(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビボにおける血管運動反応に及ぼす化合物の効果を評価する非侵襲の方法であって、
ａ．ウサギの中心耳動脈（ＣＥＡ）の管内腔の基線直径を測定すること；
ｂ．該ウサギに該化合物を投与すること；
ｃ．該化合物の投与の後に該管の直径を前収縮させるために該ウサギの該ＣＥＡに血管収縮剤を投与すること；
ｄ．該血管収縮剤の投与の後に該前収縮された管の直径を増加させるために該ウサギの該ＣＥＡに血管拡張剤を投与すること；そして
ｅ．該ウサギの該ＣＥＡの該管内腔の直径を測定し、段階ａにおいて測定される該管内腔の基線直径と比較することによって、段階ｃおよびｄから得られる該管の直径に及ぼす該化合物の効果を決定すること；
の段階を含む、方法。
【請求項２】
該管内腔の直径が超音波画像システムによって測定される、請求項１の方法。
【請求項３】
該血管収縮剤が、ノルエピネフリン、エピネフリン、フェニレフリン、メトキサミン、メフェンテルミン、メタラミノール、ミドドリン、高用量ドーパミン、コカイン、アンフェタミンおよび関連作用物、セロトニン、バソプレッシンおよび関連類似体、アンギオテンシンＩＩおよび関連ペプチド、エンドテリンペプチド、ウロテンシンＩＩ、またはそれらの組み合わせ物から成る群から選択される、請求項１または２の方法。
【請求項４】
該血管拡張剤が、アセチルコリン、メタコリン、アセクリジン、アレコリン、ピロカルピン、セビメリン、ニトロプルッシド、ニトログリセリン、ニトロプルッシド、ニトログリセリン、一酸化窒素ガス、イソプロテレノールおよび関連β−２アドレナリン受容体アゴニスト、ヒドララジン、ミノキシジル、ジアゾキシド、ベラパミルおよび他のカルシウムチャンネルアンタゴニスト、カプトプリル、ロサルタン、クロニジン、ケタンセリン、ヒスタミン、ヘキサメトニウム、ブラジキニンおよび関連ペプチド、アドレノメヅリン、心房および脳ナトリウム排泄増加ペプチド、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、またはそれらの組み合わせ物から成る群から選択される、請求項１または２の方法。
【請求項５】
該血管拡張剤がコリン作動性アゴニストまたは血管拡張ペプチドである、請求項１または２の方法。
【請求項６】
該血管拡張剤が、アセチルコリン、メタコリン、アセクリジン、アレコリン、ピロカルピン、セビメリン、またはそれらの組み合わせ物から成る群から選択されるコリン作動性アゴニストである、請求項５の方法。
【請求項７】
該血管拡張剤が、ブラジキニンおよび関連ペプチド、アドレノメヅリン、心房および脳ナトリウム排泄増加ペプチド、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、またはそれらの組み合わせ物から成る群から選択されるコリン作動性アゴニストである、請求項５の方法。
【請求項８】
インビボにおける血管運動反応に及ぼす化合物の効果を評価する非侵襲の方法であって、
ａ．ウサギの中心耳動脈（ＣＥＡ）の管内腔の基線直径を測定すること；
ｂ．ウサギに該化合物を投与すること；
ｃ．該管の直径を前収縮させるために該ウサギの該ＣＥＡに血管収縮剤を投与すること；そして
ｄ．段階ａにおいて測定される該管内腔の基線直径と比較して該ウサギの該ＣＥＡの該管内腔の直径を測定することによって、段階ｃから得られる該管の直径に及ぼす該化合物の効果を決定すること；
の段階を含む、方法。
【請求項９】
該管内腔の直径が超音波画像システムによって測定される、請求項８の方法。
【請求項１０】
インビボにおける血管運動反応に及ぼす化合物の効果を評価する非侵襲の方法であって、
ａ．ウサギの中心耳動脈（ＣＥＡ）の管内腔の基線直径を測定すること；
ｂ．該ウサギに該化合物を投与すること；
ｃ．段階ａにおいて測定される該管内腔の基線直径と比較して該ウサギの該ＣＥＡの該管内腔の直径を測定することによって、段階ｂから得られる該管内腔の直径に及ぼす該化合物の効果を決定すること；
の段階を含む、方法。
【請求項１１】
該管内腔の直径が超音波画像システムによって測定される、請求項１０の方法。
【請求項１２】
内皮媒介の血管拡張を妨げる化合物を同定する非侵襲の方法であって、
ａ．ウサギの中心耳動脈（ＣＥＡ）の管内腔の基線直径を測定すること；
ｂ．試験される化合物を得ること；
ｃ．該ウサギに該化合物を投与すること；
ｃ．該化合物の投与の後に該管の直径を前収縮させるために該ウサギの該ＣＥＡに血管収縮剤を投与すること；
ｅ．該血管収縮剤の投与の後に該前収縮された管の直径を増加させるために該ウサギの該ＣＥＡに血管拡張剤を投与すること；そして
ｆ．段階ｄ及びｅの後に該ウサギの該ＣＥＡの管内腔の直径を測定すること；
ｇ．段階ｆの結果を段階ａの結果と比較して、該試験化合物が該血管収縮剤の活性への影響を有するか否かを決定すること；
ｈ．該化合物が内皮媒介の血管拡張を妨げるか否かを同定すること；
の段階を含む、方法。
【請求項１３】
該血管収縮剤が、ノルエピネフリン、エピネフリン、フェニレフリン、メトキサミン、メフェンテルミン、メタラミノール、ミドドリン、高用量ドーパミン、コカイン、アンフェタミン、セロトニン、バソプレッシン、アンギオテンシンＩＩ、エンドテリンペプチド、ウロテンシンＩＩ、またはそれらの組み合わせ物から成る群から選択される、請求項１２の方法。
【請求項１４】
該血管拡張剤が、アセチルコリン、メタコリン、アセクリジン、アレコリン、ピロカルピン、セビメリン、ニトロプルッシド、ニトログリセリン、ニトロプルッシド、ニトログリセリン、ヒドララジン、ミノキシジル、ジアゾキシド、ベラパミル、カルシウムチャンネルアンタゴニスト、カプトプリル、ロサルタン、クロニジン、ケタンセリン、ヒスタミン、ヘキサメトニウム、ブラジキニン、アドレノメヅリン、心房ナトリウム排泄増加ペプチド、脳ナトリウム排泄増加ペプチド、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、またはそれらの組み合わせ物から成る群から選択される、請求項１２の方法。
【請求項１５】
該血管拡張剤がコリン作動性アゴニストまたは血管拡張ペプチドである、請求項１２の方法。
【請求項１６】
該血管拡張剤が、アセチルコリン、メタコリン、アセクリジン、アレコリン、ピロカルピン、セビメリン、またはそれらの組み合わせ物から成る群から選択されるコリン作動性アゴニストである、請求項１５の方法。
【請求項１７】
該血管拡張剤が、ブラジキニン、アドレノメヅリン、心房ナトリウム排泄増加ペプチド、脳ナトリウム排泄増加ペプチド、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、またはそれらの組み合わせ物から成る群から選択されるコリン作動性アゴニストである、請求項１５の方法。
【請求項１８】
該血管収縮剤がノルエピネフリンである、請求項１２の方法。
【請求項１９】
該管内腔の直径が超音波画像システムによって測定される、請求項１２から１８の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対するクロス・リファレンス
本出願は、２００８年１０月２１日提出の米国暫定特許出願第６１／１０７，０５３号に対する利益を請求するものであり、この内容は完全に引用によって本明細書に組み入れられている。
【０００２】
方法は、インビボにおける血管収縮および血管拡張を非侵襲的に評価するために提供される。
【背景技術】
【０００３】
心臓、脳および腎臓の血管系は、広範囲の潅流圧力にわたり定常的血流を維持する−自己調節として知られる現象−ことができる。動脈圧、組織圧、神経性および体液性影響、組織代謝物、血管の筋原性緊張および内皮を含むいくつかの因子が、冠状および他の血管床における血流に影響を与える（非特許文献１）。血管における収縮性および拡張性刺激に対する適当な血管運動反応は、血流を調節するための重要な要素である。収縮性と拡張性刺激の間の平衡における乱れは、臓器の血流（例えば、虚血）および血圧変化をもたらす全末梢抵抗（例えば、高血圧）に影響を与えることができる。
【０００４】
正常な生理学的状態下では、血流に対する抵抗は多数の因子に反応して拡張する抵抗血管の能力によって克服できるであろう。しかしながら、アテローム性動脈硬化症、血栓症および内皮性傷害を含むいくつかの病理生理学的状態は、正常な血管拡張シグナルに反応して拡張する抵抗血管の能力に影響を与える。それに加えて、真性糖尿病、肥満症、うっ血性心不全および高血圧、ある種の自己免疫疾患およびある種の内分泌障害のような疾病は、抵抗血管の拡張に悪影響を及ぼす。
【０００５】
内因性因子、薬物および飲食物のような他の因子が、正常な動脈血管拡張を妨害することがある。例えば、メチオニンとその代謝副産物ホモセリンおよび脂質代謝異常は、多くの血管類において拡張プロセスを損なう（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。高い脂肪または食塩の摂取は異常な血管拡張を生じる（非特許文献６；非特許文献７）。可溶化したたばこ煙粒子ならびにニコチン代謝物もまた血管の弛緩を阻止することが分かっている（非特許文献８；非特許文献９）。褐色細胞腫においてしばしば見られる過剰な循環ノルエピネフリンのレベルは、血管拡張における異常をもたらす（非特許文献１０）。グルココルチコイド、コカイン、ある種の抗腫瘍薬、シクロスポリンＡ、ハロタンは、例えば、正常な動脈血管拡張に悪影響を及ぼすことが知られている（非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４）。
【０００６】
内皮が機能的に損なわれていない場合、血管はコリン作動性アゴニストまたはコリン様薬剤に対して拡張反応を現すという研究が示された（非特許文献１５；非特許文献１６）。血管拡張は、内皮細胞に及ぼすアセチルコリンおよび他のコリン様薬剤によるムスカリン性Ｍ３受容体の刺激と、それに続く、休止している血管緊張の顕著な決定因子である血管拡張剤一酸化窒素（ＮＯ）の遊離によっている（非特許文献１７；非特許文献１８）。内皮細胞が傷害または損傷されると、ムスカリン性受容体に刺激されるＮＯ生成が低下される。対立しない交感神経性アドレナリン性緊張の存在下で平滑筋細胞におけるムスカリン性受容体の刺激と組み合わされたＮＯ量の減少は、血管拡張反応の喪失をもたらすだけでなく、血管における血管収縮を潜在的に起こすことができる。したがって、コリン作動性アゴニストによって刺激される血管拡張は、機能的に無傷な内皮に依存している。
【０００７】
ヒトとウサギの間の血管の形態学的類似性により、ウサギは薬物に対する血管運動反応を測定するための研究モデルとして使用されてきた。Ｌａｈｅｒらは、α−トキシンが内皮媒介の血管拡張を選択的に損なうことを例証するためにウサギの腎臓または耳から単離された血管を使用した（非特許文献１６）。近年、Ｄｒｏｌｅｔら（非特許文献１９）は、腹大動脈の超音波記録を使用して、腹大動脈の直径がアセチルコリンに反応して１〜４％変化することを示した。これらの方法は、インビボにおいて正常に存在する適当な生理学的環境を与えていないか、あるいはインビボにおける血管運動反応を効率的に検査するために十分な動的範囲または感受性を欠いているかいずれかである。したがって、インビボにおける血管運動反応を測定するために効率的かつ感受性の高い方法を開発する必要が今なお存在する。
【０００８】
本出願は、血管運動反応に及ぼす試験化合物の効果を評価する方法を提供する。さらに、方法は、ノルエピネフリンのような収縮性作用物、アセチルコリンのような拡張性作用物、または内皮性信号伝達を増大または妨害する他の作用物に対する全身性曝露、およびウサギの中心耳動脈の内腔を測定することからなる血管運動機能に及ぼす内皮性効果を評価するために提供される。本出願の動脈血管運動機能の動物モデルは、インビボにおける基礎的血管緊張および内皮依存性血管運動機能に及ぼす試験化合物の効果を評価するために有用である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】総説、Ｋｏｎｉｄａｌａ  ａｎｄ  Ｇｕｔｔｅｒｍａｎ，２００４，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ４６：３４９−３７３
【非特許文献２】Ｄａｙａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１２：７３７−７４４
【非特許文献３】Ｄｉｓｔｒｕｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ４７：６５９−６６７
【非特許文献４】Ｈａｎｓｒａｎｉ  ａｎｄ  Ｓｔａｎｓｂｙ，２００８，Ｊｏｕｎａｌ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １４５：１３−１８
【非特許文献５】Ｍｏａｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ３６：８５０−８５９
【非特許文献６】Ｈｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０８：２３０８−２３１１
【非特許文献７】Ｍａｈｍｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  １５２：５５７−５６２
【非特許文献８】Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，ＢＭＣ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ６：３
【非特許文献９】Ｃｏｎｋｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊｏｕｎａｌ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９５：２３−３１
【非特許文献１０】Ｈａｇａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ３９：５１３−５１８
【非特許文献１１】Ｔｏｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １２３：４３−５０
【非特許文献１２】Ｅｌ−Ｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ７３：３５９−３６７
【非特許文献１３】Ｃｈｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２４：９２５−９２８
【非特許文献１４】Ｍｏｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ３３：１０２９−１０３４
【非特許文献１５】Ｓｕｇａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊａｐａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ  ４３：５４５−５５８
【非特許文献１６】Ｌａｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ７３：１６６９−１６７３
【非特許文献１７】Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｔａｙｌｏｒ，２００１，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｈａｒｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ  ａｎｄ  Ｌｉｍｂｉｒｄ，１０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｐ  １５５−１７３
【非特許文献１８】Ｍｏｏｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｈａｒｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ  ａｎｄ  Ｌｉｍｂｉｒｄ，１０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｐ  ３８５−３９７
【非特許文献１９】Ｄｒｏｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  ２：１０
【発明の概要】
【００１０】
本発明の目的は、ウサギに化合物を投与し、そしてウサギの中心耳動脈の管内腔の基線直径と比較してウサギの中心耳動脈の管内腔の直径を測定する段階を含む、インビボにおける血管運動反応に及ぼす化合物の効果を評価する方法を提供することである。化合物は血管拡張剤または血管収縮剤であってもよい。
【００１１】
本発明のその他の目的は、ウサギの中心耳動脈の管内腔の基線直径を測定し、ウサギに化合物を投与し、次いで管の直径を前収縮させるために血管収縮剤を投与し、続いて前収縮された管の直径を増加するためにウサギに血管拡張剤を投与し、そしてウサギの中心耳動脈の管内腔の直径を再び測定することによって血管拡張剤に対する反応において前収縮された管の基線直径での変化に及ぼす化合物の効果を決定する段階を含む、インビボにおける血管運動反応に及ぼす化合物の効果を評価する方法を提供することである。
【００１２】
本発明のその他の目的は、ウサギに化合物を投与し、ウサギの中心耳動脈の管内腔の基線直径を測定し、次いで管の直径を収縮させるためにウサギの中心耳動脈に血管収縮剤を投与し、そしてウサギの中心耳動脈の管内腔の基線直径を再び測定することによって収縮された管の直径に及ぼす化合物の効果を決定する段階を含む、インビボにおける血管運動反応に及ぼす化合物の効果を評価する方法を提供することである。
【００１３】
本発明のその他の目的は、ウサギに化合物を投与し、ウサギの中心耳動脈の管内腔の基線直径を測定し、そしてウサギの中心耳動脈の管内腔の基線直径を再び測定することによって収縮された管の直径に及ぼす化合物の効果を決定する段階を含む、インビボにおける血管運動反応に及ぼす化合物の効果を評価する方法を提供することである。
【００１４】
本発明によれば、化合物は、経口的、末梢的、非経口的または局所的にウサギに投与されてもよく、そして該管内腔の直径は超音波画像システムによって測定されてもよい。
【００１５】
本発明の他の目的および特徴は、付随する図面と一緒に考慮される次の詳細な記述から明らかになるであろう。しかしながら、図面は具体的な説明の目的のためにのみ企画されたものであり、本発明の範囲の定義として企画されたものではなく、これのための言及は添付される請求項についてなされるべきであることが理解されねばならない。図面は必ずしも一定の比率で描かれたものではなく、そして別に指示されない限り、それらは、単に本明細者に記述される構造および方法を概念的に具体的に説明するものであることを、さらに理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】（Ａ）ウサギにおいてノルエピネフリンで前収縮された動脈におけるアセチルコリン誘導の血管拡張において中心耳動脈内腔直径に及ぼすＬ−ＮＡＭＥの効果。データは最終平均直径±ＳＥＭとして示される。Ｎ＝６血管。（Ｂ）ウサギにおいてノルエピネフリンで前収縮された動脈におけるアセチルコリン誘導の血管拡張において中心耳動脈内腔面積に及ぼすＬ−ＮＡＭＥの効果。データは最終平均面積±ＳＥＭとして示される。Ｎ＝６。
【図２】（Ａ）ウサギにおいてノルエピネフリンで前収縮された動脈におけるアセチルコリン誘導の血管拡張において中心耳動脈内腔直径に及ぼす化合物２の効果。データは最終平均直径±ＳＥＭとして示される。Ｎ＝６。（Ｂ）ウサギにおいてノルエピネフリンで前収縮された動脈におけるアセチルコリン誘導の血管拡張において中心耳動脈内腔面積に及ぼす化合物２の効果。データは最終平均面積±ＳＥＭとして示される。Ｎ＝６。
【図３】（Ａ）ウサギにおいてノルエピネフリンで前収縮された動脈におけるアセチルコリン誘導の血管拡張において中心耳動脈内腔直径に及ぼすトルセトラピブ（ｔｏｒｃｅｔｒａｐｉｂ）の効果。データは最終平均直径±ＳＥＭとして示される。Ｎ＝６。（Ｂ）ウサギにおいてノルエピネフリンで前収縮された動脈におけるアセチルコリン誘導の血管拡張において中心耳動脈内腔面積に及ぼすトルセトラピブの効果。データは最終平均面積±ＳＥＭとして示される。Ｎ＝６。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
一酸化窒素によって正常に媒介される内皮依存性血管拡張を含む血管運動反応における異常は、血管疾患（ＣＡＤ、高血圧など）において大きな役割を演じると考えられ、そして心臓血管リスクの増大に関連しているであろう。正常な血管拡張メカニズムを損なう薬物は、悪い心臓血管事象に対するリスクを増大するかもしれない。臨床研究は、トルセトラピブ、コレステリルエステル転移タンパク質（ＣＥＴＰ）インヒビターを受けている患者では比較的高い収縮期血圧を示す（Ｂａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５７：２１０９−２１２２）。これは、正常な血管拡張刺激に対する血管運動反応に及ぼすトルセトラピブの影響によるのかもしれない。ＣＥＴＰインヒビターはコレステロール代謝を調節するための潜在的薬物であるので、トルセトラピブおよび化合物２を含むＣＥＴＰインヒビターを、血管運動反応に及ぼすそれらの効果に関して試験することは有用である。トルセトラピブ、（２Ｒ，４Ｓ）−４−［［３，５−ビス（トリフルオロメチル）ベンジル］（メトキシカルボニル）アミノ］−２−エチル−６−（トリフルオロメチル）−３，４−ジヒドロキノリン−１（２Ｈ）−カルボン酸エチルは、次の化学構造：
【化１】
0005400163.tif 000002
を有する。
【００１８】
化合物２、１，１，１−トリフルオロ−３−［２−｛３−［（１，１，２，２−テトラフルオロエチル）オキシ］フェニル｝−５−｛３−［（トリフルオロメチル）オキシ］フェニル｝−３，４−ジヒドロキノリン−１（２Ｈ）−イル］プロパン−２−オールは、次の構造：
【化２】
0005400163.tif 000003
を有する。
【００１９】
本出願では、方法はインビボにおける血管運動反応を評価するために提供される。さらに、方法はインビボにおける血管運動反応に及ぼす薬物または試験化合物の効果を評価するために提供される。内皮によって媒介される血管運動反応に及ぼす試験化合物の効果は、また、ノルエピネフリンにより前収縮されたウサギの中心耳動脈（ＣＥＡ）においてコリン作動性アゴニストを用いて血管拡張を誘導することによって評価することもできる。試験化合物は、拡張または収縮作用物であってもよく、あるいは血管運動緊張または血管直径に及ぼす直接効果をもたなくてもよく、そしてトルセトラピブおよび化合物２を含んでもよい。
【００２０】
本明細書で使用されるような用語「拡張（性）作用物（ｄｉｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔ）」、「拡張（性）薬物（ｄｉｌａｔｏｒｙ  ｄｒｕｇ）」、「血管拡張剤（ｖａｓｏｄｉｌａｔｏｒ）」またはそれらの変異体は、抵抗血管の直径を増大することができるすべての分子を意味する。例を挙げれば、拡張性作用物または薬物は、必ずしも限定されるものではないが、次の化合物：アセチルコリン、メタコリン、アセクリジン、アレコリン、ピロカルピン、セビメリンのようなコリン作動性アゴニスト、硝酸化合物（例えば、ニトロプルッシド、ニトログリセリン）、一酸化窒素ガス、イソプロテレノールおよび関連β−２アドレナリン受容体アゴニスト、ヒドララジン、ミノキシジル、ジアゾキシド、および他のカリウムチャンネル開口薬、ベラパミルおよび他のカルシウムチャンネルアンタゴニスト、カプトプリルのようなアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、ロサルタンのようなアンギオテンシン受容体アンタゴニスト、クロニジンおよびその他を含むα−２アドレナリン受容体アンタゴニスト、ケタンセリンを含むセロトニンアンタゴニスト、ヒスタミン、ヘキサメトニウムのような神経節遮断薬物、エンドセリン受容体アンタゴニスト、バソプレッシンアンタゴニスト、ホスホジエステラーゼ阻害剤、ブラジキニンおよび関連ペプチド、アドレノメヅリン、心房および脳ナトリウム排泄増加ペプチド、カルシトニン遺伝子関連ペプチドのような血管拡張ペプチド、およびそれに類するものを含む。
【００２１】
本明細書で使用されるような用語「収縮（性）作用物（ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）」、「収縮（性）薬物（ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｖｅ  ｄｒｕｇ）」、「血管収縮剤（ｖａｓｏｃｏｎｓｔｒｉｃｔｏｒ）」またはそれらの変異体は、抵抗血管の直径を減少することができるすべての分子を意味する。例を挙げれば、収縮作用物は、必ずしも限定されるものではないが、次の化合物：ノルエピネフリン、エピネフリン、フェニレフリン、メトキサミン、メフェンテルミン、メタラミノール、ミドドリン、高用量ドーパミン、コカイン、アンフェタミンおよび関連作用物、セロトニン、バソプレッシンおよび関連類似体、アンギオテンシンＩＩおよび関連ペプチド、エンドテリンペプチド、ウロテンシンＩＩ、およびそれに類するものを含む。
【００２２】
インビボにおいて血管拡張剤または血管収縮剤の存在下で血管運動反応を試験するために、ウサギ耳の中心動脈がこれらの作用物に曝露された。ＣＥＡ、抵抗血管は、血管拡張剤または血管収縮剤に反応して管内腔の直径で大きな変化を受け得ることが、本明細書において見い出される。このことは、これらの作用物への反応において管内腔の直径では最小の変化を受ける大動脈または他の弾力性動脈の使用とは反する。
【００２３】
ウサギ６羽の一群が、筋肉内に投与されたケタミン（５０ｍｇ／ｋｇ）／キシラジン（１００ｍｇ／ｋｇ）の混合液により麻酔され、そして体温を維持するために加温パッド上に置かれた。ウサギの耳翼が剃られ、そして店頭の脱毛剤を用いて脱毛された。右耳のＣＥＡを覆う背面の約２ｃｍの部分が加温された超音波ゲルを塗られた。ウサギのＣＥＡの基線直径と面積は２３．５ＭＨｚ超音波プローブ（モデルＲＭＶ  ７０８）を使用して評価された。画像はＶｉｓｕａｌｓｏｎｉｃｓ  Ｖｅｖｏ  ６００システムに記録され、ここで、続いてＣＥＡ内腔の直径および面積が測定された。血管内腔の直径および面積が平均値および平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として表された。ノルエピネフリンおよびアセチルコリンが、注入ポンプに連結された２７−ゲージ翼状針注入セットを通して反対側の左耳静脈中に注入された。画像は注入期間中約５分間隔で得られた。
【００２４】
アセチルコリン誘導の血管拡張がＮＯ依存性であることを確認するために、ウサギ６羽の第２群が、連続５日間、ＴａｎｇＴＭで着香された飲料水中に混合された一酸化窒素合成酵素阻害剤Ｌ−ＮＡＭＥ（４００μｇ／ｍｌ）（Ｎ＝３）またはＴａｎｇＴＭで着香された飲料水のみ（Ｎ＝３）のいずれかを投与された。Ｌ−ＮＡＭＥ、Ｎ（Ｇ）−ニトロ−Ｌ−アルギニン−メチルエステルは、正常な一酸化窒素依存性血管拡張をブロックするアルギニン誘導体である。次いで、ウサギのＣＥＡが６日目に画像撮影された。ウサギは約１週間回復させられ、次いで、交差方式で、各群３羽が５日間反対の処置を与えられ、次いで６日目に画像撮影された。
【００２５】
その他の群では、６羽の成熟Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ雄ウサギ（２．５−３．５ｋｇ）が、１週目の間、連続４日間Ｉｍｗｉｔｏｒ／Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ／水・溶媒を経口的（フィーディングチューブによる摂食）に投与された。その溶媒（１０％Ｉｍｗｉｔｏｒ、２０％Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＲＨ４０および７０％水、薄い乳状化合物溶液）は、１日当たり３ｍｌ／ｋｇの総容量で与えられた。４日目に、溶媒または薬物を経口投与３時間後、ウサギは麻酔され、そして上記のようにＣＥＡ血管内腔に及ぼす溶媒の影響について測定された。第１週後、ウサギは３日間回復させられ、次いで、第２週の間は連続４日間、トルセトラピブまたは化合物２のような試験化合物を約３０ｍｇ／ｋｇにおいて経口投与された。２週目の第４日に、試験化合物への反応におけるウサギＣＥＡの直径変化が、前記のようにノルエピネフリンとそれに続くアセチルコリンの注入により調査された。ウサギは、再び、薬物消失を考慮するためにさらに１週間回復させられ、次いで、毎日、溶媒投与され、そして試験化合物への反応におけるＣＥＡの直径変化が前記のように評価された。
【００２６】
試験化合物は経口的、末梢的、非経口的または局所的のいずれで投与されてもよい。試験化合物の各投与量および処置の期間は、試験化合物の効力または性質に応じて変わってもよく、これは当業者によって容易に決定できる。
【００２７】
本ウサギＣＥＡモデルは、ノルエピネフリン誘導の前収縮に関しては、血管収縮を誘導するノルエピネフリンおよび血管拡張を誘導するアセチルコリンに対して感受性であることが示される。また、アセチルコリンの効果は、Ｌ−ＮＡＭＥ前処置を受けている群においてはアセチルコリン注入に反応する血管拡張の欠如によって示されるように、一酸化窒素依存性であることが示される。トルセトラピブの毎日の投与は、溶媒処置に較べて、基礎の血管収縮剤緊張における増大をもたらし、そしてアセチルコリン誘導の血管拡張を無
効にする。化合物２は基礎血管緊張またはアセチルコリン誘導の血管拡張に及ぼす効果を有しない。
【００２８】
当業者は、本明細書に記述された方法に対する他の適当な変異物または修飾物を知ることができ、そして本出願によるウサギＣＥＡの使用のためにそのような方法を適合させることができるであろう。例えば、病状をもつウサギのＣＥＡは、病的状況下での血管運動反応に及ぼす試験化合物の効果を評価するために使用されてもよい。病状をもつウサギの血管は、異常な基線血管運動緊張を現すことがあり、そして／または病気により収縮性または拡張性刺激に対して異常に反応することもある。このことは、ある病的状況下で内皮によって媒介される血管運動反応の理解を容易にするであろう。さらに、病状をもつウサギのＣＥＡは血管拡張剤または血管収縮剤によって前処置される必要がないかもしれない。血管運動反応に及ぼす試験化合物の効果は、ＣＥＡ管内腔の基線直径または面積に及ぼす化合物の効果を調査することによって評価されるかもしれない。これは、病的血管を直接収縮または拡張することができる薬物または化合物を同定するのに有用であり、そして血管に及ぼす疾病の病理生理学的影響を理解するにも、あるいは疾病の血管への影響を処置するのにも有用である。さらに、正常および病的ウサギのＣＥＡは、試験化合物の効果を理解するために並行させて（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄ）比較する目的に使用されてもよい。
【実施例１】
【００２９】
アセチルコリンおよびノルエピネフリンによって誘導される血管運動反応の評価
ＣＥＡの一連の５画像（約５分間隔）が撮られ、そしてそれぞれ基線内腔の直径（ｍｍ）および面積（ｍｍ２）の測定のために使用された。アドレナリン作動アゴニスト・ノルエピネフリンが１分当り約２８μｇで徐々に注入され、かつその手順の間維持された。アセチルコリンの注入は、ノルエピネフリンの注入と一緒に、約１０，１７，３０および５６μｇ／分での段階的拡大用量において各１５分間投与された。画像は各１５分の注入期間の間数回収集された。最終のアセチルコリンおよび同時ノルエピネフリンの注入期間後、全注入は終了され、そして血管はそのままその最初のサイズに戻された。血液約２ｍｌが、最後の測定後直ちに、画像撮影されなかった反対側のＣＥＡからサンプリングされた。全サンプルはＥＤＴＡを含有するチューブ中に収集され、そして約１０，０００ｒｐｍにおいて６分間遠心分離された。血漿は、試験された化合物の濃度について分析されるまで−８０℃で保存された。さらに、血液が標準薬物濃度曲線の作成のために無処置のウサギから採取された。
【００３０】
拡張作用物、収縮作用物または試験化合物のいずれの処置も受けない麻酔ウサギでは、基線ＣＥＡ内腔の直径および面積は、それぞれ、約０．８−０．９ｍｍおよび約０．６−０．７ｍｍ２であることが分かった。基線ＣＥＡ内腔直径は静脈内生理食塩水の注入によって影響を受けなかった。本明細書で使用されるように、熟語、基線ＣＥＡ内腔直径および面積またはその変異物は、いずれかの化合物の投与前のＣＥＡ内腔の血管口径の最初の測定値を指す。
【００３１】
アセチルコリン注入のみを受けた群では、基線ＣＥＡの直径および面積は、５６μｇ／分までの用量において麻酔されたウサギでの変化はなかった。このことは、アセチルコリンが既に拡張された内腔には効果をもたないことを示した。
【００３２】
ノルエピネフリンを注入された群では、ＣＥＡ内腔直径および面積は、それぞれ、約０．５ｍｍおよび約０．２ｍｍ２まで減少された。前収縮されたＣＥＡを有するウサギにおける続くアセチルコリンの注入は、血管内腔を基線直径および面積まで回復させた。これらの結果は、ウサギのＣＥＡモデルが基線の直径または内腔面積のそれぞれ約４４または７０％の範囲における血管運動変化の評価を提供することを示した。
【００３３】
これらの反応が一酸化窒素によって媒介されたか否かを試験するために、一酸化窒素合成酵素阻害剤、Ｌ−ＮＡＭＥが、アセチルコリンおよびノルエピネフリンにより処置されるウサギに対して飲料水（４００μｇ／ｍｌ）において投与された。実施例１の結果は、ノルエピネフリンで前収縮されたＣＥＡにおけるアセチルコリン誘導の血管拡張が用量依存性であり、かつＬ−ＮＡＭＥによる処置がこのアセチルコリン誘導の血管拡張を阻害することを示している（図１Ａおよび１Ｂ）。このことは、前収縮されたＣＥＡの血管拡張反応が、ＮＯによって媒介され、かつウサギＣＥＡがインビボにおける内皮性機能を模することを示す。
【実施例２】
【００３４】
血管拡張反応に及ぼす試験化合物の効果の評価
血管運動緊張に及ぼすトルセトラピブおよび化合物２の効果が、ウサギに溶媒を４日間経口投与し、続いてこれらの化合物を経口投与することによって試験された。処置されたウサギのＣＥＡ管内腔は前記のように測定された。
【００３５】
約３０ｍｇ／ｋｇの経口用量で４日間、化合物２で処置されたウサギでは、処置されたウサギにおける基線ＣＥＡ内腔直径および面積は、溶媒のそれらに類似していた（図２ＡおよびＢ）。図２において示されるように、溶媒は、ノルエピネフリン前収縮されたＣＥＡ内腔の直径および面積においてアセチルコリン誘導の血管拡張には効果をもたなかった。ノルエピネフリンおよびアセチルコリンを投与した後、化合物２で処置されたウサギのＣＥＡ内腔直径および面積は、溶媒群におけるそれらに類似して、それぞれ、約０．８ｍｍおよび約０．６ｍｍ２であった（図２Ａおよび２Ｂ）。最後の経口投与４時間後、血液サンプルが収集されてウサギにおける化合物２の濃度を決定した。化合物２により処置されたウサギの血漿濃度は最後の投与後４時間には２．５８±０．６７μＭである。このことは、化合物２が、血漿中にそれが豊富にあるにも拘らず、基線ＣＥＡ内腔の直径および面積、またはノルエピネフリンで前収縮されたＣＥＡ管内腔および面積におけるアセチルコリン誘導の血管拡張には影響しないことを示している。
【００３６】
ノルエピネフリンまたはアセチルコリンを投与する前４日間、トルセトラピブを約３０ｍｇ／ｋｇの経口用量で投与されたウサギでは、基線ＣＥＡ内腔直径は、溶媒群における０．８５ｍｍに比較して約０．５５ｍｍまで減少され、そして基線ＣＥＡ内腔面積は、溶媒群における０．６５ｍｍ２に比較して約０．３ｍｍ２まで減少された（図３Ａおよび３Ｂ）。ノルエピネフリン投与後、ＣＥＡ管内腔の直径および面積によって測定されるようなトルセトラピブ処置されたウサギにおけるアセチルコリン誘導の血管拡張反応は、溶媒群における０．８ｍｍに比較して約０．４５ｍｍまで減少された（ＣＥＡ内腔面積における対応する変化は、溶媒群における０．６ｍｍ２に比較して約０．２ｍｍ２であった）。トルセトラピブにより処置されたウサギの血漿濃度は最終用量後４時間には約１．０１±０．５４μＭであった。このことは、トルセトラピブが測定可能な基線血管収縮を惹起し、かつ化合物２より低い血漿中のそのレベルによって、ノルエピネフリンで前収縮されたＣＥＡ管内腔におけるアセチルコリン誘導の血管拡張を阻害することを示している。
【００３７】
実施例２では、その結果は、４日間のトルセトラピブ（３０ｍｇ／ｋｇ）１日１回経口投与が、溶媒処置した対照と比較した場合、基線血管収縮を生じ、かつ麻酔ウサギのノルエピネフリン前収縮された中心耳動脈のアセチルコリン誘導性拡張の阻害を起こしたことを示す。同じ投与計画により同じ用量で経口的に投与された化合物２は、基線血管収縮を生じず、かつノルエピネフリン前収縮に続くアセチルコリン誘導性血管拡張を生じない。いずれかの化合物の最終用量４時間後にサンプリングされた血漿レベルは、各薬物がマイクロモル濃度で存在することを示し、かつ化合物２の血漿濃度がトルセトラピブのそれを約２．５倍上回ったことを示している。これらの２種の化合物の異なる反応は、あらゆる
ＣＥＰＴインヒビターが必ずしも基線および内皮依存の血管運動反応を妨害しないことを示した。
【００３８】
かくして、本発明の好適な実施態様に応用されるような本発明の基本的新規特徴が示され、記述され、そして指摘されたけれども、具体的に説明されるデバイスの形態および詳細部分における、またそれらの操作における種々の省略および置換および変化が、本発明の精神から逸脱することなく当業者によって作成されてもよいことは理解されるであろう。例えば、同じ結果を達成するために本質的に同じ方法で本質的に同じ機能を実施するそれらの要素のすべての組み合わせおよび／または方法段階は、本発明の範囲内に存在する。さらに、本発明のすべての開示された形態または実施態様とともに示され、そして／または記述される構造物および／または要素および／または方法段階は、設計選択の一般問題としてすべての他の開示または記述または示唆された形態または実施態様に組み入れられてもよいことを認識すべきである。したがって、本明細書に添付される請求項の範囲によって示されるようにのみ限定されることが強調される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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