(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
メタルヒジウムｓｐ．ＳＭＺ−２０００株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１１３）。
【請求項２】
請求項１に記載のメタルヒジウム属の菌を含む、害虫防除剤。
【請求項３】
アザミウマ類、コナジラミ類、及びアブラムシ類の何れかに属する害虫を防除するための請求項２に記載の害虫防除剤。
【請求項４】
アザミウマ類に属する害虫、及びアブラムシ類に属する害虫を防除するための請求項３に記載の害虫防除剤。
【請求項５】
アザミウマ類に属する害虫、コナジラミ類に属する害虫、及びアブラムシ類に属する害虫を防除するための請求項３に記載の害虫防除剤。
【請求項６】
請求項１に記載の菌、或いは請求項２に記載の害虫防除剤を使用することを特徴とする害虫の防除方法。
【請求項７】
アザミウマ類、コナジラミ類及びアブラムシ類の何れかに属する害虫に適用する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
アザミウマ類に属する害虫、及びアブラムシ類に属する害虫に適用する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
メタルヒジウムｓｐ．ＳＭＺ−２０００株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１１３）を、紫外線又は変異誘発剤に曝して遺伝的変異を生じさせる工程、或いは遺伝子工学的方法で遺伝子を改変する工程を含む、昆虫病原性微生物の産生方法。
【請求項１０】
更に、遺伝的変異を生じた菌を培地で培養し、培地に形成されたコロニーから採取した菌株を、アザミウマ類、コナジラミ類、及びアブラムシ類の何れかに属する害虫に対する病原性を試験する工程を含む、請求項９に記載の昆虫病原性微生物の産生方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、昆虫病原性微生物に関する。具体的には、アザミウマ類、コナジラミ類、及びアブラムシ類に対して病原性を有する新規なメタルヒジウム属の昆虫病原性微生物に関する。本発明はまた、そのような新規昆虫病原性微生物を含む害虫防除剤、及びそれを用いた害虫防除方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物の病害虫の防除には、化学物質を用いた防除方法の開発が進展し、現在、化学物質を有効成分とする殺虫剤による防除がその主流を占めている。しかしながら、化学物質を有効成分とする農薬は、その効果が優れている反面、人畜に対して毒性を有しているものや、自然環境に残留して、他の生態系に影響を及ぼすものがある。また化学物質を有効成分とする農薬では、長期間の使用によって当該化学物質に対する抵抗性を獲得した病害虫が出現したり、天然に存在していた天敵まで殺して逆に病害虫を増加させる環境を創出してしまうことがある。
【０００３】
このような化学物質を用いた農薬に対して、他の生態系への影響を極力抑え、防除の目的とする病害虫のみを特異的に駆除する手段として、昆虫病原性微生物を用いる方法が研究されている。
昆虫病原性微生物としては、ボーベリア（Beauveria）属菌、メタルヒジウム（Metarhizium）属菌、ヒルステラ（Hirustella）属菌、ノムラエ（Nomurae）属菌、及びバーティシリウム（Verticillium）属菌等の糸状菌が知られている（特許文献４〜５、９、１２、１５、１９）。また、メタルヒジウム属に属する昆虫病原性糸状菌としては、メタルヒジウム  アニソピィリエ（Metarhizium anisopliae）、メタルヒジウム  フラボビリデ（Metarhizium flavoviride）、及びメタルヒジウム  シリンドロスポラエ（Metarhizium cylindrosporae）等が知られている（特許文献１、２、３、６、７、８、１０、１１、１３，１４、１６、１７、１８、２０、２１、２２及び２３、並びに非特許文献１及び２）。
概括的に昆虫病原性糸状菌を記述する非特許文献３及び４で述べられている通り、メタリジウム属の糸状菌は、鞘翅目及び鱗翅目の昆虫に対して病原性を有するが、半翅目の昆虫に対する病原性は低く、アザミウマ類、アブラムシ類及びコナジラミ類の昆虫に対する病原性は無いものと一般的に理解されている。また、非特許文献５で述べられている通り、メタリジウム属の糸状菌の個々の菌株は、それぞれ異なる様々な種に殺虫効果を奏するが、各菌株が殺虫効果を有する昆虫の範囲は狭いと理解されている。
もっとも、形態分類に基づきメタルヒジウム  アニソピィリエ（Metarhizium anisopliae）と分類された菌株の一部には、アザミウマ類の昆虫に対する病原性が報告されているものがある。例えばVestergaardらは、メタルヒジウム  アニソピィリエ（Metarhizium anisopliae）と分類された菌株が、ミカンキイロアザミウマに対して殺虫効果を有し、ＬＤ５０値が、３×１０５分生子数／ｍｌであったことを報告している（非特許文献６、非特許文献７）。また、本発明者らは、メタルヒジウム  アニソピィリエ（Metarhizium anisopliae）と分類された２株が、ミナミキイロアザミウマに対して殺虫効果を有し、それぞれ２．５×１０５と７．５×１０５ＣＦＵ／ｍｌのＬＤ５０値を有していたことを報告している（非特許文献８）。また、Ｒｅｉｄらは、やはり、メタルヒジウム  アニソピィリエ（Metarhizium anisopliae）と分類された菌株が、モモアカアブラムシに対して殺虫効果を有し、５×１０６分生子数／ｍｌの濃度で、６日後の死亡率が９５％であったことを報告している（非特許文献９）。Ｓｈａｎらは、メタルヒジウム  アニソピィリエ（Metarhizium anisopliae）と分類された９分離株を使用し、１×１０７分生子数／ｍｌ濃度で４日後の死亡率が０〜５０％前後であったと報告している（非特許文献１０）。Ｖｕらは、メタルヒジウム  アニソピィリエ（Metarhizium anisopliae）と分類された菌株をモモアカアブラムシに対して使用したところ、１×１０７分生子数／ｍｌの濃度で４日後の死亡率は７０％であったと報告し、Ｌｕｒｅｉｒｏらも、メタルヒジウム  アニソピィリエ（Metarhizium anisopliae）と分類された菌株が、ワタアブラムシに対して殺虫効果を有し、１×１０７分生子数／ｍｌの濃度で４日後の死亡率が８０％前後であったことを報告している（非特許文献１１、１２）。しかし、いずれの菌株でも、殺虫効果は実用上十分なものではないし、即効性の点でも不十分なものである。
また、これらの菌株は、それぞれミカンキイロアザミウマ、ミナミキイロアザミウマ、モモアカアブラムシ又はワタアブラムシに対して殺虫効果を有するのみであり、アザミウマ類およびアブラムシ類を含む広い範囲の昆虫への有効性は示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】昭６３−１３５３０８号公開特許公報
【特許文献２】特表平９−５０６５０５公表特許公報
【特許文献３】特表平１０−５０９９６４公表特許公報
【特許文献４】特表平１１−５０５４０３公表特許公報
【特許文献５】特表平１１−５０７０１０公表特許公報
【特許文献６】特開平６−１６６６０７公開特許公報
【特許文献７】特開平８−３０１７１３公開特許公報
【特許文献８】特開平１０−２６５３１５公開特許公報
【特許文献９】特開平１１−１３７２４４公開特許公報
【特許文献１０】特開２０００−２３９１１４公開特許公報
【特許文献１１】特開２０００−２３９１１５公開特許公報
【特許文献１２】特開２００１−７８７５１公開特許公報
【特許文献１３】特開２００１−３２７２３７公開特許公報
【特許文献１４】特開２００２−３３８４１９公開特許公報
【特許文献１５】特開２００５−２０６４８６公開特許公報
【特許文献１６】特開２００５−２８９８６４公開特許公報
【特許文献１７】特開２００６−１１７６１７公開特許公報
【特許文献１８】特開２００６−２３２７７５公開特許公報
【特許文献１９】特開２００６−２６５２２６公開特許公報
【特許文献２０】特開２００７−１０４９２４公開特許公報
【特許文献２１】特開２００７−１４２９６公開特許公報
【特許文献２２】特開２００７−１４５７１８公開特許公報
【特許文献２３】特開２００８−２６０７６４公開特許公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Stateers, T. E., Moor, D., and Prior C. (1993) The effect of different temperatures on the viability of Metarhizium flavoviride conidia stored in vegetable and mineral oils. Journal of Invertebrate Pathology, 62, 111-115.
【非特許文献２】Shimazu Mitsuaki (1989) Metarhizium cylindrosporae Chen et Guo (Deuteromycotina: Hyphomycetes), the causative agent of an epizootic on Graptopsaltria nigrofuscata Motchulski (HOmoptera: Cicadidae). Japanese Society of Applied Entomology and Zoology, 24(4): 430-434.
【非特許文献３】Zimmermann Gisbert(2007) Review on safety of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae. Biocontrol Science and Technology, 17, 879-920.
【非特許文献４】Marcos R de Faria, Stephen P. Wraight; Mycoinsecticides and Mycoacaricides: A comprehensive list with worldwide coverage and international classification of formulation types; Biological Contorl 43 (2007) 43 (2007) 237-256
【非特許文献５】福原敏彦（１９７９）昆虫病理学  学会出版センター  東京２２４ｐｐ.
【非特許文献６】Vestergaard S, Butt TM, Bresciani J, Gillespie AT, Eilenberg J., Light and electron microscopy studies of the infection of the western flower thrips frankliniella occidentalis (Thysanoptera:thripidae) by the entomopathogenic funus metarhizium anisopliae; Vestergaard S, Butt TM, : J Invertebr Pathol, 1999 Jan; 73(1):229-35.
【非特許文献７】Vestergaard S, Gillespie AT, Butt TM, Schreiter G,  , Eilenberg J 1995. Pathogenicity of the hyphomycete fungi Vertecillium lecanii and Metarhizium anisopliae to the western flower thrips Frankliniella occidentalis. Biocontrol Science and Tecnology 5, 185-192.
【非特許文献８】岩瀬亮三郎・清水進、ミナミキイロアザミウマにおけるMetarhizium anisopliae分生子の付着と病原力、日本応用動物昆虫学会誌第48巻、第4号：275−280
【非特許文献９】Reid WR, Parker BL, Gouli ST, Skinner M, Gouli VV, Teillon HB.; Fungi associated with the hemlock wooly adelgid, Adelges tsugae, and assessment of entomopathogenic isolates for management; J Insect Sci. 2010, 10:62.
【非特許文献１０】Shan LT, Feng MG.; Evaluation of the biocontrol potential of various Metharthizium isolates against green peach aphid Myzus persicae (Homoptera: Aphididae); Pest Manag Sci. 2010 Jun; 66(6):669-75.
【非特許文献１１】Vu VH, Hong SI, Kim K.; Selection of entomopathigenic fungi for aphid control; J Biosci Bioeng. 2007 Dec; 104(6):498-505.
【非特許文献１２】Lureiro Ede S, Oino A Jr.; Pathogenicity of hyphomycet fungi to aphids Aphis gossypii Glover and Myzus persicae (Sulzer) (Hemiotera:Aphididae); Neotrop Entomol. 2006 Sep-Oct; 35(5):660-665.
【非特許文献１３】昆虫病原菌の検索  青木襄児著１９８９年（全国農協協会）
【非特許文献１４】Driver F., Milner R. J., and Trueman J. W. H. (2000) A taxonomic revision of Metarhizium based on a phylogenetic analysis of rDNA sequence data. Mycol Res. 104, 134-150.
【非特許文献１５】Bischoff J. F., Rehner S. A., and Humber R. A. (2006) Metarhizium frigidum sp. Nov.: a cryptic species of M. anisopliae and a member of the M. flavoviride complex. Mycologia, 98, 737-745.
【非特許文献１６】Bischoff J. F., Rehner S. A., and Humber R. A. (2009) A multilocus phylogeny of the Metarhizium anisopliae lineage. Mycologia, 101, 512-530.
【非特許文献１７】Reed L. J. and Muench H. (1938); A simple method of estimating fifty persent endpoints; Am. J. Higg. 27, 493-497.
【非特許文献１８】Boucias, D.G., J.C. Pendland and J.P. Latge (1988) Nonspecific factors involved in attachment of entomopathogenic deuteromycetec to host insect cuticle. Appl. Environ. Microbiol. 54: 1795-1805.
【非特許文献１９】Helyer, N. L. and P. J. Brobyn (1992) Chemical control of western flower thrips (Frankliniella occidentalis Pergande). Ann. Appl. Biol. 121: 219-231.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、アザミウマ類の害虫に対する昆虫病原性糸状菌をスクリーニングしていた際、メタルヒジウム属に属する菌株を発見し、その菌株の昆虫病原性を調べたところ、アザミウマ類の害虫に対してメタルヒジウム  アニソピィリエ（Metarhizium anisopliae）と分類される既知の昆虫病原性微生物や、他の昆虫病原性微生物よりも高い病原性を示し、更には、アザミウマ類の害虫のみならず、コナジラミ類やアブラムシ類等の害虫に対しても病原性を示すことを見出した。そこで、当該菌株の各種塩基配列等を調査したところ、ハイドロホビンをコードする塩基配列が従来知られているメタルヒジウム属の菌には見られない配列を有していることを見出し、本発明をなすに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、ハイドロホビンをコードする塩基配列が、配列番号３に示す配列の１〜２４３及び３０６〜３４４のＤＮＡ配列、又はそれに９５％以上の配列同一性を有する配列を含む、メタルヒジウム属の菌を提供するものである。このようなメタルヒジウム属の菌は、アザミウマ類の害虫に対して従来知られる昆虫病原性微生物よりも高い病原性を示し、更には、コナジラミ類やアブラムシ類等の害虫に対しても高い病原性を示す。従って、本発明はまた、このような新規メタルヒジウム属の菌を有効成分とする、アザミウマ類、コナジラミ類及びアブラムシ類を含む広範囲の害虫に対し適用可能な害虫防除剤を提供する。
また、本発明は、このような防除剤を使用するアザミウマ類、コナジラミ類及びアブラムシ類を含む広範囲の害虫を対象とし得る防除方法を提供する。
【０００８】
ここで、昆虫病原糸状菌の害虫への感染による防除のメカニズムを簡単に説明する。昆虫病原糸状菌の害虫への感染による防除は、分生子の昆虫クチクラへの付着、菌糸の侵入、体内増殖及び致死メカニズムの工程による。付着及び侵入工程は、１）分生子の昆虫クチクラへの付着、２）クチクラと分生子の付着の強化、及び３）昆虫クチクラ上での発芽の３段階に分けることができ、最初のクチクラへの付着は昆虫病原糸状菌の害虫への感染力に大きく影響する段階である。昆虫病原糸状菌の分生子はBeauveria, Metarhizium, Paecilomyces, Nomuraea属などの疎水性のものと、Hirusutella およびLecanicillium属などの親水性の分生子に大別される。一方、昆虫クチクラは疎水性であるため、この２つのグループでは昆虫クチクラへの付着の機構が異なる。同じく疎水性である分生子を有する前者のグループのクチクラへの付着は、非特異的且つ受動的な疎水的若しくは静電気的な機序による結合であると考えられる。他方、後者のグループでは親水性分生子の表層に無定形の粘液が存在しており、それが昆虫クチクラへの付着を容易にしているものと考えられる。
メタルヒジウム  アニソピィリエ（Metarhizium anisopliae）は、その分生子の表層がハイドロホビン（hydrophobin）と呼ばれる疎水性のタンパクで主に構成されるロッドレッド（rodret）層で覆われており、この強い疎水性を有する層と宿主クチクラとの疎水性相互作用を通じて、分生子が宿主クチクラに付着すると考えられる（非特許文献１８）。また、本発明者らが非特許文献８に示した通り、分生子の付着量と殺虫活性間には正の相関関系が存在する。
理論に拘泥するものではないが、本発明のメタルヒジウム属の菌が有するハイドロホビンは、従来のメタルヒジウム属の菌では見られない塩基配列でコードされるものであり、この特有のハイドロホビンを有するために、分生子が宿主クチクラにより容易にかつ強固に付着することができ、高い殺虫活性を奏するものと考えられる。また、この特有のハイドロホビンが従来のメタルヒジウム属の昆虫病原性糸状菌より広い害虫への殺虫性に関与しているものと推察される。
なお、本願明細書の末尾に記載の配列表における塩基配列は、大文字がコード配列を示し、小文字が非コード配列を示す。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、本願の配列番号３に示すＤＮＡ配列に関しＢＬＡＳＴで類似の配列を検索した結果を示す画面の写しである。
【図２】図２は、メタルヒジウムｓｐ．ＳＭＺ−２０００株（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ  ｓｐ．ＳＭＺ−２０００）の成熟分生子の外観を示す顕微鏡写真（４００倍）の写しである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
上記の通り、本発明による新規な菌は、従来知られているメタルヒジウム属の菌には見られない、特有のハイドロホビンを有するものである。より具体的には、本発明による新規なメタルヒジウム属の菌は、以下の何れかを有する。
（１）配列番号３に示す配列の１〜２４３及び３０６〜３４４のＤＮＡ配列に対して９５％以上、好ましくは９７％以上、更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは１００％の配列同一性を有する塩基配列を含む、ハイドロホビンをコードする塩基配列
（２）配列番号３に示す配列の１〜２４３及び３０６〜３４４のＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列、或いは当該アミノ酸配列の１から５個、好ましくは３以下、より好ましくは２以下のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、ハイドロホビンをコードする塩基配列
（３）配列番号３に示す配列の１〜２４３及び３０６〜３４４のＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の１から５個、好ましくは３以下、より好ましくは２以下のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するハイドロホビン（通常ロドレット層に有する）
【００１１】
後述する実施例で実証されている通り、本発明による新規なメタルヒジウム属の菌は、アザミウマ類に属する害虫、コナジラミ類に属する害虫及びアブラムシ類に属する害虫を含む広範囲の害虫に対して病原性を有する。しかも、メタルヒジウム  アニソピィリエと分類されていた既知の昆虫病原性微生物を含む、他の昆虫病原性微生物と比較して、少なくともアザミウマ類に属する害虫及びアブラムシ類に属する害虫に対してより高い殺虫効果を有する。具体的には、ミナミキイロアザミウマ、ミカンキイロアザミウマ、ネギアザミウマなどのアザミウマ類に属する害虫に対して、１．０×１０７分生子数／ｍｌの分生子懸濁液への浸漬後、２５℃、１６時間の連続的日照条件及び８時間の連続的暗黒下条件での飼育を行う試験で、４日目の死亡率が８０％以上（通常９０％以上、典型的には９５％以上）となる殺虫活性を有し、Ｒｅｅｄ  ａｎｄ  Ｍｕｎｃｈの方法（非特許文献１７）によるＬＣ５０値が１．０×１０４ＣＦＵ／ｍｌ以下（通常５．０×１０３ＣＦＵ／ｍｌ以下、典型的には４．５×１０３ＣＦＵ／ｍｌ以下）となる殺虫活性を有することが実証されている。また、モモアカアブラムシなどのアブラムシ類に属する害虫に対して、１．０×１０７分生子数／ｍｌの分生子懸濁液への浸漬後、２５℃、１６時間の連続的日照条件及び８時間の連続的暗黒下条件での飼育を行う試験で、４日目の死亡率が６０％以上（通常は８０％以上、典型的には９０％以上）となる殺虫活性を有することも実証されている。本発明の新規メタルヒジウム属の菌は、更に他の害虫にも高い殺虫活性を有し、例えば、オンシツコナジラミに対して、１．２×１０７分生子／ｍｌの懸濁液の散布により７０％以上（典型的には８０％以上）の羽化阻害率を達成することができ、コナジラミ類に属する害虫に対しても高い殺虫活性を示す。
このように、本発明の新規メタルヒジウム属の菌は、従来の昆虫病原性微生物には見られない昆虫病原性を有する。
【００１２】
本発明の菌は、メタルヒジウム属の菌であり、通常、核遺伝子に１８ＳリボゾームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列、５．８ＳリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列、２８ＳリボゾームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列及び１８ＳリボゾームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列、並びに各コード配列間に存在するＩＴＳ（internal transcribed spacer）１領域、ＩＴＳ２領域及びＩＧＳ（Intergenic Spacer）を有する。
ここで、本願明細書中「ＩＴＳ１−５．８ＳリボソームＲＮＡ−ＩＴＳ２領域」とは、真菌の核遺伝子に存在する下記構造のＤＮＡ配列のうち、ＩＴＳ１からＩＴＳ２までの領域を意味し、「ＩＴＳ１領域」は、１８ＳリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列と、５．８ＳリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列との間に存在するスペーサー領域で成熟リボゾームＲＮＡをコードしない領域を指し、「ＩＴＳ２領域」は、５．８ＳリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列と、２８ＳリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列との間に存在するスペーサー領域で成熟リボゾームＲＮＡをコードしない領域を指し、「ＩＧＳ領域」は、２８ＳリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列と１８ＳリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列との間に存在するスペーサー領域で成熟リボゾームＲＮＡをコードしない領域を指す。
【化１】
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リボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列の領域は保存性が高いのに対して、ＩＴＳ１領域、ＩＴＳ２領域及びＩＧＳ領域（特にＩＴＳ１領域）は変異が多いため、これらの領域は種内変異の研究によく用いられている。
【００１３】
本発明の好ましい実施形態における菌は、核遺伝子が配列番号２に示す配列の１４２〜２９９のＤＮＡ配列（５．８Sリボゾームのコード配列）、又は当該ＤＮＡ配列に対して９５％以上、好ましくは９８％以上、典型的には１００％の配列同一性を有する塩基配列を含み得る。
また、本発明の好ましい実施形態における菌は、核遺伝子が配列番号２に示す配列の３〜１４１のＤＮＡ配列（ＩＴＳ−１領域）、又は該ＤＮＡ配列に対して７０％以上の配列同一性を有する塩基配列、或いは／並びに、核遺伝子が配列番号２に示す配列の３００〜４７１のＤＮＡ配列（ＩＴＳ−２領域）、又は該ＤＮＡ配列に対して７０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含み得る。ＩＴＳ−１領域及びＩＴＳ−２領域のＤＮＡ配列は、変異が多いためメタルヒジウム属の菌の中でもこれらの領域のＤＮＡ配列は比較的大きく異なるが、ＩＴＳ１領域及びＩＴＳ２領域のＤＮＡ配列の同一性が高いほど分類学上近縁の菌株と評価することができ、両領域のＤＮＡ配列の同一性が非常に高い菌株同士は類似の菌学的特性を有すると考えられる。このため、配列番号２に示す配列のＩＴＳ−１領域及びＩＴＳ−２領域のＤＮＡ配列に対してそれぞれ８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上といったように配列同一性がより高いＤＮＡ配列を有するメタルヒジウム属の菌は、後述する本出願人が寄託した菌株と同じ菌学的特性を有する可能性が高いと考えられる。
同様に、本発明の好ましい実施形態における菌は、核遺伝子が配列番号４に示す配列（ＩＧＳ領域）に対して７０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含み得る。ＩＧＳ領域のＤＮＡ配列でも、塩基配列の同一性が高いほど分類学上近縁の菌株と評価することができ、両領域のＤＮＡ配列の同一性が非常に高い菌株同士は類似の菌学的特性を有すると考えられる。このため、配列番号４に示すＩＧＳ領域のＤＮＡ配列に対してそれぞれ８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上といったように配列同一性がより高いＤＮＡ配列を有するメタルヒジウム属の菌は、後述する本出願人が寄託した菌株と同じ菌学的特性を有する可能性が高いと考えられる。
【００１４】
本発明の好ましい実施形態における菌はまた、通常、Translation Elongation Factor（EF-1α）をコードするＤＮＡ配列を有する。ここで、「Translation Elongation Factor（EF-1α）」とは、ポリペプチド鎖伸長に必要な可溶性タンパク質因子の一つであり、ＧＴＰに依存してアミノアシルｔＲＮＡをリボソームのＡ部位に結合させる機能をもつ因子である。この因子に関する遺伝子の５’側に３つのイントロンが存在し、その領域では変異が多い。このため、これらの領域も、ボーベリア（Beauveria）属やメタルヒジウム（Metarhizium）属の糸状菌における種間、種内の類縁関係の研究に頻繁に用いられている。
本発明の一の実施形態における菌では、核遺伝子が、配列番号１に示す配列の１〜３１、１５９〜２４９、５０３〜６４１及び７１０〜７４７に示すＥＦ−１αのコード配列に対して、９５％以上、好ましくは９８％以上、特に好ましくは１００％の配列同一性を有する塩基配列を含み得る。また、本発明の好ましい実施形態における菌では、核遺伝子が、配列番号１に示すＤＮＡ配列（コード配列とイントロンを含む）に対して９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含み得る。ＥＦ−１α遺伝子のＤＮＡ配列の同一性が高いほど分類学上近縁の菌株と評価されており、この因子のＤＮＡ配列の同一性が非常に高い菌株同士は類似の菌学的特性を有すると考えられる。このため、配列番号１に示すＤＮＡ配列に対して９５％以上、９８％以上といったように配列同一性がより高いＤＮＡ配列を有するメタルヒジウム属の菌は、後述する本出願人が寄託した菌株と類似の菌学的特性を有すると考えられる。
本発明の好ましい実施の形態には、配列番号２に示す配列の３〜１４１のＤＮＡ配列（ＩＴＳ−１領域）と３００〜４７１のＤＮＡ配列（ＩＴＳ−２領域）と、配列番号１に示すＤＮＡ配列（ＥＦ−１α遺伝子領域）と、配列番号４に示す配列に対して９８％以上の配列同一性を有するＤＮＡ配列（ＩＧＳ領域）とを含む、メタルヒジウム属の菌がある。
【００１５】
本出願人は、上記のような特性を有する１つの菌株を、（独）製品評価技術基盤機構・特許微生物寄託センターに寄託し、ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１１３の寄託番号が付与されている。以下では、この菌株をメタルヒジウムｓｐ．ＳＭＺ−２０００株（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ  ｓｐ．ＳＭＺ−２０００）と称する。
【００１６】
このメタルヒジウムｓｐ．ＳＭＺ−２０００株の菌学的性質は以下の通りである。
生育速度（２５℃、７日間）：  集落の直径７．９〜１０．８ｍｍ（ポテトデキストロース培地）
集落表面の色調：  白色（ポテトデキストロース培地）分生子が形成されると緑から黒色に変化
集落裏面の色調：  白色〜明るい黄色（ポテトデキストロース培地）
分生子：  楕円形〜円筒形、連鎖する  長径６．７５〜９．００（平均８．２１）μｍ、短径２．２５〜３．３８（平均２．６４）μｍ
分生子柄：  滑面  短い分生子柄がクションン状に密になりその上に分生子を形成する
厚膜胞子：  形成せず（２５℃、１０日間）
【００１７】
このような菌学的性質の菌株は、青木による形態分類によれば（非特許文献１３）、メタルヒジウム  アニソピィリエ  バライチィ  アニソピィリエ（Metarhizium anisopliae var. anisopliaeni）に同定される。
【００１８】
一方、この菌株は、核のＩＴＳ１−５．８ＳリボソームＲＮＡ−ＩＴＳ２領域の塩基配列が、配列番号２に示すＤＮＡ配列を有し、5’Translation Elongation Factor(ＥＦ−1α)をコードするＤＮＡ配列の一部を含む塩基配列が、配列番号１に示す配列を有していた。
【００１９】
メタルヒジウムｓｐ．ＳＭＺ−２０００株は、Ｄｒｉｖｅｒらの分類（非特許文献１４）によると、上記のＩＴＳ１−５．８ＳリボソームＲＮＡ−ＩＴＳ２領域のＤＮＡ配列から、メタルヒジウム  アニソピィリエ  バライチィ  アニソピィリエ（Metarhizium anisopliae var. anisopliae）と同定され、Bischoffらの分類によると（非特許文献１５及び１６）、5’Translation Elongation Factor(ＥＦ−1α)のＤＮＡ配列から、メタルヒジウム  ピグシェンセ（Metarhizium pingshaense）と同定される。
【００２０】
また、この菌株の顕微鏡写真は図１に示す通りである。この菌株をBischoffらにより（非特許文献１５及び１６）メタルヒジウム  ピグシェンセ（Metarhizium pingshaense）と同定され、成熟分生子の形態が示されているＣＢＳ２５７．９０株と比較すると、この菌株の分生子は、長径に対しての短径が小さくスレンダーであり、形態上の差異が認められた。
【００２１】
本発明の菌は、一般の糸状菌の培養に利用する培地を用いて培養することができ、より具体的には、糸状菌の培養に一般的に用いられる炭素源、窒素源、有機塩、無機塩、及び／又はビタミン等を含む培地を利用することができる。
【００２２】
本発明の菌の培養に利用可能な炭素源としては、例えば、グルコース、フルクトース、サッカロース、マルトース、糖蜜、可溶性デンプン、及びコーンスターチ等が挙げられる。窒素源としては、例えば、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素、酵母エキス、ペプトン、大豆粉、カゼイン等が挙げられる。また、無機塩類及びビタミン等としては、ＮａＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、ＭｎＳＯ４、ＦｅＳＯ４、ＭｇＳＯ４、ＮａＣｌ、糖蜜、酵母エキス、エビオス（ビタミン剤）などを添加することが好ましい。培地のｐＨは６〜８が好ましい。典型的な培地の例としては、ポテトデキストロース培地（ポテトエキス３．９ｇ、ブドウ糖２１ｇ、ｐＨ６．０）や麦芽エキス寒天培地（麦芽エキス３０．０ｇ、大豆ペプトン３．０ｇ、ｐＨ５．６）等が挙げられる。
【００２３】
培養条件も、一般の糸状菌の培養条件と同様でよく、例えば湿度は、８０％以上が好ましく、至適生育湿度は１００％である。また、培養温度は２５〜２８℃が好ましい。また、培養時間は２４〜１２０時間が好ましい。培養はまた、通気撹拌培養等の好気的条件により行うことが好ましい。
【００２４】
培養後、培養液から昆虫病原性糸状菌を分離する場合には、通常の遠心分離法、濾過法等を使用すればよい。
【００２５】
本発明の新規メタルヒジウム属の菌は、これを元株にして自然又は誘発による変異により、或いは遺伝子工学的手法により昆虫病原性を有する変異株を得るために利用することもできる。例えば、本発明の新規メタルヒジウム属の菌に、従来知られている慣用の誘発突然変異方法、例えば紫外線照射、又はＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＥＮＵ）、エタンスルホン酸メチル（ＥＭＳ）、臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）等の変異誘発剤による処理を施して昆虫病原性を有する変異株を得ることができる。この際には、例えば、遺伝子工学的手法による遺伝的改変、紫外線照射又は変異誘発剤による処理を施した菌株を、スキムミルク等を含む寒天培地等の培地に塗抹し、生育してくる菌株の中から、例えばコロニーのまわりに形成されるクリアゾーンがより大きいコロニーを選抜して菌株を採取し、アザミウマ類、コナジラミ類、及びアブラムシ類等の目的とする害虫に対する病原性を試験して、昆虫病原性の高い変異株を選別することで昆虫病原性を有する変異株を得ることができる。なお、変異が生じていることは、慣用の配列決定方法を利用して確認することができる。
ここで、本願において「変異株」とは、メタルヒジウムｓｐ．ＳＭＺ−２０００株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１１３）の有する核遺伝子の塩基配列において欠失、置換、及び／又は付加を生じており、且つメタルヒジウムｓｐ．ＳＭＺ−２０００株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１１３）のアザミウマ類に属する害虫、及びアブラムシ類に属する害虫に対する病原性を維持している菌株をいう。具体的には、メタルヒジウムｓｐ．ＳＭＺ−２０００株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１１３）の有する核遺伝子の塩基配列において欠失、置換、及び／又は付加を生じているが、ハイドロホビンをコードする塩基配列、すなわち配列番号３に示す配列の１〜２４３及び３０６〜３４４のＤＮＡ配列に対して９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の配列同一性を有する配列を含み、典型的には、ハイドロホビンをコードする塩基配列が、配列番号３に示す配列を含むメタルヒジウム属の菌である。
このような変異株には、更に、配列番号１で表されるＤＮＡ配列に対して９８％以上の配列同一性を有するＤＮＡ配列を有するメタルヒジウム属の菌、典型的には配列番号１で表されるＤＮＡ配列を有するメタルヒジウム属の菌が含まれ、更に、配列番号２に示す配列の１４２〜２９９のＤＮＡ配列に対して９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、特に好ましくは１００％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を有するメタルヒジウム属の菌も含まれ得る。勿論、配列番号１で表されるＤＮＡ配列に対して９８％以上の配列同一性を有するＤＮＡ配列と、配列番号２に示す配列の１４２〜２９９のＤＮＡ配列に対して９５％以上の配列同一性を有するＤＮＡ配列とを有するメタルヒジウム属の菌も含まれ得る。
【００２６】
本発明の新規な昆虫病原性微生物を有効成分として害虫防除剤を調製する場合、本発明の新規メタルヒジウム属の菌の含有量はその対象とする有害生物、栽培作物、使用方法、使用時期等、剤型、及び使用目的等に応じて適宜調整すればよいが、通常は本発明の菌を防除剤中１ｘ１０６ＣＦＵ／ｇ、好ましくは１ｘ１０６ＣＦＵ／ｇ〜１ｘ１０８ＣＦＵ／ｇを含む防除剤とすればよい。
【００２７】
本発明における防除剤は、対象とする害虫に対する殺虫効果を高めるための他の有効成分を含有してもよく、例えば対象とする害虫に対する本発明の昆虫病原性微生物の付着性を向上させるために、展着剤、固着剤、デンプン、還元澱粉糖化物などを含有することができる。また、本発明の昆虫病原性微生物の感染を向上させるために、例えばピレスロイド系、カーバメート系、有機リン系、ネオニコチノイド系などの対象害虫の神経又は電子伝達系に影響を及ぼす成分や、昆虫の表皮形成を阻害するフェニルウレア系の昆虫成長阻害剤（Insect Growth Regulator）などを含有させてもよい。また本菌株を処理すると同時に植物の病害を防除する手段として、例えば植物病原菌の発病を抑制する各種殺菌剤などを含有させてもよい。
特に、本発明における防除剤を粒剤として土壌表面又は土壌中に混和する場合には、その効果を向上させるために、上述した対象害虫の神経又は電子伝達系に影響を及ぼす有効成分や、昆虫成長阻害剤などを含有させることが好ましい。
【００２８】
本発明における防除剤は、更に、本発明の昆虫病原性微生物以外の有効成分を含有してもよく、例えば、除草剤、他の各種殺虫剤（他の昆虫病原性微生物を含む）、殺菌剤、植物生長調節剤、生長効果を助長させる共力剤、害虫誘引剤、植物栄養剤、肥料等を混合してもよい。
本発明の防除剤において、有効成分の量はその対象とする有害生物、栽培作物、使用方法、使用時期等、剤型、及び使用目的に応じて適宜決定すればよく、有効成分全体の含有量は、防除剤中、１〜９９質量％とすることができ、好ましくは５〜９０質量％である。
本発明の防除剤には、乾燥穀物粒子に対する酸化防止剤として、アスコルビン酸若しくはその誘導体、又はパラオキシ安息香酸誘導体などを加えてもよい。
【００２９】
本発明の害虫防除剤では、一般の農薬と同様に、対象とする害虫、使用方法等に応じて、乳剤、液剤、水和剤、粒剤、粉剤、フロアブル剤などの任意な剤型とすることができる。これらは、それぞれの剤型にふさわしい担体、例えば、ロウ石、タルク、カオリン、炭酸カルシウム、ベントナイト、珪石粉、石灰石粉末、酸性白土、珪藻土類粉末、石膏、軽石粉末、貝殻類粉末、雲母粉末、コロイド性含水珪酸ソーダなどの鉱物質粉末を、水、緩衝液などの水媒体と混合し、好ましくは、アルキルベンゼンスルホネート、アルキルスルホネート等の固着剤；ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）アルキルエーテル、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル、ＰＯＥジアルキルフェニルエーテル、ＰＯＥアルキルアミン、ジアルキルスルホサクシネート等の界面活性剤；アルキルサルフェート、ＰＯＥアルキルエーテルサルフェート、ＰＯＥアルキルフェニルエーテルサルフェート、ＰＯＥベンジル化（又はサルチル化）フェニル（又はフェニルフェニル）エーテルサルフェート、パラフィン（アルカン）スルホネート、アルファオレフィンスルホネート（ＡＯＳ）、アルキルベンゼンスルホネート、モノ又はジアルキルナフタレンスルホネート、ナフタレンスルホネート・ホルマリン縮合物、アルキルジフェニルエーテルジスルホネート、リグニンスルホネート、ＰＯＥアルキルエーテルスルホコハク酸ハーフエステル、ＰＯＥベンジル化（又はスチリル化）フェニル（又はフェニルフェニル）エーテルフォスフェート等の分散剤；及び／又はパラオキシ安息香酸誘導体、サリチルアニライド、１，２−ベンズイソチアゾリン−３−オン、テトラフタロニトリル（ＴＰＮ）、２−ニトロブロモ等の防黴剤を添加して調製される。
【００３０】
乳剤や液剤としては、培地上のコロニーから採取した分生子を、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）アルキルエーテル、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル、ＰＯＥジアルキルフェニルエーテル、ＰＯＥアルキルアミン、ジアルキルスルホサクシネート等の界面活性剤、及び任意に分散剤、防黴剤等の他の成分を添加した水溶液に懸濁したものを挙げることができ、水和剤の例としては、例えば分生子の懸濁液を乾燥して得られる分生子粉末を、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）アルキルエーテル、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル、ＰＯＥジアルキルフェニルエーテル、ＰＯＥアルキルアミン、ジアルキルスルホサクシネート等の界面活性剤；ロウ石、タルク、カオリン、炭酸カルシウム、ベントナイト、珪石粉、石灰石粉末、酸性白土、珪藻土類粉末、石膏、軽石粉末、貝殻類粉末、雲母粉末、コロイド性含水珪酸ソーダなどの鉱物質粉末等の増量剤；及びその他分散剤、防黴剤等を混合したものを挙げることができる。
【００３１】
また、粒剤としては、発芽、感染に必要な栄養、温度及び湿度等の環境条件で病原性微生物を保持し、迅速且つ長期間に亘って防除効果を発揮することができる点で、穀物に由来する材料を含む培地で、本発明の昆虫病原性微生物を培養し、得られる培養固形物、又は当該培養固形物を乾燥して得られる乾燥固形物を所定の粒径にして防除剤としたり、これらに鉱物質粒子或いはその他の成分を混合して防除剤としたものが好ましい。このような防除剤に用いる穀物材料としては、本発明のメタルヒジウム属の菌の高い増殖性が認められる点で、小麦、オオムギ、ヒエ、アワ又は米が好ましく、米がより好ましく、インディカ種の米が特に好ましい。また、やはり本発明のメタルヒジウム属の菌の高い増殖性が認められる点で、これら穀物は脱穀したものが好ましく、更に精白又は破砕したものがより好ましく、更に蒸し煮したものが特に好ましい。鉱物質粒子としては、例えばバーミキュライト、ロウ石、タルク、カオリン、炭酸カルシウム、ベントナイト、珪石、石灰石、酸性白土、珪藻土類、石膏、軽石、貝殻類、雲母、及びコロイド性含水珪酸ソーダ等を挙げることができる。なお、このような防除剤の調製は、本出願人によるＷＯ／２０１１／１３５９３７に詳細に記載されている。
【００３２】
本発明の防除剤は、前述の通り、アザミウマ類に属する害虫、コナジラミ類に属する害虫及びアブラムシ類に属する害虫に対して顕著な殺虫効果を有する。本発明の防除剤はまた、ハモグリバエ類、シンクイガ類、ネキリムシ類、ヤガ類、コガネムシ類、ゾウムシ類、ハムシ類、ケラ類、コオロギ類、シロアリ類、ウンカ類、ヨコバイ類、及びカメムシ類等の昆虫にも防除効果を有し、広範囲の害虫の防除に有効である。
【００３３】
本発明の防除剤で防除し得るアザミウマ類の昆虫としては、例えばヒラズハナアザミウマ（Frankliniella intonsa）、ミカンキイロアザミウマ(Frankliniella occidentalis)、ミナミキイロアアミウマ(Thrips palmi)、チャノキイロアザミウマ（Scirtothrips dorsalis）、ハナアザミウマ（Thrips hawaiiensis）、ダイズウスイロアザミウマ（Thrips setosus）、カキクダアザミウマ（Ponticulothrips diospyrosi）、ネギアザミウマ（Thrips tabaci））、ヒラズハナアザミウマ（Frankliniella intonsa）等のアザミウマ目アザミウマ科に属する昆虫が挙げられ、
コナジラミ類の昆虫としては、例えば、オンシツコナジラミ（Trialeurodes vaporariorum）、タバココナジラミ（Bemisia tabaci）、シルバーリーフコナジラミ（Bemisia argentifolli）等のカメムシ目コナジラミ科に属する昆虫が挙げられ、
アブラムシ類の昆虫としては、例えば、ワタアブラムシ（Aphis gossypii）、モモアカアブラムシ（Myzus persicae）、ニセダイコンアブラムシ（Lipaphis pserudobrassicae）等のカメムシ目アブラムシ上科に属する昆虫が挙げられる。
また、ハモグリバエ類の昆虫としては、例えば、マメハモグリバエ（Liriomyza trifolii）、トマトモグリバエ（Liriomyza sativae）、アカザモグリハナバエ（Pegomya exilis）、ネギハモグリバエ（Liriomyza chinensis）、ナモグリバエ（Chromatomyia horticola）等のハエ目ハモグリバエ科に属する昆虫が挙げられ、
シンクイガ類の昆虫としては、例えば、モモシンクイガ（Carposina sasakii）、ナシヒメシンクイ（Grapholita molesta）、マメシンクイガ（Leguminivora glycinivorella）等のチョウ目シンクイガ科に属する昆虫が挙げられ、
ネキリムシ類及びヤガ類の昆虫としては、例えば、カブラヤガ（Agrotis segetum）、タマナヤガ（Agrotis ipsilon）、ハスモンヨトウ（Spodoptera litura）、シロイチモンジヨトウ（Spodoptera exigua）、タバコガ（Helicoverpa assulta）、オオタバコガ（Helicoverpa armigera）、タマナギンウワバ（Autographa nigrisigna）等チョウ目ヤガ科に属する昆虫が挙げられる。
【００３４】
また、コガネムシ類の昆虫としては、例えば、ドウガネブイブイ（Anomala cuprea）、ウスチャコガネ（Anomala diversa）、ヒラタアオコガネ（Anomala octiescostata）、アシナガコガネ（Hoplia communis）、ヒメアシナガコガネ（Ectinohoplia obducta）、セマダラコガネ（Anomala orientalis）、オオサカスジコガネ（Anomala osakana）、スジコガネ（Anomala testaceipes）、チビサクラコガネ（Anomala schonfeldti）、ヒメコガネ（Anomala rufocuprea）、アオドウガネ（Anomala albopilosa）、アカビロウドコガネ（Maladera castanea）、コフキコガネ（Melolonthajaponica）、コイチャコガネ（Adoretus tenuimaculatus）、マメコガネ（Popillia japonica）等のコウチュウ目ヤコガネムシ科に属する昆虫が挙げられ、
ゾウムシ類の昆虫としては、例えば、イネミズゾウムシ（Lissorhoptrus oryzophilus）、サビヒョウタンゾウムシ（Scepticus griseus）、アリモドキゾウムシ（Cylas formicarius）、シバオサゾウムシ（Sphenophrus venatus vestius）、コクゾウムシ（Sitophilus zeamaise）等のコウチュウ目ゾウムシ科に属する昆虫が挙げられ、
ハムシ類の昆虫としては、例えば、キスジノミハムシ（Phyllotreta striolata）、ウリハムシ（Aulacophora femoralis）等のコウチュウ目ハムシ科に属する昆虫が挙げられ、
ケラ類の昆虫としては、例えば、ケラ（Gryllotalpa orientalis）等のコウチュウ目ハムシ科に属する昆虫が挙げられ、
コオロギ類の昆虫としては、例えばエンマコオロギ（Teleogryllus emma）等のバッタ目キリギリス亜目・コオロギ上科・コオロギ科に属する昆虫が挙げられ、
シロアリ類の昆虫としては、例えばヤマトシロアリ（Reticulitermes speratus）、イエシロアリ（Coptotermes formosanus）等のシロアリ目ミゾガシラシロアリ科に属する昆虫；及びアメリカカンザイシロアリ（Incisitermes minor）、ダイコクシロアリ（Cryptotermes domesticus）等のシロアリ目レイビシロアリ科に属する昆虫が挙げられる。
【００３５】
ウンカ・ヨコバイ類としては、例えば、ヒメトビウンカ（Laodelphax striatellus）、トビイロウンカ（Nilaparvata lugens）、セジロウンカ（Sogatella furcifera）、ツマグロヨコバイ（Nephotettix cincticeps）、チャノミドリヒメヨコバイ（Empoasca onukii）等のカメムシ目ヨコバイ亜目頸吻群に属する昆虫が挙げられ、
カメムシ類としては、ホソヘリカメムシ（Riptortus clavatus）、マルカメムシ（Megacopta punctatissima）、チャバネアオカメムシ（Plautia crossota）、クサギカメムシ（Halyomorpha halys）、ツヤアオカメムシ（Glaucias subpunctatus）等のカメムシ目カメムシ亜目に属する昆虫が挙げられる。
【００３６】
防除方法は、防除対象となる害虫及び防除剤の剤型等に応じて適切なものを選択すればよい。例えば、懸濁剤の場合には、希釈して茎葉に散布すればよく、水和剤の場合も、使用時に展着剤等を添加した水で懸濁・希釈し、懸濁剤と同様にして使用すればよい。また、前述したように本発明の昆虫病原性微生物を培養して得られる培養固形物、又は当該培養固形物を乾燥して得られる乾燥固形物を粒状の防除剤として使用したり、これらに鉱物質粒子等の他の成分を混合して調製した粒状の防除剤を使用する場合には、防除剤を土壌表面に置いたり、土壌中に混和して使用することができる。このような防除方法は、土壌表面又は土壌中の生活と、土壌外での生活とを含む生活史を持つ有害昆虫（例えば、アザミウマ類、ハモグリバエ類、シンクイガ類、ネキリムシ類、ヤガ類、コガネムシ類、ゾウムシ類、ケラ類、コオロギ類、シロアリ類等である）で特に有効である。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【００３８】
実施例１  懸濁剤
実施例１−１．懸濁剤の調製とコロニー数の算出
各昆虫病原性微生物を、ＰＤＡ（ジャガイモ煎汁寒天培地）上で、２５℃、１６時間連続的に日照し、８時間連続的暗黒下で（以下、「１６Ｌ−８Ｄ」と表記する）３週間培養し、形成されたコロニーより筆若しくはコンラージ棒で分生子をかきとり、０．０５％〜０．５％の界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ  ２０またはＴｗｅｅｎ  ８０）を含む滅菌蒸留水に懸濁した懸濁液を使用した。分生子数はトーマの血球計算盤を用いて算出し、１．０×１０７分生子数／ｍｌにＴｗｅｅｎ  ２０または８０液で調整した。なお、血球計算盤での算出は以下の通りに行った。よく懸濁した分生子液の５０μｌを計算室にとり、５分間静置して、分生子の流動がなくなるのをまった。顕検して中区画（０．２×０．２×０．１ｍｍ）を５以上数え、その平均値より算出した。また、Ｃｏｌｏｎｙ  Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｕｎｉｔｓ（ＣＦＵ）は１０倍段階希釈した懸濁液をＰＤＡプレートに塗布し、１週間後のコロニー数より算出した。
供試菌株はＩＦＯ番号があるものはＩＦＯ公益財団法人醗酵研究所から入手した。ボーベリア  バシアーナＧＨＡはボタニガードＥＳ（アリスタライフサイエンス社製）より分離し実験に供した。それ以外の菌株は九州大学大学院農学研究院附属生物的防除研究施設天敵微生物の保存菌株を用いた。
【００３９】
実施例１−２．数属に属する昆虫病原性糸状菌株とのミナミキイロアザミウマに対する殺虫活性の比較
直径６ｃｍのシャーレに５ｍｌの１％寒天を注ぎ固化させ、その上に直径約５．５ｃｍの円形に切り取ったインゲンマメの葉をのせ、１％寒天を注ぎ込んで葉と寒天の隙間をシールした（以下、アザミウマ用リーフディスクという）。血球計算盤を用いて１．０×１０７分生子数／ｍｌに調整した各種分生子懸濁液１．５ｍｌにミナミキイロアザミウマの成虫１０匹を浸漬し、１０秒間軽く撹拌して処理した後、濾紙上に移し供試虫を充分に乾燥させた。乾燥させた供試虫を上述のインゲンマメの葉上に移し、パラフィルムによりシャーレを密閉し恒温器内で（２５℃、１６Ｌ−８Ｄ）の条件で１週間飼育した。毎日、死亡個体を調査し、死亡率を算出した。結果を表１に示す。
【００４０】
【表１】
0005563107.tif 000003
【００４１】
実施例１−３．メタルヒジウム属の他の菌株とのミナミキイロアザミウマに対する殺虫活性の比較
１０倍段階希釈して調整した各種濃度の分生子懸濁液１．５ｍｌにミナミキイロアザミウマの成虫５匹を浸漬し、１０秒間軽く撹拌して処理した後濾紙上に移し供試虫を充分に乾燥させた。乾燥させた供試虫をアザミウマ用リーフディスクに移し、パラフィルムによりシャーレを密閉して恒温器内（２５℃、１６Ｌ−８Ｄ）で１週間飼育した。７日後の死亡率からＲｅｅｄ  ａｎｄ  Ｍｕｎｃｈ（１９３８）の方法によりＬＣ５０値（ＣＦＵ／ｍｌ）を算出した。結果を表２に示す。
【００４２】
【表２】
0005563107.tif 000004
【００４３】
実施例１−４．ボーベリア  バシアーナＧＨＡとの殺虫速度の比較
各種濃度の分生子懸濁液１．５ｍｌにミナミキイロアザミウマの成虫５匹又は６匹を浸漬し、軽く撹拌しながら、１０秒間処理後、濾紙上で供試虫を充分に乾燥させた。乾燥させた供試虫をアザミウマ用リーフディスクに移し、パラフィルムによりシャーレを密閉して飼育し（２５℃、１６Ｌ−８Ｄ）、７日間毎日死亡率を調査した。結果を表３に示す。
【００４４】
【表３】
0005563107.tif 000005
【００４５】
実施例１−５．数属の昆虫病原性糸状菌株とのモモアカアブラムシに対する殺虫活性に比較
直径６ｃｍのシャーレに５ｍｌの２％寒天を注ぎ固化させ、その上に直径約５．５ｃｍに切り取った円形の葉ダイコンの本葉をのせた（以下、アブラムシ用リーフディスクという）。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ８０を用いて１．０×１０７分生子数／ｍｌに調整した各昆虫病原性糸状菌株の分生子懸濁液２ｍｌを、直径３．５ｍｍのシャーレに入れ、モモアカアブラムシの成虫をこの懸濁液に浸漬し、１０秒間撹拌した後、風乾させた。乾燥した供試成虫を１０頭ずつアブラムシ用リーディスクに移し、恒温器内（２４℃、１６Ｌ／８Ｄ）で飼育し、４日後の死亡個体数を調査した。結果を表４に示す。
【００４６】
【表４】
0005563107.tif 000006
【００４７】
実施例１−６．メタルヒジウム属の他の菌株とのモモアカアブラムシに対する殺虫活性の比較
０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ８０液を用いて１．０×１０７分生子数／ｍｌに調整した各メタルヒジウム菌株の分生子懸濁液２ｍｌを直径３．５ｍｍのシャーレに入れ、モモアカアブラムシの成虫をこの懸濁液に浸漬し、１０秒間撹拌した後、風乾させた。乾燥後の供試成虫を１０頭ずつアブラムシ用リーディスクに移し、恒温器内（２４℃、１６Ｌ／８Ｄ）で飼育し、４日後の死亡個体数を調査した。結果を表５に示す。
【００４８】
【表５】
0005563107.tif 000007
【００４９】
実施例１−７．他の属に属する昆虫病原性糸状菌株とのオンシツコナジラミに対する殺虫活性の比較
オンシツコナジラミ成虫に自由に産卵させたインゲンの葉を採取し、直径６ｃｍのシャーレに５ｍｌの２％寒天を注ぎ固化させて作成した寒天培地の上に置いた（直径５ｃｍ程度）。産卵後約２週間目に３令幼虫が５０頭程度いることを確認した上で、リーフディスクに所定濃度に調整した分生子懸濁液を散布した。その後、恒温器内（２４℃、１６Ｌ／８Ｄ）で５日間飼育し成虫への羽化数から羽化阻害率を算出した（試験は、１菌株につき５回反復して行い、羽化阻害率はその平均値として示した）。結果を表６に示す。
【００５０】
【表６】
0005563107.tif 000008
【００５１】
実施例１−８．ネギアザミウマに対する殺虫活性
各種濃度の分生子懸濁液１．５ｍｌにネギアザミウマの成虫５匹または７匹を浸漬し、１０秒間軽く撹拌して処理した後、濾紙上に移して供試虫を充分に乾燥させた。乾燥させた供試虫をアザミウマ用リーフディスクに移し、パラフィルムによりシャーレを密閉して恒温器内（２５℃、１６Ｌ／８Ｄ）で５日間飼育し、毎日死亡率を調査した。結果を表７に示す。
【００５２】
【表７】
0005563107.tif 000009
【００５３】
実施例１−９．ミカンキイロアザミウマに対する殺虫活性
３つの異なる濃度の分生子懸濁液１．５ｍｌに、氷上で動きをとめたミカンキイロアザミウマの成虫５匹を浸漬し、１０秒間軽く撹拌して処理した後、濾紙上に移して供試虫を充分に乾燥させた。乾燥させた供試虫をアザミウマ用リーフディスクに移し、パラフィルムによりシャーレを密閉して恒温槽器内で（２５℃、１６Ｌ−８Ｄ）５日間飼育し、毎日死亡率を調査した。結果を表８に示す。
【００５４】
【表８】
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【００５５】
実施例２．茎葉散布剤（水和剤、乳剤）
実施例２−１．水和剤の調製
分生子懸濁液を乾燥し、分生子粉末を得た。得られた分生子粉末４５部を、ポリオキシエチレンアルキルアリールエーテル硫酸エステル１０部、ジアルキルスルホサクシネート５部、リグニンスルホン酸ナトリウム１０部、及びカオリン３０部と混合し、サンプルミルに２０秒間かけて破砕して１×１０１０分生子数／ｇの水和剤を得た。使用時には、この水和剤に、水和剤１ｇに対して水１リットルの比率で水を加えて懸濁液を調製した。
【００５６】
実施例２−２．乳剤の調製
分生子懸濁液を乾燥し、分生子粉末を得た。ニューカルゲン１３５−Ｂ（竹本油脂株式会社製）を７部、ニューカルゲンＤ−１２０８竹本油脂株式会社製）を３部、シェルゾールＭＣ５３１（シェルケミカルズジャパン株式会社製）を９０部混和した乳化液の５５部に対して、得られた分生子粉末４５部を混合し、１×１０１０分生子数／ｍｌの乳剤を得た。使用時には、この乳剤に、水和剤１ｇに対して水１リットルの比率で水を加えて懸濁液を調製した。
【００５７】
実施例２−３．水和剤、乳剤のミカンキイロアザミウマに対する効果
予め、ミカンキイロアザミウマが加害しているポットに植えられた３株のなすの幼苗（品種：千両二号）に、実施例２−１及び２−２で調製した懸濁液をそれぞれ十分量（１株当たり約５０ｍｌ）散布した。用いた懸濁液の菌密度は、１ｘ１０７分生子数／ｍｌであった。ポットは温室内で、温度２６〜３０℃、湿度６０〜９５％の条件下に置いた。処理前、処理４８時間後、処理１２０時間後のミカンキイロアザミウマ成虫、幼虫数を計数し１株当たりの虫数を算出した。結果を表９に示す。
【００５８】
【表９】
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【００５９】
実施例３．粒剤
実施例３−１．粒剤の調製
タイ米（インディカ種）を精白、破砕し、次いで１５時間水に浸漬したあとオートクレーブで３０分間蒸し煮した。これにメタルヒジウムｓｐ  ＳＭＺ−２０００株（寄託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１１３）を増殖させ乾燥して得られた乾燥固形物１０質量％に、乾燥タイ米（インディカ種）９０質量％を配合し、十分混合して篩でおよそ１〜５ｍｍ程度の粒径にして防除剤を調製した。
【００６０】
実施例３−２．ミカンキイロアザミウマに対する経時的殺虫効果（１）
各群当り３株のなすの幼苗（品種：筑陽）をハウスに定植した直後に、第１及び第２の群で土壌表面に実施例３−１で調製した防除剤をそれぞれ１ｍ２当り５ｇ及び１０ｇ散粒した。用いた防除剤の菌密度は、１ｘ１０７ＣＦＵ／ｇであった。第３の群では、比較対象として化学合成農薬であるジノテフラン粒剤をナス１株当たり１ｇ株元に散粒した。処理後５６日後までのナス３株１０葉（３０葉）におけるミカンキイロアザミウマ幼虫の数を調べた。結果を表１０に示す。
【００６１】
【表１０】
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【００６２】
実施例３−３．ミカンキイロアザミウマに対する経時的殺虫効果（２）
３株のなすの幼苗（品種：千両）をハウスに定植した直後、土壌表面に実施例３−１で調製した調製した防除剤を１ｍ２当り５ｇ散粒した。用いた防除剤の菌密度は、１ｘ１０７ＣＦＵ／ｇであった。処理後４８日後までのナス３株１０葉（３０葉）におけるミナミキイロアザミウマ成虫及び幼虫の合計数を調べた。結果を表１１に示す。
【００６３】
【表１１】
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【００６４】
上記の実施例により、本発明の新規昆虫病原性微生物が、アザミウマ類、コナジラミ類及びアブラムシ類に属する昆虫に対して高い病原性を有することが実証された。本発明の新規昆虫病原性微生物がこのような広範囲の昆虫に対して病原性を有するのは、特有のハイドロホビンが、分生子の疎水性又は静電気特性に変化をもたらし、種々の害虫が有するクチクラへ多くの分生子が付着可能となったためと考えられる。このため、本発明の昆虫病原性微生物は、アザミウマ類、コナジラミ類、アブラムシ類、ハモグリバエ類、シンクイガ類、ネキリムシ類、ヤガ類、コガネムシ類、ゾウムシ類、ハムシ類、ケラ類、コオロギ類、シロアリ類、ウンカ・ヨコバイ類、カメムシ類等の害虫に病原性を有することが期待され、本発明の昆虫病原性微生物を有効成分として害虫防除剤を調製することで対象害虫が非常に広く且つ病原性の高い微生物農薬を提供することが可能となる。このような特性を有する本発明の防除剤は、野菜類の主要な害虫であるアブラムシ類、コナジラミ類、及びアザミウマ類を含む広範囲の害虫に対し、１種の防除剤で対応可能であり、且つ従来の化学合成殺虫剤や微生物農薬等に比べ効果及び価格面で有利な防除剤を提供し得る。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図２】
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【配列表】
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