(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アナライト流体に存在する発光団によって放出される放射線をモニタする装置であって、
トランスペアレントな材料の基板上に配され、前記アナライト流体で満たされる少なくとも１つの開口を形成する少なくとも１つの非トランスペアレントな材料を有するバイオセンサであって、前記開口が、前記バイオセンサの放射線の有効波長の半分より小さい第１の面内寸法及び前記バイオセンサの放射線の有効波長の半分より大きい第２の面内寸法を有し、透過面を有し、前記第１及び前記第２の面内寸法は前記基板に平行な平面内の寸法である、バイオセンサと、
前記バイオセンサの前記アナライト流体に存在する発光団を励起するための励起源と、
励起に応じて前記発光団によって放出される放射線を検出する検出器と、
前記バイオセンサ及び前記検出器の間に配される偏光フィルタであって、前記開口の透過面と平行な電界を有する前記放射線を減衰させ、前記開口の透過面に垂直な電界を有する前記放射線を透過するように配される、偏光フィルタと、
を有する装置。
【請求項２】
前記検出器は、前記バイオセンサの基板側に配される、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記励起源は、楕円偏光、円偏光又は直線偏光を含む偏光光のような偏光光を放出する光源であり、又は前記励起源は、非偏光の光を放出する光源である、請求項１又は２に記載の装置。
【請求項４】
前記偏光フィルタは、回転可能である、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項５】
前記光源は、前記発光団の励起のための吸収波長帯域に対応する波長通過帯域を有する放射線を通過させ、前記発光団の放出波長に対応する波長を有する放射線を阻止する帯域通過フィルタを有する、請求項３又は４に記載の装置。
【請求項６】
前記発光団の放出波長に対応する波長を有する放射線を通過させ、前記帯域通過フィルタによって通過される放射線を阻止する波長通過フィルタが、前記検出器の前に配される、請求項５に記載の装置。
【請求項７】
前記偏光フィルタは、前記開口の透過面と直交する偏光面を有する放射線を、前記検出器の方へ通過させ、前記開口の透過面と平行な偏光を有する放射線を、第２の検出器の方へ反射し又は阻止する偏光ビームスプリッタを有し、又は
前記偏光フィルタは、前記バイオセンサの方へ前記励起放射線を向け、前記検出器へ前記放出放射線を通過させるダイクロイックミラーを有する、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の装置。
【請求項８】
前記光源からの放射線は、前記バイオセンサを照明する前に、前記偏光フィルタを通る、請求項３乃至７のいずれか１項に記載の装置。
【請求項９】
前記光源は、前記バイオセンサの基板側に配され、前記検出は、反射モードで実施され、又は
前記光源は、前記バイオセンサの前記アナライト流体側に配され、前記検出は、透過モードで実施される、請求項３乃至８のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１０】
前記光源は、例えば約１ｎｍより大きい帯域幅を有し、低いコヒーレンス長を有する光を放出する、請求項３乃至９のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１１】
前記装置は、アナライト流体を有し、前記アナライトは、前記開口内に含まれる媒体中でターゲット分子及び蛍光団のような発光団を有する、請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１２】
捕捉分子が、前記開口の基板側の部分に隣り合って配され、前記捕捉分子は、前記ターゲット分子及び発光団との会合体を形成する、請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
前記アナライト流体は、前記開口を含む基板の一方の側に配され、前記検出器及び前記偏光フィルタは、前記基板の反対側に配される、請求項１１又は１２に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオセンサの分野に関し、特に、サブ回折限界のあるバイオセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオセンサ技術は、良く知られた技術である。
【０００３】
米国特許出願第２００３／０１７４９９２号は、アナライトを解析するために電磁放射による活性化を受けるアナライトを含むゼロモード導波管を提供する方法及び装置を開示する。
【０００４】
「Luminescence sensors using sub-wavelength apertures or slits」なるタイトルの国際公開第２００６／１３６９９１号パンフレットは、サブ波長空間分解能を有するバイオセンサを開示する。
【０００５】
「Luminescence sensor operating in reflection mode」なるタイトルの国際公開第２００７／０７２４１５号パンフレットは、開口内の分子によって生成される蛍光放射の検出方法を開示する。
【０００６】
このようなバイオセンサは、トランスペアレントな材料の基板上に配され、前記アナライト流体で満たされるための少なくとも１つの開口を形成する、非トランスペアレントな材料を有することができる。開口は、開口内の媒体における励起光の回折限界より小さい第１の面内寸法、及び開口内の媒体における励起光の回折限界より大きい第２の面内寸法を有する。開口面は、開口の第１の面内寸法に沿って向けられる第１のベクトル、及び開口の第２の面内寸法に沿って向けられる第２のベクトルによって規定される。このようなワイヤグリッドは、透過軸を有し、電界が第１のベクトル及び開口面に対して垂直な第３のベクトルによって規定される透過面と平行であるように偏光される、以下でＴ偏光と呼ばれる光が、本質的に透過され、電界が透過面に直交するように偏光される、以下でＲ偏光と呼ばれる光が実質的に阻止される。
【０００７】
アナライトは、バイオセンサに供給され、開口に入り込む。アナライトは、解析されるべきターゲット分子を含む。ターゲット分子は、発光団によって標識化され、発光団／ターゲット分子の集合体は、開口の基板側に固定化され、ターゲット分子に付着される１又は複数の自由発光団は、アナライト中の、開口のアナライト側に存在する。固定化された発光団は、解析されるべきターゲット分子の定性的又は定量的表現に対応する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
固定化された発光団からの放出放射線は、検出器によって決定される。固定化された発光団の所望の放射線を、自由発光団及び発光団によって標識化されたターゲット分子のバックグラウンド放射線から区別するために、バックグラウンド放射線は、抑制されなければならない。バックグラウンド放射線は、固定化された発光団からの有用な放射線より数オーダー大きいことがある。ルミネセントバックグラウンド放射線の実質的な抑制は、他の方法でリンスを必要とする本質的にはバックグラウンドのない測定を可能にするが、リンスは、例えばリアルタイムの測定中に行われることはできない。偏光された励起光により照明される実際のワイヤグリッドバイオセンサの場合、バックグラウンド放射線の抑制は、約３のオーダーの大きさに制限される。この制限されたバックグラウンド抑制は、最終的に、センサの正確さ及び表面特異性の低減をもたらす。更に、より安価であり、より大きい出力パワーを生成することができる例えば発光ダイオードＬＥＤのような非偏光の光源を使用することができるバイオセンサの技術のニーズがある。
【０００９】
従って、本発明の目的は、上述した不足及び不利益の１又は複数を単独で又は任意の組み合わせで緩和し、軽減し又は除去することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の１つの見地によれば、アナライト流体に存在する発光団によって放出される放射線をモニタする装置であって、トランスペアレントな材料の基板に配置され、前記アナライト流体で満たされるための少なくとも１つの開口を形成する、少なくとも１つの非トランスペアレントな材料を有するバイオセンサであって、前記開口は、バイオセンサにおいて放射線の有効波長の半分より短い第１の面内寸法及びバイオセンサの放射線の有効波長の半分より大きい第２の面内寸法を有し、透過面を有する、バイオセンサと、前記バイオセンサのアナライト流体に存在する発光団を励起するための励起源と、励起に応じて発光団によって放出される放射線を検出する検出器と、バイオセンサ及び検出器の間に配置される偏光フィルタと、を有する装置が提供される。検出器は、バイオセンサの基板側に配置されることができる。励起源は、例えば、円偏向、直線偏光又は楕円偏光を有する偏光光のような偏光光を放出する光源でありえ、又は前記励起源は、非偏光の光を放出する光源であってもよい。偏光フィルタは、開口の透過面と平行な電界を有する放射線を実質的に減衰するように構成されることができる。偏光フィルタは、回転可能でありうる。
【００１１】
一実施例において、光源は、前記発光団の励起のための吸収波長帯域に対応する波長通過帯域を有する放射線を通過させ、前記発光団の放出波長に対応する波長を有する放射線を阻止する帯域フィルタを有する。更に、波長通過フィルタが、前記発光団の放出波長に対応する波長を有する放射線を通過させ、前記帯域通過フィルタによって通される放射線を阻止するために、検出器の前に配置されることができる。
【００１２】
別の実施例において、偏光フィルタは、前記検出器の方へ、開口の透過面と平行な偏光面を有する放射線を通過させ、開口の透過面に直交する偏光を有する放射線を、第２の検出器を方へ反射し又は阻止する偏光ビームスプリッタを有することができ、又は偏光フィルタは、バイオセンサの方へ前記励起放射線を向け、検出器へ放出放射線を通すように配置されるダイクロイックミラーを有することができる。
【００１３】
他の実施例において、前記光源からの放射線は、バイオセンサを照明する前に、前記偏光フィルタを通過するように配置されることができる。
【００１４】
更に他の実施例において、光源は、バイオセンサの基板側に配置されることができ、検出は、反射モードにおいて実施される。代替として、光源は、バイオセンサのアナライト流体側に配置されてもよく、検出は、透過モードで実施される。光源は、例えば約１ｎｍより大きい帯域幅を有するような低いコヒーレンス長を有する光を放出することができる。
【００１５】
装置は、アナライト流体を含むことができ、アナライトは、ターゲット分子、及び例えば前記開口に含まれる媒体中の蛍光団のような発光団を有することができる。捕捉分子は、開口の基板端部に隣接して配置されることができ、前記捕捉分子は、前記ターゲット分子及び発光団との会合体を形成することを意図する。アナライト流体は、前記開口を含む基板の一方の側に配置されることができ、検出器及び偏光フィルタは、基板の反対側に配置される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の原理を説明するための概略図。
【図２】バイオセンサの一実施例の概略図。
【図３】バイオセンサの他の実施例の概略図。
【図４】バイオセンサの他の実施例の概略図。
【図５】本発明の更に別の実施例の概略ブロック図。
【図６】本発明の更に別の実施例の概略ブロック図。
【図７】本発明の更に別の実施例の概略ブロック図。
【図８】本発明の更に別の実施例の概略ブロック図。
【図９】本発明の更に別の実施例の概略ブロック図。
【図１０】本発明の更に別の実施例の概略ブロック図。
【図１１】標識化分子のパターンで覆われるワイヤグリッドに対してそれぞれ平行に及び垂直に配置された偏光フィルタを有する検出器像を示す２つの写真。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の他の目的、特徴及び利点は、図面を参照して本発明の実施例の以下の詳細な説明から明らかになる。
【００１８】
以下、本発明のいくつかの実施例が、図面を参照して記述される。これらの実施例は、当業者が本発明を実施することを可能にし、最良の形態を開示するために、説明の目的で記述されている。しかしながら、このような実施例は、本発明を制限しない。更に、さまざまな異なる特徴の他の組み合わせが、本発明の範囲内で可能である。
【００１９】
以下に記述される実施例によるバイオセンサは、励起及びルミネセンス光のうちの少なくとも１つに対して非透過である材料に規定される開口に配置されるアナライトを含むことができ、一般的な例は、開口内の媒体中の励起光の回折限界より小さい第１の面内寸法及び開口内の媒体中の励起光の回折限界より大きい第２の面内寸法を有する、アルミニウム、金、銀、クロミウムである。面内寸法とは、基板に平行な平面内の寸法を意味する。
【００２０】
アナライトは、流体中に含まれることができる。流体に存在する発光団は、励起エネルギーに露呈される場合、電磁放射線を放出する。放出された放射線は、検出器によって集められる。
【００２１】
放出された放射線エネルギー全体、すなわち発光団によって放出された個別の発光団の放射線エネルギーの合計は、例えばアナライトの分子の濃度と比例するような、アナライトの特性と予め決められた関係をもつ。放出された放射線を解析することによって、アナライトの特性が、定量的に及び／又は定性的に決定されることができる。
【００２２】
各開口の底部にアナライト分子を固定化する方法が、以下に記述される。各アナライト分子は、例えば蛍光標識のような発光団を備える。発光団を励起し、放出された放射線を集めることによって、アナライト分子の検出が、提供されることができる。検出は、定性的及び／又は定量的でありうる。
【００２３】
リガンド又は捕捉分子が、開口の特定の部分に配置され又は固定化されることができ、前記リガンドは、アナライトのターゲット分子によって接触されると、発光団を形成する。発光団のこのような形成は、例えばS.Weissによる文献「Fluorescence spectroscopy of single biomolecules」（Science, Vol. 283, pp 1676-1683）に記述されるように異なる態様で行われることができ、上記文献の技術的な内容は、参照によって本願明細書に盛り込まれるものとする。リガンドは、発光団が、励起に応じて固定化された位置から放射線を放出するように、発光団を固定化することができる。
【００２４】
リガンドは、開口の底部に隣接して、基板に配置されるトレンチに固定化されることができる。
【００２５】
発光団は、例えば電気又は化学エネルギーによって、さまざまな異なるやり方で放射線を放出するために励起されることができる。放出される放射線は、例えばルミネセンス、燐光、蛍光、ラマン散乱光、ハイパーラマン散乱光又はハイパーレイリー（Rayleight）散乱光等の異なる物理的プロセスによって、生じうる。放出される放射線は、例えば赤外光を含む光のような電磁放射線でありうる。
【００２６】
特に開口の第１の面内寸法の少なくとも２倍大きい関連する媒体中の波長を有する紫外、可視及び赤外光を含む光である電磁放射線によって励起される発光団が考慮される。有効波長は、媒体の屈折率で除算される真空中の放射線の波長である。
【００２７】
発光団によって放出されるルミネセント放射線は、バイオセンサのいずれかの側において検出されることができる。アナライト流体が、前側に存在する場合、放射線は、基板の後ろ側で検出されることができる。光源が、基板の後ろ側から基板に向けられる場合、Ｒ偏光励起光が、開口内にエバネセント場を確立し、Ｔ偏光励起光が、開口内に伝播波を確立する。このようなエバネセント場は、基板側に隣り合って開口内に存在する発光団を励起することができる。エバネセント場は、開口の基板側から、開口内に、指数関数的な崩壊を有する。こうして、開口の基板側の近くに存在する発光団は、開口のアナライト側に又はその外側に存在する発光団より効率的に励起される。非偏光であり、又は例えばＲ及びＴ偏光の線形結合である円偏光、楕円偏光又は直線偏光のような他の偏光状態を有する励起光は、Ｒ及びＴ偏光に分解されることができ、開口内にエバネセント及び伝播励起光の組み合わせを生じさせる。
【００２８】
生成されたルミネセント放射線は、概して、Ｒ及びＴ偏光成分を有する偏光状態を有する。ルミネセント光のＴ偏光部分は、基本的に開口によって透過され、Ｒ偏光成分は、実質的に開口によって抑制される。
【００２９】
多くのアプリケーションにおいて、約１０００のバックグラウンド減衰が十分であるが、例えばレーザより一般に高価でなく、必要な励起パワーをなお提供することができる、発光ダイオードＬＥＤのような非偏光の光源を使用してもよい。
【００３０】
図１は、第１の実施例によるシステムを開示している。システムは、例えば国際公開第２００７／０７２２４１号パンフレットに開示されるタイプのワイヤグリッドバイオセンサを有する。
【００３１】
バイオセンサ１は、トランスペアレントな基板２上に配置されるいくつかの「ワイヤ」３を有する。基板は、ガラス、シリカ又は例えばアクリルガラス、エポキシ樹脂、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）等の他の同様の材料から作られることができる。十分にトランスペアレントであるために、材料は、１０―４より小さい虚数部を有する屈折率を有するべきである。ワイヤは、所望の構造、すなわち複数の開口４を得るようにエッチングされ又はメッキされる、例えば金、アルミニウム、銀、クロミウム等の金属によって形成されることができる。このようなワイヤ及びワイヤグリッドの形成は従来技術において知られており、例として国際公開第２００６／１３６９９１号パンフレットを参照されたい。
【００３２】
複数の開口４が、ワイヤ３の間に形成される。開口は、第１の面内方向においてサブ回折限界寸法を有する。この第１の面内寸法は、励起放射線の有効波長の半分より小さい。水（ｎ＝１．３）が開口内に存在し、励起放射線が、真空中で６３３ｎｍの波長を有する場合、有効波長は、４８７ｎｍであり、開口の第１の面内寸法は、２４３ｎｍである有効波長の半分より小さい。第１の面内寸法は、有効波長の０．２５倍すなわち１２１ｎｍより小さくてもよい。第１の面内寸法は、有効波長の０．２倍すなわち９７ｎｍより小さくてもよい。第１の面内寸法は、有効波長の０．１５倍すなわち７３ｎｍより小さくてもよい。開口の第２の面内寸法は、有効波長の少なくとも０．５倍すなわち少なくとも２４３ｎｍのような有効波長の半分より大きい。第２の面内寸法は、有効波長の１０乃至１００倍すなわち４．９乃至４９μｍでありうる。第２の面内寸法は、有効波長の１００乃至１０００倍すなわち４９乃至４９０μｍでありうる。第２の面内寸法は、有効波長の少なくとも１０００倍すなわち少なくとも４９０μｍでありうる。
【００３３】
アナライト流体５は、バイオセンサの開口に導入されることができる。アナライトは、励起に応じて電磁放射線を放出することが可能である発光団又は蛍光団８の標識を具えるターゲット分子７を有することができる。
【００３４】
基板２は、ターゲット分子７に対する親和性を呈し、開口の底部すなわち基板側で前記基板２の表面に固定化される、捕捉分子又はリガンド６を備えることができる。ターゲット分子７がリガンド６の十分近くにくると、ターゲット分子は、リガンドによって捕えられ、リガンド６、ターゲット分子７及び蛍光団８を含む会合体９を形成する。ターゲット分子及びそれに付着される標識又は蛍光団は、開口４の基板側に近い位置に固定化される。
【００３５】
バイオセンサ１は、例えば約７００ｎｍの波長の光を有する外部放射線源からの励起放射線１０に露呈される。例えばマイクロ波、赤外光、近赤外（ＮＩＲ）光、可視光、紫外光、Ｘ線等の他の波長の放射線も同様に使用されることができる。
【００３６】
円偏光の場合、励起放射線は、（約）５０％のＴ偏光された放射線及び（約）５０％のＲ偏光された放射線に分解されることができる。結果として、励起放射線の（約）５０％は、実質的に透過され、励起放射線の他の（約）５０％は、指数関数的に崩壊し、基本的に透過されないエバネセント場を開口内に生成する。従って、ワイヤグリッドのサンプルファセットから間隔をおいて配置される位置に関する励起光の実質的な抑制は、光が基本的にＲ偏光されることを必要とする。
【００３７】
バイオセンサは、反射モードで動作されることができる。バイオセンサは、開口の基板端部の方へ向けられる励起放射線１０に露呈される。
【００３８】
基板側と隣接して固定化される蛍光団８を含む会合体９は、励起エネルギーを吸収し、遷移双極子モーメントの方向に依存して、全方向に蛍光Ｘ線を放出する。蛍光は、矢印１１ａ及び１１ｂによって示されるように、いくつかの方向においてある程度顕著である。放出された放射線の部分１１ａは、基板２の下に配置される検出器１２の方へ向けられ、他方、他の部分１１ｂは、開口のアナライト側の方へ向けられる。
【００３９】
適切に偏光された励起光が使用される場合でも、励起光のごくわずかな割合η（上述したような一般的な開口の場合、透過されるＲ偏光励起光は、入射Ｒ偏光励起光１０の１／１０００である）が、開口によって透過される。この透過される割合ηは、開口のアナライト側で、流体５に存在する蛍光団８によって吸収され、このような蛍光団を励起して、矢印１４ａ及び１４ｂによって示されるような放射線を放出することができる。放出された放射線は、概して、Ｔ及びＲ偏光成分を有する。流体は、蛍光団８を備える自由ターゲット分子７及び自由蛍光団８を有することができる。矢印１４ａによって示される放射線の部分は、開口を通り抜け、Ｔ偏光されたこのような放射線の部分は、Ｒ偏光成分と対照的に、開口によって透過され、不所望のバックグラウンド放射線を生じさせる。
【００４０】
リガンド６に結合されない大量の外部の蛍光団８が、開口のアナライト側において流体５中に存在する場合、このようなバックグラウンド放射線は大きい。このような外部蛍光団は、リンスによって低減されることができるが、リンスは、例えばリアルタイム測定中に行うことができない。
【００４１】
なお、一般に、アナライト側の流体５に存在する蛍光団からの、基板側の開口を通過する放射線１４ａの最も多くの部分は、Ｔ偏光である。開口を通る放射線１４ａの約０．５＊ηである小さい割合が、Ｒ偏光された光である。
【００４２】
偏光フィルタ３３は、検出器１２の前に配置される。偏光フィルタは、高い抑制を有し、例えばＴ偏光の場合の１０，０００より大きい、開口の１／ηに等しい又はそれより良い抑制である。こうして、流体６に存在する蛍光団から放射線１４ａの大部分は、フィルタ３３によって阻止される。こうして、バックグラウンド放射線は、フィルタ３３の抑制に依存して０．５＊ηとηの間のファクタによって低減され、これは実質的な低減である。有用な放射線すなわち検出されるべき放射線１１ａは更に、ほんのわずかなファクタのみを伴って、低減される。こうして、０．５／ηと１／ηとの間の信号対バックグラウンド比率の改善が、フィルタ３３によって得られる。
【００４３】
フィルタ３３は、前記ワイヤグリッドの減衰ファクタηと少なくとも同じ減衰ファクタを有することができるが、約１０ηより大きい減衰ファクタを有することもできる。このような偏光フィルタは、例えば１０００００の一般的な減衰ファクタを有するＧｌａｎレーザ偏光器のように、商業的に入手可能である。
【００４４】
偏光フィルタ３３はバイオセンサ１と同様のワイヤグリッドでありえ、その場合、偏光フィルタ３３は、ワイヤグリッドと同じ抑制ηを有する。この場合、抑制は、理論的に最大限に得られる改良の５０％だけである。
【００４５】
バックグラウンド放射線の他の低減は、Ｒ偏光された励起放射線を使用することによって得られることができる。この場合、励起放射線は、開口を通る際に前記減衰ファクタηによって減衰され、これは、検出器１２に達するバックグラウンド放射線が、フィルタ３３の減衰ファクタに依存して、０．５＊η２乃至η２のファクタによって、すなわち上述したケースにおいては５００，０００のファクタよって、低減される。
【００４６】
同じ偏光フィルタ３３は、図１の破線３３ａによって示されるように、励起放射線のために及び検出器へのバックグラウンド放射線を阻止するために、という両方の目的で使用されることができる。
【００４７】
基板２及びワイヤグリッドから反射される励起放射線もまた、バックグラウンド放射線として検出器に更に達する。このような励起バックグラウンド放射線は、例えば蛍光放出された放射線のみを通すフィルタのような、異なる手段によって低減されることができる。励起放射線は更に、ある角度でバイオセンサの方へ向けられることができ、それにより、反射された放射線は、検出器に達しない。この場合、検出器の方へ向けられる散乱された励起放射線は、蛍光Ｘ線を透過し及び励起放射線を阻止する波長フィルタ３７によって除去されることができる。
【００４８】
図２は、例えばアルミニウム、金、銀、クロミウム等の、金属のワイヤグリッド３を備えるガラスの基板２を有する実施例を開示している。ワイヤグリッドは、例えば７０ｎｍのような、回折限界幅２７０ｎｍより小さい第１の面内寸法（幅）を有するスリットの形の開口を有する。スリットは、例えば１ｍｍのような、回折限界幅より大きい第２の面内寸法（長さ）を有する。蛍光団２０を有するターゲット分子は、開口の基板端部において固定化され／結合し、他の蛍光団２１は、開口のアナライト端部に存在する流体５中に存在する。
【００４９】
矢印１０ｂによって示される、例えば約７００ｎｍの真空波長を有する光のような励起放射線が、光源からダイクロイックミラー３１の方へ向けられる。ダイクロイックミラー３１からの励起放射線は、前記偏光フィルタ３３を通り、偏光された励起放射線１０ｂをバイオセンサ面に向けてフォーカスするためにレンズ３２に入る。
【００５０】
励起放射線は、放射線を放出するように、蛍光団に影響を与える。開口の基板側に存在する蛍光団２０から放出された放射線２０ａは、レンズ３２を通り、Ｒ偏光された放射線２０ｂだけを通す偏光フィルタ３３を通る。通過された放射線２０ｂは、レンズ３４及び検出器２２の方へ、ダイクロイックミラー３１によって反射される。
【００５１】
開口の基板側におけるＲ偏光された励起放射線１０ｂは、指数関数的な崩壊を有する開口内のエバネセント場を形成する。励起放射線は、前記減衰ファクタηによって減衰され、励起放射線のごくわずかな割合だけが、開口のアナライト側で蛍光団２１に達する。蛍光団２１は、放射線２１ａを放出し、それは、開口を通り、レンズ３２及び偏光フィルタ３３に達する。蛍光団２１からの放射線のＴ偏光成分２１ｂは、開口を通るが、偏光フィルタ３３によって阻止される。蛍光団２１からの放射線のＲ偏光成分は、開口を通るとき、前記減衰ファクタηによって減衰され、レンズ３２及び偏光フィルタ３３を通り、ダイクロイックミラー３１によってレンズ３４及び検出器２２の方へ向けられる。こうして、蛍光団２１からのバックグラウンド放射線は、偏光フィルタ３３の無い状況と比較して、ファクタη２によって減衰される。
【００５２】
偏光フィルタ３３は、開口のアナライト側において励起放射線のレベルを測定することによって、バイオセンサのセットアップ時にワイヤグリッドとそろえられることができる。このように測定された励起放射線レベルが最小値であるとき、偏光フィルタ３３は、ワイヤグリッドとそろえられており、これは、偏光フィルタが、ワイヤグリッドに対して垂直な偏光を有する放射線のみを通す。
【００５３】
偏光フィルタを回転させることによって、バックグラウンド低減が可変にされることができる。これは、外部偏光フィルタの向きが回転されることができることにより、バックグラウンドを抑制するだけでなく、更に、バックグラウンドを測定し、結合された蛍光団の偏光状態を決定することを可能にするので、柔軟性を改善する。
【００５４】
図３は、偏光フィルタ２４が、蛍光団によって放出される放射線によってのみ通過される他の実施例を開示している。この例において、偏光フィルタ２４は、例えば１００ｎｍより大きい、より大きいストークスシフトを有する蛍光団に関連しうる励起放射線に対してトランスペアレントである必要はない。励起放射線は、円偏光を有することができる。代替として、励起放射線は、直線偏光された放射線でありえ、その場合、偏光は、上述したようにそろえられるべきである。
【００５５】
図４は、図３の実施例の偏光フィルタ２４が偏光ビームスプリッタ３５と置き換えられる他の実施例を開示している。偏光ビームスプリッタ３５は、Ｒ偏光放射線２０ｂを、レンズ３４及び検出器２２へ通過させ、偏光ビームスプリッタ３５は、Ｔ偏光放射線２０ｃ及び２１ｂを、第２のレンズ３６及び第２の検出器２３の方へ向ける。こうして、バックグラウンド信号が評価されることができる。
【００５６】
図５は、例えば紫外光、可視光又は赤外光を含む外部放射線源からの励起放射線１０に露呈されるバイオセンサ１の他の実施例を示している。放射線源は、検出装置３０に含まれており、検出装置３０は、上述したバイオセンサ１とは別である。
【００５７】
本実施例において、例えば１又は複数のＬＥＤである非偏光の光源が使用される。このような光源は、励起放射線のより大きいパワーを放出することができ、レーザ光源より非常に安価である。
【００５８】
光源ユニット４０は、６３０ｎｍの波長付近の放射線を放出する１又は複数のＬＥＤ４１、レンズ４２、及び励起光を通過させ、蛍光標識の放出帯域及び放出フィルタ５４の通過帯域に重なる光を除去する通過フィルタ４３を有する。こうして、フィルタは、一般に２０乃至３０ｎｍの幅である通過帯域を有することができ、蛍光標識の吸収帯域又は励起帯域と重なる光１０を透過する。これらのＬＥＤ用の適切な通過帯域波長レンジの例は、６２０乃至６５０ｎｍである。適切な通過フィルタは、Omega Optical,Incから入手可能な3RD Millenium620―650フィルタである。
【００５９】
光は、或る角度で基板側からバイオセンサの方へ向けられ、光は、光ビーム１５によって示されるように、ワイヤグリッドによって部分的に反射される。こうして、実質的に、励起光は、センサ７１に達しない。励起光のごくわずかな割合だけが、破線１６によって示されるように、センサ７１の方へ向けられる。
【００６０】
イメージングブロック５０は、バイオセンサの後ろ側において、バイオセンサにほぼ垂直な角度で配置される。イメージングブロック５０は、偏光板５３及び１又は複数の放出フィルタ５４を介して、検出器７１の方へ放出放射線１７を向けるために第１のレンズ５１及び第２のレンズ５２を有する。放出フィルタは、放出放射線１７を通過させ、励起放射線１６を阻止する。例えば、それぞれ７００ｎｍ及び６５０ｎｍの波長付近を中心とする約５０ｎｍのスペクトル幅を有する放出スペクトルを有するａｔｔｏ６８０染料又はＦｌｕｏｒ６３３染料のような蛍光標識の場合、放出フィルタ５４について適切な透過波長は、例えば６６５ｎｍの最小透過波長を有するOmega Optical,Incから入手可能な695AF55EmitterXF3076フィルタのような、６６０ｎｍ又はそれより大きい最小透過波長を有する。
【００６１】
検出器７１は、ＣＣＤ又はＣＭＯＳ検出器を含むカメラでありうる。他の代替例は以下である。
【００６２】
非偏光の光の場合、励起放射線は、Ｔ及びＲ偏光された放射線に分解されることができる。その結果、励起放射線の約半分は、ワイヤグリッドを通して実質的に透過され、励起放射線の他の半分は、指数関数的に崩壊する、基本的に透過されないエバネセント場を開口内に生成する。Ｒ偏光された放射線のごくわずかな割合だけが、開口を通過する。こうして、ワイヤグリッドは、実質的に偏光フィルタとして動作する。
【００６３】
ワイヤグリッドを通る放射線とワイヤグリッドに当たる放射線との間の比率は、消光レートと呼ばれ、一般的なワイヤグリッドの場合、Ｒ偏光された放射線に関して一般に約０．００１である。
【００６４】
放射線は、蛍光Ｘ線を放出するために、蛍光標識を励起する。蛍光団の集合について、標識は、励起放射線偏光と同じ偏光の約７５％を放出することができる。
【００６５】
開口の基板端部と隣り合って開口内に位置する蛍光標識６１は、Ｔ及びＲ偏光を有する励起放射線によって励起される。ここで、Ｔは、通常、非偏光の励起光の場合、Ｒにほぼ等しい。励起放射線全体は、Ｔ＋Ｅであり、これは、標識からの蛍光放出を生じさせる。放出は、すべての方向にあり、５０％が、検出器の方へ向けられるものとする。
【００６６】
バイオセンサの前側すなわちサンプル側と隣り合う開口の外側に位置する蛍光標識６２は、ほぼ減衰されてワイヤグリッドを通る励起光のＴ成分によって励起される。加えて、励起光のＲ成分は、消光ファクタｎによって減衰される。こうして、Ｔ成分及びＲ成分は、放出放射線を生じさせる。この放出は、すべての方向にあり、５０％が、開口に再び入り検出器に向かうものとする。しかしながら、Ｒ成分は、消光ファクタｎによって減衰される。最後に、偏光フィルタは、ファクタＮによってＴ成分を低減する。偏光フィルタの後に、標識６１及び６２から生じる検出される蛍光の間の比率は、以下の通りである：
（Ｎ＋１）／［（Ｎ＊３／４＋ｎ＊１／４）＋ｎ＊（ｎ＊３／４＋Ｎ＊１／４）］
Ｎ＝ｎとすると、比率は１／ｎであり、これは、本発明の第１の実施例が、ワイヤグリッドの消光比と同様のバックグラウンド抑制をもたらすことを示す。Ｎ＜＜ｎである場合、比率は約４／ｎである。ワイヤグリッドの典型的な消光比は、ｎ＝０．００１である。
【００６７】
偏光フィルタ５３は、少なくとも前記ワイヤグリッドの消光ファクタｎと同じ消光ファクタＮを有することができるが、約０．１＊ｎより小さい消滅ファクタを有することもできる。このような偏光フィルタは、商業的に入手可能であり、例えば１０−５の一般的な消光ファクタを有するＧｌａｎレーザ偏光板である。
【００６８】
偏光フィルタ５３は、ワイヤグリッド１と同様のワイヤグリッドでありえ、その場合、偏光フィルタ５３は、ワイヤグリッドと同様の消光ファクタｎを有しうる。
【００６９】
基板２及びワイヤグリッドから散乱される励起放射線もまた、バックグラウンド放射線として検出器に達する。このような励起バックグラウンド放射線は、放出フィルタ５４によって低減される。放出フィルタ５４は、放出波長より短い波長を有する光を減衰させ、ゆえに、本質的に励起光を阻止する。
【００７０】
図５による実施例は、反射モードで動作する。光源及び検出器は、両方とも、バイオセンサの後ろ側に配置され、検出されるべき流体は、基板上のワイヤの反対側にある。光は、検出器の方にではなく他の方向に反射されるようにするために、第１のレンズ５１の開口数より大きい角度を有する基板に向けられる。
【００７１】
図６は、ワイヤグリッドが第１の実施例と同じ開口を有し、透過モードで動作する他の実施例を開示している。光源は、バイオセンサの前側に配置され、検出器は、バイオセンサの後側に配置される。動作は、図５による実施例と同様である。
【００７２】
ＬＥＤ４１によって放出される光は、レンズ４２によってフォーカスされ、通過フィルタ４３を通った後、グリッドの開口又は複数の開口を照明する。Ｔ偏光を有する励起光は、本質的に減衰されずに開口を通過し、他方、Ｒ偏光を有する励起光は、実質的に阻止される。
【００７３】
開口を通過する励起光は、本質的にＴ偏光された励起光であり、Ｔ偏光された励起光は、偏光フィルタ５３によって実質的に阻止される。偏光フィルタ５３をなお通過し、消光レートＮによって減衰される任意のＴ偏光された励起光、及びワイヤグリッドをなお通過し、消光レートｎによって減衰される任意のＲ偏光された励起光は、検出器７１に達する前に、いくつかのカスケードされたフィルタを有しうる通過フィルタ５４によって阻止される。
【００７４】
開口の基板端部に位置する蛍光標識６１は、励起光のＴ成分によってのみ実質的に励起され、これは、蛍光標識６１が、図５の第１の実施例の放出放射線の約半分を放出することを意味する。
【００７５】
開口のサンプル端部と隣り合って開口の外側に位置するバックグラウンド標識６２は、放出放射線を放出する。Ｔ成分は通過し、Ｒ成分は、消光ファクタｎによって低減される。
【００７６】
こうして、検出器に達する基板端部標識６１及びサンプル端部標識６２の放出の間の比率は、以下の通りである：
（Ｎ＊３／４＋１／４＋ｎ＊３／４＋Ｎ＊ｎ＊１／４）／（Ｎ＋ｎ）
Ｎ＝ｎ及びｎ＜＜１（ｎ＝０．００１の場合の一般的な値）の場合、比率は約１／（８＊ｎ）である。ｎ＜＜１及びＮ＜＜ｎ（すなわちワイヤグリッドより実質的に小さい消光比を有する偏光板５３である）の場合、比率は約１／（４＊ｎ）である。
【００７７】
別の実施例において、励起放射線は、図７に示されるように、基板に本質的に平行なワイヤグリッドに向けられる。ダイクロイックミラー９１が、例えばＬＥＤ光の光路に配置され、基板の方へ垂直に光を向けなおす。ダイクロイックミラーは、波長６２０乃至６５０ｎｍの励起光を反射するように設計され、６７０ｎｍより大きい波長の放出光を通す。こうして、放出フィルタ５４は、図７に示されるように省かれてもよいが、ダイクロイックミラーが、なお励起光のごくわずかな割合を通す場合、放出フィルタ５４が含められることができる。
【００７８】
偏光フィルタ５３は、例えば、サンプル端部（すなわち上部の流体を介して）からワイヤグリッドを照明し、検出器７１上のパワーを最小にすることによって、バイオセンサのセットアップ時にワイヤグリッドとそろえられることができる。このように測定されたパワーが最小である場合、偏光フィルタ５３は、ワイヤグリッドとそろえられ、すなわちワイヤグリッドに対して垂直に配置され、これは、偏光フィルタが、ワイヤグリッドの透過面と垂直なＲ偏光を有する放射線のみを通すことを意味する。
【００７９】
偏光フィルタを回転させることによって、バックグラウンド低減は可変にされることができる。これは、外部偏光フィルタの向きが回転されることができることにより、バックグラウンドを抑制するだけでなく、バックグラウンドを測定し、結合された蛍光団の偏光状態を決定することを可能にするので、柔軟性を改善する。
【００８０】
図８は、偏光フィルタ９３が、図５の実施例と比較して他の位置に、すなわちイメージングブロック５０と基板２との間に配置される他の実施例を開示している。加えて、偏光フィルタ９３は、光ユニット４０と基板との間に配置され、それにより、ＬＥＤ４１からの光は、基板に達する前に、偏光フィルタ９３を通る。こうして、ＬＥＤから基板への励起光及び蛍光標識からの放出光は、同じ偏光フィルタ９３を通る。偏光フィルタは、非偏光である励起光が偏光フィルタ９３を通るような位置に配置され、偏光フィルタ９３は、Ｒ偏光された放射線を通すが、１０−３乃至１０−６でありうるファクタＮによって、Ｔ偏光された照射を減衰させる。開口の基板端部に位置する蛍光標識６１及び開口のサンプル端部に位置する蛍光標識６２は、放出放射線を放出する。Ｒ成分は、開口を通過する際、ファクタｎによって更に減衰され、Ｔ成分は、偏光フィルタを通過する際、ファクタＮによって減衰される。偏光フィルタ後の標識６１及び標識６２からの放出放射線の間の比率は、以下の通りである：
（３／４＋Ｎ＊１／４）＋（Ｎ＊Ｎ＊３／４＋Ｎ＊１／４）／
（ｎ＊ｎ＊３／４＋Ｎ＊ｎ＊１／４）＋（Ｎ＊Ｎ＊３／４＋ｎ＊Ｎ＊１／４）
Ｎ＝ｎの場合、比率は３／（８＊ｎ＊ｎ）である。Ｎ＜＜ｎの場合、比率は約１／（ｎ＊ｎ）である。
【００８１】
偏光フィルタ９３は、ワイヤグリッドのそれに対して垂直な偏光方向を有して配置される。偏光フィルタ９３がワイヤグリッドである場合、フィルタのグリッド方向は、ワイヤグリッドのグリッド方向に対して垂直であるべきである。
【００８２】
図９に示すように、図７の実施例の偏光フィルタ５３は、偏光ビームスプリッタ９２と置き換えられることができる。偏光ビームスプリッタ９２は、Ｒ偏光された放射線１８を検出器７１に通し、偏光ビームスプリッタ９２は、Ｔ偏光された放射線１９を第２の検出器９４の方へ向ける。こうして、バックグラウンド信号が、測定されることができる。偏光ビームスプリッタ９２は、図１及び図２による実施例ののように、偏光フィルタ５３と置き換わることができる。
【００８３】
図１０は、図７又は図９と同様の他の実施例を示しており、この例において、偏光フィルタは、図８の実施例と同じ位置に、すなわち基板に近いところに、配置される。こうして、非偏光の光源４１からの励起光は、ダイクロイックミラー９１の方へ向けられ、偏光フィルタ９３を介して基板の方へ反射される。偏光フィルタ９３は、実質的に、Ｒ偏光された放射線のみを通す。励起放射線は、蛍光団標識６１から、偏光フィルタ９３を通過し、ダイクロイックミラー９１を通過して、検出器７１に入る蛍光放出放射線、及び蛍光団標識６２から、開口、偏光フィルタ９３、ダイクロイックミラー９１を通過して、検出器７１に入る蛍光放出放射線を生じさせる。蛍光標識６１及び６２からの放出放射線の間の比率の算出は、図８の実施例の場合と同じである。
【００８４】
上述の実施例において、簡素であり安価な構造のワイヤグリッドバイオセンサが使用されることができ、これは、ワイヤグリッドが使い捨て可能でありえることを意味する。
【００８５】
偏光フィルタは、バイオセンサの外側に配置され、数回使用されることができる。偏光フィルタは、検査されるべきアナライトとの接触なしに配置される。偏光フィルタは、常に、トランスペアレントな基板とセンサとの間に配置される。こうして、より用途が広い偏光フィルタが使用されることができ、それにより、解析当たりの総コストを実質的に上げることなく、非常に大きいバックグラウンド放射線減衰をもたらす。
【００８６】
光源ユニット４０及びイメージングブロック５０のそれぞれ異なる素子は、上述した以外の別の順序で配置されることができる。こうして、励起放射線通過フィルタ４３は、光源４１とレンズ４２との間に配置されることができる。図７の実施例において、ダイクロイックミラーは、通過フィルタ４３の動作を実施するように配置されることができ、パスフィルタ４３は、余分になって、省かれることができる。イメージングブロック５０において、素子の順序は、異なってもよい。例えば、偏光フィルタは、基板と検出器７１との間の任意の位置に配置されることができる。
【００８７】
図５による実施例は、以下の特性を有するテスト環境において使用される：
【００８８】
バックグラウンド抑制を示すために、標識化されたタンパク質の蜂巣模様を有するサンプルが、ワイヤグリッド上でＳｉＯ２スペーサ材料のチェスボードパターンをスパッタリングし、開口４と重なり、スペーサ材料によってカバーされないトランスペアレントな基板２の部分上に、Ｆｌｕｏｒ６３３染料により標識化されたタンパク質を固定化することによって、製造された。製造されたサンプル上に、例えばAtto-Tec GmbHから入手可能なａｔｔｏ６８０染料である例えば４．５マイクロモルの染料溶液のような、非常に高い濃度で満たされた厚さ０．５ｍｍのハイブリダイゼーションチャンバが、与えられた。これらのサンプルは、６２０から６５０ｎｍの間の励起波長を制限するためにスペクトルに関してフィルタリングされる４つの赤色ＬＥＤを使用して、図１のセットアップと同様にセットアップにおいて特徴づけられる。偏光器の透過軸を回転させることによって、検出ボリュームを、本質的にエバネセント又は近距離場から、本質的に完全なハイブリダイゼーションチャンバに、切り替えることが可能であった。
【００８９】
図１１は、測定された蛍光画像を示す。左は、偏光器がワイヤグリッドの透過軸に平行である場合の、右は、偏光器がワイヤグリッドの透過軸に直交する場合の、測定された蛍光画像が示されている。検出ボリュームは、本質的には開口の基板端部における標識化されたタンパク質、及びわずか２０―３０ｎｍの高さを有する染料溶液の小さいエバネセントボリュームにのみ制限される。左の画像の積分時間は、右の画像より約５００倍小さい。図１１から、ワイヤグリッド上の蛍光流体によって生成されるバックグラウンドが効率的に抑制されることができることが明らかに分かる。左の画像の積分時間が、約５００倍小さいという事実は、信号より実質的に大きいバックグラウンド蛍光を抑制することが可能であることを明らかに示す。
【００９０】
更に、図５による実施例において、ワイヤグリッドの暗視野照明が使用され、その場合、入射光の入射角が、検出器上のイメージングのために使用される収集レンズの開口数に一致する角度より大きい。このように、鏡面反射される光は、検出器上にイメージングされない。
【００９１】
本実施例は、以下の利点の１又は複数を有する：
【００９２】
励起源の偏光軸とワイヤグリッドの透過軸との間の厳密なアライメントが、もはや必要とされない。上述の実施例において、ワイヤ間のスペースに純粋なエバネセント場を生成するために、光源の偏光軸が、ワイヤグリッドの透過軸と直交するようにそろえられなければならない。
【００９３】
レーザは、非偏光の光源より一般に高価である。蛍光のようなアプリケーションの場合、標識分子の吸収帯域は、非常に広く、これは、ＬＥＤの使用を可能にする。ＬＥＤは、それらが実質的に低いコストでレーザと同様のパワーレベルを提供するので、特に魅力的である。更に、ＬＥＤの光学パワーは、将来、実質的に増加することが予測される。
【００９４】
一般的なレーザの偏光純度は、１００：１であり、他方、ワイヤグリッドバイオセンサ概念において使用されるワイヤグリッドの一般的な消光は、１０００より良好である。これは、各レーザが、ワイヤグリッドの消光に等しい又はよりよい消光を有する専用の偏光器を必要とすることを意味する。
【００９５】
レーザの長いコヒーレンス長は、スペックルを意味し、これは、照明の均一性を制限する。本実施例において、例えば１ｎｍより大きいバンド幅の低いコヒーレンス長を有する光源が、使用される。
【００９６】
上述の実施例は、例えば高次数を有するＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイのように、例えば高いバックグラウンド環境の測定に必要とされる高い表面特異性に関する測定のための光学バイオセンサのように、さまざまな異なるアプリケーションにおいて使用されることができる。
【００９７】
上述の実施例は、顕微鏡として使用されることができ、その場合、センサ７１は、ユーザの目と本質的に置き換えられる。
【００９８】
本発明は、特定の実施例に関して上述されているが、ここに記述された特定の形に制限されることを意図しない。むしろ、本発明は、添付の請求項によってのみ制限され、特定の上述の実施例以外の他の実施例が、これらの添付の請求項の範囲内で等しく実現可能である。
【００９９】
請求項において、「有する、含む」なる語は、他の構成要素又はステップの存在を除外しない。更に、複数の手段、構成要素又は方法ステップが、個別に列挙されているが、例えば単一のユニット又はプロセッサによって実現されることができる。加えて、個別のフィーチャは、それぞれ異なる請求項に含められることができるが、これらは、おそらく有利に組み合わせられることができ、それぞれ異なる請求項に含めることは、フィーチャの組み合わせが実現可能でなく及び／又は有利でないことを示さない。加えて、単数の言及は、複数性を除外しない。不定冠詞及び「第１」、「第２」等は、複数性を除外しない。請求項における参照符号は、例示を明確にするためだけに与えられており、いかなる形であれ請求項の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0005409391.tif 000009
【図９】
0005409391.tif 000010
【図１０】
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【図１１】
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