(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
歯肉由来の線維芽細胞に対して、体細胞を多能性幹細胞に誘導可能な再プログラム因子を導入する工程を含む、誘導多能性幹細胞の製造方法。
【請求項２】
体細胞を多能性幹細胞に誘導可能な再プログラム因子が、Octファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、及びklfファミリー遺伝子を含む、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
体細胞を多能性幹細胞に誘導可能な再プログラム因子が、更にMycファミリー遺伝子を含む、請求項２に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高い樹立効率で誘導多能性幹細胞を製造する方法に関する。より詳細には、本発明は、口腔粘膜由来の体細胞を利用することによって、誘導多能性幹細胞を高樹立効率で製造する方法に関する。更に、本発明は、当該製造方法によって作製された誘導多能性幹細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍摘出などにより失われた生体組織に対し、その形態、機能の回復を図るためには、従来の生体材料を用いた置換手法に加え、細胞の移植を基盤とした新たな治療法の開発が望まれている。近年、骨髄由来間葉系幹細胞等の組織幹細胞を用いた再生療法は，骨組織などでは実現可能な段階を迎えつつある（非特許文献１参照）。但し、骨髄由来間葉系幹細胞を得るためには骨髄穿刺が必要であることや，治療に必要な幹細胞数の確保が困難であることから，より安全かつ容易に採取できる幹細胞源が望まれる。【０００３】
一方、近年、OCT3/4、KLF4、c-MYC及びSOX2をコードする各々の遺伝子を体細胞に導入することにより、体細胞を初期化して誘導多能性幹(iPS)細胞に誘導する技術が報告され、再生医薬の分野で革新的な技術が提供されている（特許文献１参照）。このiPS細胞の研究の進展はめざましく、その再生医療での応用は国家プロジェクトとして注目を浴びている。【０００４】
iPS細胞は、本人の体細胞から作製可能であり、免疫拒絶反応を起こさず、倫理的な問題も少ないため、臨床上の実用化が期待されている。従来、iPS細胞の作製には、主に皮膚の線維芽細胞が用いられているが、肝臓や胃の細胞（非特許文献２参照）、末梢血（非特許文献３参照）、又は抜去智歯（親知らず）の細胞からもiPS細胞を作り出せることが報告されている。しかしながら、従来のiPS細胞の作製に使用された体細胞では、iPS細胞の樹立効率が低く、安定なiPS細胞の供給源にはならないという課題がある。更に、従来のiPS細胞の作製に使用された体細胞では、その採取に生体への外科的侵撃を伴うため、患者への負担の点からも望ましくない。【０００５】
このような従来技術を背景として、患者への負担が少なく、しかも高樹立効率でiPS細胞を作製する技術の開発が切望されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第2007/069666号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Yamada Y, et al. Injectable tissue-engineered bone using autogenous bone marrow-derived stromal cells for maxillary sinus augmentation: Clinical application report from a 2-6-year follow-up. Tissue Eng Part A 2008; 14: 1699-707.
【非特許文献２】Aoi T et al. Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells. Science 2008; 321: 699-702.
【非特許文献３】Loh YH et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human blood. Blood 2009; in press.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、患者への負担が少なく、しかも高樹立効率でiPS細胞を作製する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、上記課題を解決すべく、鋭意検討を行ったところ、様々な体細胞の中から、患者への負担が少なく採取可能な口腔粘膜由来の細胞を選択し、当該細胞に対して多能性幹細胞に誘導可能な再プログラム因子を導入することによって、樹立効率が顕著に上昇し、iPS細胞を効率的に製造できることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて、更に検討を重ねることにより完成したものである。【００１０】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。【００１１】
項１．  口腔粘膜由来の体細胞に対して、体細胞を多能性幹細胞に誘導可能な再プログラム因子を導入する工程を含む、誘導多能性幹細胞の製造方法。
項２．  口腔粘膜由来の体細胞が、口腔粘膜由来の線維芽細胞である、項１に記載の製造方法。
項３．  口腔粘膜由来の体細胞が、歯肉由来の線維芽細胞である、項１に記載の製造方法。
項４．  体細胞を多能性幹細胞に誘導可能な再プログラム因子が、Octファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、及びklfファミリー遺伝子を含む、項１に記載の製造方法。
項５．  体細胞を多能性幹細胞に誘導可能な再プログラム因子が、更にMycファミリー遺伝子を含む、項４に記載の製造方法。
項６．  口腔粘膜由来の体細胞に対して、体細胞を多能性幹細胞に誘導可能な再プログラム因子を導入することにより得られる、誘導多能性幹細胞。
項７．  口腔粘膜由来の体細胞が、口腔粘膜由来の線維芽細胞である、項６に記載誘導多能性幹細胞。
項８．  口腔粘膜由来の体細胞が、歯肉由来の線維芽細胞である、項６に記載誘導多能性幹細胞。
項９．  細胞を多能性幹細胞に誘導可能な再プログラム因子がOctファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、及びklfファミリー遺伝子を含む、項６に記載の誘導多能性幹細胞。
項１０．  体細胞を多能性幹細胞に誘導可能な再プログラム因子が、更にMycファミリー遺伝子を含む、項９に記載の誘導多能性幹細胞。
項１１．  項６乃至１０のいずれかに記載の誘導多能性幹細胞を含む、再生医療用の細胞製剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、iPS細胞の誘導に使用する細胞として、口腔粘膜由来の体細胞を使用することによって、iPS細胞の樹立効率を高め、従来に比べて短時間でiPS細胞を樹立することが可能になる。【００１３】
口腔粘膜から細胞の採取は、抜歯術、歯周治療又はインプラント治療等の一般的な歯科治療の際に歯肉切除術などによって生じる廃棄予定の歯肉組織を用いることが可能である。治療過程で生じる廃棄予定の組織を用いてiPS細胞を樹立する技術は、医科および歯科領域において切望される組織再生医療への貢献が期待されるのみならず、低侵襲で樹立可能なiPS細胞のバンキングを容易にし、将来の疾病に自身のiPS細胞を容易に利用でき，多分野の再生医療の発展に寄与することができる。【００１４】
更に、本発明において、口腔粘膜由来の体細胞として、口腔粘膜由来（特に、口腔粘膜の歯肉由来）の線維芽細胞を使用すると、当該線維芽細胞の継代培養を繰り返した後であっても、高樹立効率でiPS細胞に誘導することができるので、iPS細胞に誘導される細胞源として、口腔粘膜由来の線維芽細胞の使用は、特に臨床上の応用に好適である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例１において、4因子（c-Myc，Oct3/4，Sox，Klf4）をマウス歯肉線維芽細胞に導入した19〜26日後の細胞形態（フィーダー細胞上に播種された状態）を観察した結果を示す。
【図２】実施例１において、3因子（Oct3/4，Sox，Klf4）をマウス歯肉線維芽細胞に導入し、クローン化した11種類のiPS細胞株およびマウスES細胞の細胞形態（フィーダー細胞上に播種された状態）を観察した結果を示す。
【図３】実施例１において、3因子（Oct3/4，Sox，Klf4）をマウス歯肉線維芽細胞に導入して作製したiPS細胞クローン株を、ES培地で3日間浮遊培養した際の細胞形態を観察した結果を示す。
【図４】実施例１において、６回継代培養したマウス歯肉線維芽細胞及び尾部由来線維芽細胞に対して、4因子（c-Myc，Oct3/4，Sox，Klf4）を導入した4日後に細胞形態を観察した結果、及び4因子（c-Myc，Oct3/4，Sox，Klf4）を導入した9日後の細胞にcrystal violet染色を行った結果を示す。
【図５】実施例１において、マウス歯肉線維芽細胞に3因子（Oct3/4，Sox，Klf4）を導入して作製されたiPS細胞のin vitroにおける分化能を観察した結果を示す。左上にはコントロールIgG（免疫グロブリンG）抗体で免疫染色及びDAPI核染色した結果；左下には抗α1-フェトプロテイン抗体で免疫染色及びDAPI核染色した結果；右上には抗β-IIIチューブリン抗体で免疫染色及びDAPI核染色した結果；右下には抗α-平滑筋アクチン抗体で免疫染色及びDAPI核染色した結果を示す。
【図６】実施例１において、マウス歯肉線維芽細胞に4因子（Oct3/4，Sox，Klf4，c-Myc）を導入して作製されたiPS細胞のin vitroにおける分化能を観察した結果を示す。左には抗β-IIIチューブリン抗体で免疫染色及びDAPI核染色した結果；中央には抗α1-フェトプロテイン抗体で免疫染色及びDAPI核染色した結果；右には抗α-平滑筋アクチン抗体で免疫染色及びDAPI核染色した結果を示す。図中、抗α1-フェトプロテイン抗体で免疫染色は緑色を呈し、DAPI核染色は赤色を呈している。
【図７】実施例１において、マウス歯肉線維芽細胞に3因子（Oct3/4，Sox，Klf4）を導入して作製されたiPS細胞のin vitroにおける拍動細胞（心筋細胞）への分化を観察した結果を示す。本図に示す細胞は、拍動していることが確認されている。
【図８】実施例１において、マウス歯肉線維芽細胞に3因子（Oct3/4，Sox，Klf4）又は４因子（c-Myc，Oct3/4，Sox，Klf4）を導入して作製されたiPS細胞（６回継代培養した歯肉線維芽細胞を使用して誘導）を、デキサメタゾン、β-グリセロリン酸及びアスコルビン酸-2-リン酸を添加した骨分化誘導培地で28日間培養し、in vitroにおける骨芽細胞への分化を観察した結果を示す。左上には3因子を、右上には4因子を導入して作製されたiPS細胞に対してアルカリフォスファターゼ及びvon Kossa二重染色を行った結果を示す。左下及び右下には、それぞれ右上及び左上に示す染色した細胞の拡大写真像を示す。図中、アルカリフォスファターゼ活性を示す細胞は赤色を呈し、石灰化した細胞外基質は黒色を呈している。
【図９】実施例１において、3因子（Oct3/4，Sox，Klf4）をマウス歯肉線維芽細胞に導入したiPS細胞（６回継代培養した歯肉線維芽細胞を使用して誘導）及びマウスES細胞について、各種マーカー遺伝子の発現を測定した結果を示す。図中、「mGF」はマウス歯肉線維芽細胞を示し、「SNL」は培養に使用したフィーダー細胞を示す。
【図１０】実施例１において、4因子（c-Myc，Oct3/4，Sox，Klf4）をマウス歯肉線維芽細胞に導入したiPS細胞（６回継代培養した歯肉線維芽細胞を使用して誘導；transduced mGF）及びマウスES細胞について、各種マーカー遺伝子の発現を測定した結果を示す。図中、「mGF」はマウス歯肉線維芽細胞を示し、「SNL」は培養に使用したフィーダー細胞を示す。
【図１１】実施例１において、3因子（Oct3/4，Sox，Klf4）又は4因子（c-Myc，Oct3/4，Sox，Klf4）をマウス歯肉線維芽細胞に導入したiPS細胞（６回継代培養した歯肉線維芽細胞を使用して誘導）に対して、アルカリフォスファターゼ染色を行った結果を示す。
【図１２】実施例１において、3因子（Oct3/4，Sox，Klf4）又は4因子（c-Myc，Oct3/4，Sox，Klf4）をマウス歯肉線維芽細胞に導入したiPS細胞（６回継代培養した歯肉線維芽細胞を使用して誘導；mGF-iPS-3F or 4F）、マウスES細胞、及びマウス歯肉線維芽細胞のNanog及びOct3/4遺伝子のプロモータ領域におけるシトシングアニンジヌクレオチド（CpG）のメチル化状態を分析した結果を示す。図１２中、黒丸がメチル化されているCpG部位、白丸がメチル化されていないCpG部位を示す。
【図１３】実施例１において、3因子（Oct3/4，Sox，Klf4）をマウス歯肉線維芽細胞に導入したiPS細胞（６回継代培養した歯肉線維芽細胞を使用して誘導）をマウスの精巣髄質に注入した後に、形成されたテラトーマをヘマトキシン及びエオシン染色によって組織学的解析した結果を示す。
【図１４】実施例１において、４因子（c-Myc，Oct3/4，Sox，Klf4）をマウス歯肉線維芽細胞に導入したiPS細胞（６回継代培養した歯肉線維芽細胞を使用して誘導）をマウスの精巣髄質に注入した後に、形成されたテラトーマをヘマトキシン及びエオシン染色によって組織学的解析した結果を示す。
【図１５】実施例１において、マウス歯肉線維芽細胞(mGF)とマウス尾部由来線維芽細胞(TTF)における再プログラミング効率（iPS細胞への誘導効率）を評価した結果を示す。Ａには、４回（Ｐ４）、７回（Ｐ７）及び１０回（Ｐ１０）の継代培養を行ったマウス歯肉線維芽細胞とマウス尾部由来線維芽細胞に、4因子（c-Myc，Oct3/4，Sox，Klf4）を導入した際にiPS細胞の樹立効率を測定した結果を示す。Ｂには、５回の継代培養を行ったマウス歯肉線維芽細胞とマウス尾部由来線維芽細胞の増殖特性を測定した結果を示す。Ｃには、４回（Ｐ４）、５回（Ｐ５）及び６回（Ｐ６）の継代培養を行ったマウス歯肉線維芽細胞とマウス尾部由来線維芽細胞について、細胞増殖に寄与するテロメアの維持に必要なTert遺伝子の内在性発現をReal-time RT-PCRにて測定した結果を示す。
【図１６】実施例２において、ヒト歯肉線維芽細胞からiPS細胞の誘導を行った際の試験材料及び各段階で得られた細胞を観察した結果を示す。Ａには、試験に供したヒト歯肉組織片を採取した際の写真を示す。Ｂには、ヒト歯肉組織片から増殖させたヒト歯肉線維芽細胞とヒト歯肉上皮細胞を観察した結果を示す。Ｃには、iPS細胞への誘導に使用したヒト歯肉線維芽細胞を観察した結果を示す。Ｄには、4因子（c-Myc，Oct3/4，Sox，Klf4）をヒト歯肉線維芽細胞に導入して誘導したiPS細胞を観察した結果を示す。Ｅ及びＦには、4因子（c-Myc，Oct3/4，Sox，Klf4）をヒト歯肉線維芽細胞に導入して誘導したiPS細胞をクローン化した状態で観察した結果を示す。Ｇには、ヒトES細胞を観察した結果を示す。Ｈには、ヒト皮膚線維芽細胞から誘導したiPS細胞を観察した結果を示す。Ｉには、4因子（c-Myc，Oct3/4，Sox，Klf4）をヒト歯肉線維芽細胞に導入して誘導したiPS細胞に対して、アルカリフォスファターゼ染色を行った結果を示す。
【図１７】実施例２において、4因子（c-Myc，Oct3/4，Sox，Klf4）をヒト歯肉線維芽細胞に導入して作成したiPS細胞（transduced hGF）及びヒトES細胞について、各種マーカー遺伝子の発現を測定した結果を示す。図中、「hGF」はヒト歯肉線維芽細胞を示し、「SNL」は培養に使用したフィーダー細胞を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明のiPS細胞の製造方法は、口腔粘膜由来の体細胞に対して、体細胞を多能性幹細胞に誘導可能な再プログラム因子を導入する工程を含むことを特徴とする。以下、本発明について、詳述する。
【００１７】
本発明では、口腔粘膜由来の体細胞から、iPS細胞を誘導する。本発明で使用される体細胞は、口腔粘膜由来であればよいが、高樹立効率でiPS細胞を誘導させるために、好ましくは歯肉細胞が挙げられる。本発明で使用される口腔粘膜由来の体細胞としては、口腔粘膜の線維芽細胞、口腔粘膜の上皮細胞のいずれであってもよいが、好ましくは歯肉線維芽細胞及び歯肉上皮細胞、更に好ましくは歯肉線維芽細胞が挙げられる。口腔粘膜の線維芽細胞、特に歯肉線維芽細胞は、高樹立効率でiPS細胞に誘導可能であると共に、継代培養を行った後でも、iPS細胞の樹立効率を維持させることができる。従来、iPS細胞に誘導する体細胞は、継代培養を行った後には、樹立効率が減少することが知られているが、口腔粘膜の線維芽細胞は、例えば7〜10継代程度まで培養した後であっても、高樹立効率でiPS細胞への誘導が可能であり、使用利便性に優れており、臨床上の実用性が極めて高いといえる。
【００１８】
また、上記口腔粘膜由来の体細胞は、誘導されるiPS細胞の使用目的に応じて、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギ、サル等の哺乳動物由来のものから適宜選択されるが、ヒトの治療やヒト治療薬の開発ツール等の目的で使用する場合にはヒト由来のものが好適である。また、ヒト由来の口腔粘膜由来の体細胞を使用する場合、胎児、幼児、小児、及び成人のいずれに由来するものであってもよい。誘導されるiPS細胞をヒトの治療目的で使用する場合には、患者から採取した口腔粘膜由来の体細胞を使用することが望ましい。また、使用する口腔粘膜由来の体細胞は、抜歯術、歯周治療又はインプラント治療等の際に歯肉切除術などによって生じる廃棄予定の歯肉組織を用いることも可能である。口腔粘膜から細胞の採取は、例えば、Nikawaらが報告した方法（Nikawa H, Egusa H, Makihira S, Okamoto T, Kurihara H, Shiba H, Amano H, Murayama T, Yatani H, Hamada T. An in vitro evaluation of the adhesion of Candidaspecies to oral and lung tissue cells. Mycoses. 2006;49(1):14-7.）に従って実施される。即ち、採取した口腔粘膜組織を組織培養プレート上に密着させて静置し、5%CO2存在下、37℃で培養することによって組織から増殖した細胞を回収する方法によって、口腔粘膜から細胞を採取することができる。
【００１９】
口腔粘膜由来の体細胞をiPS細胞に誘導するための再プログラム因子としては、体細胞を多能性幹細胞に誘導可能なものである限り特に制限されないが、一般的には、(1)Octファミリー遺伝子又はその遺伝子産物、(2)Soxファミリー遺伝子又はその遺伝子産物、及び(3)Klfファミリー遺伝子又はその遺伝子産物を含む３因子の組合せが例示される。更に、iPS細胞の樹立効率を更に向上させるという観点から、上記３因子に加えて、(4)Mycファミリー遺伝子又はその遺伝子産物を組み合わせることが望ましい。また、細胞の初期化誘導に際して、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（5-Azacytidine、5-Aza-2'-deoxycytidine）やヒストンデアセチラーゼ阻害剤（バルプロ酸、トリコスタチンＡ、スベロイラニリド・ハイドロザミック酸等）等の低分子化合物を用いることで上記再プログラム因子によるiPS細胞への誘導効率を高めることが可能であり、低分子化合物の組み合わせのみで再プログラム因子として使用することもできる。
【００２０】
Octファミリーとしては、Oct3/4、Oct1A、及びOct 6等が挙げられる。これらのOctファミリーは、1種単独で使用してもよく、また2種以上を組み合わせて使用してもよい。これらのOCTファミリーの中でも、本iPS細胞への効率的な誘導という観点から、Oct3/4が好適に使用される。Oct3/4の塩基配列は、公知（NCBI accession Number NM_002701（human）、NM_013633（Mouse））である。また、Oct1A遺伝子の塩基配列（NCBI accession NumberNM_002697（human）、NM_198934（Mouse））、Oct6遺伝子の塩基配列（NCBI accession Number NM_002699（human）、NM_011141（Mouse））についても公知である。
【００２１】
Soxファミリーとしては、Sox1、Sox2、Sox3、Sox7、Sox15、Sox17、及びSox18が挙げられる。これらのSoxファミリーは、1種単独で使用してもよく、また2種以上を組み合わせて使用してもよい。これらのSoxファミリーの中でも、iPS細胞への効率的な誘導という観点から、Sox2が好適に使用される。Sox2遺伝子の塩基配列は、公知（NCBI accession Number NM_003106（human）、NM_011443（Mouse））である。また、Sox1遺伝子の塩基配列（NCBI accession Number NM_005986（human）、NM_009233（Mouse））、Sox3遺伝子の塩基配列（NCBI accession Number NM_005634（human）、NM_009237（Mouse））、Sox7遺伝子の塩基配列（NCBI accession Number NM_031439（human）、NM_011446（Mouse））、Sox15遺伝子の塩基配列（NCBI accession Number NM_006942（human）、NM_009235（Mouse））、Sox17遺伝子の塩基配列（NCBI accession Number NM_0022454（human）、NM_011441（Mouse））、Sox18遺伝子の塩基配列（NCBI accession Number NM_018419（human）、NM_009236（Mouse））についても公知である。
【００２２】
Klfファミリーとしては、Klf1、Klf2、Klf4、及びKlf5等が挙げられる。これらのKlfファミリーは、1種単独で使用してもよく、また2種以上を組み合わせて使用してもよい。これらのKlfファミリーの中でも、iPS細胞への効率的な誘導という観点から、Klf4が好適に使用される。Klf 4遺伝子の塩基配列は公知（NCBI accession Number NM_010637（human）、NM_004235（Mouse））である。また、Klf1遺伝子の塩基配列（NCBI accession Number NM_006563（human）、NM_010635（Mouse））、Klf2遺伝子の塩基配列（NCBI accession Number NM_016270（human）、NM_008452（Mouse））、及びKlf5遺伝子の塩基配列（NCBI accession Number NM_001730（human）、NM_009769（Mouse））についても公知である。
【００２３】
Mycファミリーとしては、c-Myc、N-Myc、及びL-Myc等が挙げられる。これらのMycファミリーは、1種単独で使用してもよく、また2種以上を組み合わせて使用してもよい。これらのMycファミリーの中でも、本発明では、好ましくはc-Myc及びL-Myc、更に好ましくはc-Mycが使用される。c-Mycは、細胞の分化及び増殖に関与する転写制御因子として知られており（S. Adhikary, M. Elilers, Nat. Rav. Mol. Cell Biol., 6, pp635-645, 2005）、その塩基配列は公知（NCBI accession Number NM_010849（human）、NM_002467（Mouse））である。また、N-Myc遺伝子の塩基配列（NCBI accession Number NM_005378（human）、NM_008709（Mouse））及びL-Myc遺伝子の塩基配列（NCBI accession Number NM_005376（human）、NM_008506（Mouse））についても公知である。なお、本明細書において、NCBIとは、米国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）の略である。
【００２４】
上記再プログラム因子は、ヒトを含む哺乳動物において共通して存在しており、任意の哺乳動物由来のものを使用できるが、導入する体細胞の由来に応じて適宜選択することが望ましい。例えば、体細胞としてヒト由来のものを使用する場合であれば、上記再プログラム因子はヒト由来であることが望ましい。また、上記再プログラム因子は、野生型遺伝子又はその遺伝子産物以外に、その遺伝子産物のアミノ酸配列における数個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜６個、更に好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、特に好ましくは１又は２個）のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されており、且つ、野生型の遺伝子産物と同等の機能を有する変異遺伝子産物、又は当該変異遺伝子産物をコードしている変異遺伝子であってもよい。
【００２５】
本発明において、上記再プログラム因子は、公知の配列情報に基づいて、常法に従って調製することができる。例えば、哺乳動物由来の細胞からRNAを抽出し、常法に従ってクローニングすることにより、目的とする遺伝子のcDNAを調製することができる。
【００２６】
口腔粘膜由来の体細胞に導入される上記再プログラム因子は、体細胞を多能性幹細胞に誘導可能であることを限度として、遺伝子（核酸分子）又は遺伝子産物（タンパク質）のいずれであってもよいが、iPS細胞の樹立効率を高めるという観点から、遺伝子（核酸分子）であることが好適である。
【００２７】
口腔粘膜由来の体細胞への上記再プログラム因子の導入は、公知の方法に従って実施することができる。例えば、上記再プログラム因子が遺伝子の場合には、上記再プログラム因子の口腔粘膜由来の体細胞への導入は、動物細胞のトランスフェクションにおいて通常使用される方法で行うことができる。具体的には、上記再プログラム因子を体細胞へ導入する方法として、ベクターを使用する方法；リン酸カルシウム法；リポフェクション法；エレクトロポレーション法；マイクロインジェクション法等が例示される。これらの中でも、導入効率の点から、ベクターを使用する方法が好ましい。ベクターを使用して上記再プログラム因子を体細胞に導入する場合には、ベクターとして、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、人工ウイルス等を用いることができるが、アデノウイルス及びレトロウイルス等のウイルスベクターが、安全性の観点から好適に使用される。なお、ベクターを使用する場合、上記再プログラム因子は、各遺伝子が各々別のベクターに組み込まれていてもよく、１つのベクターに２種以上の遺伝子が組み込まれていてもよい。更に、ベクターを使用して上記再プログラム因子を体細胞に導入する場合には、上記再プログラム因子のコード配列を２Ａペプチドのコード配列につないだタンパク質発現ベクターを使用することもできる。
【００２８】
本発明において、口腔粘膜由来の体細胞をiPS細胞に誘導するために使用される再プログラム因子は、前述するものの他、核酸に限らず、従来公知の再プログラム因子及び将来新たに開発される再プログラム因子が包含される。
【００２９】
斯くして上記再プログラム因子が導入された口腔粘膜由来の体細胞は、細胞が初期化され、自己増殖能と多分化能を獲得することができ、未分化であって多能性及び増殖能を有する細胞（iPS細胞）に誘導される。上記再プログラム因子が導入された口腔粘膜由来の体細胞は、約９〜１５日間程度、培養することによって、iPS細胞に誘導される。本発明によれば、上記再プログラム因子の導入処理後にiPS細胞に誘導される期間が、従来技術に比して短いという利点もあり、短期間でiPS細胞を樹立できるという利点もある。
【００３０】
上記再プログラム因子の導入処理を行った口腔粘膜由来の体細胞の中から、iPS細胞を選択するには、細胞の増殖能の有無、iPS細胞特有の特性を有するか否か等を指標として行うことができる。このようなiPS細胞の選択は、具体的には、増殖能を有する細胞の中から、細胞の形状、iPS細胞に特異的なマーカー遺伝子（例えば、Nanog，Eras，Zfp42，内在性Oct3/4等）の発現の有無、アルカリフォスファターゼの染色性の有無、マウス体内におけるテラトーマ形成能の有無を指標として行うことができる。
【００３１】
斯くして得られたiPS細胞は、自己増殖能と共に、神経細胞、肝細胞、平滑筋細胞、骨芽細胞、心筋細胞等の各種細胞に分化する能力を備えており、表皮組織、筋組織、脂肪組織、神経組織、軟骨組織、骨組織、腸管様上皮組織等の様々な組織の再生が可能であるので、各種の再生医療目的で使用することができる。即ち、斯くして得られたiPS細胞は、再生医療用の細胞製剤として使用することができる。更に、斯くして得られたiPS細胞は、各種薬物に対する応答性を評価することによって、治療薬の開発ツールとしても使用することもできる。
【実施例】
【００３２】
以下に、実施例等に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
実施例１  マウスiPS細胞の作製及び評価
以下に示す実験材料及び条件で、マウス歯肉線維芽細胞又は尾部由来線維芽細胞からiPS細胞の誘導を行い、更に誘導されたiPS細胞の特性の評価を行った。【００３３】
＜マウス歯肉線維芽細胞及び尾部由来線維芽細胞の分離培養＞
10週齡雄C57BL/6Jマウスより口腔粘膜歯肉組織及び尾部組織を採取した。これら組織片をそれぞれ0.1%ゼラチンコート処理した組織培養プレート上に密着させて置き、MF-start培地（Toyobo，大阪）を組織片が覆われる程度に加えて5%CO2存在下、37℃で静置した。組織片から線維芽細胞が十分に生育した時点で組織片を取り除くことにより線維芽細胞を得て、２〜３日おきに新しい培地に交換した。細胞が70％コンフルエントに達した時点で継代培養し、培地をFP培地〔10%ウシ胎仔血清（Sigma, St. Louis, MO），50 units/ml penicillin，50 μg/ml streptomycin含有DMEM（Dulbecco's modified Eagle medium without sodium pyruvate: ナカライテスク，京都）培地〕に交換して培養を続けた。【００３４】
＜マウス胚性幹（ES）細胞株およびフィーダー細胞＞
マウス胚性幹（ES）細胞株（AB2.2）及びSNLP76.7-4フィーダー細胞は、Dr. Allan Bradley（Sanger Institute，London, UK）より供与されたものを用いた。【００３５】
＜レトロウイルス粒子産生＞
マウスc-Myc遺伝子、Oct3/4遺伝子、Sox2遺伝子又はKlf4遺伝子（cDNA）を組み込んだレトロウイルスベクター（pMXs-IRES-puro）はAddgene（Cambridge, MA）から購入した。また、レトロウイルスベクターの導入効率を確認するために，緑色蛍光蛋白質（GFP）遺伝子を組み込んだレトロウイルスベクター（pMX-GFP）をCell Biolabs（San Diego, CA）から購入し、用いた。ウイルス粒子の産生に用いるPlatinum-Eパッケージング細胞は、東京大学の北村俊雄教授より供与されたものを用いた。【００３６】
OPTI-MEMI培地（Invitrogen）とFuGENE 6試薬（Roche, Basel, Switzerland）の混合溶液に各プラスミドベクター（9 μg）を混合し、リポフェクション法によりPlatinum-E細胞に遺伝子導入した。24時間後に各ウイルス粒子を含んだ培養上清を回収し、歯肉線維芽細胞又は尾部由来線維芽細胞のレトロウイルス感染（iPS細胞誘導）に用いた。【００３７】
＜iPS細胞誘導＞
レトロウイルス感染による形質導入24時間前に、４〜10回継代培養した5×105 個の歯肉線維芽細胞を、0.1%ゼラチンコート処理した10-cm培養プレートに播種し、bFGF（最終濃度3 ng/ml：Peprotech, London, UK）含有FP培地で培養した。4因子（c-Myc，Oct3/4，Sox，Klf4）又はc-Mycを除いた3因子（Oct3/4，Sox，Klf4）を用いたiPS細胞誘導を実施した。iPS細胞誘導には、上記４因子又は３因子の各ウイルス含有上清を最終的に等量になるよう混合した。GFPを用いた場合には、（c-Myc，）Oct3/4，Sox，Klf4，GFPが（1:）1:1:1:3の比率となるように混合した。この混合液にpolybrene（最終濃度4 μg/ml）及びbFGF（最終濃度10 ng/ml）を添加した溶液を各線維芽細胞の培地と置換し、5%CO2存在下，37℃で一晩培養した。翌日及びその2日後に培養上清を吸引除去し、bFGF（最終濃度3 ng/ml）含有FP培地と交換した。形質導入4日後に、mitomycin C処理により増殖を不活性化したSNLP76.7-4フィーダー細胞上（2.6 x 104個/cm2）に、形質導入を行った線維芽細胞を播種した。播種した細胞の濃度は，4因子を用いた誘導では0.1×103〜1×103個/cm2，3因子を用いた誘導では0.7×104〜1×104個/cm2を用いた。翌日、培地をES培地（15%ウシ胎児血清，2 mM L-Glutamine，1×10-4 M nonessential amino acids，1×10-4M 2-mercaptoethanol, 50 U penicillin, and 50 μg/ml streptomycin含有DMEM培地）に置換し、以後毎日培地を新鮮なものに交換した。形質導入後（4因子を後板誘導の場合；9〜21日間、3因子を用いた誘導の場合；35〜50日間）に出現したいくつかのES細胞様の形態のコロニーを選択して継代培養し、クローン化したコロニーの中で特にES細胞様の形態および増殖能を示すコロニー細胞株をiPS細胞株とした。【００３８】
上記４因子又は3因子を導入して、６回継代培養した歯肉線維芽細胞からiPS細胞を誘導した際に、細胞観察を行った結果を図１及び２に示す。図１には、フィーダー細胞上に播種した細胞（4因子導入；形質導入19〜26日後）を観察した結果；図２には、3因子を導入して35〜50日間フィーダー細胞上で誘導し、クローン化した11種類のiPS細胞株（６回継代培養した歯肉線維芽細胞を使用して誘導）及びマウスES細胞を観察した結果を、それぞれ示す。この結果から、歯肉線維芽細胞に上記４因子又は3因子を導入した細胞は、ES細胞様の細胞形態を示し、iPS細胞に誘導されていることが明らかとなった。【００３９】
また、3因子を導入して６回継代培養した歯肉線維芽細胞から誘導した9種類のiPS細胞株をES培地で3日間浮遊培養して、細胞形態（embryoid body形成）を観察した。その結果を図３に示す。【００４０】
＜歯肉および尾部由来線維芽細胞におけるiPS細胞樹立効率の比較＞
同一の10週齡雄マウス固体の歯肉あるいは尾部から同時に分離培養した歯肉線維芽細胞及び尾部由来線維芽細胞を並行して６回継代培養した。これらの細胞を６ウェル培養プレートに1×104〜2×104 cells/wellの濃度で播種し、上記の４因子を用いたiPS細胞誘導を上記と同条件で行った。形質導入後に出現した細胞コロニーをcrystal violet染色にて検出し、ES細胞様コロニー数を比較検討した。【００４１】
結果を図４に示す。この結果から、歯肉線維芽細胞を使用した場合には、尾部由来線維芽細胞の場合と比較して、著明に多くのES細胞様コロニーが認められた。以上の結果から、口腔粘膜組織はiPS細胞の樹立を迅速かつ効率的に可能にする細胞源であり、歯肉線維芽細胞から樹立したiPS細胞が今後の再生医学研究に応用でき得ることが示された。【００４２】
＜歯肉線維芽細胞由来iPS細胞のin vitroにおける分化＞
歯肉線維芽細胞から誘導したiPS細胞（3因子を導入して得られたiPS細胞：６回継代培養した歯肉線維芽細胞を使用して誘導）を、トリプシン処理を行って採取し、ES培地を含むlow attachment培養ディッシュに移した。3日後、凝集した細胞を0.1%ゼラチンコート処理した12ウェル組織培養プレート、又は8ウェルのガラス製チャンバースライド（Nalge Nunc International, Naperville, IL）に播種し、更に3日間ES培地中にて培養を行った。【００４３】
蛍光免疫細胞染色のため、上記の細胞を10%リン酸緩衝ホルマリン溶液（和光純薬工業（株）、大阪、日本）で固定し、1%ウシ血清アルブミン及び0.1%toriton-X100を含有するリン酸緩衝溶液（PBS）中で20分間インキュベーションを行った。2回の洗浄後、細胞をマウス抗ヒトα-平滑筋アクチンモノクローナル抗体（0.05 mol/L; clone 1A4, Dako, Glostrup, Denmark）、ウサギ抗-ヒトα1-フェトプロテインポリクローナル抗体（0.05 mol/L; Dako）を添加して室温にて30分間インキュベーションを行うか、或いはマウス抗ヒトβ-IIIチューブリンモノクローナル抗体（0.5 μg/ml; clone TU-20, Millipore, Temecula, CA）又はコントロールIgG（0.5 μg/ml; mouse IgG whole molecules: Santa CruzBiotechnology, Santa Cruz, CA）を添加して4℃にて一晩インキュベーションを行った。その後、細胞を洗浄し、Alexa568 ヤギ抗マウス又は抗ウサギIgG（1:500; Molecular Probes, Eugene, OR）のいずれかで、37℃にて30分間インキュベーションを行い、更にDAPI（Roche）核染色を行った。結果を図５に示す。この結果から、上記で作製されたiPS細胞をフィーダー細胞非依存的に培養すると、β-III tublin（神経細胞）、α-fetoprotein（肝細胞）、α-smooth muscle actin（平滑筋細胞）蛋白質を発現する細胞への三胚葉系細胞分化が確認された。【００４４】
更に、歯肉線維芽細胞から誘導したiPS細胞（4因子を導入して得られたiPS細胞：６回継代培養した歯肉線維芽細胞を使用して誘導）を用いて、上記と同条件で蛍光免疫染色を行った。結果を図６に示す。この結果から、4因子を導入して得られたiPS細胞でも、β-III tublin（神経細胞）、α-fetoprotein（肝細胞）、α-smooth muscle actin（平滑筋細胞）蛋白質を発現する細胞への三胚葉系細胞分化が確認された。【００４５】
また、上記3因子を導入して得られたiPS細胞コロニー（形質導入から50日目）をフィーダー細胞上に播種してES培地中で5〜１０日間培養した結果、拍動する細胞（心筋細胞）への分化が確認された。結果を図７に示す。【００４６】
また、骨芽細胞分化誘導のため、12ウェル組織培養プレート中のiPS細胞（3因子又は4因子を導入して得られたiPS細胞：共に6回継代培養した歯肉線維芽細胞から誘導）を、0.1μMデキサメタゾン、10ｍM β-グリセロリン酸及び50μMアスコルビン酸-2-リン酸（Sigma）を添加した骨分化誘導培地中で培養した。骨芽細胞マーカーであるアルカリフォスファターゼ活性及び細胞外基質の石灰化を検出するために、アルカリフォスファターゼ及びvon Kossa二重染色を行った。結果を図８に示す。この結果から、上記で作製されたiPS細胞が、アルカリフォスファターゼ活性を有し、石灰化を呈する細胞（骨芽細胞）への分化能を有していることも判明した。【００４７】
＜逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）解析＞
フィーダー細胞上に播種して3日目のiPS細胞（3因子又は4因子を導入して得られたiPS細胞：６回継代培養した歯肉線維芽細胞を使用して誘導）、マウスES細胞、マウス歯肉線維芽細胞、又はiPS細胞の培養に使用したフィーダー細胞から得られた全RNAをRT-PCR解析に使用した。全RNAをRNeasy Mini Kit（QIAGEN, Hilden, Germany）を用いて抽出した。DNase I（Ambion, Austin, TX）処理の後、Super Script III逆転写酵素（Invitogen, Carlsbad, CA）を用いて、1μgの全RNAからcDNAを合成した。推奨される方法に従い、Taq DNAポリメラーゼ（Promega, Madison, WI）を用いて、このcDNAターゲットをPCRで増幅した。使用したPCRプライマー対を下記表１に示す。PCR産物を、1.5%アガロースゲル電気泳動とエチジウムブロミド染色処理を行い、紫外線照明のもとで可視化した（Dolphin-View Image System: Wealtec, Sparks, NV）。グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）mRNAの発現を内部コントロールとして用いた。【００４８】
【表１】
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【００４９】
得られた結果を図９及び１０に示す。この結果から、歯肉線維芽細胞から誘導したiPS細胞は、ES細胞に特異的なマーカー遺伝子（Nanog、ERas、zfp42、内在性Oct3/4）を強く発現していることが確認され、自己増殖能と多分化能を獲得していることが確認された。【００５０】
＜アルカリフォスファターゼによる染色＞
３因子又は４因子を導入してそれぞれ50日間又は20日間誘導したiPS細胞クローン株（６回継代培養した歯肉線維芽細胞を使用して誘導）に対して、アルカリフォスファターゼによる染色を行った。【００５１】
この結果を図１１に示す。上記で作製されたiPS細胞は、ES細胞のマーカーとされるアルカリフォスファターゼが陽性を示すことが確認された。【００５２】
＜DNAメチル化解析＞
iPS細胞（3因子又は4因子を導入して得られたiPS細胞：６回継代培養した歯肉線維芽細胞を使用して誘導）、及びマウスES細胞をそれぞれ３日間浮遊培養した後、浮遊している細胞塊（embryoid body）を回収し、これらの細胞塊、及びマウス歯肉線維芽細胞からゲノムDNAを単離した。これらのゲノムDNAを使用し、Nanog及びOct3/4遺伝子のプロモータ領域におけるシトシングアニンジヌクレオチド（CpG）のメチル化状態をBisulfite sequencing法により分析した。Nanog及びOct3/4遺伝子のプロモータ領域及びCpG lociに関する情報は、Transcriptional Start Site (DBTSS Ver. 7.0: http://dbtss.hgc.jp/)のデータベースから取得した。バイサルファイト処理は、EpiTect Bisulfite kit（Qiagen）を用いて行った。Bisulfite PCRプライマーは、表２のものを使用した。増幅産物を、pGEM-T Easy Vector (Promega)を用いてサブクローニングを行った。５つのクローンをランダムに選択し、各PCR増幅産物についてSP6フォワード及びリバースプライマーでDNA塩基配列の解析を行った。【００５３】
【表２】
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【００５４】
得られた結果を図１２に示す。この結果から、マウス歯肉線維芽細胞において、Nanog及びOct3/4遺伝子のプロモータ領域においてメチル化されているCpGの多くは、3因子又は4因子を導入して得られたiPS細胞では脱メチル化されていることが判明した。また、3因子又は4因子を導入して得られたiPS細胞におけるNanog及びOct3/4遺伝子のプロモータ領域のメチル化パターンは、マウスES細胞と近似していることも確認された。なお、図１２中に示す数値は、各遺伝子の転写開始部位から各CpG部位までの塩基数を示し、灰色領域は非翻訳領域、黒色領域は翻訳領域を示す。【００５５】
以上の結果から、3因子又は4因子を導入して得られたiPS細胞では、Nanog及びOct3/4遺伝子のプロモータ領域が脱メチル化されており、ES細胞と同様に、これらの遺伝子の発現が促進された状態にあることが明らかとなった。【００５６】
＜テラトーマ（teratoma）形成及び組織学的解析＞
8週齢のSCIDマウス（C.B-17; 日本クレア, 東京, 日本）をジエチルエーテル及び10倍希釈したネンブタール（大日本住友製薬, 大阪, 日本）の腹腔内投与（体重100 g につき0.1 ml）により麻酔した。冷却したハンクス平衡塩液（Hank’s balanced salt solution）(Gibco)にiPS細胞（3因子及び4因子を導入して得られたiPS細胞：３回継代培養）を懸濁した、細胞懸濁液（0.2〜0.5×106cells/精巣）20μlを、ハミルトンシリンジを用いてマウスの精巣髄質に注射した。その後、マウスを特定病原体未感染の条件のもと、飲水及び摂食が自由な状態で飼育した。7〜10週間後、マウスをPBSで灌流した後、1％パラホルムアルデヒド及び1.25%グルタルアルデヒドを含有する固定溶液で灌流を行い、マウス精巣に形成されたテラトーマを摘出して、組織学的解析を行った。試料をパラフィン包埋した後、3 μmの厚さの切片を作製し、ヘマトキシン及びエオシン（H&E）染色を行った。【００５７】
H&E染色の結果を図１３及び１４に示す。この結果から、上記で作製されたiPS細胞を注入したSCIDマウスの精巣髄質中で、表皮組織、筋組織、脂肪組織、神経組織、軟骨組織、及び腸管様上皮組織等の組織像が観察され、上記で作製されたiPS細胞の三胚葉に由来する様々な組織への分化能が確認された。【００５８】
＜再プログラミング効率の分析＞
歯肉線維芽細胞と尾部由来線維芽細胞における再プログラミング効率（iPS細胞への誘導効率）を比較するために、同一の10週齡雄C57BL/6Jマウスから、歯肉組織及び尾部組織を採取し、上記と同条件で歯肉線維芽細胞及び尾部由来線維芽細胞を得た。得られた歯肉線維芽細胞及び尾部由来線維芽細胞をFP培地〔10%ウシ胎仔血清（Sigma, St. Louis, MO），50 units/ml penicillin，50 μg/ml streptomycin含有DMEM（Dulbecco's modified Eagle medium without sodium pyruvate: ナカライテスク，京都）培地〕にて継代培養を続けた。【００５９】
歯肉線維芽細胞及び尾部由来線維芽細胞について、４、７及び１０回の継代培養を行った後に、上記と同条件で４因子（Oct3/4，Sox，Klf4，c-Myc）を導入してiPS細胞への誘導を行った。iPS細胞に誘導されていることの確認は、ES細胞様形態の観察と共に、アルカリフォスファターゼ染色によって行った。iPS細胞への再プログラミング効率は、形質転換に供した細胞数に対するiPS細胞のコロニー数の割合（％）として算出した。【００６０】
得られた結果を図１５のＡに示す。図１５のＡの左の写真は、各細胞に対して４因子を導入してiPS細胞に誘導した後に、アルカリフォスファターゼ染色を行った結果を示す。また、図１５のＡの右の図は、４、７及び１０回の継代培養後の各細胞を用いてiPS細胞に誘導した場合の再プログラミング効率を示す。この結果から、尾部由来線維芽細胞では、７及び１０回の継代培養を行った後には、４因子を導入しても、殆どiPS細胞に誘導できなかったのに対して、歯肉線維芽細胞では、１０回の継代培養を行った後でも、４因子を導入すると、効率的にiPS細胞に誘導できることが確認された。【００６１】
また、歯肉線維芽細胞及び尾部由来線維芽細胞の増殖特性を比較するために、FP培地〔10%ウシ胎仔血清（Sigma, St. Louis, MO），50 units/ml penicillin，50 μg/ml streptomycin含有DMEM（Dulbecco's modified Eagle medium without sodium pyruvate: ナカライテスク，京都）培地〕100 μl/wellを添加した96wellプレートの各ウェルに、これらの細胞を2×103 個/wellとなるように添加し、37℃、5％CO2雰囲気で８日間培養を行い、2、6、8日目にWST-1細胞増殖測定用試薬（同仁化学研究所、熊本）により細胞数を計測した。この結果を図１５のＢに示す。この結果から、歯肉線維芽細胞は、尾部由来線維芽細胞に比して、有意に高い増殖能を示すことが判明した。【００６２】
更に、４、５、及び６回の継代培養を行った後の各細胞について、細胞増殖に寄与するテロメアの維持に必要なTert遺伝子の内在的発現をReal-time RT-PCRにて分析を行った。分析にはTaqMan プローブ及びプライマーを用いた（Mm00436931_m1：Applied Biosystems）。なお、内部コントロールとして、GAPDHを使用し（4352339E：Applied Biosystems）、４回の継代培養を行った尾部由来線維芽細胞における各遺伝子のmRNA発現量に対して、対応するTert遺伝子のmRNA発現量の相対値を求めた。結果を図１５のＣに示す。図１５のＣから明らかなように、歯肉線維芽細胞では６回の継代培養後でも、Tert mRNAの発現量が維持されていたが、尾部由来線維芽細胞では継代回数の増加と共に、Tert mRNAの発現量が低下していた。以上の遺伝子発現量の分析結果からも、歯肉線維芽細胞では、尾部由来線維芽細胞に比して、増殖能が優れていることが支持された。【００６３】
実施例２  ヒトiPS細胞の作製及び評価
以下に示す実験材料及び条件で、ヒト歯肉線維芽細胞からiPS細胞の誘導を行い、更に誘導されたiPS細胞の特性の評価を行った。【００６４】
＜ヒト歯肉線維芽細胞の分離培養＞
大阪大学歯学部の施設内倫理委員会によって承認されたプロトコールに従って、２４歳男性の歯科インプラント外科手術の際に摘出された健常なヒト歯肉組織片を得た（図１６のＡ参照）。このヒト歯肉組織片を細切した後、0.1%ゼラチンコート処理した組織培養プレート上に密着させて置き、FP培地〔10%ウシ胎仔血清（Sigma, St. Louis, MO），50 units/ml penicillin，50 μg/ml streptomycin含有DMEM（Dulbecco's modified Eagle medium without sodium pyruvate: ナカライテスク，京都）培地〕を組織片が覆われる程度に加えて5%CO2存在下、37℃で静置し、線維芽細胞と上皮細胞を増殖させた（図１６のＢ参照）。FP培地中では上皮細胞は分化して増殖が停止し剥離除去されるため、この培地を用いて継代培養を行うことにより、均質なヒト歯肉線維芽細胞を得た（図１６のＣ参照）。【００６５】
＜ヒト胚性幹（ES）細胞株、及びヒト皮膚線維芽細胞から誘導したiPS細胞＞
ヒト皮膚線維芽細胞、ヒト胚性幹（ES）細胞株（KhES-1、継代回数３５）、及びヒト皮膚線維芽細胞から樹立されたiPS細胞は、京都大学再生医科学研究所から供与された。ヒトES細胞は、日本国文部科学省が定めたヒトES細胞の利用に関するガイドラインに従って取り扱った。SNLフィーダー細胞は、Dr. Allan Bradley（Sanger Institute，London, UK）より供与されたものを用いた。【００６６】
＜レトロウイルス粒子製造＞
レトロウイルス感染による4因子導入を行うにあたり、予めヒト歯肉線維芽細胞及びヒト皮膚線維芽細胞にマウスSlc7a1発現用レンチウイルスベクター（pLenti6/UbC/mSlc7a1ベクター）を発現させた。これにあたり、先ず、4 x 106個の293FT細胞（Invitrogen社）を293FT培地〔10%ウシ胎仔血清（Sigma, St. Louis, MO），2mM L-glutamine（Invitrogen社），1x10-4 M non essential amino acids（Invitrogen社），1 mM sodium pyruvate（Sigma社），50 units/ml penicillin，50 μg/ml streptomycin（Invitrogen社）含有DMEM培地（Nacalai tesque社）〕にて10-cm培養プレートに播種した。翌日に3 μgのpLenti6/UbC/mSlc7a1ベクター（Addgeneより購入）を、Virapower Lentiviral expression system（Invitrogen社）あるいはLipofectamine2000（Invitrogen社）とOPTI-MEMI培地（Invitrogen）の混合溶液を用いて293FT細胞に導入した。遺伝子導入の24時間後に新しい293FT培地に交換し、さらに24時間後に培養上清を回収した。【００６７】
一方で、レンチウイルスの感染前日に8 x 105個のヒト歯肉線維芽細胞及びヒト皮膚線維芽細胞をFP培地にて10-cm培養プレートに播種した。回収したレンチウイルス粒子を含んだ培養上清にpolybrene（最終濃度4 μg/ml）を加えたものを、ヒト歯肉線維芽細胞及びヒト皮膚線維芽細胞の培地と交換して細胞をレンチウイルスに感染させ、37℃、5% CO2で一晩培養した。感染24時間後にFP培地に交換した後の各細胞を、次のレトロウイルスの感染に用いた。【００６８】
ヒトc-Myc遺伝子、Oct3/4遺伝子、Sox2遺伝子又はKlf4遺伝子（cDNA）を組み込んだレトロウイルスベクター（pMXs）はAddgene（Cambridge, MA）から購入した。ウイルス粒子の産生に用いるPlatinum-Eパッケージング細胞は、東京大学の北村俊雄教授より供与されたものを用いた。【００６９】
OPTI-MEMI培地（Invitrogen）とFuGENE 6試薬（Roche, Basel, Switzerland）の混合溶液に各プラスミドベクター（9 μg）を混合し、リポフェクション法によりPlatinum-E細胞に遺伝子導入した。48時間後に各ウイルス粒子を含んだ培養上清を回収し、歯肉線維芽細胞又は皮膚由来線維芽細胞のレトロウイルス感染（iPS細胞誘導）に用いた。【００７０】
＜iPS細胞誘導＞
レトロウイルス感染による形質導入24時間前に、歯肉線維芽細胞又はヒト皮膚線維芽細胞を、0.1%ゼラチンコート処理した10-mm培養プレートに8×105個播種し、FP培地〔10%ウシ胎仔血清（Sigma, St. Louis, MO），50 units/ml penicillin，50 μg/ml streptomycin含有DMEM（Dulbecco's modified Eagle medium without sodium pyruvate: ナカライテスク，京都）培地〕で培養した。4因子（c-Myc，Oct3/4，Sox，Klf4）を用いたiPS細胞誘導を実施した。iPS細胞誘導には、上記４因子の各ウイルス含有上清を最終的に等量になるよう混合した。この混合液にpolybrene（最終濃度4 μg/ml）を添加した溶液を各線維芽細胞の培地と置換し、5%CO2存在下，37℃で一晩培養した。翌日から5日間、毎日培養上清を吸引除去し、新しいFP培地と交換した。レトロウイルス感染６日後に、mitomycin C処理により増殖を不活性化して10-cm培養プレートに播種したSNLフィーダー細胞（1.5 x 106個）上に、各線維芽細胞を5×104個播種した。翌日、培地をPrimate ES培地（ReproCELL社）に置換し、以後二日に1回培地を新鮮なものに交換した。形質導入15〜26日後に出現したいくつかのES細胞様の形態のコロニーを選択して継代培養し、クローン化したコロニーの中で特にES細胞様の形態および増殖能を示すコロニー細胞株をiPS細胞株とした。【００７１】
斯くして４因子を導入したヒト歯肉線維芽細胞では、iPS細胞様のコロニーを形成した（図１６のＤ参照）。一方、この条件では、４因子を導入した皮膚線維芽細胞では、iPS細胞様のコロニーの形成を殆ど認めなかった。また、形質導入26日後にヒト歯肉線維芽細胞由来のiPS細胞様コロニーを機械的に剥がして継代培養することによって、５つのクローン株を得た（図１６のＥ及びＦ参照）。当該コロニーは増殖し、ヒトES細胞（図１６のＧ参照）及びヒト皮膚線維芽細胞から樹立されたiPS細胞（図１６のＨ参照）と同じ形態及び増殖特性を示した。また、ヒト歯肉線維芽細胞から誘導されたES細胞様コロニーは、ES細胞のマーカーとされるアルカリフォスファターゼの強い活性を有することも確認された（図１６のＩ参照）。【００７２】
以上の結果から、ヒト歯肉線維芽細胞はヒト皮膚線維芽細胞よりも、効率的にヒトiPS細胞を樹立できることが確認された。【００７３】
＜逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）解析＞
上記により得られた５つのiPS細胞クローン株（４因子をヒト歯肉線維芽細胞に導入して得られたiPS細胞）、ヒトES細胞、ヒト歯肉線維芽細胞又はiPS細胞の培養に使用したフィーダー細胞から得られた全RNAをRT-PCR解析に使用した。RT-PCR解析には、表３に示すプライマーを使用して、上記実施例１と同様の手法で行った。【００７４】
【表３】
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【００７５】
得られた結果を図１７に示す。この結果から、ヒト歯肉線維芽細胞から誘導したiPS細胞は、ES細胞に特異的なマーカー遺伝子（NANOG、内在性OCT3/4、内在性SOX2、REX1）を強く発現していることが確認され、自己増殖能と多分化能を獲得していることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
0005514215.tif 000020
【図１７】
0005514215.tif 000021
【配列表】
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