(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３で示されるタンパク質の発現及び／又は機能を特異的に抑制する化合物からなる抗癌剤であって、
前記化合物が二本鎖ｓｉＲＮＡであり、該二本鎖ｓｉＲＮＡを構成するＲＮＡ分子の少なくとも一方が、配列番号４で示されるｍＲＮＡと相補的に結合可能である抗癌剤。
【請求項２】
非小細胞肺癌又は乳癌の治療に用いられる請求項１に記載の抗癌剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の抗癌剤を有効成分とする医薬組成物。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の抗癌剤を用いた、単離された癌細胞のアポトーシス誘導方法。
【請求項５】
単離された癌細胞と候補物質とを接触させる工程と、
前記癌細胞において、配列番号３で示されるタンパク質の発現及び／又は機能を検定する工程と、
前記候補物質の中から配列番号３で示されるタンパク質の発現及び／又は機能を低下させる候補物質を選択する工程と、を含む抗癌剤のスクリーニング方法。
【請求項６】
配列番号３で示されるタンパク質の発現及び／又は機能を検定する前記工程において、配列番号３で示される前記タンパク質、及び生体内において配列番号３で示される前記タンパク質と相互作用する他のタンパク質の相互作用又は複合体形成を検出し、
前記候補物質の中から配列番号３で示されるタンパク質の発現及び／又は機能を低下させる候補物質を選択する前記工程において、配列番号３で示される前記タンパク質と、前記他のタンパク質との相互作用又は複合体形成を低下させる候補物質を選択する請求項５に記載の抗癌剤のスクリーニング方法。
【請求項７】
配列番号３で示されるタンパク質の発現及び／又は機能を検定する前記工程において、配列番号４で示されるｍＲＮＡを発現する遺伝子の発現量を測定し、
前記候補物質の中から配列番号３で示されるタンパク質の発現及び／又は機能を低下させる候補物質を選択する前記工程において、配列番号４で示されるｍＲＮＡを発現する遺伝子の発現量を低下させる候補物質を選択する請求項５に記載の抗癌剤のスクリーニング方法。
【請求項８】
前記候補物質が、３’突出部を有する二本鎖ｓｉＲＮＡであり、
前記二本鎖ｓｉＲＮＡを構成するＲＮＡ分子の少なくとも一方が、配列番号４で示されるｍＲＮＡと相補的に結合可能である二本鎖ｓｉＲＮＡである請求項７に記載の抗癌剤のスクリーニング方法。
【請求項９】
単離された癌細胞を候補物質に接触させる前記工程において、候補物質の存在下で癌細胞を培養する請求項５から８のいずれかに記載の抗癌剤のスクリーニング方法。
【請求項１０】
配列番号３で示されるタンパク質の発現及び／又は機能を検定する前記工程において、配列番号３で示されるタンパク質に対する抗体を使用して前記タンパク質の発現及び／又は機能を測定する請求項５から９のいずれかに記載の抗癌剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核内タンパク質であるＲＢＭ８Ａ又はＭａｇｏｈの発現を特異的に阻害することにより癌細胞の細胞死を誘導することが可能な抗癌剤、この抗癌剤を用いた癌細胞のアポトーシス誘導方法、この抗癌剤を有効成分として含有する医薬組成物、及びＲＢＭ８Ａ又はＭａｇｏｈの発現量を測定することによる抗癌剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の診断及び治療の分野においては、これまで、様々なプロテオミクス解析によって、癌細胞に特異的に発現するタンパク質が同定されている。従来、これらのタンパク質を標的とする癌治療の研究においては、当該タンパク質の発現及び／又は活性の増強又は抑圧による制御に焦点が当てられている。【０００３】
配列番号１で表される核内タンパク質であるヒトＲＢＭ８Ａ（ＲＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｔｉｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ８Ａ）は比較的低分子量のタンパク質であり、様々な因子との相互作用が報告されているキイロショウジョウバエのＹ１４と相同性を有するものとされている。ここで、Ｙ１４については、ＲＮＡ結合モチーフを有し、他の核内タンパク質であるＭａｇｏｈとヘテロ二量体を形成してＲＮＡへ結合することが報告されており、キイロショウジョウバエの培養細胞においてその発現を阻害することにより、細胞増殖が阻害されるものとされている。しかしながら、他の生物種においてＹ１４と相同性を有するタンパク質については、その機能は不明であるとされ、特にＤＮＡ複製や細胞分裂に関する機能との関連性については何らの報告もなされていない等、細胞周期のいずれの段階において細胞の増殖を阻害しているかも明らかではなかった（非特許文献１参照）。特に、単に細胞の増殖抑制を引き起こすのみでは抗癌剤として使用はできず、アポトーシス等の細胞死を誘導して初めて抗癌剤として利用できることとなるため、Ｙ１４の他生物における相同タンパク質を阻害する因子が、抗癌剤等を含む医薬組成物に利用可能であるか否かも明らかではなかった。【０００４】
一方、配列番号５で表されるタンパク質であるヒトＭａｇｏｈは、ヒトＲＢＭ８Ａとヘテロ二量体を形成してＲＮＡへ結合することが知られている。しかしながら、このＭａｇｏｈを阻害する因子が、抗癌剤等を含む医薬組成物に利用可能であるか否かは明らかではなかった。【０００５】
現在、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：ＲＮＡｉ）技術は、生命科学分野における研究において頻繁に利用され、その有用性は広く認識されるに至っている。ここで、ＲＮＡｉとは、二本鎖ＲＮＡによってその配列特異的にｍＲＮＡが分解され、その結果、遺伝子の発現が抑制される現象をいう。２００１年に２１塩基の低分子二本鎖ＲＮＡであるｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ）が哺乳動物の細胞内でＲＮＡｉを媒介できることが報告されて以来、ｓｉＲＮＡは標的遺伝子の発現抑制方法として頻繁に利用されており、更に近年に至っては、ＲＮＡｉにおいてより高い効果を得るための、ｓｉＲＮＡの配列選択基準についても報告されている（非特許文献２及び３参照）。【０００６】
ＲＮＡｉ技術は、医薬品や癌を含む種々の難治性疾患の治療へも応用が期待されている。例えば、特許文献１には、ｓｉＲＮＡ等の特定のタンパク質の発現を抑制する物質を有効成分として含むことを特徴とする間質性肺疾患治療剤が開示されている。【０００７】
従来、抗癌剤の多くは、細胞周期のＳ期において特異的に細胞周期の進行を阻害する活性を示すのに対し、パクリタキセル等のタキサン系抗癌剤は、微小管に結合して、微小管の脱重合を阻害することで、Ｍ期における細胞周期の進行を阻害することが知られている。このように、Ｍ期における細胞周期の進行を阻害する抗癌剤は、癌治療に広く利用できることが期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００７−３１９００９号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｈｅｒｖｅ  Ｌｅ  Ｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍａｇｏ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ａ  ｌｉｎｋ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ａｎｄ  ｍＲＮＡ”，  ＥＭＢＯ  ｒｅｐｏｒｔｓ，  １２，  ｐ．１１１９−１１２４（２００１）
【非特許文献２】Ｅｌｂａｓｈｉｒ  Ｓ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｄｕｐｌｅｘｅｓ  ｏｆ  ２１−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＲＮＡｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ”，  Ｎａｔｕｒｅ，  ４１１（６８３６），  ｐ．４９４−４９８（２００１）
【非特許文献３】Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｓｉｇｎ  ｆｏｒ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ”，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２２（３），  ｐ．３２６−３３０（２００４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、パクリタキセル等のタキサン系抗癌剤は白血球や好中球の減少、末梢神経への障害、悪心や嘔吐等の副作用を示すことが懸念されており、タキサン系抗癌剤とは異なり、Ｍ期における細胞周期の進行を阻害する抗癌剤を開発することが求められていた。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意研究を行った。その結果、ヒトにおけるＹ１４の相同タンパク質であるＲＢＭ８Ａが、中心体、紡錘糸、収縮管に局在し、ＲＢＭ８Ａの発現を阻害することにより、チューブリンの正常な重合を阻害して癌細胞をＭ期に集積させること、ＲＢＭ８Ａの発現を阻害することによりＭ期に集積した細胞において、アポトーシスが引き起こされることを見出した。また、Ｍａｇｏｈの発現を阻害することによりＲＢＭ８Ａの発現も抑制され、アポトーシスが引き起こされることも見出した。このような知見に基づき、本発明者らは、ＲＢＭ８Ａ又はＭａｇｏｈの発現を阻害する物質が、抗癌剤として利用可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１２】
具体的には、本発明は以下のものを提供する。【００１３】
（１）  配列番号１で示されるタンパク質又はそのアイソフォームの発現及び／又は機能を特異的に抑制する化合物からなる抗癌剤。【００１４】
（１）に記載の抗癌剤は、配列番号１で示されるＲＢＭ８Ａ又はそのアイソフォームの発現及び／又は機能を特異的に阻害することができる。ここで、癌細胞におけるＲＢＭ８Ａの発現及び／又は機能を阻害することにより、細胞周期をＭ期において停止させ、細胞の増殖を阻害することができるため、癌細胞の増殖を抑制すると共に、癌細胞のアポトーシスを誘導することができ、癌を治癒することができる。【００１５】
また、本発明において「特異的に抑制」とは、生体内において、抗癌剤が配列番号１で示されるタンパク質の発現及び／又は機能のみを抑制し、オフターゲット効果を有しないことをいう。【００１６】
（２）  前記化合物が配列番号１で示されるタンパク質又はそのアイソフォームの発現を特異的に抑制する二本鎖ｓｉＲＮＡであって、前記二本鎖ｓｉＲＮＡを構成するＲＮＡ分子の少なくとも一方が、配列番号２で示されるｍＲＮＡと相補的に結合可能である（１）に記載の抗癌剤。【００１７】
（２）に記載の発明は、配列番号１で示されるタンパク質又はそのアイソフォームの発現を特異的に抑制する化合物として、二本鎖ｓｉＲＮＡを規定したものである。配列番号１で示されるタンパク質をコードする、配列番号２で示されるｍＲＮＡに相補的に結合可能であるＲＮＡ鎖を有する二本鎖ｓｉＲＮＡであれば、配列番号１で示されるタンパク質又はそのアイソフォームの発現を抑制することができるため、（１）に記載の抗癌剤として好適に用いることができる。【００１８】
なお、本発明において「ｓｉＲＮＡ」とは、ＲＮＡｉを媒介可能な短鎖のＲＮＡ分子であって、２１〜２７塩基のものである。【００１９】
（３）  配列番号３で示されるタンパク質又はそのアイソフォームの発現及び／又は機能を特異的に抑制する化合物からなる抗癌剤。【００２０】
（３）に記載の抗癌剤は、配列番号３で示されるＭａｇｏｈ又はそのアイソフォームの発現及び／又は機能を特異的に阻害することができる。ここで、癌細胞におけるＭａｇｏｈの発現及び／又は機能を阻害すると、ＲＢＭ８Ａの発現及び／又は機能も阻害される。したがって、癌細胞の増殖を抑制すると共に、癌細胞のアポトーシスを誘導することができ、癌を治癒することができる。【００２１】
（４）  前記化合物が配列番号３で示されるタンパク質又はそのアイソフォームの発現を特異的に抑制する二本鎖ｓｉＲＮＡであって、前記二本鎖ｓｉＲＮＡを構成するＲＮＡ分子の少なくとも一方が、配列番号４で示されるｍＲＮＡと相補的に結合可能である（３）に記載の抗癌剤。【００２２】
（４）に記載の発明は、配列番号３で示されるタンパク質又はそのアイソフォームの発現を特異的に抑制する化合物として、二本鎖ｓｉＲＮＡを規定したものである。配列番号３で示されるタンパク質をコードする、配列番号４で示されるｍＲＮＡに相補的に結合可能であるＲＮＡ鎖を有する二本鎖ｓｉＲＮＡであれば、配列番号３で示されるタンパク質又はそのアイソフォームの発現を抑制することができるため、（３）に記載の抗癌剤として好適に用いることができる。【００２３】
（５）  非小細胞肺癌又は乳癌の治療に用いられる（１）から（４）のいずれかに記載の抗癌剤。【００２４】
本発明の抗癌剤は、特に非小細胞肺癌や乳癌の治療に好適に用いられるものである。したがって、（５）に記載の発明によれば、癌細胞の増殖を特異的に抑制し、癌細胞のアポトーシスを特異的に誘導することができる。【００２５】
（６）  （１）から（５）のいずれかに記載の抗癌剤を有効成分とする医薬組成物。【００２６】
（６）に記載の発明は、（１）から（５）に記載の発明を医薬組成物の発明として規定したものである。したがって、（６）に記載の発明によれば、（１）から（５）に記載の発明と同等の効果を得ることができる。【００２７】
（７）  （１）から（５）のいずれかに記載の抗癌剤を用いた癌細胞のアポトーシス誘導方法。【００２８】
（７）に記載の発明は、（１）から（５）に記載の発明を癌細胞のアポトーシス誘導法の発明として規定したものである。したがって、（７）に記載の発明によれば、（１）から（５）に記載の発明と同等の効果を得ることができる。【００２９】
（８）  単離された癌細胞と候補物質とを接触させる工程と、前記癌細胞において、配列番号１若しくは３で示されるタンパク質又はそれらのアイソフォームの発現及び／又は機能を検定する工程と、前記候補物質の中から配列番号１若しくは３で示されるタンパク質又はそれらのアイソフォームの発現及び／又は機能を低下させる候補物質を選択する工程と、を含む抗癌剤のスクリーニング方法。【００３０】
（９）  配列番号１若しくは３で示されるタンパク質又はそれらのアイソフォームの発現及び／又は機能を検定する前記工程において、配列番号１又は３で示される前記タンパク質、及び生体内において配列番号１又は３で示される前記タンパク質と相互作用する他のタンパク質の相互作用又は複合体形成を検出し、前記候補物質の中から配列番号１若しくは３で示されるタンパク質又はそれらのアイソフォームの発現及び／又は機能を低下させる候補物質を選択する前記工程において、配列番号１又は３で示される前記タンパク質と、前記他のタンパク質との相互作用又は複合体形成を低下させる候補物質を選択する（８）に記載の抗癌剤のスクリーニング方法。【００３１】
（１０）  配列番号１若しくは３で示されるタンパク質又はそれらのアイソフォームの発現及び／又は機能を検定する前記工程において、配列番号２又は４で示されるｍＲＮＡを発現する遺伝子の発現量を測定し、前記候補物質の中から配列番号１若しくは３で示されるタンパク質又はそれらのアイソフォームの発現及び／又は機能を低下させる候補物質を選択する前記工程において、配列番号２又は４で示されるｍＲＮＡを発現する遺伝子の発現量を低下させる候補物質を選択する（８）に記載の抗癌剤のスクリーニング方法。【００３２】
（８）から（１０）に記載の発明は、配列番号１で示されるＲＢＭ８Ａ、又は配列番号３で示されるＭａｇｏｈの発現及び／又は機能の阻害活性を指標とした抗癌剤のスクリーニング方法を規定したものである。上述のとおり、癌細胞におけるＲＢＭ８Ａの発現を阻害することにより、細胞周期をＭ期において停止させ、細胞の増殖を抑制し、アポトーシスを誘導することができる。また、癌細胞におけるＭａｇｏｈの発現を阻害することにより、細胞の増殖を抑制し、アポトーシスを誘導することができる。したがって、（８）から（１０）に記載の発明によれば、ＲＢＭ８Ａ又はＭａｇｏｈの発現の阻害を介して細胞の増殖を阻害可能な抗癌剤をスクリーニングすることができる。【００３３】
（１１）  前記候補物質が、３’突出部を有する二本鎖ｓｉＲＮＡであり、前記二本鎖ｓｉＲＮＡを構成するＲＮＡ分子の少なくとも一方が、配列番号２又は４で示されるｍＲＮＡと相補的に結合可能である二本鎖ｓｉＲＮＡである（１２）に記載の抗癌剤のスクリーニング方法。【００３４】
（１１）に記載の発明は、ＲＢＭ８Ａ又はＭａｇｏｈをコードするｍＲＮＡに相補的に結合可能なＲＮＡ分子を有する二本鎖ｓｉＲＮＡを候補物質とする抗癌剤のスクリーニング方法である。タンパク質をコードするｍＲＮＡに相補的に結合可能なＲＮＡ分子を有する二本鎖ｓｉＲＮＡは、そのタンパク質の発現を阻害する傾向にあるため、上記二本鎖ｓｉＲＮＡを候補物質として用いることにより、抗癌剤を効率的にスクリーニングすることができる。【００３５】
（１２）  単離された癌細胞を候補物質に接触させる前記工程において、候補物質の存在下で癌細胞を培養する（８）から（１１）のいずれかに記載の抗癌剤のスクリーニング方法。【００３６】
（１３）  配列番号１若しくは３で示されるタンパク質又はそれらのアイソフォームの発現及び／又は機能を検定する前記工程において、配列番号１又は３で示されるタンパク質に対する抗体を使用して前記タンパク質の発現及び／又は機能を測定する（８）から（１２）のいずれかに記載の抗癌剤のスクリーニング方法。【００３７】
（１２）及び（１３）に記載の発明は、（８）から（１１）に記載の発明における具体的手法を規定したものである。したがって、（１２）及び（１３）に記載の発明によれば、（８）から（１１）に記載の発明と同等の効果を得ることができる。
【発明の効果】
【００３８】
本発明の抗癌剤は、配列番号１で示されるＲＢＭ８Ａ、配列番号５で示されるＭａｇｏｈ、又はそれらのアイソフォームの発現及び／又は機能を特異的に阻害することができる。ここで、癌細胞におけるＲＢＭ８Ａの発現及び／又は機能を阻害することにより、細胞周期をＭ期において停止させ、細胞の増殖を阻害することができる。また、癌細胞におけるＭａｇｏｈの発現を阻害することにより、細胞の増殖を阻害することができる。したがって、癌細胞の増殖を抑制すると共に、癌細胞のアポトーシスを誘導することができ、癌を治癒することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】細胞内におけるＲＢＭ８Ａの局在部位を示す図である。
【図２】細胞内におけるＲＢＭ８Ａの局在部位を示す図である。
【図３】ＲＢＭ８Ａ−ｓｉＲＮＡ（ＩＧ−Ｂ）をトランスフェクトした細胞の光学顕微鏡像を示す図である。
【図４】ＲＢＭ８Ａ−ｓｉＲＮＡ（１）〜（３）をトランスフェクトした細胞の抗リン酸化ヒストンＨ３抗体による免疫染色の結果を示す図である。
【図５】ＤＡＰＩで染まった細胞に対する抗リン酸化ヒストンＨ３抗体で染まった細胞（Ｍ期にある細胞）の割合を示す図である。
【図６】ＲＢＭ８Ａ−ｓｉＲＮＡ（１）〜（３）をトランスフェクトした細胞におけるＲＢＭ８Ａの発現量を示す図である。
【図７】ＲＢＭ８Ａ−ｓｉＲＮＡ（２）をトランスフェクトした細胞のフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図８】ＲＢＭ８Ａ−ｓｉＲＮＡ（２）をトランスフェクトした細胞の位相差顕微鏡像を示す図である。
【図９】ＲＢＭ８Ａ−ｓｉＲＮＡ（２）をトランスフェクトした細胞の抗γ−チューブリン抗体による免疫染色の結果を示す図である。
【図１０】ＲＢＭ８Ａ−ｓｉＲＮＡ（１）〜（３）をトランスフェクトした細胞における異常な微小管の形態を示す細胞の割合を示す図である。
【図１１】ＲＢＭ８Ａ−ｓｉＲＮＡ（１）〜（３）をトランスフェクトした細胞におけるカスパーゼ３／７の活性を示す図である。
【図１２】ＲＢＭ８Ａ−ｓｉＲＮＡ（ＩＧ−Ｂ），（ＩＧ−Ｆ）をトランスフェクトした細胞におけるＲＢＭ８Ａの発現量を示す図である。
【図１３】ＲＢＭ８Ａ−ｓｉＲＮＡ（ＩＧ−Ｂ），（ＩＧ−Ｆ）をトランスフェクトした細胞のギムザ染色像を示す図である。
【図１４】Ｍａｇｏｈ−ｓｉＲＮＡ（１），（２）をトランスフェクトした細胞におけるＲＢＭ８Ａ及びＭａｇｏｈの発現量を示す図である。
【図１５】Ｍａｇｏｈ−ｓｉＲＮＡ（１），（２）をトランスフェクトした細胞の細胞周期を解析した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
【００４１】
＜抗癌剤＞
本発明の抗癌剤は、配列番号１又は３で示されるタンパク質の発現及び／又は機能を特異的に抑制する化合物からなるものである。
【００４２】
上記化合物としては、例えば、配列番号１又は３で示されるタンパク質の発現を特異的に抑制する二本鎖ｓｉＲＮＡであって、前記二本鎖ｓｉＲＮＡを構成するＲＮＡ分子の少なくとも一方が、配列番号２又は４で示されるｍＲＮＡと相補的に結合可能であるものを挙げることができる。
【００４３】
後述するように、配列番号１で示されるタンパク質であるＲＢＭ８Ａは、細胞核内、中心体、紡錘糸、収縮環に局在する。そして、癌細胞においてＲＢＭ８Ａの発現を阻害することにより、細胞周期がＭ期で停止し、当該癌細胞はアポトーシスによる細胞死に至る。このため、配列番号１で示されるタンパク質であるＲＢＭ８Ａの発現及び／又は機能を特異的に阻害することにより、癌細胞の増殖を抑制すると共に、癌細胞のアポトーシスを誘導することができる。
【００４４】
また、配列番号３で示されるタンパク質であるＭａｇｏｈは、ＲＢＭ８Ａとヘテロ二量体を形成可能なものである。そして、癌細胞においてＭａｇｏｈの発現を阻害することにより、当該癌細胞はアポトーシスによる細胞死に至る。このため、配列番号３で示されるタンパク質であるＭａｇｏｈの発現及び／又は機能を特異的に阻害することにより、癌細胞の増殖を抑制すると共に、癌細胞のアポトーシスを誘導することができる。
【００４５】
ＲＢＭ８Ａを阻害する本発明の抗癌剤としては、配列番号５〜９のいずれかで示されるＲＮＡの３’末端にチミジンリボヌクレオチドの二量体からなる突出部を有するＲＮＡ鎖と、配列番号５〜９のいずれかで示されるＲＮＡの相補鎖の３’末端にチミジンリボヌクレオチドの二量体からなる突出部を有するＲＮＡ鎖を対合させて得られた二本鎖ｓｉＲＮＡが挙げられる。
【００４６】
上記二本鎖ｓｉＲＮＡは、ＲＢＭ８Ａをコードし、配列番号２で示されるｍＲＮＡに特異的に結合可能であるので、この二本鎖ｓｉＲＮＡからなる抗癌剤は癌細胞内において、配列番号１で示されるタンパク質であるＲＢＭ８Ａの発現を特異的に抑制することができる。
【００４７】
また、Ｍａｇｏｈを阻害する本発明の抗癌剤としては、配列番号１０又は１１で示されるＲＮＡの３’末端にチミジンリボヌクレオチドの二量体からなる突出部を有するＲＮＡ鎖と、配列番号１０又は１１で示されるＲＮＡの相補鎖の３’末端にチミジンリボヌクレオチドの二量体からなる突出部を有するＲＮＡ鎖を対合させて得られた二本鎖ｓｉＲＮＡが挙げられる。
【００４８】
上記二本鎖ｓｉＲＮＡは、Ｍａｇｏｈをコードし、配列番号４で示されるｍＲＮＡに特異的に結合可能であるので、この二本鎖ｓｉＲＮＡからなる抗癌剤は癌細胞内において、配列番号３で示されるタンパク質であるＭａｇｏｈの発現を特異的に抑制することができる。
【００４９】
ここで、本発明の抗癌剤を構成する二本鎖ｓｉＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで化学的又は酵素的に合成しても、ｉｎ  ｖｉｖｏで合成してもよく、その製造方法は特に限定されるものではないが、従来公知の方法により化学合成して製造することが好ましい。化学合成された二本鎖ｓｉＲＮＡであれば、二本鎖ｓｉＲＮＡの濃度調整や、雑菌の混入防止のための操作が容易となり、ＲＮＡ干渉の効果に優れ、安全性の高い二本鎖ｓｉＲＮＡを得ることができる。例えば、１９塩基対の一方の相補鎖が配列番号５で示され、２塩基の３’突出部がチミジンリボヌクレオチドの二量体である二本鎖ｓｉＲＮＡについては、配列番号５で示されるＲＮＡ鎖の３’末端に２塩基のチミジンリボヌクレオチドを加えた配列、及び配列番号５で示されるＲＮＡ鎖と相補的に結合するＲＮＡ鎖の３’末端に２塩基のチミジンリボヌクレオチドを加えた配列をそれぞれ化学合成し、これらの二本のＲＮＡ鎖が対合する条件で対合させることが好ましい。
【００５０】
本発明の抗癌剤が適用される疾患は、癌である限りにおいて特に限定されるものではないが、非小細胞肺癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、及び食道癌を挙げることができる。これらの中でも、非小細胞肺癌及び乳癌が好ましい。
【００５１】
＜医薬組成物＞
本発明は、本発明の抗癌剤を有効成分とする医薬組成物にも関する。本発明の抗癌剤はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、細胞や組織に対して使用できることに加えて、ヒトに対しても臨床応用可能である。ヒトに対して臨床応用する場合、必要に応じて薬学的に許容される担体を混合し、抗癌剤を含有する医薬組成物の形態で投与することが好ましい。ここで、薬学的に許容される担体としては、特に限定されるものではないが、本発明の抗癌剤が標的となる癌組織や癌細胞に浸透する効率を高めることができるキャリア等を好ましく用いることができる。
【００５２】
上記キャリアとしては、生体内での二本鎖ｓｉＲＮＡの分解を防ぎ、細胞内透過性を高めるためのカチオニックリポソーム（例えば、Ｙａｎｏ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  １０（２２），  ｐ．７７２１−７７２６（２００４）を参照）を挙げることができる。また、本発明の抗癌剤を構成する二本鎖ｓｉＲＮＡについては、生体内での分解を防止するために、化学修飾（例えば、Ｒｏｓｓｉ  Ｊ．Ｊ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ４３２（７０１４），  ｐ．１５５−１５６（２００４）；Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ４３２（７０１４），  ｐ．１７３−１７８（２００４）等を参照）を行ってもよい。
【００５３】
本発明の医薬組成物の剤型は、特に限定されず、注射剤、クリーム剤、軟膏、懸濁剤等を挙げることができる。
【００５４】
＜癌細胞のアポトーシス誘導方法＞
本発明は、本発明の抗癌剤を用いた癌細胞のアポトーシス誘導方法にも関する。当該癌細胞のアポトーシス誘導方法は、単離された癌細胞や、癌細胞を含む細胞集団に対して、本発明の抗癌剤を接触させることにより行われるものである。
【００５５】
本発明の癌細胞のアポトーシス誘導方法において、本発明の抗癌剤を接触させる場合、少なくとも癌細胞を含む細胞集団を、５０〜８０％の濃度で本発明の抗癌剤を含む溶液に接触させ、３６〜３７℃で４〜７２時間放置する。このような操作を行うことにより、本発明の抗癌剤を構成する二本鎖ｓｉＲＮＡが細胞内に取り込まれ、配列番号１で示されるタンパク質であるＲＢＭ８Ａ、又は配列番号３で示されるタンパク質であるＭａｇｏｈの発現が抑制されることによって、癌細胞の増殖を抑制すると共に、癌細胞のアポトーシスを誘導することができる。
【００５６】
＜抗癌剤のスクリーニング方法＞
本発明は抗癌剤のスクリーニング方法にも関する。本発明の抗癌剤のスクリーニング方法は、単離された癌細胞と候補物質とを接触させる工程（接触工程）と、前記癌細胞において、配列番号１若しくは３で示されるタンパク質又はそれらのアイソフォームの発現及び／又は機能を検定する工程と（測定工程）、前記候補物質の中から配列番号１若しくは３で示されるタンパク質又はそれらのアイソフォームの発現及び／又は機能を低下させる候補物質を選択する工程（選択工程）と、を含む抗癌剤のスクリーニング方法である。
【００５７】
（接触工程）
接触工程においては、単離された癌細胞と候補物質とを接触させる。接触工程に用いられる癌細胞については、特に限定されるものではないが、例えば、肺癌細胞、子宮頸部癌細胞、膵癌細胞等を挙げることができる。また、癌細胞と候補物質とを接触させる方法については、候補物質の存在下で癌細胞を培養してもよいし、候補物質を癌細胞内で産生させてもよい。
【００５８】
例えば、候補物質の存在下において癌細胞を培養する場合、９６ウェルマイクロプレート等で癌細胞を培養し、これに候補物質を加えて、３６〜３７℃で４〜７２時間培養し、その後、候補物質を取り除く方法を挙げることができる。
【００５９】
また、候補物質が二本鎖ｓｉＲＮＡである場合には、所定の条件下で候補物質である二本鎖ｓｉＲＮＡを産生するＤＮＡフラグメントをベクターに導入し、これを導入された癌細胞内で二本鎖ｓｉＲＮＡの産生を誘導すればよい。
【００６０】
候補物質としては、例えば、３’突出部を有する二本鎖ｓｉＲＮＡであって、二本鎖ｓｉＲＮＡを構成するＲＮＡ分子の少なくとも一方が、配列番号２又は４で示されるｍＲＮＡと相補的に結合可能である二本鎖ｓｉＲＮＡを挙げることができる。この場合、候補物質については、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて化学的又は酵素的に合成してもよいし、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて合成してもよい。特にｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて酵素的に合成する場合、ＲＢＭ８ＡのｃＤＮＡを原料として、制限酵素反応やライゲーション反応を行うことにより合成してもよい。
【００６１】
（測定工程）
測定工程においては、癌細胞において、配列番号１若しくは３で示されるタンパク質又はそれらのアイソフォームの発現及び／又は機能を検定する。配列番号１若しくは３で示されるタンパク質又はそれらのアイソフォームの発現を検定する方法としては、特に限定されるものではなく、タンパク質の発現量を測定するウェスタンブロッティング法、ｍＲＮＡの発現量を測定するノザンブロッティング法や、抗体染色法等を挙げることができる。
【００６２】
また、配列番号１若しくは３で示されるタンパク質又はそれらのアイソフォームの機能を検定する方法としては、例えば、免疫沈降法により、癌細胞の抽出液から配列番号１で示されるタンパク質であるＲＢＭ８Ａ、又は配列番号３で示されるタンパク質であるＭａｇｏｈを沈降させ、ＲＢＭ８Ａ又はＭａｇｏｈと共沈降するタンパク質の有無をウェスタンブロッティング法により確認して、ＲＢＭ８Ａ又はＭａｇｏｈと他のタンパク質との相互作用及び複合体形成の有無を検出する方法や、ＲＢＭ８Ａ又はＭａｇｏｈ、及びこれと相互作用することが知られているタンパク質を、抗体染色法により染色し、両者が共局在するか否かを確認する方法等を挙げることができる。
【００６３】
特に、ウェスタンブロッティング法や、抗体染色法を用いる場合、測定工程において、配列番号１又は３で示されるタンパク質に対する抗体を使用して前記タンパク質の発現量を測定することが好ましい。この場合、当該抗体としては、モノクローナル抗体を用いても、ポリクローナル抗体を用いてもよいが、モノクローナル抗体を用いることが好ましい。
【００６４】
（選択工程）
選択工程においては、候補物質の中から配列番号１若しくは３で示されるタンパク質又はそれらのアイソフォームの発現及び／又は機能を低下させる候補物質を選択する。選択工程においては、具体的には、測定工程において具体的に行った手法に応じて、配列番号２又は４で示されるｍＲＮＡを発現する遺伝子の発現量を低下させる候補物質を選択する手法や、配列番号１又は３で示されるタンパク質と、上記他のタンパク質との相互作用又は複合体形成を低下させる候補物質を選択すればよく、測定工程において実施する方法に応じて、従来公知の選択方法により候補物質を選択すればよい。
【実施例】
【００６５】
以下、本発明の実施例について図面を参照して詳細に説明する。なお、本発明の以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。【００６６】
以下の実施例、参考例において、ＲＢＭ８Ａを阻害する二本鎖ｓｉＲＮＡとしては、下記の５種類を用いた。
ＲＢＭ８Ａ−ｓｉＲＮＡ（ＩＧ−Ｂ）：配列番号５で示されるＲＮＡの３’末端にチミジンリボヌクレオチドの二量体からなる突出部を有するＲＮＡ鎖と、配列番号５で示されるＲＮＡの相補鎖の３’末端にチミジンリボヌクレオチドの二量体からなる突出部を有するＲＮＡ鎖を対合させて得られた二本鎖ｓｉＲＮＡ。
ＲＢＭ８Ａ−ｓｉＲＮＡ（ＩＧ−Ｆ）：配列番号６で示されるＲＮＡの３’末端にチミジンリボヌクレオチドの二量体からなる突出部を有するＲＮＡ鎖と、配列番号６で示されるＲＮＡの相補鎖の３’末端にチミジンリボヌクレオチドの二量体からなる突出部を有するＲＮＡ鎖を対合させて得られた二本鎖ｓｉＲＮＡ。
ＲＢＭ８Ａ−ｓｉＲＮＡ（１）：配列番号７で示されるＲＮＡの３’末端にチミジンリボヌクレオチドの二量体からなる突出部を有するＲＮＡ鎖と、配列番号７で示されるＲＮＡの相補鎖の３’末端にチミジンリボヌクレオチドの二量体からなる突出部を有するＲＮＡ鎖を対合させて得られた二本鎖ｓｉＲＮＡ（インビトロジェン社製、商品コード「ＨＳＳ１１５０５１」）。
ＲＢＭ８Ａ−ｓｉＲＮＡ（２）：配列番号８で示されるＲＮＡの３’末端にチミジンリボヌクレオチドの二量体からなる突出部を有するＲＮＡ鎖と、配列番号８で示されるＲＮＡの相補鎖の３’末端にチミジンリボヌクレオチドの二量体からなる突出部を有するＲＮＡ鎖を対合させて得られた二本鎖ｓｉＲＮＡ（インビトロジェン社製、商品コード「ＨＳＳ１１５０５２」）。
ＲＢＭ８Ａ−ｓｉＲＮＡ（３）：配列番号９で示されるＲＮＡの３’末端にチミジンリボヌクレオチドの二量体からなる突出部を有するＲＮＡ鎖と、配列番号９で示されるＲＮＡの相補鎖の３’末端にチミジンリボヌクレオチドの二量体からなる突出部を有するＲＮＡ鎖を対合させて得られた二本鎖ｓｉＲＮＡ（インビトロジェン社製、商品コード「ＨＳＳ１１５０５３」）。
【００６７】
また、Ｍａｇｏｈを阻害する二本鎖ｓｉＲＮＡとしては、下記の２種類を用いた。
Ｍａｇｏｈ−ｓｉＲＮＡ（１）：配列番号１０で示されるＲＮＡの３’末端にチミジンリボヌクレオチドの二量体からなる突出部を有するＲＮＡ鎖と、配列番号１０で示されるＲＮＡの相補鎖の３’末端にチミジンリボヌクレオチドの二量体からなる突出部を有するＲＮＡ鎖を対合させて得られた二本鎖ｓｉＲＮＡ（インビトロジェン社製、商品コード「ＨＳＳ１４２８６１」）。
Ｍａｇｏｈ−ｓｉＲＮＡ（２）：配列番号１１で示されるＲＮＡの３’末端にチミジンリボヌクレオチドの二量体からなる突出部を有するＲＮＡ鎖と、配列番号１１で示されるＲＮＡの相補鎖の３’末端にチミジンリボヌクレオチドの二量体からなる突出部を有するＲＮＡ鎖を対合させて得られた二本鎖ｓｉＲＮＡ（インビトロジェン社製、商品コード「ＨＳＳ１４２８６２」）。【００６８】
また、対照の二本鎖ｓｉＲＮＡとしては、下記の５種類を用いた。
対照−ｓｉＲＮＡ（Ｌ）：「Ｓｔｅａｌｔｈ（登録商標）  ＲＮＡｉ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｌｏｗ  ＧＣ  Ｄｕｐｌｅｘ」（商品名、インビトロジェン社製）
対照−ｓｉＲＮＡ（Ｍ）：「Ｓｔｅａｌｔｈ（登録商標）  ＲＮＡｉ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｍｅｄ  ＧＣ  Ｄｕｐｌｅｘ」（商品名、インビトロジェン社製）
対照−ｓｉＲＮＡ（Ｈ）：「Ｓｔｅａｌｔｈ（登録商標）  ＲＮＡｉ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｈｉ  ＧＣ  Ｄｕｐｌｅｘ」（商品名、インビトロジェン社製）
対照−ｓｉＲＮＡ（ＳＮＣ２）：タカラバイオ社製、商品コード「ＳＮＣ２」
対照−ｓｉＲＮＡ（ＳＮＣ５）：タカラバイオ社製、商品コード「ＳＮＣ５」【００６９】
＜参考例１；細胞内におけるＲＢＭ８Ａの局在部位の確認＞
ＲＢＭ８Ａの細胞内における局在部位を確認するに当たり、１０％ウシ胎児血清添加  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ中において３７℃で１６時間培養したＡ５４９細胞を用いた。培養後のＡ５４９細胞はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄後、４％パラフォルムアルデヒド溶液又は−２０℃に冷却したメタノールで固定した。固定されたＡ５４９細胞を０．２％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ１００溶液により処理し、ＰＢＳで洗浄して１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液でブロッキングした。その後、一次抗体として、抗ＲＢＭ８Ａマウス又はウサギ抗体、抗α−チューブリンラット抗体、抗γ−チューブリンウサギ又はマウス抗体、抗リン酸化ＡｕｒｏｒａＢウサギ抗体、抗Ｍａｇｏｈヤギ抗体、又は抗ＦＬＡＧペプチドマウス抗体を用い、抗体溶液を希釈して、ブロッキング後のＡ５４９細胞を処理した。次いで、二次抗体として抗ウサギＩｇＧ抗体及び／又は抗ラットＩｇＧ抗体を用いてＲＢＭ８Ａを、又はＲＢＭ８Ａと各種細胞内小器官とを染色した。染色後の培養細胞に４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を添加して対比染色した後、「Ｐｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ  ａｎｔｉｆａｄｅ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ」（商品名、封入剤、インビトロジェン社製）を用いて封入した。封入後の試料を「ＬＳＭ７１０」又は「Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ」（いずれも商品名、蛍光顕微鏡、カールツァイス社製）を使用して、ＲＢＭ８Ａ及び各細胞内小器官の局在を確認した。ＲＢＭ８Ａを単独で抗体染色した蛍光顕微鏡像を図１に、ＲＢＭ８Ａとγ−チューブリンとを二重染色した蛍光顕微鏡像を図２に示す。
【００７０】
図１に示すように、ＲＢＭ８Ａの染色パターンとＤＡＰＩの染色パターンとは重複しており、ＲＢＭ８Ａが間期の細胞において核に局在していることが分かる。また、Ｍ期の細胞においては、紡錘体と同様の局在パターンでの局在を示し、ＲＢＭ８Ａと紡錘糸との相互作用が示唆された。【００７１】
更に、図２から分かるように、ＲＢＭ８Ａは特にＭ期においてチューブリンと共局在しており、ＲＢＭ８Ａが紡錘体に局在していることが示された。【００７２】
＜参考例２；二本鎖ｓｉＲＮＡによるＲＢＭ８Ａの発現抑制１＞
ＲＢＭ８Ａ−ｓｉＲＮＡ（ＩＧ−Ｂ）又は対照−ｓｉＲＮＡ（Ｌ）を、１０％ウシ胎児血清添加  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ中において３７℃で１６時間培養したＡ５４９細胞にトランスフェクトし、更にトリプシン処理して細胞を回収した。細胞を低張液によって膨潤させた後、カルノア液にて固定した。細胞の懸濁液をスライドグラス上に滴下して乾燥させた後に、ギムザ染色液により染色した。光学顕微鏡下で染色体を形成している細胞の割合を測定した。結果を図３に示す。
【００７３】
図３より、ＲＢＭ８Ａ−ｓｉＲＮＡ（ＩＧ−Ｂ）をトランスフェクトした細胞においては、対照−ｓｉＲＮＡ（Ｌ）をトランスフェクトした細胞に比べ、凝集した染色体の観察される細胞の割合が有意に多かった。これにより、ＲＢＭ８Ａの発現抑制によって細胞がＭ期に集積していることが示された。【００７４】
＜参考例３；二本鎖ｓｉＲＮＡによるＲＢＭ８Ａの発現抑制２＞
参考例２と同様にして、Ａ５４９細胞にＲＢＭ８Ａ−ｓｉＲＮＡ（１）〜（３）、対照−ｓｉＲＮＡ（Ｌ），（Ｍ）のそれぞれをトランスフェクトし、参考例１と同様にして抗リン酸化ヒストンＨ３抗体（抗Ｐ−Ｈ３抗体）で免疫染色を行った。染色後の蛍光顕微鏡像を図４に示す。また、ＤＡＰＩで染まった細胞に対する抗リン酸化ヒストンＨ３抗体で染まった細胞（Ｍ期にある細胞）の割合（％）を図５に示す。さらに、各二本鎖ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞におけるＲＢＭ８Ａの発現量を測定した結果を図６に示す。
【００７５】
図４〜図６から分かるように、ＲＢＭ８Ａ−ｓｉＲＮＡ（１）〜（３）をトランスフェクトし、ＲＢＭ８Ａの発現が阻害された細胞においては、対照−ｓｉＲＮＡ（Ｌ），（Ｍ）をトランスフェクトした細胞に比べ、抗リン酸化ヒストンＨ３抗体により染色される細胞の数が有意に多かった。この結果から、ＲＢＭ８Ａの発現抑制によって細胞がＭ期に集積していることが示唆された。【００７６】
＜参考例４；二本鎖ｓｉＲＮＡによるＲＢＭ８Ａの発現抑制３＞
参考例２と同様にして、Ｈｅｌａ細胞にＲＢＭ８Ａ−ｓｉＲＮＡ（２）又は対照−ｓｉＲＮＡ（Ｌ）をトランスフェクトし、ダブルチミジンブロック法によりＨｅｌａ細胞の細胞周期をＧ１／Ｓ期で停止させた後、開放した。細胞周期においてＧ２／Ｍ期を通過して再びＧ１期となる細胞の割合をフローサイトメーター「ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ」（商品名、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ社製）で測定した。結果を図７に示す。
【００７７】
図７より、ＲＢＭ８Ａ−ｓｉＲＮＡ（２）をトランスフェクトした細胞においては、対照−ｓｉＲＮＡ（Ｌ）をトランスフェクトした細胞に比べ、Ｍ期移行後にＧ１期に再度進行する細胞の割合が有意に少ないことが分かる。この結果より、ＲＢＭ８Ａ−ｓｉＲＮＡ（２）をトランスフェクトした細胞においては、細胞周期がＭ期において停止する傾向にあることが分かる。【００７８】
また、ＲＢＭ８Ａ−ｓｉＲＮＡ（２）又は対照−ｓｉＲＮＡ（Ｌ）をトランスフェクトした細胞を位相差顕微鏡で観察した際の顕微鏡像を図８に示す。図８から分かるように、ＲＢＭ８Ａ−ｓｉＲＮＡ（２）をトランスフェクトした細胞では、対照−ｓｉＲＮＡ（Ｌ）をトランスフェクトした細胞に比べ、アポトーシスが誘導された細胞である浮遊細胞の割合が有意に多かった。【００７９】
＜参考例５；二本鎖ｓｉＲＮＡによるＲＢＭ８Ａの発現抑制４＞
参考例２と同様にして、Ａ５４９細胞にＲＢＭ８Ａ−ｓｉＲＮＡ（２）をトランスフェクトし、その後トリプシン処理を行って回収後、回収した細胞について、参考例１と同様にしてγ−チューブリンを染色した。蛍光顕微鏡下、チューブリンの局在を確認した。抗γ−チューブリン抗体による抗体染色像を図９に示す。なお、図９中、白矢印は異常な微小管の形態を示す細胞である。
ＲＢＭ８Ａ−ｓｉＲＮＡ（１）〜（３）、対照−ｓｉＲＮＡ（Ｍ），（Ｈ）を用いて同様にγ−チューブリンを染色し、蛍光顕微鏡下、チューブリンの局在を確認した。蛍光顕微鏡下で観察した異常な微小管の形態を示す細胞の割合（％）を図１０に示す。
【００８０】
図９，図１０から分かるように、ＲＢＭ８Ａ−ｓｉＲＮＡ（１）〜（３）によってＲＢＭ８Ａの発現が抑制された細胞においては、微小管の形態が異常になっているものが多く観察された。【００８１】
＜参考例６；二本鎖ｓｉＲＮＡによるアポトーシスの誘導＞
Ａ５４９細胞を１０％ウシ胎児血清添加  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ中において、３７℃で４８時間培養し、トリプシン処理して回収後、単個細胞として培養プレートに接種した。これにＲＢＭ８Ａ−ｓｉＲＮＡ（１）〜（３）、対照−ｓｉＲＮＡ（Ｌ），（Ｍ），（Ｈ）のそれぞれをトランスフェクトし、経時的に「Ａｐｏ−ｏｎｅ  Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ  ３／７  ａｓｓｅｙ」（商品名、アポトーシス検出キット、プロメガ社製）を用いてカスパーゼ３，７の活性を検出した。各細胞におけるカスパーゼ３／７の活性量を示す蛍光強度を図１１に示す。
【００８２】
図１１から分かるように、ＲＢＭ８Ａ−ｓｉＲＮＡ（１）〜（３）をトランスフェクトした細胞については、対照−ｓｉＲＮＡ（Ｌ），（Ｍ），（Ｈ）をトランスフェクトした細胞に比べ、カスパーゼ３／７の活性が高まっていた。この結果から、ＲＢＭ８Ａ−ｓｉＲＮＡ（１）〜（３）をトランスフェクトした細胞においては、アポトーシスが誘導される傾向にあることが分かる。【００８３】
＜参考例７；二本鎖ｓｉＲＮＡによるＲＢＭ８Ａの発現抑制５＞
参考例２と同様にして、Ａ５４９細胞にＲＢＭ８Ａ−ｓｉＲＮＡ（ＩＧ−Ｂ），（ＩＧ−Ｆ）、対照−ｓｉＲＮＡ（ＳＮＣ２），（ＳＮＣ５）のそれぞれをトランスフェクトし、その後トリプシン処理を行って回収後、単個細胞として培養プレートに接種した。各試料におけるＲＢＭ８Ａの発現量を測定した結果を図１２に示す。また、２週間培養後、細胞をＰＢＳで洗浄し、メタノールで固定してギムザ染色液で染色した結果を図１３に示す。
【００８４】
図１２，図１３より、ＲＢＭ８Ａ−ｓｉＲＮＡ（ＩＧ−Ｂ），（ＩＧ−Ｆ）をトランスフェクトし、ＲＢＭ８Ａの発現が抑制された細胞においては、生細胞の減少が見られる。この結果より、ＲＢＭ８Ａの発現抑制によりアポトーシスが誘導されていることが示唆された。【００８５】
＜実施例１；二本鎖ｓｉＲＮＡによるＭａｇｏｈの発現抑制１＞
参考例２と同様にして、Ａ５４９細胞にＭａｇｏｈ−ｓｉＲＮＡ（１），（２）、対照−ｓｉＲＮＡ（Ｍ），（Ｈ）のそれぞれをトランスフェクトし、その後トリプシン処理を行って細胞を回収した。各試料におけるＲＢＭ８Ａ及びＭａｇｏｈの発現量を測定した結果を図１４に示す。また、フローサイトメーター「ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ」（商品名、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ社製）を用いて細胞周期を解析した結果を図１５に示す。
【００８６】
図１４から分かるように、Ｍａｇｏｈ−ｓｉＲＮＡ（１），（２）をトランスフェクトした細胞においては、ＭａｇｏｈのみならずＲＢＭ８Ａの発現も抑制されていた。また、図１５から分かるように、Ｍａｇｏｈ−ｓｉＲＮＡ（１），（２）をトランスフェクトした細胞については、対照−ｓｉＲＮＡ（Ｍ），（Ｈ）をトランスフェクトした細胞に比べ、グラフの低値に集まっていた。この結果より、Ｍａｇｏｈの発現抑制によりＲＢＭ８Ａの発現も抑制され、アポトーシスが誘導されることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明の抗癌剤は、配列番号１で示されるＲＢＭ８Ａ、又は配列番号３で示されるＭａｇｏｈの発現を特異的に阻害することができる。ここで、癌細胞におけるＲＢＭ８Ａ又はＭａｇｏｈの発現及び／又は機能を阻害することにより、細胞周期をＭ期において停止させ、細胞の増殖を阻害することができるため、癌細胞の増殖を抑制すると共に、癌細胞のアポトーシスを誘導することができ、癌を治癒することができる。
【図５】
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【図７】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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