(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
米の品種を識別する方法であって、ゲノムＤＮＡ中における下記（１）〜（１３）から選択される特定塩基配列の存在もしくは非存在を識別の指標とすることを特徴とする米の品種識別方法：
（１）配列番号１で示され、組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号４２４、４２５である品種識別用ＤＮＡ領域、
（２）配列番号２で示され、組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号４８、４９である品種識別用ＤＮＡ領域、
（３）配列番号３で示され、組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号７０〜８０である品種識別用ＤＮＡ領域、
（４）配列番号４で示され、組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号１９〜２６である品種識別用ＤＮＡ領域、
（５）配列番号５で示され、組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号７６３、７６４である品種検出用ＤＮＡ領域、
（６）配列番号６で示され、組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号３６６、３６７であるＤＮＡ領域、
（７）配列番号７で示され、組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号３５３〜３６１であるＤＮＡ領域、
（８）配列番号８で示され、組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号２４９、２５０であるＤＮＡ領域、
（９）配列番号９で示され、組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号５５０、５５１であるＤＮＡ領域、
（１０）配列番号１０で示され、組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号９、１０であるＤＮＡ領域、
（１１）配列番号１１で示され、組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号１５、１６であるＤＮＡ領域、
（１２）配列番号１２で示され、組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号５５５〜５５８であるＤＮＡ領域、及び
（１３）配列番号１３で示され、組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号４７４、４７５であるＤＮＡ領域。
（１４）配列番号５７で示され、組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号２３１、２３２であるＤＮＡ領域。
（１５）配列番号５８で示され、組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号１１４、１１５であるＤＮＡ領域。
【請求項２】
下記（２）、（４）、（５）記載の特定塩基配列から選択される少なくとも１種の特定塩基配列がゲノムＤＮＡ中に存在する品種を「キヌヒカリ」でないと識別することを特徴とする請求項１記載の米の品種識別方法：
（２）配列番号２で示され、組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号４８、４９である品種識別用ＤＮＡ領域、
（４）配列番号４で示され、組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号１９〜２６である品種識別用ＤＮＡ領域、及び
（５）配列番号５で示され、組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号７６３、７６４である品種検出用ＤＮＡ領域。
【請求項３】
下記（３）、（１１）、（１３）記載の特定塩基配列から選択される少なくとも１種の特定塩基配列がゲノムＤＮＡ中に存在する品種を「きらら３９７」でないと識別することを特徴とする請求項１記載の米の品種識別方法：
（３）配列番号３で示され、組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号７０〜８０である品種識別用ＤＮＡ領域、
（１１）配列番号１１で示され、組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号１５、１６であるＤＮＡ領域、及び
（１３）配列番号１３で示され、組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号４７４、４７５であるＤＮＡ領域。
【請求項４】
下記（１１）、（１２）記載の特定塩基配列から選択される少なくとも１種の特定塩基配列がゲノムＤＮＡ中に存在する品種を「ななつぼし」でないと識別することを特徴とする請求項１記載の米の品種識別方法：
（１１）配列番号１１で示され、組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号１５、１６であるＤＮＡ領域、及び
（１２）配列番号１２で示され、組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号５５５〜５５８であるＤＮＡ領域。
【請求項５】
下記（３）、（９）、（１０）記載の特定塩基配列から選択される少なくとも１種の特定塩基配列がゲノムＤＮＡ中に存在する品種を「ほしのゆめ」でないと識別することを特徴とする請求項１記載の米の品種識別方法：
（３）配列番号３で示され、組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号７０〜８０である品種識別用ＤＮＡ領域、
（９）配列番号９で示され、組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号５５０、５５１であるＤＮＡ領域、及び
（１０）配列番号１０で示され、組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号９、１０であるＤＮＡ領域。
【請求項６】
ゲノムＤＮＡ中の特定塩基配列の存在を、核酸増幅法により増幅されるＤＮＡ断片の検出にて実施することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項記載の米の品種識別方法。
【請求項７】
ＰＣＲ法において、以下（ａ）〜（ｒ）記載のＤＮＡから選択されるプライマー対を用いることを特徴とする請求項６記載の米の品種識別方法：
（ａ）配列番号１４で表されるＤＮＡ及び配列番号１５で表されるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１６で表されるＤＮＡ及び配列番号１７で表されるＤＮＡ、
（ｃ）配列番号１８で表されるＤＮＡ及び配列番号１９で表されるＤＮＡ、
（ｄ）配列番号２０で表されるＤＮＡ及び配列番号２１で表されるＤＮＡ、
（ｅ）配列番号２２で表されるＤＮＡ及び配列番号２３で表されるＤＮＡ、
（ｆ）配列番号２４で表されるＤＮＡ及び配列番号２５で表されるＤＮＡ、
（ｇ）配列番号２６で表されるＤＮＡ及び配列番号２７で表されるＤＮＡ、
（ｈ）配列番号２８で表されるＤＮＡ及び配列番号２９で表されるＤＮＡ、
（ｉ）配列番号３０で表されるＤＮＡ及び配列番号３１で表されるＤＮＡ、
（ｊ）配列番号３２で表されるＤＮＡ及び配列番号３３で表されるＤＮＡ、
（ｋ）配列番号３４で表されるＤＮＡ及び配列番号３２で表されるＤＮＡ、
（ｌ）配列番号３５で表されるＤＮＡ及び配列番号３６で表されるＤＮＡ、
（ｍ）配列番号３７で表されるＤＮＡ及び配列番号３８で表されるＤＮＡ、
（ｎ）配列番号３９で表されるＤＮＡ及び配列番号４０で表されるＤＮＡ、
（ｏ）配列番号４１で表されるＤＮＡ及び配列番号３４で表されるＤＮＡ、
（ｐ）配列番号５９で表されるＤＮＡ及び配列番号６０で表されるＤＮＡ、
（ｑ）配列番号６１で表されるＤＮＡ及び配列番号６０で表されるＤＮＡ、及び
（ｒ）配列番号６２で表されるＤＮＡ及び配列番号６３で表されるＤＮＡ。
【請求項８】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）の工程を含むことを特徴とする請求項７記載の米の品種識別方法：
（Ａ）米試料中の米のゲノムＤＮＡを調製する核酸調製工程、
（Ｂ）工程（Ａ）で得られたゲノムＤＮＡを鋳型として核酸増幅法を実施する工程、及び
（Ｃ）工程（Ｂ）で得られたＤＮＡ断片の解析を実施する工程。
【請求項９】
配列番号２１、２２、２４、３３、３４、３８、４０で示されるＤＮＡのいずれかであることを特徴とする、ゲノムＤＮＡ中の特定塩基配列の存在を検出するためのオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項７または８のいずれか１項記載の方法を実施するためのキットであって、特定塩基配列の存在を核酸増幅法により増幅されるＤＮＡ断片として検出する目的で使用されるプライマー対を含有することを特徴とするキットであって、該プライマー対が請求項７において記載されるプライマー対である、キット。
【請求項１１】
品種識別に利用可能な配列番号１２で示されるＤＮＡ断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米などの作物の品種識別用オリゴヌクレオチドの設計方法、品種を識別する方法、品種識別用オリゴヌクレオチド、前記品種識別方法を実施するためのキット、及び品種識別に有用なＤＮＡ断片に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本では、現在２００種を越える米の品種が栽培されるが、改正ＪＡＳ法の施行により米の品種名の表示が義務づけられている。しかし、一部では、表示品種以外の米を混米しながら、表示を偽って販売する不正混米が行われている。近年の消費者の良食味指向をうけてコシヒカリなどの良食味品種が高価格で取り引きされている現状や、食品の情報公開への関心の高まりを考慮すると、内容物の表示の正確さは、行政的にも産業的にも重要な課題であり、混米による不正を防止する必要性等から、簡易で精度の高く、実用性の高い米の品種識別技術の開発が求められている。
【０００３】
しかしながら、日本において栽培されている殆どの品種が、数種の在来品種をベースとした極近縁種間の交配によって育成されてきた経緯により、これらは極めて類縁しており、特に精米について形態学的に米の品種識別を行うことは、非常に困難である。
【０００４】
一方で近年、米のゲノム配列の解析が進み、米の品種間で差異を示す遺伝的多型を利用した米の品種識別が試みられている。
【０００５】
この手法として具体的には、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、マイクロサテライト法、ＳＮＰｓ法、ＲＡＰＤ法が行われている。
【０００６】
上記手法のうち、ＲＡＰＤ（Ｒａｎｄｏｍ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ＤＮＡ）法は、それぞれ別個のプライマーを１種類だけ加えて増幅したＤＮＡを電気泳動にて分離し、多数の泳動バンドのうちから、識別性のあるバンドを選別して品種識別に使用する。使用するプライマーセットの種類分だけ多数回の増幅反応を行う必要があり、操作が煩雑で時間がかかる。また、識別に用いるバンド以外にも多数の共通バンドが出現するため、複数のプライマーを混合してＰＣＲ法による増幅を行うマルチプレックス法を採用することができない、識別バンドは増幅反応温度やＤＮＡの純度や濃度の影響を受けやすい、ＰＣＲ条件の設定が困難であり、かつ条件を設定しても、識別性や再現性に乏しい等の問題があった。
【０００７】
上記ＲＡＰＤ法の課題を解決する手段としてＲＡＰＤ−ＳＴＳ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔａｇｇｅｄ  Ｓｉｔｅ）法がある。ＲＡＰＤ法で得られた識別バンドの塩基配列を解析し、ＲＡＰＤプライマー部位から増幅物内部へプライマーを延長することで特異性を上げ、識別に必要なバンドのみ出現するように改良している。したがってマルチプレックス法を採用して増幅反応を行うこともできる。しかしながらＲＡＰＤ法により見つかった識別バンドに依存しているため、識別バンドサイズが大きい場合、加熱などで試料中に含まれるＤＮＡが低分子化している加工食品では、鋳型となりうるＤＮＡ分子数が減少し、その加工度合いによって識別が困難になる場合がある。また当該技術では識別バンドの有無で検出する場合が多く、識別バンドが検出される品種を陽性品種、識別バンドが検出されない品種を陰性品種とした場合、１粒ずつ検査を行う、所謂、定量検査では識別出来るものの、複数粒を１まとめに検査する、所謂、定性検査の場合、陽性品種中に混入した陰性品種は検出不可になるという欠点がある。
【０００８】
なお、大坪らにより開発されたＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対によるＤＮＡ品種識別技術（特開２００１−９５５８９号公報（特許文献１）など）、あるいは、大坪ら、その他により開発されたＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対により得られる識別バンドのサイズを短縮化させたＤＮＡ品種識別技術である特開２００５−７３６５５号公報（特許文献２）では、いずれも日本で育成された主要作付け品種の大部分を識別出来るとしている。これらの結果を勘案すると、ＲＡＰＤ法によって同定された米の品種識別用バンドは、塩基配列がかなり異なる多型を有するゲノム部分が識別対象となっている可能性がある。さらに、日本で育成された品種の大部分が人工交配によるものであることから、特に特開２００５−７３６５５号公報（特許文献２）で開示された１３箇所の識別領域は新品種を生むに到った交配に伴う遺伝子の変化を検出している可能性がある。しかし、これらの領域においてどのような遺伝子の変化が生じているかについての知見は存在しなかった。なお特開２００５−７３６５５号公報（特許文献２）はＲＡＰＤ法により見つかった識別バンドを短縮化させた技術ではあるが、基本的に短縮化させた元の識別バンドの約８割程度のサイズであり、１．６ｋｂｐや１．３ｋｂｐ程度の増幅物が存在するなど、充分に短縮化されているとは言いがたい。また識別性能は元のＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対による識別性能と特に変わっていない。
【０００９】
以上の通り、人工交配で育成された米の品種識別を行うにはＲＡＰＤ法で開発された識別領域が重要と示唆されるものの、識別バンドサイズが大きい、また、定性検査の場合、識別したい対象品種の組み合わせによっては、検出不可の品種が存在、場合によっては更に別の識別領域を開発する必要がある、という問題があった。
【００１０】
【特許文献１】特開２００１−９５５８９号公報
【特許文献２】特開２００５−７３６５５号公報
【特許文献３】特開２００５−２４５２４４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、品種、特に日本で育成された米の品種の識別に使用されているＲＡＰＤ法による識別領域を、更に利用しやすい米の品種識別技術を提供することにある。
【００１２】
例えば、「キヌヒカリ」は全国作付け面積順位が第５位程度で安定している品種であるが、該品種の識別を行う場合、特開２００５−２４５２４４号公報（特許文献３）に記載された品種識別に有用なプライマーのうち、主要品種では識別バンドが得られる品種数の少ないＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ａ６で識別バンドが得られるため、所謂、定量検査用反応系を構築することはさほど難しくは無い。しかしながら、定性検査用反応系を構築するとなると、「キヌヒカリ」が陰性となるＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対の中から選択する必要がある。この条件を満たすＭ２ＣＧ、Ｂ４３Ａ、Ｇ２２、Ｇ４９Ａ、Ｆ６、Ｅ３０の６種のＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対を用いたとしても、作付け上位品種の「夢つくし」などは検出不可となる。またＧ４９Ａによる増幅物は約１．５ｋｂｐ、Ｍ２ＣＧ、Ｆ６による増幅物は約１．２ｋｂｐと１ｋｂｐを超えるサイズである。一方、「夢つくし」と「キヌヒカリ」はＡ６にて識別可能であり、また前述のようにＡ６で識別バンドが得られる品種は少ない。したがって、Ａ６と識別性が反転（「キヌヒカリ」が陰性、「夢つくし」が陽性となる）するプライマー対出来れば「夢つくし」が検出可能となる。更に該プライマー対により、その他Ａ６陰性品種も「夢つくし」同様に陽性となれば、その他品種を検出するために必要なプライマー数も減らすことが可能であり定性検査用のマルチプレックスＰＣＲ系構築も容易となる。
【００１３】
「きらら３９７」は北海道の主要作付け品種であり、作付けは北海道のみではあるが全国作付け面積順位でも第６位程度で安定している。該品種の識別を行う場合、特開２００５−２４５２４４号公報（特許文献３）に記載された品種識別に有用なプライマーのうち、主要品種では識別バンドが得られる品種の少ないＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ４及びＳ１３で識別バンドが得られるため、所謂、定量検査用反応系を構築することはさほど難しくは無い。ただし、定性検査用反応系を構築するとなると、「きらら３９７」が陰性となるプライマー対より選択する必要があり、Ｍ１１、Ｂ１、Ｇ４９Ａ、Ｆ６の４種のＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対を用いたとしても、北海道産品種の「吟風」などは検出不可となる。なお「きらら３９７」はＧ２２陽性、「吟風」はＧ２２陰性であるため識別は可能である。またＧ４が陽性となる品種は「きらら３９７」、「ななつぼし」など、主要作付け品種では北海道産作付け品種に限定される。したがって、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ２２の識別バンドの出現パターンが反転する識別プライマー（「きらら３９７」が陰性、「吟風」が陽性）があれば「吟風」の検出が可能となる。またＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ４の識別性が反転するプライマー対（Ｇ４陽性品種である「きらら３９７」「ななつぼし」が陰性、その他Ｇ４陰性品種が陽性）が出来れば、該プライマーで殆どの品種が検出可能となり、マルチプレックスＰＣＲ系の構築も容易となる。なお、「きらら３９７」に混入した「ななつぼし」の検出にはＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ４９が使用出来るが、増幅物サイズは約１．５ｋｂｐと１ｋｂｐを超えるサイズである。
【００１４】
「ほしのゆめ」は北海道の主要作付け品種であり、作付けは北海道のみではあるが全国作付け面積順位でも第８位程度で安定している。該品種の識別を行う場合、特開２００５−２４５２４４号公報（特許文献３）に記載された品種識別に有用なプライマーのうち、主要品種では識別バンドが得られる品種の少ないＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｓ１３で識別バンドが得られるため、所謂、定量検査用反応系を構築することはさほど難しくは無い。ただし、定性検査用反応系を構築するとなると、「ほしのゆめ」が陰性となるプライマー対より選択する必要があり、Ｍ１１、Ｂ１、Ｆ６、Ｂ４３、Ｇ４の５種のＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対を用いたとしても、北海道産品種の「ほしたろう」などは検出不可となる。なお「ほしのゆめ」はＳ１３陽性、「ほしたろう」はＳ１３陰性であるため識別は可能である。したがって、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化Ｓ１３プライマー対の識別バンドの出現パターンが反転する識別プライマー（「ほしのゆめ」が陰性、「ほしたろう」が陽性）があれば「ほしたろう」の検出が可能となる。また該プライマーにより「ほしたろう」同様、他のＲＡＰＤ−ＳＴＳ化Ｓ１３プライマー対陰性品種も陽性となると、該プライマーで多数の品種が検出可能となり、定性検査用のマルチプレックスＰＣＲ系の構築も容易となる。
【００１５】
「ななつぼし」は北海道の次期主力作付け品種と期待されており、平成１７年度の作付け面積は全国順位でも第１０位まで上昇している。前述の「きらら３９７」の項で述べたように、全国作付け主要品種の中では「きらら３９７」と共にＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ４陽性となる数少ない品種である。したがって、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ４の識別性が反転するプライマー対（Ｇ４陽性品種である「きらら３９７」「ななつぼし」が陰性、その他Ｇ４陰性品種が陽性）が出来れば、該プライマーで殆どの品種が検出可能となり、定性検査用のマルチプレックスＰＣＲ系の構築も容易となる。なお、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｓ１３で「きらら３９７」は陽性、「ななつぼし」は陰性品種であるため、該プライマー対により「きらら３９７」の検出が可能であるが、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｓ１３による識別バンドは約１．８ｋｂｐと２ｋｂｐに迫るサイズである。一方、作付けは徐々に低下しているが北海道産品種である「あきほ」と「ななつぼし」については、特開２００５−２４５２４４号公報（特許文献３）に記載されたプライマー対では識別できない。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、ＲＡＰＤ法により得られている識別バンドの多くで識別バンド配列内に組換えを起こしたと思われる領域（以下、本明細書では組換え領域と呼ぶ）が存在することを見出した。さらに鋭意検討したところ、組換え領域を示す塩基部位を指標にＰＣＲプライマー設計位置を考慮することにより、元のＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマーによる品種識別性能は保持したまま増幅物サイズを適度に調節できることを見出した。また陰性品種ゲノム配列において、ＲＡＰＤ法により開発された識別領域に対応する遺伝子座と思われるＤＮＡ領域でＰＣＲプライマー対を設計することにより、確認を行った米の品種ＤＮＡでは識別バンドの出現パターンが反転することを見出した。
【００１７】
すなわち本発明における第１の発明は品種識別に有用なゲノムＤＮＡ領域を検出するためのオリゴヌクレオチド設計方法であって、
（１）特定することが望まれる品種のゲノムＤＮＡに存在する品種識別に有用なＤＮＡ領域と、他の品種のゲノムＤＮＡにおける前記領域に対応する領域を比較し、組換え領域と予測される塩基部位を見出す工程、及び
（２）組換え領域と予測される塩基部位が見出された場合に、当該部位もしくは当該部位に隣接するゲノムＤＮＡの塩基配列に基づいてオリゴヌクレオチドを設計する工程、
を含むことを特徴とする品種識別用オリゴヌクレオチド設計方法に関する。
【００１８】
第１の発明のひとつの態様において、品種が米の品種であることを特徴とする。
【００１９】
第１の発明の別の態様は、組換え領域と予測される塩基部位を含むＤＮＡ断片を増幅可能な核酸増幅反応用の一対のオリゴヌクレオチドを設計することを特徴とする。
【００２０】
第１の発明の別の態様は、組換え領域と予測される塩基部位に隣接し、かつ一方の品種のゲノム配列とは配列同一性の低い領域内のみをＤＮＡ断片として増幅可能な核酸増幅反応用の一対のオリゴヌクレオチドを設計することを特徴とする。
【００２１】
本発明における第２の発明は米の品種識別方法であって、ゲノムＤＮＡ中における以下（１）〜（１５）から選択される特定塩基配列の存在もしくは非存在を識別の指標とすることを特徴とする米の品種識別方法に関する：
（１）配列番号１で示され組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号４２４、４２５である品種識別用ＤＮＡ領域、
（２）配列番号２で示され組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号４８、４９である品種識別用ＤＮＡ領域、
（３）配列番号３で示され組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号７０〜８０である品種識別用ＤＮＡ領域、
（４）配列番号４で示され組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号１９〜２６である品種識別用ＤＮＡ領域、
（５）配列番号５で示され組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号７６３、７６４である品種検出用ＤＮＡ領域、
（６）配列番号６で示され組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号３６６、３６７であるＤＮＡ領域、
（７）配列番号７で示され組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号３５３〜３６１であるＤＮＡ領域、
（８）配列番号８で示され組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号２４９、２５０であるＤＮＡ領域、
（９）配列番号９で示され組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号５５０、５５１であるＤＮＡ領域、
（１０）配列番号１０で示され組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号９、１０であるＤＮＡ領域、
（１１）配列番号１１で示され組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号１５、１６であるＤＮＡ領域、
（１２）配列番号１２で示され組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号５５５〜５５８であるＤＮＡ領域、
（１３）配列番号１３で示され組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号４７４、４７５であるＤＮＡ領域、
（１４）配列番号５７で示され組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号２３１、２３２であるＤＮＡ領域、及び
（１５）配列番号５８で示され組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号１１４、１１５であるＤＮＡ領域。
【００２２】
第２の発明のひとつの態様において、下記（２）、（４）、（５）記載の特定塩基配列領域から選択される少なくとも１種の特定塩基配列領域がゲノムＤＮＡ中に存在する品種を「キヌヒカリ」でないと識別することを特徴とする：
（２）配列番号２で示され組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号４８、４９である品種識別用ＤＮＡ領域、
（４）配列番号４で示され組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号１９〜２６である品種識別用ＤＮＡ領域、及び
（５）配列番号５で示され組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号７６３、７６４である品種検出用ＤＮＡ領域。
【００２３】
第２の発明の別の態様は、下記（３）、（１１）、（１３）記載の特定塩基配列領域から選択される少なくとも１種の特定塩基配列領域がゲノムＤＮＡ中に存在する品種を「キヌヒカリ」でないと識別することを特徴とする：
（３）配列番号３で示され組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号７０〜８０である品種識別用ＤＮＡ領域、
（１１）配列番号１１で示され組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号１５、１６であるＤＮＡ領域、及び
（１３）配列番号１３で示され組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号４７４、４７５であるＤＮＡ領域。
【００２４】
第２の発明の別の態様は、下記（１１）、（１２）記載の特定塩基配列領域から選択される少なくとも１種の特定塩基配列領域がゲノムＤＮＡ中に存在する品種を「ななつぼし」でないと識別することを特徴とする：
（１１）配列番号１１で示され組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号１５、１６であるＤＮＡ領域、及び
（１２）配列番号１２で示され組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号５５５〜５５８であるＤＮＡ領域。
【００２５】
第２の発明の別の態様は、下記（３）、（９）、（１０）記載の特定塩基配列領域から選択される少なくとも１種の特定塩基配列領域がゲノムＤＮＡ中に存在する品種を「ほしのゆめ」でないと識別することを特徴とする：
（３）配列番号３で示され組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号７０〜８０である品種識別用ＤＮＡ領域、
（９）配列番号９で示され組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号５５０、５５１であるＤＮＡ領域、及び
（１０）配列番号１０で示され組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号９、１０であるＤＮＡ領域。
【００２６】
第２の発明の別の態様は、ゲノムＤＮＡ中の特定塩基配列の存在が、核酸増幅法により増幅されるＤＮＡ断片の検出によることを特徴とする。
【００２７】
第２の発明の別の態様は、核酸増幅法に使用されるプライマーが第１の発明により設計されたオリゴヌクレオチドであることを特徴とする。
【００２８】
第２の発明の別の態様は、核酸増幅法がＰＣＲ法であることを特徴とする。
【００２９】
第２の発明の別の態様は、ＰＣＲ法において、以下（ａ）〜（ｒ）記載のＤＮＡから選択されるプライマー対を用いることを特徴とする：
（ａ）配列番号１４で表されるＤＮＡ及び配列番号１５で表されるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１６で表されるＤＮＡ及び配列番号１７で表されるＤＮＡ、
（ｃ）配列番号１８で表されるＤＮＡ及び配列番号１９で表されるＤＮＡ、
（ｄ）配列番号２０で表されるＤＮＡ及び配列番号２１で表されるＤＮＡ、
（ｅ）配列番号２２で表されるＤＮＡ及び配列番号２３で表されるＤＮＡ、
（ｆ）配列番号２４で表されるＤＮＡ及び配列番号２５で表されるＤＮＡ、
（ｇ）配列番号２６で表されるＤＮＡ及び配列番号２７で表されるＤＮＡ、
（ｈ）配列番号２８で表されるＤＮＡ及び配列番号２９で表されるＤＮＡ、
（ｉ）配列番号３０で表されるＤＮＡ及び配列番号３１で表されるＤＮＡ、
（ｊ）配列番号３２で表されるＤＮＡ及び配列番号３３で表されるＤＮＡ、
（ｋ）配列番号３４で表されるＤＮＡ及び配列番号３２で表されるＤＮＡ、
（ｌ）配列番号３５で表されるＤＮＡ及び配列番号３６で表されるＤＮＡ、
（ｍ）配列番号３７で表されるＤＮＡ及び配列番号３８で表されるＤＮＡ、
（ｎ）配列番号３９で表されるＤＮＡ及び配列番号４０で表されるＤＮＡ、
（ｏ）配列番号４１で表されるＤＮＡ及び配列番号３４で表されるＤＮＡ、
（ｐ）配列番号５９で表されるＤＮＡ及び配列番号６０で表されるＤＮＡ、
（ｑ）配列番号６１で表されるＤＮＡ及び配列番号６０で表されるＤＮＡ、及び
（ｒ）配列番号６２で表されるＤＮＡ及び配列番号６３で表されるＤＮＡ。
【００３０】
第２の発明の別の態様は、以下の（Ａ）〜（Ｃ）の工程を含むことを特徴とする：
（Ａ）米試料中の米の核酸を調製する核酸調製工程、
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた核酸を鋳型として核酸増幅法を実施する工程、及び
（Ｃ）工程（Ｂ）で得られたＤＮＡ断片の解析を実施する工程。
【００３１】
本発明の第３の発明は、ゲノムＤＮＡ中の特定塩基配列の存在を検出するための下記（ｉ）〜（ｘｖｉ）から選択されるオリゴヌクレオチドに関する：
（ｉ）特定塩基配列が配列番号１で示され、塩基配列の連続する１０〜１００塩基長からなり、かつ、配列番号１で示される塩基配列の塩基番号４２４，４２５の塩基部位を包含するオリゴヌクレオチド、
（ｉｉ）特定塩基配列が配列番号２で示され、塩基配列の連続する１０〜１００塩基長からなり、かつ、配列番号２で示される塩基配列における塩基番号４８、４９の塩基部位を包含するオリゴヌクレオチド、
（ｉｉｉ）特定塩基配列が配列番号３で示され、塩基配列の連続する１５〜１００塩基長からなり、かつ、配列番号３で示される塩基配列における塩基番号７０〜８０の塩基部位を包含するオリゴヌクレオチド、
（ｉｖ）特定塩基配列が配列番号４で示され、塩基配列の連続する２０〜１００塩基長からなり、かつ、配列番号４で示される塩基配列における塩基番号１４〜３１の塩基部位を包含するオリゴヌクレオチド、
（ｖ）特定塩基配列が配列番号５で示され、塩基配列の連続する１０〜１００塩基長からなり、かつ、配列番号５で示される塩基配列における塩基番号７６３、７６４の塩基部位を包含するオリゴヌクレオチド、
（ｖｉ）特定塩基配列が配列番号６で示され、塩基配列の連続する１０〜１００塩基長からなり、かつ、配列番号６で示される塩基配列における塩基番号３６６、３６７の塩基部位を包含するオリゴヌクレオチド、
（ｖｉｉ）特定塩基配列が配列番号７で示され、塩基配列の連続する１５〜１００塩基長からなり、かつ、配列番号７で示される塩基配列における塩基番号３５３〜３６１の塩基部位を包含するオリゴヌクレオチド、
（ｖｉｉｉ）特定塩基配列が配列番号８で示され、塩基配列の連続する１０〜１００塩基長からなり、かつ、配列番号６で示される塩基配列における塩基番号２４９、２５０の塩基部位を包含するオリゴヌクレオチド、
（ｉｘ）特定塩基配列が配列番号９で示され、塩基配列の連続する１０〜１００塩基長からなり、かつ、配列番号６で示される塩基配列における塩基番号５５０、５５１の塩基部位を包含するオリゴヌクレオチド、
（ｘ）特定塩基配列が配列番号１０で示され、塩基配列の連続する１０〜１００塩基長からなり、かつ、配列番号１０で示される塩基配列における塩基番号９、１０の塩基部位を包含するオリゴヌクレオチド、
（ｘｉ）特定塩基配列が配列番号１１で示され、塩基配列の連続する１０〜１００塩基長からなり、かつ、配列番号１１で示される塩基配列における塩基番号１５、１６の塩基部位を包含するオリゴヌクレオチド、
（ｘｉｉ）特定塩基配列が配列番号１２で示され、塩基配列の連続する１０〜１００塩基長からなり、かつ、配列番号１２で示される塩基配列における塩基番号５５５〜５５８の塩基部位を包含するオリゴヌクレオチド、
（ｘｉｉｉ）特定塩基配列が配列番号１３で示され、塩基配列の連続する１０〜１００塩基長からなり、かつ、配列番号１３で示される塩基配列における塩基番号４７４、４７５の塩基部位を包含するオリゴヌクレオチド、
（ｘｉｖ）特定塩基配列が配列番号５７で示され、塩基配列の連続する１０〜１００塩基長からなり、かつ、配列番号５７で示される塩基配列における塩基番号２３１、２３２の塩基部位を包含するオリゴヌクレオチド、
（ｘｖ）特定塩基配列が配列番号５８で示され、塩基配列の連続する１０〜１００塩基長からなり、かつ、配列番号５７で示される塩基配列における塩基番号１１４、１１５の塩基部位を包含するオリゴヌクレオチド、及び
（ｘｖｉ）前記（ｉ）〜（ｘｖ）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列のオリゴヌクレオチド。
【００３２】
第３の発明のひとつの態様として、配列番号２１、２２、２４、３３、３４、３８、４０で示されるＤＮＡのいずれかであることを特徴とする。
【００３３】
本発明の第４の発明は、第２の発明を実施するためのキットであって、ゲノムＤＮＡ中の特定塩基配列の存在を核酸増幅法により増幅されるＤＮＡ断片として検出する目的で使用されるプライマー対を含有することを特徴とするキットに関する。
【００３４】
本発明の第５の発明は、品種識別に利用可能な配列番号１２で示されるＤＮＡ断片に関する。
【発明の効果】
【００３５】
本発明を用いればＲＡＰＤ法により開発された品種識別に有用なＤＮＡ領域を利用した米の品種識別方法において、ＲＡＰＤ法により得られた識別バンドより低分子化された識別バンドによる品種識別が可能となり、ＤＮＡが低分子化していると予想される加工作物（例えば、米）製品の識別をより実施しやすくなる。またＲＡＰＤ法にて識別できていた品種間では、ＲＡＰＤ法にて見出された品種識別に有用なＤＮＡ領域に対応する陰性品種のゲノム配列における遺伝子座を識別領域として用いることにより、全く新規な識別領域を開発することなく定性検査を行うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
本発明で提供する品種識別に有用なゲノムＤＮＡ領域を検出するためのオリゴヌクレオチド設計方法は、
（１）特定することが望まれる品種のゲノムＤＮＡに存在する品種識別に有用なＤＮＡ領域と、他の品種のゲノムＤＮＡにおける前記領域に対応する領域を比較し、組換え領域と予測される塩基部位を見出す工程、及び
（２）組換え領域と予測される塩基部位が見出された場合に、当該部位もしくは当該部位に隣接するゲノムＤＮＡの塩基配列に基づいてオリゴヌクレオチドを設計する工程、
を含むことを特徴とする品種識別用オリゴヌクレオチド設計方法に関する。
【００３７】
本明細書において用いる用語「品種」は同一の生物種の中で他の集団とは異なる形質を生じる遺伝的特性を有する集団をいう。以下で主に米の品種について記載するが、本発明において植物および動物を含む任意の生物を作物として使用することができる。
【００３８】
なお、本明細書における「オリゴヌクレオチ」ドとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡのほか、ＤＮＡの一部がＲＮＡに置換されている所謂キメラオリゴヌクレオチドであっても良い。また検出などを目的とした蛍光色素などにより標識されたオリゴヌクレオチドも本願オリゴヌクレオチドに包含される。
【００３９】
一方、本明細書における「品種識別用オリゴヌクレオチド」とは品種識別に利用可能なプローブやプライマーとして機能するものが挙げられる。プローブとは特定の塩基配列を有する核酸を検出するために、その配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを示す。プライマーとは鋳型核酸に相補的な配列を持ち、核酸合成酵素による合成反応の開始起点として働くオリゴヌクレオチドを示す。プローブを用いた特定塩基配列の検出方法としてはサザンハイブリダイゼーション法のほか、適当な担体に固定したプローブとのハイブリダイゼーションに基づいて品種識別用ＤＮＡ領域を包含する核酸が存在するか否かを検出する、所謂ＤＮＡチップなどの技法も挙げられる。
【００４０】
本明細書において用いる用語「ＲＡＰＤ法」は、それぞれ別個のプライマーを１種類だけ目的の品種由来の核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）を含む反応系に加えて増幅したＤＮＡを電気泳動にて分離し、多数の泳動バンドのうちから、識別性のある、すなわち、特定の品種と他の品種とにおいて出現様式の異なるバンドを選別して品種識別に使用する方法をいう。また、この方法によって識別性の確認されたプライマーを「ＲＡＰＤプライマー」という。
【００４１】
本明細書において用いる用語「ＲＡＰＤ−ＳＴＳ法」は、ＲＡＰＤ法で得られた識別バンドの塩基配列を解析し、ＲＡＰＤプライマーの配列を増幅物内部へ（すなわち、３’側へ）延長することでプライマーの長さ増加させることによって特異性を上げ、識別に必要なバンドのみ出現するように改良された方法をいう。また、この方法によってＲＡＰＤプライマーを改変することを「ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化」といい、それによって得られるプライマーを「ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー」という。
【００４２】
本発明は組換え領域と予測される塩基部位が包含される可能性が高いＲＡＰＤ法により開発された品種識別領域に好適に使用することが出来る。
【００４３】
本明細書において用いる用語「組換え領域」または「組換え点」は、一方の品種のゲノム配列と他方の品種のゲノム配列を比較した際に観察される、配列同一性の高い領域と配列同一性の低い領域との境界を含む領域または点をいう。このような組換え領域は、例えば、人口交配の際の染色体の相同組換えの結果生じると考えられる。「組換え領域と予測される塩基部位」は、上記のような比較によって見出され、組換えが起こったと予測される境界の塩基部位をいう。
【００４４】
品種識別に有用なＤＮＡ領域に組換え点が包含されるか否かの予測は、例えば、該ＤＮＡ領域により識別される品種間で前記領域に対応すると思われる遺伝子座の塩基配列を比較することにより実施することが出来る。本発明では、品種識別に有用なＤＮＡ領域である特開２００５−２４５２４４号公報（特許文献３）で開示された各種ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対により得られる増幅物塩基配列と全ゲノム配列が解析されている「日本晴」ゲノム配列とを比較することで品種識別に有用なＤＮＡ領域を下記Ａ−１、Ａ−２、Ａ−３、Ｂ−１、Ｂ−２、Ｃの６群に分類し、組換え領域と予測される塩基部位が包含されるか検討を行った。ここで「日本晴」ゲノム配列はＧｅｎＢａｎｋを対象とし、比較したい配列をＱｕｅｒｙとしたＢＬＡＳＴ検索により情報を引き出すことが可能である。塩基配列データとしては、染色体全長に関するレコードの他、ゲノム配列解析を行うために作成されたＢＡＰライブラリーなどのレコードに記載された塩基配列データを用いることが可能である。「日本晴」由来の配列か否かは、各レコードのＦＥＡＴＵＲＥＳ項におけるＳＯＵＲＣＥに記載された事項により確認出来る。
【００４５】
なお、増幅物配列において、プライマー、特に識別領域を増幅する際に使用されたＲＡＰＤプライマーの５’端近辺に由来する領域は、当該プライマーが対応するゲノムＤＮＡ領域とミスアニーリングを起こし結合している可能性があるので、ＲＡＰＤプライマー配列領域は比較対照から外すことが好ましい。
【００４６】
本発明によれば、従来のＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマーの識別性が反転するＰＣＲプライマーを設計することができる。ここで「反転」とは、特定の品種について得られる結果が、従来のＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマーを使用して得られる結果とは逆になる、すなわち、陰性が陽性に、陽性が陰性に転換することをいう。例えば、他の品種の混入を否定するための定性検査用反応系を構築するためには陰性の結果が得られる特異的プライマーを使用することが必要であり、陽性の結果が得られていた従来のＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマーの識別性を反転することができればこのような目的に特に有用である。
【００４７】
Ａ）日本晴ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲ反応では識別バンドが検出されないＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対
特開２００５−２４５２４４号公報（特許文献３）に開示されたＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対の中には「日本晴」ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲでは識別バンドが検出されないものが存在する。
【００４８】
これらプライマー対により得られる識別バンド増幅物の配列と「日本晴」のゲノム配列を比較したところ、さらに次のＡ−１とＡ−２、Ａ−３に分類することができた。
【００４９】
Ａ−１）増幅物の部分領域と高い配列同一性を示す領域が「日本晴」ゲノム配列中にも存在するＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対
「日本晴」ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲでは識別バンドが検出されないものの、「日本晴」ゲノム配列との比較において識別バンド増幅物全域にわたり配列同一性が無いのではなく、ある点で配列同一性の程度が急激に変化するという部位が存在する増幅物配列中に存在した。このような増幅物が得られるＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対としては、ＷＫＡ０９、Ｓ１３、Ｇ４、Ｇ４９Ａ、Ｍ１１、Ｂ７、Ａ７が挙げられる。
【００５０】
例えば、配列番号１で示される塩基配列を包含する、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対ＷＫＡ０９と「ひとめぼれ」ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲで得られた増幅物の場合、塩基番号４２５〜１６０８領域はほぼ完全に配列一致する領域が「日本晴」ゲノム配列上に存在するが、塩基番号の１〜４２４領域は配列同一性が低い。配列番号８で示される塩基配列を包含する、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｓ１３と「きらら３９７」ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲで得られた増幅物の場合、塩基番号２５０〜１７２１の領域はほぼ完全に配列一致する領域が「日本晴」ゲノム配列上に存在するが、塩基番号１〜２４９の領域は配列同一性が低い。配列番号１０で示される塩基配列を包含する、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ４と「きらら３９７」ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲで得られた増幅物の場合、塩基番号１〜９の領域、塩基番号１０〜４９１の領域それぞれとほぼ完全に配列一致する領域が「日本晴」ゲノム配列上に存在したが、２領域は離れた位置に存在していた。配列番号１３で示される塩基配列を包含する、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ４９と「ほしのゆめ」ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲで得られた増幅物の場合、塩基番号４７５〜１４７５の領域はほぼ完全に配列一致する領域が「日本晴」ゲノム配列上に存在するが、塩基番号１〜４７４の領域は配列同一性が低い。
【００５１】
なお、現在、日本で作付けされている米の品種の殆どが人工交配技術により育成された品種である。相同組換えにより新たな形質を有する品種が得られたと考えると、上記配列同一性が急激に変化する塩基部位は、相同組換えを起こした部位（＝組換え領域）と予想される。
【００５２】
一方、今回の解析で各ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対増幅物の部分領域と高い配列同一性を示した「日本晴」ゲノム配列領域は、陽性品種における品種識別領域に対応する遺伝子座と予想される。この「日本晴」ゲノム配列における対応遺伝子座配列情報を利用すれば、少なくとも「日本晴」ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲ反応で増幅物が得られ、遺伝子座配列解析に利用したＰＣＲ増幅物の鋳型ＤＮＡを調製した陽性品種では増幅物が得られない品種識別用プライマーを設計できるはずである。
【００５３】
本発明では、各遺伝子座の塩基配列情報を元に、陽性品種の識別領域に対応する陰性品種における品種識別に利用可能な遺伝子領域を絞り込んだ。
【００５４】
今回の発明により「ひとめぼれ」ゲノム配列におけるＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対ＷＫＡ０９による増幅領域に対応する「日本晴」ゲノム配列での遺伝子座は配列番号２で示される塩基配列を含む領域と推定され、塩基番号１〜４８領域はＷＫＡ０９増幅物配列とほぼ完全一致する配列領域、塩基番号４９〜４１６は配列同一性の低い領域である。また、「きらら３９７」ゲノム配列におけるＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｓ１３による増幅領域に対応する「日本晴」ゲノム配列での遺伝子座候補領域は３箇所存在したが、何れの領域も品種識別に有用な領域であった。今回の発明では特に配列番号９で示される塩基配列を含む領域を品種識別に有用なゲノムＤＮＡ領域として利用した。なお配列番号９に示される塩基配列において、塩基番号１〜５５０がＳ１３増幅物の一部領域とほぼ完全一致する領域、５５１〜８４４領域は配列同一性の低い領域である。一方、「きらら３９７」ゲノム配列におけるＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ４による増幅領域と対応する「日本晴」ゲノム配列での遺伝子座候補領域も３箇所存在することが予想された。「きらら３９７」を鋳型にして得られた増幅物を塩基配列解析したところ８１７ｂｐであるが、Ｆｏｒｗａｒｄ側プライマーから４８４ｂｐとほぼ配列が完全一致する領域が１箇所、残り２箇所はＲｅｖｅｒｓｅ側プライマーから３３３ｂｐとほぼ配列が完全一致する領域である。このうち２箇所は品種識別性を示す領域とは無関係であり、「きらら３９７」ゲノム配列におけるＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ４による増幅領域に対応する「日本晴」ゲノム配列での遺伝子座候補領域を絞り込むことができた。該領域は配列番号１１で示される塩基配列を包含する領域であり、塩基番号１６〜４８２領域がＧ４増幅物の一部領域とほぼ配列一致する配列領域であり、塩基番号１〜１５は配列同一性の低い領域である。同様に「ほしのゆめ」ゲノム配列におけるＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ４９Ａによる増幅領域と対応する「日本晴」ゲノム配列での遺伝子座候補領域も２箇所存在することが予想された。すなわち「ほしのゆめ」を鋳型にしてＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ４９Ａにより得られた増幅物塩基配列に包含される配列番号１３に示された塩基配列の塩基番号４７５〜１４７５の領域とほぼ完全に配列一致する領域が１箇所、及び、塩基番号９００〜１４７５の領域とほぼ完全に配列一致する領域が１箇所存在したが、本発明により「日本晴」ゲノム配列におけるＧ４９Ａ対立遺伝子候補領域を絞り込むことができた。
【００５５】
Ａ−２）増幅物の部分領域と高い配列同一性を示す領域が「日本晴」ゲノム配列中には存在しないＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対
この群に分類されるＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対としては、Ｅ３０、Ｐ５が挙げられる。この群に属するＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対により得られた増幅物配列は、全域にわたり「日本晴」ゲノムＤＮＡに対し識別能力があり、増幅物領域内の任意の位置でＰＣＲプライマーを設計しても陰性品種、少なくとも「日本晴」に対する品種識別性能は保持される可能性がある。なお、この増幅物領域は陰性品種の対応遺伝子座に挿入変異が起こって挿入された領域の一部である可能性があり、ゲノム配列上において増幅領域近辺に組換え領域が存在すると予想される。Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ技術はゲノムＤＮＡにおける特定の塩基配列近傍の塩基配列を解析する技術であるが、該技術を用いれば陽性品種ゲノムＤＮＡにおける増幅領域近傍の塩基配列が解析出来る。あとは解析された塩基配列と陰性品種である「日本晴」ゲノムＤＮＡ配列と比較し、ほぼ完全一致する領域と配列同一性の低い領域と２分できる領域が存在すれば、該境界が組換え領域を示す塩基部位と予測される。
【００５６】
Ａ−３）増幅物の全領域と高い配列同一性を示す領域が「日本晴」ゲノム配列中には存在するＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対
この群に分類されるＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対としはＢ１８（特開２００１−９５５８９号（特許文献１））がある。この群に属するＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対の場合、プライマー配列内部、特に本識別領域を開発するに到った、ＲＡＰＤプライマー配列内に識別に重要な塩基部位が存在すると予想される。
【００５７】
ただしＲＡＰＤプライマーがミスアニーリングを起こして陽性品種ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ断片が増幅されている可能性があるので、陽性品種ゲノムＤＮＡを用いたＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ技術などでプライマー結合領域の正確なゲノム配列情報を入手することが好ましい。なお、ＲＡＰＤプライマー領域に隣接する増幅物内部配列にて設計したプライマー対によるＰＣＲでＲＡＰＤ法にて認められた品種識別性が消失する場合は本タイプに属するプライマー対である可能性が高い。
【００５８】
Ｂ）「日本晴」ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲ反応で識別バンドが検出されるＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対
特開２００５−２４５２４４号公報（特許文献３）に開示されたＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対の中ではＭ２ＣＧ、Ｐ３、Ｂ１、Ｂ４３、Ｆ６が挙げられる。これらは「日本晴」ゲノム配列のどこかに鋳型となる領域が存在するため、「日本晴」ゲノム配列との比較だけではこれ以上の分類は出来ない。ただし、各プライマー対で増幅物が得られない品種（以下、陰性品種と呼ぶ）ゲノムＤＮＡ配列と比較可能な状態になった場合、Ａと同様、更に下記２群に分類出来るはずである。
【００５９】
Ｂ−１）陰性品種ゲノムＤＮＡ配列と比較した場合、識別バンド増幅物配列内に組換え点が存在するＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対、Ｂ−２）識別バンド増幅物の部分領域と高い配列同一性を示す領域が陰性品種ゲノム配列中には存在しないＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対
【００６０】
なおＢに属するＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対の場合、「日本晴」ゲノム配列における増幅領域周辺の塩基配列は判るので、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー結合領域を含むように増幅領域の両末端でＰＣＲプライマー対を設計することは可能である。このように設計した２組のプライマー対によるＰＣＲを行った際、片方のプライマー対で品種識別性が消失するとＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対によるゲノムＤＮＡ上の増幅領域内に組換え領域が存在することが予想されるＢ−１に属することになる。特開２００５−２４５２４４号公報（特許文献３）に開示された配列と「日本晴」ゲノム配列と比較したところ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対の中ではＭ２ＣＧ、Ｐ３、Ｂ１がこの群に属した。組換え領域については、陰性品種、陽性品種共に保存されていると予想される組換え領域近辺の「日本晴」ゲノム配列からの塩基配列情報と陰性品種から調製したゲノムＤＮＡを利用し、Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲなどの技術を用いることで、陰性品種における組換え点を含む対応遺伝子座領域の塩基配列情報を得ることが出来る。この配列情報と陽性品種「日本晴」ゲノム配列情報と比較することで組換え領域と予想される塩基部位を決定することが出来る。
【００６１】
例えば、「日本晴」ゲノム配列においてＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｍ２ＣＧにおいて増幅される領域は配列番号５で示される塩基配列を包含するが、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｍ２ＣＧ陰性品種である「あきたこまち」についてＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ技術により解析を行ったゲノムＤＮＡ配列と比較したところ、配列番号５の塩基番号１〜７６３領域は「あきたこまち」ゲノムＤＮＡにもほぼ完全に配列が一致する領域が存在し、塩基番号７６４〜１０８７は配列同一性が低い領域であることが判った。また、「日本晴」ゲノム配列においてＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｐ３により増幅される領域は配列番号６で示される塩基配列を包含するが、塩基番号１〜３６６領域はＰ３陰性品種である「あきたこまち」ゲノムＤＮＡにほぼ完全一致する領域が存在し、その塩基番号３６７〜４４７領域は配列同一性の低い領域であることが判った。
【００６２】
一方、上記解析に用いた陰性品種ゲノム配列上の塩基配列を有するＤＮＡ領域も品種識別に利用可能なＤＮＡ領域であると推定される。
【００６３】
例えば、「日本晴」ゲノム配列におけるＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｍ２ＣＧ増幅領域に対応する「あきたこまち」ゲノム配列における遺伝子座は配列番号４４で示される塩基配列を包含する領域と推定され、その塩基番号１〜８２１領域は「日本晴」ゲノム配列上にほぼ完全一致する領域が存在し、配列番号８２２〜１５７８領域は配列同一性の低い領域である。一方、「日本晴」ゲノム配列におけるＲＡＰＤ−ＳＴＳ化Ｐ３プライマー対増幅領域に対応する「あきたこまち」ゲノム配列における遺伝子座は配列番号７で示される塩基配列を包含する領域と推定されるが、その塩基番号１〜３６０領域と塩基番号３５４〜５２１領域が「日本晴」同一染色体配列上に約３ｋｂｐ領域を挟んで存在する。「あきたこまち」遺伝子座領域では当該領域に対応するものと予想される「日本晴」遺伝子座配列と比較して、塩基番号３５４〜３６０の７塩基部分が重なって中間の約３ｋｂｐが欠失した配列となっている。
【００６４】
一方、Ｂに分類されたＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対において、増幅領域の両末端で設計したＰＣＲプライマー対で両方が識別性を示した場合、Ｂ−２に属すると考えられる。特開２００５−２４５２４４号公報（特許文献３）に開示されたＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対の中ではＢ４３、Ｆ６が挙げられる。該増幅領域配列は陰性品種ゲノムＤＮＡに対し選択性があり、増幅物領域内の適当な位置でＰＣＲプライマー対を設計しても陰性品種に対する品種識別性能は保持されている可能性がある。
【００６５】
一方、この増幅物領域は陰性品種の対応遺伝子座に挿入が起こった領域の一部である可能性がある。したがって陽性品種のゲノム配列では該増幅領域近辺に挿入を起こした組換え領域が存在すると考えられる。「日本晴」ゲノム配列における増幅領域近傍配列は公知であるため、例えば、該配列情報を元に適当な位置でプライマー対を設計し、陰性品種でも増幅物が得られるようなプライマー対が見つかれば、該プライマー対による増幅領域と品種識別性能を維持していたプライマー対による増幅領域間に組換えを起こした部位が存在すると予想される。あとは陰性品種、陽性品種共に保存されていると予想される組換え領域近辺の「日本晴」ゲノム配列からの塩基配列情報と陰性品種から調製したゲノムＤＮＡを利用し、Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲなどの技術を用いることで、陰性品種における組換え領域を含む対応遺伝子座領域の塩基配列情報を得ることが出来る。この配列情報と陽性品種「日本晴」ゲノム配列情報と比較することで組換え領域と予想される塩基部位を決定することが出来る。
【００６６】
Ｃ）品種によりサイズの異なる識別バンドが検出されるＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対
以下、長いサイズの識別バンド増幅物を増幅物Ｌ、短いサイズの識別バンド増幅物を増幅物Ｓとすると、増幅物Ｌの塩基配列と増幅物Ｓの塩基配列とは配列同一性が無いのではなく、増幅物Ｌの塩基配列中には増幅物Ｓの塩基配列には存在しない塩基挿入領域がところどころ存在する場合が認められた。特開２００５−２４５２４４号公報（特許文献３）に開示されたＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ａ６については、ＰＣＲ反応時のＡｎｎｅａｌｉｎｇ温度を下げるなどした場合、Ａ６識別バンドが検出されなかった陰性品種で増幅物Ｌが検出されるようになりこの群に分類した。またＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対ではないＲＡＰＤプライマーＧ２２またはＧ２８で得られる識別バンド増幅物もこの群に分類される。ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ａ６において得られる識別バンド増幅物のうち長い方をＡ６Ｌ、短い方をＡ６Ｓとすると、日本晴ゲノム配列情報よりＡ６Ｌ増幅物領域は配列番号４で示される塩基配列を包含する領域であり、「はえぬき」ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより得られたＡ６Ｓ増幅物配列と比較したところ、配列番号４の塩基番号１９〜２６の挿入が認められた。またＲＡＰＤプライマーＧ２２において得られる識別用増幅物のうち長い方をＧ２２Ｌ、短い方をＧ２２Ｓとすると、日本晴ゲノム配列情報よりＧ２２Ｓ増幅物領域は配列番号３で示される塩基配列を包含する領域であり、「コシヒカリ」ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより得られたＧ２２Ｌ増幅物配列と比較した場合、Ｇ２２Ｌは配列番号３の塩基番号７１〜７９領域に挿入が起こった配列となっていた。
【００６７】
次いで上記確認結果を元にＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対の品種識別能について考察した。
【００６８】
プライマー由来領域を除く増幅物配列内に組換え領域と予測される塩基部位を包含するＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対が品種識別性を示すのは、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対の配列が重要なのではなく、プライマーの結合する領域が陽性となる品種ゲノムＤＮＡ配列中の組換え領域を挟んで存在する点にあると示唆された。したがって、少なくともＰＣＲ増幅物が組換え領域を包含するようにＰＣＲプライマーを設計すれば、ＲＡＰＤプライマー結合領域に左右されず、増幅物サイズを適度に調節可能になることが予想される。
【００６９】
これはＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対で識別される増幅領域だけでなく、該領域に対応すると思われる陰性品種におけるゲノムＤＮＡの遺伝子座領域においても同様と考えられる。
【００７０】
比較可能な品種ゲノムＤＮＡ配列情報が無い場合、例えば、ＲＡＰＤ法にて検出された識別バンドＤＮＡ断片の塩基配列を解析する。次いで、前記Ａ−２に分類されたＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対のように、該ＤＮＡ情報を基にＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ技術などにより増幅領域周辺のＤＮＡ塩基配列情報を収集する。その後、前記Ｂ−１に分類されたＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対と同様に、増幅領域の周辺領域でＰＣＲプライマー対を作成、一方のプライマー対で陰性品種ゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲでも増幅物が検出された場合、ＲＡＰＤプライマーによる識別バンドとして検出ＤＮＡ断片配列中に組換え領域が存在すると考えられる。ついで陰性品種ゲノムＤＮＡ中にも保有されていると考えられるＤＮＡ配列を基にＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ技術などにより陰性品種ゲノムＤＮＡ中の当該ＤＮＡ領域周辺のＤＮＡ塩基配列情報を解析すれば、前記同様組換え領域の推測が出来る。
【００７１】
または、上記の方法にて得られた陽性品種ゲノムＤＮＡ中及び陰性品種ゲノムＤＮＡ中に共に保有されるＤＮＡ領域よりプライマーウォーキング法などの技術で該ＤＮＡ領域周辺の塩基配列を解析することも出来る。
【００７２】
すなわち本発明における品種識別用オリゴヌクレオチド設計方法の一態様として、ゲノムＤＮＡを鋳型とした核酸増幅反応によって組換え領域と予測される塩基部位を含むＤＮＡ断片を増幅しうる一対のオリゴヌクレオチドを設計することを特徴とする、品種識別用オリゴヌクレオチドの設計方法が挙げられる。
【００７３】
ＰＣＲプライマーとして利用するオリゴヌクレオチドの場合、組換え領域と予測される塩基部位がプライマー由来領域を除く増幅物内部に存在するよう設計する他、ＰＣＲプライマー配列内に該組換え領域と予測される塩基部位が包含されるように設計しても良い。ただし、品種識別に有用なゲノムＤＮＡ領域の配列特徴などにより対として使用するプライマーが対応する遺伝子座と思われる配列とほぼ配列一致する領域でしか設計できない場合、組換え領域と予測される塩基部位が、プライマーの５’末近辺に存在すると反応条件によってはプライマーとしての配列識別性が十分に発揮されず、品種識別性を示さない、すなわち、本来その配列を保有していないと考えられる品種ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲ反応でも増幅物が得られてくる場合がある。したがって、設定した反応条件で識別性を示す、すなわちその配列を保有している品種ゲノムＤＮＡを鋳型にした反応では目的とする増幅物が得られ、その配列を保有していない品種ゲノムＤＮＡを鋳型にした反応では目的とする増幅物が得られないようにプライマーの配列や増幅条件を適宜調整する必要がある。この調整は、識別したいＤＮＡ領域配列の特徴、設定したＰＣＲ反応条件（Ａｎｎｅａｌｉｎｇ温度など）によって異なってくるので、適宜対応する必要がある。
【００７４】
オリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、組換え領域と予測される塩基部位を包含する塩基配列または当該配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを設計することにより、品種識別能を有するオリゴヌクレオチドを設計することが出来る。
【００７５】
一方、組換え領域を包含すると予測される品種識別に有用なＤＮＡ領域において、識別可能な品種のゲノム配列とは配列同一性が低い領域が存在する場合、該領域配列内でのみ設計したプライマー対、またはプローブも品種識別性能を有するはずである。
【００７６】
すなわち本発明における品種識別用オリゴヌクレオチド設計方法の一態様として、組換え領域と予測される塩基部位に隣接し、かつ一方の品種のゲノム配列とは配列同一性の低い領域のみを核酸増幅反応によって増幅しうる一対のオリゴヌクレオチドを設計することを特徴とする、品種識別用オリゴヌクレオチドの設計方法が挙げられる。
【００７７】
プライマー、プローブとしてのオリゴヌクレオチドを設計する手段としては特に限定されないが、選択された塩基配列に基づいて市販の設計ソフトを使用することが好適である。このような設計ソフトとしては、タカラバイオ（株）発売のＯＬＩＧＯ（登録商標）Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｆｏｒ  Ｗｉｄｏｗｓ（Ｃｏｄｅ  ＮＢ１００Ｗ）などが挙げられる。
【００７８】
本発明の第２の発明は米の品種識別方法であってゲノムＤＮＡ中における下記（１）〜（１５）から選択される特定塩基配列の存在もしくは非存在を識別の指標とすることを特徴とする米の品種識別方法に関する：
（１）配列番号１で示され組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号４２４、４２５である品種識別用ＤＮＡ領域、
（２）配列番号２で示され組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号４８、４９である品種識別用ＤＮＡ領域、
（３）配列番号３で示され組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号７０〜８０である品種識別用ＤＮＡ領域、
（４）配列番号４で示され組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号１９〜２６である品種識別用ＤＮＡ領域、
（５）配列番号５で示され組換え領域と予測される塩基部位がを塩基番号７６３、７６４である品種検出用ＤＮＡ領域、
（６）配列番号６で示され組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号３６６、３６７であるＤＮＡ領域、
（７）配列番号７で示され組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号３５３〜３６１であるＤＮＡ領域、
（８）配列番号８で示され組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号２４９、２５０であるＤＮＡ領域、
（９）配列番号９で示され組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号５５０、５５１であるＤＮＡ領域、
（１０）配列番号１０で示され組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号９、１０であるＤＮＡ領域、
（１１）配列番号１１で示され組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号１５、１６であるＤＮＡ領域、
（１２）配列番号１２で示され組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号５５５〜５５８であるＤＮＡ領域、
（１３）配列番号１３で示され組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号４７４、４７５の領域であるＤＮＡ領域、
（１４）配列番号５７で示され組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号２３１、２３２の領域であるＤＮＡ領域、及び
（１５）配列番号５８で示され組換え領域と予測される塩基部位が塩基番号１１４、１１５の領域であるＤＮＡ領域。
【００７９】
上記組換え領域として選択された塩基部位は、対応する遺伝子座と考えられる塩基配列間との比較において、予測された組換え領域とその両側各１塩基である。前記（１）、（２）、（５）、（６）、（８）、（９）、（１０）、（１１）、（１３）、（１４）、（１５）については、識別に利用可能なＤＮＡ領域は、比較した塩基配列に対して配列同一性の高い領域と低い領域に明瞭に２分できたため、各領域の境目を示す２塩基を組換え領域と予測される塩基部位として記載した。一方、（３）、（７）、（１２）については、識別に利用可能なＤＮＡ領域が、比較した塩基配列に対して配列同一性の高い領域と低い領域に明瞭に２分できず重複領域が存在したため、上記組換え領域として選択された塩基部位は重複領域と隣接する５’側、３’側各１塩基である。（４）については８塩基の挿入が認められたので、挿入領域を組み換え領域として記載した。
【００８０】
なお、（１２）は「ななつぼし」中に混入したＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ４陽性品種である「きらら３９７」「あきほ」検出目的に新たに開発した品種識別用ＤＮＡ領域である。
【００８１】
ＤＮＡ領域（１）は「ひとめぼれ」ゲノムＤＮＡ中のＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対ＷＫＡ０９による増幅領域で「日本晴」ゲノム配列との比較において塩基番号４２４、４２５が組換え領域と予測される塩基部位であるが、該組換え塩基部位を増幅物配列内に包含するように設計したＰＣＲプライマー対ではＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対ＷＫＡ０９陽性品種では識別バンドを検出、陰性品種では識別バンドを検出せず、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対ＷＫＡ０９と同じ識別性能を示した。
【００８２】
ＤＮＡ領域（５）は「日本晴」ゲノムＤＮＡ中のＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｍ２ＣＧによる増幅領域で「あきたこまち」ゲノム配列との比較において塩基番号７６３、７６４が組換え領域と予測される塩基部位であるが、該組換え塩基部位を増幅物配列内に包含するように設計したＰＣＲプライマー対ではＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｍ２ＣＧ陽性品種では識別バンドを検出、陰性品種では識別バンドを検出せず、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｍ２ＣＧと同じ識別性能を示した。
【００８３】
ＤＮＡ領域（８）は「きらら３９７」ゲノムＤＮＡ中のＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｓ１３による増幅領域で「日本晴」ゲノム配列との比較において塩基番号２４９、２５０が組換え領域と予測される塩基部位であるが、該組換え塩基部位を増幅物配列内に包含するように設計したＰＣＲプライマー対ではＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｓ１３陽性品種では識別バンドを検出、陰性品種では識別バンドを検出せず、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｓ１３と同じ識別性能を示した。
【００８４】
ＤＮＡ領域（１０）は「きらら３９７」ゲノムＤＮＡ中のＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ４による増幅領域で「日本晴」ゲノム配列との比較において塩基番号９、１０が組換え領域と予測される塩基部位であるが、該組換え塩基部位を増幅物配列内に包含するように設計したＰＣＲプライマー対ではＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ４陽性品種では識別バンドを検出、陰性品種では識別バンドを検出せず、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ４と同じ識別性能を示した。
【００８５】
ＤＮＡ領域（１３）は「ほしのゆめ」ゲノムＤＮＡ中のＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ４９による増幅領域で「日本晴」ゲノム配列との比較において塩基番号１〜４７４の領域が配列同一性が低く該領域内のみ増幅するように設計したＰＣＲプライマー対では、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ４９陽性品種では識別バンドを検出、陰性品種では識別バンドを検出せず、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ４９と同じ識別性能を示した。
【００８６】
一方、ＤＮＡ領域（２）は「日本晴」ゲノムＤＮＡ中のＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対ＷＫＡ０９陽性品種における増幅領域に対応する遺伝子座配列で組換え領域と予想される塩基部位は塩基番号４８、４９と予想された。ＤＮＡ領域（２）を検出する目的で設計したＰＣＲプライマー対による実施例記載の各種米ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲでは、驚くべきことに、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対ＷＫＡ０９陽性品種では識別バンドが検出されず、「日本晴」を含む陰性品種では識別バンドが検出され、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対ＷＫＡ０９と識別性が反転するＰＣＲプライマー対を設計可能であることが判明した。
【００８７】
またＤＮＡ領域（３）は「日本晴」ゲノムＤＮＡ中のＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ２２陽性品種における増幅領域に対応する遺伝子座配列で組換え領域と予想される塩基部位は塩基番号７０〜８０と予想された。ＤＮＡ領域（３）を検出する目的で設計したプライマー対による実記例記載の各種米ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲでは、驚くべきことに、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ２２と識別性が反転するＰＣＲプライマー対を設計可能であることが判明した。
【００８８】
ＤＮＡ領域（４）は「日本晴」ゲノムＤＮＡ中のＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ａ６陽性品種における増幅領域に対応する遺伝子座配列で組換え領域と予想される塩基部位は塩基番号１９〜２６と予想された。ＤＮＡ領域（４）を検出する目的で設計したプライマー対による実施例記載の各種米ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲでは、驚くべきことに、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ａ６と識別性が反転するＰＣＲプライマー対を設計可能であることが判明した。
【００８９】
ＤＮＡ領域（７）は「あきたこまち」ゲノムＤＮＡ中のＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｐ３陽性品種における増幅領域に対応する遺伝子座配列で組換え領域と予想される塩基部位は塩基番号３５３〜３６１と予想された。ＤＮＡ領域（７）を検出する目的で設計したプライマー対による実施例記載各種米ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲでは驚くべきことに、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｐ３と識別性が反転するＰＣＲプライマー対を設計可能であることが判明した。
【００９０】
ＤＮＡ領域（９）は「日本晴」ゲノムＤＮＡ中に存在し組換え領域と予想される塩基部位は塩基番号５５０、５５１と予想された。ＤＮＡ領域（９）を検出する目的で設計したプライマー対による実施例記載の各種米ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲでは驚くべきことに、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｓ１３と識別性が反転するＰＣＲプライマー対を設計可能であることが判明した。
【００９１】
ＤＮＡ領域（１１）は「日本晴」ゲノムＤＮＡにおいてＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ４陽性品種における増幅領域に対応する遺伝子座配列で組換え領域と予想される塩基部位は塩基番号１５、１６と予想された。ＤＮＡ領域（１１）を検出する目的で設計したプライマー対による実施例記載の各種米ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲでは、驚くべきことに、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ４と識別性が反転するＰＣＲプライマー対を設計可能であることが判明した。
【００９２】
ＤＮＡ領域（１４）は「あきたこまち」ゲノムＤＮＡにおいてＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｍ２ＣＧ陽性品種における増幅領域に対応する遺伝子座配列で、組換え領域と予想される塩基部位は塩基番号２３１、２３２と予想された。ＤＮＡ領域（１４）を検出する目的で設計したプライマー対による実施例記載の各種米ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲでは、驚くべきことに、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｍ２ＣＧと識別性が反転するＰＣＲプライマー対を設計可能であることが判明した。
【００９３】
ＤＮＡ領域（１５）は「日本晴」ゲノムＤＮＡにおいてＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ４９Ａ陽性品種における増幅領域に対応する遺伝子座配列で組換え領域と予想される塩基部位は塩基番号１１４、１１５と予想された。ＤＮＡ領域（１５）を検出する目的で設計したプライマー対による実施例記載の各種米ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲでは、驚くべきことに、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ４９Ａと識別性が反転するＰＣＲプライマー対を設計可能であることが判明した。
【００９４】
以上のように、ＤＮＡ領域（１）と（２）は、本願明細書の表１、ｒＷＫＡ０９−１欄において＋と−で示された品種間の識別に利用可能であり、具体例としてはコシヒカリ、日本晴、などからなる品種群と、ひとめぼれ、ヒノヒカリ、あきたこまち、などからなる品種群の識別に用いることができる。
【００９５】
ＤＮＡ領域（３）は、本願明細書の表２、ｒＧ２２−１欄において＋と−で示された品種間の識別に利用可能であり、具体例としては、コシヒカリ、ひとめぼれ、ヒノヒカリ、きらら３９７、ほしのゆめ、ななつぼし、などからなる品種群と、あきたこまち、キヌヒカリ、はえぬき、つがるロマン、日本晴、むつほまれ、ササニシキ、ハツシモ、などからなる品種群の識別に用いることができる。
【００９６】
ＤＮＡ領域（４）は、本願明細書の表１、ｒＡ６−１欄において＋と−で示された品種間の識別に利用可能であり、具体例としては、コシヒカリ、ひとめぼれ、ヒノヒカリ、あきたこまち、きらら３９７、ほしのゆめ、などからなる品種群と、キヌヒカリ、はえぬき、ハツシモ、などからなる品種群の識別に用いることができる。
【００９７】
ＤＮＡ領域（５）と（１４）は、本願明細書表１のｓＭ２ＣＧ−１欄において＋と−で示された品種間の識別に利用可能であり、具体例としてはコシヒカリ、あきたこまち、キヌヒカリ、つがるロマン、ササニシキ、などからなる品種群と、ひとめぼれ、ヒノヒカリ、はえぬき、きらら３９７、ほしのゆめ、ななつぼし、ハツシモ、などからなる品種群の識別に用いることができる。
【００９８】
ＤＮＡ領域（６）と（７）は、本願明細書の表１、ｒＰ３−１欄において＋と−で示された品種間の識別に利用可能であり、具体例としては、コシヒカリ、ヒノヒカリ、キヌヒカリ、きらら３９７、ほしのゆめ、ななつぼし、ハツシモ、などからなる品種群と、ひとめぼれ、あきたこまち、つがるロマン、はえぬき、ササニシキ、などからなる品種群の識別に用いることができる。
【００９９】
ＤＮＡ領域（８）と（９）は、本願明細書表４のｒＳ１３−１欄において＋と−で示された品種間の識別に利用可能であり、具体例としては、コシヒカリ、ひとめぼれ、ヒノヒカリ、あきたこまち、キヌヒカリ、つがるロマン、ななつぼし、などからなる品種群と、きらら３９７、ほしのゆめ、などからなる品種群の識別に用いることができる。
【０１００】
ＤＮＡ領域（１０）と（１１）は、本願明細書表４のｒＧ４−１欄において＋と−で示された品種間の識別に利用可能であり、具体例としては、コシヒカリ、ひとめぼれ、ヒノヒカリ、あきたこまち、キヌヒカリ、はえぬき、ほしのゆめ、つがるロマン、などからなる品種群と、きらら３９７、ななつぼし、などからなる品種群の識別に用いることができる。
【０１０１】
ＤＮＡ領域（１２）と（１５）は、本願明細書表４のｓＧ４９Ａ−１欄において＋と−で示された品種間の識別に利用可能であり、具体例としてはコシヒカリ、ひとめぼれ、キヌヒカリ、きらら３９７、つがるロマン、などからなる品種群と、ヒノヒカリ、あきたこまち、ほしのゆめ、ななつぼし、などからなる品種群の識別に用いることができる。
【０１０２】
ＤＮＡ領域（１３）は、本願明細書表５のＮａｋ−１欄において＋と−で示された品種間の識別に利用可能であり、具体的には、ななつぼし、日本晴、などからなる品種群と、きらら３９７、ほしのゆめ、あきほ、などからなる品種群の識別に用いることができる。
【０１０３】
本発明を用いれば、様々な品種の識別を行うことが可能となるが、利用する特定塩基配列の数は識別を行う品種とその前提条件によって変わってくる。
【０１０４】
たとえば、「検体が２品種で相互に識別」という条件の場合、最少１つの特定塩基配列の利用で識別を行うことが出来る。「検体が３品種で相互に識別」であるという条件の場合、識別には最少２つの特定塩基配列が識別に必要となる。ただし、「検体が３品種のうちのいずれかで、特定の１品種であるか否か？」という場合、特定の１品種とその他２品種の２群に識別できれば良いので最少１つの特定塩基配列の利用で識別できる可能性がある。
【０１０５】
現在、日本における主食は水稲粳であり、水稲粳作付け全国面積において、上位２０品種で９０％、上位６０品種で９７％程度を占める。
【０１０６】
したがって、水稲粳品種において、作付け上位６０品種、とりわけ上位２０品種と識別できれば、ほぼ実用的な品種識別系と考えられる。
【０１０７】
以下、作付け上位１０位以内の品種についての品種識別系を例示するが、品種識別用の特定ＤＮＡ配列の選択は上位６０品種内における異品種をできるだけ検出可能な定性検査系を前提としている。
【０１０８】
例えば、ＰＣＲ法を用いた品種識別系の場合、マルチプレックス反応系とすれば反応数を減らすことが出来るが、プライマー数が少ないほうが反応系の安定化を期待出来る。したがって、必要とするプライマー数が出来るだけ少なくなるような組み合わせとすることが好ましい。
【０１０９】
選択の仕方としては、例えば、「キヌヒカリ」を検査対象品種とした場合、「キヌヒカリ」ゲノムＤＮＡ中に保有しない特定塩基配列を選択することが第１条件である。本反応系例を表１に記載しているが、この表において、Ｍ１１、ｒＰ３−１、ｒＷＫＡ０９−１、ｒＡ６−１、ｓＭ２ＣＧ−１はＰＣＲプライマー対名を表しており、「キヌヒカリ」のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにおいて識別バンドが検出された場合は＋、識別バンドが検出されなかった場合は−で表わされている。すなわち、この表の場合、キヌヒカリで−を示している、ｒＰ３−１、ｒＡ６−１、ｓＭ２ＣＧ−１、ｒＷＫＡ０９−１各プライマー対の増幅領域となる配列を含む特定塩基配列が第１条件に合致する。なお、プライマー対ｒＷＫＡ０９−１は上記ＤＮＡ領域（２）、プライマー対ｒＡ６−１は上記（４）、プライマー対ｓＭ２ＣＧ−１は上記（５）をそれぞれ検出可能なＰＣＲプライマー対である。
【０１１０】
表１記載の品種を検査対象とした場合、第１条件を満たした前記プライマー対のうちプライマー対ｒＡ６−１で増幅物が得られる品種は「キヌヒカリ」を除く５９品種中４８品種を占める。したがってプライマー対ｒＡ６−１を用いると１プライマーで４８品種との識別が可能となる。あとはプライマー対ｒＡ６−１で増幅物が得られない品種が＋となるプライマーを選択すればよいが、プライマー対ｓＭ２ＣＧ−１が残り１１品種のうち１０品種で＋となる。残り１品種についてはプライマー対ｒＷＫＡ０９−１を用いれば識別可能となり、計３プライマー対でキヌヒカリを除くその他５９品種がすべて＋となりキヌヒカリと識別可能となる。なお、上記３プライマー対でいずれかが＋となる品種はキヌヒカリではないと識別出来るが、３プライマー対いずれも−になったからといってキヌヒカリであるとまでは断定できない。
【０１１１】
一方、表１は前記３プライマー対の他、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｍ１１、プライマー対ｒＰ３−１を用いたマルチプレックスＰＣＲ反応系での結果である。ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｍ１１はキヌヒカリで識別バンドが検出されるが、これはＰＣＲ反応に阻害がかかっていないか確認するためのＰｏｓｉｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ反応用に加えたものである。なお前記プライマー対４種にプライマー対ｒＰ３−１を加えると各品種の＋、−パターンの組み合わせがさらに広がり、１反応でより多くの品種を相互に識別出来るようになる。表１記載の５プライマー対からなる反応系は「キヌヒカリ」の定性検査での使用を目的に設計したものであるが、定量検査において、より詳細に品種を識別したい場合にも使用できる。
【０１１２】
同様の選択基準で本願発明における（１）〜（１３）で示された特定塩基配列を適宜選択した識別法の一例が、前記（３）、（１１）、（１３）から選択される少なくとも１種の特定塩基配列がゲノムＤＮＡ中に存在する品種を「きらら３９７」でないと識別する方法、前記（１１）、（１２）から選択される少なくとも１種の特定塩基配列がゲノムＤＮＡ中に存在する品種を「ななつぼし」でないと識別する方法、前記（３）、（９）、（１０）から選択される少なくとも１種の特定塩基配列がゲノムＤＮＡ中に存在する品種を「ほしのゆめ」でないと識別する方法である。
【０１１３】
なおゲノムＤＮＡ中の前記（１）〜（１５）の特定塩基配列の存在は、例えば核酸増幅法により増幅されるＤＮＡ断片の検出により実施することが出来る。核酸増幅法は、好ましくは、ＰＣＲ法であるが、プライマー対は第１の発明に基づいて設計されたプライマー対を用いればよい。
【０１１４】
このようなＰＣＲプライマー対としては、下記（ａ）〜（ｒ）を例示することが出来る：
（ａ）配列番号１４で表されるＤＮＡ及び配列番号１５で表されるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１６で表されるＤＮＡ及び配列番号１７で表されるＤＮＡ、
（ｃ）配列番号１８で表されるＤＮＡ及び配列番号１９で表されるＤＮＡ、
（ｄ）配列番号２０で表されるＤＮＡ及び配列番号２１で表されるＤＮＡ、
（ｅ）配列番号２２で表されるＤＮＡ及び配列番号２３で表されるＤＮＡ、
（ｆ）配列番号２４で表されるＤＮＡ及び配列番号２５で表されるＤＮＡ、
（ｇ）配列番号２６で表されるＤＮＡ及び配列番号２７で表されるＤＮＡ、
（ｈ）配列番号２８で表されるＤＮＡ及び配列番号２９で表されるＤＮＡ、
（ｉ）配列番号３０で表されるＤＮＡ及び配列番号３１で表されるＤＮＡ、
（ｊ）配列番号３２で表されるＤＮＡ及び配列番号３３で表されるＤＮＡ、
（ｋ）配列番号３４で表されるＤＮＡ及び配列番号３２で表されるＤＮＡ、
（ｌ）配列番号３５で表されるＤＮＡ及び配列番号３６で表されるＤＮＡ、
（ｍ）配列番号３７で表されるＤＮＡ及び配列番号３８で表されるＤＮＡ、
（ｎ）配列番号３９で表されるＤＮＡ及び配列番号４０で表されるＤＮＡ、
（ｏ）配列番号４１で表されるＤＮＡ及び配列番号３４で表されるＤＮＡ、
（ｐ）配列番号５９で表されるＤＮＡ及び配列番号６０で表されるＤＮＡ、
（ｑ）配列番号６１で表されるＤＮＡ及び配列番号６０で表されるＤＮＡ、及び
（ｒ）配列番号６２で表されるＤＮＡ及び配列番号６３で表されるＤＮＡ。
【０１１５】
上記「キヌヒカリ」についての識別をＰＣＲにより実施する場合、用いるプライマー対としては前記（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、上記「きらら３９７」についての識別をＰＣＲにより実施する場合、用いるプライマー対としては前記（ｃ）、（ｋ）、（ｌ）、上記「ななつぼし」についての識別により実施する場合、用いるプライマー対としては前記（ｍ）、（ｏ）、上記「ほしのゆめ」についての識別をＰＣＲにより実施する場合、用いるプライマー対としては前記（ｃ）、（ｉ）、（ｊ）、がそれぞれ例示される。
【０１１６】
以下、本明細書において（ａ）で示されるＤＮＡからなるプライマー対をｓＷＫＡ０９−１、（ｂ）で示されるＤＮＡからなるプライマー対をｒＷＫＡ０９−１、（ｃ）で示されるＤＮＡからなるプライマー対をｒＧ２２−１、（ｄ）で示されるＤＮＡからなるプライマー対をｒＡ６−１、（ｅ）で示されるＤＮＡからなるプライマー対をｓＭ２ＣＧ−１、（ｆ）で示されるＤＮＡからなるプライマー対をｓＰ３−１、（ｇ）で示されるＤＮＡからなるプライマー対をｒＰ３−１、（ｈ）で示されるＤＮＡからなるプライマー対をｓＳ１３−１、（ｉ）で示されるＤＮＡからなるプライマー対をｒＳ１３−１、（ｊ）で示されるＤＮＡからなるプライマー対をｓＧ４−１、（ｋ）で示されるＤＮＡからなるプライマー対をｒＧ４−１、（ｌ）で示されるＤＮＡからなるプライマー対をｓＧ４９Ａ−１、（ｍ）で示されるＤＮＡからなるプライマー対をＮａｋ−１、（ｎ）で示されるＤＮＡからなるプライマー対をｒＧ２２−２、（ｏ）で示されるＤＮＡからなるプライマー対をｒＧ４−２、（ｐ）で示されるＤＮＡからなるプライマー対をｒＭ２ＣＧ−１、（ｑ）で示されるＤＮＡからなるプライマー対をｒＭ２ＣＧ−２、（ｒ）で示されるＤＮＡからなるプライマー対をｒＧ４９Ａ−１、と呼ぶ。
【０１１７】
なお上記プライマー対は、タカラバイオ株式会社から発売されているコメ品種判別用ＰＣＲ  Ｋｉｔ  Ｉ（タカラバイオ株式会社製  製品コード  ＲＲ２１１Ａ）の反応条件でＰＣＲプライマーとして好適に使用できるよう設計されている。本発明では、その他の条件に合うようさまざまなプライマーを設計することが可能であり、上記のプライマー対の使用に限定されるものではない。
【０１１８】
前記ＰＣＲプライマー対は、ＰＣＲ増幅物の検出技術としてアガロースゲル電気泳動を前提に設計したものであるが、本明細書におけるＤＮＡ断片を検出する技術は特に限定されるものではない。例えば、ＰＣＲプライマーの他に蛍光色素を付加したプローブを併用したリアルタイムＰＣＲにより蛍光にてＤＮＡ断片を検出しても良い。このようなプライマー、プローブのセットは上記（１）〜（１３）記載の配列情報を元に市販の設計ソフトを用いて適宜設計することが可能である。また適当な担体に固定した本明細書記載のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに基づいて品種識別用ＤＮＡ領域を包含する核酸が存在するか否かを検出する、所謂ＤＮＡチップなどの技法により検出しても良い。
【０１１９】
本発明における米の品種識別方法として核酸増幅法を利用した場合、具体的に下記工程を行う方法が挙げられる：
（Ａ）米試料中の米の核酸を調製する核酸調製工程、
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた核酸を鋳型として核酸増幅法を実施する工程、及び
（Ｃ）工程（Ｂ）で得られたＤＮＡ断片の解析を実施する工程。
【０１２０】
（Ａ）米試料中の米のゲノムＤＮＡを調製する核酸調製工程
本工程において、イネ由来の米試料から米のゲノムＤＮＡを調製する。被検試料からの核酸の調製法は公知のゲノムＤＮＡ調製法を適宜選択して用いることができる。例えば、ＣＴＡＢ法、酵素法（大坪ら、特開２０００−２８７６９１号）、等に従って調製することができる。その他、植物のゲノムＤＮＡを抽出可能な調製法であれば特に限定されるものではなく、例えば市販されているＤＮＡ抽出キット（タカラバイオ株式会社製  コメＤＮＡ抽出キット（タカラバイオ株式会社：Ｃｏｄｅ９１９７、Ｃｏｄｅ９１０３）等）により調製することもできる。
【０１２１】
被検試料としては、イネであれば特に限定されることは無く、全草、葉、茎、根、種子等を本発明に用いることができる。形態学的な品種の識別がより困難な種子、形態学的又は生化学的な品種の識別がさらに困難になる玄米あるいは精米であっても、本発明の方法は適用可能である。
【０１２２】
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた核酸を鋳型として核酸増幅法を実施する工程
本工程では、工程（Ａ）で調製した核酸を鋳型ＤＮＡにして核酸増幅法を行い、得られるＤＮＡ断片により本発明における特定塩基配列の存在を検出する。
【０１２３】
反応に要する容器や試薬、組成は特に限定されるものではないが、核酸増幅法としてＰＣＲ法を利用する場合は市販のＰＣＲ用試薬、ＰＣＲ用キットを使用してもよい。タカラバイオ株式会社より販売されているコメ判別用ＰＣＲ  Ｋｉｔ  Ｉ（タカラバイオ株式会社  製品コードＲＲ２１１Ａ）に含まれているコンポーネント、その反応条件を採用して前記の工程を実施してもよい。この場合、前記製品に含まれている品種識別用プライマー対を本発明により提供されるプライマー対と併用して米の品種識別を行うことも容易である。
【０１２４】
前記製品を使用した場合、ＰＣＲ反応液は、例えば下記の組成で調製することができる。
２      μＬ：１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ（100mM Tris-HCl(pH8.3)、500mM KCl）
２      μＬ：２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
２      μＬ：ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（2.5mM each）
１．５  μＬ：ＰＣＲ  プライマー溶液
２      μＬ：鋳型  ＤＮＡ  溶液
０．１５μＬ：ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ（5u/μL）
１０．３５μＬ：滅菌水
【０１２５】
上記の反応液でのＤＮＡ増幅反応の条件は、ＰＣＲ装置としてＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＤＩＣＥ（タカラバイオ株式会社製  製品コード  ＴＰ６５０）を使用した場合、９６℃  ２分の熱変性を行った後、熱変性（９４℃  １分）、アニーリング（６２℃  １分）、伸長反応（７２℃  ２分）を３５サイクル、の実施が例示される。一般に、反応条件は、使用されるＤＮＡポリメラーゼ、増幅産物のサイズや使用する装置の能力を考慮して適宜設定すればよい。
【０１２６】
なお、複数のプライマー対を１度に反応させるマルチプレックスＰＣＲ反応の場合、高温になるまでＤＮＡポリメラーゼ活性を抑えサイクル前のミスプライミングやプライマーダイマーに由来する非特異的増幅を抑制する点で有用なＨｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＰＣＲ用酵素、例えば、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ株式会社製  製品コードＲ００７Ａ）などの使用がより好ましい。
【０１２７】
また、鋳型ＤＮＡ溶液も特に限定されるものではないが、吸光度換算値で１０ｎｇ相当のＤＮＡ溶液の使用が例示される。前記に例示された反応液組成の場合、吸光度換算値で５ｎｇ／μＬに調製したＤＮＡ溶液を使用すれば良い。プライマー使用量にも特に限定はなく、例えば上記条件で検出に適した量のＤＮＡ断片が増幅するよう、適宜調整すればよい。
【０１２８】
（Ｃ）工程（Ｂ）で得られたＤＮＡ断片の解析を実施する工程
工程（Ｂ）で得られた増幅物を適切なＤＮＡ分離手段に供することにより、増幅されたＤＮＡ断片を分離、検出し、米の品種の識別の指標となるＤＮＡ断片の存在を検定する。本工程に使用されるＤＮＡ分離手段にも特に限定は無く、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動など公知の分離手段を使用することが出来る。操作の簡便性からはアガロースゲル電気泳動が好適であり、その条件としては下記を例示出来る。
アガロースゲル：２．５％  Ａｇａｒｏｓｅ  Ｌ０３（タカラバイオ株式会社製  製品コード５００３）、電気泳動用緩衝液：１×ＴＡＥ、電気泳動装置：Ｍｕｐｉｄ−２Ｐｌｕｓ（タカラバイオ株式会社  製品コードＡＤ１１０）、サンプル泳動量：工程Ｂ例示組成の場合、１０μＬ／ウェルにて注入、５０Ｖにて６０分泳動。
【０１２９】
また分離されたＤＮＡ断片の検出手段にも限定はないが、例えば、アガロースゲルをエチジウムブロマイドやＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎにて染色後、紫外線を照射し、所定の位置に蛍光バンドが検出されるか否かで確認することが出来る。
【０１３０】
なお、本明細書におけるＤＮＡ断片を検出する技術は、上記ゲル電気泳動技術に特に限定されるものではない。例えば、ＰＣＲプライマーの他に蛍光色素を付加したプローブを併用したリアルタイムＰＣＲにより蛍光にてＤＮＡ断片を検出しても良い。このようなプライマー、プローブのセットは上記（１）〜（１３）記載の配列情報を元に市販の設計ソフトを用いて適宜設計することが可能である。また適当な担体に固定した本明細書記載のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに基づいて品種識別用ＤＮＡ領域を包含する核酸が存在するか否かを検出する、所謂ＤＮＡチップなどの技法により検出しても良い。
【０１３１】
第３の本発明は、ゲノムＤＮＡ中の特定塩基の存在を検出するために用いることを特徴とし、下記（ｉ）〜（ｘｖｉ）から選択されるオリゴヌクレオチドである：
（ｉ）特定塩基配列が配列番号１で示され、塩基配列の連続する１０〜１００塩基長からなり、かつ、配列番号１で示される塩基配列の塩基番号４２４、４２５の塩基部位を包含するオリゴヌクレオチド、
（ｉｉ）特定塩基配列が配列番号２で示され、塩基配列の連続する１０〜１００塩基長からなり、かつ、配列番号２で示される塩基配列における塩基番号４８、４９の塩基部位を包含するオリゴヌクレオチド、
（ｉｉｉ）特定塩基配列が配列番号３で示され、塩基配列の連続する１５〜１００塩基長からなり、かつ、配列番号３で示される塩基配列における塩基番号７０〜８０の塩基部位を包含するオリゴヌクレオチド、
（ｉｖ）特定塩基配列が配列番号４で示され、塩基配列の連続する２０〜１００塩基長からなり、かつ、配列番号４で示される塩基配列における塩基番号１４〜３１の塩基部位を包含するオリゴヌクレオチド、
（ｖ）特定塩基配列が配列番号５で示され、塩基配列の連続する１０〜１００塩基長からなり、かつ、配列番号５で示される塩基配列における塩基番号７６３、７６４の塩基部位を包含するオリゴヌクレオチド、
（ｖｉ）特定塩基配列が配列番号６で示され、塩基配列の連続する１０〜１００塩基長からなり、かつ、配列番号６で示される塩基配列における塩基番号３６６、３６７の塩基部位を包含するオリゴヌクレオチド、
（ｖｉｉ）特定塩基配列が配列番号７で示され、塩基配列の連続する１５〜１００塩基長からなり、かつ、配列番号７で示される塩基配列における塩基番号３５３〜３６１の塩基部位を包含するオリゴヌクレオチド、
（ｖｉｉｉ）特定塩基配列が配列番号８で示され、塩基配列の連続する１０〜１００塩基長からなり、かつ、配列番号６で示される塩基配列における塩基番号２４９、２５０の塩基部位を包含するオリゴヌクレオチド、
（ｉｘ）特定塩基配列が配列番号９で示され、塩基配列の連続する１０〜１００塩基長からなり、かつ、配列番号６で示される塩基配列における塩基番号５５０、５５１の塩基部位を包含するオリゴヌクレオチド、
（ｘ）特定塩基配列が配列番号１０で示され、塩基配列の連続する１０〜１００塩基長からなり、かつ、配列番号１０で示される塩基配列における塩基番号９、１０の塩基部位を包含するオリゴヌクレオチド、
（ｘｉ）特定塩基配列が配列番号１１で示され、塩基配列の連続する１０〜１００塩基長からなり、かつ、配列番号１１で示される塩基配列における塩基番号１５、１６の塩基部位を包含するオリゴヌクレオチド、
（ｘｉｉ）特定塩基配列が配列番号１２で示され、塩基配列の連続する１０〜１００塩基長からなり、かつ、配列番号１２で示される塩基配列における塩基番号５５５〜５５８の塩基部位を包含するオリゴヌクレオチド、
（ｘｉｉｉ）特定塩基配列が配列番号１３で示され、塩基配列の連続する１０〜１００塩基長からなり、かつ、配列番号１３で示される塩基配列における塩基番号４７４、４７５の塩基部位を包含するオリゴヌクレオチド、
（ｘｉｖ）特定塩基配列が配列番号５７で示され、塩基配列の連続する１０〜１００塩基長からなり、かつ、配列番号５７で示される塩基配列における塩基番号２３１、２３２の塩基部位を包含するオリゴヌクレオチド、
（ｘｖ）特定塩基配列が配列番号５８で示され、塩基配列の連続する１０〜１００塩基長からなり、かつ、配列番号５８で示される塩基配列における塩基番号１１４、１１５の塩基部位を包含するオリゴヌクレオチド、及び
（ｘｖｉ）前記（ｉ）〜（ｘｖ）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列のオリゴヌクレオチド。
【０１３２】
これらのオリゴヌクレオチドは、品種識別に有用なゲノムＤＮＡ領域において組換え領域と予測される塩基部位をその配列内に包含するオリゴヌクレオチドである。具体的には、配列番号２１、２２、２４、３３、３４、３８、４０で示されるＤＮＡが例示される。
【０１３３】
第４の本発明の米の品種識別キットは、上述の米の品種識別方法を実施するためのキットであり、ゲノムＤＮＡ中の特定塩基配列の存在を核酸増幅法により増幅されるＤＮＡ断片として検出する目的で使用されるプライマー対を含有することを特徴とする。好適な態様において、前記のプライマー対はＰＣＲ法に適したものである。
【０１３４】
本キットでは、さらにＰＣＲ法に適した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼや、当該ＤＮＡポリメラーゼで反応を行うための反応用緩衝液を含有することが出来る。前記の耐熱性ポリメラーゼは特に限定されるものではないが、複数のプライマー対を一度に反応するマルチプレックスＰＣＲ反応系を採用したキットの場合は、Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＰＣＲ用酵素、例えば、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ株式会社製  製品コードＲ００７Ａ）、の使用がより好ましい。
【０１３５】
反応用緩衝液も特に限定されるものではなく、使用する耐熱性ポリメラーゼ、また、希望する反応条件により適当なものを使用すれば良い。
【０１３６】
ＰＣＲ用プライマー対は溶液形態で本発明のキットに含めることができる。この場合、１種類のプライマーまたはプライマー対を含む溶液を複数本用意してもよいし、複数のプライマー対を予め混合しておき１本にまとめた状態にしておいても良い。
【０１３７】
第５の発明の品種識別に利用可能なＤＮＡ領域に関し、品種識別に利用可能なＤＮＡ領域として新規に開発した配列番号１２で示されるＤＮＡ断片である。
【実施例】
【０１３８】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。なお、本発明は、本実施例に特に限定されるものではない。
【０１３９】
［本願明細書（１）及び（２）に記載されたＤＮＡ領域を検出する品種識別用ＰＣＲプライマー対の設計］
（１）及び（２）で記載された品種識別用ＤＮＡ領域は大坪らにより開発されたＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対ＷＫＡ０９による増幅物配列情報（特開２００５−２４５２４４号公報（特許文献３）：配列番号７参照）を利用した。該配列情報とＧｅｎＢａｎｋに開示された米の品種「日本晴」のゲノム配列情報と比較したところ、配列同一性の高い領域と低い領域とに２分され、該境界領域が組換え領域と予測した。該ＤＮＡ配列情報を元にＰＣＲプライマー設計ソフトＯｌｉｇｏ６（タカラバイオ株式会社発売）を利用し、「ひとめぼれ」ゲノムＤＮＡにおけるＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対ＷＫＡ０９による品種識別用ＤＮＡ領域（１）を検出目的としたプライマー対（ａ）：ｓＷＫＡ０９−１、品種識別用ＤＮＡ領域（２）を検出目的としたプライマー対（ｂ）：ｒＷＫＡ０９−１を設計した。なおプライマー対ｓＷＫＡ０９−１、ｒＷＫＡ０９−１とも、各品種識別用ＤＮＡ領域において組換え領域と予測された塩基部位をプライマー由来領域を除く増幅物内に包含するように設計したＰＣＲプライマー対である。
【０１４０】
［本願明細書（３）に記載されたＤＮＡ領域を検出する品種識別用ＰＣＲプライマー対の設計］
（３）に記載された品種識別用ＤＮＡ領域の推定には大坪らにより開発されたＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ２２による増幅物配列情報（特開２００５−２４５２４４号公報（特許文献３）：配列番号２参照）を利用した。なお、特開２００５−２４５２４４号公報（特許文献３）：配列番号２における５’末はＲＡＰＤプライマーＧ２２の配列（ａｇｇｇｃｃａｔｇａｔａ）ではない。これは、ＲＡＰＤプライマーＧ２２による識別バンド出現パターンを確認した際、「コシヒカリ」「ひとめぼれ」では約０．８３ｋｂｐの識別バンド、「あきたこまち」「日本晴」では約０．４５ｋｂｐの識別バンドが得られることが判り、「コシヒカリ」及び「あきたこまち」から得られた増幅物の塩基配列の解析の結果、「コシヒカリ」が陽性、「あきたこまち」が陰性となるプライマーを設計したためである。なおＧ２２陽性品種である「コシヒカリ」増幅物の塩基配列の場合、配列番号３の塩基番号７１〜７９のｔｔａｇｔｃｃａｇ間で挿入が起きていると推定された。また、該挿入部分の両末端には上記ｔｔａｇｔｃｃａｇ配列が存在していた。今回、「あきたこまち」から得られた識別バンドの塩基配列を元に、両末端に存在するＲＡＰＤプライマーＧ２２配列部より増幅物内部側へと３’側に配列延長した配列番号４２、４３で示されるＤＮＡからなるＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ２２−２を設計した。なお本プライマー対はＤＮＡ識別領域（３）全域を増幅可能である。
【０１４１】
さらに該ＤＮＡ情報を元にＰＣＲプライマー設計ソフトＯｌｉｇｏ６を利用し、品種識別用ＤＮＡ領域（３）を検出目的としたなプライマー対（ｃ）：ｒＧ２２−１及び（ｒ）ｒＧ２２−２を設計した。なおプライマー対ｒＧ２２−１は品種識別領域（３）において組換え領域と予測された塩基部位（配列表の配列番号３における塩基番号７０から８０）がプライマー由来領域を除く増幅物配列内に包含するように設計、プライマー対ｒＧ２２−２はプライマー対の一方のプライマー配列内に組換え領域と予測された塩基部位が包含されるように設計したものである。
【０１４２】
［本願明細書（４）に記載されたＤＮＡ領域を検出する品種識別用ＰＣＲプライマー対の設計］
（４）で記載された品種識別用ＤＮＡ領域の推定にはＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ａ６による増幅物配列情報（特開２００５−２４５２４４号公報（特許文献３）：配列番号９参照）を利用した。該配列情報とＧｅｎＢａｎｋに開示されたＡ６陰性の米の品種「日本晴」のゲノムＤＮＡ配列情報と比較したところ、配列同一性の高い領域と低い領域とに２分され、該境界領域が組換え領域と予測した。主な違いはＡ６増幅物中に存在するＴＡ繰り返し領域の繰り返し数、及び、配列表の配列番号４の塩基配列における塩基番号１５〜３０におけるｔａｔｃの繰り返し数の違いであった。したがって、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ａ６と識別バンドパターンが反転するプライマー対を設計するには、上記ｔａｔｃの繰り返し数が異なる領域で設計することが適当と考えられた。なお、該領域からＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ａ６が結合すると思われる領域間でプライマー対を設計した場合、他の品種識別用プライマーとマルチプレックスＰＣＲ系を構築した際に増幅物サイズが近接しアガロースゲル電気泳動での分離が悪くなる可能性が考えられた。そこで、「日本晴」ゲノム配列情報よりＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ａ６増幅物領域より外側の領域で対となるプライマーを設計してみることにし、ＰＣＲプライマー設計ソフトＯｌｉｇｏ６にて品種識別用ＤＮＡ領域（４）を検出可能なプライマー対（ｄ）：ｒＡ６−１を設計した。なお、配列表の配列番号４において、塩基番号３８０〜４５９の領域が「日本晴」ゲノム配列においてＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ａ６増幅領域より外側に対応する配列である。また本プライマー対では配列表の配列番号２１で示されるプライマー配列内に組換え領域と予測された塩基部位を包含するように設計した。
【０１４３】
［本願明細書（５）、（１４）に記載されたＤＮＡ領域を検出する品種識別用ＰＣＲプライマー対の設計］
（５）に記載された品種識別用ＤＮＡ領域の推定にはＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｍ２ＣＧによる増幅物配列情報（特開２００５−２４５２４４号公報（特許文献３）：配列番号１３参照）を利用した。該配列情報とＧｅｎＢａｎｋに開示された米の品種「日本晴」のゲノム配列情報と比較したところ、「日本晴」はＭ２ＣＧ陽性品種であるため、ＲＡＰＤプライマーＭ２由来領域である数塩基を除きＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｍ２ＣＧによる増幅物配列全域にわたり配列同一性の高い領域が存在した。なお、「日本晴」ゲノム配列情報を元に「日本晴」ゲノム配列におけるＭ２ＣＧ増幅領域の両末端でプライマーを設計、ＰＣＲを行ったところ一方で品種識別性能が消失することが判った。そこで、Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法を利用してＭ２ＣＧ陰性品種のゲノム配列において対応する遺伝子座領域の塩基配列の決定を試みた。まず、Ｍ２ＣＧ陰性品種である「あきたこまち」のゲノムＤＮＡにも保存されていると予想されたＭ２ＣＧ増幅物の部分配列からこの領域を切断する制限酵素としてＥｃｏＲＩとＰｓｔＩを選択した。ついで、「あきたこまち」からゲノムＤＮＡを調製し、制限酵素ＥｃｏＲＩまたはＰｓｔＩにてゲノムＤＮＡの切断を行った。該切断ＤＮＡをタカラバイオ株式会社製  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１（製品コード６０２１）にて切断ＤＮＡ片の自己環状化反応を行った後、Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ用プライマーとして設計したＩＲＭ２−１Ｆ（ＡＴＡＴＡＡＧＧＣＡＣＡＡＣＣＡＡＣＡＴＴＡＡＣＣＣＡＡ）及びＩＲＭ２−１Ｒ（ＡＴＡＴＡＡＧＧＣＡＣＡＡＣＣＡＡＣＡＴＴＡＡＣＣＣＡＡ）によるＰＣＲを実施した。このうちＰｓｔＩ切断片を用いたＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲにより約１．５ｋｂｐの増幅物Ａが得られた。念のため前記約１．５ｋｂｐ増幅物Ａを鋳型にプライマーＩＲＭ２−２Ｆ（ＡＣＣＡＡＣＡＴＴＡＡＣＣＣＡＡＡＧＡＴＡＡＡＧＡＡＡＴ）及びプライマーＩＲＭ２−２Ｒ（ＴＧＧＣＡＴＡＣＴＣＴＡＣＣＴＡＣＣＴＡＴＣＡＧＴＴＧＴ）によるＰＣＲを実施したところ、約１．４ｋｂｐの増幅物Ｂが得られた。なお、プライマーの位置関係より増幅物Ｂは増幅物Ａより７５ｂｐ短い増幅物が得られると予測されたため、約１．４ｋｂｐ増幅物Ｂが目的ＤＮＡ断片であると決定した。該ＤＮＡ断片の配列を配列表の配列番号４４に記す。増幅物Ｂの塩基配列とＭ２ＣＧ増幅物の塩基配列を比較したところ、配列同一性の高い領域と低い領域とに２分され、境界領域が組換え領域と推定した。つぎに該ＤＮＡ断片情報を元にＰＣＲプライマー設計ソフトＯｌｉｇｏ６を利用し、品種識別ＤＮＡ領域（５）の検出を目的としたプライマー対（ｅ）：ｓＭ２ＣＧ−１及び配列表の配列番号４５、及び４６で示されるＤＮＡからなるプライマー対（ｐ）：ｓＭ２ＣＧ−２、並びに品種識別ＤＮＡ領域（１４）の検出を目的としたプライマー対（ｐ）：ｒＭ２ＣＧ−１及び（ｑ）ｒＭ２ＣＧ−２を設計した。なおプライマー対ｓＭ２ＣＧ−１、及び、ｓＭ２ＣＧ−２、並びにｒＭ２ＣＧ−１，及び、ｒＭ２ＣＧ−２ともに、組換え領域と予測された塩基部位をプライマー由来領域を除く増幅物配列内に包含するように設計したものである。なお、配列番号５７におい���、塩基番号２０４〜２３１の領域と塩基番号２９４〜３２１の領域は回文構造になっている。本領域で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは単独でＰＣＲプライマー対として機能するので、ＰＣＲプライマー対を設計する場合には注意を要する。
【０１４４】
［本願明細書（６）、（７）に記載されたＤＮＡ領域を検出する品種識別用ＰＣＲプライマー対の設計］
（６）、（７）に記載された品種識別用ＤＮＡ領域の推定にはＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｐ３による増幅物配列情報（特開２００５−２４５２４４号公報（特許文献３）：配列番号１６参照）を利用した。該配列情報とＧｅｎＢａｎｋに開示された米の品種「日本晴」のゲノム配列情報と比較したところ、「日本晴」はＰ３陽性品種であるため、ＲＡＰＤプライマーＰ３由来領域数塩基を除きＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｐ３による増幅物配列全域にわたり、配列同一性の高い領域が存在した。なお、「日本晴」ゲノム配列において、Ｐ３増幅物配列の一部１６８ｂｐを含む約０．８ｋｂｐ領域が同一染色体ゲノム配列上に２箇所存在し、２領域は約３ｋｂｐ離れて位置していた。Ｐ３陽性品種におけるＰ３増幅領域は、Ｐ３陰性品種における対応遺伝子座領域への約３ｋｂｐのＤＮＡ断片の挿入により生じたと仮定し、「日本晴」ゲノム配列情報を元に前記約３ｋｂｐ領域を包含するようなｒＰ３−Ｆ（ａｔｃａｇａａａｔｇａａｇａａｃｇｃａａａｇｇｔ）及びｒＰ３−Ｒ（ｔｔｃｇｃｔａｇｃｃｔｇｔａａｇａｇａａｃａａｔ）からなるプライマー対を設計、ＰＣＲを行った。その結果、Ｐ３陰性品種である「あきたこまち」ゲノムＤＮＡ及び「ひとめぼれ」ゲノムＤＮＡを鋳型にした反応で約０．２ｋｂｐの増幅物が得られた。ついで「あきたこまち」ゲノムＤＮＡを鋳型として得られた増幅物Ｃの塩基配列を決定、「日本晴」ゲノム配列と比較したところ、「日本晴」ゲノム配列では、配列表の配列番号７に示した塩基配列のうち塩基番号３５４〜３６０のＡＡＣＴＧＡＴの間で挿入が起こっていると予想された。なお該挿入領域の両末端には上記ＡＡＣＴＧＡＴ配列が存在した。次に該ＤＮＡ断片情報を元にＰＣＲプライマー設計ソフトＯｌｉｇｏ６を利用し、品種識別用ＤＮＡ領域（６）の検出を目的としたプライマー対（ｆ）：ｓＰ３−１、品種識別用ＤＮＡ領域（７）の検出を目的としたプライマー対（ｇ）：ｒＰ３−１を設計した。プライマー対ｓＰ３−１は配列表の配列番号２４で示されるプライマー配列内に組換え領域と予測される塩基部位を包含するように設計、プライマー対ｒＰ３−１はＤＮＡ識別領域（７）における組換え領域と予測される塩基部位をプライマー由来領域を除く増幅物配列内に包含するように設計したものである。
【０１４５】
［本願明細書（８）、（９）に記載されたＤＮＡ領域を検出する品種識別用ＰＣＲプライマー対の設計］
（８）、（９）に記載された品種識別用ＤＮＡ領域の推定には大坪らにより開発されたＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｓ１３による増幅物配列情報（特開２００５−２４５２４４号公報（特許文献３）：配列番号４参照）を利用した。該配列情報とＧｅｎＢａｎｋに開示された米の品種「日本晴」のゲノム配列情報と比較したところ、配列同一性の高い領域と低い領域とに２分され、該境界領域が組換えの起こった領域と推定した。次に該ＤＮＡ断片情報を元にＰＣＲプライマー設計ソフトＯｌｉｇｏ６を利用し、ＤＮＡ断片（８）を得る事が可能なプライマー対（ｈ）：ｓＳ１３−１を設計した。一方、「日本晴」ゲノム配列において、Ｓ１３増幅物の一部領域と高い配列同一性を示した領域は３箇所存在した。このうち２箇所は該Ｓ１３一部領域と高い配列同一性を示した領域を含む約３ｋｂｐ領域が配列一致しており、該２箇所の配列を元に品種識別用ＤＮＡ領域（９）を検出可能なプライマー対（ｉ）：ｒＳ１３−１、及び配列番号４７、４８で示されるＤＮＡからなるプライマー対（ｑ）：ｒＳ１３−２を設計した。また残る品種識別用ＤＮＡ候補領域１箇所で配列番号４９、５０で示されるＤＮＡからなるプライマー対（ｒ）：ｒＳ１３−３を設計した。プライマー対ｓＳ１３−１、ｒＳ１３−１、ｒＳ１３−２、ｒＳ１３−３とも、品種識別領域ＤＮＡ配列において組換えＤＮＡ領域と予想される塩基部位をプライマー由来領域を除く増幅物配列内に包含するように設計したものである。
【０１４６】
［本願明細書（１０）及び（１１）に記載されたＤＮＡ領域を検出する品種識別用ＰＣＲプライマー対の設計］
（１０）及び（１１）で記載された品種識別用ＤＮＡ領域の推定には大坪らにより開発されたＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ４による増幅物配列情報（特開２００５−２４５２４４号公報（特許文献３）：配列番号８参照）を利用した。該配列情報とＧｅｎＢａｎｋに開示された米の品種「日本晴」のゲノム配列情報と比較したところ、配列同一性の高い領域と低い領域とに２分され、該境界領域が組換えの起こった領域と推定した。なおＧ４増幅物塩基配列の一部と高い配列同一性を示した日本晴ゲノム配列上の領域は３箇所存在した。各領域でＰＣＲプライマー対を設計し各種米の品種ゲノムＤＮＡにて反応したところ、１箇所がＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ４陽性品種ゲノムＤＮＡでの増幅領域に対応する遺伝子座と推定される結果を示した。次に、該ＤＮＡ断片情報を元にＰＣＲプライマー設計ソフトＯｌｉｇｏ６を利用し、品種識別用ＤＮＡ領域（１０）の検出を目的としたプライマー対（ｊ）：ｓＧ４−１、品種識別用ＤＮＡ領域（１１）の検出を目的としたプライマー対（ｋ）：ｒＧ４−１及びプライマー対（ｏ）：ｒＧ４−２を設計した。なおプライマー対ｓＧ４−１において配列表の配列番号３３で示されるプライマー、及びプライマー対ｒＧ４−１及びｒＧ４−２において配列表の配列番号３４で示されるプライマーは、各配列内に各々ＤＮＡ品種識別領域における組換え領域と予測される塩基部位を包含するプライマーである。
【０１４７】
［本願明細書（１２）に記載されたＤＮＡ領域を検出する品種識別用ＰＣＲプライマー対の設計］
ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ４と識別性が反転するプライマーが出来れば、Ｇ４陽性となる数少ない北海道産品種の「きらら３９７」や「ななつぼし」の定性検査系を構築し易くなるが、「ななつぼし」を対象とした場合、「きらら３９７」や「あきほ」などの検出手段が必要となる。「ななつぼし」の表現型はＰｉｋ−と報告されているが、その他主要北海道産品種の多くはＰｉｋ＋と報告されている。Ｐｉｋ遺伝子の塩基配列情報は入手できなかったが、ＧｅｎＢａｎｋに開示された「日本晴」のゲノム配列情報、その他掲載データを比較し有望領域を決定した。該領域にて配列番号５１で示されるＤＮＡと配列番号５２で表されるＤＮＡからなるプライマー対を設計したところ、「ななつぼし」「日本晴」の各ＤＮＡからは約０．４５ｋｂｐ、「ほしたろう」「きらら３９７」「あきほ」の各ＤＮＡからは約０．６５ｋｂｐの増幅物が得られた。そこで「ほしたろう」から得られた増幅物の塩基配列を解析、「日本晴」のゲノム配列と比較したところ、「ほしたろう」では配列表の配列番号３５４〜６１６の塩基領域が「日本晴」ゲノム配列に対し挿入されていると推定される結果が得られた。次に該ＤＮＡ断片情報を元にＰＣＲプライマー設計ソフトＯｌｉｇｏ６を利用し、品種識別用ＤＮＡ領域１３）の検出を目的としたプライマー対（ｍ）：Ｎａｋ−１を構築した。なおプライマー対Ｎａｋ−１において配列表の配列番号３８で示されるプライマーは、配列内に品種識別用ＤＮＡ領域において組換え領域と予想される塩基部位を包含するプライマーである。
【０１４８】
［本願明細書（１３）、（１５）に記載されたＤＮＡ領域を検出する品種識別用ＰＣＲプライマー対の設計］
（１３）で記載された品種識別用ＤＮＡの決定には大坪らにより開発されたＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ４９による増幅物配列情報（特開２００５−２４５２４４号公報（特許文献３）：配列番号１２参照）を利用した。該配列情報とＧｅｎＢａｎｋに開示された米の品種「日本晴」のゲノム配列情報と比較したところ、配列同一性の高い領域と低い領域とに２分され、該境界領域が組換えの起こった領域と推定した。なおこの拝謁同一性の低い領域のみで再度「日本晴」ゲノム配列に対する配列同一性を確認してみたが、特に配列一致する領域は無かった。したがって、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ４９による「ほしのゆめ」ゲノムＤＮＡ上の増幅領域の「日本晴」ゲノム配列と配列同一性の低い領域全体が「日本晴」ゲノム配列に対し選択性を示すと予想された。そこで該ＤＮＡ断片情報を元にＰＣＲプライマー設計ソフトＯｌｉｇｏ６を利用し、品種識別用ＤＮＡ領域（１３）の検出を目的としたプライマー対（ｌ）：ｓＧ４９Ａ−１、品種識別用ＤＮＡ領域（１５）の検出を目的としたプライマー対（ｒ）：ｒＧ４９Ａ−１を設計した。プライマー対ｓＧ４９Ａ−１は品種識別用ＤＮＡ領域（１３）を示す配列表の配列番号１３における塩基番号９６〜３６２の領域が増幅領域となる。一方、ｒＧ４９Ａ−１は組換え領域と予測された塩基部位をプライマー由来領域を除く増幅物配列内に包含するように設計したものである。
【０１４９】
［プライマー対ｓＢ４３−１の設計］
大坪らにより開発されたＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｂ４３による増幅物配列情報（特開２００５−２４５２４４号公報（特許文献３）：配列番号３参照）とＧｅｎＢａｎｋに開示された米の品種「日本晴」のゲノム配列情報と比較したところ、「日本晴」はＢ４３陽性品種であることから、ＲＡＰＤプライマーＢ４３由来領域数塩基を除きＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｂ４３による増幅物配列全域にわたり配列同一性の高い領域が存在した。「日本晴」ゲノム配列情報を元に「日本晴」ゲノム配列におけるＢ４３増幅領域の各両末端でプライマーを設計、ＰＣＲを行ったところ両末端で設計したプライマー対とも品種識別性能が維持されることが判った。先行技術の結果も考慮するとＢ４３増幅域は該領域全体が陰性品種ゲノム配列に対し選択性があると推測された。そこで、ＰＣＲプライマー設計ソフトＯｌｉｇｏ６を利用し、他のプライマー対とのマルチプレックスＰＣＲ系を構築した際、アガロースゲル電気泳動でバンド分離が良好となる増幅物長サイズに調節可能と推測される配列表の配列番号５３、５４で示されるＤＮＡからなるプライマー対ｓＢ４３−１を設計した。
【０１５０】
［プライマー対ｓＦ６−１の設計］
大坪らにより開発されたＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｆ６による増幅物配列該配列情報（特開２００５−２４５２４４号公報（特許文献３）：配列番号５参照）とＧｅｎＢａｎｋに開示された米の品種「日本晴」のゲノム配列情報と比較したところ、「日本晴」はＦ６陽性品種であることから、ＲＡＰＤ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｆ６由来領域数塩基を除きＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｆ６による増幅物配列全域にわたり配列同一性の高い領域が存在した。なお、「日本晴」ゲノム配列情報を元に「日本晴」ゲノム配列におけるＦ６増幅領域の各両末端でプライマーを設計、ＰＣＲを行ったところ両末端で設計したプライマー対とも品種識別性能が維持されることが判った。ＲＰＡＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｆ６とは識別性能が同じで増幅サイズが短縮化されること期待し、配列表の配列番号５５、５６で示されるＤＮＡからなるプライマー対ｓＦ６−１を設計した。
【０１５１】
［設計プライマー対の品種識別性確認］
上記設計した各種ＰＣＲプライマー対の反応性を確認することにした。反応液組成は以下の通りである。
２      μＬ：１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ（100mM Tris-HCl(pH8.3)、500mM KCl）
２      μＬ：２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
２      μＬ：ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  （2.5mM each）
１．５  μＬ：ＰＣＲ  プライマー溶液
２      μＬ：鋳型  ＤＮＡ  溶液
０．１５μＬ：ＴａＫａＲａ  ＴａｑＨＳ（5u/μL）
１０．３５μＬ：滅菌水
【０１５２】
なお、１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭ  ｅａｃｈ）にはタカラバイオ株式会社製ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ（登録商標）（製品コード  Ｒ００１ＡＭ）に添付された試薬を用いることが出来る。ＴａＫａＲａ  ＴａｑＨＳはタカラバイオ株式会社製  ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ（登録商標）Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ（製品コード  Ｒ００７Ａ）である。
【０１５３】
鋳型ＤＮＡ溶液は、タカラバイオ株式会社発売のコメＤＮＡ抽出キット（製品コード９１９７）により調製した５ｎｇ／μＬ濃度のＤＮＡ溶液を用いた。
【０１５４】
なお調製した各品種ゲノムＤＮＡについては、以下、本明細書記載のプライマー対の反応性を確認する前に、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対ＷＫＡ０９（特開２００５−２４５２４４号公報（特許文献３）：配列番号３７、３８参照）、Ｂ４３（特開２００５−２４５２４４号公報（特許文献３）：配列番号２５、２６参照）、Ｍ１１（特開２００５−２４５２４４号公報（特許文献３）：配列番号１９、２０参照）、Ｇ２２（特開２００５−２４５２４４号公報（特許文献３）：配列番号２２、２３参照）、Ｓ１３（特開２００５−２４５２４４号公報（特許文献３）：配列番号２８、２９参照）、Ｆ６（特開２００５−２４５２４４号公報（特許文献３）：配列番号３１、３２参照）、Ｅ３０（特開２００５−２４５２４４号公報（特許文献３）：配列番号３４、３５参照）、Ｍ２ＣＧ（特開２００５−２４５２４４号公報（特許文献３）：配列番号５０、５１参照）、Ａ６（特開２００５−２４５２４４号公報（特許文献３）：配列番号４２、４３参照）、Ｂ１（特開２００５−２４５２４４号公報（特許文献３）：配列番号４４、４５参照）、Ｇ２８（特開２００５−２４５２４４号公報（特許文献３）：配列番号４６、４７参照）、Ｐ３（特開２００５−２４５２４４号公報（特許文献３）：配列番号５６、５７参照）、Ｇ４（特開２００５−２４５２４４号公報（特許文献３）：配列番号４０、４１参照）、Ｇ４９（特開２００５−２４５２４４号公報（特許文献３）：配列番号４８、４９参照）について、それぞれ識別バンド出現パターンを確認した。
【０１５５】
ＤＮＡ増幅反応は下記にて実施した。
ＰＣＲ装置：ＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＤｉｃｅＥ（登録商標）Ｓｔａｎｄａｒｄ（タカラバイオ株式会社製  製品コード  ＴＰ６５０）
反応条件
９６℃  ２分の熱変性
熱変性（９４℃  １分）、アニーリング（６２℃  １分）、伸長反応（７２℃  分）を１工程として３５サイクル
その後、４℃まで冷却    
【０１５６】
反応結果の解析は下記条件のアガロースゲル電気泳動により実施した。
アガロースゲル：２．５％Ａｇａｒｏｓｅ  Ｌ０３（タカラバイオ株式会社製  製品コード５００３）、電気泳動用緩衝液：１×ＴＡＥ、電気泳動装置：Ｍｕｐｉｄ−２Ｐｌｕｓ（タカラバイオ株式会社  製品コードＡＤ１１０）、サンプル泳動量：反応終了液に５μＬの電気泳動用緩衝液を添加後、１０μＬ／ウェルにてゲルに注入、５０Ｖにて６０分泳動を行った。
【０１５７】
目的とするＤＮＡ断片が得られたか否かは、サンプル泳動が終了したアガロースゲルを１μｇ／ｍｌエチジウムブロマイド水溶液にて３０〜６０分染色し、その後Ｉｍａｇｅ  Ｍａｓｔｅｒ  ＶＤＳ（ファルマシア社製）にて目的サイズにおける蛍光バンドの有無により確認した。
【０１５８】
［プライマー対ｒＷＫＡ０９−１、ｒＡ６−１、ｒＰ３−１、ｓＭ２ＣＧ−１の品種識別性確認］
確認すべき品種ゲノムＤＮＡ数が多いこともあり、マルチプレックスＰＣＲ反応系にて各プライマー対の識別性を確認した。なお実際の確認の際は、更にＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｍ１１も更に加えて反応した。電気泳動結果を図１に示す。また表１に反応に供した品種ゲノムＤＮＡの名称と識別バンドの有無を＋、−にて示した。表１においてプライマー対名称下に示した数字は該プライマー対により検出された識別バンドのサイズ（単位ｋｂｐ）を表す。確認した６０品種のＤＮＡにおいて、プライマー対ｒＷＫＡ０９−１ではＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対ＷＫＡ０９陽性品種ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲでは識別バンドが検出されず、また、「日本晴」を含むＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対ＷＫＡ０９  陰性品種ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲではすべて識別バンドが検出された。同様に、プライマー対ｒＡ６−１ではＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ａ６陽性品種ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲでは識別バンドが検出されず、また、「日本晴」を含むＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ａ６陰性品種ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲでは全て識別バンドが検出された。
【０１５９】
さらに、プライマー対ｒＰ３−１は、「日本晴」を含むＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｐ３陽性品種ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲでは識別バンドが検出されず、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｐ３陰性品種ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲではすべて識別バンドが検出された。すなわち、プライマー対ｒＷＫＡ０９−１、ｒＡ６−１、ｒＰ３−１による識別バンド出現パターンは、それぞれＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対ＷＫＡ０９、Ａ６、Ｐ３と識別バンドの出現パターンと反転する結果を示した。
【０１６０】
一方、プライマー対ｓＭ２ＣＧ−１については、「日本晴」を含むＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｍ２ＣＧ陽性品種ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲでは識別バンドが検出されＭ２ＣＧ陰性品種ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲでは識別バンドが検出されなかった。すなわちプライマー対ｓＭ２ＣＧ−１による識別バンドは、サイズが１２０７ｂｐ→２９３ｂｐに短縮されていると予想されるが、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｍ２ＣＧと同じ識別バンド出現パターンを示すことが明らかとなった。
【０１６１】
なお、本反応系において「キヌヒカリ」ではＭ１１識別バンドのみ出現したが、その他の品種は少なくともその他４本の識別バンドの何れかが出現しており、本反応系は「キヌヒカリ」の定性検査に有用な系であった。
【０１６２】
［プライマー対ｒＧ２２−１の種識別性確認］
プライマー対ｒＧ２２−１については更にＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ２８ならびにプライマー対ｓＢ４３−１及びｓＦ６−１とのマルチプレックスＰＣＲ反応系にて確認した。電気泳動結果を図２に示す。また表２に反応に供した品種ゲノムＤＮＡの名称と各プライマー対による識別バンドの有無を＋、−にて示した。表２においてプライマー対名称下に示した数字は該プライマー対で得られる識別バンドのサイズ（単位ｋｂｐ）を表す。確認した６０品種のＤＮＡにおいて、プライマー対ｒＧ２２−１による０．３７ｋｂｐ識別バンドはＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ２２陽性品種ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲでは検出されず、「日本晴」を含むＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ２２陰性品種ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲでは検出された。したがって、プライマー対ｒＧ２２−１による０．３７ｋｂｐ識別バンドの出現パターンはＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ２２による識別バンド出現パターンと反転することが明らかとなった。なお、本反応系においてＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ２２陽性品種ゲノムＤＮＡではプライマー対ｒＧ２２−１による約０．７ｋｂｐのバンドが検出された。一方、プライマー対ｓＢ４３−１による識別バンドは、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｂ４３による識別バンドに対しサイズが８２７ｂｐ→２６７ｂｐに短縮化されていると予想されるが、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｂ４３と同じ識別バンド出現パターンを示すことが明らかとなった。またプライマー対ｓＦ６−１による識別バンドも、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｆ６による識別バンドに対しサイズが１１９４ｂｐ→３０５ｂｐに短縮されてはいると予想されるが、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｆ６と同じ識別バンド出現パターンを示すことが明らかとなった。なお「ヒノヒカリ」では約０．７ｋｂｐの識別バンドのみ出現し表２に示した４本の識別バンドはいずれも出現しないが、「森のくまさん」を除くその他の品種は表２に示した４本の識別バンドの少なくとも何れかが出現しており、本反応系は「ヒノヒカリ」の定性検査に有用な系である。
【０１６３】
［プライマー対ｒＧ２２−２の品種識別性確認］
プライマー対ｒＧ２２−１ではサイズは異なるがＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ２２陽性品種ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲでも識別バンドが検出される。そこで、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ２２陽性品種のゲノムＤＮＡ配列において挿入が起きたと思われる配列番号３で示した塩基番号７１〜７９の領域がＰＣＲプライマー内に存在するように設計したプライマー対がｒＧ２２−２である。プライマー対ｒＧ２２−２の識別性は、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｍ１１及びＧ２８ならび前述のプライマー対ｓＢ４３−１、ｓＦ６−１によるマルチプレックスＰＣＲ反応系にて確認した。電気泳動結果を図３に示す。また表３に反応に供した品種ゲノムＤＮＡの名称と各プライマー対による識別バンドの有無を＋、−にて示した。表３においてプライマー対名称下に示した数字は該プライマー対で得られる識別バンドのサイズ（単位ｋｂｐ）を表す。この反応系ではＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ２２陰性品種ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲでのみプライマー対ｒＧ２２−２による識別バンドが出現することが確認できた。
【０１６４】
なお、前記（Ｇ２８、ｒＧ２２−１、ｓＢ４３−１、ｓＦ６−１）の４プライマー対のマルチプレックスＰＣＲ反応系では「きらら３９７」、「ほしのゆめ」、及び、「こしいぶき」、ならびに、「あいちのかおりＳＢＬ」及び「あさひの夢」がそれぞれ同じ識別バンド出現パターンを示していたが、プライマー対Ｍ１１を加えたことで「きらら３９７」、「ほしのゆめ」と「こしいぶき」、「あいちのかおりＳＢＬ」と「あさひの夢」各品種ゲノムＤＮＡにて得られるが識別バンド出現パターンがそれぞれ異なる結果を示すようになり、定量検査使用時での識別能力が向上した反応系となった。
【０１６５】
［プライマー対ｒＧ４−１、ｒＳ１３−１、ｓＧ４９−１の品種識別性確認］
識別性確認には更に上記プライマー対ｒＧ２２−１を加えたマルチプレックスＰＣＲ反応系にて行った。図４にアガロースゲル電気泳動結果写真を、表４に反応に供した品種ゲノムＤＮＡの名称と識別バンドの有無を＋、−にて示した。表４においてプライマー対名称下に示した数字は該プライマー対で得られる識別バンドのサイズ（単位ｋｂｐ）を表す。確認した６６品種のＤＮＡにおいて、プライマー対ｒＧ２２−１による０．３７ｋｂｐ識別バンドの出現パターンは、前記「ヒノヒカリ識別用反応系」同様、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ２２の識別バンド出現パターンと反転した。またプライマー対ｒＧ４−１による識別バンドは、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ４陽性品種ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲでは識別バンドが検出されず、「日本晴」を含むＧ４陰性品種ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲでは識別バンドが検出された。さらにプライマー対ｒＳ１３−１による識別バンドは、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｓ１３陽性品種ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲでは検出されず、「日本晴」を含む陰性品種ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲではすべて検出された。したがって、プライマー対ｒＧ４−１はＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ４に対し、プライマー対ｒＳ１３−１はＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｓ１３に対し、それぞれ識別バンド出現パターンが反転するプライマー対であった。一方、プライマー対ｓＧ４９Ａ−１による識別バンドは、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ４９陽性品種ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲで検出され、「日本晴」を含む陰性品種ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲでは検出されなかった。したがって、プライマー対ｓＧ４９−１による識別バンド出現パターンは、サイズが１５０３ｂｐ→２６７ｂｐに短縮されると予想されるがＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ４９と同じ識別バンド出現パターンを示すことが明らかとなった。なお、図４で示した約０．７ｋｂｐの識別バンドはプライマー対ｒＧ２２−１によりＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ２２陽性品種ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲで検出される識別バンドである。「きらら３９７」では約０．７ｋｂｐの識別バンドのみ出現し表４に示した４本の識別バンドは検出されないが、その他の品種は表４に示した４本の識別バンドの少なくとも何れかが出現しており、本反応系は「きらら３９７」の定性検査に有用な系である。なお表４において、プライマー対ｒＳ１３−１による識別バンドが＋となる品種についてはその他３種のプライマー対による識別バンドの少なくともいずれかで＋となるため、ｒＳ１３−１を除いた系でも定性検査における検出可能な品種数への影響は無い。
【０１６６】
［プライマー対Ｎａｋ−１、ｒＧ４−２の品種識別性確認］
Ｎａｋ−１、ｒＧ４−２に加えＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｂ４３Ａ（Ｆｏｒｗａｒｄ：ＴｇｇＣＣｇｇＣＡＴｇＡＣＴＣＡＣＡ、Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＡＣＴｇｇＣＣｇｇＣＡＴＣＡＡｇＡ）によるマルチプレックスＰＣＲ反応系にて識別性の確認を行った。図５に電気泳動結果の写真を、表５に反応に供した品種ゲノムＤＮＡの名称と識別バンドの有無を＋、−にて示した。表５においてプライマー対名称下に示した数字は該プライマー対で得られる識別バンドのサイズ（単位ｋｂｐ）を表す。プライマー対ｒＧ４−２による識別バンドは、確認した２８品種のＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲにて、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ４陽性品種ゲノムＤＮＡにおいて検出されず、「日本晴」を含む陰性品種において検出された。したがって、プライマー対ｒＧ４−２もＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ４と識別性が反転するプライマー対として使用できる。一方、識別バンド出現パターンはサイズが４８２ｂｐ→２６８ｂｐに短縮されてはいると予想されるが本願明細書記載のプライマー対ｒＧ４−１と同じ識別バンド出現パターンを示した。「ななつぼし」ではＢ４３Ａによる識別バンドのみ出現するが、その他の品種は少なくともＮａｋ−１及びｒＧ４−２の識別バンドの少なくとも何れかが出現しており、本反応系は「ななつぼし」の定性検査に有用な系である。
【０１６７】
［プライマー対ｓＧ４−１の品種識別性確認］
プライマー対ｓＧ４−１に加え、ｒＧ２２−１、ｒＳ１３−１、ｓＢ４３−１によるマルチプレックスＰＣＲ反応系にて識別性の確認を行った。表６に反応に供した品種ゲノムＤＮＡの名称と識別バンドの有無を＋、−にて示した。表６においてプライマー対名称下に示した数字は該プライマー対で得られる識別バンドのサイズ（単位ｋｂｐ）を表す。プライマー対ｓＧ４−１による識別バンドは、確認した６６品種において、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ４陽性品種ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲで検出され、「日本晴」を含む陰性品種ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲでは検出されなかった。したがって、プライマー対ｓＧ４−１は、識別バンドサイズが８１８ｂｐ→４７６ｂｐに短縮されていると予想されるがＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ４と同じ識別バンド出現パターンを示すプライマー対であることが明らかとなった。またＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ４はＲＡＰＤプライマーＧ０４が結合した領域の配列の特徴からＳＴＳ化してもアニーリング温度６２℃の反応条件では増幅がやや不安定であったが、プライマー設計位置をずらしたことによりプライマー対ｓＧ４−１はアニーリング温度６２℃の反応でも明瞭な識別バンドを生じるプライマー対となった。なお、「ほしのゆめ」ではＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ２２陽性品種で検出されるプライマー対ｒＧ２２−１による約０．７ｋｂｐの識別バンドのみ出現し表５に示した４本の識別バンドはいずれも検出されないが、「晴るる」、「はなさつま」を除く他の品種は表５に示した４本の識別バンドの少なくとも何れかが出現しており、本反応系は「ほしのゆめ」の検査に有用な系である。なお平成１７年度作付けデータでは、「晴るる」は山口県以外、「はなさつま」は鹿児島県以外では殆ど栽培されていない品種である。
【０１６８】
［ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ２２−２の品種識別性確認］
ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ２２−２について反応性を確認し、表７に反応に供した品種ゲノムＤＮＡの名称と識別バンドの有無を＋、−にて示した。表７においてプライマー対名称下に示した数字は該プライマー対で得られる識別バンドのサイズ（ｋｂｐ）を表す。ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ２２陽性品種からは約０．７８ｋｂｐの識別バンド、Ｇ２２陰性品種からは約０．４３ｋｂｐの識別バンドが検出された。
【０１６９】
［ｓＭ２ＣＧ−２の品種識別性確認］
プライマー対ｓＭ２ＣＧ−２について反応性を確認し、表７に反応に供した品種ゲノムＤＮＡの名称と識別バンドの有無を＋、−にて示した。表７においてプライマー対名称下に示した数字は該プライマー対で得られる識別バンドのサイズ（単位ｋｂｐ）を表す。プライマー対ｓＭ２ＣＧ−２においても、「日本晴」を含むＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｍ２ＣＧ陽性品種ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲでは識別バンドが検出され、陰性品種では識別バンドが検出されなかった。プライマー対ｓＭ２ＣＧ−２では識別バンドサイズが１２０７ｂｐ→１０８４ｂｐに短縮されていると予想されるが、プライマー対Ｍ２ＣＧ−２はＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｍ２ＣＧ及び本願明細書におけるプライマー対ｓＭ２ＣＧ−１と同じ識別バンド出現パターンを示すプライマー対であることが明らかとなった。
【０１７０】
［ｓＰ３−１の品種識別性確認］
プライマー対ｓＰ３−１について反応性を確認し、表７に反応に供した品種ゲノムＤＮＡの名称と識別バンドの有無を＋、−にて示した。表７においてプライマー対名称下に示した数字は該プライマー対で得られる増幅物のサイズ（単位ｋｂｐ）を表す。プライマー対ｓＰ３−１では、「日本晴」を含むＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｐ３陽性品種ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲで識別バンドが検出され、陰性品種ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲでは識別バンドが検出されなかった。したがって、プライマー対ｓＰ３−１は識別バンドサイズが５３３ｂｐ→３７４ｂｐに短縮されていると予想されるが、プライマー対ｓＰ３−１とＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｐ３は同じ識別バンド出現パターンを示すプライマー対であることが明らかとなった。
【０１７１】
［プライマー対ｓＷＫＡ０９−１の品種識別性確認］
プライマー対ｓＷＫＡ０９−１については「コシヒカリ」「ヒノヒカリ」「あきたこまち」「キヌヒカリ」「日本晴」の各品種ゲノムＤＮＡについて反応性を調べた。プライマー対ｓＷＫＡ０９−１では、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対ＷＫＡ０９陽性品種である「ヒノヒカリ」「あきたこまち」「キヌヒカリ」各品種ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲでは識別バンドが検出され、陰性品種である「日本晴」及び「コシヒカリ」各品種ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲでは識別バンドが検出されなかった。つまり、ｓＷＫＡ０９−１による識別バンドは、１６６３ｂｐ→２６０ｂｐにサイズが短縮されたと予想されるが、確認した４品種ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲではＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマーＷＫＡ０９と同じ識別バンド出現パターンを示すことが明らかとなった。なお特開２００５−７３６５５号（特許文献２）において本品種識別ＤＮＡ領域を検出していると思われるプライマー対による識別バンドサイズは約１．２ｋｂｐであり、更なる識別バンドの短小化を実施できた。
【０１７２】
［プライマー対ｓＳ１３−１の品種識別性確認］
プライマー対ｓＳ１３−１について「きらら３９７」「ほしのゆめ」「ヒノヒカリ」「あきたこまち」の各品種ゲノムＤＮＡについて反応性を調べた。Ｓ１３陽性品種である「きらら３９７」「ほしのゆめ」各品種ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲでは０．３ｋｂｐ識別バンドが検出され、「ヒノヒカリ」「あきたこまち」各品種ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲでは約０．３ｋｂｐ識別バンドが検出されず、確認した４品種ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲにおいてプライマー対ｓＳ１３−１もＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｓ１３と同じ識別性を示した。なお特開２００５−７３６５５号（特許文献２）において本品種識別ＤＮＡ領域を検出していると思われるプライマー対による増幅物サイズは約１．６ｋｂｐであり、更なる識別バンド短小化を実施できた。
【０１７３】
［プライマー対ｒＳ１３−２の品種識別性確認］
配列表の配列番号５３及び５４で示されるＤＮＡからなるプライマー対ｒＳ１３−２について「ほしのゆめ」「ほしたろう」「日本晴」の各品種ゲノムＤＮＡについて反応性を調べた。Ｓ１３陰性品種である「ほしたろう」「日本晴」各品種ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲでは「日本晴」ゲノム配列より期待された約０．７ｋｂｐ識別バンドが検出され、「ほしのゆめ」ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲでは約０．７ｋｂｐ識別バンドは検出されなかった。プライマー対ｒＳ１３−１より識別バンドサイズが大きくなっているが、同じ識別バンド出現パターンを示す可能性がある。
【０１７４】
［プライマー対ｒＳ１３−３の品種識別性確認］
本願明細書に記載したが、「きらら３９７」ゲノムＤＮＡを鋳型としたＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｓ１３にて得られた増幅物の塩基配列とＳ１３陰性品種である「日本晴」ゲノム配列とを比較したところ、Ｓ１３増幅物一部領域と高い配列同一性を示した領域は３箇所存在した。そのうち２箇所は本願明細書（９）で示したＤＮＡ領域であるが、残り１箇所で設計したプライマー対が配列表の配列番号５５及び５６で示されるＤＮＡからなるプライマー対ｒＳ１３−３である。
【０１７５】
プライマー対ｒＳ１３−３について「ほしのゆめ」「ほしたろう」「日本晴」の各品種ゲノムＤＮＡについて反応性を調べた。ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｓ１３陰性品種である「ほしたろう」「日本晴」各品種ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲでは「日本晴」ゲノム配列より期待された約０．７５ｋｂｐ識別バンドが検出されたが、Ｓ１３陽性品種である「ほしのゆめ」ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲでは約１．３ｋｂｐ識別バンドが検出された。プライマー対ｒＳ１３−３を設計した「日本晴」ゲノム配列領域もＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｓ１３による識別バンドに対し出現パターンが反転するＰＣＲプライマー対を設計可能な領域である可能性がある。
【０１７６】
［プライマー対ｒＭ２ＣＧ−１、ｒＭ２ＣＧ−２の品種識別性確認］
配列表の配列番号５９及び６０で示されるＤＮＡからなるプライマー対ｒＭ２ＣＧ−１、及び、配列表の配列番号６１及び６０で示されるＤＮＡからなるプライマー対ｒＭ２ＣＧ−２について反応性を確認し、表８に反応に供した品種ゲノムＤＮＡの名称と識別バンドの有無を＋、−にて示した。表８においてプライマー対名称下に示した数字は該プライマー対で得られる増幅物のサイズ（単位ｋｂｐ）を表す。プライマー対ｒＭ２ＣＧ−１及びｒＭ２ＣＧ−２では、「日本晴」を含むＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｍ２ＣＧ陽性品種ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲで識別バンドが検出されず、プライマー対Ｍ２ＣＧ陰性品種ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲでは識別バンドが検出された。したがって、プライマー対ｒＭ２ＣＧ−１及びｒＭ２ＣＧ−２はＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｍ２ＣＧに対し識別バンド出現パターンが反転するプライマー対であることが明らかとなった。
【０１７７】
［プライマー対ｒＧ４９Ａ−１の品種識別性確認］
配列表の配列番号６２及び６３で示されるＤＮＡからなるプライマー対ｒＧ４９Ａ−１について反応性を確認し、表８に反応に供した品種ゲノムＤＮＡの名称と識別バンドの有無を＋、−にて示した。表８においてプライマー対名称下に示した数字は該プライマー対で得られる増幅物のサイズ（単位ｋｂｐ）を表す。プライマー対ｒＧ４９Ａ−１では、「日本晴」を含むＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ４９Ａ陰性品種ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲで識別バンドが検出され、プライマー対Ｇ４９Ａ陽性品種ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲでは識別バンドが検出されなかった。したがって、プライマー対ｒＧ４９Ａ−１はＲＡＰＤ−ＳＴＳ化プライマー対Ｇ４９Ａに対し識別バンド出現パターンが反転するプライマー対であることが明らかとなった。
【０１７８】
品種識別用ＰＣＲキットの製造
以下のコンポーネントからなるコメ品種識別用ＰＣＲキット（１００反応／キット）を製造した。
１．ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ  ＨＳ（５ｕ／μＬ）              ２０μＬ
２．１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ                          ２５０μＬ
３．２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２                                 ２５０μＬ
４．ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭ  ｅａｄｈ）    ２５０μＬ
５．品種識別用Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘｔｕｒｅ              １５０μＬ
６．電気泳動用  Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ            ５００μＬ
【０１７９】
【表１】
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【０１８０】
【表２】
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【０１８１】
【表３】
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【０１８２】
【表４】
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【０１８３】
【表５】
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【０１８４】
【表６】
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【０１８５】
【表７】
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【０１８６】
【表８】
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【産業上の利用可能性】
【０１８７】
本発明を用いればＲＡＰＤ法により開発された品種識別に有用なＤＮＡ領域を利用した米の品種識別方法において、ＲＡＰＤ法により得られた識別バンドより低分子化された識別バンドによる品種識別が可能となり、ＤＮＡが低分子化していると予想される加工作物（例えば、米）製品の識別をより実施しやすくなる。またＲＡＰＤ法にて識別できていた品種間では、ＲＡＰＤ法にて見出された品種識別に有用なＤＮＡ領域に対応する陰性品種のゲノム配列における遺伝子座を識別領域として用いることにより、全く新規な識別領域を開発することなく定性検査を行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０１８８】
図１〜図５は、各種ＰＣＲ反応系について２０種類の品種米試料から調製したＤＮＡを鋳型として用いた際のアガロースゲル電気泳動写真である。なお、１は「コシヒカリ」を、２は「ひとめぼれ」を、３は「ヒノヒカリ」を、４は「あきたこまち」を、５は「キヌヒカリ」を、６は「きらら３９７」を、７は「はえぬき」を、８は「ほしのゆめ」を、９は「つがるロマン」を、１０は「ななつぼし」を、１１は「ゆめあかり」を、１２は「ササニシキ」を、１３は「あいちのかおりＳＢＬ」を、１４は「夢つくし」を、１５は「あさひの夢」を、１６は「日本晴」を、１７は「ハツシモ」を、１８は「ハナエチゼン」を、１９は「こしいぶき」を、２０は「祭り晴」をそれぞれ被検米試料として用いた結果を示す。また、Ｎは陰性コントロール、Ｐは全ての識別バンドが検出されるよう複数品種の米ＤＮＡ混合物、を用いた場合の検出結果を示す。なお、ＭはΦＸ１７４  ＨａｅＩＩＩ  ｄｉｇｅｓｔ  ＤＮＡを分子量マーカーとして泳動したレーンであることを示す。
【０１８９】
【図１】プライマー対Ｍ１１、ｒＡ６−１、ｒＰ３−１、ｒＷＫＡ０９−１、ｓＭ２ＣＧ−１によるマルチプレックスＰＣＲ反応結果を示した図である。
【図２】プライマー対Ｇ２８、ｓＦ６−１、ｒＧ２２−１、ｓＢ４３−１によるマルチプレックスＰＣＲ反応結果を示した図である。
【図３】プライマー対Ｍ１１、Ｇ２８、ｓＦ６−１、ｒＧ２２−２、ｓＢ４３−１によるマルチプレックスＰＣＲ反応結果を示した図である。
【図４】プライマー対ｒＧ２２−１、ｒＧ４−１、ｒＳ１３−１、ｓＧ４９−１によるマルチプレックスＰＣＲ反応結果を示した図である。
【図５】プライマー対４３Ａ、ｒＧ４−１、Ｎａｋ−１によるマルチプレックスＰＣＲ反応結果を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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