(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
【化１】
0005615495.tif 000020
［式中、
Ｒｎは、Ｈを表し、
Ｒ１は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、またはＢｒを表し、
Ｒは、Ｈを表し、および
３≦ｎ≦１４であり、
ただし、ｎ≠１０である場合に、Ｒ１基およびＲｎ基の少なくとも１つは水素を表さない］
に相当する不飽和ヒドロキシ脂肪酸誘導体。
【請求項２】
Ｒ１がＦ、Ｃｌ、またはＢｒを表す、請求項１に記載の一般式（Ｉ）の不飽和ヒドロキシ脂肪酸誘導体。
【請求項３】
６≦ｎ≦１４である、請求項１に記載の一般式（Ｉ）の不飽和ヒドロキシ脂肪酸誘導体。
【請求項４】
Ｒ１＝Ｆである、請求項１または２に記載の一般式（Ｉ）の不飽和ヒドロキシ脂肪酸誘導体。
【請求項５】
Ｒ１＝Ｆ、および
ｎ＝１３である、
請求項４に記載の一般式（Ｉ）の不飽和ヒドロキシ脂肪酸誘導体。
【請求項６】
Ｒ１＝Ｆ、および
ｎ＝６である、
請求項２に記載の一般式（Ｉ）の不飽和ヒドロキシ脂肪酸誘導体。
【請求項７】
Ｒ１＝Ｈ、および
ｎ＝１０である、
請求項１に記載の一般式（Ｉ）の不飽和ヒドロキシ脂肪酸誘導体。
【請求項８】
Ｒ１＝Ｆ、および
ｎ＝１０である、
請求項２に記載の一般式（Ｉ）の不飽和ヒドロキシ脂肪酸誘導体。
【請求項９】
Ｒ１＝Ｆ、および
ｎ＝８である、
請求項２に記載の一般式（Ｉ）の不飽和ヒドロキシ脂肪酸誘導体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の一般式（Ｉ）の不飽和ヒドロキシ脂肪酸誘導体を皮膚科的に許容される賦形剤とともに含む、皮膚美容用組成物。
【請求項１１】
一般式（Ｉ）：
【化２】
0005615495.tif 000021
［式中、
Ｒｎは、Ｈを表し、
Ｒ１は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、またはＢｒを表し、
Ｒは、Ｈを表し、および
３≦ｎ≦１４である］
の不飽和ヒドロキシ脂肪酸誘導体を、皮膚科的に許容される賦形剤とともに含む、炎症および／もしくは角質化の治療に用いるための、並びに／または治癒の改善に用いるための皮膚美容用組成物。
【請求項１２】
一般式（Ｉ）：
【化３】
0005615495.tif 000022
［式中、
Ｒｎは、Ｈを表し、
Ｒ１は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、またはＢｒを表し、
Ｒは、Ｈを表し、および
３≦ｎ≦１４である］
の不飽和ヒドロキシ脂肪酸誘導体を、皮膚科的に許容される賦形剤とともに含む、乾癬、掻痒および／またはアトピー性皮膚炎の治療に用いるための皮膚美容用組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、新規な不飽和ヒドロキシ脂肪酸誘導体およびその皮膚美容的使用に関する。
【０００２】
多くの飽和ヒドロキシ脂肪酸が知られており、それらの美容特性および薬理学的特性に関しては文献に記載されている。例えば、ミツバチのローヤルゼリーの主要な脂質成分は不飽和ヒドロキシ脂肪酸であり、ヒドロキシ−１０−デセン２（トランス）オイックアシッドである(Edward E. Smissman et al., 1964. JOU. 29 3517-3520)。
【０００３】
当技術分野の現状の種々の文書に、不飽和ヒドロキシ脂肪酸およびそれらのエステルの製造方法が記載されている(Lee et al, 1993, J. Org. Chem., Vol. 58, pages 2918-2919; Hurd and Saunders, 1952, J. Am. Chem. Soc., Vol. 74, pages 5324-5328; Krishnamurthy et al., 1989, Indian J. Chem. Sect. A, vol. 28, pages 288-291; Plettner et al., 1995, J. Chem, Ecol., vol. 21, pages 1017-1030)。
【０００４】
より詳しくは、本発明は、一般式（Ｉ）：
【化１】
0005615495.tif 000002
［式中、
Ｒｎは互いに独立にＨ、または１〜６個の炭素原子からなり、ハロゲン原子、特にフッ素により置換されていてもよい直鎖もしくは分枝アルキル基を表し、
Ｒ１はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＦ３を表し、
ＲはＨ、または１〜６個の炭素原子からなり、ハロゲン原子、特にフッ素により置換されていてもよい直鎖もしくは分枝アルキル基を表し、
３≦ｎ≦１４である］
の不飽和ヒドロキシ脂肪酸誘導体に関する。
【０００５】
本発明の特定の特徴によれば、一般式（Ｉ）の不飽和ヒドロキシ脂肪酸誘導体は次の基準を満たす：
・Ｒは水素を表す、
・Ｒｎは互いに独立にＨ、または１〜６個の炭素原子からなり、ハロゲン原子、特にフッ素により置換されていてもよい直鎖もしくは分枝アルキル基を表し、
・Ｒ１はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＦ３を表し、
・３≦ｎ≦１４
（ただし、ｎ≠１０である時、Ｒ１基およびＲｎ基の少なくとも１つは水素を表さない）。
【０００６】
本発明の特定の特徴によれば、一般式（Ｉ）の不飽和ヒドロキシ脂肪酸誘導体は次の基準を満たす：
・Ｒ１はＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＦ３を表し、
・Ｒｎは互いに独立にＨ、または１〜６個の炭素原子からなり、ハロゲン原子、特にフッ素により置換されていてもよい直鎖もしくは分枝アルキル基を表し、
・ＲはＨ、または１〜６個の炭素原子からなり、ハロゲン原子、特にフッ素により置換されていてもよい直鎖もしくは分枝アルキル基を表し、
・３≦ｎ≦１４。
【０００７】
本発明の特定の特徴によれば、一般式（Ｉ）の不飽和ヒドロキシ脂肪酸誘導体は次の基準を満たす：
・Ｒｎは互いに独立にＨ、または１〜６個の炭素原子からなり、ハロゲン原子、特にフッ素により置換されていてもよい直鎖もしくは分枝アルキル基を表し、
・Ｒ１はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＦ３を表し、
・ＲはＨ、または１〜６個の炭素原子からなり、ハロゲン原子、特にフッ素により置換されていてもよい直鎖もしくは分枝アルキル基を表し、
・６≦ｎ≦１４。
（ただし、ｎ≠１０である時、Ｒ１基およびＲｎ基の少なくとも１つは水素を表さない）。
【０００８】
本発明の別の特定の特徴によれば、一般式（Ｉ）の不飽和ヒドロキシ脂肪酸誘導体は次の基準を満たす：
・Ｒ１＝Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＦ３、
・Ｒｎ＝Ｈ、および
・３≦ｎ≦１４。
【０００９】
本発明の別の特定の特徴によれば、一般式（Ｉ）の不飽和ヒドロキシ脂肪酸誘導体は次の基準を満たす：
・Ｒ１はＦ、Ｃｌ、ＢｒまたはＣＦ３を表し、
・Ｒｎ基の少なくとも１つは、１〜６個の炭素原子からなり、ハロゲン原子、特にフッ素により置換されていてもよい直鎖もしくは分枝アルキル基を表し、
・３≦ｎ≦１４。
【００１０】
本発明の別の特定の特徴によれば、一般式（Ｉ）の不飽和ヒドロキシ脂肪酸誘導体は次の基準を満たす：
・Ｒ１＝Ｆ
・Ｒｎ＝Ｈ
・３≦ｎ≦１４。
【００１１】
本発明の別の特定の特徴によれば、一般式（Ｉ）の不飽和ヒドロキシ脂肪酸誘導体は次の基準を満たす：
・Ｒ１＝Ｆ
・Ｒｎ＝Ｈ
・ｎ＝１３。
【００１２】
本発明の別の特定の特徴によれば、一般式（Ｉ）の不飽和ヒドロキシ脂肪酸誘導体は次の基準を満たす：
・Ｒ１＝Ｆ
・Ｒｎ＝Ｈ
・ｎ＝６。
【００１３】
本発明の別の特定の特徴によれば、一般式（Ｉ）の不飽和ヒドロキシ脂肪酸誘導体は次の基準を満たす：
・Ｒ＝Ｒ１＝Ｈ
・Ｒｎ基の１つだけがメチル基を表し、他は水素原子であり、および
・ｎ＝４。
【００１４】
本発明の別の特定の特徴によれば、一般式（Ｉ）の不飽和ヒドロキシ脂肪酸誘導体は次の基準を満たす：
・Ｒ１＝Ｒｎ＝Ｈおよび
・ｎ＝１０。
【００１５】
本発明の別の特定の特徴によれば、一般式（Ｉ）の不飽和ヒドロキシ脂肪酸誘導体は次の基準を満たす：
・Ｒ１＝Ｆ
・Ｒｎ＝Ｈ、および
・ｎ＝１０。
【００１６】
本発明の別の特定の特徴によれば、一般式（Ｉ）の不飽和ヒドロキシ脂肪酸誘導体は次の基準を満たす：
・Ｒ１＝Ｆ
・Ｒｎ＝Ｈ、および
・ｎ＝８。
【００１７】
本発明によれば、上記で定義されたような一般式（Ｉ）の不飽和ヒドロキシ脂肪酸誘導体は、抗ラジカル活性、抗炎症活性、抗痒疹活性を有する皮膚美容用組成物の製造のため、ならびに／または角質化および色素沈着障害の治療のため、ならびに／または治癒の改善のために、好適な賦形を組み合わせて、有効成分として使用することができる。
【００１８】
一般式（Ｉ）の不飽和ヒドロキシ脂肪酸誘導体は特に、乾癬、掻痒および／またはアトピー性皮膚炎の治療、ならびに皮膚の老化および白色または褐色加齢斑(age spot)の治療を意図した組成物における使用が意図される。
【００１９】
本発明によれば、一般式（Ｉ）の不飽和ヒドロキシ脂肪酸誘導体はさらに特に、皮膚の白化(whitening)を意図した組成物における使用が意図される。
【００２０】
それらの抗ラジカル活性の結果として、一般式（Ｉ）の不飽和ヒドロキシ脂肪酸はまた、初期段階の皮膚の光発癌物質を予防または制限するのにも有用であり、従って、種々の皮膚腫瘍疾患の予防および治療に使用することができる。
【００２１】
一般式（Ｉ）の不飽和ヒドロキシ脂肪酸誘導体は、
式（ＩＩＩ）：
【化２】
0005615495.tif 000003
［式中、
Ｒ１は式（Ｉ）で定義された通りであり、
Ｒ２は、１〜６個の炭素原子を有する直鎖または分枝アルキル基、好ましくはエチルまたはメチル基を表し、該Ｒ２基はＯＲ２基の酸素原子と隣接するリン原子と一緒になって環状構造を形成することができ、
Ｒ４は、１〜６個の炭素原子を有する直鎖または分枝アルキル基を表し、好ましくはエチル基である］
のリン酸基を反応させることによるＷｉｔｔｉｇ−Ｈｏｒｎｅｒ反応により、あるいは
Ｒ１＝Ｈである場合には、式Ｒ４ＯＯＣ−ＣＨ２ＣＯＯＲ（式中、Ｒは上記で式（Ｉ）において定義された通り）のマロン酸誘導体と式（ＩＩ）：
【化３】
0005615495.tif 000004
（Ｒｎおよびｎは上記で定義された通り）
のラクトールを反応させることによるＤｏｅｂｎｅｒ−Ｋｎｏｅｖｅｎａｇｅｌ反応を用いて製造し、式（ＩＶ）：
【化４】
0005615495.tif 000005
（式中、ｎ、ＲおよびＲ１は上記で定義された通り）
のヒドロキシエステルを得ることができ、また場合により、Ｒが上記で定義されたようなＲ４基を表す場合には、上記で定義された式（ＩＶ）のヒドロキシエステルの鹸化反応により、対応する式（Ｉ）のヒドロキシ酸誘導体を得ることができる。
【００２２】
以下に示す合成例により本発明を説明する。
【実施例】
【００２３】
実施例１：  ＤＨＡの合成操作法
１．工程１：オキソナン−２−オンの製造
４３．５ｇ（３４５ｍｍｏｌ）のシクロオクタンを４３０ｍｌのジクロロエタンの溶液に入れる。次に、１７０ｇ（９８５ｍｍｏｌ）のメタクロロ過安息香酸を加える。この媒体を８０℃で４８時間加熱する。室温で、４００ｍｌのＮａ２Ｓ２Ｏ５およびＮａＨＣＯ３飽和溶液（１／１ｖ／ｖ）を加える。この媒体を１８時間激しく攪拌する。有機相を分離し、６時間ＫｌおよびＨ２Ｏに接触させる。有機相を分離し、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３飽和溶液、ＮａＣｌ飽和溶液で洗浄した後、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空濃縮すると、３６ｇの粗生成物が得られる。
【００２４】
ペンタン（６０ｍｌ）中で濃縮した後、メタクロロ安息香酸沈殿物を濾過することによりラクトンを精製する。ｗ＝２６．６ｇ（５４％）。得られたラクトンは式：
【化５】
0005615495.tif 000006
の化合物である。
特性決定：
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．３（ヘプタン/酢酸エチル７／３）
1H NMR（３００MHｚ、CDCI3）：δ１．４２−１．４９（ｍ，４Ｈ），１．６５−１．７５（ｍ，６Ｈ），２．３０（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２Ｈ），４．３０（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ）．
【００２５】
２．ラクトール中での部分的還元工程
窒素下、２６．６ｇ（１８７．２ｍｍｏｌ）のラクトンを２１０ｍｌのトルエンで希釈する。この媒体を−７８℃まで冷却し、温度を−７８℃に維持しながら、１５６．４ｍｌ（１８９．１ｍｍｏｌ）のＤｉｂａｌ−Ｈをトルエン中２０％濃度溶液として滴下する。この混合物を２時間−７８℃で攪拌する。ローゼン塩の飽和溶液２００ｍｌを−７８℃で加える。室温で１８時間攪拌した後、二相混合物をセライトで濾過した後、酢酸エチルで抽出する。有機相を飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空濃縮すると、２６ｇの粗生成物が得られる（そのうち２５％がジオール誘導体であり、すなわち、収率は７２％と見積もられる）。従って、開環型と環状型が均衡したラクトールを、それ以上精製せずに用いる。
特性決定：
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．４（ヘプタン/酢酸エチル６／４）
1H NMR（３００MHｚ、CDCI3）：δ１．３４−１．６８（ｍ，１０Ｈ），２．４５（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２Ｈ），３．６６（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），９．７８（ｔ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，１Ｈ）．
【００２６】
３．工程３：  Ｗｉｔｔｉｇ−Ｈｏｒｎｅｒ反応
１９ｇ（１３１．８ｍｍｏｌ）のラクトールを２５０ｍｌのエタノールで希釈する。２７．３ｇ（１９７．５ｍｍｏｌ）の炭酸カリウムの存在下、この媒体に３１．４ｍｌ（１５８．１ｍｍｏｌ）のトリエチルホスホンアセテートを加える。この反応媒体を１８時間４０℃に加熱する。室温で、この媒体を２００ｍｌの蒸留水により加水分解し、酢酸エチルで抽出する。有機相を飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空濃縮すると、２０ｇの粗生成物が得られる。
【００２７】
得られたエステルを、ヘプタン／酢酸エチル７／３で溶出するクロマトグラフィーにより精製する。１５ｇの生成物が得られる（収率５３％）。得られたエステルは式：
【化６】
0005615495.tif 000007
の化合物である。
特性決定：
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．４（ヘプタン/酢酸エチル７／３）
1H NMR（３００MHｚ、CDCI3）：δ１．２４−１．３８（ｍ，９Ｈ），１．４３−１．５０（ｍ，２Ｈ），１．５１−１．５７（ｍ，２Ｈ），２．１５−２．２１（ｑ，２Ｈ），３．６０−３．６４（ｔ，２Ｈ），４．１４−４．２０（ｔ，２Ｈ），５．７７−５．８２（ｄ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，１Ｈ），６．９１−６．９８（ｄｔ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，１Ｈ）．
【００２８】
４．工程４：  鹸化反応
０．６０ｇ（２．８１ｍｍｏｌ）のヒドロキシエステルを１０倍容量のテトラヒドロフランに溶解させる。３．４ｍｌ（６．７５ｍｍｏｌ）の２Ｍソーダ溶液をゆっくり加える。この媒体を６５℃で３時間加熱する。反応が終了したところで、３Ｍの塩酸溶液をｐＨ＝２となるまで加えることにより、この媒体を加水分解する。この混合物を濃縮乾固し、水相を酢酸エチルで抽出する。有機相を飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空濃縮すると、０．６ｇの粗生成物が得られる。
【００２９】
アセトニトリル中での再結晶化により、期待された不飽和ヒドロキシ酸誘導体が白色固体の形態で得られる。ｗ＝０．３７ｇ（７１％）。
得られたヒドロキシ酸誘導体は式：
【化７】
0005615495.tif 000008
の化合物である。
特性決定：
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．１（ヘプタン/酢酸エチル６／４）
1H NMR（３００MHｚ、CDCI3）：δ１．３３−１．３７（ｍ，６Ｈ），１．４５−１．４９（ｍ，２Ｈ），１．５５−１．５８（ｍ，２Ｈ），２．２０−２．２５（ｑ，２Ｈ），３．６２−３．６６（ｔ，２Ｈ），５．７９−５．８４（ｄ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，１Ｈ），７．０３−７．１０（ｄｔ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，１Ｈ）．
質量分析：［Ｍ−Ｎａ］＋  ２０９（理論値１８６）
融点：６２．５℃±１℃
【００３０】
実施例２：  １０−ヒドロキシ−デク−２−フルオロ−２−エン酸のα−フッ素化ＤＨＡ（Ｒ１＝Ｆ、ｎ＝６）の合成操作法
工程３だけが、ラクトール（０．８９ｇ、７．７ｍｍｏｌ）を用いることで異なるＷｉｔｔｉｇ−Ｈｏｒｎｅｒ反応を、４０℃でエタノール（９ｍｌ）中、メチルジエチルホスホノフルオロアセテート（２．１ｇ、９．２ｍｍｏｌ）と炭酸カリウム（１．６ｇ、１１．５ｍｍｏｌ）の存在下で行う。工程４は先の手順に従って行う。再結晶化の後に得られた生成物はシス−トランス混合物の形態である。得られたヒドロキシ酸誘導体は式：
【化８】
0005615495.tif 000009
の化合物である。
特性決定：
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．１（ヘプタン/酢酸エチル６／４）
1H NMR（３００MHｚ、CDCI3）：δ１．３６−１．６２（ｍ，２０Ｈ），２．２７−２．３０（ｍ，２Ｈ，シス形態），２．５０−２．５８（ｍ，２Ｈ，トランス形態），３．６９（ｍ，４Ｈ），６．０５（ｄｔ，Ｊ＝２１．６Ｈｚ，１Ｈ，トランス形態）および６．２５（ｄｔ，Ｊ＝４０．８Ｈｚ，１Ｈ，シス形態）．
質量分析：［Ｍ−Ｎａ］＋  ２２７（理論値２０４）
【００３１】
実施例３：  ９−ヒドロキシ−ノナ−２ｔ−エン酸の合成操作法
９−ヒドロキシ−ノナ−２ｔ−エン酸を得るため、ＤＨＡの合成プロトコールをシクロヘプタノンに適用する。
特性決定：
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．１（ヘプタン/酢酸エチル６／４）
1H NMR（３００MHｚ、CDCI3）：δ１．３６−１．６１（ｍ，８Ｈ），２．２２−２．２７（ｍ，２Ｈ），３．６７（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），５．８４（ｄｔ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，１Ｈ），７．０９（ｄｔ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，１Ｈ）．
質量分析：［Ｍ−Ｎａ］＋  １９５（理論値１７２）
【００３２】
実施例４：  １１−ヒドロキシ−ウンデカ−２ｔ−エン酸の合成操作法
１１−ヒドロキシ−ウンデカ−２ｔ−エン酸を得るため、ＤＨＡの合成プロトコールをシクロノナノンに適用する。
特性決定：
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．１（ヘプタン/酢酸エチル６／４）
1H NMR（３００MHｚ、CDCI3）：δ１．３３−１．６１（ｍ，１２Ｈ），２．２０−２．２８（ｍ，２Ｈ），３．６６（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），５．８４（ｄｔ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ，１Ｈ），７．０９（ｄｔ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ，１Ｈ）．
質量分析：［Ｍ−Ｎａ］＋  ２２３（理論値２００）
【００３３】
実施例５：  １２−ヒドロキシ−ドデカ−２ｔ−エン酸の合成操作法
１２−ヒドロキシ−ドデカ−２ｔ−エン酸を得るため、ＤＨＡの合成プロトコールをシクロデカノンに適用する。
特性決定：
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．１（ヘプタン/酢酸エチル６／４）
1H NMR（３００MHｚ、CDCI3）：δ１．３５−１．５６（ｍ，１４Ｈ），２．２０−２．２７（ｍ，２Ｈ），３．５５（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），５．８０（ｄｔ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，１Ｈ），６．９６（ｄｔ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，１Ｈ）．
質量分析：［Ｍ−Ｎａ］＋  ２３７（理論値２１４）
【００３４】
実施例６：  １２−ヒドロキシ−ドデカ−２−フルオロ−２ｔ−エン酸の合成操作法
シス／トランス混合物形態の１２−ヒドロキシ−ドデカ−２−フルオロ−２−エン酸を得るため、２位でフッ素化されたＤＨＡの合成プロトコール（実施例２）をシクロデカノンに適用する。
特性決定：
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．１（ヘプタン/酢酸エチル６／４）
1H NMR（３００MHｚ、CDCI3）：δ１．３４−１．５６（ｍ，１４Ｈ），２．２４−２．２７（ｍ，２Ｈ，シス形態）または２．４９−２．５４（ｍ，２Ｈ，トランス構造），３．５５（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），５．９７（ｄｔ，Ｊ＝２１．９Ｈｚ，１Ｈ，トランス構造）または６．１０（ｄｔ，Ｊ＝５５．２Ｈｚ，１Ｈ，シス形態）．
質量分析：［Ｍ−Ｎａ］＋  ２５５（理論値２３２）
【００３５】
実施例７：  １３−ヒドロキシ−トリデク−２ｔ−エン酸の合成操作法
１３−ヒドロキシ−トリデク−２ｔ−エン酸を得るため、ＤＨＡ合成プロトコールをオキサシクロドデカン−２−オンに適用する。
特性決定：
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．１（ヘプタン/酢酸エチル６／４）
1H NMR（３００MHｚ、CDCI3）：δ１．２７−１．６３（ｍ，１６Ｈ），２．２１−２．２８（ｍ，２Ｈ），３．６４（ｔ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，２Ｈ），５．８４（ｄｔ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，１Ｈ），７．０９（ｄｔ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，１Ｈ）．
質量分析：［Ｍ−Ｎａ］＋  ２５１（理論値２２８）
【００３６】
実施例８：  １４−ヒドロキシ−テトラデク−２ｔ−エン酸の合成操作法
１４−ヒドロキシ−テトラデク−２ｔ−エン酸を得るため、ＤＨＡ合成プロトコールをオキサシクロトリデカン−２−オンに適用する。
特性決定：
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．１（ヘプタン/酢酸エチル６／４）
1H NMR（３００MHｚ、CDCI3）：δ１．２９−１．３５（ｍ，１４Ｈ），１．４６−１．６１（ｍ，４Ｈ），２．２１−２．２９（ｍ，２Ｈ），３．６６（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），５．８４（ｄｔ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，１Ｈ），７．０９（ｄｔ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，１Ｈ）．
質量分析：［Ｍ−Ｎａ］＋  ２６５（理論値２４２）
【００３７】
実施例９：  １４−ヒドロキシ−テトラデク−２−フルオロ−２−エン酸の合成操作法
シス／トランス混合物の形態の１４−ヒドロキシ−テトラデク−２−フルオロ−２−エン酸を得るため、２位でフッ素化されたＤＨＡの合成プロトコール（実施例２）をオキサシクロトリデカン−２−オンに適用する。
特性決定：
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．１（ヘプタン/酢酸エチル６／４）
1H NMR（３００MHｚ、CDCI3）：δ１．２９（ｍ，２８Ｈ），１．４２−１．６２（ｍ，８Ｈ），２．２７−２．３１（ｍ，２Ｈ，シス形態），２．５１−２．５６（ｍ，２Ｈ，トランス形態），３．６８（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），３．７０（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），６．０４（ｄｔ，Ｊ＝２１．３Ｈｚ，１Ｈ，トランス形態），６．２７（ｄｔ，Ｊ＝３３．０Ｈｚ，１Ｈ，シス形態）．
質量分析：［Ｍ−Ｎａ］＋  ２８３（理論値２６０）
【００３８】
実施例１０：  １７−ヒドロキシ−ヘプタデク−２ｔ−エン酸の合成操作法
１７−ヒドロキシ−ヘプタデク−２ｔ−エン酸を得るため、ＤＨＡ合成プロトコールをシクロペンタデカノリドに適用する。
特性決定：
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．１（ヘプタン/酢酸エチル６／４）
1H NMR（３００MHｚ、CDCI3）：δ１．２７−１．３２（ｍ，２０Ｈ），１．４６−１．６１（ｍ，４Ｈ），２．２０−２．２９（ｍ，２Ｈ），３．６７（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），５．８４（ｄｔ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，１Ｈ），７．０８（ｄｔ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，１Ｈ）．
質量分析：［Ｍ−Ｎａ］＋  ３０７（理論値２８４）
【００３９】
実施例１１：  １７−ヒドロキシ−ヘプタデク−２−フルオロ−２−エン酸の合成操作法
シス／トランス混合物の形態の１７−ヒドロキシ−ヘプタデク−２−フルオロ−２−エン酸を得るため、２位でフッ素化されたＤＨＡの合成プロトコール（実施例２）をシクロペンタデノリドに適用する。
特性決定：
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．１（ヘプタン/酢酸エチル６／４）
1H NMR（３００MHｚ、CDCI3）：δ１．２７（ｍ，４０Ｈ），１．４５−１．６２（ｍ，８Ｈ），２．２４−２．３２（ｍ，２Ｈ，シス形態），２．５０−２．５８（ｍ，２Ｈ，トランス形態），３．６９（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，４Ｈ），６．０５（ｄｔ，Ｊ＝２１．６Ｈｚ，１Ｈ，トランス形態），６．２６（ｄｔ，Ｊ＝４０．８Ｈｚ，１Ｈ，シス形態）．
質量分析：［Ｍ−Ｈ］＋  ３０１（理論値３０２）
融点：７７℃±１℃
【００４０】
実施例１２：  １８−ヒドロキシ−オクタデク−２ｔ−エン酸（Ｒ１＝Ｈ、ｎ＝１４）の合成操作法
１８−ヒドロキシ−オクタデク−２ｔ−エン酸を得るため、ＤＨＡ合成プロトコールをヘキサシクロデカノリドに適用する。
特性決定：
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．１（ヘプタン/酢酸エチル６／４）
1H NMR（３００MHｚ、CDCI3）：δ１．２７−１．６５（ｍ，２６Ｈ），２．１９−２．３９（ｍ，２Ｈ），３．６７（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），５．８３（ｄｔ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，１Ｈ），７．０９（ｄｔ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，１Ｈ）．
質量分析：［Ｍ−Ｎａ］＋  ３２１（理論値２９８）
【００４１】
実施例１３：  １６−ヒドロキシ−ヘキサデク−２ｔ−エン酸の特性決定
特性決定：
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．１（ヘプタン/酢酸エチル６／４）
1H NMR（３００MHｚ、CDCI3）：δ１．２７−１．３２（ｍ，１８Ｈ），１．４６−１．６１（ｍ，４Ｈ），２．２１−２．２８（ｍ，２Ｈ），３．６６（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），５．８５（ｄｔ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，１Ｈ），７．０９（ｄｔ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，１Ｈ）．
質量分析：［Ｍ−Ｎａ］＋  ２９３（理論値２７０）
【００４２】
オキサシクロトリデカノールを用いたＤｏｅｂｎｅｒ−Ｋｎｏｖｅｎａｇｅｌ反応の例
１．４ｇ（７．０ｍｍｏｌ）のオキサシクロトリデカノール（ラクトール部分還元プロトコールにより得られたもの）を、窒素下、１．０９ｇ（１０．５ｍｍｏｌ）のマロン酸と０．１１ｍｌのピペリジンの存在下で４倍容量のピリジンに溶かす。この反応媒体を８０で１時間半、次いで還流下で２時間加熱する。室温で、この溶液を３Ｍ  ＨＣｌ（５０ｍｌ）に注ぐ。濾過した固体を水で洗浄した後、アセトニトリル中で再結晶化させる（１．２ｇが得られ、すなわち、収率７０％）。
【００４３】
本発明の不飽和ヒドロキシ脂肪酸誘導体に対し、皮膚用および／または美容用組成物における有効成分としてのそれらの利益を実証するためいくつかの実験を行った。
【００４４】
活性酸素種（ＡＯＳ）に対する抗ラジカル作用の研究
正常な細胞代謝の過程で、または時として皮膚がストレス物質に曝される際に、または皮膚科的疾患の過程で、活性酸素種（ＡＯＳ）と呼ばれる反応性酸素化種が生じる(Y.M.W. Janssen et al, 1993)。ＡＯＳは高反応性代謝物といわれ、炎症、老化および腫瘍などの多くのプロセスに重要な役割を果たしている。
【００４５】
ＡＯＳは酸化ストレスに関連する細胞シグナル伝達プロセスの第二のメッセンジャーであり、従って炎症プロセスの初期メディエーターと考えられる(A.Van Der Vliet and A.Bast. 1992)。
【００４６】
ＡＯＳの過剰生産は、細胞に大きな損傷をもたらす。従って、ある種の細胞成分が酸化ストレスの標的となり、原形質膜の脂質成分（脂質過酸化）、タンパク質（変性および分解）ならびに遺伝物質またはＤＮＡ（突然変異）が変化を受け得る。細胞は種々の抗ラジカル防御系（酵素抗酸化剤および非酵素抗酸化剤）によって酸化傷害を制限することができる(B.P.Yu, 1994; H.Steiling et al, 1999)。
【００４７】
しかしながら、ある種の条件下では、ＡＯＳは細胞の抗酸化活性が不十分となるような量で産生される。従って、これらのＡＯＳは炎症性障害や組織の老化を誘発する因子となる(Y. Miyachi et al, 1986; M. Kress et al, 1995)。
【００４８】
in vitroで酸化ストレスを生じ得る種々の化学的作用因子（例えば、Ｈ２Ｏ２）または物理的作用物質（例えば、ＵＶＡ）が存在する。生じたＡＯＳは様々な細胞標的（膜、ＤＮＡまたはタンパク質）を変化させ、この変化は、脂質過酸化のためのＴＢＡＲＳアッセイまたはＨ２ＤＣＦ−ＤＡプローブを用いる細胞内ＡＯＳのin vitroアッセイなどの汎用されている生物学的手順を用いて分析することができる。
【００４９】
Ｈ２Ｏ２は膜脂質の酸化により誘発される連鎖反応の結果として多量の細胞内ＡＯＳを生成することから、本発明者らはＨ２Ｏ２／鉄により誘導される酸化ストレスのin vitro研究モデルを設定した。
【００５０】
この技術は、ひと度細胞に浸透すると細胞内エステラーゼにより脱アセチル化されてＨ２ＤＣＦを形成する蛍光プローブである６−カルボキシ−２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート，ジ（アセトキシメチルエステル）（Ｈ２ＤＣＦＤＡ）の使用に基づくものである。この生成物は細胞内ＡＯＳにより酸化されて蛍光性の高い化合物となる：２’，７’−ジクロロフルオレセイン（ＤＣＦ）(Suematsu M et al., 1996, Free Radicals Practical Approach, Punchard ed. P83-99)。
【００５１】
細胞内ＡＯＳのin vitroアッセイに用いる材料および方法を以下に示す。
ａ）細胞ツール
ネズミ皮膚繊維芽細胞系統Ｌ９２９
【００５２】
ｂ）材料
９６穴平底マイクロプレート
Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ  ＩＩ  ｃｙｔｏｆｌｕｏｒａｍｅｔｅｒ：PERCEPTIVE BIOSYSTEMS参照
【００５３】
ｃ）試薬
細胞培養試薬：
培養培地としてのダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）
ウシ胎児血清
リン酸緩衝ＰＢＳ  ｐＨ７．４
トリプシンＥＤＴＡ（１×）
蛍光プローブ
６−カルボキシ−２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート，ジ（アセトキシメチルエステル）（ＰＭ．６７５，４３）
細胞刺激物
過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）  ３％ＧＩＦＲＥＲ(Gifrer Barbezat Laboratory)
硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）（Ｆｅ２＋）
硫酸アンモニウム鉄（ＩＩＩ）（Ｆｅ３＋）
【００５４】
ｄ）試験対象物：
試験濃度は細胞傷害性のない濃度である。細胞傷害性は対象物(product)を３時間インキュベーションした後、ニュートラルレッド法を用いて調べた。
【００５５】
参照用の抗ラジカル物質はビタミンＥまたはαトコフェロール（ＭＷ：４３０．７）（ＳＩＧＭＡ，ｒｅｆ：Ｔ−１５３９）とする。
【００５６】
保存溶液はＤＭＳＯ中４００ｍｇ／ｍｌの濃度で調製し、−２０℃で保存する。前処理溶液はウシ胎児血清を含まない培養培地中４００μｇ／ｍｌの濃度で新たに調製する。
【００５７】
不飽和ヒドロキシ脂肪酸誘導体の評価では、希釈液は、新たに調製した培養培地で０．０２、０．２、２および２０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で調製する。
【００５８】
ｅ）プロトコール
細胞培養：
繊維芽細胞系統Ｌ９２９由来の細胞を、９６穴平底マイクロプレートの１０％ウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭ１００μｌ中で培養した。これらを５％ＣＯ２、加湿雰囲気下、３７℃で一晩インキュベートした。細胞を含まないブランクプレートは、６穴を用いて評価した。
【００５９】
細胞の前処理：
試験対象物および参照分子の希釈液を、ウシ胎児血清を含まない培養培地で調製した後、１００μｌ／穴の割合で７穴に分注した。
【００６０】
次に、細胞を５％ＣＯ２、加湿雰囲気下、３７℃で３時間インキュベートした。
【００６１】
「ブランク」（細胞の自然の蛍光）、「対照」（ＡＯＳの基本産生）および刺激細胞（酸化処理後のＡＯＳの産生）を１００μｌのＤＭＥＭで覆った。
【００６２】
「対照」細胞をプローブとともにインキュベートしたが、前処理も処理もしなかった。
【００６３】
「刺激」細胞はプローブとともにインキュベートし、処理はしたが、前処理はしなかった。
【００６４】
「ブランク」細胞は前処理もプローブとのインキュベーションもせず、処理もしなかった。
【００６５】
細胞のプローブとのインキュベーションおよび酸化ストレス：
細胞を１００μｌ／穴の割合のＰＢＳ  １×ですすいだ。次にそれらを５％ＣＯ２の加湿雰囲気下、３７℃で３０分間、５μＭのＨ２ＤＣＦ−ＤＡプローブ５０μｌとともにインキュベートした。
【００６６】
プローブ単独と３０分間接触させた後、８００μＭのＨ２Ｏ２  ２５μｌならびに８ｍＭの鉄（ＩＩ）および鉄（ＩＩＩ）溶液２５μｌを加えて終濃度をＨ２Ｏ２  ２００μＭ、鉄（ＩＩ）および鉄（ＩＩＩ）２ｍＭとし、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下、３７℃で３０分間細胞をインキュベートした。
【００６７】
次に細胞を１００μｌ／穴の割合のＰＢＳ  １×ですすいだ後、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下、３７℃で３０分間、１００μｌのＰＢＳ  １×とともにインキュベートした。
【００６８】
この３７℃で１時間３０分のインキュベーションは、細胞内エステラーゼにプローブをＨ２ＤＣＦへと脱アセチル化させ、Ｈ２ＤＣＦは細胞内ＡＯＳによりＤＣＦへと酸化可能であり、ＤＣＦはその形成が細胞内ＡＯＳの量に比例する蛍光化合物である。
【００６９】
蛍光強度はλ（励起）＝４８５ｎｍおよびλ（発光）＝５３０ｎｍにてサイトフルオロメーターで測定する。これは産生された細胞内ＡＯＳの量を表す。
【００７０】
試験プロトコールの概略図：
【化９】
0005615495.tif 000010
【００７１】
細胞内ＡＯＳの産生に対する保護率％の算出
以下の比により、各試験対象物濃度に関する細胞内ＡＯＳの産生に対する保護率％が算出できる（蛍光強度すなわちＩＦは細胞内ＡＯＳの放出を表すため）
［ＩＦ酸化体（Ｈ２Ｏ２／鉄）−ＩＦ（酸化体＋対象物］×１００
ＩＦ酸化体（Ｈ２Ｏ２／鉄）−ＩＦ対照
【００７２】
下表に示す値は、「ブランク」細胞（１００％）および「刺激」細胞（０％）と比べた外的酸化ストレス後の細胞内ＡＯＳ産生の阻害率％である。
【００７３】
Ｌ９２９系統に関して４濃度で試験した１３種類の分子の平均保護率％を下表Ｉに示す。
【００７４】
表Ｉ：不飽和ヒドロキシ脂肪酸由来の１３種類の分子に関しての細胞内ＡＯＳ産生に対する保護の分析：
細胞内ＡＯＳ産生の阻害率％
【表１】
0005615495.tif 000011
プレインキュベーション：３時間
試験数＝全ての化合物について３
試験数＝ビタミンＥについては１８
【００７５】
in vitroでは細胞レベルで、Ｈ２Ｏ２／Ｆｅ２＋／Ｆｅ３＋の結果としての外的ストレスは、蛍光プローブにより検出される細胞内ＡＯＳの産生を誘発し得る。
【００７６】
結論として、フッ素化されていない短鎖（Ｃ９およびＣ１０）不飽和ヒドロキシル脂肪酸誘導体は抗ラジカル細胞保護として特に有効であると思われる。
【００７７】
抗ラジカル作用の研究  脂質過酸化の分析
さらに、正常な細胞代謝の過程で、または時として皮膚がストレス物質に曝される際に、または皮膚科的疾患の過程で、酸化フリーラジカル（ＯＦＲ）と呼ばれる反応性酸素化種も生じる(Y.M.W. Janssen et al, 1993)。ＯＦＲは高反応性代謝物といわれ、炎症、老化および腫瘍などの多くのプロセスに重要な役割を果たしている。
【００７８】
ＯＦＲは酸化ストレスに関連する細胞シグナル伝達プロセスの第二のメッセンジャーであり、従って炎症プロセスの初期メディエーターと考えられる(A.Van Der Vliet and A.Bast. 1992)。
【００７９】
ＯＦＲの過剰生産は、細胞に大きな損傷をもたらす。従って、ある種の細胞成分が酸化ストレスの標的となり、原形質膜の脂質成分（脂質過酸化）、タンパク質（変性および分解）ならびに遺伝物質またはＤＮＡ（突然変異）が変化を受け得る。細胞は種々の抗ラジカル防御系（酵素抗酸化剤および非酵素抗酸化剤）によって酸化傷害を制限することができる(B.P.Yu, 1994; H.Steiling et al, 1999)。
【００８０】
しかしながら、ある種の条件下では、ＯＦＲは細胞の抗酸化活性が不十分となるような量で産生される。従って、これらのＯＦＲは炎症性障害や組織の老化を誘発する因子となる(Y. Miyachi et al, 1986; M. Kress et al, 1995)。
【００８１】
本発明による種々のヒドロキシル化誘導体の抗ラジカル活性を評価するため、本発明者らは参照抗酸化剤（ビタミンＥ）に比べての、酸化ストレス（化学的）により誘発される細胞膜変化に対して保護をもたらすそれらの能力を分析した。
【００８２】
原形質膜はＯＦＲの主要かつ最初の標的となり、脂質に富み、過酸化の高い部位である(A.W. Girotti, 1985)。この脂質酸化プロセスの過程で生じた過酸化物もまた反応性が高く、タンパク質や遺伝物質を破壊することができる。
【００８３】
膜の変化を評価するため、本発明者らは、脂質酸化対象物とチオバルビツール酸との間の複合体のin vitroアッセイにより脂質の過酸化を測定した。これらの複合体はＴＢＡＲＳ（チオバルビツール酸反応性物質）と呼ばれ、この試験はＴＢＡＲＳ試験と呼ばれている。
【００８４】
化学的酸化ストレスを模倣するため、本発明者らは過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）と鉄（Ｆｅ２＋／Ｆｅ３＋）からなる、従って、酸素型(oxygenated)フリーラジカル、特にヒドロキシルラジカル（ＯＨ°）の供給源となるフェントン反応を再構成する複合体を用い、繊維芽細胞系統（Ｌ９２９）を試験した(D.A Vessey et al. 1992)。
Ｈ２Ｏ２＋Ｆｅ２→ＯＨ°＋ＯＨ−＋Ｆｅ３＋
【００８５】
これらの対象物をネズミ繊維芽細胞系統Ｌ９２９で評価した。細胞を種々の濃度の対象物で１６時間前処理した後、Ｈ２Ｏ２／Ｆｅ２＋／Ｆｅ３＋複合体（２００μＭ〜１ｍＭ）で１時間刺激した。
保存溶液：１００ｍｇ／ｍｌエタノール、４℃
最終溶液：０．０２ｎｇ／ｍｌ
【００８６】
膜脂質の過酸化はＴＢＡＲＳを測定することにより分析した（参照プロトコールは、Morliere et al, 1991のＰＬＮ°２）。
【００８７】
試験原理
９５℃の酸性媒体中で、脂質酸化対象物（マロンジアルデヒドまたはＭＤＡ）とチオバルビツール酸（ＴＢＡ）の間でＴＢＡＲＳ複合体が形成され（チオバルビツール酸反応性物質）、これは蛍光を用い、標準ＭＤＡ範囲と比べることでアッセイすることができる。従って、ＴＢＡＲＳアッセイはタンパク質ピコモル／μｇで表される。タンパク質およびＴＢＡＲＳは細胞内媒体でアッセイされる。
【００８８】
細胞膜の保護率％の算出：
ＴＢＡＲＳ算出法（ピコモル／μｇタンパク質）を用い、本発明者らは脂質膜の酸化に対する種々の生成物の保護効力を算出した。
保護率％＝［ＴＢＡＲ対照］−［ＴＢＡＲＳ（＋対象物）］×１００
ＴＢＡＲＳ対照
【００８９】
独立した４つの実験を行った。これらの実験の過程で数種の化合物を評価した（この試験では一度に評価できるのは分子１０種類だけ）。化合物は数回評価し、抗ラジカル活性を測定した別の試験（活性化酸素種に関するアッセイ試験）で得られた結果に応じて選択した。
【００９０】
この実験に用いたモデル（フェントン反応）はＬ９２９繊維芽細胞の著しい脂質過酸化を誘発する。従って、この多量のヒドロキシルラジカルＯＨ°の放出は細胞内、特に膜内の酸化ストレスを生じさせる。しかし、この種の酸化反応では、脂質の過酸化から生じた生成物は細胞においてインターナライズされ、従って、ＴＢＡＲＳは細胞内媒体でアッセイされる。
【００９１】
ビタミンＥは４００μｇ／ｍｌで、Ｈ２Ｏ２／Ｆｅ２＋／Ｆｅ３＋複合体により誘発された脂質の過酸化を軽減し、細胞膜を極めて効果的に保護する。
【００９２】
４つ実験の結果を表ＩＩに示す。
【００９３】
これらのヒドロキシル化誘導体が安定かつ再現性のある抗酸化活性を有するのは極めて明らかである。このことは、とりわけ短い炭素鎖を有する誘導体について当てはまる。
【００９４】
表ＩＩ：種々のヒドロキシル化誘導体による膜脂質の保護
【表２】
0005615495.tif 000012
【００９５】
この研究で示されたin vitroモデルは、主要な細胞標的、すなわち原形質膜に対する主要な酸化ストレスの結果を反映する。従って、脂質過酸化アッセイは酸化ストレスの良好なマーカーとなり、細胞膜におけるヒドロキシルラジカルに対する有効成分の抗酸化作用の評価が可能となる。
【００９６】
抗酸化分子であるビタミンＥにより、このモデルを酸化ストレスに対する細胞膜の効果的保護に関して実証することができる。
【００９７】
ケラチノサイトの分化
最後に、表皮は、環境に耐性を持ち、環境に対して保護をもたらすという皮膚の主要な働きに関与している。表皮は絶えず更新されている層状の扁平上皮である。ホメオスタシスと組織再生はケラチノサイト細胞、支持細胞、可溶性因子に基づき、細胞近接増強細胞間相互作用および細胞外マトリックスとの相互作用を伴う。
【００９８】
表皮分化の最終段階である角質層(stratum corneum)は、ケラチン繊維の形成、ケラチノサイトの角化および層状構造に組織化される細胞間脂質セメントの形成という３つの主要なプロセスから生じる。
【００９９】
表皮内で、脂質の組成および性質はケラチノサイトの分化状態に応じて変動する。従って、基底細胞は角質層(horny layer)の細胞へと遷移するので、活動中の層において原形質膜の無傷性（intactness）を担うリン脂質に実質的な低下が見られる。これと並行して、中性脂質（遊離脂肪酸およびトリグリセリド）およびステロール（コレステロール）の増加ならびにスフィンゴ脂質、特にセラミドの大きな増加が見られる。この角質層(horny layer)で、本発明者らは４０〜５０％のスフィンゴ脂質、２０〜２７％のコレステロールおよび９〜２６％の遊離脂肪酸を認めている。セラミドは、角膜外被の前駆体であるインボルクリン(involucrine)のグルタミン酸残基と共有結合している。それらの疎水性の結果として、脂肪酸は皮膚の不透性の制御に関与し、コレステロールの方は膜の流動性に関与している。
【０１００】
角質層(horny layer)または角質層(stratum corneum)（表皮にバリア機能を持たせる層）の多くの特定のタンパク質は、角化を伴う核溶解に先立つ転写および翻訳活性をもたらす最終のケラチノサイトからなる顆粒層で産生される。
【０１０１】
ケラチノサイト分化は主として、表皮の構造的無傷性に寄与するケラチンなどの構造タンパク質の進化に基づく。それらの発現は表皮細胞の成熟度に応じて変動する。超基底層は、いわゆる最終分化ケラチンである塩基性ケラチン１と酸性ケラチン１０を含む。
【０１０２】
角質層に隣接して、ケラチンはヒスチジンに富んだタンパク質と相互作用して、角質細胞を満たす比較的均質な混合物を形成する。これらのタンパク質は、顆粒層に貯蔵されている大分子（ＭＷ＞４５０ｋＤａ）である前駆体のプロフィラグリンから誘導される。これは末端のＮ基およびＣ基がカルシウムに結合し、従って脱リン酸化と部分的タンパク質分解をもたらしてフィラグリンを生成するタンパク質である。これはケラチン繊維間のジスルフィド橋の形成を触媒し、それらの角質細胞マトリックスへの取り込みに寄与する。さらに、タンパク質分解の結果として、角質層(horney layer)に水分保持特性を付与するアミノ酸およびペプチド誘導体が産生される。
【０１０３】
角質層(horney layer)の角質細胞は本質的に、厚く、耐性のあるタンパク壁である角膜外被により取り囲まれている稠密なマトリックスに挿入されているケラチン繊維を含む。原形質膜の内側に並んでいるこの構造の前駆タンパク質は、この有棘層からケラチノサイトにより合成される。しかしながら、酵素（トランスグルタミナーゼ）の作用下での架橋形成は有棘層と顆粒層の間で起こる。ケラチノサイトの膜画分と結びついた、あるいはケラトヒアリン顆粒に貯蔵されている、多くのサイトゾルタンパク質が角膜層の発達に寄与している。従って、本発明者らは、グルタミンおよびリジンに富んだインボルクリン（６８ｋＤａ）に着目する。
【０１０４】
角質層(horney layer)の不透過性は、その大部分は、角質細胞と一緒に結合している疎水性細胞間脂質セメントによるものである。表皮の脂質含量はケラチノサイトと皮脂脂肪生成の最終帰結である。正常な表皮では、深層には中性脂質と極性脂質の混合物が優勢であり、セラミドを含むより極性の低い内容物に徐々に置きかわる。多くのタンパク質が脂質生成プロセス、従ってセラミドの合成に関与している。これらの中でも、タンパク質ＤＥＳ２（スフィンゴ脂質Ｃ４−ヒドロキシラーゼ／δ−４デサチュラーゼ）が検出されている。これはヒドロセラミドヒドロキシラーゼ活性を有し、フィトセラミドの合成に関与している。その発現は分化によって誘導される(MIZUTANI Y. et Al, 2004)。ケラチノサイトにより合成される脂質はラメラボディー（ケラチノソーム）により皮膚表面に向けられる。これらは細胞間空間に分泌され、角質細胞の細胞膜と平行に並ぶ連続シートの形態となる。表皮分化の過程で起こるこの脂質再編成はＡＢＣ輸送体ファミリー（アデノシン三リン酸結合カセット輸送体）由来のいくつかの脂質輸送体の働きをもたらす。これらの輸送体の中には、ケラチノサイト分化の結果として発現するもの（ＡＢＣＢ１、ＡＢＣＣ１、ＡＢＣＣ３、ＡＢＣＣ４およびＡＢＣＧ１）もあるし、発現が抑制されているもの（ＡＢＣＢ９およびＡＢＣＤ１）もあり、調節を受けていないものまである。発現が誘導される輸送体の役割を研究した。例えば、ＡＢＣＧ１は分化下のケラチノサイトにおけるコレステロールの移動に関与している。別のカテゴリーの輸送体のいくつかのメンバー、すなわち、ＦＡＴＰ１、ＦＡＴＰ３、ＦＡＴＰ４およびＦＡＴＰ５などのＦＡＴＰ（脂肪酸輸送タンパク質）の発現はケラチノサイト分化の過程で誘導される。これらの輸送体は中性脂質プールの再編成に関与すると思われる(KIELAR et Al, 2003)。
【０１０５】
正常ヒトケラチノサイト（ＮＨＫ）はin vitroで増殖および分化して、皮膚の基本編成を模倣する層状構造を形成する。０．１ｍＭを超える細胞外カルシウム濃度は、ケラチノサイトを増殖期から分化期へ向かわせるゲノムおよび非ゲノム事象のカスケードを誘導する。次に、ケラチノサイト分化は、ケラチン１および１０、トランスグルタミナーゼ１、デサチュラーゼＤＥＳ２、インボルクリン、ＦＡＴＰ４およびＡＢＣＧ１輸送体などのいくつかのマーカーの発現を研究することにより評価することができる。従って本発明者らは、in vitro培養モデルにおけるある種のヒドロキシアルセンカルボン酸の作用を評価した。
【０１０６】
この研究計画は次のように示すことができる。in vitroにおけるＮＨＫの分化および分析のためのサンプル
【化１０】
0005615495.tif 000013
【０１０７】
培養およびサンプリング条件
正常ヒトケラチノサイトは皮膚外植片から単離する。それらを、２５μｇ／ｍｌのＢＰＥ（ウシ脳下垂体抽出物）および１．５ｍｇ／ｍｌのＥＧＦ（上皮増殖因子）を含む低カルシウム含量（０．１ｍＭ）のＫＳＦＭ培地(Gibco)で培養する。培養２４時間後、カルシウム（終濃度１．２ｍＭ）を添加することで分化を誘導する。１００および１μｇ／ｍｌの濃度のカルシウムと同時に有効成分を加える、または加えずに、分化に対して効果を有するかどうかを調べる。次に、細胞をこれらのカルシウムおよび生成物を添加して４８時間後に分析する。
【０１０８】
ＲＮＡの抽出およびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡをケラチノサイトから低温条件下で抽出した。
【０１０９】
ｍＲＮＡからｃＤＮＡを逆転写した後、９６穴プレート(iCycler quantitative PCR apparatus, BioRad)でＰＣＲを行った。トランスグルタミナーゼ、デサチュラーゼ（ＤＥＳ２）、ＡＢＣＧ１およびＦＡＴＰ４の転写物の発現を参照遺伝子（ＧＡＰＤＨ、ＵＢＣ、ＨＰＲＴ）の発現に関して標準化した。カルシウムと有効成分で処理したサンプルの発現レベルをカルシウムのみで処理したサンプルの発現に関して比較した。
【０１１０】
１μｇ／ｍｌの対象物の結果を下表に示す。
【０１１１】
【表３】
0005615495.tif 000014
【０１１２】
１μｇ／ｍｌの用量で、これらの対象物は分化マーカーの発現に対して中程度の作用を有する。
【０１１３】
対象物１００μｇ／ｍｌの作用
【表４】
0005615495.tif 000015
【０１１４】
１０μｍのビタミンＤ３は、カルシウムのみで処理した対照に比べ、トランスグルタミナーゼ１、ＤＥＳ２およびＡＢＣＧ１の転写物の発現をそれぞれ８．３、１１．１および３．１倍、誘導する。他方、ＦＡＴＰ４の発現はビタミンＤ３での処理によっては変化しない。
【０１１５】
従って、本発明の不飽和ヒドロキシル脂肪酸誘導体に対する分化の増強作用が実証された。
【０１１６】
炎症の脂質メディエーターにおいて分析した抗炎症作用
その環境に存在する多くの細胞外因子に応答して、表皮に最も豊富な細胞であるケラチノサイトは生物学的に活性なメディエーター、すなわち、皮膚の炎症反応の誘発および調節に重要な役割を果たし、免疫応答の調節にも関与しているプロスタグランジンおよびロイコトリエンを放出する。プロスタグランジンＰＧ６ＫＦ１αは刺激されたケラチノサイトにより産生される主要な代謝産物であり、シクロオキシゲナーゼ経路によるアラキドン酸代謝によって起こる代謝産物の調節を代表するものである。
【０１１７】
プロトコール：
ＤＭＥＭ１０％ウシ胎児血清中のケラチノサイト懸濁液を６穴プレートに分注し（１．２×１０６細胞／穴）、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１６時間インキュベートした。次に、ケラチノサイトをＰＢＳですすいで結合していない細胞を除去した後、ウシ胎児血清（アッセイを妨害することがある）を含まないＤＭＥＭに添加した試験対象物に曝した。
【０１１８】
培養物中の試験濃度は３μｇ／ｍｌとした。これは細胞傷害性に関する予備評価試験（ニュートラルレッド）の後も試験濃度として維持され、細胞傷害性ではない。
【０１１９】
各処理につき、３穴を試験した。細胞を試験対象物とともに６０分間プレインキュベートした後、アラキドン酸カスケード（カルシウムイオノフォア）を刺激するために刺激剤を加え、これは５時間加え、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７は１μｍの濃度で用いた。
【０１２０】
培養５時間後、各穴の培養培地を回収し、３０００ｒｐｍで遠心分離し、−８０℃で保存した。
【０１２１】
各試験でのプロスタグランジン６ＫＦ１αの産生をＥＵＲＯＭＥＤＥＸ  Ｅｌｉｓａキットを用いて測定した。
【０１２２】
結果：
結果を活性／刺激対照％として表す。
【０１２３】
【表５】
0005615495.tif 000016
【０１２４】
抗炎症特性：炎症誘発性サイトカインＩＬ８の合成の阻害
皮膚のバリア機能は外部環境に対する防御をもたらし、表皮のケラチノサイトは多様な刺激物またはアレルギー性物質に直接応答し、特にタンパク質起源のメディエーターである炎症誘発性サイトカインの産生を介して皮膚の炎症および免疫応答プロセスに積極的に関与する。これらの生物学的に活性な分子の中でも、ＩＬ１α（インターロイキン１α）およびＴＮＦα（腫瘍壊死因子α）は、それらは内皮細胞周辺に接着分子を誘導し、ケモカインなどの走化因子を誘導することからそれらの放出が炎症の誘発に十分であるので、主要なサイトカインであると考えられる。ケモカイン系は炎症応答の過程で白血球の輸送を制御し、先天性免疫応答と後天性免疫応答の相互作用に必要とされる。
【０１２５】
この研究では、本発明者らは特に、炎症性応答の増幅に大きく関与しており、従って、その主要な役割が多核好中球を補充し活性化させること、すなわちそれらの炎症誘発性分子の放出を刺激することによるものである、ケモカイン（インターロイキン８）に着目した。
【０１２６】
９６穴プレートを用いて行ったこの研究では、本発明者らは、ホルボールエステルＰＭＡおよびカルシウムイオノフォアＡ２３１８７によるケラチノサイトにおいて産生されるインターロイキン８の産生に対するヒドロキシルアルキン酸の活性を評価した。
【０１２７】
プロトコール：
補給ＫＳＦＭ中のケラチノサイト懸濁液を９６穴プレート（３×１０４細胞／穴）に分注し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１６時間インキュベートした。次に、ケラチノサイトをＰＢＳですすいで接着していない細胞を除去した後、補給ＫＳＦＭ（アッセイを妨害することがある）を含まない試験対象物に曝した。
【０１２８】
培養物中の試験濃度は３μｇ／ｍｌとした。これは細胞傷害性を評価する予備試験（ニュートラルレッド）の後も維持され、細胞傷害性ではない。
【０１２９】
各処理につき、３穴を試験した。細胞を試験対象物とともに６０分間プレインキュベートした後、刺激剤を含まない陰性対照と並行して、ミリスチン酸酢酸ホルボール（ＰＭＡ）１μｍ＋カルシウムイオノフォア（Ａ２３１８７）０．１μｍで刺激した。
【０１３０】
５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気下、３７℃で６時間インキュベートした。
【０１３１】
各穴の培養培地を回収し、３０００ｒｐｍで遠心分離し、−８０℃で保存した。
【０１３２】
サイトカインアッセイ：ＩＬ８をＥＬＩＳＡキット免疫酵素法(immunotech)を用いてアッセイした。
【０１３３】
結果：
結果を活性／刺激対照％として表す。
【０１３４】
【表６】
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【０１３５】
本発明による化合物を、ホルボールエステルＰＭＡ＋カルシウムイオノフォアＡ２３１８７により刺激されたヒトケラチノサイトＮＨＫによるインターロイキン８の放出に対する抗炎症活性に関して評価した。
【０１３６】
３つの独立した実験を行った。得られたデータを合成すると、特に以下の２つの化合物の抗炎症能が明らかである。
ｎ＝１３，Ｒ＝Ｒｎ＝Ｈ，Ｒ１＝Ｆ
ｎ＝１３，Ｒ＝Ｒｎ＝Ｒ１＝Ｈ
【０１３７】
各分子に関して評価された濃度について、有効用量５０を算出した後の、本発明者らの結果を以下に示す。
【０１３８】
【表７】
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【０１３９】
炎症および掻痒：ＰＡＲ２受容体の刺激後のカルシウム流に分析
プロテアーゼにより活性化される受容体−２（ＰＡＲ−２）は、炎症反応が存在するいくつかの疾病の生理病理学に関与している。ＰＡＲ−２は、ケラチノサイト、汗腺の筋上皮細胞、毛包、真皮の樹状様細胞ならびに固有層および真皮の内皮細胞など、種々のタイプの皮膚細胞により発現される(Steinhoff et al. 1999; Santulli et al., 1995)。メラノサイトはこの受容体を発現しない(Seiberg et al., 2000)が、ＰＡＲ−２はメラノサイトからケラチノサイトへメラニンの輸送を促すことによる色素沈着において重要な役割を果たす(Sharlow et al., 2000)。
【０１４０】
表皮が生成したセリンプロテアーゼは、皮膚において白血球の補充を誘導する走化作用を発揮する。これらはまたホメオスタシス、有糸分裂誘発および表皮分化の調節に関与し、皮膚のバリア機能を調節する。さらに、セリンプロテアーゼは炎症、宿主防御、発癌、繊維症および神経刺激に関連した皮膚疾患の生理病理学にも関与する。
【０１４１】
セリンプロテアーゼの生理学的および生理病理学的な皮膚特性は、ＰＡＲ受容体と一部関連があると思われる。実際、ＰＡＲ−２受容体は、アトピー性皮膚炎、扁平苔癬および乾癬などの炎症性皮膚疾患の場合に表皮、真皮および血管で過剰発現される(Steinhoff et al., 1999)。これらのＰＡＲ２受容体はまた、アトピー性皮膚炎患者における掻痒の発生にも役割を果たしていると思われる(Steinhoff et al., 2003)。
【０１４２】
トリプシン様プロテアーゼによるＰＡＲ−２の活性化は、ケラチノサイト（ＨａＣａＴ）からのＩＬ８の産生を誘発する(Hou et al., 1998)。さらに最近では、白血球に対する化学誘因ケモカインであるＩＬ−８が、尋常性乾癬患者において好中球を表皮へ浸潤させることが実証されている(Iwakiri et al., 2004)。
【０１４３】
細胞内および細胞外カルシウムの可動化の基礎には、１つにはＰＡＲ−２受容体の細胞内シグナル伝達がある。
【０１４４】
従って、本発明者らは、ＨａＣａＴ系統由来のヒトケラチノサイトに存在するトリプシンに対するＰＡＲ−２受容体により特異的に刺激された後に誘導される細胞内カルシウム流入に対する式Ｉのヒドロキシル酸誘導体の抗ＰＡＲ−２活性を評価することを考えた。
【０１４５】
この技術は細胞への受動的拡散によりその浸透を助長するＡＭ基による、エステル化蛍光プローブの使用に基づいている。使用プローブはＦｌｕｏ−４／ＡＭである。カルシウムイオンに結合している脱エステル化形態のみが蛍光励起可能で（４８５ｎｍ）、５３５ｎｍで発光する。
【０１４６】
トリプシンにより誘導されるカルシウム流の阻害％
【表８】
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【０１４７】
トリプシンによる刺激
ＨａＣａＴ系統から起源するケラチノサイト：
上記表に記載されている一般式Ｉのヒドロキシ酸誘導体は、最初の化合物では１０μｇ／ｍｌの濃度で、また、後の２つの化合物では１００μｇ／ｍｌの濃度で、トリプシンにより誘導されるカルシウム流に阻害作用を有する。
【０１４８】
in vitroにおいて、細胞レベルで、トリプシンによるＰＡＲ−２受容体の特異的刺激は、蛍光プローブの助けで検出される細胞内および細胞外カルシウムの可動化をもたらす。
【０１４９】
この実験の条件下、試験した濃度で、上記の表で示した一般式（Ｉ）の化合物は抗ＰＡＲ−２の活性を有意に調節する。
【０１５０】
in vitroにおけるメラニン合成に対するヒドロキシ脂肪酸誘導体の作用
メラノサイトは表皮の基底層に少量見られる星形の細胞である。それらの主な役割は、特殊なオルガネラであるメラノソームでメラニンが合成されるプロセス、すなわちメラニン形成を行うことであり、その後それは輸送され、それらの樹状突起を介して隣接するケラチノサイトに分布される。このケラチノサイトとの接触により、紫外線の突然変異誘発作用から表皮を保護する機構である皮膚の色素沈着がもたらされる。各メラノサイトは３６のケラチノサイトと接し、「表皮メラニン沈着ユニット」を形成する。
【０１５１】
メラニン形成は、一連の酵素反応および自然反応からなり、その前駆体はチロシンである。このプロセスには、チロシナーゼならびにチロシナーゼ関連タンパク質１および２（ＴＲＰ１および２）の３つの主要な酵素が関与している（１）。チロシナーゼはチロシンのドーパキノンへの変換を触媒する。この後、ユーメラニン形成とフェオメラニン形成の可能性のある２つの合成経路が存在する。ドーパキノンのユーメラニンへの変換は、ＴＲＰ−１およびＴＲＰ−２を含む一連の酸化反応を介して起こる。ユーメラニンは硫黄含量の低い褐色〜黒色の色素に相当し、光保護を提供する。フェオメラニン形成では、硫黄含量の高い分子がドーパキノンに取り込まれて、赤毛に見られる黄色〜橙色のフェオメラニンとなる。
【０１５２】
メラニン合成の生理学的刺激は、メラノサイトの増加、メラニンの新生、およびデンドリシティー(dendricity)の上昇とメラノソームのケラチノサイトへの輸送の増加を合わせたメラノサイトの形態変化をもたらす太陽光である。分子レベルでは、太陽光に曝されると、αメラノサイト刺激ホルモンの合成および分泌が刺激される。α−ＭＳＨはメラノサイト内のｃＡＭＰ濃度を高め、転写因子Ｍｉｔｆを活性化させ、これが次に、チロシナーゼをコードする遺伝子であるＴＲＰ−１とＴＲＰ−２の転写活性を刺激する。
【０１５３】
また、いくつかの外因性分子がメラニン形成に対して負の調節作用を持つことも知られている。ヒドロキノンは、その活性を別の方向へ向けるよう、チロシナーゼの基質としてそれ自体を提示することで、メラニンの合成を阻害する。
【０１５４】
メラニン形成に対する不飽和ヒドロキシ脂肪酸誘導体の調節作用を分析した。これを行うため、ネズミメラノーマ細胞系統であるＢ１６Ｆ１０系統で、比色定量アッセイによりメラニン合成の測定を行った。
【０１５５】
生成物の作用は、色素脱失能を調べるために、基底状態とα−ＭＳＨによる刺激後に検討した。
【０１５６】
メラニンアッセイ
細胞外と細胞内のメラニンのレベルを、Anob et al., 1999が記載しているプロトコールに従い、波長４０５ｎｍの分光光度により測定した。色素の量はスタンダードメラニンレンジとＭｉｃｒｏｗｉｎソフトウエア(Berthold Biotechnologies)による分析を用いて求めた。総タンパク質アッセイは、５４０ｎｍでのＢＣＡ−銅法により細胞内メラニンサンプルに対して行った。スタンダードレンジは、標準タンパク質ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を用いて作成した。
【０１５７】
結果
基底状態では、αＭＳＨは１μＭで、対照細胞に比べてメラニン生成を１００％増加させる。
【０１５８】
このメラニン増加は、αＭＳＨ活性の６０％阻害をもたらすヒドロキノン１μ／ｍｌまたはビタミンＣ４０μｇ／ｍｌなどの色素脱失剤により逆転する。
【０１５９】
３０μｇ／ｍｌ基底状態において、
・ｎ＝１０、Ｒ＝Ｒｎ＝Ｈ、Ｒ１＝Ｆの一般式１の化合物はメラニン合成を３０〜４５％阻害するが、αＭＳＨの不在下では、この同じ化合物が３０μｇ／ｍｌで４５〜６０％の阻害をもたらす。
・ｎ＝１０、Ｒ＝Ｒ１＝Ｒｎ＝Ｈの一般式１の化合物は前述の化合物よりも活性が低く、基底状態で１５％の阻害を示すが、αＭＳＨの不在下では、このメラニン向性物質に対するこの化合物の阻害能は前述の化合物と同等で、すなわち、４５〜６０％である。
【０１６０】
１０μｇ／ｍｌでは、αＭＳＨによるメラニン形成の誘導に対するこれら２つの酸の阻害活性は３５％程度である。