(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のいずれか１つから選択される組合せを含む、癌の治療に用いるための医薬品であって、癌の治療において同時、順次、又は別々に使用するための組合せ製剤としての前記医薬品。
（ｉ）トラスツズマブと、ロスコビチン又は薬学的に許容されるその塩との組合せ；
（ii）ＡＧ１４７８と、（ａ）ロスコビチン、（ｂ）３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−２−メチル−ペンタン−２−オール、（ｃ）３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−ペンタン−２−オール、及び（ｄ）（２Ｒ，３Ｓ−３−（６−（（４，６−ジメチルピリジン−３−イルメチルアミノ）−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ）ペンタン−２−オールから選択されるＣＤＫ阻害剤又は薬学的に許容されるその塩との組合せ；
（iii）エルロチニブと、（ａ）ロスコビチン、（ｂ）３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−２−メチル−ペンタン−２−オール、（ｃ）３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−ペンタン−２−オール、及び（ｄ）（２Ｒ，３Ｓ−３−（６−（（４，６−ジメチルピリジン−３−イルメチルアミノ）−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ）ペンタン−２−オールから選択されるＣＤＫ阻害剤又は薬学的に許容されるその塩との組合せ；
（iv）ゲフィチニブと、（ａ）ロスコビチン、（ｂ）３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−２−メチル−ペンタン−２−オール、（ｃ）３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−ペンタン−２−オール、及び（ｄ）（２Ｒ，３Ｓ−３−（６−（（４，６−ジメチルピリジン−３−イルメチルアミノ）−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ）ペンタン−２−オールから選択されるＣＤＫ阻害剤又は薬学的に許容されるその塩との組合せ；
（v）ラパチニブと、（ａ）ロスコビチン、（ｂ）３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−２−メチル−ペンタン−２−オール、（ｃ）３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−ペンタン−２−オール、及び（ｄ）（２Ｒ，３Ｓ−３−（６−（（４，６−ジメチルピリジン−３−イルメチルアミノ）−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ）ペンタン−２−オールから選択されるＣＤＫ阻害剤又は薬学的に許容されるその塩との組合せ；
【請求項２】
ＣＤＫ阻害剤がＲ−ロスコビチンである、請求項１に記載の医薬品。
【請求項３】
薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物の形態での、請求項１又は２に記載の医薬品。
【請求項４】
癌が、肺癌、頭部又は頸部癌、卵巣癌及び乳癌から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の医薬品。
【請求項５】
肺癌が非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、請求項４に記載の医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌及び他の増殖性障害の治療に適した医薬の組合せに関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテインキナーゼは、本質的な細胞過程の重要な調節因子であり、これらは、異なる活性部位を含むことによって化合物の結合を可能にするので、キナーゼは、抗癌剤発見にとって魅力的な分野である［Dancey, J. and E.A. Sausville, Issues and progress with protein kinase inhibitors for cancer treatment. Nature Reviews Drug Discovery, 2003. 2: p. 296-313］。しかし、最初の標的プロテインキナーゼ阻害剤が、認可された癌化学療法剤となったのは、ＢＣＲ−ＡＢＬを標的にするイマチニブの臨床開発に成功してからであった［Kantarjian, H., et al., Hematologic and Cytogenetic Responses to Imatinib Mesylate in Chronic Myelogenous Leukemia. N EnglJ Med, 2002. 346(9): p. 645-652］。現在、プロテインキナーゼは、抗癌剤発見にとって非常に活発な分野であり、多くのプロテインキナーゼファミリーが、薬剤開発プログラムの中心となっている。そのような発見プログラムは、腫瘍発生の間に調節が解除される、シグナル伝達経路を標的にすることが多い。
【０００３】
ＥｒｂＢファミリーのメンバーは、多くの他の成長因子受容体と同様に、リガンドが刺激されると二量体化し、その細胞質チロシンキナーゼドメインを通じて自己リン酸化する。活性化されると、ＥｒｂＢキナーゼは、ＥＲＫ及びＰＫＢを含めたいくつかの細胞プロテインキナーゼを介してそのシグナルを伝達することによって、最終的にサイクリンＤ１レベルの上方制御をもたらし、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ、cyclin dependent kinase）を活性化し、細胞増殖を開始させる［Harari, D. and Y. Yarden, Molecular mechanisms underlying ErbB2/HER2 action in breast cancer. Oncogene., 2000. 19(53): p. 6102-14］。乳癌患者の最大３０％における、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）の過剰発現を含めた、いくつかの異なるヒト癌において、ＥｒｂＢ受容体チロシンキナーゼシグナル伝達の過剰刺激が立証されているが［Slamon, D.J., et al., Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science., 1987. 235(4785): p. 177-82］、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１）は、卵巣癌（３５〜６０％）、頭頸部腫瘍（７０〜１００％）及び非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ、non-small cell lung cancer；５０〜９０％）において過剰発現する［Tortora, G. and F. Ciardiello, Anti-epidermal growth factor receptor drugs in cancer therapy. Expert Opinion on Investigational Drugs, 2002. 11(6): p. 755-768、Salomon, D.S., et al., Epidermal growth factor-related peptides and their receptors in human malignancies. Crit Rev Oncol Hematol., 1995. 19(3): p. 183-232］。ＥｒｂＢファミリーを標的にする薬剤を開発するために、２つの主な手法が探求されている。トラスツズマブ及びセツキシマブなどのヒト化モノクローナル抗体は、それぞれ、ＨＥＲ２及びＥＧＦ受容体に結合し、それによって受容体の二量体化／活性化を遮断し、これらのタンパク質の細胞表面からの除去を促進する［Harari, D. and Y. Yarden, Molecular mechanisms underlying ErbB2/HER2 action in breast cancer. Oncogene., 2000. 19(53): p. 6102-14］。対照的に、エルロチニブ及びゲフィチニブは、ＥＧＦＲのＡＴＰ結合活性部位に直接結合する小分子であり、チロシンキナーゼ活性を遮断する［Silvestri, G.A. and M.P. Rivera, Targeted Therapy for the Treatment of Advanced Non-small Cell Lung Cancer: A Review of the Epidermal Growth Factor Receptor Antagonists 10.1378/chest.128.6.3975. Chest, 2005. 128(6): p. 3975-3984］。これらの作用剤のそれぞれについて、その後の分裂促進シグナル伝達の喪失により、細胞増殖が停止する。
【０００４】
ＣＤＫは、薬剤発見の展望から、相当量の興味を集めている第２のキナーゼファミリーであり、３つの最も進歩した化合物、セリシクリブ（ＣＹＣ２０２、Ｒ−ロスコビチン）、アルボシジブ（フラボピリドール）及びＳＮＳ−０３２（以前はＢＭＳ−３８７０３２）は、すべて現在、フェーズII臨床開発にある［Shapiro, G.I., Cyclin-dependent kinase pathways as targets for cancer treatment. J Clin Oncol., 2006. 24(11): p. 1770-83、Senderowicz, A.M., Small-molecule cyclin-dependent kinase modulators. Oncogene, 2003. 22: p. 6609-6620］。細胞周期チェックポイントの調節に関与するタンパク質をリン酸化するというその重要な役割を通じて、ＣＤＫは、細胞分裂周期の規則的進行を制御する［Shapiro, G.I., Cyclin-dependent kinase pathways as targets for cancer treatment. J Clin Oncol., 2006. 24(11): p. 1770-83］。癌細胞では、同族パートナーであるサイクリンの過剰発現又はｐ１６などの内因性阻害剤の喪失によるＣＤＫの活性化により、特定の細胞周期チェックポイントで、通常停止され、修復又は誘発されることによってアポトーシスを起こす細胞が不適切に増殖する。［Shapiro, G.I. and J.W. Harper, Anticancer drug targets: cell cycle and checkpoint control. Journal of Clinical Investigation, 1999. 104(12): p. 1645-1653］。細胞周期を制御することに加えて、ＣＤＫ７及びＣＤＫ９などのいくつかのＣＤＫは、ＲＮＡポリメラーゼIIのカルボキシ末端ドメインをリン酸化することによって転写を調節する。セリシクリブ、アルボシジブ及びＳＮＳ−０３２はすべてＣＤＫ７及び／又は９を阻害し、それによって転写を阻害し、それぞれ約３時間及び３０分の短い半減期を有する、Ｍｃｌ−１及びサイクリンＤ１［MacCallum, D.E., et al., Seliciclib (CYC202, R-Roscovitine) Induces Cell Death in Multiple Myeloma Cells by Inhibition of RNA Polymerase II-Dependent Transcription and Down-regulation of Mcl-1. Cancer Res, 2005. 65(12): p. 5399-5407、Whittaker, S.R., et al., The Cyclin-dependent kinase inhibitor CYC202 (R-roscovitine) inhibits retinoblastoma protein phosphorylation, causes loss of Cyclin D1, and activates the mitogen-activated protein kinase pathway. Cancer Research, 2004. 64(1): p. 262-272］などのタンパク質を下方制御する［Schubert, K.M. and V. Duronio, Distinct roles for extracellular-signal-regulated protein kinase (ERK) mitogen-activated protein kinases and phosphatidylinositol 3-kinase in the regulation of Mcl-1 synthesis. Biochemical journal, 2001. 356: p. 473-480、Carlson, B., et al., Down-regulation of cyclin D1 by transcriptional repression in MCF-7 human breast carcinoma cells induced by flavopiridol. Cancer Res., 1999. 59(18): p. 4634-41］。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Dancey, J. and E.A. Sausville, Issues and progress with protein kinase inhibitors for cancer treatment. Nature Reviews Drug Discovery, 2003. 2: p. 296-313
【非特許文献２】Kantarjian, H., et al., Hematologic and Cytogenetic Responses to Imatinib Mesylate in Chronic Myelogenous Leukemia. N Engl J Med, 2002. 346(9): p. 645-652
【非特許文献３】Harari, D. and Y. Yarden, Molecular mechanisms underlying ErbB2/HER2 action in breast cancer. Oncogene., 2000. 19(53): p. 6102-14
【非特許文献４】Slamon, D.J., et al., Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science., 1987. 235(4785): p. 177-82
【非特許文献５】Tortora, G. and F. Ciardiello, Anti-epidermal growth factor receptor drugs in cancer therapy. Expert Opinion on Investigational Drugs, 2002. 11(6): p. 755-768
【非特許文献６】Salomon, D.S., et al., Epidermal growth factor-related peptides and their receptors in human malignancies. Crit Rev Oncol Hematol., 1995. 19(3): p. 183-232
【非特許文献７】Silvestri, G.A. and M.P. Rivera, Targeted Therapy for the Treatment of Advanced Non-small Cell Lung Cancer: A Review of the Epidermal Growth Factor Receptor Antagonists 10.1378/chest.128.6.3975. Chest, 2005. 128(6): p. 3975-3984
【非特許文献８】Shapiro, G.I., Cyclin-dependent kinase pathways as targets for cancer treatment. J Clin Oncol., 2006. 24(11): p. 1770-83
【非特許文献９】Senderowicz, A.M., Small-molecule cyclin-dependent kinase modulators. Oncogene, 2003. 22: p. 6609-6620
【非特許文献１０】Shapiro, G.I. and J.W. Harper, Anticancer drug targets: cell cycle and checkpoint control. Journal of Clinical Investigation, 1999. 104(12): p. 1645-1653
【非特許文献１１】MacCallum, D.E., et al., Seliciclib (CYC202, R-Roscovitine) Induces Cell Death in Multiple Myeloma Cells by Inhibition of RNA Polymerase II-Dependent Transcription and Down-regulation of Mcl-1. Cancer Res, 2005. 65(12): p. 5399-5407
【非特許文献１２】Whittaker, S.R., et al., The Cyclin-dependent kinase inhibitor CYC202 (R-roscovitine) inhibits retinoblastoma protein phosphorylation, causes loss of Cyclin D1, and activates the mitogen-activated protein kinase pathway. Cancer Research, 2004. 64(1): p. 262-272
【非特許文献１３】Schubert, K.M. and V. Duronio, Distinct roles for extracellular-signal-regulated protein kinase (ERK) mitogen-activated protein kinases and phosphatidylinositol 3-kinase in the regulation of Mcl-1 synthesis. Biochemical journal, 2001. 356: p. 473-480
【非特許文献１４】Carlson, B., et al., Down-regulation of cyclin D1 by transcriptional repression in MCF-7 human breast carcinoma cells induced by flavopiridol. Cancer Res., 1999. 59(18): p. 4634-41
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、様々な増殖性障害、より詳細には癌の治療において治療用途を有する新規な組合せを提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
第１の態様は、（ｉ）ＥｒｂＢ阻害剤と、（ii）（ａ）ロスコビチン；（ｂ）３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−２−メチルペンタン−２−オール；（ｃ）３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−ペンタン−２−オール；及び（ｄ）（２Ｒ，３Ｓ−３−（６−（（４，６−ジメチルピリジン−３−イルメチルアミノ）−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ）ペンタン−２−オールから選択される、ＣＤＫ阻害剤、又は薬学的に許容されるその塩とを含む組合せに関する。
【０００８】
第２の態様は、本発明による組合せ及び薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【０００９】
第３の態様は、治療において同時、順次、又は別々に使用するための組合せ製剤としての、（ｉ）ＥｒｂＢ阻害剤；と、（ii）（ａ）ロスコビチン；（ｂ）３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−２−メチル−ペンタン−２−オール；（ｃ）３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−ペンタン−２−オール；及び（ｄ）（２Ｒ，３Ｓ−３−（６−（（４，６−ジメチルピリジン−３−イルメチルアミノ）−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ）ペンタン−２−オールから選択される、ＣＤＫ阻害剤、又は薬学的に許容されるその塩とを含む医薬品に関する。
【００１０】
第４の態様は、増殖性障害の治療方法であって、（ｉ）ＥｒｂＢ阻害剤と、（ii）（ａ）ロスコビチン；（ｂ）３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−２−メチル−ペンタン−２−オール；（ｃ）３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−ペンタン−２−オール；及び（ｄ）（２Ｒ，３Ｓ−３−（６−（（４，６−ジメチルピリジン−３−イルメチルアミノ）−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ）ペンタン−２−オールから選択される、ＣＤＫ阻害剤又は薬学的に許容されるその塩とを対象に、同時、順次、又は別々に投与するステップを含む方法に関する。
【００１１】
第５の態様は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療方法であって、（ｉ）ＥｒｂＢ阻害剤と、（ii）（ａ）ロスコビチン；（ｂ）３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−２−メチル−ペンタン−２−オール；（ｃ）３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−ペンタン−２−オール；及び（ｄ）（２Ｒ，３Ｓ−３−（６−（（４，６−ジメチルピリジン−３−イルメチルアミノ）−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ）ペンタン−２−オールから選択される、ＣＤＫ阻害剤、又は薬学的に許容されるその塩とを対象に、同時、順次、又は別々に投与するステップを含む方法に関する。
【００１２】
第６の態様は、
（ｉ）ＥｒｂＢ阻害剤と、
（ii）（ａ）ロスコビチン；（ｂ）３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−２−メチル−ペンタン−２−オール；（ｃ）３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−ペンタン−２−オール；及び（ｄ）（２Ｒ，３Ｓ−３−（６−（（４，６−ジメチルピリジン−３−イルメチルアミノ）−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ）ペンタン−２−オールから選択される、ＣＤＫ阻害剤、又は薬学的に許容されるその塩と
を含むキットのパーツ（parts）に関する。
【００１３】
本発明のさらなる態様は、（ｉ）ＥｒｂＢ阻害剤と、（ii）式Ｉの化合物、又は薬学的に許容されるその塩、
【００１４】
【化１】
0005514099.tif 000002
（Ｉ）
【００１５】
（式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ又はアルキルであり、
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル又はアリールであり、
Ｒ５はアルキル又はシクロアルキルであり、そのそれぞれは、１又は複数のＯＨ基で置換されていてもよく、
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、ハロアルキル、ハロゲン、ＮＯ２、ＯＨ、ＯＭｅ、ＣＮ、ＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２、又はＳＯ２ＮＨ２である）と
を含む組合せに関する。
【００１６】
本発明のさらなる態様は、前記組合せを含む医薬品、医薬組成物及びキットのパーツ、並びにこれらを使用する治療方法に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下に示す好適な実施形態は、本発明の上述した態様すべてに適用できる。
【００１８】
上述したように、本発明は、上記に示したような、ＥｒｂＢ阻害剤及びＣＤＫ阻害剤を含む組合せに関する。
【００１９】
好適な一実施形態では、ＥｒｂＢ阻害剤は、ＥｒｂＢ１（ＥＧＦＲ）阻害剤である。
【００２０】
ＥＧＦＲ阻害剤は、ＡＧ１４７８、セツキシマブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、パニツムマブ、マツズマブ、ニモツズマブ、ザルツムマブ、ペルツズマブ、カネルチニブ、バンデタニブ、ＥＫＢ−５６９、ＨＫＩ−２７２、ＢＩＢＷ−２９９２、ＡＥＥ−７８８、ＸＬ６４７、ＢＭＳ−５９９６２６、ＰＫＩ−１１６及びＡＲＲＹ−３３４５４３から選択されることが好ましい。
【００２１】
ＥＧＦＲ阻害剤は、ＡＧ１４７８、セツキシマブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ及びラパチニブから選択されることがより好ましい。
【００２２】
別の好適な実施形態では、ＥｒｂＢ阻害剤はＥｒｂＢ２（Ｈｅｒ２）阻害剤である。ＥｒｂＢ２阻害剤はトラスツズマブであることがより好ましい。
【００２３】
好適な一実施形態では、ＥｒｂＢ阻害剤は、Ｈｅｒ２及びＥＧＦＲ（例えば、ラパチニブ、カネルチニブ、ＥＫＢ−５６９、ＨＫＩ−２７２、ＢＩＢＷ−２９９２、ＡＥＥ−７８８、ＸＬ６４７、ＢＭＳ−５９９６２６、ＰＫＩ−１１６及びＡＲＲＹ−３３４５４３）の両方を標的にする。
【００２４】
好適な一実施形態では、ＥｒｂＢ阻害剤は、ＡＧ１４７８、トラスツズマブ、セツキシマブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、パニツムマブ、マツズマブ、ニモツズマブ、ザルツムマブ、ペルツズマブ、カネルチニブ、バンデタニブ、ＥＫＢ−５６９、ＨＫＩ−２７２、ＢＩＢＷ−２９９２、ＡＥＥ−７８８、ＸＬ６４７、ＢＭＳ−５９９６２６、ＰＫＩ−１１６、ＡＲＲＹ−３３４５４３から選択される。
【００２５】
ＥｒｂＢ阻害剤は、ＡＧ１４７８、トラスツズマブ、セツキシマブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ及びラパチニブから選択されることがより好ましい。
【００２６】
特に好適な一実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤はＡＧ１４７８である。
【００２７】
ＡＧ１４７８［４−（３−クロロアニリノ）−６，７−ジメトキシキナゾリン］は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性の可逆性の、非常に強力な（ＩＣ５０＝３ｎＭ）選択された阻害剤であり、ＥＧＦシグナル伝達遮断薬として一般に使用される（www.alomone.com）。ＡＧ１４７８は以下の化学構造である。
【００２８】
【化２】
0005514099.tif 000003
【００２９】
別の特に好適な実施形態では、ＥｒｂＢ阻害剤はトラスツズマブである。
【００３０】
上述したように、トラスツズマブ（Herceptin（登録商標））は、組換えＤＮＡ由来ヒト化モノクローナル抗体であり、これは、細胞ベースのアッセイ（Ｋｄ＝５ｎＭ）において、ヒト上皮成長因子受容体２タンパク質、ＨＥＲ２（human epidermal growth factor receptor 2）の細胞外ドメインに、高い親和性で選択的に結合する（Coussens, L. et al., Science, 1985; 230: 1132-9；Slamon, D. J. et al., Science, 1989; 244:707-12）。抗体はＩｇＧ１κであり、これは、ＨＥＲ２に結合するマウス抗体（４Ｄ５）の相補性決定領域を伴ったヒトフレームワーク領域を含む。
【００３１】
単剤療法については、トラスツズマブは、腫瘍がＨＥＲ２タンパク質を過剰発現する転移性乳癌を有し、その転移性疾患のための１又は複数の化学療法レジメンを受けている患者を治療するために指示される。トラスツズマブは、腫瘍がＨＥＲ２タンパク質を過剰発現する転移性乳癌を有し、その転移性疾患のための化学療法を受けていない患者を治療するために、パクリタキセルと組み合わせて使用することにも認可されている。
【００３２】
本願者による研究では、ＨＥＲ２受容体を過剰発現する乳癌細胞株における、組合せでのセリシクリブとトラスツズマブの効果を調査した。さらに、セリシクリブとチロホスチンＡＧ１４７８との間の相互作用を検査することによって、ＣＤＫ阻害剤とＥＧＦＲチロシンキナーゼの小分子阻害剤との間に相乗作用が起こるかどうかを判定した［Osherov, N. and A. Levitzki, Epidermal-growth-factor-dependent activation of the src-family kinases. Eur J Biochem., 1994. 225(3): p. 1047-53］。結果は、セリシクリブは、ＨＥＲ２を過剰発現する乳癌細胞株ＳｋＢｒ３において、トラスツズマブと相乗作用することを実証した。セリシクリブは、それぞれ、野生型及び突然変異体ＥＧＦＲを発現する、ＮＳＣＬＣ細胞株Ｈ３５８及びＨ１６５０において、ＡＧ１４７８とも相乗作用した。各場合において、相乗作用は、ＨＥＲ２／ＥＧＦＲシグナル伝達経路の阻害を伴った。これらのインビトロでの知見をさらに展開することによって、セリシクリブとエルロチニブの組合せが、Ｈ３５８異種移植モデルにおいて相乗的であることを実証した。本明細書に示したデータは、セリシクリブとＥｒｂＢ受容体ファミリーの阻害剤との組合せは、癌細胞増殖に対して相乗効果を生じ得ることを示す。
【００３３】
別の特に好適な実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤はセツキシマブである。
【００３４】
セツキシマブは、ヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ、epidermal growth factor receptor）の細胞外ドメインに特異的に結合する、組換えヒト／マウスキメラモノクローナル抗体である。セツキシマブは、ヒトＩｇＧ１重鎖及びκ軽鎖定常領域を含む、マウス抗−ＥＧＦＲ抗体のＦｖ領域からなり、およその分子量は１５２ｋＤａである。セツキシマブは、哺乳動物の（マウスの骨髄腫）細胞培養において産生される。
【００３５】
セツキシマブは、頭頸部癌及び結腸直腸癌を治療するために、単一薬剤として、及び他のレジメンと組み合わせて使用するために認可されている。
【００３６】
別の特に好適な実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤はエルロチニブである。
【００３７】
エルロチニブ［Tarceva（登録商標）；Ｎ−（３−エチニルフェニル−６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）−４−キナゾリンアミン］は、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ阻害剤であり、以下の化学構造を有する。
【００３８】
【化３】
0005514099.tif 000004
【００３９】
エルロチニブ単剤療法は、局所的に進行した、又は転移性の非小細胞肺癌を有する患者を少なくとも１つの以前の化学療法レジメンに失敗した後に治療するために使用するために認可されている。
【００４０】
別の特に好適な実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤はゲフィチニブである。
【００４１】
ゲフィチニブ［Iressa（登録商標）；Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−メトキシ−６−［（３，４−モルホリン）プロポキシ］−４−キナゾリンアミン］は、以下の化学構造を有する：
【００４２】
【化４】
0005514099.tif 000005
【００４３】
ゲフィチニブは、局所的に進行した、又は転移性の非小細胞肺癌を有する患者を白金ベース及びドセタキセル化学療法の両方に失敗した後に治療を継続するために、単剤療法として使用するために認可されている。
【００４４】
本発明の好適な一実施形態では、ＥｒｂＢ阻害剤はラパチニブ（Tykerb（登録商標））である。ラパチニブは、Ｎ−［３−クロロ−４−［（３−フルオロフェニル）メトキシ］フェニル］−６−［５−［（２メチルスルホニルエチルアミノ）メチル］−２−フリル］キナゾリン−４−アミンとして知られている化合物であり、以下に示す構造を有する。
【００４５】
【化５】
0005514099.tif 000006
【００４６】
ラパチニブ（国際一般名称）又はラパチニブジトシレート（米国一般名）は、ＧＷ５７２０１６としても知られており、乳癌及び肺癌などの固形腫瘍を治療するための抗癌剤である。これは、化学療法薬Xelodaと併せて、進行した転移性乳癌を有する患者において使用するために認可されている。より具体的には、ラパチニブは、Herceptin及びタキサン及びアントラサイクリンを用いて以前に治療を受けていた女性に対して指示される１日１回の経口薬である。ラパチニブは、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２／ｎｅｕ（ＥｒｂＢ−２）二重チロシンキナーゼ阻害剤であり、これは、細胞内のリン酸化ドメインに結合することによって、受容体がリガンドに結合した際に自己リン酸化するのを防止する。
【００４７】
特に好ましい実施形態では、ＥｒｂＢ阻害剤は、ＡＧ１４７８、トラスツズマブ及びエルロチニブから選択される。
【００４８】
本発明の組合せは、様々なプリンに基づくＣＤＫ阻害剤、例えば、ロスコビチン及び一般式（Ｉ）の関連化合物を含む。
【００４９】
現在特許請求されている組合せのＣＤＫ阻害剤は、ＣＤＫ２に対して最も強力であることが好ましい。
【００５０】
現在特許請求されている組合せのＣＤＫ阻害剤は、ＣＤＫ２及びＣＤＫ９に対して最も強力であり、ＣＤＫ１及びＣＤＫ４に対する活性が少なくとも２０分の１であることがより好ましい。
【００５１】
現在特許請求されている組合せのＣＤＫ阻害剤は、ＣＤＫ２及びＣＤＫ９に対して最も強力であり、ＣＤＫ１及びＣＤＫ４に対する活性が少なくとも５０分の１であることがさらにより好ましい。
【００５２】
現在特許請求されている組合せのＣＤＫ阻害剤は、ＣＤＫ２及びＣＤＫ９に対して最も強力であり、ＣＤＫ４に対する活性が少なくとも１００分の１であることがさらになおより好ましい。
【００５３】
非常に好適な一実施形態では、ＣＤＫ阻害剤は、ＣＤＫ２、ＣＤＫ７及びＣＤＫ９を最も強力に阻害し、ＣＤＫ１及びＣＤＫ４に対する活性が少なくとも２０分の１である。
【００５４】
本発明の好適な一実施形態では、ＣＤＫ阻害剤は、ロスコビチン又は薬学的に許容されるその塩である。
【００５５】
ロスコビチン、即ち２−［（１−エチル−２−ヒドロキシエチル）アミノ］−６−ベンジルアミン−９−イソプロピルプリンは、２−（１−Ｄ，Ｌ−ヒドロキシメチルプロピルアミノ）−６−ベンジルアミン−９−イソプロピルプリンとしても記載される。本明細書で使用される場合、用語「ロスコビチン」は、分割されたＲ及びＳ鏡像異性体、その混合物並びにそのラセミ体を包含する。
【００５６】
本明細書で使用される場合、用語「セリシクリブ」は、ロスコビチンのＲ鏡像異性体、即ち、２−（１−Ｒ−ヒドロキシメチルプロピルアミノ）−６−ベンジルアミノ−９−イソプロピルプリンを指し、その構造を以下に示す。
【００５７】
【化６】
0005514099.tif 000007
【００５８】
本発明のすべての実施形態について、ロスコビチンは、Ｒ鏡像異性体、即ち、２−（１−Ｒ−ヒドロキシメチルプロピルアミノ）−６−ベンジルアミノ−９−イソプロピルプリンの形態であることが好ましく、以下「セリシクリブ」又は「ＣＹＣ２０２」又は「Ｒ−ロスコビチン」と呼ぶ。
【００５９】
ロスコビチンのインビトロでの活性は以下の通りである。
【００６０】
【表１】
0005514099.tif 000008
【００６１】
別の非常に好適な実施形態では、ＣＤＫ阻害剤は、
（３Ｒ）−３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−２−メチル−ペンタン−２−オール［１］；
（３Ｓ）−３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−２−メチル−ペンタン−２−オール［２］；
（２Ｒ３Ｓ）−３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−ペンタン−２−オール［３］；及び
（２Ｒ，３Ｓ−３−（６−（（４，６−ジメチルピリジン−３−イルメチルアミノ）−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ）ペンタン−２−オール［４］
から選択される。
【００６２】
別の好適な実施形態では、ＣＤＫ阻害剤は、３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−２−メチル−ペンタン−２−オールである。本明細書で使用される場合、３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２イルアミノ｝−２−メチル−ペンタン−２−オールは、分割されたＲ及びＳ鏡像異性体、その混合物、並びにそのラセミ体を包含する。
【００６３】
非常に好適な一実施形態では、ＣＤＫ阻害剤は、（３Ｒ）−３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−２−メチル−ペンタン−２−オール［１］であり、その構造を以下に示す。
【００６４】
【化７】
0005514099.tif 000009
［１］
【００６５】
別の非常に好適な実施形態では、ＣＤＫ阻害剤は、（３Ｓ）−３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−２−メチル−ペンタン−２−オール［２］であり、その構造を以下に示す。
【００６６】
【化８】
0005514099.tif 000010
［２］
【００６７】
さらに別の好適な実施形態では、ＣＤＫ阻害剤は、３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−ペンタン−２−オールである。本明細書で使用される場合、３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−ペンタン−２−オールは、分割された、及び分割されていないジアステレオ異性体、並びにその混合物を包含する。
【００６８】
非常に好適な実施形態では、ＣＤＫ阻害剤は、（２Ｒ３Ｓ）−３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−ペンタン−２−オール［３］であり、その構造を以下に示す。
【００６９】
【化９】
0005514099.tif 000011
［３］
【００７０】
さらに別の好適な実施形態では、ＣＤＫ阻害剤は、（２Ｒ，３Ｓ−３−（６−（（４，６−ジメチルピリジン−３−イルメチルアミノ）−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ）ペンタン−２−オール［４］であり、その構造を以下に示す。
【００７１】
【化１０】
0005514099.tif 000012
［４］
【００７２】
別の態様は、本発明による組合せ、及び薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【００７３】
別の態様は、増殖性障害を治療するのに使用するための、本発明の組合せを含む医薬品に関する。
【００７４】
治療法を最適にするために、多くの抗癌剤が組み合わせて投与される。薬剤の組合せの効果は、本質的に予測不可能であり、１つの薬剤が、他の薬剤の効果を部分的又は完全に阻害する傾向が存在することが多い。
【００７５】
本発明は、ＥｒｂＢ阻害剤（例えば、ＥＧＦＲ阻害剤）、又は薬学的に許容されるその塩と、ＣＤＫ阻害剤を含む組合せを同時、別々、又は順次に投与しても、２つの薬剤の間で、いずれの著しい又は劇的な、有害な相互作用に至らないという驚くべき知見に基づく。いずれのそのようなアンタゴニスト的相互作用も予想外に存在しないことは、臨床用途にとって極めて重要である。
【００７６】
本発明の組合せは、ＥｒｂＢ阻害剤（例えば、ＥＧＦＲ阻害剤）と、上記に定義したＣＤＫ阻害剤、又は薬学的に許容されるその塩とを含む相乗的な組合せである、即ち、組合せは相乗効果を有することが好ましい。
【００７７】
好適な実施形態では、ＥｒｂＢ阻害剤と、ＣＤＫ阻害剤、又は薬学的に許容されるその塩との組合せにより、いずれかの薬剤を単独で投与した場合と比較して効果が増強される。この知見の驚くべき性質は、従来技術に基づいて予期される性質と対照的である。相乗的相互作用により、患者に投与される各成分の用量を下げることを可能にすることができ、それによって化学療法の毒性が低下する一方で、同じ治療効果が生じ、且つ／又は維持されることが有利である。したがって、特に好適な実施形態では、各成分は、治療量以下の量で投与することができる。
【００７８】
別の好適な実施形態では、ＥｒｂＢ阻害剤とＣＤＫ阻害剤、又は薬学的に許容されるその塩は、単剤療法において個々の成分を使用した場合に関連し、又は既知の組合せでこれらを使用した場合に関連する、有害な副作用を軽減又は排除するような様式で相互作用する。
【００７９】
上述したように、本発明の一態様は、治療において同時、順次、又は別々に使用するための組合せ製剤としての、ＥｒｂＢ阻害剤と、（ａ）ロスコビチン；（ｂ）３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−２−メチル−ペンタン−２−オール；（ｃ）３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−ペンタン−２−オール；及び（ｄ）（２Ｒ，３Ｓ−３−（６−（（４，６−ジメチルピリジン−３−イルメチルアミノ）−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ）ペンタン−２−オールから選択される、ＣＤＫ阻害剤、又は薬学的に許容されるその塩とを含む医薬品に関する。
【００８０】
ＥｒｂＢ阻害剤と、ＣＤＫ阻害剤、又は薬学的に許容されるその塩とを含む組合せは、同時、順次又は別々に（投与法の一部として）投与することができる。
【００８１】
本明細書で使用される場合、「同時に」は、２つの薬剤が同時的に投与されることを意味するように使用される。したがって、「順次に」投与することは、一方の薬剤を他方の薬剤の、５分、１０分、又は数時間程度以内の後に投与することを可能にすることができ、但し、最初に投与される薬剤の循環半減期は、これらが、治療有効量でともに同時に存在するようになっている。成分の投与間の時間遅延量は、成分の正確な性質、これらの間の相互作用、及びそのそれぞれの半減期に応じて変化する。
【００８２】
「順次に」と対照的に、「別々に」は、一方の薬剤の投与と他方の薬剤の投与の間隔が著しい、即ち、第２の薬剤が投与されるとき、最初に投与された薬剤は、血流中に治療有効量でもはや存在しない場合があることを意味するために、本明細書で使用される。
【００８３】
好適な一実施形態では、第２の薬剤は、第１の薬剤を投与してから、少なくとも２時間後、より好ましくは少なくとも４時間後、さらにより好ましくは少なくとも８時間後、さらになおより好ましくは少なくとも１２又は２４又は４８又は７２時間後に投与される。特に好適な一実施形態では、第２の薬剤は、第１の薬剤を投与してから少なくとも２４時間後に投与される。
【００８４】
一態様では、本発明は、増殖性障害の治療方法であって、ＥｒｂＢ阻害剤と、（ａ）ロスコビチン；（ｂ）３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−２−メチル−ペンタン−２−オール；（ｃ）３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−ペンタン−２−オール；及び（ｄ）（２Ｒ，３Ｓ−３−（６−（（４，６−ジメチルピリジン−３−イルメチルアミノ）−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ）ペンタン−２−オールから選択される、ＣＤＫ阻害剤、又は薬学的に許容されるその塩とを対象に、同時、順次、又は別々に投与するステップを含む方法に関する。
【００８５】
対象は哺乳動物であることが好ましく、ヒトであることがより好ましい。
【００８６】
好適な一実施形態では、ＥｒｂＢ阻害剤と、ＣＤＫ阻害剤、又は薬学的に許容される塩は、同時に投与される。
【００８７】
別の好適な実施形態では、ＥｒｂＢ阻害剤と、ＣＤＫ阻害剤、又は薬学的に許容されるその塩は、順次又は別々に投与される。
【００８８】
好ましくは、ＥｒｂＢ阻害剤は、ＣＤＫ阻害剤、又は薬学的に許容されるその塩を投与する、少なくとも２時間前、より好ましくは少なくとも４時間前、さらにより好ましくは少なくとも８時間前、さらになおより好ましくは、少なくとも１２又は２４又は４８又は７２時間前に投与される。特に好適な一実施形態では、ＥｒｂＢ阻害剤は、ＣＤＫ阻害剤、又は薬学的に許容されるその塩を投与する、少なくとも２４時間前に投与される。別の好適な実施形態では、ＥｒｂＢ阻害剤と、ＣＤＫ阻害剤、又は薬学的に許容されるその塩は、個々の成分に対して治療有効量でそれぞれ投与される。
【００８９】
代替の好適な実施形態では、ＥｒｂＢ阻害剤と、ＣＤＫ阻害剤、又は薬学的に許容されるその塩は、個々の成分に対して治療有効量以下でそれぞれ投与される。
【００９０】
用語「治療有効量以下」は、ＥｒｂＢ阻害剤又はＣＤＫ阻害剤、若しくは薬学的に許容されるその塩を単独で用いる治療に関して、治療効果をもたらすのに一般に必要とされる量よりも低い量を意味する。
【００９１】
非常に好適な実施形態では、ＥｒｂＢ阻害剤は、ＣＤＫ阻害剤、又は薬学的に許容されるその塩を投与する前に、順次又は別々に投与される。
【００９２】
別の非常に好適な実施形態では、ＣＤＫ阻害剤、又は薬学的に許容されるその塩は、ＥｒｂＢ阻害剤を投与する前に、順次又は別々に投与される。
【００９３】
増殖性障害
用語「増殖性障害」は、広い意味で、本明細書で使用されることによって、細胞周期の制御を必要とする任意の障害、例えば、再狭窄及び心筋症などの心血管障害、糸球体腎炎、ループス腎炎、糸球体間質の増殖性障害及び関節リウマチなどの自己免疫障害、多発性嚢胞腎、多嚢胞性肝疾患、髄質嚢胞性疾患などの嚢胞性疾患、乾癬などの皮膚障害、マラリアなどの抗炎症、抗真菌、駆虫性の障害、気腫及び脱毛症を含む。これらの障害では、本発明の化合物は、必要とされる場合、所望の細胞内でアポトーシスを誘発し、又は静止を維持することができる。
【００９４】
上記態様及び実施形態のすべてに関して、増殖性障害は癌であることが好ましい。
【００９５】
非常に好適な一実施形態では、増殖性障害は卵巣癌である。
【００９６】
さらに別の非常に好適な実施形態では、増殖性障害は頭部又は頸部癌である。
【００９７】
さらに別の非常に好適な実施形態では、増殖性障害は乳癌である。
【００９８】
さらに別の非常に好適な実施形態では、増殖性障害は肺癌であり、より好ましくはＮＳＣＬＣである。
【００９９】
好適な一実施形態では、本発明は、非小細胞肺癌の治療方法であって、ＥｒｂＢ阻害剤と、（ａ）ロスコビチン；（ｂ）３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−２−メチル−ペンタン−２−オール；（ｃ）３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−ペンタン−２−オール；及び（ｄ）（２Ｒ，３Ｓ−３−（６−（（４，６−ジメチルピリジン−３−イルメチルアミノ）−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ）ペンタン−２−オールから選択される、ＣＤＫ阻害剤、又は薬学的に許容されるその塩とを対象に、同時、順次、又は別々に投与するステップを含む方法に関する。
【０１００】
肺癌（気管支原性癌）は、２つの広い分類、即ち、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）と非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）に区分することができる。これらの２つの種類の癌の間の区別は、顕微鏡下で見たときの腫瘍細胞の外観に基づく。
【０１０１】
ＳＣＬＣは、診断される肺癌の２０％の割合を占め、大部分が核で満たされている小細胞を特徴とする（それがこの名称の由来である）。これは、時折「燕麦細胞」癌とも呼ばれる。ＳＣＬＣは、最も攻撃的な種類の癌であり、体の他の部分に急速に転移する。ＳＣＬＣは、癌が体中に蔓延した後にのみ診断されることが多い。一般に、ＳＣＬＣは、ほとんど常に、喫煙の結果として生じる。
【０１０２】
ＮＳＣＬＣは、関連する肺癌の群にさらに区分することができ、これには、類表皮癌又は扁平上皮癌、腺癌及び大細胞癌が含まれる。
【０１０３】
扁平上皮肺癌は、すべての肺癌症例の約３０％の割合を占め、肺及び気管支のライニングにおいて、予備細胞（損傷した上皮細胞と交替する役割を有する）から発症する。結果として、この癌は、胸部の中心部に最初に発症することが多い。扁平上皮肺癌は、徐々に増殖することが多く、限局性腫瘍から浸潤癌に進行するのに数年かかる場合がある。症例の１０−２０％では、癌により、肺内に空洞が形成される。転移すると、癌は骨、肝臓、副腎、小腸及び脳に蔓延することが多い。
【０１０４】
腺癌は、肺癌の最も一般的な形態であり、すべての肺癌症例の３０〜４０％を構成する。腺癌は、肺の外側部分で発症し、粘液産生細胞から発生する。この癌の過程は広く変化するが、徐々に進行することが多く、患者は、ほとんど又はまったく症状を示さない。しかし場合によっては、これは、極端に攻撃的であり、急速に致命的となる場合がある。転移する症例の５０％では、これは脳にだけ蔓延する。腺癌が蔓延する他の位置には、肝臓、副腎及び骨が含まれる。
【０１０５】
大細胞癌の発生頻度は、腺癌又は扁平上皮癌より低く、肺癌症例の１０〜２０％の割合を占める。この癌は、性質上未分化である、大きなサイズの細胞からなり、気管支に生じることが多い。大細胞癌は、肺の周囲に発症し、プルラ（plura）に蔓延する場合がある。
【０１０６】
現在、肺癌は、手術、放射線療法又は化学療法によって治療することができる。化学療法は、単独又は他の治療オプションと組み合わせて投与することができる。一般的なＮＳＣＬＣ用薬剤及びレジメンには、Camptosar（登録商標）（イリノテカン；ＣＰＴ−１１）、カンプトテシン、Paraplatin（登録商標）（カルボプラチン）、Platinol（登録商標）（シスプラチン）、エピルビシン、Gemzar（登録商標）（ゲムシタビン）、Navelbine（登録商標）（ビノレルビン）、オキサリプラチン、Taxol（登録商標）（パクリタキセル）及びTaxotere（登録商標）（ドセタキソール）が含まれる（NSCLC Treatment - Chemotherapy, Lung Cancer Online）。
【０１０７】
しかし、化学療法は治癒的ではない。この治療の他の不利点には、毒性、正常組織のバイスタンダー損傷及び薬剤耐性が含まれる（W. Wang et al, Cancer Sci., 2005, 96(10), 706）。さらに、研究により、ビノレルビンなどのいくつかの既知の治療には、わずかな生存利益しかないことが示されている（M. A. Socinski et al, Clin. Adv. Hematol. Oncol., 2003, 1(1), 33）。トロキサシタビンなどの新規な活性剤（active）でさえ、１０ｍｇ／ｍ２の用量を３週間毎に３０分にわたって静脈内に投与しても、ＮＳＣＬＣにおいてわずかな活性を有するだけであることが示されている（S. F. Dent et al, Lung, 2005, 183(4), 265）。
【０１０８】
ゲムシタビン／シスプラチンの組合せは、ＮＳＣＬＣを治療するために欧州で広く使用されるようになってきた。しかし、シスプラチンは、嘔吐とともに著しい非血液毒性（聴器毒性及び腎毒性）が患者に生じるという点で、ある特定の不利点を有することが認められている（P. Zatloukal et al, Lung Cancer, 2002, 38, S33）。
【０１０９】
肺癌と診断された患者の転帰は悪く、すべての治療した症例についての１０年生存率はわずか約８％であるので、有効な治療を開発する必要性が続いている。
【０１１０】
非常に好適な一実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤はエルロチニブであり、ＣＤＫ阻害剤はセリシクリブである。増殖性障害は肺癌であることが好ましく、非小細胞肺癌であることがより好ましい。
【０１１１】
別の非常に好適な一実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤はエルロチニブであり、ＣＤＫ阻害剤は、
（３Ｒ）−３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−２−メチル−ペンタン−２−オール；
（３Ｓ）−３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−２−メチル−ペンタン−２−オール；
（２Ｒ３Ｓ）−３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−ペンタン−２−オール；及び
（２Ｒ，３Ｓ−３−（６−（（４，６−ジメチルピリジン−３−イルメチルアミノ）−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ）ペンタン−２−オール
から選択される。
【０１１２】
特に好適な一実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤はＡＧ１４７８であり、ＣＤＫ阻害剤はセリシクリブである。増殖性障害は肺癌であることが好ましく、非小細胞肺癌であることがより好ましい。
【０１１３】
さらに別の特に好適な実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤はＡＧ１４７８であり、ＣＤＫ阻害剤は、（３Ｒ）−３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−２−メチル−ペンタン−２−オールである。増殖性障害は肺癌又は乳癌であることが好ましい。
【０１１４】
別の特に好適な実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤はＡＧ１４７８であり、ＣＤＫ阻害剤は、（３Ｓ）−３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−２−メチル−ペンタン−２−オールである。増殖性障害は肺癌又は乳癌であることが好ましい。
【０１１５】
さらに別の特に好適な実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤はＡＧ１４７８であり、ＣＤＫ阻害剤は、（２Ｒ３Ｓ）−３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−ペンタン−２−オールである。増殖性障害は肺癌又は乳癌であることが好ましい。
【０１１６】
特に好適な実施形態では、ＥｒｂＢ阻害剤はトラスツズマブであり、ＣＤＫ阻害剤はセリシクリブである。増殖性障害は乳癌であることが好ましい。
【０１１７】
特に好適な実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤はラパチニブであり、ＣＤＫ阻害剤はセリシクリブである。増殖性障害は乳癌であることが好ましい。
【０１１８】
特に好適な実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤はラパチニブであり、ＣＤＫ阻害剤は、（３Ｒ）−３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−２−メチル−ペンタン−２−オールである。増殖性障害は乳癌であることが好ましい。
【０１１９】
特に好適な一実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤は、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ＡＧ１４７８及びラパチニブから選択され、ＣＤＫ阻害剤はセリシクリブである。増殖性障害は乳癌又は肺癌であることが好ましい。
【０１２０】
特に好適な一実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤は、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ＡＧ１４７８及びラパチニブから選択され、ＣＤＫ阻害剤は、（３Ｒ）−３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−２−メチル−ペンタン−２−オールである。増殖性障害は乳癌又は肺癌であることが好ましい。
【０１２１】
特に好適な一実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤は、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ＡＧ１４７８及びラパチニブから選択され、ＣＤＫ阻害剤は、（３Ｓ）−３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−２−メチル−ペンタン−２−オールである。増殖性障害は乳癌又は肺癌であることが好ましい。
【０１２２】
特に好適な一実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤は、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ＡＧ１４７８及びラパチニブから選択され、ＣＤＫ阻害剤は、（２Ｒ３Ｓ）−３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−ペンタン−２−オールである。増殖性障害は乳癌又は肺癌であることが好ましい。
【０１２３】
特に好適な一実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤は、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ＡＧ１４７８及びラパチニブから選択され、ＣＤＫ阻害剤は、（２Ｒ，３Ｓ−３−（６−（（４，６−ジメチルピリジン−３−イルメチルアミノ）−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ）ペンタン−２−オールである。増殖性障害は乳癌又は肺癌であることが好ましい。
【０１２４】
特に好適な一実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤はエルロチニブであり、ＣＤＫ阻害剤は、（３Ｒ）−３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−２−メチル−ペンタン−２−オールである。増殖性障害は肺癌であることが好ましい。
【０１２５】
非常に好適な一実施形態では、本発明は、肺癌の治療方法であって、エルロチニブとセリシクリブを含む組合せを対象に投与するステップを含む方法に関する。
【０１２６】
別の非常に好適な実施形態では、本発明は、乳癌の治療方法であって、エルロチニブとセリシクリブを含む組合せを対象に投与するステップを含む方法に関する。
【０１２７】
別の非常に好適な実施形態では、本発明は、肺癌の治療方法であって、トラスツズマブとセリシクリブを含む組合せを対象に投与するステップを含む方法に関する。組合せの薬剤は、同時に投与されることが好ましい。
【０１２８】
別の非常に好適な実施形態では、本発明は、乳癌の治療方法であって、トラスツズマブとセリシクリブを含む組合せを対象に投与するステップを含む方法に関する。組合せの薬剤は、同時に投与されることが好ましい。
【０１２９】
別の非常に好適な実施形態では、本発明は、肺癌の治療方法であって、ＡＧ１４７８とセリシクリブを含む組合せを対象に投与するステップを含む方法に関する。組合せの薬剤は、同時に投与されることが好ましい。
【０１３０】
式（Ｉ）の化合物を含む組合せ
本発明の一態様は、（ｉ）ＥｒｂＢ阻害剤と、（ii）式Ｉの化合物、又は薬学的に許容されるその塩
【０１３１】
【化１１】
0005514099.tif 000013
（Ｉ）
【０１３２】
（式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ又はアルキルであり、
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル又はアリールであり、
Ｒ５はアルキル又はシクロアルキルであり、そのそれぞれは、１又は複数のＯＨ基で置換されていてもよく、
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、ハロアルキル、ハロゲン、ＮＯ２、ＯＨ、ＯＭｅ、ＣＮ、ＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２、又はＳＯ２ＮＨ２である）と
を含む組合せに関する。
【０１３３】
本明細書で使用される場合、用語「アルキル」には、飽和した直鎖状及び分岐状のアルキル基の両方が含まれる。好ましくは、アルキル基は、Ｃ１−２０アルキル基であり、より好ましくは、Ｃ１−１５、さらにより好ましくは、Ｃ１−１２アルキル基、さらにより好ましくは、Ｃ１−６アルキル基、より好ましくは、Ｃ１−３アルキル基である。特に好適なアルキル基として、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、及びヘキシルが挙げられる。
【０１３４】
本明細書で使用される場合、用語「シクロアルキル」は、環式アルキル基を指す。シクロアルキル基は、Ｃ３−１２シクロアルキル基であることが好ましい。
【０１３５】
本明細書で使用される場合、用語「アリール」は、Ｃ６−１２芳香族基を指す。一般的な例には、フェニル及びナフチルなどが含まれる。
【０１３６】
本発明のこの態様については、Ｒ３及びＲ４の少なくとも１つはＨ以外であることが好ましい。
【０１３７】
好適な一実施形態では、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、Ｈ、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル又はフェニルである。
【０１３８】
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、Ｈ、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル又はｔ−ブチルであることがより好ましい。
【０１３９】
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル又はｔ−ブチルであることがさらにより好ましい。
【０１４０】
好適な一実施形態では、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル又はハロアルキルである。Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、Ｈ又はアルキルであることがより好ましい。特に好適な一実施形態では、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９はすべてＨである。別の特に好適な実施形態では、Ｒ６及びＲ８はＨであり、Ｒ７及びＲ９はＭｅである。
【０１４１】
好適な一実施形態では、Ｒ１及びＲ２の一方はエチル又はイソプロピルであり、他方はＨである。Ｒ１及びＲ２の一方はエチルであり、他方はＨであることがより好ましい。
【０１４２】
好適な一実施形態では、Ｒ５はイソプロピル又はシクロペンチルである。
【０１４３】
本発明の非常に好適な一実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、
３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−２−メチル−ペンタン−２−オール；
３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−ペンタン−２−オール；
（２Ｒ，３Ｓ−３−（６−（（４，６−ジメチルピリジン−３−イルメチルアミノ）−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ）ペンタン−２−オール；
（３Ｒ）−３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−２−メチル−ペンタン−２−オール；及び
（３Ｓ）−３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−２−メチル−ペンタン−２−オール
から選択される。
【０１４４】
医薬組成物
特に好適な実施形態では、本発明の医薬品は、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物の形態である。
【０１４５】
本発明の化合物（その薬学的に許容される塩、エステル及び薬学的に許容される溶媒和物を含めて）は、特にヒトの治療のために、単独で投与することができるが、これらは一般に、医薬担体、賦形剤又は希釈剤と混合して投与される。この医薬組成物は、ヒト用医薬及び獣医薬として、ヒト又は動物に使用するためとすることができる。
【０１４６】
様々な異なる形態の医薬組成物に対するそのような適当な賦形剤の例は、"Handbook of Pharmaceutical Excipients", 2nd Edition, (1994), Edited by A Wade and PJ Wellerに見出すことができる。
【０１４７】
治療で使用するのに許容される担体又は希釈剤は、薬学の分野で公知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985)に記載されている。
【０１４８】
適当な担体の例として、ラクトース、デンプン、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、ソルビトールなどが挙げられる。適当な希釈剤の例として、エタノール、グリセロール、及び水が挙げられる。
【０１４９】
医薬担体、賦形剤又は希釈剤の選択は、意図した投与経路及び標準的な薬務に関して選択することができる。医薬組成物は、担体、賦形剤若しくは希釈剤として、又はこれらに加えて、任意の適当な結合剤（複数可）、滑剤（複数可）、懸濁剤（複数可）、コーティング剤（複数可）、可溶化剤（複数可）を含むことができる。
【０１５０】
適当な結合剤の例として、デンプン、ゼラチン、天然の糖、例えば、グルコース、無水ラクトース、易流動性ラクトース、β−ラクトース、トウモロコシ甘味料など、天然及び合成のゴム、例えば、アカシア、トラガカント又はアルギン酸ナトリウムなど、カルボキシメチルセルロース及びポリエチレングリコールが挙げられる。
【０１５１】
適当な滑剤の例として、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが挙げられる。
【０１５２】
保存剤、安定剤、染料、さらに香味剤も、医薬組成物中に提供することができる。保存剤の例として、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが挙げられる。酸化防止剤及び懸濁剤も使用することができる。
【０１５３】
プロドラッグ
本発明は、プロドラッグ形態での本発明の作用剤をさらに含む。そのようなプロドラッグは、一般に、１又は複数の適切な基が、ヒト又は哺乳動物の対象に投与されると、修飾が逆に戻ることができるように修飾された化合物である。そのような逆戻りは、そのような対象中に自然に存在する酵素によって通常実施されるが、そのようなプロドラッグと一緒に第２の作用剤を投与することによって、逆戻りをインビボで実施することが可能である。そのような修飾の例には、エステル（例えば、任意の上述したもの）が含まれ、逆戻りは、エステラーゼなどによって実施することができる。他のそのような系は、当業者に公知である。
【０１５４】
塩／エステル
本発明の作用剤は、塩又はエステル、特に、薬学的に許容される塩又はエステルとして存在することができる。
【０１５５】
本発明の作用剤の薬学的に許容される塩には、その酸付加塩又は塩基塩が含まれる。適当な医薬用塩の概説は、Berge et al, J Pharm Sci, 66, 1-19 (1977)に見出すことができる。塩は、例えば、鉱酸などの強無機酸、例えば、硫酸、リン酸又はハロゲン化水素酸；強有機カルボン酸、例えば、酢酸などの、非置換であるか、置換されている（例えば、ハロゲンによって）、１〜４個の炭素原子のアルカンカルボン酸など；飽和又は不飽和ジカルボン酸、例えば、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸若しくはテトラフタル酸；ヒドロキシカルボン酸、例えば、アスコルビン酸、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸若しくはクエン酸；アミノ酸、例えば、アスパラギン酸若しくはグルタミン酸；安息香酸；又は有機スルホン酸、例えば、メタン−若しくはｐ−トルエンスルホン酸などの、非置換であるか、置換されている（例えば、ハロゲンによって）、（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル−若しくはアリールスルホン酸などを用いて形成される。
【０１５６】
エステルは、エステル化される官能基に応じて、有機酸又はアルコール／水酸化物を使用して形成される。有機酸として、例えば、酢酸などの、非置換であるか、置換されている（例えば、ハロゲンによって）、１〜１２個の炭素原子のアルカンカルボン酸などのカルボン酸；飽和又は不飽和ジカルボン酸、例えば、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸若しくはテトラフタル酸；ヒドロキシカルボン酸、例えば、アスコルビン酸、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸若しくはクエン酸；アミノ酸、例えば、アスパラギン酸若しくはグルタミン酸；安息香酸；又は有機スルホン酸、例えば、メタン−若しくはｐ−トルエンスルホン酸などの、非置換であるか、置換されている（例えば、ハロゲンによって）、（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル−若しくはアリールスルホン酸などが挙げられる。適当な水酸化物として、無機水酸化物、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化アルミニウムなどが挙げられる。アルコールには、非置換であっても、例えば、ハロゲンによって置換されていてもよい、１〜１２個の炭素原子のアルカンアルコールが含まれる。
【０１５７】
鏡像異性体／互変異性体
本発明は、適切な場合、作用剤のすべての鏡像異性体及び互変異性体も含む。当業者は、化合物は、光学的性質（１又は複数の不斉炭素原子）又は互変異性特性を有することを認識する。対応する鏡像異性体及び／又は互変異性体は、当技術分野で既知の方法によって単離／調製することができる。
【０１５８】
立体異性体及び幾何異性体
いくつかの本発明の作用剤は、立体異性体及び／又は幾何異性体として存在することができ、例えば、これらは、１又は複数の非対称中心及び／又は幾何的中心を有することができ、したがって、２つ以上の立体異性体及び／又は幾何的形態で存在することができる。本発明は、こうした阻害剤のすべての個々の立体異性体及び幾何異性体、並びにこれらの混合物の使用を企図する。特許請求の範囲で使用される用語は、これらの形態を包含し、但し、前記形態は、適切な機能活性（必ずしも同じ程度までではないが）を保持する。
【０１５９】
本発明は、作用剤のすべての適当な同位体変形体（isotopic variation）、又は薬学的に許容されるその塩も含む。本発明の作用剤の同位体変形体、又は薬学的に許容されるその塩は、少なくとも１つの原子が、同じ原子番号を有するが、自然に通常見出される原子質量と異なる原子質量を有する原子によって置換されているものとして定義される。作用剤及び薬学的に許容されるその塩の中に組み込むことができる同位体の例として、水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素及び塩素の同位体、例えば、それぞれ、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆ及び３６Ｃｌなどが挙げられる。作用剤及び薬学的に許容されるその塩のある特定の同位体変形体、例えば、３Ｈ又は１４Ｃなどの放射性同位体が組み込まれているものは、薬剤及び／又は基質組織分布研究において有用である。同位体である、トリチウム化した、即ち、３Ｈ、及び炭素−１４、即ち、１４Ｃは、調製のしやすさ及び検出性にとって特に好適である。さらに、重水素、即ち、２Ｈなどの同位元素との置換は、より大きな代謝的安定性、例えば、インビボ半減期の増大、又は投与必要量の低減から生じる、ある特定の治療上の利点を提供することができ、状況によっては好適となり得る。本発明の作用剤の同位体変形体、及び本発明の薬学的に許容されるその塩は、一般に、適当な試薬の適切な同位体変形体を使用して、従来の手順によって調製することができる。
【０１６０】
溶媒和物
本発明は、本発明の作用剤の溶媒和物形態も含む。特許請求の範囲において使用される用語は、これらの形態を包含する。
【０１６１】
多形
本発明は、さらに、様々な結晶形態、多形形態及び無水形態又は水和形態における本発明の作用剤に関する。化合物は、そのような化合物の合成的調製において使用される溶媒からの精製及び又は単離の方法をわずかに変更することによって、任意のそのような形態で単離することができることが、医薬品産業においてよく確立されている。
【０１６２】
投与
本発明の医薬組成物は、経口、直腸、膣、非経口、筋肉内、腹腔内、動脈内、クモ膜下、気管支内、皮下、皮内、静脈内、経鼻、頬側又は舌下の投与経路に適合させることができる。
【０１６３】
経口投与については、圧縮錠剤、ピル、錠剤、ゲルウレ（gellule）、ドロップ、及びカプセルが特に使用される。好ましくは、これらの組成物は、１用量当たり、１〜２０００ｍｇ、より好ましくは５０〜１０００ｍｇの活性成分を含有する。
【０１６４】
他の投与形態は、溶液又はエマルジョンを含み、これは、静脈内、動脈内、クモ膜下、皮下、皮内、腹腔内又は筋肉内に注射することができ、滅菌した、又は滅菌可能な溶液から調製される。本発明の医薬組成物は、坐剤、ペッサリー、懸濁液、エマルジョン、ローション剤、軟膏、クリーム、ゲル、スプレー、溶液又は粉剤の形態とすることもできる。
【０１６５】
経皮投与の代替の手段は、皮膚パッチの使用によるものである。例えば、活性成分は、ポリエチレングリコール又は液体パラフィンの水性エマルジョンからなるクリーム中に組み込むことができる。活性成分は、必要とされる場合のある安定剤及び保存剤と一緒に、白色ワックス又は白色軟パラフィン基剤からなる軟膏中に、１〜１０重量％の濃度で組み込むこともできる。
【０１６６】
注射用形態は、１用量当たり、１０〜１０００ｍｇ、好ましくは１０〜５００ｍｇの活性成分を含むことができる。
【０１６７】
組成物は、単位剤形、即ち、単位用量又は単位用量の複数ユニット若しくはサブユニットを含む別個の部分の形態で製剤化することができる。
【０１６８】
好適な一実施形態では、ＣＤＫ阻害剤、又は薬学的に許容されるその塩は、経口又は静脈内投与される。
【０１６９】
好適な一実施形態では、ＡＧ１４７８は、静脈内投与される。
【０１７０】
好適な一実施形態では、トラスツズマブは、静脈内投与される。
【０１７１】
好適な一実施形態では、セツキシマブは、静脈内投与される。
【０１７２】
好適な一実施形態では、エルロチニブは経口投与される。
【０１７３】
好適な一実施形態では、ゲフィチニブは経口投与される。
【０１７４】
好適な一実施形態では、ラパチニブは経口投与される。
【０１７５】
投与量
当業者は、即席の組成物の１つの適切な用量を容易に決定することによって、過度の実験を行うことなく、対象に投与することができる。一般に、医師は、個々の患者にとって最適となる実際の投与量を決定し、これは、使用される特定の化合物活性、その化合物の代謝的安定性及び作用の長さ、年齢、体重、全体的な健康、性別、飲食物、投与の様式及び時間、排泄率、薬剤の組合せ、特定の状態の重症度、並びに個々の受けている治療を含めた、様々な要因に依存する。本明細書に開示される投与量は、平均ケースの例示的なものである。より多い又はより少ない投与量範囲が適する、個々の場合ももちろんあり得るが、そのようなものも本発明の目的の範囲内である。
【０１７６】
必要に応じて、作用剤は、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇなどの、体重１ｋｇ当たり０．１〜３０ｍｇ、より好ましくは、体重１ｋｇ当たり２〜２０ｍｇの用量で投与することができる。
【０１７７】
ＣＤＫ阻害剤、又は薬学的に許容されるその塩は一般に、約０．０５〜約５ｇ／日、好ましくは約０．４〜約３ｇ／日を投与される。ロスコビチンは、錠剤又はカプセルで経口投与されることが好ましい。ロスコビチンの総１日量は、単一用量として投与し、又は１日に２、３若しくは４回投与される、別々の投与量に分割することができる。
【０１７８】
ロスコビチンは、０．４〜３ｇ／日の投与量で、経口又は静脈内投与されることが好ましい。
【０１７９】
ガイダンスとして、ＥｒｂＢ阻害剤は一般に、医師の指示に従って、関連した参考文献に記載されている投与量で、又は前記ＥｒｂＢ阻害剤について認可された投与量の間で投与される。前記認可された投与量は、製造者又は文献、例えば、www.emea.eu.int/htms/human/epar/azepar.htmから得ることができる、各薬剤についての製品特性の要約から利用可能である。
【０１８０】
キットのパーツ
本発明のさらなる態様は、
（ｉ）ＥｒｂＢ阻害剤と、
（ii）（ａ）ロスコビチン；（ｂ）３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−２−メチル−ペンタン−２−オール；（ｃ）３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−ペンタン−２−オール；及び（ｄ）（２Ｒ，３Ｓ−３−（６−（（４，６−ジメチルピリジン−３−イルメチルアミノ）−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ）ペンタン−２−オールから選択される、ＣＤＫ阻害剤、又は薬学的に許容されるその塩と
を含むキットのパーツに関する。
【０１８１】
ＥｒｂＢ阻害剤及びＣＤＫ阻害剤、又は薬学的に許容されるその塩はそれぞれ、単位剤形であることが好ましい。キットのパーツは、各成分、即ち、上記成分（ｉ）と（ii）の複数の単位剤形を含むことが好ましい。場合により、キットのパーツは、特定の投薬レジメン、例えば、各成分の単位剤形を服用するべき時間、方法、及び頻度を示す指示書の遵守を促進するための手段をさらに含むことができる。
【０１８２】
本発明を例として、及び以下の図面を参照してさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１８３】
【図１】セリシクリブとトラスツズマブが、ＳｋＢｒ３細胞におけるＨＥＲ２レベルを相乗的に下方制御することを示す図である。より詳細には、ＳｋＢｒ３細胞を１０ｃｍの皿中で、約８×１０５細胞／プレートで播種し、一晩放置して定着させた。細胞を指示された濃度のトラスツズマブ（Ａ）、セリシクリブ（Ｂ）又はセリシクリブ＋トラスツズマブ（Ｃ）とともにインキュベートし、２４時間後に収集した。各処理からのタンパク質溶解産物（３０μｇ）を３〜８％のアクリルアミドトリス−アセテートゲル又は１０％のアクリルアミドビス−トリスゲル上で分解し、ニトロセルロース膜に移し、示した抗体でプローブした。結果は、２つの独立した実験を表す。
【図２】Ａ５４９、Ｈ４６０及びＨ３５８細胞溶解産物中のＥＧＦＲシグナル伝達経路タンパク質の分析結果を示す図である。より詳細には、未処理のＡ５４９、Ｈ４６０及びＨ３５８細胞からの溶解産物（３０μｇ）を３〜８％のアクリルアミドトリス−アセテートゲル又は１０％のアクリルアミドビス−トリスゲル上で分解し、ニトロセルロース膜に移し、示した抗体でプローブした。結果は、２つの独立した実験を表す。
【図３】セリシクリブとＡＧ１４７８が、Ｈ３５８細胞におけるＥＧＦＲシグナル伝達を相乗的に下方制御することを示す図である。より詳細には、Ｈ３５８細胞を１０ｃｍの皿中で、約８×１０５細胞／プレートで播種し、一晩放置して定着させた。細胞をセリシクリブ及びＡＧ１４７８の存在下（＋）又は不存在下（−）で７２時間インキュベートした後、収集した。Ｈ３５８細胞中で、セリシクリブに対するＩＣ５０は８．５μＭであり、ＡＧ１４７８については、ＩＣ５０は４．０μＭであった。各処理からのタンパク質溶解産物（３０μｇ）を３〜８％のアクリルアミドトリス−アセテートゲル又は１０％のアクリルアミドビス−トリスゲル上で分解し、ニトロセルロース膜に移し、示した抗体でプローブした。結果は、２つの独立した実験を表す。
【図４】セリシクリブとＡＧ１４７８が、細胞株に依存した様式でアポトーシスの増大を誘発することを示す図である。より詳細には、Ｈ３５８細胞又はＨ１６５０細胞を１×ＩＣ５０セリシクリブ、ＡＧ１４７８、又はセリシクリブとＡＧ１４７８で７２時間処理した後に収集し、アポトーシスのマーカーについて分析した。（Ａ）各処理からのタンパク質溶解産物（２５μｇ）を４〜１２％のアクリルアミドビス−トリスゲル上で分解し、ニトロセルロース膜に移し、切断されたＰＡＲＰ及びアクチン（負荷対照として）を認識する抗体でプローブした。（Ｂ）細胞のＤＮＡ内容物をヨウ化プロピジウムで染色した後に、フローサイトメトリーによって分析した。サブＧｌ細胞は、正常な二倍体細胞よりも少ないＤＮＡを含むものである。結果は、２つの独立した実験を表す。
【図５】Ｈ３５８異種移植片の増殖に対する、セリシクリブとエルロチニブの組合せの効果を示す図である。より詳細には、マウス（ｎｕ／ｎｕ）の側腹部の単一部位で、約１×１０７Ｈ３５８細胞／マウスを皮下注射した。処理は、腫瘍が約１１０ｍｍ３になったときに開始し、２８日間継続した。結果は、各処理群（９マウス／群）についての平均腫瘍体積（±標準誤差）を示し、媒体、連続して５日間、１日２回腹腔内注射した後、２日中断し、次いで合計４サイクル繰り返した場合のセリシクリブ（５０ｍｇ／ｋｇ）、連続して２８日間の毎日の経口強制飼養によるエルロチニブ（１００ｍｇ／ｋｇ）、又は両薬剤の組合せでの処理を表す。
【図６】Ｈ２９２異種移植モデルを使用した、セリシクリブ（５０ｍｇ  １日２回  腹腔内）、化合物［１］（４０ｍｇ  １日２回  腹腔内）、エルロチニブ（１００ｍｇ  毎日  経口）並びにエルロチニブ＋セリシクリブ、及びエルロチニブ＋化合物［１］の組合せの、平均腫瘍体積に対する効果を示す図である。［実施例］
【０１８４】
材料及び方法
概要
化学物質及び溶媒は、市販供給源から購入し、別段の記載のない限り、受け取った状態で使用した。ＴＨＦ及びＥｔ２Ｏは、Ｎ２下でナトリウム−ベンゾフェノンを用いて、還流下で加熱することによって乾燥し、蒸留によって収集した。トルエンは、Ｎ２下のナトリウム上で、還流下で加熱することによって乾燥した。ＣＨ２Ｃｌ２は、Ｎ２下のＣａＨ２上で、還流下で加熱することによって乾燥した。使用したマイクロ波発振器は、ＣＥＭ社製「Discover」モデルであり、環状の単一モード空洞デザインを有しており、これによりマイクロ波照射を試料管に集中させた。ＴＬＣ（thin-layer chromatography、薄層クロマトグラフィー）は、シリカゲルＧ６０（０．２５ｃｍ）でコーティングしたガラスプレートを使用して実施した。展開したプレートは、空気で乾燥し、ＵＶランプ（２５４／３６５ｎｍ）下で分析した。別段の記載のない限り、無水ＭｇＳＯ４を有機溶液の標準的な乾燥剤として使用した。フラッシュカラムクロマトグラフィーは、Fluorochem社製シリカゲル（３５〜７０μｍ）を使用して実施した。融点（ｍｐ、melting point）は、Electrothermal 9100キャピラリー融点装置を用いて求め、修正していない。略語（ｄｅｃ）は分解点を表す。すべての場合において、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、重水素化溶媒をロックとして、及び残留溶媒を内部基準として使用して、Broker Avance 300（３００．１ＭＨｚ）又はVarian Gemini 2000（３００ＭＨｚ）分光計で記録した。ＰＥＮＤＡＮＴシーケンス（sequence）を使用する１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、Bruker Avance 300（７５．５ＭＨｚ）分光計で記録した。すべての他の１３Ｃ−スペクトルは、合成パルス１Ｈデカップリングを使用して、Varian Gemini 2000（７５．５ＭＨｚ）分光計で記録した。カップリング定数（Ｊ）は、最も近い０．１Ｈｚまで引用する。以下の略語を使用する：ｓ、一重線；ｄ、二重線；ｔ、三重線；ｑ、四重線；ｑｕ、五重線（quintuplet）；ｍ、多重線及びｂｒ、幅広線。微量元素分析は、Mrs S Williamson、School of Chemistry、Purdie Building、University of St. Andrews、UKによって実施された。得られた結果は計算値の０．４％以内であった。エレクトロスプレー質量スペクトル（ＥＳＩ、Electrospray mass spectra）は、Waters 2975 HPLCに連結したMicromass社製ＬＣＴ質量分析計で記録した。分析用ＲＰ−ＨＰＬＣは、Dionex P580ポンプに連結したDionex ASI-100自動試料注入器を使用して実施した。２５℃の温度に維持したPhenomenex社製カラム（１５０×４．６０ｍｍ、Synergi  ４μ  hydro-RP  ８０Å）を分析目的で使用した。ＨＰＬＣユニットは、Chromeleonソフトウェアを使用して制御した。１ｍＬ／分の流速で、Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ系（０．１％のＣＦ３ＣＯＯＨを含む）を使用して線形勾配溶出を実施した。純度は、クロマトグラム（λ＝２５４ｎｍ）の積分によって評価した。
【０１８５】
ＥｒｂＢ阻害剤
ＡＧ１４７８は、Tocris Biosciences社から得た。トラスツズマブは、Genentech社から得た。セツキシマブは、Imclone社から得た。エルロチニブは、Genentech社から得た。ゲフィチニブは、Astra Zeneca社から得た。ラパタニブ（lapatanib）は、Glaxo SmithKline社から得た。
【０１８６】
セリシクリブの調製
ロスコビチンは、欧州特許第０８７４８４７号明細書（ＣＮＲＳ）に開示されている方法に従って調製した。セリシクリブは、Cyclacel社（Dundee、UK）から得た。（３Ｒ）−３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−２−メチル−ペンタン−２−オール［１］、（３Ｓ）−３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−２−メチル−ペンタン−２−オール［２］及び（２Ｒ３Ｓ）−３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−ペンタン−２−オール［３］、及び他の式（Ｉ）の化合物は、国際公開第２００４／０１６６１２号パンフレット（Cyclacel Ltd）に開示されている方法に従って調製した。
【０１８７】
（２Ｒ，３Ｓ−３−（６−（（４，６−ジメチルピリジン−３−イルメチルアミノ）−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ）ペンタン−２−オール［４］の調製
（２Ｒ，３Ｓ）−３−アミノ−ペンタン−２−オールは、アミンに使用した保護基が異なる２つの経路の一方又は他方によって調製した。式（Ｉ）の化合物のさらなる詳細は、ＧＢ０７０６６３２．７と米国特許仮出願第６０／９２１，８９７号明細書からの優先権を主張している、同時係属のＰＣＴ出願＜代理人参照Ｐ２９０５５ＷＯ＞に見出すことができる。
【０１８８】
トリチルを保護基として使用した経路１
（Ｓ）−２−（トリチルアミノ）ブタン−１−オール
【０１８９】
【化１２】
0005514099.tif 000014
【０１９０】
室温で、アルゴン雰囲気下で、（Ｓ）−（＋）−２−アミノブタン−１−オール（１０ｇ、１１２．１８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（ＤＣＭ、２５０ｍｌ）中の攪拌した溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、diisopropylethylamine、１９．４ｍｌ、１１２．１８ｍｍｏｌ）、その後に塩化トリチル（３１．２ｇ、１１２．１８ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物をこの温度で４８時間攪拌し、そのとき、ＴＬＣ（ヘキサン：エーテル：ＭｅＯＨ；５５：４０：５）により、反応が完了していたことが示された。溶媒を真空で蒸発し、残留物を酢酸エチル中に溶解させた。有機溶液を水で洗浄し（２回）、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を除去することによって、（Ｓ）−２−（トリチル−アミノ）−ブタン−１−オールを薄黄色油状物として得た；収量：３３ｇ（８９％）。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，２５０ＭＨｚ）：δ０．７２（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，−ＮＨＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ２ＯＨ）、１．１５〜１．１０（ｍ，２Ｈ，−ＮＨＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ２ＯＨ）、２．０５（１Ｈ，ｓ，ｂｒ，ＮＨ）、２．２４（１Ｈ，ｓ，ｂｒ，ＯＨ）、２．６２〜２．５４（ｍ，１Ｈ，−ＮＨＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ２ＯＨ）、３．１７〜３．０８（１Ｈ  ｍ，−ＮＨＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）ＣＨＨＯＨ）、３．３５〜３．２９（１Ｈ，ｍ，ＮＨＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）ＣＨＨＯＨ）、７．３７〜７．２（１２Ｈ，ｍ，，ＡｒＨ）、７．６５〜７．５８（３Ｈ，ｍ，ＡｒＨ）；δＣ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１４６．８６（Ｃ）、１２９．４３（６×ＣＨ）、１２７．９０（６×ＣＨ）、１２６．４８（３×ＣＨ）、７１．２７（Ｃ）、６２．７２（ＣＨ２）、４８．９１（ＣＨ）、２４．５５（ＣＨ２）、１０．４７（ＣＨ３）
【０１９１】
（Ｓ）−２−（トリチルアミノ）ブチルアルデヒド
【０１９２】
【化１３】
0005514099.tif 000015
【０１９３】
−７８℃で、アルゴン雰囲気下で、乾燥ジメチルスルホキシド（２．４ｍｌ、２．８当量、３３．８２ｍｍｏｌ）の乾燥ジクロロメタン（３０ｍｌ）中の攪拌した溶液に、塩化オキサリル（ＤＣＭ中の２Ｍ溶液、８．４５ｍｌ、１．４０当量、１６．９ｍｍｏｌ）を液滴で添加した。この反応混合物を−７８℃で１時間攪拌し、その後、（Ｓ）−２−（トリチル−アミノ）−ブタン−１−オール（４ｇ、１当量、１２．０７ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（３０ｍｌ）中の溶液を攪拌しながら液滴で添加した。この反応混合物をこの温度で２時間攪拌し、その後、トリエチルアミン（ＴＥＡ、triethylamine、８．４ｍｌ、５当量、６０．２７ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（３０ｍｌ）中の溶液を添加し、この溶液を１時間にわたって室温に加温させた。この反応混合物をＤＣＭ（１００ｍｌ）でさらに希釈し、水（２５０ｍｌ）で洗浄した。この水相をＤＣＭ（３×５０ｍｌ）で抽出し、合わせた有機相をブライン（５０ｍｌ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、真空で蒸発させた。残留物をフラッシュシリカクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン１：４）によって精製することによって、（Ｓ）−２−（トリチル−アミノ）−ブチルアルデヒドを薄黄色油状物として得た；収量：３．６４ｇ（９１％）。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，２５０ＭＨｚ）：δ０．９５（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，−ＮＨＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）ＣＨＯ）、１．７２〜１．５２［２Ｈ，ｍ，ＮＨＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）ＣＨＯ］、２．７６（１Ｈ，ｓ，ｂｒ，−ＮＨ）、３．４１〜３．３６［１Ｈ，ｍ，ＮＨＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）ＣＨＯ］、７．３５〜７．１７（１２Ｈ，ｍ，ＡｒＨ）、７．６７〜７．５１（３Ｈ，ｍ，ＡｒＨ）、９．０５（１Ｈ，ｓ，ＮＨＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）ＣＨＯ）。δＣ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）２０２．９５（ＣＯ）、１４６．２３（Ｃ）、１２９．２３（６×ＣＨ）、１２７．９６（６×ＣＨ）、１２６．８５（３×ＣＨ）、７１．１３（Ｃ）、６２．６２（ＣＨ）、２４．７８（ＣＨ２）、１０．４８（ＣＨ３）
【０１９４】
（２Ｒ，３Ｓ）−３−（トリチルアミノ）ペンタン−２−オール
【０１９５】
【化１４】
0005514099.tif 000016
【０１９６】
−７８℃で、アルゴン雰囲気下で、ＣｕＢｒ．ＳＭｅ２（３ｇ、１４．６ｍｍｏｌ）の、無水エーテル（１００ｍｌ）中の攪拌した懸濁液に、メチルリチウム（エーテル中、１．６Ｍ、１６．５ｍｌ、４．０当量、２６．５ｍｍｏｌ）を液滴で添加し、この溶液を１時間にわたって室温に加温させた。この混合物を−７８℃に再冷却し、（Ｓ）−２−（トリチル−アミノ）−ブチルアルデヒド（２．２ｇ、６．６２ｍｍｏｌ）のエーテル（２５ｍｌ）中の溶液を攪拌しながら液滴で添加した。この反応混合物をこの温度で２時間攪拌し、次いで１時間にわたって室温に加温させた。ＮＨ４Ｃｌ（５０ｍｌ）の飽和水溶液を添加し、２層を分離した。有機相をブライン（５０ｍｌ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、真空で蒸発させた。残留物をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、ヘキサン：酢酸エチル（８０：２０）で溶出することによって、（２Ｒ，３Ｓ）−３−（トリチルアミノ−ペンタン−２−オールを薄黄色油状物として得た；収量：１．５ｇ（６６％）。（７５％ｄｅ  ２Ｒ，３Ｓ：２５％ｄｅ  ２Ｓ，３Ｓ）。１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ，２５０ＭＨｚ）：δ０．０．４７＋０．５５（２×ｔ，Ｊ＝７．５０＋７．２６Ｈｚ−ＮＨＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）ＯＨ）、０．９９〜１．１２（ｍ，５Ｈ，−ＮＨＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）ＯＨ）、２．０１（１Ｈ，ｍ，，−ＮＨＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）ＯＨ）、３．２２〜３．４３（ｍ，１Ｈ，−ＮＨＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）ＯＨ）、４．４１［１Ｈ，ｄ，，Ｊ＝３．３，ＮＨＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）ＯＨ］、７．１４〜７．５６（１５Ｈ，ｍ，，ＡｒＨ）。δＣ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１４６．８８（Ｃ）、１２８．９７（６×ＣＨ）、１２７．８３（６×ＣＨ）、１２６．４３（３×ＣＨ）、７１．０３（Ｃ）、６８．１３（ＣＨ）、５８．７７（ＣＨ）、２３．０９（ＣＨ２）、１７．８８（ＣＨ３）、１０．４７（ＣＨ３）
【０１９７】
（２Ｒ，３Ｓ）−３−アミノ−ペンタン−２−オール
【０１９８】
【化１５】
0005514099.tif 000017
【０１９９】
室温で、アルゴン雰囲気下で、（２Ｒ，３Ｓ）−３−（トリチル−アミノ）−ペンタン−２−オール（１．６４ｇ、４．７５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（２０ｍｌ）中の攪拌した溶液に、トリフルオロ酢酸（１０ｍｌ）を液滴で添加し、この溶液をこの温度で１時間攪拌した。溶媒を真空で蒸発させ、残留物を攪拌しながらヘキサン（１５０ｍｌ）を用いてエーテル（１５ｍｌ）から沈殿させることによって黄色油状物を得た。溶媒を油状物からデカントし、この油状物をヘキサン（３０ｍｌ）で洗浄し、真空で乾燥することによって、（２Ｒ，３Ｓ）−３−アミノ−ペンタン−２−オールを薄黄色油状物として得た；収量：０．３０ｇ（９８％）。（７５％ｄｅ  ２Ｒ，３Ｓ：２５％ｄｅ  ２Ｓ，３Ｓ）。１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ，２５０ＭＨｚ）：δ０．９１３＋０．９２３（２×ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．５０＋７．５０Ｈｚ，ＮＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）ＯＨ）、１．１１＋１．１８（３Ｈ，２×ｄ，Ｊ＝６．４８＋６．４８Ｈｚ，ＮＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）ＯＨ）、１．４１〜１．６５（２Ｈ，ｍ，ＮＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）ＯＨ）、２．７６＋２．９３［２×１Ｈ，ｍ，ＮＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）ＯＨ］、３．６１〜３．６９＋３．８０〜３．９０［２×１Ｈ，ｍ，ＮＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）ＯＨ］、７．７３（２Ｈ，ｓ，ｂｒ，ＮＨ２）。
【０２００】
ジベンジル化（dibenzylation）によってアミンを保護した経路２
（Ｓ）−２−（ジベンジルアミノ）ブタン−１−オール
【０２０１】
【化１６】
0005514099.tif 000018
【０２０２】
（Ｓ）−（＋）−２−アミノブタン−１−オール（５ｇ、５６．１８ｍｍｏｌ）の乾燥アセトニトリル（１００ｍｌ）中の攪拌した溶液に、乾燥粉末化した炭酸カリウム（３１ｇ、２２４．７２ｍｍｏｌ）、その後に臭化ベンジル（１９ｇ、１１１．１１ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で２４時間攪拌した。溶媒を真空下で除去し、残留物を酢酸エチル（１００ｍｌ）及び水（１００ｍｌ）中に溶解させた。有機相を水で再び洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮することによって、純粋な生成物をわずかに黄色の油状物として得た（１４．５ｇ、９７．３％）。δＨ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）０．９８（３Ｈ，ｔ，Ｊ  ７．５，ＣＨＣＨ２ＣＨ３）、１．３８〜１．２（１Ｈ，ｍ，ＣＨＣＨＨＣＨ３）、１．９４〜１．７８（１Ｈ，ｍ，ＣＨＨＣＨ３）、２．８３〜２．７１（１Ｈ，ｍ，ＣＨＣＨＨＣＨ３）、３．２２（１Ｈ，ｓ，ｂ，ＯＨ）、３．６５〜３．４（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２ＯＨ）、３．４７（２Ｈ，ｄ，Ｊ  １７．５，２×ＣＨＨＰｈ）、３．９４（２Ｈ，ｄ，Ｊ  １７．５，２×ＣＨＨＰｈ）、７．４６〜７．２６（１０Ｈ，ｍ，２×Ｃ６Ｈ５）；δＣ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１３９．４２（２×Ｃ）、１２９．１（２×ＣＨ）、１２８．５２（２×ＣＨ）、１２７．２５（２×ＣＨ）、６１．９７（ＣＨ）、６０．６７（ＣＨ２）、５３．２３（ＣＨ２）、１７．９２（ＣＨ２）、１１．８３（ＣＨ３）；ｍ／ｚ  ２７０．２（Ｍ＋Ｈ）
【０２０３】
（Ｓ）−２−（ジベンジルアミノ）ブタナール
【０２０４】
【化１７】
0005514099.tif 000019
【０２０５】
塩化オキサリルのジクロロメタン（３．１８ｍｌ、６．３６ｍｍｏｌ）中の２Ｍの溶液を−７８．０℃に冷却し、乾燥窒素下で、乾燥ジクロロメタン（２０ｍｌ）を用いて希釈した。ジメチルスルホキシド（１ｇ、１２．７２ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン溶液を冷却された攪拌した溶液に液滴で添加した。添加を完了した後、反応物をさらに１時間攪拌した。（Ｓ）−２−（ジベンジルアミノ）ブタン−１−オール（１．４３ｇ，５．３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液を５分にわたって添加した。１０分後に、ジイソプロピルエチルアミン（２．７３ｇ、２１．２ｍｍｏｌ）を添加した。この反応物を室温に加温させ、攪拌しながら１時間放置した。これを０℃に冷却し、酢酸エチル／水（５０ｍｌ：５０ｍｌ）を添加した。有機層を水（５０ｍｌ）、ブライン（５０ｍｌ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮した。生成物をフラッシュシリカカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン  １：４）により精製することによって、純粋な生成物（１．２８ｇ、９０．５％）を得た。δＨ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）０．８８（３Ｈ，ｔ，Ｊ  ７．５，ＣＨＣＨ２ＣＨ３）、１．７７〜１．５４（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２ＣＨ３）、２．９９（１Ｈ，ｔ，Ｊ  ７．５，ＣＨＣＨ２ＣＨ３）、３．７４〜３．５７（４Ｈ，ｍ，２×ＣＨ２Ｐｈ）、７．３１〜７．１１（１０Ｈ，ｍ，２×Ｃ６Ｈ５）９．６４（１Ｈ，ｓ，ＣＨＯ）；δＣ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）２０３．９（ＣＯ）、１３９．３３（２×Ｃ）、１２８．９９（４×ＣＨ）、１２８．４５（４×ＣＨ）、１２７．３（２×ＣＨ）、６８．４６（ＣＨ）、５４．８５（ＣＨ２）、１７．４４（ＣＨ２）、１１．８３（ＣＨ３）；ｍ／ｚ  ２６８．２（Ｍ＋Ｈ）
【０２０６】
（２Ｒ，３Ｓ）−３−（ジベンジルアミノ）ペンタン−２−オール
【０２０７】
【化１８】
0005514099.tif 000020
【０２０８】
−７８℃で、アルゴン雰囲気下で、ＣｕＢｒ．ＳＭｅ２（１．５４ｇ、７．５ｍｍｏｌ）の無水エーテル中の攪拌した懸濁液に、メチルリチウム（エーテル中１．６Ｍ、９．４ｍｌ、１５ｍｍｏｌ）を液滴で添加した。添加が完了した後、反応物を室温に加温させた。この反応物を−７８℃に再冷却し、（Ｓ）−２−（ジベンジルアミノ）ブタナール（１ｇ、３．７５ｍｍｏｌ）のエーテル（２０ｍｌ）中の溶液を液滴で添加した。添加後、攪拌を２時間継続した。次いで反応をＮＨ４Ｃｌ（１０ｍｌ）の飽和水溶液でクエンチした。反応混合物をエーテル（２×３０ｍｌ）で抽出し、合わせた有機相をブライン（２０ｍｌ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、真空で蒸発させた。残留物をフラッシュシリカゲル勾配カラムクロマトグラフィーによって精製し、ヘキサン：酢酸エチル（１００：０→８０：２０）で溶出することによって、生成物を薄黄色油状物（０．９５ｇ、８９％）として、唯一の異性体として得た。δＨ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１．０５（３Ｈ，ｔ，Ｊ  ７．５，ＣＨＣＨ２ＣＨ３）、１．２５［３Ｈ，ｄ，Ｊ  ７．５，ＣＨ（ＣＨ３）ＯＨ］、１．６〜１．４９（１Ｈ，ｍ，ＣＨＨＣＨ３）、１．８８〜１．７３（１Ｈ，ｍ，ＣＨＨＣＨ３）、２．４１（１Ｈ，ｓ，ｂｒ，ＯＨ）、２．６６〜２．５９（１Ｈ，ｍ，ＣＨＣＨ２ＣＨ３）、３．８５〜３．６５（４Ｈ，ｍ，２×ＣＨ２Ｐｈ）、４．０５〜３．９（１Ｈ，ｍ，ＣＨＯＨ）、７．４１〜７．２５（１０Ｈ，ｍ，ＡｒＨ）δＣ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１４０．０５（２×Ｃ）、１２８．９８（４×ＣＨ）、１２８．３７（４×ＣＨ）、１２７．３（２×ＣＨ）、６６．８１（ＣＨ）、６３．６５（ＣＨ）、５５．４１（ＣＨ２）、２０．６３（ＣＨ３）１８．４４（ＣＨ２）、１２．５（ＣＨ３）
【実施例１】
【０２０９】
２−クロロ−４，６−ジメチルニコチノニトリル
【０２１０】
【化１９】
0005514099.tif 000021
【０２１１】
４，６−ジメチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボニトリル（５ｇ、３４ｍｍｏｌ）をオキシ塩化リン（２０ｍｌ）に添加した。反応物を還流しながら２時間攪拌し、その後完了したと見られた。揮発分を除去し、残留物をガソリンでトリチュレートした。得られた固体を濾別（filter off）し、ヘキサンで洗浄し、乾燥することによって、純粋な白色固体（５．１ｇ、９０％）を得た。δＨ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）２．５５（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３）、２．５７（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３）、７．０９（１Ｈ，ｓ，ＡｒＨ）；δＣ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１６２．６４（Ｃ）、１５４．３９（Ｃ）、１５２．２６（Ｃ）、１２３．２２（ＣＨ）、１１４．２８（Ｃ）、１０８．３１（Ｃ）、２４．５（ＣＨ３）、２０．５４（ＣＨ３）。；ｍ／ｚ  １８９（Ｍ＋Ｎａ）
【０２１２】
４，６−ジメチルピリジン−３−イルメチルカルバミン酸ｔ−ブチルエステル
【０２１３】
【化２０】
0005514099.tif 000022
【０２１４】
２−クロロ−４，６−ジメチル−ニコチノニトリル（５ｇ、３０．１ｍｍｏｌ）を１０％の酢酸／エタノール（３０ｍｌ）中に溶解させた。１０％の木炭上パラジウム触媒（０．５ｇ）を添加し、反応物を水素雰囲気下で、６０℃で２４時間攪拌した。この混合物をセライトの詰め物を通して濾過した。揮発分を除去し、粗残留物をジクロロメタン（３０ｍｌ）中に溶解させた。次いで攪拌した溶液に、トリエチルアミン（５ｍｌ）、その後にジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（６．５ｇ、３０ｍｍｏｌ）を添加した。３時間後に、溶媒を除去し、残留物を酢酸エチル中に溶解させた。これを水（５０ｍｌ）、飽和ビカーボネート（５０ｍｌ）で洗浄し、乾燥し、蒸発させた。粗生成物をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン  １：２）により精製することによって、１．４ｇの純粋な表題化合物を得た（２０％の収率）。δＨ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１．４３（９Ｈ，ｓ，３×ＣＨ３）２．１９（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３）、２．３８（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３）、４．１９（２Ｈ，ｓ，ｂｒ，ＡｒＣＨ２ＮＨ）、６．８４（１Ｈ，ｓ，ＡｒＨ）、８．１５（１Ｈ，ｓ，ＡｒＨ）；δＣ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１５７．４１（ＣＯ）、１５５．６３（Ｃ）、１４８．９３（ＣＨ）、１４５．９１（Ｃ）、１２９．５１（Ｃ）、１２４．７６（ＣＨ）、７９．４４（Ｃ）、４６．１２（ＣＨ２）、２８．３２（３×ＣＨ３）、２３．７４（ＣＨ３）、１８．９７（ＣＨ３）；ｍ／ｚ  ２３７．２（Ｍ＋Ｈ）
【０２１５】
（４，６−ジメチルピリジン−３−イルメチル）−（２−フルオロ−９Ｈ−プリン−６−イル）−アミン
【０２１６】
【化２１】
0005514099.tif 000023
【０２１７】
０℃で、アルゴン雰囲気下で、６−クロロ−２−フルオロプリン（０．８３ｇ、４．９ｍｍｏｌ）のｎ−ＢｕＯＨ（５０ｍｌ）中の攪拌した溶液に、ＤＩＥＡ（２．５ｍｌ、１４．７ｍｍｏｌ）、その後に（４，６−ジメチルピリジン−３−イル）メタンアミン（１ｇ、７．３５ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物をこの温度で１時間攪拌し、次いで室温に戻し、４時間攪拌したが、依然として完了していないと見られたので、反応物を１００℃に加熱し、その温度で２時間放置した。溶媒を真空で蒸発させ、残留物をシリカゲル上で勾配フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ（１００：０→９０：１０）で溶出することによって、生成物を白色固体として得た；収量：０．８６ｇ（６５％）。δＨ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）２．３５（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３）、２．３９（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３）、４．６１（２Ｈ，ｓ，ｂｒ，ＮＨＣＨ２）、７．０７（１Ｈ，ｓ，ＡｒＨ）、８．１３（１Ｈ，ｓ，ＡｒＨ）、８．３３（１Ｈ，ｓ，ＡｒＨ）、８．６９（１Ｈ，ｓ，ｂｒ，ＮＨ）；δＣ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１６１．２（Ｃ）、１５８．５７（Ｃ）、１５６．０８（Ｃ）、１５０（Ｃ）、１４８．０８（ＣＨ）、１４８．１４（ＣＨ）、１４７．９（ＣＨ）、１４５．９３（Ｃ）、１２９．９２（Ｃ）、１２９．７６（Ｃ）、１２４．３７（ＣＨ）、４１．７（ＣＨ２）、２３．１７（ＣＨ３）、１８．１４（ＣＨ３）；ｍ／ｚ  ２７３．２（Ｍ＋Ｈ）
【０２１８】
（４，６−ジメチルピリジン−３−イルメチル）−（２−フルオロ−９−イソプロピル  ９Ｈ−プリン−６−イル）−アミン
【０２１９】
【化２２】
0005514099.tif 000024
【０２２０】
室温で、アルゴン雰囲気下で、（４，６−ジメチル−ピリジン−３−イルメチル）−（２−フルオロ−９Ｈ−プリン−６−イル）−アミン（０．６ｇ、１．９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１０ｍｌ）中の攪拌した溶液に、Ｋ２ＣＯ３（粉末化、無水、１．７７ｇ、５当量、１３ｍｍｏｌ）、その後に２−ブロモプロパン（１．８ｍｌ、１０当量、１９ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を室温で２４時間攪拌し、そのとき、ＴＬＣ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ；９０：１０）により、反応が完了していたことが示された。溶媒を真空で蒸発させ、残留物を水（５０ｍｌ）と酢酸エチル（５０ｍｌ）の間で分配し、水相を分離し、さらなるＥｔＯＡｃ（２×５０ｍｌ）で抽出した。まとめた有機相をブライン（５０ｍｌ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、真空で蒸発させ、残留物をシリカゲル上で勾配カラムクロマトグラフィーによって精製し、ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ（１００：０→９５：５）で溶出することによって、生成物を黄色膜として得た（０．４ｇ、５９％）。δＨ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１．５２［６Ｈ，ｄ，Ｊ  ７．５  ＣＨ（ＣＨ３）２］２．２７（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３）、２．４５（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３）、４．７３〜４．６２（３Ｈ，ｍ，ＮＨＣＨ２及びＣＨ［ＣＨ３］２）、６．９１（１Ｈ，ｓ，ＡｒＨ）、７．１２（１Ｈ，ＮＨ）、７．４７（１Ｈ，ｓ，ＡｒＨ）、８．３２（１Ｈ，ｓ，ＡｒＨ）；δＣ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１６０．７７（Ｃ）、１５７．８９（Ｃ）、１５７．４３（Ｃ）、１５６．１２（Ｃ）、１５５．７９（Ｃ）、１４９．１４（ＣＨ）、１３７．７（ＣＨ）、１２８．７（Ｃ）、１２９．７６（Ｃ）、１２４．８３（ＣＨ）、４７．２（ＣＨ）、４０．１４（ＣＨ２）、２３．９（ＣＨ３）、２２．４７（２×ＣＨ３）、１８．５４（ＣＨ３）；ｍ／ｚ  ３１５．３（Ｍ＋Ｈ）
【０２２１】
（２Ｒ，３Ｓ−３−（６−（（４，６−ジメチルピリジン−３−イルメチルアミノ）−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ）ペンタン−２−オール
【０２２２】
【化２３】
0005514099.tif 000025
【０２２３】
室温で、アルゴン雰囲気下で、（４，６−ジメチル−ピリジン−３−イルメチル）−（２−フルオロ−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン−６−イル）−アミン（３００ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ）の、ｎ−ＢｕＯＨ／ＤＭＳＯ（５ｍｌ、４：１）中の攪拌した溶液に、ＤＩＥＡ（１．７ｍｌ、１０当量、８．４ｍｍｏｌ）、その後に（２Ｒ，３Ｓ）−３−アミノ−ペンタン−２−オール（０．５ｇ、４．８ｍｍｏｌ）を添加した。フラスコに冷却管を装着し、反応混合物を１４０℃で予熱した油浴中に置き、この温度で７２時間攪拌した。この反応混合物を室温に冷却させ、溶媒を真空で蒸発させた。残留物を酢酸エチル（５０ｍｌ）と水（５０ｍｌ）の間で分配し、水相をさらなるＥｔＯＡｃ（２×２５ｍｌ）で抽出し、合わせた有機相をブライン（５０ｍｌ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、真空で蒸発させた。残留物をシリカゲル上でフラッシュ勾配カラムクロマトグラフィーによって精製し、ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ（１００：０→９５：５）で溶出することによって、５５ｍｇの純粋な表題化合物（１２％）を得た。δＨ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）０．９５（３Ｈ，ｔ，Ｊ  ７．５，ＣＨＣＨ２ＣＨ３）、１．０６（３Ｈ，ｄ，Ｊ  ７．５，ＣＨＣＨ３ＯＨ）１．４８［６Ｈ，ｄ，Ｊ  ７．５  ＣＨ（ＣＨ３）２］、２．２４（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３）、２．４（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３）、３．９２〜３．８２（２Ｈ，ｍ，ＮＨＣＨ２）、４．６７〜４．４５（３Ｈ，ｍ，ＣＨＥｔＣＨＭｅＯＨ）、６．１５（１Ｈ，ｓ，ｂｒ，ＮＨ）、６．８７（１Ｈ，ｓ，ＡｒＨ）、７．３７（１Ｈ，ＡｒＨ）、８．３１（１Ｈ，ｓ，ＡｒＨ）；δＣ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１６０．１１（Ｃ）、１５７．６８（Ｃ）、１５４．５７（Ｃ）、１４９．４２（ＣＨ）、１４６．３８（Ｃ）、１３４．５４（ＣＨ）、１２９．２４（Ｃ）、１２４．８４（ＣＨ）、７１．５２（ＣＨ）、５９．６５（ＣＨ）、４６．４７（ＣＨ）、４０．３３（ＣＨ２）、２４．９４（ＣＨ２）、２３．８９（ＣＨ３）、２３．５２（２×ＣＨ３）、１７．３７（ＣＨ３）、１２．５７（ＣＨ３）；ｍ／ｚ  ３９８．３（Ｍ＋Ｈ）
【０２２４】
略語
以下の略語を使用する：ＣＴＤ（Carboxyl terminal domain）、カルボキシル末端ドメイン；ＤＭＥＭ（Dulbecco's modified Eagle's medium）、ダルベッコ変法イーグル培地；ＤＭＳＯ（Dimethylsulphoxide）、ジメチルスルホキシド；ＥＧＦ（Epidermal Growth Factor）、上皮成長因子；ＥＧＦＲ（Epidermal Growth Factor Receptor）、上皮成長因子受容体；ＥＲＫ（extracellular signal regulated kinase）、細胞外シグナル制御キナーゼ；ＦＣＳ（Foetal calf serum）、ウシ胎児血清；ＮＳＣＬＣ、非小細胞肺癌；ＰＡＲＰ（poly-ADP ribose polymerase）、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ；ＰＢＳ（Phosphate-buffered Saline）、リン酸緩衝食塩水；ＰＫＢ（protein kinase B）、プロテインキナーゼＢ；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis）、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動。
【０２２５】
細胞株、細胞培養及び試薬
ＭＣＦ７、Ａ５４９、Ｈ４６０、ＳｋＢｒ３、Ｈ１６５０及びＨ３５８細胞は、ATCC社（Mannassas、USA）から購入した。細胞培養は、ＲＰＭＩ培地中で増殖させたＨ１６５０及びＨ３５８細胞を除いて、ＤＭＥＭ中で維持した。細胞は、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１００ユニット／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含む培地中で、５％のＣＯ２の加湿雰囲気中、３７℃で培養した。別段の記載のない限り、すべての試薬はSigma社（Poole、UK）から購入した。
【０２２６】
薬剤の組合せの分析
実験は、９６ウェルプレート中で実施した。ＳｋＢｒ３及びＭＣＦ７細胞は、１％（ｖ／ｖ）のＦＣＳを含む培地中に、５，０００細胞／ウェルの密度で播種した。１０％（ｖ／ｖ）のＦＣＳを含む培地中に、Ｈ３５８、Ｈ１６５０及びＨ４６０細胞を３，０００細胞／ウェルで播種し、Ａ５４９細胞を２，０００細胞／ウェルで播種した。セリシクリブ（Cyclacel Ltd.社製、Dundee、UK）及びＡＧ１４７８（Tocris Bioscience社製、Bristol、UK）の原液は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で調製し、トラスツズマブ（Genentech Inc社製、South San Francisco、USA）は、０．９％（ｗ／ｖ）の滅菌食塩液中に溶解させた。各薬剤のＩＣ５０値に及ぶ濃度範囲で、各化合物の連続希釈液（１．５倍）を調製した。
【０２２７】
潜在的な相乗的相互作用の実験評価のために、同時処理法には、個々の化合物を単独で用いて７２時間処理した細胞の適当な対照とともに、セリシクリブと、トラスツズマブ又はＡＧ１４７８とを用いた７２時間の細胞の同時処理が含まれた。連続処理法では、１つの薬剤をプレーティングして２時間後に細胞に添加し、２４時間放置した。次いで培地を吸引し、第２の薬剤を含む新鮮な培地と交換し、さらに７２時間インキュベートした。連続処理法についての２つの個々の処理対照では、薬剤処理の１つを薬剤を含まない培地で置き換えた。すべての処理は三つ組のウェルで実施した。
【０２２８】
薬剤で処理した後、各ウェル中の生細胞数を１０％のアラマーブルー（Roche社製、Lewes、East Sussex、U.K.）を含む培地中で１時間インキュベートし、４８８〜５９５ｎｍで吸光度を測定することによって推定した。薬剤相互作用は、Calcusynソフトウェアパッケージ（BioSoft社製、Cambridge、U.K.）を使用して分析した。これは、Chou and Talalayの半有効モデルに基づく［Chou, T.C. and P. Talalay, Quantitative analysis of dose-effect relationships: the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors. Adv Enzyme Regul, 1984. 22: p. 27-55］。組合せ指数（Ｃ．Ｉ．、combination index）が１であることは、相加的な薬剤相互作用を示し、１を超えるＣ．Ｉ．は拮抗性であり、１未満のスコアは相乗的であった。
【０２２９】
ウェスタンブロット分析
細胞を１０ｃｍのプレート上で約８×１０５細胞／プレートで播種し、一晩放置して定着させた。化合物をプレートに添加し、細胞を指定した時間インキュベートした。培地をそれぞれのウェルから取り出し、１，０００×ｇで５分間遠心機にかけることによって、プレート表面からはがれていた任意の細胞をペレットにした。プレートに依然として接着していた細胞を氷冷緩衝液Ａ（２０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Merck社製、Nottingham、U.K.）を含む、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０）で１回洗浄し、次いで掻爬して０．３５０ｍｌの緩衝液Ｂ（１０ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１０ｍＭのフッ化ナトリウム及び１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウムを含む緩衝液Ａ）中に入れた。次いで再懸濁した細胞を適切な培地細胞ペレット（media cell pellet）を用いてプールし、超音波処理（５アンペアで、Sanyo soniprep 150を使用して、２×３秒のバースト）によって溶解させた。各溶解産物のタンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイ（Perbio Science, Northumberland、U.K.）を使用して求めた。溶解産物（２０〜３０μｇのタンパク質／ウェル）を３〜８％のアクリルアミドトリス−アセテートゲル又は１０％のアクリルアミドビス−トリスゲル（Invitrogen社製、Glasgow、U.K.）上で分解し、Invitrogen社製ウェットトランスファーシステムを使用して、タンパク質をニトロセルロース膜（Schleicher & Schuell社製、London、U.K.）に移した。０．０２％（ｖ／ｖ）のTween 20（ＰＢＳＴ）及び５％（ｗ／ｖ）の無脂肪のドライミルクを含むＰＢＳ中で、室温で１時間膜をブロックした。一次抗体のインキュベーションは、以下の一次抗体を使用して、３％（ｗ／ｖ）のドライミルクを含むＰＢＳＴ中で、２〜８℃で一晩実施した：ＥｒｂＢ２（Calbiochem社製、Nottingham、U.K.）、ＥＧＦＲ（Calbiochem社製）、ホスホ−Ｔｙｒ１０６８  ＥＧＦＲ（New England Biolabs社製、Hertfordshire、U.K.）、サイクリンＤ１（Lab Vision社製、Suffolk、U.K.）、ホスホ−Ｔｈｒ１８５  ＥＲＫ１及びホスホ−Ｔｈｒ２０２  ＥＲＫ２（Abcam社製、Cambridge、U.K.）、ＥＲＫ２（Abeam社製）、Ａｓｐ−２１４切断ＰＡＲＰ（BD Pharmingen社製、Oxford、UK）並びにβ−アクチン。膜をＰＢＳＴ中で３回洗浄し、次いで３％（ｗ／ｖ）ミルクを含むＰＢＳＴ中１：５０００の希釈で、適切な西洋わさびペルオキシダーゼ結合二次抗体（Perbio社製）とともに、１時間インキュベートした。膜をＰＢＳＴ中で３回洗浄した後、高感度化学発光キット（Amersham Corporation社製、Buckinghamshire、U.K.）を使用して現像した。
【０２３０】
フローサイトメトリー
Ｈ３５８又はＨ１６５０細胞を１０ｃｍのプレート中で、約５×１０５細胞／プレートで播種し、一晩放置して定着させた。細胞を１×ＩＣ５０のセリシクリブ、ＡＧ１４７８で、又は両方の薬剤を一緒に用いて処理した。７２時間処理した後、細胞をトリプシン処理によって収集し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、次いで−２０℃で、７０％（ｖ／ｖ）のエタノール中で一晩固定した。細胞を１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡを含むＰＢＳ中で２回洗浄し、次いで室温で２０分間、５０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム及び５０μｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡとともにインキュベートした。Becton Dickinson社製ＬＳＲフローサイトメーターで、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔプログラムを使用して、フローサイトメトリーによって、ＤＮＡ含量について細胞を分析した。
【０２３１】
インビボ研究
メスの（ｎｕ／ｎｕ）マウスの側腹部の単一部位で、約１×１０７Ｈ３５８細胞／マウスを皮下注射した。腫瘍を約１１０ｍｍ３に増殖させた後、腫瘍サイズによってペアマッチして処置群（９マウス／群）にした。１つの群は、連続して５日間、１日２回腹腔内注射した後、２日中断するようにセリシクリブ（５０ｍｇ／ｋｇ）で処置し、次いでこの処置を合計４サイクル繰り返した。エルロチニブ（１００ｍｇ／ｋｇ）は、連続して２８日間、経口強制飼養によって毎日投与した。組合せで処置した群には、両単一薬剤群と同じ様式で投薬した。マウスを少なくとも１週間に２回計量することによって処置の毒性を評価し、腫瘍をノギスを用いて少なくとも１週間に２回測定することによって腫瘍の増殖を求めた。処置の最初の１週間の間に、動物の体重がいくらか減少した。しかし、重量減少は、媒体対照群においても発生したので（８〜１１日目の最大重量減少は１１％）、これは、セリシクリブに使用した最初の媒体（５０ｍＭ  ＨＣｌ）に関連していると思われた。１０日目に、対照及びセリシクリブを投与している２つの群について、媒体を１０％のクレモホル、１０％のエタノール、８０％の食塩水に変更した。すべての３つの群は、直ちに体重が増加し始めた。腫瘍の測定値は、式：腫瘍体積（ｍｍ３）＝幅２（ｍｍ）×長さ（ｍｍ）×０．５２を使用して体積に変換した。腫瘍増殖阻害百分率は、式：１−（処置した腫瘍の体積の変化／対照の腫瘍体積の変化）×１００を用いて求めた。それぞれの群について、統計的有意性は、一元配置ＡＮＯＶＡを使用し、その後にダネット検定を使用して、対照群と比較することによって求めた。異なる処置群間の有意性は、両側、対応のないスチューデントＴ検定を使用して求めた。
【０２３２】
結果及び考察
ＣＤＫ又はＥｒｂＢファミリーのメンバーを標的にする化合物は、癌治療剤として大きな関心を集めている。これらのキナーゼファミリーのいずれの阻害剤も、単一薬剤としていくらかの臨床活性を示しているが、最終的には、他の薬剤と組み合わせて使用される傾向が強い［Dancey, J.E. and H.X. Chen, Strategies for optimizing combinations of molecularly targeted anticancer agents. 2006. 5(8): p. 649-659］。この一連の実験の目的は、これらの２つのプロテインキナーゼファミリーの阻害剤を相乗的に併用することができるかどうかを判定することであった。
【０２３３】
セリシクリブとトラスツズマブの間の相互作用を評価するために、乳癌細胞株、即ち、ＨＥＲ２を過剰発現するＳｋＢｒ３、又は低レベルのＨＥＲ２を発現するＭＣＦ７において、組合せ実験を実施した［Wu, K., et al., Flavopiridol and trastuzumab synergistically inhibit proliferation of breast cancer cells: association with selective cooperative inhibition of cyclin D1-dependent kinase and Akt signaling pathways. Molecular Cancer Therapeutics, 2002. 1(9): p. 695-706］。トラスツズマブ（１〜１００ｎＭ）とともにインキュベートすると、ＳｋＢｒ３細胞の増殖が最大４０％低減したが、ＭＣＦ７細胞に対してはまったく有意な効果がなく（データを示していない）、以前のデータと一致した［Wu, K., et al., Flavopiridol and trastuzumab synergistically inhibit proliferation of breast cancer cells: association with selective cooperative inhibition of cyclin D1-dependent kinase and Akt signaling pathways. Molecular Cancer Therapeutics, 2002. 1(9): p. 695-706］。セリシクリブは、両細胞株の増殖を阻害し、ＳｋＢｒ３及びＭＣＦ７細胞におけるＩＣ７０は、それぞれ２０．４μＭ及び１５．４μＭであった。セリシクリブとトラスツズマブを共インキュベートすると、ＳｋＢｒ３細胞株における細胞増殖が適度に相乗的に阻害され（表１）、ＥＤ５０（組合せにより、細胞増殖が５０％阻害される点）で、０．７３のCalcusyn組合せ指数（ＣＩ）を生じた。ＨＥＲ２シグナル伝達経路によって伝達される分裂促進刺激により、サイクリンＤ１が発現し、結果としてＣＤＫが活性化され、細胞増殖に至る［Harari, D. and Y. Yarden, Molecular mechanisms underlying ErbB2/HER2 action in breast cancer. Oncogene., 2000. 19(53): p. 6102-14］。したがって、これらの受容体の過剰発現又は構成的活性化により、癌化が生じる。実際に、サイクリンＤは、ＨＥＲ２受容体による変換に必要であり［Lee, R.J., et al., Cyclin D1 is required for transformation by activated Neu and is induced through an E2F-dependent signaling pathway. Mol Cell Biol., 2000. 20(2): p. 672-83］、サイクリンＤ１が欠乏したマウスは、ＨＥＲ２媒介腫瘍形成に耐性である［Yu, Q., Y. Gaeng, and P. Sicinski, Specific protection against breast cancers by cyclin D1 ablation. Nature, 2001. 411(6841): p. 1017-1021、Landis, M.W., et al., Cyclin D1-dependent kinase activity in murine development and mammary tumorigenesis. Cancer Cell., 2006. 9(1): p. 13-22］ことが示されている。相乗的なセリシクリブ／トラスツズマブの組合せの背景にある機構を評価するために、ＨＥＲ２シグナル伝達経路に対する効果の分析を実施した。ＳｋＢｒ３細胞をセリシクリブ、トラスツズマブ又は両薬剤の組合せとともに２４時間インキュベートし、細胞溶解産物を調製し、ＨＥＲ２及びサイクリンＤ１タンパク質のレベルをウェスタンブロットによって検査した。トラスツズマブによる処置では、最大２８ｎＭの濃度で、ＨＥＲ２レベルに対する効果は中程度であり（図１Ａ）、これは、この薬剤は、ＳｋＢｒ３細胞中のＨＥＲ２レベルを劇的に下方制御しないことを実証した以前の知見［Longva, K.E., et al., Herceptin-induced inhibition of ErbB2 signaling involves reduced phosphorylation of Akt but not endocytic down-regulation of ErbB2. Int J Cancer., 2005. 116(3): p. 359-67］と一致している。一方、セリシクリブ単独での処置では、ＨＥＲ２レベルは、用量依存的な様式で減少した（図１Ｂ）。セリシクリブによるＨＥＲ２受容体レベルの下方制御は、おそらくＣＤＫ７及び９に対するその阻害効果に���るものであり［Ljungman, M. and M.T. Paulsen, The cyclin-dependent kinase inhibitor roscovitine inhibits RNA synthesis and triggers nuclear accumulation of p53 that is unmodified at Ser15 and Lys382. Mol Pharmacol, 2001. 60(4): p. 785-9、Dubois, M.F., et al., Inhibitors of transcription such as 5,6-dichloro-1-beta-D-ribofuranosylbenzimidazole and ioquinoline sulphonamide derivatives (H-8 and H-7) promote dephosphorylation of the carboxyl-terminal domain of RNA polymerase II largest subunit. Journal of biological chemistry, 1994. 269: p. 13331-13336］、この効果により、受容体の転写が減少し、ＨＥＲ２タンパク質は、細胞内に自然に代謝回転されるので減少する［Scott, G.K., et al., Transcriptional repression of ErbB2 by histone deacetylase inhibitors detected by a genomically integrated ErbB2 promoter-reporting cell screen. Mol Cancer Ther., 2002. 1(6): p. 385-92］。トラスツズマブとセリシクリブは、一緒に投与したとき、いずれかの単一薬剤処置単独よりも、ＨＥＲ２受容体の大きな下方制御を生じ、これらの薬剤は、この受容体のレベルを相乗的に下方制御することを示した（図１Ｃ）。
【０２３４】
ＨＥＲ２シグナル伝達経路の最終下流成分の１つとして、サイクリンＤ１タンパク質レベルに対する組合せの効果を検査することは興味深いことであった。これらの実験において試験した濃度で、トラスツズマブによる処置だけでは、サイクリンＤ１レベルに対する明らかな効果はまったくなかったが（図１Ａ）、セリシクリブでは、サイクリンＤ１レベルが、用量依存的な様式で著しく減少した（図１Ｂ）。このサイクリンＤ１の減少は、セリシクリブをトラスツズマブと組み合わせることによってわずかに増強された（図１Ｃ）。サイクリンＤ１レベルは、ＨＥＲ２シグナル伝達の減少の結果として、及びまたサイクリンＤｌ転写のセリシクリブ媒介阻害によっておそらく下方制御されたと思われる［Whittaker, S.R., et al., The Cyclin-dependent kinase inhibitor CYC202 (R-roscovitine) inhibits retinoblastoma protein phosphorylation, causes loss of Cyclin D1, and activates the mitogen-activated protein kinase pathway. Cancer Research, 2004. 64(1): p. 262-272］。これらのデータは、ＳｋＢｒ３細胞では、セリシクリブは、ＨＥＲ２受容体の下方制御、及びＨＥＲ２分裂促進シグナルを伝えるのに極めて重要であることが示されている、細胞周期調節因子サイクリンＤ１の減少を促進することによって、ＨＥＲ２シグナル伝達経路に対するトラスツズマブの効力を増強したことを示す［Lee, R.J., et al., Cyclin D1 is required for transformation by activated Neu and is induced through an E2F-dependent signaling pathway. Mol Cell Biol., 2000. 20(2): p. 672-83、Yu, Q., Y. Gaeng, and P. Sicinski, Specific protection against breast cancers by cyclin D1 ablation. Nature, 2001. 411(6841): p. 1017-1021、Landis, M.W., et al., Cyclin D1-dependent kinase activity in murine development and mammary tumorigenesis. Cancer Cell., 2006. 9(1): p. 13-22］。
【０２３５】
セリシクリブとＥｒｂＢファミリーメンバーの阻害剤との相乗的相互作用の分析を拡張するために、セリシクリブをＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤ＡＧ１４７８［Osherov, N. and A. Levitzki, Epidermal-growth-factor-dependent activation of the src-family kinases. Eur J Biochem., 1994. 225(3): p. 1047-53、Levitzki, A. and A. Gazit, Tyrosine kinase inhibition: an approach to drug development. Science., 1995. 267(5205): p. 1782-8］、エルロチニブの類似体と組み合わせて試験した。エルロチニブは、進行ＮＳＣＬＣを治療するために認可されており、臨床試験における肺癌の治療において生存利益を示している［Shepherd, F.A., et al., Erlotinib in Previously Treated Non-Small-Cell Lung Cancer. N Engl J Med, 2005. 353(2): p. 123-132］。セリシクリブとＡＧ１４７８の組合せは、３つのＮＳＣＬＣ細胞株、即ちＮＣＩ−Ｈ３５８、Ａ５４９及びＮＣＩ−Ｈ４６０において最初に評価された。これらの細胞株は、異なるレベルの野生型ＥＧＦＲを発現し、Ａ５４９細胞は、最も高いレベルのこの受容体を発現し、Ｈ３５８細胞は最も低いレベルのこの受容体を発現する（図２）。ＡＧ１４７８についてのＩＣ５０値は、Ｈ３５８、Ａ５４９及びＨ４６０細胞においてそれぞれ、４μＭ、６．６μＭ、及び１０．４μＭであり、ＥＧＦＲタンパク質レベルと、ＡＧ１４７８に対する感受性との間に直接の相関はまったくないことを実証している。等価なパターンの感受性がエルロチニブについて報告されており、これらの３つの細胞株をそれぞれ感受性、中間、及び耐性として記述している［Thomson, S., et al., Epithelial to mesenchymal transition is a determinant of sensitivity of non-small-cell lung carcinoma cell lines and xenografts to epidermal growth factor receptor inhibition. Cancer Res., 2005. 65(20): p. 9455-62］。組合せ分析を実施し、同時インキュベーションと順次添加（両方向）を評価した。Ｈ３５８細胞では、同時に薬剤処理すること及びＡＧ１４７８で前処理しその後にセリシクリブで処理することにより、細胞増殖が相乗的に阻害された（それぞれ、０．７４及び０．８１のＥＤ５０でのＣＩ値）（表２）。
【０２３６】
セリシクリブとＡＧ１４７８の相乗効果に関与する分子機構を解明するために、細胞毒性分析に使用したものと等価な濃度で、Ｈ３５８細胞をいずれかの薬剤単独で、又は組合せで処理した。細胞溶解産物を調製し、タンパク質をウェスタンブロッティングによって分析した（図３）。最初に、ＥＧＦＲのレベルに対する化合物の効果及びそのリン酸化状態を研究した。ＡＧ１４７８又はセリシクリブで処理することにより、ＥＧＦＲのレベルは用量依存的な様式で減少した。ＡＧ１４７８とセリシクリブを一緒に適用すると、ＥＧＦＲタンパク質レベルは、２つの個々の薬剤処理のいずれよりも有効に減少し、これらの薬剤は、受容体の相乗的な下方制御を促進していたことを示した（図３）。さらに、ＡＧ１４７８による処理では、ＥＧＦＲリン酸化が用量依存的に減少し、セリシクリブによる処理では、効果は限られていた。ＥＧＦＲリン酸化のレベルの低減は、同時処理によって増強され、化合物はＥＧＦＲの量及び活性化状態を相乗的に下方制御していたことを示した。
【０２３７】
ＥＧＦＲシグナル伝達経路に対するセリシクリブとＡＧ１４７８の組合せの効果をさらに調査するために、この経路の２つの下流成分、即ち、ＥＲＫのリン酸化状態及びサイクリンＤ１タンパク質レベルを分析した。試験した濃度で、セリシクリブ単独では、ＥＲＫリン酸化に対する有意な効果はまったくなかった。一方、ＡＧ１４７８により、低濃度でＥＲＫリン酸化が刺激され、これは、ＮＳＣＬＣ細胞株においてゲフィチニブでも観察された効果であるが［Janmaat, M.L., et al., Response to Epidermal Growth Factor Receptor Inhibitors in Non-Small Cell Lung Cancer Cells: Limited Antiproliferative Effects and Absence of Apoptosis Associated with Persistent Activity of Extracellular Signal-regulated Kinase or Akt Kinase Pathways. Clin Cancer Res, 2003. 9(6): p. 2316-2326］、より高い濃度で効果は最小であった。しかし、組合せは、ＥＲＫリン酸化の低減に非常に有効であり、ホスホ−ＥＲＫのレベルを明らかに減少させ、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害を示した。サイクリンＤ１は、細胞周期の重要な調節因子の１つとして、その役割において大多数のＥｒｂＢ受容体シグナル伝達経路の下流に位置する。実際に、サイクリンＤ１レベルの低減は、インビトロ及び患者の両方において、ＥＧＦＲ阻害剤に対する応答を得るのに必須であることが示されている［Kalish, L.H., et al., Deregulated Cyclin D1 Expression Is Associated with Decreased Efficacy of the Selective Epidermal Growth Factor Receptor Tyrosine Kinase Inhibitor Gefitinib in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Cell Lines 10.1158/1078-0432.CCR-04-0012. Clin Cancer Res, 2004. 10(22): p. 7764-7774、Petty, W.J., et al., Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibition represses cyclin D1 in aerodigestive tract cancers. Clin Cancer Res., 2004. 10(22): p. 7547-54］。細胞のＩＣ５０値又はこれを超える濃度のセリシクリブでは、Ｈ３５８細胞において、サイクリンＤ１レベルが中程度に減少したが、試験した濃度で、ＡＧ１４７８では、このタンパク質のレベルに対する効果は非常にわずかであった。しかし、一緒に適用すると、この２つの薬剤により、用量依存的な様式でサイクリンＤ１の発現が劇的に低減した（図３）。やはり、セリシクリブの相乗的相互作用に対する寄与は、おそらくＣＤＫ７及び９の阻害によるものであり、この阻害によりＥＧＦＲシグナル伝達経路の重要成分のレベルの低減に至る。
【０２３８】
セリシクリブ処理により、アポトーシス細胞死が生じることが知られているが［MacCallum, D.E., et al., Seliciclib (CYC202, R-Roscovitine) Induces Cell Death in Multiple Myeloma Cells by Inhibition of RNA Polymerase II-Dependent Transcription and Down-regulation of Mcl-1. Cancer Res, 2005. 65(12): p. 5399-5407、McClue, S., et al., In vitro and in vivo antitumour propertiess of the cyclin dependent kinase inhibitor CYC202 (R-roscovitine). International journal of cancer, 2002. 102(463-468)］、ＡＧ１４７８、エルロチニブ又はトラスツズマブで処理された多くの細胞株では、アポトーシスの有意な誘発は観察されていない［Nahta, R., et al., Epidermal growth factor receptor expression is a candidate target of the synergistic combination of trastuzumab and flavopiridol in breast cancer. Cancer Research, 2003. 63(13): p. 3626-31、Chinnaiyan, P., et al., Mechanisms of enhanced radiation response following epidermal growth factor receptor signaling inhibition by erlotinib (Tarceva). Cancer Res., 2005. 65(8): p. 3328-35、Huang, S., et al., Dual-agent molecular targeting of the epidermal growth factor receptor (EGFR): combining anti-EGFR antibody with tyrosine kinase inhibitor. Cancer Res., 2004. 64(15): p. 5355-62、Zhou, Y. and M.G. Brattain, Synergy of epidermal growth factor receptor kinase inhibitor AG1478 and ErbB2 kinase inhibitor AG879 in human colon carcinoma cells is associated with induction of apoptosis. Cancer Res., 2005. 65(13): p. 5848-56］。したがって、セリシクリブとＡＧ１４７８を組み合わせたとき、アポトーシスの相乗的な誘発は予測していなかった。アポトーシスのマーカーとしてＰＡＲＰ切断を使用して、ウェスタンブロット分析により、Ｈ３５８細胞において試験したＡＧ１４７８濃度で、ＰＡＲＰ切断はまったく増大しなかったことが実証された（図３）。対照的に、セリシクリブでは、切断ＰＡＲＰが用量依存的に増加したが、これは、ＡＧ１４７８の存在下で増強されなかった（図３）。総合すると、これらの結果は、Ｈ３５８細胞では、セリシクリブとＡＧ１４７８の組合せにより、主にＥＧＦＲシグナル伝達経路の下方制御によって細胞増殖が相乗的に阻害され、アポトーシス細胞死の誘発が増大するのではなく、細胞増殖が停止することを示す。
【０２３９】
アポトーシスの誘発をより詳細に調査するために、これらの研究を拡張することによって、ＮＣＩ−Ｈ１６５０  ＮＳＣＬＣ細胞株においてこの組合せを評価した。この細胞株は、突然変異体ＥＧＦＲを発現し、エルロチニブに対して非常に感受性であり、エルロチニブで処理した後にアポトーシスが誘発されることが報告されている［Yauch, R.L., et al., Epithelial versus Mesenchymal Phenotype Determines In vitro Sensitivity and Predicts Clinical Activity of Erlotinib in Lung Cancer Patients 10.1158/1078-0432.CCR-05-1492. Clin Cancer Res, 2005. 11(24): p. 8686-8698］。Calcusyn分析では、セリシクリブ／ＡＧ１４７８の組合せは、Ｈ３５８細胞よりＨ１６５０細胞株においてわずかに相乗的であることが示された（データを示していない）。アポトーシスに対する組合せの効果を評価するために、Ｈ１６５０及びＨ３５８細胞を適切な細胞毒性のＩＣ５０濃度の化合物で処理し、アポトーシスの誘発を切断ＰＡＲＰのレベルに関してウェスタンブロット分析、及びサブＧ１  ＤＮＡ内容物を含む細胞数に関してフローサイトメトリー分析の両方によって判定した。以前に示したように（図３）、ＩＣ５０濃度では、単一薬剤又は組合せのいずれも、Ｈ３５８細胞において、切断ＰＡＲＰの誘発に対する効果は有意でない（図４Ａ）。ＤＭＳＯ対照中の少量の切断ＰＡＲＰは、この細胞株内での自然のアポトーシスターンオーバーを示し、これは、いずれの処理によっても増大しなかった。対照的に、Ｈ１６５０細胞では、ＤＭＳＯで処理した対照と比較したとき、セリシクリブ及びＡＧ１４７８ではともに、切断ＰＡＲＰのレベルの増大は小さかった。さらに、組合せで処理した後では、切断ＰＡＲＰの増大は、いずれの単一薬剤単独より大きかった（図４Ａ）。同じ実験からの細胞のフローサイトメトリー分析により、Ｈ３５８及びＨ１６５０細胞の両方について、セリシクリブで処理した後のＧ２／Ｍ期の細胞の特徴的な増加が示された（図４Ｂ）。Ｈ３５８細胞では、いずれの処理によっても、ＤＭＳＯで処理した対照細胞中に存在する約１０％を超えて、サブＧ１  ＤＮＡ内容物を含む細胞（アポトーシス細胞）は有意に増加しなかった。Ｈ１６５０細胞では、対照細胞は、サブＧｌ内容物を含む細胞数が非常に少なく、（約２．５％）；単一薬剤処理ではともに、サブＧｌ集団がわずかに増大し、組合せでは、切断ＰＡＲＰデータに類似した様式で（図４Ａ）、アポトーシス集団がより大幅に増大した（図４Ｂ）。処理濃度を細胞毒性のＩＣ５０値の１．５倍又は２．２５倍に増加させた場合、Ｈ１６５０細胞において同等の結果を得たが、それぞれの場合において、より大きな割合のアポトーシス細胞が検出されたことは重要である（データを示していない）。これらのデータは、ＡＧ１４７８で処理した後に、アポトーシスを誘発しやすい細胞株において、セリシクリブとの組合せにより、アポトーシスの誘発のレベルがより大きくなることを示す。
【０２４０】
最後に、セリシクリブとエルロチニブの組合せをＨ３５８  ＮＳＣＬＣ異種移植モデルにおいてインビボで評価した。約１１０ｍｍ３のＨ３５８腫瘍を有するマウスに、セリシクリブ（５０ｍｇ／ｋｇ）を連続して５日間、１日当たり２回腹腔内投与し、次いで、２日処置を中断した後、このスケジュールを合計２８日間繰り返した。エルロチニブ（１００ｍｇ／ｋｇ）は、連続して２８日間、１日１回、経口強制飼養により投与し、組合せによる処理については、マウスに、それぞれの単一薬剤と同じスケジュールで投与した。対照マウスには、１日２回のスケジュールでセリシクリブ媒体を投与した。すべての処置を終えて３週間後の４９日目で、対照マウスの腫瘍は、平均体積が７００ｍｍ３であり、６倍を超える腫瘍サイズの増大を示した。（図５）。単一薬剤のセリシクリブ又はエルロチニブで処理したマウスの平均腫瘍体積は、それぞれ７１７ｍｍ３及び４４４ｍｍ３であり、いずれの薬剤も、これらの用量では、それ自体で有意な活性を有さないことを示した。この低レベルのエルロチニブ活性（４４％の腫瘍増殖阻害０．０５を超えるｐ）は、この腫瘍タイプについて以前に報告された中程度の活性と相関した［Thomson, S., et al., Epithelial to mesenchymal transition is a determinant of sensitivity of non-small-cell lung carcinoma cell lines and xenografts to epidermal growth factor receptor inhibition. Cancer Res., 2005. 65(20): p. 9455-62］。しかし、４９日目までで、セリシクリブとエルロチニブの組合せで処置したマウスの平均腫瘍体積は、１５３ｍｍ３であり、９３％の腫瘍増殖阻害を示した。ＡＮＯＶＡ、その後にダネットの多重比較検定を使用して、すべての群を媒体対照と比較したとき、統計的に異なった唯一の群は、組合せの群であった（０．０１未満のｐ）。個々の群をスチューデントのＴ検定を使用して互いに比較すると、組合せは、単一薬剤のセリシクリブ及びエルロチニブによる処置からも統計的に有意であった（０．００２未満のｐ）。至適なＴ／Ｃ比（百分率で表した、処置した腫瘍体積の中央値と、対照の腫瘍体積の中央値との比）は、４９日目までで２２％であった。したがって、このＨ３５８異種移植では、エルロチニブ又はセリシクリブのいずれも、単一薬剤として使用される場合特に有効ではないが、この２つの化合物の組合せでは、腫瘍増殖を有意に遅延させる。
【０２４１】
本文書に示したデータは、セリシクリブなどのＣＤＫ阻害剤は、ＥｒｂＢシグナル伝達経路の阻害剤と相乗的に相互作用することによって、細胞増殖を防止することができることを示す。このデータは、ＣＤＫ阻害剤とＥＧＦＲ阻害剤の相乗作用の最初の報告を表す。セリシクリブとＡＧ１４７８の組合せは、突然変異体ＥＧＦＲ又は野生型ＥＧＦＲを発現する細胞において相乗的であったことが重要である。セリシクリブとエルロチニブの組合せが、野生型ＥＧＦＲを発現するＨ３５８異種移植モデルにおいて、インビボで劇的な相乗作用を示したことは重要である。分子レベルでは、相乗作用には、ＥｒｂＢ受容体レベルの下方制御の増強、及び下流シグナル伝達の阻害が主に関与していると思われ、ＥｒｂＢシグナル伝達経路の重要な下流成分の１つである、サイクリンＤ１の減少が増強される。セリシクリブとＥｒｂＢ受容体ファミリーの阻害剤との組合せは、機構レベルで相乗的に作用すると思われるので、これらの薬剤の組合せは、ＥｒｂＢ阻害剤の臨床的効力を潜在的に改善し、これらの薬剤に感受性である腫瘍の数を増やすこともできるであろう。これらのデータは、これらの組合せは、さらに調査する価値があることを示す。
【０２４２】
Ｈ２９２及びＳｋＢｒ３細胞における、セリシクリブ又は第二世代ｃｄｋ阻害剤と、他のＥＧＦＲ阻害剤又はＨｅｒ２阻害剤との、インビトロ及びインビボでの相乗作用の検査
Ｈ２９２細胞を様々な濃度の（ｉ）セリシクリブ又は第二世代阻害剤［１］〜［４］、（ii）ＥｒｂＢ阻害剤ＡＧ１４７８、エルロチニブ、ゲフィチニブ若しくはラパチニブ、又は（iii）これらの組合せで、７２時間処理した。細胞をアラマーブルー試薬とともにインキュベートし、吸光度の読みをCalcusynで分析することによって、５０％の有効用量値を得た。実験は、三つ組で少なくとも３回繰り返した。結果を以下の表３に示す。
【０２４３】
実験はまた、ラパチニブと組み合わせたセリシクリブ又は化合物［４］を用いて、Ｈｅｒ２を過剰発現する乳癌細胞株ＳｋＢｒ３において実施することによって、Ｈｅｒ２シグナル伝達経路を標的化することの相乗効果を評価した（表４）。
【０２４４】
すべての第二世代化合物について、有意な相乗作用がＥＤ５０で観察され、セリシクリブで観察されたことと一致した。
【０２４５】
これらの有望な結果は、Ｈ２９２異種移植モデルを使用してインビボで追跡調査した。腫瘍細胞をヌードマウスに注射し、約１３０ｍｍ３に増殖させた。この時点で処置を開始した。複数の群のマウスに、媒体、セリシクリブ、エルロチニブ又は両方の化合物を約２週間投与した。マウスは、毒性の徴候についてモニターし、腫瘍は、２〜３日毎に測定し、以下のグラフにプロットした。セリシクリブ又は（３Ｒ）−３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−２−メチル−ペンタン−２−オール［１］を１〜５日目と１１〜１５日目に、それぞれ５０ｍｇと４０ｍｇで１日２回投与し、エルロチニブを１〜７日目と１１〜１５日目に投与した。エルロチニブの投薬は、最初の７日間については、毎日経口で、１００ｍｇで開始したが、１１日目からは毎日経口で５０ｍｇに低減した。
【０２４６】
セリシクリブ及び（３Ｒ）−３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−２−メチル−ペンタン−２−オール［１］は、単一薬剤としてこれらの用量で、腫瘍増殖に対する効果は、あったとしても最小であった（図６）。エルロチニブは、単一薬剤としてこの用量で適度に有効であった。エルロチニブとセリシクリブの組合せは、エルロチニブ単独よりわずかに良好であったが、最も劇的な効果は、（３Ｒ）−３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−２−メチル−ペンタン−２−オール［１］とエルロチニブを組み合わせることによって得た。８日目で、両方の組合せは、エルロチニブの単一薬剤処置と著しく異なることが判明した（約０．０２のｐ）。しかし、その後、（３Ｒ）−３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−２−メチル−ペンタン−２−オール［１］とエルロチニブの組合せのみが、依然として統計的に有意であり、１５日目でｐ＝０．００７に到達した。
【０２４７】
総合すると、このデータは、セリシクリブなどのＣＤＫ阻害剤又は化合物［１］〜［４］などの第二世代阻害剤と、ＥＧＦＲ阻害剤との組合せは、インビトロ及びインビボで相乗的であることを実証する。
【０２４８】
本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、本発明の様々な改変及び変形が、当業者にとって明らかになる。本発明を具体的な好適な実施形態に関連して説明してきたが、特許請求した本発明は、そのような具体的な実施形態に不当に制限されるべきでないことが理解されるべきである。実際に、当業者に明白である、本発明を実施するために説明した様式の様々な改変は、本発明によって包含されることが意図されている。
【０２４９】
表１：ＳｋＢｒ３細胞における、トラスツズマブと組み合わせたセリシクリブ
方法及び材料に記載されているプロトコルを使用して、ＳｋＢｒ３細胞において、セリシクリブとトラスツズマブを組み合わせて試験した。同時処理法を使用し、ＥＤ５０（細胞増殖が５０％阻害される、曲線上の点）について得られた組合せ指数値（ＣＩ）を示した。結果は、少なくとも３つの独立した実験の平均である。ＣＩ値の定義は以下の通りである。１．１−０．９は相加的であり、０．９〜０．８５はわずかに相乗的であり、０．８５〜０．７は適度に相乗的であり、０．７〜０．３は相乗的である。
【０２５０】
【表２】
0005514099.tif 000026
【０２５１】
表２：ＮＳＣＬＣ細胞株Ｈ３５８における、ＥＧＦＲ阻害剤ＡＧ１４７８と組み合わせたセリシクリブ
方法及び材料に記載されているプロトコルを使用して、ＮＳＣＬＣ細胞株Ｈ３５８において、セリシクリブとＡＧ１４７８を組み合わせて試験した。同時（＋）及び順次（／）処理スケジュールを試験し、ＥＤ５０（細胞増殖が５０％阻害される、曲線上の点）について得られた組合せ指数値を示した。結果は、少なくとも３つの独立した実験の平均である。ＣＩ値の定義は以下の通りである。１．４５〜１．２は適度に拮抗性であり、１．２〜１．１はわずかに拮抗性であり、１．１〜０．９は相加的であり、０．９〜０．８５はわずかに相乗的であり、０．８５〜０．７は、適度に相乗的であり、０．７〜０．３は相乗的である。
【０２５２】
【表３】
0005514099.tif 000027
【０２５３】
表３：Ｈ２９２細胞における、（ｉ）セリシクリブ又は第二世代阻害剤［１］〜［４］と、（ii）ＥＧＦＲ阻害剤ＡＧ１４７８、エルロチニブ、ゲフィチニブ又はラパチニブとの組合せ
【０２５４】
【表４】
0005514099.tif 000028
【０２５５】
［１］：（３Ｒ）−３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−２−メチル−ペンタン−２−オール。
［２］：（３Ｓ）−３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−２−メチル−ペンタン−２−オール。
［３］：（２Ｒ３Ｓ）−３−｛９−イソプロピル−６−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ｝−ペンタン−２−オール。
［４］：（２Ｒ，３Ｓ−３−（６−（（４，６−ジメチルピリジン−３−イルメチルアミノ）−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ）ペンタン−２−オール
【０２５６】
表４：Ｈｅｒ２を過剰発現する乳癌細胞株ＳｋＢｒ３における、ラパチニブと組み合わせたセリシクリブ又は化合物［４］
【表５】
0005514099.tif 000029
【０２５７】
（参考文献）
1. Dancey, J. and E.A. Sausville, Issues and progress with protein kinase inhibitors for cancer treatment. Nature Reviews Drug Discovery, 2003. 2: p. 296-313
2. Kantarjian, H., et al., Hematologic and Cytogenetic Responses to Imatinib Mesylate in Chronic Myelogenous Leukemia. N Engl J Med, 2002. 346(9): p. 645-652
3. Harari, D. and Y. Yarden, Molecular mechanisms underlying ErbB2/HER2 action in breast cancer. Oncogene., 2000. 19(53): p. 6102-14
4. Slamon, D.J., et al., Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science., 1987. 235(4785): p. 177-82
5. Tortora, G. and F. Ciardiello, Anti-epidermal growth factor receptor drugs in cancer therapy. Expert Opinion on Investigational Drugs, 2002. 11(6): p. 755-768
6. Salomon, D.S., et al., Epidermal growth factor-related peptides and their receptors in human malignancies. Crit Rev Oncol Hematol., 1995. 19(3): p. 183-232
7. Silvestri, G.A. and M.P. Rivera, Targeted Therapy for the Treatment of Advanced Non-small Cell Lung Cancer: A Review of the Epidermal Growth Factor Receptor Antagonists 10.1378/chest.128.6.3975. Chest, 2005. 128(6): p. 3975-3984
8. Shapiro, G.I., Cyclin-dependent kinase pathways as targets for cancer treatment. J Clin Oncol., 2006. 24(11): p. 1770-83
9. Senderowicz, A.M., Small-molecule cyclin-dependent kinase modulators. Oncogene, 2003. 22: p. 6609-6620
10. Shapiro, G.I. and J.W. Harper, Anticancer drug targets: cell cycle and checkpoint control. Journal of Clinical Investigation, 1999. 104(12): p. 1645-1653
11. MacCallum, D.E., et al., Seliciclib (CYC202, R-Roscovitine) Induces Cell Death in Multiple Myeloma Cells by Inhibition of RNA Polymerase II-Dependent Transcription and Down-regulation of Mcl-1. Cancer Res, 2005. 65(12): p. 5399-5407
12. Whittaker, S.R., et al., The Cyclin-dependent kinase inhibitor CYC202 (R-roscovitine) inhibits retinoblastoma protein phosphorylation, causes loss of Cyclin D1, and activates the mitogen-activated protein kinase pathway. Cancer Research, 2004. 64(1): p. 262-272
13. Schubert, K.M. and V. Duronio, Distinct roles for extracellular-signal-regulated protein kinase (ERK) mitogen-activated protein kinases and phosphatidylinositol 3-kinase in the regulation of Mcl-1 synthesis. Biochemical journal, 2001. 356: p. 473-480
14. Carlson, B., et al., Down-regulation of cyclin D1 by transcriptional repression in MCF-7 human breast carcinoma cells induced by flavopiridol. Cancer Res., 1999. 59(18): p. 4634-41
15. Wu, K., et al., Flavopiridol and trastuzumab synergistically inhibit proliferation of breast cancer cells: association with selective cooperative inhibition of cyclin D1-dependent kinase and Akt signaling pathways. Molecular Cancer Therapeutics, 2002. 1(9): p. 695-706
16. Nahta, R., et al., Rate-limiting effects of Cyclin D1 in transformation by ErbB2 predicts synergy between herceptin and flavopiridol. Cancer Research, 2002. 62(8): p. 2267-71
17. Nahta, R., et al., Epidermal growth factor receptor expression is a candidate target of the synergistic combination of trastuzumab and flavopiridol in breast cancer. Cancer Research, 2003. 63(13): p. 3626-31
18. Osherov, N. and A. Levitzki, Epidermal-growth-factor-dependent activation of the src-family kinases. Eur J Biochem., 1994. 225(3): p. 1047-53
19. Chou, T.C. and P. Talalay, Quantitative analysis of dose-effect relationships: the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors. Adv Enzyme Regul, 1984. 22: p. 27-55
20. Dancey, J.E. and H.X. Chen, Strategies for optimizing combinations of molecularly targeted anticancer agents. 2006. 5(8): p. 649-659
21. Lee, R.J., et al., Cyclin D1 is required for transformation by activated Neu and is induced through an E2F-dependent signaling pathway. Mol Cell Biol., 2000. 20(2): p. 672-83
22. Yu, Q., Y. Gaeng, and P. Sicinski, Specific protection against breast cancers by cyclin D1 ablation. Nature, 2001. 411(6841): p. 1017-1021
23. Landis, M.W., et al., Cyclin D1-dependent kinase activity in murine development and mammary tumorigenesis. Cancer Cell., 2006. 9(1): p. 13-22
24. Longva, K.E., et al., Herceptin-induced inhibition of ErbB2 signaling involves reduced phosphorylation of Akt but not endocytic down-regulation of ErbB2. Int J Cancer., 2005. 116(3): p. 359-67
25. Ljungman, M. and M.T. Paulsen, The cyclin-dependent kinase inhibitor roscovitine inhibits RNA synthesis and triggers nuclear accumulation of p53 that is unmodified at Ser15 and Lys382. Mol Pharmacol, 2001. 60(4): p. 785-9
26. Dubois, M.F., et al., Inhibitors of transcription such as 5,6-dichloro-1-beta-D-ribofuranosylbenzimidazole and ioquinoline sulphonamide derivatives (H-8 and H-7) promote dephosphorylation of the carboxyl-terminal domain of RNA polymerase II largest subunit. Journal of biological chemistry, 1994. 269: p. 13331-13336
27. Scott, G.K., et al., Transcriptional repression of ErbB2 by histone deacetylase inhibitors detected by a genomically integrated ErbB2 promoter-reporting cell screen. Mol Cancer Ther., 2002. 1(6): p. 385-92
28. Levitzki, A. and A. Gazit, Tyrosine kinase inhibition: an approach to drug development. Science., 1995. 267(5205): p. 1782-8
29. Shepherd, F.A., et al., Erlotinib in Previously Treated Non-Small-Cell Lung Cancer. N EnglJ Med, 2005. 353(2): p. 123-132
30. Thomson, S., et al., Epithelial to mesenchymal transition is a determinant of sensitivity of non-small-cell lung carcinoma cell lines and xenografts to epidermal growth factor receptor inhibition. Cancer Res., 2005. 65(20): p. 9455-62
31. Janmaat, M.L., et al., Response to Epidermal Growth Factor Receptor Inhibitors in Non-Small Cell Lung Cancer Cells: Limited Antiproliferative Effects and Absence of Apoptosis Associated with Persistent Activity of Extracellular Signal-regulated Kinase or Akt Kinase Pathways. Clin Cancer Res, 2003. 9(6): p. 2316-2326
32. Kalish, L.H., et al., Deregulated Cyclin D1 Expression Is Associated with Decreased Efficacy of the Selective Epidermal Growth Factor Receptor Tyrosine Kinase Inhibitor Gefitinib in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Cell Lines 10.1158/1078-0432.CCR-04-0012. Clin Cancer Res, 2004. 10(22): p. 7764-7774
33. Petty, W.J., et al., Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibition represses cyclin D1 in aerodigestive tract cancers. Clin Cancer Res., 2004. 10(22): p. 7547-54
34. McClue, S., et al., In vitro and in vivo antitumour propertiess of the cyclin dependent kinase inhibitor CYC202 (R-roscovitine). International journal of cancer, 2002. 102(463-468)
35. Chinnaiyan, P., et al., Mechanisms of enhanced radiation response following epidermal growth factor receptor signaling inhibition by erlotinib (Tarceva). Cancer Res., 2005. 65(8): p. 3328-35
36. Huang, S., et al., Dual-agent molecular targeting of the epidermal growth factor receptor (EGFR): combining anti-EGFR antibody with tyrosine kinase inhibitor. Cancer Res., 2004. 64(15): p. 5355-62
37. Zhou, Y. and M.G. Brattain, Synergy of epidermal growth factor receptor kinase inhibitor AG1478 and ErbB2 kinase inhibitor AG879 in human colon carcinoma cells is associated with induction of apoptosis. Cancer Res., 2005. 65(13): p. 5848-56
38. Yauch, R.L., et al., Epithelial versus Mesenchymal Phenotype Determines In vitro Sensitivity and Predicts Clinical Activity of Erlotinib in Lung Cancer Patients 10.1158/1078-0432.CCR-05-1492. Clin Cancer Res, 2005. 11(24): p. 8686-8698
【図４】
0005514099.tif 000030
【図５】
0005514099.tif 000031
【図６】
0005514099.tif 000032
【図１】
0005514099.tif 000033
【図２】
0005514099.tif 000034
【図３】
0005514099.tif 000035