(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記アミノ酸配列：
Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ（配列番号：４）からなるペプチド。
【請求項２】
下記アミノ酸配列：
（ａ）Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ（配列番号：２）、
（ｂ）Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ（配列番号：３）、
（ｃ）Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ（配列番号：４）、および
（ｄ）Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ（配列番号：５）
からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドを含む、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３陽性対象における癌を治療または予防するための医薬組成物。
【請求項３】
下記アミノ酸配列：
（ａ）Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ（配列番号：２）、
（ｂ）Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ（配列番号：３）、
（ｃ）Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ（配列番号：４）、および
（ｄ）Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ（配列番号：５）
からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドの、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３陽性対象における癌を治療または予防するための医薬組成物の製造のための使用。
【請求項４】
請求項１記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項６】
下記（１）または（２）を含む、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３陽性対象における癌を治療または予防するための医薬組成物：
（１）
（ａ）Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ（配列番号：２）、
（ｂ）Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ（配列番号：３）、
（ｃ）Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ（配列番号：４）、および
（ｄ）Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ（配列番号：５）
からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードするポリヌクレオチド
（２）（１）のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項７】
ＨＬＡ−Ａ＊３３０３陽性対象における癌を治療または予防するための医薬組成物の製造のための、下記（１）または（２）の使用：
（１）
（ａ）Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ（配列番号：２）、
（ｂ）Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ（配列番号：３）、
（ｃ）Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ（配列番号：４）、および
（ｄ）Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ（配列番号：５）
からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードするポリヌクレオチド
（２）（１）のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項８】
下記アミノ酸配列：
（ａ）Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ（配列番号：２）、
（ｂ）Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ（配列番号：３）、
（ｃ）Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ（配列番号：４）、および
（ｄ）Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ（配列番号：５）
からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドにより誘導される、ＷＴ１ペプチドとＨＬＡ−Ａ＊３３０３分子との複合体を認識するＣＴＬ。
【請求項９】
下記アミノ酸配列：
（ａ）Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ（配列番号：２）、
（ｂ）Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ（配列番号：３）、
（ｃ）Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ（配列番号：４）、および
（ｄ）Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ（配列番号：５）
からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドの存在下で、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３陽性対象由来の末梢血単核球を培養し、該末梢血単核球からＷＴ１特異的ＣＴＬを誘導することを特徴とする、ＷＴ１ペプチドとＨＬＡ−Ａ＊３３０３分子との複合体を認識するＣＴＬの誘導方法。
【請求項１０】
下記アミノ酸配列：
（ａ）Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ（配列番号：２）、
（ｂ）Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ（配列番号：３）、
（ｃ）Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ（配列番号：４）、および
（ｄ）Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ（配列番号：５）
からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドを必須構成成分として含む、ＷＴ１ペプチドとＨＬＡ−Ａ＊３３０３分子との複合体を認識するＣＴＬを誘導するためのキット。
【請求項１１】
下記アミノ酸配列：
（ａ）Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ（配列番号：２）、
（ｂ）Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ（配列番号：３）、
（ｃ）Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ（配列番号：４）、および
（ｄ）Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ（配列番号：５）
からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドにより誘導される、ＷＴ１ペプチドをＨＬＡ−Ａ＊３３０３分子を介して提示する抗原提示細胞。
【請求項１２】
下記アミノ酸配列：
（ａ）Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ（配列番号：２）、
（ｂ）Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ（配列番号：３）、
（ｃ）Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ（配列番号：４）、および
（ｄ）Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ（配列番号：５）
からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドの存在下で未熟抗原提示細胞を培養し、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３陽性対象由来の該未熟抗原提示細胞からＷＴ１ペプチドをＨＬＡ−Ａ＊３３０３分子を介して提示する抗原提示細胞を誘導することを特徴とする、ＷＴ１ペプチドをＨＬＡ−Ａ＊３３０３分子を介して提示する抗原提示細胞の誘導方法。
【請求項１３】
下記アミノ酸配列：
（ａ）Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ（配列番号：２）、
（ｂ）Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ（配列番号：３）、
（ｃ）Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ（配列番号：４）、および
（ｄ）Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ（配列番号：５）
からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドを必須構成成分として含む、ＷＴ１ペプチドをＨＬＡ−Ａ＊３３０３分子を介して提示する抗原提示細胞を誘導するためのキット。
【請求項１４】
請求項８記載のＣＴＬまたは請求項１１記載の抗原提示細胞をＨＬＡ−Ａ＊３３０３陽性対象由来の試料とインキュベーションし、次いで、
該ＣＴＬまたは該抗原提示細胞の量を決定することを特徴とする、
癌の検査を補助する方法。
【請求項１５】
ＨＬＡ−Ａ＊３３０３陽性対象におけるＷＴ１特異的ＣＴＬの存在または量を決定する方法であって、
（ａ）ＷＴ１ペプチドとＨＬＡ−Ａ＊３３０３分子との複合体をＨＬＡ−Ａ＊３３０３陽性対象由来試料と反応させ；次に、
（ｂ）該試料に含まれる該複合体を認識するＣＴＬの存在または量を調べる、
工程を含む方法であって、該ＷＴ１ペプチドが下記アミノ酸配列：
（ａ）Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ（配列番号：２）、
（ｂ）Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ（配列番号：３）、
（ｃ）Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ（配列番号：４）、および
（ｄ）Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ（配列番号：５）
からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドである、方法。
【請求項１６】
複合体がテトラマーの形態である、請求項１５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３拘束性ＷＴ１ペプチド、詳細には、ＷＴ１タンパク質由来の９個の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列を含むペプチドであって、該９個の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列の第２位のアミノ酸がＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、およびＡｓｐからなる群から選択されるものであり、第９位のアミノ酸がＡｒｇである、ペプチドに関する。さらに本発明は、該ペプチドをコードするポリヌクレオチド、それらを含む癌治療／予防用医薬組成物などに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＷＴ１遺伝子（Wilms' tumor 1 gene）は、小児の腎癌であるウイルムス腫瘍の責任遺伝子として同定された遺伝子であり（非特許文献１および２）、ジンクフィンガー構造を有する転写因子である。当初、ＷＴ１遺伝子は癌抑制遺伝子であるとされたが、その後の研究（非特許文献３、４、５および６）により、造血器腫瘍や固形癌においてはむしろ癌遺伝子として働くことが示された。【０００３】
ＷＴ１遺伝子が多くの悪性腫瘍において高発現していることから、変異のない自己タンパク質であるＷＴ１遺伝子産物の生体内における免疫原性の有無が検証されてきた。その結果、腫瘍細胞で高発現しているＷＴ１遺伝子由来のタンパク質は細胞内プロセッシングにより断片化され、生じたペプチドがＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成して細胞表面に提示されること、およびかかる複合体を認識するＣＴＬがＷＴ１ペプチドワクチネーションにより誘導され得ることが明らかとなった（非特許文献７、８および９）。さらに、ＷＴ１ペプチドまたはＷＴ１  ｃＤＮＡで免疫されたマウスは、移植されたＷＴ１遺伝子発現腫瘍細胞を高い確率で拒絶するが（非特許文献７および１０）、ＷＴ１遺伝子を生理的に発現している正常組織は誘導されたＣＴＬによって傷害されないことも示された（非特許文献７）。ヒト細胞を用いたインビトロの実験において、ヒトＭＨＣクラスＩ分子の１つであるＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子高結合性Ｄｂ１２６ペプチドおよびＷＨ１８７ペプチド（配列番号：１におけるアミノ酸１８７−１９５、ＳＬＧＥＱＱＹＳＶ）を用いてＨＬＡ−Ａ＊０２０１を持つヒト末梢血単核球を刺激すると、ＷＴ１特異的ＣＴＬが誘導され、誘導されたＣＴＬは内因性にＷＴ１遺伝子を高発現している腫瘍細胞に対し特異的な傷害活性を有すること、およびかかるＣＴＬの傷害活性はＨＬＡ−Ａ２拘束性であることが示された（非特許文献１１）。ＨＬＡ−Ａアリールのうち、日本人に最も多いＨＬＡ−Ａ＊２４０２に適合するＷＴ１ペプチド（ＷＴ１２３５；配列番号：１におけるアミノ酸２３５−２４３、ＣＭＴＷＮＱＭＮＬ）を用いたヒト細胞でのインビトロの実験において、ＷＴ１特異的ＣＴＬ（ＴＡＫ−１）が誘導され（非特許文献１２）、誘導されたＣＴＬは、一部ＷＴ１遺伝子を生理的に発現している正常造血幹細胞のコロニー形成能を抑制しないことが示された（非特許文献１３および１４）。これらの報告から、マウスだけでなくヒトにおいてもＷＴ１特異的ＣＴＬの誘導が可能であり、かかるＣＴＬがＷＴ１遺伝子を高発現する腫瘍細胞に対しては傷害活性を有するが、ＷＴ１遺伝子を生理的に発現する正常細胞には傷害活性を有さない可能性が強く示唆された（非特許文献７、１０、１１、１２、１３および１４）。【０００４】
ＷＴ１遺伝子産物は核内タンパク質として存在し、細胞質内でプロテアソームによってプロセッシングを受け、ペプチドに断片化される。断片化されたペプチドは、ＴＡＰ（transporter associated with antigen processing）分子によって小胞体内腔へと導かれ、ＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成し、細胞表面に提示される。ＣＴＬ前駆細胞がＴＣＲを介してＷＴ１ペプチド−ＭＨＣクラスＩ分子複合体を認識することによって、ＷＴ１特異的ＣＴＬが誘導され、ＭＨＣクラスＩ分子を介してＷＴ１遺伝子産物を提示する腫瘍細胞に対して細胞傷害作用を発揮する（非特許文献７、８および９）。そうすると、ＷＴ１遺伝子産物を標的とした癌免疫療法において用いられるＷＴ１ペプチドは、少なくとも生体内でＭＨＣクラスＩ分子に結合する形態となる必要がある。しかし、ＭＨＣクラスＩ分子には多様性があり、それぞれのＭＨＣクラスＩ分子に結合するＷＴ１ペプチドのアミノ酸配列は異なるため、ＭＨＣクラスＩの型別に適合するペプチドを用意する必要がある。しかしながら、現在分かっているＨＬＡ分子に拘束性のＷＴ１ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子、ＨＬＡ−Ａ＊２６０１分子拘束性のもののみである（それぞれ、特許文献１、非特許文献１１、および特許文献２）。日本人において、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２に次いで多いＨＬＡ−ＡアリールはＨＬＡ−Ａ＊３３０３であるため、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３拘束性ＷＴ１ペプチドを見出す必要があった。
【特許文献１】国際公開２００３／１０６６８２号公報
【特許文献２】国際公開２００５／０９５５９８号公報
【非特許文献１】Daniel A. Haber et al., Cell. 1990 Jun 29;61(7):1257-69.
【非特許文献２】Call KM et al., Cell. 1990 Feb 9;60(3):509-20.
【非特許文献３】Menke AL et al., Int Rev Cytol. 1998;181:151-212. Review.
【非特許文献４】Yamagami T et al., Blood. 1996 Apr 1;87(7):2878-84.
【非特許文献５】Inoue K et al., Blood. 1998 Apr 15;91(8):2969-76.
【非特許文献６】Tsuboi A et al., Leuk Res. 1999 May;23(5):499-505.
【非特許文献７】Oka Y et al., J Immunol. 2000 Feb 15;164(4):1873-80.
【非特許文献８】Melief CJ et al., Immunol Rev. 1995 Jun;145:167-77.
【非特許文献９】Ritz J, J Clin Oncol. 1994 Feb;12(2):237-8.
【非特許文献１０】Tsuboi A et al., J Clin Immunol. 2000 May;20(3):195-202.
【非特許文献１１】Oka Y et al., Immunogenetics. 2000 Feb;51(2):99-107.
【非特許文献１２】Ohminami H et al., Blood. 2000 Jan 1;95(1):286-93.
【非特許文献１３】Gao L et al., Blood. 2000 Apr 1;95(7):2198-203.
【非特許文献１４】Ohminami H et al., Blood. 2000 Jan 1;95(1):286-93.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の解決課題は、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３拘束性ＷＴ１ペプチド、およびそれをコードするポリヌクレオチド、ならびにそれらを含む癌の治療／予防用医薬組成物などを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記事情に鑑み鋭意研究を重ねた結果、ＷＴ１タンパク質由来の９個の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列を含むペプチドであって、該９個の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列の第２位のアミノ酸がＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、およびＡｓｐからなる群から選択されるものであり、第９位のアミノ酸がＡｒｇであるペプチドが、ＷＴ１特異的ＣＴＬを高い確率で誘導することを見出し、本発明を完成するに至った。【０００７】
すなわち、本発明は、
（１）ＷＴ１タンパク質由来の９個の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列を含むペプチドであって、該９個の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列の第２位のアミノ酸がＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、およびＡｓｐからなる群から選択されるものであり、第９位のアミノ酸がＡｒｇである、ペプチド、
（２）アミノ酸配列が以下の群：
Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ（配列番号：２）、
Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ（配列番号：３）、
Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ（配列番号：４）、および
Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ（配列番号：５）
から選択されるものである、（１）記載のペプチド、
（３）アミノ酸配列がＳｅｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ（配列番号：４）である、（２）記載のペプチド、
（４）（１）記載のペプチドを含む、癌を治療または予防するための医薬組成物、
（５）有効量の（４）記載の医薬組成物をＨＬＡ−Ａ＊３３０３陽性対象に投与することを特徴とする、癌を治療または予防するための方法、
（６）（４）記載の医薬組成物を製造するための（１）記載のペプチドの使用、
（７）（１）記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（８）（７）記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
（９）（７）記載のポリヌクレオチドまたは（８）記載のベクターを含む、癌を治療または予防するための医薬組成物、
（１０）有効量の（９）記載の医薬組成物をＨＬＡ−Ａ＊３３０３陽性対象に投与することを特徴とする、癌を治療または予防するための方法、
（１１）（９）記載の医薬組成物を製造するための（７）記載のポリヌクレオチドまたは（８）記載のベクターの使用、
（１２）（１）記載のペプチドにより誘導される、ＷＴ１特異的ＣＴＬ、
（１３）末梢血単核球を（１）記載のペプチドの存在下で培養し、該末梢血単核球からＷＴ１特異的ＣＴＬを誘導することを特徴とする、ＷＴ１特異的ＣＴＬの誘導方法、
（１４）（１）記載のペプチドを必須構成成分として含む、ＷＴ１特異的ＣＴＬを誘導するためのキット、
（１５）（１）記載のペプチドにより誘導される、ＷＴ１ペプチドを提示する抗原提示細胞、
（１６）未熟抗原提示細胞を（１）記載のペプチドの存在下で培養し、該未熟抗原提示細胞からＷＴ１ペプチドを提示する抗原提示細胞を誘導することを特徴とする、ＷＴ１ペプチドを提示する抗原提示細胞の誘導方法、
（１７）（１）記載のペプチドを必須構成成分として含む、ＷＴ１ペプチドを提示する抗原提示細胞を誘導するためのキット、
（１８）（１２）記載のＣＴＬまたは（１５）記載の抗原提示細胞を用いることを特徴とする、癌の診断方法、
（１９）ＨＬＡ−Ａ＊３３０３陽性対象におけるＷＴ１特異的ＣＴＬの存在または量を決定する方法であって、
（ａ）ＷＴ１ペプチドとＨＬＡ−Ａ＊３３０３分子との複合体を該対象由来試料と反応させ；次に、
（ｂ）該試料に含まれる該複合体を認識するＣＴＬの存在または量を調べる、
工程を含む方法、
（２０）複合体がテトラマーの形態である、（１９）記載の方法、
を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３拘束性ＷＴ１ペプチド、およびそれをコードするポリヌクレオチド、ならびにそれらを含む癌の治療／予防用医薬組成物などが得られるので、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３を有する対象におけるインビボおよびインビトロでのＷＴ１特異的ＣＴＬの誘導が可能となる。日本人の約２４％が少なくとも１つのＨＬＡ−Ａ＊３３０３分子を有していることから、非常に広範囲の対象においてＷＴ１特異的ＣＴＬを誘導できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ＷＴ１３３７を用いて誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性を示す。
【図２】図２は、ＷＴ１３６４を用いて誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性を示す。
【図３】図３は、ＷＴ１３６７を用いて誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性を示す。
【図４】図４は、ＷＴ１４０９を用いて誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性を示す。
【図５】図５は、ＷＴ１３６４を用いて誘導されたＣＴＬの内因性ＷＴ１遺伝子発現細胞に対する細胞傷害活性を示す。
【図６】図６は、ＷＴ１３６７を用いて誘導されたＣＴＬの内因性ＷＴ１遺伝子発現細胞に対する細胞傷害活性を示す。
【図７】図７は、ＷＴ１４０９を用いて誘導されたＣＴＬの内因性ＷＴ１遺伝子発現細胞に対する細胞傷害活性を示す。
【図８】図８は、ＷＴ１３６７を用いて誘導されたＣＴＬのＷＴ１遺伝子発現細胞に対する細胞傷害活性を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
ヒトＷＴ１タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：１に示す。ＷＴ１遺伝子は、例えば、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌などの固形癌において天然型で高発現している。また、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３アンカーモチーフは、第２位にＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、およびＡｓｐのいずれか、第９位にＡｒｇを有する。従って、本発明は、１の態様において、ＷＴ１タンパク質由来の９個の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列を含むペプチドであって、該９個の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列の第２位のアミノ酸が、好ましくはＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、およびＡｓｐからなる群から選択されるものであり、第９位のアミノ酸が、好ましくはＡｒｇである、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３拘束性ＷＴ１ペプチド（以下、ＷＴ１ペプチドともいう）に関するものである。【００１１】
本発明のペプチドが含む該９個のアミノ酸からなるアミノ酸配列のうち好ましいものは、Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ（配列番号：２）、Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ（配列番号：３）、Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ（配列番号：４）、またはＴｈｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ（配列番号：５）であり、最も好ましいものは、Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ（配列番号：４）である。さらに、配列番号：２〜５のいずれかにおいて、該９個のアミノ酸のうち１個ないし数個、好ましくは１個ないし５個のアミノ酸が別のアミノ酸に置換されたものであってもよい。また、該９個のアミノ酸および置換された別のアミノ酸のいずれかが、適宜修飾されたものであってもよい。但し、いずれの場合にも、本発明のペプチドがＨＬＡ−Ａ＊３３０３分子との結合能を保持していることが条件となる。【００１２】
本発明は、上述の通りＨＬＡ−Ａ＊３３０３拘束性を有するＷＴ１ペプチドを得ることを目的としている。ゆえに、本発明のペプチドは、ＷＴ１タンパク質由来であって、上記９個の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列を含んでいればよい。従って、本発明のペプチドは配列番号：２〜５に示すアミノ酸配列からなるペプチドそのものであってもよく、あるいは配列番号：２〜５に示すアミノ酸配列を含む、ＷＴ１タンパク質またはその一部であってもよい。本発明のペプチドはまた、上記９個の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端に、種々の物質を結合させることができる。例えば、アミノ酸、ペプチド、それらのアナログ等を結合させてもよい。本発明のペプチドにこれらの物質が結合している場合、これらの物質が例えば、生体内酵素などにより、あるいは細胞内プロセッシングなどの過程により処理され、最終的に上記９個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を生じ、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３分子との複合体として細胞表面に提示されることにより、ＣＴＬ誘導効果を得ることができる。これらの物質は、本発明のペプチドの溶解性を調節するものであってもよく、耐プロテアーゼ作用等その安定性を向上させるものであってもよく、また例えば、所定の組織・器官に特異的に本発明のペプチドをデリバリーするようなものであってもよく、あるいはまた抗原提示細胞の取込み効率を増強させる作用などを有するものであってもよい。これらの物質はまた、ＣＴＬ誘導能を増大させるもの、例えば、ヘルパーペプチドなどであってもよい。【００１３】
本発明のペプチドは、当該技術分野において通常用いられる方法またはそれらの変法を用いて合成することができる。かかる合成方法は、例えば、Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966；The Proteins, Vol 2, Academic Press Inc., New York, 1976；ペプチド合成、丸善（株），1975；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），1985；医薬品の開発  続  第１４巻・ペプチド合成、広川書店，1991などに記載されている。【００１４】
本発明のペプチドはまた、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列情報に基づき、遺伝子工学的手法を用いて製造することもできる。かかる遺伝子工学的手法は、当業者に周知のものである。【００１５】
本発明は、もう１つの態様において、上記ＨＬＡ−Ａ＊３３０３拘束性ＷＴ１ペプチドを含む、癌を治療または予防するための医薬組成物に関するものである。ＷＴ１遺伝子は、例えば、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌などの固形癌において高発現しているため、本発明の医薬組成物を癌の治療または予防のために用いることができる。本発明の医薬組成物がＨＬＡ−Ａ＊３３０３陽性対象に投与されると、該医薬組成物に含まれるＨＬＡ−Ａ＊３３０３拘束性ＷＴ１ペプチドにより、ＷＴ１特異的ＣＴＬが誘導され、かかるＣＴＬにより対象中の癌細胞が傷害される。【００１６】
本発明の医薬組成物は、有効成分としての上記ＨＬＡ−Ａ＊３３０３拘束性ＷＴ１ペプチド以外に、例えば、担体、賦形剤などを含んでいてもよい。本発明の医薬組成物に含まれるＨＬＡ−Ａ＊３３０３拘束性ＷＴ１ペプチドは、ＷＴ１特異的ＣＴＬを誘導することから、その誘導効率を増強させるために、本発明の医薬組成物は適当なアジュバントを含むか、あるいは適当なアジュバントと共に投与されてもよい。好ましいアジュバントとしては、例えば、完全または不完全フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなどが挙げられるがこれらに制限されない。【００１７】
本発明の医薬組成物の投与方法は、疾患の種類、対象の状態、標的部位などの条件に応じて適宜選択することができる。当該方法は、例えば、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、経鼻投与、経口投与などが挙げられるが、これらに限らない。本発明の医薬組成物に含まれるペプチドの量、医薬組成物の剤形、投与回数などは、疾患の種類、対象の状態、標的部位などの条件に応じて適宜選択できるが、１回あたりのペプチド投与量は、通常、０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは、０．００１ｍｇ〜１００００ｍｇである。【００１８】
本発明は、別の態様において、有効量の上記医薬組成物をＨＬＡ−Ａ＊３３０３陽性対象に投与することを特徴とする、癌を治療または予防するための方法に関するものである。治療または予防される癌は、いずれのものであってもよく、例えば、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌などの固形癌を含む。【００１９】
本発明は、なお別の態様において、上記医薬組成物を製造するためのＨＬＡ−Ａ＊３３０３拘束性ＷＴ１ペプチドの使用に関する。【００２０】
本発明は、さらなる態様において、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３陽性対象におけるＷＴ１特異的ＣＴＬの存在または量を決定する方法であって、
（ａ）ＷＴ１ペプチドとＨＬＡ−Ａ＊３３０３分子との複合体を該対象由来試料と反応させ；次に、
（ｂ）該試料に含まれる該複合体を認識するＣＴＬの存在または量を調べる、
工程を含む方法に関するものである。対象由来試料は、リンパ球が含まれている可能性があればいずれのものであってもよく、例えば、血液、リンパ液などの体液、組織などが挙げられる。ＷＴ１ペプチドとＨＬＡ−Ａ＊３３０３分子との複合体は、例えば、ビオチンストレプトアビジン法などの当業者に既知の方法を用いて、例えば、テトラマー、ペンタマーなどの形態にされていてもよい。かかる複合体を認識するＣＴＬの存在または量は、当業者に既知の方法により測定することができる。本発明のこの態様において、上記複合体は標識されたものであってもよい。標識としては、蛍光標識、放射性標識などの公知のものを使用することができる。標識することで、ＣＴＬの存在または量の決定が容易かつ迅速になる。本発明のこの態様の方法を用いて、癌の診断、予後診断などが可能になる。【００２１】
従って、本発明はまた、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３陽性対象におけるＷＴ１特異的ＣＴＬの存在または量を決定するための、ＷＴ１ペプチドとＨＬＡ−Ａ＊３３０３分子との複合体を含む組成物を提供する。【００２２】
さらに、本発明は、ＷＴ１ペプチドとＨＬＡ−Ａ＊３３０３分子との複合体を含む、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３陽性対象におけるＷＴ１特異的ＣＴＬの存在または量を決定するためのキットを提供する。【００２３】
本発明は、さらなる態様において、ＷＴ１ペプチドとＨＬＡ−Ａ＊３３０３分子との複合体を用いて、ＷＴ１特異的ＣＴＬを得る方法であって、
（ａ）試料と複合体を反応させ、
（ｂ）該試料中に含まれる該複合体を認識するＣＴＬを得る、
工程を含む方法に関するものである。ＷＴ１ペプチドとＨＬＡ−Ａ＊３３０３分子との複合体については上述の通りである。試料は、リンパ球が含まれている可能性があればいずれのものであってもよく、例えば、血液などの対象由来試料、細胞培養液などが挙げられる。複合体を認識するＣＴＬの取得は、例えば、ＦＡＣＳ、ＭＡＣＳなど当業者に既知の方法を用いて行うことができる。得られたＷＴ１特異的ＣＴＬを培養し、種々の癌の治療または予防に用いることも可能になる。【００２４】
従って、本発明はまた、ＷＴ１ペプチドとＨＬＡ−Ａ＊３３０３分子との複合体を用いて、ＷＴ１特異的ＣＴＬを得る方法により得ることのできる、ＷＴ１特異的ＣＴＬに関するものである。【００２５】
さらに、本発明は、ＷＴ１ペプチドとＨＬＡ−Ａ＊３３０３分子との複合体を含む、ＷＴ１特異的ＣＴＬを得るためのキットに関するものである。【００２６】
本発明は、さらにもう１つの態様において上記ＨＬＡ−Ａ＊３３０３拘束性ＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、ＷＴ１ポリヌクレオチドともいう）に関するものである。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。本発明のポリヌクレオチドの塩基配列は、上記ＨＬＡ−Ａ＊３３０３拘束性ＷＴ１ペプチドのアミノ酸配列に基づき決定できる。該ポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ合成方法、ＰＣＲ法などにより製造することができる。【００２７】
本発明は、別の態様において上記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター（以下、ＷＴ１発現ベクターともいう）に関するものである。発現ベクターの種類、上記ポリヌクレオチド配列以外で含まれる配列等は、当該発現ベクターを導入する宿主の種類、目的等に応じて適宜選択できる。本発明の発現ベクターをＨＬＡ−Ａ＊３３０３陽性対象に投与し、生体内においてＷＴ１ペプチドを産生させ、ＷＴ１特異的ＣＴＬを誘導し、これにより対象中の造血器腫瘍細胞、固形癌細胞などを傷害することで、該造血器腫瘍、固形癌の治療または予防を行うことができる。【００２８】
本発明は、さらに別の態様において上記ＷＴ１ポリヌクレオチドまたは上記ＷＴ１発現ベクターを含む、癌を治療または予防するための医薬組成物に関するものである。本発明のこの態様の医薬組成物の組成、投与方法等は、上述の通りである。【００２９】
本発明は、別の態様において、有効量の上記ＷＴ１ポリヌクレオチドまたはＷＴ１発現ベクターを含む医薬組成物をＨＬＡ−Ａ＊３３０３陽性対象に投与することを特徴とする、癌を治療または予防するための方法に関するものである。治療または予防される癌は、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌などの固形癌を含む。【００３０】
本発明は、なお別の態様において、上記ＷＴ１ポリヌクレオチドまたはＷＴ１発現ベクターを含む医薬組成物を製造するためのＷＴ１ポリヌクレオチドまたはＷＴ１発現ベクターの使用に関するものである。【００３１】
本発明は、別の態様において、上記ＷＴ１発現ベクターを含有する細胞に関するものである。本発明の細胞は、例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などの宿主細胞を上記発現ベクターを用いて形質転換することにより製造することができる。宿主細胞への発現ベクターの導入方法は、種々の方法を適宜選択して用いることができる。形質転換した細胞を培養し、産生されたＷＴ１ペプチドを回収・精製することにより、本発明のペプチドを製造することもできる。【００３２】
本発明は、さらなる態様において、上記ＨＬＡ−Ａ＊３３０３拘束性ＷＴ１ペプチドにより誘導される、ＷＴ１特異的ＣＴＬに関するものである。本発明のＣＴＬは、ＷＴ１ペプチドとＨＬＡ−Ａ＊３３０３分子との複合体を認識する。従って、本発明のＣＴＬを用いて、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３陽性、かつＷＴ１高発現腫瘍細胞を特異的に傷害することができる。【００３３】
本発明は、別の態様において、ＷＴ１特異的ＣＴＬをＨＬＡ−Ａ＊３３０３陽性対象に投与することを特徴とする、癌を治療または予防するための方法に関するものである。ＷＴ１特異的ＣＴＬの投与方法は、疾患の種類、対象の状態、標的部位などの条件に応じて適宜選択することができる。当該方法は、例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、経鼻投与、経口投与などが挙げられるが、これらに限らない。【００３４】
本発明は、別の態様において、末梢血単核球を上記ＨＬＡ−Ａ＊３３０３拘束性ＷＴ１ペプチドの存在下で培養し、該末梢血単核球からＷＴ１特異的ＣＴＬを誘導することを特徴とする、ＷＴ１特異的ＣＴＬの誘導方法に関するものである。末梢血単核球が由来する対象は、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３陽性であればいずれであってもよい。末梢血単核球をＨＬＡ−Ａ＊３３０３拘束性ＷＴ１ペプチドの存在下で培養することで、末梢血単核球中のＣＴＬ前駆細胞からＷＴ１特異的ＣＴＬが誘導される。本発明により得られたＷＴ１特異的ＣＴＬをＨＬＡ−Ａ＊３３０３陽性対象に投与することで、対象の造血器腫瘍、固形癌を治療または予防することができる。【００３５】
本発明は、さらに別の態様において、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３拘束性ＷＴ１ペプチドを必須構成成分として含む、ＷＴ１特異的ＣＴＬを誘導するためのキットに関するものである。好ましくは、該キットは上記ＷＴ１特異的ＣＴＬの誘導方法に用いられる。本発明のキットは、上記ＨＬＡ−Ａ＊３３０３拘束性ＷＴ１ペプチドのほかに、例えば、末梢血単核球の取得手段、アジュバント、反応容器等を含んでいてもよい。一般的には、キットには取扱説明書を添付する。本発明のキットを用いて、ＷＴ１特異的ＣＴＬを効率よく誘導できる。【００３６】
本発明は、さらなる態様において、上記ＨＬＡ−Ａ＊３３０３拘束性ＷＴ１ペプチドにより誘導される、ＷＴ１ペプチドをＨＬＡ−Ａ＊３３０３分子を介して提示する抗原提示細胞（樹状細胞など）に関するものである。本発明の抗原提示細胞を用いることで、上記ＷＴ１特異的ＣＴＬが効率よく誘導される。【００３７】
本発明は、別の態様において、上記ＷＴ１ペプチドをＨＬＡ−Ａ＊３３０３分子を介して提示する抗原提示細胞をＨＬＡ−Ａ＊３３０３陽性対象に投与することを特徴とする、癌を治療または予防するための方法に関するものである。抗原提示細胞の投与方法は、疾患の種類、対象の状態、標的部位などの条件に応じて適宜選択することができる。当該方法は、例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、経鼻投与、経口投与などが挙げられるが、これらに限らない。【００３８】
本発明は、別の態様において、未熟抗原提示細胞を上記ＨＬＡ−Ａ＊３３０３拘束性ＷＴ１ペプチドの存在下で培養し、該未熟抗原提示細胞からＷＴ１ペプチドをＨＬＡ−Ａ＊３３０３分子を介して提示する抗原提示細胞を誘導することを特徴とする、ＷＴ１ペプチドをＨＬＡ−Ａ＊３３０３分子を介して提示する抗原提示細胞の誘導方法に関するものである。未熟抗原提示細胞は、未熟樹状細胞などの成熟して抗原提示細胞となり得る細胞をいう。未熟抗原提示細胞が由来する対象は、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３陽性であればいずれのものであってもよい。未熟抗原提示細胞は、例えば、末梢血単核球などに含まれているため、かかる細胞を上記ＷＴ１ペプチドの存在下で培養してもよい。【００３９】
本発明は、さらに別の態様において、上記ＨＬＡ−Ａ＊３３０３拘束性ＷＴ１ペプチドを必須構成成分として含む、ＷＴ１ペプチドをＨＬＡ−Ａ＊３３０３分子を介して提示する抗原提示細胞を誘導するためのキットに関するものである。好ましくは、該キットは上記抗原提示細胞の誘導方法に用いられる。本発明のキットに含まれるその他の構成成分等は上述の通りである。本発明のキットを用いて、ＷＴ１ペプチドをＨＬＡ−Ａ＊３３０３分子を介して提示する抗原提示細胞を効率よく誘導できる。【００４０】
本発明は、別の態様において、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３拘束性ＷＴ１ペプチドに対する抗体または該ペプチドをコードするポリヌクレオチドに対する抗体に関するものである。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよい。【００４１】
本発明は、さらなる態様において、上記ＷＴ１特異的ＣＴＬ、ＷＴ１ペプチドをＨＬＡ−Ａ＊３３０３分子を介して提示する抗原提示細胞、またはＨＬＡ−Ａ＊３３０３拘束性ＷＴ１ペプチドに対する抗体または該ペプチドをコードするポリヌクレオチドに対する抗体を用いることを特徴とする、癌の診断方法に関するものである。好ましくは、ＷＴ１特異的ＣＴＬが本発明の診断方法に用いられる。例えば、上記ＣＴＬ、抗原提示細胞または抗体をＨＬＡ−Ａ＊３３０３陽性対象由来の試料とインキュベーションする、あるいはＨＬＡ−Ａ＊３３０３陽性対象に投与し、次に該ＣＴＬ、抗原提示細胞または抗体の例えば、位置、部位、量等を決定することで、癌の診断が可能となる。上記ＣＴＬ、抗原提示細胞または抗体は、標識されたものであってもよい。かかる標識を付すことで、本発明の診断方法を効率よく行うことができる。【００４２】
本発明は、別の態様において、上記ＷＴ１特異的ＣＴＬ、ＷＴ１ペプチドをＨＬＡ−Ａ＊３３０３分子を介して提示する抗原提示細胞、またはＨＬＡ−Ａ＊３３０３拘束性ＷＴ１ペプチドに対する抗体または該ペプチドをコードするポリヌクレオチドに対する抗体を必須構成成分として含む、癌の診断用キットに関するものである。【００４３】
以下に実施例を示して本発明を具体的かつ詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。
【実施例１】
【００４４】
ＷＴ１ペプチドの選択
ＮｅｔＭＨＣ２．０プログラム（Technical University of Denmark）を用いて、ＷＴ１タンパク質（配列番号：１）由来のペプチドから、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３適合アンカーモチーフ（Ｎ末端より２番目のアミノ酸がＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、またはＡｓｐであり、Ｃ末端がＡｒｇである）を有する９個のアミノ酸からなる親水性ペプチドであって、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３分子に対する結合親和性が高いと推測されるペプチドＷＴ１３３７、ＷＴ１３６４、ＷＴ１３６７およびＷＴ１４０９を選択した。これらのペプチドのアミノ酸配列、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３分子に対する結合親和性を表１に示す。【００４５】
【表１】
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【００４６】
Ｂ−ＬＣＬ細胞の調製
ＨＬＡ−Ａ＊３３０３陽性健常人ドナー（ＨＬＡ−Ａ＊３３０３／０２０７）より採取した末梢血からFicoll-Hypaque gradient density centrifugation法により末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を分離した。次に、ＰＢＭＣを２４ウェル細胞培養用プレートに１０％  ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ  １６４０培地中約１×１０７個の密度で播種し、Ｂ９５−８細胞（ＥＢウイルス産生細胞）の培養上清を添加して、３７℃、５％  ＣＯ２で約１ヶ月間培養した。ＥＢウイルスにより形質転換された、Ｂ細胞系腫瘍細胞であるＢ−ＬＣＬ細胞を得た。得られたＢ−ＬＣＬ細胞がＷＴ１遺伝子を発現していないことを確認した。Ｂ−ＬＣＬ細胞を２０μｇ／ｍｌ  ＷＴ１３３７、ＷＴ１３６４、ＷＴ１３６７またはＷＴ１４０９と共に２時間インキュベーションすることでパルスし、次に、放射線８０Ｇｙを照射させた。得られたＢ−ＬＣＬ細胞（以下、ＷＴ１ペプチドでパルスしたＢ−ＬＣＬ細胞という）を抗原提示細胞として以下の実験に用いた。【００４７】
ＷＴ１特異的ＣＴＬの誘導
ＰＢＭＣ（ＨＬＡ−Ａ＊３３０３／１１０１）３×１０６個を、２４ウェル細胞培養用プレートにて２０μｇ／ｍｌ  ＷＴ１３３７、ＷＴ１３６４、ＷＴ１３６７またはＷＴ１４０９を含む完全培地（４５％  ＲＰＭＩ、４５％  ＡＭＩ−Ｖ培地、および１０％  ヒトＡＢ血清）中、３７℃、５％  ＣＯ２で１週間培養し、応答細胞を得た。得られた応答細胞  ２×１０６個を、同じＷＴ１ペプチドでパルスしたＢ−ＬＣＬ細胞  １×１０６個と完全培地中で１週間共培養した（１回目刺激）。ＰＢＭＣをＷＴ１ペプチドでパルスしたＢ−ＬＣＬ細胞とさらに３回共培養し（２〜４回目刺激）、その際２０ＩＵ／ｍｌ（最終濃度）ＩＬ−２を、次の条件；２回目刺激：刺激開始の３日後から１日置き計２回；３回目および４回目刺激：刺激開始の翌日から１日置き計３回添加した。得られた細胞を、Negative Selection Columns Gravity Feed Kit（StemSp）を用いてＣＤ８陽性Ｔ細胞が約８０％となるよう濃縮し、次に、ＷＴ１ペプチドでパルスしたＢ−ＬＣＬ細胞と共培養した（５回目刺激）。刺激開始５日後のＣＤ８陽性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を細胞傷害活性の測定のために用いた。【００４８】
ＣＴＬの細胞傷害活性
ＣＴＬの細胞傷害活性を５１Ｃｒ遊離試験を用いて測定した。ＣＴＬ細胞（以下、エフェクター細胞ともいう）を、あらかじめ５１Ｃｒを取り込ませた標的細胞と１：１、５：１、または１０：１の比率（Ｅ／Ｔ比）となるよう培地  ２００μｌに調製し、９６ウェル細胞培養用プレート中、３７℃、５％  ＣＯ２で４時間培養した。標的細胞として、ＣＴＬ誘導に用いたＷＴ１ペプチドと同じペプチドでパルスしたＢ−ＬＣＬ細胞（ＢＬＣＬ−Ｐ）、およびＷＴ１ペプチドをパルスしていないＢ−ＬＣＬ細胞（ＢＬＣＬ−ＮＰ）を用いた。培養後、遠心して上清を回収し、液体シンチレーションカウンターを用いて、上清中に遊離した５１Ｃｒ量を測定した。細胞傷害活性（％）を次の式：
（試料上清中の５１Ｃｒ遊離量−自然発生５１Ｃｒ遊離量）／（最大５１Ｃｒ遊離量−自然発生５１Ｃｒ遊離量）×１００
（自然発生５１Ｃｒ遊離量は、５１Ｃｒを取り込ませた標的細胞のみを同様の条件で培養したときの５１Ｃｒ遊離量であり、最大５１Ｃｒ遊離量は、５１Ｃｒを取り込ませた標的細胞を１％  トリトンＸ−１００を用いて全細胞を溶解させたときの５１Ｃｒ遊離量である）
を用いて決定した。結果を図１〜４に示す。図中、縦軸は特異的溶解（％）を示し、横軸はＥ／Ｔ比を示す。また、ＢＬＣＬ−Ｐを実線、ＢＬＣＬ−ＮＰを点線で示す。ＷＴ１３３７、ＷＴ１３６４、ＷＴ１３６７およびＷＴ１４０９を用いて誘導されたＣＴＬは、ＢＬＣＬ−ＮＰ細胞と比較して、ＷＴ１ペプチドをＨＬＡ−Ａ＊３３０３分子との複合体として提示しているＢＬＣＬ−Ｐ細胞を特異的に傷害することが確認できた。以下で、ＷＴ１３６４、ＷＴ１３６７およびＷＴ１４０９を用いて誘導されたＣＴＬについてさらなる実験を行った。【００４９】
ＣＴＬの内因性ＷＴ１遺伝子発現細胞に対する細胞傷害活性
ＷＴ１３６４、ＷＴ１３６７およびＷＴ１４０９を用いて誘導されたＣＴＬのＷＴ１遺伝子発現腫瘍細胞ＴＦ−１細胞（ＨＬＡ−Ａ＊３３０３陽性）に対する細胞傷害活性を上述の方法を用いて決定した。対照として、ＷＴ１遺伝子を発現しているが、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３陰性細胞であるＫ５６２細胞を用いた。結果を図５〜７に示す。図中、縦軸は特異的溶解（％）を示し、横軸はＥ／Ｔ比を示す。また、ＴＦ−１を実線、Ｋ５６２を点線で示す。ＷＴ１３６４、ＷＴ１３６７およびＷＴ１４０９を用いて誘導されたＣＴＬが、ＷＴ１遺伝子を内因性に発現している細胞に対しても傷害活性を有することが確認できた。【００５０】
次に、ＷＴ１３６７を用いて誘導されたＣＴＬのＷＴ１発現Ｂ−ＬＣＬ細胞に対する細胞傷害活性を上述の方法を用いて決定した。ＷＴ１発現Ｂ−ＬＣＬ細胞（Ｂ−ＬＣＬ−ＷＴ１）は、ヒトＷＴ１遺伝子を導入したＢ−ＬＣＬ細胞であって、細胞内でＷＴ１タンパク質を発現し、プロセスされて約９個のアミノ酸からなるペプチドをＨＬＡ−Ａ＊３３０３分子と共に提示する細胞をいう。対照として、ＷＴ１遺伝子ではないコントロール遺伝子を導入したＢ−ＬＣＬ細胞（Ｂ−ＬＣＬ−ＣＶ）を用いた。結果を図８に示す。図中、縦軸は特異的溶解（％）を示し、横軸はＥ／Ｔ比を示す。また、Ｂ−ＬＣＬ−ＷＴ１を実線で、Ｂ−ＬＣＬ−ＣＶを点線で示す。ＷＴ１３６７を用いて誘導されたＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３陽性かつＷＴ１陽性細胞のみを傷害することを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明により、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３拘束性のＷＴ１ペプチド、該ペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびそれらを含む医薬組成物等が提供されるので、医薬品等の分野、例えば、ＷＴ１遺伝子を高発現している種々の造血器腫瘍、固形癌の予防薬、または治療薬の開発、製造分野において利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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