(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
キュウリに発生するクロステロウイルスに耐性のキュウリ植物の生産方法であって、
ａ．キュウリクロステロウイルスに対する耐性を与える対立遺伝子を含有するククミス  サティバス（Cucumis sativus）ＰＩ２５０１４７植物を提供する段階であって、
該対立遺伝子は異なる染色体上にある２種類の量的遺伝子座ＱＴＬ１およびＱＴＬ２を特徴としており、
該ＱＴＬ１は以下のフランキングマーカー、
ｉ）５'から３'に向かって、配列番号１のヌクレオチド配列を有するＥｃｏＲＩプライマー、キュウリゲノム断片および配列番号２のヌクレオチド配列有するＭｓｅＩプライマーから成る約２４４ｂｐのマーカー、
ｉｉ）５'から３'に向かって、配列番号１のヌクレオチド配列を有するＥｃｏＲＩプライマー、キュウリゲノム断片および配列番号２のヌクレオチド配列を有するＭｓｅＩプライマーから成る約１８８ｂｐのマーカー、及び
ｉｉｉ）５'から３'に向かって、配列番号３のヌクレオチド配列を有するＥｃｏＲＩプライマー、キュウリゲノム断片および配列番号４のヌクレオチド配列を有するＭｓｅＩプライマーから成る約２５１ｂｐのマーカー、
によって定義され、
該ＱＴＬ２は以下のマーカー、
ｉ）５'から３'に向かって、配列番号５のヌクレオチド配列を有するＥｃｏＲＩプライマー、キュウリゲノム断片および配列番号２のヌクレオチド配列を有するＭｓｅＩプライマーから成る約２６０ｂｐのマーカー、及び
ｉｉ）５'から３'に向かって、配列番号５のヌクレオチド配列を有するＥｃｏＲＩプライマー、キュウリゲノム断片および配列番号６のヌクレオチド配列を有するＭｓｅＩプライマーから成る約１０７ｂｐのマーカー、
によって定義され、
ｂ．段階ａで得られたククミス  サティバス（Cucumis sativus）をククミス  サティバス（Cucumis sativus）栽培育種材料と交配する段階、
ｃ．段階ｂの交配体から得られた種子を採取する段階、
ｄ．該種子から植物を再生する段階、
ｅ．段階ｄの植物のキュウリクロステロウイルス耐性を評価する段階、および
ｆ．段階ａで定義したマーカーを使用して、キュウリクロステロウイルスに耐性の植物を同定し選択する段階、
を含む方法。
【請求項２】
前記クロステロウイルスがビートシュード−イエローウイルス（ＢＰＹＶ）またはウリイエロースタンティングディスオーダーウイルス（ＣＹＳＤＶ）である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法によって生産した、キュウリに発生するクロステロウイルスに耐性を有する、優良系のキュウリ植物。
【請求項４】
請求項３に記載の交雑キュウリ植物。
【請求項５】
請求項３または４に記載の植物によって生産した果実または種子。
【請求項６】
キュウリに発生するクロステロウイルスに耐性のキュウリ植物を生じる種子の生産方法であって、
ａ．キュウリクロステロウイルスに対する耐性を与える対立遺伝子を含有するククミス  サティバス（Cucumis sativus）ＰＩ２５０１４７植物を提供する段階であって、
該対立遺伝子は異なる染色体上にある２種類の量的遺伝子座ＱＴＬ１およびＱＴＬ２を特徴としており、
該ＱＴＬ１は以下のフランキングマーカー、
ｉ）５'から３'に向かって、配列番号１のヌクレオチド配列を有するＥｃｏＲＩプライマー、キュウリゲノム断片および配列番号２のヌクレオチド配列有するＭｓｅＩプライマーから成る約２４４ｂｐのマーカー、
ｉｉ）５'から３'に向かって、配列番号１のヌクレオチド配列を有するＥｃｏＲＩプライマー、キュウリゲノム断片および配列番号２のヌクレオチド配列を有するＭｓｅＩプライマーから成る約１８８ｂｐのマーカー、及び
ｉｉｉ）５'から３'に向かって、配列番号３のヌクレオチド配列を有するＥｃｏＲＩプライマー、キュウリゲノム断片および配列番号４のヌクレオチド配列を有するＭｓｅＩプライマーから成る約２５１ｂｐのマーカー、
によって定義され、
該ＱＴＬ２は以下のマーカー、
ｉ）５'から３'に向かって、配列番号５のヌクレオチド配列を有するＥｃｏＲＩプライマー、キュウリゲノム断片および配列番号２のヌクレオチド配列を有するＭｓｅＩプライマーから成る約２６０ｂｐのマーカー、及び
ｉｉ）５'から３'に向かって、配列番号５のヌクレオチド配列を有するＥｃｏＲＩプライマー、キュウリゲノム断片および配列番号６のヌクレオチド配列を有するＭｓｅＩプライマーから成る約１０７ｂｐのマーカー、
によって定義され、
ｂ．段階ａで得られたククミス  サティバス（Cucumis sativus）をククミス  サティバス（Cucumis sativus）栽培育種材料と交配する段階、
ｃ．段階ｂの交配体から得られた種子を採取する段階、
ｄ．段階ａで定義したマーカーを使用して、キュウリクロステロウイルスに耐性の植物中に得られる種子を選択し、同定する段階、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】  本発明は、キュウリに発生するクロステロウイルスに耐性のキュウリ植物を生産する方法に関する。さらに、本発明は、前記方法によって生産したキュウリ植物並びに前記植物によって作られた果実および種子に関する。
【０００２】    （発明の背景）
この１５年間、キュウリの黄斑ウイルスがキュウリを生産する生産者の主な関心事となっている（Ｈａｓｓａｎ「Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ａ  Ｙｅｌｌｏｗｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｔｕｎｔｉｎｇ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ  ｏｆ  Ｃｕｃｕｒｂｉｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ａｒａｂ  Ｅｍｉｒａｔｅｓ  Ｅｍｉｒ」Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｓｃｉ．（１９９１）、２、１〜１６）。黄斑ウイルスとはクロステロウイルスのことである。特に、２種類のコナジラミが運ぶウイルスが問題である。これらのウイルスは、Ｔｒｉａｌｅｕｒｏｄｅｓ  ｖａｐｏｒａｒｉｏｒｕｍによって運ばれる別名キュウリクロロテックスポットウイルス（ｃｕｃｕｍｂｅｒ  ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ  ｓｐｏｔ  ｖｉｒｕｓ）と呼ばれるビートシュード−イエローウイルス（ｂｅａｔ  ｐｓｅｕｄｏ−ｙｅｌｌｏｗｓ  ｖｉｒｕｓ）（ＢＰＹＶ）、およびＢｅｍｉｓｉａ  ｔａｂａｃｉによって運ばれるウリイエロースタンティングディスオーダーウイルス（ｃｕｃｕｒｂｉｔ  ｙｅｌｌｏｗ  ｓｔｕｎｔｉｎｇ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ  ｖｉｒｕｓ）（ＣＹＳＤＶ）として知られている。クロステロウイルスの群にはさらに、とりわけクロステロウイルスのクリニウイルス属の１種であるレタス伝染性黄斑ウイルス（ＬＩＹＶ）が含まれる。これらのウイルスは通常約７日間媒介昆虫内に保持され、コナジラミの摂食活動によって植物上に運ばれる。疾患の制御は通常、殺虫剤処理処理による媒介昆虫の排除によって実施される。現在まで、この病原体に耐性の植物原料は知られておらず、殺虫剤処理またはコナジラミ耐性の品種改良によって媒介昆虫を排除する研究が行われてきた。現在のところ、いずれの取り組みもこの疾患の制御に成功していない。本発明の目的は、キュウリに発生するクロステロウイルス、特にＢＰＳＶおよびＣＹＳＤＶに耐性のキュウリ植物を提供することである。
【０００３】    （発明の概要）
本発明者等は、パキスタン原産のキュウリ在来系統Ｋｈｉｒａ、ＰＩ２５０１４７がＢＰＳＶおよびＣＹＳＤＶに対する耐性をもたらすことを発見した。ＰＩ２５０１４７とＣｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ栽培育種材料とを交配した。交配実施後この植物には種子が生じたので、この種子を採取して植物体に生育させた。この植物のＢＰＹＶおよびＣＹＳＤＶに対する耐性を評価した。耐性を示した植物を感受性のキュウリ優良系に戻し交配した。ＡＦＬＰフィンガープリント技術を使用して量的遺伝子座（ＱＴＬ）解析を実施したところ、この耐性が２種のＱＴＬに関連するという結果が導かれた。
【０００４】  したがって、本発明は、キュウリに発生するクロステロウイルスに耐性のキュウリ植物の生産方法を提供し、この方法には、
ａ．キュウリクロステロウイルスに対する耐性を与える対立遺伝子を含有するＣｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ植物を提供する段階であって、この対立遺伝子は異なる染色体上にある２種類の量的遺伝子座ＱＴＬ１およびＱＴＬ２を特徴としており、ＱＴＬ１は以下のフランキングマーカー、
ｉ）５’から３’に向かってヌクレオチド配列、配列番号１を有するＥｃｏＲＩプライマー、キュウリゲノム断片およびヌクレオチド配列、配列番号２を有するＭｓｅＩプライマーから成る約２４４ｂｐのマーカー、
ｉｉ）５’から３’に向かってヌクレオチド配列、配列番号１を有するＥｃｏＲＩプライマー、キュウリゲノム断片およびヌクレオチド配列、配列番号２を有するＭｓｅＩプライマーから成る約１８８ｂｐのマーカー、
ｉｉｉ）５’から３’に向かってヌクレオチド配列、配列番号３を有するＥｃｏＲＩプライマー、キュウリゲノム断片およびヌクレオチド配列、配列番号４を有するＭｓｅＩプライマーから成る約２５１ｂｐのマーカー、
または、クロステロウイルス耐性を与えるフランキングマーカーの間のＰＩ２５０１４７にあるようなＤＮＡ配列のいずれかの部分によって定義され、ＱＴＬ２は以下のマーカー、
ｉ）５’から３’に向かってヌクレオチド配列、配列番号５を有するＥｃｏＲＩプライマー、キュウリゲノム断片およびヌクレオチド配列、配列番号２を有するＭｓｅＩプライマーから成る約２６０ｂｐのマーカー、
ｉｉ）５’から３’に向かってヌクレオチド配列、配列番号５を有するＥｃｏＲＩプライマー、キュウリゲノム断片およびヌクレオチド配列、配列番号６を有するＭｓｅＩプライマーから成る約１０７ｂｐのマーカー、
または、クロステロウイルス耐性を与えるフランキングマーカーの間のＰＩ２５０１４７にあるようなＤＮＡ配列のいずれかの部分によって定義される段階、
ｂ．段階ａで得られたＣｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓをＣｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ栽培育種材料とを交配する段階、
ｃ．段階ｂの交配体から得られた種子を採取する段階、
ｄ．種子を植物に再生する段階、
ｅ．段階ｄの植物のキュウリクロステロウイルス耐性を評価する段階、および
ｆ．キュウリクロステロウイルスに耐性の植物を同定し選択する段階が含まれる。
【０００５】  本発明はさらに、キュウリに発生するクロステロウイルスに耐性の、前記方法によって作製したキュウリ植物、特に交雑キュウリ植物を提供する。本発明はまた、前記植物によって生産した果実および種子と種子生産方法を提供する。
【０００６】  本明細書では、「キュウリクロステロウイルスに耐性」という用語は栽培者が使用する意味と同じで、クロステロウイルスによって引き起こされる症状が葉、茎または果実に認められない植物のことである。
【０００７】  キュウリでは、ゲノム変異性は限定されている。また、Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓと関連種との交配は実質的に不可能である。したがって、（新規）疾患の特性を含有する遺伝子物質材料を得ることは困難である。しかし、商用に使用される長型スライス用キュウリの亜種であるいわゆる在来系統は、たとえば東ヨーロッパに、亜種ｒｉｇｉｄｕｓ  ｖａｒ  「Ｅｕｒｏｐｅａ」および亜種ｇｒａｃｉｌｉｓ  ｖａｒ．「Ｉｚｍｉｒ  ａｎｄ  Ｃｉｌｉｃｉｕｍ」として維持されている（Ｓ．Ｎｅｙｋｏｖ、Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ、９９、１〜２（１９９４））。この文献では、インド原産のＫｈｉｒａ  ＰＩ１９６２８９は特に食感特性の組み合わせ選択が可能であることを示唆している。驚くべきことに、Ｋｈｉｒａ  ＰＩ２５０１４７は試験した１５０種と公知の登録物との間でＢＰＹＶおよびＳＹＳＤＶに対する新規耐性を有することがわかった。本発明は、ＢＰＹＶおよびＳＹＳＤＶに対する耐性を与える対立遺伝子をヨーロッパおよび中東で通常使用される長型および短型キュウリに首尾良く転移させることに関与する。
【０００８】  英語の文献では、Ｋｈｉｒａという名称は何回も出てきているが（Ｎｅｙｋｏｖ、１９９４、Ｄｈｉｌｌｏｎ、Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ、１１９、５９〜６１、１９９９）、ウイルス耐性とは関連づけられたことはなかった。これは、２種類の関連するウイルスがパキスタンおよびその周辺の地域で発見されなかったことによる。
【０００９】    （発明の詳細な説明）
本発明は、ＢＰＹＶおよびＣＹＳＤＶに耐性のキュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ）を生産することに関する。植物は、ＢＰＹＶおよびＣＹＳＤＶを含有するコナジラミに暴露したとき、疾患の徴候が現れないか、または感受性植物と比較して有意に徴候の減少が見られる場合、疾患耐性であると言われる。Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓにおいてＢＰＹＶおよびＣＹＳＤＶに対する耐性が認められたことはなかったので、本発明の植物は新規である。ＰＩ２０５１４７は、ＢＰＹＶおよびＣＹＳＤＶに対する耐性を与える対立遺伝子を含有する。この対立遺伝子は、マーカーを補った交配方法を使用することによって優良種に首尾良く転移することができる。本発明の植物は、伝統的な交配技術によって作製することができる。たとえば、ＰＩ２５０１４７の種子を使用することができる。しかし、疾患は変化しやすいので、市場で知られている優良な雑種に対抗できる優良種に選択的に転移するためにマーカーを選択することは極めて重要である。
【００１０】  遺伝は主働遺伝子の劣性遺伝である。これは、大量の植物世代を分離して、２パーセント未満の耐性（ホモ接合）植物を発見することが必要であることを意味する。
【００１１】  実施例１：
媒介昆虫であるコナジラミ（Ｔｒｉａｌｅｕｒｏｄｅｓおよび／またはＢｅｍｉｓｉａ）を使用して試験方法を開発した。管理した温室環境内でコナジラミにＢＰＹＶを含有する感染キュウリ植物成木を与えた。この温室内には、感受性を調べた遺伝子バンクの１５０品目（インド産７５品目、中国産６０品目およびパキスタン産１５品目）を置いた。２〜４葉期の個々の幼木をトレイに入れて（３０植物／ｍ2）、感染した植物およびコナジラミに取り巻かれた温室内に置いた。２週間後に２連ずつ評価した。このように設定した試験によって、トレイ内の幼木全てにウイルスを無作為に分布させることができた。２週間後、全植物を媒介動物が含まれる温室に植えた。さらに３〜４週間した後、感染を１（耐性）から８（感受性）の段階で評価した。感受性の徴候は、実験開始後５〜６週間して認められた。驚いたことに、１個の登録番号、ＰＩ２５０１４７（Ｋｈｉｒａ）だけは徴候が明らかに認められず、耐性であることが判明した。
【００１２】
【表１】
0005599541.tif 000002
耐性の登録物を優良育種系と交配した。１回目の戻し交配（ＢＣ１）によって、ウイルスに対して完全に感受性になることが判明し、耐性は劣性遺伝子によって制御されているという事実が示された。したがって、ＢＣ１を自殖した。自殖した種子をこの実施例で説明したようにトレイに播種して、植物の耐性を試験した。耐性植物を温室に置いて、そこで最初の交配で使用した優良系と同等の表現型が認められるものの選択を実施した。選択した個々の植物を元の優良系親に戻し交配し、その後優良系に劣性特性を転移する同様の育種計画を実施した。
【００１３】  実施例２：
ＰＩ２５０１４７を優良育種系と交配した。Ｆ１種子を採取した。Ｆ１植物を成熟するまで生育させ、植物を自殖させた。その後Ｆ２種子を収穫した。実施例１で説明した条件と本質的に同様の試験条件下で、Ｆ２集団を温室内で播種した。個々の植物の耐性の程度を評価し、ＤＮＡ試料を得た。Ｙｏｕｎｇ、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ３４、４７９〜５０１（１９９６）の記載と本質的に同様に量的遺伝子座（ＱＴＬ）分析をこの物質に実施した。この分析は、ＫｅｙｇｅｎｅでＡＦＬＰ法を使用して実施された（Ｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９５、Ｖｏｌ２３、Ｎｏ２１、４４０７〜４４１４）。その結果、耐性は３種類のＱＴＬに関連していた。
【００１４】  表現型変種の４２％が説明される１種の主要なＱＴＬ（４個のマーカーを含有する本来は２４ｃＭ領域にあるＱＴＬ１）。表現型の１３％が説明される異なる染色体上にある第２の中間ＱＴＬ（７個のマーカーを含有する本来は２４ｃＭ傾域にあるＱＴＬ２）および８個のマーカーを含有する領域にある第３のＱＴＬである。それぞれのＱＴＬ領域のマーカーを使用して、３種類のＱＴＬ領域の１つの組換体であるＦ２個体を大量のＦ２から同定した。この組換体は準同一遺伝子組換体（ＮＩＲ）の組に分類されたので、組の結合の遺伝子構造は分析するＱＴＬについてのみ異なる。組内および組間のＦ３表現型を比較することによって、ＱＴＬのファインマッピングを実施した。これらのＮＩＲセットのＦ３について耐性を試験した。
【００１５】  ３種のＱＴＬ領域のうち２種に限定することに成功した。ＱＴＬ１は依然として１６のみで、ＱＴＬ２の大きさはほんの１０ｃＭである。
【００１６】  配列リスト
配列番号１
ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＣＣ
配列番号２
ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＡＣＡＴ
配列番号３
ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＡ
配列番号４
ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＡＣＡＣ
配列番号５
ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＴ
配列番号６
ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＡＣＧＴ
【００１７】
【配列表】
0005599541.tif 000003
0005599541.tif 000004
0005599541.tif 000005
0005599541.tif 000006