(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
γ−グルタミルシステインを含む腸管免疫賦活剤を有効成分として含有する医薬組成物であって、消化管感染性ウイルス感染症、下痢、ポリープ、腸炎もしくはアレルギーの治療または予防のために用いられる医薬組成物。
【請求項２】
腸管免疫賦活剤が小腸におけるIgAの分泌促進作用を有する、請求項１に記載の医薬組成
物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腸管免疫賦活剤に関し、医薬及び食品分野等において利用できる。
【背景技術】
【０００２】
γ−グルタミルシステイン（γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ、γ−ＥＣ）は、グルタチオンの前駆体であるジペプチドである。γ−グルタミルシステインを含む酵母エキスを加熱または酵素処理することによって、システインを高含有する食品素材を得ることが可能である（特許文献１）。【０００３】
また、γ−グルタミルシステイン、並びにその誘導体又は類似体は、カルシウムセンシング受容体（Calcium Sensing Receptor:CaSR）を活性化する作用を有し、これらのCaSRアゴニストは内科系疾患治療剤として利用できることが示唆されている（特許文献２）。【０００４】
また、マクロファージ細胞内の還元型グルタチオン量を減少させることによりＩＬ−１２産生、ＮＯ産生及びＩＦＮγ産生を抑制し、遅延型過敏症反応を抑制する作用を有する物質を含有することを特徴とする抗リウマチ剤が開示されており、γ−グルタミルシステインやγ−グルタミルシステインジエチルエステル等の化合物が、マクロファージ細胞内の還元型グルタチオン量を増加させる物質であることが報告されている（特許文献３）。【０００５】
さらに、マクロファージ細胞内の還元型グルタチオン量を変化させる作用を有する物質を含有する免疫調整剤が開示されており、前記物質としてγ−グルタミルシステインジエチルエステル等が挙げられている（特許文献４）。さらに、マクロファージ細胞内の還元型グルタチオン量を変化させる作用を有する物質を含有する抗糖尿病剤が開示されており、前記物質としてγ−グルタミルシステインやγ−グルタミルシステインジメチルエステルが挙げられている（特許文献５）。【０００６】
また、システイン化合物であるシスチン又はその誘導体と、テアニンとを組合わせてなる感染症予防剤が知られている（特許文献６）。【０００７】
しかしながら、γ−グルタミルシステインが腸管免疫を顕著に賦活し得ることは知られていない。また、前述したように、システインを含有する食品を製造するために、γ−グルタミルシステインを含む酵母エキス等を食品素材として用いることは知られているが、最終形態として、有意な量のγ−グルタミルシステインを含む食品は知られていない。
【特許文献１】WO00/30474号国際公開パンフレット
【特許文献２】WO2007/55388号国際公開パンフレット
【特許文献３】特開2000-309532
【特許文献４】特開平11-246435号
【特許文献５】特開2000-309543
【特許文献６】WO2003/068214号国際公開パンフレット
【発明の開示】
【０００８】
本発明は、腸管免疫を有効に賦活することができ、かつ、安全な腸管免疫賦活剤、及びそれを含む飲食品を提供することを課題とする。
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、γ−グルタミルシステインが腸管免疫賦活作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は以下のとおりである。
（１）γ−グルタミルシステインを含む腸管免疫賦活剤。
（２）感染症、下痢、ポリープ、腫瘍、腸炎、又はアレルギーの治療もしくは予防のための医薬として用いられる、前記腸管免疫賦活剤。
（３）γ−グルタミルシステインを含む飲食品。
（４）γ−グルタミルシステインを0.000001質量％以上含む前記飲食品。
（５）腸管免疫賦活効果を有する上記（３）又は（４）の飲食品。
（６）腸管免疫賦活剤の製造のためのγ−グルタミルシステインの使用。
（７）腸管免疫賦活剤が、下痢、ポリープ、腫瘍、腸炎、又はアレルギーの治療もしくは予防のための医薬である（６）の使用。
（８）γ−グルタミルシステインを腸管免疫の賦活が必要な対象に投与することを含む、腸管免疫賦活方法。
（９）γ−グルタミルシステインを、感染症、下痢、ポリープ、腫瘍、腸炎、又はアレルギーを有する対象に投与することを含む、感染症、下痢、ポリープ、腫瘍、腸炎、又はアレルギーの治療もしくは予防方法。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】マウス脾臓細胞のLPS刺激時のIgA産生量を示す図。図中、ＥＣはγ−グルタミルシステインを表し、ＧＳＨはグルタチオンを表す（以下の図でも同様）。
【図２】マウス脾臓細胞のLPS刺激時のIgG産生量を示す図。
【図３】マウス脾臓細胞のConA刺激時のIgA産生量を示す図。
【図４】マウス脾臓細胞のConA刺激時のIgG産生量を示す図。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の腸管免疫賦活剤は、γ−グルタミルシステインを含む。
γ−グルタミルシステインは、例えば、γ−グルタミルシステインを含有する酵母から調製することができる。【００１２】
γ−グルタミルシステインを含有する酵母としては、
γ−グルタミルシステイン合成酵素を過剰発現する酵母（大竹ら、バイオサイエンスとインダストリー、５０巻、１０号、９８９〜９９４頁、１９９２年）、
グルタチオン合成酵素遺伝子が破壊することによってグルタチオン合成酵素が機能しなくなった酵母（WO00/30474）、４７位のスレオニン残基をイソロイシン残基に置換する変異、及び、３８７位のグリシン残基をアスパラギン酸残基に置換する変異から選ばれる一方または両方の変異を有する変異型グルタチオン合成酵素を保持し、かつ、γ−グルタミルシステインを産生する酵母（US2003159049、EP1449913）、
γ−グルタミルシステイン生産能を有し、かつ、コードされる蛋白質の５６９位のセリンがセリン以外の他のアミノ酸に置換する変異を有する変異型ＭＥＴ３０遺伝子を保持する酵母（特開2004-113155）、
染色体上のグルタチオン合成酵素遺伝子によってコードされるグルタチオン合成酵素が、３７０位のアルギニン残基以降のＣ末端側の領域を欠失しているサッカロマイセス・セレビシエ（US2003124684、EP1201747）、及び
細胞内のグルタチオン合成酵素活性が低下するようにグルタチオン合成酵素をコードする遺伝子が改変されたキャンディダ・ユティリス（EP1489173）等が知られている。【００１３】
また、γ−グルタミルシステイン産生能を有する酵母を得る方法としては、
酵母の集団から、一定の濃度範囲のＭＮＮＧに対する耐性を有する酵母菌株を選択し、選択された菌株からグルタチオン合成酵素活性が弱化し、かつ、γ−グルタミルシステイン産生能を有する菌株を選択することを含む方法（US2004214308、EP1452585）、及び
パントテン酸要求性を有する酵母を、十分な量のパントテン酸を含む培地で培養して同酵母を増殖させる工程と、パントテン酸量が制限された培地で培養し、菌体内のγ−グルタミルシステイン含有量を上昇させる工程を含む方法（特開2004-201677）等が知られている。【００１４】
上記のようなγ−グルタミルシステインを産生する酵母を好適な条件で培養すれば、γ−グルタミルシステインを含有する酵母又はそれを含む培養物が得られる。
酵母の培養に用いる培地は、酵母が良好に生育し、かつ、γ−グルタミルシステインを効率よく産生するものであれば特に制限されず、通常、工業的に用いられる培地を用いることができる。尚、必要に応じて、用いる酵母の形質にしたがって必要な栄養素を培地に添加する。【００１５】
例えば、サッカロマイセス・セレビシエでは、対数増殖期又は定常期まで培養した培養液を２％となるように栄養培地に接種し、３０℃で１０〜３０時間培養することが好ましい。【００１６】
上記のようにして得られる酵母の培養物又はその分画物は、γ−グルタミルシステインを含有する。本発明に使用するγ−グルタミルシステインは精製されたものであってもよいが、γ−グルタミルシステインを含む限り、酵母の培養液、酵母菌体、菌体破砕物、又は菌体抽出物（酵母エキス）等であってもよい。さらに、菌体破砕物又は酵母エキスから、γ−グルタミルシステインを含む画分を得てもよい。【００１７】
γ−グルタミルシステインは塩の形態であってもよい。塩は薬理学的に許容されるものであればよく、例えば、アンモニウム塩、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩、アルミニウム塩、亜鉛塩、トリエチルアミン、エタノールアミン、モルホリン、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、ジシクロへキシルアミン等の有機アミンとの塩、アルギニン、リジン等の塩基性アミノ酸との塩等を挙げることができる。【００１８】
本発明の腸管免疫賦活剤は、有効成分としてγ−グルタミルシステインを含む。本発明の腸管免疫賦活剤の形態としては、医薬、医薬部外品、飲食品等が挙げられる。【００１９】
腸は最大の免疫臓器ともいわれており、腸管免疫系を賦活することにより免疫力が向上する。したがって、本発明の腸管免疫賦活剤は、腸管免疫を賦活することが予防又は治療に有効な疾患、例えば種々の感染症、下痢、ポリープ、腫瘍、腸炎、又はアレルギー等の治療もしくは予防に有効である。【００２０】
感染症としては、ウイルス感染症、及び細菌感染症が挙げられる。ウイルス感染症は特に限定されず、例えば、消化管感染性ウイルス感染症（例えば、エンテロウイルス、サイトメガロウイルス等の消化管感染性ウィルスによる感染症）、呼吸器感染性ウイルス感染症（例えば、インフルエンザウイルス、ライノウイルス、コロナウイ ルス、パラインフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、アデノウイルス、 レオウイルス等の呼吸器感染性ウイルスによる感染症）、ヘルペスウイルスを原因とする帯状癌疹、ロタウイルスを原因とする下痢、ウイルス性肝炎、ＡＩＤＳ等が挙げられるが、本発明においては、特に消化管感染性ウイルス感染症感染症に対して効果的である。【００２１】
また、細菌感染症は特に限定されず、例えば、セレウス菌、腸炎ビブリオ、腸管出血性大腸菌、黄色ブドウ球菌、ＭＲＳＡ、サルモネラ、ボツリヌス、カンジダ等による感染症が挙げられる。【００２２】
本発明において腸管免疫賦活とは、腸管が独自に有する免疫系を活性化することを意味し、具体的には例えば、腸管、特に小腸におけるIgAの分泌を促進することをいう。【００２３】
腸管の免疫低下は病気を招き、腸管の免疫の常に関連した症状・疾患には感染症、アレルギー疾患、ポリープ、腫瘍、腸炎などがあることが知られている（腸管免疫講座、http://www.ioudou.co.jp/col/archives/2004/11/post_7.html）。
また、後記実施例に示すように、γ−グルタミルシステインは、腸管、特に小腸におけるIgA分泌を促進する作用を有する。分泌型IgAは、例えば、侵入性の細菌やウイルスなどの微生物に特異的に結合し、これらの微生物が上皮細胞に接着するのを阻止する。さらに、分泌型IgAは、コレラ菌などの細菌が産生する毒素に対しても中和活性を有し、また、食物中に含まれるアレルゲンと結合して食餌性抗原の体内への吸収を阻止することが知られている（保井久子、ビフィズス菌の腸管免疫調節作用、http://www.healthist.jp/special/150_03/03_03.html）。【００２４】
さらに、分泌型IgAは、腸管から吸収されるタンパク質に対して免疫抑制機構である「経口免疫寛容」の誘導に関与することが知られており（八村敏志、食品と免疫系の接点としての腸管免疫系：その特有の細胞応答性、http://jsbba.bt.a.u-tokyo.ac.jp/03reikai3/hachimura.pdf）、経口免疫寛容を誘導することによってアレルギーを抑制し得る。【００２５】
以上のことから、腸管免疫を賦活、特に腸管におけるIgAの分泌を促進することは、前記疾患の治療又は予防に有効であると考えられる。【００２６】
本発明の腸管免疫賦活剤の適用方法としては、特に制限されず、経口投与あるいは注射等を利用した浸襲的投与あるいは座薬投与あるいは経皮投与を採用することが出来る。有効成分を経口、注射などの投与方法に適した固体または液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬製剤の形態で投与することが出来る。このような製剤としては例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などの固形剤の形態、溶液剤、懸濁剤、乳剤などの液剤の形態、凍結乾燥剤などの形態が挙げられる。これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。【００２７】
上記医薬用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ゼラチン、アルブミン、アミノ酸、水、生理食塩水などが挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤などの慣用の添加剤を適宜添加することもできる。【００２８】
本発明の腸管免疫賦活剤は、γ−グルタミルシステインに加えて、腸管免疫賦活作用、又は感染症の治療又は予防作用を有する物質等、対象疾患の治療に有効な他の薬剤を１種または２種以上含むものであってもよい。そのような薬剤としては、例えば、シスチン又はその誘導体及びテアニン、乳酸菌等が挙げられる。【００２９】
本発明の腸管免疫賦活剤の投与又は摂取量は、治療や予防に有効な量であればよく、患者の年齢、性別、体重、症状などに応じて適宜調節されるが、例えば、経口投与の場合、γ−グルタミルシステインの量として、１回の投与において１ｋｇ体重あたり、0.0005g〜1gが好ましく、１ｋｇ体重あたり、0.001g〜0.2gがより好ましい。投与回数は特に制限されず、１日あたり１回〜数回投与することができる。【００３０】
本発明の腸管免疫賦活剤中のγ−グルタミルシステインの含有量は、上記投与量に適したものであれば特に制限されず、好ましくは乾燥重量当り0.000001質量％〜70質量％、より好ましくは0.00001質量％〜50質量％、特に好ましくは0.0001質量％〜40質量％である。【００３１】
本発明の飲食品は、γ−グルタミルシステインを含む。本発明の飲食品の種類は特に制限されず、例えば、調味料、発酵食品、アルコール飲料、スープ、ソース、マヨネーズ、ドレッシング、カレールー、ジュース、栄養飲料、おかゆ、パン、菓子類、レトルト食品、冷凍食品、サプリメント、乳製品、及び美容食品等が挙げられる。【００３２】
本発明の飲食品は、γ−グルタミルシステインを含むこと以外は、通常の飲食品と同様の原料を用い、同様の方法によって製造することができる。このような原料としては、特に制限されないが、例えばアルコール飲料では、米、大麦、コーンスターチ等、パンでは小麦粉、砂糖、食塩、バター、発酵用酵母菌等が、発酵食品では大豆、小麦等が挙げられる。【００３３】
本発明の飲食品は、γ−グルタミルシステインを0.000001質量％以上、好ましくは0.01質量％以上、より好ましくは0.05質量％以上特に好ましくは0.1質量％以上含む。γ−グルタミルシステインの含有量の上限は特に制限されないが、好ましくは50質量％以下、より好ましくは10質量％以下、特に好ましくは5質量％以下である。【００３４】
本発明の飲食品は、腸管免疫賦活効果を有し、例えば、容器や包装に同効果を有すること、又は、前記疾患に対する治療効果や予防効果がある旨を表示してもよい。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に制限されない。なお実施例に使用したγ−グルタミルシステインは、ペプチド研究所にて委託合成及び精製されたγ−グルタミルシステインを使用した。【００３６】
〔実施例１〕
６〜８週齢のBALBマウス（メス）を購入し、馴化のため、１週間飼育した。飼料は、市販固形飼料を用い、水は市水を使用した。γ−グルタミルシステインの抗体産生活性への影響を評価するため、マウス脾臓細胞を用いた培養システムを活用した。脾臓はBALB-cマウス(n=3)から採取した。採取した細胞は洗浄後、RPMI1640培地（10% FCS、50U/mlペニシリン、50μg/mlストレプトマイシン）に懸濁した。48ウエル培養プレート当り1×106個に調整した細胞に対し、γ−グルタミルシステインあるいはグルタチオン（シグマ社より購入）（それぞれリン酸緩衝液に溶解）、又は対象としてリン酸緩衝液を添加して、5μgのLPS（リポ多糖類。シグマ社から入手）で刺激した。【００３７】
同様に、48ウエル培養プレート当り1×106個に調整した細胞に対し、γ−グルタミルシステインあるいはグルタチオン存在下、あるいは非存在下で0.5μgのConA（コンカナバリンＡ）で刺激した。その後、37℃のCO2インキュベーターにて5日間培養し、上清の抗体量を分析した。【００３８】
IgAとIgG量はELISA法にて測定した。IgGの測定法を以下に示す。100μlのラット抗マウスIgG抗体（Calbiochem社、1μg/ml 50mM炭酸ナトリウム緩衝液, pH8.5）液を96ウエルELISAプレートに添加し、4℃、一晩インキュベートして各ウエルを抗マウスIgG抗体でコーティングした。プレートはPBST（リン酸緩衝生理食塩水、0.05% Tween 20）にて3回洗浄した後、2% BSAを含むPBS液200μlで、37℃、1hrブロッキング処理した。【００３９】
プレートはPBSTで3回洗浄し、100μlの培養上清（1% BSAを含むPBSTで9倍希釈）を添加して37℃、2hr反応させた。プレートは再度、PBSTで4回洗浄した。1% BSAを含むPBSTで2000倍希釈した100μlのアルカリホスファターゼ結合抗マウスIgG(ウサギ)（BD Biosciences社）溶液を添加し、37℃で1時間反応させた。プレートは6回洗浄した後、p-ニトロフェニルホスフェートで発色させた。反応は100μl/wellの3M NaOHで停止させた後、405nmの吸光度を測定した。【００４０】
IgAの測定もIgGの方法に準じたが、固相化抗体としてラット抗マウスIgA抗体（BD Biosciences社）、標識抗体としてビオチン化抗マウスIgA抗体(ラット)（BD Biosciences社）、発色基質に3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン溶液（TMB substrate-developing solution、シグマ社）を用い、発色停止は１M 硫酸を用いて行い、吸光度は450nmで測定した。
統計処理はスチューデントt検定により行い、危険率5%以下を有意差とした。【００４１】
結果を図１〜４に示した。ConA刺激、LPS刺激ともペプチドによるIgA産生促進能が有意に確認できた。一方、IgG産生促進効果はIgAと比較して低く、γ−グルタミルシステインはIgA産生に対して促進効果が高いことが示唆された。またγ−グルタミルシステインはグルタチオンと比較しても、IgA産生に対して促進効果が特に高いことが示された。【００４２】
〔実施例２〕
５週齢のBALB/cオスマウス（n=6）を１週間馴化飼育後、実験に使用した。飼育期間中、市販飼料を使用し、摂食飲水（市水）は自由摂取とした。γ−グルタミルシステインは滅菌生理食塩水で溶解し、10mg/kg B.W./dayになるよう、強制経口投与した。投与期間は7日間である。投与期間中は投与量決定のため、投与直前に毎日体重測定を行った。群間での体重の違いは認められなかった。【００４３】
試験開始後、7日目に解剖検査を実施した。麻酔はペントバルビタール製剤を腹腔内投与により行った。開腹時に腹部大静脈から採血を行った。小腸内容物も採取した。
採血した血液から血清を採取し、総IgAと総IgG濃度はELISAキットを用いて測定した。腸管内容物はPBSを用いて10倍希釈し、十分に懸濁後、遠心分離にて上清を分取し、実施例１と同様にELISAにて総IgA濃度を測定した。【００４４】
結果を表１に示した。表中、γ−ＥＣはγ−グルタミルシステインを表す。γ−グルタミルシステイン無投与対照群を１としたときの各試験群の相対指数を示す。小腸IgA量はペプチド摂取による増加が認められた。一方、血清IgA、血清IgG量は増加効果が認められず、本ペプチドは腸管粘膜での免疫活性を賦活する効果を有することが確認できた。【００４５】
【表１】
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【産業上の利用の可能性】
【００４６】
本発明の腸管免疫賦活剤は、安全、かつ有効に腸管免疫を賦活することができる。また、本発明の飲食品は、腸管免疫賦活作用を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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