(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．i）ＢｌｙＳ及び／又はＡＰＲＩＬに結合するＴＡＣＩ細胞外ドメイン；及び
ii）免疫グロブリン−定常ドメイン
を含んでなる、ＴＡＣＩ−免疫グロブリン（ＴＡＣＩ−Ｉｇ）融合タンパク質；
ｂ．ｐＨ4.9〜5.1の範囲で調製物を緩衝化する酢酸塩緩衝剤、
ｃ．６０〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度のトレハロース
を含む、調製物。
【請求項２】
前記酢酸塩緩衝剤が、５〜２５ｍＭの濃度である、請求項１に記載の調製物。
【請求項３】
前記酢酸塩緩衝剤が、１０ｍＭの濃度である、請求項１又は２に記載の調製物。
【請求項４】
前記酢酸塩緩衝剤が、酢酸ナトリウム緩衝剤である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の調製物。
【請求項５】
ｐＨ５．０を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の調製物。
【請求項６】
トレハロースが、８０ｍｇ／ｍｌの濃度である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の調製物。
【請求項７】
前記ＴＡＣＩ−Ｉｇ融合タンパク質を２０〜１８０ｍｇ／ｍｌの濃度で含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の調製物。
【請求項８】
前記ＴＡＣＩ−Ｉｇ融合タンパク質が、７０、７５、１００、１２５又は１５０ｍｇ／ｍｌの濃度である、請求項７に記載の調製物。
【請求項９】
前記ＴＡＣＩ細胞外ドメイン断片が、配列番号１のアミノ酸残基３４〜６６及び/又はアミノ酸残基７１〜１０４を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の調製物。
【請求項１０】
前記ＴＡＣＩ細胞外ドメイン断片が、配列番号１のアミノ酸残基３０〜１１０、又はそれに少なくとも９０％同一であるか、又は１０未満の保存的アミノ酸置換を有する変種であって、ＢｌｙＳ及び/又はＡＰＲＩＬに結合する変種を含む、請求項９に記載の調製物。
【請求項１１】
前記免疫グロブリン定常ドメインが、配列番号２の配列か、２０未満の保存的アミノ酸置換を含むその変種を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の調製物。
【請求項１２】
前記ＴＡＣＩ−Ｉｇ融合タンパク質が、配列番号３の配列、又はそれに少なくとも９０％同一であるか、又は３０未満の保存的アミノ酸置換を有する変種であって、ＢｌｙＳ及び/又はＡＰＲＩＬに結合する変種を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の調製物。
【請求項１３】
ベンジルアルコールと塩化ベンザルコニウムとの組み合わせをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に載の調製物。
【請求項１４】
前記調製物が、液状である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の調製物。
【請求項１５】
前記調製物が、多回投与用である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の調製物。
【請求項１６】
前記調製物が、
７０〜１８０ｍｇ/ｍｌの濃度のＴＡＣＩ−Ｉｇ融合タンパク質；
６０〜１００ｍｇ/ｍｌの濃度のトレハロース；及び
１０ｍＭの濃度の酢酸ナトリウムを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の調製物。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の調製物を含む、医薬組成物。
【請求項１８】
自己免疫疾患又はリンパ増殖性障害の治療において使用するための、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の調製物、又は請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記ＴＡＣＩ−Ｉｇ融合タンパク質、前記酢酸塩緩衝剤、及び６０〜１００ｍｇ/ｍｌの濃度のトレハロースを、混合し、そしてｐＨ４．９〜５．１に調節する工程を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の調製物の製造方法。
【請求項２０】
所定量の調製物を、滅菌容器に配置する工程をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記滅菌容器が、ガラスバイアル又は予備充填型シリンジから選択される、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療用タンパク質のための調製物の分野に属する。より詳細には、これは、ｐＨが4.5〜5.5の範囲の、ＴＡＣＩ−免疫グロブリン（Ｉｇ）融合タンパク質のための調製物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＢＬｙＳリガンド／受容体ファミリー
２種の増殖因子ＢＬｙＳ（Ｂリンパ球刺激因子）及びＡＰＲＩＬ（増殖誘発リガンド）に関する独自の結合親和性を有する、３種の受容体ＴＡＣＩ（膜貫通アクチベーター及びＣＡＭＬ−インターアクター）、ＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原）及びＢＡＦＦ−Ｒ（Ｂ細胞活性化因子の受容体）が同定されている（Marstersら、2000；Thompsonら、2001）。
【０００３】
ＴＡＣＩ及びＢＣＭＡは、ＢＬｙＳ及びＡＰＲＩＬの両方に結合するが、ＢＡＦＦ−Ｒは、ＢＬｙＳのみに高親和性で結合することが可能なようである（Marstersら、2000；Thompsonら、2001）。結果として、ＢＬｙＳは、３種全ての受容体を通じてシグナル伝達することができるのに対し、ＡＰＲＩＬは、ＴＡＣＩ及びＢＣＭＡのみを通じてシグナル伝達することが可能なようである。加えて、ＢＬｙＳ及びＡＰＲＩＬの循環性ヘテロ三量体型複合体（ＢＬｙＳ及びＡＰＲＩＬの各サブユニットの１個又は２個のコピーを含む、３個のタンパク質サブユニットのグループ化）が、全身性免疫−ベースのリウマチ疾患の患者から採取された血清試料中において同定され、かつインビトロにおいてＢ細胞増殖を誘導することが示されている（Roschkeら、2002）。
【０００４】
ＢＬｙＳ及びＡＰＲＩＬは、Ｂ細胞の成熟、増殖及び生存の強力な刺激因子である（Mooreら、1999；Schneiderら、1999；Doら、2000）。ＢＬｙＳ及びＡＰＲＩＬは、自己免疫疾患、特にＢ細胞に関与した疾患の持続に必要であることがある。高レベルのＢＬｙＳを発現するように操作されたトランスジェニックマウスは、免疫細胞障害を示し、かつ全身性紅斑性狼瘡患者において認められる症状に類似した症状を呈する（Grossら、2000；Mackayら、1999）。同様に増大したレベルのＢＬｙＳ／ＡＰＲＩＬが、全身性紅斑性狼瘡患者及び関節リウマチのような他の様々な自己免疫疾患の患者から採取された血清試料中で測定され（Roschke、2002；Cheemaら、2001；Groomら、2002）、ＢＬｙＳ及び／又はＡＰＲＩＬとＢ細胞媒介型疾患の関係を、動物モデルからヒトまで拡大している。ＢＬｙＳ及びＡＰＲＩＬの発現は、ＭＳ患者の末梢血単球及びＴ細胞において上方制御される（Thangarajhら、2004；Thangarajhら、2005）。ＭＳ病巣において、ＢＬｙＳ発現は、ＢＡＦＦ−Ｒを発現している免疫細胞近くに局在化された星状膠細胞上で強力に上方制御されることがわかった（Krumbholzら、2005）。
【０００５】
アタシセプト
アタシセプト（atacicept）（ＩＮＮ）は、受容体ＴＡＣＩ（膜貫通アクチベーター及びカルシウムモジュレーター及びシクロフィリンリガンド（ＣＡＭＬ）−インターアクター）の細胞外リガンド結合部分及びヒトＩｇＧの修飾されたＦｃ部分を含む、組換え融合タンパク質である。アタシセプトは、ＢＬｙＳ（Ｂリンパ球刺激因子）及びＡＰＲＩＬ（増殖誘発リガンド）に対するアンタゴニストとして作用し、これらは両方共腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーの一員である。ＢＬｙＳ及びＡＰＲＩＬは、Ｂ細胞成熟機能及び生存の重要な調節因子であることが示されている。
【０００６】
アタシセプトは、ヒトＩｇＧ１−ＦｃとＢＬｙＳ受容体ＴＡＣＩの細胞外ドメインの融合から生じる、３１３個のアミノ酸を含む可溶性糖タンパク質であり、推定質量は３５．４キロダルトン（ｋＤａ）である。この生成物の高次構造は、二量体であり、推定質量は７３．４ｋＤａである。アタシセプトは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞から、組換え技術により作製される。
【０００７】
アタシセプトにおいて、ヒトＩｇＧ１−Ｆｃは、補体Ｃ１ｑ成分へのＦｃ結合及び抗体受容体との相互作用を低下するように修飾された（Taoら、1993；Canfieldら、1991）。アタシセプトは、これらのＦｃエフェクター機能について試験されかつ確認された。
【０００８】
治療用タンパク質の調製物
アタシセプト等のＴＡＣＩ−Ｉｇ融合タンパク質は、生物製剤、すなわち、ヒト疾患の治療のため、つまりヒトへ投与のための治療用タンパク質である。治療用タンパク質の送達の成功を補助するために、調製物が開発される。治療用タンパク質に関連して頻繁に直面する問題は、例えば、タンパク質の安定性不良（多くの場合、冷蔵庫又は冷凍庫での保存が必要）、バイオアベイラビリティの不良、及び通常は非経口経路での患者に不親切な剤型等がある。
【０００９】
生物工学的生産のプロセスにおいて、治療用タンパク質は、一般的に、水溶液中で高度に精製された状態で得られる。例えば非経口送達のためにこれらのタンパク質溶液を調製する場合、当該タンパク質の安定化は重要である。したがって、タンパク質を安定化する賦形剤を選択する必要がある。溶液中で高度に精製されたタンパク質の安定性は、緩衝剤によっても影響を受ける。緩衝剤は、溶液中のタンパク質の安定性に対し、溶液のイオン強度及びｐＨの両方により影響を与える。この目的のために使用される緩衝剤の例として、リン酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩及びコハク酸塩の緩衝剤がある。
【００１０】
治療用タンパク質は、その保存期間の開始時に溶液中にあったとしても、課題は、溶液中のタンパク質を維持すること、粒子又は沈殿の形態に導く保存中の凝集を阻止すること、及び分解（例えば、加水分解、酸化、アミド分解、開裂、又は変性による）の阻止である。
【００１１】
温度も溶解性に影響する。通常は、溶解性は温度と共に向上する。しかしながら、特定の閾値超の温度で、タンパク質は部分的にアンフォールディングし、溶解性の低下又は凝集／沈殿をもたらす。
【００１２】
凝集及び分解を阻止するために、及び長期間安定な薬物を得るために、治療用タンパク質を安定化する１又は複数の賦形剤を含有する調製物の開発が必要とされる。
【００１３】
本発明は、安定且つ医薬的に許容され、ヒト疾患の治療のための治療用タンパク質として使用されるＴＡＣＩ−Ｉｇ融合タンパク質のための調製物の要請に対処する。
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、ＴＡＣＩ−Ｉｇ融合タンパク質のための安定な調製物の開発に基づく。
【００１５】
第一の態様によれば、本発明の調製物は、
ａ．i）ＢＬｙＳ及び／又はＡＰＲＩＬに結合するＴＡＣＩ細胞外ドメイン又はその断片もしくは変種；及び
ii）免疫グロブリン−定常ドメイン
を含んでなる、ＴＡＣＩ−免疫グロブリン（ＴＡＣＩ−Ｉｇ）融合タンパク質；並びに
ｂ．ｐＨ4.5〜5.5の範囲で調製物を緩衝する緩衝剤、
を含んでなる。
【００１６】
第二の態様によれば、本発明は、前記調製物を含んでなる医薬組成物に関する。
【００１７】
本発明の第三の態様は、自己免疫疾患又はリンパ増殖性障害の治療又は予防のための、本発明の調製物又は医薬組成物に関する。
【００１８】
第四の態様によれば、本発明は、ＴＡＣＩ−Ｉｇ融合タンパク質の溶液を調製するステップ、及び当該溶液のｐＨを4.5〜5.5の範囲に調整するステップを含んでなる、本発明の調製物の製造方法に関する。
【００１９】
本発明の第五の態様は、滅菌容器に、所定量の前記調製物を充填するステップを含んでなる、本発明の調製物の製造方法に関する。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、ＴＡＣＩ−免疫グロブリン（ＴＡＣＩ−Ｉｇ）融合タンパク質が長期間にわたり（例えば、３ヶ月以上、６ヶ月以上、１２ヶ月以上、１５ヶ月以上、又は１８ヶ月以上）安定である、ＴＡＣＩ−Ｉｇ融合タンパク質のための調製物の開発に基づく。
【００２１】
本発明によれば、当該調製物は、
ａ．i）ＢＬｙＳ及び／又はＡＰＲＩＬに結合するＴＡＣＩ細胞外ドメイン又はその断片もしくは変種；及び
ii）免疫グロブリン−定常ドメイン
を含んでなる、ＴＡＣＩ−免疫グロブリン（ＴＡＣＩ−Ｉｇ）融合タンパク質；並びに
ｂ．ｐＨ4.5〜5.5の範囲で調製物を緩衝する緩衝剤、
を含んでなる。
【００２２】
本発明の調製物の実施態様によれば、当該調製物のｐＨは、4.7〜5.3、及びより好ましくは4.9〜5.1の範囲である。
【００２３】
すなわち、当該調製物は、ｐＨが、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4又は5.5である。好ましい実施態様によれば、調製物のｐＨは5.0である。
【００２４】
本発明の調製物において使用される緩衝剤は、たとえば、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、又はヒスチジンの緩衝剤があり得る。当該緩衝剤は、1〜50 mM、好ましくは5〜25 mMの範囲の強度を有することができる。例えば、本発明の調製物に含まれる緩衝剤は、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45又は50 mMの強度を有することができる。
【００２５】
本発明の好ましい実施態様によれば、当該緩衝剤は酢酸塩の緩衝剤である。好ましくは、これは酢酸ナトリウム（Ｎａ−酢酸）緩衝剤である。本発明のある実施態様によれば、当該緩衝剤は、5〜25 mM、好ましくは8〜12 mM、より好ましくは10 mM付近のＮａ−酢酸緩衝剤である。
【００２６】
ある実施態様によれば、本発明の調製物は賦形剤を含んでなる。好適な賦形剤は、例えば、マンニトール、ソルビトール、グリシン又はトレハロースである。マンニトール又はソルビトールは、例えば調製物中に、30〜80、又は40〜60、又は約50又は51 mg/mLの濃度範囲で存在させることができる。グリシンは、例えば、10〜30、又は好ましくは15〜25、又は20又は21 mg/mLの濃度範囲で存在させることができる。
【００２７】
トレハロースは、２つのグルコース分子がアルファ、アルファ−１,１結合で結合する二糖類（糖）である。無水トレハロース等のトレハロースは、例えば、本発明の調製物中に、50〜120 mg/mL、又は好ましくは60〜100 mg/mLの濃度範囲で存在させることができる。例えば、当該調製物は、トレハロースを、70、75、80、85、90、95、100、105、又は110 mg/mL含むことができる。
【００２８】
本発明の調製物は、賦形剤、又はＮａＣｌ、ＣａＣｌ2、ＭｇＣｌ2等の塩を含むことができ、本発明においては、調製物は遊離塩であることが好ましい。調製物は、Ｔｗｅｅｎ２０、又は好ましくはポロキサマー（Poloxamer）１８８（Lutrol（登録商標）又はPluronic（登録商標）Ｆ６８）等の界面活性剤をさらに含むことができる。本発明の実施態様によれば、調製物は界面活性剤を含まない。
【００２９】
ある実施態様によれば、本発明の調製物は、さらに防腐剤を含んでなる。防腐剤として、ベンジルアルコールと塩化ベンザルコニウムとを組み合わせて使用することが好ましい。例えば、調製物は、ベンジルアルコールを、0.1％〜0.5％、例えば、0.2％、0.3％又は0.4％、塩化ベンザルコニウムを、0.0007％〜0.0015％、例えば、0.0008％、0.0009％、0.001％、0.0011％又は0.0012％含むことができる。非常に好ましい実施態様によれば、当該調製物は、ベンジルアルコール0.3％と塩化ベンザルコニウム0.001％とを組み合わせて含んでなる。本発明の調製物は、治療用活性化合物、すなわち、活性成分として、ＴＡＣＩ−免疫グロブリン（ＴＡＣＩ−Ｉｇ）融合タンパク質を含んでなる。当該ＴＡＣＩ−Ｉｇ融合タンパク質は、（ａ）ＢＬｙＳ及び／又はＡＰＲＩＬに結合するＴＡＣＩ細胞外ドメイン又はそれらのもしくは変種；及び、（ｂ）ヒト免疫グロブリン−定常ドメイン：を含んでなるか、又はこれらからなる。当業者は、本発明にしたがって調製されるＴＡＣＩ−Ｉｇ融合タンパク質は、抗−ＴＡＣＩ抗体ではないと解する。抗−ＴＡＣＩ抗体は、ＢＬｙＳ及び／又はＡＰＲＩＬに結合するＴＡＣＩ細胞外ドメイン、又はその変種もしくは断片を含まず、ＴＡＣＩ細胞外ドメイン由来のエピトープを指向しない。
【００３０】
本発明のフレーム内で、用語「ＴＡＣＩ細胞外ドメイン」はまた、ＴＡＣＩ細胞外ドメイン（配列番号１）と少なくとも８０％又は８５％、好ましくは少なくとも９０％又は９５％又は９９％同一である、その任意の変種のことを言う。用語「ＴＡＣＩ細胞外ドメイン」は、５０個を超えない又は４０個又は３０個又は２０個又は１０個又は５個又は３個又は２個又は１個の保存的アミノ酸置換を含む変種も含む。任意のそのような変種は、ＢＬｙＳ及び／又はＡＰＲＩＬ及び／又は任意のＢＬｙＳ−ＡＰＲＩＬヘテロ三量体に結合することができる。好ましくは、このような変種も、ＢＬｙＳ及び／又はＡＰＲＩＬ及び／又は任意のＢＬｙＳ−ＡＰＲＩＬヘテロ三量体の生物活性を阻害する。ＢＬｙＳ又はＡＰＲＩＬの生物活性は、例えばＢ細胞増殖である。
【００３１】
加えてＴＡＣＩ細胞外ドメインの断片（活性断片）及び変種は、該断片がＢＬｙＳ及び／又はＡＰＲＩＬ及び／又はＢＬｙＳ−ＡＰＲＩＬヘテロ三量体に結合することができる限りは、本発明の状況において使用することができる。好ましくはこのような断片は、ＢＬｙＳ及び／又はＡＰＲＩＬ及び／又はＢＬｙＳ−ＡＰＲＩＬヘテロ三量体の生物活性も阻害もしくは低下する。
【００３２】
任意のＴＡＣＩ細胞外ドメイン、ＴＡＣＩ−Ｉｇ融合タンパク質、又はそれらの任意の変種もしくは断片のＢＬｙＳ及び／又はＡＰＲＩＬ及び／又はＢＬｙＳ／ＡＰＲＩＬヘテロ三量体に結合する能力は、例えば下記実施例２に従い、評価することができる。ＢＬｙＳ、ＡＰＲＩＬ又はＢＬｙＳ／ＡＰＲＩＬヘテロ三量体の生物活性を阻害又は低下する能力は、例えば下記実施例３に従い、評価することができる。
【００３３】
本発明において、ＴＡＣＩ細胞外ドメインのそのような断片もしくは変種又はＴＡＣＩ−Ｉｇ融合タンパク質は、アタシセプト、すなわち配列番号３のアミノ酸配列を有するタンパク質の活性を有意に低下する生物活性を有さないことは好ましい。
【００３４】
本明細書において使用される用語「免疫グロブリン（Ｉｇ）−定常ドメイン」は、「Ｆｃドメイン」とも称され、ヒト又は動物の免疫グロブリン（Ｉｇ）に由来し、好ましくはＩｇＧである。このＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４であってよい。このＦｃドメインは、好ましくはヒンジ領域と一緒に、ＩｇＧ１の少なくともＣＨ２、ＣＨ３ドメインを含むことが好ましい。
【００３５】
好ましくは、Ｉｇ定常ドメインは、ヒトＩｇＧ１ドメインである。
ある実施態様によれば、ヒトＩｇＧ１定常ドメインは、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）及び／又は抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を低下するように、修飾されている。
【００３６】
ＡＤＣＣにおいて、抗体のＦｃドメインは、ナチュラルキラー細胞及びマクロファージなどの、免疫エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体（ＦｃγＲ）に結合し、標的化された細胞のファゴサイトーシス又は溶解につながる。ＣＤＣにおいて、これらの抗体は、細胞表面で補体カスケードの引き金を引くことにより、標的化された細胞を死滅する。ＩｇＧの活性ＦｃγＲ（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩｂ）並びに阻害ＦｃγＲ（ＦｃγＲＩＩｂ）又は補体第一成分（Ｃ１ｑ）への結合は、ヒンジ領域及びＣＨ２ドメインに位置した残基によって決まる。ＣＨ２ドメインの二つの領域は、ＦｃγＲ及び補体Ｃ１ｑ結合にとって重要であり、かつＩｇＧ２及びＩｇＧ４で独自の配列を有する。例えば、ＩｇＧ２残基の２３３−２３６位でのヒトＩｇＧ１への置換は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣを大きく低下する（Armourら、1999、及びShieldsら、2001）。EUインデックス位置（Kabatら、1991）に従い、下記Ｆｃ変異を、例えばＩｇＧ１由来のＦｃへ導入することができる：
T250Q/M428L
M252Y/S254T/T256E+H433K/N434F
E233P/L234V/L235A/ΔG236+A327G/A330S/P331S
E333A;K322A。
【００３７】
更にＦｃ変異は、例えば３３０、３３１、２３４、又は２３５、又はそれらの組合せから選択されたＥＵインデックス位置における置換であってよい。ＣＨ２ドメイン内のＥＵインデックス位置２９７でのアミノ酸置換も、本発明の状況においてＦｃドメインに導入され、Ｎ−結合型糖結合の可能性のある部位を排除する。ＥＵインデックス位置２２０のシステイン残基もセリン残基と置換され、通常免疫グロブリン軽鎖定常領域とジスルフィド結合を形成するシステイン残基を排除する。
【００３８】
本発明に従い使用されるＴＡＣＩ−Ｉｇ融合タンパク質に適した特定のＦｃドメインは、調製されている。
具体的には、修飾されたヒトＩｇＧ１  Ｆｃの６種の形が、Ｆｃ融合タンパク質の作出のために作製され、かつＦｃ−４８８、更にはＦｃ４、Ｆｃ５、Ｆｃ６、Ｆｃ７、及びＦｃ８と命名されている。Ｆｃ−４８８（配列番号４のＤＮＡ配列及び配列番号５のアミノ酸配列を有する）は、ヒトγ１  Ｆｃ領域を含む融合タンパク質の通常のクローニングのためにデザインされ、並びにこれは鋳型として野生型ヒト免疫グロブリンγ１定常領域を用いて構築された。対合していないシステイン残基に起因した可能性のある有害作用に関する懸念により、通常免疫グロブリン軽鎖定常領域とジスルフィド結合するシステインをセリン残基と置換するという決定がなされた。追加の変化は、ＥＵインデックス位置２１８をコードしているコドンへの、その後のＤＮＡ操作が容易になるようにＢｇＩＩＩ制限酵素認識部位の導入であった。これらの変化は、ＰＣＲプライマーでコードされたＰＣＲ産物に導入された。ＢｇＩＩＩ部位の位置により、及びＦｃヒンジ領域を完全にするために、ＥＵインデックス位置２１６及び２１７のコドンは、この融合タンパク質パートナー配列に取り込まれた。
【００３９】
Ｆｃ４、Ｆｃ５、及びＦｃ６は、ＦｃγＲＩ結合及び補体Ｃ１ｑ結合を低下することにより、Ｆｃにより媒介されたエフェクター機能を低下させる変異を含む。Ｆｃ４は、Ｆｃ−４８８に導入されたものと同じアミノ酸置換を含む。追加のアミノ酸置換は、可能性のあるＦｃ媒介したエフェクター機能を低下するために導入された。具体的には、ＦｃγＲＩ結合を低下するために、３つのアミノ酸置換が導入された。これらは、ＥＵインデックス位置２３４、２３５、及び２３７での置換である。これらの位置での置換は、ＦｃγＲＩへの結合を低下することが示されている（Duncanら、1988）。これらのアミノ酸置換は、ＦｃγＲＩＩａ結合に加え、ＦｃγＲＩＩＩ結合も低下させることができる（Sondermannら、2000；Winesら、2000）。
【００４０】
いくつかの基が、補体Ｃ１ｑ結合及びそれに続く補体固定におけるＥＵインデックス位置３３０及び３３１に関して説明されている（Canfield及びMorrison、1991；Taoら、1993）。これらの位置でのアミノ酸置換は、補体固定を低下するために、Ｆｃ４において導入された。Ｆｃ４のＣH3ドメインは、クローニングされたＤＮＡが大腸菌のｄａｍプラス株において増殖される場合に可能性のあるｄａｍメチル化部位を排除するために、ＴＧＡからＴＡＡへ変更された、停止コドンを除いて、対応する野生型ポリペプチドにおいて認められるものと同一である。
【００４１】
Ｆｃ５において、ＢｇＩＩＩクローニングスキームは、この特定のＦｃを含む融合タンパク質において使用されないので、ＥＵインデックス位置２１８のアルギニン残基は、リシンに戻し変異される。Ｆｃ５配列の残りは、Ｆｃ４に関する先の説明と一致する。
【００４２】
Ｆｃ６は、そのカルボキシル末端リジンコドンが排除されること以外は、Ｆｃ５と同じである。成熟免疫グロブリンのＣ−末端リシンは、Ｂ細胞から分泌される前に、翻訳後に成熟免疫グロブリンから除去されるか、又は血清循環時に除去されることが多い。結果的にこのＣ−末端リシン残基は、典型的には、一般的な抗体中には認められない。先のＦｃ４及びＦｃ５のように、Ｆｃ６配列の停止コドンは、ＴＡＡに変更される。
【００４３】
Ｆｃ７は、ＣH2ドメインに配置されたＥＵインデックス位置２９７でのアミノ酸置換以外は、野生型γ１Ｆｃと同じである。ＥＵインデックス位置Ａｓｎ−２９７は、Ｎ−結合型糖結合の位置である。Ｎ−結合型糖は、その糖構造のバッチ毎の変動の可能性のために、組換えにより発現されたタンパク質に可能性のある変動性の源を導入する。この可能性のある変動性を排除する試みにおいて、Ａｓｎ−２９７は、グルタミン残基に変異され、その残基位置でのＮ−結合型糖の結合を防止する。残基２９７の糖は、ＦｃＲＩＩＩへのＦｃ結合にも関与している（Sondermannら、Nature 406:267 （2000））。従ってこの糖の除去は、概して組換えＦｃ７を含有する融合タンパク質の、ＦｃγＲへの結合を減少するはずである。前述のように、Ｆｃ７配列中の停止コドンは、ＴＡＡに変異された。
【００４４】
Ｆｃ８は、ＥＵインデックス位置２２０のシステイン残基が、セリン残基と交換されていること以外は、配列番号４に示された野生型免疫グロブリンγ１領域と同じである。この変異は、通常免疫グロブリン軽鎖定常領域とジスルフィド結合するシステイン残基を除去する。
ＴＡＣＩ−Ｉｇ融合タンパク質の形成のためのこれらの特定されたＦｃドメインのいずれかの使用は、本発明の範囲内である。
【００４５】
ＴＡＣＩ−Ｉｇの免疫グロブリン定常ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又はＴＡＣＩ−Ｉｇ融合タンパク質の全般的生物活性に影響がなく、及びＴＡＣＩ−Ｉｇタンパク質の免疫原性が、アタシセプト（配列番号３）のそれよりも有意に高くない限りは、配列番号２のＩｇ定常ドメインと少なくとも８０％もしくは８５％、好ましくは少なくとも９０％もしくは９５％もしくは９９％同一であるそれらの変種、又は５０個未満、もしくは４０個もしくは３０個もしくは２０個もしくは１０個もしくは５個もしくは３個もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含む変種を有するポリペプチドを含んでなるか、又はこれらからなることが好ましい。
【００４６】
本発明の状況において、用語「同一性」は、これらの配列を比較することにより決定された、２つ以上のポリペプチド配列の間の関係を反映している。概して、同一性は、比較される配列の長さにわたり、２つのポリペプチド配列のそれぞれの正確なアミノ酸毎の対応をいう。
【００４７】
正確な対応のない配列に関して、「同一性％」を決定することができる。一般に比較される２つの配列は、これらの配列間の最大相関をもたらすように、並置される。これは、いずれか一方又は両方の配列へ「ギャップ」を挿入し、並置度を増大することを含むことができる。同一性％は、同じ又は非常に似た長さの配列について特に適しているように、比較される各配列の長さ全体にわたり決定されてよいか（いわゆるグローバルアラインメント）、又は等しくない長さの配列についてより適しているように、より短い規定された長さの配列について決定されてよい（いわゆるローカルアラインメント）。
【００４８】
二つ以上の配列の同一性の比較法は、当該技術分野において周知である。従って例えば、Wisconsin Sequence Analysis Package、9.1版において利用可能なプログラム（Devereux Jら、1984）、例としてプログラムBESTFIT及びGAPは、二つのポリヌクレオチド間の同一性％及び二つのポリペプチド配列間の同一性％を決定するために使用することができる。BESTFITは、Smith及びWaterman（1981）の「ローカルホモロジー」アルゴリズムを利用し、二つの配列間の類似性の最良の単独領域を発見する。配列の同一性を決定するその他のプログラムも、当該技術分野において公知であり、例えばBLASTプログラムファミリー（Altschul S Fら、1990、Altschul S Fら、1997、NCBIのホームページ（www.ncbi.nlm.nih.gov）でアクセス可能）、及びFASTA（Pearson W R、1990）などがある。
【００４９】
本発明による好ましいアミノ酸置換は、「保存的」置換として公知のものである。ＴＡＣＩの細胞外ドメイン又はＴＡＣＩ−Ｉｇ融合タンパク質の免疫グロブリン定常ドメイン部分の保存的アミノ酸置換は、群内のメンバーの置換がその分子の生物学的機能を保存するような、十分に類似した物理化学特性を有するような、群内の同義アミノ酸を含む（Grantham、1974）。先に規定された配列において、特に挿入又は欠失が、数個のアミノ酸、例えば５０個以下又は３０個以下、２０個以下、もしくは好ましくは１０個以下もしくは５個以下のアミノ酸残基にのみ関与し、例えばシステイン残基などの、機能的高次構造に重要であるアミノ酸を除去もしくは移動しない場合に、それらの機能を変更することなく、アミノ酸の挿入及び欠失も行われ得ることは明らかである。そのような欠失及び／又は挿入により生成されたタンパク質及び変種は、その生物活性が、アタシセプト（配列番号３のアミノ酸配列を有するタンパク質）の生物活性よりも有意に低くない限りは、再発性ＭＳの治療に使用することができる。
【００５０】
WO 00/40716及びWO 02/094852として公開された国際特許出願は、ＴＡＣＩの細胞外ドメインに加え、そのリガンドＢＬｙＳ及びＡＰＲＩＬと相互作用するＴＡＣＩ細胞外ドメインの特異断片の配列を開示している。
WO 00/40716等に開示されたように、ＴＡＣＩ細胞外ドメインは、ＴＡＣＩ受容体が属する腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーの一員にとって特徴的である、２個のシステイン（Ｃｙｓ）−リッチな反復配列を含む。WO 00/40716において、２番目の保存性の低いＣｙｓ−リッチ反復配列のみを含む、ＢＲ４２ｘ２と称されるＴＡＣＩのスプライシング変種は、ＢＬｙＳに結合することができることも確立されている。従って本発明のフレームにおいて、本ＴＡＣＩ細胞外ドメイン断片は、好ましくは、２番目のＣｙｓ−リッチ反復配列に相当する配列番号１のアミノ酸残基７１から１０４を少なくとも含んでなるか、又はこれらからなる。本ＴＡＣＩ−Ｉｇ融合タンパク質は、１番目のＣｙｓ−リッチ反復配列に相当する配列番号１のアミノ酸残基３４から６６を更に含んでなることは更に好ましい。
【００５１】
更なる本発明の実施態様において、ＢＬｙＳ及び／又はＡＰＲＩＬ活性に結合しかつ阻害する該ＴＡＣＩ細胞外ドメイン断片は、配列番号１のアミノ酸残基３０から１１０を含んでなるか、又はこれらからなる。
【００５２】
より更なる本発明の実施態様において、本ＴＡＣＩ−Ｉｇ融合タンパク質は、配列番号３の配列を有するポリペプチド、又はそれらと少なくとも９０％もしくは９５％もしくは９８％もしくは９９％同一であるか、又は３０個未満もしくは２０個もしくは１５個もしくは１０個もしくは５個もしくは３個もしくは２個の保存的アミノ酸置換を有するそれらの変種であって、ＢＬｙＳ及び／又はＡＰＲＩＬに結合する変種を含んでなるか、又はこれらからなる。
【００５３】
より更なる本発明の実施態様において、本ＴＡＣＩ−Ｉｇ融合タンパク質は、配列番号８の配列を有するポリペプチド、又はそれらと少なくとも９０％もしくは９５％もしくは９８％もしくは９９％同一であるか、又は３０個未満もしくは２０個もしくは１５個もしくは１０個もしくは５個もしくは３個もしくは２個の保存的アミノ酸置換を有するそれらの変種であって、ＢＬｙＳ及び／又はＡＰＲＩＬに結合する変種を含んでなるか、又はこれらからなる。
【００５４】
より更なる本発明の実施態様において、本ＴＡＣＩ−Ｉｇ融合タンパク質は、配列番号１０の配列を有するポリペプチド、又はそれらと少なくとも９０％もしくは９５％もしくは９８％もしくは９９％同一であるか、又は３０個未満もしくは２０個もしくは１５個もしくは１０個もしくは５個もしくは３個もしくは２個の保存的アミノ酸置換を有するそれらの変種であって、ＢＬｙＳ及び／又はＡＰＲＩＬに結合する変種を含んでなるか、又はこれらからなる。
【００５５】
より更なる本発明の実施態様において、本ＴＡＣＩ−Ｉｇ融合タンパク質は、配列番号１２の配列を有するポリペプチド、又はそれらと少なくとも９０％もしくは９５％もしくは９８％もしくは９９％同一であるか、又は３０個未満もしくは２０個もしくは１５個もしくは１０個もしくは５個もしくは３個もしくは２個の保存的アミノ酸置換を有するそれらの変種であって、ＢＬｙＳ及び／又はＡＰＲＩＬに結合する変種を含んでなるか、又はこれらからなる。
【００５６】
より更なる本発明の実施態様において、本ＴＡＣＩ−Ｉｇ融合タンパク質は、配列番号１４の配列を有するポリペプチド、又はそれらと少なくとも９０％もしくは９５％もしくは９８％もしくは９９％同一であるか、又は３０個未満もしくは２０個もしくは１５個もしくは１０個もしくは５個もしくは３個もしくは２個の保存的アミノ酸置換を有するそれらの変種であって、ＢＬｙＳ及び／又はＡＰＲＩＬに結合する変種を含んでなるか、又はこれらからなる。
【００５７】
本発明の別の実施態様によれば、調製物は、ＴＡＣＩ−Ｉｇ融合タンパク質を、20 mg/mL〜180 mg/mLの濃度範囲で、例えば、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175 mg/mLの濃度で含む。
【００５８】
本発明のさらなる実施態様によれば、調製物は液状（例えば、水溶液）である。
【００５９】
よりさらなる実施態様によれば、本発明の調製物は、反復投与のためのものである。反復投与においては、防腐剤を含むことが好ましい。上記の通り、好ましい実施態様によれば、調製物はベンジルアルコール（例えば0.3％で）、及び塩化ベンザルコニウム（例えば0.001％で）を含んでなる。
【００６０】
ＴＡＣＩ−Ｉｇ融合タンパク質調製物は、毎日又は１日おきに、好ましくは１週間に２回又は１回投与してもよい。好ましくは、ＴＡＣＩ−Ｉｇの投与は、１週間に１回のボーラス投与である。あるいは、調製物は、１週間おきか、１月に１回投与することもできる。
【００６１】
本発明の調製物は、静脈内、皮下、又は筋肉内等の経路のためとすることができる。本発明の実施態様によれば、調製物は皮下投与のためのものである。
【００６２】
本発明の調製物は、疾患の治療、好ましくはヒト疾患の治療を意図するものである。したがって、ある実施態様によれば、本発明の調製物は、医薬組成物として提示される。ＴＡＣＩ−Ｉｇ融合タンパク質を含んでなる調製物又は医薬組成物は、好ましくは、自己免疫疾患又はリンパ増殖性障害の治療、又は治療のための医薬の製造に適する。
【００６３】
本発明において、自己免疫疾患には、限定するものではないが、例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、リウマチ性関節炎、多発性硬化症又は視神経炎がある。
【００６４】
リンパ増殖性障害は、リンパ系の細胞が過剰に増殖する疾患である。Ｂ細胞悪性腫瘍は、例えば、リンパ増殖性障害である。Ｂ細胞悪性腫瘍には、限定するものではないが、白血病及びリンパ腫、例えば急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄芽球白血病、前骨隋球白血病、骨髄単核白血病、単核赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性（顆粒球）白血病、慢性リンパ性白血病、真性赤血球増加症、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、及びヴァンデルストレーム・マクログロブリン血症がある。
【００６５】
本発明は、好ましくは溶液（例えば水溶液）中で、（ａ）〜（ｃ）の成分を調製する（例えば混合することにより）ステップを含んでなる、本発明による調製物の製造又は調製方法にも関する。
【００６６】
本発明は、所定量の調製物を滅菌容器に入れるステップを含んでなる、本発明の調製物の製造又は調製方法にも関する。所定量は、0.5〜5 mL、好ましくは1〜2 mLとすることができる。
【００６７】
本発明の実施態様によれば、容器は、ガラスバイアル又は予備充填型シリンジから選択される。ガラスバイアルは、例えば未被覆ストッパー又は被覆ストッパーを用いて閉鎖することができる。当該ストッパーは、例えばゴム製ストッパー、又はブロモブチル・ストッパーとすることができる。予備充填型シリンジ等のシリンジは、ゴム製プランジャー又は被覆プランジャーで栓をすることができる。当該被覆は、例えばシリコン油未含有被覆があり得る。
【００６８】
予備充填型シリンジは、0.5、1、1.5又は2 mL等の異なる容量であってよい。好ましくは、１mLシリンジである。シリンジの充填容量は、好ましくは1又は1.2 mLである。予備充填型シリンジは、プラスチック製、又は好ましくはガラスシリンジとすることができる。好ましいガラスシリンジは、例えば、１mL ハイパック（Hypac）ガラスシリンジ27G1/2 RNG W 7974/50G（Becton Dickinson製）である。充填型シリンジは、好ましくは被覆ストッパー（例えばBecton Dickinson、FluroTec製）及び未被覆プランジャー（例えば、W4023/50G、West Pharmaceutical製）で栓をすることができる。本発明によれば、充填型シリンジは、好ましくはＴＡＣＩ−Ｉｇ融合タンパク質の量を、薬物量で20〜160 mgの範囲、例えば、20、25、50、75、100、125又は150 mgとして含む。以下の実施例４に示すように、ｐＨ5.0の、酢酸ナトリウム緩衝剤及びトレハロースを含んでなるＴＡＣＩ−Ｉｇ融合タンパク質の調製物は、５又は25℃を維持した場合、長期間にわたって、例えば１８ヶ月まで安定であった。
【００６９】
本出願において特定された様々な範囲の数値の使用は、特に明確に記さない限りは、記載された範囲内の最小値及び最大値は両方とも語句「約」に優先するように、近似値として記載される。この様式で、記載された範囲を上回る及び下回るわずかな変動を使用し、該範囲内の数値と実質的に同じ結果を実現することができる。同じく明らかにされた範囲は、言及された最小値と最大値の間の全ての値に加え、それらにより形成可能である任意の範囲を含む、連続した範囲であることが意図されている。
【００７０】
本発明に関して、本発明の調製物又は医薬組成物は、ＴＡＣＩ−Ｉｇ融合タンパク質に加え、さらなる活性成分との組み合わせを含むことができ、当該組み合わせで投与できる。例えば、コルチコステロイド、特にメチルプレドニゾロンを存在させてもよい。さらに、インターフェロン−β、クラドリビン、ミトキサントロン、酢酸グラチラマー、ナタリズマブ、リツキシマブ、テリフルノミド、フィンゴリモド、ラキニモド、又はＢＧ−１２（経口フマル酸塩）による治療などと組合せることができる。この組合せ治療は、同時、個別又は逐次であることができる。
【００７１】
ここで本発明を完全に説明する上で、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、かつ過度の実験を行うことなく、広範な同等のパラメータ、濃度及び条件で、同じ事を実行することができることは、当業者には明らかであろう。
【００７２】
本発明は、それらの具体的実施態様に結びつけて説明されているが、更なる修飾が可能であることは理解されるであろう。本出願は、概して本発明の原理に従い、かつ本発明が属する技術分野において公知の又は慣習的実践となるような、並びに添付された「特許請求の範囲」に従い先に示された本質的特徴に適用されるような、本発明の開示からのそのような逸脱を含む、本発明のあらゆる変化、使用又は適応を対象とすることが意図されている。
【００７３】
雑誌論文又は要約、公開又は非公開の米国もしくは外国の特許出願、発行された米国もしくは外国の特許又は任意の他の参考文献を含む、本明細書に引用された参考文献は全て、引用された参考文献内に示されたデータ、表、図面及び本文を含む全体が参照により本明細書中に組み込まれている。加えて、本明細書に引用された参考文献内に引用された参考文献の全内容も、全面的に参照により組込まれている。
【００７４】
公知の方法の段階、通常の方法の段階、公知の方法又は通常の方法の言及は、いかなる意味においても、本発明のいずれかの態様、説明又は実施態様が、関連技術分野において明らかにされ、教示され又は示唆されることの承認ではない。
【００７５】
先の具体的実施態様の説明は、他者が、過度の実験をすることなく、本発明の全般的概念から逸脱することなく、そのような具体的実施態様の様々な適用に関して、当業者の知識（本明細書に引用された参考文献の内容を含む）の適用により、容易に修飾及び／又は適合することができる、本発明の全般的性質を完全に明らかにするであろう。従って、そのような適応及び修飾は、本明細書に示された教示及び指針を基に、明らかにされた実施態様の一連の同等物の範囲内であることが意図されている。ここでの表現及び用語は、説明を目的とし、限定を目的とせず、その結果本明細書の用語又は表現は、当業者の知識と組合せて、ここで示された教示及び指針を鑑み当業者により理解されるべきであることも理解されるべきである。
【００７６】
ここで本発明を説明する上で本発明は、例証として提供され、本発明の限定を意図するものではない、以下の例証的臨床試験の概略の実施例を参照しより容易に理解されるであろう。
【００７７】
実施例１：液体調製物の開発
用語集
ＡＵＣ：分析超遠心
ＣＤ：円偏光二色性
ＤＬＳ：動的光散乱
ＤＳＣ：示差走査熱量計
ＩＥＣ：イオン交換クロマトグラフィ
ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ：マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析計
ＯＤ：光学密度
ＲＡＬＳ：直角光散乱
ＲＰ：逆相
ＳＥＣ：サイズ排除クロマトグラフィ
【００７８】
原料
−ｐＨ６のリン酸緩衝液＋140 mM ＮａＣｌ中のＴＡＣＩ−Ｆｃ薬物物質
−ｐＨ５のリン酸緩衝液中のＴＡＣＩ−Ｆｃ薬物物質
−ｐＨの酢酸緩衝液中のＴＡＣＩ−Ｆｃ薬物物質
−オルトリン酸（1.00563、Merck）
−コハク酸（1.00682、Merck）
−クエン酸（1.59134、Merck）
−ヒスチジン（1.04351 、Merck）
−氷酢酸１００％（1.00063、Merck）；
−Ｄ−マンニトールＤＡＢ、Ｐｈ Ｅｕｒ、ＢＰ、ＵＳＰ、ＦＣＣ、Ｅ４２１（1.05980、Merck）
−Ｄ−ソルビトール（S-1876、Sigma）
−スクロースＤＡＢ、Ｐｈ Ｅｕｒ、ＢＰ、ＮＦ （1.07653、Merck）
−トレハロース（1.08216、Merck）
−Ｄ−グルコース１水和物（346971 、Carlo Erba）
−水酸化ナトリウムペレットＧＲ（1.06498、Merck）
−合成用Ｔｗｅｅｎ２０8.22184、Merck）；
−ポロキサマー１８８（Lutrol F 68 DAC、USP/NF、Basf）
−塩化カルシウム２水和物（1.02382、Merck）
−塩化マグネシウム（1.05833、Merck）
−塩化ナトリウム（1.06404、Merck）
−アルギニン塩酸塩（A-5131 、Sigma）;
−リジン塩酸塩（1.0571 、Merck）
−グリシン（5.00190、Merck）;
−アセトニトリル（00030、Merck）
−１０×ＰＢＳ（P/N 70013-032、Gibco）
−トリフルオロ酢酸（9470、Baker）
−硫酸アンモニウム（1.01217、Merck）
−１Ｎ 水酸化ナトリウム（1.09137、Merck）
−１Ｎ 塩酸（1.09057、Merck）
−ＨＰＬＣ級水（MiIIiQ）
−注射用水
−無水硫酸ナトリウム（code 6649、Merck）
−メタノール（code 06009、Merck）
−アジ化ナトリウム（code 6688、Merck）
−リン酸二水素ナトリウム１水和物（code 06346、Merck）
−リン酸水素二ナトリウム２水和物（code 06580、Merck） 
【００７９】
バイオアッセイ用
−Jurkat pKZ142 clone.24細胞（WCB）
−TACI-Fc5（1-8.66 mg/mL）
−zTNF4（1.44 mg/mL）
−RPMI 1640フェノールレッド含有及び未含有（Gibco）
−ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（GIBCO）
−Ｌ−グルタミン（Hyclone）
−ピルビン酸ナトリウム（Gibco）プロマイシン（Sigma）
−固定ＧＬＯルシフェラーゼアッセイ緩衝液及び基質（ProMega. E2510） White tissue culture 96 well plates with lids （Dynex）
−カバー付９６ウェルプレート（Falcon）
−5 mlポリプロピレン管（Falcon）
【００８０】
装置
−ＨＰＬＣシステム（Waters）
−校正ピペット（Gilson）
−示差走査熱量計（mod. 2920、TA Instruments）
−マイクロ熱量計（mod. VP-DSC、MicroCal）
−ｐＨメーター（mod. 713、Metrohm）
−浸透圧計（Osmomat 030-D、Gonotec）
−分光旋光計J−810、温度のペルチェ制御装置PTC-423S付き（Jasco）
−蛍光分光計FluoroMax3、マイクロプレートリーダーMicroMax384付き（Jobin Yvon）
−９６ウェルMaxSorpプレート（Nunc）
−分光光度計lambda 354（Perkin-Elmer）
−水晶キュベット 0.1及び1 cm路程（Perkin Elmer）
−ゼータサイザー・ナノシリーズ（Zetasizer Nano Series）（Malvern）
−低量用（Reduced volume)（〜70μL）水晶キュベット
−細胞核酸システム（Stirred Cell system）（mod. 8400 or 8450、Amicon）
−10 kDa カットオフ膜（type YM10、Amicon）
ステンレス鋼ホルダー22 mL及び220 mL容量（Sartorius）
−フィルター膜 0.22 μm（Durapore type GWVP、Millipore）
−フィルター膜 0.45 μm（Durapore type HVLP、Millipore）
−蛍光/ＲＡＬＳ分光計（Photon Technology International）
−IKA-Vibrax-VXR shaker （IKA-Works、Inc.）
−凍結乾燥機（Lyoflex 06、Lyoflex 08、Edwards）
−ボルテックス（FaIc）
−恒温キャビネット（Heraeus）
−冷凍庫（Angelantoni）
【００８１】
バイオアッセイ用
−照度計プレートリーダー、Lumicount Packard
−グラフ・パッド・プリズム・ソフトウェア
−薄板フローフード（Laminar Flow Hood）（Flow Laboratories）
−３７℃及びＣＯ2インキュベーター（Heraeus）
−３７℃の水浴
−細胞計数器
−顕微鏡
−振とう盤（Shaking Platform）
−卓上遠心器
−校正シングル−及びマルチ−チャネルピペット及びピペットチップ
−ピペットエイド
【００８２】
−DIN2R （3 mL）ガラスバイアル（Nuova OMPI）
−Flurotec ゴム製ストッパー（S2F452、D777-1、B2-40、West Pharmaceutical）
−ゴム製ストッパー（1779 W1816 grey、Pharmagummi）
【００８３】
方法
サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）
方法１
サンプルをＰＢＳ１×ｐＨ＝7.2で0.5 mg/mLまで希釈し、40μL（20μg）を、ＴＳＫゲルG3000SWXL、5μm、7.8×300 mmにロードした。全てのランについて、溶離液は、0.05 Mリン酸ナトリウム、0.5 M硫酸アンモニウム、ｐＨ＝6.0とした。
【００８４】
方法２
サンプルを移動相で0.25 mg/mLまで希釈し、40μL（20μg）を、ＴＳＫゲルSAXLガードカラム6 mm×4 cmを連結した、ＴＳＫゲルG3000SWXL、5μm、7.8×300 mmにロードした。全てのランについて、溶離液は、0.05 Mリン酸ナトリウム、0.5 M硫酸アンモニウム、ｐＨ＝6.0とした。
【００８５】
逆相クロマトグラフィ（ＲＰ）
サンプルをＰＢＳ１×ｐＨ＝7.2で0.5 mg/mLまで希釈し、40μL（20μg）を、71％の緩衝液Ａ（0.1％ＴＦＡ添加水）、及び29％緩衝液Ｂ（0.1％ＴＦＡ添加アセトニトリル）で平衡化した、PLRP 4000 Aカラム、 8 μm, 50×4.6 mmにロードした。サンプルを、流速2 mL/分の直線グラジエントを用いて溶出した。異なる量の標準（IRS TACI-Fc5 2002/2001）を注入することにより、キャリブレーション曲線を作成した。
【００８６】
Ｃ末端開裂（ＲＰ）
サンプルを、37℃２時間、酵素的分解（Ｌｙｓ−Ｃ）に供し、ガードカラム付のVydac C18 （4.6×50 mm）カラムで逆相クロマトグラフィを行った。
溶離液Ａ：0.1％ＴＦＡ添加水
Ｂ：0.08％ＴＦＡ添加ＣＨ3ＣＮ７０％
流速：１mL/分
Ｔ.：40±5℃
検出：214nm
溶出グラジエント：７分間でＢが15％〜23％、全部で15分。
【００８７】
短縮形態（ＲＰ）
ＴＡＣＩ−Ｆｃ薬物製品サンプルを、タンパク質濃度が4 mg/mLとなるよう、精製水で希釈した。その後、10μLの希釈サンプルを、200μLの変性還元溶液中（グアニジン 6 M中、0.15 MＤＴＴ）で希釈し、ボルテックスし、最後に60℃±2℃で90分インキュベートする。開始条件（71％溶離液Ａ、0.05％トリフルオロ酢酸添加水、及び29％溶離液Ｂ、0.04％トリフルオロ酢酸添加アセトニトリル）で事前に平衡化したカラム（広孔ブチル、5mm、4.6 mm i.d.×50 mm、cod. 71 16-05、J. T. Baker製）に、75〜150μL（15〜30μg）を注入する。
【００８８】
遊離Ｆｃ二量体（ＩＥＣ）
ＴＡＣＩ−Ｆｃ薬物製品サンプルを、タンパク質濃度10 mg/mLとするために、10 mMリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ4.0中の、100 mg/mLのポロキサマー188溶液中で希釈した。ＴＡＣＩ−Ｆｃ濃度が100 mg/mLより高い場合、計量によりサンプルの希釈を行うべきである。
【００８９】
開始条件（80％溶離液Ａ、10 mMリン酸ナトリウムｐＨ4.0、及び20％溶離液Ｂ、10 mMリン酸ナトリウムｐＨ4.0＋0.5 MＫＣｌ）で事前に平衡化したカラム（ProPac WCX-10G （ガード）、4×50 mm、cod. 054994、Dionex製）に、25μL（250μg）を注入する。
【００９０】
酸化状態（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ）
ＴＡＣＩ−Ｆｃ薬物サンプルのペプチドマッピングを行い、酸化状態の定量についての、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ検出の利用可能性を確認した。
【００９１】
分析超遠心
12mmの光路長を有する2チャンネル・チャコール−エポン・センターピースを用いて、細胞にサンプルをロードした。ＨＰＬＣ試験の条件を模倣するように、サンプルを、希釈剤としてＳＥ−ＨＰＬＣ溶離緩衝液を用いて希釈した。対応する緩衝液を、参照チャネルにロードした（当該装置は、デュアルビーム分光光度計のように機能する）。その後、ロードした細胞を、Beckman Optima XL-I分析超遠心のAN-50Ti分析用ローターに入れた。以下の試験設定に従って、この分析を行った。
ローター種類：８穴ローター
ローター速度：40Ｋ rpm
センターピース：チャコール−エポン
チャネル長：12 mm
ＡＵＣランの間の温度：20℃±0.2℃
検出波長：280 nm
サンプル濃度：0.5 mg/mL
サンプル容量：432 mL/チャネル
参照容量：442 mＬ/チャネル。
【００９２】
データは、Ｎ.Ｉ.Ｈ.でPeter Schuckにより開発されたｃ（ｓ）の方法を用いて分析され、彼の分析プログラムSEDFIT（第8.7版）で実行された。
【００９３】
示差走査熱量計（ＤＳＣ）
TA Instrument製のDSC 2920 CE：Ｔ範囲＝25〜100℃；加熱速度＝2℃／分；高容量パン（ＨＶＰ）に75μLの溶液を充填した；マイクロ熱量計、MicroCal VP-DSC：Ｔ範囲＝25〜100℃；加熱速度＝70℃／時間；応答＝15秒；データピッチ＝0.2〜8℃；サンプル細胞に、約600 mLの5 mg/mLのＴａｃｉ−Ｆｃ５溶液を充填した；参照溶液として水を使用した。
【００９４】
光学密度（ＯＤ）
0.5 mg/mLのＴＡＣＩ−Ｆｃ溶液を調製し（水での希釈により）、その濃度（ｃ）を、ランベルト・ベールの等式により得た：ＯＤ＝εｂｃ（ε＝モル吸光係数；ｂ＝光学細胞厚み）、ε（280 nm）＝1.56（mL/mg）。出発溶液の濃度を、希釈係数により計算されたこれらの値を乗じることにより決定した。
【００９５】
円偏光二色性（ＣＤ）
コンフォメーション解析
ＣＤは、一般的にペプチド及びタンパク質のコンフォメーションを研究するために使用される。遠紫外線（180〜250 nm）、及び近紫外線領域（250〜350 nm）の両方において、複数の因子が、ＣＤスペクトルにおける特徴的ピークの出現に影響を及ぼす可能性があり、例えば、タンパク質濃度、温度、ｐＨ及びイオン強度がある。遠紫外線で観察される一般的なバンド位置は文献で報告されており、特定の二次構造の種類を表す（α−ヘリックス、β−シート、ランダムコイル）。近紫外線領域で観察されるＣＤバンドは、主に、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ及びジスルフィド結合によるものである。
【００９６】
しかしながら、ジスルフィド結合からのシグナルは、一般的に芳香族アミノ酸のものより非常に弱いことを指摘しなければならない。これらの残基が非対称環境にある限り、ＣＤシグナルが提供され得る。タンパク質の３次構造におけるコンフォメーション変化は、通常出発環境の変動をもたらすため、ＣＤスペクトルを変化させる。実際、天然のタンパク質においては、個々のアミノ酸が３次元構造内で独自の位置を占める。この構造における変更は、その近接性に変化をもたらすことができるはずである。
【００９７】
近紫外線ＣＤスペクトルの設定
スキャン速度＝５〜20 nm/分；範囲＝250〜350 nm；応答＝８秒；濃度＝2 mg/mL；路程＝1cm；データピッチ＝0.5 nm；バンド幅＝1nm；積算＝2。標準的感度。スペクトルは室温で得た。
【００９８】
遠紫外線ＣＤスペクトルの設定
スキャン速度＝５〜20 nm/分；範囲＝200〜300 nm；応答＝８秒；濃度＝0.25 mg/mL；路程＝0.1cm；データピッチ＝0.5 nm；バンド幅＝1nm；積算＝2。標準的感度。スペクトルは室温で得た。
【００９９】
アンフォールディング温度
固定波長でのＣＤにより観測される温度スキャンは、異なる温度での、タンパク質の２次及び３次構造の両方を調べる価値ある手法である。当該測定により、異なる形態における、タンパク質のアンフォールディング温度（Ｔunf）を評価することが可能となる。Ｔunfは、タンパク質のアンフォールディングの自由エネルギー（タンパク質の安定性の指標である）と直接的な関係を有するわけではないが、Ｔunfの任意の増加は、タンパク質安定性の増加に比例するはずであることが、広く認められている。したがって、Ｔｍの変化は、特定の組成物が任意の安定化又は不安定化効果を有するかを示唆する。熱的変性は、温度と共にタンパク質コンフォメーション変化に関連するＴｒｐ（トリプトファン）のシグナル変動を観測することにより調べた。当該薬物物質調製物を、55〜70℃の範囲で、加熱した（1℃／分）。３次構造に対する温度の効果を、292.5 nmでの最小に対するＣＤ楕円率の変化により検出した。遷移温度を計算するために、第四級多項式フィッティングを使用した。
【０１００】
ＣＤ温度スキャン設定
Ｔ範囲＝55〜70℃；加熱速度＝1℃／分；λ＝292.5 nm；濃度＝2 mg/mL；応答＝8秒；データピッチ＝0.2〜8℃；バンド幅＝1.5 nm。標準的感度。攪拌速度＝低い。
【０１０１】
動的光散乱（ＤＬＳ）
動的光散乱は、粒子のブラウン運動により誘導される散乱を測定し、それを粒子サイズと関連付ける。これは、粒子をレーザービームにさらし、散乱光の強度ゆらぎを解析することが必要となる。より正確には、ブラウン運動により動く粒子のスピードを、粒子の大きさと関連付ける（ストークス−アインシュタイン等式）。デジタル式相関器が、２つのシグナル（この場合、強度シグナル）間の類似度を経時で測定し、それが、粒子の直径に関連する散乱強度ゆらぎの性質及び程度に関連する情報を与える。相関関数の決定後、それをサイズ分布の計算に用いることができる。
【０１０２】
ゼータサイザー・ナノシリーズは、180°付近（後方散乱）の散乱強度を測定する。当該立体配置は、サンプルを通る多重散乱の影響と、大きな夾雑物の影響を低減する。ディスポーザブル・サイズ測定キュベット（内部容量〜70μL）を使用した。測定は、Ｔ＝25℃で行った。平衡化時間＝１分；ラン回数＝１１；ラン間隔＝１０秒；測定回数＝２。分散剤：水（粘度＝0.8872 cP；屈折率＝1.330）。希釈は行わなかった。
【０１０３】
蛍光を用いる直角光散乱（ＲＡＬＳ）
ＲＡＬＳは、蛍光検出器を用いて測定され、ここで励起及び発光波長は同一に設定されている。この立体配置において、当該蛍光検出器は、非常に感度の高いＲＡＬＳ検出器となる。ＲＡＬＳの増加は、サンプルにおける凝集／沈殿の指標である。
【０１０４】
蛍光
内在蛍光
タンパク質は、内在蛍光に寄与する可能性のある３つの芳香族アミノ酸残基（トリプトファン：Ｔｒｐ；チロシン：Ｔｙｒ；フェニルアラニン：Ｐｈｅ）を含有する。フォールディングしたタンパク質の蛍光は、個々の芳香族残基由来の蛍光の組み合わせである。タンパク質蛍光は、一般的に、280 nm以上の波長、通常は295 nmで励起される。ほとんどの発光は、トリプトファン残基の励起により、チロシン及びフェニルアラニンによる発光はわずかである。トリプトファン最大蛍光発光の強度、量子収量及び波長は、非常に溶媒依存性である。トリプトファン残基を取り巻く溶媒の極性の減少により、蛍光スペクトルが低波長側へのシフトし、蛍光強度が増加する。タンパク質の疎水性中心に埋め込まれているトリプトファン残基は、タンパク質表面のトリプトファンと比較して、10〜20 nmシフトする。さらにトリプトファン蛍光を、近傍のプロトン化された、Ａｓｐ又はＧｌｕ等の酸性基により消光させることができる。すなわち、蛍光は、芳香族残基が存在する微小環境における変動を反映する、強力な観測用ツールとして使用することができる。
【０１０５】
MicroMax 384は、最大384ウェルを有するプレートを使用できる、FluoroMax蛍光分光計と接続することができる、マイクロウェルプレートリーダーである。励起及び発光の単色光分光器からの光は、MicroMax 384と行き来する光ファイバー束を介して運搬される。すなわち、使用者は、強度測定について、主要な蛍光分光計でスキャンしても、任意の励起及び発光波長の対を選択してもよい。MicroMax 384は、DataMaxソフトウェアを通して全て自動化制御されており；プレート上のマイクロウェルのカスタム選択は、ソフトウェアを介して行うことができる。
【０１０６】
ハイスループット蛍光スキャンは、MicroMax 384プレートリーダーを用い、以下の設定で行った。励起及び発光スリット＝5 nm；λexc＝280 nm；発光範囲＝300〜450 nm；積算時間＝0.1秒。希釈は行わなかった。最大発光波長は、Fluromax 3ソフトウェアにより自動的に計算された。
【０１０７】
ＲＡＬＳ
ＲＡＬＳの測定は、FluoroMax蛍光分光計で、500〜800 nmの範囲で同期スキャン（λexc＝λem）することによって行われる。これらの条件下（サンプルによる吸収はなく、光源による影響もない）、暴露強度は、主に溶液中に存在する散乱現象による（入射光／タンパク質）。総散乱強度は、タンパク質容量（dimension）の増加と共に増加するため、この補法は、凝集、サブユニット解離、分解等の事象の発生を観測するのに有用である。
【０１０８】
散乱強度は、タンパク質濃度及び屈折率にも影響するので、同じタンパク質濃度での比較測定を行う必要がある。
【０１０９】
ＲＡＬＳ測定は、以下のパラメータ設定で行った：同期スキャン；波長範囲＝500〜800 nm；スリット＝15 nm；積算時間＝0.5秒；補正＝0 nm；サンプル濃度＝35 mg/mL（milliQ水を希釈剤として使用した）。
【０１１０】
蛍光発光の異方性
微小分子の回転は、そのサイズ、形及び局所環境（すなわち溶媒）に依存する。極性化発光測定は、分子サイズの小変化（凝集、結合、開裂）及び環境変化（局所粘度、相転移等）を検出するためによく使用される。これらの測定における第一のステップは、フルオロフォアの選択群（光選択）の励起である。垂直極性化光は、典型的には、その吸収双極子が垂直方向に向く、分子群を励起するために使用する。この相において、垂直極性化励起光は、経路上での励起の際に、偏光子を用いて作製される。励起されると、当該分子は、励起状態の寿命の間（〜10-9秒）回転する可能性がある。当該化合物移転は、蛍光発光を脱分極することになる。当該分極化発光成分の測定により、分子の回転運動の種類及び程度の計算をすることができる。蛍光発光の分極化成分は、発光経路における偏光子を用いて測定する。垂直（Ｖ）及び水平（Ｈ）の発光成分の大きさから、回転挙動の程度及び種類を計算できる。異方性（Ａ）は、総光強度で除した、直線分極化成分の強度の間の差異として定義される比率である。
【０１１１】
【数１】
0005469077.tif 000002
【０１１２】
式中、
Ｇは、補正因子、Ｇ＝ＩHV／IHHである。
【０１１３】
これらの等式において、強度Ｉの最初の下付文字は、励起偏光子の位置（Ｈ又はＶ）を示し、第二は、発光偏光子のもの（Ｈ又はＶ）を示す。蛍光異方性は、励起波長をλ＝295 nmに設定する場合、Ｔｒｐ残基の運動性、及びそれらが受ける局所粘度に関する情報を提供する。すなわち、蛍光異方性の増加は、タンパク質におけるこれらの残基のより厳密な環境を反映することができる。
【０１１４】
異方性測定は、以下のパラメータを設定することにより行った：λexc＝295 nm；発光範囲＝330〜350 nm；積算時間＝0.5秒；スリット＝15 nm；サンプル濃度＝35 mg/mL（希釈剤としてmilliQ水を用いた）。
【０１１５】
バイオアッセイ
ＴＡＣＩ−Ｆｃインビトロバイオアッセイは、Jurkat（ヒト急性Ｔ細胞リンパ球）形質移入細胞（Jurkat pKZ142）に基づく。この細胞系列は、２つのプラスミドを形質移入されている。第一のプラスミドは、ＣＭＶプロモーターの制御下の全長ＴＡＣＩ ｃＤＮＡ、そして第二のプラスミドは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を駆動するＮＦ−ｋＢ／ＡＰ−１をコードする。この方法は、ｚＴＮＦ４が細胞表面ＴＡＣＩレポーターに結合し、シグナル伝達カスケードを誘因し、形質移入したＮＦ−ｋＢ／ＡＰ−１ルシフェラーゼレポーター遺伝子を刺激する能力に基づく。可溶性ＴＡＣＩ−Ｆｃの存在は、ＴＡＣＩ受容体の結合によるｘＴＮＦ４を阻害し、ルシフェラーゼ発現を低下させる。
【０１１６】
Jurkat pKZ142細胞を、全体の用量−応答曲線（27.86〜1.63 U/mL）を作製するためのＴＡＣＩ−Ｆｃ標準品、及び標準曲線の直線部分に位置する２つの濃度で試験するサンプル（すなわち、４及び６U/mL）とインキュベートした。
【０１１７】
その後、標準曲線及びサンプルの両方に、ｚＴＮＦ溶液を、ルシフェラーゼの準最大産生を誘導できる濃度比率（すなわち、150 ng/mLウェル）で添加する。最小及び最大ルシフェラーゼ産生もコントロールとして行う。
【０１１８】
37℃（５％ ＣＯ2）で４時間インキュベーション後、細胞を、ルシフェラーゼ固定化Ｇｌｏキット（luciferase Steady GIo kit）と共に添加し、ルシフェラーゼ発光を照度計により検出する。
【０１１９】
サンプルの有効性を、標準用量−応答曲線の直線部分上の２つの試験濃度について、Ｙ値（ＲＬＵ）を挿入することにより計算し、ｘ軸上のＴＡＣＩ−Ｆｃの濃度を求める（グラフパッドソフトウェア）。この独立したアッセイの２つの濃度の値は、平均化され、その後、ＴＡＣＩ−Ｆｃ５生物活性を、各々の独立したアッセイから得られる有効性の算術平均を行うことにより計算する。
【０１２０】
予備調製プロセス
ｐＨ、緩衝剤種類、及び賦形剤のタンパク質安定性への影響を評価した。70又は100 mg/mLの濃度でＴＡＣＩ−Ｆｃの溶液を調製し、以下の変数について予備的に調べた。
−ｐＨ（４、５、６、７）
−緩衝剤（酢酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、ヒスチジン）
−糖（マンニトール、ソルビトール、グルコース、スクロース、トレハロース）
−賦形剤（塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、グリシン）
【０１２１】
これに加え、ＴＡＣＩ−Ｆｃ５、70 mg/mLに対して、さらに以下の予備スクリーニング試験を行った。
−凍結−融解（Ｆ−Ｔ）サイクル（１、３、５回のＦ−Ｔ）、20 mM緩衝液中（ヒスチジン、リン酸塩、コハク酸、クエン酸）ｐＨ５−６−７。
−40℃でのインキュベーション（振とう及び非振とう条件）
−２〜８℃での保存、20 mM緩衝液中（酢酸塩、ヒスチジン、リン酸塩）ｐＨ５−６−７。
【０１２２】
これらの第一の観察から得られる結果に基づき、２つの緩衝剤（リン酸及びヒスチジン）、ｐＨ５及び６を選択し、第二セットの調製物を調製し、追加の安定化剤の含有の影響を調べた（残存オスモル濃度0.280 OSMで）。以下の安定化剤を試験した：グルコース、マンニトール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、グリシン、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ2、ＣａＣｌ2。
【０１２３】
溶液を、２〜８℃、25℃及び40℃に保存し、凝集（ＳＥ−ＨＰＬＣ）、タンパク質含量（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、ｐＨ及び外観について最大14日間試験した。
【０１２４】
実験計画
予備的期間の間になされた選択に基づき、実験計画を設定し、タンパク質安定性に関する異なるレベルでの事前に調べられた因子の影響を評価した。酢酸塩及びヒスチジン緩衝液中の調製物を、以下の界面活性剤：ポロキサマー188（Lutrol（登録商標） F-68）及びＴｗｅｅｎ２０ｐと共に、及び以下の賦形剤：アルギニン、グリシン、リジン、マンニトール及びトレハロースと共に試験した。これらの調製物をガラスバイアル中、２〜８℃、25℃及び40℃で保存し、凝集（ＳＥ−ＨＰＬＣ及びＡＵＣにより）、ｐＨ、外観及びオスモル濃度について試験した。生物物理学的解析手法（例えば、円偏光二色性、第二ＵＶ微分分光法、内因性蛍光等）も適用した。
【０１２５】
候補調製物
予備調製期間の終わりに、いくつかの候補調製物が確認され、それらは、70又は100 mg/mLいずれかのＴＡＣＩ−Ｆｃ、10 mM酢酸緩衝液、賦形剤としてマンニトール（51 mg/mL）又は無水トレハロース（80又は96 mg/mL）、ポロキサマー188（Lutrol（登録商標） F-68）（0.05 mg/mL）含有又は未含有のいずれか、を含む調製物であった。ｐＨ値は、4.8、5.0、5.2及び5.4で試験した。
【０１２６】
全ての溶液を、0.22μm Durapore膜を通して滅菌状態で濾過し、滅菌容器に回収した。その後、当該溶液をＤＩＮ２Ｒガラスバイアル（１mL充填容量）に充填した。プロセスの途中のサンプル（濾過前後）を、製造している間に採取し、タンパク質の損失又は凝集の増加を評価した。
【０１２７】
サンプルを、２〜８℃、25℃及び40℃で保存し、１ヶ月（40℃）及び６ヶ月（２〜８℃及び25℃）まで試験した。
【０１２８】
候補調製物を、凝集（ＳＥ−ＨＰＬＣ、ＡＵＣ）、タンパク質含量（ＳＥ−ＨＰＬＣ）、ｐＨ、オスモル濃度及び生物活性について試験した。Ｃ末端開裂の程度及び開裂／短縮状態の割合も検出した。生物物理学的方法（内因性蛍光、動的光散乱、90°光散乱）も適用した。
【０１２９】
凍結−融解の影響も、２〜８℃で保存した候補調製物の液体サンプルで評価した。当該サンプルを、−80℃で凍結させ、その後、室温で融解させた。凍結−融解前後の行終了をＳＥ−ＨＰＬＣにより評価した。
【０１３０】
薬物製品の輸送を模擬実験するために24時間振とうの影響を、２〜８℃保存サンプルについて評価し、24時間室温で、マイクロプレート振とう機上の振とう条件に置いた。凝集レベルは、初期のレベルに対する値を、ＳＥ−ＨＰＬＣで評価した。
【０１３１】
結果
10 mM Ｎａ−酢酸中の候補化合物
【０１３２】
【表１】
0005469077.tif 000003
【０１３３】
詳細な結果を、以下の表Ａ〜Ｔで報告する。
【０１３４】
【表２】
0005469077.tif 000004
【０１３５】
【表３】
0005469077.tif 000005
【０１３６】
【表４】
0005469077.tif 000006
【０１３７】
【表５】
0005469077.tif 000007
【０１３８】
【表６】
0005469077.tif 000008
【０１３９】
【表７】
0005469077.tif 000009
【０１４０】
【表８】
0005469077.tif 000010
【０１４１】
【表９】
0005469077.tif 000011
【０１４２】
【表１０】
0005469077.tif 000012
【０１４３】
【表１１】
0005469077.tif 000013
【０１４４】
【表１２】
0005469077.tif 000014
【０１４５】
【表１３】
0005469077.tif 000015
【０１４６】
【表１４】
0005469077.tif 000016
【０１４７】
【表１５】
0005469077.tif 000017
【０１４８】
【表１６】
0005469077.tif 000018
【０１４９】
【表１７】
0005469077.tif 000019
【０１５０】
【表１８】
0005469077.tif 000020
【０１５１】
【表１９】
0005469077.tif 000021
【０１５２】
【表２０】
0005469077.tif 000022
【０１５３】
【表２１】
0005469077.tif 000023
【０１５４】
主要な結果の要約
サイズ排除クロマトグラフィ
25℃では、70 mg/mLの調製物は、一般的に100 mg/mLのものよりも、凝集の比率（凝集／月（％））に関して緩やかな傾きを示した。後者の群においては、調製物２１Ｄ及び２１Ｅが、最も緩やかな傾きを示すものであった。40℃では、調製物２１Ｅが、100 mg/mL液体調製物の群において最も緩やかな値の傾きを呈した。
【０１５５】
ＡＵＣ
ＡＵＣプロファイルは、調製物２１Ｅについて２〜８℃及び25℃では、変化は観察されなかった。安定時間にわたるモノマー増加傾向が、70 mg/mL調製物について検出された。
【０１５６】
ＣＤで観測されたアンフォールディング
100 mg/mL調製物の群においては、２１Ｅが、最も高いＴunfを示すものであった。5.0以外のｐＨ値は、より低いＴunfをもたらした（すなわち、より高い安定性）。
【０１５７】
内因性蛍光
40℃では、最大発光波長における少数の変動が、70 mg/mL、及び100 mg/mL候補では２１Ｅで検出された。
【０１５８】
ＲＡＬＳ
40℃で保存後、「最適な」ｐＨ5以外のｐＨでは、ＲＡＬＳが顕著に増加する。マンニトールを含む調製物の散乱は、他のものよりもかなり高かった。調製物２１Ａ、２１Ｂ、２１Ｄ及び２１Ｅは、より低い値の散乱を示した。２〜８℃で保存後、これらは全く散乱光の増加を示さなかった。
【０１５９】
蛍光発光の異方性
調製物２１Ａ及び２１Ｂについて、40℃で（１ヶ月）保存後、異方性の変動は観察されなかった。調製物２１Ｆ及び２１Ｈについて、明らかな変動があった。他のものについては、中間の変動が観察された。
【０１６０】
動的光散乱
２〜８℃では、サイズ分布の明らかな変動は検出されなかった。25℃での保存後、より大きな種においていくらかの減少％が観察された。40℃で保存後、マンニトール含有のものと、ｐＨが5.0以外のものの両方を除く全ての調製物について、高分子量の種は、劇的に増加しなかった。
【０１６１】
アンフォールディングの自由エネルギー
100 mg/mLの群において、調製物２１Ｄ及び２１Ｅについて、より高い熱力学的安定性が観察された。
【０１６２】
バイオアッセイ
25℃及び40℃で３ヶ月にわたって、生物活性の減少は観察されなかった。
【０１６３】
全体的結論
液体調製物の予備スクリーニング研究は、70 mg/mLのＴＡＣＩ−Ｆｃ５溶液の安定性について最適なｐＨがｐＨ5付近であることが示されている。ｐＨが高くなればなるほど、凝集現象（ＳＥ−ＨＰＬＣにより評価）及び濃度低下の発生（ＲＰ−ＨＰＬＣ及び最適密度から推定）がより強かった。塩（ＮａＣｌ、ＣａＣｌ2及びＭｇＣｌ2等）の存在は、同様に凝集体の増加をもたらした。ｐＨが5未満の値も最適ではなく、異なる緩衝液において、ｐＨ＝5.0と比較した4.0での、円偏光二色性でのコンフォメーション研究によっても示される通りである。予備的なＤＳＣ実験は、トレハロース及びスクロースが分子の安定性にいくらかの正の影響をもたらすことを示した（すなわち、より高いアンフォールディング温度）。
【０１６４】
この実験計画の段階では、Lutrol（登録商標）F-68及びＴｗｅｅｎ２０等の界面活性剤の存在下、ｐＨ=5.0の酢酸又はヒスチジン緩衝剤（異なる緩衝剤強度も同様に試験した）に溶解させた複数の賦形剤の効果を調べる目的であった。マンニトール又はトレハロースの存在下、低濃度の酢酸緩衝液は、サンプルに、分解に対しより高い安定性を提供する。Lutrol（登録商標）F-68は、タンパク質の安定化において、Ｔｗｅｅｎ２０よりもより有効であるようである。
【０１６５】
蛍光及び動的光散乱試験は、当該結果と一致した。
【０１６６】
70及び100 mg/mLのＴＡＣＩ−Ｆｃ濃度の研究室スケールで、候補サンプルを製造した。トレハロース及びマンニトールを賦形剤として使用した（酢酸ナトリウム緩衝液の存在下、ｐＨ＝4.8、5.0、5.2及び5.4）。経時での候補物の発生（evolution）を、複数の分光的手法と共に、ＳＥ−ＨＰＬＣ及びＡＵＣにより観測した。
【０１６７】
この研究から、より低濃度のタンパク質は、より少量の凝集体をもたらすことがわかった。最適ｐＨ値は5.0であることを確認した。ＴＡＣＩ−Ｆｃ調製物安定化は、マンニトールよりもトレハロースが成功した。100 mg/mLのＴＡＣＩ−Ｆｃ候補の群においては、調製物２１Ｅ（10 mM酢酸ナトリウム、ｐＨ＝5.0、80 mg/mLの無水トレハロース）が、40℃での凝集に対して、より強い耐性を呈した（２〜８℃では、統計的に有意な凝集体の増加は検出されなかった）。より正確には、２〜８℃で、液体候補２１Ｅが、26週で、その純度が1.4％上昇した。25℃では、純度は、1％だけ減少した（26週）。
【０１６８】
候補２１Ｅの全ての短縮形態（２〜８℃及び25℃で１０ヶ月）を、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析により決定した。出発バルク物質（約19％）と比較して、短縮形態の濃度の変動は発生しなかった。Ｃ末端開裂は、約95％であることがわかり、初期バルクにおけるものと同じであった。この開裂のレベルは、ヒト抗体で通常観察される。
【０１６９】
酸化状態のレベルも、液体候補２１Ｅについて、ＲＰ−ＭＡＬＤＩ分析により確認された（２〜８℃及び25℃で１０ヶ月保存したもの）。それの元となるバルク薬物物質と比較すると、保存で酸化の顕著な増加は観察されなかった（約2.4％）。
【０１７０】
実施例２：ＴＡＣＩ−Ｆｃの静菌剤との適合性
目的：
本研究の目的は、反復投与調製物の観点から、異なる静菌剤とＴＡＣＩ−Ｆｃとの適合性を評価することであった。以下の静菌剤を試験した。ベンジルアルコール0.9％；ｍ−クレゾール0.3％；フェノール0.5％；クロロブタノール0.5％；フェニルエタノール0.5％；ベンジルアルコール0.3％＋塩化ベンザルコニウム0.001％。
【０１７１】
主な結果
薬物物質＋静菌剤：
−40℃で２週間保存後、参照サンプル（静菌剤無添加）と比較して、防腐剤の存在下での薬物物質に対して、総凝集体の増加（15〜70％）が観察された（ＳＥＣによる）。同様の分解速度が、25℃及び２〜８℃で観察された。
−（ＳＥＣ及びＣＤ分析により）負の影響が最小であることが判明した静菌剤は、ベンジルアルコール＋塩化ベンザルコニウムの混合物であった。
【０１７２】
液体候補物＋静菌剤：
−ＴＡＣＩ−Ｆｃ液体候補物（酢酸、ｐＨ5、トレハロース）への防腐剤の添加により、薬物物質で観察されたものより、それほど顕著でない凝集体の増加がもたらされた（約10〜25％、40℃で２週間後）。これは、凝集の阻止及び負の二次構造の低減（遠紫外線ＣＤ実験により証明される）に、トレハロースが有効であることを実証する。
−ベンジルアルコール＋塩化ベンザルコニウムの連携は、防腐剤の存在下の調製物群の中で、凝集体について、最良の結果を提供した。
【０１７３】
結論
タンパク質の完全性に与える複数の静菌剤の影響を、ＴＡＣＩ−Ｆｃ薬物物質（未処理バルク）、及びＮａ−酢酸及びトレハロースｐＨ5中、100 mg/mLで調製した調製ＴＡＣＩ−Ｆｃで評価した。
【０１７４】
いずれの静菌剤の含有も、未処理バルク薬物物質に対し、特にタンパク質完全性に負の影響を与えた。0.3％ベンジルアルコール＋0.001％塩化ベンザルコニウムの連携は、タンパク質構造に対して、最も害が少ないことが判明した。
【０１７５】
実施例３：予備充填型シリンジにおけるＴＡＣＩ−Ｆｃ液体候補物の安定性
目的：
本研究の目的は、ＴＡＣＩ−Ｆｃの液体調製物（Ｎａ−酢酸、トレハロース、ｐＨ5）を、100 mg/mLで1mLのHypakシリンジに充填し、当該シリンジを２種類のゴム製プランジャー（W4023/50及びW4023/50G FluroTec）で栓をしたものの安定性を評価することであった。
【０１７６】
主な結果
−被覆（W4023/50G FluroTec）及び未被覆（W4023/50G）プランジャーで栓をした1mLのガラスシリンジに充填した、100 mg/mLのＴＡＣＩ−Ｆｃについて、６ヶ月まで試験した結果は、以下の通りに要約できる。
【０１７７】
−二量体及びＨＭＷ：40℃（1.6％増加／週）及び25℃（0.5％増加／月）で、分解速度は同程度であった。２〜８℃ではわずかに異なる挙動が観察されたが、全体的な安定性に顕著に影響するものではなく、２つの異なる製造バッチについて、0.2％及び0.1％増加／月であった。
−タンパク質含量：保存で、タンパク質含量の減少は観察されなかった。
−短縮形態：短縮形態において、測定値対バイアル中の物質は同程度であった（約40℃及び25℃で５ヶ月後の薬物物質と比較して、２〜８℃では増加しない）。
−生物有効性：生物活性を、３ヶ月保持した（２〜８℃及び25℃）。
−ｐＨ：保存で、ｐＨ移動は観察されなかった。
【０１７８】
結論
1 mLのHypakシリンジに100 mg/mLで充填したＴＡＣＩ−Ｆｃ液体調製物（酢酸緩衝液、ｐＨ5＋トレハロース）は安定であった。この試験において評価された２種類のゴム製プランジャー（W4023/50及びW4023/50G FluroTec）は、同等であり、液体調製物の安定性に影響はなかった。
【０１７９】
実施例４：予備充填型シリンジにおける異なる強度でのアタシセプト安定性
予備充填型シリンジにおける異なる強度でのアタシセプトの安定性を評価した。方法論は、実施例１に記載した通りに行った。
【０１８０】
試験化合物の組成は以下の通りである。
【０１８１】
【表２２】
0005469077.tif 000024
【０１８２】
安定性試験から得た結果を、以下の表Ｕ〜Ｚで報告する。
【０１８３】
【表２３】
0005469077.tif 000025
【０１８４】
【表２４】
0005469077.tif 000026
【０１８５】
【表２５】
0005469077.tif 000027
【０１８６】
【表２６】
0005469077.tif 000028
【０１８７】
【表２７】
0005469077.tif 000029
【０１８８】
【表２８】
0005469077.tif 000030
【０１８９】
【表２９】
0005469077.tif 000031
【０１９０】
【表３０】
0005469077.tif 000032
【０１９１】
【表３１】
0005469077.tif 000033
【０１９２】
【表３２】
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【０１９３】
【表３３】
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【０１９４】
【表３４】
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【０１９５】
【表３５】
0005469077.tif 000037
【０１９６】
実施例５：Ｂｌｙｓアンタゴニストの作製
４種のＴＡＣＩ−Ｆｃアミノ末端切断型が作製された。４種全て、配列番号６のアミノ酸残基番号３０に融合された、WO 02/094852に開示されたような修飾されたヒト組織プラスミノーゲン活性化因子シグナル配列（配列番号２５）を有する。しかし、これら４種のタンパク質は、「Ｆｃ５」が配列番号６のＴＡＣＩアミノ酸配列に融合される点の位置が異なる。表１は、４種の融合タンパク質の構造を概説している。
【０１９７】
【表３６】
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【０１９８】
タンパク質をコードしている発現カセットは、標準技術を用いる、オーバーラップＰＣＲにより作製した（例えば、Hortonら、1989参照）。ＴＡＣＩをコードしている核酸分子及びＦｃ５をコードしている核酸分子を、ＰＣＲ鋳型として使用する。オリゴヌクレオチドプライマーは、表２及び３で確認される。
【０１９９】
【表３７】
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【０２００】
【表３８】
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【０２０１】
ＰＣＲ増幅の第一ラウンドは、４種のアミノ末端切断型の各々に関する２反応からなった。これらの２反応は、各型に関して１つの反応において５’及び３’ＴＡＣＩオリゴヌクレオチドを用い、並びに別の反応において５’及び３’  Ｆｃ５オリゴヌクレオチドを用い、個別に行った。第一ラウンドのＰＣＲ増幅の条件は、以下であった。最終容積２５μｌに、鋳型ＤＮＡ約２００ｎｇ、１０×Ｐｆｕ反応緩衝液（Stratagene社）２．５μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰを２μｌ、２０μＭの各５’オリゴヌクレオチド及び３’オリゴヌクレオチドを０．５μｌ、並びにＰｆｕポリメラーゼ０．５μｌ（２．５単位、Stratagene社）を添加した。増幅の熱プロファイルは、９４℃で３分間；９４℃で１５秒間、５０℃で１５秒間、７２℃で２分間を３５サイクル；その後７２℃で２分間の伸長からなる。この反応生成物は、アガロースゲル電気泳動により分画し、かつ予想されるサイズに対応するバンドをゲルから切り出し、QIAGEN QIAQUICKゲル抽出キット（Qiagen社）を製造業者の指示に従い使用し、回収した。
【０２０２】
ＰＣＲ増幅の第二ラウンド、又はオーバーラップＰＣＲ増幅反応は、ＤＮＡ鋳型として、第一ラウンドＰＣＲ由来のゲルで精製された断片を用いて行った。第二ラウンドＰＣＲ増幅の条件は、以下であった。最終容積２５μｌに、ＴＡＣＩ断片及びＦｃ５断片の各々の鋳型ＤＮＡ約１０ｎｇ、１０×Ｐｆｕ反応緩衝液（Stratagene社）２．５μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰを２μｌ、２０μＭのＺＣ２４，９０３（配列番号１５）及びＺＣ２４，９４６（配列番号１８）を各々０．５μｌ、並びにＰｆｕポリメラーゼ０．５μｌ（２．５単位、Stratagene社）を添加した。増幅の熱プロファイルは、９４℃で１分間；９４℃で１５秒間、５５℃で１５秒間、７２℃で２分間を３５サイクル；その後７２℃で２分間の伸長からなる。この反応生成物は、アガロースゲル電気泳動により分画し、かつ予想されるサイズに対応するバンドをゲルから切り出し、QIAGEN QIAQUICKゲル抽出キット（Qiagen社）を製造業者の指示に従い使用し、回収した。
【０２０３】
４種の型のアミノ末端切断型ＴＡＣＩ−Ｆｃ  ＰＣＲ産物の各々は、Invitrogen社のZEROBLUNT TOPO PCRクローニングキットを製造業者の推奨プロトコールに従い用い、個別にクローニングした。表４で、これらのＴＡＣＩ−Ｆｃ構築体のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を確認する。
【０２０４】
【表３９】
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【０２０５】
これらのヌクレオチド配列を確認した後、アミノ末端切断型ＴＡＣＩ−Ｆｃ融合体の４つの型の各々を含むプラスミドを、ＦｓｅＩ及びＡｓｃＩで消化し、このアミノ酸コードしているセグメントを放出した。ＦｓｅＩ−ＡｓｃＩ断片を、ＣＭＶプロモーター及びＳＶ４０ポリＡセグメントを含む、哺乳類発現ベクターにライゲーションした。発現ベクターは、以下に説明されたようにチャイニーズハムスター卵巣細胞に導入した。
【０２０６】
実施例６：チャイニーズハムスター卵巣細胞によるＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質の生成
前記ＴＡＣＩ−Ｆｃ発現構築体を使用し、電気穿孔法により、動物タンパク質−非含有培地において増殖した懸濁−適合されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）ＤＧ４４細胞を、形質移入した（Urlaubら、1986）。ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞は、両方のジヒドロ葉酸レダクターゼ染色体座における欠失のために、機能的ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を欠いている。漸増濃度のメトトレキサート存在下での細胞の増殖は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子の増幅を生じ、かつ本発現構築体上に連結された組換えタンパク質−コードされた遺伝子を生じた。
【０２０７】
ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞は、ＰＦＣＨＯ培地（JRH Biosciences社, Lenexa, KS）、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン（JRH Biosciences社）、及び１×ヒポサンキシン（hypothanxine）−チミジン補充物（Life Technologies社）中で継代し、これらの細胞を、回転振盪プラットフォーム上で、１２０ＲＰＭで、コーニング振盪フラスコ内、３７℃及び５％ＣＯ2でインキュベーションした。これらの細胞は、直線化された発現プラスミドにより個別に形質移入した。無菌性を確実にするために、１回のエタノール沈殿工程を、エッペンドルフチューブ内のプラスミドＤＮＡの２００μｇを、剪断サケ精子担体ＤＮＡ（5'→3' Inc. ボールダー, CO, １０ｍｇ／ｍｌ）２０μｌ、３Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）の２２μｌ、及び１００％エタノール（Gold Shield Chemical社, Hayward, CA）４８４μｌと混合することにより、氷上で２５分間かけて行った。インキュベーション後、このチューブを、４℃のコールドルームに配置された微量遠心機において、１４，０００ＲＰＭで遠心し、上清を除去し、ペレットを７０％エタノール０．５ｍｌで２回洗浄し、風乾させた。
【０２０８】
このＤＮＡペレットが乾燥する間に、２５ｍｌコニカル遠心チューブ中で１０6個の総細胞（１６．５ｍｌ）を９００ＲＰＭで５分間遠心することにより、ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞を調製した。ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞を、総容積３００μｌのＰＦＣＨＯ増殖培地に再度懸濁し、０．４ｃｍの電極ギャップ（Bio-Rad社）を備えるGene-Pulserキュベット内に配置した。およそ５０分間の乾燥時間の後、前記ＤＮＡを、ＰＦＣＨＯ増殖培地５００μｌに再度懸濁し、総容積は８００μｌを超えないよう、キュベット中の細胞に添加し、これを室温で５分間静置し、泡の発生を鎮めた。このキュベットを、BioRad Gene Pulser IIユニットセットに０．２９６ｋＶ（キロボルト）及び０．９５０ＨＣ（高キャパシタンス）で配置し、直ちに電気穿孔した。
【０２０９】
これらの細胞を、室温で５分間インキュベーションし、その後CoStar T-75フラスコ中の総容積２０ｍｌのＰＦＣＨＯ培地中に配置した。このフラスコを、３７℃及び５％ＣＯ2に４８時間配置し、次にこれらの細胞は、トリパンブルー色素排除法を利用し、血球計によりカウントし、ヒポサンキシン−チミジン補充物を含まないが２００ｍＭメトトレキサートを含有するＰＦＣＨＯ選択培地（Cal Biochem社）に入れた。
メトトレキサート選択プロセスの回収時に、分泌されたＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質を含有する馴化培地を、ウェスタンブロット分析により試験した。
【０２１０】
【表４０】
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【０２１１】
【表４１】
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【配列表】
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