(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔリンパ球をｅｘ  ｖｉｖｏで有効量の一次細胞由来バイオロジックのみからなる配合物と接触させることにより作製される、ｅｘ  ｖｉｖｏでアポトーシスから防御されるＴリンパ球を含有し、細胞防御的がん療法に使用される医薬組成物であって、
該一次細胞由来バイオロジックは、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）及びγ−インターフェロン（ＩＦＮ−γ）を含むことを特徴とする、前記医薬組成物。
【請求項２】
前記Ｔリンパ球は、一次血液由来Ｔリンパ球である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記Ｔリンパ球は、ＣＤ４＋である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記Ｔリンパ球は、ＣＤ８＋である、請求項１〜３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記一次細胞由来バイオロジックは、４−アミノキノン抗生物質の持続的存在下、及び、ミトーゲンの持続的又はパルス化した存在とともに調製されることによって取得することができる、請求項１〜４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ミトーゲンは、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記一次細胞由来バイオロジックは、さらに、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び果粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００７年１１月２８日に出願された米国特許仮出願第６０／９９０，７５９及び２００８年５月２９日に出願され、本明細書に参照のために挿入する米国特許仮出願６１，０５６，９２５の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．セクション１１９（ｅ）に基づく優先権を請求するものである。
【０００２】
本発明は、免疫系の治療に関する。特に、本発明は、一次細胞由来バイオロジック（ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｅｌｌ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃ）、及び免疫系の効果を改善するためにそれを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
機能性かつ免疫応答を起こし得る免疫系において、未熟樹状細胞は、抗原を取り込んだ後、リンパ節へ遊走し、そこで成熟する。得られる成熟樹状細胞は、次いで、ナイーブＴ細胞を活性化し、抗原特異的な細胞障害性Ｔ細胞を産生し、その細胞障害性Ｔ細胞はその後増殖し、血行中に入り、抗原性標的を探索して殺す。これは、一般に、強力で効果的かつ迅速な応答である。例えば、この免疫系は、インフルエンザ感染症を７〜１２日間で回復させることができる。
【０００４】
免疫系が免疫応答を起こし得る場合のみ、抗原性標的を排除し得る。腫瘍やその他のさまざまな抗原性標的は、ホストの免疫系をうまく回避するための効率的に進化する戦略を有し、そして、腫瘍の免疫系からの回避（ｔｕｍｏｒ  ｅｖａｓｉｏｎ）を請け負うさまざまな分子及び細胞のメカニズムが同定されている。これらのメカニズムのいくつかは、免疫性抗腫瘍エフェクター細胞を攻撃する。例えば、腫瘍を担持するホスト内で、これらの細胞の機能不全及びアポトーシスは、抗腫瘍免疫応答の活性化のみを照準とする免疫療法では修正することのできない免疫不均衡を形成する。
【０００５】
アポトーシス、すなわちＩ型細胞死は、プログラム細胞死の一分類であり、ストレス、感染やＤＮＡ傷害により誘発され得る。アポトーシスは、成長の間に不可欠なプロセスであるが、一定の場合、実際に害悪になり得る。例えば、Ｔ細胞をはじめとするリンパ球／造血集団のアポトーシスは、がん治療に関連している化学療法及び／又は放射線療法の重大な問題となり得る。これらの細胞は、化学療法や放射線療法に対して敏感な傾向にある。
【０００６】
細胞内のアポトーシスを制御する二つの主要なメカニズム：ｐ５３系路（アポトーシス促進性）及び核内因子κＢ（ＮＦ−κＢ）系路（抗アポトーシス性）が存在する。ｐ５３は通常消失し、一方、ＮＦ−κＢは恒常的に活性になるので、両系路は、腫瘍内で頻繁に調節が解除される。
【０００７】
リンパ球の腫瘍誘発アポトーシスは、がん患者に見られる免疫抑制において重要な役割を演ずると考えられる。抗腫瘍エフェクター細胞のアポトーシスは、腫瘍細胞表面上のＦａｓＬ発現を伴っている。これは、中枢性及び抹消性の免疫寛容を維持するために活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）をトリガーすることを含む免疫機能のダウン・モジュレーションにおいてＦａｓ／ＦａｓＬ相互作用が重要な役割を演ずるという、文書で十分に裏付けされた証拠に基づく。多くのヒト腫瘍はＦａｓＬを発現し、活性化Ｆａｓ＋エフェクターリンパ球をＦａｓ／ＦａｓＬ系路を介して排除することができる。腫瘍細胞上でのＦａｓＬ発現は、患者予後とは負に相関することが示されている。さらに、腫瘍は、膜関連ＦａｓＬを膜性微細小胞（ＭＶ）の分泌を介して放出し、これにより、がん患者の末梢循環内で観察されるＴリンパ球の突然のアポトーシスの説明を提供することが示されている。
【０００８】
出願人は、以前に、口腔がん患者の血清内で検出されたＭＶは、活性化Ｔリンパ球内のカスパーゼ−３開裂、ＤＮＡ断片化、チトクロームｃ放出、ミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ）の低下（ｌｏｓｓ）、及びＴＣＲζ鎖ダウン・レギュレーションを誘発したことを示した。さらに、出願人は、これらの腫瘍由来ＭＶは、それらの特有の分子プロファイル及び免疫抑制特性によって免疫細胞由来ＭＶと区別できることを立証した。また、最近のデータは、ＭＶが頭頸部の扁平上皮がん（Ｈ＆ＮＳＣＣ）患者の血清内に存在すること、及び、これらのＭＶは、生物学的に活性なＦａｓＬを含有し、これが末梢循環内のＦａｓ陽性Ｔ細胞の溶解を媒介することに関与するかもしれないことを示している。したがって、腫瘍由来ＭＶの活性は、がん患者のエフェクターＴ細胞の機能不全や死に顕著に寄与したかもしれない。これらの細胞の喪失は、不適切な抗腫瘍機能、並びにその延長としてがんワクチンに対する不適切な免疫応答の原因であり得た。
【０００９】
Ｈ＆ＮＳＣＣは、さまざまなメカニズムによって抗原提示細胞（ＡＰＣ）だけでなく免疫エフェクター細胞の機能的欠陥及びアポトーシスを誘発し得ることが、説得力をもって立証されている。以前の研究で、出願人は、Ｈ＆ＮＳＣＣ及びメラノーマ患者の末梢循環内の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）及びＴリンパ球の高レベルのアポトーシスを観察している。出願人はＣＤ８＋Ｔ細胞がアポトーシスに対してＣＤ４＋細胞よりも敏感であり、そしてＣＤ８＋Ｔ細胞のエフェクター及び腫瘍特異的亜集団を優先してアポトーシスの標的とすることを実証した。また、ＨＩＶを持つ人は、一般に、ヘルパーＴ細胞集団の劇的な減少を原因とする免疫抑制を経験する。この減少は、ＨＩＶ感染ヘルパーＴ細胞のアポトーシスが原因である。
【００１０】
がん患者の免疫細胞機能不全の原因であるメカニズムは、多数さまざまである。さらに、ＰＧＥ２、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０及びＶＥＧＦのような広い範囲の溶解性免疫抑制性因子や、微細環境内の腫瘍細胞や他の細胞により放出されるＦａｓＬ（上記した）のようなアポトーシス促進性リガンドに加えて、サプレッサー細胞集団、すなわち、制御性Ｔ細胞（Ｔ  ｒｅｇ）は、抗腫瘍ホスト免疫のダウン・レギュレーションにおいて鍵となる役割を果たすことが示されている。
【００１１】
一般的に、これらのメカニズムは、毒のある環境を産生し、これにより、過去の免疫療法的アプローチの失敗が説明される。効果的な治療成績を有するためには、免疫抑制のこれらの腫瘍誘発メカニズムに直に対処しなければならない。がん患者に見られる免疫機能不全の複数の原因に関して新しく見い出した知識では、複数の活性成分は、効果的ながん免疫療法を作る必要があることがより明らかになりつつある。しかし、効果的な免疫療法を見いだして、そのメカニズムを理解することに多くの困難が存在する。
【００１２】
２０世紀初頭にＷｉｌｌｉａｍ  Ｃｏｌｅｙがヒトがんの毒素誘発腫瘍後退を達成して以来、がん治療専門医は、数百の異なる免疫療法を採用してきたが、比較的まれな臨床的応答しかもたなかった。これらの失敗の原因について洞察が少ないか全くないため、一貫したメカニズムが現れなかった。明解なメカニズムを確立するためには、首尾一貫して応答を作り、次いで詳細に吟味される療法の案出が必要であった。
【００１３】
頭頸部扁平上皮がん（Ｈ＆ＮＳＣＣ）は、これらの患者に見られる免疫欠陥について多くのことが知られているので、よいモデルを提供する。それらには、ほんの数例を挙げると、（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅ、２００１；Ｈａｄｄｅｎ、１９９５）：１）腫瘍、並びにプロスタグランジン、Ｔ  ｒｅｇ、骨髄性サプレッサー細胞、抗原抗体複合体、及びＩＬ−１０のようなサイトカインを含むホスト媒介メカニズムにより誘発されるＴリンパ球のアネルギー及び枯渇；２）サプレッサー及び炎症性変化の証拠となる単球／マクロファージ機能欠陥（Ｍａｎｔｖａｎｉ、２００２）、並びに３）洞組織球症（ＳＨ）により特徴づけられる樹状細胞（ＤＣ）の欠陥（Ｄｕｎｎ，２００５）が含まれる。
【００１４】
これらの複数の欠陥を逆行（ｒｅｖｅｒｓｅ）させるのに効果的治療の努力が必要であった。文献の広範囲のレビュー（Ｈａｄｄｅｎ、１９９５）及び一連の前臨床実験は、一次細胞由来バイオロジック（ＩＲＸ−２としても知られる）プロトコルを産んだ。図１に示すＩＲＸ−２プロトコルは、点滴静注による低用量シクロホスファミド（ＣＹ）（３００ｍｇ／ｍ２）の初回投与を採用し、制御性Ｔ細胞とたぶん他形態のサプレッサーによる抑制を逆行させる。ＣＹに続いて、頭骨の付け根にＩＲＸ−２を１０−２０日連日注射してがんの局在するリンパ節のリンパ流（ｊｕｇｕｌａｒ  ｃｈａｉｎｓ）内に供給する。
【００１５】
ＩＲＸ−２は、初期には、増大するＴリンパ球数と機能を介して作用すると考えられた。最近の証拠は、Ｓｉｇｎｏｒｅｌｌｉらの米国仮出願第６０／９９０，７５９に開示されるとおり、腫瘍誘発アポトーシスの逆行が主要なメカニズムでもあることを示している。インドメタシン（ＩＮＤＯ）を約２１日連日投与して腫瘍及び単球／マクロファージによるプロスタグランジン産生をブロックしたが、これは公知のがん関連抑制メカニズムであった。亜鉛を、また、戦略の免疫回復成分の別の側面で投与した（Ｈａｄｄｅｎ、１９９５）。
【００１６】
さらに、プロトコルを開発したときは、Ｔ細胞への腫瘍抗原の提示者としての樹状細胞の決定的な役割は未知であった。また、洞組織球症（ＳＨ）がＤＣ欠陥を反映したこと、特に腫瘍が成熟及び抗原提示の失敗を誘発したことも未知であった。出願人に対する米国特許第６，９７７，０７２及び７，１５３，４９９に開示されたメカニズムの研究は、ＩＲＸ−２プロトコルがこのＤＣ欠陥を逆行させ、そして、強力な免疫化を反映する領域リンパ節の変化を生むこと（Ｍｅｎｅｓｅｓ、２００３）を明らかにした。とりわけ、これらの特許は、ＩＲＸ−２、好ましくはサイトカインＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＮＦ−γ及びＴＮＦ−αを含むＩＲＸ−２投与により、ナイーブＴ細胞の産生を誘発し、そして、Ｔ細胞免疫を回復する方法を開示する。これは、ヒト成人は分子療法を介してナイーブＴ細胞を産生することできるとの最初の発表の１つであった。抗原提示に利用されるナイーブＴ細胞の出現は、免疫回復において重要であった。
【００１７】
ＩＲＸ−２を支持するメカニズムの仮説は、治療上有効ながんワクチンのものと同様であるが、外因性抗原を必要としない。頸部に投与されるとき、薬剤は、ＤＣ上で頸部リンパ節流に直接作用して、それらの成熟と後続のナイーブＴ細胞への内因性腫瘍抗原提示能を促進すると考えられる。
【００１８】
ＩＲＸ−２のメカニズムに関する非臨床データは、この薬剤は、ヒト単球由来ＤＣを効果的に刺激かつ活性化することを示している（Ｅｇａｎ、２００７）。未熟ＤＣのＩＲＸ−２処置は、ＣＤ８３及びＣＣＲ７（それぞれ、成熟及びリンパ節移動のためのマーカー）の発現を、ナイーブＴ細胞への抗原提示にとって重要な分化分子とともに増大させた。さらに、ＩＲＸ−２は、ナイーブＴ細胞の活性化にとって重要な同時刺激レセプターであるＣＤ４０、ＣＤ５４及びＣＤ８６を誘発した。ＩＲＸ−２処置ＤＣの機能的変化は、抗原提示及びＴ細胞活性の増大を含んだ。総括すると、未熟ＤＣのＩＲＸ−２処置は、ナイーブＴ細胞を効果的に刺激する成熟及び活性化ＤＣの成長と一致する形態学上、表現型及び機能上の変化を推進する。
【００１９】
抗原特異的反応性が測定可能な場での限定された抗原ベースの治療上有効ながんワクチンとは対照的に、拒絶抗原がＨ＆ＮＳＣＣで発見されておらず、したがって、ＩＲＸ−２療法後の抗原特異的反応性を測定する能力を限定する。
【００２０】
ＩＲＸ−２は、Ｔリンパ球機能を増大し、新しい未熟Ｔ細胞を産生することを示したが、ＩＲＸ−２が、一旦産生したこれらのＴ細胞のアポトーシスを防止したことの開示及び示唆がなく、したがって決定的実証もなく、そして、抗原提示後のＴ細胞機能が何であるかは公知でなかった。Ｔ細胞のアポトーシスが防止されたことを示した実験結果は存在せず、その作用のメカニズムを示唆する実験結果も存在しなかった。増殖及びアポトーシスは別個の細胞プロセスであり、増殖の原因となる因子が、プログラム細胞死から必然的に防御されると推測することは軽率である。ＩＲＸ−２がＴ細胞の抗腫瘍応答を回復し、それらのアポトーシスを防止する適確なメカニズムは、従来技術に明示的にも内在的にも開示されていなかった。さらに、ＩＲＸ−２は、がん治療の間、上記メカニズムに効果的であると示されたものの、ＩＲＸ−２ががん以外の免疫抑制の他の事例と同じメカニズムを提供したという証拠はない。
【００２１】
個々のサイトカインは、ＤＣ成熟の促進、新規Ｔ細胞の産生、及びそれらのアポトーシス防止を介して、免疫系の各パートを完全に回復できていないだけでなく、複数のサイトカインを含む他の治療法も同様にこれをすることができていない。例えば、ＭＵＬＴＩＫＩＮＥ（登録商標、Ｃｅｌ−Ｓｃｉ）は、腫瘍自体にのみ効果的であり、腫瘍細胞の細胞サイクルに影響を与える。ＰＲＯＶＥＮＧＥ（登録商標、ｓｉｐｕｌｅｕｃｅｉ−Ｔ、Ｄｅｎｄｒｅｏｎ）、ＧＶＡＸ（登録商標、Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｓｙｓ）、ＰＲＯＭＵＮＥ（登録商標、Ｃｏｌｅｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｇｒｏｕｐ）、Ｄｙｎａｖａｘ  ＴＬＲ  ９  ＩＳＳ，ＯＮＣＯＰＨＡＧＥ（登録商標、ｖｉｔｅｓｐｅｎ、Ａｎｔｉｇｅｉｃｓ）、ＣＡＮＶＡＸＩＮ（登録商標、ＣａｎｃｅｒＶａｘ）及びＴＲＯＶＡＸ（登録商標、Ｏｘｆｏｒｄ  ＢｉｏＭｅｄｉｃａ）は、抗原増強、樹状細胞プロセッシング及びいくつかの細胞性アジュバント活性を示すことができている。ＴＲＥＭＥＬＩＭＵＭＡＢ（登録商標、Ｐｆｉｚｅｒ）及びＩＰＩＬＩＭＵＭＡＢ（登録商標、Ｍｅｄａｒｅｘ  ａｎｄ  Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）は、Ｔ制御性細胞集団のみを標的とする。
【００２２】
さらに、いくつかの治療薬は、細胞アポトーシスの問題に対処している。細胞及びリンパ球のアポトーシスを防止するために開発されたいくつかの生物剤及び小分子が存在する。例えば、Ｍａｘｉｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃの国際特許出願公開ＷＯ／２００６／０３９５４５は、細胞障害性Ｔリンパ球及びＮＫ細胞を含む腫瘍殺傷性リンパ球をアポトーシスから防御するために、ＰＡＲＰ−１インヒビター及び付加的な活性酸素代謝物（ＲＯＭ）生成又は放出のインヒビターの投与を開示する。さまざまなサイトカインを含む細胞障害性リンパ球刺激組成物を同時投与することができる。この出願は、食細胞の隣の腫瘍により生成したフリーラジカルが腫瘍殺傷性又は細胞障害性リンパ球の機能不全及びアポトーシスの原因であることを報告する。
【００２３】
Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎの国際特許出願公開ＷＯ／２００５／０５６０４１は、アポトーシスを誘発する治療から患者を防御することの可能な化合物として潜在型ＴＧＦ−βを開示する。この潜在的なＴＧＦ−βは、ＮＦ−κＢ活性を誘発し、したがってアポトーシスを防止する。
【００２４】
Ｆｕｎｄａｃｉｏｎ  ｄｅ  Ｉａ  Ｃｏｍｕｎｉｄａｄ  Ｖａｌｅｎｃｉａｎａの国際特許出願公開ＷＯ／２００７／０６０５２４は、Ａｐａｆ−１のインヒビターであり、したがって、アポトーシスインヒビターとして作用するさまざまな環状化合物を開示する。Ａｐａｆ−１は、アポトソームの一部を作り上げるアポトーシスプロテアーゼ活性化因子である。カスパーゼ−９は、アポトソーム内で活性化され、アポトーシス誘発シグナルを始動する。
【００２５】
アミホスチン（ＥＴＨＹＯＬ、Ｍｅｄｌｍｍｕｎｅ）は、化学療法及び放射線療法から生じる毒性を減ずるために投与される別の化合物である。より特定的には、それは、経静脈有機チオリン酸塩細胞保護剤である。
【００２６】
これらの現在の治療にはいくつかの欠点が存在する。生物剤には、製造に関する困難性、及び、既存の細胞集団を特異的に標的する困難性の問題がある。小分子には、体系的に使用されると毒性の問題があり得る。さらに、単一のメカニズムを有する薬剤は、リンパ球細胞集団内で抗アポトーシス性効果を促進するには複数の活性が必要なため、効能の欠如が見られる。また、これらの治療のどれも、直接には、腫瘍によって作られた免疫抑制性環境に対処していない。したがって、腫瘍誘発抑制を中和する効果的なアジュバントやアプローチが、従来技術には欠けている。
【００２７】
出願人の以前の仕事は、本質的に、ＤＣ成熟及びナイーブＴ細胞の産生、すなわち、免疫系に影響を及ぼすいくつかの特異的レベルに関して一次細胞由来バイオロジックのメカニズムを記載した。本明細書で提案するものは、一次細胞由来バイオロジックの別のレベルの効果の証拠、すなわち、リンパ球の生存の促進である。本明細書のデータは、出願人による従来開示と併せて、一次細胞由来バイオロジックは、特異的エフェクターの産生及び活性化、並びにそれらに後続する生存−各レベルの免疫系（すなわち、各アーム（ａｒｍ）の免疫系）に関する調整的かつ積極的な作用を有することを示す。従来技術の組成物は、これらのレベルの１つのみに向かっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
したがって、エフェクター産生及びエフェクター生存の両方を効果的に増強し、そして免疫系の各アームを標的として、免疫系を回復し、そして免疫抑制に対する完全なメカニズムを提供する組成物が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
本発明は、有効量の一次細胞由来バイオロジックを患者に投与し、免疫形成を誘発し、免疫破壊をブロックし、そして患者の免疫学的効果を増大させる工程を含む、免疫学的効果を増大させる方法を提供する。
【００３０】
本発明は、有効量の一次細胞由来バイオロジックを患者に投与し、免疫形成を誘発し、免疫破壊をブロックし、そして患者の免疫標的を治療する工程を含む、患者の免疫標的を治療する方法を提供する。
【００３１】
本発明は、また、有効量の一次細胞由来バイオロジックを患者に投与し、免疫形成を誘発し、免疫破壊をブロックし、そして患者の腫瘍を治療する工程を含む、患者の腫瘍を治療する方法を提供する。
【００３２】
本発明は、さらに、有効量の一次細胞由来バイオロジックを患者に投与し、免疫形成を誘発し、免疫破壊をブロックし、そして患者の免疫抑制を回避する工程を含む、免疫学的に予防する方法を提供する。
【００３３】
本発明は、また、有効量の一次細胞由来バイオロジックを患者に投与し、免疫形成を誘発し、免疫破壊をブロックし、そして患者の腫瘍エスケープを回避する工程を含む、患者の腫瘍エスケープを回避する方法を提供する。
【００３４】
本発明の他の利点は、以下の詳細な説明を添付の図面と関連して参照することにより容易に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、ＩＲＸ−２プロトコルを表示する。
【００３６】
【図２】図２は、化学阻害剤及びＮＳＡＩＤと組み合わせたＩＲＸ−２のメカニズムの説明である。
【００３７】
【図３】図３は、ＩＲＸ−２のメカニズムの説明である。
【００３８】
【図４】図４Ａは、フロー・サイトメトリーでアネキシンＶ結合を分析したＣＤ８＋ジャーカット細胞を示し、図４Ｂは、ＦＩＴＣ−ＶＡＤ−ＦＭＫ染色及びフロー・サイトメトリーで検出したカスパーゼ活性を示し、図４Ｃは、後に各種アポトーシス誘発剤を用いてインキュベーションするアネキシンＶ陽性／７−ＡＡＤ陰性ジャーカット細胞の平均％＋／−標準偏差（ＳＤ）を示し、そして、図４Ｄは、後に各種アポトーシス誘発剤を用いてインキュベーションするＦＩＴＣ−ＶＡＤ−ＦＭＫ＋ジャーカットＴ細胞の平均％＋／−ＳＤを示す。
【００３９】
【図５】図５Ａは、ＣＤ８＋ジャーカット細胞の時間経過解析を示す、図５Ｂは、濃度経過解析を示す。
【００４０】
【図６】図６は、ＣＤ８＋ジャーカット細胞のさまざまな治療のためのＦＩＴＣ−ＶＡＤ−ＦＭＫ陽性細胞の割合（％）のグラフを示す。
【００４１】
【図７】図は、ＩＲＸ−２又はサイトカインを用いた治療と腫瘍−微細小胞（ＭＶ）を用いたインキュベーション後のジャーカットＣＤ８＋におけるカスパーゼ−活性のグラフである。
【００４２】
【図８】図８Ａは、ヒト末梢血プレ活性化ＣＤ４＋細胞のグラフであり、図８Ｂはで腫瘍ＭＶ（１５μｇ）処置し、そして指示されたサイトカイン又はＩＲＸ−２でプレ処置たヒト末梢血プレ活性化ＣＤ８＋細胞のグラフである。
【００４３】
【図９】図９Ａは、活性化ヒト末梢血プレ活性化ＣＤ４＋細胞のグラフであり、図９Ｂは、ＣＨ−１１  Ａｂ（４００ｎｇ／ｍＬ）で処置し、続いて指示されたサイトカイン又はＩＲＸ−２でプレ処置したヒト末梢血プレ活性化ＣＤ８＋細胞のグラフである。
【００４４】
【図１０】図１０Ａは、ＣＤ８＋ジャーカット細胞におけるカスパーゼ−３及び７の活性をフロー・サイトメトリーによりカスパーゼ３／７−ＦＡＭ結合について評価し、図１０Ｂは、ＣＤ８＋ジャーカット細胞におけるカスパーゼ−３活性を示すウエスタン免疫ブロットを示す。
【００４５】
【図１１】図１１Ａは、ＣＤ８＋ジャーカット細胞をフロー・サイトメトリーでカチオン染料ＪＣ−１の赤色蛍光の減少（ＭＭＰの低下を示す）について分析し、図１１Ｂは、ＪＣ−１  ｒｅｄ陰性細胞の割合（％）のグラフを示す。
【００４６】
【図１２】図１２Ａは、ＣＤ８＋ジャーカット細胞の蛍光顕微鏡検査であり、それは、未処置（ａ）、ＩＲＸ−２単独に用いた２４時間のインキュベーション（ｂ）、ＭＶ単独の２４時間（ｃ）、又はＩＲＸ−２を用いた２４時間のプレインキュベーションと、続くＭＶで２４時間処置（ｄ）、並びにその後、ＴＵＮＥＬ法で染色して、アポトーシスの指標であるＤＮＡストランド切断（赤核）を露わにする、並びに図１５Ｂは、上記共培養におけるＴＵＮＥＬ陽性ＣＤ８＋ジャーカット細胞の割合（％）のグラフである。
【００４７】
【図１３】図１３は、さまざまな処置でのＣＤ８＋ジャーカット細胞のウエスタンブロットを示す。
【００４８】
【図１４】図１４Ａは、ＩＲＸ−２を用いたプレ処置が、プロ−及び抗アポトーシス性タンパク質の比におけるＭＶ誘発変化を逆行させ、図１４ＢはＩＲＸ−２処置がプロ−及び抗アポトーシス性タンパク質の発現を調節することを示す代表的トッドプロット及び対応のヒストグラムを示す。
【００４９】
【図１５】図１５Ａは、さまざまな処置でのＣＤ８＋ジャーカット細胞のウエスタンブロットであり、図１５Ｂは、ＦＩＴＣ−ＶＡＤ−ＦＭＫ陽性細胞の割合（％）のグラフである。
【００５０】
【図１６】図１６は、ＩＲＸ−２の場合のｉｎ  ｖｉｖｏ投与応答のグラフである。
【００５１】
【図１７】図１７は、４群の患者における生存率の割合（％）のグラフである。
【００５２】
【図１８】図１８は、４群の患者におけるリンパ球浸潤のメジアン％のグラフである。
【００５３】
【図１９】図１９は、リンパ球のＨ＆Ｅ染色写真である。
【００５４】
【図２０】図２０は、リンパ球浸潤のＨ＆Ｅ染色写真である。
【００５５】
【図２１】図２１は、応答者（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒｓ）におけるリンパ性浸潤密度のグラフであり、図２１Ｂは、非応答者（ｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒｓ）におけるリンパ性浸潤密度のグラフである。
【００５６】
【図２２】図２２は、腫瘍内（ＩＮＴＲＡ）／腫瘍周囲（ＰＥＲＩ）のリンパ球浸潤場所のグラフである。
【００５７】
【図２３】図２３は、ＣＤ４５ＲＯ＋記憶Ｔ細胞のＩＨＣ染色写真である。
【００５８】
【図２４】図２４は、０日及び２１日目の融合ＦＤＧ  ＰＥＴ／ＣＴスキャン写真である。
【００５９】
【図２６】図２６は、ステージＩＶａ患者の全生存率のグラフである。
【００６０】
【図２７】図２７Ａは、節サイズのグラフであり、図２７ＢはＴ細胞領域のグラフであり、図２７Ｃは、洞組織球症のグラフであり、図２７Ｄは、Ｔ細胞密度をコントロール、Ｈ＆ＮＳＣＣコントロール及びＩＲＸ−２投与Ｈ＆ＮＳＣＣ患者で比べたグラフである。
【００６１】
【図２８】図２８Ａは、洞組織球症をもつ頭頸部がん患者の典型的リンパ節のＨ＆Ｅ染色写真であり、図２８Ｂは、洞組織球症をもつ頭頸部がん患者の典型的リンパ節のＨ＆Ｅ及びＣＤ６８染色の写真であり、図２８Ｃは、洞組織球症をもつ頭頸部がん患者における赤血球うっ血（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  ｃｏｎｇｅｓｔｉｏｎ）したリンパ節Ｈ＆Ｅ染色の写真であり、図２８Ｄは、ＩＲＸ−２処置はリンパ節内の活性化樹状細胞数を増加させることを示すグラフである。
【００６２】
【図２９】図２９Ａ−Ｃは、頭頸部がん患者の腫瘍サンプルのＨ＆Ｅ染色の写真であり、リンパ球浸潤の欠如を示している。
【００６３】
図２９Ｄ−Ｆは、ＩＲＸ−２処置後の頭頸部がん患者の腫瘍検体のＨ＆Ｅ染色写真であり、リンパ球浸潤の欠如を示している。
【００６４】
【図３０】図３０は、応答者及び非応答者における繊維化及び壊死のグラフである。
【００６５】
【図３１】図３１Ａは、腫瘍断片化の写真であり、図３１Ｂはリンパ球浸潤の写真であり、図３１Ｃ−ＤはキラーＴ細胞の写真である。
【００６６】
【図３２】図３２は、アップ・レギュレーティングキー活性化レセプターにより樹状細胞機能を回復するＩＲＸ−２のメカニズムの表示である。
【００６７】
【図３３】図３３Ａは、ＩＲＸ−２による抗原提示（ＨＬＡ−ＤＲ）増大のグラフであり、図３３Ｂは、ＩＲＸ−２による同時刺激増大（ＣＤ８６）のグラフである。
【００６８】
【図３４】図３４Ａは、ＩＲＸ−２によるＣＤ４０アップ・レギュレーションのグラフであり、図３４Ｂは、ＩＲＸ−２によるＣＤ５４のアップ・レギュレーションのグラフである。
【００６９】
【図３５】図３５は、ＩＲＸ−２を用いたＣＤ８３発現のグラフである。
【００７０】
【図３６】図３６は、ＩＲＸ−２処置後の、樹状細胞媒介Ｔ細胞刺激のグラフである。
【００７１】
【図３７】図３７Ａは、遅延型過敏性のグラフであり、図３７ＢはＩＲＸ−２を用いたＩＦＮ−γ増大のグラフである。
【００７２】
【図３８】図３８は、処置間で比べた遅延型過敏性のグラフである。
【００７３】
【図３９】図３９は、末梢循環における免疫性細胞の作用の証拠を示す。
【００７４】
【図４０】図４０は、ＩＲＸ−２処置でのＴ  ｒｅｇカウントのグラフである。
【００７５】
【図４１】図４１Ａは、ＩＲＸ−２でプレ処置した腫瘍の写真であり、図４１ＢはＩＲＸ−２でポスト処置した腫瘍の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００７６】
本発明は、全般的に、腫瘍及び免疫系全般の両方に関するＩＲＸ−２のメカニズムへの適用に向けられ、そして、一次細胞由来バイオロジックの投与により免疫標的を治療する方法を提供する。一次細胞由来バイオロジックは、以下に説明するとおり、免疫応答不能を逆行させ、そして免疫応答を強化することにより、免疫標的の免疫拒絶（ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）を作りだす。
【００７７】
とりわけ、本発明の一次細胞バイオロジックは、免疫系（細胞性及び液性）の各アームに影響を及ぼし、そして、それをすることによって、一次細胞由来バイオロジックは、免疫系を効果的に強化することができる。一次細胞由来バイオロジックは、免疫形成の誘発と、免疫破壊のブロックの両方を行い、その結果として、正味のポジティブな免疫効果が存在する。すなわち、免疫破壊の効果が逆行されるだけでなく、その逆行にもかかわらず免疫形成が増大する。したがって、免疫系は、液性及び／又は細胞性応答が存在した場合や、免疫破壊の抑制だけが減少した場合よりもさらに大きな段階まで強化される。免疫系のすべての側面は、図３に示すとおり、一次細胞由来バイオロジックの投与により影響を受け、それは、樹状細胞成熟、ナイーブＴ細胞産生、効果的抗原提示、アポトーシス防止、及びリンパ球による腫瘍浸潤を含む。一次細胞由来バイオロジックが免疫系のすべての側面に影響することは、免疫系の一側面にのみ向かう以前の療法と異ならせ、かつより効果的にする。
【００７８】
一次細胞由来バイオロジックは、言葉の古典的意味において「ワクチン」ではないが、それは、ワクチンのように一定の機能をする。古典的なワクチンは、免疫応答を起こし得る免疫系を「オンする」のに使用され、伝統的に予防設定においてのみ効果的であった。しかし、一次細胞由来バイオロジックは、免疫応答を起こす能力のない免疫系を逆行させ、すなわち、免疫標的や他の療法（例えば放射線、化学療法）が免疫応答を起こす能力を無くさせているものを、このインコンピーテンスを逆行させる。すなわち、一次細胞由来バイオロジックは、免疫応答不能患者を免疫応答可能にすることができる。これは、がんや慢性ウイルス性感染症のような免疫標的を治療する際に重要な工程である。
【００７９】
定義
本明細書で使用する用語「免疫標的」は、ホストの患者に抗原性を示すことができ、そして患者を苦しめるすべての抗原性の発生源又は実体を意味する。一般に、そのような標的（免疫原性病原体、腫瘍など）は、免疫応答を起こし得る患者において免疫応答を誘発したであろう表面抗原を見せる。さらに、外因性抗原は、免疫応答を起こし得る患者において免疫攻撃を受けやすい他の非免疫原性免疫標的の原因となり得る。特に本発明に関して、免疫標的は、免疫系がなんらかの原因から免疫応答不能のために非応答性である免疫原性又は潜在的免疫原性である。本発明において、免疫標的は、免疫抑制を逆行させ、免疫系を機能するように回復する一次細胞由来バイオロジックにより免疫応答を起こし得るようにされた免疫系により「標的される」。
【００８０】
免疫応答不能（ｉｍｍｕｎｅ  ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ）は、免疫系の成分の遺伝学的欠陥によって起こり得る（内在性又は一次免疫欠陥）。免疫抑制は、また、外部要因により起こり得る（二次免疫欠陥）。例えば、ＡＩＤＳやＨＩＶのような疾患、放射線（放射線療法）、化学療法、栄養失調、熱傷、感染症及びがん（腫瘍）が免疫抑制をほう起する。
【００８１】
本明細書で使用する「アポトーシス」は、細胞死を意味する。上記したように、アポトーシス（ＴｙｐｅＩ細胞死）は、ストレス、感染やＤＮＡ傷害のようなさまざまな理由で起きるプログラム細胞死の一形態である。リンパ球のアポトーシスは、がん関連療法（化学療法、放射線）及びアポトーシス誘発因子を作る腫瘍自体のような（ただし限定されない）さまざまな現象により誘発され得る。
【００８２】
本明細書で使用する「有効量」は、本発明の所望する結果を達成する、すなわち、リンパ球や他の造血性成分をアポトーシスから防御し、免疫標的を攻撃する免疫系を活性化するのにも必要な一次細胞由来バイオロジックの量を意味する。当業者は、特定の患者に与えるべき一次細胞由来バイオロジックの有効量を決定することができる。
【００８３】
本明細書で使用する「免疫学的効果を増大させる」は、免疫応答不能（ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）な免疫系を、免疫応答可能（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）な免疫系に変化させるプロセスを意味する。免疫系の単一成分の機能が、免疫応答を起こす能力のないから免疫応答を起こし得るに逆行され、好ましくは、複数の成分の機能は、免疫応答不能から免疫応答可能に反転される。したがって、免疫系が免疫標的に対して持つ効果は増大する。免疫応答を起こし得る免疫系は、腫瘍及び他の免疫標的を効果的に破壊することを必要とする。免疫の構築が存在するようにオンするだけでなく、ブレイクダウンを防止する。
【００８４】
本明細書で使用する「リンパ球」は、免疫系内で存在する白血球細胞を意味し、そして大顆粒リンパ球（ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）並びに小顆粒リンパ球（Ｔ細胞及びＢ細胞）を含む。
【００８５】
本明細書で使用する「一次細胞由来バイオロジック」は、サイトカイン、好ましくは天然及び非組換サイトカイン、また、以前から公知の天然サイトカイン混合物（ＮＣＭ）の組み合わせである。好ましくは、一次細胞由来バイオロジックは、以下に記載するようなＩＲＸ−２（サイトプルリキン、ｃｉｔｏｐｌｕｒｉｋｉｎ）であり、二つの用語が、この出願を通して意図される意味から逸脱せずに互換可能に使用し得る。
【００８６】
「サイトプルリキン」としても公知の「ＩＲＸ−２」は、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）及びシプロフロキサシン（ＣＩＰＲＯ）により刺激された精製ヒト白血球細胞（単核細胞）により作られる白血球由来の天然一次細胞由来バイオロジックである。主要な活性成分は、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、及びγ−インターフェロン（ＩＦＮ−γ）である。好ましくは、本発明で使用するＩＲＸ−２は、これらの６つの重要なサイトカインを含む。ＩＲＸ−２は、また、以前に、米国特許第６，９７７，０７２及び７，１５３，４９９で定義及び開示される「ＮＣＭ」（天然サイトカイン混合物）として呼ばれている。
【００８７】
簡略的には、ＩＲＸ−２は、４−アミノキノン抗生物質の持続的存在下、及び、ミトーゲン（好ましい実施態様ではＰＨＡである）の持続的又はパルス化した存在とともに調製される。しかし、他のミトーゲンもまた使用可能である。患者への投与のために作製されるＩＲＸ−２は、６０〜６，０００ｐｃｇ／ｍＬ、より好ましくは１５０〜１，８００ｐｃｇ／ｍＬの範囲にある濃度のＩＬ−１β、６００〜６０，０００ｐｃｇ／ｍＬ、より好ましくは３，０００〜１２，０００ｐｃｇ／ｍＬの範囲にある濃度のＩＬ−２、並びに２００〜２０，０００ｐｃｇ／ｍＬ、より好ましくは１，０００〜４，０００ｐｃｇ／ｍＬの範囲の濃度のＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αを含有する。
【００８８】
ＩＲＸ−２は、また、６０〜６，０００ｐｃｇ／ｍＬ、より好ましくは３００〜２，０００ｐｃｇ／ｍＬの範囲にある濃度の濃度ＩＬ−６、６０００〜６００，０００ｐｃｇ／ｍＬ、より好ましくは２０，０００〜１８０，０００ｐｃｇ／ｍＬの範囲にある濃度のＩＬ−８、２００〜２０，０００ｐｃｇ／ｍｌ、より好ましくは１，０００〜４，０００ｐｃｇ／ｍＬの範囲にあるＴＮＦ−αを含有する。組換体、天然又はペグ化サイトカインを使用でき、あるいはＩＲＸ−２は組換体、天然又はペグ化したサイトカインの混合物を含み得る。本発明のＩＲＸ−２は、さらに、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ（濃度は、１００〜１０，０００ｐｃｇ／ｍＬ、より好ましくは５００−２，０００ｐｃｇ／ｍＬの範囲にある）及びＧ−ＣＳＦのような他の組換体、天然又はペグ化したサイトカインを含み得る。ＩＲＸ−２の作製方法は、上記した特許及び米国仮出願第６１／０４４，６７４に開示される。
【００８９】
化学阻害剤、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）、亜鉛及びこれらの組み合わせのような他の化合物もまた、ＩＲＸ−２とともに投与できる。化学阻害剤は、免疫及び／又は免疫応答を増大する、例えば好ましくは免疫抑制又は抑制因子のメカニズムを体内において抑制するように免疫修飾効果を有するすべての化学療法剤（好ましくは低用量で使用）であり得る。好ましい実施態様によれば、化学阻害剤は、アルキル化剤、代謝拮抗薬及び抗生物質をはじめてとする（しかし、限定されない）抗悪性腫瘍薬である。化学阻害剤は、また、サリドマイドのような免疫調節剤であり得る。化学阻害剤は、塩又は他の複合体の形態であり得る。好ましくは、化学阻害剤は、アルキル化剤シクロホスファミド（ＣＹ）である。ＮＳＡＩＤは、好ましくはインドメタシン（ＩＮＤＯ）であり、これは、ＣｏｘＩ及びＣｏｘＩＩインヒビターの両方である。ＮＳＡＩＤは、また、イブプロフェンや、セレコキシブ及びロフェコキシブのようなＣｏｘＩＩインヒビター又はこれらの組み合わせであり得る。共に使用する４つの成分（すなわち、化学阻害剤、ＮＳＡＩＤ、一次細胞由来バイオロジック及び亜鉛）は、免疫標的によって作られる抑制型環境に取り組んで、患者の細胞性免疫応答を回復することができる。とりわけ、図２に示されるように、化学阻害剤はＴ制御性細胞を抑制し、ＮＳＡＩＤはプロスタグランジンによる局所的免疫抑制を逆行させ、一次細胞由来バイオロジックは樹状細胞を活性化し、Ｔ細胞を刺激し、そしてＴ細胞をアポトーシスから防御し、亜鉛はＴ細胞機能のためのキー栄養素を提供する。この連合した作用は、内因性及び外因性の両抗原への免疫応答を鼓舞する。
【００９０】
本明細書で使用する「腫瘍エスケープ」は、腫瘍がホストの免疫系から逃れるすべてのメカニズムを意味する。
一次細胞由来バイオロジックの全体メカニズム
【００９１】
本発明は、有効量の一次細胞由来バイオロジックを投与し、免疫形成を誘発し、免疫破壊をブロックし、そして免疫学的効果を増大させる工程を含む、免疫学的効果を増大させる方法に向けられる。
免疫形成
【００９２】
免疫形成は、未熟樹状細胞を成熟化することにより誘発され、得られる成熟樹状細胞は、ナイーブＴ細胞を活性化し、血液中のＢ及びＴ細胞の集団を改変（ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ）し、領域リンパ節を活性化し、免疫標的に隣接する領域へＴヘルパー細胞及びＢ細胞を浸潤させ、そして、免疫標的をＴキラー細胞及びマクロファージで浸潤させる。
【００９３】
一次細胞由来バイオロジックは、樹状細胞の成熟をほう起させ、そして、米国特許第６，９７７，０７２及び７，１５３，４９９に記載されるようにナイーブＴ細胞産生を誘発する。成熟樹状細胞は、次いで、ナイーブ及び記憶Ｔ細胞へ抗原を提示し、それらを活性化することができる。
【００９４】
Ｂ及びＴ細胞の集団は、ＩＲＸ−２投与が原因でアップ・レギュレート又はダウン・レギュレート、すなわち、改変される。改変される血液内Ｂ及びＴ細胞集団は、とりわけ、ナイーブＴ細胞及びアーリー（ｅａｒｌｙ）記憶Ｔ細胞の集団である。改変されるナイーブＴ細胞の集団は、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋である。これは、ナイーブＴ細胞を記憶及びエフェクターＴ細胞へ分化することにより達成されるが、これは時間依存性プロセスである。セントラル（ｃｅｎｔｒａｌ）記憶Ｔ細胞は、また、血流から出させられ、流入リンパ節に遊走する。すなわち、ナイーブＴ細胞のレベルの改変は、免疫標的を効果的に攻撃することのできるより進歩した形態のＴ細胞にナイーブＴ細胞が分化することの結果である。血液中のＢ細胞集団もまた、改変され、なぜなら、Ｂ細胞はリンパ節へ動員され、抗原へ曝され、免疫標的へ遊走し、そして免疫標的を攻撃するからである。とりわけ、Ｂ細胞は、抗体を作製し及び／又は抗体依存性細胞障害活性をサポートすることにより、免疫標的を攻撃する。
【００９５】
領域リンパ節は、それらの拡大、リンパ球の補給、及び洞組織球症を逆行することによって証明されるように、活性化される。免疫標的に対する抗原免疫化は領域リンパ節内で起きる。
【００９６】
免疫標的に隣接する領域の浸潤は、主に、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ３＋、及びＣＤ４＋Ｔリンパ球並びにＣＤ２０＋Ｂリンパ球による。免疫標的に隣接する領域は、免疫標的自体の表面から、表面からの一定距離までの範囲にわたる。免疫標的自体の浸潤、すなわち、免疫標的内に直接に浸潤することは、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ３＋、及びＣＤ８＋リンパ球（すなわちキラーＴ細胞）並びにＣＤ６８＋マクロファージとともに起きる。各浸潤プロセスは、液性（抗体により媒介される）と細胞性（細胞により媒介される）免疫を作ることに寄与する。
免疫破壊のブロック
【００９７】
免疫破壊は、活性化Ｔ細胞をアポトーシスから防御することによってブロックされる。腫瘍エスケープのメカニズムの１つには、腫瘍由来微細小胞（ＭＶ）により媒介されたアポトーシスを介したＣＤ８＋エフェクターＴ細胞を標的とした排除が関係する。免疫抑制性ＭＶは、がん患者から得た腫瘍性病変、血清、腹水及び胸水内に見いだされており、そして、これらの患者内のエフェクターＴ細胞のアポトーシス及びＴＣＲ変質とつながっている。ＭＶが駆動するエフェクターＴ細胞の排除（これは、抗腫瘍のホスト防御にとって必要である）は、腫瘍エスケープとがん進行に寄与する。したがって、抗腫瘍エフェクター細胞の機能不全及び死からの防御は、免疫療法の主要な目的である。臨床及び実験データは、一定のサイトカイン、特に共通のレセプターＹ鎖を用いる生存性サイトカインは活性化Ｔ細胞を腫瘍誘発死から防御し、そしてそれらの抗腫瘍活性を増強することができることを示す。
【００９８】
とりわけ、ＩＲＸ−２がＴ細胞をアポトーシスから防御するのにいくつかの方法が存在する。抗アポトーシス性シグナル分子（すなわち、ＪＡＫ−３及びホスホ（ｐｈｏｓｐｈｏｒ）−Ａｋｔ）発現がアップ・レギュレートされ、そして、アポトーシス促進性分子（すなわち、ＳＯＣＳ−２）発現がダウン・レギュレートされる。ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔリンパ球におけるカスパーゼ活性化が減少し、ｃＦＬＩＰ発現が増大する。ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ生存系路の抑制は、ＩＲＸ−２により防がれる。Ｔ細胞は、外因性アポトーシス（ＭＶ誘発及びＦａｓＬ誘発アポトーシス）並びに内在性代謝性（細胞性ストレス又はＤＮＡ傷害関連）アポトーシスの両方から防御される。
【００９９】
外因性ＭＶ誘発アポトーシスからの防御は、さらに、ＪＡＫ３、ＣＤ３−ζ、及びＳＴＡＴ５のダウン・レギュレーションを防止すること、Ａｋｔ−１／２の脱リン酸化を抑制すること、並びにＢａｘ／Ｂｃｌ−２、Ｂａｘ−Ｂｃｌ−ｘＬ及びＢｉｍ／Ｍｃｌ−１のバランスのよい比率を維持することにより達成される。ＭＶ誘発アポトーシスからの防御は、また、カスパーゼ−３及びカスパーゼ−７の活性の誘発防止により達成される。とりわけ、カスパーゼ−３の活性開裂形態の誘発が、ミトコンドリア膜電位の低下のとおり、防御される。核ＤＮＡ断片化は抑制される。ＩＲＸ−２による内因性アポトーシスからの防御は、活性化Ｔ細胞のスタウロスポリン誘発アポトーシスからの防御によって示される。
【０１００】
重要なことは、ＩＲＸ−２のサイトカインが、活性化Ｔ細胞をアポトーシスから相乗的に防御する。すなわち、ＩＲＸ−２におけるサイトカインの組み合わせが、個々のサイトカインを単独に投与するときに見られるよりも大きな影響を作る。
【０１０１】
投与される一次細胞由来バイオロジック、すなわち、ＩＲＸ−２は、好ましくは上記したとおりである。化学阻害剤、低用量のシクロホスファミドは、好ましくはＩＲＸ−２の投与前に投与され、これは、制御性Ｔ細胞リンパ球による抑制を逆行させる。ＮＳＡＩＤ（好ましくはインドメタシン）及び亜鉛は、また、ＩＲＸ−２レジメンの間、連日投与することができる。さらに、ＩＲＸ−２の用法を以下に記載する。
【０１０２】
免疫形成を誘発すること及び免疫破壊をブロックすることは、本質的に、以前は免疫応答を起こす能力のなかった患者の免疫系の細胞性及び液性のアームを回復及び強化する。これは、上記したようにナイーブＴ細胞集団を回復する、Ｔ及びＢ細胞を活性化する、白血球の免疫標的内及び近くへの浸潤を促進する、そして免疫応答の期間を伸長することにより達成される。免疫形成を誘発し、そして免疫破壊をブロックするこれらの工程は、ともに、免疫学的効果の増大の証拠となり、なぜなら、免疫系の各アームが、免疫応答を起こす能力のないから免疫応答を起こし得るに変化し、したがって、免疫標的が効果的に攻撃及び破壊されるからである。
【０１０３】
抑制された免疫系又は免疫応答不能を有する患者は、ＩＲＸ−２処置から恩恵を受け、彼らの免疫系を正常又は高レベルの機能まで回復してもらい、すなわち、彼らは免疫応答不能の逆行及び免疫学的効果の増大を有する。例えば、腫瘍及び他の免疫標的は、その免疫標的を攻撃する必要があるさまざまな免疫成分をダウン・レギュレートする傾向がある。免疫標的は、免疫系による有効な攻撃を回避する防備を有する。さらに、免疫抑制された患者の樹状細胞は、Ｔ及びＢ細胞を免疫標的の存在に寛容になるように誘発することができる。しかし、一旦、免疫系は抑圧から解除され、そして、免疫応答不能から免疫応答可能に転換すると、これらの免疫標的は攻撃を受けやすい。ＩＲＸ−２は、免疫標的に対して樹状細胞の成熟を誘発することによって、免疫寛容を壊し、成熟樹状細胞により活性化されるナイーブＴ細胞の産生を奨励し、抑制を圧倒し、Ｔ細胞アポトーシスを回避する。このようにして、ＩＲＸ−２は、免疫標的の防御作用のすべてに打ち勝つために上記した免疫系のアームのそれぞれを活性化する。
他の実施態様
【０１０４】
本発明の方法のそれぞれにおいて、限定されない手術、放射線療法、化学療法又はこれらの組み合わせのような療法をさらに増強するためにＩＲＸ−２投与と組み合わせてさまざまな他の手順を実行することができる。例えば、放射線療法又は化学療法（細胞破壊的プロセス）前のＩＲＸ−２投与は、これらのプロセスの結果を改善し、なぜなら、ＩＲＸ−２が、Ｔリンパ球をアポトーシスから防御することにより細胞防御として働くからである。
【０１０５】
本発明は、また、有効量の一次細胞由来バイオロジックを投与し、免疫形成を誘発し、免疫破壊をブロックし、そしてを免疫標的を治療する工程を含む、免疫標的を治療する方法を提供する。これらの工程は、免疫標的の免疫拒絶の証拠を作る。すなわち、免疫防御を誘発すること、及び免疫破壊をブロックすることは、免役標的は破壊されねばならないと免疫系が認識している証拠であるとともに、免疫系は正常に（又は以前の疾患又は免疫抑圧状態よりも高レベルに）機能するように回復されている証拠である。
【０１０６】
本発明は、有効量の一次細胞由来バイオロジックを投与し、上記したように免疫形成を誘発し、免疫破壊をブロックし、そして腫瘍を治療する工程を含む、腫瘍の治療方法を提供する。とりわけ、腫瘍を治療する方法は、血液中のＢ及びＴ細胞の集団を改変し、領域リンパ節を活性化し、腫瘍をＴヘルパー及びＢ細胞で腫瘍周囲浸潤し、腫瘍をキラーＴ細胞及びマクロファージで腫瘍内浸潤し、そして、腫瘍を治療することにより達成される。キラーＴ細胞は、未熟樹状細胞を成熟化し、ナイーブＴ細胞を活性化し、得られる成熟樹状細胞がナイーブＴ細胞を刺激し、そして、ナイーブＴ細胞をキラーＴ細胞へ分化することにより作成される。本明細書で証明されるとおり、ナイーブＴ細胞は、今般、キラーＴ細胞へ分化し、そして、腫瘍が治療及び破壊されるよう腫瘍に向けられる。これらの各工程は、上記したとおりである。以下の実施例で腫瘍の軟化、腫瘍が引き起こす痛みの減少、腫瘍サイズの減少、腫瘍断片化、腫瘍壊死、及び腫瘍繊維化により証明されるとおり、ＩＲＸ−２がさまざまなステージのがんの腫瘍を治療することが示される。本質的に、免疫の細胞性及び液性のアームの抑圧を解除しそして強化し、その結果、腫瘍が効果的に治療及びがん撲滅され、すなわち、患者から完全に排除される。
【０１０７】
本発明は、有効量の一次細胞由来バイオロジックを投与し、上記したように、免疫形成を誘発し、免疫破壊をブロックし、そして免疫抑制を防止する工程を含む、免疫学的に予防する方法を提供する。免疫学的予防は、免疫系が抑圧されることからの回避である。一次細胞由来バイオロジックは、特に未熟樹状細胞を成熟化し、ナイーブＴ細胞を活性化し、得られる成熟樹状細胞がナイーブＴ細胞を活性化し、活性化ナイーブＴ細胞をアポトーシスから防御（特に化学療法又は放射線療法を行う前に投与するとき）し、ナイーブＴ細胞を記憶及びエフェクターＴ細胞へ分化し、領域リンパ節を活性化して、免疫系が抑圧されないようにすることにより、免疫系のすべてのパーツを活発に作動させる。これらの各工程は上記したとおりである。もし、患者が生物学的因子のせいで免疫抑制になりやすいなら、この患者に予防的にＩＲＸ−２を与えて、それらの免疫系が低下するのを回避する。例えば、患者が、がんの進行を促す一定の遺伝学的因子を有するならば、ＩＲＸ−２を投与して、がんなどの免疫標的が出現したときに免疫系が免疫標的を攻撃する準備をするようになる。
【０１０８】
本発明は、さらに、有効量の一次細胞由来バイオロジックを投与し、上記したように、免疫形成を誘発し、免疫破壊をブロックし、そして腫瘍エスケープを防止する工程を含む、腫瘍エスケープを防止する方法を提供する。とりわけ、腫瘍エスケープは、血液中のＢ及びＴ細胞の集団を改変し、領域リンパ節を活性化し、腫瘍をＴヘルパー及びＢ細胞で腫瘍周囲浸潤し、腫瘍をキラーＴ細胞及びマクロファージで腫瘍内浸潤することで腫瘍の免疫後退を作ることにより防止される。こららの各工程は、上記したとおりである。多くの腫瘍は、免疫抑制性シグナルを現すことで免疫応答に抵抗する。免疫系は、ＩＲＸ−２により抑制が解除され、腫瘍エスケープとそれに続く転移が防止される。重要なことは、以下の実施例での患者は、ＩＲＸ−２処置後には、腫瘍再発の減少又は遅延を経験し、これは、ＩＲＸ−２が腫瘍エスケープを防止することを示している。
【０１０９】
本発明は、有効量の一次細胞由来バイオロジック（ＩＲＸ−２）を投与し、そして、活性化Ｔ細胞をアポトーシスから防御する工程を含む、活性化Ｔ細胞をアポトーシスから防御する方法を提供する。本質的には、活性化Ｔ細胞をアポトーシスから防御する方法は、それらの抗腫瘍活性を増強し、なぜなら、Ｔ細胞は、より長く生き、その必要な機能を実行するからである。
【０１１０】
本発明は、また、有効量の一次細胞由来バイオロジックを投与し、ナイーブＴ細胞の産生を刺激し、ナイーブＴ細胞を活性化し、活性化Ｔ細胞をアポトーシスから防御し、そして、Ｔ細胞の抗腫瘍活性を増強する工程を含む、Ｔ細胞の抗腫瘍活性を増強する方法を提供する。ナイーブＴ細胞は、米国特許第６，９７７，０７２及び７，１５３，４９９に開示されるとおり、ＩＲＸ−２の投与に応答して作製される。これらのナイーブＴ細胞は、腫瘍抗原の提示を介して活性になり、そして成熟する。本発明によれば、ＩＲＸ−２は、今般、これらの活性化Ｔ細胞をアポトーシスから防御することが可能である。この防御は、上記したとおりに達成される。
【０１１１】
本発明は、扁平細胞頭頸部がん（Ｈ＆ＮＳＣＣ）、肺がん、腎細胞がん、乳癌、結直腸がん（ただしこれらに限定されない）のようながんを患っているがん患者のアポトーシスを回避するのに有益である。さらに、本発明は、ヘルパーＴ細胞のアポトーシス防止することによりＨＩＶ患者の免疫抑制を防止及び／又は逆行させるのに使用可能である。
【０１１２】
本発明は、また、有効量の一次細胞由来バイオロジック（ＩＲＸ−２）を投与し、そして、リンパ球の寿命を延ばす工程を含む、リンパ球の寿命を延ばす方法を提供する。ＩＲＸ−２によって影響を受けるリンパ球は、好ましくはＴ細胞である。ＩＲＸ−２は、さらに、Ｂ細胞及び造血集団（樹状細胞、単球及び骨髄性細胞）のようなアポトーシスの影響を受ける他の細胞の寿命を延ばすことが可能である。ＩＲＸ−２は、Ｔ細胞を別の死から防止し、こうして、その寿命を延ばし、そして、それに例えば細胞溶解活性やＴヘルパー活性がプログラムされる抗腫瘍効果を獲得しかつ発揮させる。すなわち、ＩＲＸ−２は、Ｔ細胞のアポトーシスを防止し、こうしてＴ細胞の寿命を延ばす。
【０１１３】
本発明は、また、有効量の一次細胞由来バイオロジック（ＩＲＸ−２）を投与し、Ｔ細胞の細胞防御的効果を作り、そして、放射線療法、化学療法及びこれらの組み合わせなど（ただしこれらに限定されない）のがん療法を実行する工程を含む、細胞防御的がん療法を提供する。通常、放射線及び化学療法などのがん療法は、Ｔ細胞のアポトーシスを誘発することにより免疫を抑圧し、すなわち、それらは、細胞破壊的である。本発明は、細胞破壊的作用を妨げ、免疫機能を保全し及び／又は治療後の回復を促進する。
【０１１４】
本発明にはアポトーシスに関していくつかの利点が存在する。まず、本発明で使用する一次細胞由来バイオロジックは、確固したかつ一貫したやりかたで製造される詳細に明らかにされたバイオロジック（ＩＲＸ−２）である。これは、以前に開示されたＴ細胞をアポトーシスから防御することができるがしかし確固として製造されない従来技術の化合物と異なる。さらに、本発明で使用する一次細胞由来バイオロジック中のサイトカインは、以下の実施例で証明されるように、複数の細胞型の免疫系に相乗的に作用し、単一の組換体サイトカインを用いて同等の結果を達成するのに必要とされるよりもはるかに低用量にて対等の免疫応答を生ずる。
【０１１５】
以下の実施例に示されるように、ＩＲＸ−２は、腫瘍由来ＭＶによって媒介されるアポトーシスからＴ細胞を防御することが可能であることが測定された。ＩＬ−２のようなＩＲＸ−２に存在するいくつかのサイトカインは、抗アポトーシス性作用を有することが知られている。したがって、ＩＲＸ−２がＴ細胞に対して促進作用とともに防御作用を有するかどうか評価することは妥当であった。Ｔ細胞の生存強化及び機能促進の複合効果は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＩＲＸ−２の明らかな相乗作用の基礎をなす。以前に確立されたｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルの腫瘍誘発アポトーシスを用いて、ＩＲＸ−２が生存系路の活性化を通してＴ細胞に腫瘍由来ＭＶによって媒介されるアポトーシスから強い防御を提供し、それによりがん関連免疫抑制を効果的に対抗することが本明細書で実証される。これらの実験の結果は、以下の実施例に表される。したがって、ＩＲＸ−２が免疫系の新規なアームに対して効果的であり、免疫系のアームを回復し、すなわち、リンパ球のアポトーシスを防止することが本明細書に示される。
【０１１６】
膜型のＦａｓＬを発現する腫瘍由来微細小胞（ＭＶ）は、ＰＣＩ−１３腫瘍株化細胞から精製し、ＣＤ８＋ジャーカット細胞又は活性化末梢血（ＰＢ）Ｔ細胞とともに共培養した。ＦａｓＬ（Ｆａｓリガンド）は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーに属するＩＩ型膜貫通タンパク質である。ＦａｓＬ−レセプター相互作用は、免疫系の制御及びがんの進行において重要な役割を演ずる。アポトーシスは、ＦａｓＬがそのレセプター（ＦａｓＲ）に結合し三量体を形成すると誘発し、これは、標的された細胞の膜を死へ至らせる。
【０１１７】
ＣＤ８＋ジャーカットＴ細胞及び活性化ＰＢ  Ｔ細胞の腫瘍由来ＭＶを用いたインキュベーションは、アネキシン結合の増大（６４．４％±６．４）、カスパーゼ活性化（５８．１％±７．６）、ミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ）の低下（８２．９％±３．９）、ＤＮＡ−断片化で証明されるとおり、アポトーシスを顕著に誘発した。
【０１１８】
ＩＲＸ−２を用いたＴ細胞のプレインキュベーションは、用量及び時間依存的（ｐ＜０．００１〜ｐ＜０．００５）にアポトーシスを抑圧した。ＩＲＸ−２のＣＤ８＋Ｔ細胞に関する観測された防御効果は、組換体ＩＬ−２又はＩＬ−１５単独の細胞防御作用と等価であったが、ＩＬ−７より勝っていた。しかし、ＩＲＸ−２はＣＤ４＋Ｔ細胞のアポトーシスからの防御に関してより大きな効果を有した。ＩＲＸ−２がＩＬ−７やＩＬ−１５  含まず、そして、当量の組換体ＩＬ−２よりも効果的にアポトーシスからＣＤ４＋Ｔ細胞を防御することはＩＲＸ−２の特異的成分がＴ細胞をアポトーシスから防御するために相乗的に作用することを意味する。
【０１１９】
ＩＲＸ−２は、Ｔ細胞内でＪＡＫ３及びＴＣＲ関連ζ鎖のＭＶ誘発ダウン・レギュレーションを抑圧し及びＳｔａｔ５強活性化を誘発した。フロー・サイトメトリー分析は、アポトーシス促進性タンパク質Ｂａｘ及びＢｉｍのＭＶ−媒介アップ・レギュレーションを抑圧し（ｐ＜０．００５〜ｐ＜０．０５）、そして、抗アポトーシス性タンパク質Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、ＦＬＩＰ及びＭｃｌ−１の発現を同時に回復する（ｐ＜０．００５〜ｐ＜０．０１）ことにより、ＩＲＸ−２がＴ細胞内のプロ−及び抗アポトーシス性タンパク質のＭＶ誘発不均衡を逆行させること示した。さらに、ＩＲＸ−２処置は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ生存系路のＭＶ誘発抑制に対抗した。特異的Ａｋｔインヒビター（Ａｋｔｉ−１／２）は、ＩＲＸ−２の防御効果を抑制するが、これは、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ系路がＩＲＸ−２媒介生存シグナル伝達の重要な役割を演ずることを示す。ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ系路は、アポトーシスを防止する際の主要成分であり、この系路の活性化は、アポトーシスの多くの異なる誘発因子を阻止する。これらの研究は、ＩＲＸ−２を用いたの短いｅｘ  ｖｉｖｏプレ処置は、Ｔ細胞の腫瘍誘発アポトーシスからの強力な防御をもたらすことを示す。腫瘍微細環境の免疫抑制性感応に抵抗力が有するエフェクターＴ細胞は、抗腫瘍ホストの防御に不可欠なので、ＩＲＸ−２の利用は、がん生物学的治療の効果を顕著に改善する。
【０１２０】
本発明は、また、有効量の一次細胞由来バイオロジックを投与し、Ｔ及びＢ細胞の変化を検出し、そして患者の免疫化を誘発する工程を含む、患者の免疫化の誘発する方法を提供する。上記した、循環Ｔ及びＢ細胞サブセット組成の変化は、リンパ球産生、分化、及び輸送の変更に反映され、すなわち、それらが分化するか他の領域へ移動するので、血液中のＴ細胞及びＢ細胞のレベルの修正が起きる。サブセット組成の変化は、免疫化が患者内で誘発されている証拠である。
【０１２１】
本発明は、また、有効量の一次細胞由来バイオロジックを投与し、腫瘍周囲のＴヘルパー細胞及びＢ細胞の増大並びに腫瘍内のＴキラー細胞及びマクロファージの増大を検出し、そして、がん治療に対して順調な治療成績を予測する工程を含む、がん治療に対して順調な治療成績を予測する方法を提供する。とりわけ、上記したように、腫瘍周囲のＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔリンパ球及びＣＤ２０＋Ｂリンパ球並びに腫瘍内のＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋リンパ球及びＣＤ６８＋マクロファージの増大が検出される。すなわち、白血球浸潤の特徴的変化は、一次細胞由来バイオロジックを用いた治療が有効であることを示すバイオマーカーである。このバイオマーカーは、一次細胞由来バイオロジックを用いた継続処置がよい結果とならない患者をスクリーニングして除き、その結果、患者は、他の選択肢を探すことができるのに使用可能である。この方法は、さまざまなアッセイやイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ）及びフロー又はマイクロスコピックサイトメトリーのような高スループット法（ただし限定されない）などの治療成績を予測する自動化手段を使用可能である。
一次細胞由来バイオロジックの利点
【０１２２】
結局、ＩＲＸ−２は、免疫系のすべての側面の細胞性及び液性アームの抑制を解除しそして強化して、さまざまな免疫標的を攻撃する。すべての免疫応答不能疾患状態（上記したがん、ＡＩＤＳ及び他のもの）は、今般、ＩＲＸ−２を介して免疫系の抑制を解除し、強化することにより逆行される。成分の組合せではあるけれども各成分がエフェクターの産生を増やし、又はそれらのアポトーシスを防止する、すなわち、免疫系の各パート上でのみ働く従来技術の治療薬とは対照的に、ＩＲＸ−２は、ＩＲＸ−２のサイトカインの特異的組合せが免疫系の複数のパートを実施する点において単一の「楽器」というよりむしろ「シンフォニー」として機能する。免疫系の各パートは、ＩＲＸ−２投与によって経験される一効果のゲートキーパーである。免疫系のこれらの各パートは、免疫標的を攻撃するために必要である。図２及び３は、ＩＲＸ−２療法によって強化されるプロセスを示している。未熟樹状細胞は、ナイーブＴ細胞を活性化するために成熟になる必要がある。ナイーブＴ細胞の産生は、また、それらが成熟樹状細胞によって抗原提示されるように誘発される必要がある。抗原が樹状細胞によりナイーブＴ細胞に提示されるために、ナイーブＴ細胞及び樹状細胞の両方とも、所属リンパ節へ遊走しなければならない。一旦、活性化されると、Ｔ細胞は、それらが、キラーＴ細胞へ分化して免疫標的を攻撃できるようにアポトーシスから防御されねばならない。Ｂ細胞は、また、免疫標的の攻撃を助成するためにプラズマ細胞に成熟しなければならない。ＩＲＸ−２の投与は、これらのプロセスのすべてを増強し、免疫標的を攻撃する準備のできたコンピテントな免疫系を提供する。
投薬及び投与
【０１２３】
一次細胞由来バイオロジックのｉｎ  ｖｉｖｏへの投与は、ＩＲＸ−２に関連して前記した特許に開示されるワクチン＋ＩＲＸ−２又はＩＲＸ−２単独の免疫療法に開示されるのと同じである。ＩＲＸ−２は、好ましくは、リンパ周囲へ１０日レジメンにわたって１注入当たり１１５単位注射するが、以下に記載する他の方法を用いて注入することもできる。別法として、他のレジームを使用することができ、そこでは、ＩＲＸ−２を間欠的に投与する。例えば、１週間につき３日、又は１週間につき７日のうち５日投与することができる。以下に示すように、ＩＲＸ−２は、ＩＲＸ−２液の１：１〜１：１０希釈度の濃度範囲（ＩＲＸ−２の製造でされた媒体における希釈）にわたってアポトーシスを抑制する。
【０１２４】
好ましくは、ＩＲＸ−２は、腫瘍や他の持続性病変などの病変の所属するリンパ節に注ぐリンパ管周辺に注射される。注いでいる節における外リンパ投与は、重要である。腫瘍周囲注射は、応答、腫瘍の有糸分裂指数の増大、さらには進行にほとんど関与しないので、禁忌である。１０日注射計画が最適であり、２０日注射計画は、臨床上効果的であるが、がんのリンパ性浸潤によって測定されるように、ＴＨ１応答を減少させる傾向にあり、少ししか好ましくないＴＨ２応答へ移行しやすい。両側注入が効果的である。根治的頚部郭清術が起きている場合は、対側注入が効果的である。
【０１２５】
本発明の化合物（ＩＲＸ−２を含む）は、各患者の臨床状態、投与の場所と方法、投与のスケジュール、患者の年齢、性別及び体重を考慮しながら、外因性又は内因性抗原のいずれかに対して最適な免疫化とともにアポトーシスからの防御を促進するために投与及び投薬される。したがって、ここでも目的のための薬学的「有効量」は、従来技術で公知の検討によって決定される。その量は、好ましくは、免疫形成を誘発し、免疫破壊をブロックするのに効果的である。その量はまた、好ましくは、免疫化、例えば腫瘍減少、腫瘍断片化及び白血球浸潤へと導き、再発を遅延し、又は生存率を改善し、あるいは兆候を改善又は排除することを促進するのに効果的である。
【０１２６】
本発明の方法では、本発明の化合物は、さまざまな方法で投与可能であるが、好ましい方法は、外リンパ注射である。特記することは、該化合物を化合物のまま、あるいは薬学的に許容される誘導体として投与でき、そして、単独、又は、薬学的に許容される担体、希釈剤、アジュバント及びベヒクルと組み合わせた有効成分として投与可能である。該化合物は、また、皮内又は皮下、若しくはリンパ周囲又はリンパ内、節内又は脾臓内、若しくは筋肉内、腹腔内及び胸腔内に投与可能である。化合物のインプラントもまた有益である。治療される患者は、温血動物、特にヒトを含む哺乳動物である。提示したデータは、ＩＲＸ−２のヒト又はヒトに由来する細胞での活性を示し、したがって、ここに示すデータはすべて、ヒトに直接関連しかつ応用可能である。薬学的に許容される担体、希釈剤、アジュバント及びベヒクルは、インプラント担体とともに、一般に、不活性、無毒の固体又は液体のフィラー、希釈剤、本発明の活性成分と反応しないカプセル化材を意味する。
【０１２７】
投薬は、１回投与又は数日にわたる複数回投与であり得るが、好ましくは１０日間の注射計画を使用する。本発明の化合物を投与する際、一般に、単位投与注入形式（例えば、溶液、懸濁液又はエマルジョン）に処方される。注射に適した薬理学的製剤には、無菌の水溶液又は分散液、及び無菌の注射液又は分散液に再調製するための無菌の粉末が挙げられる。担体は、溶媒又は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリコール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、これらの適当な混合物及び植物油を含有する分散媒体であり得る。
【０１２８】
適当な流動性は、例えばレシチンのようなコーティング剤の使用により、分散液の場合は要求される粒径の維持により、そして、表面活性剤の使用により維持され得る。綿実油、ゴマ油、オリーブ油、大豆油、コーン油、ひまわり油、落花生油のような非水性ベヒクル、ミリスチン酸イソプロピルのようなエステルもまた、化合物組成物の溶媒システムとして使用可能である。さらに、抗菌性保存剤、抗酸化剤、キレート化剤及びバッファーをはじめとする組成物の安定性、不稔性及び等張性を増強するさまざまな添加剤を添加し得る。微生物の行動の防止は、さまざまな抗菌剤や防かび剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などにより確保できる。多くの場合、等張剤、例えば糖、塩化ナトリウムなどを含めることが望ましい。注入可能な剤型の長期にわたる吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用により起こり得る。しかし、本発明によれば、使用するすべてのベヒクル、希釈剤や添加剤は、化合物と相溶性である必要がある。
【０１２９】
無菌の注射液は、本発明を実施するのに使用される化合物を上記したようないくつかの他の成分とともに必要量の適当な溶媒内に組み込むことにより調製され得る。
【０１３０】
本発明の薬理学的製剤は、さまざまなベヒクル、添加剤及び希釈剤などのすべての相溶性担体を含有する注射製剤で患者へ投与され得、また、本発明に使用される化合物は、遅効性皮下埋込又はモノクローナル抗体、ベクター送達、イオン注入、ポリマーマトリックス、リポソーム及び微粒子のような標的送達系の形態で患者に非経口投与され得る。本発明に有用な送達系の例には、米国特許第５，２２５，１８２、５，１６９，３８３、５，１６７，６１６、４，９５９，２１７、４，９２５，６７８、４，４８７，６０３、４，４８６，１９４、４，４４７，２３３、４，４４７，２２４、４，４３９，１９６及び４，４７５，１９６に開示のものが挙げられる。インプラント、送達系、モジュールなどの他のものの多くが当業者には周知である。
【０１３１】
以下の実験例を参照して、本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、説明のためだけに提供され、その他に明示しない限り限定する意図ではない。したがって、本発明は、以下の実施例に限定されると全く解釈されるべきでなく、むしろ、本明細書で提供された教示の結果として明白なすべての変更を含むと解釈されるべきである。
【実施例】
【０１３２】
材料と方法
細胞培養に関するすべての工程は、無菌条件下で行われる。本明細書に記載されない細胞免疫学の一般的な方法は、Ｍｉｓｈｅｌｌ及びＳｈｉｉｇｉ（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９８１）などの細胞免疫学技術のための文献に概説されるとおりに行われ、そしてそれは当業者には周知である。
抗体及び試薬：
【０１３３】
以下のモノクローナル抗体をフロー・サイトメトリー分析に使用した：抗−ＣＤ３−ＥＣＤ、−ＣＤ８−ＰＣ５、−ＣＤ４−ＰＥ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｍｉａｍｉ、ＦＬ）；抗−Ｂｃｌ−２−ＦＩＴＣ、−Ｂｃｌ−２−ＰＥ、−Ｆａｓ−ＦＩＴＣ、−ＦａｓＬ−ＰＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）；抗−Ｂａｘ−ＦＩＴＣ、−ＢｃＩ−ｘＬ−ＦＩＴＣ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）及び抗−Ｂｉｄ−抗体（Ａｂｃａｍ  Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）。ポリクローナル抗体は、抗−Ｂｉｍ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）、抗−ＦＬＩＰ（ＧｅｎＷａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）及び抗−ＭｃＩ−１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。ＦＩＴＣ結合アネキシンＶをＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒから購入した。ＦＩＴＣ結合抗−ウサギＩｇＧをＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）から購入し、そしてアイソタイプコントロール（ＩｇＧ１−ＦＩＴＣ、ｌｇＧ２ａ−ＦＩＴＣ及びｌｇＧ２ｂ−ＦＩＴＣ並びにＩｇＧ２−ＰＥ）をＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。ウエスタンブロット分析のために購入した抗体には、以下のものが含まれる：ポリクローナルホスホ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）、ポリクローナルトータル−Ａｋｔ、モノクローナルホスホＳＴＡＴ５（Ｔｙｒ６９４）及びモノクローナルトータル−ＳＴＡＴ５（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、モノクローナルＢｃｌ−２、モノクローナルＣＤ３−ζ、モノクローナルＪＡＫ３、ポリクローナルＳＯＣＳ−２及びポリクローナルＭｃｌ−１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ポリクローナルカスパーゼ−３、ポリクローナルＦａｓＬ抗体−３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）並びにモノクローナルβ−アクチン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）。抗−Ｆａｓ（ＣＨ−１１）アゴニストモノクローナル抗体、ＣＨ−１１用ＩｇＭアイソタイプコントロール、抗−Ｆａｓブロッキングモノクローナル抗体、クローンＺＢ４、及びＺＢ４用アイソタイプＩｇＧ１コントロールは、すべてＵｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ、ＮＹ）から購入した。ＡＩＭ  Ｖ培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、熱失活ウシ胎児血清（ΔＦＣＳ）、ストレプトマイシン、ペニシリン、Ｉ−グルタミン、組み換え型トリプシン様タンパク質（ＴｒｙｐＬＥ）及びトリパンブルー色素を含むすべての細胞培養試薬を、Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）から購入した。ヒト組み換え型サイトカイン、ｒｈｌＬ−２、ｒｈｌＬ−７及びｒｈｌＬ−１５を、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ）から購入した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、サポニン、エトポシド及びスタウロスポリンを、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから得た。７−アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）及びパンカスパーゼ阻害剤、ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫをＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから得た。Ａｋｔ���／Ａｋｔ２の選択的阻害剤を、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入し、そして、カスパーゼ−３、カスパーゼ−８及びカスパーゼ−９の選択的阻害剤を、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から購入した。
一次細胞由来バイオロジック（ＩＲＸ−２）の調製：
【０１３４】
一次細胞由来バイオロジックの作製方法は、一般に米国仮出願第６１／０４４，６７４に記載されている。自動化細胞処理洗浄装置を用いて、白血球をリンパ球分離用培地（ＬＳＭ）に投入し、培地を遠心分離して精製ＭＮＣを取得することにより、単核細胞（ＭＮＣ）を精製して、汚染させている細胞を除去する。その後、ＭＮＣをＦＥＰリンパ球ストレージバッグ内で一晩放置する。ＭＮＣの誘発混合物（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｍｉｘｔｕｒｅ）を、ディスポーザブル細胞培養装置内でミトーゲン、好ましくはフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）及びシプロフロキサシンで刺激し、一次細胞由来バイオロジックをＭＮＣから作り出す。濾過及びタンジェンシャルフロー濾過モードにより誘発混合物からミトーゲンを除去し、次いで、誘発混合物をインキュベーションする。誘発混合物を濾過により清澄させて一次細胞由来バイオロジックの上清を得る。最後に、陰イオン交換クロマトグラフィー及び１５ｎｍ濾過並びに適宜追加の紫外線−Ｃ（ＵＶＣ）による不活性化にかけてＤＮＡ及び外来の薬剤（ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ  ａｇｅｎｔｓ）から一次細胞由来バイオロジック上清を取り出す。その後、最終生成物をガラス瓶に入れ、将来の患者への投与のために保管する。
細胞及び株化細胞：
【０１３５】
頭頸部扁平上皮がん（Ｈ＆ＮＳＣＣ）株化細胞ＰＣ−１３を、前に述べたとおり、出願人の実験室内で確立して維持した。それを、前に報告したとおり、Ｄｒ．Ｓ．Ｎａｇａｔａ（大阪バイオ研究所、大阪府、日本）から入手したヒトＦａｓＬ遺伝子を、レトロウイルスを介してトランスフェクトした。トランスフェクトされたＰＣＩ−１３−細胞（ＰＣＩ−１３−ＦａｓＬ）の上清（これは、ＦａｓＬ及び４２ｋＤａ膜性型のＦａｓＬの両方を含む）を腫瘍由来微細小胞（ＭＶ）の出所として用いた。ジャーカット細胞を米国ティッシュ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手し、ＣＤ８をトランスフェクトした。１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、Ｌ−グルタミン及び抗生物質を補充したＲＰＭＩ１６４０培地内でＣＤ８＋ジャーカット細胞をインキュベーションした。同意した健常ドナーから入手した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からヒトＴリンパ球を分離した。ＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ比重遠心法（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）により分離し、洗浄し、そして、５％ＣＯ２の雰囲気の培養フラスコ（Ｔ１６２）内に３７℃で１時間置いて、ＣＤ１４＋単球を除去した。非接着Ｔ−リンパ球フラクションを採集し、直ぐに実験に使用するか、低温保存した。ＡｕｔｏＭＡＣＳシステムと製造者マニュアルを用いて、ＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ４＋Ｔ細胞をそれぞれＣＤ８マイクロビーズ又はＣＤ４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）を用いたポジティブ選択で精製した。次いで、精製したＣＤ８＋又はＣＤ４＋Ｔ細胞を、１０％ＦＢＳを補充したＡＩＭ  Ｖ培地内で、抗−ＣＤ３及び抗−ＣＤ２８抗体（Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ／Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を塗布したビーズの存在下で２〜３日間インキュベーションした。上記した実験に使用したすべての細胞は、対数増殖期にあった。
微細小胞の分離：
【０１３６】
微細小胞（ＭＶ）を、上記したとおり、ＦａｓＬ−トランスフェクトＰＣＩ−１３株化細胞のインキュベーション上清から分離した。詳細には、濃縮された細胞培養上清を、サイズ排除クロマトグラフィー及び超遠心分離を含む二工程手順で分別した。ＰＣＩ−１３−ＦａｓＬ上清を、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐフィルタ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を用いて少なくとも１０回濃縮した。次に、濃縮上清の１０ｍＬアリコートを、ＰＢＳで平衡化したセファロース２Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）のカラム（１．５ｘ３５ｃｍ）にかけた。１ｍＬ分画ずつ採集し、２８０ｎｍの吸収を測定することによりタンパク含量をモニターした。５０ミリオンｋＤＡを越えるタンパク質を含有する排除ピーク材料（ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｐｅａｋ  ｍａｔｅｒｉａｌ）を４℃、１０５，０００ｘｇにて、２時間遠心分離した。ペレットを、３００〜５００μＬの無菌ＰＢＳ内に再懸濁した。各ＭＶ調製物内のタンパク質濃度を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準として用いたＬｏｗｒｙプロテインアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）により評価した。
ウエスタンブロットアッセイ：
【０１３７】
Ａｋｔ、Ｂｃｌ−２、ＣＤ３ζ、カスパーゼ−３、ＪＡＫ３、ＳＴＡＴ５、ＦＬＩＰ及びＭｃｌ−１の全体又はリン酸化型を測定するため、ジャーカットＣＤ８＋細胞、若しくは精製活性化ＣＤ８＋又はＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＭＶとともに指定された濃度にて、及び／又は、ＩＲＸ−２（１：３最終希釈）とともに指定された期間、３７℃で共培養した。次いで、細胞を洗浄し、４℃で遠心し、そして、等容積の氷冷ソリューションバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０）及びプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）でリンスした。溶解後、ホモジネートを遠心処理で清澄にした。上清を分離し、５倍Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッッファー内で５分間煮沸した。タンパク質をドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離し、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜にエレクトロトランスファーした。この膜をＴＴＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するトリス緩衝生理食塩水）内５％無脂肪ミルク又は５％ＢＳＡで１時間、室温（ＲＴ）でブロックし、次いで、適当な抗体とともに４℃で一晩インキュベーションした。室温にてＴＴＢで洗浄（３ｘ１５分間）後、膜を１：１５０，０００希釈（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ）のセイヨウワサビ］ペルオキシダーゼ結合二次抗体とともに１時間、室温でインキュベーションした。洗浄後、膜をＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ化学発光検出システム（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ）を用いて展開した。別の一次抗体でリプローブするため、膜をストリッピングバッファー（０．５Ｍ  ＮａＣＩ、３％（ｖ／ｖ）氷酢酸）内でインキュベーションし、洗浄し、その後の研究に使用した。
ＣＤ８＋ジャーカット細胞又は活性化正常Ｔ−リンパ球とＭＶ及びＩＲＸ−２との共培養：
【０１３８】
９６−ウエルプレート内にＣＤ８＋ジャーカット細胞又は活性化正常Ｔリンパ球を各ウエルにつき０．３ｘ１０６細胞を置き、ＩＲＸ−２無しにあるいは組換体ヒトサイトカインとともに最終濃度１０ｎｇ／ｍＬ又は１００ＩＵ／ｍＬにて２４時間（その他に注記しないかぎり）プレ処置した。次いで、ＭＶ（０．３ｘ１０６細胞につき１０μｇタンパク質）を３〜２４時間追加した。いくつかの実験では、まず、細胞をＭＶとともに３〜２４時間共培養し、洗浄し、さらにＩＲＸ−２又はサイトカインで処置し、あるいは同時添加のＭＶ及びＩＲＸ−２で指定された時間、処置した。選択されたブロック実験では、抗−Ｆａｓ中和モノクローナル抗体、ＺＢ−４、パン−カスパーゼインヒビター、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ又は特異的Ａｋｔ−インヒビター若しくはカスパーゼ−３、カスパーゼ−８及びカスパーゼ−９用の特異的インヒビターを、ＭＶ共培養に先駆けて指定された濃度で添加した。
細胞表面染色：
【０１３９】
ＭＶ及び／又はＩＲＸ−２共培養ＣＤ８＋ジャーカット細胞又は活性化Ｔ−リンパ球（少なくとも３００，０００細胞／チューブ）を染色液（ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）（０．１％ｗ／ｖ  ＢＳＡ及び０．１％ｗ／ｖ  ＮａＮ３）二度洗浄した。細胞を、以前に述べた細胞表面マーカーについて染色した。詳細には、細胞を各抗体の最適な希釈液とともに室温の暗所で２０分間、インキュベーションし、染色液で二度洗浄し、最後に１％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）のＰＢＳで固定した。以下の抗体を表面染色のために使用した：抗−ＣＤ３−ＥＣＤ、抗−ＣＤ４−ＰＥ、抗−ＣＤ８−ＰＣ５、抗−Ｆａｓ−ＦＩＴＣ及び抗−ＦａｓＬ−ＰＥ。
フロー・サイトメトリー：
【０１４０】
Ｅｘｐｏ３２ソフトウエア（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を備えたＦＡＣＳｃａｎフロー・サイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて４色フロー・サイトメトリーを実行した。リンパ球をモルフォロジーに基づいて遮断し、異物、ＭＶを単球及び顆粒球とともに除去し、データを少なくとも１０５個の細胞を採集した。活性化一次Ｔリンパ球の分析のために、ゲートをＣＤ３＋ＣＤ８＋又はＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ−細胞サブセットに対して制限した。データをＣｏｕｌｔｅｒ  ＥＸＰＯ３２ｖｌ．２解析ソフトウエア用いて解析した。
アネキシンＶ結合アッセイ：
【０１４１】
ＭＶ及び／又はＩＲＸ−２共培養ＣＤ８＋ジャーカット細胞又は活性化Ｔリンパ球に対するアネキシンＶ（ＡＮＸ）結合をフロー・サイトメトリーにより測定し、自発性（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ）の又はｉｎ  ｖｉｔｒｏの誘発アポトーシスを評価した。ＣＤ３、ＣＤ８又はＣＤ４に対する抗体を用いた表面染色に続いて、細胞をアネキシン結合バッファーに再懸濁し、氷上でＦＩＴＣ結合アネキシンＶとともに１５分間インキュベーションした。７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）を用いた追加の染色を実行して、死んだ細胞と生きた細胞を区別した。染色から３０分間以内に細胞をフロー・サイトメトリーで分析した。
カスパーゼ活性の測定：
【０１４２】
パンカスパーゼインヒビター、ＣＡＳＰＡＣＥ  ＦｌＴＣ−ＶＡＤ−ＦＭＫ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｍａｒｋｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｌ）を用いた活性化カスパーゼの細胞内染色により、トータル細胞性カスパーゼ活性を試験した。細胞をＰＢＳに再懸濁し、ＦＩＴＣ−ＶＡＤ−ＦＭＫを最終濃度５μＭにて添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２にて２０分間、インキュベーションし、ＰＢＳで洗浄した。その後、細胞を細胞表面レセプターについて染色し、１％パラホルムアルデヒドで固定し、フロー・サイトメトリーで分析した。カスパーゼ−３及びカスパーゼ−７の特異的活性化をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得たＶＹＢＲＡＮＴ  ＦＡＭカスパーゼ−３及び７−アッセイキット（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）と製造者マニュアルを用いて測定した。詳細には、細胞をＰＢＳに再懸濁し、１５０倍希釈のカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）標識ＦＭＫカスパーゼインヒビターで３７℃、５％ＣＯ２にて６０分間、染色した。その後、細胞を洗浄バッファー内で洗浄し、１％パラホルムアルデヒドで固定した。細胞をＦＬ１チャンネル上で測定されたフルオレセインを用いてフロー・サイトメトリーで分析した。
ミトコンドリア膜電位の測定：
【０１４３】
アポトーシスの特徴としてのミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ）の低下を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）のＭＩＴＯＰＲＯＢＥ  ＪＣ−１アッセイキットを用いて測定した。カチオン染料ＪＣ−１（５，５‘，６，６’−テトラクロロ−１，１，３‘，３’−テトラエチルベンズイミダゾリルカルボシアニンアイオダイド）は、健康な細胞でサイトゾル内の緑色モノマーとして存在し、そしてまたミトコンドリア内に赤色凝集物として堆積する。アポトーシス性及び壊死性細胞では、ＪＣ−１はミトコンドリア脱分極のせいで細胞質内のみに残存し、これは、フロー・サイトメトリーにより赤／緑蛍光強度比の減少として検出することができる。ＣＤ８＋ジャーカット細胞又は活性化Ｔリンパ球を２μＭのＪＣ−１を含有するＰＢＳ内で、３７℃、５％ＣＯ２にて３０分間インキュベーションした。染色期間中、ミトコンドリアル脱分極の陽性対照として５０μＭのミトコンドリアルアンカプラーのカルボニルシアナイド３−クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）で細胞のアリコットを処置した。染色後直ぐに、フロー・サイトメーター用いて細胞を分析した。
アポトーシス−関連タンパク質の評価：
【０１４４】
抗アポトーシス性タンパク質Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、ＦＬＩＰ及びＭｃｌ−１、並びにアポトーシス促進性タンパク質Ｂａｘ、Ｂｉｍ及びＢｉｄの発現を、ＣＤ８＋ジャーカット細胞又は活性化一次Ｔリンパ球内でマルチカラーフロー・サイトメトリーを用いて調査した。まず、細胞を上記したように、表面Ｔ細胞マーカーについて染色した。アポトーシス関連タンパク質の細胞内染色のために、細胞を１％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒドのＰＢＳで、室温で１０分間固定した後、サポニン（ＰＢＳ中０．１％ｖ／ｖ）で、４℃で１５分間、透過処理した。次に、細胞を４０℃で３０分間、ＦＩＴＣ−又はＰＥ−結合抗ヒトＢｃｌ−２、Ｂａｘ及びＢｃｌ−ｘＬ若しくは、ＦＬＩＰ、Ｂｉｍ、Ｂｉｄ又はＭｃｌ−１についての未結合抗体で染色し、続いて、０．１％サポニンで洗浄した。未結合抗体で染色された試料は、さらに、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧとともに室温で１５分間、インキュベーションした。０．１％サポニンで洗浄後、細胞を１％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒドで固定し、アイソタイプコントロール適合抗体を表面及び細胞内細胞性コントロールの両方のために使用し、そしてすべての抗体をフレッシュなＰＢＭＣ上で予備滴定（ｐｒｅ−ｔｉｔｅｒｅｄ）した。
ＴＵＮＥＬアッセイ：
【０１４５】
ＤＮＡ断片化を、Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，ＴＭＲｒｅｄ（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いて測定した。詳細には、ＭＶ−及びＩＲＸ−２処置Ｔ細胞のサイトスピン調製物（１００，０００細胞／スライド）を、風乾し、そして、４％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を含有するＰＢＳ内で、室温で１時間固定した。スライドを、ＰＢＳでリンスし、浸潤化溶液（０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する０．１％クエン酸ナトリウム）とともに氷上で２分間インキュベーションした。その後、スライドをＰＢＳで二度洗浄し、暗所加湿チャンバー内で２０μｌのＴＵＮＥＬ反応混合物とともに３７℃で１時間インキュベーションした。次いで、試料をＰＢＳでよく洗浄し、４‘，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ；  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣＡ）内でインキュベーションして細胞核をトレースした。スライドを、２００倍のＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ−８００蛍光顕微鏡内で評価した。デジタルイメージ解析のために、アドビフォトショップ６．０を使用した。顕微鏡視野内で最小３００個の細胞をランダムに計数し、ＤＮＡ断片化をもつ細胞の割合（％）を測定した。
統計分析：
【０１４６】
統計分析は、スチューデントｔ検定を用いて行った。Ｐ値＜０．０５を有意とみなした。
実施例１
ＩＲＸ−２は、各種アポトーシス誘発剤が媒介する細胞死からジャーカットＴ細胞及び一次Ｔリンパ球の両方を防御する。
【０１４７】
ｌＲＸ−２が腫瘍由来微細小胞（ＭＶ）が媒介するアポトーシスからＴ細胞を防御するかどうかを決定するため、ＣＤ８＋ＦａｓＬ感受性ジャーカット細胞をＩＲＸ−２の１：３希釈液（約４ｎｇ／ｍＬ又は９０ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２）とともに２４時間プレインキュベーションし、続いて、それらを１０μｇの腫瘍由来ＭＶ（１０μｇ）、ＣＨ−１１（４００ｎｇ／ｍＬ）又はスタウロスポリン（１μｇ／ｍＬ）とともに３時間処置した。出願人の以前の研究に示されるように、ジャーカット細胞とＭＶとの共培養は、顕著なアポトーシスをほう起し、それは、アネキシンＶ結合（図４Ａ及び４Ｃ）及びカスパーゼ活性化の指標であるＦＩＴＣ−ＶＡＤ−ＦＭＫ結合（図４Ｂ及び４Ｄ）の増強を示した。死んだ細胞（７−ＡＡＤ＋）を取り除き、ゲートを７−ＡＡＤ陰性ＣＤ８＋ジャーカット細胞上にセットした。ジャーカットＴ細胞とＩＲＸ−２とのプレインキュベーションの際、両アッセイで検出されるように、ＭＶ誘発アポトーシスは有意に減少した（図４Ａ−４Ｄ）。
【０１４８】
面白いことに、ＩＲＸ−２は、ＭＶ誘発アポトーシスに対して有効なだけでなく、ＦａｓＬ誘発（ＣＨ−１１−Ａｂ）及び細胞障害性薬剤誘発（スタウロスポリン）アポトーシスからのジャーカットＴ細胞の防御をもたらすことが判明した。図１２Ｃ−１２Ｄは、アネキシンＶ結合の減少（図４Ｃ）及びカスパーゼ活性化の減少（図１２Ｄ）によって測定されるとおり、ＩＲＸ−２がこれらの各薬剤により誘発されるアポトーシスを有意に減少させたことを示す。図４Ｃ及び図４Ｄに示す結果は、３つの独立した実験の代表例である（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００２）。
【０１４９】
ＩＲＸ−２媒介防御は、また、一次血液由来ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔリンパ球を用いた時に観測された。表１のデータは、ＭＶ−又はＣＨ−１１誘発アポトーシスの両方に関するＩＲＸ−２の防御効果を示し、それは、これらの細胞でのカスパーゼ活性化の減少により示されるとおりである（表１）。アネキシンＶ結合の同様の減少が、ＩＲＸ−２を用いて観察された（データは示さず）。ＣＤ８＋Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞よりもＭＶ誘発アポトーシスに対して有意に強い感受性を示したが、これらのサブセットの両方で、カスパーゼ−活性化を用いたＴ細胞の全体減少パーセントによって測定されたとおり、ＩＲＸ−２処置は、ＭＶ誘発アポトーシスに対して強固な防御をもたらした。ＩＲＸ−２は、また、ＣＨ−１１  Ａｂ誘発アポトーシスから両細胞サブセットを防御した（表１）。まとめると、これらの発見は、ＩＲＸ−２は、ＭＶ−又は抗−Ｆａｓ  ＣＨ−１１  Ａｂ誘発アポトーシスだけでなく、スタウロスポリン誘発ミトコンドリアル変換に伴う内因性アポトーシスからも一次Ｔ細胞及び株化細胞を効果的に防御することを示す。そのような結果は、ＩＲＸ−２は、腫瘍に由来するものや、例えば化学療法、放射線療法又はウイルスにより誘発されるかもしれない内在性メカニズムをはじめとするいくつかの異なるアポトーシス性刺激からの有意な防御を提供するというの意見を強める。
【表１】
0005563472.tif 000002

ａ  活性化ＣＤ８＋又はＣＤ４＋細胞を、ＩＲＸ−２とともに２４時間プレインキュベーションし（１：３最終希釈、９０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含有；追加のサイトキン濃度の詳細は、材料及び方法を参照）、次いで、１０μｇのＭＶ又はＣＨ−１１抗体（Ａｂ）（４００ｎｇ／ｍＬ）でさらに２４時間処置した。細胞のカスパーゼ活性化を、フロー・サイトメトリーを介したＦＩＴＣ−ＶＡＤ−ＦＭＫ染色により分析した。結果は、３つの独立実験における平均％±ＳＤである。
ｂ  Ｐ値は、ＩＲＸ−２無しと＋ＩＲＸ−２処置細胞との間の相違についてである。  
実施例２
アポトーシスからのＩＲＸ−２媒介防御は、時間−及び濃度−依存的である
【０１５０】
ＩＲＸ−２のＴ細胞に関する防御効果をよりよく理解するために、ＣＤ８＋ジャーカット細胞をＩＲＸ−２（固定された希釈度１：３＝９０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２）とともに、時間を漸増（０〜２４時間）させ、又は２４時間一定でＩＲＸ−２（指定したとおり）濃度を増大させながら、プレインキュベーションし、続いてＭＶ（１０μｇ）で３時間処置した（それぞれ、図５Ａ及び５Ｂ）。アポトーシスを、フロー・サイトメトリーによる活性化カスパーゼのＦＩＴＣ−ＶＡＤ−ＦＭＫ染色を用いて評価した。ＩＲＸ−２はＭＶ誘発アポトーシスをブロックし、そして、この抑制は、ＩＲＸ−２とのプレインキュベーション時間が延長すると防御効果を増強したように時間依存的であることが判明した。最高の抑制は、ＭＶ治療の２４時間後に観測された（図５Ａ）。異なるＩＲＸ−２濃度でのＴ細胞のプレインキュベーションは、ＭＶによってほう起されるアポトーシスの用量依存的な抑制を示した（図５）。最も高く可能な濃度（すなわち、未希釈ＩＲＸ−２）では、ＩＲＸ−２が、ＭＶによるアポトーシスの誘発を完全に抑制した（図５Ｂ）。結果は、４つの独立した実験の平均％±ＳＤである。ＩＲＸ−２媒介抑制が時間及び濃度依存的の両方であるという事実は、効果が薬剤に対して特異的であることを証明している。
【０１５１】
一旦、アポトーシスカスケードが開始していたら、ＩＲＸ−２がＴ細胞をアポトーシス性細胞死から防御するどうかを決定することが望ましかった。この問題に対処するため、ＣＤ８＋ジャーカット細胞を処置せず、ＩＲＸ−２（１：３希釈）で２４時間処置（＋ＩＲＸ）し、ＭＶで３時間処置（＋ＭＶ）し、ＩＲＸ−２とともに２４時間プレインキュベーションし、その後ＭＶ（１０μｇ）で３時間処置（＋ＩＲＸ→ＭＶ）するか、又は、最初にＭＶとともにインキュベーションし、次いでＩＲＸ−２で処置（＋ＭＶ→ＩＲＸ−２）し、あるいは両薬剤とともに同時（＋ＭＶ及びＩＲＸ）に３時間又は２４時間それぞれインキュベーションした。カスパーゼの活性化をフロー・サイトメトリーで分析した。結果は、３つ行った各実験の平均％±ＳＤである（ＭＶ処置試料に対して＊ｐ＜０．００２）。ＭＶの添加に先駆けたＩＲＸ−２処置の効果の比較において、アポトーシスは、Ｔ細胞とＭＶ＋ＩＲＸ−２との同時共培養後、約５０％だけ減少した（図６）。ＩＲＸ−２を、ＭＶ処置３時間後に添加すると、ＩＲＸ−２の防御効果は、完全に阻害された。ＩＲＸ−２は、ＭＶによりすでに開始されたアポトーシスカスケードを克服することが明らかに可能でないため、それは、ＭＶによって開始された進行中のアポトーシス過程の逆行というよりむしろ防御メカニズムを介して作用する。
実施例３
ＩＲＸ−２の防御効果と生存性サイトカイン１Ｌ−７及びＩＬ−１５の効果との比較：腫瘍−ＭＶで処置した後のジャーカットＣＤ８＋細胞のカスパーゼ−活性化
【０１５２】
ジャーカットＣＤ８＋細胞を９６ウエルプレート内に密度３００，０００細胞／１００μＬ／ウエルにて置き、ＩＲＸ−２（１：３最終濃度）、ＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍＬ）又は両サイトカイン（各１０ｎｇ／ｍＬ）とともに、それぞれ２４時間、インキュベーションした。細胞をＰＣＩ−１３／ＦａｓＬ−ＭＶ（１５μｇ）で３時間処置した。５６℃で１０分間加熱したジャーカットＣＤ８＋細胞を、陽性対照として使用した。細胞を集め、１ｍＬのＰＢＳ内で洗浄し、５００μＬのＰＢＳ内に再懸濁し、そして、５μＭのＶＡＤ−ＦＩＴＣで３７℃、２０分間、染色した。次いで、細胞をＰＢＳ内で洗浄し、そしてＣＤ８−ＰＥ−Ｃｙ５について１５分間染色した。洗浄後、細胞を１％ＰＦＡ内に固定し、マルチパラメトリックフロー・サイトメトリーで分析した。
【０１５３】
活性化カスパーゼ−ＶＡＤ−ＦＩＴＣ結合ＣＤ８＋ジャーカット細胞の割合（％）を図７に示す各処置群について測定した。ＭＶ誘発アポトーシス（ＩＲＸ−２無しレーン；アポトーシス進行中の５０％細胞）は、ＩＲＸ−２単独（１１％アポトーシス細胞＝４．５倍減少）、又はＩＬ−７及びＩＬ−１５の混合物（５％アポトーシス細胞＝１０倍減少）のいずれかを用いたプレ処置により劇的に抑制された。別々に、ＩＬ−７又はＩＬ−１５単独のどれも、コントロールのＭＶ誘発レベル以下にアポトーシスレベルを減少できなかった。ＩＲＸ−２は、ＩＬ−７又はＩＬ−１５のいずれも含有しないが、両者は、リンパ性細胞の潜在的な「生存」因子と認識されている。これは、ＩＲＸ−２のアポトーシス−抑制活性は、生物学的活性成分の相乗作用的組合せの結果であり、単一の組換体サイトカインによっては再生できないことの証明になる。
実施例４
ＩＲＸ−２並びに生存性サイトカインＩＬ−７及びＩＬ−１５の防御効果：アポトーシス誘発剤を用いて処置した後の活性化ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞におけるカスパーゼ−活性化
【０１５４】
白血球ユニット（バフィコート）からの浮遊細胞を溶かし、６０ｘ１０６細胞（６０ｍｌの１０％ＦＣＳ内、ＲＰＭＩ−培地）を、ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｌビーズ（１ｂｅａｄ／細胞）を用いて３日間、活性化した。活性化後、細胞を洗浄し、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋細胞を磁気分離（ポジティブ選択、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｍｉｃｒｏ  Ｂｅａｄｓ）により分離した。３００，０００個の細胞を１００μＬ／ウエルの９６ウエルプレート内に置き、ＩＲＸ−２（１：３）又はサイトカインＩＩ−７及びＩＬ−１５（１００ｎｇ／ｍＬ）とともに２４時間、インキュベーションした。その後、細胞をＰＣＩ−１３／ＦａｓＬ−ＭＶ（１５μｇ）（図８Ａ，８Ｂ）又はＣＨ−１１  Ａｂ（４００ｎｇ／ｍＬ）（図９Ａ，９Ｂ）でさらに２４時間処置して、アポトーシスを誘発させた。
【０１５５】
インキュベーション後、細胞を集め、１ｍＬのＰＢＳで洗浄し、３００μＬのＰＢＳ内に再懸濁し、そして、３μＭのＶＡＤ−ＦＩＴＣで３７℃、２０分間染色した。細胞をＰＢＳで洗浄し、示したように、ＣＤ８−ＰＥ−Ｃｙ５又はＣＤ４−ＰＥ−Ｃｙ５について１５分間染色した。洗浄後、細胞を１％ＰＦＡ内に固定し、マルチパラメトリックフロー・サイトメトリーで分析した。
【０１５６】
腫瘍株化細胞ＰＣｌ−１３／ＦａｓＬ−ＭＶを経たアポトーシス誘発の応答において、細胞結合カスパーゼ−ＶＡＤ−ＦＩＴＣ（細胞の指標はアポトーシス進行中であった）の割合（％）を、ＩＲＸ−２単独又は指定の組換体サイトカインとともにプレインキュベーションしておいたプレ活性化ヒト末梢血由来ＣＤ４＋（図８Ａ）又はＣＤ８＋（図８Ｂ）細胞について測定した。これらのデータは、ＩＲＸ−２は、前にジャーカットＣＤ８＋細胞（図４−６）で見たようにアポトーシスを抑制することができるが、抑制の程度は、ジャーカット細胞で観測されたものより少ないようであることを示す。一次ヒト（非株化細胞）Ｔ細胞を採用するこの実験的状況では、ＩＬ−７及びＩＬ−１５は、ＩＲＸ−２の単独又は組合せと比べて同様に効果的であった。この明らかな相違は、クローニングされた均質なジャーカット細胞株よりもむしろ末梢血からの不均質Ｔ細胞集団の使用と多いに関連しそうである。にもかかわらず、どちらかの状況及び両ＣＤ４＋及びＣＤ８＋集団では、ＩＲＸ−２は、実際、腫瘍由来ＭＶに応答してアポトーシスを抑制した。
【０１５７】
上記発見を拡張し、別法のアポトーシス誘発剤、抗−Ｆａｓ抗体（ＣＨ−１１）で処置した場合のプレ活性化ヒト末梢血由来ＣＤ４＋（図９Ａ）又はＣＤ８＋（図９Ｂ）細胞のカスパーゼ−ＶＡＤ−ＦＩＴＣ結合の割合（％）を評価するために同様の実験に着手した。この状況では、ＩＲＸ−２は、ＩＬ−７又はＩＬ−１５単独、若しくは両方の組合せと比べて、アポトーシス誘発の抑制に最も効果的である。これは、健常血液ドナーから取得したＣＤ４＋及びＣＤ８＋集団についても正しかった。このような結果は、ＩＲＸ−２は、腫瘍から由来したものを含むいくつかの異なるタイプのアポトーシス性刺激からの顕著な防御を提供するという意見を強固にする。
実施例５
他の組換体生存性サイトカインの防御効果よりも多大なＩＲＸ−２により促進される生存シグナル
【０１５８】
ＩＬ−２は、ＩＲＸ−２（使用した１：３希釈にて〜９０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２）において主役のサイトカインであるため、ＩＲＸ−２で観測された抗アポトーシス活性は、一部ＩＬ−２−依存性でありえた。一方、ＩＲＸ−２内に存在する他のサイトカインとの相乗効果は、生存を促進し得た。活性化ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞を、１００ＩＵ／ｍＬの組換体ヒトＩＬ−２（用量は、１：３ＩＲＸ−２希釈液に近い）又は、ＩＲＸ−２（１：３にて−９０ＩＵ／ｍＬ）のいずれかとともにインキュベーションし、ＭＶ−又はＣＨ−１１抗体誘発アポトーシスを抑制する能力を比較した。表２Ａに示されるとおり、ＩＬ−２は、ＭＶ誘発アポトーシスに対して、ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＩＲＸ−２と同様の防御効果を有したが、ＣＤ４＋Ｔ細胞中の防御効果より低かった。ＣＨ−１１Ａｂ誘発アポトーシスに対する防御に関しては、ＩＬ−２は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の生存を増強することにおいてＩＲＸ−２より有意にあまり効果的でなく、そして、ＣＤ８＋Ｔ細胞においてはほとんど効果がなかった（表２Ｂ）。これらの発見は、ＩＲＸ−２の生存性増強ポテンシャルは、その主要なサイトカインＩＬ−２よりも大であること、及びＩＲＸ−２内に存在する他のサイトカインのサポートは、きわめて低い生理学的濃度でこれらの効果に寄与することを示している。
【０１５９】
ＩＲＸ−２内に存在するＩＬ−２の細胞防御的効果は、ＩＦＮγ及びＧＭ−ＣＳＦの存在によって増強されるが、これらは、組み合わさると、免疫増強効果を媒介したようである。ＩＲＸ−２中の他の成分（例えばＩＬ−１α、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦα）のＴ細胞生存の促進における役割は、あまり明確でないが、組織の場所及び濃度に依存して、これらの炎症促進性サイトカインのいくつかもまた、抗腫瘍免疫応答を支持するという研究が示されている。ＩＲＸ−２のさまざまな成分のうち機能的相乗作用は、前に記載し、例えば、ＩＲＸ−２は、樹状細胞の成熟を、ＴＮＦα単独に匹敵するレベルよりも大きな程度で誘発することが可能であることを証明したことを特記することは重要である。
【０１６０】
さらに、ＩＲＸ−２の防御効果を、両方ともリンパ球の潜在的生存性サイトカインであるが、ＩＲＸ−２混合物内には存在しない組換体ＩＬ−７及びＩＬ−１５の活性と比較した。これらのサイトカインを１０ｎｇ／ｍＬの濃度で単独又は組み合わせて用いたＴ細胞のプレインキュベーションは、すべての事例で、異なる程度ではあるがＭＶ誘発又はＣＨ−１１  Ａｂ誘発アポトーシスからの防御をもたらした（表２Ａ及びＢ）。ＩＬ−７単独のみが、両細胞サブセットでのＣＨ−１１  Ａｂ−及びＭＶ誘発アポトーシスをＩＲＸ−２と比べて弱く抑制した。ＩＬ−１５単独は、ＭＶ誘発アポトーシスに対する防御においてＩＲＸ−２と同じくらい力強かったが、ＣＨ−１１  Ａｂ誘発アポトーシスに対してより弱い生存シグナルをもたらした。両サイトカインの組み合わせは、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋細胞サブセットでのアポトーシスをブロックし、そしてアポトーシス抑制の程度は、ＩＲＸ−２により媒介されたものと同様であったが、ＭＶ誘発アポトーシスの場合のみであった（表２Ａ及びＢ）。したがって、ＩＲＸ−２の防御効果は、ＣＤ４＋細胞の防御において、組換体生存性サイトカイン、ＩＬ−７及びＩＬ−１５と等価であるか、またいくつかの事例（例えばＣＤ８＋細胞）ではより強大でさえあった。ＩＲＸ−２は、ＭＶ−及びＣＨ−１１  Ａｂ誘発アポトーシスからの活性化ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の防御において、組換体ＩＬ−７よりも顕著に効果的であり、そして、ＩＬ−１５と同様の防御効果を有することが判明した。試験したサイトカインの中で、ＩＲＸ−２は、アポトーシスを誘発するのにＣＨ−１１  Ａｂを使用すると、最大の生存力を有したが、これは、レセプター媒介アポトーシスの防御を意味する。ことが特記される。これらの実験に使用したＩＬ−７及びＩＬ−１５の濃度は、比較的高く、そして、生理学的レベルでなく、これは再び、ＩＲＸ−２の成分間の強い相乗作用を暗示している。
【表２】
0005563472.tif 000003
ａ  活性化一次ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＩＲＸ−２（１：３希釈、〜９０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含む、材料及び方法を参照）、組換体ヒトＩＬ−２（１００ＩＵ／ｍＬ）、ＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍＬ）、又はＩＬ−７及びＩＬ−１５（両方とも１０ｎｇ／ｍＬ）とともに、２４時間プレインキュベーションし、その後、１０μｇのＭＶ又は４００ｎｇ／ｍＬのＣＨ−１１抗体（Ａｂ）でさら２４時間処置した。カスパーゼの活性化を、フロー・サイトメトリーで分析した。データは、ＦＩＴＣ−ＶＡＤ−ＦＭＫ＋細胞の平均％±ＳＤである。
ｂ  Ｐ値は、ＭＶ単独と比べたＩＲＸ−２でプレ処置した細胞間の有意な差、又はＩＲＸ−２でプレ処置したものと比べた指定のサイトカインでプレ処置した細胞間の有意な差を意味する。
実施例６
ＩＲＸ−２は、アポトーシス経路におけるさまざまな過程でのＭＶ誘発アポトーシスに対する防御を提供する。
【０１６１】
ＩＲＸ−２−媒介防御がジャーカット細胞株及びいくつかの誘発剤とともに一次Ｔ細胞まで拡張することが示されているので、われわれは、ジャーカット細胞とＭＶとの共培養を用いてアポトーシス過程における下流過程を抑制するＩＲＸ−２の能力を評価することを継続した。ＣＤ８＋ジャーカット細胞を処置せず、１０μｇのＭＶとともに３時間インキュベーションするか、あるいはＩＲＸ−２（１：３希釈）で２４時間プレ処置し、次いでＭＶとともに３時間インキュベーションするかのいずれかを行った。また、ＣＤ８＋ジャーカット細胞をＭＶ及び２０μＭのパン−カスパーゼインヒビターＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫ（ｚＶＡＤ）とともに共培養するか、あるいはＭＶ及び抗−Ｆａｓ中和ｍＡｂ  ＺＢ４（１０μｇ／ｍＬ）（コントロール）とともに共培養した。結果は、３つの独立した実験の平均ＭＦＩ±ＳＤである。図１３Ａに示すとおり、ジャーカット細胞のＭＶ処置は、カスパーゼ−３／−７−ＦＡＭの平均蛍光強度（ＭＦＩ）、活性化カスパーゼ−３及びカスパーゼ−７に特異的に結合する染料、レセプター及びミトコンドリアル媒介アポトーシスの両方の主要エフェクターカスパーゼのきわめて強い増大を導いた。ＩＲＸ−２を用いたプレ処置は、ＭＶが誘発するカスパーゼ−３及び７活性の誘導、非可逆カスパーゼインヒビターｚＶＡＤ、及び抗−Ｆａｓ中和モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＺＢ４を完全に防止した。ＭＶによるカスパーゼ−３活性化は、また、ウエスタン免疫ブロット分析で検出され、ここでは、非活性カスパーゼ−３プロ−形態のタンパク質レベルの劇的な減少と同時の活性開裂形態の増大がＭＶ処置ジャーカットＴ細胞内で２４時間にわたり観測された（図１０Ｂ、レーン３及び４）。ＩＲＸ−２プレ処置は、活性な開裂形態の誘発を効果的にブロックした（図１０Ｂ、レーン５及び６）。細胞を、処置せず、ＩＲＸ−２（１：３希釈）で２４時間処置（＋ＩＲＸ）、ＭＶ（１０μｇ）で３時間処置（＋ＭＶ３時間）又は２４時間処置（＋ＭＶ２４時間）、若しくはＩＲＸ−２で２４時間プレインキュベーションし、次いでＭＶ（１０μｇ）で３時間又は２４時間処置（＋ＩＲＸ→ＭＶ）のいずれかをした。全細胞ライセートをＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、続くウエスタンブロットのためにＰＶＤＦ膜にトランスファーした。カスパーゼ−３の活性化は、活性なプロ−形態の減少、及び活性なサブユニットｐ１７及びｐ１０の出現として示される。結果は、３つのウエスタンブロットを表している。
【０１６２】
さらに、ＩＲＸ−２は、ジャーカットＴ細胞でのミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ）のＭＶ誘発低下をブロックした（図１１Ａ及び１１Ｂ）。このブロックは、二つのインヒビターｚ−ＶＡＤ及びＺＢ４により提供されるものと等価であった（図１１Ｂ）。ＣＤ８＋ジャーカット細胞を、フロー・サイトメトリーでカチオン染料ＪＣ−１の赤色蛍光の減少について分析したが、これは、ＭＭＰの低下を示している。無処置、ＭＶ（１０μｇ）単独（ＩＲＸ無し）での処置２４時間後、あるいは、ＩＲＸ−２（１：３希釈）又はＭＶとアポトーシス−インヒビターＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫ（パン−カスパーゼインヒビター；ｃｏｎｃ）又はＺＢ４（抗−Ｆａｓ中和ｍＡｂ，ｃｏｎｃ／ｄｏｓｅ）との組合せでのプレ処置２４時間後のＣＤ８＋ジャーカット細胞の培養物内でＪＣ−１レッド陰性細胞の割合（％）を測定した。内側ミトコンドリアル膜を横切るＨ＋勾配を消失させるプロトノフォアであるカルボニルシアニド３−クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）５０μＭで処置した細胞を、陽性対照として使用した。結果は、結果は、独立した３つの実験の平均±ＳＤである（＊ｐ＜０．００５；＊＊ｐ＜０．００２、ＩＲＸ−２無しの試料との比較）。
【０１６３】
最後に、ＩＲＸ−２プレ処置は、アポトーシスプロセスの最終過程（ｐ＜０．０００２；図１２Ｂ）を表すＴＵＮＥＬアッセイで検出したとおりＭＶ誘発核ＤＮＡの断片化を有意に減少させた（図１２Ａ及び１２Ｂ）。ＣＤ８＋ジャーカット細胞を、未処置（ａ）、ＩＲＸ−２単独に用いて２４時間インキュベーション（ｂ）、又はＭＶ単独に用いて２４時間インキュベーション（ｃ）、若しくはＩＲＸ−２を用いて２４時間プレインキュベーション後、ＭＶで２４時間インキュベーション（ｄ）のいずれかを行い、その後、ＴＵＮＥＬ法により染色し、アポトーシスの指標であるＤＮＡストランド分断（赤色核）を明らかにした。最少３００個のＣＤ８＋ジャーカット細胞を各処置群について計数した。結果は、独立した二つの実験の平均％±ＳＤ（＊ｐ＜０．０００２、ＭＶ処置試料と比較）として表現される。したがって、このデータにより、ＩＲＸ−２は、Ｔ細胞死に終わる関連過程のそれぞれにて防御効果を提示することが確かめられる。
実施例７
ＩＲＸ−２は、ＪＡＫ３及びＳＴＡＴ５の発現のＭＶ誘発ダウン・レギュレーションからＴ細胞を防御する。
【０１６４】
がん患者の血清に由来するＭＶは、ＪＡＫ３及びＳＴＡＴ５をはじめとする分子媒介共通ｙ鎖サイトカインレセプターシグナル系路の発現をダウン・レギュレートすることが以前に観測されている。この系路は、リンパ球、特にＣＤ８＋細胞の発達、維持及び生存に必須であるため、次にＣＤ８＋ジャーカット細胞内でのＪＡＫ３及びＳＴＡＴ５の発現に関するＭＶ及びＩＲＸ−２の作用を試験した。
【０１６５】
ＣＤ８＋ジャーカット細胞を、処置しないか、あるいはＩＲＸ−２（１：３希釈）及び異なる濃度のＭＶで処置した。各処置群からの細胞の全細胞ライセートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、そして、後続のウエスタンブロットのためにＰＶＤＦ膜にトランスファーした。ＪＡＫ３、リン酸化及びトータルＳＴＡＴ５、ＣＤ３ζ及びＦＬＩＰの発現レベルを特異的抗体のついたプローブ膜（ｐｒｏｂｉｎｇ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）により分析した。βアクチン抗体を用いたリプローブは、等しいタンパク質負荷（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｏａｄｉｎｇ）を確認した。
【０１６６】
示された結果は、行った４つの実験を表す。以前に観測したように、ＭＶは、Ｔ細胞においてＪＡＫ３の有意なダウン・レギュレーション（図１８、パネル１、レーン１及び３を比較）を引き起こし、これは、共培養時間の延長により強まった（図１８、パネル１、レーン３及び４）。ＩＲＸ−２単独は、ＪＡＫ３発現を増大させなかったところ（図１８、パネル１、レーン１及び２を比較）、ＭＶ誘発ＪＡＫ３ダウン・レギュレーションを完全に逆行させ、そしてその発現を回復させることが可能であった（図１８、パネル１、レーン３，４をレーン５，６と比較）。さらに、このタンパク質のリン酸化に示されるとおり、ＪＡＫ３シグナル伝達物質であるＳＴＡＴ５の強い活性化をＩＲＸ−２が引き起こした（図１８、パネル２、レーン５）。ＳＴＡＴ５のこの劇的な活性化は、ＭＶを用いた長期（２４時間）インキュベーションの後さえも継続した（図１８、パネル２、レーン６）。さらに、Ｔ細胞内でのＣＤ３ζ発現の低下が、ＭＶ処置後に観測された。ここで再び、ＩＲＸ−２を用いたプレインキュベーションは、ＭＶ媒介ＣＤ３ζダウン・レギュレーションからＴリンパ球を防御した（図１８、パネル４、レーン３，４をレーン５，６と比較）。
【０１６７】
これらの変化はすべて、ＩＲＸ−２内に存在するサイトカインによる、特にＩＬ−２レセプター及びダウン・ストリーム細胞内シグナル分子Ｊａｋ３／Ｓｔａｔ５を通してシグナル伝達することが知られている一次サイトカインＩＬ−２によるアポトーシスからのＩＲＸ−２媒介防御と首尾一貫する。これらのデータは、生存及び刺激シグナルをリンパ性細胞に送る中心であるＩＲＸ−２のダウン・ストリーム分子標的を解明する。
実施例８
ＩＲＸ−２は、プロ−及び抗アポトーシス性タンパク質のＭＶ誘発不均衡を逆行させる。
【０１６８】
アポトーシスからのＴ細胞の防御をＩＲＸ−２が促進するメカニズムをさらに試験するため、さまざまなプロ−及び抗アポトーシス性タンパク質の発現レベルを、活性化ＭＶ処置Ｔリンパ球及びＣＤ８＋ジャーカット細胞内でＩＲＸ−２の存在又は非存在下で定量的フロー・サイトメトリーにより測定した。表３に、いくつかのアポトーシス−関連タンパク質の発現レベルを、ＭＶ処置前後の活性化ＣＤ８＋細胞内平均蛍光強度（ＭＦＩ）として示す。ＭＶを用いたＴ細胞のインキュベーションは、アポトーシス促進性タンパク質Ｂａｘ及びＢｉｍの有意なアップ・レギュレーションと同時に抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、ＦＬＩＰ及びＭｃｌ−１のダウン・レギュレーションをほう起した（表３Ａ）。これは、ＭＶがＴ細胞のアポトーシスを誘発することを示す出願人の以前の発見と一致する。絶対タンパク質レベルが重要であるところ、それは、実際に細胞運命を決定する細胞中に存在するプロ−／抗アポトーシス性タンパク質の比率である。したがって、これらの比率の変化は、細胞状態の最も多くの情報を提供する（表３Ｂ）。ＭＶ又はＩＲＸ−２＋ＭＶを用いた処置の際にＢａｘ／Ｂｃｌ−２、Ｂａｘ／Ｂｃｌ−ｘＬ及びＢｉｍ／Ｍｃｌ−１の比率の劇的な変化が観測された。これらの比の有意なアポトーシス促進性シフトは、ＭＶを用いたインキュベーション時のＣＤ８＋細胞に生じた。対照的に、ＩＲＸ−２を用いたＴ細胞のプレ処置は、図１４Ａに示されるとおり、これらの比の劇的な減少を引き起こし、これは未処置細胞内に存在するものと一致した（表３Ｂ）。活性化末梢血（ＰＢ）ＣＤ８＋細胞を、ＩＲＸ−２（１：３希釈にて）を用いて２４時間、プレインキュベーションし、次いで、１０μｇのＭＶでさらに２４時間処置した。異なるプロ−及び抗アポトーシス性タンパク質の発現レベル（平均蛍光強度）を、定量的フロー・サイトメトリーで測定した。図１４Ｂに示されるように、ＩＲＸ−２処置は、ＭＶ処置後の抗アポトーシス性タンパク質Ｂｃｌ−２及びＭｃｌ−１のレベルを維持することが可能であり、そして、アポトーシス促進性タンパク質Ｂａｘの発現をダウン・レギュレートする。ＭＶ及びＩＲＸ−２は、アポトーシス促進性ＦａｓＬ及びＢｉｄの発現にほとんど影響しなかった（データは示さず）。同様の結果が、活性化一次ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋ジャーカット細胞のＩＲＸ−２インキュベーション及びＭＶ処置の後に得られた。
【０１６９】
プロ−  対  抗アポトーシス性タンパク質のバランスは、細胞がアポトーシスプロセスを完了し、細胞死を生じるかどうかを決定する。ＩＲＸ−２は、アポトーシスへ向かうＭＶ誘発シフトを逆行させ、これは、アポトーシスからの防御を導く。ＢＣＬ−２のようなコア抗アポトーシス性タンパク質をアップ・レギュレートするのに働くという事実は、それが、リンパ性細胞におけるアポトーシスの一般的インヒビターであり、そして、広い範囲の腫瘍由来因子からこれらの細胞を防御するのに有益であることを証明している。
【表３】
0005563472.tif 000004
ａ  活性化末梢血（ＰＢ）ＣＤ８＋細胞を、ＩＲＸ−２（１：３希釈にて、〜４ｎｇ／ｍｌ又は９０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含有）とともに２４時間プレインキュベーションし、その後、１０μｇのＭＶでさらに２４時間処置した。異なるプロ−及び抗アポトーシス性タンパク質の発現レベル（平均蛍光強度）を、定量的フロー・サイトメトリーにより測定した。データは、独立した３つの実験で得られた平均±ＳＤである。
ｂ  Ｐ値は、未処置とＭＶ処置又はＩＲＸ−２＋ＭＶ処置細胞との間の比の有意な変化を示す。
実施例９
Ａｋｔ／ＰＩ３Ｋ系路は、ＩＲＸ−２の抗アポトーシス性活性の主要なダウン・ストリーム標的である。
【０１７０】
Ａｋｔ／ＰＩ３Ｋシグナル伝達系路は、細胞生存を調節する際の最も重要な系路の一つとして認識される。われわれの発見は、Ａｋｔ／ＰＫＢによって調節されるＢｃｌ−２ファミリーのいくつかのキータンパク質にＩＲＸ−２が実質的な影響を示したので、われわれは、二つの主要な調節リン酸化部位の一つであるホスホセリン４７３に特異的な抗体を用いて、ＭＶ及び／又はＩＲＸ−２に応答したＡｋｔ−１／２の活性化を測定した。ＣＤ８＋ジャーカット細胞を、処置せず、又はＩＲＸ−２及びＭＶ（１０μｇ）を指定した異なる組合せで用いて処置した。各処置群からの細胞の全細胞ライセートをＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、そして、後続のウエスタンブロットのためにＰＶＤＦ膜にトランスファーした。Ａｋｔ−１／２の活性化を、Ｓｅｒ４７３−特異的抗−ホスホＡｋｔ  ｍＡｂを用いた免疫ブロットで分析した。トータルＡｋｔ抗体を用いたリプロービングは、等しいタンパク質負荷を確認した。示された結果は、行った３つのうちの１つを表している。
【０１７１】
未処置ＣＤ８＋ジャーカット細胞（コントロール）では、Ａｋｔ−１／２は、ジャーカット細胞の特徴的レベルまで恒常的にリン酸化された（図２０Ａ、パネル１、レーン１）。ＩＲＸ−２を用いたプレインキュベーションは、基礎のＡｋｔリン酸化を増強しなかった（図１５Ａ、パネル１、レーン２）。しかし、細胞をＭＶで処置したときは、Ａｋｔ−１／２の劇的な時間依存性脱リン酸化が観測された（図２０Ａ、パネル１、レーン３及び４）。１０μｇのＭＶを用いての経時変化は、Ａｋｔ脱リン酸化がインキュベーション３時間で始まり、そして時間が経つにつれて強化した（データは示さず）ことを示した。ＩＲＸ−２でプレ処置したジャーカット細胞は、処置３及び２４時間にＡｋｔ−１／２のＭＶ誘発脱リン酸化を完全に抑制した（図２１５Ａ、パネル１、レーン５及び６）。
【０１７２】
ＭＶ誘発Ａｋｔ不活性化を明らかに妨げるＣＤ８＋ジャーカット細胞におけるＩＲＸ−２のこの明白なプロ−生存効果は、Ａｋｔは、ＩＲＸ−２シグナル伝達の主要なダウン・ストリーム標的として働いたのかもしれないことを示した。この仮説を確認するため、ＩＲＸ−２及びＭＶ処置に先駆けてＣＤ８＋ジャーカット細胞をＡｋｔ，Ａｋｔｉ−１／２に特異的な小分子インヒビターを用いてプレインキュベーションし、そして、Ｔ細胞アポトーシスのレベルを測定した。ＣＤ８＋ジャーカット細胞をＩＲＸ−２で２４時間プレインキュベーションし、又は、未処置のまま置いた。その後、細胞を、異なる濃度（０−５μＭ）のＡｋｔインヒビター、Ａｋｔｉ−１／２で１時間処置し、さらに３時間、ＭＶを添加した。アポトーシスのレベルを、ＦＩＴＣ−ＶＡＤ−ＦＭＫ染色及びフロー・サイトメトリー分析により測定した。結果は、３つの独立した実験で得られた平均％±ＳＤ（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、ＩＲＸ−２及びＡｋｔインヒビター無しのＭＶ処置試料との比較）である。
【０１７３】
図１５Ｂに示されるように、Ａｋｔインヒビターを用いた細胞のプレ処置は、ＩＲＸ−２の抗アポトーシス性作用の緩和な阻害を生じた。１μＭの比較的低いインヒビター濃度にて、ＩＲＸ−２によって提供されるアポトーシスからの防御は、かすかに抑制されるだけであった。しかし、５μＭのインヒビター濃度では完全にブロックされた。これらのインヒビター濃度では、細胞生存率は影響されなかった（データは示さず）。この発見は、ＡｋｔがＩＲＸ−２によって提供される生存シグナルの主要なダウン・ストリームコーディネーターであることを示す。
実施例１−９の結論
【０１７４】
出願人の以前の発見を確認すると、まず、ＭＶを用いたＣＤ８＋ジャーカット細胞又は活性化Ｔリンパ球のインキュベーションは、有意なレベルのアポトーシスを誘発することが示された。膜形態のＦａｓＬを発現する腫瘍由来ＭＶを、ＰＣＩ−１３腫瘍株化細胞の上清から精製し、そして、ＣＤ８＋ジャーカット細胞又は活性化末梢血（ＰＢ）Ｔ細胞とともに共培養した。ＦａｓＬ（Ｆａｓリガンド）は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーに属するＩＩ型膜貫タンパク質である。ＦａｓＬ−レセプター相互作用は、免疫系の調節、及びがんの進行において重要な役割を演ずる。アポトーシスは、ＦａｓＬがそのレセプター（ＦａｓＲ）と結合し三量化すると誘発され、これは、標的された細胞の膜を死に向けて広がる。ＦａｓＬ＋ＭＶは、活性化されたＴ細胞において、アポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーであるＢａｘ及びＢｉｍのアップ・レギュレーションをともないながら外因性レセプター媒介アポトーシス系路だけでなく、内在性ミトコンドリアル系路を誘発した。ＩＲＸ−２を用いたＣＤ８＋ジャーカット又は活性化一次Ｔ細胞のプレインキュベーションは、用量及び時間依存的な様式でアポトーシス系路を抑圧した。さらに、ＩＲＸ−２を用いたＴ細胞のプレ処置は、ＭＶ誘発細胞死に対してだけでなく、ＣＨ−１１  Ａｂ−及びスタウロスポリン誘発アポトーシスに対する防御ももたらした。前者は主に細胞死レセプター経路を介してアポトーシスを誘発し、そして、後者は、ミトコンドリアル系路も活性化するので、これらの発見は、さらに、ＩＲＸ−２は、外因性及び内在性デス系路の両方の活性化からＴ細胞を防御することができることを示している。
実施例１０
【０１７５】
実験で使用するべきＩＲＸ−２レジメンの投薬量及びスケジュールの選択は、ＩＲＸ療法により行われる研究に基づいた。ＩＲＸ療法の研究は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）ペプチド結合体を用いて免疫し、そして足底腫脹の増大として査定されたマウスで行った。これらのデータ及び特徴的「釣鐘形（ｂｅｌｌ−ｓｈａｐｅｄ）」曲線を図２１に示す。
【０１７６】
研究は、以下の表４に示すように、４群の患者で行った。腫瘍リンパ球浸潤の図及びこれらの群の生存率を、それぞれ、図１７及び１８に表す。
【表４】
0005563472.tif 000005
【０１７７】
この研究では、ＩＬ−２当量１１５Ｕ／日を１０日間処置した患者について最大のリンパ性浸潤を達成した。生存率は、最低の投薬量を受けた４患者で貧弱であった（レジメン１）。同様に、最高の投薬量で処置した６患者でより貧弱な生存率が特記された。レジメン２及び３について生存率が同程度のようであったが、レジメン２の患者は、リンパ性浸潤で測定されるような最も顕著な組織学的応答を経験した。
【０１７８】
さらに研究すべきＩＲＸ−２の用量を、結果として、調査した二つの最も活性な投薬量（レジメン２及び３）の中間、腫瘍及びリンパ節内で有意な組織学的変化を達成するのにはっきりと適した投薬量として選択した。２０日対１０日の処置の付加的不都合及び、より高い投薬量を受けた患者のより低いリンパ性浸潤に基づいて、両側注射を用いる１０日注射プロトコル（ＩＲＸ−２全約２３００Ｕ）を以下に議論するさらなる研究のために選択した。
実施例１１
【０１７９】
図１に記載されるような手術及び／又は放射線療法及び／又は放射線化学療法に先立つＨ＆ＮＳＣＣ患者でＩＲＸ−２プロトコルの研究を行った。ＩＲＸ−２を１１５単位／側にて両側投与した。２７名の患者を処置した。そのデモグラフィックスを表５にまとめた。
【表５】
0005563472.tif 000006
【０１８０】
手術開始及び前に放射線医学的検討（ＣＴ又はＭＲＩ）を行って中央（Ｐｅｒｃｅｐｔｉｖｅ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で検討した。手術の開始及び前に血液のさまざまな白血球集団（表６及び７）を中央（Ｉｍｍｕｎｏｓｉｔｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）で分析した。さまざまな白血球マーカー（表８）について組織学的変化及び免疫組織化学の成果を評価するために、外科試料をセントラル・リファレンス・ラボラトリー（Ｐｈｅｎｏｐａｔｈ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）へ送った。モニターすべき無病及び全体生存率の継続を通して毒物学的及び症状の改善を評価するために適切な実験室及び臨床測定を行った。
臨床成績
【０１８１】
３名の患者が目的の腫瘍応答を有した（２ＰＲ；１ＭＲ）。４名の患者が放射線学的応答（＞１２．５％減少）を示し、５名の患者（Ｎ２，Ｎ２，Ｎ１，Ｎ１，Ｎ１）は当該部位で腫瘍ポジティブとして検出された節のステージが下がり、そして、中央では（ｃｅｎｔｒａｌｌｙ）外科検体が陰性を示した。４名の腫瘍が軟化し（ポジティブサイン）、１４名の患者が、症候改善／痛み及び圧痛の減少、嚥下作用の改善、並びに出血の低下をもった。吐き気、嘔吐、口渇、便秘、注射部位の痛み、頭痛、筋痛、貧血及び挫傷をはじめとする治療に関連した副作用は、一般に緩和（グレードＩ又はＩＩ）でありかつまれであった。グレードＩＩＩの消化不良の一例が観測された。無病及び全体生存率を追跡しているところである。ほとんどの患者は１年をクリアーし、生存曲線は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｅｘｉｃｏでの研究において以前に出願人が観測したものと密に近似し、そして、米国及びメキシコ人の症例一致コントロール（ｃａｓｅ−ｍａｔｃｈｅｄ  Ｕ．Ｓ．  ａｎｄ  Ｍｅｘｉｃａｎ  ｃｏｎｔｒｏｌｅｓ）よりも良好なようである。
実施例１２
【０１８２】
免疫表現型検査の研究のためにヘパリン添加血を採集し、Ｂ、Ｔ、ＮＫ、並びにＴナイーブ、Ｔ記憶細胞及びＴエフェクター細胞を含む免疫細胞サブセットの数を測定した。指定した細胞表面マーカー（又は対応するアイソトープコントロール）に対する蛍光タグモノクローナル抗体を使用してフレッシュな未分画全血を染色した。
【０１８３】
次いで、染色及び固定された試料を獲得し、そして、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＦＣ５００フロー・サイトメーター及びＣＸＰ（ＴＭ）解析ソフトウエアを用いたマルチパラメーターフロー・サイトメトリーで分析した。Ｆｌｏｗ  Ｃｏｕｎｔ（ＴＭ）ビーズを採用するこのシングルプラットフォーム（フロー・サイトメトリーのみ）法を用いた絶対Ｔリンパ球サブセットの数値は、デュアル（血液分析装置及びフロー・サイトメトリー）プラットフォーム技術（Ｒｅｉｍａｎｎら、２０００）よりも正確であることを証明している。以下の表６は、ＩｍｍｕｎｏＳｉｔｅで分析した免疫マーカーのリスト及び免疫化におけるそれらの役割を表す。
【表６】
0005563472.tif 000007
【０１８４】
本発明の目的のために、免疫化を生起するか否かの仮説を評価するのに直接的に関連する細胞集団のみを以下に検討する。
【０１８５】
Ｔリンパ球、特にＣＤ８＋Ｔ細胞のための発生経路は、過去１０年にわたり、特にＣＤ８＋Ｔ細胞に集中して徹底的に研究されており、なぜなら、それらは、効果的な抗腫瘍免疫と最も密接に関連するからである。ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞及びＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞の両方とも、相互のＣＤ４５ＲＡ＋及びＣＤ４５ＲＯ＋亜集団に細分化することができる。ＣＤ４５ＲＡ＋細胞は、以前は、ナイーブＴ細胞と呼ばれていたが、より最近の研究は、血液中のこれらのＴ細胞は、ナイーブＴ細胞とともに、ＴＥＭＲＡとよく呼ばれるより充分に分化したエフェクターを含む（Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ、２００５；Ｋａｅｃｈ、２００２）。ＣＤ４５ＲＯ＋（ＣＤ４５ＲＡ−）記憶Ｔ細胞は、また、Ｔセントラル記憶（ＴＣＭ）及びＴエフェクター記憶（ＴＥＭ）に細分化することができる。これらの下位分類は、ＣＣＲ７（Ｓａｌｌｕｓｔｏ、１９９９；Ｔｏｍｉｙａｍａ、２００４）を含む追加のマーカーの表面発現に基づく。さまざまなＴ細胞サブセットの発生系路及びそれらの系列関係は複雑なままである。重要性についてのデータ及び試験を以下の表７に表す。
【表７】
0005563472.tif 000008
【０１８６】
ＩＲＸ−２はＴ細胞及びＤＣ上で作用して、活性化、成熟、ナイーブＴ細胞への内因性腫瘍抗原提示の増強を促進するという仮説と一致して、ナイーブＴ細胞集団（ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋）はベースライン２１日との間で減少したことが観測された。ナイーブＴ細胞は、最初は、成熟ＤＣにより適当な主要組織適合抗原複合体（ＭＣＨ）分子上に現れたときに、抗原認識により活性化される。Ｔ細胞の記憶及び完全なエフェクター機能を産生する後続工程は完全に定義されていないが、いくつかのマーカー、すなわち、ＣＤ４５ＲＡ／ＲＯ及びＣＣＲ７によって定義されるようなＴ細胞の異なる亜集団が確固たる機能特性を有するのは明らかである。例えば、ＣＣＲ７発現はＴ細胞にリンパ節へのホーミング能力を与え、そこで、最も効果的な抗腫瘍プライミングが起きる。
【０１８７】
ナイーブＴ細胞集団（ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋）で、ベースラインの５５．６細胞／ｍＬ３の集団レベルが２１日に１７．４細胞／ｍＬ３落ち込む（ｐ＝０．０２）有意な減退を観測した。ナイーブＴ細胞の喪失は、これらの細胞が発見し、その各自のコクネイト抗原により刺激され、そして、記憶又は十分なエフェクター集団の二者のいずれかである代替の機能集団に分化することから生ずる。
【０１８８】
さらに、セントラル記憶Ｔ細胞集団（ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７＋）はＣＣＲ７＋とともにリンパ節ホーミング傾向を付与し、ベースラインの５６．９細胞／ｍＬ３から２１日の３４．１細胞／ｍＬ３に降下した（ｐ＝０．０２８）。これは、腫瘍抗原に対する免疫化がＩＲＸ−２療法に応答して生起している指標でもある。研究は、Ｔ細胞のＴＣＭ集団が、再刺激で好ましくはリンパ節へホーミングしてそこでより多くのエフェクター、例えば細胞溶解機能を獲得することのできる初期のより「ステムライク（ｓｔｅｍ−ｌｉｋｅ）」な記憶集団を表していることを示している。この集団で見られた有意な減退は、これらのＴＣＭ細胞が血流を出て、そして流入リンパ節へ遊走してそこでさらに活性化されることと一致する。
【０１８９】
一の免疫化後、抗原担持有害物（ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｅａｒｉｎｇ  ｏｆｆｅｎｄｅｒ）への攻撃が求められる他の免疫細胞を待つ。さらに、免疫化仮説のサポートが、Ｂ細胞の有意な低下（ｐ＜０．０１）が観測されたことに観測された。Ｂ細胞はリンパ節中へ動員され、そこで抗原へ暴露され、その後、そこを出て腫瘍内に現れ、そこで、おそらく、腫瘍を直接攻撃するか又は抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）を支援可能な抗体を産生する。
【０１９０】
ここで観測された統計的に有意な変化及び傾向は、ナイーブＴ細胞の免疫化は、ＩＲＸ−２投与が原因で起きていることを強く示している。他にこれらの患者に一次インターベンションが観察されなかったので、これらの変化は、無秩序に起きたようではない。
【０１９１】
ＩＲＸ−２処置が、自己腫瘍抗原に対して免疫化を誘発するという仮説は、また、非無作為健常及びＨ＆ＮＳＣＣコントロール患者と比べたＨ＆ＮＳＣＣリンパ節応答と後続のＩＲＸ−２処置に関して出願人が発表した情報により支持される（Ｍｅｎｅｓｅｓ、２００３）。ＩＲＸ−２処置と関連した顕著なリンパ節応答の特徴は、節の補充とリンパ球の拡張、特にＴリンパ球の拡張であり、これらは、未処置のＨ＆ＮＳＣＣ患者のリンパ節内で激減していることが示された（Ｖｅｒａｓｔｅｇｕｉ、２００２）。おそらくＩＲＸ−２のせいで免疫化中に起きる節の拡張は、また、明確な樹上細胞の欠陥である洞組織球症の逆行と関連することが観測された。これらの変化は、免疫化と一致する。先行研究によれば、腫瘍抗原に対する免疫化は、所属リンパ節のレベルで起き、腫瘍自体でないことが確認される（Ｍａａｓｓ、１９９５）。
組織学
【０１９２】
リンパ節内で免疫化が起きると、新しいキラー記憶Ｔ細胞が発生し、次いで、血管を通って節から出て、そして組織内に流入して抗原性標的（すなわち免疫標的）を求めてパトロールすると考えられる。抗原性標的が同定されたら、キラー記憶Ｔ細胞が組織に浸潤して標的を殺す。細胞性免疫応答が開始されるときは、他の免疫細胞を動員して殺し、そして掃除する工程に参加させる。
【０１９３】
腫瘍へのＴリンパ球浸潤、特にＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤は、腫瘍抗原への免疫化、及びそのような浸潤は、Ｈ＆ＮＳＣＣ、メラノーマ、結直腸がん及び卵巣がんをはじめとする多様ながんにおける生存の改善と相関する証拠である（Ｗｏｌｆ、１９８６；Ｐａｇｅｓ，２００５；Ｇａｌｏｎ、２００６）。
【０１９４】
ここでリンパ節内のＩＲＸ−２誘発免疫は、腫瘍内リンパ球浸潤と腫瘍破壊を生じ、そして、特異的免疫細胞の腫瘍内の出現が、抗腫瘍免疫応答の証拠を提供するであろうと仮説された。また、腫瘍への免疫応答は、腫瘍の周辺領域からその腫瘍内領域におよぶびまん性リンパ球浸潤の証拠であると仮説された。
【０１９５】
一次腫瘍生検及び切除検体からのフォルマリン固定パラフィン埋め込みブロック又は未染色スライドをヘマトキシリン及びエオシン（「Ｈ＆Ｅ」）及び免疫組織化学染色（「ＩＨＣ」）用に臨床部門がＰｈｅｎｏＰａｔｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）へ提出した。ＩＲＸ−２研究の被験者２６名からのペアサンプルを提出し、２５が評価可能であり、そして外科用標本１個は腫瘍の組織学的証拠がなかった。Ｈ＆Ｅ比較研究の最後に、外科用標本の二つのアドホックコンパレータ群を採取した：ＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎから２５個の外科用標本、及びＳｔｏｎｙ  Ｂｒｏｏｋ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｅｎｔｅｒから１０個の外科用標本であり、これらは、未処置のＨ＆ＮＳＣＣ外科用標本から無秩序に選択された。
【０１９６】
免疫組織化学染色はＩＲＸ−２処置試料についてのみ行い、腫瘍内の免疫マーカーの存在を測定した。それらのマーカーを表８にリストする。
【表８】
0005563472.tif 000009
【０１９７】
ＩＨＣ染色マーカーの存在を低出力のもとで評価し、そして、予測的に定義された０−１００ｍｍ視覚的アナログスケール（ＶＡＳ）用いてグレード付けし、ここで０は、マーカーを陽性染色する細胞の出現０％を表し、そして１００は出現１００％を表した。マーカーを強調するために使用したペルオキシダーゼ反応は、Ｈ＆Ｅ染色と比べてリンパ球浸潤の面積又は密度を過剰評価するので、ＩＨＣをベースとする密度測定の信憑性を乏しくするが、ＩＨＣは、細胞型間の相関関係を解明するのに依然として有効である。
Ｈ＆Ｓ研究：方法及び解析
【０１９８】
Ｈ＆Ｅ染色スライドを比較する３つの分析を行った。２つの分析は、２５個のＩＲＸ−２処置外科用標本、及びＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎから得た２５個の未処置の外科用標本のブラインド抽出であり、一つは腫瘍特性について、そして一つは免疫応答特性についてであった。３つ目の分析は、同一であるが、Ｓｔｏｎｙ  Ｂｒｏｏｋから得た１０個のブレンドしないＨ＆Ｅ染色スライドからの免疫応答の特徴抽出であった。各ケースにおいて、特徴を抽出し、ＶＡＳを用いて症例報告書へ定量化した。
【０１９９】
免疫応答の特徴について２つの評価を行い、１つ目の評価は、外科標本全体にわたるマーカー全体の存在であり、２つ目は、浸潤の場所が腫瘍の周囲又は腫瘍内の程度に対してであった。
【０２００】
全体評価は、リンパ球浸潤、その密度、腫瘍と浸潤との間のバランス、及び、腫瘍形態の印象を含む他の特徴を考慮してなされた。他の準特徴には、腫瘍のあった場所だがもはやないことを示唆する繊維化及び壊死の大きさが含まれ、そしてよく分化した扁平細胞がんの場合は、最小のがん真珠（ｋｅｒａｔｉｎ  ｐｅａｒｌｓ）の終結又はそれを囲む非腫瘍は、腫瘍破壊の別のサインである。「活性な免疫学的応答」には、免疫系によって作られた損傷のリンパ性浸潤の証拠、及び、腫瘍がもはや生存できずに破壊される程度、すなわち、ホストが腫瘍と戦っている程度や過程が含まれる。「活性免疫応答」のリンパ球浸潤準特徴を図１９及び２０に示す。
【０２０１】
変化する活性な免疫応答に関する有力な準特徴の一つは、ＩＲＸ−２で処置した患者内に観察されるリンパ球浸潤（ＬＩ）の局在と強度である。ＩＲＸ−２処置患者及びアドホックコンパレータ群の両方でこの反応を裏付ける外科標本は、総合ＬＩ、腫瘍周囲ＬＩ、及び腫瘍内ＬＩの密度の顕著な増大を実証した。
【０２０２】
ＶＡＳ上で５０ｍｍ以上の予め決めた臨界点に基づく解析は、以下の表９に示す３つの群の外科標本で異なる活性免疫応答率を示した。
【表９】
0005563472.tif 000010
【０２０３】
活性免疫応答を発揮したこれらの患者の頻度の増大は、ＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ及びＳｔｏｎｙ  Ｂｒｏｏｋ群をまとめて２０％からＩＲＸ−２処置群の４４％にわたった（ｐ＜０．０５、カイ二乗検定による）。
腫瘍周囲ＬＩ  対  腫瘍内ＬＩの測定
【０２０４】
腫瘍内の免疫細胞の場所もまた評価した。本明細書では、活性な抗腫瘍免疫応答は、腫瘍周囲領域から腫瘍内領域を含めるように拡大したリンパ球浸潤を含むであろうと仮説した。
【０２０５】
ＩＲＸ処置患者の活性免疫応答のＶＡＳ分析に基づいて、１１名が強い反応を示し（≧５０，応答者と呼ぶ）、そして１４名があまり強くない反応を示した（＜５０，非応答者と呼ぶ）。これらの２群のＬＩの比較を図２１Ａ及び２１Ｂに示す。
【０２０６】
見てとれるように、応答者は、非応答者に比べて、代表的なセクションのＬＩ（領域及び密度の両方）の顕著な増大を示し、腫瘍内ＬＩの増大は、腫瘍周囲の変化よりも比例してかなり大であった。
【０２０７】
さまざまなマーカーの位置の免疫組織化学は、どの細胞が各領域で優位を占めるかを明確にするのに役立つ。図２２はこれらの結果を示す。標本中の約２５％のＬＩを示す腫瘍周囲浸潤は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋Ｔリンパ球及びＣＤ２０＋Ｂリンパ球が優勢であった。一方、標本中の約７５％のＬＩを示す腫瘍内浸潤は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ３＋及びＣＤ８＋リンパ球（すなわち、「キラー」エフェクターＴ細胞表現型）並びにＣＤ６８＋マクロファージが優勢であった。図２３は、ＩＲＸ−２処置外科標本におけるＣＤ４５ＲＯ＋記憶Ｔ細胞のＩＨＣ染色の画像例を提供する。表１０は、腫瘍内の各細胞集団の存在の結果を示す。
【表１０】
0005563472.tif 000011
＊１００ｍｍ視覚的アナログスケール（ＶＡＳ）評価に基づく測定
【０２０８】
この免疫化仮説の最も強い支持は、腫瘍内及び腫瘍周囲の浸潤についてのリンパ球浸潤試験、並びに壊死、繊維化及び腫瘍減少を示す腫瘍拒絶の写真に由来する。拒絶パターンは、それぞれ、腫瘍内に増大したＢリンパ球及び活性化マクロファージをもつ液性及び細胞性免疫の両方に特徴的である。がん患者に見られる免疫抑制を克服し、そして免疫機能を回復することでバランスを免疫監視へバックさせることにより、ＩＲＸ−２療法は、ホストに腫瘍を拒絶させ、そして、腫瘍に対して自己免疫させて再発の減少と生存の増大へ導く。
実施例１３
【０２０９】
一の患者で、図２４に示すように、融合ＦＤＧ  ＰＥＴ／ＣＴスキャンを、０日と２１日で比較した。全解糖活性（ｔｏｔａｌ  ｇｌｙｃｏｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）及び体積を測定し、表１１に示す。
【表１１】
0005563472.tif 000012
実施例１４
【０２１０】
患者全体（図２５）とステージＩＶａの患者（図２６）の両者について全生存率を測定した。図２５は、全生存率の３つのカプラン・マイヤー曲線を示す。上段の線は、最近完了した多施設フェーズ２研究（１８．６ヶ月の追跡期間中央値）であり、中段の線は、１０年前に完了した単一施設フェーズ１／２であり、そして、最もよく利用されるコンパレータ（無作為部位適合（ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｓｉｔｅ  ｍａｔｃｈｅｄ）ＲＴＯＧ９５０１試験）と比べたたものである。両ＩＲＸ−２処置群では、生存率が、解剖部位適合（ａｎａｔｏｍｉｃ  ｓｉｔｅ−ｍａｔｃｈｅｄ）ＲＴＯＧ  ９５０１試験データよりも高い。このデータは、ＩＲＸ−２が推進する免疫化が永続的であり、そして、生存率の改善を導くことを示唆する。図２６は、ステージＩｖａ集団の全体生存率に関する３つのカプラン・マイヤー曲線を示す。上段の線は、最近完了した多施設フェーズ２研究（１８．６ヶ月の中間追跡値）であり、中段の線は、１０年前に完了した単一施設フェーズ１／２であり、そして、最もよく利用されるコンパレータ（無作為部位適合ＲＴＯＧ９５０１試験）と比べたたものである。両ＩＲＸ−２処置群では、生存率が、解剖部位適合ＲＴＯＧ  ９５０１試験データよりも高い。このデータは、ＩＲＸ−２が推進する免疫化が永続的であり、そして、ステージＩＶａ患者の生存率の改善を導くことを示唆する。
実施例１５
【０２１１】
ＩＲＸ−２は、所属リンパ節のサイズ、Ｔ細胞領域及び密度を増大させ、そして洞組織球症を逆行させることが示された。コントロール、Ｈ＆ＮＳＣＣコントロール、及びＩＲＸ−２の投与されたＨ＆ＮＳＣＣ患者を、図２７Ａ−Ｄで比較する。ＩＲＸ−２プロトコルで処置したＨ＆ＮＳＣＣをもつ全５０名から２０名の患者を、評価に適した複雑でない領域リンパ節をもつとして選択した。すべてが臨床応答を示し、それは、部分応答（ＰＲ，＞５０％腫瘍減少）又はマイナー応答（ＭＲ，＜５０％  ＞２５％腫瘍減少）のいずれかであった。完全な応答者（３／５０）及び非応答者（５／５０）を明らかな理由のため除外した。１０名の未処置Ｈ＆ＮＳＣＣコントロールＬＮ標本を、一コントロール群（Ｈ＆ＮＳＣＣコントロール）としてランダムに選択し、そして、１０名の非がんコントロールＬＮ生検を、ランダムに選択した（コントロール群）。明白なＬＮ病態は、コントロール群から除外した。全体的に、９５％のＩＲＸ−２  ＬＮ、８０％の非がんコントロール、及び６０％のＨ＆ＮＳＣＣコントロールは、刺激と判断された。全体的に、ＩＲＸ−２処置患者のＬＮは、Ｔ細胞反応性へのシフトをもって高い割合（％）の刺激を示した。Ｈ＆ＮＳＣＣコントロールのＬＮの平均サイズは、コントロール群より有意に小さく、そして、ＩＲＸ−２処置Ｈ＆ＮＳＣＣ患者のものは、がん及び非がんコントロールよりも有意に大きかった（ｐ‘ｓ＜０．０１）（図２７Ａ）。サブトラクションによりそしてＰＡＳ染色により非−Ｔ及びＢ細胞「他の細胞」ＬＮ領域は、全体の２５％であり、そして洞組織球症の程度にほとんど相当した（図５）。洞組織球症がＨ＆ＮＳＣＣコントロールに特徴づけられ、他の群にないことは注目すべきである。１０名のＨ＆ＮＳＣＣコントロールのうち９名（しかし他のケースでは０）において、赤血球での副鼻腔うっ血も観測された。しかし、ｈｉｓ−リンパ球、Ｂ及びＰＣ又はＴリンパ球のいずれかによる赤血球食細胞増加症を計数し、そして、対応のリンパ性集団をもつリンパ節の領域と関連させた（図２７Ｃ）。Ｈ＆ＮＳＣＣコントロールのＴ細胞領域は、非がんコントロールと比べて適度に減少し（ｐ＝ＮＳ）、そして密度が有意に減少した（ｐ＜０．０１）（図２７Ｂ）。ＩＲＸ−２処置患者のＴ細胞領域は、非がんコントロールと比べて適度に増加し（ｐ＝ＮＳ）、そしてＨ＆ＮＳＣＣコントロールを顕著に越えた（ｐ＜０．０１）。ＩＲＸ−２処置ＬＮのＴ細胞密度は、両コントロールよりも有意に大きかった（ｐ‘ｓ＜０．０１）（図２７Ｄ）。
実施例１６
【０２１２】
図２８Ａ−Ｄの洞組織球症は、大多数の大顆粒ＰＡＳ−陽性細胞、及び少数のサイズのさまざまなＣＤ３＋Ｔ細胞によって特徴づけられる。図２８Ａは、洞組織球症をもつＨＮＳＣＣコントロールの典型例を表す。図２８Ｂは、洞をもつリンパ節のＣＤ６８＋染色を示す。ＩＲＸ−２での処置は、ＨＮＳＣＣコントロールに明白な洞組織球症の逆行と関連した。図２８Ｃは、洞組織球症及び赤血球うっ血をもつリンパ節の典型的な例を示す。図２８Ｄは、ＩＲＸ−２処置患者でのを洞組織球症の逆行を示す棒グラフである。
実施例１７
【０２１３】
図２９Ａ−Ｆの上段パネルは、頭頸部扁平上皮がん（Ｈ＆ＮＳＣＣ）をもつ三名の患者のプレ処置バイオプシーの例を示す。バイオプシーは、平均８０％の腫瘍、及び、ストロマ内にリンパ球が軽く散在した２０％のストロマになる。下段のパネルは、後でＩＲＸ−２レジメンの処置をする腫瘍の典型的部分を示す。腫瘍と置換されるリンパ球の激しい浸潤は注目に値する。ＩＮＣＡＮでのこの試験では、２５名中２２名（８８％）が応答を示した。
実施例１８
【０２１４】
図３０は、ＵＳ２相試験で、ＩＲＸ−２レジメンで処置した１１名の応答患者（４４％）と１４名の非応答患者の外科標本の壊死及び繊維化の強度を示す。
実施例１９
【０２１５】
図３１Ａ−Ｄに示すように、ＩＲＸ−２は、腫瘍破壊をほう起するキラーＴ細胞浸潤を刺激することが示される。図３１Ａ−Ｄは、ＩＲＸ−２で処置した患者からの切除標本のＨ＆Ｅ及びＩＨＣ（免疫組織化学）染色である。腫瘍の不均一性にもかかわらず、図３１Ｂの写真にとられ、そして、リンパ球の湖が矢で注記されたリンパ球の活発な浸潤の頻度の増大が見られる。図３１Ｄの写真の免疫組織化学染色により、浸潤はＣＤ４５ＲＯ記憶キラーＴ細胞表現型であることが確かめられる。腫瘍へのリンパ球浸潤が、結直腸、卵巣、乳房、頭頸部のがんにおける成績の改善を予見する証拠が次々にでている。リンパ球浸潤は、なぜ、患者に再発なく予想よりも長く生きるようになるかに関する架け橋を提供し、微小転移を攻撃することができ、それにより再発を遅延又は防止し、生存率を改善する免疫記憶の結果である。
実施例２０  
【０２１６】
腫瘍内対腫瘍周囲の浸潤を比較するため、免疫組織化学を行った。免疫組織化学染色に基づく腫瘍切除標本内の免疫細胞の全体の存在（ｏｖｅｒａｌｌ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ）と位置の評価から得られる要約データを、表１２に示す。腫瘍周囲領域のＢ細胞の複合的存在、及び、本質的に活性化ＣＤ６８＋マクロファージと共存するＣＤ８＋及びＣＤ４５ＲＯ＋（すなわち、「キラー」エフェクターＴ細胞表現型）である拡散した腫瘍内リンパ球浸潤は、抗原刺激及び抗腫瘍免疫応答を示唆する。
【表１２】
0005563472.tif 000013
実施例２１
樹状細胞
【０２１７】
ＩＲＸ−２が作用するキーとなる細胞の一タイプは、樹状細胞である。がん患者は、抗原取り込み、抗原提示、及び効果的なＴ細胞刺激に必要なシグナル分子の発現の減少の結果として樹状細胞機能が減じている。
【０２１８】
図３２に示すように、Ｔ細胞刺激及び樹状細胞への接着のキーとなるシグナル分子は、ＣＤ８６、ＣＤ４０及びＣＤ５４である。がん患者では、稼動部分（ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）を提示する抗原の成分は、樹状細胞においてダウン・レギュレートし、Ｔ細胞に対する効果的な抗原提示の減少を生じる。ＩＲＸ−２は、樹状細胞を表現型的及び機能的の両方で活性化し、そして成熟させることができる。可動部分を提示する抗原の発現を増大させることにより、ＩＲＸ−２は、抗原提示機能を回復させるよう作用する。
【０２１９】
図３３に、可動部分を提示する樹状細胞の抗原へのＩＲＸ−２の作用及びＴ細胞刺激能を示した統計的に高い有意性を示すフロー・サイトメトリーデータを示す。ＨＬＡ−ＤＲアップ・レギュレーションが樹状細胞により要求され、ＭＨＣクラスＩＩ溝内に抗原を提示する。ＣＤ８６は、ナイーブＴ細胞の同時刺激レセプターであり、それは、Ｔ細胞活性化及びキラー記憶Ｔ細胞産生のために要求されるシグナルの一つである。ＣＤ８６を発現しない樹状細胞は、免疫寛容性樹状細胞であり、そして、抗原特異的抑制型制御性Ｔ細胞を産生するよう機能する。ＩＲＸ−２を投与し、そして同時刺激タンパク質を増大させることにより、このバランスを免疫寛容性樹状細胞から活性化樹状細胞へとシフトさせることが可能であり、そして、免疫標的に対して連携かつ強固な免疫応答が開始される。
【０２２０】
図３４に、樹状細胞の潜在的Ｔ細胞刺激能へのＩＲＸ−２の作用を示した統計的に高い有意性を示すフロー・サイトメトリーデータを示す。ＣＤ４０発現の増大は、持続したＴ細胞活性化及び記憶Ｔ細胞の産生に必要である。ＣＤ５４は、また、ＩＣＡＭ−１と呼ばれ、そして、樹状細胞−Ｔ細胞相互作用に関わり、そして、Ｔ細胞活性に必要な二番目のシグナルを提供する。したがって、樹状細胞内のこれらの分子のアップ・レギュレーションにより、ＩＲＸ−２により開始された細胞性免疫応答が持続かつ強固であることが確実になる。
【０２２１】
図４５に、さまざまな希釈のＩＲＸ−２及び組換体ＴＮＦと、成熟樹状細胞のマーカーであるＣＤ８３発現をアップ・レギュレートするそれらの能力を比較したデータを示す。ＩＲＸ−２内に生理学的量存在する複数の活性成分は、相乗的に作用して、ＩＲＸ−２内に存在するＴＮＦの約４倍当量だけＣＤ８３発現を増大する。ＴＮＦ単独で同様の結果を達成するには、１０−２５倍の濃度が必要であったが、その量は、組織又はリンパ節内の濃度を明らかに超えている（超生理的／薬理学的）。
【０２２２】
図３６に、樹状細胞のＴ細胞増殖を誘発する能力を測定するアッセイからのデータ、樹状細胞のナイーブＴ細胞活性化能の機能的評価を示す。ＩＲＸ−２は、ＤＣのＴ細胞刺激活性を増強する。未熟ＤＣ（ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ４ｘ７ｄ）を、ＩＲＸ−２、又は、Ｘ−ＶＩＶＯ  １０媒体単独のコントロール（それぞれ、黒丸又は白丸）で刺激した。４８時間後、ＤＣを収穫し、激しく洗浄し、そして、丸底９６ウエルマイクロタイタープレート内で、指示したスティミュレーター（ＤＣ）対レスポンダー（Ｔ）比のナイロン・ウール精製同種異系Ｔ細胞（２ｘ１０５／ウエル）とともに共培養した。共培養５日目、細胞にＢｒｄＵをパルシングし、１８時間後取り込まれたＢｒｄＵを比色抗ＢｒｄＵ  ＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。このグラフは、試験した６名の各ドナーのうち代表的なドナーからの結果を示し、試験した４ＤＣ：Ｔ比における平均刺激指数（Ｓ．Ｉ．）（＋／−ＳＥＭ）として表した。Ｓ．Ｉ．は［（ＤＣ刺激Ｔ細胞のＯ．Ｄ．−ＤＣ単独のＯ．Ｄ．）／休止期Ｔ細胞のＯ．Ｄ．］として定義される。６名すべてのドナーからのＤＣ：Ｔ比の全範囲にわたる平均Ｓ．Ｉ．は、ＩＲＸ−２処置ＤＣを刺激薬として使用した場合に統計的に有意な改善を示した（ｐ＜．０．０５，  ＡＮＯＶＡによる）。ＩＲＸ−２処置樹状細胞のＴ細胞増殖を誘発する能力の有意な増大があり、ＩＲＸ−２によって誘発された樹状細胞表現型変化は、また、Ｔ細胞刺激及び増殖を効果的にほう起する能力を有する機能的に活性な樹状細胞を生じることを確認した。
実施例２２
ＩＲＸ−２は、ペプチド−特異的ＩＦＮ−γ産生及びＤＴＨを増強する。
【０２２３】
さまざまな用量のＰＳＭＡペプチドで、ＩＲＸ−２とともにあるいは無しにマウスを免疫した。ぺプチド又は結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）攻撃後のＴ細胞応答を、ＤＴＨ応答（図３７Ａ）又は、後続のペプチドに応答したＩＦＮ−γ産生（図３７Ｂ）により評価した。ＩＲＸ−２＋結合型ワクチンは、ｉｎ  ｖｉｖｏ（ＤＴＨ）及びｅｘ  ｖｉｖｏ（脾臓リンパ球によるＩＦＮ−γ産生）での抗原特異的細胞性Ｔ細胞応答を増強する。これは、効果的がんワクチンにおいて細胞性応答が本質的な要求の理由から重要である。また、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｅｘ  ｖｉｖｏでのＴ細胞応答は、両方とも、ＩＲＸ−２とともに使用したワクチンの用量と関連する。用量応答により、応答はワクチン抗原が推し進め、単にＩＲＸ−２のせいでないことが確認される。
実施例２３
ＩＲＸ−２は、ペプチド−特異的ＤＴＨを増強する他のアジュバントより勝る。
【０２２４】
ＩＲＸ−２活性の新規な性質を、ＩＲＸ−２をさまざまなメカニズムを現すのに選択される他のアジュバントと比べることより確認した。広く使用されるＦＤＡ承認アジュバントの理由からミョウバン（Ａｌｕｍ）、抗原提示細胞を標的するＴＬＲアゴニストの理由からＣｐＧ、複数のアジュバント活性を含みそしてフロイントアジュバントよりも安全な選択枝である理由からＲＩＢＩアジュバントシステム（ＲＡＳ）を評価した。図３８に示されるように、試験したすべてのアジュバントは、結合体を攻撃したときにＤＴＨ応答をほう起した。しかし、ＩＲＸ−２のみが、ワクチン結合型に対するペプチド特異的ＤＴＨ応答を増強し、一方、図４３に示すように、ミョウバン、ＣｐＧ及びＲＡＳは増強しなかった。本明細書で報告した研究は、ＩＲＸ−２が治療上有効ながんワクチンにおいて複数の抗原タイプと組み合わせて使用するための外因性抗原に対してＴ細胞免疫応答を増強するという仮説を支持する重要な前臨床データを提供している。結合型ワクチンに対するＴ細胞ペプチド−特異的応答のユニークな性質は、ＩＲＸ−２の作用の複数の標的モードとサイトカイン間の予測された相乗作用の結果である。
実施例２４
末梢循環内の免疫細胞への作用の証拠
【０２２５】
以下のデータは、ベースライン及び２１日における末梢血の免疫モニタリングをまとめたものである。２１日の末梢血におけるＣＣＲ７＋細胞集団（リンパ節ホーミングポテンシャル及びＢ細胞とともに）の統計的に有意な減少は、血行からのこれらの細胞の動員と樹状細胞による活性化のためのリンパ節への加入と一致する。エフェクター細胞数の増大に対する無変化又はかすかな傾向は、一時的に血行内とその後の組織内を通過して抗原標的を殺す細胞障害性Ｔ細胞と一致する。ＩＲＸ−２レジメン処置患者の末梢血内の免疫細胞及びＴ制御性細胞の両方の全変化は、図３９に概略示すように、リンパ節内免疫化、免疫寛容から刺激環境への変化と一致する。
【０２２６】
図４０に、頭頸部がん患者からの末梢血のベースライン及び２１日（ＩＲＸ−２レジメン完了後）におけるＴ制御性細胞の絶対数値を示す。各線は、患者を表し、そして、太線は、グループ平均を表す。いくつかの従前の研究は、Ｔ  ｒｅｇ細胞ががん患者（卵巣、結直腸、肝細胞，ＨＮＳＣＣ）で増加すること、及び、増加した制御性Ｔ細胞は、悪化する予後と関連することを示している。２６名中１８名の患者の制御性Ｔ細胞が２１日のみ同じにとどまるか低下しているという事実は、衝撃的かつ有意な発見であり、なぜなら、免疫寛容樹状細胞は、Ｔ  ｒｅｇ集団を拡張し続けるからである。Ｔ  ｒｅｇカウントをベースラインレベルに安定化するＩＲＸ−２レジメンは、これらの患者の生存率の改善に反映する顕著な発見である。
実施例２５
免疫化と首尾一貫する腫瘍収縮の証拠
【０２２７】
図４１Ａ及び４１Ｂは、５．２ｃｍ大の右舌根部の融合ＦＤＧ−ＰＥＴ／ＣＴスキャンを示し、２１日目に一次腫瘍は、二個の関係するリンパ節とともに、体積５８％の減少及び全解糖活性７５％の減少を示す。抗腫瘍拒絶及び免疫化が起きているという仮説を支持する腫瘍収縮の証拠がある。
実施例２６
【０２２８】
以前は、バイオプシー対腫瘍標本（Ｍｅｎｅｓｅｓ）の組織病理学の評価基準は、
腫瘍が全体に減少したこと、腫瘍の断片化が起きたこと、及び、リンパ球浸潤（ＬＩ）の増大があったことであった。本発明によれば、処置腫瘍対コントロール腫瘍について本明細書に提示した新しい評価基準、すなわち、壊死及び繊維化をともなう腫瘍破壊、及び腫瘍周囲よりも腫瘍内でより大であるＬＩの増大が存在する。以下の表１３に、Ｈ＆ＮＳＣＣへのサイトカイン治療のさまざまな発見を要約する。重要なことは、ＩＲＸ−２は、免疫系のすべてのアーム上で働き、一方、他の複数の成分サイトカイン治療は働かないことが示される。ＭＵＬＴＩＫＩＮＥ（Ｃｅｌ−Ｓｃｉ）は、その組成内に複数のサイトカインを含む。しかし、その効果は、腫瘍自体に関して単一であり、免疫系に関してではない。
【表１３】
0005563472.tif 000014
総括
【０２２９】
この研究は、扁平細胞頭頸部がん患者に手術前の治療で有意な生物学的活性を持つＩＲＸ−２レジメンの能力に関する出願人の従前の所見を確認及び拡張する。本研究は、レジメンに起因する有害事象がほとんど無く治療が安全であることを確認する。実際、リンパ球浸潤の病理組織学的変化の証拠を示したこれらの患者は、痛み及び圧痛の減少、呼吸及び発声の改善、並びに、腫瘍の軟化（溶解のサインとして）のような大部分の症状の改善をもった。３名の患者は、臨床応答（２ＰＲｓ，１ＭＲ）をもつと判断された。全体の生存率データ及び再発フリーの生存率は、未完成であるけれども、助長し、出願人の以前の研究と程度及びプロファイルが同様である。経過観察の最初の１２ヶ月内に再発による死亡が起きなかったことは特筆すべきである。これまでの一名以外のすべての死亡は、非応答者群にある。
【０２３０】
最も無視できないデータは、メカニズム研究に関連したものである。Ｂリンパ球及び二つのＴ細胞サブセットの低下が初期の免疫化とリンパ節ホーミングに関係したことが観測された。血液中に記憶／エフェクター細胞の増加は観測されなかった。しかし、免疫化とともに起きるＴ細胞のトラッフィックパターンに基づいて説明することができる。特に、制御性Ｔ細胞の増加は観測されなかった。
【０２３１】
出願人の従前の研究は、ＩＲＸ−２に応答する患者が、腫瘍近くの関与しないリンパ節、消耗したＴリンパ球領域の補充、及び抗原とともに生起するような活性化の病像の増大を示した。したがって、リンパ球は、血液及びリンパ管を介して領域リンパ節へ輸送し、そこで、リンパ球は、おそらく、自家腫瘍抗原に対して免疫化される。本明細書に示すように、その後、それらは、リンパ節を去り、そして血液によって腫瘍へ移行し、そこで、腫瘍内及び腫瘍周囲に浸潤し、腫瘍破壊（壊死、繊維化及び腫瘍減少）の証拠と関連する。この反応を示す患者では、リンパ球浸潤の増大は、主として、腫瘍周囲のＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞集団及びＣＤ２０＋Ｂリンパ球、並びに腫瘍内のＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔリンパ球集団及びマクロファージと関わる。腫瘍内の変化は、周囲のものより大きい。このメカニズムは、一般に図２に示される。
【０２３２】
特に、未処置患者は、そのような反応をたまに（２０％）示し、ＩＲＸ−２レジメンで処置した患者よりもきわめて低い頻度であるけれども４４％対２０％）、コントロールにおける反応の存在は、良好な成績を予測する新規なバイオマーカーを表している。
【０２３３】
その病像は、臨床的、放射線学的、病理学的及び免疫学的に統合されたものであり、そして、自家腫瘍抗原に対する免疫化のための豊富な証拠を提供する。ＩＲＸ−２は、免疫系のすべてのアームを活性化することが示され、免疫機構の全体の回復及び免疫標的を攻撃する能力を提供する。
【０２３４】
この出願を通して、米国特許を含むさまざまな刊行物を、著者及び年度、並びに特許番号により参照する。刊行物の十分な引用を以下にリストする。本発明が関係する現在の水準をより十分に説明するために、これらの刊行物及び特許の全体の開示を本明細書に参照として本出願に組み込む。
【０２３５】
本発明を例示的に説明しているが、使用してきた用語は、限定よりは説明の単語の本質であることを理解するべきである。
【０２３６】
明らかに、本発明の多くの改変と変更が上記の教示に照らして可能である。したがって、本発明は、添付した請求の範囲内で、特に記載された以外に実施されてもよいと理解されるべきである。
ＲＥＦＥＲＥＮＣＥＳ
Ｄｕｎｎ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ＨＮＳＣＣ：Ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｐｔｉｏｎ？（Ｒｅｖｉｅｗ）．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １３：３−１０，２００５．
Ｅｇａｎ  ＪＥ，ｅｔ  ａｌ．ＩＲＸ−２，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ，ｉｎｄｕｃｅｓ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｊ  ｌｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ３０：６２４−６３３，２００７．  
Ｇａｌｏｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｙｐｅ，ｄｅｎｓｉｔｙ，  ａｎｄ  ｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｔｕｍｏｒｓ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１３：１９６０，２００６．
Ｈａｄｄｅｎ  ＪＷ，ｅｔ  ａｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｎａｔｕｒａｌ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎｓ  ａｎｄ／ｏｒ  ｔｈｙｍｏｓｉｎ  ａｌｐｈａ  １，ｐｏｔｅｎｔｌｙ  ａｕｇｍｅｎｔｓ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ−ｔｒｅａｔｅｄ  ａｇｅｄ  ｍｉｃｅ，ｌｎｔ  Ｊ  ｌｍｍｕｎｏｐｈａｒｍ  １７（１０）：８２１−８２８，１９９５．
Ｈａｄｄｅｎ  ＪＷ，ｅｔ  ａｌ．Ｚｉｎｃ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｔｈｙｍｕｌｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｔｈｙｍｉｃ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ａｕｇｍｅｎｔｓ  ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｙｍｏｃｙｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ，  ｌｎｔ  Ｊ．  ｌｍｍｕｎｏｐｈａｒｍ  １７（９）：７２９−７３３，１９９５．
Ｋａｅｃｈ  ＳＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｍｅｍｏｒｙ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２：２５１，２００１．
Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｍｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｓｅｔｓ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７：３２６，２００５．
Ｍａａｓｓ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｉｍｉｎｇ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｒａｉｎｉｎｇ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅｓ  ａｆｔｅｒ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ：  Ｔｈｒｅｅ  ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ  ｓｔａｇｅｓ  ｍａｙ  ｂｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ  ｔｕｍｏｒ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９２：５５４０，１９９５．
Ｍａｎｔｏｖａｎｉ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ：  ｔｕｍｏｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ａｓ  ａ  ｐａｒａｄｉｇｍ  ｆｏｒ  ｐｏｌａｒｉｚｅｄ  Ｍ２  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｐｈａｇｏｃｙｔｅｓ．  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２３（１１）２００２．
Ｍｅｎｅｓｅｓ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｃａｎｃｅｒ：  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ＩＲＸ−２．  Ｉｎｔ‘ｌ  ｌｍｍｕｎｏｐｈａｒｍ．３：１０８３−１０９１，２００３．
Ｐａｇｅｓ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｍｅｍｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ，  ｅａｒｌｙ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．ＮＥＪＭ  ３５３：２６５４−６６，２００５．
Ｓａｌｌｕｓｔｏ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．  Ｔｗｏ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｏｆ  ｍｅｍｏｒｙ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｈｏｍｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４０１：７０８，１９９９．
Ｔｏｍｉｙａｍａ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｆｌｅｃｔｉｎｇ  ｔｈｅｉｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ：  ｉｎｖｅｒｓｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ２７  ａｎｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３４：９９９，２００４．
Ｖｅｒａｓｔｅｇｕｉ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｇｉｏｎａｌ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅｓ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ．  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０２：３７，２００２．
Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅ  ＴＬ．  ｌｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｎｅ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ３：４６−５５，２００１．
Ｗｏｌｆ  ＧＴ，ｅｔ  ａｌ．Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ／  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｅｘｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ．  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ  Ｈｅａｄ  Ｎｅｃｋ  Ｓｕｒｇ  ９５：１４５，１９８６．
【図１】
0005563472.tif 000015
【図２】
0005563472.tif 000016
【図３】
0005563472.tif 000017
【図４】
0005563472.tif 000018
【図５】
0005563472.tif 000019
【図６】
0005563472.tif 000020
【図７】
0005563472.tif 000021
【図８】
0005563472.tif 000022
【図９】
0005563472.tif 000023
【図１０】
0005563472.tif 000024
【図１１】
0005563472.tif 000025
【図１２】
0005563472.tif 000026
【図１３】
0005563472.tif 000027
【図１４】
0005563472.tif 000028
【図１５】
0005563472.tif 000029
【図１６】
0005563472.tif 000030
【図１７】
0005563472.tif 000031
【図１８】
0005563472.tif 000032
【図１９】
0005563472.tif 000033
【図２０】
0005563472.tif 000034
【図２１】
0005563472.tif 000035
【図２２】
0005563472.tif 000036
【図２３】
0005563472.tif 000037
【図２４】
0005563472.tif 000038
【図２５】
0005563472.tif 000039
【図２６】
0005563472.tif 000040
【図２７】
0005563472.tif 000041
【図２８】
0005563472.tif 000042
【図２９】
0005563472.tif 000043
【図３０】
0005563472.tif 000044
【図３１】
0005563472.tif 000045
【図３２】
0005563472.tif 000046
【図３３】
0005563472.tif 000047
【図３４】
0005563472.tif 000048
【図３５】
0005563472.tif 000049
【図３６】
0005563472.tif 000050
【図３７】
0005563472.tif 000051
【図３８】
0005563472.tif 000052
【図３９】
0005563472.tif 000053
【図４０】
0005563472.tif 000054
【図４１】
0005563472.tif 000055