(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量の弱毒化ＰＲＲＳII型ウイルスを含む免疫原性組成物をブタに投与することを含む、高熱病型ＰＲＲＳの影響に対してブタをワクチン接種する方法、ここで該高熱病型ＰＲＲＳが、配列番号１で示されるＪＸ１４３の核酸配列を有する中国のＰＲＲＳＶに由来し、該弱毒化ＰＲＲＳII型ウイルスが、登録番号ＡＴＣＣ ＶＲ−２３３２を有する株である、方法。
【請求項２】
組成物が、さらにアジュバントを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
有効量の弱毒化ＰＲＲＳII型ウイルスを含む免疫原性組成物をブタに投与することを含む、配列番号１で示されるＪＸ１４３の核酸配列を有する高熱病型ＰＲＲＳウイルスＪＸ１４３の影響に対してブタをワクチン接種する方法、ここで該弱毒化ＰＲＲＳII型ウイルスが、登録番号ＡＴＣＣ ＶＲ−２３３２を有する株である、方法。
【請求項４】
有効量の弱毒化ＰＲＲＳII型ウイルスを含む免疫原性組成物を、それを必要とするブタに投与することを含む、高熱病型ＰＲＲＳの臨床徴候の発生率または重篤度を低下させる方法、ここで該高熱病型ＰＲＲＳが、配列番号１で示されるＪＸ１４３の核酸配列を有する中国のＰＲＲＳＶに由来し、該弱毒化ＰＲＲＳII型ウイルスが、登録番号ＡＴＣＣ ＶＲ−２３３２を有する株である、方法。
【請求項５】
有効量の弱毒化ＰＲＲＳII型ウイルスを含む免疫原性組成物をブタに投与することを含む、高熱病型ＰＲＲＳの影響に対してブタをワクチン接種するためのＰＲＲＳII型ウイルスの使用、ここで該高熱病型ＰＲＲＳが、配列番号１で示されるＪＸ１４３の核酸配列を有する中国のＰＲＲＳＶに由来し、該弱毒化ＰＲＲＳII型ウイルスが、登録番号ＡＴＣＣ ＶＲ−２３３２を有する株である、使用。
【請求項６】
有効量のＰＲＲＳII型ウイルスを含む免疫原性組成物をブタに投与することを含む、高熱病型ＰＲＲＳの影響に対してブタをワクチン接種するための薬学的組成物を製造するためのＰＲＲＳII型ウイルスの使用、ここで該高熱病型ＰＲＲＳが、配列番号１で示されるＪＸ１４３の核酸配列を有する中国のＰＲＲＳＶに由来し、該弱毒化ＰＲＲＳII型ウイルスが、登録番号ＡＴＣＣ ＶＲ−２３３２を有する株である、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本出願は、紙形式およびコンピューター読み取り可能形式の配列表を含み、その教示および内容を引用により本明細書の一部とする。
【０００２】
発明の背景
技術分野
本発明は一般に感染症に対するワクチンに関するものである。より詳細には、それは、ブタを冒すウイルス性疾患である高病原性ブタ繁殖・呼吸障害症候群（ＨＰ ＰＲＲＳ）のワクチンに関するものである。
【０００３】
背景情報
ブタ繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）は深刻なブタの疾患として認識されており、妊娠ブタの生殖障害または特に哺乳ブタの気道急迫のいずれかを特徴とする。このウイルス性疾患は１９８７年に米国で初めて発見され、その後欧州で見つかり、１９９０年代初期にアジアで確認された。これまでＰＲＲＳは、その養豚国に固有の特徴を伴って世界中に蔓延しており、毎年膨大な経済的損失をもたらしている。ＰＲＲＳの病原体はブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）であり、これは、マウスの乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス（ＬＤＥＶ）、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）、およびサル出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ）と共にニドウイルス目アルテリウイルス科に属する。
【０００４】
小型エンベロープウイルスの一員であるＰＲＲＳＶは、約２０の推定タンパク質をコードしている少なくとも８個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む、およそ１５．１〜１５．５kbの一本鎖プラスセンスＲＮＡ（＋ｓｓＲＮＡ）ゲノムを有する。さらにそのゲノムは、５’および３’末端の両方に２個の非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。詳細には、ＯＲＦ１（ＯＲＦ１ａおよびＯＲＦ１ｂ）は５’−ＵＴＲの下流に位置し、ゲノム全体の三分の二以上を占めている。ＯＲＦ１ａは直接翻訳され、一方ＯＲＦ１ｂはリボソームフレームシフトにより翻訳され、大きなＯＲＦ１ａｂポリタンパク質を生成し、それが、ウイルスの転写および複製機構に関連する生成物へとタンパク質分解的に開裂する。３’−ＵＴＲの上流にあるＯＲＦ２〜７は、ビリオンに関連する一連のウイルス構造タンパク質、例えばエンベロープタンパク質（Ｅ）およびヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）をコードしている。これらのタンパク質は全てサブゲノムｍＲＮＡ（ｓｇｍＲＮＡ）の３’−共通末端ネスト化セットから翻訳される。
【０００５】
世界中の様々な地理的地域からのＰＲＲＳＶ単離物の系統発生解析は、二つの主要な遺伝子型：欧州プロトタイプを表すＩ型（レリスタッドウイルス、ＬＶ）、およびプロトタイプとして北米株ＡＴＣＣ ＶＲ２３３２（ＶＲ２３３２のゲノム配列についてはＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ１５０５６４を参照されたい）を表すII型の存在を明確に示している（Murtaugh et al., Arch Virol. 1995;140:1451-1460）。さらに、幾つかの研究は、ＯＲＦ５および非構造タンパク質２（ＮＳＰ２）−コード遺伝子（ｎｓｐ２）が、ＰＲＲＳＶゲノムにおいて最も遺伝的に可変性の領域であり得ることを示した。ＶＲ２３３２のＮＳＰ２の配列についてはＳｗｉｓｓＰｒｏｔ登録番号Ｑ９ＷＪＢ２または配列番号２を参照されたい。ＰＲＲＳＶ株はその病原性が大きく異なっているということもまた充分に立証されている。
【０００６】
２００６年、当初知られていなかった、ＰＲＲＳの症状を伴ういわゆる「高熱」病の空前の未曽有の大規模流行が起こり、それは１０以上の省に蔓延して２００００００頭以上のブタを襲い、約４０００００頭の死亡例を出した。典型的なＰＲＲＳとは異なり、多数の成雌豚もまたこの「高熱」病に感染した。この非典型的ＰＲＲＳの広域的流行は、当初、神経症状（例えば震え）、高熱（４０〜４２℃）、紅斑性白化皮疹などを発症するブタコレラ様疾患として認定された。免疫学的解析と共に行われた剖検は、複数の臓器が高病原性ＰＲＲＳＶに感染していることを明確に示し、重度の病理学的変化が観察された（Tian et al., PLoS ONE. 2007; 2(6): e526）。単離されたウイルスの全ゲノム解析により、このＰＲＲＳＶ単離物はII型に分類され、ＨＢ−１、ＰＲＲＳＶの中国株（９６．５％のヌクレオチド同一性）、およびＪＸ１４３に高い相同性を示すことが明らかとなった（Yuan et al., 2007 International PRRS Symposium, Chicago）。ＪＸ１４３のゲノム配列については、配列番号１、またはＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＥＵ７０８７２６を参照されたい。このウイルス単離物は、特異な分子特徴、即ち非構造タンパク質２（ＮＳＰ２）中に３０アミノ酸の非連続的欠失を含むこともまた観察された（Tian et al., PLoS ONE. 2007; 2(6): e526）。ＰＲＲＳの「高熱病」型は現在「高病原性ＰＲＲＳ」またはＨＰ ＰＲＲＳとも呼ばれている。
【０００７】
ＰＲＲＳウイルス（ＰＲＲＳＶ）の単離、および改変された生（弱毒化）または不活化ＰＲＲＳＶのいずれかを含むＰＲＲＳに対するワクチンの製造が、幾つかの刊行物に記載されている（ＷＯ９２／２１３７５、ＷＯ９３／０６２１１、ＷＯ９３／０３７６０、ＷＯ９３／０７８９８、ＷＯ９６／３６３５６）。特にＷＯ９３／０３７６０は、ＰＲＲＳウイルスの単離、培養、弱毒化の方法、および各ワクチン製造、とりわけＰＲＲＳII型プロトタイプ単離物ＡＴＣＣ ＶＲ−２３３２について開示している。ＷＯ９６／３６３５６は、サルの細胞の連続継代により得られた前記単離物の特に有用な弱毒化系列を開示しており、それは登録番号ＡＴＣＣ ＶＲ−２４９５として寄託されている。各々の改変生（ＭＬＶ）ワクチン製品は、Ingelvac(登録商標) ＰＲＲＳ ＭＬＶブランド名でBoehringer Ingelheimから市販されている。II型単離物に基づく別のＭＬＶワクチンが、Ingelvac(登録商標) ＰＲＲＳ ＡＴＰブランド名として市販されている。
【０００８】
ＰＲＲＳの予防における適切な方法はワクチン接種である。しかしながら、ワクチン接種がＨＰ ＰＲＲＳに対して有効であるかどうか、そしてどの型のワクチンが使用できるかはこれまで判っていない。
【０００９】
発明の概要
本発明者等は、ＰＲＲＳII型ウイルスの弱毒化株をワクチン接種に使用して、ブタ繁殖・呼吸障害症候群に付随する高熱病型の影響からブタを守ることができるという驚くべき発見をした。ＰＲＲＳII型ウイルスの弱毒化株の予防特性の確認は、例えばＨＰ ＰＲＲＳのリスクが高いブタの処置を可能にする。このようなワクチン接種または処置プログラムは、２００６年に中国の養豚産業に打撃を与え、およそ２０００万頭のブタを処分する結果となったＰＲＲＳ流行に類似の、他のＨＰ ＰＲＲＳ流行の可能性または影響を低減させる助けとなり得る。
【００１０】
本明細書で提供する本発明の１つの態様は、ＰＲＲＳII型ウイルス、好ましくは弱毒化ＰＲＲＳII型ウイルスを有効量含む免疫原性組成物を、それを必要とするブタに投与することを含む、高熱病の影響からブタを予防的に防御する方法を包含する。この組成物はさらに薬学的に許容される担体を含むことができる。この組成物はさらにアジュバントを含むことができる。本方法は、予防または治療手段として利用できる。さらに、このような免疫原性組成物の有効量の投与は、高熱病型ＰＲＲＳの臨床徴候の発生率または重篤度を低下させる結果となる。
【００１１】
ＰＲＲＳII型ウイルス、好ましくは弱毒化ＰＲＲＳII型ウイルスを有効量含む免疫原性組成物をブタに投与することを含む、高熱病のブタにワクチン接種する方法もまた、本明細書で提供する。この組成物はさらに薬学的に許容される担体を含むことができる。この組成物はさらにアジュバントを含むことができる。有効量の免疫原性組成物を用いたこのようなワクチン接種は、好ましくは高熱病型ＰＲＲＳの臨床徴候の発生率または重篤度を低下させる結果となる。
【００１２】
この高熱病は、ブタ繁殖・呼吸障害症候群に付随する型であってよい。ブタ繁殖・呼吸障害症候群は高病原性（ＨＰ ＰＲＲＳ）であってよい。ＨＰ ＰＲＲＳまたは高熱病型は、以下の臨床徴候：発赤、出血斑、点状出血、紅斑性白化皮疹、ならびに耳、口、鼻、背、および内腿にしばしば観察される吹き出物、のうち１以上を呈するブタに検出され得る。その他の一般的な症状には、高熱（４０℃以上）、抑うつ、食欲不振、咳嗽、喘息、跛行、震え、気道の障害、および下痢がある。ＨＰ ＰＲＲＳはＨＰ ＰＲＲＳウイルスにより起き起こされる。
【００１３】
本明細書で提供する本発明の別の態様は、ＰＲＲＳII型ウイルス、好ましくは弱毒化ＰＲＲＳII型ウイルスを有効量含む免疫学的組成物を、それを必要とするブタに投与することを含む、ＨＰ ＰＲＲＳ感染からブタを予防的に防御する方法を包含する。
【００１４】
ＰＲＲＳII型遺伝子型のメンバーであることとして２００２年に中国で明らかとなったＨＰ ＰＲＲＳウイルスは、いわゆる高熱病と相関している。ＨＰ ＰＲＲＳウイルスはその後中国の幾つかの省で広まったが、このことは、他のＰＲＲＳウイルスと比較して罹患ブタ集団内での蔓延における選択的優位性を示している。
【００１５】
「ＨＰ ＰＲＲＳウイルス」という用語は、配列番号１と実質的に同一であるヌクレオチド配列を有するＰＲＲＳウイルス株を意味するが、それに限定される訳ではない。好ましくはＨＰ ＰＲＲＳウイルスは、配列番号１と実質的に同一であるヌクレオチド配列を有するＰＲＲＳウイルス株である。配列番号１と実質的に同一である、とは、好ましくは当該ＨＰ ＰＲＲＳウイルスが本明細書に定義するＰＲＲＳII型ウイルスではないという但し書きの下で、そのＰＲＲＳウイルス株のヌクレオチド配列が、好ましくは配列番号１と８５％〜１００％同一である配列を含むこと、例えばそのヌクレオチド相同性が、参照ウイルス単離物であるＶＲ２３３２に対してＯＲＦ５において９１％未満、好ましくは９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％未満の相同性であることを意味する。ＨＰ ＰＲＲＳウイルス株のヌクレオチド配列は、同様に、好ましくは当該ＨＰ ＰＲＲＳウイルスが本明細書に定義するＰＲＲＳII型ウイルスではないという但し書きの下で、好ましくは配列番号１と８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％または８９％以上同一であり、例えばそのヌクレオチド相同性は、参照ウイルス単離物であるＶＲ２３３２に対してＯＲＦ５において９１％未満、好ましくは９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％未満の相同性である。さらに好ましくはＰＲＲＳウイルス株のヌクレオチド配列は、好ましくは当該ＨＰ ＰＲＲＳウイルスが本明細書に定義するＰＲＲＳII型ウイルスではないという但し書きの下で、配列番号１と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％以上、または９９％以上同一であり、例えばそのヌクレオチド相同性は、参照ウイルス単離物であるＶＲ２３３２に対してＯＲＦ５において９１％未満、好ましくは９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％未満の相同性である。
【００１６】
ＨＰ ＰＲＲＳウイルスという用語はまた、ＮＳＰ２タンパク質内に規定の改変を有する任意のＰＲＲＳウイルス株をも意味する。この定義によれば、ＨＰ ＰＲＲＳウイルス株は、ＮＳＰ２タンパク質［ここで、配列番号２のアミノ酸位置４８２のロイシンに対応するアミノ酸が欠失しており、このことが高熱の臨床徴候を引き起こす］をコードしているＰＲＲＳウイルス株である。これに代わり、または配列番号２のアミノ酸位置において欠失したロイシンに加えて、配列番号２のアミノ酸５３４〜５６２に対応するアミノ酸がＰＲＲＳウイルスによりコードされているＮＳＰ２タンパク質から欠失しているかも知れない。この文脈において、配列番号２は例示的に理解するものとし、ＮＳＰ２タンパク質は配列番号２のＮＳＰ２タンパク質に限定されるものではない。上の教示に基づき当業者は、配列番号２の配列とは異なるが同じ改変を示すＮＳＰ２タンパク質配列を有する、ＰＲＲＳウイルス株における任意の対応する改変を容易に同定することができ、それは、配列番号２の４８２位のロイシンに対応するロイシンの欠失、および／または、配列番号２のアミノ酸５３４〜５６２に対応するアミノ酸の欠失を意味する。
【００１７】
さらに、ＨＰ ＰＲＲＳウイルスという用語は、配列番号１（上記で定義した）と実質的に同一であるヌクレオチド配列を有し、ＮＳＰ２タンパク質［ここで、配列番号２のアミノ酸位置４８２のロイシンに対応するアミノ酸および／または配列番号２のアミノ酸５３４〜５６２に対応するアミノ酸が、そのＰＲＲＳウイルスによりコードされているＮＳＰ２タンパク質から欠失している］をコードしているＰＲＲＳウイルス株をも意味し得る。
【００１８】
さらに、ＨＰ ＰＲＲＳウイルスという用語は、当該ＨＰ ＰＲＲＳウイルスが本明細書に定義するＰＲＲＳII型ウイルスではないという但し書きの下で、配列番号１と実質的に同一であるヌクレオチド配列を有する（例えばそのヌクレオチド相同性は、参照ウイルス単離物（上記で定義した）であるＶＲ２３３２に対してＯＲＦ５において９１％未満、好ましくは９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％未満の相同性である）ＰＲＲＳウイルス株であり、且つ、ＮＳＰ２タンパク質［ここで、配列番号２のアミノ酸位置４８２のロイシンに対応するアミノ酸および／または配列番号２のアミノ酸５３４〜５６２に対応するアミノ酸が、そのＰＲＲＳウイルスによりコードされているＮＳＰ２タンパク質から欠失している］をコードしている、ＨＰ ＰＲＲＳウイルスを意味する。
【００１９】
さらに、ＨＰ ＰＲＲＳウイルスという用語は、好ましくは当該ＨＰ ＰＲＲＳウイルスが本明細書に定義するＰＲＲＳII型ウイルスではないという但し書きの下で、配列番号１と実質的に同一であるヌクレオチド配列を有する（例えばそのヌクレオチド相同性は、参照ウイルス単離物（上記で定義した）であるＶＲ２３３２に対してＯＲＦ５において９１％未満、好ましくは９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％未満の相同性である）ＰＲＲＳウイルス株であり、且つ、ＮＳＰ２タンパク質［ここで、アミノ酸位置５３６〜５５０または５４６〜５６０または４７６〜４９０に対応するペプチドに対して反応性を持つ抗体は、反応性を示さない］をコードしている、ＨＰ ＰＲＲＳウイルスを意味する。
【００２０】
さらに、以下のＰＲＲＳウイルス単離物はＨＰ ＰＲＲＳウイルス株であることが判っている。したがって本明細書で使用するＨＰ ＰＲＲＳウイルス株という用語は、これらのウイルス株のうち任意のものおよびその任意の系列を包含する：ＨＰ ＰＲＲＳウイルス株ＡＨ１；ＡＨＣＦＳＨ；ＡＨＣＦＺＣ；ＢＢ０７；ＢＤ−８；ＢＱ０７；ＣＬ０７；ＣＸ０７；ＣＺ０７；ＦＹ０６０９１５；ＦＹ０８０１０８；ＧＣ−２；ＧＣＨ−３；ＧＤ１；ＧＤ２；ＧＤ２００７；ＧＤ３；ＧＤ４；ＧＤＳＤ１；ＧＤＹ１−２００７；ＧＤＹ２−２００７；ＧＤＹＦ１；ＧＳ２００８；ＧＸＨＺ１２；ＧＸＨＺ１３；ＧＸＨＺ１４；ＧＸＨＺ１６；ＧＸＨＺ１９；ＧＸＨＺ２；ＧＸＨＺ２１；ＧＸＨＺ４；ＧＸＬＺ５；ＧＸＬＺ７；ＧＹ；ＧＺＣＪ；ＧＺＤＪ；ＧＺＨＷ１；ＧＺＨＷ２；ＧＺＨＸ：ＧＺＪＳ；ＧＺＫＢ；ＧＺＫＹ；ＧＺＬＪ１；ＧＺＷＢ；ＧＺＷＭ；ＧＺＺＢ；Ｈａｉｎａｎ−１；Ｈａｉｎａｎ−２；ＨＢ１；ＨＢ２；ＨＢ３；ＨＢ−Ｔｓｈ１；ＨＢ−Ｘｔ１；ＨＥＮ４６；ＨｅＮ−ＫＦ：ＨｅＮ−ＬＨ；ＨｅＮ−ＬＹ；ＨＬＪＤＦ；ＨＬＪＭＺ１；ＨＬＪＭＺ２；ＨＬＪＭＺ３；ＨＬＪＺＹ；ＨＭ−１；ＨＮ２；ＨＮ２００７；ＨＮ３；ＨＮｌｄ；ＨＮｌｙ；ＨＮＬＹ０１；ＨＮＮＸ０１；ＨＮＰＪ０１；ＨＮｓｐ；ＨＮＸＴ１；ＨＮｙｙ；ＨＮｙｚ；ＨＱ−５；ＨＱ−６；ＨＵＢ；ＨｕＮ；ＨＵＮ１；ＨＵＮ１１；ＨＵＮ１５；ＨＵＮ１６；ＨＵＮ１７；ＨＵＮ２；ＨＵＮ３；ＨＵＮ４；ＨＵＮ５；ＨＵＮ６；ＨＵＮ７；Ｈｕｎａｎ−１；Ｈｕｎａｎ−２；Ｈｕｎａｎ−３；ＨＵＮＨ２；ＨＵＮＨ４；ＨｕＮｈｌ；ＨＵＮＬ１；ＨＵＮＸ４；ＨＺ０６１２２６；ＨＺ０７０１０５；Ｊｉａｎｇｓｕ−１；Ｊｉａｎｇｓｕ−２；Ｊｉａｎｇｓｕ−３；Ｊｉａｎｇｘｉ−２；Ｊｉａｎｇｘｉ−４；ＪＬＹＳ；ＪＮ；ＪＸ１；ＪＸ１４３；ＪＸ２；ＪＸ−２；ＪＸ２００６；ＪＸ３；ＪＸ４；ＪＸ５；ＪＸＡ１；ＫＳ０６；ＬＣ０７；ＬＪ；ＬＳ０６；ＬＳ−４；ＬＹ０７；ＮＢ０７０３１９；ＳＣ０７；ＳＤ；ＳＤ１４；ＳＤＷＦ２；ＳＨ０２；ＳＴ−７；ＳＸ２００７；ＳＹ０６０８；ＴＪＤＭＪ；ＴＪＺＨＪ２；ＴＪＺＨＪ３；ＴＱ；ＴＱ０７；ＴＷＯ７；ＷＦ０７；ＸＪ０７；ＸＬ２００８；ＹＮ２００８；ＹＮＢＳ；ＹＮＤＬ；ＹＮＭＧ；ＹＮＷＳ；ＹＮＹＳ；ＹＮＹＸ１；ＹＮＹＸ３；ＺＪ０６；ＺＪＣＪ；ＺＪＷＬ；ＺＸ０７；ＺＳ０７０９２１。系列とは、上に列挙した任意の親ウイルスを起源とし、対応する親ウイルス株と８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％以上のヌクレオチド配列同一性を有するウイルス単離物を意味するが、それらに限定される訳ではない。
【００２１】
「ＰＲＲＳII型ウイルス」という用語は、ＡＴＣＣ−ＶＲ２３３２として寄託されたウイルス単離物またはＡＴＣＣ−ＶＲ２３３２として寄託されたウイルス単離物の任意の系列と実質的に同一であるＰＲＲＳウイルス株を意味するが、それに限定される訳ではない。本明細書で使用する、実質的に同一である、とは、ＯＲＦ５タンパク質をコードしているヌクレオチド配列が、ＡＴＣＣ−ＶＲ２３３２として寄託されたウイルス単離物の、そして配列番号３に定義されているヌクレオチド配列と８５％〜１００％同一であることを意味する。ＯＲＦ５ヌクレオチド配列は、好ましくは配列番号３と８６％、８７％、８８％、または８９％以上同一である。さらに好ましくは、ＯＲＦ５ヌクレオチド配列は、配列番号３と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％以上または９９％以上同一である。好ましくは、本明細書で使用するＰＲＲＳII型ウイルスは、ＡＴＣＣ−ＶＲ２３３２として寄託されたウイルス単離物またはＡＴＣＣ−ＶＲ２３３２として寄託されたウイルス単離物の任意の系列（上記で定義した）と実質的に同一であるＰＲＲＳウイルス株であるが、アミノ酸のＮＳＰ２遺伝子内部に、配列番号２のアミノ酸５３４〜５６２に対応する欠失を持たない。ＰＲＲＳウイルスＡＴＣＣ−ＶＲ２３３２の完全な配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ８７３９２に見出される。
【００２２】
ＰＲＲＳII型ウイルスという用語はさらに、上記のＰＲＲＳII型ウイルス株のいずれかを起源とする任意の弱毒化ウイルスを包含する。例えば、ＰＲＲＳII型ウイルスという用語は、ＡＴＣＣ−ＶＲ２４９５として寄託された弱毒化ＰＲＲＳII型ウイルスをも包含する。さらに、弱毒化ＰＲＲＳII型ウイルスは、ＡＴＣＣ−ＶＲ２３３２として寄託されたウイルス単離物の任意の弱毒化系列であってもよい。幾つかの好ましい形態においては、ＰＲＲＳII型ウイルスおよび薬学的に許容される担体は、Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.（St. Joseph, MO）社製のIngelvac(登録商標)ＰＲＲＳ ＭＬＶワクチン（製造番号ＪＡ−Ａ６４Ａ−１４９）であってよい。ＰＲＲＳII型ウイルスという用語はさらに、ＨＢ−１；ＢＪ−４；ＣＨ−１ａ；ＣＨ−１Ｒ；ＣＨ−１Ｒ０１；ＨＢ−２；ＨＮ１；ＨＴ０６；ＨＺ０７；ＬＳ０５；ＬＹ０３；ＮＨ０４；ＰＬ９７−１；Ｓ１；ＳＨ０６１１３０；ＳＸ０７１２２６；ＴＷ０７−１；ＷＦ０３；ＸＸ０３；ＺＪＪ０４；ＺＪＪ０５；ＺＪＪ０７として知られる単離物をも包含でき、これらは中国起源の非ＨＰ ＰＲＲＳ株である。
【００２３】
本明細書で提供する本発明の別の態様は、ＰＲＲＳII型ウイルス、好ましくは弱毒化ＰＲＲＳII型ウイルス［ここで、該ＰＲＲＳII型ウイルスは、ＡＴＣＣ−ＶＲ２３３２として寄託されたウイルス単離物またはＡＴＣＣ−ＶＲ２３３２として寄託されたウイルス単離物の任意の系列と実質的に同一であるＰＲＲＳウイルス株である］を有効量含む免疫原性組成物を、それを必要とするブタに投与することを含む、ブタのＨＰ ＰＲＲＳ感染を予防する方法を包含する。好ましくは、そのＰＲＲＳII型ウイルスは、ＮＳＰ２遺伝子内部に、配列番号２のアミノ酸５３４〜５６２に対応するアミノ酸の欠失を持たない。さらに好ましくは、そのＰＲＲＳII型ウイルスは、ＡＴＣＣ−ＶＲ２４９５として寄託された弱毒化ＰＲＲＳII型ウイルスである。さらに、そのＰＲＲＳII型ウイルスはIngelvac(登録商標)ＰＲＲＳ ＭＬＶワクチン（製造番号ＪＡ−Ａ６４Ａ−１４９）のウイルスである。
【００２４】
ＰＲＲＳII型ウイルスの有効量とは、そのウイルスの有効用量が投与される動物において免疫反応を誘発させるまたは誘発させ得る該ウイルスの量であってよい。有効な量は、ワクチンの成分および投与スケジュールに依存し得る。不活化ウイルスまたは改変された生ウイルス調製物を使用する場合、用量あたり約１０２．０〜約１０９．０ＴＣＩＤ５０（組織培養感染用量５０％終点）、より好ましくは約１０３．０〜約１０４．０ＴＣＩＤ５０、さらに好ましくは約１０４．０〜約１０８．０ＴＣＩＤ５０を含有するワクチン量が推奨できる。
【００２５】
本明細書に記載のＰＲＲＳII型ウイルスは、本明細書に記載のブタの高熱病の影響を予防するために、ＰＲＲＳII型ウイルスの不活化した死滅全ウイルスとして、またはその弱毒化型として使用できる。さらに、ＰＲＲＳII型ウイルスの免疫原性フラグメントまたは画分を包含するサブユニットもまた、ブタの高熱病の影響を予防するために使用できる。
【００２６】
本明細書に記載の弱毒化ＰＲＲＳII型ウイルスは、薬学的に許容される担体中に１以上の上記株を生きたまま含む、改変された生ワクチン（ＭＬＶ）であってよい。さらに、或いは、不活化ウイルスを使用して上記のような死菌ワクチン（ＫＶ）を製造することもできる。ＭＬＶは、用量あたり１０１〜１０７のウイルス粒子、より好ましくは１０３〜１０５のウイルス粒子、さらに好ましくは１０４〜１０５のウイルス粒子を投与できるよう製剤化できる。ＫＶは、用量あたり１０３〜１０１０、１０４〜１０９、１０５〜１０８、または１０６〜１０７のウイルス粒子という不活化前力価に基づいて製剤化できる。
【００２７】
ＰＲＲＳII型ウイルス、好ましくは弱毒化ＰＲＲＳII型ウイルスは、ＨＰ ＰＲＲＳを引き起こすＰＲＲＳウイルス株にブタが暴露される前に予防として、またはＨＰ ＰＲＲＳを引き起こすＰＲＲＳウイルス株にブタが暴露されると同時に、またはＨＰ ＰＲＲＳを引き起こすＰＲＲＳウイルス株に標的ブタが暴露された後の処置として、ブタに投与できる。標的ブタは、ＨＰ ＰＲＲＳもしくは上記のような高熱病型の、１以上の臨床徴候または共通症状を示し得る。標的ブタは、特にＨＰ ＰＲＲＳに付随する高熱病に罹患し易いかも知れない。標的ブタは特にＨＰ ＰＲＲＳに罹患し易いかも知れない。標的ブタは、免疫不全のためにＨＰ ＰＲＲＳに罹患し易いかも知れない。標的ブタは、そのブタが飼育されている場所のためにＨＰ ＰＲＲＳに罹患し易いかも知れない。感受性ブタは中国で飼育されているかも知れない。感受性ブタは、江西省、河北省などの中国の省、または上海市で飼育されているかも知れない。Tian et al., PloS ONE. 2007;2(6):e526を参照されたく、その内容は引用により本明細書の一部とする。弱毒化ＰＲＲＳII型ウイルスは、注射、吸入、またはインプラントすることによって投与でき、注射が特に好ましい。ワクチン接種または処置に望まれる期間および有効性に応じて、ＰＲＲＳII型ウイルス、好ましくは弱毒化ＰＲＲＳII型ウイルスを１回または数回、さらには間欠的に、例えば毎日、数日間、数週間または数ヶ月間、そして異なる用量で投与できる。これらの中で単回投与が好ましい。注射は末梢に、もしくは中心静脈に所望量を、または持続注入であってもよい。ＰＲＲＳII型ウイルス、好ましくは弱毒化ＰＲＲＳII型ウイルスは、経口、非経口、皮下、筋肉内、皮内、舌下、経皮、直腸内、経粘膜、局所に吸入により、口腔内投与により、またはこれらの組み合わせによって投与できる。ＰＲＲＳII型ウイルス、好ましくは弱毒化ＰＲＲＳII型ウイルスは、弱毒化ウイルスの徐放を可能にするインプラントの形態で投与することもできる。筋肉内注射のためには、０．５mL〜３mL、より好ましくは１mL〜２．５mL、なおさらに好ましくは１．５mL〜２mLの容量を適用できる。２mLの筋肉内注射が最も好ましい。皮内注射のためには、０．０５mL〜１mL、より好ましくは０．１mL〜０．８mL、さらに好ましくは０．１mL〜０．５mL、さらに好ましくは０．２〜０．４mLの容量を投与する。最も好ましくは０．２mLの皮内注射を適用できる。０．５mL〜５mL、より好ましくは１mL〜４mL、さらに好ましくは２mL〜３mLのＰＲＲＳII型ウイルス容量を鼻内適用できる。最も好ましくは容量３mLを鼻内適用できる。
【００２８】
薬学的に許容される担体には、任意のそして全ての溶媒、分散媒、被覆剤、安定剤、希釈剤、防腐剤、抗菌剤および抗真菌剤、浸透圧調整剤、吸着遅延剤などが包含される。
【００２９】
本明細書で使用する「アジュバント」には、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム、サポニン、例えばＱｕｉｌ Ａ、ＱＳ−２１（Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA）、ＧＰＩ−０１００（Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL）、油中水エマルション、水中油エマルション、水中油中水エマルションがある。このエマルションは特に、軽質流動パラフィン油（欧州薬局方タイプ）に基づいていてよく；イソプレノイド油、例えばアルケン、特にイソブテンもしくはデセンのオリゴマー化から生ずるスクアランまたはスクアレン油；直鎖アルキル基を含む酸またはアルコールのエステル、より詳細には植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコールジ−（カプリル酸エステル／カプリン酸エステル）、グリセリルトリ−（カプリル酸エステル／カプリン酸エステル）またはオレイン酸プロピレングリコール；分岐脂肪酸またはアルコールのエステル、特にイソステアリン酸エステルがある。油を乳化剤と組み合わせて使用し、エマルションを形成させる。乳化剤は好ましくは非イオン性界面活性剤、特にソルビタン、マンニド（例えば無水オレイン酸マンニトール）、グリコール、ポリグリセロール、プロピレングリコールおよびオレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸またはヒドロキシステアリン酸のエステル（これらは場合によりエトキシ化されていてもよい）、ならびにポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンコポリマーブロック、特にプルロニック製品、とりわけＬ１２１である。Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants（Ed. Stewart-Tull, D. E. S.）JohnWiley and Sons, NY, pp51-94(1995) およびTodd et al., Vaccine 15:564-570(1997) を参照されたい。
【００３０】
例えば、”Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach”（M. Powell and M. Newman編）Plenum Press, 1995の１４７頁に記載されているＳＰＴエマルション、および同書の１８３頁に記載のエマルションＭＦ５９を使用することが可能である。
【００３１】
さらなるアジュバントの例は、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマーならびに無水マレイン酸およびアルケニル誘導体のコポリマーから選ばれる化合物である。有利なアジュバント化合物は、特に糖のポリアルケニルエーテルまたはポリアルコールで架橋したアクリル酸またはメタクリル酸のポリマーである。これらの化合物はカルボマーという名称で知られている（Pharmeuropa Vol. 8, No.2, June 1996）。当業者はさらに米国特許第２９０９４６２号を参照することができるが、これは、少なくとも３個、好ましくは最大８個のヒドロキシル基（少なくとも３個のヒドロキシルの水素原子は少なくとも２個の炭素原子を有する不飽和脂肪族基に置き換わっている）を有するポリヒドロキシル化化合物で架橋されているアクリルポリマーを記載している。好ましい基は、２〜４個の炭素原子を含む基、例えば、ビニル、アリルおよびその他のエチレン性不飽和基である。この不飽和基は、自身他の置換基、例えばメチルを含み得る。Carbopolという名称で販売されている製品（BF Goodrich, Ohio, USA）が特に好適である。それらはアリルスクロースまたはアリルペンタエリスリトールで架橋されている。それらのうち、Carbopol 974P、934Pおよび971Pが挙げられる。Carbopol 971Pの使用が最も好ましい。無水マレイン酸およびアルケニル誘導体のコポリマーの中では、無水マレイン酸およびエチレンのコポリマーであるコポリマーＥＭＡ（Monsanto）。これらのポリマーを水に溶解すると酸溶液が得られ、それを、免疫原性、免疫学的またはワクチン組成物自身が配合されるアジュバント溶液を得るため、好ましくは生理的ｐＨに中和する。
【００３２】
さらなる好適なアジュバントには、特にα−トコフェロールアセタート、ＲＩＢＩアジュバント系（Ribi Inc.）、ブロックコポリマー（CytRx, Atlanta GA）、ＳＡＦ−Ｍ（Chiron, Emeryville CA）、モノホスホリル脂質Ａ、アブリジン脂質−アミンアジュバント、E. coli（組換えまたはそれ以外）由来の熱不安定性エンテロトキシン、コレラ毒素、ＩＭＳ１３１４またはムラミルジペプチドがあるが、これらに限定される訳ではない。
【００３３】
好ましくは、用量あたり約１００μg〜約１０mgの量でアジュバントを加える。より好ましくは、用量あたり約１００μg〜約１０mgの量でアジュバントを加える。さらに好ましくは、用量あたり約５００μg〜約５mgの量でアジュバントを加える。なおさらに好ましくは、用量あたり約７５０μg〜約２．５mgの量でアジュバントを加える。最も好ましくは、用量あたり約１mgの量でアジュバントを加える。
【００３４】
ＨＰ ＰＲＲＳの標的ブタを処置または免疫することのできる弱毒化ＰＲＲＳII型ウイルスを生産する方法もまた本明細書で提供する。その方法は、以下の工程：（ａ）ＡＴＣＣ−ＶＲ２３３２またはＡＴＣＣ−ＶＲ２３３２と実質的に同一である任意のＰＲＲＳII型を下記のように継代して、該ウイルスを改変し非病原性とし、ＨＰ ＰＲＲＳの標的ブタを免疫できるようにし、（ｂ）生産ウイルス細胞または細胞培養物を回収し、（ｃ）その生産ウイルス培養物に安定剤を添加し；そして／または（ｄ）その生産ウイルス培養物を凍結乾燥する、のうち１以上を含み得る。ウイルス継代は、古典的な増殖および選択技術；例えば、弱毒化表現型を付与するための適当な宿主細胞における連続増殖、を包含できる。継代することで、後天性の突然変異を有するウイルス株が得れ、その突然変異の多くは親株の性質を有意に変化させないであろう。弱毒化ＰＲＲＳII型ウイルスは、宿主細胞において少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、またはそれ以上の回数を継代したＡＴＣＣ−ＶＲ２３３２またはＡＴＣＣ−ＶＲ２３３２と実質的に同一である任意のＰＲＲＳII型の所産であり得る。弱毒化ＰＲＲＳII型ウイルスは、宿主細胞において５０〜１００回、６０〜９０回、７０〜８０回、または６５〜７５回継代したＡＴＣＣ−ＶＲ２３３２またはＡＴＣＣ−ＶＲ２３３２と実質的に同一である任意のＰＲＲＳII型の所産であり得る。弱毒化ＰＲＲＳII型ウイルスは、宿主細胞において７０または７５回継代させたＡＴＣＣ−ＶＲ２３３２またはＡＴＣＣ−ＶＲ２３３２と実質的に同一である任意のＰＲＲＳII型の所産であり得る。好適な宿主細胞には、サルセルライン、Ｖｅｒｏ細胞、またはブタ肺胞マクロファージがある。好ましいサルセルラインはＭＡ−１０４である。宿主細胞は細胞培養物であってよい。そのセルラインを、継代しようとするウイルスに感染させる。各継代は、得られたウイルス感染セルラインまたは細胞培養物を３４℃〜４０℃、より好ましくは３５℃〜３９℃、さらに好ましくは３６℃〜３８℃、そしてさらに好ましくは３５℃〜３７℃の温度でインキュベートすることを要するかも知れない。最も好ましくは、各継代は、得られたウイルス感染セルラインまたは細胞培養物を３７℃の温度でインキュベートすることを要するかも知れない。回収の工程は、ウイルス感染細胞培養物を凍結することを包含し得る。凍結乾燥は、ウイルス感染細胞培養物の凍結試料から水分を昇華させることを包含し得る。
【００３５】
弱毒化ＰＲＲＳII型ウイルスを生産するためにウイルスの改変を利用することもでき、それは、適当な遺伝子工学技術によるウイルス株の核酸配列の直接的突然変異によって達成できる。このような技術は、核酸組換えおよび操作方法により改変され得るウイルスゲノムの全長相補的核酸コピーの構築物を利用できる。係る方法は、位置指定突然変異誘発を利用することができる。次いでウイルスタンパク質の抗原部位または酵素的性質を改変できる。
【００３６】
さらに、前記方法のいずれかを実施するためのキットを本明細書で提供する。このキットは、容器、好ましくは弱毒化ＰＲＲＳII型ウイルスを含む免疫原性組成物、薬学的に許容される担体、アジュバント、ならびに、ＰＲＲＳ感染、および好ましくは高熱病型ＰＲＲＳまたはＨＰ−ＰＲＲＳの臨床徴候の発症率重篤度または影響を低下させるため、該免疫原性組成物をそれを必要とする動物に投与するための説明書を含み得る。キットはさらに、注射手段および／または別の投与形態のための手段を含み得る。キットはさらなる溶媒を含んでいてもよい。弱毒化ワクチンは凍結乾燥することができ、溶媒で再構成して注射および／または吸入のための溶液が得られる。溶媒は、水、生理食塩水、緩衝液、またはアジュバント化溶媒であってよい。キットは、弱毒化ウイルス、溶媒、および／または薬学的に許容される担体を入れる別個の容器を含んでいてもよい。説明書は、小冊子および／または１以上の容器に貼付されたラベルであってよい。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、可視的な肺炎に冒された領域のパーセンテージについて肺を評点および評価する方法を表している。
【図２】図２は、ワクチン接種群および非ワクチン接種群のブタの直腸温を比較するグラフである。
【図３】図３は、ワクチン接種群および非ワクチン接種群のブタの平均Ｓ／Ｐ比の比較を示すグラフである［ここでは、平均ＥＬＩＳＡ群 Ｓ／Ｐ比を利用してＰＲＲＳＶに対する各群の血清学的反応を測定した］。
【図４】図４は、ワクチン接種群および非ワクチン接種群のブタの群平均臨床評点の比較を示すグラフである［ここでは、ワクチン接種群および非ワクチン接種群のブタの呼吸器疾患評点を記録した］。
【図５】図５は、ワクチン接種群および非ワクチン接種群のブタの平均１日体重増加（ＡＤＧ）を比較するグラフである。
【図６】図６は、ＭＬＶワクチン接種ブタおよび非ワクチン接種／チャレンジブタのＰＲＲＳＶ ＲＴ−ＰＣＲ陽性血清のパーセンテージの概要を示すグラフである。
【００３８】
発明の詳細な説明
定義
本明細書で使用する用語は、特定の実施態様のみを説明する目的のためのものであって、限定を意図するものではない。明細書および添付の請求項で使用する単数形「ａ」、「ａｎｄ」および「ｔｈｅ」は、文脈がそれに反する旨を明確に述べていない限り、複数の対象を包含する。
【００３９】
本明細書における数値範囲の記載については、各々間に挟まれた数値が、同程度の正確さをもって明確に意図されている。例えば６〜９という範囲の場合、６および９に加えて数値７および８が意図され、範囲６．０〜７．０の場合、数値６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０が明確に意図されている。
【００４０】
本明細書で使用する「弱毒化ウイルス」とは、標的哺乳動物においてＰＲＲＳ疾患の臨床徴候を生じないが免疫反応を誘発できる非病原性ウイルスを意味し得るが、非弱毒化ＰＲＲＳウイルスに感染した、および弱毒化ウイルスを投与されていない「コントロール群」の動物と比較して、弱毒化ウイルスに感染した動物の発生率または重篤度において臨床徴候が低下していることをも意味し得る。この文脈において「低下する／低下した」という用語は、上記定義によるコントロール群と比較して少なくとも１０％、好ましくは２５％、さらに好ましくは５０％、最も好ましくは１００％以上の低減を意味する。
【００４１】
本明細書で使用する「免疫原性フラグメント」とは、ＰＲＲＳＶに対する細胞性および／または体液性免疫反応を包含する免疫反応を宿主において誘発できる、ＰＲＲＳII型ウイルスのペプチドもしくはポリペプチドまたは核酸配列の一部を意味し得る。
【００４２】
２以上のポリペプチドまたはヌクレオチド配列の文脈において本明細書で使用する「同一である」または「同一性」とは、その配列が、特定の領域にわたり同一である残基またはヌクレオチドの特定パーセンテージを有することを意味し得る。このパーセンテージは、最適には、二つの配列をアライニングし、特定の領域にわたりその二つの配列を比較し、同一の残基が両配列に出現する位置の数を確定して合致する位置の数を求め、合致する位置の数を特定の領域における位置の総数で除し、そしてその結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを求めることによって算出できる。二つの配列が異なる長さであるかまたはアラインメントが１以上の付着末端を生成し、特定の比較領域が単一配列のみを含む場合、その単一配列の残基は、その計算の分子ではなく分母に含まれる。
【００４３】
ＰＲＲＳ単離物ＡＴＣＣ ＶＲ−２３３２は、ブダペスト条約に従い１９９２年７月７日にAmerican Type Culture Collection（Rockville, Maryland）に寄託され、登録番号ＡＴＣＣ−ＶＲ２３３２を付与された。
【００４４】
ＰＲＲＳ単離物ＡＴＣＣ ＶＲ−２４９５は、ブダペスト条約に従い１９９５年１月２８日にAmerican Type Culture Collection（Rockville, Maryland）に寄託され、登録番号ＡＴＣＣ−ＶＲ２４９５を付与された。
【００４５】
本明細書で使用する「免疫原性組成物」または「ワクチン」とは、ＰＲＲＳII型ウイルス（ＭＬＶまたは死滅ウイルス）またはその任意の免疫原性フラグメントもしくは画分、好ましくは弱毒化ＰＲＲＳII型ウイルス、例えばIngelvac ＰＲＲＳ ＭＬＶまたはIngelvac ＰＲＲＳ ＡＴＰ（これらはＰＲＲＳＶに対する細胞性および／または抗体仲介性免疫反応という「免疫学的反応」を宿主において誘発する）を含む組成物を意味する。好ましくはこの免疫原性組成物は、ＰＲＲＳＶ感染およびそれに伴う臨床徴候に対する防御免疫を付与することができる。
【００４６】
本明細書で使用する「免疫学的反応または免疫反応を誘発する」とは、免疫原性組成物またはワクチンを受ける動物に投与された免疫原性組成物またはワクチンに対する任意の細胞性および／または抗体仲介性免疫反応を意味する。通常、「免疫反応」には、該組成物もしくは対象のワクチンに含まれる抗原または抗原群に対して特に向けられた、以下の作用：抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、および／もしくは細胞毒性Ｔ細胞並びに／またはｙｄ Ｔ細胞の産生または活性化、のうち１以上が包含されるがそれらに限定される訳ではない。好ましくは、宿主は治療的または防御的免疫学的反応のいずれかを示し、その結果、新たな感染に対する抵抗性が増強し、そして／または該疾患の臨床的重篤度が、該免疫原性組成物またはワクチンの投与を受けていないコントロールに比較して低下する。このような防御は、上記のような宿主感染に付随する症状の発生率の低下、または、該症状の欠如に至る、且つそれを包含する、重篤度の低下のいずれかによって立証される。
【００４７】
本明細書で使用する「防御的免疫」とは、或る動物群におけるＰＲＲＳ、好ましくはＨＰ ＰＲＲＳ罹病に対する抵抗性が、ＨＰ ＰＲＲＳ罹患しているがＰＲＲＳ、好ましくはＰＲＲＳII型を含有する免疫原性組成物もしくはワクチンを投与されていないコントロールの動物群に比較して増強されていることを意味する。本明細書で使用する「増強された抵抗性」という用語は、本発明に係る免疫原性組成物またはワクチンを投与された動物の１０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは３０％未満、さらに好ましくは４０％未満、さらに好ましくは５０％未満、さらに好ましくは７５％未満、さらに好ましくは１００％未満が、ＰＲＲＳに罹患しているが該免疫原性組成物またはワクチンを投与されていない動物群と比較して、好ましくは本明細書に記載のＨＰ ＰＲＲＳにより引き起こされる、高熱を伴う１以上の臨床症状を発現することを意味する。
【００４８】
本明細書で使用する「実質的に相補的」とは、第一の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００またはそれ以上のヌクレオチド領域にわたり、第二の配列の相補物と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％一致すること、または、二つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味し得る。
【００４９】
本明細書で使用する「実質的に同一である」とは、第一および第二の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００もしくはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の領域にわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％一致すること、または、核酸に関して、第一の配列が第二の配列の相補物と実質的に相補的であることを意味し得る。
【００５０】
本明細書で使用する「ブタの」、「ブタ」および「子豚」は、互換的に使用できる。
【００５１】
「ワクチン接種する」とは、高熱病型ＰＲＲＳまたはＨＰ ＰＲＲＳに暴露される前に本明細書に記載の免疫原性組成物またはワクチンを投与することを指す。
【００５２】
「防御する」または「防御」とは、本発明に係る免疫原性組成物の投与を受けた結果として、ＨＰ ＰＲＲＳ罹患または高熱病型ＰＲＲＳ罹患の臨床徴候の重篤度または発生率が低下することを指す。重篤度または発生率の低下は、本発明に係る免疫原性組成物を投与されていない動物または動物群と比較した場合の低下である。
【００５３】
好ましい実施態様
以下の実施例は本発明に従う好ましい材料および方法を開示するものである。本発明の実施または試験に際し、本明細書に記載のものと類似または等価な任意の材料および方法が使用できるが、好ましい方法、機器、および材料をここに記載する。但し、これらの実施例は例示のためにのみ供するものであり、その中のいかなるものも、本発明の全範囲に対する限定と解してはならないことを理解されたい。
【００５４】
実施例
下記に特定した実施例は、ＰＲＲＳＶ単離物ＪＸ１４３の強毒性を例示するものである。Ingelvac(登録商標)ＰＲＲＳ ＭＬＶワクチンを接種したブタは、強毒性ＰＲＲＳＶ株チャレンジ後、非ワクチン接種ブタと比較して、１００％生存し、有意に高い抗体反応、低発生率の臨床的ＰＲＲＳおよびウイルス血症、より重症度の低い肺病変、より少ない、軽度の、そして短期間の臨床徴候、ならびにより短期間の直腸温上昇を示す。
【００５５】
１．材料および方法
１．１  ワクチンおよびウイルス
Ingelvac(登録商標)ＰＲＲＳ ＭＬＶワクチン（製造番号ＪＡ−Ａ６４Ａ−１４９）はBoehringer Ingelheim Vetmedicaから購入したものである。強毒性ＰＲＲＳＶ単離物ＪＸ１４３はShanghai Veterinary Research Instituteにより単離された。ＰＲＲＳＶ ＪＸ１４３組織培養物（１０５．２ＴＣＩＤ５０／ml）を、ブタへの接種のためにＤＭＥＭで５倍に希釈した。
【００５６】
１．２  プライマーおよび試薬
逆転写ポリメラーゼおよびＤＮＡラダーはTiangen biotechnology社より購入した。２ｘＰＣＲミックスはDongsheng社から購入した。Trizol(登録商標)およびプライマーはInvitrogen社由来のものであった。
【００５７】
【表１】
0005619004.tif 000002
【００５８】
１．３  動物の起源およびグループ化
２９日齢のブタ５０頭を試験のためHenan Muyuan養豚農場から購入した。これらを、到着時に採取した血清試料で各々３回ずつ試験を実施することにより、ＲＴ−ＰＣＲ（ＰＲＲＳＶおよびＰＣＶ２について）およびＥＬＩＳＡ（抗ＰＲＲＳＶキット、IDEXX Laboratory, Inc.）によって、ＰＲＲＳＶおよびＰＣＶ２について陰性であることを確認した。ブタを体重測定し、無作為に、各々２２、１４および１４頭のブタを含む第１群、第２群または第３群に分けた。その後各群に従ってブタを別個の部屋に収容した。
【００５９】
１．４  ワクチン接種およびウイルスチャレンジ
０日目に、第１群（Ｖ／Ｃ）の２２頭のブタに、Ingelvac(登録商標) ＰＲＲＳ ＭＬＶワクチン２mL単回用量を筋肉内接種した。第２群（非Ｖ／Ｃ）の１４頭のブタには０日目にＰＢＳ ２mLを注射した。第１群および第２群のブタへのウイルス投与は、２８日目に希釈ＰＲＲＳＶ ＪＸ１４３ ３mLの経鼻投与により実施した。第３群（非Ｖ／非Ｃ）のブタは厳密なネガティブコントロールとしてワクチン接種もチャレンジも行わず、２８日目にＤＭＥＭ ３mLを注射した。１４日目および４２日目にそれぞれ１群につき２頭のブタを観察のため剖検した。残りのブタは４９日目に剖検した。
【００６０】
１．５  直腸温
０日目から４９日目（チャレンジの２１日後）まで、直腸温を毎日同時刻に記録した。
【００６１】
１．６  血清学
０、７、１４、２１、２８、３２、４２および４９日目に全てのブタから血清を採取し、ＩＤＥＸＸ ＰＲＲＳＶ ＥＬＩＳＡキットを用いて抗ＰＲＲＳＶ抗体について検査した。
【００６２】
１．７  臨床評価
０日目から４９日目まで毎日ブタを監視し、行動変化ならびに呼吸および咳嗽などの臨床的呼吸徴候の重篤度を採点した。臨床徴候の採点法を表２に示す。
【００６３】
【表２】
0005619004.tif 000003
【００６４】
＊  呼吸：評点２（軽度）は、浅薄呼吸、鼻汁、刺激時の「激しい」腹式呼吸に対応する。評点３（重篤）は、速い浅薄呼吸、鼻汁、開口呼吸、「激しい」腹式呼吸に対応する。
【００６５】
＊  行動：１．口、鼻、耳および脚の内側の皮膚が赤くなり、うっ血、赤色斑、丘疹。２．抑うつ、被毛粗剛。３．食欲不振。４．跛行、震え、痙攣。５．るい痩。評点２は、上記症状の１または２個に対応する。評点３は、上記症状の３個以上に対応する。
【００６６】
＊  咳嗽：評点２は、喀痰を伴わない咳に対応する。評点３は喀痰を伴う咳に対応する。
【００６７】
１．８  生産性の評価
全てのブタの体重を、０日目（ワクチン接種前）、２８日目（チャレンジ前）、４９日目（チャレンジの２１日後）に記録した。
【００６８】
１．９  Ingelvac(登録商標)ＰＲＲＳ ＭＬＶの有効性を、チャレンジコントロールおよびネガティブコントロール群と比較した、チャレンジ後のワクチン接種ブタの臨床徴候、肺病変評点および直腸温を評価することにより見積もった。１）３日間以上の高い直腸温（４１℃）、２）抑うつ、食欲不振、結膜炎、咳嗽、呼吸障害、および３）肺炎、が明白である時、ブタがＰＲＲＳに臨床的に罹患したと考えた。
【００６９】
１．１０  肺病変
４９日目（ＰＲＲＳＶチャレンジの２１日後）に剖検を実施した。各々のブタについて、肉眼で確認できる肺炎（浮腫、うっ血、出血、肉様の堅固な線維状構造）に罹患している領域のパーセンテージ（０〜１００％）について盲検により肺を評価した。
【００７０】
１．１１  ＰＲＲＳＶ ＲＮＡの検出および定量
第１群（Ｖ／Ｃ）のブタから０、７、１４、２１、２８、３２、３５、４２日目に、そして第２群（非Ｖ／Ｃ）のブタから２８、３２、３５および４２日目に血清を採取した。QIAampウイルスＲＮＡミニキット（QIAGEN）を用いて個々の血清試料１４０μlからＲＮＡ抽出を実施した。次いで、ＰＲＲＳＶ ＲＮＡ（Genbank）の保存領域に特異的なプライム−プローブ（Invitrogen）の組み合わせ（表１）を用いてＲＴ−ＰＣＲを実施した。
【００７１】
各々のＲＴ反応物を、１２．５μLのＲＮＡテンプレート、４μLのｄＮＴＰ、２μLの１０ｘ緩衝液、０．５μLのプライマーＱｓｔおよび１μLのＱｕａｎｔ逆転写酵素で構成した。混合物を３７℃の水浴で１時間インキュベートし、−２０℃で保存した。次に、１μLのＲＴ反応物、各１μLのＳＦ１４４１３およびＳＲ１５４９プライマー、２μLの１０ｘ緩衝液、２μLのｄＮＴＰ、５ユニットのｒＴａｑポリメラーゼおよび総容量２０μLとするための水を用いてＰＣＲを実施した。反応プレートを特定の条件の下で配列検出系にかけた（９４℃で５分間；次いで９４℃３０秒間、６５℃３０秒間、７２℃７５秒間を４０サイクル；最後に７２℃で１０分間）。ＰＣＲ増幅されたフラグメントをアガロースゲルで分離し、紫外光の下で検出した。
【００７２】
１．１２  ＰＲＲＳＶ抗原検出のための免疫組織化学
ＰＲＲＳＶ特異抗原検出のための免疫組織化学を、ＰＲＲＳＶ抗Ｎ−タンパク質モノクローナル抗体（ＳＲ３０またはＳＤＯＷ１７）および二次抗体を使用して、剖検後４８時間以内に作製したホルマリン固定パラフィン包埋肺組織切片で実施した。
【００７３】
２．結果
２．１  チャレンジ後の直腸温の変化
強毒性ＰＲＲＳＶ ＪＸ１４３を接種した後、ワクチン接種群および非ワクチン接種群両方のブタの直腸温は速やかに上昇した。ピーク温度は４１℃であり、７５％のブタは投与ウイルスの接種後直ちに発熱した。直腸温は、ワクチン接種したブタでは１０日間以内にチャレンジ前のレベルに下降したが、非Ｖ／Ｃ群のブタは発熱期間がより長く、直腸温上昇が有意に長く見られた（図２）。
【００７４】
２．２  血清学的反応
ＥＬＩＳＡ Ｓ／Ｐ反応群平均を利用してＰＲＲＳＶに対する各群の血清学的反応を測定した（図３）。ネガティブコントロールのブタは、この研究全体を通してＰＲＲＳＶ抗体について陰性であり続けた。Ｖ／Ｃ群において、この抗体はワクチン接種の１０〜１４日後に初めて検出され、Ｓ／Ｐ比≧０．４が接種後（ｐ．ｉ．）１４日目に出現し、２０頭のブタのうち８頭が陽性であり、そして、ｐ．ｉ．２１日目にはＶ／Ｃ群内の２０頭のブタのうち１３頭が陽性であった。Ｖ／Ｃ群における最高のＳ／Ｐ比がチャレンジ後に観察され、この研究の終了時まで高値のままであった（ＥＬＩＳＡ Ｓ／Ｐ  ２）。非Ｖ／Ｃブタはチャレンジ後速やかにセロコンバージョンした；ｐ．ｉ．７日目において１２頭のブタのうち９頭が陽性であり、Ｓ／Ｐ比≧０．４であった。
【００７５】
２．３  臨床徴候
Ｖ／Ｃ群および非Ｖ／Ｃ群から得られた呼吸障害評点を記録した（図４）。チャレンジ後、Ｖ／Ｃ群の２０頭のブタのうち５頭が呼吸徴候および咳嗽を示し、２頭が「激しい」腹式呼吸を示した。非Ｖ／Ｃ群の１２頭のブタのうち８頭がｐ．ｉ．２１日目より前に死亡し、非Ｖ／Ｃ群の残りのブタは、「激しい」腹式呼吸と共に重度の呼吸徴候および咳嗽を示した。非Ｖ／Ｃブタの評点は連続して１０日間６を超え、最高点は７に達した。Ｖ／Ｃブタは著明な臨床徴候を呈さず、それらは連続７日間４〜５の範囲で高い平均点を示した。厳密なネガティブコントロールとしての非Ｖ／非Ｃブタは臨床徴候を示さず、それらの平均評点は３（正常）であった。
【００７６】
２．４  チャレンジ前後の１日あたりの平均体重増加
１日あたりの平均体重増加（ＡＤＧ）を図５にまとめる。０〜２８日目まで、ＡＤＧはワクチン接種ブタ（０．３３０１±０．０４１４Kg）および非ワクチン接種ブタ（０．３００８±０．０６５３Kg）間で有意な相違は見られなかった。２８日目（チャレンジ日の前）から４９日目まで、ワクチン接種ブタは非Ｖ／非Ｃコントロールブタと同様のＡＤＧであった（０．３３７３±０．０８００Kg対０．３４８４±０．０８９０Kg）が、非Ｖ／Ｃブタは明らかに遙かに低いＡＤＧ（０．０３９２±０．２３９８）を示した。
【００７７】
２．５  ワクチン接種の有効性
チャレンジの後、ＭＬＶワクチン接種したブタは、チャレンジ後間もなく平均臨床徴候評点５の臨床徴候を示し、３頭以上のブタが高い直腸温（４１℃）および肺病変を示した。方法の項で述べた基準によって判断すると、ＭＬＶワクチン接種ブタの２５％（５／２０）がＰＲＲＳを発症し、７５％（１５／２０）が防御された。対照的に、全ての非ワクチン接種ブタはチャレンジ後にＰＲＲＳを発症し、８頭が死亡しその後剖検がなされた。
【００７８】
【表３】
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【００７９】
２．６  肉眼的病変
剖検において、非Ｖ／Ｃ群中の４頭の生存ブタは、肺不全／虚脱、斑状黄褐色、うっ血、鼠径部、顎部、腸間膜リンパの浮腫およびうっ血を含む肉眼的病変を呈し、ならびに幾つかにおいては肝壊死を示した。Ｖ／Ｃ群の数頭のブタは、同様の、但しより重篤度の低い病変を有していた。非Ｖ／非Ｃコントロールブタは肉眼的病変を有していなかった。
【００８０】
２．７  肉眼的肺病変評点
ＭＬＶワクチン接種ブタの肉眼的肺病変評点は非Ｖ／Ｃブタよりも著明に低く、これは、ＭＬＶが高病原性ＰＲＲＳＶ接種に対して良好な防御を提供したことを示唆するものである（表４。巨視的肺病変発症の範囲は０〜１００％である）。
【００８１】
【表４】
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【００８２】
２．８  ウイルス血症の検出
ＰＲＲＳＶ ＲＴ−ＰＣＲ陽性血清のパーセンテージを図６にまとめる。ウイルス血症はワクチン接種の７日後にＭＬＶワクチン接種ブタの６０％に検出され、チャレンジ前に２０％まで減少した。チャレンジ後、ワクチン接種ブタの７０％がウイルス血症を発症し、これがｐ．ｉ．７日目に６０％まで減少し、ｐ．ｉ．２１日目には２０％がウイルス血症であった。対照的に、非Ｖ／Ｃブタの１００％がチャレンジ後にウイルス血症を発症し、ウイルス血はチャレンジ後に高レベルを保ち続け、非Ｖ／Ｃブタの７０％がチャレンジ後２１日目にウイルス血症であった。
【００８３】
２．９  免疫組織化学による抗原検出
微小の肺病変が顕微鏡下に観察された。ＰＲＲＳＶ感染した細胞が、チャレンジを受けた全てのブタにおいて見られた。ＭＬＶ−Ｖ／ＣブタはＰＲＲＳＶ感染細胞がより少なかった。全細胞およびＰＲＲＳＶ感染細胞の数を様々な領域において記録した。細胞感染の比率は群間で著しい相違が見られ、非Ｖ／Ｃブタでは２３．３４±４．６９１、Ｖ／Ｃブタでは９．３６±８．０６９、そして非Ｖ／非Ｃブタでは０．２４±０．１１４であった（表５）。
【００８４】
【表５】
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【００８５】
配列
配列番号１（ＪＸ１４３の配列、ＧＥＮＢＡＮＫ ＥＵ７０８７２６）
【表６】
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【００８６】
配列番号２（ＶＲ２３３２のＮＳＰ２、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ登録番号Ｑ９ＷＪＢ２）
【表７】
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【００８７】
配列番号３  ＰＲＲＳ ＶＲ２３３２のＯＲＦ５配列（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号Ｕ８７３９２）
【表８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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