(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルギニン９残基〜１３残基および配列番号１のアミノ酸配列を含有するペプチド化合物を有効成分として含有する外用塗布用の発毛促進剤。
【請求項２】
前記ペプチド化合物中の連続したアルギニンが１１残基である請求項１記載の発毛促進剤。
【請求項３】
剤形が軟膏である請求項１または２記載の発毛促進剤。
【請求項４】
前記ペプチド化合物の濃度が５〜２０ｍｇ／ｇである請求項３記載の発毛促進剤。
【請求項５】
有効成分がアルギニン１１残基および配列番号１のアミノ酸配列を含有するペプチド化合物であり、軟膏が、該有効成分、白色ワセリン、ステアリルアルコール、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、モノステアリン酸グリセリン、パラオキシ安息香酸メチルおよびパラオキシ安息香酸エチルを含む親水性軟膏である請求項３または４記載の発毛促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、副作用の少ない発毛促進剤に関する。詳細には、アルギニン９残基〜１３残基および配列番号１のアミノ酸配列を含有するペプチド化合物を含む発毛促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
発毛効果を謳う製品は現在多く見受けられるが、アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）が認めた男性型脱毛症に有効な薬品はミノキシジルとフィナステリドの２つのみである。ミノキシジルに関してはMessenger AGらが血管拡張作用をもとに発毛現象を説明している（British Journal of Dermatology、2004年、第150巻、p.186-194参照）。またフィナステリドに関しては、Diani ARらが初めて報告しており（Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism、1992年、第74巻、p.345-350参照）、テストステロンから頭髪の成長を阻害するジヒドロテストステロンへと変換させる酵素を阻害することで、頭髪の成長を促すとされる。【０００３】
しかしながら、これら従来の２つの薬剤はいずれも低分子化合物であるが、それぞれに決定的な問題点が散在する。まずミノキシジルは、もとは血管拡張剤として開発された経緯があるように、毛根周囲における血液循環量を増加させることが発毛の誘導に関与するという見解が一般的である。しかし毛根での血流増加と発毛促進を直接関係付ける証拠は乏しく、いまだ発毛のメカニズムの詳細な解明がなされていない。また副作用についても、循環動態の変化とくに致死的な不整脈の存在も示唆されている。【０００４】
次にフィナステリドは、特に男性型脱毛症に対して現在もっとも有効とされる経口治療薬として認識されているが、厚生労働省の注意喚起によるとその作用機序から女性には使用できず（男性専用）、本薬剤が有する胎児への催奇形性から女性に対しては厳格な接触禁止が推奨されている。また、副作用として１〜５％にリビドー減退がみられ、頻度不明であるが女性化乳房も生じている。【０００５】
頭髪における発毛メカニズムはその研究に従事するもののみならず、広く一般の人々の間においても絶えず関心の尽きない話題である。発毛メカニズムはこれまで多岐に亘って研究されており、様々な関連因子が同定されてきたが、そのうちの１つにカルシニューリン・ＮＦＡＴ経路（以下、ＣａＮ／ＮＦＡＴ経路と略称する）がある。【０００６】
ＮＦＡＴは活性化Ｔ細胞核因子の略語であり、この名が示すとおり、もとは免疫応答に関連する重要な転写因子として発見された。しかしその後の研究によりＣａＮ／ＮＦＡＴ経路は免疫系のみならず、心筋や神経、膵臓などの多くの臓器で重要な役割を果たしていることがわかった。発毛メカニズムとこの経路の関連性については、Gafter-Gviliらにより、免疫抑制剤シクロスポリンＡ（以下、ＣｓＡと略称する）の副作用として全身の毛が濃くなる多毛症が有名であることを端緒に、毛包内ケラチノサイトにおいて脱リン酸化酵素であるカルシニューリン（以下、ＣａＮと略称する）の酵素活性がＣｓＡにより抑制されることで、ＮＦＡＴの脱リン酸化と核内移行さらに細胞周期に係る種々の転写調節が後続して制御され、結果的に発毛を誘導したとの報告がなされている（たとえば、American Journal of Physiology、2003年、第284巻、p.1593-1603参照）。発毛とＣａＮ／ＮＦＡＴ経路の関連は、その後他のグループによる研究でも検証され、多くの研究者らによって広く受け入れられている。【０００７】
一方で、ＣｓＡはＣａＮの酵素活性そのものを抑制するため、ＣａＮ／ＮＦＡＴ経路のみならずＣａＮが関わる多くの反応が阻害されている可能性があり、ＣｓＡの全身投与によって生じる副作用である腎障害および神経症状はこのためであると推測されている。また、ＣｓＡは、皮膚において局所的な塗布で発毛を誘導したという報告はあるが、経口摂取時と同様に多くの副作用が予想される。本発明者らは、先にＣａＮの酵素活性を抑制することなくＮＦＡＴ核移行を特異的に阻害するペプチド性薬剤を開発し、免疫抑制効果ならびに心肥大抑制効果について立証した（特開２００３−２５２８９８号公報参照）。
【発明の開示】
【０００８】
本発明の目的は、外用塗布により効率の良い発毛を誘導でき、かつ副作用の少ない発毛剤を提供することにある。
【０００９】
本発明者らが先に開示した細胞膜透過性のＣａＮ／ＮＦＡＴ経路特異的阻害ペプチドである、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴ（連続したアルギニン１１残基およびグリシン３残基を付加したＶＩＶＩＴ（配列番号１）からなるペプチド：配列番号２）が、発毛促進において優れた効果を示すことを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、アルギニン９残基〜１３残基および配列番号１のアミノ酸配列を含有するペプチド化合物を有効成分として含有する発毛促進剤に関する。
【００１１】
前記発毛促進剤において、ペプチド化合物中の連続したアルギニンが１１残基であることが好ましい。
【００１２】
前記発毛促進剤において、剤形が軟膏の場合、ペプチド化合物の濃度は５〜２０ｍｇ／ｇであることが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の発毛促進剤、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを塗布して７日後のヌードマウスの耳間の頭頂部の写真である（ｂ）。（ａ）はコントロール群のヌードマウスの同部位の写真である。（ａ）と比較して、（ｂ）では耳間の頭頂部に明らかな発毛が観察された。
【図２】本発明の発毛促進剤、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴ投与群（（ｃ）および（ｄ））ならびにコントロール群（（ａ）および（ｂ））のＨ．−Ｅ．染色した組織片の顕微鏡写真（（ａ）および（ｃ））および複屈折顕微鏡写真（（ｂ）および（ｄ））を示す。１１Ｒ−ＶＩＶＩＴ投与群では、機能分化した毛髪１が白く光って観察された。
【図３】皮膚切片２０ｍｍ2当たりの複屈折を示す毛髪を有する毛包の数を示す（１１Ｒ−ＶＩＶＩＴ投与群：ｎ＝６、コントロール群：ｎ＝８、＊：ｐ＜０．０００５）。
【図４】ＷＳＴ−１アッセイにおけるケラチノサイトの吸光度を示す（各群：ｎ＝７、＊：ｐ＜０．０１、†：ｐ＜０．０５）。コントロール群と比較して、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴ含有培地で培養したケラチノサイトが有意に増殖した。
【図５】１１Ｒ−ＶＩＶＩＴによるＮＦＡＴの核外移行を示す、共焦点レーザー顕微鏡の写真を示す。（ａ）は１１Ｒ−ＶＩＶＩＴ投与前のケラチノサイトの写真であり、（ｂ）は（ａ）と同一細胞の１１Ｒ−ＶＩＶＩＴ投与６時間後の写真である。コントラスト強調のため、ＧＦＰの蛍光を白黒で表した。コントロールのケラチノサイト（ａ）では内ではＮＦＡＴが幾分核２内に存在するのに対して、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴ含有培地下で培養したケラチノサイト（ｂ）内では、ＮＦＡＴは完全に核２外に移行されたことが観察された。
【図６】１１Ｒ−ＶＩＶＩＴおよびＣｓＡ投与により転写が２倍以上低下した遺伝子を示す図である。１１Ｒ−ＶＩＶＩＴにより転写が２倍以上低下した遺伝子群は７４個あり、ＣｓＡにより転写が２倍以上低下した遺伝子群は１７３個であった。双方に共通して転写が２倍以上低下した遺伝子は２４個あった。
【図７】ウエスタンブロッティング法によるサイクリンＧ２の経時変化を示すグラフである。時間ごとにサイクリンＧ２の発現量をアクチンの量で補正した相対量を示す（４回計測）。
【図８】ウエスタンブロッティング法によるｐ２１発現量の経時変化を示すグラフである。時間ごとにｐ２１の発現量をアクチンの量で補正した相対量を示す（３回計測）。
【符号の説明】
【００１４】
１  機能分化した毛髪
２  核
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の発毛促進剤について詳細に説明する。【００１６】
本発明の発毛促進剤は、９〜１３個のアルギニンが連続するアミノ酸配列および配列番号１のアミノ酸配列を含有するペプチド化合物を有効成分とする。【００１７】
連続するアルギニンの残基数としては、１１残基が最も好ましい。連続したアルギニンが８残基以下または１４残基以上であると、本発明の発毛促進剤の皮膚からの導入効率が悪くなる傾向がある。【００１８】
配列番号１のアミノ酸配列は、ＭＡＧＰＨＰＶＩＶＩＴＧＰＨＥＥであり、ＮＦＡＴの活性阻害ペプチド（ＶＩＶＩＴと略称する）である。ＶＩＶＩＴはカルシニューリンのホスファターゼ活性に影響することなく、ＮＦＡＴファミリーに属するタンパク質（ＮＦＡＴ１、ＮＦＡＴ２、ＮＦＡＴ３およびＮＦＡＴ４など）とカルシニューリンとの相互作用を選択的に阻害する。配列番号１に示すアミノ酸配列において、各アミノ酸残基は、ＮＦＡＴを阻害するものであれば生物学的に同等のアミノ酸配列に置換してもよく、ＶＩＶＩＴと同等の生物学的活性を有するものであれば、数個、たとえば１〜３個のアミノ酸残基が付加、欠失されていてもよい。【００１９】
また、本発明において、有効成分であるペプチド化合物は、同等の生物学的活性を有する限り、前記の９〜１３個のアルギニンが連続するアミノ酸配列および配列番号１のアミノ酸配列に加え、数個、たとえば１〜３個のアミノ酸残基が付加、欠失または置換されていてもよい。たとえば、連続するアルギニン残基と配列番号１のアミノ酸配列との間にリンカーとしてグリシンを数残基、たとえば１〜３残基挿入したものが好ましい。【００２０】
さらに、本発明において、有効成分であるペプチド化合物は、発毛研究のモデルに使用する場合など、細胞内に導入されたことを確認するためのマーカーを含有してもよい。マーカーはとくに限定されるものではなく、たとえばフルオレセインイソチオシアネート（以下、ＦＩＴＣと略称する）、ローダミンなどの蛍光色素、およびＧＦＰなどの蛍光タンパク質を使用することができる。【００２１】
本発明において、有効成分であるペプチド化合物は、通常の人工合成法によって、または一般に市販されている人工合成機によって製造することができる。あるいは、このペプチド化合物は、遺伝子工学的手法を用いて製造することができる。たとえば、数個のアルギニンが連続する配列およびＶＩＶＩＴからなる配列を含むペプチド配列をコードするＤＮＡを挿入した組換えベクターを作製し、適当な宿主細胞に組換えベクターを導入後、その宿主細胞を培養する。ついで、培養物を回収することにより、ペプチド化合物を得ることができる。製造後、得られたペプチド化合物は公知の方法で精製することもできる。これらのペプチド化合物の製造法および精製法は、本分野において一般的な手法であり、当業者により容易に実施されるものである。【００２２】
本発明の発毛促進剤は、全身性の副作用を回避するという点などから外用塗布により投与することが最も好ましい。【００２３】
本発明の発毛促進剤の剤形は投与方法によって適宜設定することができる。具体的には、水溶液および乳液などの液剤および軟膏を例示することができる。【００２４】
本発明の発毛促進剤において、有効成分であるペプチド化合物の濃度は、剤形、使用する基材などにあわせて適宜設定することができる。たとえば、親水性軟膏の場合、ペプチド化合物の濃度は、５〜２０ｍｇ／ｇが好ましく、約１０ｍｇ／ｇがより好ましい。有効成分であるペプチド化合物の濃度が５ｍｇ／ｇより低いと有意な発毛が見られにくく、２０ｍｇ／ｇより高いと発毛誘導された毛髪が早期に脱毛する傾向がある。同様に、水溶液とする場合、ペプチド化合物の濃度は、５〜２０ｍｇ／ｍｌが好ましく、約１０ｍｇ／ｍｌが好ましい。さらに、乳液とする場合には、ペプチド化合物の濃度は、５〜２０ｍｇ／ｍｌが好ましく、約１０ｍｇ／ｍｌが好ましい。なお、本発明の発毛促進剤は、親水性軟膏１ｇに対して１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを１０ｍｇ含むものが最も好ましい。【００２５】
本発明の発毛促進剤の有効成分であるペプチド化合物は、塗布面積当たり、一回塗布量として１．２５〜５．００μｇ／ｍｍ2が好ましく、約２．５μｇ／ｍｍ2がより好ましい。たとえば、塗布面積１００ｍｍ2当たり１１Ｒ−ＶＩＶＩＴ量として２５０μｇが最も好ましい。【００２６】
本発明の発毛促進剤は、有効成分である前記ペプチド化合物の他に、適当な薬学的賦形剤、適当な担体、溶媒、ゲル形成剤、酸化防止剤、希釈剤、等張化剤、担体、ｐＨ安定剤など本技術分野で通常用いられるほかの成分を添加してもよい。これらの添加剤は、通常当業者により適宜選択され得る。【００２７】
以下、実施例によって、本発明の発毛促進剤をさらに詳細に説明するが、本発明はその趣旨と適用範囲に逸脱しない限りこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００２８】
実施例１：ヌードマウスにおいて１１Ｒ−ＶＩＶＩＴ塗布がもたらす発毛誘導
まず、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴが発毛を誘導できるかを調べた。１１Ｒ−ＶＩＶＩＴ（シグマ ジェノシス ジャパン社（Sigma Genosis Japan,Inc.）に製造依頼）を含有する親水性軟膏を表１に示す組成で調製した。【００２９】
【表１】
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【００３０】
１回につき１１Ｒ−ＶＩＶＩＴ量として２５０μｇの親水性軟膏を全身体毛の欠失したヌードマウス（ｎ＝１０、ＢＡＬＢ／ｃ  Ｓｌｃ−ｎｕ、雄、５週齢、平均体重３０ｇ、清水実験材料株式会社より購入）のうち特に毛のない箇所である耳間の頭頂部（約１００ｍｍ2）に塗布した。これを１日１回、７日間連続塗布した。コントロールとして、親水性軟膏のみを同量塗布した。塗布後７日目に１１Ｒ−ＶＩＶＩＴ塗布群において、明らかな発毛効果が認められた（図１）。さらに発毛効果を顕微鏡下で詳細に検討するために光学顕微鏡と複屈折顕微鏡による発毛評価を行った（図２）。１１Ｒ−ＶＩＶＩＴ塗布により発毛の誘導された皮膚切片を複屈折顕微鏡で観察すると、機能的に分化した（つまり完全に成長した）毛髪１が白く光って見える（図２（ｄ））。この評価方法はすでに確立された手法である（American Journal of Physiology、2003年、第284巻、p.1593-1603参照）。１１Ｒ−ＶＩＶＩＴ投与群ならびにコントロール群各１０匹ずつの組織切片を作製し、各切片中の複屈折を示す毛髪を有する毛包の数を測定した。【００３１】
結果を図３に示す。複屈折顕微鏡にて観察すると、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴ投与群においてコントロール群と比較して有意な発毛効果が認められた。（図２および３）。【００３２】
実施例２：１１Ｒ−ＶＩＶＩＴが発毛を誘導するメカニズム
ケラチノサイトの基本培地としては、ＥｐｉＬｉｆｅ（登録商標）（Ｍ−ＥＰＩ−５００−ＣＡ；カスケードバイオロジクス（Cascade Biologics）社製）５００ｍｌに、正常ヒト表皮角化細胞用添加剤（カスケードバイオロジクス社製、ＥＤＧＳ（Ｓ−０１２−５））５ｍｌおよび、ゲンタマイシンおよびアンフォテリシンＢを含む混合抗菌剤である抗菌剤ＧＡ溶液（カスケードバイオロジクス社製、Ｒ−０１５−１０）１ｍｌを添加した培地を使用した。【００３３】
（１）毛包内ケラチノサイトの増殖
毛髪の成長には、毛包内ケラチノサイト（角化細胞）の増殖が重要であることは、前述のGafter-Gviliらの論文で指摘されている。そこで本発明者らは、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴ投与によってケラチノサイトの増殖が誘導されるかどうかを、ＷＳＴ−１アッセイにより評価した。培養には株化ケラチノサイトのＰＨＫ細胞（細胞バンク、Health Science Research Resources Bank:HSRRBより入手、資源名：PHK16-0b、資源番号：JCRB0141）を用いた。９６ウェルプレートで６０％コンフルエントにまでＰＨＫ細胞を基本培地中で培養し、その後、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴ（３μＭ）、ＣｓＡ（１μＭ）またはネガティブコントロールとしてカルシウム（１ｍＭ）を添加した基本培地中で２４時間培養した。コントロールは基本培地のみで同様に２４時間培養した。各薬剤の添加前（０時間）および添加後２４時間の細胞の生存率を測定した。【００３４】
その結果を図４に示す。コントロールに比べて１１Ｒ−ＶＩＶＩＴ含有培地で培養したケラチノサイトが有意に増殖した。【００３５】
（２）ケラチノサイト内のＮＦＡＴの局在
さらにＣａＮ／ＮＦＡＴ経路阻害剤である１１Ｒ−ＶＩＶＩＴの投与に応答してケラチノサイト内のＮＦＡＴの局在がどのように変化しているのかを見るために、蛍光タンパク質ＧＦＰをＮ末端につけたＮＦＡＴをリポフェクタミン法でケラチノサイト内に導入して２４時間培養し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した（図５（ａ））。その後、同一細胞を１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを３μＭの濃度で含む基本培地にて６時間培養した。１１Ｒ−ＶＩＶＩＴ投与前のコントロールのケラチノサイト内ではＮＦＡＴが幾分核内に存在していた（図５（ａ））のに対して、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴ含有培地下で培養した後のケラチノサイト内ではＮＦＡＴは完全に核外に存在していた（図５（ｂ））。【００３６】
１１Ｒ−ＶＩＶＩＴによりＮＦＡＴの核内移行が阻害されたことから、ケラチノサイト内でＮＦＡＴによって転写調節を受ける何らかの遺伝子の存在を予想した上で、全遺伝子発現の増減を数値化して示すマイクロアレイ法を行った。１１Ｒ−ＶＩＶＩＴ（３μＭ）またはＣｓＡ（１μＭ）を含む基本培地で１２時間培養し、その後ＰＨＫ細胞の全ｍＲＮＡを抽出し、マイクロアレイ法にて解析した。ＣａＮ／ＮＦＡＴ経路とＰＨＫ細胞増殖の関係を評価するため、両薬剤で変動した細胞周期に関する遺伝子を表２に示す。【００３７】
【表２】
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【００３８】
また、図６に示すように、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴにより転写が２倍以上低下した遺伝子群は７４個あり、ＣｓＡにより転写が２倍以上低下した遺伝子群は１７３個あった。双方に共通して転写が２倍以上低下した遺伝子は２４個あり、そのうち細胞周期に関するものは、サイクリンＧ２のみで、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴでは３．３０倍、ＣｓＡでは２．７９倍転写量が低下した。【００３９】
ＰＨＫ細胞内での新しいＮＦＡＴの標的として同定したサイクリンＧ２は、Horne MCらがJournal of Biological Chemistry（272巻、12650〜12661頁、1997年）で報告したとおり、一般的に細胞周期の停止に関係していると考えられており、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴの投与によってサイクリンＧ２の発現が低下することで、細胞周期の停止が抑制され、ケラチノサイトの増殖につながったものと考えられる。１１Ｒ−ＶＩＶＩＴ投与後のサイクリンＧ２の発現量低下は細胞周期のマーカーであるｐ２１とともにウェスタンブロッティング法により確かめられた（図７）。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明の発毛促進剤は、既存の免疫抑制剤と異なり、ＣａＮの酵素活性そのものを抑制することなくＣａＮ／ＮＦＡＴ経路を特異的に阻害するため、副作用が少ない。また、細胞膜透過性を有するペプチドであるため皮膚から直接作用させることができ、薬剤を塗布した部位のみに局所的に強力な発毛を誘導することができる。【００４１】
本発明の発毛促進剤は、発毛サイクルのメカニズムそのものに基づく発毛作用が確認されたため、従来の他剤にはない、根拠に基づいた医療（ＥＢＭ）に即した発毛剤として応用することが可能である。【００４２】
また、本発明の発毛促進剤による局所的発毛誘導は、その基礎研究的興味のみならず、広く発毛研究のモデルとして臨床的にあるいは一般治療薬として使用することができる。【００４３】
さらに、本発明の発毛促進剤は、毛包内ケラチノサイトに対して直接増殖させる作用を有するため、毛周期を成長期に移行させるだけでなく、細く弱った毛髪も強い毛髪へと変化させることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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