(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
亜鉛強化バイオマスの製造方法であって、該バイオマスが、
（ｉ）亜鉛塩を含む栄養培養培地中、２００５年１２月２３日に受託番号ＤＳＭ１７８５０として、ドイツ、ブラウンシュヴァイクのＤＳＭＺにブダペスト条約に基づいて寄託されたビフィドバクテリウム・アニマリス  サブスピーシーズ  ラクチスＢＢ  １  ＢＭ、２００７年７月１３日に受託番号ＤＳＭ１９５２６として、ドイツ、ブラウンシュヴァイクのＤＳＭＺにブダペスト条約に基づいて寄託されたストレプトコッカス・サーモフィルス  ＳＴ  １６  ＢＭおよびそれらの組み合わせからなる群から選択された微生物を培養して、その結果、該微生物が亜鉛を蓄積し；次いで、
（ｉｉ）該亜鉛強化微生物を培養培地から分離すること
によって得られることを特徴とする方法。
【請求項２】
培養培地から分離される微生物が、凍結乾燥、乾燥、マイクロカプセル化、および／または凍結に供される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
亜鉛塩が硫酸亜鉛である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
栄養培養培地が、５〜５０ｍＭの範囲の硫酸亜鉛量を含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
栄養培養培地が、１０〜４０ｍＭの範囲の硫酸亜鉛量を含む、請求項３記載の方法。
【請求項６】
培養培地が液体培地である、請求項１ないし５のいずれか一つに記載の方法。
【請求項７】
培養培地が、無機塩類、炭素、窒素、ビタミン類および微量栄養源およびそれらの混合物からなる群から選択される微生物の成長のための従来の栄養分を含む、請求項１〜６のいずれか一つに記載の方法。
【請求項８】
培養培地が、２．５から８．０までの範囲のｐＨを有する、請求項１〜７のいずれか一つに記載の方法。
【請求項９】
培養培地が、３．５から７．５までの範囲のｐＨを有する、請求項１〜７のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１０】
微生物が、培養培地中、２５℃から４８℃までの範囲の温度で培養される、請求項１〜９のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１１】
微生物が、培養培地中、３５℃から４５℃までの範囲の温度で培養される、請求項１〜９のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１２】
微生物が、培養培地中、６〜４０時間培養される、請求項１〜１１のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１３】
微生物が、培養培地中、８〜３６時間培養される、請求項１〜１１のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１４】
微生物が、遠心分離または精密濾過法によって培養培地から分離される、請求項１〜９のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一つに記載の方法によって入手可能な亜鉛強化バイオマス。
【請求項１６】
２００７年７月１３日に受託番号ＤＳＭ１９５２６として、ドイツ、ブラウンシュヴァイクのＤＳＭＺにブダペスト条約に基づいて寄託されたストレプトコッカス・サーモフィルス  ＳＴ  １６  ＢＭ、および、２００５年１２月２３日に受託番号ＤＳＭ１７８５０として、ドイツ、ブラウンシュヴァイクのＤＳＭＺにブダペスト条約に基づいて寄託されたビフィドバクテリウム・アニマリス  サブスピーシーズ  ラクチスＢＢ  １  ＢＭからなる群から選択される微生物を含む、請求項１５記載のバイオマス。
【請求項１７】
生きている微生物を含む、請求項１５または１６記載のバイオマス。
【請求項１８】
プロバイオティック剤としての、請求項１７記載のバイオマス。
【請求項１９】
プロバイオティック活性を有する組成物の製造のための、請求項１７記載のバイオマスの使用。
【請求項２０】
プロバイオティック活性を有する組成物が、食物サプリメント、ダイエタリー品、機能性食品、栄養補給品および食物調製物からなる群から選択される、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
死んだ微生物を含む、請求項１５または１６記載のバイオマス。
【請求項２２】
化粧品または食品の製造のための、請求項２１記載のバイオマスの使用。
【請求項２３】
適当なビヒクルおよび／または賦形剤と共に請求項１７記載の生きている亜鉛強化バイオマスを含む、プロバイオティック活性を有する組成物。
【請求項２４】
少なくとも１０９ＣＦＵ／ｇの細菌負荷を有する、請求項２３記載の組成物。
【請求項２５】
請求項２３または２４記載の組成物を含む、食物調製物、食物サプリメント、ダイエタリー品、機能性食品、栄養補給品または薬用化粧品。
【請求項２６】
請求項２１記載のバイオマスを含む化粧品または食品。
【請求項２７】
２００７年７月１３日に受託番号ＤＳＭ１９５２６として、ドイツ、ブラウンシュヴァイクのＤＳＭＺにブダペスト条約に基づいて寄託されたストレプトコッカス・サーモフィルス  ＳＴ  １６  ＢＭ、および、２００５年１２月２３日に受託番号ＤＳＭ１７８５０として、ドイツ、ブラウンシュヴァイクのＤＳＭＺにブダペスト条約に基づいて寄託されたビフィドバクテリウム・アニマリス  サブスピーシーズ  ラクチスＢＢ  １  ＢＭからなる群から選択される微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、亜鉛強化（zinc-enriched）バイオマス、その調製方法、ならびに、それを含む食糧品、プロバイオティック品、ダイエタリー品、栄養補給品および化粧品に関する。本発明は、さらに、本発明の方法で用いられるために適した菌株に関する。
【背景技術】
【０００２】
亜鉛は、鉄を除くいずれか他の少数元素より大量に生体に存在する必須無機物である。それは、ビタミン（特に、ビタミンＢ群）の正常な吸収および活性と関連がある。それは、組織呼吸のために必要な消化および代謝において役割を果たす数多くの酵素（炭酸脱水酵素を含む）の構成元素である。人体において、亜鉛は、特に、骨、歯、皮膚、肝臓、筋肉および毛髪において見られる。亜鉛は、小腸の上部に急速に吸収される。亜鉛は、また、特定の眼組織、前立腺、精子、皮膚、毛髪、爪に蓄積され、白血球にも見られる。これらの供給は容易に使用できず、従って、食物は生体要求を満たすためにその充分な量を含まなければならない。それは、身体の成長、組織修復、および正常な免疫応答のために不可欠である。それは、また、炭水化物消化およびリン代謝にとっても重要である。それは、細胞中で様々なタンパク質の生成を制御する核酸の合成に関与し、ビタミン吸収にとって重要であり、治癒プロセスに有用であり、そして、細菌、酵母および皮膚腐生菌リパーゼを阻害する。非常に多くの酵素が活性であるために亜鉛を必要とし、それは、タンパク質合成、ホルモン機能の特定の態様、脳機能、視力および味覚のために必要である。さらに、アルコール分解に関与するアルコールデヒドロゲナーゼ酵素は亜鉛を含有するので、アルコールは亜鉛の喪失を引き起こす。亜鉛は、内外の創傷の治癒プロセスにおいて（それは、創傷治癒を加速する）、ざ瘡および脂漏性皮膚炎の治療において、皮脂性分泌物を減少させるために用いられる。該金属は、血中インシュリンに対するその調節効果のため、円形脱毛症全頭脱毛症（ａｌｏｐｅｃｉａ  ａｅｒａｔａ  ｔｏｔａｌｉｓ）を患う人の毛髪再成長を促進することができ、また、糖尿病治療において用いられることができる。インシュリンに対する亜鉛の添加は、血糖値に対するホルモンの影響を延長することがわかった。
【０００３】
亜鉛欠乏症は、すべての生物において重篤な障害を引き起こす。特定の薬物、なかでも、抗ＭＡＯ（抗モノアミンオキシダーゼ）、コルチコステロイド、利尿薬が亜鉛欠乏症を誘発しうることが知られている。亜鉛欠乏症は、成長遅延、性成熟の遅延、および創傷治癒の長期化を引き起こすことができる。亜鉛欠乏症は、また、アテローム性動脈硬化症を導き、また、感染に対する感受性を高めることもできる。皮膚線条および爪白斑は、亜鉛欠乏症の症状である可能性がある。亜鉛欠乏症の他の症状は、もろい爪および毛髪、毛髪色素の欠乏、青年期女子の不規則な月経周期、若年男性の性的不能、および青年期の膝および関節の痛みである。慢性の亜鉛欠乏は、体細胞に癌の素因を与えることさえある。わずかな亜鉛欠乏症でさえ生体に有害であり、例えば、それらは、精子濃度の減少および性的不能を左右することができる。さらに、亜鉛欠乏症は、疲労、感染症にかかるかまたは創傷を経験するより高い可能性、および精神的敏捷性の低下を引き起こす。実際、亜鉛欠乏症は、エネルギー生産、タンパク質合成、コラーゲン形成およびアルコール耐性を妨げる。
【０００４】
プロバイオティック剤と組み合わせて亜鉛を含有する食物またはダイエット組成物は、従来技術に記載されている。
【０００５】
例えば、米国特許出願第２００７０００９５０２Ａ号は、胃腸ミクロフローラの改善または維持のために設計された動物飼料のための栄養組成物を記載し、それは、プロバイオティック剤（例えば、酵母および／または細菌、例えば、ビフィドバクテリウム、エンテロコッカスまたはラクトバシラス）、プレバイオティック剤、グルタミンまたはその類似体、グルコース、グリシン、電解質、ビタミン類、およびミネラル亜鉛（１００−２００ｍｇ／ｋｇ）を包含する無機物を含む。
【０００６】
特許出願第ＷＯ２００６／１１２９９８号は、成長が遅延している母乳育ちの乳児の成長を促進するように設計された人乳と組み合わせて用いられるべき液状栄養補助剤を記載し、それは、多くの材料、なかでも、プロバイオティック剤（例えば、ラクトバシラスおよび／またはビフィドバクテリウム）、および亜鉛を包含する無機物を含む。
【０００７】
特許出願第ＣＡ２５２５３４２Ａ号は、例えば疾病に対する免疫応答を改善するための、食物補助剤に有用な幅広い範囲のプロバイオティック食物調製物を記載し、それは、ラクトバシラス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・カゼイ・サブスピーシーズ・プソイドプランタルム（Lactobacillus casei sbp. pseudoplantarum）、ラクトバシラス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）およびラクトバシラス・カゼイ（Lactobacillus casei）の特定の菌株をさらなる補助成分、リンカーおよびエネルギー成分（亜鉛を包含する）と組み合わせて含む。
【０００８】
上述の先行文献は、ヒトまたは動物の体内で亜鉛のデリバリーに適した組成物を記載し、ここに、亜鉛は無機亜鉛の形であり、プロバイオティック微生物を包含する多くの他の材料と組み合わされている。
【０００９】
これらの組成物には、排他的に無機形態の亜鉛を含むという不利な点があり、それを人体が吸収するのは、有機亜鉛よりも困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】ＵＳ２００７０００９５０２Ａ
【特許文献２】ＷＯ２００６／１１２９９８
【特許文献３】ＣＡ２５２５３４２Ａ
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明者らは、今回、ビフィドバクテリウムおよびストレプトコッカス属に属している特定の細菌種、特にビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）およびストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）種が、無機亜鉛を含有する培養培地において成長するときに、バイオマス自体の生存に有害なような大量の細胞内亜鉛を伴うことなく、細胞内に極めて大量の亜鉛を蓄積するという予想外な有利な能力を示すことを見出した。細胞内に亜鉛を蓄積するこのような能力は、上記の細菌種を、定義上、生きているバイオマスを含有しなければならないプロバイオティック製品の製造に特に有用なヒトまたは動物の体内での亜鉛のデリバリー手段としての用途に特に適したものとする。本発明の亜鉛強化バイオマスは、また、特に化粧品（cosmetic）または薬用化粧品（cosmeceutic）の製造のために、化粧品への応用において用いられてもよい。化粧品の製造の場合、バイオマスは死んだ微生物で構成される必要があり、一方、薬用化粧品の製造の場合、バイオマスは生きている微生物で構成される必要がある。
【００１２】
かくして、本発明の目的の１つは、
（ｉ）亜鉛塩を含む栄養培養培地中、ビフィドバクテリウム・アニマリス、ストレプトコッカス・サーモフィルスおよびそれらの組み合わせからなる群から選択された微生物を培養して、その結果、該微生物が亜鉛を蓄積し；次いで、
（ｉｉ）該亜鉛強化微生物を培養培地から分離すること
によって得られることを特徴とする亜鉛強化バイオマスの製造方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
（原文に記載なし）
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下に報告される研究から明らかなように、細胞内に蓄積された大量の亜鉛を含有する生きている微生物を含むバイオマスは、本発明の方法によって達成される。
【００１５】
本発明の亜鉛強化バイオマスの製造方法は、微生物が亜鉛塩、好ましくは硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ４）で補充されたビフィドバクテリウムおよびストレプトコッカス属由来の微生物の成長に適した栄養培地で培養される第１の発酵ステップを提供する。栄養培地は、好ましくは、炭素源（例えば、グルコースおよび／またはラクトース）、窒素源（例えば、ペプトン、カゼイン水解物、酵母抽出物）、無機塩類、微量元素およびビタミン源を含有する液体培地である。
【００１６】
培養培地中の亜鉛塩の濃度は、好ましくは、５〜５０ｍＭ、さらにより好ましくは、１０〜４０ｍＭである。
【００１７】
硫酸亜鉛が好ましい。
【００１８】
発酵は、好ましくは、２５℃〜４８℃、より好ましくは、３５℃〜４５℃の温度で実施される。液体培地のｐＨ値は、好ましくは２．５〜８．０、より好ましくは、３．５〜７．５である。発酵時間の長さは、好ましくは、６〜４０時間、より好ましくは、８〜３６時間である。発酵は、好気性、微好気性および／または、嫌気性条件下で実施されてもよい。
【００１９】
発酵ステップの後、その間、細菌細胞内でバイオマス成長および亜鉛蓄積が起こるが、得られたバイオマスは、任意の適切なそれ自体が公知の方法、例えば、遠心分離法または精密濾過法によって、細胞の生存を危うくしないような方法で、培養培地から分離される。こうして、本発明の方法によって、生きている微生物を含む亜鉛強化微生物バイオマスが得られる。所望により、得られたバイオマスを次いで、常法に従って実施される凍結乾燥、乾燥、マイクロカプセル化および／または冷凍に付してもよい。
【００２０】
また、ストレプトコッカス・サーモフィルスおよびビフィドバクテリウム・アニマリス種由来の２つの微生物株は細胞内で亜鉛を蓄積する特に高い能力を付与されているので、本発明者らは、特に本発明の方法の使用に適していると証明されたこれらの株を選択した。このような株は、ストレプトコッカス・サーモフィルス  ＳＴ  １６  ＢＭおよびビフィドバクテリウム・アニマリスサブスピーシーズ  ラクチス  ＢＢ  １  ＢＭと称され、各々、受託番号ＤＳＭ１９５２６として２００７年７月１３日にストレプトコッカス・サーモフィルス  ＳＴ  １６  ＢＭ、および受託番号ＤＳＭ１７８５０として２００５年１２月２３日にビフィドバクテリウム・アニマリス  サブスピーシーズ  ラクチスＢＢ  １  ＢＭとして、ブタペスト条約に基づいてＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｆｕｅｒ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ，  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）に寄託された。
【００２１】
上述したように、本発明の方法によって達成可能な亜鉛強化バイオマスは、有機形態におけるよりも高い亜鉛濃度を有するという点で、プロバイオティック剤としての用途に特に適している。
【００２２】
この目的のために、生きている微生物を含む、したがって、プロバイオティック活性を有するバイオマスは、種々の形態で調製されうる。例えば、プロバイオティック活性を有する食物調製物を得るために、食品、好ましくは、ミルクまたは乳製品（例えば、ヨーグルト）に加えることができる。別法では、プロバイオティック活性を有する組成物（例えば、食物サプリメント、ダイエタリー品、機能性食品）の製造のために、または適切なビヒクルおよび／または賦形剤と併用される経口投与のための非食物調製物（例えば、栄養補給品）の製造のために用いられてもよい。この目的のために、バイオマスは、好ましくは、それ自体が凍結乾燥または乾燥組成物の形態、および／またはマイクロカプセル化された組成物の形態で用いられる。
【００２３】
プロバイオティック活性を有する組成物においてその後に用いられるべき凍結乾燥または乾燥製品の細菌負荷は、少なくとも生成物の１０１０〜１０１１ＣＦＵ／ｇである。
【００２４】
凍結乾燥または乾燥製品の製造の場合、湿ったバイオマスを、保護剤、例えば、脱脂乳、ラクトース、グルコース、酵母抽出物、ジャガイモ澱粉、グルタミン酸ナトリウム、イノシトール、クエン酸ナトリウム、ゼラチン、マルトデキストリン、ステアリン酸マグネシウム、アスコルビン酸、ステアリン酸およびそれらの組み合わせを包含する液体培地、例えば、水または滅菌生理溶液中に懸濁する。
【００２５】
該凍結乾燥または乾燥製品は、次いで、例えば、好ましくは、製品の少なくとも１０９ＣＦＵ／ｇの細菌負荷を得るように、例えば、凍結乾燥のために上記したものから選択される不活性物質と共に、プロバイオティック剤の製造のために希釈される。凍結乾燥製品は、室温での安定性（１８−２４ヵ月）を増加させるために、マイクロカプセルに入れられてもよい。
【００２６】
バイオマスが死んでいなければならない製品、例えば、化粧品またはいくつかの食品（例えば、ベーカリー製品）の製造の場合、本発明の方法によって達成可能な亜鉛強化バイオマスは、死んだ細胞を得るために、自体既知の方法（例えば、乾燥）に付される。
【００２７】
以下の実験的なセクションは、説明として提供され、添付の請求の範囲に記載の本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００２８】
細胞内亜鉛の取り込み試験
総細胞内亜鉛含量を比較して、該金属の蓄積容量を細胞質または膜レベルで評価するために、発明者らは、硫酸亜鉛を有する、または有さない培地上で生育するプロバイオティック微生物株についてスクリーニングを行った。
【００２９】
ＭＲＳインフィション（infission）中に保存されたビフィドバクテリウム培養物を液体ＭＲＳ中に接種し、３７℃で嫌気的にインキュベートした。２４時間の生育期間後、それぞれ、液体ＭＲＳ単独の１２０ｍｌ（１０％ｖ／ｖ）および１０ｍＭのＺｎＳＯ４を補足した液体ＭＲＳの１２０ｍｌ（１０％ｖ／ｖ）に各々接種した。これらの培養物を３７℃の嫌気性条件下で４８時間培養した。同じ実験手順は、ストレプトコッカスの細胞内取り込みの試験を始めるために追随された。この場合、液体Ｍ１７培地が用いられ、培養物は、４２℃の嫌気性条件下で４８時間培養された。
【００３０】
生育期間の最後に、乾燥重量の測定のための小さいアリコートを保存しつつ、続けて、バイオマスを遠心分離によって培養培地から分離し、収集したバイオマスを無機化した。
【００３１】
バイオマスの無機化
全細胞内亜鉛を決定するために、細菌性細胞を完全に破壊し、バイオマスを下記のプロトコルに従って無機化した。
【００３２】
１００ｍｌの成長した培養物を４５００ｒｐｍで３０分間、遠心分離して（４℃まで冷却された遠心分離機、Beckman GS-15R centrifuge）、細胞を収集した。次いで、ペレットを４回、各回に１４０ｍｌの蒸留水で洗浄して、残留する亜鉛を上清から除去した。４回目の洗浄水を保持して、ＩＣＰ技術によってその亜鉛含量を分析した。
【００３３】
バイオマスは、硝酸ＨＮＯ３の水溶液で１：１比（ｗ／ｖ）にペレットを再懸濁することによって無機化した。無機化手法の最適化の間、細胞内亜鉛の完全な回収を達成するために、硝酸溶液の濃度を各々、０．６５％、６．５％および２０％に増大させて用いた。
【００３４】
かくして得られた各細胞懸濁液をスクリューキャップ管に移し、−２０℃で少なくとも２時間保管した。次いで、スクリューキャップ管を、管内での過剰な蒸発および圧力を回避するために、ドラフト下、恒温槽中１００℃にて３０分間解凍し、これらを、通気針を備えた栓で密封した。水溶液を室温で冷却し、反応蒸気が放出されるようにした。無機化手法の最後に、細胞懸濁液を４℃にて、１３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して、無機化抽出物を収集し、細胞細片を除去した。
【００３５】
ＩＣＰによる全亜鉛分析
ＩＣＰによる分析のために、試料を６５％濃ＨＮＯ３により２％に酸性化し、次いで、５ｍｌの最終容量まで再蒸留水で希釈した。これらの操作は、ドラフト下で実施された。かくして得られた水溶液を、完全に透明になるまで、０．８μｍの酢酸セルロース・フィルタ（Millex-AA, Millipore）を用いて濾過した。
【００３６】
試験下の菌株によって蓄積された細胞内亜鉛の定量は、ＩＣＰ−ＡＥＳ技術（OES - OPTIMA 4200 DV, Perkin Elmer）によって行われた。
【００３７】
該系は、４０ＭＨｚの周波数を使用する。プラズマ入射は、コンピュータ接続した電子システムによって自動化され、制御される。
【００３８】
使用されるアルゴンは、９９．９９％純粋でなければならず、その流量は、１リットル／分の可変増加により、常に、０〜２０リットル／分の範囲でなければならない。霧状試料流量は、１リットル／分の可変増加により、０〜０．０１リットル／分の質量流量値の範囲内で発生しなければならない。
【００３９】
噴霧器は、耐腐食性材料により製造されるので、該系は、ＨＣｌ、ＨＮＯ３、Ｈ２ＳＯ４、Ｈ３ＰＯ４の５０％（ｖ／ｖ）濃度、ＮａＯＨの３０％（ｖ／ｖ）濃度およびＨＦの２０％（ｖ／ｖ）濃度を有する溶液に耐えることができる。
【００４０】
分光光度計は、３８℃でサーモスタット・コンパートメントにあるポリクロメーターからなる。使用される検出方法は、ＣＣＤであり、読み出しは、ＵＶフィールドでされる。
【００４１】
以下の分析パラメータを使用した。
解像度：高
パージ・ガス・フロー：通常
読み込み遅延時間（秒）：４５
反復：３
読み込み時間：自動
最小時間：１．０００秒  −  最大時間：１０．０００秒
光源平衡遅延：１５秒
プラズマエーロゾルタイプ：湿
噴霧器運転開始条件：即時
【００４２】
未知の亜鉛濃度を得るために、２％ＨＮＯ３で酸性化した以下の標準溶液（０．５ｐｐｍ、１ｐｐｍ、２ｐｐｍおよび１０ｐｐｍ亜鉛）によって構築した検量線を使用した。
【００４３】
総細胞亜鉛量は、乾燥したバイオマスのグラム当たりの金属のｍｇにおいて示される。
【００４４】
蓄積された金属の総細胞内濃度は、得られた試料を２％ＨＮＯ３で酸性化することによって、上記のＩＣＰ−ＡＥＳ技術によって定義された。
【００４５】
図１は、ビフィドバクテリウムの異なる種の株において実施される取り込み試験において測定される細胞内亜鉛濃度（乾燥細胞重量のグラム当たりの細胞内亜鉛のｍｇとして示される）を報告する。詳細には、試験は、ビー・インファンティス（B. infantis）、ビー・ブレビ（B. breve）、ビー・ビフィダム（B. bifidum）、ビー・アニマリス（B. animalis）、ビー・ロングム（B. longum）の株において実施された。亜鉛不含ＭＲＳ培地で生育させた場合、分析された株の全てが０．０１〜０．２０ｍｇ／ｇＤＷという非常に低い細胞内亜鉛濃度を示す。１０ｍＭの硫酸亜鉛のＭＲＳ培養培地への添加は、細胞内亜鉛濃度の増加を誘導する。しかしながら、図１に示されるように、ビフィドバクテリウム・アニマリスサブスピーシーズ  ラクチス  ＢＢ  １  ＢＭ株（受託番号ＤＳＭ１７８５０；寄託日２００５年１２月２３日）を除く全ての種の株において、該内在化金属の濃度は、むしろ低く、０．７２ｍｇ／ｇＤＷ〜２．１２ｍｇ／ｇＤＷであり、ここに、細胞内亜鉛濃度は、最高５３．３２ｍｇ／ｇＤＷ（基底濃度の１．０００倍の増加）まで増加する。
【００４６】
図２に示されるように、比較可能な細胞内亜鉛値は、１０ｍＭ硫酸亜鉛（細胞内亜鉛濃度＝５９．３１ｍｇ／ｇＤＷ）で強化されたＭ１７培地上で生育させたストレプトコッカス・サーモフィルス  ＳＴ  １６  ＢＭ株（受託番号ＤＳＭ１９５２６；寄託日２００７年７月１３日）によって達成された（シリーズ１）。図２は、さらに、同じ培地上で生育させた場合、他のストレプトコッカス種、例えば、エス・サリバリウス（S. salivarius）、エス・フェシウム（S. faecium）およびエス・ラクチス（S. lactis）に属する菌株が非常に低い細胞内亜鉛蓄積能を明らかにすることを示す。さらにまた、該図は、該菌株を、硫酸亜鉛を添加しない同じＭ１７培地上で生育させた場合に検出される細胞内亜鉛濃度との比較を示す（シリーズ２）。
【実施例１】
【００４７】
１０ｍＭの硫酸亜鉛を添加した２００ｍｌのＭ１７培地（Merck）を５００ｍｌのフラスコ中で滅菌した。あらかじめ嫌気性条件下で４２℃にて２４時間生育させたストレプトコッカス・サーモフィルスＳＴ  １６  ＢＭの種培養（受託番号ＤＳＭ１９５２６；寄託日２００７年７月１３日）を１０％（ｖ／ｖ）の量でフラスコ中に接種した。次いで、培養物を嫌気的条件下、４２℃で４０時間生育させ続けた。該培養の最後に、２．７３ｘ１０９ＣＦＵ／ｍｌを得た。バイオマスを遠心分離によって収集し、上記の方法に従って処理および分析した。細胞によって蓄積された全亜鉛は、５９．３１ｍｇ／ｇＤＷであった。Ｄ．Ｗ．＝乾燥重量。
【実施例２】
【００４８】
実施例１のように、濾過によって別々に滅菌されたＳＢＦ３１培地＋１５ｍＭ  Ｚｎ２＋を用いる。ＳＢＦ３１培地：トリプトン  ２３ｇ／ｌ；ダイズ・ペプトン  １６ｇ／ｌ；酵母抽出物  １２ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ４  ０．２５ｇ／ｌ；Ｋ２ＨＰＯ４  ２．５ｇ／ｌ；アスコルビン酸  ０．５ｇ／ｌ；グルコース  ４５ｇ／ｌ；ジグリセロリン酸ナトリウム  １９ｇ／ｌ。
【００４９】
発酵時間：２１時間；生きている細胞の産生：５．３ｘ１０１０ＣＦＵ／ｍｌ；蓄積された亜鉛：５１．６７ｍｇ／ｇＤＷ
【実施例３】
【００５０】
実施例１のように、濾過によって別々に滅菌されたＳＢＦ３２培地＋３０ｍＭ  Ｚｎ２＋を用いる。２１時間後に、３．１５ｘ１０１０ＣＦＵ／ｍｌの生存能力を有する乾燥したバイオマス２．１ｇ／リットルが得られた。蓄積された亜鉛：６３．４２ｍｇ／ｇＤＷ。ＳＢＦ３２培地：トリプトン  ２３ｇ／ｌ；ダイズ・ペプトン  １６ｇ／ｌ；酵母抽出物  １２ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ４  ０．２５ｇ／ｌ；Ｋ２ＨＰＯ４  ２．５ｇ／ｌ；アスコルビン酸  ０．５ｇ／ｌ；ラクトース  ４５ｇ／ｌ；グリセリン  １９ｇ／ｌ。
【実施例４】
【００５１】
１０ｍＭの硫酸亜鉛が添加されたＭ１７培地（別々に濾過によって滅菌される）７１ｍｌに、あらかじめストレプトコッカス・サーモフィルスＳＴ  １６  ＢＭ（受託番号ＤＳＭ１９５２６；寄託日２００７年７月１３日）を嫌気的条件下で４２℃にて２４時間生育させた同じＭ１７培地＋１０ｍＭ硫酸亜鉛由来の種培養液５００ｍｌを接種した。発酵槽条件：１５０ｒｐｍ；０．５ｌ  エアー／ｌ／分；温度：４２℃；１０％ＮａＯＨで４．８（±０．２）に調整されたｐＨ；発酵時間：２１時間。２．７５ｘ１０１０ＣＦＵ／ｍｌが得られた。細胞によって蓄積された全亜鉛は、５７．２ｍｇ／ｇＤＷであった。
【実施例５】
【００５２】
ｌｏｇ１２およびｌｏｇ１８での発酵の間に１５ｍＭのＺｎ２＋の２回の添加を行う以外は実施例４と同様に実施した。発酵時間：２４時間。発酵の最後での細胞生存能力：２．２５ｘ１０１０ＣＦＵ／ｍｌ。細胞によって蓄積された全亜鉛は、９１．３ｍｇ／ｇＤＷであった。
【実施例６】
【００５３】
フィルタ滅菌した１０ｍＭの硫酸亜鉛を添加し、１２０℃で３０分間滅菌された３００ｍｌのＭＲＳ培地（Merck）＋システインを好気性環境下で少なくとも２４時間、予備還元において維持した。あらかじめ嫌気性条件下で３７℃にて同じ培地中で２４時間生育させたビフィドバクテリウム・アニマリス  サブスピーシーズ  ラクチス  ＢＢ  １  ＢＭ（受託番号ＤＳＭ１７８５０；寄託日２００５年１２月２３日）の種培養液を、上記の３００ｍｌ培地中に１０％（ｖ／ｖ）で接種し、嫌気性条件下、３７℃で２４時間生育させた。１ｘ１０１１ＣＦＵ／ｍｌを培養の最後に得た。細胞によって蓄積された全亜鉛は、５３．３２ｍｇ／ｇＤＷであった。
【実施例７】
【００５４】
シャフトの代わりにシェーカー・プレートを備え付けた１５リットルの嫌気性発酵槽を、１０リットルの培地を用いて、実施例６と同じ条件において用意した。硫酸亜鉛を１５ｍＭに調整した。発酵槽に、２４時間のビフィドバクテリウム・アニマリス  サブスピーシーズ  ラクチス  ＢＢ  １  ＢＭ（受託番号ＤＳＭ１７８５０；寄託日２００５年１２月２３日）の種培養液１０％（ｖ／ｖ）を接種し、３７℃で２４時間インキュベートした。生きている細胞の量は、１ｘ１０１１ＣＦＵ／ｍｌであった。細胞によって蓄積された全亜鉛は、６７．１ｍｇ／ｇＤＷであった。
【実施例８】
【００５５】
１０ｍＭの硫酸亜鉛を添加した０．０５％のシステインを含有する９０ｍｌのＭＲＳ培地を１００ｍｌのフラスコ中で滅菌した。あらかじめ嫌気性条件下で３７℃にて２４時間、同じ培地中で生育させたビフィドバクテリウム・アニマリス  サブスピーシーズ  ラクチス  ＢＢ  １  ＢＭ種培養を１０％（ｖ／ｖ）の量でフラスコ中に接種した。次いで、該培養物を嫌気的条件下、３７℃で４０時間生育させ続けた。３．１２ｘ１０９ＣＦＵ／ｍｌを培養の最後に得た。バイオマスを遠心分離によって収集し、開示された方法に従って処理および分析した。細胞によって蓄積された全亜鉛は、５４．３６ｍｇ／ｇｐ．ｓ．であった。
【実施例９】
【００５６】
９０ｍｌの最少基礎培地は、以下の通りに処方された（１リットル当たりのグラム数で示す）。カザミノ酸（Difco Laboratories, Sparks, Md.）、１５；酵母窒素塩基（Difco Laboratories）、６．７；アスコルビン酸、１０；酢酸ナトリウム、１０；（ＮＨ４）２ＳＯ４、５；尿素、２；ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２；ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１；ＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．００７；ＮａＣｌ、０．０１；Ｔｗｅｅｎ８０、１；システイン、０．５（ｐＨは７．０に調整し、１１０℃で３０分間オートクレーブ処理した）。以下の炭水化物（グルコース、フラクトオリゴ糖、イヌリン、ラフィノース、ラクトース、ガラクトオリゴ糖、フラクトース、ガラクトースまたはキシロ−オリゴ糖）のうちの１つを別々にオートクレーブ処理し、基礎培地に加えて、１０ｇ／ｌの濃度を達成した。１０ｍＭの硫酸亜鉛を更に加えた。あらかじめ同じ培地で嫌気性条件下で３７℃にて２４時間生育させたビフィドバクテリウム・アニマリス  サブスピーシーズ  ラクチス  ＢＢ  １  ＢＭ種培養を１０％（ｖ／ｖ）の量でフラスコ中に接種した。次いで、培養物を嫌気的条件下、３７℃で４０時間生育させ続けた。１．５ｘ１０８ＣＦＵ／ｍｌ〜３．２ｘ１０９ＣＦＵ／ｍｌの範囲のバイオマス濃度を培養の最後に得た。バイオマスを遠心分離によって収集し、記載されている方法に従って処理および分析した。細胞中に蓄積された全亜鉛は、４８．１２〜５４．３７ｍｇ／ｇｐ．ｓ．の範囲であった。
【実施例１０】
【００５７】
０．０５％のシステインを含有し、１０ｍＭの硫酸亜鉛を添加した２リットルのＭＲＳ培地を３．６リットルのバイオリアクタ中で滅菌し、同じ培地中で２４時間生育させたビフィドバクテリウム・アニマリス  サブスピーシーズ  ラクチス  ＢＢ  １  ＢＭ培養物を１０％で接種した。バイオリアクタをin situ滅菌し、窒素で加圧した。プロセス条件は、０．０１での一定の窒素吹き入れ、１５０ｒｐｍ、３７℃、０．１ＭのＮａＯＨにより６．２に維持されるｐＨであった。４８時間後、バイオマスは、３．６ｘ１０９ＣＦＵ／ｍｌの濃度を有した。バイオマスを収集し、亜鉛の量について分析した。細胞中に蓄積された全亜鉛は、５３．８１ｍｇ／ｇｐ．ｓ．であった。
【実施例１１】
【００５８】
０．０５％のシステインを含有する２リットルのＭＲＳ培地を３．６リットルのバイオリアクタ中で滅菌し、同じ培地中で２４時間生育させたビフィドバクテリウム・アニマリス  サブスピーシーズ  ラクチス  ＢＢ  １  ＢＭ培養を１０％接種した。バイオリアクタをin situ滅菌し、窒素で加圧した。プロセス条件は、０．０１での一定の窒素吹き入れ、１５０ｒｐｍ、３７℃、０．１ＭのＮａＯＨにより６．２に維持されるｐＨであった。２４時間の生育期間後、硫酸亜鉛を培養物に添加して、１０ｍＭの最終濃度を達成した。金属添加から２４時間後、バイオマスは、３．６ｘ１０９ＣＦＵ／ｍｌの濃度を有した。バイオマスを収集し、亜鉛の量について分析した。細胞中に蓄積された全亜鉛は、５３．８１ｍｇ／ｇｐ．ｓ．であった。
【実施例１２】
【００５９】
１０ｍＭの硫酸亜鉛を添加した０．０５％のシステインを含有する１０リットルのＭＲＳ培地を３．６リットルのバイオリアクタ中で滅菌し、同じ培地中で２４時間生育させたビフィドバクテリウム・アニマリス  サブスピーシーズ  ラクチス  ＢＢ  １  ＢＭ培養物を１０％接種した。バイオリアクタをin situ滅菌し、窒素で加圧した。プロセス条件は、０．０１での一定の窒素吹き入れ、１５０ｒｐｍ、３７℃、０．１ＭのＮａＯＨにより６．２に維持されるｐＨであった。ＮａＯＨ親和の終了によって示されるように、培養物が酸性化を終えた後、培養物に３０％グルコースおよび１０ｍＭ硫酸亜鉛溶液を流加（fed-batch）様式で補足した。１５リットルの容量に達した後、バイオマスは、１．２ｘ１０１０ＣＦＵ／ｍｌの濃度を有し、収集され、亜鉛量について分析された。細胞中に蓄積された全亜鉛は、５２．１５ｍｇ／ｇｐ．ｓ．であった。
【図１】
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【図２】
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