(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
方向性を持つ電磁波を放出する放射源を設けるステップと、
特徴付けられるべき組織に前記電磁波を照射し、これにより、該組織内に該組織固有の反射電磁波が生成されるステップと、
前記組織内に侵入した前記電磁波は、前記電磁波の伝搬方向に対して横方向に広がった励起域内で、前記組織内に反射電磁波を励起するのに十分な強度を有するステップとを有する、細胞から形成されたヒトまたは動物の組織を視覚的に特徴付けるための方法であって、
前記放射源によって放出された前記電磁波は該電磁波の伝搬方向に対して横方向に強度プロフィルが付与され、前記強度プロフィルは前記励起域が前記組織の複数の細胞をカバーするように形成され、励起された前記反射電磁波は細胞間組織特性に由来しており、
前記強度プロフィルの付与は、前記放射源によって放出された前記電磁波をビームスプリッタにより少なくとも２本の部分ビームに分割することを含み、前記励起域は前記部分ビームの位置によって決定され、前記少なくとも２本の部分ビームは前記組織に照射されることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１において、前記強度プロフィルの付与は前記電磁波をレンズを経て前記組織内に結像させることであることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項２において、前記レンズは０．３〜１．５の開口数を有することを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１において、前記部分ビームはそれぞれ前記部分ビームの焦点が互いに離間するようにして前記組織内に集束されることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４において、前記強度プロフィルは個々の部分ビームの前記励起域が、前記放射源から放出した前記電磁波の伝搬方向に対して横方向に前記組織の１〜２５００個の細胞に及ぶように選択されることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項４または５において、生成した前記部分ビームの総和励起域は前記放射源から放出した前記電磁波の伝搬方向に対して横方向に前記組織の約１０００〜２０００００個の細胞に及ぶことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項において、前記反射電磁波は蛍光信号、前記放射源の前記電磁波の調波および／または反射信号であることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項において、前記電磁波の強度は前記組織内に２光子または多光子励起が生ずるように選択されることを特徴とする方法。
【請求項９】
前記請求項８において、前記反射電磁波は前記組織に照射される前記電磁波の２倍の周波数を有することを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項において、前記放射源によって放出された前記電磁波は、コヒーレンス反射率測定による前記組織の付加的特徴付けのため、前記組織内に蛍光を励起するための励起ビームと参照ビームとに分割され、該励起ビームの一部は前記組織から反射戻しされ、前記参照ビームは前記組織からの反射電磁波と重ね合わされることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１０において、前記参照ビームおよび励起ビームは空間分解の干渉検出器において重ね合わされることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１１において、前記干渉検出器は少なくとも４ピクセルを有し、特にＣＣＤチップ、ＣＣＤカメラ、ＣＣＤラインまたはラインカメラを有する一次元または二次元画像生成器であることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１０〜１２のいずれか１項において、前記放射源から発する前記電磁波に付与された強度プロフィルは少なくとも２つの強度最大値を有する強度分布を有することを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１１において、前記放射源から発する前記電磁波に付与された強度プロフィルは少なくとも２つの強度最大値を有する強度分布を有し、
前記参照ビームの光路長は前記放射源によって放出された前記電磁波に付与された強度分布が前記干渉検出器で検出されるように設定され、この場合、前記参照ビームの光路長は、前記放射源から焦点へ、さらに焦点から前記干渉検出器まで反射戻しされる前記励起ビームによってカバーされる光路長と同じであることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１４において、ａ）前記干渉検出器は焦点に達する前記電磁波の強度を該電磁波に対して垂直な面内で空間分解した形で判定し、
ｂ）各々の場合に、互いに近接した位置で前記強度を比較して、位置依存コントラスト値を決定し、
ｃ）前記位置依存コントラスト値から、前記干渉検出器になる前記電磁波の固有の積分コントラスト変数を表す平均値を決定し、
ｄ）前記付与された強度プロフィルは最大値に達する前記積分コントラスト変数によって検出されることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項において、ａ）前記組織は波長域７２０〜８８０ｎｍまたは９８０〜１０８０ｎｍの短パルスレーザビームで照射され、
ｂ）該ステップａ）による前記組織の照射に使用される電磁波の１／２の波長の戻り電磁波の強度を検出し、
ｃ）前記電磁波はレンズを経て前記組織内に結像され、該レンズは前記放射源によって放出された前記電磁波の伝搬方向に沿って徐々に変位させられ、前記ステップａ）と前記ステップｂ）は複数のレンズポジションにつき実施され、こうして、焦点が前記組織を通って前記電磁波の伝搬方向に案内されて、複数の組織深さにつき蛍光信号が測定され、
前記測定は健康な組織について実施され、こうして測定された前記蛍光信号の強度は参照値として記憶されることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１６において、ａ）特徴付けられるべき組織について実施され、
ｂ）各々の深さにつき測定された前記強度は前記記憶された参照信号のそれぞれの強度と比によって関係付けられ、
ｃ）該ステップｂ）で決定された比に応じて信号が生成されることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１７において、前記信号は前記ステップｂ）で決定された前記比が値１から４０％偏差している場合に生成されることを特徴とする方法。
【請求項１９】
方向性を持つ電磁波を放出する放射源を設けるステップと、
特徴付けられるべき組織に測定位置で前記電磁波を照射し、これにより、該組織内に該組織固有の後方散乱電磁波が励起されるステップとを有する、細胞から形成された組織を視覚的に特徴付けるための方法であって、
前記放射源によって放出された前記電磁波は伝搬方向に対して横方向に周期的に偏向させられ、こうして、前記電磁波は前記組織の複数の細胞に及んで広がる前記測定位置の周辺組織域を周期的に走査し、
前記放射源によって放出された前記電磁波はビームスプリッタにより少なくとも２本の部分ビームに分割され、
前記部分ビームは隣接部分ビームの焦点が互いに一定の距離を保つって離間するように集束させられ、前記部分ビームは前記離間距離と同一であるそれぞれの大きさだけ偏向されて、前記部分ビーム間のギャップを埋め合わせて補償されることを特徴とする方法。
【請求項２０】
特徴付けられるべき組織に照射されて、該組織内に組織固有の後方散乱電磁波を励起させることのできる方向性を持つ電磁波を放出する放射源と、
前記組織内に侵入して、前記電磁波の伝搬方向に対して横方向に広がった励起域内で、前記組織内に固有後方散乱電磁波を励起するのに十分な強度を有する電磁波とを有し、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法を実施するための装置であって、
前記放射源によって放出された前記電磁波に、前記励起域が前記組織の複数の細胞をカバーし得るようにする強度プロフィルを付与するビーム形成手段が設けられ、前記組織の照射によって励起された前記後方散乱電磁波は細胞間組織特性に由来しており、
前記ビーム形成手段は、前記放射源によって放出された前記電磁波をビームスプリッタにより、前記組織に照射される少なくとも２本の部分ビームに分割し、前記励起域は前記部分ビームの位置によって決定されることを特徴とする組織を視覚的に特徴づける装置。
【請求項２１】
請求項２０において、前記放射源によって放出された前記電磁波を前記組織内に集束させるためのイメージング手段を備えることを特徴とする組織を視覚的に特徴づける装置。
【請求項２２】
請求項２１において、前記イメージング手段は、前記放射源から見て、前記ビーム形成手段の上流または下流に配置されることを特徴とする組織を視覚的に特徴づける装置。
【請求項２３】
請求項２２において、前記イメージング手段は複数のレンズを有し、各々の部分ビームは専用のレンズによって前記組織内に集束させられることを特徴とする組織を視覚的に特徴づける装置。
【請求項２４】
請求項２０〜２３のいずれか１項において、前記イメージング手段は前記電磁波を集束させるための少なくとも１個のレンズと、さらに、少なくとも１個の該レンズを前記電磁波の伝搬方向に沿って運動させて、該レンズの焦点を前記方向に沿って運動させ、こうして、前記組織が該組織表面に対して垂直に広がる面内で走査されるようにする調節ユニットとを有することを特徴とする組織を視覚的に特徴づける装置。
【請求項２５】
請求項２４において、前記調節ユニットと前記レンズは、検査されるべき前記組織の上に位置して該組織表面と平行に変位させることのできるハウジング内に組み込まれていることを特徴とする組織を視覚的に特徴づける装置。
【請求項２６】
請求項２５において、前記ハウジングを前記組織表面と平行に変位させることのできる電動式および／またはマイクロメカニカル作動手段を備えることを特徴とする組織を視覚的に特徴づける装置。
【請求項２７】
請求項２０〜２６のいずれか１項において、前記放射源によって生成された前記電磁波を、特徴付けられるべき前記組織に向かって案内する光ファイバを有することを特徴とする組織を視覚的に特徴づける装置。
【請求項２８】
請求項２０〜２７のいずれか１項において、前記後方散乱電磁波を検出して、検出された該電磁波に応じて電気信号を生成する検出器と、
前記検出器によって生成された前記電気信号を評価するための評価ユニットとを備え、前記評価ユニットは前記検出器によって生成された前記電気信号をイメージ情報信号に変換することを特徴とする組織を視覚的に特徴づける装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞から形成されたヒトまたは動物の組織を視覚的に特徴づけるための方法および該方法を実施するための装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
表皮、皮膚、子宮付属器および粘膜の変化は２０世紀末まで主として臨床的に診断されていたが、１９８０年代以降、技術の急速な進歩、主としてコンピュータ技術の急速な進歩の結果として、皮膚科学の分野で一連のイメージング法が確立されるに至った。
【０００３】
この場合、蛍光ベースの腫瘍診断が特に重要である。この分野ではキセノンランプによる線形ＵＶ励起をベースとした多くの装置がすでに商業的に入手可能である。一般に、自己蛍光強度は白色光バックグラウンドイメージに対する固有波長域で評価される（Ｓｔｏｒｚ，Ｒｉｃｈａｒｄ−Ｗｏｌｆ  ＧｍｂＨ，Ｏｌｙｍｐｕｓ）。
【０００４】
特に、Ｈ．ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇｈの研究グループは、シーケンシャル多色励起、ライフタイム分解能および特別なデータ評価によって大幅な診断改善がいかにして達成可能であるかを研究している(H.van den Bergh Med.Laser Appl.18 (2003)1,20および同所引用)。あらゆる場合に、方位分解能はサブミリメーターレベルにある。深さの識別は基本的な理由から不可能である。
【０００５】
受容し得る発光効率で組織の三次元蛍光表示を実現しようとの目標は、もっぱら多光子蛍光顕微鏡法の出現によって達成に近づいた(W.Denk, J.H.Strickler, W.W.Webb,“2-Photon laserscanning fluorescence microscopy”Science 248(1990), 73~76)。この方法では、非常に低い蛍光信号と、したがって低い走査速度の原因となる共焦点顕微鏡法の空間分解蛍光検出が、多光子励起による局所化によって置き換えられる。加えてさらに、この方法では、いわゆる組織の光窓の波長（７００ｎｍ〜１０００ｎｍ）を励起に使用することが可能である。研究開始以来のこの分野の研究の焦点は、細胞および細胞以下のレベルにおけるさまざまな生体分子の濃度を空間分解表示することに置かれてきた(概要W.R.Zipfel et al. Nature Biotechnology21(2003),11,1369~1377および同所引用）。
【０００６】
多光子顕微鏡法(トモグラフィー)の分野はＰｒｏｆ．Ｋａｒｓｔｅｎ  Ｋｏｅｎｉｇ(K.Konig et al. J.Biomed.Opt.8(2003)3,432-439)のグループによる最新の研究も包括している。サブミクロンレベルにおける空間分解表示された細胞内構造は個々の細胞の細胞分裂および代謝挙動に関する判定を可能とし、したがって、療法コントロールを可能とするが、広範な組織域の検査は不可能である。多光子顕微鏡法をベースとした診断アプローチは細胞内代謝過程および細胞構造の解明から出発する。
【０００７】
集束蛍光励起をベースとした当該空間分解表示には、以前から定着している従来の技術としての共焦点蛍光顕微鏡法を参照することができる。該顕微鏡法は使用波長域での分解による水平断面像を生成する。この方法つまり“光窓”での励起による2光子励起と、散乱性組織においても著しく優れている空間分解能との利点は詳細に論じられ、具体的に示されている[総説:W.R.Zipfel, R.M.Williams, W.W.Webb, nature biotechnology, 21/11,2003年11月]。ここで、一例として、Ｌｅｖｅｎｅらによる研究[M.J. Levene et al. In vivo multiphoton microscopy of deep braintissue. J Neurophysiol 91: 1908~1912, 2004]およびＴｈｅｅｒらによる研究[P.Theer et al., Two-Photonimagingto a depth of 1000 mm in living braintissue... Optics Lett. VOL.28(12), 2003]に触れておくこととするが、該研究ではラットおよびマウスの神経細胞および血管を生体内深度１ｍｍにて表示することができた。この研究は、共焦点非線形励起された蛍光は組織内の深い深度からも空間分解された情報として検出することができることを実証している。ただし、腫瘍診断に関していえば、これらの方法ではこれまで形態的情報ならびに細胞間情報を得ることができただけであり、組織域の代謝状態に関する情報は得られなかった。治療上の決定にとって重要な情報たとえば腫瘍の広がりと全体的活性などはこれまで得られてきていない。
【０００８】
２光子顕微鏡法とその後の多光子顕微鏡法とは特許文献US5034613およびUS6166385ならびに付属文書によって開示された。これらの方法のコンセプトは、三次元空間分解は２光子または多光子プロセスによって励起された蛍光を空間的に狭く区別することによって達成されることに基づいている。イメージ自体の取得は励起電磁波による検査域のラスタ走査を基礎としている。
【０００９】
２光子または多光子プロセスの分解能は励起域における２またはそれ以上の光子の同時吸収と結びついている。したがって、一般に、たとえばパルスレーザシステムによって得られるような高い強度がこのために必要とされる。もし、励起域における組織のダメージを回避するために、レーザの平均出力が制限されなければならない場合には、これらは一般にピコセカンドまたはフェムトセカンド・パルスであるかまたはそうしたパルスの連続である。
【００１０】
この方法に固有の２光子または多光子吸収は前記プロセスの当該強度依存性も決定する。２光子プロセスの場合には収率は強度の２乗に依存し、３光子プロセスの場合には強度の３乗に依存する等々である。
【００１１】
ここで２光子または多光子顕微鏡法がその一例として触れられた方法の三次元空間分解は、一般に使用されるレーザシステムを基礎として説明される２つの連結効果に基づいている。
【００１２】
励起電磁波を対象試料に集束させる光学系の像面において、当該放射源および使用される光学系の特性から区別ができる。これは、本発明のコンセプトの一般性を制限することのない一例としてここで参照される基本モード電磁波の一般ケースにつき、ほぼ以下のように計算されるビームウエストｗ０の半径によって表される。
【数１】
0005619351.tif 000002
【００１３】
この場合、λは電磁波の波長、ｆは使用される光学系の焦点距離、Ｄは電磁波が光学系に入射するときの照光直径である。容易に分かるように、光学系像面における励起域の直径はたとえば比ｆ／Ｄの選択によって設定することができる。
【００１４】
基本モードビームの半径ｗ（ｚ）―これはまたも一例と見なされることとする―は電磁波の伝搬方向（ｚ方向）に沿って増大する。
【数２】
0005619351.tif 000003
【００１５】
ビーム半径が増大するにつれて、励起電磁波の強度と、したがってプロセスの収率は減少する。
【数３】
0005619351.tif 000004
【数４】
0005619351.tif 000005
【００１６】
この場合、Ｉ０は励起焦点における強度である。この事実は、強度が半減した、焦点からの距離を表すいわゆるレイリー長によって特徴づけられる。
【００１７】
プロセスの収率と励起強度との間の上述した２乗もしくはより高次の関係により、励起域もここでｚ軸と称される伝搬方向に沿って区別されることが明白になる。
【００１８】
これらの関係の表現もまた、このシステムにおいて、励起域の寸法を励起電磁波と光学系の選択とによって互いに独立に定めることはできないことを明らかにしている。ｚ方向における励起域の広がりは焦点における励起ビームの半径の２乗に比例して増大する。
【００１９】
この事実からして、多光子顕微鏡法にとって、たとえば、低下した分解能（つまり焦点の拡大）と相応した収率の増大とによって総括的測定を行うことは、励起電磁波の伝搬方向における分解能がそれによって不相応に損失を受けることなしには不可能である。この事実は、対象試料における望ましくないプロセスを回避するため励起電磁波の強度が制限される場合に、特に不利である。
【００２０】
さらに、有機もしくは無機物における当該プロセスの非線形励起が対象とされる場合には、以下の点が考慮される必要があろう。
【００２１】
非線形プロセスが進行するスポットはガウスビームのウエストとして形成され、開口が過度に大きくなければ比較的縦長である。ただし、評価にとって望ましいのは普通、コンパクトな形の励起体積、つまり、該体積の直径とビーム軸に対して垂直な広がりとがほぼ同じオーダを有する体積である。
【００２２】
この場合、原理的に、上述した方法におけるように、三次元像は普通、走査によって生成される。前記パラグラフに述べた制限は、以下に開示される、更なる発明の新規な方法と装置設備によって除かれる。
【００２３】
臨床的、生物学的研究外での非線形蛍光技法の使用を制限する従前の技法の更なる制限は従来の技術による方法に要される小さな体積であり、被検査組織体積の広がりの小ささである。これはおおよそ、水平方向について５００×５００μｍ、深さ方向の点で２００〜４００μｍのオーダである。この制限は一方で、既述したように、極度に高い空間分解能によって限定される。他方で、リアルタイム評価において、たとえば、疾病とくに潰瘍性疾病の臨床診断と初期鑑別への使用のために必要とされるようなデータ量とデータ率も前記方法の極めて望ましい臨床使用を制限する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
本発明の目的は、健康な組織と病的組織との間の従来可能であったよりもさらに高信頼度の鑑別を可能にする、組織の視覚的特徴付けのための方法および装置を明示することである。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
上記課題は、請求項１に記載の特徴を有する方法、請求項２０に記載の特徴を有する方法、請求項２２に記載の装置、また、態様３０に記載の装置によって解決される。本発明の特に好ましい実施形態は従属請求項に記載されている。
【００２６】
したがって、以下のステップつまり、方向性を持つ電磁波を放出する放射源を設けるステップと、特徴付けられるべき組織に前記電磁波を照射し、これにより、該組織内に該組織固有の反射電磁波が生成されるステップとを有し、その際、前記組織内に侵入した前記電磁波は、前記電磁波の伝搬方向に対して横方向に広がった励起域内で、前記組織内に固有反射電磁波を励起するのに十分な強度を有し、前記放射源によって放出された前記電磁波には該電磁波の伝搬方向に対して横方向に強度プロフィルが付与され、前記強度プロフィールは前記励起域が前記組織の複数の細胞をカバーするように形成され、励起された前記反射電磁波は細胞間組織特性に由来するように構成した、細胞から形成されたヒトまたは動物の組織を視覚的に特徴付けるための方法が明示される。
【００２７】
本発明による前記方法は、早期鑑別およびスクリーニング（体内で（invivo）および対外で（invitro）に適した、革新的な蛍光診断イメージングによる、非観血腫瘍診断法の基礎を提供する。前記方法は、組織または代謝状態、したがって病的な、特に腫瘍性変化を、臨床目的に合った、医師にとって目下得ることのできない、有意性と空間分解能とを以って特徴付けることを可能にする。組織状態は分光分析データから超細胞レベル加算平均によって決定されて、腫瘍の広がり、位置および悪性に関する腫瘍評価を可能にする、数ミリメートルに及ぶ形態的断面像として医師に表示される。
【００２８】
患者は第一に、改善された早期の鑑別および診断による恩恵を受けることができる。これらによって、手術治療を回避し、または局在化の初期ステージであれば、侵襲の少ない
方法によってそれを著しく縮小させることが可能である。健康保険者は、従来不可避であった生検（biopsie）に比較して費用が２／３だけ低下する結果として、さらにまた、手術治療の頻度および過酷さの顕著な低下により、医療コストを節約することができる。健康な組織と病的組織との間の識別が従来よりも遥かに正確に行われることができるため、外科治療が回避不能であるかまたはそれを侵襲の少ない方法たとえばＰＤＴ（光線力学療法  Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ）で置き換えることができない場合、治療の過酷さならびにその治療の関連影響および美観の影響は顕著に低下する。
【００２９】
ただし、上記の新規方法は好ましくは、たとえば病理学、生化学、バイオテクノロジーの分野において、固体または液体状態の生体または非生体有機物および無機物に関するその他の測定および特徴付けの目的に使用することもできる。理解を促進するために、以下、腫瘍の蛍光診断を一例として用いて、全ての詳細を提示するが、ただしこれは本発明のコンセプトの一般的有効性ならびに範囲を限定しようとするものではない。
【００３０】
最初に提示した、皮膚領域の応用分野に加えて、到達可能な体腔領域（ＥＮＴ，婦人科学）および内視鏡によって到達可能な身体内部部分におけるその他の応用領域（胃腸病学、泌尿器科学、気管支鏡検査法）も本発明の応用分野の一部である。
【００３１】
悪性疾病の治療において、癌の早期ステージと並んで、主として予備ステージの早期の鑑別は回復の見通しにとって決定的に重要である。さらに、こうした予備ステージの癌の発生率は平均余命の増加の結果として増大しており、これはまたたとえば集中的な日光浴などの生活習慣、性交によって感染するウイルスに起因する疾病および環境病毒などによって増大される。ここで一例として以下に触れておくこととする。ａ）光線性角化症。これは累積的な紫外線（ＵＶ）暴露によって引き起こされる疾病であり、皮膚癌または基底細胞癌に転化することがある。ｂ）ＨＰＶウイルスによって引き起こされる生殖器疣“コンジローム”。これは女性の子宮頸癌を引き起こす原因であるのみならず、男女の肛門性器部の癌を誘発する恐れがある。
【００３２】
明白な癌疾患は明確に同定し得ることが多い（癌のほぼ５０％は“目視診断”が可能である）が、その予備ステージおよび非常に早期のステージは視覚診断では目立たないことが多い。スクリーニング検査が所望の効果をもたらさない理由の一つはこれである。これらの検査は“偽陰性”であることがあり、つまり、癌疾患の存在を早期に同定し得ず、そのため、低侵襲処置による治療のチャンスを逃してしまうことがある。“偽陽性”診断も同様に好ましくなく、これは、癌との診断が排除されるまで患者に多大な心理的負担をもたらす以外に、追加的な身体的負担をもたらして患者を危険に曝すだけでなく、かなりの付随的費用を生じる多くの複雑な検査を必要とする。
【００３３】
他方、侵襲の少ない方法たとえば凍結療法、光線力学療法および最近では薬物療法（有
効成分イミキモド）も上皮性腫瘍の治療において重要性を増しつつある。ただし、これらの治療法は切除なしで行われることから、診断を確実なものとするために使用されるだけでなく、腫瘍の攻撃性（“等級付け”）、境界構造のゆ越および周辺組織への浸潤（“病期診断”）に関する情報を得るために使用される組織学的検査の可能性を欠いている。したがって、スクリーニングの前提条件には、蛍光の空間的対応付けによる明確な診断だけでなく、浸潤の広がりおよび程度に関する判定も含まれる。
【００３４】
上記から、本発明による方法は、臨床経験に基づき、寸法の点で横方向に４ｍｍ、深さ方向０．５ｍｍを下回ってはならない検査域の形態的枠組みに組み込まれた空間分解診断に関する医学的診断法要件を満たしていることが明らかである。
【００３５】
本方法の好ましい発展実施形態において、前記強度プロフィルの付与は前記電磁波をレンズを経て前記組織内に結像させることである。この場合、前記レンズは約０．３〜１．５の開口数を有する。
【００３６】
本発明のさらに別の好ましい実施形態において、前記強度プロフィルの付与は前記放射源によって放出された前記電磁波を少なくとも２本の部分ビームに分割することであり、この場合、前記励起域は前記部分ビームの位置によって決定される。好ましい実施形態において、前記部分ビームはそれぞれ前記部分ビームの焦点が互いに離間するようにして前記組織内に集束される。
【００３７】
本発明のこの実施形態の基本コンセプトは、方向の相違する複数本の部分ビームが前記放射源によって生成された励起ビームから形成される点にある。集束光学系により、部分ビームの数と配置に応じて、光学系の焦点面に一連の焦点が生ずる。焦点面における焦点間の距離が適切な方法で設定されれば、励起電磁波の伝搬方向に沿って、部分ビームの本数から少なくともほぼ独立して多光子励起域が区別される。
【００３８】
反射電磁波は蛍光信号たとえば２光子または多光子蛍光であれば特に好ましい。自己蛍光および外来蛍光の双方による、従前の臨床蛍光診断法では表面組織層の総和像しか検出されない。励起は短波ＵＶまたは青色光によって行われ、この場合、上部の非代謝活性壊死組織による消光の結果として“偽陰性”所見が得られるか、または、腫瘍が健康な皮膚の下に広がっている場合には、腫瘍の実際の広がり、したがって腫瘍サイズの不正確な評価による判定が行われるかになる。これらの短所はレーザによる近赤外線（ＮＩＲ）多光子励起の狭い空間的区別によって克服することができる。
【００３９】
近年開発された多光子顕微鏡法の方法はこの方式による組織内蛍光励起を活用する。該方法は小細胞レベルの細胞生物学的プロセスを検査するための高い空間分解能（＜１μｍ）を目的としている。このために使用される走査顕微鏡法は走査体積を視界寸法と、数百μｍオーダの走査深度とに制限する。本発明による方法とは異なり、これらの値は基本的に、臨床使用に必要とされる上述した走査体積寸法にまで拡大することはできない。
【００４０】
さらに、従来の方法の小細胞レベル分解能では、本発明による方法の細胞レベル以上の超細胞レベル分解能とは対照的に、内因性蛍光体の蛍光スペクトルと、対応する細胞域の病理学的状態との間の相関性を決定することはできない。多光子顕微鏡法は細胞生物学的研究の有効な手段に成熟してきているが、腫瘍病期診断のための臨床使用はそれの目下の応用分野ではない。
【００４１】
腫瘍診断の領域において、本発明の方法は実際に必要とされる手術治療件数を劇的に減少させるという目的に役立つ。何よりも先ず、皮膚腫瘍はそれらが外部から容易に到達可能であることから治療の中心に位置している。さらに進んで、体内および体外において、部分的にもっと有意とさえいえる応用が、走査機能を組み込んだ内視鏡装置および術中アプリケータ装置によって可能である。
【００４２】
本発明によって実現される相応した応用範囲の拡大と装置の小型化とを前提とすれば、本発明のさらに進んだ事後の可能性が内視鏡診断においても、主として婦人科学および耳鼻咽喉科（ＥＮＴ）医療について生ずる。特に、ヒト乳頭種ウイルスによって引き起こされる子宮頸疾患ならびにその他の疾患の鑑別診断、さらにまた、口腔白板症および苔癬様予備ステージの癌も非常に重要と見なされるべき本発明の応用分野である。
【００４３】
腫瘍病期診断ひいて低侵襲処置法の適用にとっては、腫瘍のサイズ以外に、瀰漫深度および間質浸潤がさらに決定的に重要である。たとえばＭＲＴのような従来の断面イメージ法は、この点で、それらの空間分解能の点からして無能である。１００ＭＨｚでの高分解能ソノグラフィーには、それが、接触法として、異なったサウンドヘッド方位圧力で異なった厚さ測定結果をもたらすとの事実によるためであるにせよ、非常に多くの障害因子が付随している。光コヒーレンス・トモグラフィー（ＯＣＴ  断層影像法）はその高い分解能の故に、この点に関する一つの解決法を表すことができよう。ただし、これら３つの方法のすべてに関するこれまでの経験は、腫脹、炎症および癌原性病理所見の間の鑑別（“悪性／良性鑑別”）が形態情報に基づくのみでは不可能であることを示してきた。
【００４４】
したがって、本発明による方法の発展実施形態において、蛍光分光空間分解機能診断が検査域の形態表示に組み込まれる。そのため、放射源によって放出された電磁波は、コヒーレンス反射率測定による組織の付加的特徴付けのため、組織内に蛍光を励起するための励起ビームと参照ビームとに分割され、励起ビームの一部は組織から反射戻しされ、参照ビームは組織から反射戻しされたビームと重ね合わされる。
【００４５】
特に好ましくは、放射源から発した電磁波に付与された強度プロフィールは少なくとも２つの強度最大値を有する固有の差異を有している。ビームのこの“フィンガープリント”は参照ビームと反射ビームとの光路長を調整するために使用することができる。このため、参照ビームの光路長は好ましくは、放射源によって放出された電磁波に付与された強度分布が干渉検出器で検出されるように設定され、この場合、参照ビームの光路長は、放射源から焦点へ、さらに焦点から干渉検出器まで反射戻しされる励起ビームによってカバーされる光路長に一致している。
【００４６】
多光子励起プロセスを光コヒーレンス反射率測定と組み合わせ、こうして、励起位置に関する付加的な情報を得ることが所望される場合には、情報の２つのプロセスまたはアイテムの空間的対応付けの問題が生ずる。これは、特に光学的に不均一な試料（たとえば組織）の場合に、試料の不均一な屈折率が多光子励起の位置と光コヒーレンス反射率測定信号とに異なった形で影響を及ぼすということにある。つまり、屈折力は試料深さへの励起位置（焦点）までの励起光の光路に１回だけ影響を及ぼし、後方散乱信号が光コヒーレンス反射率測定法によって検出される場合には、屈折率はビーム路に、光が往路と復路で試料を透過しなければならないために、２回影響を及ぼすということである。したがって、多光子励起と光コヒーレンス反射率測定との所望の組み合わせにとって、特に励起電磁波の伝搬方向に沿った相互の空間的対応付けが不足している。要約すると、蛍光分光法とコヒーレンス分光法とのコンビネーションのために、特に、(１)２光子または多光子プロセスの励起および／または光コヒーレンス反射率測定に適したレーザの電磁波が励起ビームと参照ビームとに分割され、(２)励起ビームは、１つの最小値によって分離された少なくとも２つの最大値を有する強度構造が下流光学系の焦点面にのみ形成されるか、または該焦点面の直接の近傍に励起光の伝搬方向に対して横方向に形成されるように、励起ビームの伝搬方向に対して横方向に付与された構造を有し、(３)前記焦点域は所望の２光子または多光子プロセスが主として生ずる領域に一致し、(４)前記構造化された励起ビームは適切な光学系により、励起されるべきおよび／または検査されるべき対象試料内に集束され、(５)対象試料中で生ずる後方散乱電磁波は集束光学系によって捕集されて、励起光の元の伝搬方向とは逆方向に伝播し、(６)こうして、励起ビームにその伝搬方向に対して横方向に前記構造を付与した素子を前記後方散乱電磁波が再び通過することがないように、適切な光偏向素子が導入され、(７)後方散乱電磁波は、焦点面に対する光学的共役面で、対象試料の照射点に対する共役点が参照ビームによって完全に検出されるように、参照ビームとの干渉に付され、(８)同所に生ずる干渉パターンが空間分解-光検出器によって検出、評価され、(９)参照ビームの光路長は変更可能であり、(１０)２光子または多光子励起の位置と後方散乱光信号が生ずる位置との一致に関する指標として、励起電磁波の焦点域でのみ生ずる構造を反映する干渉パターンが結像される、ように構成した好ましい発展実施形態が存在する。
【００４７】
本発明の基本コンセプトは、焦点、つまり多光子励起の位置でのみ生ずる構造を励起ビームに付与するかまたは、前記構造の検出可能な変化ないし、より正確には、そのイメージが焦点近傍でのみ生ずるようにして伝搬長さと共に変化する構造を励起ビームに付与することである。励起面に対する光学的共役面における後方散乱光の干渉はまさに前記構造のイメージを有するであろう。この場合、参照ビーム路の長さは、干渉信号の空間分解検出素子によって、予測される構造が干渉パターンに現れるまで適合させることが可能である。これは、多光子励起の位置と、光コヒーレンス反射率測定による形態走査の位置との重なり合いを表す指標である。
【００４８】
要約すると、特に、以下の利点が達成された。(１)腫瘍と正常組織との蛍光曲線の固有の相違によって、有意な選択度と特異度による組織診断が可能であること、(２)組織は超細胞レベルでの方法にとって好適な焦点サイズで走査され、これによって、適切な分解能により、リアルタイムで、組織代謝の局所評価が可能であること、(３)一群の好ましい実施形態として、走査焦点のサイズは走査点に指定されるべき“走査体積”のサイズから切離される。これによって本発明は、従来公知の光診断法において、ここで追求される使用目的の妨げとなっていた好ましくない制限を取り除くことができること。(４)特段の参照法により、外乱変数からほぼ独立に観察される組織域の代謝状態、脈管新生の程度または構造化状態を表し、自動的な前病理学的評価を可能にする、悪性／良性鑑別のための局所特性値が決定されること（“スペクトルフィンガープリント”）。(５)空間分解による機能的バイオステータス評価と形態イメージングとのコンビネーションにより、皮膚上層の臨床診断の質的な飛躍が達成されること、(６)特に、本方法のパラメータの選択と固有な評価法とによって基底膜までの十分な侵入深さが達成され、これによって、発癌現象のさまざまな侵襲型の間の鑑別が可能であること。
【００４９】
放射源は、したがって、多光子励起と光コヒーレンス反射率測定との双方に使用される。適切であれば、放射源のスペクトル特性は所望の深さ分解能（電磁波伝搬に沿った分解能）が可能となるように設定される必要があろう。前記電磁波は部分透過性ミラーにより励起ビームと参照ビームとに分割される。双方のビームにはさらに、時間的に強度を調整するが、ただし光路長を調整することのない調整器が設けられてよい。
【００５０】
特に好ましい方法の実施形態において、ａ）組織は波長域７２０〜８００ｎｍの電磁波で照射され、これによって、組織内に２光子蛍光が励起され、ｂ）第１の蛍光信号の強度は５５０±３０ｎｍの波長で、第２の蛍光信号の強度は４６０±３０ｎｍの波長でそれぞれ検出され、ｃ）第１と第２の蛍光信号の強度比が決定され、ｄ）ステップｃ）で決定された比に応じて信号が生成される。
【００５１】
この場合、４６０±３０ｎｍの波長域はＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（脱水素酵素複合体）にとって重要であり、５５０±３０ｎｍの波長域はフラビン（黄色色素）にとって重要である。（ａ）と（ｂ）から得られた測定値の比の形成は、外乱因子の参照と、同一タイプの正常な組織体積と病的な組織体積との間で著しく相違する代謝活性を表す活性信号の取得とに役立つ。
【００５２】
さらに別の好ましい実施形態において、ａ）組織は５００〜５５０ｎｍの波長域の電磁波で照射され、この場合、ｂ）２光子蛍光の第１の強度は３４０±４０ｎｍの波長で検出され、（トリプトファンにとって重要）ｃ）組織は７２０〜８００ｎｍの波長域の電磁波で照射され、この場合、ｄ）２光子蛍光の第２の強度は４６０±４０ｎｍの波長で検出され（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈにとって重要）、ｅ）ステップｂ）で決定された第１の強度とステップｄ）で決定された第２の強度との比が（外乱因子の参照と、同一タイプの正常な組織体積と病的な組織体積との間で有意に相違する特性値の取得とのために）決定され、ｆ）ステップｅ）で決定された比に応じた電気信号が生成される。
【００５３】
本方法のさらに別の好ましい実施形態は、以下のステップつまり、(１)波長域７２０〜８００ｎｍでの２光子蛍光の励起と、組織深さｚの関数としての４６０±４０ｎｍでの蛍光信号の測定（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈにとって重要）とが行われるステップと、(２)健康であることが判明している組織域における深さの関数としての測定値（＝ｚの関数としての“正常変動”）と、疑わしい領域における同等な測定値（＝ｚの関数としての“異常変動”）とが記憶されるステップと、(３)前記２つの信号変動が続いて比によって関連付けられ（＝ｚの関数としての“インジケータ変動”）、疑わしい領域における値１からのインジケータの２０〜４０％偏差範囲が同一タイプの正常な組織体積と病的組織体積との間で有意に相違する代謝異常に関する指標限界として使用されるステップとを有する。
【００５４】
さらに、本方法は、(１)７２０〜８８０ｎｍまたは９８０〜１０８０ｎｍの波長域の集束短パルスレーザビームの照射と深さ走査および、健康であることが判明している組織域における組織深さｚの関数としての、照射波長の正確に１／２の波長の戻り電磁波の測定［構造的特徴としてのコラーゲンのタイプおよび構造のインジケータ］（＝ｚの関数としての“正常変動”）が行われるステップと、(２)疑わしい領域における同等な測定（＝ｚの関数としての“異常変動”）が行われステップと、(３)前記２つの信号変動が続いて比によって関連付けられ（＝ｚの関数としての“インジケータ変動”）、疑わしい領域における値１からのインジケータの３０〜５０％偏差の範囲が同一タイプの正常な組織体積と病的組織体積との間で有意に相違する組織構造異常に関する指標限界として使用されるステップとを含むことができる。
【００５５】
この場合、前記集束ビームは適切な（走査）装置によって組織を通って可動される。この運動は以下の走査モードつまり、ａ）水平な（＝組織表面と平行な）走査面を趣旨とする二次元モード、ｂ）垂直な（＝組織表面に対して直角な）走査面を趣旨とする二次元モード（“光超音波”）、ｃ）走査体積を趣旨とする三次元モードのいずれか１つで実施することが可能である。
【００５６】
目標は、特に、早期ステージの腫瘍（“上皮内癌”）の発見と、より進行したステージ（微細血管の遊走、基底膜の破れ、組織構造化の喪失）との分別である。ここで、以下の知見が使用される。ａ）微小循環はヘモグロビン信号の増加から同定される。ｂ）構造の分解はエラスチンおよび／またはコラーゲンの含有量の局所的偏差から同定される。ｃ）基底膜の破れはイメージ評価による乳頭構造の欠如によって同定される。外乱を抑制し、一方で測定システムの、他方で生物試料の未知のスケーリングが励起ビーム路と測定ビーム路とに及ぼす影響を補償するため、測定信号の参照が行われ、その際、ここでは特にＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、フラビンおよびトリプトファンの物質群のうち少なくとも２つの有意な物質の測定データが使用される。さらなる有意性増強情報として、形態データたとえばエラスチンまたはコラーゲンの局所的含有量が使用されるが、これらは専用の蛍光特徴（エラ
スチン）によるかまたは参照信号の非線形発生（好ましくはＳＨＧ＝第二次高調波発生＝好ましくはコラーゲンの場合に、励起電磁波の二倍の周波数）によって検出することができる。
【００５７】
被検査組織域の形態イメージはモニタ上で医師に示される。前記イメージは構造分子（エラスチンおよび／またはコラーゲン）の信号と、励起電磁波の直接の反射（表面反射および散乱振幅）との評価に基づいている。
【００５８】
“組織の分光フィンガープリント”は、上述した、コンピュータによって自動的に評価される参照方法によって決定される［少なくとも２つの評価（＝“正常”または“偏差”）または３つの評価（＝“正常”、“偏差”または“不明／不定”）］。代替代謝の領域はモニタイメージに擬似カラー表示によって再現される。
【００５９】
装置構造：組織を視覚的に特徴づける装置は、供給電源、制御素子、組込みコンピュータを備えた操作装置と、接続されたモニタと、集束光学系を備えたハンドピースと、励起電磁波用のスキャナと、測定電磁波（励起波長での反射ビームおよび散乱ビーム、励起波長の１／２のＳＨＧ電磁波さらにまた蛍光電磁波）の捕集用素子とを含んでいる。
【００６０】
励起電磁波はファイバーオプティックス好ましくは光子ファイバによるかまたは多関節アームによって供給される。この場合、蛍光励起電磁波用の照射光学素子は測定する電磁波の捕集にも使用することができる。
【００６１】
特に有利な実施形態として、医療超音波イメージングと同様に構成された走査方式（“光超音波”）の場合、ハンドピースに対して固定された走査面が組織内に垂直に配置され、医師により、超音波の場合と同じ通例のやり方で、組織を貫いて運動させられる。上述した付加的な情報（自動評価による“フィンガープリント”）を有した断面イメージがスクリーンにリアルタイムで表示される。
【００６２】
高い分解能による作動状態において、手動によるポジショニング精度が不十分であるか、無意識の手の動きによって起こる不安定性がこの方法にとって過大にすぎる場合には、ハンドピースが固定されて、走査面の変位は電動式またはマイクロメカニカル作動素子によって実施される。
【００６３】
好ましくはレーザ、特にパルスレーザが放射源として使用される。ピコ秒レベルのパルスで作動することのできる励起源はさらに、光子ファイバの使用により、多色励起用の広帯域光の発生も可能にする。この種の光源は蛍光ベースの腫瘍診断においても多光子顕微鏡法においてもこれまで使用されてこなかった。
【００６４】
本発明の方法は、皮膚の三次元走査イメージによって組織状態を評価し、組織状態の悪性／良性鑑別を表示することによって、公知の診断法とは区別される。この場合、分解能は、観察される組織深度に応じて約２０〜２０００００個の細胞が局所信号をもたらすように選択される。
【００６５】
したがって、本発明の方法は、個々の腫瘍細胞の形態、分裂挙動および代謝を顕微鏡によって観察する高解像度法から区別される。該高解像度法はラボテクノロジーならびに研究にとって興味深い結果をもたらすが、患者への臨床適用にはごく限定された程度でしか適していない。これらの実験室方式にとって必要な１μｍ領域の高解像度には、患者を不動にすることなしには不可能な高開口光学イメージングによる落射蛍光顕微鏡が必要である。また、達成可能な組織深さは、明確に限定される。高度に詳細な情報を取得し、評価するには、比較的長い測定時間が必要であり、そのためこの種の方法は、本発明による方法とは異なり、臨床病期診断には不適である。
【００６６】
上述した本発明による方法は完全に非侵襲的に行われる。皮膚表面は触れられることがなく、したがって、陽性所見の場合でも、本方法が腫瘍の娘細胞のフラッシングを引き起こす危険はまったくない。
【００６７】
蛍光法とＯＣＴシステムとのコンビネーションは三次元走査動作によって３Ｄ−ＯＣＴをもたらし、こうして、同一の組織体積（“走査体積”）が同時に、一方で、悪性／良性鑑別に関して好適な分解能で評価され、他方で、形態的にイメージ化される。したがって検査医は組織とその代謝状態評価との完全な三次元イメージを得る。
【００６８】
本方法は以上に比較的容易に到達し得る器官としての皮膚との関連で説明している。ただし、本方法はその他の医療分野ならびにラボテクノロジー分野へのさらなる応用発展の重要な可能性を持っている。
【００６９】
本発明のさらなる別途実施形態は、(１)方向性を持つ電磁波を放出する放射源を設けるステップと、(２)特徴付けられるべき組織に測定位置で前記電磁波を照射し、これにより、該組織内に該組織固有の後方散乱電磁波が励起されるステップと、(３)前記放射源によって放出された電磁波は伝搬方向に対して横方向に周期的に偏向させられ、こうして、前記電磁波が前記組織の複数の細胞に及んで広がる前記測定位置周辺組織域を周期的に走査するステップとを有する、細胞から形成された組織を視覚的に特徴付けるための方法を特定する。
【００７０】
多数の励起パルスの蛍光信号の積分によって対象点に関する情報を推定する方法が多くの場合に採用される。伸長した励起焦点から横方向にほぼ同じ広がりを有する励起体積を得るため、ビームは高速で横向きにｘ，ｙ方向に運動させられ（ビーム軸はｚ方向に選択されている）、これによって、多数の励起パルスからの蛍光を対象点に関して密に利用することができる。
【００７１】
レーザの繰返し周波数は通例８０ＭＨｚのレベルであることから、従来の機械式スキャナは“揺動”用の手段としては適切ではない。
【００７２】
むしろ、ここではマイクロシステムエンジニアリングまたはマイクロメカニクスの趣旨での解決法が採用される。
【００７３】
ここで、単軸式または二軸式自在懸架ミラーが板バネ式ミラー担持素子の復元力に抗して電磁場によって制御されて偏向される従来通例のマイクロスキャナ設計から脱却して、共振ガイドを採用することができる。このため、ミラー装置の機械的共振周波数は、所望の振動周波数が生ずるように、ねじれスプリングモーメントと慣性モーメントを適切に選択することによって決定される。まさにこの共振周波数で、電場または磁場による励起も行われる。これによってミラー
の正弦波振動と、対応する焦点の１軸運動を起こす。“揺動”が２軸で生じるようにすることが意図される場合には、互いに垂直をなす２つの振動軸の共振周波数は、２つの異なった共振周波数が２つの軸ｘとｙで生ずるように、異なったねじれおよび慣性モーメントで設計される。この場合、低周波数軸は振動が高周波数方向におけるよりも約６〜１５倍緩慢に生ずるように設計される。
【００７４】
したがって、走査スポットはリサジュー図形を描いて対象領域をｘおよびｙ方向に運動し、前記対象領域をほぼ均等に走査する。この１軸または２軸共振励起は以下において“非同期２軸調波駆動”と称される。別法として、ポッケルスもしくはカー効果を用いた偏向も可能である。
【００７５】
さらに別の実施形態はマイクロメカニカル作動装置による反射の活性相調整である。
【００７６】
このため、それぞれ３〜４箇所のラグポイントで懸架された自由に振動するミラーの配列がマイクロメカニクスによってつくり出される。これらの個々の、かつ互いに同一の位相作動装置のキャリアストリップは一様に形成され、幅に比較してわずかな厚さを有している。結果として、これらは傾倒することなくミラー表面に対して垂直に容易に偏向可能であり、こうして、偏向時にあっても他のポジションと平行なそれらのポジションは維持されることになる。
【００７７】
ミラー下の支持層には、ｘ−ｙ方向にミラーエレメントごとに電極が下側に配置されるようにして電極アレーが設けられる。ミラー自体も同じく下側面に導電接触域を有する。
【００７８】
個々の電極の駆動によって、ミラーエレメントの上下運動が静電力により、ねじりなしに達成される。結果として、各々の個別点の実効高さ位置を個別に駆動することが可能である。これは、反射の場合に、位置に応じて設定可能な移相を可能にする。ミラーの偏向は、完全な位相消滅のために、可視域の通例の波長（４００〜１５００μｍ）であればよく、２００〜７５０ｎｍが最適な効果となる。これは適切に設計されたキャリアラグによりまったく問題なく行うことができる。
【００７９】
部分ビームの生成に関して重要なのは、各々の部分ビームにおいて、選択された光学系により焦点において所望の強度の励起電磁波が達成されるように諸条件が設定されること、ならびに、部分ビームの各々が、選択された集束光学系により、該光学系の像面において他の部分ビームの焦点から分離した焦点を形成するように設定されることである。さらに、像面におけるこれら少なくとも２つの焦点間の距離は次のように、つまり、励起電磁波の伝搬方向に沿った、特に各々の部分ビームの焦点近傍におけるそれらの重なり合いが焦点における励起電磁波の強度の選択可能な何分の一かの強度を上回らないように設定される。
【００８０】
要約すると、好ましくは、(１)所望の数の部分ビームに分割するための光学素子は、部分ビームの数とそれらの焦点間の距離の選択を可能にすると共に、部分ビームまたは総ビームの強度を適切な光学素子によって変化させて、２光子または多光子励起プロセスの要件に応じ、各々の部分ビームの焦点における強度につき適切な値を設定することを可能にする作動素子として形成され、(２)所望の数の部分ビームに分割するための光学素子または付加的な光学素子は、レンズの像面において、励起域または励起域の一部の相応した時間可変の変化を可能にする部分ビームの時間可変の偏向または配置を可能にし、(３)このような配置によって生ずる励起域の時間の変化によって焦点域における励起域の、部分ビームの配置から生ずる、ギャップを埋める補償に使用され、(４)励起体積の造形は“微小揺動”によって得られ、(５)所望の運動は機械的または電磁的効果たとえばポッケルスまたはカー効果によって得られ、(６)マイクロメカニカル素子は焦点の迅速な微小運動（または位相制御）のために使用される。
【００８１】
組織の目視検査用装置の高信頼性動作には以下の基本的な要件が存在する。Ａ．正規動
作において患者にとっていかなる害も生じてはならないこと。Ｂ．おなじく、“単一故障ケース”において患者にとっていかなる害も生じてはならないこと。Ｃ．複数の動作不良の組み合わせから想定されるワーストケースに関して結果として得られる効果が検討されること。病理学的徴候のある患者にとっての害は防止されなければならないこと。
【００８２】
上記の３要件は以下のセクションにおいて、ＩＳＯ１４１９１に基づくリスク分析として個別に評価される。以下の結論は安全評価を要約したものである。
【００８３】
正規動作の説明（ケースＡ）：カテゴリー：ルーチン動作において、本発明による装置は走査運動を実施し、その際、レーザの焦点は組織に侵入して横方向および深さ方向に運動させられ、強度制御により、組織内におけるビームの減衰が補償され、焦点における強度は一定に保たれる。安全上の理由から、一方で、個々のパルスはいかなる害も惹起しないとの要件を満たすことが必要である。他方、続いて来るパルスのコンビネーション効果ならびに組織内における適用中に累積されたエネルギーも害を発生させてはならない。
【００８４】
個々のパルスの場合、断熱効果、光化学の影響および急速なエネルギー励起プロセスによる分子内、分子間遷移時間も考慮することが必要である。最も高い励起強度はレーザ放射の焦点にあることから、ここでの特性変数は焦点体積中の吸収パルスエネルギーおよび吸収ピークパルス出力の体積密度である。熱伝導プロセスは無視することができる。
【００８５】
続いて来るパルスのコンビネーション効果の評価のため、個々のパルスの吸収エネルギーが走査運動によって掃引された体積に関連付けられなければならない。個々のパルスの励起体積がオーバラップしているケースについては、個々のパルスの結果としてよりも高い負荷が生ずることがある。
【００８６】
上記の２つのケースでは焦点体積における電磁波の吸収が考慮されるが、組織内に累積されたエネルギーの効果の評価には組織の多量の散乱が考慮されなければならない。これは吸収が比較的低い場合に光窓の波長域でも電磁波が限定された組織体積を離れず、最終的に前記体積に吸収されるという効果を有している。ここで特徴的なのは平均出力および
また組織内の熱移動プロセスであり、つまり、血液循環による熱伝導と熱除去が考慮されなければならないことである。
【００８７】
非熱効果：低い光子エネルギー（〜１０４ｃｍ−１）と出力密度（〜１０１１Ｗ／ｃｍ２）であるので、結合破壊に起因するダメージは除外することができる。ピコ秒（ｐｓ）レベルでの加熱中の温度勾配に起因するダメージは知られていない。したがって、以下において、組織ダメージの推定は純然たる熱負荷に集中される。
【００８８】
組織の熱負荷の推定および評価：有害な副次的効果の評価には、組織の吸収特性と散乱特性との双方が考慮されなければならない。想定された電磁波波長域において、散乱プロセスに関する実効断面積は光の吸収に関する実効断面積よりも１〜２桁高い。１０６４ｎｍに関していえば、純然たる吸収については４ｃｍ−１の吸収係数が特定され、吸収と散乱とのコンビネーションに関する実効断面積としては５ｃｍ−１が特定される。侵入深度（１／ｅへの強度減少）は４ｍｍと推定される。温度変化は、短いパルス幅（〜１ｐｓ）のせいで、当初は断熱的に、組織の熱容量によって除された吸収エネルギーから生ずる。ここで、熱容量に関する最低値（脂肪組織につき１９３０Ｊｋｇ−１Ｋ−１）を控えめな推定として仮定することができる。こうして、温度差は組織の熱伝導率の結果として、比較的長時間の間に再びバランスされる。ここでも、最小値（λ＝０．３Ｗｍ−１Ｋ−１、脂肪）が推定される。
【００８９】
個々のパルスの断熱効果の推定には、最大強度が生ずる位置を考慮すれば十分である。前記の位置は焦点にあり、同所で、レーザパルスの間に同所に吸収された全エネルギーは断熱的に、つまり周囲との間の熱交換なしに累積される。強度制御であるので、この強度は全走査ポジションにつき、つまり組織のすべての深度につき同一である。エネルギー移動は線形および非線形吸収を通じてのみ生ずる。散乱は計算に考慮される必要はない。ｍｍ当たり５０％の吸収と上述した熱容量とを仮定すれば、設定された装置パラメータから個々のレーザパルスによる２．６℃の焦点体積の加熱が結果として得られる。
【００９０】
横方向走査動作中の続いて来るパルスのコンビネーション効果の評価には、たとえば、１００μｍの走査セクションの間に組織に当たるすべてのパルスの吸収エネルギーを考慮することが必要である。これは対応する走査体積（幅：ウエスト直径、深さ：２倍のレイリー長１００μｍ）に関連付けられなければならない。控えめな推定として、この考察は、２つのパルスの間の時間間隔内に組織中に熱が加わることにより、わずかな分布が生ずるとしても、断熱的に行うことも可能である。上述した値を使用した計算から、測定点の単一回の横方向掃引の場合につき、レーザの焦点域における４．７℃の組織加熱が導きだされる。走査動作は“ラインごと”に行われることから、つまり、測定スポットは、次の“ライン”が新しい深さで測定される前に、まず固定された深さで組織を横断して移動させられることから、深さ方向におけるパルスのコンビネーション効果は断熱的に推定されてはならない。２つの“ライン”の間の時間間隔内に熱はより大きな体積中に拡散するため、２つの矢状の隣接パルスのコンビネーション効果は以下のセクションで考察される全パルスの共同効果によって遥かに上回る。
【００９１】
長期的に（つまり、１０５パルス以上にわたって）累積したこのエネルギーを評価するため、それは多量の散乱による電磁波から離れることのない体積に関連付けられなければならない。最も高いレーザ出力、つまり最大深度での測定のためのレーザ出力が控えめな推定とされる。直径２ｍｍ、深さ４ｍｍで、その中心が４ｍｍのライン上を横方向に迅速に移動させられる円筒状の走査体積を仮定すれば、この体積中に１秒当たり１℃の加熱が生ずる。静的条件下で、すなわち、アプリケータが長時間にわたって皮膚上を運動させられない場合、ワーストケース条件下（脂肪組織、上記参照）での組織の熱移動はビーム面（厚さ１０μｍ）の温度を４３℃に制限する。（仮定：拡散熱伝導、５ｍｍの距離で体温は血液循環によって３７℃に保たれる）。
【００９２】
技術的安全性の観点から組織内の温度上昇の意義を評価するため、文献中の結果に依拠することができる（以下参照、たとえば、G.Muller,H.P.Berlien“Angewandte Lasermedizin”[“Applied lasermedicine”],ECOMED-Verlag,loose-leaf publication,1993 ff., section3.3“Thermische Wirkungen”[“Thermaleffects”]）。したがって、有害な熱の影響は温度とその作用持続時間との双方に依存している。ここで考察された時間スケールで、限界温度は１秒から最大で１０秒間だけ適用されるべきである。文献データによれば、ダメージはこれらの作用持続時間で５７℃を越えて初めて、つまり体温を２０℃だけ越えて初めて生ずる。
【００９３】
単一故障ケースの説明（ケースＢ）：安全上の理由から以下の故障源が考慮されなければならない：ａ）制御故障に起因する、レーザの最大値へのパルスエネルギー上昇。ｂ）走査動作が生じそこなって、続いて来るパルスが繰り返して同じ場所に当たること。故障処置：許容し得ない動作状態ａ），ｂ）の双方に対する最も重要な対策として、構造およびシステムレイアウト中に高速電子モニタリングユニットが設けられて、制御動作およびまた皮膚上におけるアプリケータは目にとって安全な接触動作を絶えずチェックする。また、該ユニットは装置の電子制御ユニットとは独立に動作する。この電子モニタリングユニットは故障を認知すると即座にレーザの電源を遮断する。これによってリスクは取り除かれる。ケースａ）に対する予備対策として、特定の値を上回るエネルギー出力を防止するハードウェア制限がレーザ中に導入される。
【００９４】
残存リスクの評価（ケースＣ）：故障発生の確率：上述した故障（パルスエネルギー上昇、走査動作の生じそこない）の発生確率は電子的対策と独立した電子モニタリングユニットによって容認可能な値にまで低下される（正確な定義は導入が行われて初めて特定することができる）。
【００９５】
多重故障ケースから結果として得られる効果：それにもかかわらず万一モニタリングに故障が生じた場合には、効果は以下のようにして評価されなければならない。：ａ）出力制御の故障：個々のパルスの効果および続いて来るパルスのコンビネーション効果は制御動作につき断熱的に計算された。したがって、効果（非線形吸収を無視）はレーザ出力に比例する。かくて、短期的な断熱加熱は１０℃以下のままである。組織内に累積したエネルギーの評価のため、一般に最大レーザ出力が推定のためにすでに考慮された。したがって、出力制御の故障は患者を害するには至らない。
【００９６】
ｂ）走査運動の故障：個々のパルスはすべて同一組織体積内に集束させられ、その結果、焦点体積が周囲組織への熱拡散の結果として６２℃の定温に達するまで急速な温度上昇が生ずる。組織内に累積された出力に関していえば、走査運動の故障はレーザビームの軸上に約４ｍｍの深さまで５０℃の最大温度が生ずることを意味している。したがって、レーザが電源遮断されることのない走査運動の故障の結果、患者は疼痛刺激を経験する。これはこれらの放射条件が敏感な皮膚域（肘）への“針を刺したような痛み”として感じられた自己実験に符合する。
【００９７】
走査運動の故障により像の生成はできず、したがって、特筆されるべきことは、治療医が障害を認識することができることである。レーザはアプリケータが皮膚から引き離されるだけでも即座に電源が遮断される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９８】
以下、図面を参照し、代表的な実施形態を基礎として、本発明を詳細に説明する。
【００９９】
図１はヒトまたは動物の組織１の視覚的特徴付けを行うための装置を示している。多光子プロセスを開始させるために一般に使用される放射源であるレーザ２の光はビーム形成手段を構成するビームスプリッタ３により部分ビーム４ａ，４ｂ，４ｃに分割される。３本の部分ビームが図示されているが、本発明は３本の部分ビームに限定されるものではなく、任意の所望の数の部分ビームを使用することができることはいうまでもない。
【０１００】
前記部分ビーム４ａ，４ｂ，４ｃの方向の相違はレンズ５によって焦点５１ａ，５１ｂ，５１ｃの相応した配置に変換される。ビームスプリッタ３とイメージング手段を構成するレンズ５との間の光路には、一方で、たとえば部分ビームの強度に影響を及ぼす素子（ここでは図示なし）を導入するかあるいは図１に一例として示したように、対象試料１（組織）の走査励起に使用される偏向手段を構成するスキャナ６を導入することができる。
【０１０１】
多光子吸収は高い強度により部分ビーム４ａ，４ｂ，４ｃの焦点５１ａ，５１ｂ，５１ｃで生じ、その吸収の結果として、これらの領域は１つまたは複数の励起域の特徴付けに使用することのできる対応した蛍光信号を放出する。この蛍光の一部はレンズ５によって集められ、さらに、ダイクロイックミラー7によって励起光からスペクトル的、空間的に分離されて、蛍光用の検出器８によって検出される。
【０１０２】
図１は、前記対象試料中の励起焦点の光束によってカバーされる全域（“積分励起域”）は前記蛍光信号の総和を検出することによって特徴付けられることを明らかにしている。万一、検出技術上の理由から、この励起パターン中のギャップを検出することも必要であれば、これはたとえば最小走査運動と複数のレーザパルスに及ぶ合算平均によって行うことができる。
【０１０３】
この種の装置は、たとえばダメージを回避するために励起電磁波の強度の上限が設定される場合に、特に有利である。本発明の装置において、各々の部分ビームに最大許容強度を適用することが可能である。その場合、予測される蛍光信号は、選択された部分ビームの本数に従って、1本の部分ビームから得られる蛍光信号に比較して増大する。ただし、この場合、当初に述べたように、励起ビームの伝搬方向に沿った励起域の空間的な区別、ひいては本方法の分解能は、ほとんど不変のままとすることができる。
【０１０４】
本発明上重要である、前記対象試料中の焦点の適切な配置の問題は図２を参照して説明する。図２は、同一強度の９本の部分ビームが重畳した選択事例につき、電磁波の伝搬方向の軸に対して正規化された光束中心における強度変化と部分ビームのレイリー長の倍数との相関性を示している。焦点面につき、ｚはゼロに設定される。
【０１０５】
この場合、実線Ａは１部分ビームの変化を示している。比較のため、点線Ｂは、Ａと同じピーク強度を有するが、相応して選択された開口により９本の部分ビームと同じ総エネルギーを有するビームに関する強度変化を示している。この曲線は伝搬方向に沿って著しく緩慢な強度減退を示している。これは励起域がこの軸上で著しく伸びていることを意味している。
【０１０６】
他の３本の曲線は部分ビームの焦点間の異なった横方向距離に関する強度変化を表している（Ｃ：距離＝ウエスト半径の１．５倍；Ｄ：距離＝ウエスト半径の３倍；Ｅ：距離＝ウエスト半径の５倍）。
【０１０７】
前記の距離が過度に小さく選択されると（たとえばウエスト半径の１．５倍）、重なり合いによって焦点自体においてやや高い強度が生み出され、励起域は伝搬方向に沿ってかなり拡大される。これはたとえば焦点強度の１／２への減退点を尺度とすれば明らかである。
【０１０８】
ただし、この例示装置において、たとえばウエスト半径の３倍ないし５倍が設定される場合、強度は、同じウエストを有するビームの場合と同じ焦点からの距離で、ほぼ半減した。
【０１０９】
この例は、本発明による焦点間距離の有利な選択によって、部分ビームの本数と、したがって励起域のサイズとはほぼ独立に、伝搬方向に沿った励起域の広がりを設定することが可能であることを明らかにしている。
【０１１０】
最も好ましい焦点間距離の選択はレンズの焦点面におけるそれらの配置、それらの数および励起電磁波の特性に依存している。好ましくは単一ビームのウエスト半径の２．５〜１５倍の大きさの距離が選択される。
【０１１１】
図３は、放射源であるレーザビーム源２が多光子励起と光学コヒーレンス反射率測定との双方に使用される装置を示している。適切であれば、前記ビーム源のスペクトル特性は所望の深さ分解能（電磁波伝搬に沿った分解能）が可能となるように設定される。前記電磁波は部分透過性ミラー７１により励起ビームＡＳと参照ビームＲＳとに分割される。
【０１１２】
双方のビームにはさらに、時間的に強度を調整するが、ただし光路長を調整することのない調整器を設けることができる。この種の装置は表されていない。
【０１１３】
励起ビームＡＳにはビーム形成ユニット（手段）３によって、伝搬方向に対して横方向の構造が付与され、この構造は対象試料内においてレンズ５の焦点面近傍にのみ集光が行なわれることによりハイコントラストで現れる。例えば、ホログラフィー素子またはマイクロレンズまたはマイクロプリズム装置を前記ビーム形成ユニットとして使用することができる。図３は、この種の装置の可能な実施形態として、対象試料１（組織）内に密接した焦点を形成する３本の部分ビーム４ａ，４ｂ，４ｃへの分割を示している。焦点面の外側では、焦点間のコントラストは部分ビームの混合によって減少する。こうして構成された励起ビームＡＳは前記対象試料の空間的に画定された励起のために偏向手段を構成するスキャナ６によって対象試料１に対して相対運動させることができる。
【０１１４】
構造化された励起ビームＡＳが対象試料１の内部を照射する場合には、構造境界で散乱が生ずる。後方散乱された部分はレンズ５（同所で該部分は再び集光される）と、適切な場合、走査ビーム運動を逆転させるスキャナ６とを通過する。対象試料１の深さに由来するこの光はビームスプリッタ７と、適切な場合、視野レンズ１０によって、参照ビームＲＳによる干渉を経て干渉検出器２０（たとえばＣＣＤカメラ）に達する。
【０１１５】
参照ビームＲＳの光路長は可動ミラー１９によって変えることができる（運動方向は双方向矢印Ｍで表されている）。干渉が空間分解された形で観測される場合には、参照ビームの光路長が焦点までの励起光線の長さおよび後方散乱光が重ね合わせ位置まで戻る長さと正確に一致していれば、特にハイコントラストの干渉パターンが観測されよう。励起ビームに付与された構造のイメージは干渉パターンで現れる。これはコヒーレンス反射率測定が励起焦点域を表すことを示すものである。
【０１１６】
一例として、図３には、考えられる１方法として２光子または多光子顕微鏡法が表されている。ここに図示した実施形態において、多光子蛍光は、ダイクロイック・ビームスプリッタ７２と検出器８によって、３本の部分ビームすべての焦点域から合算して検出される。ただし、選択された部分域のみの蛍光信号の検出ができるその他の装置も同じく可能である。
【０１１７】
図４Ａ，４Ｂは組織の視覚的特徴付けを行うための一連の装置の原理を示している。集束されたＩＲレーザパルス（〜フェムト秒（ｆｓ）−ピコ秒（ｐｓ））（矢印Ｐ）による励起の後、試料／組織から発された光は分光計１１によって検出される。該分光計１１は、評価を容易にすると共に反射光の捕集効率を改善するため、比較的低いスペクトル分解能と広いスペクトル窓を有したポリクロメータとして実施している。後者の場合には、適切な場合、ポリクロメータ１１の上流の集束レンズを省くこともできる。
【０１１８】
内部放射された光のエネルギーよりも高いエネルギーを有する光子の光のみが評価されるため、信号はもっぱら焦点域で生じ得る非線形プロセスから発生するようにできる。焦点５１の位置はレンズ５の位置と組織の屈折率から明確に決定される。深さ指定は適切に調整された対象試料に応じて調整することができる。
【０１１９】
強度は、より深い組織域への集束中の励起光の減衰を補償するため、深さ走査の間変化させられる。制御は、組織とは独立に、焦点での励起強度の関数として開始され、したがって、さまざまなタイプの組織における減衰を補償する物理的効果に基づいている。このようにして、自己集束の妨害と組織内の量的なＵＶ変換が回避される。
【０１２０】
一般性を限定することなく、図４Ａ，４Ｂはそれぞれ、ビームと焦点との間の相対運動をもっぱら２つの座標で表している（ｘは水平方向、ｚは組織深さ方向）。本発明によれば、さらに、第２の水平方向軸ｙを前記のいずれか１方向に採りいれることができる。
【０１２１】
図４Ｂの装置の原理は図４Ａの装置の原理と同じであり、試料のさまざまな点を測定するために、調整ユニットであるポジショニングユニット１２によって試料を集束レンズに対して相対運動させることができる点が相違しているだけであり、イメージング手段このポジショニングユニット１２とレンズとを有する。さらに、分光計またはポリクロメータ（図４Ａの当該記述、参照）１１ａが配置されており、これは時間的循環測定を可能にし、評価ユニット１３に接続されている。図４Ｂによる装置は、切除された組織試料または病理学的標本の、たとえば細胞培養のようなインビトロ検査に特に適している。
【０１２２】
図５は、蛍光とＯＣＴのコンビネーションシステムを備えた、組織の視覚的特徴付けを行うための装置のさらに別の実施形態を示している。このシステムの原理は図３に関連してすでに説明した。この装置は分光計を備えていず、むしろ、上流に接続されたフィルタ１６ａ，１６ｂによるろ波によって蛍光スペクトルの部分スペクトル信号を利用する複数の個別センサ１５ａ，１５ｂで作動させられる。
【０１２３】
フィルタ１６ａ，１６ｂは単に線路フィルタ、帯域フィルタまたはカットオフフィルタに限られるものではない。むしろ、少なくとも一部は、重み関数に従って計算、生成される複素グレーデッドフィルタが使用される。
【０１２４】
例示的に、この種の装置のいくつかの代表的な演算値を以下に表の形で示すこととする。予備的試験から得られた結果を変換するにあたり、以下の装置パラメータを用いて、横方向および縦方向のステップサイズ５０μｍ、イメージ繰返し率２Ｈｚ、１．５×４ｍｍ２スライスでの評価のために求められた個々の測定結果を決定することができる。
【表１】
0005619351.tif 000006
【０１２５】
図５に示した装置は非線形蛍光励起で動作する。これは以下の理由による。Ａ．十分な侵入深さはほぼ７５０〜９００ｎｍの“赤外線（ＩＲ）窓”内でのみ可能である。Ｂ．非線形効果の結果として、蛍光励起は実際にもっぱら励起焦点で、したがって高度に局所化されて生じ、高い水平方向ならびに深さの分解能が達成される。Ｃ．我々の先の測定によれば、非線形励起によって得られた蛍光スペクトルは、線形励起すなわち励起波長の１／２で得られるものとは原理的に異なっている。その理由は、励起速度論（kinetics）、放出速度論（kinetics）ならびに分子内エネルギー移動プロセスのいずれもが蛍光プロセスに不可欠であるということである。この知見は関連する科学研究から原理的に知られている。特異度の著しく改善された当該の非線形レーザ分光分析法はこの間に幾つかの技術的、生物・医学的応用分野に好適に使用されつつある。
【０１２６】
前記の理由点Ｃに関する予備的調査に関連して、組織病理学的に定義された試料が使用され、インビトロで検査される（基底細胞癌／皮膚）。この新しいアプローチ（超細胞平均値測定による非線形分光法）は検査に際して基底細胞癌と正常組織との間の非常に優れた鑑別を可能にした。こうして生じた放出スペクトルにおいて、細胞代謝の正常または異常に関する当否判定を実際に可能にするスペクトル域を同定することが可能であった。予備的研究において、この間、この方法を使用して総計２６シリーズの測定が実施されて、評価された。結果は図６に表示されている。
【０１２７】
図６は２６個の試料に関する非線形励起放出測定の評価を示しており、該試料のうち１１個は健康な組織であり、１５個は病的組織である。スペクトルから計算された固有波長（λｃｈａｒ）の位置は縦座標で表され、定義された２つの波長の強度比Ｖ（λ１／λ２）は横座標に表されている。破線Ｇは境界線を表している。基底細胞癌を正常な皮膚から識別し得ることがはっきりと見える。
【０１２８】
測定結果の適切な数学的簡約化により、以下において蛍光光学的組織インジケータ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｏｐｔｉｃａｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）（ＦＴＩ）と称される、自己参照、すなわち、総強度から独立した、固有スカラ変数を決定し得ることが明らかである。組織内の特定の幾何的測定点におけるＦＴＩはいくつかの固有波長における強度値から決定することができる。これらの測定の評価は、この非線形法によって、病的組織を健康な組織からほぼ明確に見分けることが可能であることを示している。この正確な方法は本特許出願の主題である。
【０１２９】
この新規方法の背景をなすものは、病的組織内に一連の分子インジケータが存在するという事実である。ただし、該インジケータは線形法では、図７に示すように、該方法の分光特性によって見分けることができない。
【０１３０】
図７は異なったタイプの組織（真皮は実線で表され、上皮組織は破線で表されている）の従来の蛍光分光検査（１光子励起でのＵＶ誘起された自己蛍光）を示している。このスペクトルから有意な分光分析上の相違は存在しないことが看取される。これはここで検討された物質が分子構造の点でごくわずかしか相違していないことからして驚くには当たらない。本発明によれば、この場合、広い吸収帯と統計的な平均値算出の結果として、特異度が予測されることもない。
【０１３１】
ここで非線形法は、異なった分子システム間の相違が、非線形条件下で著しく増幅されることにより、分光分析によって評価可能であるとの点で、改善方法を備えている。図８はこれらの相違がいかに大きいかを表している。図８は異なったタイプの組織の非線形励起による分光検査の結果を示している。図７に対比して、有意な相違が存在する。
【０１３２】
これらの若干の事例は、非線形分光法がまさしく生物医学分野における分析に根本的に新しいアクセス方途を切り開くことを証明しようとするものである。これらの特定の事例は、一般性を制限することなく、この新規方法の原理を示すと共にその実現可能性を証明している。本発明による幅広いアプローチは請求項ならびに記載された説明によって提示される。
【０１３３】
本発明による方法アプローチの本質的部分は、平均して２０〜２０００００個の細胞体積（集束体積）に及ぶ空間分解能で前記ＦＴＩが検出されることである。したがって、この蛍光光学的組織インジケータは組織を表す超細胞平均変数であり、細胞小器官または特定の細胞区画に関する特性変数ではない。診断目的にとって適切な程度にまでデータ整理を行うことにより、患者を長時間にわたって拘束することなく、リアルタイムで時間的評価の実施を可能にするのはこの定義のみである。
【０１３４】
これまでに実施された組織測定へのＦＴＩの適用は健康な組織と病的組織との間の明確な線引きを可能にしている（図４、参照）。要約すると、蛍光データの評価によって選択度を得ることが実現される。これらの蛍光データとＯＣＴとの時間的、空間的に適合した組み合わせにより医師は組織に対して方向付けすることができ、検査される皮膚領域の形態への蛍光光学的測定の対応付けを行うことができる。
【０１３５】
先の調査は、まさに純然たる強度評価と２つの波長での比率の形成（自己参照）の場合に、固有蛍光最大値と結びついた蛍光組織インジケータＦＴＩによって組織の病理学的状態の明確なインジケータを見出し得たことを示している。
【０１３６】
したがって、例示的に述べたＦＴＩの定義によって、今や、閾値により健康な組織と病的組織との間の自動的な鑑別を可能にする、明確に区別可能なインジケータ値が見出された。本発明による方法原理は、選択度と特異度をさらに改善し、さまざまな問題に個別に適合させることを可能にする。
【０１３７】
かくて、本発明によれば、最適かつできるだけ有意な診断という目的を最小限の偽陰性および偽陽性情報で達成可能とし、かつ、診断所見を向上させるため、先に説明したように、さらなる波長が使用されおよび／または２つ以上の波長につき相関率が算出される。
【０１３８】
像点または焦点から、２つまたはそれ以上の有意なインジケータまたは参照波長における蛍光放射の強度値を決定し、比率によって関連付けることができる。こうして、所望の速度の評価を得て、リアルタイムで、測定信号を評価して良／不良決定を行うと共に結果をＯＣＴ像で表すことができる。
【０１３９】
この場合、さらに、以下を考慮することが可能である。ａ）減衰挙動、すなわち蛍光放出の時間成分、およびｂ）蛍光励起波長の影響。ａ）につき：所定の検出波長による適切な高速センサ（たとえばＰＭＴ＝光電子増倍管）を用い、時間的変化を電子的にゲーティングすることによって評価することができる。ｂ）につき: 励起波長を変化させることにより、検出信頼度と鋭敏性が本発明により増大する。
【０１４０】
オプショナルな付加的方法により、それらを上述した新規方法と組み合わせて、医師にとって有用な付加的情報を得ることが可能である。
【０１４１】
これは第一に、本発明の新規な方法の特異度にとっては不要であるが、医師にさらなる治療の実施を容易にする形態に関する付加的情報を供するＯＣＴ法との組み合わせが可能であることを意味している。
【０１４２】
図９は組織の視覚的特徴付けを行うための装置のさらに別途の実施形態を示している。レーザ光源（図示なし）は光ファイバー３０を経て測定ヘッド３１に接続されている。レーザ光は光ファイバー３０と測定ヘッド３１によって検査さるべき組織に照射され、同所から戻される。したがって、超音波検査法と同様に、広い組織域を光学的に“走査”することができる。後方散乱光または組織内で励起された光は光ファイバー３０を経て一体化された評価ユニットに導かれ、該評価ユニットは決定されたデータから当該組織に関するイメージ情報を生成する。該イメージ情報は一体化されたスクリーン４０に表示される。
【０１４３】
蛍光システムに加えて、該蛍光システムと同期しかつ空間的に合致して動作するＯＣＴシステムを組み込むことが可能である。これは、当該蛍光システムの光学系、スキャナ、レーザ光源および信号路を利用することができるため、比較的低い装置費用で実現することができる。前記ＯＣＴは、重要な付加的情報として、代謝異常に関する前記情報が蛍光光学的に判定される当該組織体積の形態的構造情報を供する。したがって、この情報を当該組織の形態イメージに直接対応させることが可能である。こうして、測定ヘッドへの幾何的対応付けにより、組織構造に関するイメージが生成される。医師には、代謝異常のある危険エリアが位置する、組織形態的特徴を有する組織域が表示される。本発明の装置の顕著な特徴は、日常診療または臨床ルーチンに適した、効果的で信頼度の高い再現性ある腫瘍診断に役立つ医療装置である。この目的のために使用される有効な原理、方法およびアルゴリズムは診断目的によって決定される。これはたとえば単色または多色励起および、蛍光のスペクトル検出、時間分解検出に関係している。診断観察野の寸法は臨床医療に準拠し、深さ分解能０．５〜１．５ｍｍ、エッジ長数ミリメートル（たとえば４ｍｍ）の断面イメージ表示である。
【０１４４】
この場合の診断解釈の本質的な特徴は蛍光光学データと形態的情報との組合わせである。というのも、基底膜の癌原性浸潤を同定し得るのはこの手段によってのみだからである。本発明によれば、ＯＣＴ法または当該蛍光信号の抽出はこうした形態情報のために使用される。  
【０１４５】
上記で説明した実施形態の基本構成となる細胞から形成されたヒトまたは動物の組織を視覚的に特徴付けるための方法は、方向性を持つ電磁波を放出する放射源を設けるステップと、特徴付けられるべき組織に前記電磁波を照射し、これにより、該組織内に該組織固有の反射電磁波が生成されるステップと、前記組織内に侵入した前記電磁波は、前記電磁波の伝搬方向に対して横方向に広がった励起域内で、前記組織内に固有反射電磁波を励起するのに十分な強度を有するステップとを有しており、前記放射源によって放出された前記電磁波は該電磁波の伝搬方向に対して横方向に強度プロフィルが付与され、前記強度プロフィールは前記励起域が前記組織の複数の細胞をカバーするように形成され、励起された前記反射電磁波は細胞間組織特性に由来している。さらに、上記で説明した細胞から形成されたヒトまたは動物の組織を視覚的に特徴付けるための方法の実施形態またはその変形例は、以下の態様１〜１３を含む。
【０１４６】
（態様１）
上記基本構成に係わる細胞から形成されたヒトまたは動物の組織を視覚的に特徴付けるための方法において、ａ）前記干渉検出器は焦点に達する前記電磁波の強度を該電磁波に対して垂直な面内で空間分解した形で判定し、ｂ）前記判定された強度値と、前記放射源の前記電磁波に付与された前記強度プロフィールとから、相関値が決定され、ｃ）前記付与された強度プロフィールは最大値になる前記相関値によって検出されることが可能であってもよい。
【０１４７】
（態様２）
上記基本構成に係わる細胞から形成されたヒトまたは動物の組織を視覚的に特徴付けるための方法において、前記放射源によって放出された前記電磁波は該電磁波の伝搬方向に対して横方向に偏向されて、前記組織表面と平行に広がる前記組織域が走査されることが可能であってもよい。
【０１４８】
（態様３）
上記基本構成に係わる細胞から形成されたヒトまたは動物の組織を視覚的に特徴付けるための方法において、前記放射源によって放出された前記電磁波の焦点面への集束は時間に依存して行われ、該焦点面は前記電磁波の伝搬方向に変位させられて、前記組織表面に対して垂直に広がる領域が走査されることが可能であってもよい。
【０１４９】
（態様４）
上記基本構成に係わる細胞から形成されたヒトまたは動物の組織を視覚的に特徴付けるための方法において、前記組織内に励起された前記後方散乱電磁波は検出器によって検出され、該強度は波長および／時間に依存して決定されることが可能であってもよい。
【０１５０】
（態様５）
上記基本構成に係わる細胞から形成されたヒトまたは動物の組織を視覚的に特徴付けるための方法において、ａ）前記組織は波長域７２０〜８００ｎｍの電磁波で照射され、これによって、前記組織内に２光子蛍光が励起され、ｂ）第１の蛍光信号の強度は４６０±３０ｎｍの波長で、第２の蛍光信号の強度は５５０±３０ｎｍの波長でそれぞれ検出され、
ｃ）前記第１と第２の蛍光信号の強度比が決定され、ｄ）該ステップｃ）で決定された比に応じて信号が生成されることが可能であってもよい。
【０１５１】
（態様６）
上記基本構成に係わる細胞から形成されたヒトまたは動物の組織を視覚的に特徴付けるための方法において、ａ）前記組織は５００〜５５０ｎｍの波長域の電磁波で照射され、この場合、ｂ）２光子蛍光の第１の強度は３４０±４０ｎｍの波長で検出され、ｃ）前記組織は７２０〜８００ｎｍの波長域の電磁波で照射され、この場合、ｄ）２光子蛍光の第２の強度は４６０±４０ｎｍの波長で検出され、ｅ）該ステップｂ）で決定された前記第１の強度と該ステップｄ）で決定された前記第２の強度との比が決定され、ｆ）該ステップｅ）で決定された比に応じて信号が生成されることが可能であってもよい。
【０１５２】
（態様７）
上記基本構成に係わる細胞から形成されたヒトまたは動物の組織を視覚的に特徴付けるための方法において、ａ）前記組織は７２０〜８００ｎｍの波長域の電磁波で照射され、この場合、ｂ）２光子蛍光の強度は４６０±４０ｎｍの波長で検出されることが可能であってもよい。
【０１５３】
（態様８）
態様７に係わる細胞から形成されたヒトまたは動物の組織を視覚的に特徴付けるための方法において、前記電磁波はレンズを経て前記組織内に結像され、該レンズは前記放射源によって放出された前記電磁波の伝搬方向に沿って徐々に変位させられ、前記ステップａ）と前記ステップｂ）は複数のレンズポジションにつき実施され、こうして、焦点が前記組織を通って前記電磁波の伝搬方向に案内されて、複数の組織深さにつき蛍光信号が測定されることが可能であってもよい。
【０１５４】
（態様９）
態様８に係わる細胞から形成されたヒトまたは動物の組織を視覚的に特徴付けるための方法において、前記方法は健康な組織について実施され、こうして測定された前記蛍光信号の強度は参照値として記憶されることが可能であってもよい。
【０１５５】
（態様１０）
態様９に係わる細胞から形成されたヒトまたは動物の組織を視覚的に特徴付けるための方法において、ａ）特徴付けられるべき組織につき実施され、ｂ）各々の深さにつき測定された前記強度は前記記憶された参照信号のそれぞれの強度と比によって関係付けられ、
ｃ）該ステップｂ）で測定された比に応じて信号が生成されることが可能であってもよい。
【０１５６】
（態様１１）
態様１０に係わる細胞から形成されたヒトまたは動物の組織を視覚的に特徴付けるための方法において、前記信号は前記ステップｂ）で決定された前記比が値１から３０％偏差している場合に生成されることが可能であってもよい。
【０１５７】
（態様１２）
上記基本構成に係わる細胞から形成されたヒトまたは動物の組織を視覚的に特徴付けるための方法において、ａ）前記組織は波長域７２０〜８８０ｎｍまたは９８０〜１０８０ｎｍの短パルスレーザビームで照射され、ｂ）該ステップａ）による前記組織の照射に使用される電磁波の１／２の波長の戻り電磁波の強度を検出することが可能であってもよい。
【０１５８】
（態様１３）
態様１２に係わる細胞から形成されたヒトまたは動物の組織を視覚的に特徴付けるための方法において、前記電磁波はレンズを経て前記組織内に結像され、該レンズは前記放射源によって放出された前記電磁波の伝搬方向に沿って徐々に変位させられ、前記ステップａ）と前記ステップｂ）は複数のレンズポジションにつき実施され、こうして、焦点が前記組織を通って前記電磁波の伝搬方向に案内されて、複数の組織深さにつき蛍光信号が測定されることが可能であってもよい。
【０１５９】
上記で説明した実施形態の基本構成となる細胞から形成された組織を視覚的に特徴付けるための方法は、方向性を持つ電磁波を放出する放射源を設けるステップと、特徴付けられるべき組織に測定位置で前記電磁波を照射し、これにより、該組織内に該組織固有の後方散乱電磁波が励起されるステップとを有しており、前記放射源によって放出された前記電磁波は伝搬方向に対して横方向に周期的に偏向させられ、こうして、前記電磁波は前記組織の複数の細胞に及んで広がる前記測定位置の周辺組織域を周期的に走査する。さらに、上記で説明した細胞から形成された組織を視覚的に特徴付けるための方法の実施形態またはその変形例は、以下の態様１４〜２４を含む。
【０１６０】
（態様１４）
上記基本構成に係わる細胞から形成された組織を視覚的に特徴付けるための方法において、前記電磁波は前記組織内に集束させられ、前記電磁波の強度は、伝搬方向に沿って広がる焦点の周囲の焦点域に固有の反射電磁波が励起されるように選択されることが可能であってもよい。
【０１６１】
（態様１５）
態様１４に係わる細胞から形成された組織を視覚的に特徴付けるための方法において、前記固有の反射電磁波が生成される前記焦点域は前記電磁波の伝搬方向に沿って周期的に運動させられ、こうして、測定位置周囲の特定の組織体積が走査されることが可能であってもよい。
【０１６２】
（態様１６）
態様１５に係わる細胞から形成された組織を視覚的に特徴付けるための方法において、前記組織体積は前記電磁波の伝搬方向に対して横方向に２〜１０ｍｍの広がりを有することが可能であってもよい。
【０１６３】
（態様１７）
態様１５または１６に係わる細胞から形成された組織を視覚的に特徴付けるための方法において、前記組織体積は前記電磁波の伝搬方向に０．３〜４ｍｍの広がりを有することが可能であってもよい。
【０１６４】
（態様１８）
上記基本構成に係わる細胞から形成された組織を視覚的に特徴付けるための方法において、前記放射源はパルス電磁波を放出するパルス源であることが可能であってもよい。
【０１６５】
（態様１９）
態様１８に係わる細胞から形成された組織を視覚的に特徴付けるための方法において、前記パルス源は３５〜１５０ＭＨｚの範囲内のパルス繰返し周波数を有することが可能であってもよい。
【０１６６】
（態様２０）
上記基本構成に係わる細胞から形成された組織を視覚的に特徴付けるための方法において、測定位置周囲の前記周期的走査は０．５〜２ＭＨｚの繰返し周波数で実施されることが可能であってもよい。
【０１６７】
（態様２１）
上記基本構成に係わる細胞から形成された組織を視覚的に特徴付けるための方法において、前記放射源から放出した前記電磁波は、前記周期的偏向に加えて、伝搬方向に対して横方向に偏向させられ、こうして、複数の測定位置で前記組織を走査することが可能であってもよい。
【０１６８】
（態様２２）
上記基本構成に係わる細胞から形成された組織を視覚的に特徴付けるための方法において、前記放射源によって放出された電磁波は少なくとも２本の部分ビームに分割されることが可能であってもよい。
【０１６９】
（態様２３）
態様２２に係わる細胞から形成された組織を視覚的に特徴付けるための方法において、前記部分ビームは前記組織内に集束させられることが可能であってもよい。
【０１７０】
（態様２４）
態様２２または２３に係わる細胞から形成された組織を視覚的に特徴付けるための方法において、前記個々の部分ビームは別々にまたは一緒に偏向されることが可能であってもよい。
【０１７１】
上記で説明した実施形態の基本構成となるヒトまたは動物の組織を視覚的に特徴づける装置は、特徴付けられるべき組織に照射されて、該組織内に組織固有の後方散乱電磁波を励起させることのできる方向性を持つ電磁波を放出する放射源と、前記組織内に侵入して、前記電磁波の伝搬方向に対して横方向に広がった励起域内で、前記組織内に固有後方散乱電磁波を励起するのに十分な強度を有する電磁波とを有し、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法を実施するための装置であって、前記放射源によって放出された前記電磁波に、前記励起域が前記組織の複数の細胞をカバーし得るようにする強度プロフィールを付与するビーム形成手段が設けられ、前記組織の照射によって励起された前記後方散乱電磁波は細胞間組織特性に由来していることを特徴とする組織を視覚的に特徴づける。さらに、上記で説明したヒトまたは動物の組織を視覚的に特徴づける装置の実施形態またはその変形例は、以下の態様２５〜２９を含む。
【０１７２】
（態様２５）
上記基本構成に係わる組織を視覚的に特徴づける装置において、前記光ファイバは前記イメージング手段および／又は前記ビーム形成手段を有するものとしてもよい。
【０１７３】
（態様２６）
態様２５に係わる組織を視覚的に特徴づける装置において、前記イメージング手段および／または前記ビーム形成手段は前記光ファイバと一体に形成されているものとしてもよい。
【０１７４】
（態様２７）
上記基本構成に係わる組織を視覚的に特徴づける装置において、前記後方散乱電磁波を検出して、検出された該電磁波に応じて電気信号を生成する検出器を備えるものとしてもよい。
【０１７５】
（態様２８）
態様２７に係わる組織を視覚的に特徴づける装置において、前記検出器によって生成された前記電気信号を評価するための評価ユニットを備えるものとしてもよい。
【０１７６】
（態様２９）
態様２８に係わる組織を視覚的に特徴づける装置において、前記評価ユニットは前記検出器によって生成された前記電気信号をイメージ情報信号に変換し、前記イメージ情報信号を視覚表示するためのスクリーンを有するものとしてもよい。
【０１７７】
（態様３０）
上記で説明した実施形態の基本構成となる組織を視覚的に特徴づける装置は、特徴付けられるべき前記組織に照射される方向性を持つ電磁波を生成するための放射源を有する、態様１４〜２４および請求項２１のいずれかに係わる細胞から形成された組織を視覚的に特徴付けるための方法を実施するための装置であって、前記放射源によって生成された前記電磁波を偏向させるための偏向手段を備え、該偏向手段により前記電磁波を伝搬方向に対して横方向に周期的に偏向し、こうして、前記電磁波を前記組織の複数の細胞に及んで広がる前記組織域に周期的に走査するものとしてもよい。さらに、上記で説明した組織を視覚的に特徴づける装置の実施形態またはその変形例は、以下の態様３１〜３５を含む。
【０１７８】
（態様３１）
態様３０に係わる組織を視覚的に特徴づける装置において、前記偏向手段は、電場または磁場によって周期運動を行い、前記電磁波を偏向するためのミラー要素を含むものとしてもよい。
【０１７９】
（態様３２）
態様３０または３１に係わる組織を視覚的に特徴づける装置において、前記ミラー要素は前記電磁波の伝搬方向に対して横向きの第１の方向に第１の共振周波数を有し、該第１の方向ならびに前記電磁波の伝搬方向に対して垂直な第２の方向に第２の共振周波数を有するものとしてもよい。
【０１８０】
（態様３３）
上記基本構成に係わる組織を視覚的に特徴づける装置において、前記放射源はパルスレーザであるものとしてもよい。
【０１８１】
（態様３４）
態様３３に係わる組織を視覚的に特徴づける装置において、前記レーザは５００〜１０００ｎｍの範囲の波長を有する電磁波を放出するものとしてもよい。
【０１８２】
（態様３５）
態様３３または３４に係わる組織を視覚的に特徴づける装置において、前記レーザは８０フェムト秒（ｆｓ）〜８００ピコ秒（ｐｓ）の範囲のパルス幅を有するパルスを生成するものとしてもよい。
【図面の簡単な説明】
【０１８３】
【図１】本発明の第１の実施形態による、組織の視覚的特徴付けを行うための装置の概略図である。
【図２】さまざまな強度プロフィールに関する強度の変化を例示的に示す図である。
【図３】第２の実施形態による、組織の視覚的特徴付けを行うための装置の概略図である。
【図４Ａ】第３の実施形態による、組織の視覚的特徴付けを行うための装置の概略図である。
【図４Ｂ】第４の実施形態による、組織の視覚的特徴付けを行うための装置の概略図である。
【図５】第５の実施形態による、組織の視覚的特徴付けを行うための装置の概略図である。
【図６】蛍光測定の結果をグラフによって示す図である。
【図７】組織内励起された１光子蛍光強度をグラフによって示す図である。
【図８】組織内励起された２光子蛍光強度をグラフで表示する図である。
【図９】第６の実施形態による、組織の視覚的特徴付けを行うための装置を示す図である。
【符号の説明】
【０１８４】
１    組織
２    放射源
３    ビームスプリッタ  ビーム形成ユニット
５    レンズ
６    スキャナー
８    検出器
１３  評価ユニット
２０  干渉検出器
３０  光ファイバ
４０  スクリーン 
【図１】
0005619351.tif 000007
【図２】
0005619351.tif 000008
【図３】
0005619351.tif 000009
【図４Ａ】
0005619351.tif 000010
【図４Ｂ】
0005619351.tif 000011
【図５】
0005619351.tif 000012
【図６】
0005619351.tif 000013
【図７】
0005619351.tif 000014
【図８】
0005619351.tif 000015
【図９】
0005619351.tif 000016