(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）少なくとも１つの表面を有する、架橋したゼラチンスポンジを提供する工程と、
ｂ）前記スポンジの前記少なくとも１つの表面に、タンパク質又はペプチド活性成分を含む液体を均一に適用する工程であって、前記スポンジの前記表面に取り込まれる前記液体の体積が、ａ）の前記スポンジの体積の５％以下である、工程と、
ｃ）前記スポンジを乾燥させる工程と、
を含み、
前記乾燥工程は、真空炉によって実行され、これによって、前記スポンジの少なくとも１つの表面上にタンパク質又はペプチド活性成分の安定な層を含む、可撓性の、乾燥した、架橋したゼラチンスポンジを得て、
前記乾燥したスポンジは、ａ）の前記スポンジの厚さの少なくとも７５％が維持される、
タンパク質又はペプチド活性成分を含む、架橋したゼラチンスポンジを製造するための方法。
【請求項２】
前記液体適用工程が、単一工程で実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記液体中にイプシロンアミノカプロン酸が存在しない、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記液体適用工程が、ローラーを使用して実行される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記液体適用工程が、
ａ）外部表面を有する回転ローラーを提供する工程であって、前記外部表面の少なくとも一部が前記液体を含むリザーバと接触する、工程と、
ｂ）前記ローラーを回転させて、前記液体で前記外部表面を被覆する工程と、
ｃ）前記ローラーの前記外部表面を、前記スポンジの前記少なくとも１つの表面と接触させる工程と、
ｄ）前記ローラーの前記外部表面と、前記スポンジの前記少なくとも１つの表面とを互いに移動させ、
これによって前記液体を前記スポンジの前記少なくとも１つの表面に付着させる工程と、を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記外部表面が、前記液体を保持することができる、複数の中空空間を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記液体適用工程が、液体ディスペンサを使用して実行される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記液体適用工程が、ＰｉｐｅＪｅｔ（商標）技術の使用によって実行される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記層の厚さが、前記乾燥工程の後の、前記スポンジの全体厚さの２４％以下である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記活性成分がトロンビンを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記液体中の前記トロンビンの活性が、２〜１５，０００ＩＵ／ｍＬの範囲である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法によって製造された、架橋したゼラチンスポンジ。
【請求項１３】
前記層中に湿潤剤が存在しない、請求項１２に記載のスポンジ。
【請求項１４】
前記活性成分がトロンビンを含む、請求項１２又は１３に記載のスポンジ。
【請求項１５】
前記トロンビンの活性は、１〜３００ＩＵ／ｃｍ２の範囲である、請求項１４に記載のスポンジ。
【請求項１６】
外科手術で使用するための、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載のスポンジ。
【請求項１７】
血液凝固を促進するための、請求項１６に記載のスポンジ。
【請求項１８】
請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の、無菌の架橋したゼラチンスポンジを含む、パッケージ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性成分の層を含む、改善された、乾燥した、可撓性の、架橋したゼラチンスポンジ、及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
比較的大きな表面からの急速な失血は、縫合又は他の結紮手段で抑えることができないため、抑えることが特に困難である。創傷部位又は出血部位における、急速な血液の凝固及び止血をもたらすための、迅速かつ有効な組成物を提供する、止血スポンジを開発するための試みが成されてきた。１つのこのような止血スポンジ組成物は、吸収性ゼラチンスポンジである。ゼラチンスポンジのスポンジ状物理特性は、血餅の形成を促進し、血餅形成のための構造的支持を提供する。
【０００３】
ゼラチンスポンジは、ゼラチンの溶液を泡立て、その泡を（通常は凍結乾燥により）乾燥させることによって作製される。中性の水溶液中で本来不溶であるコラーゲンとは異なり、ゼラチンは３０℃超、特に３７℃の温度、生理学的温度で可溶性である。この特性は、スポンジが素早く溶解し、その構造的一体性及び多孔性構造を喪失するため、スポンジを生体内での使用に不適なものにする。ゼラチンはしたがって、血液中におけるその迅速な溶解を防ぐために、架橋されなければならない。架橋の方法は、化学架橋剤、例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、及びカルボジイミド（carbadiimides）（例えば、ＥＤＣ）でのスポンジの処理を含み、又は乾熱（１００〜１６０℃で数時間）での乾燥スポンジの処理による。
【０００４】
その作用様式は完全に理解されていないが、現在その効果は、ゼラチンスポンジの、自重の何倍もの重量の血液及び他の流体を、その隙間内に吸収及び保持する能力に関連するらしいと考えられている。捕捉された血小板は、スポンジと相互作用して活性化され、止血栓の形成、及び出血の停止を生じる。この止血栓は、損傷の後に身体内に通常形成される自然の血栓と似ている。活性化された血小板はまた、凝固カスケードを開始し、これは、可溶性フィブリノゲンを、トロンビンの作用によって、不溶性フィブリンのネットへと転換することで終結する。Ｃａ２＋の存在下で、トロンビンによって活性化される第ＸＩＩＩ因子は、血餅のフィブリンモノマーを架橋及び安定化する。
【０００５】
ＧＥＬＦＯＡＭ（登録商標）及びＳＵＲＧＩＦＯＡＭ（登録商標）は、乾燥状態で、又は無菌生理食塩水若しくはトロンビンで湿った状態で、創傷部位に直接適用されて、出血の制御を獲得する、止血装置の例である。ゼラチンの自然の止血特性を向上させるために、ゼラチンスポンジ、トロンビン及びＣａ２＋の止血特性を組み合わせる製品又はキットが開発及び製造されてきた。例えば、外科手術において、ゼラチンスポンジがそのパッケージから取り出され、希釈されたトロンビン溶液に液浸され、空気が全て排除されるまで激しく揉まれることが慣例である。この工程に続いて、トロンビン溶液への２回目の浸漬、及び湿ったスポンジの、出血している器官への弱い圧力での適用が行われる。しかしながら、スポンジの浸漬は、濃縮されたトロンビン溶液の融解、及び事前希釈を含む、時間のかかる煩雑な手順を必要とする。各準備工程は、潜在的な過失を引き起こし、これは無菌調製を難しくし、スポンジの有効性を変化させることがある。更に、複雑な手順は、訓練を受けた緊急要員による、スポンジの管理を必要とする。この技術における別の主要な欠点は、スポンジの隙間を充填するために大量の液体が必要とされ、結果的にスポンジと創傷部位との間の境界面においてトロンビン及びＣａ２＋の低い濃度を生じることである。結果として、スポンジは、止血の提供及び維持において無効である。この問題を克服するために、外科医は、多くの場合、高濃度のトロンビンの使用に頼り、これは、局部的な血栓事象に繋がることがある。
【０００６】
以下の特許出願公開は、架橋したゼラチンスポンジの活性成分溶液でのコーティング、及びスポンジの乾燥を開示する。
【０００７】
米国特許第５，６４３，５９６号及び国際公開特許ＷＯ９５１２３７１号は、吸収性ゼラチンスポンジなどのマトリックス、及びマトリックスの一方の側のみの、有効量のイプシロンアミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）を含む、止血パッチを開示する。これらの記載によると、マトリックスは、ＥＡＣＡを加える前及び後に、トロンビン溶液でコーティングされ得る。ＥＡＣＡは、粉末を噴霧するか、マトリックスに溶液をコーティングするか、又は、完全に若しくは部分的に液浸することによって適用され得る。濡れたスポンジの乾燥は、好ましくは凍結乾燥によって達成される。この特許出願は、パッチにおけるＥＡＣＡの重要性を強調し、ＥＡＣＡを有さない生分解性マトリックスについては触れていない。
【０００８】
国際公開特許ＷＯ９０１３３２０号は、生物学的に吸収性の多孔性構造、変性ゼラチンスポンジなどの固体物質、トロンビン、及び１つ以上のトロンビン安定化剤を含む、止血スポンジに関する。止血スポンジは、トロンビンの水溶液を、複数の部位での注入によって、スポンジ内に導入することによって調製される。注入は、注入された液体が、スポンジ材料の表面に漏出する結果を生じないように実行される。スポンジは次に、水分含量を５０％未満に低減させるために十分な期間、３０〜１００℃の温度で風乾される。この記載によると、トロンビン溶液の注入は、スポンジの構造的変形を生じ得る。
【０００９】
米国特許第２，５５８，３９５号は、トロンビンを含有する、すぐに使えるゼラチンスポンジを開示している。この特許によれば、トロンビンがゼラチン水溶液に加えられ、泡に転換され、真空中において低温で乾燥される。この特許におけるゼラチンは、調製のいかなる段階においても架橋されていなかった。したがって、血液と接触した際に、ゼラチン組成物が溶解し、トロンビンが迅速に解放され、フィブリノゲンがフィブリンに転換されて、創傷全体にわたってフィブリン膜が形成される。
【００１０】
米国特許第４，２９２，９７２号は、凍結乾燥された泡スポンジ製品に関連し、これはヒドロコロイド組成物を有する。この記載によれば、凍結乾燥された泡製品の溶解度及び吸収性は、凍結乾燥手順の前又は後のいずれかにおいて架橋することによって、低減され得る。凍結乾燥された泡製品は、ゼラチン、ペクチン及びカルボキシメチルセルロースナトリウムの混合物から形成される。
【００１１】
米国特許第４，２６５，２３３号は、創傷治癒物質を開示し、トロンビンを有するか又は有さない第ＸＩＩＩ因子が、共有結合、イオン結合吸着、又は封入によって、これに固定されている。この記載によれば、創傷治癒物質は、合成又は天然ポリマーであってよい。この特許は、セルロース、ビスコースレーヨン、銅アンモニアレーヨン、酢酸セルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、アガロース、デキストラン、プルラン、ペクチン、アルギン酸、キチン、例えばムコ多糖類などの多糖類、及び、羊毛、絹、コラーゲン、ゼラチン、及びカゼインなどのタンパク質を含む、いくつかの天然のタンパク質を開示する。この実施例は、５×２．５×０．５ｃｍの大きさのゼラチンスポンジの、１０ｍＬの第ＸＩＩＩ因子水溶液中（トロンビンを有するか又は有さない）への液浸、及びそれに続く２０時間にわたる凍結乾燥を開示する。
【００１２】
欧州特許第０２７７０９６号は、止血物質、例えば、ＧＥＬＦＯＡＭ（登録商標）、ＳＵＲＧＩＣＥＬ（登録商標）及びＡＶＩＣＥＬ（登録商標）、並びに安定化されたトロンビン配合物と組み合わせて有効に使用され得るコラーゲンを開示する。この特許によると、配合物は、ポリオール及び少なくとも１つの緩衝液、例えば、酢酸塩又はリン酸塩緩衝液を含有しなくてはならない。この記載によれば、安定化された溶液は、好ましくは止血剤に吸収され、パッドは凍結乾燥されて、無菌状態で包装される。
【００１３】
国際公開特許ＷＯ０２０７２１２８号は、架橋したゼラチン組成物を開示し、これは、内部に組み込まれる湿潤剤を有する。この記載によれば、湿潤剤は、ゼラチンスポンジの表面にわたってコーティングされ得る。この実施例は、湿潤剤の、スポンジの表面への添加が、スポンジを湿潤剤及び溶媒の溶液を含むバイアル瓶内に配置することによって実行されることを示す。バイアル瓶を次に反転して、溶液をスポンジ内に浸透させる。次にコーティングされた組成物を取り除き、余分な液体を排出し、一晩風乾させる。この記載によると、ゼラチン組成物はまた、薬剤、例えば、トロンビン、フィブリノゲン、第ＸＩＩＩ因子及び他の凝固因子を含み得る。
【００１４】
欧州特許第０５６８３３４号は、吸収性ゼラチンスポンジ、コラーゲン及び活性成分を含む、コラーゲン含有スポンジに関する。吸収性ゼラチンスポンジは、所定量のコラーゲン溶液をゼラチンスポンジ上に移すことによって、コラーゲン及び活性物質と組合され得る。この実施例は、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）を含有する、０．２４又は０．４ｍＬのコラーゲン溶液を、１ｍｍのゼラチンシート上にピペットで取ることによる、コラーゲンスポンジの調製を開示する。浸漬に続いて、好ましくは、室温で、約１時間〜約５日の期間にわたり、スポンジが乾燥される。スポンジの可撓性を改善するために、好適な可塑剤が使用され得ることが、この特許に示される。
【００１５】
国際公開特許ＷＯ９３０６８５５号は、止血のために有効な量の第ＶＩＩａ因子を、生物学的に適合性を有するキャリア、例えば、生分解性スポンジ物質と共に含む、止血組成物に関する。キャリアは、トロンビン又は他のいずれの血液凝固因子も含有しない。この記載は、止血スポンジの調製のためのいくつかの物質、例えば、コラーゲン、例えば変性ゼラチンなどのゼラチン、キチン、セルロース、ポリグリコール酸（plolyglycolic acid）、及びポリ酢酸（polyacetic acid）を開示する。スポンジは、乾燥処理されたスポンジを、ＶＩＩａ因子の溶液で満たし、続いて凍結乾燥することによって、調製され得る。この実施例は、ゼラチンスポンジの５ｍｍの中核の、ＶＩＩａ因子を含有する２ｍＬの無菌水への浸漬を開示する。湿ったスポンジが、乾燥されることなく、出血部位に適用された。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
吸収性ゼラチンスポンジは、出血の停止を補助するために、様々な手術手順において使用される。現在では、スポンジの止血効果は、スポンジの多孔性、及びその血液を吸収する能力に関連するものと考えられている。更に、スポンジの多孔性のために、血小板が捕捉されて、凝固カスケードが活性化され、可溶性フィブリノゲンを不溶性フィブリンのネットに転換し、これが出血を停止する。したがって、スポンジの構造は、スポンジの作用様式のために不可欠であるものと考えられる。使用する際、ゼラチンスポンジは、その止血性能を向上させるため、損傷した組織に適用する前にトロンビン溶液に液浸される。この工程は、時間がかかり、複雑であり、かつ表面と接触する創傷において、トロンビンの比較的低い濃度を生じる。
【００１７】
使用の容易性を促進するために、トロンビンを含むゼラチンスポンジは、乾燥形態で供給され得る。しかしながら、湿ったスポンジを乾燥させると、スポンジの崩壊、並びに／又は、スポンジ材料の元の形状、若しくは構造的一体性の変化が生じることが、本発明により見出された。また、本発明により、この構造の変化が、血液を吸収するスポンジ材料の能力、及び／又は身体表面の形状に容易に適合するスポンジの能力を低減させることも見出された。
【００１８】
本発明は、活性成分を含む液体が少量でスポンジ内に吸収され、それによってスポンジの僅かな部分のみが湿り、一方でスポンジの大部分が乾燥したままであり、結果として、元の構造的特性（例えば、厚さ、質感、及び外観）及びスポンジの可撓性は、乾燥手順の後に実質的に維持されるため、これらの問題を解決する。更に、完全な浸漬の場合は、トロンビンが、スポンジの格子間空隙内に分散され、創傷と接触するスポンジの表面でトロンビンの低い濃度を生じる。結果として、スポンジは、止血の補助において無効である。有利なことに、本発明は、スポンジの表面において、トロンビンの非常に高度に濃縮された、薄い層を含有するスポンジを提供する。
【００１９】
開示される技術は、湿潤及び乾燥の後の、スポンジの可撓性若しくは厚さの喪失の問題のいずれとも関連せず、活性成分の適用時に、スポンジに適用されるべき最適な限界液体体積を、提示又は開示しない。
【００２０】
本発明の目的は、
ａ）少なくとも１つの表面を有する、架橋したゼラチンスポンジを提供する工程と、
ｂ）スポンジの少なくとも１つの表面に、タンパク質又はペプチド活性成分を含む液体を均一に適用する工程であって、適用される液体の体積が、ａ）のスポンジの体積の５％以下である、工程と、
ｃ）スポンジを乾燥させ、
これによって、スポンジの少なくとも１つの表面上にタンパク質又はペプチド活性成分の安定な層を含む、可撓性の、乾燥した、架橋したゼラチンスポンジを得る工程と、を含む、タンパク質又はペプチド活性成分を含む、改善された、架橋したゼラチンスポンジを製造するための方法を提供することである。
【００２１】
本発明の一実施形態では、液体適用工程は、単一の段階で実行される。
【００２２】
本発明の別の実施形態では、液体中に、イプシロンアミノカプロン酸が存在しない。
【００２３】
本発明の更に別の実施形態では、液体適用工程が、ローラーを使用して実行される。
【００２４】
本発明の更に別の実施形態では、液体適用工程は、
ａ）外部表面を有する回転ローラーを提供する工程であって、外部表面の少なくとも一部が液体を含むリザーバと接触する工程と、
ｂ）ローラーを回転させて、液体で外部表面を被覆する工程と、
ｃ）ローラーの外部表面を、スポンジの少なくとも１つの表面と接触させる工程と、
ｄ）ローラーの外部表面と、スポンジの少なくとも１つの表面とを互いに移動させ、
これによって液体をスポンジの少なくとも１つの表面に付着させる工程と、を含む。
【００２５】
また本発明の更に別の実施形態では、外部表面が、液体を保持することのできる複数の中空空間を含む。
【００２６】
本発明の一実施形態では、液体適用工程は、液体ディスペンサを使用して実行される。
【００２７】
本発明の別の実施形態では、液体適用工程は、ＰｉｐｅＪｅｔ（商標）技術を使用して実行される。
【００２８】
本発明の更に別の実施形態では、乾燥したスポンジの厚さ及び可撓性が、元のゼラチンスポンジに見出されるものと、実質的に同様である。
【００２９】
本発明の他の実施形態では、元のゼラチンスポンジの厚さの少なくとも７５％が維持される。
【００３０】
本発明の別の実施形態では、層の厚さが、乾燥工程の後のスポンジの全体厚さの２４％以下である。
【００３１】
また本発明の更に別の実施形態では、乾燥工程が、真空炉、凍結乾燥、及び風乾からなる群から選択されるプロセスによって実行される。
【００３２】
本発明の更に別の実施形態では、乾燥工程は、真空炉によって実行される。
【００３３】
本発明の一実施形態では、活性成分はトロンビンを含む。本発明の別の実施形態では、液体中のトロンビンの活性は、約２〜約１５，０００ＩＵ／ｍＬの範囲、約２〜約４，０００ＩＵ／ｍＬの範囲、又は約４，０００〜約１０，０００ＩＵ／ｍＬの範囲である。
【００３４】
別の態様では、本発明は、改善された、乾燥した、架橋したゼラチンスポンジに関連し、スポンジはそのスポンジの少なくとも１つの表面上にタンパク質又はペプチド活性成分の層を含み、層は、スポンジの全体厚さの約２４％以下の平均厚さを有し、層は安定であり、表面全体にわたって均一に分布し、スポンジの厚さ及び可撓性は、元の、同等の層化されていないゼラチンスポンジに見出されるものと、実質的に同様である。
【００３５】
本発明の一実施形態では、層中に湿潤剤が存在しない。
【００３６】
本発明の別の実施形態では、活性成分がトロンビンを含む。トロンビンの活性は、約１〜約３００ＩＵ／ｃｍ２の範囲、約１０〜約４０ＩＵ／ｃｍ２の範囲、又は約２０〜約４０ＩＵ／ｃｍ２の範囲であり得る。
【００３７】
本発明によるスポンジは、外科手術において使用され得る。本発明の別の実施形態では、本発明によるスポンジは、血液凝固を促進するために使用され得る。
【００３８】
本発明の別の目的は、本発明による無菌の架橋したゼラチンスポンジを含む、パッケージを提供することである。
【００３９】
本発明の更に別の態様は、創傷又は出血部位に、本発明による、又は本発明によるパッケージを使用した、架橋したゼラチンスポンジを投入することを含む、血液凝固を促進するための方法を提供することである。
【００４０】
本発明による、架橋したゼラチンスポンジは、血液凝固の促進のために使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
本発明の特徴、態様、及び利点は、以下の明細書、実施例、請求の範囲、及び以下の図面に関して、更に良く理解されるであろう。
【図１】乾燥手順後の、５００μＬの蒸留水＋０．１％ＮＰ４０中に部分的に浸漬したスポンジ（Ｂ；スポンジＮｏ．２）と比較した、５００μＬの生理食塩水中に部分的に浸漬したゼラチンスポンジ（Ａ；スポンジＮｏ．１）の平面図を示す。スポンジの側面図が、Ｃ及びＤ（各々スポンジＮｏ．１及びＮｏ．２）に示される。
【図２】各々、６００μＬのＬ９＋生理食塩水＋０．５％のメチレンブルー（ＭＢ）、及びＬ９＋生理食塩水＋０．０１％ＮＰ４０＋０．５％ＭＢに部分的に浸漬された、ゼラチンスポンジＮｏ．６（Ａ）及びＮｏ．７（Ｂ）の平面図を示す。スポンジの側面図が、Ｃ及びＤ（各々スポンジＮｏ．６及びＮｏ．７）に示される。
【図３】各々、２００又は６００μＬのＬ９＋生理食塩水＋０．５％ＭＢ中に部分的に浸漬されたゼラチンスポンジＮｏ．３（Ａ）及びＮｏ．５（Ｂ）の平面図を示す。スポンジ３及び５の側面図が、各々図３Ｃ及びＤに示される。
【図４】Ｌ９（２０ｍＭの酢酸ナトリウム、４０ｍＭのＣａＣｌ２、１１０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％ｗ／ｗのヒトアルブミン、２％ｗ／ｗのマニトール；ｐＨ６．９〜７．１）＋０．１ＭのＮａＣｌの体積を増加させたときの市販のゼラチンスポンジＧｅｌｉｔａｓｐｏｎ（商標）の液体取り込みにおけるエタノールの影響を示す。
【図５】ＳＰＯＮＧＯＳＴＡＮ（登録商標）又は自社製ゼラチンスポンジ（Ｏｍｒｉｘ  ＩＬで製造）内への毛管現象による液体取り込みの動力学と、スポンジ内への液体取り込みにおける界面活性剤の影響と、を示す。
【図６】乾燥前のスポンジの液体取り込みの関数としてプロットされた、真空乾燥したＳＰＯＮＧＯＳＴＡＮ（登録商標）ゼラチンスポンジの厚さを示す。
【図７】真空乾燥したスポンジの厚さの関数としてプロットされた、ＳＰＯＮＧＯＳＴＡＮ（商標）ゼラチンスポンジの吸水倍率を示す。
【図８】乾燥手順後のＳＰＯＮＧＯＳＴＡＮ（登録商標）スポンジの厚さと乾燥手順前のスポンジの正味液体取り込みとの間の逆相関関係を示す。ＰＶ−部分的に浸漬した後に真空乾燥したスポンジ；ＰＬ−部分的に浸漬した後に凍結乾燥手順を行ったスポンジ。
【図９】真空乾燥したゼラチンスポンジ（Ａ、Ｃ）及び凍結乾燥したゼラチンスポンジ（Ｂ、Ｄ）内の、適用された活性成分層の厚さを示す。
【図１０】自社製スポンジの正味液体取り込みと乾燥後のスポンジの厚さとの間の関係を示す。
【図１１】真空炉内で乾燥させた部分的に浸漬させたスポンジと比較した、凍結乾燥により乾燥させた完全に浸漬したＳＰＯＮＧＯＳＴＡＮ（登録商標）スポンジからの活性成分の放出を示す。
【図１２】これらの実験で使用された組立装置を示す。１−下部ローラー；２−上部ローラー；３−ポリプロピレンネット；４−ベース板；５−運搬支持体（５ａは下部ローラーを保持し、５ｂは上部可動性ローラーを保持する）；６−バネ；７−ネジ；８−調節ネジ；９−調整板；１０−シャフト；１１−槽；１２−スポンジ。
【図１３】スポンジの開口側（Ａ）又は閉鎖側（Ｂ）のいずれかにおいて装置内に供給されるときの様々な操作速度（２０〜１００ＲＰＭ）でのＳＰＯＮＧＯＳＴＡＮ（登録商標）スポンジの液体取り込みを示す。
【図１４】Ｌ９緩衝溶液又はトロンビン溶液（４０００ＩＵ／ｍＬ）を使用する、スポンジの液体取り込みｖｓ．ローラー速度を示す。閉鎖側を下向きにしてスポンジに装置を通過させ（１回目の通過）、真空乾燥させ、開口部を下向きにして再び通過させた（２回目の通過）。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
一態様では、本発明は、スポンジの表面上の、タンパク質又はペプチド活性物質の安定層を含む、改善された、乾燥した、すぐに使える架橋したゼラチンスポンジを製造するための方法を提供する。
【００４３】
本発明により得られる結果は、ａ）架橋したゼラチンスポンジを提供する工程と、ｂ）タンパク質又はペプチド活性物質を含む液体を、スポンジの少なくとも１つの表面上に均一に適用する工程（適用される液体の体積は、スポンジの最初の体積の５％以下である）と、Ｃ）スポンジを乾燥させる工程とを含む方法によって得られる、スポンジの少なくとも１つの表面上にタンパク質又はペプチド活性成分の層を含む、ゼラチンスポンジの利点を示す。
【００４４】
用語「タンパク質又はペプチド活性成分を含む、改善されたゼラチンスポンジ」は、少なくとも１つの表面上にタンパク質／ペプチド活性成分の安定層を含む、ゼラチンスポンジに関し、この層は、スポンジの表面全体にわたって均一に分布しており、このスポンジは、元の同等のゼラチンスポンジに見出されるものと、実質的に同様である厚さ及び可撓性を有する。
【００４５】
用語「トロンビンを含む、改善されたゼラチンスポンジ」は、少なくとも１つの表面上にトロンビンの安定層を含む、ゼラチンスポンジに関し、この層は、スポンジの表面全体にわたって均一に分布しており、このスポンジは、元の同等のゼラチンスポンジに見出されるものと、実質的に同様の厚さ及び可撓性を有する。
【００４６】
記載全体を通じて、用語「厚さ」は、用語「高さ」と互換可能である。
【００４７】
本発明によるスポンジに適用される液体の許容可能な体積は、以下のように計算される：例えば、２．５×２．５×１ｃｍ（６．２５ｃｍ３）の寸法のスポンジ（これは、６２５０μＬの体積に相当する）を使用する場合、液体のスポンジ内への取り込みは、３１２μＬ以下であるべきである。液体を、スポンジの複数の表面に適用する場合、体積は、各々、全ての表面において別個に、スポンジの体積の５％以下であるべきである。
【００４８】
用語「スポンジの最初の体積」とは、液体を適用する工程の前のスポンジの体積に関する。
【００４９】
本発明により、湿ったスポンジを乾燥させるとスポンジの崩壊を生じ、スポンジ内への液体取り込みを増加させると、凍結乾燥又は真空乾燥手順後のスポンジの全体厚さに有意に影響することが見出された。実際に、湿潤化工程における液体取り込み体積は、乾燥手順後のスポンジ厚さと反比例することが示された。例えば、界面活性剤の使用などによりスポンジ内への液体取り込みの量を増加させることは、乾燥したスポンジの全体厚さの低減に繋がる。
【００５０】
用語「界面活性剤」とは、スポンジの湿潤を促進するか、スポンジの吸水時間を低減させる作用剤を指す。好適な界面活性剤の例としては、０．０１〜０．１％ＮＰ４０、２０％エタノール、及び０．０２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０が挙げられるが、これらに限定されない。用語「界面活性剤」は、用語「湿潤剤」と互換可能である。
【００５１】
このスポンジの厚さの減少は、例えば、スポンジの変形、一体性／多孔性の損傷などのスポンジの構造的変性、及び／又は、例えば可撓性などのスポンジの機械的特性の変性を生じる。この構造的変性は、スポンジの吸水能力に影響することがまた見出され、すなわち、湿潤化工程中に高水準の水を吸収したスポンジを乾燥させることによって得られる薄いスポンジは、湿潤化工程中に低水準の水を吸収したスポンジを乾燥させることによって得られる厚いスポンジよりも、少ない水を吸収した。
【００５２】
スポンジの最初の体積の５％以下の体積で、スポンジに液体を適用すると、スポンジの最初の体積の５％以下の液体取り込み／吸収が生じることに注目すべきである。
【００５３】
方法は、元の、同等の、層化されていないゼラチンスポンジに見出されるものと比較した際に、実質的に変わらない吸収能力を有する、本発明によるスポンジの調製を可能にする。米国薬局方は、吸収性ゼラチンスポンジは、自重の３５倍以上の水を吸収するべきであることを示していることに注意すべきである。本発明により、薬局方の要求を満たすため、１０ｍｍの最初の厚さを有する、ＳＰＯＮＧＯＳＴＡＮ（登録商標）などのゼラチンスポンジは、その３５倍以上の重量の水を吸収するために、湿潤化及び乾燥の後に７．４４ｍｍ以上の厚さを維持してもよく、即ち、ゼラチンスポンジの湿潤化及び乾燥の後の厚さの喪失は、最初の高さの２６％を超えるべきではないことが見出された。
【００５４】
例えば、ゼラチンスポンジの最初の厚さが１０ｍｍであるとき、本発明による、乾燥した、すぐに使えるスポンジの全体厚さは、約７〜約９．８ｍｍの範囲、例えば、約７．２、７．３、７．４４、７．５、８、８．２、８．５、９及び９．５ｍｍであり得、すなわち、スポンジは、湿潤化及び乾燥工程後、元のゼラチンスポンジの最初の高さの、約７０〜約９８％、例えば、７３、７４、７５、８０、８２、８５、９０及び９５％を維持し得る。
【００５５】
更に、本発明により、最初の厚さの少なくとも約７４％を維持するために、ＳＰＯＮＧＯＳＴＡＮ（登録商標）スポンジに適用される液体の体積は、上記で定義されたように、液体適用段階の前のスポンジの体積の５％以下の範囲、例えば、４．５、４、３．５、３、２．５、２％であるべきであることが見出された。例えば、活性成分でコーティングされた際に、約２２０μＬまでのような少量の液体（すなわち、スポンジの体積の３．５％未満の算出された液体取り込み）を吸収した２．５×２．５×１ｃｍのスポンジで調製された、予め作製されたゼラチン乾燥スポンジは、元のゼラチンスポンジと比較して、その機械的特性（例えば、可撓性）、及び構造的特性（例えば、厚さ）を実質的に変えなかったことが見出された。このスポンジは、活性成分の高度に濃縮された、薄い層を、その創傷に面する側面に含み、この面はスポンジの非生物学的側面から容易に見分けることができるが、それは、これがスポンジの他の非処理面よりも、外観において多孔性が低いためである。活性成分を含む層は、貯蔵の際に安定であり、湿ったときに活性成分が溶解して、拡散する。用語「安定」とは、剥がれ落ちない層、例えば、破断しない層及び／又は個別の断片に崩れない層を指す。
【００５６】
本発明の一実施形態では、層の安定性は以下のように評価することができる。特定の寸法の乾燥した、すぐに使えるスポンジを切断し、その重量を決定する。次に、試料をホウケイ酸ガラスシンチレーションバイアル瓶の内部に、層化された表面を上向きにして配置し、バイアル瓶に栓をする。次に、プラスチックチューブを保持することができる、延長クランプを有する支持スタンドを硬い水平面に配置する。プラスチックチューブをクランプ内に垂直に挿入し、クランプを締め、プラスチックチューブの底部に固体シリコーンストッパーを配置する。測定中にストッパーが放り出されることを防止するために、プラスチックブロックをストッパーの下部に配置する。その後、試料を含有するバイアル瓶を、栓の側を上向きにしてプラスチックチューブの上から４回落とし、試料の重量を測定する。変動性を排除し、標準化を確実にするために、全ての試験において、落下点は同じであった。試料の落下後の重量を、試料の落下前の重量から引き算することによって粉末喪失を計算し、粉末喪失を落下前の重量で除算し、その結果に１００を乗じることによって試料の重量低下の百分率を計算する。例えば、試料の寸法が約１．７ｃｍ２であり、上記の安定性試験が実行された場合、試料の望ましい重量低下は５％未満である。
【００５７】
本発明により、凍結乾燥又は真空乾燥手順による乾燥（双方とも現在使用され、タンパク質／ペプチド成分との使用のために適切な方法である）は、スポンジの表面上の層の厚さに影響し得ることがまた見出された。これらの結果は、湿潤化工程の間における５％の液体取り込みが、真空乾燥及び凍結乾燥されたスポンジにおいて、各々スポンジの全体厚さの５．８〜８．３％及び１２．５〜２４％の、乾燥した上部層（又は、適用された活性成分の層）を生じたことを示す。得られた結果は、活性成分のより薄い層を有する、及び／又は活性物質を持続放出する能力を有するスポンジを得るために、真空乾燥手順が使用され得ることを示している。活性成分のより厚い層を有するスポンジを得るためには、乾燥凍結による乾燥の方法が使用され得る。
【００５８】
乾燥工程は、真空乾燥、凍結乾燥及び風乾、例えば室温乾燥などが挙げられるがこれらに限定されない、熱的手順に感受性を有する活性成分を分解又は変性しない、当該技術分野において既知の任意の手順によって実行され得る。
【００５９】
一般的に、真空乾燥手順の使用は、風乾及び凍結乾燥に勝るいくつかの利点を提供し得る。室温での乾燥は、水分含量の緩やかな減少を達成する。凍結乾燥は、スポンジの元の構造を本質的に保存するが、これは、乾燥の、複雑かつ高価な形態である。真空乾燥は、スポンジの元の多孔性構造を実質的に保存する、安価かつ迅速な手順である。
【００６０】
本発明による発見はまた、活性成分としてトロンビンを使用するときに、完全に浸漬し、次に乾燥凍結して調製されるスポンジにおいては、部分的に浸漬して真空炉で乾燥させることによって調製されるスポンジ（トロンビンは徐々に放出された）におけるよりも、トロンビンが迅速に放出されることを示している。試験の最後において、双方のスポンジは、同様の、回復した活性を有し、真空炉内で乾燥された部分的に浸漬されたスポンジが、トロンビンの活性を保存することを示した。本発明による方法の重要な利点は、すぐに使えるスポンジにおける活性成分の活性が実質的に保存されることである。
【００６１】
用語「部分的な浸漬」とは、本明細書において使用されるとき、スポンジの少なくとも１つの表面への液体の適用に関し、スポンジに適用される液体の体積は、スポンジの最初の体積の５％以下である。用語「完全な浸漬」とは、スポンジに適用される液体の体積が、スポンジの最初の体積の５％超であるスポンジへの液体の適用を指す。
【００６２】
本発明によるスポンジの別の利点は、その可撓性である。その可撓性は、完全に浸漬され、乾燥したスポンジ（これは、乾燥したクッキーの構造を示し、はるかに可撓性が低い）と比較した際に、これが適用される身体表面の形状に、より容易に適合することを可能にする。
【００６３】
スポンジの可撓性は、当業者に既知の任意の方法によって測定することができる。例えば、ＧＦ−５４  ３−Ｐｏｉｎｔ  Ｂｅｎｄ  Ｊｉｇ（ＬＬＯＹＤ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．）などの曲げ治具及びＬＦ  ｐｌｕｓ  ｓｅｒｉｅｓ（ＬＬＯＹＤ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ，Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，ＵＫ）などの引張圧縮試験機を使用する３点曲げ屈曲性試験による。この試験は、逆向きの力が軸に沿って印加されるときにその軸に沿って物体が変形する傾向を測定する。
【００６４】
用語「タンパク質又はペプチド活性成分」は、アミノ酸から作られ、ペプチド結合によって互いに結合される、あらゆる化合物を含む。この用語は、オリゴペプチド、タンパク質フラグメント、アナログ、融合タンパク質などを含む。アミノ酸鎖は、脂質、オリゴ糖鎖などの、追加的な部分を含み得る。活性成分は、天然又は合成であり得る。タンパク質又はペプチド活性成分の例としては、血液凝固因子、例えば、トロンビン、ヘビ毒から得られるタンパク分解酵素、フィブリノゲン、ビタミンｋ依存性凝固因子、第ＸＩＩＩ因子、フィブロネクチン、ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ；ＲＧＤペプチド；増殖因子、例えば、血小板由来増殖因子、軟骨形成因子、類骨形成因子、骨成長因子、コラーゲン成長因子；サイトカイン；インターフェロン；ホルモン；治療薬、例えば、抗菌剤、抗炎症剤；抗癌剤；化学療法剤；鎮痛剤；インターロイキン；ミネラル；細胞移動、癒着、及び／又は増殖を刺激する分子；酵素；神経栄養性因子、例えば、神経成長因子（ＮＧＦ）；毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、並びにこれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。活性成分は、ヒト又は哺乳類の血漿から単離することができ、又は組み換えることができる。
【００６５】
スポンジは、様々なプロテアーゼ、例えば、ヒアルロニダーゼ若しくはコラゲナーゼで、又は治癒しない潰瘍を治療するか、若しくは肌の再生を促進する、特定のプロテアーゼ抑制剤の様々な組み合わせでコーティングされ得る。
【００６６】
スポンジに適用される溶液内のタンパク質又はペプチド活性成分の量は、非常に微量から、飽和を超える量まで様々であり得る。当然、活性成分の実際の量は、とりわけ、その意図される目的、その有効性、疾患状態、患者の年齢及び体重による。本発明により、スポンジの表面にコロイド溶液が適用され得る。タンパク質又はペプチド活性成分が、乾燥手順後に、それらの活性を本質的に維持することが望ましい。
【００６７】
層内の活性成分の量及び濃度は、当業者に既知の任意の方法により、実験的に決定され得る。例えば、トロンビンの活性は、変更された欧州薬局方アッセイ（０９０３／１９９７）手順によって直接決定することができ、凝固時間は凝固機器によって自動的に計算され、活性は、適切なトロンビン基準物を使用して求められる較正曲線から補間されるか、及び／又は間接的に、斜面の移動距離を測定して（又は液滴試験モデル）、若しくは当業者に既知の他の任意の方法により決定される。
【００６８】
活性成分を含む液体は、任意の液体キャリアであり得る。用語「キャリア」は、スポンジの表面への活性成分の適用を促進するために活性成分が混合又は配合される、希釈剤又は溶媒を指す。キャリアは、体内への投与のために好適である、当該技術分野において既知のキャリアのいずれかから選択され得る。キャリアの非限定的な例は、水、例えば生理食塩水などの食塩水、及び有機溶媒、並びにこれらの混合物である。
【００６９】
本発明の一実施形態では、活性成分はトロンビンである。このような実施形態では、トロンビンは、初期血液組成物から調製することができる。血液組成物は、全血液、又は血液の一部、すなわち、血漿などの全血液の生成物であり得る。トロンビンは内生（autologous）、プール血漿を含むヒト又は非ヒト供給源のものであり得る。トロンビンが組み換え方法によって調製されることもまた可能である。トロンビンは、追加的な活性成分として、塩化カルシウムを含み得る。
【００７０】
溶液中のトロンビンの濃度は、約２〜約１５，０００ＩＵ／ｍＬの範囲、約２〜約４，０００ＩＵ／ｍＬの範囲、約４，０００〜約１０，０００ＩＵ／ｍＬの範囲内であり得る。溶液中の塩化カルシウム濃度は、約２〜約６．２ｍｇ／ｍＬの範囲、約５．６〜約６．２ｍｇ／ｍＬの範囲、例えば、５．８８ｍｇ／ｍＬの濃度であり得る。トロンビンはまた、賦形剤を含み得る。本明細書で使用するとき、用語「賦形剤」は、溶液に加えられる不活性物質を指す。賦形剤は、活性成分が、貯蔵の際にその化学安定性及び生物学的活性を維持することを確実にするため、又は審美的理由、例えば色のために、溶液に加えることができる。賦形剤の例としては、ヒトアルブミン、マニトール及び酢酸ナトリウムが挙げられるがこれらに限定されない。溶液中のヒトアルブミンは、約２〜約８ｍｇ／ｍＬの範囲であり得る。マニトールは、約１５〜約２５ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度であり得る。酢酸ナトリウムは、約２〜約３ｍｇ／ｍＬの範囲で溶液に加えることができる。トロンビンは、注入のために、水などのキャリアを含むこともできる。
【００７１】
本発明の別の実施形態では、活性成分は、Ｌ９緩衝溶液（２０ｍＭの酢酸溶液、４０ｍＭのＣａＣｌ２、１１０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％ｗ／ｗのヒトアルブミン、２％ｗ／ｗのマニトール、ｐＨ６．９〜７．１）と配合されるトロンビンである。
【００７２】
トロンビン溶液との部分的浸漬、及び真空炉を使用した乾燥によって調製されたゼラチンスポンジの止血特性が、実施例の方法で記載されるように、生体内ラット腎出血モデルで試験された。結果は、本発明の方法によって調製され、真空炉内で乾燥されたスポンジが、出血表面に適用された際に失血を防止するために有効であり、完全に浸漬されて乾燥されたスポンジよりも柔軟であったことを示す。
【００７３】
また、この発見は、活性物質としてトロンビンを含む、本発明によるすぐに使えるゼラチンスポンジが、生体内環境における失血の防止に非常に有効であることを示している。例えば、トロンビンの使用による本発明によって調製されるスポンジは、トロンビンを有さない対照スポンジよりも、失血防止において少なくとも３倍有効であることが見出された。本発明の一実施形態では、トロンビン及び塩化カルシウムは、すぐに使えるスポンジの層中で、唯一の活性成分である。用語「唯一の活性成分」とは、特定の活性成分が、製品の機能のために必要とされる、唯一の化学活性成分であることを意味する。本発明の別の実施形態では、活性成分を含む層にイプシロンアミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）は存在しない。
【００７４】
有利なことに、活性成分を含む液体は、単一の工程において、一度だけ、スポンジの表面に適用され得る。この手法は、製造手順のスケールアップを容易にする。液体は、物理吸着、毛管力、噴霧、部分浸漬、ピペット、活性成分を含む溶液で満たしたローラーに対してスポンジを押し付けること、装置での滴下、若しくは少なくとも１つのジェットを含むアプリケータの使用、又はスプレイディスペンサなどのディスペンサの使用、又はＰｉｐｅＪｅｔ（商標）技術の使用が挙げられるがこれらに限定されない、当業者に既知の方法の任意のものによって適用され得る。いずれにせよ、湿潤化工程中にスポンジに適用される液体の体積は、上記のように、スポンジの最初の体積の５％以下であるべきである。本発明の一実施形態では、液体は、受動的な毛管力によって適用される。本発明の別の実施形態では、液体は、活性成分を含む溶液で満たされたローラーに対してスポンジを押し付けることによって適用される。本発明により、そのローラー表面上に液体を保持することができる、複数の中空空間を含有する外部表面を有する任意のローラーが使用され得る。このような表面は、ローラー表面の単位面積当たりに保持される液体の体積の正確な決定を可能にする。本発明の一実施形態では、中空空間は、ローラーの外部表面に彫刻されている。本発明の別の実施形態では、ローラーは、多孔性ネットで被覆されている。中空空間は、菱形、正方形又は矩形などの、任意の好適な形状であり得る。ネットは、生体溶液との使用に好適な任意の材料、例えば、ポリプロピレン、ポリエステルであり得る。「好適な」とは、生体溶液と相互作用しない、不活性材料を意味する。
【００７５】
中空空間の液体を維持する能力は、異なる手段、例えば、溶液の表面張力及び粘度、並びにローラーの材料、すなわち、親水性又は疎水性材料によって影響され得る。典型的には、採用される空間の寸法は、溶液の特性、及びローラーの材料に応じて決定される。
【００７６】
好適な技術、例えば、浸漬、液浸、又はブラシの使用、若しくは液体溶液をローラーの表面に噴霧することなどによって、所定量の液体が周囲に適用される、平滑な表面を有するローラーを使用することがまた可能である。
【００７７】
コーティングされるべきスポンジの表面と接触する、ローラーの外部表面の少なくとも一部が、液体溶液を含むリザーバに接触するべきである。ローラーの外部表面から、スポンジの表面への流体移送メカニズムは、重力などの駆動力を利用して、スポンジの表面全体にわたる流体の分配を補助してもよい。ローラーの外部表面と、コーティングされるべきスポンジの表面を接触させ、ローラーの外部表面とスポンジの表面とを互いに対して移動させることによって、液体がスポンジの表面上に移送され得る。本発明の一実施形態では、ローラーは、コーティングされるべきスポンジの表面に沿って回転する。本発明の別の実施形態では、スポンジが、ローラーの表面に対して移動する。
【００７８】
本発明の一実施形態では、スポンジが、２つの逆回転ローラー（下部ローラー及び垂直可動性上部ローラー）、上部ローラーと下部ローラーとの間の空隙空間を調節することができる、例えば２つの回転ねじなどの２つの上昇区分、ローラーの少なくとも一方を回転させるための、モーターなどの手段、及び以下に記載されるような、生体溶液を保持するための槽を含む、装置へと供給される。このような実施形態では、下部ローラーが複数の中空空間を含み、液体溶液を含むリザーバと接触する。下部ローラーは据え置きであってもよく、又は代替的に可動であってもよい。
【００７９】
以下に例示されるような装置を使用するとき、液体適用工程は、以下のように実行され得る。ローラーの間の空隙空間を、コーティングされるスポンジの厚さに適合するように、合わせる。その後、装置を硬い水平面に配置し、水準器を使用して装置の水平調整を行う。液体を槽に適用し、装置を操作する。速度を望ましいＲＰＭに調節する。一般的に、速度は、スポンジの最初の体積の５％以下である液体の体積の適用を可能にするように調節すべきである。下部ローラーが、液体組成物を含む槽の中で運動し、液体組成物が、ローラーの多孔性構造をコーティング材料で充填する。有利なことに、この工程は、下部ローラーと槽との間の液体平衡取り込みが達成されるまで実行される。下部ローラーの表面全体にわたり、液体材料の連続的で一様な層を有することが望ましい。これは、ドクターブレードセットなどの、ローラーの表面から余分な材料を取り除く装置を使用することによって得ることができる。このようにして、液体は、多孔性構造内に維持され得る。次に、２つのローラーの間にスポンジを通過させて、生体溶液を毛管力によって基材の下面に受動的に付着させる。湿潤化工程中、上方ローラーはスポンジ上に圧力を印加し、これによりスポンジが装置から押し出されるのを可能にし、スポンジの液体取り込み能力を制御する。湿潤化プロセスの前後でスポンジを重量測定し、湿潤化工程後のスポンジの重量を湿潤化前のその重量から引き算することにより、液体取り込みを計算する。
【００８０】
本発明に従って使用され得る別のローラー装置が、米国特許第４，５２２，０５７号に開示され、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。これらの結果は、ローラー装置を使用して、液体をスポンジの表面に適用することが有利であることを示しているが、これは、この技術によって、スポンジに適用される液体を調節することができるからである。
【００８１】
本発明の更なる実施形態では、液体溶液が、液体ディスペンサの使用によってスポンジの表面に適用される。本発明の更に別の実施形態では、液体溶液は、Ｐｉｐｅ−Ｊｅｔ（商標）技術の使用によってスポンジの表面に適用される。この技術は、数ナノリットルから最大で数マイクロリットルの範囲内で液体を非接触散布するためのバルブフリー方法である。Ｐｉｐｅ−Ｊｅｔ（商標）技術などの液体ディスペンサの使用が、スポンジの表面全体にわたって、散布される体積を画定された正確な方法で制御することを可能にし、その結果、スポンジの表面上に、活性成分を含む液体の実質的に一様な分布が生じることが示された。
【００８２】
有利なことに、液体溶液はスポンジの表面に、注入によっても、又はスポンジ上に機械的圧力を印加する他のいずれの方法によっても適用されないが、これは、これらの方法による適用が、液体のスポンジ内へのより深い浸透、スポンジの表面への活性成分の不均一な分布、及び／又はスポンジのかなりの変形を生じ得るからである。
【００８３】
用語「均一な」とは、これに関して使用される際、活性成分を含む液体が、スポンジの表面全体にわたって実質的に一様に適用されることを意味する。結果的に活性成分は、薄層として、スポンジの表面全体にわたって一様に分布する。有利なことに、寸法が同じであれば、層の異なる領域でも、ほぼ同じ生物学的活性を有する。
【００８４】
適切な架橋したゼラチンスポンジは、自社製造のゼラチンスポンジ、例えば、実施例に記載されるもの、又はＳＰＯＮＧＯＳＴＡＮ（登録商標）、ＧＥＬＩＴＡＳＰＯＮなどの様々な市販のスポンジの使用によるものなど、いずれの吸収性スポンジ製品であってもよい。
【００８５】
本発明によるすぐに使える架橋ゼラチンスポンジを製造する際、湿潤剤が、泡立ての前にゼラチン溶液に組み込まれてもよく、湿潤化工程の前に架橋ゼラチンスポンジの表面に適用されてもよく、活性成分を含む液体に含まれてもよい。しかしながら、このような追加は必須ではない。いずれにせよ、湿潤化工程においてスポンジに適用される液体の体積は、スポンジの体積の５％以下の範囲であるべきである。
【００８６】
本発明のスポンジは、意図される用途により、様々な寸法及び形状、例えば、正方形、多角形、球状、円錐形、立方体、楕円形、矩形又は円筒形で、調製及び提供され得る。例えば、本発明のすぐに使える、架橋したゼラチンスポンジは、以下のスポンジの寸法を使用して調製され得る：８×φ３ｃｍ、１０×１０×１ｃｍ、ｌ×ｌ×ｌｃｍ、７×５×１ｃｍ、２．５×２．５×１ｃｍ。
【００８７】
本発明の別の態様は、スポンジの少なくとも１つの表面上にタンパク質又はペプチド活性成分の層を含む、改善された、乾燥した、すぐに使える架橋したゼラチンスポンジに関する。層は、すぐに使えるスポンジの全体厚さの約２４％以下の平均厚さを有する。
【００８８】
層中の活性成分は、患者への投与に好適であり、上記の所望される効果を生じる、任意の物質であり得る。本発明の一実施形態では、活性成分はトロンビンである。本発明の別の実施形態では、活性成分はトロンビン及び塩化カルシウムである。トロンビン及び塩化カルシウムの、別の量及び濃度が使用されてもよい。活性成分を含む層中の量及び濃度は、好ましくは、タンパク質の効果及び機能性を最適化するように選択される。すぐに使えるスポンジの層中のトロンビンの活性は、約１〜約３００ＩＵ／ｃｍ２の範囲、約１０〜約４０ＩＵ／ｃｍ２の範囲、約２０〜約４０ＩＵ／ｃｍ２の範囲、又は約３５ＩＵ／ｃｍ２トロンビンであり得る。
【００８９】
この関連において、用語「トロンビン」は、トロンビンの前駆物質であるプロトロンビンを含む。プロトロンビンが使用される場合、すぐに使えるスポンジの層中の濃度は、約１〜約３００ＩＵ／ｃｍ２のトロンビンの活性に対応する濃度であり得る。
【００９０】
層は上記の賦形剤、及び／又はキャリアを更に含むことができる。賦形剤の例としては、ヒトアルブミン、マニトール及び酢酸ナトリウムが挙げられるがこれらに限定されない。１つの非限定的な実施例では、液体キャリアは、注入のために水である。
【００９１】
層は、これが安定であり、スポンジの表面全体にわたって実質的に均一に分布することによって特徴付けられる。層の安定性は、上記の安定性試験の使用により、又は当業者に既知の方法のいずれかにより、評価され得る。本発明の一実施形態では、試料の寸法が約１．７ｃｍ２であり、上記の安定性試験が実行されたとき、試料の重量喪失は５％未満であり得る。
【００９２】
本発明により、すぐに使える架橋したゼラチンスポンジは、水溶液の存在下で、湿潤剤を加えることなく、一様に湿潤化され得ることが見出された。したがって、本発明の一実施形態では、すぐに使える架橋したゼラチンスポンジの層は、スポンジの吸水時間を促進するために湿潤剤を必要としない。
【００９３】
本発明による改善されたスポンジの厚さ及び可撓性は、元の同等の層化されていないゼラチンスポンジに見出されるものと実質的に同様である。実質的に同様のスポンジは、元の層化されていないスポンジの厚さの少なくとも７５％、及び元のスポンジの少なくとも８０％の可撓性を維持するスポンジであり得る。
【００９４】
本発明の主題は、本発明による、無菌のすぐに使える架橋したゼラチンスポンジを含有する、密封されたパッケージを包含し、これは、汚染を生じることなくパッチを取り出すことを可能にする。アルミニウム箔パウチなどの様々な材料がパッケージに利用され得る。
【００９５】
電子ビーム照射、ガンマ線照射、エチレンオキシド（ＥｔＯ）殺菌が挙げられるがこれらに限定されない、熱的手順に感受性を有する生物学的化合物を分解しない、当該技術分野において既知の任意の殺菌方法が使用され得る。本発明の一実施形態では、すぐに使えるスポンジ及び包装材料が、例えば、ガンマ線照射を使用して、共に殺菌される。
【００９６】
本発明によるスポンジは、上記のスポンジのいずれかを含むキットの形態で提供され得る。キットは、多くのすぐに使えるスポンジを含み得る。
【００９７】
スポンジは、密封された無菌のパッケージ内に収容され得る。加えて、キットは、殺菌された外科器具、例えば、メス、止血剤、及び／又は使用取扱説明書を含み得る。キットはまた、無菌包帯、無菌パッド、ガーゼ及び／又は消毒剤を含むことができる。キットは更に、無菌生理食塩水溶液を含み得る。
【００９８】
本発明によるすぐに使えるスポンジ又はキットは、手術、例えば、神経外科手術、脳手術、組織の再建手術及び美容整形手術（例えば、軟骨、神経、及び骨の再生）において有利に使用され得る。すぐに使えるスポンジ又はキットはまた、止血、癒着の防止、並びに／又は損傷した組織の修復及び／若しくは治療に使用され得る。
【００９９】
本発明の一実施形態では、スポンジは、止血剤によってコーティングされる。用語「止血剤」とは、本明細書において使用するとき、当業者に認識されるように、有効な時間内において、重度の又は急激な出血を含む毛細血管、静脈、細動脈の出血を制御、低減又は停止させる、作用剤の能力を指す。出血は、手術手順の結果、止血障害、あるいは他の状況、例えば、血液凝固障害を有するか、又はヘパリン、若しくは凝固阻止剤を投与されている患者において生じ得る。
【０１００】
本明細書において使用するとき、「重度の又は急激な出血」とは、大きな体積の、急速な出血が生じている場合の出血を指す。重度の又は急激な出血の例としては、動脈穿刺、肝臓切除、腎臓切除、血友病患者、及び凝固阻止剤の投薬を受けている患者による出血などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０１】
止血剤の例としては、プロトロンビン、トロンビン、フィブリン、フィブロネクチン、第ＸｆＸａ因子、第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、第ＩＸ／ＩＸａ因子、第Ｘｌ／ＸＩａ因子、第ＸＩＩ／ＸＩＩａ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、ビトロネクチン、組織因子、ヘビ毒から得られるタンパク質分解酵素（例えば、バトロキソビン）、ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子、プラスミノゲン活性化阻害因子、血小板活性化剤、止血活性を有する合成ペプチド、上記の誘導体、及びこれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０２】
止血製品としてスポンジを使用する場合、血餅の形成を促進する追加的な物質が、活性成分、例えば塩化カルシウムを含む層中に含まれ得る。
【０１０３】
例えば、スポンジの十分な吸水を提供するのに体液が不十分である場合に、すぐに使えるスポンジは、使用前に無菌の生理食塩水溶液に浸漬され得る。あるいは、スポンジは、最初に生理食塩水溶液に浸漬させることなく適用されて、止血剤が体液によって活性化されてもよい。
【０１０４】
すぐに使えるスポンジは、所望の部位に適用され、スポンジと適用部位との間の境界面において凝固が生じ、続いて出血が停止されるために十分な時間にわたって、圧力下で保持され得る。
【０１０５】
本発明の別の実施形態では、活性成分は、癒着防止剤である。このような実施形態では、すぐに使えるスポンジは、癒着の防止に使用され得る。癒着は所望されない副作用であり、通常は別々である身体組織が融合する。この望ましくない副作用は、外科手術手順、又は非外科的外傷、例えば、子宮内膜症、感染、外傷、化学療法、放射線、及び癌の結果として生じ得る。典型的に、癒着防止剤とは、手術部位における隣接する組織間を分離する物理障壁（コーティング）を形成することができ、それによって手術後の癒着の形成を防止及び／又は低減する作用剤を指す。
【０１０６】
スポンジは更に、１つ以上のタンパク質又はペプチド活性成分を含み、薬物送達システムとして機能することができる。
【０１０７】
用語「薬物送達システム」とは、活性タンパク質又はペプチドの送達を指し、これらはスポンジに組み込まれて、生体内の特定の組織内のタンパク質又はペプチドの制御された送達を可能にする。
【０１０８】
本発明により作製されるスポンジは、以下の利点の少なくとも１つを有する：元の可撓性、質感、損なわれない多孔性構造、創傷と接触する境界面における薄い層として高度に濃縮された活性成分、安定な層、及び機能の安定性。
【０１０９】
本発明の明細書中の範囲の開示は、当業者が容易に理解できる。これは、範囲の制限の間における、連続的な値、及び数の開示は、中間的な部分的範囲の全ての組み合わせによる、制限的な数及び値を含むことを意味する。
【０１１０】
以上又は以下に引用する出願、特許、及び刊行物の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１１】
以下の例は例示であり、限定するものではない。
【実施例】
【０１１２】
方法
凍結乾燥手順。凍結乾燥手順は、ＣＨＲＩＳＴ，ＥＰＳＩＬＯＮ  ２−８Ｄ  Ｆｒｅｅｚｅ  Ｄｒｙｅｒを使用して下記のように実行された。棚温度を２時間にわたって−４５℃に低下させた。その後、温度を更に３０分間にわたって−５０℃に低下させた。次に、棚を５時間にわたって−５０℃に保持した。この工程に続き、最大２４時間にわたって−１５℃及び１４Ｐａ（０．１４ｍｂａｒ）での昇華を行った。棚温度を＋２５℃に上昇させた後で、圧力を２．０Ｐａ（０．０２ｍｂａｒ）に低下させ、第二の乾燥を最大２４時間にわたって実行した。
【０１１３】
真空乾燥手順。真空乾燥手順は、３〜４時間にわたって、１００００Ｐａ（０．１ｂａｒｓ）以下の圧力で室温に設定した炉（ＳｈｅｌＬａＢ  Ｍｏｄｅｌ  １４３０−２Ｅ）内で行われた。
【０１１４】
ゼラチンスポンジ（自社製スポンジ）の製造。３０ｇのゼラチンフレーク（ＰＢ  Ｇｅｌａｔｉｎｓ；医薬用ゼラチン、ブタ皮膚からのＴｙｐｅ  Ａ、２５０ブルーム、８メッシュ；カタログＮｏ．１１５４）を５００ｍＬの蒸留水に加えた。ゼラチンが完全に溶解するまで、分散液を６０℃に加熱した。次に、溶液（６％ｗ／ｖ）を５０℃に冷却し、ミキサーボウル（ＫｉｔｃｈｅｎＡｉｄ  Ｈｅａｖｙ  Ｄｕｔｙ  Ｍｏｄｅｌ  ＫＳＭ  １５０）に移し、ゼラチン溶液の最初の体積の６〜８倍大きな体積を有する安定な泡が形成されるまで、約２分間にわたって速度６で溶液を泡立てた。泡は金属成形型（２１×３０ｃｍ、深さ１．５ｃｍ）に注入した。泡を硬化させるために、成形型を１時間にわたって４℃で定置した。その後、成形型を、予め冷却した棚（４℃）を有する凍結乾燥機に移した。凍結乾燥手順を上記のように実行した。乾燥手順に続いて、乾燥スポンジを大気圧で３時間にわたって１６０℃において架橋した。
【０１１５】
スポンジからのトロンビン放出。スポンジ［２．５×２．５×１（厚さ）ｃｍ］を５０ｍＬポリプロピレンチューブの内側の１０ｍＬの緩衝液（０．４％クエン酸三ナトリウム二水和物、１５４ｍＭのＮａＣｌ及び１％ＢＳＡ）中に浸漬した。チューブを室温でローラー上に配置した。
【０１１６】
様々な時点において緩衝液中で回復したトロンビンの活性を測定することにより、スポンジからのトロンビン放出を測定した。以下の変更された欧州薬局方アッセイ（０９０３／１９９７）手順により、トロンビンの凝固活性を測定した。簡潔には、各トロンビン標準溶液（４、６、８及び１０ＩＵ／ｍＬ；Ｏｍｒｉｘ  ＩＬ；米国特許第５，１４３，８３８号及び欧州特許第３７８，７９８号に記載されているように調製）を３０℃で２分間にわたってインキュベートした。次に、各標準溶液の４０μＬのトロンビン溶液を１６０μＬのフィブリノゲン溶液（０．１％；Ｅｎｚｙｍｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；カタログＮｏ  ＦＩＢｌ）と混合し、凝固時間を測定した（Ｈａｅｍｏｓｔａｉｓｉ  ａｎａｌｙｓｅｒ：Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ；Ｍｏｄｅｌ  Ｓｔａｒｔ）。凝固時間の対数ｖｓ．トロンビン濃度の対数の検量線をプロットした。次に、０．３ｍＬの試料をチューブから取り、そこから４０μＬを測定に使用した（同量の緩衝液を加え直して試料体積を補充した）。実験の開始後から以下の時点で測定を二重に実行した：２、５、１０、１５、３０、４５及び６０分。得られた凝固時間（凝固機により自動的に計算、検量線から内挿し、かつ希釈係数を乗じた）により各試料中のトロンビンの活性を決定した。
【０１１７】
ラット腎出血モデル。現行の倫理的要件に従って認可された施設で３５０〜５００ｇのＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙアルビノラットを飼育した。各動物の健康を確かめ、明らかに健康な動物のみを試験に使用した。入手後、少なくとも５日間の馴化期間に置いた。動物には、適宜市販のげっ歯類用飼料を提供し、自由な飲料水摂取をさせた。Ｐｅｎｔａｌ（３０〜５０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射で動物を麻酔にかけた。その後、傍腰部（paralumbar）切開のために、動物の左側腹部の毛を剃った。剃った部位をアルコールで拭いた。３８〜４０℃の温度を維持するために、ラットを４０℃に予熱した水槽上のプラスチックカバー台に定置した。熱プローブを動物の直腸に挿入し、体温をモニターした。動物を横向きに配置し、ヘパリンナトリウム（２０００ＩＬＶＫｇ）を尾静脈を通して静脈内に注射した。左傍腰部切開口を左臀部から第１２肋骨まで作り、左腎を露出し、周囲脂肪から分離した。ラットを背臥位に再配置し、５分間にわたって又は体温が最高３９℃になるまで安定化させた。腎血管を柔らかな血管クランプで閉塞し、切開口の背縁、外に出した腎臓と切開された腹壁との間にガーゼのパッドを押し込んで、切開口から又は腎臓の背後の腹腔から流れるあらゆる血液及び流体を吸収させた。血流を腎臓からパッド中に向けるために、一片の透明な予め切ったプラスチック片をガーゼのパッドの上に配置した。別の１つ又は２つの正方形のガーゼをプラスチックの台の底部に置き、腎血管を柔らかな血管クランプで閉塞した。矢状片側腎切除を行い、腎臓の遠位半分体全体を腎血管に垂直に除去した。腎臓の除去区画の切断面を一片の濾紙で３回拭いて、切除表面積を測定した。３つの腎臓ブロットをそれぞれトレースして、表面積測定を助けた。残った腎臓の切断面をブロット乾燥させた。腎臓クランプを解放する前に、圧力下で１分間にわたって腎臓の切断面上にゼラチンスポンジを適用した。１時間にわたり、出血の発生について腎臓を観察した。スポンジを通過する出血が生じたときには、出血領域をガーゼで優しく拭いた。出血表面からゼラチンスポンジを取り除くと出血の再開が生じたが、これは出血停止がゼラチンスポンジの適用によるものであったことを実証する。血液に浸漬したパッドの重量測定により、腎失血を査定した。生き残った動物はＣＯ２窒息により安楽死させた。
【０１１８】
タンパク質層についての安定性査定。安定性査定は、スポンジからのタンパク質層の脆砕性を測定する。打抜機を使用して、すぐに使える架橋ゼラチンスポンジから約１．７ｃｍの試料を切断し、その重量を測定した。次に、試料をホウケイ酸塩ガラスシンチレーション用バイアル瓶（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；カタログＮｏ  ０３−３３７−４）内に、コーティング面を上向きに、バイアル瓶に栓をした状態で、配置した。プラスチックチューブ（長さ１２１．９ｃｍ（４８インチ）及び直径４．１２７５ｃｍ（１．６２５インチ））を保持できる、延長クランプを有する支持スタンドを、硬い水平面上に配置した。プラスチックチューブをクランプ内に垂直方向に挿入し、クランプを締め、固体シリコーンストッパー（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；カタログＮｏ  ０９−７０４−ＩＰ）をプラスチックチューブの底に配置した。プラスチックブロックをシリコーンストッパーの下に配置して、測定中にシリコーンストッパーが放り出されるのを防いだ。その後、試料を含有するバイアル瓶を栓の側を上にしてプラスチックチューブの上から落とした。各落下は、変動性を除去して標準化を確保するために、同一の地点から実行した。試料を４回落とした後で、試料を重量測定した。試料の落下前重量から試料の落下後重量を引き算することにより、粉末喪失を計算した。試料の重量減少の百分率を下式により計算した：
【数１】
0005615719.tif 000002
【０１１９】
５％未満の重量減少であれば、スポンジ表面から剥がれ落ちない安定な層としてみなされる。
【０１２０】
８０００及び４０００ＩＵ／ｍＬのトロンビン溶液の調製。
１０Ｋ  Ｏｍｅｇａ（商標）Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｄｉｓｃ  Ｆｉｌｔｅｒｓ  （ＳＥＲ  Ｎｏ．３９１８２１０１）を使用して、１０００ＩＵ／ｍＬのトロンビン溶液（Ｏｍｒｉｘ，ＩＬ；米国特許第５，１４３，８３８号及び欧州特許第３７８，７９８号に記載のように調製）の濃縮及び透析濾過を実行し、これにより、８０００ＩＵ／ｍＬのトロンビン溶液を得た。８０００ＩＵ／ｍＬの溶液をＬ９緩衝溶液で希釈する（１：１の比）ことにより、トロンビン溶液４０００ＩＵ／ｍＬを調製した。上記に示したフィルターを使用してＬ９緩衝溶液の濃縮及び透析濾過を実行した。
【０１２１】
３点曲げ屈曲性試験。この試験は、逆向きの力が軸に沿って印加されるときにその軸に沿って物体が変形する傾向を測る弾性係数についての数値を提供する。曲げ治具（ＧＦ−５４  ３−Ｐｏｉｎｔ  Ｂｅｎｄ  Ｊｉｇ；ＬＬＯＹＤ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ）を使用して、測定を実行した。いったん、治具の曲げハブを全長４０ｍｍに調節してから、被検査物をこれらの上に配置し、曲げ試験の持続時間を通して被検査物上に圧縮力を印加した（ＬＦ  ｐｌｕｓ  ｓｅｒｉｅｓ，ＬＬＯＹＤ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ，Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，ＵＫ）。伸長速度を１５ｍｍ／分に設定した。被検査物が破裂するまで、曲げ試験を実行した。
【０１２２】
実施例１：スポンジ内への液体取り込みと、真空乾燥手順後のゼラチンスポンジの厚さ及び外観との間の関係。
この実験は、乾燥後のスポンジの厚さ及び外観におけるスポンジ内への液体取り込みの影響を判定することを目的とした。ＮＰ４０、非イオン性界面活性剤、を液体配合物中に加えて、スポンジ内への液体取り込みを変更した。この目的のために、７×５×１（厚さ）ｃｍのＳＰＯＮＧＯＳＴＡＮ（登録商標）スポンジ（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎにより流通；カタログＮｏ  ＭＳ０００２）を２．５×２．５×１ｃｍの寸法に切断した。これらのスポンジは、８０〜９０ｍｇの重量であり、様々な液体配合物及び体積を有するプラスチックトレイ［３×３×０．２（深さ）ｃｍ］内に３分間にわたって配置された。試験設計を以下の表１に列挙する。毛管現象の結果として吸水が生じた。スポンジ内への液体取り込みは、湿潤化手順の前後にスポンジを重量測定することにより、重力測定的にモニターされたが、ただし、１ｍｇを１μＬとして考えた。その後、スポンジを上記のように真空炉で乾燥し、これらの厚さを測定した。これらの結果を以下の表１に特定する。
【表１】
0005615719.tif 000003
＊Ｌ９組成物−２０ｍＭの酢酸ナトリウム、４０ｍＭのＣａＣｌ２、１１０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％ｗ／ｗのヒトアルブミン、及び２％ｗ／ｗのマニトール；ｐＨ６．９〜７．１。
＊＊ＭＢ−メチレンブルー（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ；カタログＮｏ．ＭＥ１４１，ＵＳＰ−２５ｇ）。
【０１２３】
Ａ．真空乾燥後のスポンジの厚さにおけるスポンジ内への液体取り込みの影響。
スポンジＮｏ．１及び２を各々５００μＬの生理食塩水及び蒸留水＋０．１％ＮＰ４０中に部分的に浸漬した。スポンジの液体取り込みの測定は、蒸留水＋０．１％ＮＰ４０を含有する液体中に部分的に浸漬することによって、生理食塩水に浸漬したゼラチンスポンジよりも多くの液体吸収と、真空乾燥したときのスポンジの厚さにおける有意な減少と、が生じることを明らかにした（スポンジＮｏ．２及びＮｏ．１；各々４５７．８ｍｇの液体取り込み及び３．７ｍｍの厚さｖｓ．１１８．４ｍｇ及び９ｍｍ）。液体取り込み及びスポンジの厚さは、表１に列挙されている。
【０１２４】
図１Ａ〜Ｂは、乾燥手順後の、蒸留水＋０．１％ＮＰ４０中に部分的に浸漬したスポンジ（Ｂ；スポンジＮｏ．２）と比較した生理食塩水中に部分的に浸漬したスポンジ（Ａ；スポンジＮｏ．１）の平面図を示す。これらの結果は、スポンジＢが、特に液体を吸収した上側において歪み、縮んでいることを示す。スポンジの側面図において、スポンジ２はスポンジ１よりも薄い（各々図１Ｄ及びＣ）。乾燥後のスポンジの厚さは、液体取り込みに対して可逆比例していることが示された。
【０１２５】
スポンジ６及び７［各々、６００μＬのＬ９＋生理食塩水＋０．５％メチレンブルー（ＭＢ）及び６００μＬのＬ９＋生理食塩水＋０．０１％ＮＰ４０＋０．５％ＭＢ］を比較すると、これらの結果は、スポンジＮｏ．７は、スポンジＮｏ．６と比較して３倍を超える液体を吸収したことを示している（各々５６７．８  ｖｓ．１６４．７ｍｇ）。前述の実験の設定で示したように、スポンジ７の多量の液体取り込みにより、真空乾燥したときのスポンジの厚さに有意な減少が生じた（スポンジ６の８．２５ｍｍと比較して４．７５）。スポンジ６及び７の平面図（各々図２Ａ〜Ｂ）は、スポンジ７がスポンジ６よりも縮んでいることを示す。側面図は、スポンジ７がスポンジ６よりも薄く、歪んでいることを示す（各々図２Ｄ及びＣ）。これは、乾燥中にスポンジの崩壊を生じる、スポンジの多量の液体取り込みの結果である。
【０１２６】
また、各々２００μＬのＬ９＋生理食塩水＋０．５％ＭＢ中及び２００μＬのＬ９＋生理食塩水＋０．０１％ＮＰ４０＋０．５％ＭＢ中に部分的に浸漬したスポンジＮｏ．３及び４の比較は、界面活性剤の存在の結果として液体取り込みが増加することを示す。
【０１２７】
以上の結果は、例えば、ＮＰ４０といった界面活性剤を溶液に組み込むことが、スポンジの吸水時間を促進又は改善することを示す。界面活性剤の組み込みは、液体組成物の表面張力の低下を引き起こし、その結果、スポンジ内への液体取り込みが増加する。これは真空乾燥したときにスポンジの厚さに有意な減少をもたらすことが分かっている。それゆえに、界面活性剤を含有する組成物を使用するときには、浸漬時間は、スポンジの乾燥収縮及び変形を避けるために、そのような作用剤を有さない同一の組成物の吸水時間と比較して減らすべきである。
【０１２８】
Ｂ．乾燥工程後のスポンジの厚さにおける湿潤化時のスポンジ内への液体浸透深度の影響
実験の別の設定では、２００又は６００μＬのＬ９＋生理食塩水＋０．５％ＭＢを含有するトレイ内にＳＰＯＮＧＯＳＴＡＮ（登録商標）スポンジを配置した（各々スポンジ３及び５）（スポンジとトレイの寸法は上述されている）。
【０１２９】
これらの結果は、スポンジ５が、スポンジ３と比較して約３．５倍多くの液体を吸収したことを示す（各々、１６１．２及び４４ｍｇの取り込み）。スポンジ５の多量の液体吸収により、スポンジ３と比較して重度の着色が生じた（図３Ａ〜Ｂは各々スポンジ３及び５を示す）。
【０１３０】
図３Ｃ〜Ｄは各々スポンジ３及び５の側面図を示す。以上に示した結果は、浸漬中にトレイ内に存在する体積がスポンジ内への液体取り込みに影響し得ることを示唆する。液体浸透深度は比較的低く（スポンジＮｏ．３及び５について各々最初の高さの０．７０４及び２．５７％）、乾燥工程後の両方のスポンジにおいて真空乾燥中に最小限の崩壊が生じた（各々９及び８．２５ｍｍ）。
【０１３１】
実施例２：ゼラチンスポンジ内への液体取り込みにおけるエタノールの影響。
上記の例は、毛管現象によるスポンジ内への液体取り込みが液体の種類（例えば、界面活性剤の組み込み）によって影響されることを示す。増加した液体取り込みは乾燥収縮において有意な減少をもたらすこともまた分かった。以下の例は、湿潤化組成物に界面活性剤を含める影響を更に調べるために実行された。エタノール及びＧＥＬＩＴ  ＡＳＰＯＮ（Ｇｅｌｉｔａ  Ｍｅｄｉｃａｌ；カタログＮｏ．ＧＳＯｌＯ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  １０；寸法８０×５０×１０ｍｍ）をこれらの実験に使用した。スポンジを寸法２．５×２．５×１ｃｍに切断し、２０％エタノールを有するか又は有さない、様々な体積のＬ９＋０．１ＭのＮａＣｌを含有するプラスチックトレイ［３×３×０．２ｃｍ（深さ）］内に配置した。スポンジを１５分間にわたってインキュベートし、重量測定した。試験設計を以下の表２に特定する。
【表２】
0005615719.tif 000004
【０１３２】
図４に要約された結果は、前述の結果を確証し、２０％エタノールなどの界面活性剤の組み込みがスポンジの液体取り込み能力の変更をもたらすことを示す。
【０１３３】
実施例３：トロンビンの凝固活性における界面活性剤の影響。
本実施例は、トロンビンの活性における界面活性剤添加の影響を判定することを目的とした。この目的のために、０．８ｍＬのトロンビン溶液（１０００ＩＵ／ｍＬ；Ｏｍｒｉｘ  ＩＬ）を０．２ｍＬの９５％エタノールと混合した。この混合物を室温で最大６０分間インキュベートし、トロンビンの活性を１５分毎に測定した。対照群では、エタノールの代わりに蒸留水を使用した。上記方法セクションに特定されている変更された欧州薬局方アッセイ（０９０３／１９９７）手順により、回復トロンビンの活性を測定した。表３は、様々な時点での配合物における回復トロンビンの活性を要約する。
【表３】
0005615719.tif 000005
【０１３４】
エタノールを含有する配合物における回復活性は、対照群の回復活性と同様であった。これらの発見は、２０％エタノールはトロンビンの凝固活性に影響しないことを示唆する。
【０１３５】
実施例４：様々なスポンジ内への毛管現象による液体吸収の動力学。
この例は、スポンジ内への液体吸収の動力学を示す。吸収は、毛管減少の結果として実行された。異なる製造者の２つのスポンジで実験を行った：ＳＰＯＮＧＯＳＴＡＮ（登録商標）（８０〜９０ｍｇ）及び自社製スポンジ（上記のようにＯｍｒｉｘ  ＩＬで製造）。４００μＬのＬ９緩衝液＋０．１ＭのＮａＣｌを含有したプラスチックトレイ（３×３×０．２ｃｍ）内にスポンジを配置した。加えて、４００μＬのＬ９緩衝液＋０．１ＭのＮａＣｌ＋０．０２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有した別の配合物内にＳＰＯＮＧＯＳＴＡＮ（登録商標）スポンジを配置した。様々な時点でスポンジを重量測定することにより、液体吸収をモニターした。
【０１３６】
これらの結果は、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０による配合物の補充が、スポンジを濡らすのに必要とされる吸水時間を有意に低減し、ＳＰＯＮＧＯＳＴＡＮ（登録商標）スポンジの液体取り込み能力を増加させることを実証する。更に、自社製スポンジはＳＰＯＮＧＯＳＴＡＮ（登録商標）スポンジよりも急速に液体を吸収したことが示唆される（図５）。
【０１３７】
実施例５：真空乾燥後のスポンジの厚さにおける、スポンジ内への液体取り込みの影響。
スポンジの液体取り込みの増加は、真空乾燥したときのスポンジの厚さにおける減少をもたらすことが示された。これらの結果を以下の設定の実験で検証した。様々な液体体積のＬ９＋０．１ＭのＮａＣｌを含有するトレイ［３×３×０．２ｃｍ］内に３分間にわたって２．５×２．５×１ｃｍのＳＰＯＮＧＯＳＴＡＮ（登録商標）スポンジ［５×７×１ｃｍから切断］を配置した。湿潤化工程後、上記方法セクションで特定したように、真空炉内でスポンジを乾燥させた。トレイ内の液体体積、乾燥したスポンジの重量、液体取り込み及び真空乾燥したスポンジの厚さを以下の表４に特定する。図６は、スポンジの液体取り込みに対してプロットされた、真空乾燥手順後のスポンジの厚さを示す。これらの結果は前述の結果を裏付け、真空乾燥手順により、過剰に湿潤したスポンジの崩壊を生じることを示す。それゆえに、タンパク質又はペプチド活性成分を含む少量の液体をスポンジの一表面に適用することは特に有利である。活性成分の適用に少量の液体を使用することにより、タンパク質又は活性成分の薄層を表面上に有するスポンジが得られ、スポンジの元々の特徴（高さ、質感及び外観）が本質的に保持される。
【０１３８】
実施例６：乾燥後のスポンジの吸水能力におけるスポンジの厚さの影響。
乾燥工程後のスポンジの吸水能力におけるその厚さの影響を調べるために、上記の（実施例５からの）真空乾燥したスポンジを米国薬局方（ＵＳＰ）に従って２分間にわたって蒸留水中に浸漬した。浸漬手順の前後でスポンジを重量測定した。スポンジの厚さ、真空乾燥したスポンジの重量、最終製品の吸水量及びスポンジの給水能力を以下の表４に列挙する。スポンジの給水能力は、下式により計算された：（最終製品の正味吸水量−真空後の乾燥重量）／真空後の乾燥重量。厚さに対してプロットされたスポンジの吸収倍率を図７に示す。これらの結果は、スポンジが流体を吸収する能力が乾燥手順後のスポンジの厚さに正比例する、すなわち、薄いスポンジは厚いスポンジよりも少量の流体を吸収することを示唆する。
【０１３９】
米国薬局方によると、吸収性ゼラチンスポンジは、その重量の３５倍以上の水を吸収すべきである。この薬局方の要求に応えるために、ＳＰＯＮＧＯＳＴＡＮ（登録商標）スポンジは、７．４４ｍｍ以上の厚さを保持すべきであり、すなわち、これらのスポンジは、乾燥手順中にこれらの最初の重量から２５％を超えて喪失すべきではない。更に、７．４４ｍｍ以上の厚さを得るために、ＳＰＯＮＧＯＳＴＡＮ（登録商標）スポンジの液体取り込みは、２１９μＬ以下であるべきである（実施例５による；図６）。スポンジ内への液体取り込みの計算は、その元々の構造を保持し、乾燥後に生じ得る変形を避けるために、スポンジ内への液体取り込みが乾燥工程前のスポンジの３．５体積％以下であり得ることを示す。
【表４】
0005615719.tif 000006
＊スポンジの吸水能力は以下のように計算された：（最終製品の正味吸水量−真空後の乾燥重量）／真空後の乾燥重量。
【０１４０】
実施例７：スポンジの厚さにおける凍結乾燥と真空乾燥手順の比較。
前述の例において、真空乾燥により湿潤したスポンジの収縮が生じることが示された。以下の例は、上記の結果を裏付け、スポンジの厚さにおける凍結乾燥と真空乾燥手順の両方の影響を調べるために実行された。２つの異なるゼラチンスポンジ、市販のスポンジ（５×７×１ｃｍのＳＰＯＮＧＯＳＴＡＮ（登録商標）スポンジ）及び自社製スポンジ（上記のように製造）、を使用して、実験を実行した。
【０１４１】
両方のスポンジを２．５×２．５×１ｃｍ、重量８０〜９０ｍｇに切断し、増加体積のＬ９＋０．１ＭのＮａＣｌを含有するプラスチックトレイ（３×３×０．２ｃｍ）内に３分間にわたって配置した。湿潤化工程後のスポンジの重量を測定し、正味液体取り込みを計算した。
【０１４２】
その後、ＳＰＯＮＧＯＳＴＡＮ（登録商標）を真空乾燥又は凍結乾燥（前述のように）のいずれかで乾燥させ、自社製スポンジを真空炉により乾燥させた。乾燥手順後にスポンジの厚さを測定する。
【０１４３】
図８は、乾燥手順後の市販のスポンジ（ＳＰＯＮＧＯＳＴＡＮ（登録商標））の厚さと浸漬工程中の正味液体取り込みとの間の逆相関関係を示す。ＰＶ−部分的に浸漬した後に真空乾燥したスポンジ；ＰＬ−部分的に浸漬した後に凍結乾燥手順を行ったスポンジ。
【０１４４】
これらの結果は、正味液体取り込みの増加により、乾燥手順後のスポンジの厚さの減少が、凍結乾燥と真空乾燥手順の両方において同様な程度で生じたことを示す。しかしながら、適用された活性成分の厚さを比較すると、これらの結果は、真空での乾燥（図９Ａ、Ｃ）は、凍結乾燥手順（図９Ｂ、Ｄ）よりも薄い層を生じさせることを示す。真空乾燥したスポンジの乾燥した上層は、乾燥したスポンジの全体厚さの５．８〜８．３％であったのに対して、凍結乾燥したスポンジでは１２．５〜２４％であった。適用された物質のこの厚さの層は、各図の上部に黒い四角形でマークされている。
【０１４５】
自社製スポンジの浸漬工程中におけるスポンジの正味液体取り込みと乾燥後のスポンジの厚さとの間の関係の結果は図１０に示されている。これらの結果は、浸漬工程中における液体取り込みと乾燥手順後のスポンジの厚さとの間に逆相関関係がある、すなわち、乾燥工程は過剰に湿潤したスポンジの収縮をもたらす、ことを示唆する前述の結果と一致する。これらの結果は、液体組成物の非常に薄い層での適用における利点を強調する。
【０１４６】
実施例８：異なるゼラチンスポンジからの活性成分の放出。
以下の例は、ゼラチンスポンジからの活性物質の放出を判定するために、及び、スポンジのインビボ性能を査定するために、行われた。この目的のために、２．５×２．５×１ｃｍのＳＰＯＮＧＯＳＴＡＮ（登録商標）ゼラチンスポンジを以下のように完全に又は部分的に浸漬した。完全に浸漬したスポンジ用に、２ｍＬのトロンビン溶液（１０００ＵＩ／ｍＬ）を２０ｍＬのＬ９緩衝液に加えて、９０ＩＵ／ｍＬ溶液を得た。スポンジを濡らし、揉み、この溶液中に約１分間にわたって浸漬した。スポンジは、３５ＩＵ／ｃｍ２（２２５ＩＵ／インチ２）に相当するおよそ２．５ｍＬを吸収した。部分的に浸漬したスポンジを、４００μＬのトロンビン溶液（１６００ＩＵ／ｍＬ）を含有する３×３×０．２ｃｍのプラスチックトレイ内に約３分間にわたって浸した。この溶液を毛管現象により吸収させた。この方法で、スポンジは、３５ＩＵ／ｃｍ２（２２５ＩＵ／インチ２）に相当する平均１４０ｍｇの液体を吸収する。その後、完全に浸漬したスポンジを凍結乾燥で乾燥させ、部分的に浸漬したスポンジを真空炉で乾燥させた（両方の乾燥手順は方法セクションで上記で特定したように実行した）。
【０１４７】
方法セクションで特定されているような様々な時点におけるトロンビンの凝固活性を測定することにより、スポンジから放出されるトロンビンを試験した。
【０１４８】
この発見は、完全に浸漬した後に凍結乾燥手順を行うことにより調製されたスポンジが、トロンビンを徐々に放出した、部分的に浸漬して真空炉で乾燥させることにより調製されたスポンジよりも、トロンビンを速く放出することを示す。更に、これらの結果は、試験の最後にはどちらのスポンジも同様の回復活性を有することを示し、これは、部分的に浸漬した後に真空炉乾燥手順により調製したスポンジがトロンビンの活性を保存することを示唆する（図１１）。
【０１４９】
上記のように、ラット腎出血モデルで腎失血を測定することにより、これらの２つのゼラチンスポンジ［完全に浸漬した後に凍結乾燥手順を行った（Ａ）と部分的に浸漬した後に真空炉で乾燥させた（Ｂ）］の止血特性の生体内評価を行った。結果を表５に示す。
【表５】
0005615719.tif 000007
＊ｔ検定分析を使用したところ、有意水準０．０５では、２つの群の間に統計的な差異は見られなかった。
＊３５ＩＵ／ｃｍ２のトロンビンを含むＳＰＯＮＧＯＳＴＡＮ（登録商標）を用いて、全ての実験を行った。
【０１５０】
この傾向は、部分的に浸漬したスポンジが完全に浸漬したスポンジよりも失血を防ぐのにより有効であることを示す。加えて、部分的に浸漬したスポンジはまた、乾燥工程後、完全に浸漬したスポンジよりも柔軟であった。
【０１５１】
実施例９：部分的な浸漬及び真空乾燥により調製されるゼラチンスポンジによって達成される止血有効性。
この例は、上記ラット腎出血モデルを使用し、部分的に浸漬して真空乾燥することにより調製されるすぐに使えるゼラチンスポンジの止血特性を評価する。
【０１５２】
実施例８に記載されているようにゼラチンスポンジを調製した（部分的に浸漬したスポンジ）。スポンジの創傷接触表面に適用されたトロンビンの総量は、３５ＩＵ／ｃｍ２であった。表６は、すぐに使えるゼラチンスポンジを使用した場合の失血を要約する。
【表６】
0005615719.tif 000008
＊Ａ群ｖｓ．Ｂ群ｐ＝０．００９１、ｔ検定分析を使用。
＊３５ＩＵ／ｃｍ２トロンビンを含むＳＰＯＮＧＯＳＴＡＮ（登録商標）ゼラチンスポンジを用いて、全ての実験を行った。トロンビンを有さないＳＰＯＮＧＯＳＴＡＮ（登録商標）スポンジを対照群として使用した。
【０１５３】
以上のデータは、トロンビンを有するゼラチンスポンジ（組成Ｂ）が対照ゼラチンスポンジ（組成Ａ）よりも失血を防ぐのに有効であることを実証し、すなわち、スポンジの一表面上にトロンビンの薄層を含むゼラチンスポンジを使用すると失血が有意に低減した。
【０１５４】
実施例１０：ローラー装置：構造及び操作技術。
構造：以下の構成要素を使用して、ローラー装置を組み立てた。
−２つのローラー（長さ６０ｍｍ、直径２０ｍｍ）。これらのローラーの１つをポリプロピレンネット（図１２のマーク番号３を参照；対角寸法：１１００μｍ）で被覆し、下部ローラーとして使用した。
−槽［外形寸法：３８×７２×１５ｍｍ（Ｗ×Ｌ×Ｈ）］。壁の厚さは３ｍｍである。この槽は、最大９．５ｍＬの液体を含有することができる。
−上部ローラーと下部ローラーとの間の空隙を変更できる調節ユニット。このユニットは、２つのネジと２つの調整板（各側に１つ）を含む。
−構造全体を支持するためのベース板。
−５〜２００ＲＰＭの速度範囲を有するモーター。
【０１５５】
ローラーの各末端部にある２つの運搬支持体（５ａ〜ｂ）を使用して、２つのローラーを、一方をもう一方の上にして（１及び２−各々下部及び上部ローラー）ベース板（４）上に配置した。５ａは下部ローラーを保持し、５ｂは上部可動ローラーを保持する。
【０１５６】
構成要素５ａと５ｂの間には、構成要素５ａと５ｂとの間の隙間を維持するために、バネ（６；各側に２つ）が存在する。
【０１５７】
ネジ（ローラーの各末端部に２つ；７）を使用して運搬支持体を固定した。下部ローラーはｙ軸上で据え置きであり、上部ローラーは下部ローラーの上のｙ軸上を往復運動可能である。各運搬支持体の中心には、構成要素４ｂを動かすことにより２つのローラー間の空隙の低減又は増大を生じることができる調節ねじ（８）が存在する。調整板（９）は、調節ネジを支持する。構成要素５ａを通してシャフト（１０）を下部ローラーに接続する。モーターによりシャフトを回転させ、その速度は制御することができる。装置の作動により、２つのローラーの逆向きの回転が生じる。槽（１１）を下部ローラーの下に配置する。ベース板の下の、各末端部に、装置の水平を得るために使用されるネジ（図示せず）が存在する。このローラー装置は、以下の範囲内の任意の基材と適合する：幅最大６０ｍｍ、長さ非限定、厚さ最大３０ｍｍシート状。装置寸法は、様々な幅及び厚さの任意の基材に適合できる。
【０１５８】
操作技術。底部ローラーと上部ローラーとの間の空隙を調節し、装置を硬い水平面に配置し、水準器を使用して水平を調節した。溶液（約９．５ｍＬ）を槽内に注入し、装置を約５分間にわたって操作して、下部ローラーと槽との間の液体平衡取り込みに到達した。次に、スポンジを２つのローラー（図１２のマーク番号１２を参照）間を通過させ、溶液を毛管力によりスポンジの底側上に受動的に付着させた。湿潤化工程中、上部ローラーはスポンジ上に圧力を印加し、これによりスポンジが装置から押し出されるのを可能にし、スポンジの液体取り込み能力を制御する。湿潤化プロセスの前後でスポンジを重量測定し、湿潤化工程後のスポンジの重量を湿潤化前のその重量から引き算することにより、液体取り込みを計算した。追加的な供給の前に溶液を槽に加えてリザーバを維持し、ローラーを操作して下部ローラーと槽との間の液体平衡取り込みに到達させた。
【０１５９】
図１２は、これらの実験で使用された組立装置を示す。１−下部ローラー；２−上部ローラー；３−ポリプロピレンネット；４−ベース板；５−運搬支持体（５ａは下部ローラーを保持し、５ｂは上部可動性ローラーを保持する）；６−バネ；７−ネジ；８−調節ネジ；９−調整板；１０−シャフト；１１−槽；１２−スポンジ。
【０１６０】
実施例１１：市販のスポンジの厚さ測定。
上部ローラーと下部ローラーとの間の空隙は、ローラー装置へのスポンジの供給前に調節される必要がある。スポンジの厚さには変動が存在し得るので、デジタルキャリパーを使用して、２１個のスポンジ（ＳＰＯＮＧＯＳＴＡＮ（登録商標）；５×７×１ｃｍ）で厚さを測定した。スポンジの中心で測定を実行した。結果を表７に列挙する。
【表７】
0005615719.tif 000009
【０１６１】
これらの結果は、スポンジの厚さに変動が存在することを示す。それゆえに、スポンジを装置に通す前にスポンジの厚さをモニターすることが有利である。平均厚さが１０．１±０．４５であったので、したがって、ローラー間の空隙を１０ｍｍに調節した。
【０１６２】
実施例１２：ローラー装置を使用するトロンビンコーティングの適用。
本実施例は、ローラー装置を使用することにより、湿潤化プロセス中のスポンジ内への液体取り込み量を制御できることを示す。
【０１６３】
スポンジの異なる領域間で変動するスポンジの質感特性を観察した：スポンジの上部領域は大きな孔を有して低密度であり（本明細書では「開口側」と称する）、一方で、底側はより小さな孔を有してより高密度であった（本明細書では「閉鎖側」と称する）。
【０１６４】
この装置を上記（実施例１０）に特定したように操作した。開口側を下向きにしてスポンジ（ＳＰＯＮＧＯＳＴＡＮ（登録商標）５×７×１ｃｍ）を装置の中に挿入した。濃縮トロンビン溶液（８０００ＩＵ／ｍＬ）をコーティング溶液として使用した。ローラー速度を２０ＲＰＭに設定した。表８は、２つの設定の実験におけるトロンビン溶液取り込みを示す。
【表８】
0005615719.tif 000010
【０１６５】
これらの結果は、試験されたスポンジ全てでトロンビン取り込みが実質的に同一であってことを示す。４０００ＩＵ／ｍＬの濃度でトロンビン溶液を使用して、これらの結果を検証した。この試験では、液体適用工程は以下の通りであった：開口側を下向きにしてスポンジ（ＳＰＯＮＧＯＳＴＡＮ（登録商標）；５×７×１ｃｍ）を装置内に供給し、真空炉内において約４０Ｐａ（０．４ｍｂａｒ）で３時間にわたって乾燥させ、閉鎖側を下向きにして再び通過させた。ローラー速度を２０ＲＰＭに設定した。各供給の前後で各スポンジを重量測定し、正味重量を計算した。以下の表９に結果を示す。
【表９】
0005615719.tif 000011
【０１６６】
この試験の結果は上述の結果と一致し、ローラー装置がスポンジの表面上に液体を適用するのに有効な方法であることを示す。
【０１６７】
実施例１３：スポンジの液体取り込みにおける液体適用工程中のローラー速度の影響。
この試験の目的は、スポンジの液体取り込みにおけるローラー速度の影響を判定することであった。２０ＲＰＭから１００ＲＰＭへ増加するロール速度を使用して、この査定を実行した。実験中、開口側又は閉鎖側を下向きにしてスポンジ（ＳＰＯＮＧＯＳＴＡＮ（登録商標）；５×７×１ｃｍ）を装置内に挿入した。実施例１０に記載のように装置を操作した。限外濾過したＬ９緩衝溶液で槽を充填した。
【０１６８】
図１３は、スポンジがその開口側（Ａ）又は閉鎖側（Ｂ）のいずれかにおいて装置内に供給されるときの、様々な操作速度でのスポンジの液体取り込みを示す。
【０１６９】
開口側を下向きにしてスポンジを装置内に挿入したとき、ローラー速度の増加は、液体取り込みに大きな影響を与えたことが明白である。スポンジによる液体取り込みは、速度に正比例することが示された。対照的に、閉鎖側を下向きにしてスポンジを挿入したとき、液体取り込みに有意差は観察されなかった。
【０１７０】
更に、この例で示されたように、スポンジの閉鎖側は開口側と比較して、全ての試験速度で低い液体取り込みを呈した。これらの発見は、スポンジの密度がその液体取り込み能力に影響することを示す。低密度スポンジは多くの場合、高密度スポンジよりも多くの通気孔を有し、それゆえにより多くの液体を吸収することができる。
【０１７１】
実施例１２において、閉鎖側が開口側よりも僅かに多い液体吸収を呈したことに注意されたい（各々、１６３．７５±１０．０及び１３７．７４±６．３）。この実験では、始めにスポンジの開口側でスポンジを装置内に挿入し、その閉鎖側で装置内に供給する前に乾燥にかけた。これらの先行工程は、スポンジの液体取り込み能力を変化させるようである。
【０１７２】
本実施例は、ローラーの速度を変化させることにより、スポンジに適用される液体の量を調節できることを示す。
【０１７３】
実施例１４：スポンジの液体取り込み能力におけるスポンジ及び溶液の特性の影響。
上述の例は、スポンジの密度がその液体吸収能力に影響することを示す。これらの結果を検証するために、更には、液体取り込みにおける溶液特性（例えば、粘度）の影響を評価するために、以下の例を実行した。上記のように装置を操作した。Ｌ９緩衝溶液又は上記のように調製したトロンビン溶液（４０００ＩＵ／ｍＬ）のいずれかで、槽を充填した。湿潤化工程を以下のように行った：閉鎖側を下向きにしてスポンジ（ＳＰＯＮＧＯＳＴＡＮ（登録商標）；５×７×１ｃｍ）に装置を通過させ（１回目の通過）、方法セクションで特定したように真空乾燥させ、開口部を下向きにして再び通過させた（２回目の通過）。１回目の供給と同一の溶液を使用して、２回目の供給を実行した。各供給の前後で各スポンジを重量測定し、正味重量を計算した。この手順を異なるローラー速度で実行した（４０〜１４０ＲＰＭ）。
【０１７４】
図１４は、Ｌ９緩衝溶液又はトロンビン溶液（４０００ＩＵ／ｍＬ）を使用した、スポンジの液体取り込み  ｖｓ．ローラー速度を示す。
【０１７５】
これらの結果は、前述の結果を確証し、スポンジの閉鎖側（より高密度側）が開口側よりも少ない液体を吸収することを示す。加えて、上記で証明したように、開口側とは異なり、閉鎖側は異なるローラー速度においても同様な液体取り込みを呈することも明白である。
【０１７６】
また、湿潤化溶液としてトロンビン溶液を使用するとき、スポンジの両側でより多くの液体取り込みが観察された。これは、溶液の粘度の差異の結果であり得る（Ｌ９及びトロンビン溶液について各々０．９５及び０．００１３１Ｐａ．ｓ（１．３１ｃＰｓ））。製造者の使用取扱説明書に従ってガラスキャピラリー粘度計を使用して、２５℃で粘度を測定した。得られた結果は、高粘性の溶液における液体取り込みは、低粘度を有する溶液におけるよりも多いことを示す。
【０１７７】
実施例１５：ＰｉｐｅＪｅｔ（商標）技術を使用するトロンビンコーティングの適用。
以下の例は、ＰｉｐｅＪｅｔ（商標）技術を使用するゼラチンスポンジ上へのトロンビン溶液の適用を実証する。この技術は、数ナノリットルから最大で数マイクロリットルの範囲内で液体を非接触散布するためのバルブフリー方法である。リザーバに接続されたディスペンサは、ピストン（「Ｐｉｅｚｏ  Ｓｔａｃｋ  Ａｃｔｕａｔｏｒ」）及び可撓性ポリマーチューブ（「パイプ」）を含む。チューブに対してピストンを加圧し、液体をノズルから放出する。溶液を適用するとき、基材を動かし、スポンジの表面全体にわたって液体を分散させる（ディスペンサは据え置きである）。最初にスポンジを運搬する台をｙ軸上で動かし、次にｘ軸上で一段階移動させる（滴点間の距離は以下に示される）。スポンジが完全に覆われるまで、これら２つの工程を繰り返した。各停止点で滴下を行った。差動装置の振幅により、ＰｉｐｅＪｅｔ（商標）方法により散布する体積を制御する。どちらも４３０〜４４８ｍｇの重量で７×５×１ｃｍのＳＰＯＮＧＯＳＴＡＮスポンジ（登録商標）を使用して、２つの設定の実験を実行した。第１の設定の実験では、使用されたディスペンサチューブは内径２００μｍを有し、ジェットを以下のパラメータにプログラムした：投与頻度：３７Ｈｚ；滴下量：７ｎｌ；ｘ軸上の滴点間の距離：０．４ｍｍ；ｙ軸上の滴点間の距離：０．４ｍｍ。この群は、４つの異なるスポンジを含有した。２つはその開口側で覆われ、２つはその閉鎖側で覆われた。第２の設定の実験では、使用されたディスペンサチューブは内径５００μｍを有し、ジェットを以下のパラメータにプログラムした：投与頻度：９０Ｈｚ；滴下量：４４ｎｌ。この群は、４つの異なるスポンジを含有し、そのうち、３つのスポンジ（１つはその開口側で、２つはその閉鎖側で、コーティングされた）では、距離を以下のように設定した：ｘ軸−１ｍｍ；ｙ軸−１ｍｍ。追加のスポンジ（試料８）をその開口側で被覆し、ｘ軸上の距離を１ｍｍに設定し、ｙ軸上の距離を０．４又は１ｍｍに設定した（第１列では０．４ｍｍの距離を使用し、第２列では１ｍｍの距離を使用するなどした）。
【０１７８】
どちらの実験でも、使用されたコーティング材は、０．０１％インジゴカルミン（Ａｍｒｅｓｃｏ  ｃｏｄｅカタログＮｏ９８２７−２５ｇ）を含有する８０００ＩＵ／ｍＬのトロンビン溶液であり、プロセス速度を１５００ステップ／秒に設定し、散布総体積は１５０μＬであり、Ｐｉｐｅｊｅｔ（商標）Ｐ９モジュールを使用した。液体適用工程に続き、スポンジを上記のように真空乾燥させた。
【０１７９】
乾燥したスポンジの目視検査は、各スポンジでトロンビン層がスポンジ表面全体にわたって比較的一様に分布したことを示した。層の一様性を定量するために、２つの試料（１．５×１．５ｍｍ）を乾燥したスポンジの角部及び中央部から切断し（各実験から２つずつのスポンジを評価した）、方法セクションに特定したようにトロンビンの活性を測定した。試料領域の予想トロンビンの活性の百分率（１００％）を各試料について計算した。角部試料と中央部試料の測定された活性間のΔを以下の表１０に列挙する。
【表１０】
0005615719.tif 000012
【０１８０】
結果は、トロンビンの活性が、各スポンジの角部試料と中央部試料とで実質的に同一であった（３未満のΔが試験されたスポンジの全てで観察された）ことを示し、これは活性成分がスポンジの表面に等しく分布していることを示唆する。これらの結果は、ＰｉｐｅＪｅｔ（商標）技術が、散布される体積の制御を可能する有効かつ正確な方法であり、結果的にスポンジの表面上に活性成分を含む液体の均一な分布を生じることを実証する。
【０１８１】
実施例１６：スポンジの表面上のタンパク質層の安定性。
この例は、すぐに使えるゼラチンスポンジの表面上のトロンビン層の安定性を調べる。この目的のために、上記のようにローラー装置を使用して、１５０μＬのトロンビン溶液（上記のように調整された８０００ＩＵ／ｍＬ）をＳＰＯＮＧＯＳＴＡＮ（登録商標）スポンジ（７×５×１ｃｍ）の開口側に適用した。湿潤化工程に続き、方法セクションに特定したように、スポンジを真空乾燥させた。方法セクションに特定したように安定性試験を実行した。上記のように調製した２つの異なるスポンジで測定を実行した。３〜４つの異なる試料を各スポンジから個別に採取した。結果を次の表１１に示す。
【表１１】
0005615719.tif 000013
【０１８２】
これらの結果は、スポンジの重量減少がスポンジＩ及びＩＩで各々１．１４及び１．９０％であったことを示す。
【０１８３】
これらの結果は、タンパク質層が安定であり、タンパク質が剥がれ落ちず、タンパク質層は連続的であり、個々の片に破断及び／又は粉砕しないことを示す。
【０１８４】
実施例１７：スポンジの機械特性におけるスポンジ内への液体体積取り込みの影響。
以下の例は、例えば可撓性といった、スポンジの元々の特性における、スポンジ内への液体体積取り込みの影響を評価する。
【０１８５】
この目的のために、ＳＰＯＮＧＯＳＴＡＮ（登録商標）スポンジを５．５×２×１ｃｍの寸法に切断し、７４、１１１及び１７６の取り込みが得られるまで、Ｌ９緩衝溶液を含有するトレイ［３×３×０．２（深さ）ｃｍ］内に部分的に浸漬した。対照ＳＰＯＮＧＯＳＴＡＮ（登録商標）スポンジには、液体を適用しなかった。湿潤化工程の前後でスポンジの重量を測定した。次にスポンジを真空乾燥し、これらの高さを測定し、３点曲げ屈曲性試験を実行した（上記方法セクションを参照）。すぐに使えるスポンジの湿潤化工程中の液体取り込み、乾燥工程後のスポンジの厚さ、及び弾性係数を以下の表１２に列挙する。
【表１２】
0005615719.tif 000014
【０１８６】
これらの結果は、試験された試料の全てがほぼ同一の可撓性強度を有することを明らかにし、これはすぐに使えるスポンジの可撓性が実質的に湿潤化工程後及び乾燥工程後に得られることを示す。
【０１８７】
〔実施の態様〕
（１）  ａ）少なくとも１つの表面を有する、架橋したゼラチンスポンジを提供する工程と、
ｂ）前記スポンジの前記少なくとも１つの表面に、タンパク質又はペプチド活性成分を含む液体を均一に適用する工程であって、適用される前記液体の体積が、ａ）の前記スポンジの体積の５％以下である、工程と、
ｃ）前記スポンジを乾燥させ、
これによって、前記スポンジの少なくとも１つの表面上にタンパク質又はペプチド活性成分の安定な層を含む、可撓性の、乾燥した、架橋したゼラチンスポンジを得る工程と、を含む、タンパク質又はペプチド活性成分を含む、改善された、架橋したゼラチンスポンジを製造するための方法。
（２）  前記液体適用工程が、単一工程で実行される、実施態様１に記載の方法。
（３）  前記液体中にイプシロンアミノカプロン酸が存在しない、実施態様１に記載の方法。
（４）  前記液体適用工程が、ローラーを使用して実行される、実施態様１〜３のいずれかに記載の方法。
（５）  前記液体適用工程が、
ａ）外部表面を有する回転ローラーを提供する工程であって、前記外部表面の少なくとも一部が前記液体を含むリザーバと接触する、工程と、
ｂ）前記ローラーを回転させて、前記液体で前記外部表面を被覆する工程と、
ｃ）前記ローラーの前記外部表面を、前記スポンジの前記少なくとも１つの表面と接触させる工程と、
ｄ）前記ローラーの前記外部表面と、前記スポンジの前記少なくとも１つの表面とを互いに移動させ、
これによって前記液体を前記スポンジの前記少なくとも１つの表面に付着させる工程と、を含む、実施態様４に記載の方法。
（６）  前記外部表面が、前記液体を保持することができる、複数の中空空間を含む、実施態様５に記載の方法。
（７）  前記液体適用工程が、液体ディスペンサを使用して実行される、実施態様１〜３のいずれかに記載の方法。
（８）  前記液体適用工程が、ＰｉｐｅＪｅｔ（商標）技術の使用によって実行される、実施態様７に記載の方法。
（９）  前記乾燥したスポンジの厚さ及び可撓性が、ａ）の前記スポンジのものと実質的に同様である、実施態様１〜８のいずれかに記載の方法。
（１０）  ａ）の前記スポンジの前記厚さの少なくとも７５％が維持される、実施態様９に記載の方法。
【０１８８】
（１１）  前記層の厚さが、前記乾燥工程の後の、前記スポンジの全体厚さの２４％以下である、実施態様１〜１０のいずれかに記載の方法。
（１２）  前記乾燥工程が、真空炉、凍結乾燥、及び風乾からなる群から選択されるプロセスによって実行される、実施態様１〜１０のいずれかに記載の方法。
（１３）  前記乾燥工程が、真空炉によって実行される、実施態様１２に記載の方法。
（１４）  前記活性成分がトロンビンを含む、実施態様１〜１３のいずれかに記載の方法。
（１５）  前記液体中の前記トロンビンの活性が、約２〜約１５，０００ＩＵ／ｍＬの範囲、約２〜約４，０００ＩＵ／ｍＬの範囲、又は約４，０００〜約１０，０００ＩＵ／ｍＬの範囲である、実施態様１〜１４のいずれかに記載の方法。
（１６）  改善された、乾燥した、架橋したゼラチンスポンジであって、前記スポンジは、前記スポンジの少なくとも１つの表面上にタンパク質又はペプチド活性成分の層を含み、前記層は、前記スポンジの全体厚さの約２４％以下の平均厚さを有し、前記層は安定であり、前記表面全体にわたって実質的に均一に分布し、前記スポンジの厚さ、及び可撓性は、元の、同等の層化されていないゼラチンスポンジに見出されるものと、実質的に同様である、改善された、乾燥した、架橋したゼラチンスポンジ。
（１７）  前記層中に湿潤剤が存在しない、実施態様１６に記載のスポンジ。
（１８）  前記活性成分がトロンビンを含む、実施態様１６又は１７に記載のスポンジ。
（１９）  前記トロンビンの活性は、約１〜約３００ＩＵ／ｃｍ２の範囲、約１０〜約４０／ＩＵｃｍ２の範囲、又は約２０〜約４０ＩＵ／ｃｍ２の範囲である、実施態様１８に記載のスポンジ。
（２０）  外科手術で使用するための、実施態様１６〜１９のいずれかに記載のスポンジ。
【０１８９】
（２１）  血液凝固を促進するための、実施態様２０に記載のスポンジ。
（２２）  実施態様１６〜１９のいずれかに記載の、無菌の架橋したゼラチンスポンジを含む、パッケージ。
（２３）  創傷又は出血部位に、実施態様１６〜１９のいずれかに記載の架橋したゼラチンスポンジを投入すること、又は実施態様２２に記載のパッケージを使用すること、を含む、血液凝固を促進するための方法。
（２４）  実施態様１６〜１９のいずれかに記載の架橋したゼラチンスポンジ、又は実施態様２２に記載のパッケージの、血液凝固を促進するための使用。
【図１ａ−１ｂ】
0005615719.tif 000015
【図１ｃ−１ｄ】
0005615719.tif 000016
【図２ａ−２ｂ】
0005615719.tif 000017
【図２ｃ−２ｄ】
0005615719.tif 000018
【図３ａ−３ｂ】
0005615719.tif 000019
【図３ｃ−３ｄ】
0005615719.tif 000020
【図４】
0005615719.tif 000021
【図５】
0005615719.tif 000022
【図６】
0005615719.tif 000023
【図７】
0005615719.tif 000024
【図８】
0005615719.tif 000025
【図９ａ−９ｂ】
0005615719.tif 000026
【図９ｃ−９ｄ】
0005615719.tif 000027
【図１０】
0005615719.tif 000028
【図１１】
0005615719.tif 000029
【図１２】
0005615719.tif 000030
【図１３ａ】
0005615719.tif 000031
【図１３ｂ】
0005615719.tif 000032
【図１４】
0005615719.tif 000033