(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の主要な２種の複合体集団：
（ａ）水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウム粒子上に吸着された３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリル・リピドＡを含む第一複合体、ここで、該水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウム粒子は抗原を有さない；及び
（ｂ）上記水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウム粒子上に吸着された、Ｂ型肝炎表面抗原又はＨＰＶ  Ｌ１粒子若しくはキャプソマーである抗原を含む第二複合体、ここで、該水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウム粒子は免疫刺激剤を有さない；
を含む、ワクチン組成物。
【請求項２】
前記第一複合体及び第二複合体上に存在するアルミニウム塩が同じである、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
前記第二の複合体が、複数のサブ複合体を含み、ここで各サブ複合体は、水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウム粒子上に吸着された異なる抗原を含む、請求項１又は２に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
前記抗原は、ＨＰＶ  Ｌ１粒子又はキャプソマーである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
前記ＨＰＶ  Ｌ１粒子又はキャプソマーは、ＨＰＶ６、１１、１６又は１８由来である、請求項４に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
前記ＨＰＶ  Ｌ１粒子又はキャプソマーは、ＨＰＶ１６又は１８由来である、請求項５に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
前記抗原は、Ｂ型肝炎表面抗原である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
以下のステップ：
（ａ）水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウムの第一粒子上に、Ｂ型肝炎表面抗原又はＨＰＶ  Ｌ１  粒子若しくはキャプソマーである抗原を吸着させ；
（ｂ）水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウムの第二粒子上に、３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリル・リピドＡを吸着させ；そして
（ｃ）上記ステップ（ａ）の産物と上記ステップ（ｂ）の産物を混合する；
を含む、ワクチン組成物の製造方法。
【請求項９】
前記抗原は、ＨＰＶ  Ｌ１粒子又はキャプソマーである、請求項８に記載のワクチン組成物の製造方法。
【請求項１０】
前記抗原は、Ｂ型肝炎表面抗原である、請求項８に記載のワクチン組成物の製造方法。
【請求項１１】
請求項９〜１０のいずれか１項に記載の方法により得られうるワクチン組成物。
【請求項１２】
医薬において使用するための請求項１〜７のいずれか１項又は請求項１１に記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
以下の２種の容器：
水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウム上に吸着された３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリル・リピドＡを有する第一の容器；及び
水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウム上に吸着されたＢ型肝炎表面抗原又はＨＰＶ  Ｌ１粒子若しくはキャプソマーである抗原を有する第二の容器；
を含むキット。
【請求項１４】
前記抗原は、ＨＰＶ  Ｌ１粒子又はキャプソマーである、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
前記抗原は、Ｂ型肝炎表面抗原である、請求項１３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改良されたワクチン、アジュバント系、並びに上記ワクチン及びアジュバント系の製法に関する。特に、本発明のワクチン及びアジュバント系は、金属塩及び追加の免疫刺激剤、例えば、モノホスホリル・リピドＡ又はその誘導体、ＱｕｉｌＡ又はその誘導体、又はＣｐＧの如き免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含む。
【背景技術】
【０００２】
アルミニウム塩は、安全な賦形剤にアジュバント活性を提供するものとして本分野において周知である。これらのアジュバントの作用機構は、投与後３週間までの間注射部位に抗原が留ることができるような抗原貯蔵庫の形成、そしてまた抗原提示細胞によりより容易に取り込まれる抗原／金属塩複合体の形成を含むと考えられる。アルミニウムに加えて、亜鉛、カルシウム、セリウム、クロム、鉄、及びベリリウムを含む他の金属塩が、抗原を吸着するために使用されてきた。アルミニウムの水酸化物及びリン酸塩は最も一般的である。
【０００３】
アルミニウム塩、抗原、及び追加の免疫刺激剤を含むワクチン配合物は、本分野において知られている。このような配合物は、アルミニウム塩単独及び抗原単独により刺激されるものに比較してより高い免疫応答を導発した。これらのワクチン調製物の配合は、特別な製造手順を従来含んでいた。なぜなら、最適な免疫応答が生じるためには、上記抗原は、上記免疫刺激剤と同じアルミニウム塩粒子上に吸着されなければならないと信じられているからである。この方法においては、抗原が抗原提示細胞により取り込まれるとき、同時吸着された免疫刺激剤は、同一抗原提示細胞上に直接その刺激活性を発揮する。
【０００４】
アルミニウム・ベースのワクチン配合物であって、上記抗原及び上記免疫刺激剤３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリル・リピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）が同一粒子上に吸着されているものは、ＥＰ０５７６４７８Ｂ１，ＥＰ０６８９４５４Ｂ１、及びＥＰ０６３３７８４Ｂ１中に記載されている。上記の場合には、次いで抗原が、上記アルミニウム塩上にまず吸着され、その後、同一アルミニウム塩粒子上に免疫刺激剤３Ｄ−ＭＰＬの吸着が行われる。このようなプロセスは、第１に、粒子が８０〜５００nmの間のサイズに到達するまでの水浴内での音波処理による３Ｄ−ＭＰＬの懸濁を含む。上記抗原は、典型的には、撹拌下室温において１時間アルミニウム塩上に吸着される。次に３Ｄ−ＭＰＬ懸濁液は、上記吸着された抗原に添加され、そして上記配合物は、１時間室温においてインキュベートされ、そして次に使用まで４℃において保たれる。
【０００５】
従来技術の配合プロセスは、免疫学的観点から強力なワクチンを規定する。しかしながら、それらは、いくつかの商業的な欠点を含む。ワクチンがヒト投与のために好適であるためには、上記プロセスは、直一的であり、かつ、Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ＧＭＰ）管理及びＱｕａｌｉｔｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＱＣ）に供されなければならない。いくつかの場合、従来技術のプロセスは、上記抗原（単数又は複数）の全てが金属塩の同一粒子上に吸着されているワクチンを提供する。上記プロセスは、３Ｄ−ＭＰＬが同一金属粒子上に吸着されなければならないという要求により複雑となる。これは、多抗原を含有する併合ワクチンの場合特にやっかいである（その吸着は、所定のｐＨにおいて特定の金属塩への各抗原のアフィニティーに依存することができる）。従来技術のプロセスは、再現性及びワクチンのＱＣにおいて、どの抗原が存在するかに依存して、問題をもつことができる。さらに、望ましくないことが、１の特定抗原のＱＣとともに生じ、又は上記ワクチンの汚染をもたらすことができる事件がある場合、これは、その問題が生じたところの特定の抗原だけでなく、個々の成分の全ての無駄をもたらすことができる。その上、いくつかの状況においては、併合ワクチンは上記抗原の逐次的添加を要求することができ、このようなプロセスはかなり時間がかかり、そして高価である。それ故、従来技術のプロセスは、複雑であり、制御（管理）が難しく、そして費用がかかる。
【発明の開示】
【０００６】
驚くべきことに、本発明者らは、同一粒子上に抗原及び免疫刺激剤を吸着させる必要がないことを発見した。本分野において認められた考えに反し、上記免疫刺激剤と会合した上記金属塩粒子とは別個の特定の金属塩粒子上に抗原が吸着されるときに、良好なワクチンを製造することができるということを発見した。
【０００７】
上記の改良されたプロセスは、金属塩粒子上への、免疫刺激剤の吸着、その後の他金属塩粒子上への上記抗原の吸着、その後は、上記別個の粒子を混合してワクチンを作ることを含む。本発明は、金属塩粒子上に吸着された免疫刺激剤を含むアジュバント組成物であって、上記金属塩粒子が他の抗原を実質的に含有しないことを特徴とするものをも提供する。さらに、本発明によりワクチンが提供され、そしてそれは、上記免疫刺激剤が、他の抗原を実質的に含有しない金属塩の粒子上に吸着され、そして上記抗原上に吸着された金属塩の粒子が他の免疫刺激剤を実質的に含有しないことを特徴とする。
【０００８】
したがって、本発明は、金属塩の粒子上に吸着されている免疫刺激剤を含むアジュバント配合物であって、上記組成物が他の抗原を実質的に含有しないものを提供する。その上、上記アジュバント配合物は、ワクチンの製造の間、本発明のプロセスの間に要求される中間体である。従って、本発明のアジュバント組成物を抗原と混合することを含むワクチンの製造方法が提供される。好ましくは、上記抗原は、金属塩上に前もって吸着されている。上記金属塩は、上記免疫刺激剤上に吸着されている金属塩と同一又は類似であることができる。
【０００９】
本発明は、さらに、金属塩の第１粒子上に吸着されている免疫刺激剤、及び金属塩上に吸着されている抗原を含むワクチン組成物であって、上記金属塩の第１粒子と第２粒子が相違することを特徴とするものを規定する。
あるいは、本発明の一部を形成するワクチンは、２つの主要複合体集団、１の複合体であって（ａ）金属塩粒子上に吸着された免疫刺激剤を含み、上記金属塩粒子が抗原を実質的に含有しないもの；及び第２複合体であって、（ｂ）金属塩粒子上に吸着された抗原を含むもの、を含む、また、上記ワクチン組成物は、２つの主要な複合体集団；第１複合体であって、（ａ）金属塩粒子上に吸着された免疫刺激剤を含み、上記金属塩粒子が抗原を実質的に含有しないもの；及び第２複合体であって、（ｂ）金属塩粒子上に吸着された抗原を含み、上記金属塩粒子が免疫刺激剤を実質的に含有しないもの、を含むことができる。
【００１０】
上記２つの主要な複合体集団中に存在する金属塩は、同一でも異なっていてもよい。さらに、複数の異なる抗原がその中に存在している併合ワクチンの場合には、（上記の）第２複合体は、異なる金属粒子上に吸着された複数の抗原を含むことができる。
本発明に関して、他の抗原を実質に含有しないという定義は、金属塩の粒子に吸着することができる全ての物質の２０重量％以下が、好ましくは１０％以下が、そして最も好ましくは５％以下が、他の抗原である場合をいう。あるいは、本発明に関して、免疫刺激剤を実質的に含有しないということは、金属塩の粒子に吸着することができる全ての物質の２０重量％以下、好ましくは１０％以下、そして最も好ましくは５％以下が、免疫刺激剤である場合をいう。定常アッセイは、当業者には自明であるが、上記抗原及び免疫刺激剤が、異なる別個の粒子上に吸着されているかどうかを決定するために使用されることができるであろう。そして上記アッセイは、非限定的に、電場内での上記配合物の自由な流れにより上記ワクチンを別々のフラクションに分離すること、又は非粒状抗原に特に適した沈降速度分析の如き技術、その後の、上記フラクション中の上記免疫刺激剤又は抗原についてのアッセイを含む。
【００１１】
本発明においては、第１の容器であって金属塩上に吸着された免疫刺激剤をもつもの；及び第２の容器であって、抗原、好ましくは、金属塩上に吸着されているものをもつもの、を含むキットも供給される。
本発明の方法は、商業的規模の量の併合ワクチンが要求されるときに、特に有用である。併合ワクチンは、２以上の病原体からの２以上の抗原を含む、１投与ワクチンである。このようなワクチンは、多くの病原体及び疾患に対して保護を誘導するために要求されるワクチン接種の数を減少させることができる。
【００１２】
例えば、１のワクチンが ＡｌＯＨ3，３Ｄ−ＭＰＬ、及び抗原Ｖ，Ｗ，Ｘ，Ｙ，Ｚを含む場合、従来の方法は、ＡｌＯＨ3 の同一粒子上に、上記抗原と３Ｄ−ＭＰＬを配合することを含む。このような従来技術の方法は、Ｖ，Ｗ，Ｘ，Ｙ，ＺがＡｌＯＨ上に吸着され、その後に、前もって吸着された抗原複合体の各々の上に遊離の３Ｄ−ＭＰＬを添加することを要求する。
【００１３】
これに対して、本発明の配合方法においては、抗原Ｖ，Ｗ，Ｘ，Ｙ，Ｚは、それぞれ、別々の容器内のＡｌＯＨ3 の別々の粒子上に個々に吸着される。３Ｄ−ＭＰＬも、他の容器内のＡｌＯＨ3 上に吸着される。次に、上記ワクチンは、上記別々の容器のそれぞれから採取された材料を単に混合することにより形成される。この場合、３Ｄ−ＭＰＬと会合したＡｌＯＨ3 の粒子は、上記抗原を会合したＡｌＯＨ3 の粒子とは別個のものであることができる。
【００１４】
あるいは、本発明は、免疫刺激剤、抗原、及び金属塩を含むワクチンの製法であって：
１．金属塩の第１粒子に上記抗原を吸着させ、
２．金属塩の第２粒子に上記免疫刺激剤を吸着させ、
そして
３．上記ステップ１からの生成物とステップ２からの生成物を混合する、を含む前記製法を提供する。
【００１５】
本発明は、従来技術に存在する問題を克服するワクチンの製法を提供する。各個々の抗原−金属塩複合体は、ＧＭＰ管理に従うことができ、そして特定の抗原−金属塩調製物の不都合な汚染がある場合、他の抗原及び免疫刺激剤アジュバントの完全性が傷つけられることはないであろう。驚くべきことに、そして本分野において認められた考えに反して、本発明の方法により製造されたワクチンは、従来技術の方法を用いて製造されたワクチンと同程度に強力である。
【００１６】
本発明の意味における免疫刺激剤の定義は、知られたアジュバント活性をもつ天然又は合成化合物として記載されることができ、このアジュバント活性は、免疫系自体の細胞に対する上記化合物の直接又は間接的刺激効果から派生し、そして上記免疫系に対する他の非刺激効果、例えば貯蔵効果又は上記免疫系への標的化を介するものではない。このような免疫刺激剤の例は、“Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ−ｔｈｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ”（編集  Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｆ．ａｎｄ  Ｎｅｗｍａｎ，Ｍ．Ｊ．，１９９５，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ａｎｄ  Ｌｏｎｄｏｎ，ＩＳＢＮ  ０−３０６−４４８６７−Ｘ）表題“Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ａｎｄ  ｅｘｃｉｐｉｅｕｔｓ”著者  Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｆ．ａｎｄ  Ｎｅｗｍａｎ  Ｍ．中のある章中に記載されている。本発明内にある上記免疫刺激剤は：バクテリア由来化合物、例えば、モノホスホリル・リピドＡ又はその誘導体；植物由来サポニン又はその誘導体、例えば、ＱｕｉｌＡ；又は免疫刺激性オリゴヌクレチオド、例えば、ＣｐＧ、ブロック・コポリマー、コレラ毒素、免疫刺激性サイトカイン、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−１、ポリリボＡ（ｐｏｌｙｒｉｂｏＡ）及びポリリボＵ、及びムラミル・トリペプチド（Ｍｕｒａｍｙｌ  ｔｒｉｐｅｐｔｉｄｅ（ＭＴＰ））を含む。
【００１７】
モノホスホリル・リピドＡはアジュバント活性をもつバクテリア由来の化合物であり、そして本発明における使用のために好ましい免疫刺激剤である。この毒性化合物は、毒性のより近い誘導体に変更されており、このような誘導体の中の１は、３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリル・リピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ又はｄ３−ＭＰＬといわれる。それは、グルコサミンの還元性末端の３位が脱−Ｏ−アシル化されていることを示している）。３Ｄ−ＭＰＬの製造に関しては、ＧＢ２２２０２１１Ａを参照のこと。化学的には、それは、３−脱アシル化されたモノホスホリル・リピドＡと、３，４，５又は６アシル化鎖との混合物である。好ましくは、本発明の組成物においては、小粒子ＭＰＬが使用される。小粒子ＭＰＬは、それが０．２２μｍフィルターを通して滅菌濾過されることができるような粒子サイズをもつ。このような調製物は、国際特許出願第ＷＯ９４／２１２９２号中に記載されている。さらなる改良がＧＢ９８０７９３３、８中に記載されており、これは、トリ及びテトラ・アシル・コンジナー（ｃｏｎｇｅｎｅｒ）から成る３Ｄ−ＭＰＬの安定製造を開示する。
【００１８】
ＧＢ２２２０２１１Ａは、従来使用された腸内細菌のリポポリサッカライド（ＬＰＳ）の内毒性が、その免疫原性特性を保存しながら、低下されることを言及している。しかしながら、ＧＢ２２２０２１１は、バクテリア（グラム陰性）系に関してのみ、上記発見を引用した。
本発明における使用のための他の好ましい免疫刺激剤は、クイルＡ（ＱｕｉｌＡ）及びその誘導体である。ＱｕｉｌＡは南米の木キラヤ・サポナリア・モノナ（Ｑｕｉｌａｊａ  Ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａ）から単離されたサポニン調製物であり、そしてアジュバント活性をもつと、Ｄａｌｓｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．により１９７４年に最初に記載された（“Ｓａｐｏｎｉｎ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ”、Ａｒｃｈｉｖ．ｆｕｅｒ  ｄｉｅ  ｇｅｓａｍｔｅ  Ｖｉｒｕｓｆｏｒｓ  ｃｈｕｎｇ，Ｖｏｌ．４４，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，ｐ２４３−２５４）。ＱｕｉｌＡの精製された断片は、ＨＰＬＣにより単離されており、これは、ＱｕｉｌＡに係わる毒性を伴わずにアジュバント活性を保持する（ＥＰ０３６２２７８）。例えば、これらの断片には、ＱＳ７やＱＳ２１（ＱＡ７とＱＡ２１としても知られる）がある。特に好ましいＱＳ２１の特定の配合物が記載されており、これらの配合物は、さらに、ステロールを含む（ＷＯ９６／３３７３９）。
【００１９】
ＣｐＧは、知られたアジュバント特性をもつ免疫刺激性オリゴヌクレオチドである（ＷＯ９６／０２５５５）本発明の文脈において好ましいＣｐＧ配列は：（ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＡＧＣ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＡＣＧ  ＴＴ，Ｋｒｉｅｇ  １８２６）、（ＴＣＴ  ＣＣＣ  ＡＧＣ  ＧＴＧ  ＣＧＣ  ＣＡＴ，Ｋｒｅｉｇ  １７５８）、及びＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＧＴＴである。
【００２０】
本発明は、上記アジュバントの特定の配合方法及び特徴に関し、そしてそれ故、多種多様な抗原とともに使用されることができる。本発明のワクチンは、プライミング投与及びブースティング投与のために使用されることができ、そして多種多様な抗原に対する免疫応答の誘発、及びそれにより仲介される感染からの保護のために使用されることができる。また、本発明は、抗原に対する免疫応答を顕出する方法であって、金属塩、免疫刺激剤、及び抗原を含むワクチンの使用を含み、ここで、上記免疫刺激剤が、上記抗原に吸着された上記金属塩粒子とは別個の金属塩の粒子上に吸着されている、前記方法を規定する。上記病原体及び抗原の中のいくつかを以下に列記する。
【００２１】
Ａ，Ｂ，Ｃ、及びＤ型肝炎ウイルスにより引き起こされるウイルス性肝炎は、ひじょうに一般的なウイルス性疾患である。特に、Ｂ型及びＣ型ウイルスを介して、それは、肝臓癌の多くのケースの原因でもある。従って、有効なワクチンの開発は重要であり、そして顕著な成功にも拘らず、未だ進行中の研究である。多数の主要な文献を含む、最近の肝炎ワクチンについてのレビューは、Ｌａｎｃｅｔ，Ｍａｙ  １２ｔｈ  １９９０  ａｔ  ｐａｇｅ  １１４２  ｆｆ（Ｐｒｏｆ  Ａ．Ｌ．Ｗ．Ｆ．Ｅｄｄｌｅｓｔｏｎ）中に見ることができる。また、“Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ”（Ｖｙａｓ，Ｂ．Ｎ．，Ｄｉｅｎｓｔａｇ，Ｊ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｈｏｏｆｎａｇｌｅ，Ｊ．Ｈ．，ｅｄｓ，Ｇｒｕｎｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒａｔｔｏｎ，Ｉｎｃ．（１９８４）及び“Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ”（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  １９９０  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，ｅｄｓ  Ｆ．Ｂ．Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｓ．Ｍ．Ｌｅｍｏｎ  ａｎｄ  Ｈ．Ｍａｒｇｏｌｉｓ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ）を参照のこと。
【００２２】
本明細書中に使用するとき、表現“Ｂ型肝炎抗原”は、ヒトにおいて上記ウイルスに対する免疫を誘導するために使用されることができるＢ型肝炎ウイルスから得られるいずれかの抗原性材料を指すために使用される。
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）による感染は広い問題であるが、大量免疫感作のために使用されることができるワクチン、例えば、遺伝子工学技術により得られる製品“Ｅｎｇｅｒｉｘ−Ｂ”（Ｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ  ｐｌｃ）が現在利用可能である。
【００２３】
Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の製造はよく記載されている。例えば、Ｈａｒｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ  ｉｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｆｏｒｄ  ５４，ｐａｇｅ  １２５（１９８３）、Ｇｒｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５，ｐａｇｅ  ４７９（１９８７），ＥＰ−Ａ−０２２６８４６，ＥＰ−Ａ−０２９９１０８、及び上記文献中の引用文献を参照のこと。
【００２４】
本明細書中に使用するとき、表現“Ｂ型肝炎表面抗原”“ＨＢｓＡｇ”は、ＨＢＶ表面抗原の抗原性を示すいずれかのＨＢｓＡｇ抗原又はその断片を含む。ＨＢｓＡｇ  Ｓ抗原の２２６アミノ酸配列に加えて（Ｔｉｏｌｌａｉｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３１７，４８９（１９８５）及びその中の引用文献を参照のこと）、本明細書中に記載するＨＢｓＡｇは、適宜、上記文献及びＥＰ−Ａ−０  ２７８９４０中に記載されるようなプレーＳ配列の全部又は一部を含むことができる。特に、ＨＢｓＡｇは、ａｄ血清型のＢ型肝炎ウイルス上のオープン・リーディングフレームに対して残基１２〜５２、その後の残基１３３〜１４５、その後の残基１７５〜４００を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む（このポリペプチドを、Ｌ* という；ＥＰ０４１４３７４を参照のこと）。本発明の範囲内のＨＢｓＡｇは、ＥＰ０１９８４７４（Ｅｎｄｏｔｒｏｎｉｃｓ）中に記載されたプレＳ１−プレＳ２−Ｓ  ポリペプチド又はそのアナログ、例えば、ＥＰ０３０４５７８（Ｍｃ  Ｃｏｒｍｉｃｋ  ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ）中に記載されたものを含むこともできる。ＨＢｓＡｇは、本明細書中に記載するとき、突然変異体、例えば、ＷＯ９１／１４７０３又はヨーロッパ特許出願公開第０５１１８５５Ａ１号中に記載された“エスケープ突然変異体”、特に、１４５位におけるアミノ酸置換がグリシンからアルギニンであるＨＢｓＡｇをいうこともできる。
【００２５】
通常、ＨＢｓＡｇは粒子形態にあるであろう。これらの粒子は、例えば、Ｓタンパク質を単独で含むことができ、又は複合粒子、例えば、(Ｌ*，Ｓ）｛ここで、Ｌ* は先に定義したものであり、そしてＳはＨＢｓＡｇのＳ−タンパク質を表す。｝であることができる。上記粒子は、有利には、それが酵母内で発現されるところの形態にある。
【００２６】
Ａ型肝炎に対する保護を与える成分は、好ましくは、ＨＡＶのＨＭ−１７５株由来の死菌減弱ワクチンである“Ｈａｖｒｉｘ”（Ｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）として知られた製品である〔“Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃａｎｄｉｄａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ａ”ｂｙ  Ｆ．Ｅ．Ａｎｄｒｅ，Ａ．Ｈｅｐｂｕｒｎ  ａｎｄ  Ｅ．Ｄ′Ｈｏｎｄｔ（１９８０）、Ｐｒｏｇ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ． Ｖｏｌ  ３７，ｐａｇｅｓ  ７２−９５及び製品モノグラフ“Ｈａｖｒｉｘ”ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（１９９１）を参照のこと。〕。
【００２７】
従って、本発明の好ましい態様においては、ＨＢｓＡｇとＡ型肝炎抗原を含む併合ワクチンが提供される。また、本発明により、Ａ型肝炎とＢ型肝炎併（混）合ワクチンの製法、及び上記製法から得られた製品が提供される。
Ｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓにより製造されたＩｎｆａｎｒｉｘ（商標）レンジを含む他の併合ワクチンも市販されている。このようなワクチンは、ジフテリア毒素、破傷風毒素、及びＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ抗原の“コア（ｃｏｒｅ）”の併合に基づく。このワクチンは、百日咳成分（死菌全細胞Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ又は無細胞百日咳であって、典型的には２つの抗原−ＰＴとＦＨＡから成り、そしてしばしば、６９kDa であり、場合により１又は両者のアグルチノゲン２又はアグルチノゲン３を含むもの）を含む。このようなワクチンは、しばしば、ＤＴＰｗ（全細胞）又はＤＴＰａ（無細胞）といわれる。
【００２８】
本発明の範囲内の特定の併（混）合ワクチンは：
・ジフテリア−破傷風−百日咳−Ｂ型肝炎（ＤＴＰ−ＨＢ）
・ジフテリア−破傷風−Ｂ型肝炎（ＤＴ−ＨＢ）
・Ｈｉｂ−Ｂ型肝炎
・ＤＴＰ−Ｈｉｂ−Ｂ型肝炎
・ＩＰＶ（不活性ポリオ・ワクチン）−ＤＴＰ−Ｈｉｂ−Ｂ型肝炎
百日咳成分は、好適には、全細胞百日咳ワクチン又は無細胞百日咳ワクチンであって部分精製又は高精製された抗原を含むものである。上記の併合物は場合によりＡ型肝炎に対して保護する成分を含むことができる。好ましくは、Ａ型肝炎成分は、ホルマリンＨＭ−１７５不活性である。有利には、ＨＭ−１７５は、培養したＨＭ−１７５をトリプシンで処理し、パーミエーション・クロマトグラフィーにより小さなプロテアーゼ消化タンパク質から無傷のウイルスを分離し、そしてホルマリンで不活化することにより、精製される。有利には、Ｂ型肝炎併合ワクチンは小児ワクチンである。
【００２９】
本発明の他の併合ワクチンは、ＧＢ９８０５１０５．５（Ｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ｓ．ａ．）中に開示されている。このような併合ワクチンは、青年期のためのワクチンにとって特に有益である。好ましい併合物は、Ｂ型肝炎抗原（ＨｅｐＢ）と単純ヘルペス（ＨＳＶ）抗原の“コア”併合に基づく。場合により、この“コア”に、以下の群由来の１以上の抗原：エプスタインバール・ウイルス（ＥＢＶ）抗原、Ａ型肝炎抗原（ＨｅｐＡ）、ヒト・パピローマ・ウイルス（ＨＰＶ）抗原、が添加されることができる。これらの併合ワクチンは、さらに、水疱瘡ウイルス（ＶＺＶ）、ヒト・サイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）又はトキソプラズマ抗原を含むことができる。
【００３０】
好ましくは、本発明のワクチン配合物は、ヒト病原体に対する免疫応答を顕出することができる抗原又は抗原組成物を含み、この抗原又は抗原組成物は、ＨＩＶ−１、（例えば、ｔａｔ，ｎｅｆ，ｇｐ１２０又はｇｐ１６０）、ヒト・ヘルペス・ウイルス、例えば、ｇＤ又はその誘導体又は直初期タンパク質、例えばＨＳＶ１又はＨＳＶ２からのＩＣＰ２７、サイトメガロウイルス（（特にヒト）（例えば、ｇＢ又はその誘導体））、ロタウイルス（生弱毒化ウイルスを含む）、エプスタイン・バール・ウイルス（例えば、ｇｐ３５０又はその誘導体）、水疱瘡ウイルス（例えば、ｇｐＩ，II及びＩＥ６３）、又は肝炎ウイルス、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎表面抗原又はその誘導体）、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス及びＥ型肝炎ウイルス、又は他のウイルス性病原体、例えば、パラミクソウイルス：呼吸器合胞体ウイルス（例えば、Ｆ及びＧタンパク質又はその誘導体）、パラインフルエンザ・ウイルス、風疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ヒト・パピローマ・ウイルス（例えば、ＨＰＶ６，１１，１６、及び１８）、フラビウイルス（例えば、黄熱ウイルス、デング熱ウイルス、ダニ伝染脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス）又はインフルエンザ・ウイルス、又はバクテリア病原体、例えば、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、例えば、ナイセリア・ゴノレア（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）及びナイセリア・メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（例えば、莢膜多糖類及びその抱合体、トランスフェリン結合性タンパク質、ラクトフェリン結合性タンパク質、ＰｉｌＣ、アドヘシン）；ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、例えば、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（例えば、莢膜多糖類及びその抱合体、ＰｓａＡ，ＰｓｐＡ、ストレプトリジン、コリン結合性タンパク質）、ストレプトコッカス・ピオジェンス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（例えば、Ｍプロテイン又はその断片、Ｃ５Ａプロアテーゼ、リポテイコ酸）、ストレプトコッカス・アガラクチエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ムュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）；ヘモフィラス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）種、例えば、ヘモフィラス・インフルエンザＢ型（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｔｙｐｅＢ）（例えば、ＰＲＰ及びその抱合体）、未分類ヘモフィラス・インフルエンザ（例えば、ＯＭＰ２６、高分子量アドヘシン、Ｐ５，Ｐ６、リポプロテインＤ）、ヘモフィラス・デュクレイ（Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉ）；モラキセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）種、例えば、モラキセラ・カタラリス（Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）であってブランハメラ・カタラリス（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）としても知られるもの（例えば、高及び低分子量アドヘシン及びインバシン）；ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）種、例えば、ボルデテラ・ペルタシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）（例えば、パータクチン、百日咳毒素又はその誘導体）、繊維状赤血球凝集素、アデニレート・シワラーゼ・フィムブリエ）、ボルデテラ・パラペルタシス（Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）及びボルデテラ・ブロンキセプティカ（Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）；マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、例えば、マイコバクテリウム・チューバーキュローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（例えば、ＥＳＡＴ６、抗原８５Ａ、−Ｂ又は−Ｃ）、マイコバクテリウム・ボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、マイコバクテリウム・レプラエ（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム・パラチューバーキュローシス（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・スメグマティス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）；レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）種、例えば、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）；エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種、例えば、腸内毒性エキュリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（例えば、コロニー形成因子、熱不安定性毒素又はその誘導体、熱安定性毒素又はその誘導体）、腸管出血性Ｅ．ｃｏｌｉ、腸管病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、赤痢菌毒素様毒素又はその誘導体）；ビブリオ（ｖｉｂｒｉｏ）種、例えば、ビブリオ・コレラ（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａ）（例えば、コレラ毒素又はその誘導体）；シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）種、例えば、シゲラ・ソネイ（Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ）、ジゲラ・ジセンテリエ（Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、シゲラ・フレキシネリ（Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉｉ）；エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）種、例えば、エルシニア・エンテロコリティカ（Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）（例えば、Ｙｏｐタンパク質）、エルシニア・ペスティス（Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ）、エルシニア・シュードチューバーキュローシス（Ｙ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）；カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種、例えば、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）（例えば、毒素、アドヘシン、及びインバシン）及びカンピロバクター・コリ（Ｃ．ｃｏｌｉ）；サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種、例えば、サルモネラ・チフィ（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）、サルモネラ・パラチフィ（Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ）、サルモネラ・コレレスイ（Ｓ．ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）、サルモネラ・エンテリティディス（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）；リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）種、例えば、リステリア・モノサイトジェン（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）；ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）種、例えば、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）（例えば、ウレアーゼ、カタラーゼ、空胞形成毒素）；シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）；スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、例えば、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピダーミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）；エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種、例えば、エンテロコッカス・ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・ファエシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）；クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種、例えば、クロストリジウム・テタニ（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ）（例えば、破傷風毒素及びその誘導体）、クロストリジウム・ボツリナム（Ｃ・ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）（例えば、ボツリヌス毒素及びその誘導体）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）（例えば、クロストリジウム毒素Ａ又はＢ及びその誘導体）；バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、例えば、バシルス・アンスラシス（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（例えば、ボツリヌス毒素及びその誘導体）；コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、例えば、コリネバクテリウム・ジフテリエ（Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）（例えば、ジフテリア毒素及びその誘導体）；ボレリア（Ｂｏｒｒｅｒｉａ）種、例えば、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）（例えば、ＯｓｐＡ，ＯｓｐＣ，ＤｂｐＡ，ＤｂｐＢ）、ボレリア・ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）（例えば、ＯｓｐＡ，ＯｓｐＣ，ＤｂｐＡ，ＤｂｐＢ）、ボレリア・アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）（例えば、ＯｓｐＡ，ＯｓｐＣ，ＤｂｐＡ，ＤｂｐＢ）、ボレリア・アンダーソニイ（Ｂｉａｎｄｅｒｓｏｎｉｉ）（例えば、ＯｓｐＡ，ＯｓｐＣ，ＤｂｐＡ，ＤｂｐＢ）、ボレリア・ヘルムシ（Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉ）；エールリヒア（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）種、例えば、エールリヒア・エクイ（Ｅ．ｅｑｕｉ）及びヒト顆粒球エールリヒア症；リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）種、例えば、リケッチア・リケッチイ（Ｒ．ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）；クラミジア（ｃｈｌａｍｙｄｉａ）種、例えば、クラミジア・トラコマティス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（例えば、ＭＯＭＰ、ヘパリン結合性タンパク質）、クラミジア・ニューモニエ（Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（例えば、ＭＯＭＰ、ヘパリン結合性タンパク質）、クラミジア・ピタチ（Ｃ．ｐｓｉｔｔａｃｉ）；レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）種、例えば、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌ．ｉｎｔｅｒｏｇａｎｓ）；トレポネマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）種、例えば、トレポネマ・パリダム（Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ）（例えば、稀な外膜タンパク質）、トレポネマ・デンティコーラ（Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、トレポネマ・ヒオディセンテリエ（Ｔ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）；又は寄生生物、例えば、プラスモディウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種、例えば、プラスモディウム・ファルシパラム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）；トキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）種、例えば、トキソプラズマ・ゴンジイ（Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ）（例えば、ＳＡＧ２，ＳＡＧ３，Ｔｇ３４）；エンタモエバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）種、例えば、エンタモエバ・ヒストリティカ（Ｅ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）；バベシア（Ｂａｂｅｓｉａ）種、例えば、バベシア・ミクロチ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）；トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）種、例えば、トリパノソーマ・クルジ（Ｔ．ｃｒｕｚｉ）；ジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）種、例えば、ジアルジア・ランブリア（Ｇ．ｌａｍｂｌｉａ）；レシュマニア（Ｌｅｓｈｍａｎｉａ）種、例えば、レシュマニア・メージャー（Ｌ．ｍａｊｏｒ）；ニューモシスティス（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ）種、例えば、ニューモシスティス・カリニ（Ｐ．ｃａｒｉｎｉｉ）；トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）種、例えば、トリコモナス・バギナリス（Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ）；スキゾストーマ（Ｓｃｈｉｓｏｓｔｏｍａ）種、例えば、スキゾストーマ・マンソニ（Ｓ．ｍａｎｓｏｎｉ）、又は酵母、例えば、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種、例えば、キャンディダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）；クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、例えば、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）由来である。
【００３１】
１の好ましい局面においては、本発明のワクチン配合物は、特にＣＨＯ細胞内で発現されるとき、ＨＩＶ−１抗原、ｇｐ１２０を含む。さらなる態様においては、本発明のワクチン配合物は、先に定義したようなｇＤ２ｔを含む。
本発明の好ましい態様においては、請求に係るアジュバントを含有するワクチンは、生殖器いぼの原因であると考えられるＨＰＶウイルス（ＨＰＶ６又はＨＰＶ１１その他）、及び子宮頚癌の原因であるＨＰＶウイルス（ＨＰＶ１６，ＨＰＶ１８その他）を含む。特に好ましいワクチン形態は、Ｌ１粒子又はキャプソメア、並びに融合タンパク質であってＨＰＶ６及びＨＰＶ１１タンパク質Ｅ６，Ｅ７，Ｌ１及びＬ２から選ばれた１以上の抗原を含むものを含む。最も好ましい、融合タンパク質の形態は：ＧＢ９５１５４７８．７中に開示されたＬ２Ｅ７、及びＧＢ９７１７９５３．５（ＷＯ９９／１０３７５）中に開示されたプロテインＤ（１／３）−Ｅ７である。
【００３２】
本発明のワクチンは、さらに、マラリアを引き起こす寄生生物由来の抗原を含む。例えば、プラスモディア・ファルシパラム（Ｐｌａｓｍｏｄｉａ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）からの好ましい抗原は、ＲＴＳ，Ｓ、及びＴＲＡＰを含む。ＲＴＳは、Ｂ型肝炎表面抗原のプレＳ２部分の４アミノ酸を介して、Ｂ型肝炎ウイルスの表面（Ｓ）抗原に結合されたプラスモディア・ファルシパラム（Ｐｌａｓｍｏｄｉａ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のサーカムスポロゾイト（ＣＳ）タンパク質のＣ末端部分の実質的に全てを含むハイブリッド・タンパク質である。その全体構造は、ＵＫ特許出願第９１２４３９０．７号に基づく優先権を主張し、公開番号ＷＯ９３／１０１５２の下で公開された、国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ９２／０２５９１号中に開示されている。酵母内で発現されるとき、ＲＴＳは、リポプロテイン粒子として製造され、そしてそれがＨＢＶからのＳ−抗原とともに同時発現されるとき、それはＲＴＳ，Ｓとして知られる混合粒子を製造する。ＴＲＡＰ抗原は、ＷＯ９０／０１４９６下で公開された、国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ８９／００８９５号中に記載されている。本発明の好ましい態様は、マラリアワクチンであり、ここでは上記抗原性調製物は、上記ＲＴＳ，Ｓ抗原とＴＲＡＰ抗原の併合を含む。他のプラスディウム抗原であって、マルチステージ・マラリア・ワクチンの成分の候補であろうものは、プラスモディウム・ファシパラム（Ｐ．ｆａｃｉｐａｒｕｍ）ＭＳＰ１，ＡＭＡ１，ＭＳＰ３，ＥＢＡ，ＧＬＵＲＰ，ＲＡＰ１，ＲＡＰ２、セクエストリン（Ｓｅｑｕｅｓｔｒｉｎ）、ＰｆＥＭＰ１，Ｐｆ３３２，ＬＳＡ１，ＬＳＡ３，ＳＴＡＲＰ，ＳＡＬＳＡ，ＰｆＥＸＰ１，Ｐｆｓ２５，Ｐｆｓ２８，ＰＦＳ２７／２５，Ｐｆｓ１６，Ｐｆｓ４８／４５Ｐｆｓ２３０、及びプラスモディウム種におけるそれらのアナログである。
【００３３】
上記配合物は、抗腫瘍抗原を含むこともでき、そして免疫療法治療癌のために有用であることができる。例えば、上記アジュバント配合物は、腫瘍拒絶抗原、例えば、前立腺、乳、結直腸、肺、膵臓、腎臓又はメラノーマ癌のためのものとともに有用である。例示的抗原は、ＭＡＧＥ１及びＭＡＧＥ２又は他のＭＡＧＥ抗原であってメラノーマの治療のためのもの、ＰＲＡＭＥ，ＢＡＧＥ又はＧＡＧＥを含む（Ｒｏｂｂｉｎｓ  ａｎｄ  Ｋａｗａｋａｍｉ，１９９６，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８，ｐｐｓ  ６２８−６３６；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｙｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ＆  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ  １９９７）；Ｃｏｒｒｅａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ８９，ｐ２９３）。もちろん上記抗原は、広いレンジの腫瘍タイプ、例えば、メラノーマ、肺癌腫、肉腫、及び膀胱癌腫内で発現される。他の腫瘍特異的抗原は、本発明のアジュバントとの併用に好適であり、そして非限定的に、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）又はＨｅｒ−２／ｎｅｕ，ＫＳＡ（ＧＡ７３３）、ＭＵＣ−１、及び癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を含む。他の抗原は、チロシナーゼ（Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）及びスルビビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）を含む他の抗原が汎−癌治療剤として出されてきた。従って、本発明の１の局面においては、本発に係るアジュバント組成物及び腫瘍拒絶抗原を含むワクチンが提供される。
【００３４】
本発明の組成物はボレリア種由来の抗原を含むワクチンを配合するために使用されるであろうと予想される。例えば、抗原は、核酸、病原体由来抗原又は抗原調製物、組換え製造タンパク質又はペプチド、及びキメラ融合タンパク質を含むことができる。特に、上記抗原はＯｓｐＡである。このＯｓｐＡは、（Ｌｉｐｏ−ＯｓｐＡ）といわれる宿主細胞（Ｅ．ｃｏｌｉ）のおかげで脂質化された形態にある完全成熟タンパク質又は非脂質化タンパク質であることができる。このような非脂質化誘導体は、非脂質化ＮＳ１−ＯｓｐＡ融合タンパク質であってインフルエンザ・ウイルスの非構造タンパク質の最初の８１Ｎ−末端アミノ酸（ＭＳ１）をもつもの、及び完全ＯｓｐＡタンパク質を含み、そして他の、ＭＤＰ−ＯｓｐＡは、３つの追加のＮ−末端アミノ酸を担持するＯｓｐＡの非脂質形態である。
【００３５】
本発明のワクチンは、アレルギーの予防又は治療のために使用されることができる。このようなワクチンは、アレルゲン特異的抗原（例えば、Ｄｅｒ  ｐ１、及び花粉関連抗原）及びアレルゲン非特異的抗原（例えば、スタンワース（ｓｔａｎｗｏｒｔｈ）デカペプチド）を含むであろう。
各ワクチン投与における抗原の量は、典型的なワクチン接種を受けた者において有意な有害副作用を伴わずに免疫保護応答を誘導する量として、選択される。このような量は、どの特異的免疫原が使用されるか及びそれがどのように提示されるかに依存して変化するであろう。一般的には、各投与量は、１〜１０００μｇの、好ましくは１〜５００μｇの、好ましくは１〜１００μｇの、最も好ましくは、１〜５０μｇの抗原を含むであろうと予想される。特定のワクチンの最適量は、被験体における適当な免疫応答の観察を含む標準的な試験により確められることができる。一次ワクチン接種の後、被験体は、適当に間隔をあけて１又は数回の追加免疫感作を受容することができる。典型的には、ヒト投与のためには、上記免疫刺激剤は、１投与当り１〜１００μｇ、好ましくは１０〜５００μｇ、より好ましくは２０〜２００μｇ、より好ましくは２０〜１００μｇ、そして最も好ましくは１０〜５０μｇの範囲内で存在するであろう。
【００３６】
本発明は、さらに、医療における、特に病原体感染、又は癌、又はアレルギーを患った又はこれに罹り易い哺乳動物の治療方法としての使用のための、本発明のアジュバント及びワクチンを規定する。
また、ウイルス、バクテリア、寄生生物感染、アレルギー、又は癌の免疫予防及び免疫治療剤の製造における本発明のアジュバント及びワクチンの使用も規定される。本発明の配合物は、予防目的と治療目的の両者のために使用されうる。
【００３７】
ワクチンの調製は、一般に、“Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ−ｔｈｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ”Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｆ．ａｎｄ  Ｎｅｗｍａｎ，Ｍ．Ｊ．；１９９５，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ａｎｄ  Ｌｏｎｄｏｎ，ＩＳＢＮ  ０−３０６−４４８６７−Ｘ）中に記載されている。
【実施例】
【００３８】
本発明は、以下の実施例により説明されるが、これに限定されるものではない。
実施例１：材料及び方法
血清学
抗−ＨＢｓ抗体の定量を、コーティング抗原としてＨＢｓ（Ｈｅｐ２８６）を用いたＥＬＩＳＡにより行った。抗原及び抗体溶液をウェル当り５０μｌにおいて使用した。抗原をＰＢＳ中１μｇ／mlの最終濃度において希釈し、そして９６ウェル・マイクロタイター・プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ  Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ，Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）のウェルに４℃で一夜吸着させた。次に上記プレートを、１％ウシ血清アルブミン及び０．１％ＴＷＥＥＮ２０を含むＰＢＳとともに３７℃で１時間インキュベートした（飽和バッファー；１００μｌ／ウェル）。上記飽和バッファー中の（１／１００希釈から出発する）血清の２倍希釈物を、上記ＨＢｓ被覆されたプレートに添加し、そして３７℃で１時間インキュベートした。上記プレートを、ＰＢＳ０．１％ＴＷＥＥＮ２０で４回洗浄し、そして飽和バッファー中で１／１０００希釈されたビオチン結合抗−マウスＩｇＧ１，ＩｇＧ２ａ，ＩｇＧ２ｂ又はＩｇ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ）を各ウェルに添加し、そして３７℃で１時間インキュベートした。洗浄ステップの後、飽和バッファー中で１／５０００希釈されたストレプトアビジン−ビオチニル化ペルオキシダーゼ複合体（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ）を、３７℃でさらに３０分間添加した。プレートを上述のように洗浄し、そして０．１％ＴＷＥＥＮ２０，０．０５Ｍクエン酸バッファーｐＨ４．５中Ｏ−フェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ）０．０４％Ｈ2Ｏ2０．０３％の溶液とともに２０分間インキュベートした。この溶液をＨ2ＳＯ4２Ｎで停止させ、そして４９０／６３０nmで読んだ。ＥＬＩＳＡ力価を（４変数等式を用いて）ＳｏｆｔｍａｘＰｒｏによる参考資料から計算し、そしてＥＵ／mlで表した。
【００３９】
Ｔ細胞増殖
２次免疫感作から２週間後、マウスを殺し、脾臓を無菌的にプールに取り出した。２mMＬ−グルタミン、抗生物質、５×１０-5Ｍ  ２−メルカプトエタノール、及び１％同一遺伝子型の正常マウス血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ）中で、細胞懸濁液を調製した。脾臓細胞を、ＨＢｓ抗原の異なる濃度（１０〜０．０３μｇ／ml）を含んだ丸底９６ウェル−プレート内で２００μｌにおいて２×１０6細胞／ml の最終濃度で培養した。各テストを４連で行った。５％ＣＯ2 の下３７℃における９６時間の培養後、上記細胞を、０．５μＣｉ／ウェルにおいて 3Ｈ−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ，５Ｃｉ／mmol）で１８時間パルスし、そして次に、細胞ハーベスターを用いてＵｎｉｆｉｌｔｅｒプレート（Ｐａｃｋａｒｄ）上に収穫した。取り込まれた放射能を、シンチレーション・カウンター（Ｔｏｐｃｏｕｎｔ，Ｐａｃｋａｒｄ）内で計測した。結果を、cpm（４連ウェル内の平均cpm）において、又は刺激係数（抗原を含む細胞培養物における平均cpm／抗原を含まない細胞培養物における平均cpm）として表す。
【００４０】
サイトカイン産生
２次免疫感作から２週間後、マウスを殺し、脾臓を、プール内に無菌的に取り出した（群当り３プール）。２mMＬ−グルタミン、抗生物質、５×１０-5Ｍ  ２−メルカプトエタノール、及び５％胎児ウシ血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ）中で細胞懸濁液を調製した。ＨＢｓ抗原の異なる濃度（１０〜０．１μｇ／ml）をもつ平底２４ウェル−プレート内で１mlにおいて、５×１０6 細胞／mlの最終濃度において細胞を培養した。上清を９６時間後に収穫し、そしてＥＬＩＳＡによりＩＦＮγ及びＩＬ−５の存在についてテストするまで冷凍した。
【００４１】
ＩＦＮγ産生
ＩＦＮγの定量を、Ｇｅｎｚｙｍｅからの試薬を用いてＥＬＩＳＡにより行った。サンプル及び抗体溶液をウェル当り５０μｌにおいて用いた。９６ウェル・マイクロタイター・プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ  Ｉｍｍｏ−ｐｌａｔｅ，Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を、炭酸塩バッファーｐＨ９．５中１．５μｇ／mlに希釈した５０μｌのハムスター抗−マウスＩＦＮγを用いて４℃で一夜コートした。次に、プレートを、１％ウシ血清アルブミン及び０．１％ＴＷＥＥＮ２０を含むＰＢＳ１００μｌ（飽和バッファー）とともに３７℃で１時間インキュベートした。飽和バッファー中の（１／２から出発する）インビトロ刺激物からの上清の２倍希釈物を抗−ＩＦＮγ−コートされたプレートに添加し、そして３７℃で１時間３０分の間インキュベートした。上記プレートを、ＰＢＳ  ＴＷＥＥＮ０．１％（洗浄バッファー）で４回洗浄し、そして０．５μｇ／mlの最終濃度における飽和バッファー中で希釈されたビオチン結合ヤギ抗−マウスＩＦＮγを各ウェルに添加し、そして３７℃で１時間インキュベートした。洗浄ステップの後、飽和バッファー中で１／１００００に希釈されたＡＭＤＥＸ抱合体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を３７℃で３０分間添加する。プレートを上述のように洗浄し、そして１０分間５０μｌのＴＭＢ（Ｂｉｏｒａｄ）とともにインキュベートした。反応をＨ2ＳＯ4０．４Ｎを用いて停止させ、そして４５０／６３０nmで読んだ。濃度を、（４変数等式を用いた）ＳｏｆｔｍａｘＰｒｏによる標準曲線（マウスＩＦＮγ標準）を用いて計算し、そしてpg／mlで表した。
【００４２】
ＩＬ−５産生
ＩＬ−５の定量を、Ｇｅｎｚｙｍｅからの試薬を用いてＥＬＩＳＡにより行った。サンプル及び抗体溶液をウェル当り５０μｌにおいて用いた。９６ウェル・マイクロタイター・プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ  Ｉｍｍｏ−ｐｌａｔｅ，Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を、炭酸塩バッファーｐＨ９．５中１μｇ／mlに希釈した５０μｌのラット抗−マウスＩＬ−５を用いて４℃で一夜コートした。次に、プレートを、１％ウシ血清アルブミン及び０．１％ＴＷＥＥＮ２０を含むＰＢＳ１００μｌ（飽和バッファー）とともに３７℃で１時間インキュベートした。飽和バッファー中の（１／２から出発する）インビトロ刺激物からの上清の２倍希釈物を抗−ＩＦＮγ−コートされたプレートに添加し、そして３７℃で１時間３０分の間インキュベートした。上記プレートを、ＰＢＳ  ＴＷＥＥＮ０．１％（洗浄バッファー）で４回洗浄し、そして１μｇ／mlの最終濃度における飽和バッファー中で希釈されたビオチン結合ラット抗−マウスＩＬ−５を各ウェルに添加し、そして３７℃で１時間インキュベートした。洗浄ステップの後、飽和バッファー中で１／１００００に希釈されたＡＭＤＥＸ抱合体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を３７℃で３０分間添加する。プレートを上述のように洗浄し、そして１５分間５０μｌのＴＭＢ（Ｂｉｏｒａｄ）とともにインキュベートした。反応を Ｈ2ＳＯ4 ０．４Ｎを用いて停止させ、そして４５０／６３０nmで読んだ。濃度を、（４変数等式を用いた）ＳｏｆｔｍａｘＰｒｏによる標準曲線（組換えマウスＩＬ−５）を用いて計算し、そしてpg／mlで表した。
【００４３】
実施例２：マウスにおける免疫原性試験
抗原を含まない固体粒状担体上のＭＰＬのコンセプトをテストするために、免疫原性試験を、ＨＡＢＭＰＬワクチンの配合物の各種シーケンスを用いてＢａｌｂ／Ｃマウスにおいて行った：
【００４４】
【表１】
0005563189.tif 000002
【００４５】
配合方法の説明：
グループ１、従来技術の配合方法。抗原をまず金属塩上に吸着させ、その後、遊離３Ｄ−ＭＰＬを添加する。これは、抗原と同一粒子の金属塩上の３Ｄ−ＭＰＬの吸着をもたらす。
グループ２と３、本発明の配合方法。３Ｄ−ＭＰＬを金属塩の１の粒子上に吸着させ、抗原を、金属塩の別の粒子上に吸着させ、その後、上記の前もって吸着させた複合体を混合する。
免疫感作スキーム
【００４６】
１０匹のマウスから成る群を、ＨＡＢベースの配合物（１／１０ヒト投与量、すなわち、ＨＡＶ７２ＥＬＵ、ＨＢｓ２μｇ，ＭＰＬ５μｇ）を用いて４週間間隔で２回皮下に免疫感作させた。IIから１４日後に（ｄａy １４  ｐｏｓｔ  II，２次免疫感作から１４日後に）、リンパ球増殖性応答及びサイトカイン産生（ＩＬ５／ＩＦＮγ）を、ＨＢｓ及びＨＡＶによる脾臓細胞のインビトロ刺激後に分析した。血液を３５日目に眼窩後洞から（ｒｅｔｒｏｏｒｂｉｔａｌｓｉｎｕｓ）から採取し、そしてＨＢｓ及びＨＡＶに対する抗体応答並びに誘導されたアイソタイプ特性（ＨＢｓだけ）をＥＬＩＳＡによりモニターした。
【００４７】
結果
体液応答（Ｉｇ及びアイソタイプ）を、ＨＢＶに関してコーティング抗原としてＨＢｓを使用して、そしてＨＡＶに関してＢｅｈｒｉｎｇキットを使用して、ＥＬＩＳＡにより計測した。IIから１４日後にだけ、血液を分析した。
【００４８】
図１は、個々の血清について計測され、そしてＧＭＴと表された抗−ＨＢｓＩｇ抗体応答を示す。
図２は、プールされた血清についての分析から計算されたアイソタイプの再分配（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２ａ、及びＩｇＧ２ｂ）を示す。
グループ１と新規配合物（グループ２とグループ３）の間に抗体力価における差は全く観察されなかった。さらに、新規配合物（グループ２とグループ３）は、従来技術の配合物（グループ１）により刺激されたものと類似の、ＩｇＧ１対ＩｇＧ２ａ／ｂアイソタイプ比を刺激する。
【００４９】
細胞仲介免疫応答
細胞仲介免疫応答（リンパ球増殖及びＩＦＮγ／ＩＬ−５産生）を、ＨＢｓ又はＨＡ抗原による脾臓細胞のインビトロ再刺激後に、IIの後１４日目に計測した。マウスの各グループに関して、５匹の動物を殺し、そしてインビトロ試験のために脾臓をプールした。
【００５０】
図３は、ＨＢｓにより再刺激された脾臓細胞内でモニターされたリンパ球増殖を示す。
図４は、ＨＢｓにより再刺激された脾臓細胞内でモニターされたサイトカイン産生を示す。
上記配合物の間に、リンパ球増殖性応答における差は全く観察されなかった。
【００５１】
強いＩＦＮ−γ（＋／−１０００pg／ml）応答が、全てのグループにおいて観察された。その上、上記グループの間には、（６０pg／ml未満の）ＩＬ−５産生における差は全く観察されなかった。
【００５２】
結論
ＨＢｓＡｇに対する体液性及び細胞仲介免疫応答における有意差は、ＨＡＢＭＰＬ配合配列間には、観察されなかった。
【００５３】
実施例３：モルモット（Ｇｕｉｎｅａ  Ｐｉｇｓ）のＨＳＶワクチン接種
その実施例は、肝炎抗原に関する、上記新規配合物及び方法の効果を証明した。本実施例は、本発明の方法に比較して古典的な方法におけるアルミニウム（ａｌｕｍ）と３Ｄ−ＭＰＬで配合された単純ヘルペス・ウイルスｇＤワクチンの免疫原性及び保護効果を調べた。上記２つのワクチンを、ＨＳＶモルモット膣内保護モデルにおいて比較した。
【００５４】
【表２】
0005563189.tif 000003
【００５５】
実験プロトコール
１２匹の雌Ｈａｒｔｌｅｙモルモットのグループを、０日目と２８日目に２回免疫感作させた。５７日目に、上記動物を、１０5PfuのＨＳＶ２  ＭＳ株（１００μｌ）で膣内接種した。接種後、動物を、４日目から１２日目まで一次疾患の臨床兆候について毎日モニターした。二次免疫感作後１４日目と２８日目に、眼窩後洞から血液を採取し、そして抗−ｇＤ抗体応答（ＩｇＧ）をＥＬＩＳＡによりモニターした。
【００５６】
配合方法
ＨＳＶ２からのｇＤ２ｔを、ＷＯ９２／１６２３１中に記載された技術に従って調製した。３Ｄ−ＭＰＬを、Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．，Ｍｏｎｔａｎａ，ＵＳＡから購入した。ＡｌＯＨ3 をＳｕｐｅｒｆｏｓから購入した。配合物を、一次注射の１５日前に調製した。全インキュベーションを撹拌しながら室温で行った。
グループ４  Ａｌ（ＯＨ)3ベースの配合物（２５０μｌ／投与）：古典的方法
ｇＤ２ｔ（５μｇ）を、ＭＰＬ添加（１２．５μｇ）前１５分間１２５μｇのＡｌ（ＯＨ)3上に吸着させた。３０分後、上記配合物を１０倍に濃縮したＰＢＳ  ｐＨ７．４溶液を用いて緩衝液化した。１５分後、５００μｇ／mlのフェノキシエタノール保存料として添加した。
【００５７】
Ｈ2Ｏ＋Ａｌ（ＯＨ）3＋Ａｇ−１５ｍ−ＭＰＬ−３０ｍ−１０×ＰＢＳ  ｐＨ７．４−１５ｍ−２フェノキシ
グループ５  Ａｌ（ＯＨ)3ベースの配合物（２５０μｌ／投与）：新規方法
ｇＤ２ｔ（５μｇ）を１５分間１００μｇのＡｌ（ＯＨ)3上に吸着させ、そして濃縮モノバルクとして保存した。他方において、ＭＰＬ（１２．５μｇ）を３０分間２５μｇのＡｌ（ＯＨ)3上に吸着させ、そして他の濃縮モノバルクとして保存した。最終配合物のために、上記の吸着されたｇＤ２ｔを Ｈ2Ｏ及び１０倍濃縮ＰＢＳ  ｐＨ７．４中で希釈した。１５分後、吸着されたＭＰＬを、保存料としてフェノキシエタノールを添加する前に、添加した。
【００５８】
Ａｌ（ＯＨ)3＋Ａｇ
Ａｌ（ＯＨ)3＋ＭＰＬ
Ｈ2Ｏ＋１０×ＰＢＳ ｐＨ７．４＋Ａｄｓ ｇＤ２ｔ−１５ｍ−Ａｄｓ ＭＰＬ−１５ｍ−２フェノキシ
【００５９】
サンプル定量
抗−ｇＤ抗体の定量を、コーティング抗原としてｇＤ４３Ｄ３１８を用いてＥｌｉｓａにより行った。抗原及び抗体溶液を、ウェル当り５０μｌにおいて使用した。抗原を、ＰＢＳ中１μｇ／mlの最終濃度において希釈し、そして９６ウェル・マイクロタイター・プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ  Ｉｍｍｕｎｏ−ｐｌａｔｅ，Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に４℃で一夜吸着させた。次に上記プレートを、１％ウシ血清アルブミンと０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（飽和バッファー）を含むＰＢＳとともに３７℃で１時間インキュベートした。上記飽和バッファー中の血清の２倍希釈物を、上記ｇＤ−被覆プレートに添加し、そして３７℃で１時間３０分間インキュベートした。上記プレートを、ＰＢＳ０．１ｙ％Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄し、そして飽和バッファー中で１／１００００希釈されたビオチン抱合抗−モルモットＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ）を各ウェルに添加し、そして３７℃で１時間３０分間インキュベートした。洗浄ステップ後、飽和バッファー中、１／１０００希釈したストレプトアビジン−ビオチニル化ペルオキシダーゼ複合体（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ）を３７℃でさらに３０分間添加した。プレートを上述のように洗浄し、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０  ０．０５Ｍクエン酸塩バッファーｐＨ４．５中Ｏ−フェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ）０．０４％  Ｈ2Ｏ2 ０．０３％の溶液とともに２０分間インキュベートした。この反応をＨ2ＳＯ4 ２Ｎで停止させ、そして４９０／６３０nmで読んだ。ＥＬＩＳＡ力価を（４変数等式を用いて）ＳｏｆｔｍａｘＰｒｏによる参考資料から計算し、そしてＥＵ／mlにおいて表した。
【００６０】
統計学的分析
統計学的分析を、ＵＮＩＳＴＡＴを用いて血清データについて行った。バラツキの一方向分析のために適用されたプロトコールは以下のように簡単に説明されることができる：
１）データのＬｏｇ変換確認
２）正規性を確認するための各集団（グループ）についてのＫｏｌｍｏｇｏｒｏｖ  Ｓｍｉｒｎｏｖテスト
３）異なる集団（グループ）の間のバラツキの同質性を確認するためのＨａｒｔｌｅｙ  ａｎｄ  Ｃｏｃｈｒａｎテスト
４）選択されたデータについてのバラツキの分析：II後１４日目又はII後２８日目のデータ
【００６１】
結果
血清学
図５は、個々の血清に対するII後に計測された抗−ｇＤＩｇＧ抗体応答を示す。II後１４日目の配合物（ＧＭＴについて１７０９０−１８５０８ＥＵ／ml）又はII後２８日目の配合物（ＧＭＴについて１０２２７−１１９６５ＥＵ／ml）の間に抗体力価における顕著な差は観察されていない。バラツキの１方向分析を、データのＬｏｇ変換後の両時間的からの、ワクチン配合物により生じた抗−ｇＤＩｇＧ力価について別々に行った。いずれの配合物の間にも統計的に有意な差は全く検出されなかった。（ｐ−値＝II後１４日目とII後２８日目のデータについてそれぞれ０．７３９７と０．５０７８）。
【００６２】
疾患からの保護
ワクチン接種された動物と接種されなかった動物におけるいくつかのパラメータを比較することにより、接種後４日目と１２日目の間に一次疾患に対する保護を評価した。
【００６３】
・病変を伴う及び伴わない動物のパーセンテージ（膣又は外部）
・以下のように各グループから計算された一次感染率（ＰＩ）：Σ（最大等級×％において表す発生率）
・平均として表す病変等級の合計（４日目〜１２日目）及び病変を示す動物の数
・４日目と１２日目の間の各グループについて計算された平均累積等級
【００６４】
【表３】
0005563189.tif 000004
【００６５】
図６は、ＨＳＶ接種後の累積病変等級曲線を示す。
ワクチン接種された動物の高パーセンテージは、いずれの病変を顕出せず（６６％〜８３％）又は膣病変を顕出した。比較において、対照グループの動物の８９％が外部病変を示した。
一次感染率の強い低下が、ワクチン接種された動物において観察された（９７％〜９９％）。これはひじょうに低い病変重度をもち、これは、処理されなかったグループに比較して（平均（ｍｅｄｉａｎ）＝２８）ワクチン接種されたグループ（平均＝０．５又は１）について記録された。
【００６６】
累積等級の曲線により示されるように、両グループ（４と５）は、一次疾患に対してひじょうに良い及びかなりのレベルの保護を与えた。
【００６７】
結論
ＨＳＶワクチン配合物のための旧方法と新規方法を比較した。ＩｇＧ力価又は一次疾患に対する保護において上記２つの方法の間に、統計的に有意な差は全く観察されなかった。
【００６８】
実施例４：マウスのＨＰＶワクチン接種
ヒト・パピローマ・ウイルス  Ｅ７抗原と３Ｄ−ＭＰＬの（ＡｌＯＨ又はＡｌＰＯ4ベースの)配合物のさまざまなシーケンスを、抗原特異的体液性応答を誘導するそれらの能力に関して比較した。比較に値するＩｇ力価を、同一担体上の３Ｄ−ＭＰＬとプロテインＤ１／３−Ｅ７の混合吸着による配合物（方法１）、及び抗原を含まない担体上に別々に３Ｄ−ＭＰＬが吸着されているところの配合物（方法２）を用いて得た。プロテインＤ１／３Ｅ７を、ＷＯ９９／１０３７５の手順に従って調製した。上記抗原とＭＰＬ配合物は、ＡｌＯＨベースか又はＡｌＰＯ4 ベースかのいずれかであった。抗原と３Ｄ−ＭＰＬを、アルミニウム塩の同一粒子に順番に吸着させ（方法１）、又は別々の吸着を混合前に行った（方法２）。
【００６９】
【表４】
0005563189.tif 000005
【００７０】
マウスを、筋中経路により２１日間隔で２回免疫感作させた。血清を３５日目（II後１４日目）に採取し、そしてＥ７特異的抗体の存在について分析した（材料及び方法参照）。配合物を、一回目の注射の５日前に調製した。全インキュベーションを撹拌しながら室温で行った。
Ｉ．Ａｌベースの配合物（５０μｌ／投与）：古典的方法（方法１）
ＰＤ１／３Ｅ７（５μｇ）を、ＭＰＬ添加の３０分前（５μｇ）に、５０μｇのＡｌ（ＯＨ）3又はＡｌＰＯ4上に吸着させた。３０分後、上記配合物を、１０倍に濃縮したＰＯ４，ＮａＣｌ  ｐＨ６．３溶液を用いて緩衝液化した。１５分後、５０μｇ／mlのチオメルサールを保存料として添加した。
【００７１】
Ｈ2Ｏ＋Ａｌ＋Ａｇ−３０ｍ−ＭＰＬ−３０ｍ−１０×ＰＮｐＨ ６．８−１５ｍ−Ｔｈｉｏ
II．Ａｌベースの配合物（５０μｌ／投与）：新規方法（方法２）
ＰＤ１／３Ｅ７（５μｇ）を、３０分間１０μｇのＡｌ（ＯＨ)3又はＡｌＰＯ4 上に吸着させ、そして濃縮モノバルクとして保存した。他方、ＭＰＬ（５μｇ）を３０分間２０μｇのＡｌ（ＯＨ）3又はＡｌＰＯ4上に吸着させ、そして他の濃縮モノバルクとして保存した。最終配合物のために、上記の吸着された抗原を、上記の吸着されたＭＰＬ及びＡＬの残り（２０μｇ）の添加前に、Ｈ2Ｏ 及び１０倍に濃縮されたＰＯ４，ＮａＣｌ  ｐＨ６．８溶液中で希釈した。１３分後、５０μｇ／mlのチオメルサールを保存料として添加した。
【００７２】
Ａｌ＋Ａｇ
Ａｌ＋ＭＰＬ
Ｈ2Ｏ＋１０×ＰＮ ｐＨ６．８＋Ａｄｓ ＰＤ１／３Ｅ７＋Ａｄｓ ＭＰＬ＋Ａｌ−３０ｍ−Ｔｈｉｏ
【００７３】
血清学
抗−Ｅ７抗体の定量を、コーティング抗原としてＥ７（Ｂｏｌｌｅｎ）を用いてＥｌｉｓａにより行った。抗原及び抗体溶液を、ウェル当り５０μｌにおいて使用した。抗原を、炭酸塩バッファーｐＨ９．５中で３μｇ／mlの最終濃度において希釈し、そして９６ウェル・マイクロタイター・プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ  ｉｍｍｕｎｏ−ｐｌａｔｅ，Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に４℃において一夜吸着させた。次にこのプレートを、１％ウシ血清アルブミンと０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（飽和バッファー）を含有するＰＢＳとともに３７℃で１時間インキュベートした。飽和バッファー中の（１／１００希釈から出発する）血清の２倍希釈物をＥ７被覆されたプレートに添加し、そして３７℃において１時間３０分の間インキュベートした。上記プレートを、ＰＢＳ０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、そして飽和バッファー中で１／５０００希釈されたビオチン抱合抗マウス（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２ａ又はＩｇＧ２ｂ又は）ＩｇＧｔｏｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ）を各ウェルに添加し、そして３７℃で１時間３０分の間インキュベートした。洗浄ステップ後、飽和バッファー中で１／５０００希釈されたストレプトアビジン−ビオチニル化ペルオキシダーゼ複合体（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ）を３７℃でさらに３０分間添加した。プレートを上記のように洗浄し、そしてＴＭＢ（テトラ−メチル−ベンジジン）とともに１０分間インキュベートした。この反応をＨ2ＳＯ4で停止させ、そして４５０nmで読んだ。中間希釈を、（４変数等式を用いた）ＳｏｆｔｍａｘＰｒｏにより計算した。
【００７４】
結果
ＥＵ／mlで表されるＥＬＩＳＡによるプールされた血清について計測された抗−Ｅ７Ｉｇ力価は、以下のようである：
【００７５】
【表５】
0005563189.tif 000006
【００７６】
上記ＡｌＯＨベースの配合物又は上記ＡｌＰＯ4 ベースの配合物を比較するとき、比較に値する力価が得られる。ＭＰＬがＡｌＯＨ又はＡｌＰＯ4 配合物に添加されるとき、到達した力価は、Ａｌ配合物についての５，０００ＥＵ／ml未満に比較して、１０，０００ＥＵ／mlを上廻るものである。両配合シーケンスを用いて、比較に値する力価が得られる。
【００７７】
抗原及びＭＰＬの（ＡｌＯＨ又はＡｌＰＯ4ベースの)配合物のさまざまなシーケンスを、抗原特異的抗体の産生を誘導するそれらの能力に関して比較した：
ＭＰＬを含有する配合物の全てがＡｌｕｍ配合物よりも高いレベルのＥ７−特異的Ｉｇを誘導する。同一担体上のＭＰＬ及びｐＤ１／３−Ｅ７の混合吸着による配合物（方法１）、及び抗原を含有しない担体上に別々にＭＰＬが吸着されるところの配合物（方法２）を用いて、比較に値する（ｃｏｍｐａｒａｂｌｅ同程度の）Ｉｇ力価が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図１は、個々の血清について計測され、そしてＧＭＴと表された抗−ＨＢｓＩｇ抗体応答を示す。
【図２】図２は、プールされた血清についての分析から計算されたアイソタイプの再分配（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２ａ、及びＩｇＧ２ｂ）を示す。
【図３】図３は、ＨＢｓにより再刺激された脾臓細胞内でモニターされたリンパ球増殖を示す。
【図４】図４は、ＨＢｓにより再刺激された脾臓細胞内でモニターされたサイトカイン産生を示す。
【図５】図５は、個々の血清に対するII後に計測された抗−ｇＤＩｇＧ抗体応答を示す。
【図６】図６は、ＨＳＶ接種後の累積病変等級曲線を示す。
【図１】
0005563189.tif 000007
【図２】
0005563189.tif 000008
【図３】
0005563189.tif 000009
【図４】
0005563189.tif 000010
【図５】
0005563189.tif 000011
【図６】
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