(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）又は（２）のタンパク質又はペプチドをコードする遺伝子：
（１）配列番号２の１〜１８０番、３２〜７１番、３２〜１２６番、３２〜１７４番、８７〜１２６番、８７〜１７４番、及び１３５〜１７４番のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はペプチド、
（２）配列番号２の１〜１８０番、３２〜７１番、３２〜１２６番、３２〜１７４番、８７〜１２６番、８７〜１７４番、及び１３５〜１７４番のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ糖認識活性を有するタンパク質又はペプチド。
【請求項２】
前記配列番号２のアミノ酸配列をコードする遺伝子が、配列番号１で示される、請求項１に記載の遺伝子。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の組換えベクターを宿主に導入して得られる形質転換体。
【請求項５】
請求項４に記載の形質転換体を培養又は生育することを特徴とする、組換えタンパク質又はペプチドの製造方法。
【請求項６】
請求項３に記載の組換えベクターを無細胞タンパク質合成系に供して組換えタンパク質又はペプチドを発現させることを特徴とする、組換えタンパク質又はペプチドの製造方法。
【請求項７】
請求項４に記載の形質転換体から発現した組換えタンパク質又はペプチドを、タグ配列及び／又は糖認識活性を介したアフィニティー精製にかけることを特徴とする、組換えタンパク質又はペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖認識活性を有するタンパク質又はペプチドをコードする遺伝子に関し、より詳細にはα１→６フコース特異的に認識するタンパク質又はペプチドをコードする遺伝子とその遺伝子工学的製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｎ結合型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースをα１→６結合として転移させるフコースα１→６転移酵素（α１→６ＦｕｃＴ）の遺伝子は、肝細胞の癌化にともなって発現することが知られている。この癌化した肝細胞の有無は、フコースに親和性をもつレンズマメレクチン（ＬＣＡ）を用いたレクチン親和電気泳動で検出できる。
【０００３】
従来、フコースα１→６糖鎖と親和性を有するレクチンとして、上記ＬＣＡの他に、エンドウマメレクチン（ＰＳＡ）、ヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）、ラッパスイセンレクチン（ＮＰＡ）、ソラマメレクチン（ＶＦＡ）、麹菌レクチン（ＡＯＬ）等が知られている（特許文献１〜５）。
【０００４】
しかし、上記の公知のレクチンは、フコースα１→６糖鎖の他にも、α１→６結合以外のフコースを持つ糖脂質系糖鎖にも親和性を示し、３本鎖以上のフコースα１→６糖鎖へは親和性を示さない。具体的には、ＡＡＬ及びＡＯＬは、フコースα１→２、フコースα１→３等にも親和性を有する。ＬＣＡ、ＰＳＡ及びＶＦＡは、３本鎖以上のフコースα１→６糖鎖への親和性を有していない。
【０００５】
本発明者らは、担子菌に由来し、フコースα１→６糖鎖に特異的に結合する新規レクチンを発見し、その製造方法、並びに該レクチンを用いた糖鎖の検出及び分別方法に利用できることを明らかにした（特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２００２／０３０９５４
【特許文献２】ＷＯ２００３／０８４５６９
【特許文献３】特開平０２−０８３３３７の実施例
【特許文献４】特開２００２−１１２７８６の実施例５
【特許文献５】特開２００７−１６１６３３
【特許文献６】ＰＣＴ／ＪＰ２００９／００３３４６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らが天然物から取得したα１→６フコース特異的レクチンを、遺伝子工学的手法を用いた組換えタンパクとして安定に製造することができれば、α１→６フコース特異的レクチンの利用度が向上する。そこで、本発明の目的は、本発明者らが担子菌から新規に単離したα１→６フコース特異的レクチンをコードする遺伝子、及びその遺伝子に基づいてα１→６フコース特異的に認識するタンパク質又はペプチドを遺伝子工学的に製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記の課題を解決するために、ツチスギタケ由来のレクチン（ツチスギタケレクチン、以下、ＰＴＬと記載する）の部分アミノ酸配列を基に、Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄ法（以下、ＲＡＣＥ法と記載する）を利用して該レクチンをコードする遺伝子の完全長ｃＤＮＡをクローニングし、その塩基配列を決定することに成功した。すなわち、本発明は、以下の（１）又は（２）のタンパク質又はペプチドをコードする遺伝子：
（１）配列番号２の１〜１８０番、３２〜７１番、３２〜１２６番、３２〜１７４番、８７〜１２６番、８７〜１７４番、及び１３５〜１７４番のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はペプチド、
（２）配列番号２の１〜１８０番、３２〜７１番、３２〜１２６番、３２〜１７４番、８７〜１２６番、８７〜１７４番、及び１３５〜１７４番のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ糖認識活性を有するタンパク質又はペプチドを提供する。
【０００９】
前記配列番号２のアミノ酸配列をコードする遺伝子は、例えば配列番号１で示される。
【００１０】
本発明は、また、上記遺伝子を含有する組換えベクターを提供する。
【００１１】
本発明は、また、上記組換えベクターを宿主に導入して得られる形質転換体を提供する。
【００１２】
本発明は、また、上記形質転換体から発現した組換えタンパク質又はペプチドを提供する。
【００１３】
本発明は、また、上記形質転換体を培養又は生育することを特徴とする、組換えタンパク質又はペプチドの製造方法である。
【００１４】
本発明は、また、上記組換えベクターを、無細胞タンパク質合成系に供して組換えタンパク質又はペプチドを発現（すなわち、インビトロの転写と翻訳）させることを特徴とする、組換えタンパク質又はペプチドの製造方法である。
【００１５】
本発明は、また、上記で得られた組換えタンパク質又はペプチドを、タグ配列及び／又は糖認識活性を介したアフィニティー精製にかけることを特徴とする、組換えタンパク質又はペプチドの製造方法である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、ＰＴＬをコードする遺伝子が提供される。遺伝子を利用すれば、ＰＴＬの大量生産が可能になる。ＰＴＬは、フコースα１→６糖鎖を特異的に検出できることから、フコースα１→６糖鎖の特異的結合剤や糖鎖研究用試薬をはじめとして、フコースα１→６糖鎖が関係する腫瘍マーカーの正確な検出、予後判定、治療効果判定、並びに新規な腫瘍マーカーの探索等にも有用である。本発明により、糖認識部位を１個又は複数持つ組換えタンパク質又はペプチドの作製が可能になる。糖認識部位の数を変えることにより、細胞又は糖タンパク質の凝集を制御できることから、今までのレクチンでは困難であった検出手法への応用も可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＰＴＬ遺伝子全長配列図を示す。
【図２】ＰＣＲ産物のアガロース電気泳動を示す。
【図３】ｒＰＴＬ７のＳＤＳ電気泳動図を示す。
【図４】ｒＰＴＬ８〜１０のＳＤＳ電気泳動図を示す。
【図５】ｒＰＴＬ１〜６のＳＤＳ電気泳動図を示す。
【図６】ｒＰＴＬの糖タンパク質アレイ図を示す。
【図７】Ｓｔｒｅｐ・ＴａｇＩＩ除去ｒＰＴＬによる糖タンパク質アレイを示す。
【図８Ａ】ＰＡ化糖鎖の構造図を示す。
【図８Ｂ】ＰＡ化糖鎖の構造図を示す。
【図９】ＳＲＬ遺伝子全長配列を時雌。
【図１０】ｒＳＲＬのＳＤＳ電気泳動図を示す。
【図１１】ｒＳＲＬの糖タンパク質アレイを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下に、本発明の一実施形態について、詳細に説明する。
（Ａ．ツチスギタケレクチン）
ツチスギタケは、担子菌モエギタケ科に属するキノコの一種である。レクチンは、生物界に広く存在し、糖を特異的に認識して結合するタンパク質の総称である。分子内サブドメイン内に糖認識サイトを一つしか持っていない場合でも、多くの分子は多量体を形成するため、糖鎖分子を介した架橋形成能を有する。
【００１９】
ＰＴＬは、本発明者らがツチスギタケの子実体より抽出・精製し、その物性とＮ末端のアミノ酸配列を明らかにした（特許文献６）。それによれば、ＰＴＬは、ドデシル硫酸ナトリウム電気泳動法（以下、ＳＤＳ電気泳動法と記載する）による分子量が４，０００〜４０，０００であり、またフコースα１→６糖鎖に対する結合定数が１．０×１０４Ｍ−１以上である。ＰＴＬは、フコースα１→６糖鎖の非還元末端にシアル酸を有するものに対しても親和性が高い。従来のフコースα１→６特異的レクチン（例えばＬＣＡ、ＮＰＡ及びＰＳＡ）は、非還元末端にシアル酸を有するフコースα１→６糖鎖に対する親和性が低い。このことは、ＰＴＬが従来のレクチンより優れていることを意味する。
【００２０】
（Ｂ．ＰＴＬ遺伝子のクローニング）
ＰＴＬをコードする遺伝子（以下、ＰＴＬ遺伝子と記載する）は、すでに特定されているＮ末端部分のアミノ酸配列に基づき、ツチスギタケのｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーから周知の方法に従ってクローニングすることができる。例えば、ｃＤＮＡに対して、上記部分アミノ酸配列から作製されるプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと記載する）を行い、得られた増幅断片によりツチスギタケｃＤＮＡライブラリーから目的とするＰＴＬ遺伝子をクローニングする。あるいは、ｃＤＮＡライブラリーを作製することなく、ＲＡＣＥ法を利用してｃＤＮＡから目的のＰＴＬ遺伝子をクローニングする。一般に、ｃＤＮＡライブラリーからの全長ｃＤＮＡの取得は困難であることが多く、ここではＲＡＣＥ法によるクローニングについて説明する。
【００２１】
１．ｍＲＮＡの抽出
まず、ツチスギタケよりｍＲＮＡを調製する。ｍＲＮＡの供給源は、ツチスギタケの傘、菌褶、菌輪、菌柄、脚苞、菌糸等子実体の一部であっても、子実体全体であってもよいが、子実体全体が好ましい。
【００２２】
ｍＲＮＡの抽出は、通常行われる手法により行うことができる。例えば、子実体全体を液体窒素で凍結する。次いで、凍結した子実体全体を粉砕後、トリゾル試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等を加えて核酸を抽出する。あるいは、市販のキットであるＭＡＣＳ  ｍＲＮＡ  アイソレーションキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）等を用いて抽出してもよい。抽出した核酸は、クロロホルム、フェノール試薬等で処理して全ＲＮＡを得る。次いで、オリゴ（ｄＴ）磁性ビーズと磁石、又はオリゴ（ｄＴ）−セルロース等を用いたアフィニティーカラム、若しくは全ＲＮＡからのＰｏｌｙ（Ａ）＋  アイソレーションキット  （ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ社製）等のキットにより、ｍＲＮＡ（Ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ）を調製する。
【００２３】
２．ｃＤＮＡの合成
こうして得られたｍＲＮＡを鋳型として、市販のキット、例えばマラソン（登録商標）  ｃＤＮＡ  アンプリフィケーション  キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等を用いて、オリゴ（ｄＴ）プライマー及び逆転写酵素によって一本鎖ｃＤＮＡを合成した後、一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合成する。
【００２４】
３．ＲＡＣＥ法による完全長ｃＤＮＡの取得
得られた二本鎖ｃＤＮＡに、適切なアダプターを付加した後、アダプタープライマーと、例えば表６に示すような遺伝子特異的プライマー（Ｇｅｎｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｒｉｍｅｒ、以下ＧＳＰと記載する）を用いてＰＣＲを行う。得られる５’−ＲＡＣＥ産物、及び３’−ＲＡＣＥ産物の末端の塩基配列を決定し、その配列から、新たに５’側及び３’側ＧＳＰを作製してＰＣＲを行い、目的とする完全長ｃＤＮＡを取得する。
【００２５】
ＰＴＬの場合、Ｎ末端のアミノ酸配列を基に作製した縮重プライマーとアダプタープライマーによる一次ＰＣＲ反応後に、さらに縮重プライマーの内側の配列を基に作製したｎｅｓｔｅｄ縮重プライマーとｎｅｓｔｅｄ−アダプタープライマーによる二次ＰＣＲ反応を行い目的とするＰＴＬ  ｃＤＮＡを増幅する。
【００２６】
４．塩基配列の決定
得られたＰＴＬ  ｃＤＮＡは、ダイレクトシークエンス法、あるいはｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ  ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＢｌｕｅ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等の市販のプラスミドベクターにサブクローニングするサイクルシークエンス法により塩基配列解析を行う。塩基配列の決定は、マキサム−ギルバートの化学修飾法、Ｍ１３ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法等の公知の手法により行うことができる。自動塩基配列解析装置（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ社製：ＣＥＱＴＭ  ８０００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ等）を用いる方法が簡便で好ましい。
【００２７】
（Ｃ．ＰＴＬ遺伝子）
上記の方法により単離されるＰＴＬ遺伝子（ｃＤＮＡ）は、配列番号１に示す６９５塩基からなる塩基配列を有する。配列番号１の塩基配列は、コドン表に基づいて配列番号２に示す１８０アミノ酸残基に変換される。図１にアミノ酸配列の特徴を示す。図１中、糖認識ドメイン（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎ）と見なされるＣＲＤ１、ＣＲＤ２及びＣＲＤ３の部分配列は、天然ＰＴＬのＮ末端アミノ酸配列の分析結果（４０アミノ酸残基）と相同性が非常に高い（８０％以上）。さらに、これらのペプチド同士の相同性もまた、表１に示すように非常に高い。
【００２８】
【表１】
0005531290.tif 000002
【００２９】
上記したように、ＣＲＤ１、ＣＲＤ２及びＣＲＤ３は、ツチスギタケ由来のレクチンのＮ末端アミノ酸配列や他のＣＲＤと相同性が高い。また、実施例５並びに７に示すように、ＣＲＤ１、ＣＲＤ１＋ＣＲＤ２、ＣＲＤ１＋ＣＲＤ２＋ＣＲＤ３、ＣＲＤ２、ＣＲＤ２＋ＣＲＤ３、並びにＣＲＤ３、のいずれも、α１→６フコース特異的に認識するタンパク質又はペプチドであることが判明している。
【００３０】
したがって、本発明の遺伝子は、以下の（１）又は（２）のタンパク質又はペプチドをコードする遺伝子と定義することができる。
（１）配列番号２の１〜１８０番、３２〜７１番、３２〜１２６番、３２〜１７４番、８７〜１２６番、８７〜１７４番、及び１３５〜１７４番のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はペプチド、
（２）配列番号２の１〜１８０番、３２〜７１番、３２〜１２６番、３２〜１７４番、８７〜１２６番、８７〜１７４番、及び１３５〜１７４番のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ糖認識活性を有するタンパク質又はペプチド。
アミノ酸配列及び塩基配列の範囲の意味づけを表２に示す。
【００３１】
【表２】
0005531290.tif 000003
【００３２】
本発明のＰＴＬ遺伝子は、また、配列番号１の２０〜５６２番、１１３〜２３２番、１１３〜３９７番、１１３〜５４１番、２７８〜３９７番、２７８〜５４１番、及び４２２〜５４１番のいずれかで表される塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる他のポリヌクレオチドであっても、本発明の糖認識活性を有するＰＴＬタンパク質をコードする限り、本発明の遺伝子に含まれる。ここで、ストリンジェントな条件下とは、例えば、ナトリウム濃度が３０ｍＭかつ温度が６５℃、好ましくはナトリウム濃度が１０ｍＭかつ温度が６５℃の条件下をいう。
【００３３】
なお、本明細書中において、「遺伝子」という用語には、ＤＮＡのみならずそのｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びｃＲＮＡも含むものとする。したがって、本発明の遺伝子には、常に配列表に示されるコーディング鎖とその相補鎖の両方が含まれ、該塩基配列を有するＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、及びｃＲＮＡの全てが含まれる。また、配列表の塩基配列は、すべてＤＮＡ配列として記載するが、該配列がＲＮＡを示す場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は、「ｕ」に読み替えるものとする。
【００３４】
一旦、ＰＴＬ遺伝子とその塩基配列が確定されると、その後は、化学合成、ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ、あるいは塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることによってＰＴＬ遺伝子を取得することは、当業者には容易である。
【００３５】
（Ｄ．組換えＰＴＬタンパク質の製造）
本発明者らは、このＰＴＬの効果的な精製法を開発した（特許文献６）。しかし、その方法は、天然に生息しているツチスギタケを原料として用いているため、天候や季節による原料確保の問題が含まれていた。
【００３６】
ＰＴＬは、糖鎖研究用試薬への応用のほか、癌化に伴いフコースα１→６糖鎖が増加するという知見から、癌医療において腫瘍マーカーの正確な診断並びに、新規な腫瘍マーカーの探索等にも応用できることが期待される。したがって、遺伝子工学的にＰＴＬを大量生産することができれば、それは極めて効率的な当該レクチンの取得方法となる。以下、本発明の遺伝子を利用した組換えタンパク質又はペプチドの製造方法について説明する。
【００３７】
１．組換えベクターの作製
ＰＴＬ遺伝子を含む組換えベクターは、公知のベクターにＰＴＬ遺伝子を連結（挿入）することによって得ることができる。前記ベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等を用いることができる。
【００３８】
前記プラスミドベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２，  ｐＵＣ１８，  ｐＵＣ１１９，  ｐＴｒｃＨｉｓ，  ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０，  ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３，  ＹＥｐ２４，  ＹＣｐ５０，  ｐＹＥ５２等）が挙げられる。ファージベクターとしては、λファージ等が挙げられる。さらに、レトロウイルス、ワクシニアウイルスのような動物ウイルスベクター、バキュロウイルスのような昆虫ウイルスベクター、ジャガイモエックスウイルスのような植物ウイルスベクター等を用いてもよい。
【００３９】
前記ベクターへのＰＴＬ遺伝子の挿入は、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、ベクターＤＮＡの適当な制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法が採用される。
【００４０】
ＰＴＬ遺伝子は、その遺伝子の機能を好適に発揮できるようにベクターに組み込む必要がある。そのために、ベクターには、ＰＴＬ遺伝子の他に、プロモーター、必要であればエンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選抜マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等を含有させることができる。選抜マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等を挙げることができる。
【００４１】
組換えベクターは、ＰＴＬ遺伝子を開始コドンから直接発現させるものでも、融合タンパク質として発現させるものでもよい。さらには、ＰＴＬ遺伝子を含むＤＮＡ断片を発現させてもよい。
【００４２】
２．形質転換体の作出
ＰＴＬ遺伝子を導入した形質転換体は、上述の組換えベクターをＰＴＬ遺伝子が発現しうる態様で宿主中に導入することによって得ることができる。宿主としては、ＰＴＬ遺伝子を発現できるものであれば特に限定されない。例えば、エッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロテイ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｅｉ）等のリゾビウム属に属する細菌、サッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ  ｓｃｅｒｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）等の酵母、サル細胞（ＣＯＳ細胞）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）等の動物細胞、Ｓｆ１９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）等の昆虫、並びに大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、ウキクサ（Ｓｐｉｒｏｄｅｌａ  ｐｏｌｙｒｈｉｚａ）等の植物を挙げることができる。
【００４３】
大腸菌等の細菌を宿主とする場合、組換えベクターは、各細菌中で自律複製可能であるとともに、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の遺伝子及び転写終結配列により構成されていることが望ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。大腸菌としては、エッシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２、ＤＨ１、ＴＯＰ１０Ｆ等が挙げられ、枯草菌としては、バチルス・ズブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４、２０７−２１等が挙げられる。
【００４４】
前記プロモーターとしては、大腸菌等の宿主で発現できるものであれば特に限定されない。例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター等の大腸菌由来のプロモーターを用いることができる。人為的に設計されたｔａｃプロモーター等のプロモーターを用いてもよい。
【００４５】
組換えベクターの大腸菌等の細菌への導入方法は、細菌にＤＮＡを導入できる方法であれば特に限定されない。例えば、カルシウムイオンを用いる方法（Ｃｏｈｅｎ，  Ｓ．Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．：  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ６９：２１１０  （１９７２））、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００４６】
酵母を宿主とする場合、例えばサッカロミセス・セルビシエ（Ｓ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）等が用いられる。プロモーターとしては、酵母で発現できるものであれば特に限定されない。例えば、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸプロモーター等を挙げることができる。
【００４７】
組換えベクターの酵母への導入方法は、酵母にＤＮＡを導入しうる方法であれば特に限定されない。例えば、エレクトロポレーション法（Ｂｅｃｋｅｒ，  Ｄ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．：Ｍｅｔｈｏｄｓ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４：  １８０  （１９９０））、スフェロプラスト法（Ｈｉｎｎｅｎ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．：Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７５：１９２９  （１９７８））、酢酸リチウム法（Ｉｔｏｈ，  Ｈ．：  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３：１６３  （１９８３））等を挙げることができる。
【００４８】
動物細胞を宿主とする場合、サル細胞（ＣＯＳ−７）、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３細胞、ヒトＦＬ細胞等が用いられる。プロモーターとしては、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター等が用いられる。
【００４９】
組換えベクターの動物細胞への導入方法は、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００５０】
昆虫細胞を宿主とする場合、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞等が用いられる。プロモーターとしては、ポリヘドリンプロモーター、ｐ１０プロモーター等が用いられる。
【００５１】
組換えベクターの昆虫細胞への導入方法は、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、バキュロウイルス法等が用いられる。
【００５２】
昆虫を宿種とする場合、カイコ等が用いられる。プロモーターとしては、ポリヘドリンプロモーター、人為的に設計されたＥ−ｖｐ３９ｐｕロモーター等が用いられる。
【００５３】
組換えベクターの昆虫への導入方法は、例えばバキュロウイルス法、卵への顕微注射等が用いられる。
【００５４】
植物を宿種とする場合、大豆、ウキクサ、トウモロコシ等が用いられる。プロモーターとしては、３５Ｓプロモーター、ＮＯＳプロモーター等が用いられる。
【００５５】
組換えベクターの植物への導入方法は、例えばアグロバクテリウム法、パーティクルガン法等が用いられる。
【００５６】
３．組換えＰＴＬタンパク質の生産
ＰＴＬタンパク質は、前項（２．形質転換体の作出）で記載の形質転換体を培養又は生育し、その培養物から該タンパク質を採取することによって得ることができる。形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。或いは前項（１．組換えベクターの作製）で記載の組換えベクターを無細胞タンパク質合成系に供し、インビトロでタンパク質又はペプチドを発現させることによって得ることもできる。
【００５７】
大腸菌、酵母等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化しうる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体を効率的に培養しうる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００５８】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン、マルトース、デキストリン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としてはアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩若しくはその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、カザミノ酸、ＮＺアミン等が用いられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム、硫酸亜鉛、塩化コバルト等が用いられる。
【００５９】
培養は、通常、振とう培養又は通気攪拌培養等の好気的条件下で、温度は約１５℃〜４０℃で、培養時間は３〜２４時間行う。培養期間中、ｐＨは５．０〜８．０に保持する。ｐＨの調製は、無機又は有機の酸、アルカリ溶液による。
【００６０】
培養中には、必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のものを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する場合、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する場合、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する場合、インドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
【００６１】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般的に使用されているＲＰＭｌ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地等、これらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が挙げられる。培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、２０〜３７℃で１〜７日間行う。培養中、必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００６２】
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｒａｃｅ，Ｔ．Ｃ．Ｃ．：Ｎａｔｕｒｅ，  １９５：７８８  （１９６２））等に牛胎児血清等を添加した培地が挙げられる。培養は、通常２５℃で１〜７日間行う。培養期間中、ｐＨは６．０〜７．０に保持し、必要に応じて通気や攪拌を加える。
【００６３】
培養後、本発明のタンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合、菌体又は細胞を破砕する。一方、本発明のタンパク質が菌体外又は細胞外に分泌される場合、培養液をそのまま用いるか、遠心分離等によって菌体又は細胞を除去した後に上清を得る。タンパク質の単離・精製には、一般的に、例えば硫酸アンモニウム沈澱、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独であるいは適宜組み合わせて用いることにより、上記の培養物（細胞破砕液、培養液、又はそれらの上清）から本発明の組換えＰＴＬタンパク質を単離・精製することができる。
【００６４】
無細胞タンパク質合成系としては、大腸菌抽出液、コムギ胚芽抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、昆虫細胞抽出液、哺乳細胞抽出液、インビトロタンパク質合成キット等が用いられる。
【００６５】
以上に説明したように、ＰＴＬ遺伝子を用いることで、ＰＴＬを遺伝子工学的に生産することができかつ、安定的、効率的に得ることができる。
【００６６】
また、遺伝子工学技術により組換えＰＴＬタンパク質又はペプチドにレクチン以外の機能を持った公知のタンパク質、例えば抗体のＦｃ鎖やオワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ，  ＧＦＰ）等を融合させることが容易におこなえる。これにより、天然物にはない有用な機能を持つＰＴＬの製造が可能になる。
【実施例】
【００６７】
以下に、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。しかし、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕（ツチスギタケ由来のレクチン遺伝子のクローニング）
本発明者らは、先のＰＣＴ／ＪＰ２００９／００３３４６（発明の名称：α１→６フコース特異的レクチン）にＰＴＬのアミノ酸配列をＰｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ＰＰＳＱ−２１  Ｓｙｓｔｅｍ（（株）島津製作所製）を用いて解析した結果を示した。得られたＮ末端のアミノ酸配列を基に、５’ＲＡＣＥ法及び３’ＲＡＣＥ法により、レクチン遺伝子のクローニングを、以下の手順で試みた。
【００６８】
（ｍＲＮＡの抽出）
ツチスギタケ子実体を、乳鉢と乳棒により液体窒素中で破砕した。１００ｍｇの破砕サンプルにトリゾル試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１ｍＬ加え、全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡからのｍＲＮＡの精製は、Ｐｏｌｙ（Ａ）＋  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  キット  ｆｒｏｍ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ（ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ社製）を用いて、該当キットの説明書に従いｍＲＮＡを精製した。
【００６９】
（ｃＤＮＡ合成）
精製したｍＲＮＡからの２本鎖ｃＤＮＡ合成は、マラソン（登録商標）  ｃＤＮＡ  アンプリフィケーション  キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて行った。すなわち、２．５μＬのｍＲＮＡ溶液（４６０ｎｇ）に、付属のｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  プライマー溶液（１０μＭ）を０．５μＬ加えた。溶液を、７０℃で２分間加熱後、氷上で２分間静置した。続いて、表３に記載の反応組成にて、４２℃で１時間反応させ、１本鎖ｃＤＮＡ反応液を調製した。
【００７０】
【表３】
0005531290.tif 000004
【００７１】
この１本鎖ｃＤＮＡ反応液を、表４に記載の反応組成にて１６℃で１．５時間反応させた。
【００７２】
【表４】
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【００７３】
さらに１μＬのＴ４  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（３  ｕｎｉｔｓ）を加えて、１６℃で４５分間反応させた。続いて、２μＬのＥＤＴＡ／ｇｌｙｃｏｇｅｎ溶液を添加し、２本鎖ｃＤＮＡ合成反応を停止させた。この反応液に、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）溶液を５０μＬ加え混和した。遠心分離（１４，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、２５℃）後、水層を回収した。回収した水層に、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）溶液を５０μＬ加え混和した。遠心分離（１４，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、２５℃）後、水層を回収した。回収した溶液に、１／２倍量の４Ｍ  酢酸アンモニウム溶液と２．５倍量の９５％  エタノールを加えて混和した。遠心分離（１４，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、２５℃）し、ｃＤＮＡを沈殿させた。上清を除いた沈殿物に、８０％  エタノールを１５０μＬ加え、沈殿を洗浄した。遠心分離（１４，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、２５℃）後、上清を除き、沈殿物を乾燥させた。乾燥させた沈殿物を５μＬの滅菌水で溶解することにより、２本鎖ｃＤＮＡ溶液を調製した。
【００７４】
（２本鎖ｃＤＮＡへのアダプター配列の付加）
調製した２本鎖ｃＤＮＡへのアダプター配列の付加は、マラソン（登録商標）  ｃＤＮＡ  アンプリフィケーション  キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に付属しているアダプターを用いて行った。すなわち、２．５μＬの２本鎖ｃＤＮＡ溶液を、表５に記載の反応組成にて、１６℃で１晩反応させ、アダプター配列が付加した２本鎖ｃＤＮＡ（アダプター配列付加２本鎖ｃＤＮＡ溶液）を調製した。
【００７５】
【表５】
0005531290.tif 000006
【００７６】
（縮重プライマーの設計）
ペプチドシーケンンサー：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ＰＰＳＱ−２１  Ｓｙｓｔｅｍ（（株）島津製作所製）で解析したＰＴＬのＮ末端部分アミノ酸配列を基に、縮重プライマーを作製した。表６に示す４種類のプライマーを作製した。ＮＧＳＰ＿ｓｅｎｃｅ＿ＰＴＬ及びＮＧＳＰ＿ａｎｔｉｓｅｎｃｅ＿ＰＴＬは、それぞれ、ＧＳＰ＿ｓｅｎｃｅ＿ＰＴＬ及びＧＳＰ＿ａｎｔｉｓｅｎｃｅ＿ＰＴＬの内側の配列を基に作製した。
【００７７】
【表６】
0005531290.tif 000007
【００７８】
（一次ＰＣＲ）
ＰＣＲは、Ｔａｋａｒａ  Ｅｘ−Ｔａｑ（登録商標）（タカラバイオ株式会社製）を用いて行った。まず、先に得られたｃＤＮＡを鋳型として、マラソン（登録商標）  ｃＤＮＡ  アンプリフィケーション  キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に付属しているアダプタープライマーとＧＳＰ＿ｓｅｎｃｅ＿ＰＴＬ（５’ＲＡＣＥ）又はＧＳＰ＿ａｎｔｉｓｅｎｃｅ＿ＰＴＬ（３’ＲＡＣＥ）を用いて、表７に記載の反応組成及び表８に記載の反応条件で、一次ＰＣＲを行った。一次ＰＣＲ産物は、分析時まで４℃に保存した。一次ＰＣＲによって、ＤＮＡ断片が増幅されたことを、ＰＣＲ産物のアガロース電気泳動、及びエチジウムブロマイド染色にて確認した。
【００７９】
【表７】
0005531290.tif 000008
【００８０】
【表８】
0005531290.tif 000009
【００８１】
（二次ＰＣＲ）
次に、増幅されたＤＮＡ断片を鋳型としてマラソン（登録商標）  ｃＤＮＡ  アンプリフィケーション  キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に付属しているｎｅｓｔｅｄ−アダプタープライマーとＮＧＳＰ＿ｓｅｎｃｅ＿ＰＴＬ（５’ＲＡＣＥ）又はＮＧＳＰ＿ａｎｔｉｓｅｎｃｅ＿ＰＴＬ（３’ＲＡＣＥ）を用いて、表９に記載の反応組成及び表１０に記載の反応条件で、二次ＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ）を行った。二次ＰＣＲ産物は、分析時まで４℃に保存した。
【００８２】
【表９】
0005531290.tif 000010
【００８３】
【表１０】
0005531290.tif 000011
【００８４】
二次ＰＣＲによってＤＮＡ断片が増幅されたことを、ＰＣＲ産物のアガロース電気泳動並びにエチジウムブロマイド染色にて確認した。結果を図２に示す。得られたＤＮＡ断片の塩基配列を決定するために、以下の手順でサブクローニングを行った。
【００８５】
（サブクローニング）
得られたＤＮＡ断片を、ｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ  ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、ＴＡクローニングした。まず、表１１に記載の反応液を調製し、室温で１時間反応させた。
【００８６】
【表１１】
0005531290.tif 000012
【００８７】
次に、ライゲーション反応液１μＬを、氷上で融解したＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ株式会社製）４０μＬと混合してエレクトロポレーションを行った。その後、ＳＯＣ培地（タカラバイオ株式会社製）を５００μＬ添加して、３７℃で１時間振とう培養した。振とう培養後の培養液を、ＬＢ寒天培地（アンピシリン、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、Ｘ−ｇａｌ配合）に展開した。３７℃で１６時間培養し、形質転換したコロニーを形成させた。
【００８８】
ＰＣＲは、２×ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、マルチクローニングサイトを増幅するように設計されたプライマーセット（Ｍ１３  フォワード及びＭ１３  リバース）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いて行った。まず、形質転換されたコロニーを、滅菌した爪楊枝で掻き取り、表１２記載の反応液中に懸濁した。表１３に記載の反応条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物は、分析時まで４℃に保存した。ＰＣＲ産物を、アガロース電気泳動並びにエチジウムブロマイド染色にて１０００ｂｐ以下のＤＮＡ断片が組み込まれているクローンを選択した。
【００８９】
【表１２】
0005531290.tif 000013
【００９０】
【表１３】
0005531290.tif 000014
【００９１】
アンピシリンを５０μｇ／ｍＬ含むＬＢ液体培地２ｍＬに、上記で選択されたコロニーを植菌して、３７℃にて１６時間振とう培養した。培養後、遠心分離（１４，０００ｒｐｍ、１ｍｉｎ、４℃）により菌体を集菌した。得られた菌体からのプラスミド抽出は、市販のＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  キット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて行った。操作は、その説明書に従った。
【００９２】
（塩基配列の決定）
こうして精製されたプラスミドを用いて、挿入された５’ＲＡＣＥ並びに３’ＲＡＣＥによるＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。塩基配列の決定には、ＤＮＡシーケンサーを用いた。すなわち、Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒ法とキャピラリーシーケンスによるＣＥＱＴＭ  ８０００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  （ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ社製）を用いて、塩基配列を決定した。
【００９３】
得られたプラスミドを、１００−２００ｎｇ／μＬになるように調製した。サイクルシーケンシングは、ＤＴＣＳ  クイックスタートマスターミックス  キット（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ社製）を用いて行った。操作はその説明書に従った。ＰＣＲ反応は、表１４及び表１５記載の条件で行った。プライマーは、Ｍ１３  フォワード及びＭ１３  リバースを、適宜使用した。
【００９４】
【表１４】
0005531290.tif 000015
【００９５】
【表１５】
0005531290.tif 000016
【００９６】
サイクルシーケンス終了後に、表１６に記載の反応停止液を５μＬ添加した。続いて、１００％エタノールを６０μＬ加え、撹拌した。
【００９７】
【表１６】
0005531290.tif 000017
【００９８】
反応産物を、遠心分離（１４，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４℃）した。上清を除き７０％エタノールを２００μＬ加えた。再度遠心分離（１４，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４℃）により、沈殿物を洗浄した。この操作を、２回繰り返した。沈殿物を風乾させ、キット付属のサンプルローディングソリューション（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ社製）を４０μＬ添加し、沈殿物を溶解させた。溶解サンプルを全量ＣＥＱサンプルプレートに移した。各ウェルにミネラルオイルを１滴ずつ滴下し、キャピラリーシーケンスを行った。
【００９９】
５’ＲＡＣＥ並びに３’ＲＡＣＥを解析した蛍光パターンの結果から、ＰＴＬ  ｃＤＮＡの全長配列（図１、配列番号１）が決定された。
【０１００】
ｃＤＮＡの全長配列をコドン表に基づいて変換したアミノ酸配列（図１、配列番号２）は、開始コドン（ＡＴＧ）から停止コドン（ＴＡＡ）まで、１８０個のアミノ酸をコードする塩基配列を含んでいた。このアミノ酸配列は、先に精製したＰＴＬのＮ末端アミノ酸配列分析結果（４０アミノ酸残基）と非常に相同性の高い配列が３ヶ所存在していることが明らかとなった。これらの相同性の高い配列を、５’側から順にＣＲＤ１、ＣＲＤ２及びＣＲＤ３と命名した。
【０１０１】
ＢＬＡＳＴを用いて、得られた１８０残基のアミノ酸配列を公知のアミノ酸配列と比較したところ、有意な相同性を示したタンパク質は確認されなかった。
【０１０２】
〔実施例２〕（組換えＰＴＬの大腸菌での発現１）
上記で得られた全長配列のコーディング領域に、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を付加し発現させた。まず、表２に示すｒＰＴＬ０の塩基配列の遺伝子断片に制限酵素配列を付加し、ｐＥＴ２７ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＨｉｓタグ配列の上流へ挿入した。
【０１０３】
作製したｐＥＴ２７ｂ／ＰＴＬ０プラスミドを大腸菌Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＢＬ２１  Ｓｔａｒ  （ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）へ形質転換した。形質転換された大腸菌を、ＬＢ寒天培地（カナマイシン含有）に展開し、３７℃で１６時間培養を行った。得られた単一コロニーを、ＬＢ液体培地（カナマイシン含有）に植菌して、３７℃にて１６時間振とう培養した。ＬＢ液体培地（カナマイシン含有）に前培養液を、全量添加した。波長６００ｎｍの吸光度が０．６〜１．０となるまで３７℃で培養した。最終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加えた。さらに、２５℃にて２４時間培養後、菌体を遠心分離（５０００ｇ，２０ｍｉｎ，４℃）により集菌した。菌体ペレットに１０ｍＭ  リン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４、以後ＰＢＳと記載する）を加え懸濁した。超音波破砕処理にて、菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離（８５００ｇ，３０ｍｉｎ，４℃）により上清を回収した。
【０１０４】
（Ｈｉｓタグによる精製）
得られた上清を、ＨｉＴｒａｐ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ＨＰ（ＧＥ  ヘルスケアバイオサイエンス社製）にて、表２に示すｒＰＴＬ７のアフィニティー精製を行った。精製結果を、図３に示す。予想通りの２２ｋＤａのバンドを検出した。以上のことから、ｐＥＴ２７ｂ／ＰＴＬ０プラスミドから、ｒＰＴＬ７の発現を確認し、そしてｒＰＴＬ７を精製することができた。
【０１０５】
〔実施例３〕（組換えＰＴＬの大腸菌での発現２）
上記で得られた全長配列のうち、ＰＴＬのＮ末端アミノ酸配列と相同性の高い領域を発現させた。まず、表２に示すｒＰＴＬ１、ｒＰＴＬ２及びｒＰＴＬ３の３種類の塩基配列の遺伝子断片に、停止コドン（ＴＡＡ）と制限酵素配列を付加した。ｐＥＴ５１ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＳｔｒｅｐ・Ｔａｇ（登録商標）ＩＩ配列の下流へ挿入して、３種類の組換えベクターを作製した。
【０１０６】
作製した３種類のｐＥＴ５１ｂ／ＰＴＬプラスミドをそれぞれ、エレクトロポレーションにより大腸菌ＢＬ２１−コドンプラス（商標登録）（ＤＥ３）−ＲＩＬへ形質転換した。形質転換された大腸菌を、ＬＢ寒天培地（アンピシリン含有）に展開し、３７℃で１６時間培養を行った。得られた単一コロニーを、ＬＢ液体培地（アンピシリン含有）に植菌して、３７℃にて１６時間、振とう培養した。ＬＢ液体培地（アンピシリン含有）に前培養液を、全量添加した。波長６００ｎｍの吸光度が０．６〜１．０となるまで３７℃で培養した。最終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加えた。さらに、２５℃にて２４時間培養後、菌体を遠心分離（５０００ｇ，２０ｍｉｎ，４℃）により集菌した。菌体ペレットにＰＢＳを加え懸濁した。超音波破砕処理にて菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離（８５００ｇ，３０ｍｉｎ，４℃）により上清を回収した。
【０１０７】
（Ｓｔｒｅｐ・Ｔａｃｔｉｎ  ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ  ｃｏｌｕｍｎによる精製）
得られた上清を、Ｓｔｒｅｐ・Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）  ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ  ｃｏｌｕｍｎ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にて、表２に示すｒＰＴＬ８、ｒＰＴＬ９及びｒＰＴＬ１０のアフィニティー精製を行った。精製結果を、図４に示す。予想通りの７．３ｋＤａ、１３．２ｋＤａ、１８．３ｋＤａのバンドを検出した。以上のことから、ｒＰＴＬ８、ｒＰＴＬ９、及びｒＰＴＬ１０の発現を確認し、そしてｒＰＴＬ８、ｒＰＴＬ９及びｒＰＴＬ１０を精製することができた。
【０１０８】
〔実施例４〕（組換えＰＴＬの大腸菌での発現３）
上記で得られた全長配列のうち、ＰＴＬのＮ末端アミノ酸配列と相同性の高い領域のみを発現させた。まず、表２に示すｒＰＴＬ１〜６の６種類の塩基配列の遺伝子断片の前後に、開始コドン（ＡＴＧ）と停止コドン（ＴＡＡ）並びに制限酵素配列を付加した。タグ配列を除いたｐＥＴ５１ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）へ挿入して、６種類の組換えベクターを作製した。
【０１０９】
実施例３と同様の操作を行い、上清を回収した。
【０１１０】
（アフィニティークロマトグラフィーによる精製）
得られた上清を、ＰＢＳで平衡化したチログロブリン固定化アガロースに供した。ＰＢＳでカラムを洗浄後、０．２Ｍアンモニアで溶出した。溶出した画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＣＢＢ染色により解析した。その結果を図５に示す。予想通りそれぞれ、４．６ｋＤａ、１０．５ｋＤａ、１５．６ｋＤａ、４．６ｋＤａ、９．７ｋＤａ、４．５ｋＤａのバンドを検出した。以上のことから、ｒＰＴＬ１〜６の発現を確認し、そしてｒＰＴＬ１〜６を精製することができた。
【０１１１】
〔実施例５〕（糖タンパク質アレイ）
フコースα１→６糖鎖を持つ糖タンパク質してチログロブリンを用意し、またフコースα１→６糖鎖を持たない糖タンパク質としてトランスフェリンを用意した。これら糖タンパク質をガラス基板に固定化し、ＧｌｙｃｏＳｔａｔｉｏｎＴＭ  Ｒｅａｄｅｒ  １２００（ＧＰバイオサイエンス社製）を用いて糖タンパク質アレイを行った。まず、精製した組換えＰＴＬを、Ｃｙ３  Ｍｏｎｏ−Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｄｙｅ  Ｐａｃｋ（ＧＥ  ヘルスケアバイオサイエンス社製）の説明書に従ってＣｙ３標識した。５００ｍＭ  グリシン、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ  −  １００、  １ｍＭ  ＣａＣｌ２、  １ｍＭ  ＺｎＣｌ２、０．８％  ＮａＣｌを含むトリス緩衝液（ｐＨ７．４、以下Ｐｒｏｂｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒと記載する）中に標識化組換えＰＴＬを懸濁させ、糖タンパク質を固定化したガラス基板に標識化組換えＰＴＬを供した。２０℃で一晩反応させた後、Ｐｒｏｂｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒでガラス基板を洗浄した。
【０１１２】
洗浄後のガラス基板をＧｌｙｃｏＳｔａｔｉｏｎＴＭ  Ｒｅａｄｅｒ  １２００に供し、固定化糖タンパク質とＣｙ３標識した組換えＰＴＬとの結合を解析した。その結果を、図６に示す。
【０１１３】
図６から、全ての組換えＰＴＬにおいて、フコースα１→６糖鎖を持つ糖タンパク質に結合し、かつフコースα１→６糖鎖を持たない糖タンパク質には結合しないことがわかる。
【０１１４】
〔実施例６〕（Ｓｔｒｅｐ・Ｔａｇ（登録商標）ＩＩ配列の除去及び糖タンパク質への特異性解析）
ｒＰＴＬ８のＮ末端に付加させたＳｔｒｅｐ・Ｔａｇ（登録商標）ＩＩ配列をＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）により除去した。まず、精製したｒＰＴＬ８を表１７記載の反応組成にて、室温で一晩反応させた。反応後の溶液を実施例５と同様の操作を行い、糖タンパク質アレイにて特異性を解析した。その結果を、図７に示す。
【０１１５】
【表１７】
0005531290.tif 000018
【０１１６】
図７から、Ｓｔｒｅｐ・Ｔａｇ（登録商標）ＩＩ配列を除去したｒＰＴＬにおいても、フコースα１→６糖鎖を持つ糖タンパク質に結合し、かつフコースα１→６糖鎖を持たない糖タンパク質には結合しないことがわかる。このように、タグ配列によるアフィニティー精製後に、タグ配列を除去することで、タグ配列等の余分な配列を含まないｒＰＴＬの製造が可能である。
【０１１７】
さらに、ｒＰＴＬ８よりＳｔｒｅｐ・Ｔａｇ（登録商標）ＩＩ配列を除去したｒＰＴＬ８の方が、フコースα１→６糖鎖を持つ糖タンパク質への蛍光強度が増加した。このことは、ｒＰＴＬの活性を最大限発揮する上で、タグ配列などの余分な配列が付加していないほうが好ましい場合もあることを意味する。
【０１１８】
〔実施例７〕（フロンタルアフィニティクロマトグラフィー）
図８に示す構造のピリジルアミノ（ＰＡ）化糖鎖を用意した。ＦＡＣ−１（島津製作所製）を用いて、フロンタルアフィニティクロマトグラフィーを行った。まず、ｒＰＴＬ１〜３を、ＮＨＳ−活性化セファロース（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）の説明書に従って、ｒＰＴＬ−セファロースを作製した。０．８％  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ７．４、以下ＴＢＳと記載する）中に、ｒＰＴＬ−セファロースを懸濁させ、ミニチュアカラム（φ２ｍｍ  ｘ  １０ｍｍ，  ３１．４μＬ）に充填した。作製したカラムを、ステンレスホルダーに差し込み、ＦＡＣ−１装置に接続した。流速及びカラム温度を、それぞれ０．１２５ｍｌ／ｍｉｎ及び２５℃に保った。前記ＴＢＳでミニチュアカラムを平衡後、過剰容積（０．５ｍｌ〜４ｍｌ）のＰＡ化糖鎖（３．７５ｎＭ又は７．５ｎＭ）を、自動サンプリング装置あるいは手動インジェクション装置を用いてカラム中へ注入した。
【０１１９】
各ＰＡ化糖鎖の溶出液の蛍光強度（励起波長３１０ｎｍ及び蛍光波長３８０ｎｍ）をモニターし、相互作用強度〔標準オリゴ糖（糖鎖Ｎｏ．００３）に対する前端溶出液の差：Ｖ−Ｖ０〕を測定した。相互作用強度及び有効リガンド量から結合定数Ｋａを求めた。その結果を、表１８、１９及び２０Ａ〜２０Ｅに示す。
【０１２０】
【表１８】
0005531290.tif 000019
【０１２１】
【表１９】
0005531290.tif 000020
【０１２２】
【表２０Ａ】
0005531290.tif 000021
【０１２３】
【表２０Ｂ】
0005531290.tif 000022
【０１２４】
【表２０Ｃ】
0005531290.tif 000023
【０１２５】
【表２０Ｄ】
0005531290.tif 000024
【０１２６】
【表２０Ｅ】
0005531290.tif 000025
【０１２７】
表１８〜２０から以下のことがわかる。３種類のｒＰＴＬとも、フコースα１→６糖鎖に対する結合定数はＫａ＝１．０×１０５Ｍ−１以上となり、強く結合していることがわかる。また、非フコースα１→６糖鎖やフコースを持たない糖鎖に対する結合定数がＫａ＝５．１５×１０３Ｍ−１以下であることは、ｒＰＴＬがこれら糖鎖に結合しないことを意味している。さらに、フコースα１→６糖鎖の三本鎖（糖鎖Ｎｏ．４１０）や四本鎖（糖鎖Ｎｏ．４１８）にも強く結合し、シアル酸が付加されているフコースα１→６糖鎖（糖鎖Ｎｏ．６０２）の結合定数が下がっていない。このことは、従来のフコースα１→６糖鎖に結合するレクチンより優れていることを意味している。
【０１２８】
また、ＣＲＤ１、ＣＲＤ２及びＣＲＤ３のいずれにも、フコースα１→６糖鎖に結合しうることから、これらの配列を任意に組み合わせることで、フコースα１→６糖鎖に高い親和性を有する組換えタンパク質又はペプチドを製造できることが容易に推定できる。
【０１２９】
〔実施例８〕（サケツバタケ由来のレクチン遺伝子のクローニング）
サケツバタケ子実体を原料に、実施例１と同様の操作を行い、塩基配列を決定した。解析結果から、サケツバタケ由来レクチン（以下、ＳＲＬと記載）ｃＤＮＡの全長配列（図９、配列番号７）が決定された。ＳＲＬの全長配列をコドン表に基づいて変換したアミノ酸配列（図９、配列番号８）は、開始コドン（ＡＴＧ）から停止コドン（ＴＡＡ）まで、１７９個のアミノ酸をコードしていた。また、ＰＴＬ  ｃＤＮＡからのアミノ酸配列と比較したところ、２ヶ所のアミノ酸欠失、及び１ヶ所のアミノ酸付加、並びに５９ヶ所のアミノ酸置換が確認された。
【０１３０】
また、アミノ酸配列の相同性から、ＳＲＬのＰＴＬのＣＲＤ１〜３に相当する部位を同定した。ＳＲＬとＰＴＬの各ＣＲＤ間の相同性を表２１に示す。いずれのＣＲＤ間で６４％以上の相同性があった。さらに、ＰＴＬとＳＲＬの同一のＣＲＤ間の相同性は、７４％以上であった。
【０１３１】
【表２１】
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【０１３２】
表２１から、ＰＴＬと同様に、以下の（１）又は（２）のタンパク質又はペプチドをコードする遺伝子もまた、糖結合活性を有する遺伝子であると予測される。
（１）配列番号８の１〜１７９番、３０〜６８番、３０〜１２３番、３０〜１７２番、８５〜１２３番、８５〜１７２番、及び１３４〜１７２番のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はペプチド、
（２）配列番号８の１〜１７９番、３０〜６８番、３０〜１２３番、３０〜１７２番、８５〜１２３番、８５〜１７２番、及び１３４〜１７２番のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ糖認識活性を有するタンパク質又はペプチド。
上記７種類のアミノ酸配列の範囲の意味づけを表２２に示す。
【０１３３】
【表２２】
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【０１３４】
〔実施例９〕（組換えＳＲＬ（ｒＳＲＬ）の大腸菌での発現と精製）
実施例２と同様の操作を行い、ｒＳＲＬ０（全長ｃＤＮＡ）を得た。その結果を、図１０に示す。予想通りの１５．６ｋＤａのバンドを検出した。以上のことから、ｒＳＲＬの発現を確認し、そしてｒＳＲＬを精製することができた。
【０１３５】
〔実施例１０〕（糖タンパク質アレイ）
実施例５と同様の操作を行い、ｒＳＲＬの特異性を解析した。その結果を、図１１に示す。図１１から、ｒＳＲＬは、フコースα１→６糖鎖を持つ糖タンパク質に結合し、かつフコースα１→６糖鎖を持たない糖タンパク質には結合しないことがわかる。
【０１３６】
本発明者らは、先のＰＣＴ／ＪＰ２００９／００３３４６（発明の名称：α１→６フコース特異的レクチン）において、ＰＴＬ及びＳＲＬがα１→６フコース特異的レクチンであることを示した。本発明においても、ｒＰＴＬ及びｒＳＲＬが、α１→６フコース特異的に認識することを示した。以上のことから、ｒＳＲＬをコードする遺伝子が、タンパク質又はペプチドのアミノ酸欠失、及びアミノ酸付加、並びにアミノ酸置換体をコードする本発明の遺伝子の一例とみなすことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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