ２−ＮＨＳ固形物を室温で重合体対タンパク質アミノ基のモル比がそれぞれ２／１と１／１となるように加えた。天然型のリボヌクレアーゼ、ウリカーゼおよびカタラーゼのタンパク濃度を、２８０ｎｍでそれぞれ９．４５ｘ１０３、１３ｘ１０３および１．６７ｘ１０５のモル吸光係数を使用して分光光度法で評価した。３０分後、０．１ＭのｐＨ７．４のリン酸エステル緩衝剤を溶離剤とするゲル浸透クロマトグラフィＳｅｐｈａｄｅｘＧ−７５カラムによって重合体−酵素の複合体を未反応重合体およびｎ−ヒドロキシスクシンイミドから除いた。
【０２０５】
タンパク質修飾の度合いをＴＮＢＳアッセイによって比色分析で評価し、共役アミノ基のタンパク質上に存在する総量に対する割合として表した。天然ならびに修飾酵素の酵素活性を以下のとおり評価した。リボヌクレアーゼ活性をＣｒｏｏｋら（ＢｉｏｃｈｅｍＪ．１９６０Ｆｅｂ；７４：２３４−８）の方法で分析し、ウリカーゼ活性をＭａｈｌｅｒ（ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ．１９７０Ｎｏｖ；３８（１）：６５−８４）の方法によって決定し、カタラーゼをＢｅｅｒｓおよびＳｉｚｅｒ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９５２Ｍａｒ；１９５（ｌ）：１３３−４０）の報告による方法に従って分析した。
【０２０６】
表７Ａから表７Ｃに、それぞれリボヌクレアーゼ（ＲＮＡｓｅ）、ウリカーゼおよびカタラーゼについての結果を提供する。
【０２０７】
【表７】
0005615558.tif 000023
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【０２０８】
リボヌクレアーゼには高い程度の修飾がされたことが見られ、結果的にＭ−ＰＯＺ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ２−ＮＨＳに対するよりもＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ２−ＮＨＳで修飾された場合に活性の損失が高いことがわかった。ウリカーゼにおいては、修飾および活性の損失の双方の度合いは、ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ２−ＮＨＳおよびＭ−ＰＯＺ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ２−ＮＨＳに類似した。しかしながら、ＰＯＺ複合体は、テストされた双方のモル比において若干高い活性を示した。カタラーゼについては、ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ２−ＮＨＳおよびＭ−ＰＯＺ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ２−ＮＨＳの修飾の程度は類似し、双方の場合において、酵素活性の微小な損失が認められ、テストされた双方のモル比においてＰＯＺ複合体のほうがＰＥＧ複合体よりも活性であった。
【０２０９】
実施例２７．Ｍ−ＰＥＯＺ−ＮＨ２のＴＧＡｓｅによるＧ−ＣＳＦへの共役
本実施例では、酵素ＴＧＡｓｅを使用したＰＯＺ−ＮＨ２によるＧ−ＣＳＦの部位特異性修飾を調査した。比較のため、ＰＥＧ−ＮＨ２を使用した同一の反応も同一の試薬濃度で行われた。
【０２１０】
単官能性アルキルアミンＭ−ＰＥＯＺ誘導体を、上に記載のとおりに生成物Ｍ−ＰＥＯＺ−ＯＨから調製した。Ｍ−ＰＥＯＺ−ＮＨ２とＰＥＧ−ＮＨ２のＧ−ＣＳとのＴＧＡｓｅ触媒共役を、Ｇ−ＣＳＦ１．６ｍｇ、どちらかのアミンの５０ｍｇ、およびＴＧＡｓｅ（市販）２ｍｇ／ｍｌを使用して、ｐＨ７．２、０．１Ｍのリン酸塩緩衝剤中で、室温で１８時間行った。これらの条件下で、Ｇ−ＣＳＦおよびＭ−ＰＥＯＺ−ＮＨ２の顕著なまたは明確な共役は発生しないが（逆相クロマトグラフィが示すとおり、上に詳述）、一方ＰＥＧ−ＮＨ２では明確な共役を得た。
【０２１１】
さらなる２ｍｇ／ｍｌのＴＧＡｓｅ酵素をＭ−ＰＥＯＺ−ＮＨ２反応混合物に加えると、天然Ｇ−ＣＳＦタンパク質のピークは下降し、共役Ｍ−ＰＥＯＺ−Ｇ−ＣＳＦを示す新規のピークが観察された。
【０２１２】
実施例２８．Ｍ−ＰＥＯＺアルデヒドの調製
【０２１３】
【化１６】
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【０２１４】
ジオールの調製
ｐＨ８．０の０．１Ｍホウ酸緩衝剤（３ｍＬ）中の３−アミノ−ｌ、２−プロパンジオール（１．４１ｇｍ、１５ｍｍｏｌ）をガラスバイアル中で調製した。濃縮ＨＣｌを使用して溶液のｐＨをｐＨ９に調節した。この溶液に、上に記載のとおりに調製したＭ−ＰＥＯＺＮＨＳエステル（１．００ｇｍ、０．１９７ｍｍｏｌ）を激しく攪拌しながら加えた。１ＮのＮａＯＨを加えて溶液のｐＨを９に維持した。溶液を室温で３時間放置して攪拌した。１ＮのＨＣｌを使用して溶液のｐＨをｐＨ６．８に調節した。この溶液に、塩化ナトリウム（３ｇｍ）を加えた。この溶液に水（１ｍＬ）を加え、続いてジクロロメタン（３ｘ１０ｍＬ）で３回抽出した。水相を廃棄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、回転蒸発によって濃縮した。濃縮した溶液をジエチルエーテル（１００ｍＬ）中に沈殿させた。得られた粉末を一晩高真空で乾燥させた。収量０．７ｇｍ。ＮＭＲでは置換は９６％、およびＧＦＣでは９５％であった。ＤＭＳＯ−ｄ６のＮＭＲ：−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＨ：１Ｈ、δ４．４９、ｔ；−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＨ：１Ｈ、δ４．７０、ｄ；−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＨ：１Ｈ、δ７．８７、ｔ（不十分な解析）。
アルデヒドへの酸化
ジオール（０．５００ｇｍ、０．１１２ｍｍｏｌ）を水（８ｍＬ）に溶解した。０．１ＮのＮａＯＨを加えて溶液のｐＨを６．８５に調節し、続いて過ヨウ素酸ナトリウム（２７．９ｍｇ、０．１３０ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を室温で１時間攪拌した。水（２ｍＬ）とＮａＣｌ（２ｇｍ）をこの溶液に加えた。溶液をジクロロメタン（３ｘ１０ｍＬ）で３回抽出した。混合した有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。混合物を濾過し、続いて濾液を減圧下で濃縮した。残留物をエチルエーテル（５０ｍＬ）に加えることによって沈殿させた。濾過に続いて、得られた粉末を高真空下で乾燥させた。収量０．４７ｇｍ。Ｍｎは、ＧＰＣによって４８４０Ｄａと決定された。アルデヒドの置換はＣＤＣｌ３のＮＭＲによると８９％であった。ＣＤＣｌ３のＩＨ−ＮＭＲ：−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨＯ、ＩＨ、δ９．６３５、ｓ；−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨＯ、２Ｈ、δ４．１７５、ｑ（良好に解析されなかった）。
【０２１５】
実施例２９．Ｍ−ＰＥＯＺ−ＰＮＰＣからのＭ−ＰＥＯＺマレイミド２Ｋの合成
【０２１６】
【化１７】
0005615558.tif 000026
【０２１７】
上に記載のとおりに調製したＭ−ＰＥＯＺ  ｐ−ニトロフェニル炭酸塩（Ｍｎ２１５０Ｄａ、０．５００ｇ、０．２３２ｍｍｏｌ）を、塩化メチレン（５ｍＬ）中のＮ−（２−アミノエチル）マレイミドトリフルオロ酢酸塩（０．０６５ｇ、０．２５５ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（０．０９７ｍＬ、０．６９６ｍｍｏｌ）の混合物に加えた。室温で１８時間攪拌後、この混合物を濾過し、次に滴下でジエチルエーテル中に加えると、淡黄色の沈殿物を得た。溶剤をデカンタし、固形物を真空下で乾燥すると、定量的収量を得た。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルでは、通常の骨格ピークに加えて、末端メチレンプロトン（−ＣＨ２−ＯＣＯ−ＮＵ−）を４．１５ｐｐｍ（ｂｒ  ｓ、２Ｈ）で示し、マレイミドに関連するプロトンを６．７２ｐｐｍ（ｓ、２Ｈ）で示した。収率は、開始メチル基およびマレイミドの積分の比較によって約８０％と算出された。
【０２１８】
実施例３０．イソニペコチン酸エチルを経由したＭ−ＰＥＯＺ  ＮＨＳエーテルの合成
【０２１９】
【化１８】
0005615558.tif 000027
【０２２０】
エチルエーテルの合成
メチルトリフラート（２．８３ｍＬ、２５．０ｍｍｏｌ）をクロロベンゼン（２５０ｍＬ）中の２−エチル−２−オキサゾリン単量体（５０．４７ｍＬ、０．５００ｍｏｌ）の水溶液に室温で加えた。１０分間攪拌後、反応混合物を１１０℃まで４０分間加熱した。反応混合物を０℃に冷却し、次にイソニペコチン酸エチル（１１．５５ｍＬ、７５．０ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で２時間攪拌した後、これをエーテル（１５００ｍＬ）中に沈殿して白色粉末５７ｇを得た。沈殿物を２００ｍＬのＨ２Ｏに溶解し、次に２００ｍＬの塩化メチレンで３回抽出した。混合した有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮した。粘り気のある油状の残留物をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）に溶解し、ジエチルエーテル（１０００ｍＬ）に沈殿させた。溶剤をデカンタした後、残留物を真空中で乾燥させ、白色粉末４３．５ｇを収率８６％で提供した。ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、１０ｍｇ／ｍＬ  ＣＤＣｌ３）では、１．１２ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−）、２．３１ｐｐｍ（小さいｓ）および２．４１（大きいｓ）（総面積２Ｈ、ＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−）、および３．４６ｐｐｍ（ｓ、４Ｈ、−ＮＣＨ２ＣＨ２Ｎ−）で通常の骨格ピークを示す。開始メチルのピークは、２．９ｐｐｍ（小）および３．０３ｐｐｍ（大）（ＣＨ３−ＮＣＨ２ＣＨ２）で２つの一重項として出現する。ピペリジンのピークは、１．６８ｐｐｍ（ｂｒ  ｓ、３Ｈ）、１．９０ｐｐｍ（ｂｒ  ｓ、２Ｈ）、２．１５ｐｐｍ（ｂｒ  ｓ、２Ｈ）、および２．８４ｐｐｍ（ｂｒ  ｓ、２Ｈ）で示される。末端エチルエステルのピークは、１．２６ｐｐｍ（ｔ、３Ｈ、Ｊ＝７．０ＭＨｚ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ２ＣＨ３）および４．１３ｐｐｍ（ｑ、２Ｈ、Ｊ＝６．５ＭＨｚ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ２ＣＨ３）で出現する。ＧＰＣでは、Ｍｎ＝１７７０ＤａおよびＰＤ＝１．０６を示す。ＭＡＬＤＩでは、Ｍｎ＝２０５０ＤａおよびＰＤ＝１．０２を示す。
酸の合成
Ｍ−ＰＥＯＺエチルエーテル（Ｍｎ＝２０５０Ｄａ、１０．０ｇ、４．８９ｍｍｏｌ）をＨ２Ｏ（６０ｍＬ）に溶解した。Ｈ２Ｏ（２０ｍＬ）中のＮａＯＨ（０．９７７ｇ、２４．４ｍｍｏｌ）溶液を加え、混合物を４０分間攪拌した。混合物を５％ＨＣｌ水溶液で酸性化し、次にジクロロメタンで抽出した。混合された有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、エーテルに加えることにより沈殿させた。エーテルをデカントし、残留物を真空下で乾燥すると白色粉末９．０ｇを９１％収率で得た。１Ｈ  ＮＭＲは、エチルエステル基のピークが加水分解によって完全に消失したことを示した。
ＮＨＳエステルの合成
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．１７３ｇ、１．５０ｍｍｏｌ）およびＤＣＣ（０．３１０ｇ、１．５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５０ｍＬ）中のＭ−ＰＥＯＺ−ＣＯ２Ｈ（Ｍｎ２０２０Ｄａ、３．０ｇ、１．４９ｍｍｏｌ）の溶液に０℃で加えた。この低温で２時間攪拌した後、混合物を室温まで加温し、一晩攪拌した。混合物を濾過し、濾液をジエチルエーテルに加えると白色粉末を得た。生成物を濾過によって採取し、真空下で乾燥させた（２．８ｇ、収率９３％）。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、２．８９ｐｐｍ（ｓ、２Ｈ）でスクシニミジルプロトンおよび通常の骨格ピークを示した。
【０２２１】
実施例３１．Ｍ−ＰＥＯＺ−メシラートの試行的調製
【０２２２】
【化１９】
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上に記載のとおり、Ｍ−ＰＥＯＺ−ＯＨ  ２Ｋを調製した。Ｍ−ＰＥＯＺ−ＯＨ  ２Ｋ（１．００ｇｍ、０．６０８ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリル（２０ｍＬ）に溶解し、回転蒸発器でほぼ乾燥するまで蒸発させた。残留シロップをアセトニトリル（２０ｍＬ）に再度溶解し、回転蒸発でほぼ乾燥するまで蒸発させた。無水ジクロロメタン（５ｍＬ）を加えた。低速のアルゴン流下で、トリエチルアミン（１６９．３μＬ、１．２１５ｍｍｏｌ）、続いて塩化メシル（８４．６μＬ、１．０９４ｍｍｏｌ）を加えた。溶液をアルゴン雰囲気下で放置して室温で一晩攪拌した。溶液を回転蒸発によって濃縮した。濃縮した溶液を、ジエチルエーテルに加えることによって沈殿させた。沈殿物を採取して、高真空下で乾燥させた。収量０．６ｇｍ。ＣＤＣｌ３におけるＮＭＲでは、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＭｓ（δ４．４４）のピークを示が、面積は約５０％変換のみと一致する。−ＯＭｓの置換の低さは、メシラートの形成に続くオキサゾリニウムイオンを形成する副反応に起因する。ＣＤＣｌ３におけるＮＭＲは、δ５．０１（２Ｈ、ｔ、正電荷を持つ５員環：−０−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ）およびδ４．４４（２Ｈ、ｔ、同一の５員環：−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ、−ＣＨ２−ＯＭｓと同一の移動）でピークを示す。
【０２２３】
実施例３２．Ｍ−ＰＰＯＺ−ＯＨの合成
【０２２４】
【化２０】
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【０２２５】
メチルトリフラート（ＭｅＯＴｆ、２５．０μＬ、０．２２１ｍｍｏｌ）を、新たに乾燥させ、蒸留したクロロベンゼン（２ｍＬ）と混合した、新たに乾燥させ、蒸留した２−ｎ−プロピル−２−オキサゾリン（０．５００ｇ、４．４２ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。１０分間攪拌した後、混合物を１１０℃まで２０分間加熱した。混合物を０℃に冷却し、メタノール（２ｍＬ）中のＮａＯＨ（０．０４４ｇ、１．１１ｍｍｏｌ）の水溶液を使用して末端停止した。ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、１０ｍｇ／ｍＬ  ＣＤＣｌ３）は、０．９５ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−）、１．６５ｐｐｍ（ｓ、２Ｈ、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−）、２．２５ｐｐｍ（小さいｓ）および２．３４（大きいｓ）（総面積３Ｈ、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−）、および３．４５ｐｐｍ（ｓ、４Ｈ、−ＮＣＨ２ＣＨ２Ｎ−）で骨格ピークを示す。開始メチルのピークは２．９４ｐｐｍ（小）および３．０３ｐｐｍ（大）（ＣＨ３−ＮＣＨ２ＣＨ２、総面積３Ｈ）で２つの一重項として出現する。末端メチレン（−ＯＣＨ２−ＯＨ）は３．８ｐｐｍで出現する。粗混合物のＧＰＣでは、Ｍｎ＝１７６０ＤａおよびＰＤ＝１．１を示した。
【０２２６】
実施例３３．Ｍ−ＰＰＯＺ−チオ−プロピオン酸の合成
【０２２７】
【化２１】
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【０２２８】
クロロベンゼン（２５ｍＬ）中の２−プロピル−２−オキサゾリン（５．６６ｍＬ、５０ｍｍｏｌ）およびメチルトリフラート（０．８０８ｍＬ、７．１４ｍｍｏｌ）を使用してＭ−ＰＥＯＺ＋を上記に示すとおりに調製し、１１０℃まで２５分間加熱し、次に０℃に冷却した。末端停止試薬を得るため、メチル３−メルカプトプロピオン酸（３．０９ｍＬ、２８．６ｍｍｏｌ）をクロロベンゼン（１４ｍＬ）中のカリウムｔｅｒｔ−ブトキサイド懸濁液（１．６０ｇ、１４．３ｍｍｏｌ）に滴下で０℃で加えた。混合物を２時間その低温で攪拌した後、クロロベンゼン中のＭ−ＰＥＯＺ＋の溶液を、注射器を使用して滴下で加えた。混合物をその低温で４時間攪拌し、次に室温で１８時間攪拌した。水（３０ｍＬ）を加え、５％のＨＣｌ水溶液を追加することによって混合物を酸性化（約ｐＨ３）した。クロロベンゼンを含む揮発物を回転蒸発を使用して除去した。得られた水溶液をＨ２Ｏ（６０ｍＬ）および固体ＮａＯＨ（１．４３ｇ、３５．７ｍｍｏｌ）で希釈した。１時間攪拌後、混合物を５％のＨＣｌ水溶液で酸性化し、次にジクロロメタンで抽出した。混合した有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、エーテルに加えることにより沈殿させた。エーテルをデカントし、残留物を真空下で乾燥させると、粘性のある透明な黄色油を得た。ＧＰＣでは、Ｍｎが８６７Ｄａ、ＰＤが１．０１の単一の主ピークを示した。ＧＦＣでは、粗生成物が２つの異なる種、すなわちＭ−ＰＰＯＺ−Ｔ−ＣＯ２Ｈ（８０％）およびＭ−ＰＰＯＺ−Ｔ−ＯＨ（２０％）を含むことを示した。
【０２２９】
実施例３４．Ｍ−ＰＥＯＺ−Ｔ−レチノイン酸の合成
レチノイン酸（０．０１０２ｇ、０．０４２５ｍｍｏｌ）とヒドロキシベンズトリアゾール（ＨＯＢｔ、０．０１１５ｇ、０．０８４９ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１０ｍＬ）に溶解し、回転蒸発を使用して共沸した。残留物をジクロロメタン（３ｍＬ）に再溶解した。固形のＤＣＣ（０．００８８ｇ、０．０４２５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を２時間攪拌した。４３００ＤａのＭ−ＰＥＯＺ−ＮＨ２（０．１２２ｇ、０．０２８３ｍｍｏｌ）を混合物に加え、放置して４０時間攪拌させた。混合物をジエチルエーテルにゆっくりと加えると、黄白色粉末を得た。生成物を濾過し、乾燥すると、生成物０．０８２３ｇを収率６３％で得た。
【０２３０】
実施例３５．Ｍ−ＰＥＯＺ−ＳＣＭによるＡｒａ−Ｃの修飾および共役活性  ＰＯＺ−共役
Ｍ−ＰＥＯＺ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ２−ＮＨＳ（Ｍ−ＰＥＯＺ−ＳＣＭ５０００）（１８０ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）をピリジン１１ｍＬに溶解し、無水ピリジン５ｍＬに事前に溶解したシトシンアラビノースの溶液（Ａｒａ−Ｃ）（５．７ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）に０℃で加えた。得られた溶液を、７２時間室温で攪拌した。逆相ＨＰＬＣ（Ｃ−１８カラム）は反応の完了を示した。溶剤の蒸発後、生成物を塩化メチレン（５ｍＬ）に溶解し、１５０ｍＬエーテルに一滴ずつ加えた。沈殿物を遠心分離で４oＣで採取し、真空下で乾燥させた。収量１５０ｍｇ、８０％。ＮＭＲは、通常のＭ−ＰＥＯＺ骨格（上記）に加えて、７．３１、７．６７、８．１６、および８．６２ｐｐｍで、Ａｒａ−Ｃのピリミジンプロトンのピークを示した。共役のｐＨ８緩衝剤への曝露は、Ａｒａ−Ｃがゆっくりと放出されることを示し（２４時間後で１５％）、しかるに共役はプロドラッグと見なされ得る。
共役活性
標準的な手順で培養したヒト頚部腺癌細胞（ＨｅＬａ）を、２４ウェル細胞培養プレートの各ウェルの中に播種した。２４時間後、培地を新鮮培地と取替え、細胞をＭ−ＰＥＯＺ−Ａｒａ−Ｃまたは遊離Ａｒａ−Ｃ（Ａｒａ−Ｃ中２０ｍＭ）の水溶液で濃度を上昇させながら処理した。細胞を標準状態で７２時間培養した。Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅアッセイを実施して、細胞の生存を判定した。このアッセイにより、共役されたＡｒａ−Ｃは、ＨｅＬａ細胞に対して細胞障害性であることが示されたが、遊離Ａｒａ−Ｃと比較して３０分の１の細胞障害性であり、共役の持続放出プロセスと一致する。類似の手法で調製されたＰＥＧ−Ａｒａ−Ｃと比較すると、ＰＥＧ−とＰＯＺ−複合体は類似の特性を有することが示された。
【０２３１】
実施例３６．Ｈ−ＰＥＯＺ−Ｓ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ２Ｈの合成
クロロベンゼン（２５ｍＬ）と２−エチル−２−オキサゾリン（９．９２ｇ、０．１ｍｏｌ、２００等量）を周囲温度でアルゴン下で混合し、０℃に冷却した。トリフルオロメタンスルホン酸（０．０７５ｇ、１等量）を攪拌しながら加え、反応混合物を３０分間攪拌した。混合物を次に８０℃まで加熱し、７時間攪拌した。カリウムｔ−ブトキサイド（１６８ｍｇ、３等量）およびメチル３−メルカプトプロピオン酸（０．３６０ｇ、６等量）を０℃で６時間反応させることにより、末端停止混合物を別個に調製した。末端停止混合物を重合反応物に０℃で加え、次に室温で一晩攪拌した。溶液を次に０．２５Ｍの水酸化ナトリウム５０ｍＬと混合し、１時間攪拌した。水層を分離し、塩化ナトリウムで飽和し、塩化メチレン（２５０ｍＬｘ３）で抽出した。塩化メチレンを回転蒸発で除去し、重合体を真空下で乾燥させた。
【０２３２】
得られた酸をＤＥＡＥクロマトグラフィで精製すると、１．５グラムの白色粉末を得た。プロトンＮＭＲは、１．１２ｐｐｍ（ｍ、３Ｈ、ＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−）、２．３１ｐｐｍ（ｍ）および２．４１ｐｐｍ（ｓ）（面積２Ｈ、ＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−）、および３．４７ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、−ＮＣＨ２ＣＨ２Ｎ−）．で通常の骨格ピークを示した。プロピオン酸塩メチレンのピークは、２．７４、２．８１および２．８５ｐｐｍで出現した。ＧＦＣでは、単一のピークが示された。ＧＰＣでは、Ｍｎが１５、２００Ｄａ、ＰＤが１．０９であった。
【０２３３】
前述の記載は、本開示の化合物および用途のある実施形態を説明し記載する。また、本開示は、本願の化合物および用途の例示的な実施形態のみを示し、説明するものであるが、上に記載の通り、本開示の教示は種々の他の組み合わせ、変更、および環境において使用することができ、本願に示すように、上記の教示および／または関連する技術分野における技術または知識に相応する理念の範囲内で変更することができるものと理解されたい。上に記載の実施形態は、本発明を行う者が知る最良の形態をさらに説明し、当業者が本発明をかかる、もしくは他の実施形態において、本発明の特定の用途または使用によって必要とされる種々の変更とともに、利用することを可能にすることを意図する。したがって、本願の説明は、本発明の本願に開示される形態への制限を意図するものではない。本願に引用されるすべての参考文献は、本開示に完全に記載されるごとく参照によって組み込まれる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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