(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
再発性多発軟骨炎を検査するために、被験者から採取された生体試料中のＴＲＥＭ−１タンパク質の量を測定する方法。
【請求項２】
前記生体試料は血清である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＴＲＥＭ−１タンパク質の量は、免疫測定法により測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
抗ＴＲＥＭ−１抗体またはその断片を有する、再発性多発軟骨炎の検査キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、再発性多発軟骨炎のバイオマーカーに関する。より具体的には、本発明は、前記バイオマーカーを用いた再発性多発軟骨炎の検査方法およびそれに用いられる検査キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
再発性多発軟骨炎（relapsing polychondritis；「ＲＰ」とも略記される）は、全身の軟骨組織に炎症を引き起こす、原因不明の慢性疾患である。症状としては、軟骨組織における疼痛や発赤、腫脹などが挙げられる。特に、鼻根部および耳介における病変は特徴的であり、多発性関節炎との合併も多く見られる。また、咽頭や気管、気管支の軟骨病変により、気道閉塞を生じる例も報告されている。日本における再発性多発軟骨炎についての正確な統計はないが、日本国内には４００〜５００人の患者がいると推定されている。１９８６年の報告では、１０年生存率が５５％であったが、１９９８年の報告では、８年生存率が９４％であると報告されている。
【０００３】
再発性多発軟骨炎の血液検査の所見としては、１）赤血球沈降速度の上昇、２）血清中のＣ反応性タンパク質（C-reactive protein；以下「ＣＲＰ」という）量の上昇、３）正球性正色素性貧血、４）好酸球増多症（約１０％）、５）抗核抗体陽性（約２２〜６６％）、６）抗II型コラーゲン抗体陽性（約５０％以下）、７）リウマチ因子陽性（約１６％）、８）抗好中球細胞質抗体陽性（一部）などが報告されている。しかしながら、軟骨破壊が進行していてもＣＲＰの値が正常範囲内である症例が認められるなど、再発性多発軟骨炎の有用な検査方法はこれまでに確立されておらず、診断は臨床的になされている。
【０００４】
一方、血液中の血球におけるTriggering Receptor Expressed on Myeloid cells-1（以下「ＴＲＥＭ−１」と略記する）タンパク質の量を測定して、自己免疫疾患（例えば、慢性関節リウマチなど）による炎症性応答を診断する方法が提案されている（特許文献１参照）。特許文献１では、血球におけるＴＲＥＭ−１タンパク質量を測定して自己免疫疾患による炎症性応答を診断する方法が提案されているが、実際にＴＲＥＭ−１タンパク質量を測定して自己免疫疾患を診断した結果は示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００４−５２２７４２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ヒトの様々な疾患について、その疾患に特異的なバイオマーカーを指標とする検査方法が普及してきている。この方法は、大掛かりな設備を必要とせず、被験者への負担も少ないため、自覚症状のない多くの被験者に対しても広範囲に実施することが可能である。しかしながら、再発性多発軟骨炎に特異的なバイオマーカーは、現在までに報告されておらず、特異的な検査方法が確立されていない。したがって、再発性多発軟骨炎の検査および治療が遅れてしまい、重度の後遺症や著しいＱＯＬの低下をきたす症例も少なくなかった。このような状況のため、再発性多発軟骨炎の検査方法に対する社会的要求が高まってきている。
【０００７】
本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、再発性多発軟骨炎のバイオマーカーを提供することを第一の目的とする。
【０００８】
また、本発明は、再発性多発軟骨炎の検査方法および再発性多発軟骨炎の検査キットを提供することを第二の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、再発性多発軟骨炎の患者の血清中のサイトカインやケモカインなどについて網羅的に解析を行ったところ、ＴＲＥＭ−１が再発性多発軟骨炎に特異的なバイオマーカーとなりうることを見出し、さらに検討を加えて本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の再発性多発軟骨炎の検査方法に関する。
［１］被験者から採取された生体試料中のＴＲＥＭ−１タンパク質の量を測定するステップを含む、再発性多発軟骨炎の検査方法。
［２］前記ＴＲＥＭ−１タンパク質の量が所定の値より多いとき、前記被験者は再発性多発軟骨炎を発病している可能性が高いと判定するステップをさらに含む、［１］に記載の検査方法。
［３］前記生体試料は血清である、［１］または［２］に記載の検査方法。
［４］前記ＴＲＥＭ−１タンパク質の量は、免疫測定法により測定される、［１］〜［３］のいずれかに記載の検査方法。
【００１１】
また、本発明は、以下の再発性多発軟骨炎の検査キットに関する。
［５］抗ＴＲＥＭ−１抗体またはその断片を有する、再発性多発軟骨炎の検査キット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、再発性多発軟骨炎の検査（診断）、疾患活動性の評価、治療効果の評価などを迅速かつ容易に行うことができる。したがって、本発明によれば、再発性多発軟骨炎の検査および治療を早期に行うことが可能となり、患者のＱＯＬを向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】再発性多発軟骨炎に対するＴＲＥＭ−１の感度および特異度を示すＲＯＣ曲線
【図２】健常者および再発性多発軟骨炎の患者における血清中ＴＲＥＭ−１濃度を示すグラフ
【図３】健常者および再発性多発軟骨炎の患者における血清中の６種類の炎症関連因子の濃度を示すグラフ
【図４】再発性多発軟骨炎に対する６種類の炎症関連因子の感度および特異度を示すＲＯＣ曲線
【図５】健常者、再発性多発軟骨炎の患者、全身性強皮症の患者およびＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の患者における血清中ＴＲＥＭ−１濃度を示すグラフ
【発明を実施するための形態】
【００１４】
１．本発明の再発性多発軟骨炎の検査方法
本発明の検査方法は、被験者から採取された生体試料中のＴＲＥＭ−１タンパク質の量を測定するステップを含む。
【００１５】
ＴＲＥＭ−１（Triggering Receptor Expressed on Myeloid cells-1）は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する膜貫通型の受容体であり、単球／マクロファージや好中球などのミエロイド系細胞において発現している。ＴＲＥＭ−１は、ＩＴＡＭ（immunoreceptor tyrosine-based activation motief）を有するＤＡＰ１２を介して細胞内にシグナルを伝達する。アゴニスト抗体を用いてＴＲＥＭ−１を刺激すると、ＴＮＦα、ＩＬ−１などの炎症性サイトカインや、ＭＣＰ−１などのケモカイン、細胞接着分子などの表面分子の発現が誘導される。また、ＴＲＥＭ−１には、ＴＬＲやＮＬＲと協調して炎症反応を飛躍的に増強する作用がある。これらのことから、ＴＲＥＭ−１は、炎症反応の強度を決定する役割を担うと考えられている。ＴＲＥＭ−１には、可溶型のものも存在している。この可溶型のＴＲＥＭ−１は、膜貫通型のＴＲＥＭ−１がメタロプロテナーゼにより切断されたものである。
【００１６】
本発明者は、再発性多発軟骨炎に特異的なバイオマーカーを網羅的に探索したところ、生体試料（特に血漿）中の可溶型ＴＲＥＭ−１タンパク質が再発性多発軟骨炎のバイオマーカーになりうることを見出した。本発明者の研究によれば、再発性多発軟骨炎の患者の生体試料（特に血漿）中で可溶型ＴＲＥＭ−１タンパク質の量が特異的に上昇する。実施例に示されるように、可溶型ＴＲＥＭ−１タンパク質を測定する本発明の検査方法は、適切なカットオフ値を設定することで高感度かつ高特異度の検査方法となりうる。
【００１７】
測定対象となる生体試料の種類は、特に限定されないが、血液、血漿、血清、これらの希釈液などを用いることができる。生体試料が血清である場合は、生体試料の採取が容易であり、かつ生検などに比べて侵襲を伴わずに短時間で検査を行うことができる。
【００１８】
生体試料中のＴＲＥＭ−１タンパク質の量を測定する方法は、特に限定されず、免疫測定法や質量分析法、電気泳動法、液体クロマトグラフィー法、ガスクロマトグラフィー法などの当業者に公知の測定法から適宜選択されうる。
【００１９】
免疫測定法の例には、ＥＬＩＳＡ法、放射能免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、ウェスタンブロット法、ラテックス凝集法、イムノクロマト法などが含まれる。たとえば、物理吸着や化学結合などにより抗体を結合させた固相担体（例えば、イムノプレートやラテックス粒子など）を用いて生体試料中のＴＲＥＭ−１タンパク質を捕捉した後、固相担体に固定化した抗体とは抗原認識部位が異なる標識化抗体（酵素や蛍光物質などで標識した抗体）を用いて捕捉されたＴＲＥＭ−１タンパク質を定量すればよい。
【００２０】
免疫測定法によりＴＲＥＭ−１タンパク質の量を測定する場合、使用する抗体は、可溶型ＴＲＥＭ−１タンパク質に特異的に結合しうる抗体またはその断片であれば特に限定されない。抗体の例には、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体が含まれる。また、抗体の断片の例には、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）などが含まれる。また、これらの抗原は、酵素、放射性同位体、蛍光色素、アビジン、ビオチンなどで標識されていてもよい。
【００２１】
たとえば、生体試料中のＴＲＥＭ−１タンパク質の量を測定した結果、ＴＲＥＭ−１タンパク質の量が所定のカットオフ値よりも多いときは、その被検者は再発性多発軟骨炎を発病している可能性が高いと判定し、ＴＲＥＭ−１タンパク質の量が所定のカットオフ値よりも少ないときは、その被検者はＴＲＥＭ−１タンパク質を発病していない可能性が高いと判定する。ＴＲＥＭ−１タンパク質のカットオフ値は、例えばＲＯＣ曲線を用いて設定されうる（実施例参照）。
【００２２】
本発明の検査方法は、ＴＲＥＭ−１タンパク質を再発性多発軟骨炎のバイオマーカーとすることで、再発性多発軟骨炎を迅速かつ容易に検査することができる。本発明の検査方法は、再発性多発軟骨炎であるかどうかを医療従事者が診断する際の補助的な検査として有用である。また、本発明の検査方法は、再発性多発軟骨炎の疾患活動性の評価、治療効果の確認、臨床経過のモニタリングなどにおいても適用可能である。
【００２３】
２．本発明の再発性多発軟骨炎の検査キット
本発明の検査キットは、生体試料中のＴＲＥＭ−１タンパク質の量を免疫測定法により測定するためのキットであり、本発明の検査方法に用いることができる。
【００２４】
本発明の検査キットは、可溶型ＴＲＥＭ−１タンパク質に特異的に結合しうる抗体を有することを特徴とする。本発明の検査キットは、この抗体と可溶型ＴＲＥＭ−１タンパク質との抗原抗体反応を検出して、生体試料中のＴＲＥＭ−１タンパク質の量を測定する。
【００２５】
抗体は、可溶型ＴＲＥＭ−１タンパク質に特異的に結合しうる抗体またはその断片であれば特に限定されず、市販されているものでもよい。抗体の例には、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体が含まれる。また、抗体の断片の例には、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）などが含まれる。これらの抗体は、担体に固定化されていてもよいし、固定化されていなくてもよい。また、これらの抗原は、酵素、放射性同位体、蛍光色素、アビジン、ビオチンなどで標識されていてもよい。
【００２６】
生体試料中のタンパク質量を測定するための検査キットは、タンパク質の種類に応じて様々なものが市販されている。本発明の検査キットも、可溶型ＴＲＥＭ−１タンパク質に特異的に結合しうる抗体またはその断片を用いることを除き、当業者に公知の検査キットに用いられている各要素によって構成することができる。
【００２７】
以下、本発明を実施例を参照して詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。
【実施例】
【００２８】
［実施例１］
実施例１では、再発性多発軟骨炎のバイオマーカーとして血清中ＴＲＥＭ−１濃度が使用可能であることを示す。
【００２９】
倫理性を確保するための手続を終えた後、再発性多発軟骨炎の患者１６名および健常者１６名から血液を採取し、血清（サンプル）を得た。再発性多発軟骨炎の診断は、ダミアニの診断基準（Damiani, J. M. and Levine, H. L., "Relapsing polychondritis-report of ten cases", Laryngoscope, Vol.89, pp.929-946.）に基づいて行った。
【００３０】
各サンプル（血清）中に含まれるＴＲＥＭ−１の濃度を、市販のＥＬＩＳＡキット（Human TREM-1 Quantikine ELISA kit；R&D Systems）を用いて測定した。測定手順は、キットに付属のプロトコールに従い、以下のように行った。
【００３１】
まず、マウス抗ＴＲＥＭ−１モノクローナル抗体が固定化された９６穴マイクロプレート（TREM-1 Microplate）の各ウェルに、希釈溶液（Assay Diluent RD1-52）を１００μＬずつ加えた。次いで、各ウェルにサンプル（血清）またはスタンダード（TREM-1 Standard）を１００μＬずつ加え、室温で２時間反応させた。４回洗浄した後、各ウェルにＨＲＰ標識抗ＴＲＥＭ−１抗体溶液（TREM-1 Conjugate）を２００μＬ加え、室温で２時間反応させた。再度４回洗浄した後、各ウェルに基質溶液（Substrate Solution）を２００μＬ加え、室温で３０分間反応させた。反応後、各ウェルに停止溶液（Stop Solution）を５０μＬ加え、各ウェルの吸光度を波長４５０ｎｍで測定した。表計算ソフト（Excel；Microsoft）を用いて標準曲線を描いて、各サンプル（血清）中のＴＲＥＭ−１の濃度を算出した。
【００３２】
各被検者（再発性多発軟骨炎の患者および健常者）の血清中ＴＲＥＭ−１濃度のデータを用いて、図１に示されるＲＯＣ曲線を作成した。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）は、約０.９であった。このことから、血清中ＴＲＥＭ−１濃度は、再発性多発軟骨炎のバイオマーカーとして感度および特異度に優れているといえる。
【００３３】
図２は、健常者および再発性多発軟骨炎の患者における血清中ＴＲＥＭ−１濃度を示すグラフである。図中の破線は、図１のＲＯＣ曲線から求められるカットオフ値（１５５ｐｇ／ｍＬ）を示している。ここでは、図１のグラフにおいて左上の隅との距離が最小となる点に対応する血清中ＴＲＥＭ−１濃度をカットオフ値とした。このようにカットオフ値を１５５ｐｇ／ｍＬとした場合、感度８１.２５％、特異度８７.５％で検査を行うことができる。
【００３４】
［実施例２］
実施例２では、サイトカイン（ケモカインを含む）やマトリックスメタロプロテアーゼなどの２５種類の炎症関連因子（ＴＲＥＭ−１を含む）について、再発性多発軟骨炎の患者および健常者の血清中濃度を測定した結果を示す。
【００３５】
実施例１と同一の血清（再発性多発軟骨炎の患者１６名、健常者１６名）を準備し、各サンプル（血清）中に含まれる炎症関連因子の濃度を市販のキットを用いて測定した。
【００３６】
ＴＲＥＭ−１の濃度については、実施例１と同様の手順で、Human TREM-1 Quantikine ELISA kit（R&D Systems）を用いて、キットに付属のプロトコールに従って測定した。
【００３７】
ＩＬ−１７の濃度については、Human IL-17A ELISA kit（Tepnel Life Sciences）を用いて、キットに付属のプロトコールに従って測定した。
【００３８】
ＭＭＰ−１の濃度およびＭＭＰ２の濃度については、それぞれHuman Pro-MMP-1 Quantikine ELISA kitおよびHuman MMP-2 Quantikine ELISA kit（いずれもR&D Systems）を用いて、キットに付属のプロトコールに従って測定した。
【００３９】
ＭＭＰ−３の濃度については、Human MMP-3 ELISA kit（第一ファインケミカル）を用いて、キットに付属のプロトコールに従って測定した。
【００４０】
ＭＭＰ−１３の濃度については、Human MMP-13 Assay（GE Healthcare）を用いて、キットに付属のプロトコールに従って測定した。
【００４１】
ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＴＮＦ、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、ＩＰ−１０、ＲＡＮＴＥＳ、ＶＥＧＦおよびフラクタルカインの濃度については、Cytometric Bead Array Flex set system（BD Biosciences）を用いて以下の手順で測定した。
【００４２】
まず、同時に測定するサイトカインのスタンダードを希釈溶液（Assay Diluent）で溶解して１本にまとめてから、希釈系列（０、５、１０、２０、４０、８０、１５６、３１２.５、６２５、１２５０、２５００ｐｇ／ｍＬ）を作製した。一方で、各サンプル（血清）を希釈溶液（Assay Diluent）で４倍（ＲＡＮＴＥＳのみ４０倍）に希釈した。次いで、同時に測定したいサイトカインに対応するビーズ（Capture Beads）を混和した混合物を５０μＬずつすべてのＦＡＣＳチューブに入れた。サンプルの希釈物およびスタンダードを５０μＬずつＦＡＣＳチューブに順番に入れて、室温で１時間インキュベートした。次いで、同時に測定するサイトカインのＰＥ検出試薬（PE detection reagent）を混和した混合物を５０μＬずつすべてのＦＡＣＳチューブに入れて、遮光条件下、室温で２時間インキュベートした。洗浄後、フローサイトメーター（FACSCalibur；BD Biosciences）を用いてデータを測定した。得られたデータを解析ソフト（FCAP Array Software；BD Biosciences）を用いて解析し、各サンプル中のサイトカインの濃度を測定した。
【００４３】
各サンプル中の２５種類の炎症関連因子（ＴＲＥＭ−１を含む）の濃度を測定した結果、ＴＲＥＭ−１を含む５種類の炎症関連因子（ＴＲＥＭ−１、ＭＭＰ−３、ＶＥＧＦ、ＭＩＰ−１β、ＩＰ−１０）が、再発性多発軟骨炎の患者群において有意に上昇していた（ｐ＜０.０５）。一方、残りの２０種類の炎症関連因子（ＴＮＦ−αやＩＬ−６など）については、統計学的有意差は認められなかった。
【００４４】
図３Ａ〜Ｅは、再発性多発軟骨炎の患者群において有意に上昇していた５種類の炎症関連因子（ＴＲＥＭ−１、ＭＭＰ−３、ＶＥＧＦ、ＭＩＰ−１β、ＩＰ−１０）の、健常者および再発性多発軟骨炎の患者における血清中の濃度を示すグラフであり、図３Ｆは、統計学的有意差が認められなかった炎症関連因子（ＭＣＰ−１）の、健常者および再発性多発軟骨炎の患者における血清中の濃度を示すグラフである。図３Ａは、血清中ＴＲＥＭ−１濃度を示すグラフであり（ｐ＜０.０００１）、図３Ｂは、血清中ＭＭＰ−３濃度を示すグラフであり（ｐ＝０.００８３）、図３Ｃは、血清中ＶＥＧＦ濃度を示すグラフであり（ｐ＝０.０１２３）、図３Ｄは、血清中ＭＩＰ−１β濃度を示すグラフであり（ｐ＝０.００４１）、図３Ｅは、血清中ＩＰ−１０濃度を示すグラフである（ｐ＝０.０４１３）であり、図３Ｆは、血清中ＭＣＰ−１濃度を示すグラフである（ｐ＝０.６６５２）。
【００４５】
図４は、上記６種類の炎症関連因子（ＴＲＥＭ−１、ＭＭＰ−３、ＶＥＧＦ、ＭＩＰ−１β、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１）についてのＲＯＣ曲線である。このグラフから、再発性多発軟骨炎の患者群において有意に上昇していた５種類の炎症関連因子（ＴＲＥＭ−１、ＭＭＰ−３、ＶＥＧＦ、ＭＩＰ−１β、ＩＰ−１０）の中でも、特にＴＲＥＭ−１は、再発性多発軟骨炎のバイオマーカーとして感度および特異度共に最も優れていることがわかる。
【００４６】
［実施例３］
実施例３では、再発性多発軟骨炎の患者だけでなく、他の自己免疫疾患（全身性強皮症およびＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症）の患者における血清中ＴＲＥＭ−１濃度を測定した結果を示す。
【００４７】
再発性多発軟骨炎の患者および健常者の血清については、実施例１と同一の血清（再発性多発軟骨炎の患者１６名、健常者１６名）を準備した。また、全身性強皮症の患者およびＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の患者の血清については、倫理性を確保するための手続を終えた後、全身性強皮症の患者１０名およびＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の患者１４名からそれぞれ血液を採取し、血清（サンプル）を得た。全身性強皮症およびＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の診断は、臨床診断の結果に基づいて行った。
【００４８】
各サンプル（血清）中に含まれるＴＲＥＭ−１の濃度を、市販のＥＬＩＳＡキット（Human TREM-1 Quantikine ELISA kit；R&D Systems）を用いて実施例１と同様の手順で測定した。
【００４９】
図５は、健常者、再発性多発軟骨炎の患者、全身性強皮症の患者およびＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の患者における血清中ＴＲＥＭ−１濃度を示すグラフである。このグラフに示されるように、再発性多発軟骨炎の患者では、健常者だけでなく、全身性強皮症の患者およびＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の患者に対しても血清中ＴＲＥＭ−１濃度が有意に上昇していた（ｐ＜０.０５）。
【００５０】
以上の結果から、血清中ＴＲＥＭ−１濃度は、他の自己免疫疾患の患者ではほとんど上昇せず、再発性多発軟骨炎に特異的なマーカーとして利用可能であることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明の再発性多発軟骨炎の検査方法は、大掛かりな設備を必要とせず、被験者への負担も少ないため、例えば再発性多発軟骨炎の診断補助血液検査として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図４】
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