(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
増幅した二本鎖核酸の混合物を製造する方法であって、
(a)一本鎖アダプター1、一本鎖核酸断片及び一本鎖アダプター2を含む一本鎖核酸を調製すること、
但し、
前記一本鎖アダプター1は、少なくとも共通配列1及びサフィックス配列1を含み、
前記一本鎖アダプター2は、少なくともサフィックス配列2及び共通配列2を含み、
前記共通配列1及び前記共通配列2は逆相補的であり、かつ
前記サフィックス配列1及び前記サフィックス配列2は、非逆相補的である；並びに
(b)工程(a)で調製された前記一本鎖核酸、少なくとも共通配列１の一部及びサフィックス配列１を含むプライマー１、並びに共通配列２の逆相補鎖の一部及びサフィックス配列２の逆相補鎖を含むプライマー２を用いてPCRを行い、二本鎖核酸を増幅すること、
を含む方法。
【請求項２】
前記アダプター1は、その5'末端にプレフィックス配列1をさらに含み、かつ前記プライマー1は、その5'末端に前記プレフィックス配列1をさらに含み、または
前記プライマー1は、その5'末端に前記プレフィックス配列1をさらに含む、
請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記アダプター2は、その3'末端にプレフィックス配列2をさらに含み、かつ前記プライマー2は、その5'末端に前記プレフィックス配列2に対して逆相補的な配列をさらに含み、または
前記プライマー2は、その5'末端に前記プレフィックス配列2に対して逆相補的な配列をさらに含む、
請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
一本鎖核酸断片に対して相補的な配列を含む一本鎖鋳型核酸がキャップ構造または1つ以上の追加3’-リボヌクレオチドをその5'末端に有する場合、前記工程(a)は、一本鎖鋳型核酸;一本鎖核酸断片の3'末端における追加3'-ヌクレオチドにハイブリダイズできる少なくとも1つのヌクレオチドを３’末端に含み、かつアダプター2に対して逆相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド; 並びに3'末端に少なくとも1つのランダム配列またはオリゴ-Tを含み、かつアダプター1に対応する配列を含むプライマー3を用いる核酸鎖合成反応を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
一本鎖鋳型核酸がRNAであり、かつ核酸鎖合成反応が逆転写反応である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記共通配列1及び共通配列2はそれぞれ少なくとも1つの制限酵素認識部位を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記サフィックス配列1及びサフィックス配列2のヌクレオチド長は２〜５塩基である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記共通配列1及び共通配列2のヌクレオチド長は15〜30塩基である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記プレフィックス配列1のヌクレオチド長は8〜15塩基である、請求項２〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記プレフィックス配列2のヌクレオチド長は8〜15塩基である、請求項３〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
増幅された各二本鎖核酸は、RNAの5'末端側の配列に対応する配列を含む二本鎖cDNAである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記一本鎖アダプター1は、サフィックス配列1の3'末端に追加配列1をさらに含み、及び/または前記一本鎖アダプター2は、サフィックス配列2の5'末端に追加配列2をさらに含む、請求項５〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記追加配列1のヌクレオチド長は15〜30塩基であり、かつ前記追加配列２のヌクレオチド長は15〜30塩基である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
RNAの5'末端側の配列を決定する方法であって、
請求項５〜１３のいずれか１項に記載の方法により得られた増幅した二本鎖核酸の混合物における二本鎖核酸を、3'末端から5'末端にシーケンスするか、及び/または、5'末端から3'末端にシーケンスすることにより、一本鎖鋳型核酸として用いたRNAの5'末端側の配列を決定することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、未知の配列を含む、増幅した二本鎖核酸の混合物を製造する独特の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸鎖の5'末端、及びそれを捕捉する方法
核酸の各5'末端周辺の配列の正確な決定は、生物学においては特別な興味の対象である。リボ核酸（RNA)の場合、この配列は、染色体における対応部位、すなわち、遺伝子調節機構の最重要成分である遺伝子プロモーターを明らかにする。したがって、これまでにも、RNA分子の5'末端を単離するために多大の努力が為されてきた。しかしながら、観察される5'末端が、インビボにおいて本当に存在する分子に対応し、かつ実験中におけるより長いRNA分子の切断産物ではないことを確かめるのは困難である。
【０００３】
（メッセンジャーRNA（mRNA）を含む）生細胞のトータルＲＮＡ含量の複合分画の5'末端については、キャップと呼ばれる特異的修飾の存在によって識別することが可能であるという事実を利用して、これまでいくつかのアプローチが為されている。このキャップは、一つ以上のメチル化によって修飾されるグアノシン5'三リン酸から成る。実験条件において、キャップを有するRNA分子は、その5'末端において完全無傷と考えることが可能なので、方法は、これらの分子のみが最終産物に与ることを確保することによって5'末端を捕捉することを目指した。例えば、キャップ・トラッパー（Cap-Trapper）法では、キャップのジオール基を用いて、5'-無傷RNA分子をビーズに結合させ、切断RNA分子の相補的デオキシリリボ核酸(cDNA)を排除する（カルニンチ(Carninci) 2001、この開示の全体を引用により本明細書に含める）。オリゴキャッピング法では、フォスファターゼ、ピロフォスファターゼ、及びリガーゼを用いた三つの反応において5'オリゴヌクレオチドをRNA分子に付着させる（マルヤマ(Maruyama) 1994、この開示の全体を引用により本明細書に含める）。キャップスイッチ（CAPswitch）法では、逆転写酵素（RTアーゼ）がキャップ保護分子を鋳型として生成される第１鎖cDNA(first-strand cDNA)に対して余分のシチジンヌクレオチドを付加する性質を有することを利用して、それらを、非キャップ保護RNAから区別する（チェンチク(Chenchik) 1999、この開示の全体を引用により本明細書に含める）。
【０００４】
キャップスイッチ（CAPswitch）法
チェンチク（Chenchick）らは、「mRNA分子の5'-末端の完全配列に対応する、完全長cDNAまたはcDNA断片の合成及びクローニングのために」キャップスイッチ（CAPswitch）法を発明した。この方法において鍵となるのは、第1鎖cDNA(first-strand cDNA)がそのmRNA鋳型のキャップに達した後、該第1鎖cDNAを延長するための新規鋳型としてテンプレート・スイッチング(template switching;TS)オリゴヌクレオチドを用いることにある。この方法に特許が与えられたとき、キャップスイッチ（CAPswitch）の機序は明確に理解されなかった。TSオリゴヌクレオチドの3'末端における最適配列は、チェンチク（Chenchick）らが、ランダムヌクレオチドを持って終了するTSオリゴヌクレオチドを用い、得られた完全長cDNAの配列を分析することによって決定した。次に、これは、突然変異分析によってさらに洗練された。彼らは、TSオリゴヌクレオチドは、ｍRNAのキャップ構造にハイブリダイズするか（キャップスイッチ（CAPswitch）特許の要約及び図を参照）、又は、RTアーゼの末端トランスフェラーゼ活性によって付加される、第1鎖cDNA上の追加3'シチジン残基にハイブリダイズするのであろうと仮定した。それは、鎖のテンプレート・スイッチング(template-switching)にとって必ずしも必要なものではなく、反応を完全長に向けてより有効にするものと述べられているだけであるから、キャップ（CAP）の役割は不明である。
【０００５】
実際に、下記が実証されている、すなわち、第1鎖cDNA伸長の機序は、キャップの分子的性状に依存する、なぜなら、それは、完全長cDNAの短い伸長のための鋳型としてRTアーゼによって使用されるからである：シトシンが、7-メチルグアノシンキャップに対して付加されるが（ヒルツマン(Hirzmann)1993、この開示の全体を引用により本明細書に含める）、アデノシンキャップの場合（酵素反応では中間ステップとしてきわめてしばしば起こる）は、付加される追加ヌクレオチドはチミジンである（オオタケ(Ohtake) 2004、この開示の全体を引用により本明細書に含める）。残留末端トランスフェラーゼ活性が、キャップ無しRNA分子には検出されるが、キャップ保護分子には5%バックグラウンドとして検出される。これは、RNA分子の5'末端に達したcDNAのみが鋳型を切り替えることが可能であるという理由を説明する。
【０００６】
チェンチク（Chenchick）らの特許は広く記載されており、トータルＲＮＡ又はポリAテイルRNAの利用法、オリゴdT又はランダムRTプライマーの使用、一遺伝子の特異的増幅、又は全ライブラリーの増幅をカバーする。
【０００７】
しかしながら、この特許の発行の8年後、ナノグラムスケールで、トータルＲＮＡに対しランダムRTプライマーを用い、キャップ保護RNA（ポリAテイル付加及び欠如）の完全な5'末端のライブラリーを増幅するために、この特許の方法が使用可能であることを実証する学術的または商業的証拠はない。該特許の実施例１では、ランダムプライマーを、ただしポリアデニル化RNAと一緒に用いてライブラリーが作製される。実施例2では、100ナノグラムのトータルＲＮＡから、ただしオリゴdT RTプライマーを用いてライブラリーが作製される。実施例3では、ポリアデニル化RNAが、二本鎖オリゴdTプライマーを用いて逆転写されている。実施例4では、トータルＲＮＡが、オリゴdTプライマーによって逆転写されており、その後続工程は、5'完全性が失われる酵素的切断を含む。この特許は、トータルＲＮＡ及びランダムRTプライマーによるキャップスイッチ（CAPswitch）の使用法の例を確かに含んではいる。しかしながら、それは、遺伝子特異的な、「cDNA5'末端の高速増幅」("5' rapid amplification of cDNA ends")法との関連においてであって、そのRT産物は、ライブラリーとして増幅されていない。
【０００８】
結果として、特許又はその後の文献においても、完全5'末端のライブラリー作製のためのランダムRTプライマー及びトータルＲＮＡの同時的かつ実践的な使用法は存在せず、したがって、完全な5'末端を有するRT産物はライブラリーとして増幅されていない。
【０００９】
抑制PCR（Suppressive PCR）
抑制PCR（Suppressive PCR）は、複雑な核酸混合物において標的核酸ライブラリーを調製するために用いられ、かつ反応において増幅することができるPCR産物のサイズを選択的に調節するために用いられる方法として知られる。
【００１０】
抑制PCRは、チェンチク（Chenchik）らによって発明され、彼らに対し1996年米国特許第5,565,340号が発行された（チェンチク（Chenchik）1996、この開示の全体を引用により本明細書に含める）。この方法では、PCRの間、いくつかのDNA分子を、その5'及び3'末端に相補的アダプターを加えることによって増幅しないように阻止する。アダプター間の相補性は、アダプターとPCRプライマーとの間の相補性を超える。反応のアニーリング工程の間、分子内フォールディング（折り畳み）の方が、PCRプライマーとのハイブリダイゼーションよりも優先され、折り畳まれた鋳型は伸長しない。PCRの指数関数的性質のために、相当数の分子が各サイクルにおいて増幅を免れても、最終産物に対するそれらの寄与は無視できる程度のものとなる。
【００１１】
抑制PCRの戦略は二つのカテゴリーに分類することが可能である。第一に、PCRは、一対の異なるフォワード及びリバース・プライマーを用いて行い、各アダプターは、それらの内の一方に対して相補性を有する。したがって、同じアダプターによって側接される鋳型は抑制されるが、一方、両方のPCRプライマーにマッチする鋳型は増幅される。
【００１２】
第二のカテゴリーでは、PCRは単一プライマーによって実行される。この場合、増幅される分子は、分子内フォールディングの起こる蓋然性の低いもの：比較的長い分子である。この方法は、通常、プライマー二量体を抑制し、PCRが最短アンプリコンを優先する傾向を平衡させるために使用される（ブラウニー(Brownie)1997、この開示の全体を引用により本明細書に含める）。
【００１３】
要約すると、抑制PCRについては、それぞれ別の利点を持つ、二つの可能な戦略がある：上述の第一の戦略は、配列に基づく選択をもたらし、一方、後者の戦略は、サイズに基づく選択を生じ、一般にPCRに悪影響を及ぼす、短いサイズの鋳型に向かう偏倚に対処するものである。
【００１４】
しかしながら、抑制PCR法の全ての利点を同時に獲得することは残念ながら困難である：アンプリコンのサイズを標準化し、かつプライマー二量体を排除するには、鋳型は、5'及び3'において抑制性配列(suppressive sequence)を持たねばならないが、他のアーチファクトを排除するために方法が使用される場合、それぞれ異なるフォワード及びリバースPCRプライマーを用いて所望の鋳型を増幅しなければならない。
【００１５】
ナノグラムの鋳型から完全5'末端のライブラリーを調製するために、トータルＲＮＡ、キャップスイッチ（CAPswitch）、及びランダムプライミング(random priming)を組合せることはきわめて困難であるが、その理由は、RTの間に生じるアーチファクトである。ごく少量の鋳型が使用されるために、第2鎖cDNA合成は、増幅工程と連動しなければならないが、これは、通常、5'完全cDNAがアーチファクトによって凌駕されるPCRとなる。アーチファクトは、下記の状況下で生じる得る：
−TSオリゴヌクレオチドは、RNA分子の結合において、RTプライマーと、特に、ランダムプライマーのアニーリングのために使用される低温において競合し得る（スキームA）、
0005455243.tif 000002
−RTプライマーは、RTアーゼ（この酵素はあまり処理能が高くない）が休止すると、DNA-RNA二本鎖に侵入し、早期のテンプレート・スイッチングによって反応を停止させ得る（スキームB）。
0005455243.tif 000003
−ランダムRTプライマーの25%はグアニンで終わるので、これらは、RTによって第1鎖cDNAの5'に付加される追加シトシンの結合に対し、TSオリゴヌクレオチドと競合し得る（スキームC)。
0005455243.tif 000004
−TSオリゴヌクレオチドは、ランダムRTプライマーとハイブリダイズし、RTアーゼは、これらの複合体を伸長し得る（スキームD）。
−ランダムRTプライマーは、互いにハイブリダイズし、同様に伸長され得る（スキームD)。
0005455243.tif 000005
【００１６】
先ず、本発明者らは、プライマー二量体の増幅を回避するために、それらにチェンチク（Chenchick）らの方法にしたがって設計された配列テイル（sequence tail）を与え、かつ単一のユニバーサルPCRプライマーを用いることによって抑制PCRを利用することを考えた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
しかしながら、この設計では、鎖侵入後の早期のテンプレート・スイッチング、又は、TSオリゴヌクレオチドによるRNAへのプライミングによって生成されるアーチファクトを抑制することができない。各アーチファクトは情報の中にノイズをもたらす：RTプライマーが、RTアーゼのテンプレート・スイッチングを誘発する場合、いくつかの内部配列が誤って転写開始部位と受け取られる可能性があり、TSオリゴヌクレオチドがRNAにプライマーとして結合する場合、得られるcDNAは方向性を失い、アンチセンス転写物と間違われる可能性がある。
【００１８】
したがって、本発明の目的は、完全な5'末端配列を包含する未知の配列を含む、増幅二本鎖核酸の混合物を製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは、TSオリゴヌクレオチド及びRTプライマー尾部（tail;テイル）に異なる配列を用いると、長いアーチファクトという問題点が解消されるであろうと予想したが、実際は、TSオリゴヌクレオチドとRTプライマーとの間の相互作用から発生するプライマー二量体がPCRを占めることを見出した。
【００２０】
結果として、本発明者らは、上記知見に基づき、全ての問題を同時に解消する下記の方法を発明することに成功した。
【００２１】
［１］増幅した二本鎖核酸の混合物を製造する方法であって、
(a)一本鎖アダプター1、一本鎖核酸断片及び一本鎖アダプター2を含む一本鎖核酸を調製すること、
但し、
前記一本鎖アダプター1は、少なくとも共通配列1及びサフィックス配列1を含み、
前記一本鎖アダプター2は、少なくともサフィックス配列2及び共通配列2を含み、
前記共通配列1及び前記共通配列2は逆相補的であり、かつ
前記サフィックス配列1及び前記サフィックス配列2は、非逆相補的である；並びに
(b)工程(a)で調製された前記一本鎖核酸、少なくとも共通配列１の一部及びサフィックス配列１を含むプライマー１、並びに共通配列２の逆相補鎖の一部及びサフィックス配列２の逆相補鎖を含むプライマー２を用いてPCRを行い、二本鎖核酸を増幅すること、
を含む方法。
【００２２】
［２］前記アダプター1は、その5'末端にプレフィックス配列1をさらに含み、かつ前記プライマー1は、その5'末端に前記プレフィックス配列1をさらに含み、または
前記プライマー1は、その5'末端に前記プレフィックス配列1をさらに含む、
上記［１］に記載の方法。
【００２３】
［３］前記アダプター2は、その3'末端にプレフィックス配列2をさらに含み、かつ前記プライマー2は、その5'末端に前記プレフィックス配列2に対して逆相補的な配列をさらに含み、または
前記プライマー2は、その5'末端に前記プレフィックス配列2に対して逆相補的な配列をさらに含む、
上記［１］または［２］に記載の方法。
【００２４】
［４］一本鎖核酸断片に対して相補的な配列を含む一本鎖鋳型核酸がキャップ構造または1つ以上の追加3’-リボヌクレオチドをその5'末端に有する場合、前記工程(a)は、一本鎖鋳型核酸;一本鎖核酸断片の3'末端における追加3'-ヌクレオチドにハイブリダイズできる少なくとも1つのヌクレオチドを３’末端に含み、かつアダプター2に対して逆相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド; 並びに3'末端に少なくとも1つのランダム配列またはオリゴ-Tを含み、かつアダプター1に対応する配列を含むプライマー3を用いる核酸鎖合成反応を含む、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
【００２５】
［５］一本鎖鋳型核酸がRNAであり、かつ核酸鎖合成反応が逆転写反応である、上記［４］に記載の方法。
【００２６】
［６］前記共通配列1及び共通配列2はそれぞれ少なくとも1つの制限酵素認識部位を含む、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
【００２７】
［７］前記サフィックス配列1及びサフィックス配列2のヌクレオチド長は２〜５塩基である、上記［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
【００２８】
［８］前記共通配列1及び共通配列2のヌクレオチド長は15〜30塩基である、上記［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
【００２９】
［９］前記プレフィックス配列1のヌクレオチド長は8〜15塩基である、上記［２］〜［８］のいずれかに記載の方法。
【００３０】
［１０］前記プレフィックス配列2のヌクレオチド長は8〜15塩基である、上記［３］〜［９］のいずれかに記載の方法。
【００３１】
［１１］増幅された各二本鎖核酸は、RNAの5'末端側の配列に対応する配列を含む二本鎖cDNAである、上記［１］〜［１０］のいずれかに記載の方法。
【００３２】
［１２］前記一本鎖アダプター1は、サフィックス配列1の3'末端に追加配列1をさらに含み、及び/または前記一本鎖アダプター2は、サフィックス配列2の5'末端に追加配列2をさらに含む、上記［５］〜［１１］のいずれかに記載の方法。
【００３３】
［１３］前記追加配列1のヌクレオチド長は15〜30塩基であり、かつ前記追加配列２のヌクレオチド長は15〜30塩基である、上記［１２］に記載の方法。
【００３４】
［１４］RNAの5'末端側の配列を決定する方法であって、
上記［５］〜［１３］のいずれかに記載の方法により得られた増幅した二本鎖核酸の混合物における二本鎖核酸を、3'末端から5'末端にシーケンスするか、及び/または、5'末端から3'末端にシーケンスすることにより、一本鎖鋳型核酸として用いたRNAの5'末端側の配列を決定することを含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】チェンチク（Chenchik）らのキャップスイッチ（CAPswitch）法によって産出されるアーチファクトを示す。
【図２】部分的に相補的である二つのアダプターを使用する、本発明の方法を示す。本発明の方法は、部分的に相補的である二つのアダプターを使用する。
【図３】アダプターの様々な組合せによって引き起こされる抑制作用(suppression effect)を示す。抑制は、各末端に異なるアダプターを有する長尺分子においてもっとも弱い。「中度の抑制」とは、抑制効果は検出可能であるが（例えば、ゲル画像において200bpよりも小さいcDNAは存在しない）、「強力な抑制」の場合に比べて弱いことを意味する。その結果、ポリメラーゼ連鎖反応時、この「中度に抑制される」分子は優先的に増幅される。
【図４】二つのタイプのアダプター・アイデンティティを示す。アダプター・アイデンティティはPCR中維持される。なぜなら、PCRプライマーは、それらが間違ったアダプターにアニールされると、伸長されないからである。
【図５】キャップスイッチ（CAPswitch）法を用いた逆転写後、中度の抑制PCRによって増幅される5'cDNAを実証する実施例1の結果を示す。キャップスイッチ（CAPswitch）法による逆転写後、中度の抑制PCRによって増幅される5'cDNA。コントロールとして、いくつかの反応においてテンプレート・スイッチングオリゴヌクレオチドを省略した。逆転写時に使用されるRNAは、マウスの嗅上皮（OE)、又はマウス胚（Ctrl)から抽出した。
【図６】キャップスイッチ（CAPswitch）法を用いた逆転写後、中度の抑制PCRによって増幅される5'cDNAを実証する実施例2の結果を示す。キャップスイッチ（CAPswitch）法を用いた逆転写後、中度の抑制PCRによって増幅される5'cDNA。コントロールとして、いくつかの反応において逆転写プライマーを省略した。2サイクル毎にアリコートを採取してPCRをモニターした。
【図７】工程(a)及び工程(b)を含む本発明の方法において、一本鎖鋳型核酸がRNAであり；核酸鎖合成反応が逆転写反応であり；プライマー3が、その3'末端にランダム配列を含み；かつ、オリゴヌクレオチドが、その3'末端にオリゴ-リボグアノシンを含む方法の例を示す。
【図８】実施例3によって実施した第１PCR（中度抑制PCR）スモールスケール(small scale)のアガロースゲル分析の結果を示す。
【図９】実施例3によって実施した第２PCRスモールスケールのアガロースゲル分析の結果を示す。
【図１０】実施例3によって実施した切り出し前後のPCR産物のアガロースゲル分析を示す。
【図１１】実施例3によって実施したバイオアナライザー（Bio Analyzer）の結果を示す。
【図１２】実施例4によって実施した第１PCR（中度抑制PCR）スモールスケールのアガロースゲル分析の結果を示す。
【図１３】実施例4によって実施した第２PCRスモールスケールのアガロースゲル分析の結果を示す。
【図１４】実施例4によって実施した切り出し前後のPCR産物のアガロースゲル分析を示す。
【図１５】実施例4によって実施したバイオアナライザー（Bio Analyzer）の結果を示す。
【図１６】実施例5によって実施した第１PCR（中度抑制PCR）スモールスケールのアガロースゲル分析の結果を示す。
【図１７】実施例5によって実施した第２PCRスモールスケールのアガロースゲル分析の結果を示す。
【図１８】実施例5によって実施した切り出し前後のPCR産物のアガロースゲル分析を示す。
【図１９】実施例5によって実施したバイオアナライザー（Bio Analyzer）の結果を示す。
【図２０】実施例6によって実施した小規模の第１PCR（中等抑制PCR）のアガロースゲル分析の結果を示す。
【図２１】実施例6によって実施した第２PCRスモールスケールのアガロースゲル分析の結果を示す。
【図２２】実施例6によって実施した切り出し前後のPCR産物のアガロースゲル分析を示す。
【図２３】実施例6によって実施したバイオアナライザー（Bio Analyzer）の結果を示す。
【図２４】実施例7によって実施した、第１PCR（中度抑制PCR)スモールスケールのアガロースゲル分析の結果を示す。A-：ストランド・スイッチング(strand-switching)オリゴヌクレオチド無し、E-：ストランド・スイッチングオリゴヌクレオチド無し、−：鋳型無し。
【図２５】実施例7によって実施した、第１PCR（中度抑制PCR)ラージスケールの第1ラウンドのアガロースゲル分析の結果を示す。A-：ストランド・スイッチングオリゴヌクレオチド無し、E-：ストランド・スイッチングオリゴヌクレオチド無し、−：鋳型無し。
【図２６】実施例7によって実施した、第１PCR（中度抑制PCR)ラージスケールの第2ラウンドのアガロースゲル分析の結果を示す。
【図２７】実施例7によって実施したゲル切り出し前後のタグの精製結果を示す。
【図２８】実施例7によって実施したサンプル純度の結果を示す。
【図２９】実施例8によって実施した、第１PCR（中度抑制PCR)ラージスケールのアガロースゲル分析の結果を示す。A-：ストランド・スイッチングオリゴヌクレオチド無し、E-：ストランド・スイッチングオリゴヌクレオチド無し、−：鋳型無し。
【図３０】実施例8によって実施した、第１PCR（中度抑制PCR)ラージスケールの第1ラウンドのアガロースゲル分析の結果を示す。A-：ストランド・スイッチングオリゴヌクレオチド無し、E-：ストランド・スイッチングオリゴヌクレオチド無し、−：鋳型無し。
【図３１】実施例8によって実施した、第１PCR（中度抑制PCR)ラージスケールの第2ラウンドのアガロースゲル分析の結果を示す。
【図３２】実施例8によって実施した、ゲル切り出し前後の第1ラウンドタグの精製結果を示す。
【図３３】実施例8によって実施した、ゲル切り出し前後の第2ラウンドタグの精製結果を示す。
【図３４】実施例9によって実施した、中度抑制PCRによる3'-RACEの結果を示す。1.5%アガロースゲル：100V、27分、NC:ネガティブ・コントロール（鋳型無し）。
【図３５】実施例9によって実施したPCR産物の純度を示す。1.5%アガロースゲル：100V、12分、NC:ネガティブ・コントロール（鋳型無し）。
【図３６】実施例9によって実施した454PCR、及びssDNA分離の結果を示す。1.5%アガロースゲル：100V、20分、NC:ネガティブ・コントロール（鋳型無し）。
【図３７】実施例10によって実施した、第１PCR（中度抑制PCR)スモールスケールのアガロースゲル分析の結果を示す。
【図３８】実施例10によって実施した、第２PCRスモールスケールのアガロースゲル分析の結果を示す。
【図３９】実施例10によって実施した切り出し前後のPCR産物のアガロースゲル分析を示す。
【図４０】実施例11によって実施したリアルタイムPCRの結果を示す。
【図４１】実施例11によって実施した、第１鎖ｃＤＮＡ(first-strand cDNA)を用いた第１PCR（中度抑制PCR）ラージスケール調製の結果を示す。
【図４２】実施例11によって実施した、精製後の第１PCR産物(GFX-CTAB)を示す。
【図４３】実施例11によって実施した第２PCR産物を示す。
【図４４】実施例11によって実施した、精製後の第２PCR産物(AMpure)を示す。
【図４５】RT／中度抑制プライマーの比較によって実施した中度抑制PCRで使用されたプライマーのリストを示す。
【図４６】RT／中度抑制プライマーの比較によって実施したPCRの結果を示す。
【図４７】DNA TSオリゴの比較によって実施したPCRの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明は、増幅した二本鎖核酸の混合物を製造する方法に関する。
【００３７】
本発明の方法は、(a) 一本鎖アダプター1、一本鎖核酸断片、及び一本鎖アダプター2を含む一本鎖核酸を調整すること、及び、(b) 工程(a)で調整された一本鎖核酸を用いてPCRを実行すること、を含む。該一本鎖核酸の例としては、5'から3'の方向に、一本鎖アダプター1、一本鎖核酸断片、及び、一本鎖アダプター2を含むものがある。
【００３８】
工程(a)では、一本鎖アダプター1は共通配列1及びサフィックス(suffix)配列1を含み、一本鎖アダプター2は共通配列2及びサフィックス(suffix)配列2を含む。共通配列1及び共通配列2は逆相補的である。サフィックス配列1及びサフィックス配列2は逆相補的ではない。一本鎖アダプター1の例としては、5'から3'方向に、共通配列1、及び、サフィックス配列1を含むものがあり、一本鎖アダプター2の例としては、5'から3'方向に、サフィックス配列2、及び、共通配列2を含むものがある。
【００３９】
工程(b)では、共通配列1の一部及びサフィックス配列1を含むプライマー1、及び、共通配列2の一部及びサフィックス配列2に対して逆相補的なプライマー2を用いて、二本鎖核酸を増幅する。この実施態様では、プライマー1は、中度抑制PCRにおける「リバースPCRプライマー」と呼ばれ、プライマー2は、中度抑制PCRにおける「フォワードPCRプライマー」と呼ばれる。
【００４０】
上記一本鎖核酸断片は、標的配列を含むか、又は、標的配列から成る。標的配列とは、増幅した二本鎖核酸の混合物において増幅される所望の配列である。標的配列の例としては、生物学において特別な興味の対象であり、かつより長いRNA分子の切断産物ではないRNAの5'末端側の配列が含まれる。
【００４１】
共通配列1及び共通配列2は、同じヌクレオチド長を有し、そのヌクレオチド長は、好ましくは10から40の範囲にあり、より好ましくは15から30の範囲にあり、さらに好ましくは20から30の範囲にある。その理由は、工程(b)において、上記範囲の共通配列1及び2のヌクレオチド長は、該共通配列1及び2が互いにハイブリダイズすることを可能とするからである。
【００４２】
共通配列1は、共通配列2に対して逆相補的である。共通配列1及び2のヌクレオチド配列が上記の関係にある理由は、共通配列1及び2が、工程(b)において互いにハイブリダイズすることができるからである。共通配列1及び共通配列2の例としては、同じヌクレオチド長であるが、5'から3'方向における共通配列１のヌクレオチド配列は、3'から5'方向における共通配列２のヌクレオチド配列に対して相補的なものが挙げられる。
【００４３】
共通配列1及び共通配列2は、アニールした場合、制限酵素認識部位（単数又は複数）を形成してもよく、その数は、一つ、二つ、三つ、又は四つ以上であることができる。
【００４４】
サフィックス配列1及びサフィックス配列2は、同じヌクレオチド長を有し、そのヌクレオチド長は、好ましくは2から10の範囲にあり、より好ましくは2から5の範囲にあり、さらに好ましくは3又は4である。なぜならば、上記の範囲のサフィックス配列1及び2のヌクレオチド長は、後述するように、工程(b)のPCRを中度に抑制することを可能とするからである。
【００４５】
サフィックス配列1のヌクレオチド配列は、サフィックス配列2に対して逆相補的ではない。サフィックス配列1及び2のヌクレオチド配列の方向性が上記関係にある理由は、サフィックス配列1及び2が工程(b)において互いにハイブリダイズすることができないようにするためである。サフィックス配列1及びサフィックス配列2の例としては、同じヌクレオチド長であるが、5'から3'方向におけるサフィックス配列1のヌクレオチド配列は、3'から5'方向におけるサフィックス配列2のヌクレオチド配列に対して相補的ではないものが挙げられる。
【００４６】
アダプター1は、好ましくは、該アダプター1の5'末端にプレフィックス(prefix)配列1を含み、アダプター2は、好ましくは、該アダプター2の3'末端にプレフィックス配列2を含む。プレフィックス配列1及び2は、同じか、又は異なるヌクレオチド長を有し、該ヌクレオチド長は、独立に、好ましくは1から25の範囲にあり、より好ましくは5から20の範囲にあり、さらに好ましくは5から15の範囲にある。その理由は、上記の範囲のプレフィックス配列1及び2のヌクレオチド長は、サフィックス配列1及び2と共に、工程(b)のPCRを中度に抑制することを可能とするからである。
【００４７】
プレフィックス配列1のヌクレオチド配列は、プレフィックス配列1及び2が共通配列1及び2から区別されるよう、プレフィックス配列2のヌクレオチド配列に対し逆相補的ではないことが好ましい。
【００４８】
アダプター1が共通配列1及びサフィックス配列1を含む場合、アダプター1のヌクレオチド長は、好ましくは約12から50、より好ましくは20から40である。アダプター1が、共通配列1、サフィックス配列1、及びプレフィックス配列1を含む場合、アダプター1のヌクレオチド長は、好ましくは約13から75であり、より好ましくは25から50である。同様のことがアダプター2にも当てはまる。その理由は、工程(b)において、上記の範囲のアダプター1のヌクレオチド長は、該アダプター1がプライマー1とハイブリダイズすることを可能とするからである。
【００４９】
下記のスキームは、アダプター1がプレフィックス配列1を含む、一本鎖核酸の例である。
0005455243.tif 000006
【００５０】
後述するように、工程(a)における一本鎖核酸の調製は、好ましくは、アダプター2に対して逆相補的な配列を、一本鎖核酸断片に対して逆相補的な配列を含む一本鎖鋳型核酸の5'末端に付着させること、及び、その5'末端側にアダプター1を、かつ、その3'末端に、一本鎖核酸断片の少なくとも一部に対して相補的な配列を含むプライマーを用いて核酸鎖合成反応を実施することを含む。しかしながら、本発明を上記方式に限定する意図は全く無い。
【００５１】
アダプター2は、好ましくは、オリゴヌクレオチドの尾部（テイル；tail）（本明細書では、例えば、「ストランド・スイッチングオリゴヌクレオチド」（"strand-switching oligonucleotide"）及び「TSオリゴ」とも呼ばれる）を介して導入され、アダプター1は、好ましくは、核酸鎖合成反応、例えば、キャップスイッチ（CAPswitch）法を用いた逆転写反応によってプライマー3の尾部を介して導入される。この実施態様では、プライマー3は、中度抑制PCRにおいて「ランダムRTプライマー」とも呼ばれる。例えば、一本鎖核酸断片に対して相補的な配列を含む一本鎖鋳型核酸が、その5'末端に、7-メチルグアノシンキャップなどのキャップ構造を、又は、その5'末端に、3'-シチジンなどの、一つ以上の追加3'-リボヌクレオチドを有する場合は、前記工程(a)は、一本鎖鋳型核酸；その3'末端において、一本鎖核酸断片の3'末端における追加3'-リボヌクレオチドにハイブリダイズすることができる少なくとも一つのヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド、アダプター2に対して逆相補的な配列、及び、その3'末端に少なくとも一つのランダム配列又はオリゴT、及びアダプター1に対応する配列を含むプライマー3、を用いる核酸鎖合成反応を含むことができる。一本鎖鋳型核酸が、7-メチルグアノシンキャップ（単数又は複数）又はアデノシンキャップ（単数又は複数）を有する場合は、前記工程(a)の例は、一本鎖核酸断片に対して相補的な配列を含むRNA、その3'末端に少なくともオリゴ-リボグアノシン又はオリゴ-リボアデノシン及びアダプター2に対して逆相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、その3'末端に少なくともランダム配列又はオリゴT、及びアダプター1に対応する配列を含むプライマー3を用いた逆転写反応を含む。
【００５２】
下記のスキームは、プライマー3が、その3'末端にランダム配列を含み、オリゴヌクレオチドが、その3'末端にオリゴ-リボグアノシンを含む工程(a)の例を示す。
0005455243.tif 000007
【００５３】
上記の場合では、逆転写酵素は、プライマー3による逆転写反応の進行においてRNAの3'末端に達し、次いで、RNAに対して相補的な逆転写cDNAは、キャップがRNAの5'末端に存在する場合、該cDNAの3'末端にいくつかの追加シトシン残基を付加する。その3'末端にいくつかのグアニン残基を有するオリゴヌクレオチドは、RNAに付加された追加のシトシン残基とハイブリダイズすることができる。次に、このハイブリッドは、逆転写反応によって伸長される。注目すべき点は、上記オリゴヌクレオチドは、RNAとではなく、第1鎖cDNAとハイブリダイズすることである。
【００５４】
上記オリゴ-リボグアノシン及びオリゴ-リボアデノシンは、連続したリボグアノシン又はリボアデノシン残基からなる配列を意味する。オリゴヌクレオチドにおいて、オリゴ-リボグアノシン又はオリゴ-リボアデノシンの使用は、一本鎖鋳型核酸の5'末端修飾に依存する。修飾がキャップである場合、オリゴ-リボグアノシンを使用することができる。修飾がADP成分である場合、オリゴ-リボアデノシンを使用することができる。
【００５５】
ランダム配列は、ランダムな配列から成り、オリゴ-Tは、連続したチミン残基の配列からなり、一本鎖鋳型核酸の一部と特異的にハイブリダイズすることができる。
【００５６】
工程(b)において使用されるプライマー1は、共通配列1の一部、及び全サフィックス配列1の両方を含む。プライマー1は、好ましくは、その5'末端にプレフィックス配列1を含む。アダプター1がプレフィックス配列1を含む場合は必ず、プライマー1はプレフィックス配列1を含む。しかしながら、プライマー1がプレフィックス配列1を含む場合、アダプター1は、該プレフィックス配列1を含まない配列であってもよい。
【００５７】
工程(b)において使用されるプライマー2は、共通配列2の一部に対して逆相補的な配列、及び全サフィックス配列2に対して逆相補的な配列を含み、好ましくは、その5'末端にプレフィックス配列2に対して逆相補的な配列を含む。アダプター2がプレフィックス配列2を含む場合は必ず、プライマー2は、プレフィックス配列2に対して逆相補的な配列を含む。しかしながら、プライマー2が、プレフィックス配列2に対して逆相補的な配列を含む場合、アダプター2は、プレフィックス配列2を含まない配列であってもよい。
【００５８】
図7は、工程(a)及び工程(b)を含む本発明の方法において、一本鎖鋳型核酸がRNAであり；核酸鎖合成反応が逆転写反応であり；プライマー3が、その3'末端にランダム配列を含み；かつ、オリゴヌクレオチドが、その3'末端にオリゴ-リボグアノシンを含む、方法の例を示す。
【００５９】
工程(b)において実施されるPCRは、5分95℃、n×(10秒95℃、15秒65℃、6分68℃）などの一般的なPCR条件で（但し、nは、サイクル数、例えば、30を表す）、かつホット・スタート（hot start）を用いて、実施することができる。
【００６０】
PCRにおいて、一本鎖核酸に対して逆相補的な配列は、鋳型として一本鎖核酸とハイブリダイズするプライマー1から出発して、伸長され、二本鎖核酸が得られる。次に、二本鎖核酸は、一般的条件下にプライマー1及びプライマー2を用いることによって増幅される。PCR条件は、増幅する配列のヌクレオチド長及び配列の観点から最適となるように修飾することができる。
【００６１】
図2は、本発明の方法の工程(a)によって調製される一本鎖核酸を示す。C1及びC2は、それぞれ、共通配列1及び2を表す。S1及びS2は、それぞれ、サフィックス配列1及び2を表す。P1及びP2は、それぞれ、プレフィックス配列1及び2を表す。図2に記載されるように、PCRによる増幅時、アダプター1及びアダプター2によって側接される、一本鎖核酸の5'及び3'末端の相補性は、共通配列の長さに対応する。
【００６２】
図3は、本発明の方法の工程(a)によって調製することができる三つのタイプの一本鎖核酸を示す。図3の項目(i)は、異なるアダプター、すなわち、アダプター1及びアダプター2によって側接される一本鎖核酸を示す。この場合、一本鎖核酸は、工程(b)の進行時、一本鎖核酸断片及び共通配列のヌクレオチド長に応じて中度に抑制される。例えば、一本鎖核酸断片のヌクレオチド長が200bpであり、共通配列1及び2のヌクレオチド長が20bpである場合、工程(b)の後、200bpよりも小さいcDNAは検出されない。図3の項目(ii)は、同じアダプター、すなわち、二つのアダプター1、又は二つのアダプター2によって側接される一本鎖核酸を示す。項目(ii)の抑制効果は、項目(i)のそれよりも強力であり得る。なぜならば、相補性が、アダプター1又はアダプター2の全長に亘るからで、その長さは、必ず、共通配列単独よりも長いからである。したがって、アダプター1及びアダプター2によって側接される一本鎖核酸の増幅は、同じアダプターの2コピーによって側接される一本鎖核酸の増幅を上回る。一本鎖核酸断片のヌクレオチド長がはるかに長い、項目(iii)に示す場合では、異なるアダプターによって側接される一本鎖核酸断片の抑制効果はもっとも弱い。
【００６３】
一本鎖アダプター1は、サフィックス配列1の3'末端に、追加配列1と名づけられる追加配列を含んでもよい。同様に、一本鎖アダプター2は、一本鎖アダプター1が追加配列1を含むか否かとは無関係に、サフィックス配列2の3'末端に追加配列2を含んでもよい。この追加配列1及び／又は2は、当業者に公知の方法を用いて一本鎖核酸断片の塩基配列の決定をするために、使用されるプライマーにハイブリダイズすることができる。追加配列1及び2の各長さは、一般的PCRのアニーリング工程の条件下にプライマーとハイブリダイズすることが可能な長さ、例えば、ただしこれに限定されないが、15から30bpである。
【００６４】
本発明の方法は、アダプター同士の任意の組み合わせを含む二量体も抑制することが可能である。アダプター1及びアダプター2は完全には相補的ではないが、それらは、共通配列を共有するので（図2参照）、その5'及び3'末端がごく近接すると、PCRによって増幅することができない分子内複合体の形成が強力に増強される（図3(ii)を参照）。
【００６５】
本発明の方法は、単一反応において、最小の一本鎖核酸の抑制、及び、二つの同じアダプターによって側接される一本鎖核酸の識別を可能とする。これは、チェンチク（Chenchick）らによって発表された抑制ＰＣＲでは不可能であった。
【００６６】
図4に示すように、プライマー1は、アダプター1及びアダプター2の両方に結合する。プライマー2も同様にアダプター1及びアダプター2に結合する、例えば、プライマー1がアダプター1に対してアニールされると、一本鎖核酸に対して相補的な配列は、PCR時、プライマー1からスタートして伸長することが可能である。しかしながら、他方の場合、すなわち、プライマー1がアダプター2にアニールされる場合、上記配列は、PCR時、伸長することができない。なぜなら、プライマー1は、アダプター2に対して完全には相補的ではないからである。同じことが、プライマー2とアダプター1との組み合わせにも当てはまる。
【００６７】
最悪の筋書きでは、アダプターの半分が、一本鎖核酸に対して相補的な配列を伸長させないプライマー（サフィックス配列1とサフィックス配列2のミスマッチのため）によって占められる場合、増幅収率は、通常のPCRの(3/4)nとなるだろう。ここで、nはサイクル数である。30サイクルの場合、これは、5000倍を超える低下である。しかしながら、共通配列の核酸二本鎖の融解温度とあまり差が無いアニーリング温度を用いることによって、一方では、抑制ＰＣＲ法の抑制的及び識別的利点を確保しながら、プライマー1及びプライマー2を、それぞれの最善標的配列を求めて効率的に競合させ、許容できる収率を取得することが可能である。
【００６８】
本発明の方法と抑制PCRとの比較を下記の表に示す。
0005455243.tif 000008
【００６９】
表1に示すように、本発明の方法は、抑制の緩和、抑制される分子の状況及び長さ、及び、二つの異なるアダプターを使用する分子の抑制の点で、抑制PCRよりも優れる。さらに、本発明の方法は、プライマー二量体の増幅を抑制することが可能なので、少量のRNA、例えば、CAGEによって分析することが不可能なポリソームのポリA-RNAの増幅が得られる。
【００７０】
驚くべきことに、本発明の方法は、方向性を維持し、かつ抑制PCRでは実現することができない小さなアーチファクトを抑制することができる。
【００７１】
本発明の方法におおいて、5'末端側で共通配列にマッチし、かつ3'末端側でサフィックス配列にマッチするプライマー1及び2を用いることはきわめて革新的である。その理由は、抑制ＰＣＲを考えると、PCRプライマーは、5'半分か又は共通配列だけにはマッチするが、全体プライマーにはマッチしないのが良いとされる場合すらあるからである。
【００７２】
本発明の方法は、RNAの5'末端側配列に対応する配列を含む二本鎖cDNAを提供することができる。したがって、一本鎖鋳型核酸として使用されるRNAの5'末端側配列は、本発明の方法によって取得される増幅した二本鎖核酸の混合物において二本鎖核酸の塩基配列を決定することによって、決定することができる。二本鎖核酸の塩基配列決定（シーケンシング）は、当業者に公知の方法を用いて、(i)3'末端側から5'末端側へ、(ii)5'末端側から3'末端側へ、又は、(iii)3'及び5'末端側の両方から同時に実行することができる。
【００７３】
上記(i)の実施態様を、後述の実施例1から8に示す。上記(ii)の実施態様を、後述の実施例9及び11に示す。さらに、上記(iii)の実施態様を、後述の実施例10に示す。
【００７４】
上記(i)の場合においてRNAの5'末端側配列を決定する方法は、中度抑制PCR、それに続けて、ただしこれらに限定されないが、下記の工程を含んでもよい。すなわち、制限酵素、例えば、ただしこれに限定されないが、EcoP15Iによる、二本鎖核酸の3'末端側の切断；該切断部位におけるアダプターの連結；第2のPCR；エキソヌクレアーゼ処理；及び、次いで第2PCR産物として得られる二本鎖核酸の塩基配列決定（シーケンシング）の諸工程である。上記(ii)の場合においてRNAの5'末端側配列を決定する方法は、中度抑制PCR、それに続けて、ただしこれに限定されないが、下記の工程を含んでもよい。すなわち、第2PCR又は内部3'RACE、454アダプターPCR、及び次いで454アダプターPCR産物として得られる二本鎖核酸の塩基配列決定（シーケンシング）の諸工程である。上記(iii)の場合においてRNAの5'末端側配列を決定する方法は、中度抑制PCR、それに続けて、ただしこれに限定されないが、下記の工程を含んでもよい。すなわち、第2PCR、及び次いで第2 PCR産物として得られる二本鎖核酸の塩基配列決定（シーケンシング）の諸工程である。同様に、上記(i)から(iii)の各場合においてRNAの5'末端側配列を決定する方法は、中度抑制PCR、それに続けて、公知の方法、例えば、ただしこれに限定されないが、二本鎖核酸の塩基配列決定（シーケンシング）を含む、クローニングと分析のためにmRNAの5'末端を利用する、ＷＯ０３／１０６６７２に開示される方法を含んでもよい。
【００７５】
下記のスキームは、本発明の方法により得られた増幅した二本鎖核酸の混合物における二本鎖核酸を3'末端側から5'末端側に塩基配列決定（シーケンス）することによって、一本鎖鋳型核酸として使用されるRNAの5'末端側の配列を決定する戦略を示す。
0005455243.tif 000009
0005455243.tif 000010
【００７６】
下記のスキームは、本発明の方法によって取得される増幅した二本鎖核酸の混合物における二本鎖核酸を5'末端側から3'末端側に又は両末端側から塩基配列決定（シーケンス）することによって、一本鎖鋳型核酸として使用されるRNAの5'末端側の配列を決定する戦略を示す。
0005455243.tif 000011
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【００７７】
下記のスキームは、本発明の方法によって取得される増幅した二本鎖核酸の混合物における二本鎖核酸を5'末端側から3'末端側に塩基配列決定（シーケンス）することによって、一本鎖鋳型核酸として使用されるRNAの5'末端側の配列を決定する別の戦略を示す。
0005455243.tif 000013
【００７８】
本発明の方法によれば、一本鎖鋳型核酸としてのRNA、オリゴヌクレオチド、及びプライマー3を用いて逆転写反応を実施して、アダプター1及び2の外、RNAに対して相補的なcDNAを含む一本鎖核酸を生成する。次に、鋳型としてこの一本鎖核酸、及び、プライマー1及び2を用いて、中度抑制PCRを実施する。任意に、さらに別のPCR、例えば、ただしこれに限定されないが、ネスティッドPCR及び454PCR、及び、続く配列決定のために好適な他の処理を追加してもよい。その結果、配列は、当業者に公知の方法、例えば、ただしこれに限定されないが、454シーケンシングによる塩基配列決定を実施することによって決定することができる。
【００７９】
上記(i)から(iii)の場合における塩基配列決定（シーケンシング）は、それぞれ、互いに異なる利点を有する。例えば、この場合、ランダムプライマーによる3'RACE分析を実施するプロトコールは用いられないだろう。同様に、同時に5'及び3'の両末端側から二本鎖核酸の塩基配列決定（シーケンス）を実施すれば、タグ切断及び増幅を含まない、より短いプロトコールによる内部エキソンの分析を可能とする。
【実施例】
【００８０】
実施例１
提示の方法は、イルミナ-ソレクサ（Illumina-Solexa）プラットフォームによる直接塩基配列決定（ダイレクト・シーケンシング）に好適な、5'末端配列タグ（CAGEタグ、シラキ（Shiraki）2003、なお、この文献の全体を引用により本明細書に含める）のライブラリーを作出するのに使用される下記のプロトコールにおいて具体化される。
【００８１】
固定済み、クライオスタット組織切片からマイクロディセクションによって抽出したトータルＲＮＡ5から10 ngを、最終容量5μlにおいて、50pmolのストランド・スイッチングオリゴヌクレオチド(TAGTCGAACTGAAGGTCTCCAGCArGrGrG、ここで、rGはリボグアノシンである）、10pmolのランダムRTプライマー(GTACCAGCAGTAGTCGAACTGAAGGTCTCCTCTN15)、10pmolのポリチミンRTプライマー(GTACCAGCAGTAGTCGAACTGAAGGTCTCCTCT18)と共に、65℃で10分間加熱変性し、次いで、素早く氷／水ミックスに移した。下記の成分を以下の最終濃度：1×ファースト・ストランド（第1鎖）バッファー（インビトロジェン；Invitrogen）、0.5mMdNTPs(タカラ；TaKaRa)、1mM DTT (インビトロジェン；Invitrogen)、0.75Mベタイン(betaine)(ワコー；WAKO)、0.41M D-トレアロース(ナカライ・テスク；Nacalai Tesque)、3.4%D-ソルビトール(ワコー；WAKO)、及び400ユニット(units)のスーパースクリプトII（SuperScriptII）(インビトロジェン；Invitrogen)に達するように加え、20μlの容量においてRTを実行し、MWGサーモサイクラーにおいて12℃で10分、50℃で45分、75℃で10分インキュベートした。次いで直ちにチューブを氷／水ミックスに移した。第2鎖合成のために、最適サイクル数--産物の強度が増加するのを止める直前のサイクルと定義--を評価するために、スモールスケールの中度抑制PCR反応を実行した。10μlアリコートを2サイクル毎に取り出し、1%アガロースゲルにおいて分析した。2μlの第1鎖cDNAを、総容量100μlにおいて、1×イーエックス・タック（ExTaq）バッファー(タカラ；TaKaRa)、250μM dNTPs (タカラ；TaKaRa)、100nMのフォワードPCRプライマー(TAGTCGAACTGAAGGTCTCCAGC)、100nMのリバースPCRプライマー(GTACCAGCAGTAGTCGAACTGAAGGTCTCCTCT)、及び5ユニット(units)のイーエックス・タック（ExTaq） (TaKaRa)を含む混合液を用い、以下のPCRプログラム、95℃5分、n×（95℃10秒、65℃15秒、68℃6分）により、かつホット・スタートを用いて増幅した（図5）。第1鎖cDNA (18μl）を全て用いラージスケール中度抑制PCRを、100μlの9反応において実施した。PCR産物を、キアクイックＰＣＲ（Qiaquick PCR）精製カラム(キアゲン；Qiagen)を用いて精製し、産物を全て一緒にプールした。
【００８２】
プールしたcDNAの半分を、それぞれ300μlの4反応として、150ユニット(units)のEcoP15l(ネブ；NEB)、1×バッファー3（ネブ；NEB)、1 mM ATP(ネブ；NEB)、1×BSA(ネブ；NEB)を用い、37℃で4時間インキュベートして消化した。低分子量切断産物を、マイクロコン（Microcon）YM-100膜(ミリポア；Millipore)によって精製し、濾液を、メーカーの指示にしたがってマイクロコン（Microcon）YM-10(ミリポア；Millipore)において濃縮した。等モル量の二つのオリゴヌクレオチド(NNAGCTGTAGAACTCTGAACCTGT及びACAGGTTCAGAGTTCTACAGCT)を、95℃に加熱したウォーター・バスでアニールさせ、放置して室温に冷却させ連結（ライゲーション）アダプターを形成した。30μlにおいて1200ユニット単位のT4 DNAリガーゼ(NEB)を用い、ウォーター・バスにおいて16℃で16時間インキュベートすることによって、2μMアダプターを15μlのEcoP15l切断産物に連結した。増幅すべきライゲーション産物の最適サイクル数は、5μMのフォワードPCRプライマー(AATGATACGGCGACCACCGACAGGTTCAGAGTTCTACAG)、5μMのリバースPCRプライマー(CAAGCAGAAGACGGCATACGATAGTCGAACTGAAGGTCTCCAG)、1×イーエックス・タック（ExTaq）バッファー(タカラ；TaKaRa)、200μMdNTPs(タカラ；TaKaRa)、5ユニット(units)のイーエックス・タック(ExTaq)(タカラ；TaKaRa)によるPCRによって決定した。プログラムは、95℃5分、n×（95℃20秒、57℃20秒、68℃20秒）であった。各サンプルについて100μlにおいて6PCR反応を実施した。
【００８３】
過剰なプライマーは、20ユニット(units)のエキソヌクレアーゼI(タカラ；TaKaRa)を用い、37℃30分で消化し、次に、この酵素を、55℃15分で加熱し不活性化した。次に、このPCR産物を、10%ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動によって精製し、予想サイズ（112塩基対）に対応するバンドを切り出し、シリンジ中を通過させてポリアクリルアミドの構造を破壊し、マイクロチューブにおいて、800μlの1×TEバッファーを用いて室温で一晩回転してDNAを抽出した。チューブを13,000rpmで10分遠心し、上清を回収した。600μlの1×TEバッファーを、マイクロチューブ中のポリアクリルアミドに加え、室温で1時間回転させた。この工程をもう一度繰り返した。次に、各サンプルについて、全ての回収分画を一緒にプールし、マイクロスピン（Microspin）フィルター(ジーイー・ヘルスケア；GE Healthcare)を通過させ、ポリアクリルアミドの残留物を除去した。合計2mlの濾液を、マイクロコン（Microcon）YM-10カラム(ミリポア；Millipore)を通過させることによって100μlに濃縮し、キアクイックPCR精製カラム(Qiaquick PCR purification column)(キアゲン；Qiagen)を用いてさらに精製し、100μlのEBバッファー（10mM Tris-HCl pH8.5)において溶出した。サンプルの純度及び濃度は、ナノドロップ（Nanodrop）UV分光光度計及びアジレント2100バイオアナライザー（Agilent 2100 Bioanalyzer）によって推定し、回収DNAの正確なサイズをチェックするために、10μlのアリコートをポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。
【００８４】
ライブラリーは、イルミナ-ソレクサ（Illumine-Solexa）プラットフォームを用いてシーケンスした。2,859,511の読み取り値を記録し、2,535,405のCAGEタグを抽出した。33,558は、マウスのリボソームDNAにマップされ、2,316,861は、マウスのゲノムにマップされた（アッセンブリmm9）。もっとも高頻度のタグは、領域46,703,702-46,703,726において染色体14のubb遺伝子にマップされ、18,116回を数えた。リボソーム配列にマッチするタグの比率がきわめて低いのは、キャップ保護分子が、きわめて大量の28S及び18SリボソームRNAなどの非キャップ保護分子から適正に識別されていることを示す。これらのタグは、例えば、神経の生存に重要なユビキチンBタンパクをコードするubb転写物の5'末端にマッチするタグGAGTGACGAGAGGCTTTGTCCGGTTによって例示されるように、多くの5'末端を特定する。
【００８５】
実施例２
この実験では、肝癌細胞系統Hep G2（ATCC番号HB-8065)由来のトータルＲＮＡを用いて、ランダムプライミングによってCAGEタグを作出した。
【００８６】
50ngのトータルＲＮＡを、最終容量2μlにおいて、1.62μM D-トレアロース(ナカライ・テスク；Nacalai Tesque)及び13.3%D-ソルビトール(ワコー；WAKO)において100pmolのストランド・スイッチングオリゴヌクレオチド(TAGTCGAACTGAAGGTCTCCAGCArGrGrG)、及び、10 pmolのランダムRTプライマー(GTACCAGCAGTAGTCGAACTGAAGGTCTCCTCTN15)と共に、65℃で10分間加熱変性し、次いで、素早く氷／水ミックスに移した。下記の成分を以下の最終濃度：1×ファースト・ストランド（第1鎖）バッファー（インビトロジェン；Invitrogen）、0.5mM dNTPs(タカラ；TaKaRa)、1mM DTT(インビトロジェン；Invitrogen)、0.75Mベタイン(betaine)(ワコー；WAKO)、及び400ユニット(units)のスーパースクリプトII（SuperScriptII）(インビトロジェン；Invitrogen)に達するように加え10μlの容量においてRTを実施し、MWGサーモサイクラーにおいて22℃で10分、50℃で45分、75℃で10分インキュベートした。次いで直ちに試験管を氷／水ミックスに移した。第2鎖合成のため、最適サイクル数を評価するために、スモールスケールの中度抑制PCR反応を実施した（図6）。5μlアリコートを2サイクル毎に取り出し、1%アガロースゲルにおいて分析した。2μlの第1鎖cDNAを、総容量100μlにおいて、1×イーエックス・タック（ExTaq）バッファー(タカラ；TaKaRa)、250μM dNTPs(タカラ；TaKaRa)、100nMのフォワードPCRプライマー(TAGTCGAACTGAAGGTCTCCAGC)、100 nMのリバースPCRプライマー(GTACCAGCAGTAGTCGAACTGAAGGTCTCCTCT)、及び、5ユニット(units)のイーエックス・タック(ExTaq)(タカラ；TaKaRa)を含む混合液を用い、下記のPCRプログラム、95℃5分、n×（95℃10秒、65℃15秒、68℃6分）により、かつホット・スタートを用いて増幅した。2μlの第1鎖cDNAを用いラージスケール中度抑制PCR調製を、100μlの1反応として実施した。PCR産物を、キアクイックPCR精製カラム（Qiaquick PCR purification solums）(キアゲン；Qiagen)を用いて精製し、50μlのEBバッファー（キアゲン；Qiagen)において回収した。
【００８７】
全てのcDNAを、それぞれ96μlの容量において、100ユニット(units)のEcoP15l(ネブ；NEB)、1×バッファー3（ネブ；NEB)、1mM ATP(ネブ；NEB)、1×BSA(ネブ；NEB)を用い、37℃4時間で消化した。低分子量切断産物を、マイクロコン（Microcon）YM-100膜(ミリポア；Millipore)によって精製し、濾液を、メーカーの指示にしたがってマイクロコン（Microcon）YM-10(ミリポア；Millipore)において濃縮した。二つのオリゴヌクレオチドNNACCCTGTAGAACTCTGAACCTGT及びACAGGTTCAGAGTTCTACAGCTを、10μlにおいて、各1mMで、95℃に加熱したサーモサイクラー中でアニールさせ、放置して室温に冷却させ連結（ライゲーション）アダプターを形成した。10μlのマイティ・ライゲーション・ミックス（Mighty Ligation Mix）(タカラ；TaKaRa)を用い、ウォーター・バス中で16℃16時間インキュベートすることによって、1pmolアダプターを10μlのEcoP15l切断産物に連結した。増幅されるライゲーション産物の最適サイクル数は、5μMのフォワードPCRプライマー(AATGATACGGCGACCACCGACAGGTTCAGAGTTCTACAG)、5μMのリバースPCRプライマー(CAAGCAGAAGACGGCATACGATAGTCGAACTGAAGGTCTCCAG)、1×イーエックス・タック(ExTaq)バッファー(タカラ；TaKaRa)、200μM dNTPs(タカラ；TaKaRa)、5ユニット(units)のイーエックス・タック(ExTaq)(タカラ；TaKaRa)、及び1μlのライゲーション産物によるPCRによって決定した。ラージスケール増幅のために、3×100μlのPCRを、各チューブにおいて1μlのライゲーション産物を用い、12サイクルで行った。
【００８８】
過剰なプライマーは、20ユニット(units)のエキソヌクレアーゼI(タカラ；TaKaRa)を用いて、37℃30分で消化し、次に、この酵素を、55℃15分で加熱し不活性化した。次に、このPCR産物を、6%ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動によって精製し、予想サイズ（112塩基対）に対応するバンドを切り出し、シリンジ中を通過させてポリアクリルアミドの構造を破壊し、マイクロチューブにおいて、800μlの1×TEバッファーと共に室温で一晩回転してDNAを抽出した。チューブを13,000rpmで10分遠心し、上清を回収した。600μlの1×TEバッファーを、マイクロチューブ中のポリアクリルアミドに加え、室温で1時間回転させた。この工程をもう一度繰り返した。次に、各サンプルについて、全ての回収分画を一緒にプールし、マイクロスピン（Microspin）フィルター(ジーイー・ヘルスケア；GE Healthcare)を通過させ、ポリアクリルアミドの残留物を除去した。合計2mlの濾液を、マイクロコン（Microcon）YM-10カラム (ミリポア；Millipore)を通過させることによって100μlに濃縮した。サンプルの純度及び濃度は、ナノドロップ（Nanodrop）UV分光光度計及びアジレント2100バイオアナライザー（Agilent 2100 Bioanalyzer）によって推定し、回収DNAの正確なサイズをチェックするために、10μlのアリコートをポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。
【００８９】
ライブラリーは、イルミナ-ソレクサ（Illumina-Solexa）プラットフォームを用いてシーケンスした。4,314,825の読み取り値を記録し、1,972,665のCAGEタグを抽出した。215,933は、マウスのリボソームDNAにマップされ、1,458,717は、マウスのゲノムにマップされた（アッセンブリmm9）。もっとも高頻度のタグは、領域134,947,926-134,947,950において染色体3のTF遺伝子にマップされ、12,466回を数えた。リボソーム配列にマッチするタグの比率がきわめて低いのは、キャップ保護分子が、きわめて大量の28S及び18SリボソームRNAのような非キャップ保護分子から適正に識別されていることを示す。これらのタグは、例えば、鉄代謝にとって重要で、肝臓に豊富なトランスフェリンタンパク質をコードするTF転写物の5'末端にマッチするタグGACAGAAGCGAGTCCGACTGTGCTCによって例示されるように、多くの5'末端を特定する。
【００９０】
実施例３
この実験では、K562細胞系統（ATCCロット番号4607240)由来のポリソームのポリA-RNAを用いて、ランダムプライミングによってCAGEタグを作出した。
【００９１】
500ngのポリソームのポリA-RNAを、最終容量2μlにおいて、264μM D-トレアロース(ナカライ・テスク；Nacalai Tesque)及び1.32M D-ソルビトール(ワコー；WAKO)において、50μMのストランド・スイッチングオリゴヌクレオチド(5'-TAGTCGAACTGAAGGTCTCCAGCArGrGrG-3')、及び、5 μMのランダムRTプライマー(GTACCAGCAGTAGTCGAACTGAAGGTCTCCTCTN15)と共に、65℃で10分間加熱変性し、次いで、素早く氷／水ミックスに移した。下記の成分を以下の最終濃度：1.19×ファースト・ストランド（第1鎖）バッファー（インビトロジェン；Invitrogen）、595μM dNTPs(タカラ；TaKaRa)、1.24mM DTT(インビトロジェン；Invitrogen)、881mMベタイン(betaine)(ワコー；WAKO)、及び、200ユニット(units)のスーパースクリプトII（SuperScriptII）(インビトロジェン；Invitrogen)に達するように加え10.5μlの容量においてRTを実行し、MWGサーモサイクラーにおいて22℃で10分、50℃で30分、75℃で15分インキュベートした。次いで直ちにチューブを氷／水ミックスに移した。第2鎖合成のために、最適サイクル数--産物の強度が増加するのを止める直前のサイクルと定義--を評価するために、スモールスケールの中度抑制PCR反応を実施した。1μlの第1鎖cDNAを、総容量100μlにおいて、1×イーエックス・タック（ExTaq）バッファー(タカラ；TaKaRa)、200μM dNTPs(タカラ；TaKaRa)、100 nMのフォワードPCRプライマー(5'-TAGTCGAACTGAAGGTCTCCAGC-3')、100 nMのリバースPCRプライマー(5'-GTACCAGCAGTAGTCGAACTGAAGGTCTCCTCT-3')、及び、5ユニット(units)のイーエックス・タック（ExTaq）(タカラ；TaKaRa)を含む混合液を用い、以下のPCRプログラム、95℃5分、n×（95℃15秒、65℃10秒、68℃2分）、68℃15分により、かつホット・スタートを用いて増幅した。10μlのアリコートを2サイクル毎に採取し、2%アガロースゲルにおいて分析した（図8）。全ての第1鎖cDNA（9μl)を用いラージスケール中度抑制PCR調製を、100μlの9反応として実施した。PCR産物をプールし、CTAB及びジーイー・ヘルスケアGFX精製カラム(GE Healthcare GFX purification column)を用いて精製した。
【００９２】
全てのcDNAを、それぞれ100μlの容量において、100ユニット(units)のEcoP15l(ネブ；NEB)、1×バッファー3（ネブ；NEB)、1mM ATP(ネブ；NEB)、1×BSA(ネブ；NEB)を用い、37℃4時間で消化した。低分子量切断産物を、マイクロコン（Microcon）YM-100膜(ミリポア；Millipore)によって精製し、濾液を、メーカーの指示にしたがってマイクロコン（Microcon）YM-10(ミリポア；Millipore)において濃縮した。二つのオリゴヌクレオチド5'-NNGTCCTGTAGAACTCTGAACCTGT-3'及び5'-ACAGGTTCAGAGTTCTACAGGAC-3'を、10μlにおいて、それぞれ1mMで、95℃に加熱したサーモサイクラー中でアニールさせ、放置して室温に冷却させ連結（ライゲーション）アダプターを形成した。10μlのマイティ・ライゲーション・ミックス（Mighty Ligation Mix）(タカラ；TaKaRa)を用い、サーモサイクラー中で、16℃で16時間インキュベートすることによって、10pmolアダプターを10μlのEcoP15l切断産物に連結した。増幅されるライゲーション産物の最適サイクル数は、100μlの全体容量において、50nMのフォワードPCRプライマー(5'-AATGATACGGCGACCACCGACAGGTTCAGAGTTCTACAG-3')、50nMのリバースPCRプライマー(5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGATAGTCGAACTGAAGGTCTCCAG-3')、1×イーエックス・タック（ExTaq）バッファー(タカラ；TaKaRa)、200μM dNTPs(タカラ；TaKaRa)、5ユニット（units）のイーエックス・タック（ExTaq）(タカラ；TaKaRa)、及び1μlのライゲーション産物によるPCRによって決定した。プログラムは、95℃2分、n×（95℃10秒、57℃10秒）であった。ラージスケール増幅のために、5×100μlのPCRを、各チューブにおいて1μlのライゲーション産物を用い、8サイクルで行った（図9）。
【００９３】
過剰なプライマーは、100μlのPCR反応当たり5ユニット(units)のエキソヌクレアーゼI(タカラ；TaKaRa)を用い、37℃15分で消化し、次に、この酵素を、55℃15分で加熱し不活性化した。次に、このPCR産物を、8%ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動によって精製し、予想サイズ（112塩基対）に対応するバンドを切り出し、キアクイック・ゲル抽出キット(Qiaquick gel extraction kit)（キアゲン；Qiagen)によって抽出した（図10）。サンプルの純度及び濃度は、アジレント2100バイオアナライザー(Agilent 2100 Bioanalyzer)によって分析した（図11）。
【００９４】
ライブラリーは、イルミナ-ソレクサ(Illumina-Solexa)プラットフォームを用いてシーケンスした。23,204,073の読み取り値を記録し、17,902,698のCAGEタグを抽出した。これらのタグの26.31%は、ヒトのリボソームDNAにマップされ、82.42%は、ヒトのゲノムにマップされた。
【００９５】
実施例４
この実験では、K562細胞系統由来の核小体トータルＲＮＡを用い、ランダムプライミングによってCAGEタグを作出した。
【００９６】
500ngの核小体トータルＲＮＡを、最終容量2μlにおいて、264μM D-トレアロース(ナカライ・テスク；Nacalai Tesque)、1.32M D-ソルビトール (ワコー；WAKO)において、50μMのストランド・スイッチングオリゴヌクレオチド(5'-TAGTCGAACTGAAGGTCTCCAGCArGrGrG-3')、及び、5μMのランダムRTプライマー(5'-GTACCAGCAGTAGTCGAACTGAAGGTCTCCTCTN15-3')と共に、65℃で10分間加熱変性し、次いで、素早く氷／水ミックスに移した。下記の成分を以下の最終濃度：1.19×ファースト・ストランド（第1鎖）バッファー（インビトロジェン；Invitrogen）、595μM dNTPs(タカラ；TaKaRa)、1.24mM DTT(インビトロジェン；Invitrogen)、881mMベタイン(betaine)(ワコー；WAKO)、及び、200ユニット(units)のスーパースクリプトII(SuperScriptII)(インビトロジェン；Invitrogen)に達するように加え10.5μlの容量でRTを実施し、MWGサーモサイクラーにおいて22℃で10分、50℃で30分、75℃で15分インキュベートした。次いで直ちにチューブを氷／水ミックスに移した。第2鎖合成のために、最適サイクル数--産物の強度が増加するのを止める直前のサイクルと定義--を評価するために、スモールスケールの中度抑制PCR反応を実施した。1μlの第1鎖cDNAを、総容量100μlにおいて、1×イーエックス・タック（ExTaq）バッファー(タカラ；TaKaRa)、200μM dNTPs(タカラ；TaKaRa)、100nMのフォワードPCRプライマー(5'-TAGTCGAACTGAAGGTCTCCAGC-3')、100nMのリバースPCRプライマー(5'-GTACCAGCAGTAGTCGAACTGAAGGTCTCCTCT-3')、及び、5ユニット(units)のイーエックス・タック(ExTaq)(タカラ；TaKaRa)を含む混合液を用い、以下のPCRプログラム、95℃5分、n×（95℃15秒、65℃10秒、68℃2分）、68℃15分により、かつホット・スタートを用いて増幅した。10μlのアリコートを2サイクル毎に採取し、2%アガロースゲルにおいて分析した（図12）。全ての第1鎖cDNA（9μl)を用いラージスケール中度抑制PCR調製を、100μlの9反応として実施した。PCR産物をプールし、CTAB及びジーイー・ヘルスケアGFX精製カラム(GE Healthcare GFX purification column)を用いて精製した。
【００９７】
全てのcDNAを、それぞれ100μlの容量において、100ユニット(units)のEcoP15l (ネブ；NEB)、1×バッファー3（ネブ；NEB)、1mM ATP(ネブ；NEB)、1×BSA(ネブ；NEB)を用い、37℃4時間で消化した。低分子量切断産物を、マイクロコン(Microcon)YM-100膜(ミリポア；Millipore)によって精製し、濾液を、メーカーの指示にしたがってマイクロコン（Microcon）YM-10(ミリポア；Millipore)において濃縮した。二つのオリゴヌクレオチド(5'-NNGGACTGTAGAACTCTGAACCTGT-3')及び(5'-ACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCC-3')を、10μlにおいて、各1mMで、95℃に加熱したサーモサイクラー中でアニールさせ、放置して室温に冷却させ連結（ライゲーション）アダプターを形成した。10μlのマイティ・ライゲーション・ミックス（Mighty Ligation Mix）(タカラ；TaKaRa)を用い、サーモサイクラー中で、16℃で16時間インキュベートすることによって、10pmolアダプターを10μlのEcoP15l切断産物に連結した。増幅されるライゲーション産物の最適サイクル数は、100μlの全体容量において、50nMのフォワードPCRプライマー(5'-AATGATACGGCGACCACCGACAGGTTCAGAGTTCTACAG-3')、50nMのリバースPCRプライマー(5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGATAGTCGAACTGAAGGTCTCCAG-3')、1×イーエックス・タック(ExTaq)バッファー(タカラ；TaKaRa)、200μM dNTPs(タカラ；TaKaRa)、5ユニット(units)のイーエックス・タック(ExTaq)(タカラ；TaKaRa)、及び1μlのライゲーション産物によるPCRによって決定した。プログラムは、95℃2分、n×（95℃10秒、57℃10秒）であった。ラージスケール増幅のために、5×100μlのPCRを、各チューブにおいて1μlのライゲーション産物を用い、8サイクルで行った（図13）。
【００９８】
過剰なプライマーは、100μlのPCR反応当たり5ユニット(units)のエキソヌクレアーゼI(タカラ；TaKaRa)を用い、37℃15分で消化し、次に、この酵素を、55℃15分で加熱し不活性化した。次に、このPCR産物を、8%ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動によって精製し、予想サイズ（112塩基対）に対応するバンドを切り出し、キアクイック・ゲル抽出キット(Qiaquick gel extraction kit)（キアゲン；Qiagen)によって抽出した（図14）。サンプルの純度及び濃度は、アジレント2100バイオアナライザー(Agilent 2100 Bioanalyzer)によって分析した（図15）。
【００９９】
ライブラリーは、イルミナ-ソレクサ(Illumina-Solexa)プラットフォームを用いてシーケンスした。27,839,343の読み取り値を記録し、21,856,936のCAGEタグを抽出した。これらのタグの26.01%は、ヒトのリボソームDNAにマップされ、76.58%は、ヒトのゲノムにマップされた。
【０１００】
実施例５
この実験では、K562細胞系統由来の細胞核原形質のトータルＲＮＡを用い、ランダムプライミングによってCAGEタグを作出した。
【０１０１】
500ngの細胞核原形質のトータルＲＮＡを、最終容量2μlにおいて、264μM D-トレアロース(ナカライ・テスク；Nacalai Tesque)及び1.32M D-ソルビトール(ワコー；WAKO)において、50μMのストランド・スイッチングオリゴヌクレオチド(5'-TAGTCGAACTGAAGGTCTCCAGCArGrGrG-3')、及び、5μMのランダムRTプライマー(5'-GTACCAGCAGTAGTCGAACTGAAGGTCTCCTCTN15-3')と共に、65℃で10分間加熱変性し、次いで、素早く氷／水ミックスに移した。下記の成分を以下の最終濃度：1.19×ファースト・ストランド(第1鎖)バッファー（インビトロジェン；Invitrogen）、595μM dNTPs(タカラ；TaKaRa)、1.24mM DTT(インビトロジェン；Invitrogen)、881mMベタイン(betaine)(ワコー；WAKO)、及び、200ユニット(units)のスーパースクリプトII（SuperScriptII）(インビトロジェン；Invitrogen)に達するように加え10.5μlの容量でRTを実行し、MWGサーモサイクラーにおいて22℃で10分、50℃で30分、75℃で15分インキュベートした。次いで直ちにチューブを氷／水ミックスに移した。第2鎖合成のために、最適サイクル数--産物の強度が増加するのを止める直前のサイクルと定義--を評価するために、スモールスケールの中度抑制PCR反応を実施した。1μlの第1鎖cDNAを、総容量100μlにおいて、1×イーエックス・タック(ExTaq)バッファー(タカラ；TaKaRa)、200μM dNTPs(タカラ；TaKaRa)、100nMのフォワードPCRプライマー(5'-TAGTCGAACTGAAGGTCTCCAGC-3')、100nMのリバースPCRプライマー(5'-GTACCAGCAGTAGTCGAACTGAAGGTCTCCTCT-3')、及び、5ユニット(units)のイーエックス・タック(ExTaq)(タカラ;TaKaRa)を含む混合液を用い、下記のPCRプログラム、95℃5分、n×（95℃15秒、65℃10秒、68℃2分）、68℃15分により、かつホット・スタートを用いて増幅した。10μlのアリコートを2サイクル毎に採取し、2%アガロースゲルにおいて分析した（図16）。全ての第1鎖cDNA（9μl)を用いラージスケール中度抑制PCR調製を、100μlの9反応として実施した。PCR産物をプールし、CTAB及びジーイー・ヘルスケアGFX精製カラム(GE Healthcare GFX purification columns)を用いて精製した。
【０１０２】
全てのcDNAを、それぞれ100μlの容量において、100ユニット(units)のEcoP15l (ネブ；NEB)、1×バッファー3（ネブ；NEB)、1mM ATP(ネブ；NEB)、1×BSA(ネブ；NEB)を用い、37℃4時間で消化した。低分子量切断産物を、マイクロコン(Microcon)YM-100膜(ミリポア；Millipore)によって精製し、濾液を、メーカーの指示にしたがってマイクロコン(Microcon)YM-10(ミリポア;Millipore)において濃縮した。二つのオリゴヌクレオチド(5'- NNGAGCTGTAGAACTCTGAACCTGT -3')及び(5'- ACAGGTTCAGAGTTCTACAGCTC -3')を、10μlにおいて、各1mMで、95℃に加熱したサーモサイクラー中でアニールさせ、放置して室温に冷却させ連結（ライゲーション）アダプターを形成した。10μlのマイティ・ライゲーション・ミックス(Mighty Ligation Mix)(タカラ；TaKaRa)を用い、サーモサイクラー中で16℃16時間インキュベートすることによって、10pmolアダプターを10μlのEcoP15l切断産物に連結した。増幅されるライゲーション産物の最適サイクル数は、100μlの全体容量において、50nMのフォワードPCRプライマー(5'-AATGATACGGCGACCACCGACAGGTTCAGAGTTCTACAG-3')、50nMのリバースPCRプライマー(5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGATAGTCGAACTGAAGGTCTCCAG-3')、1×イーエックス・タック(ExTaq)バッファー(TaKaRa)、200μM dNTPs(タカラ；TaKaRa)、5ユニット(units)のイーエックス・タック(ExTaq)(タカラ；TaKaRa)、及び1μlのライゲーション産物によるPCRによって決定した。プログラムは、95℃2分、n×（95℃10秒、57℃10秒）であった。ラージスケール増幅のために、5×100μlのPCRを、各チューブにおいて1μlのライゲーション産物を用い、8サイクルで行った（図17）。
【０１０３】
過剰なプライマーは、100μlのPCR反応当たり5ユニット(units)のエキソヌクレアーゼI(タカラ；TaKaRa)、37℃15分で消化し、次に、この酵素を、55℃15分で加熱し不活性化した。次に、このPCR産物を、8%ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動によって精製し、予想サイズ（112塩基対）に対応するバンドを切り出し、キアクイック・ゲル抽出キット(Qiaquick gel extraction kit)（キアゲン；Qiagen)によって抽出した（図18）。サンプルの純度及び濃度は、アジレント2100バイオアナライザー(Agilent 2100 Bioanalyzer)によって分析した（図19）。
【０１０４】
ライブラリーは、イルミナ-ソレクサ(Illumina-Solexa)プラットフォームを用いてシーケンスした。25,305,506の読み取り値を記録し、20,328,111のCAGEタグを抽出した。これらのタグの10.95%は、ヒトのリボソームDNAにマップされ、86.30%は、ヒトのゲノムにマップされた。
【０１０５】
実施例６
この実験では、K562細胞系統由来のクロマチンのトータルＲＮＡを用い、ランダムプライミングによってCAGEタグを作出した。
【０１０６】
500ngのクロマチンのトータルＲＮＡを、最終容量2μlにおいて、264μM D-トレアロース(ナカライ・テスク；Nacalai Tesque)及び1.32M D-ソルビトール(ワコー；WAKO)において50 μMのストランド・スイッチングオリゴヌクレオチド(5'-TAGTCGAACTGAAGGTCTCCAGCArGrGrG-3')、及び、5μMのランダムRTプライマー(5'-GTACCAGCAGTAGTCGAACTGAAGGTCTCCTCTN15-3')と共に、65℃で10分間加熱変性し、次いで、素早く氷／水ミックスに移した。下記の成分を以下の最終濃度：1.19×ファースト・ストランド(第1鎖)バッファー（インビトロジェン；Invitrogen）、595μM dNTPs (タカラ；TaKaRa)、1.24mM DTT(インビトロジェン；Invitrogen)、881mMベタイン(betaine)(ワコー；WAKO)、及び、200ユニット(units)のスーパースクリプトII（SuperScriptII）(インビトロジェン；Invitrogen)に達するように加え10.5μlの容量でRTを実行し、MWGサーモサイクラーにおいて22℃で10分、50℃で30分、75℃で15分インキュベートした。次いで直ちにチューブを氷／水ミックスに移した。第2鎖合成のために、最適サイクル数--産物の強度が増加するのを止める直前のサイクルと定義--を評価するために、スモールスケールの中度抑制PCR反応を実施した。1μlの第1鎖cDNAを、総容量100μlにおいて、1×イーエックス・タック(ExTaq)バッファー(タカラ；TaKaRa)、200μM dNTPs(タカラ；TaKaRa)、100nMのフォワードPCRプライマー(5'-TAGTCGAACTGAAGGTCTCCAGC-3')、100nMのリバースPCRプライマー(5'-GTACCAGCAGTAGTCGAACTGAAGGTCTCCTCT-3')、及び、5ユニット(units)のイーエックス・タック(ExTaq)(タカラ；TaKaRa)を含む混合液を用い、以下のPCRプログラム、95℃5分、n×（95℃15秒、65℃10秒、68℃2分）、68℃15分により、かつホット・スタートを用いて増幅した。10μlのアリコートを2サイクル毎に採取し、2%アガロースゲルにおいて分析した（図20）。全ての第1鎖cDNA（9μl)を用いラージスケール中度抑制PCR調製を、100μlの9反応として実施した。PCR産物をプールし、CTAB及びジーイー・ヘルスケアGFX精製カラム(GE Healthcare GFX purification columns)を用いて精製した。
【０１０７】
全てのcDNAを、それぞれ100μlの容量において、100ユニット(units)のEcoP15l(ネブ；NEB)、1×バッファー3（ネブ；NEB)、1mM ATP(ネブ；NEB)、1×BSA(ネブ；NEB)を用い、37℃4時間で消化した。低分子量切断産物を、マイクロコン(Microcon)YM-100膜(ミリポア；Millipore)によって精製し、濾液を、メーカーの指示にしたがってマイクロコン(Microcon)YM-10(ミリポア;Millipore)において濃縮した。二つのオリゴヌクレオチド(5'-NNGCTCTGTAGAACTCTGAACCTGT-3')及び(5'-ACAGGTTCAGAGTTCTACAGAGC-3')を、10μl、それぞれ1 mMで、95℃に加熱したサーモサイクラー中でアニールさせ、放置して室温に冷却させ連結（ライゲーション）アダプターを形成した。10μlのマイティ・ライゲーション・ミックス(Mighty Ligation Mix)(タカラ；TaKaRa)を用い、サーモサイクラー中で16℃16時間インキュベートすることによって、10pmolアダプターを10μlのEcoP15l切断産物に連結した。増幅されるライゲーション産物の最適サイクル数は、100μlの全体容量において、50nMのフォワードPCRプライマー(5'-AATGATACGGCGACCACCGACAGGTTCAGAGTTCTACAG-3')、50nMのリバースPCRプライマー(5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGATAGTCGAACTGAAGGTCTCCAG-3')、1×イーエックス・タック(ExTaq)バッファー(タカラ；TaKaRa)、200μM dNTPs(タカラ；TaKaRa)、5ユニット(units)のイーエックス・タック(ExTaq)(タカラ；TaKaRa)、及び1μlのライゲーション産物によるPCRによって決定した。プログラムは、95℃2分、n×（95℃10秒、57℃10秒）であった。ラージスケール増幅のために、5×100μlのPCRを、各チューブにおいて1μlのライゲーション産物を用い、8サイクルで行った（図21）。
【０１０８】
過剰なプライマーは、100μlのPCR反応当たり5ユニット(units)のエキソヌクレアーゼI(タカラ；TaKaRa)、37℃15分で消化し、次に、この酵素を、55℃15分で加熱し不活性化した。次に、PCR産物を、8%ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動によって精製し、予想サイズ（112塩基対）に対応するバンドを切り出し、キアクイック・ゲル抽出キット(Qiaquick gel extraction kit)（キアゲン；Qiagen)によって抽出した（図22）。サンプルの純度及び濃度は、アジレント2100バイオアナライザー(Agilent 2100 Bioanalyzer)によって分析した（図23）。
【０１０９】
ライブラリーは、イルミナ-ソレクサ(Illumine-Solexa)プラットフォームを用いてシーケンスした。21,253,077の読み取り値を記録し、16,137,405のCAGEタグを抽出した。これらのタグの5.28%は、ヒトのリボソームDNAにマップされ、86.71%は、ヒトのゲノムにマップされた。
【０１１０】
実施例７
この実験では、ラット新生仔からマイクロディセクションによって切り出した脳組織からトータルＲＮＡを調製し、ランダムプライミングによってCAGEタグを作出した。ラット新生仔の生後日数は、3、5、7、9、12、18、28日であった。マイクロディセクションサンプルは、10から20ngのRNAを含んでいた。我々は、さらに、コントロールとして市販のトータルＲＮＡ（全体胚、及び全体成体脳）を用いた。
【０１１１】
10から20ngのトータルＲＮＡを、最終容量2μlにおいて、264μM D-トレアロース(ナカライ・テスク；Nacalai Tesque)及び1.32M D-ソルビトール(ワコー；WAKO)において、50μMのストランド・スイッチングオリゴヌクレオチド(TAGTCGAACTGAAGGTCTCCAGCArGrGrG)、及び、5μMのランダムRTプライマー(GTACCAGCAGTAGTCGAACTGAAGGTCTCCTCTN15)と共に、65℃で10分間加熱変性し、次いで、素早く氷／水ミックスに移した。下記の成分を以下の最終濃度：1.19×ファースト・ストランド(第1鎖)バッファー（インビトロジェン；Invitrogen）、595μM dNTPs(タカラ；TaKaRa)、1.24mM DTT(インビトロジェン；Invitrogen)、881mMベタイン(betaine)(ワコー；WAKO)、及び、200ユニット(units)単位のスーパースクリプトII(SuperScriptII)(インビトロジェン；Invitrogen)に達するように加え10.5μlの容量でRTを実行し、MWGサーモサイクラーにおいて22℃で10分、50℃で30分、75℃で15分インキュベートした。次いで直ちにチューブを氷／水ミックスに移した。第2鎖合成のために、最適サイクル数--産物の強度が増加するのを止める直前のサイクルと定義--を評価するために、スモールスケールの中度抑制PCR反応を実施した。1.5μlの第1鎖cDNAを、総容量100μlにおいて、1×イーエックス・タック（ExTaq）バッファー（タカラ；TaKaRa)、200μM dNTPs(タカラ；TaKaRa)、100nMのフォワードPCRプライマー(TAGTCGAACTGAAGGTCTCCAGC)、100nMのリバースPCRプライマー(GTACCAGCAGTAGTCGAACTGAAGGTCTCCTCT)、及び、5ユニット(units)のイーエックス・タック（ExTaq）(タカラ；TaKaRa)を含む混合液を用い、下記のPCRプログラム、95℃5分、n×（95℃15秒、65℃10秒、68℃2分）、68℃15分により、かつホット・スタートを用いて増幅した。5μlのアリコートを2サイクル毎に採取し、2%アガロースゲルにおいて分析した（図24）。第1鎖cDNAを用い、2ラウンドに分割される、ラージスケール中度抑制PCR調製を、100μl、2反応の2ラウンドとして実施した（図25、26）。PCR産物は、キアクイック（QIAquick）（キアゲン；Qiagen)において精製した。
【０１１２】
全てのcDNAを、それぞれ100μlの容量において、100ユニット(units)のEcoP15l (ネブ；NEB)、1×バッファー3（ネブ；NEB)、1mM ATP(ネブ；NEB)、1×BSA(ネブ；NEB)を用い、37℃4時間で消化した。低分子量切断産物を、マイクロコン(Microcon)YM-100膜(ミリポア；Millipore)によって精製し、濾液を、メーカーの指示にしたがってマイクロコン(Microcon)YM-10(ミリポア；Millipore)において濃縮した。以下の9対のオリゴヌクレオチド：
5'-NNAAACTGTAGAACTCTGAACCTGT-3'及び
5'-ACAGGTTCAGAGTTCTACAGTTT-3'、
5'-NNACCCTGTAGAACTCTGAACCTGT-3'及び
5'-ACAGGTTCAGAGTTCTACAGGGT-3'、
5'-NNAGGCTGTAGAACTCTGAACCTGT-3'及び
5'-ACAGGTTCAGAGTTCTACAGCCT-3'、
5'-NNATTCTGTAGAACTCTGAACCTGT-3'及び
5'-ACAGGTTCAGAGTTCTACAGAAT-3'、
5'-NNCTACTGTAGAACTCTGAACCTGT-3'及び
5'-ACAGGTTCAGAGTTCTACAGTAG-3'、
5'-NNCACCTGTAGAACTCTGAACCTGT-3'及び
5'-ACAGGTTCAGAGTTCTACAGGTG-3'、
5'-NNCCGCTGTAGAACTCTGAACCTGT-3'及び
5'-ACAGGTTCAGAGTTCTACAGCGG-3'、
5'-NNCGTCTGTAGAACTCTGAACCTGT-3'及び
5'-ACAGGTTCAGAGTTCTACAGACG-3'、及び
5'-NNGAGCTGTAGAACTCTGAACCTGT-3'及び
5'-ACAGGTTCAGAGTTCTACAGCTC-3'
を、10μlにおいて、各1mMで、95℃に加熱したサーモサイクラー中でアニールさせ、放置して室温に冷却させ連結（ライゲーション）アダプターを形成した。10μlのマイティ・ライゲーション・ミックス（Mighty Ligation Mix）(タカラ；TaKaRa)を用い、サーモサイクラー中で16℃16時間インキュベートすることによって、10pmolアダプターを10μlのEcoP15l切断産物に連結した。増幅されるライゲーション産物の最適サイクル数は、100μlの全体容量において、50nMのフォワードPCRプライマー(AATGATACGGCGACCACCGACAGGTTCAGAGTTCTACAG)、50nMのリバースPCRプライマー(CAAGCAGAAGACGGCATACGATAGTCGAACTGAAGGTCTCCAG)、1×イーエックス・タック（ExTaq）バッファー(タカラ；TaKaRa)、200μM dNTPs(タカラ；TaKaRa)、5ユニット(units)のイーエックス・タック(ExTaq)(タカラ；TaKaRa)、及び2μlのライゲーション産物によるPCRによって決定した。プログラムは、95℃2分、n×（95℃10秒、57℃10秒）であった。ラージスケール増幅のために、2〜4×100μlのPCRを、各チューブにおいて2μlのライゲーション産物を用い、13サイクルで行った。
【０１１３】
過剰なプライマーは、100μlのPCR反応当たり5ユニット(unit)のエキソヌクレアーゼI(タカラ；TaKaRa)、37℃15分で消化し、次に、この酵素を、55℃15分で加熱し不活性化した。次に、このPCR産物を、8%ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動によって精製し、予想サイズ（112塩基対）に対応するバンドを切り出し、キアクイック・ゲル抽出キット(Qiaquick gel extraction kit)（キアゲン；Qiagen)によって抽出した（図27）。サンプルの純度は電気泳動によって分析した（図28）。ライブラリーは、イルミナ-ソレクサ(illumina-Solexa)プラットフォームによってシーケンスした。
【０１１４】
実施例８
この実験では、上述のものと同様に、ラット新生仔からマイクロディセクションによって切り出した脳組織からトータルＲＮＡを調製し、ランダムプライミングによってCAGEタグを作出した。ラット新生仔の生後日数は、3、5、7、9、12、18、28日であった。マイクロディセクションサンプルは、10から20 ngのRNAを含んでいた。我々はさらに、コントロールとして市販のトータルＲＮＡ（全体胚、及び全体成体脳）を用いた。
【０１１５】
10から20 ngのトータルＲＮＡを、最終容量2μlにおいて、264μM D-トレアロース(ナカライ・テスク；Nacalai Tesque)及び1.32M D-ソルビトール(ワコー；WAKO)において50μMのストランド・スイッチングオリゴヌクレオチド(TAGTCGAACTGAAGGTCTCCAGCArGrGrG)、及び、5μMのランダムRTプライマー(GTACCAGCAGTAGTCGAACTGAAGGTCTCCTCTN15)と共に、65℃で10分間加熱変性し、次いで、素早く氷／水ミックスに移した。下記の成分を以下の最終濃度：1.19×ファースト・ストランド（第1鎖）バッファー（インビトロジェン；Invitrogen）、595μM dNTPs(タカラ；TaKaRa)、1.24mM DTT(インビトロジェン；Invitrogen)、881mMベタイン(betaine)(ワコー；WAKO)、及び、200ユニット(units)のスーパースクリプトII（SuperScriptII）(インビトロジェン；Invitrogen)に達するように加え10.5μlの容量でRTを実行し、MWGサーモサイクラーにおいて22℃で10分、50℃で30分、75℃で15分インキュベートした。次いで直ちにチューブを氷／水ミックスに移した。第2鎖合成のために、最適サイクル数--産物の強度が増加するのを止める直前のサイクルと定義--を評価するために、スモールスケールの中度抑制PCR反応を実施した。1.5μlの第1鎖cDNAを、総容量100μlにおいて、1×イーエックス・タック(ExTaq)バッファー(タカラ；TaKaRa)、200μM dNTPs(タカラ；TaKaRa)、100nMのフォワードPCRプライマー(TAGTCGAACTGAAGGTCTCCAGC)、100nMのリバースPCRプライマー(GTACCAGCAGTAGTCGAACTGAAGGTCTCCTCT)、及び、5ユニット(units)のイーエックス・タック（ExTaq）(タカラ；TaKaRa)を含む混合液を用い、下記のPCRプログラム、95℃5分、n×（95℃15秒、65℃10秒、68℃2分）、68℃15分により、かつホット・スタートを用いて増幅した。5μlのアリコートを2サイクル毎に採取し、2%アガロースゲルにおいて分析した（図29）。第1鎖cDNAを用い、2ラウンドに分割される、ラージスケール中度抑制PCR調製を、100μl、2反応の2ラウンドとして実施した（図30、31）。PCR産物は、キアクイック(QIAquick)（キアゲン；Qiagen)において精製した。
【０１１６】
全てのcDNAを、それぞれ100μlの容量において、100ユニット(units)のEcoP15l(ネブ；NEB)、1×バッファー3（ネブ；NEB)、1 mM ATP (ネブ；NEB)、1×BSA(ネブ；NEB)を用い、37℃4時間で消化した。低分子量切断産物を、マイクロコン(Microcon)YM-100膜(ミリポア；Millipore)によって精製し、濾液を、メーカーの指示にしたがってマイクロコン(Microcon)YM-10(ミリポア;Millipore)において濃縮した。以下の9対のオリゴヌクレオチド：
5'-NNAAACTGTAGAACTCTGAACCTGT-3'及び
5'-ACAGGTTCAGAGTTCTACAGTTT-3'、
5'-NNACCCTGTAGAACTCTGAACCTGT-3'及び
5'-ACAGGTTCAGAGTTCTACAGGGT-3'、
5'-NNAGGCTGTAGAACTCTGAACCTGT-3'及び
5'-ACAGGTTCAGAGTTCTACAGCCT-3'、
5'-NNATTCTGTAGAACTCTGAACCTGT-3'及び
5'-ACAGGTTCAGAGTTCTACAGAAT-3'、
5'-NNCGTCTGTAGAACTCTGAACCTGT-3'及び
5'-ACAGGTTCAGAGTTCTACAGACG-3'、
5'-NNGGACTGTAGAACTCTGAACCTGT-3'及び
5'-ACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCC-3'、
5'-NNGTCCTGTAGAACTCTGAACCTGT-3'及び
5'-ACAGGTTCAGAGTTCTACAGGAC-3'、
5'-NNGAGCTGTAGAACTCTGAACCTGT-3'及び
5'-ACAGGTTCAGAGTTCTACAGCTC-3'、及び
5'-NNGCTCTGTAGAACTCTGAACCTGT-3'及び
5'-ACAGGTTCAGAGTTCTACAGAGC-3'
を、10μl、各1mMで、95℃に加熱したサーモサイクラー中でアニールさせ、放置して室温に冷却させ連結（ライゲーション）アダプターを形成した。10μlのマイティ・ライゲーション・ミックス（Mighty Ligation Mix）(タカラ；TaKaRa)を用い、サーモサイクラー中で16℃16時間インキュベートすることによって、10pmolアダプターを10μlのEcoP15l切断産物に連結した。増幅されるライゲーション産物の最適サイクル数は、100μlの全体容量において、50nMのフォワードPCRプライマー(AATGATACGGCGACCACCGACAGGTTCAGAGTTCTACAG)、50nMのリバースPCRプライマー(CAAGCAGAAGACGGCATACGATAGTCGAACTGAAGGTCTCCAG)、1×イーエックス・タック(ExTaq)バッファー(タカラ；TaKaRa)、200μM dNTPs(タカラ；TaKaRa)、5ユニット(units)のイーエックス・タック(ExTaq)(タカラ；TaKaRa)、及び2μlのライゲーション産物によるPCRによって決定した。プログラムは、95℃2分、n×（95℃10秒、57℃10秒）であった。ラージスケール増幅のために、2〜4×100μlのPCRを、各チューブにおいて2μlのライゲーション産物を用い、13サイクルで行った。
【０１１７】
過剰なプライマーは、100μlのPCR反応当たり5ユニット(units)のエキソヌクレアーゼI(タカラ；TaKaRa)を用い、37℃15分で消化し、次に、この酵素を、55℃15分で加熱し不活性化した。次に、このPCR産物を、8%ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動によって精製し、予想サイズ（112塩基対）に対応するバンドを切り出し、キアクイック・ゲル抽出キット(Qiaquick gel extraction kit)（キアゲン；Qiagen)によって抽出した（図32、33）。サンプルの純度は電気泳動によって分析した（図28）。ライブラリーは、イルミナ-ソレクサ(illumine-Solexa)プラットフォームによってシーケンスした。
【０１１８】
実施例９
この実験では、C2C12 MBc WT細胞系統由来のトータルＲＮＡを用い、ランダムプライミングによってCAGEタグを作出した。
【０１１９】
1μgのトータルＲＮＡを、最終容量2μlにおいて、264μM D-トレアロース(ナカライ・テスク;Nacalai Tesque)及び1.32M D-ソルビトール(ワコー；WAKO)において5μMのランダムRTプライマー(5'-GTACCAGCAGTAGTCGAACTGAAGGTCTCCTCTN15-3')と共に、65℃で10分間加熱変性し、次いで、素早く氷／水ミックスに移した。下記の成分を以下の最終濃度：1.19×ファースト・ストランド（第1鎖）バッファー（インビトロジェン；Invitrogen）、595μM dNTPs(タカラ；TaKaRa)、1.24mM DTT(インビトロジェン；Invitrogen)、881mMベタイン(betaine)(ワコー；WAKO)、及び、200ユニット(units)のスーパースクリプトII(SuperScriptII)(インビトロジェン；Invitrogen)に達するように加え10.5μlの容量でRTを実行し、MWGサーモサイクラーにおいて22℃で10分、50℃で30分、75℃で15分インキュベートした。次いで直ちにチューブを氷／水ミックスに移した。第2鎖合成のために、最適サイクル数--産物の強度が増加するのを止める直前のサイクルと定義--を評価するために、スモールスケールの中度抑制PCR反応を実施した。2.0μlの第1鎖cDNAを、総容量100μlにおいて、1×イーエックス・タック(ExTaq)バッファー(タカラ；TaKaRa)、200μM dNTPs(タカラ；TaKaRa)、100nM L1-6フォワードPCRプライマー(5'-TAGTCGAACTGAAGGTCTCCAGCACAAGAAGCCTACAGGACT-3')、又は、L1-13フォワードPCRプライマー(5'-TAGTCGAACTGAAGGTCTCCAGCGCCTACAGGACTCCAAATA-3')、100nMのリバースPCRプライマー(GTACCAGCAGTAGTCGAACTGAAGGTCTCCTCT)、及び、5ユニット(units)のイーエックス・タック(ExTaq)(タカラ；TaKaRa)を含む混合液を用い、下記のPCRプログラム、95℃5分、n×（95℃15秒、65℃10秒、68℃2分）、68℃15分により、かつホット・スタートを用いて増幅した。5μlのアリコートを2サイクル毎に採取し、1.5%アガロースゲルにおいて分析した（図34）。第1鎖cDNAを用いラージスケール中度抑制PCR調製を、100μlの5反応として実施した。PCR産物は、キアクイック(QIAquick)（キアゲン；Qiagen)において精製した。
【０１２０】
内部3'RACE PCRを、シーケンシング・アダプターの一部によって実施した。2.0μlのPCR産物を、総容量100μlにおいて、1×イーエックス・タック（ExTaq）バッファー(タカラ；TaKaRa)、200μM dNTPs(タカラ；TaKaRa)、100nMのL1-6 454-A upフォワードPCRプライマー(5'-CATCTGTTCCCTCCCTGTCTCAGACAAGAAGCCTACAGGACT-3')、又は、L1-13 454-A upフォワードPCRプライマー(5'- CATCTGTTCCCTCCCTGTCTCAGGCCTACAGGACTCCAAATA -3')、100nMのリバース454-B up PCRプライマー(5'-CTATCCCCTGTTGCGTGTCTCAGTAGTCGAACTGAAGGTCTCCTCT-3')、及び、5ユニット(units)のイーエックス・タック(ExTaq)(タカラ；TaKaRa)を含む混合液を用い、下記のPCRプログラム、94℃5分、35サイクル×（94℃30秒、60℃30秒、72℃2分）、72℃15分により、かつホット・スタートを用いて増幅した。PCR産物は、キアゲン・ミンエリュート・カラム(QIAGEN MinElute column)（キアゲン；Qiagen)によって精製し、1.5%アガロースゲルにおいて分析した（図35）。
【０１２１】
ビオチニル化プライマーによってビオチニル化PCR産物を合成するために、20ng (2.0μl)の内部PCR産物を、総容量100μlにおいて、1×イーエックス・タック(ExTaq)バッファー(タカラ；TaKaRa)、200μM dNTPs(タカラ；TaKaRa)、100nMの454-A upフォワードPCRプライマー(5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCCCATCTGTTCCCTCCCTGTCTCAG-3')、100nMのリバース454-B up ビオチニル化PCRプライマー(5'-ビオチン-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGCCTATCCCCTGTTGCGTGTCTCAG-3')、及び、5ユニット(units)のイーエックス・タック(ExTaq)(タカラ；TaKaRa)を含む混合液を用い、下記のPCRプログラム、94℃5分、5サイクル×（94℃30秒、60℃30秒、72℃2分）、72℃15分により、かつホット・スタートを用いて増幅した。PCR産物は、キアゲン・ミンエリュート・カラム(QIAGEN MinElute column)（キアゲン；Qiagen)によって精製かつ濃縮し、1.5%アガロースゲルにおいて分析した（図36）。
【０１２２】
一本鎖DNAの分離のため、PCR産物を0.1N NaOHで処理し、一本鎖PCR産物をM-270磁気ビーズ（インビトロジェン；invitrogen)に結合させ、分離した。分離したssDNAは、ミンエリュート精製キット(MinElute purification kit)(キアゲン；Qiagen)によって精製したが、その溶出容量は15μlであった。サンプルの純度及び濃度はアジレント2100バイオアナライザー(Agilent 2100 Bioanalyzer)よって分析した。ライブラリー（L1-6及びL1-13)は、それぞれ混合し、最終的にFLX-454シーケンサーによってシーケンスした。
【０１２３】
実施例１０
この実験では、K562細胞系統由来の、核のポリA-RNA、核のポリA+RNA、細胞質ポリA-RNA、及び細胞質ポリA+RNAを用い、ランダムプライミングによってCAGEタグを作出した。
【０１２４】
100ngのRNA、0.66M D-トレアロース(ナカライ・テスク；Nacalai Tesque)、3.3MD-ソルビトール(ワコー；WAKO)、100μMのTSオリゴヌクレオチド(5'-TAGTCGAACTGAAGGTCTCCAGCA(rG)(rG)(rG)-3')、10μMのランダムRTプライマー(5'-TAGTCGAACTGAAGGTCTCCGAACCGCTCTTCCGATCTNNNNNN-3'を核のポリA-RNAに加え、5'-TAGTCGAACTGAAGGTCTCCGAACCGCTCTTCCGATCTCGANNNNNN-3'を核のポリA+RNAに加え、5'-TAGTCGAACTGAAGGTCTCCGAACCGCTCTTCCGATCTATCNNNNNN-3'を細胞質のポリA-RNAに加え、5'-TAGTCGAACTGAAGGTCTCCGAACCGCTCTTCCGATCTGCTNNNNNN-3'を細胞質のポリA+RNAに加えた）の存在下に、水分容量を、それぞれ、室温における遠心蒸発によって2μlに減じた。次に、この混合物を、サーモサイクラー(MWG)において65℃で10分間加熱変性し、次いで、二次構造の形成を避けるため、素早く氷／水ミックスに移した。逆転写及びテンプレート・スイッチング(template switching)は、10.5μlの容量において、下記の成分：1.19×ファースト・ストランド(第1鎖)バッファー（インビトロジェン；Invitrogen）、595μM dNTPs(タカラ；TaKaRa)、1.24mM DTT(インビトロジェン；Invitrogen)、881mMベタイン(betaine)（スピエス(Spiess)及びイベル(Ivell),2002）(ワコー；WAKO)、及び、200ユニット(units)のスーパースクリプトII（SuperScriptII）(インビトロジェン；Invitrogen)と共に行った。これらを、MWGサーモサイクラーにおいて22℃で10分、50℃で30分、75℃で15分インキュベートした。次いで直ちにチューブを氷／水ミックスに移した。第2鎖合成のため、最適サイクル数--産物の強度が増加するのを止める直前のサイクルと定義--を評価するために、スモールスケールの中度抑制PCR反応を実施した。1μlの第1鎖cDNAを、総容量100μlにおいて、1×イーエックス・タック(ExTaq)バッファー(タカラ；TaKaRa)、200μM dNTPs(タカラ；TaKaRa)、1.0μMのフォワードPCRプライマー(5'-TAGTCGAACTGAAGGTCTCCAGC-3')、1.0μMのリバースPCRプライマー(5'-TGACGTCGTCTAGTCGAACTGAAGGTCTCCGAACC-3')、及び、5ユニット(units)のイーエックス・タック(ExTaq)(タカラ；TaKaRa)を含む混合液を用い、下記のPCRプログラム、95℃5分、n×（95℃15秒、65℃10秒、68℃2分）、∞4℃により、かつホット・スタートを用いて増幅した。10μlのアリコートを2サイクル毎に採取し、1.5%アガロースゲルにおいて分析した（図37）。第1鎖cDNAを用いラージスケール中度抑制PCR調製を、100μlの1反応として実施した。PCR産物をプールし、CTAB及びジーイー・ヘルスケアGFX精製カラム（GE Healthcare GFX purification columns）を用いて精製した。
【０１２５】
次いでPCR反応を再び実施した。増幅されるPCR産物の最適サイクル数は、総容量100μlにおいて、1.0μMのフォワードPCRプライマー(5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTAGTCGAACTGAAGG-3')、1.0μMのリバースPCRプライマー(5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT-3')、1×イーエックス・タック(ExTaq)バッファー(タカラ；TaKaRa)、200μM dNTPs(タカラ；TaKaRa)、2.5ユニット(units)のイーエックス・タック(ExTaq)(タカラ；TaKaRa)、及び、20ngのPCR産物によるPCRによって決定した。プログラムは、95℃5分、55℃10秒、68℃2分、n×（95℃15秒、65℃10秒、68℃2分）、∞4℃であった。ラージスケール増幅のために、各チューブにおいて、20 ngのPCR産物を用いて、5×50μlのPCRを実施した。（図38）。PCR産物を混合し、過剰なプライマーをアムピュア(AMpure)ビーズ(アジェンコート；Agencourt)によって除去した。精製及び分離を、1.5%アガロースゲルによって実施した（図39）。混合サンプルを、短小サイズ、中間サイズ、及び長尺サイズの三つの部分に分離した。その後、分離サンプルをソレクサ-GA2 PE(Solexa-GA2 PE)によってシーケンスした。
【０１２６】
実施例１１
この実験では、HepG2細胞系統（ヒト）由来のトータルＲＮＡを用い、ランダムプライミングによってCAGEタグを作出した。
【０１２７】
1μgのRNAを、0.66M D-トレアロース(ナカライ・テスク；Nacalai Tesque)、3.3M D-ソルビトール(ワコー；WAKO)、100μMの各TSオリゴヌクレオチド(5'-TAGTCGAACTGAAGGTCTCCAGCA(rG)(rG)(rG)-3'、5'-TAGTCGAACTGAAGGTCTCCAGCA(rA)(rA)(rA)-3'、5'-TAGTCGAACTGAAGGTCTCCAGCA(rC)(rC)(rC)-3'、及び、5'-TAGTCGAACTGAAGGTCTCCAGCA(rU)(rU)(rU)-3'、但し、rA、rC、及びrUは、それぞれ、リボアデノシン、リボシトシン、及びリボウリジンを示す）、及び、10μMのランダムRTプライマー(5'- TAGTCGAACTGAAGGTCTCCGAACCGCTCTTCCGATCTNNNNNN-3'）と混合することによって逆転写反応を開始した。各混合物の容量は、遠心蒸発によって2μlを維持し、次いで、サーモサイクラー(MWG)において65℃で10分間加熱変性し、二次構造の形成を避けるため、素早く氷／水ミックスに移した。逆転写及びテンプレート・スイッチング(template switching)は、10.5μlの容量において、下記の成分：1.19×ファースト・ストランド(第1鎖)バッファー（インビトロジェン；Invitrogen）、595μM dNTPs(タカラ；TaKaRa)、1.24mM DTT (インビトロジェン；Invitrogen)、881mMベタイン(betaine)（スピエス(Spiess)及びイベル(Ivell),2002）(ワコー；WAKO)、及び、200ユニット(units)のスーパースクリプトIII(SuperScript III)( インビトロジェン；Invitrogen)と共に行った。これらを、MWGサーモサイクラーにおいて22℃で10分、50℃で30分、75℃で15分インキュベートした。次いで直ちにチューブを氷／水ミックスに移した。最適サイクル数を推定するために、リアルタイムPCRを実施した。アプライド・バイオシステムズ・ステップワン・リアルタイムPCRシステム(Applied Bio-Systems StepOne Real Time PCR System)において付属のプロトコールにしたがって、鋳型として1μlの5×希釈RTサンプル、フォワードPCRプライマー(5'-TAGTCGAACTGAAGGTCTCCAGC-3')、リバースPCRプライマー(5'-TGACGTCGTCTAGTCGAACTGAAGGTCTCCGAACC-3')、及び、サイバー・プレミックス・イーエックスタック(SYBR Premix ExTaq)(パーフェクト・リアルタイム；Perfect Real Time)（タカラ；TAKARA)を用いて行った（図40）。次に、第2鎖合成のために、最適サイクル数--産物の強度が増加するのを止める直前のサイクルと定義--を確認するために、スモールスケールの中度抑制PCR反応を実施した。1μlの第1鎖cDNAを、総容量100μlにおいて、1×イーエックス・タック(ExTaq)バッファー(タカラ；TaKaRa)、200μM dNTPs(タカラ；TaKaRa)、1.0μMフォワードPCRプライマー(5'-TAGTCGAACTGAAGGTCTCCAGC-3')、1.0μMのリバースPCRプライマー(5'-TGACGTCGTCTAGTCGAACTGAAGGTCTCCGAACC-3')、及び、5ユニット(units)のイーエックス・タック(ExTaq)(タカラ；TaKaRa)を含む混合液を用い、下記のPCRプログラム、95℃5分、n×（95℃15秒、65℃10秒、68℃2分）、∞4℃により、かつホット・スタートを用いて増幅した。5μlのアリコートを2サイクル毎に採取し、1.5%アガロースゲルにおいて分析した。第1鎖cDNAを用いラージスケール中度抑制PCR調製を、100μlの2反応として実施した（図41）。PCR産物をプールし、CTAB及びジーイー・ヘルスケアGFX精製カラム(GE Healthcare GFX purification columns)を用いて洗浄し、1.5%アガロースゲルによって確認した（図42）。
【０１２８】
ソレクサ（solexa）アダプターを導入するためにPCR反応を再び実施した。増幅されるPCR産物の最適サイクル数は、総容量50μlにおいて、1.0μMのフォワードPCRプライマー(5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTAGTCGAACTGAAGG-3')、1.0μMのリバースPCRプライマー(5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT-3')、1×イーエックス・タック(ExTaq)バッファー(タカラ；TaKaRa)、200μM dNTPs(タカラ；TaKaRa)、2.5ユニット(units)のイーエックス・タック(ExTaq)(タカラ；TaKaRa)、及び、20 ngのPCR産物によるPCRによって決定した。プログラムは、95℃5分、55℃10秒、68℃2分、n×（95℃15秒、65℃10秒、68℃2分）、∞4℃であった。ラージスケール増幅のために、各チューブにおいて、20ngのPCR産物を用い、2×100μlのPCRを実施した（図43）。過剰なプライマーは、アムピュア(AMpure)ビーズ(アジェンコート；Agencourt)によって除去し、増幅DNAの濃度は、ナノドロップ（NanoDrop）によって測定し、1.5%アガロースゲルによって確認した（図44）。その後、全ての産物を10nM溶液に希釈し、等量と混ぜ合わせた。次に、それらをソレクサ（Solexa）シークェンサーによってシーケンスした。
【０１２９】
RT／中度抑制プライマーの比較
我々は、中度抑制PCRプロトコールを評価するために、ランダムRTプライマーについて4種の欠失、及び一つのランダム置換（シャッフル）を調べた。それらのそれぞれが、対応するリバースPCRプライマーを有していた。
【０１３０】
50ngのトータルＲＮＡを、最終容量2μlにおいて、264μM D-トレアロース(ナカライ・テスク；Nacalai Tesque)及び1.32M D-ソルビトール(ワコー；WAKO)において、50μMのテンプレート・スイッチングオリゴヌクレオチド(5'-TAGTCGAACTGAAGGTCTCCAGCArGrGrG-3')、及び、5μMのランダムRTプライマー(N-15: 5'-GTACCAGCAGTAGTCGAACTGAAGGTCTCCTCTNNNNNNNNNNNNNNN-3'、N-15-notail: 5'-TAGTCGAACTGAAGGTCTCCTCTNNNNNNNNNNNNNNN-3'、N-15-del4: 5'-GTACCAGCAGCGAACTGAAGGTCTCCTCTNNNNNNNNNNNNNNN-3'、N-15-del8: 5'-GTACCAGCAGCTGAAGGTCTCCTCTNNNNNNNNNNNNNNN-3'、N-15-shuffled: 5'-CGTCATACCTCGGCACAATTGCGATATCGGGTANNNNNNNNNNNNNNN-3')（図45）と共に、65℃で10分間加熱変性し、次いで、素早く氷／水ミックスに移した。10.5μlの容量において、下記の成分を、以下の最終濃度：1.19×ファースト・ストランド(第1鎖)バッファー（インビトロジェン；Invitrogen）、595μM dNTPs(タカラ；TaKaRa)、1.24mM DTT(インビトロジェン；Invitrogen)、881mMベタイン(betaine)(ワコー；WAKO)、及び、200ユニット(units)のスーパースクリプトII（SuperScriptII）(インビトロジェン；Invitrogen)に達するように加えRTを実行し、MWGサーモサイクラーにおいて22℃で10分、50℃で30分、75℃で15分インキュベートした。次いで直ちに試験管を氷／水ミックスに移した。第2鎖合成のために、中度抑制PCR反応を実行した。2μlの第1鎖cDNAを、総容量100μlにおいて、1×イーエックス・タック(ExTaq)バッファー(タカラ；TaKaRa)、200μM dNTPs(タカラ；TaKaRa)、100nMフォワードPCRプライマー(5'-TAGTCGAACTGAAGGTCTCCAGC-3')、100nMリバースPCRプライマー(N-15: 5'-GTACCAGCAGTAGTCGAACTGAAGGTCTCCTCT-3'、N-15-notail: 5'-TAGTCGAACTGAAGGTCTCCTCT-3'、N-15-del4: 5'-GTACCAGCAGCGAACTGAAGGTCTCCTCT-3'、N-15-del8: 5'-GTACCAGCAGCTGAAGGTCTCCTCT-3'、N-15-shuffled:  5'-CGTCATACCTCGGCACAATTGCGATATCGGGTA-3')（図45）及び、5ユニット(units)のイーエックス・タック(ExTaq)(タカラ；TaKaRa)を含む混合液を用い、下記のPCRプログラム、95℃5分、n×（95℃15秒、65℃10秒、68℃2分）、68℃15分により、かつホット・スタートを用いて増幅した。5μlのアリコートを1サイクル毎に採取し、1%アガロースゲルにおいて分析した（図46）。
【０１３１】
結果から、N-15の尾部(テイル；tail)を除去することは、中度抑制効果を弱体化する（シグナルがネガティブ・コントロールに出現する）が、それを消滅させることはなかった。N-15配列のランダムな置換は、中度抑制効果を完全に消滅させた。したがって、きわめて短い分子のみが増幅された。共通領域を次第に短縮してゆく（del4及び8）と、ランダム化と同程度に強力な、劇的な効果が得られた。
【０１３２】
DNA TSオリゴの比較
我々は、最終塩基がリボグアノシンであるDNA/RNAハイブリッドと比較するために、DNAオリゴヌクレオチドであるストランド・スイッチングオリゴヌクレオチドを調べた。
【０１３３】
50ngのトータルＲＮＡを、最終容量2μlにおいて、264μM D-トレアロース(ナカライ・テスク；Nacalai Tesque)及び1.32M D-ソルビトール(ワコー；WAKO)において50μMのストランド・スイッチングオリゴヌクレオチド（DNA/RNAハイブリッド：5'-TAGTCGAACTGAAGGTCTCCAGCArGrGrG-3'、DNA/DNA 5'-TAGTCGAACTGAAGGTCTCCAGCAGGG-3')、及び、5μMのランダムRTプライマー(5'-GTACCAGCAGTAGTCGAACTGAAGGTCTCCTCTNNNNNNNNNNNNNNN-3')と共に65℃で10分間加熱変性し、次いで、素早く氷／水ミックスに移した。10.5μlの容量において、下記の成分を、以下の最終濃度：1.19×ファースト・ストランド（第1鎖）バッファー（インビトロジェン；Invitrogen）、595μM dNTPs(タカラ；TaKaRa)、1.24mM DTT(インビトロジェン；Invitrogen)、881mMベタイン(betaine)(ワコー；WAKO)、及び、200ユニット(units)のスーパースクリプトII（SuperScriptII）(インビトロジェン；Invitrogen)に達するように加えRTを実行し、MWGサーモサイクラーにおいて22℃で10分、50℃で30分、75℃で15分インキュベートした。次いで直ちにチューブを氷／水ミックスに移した。第2鎖合成のために、中度抑制PCR反応を実施した。2μlの第1鎖cDNAを、総容量100μlにおいて、1×イーエックス・タック(ExTaq)バッファー(タカラ；TaKaRa)、200μM dNTPs(タカラ；TaKaRa)、100nMフォワードPCRプライマー(5'-TAGTCGAACTGAAGGTCTCCAGC-3')、100nMリバースPCRプライマー(5'-GTACCAGCAGTAGTCGAACTGAAGGTCTCCTCT-3')、及び、5ユニット(units)のイーエックス・タック（ExTaq）(タカラ；TaKaRa)を含む混合液を用い、下記のPCRプログラム、95℃5分、n×（95℃15秒、65℃10秒、68℃2分）、68℃15分により、かつホット・スタートを用いて増幅した。5μlのアリコートを1サイクル毎に採取し、1%アガロースゲルにおいて分析した（図47）。
【０１３４】
驚くべきことに、最終塩基がリボグアノシンであるDNA/RNAハイブリッドに比べ、ストランド・スイッチングオリゴヌクレオチドが、最終塩基がグアノシンであるときのDNAオリゴヌクレオチドである場合、cDNAはほとんど同じぐらい良好であった。
【０１３５】
参照文献
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６．アレックス・チェンチク、ルダ・ディアチェンコ、ポール・シーベルト、セルゲイ・ルキアノフ、コンスタンチン・ルキアノフ、ナディア・ガースカヤ、ビクター・タラビキン、ユージーン・スベルドルフ（Alex Chenchik, Luda Diatchenko, Paul Siebert, Sergey Lukianov, Konstantin Lukianov, Nadia Gurskaya, Victor Tarabykin, Eugene Sverdlov）(1996).PCRにおいてDNA断片増幅を抑制する方法（Method for suppressing DNA fragment amplification during PCR.）米国特許第5,565,340（US patent 5,565,340.）
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0005455243.tif 000021
【図９】
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【図１０】
0005455243.tif 000023
【図１１】
0005455243.tif 000024
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
0005455243.tif 000029
【図１７】
0005455243.tif 000030
【図１８】
0005455243.tif 000031
【図１９】
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【図２０】
0005455243.tif 000033
【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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