(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸供与体存在下において、パントテン酸類又はその塩に、リボフラビンとリン酸供与体に作用し、リボフラビン−５’−リン酸を生成する活性を有する酸性ホスファターゼであるタンパク質を作用させて、パントテン酸類の４’位リン酸エステルを生成させる工程を含む、パントテン酸類の４’位リン酸エステルの製造方法。
【請求項２】
リン酸供与体存在下において、パントテン酸類又はその塩に、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を作用させて、パントテン酸類の４’位リン酸エステルを生成させる工程を含む、パントテン酸類の４’位リン酸エステルの製造方法。
【請求項３】
リン酸供与体存在下において、パントテン酸類又はその塩に、配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であり、且つリボフラビンとリン酸供与体に作用し、リボフラビン−５’−リン酸を生成する活性を有する酸性ホスファターゼであるタンパク質を作用させて、パントテン酸類の４’位リン酸エステルを生成させる工程を含む、パントテン酸類の４’位リン酸エステルの製造方法。
【請求項４】
リン酸供与体存在下において、パントテン酸類又はその塩に、形質転換体を作用させて、パントテン酸類の４’位リン酸エステルを生成させる工程を含む、パントテン酸類の４’位リン酸エステルの製造方法であって、
前記形質転換体は、
１）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸、
２）配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有する核酸、又は
３）配列表の配列番号１に記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有し、且つ、リボフラビンとリン酸供与体に作用し、リボフラビン−５’−リン酸を生成する活性を有する酸性ホスファターゼをコードする核酸、
を含有するベクターを保有する形質転換体である、
パントテン酸類の４’位リン酸エステルの製造方法。
【請求項５】
前記パントテン酸類が、パントテン酸、パンテチン、パンテテイン、パンテテイン−Ｓ−スルホン酸、パンテノール及びパントテニルエチルエーテルからなる群より選ばれる請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸性ホスファターゼ、前記酵素をコードする核酸、前記酵素を産生する遺伝子組換え微生物及び前記酵素の製造方法、並びにこれらを利用したリボフラビン−５’−リン酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リボフラビン−５’−リン酸（以下、５’−ＦＭＮと記す場合がある）は、生体内の種々の酵素反応における補酵素として重要な役割を担う活性型ビタミンＢ２であり、医薬品、食品添加物、飼料添加物及び工業用中間体等として有用な化合物である。リボフラビンとリン酸供与体とからリボフラビン−５’−リン酸を製造する方法としては、これまでに、化学的合成法による製造方法（特許文献１−３）及び微生物由来の酵素を用いた酵素法による製造方法（特許文献４−７）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開昭４８−５４０９９号公報
【特許文献２】特開平１１−４９７９０号公報
【特許文献３】国際公開０３／０１０１７２号公報
【特許文献４】特公昭３８−８７３７号公報
【特許文献５】特開昭４９−１２４２９１号公報
【特許文献６】特開平２−１３８９８８号公報
【特許文献７】特開平５−３０４９７５号公報
【特許文献８】特開２００８−２８９４３４号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，  ２７９，５８３―５８６（１９７２）
【非特許文献２】Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ４２，８８９―８９０（１９７８）
【非特許文献３】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２０７，７６１―７６５（１９５４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これらのうちすでに工業的に実用化されているのは化学的合成法であるが、目的とする５’位のリン酸化物の他に、生体内で非活性型の異性体であるリボフラビン−４’−リン酸及びリボフラビン−３’−リン酸、リボフラビンジホスフェート、リボフラビンポリホスフェート、リボフラビン、未反応リボフラビンの副生が避けられず、高純度の５’−ＦＭＮを得ることができない。また、収率が低い、化学的合成法は複雑な精製工程を必要とするため、製造コストが高価になる等の問題点がある。
【０００６】
また、微生物由来の酵素を用いた酵素法による５’−ＦＭＮの製造方法としては、リボフラビンの直接発酵法（特許文献４及び５）、リン酸供与体としてアデノシン三リン酸（以下、ＡＴＰと記す場合がある）を使用する方法（特許文献６及び７）が知られている。しかしながら、これらの方法にあっては使用する基質が高価なために製造コストが高価になる、５’−ＦＭＮの蓄積量が低い等の問題が存在し、工業的製法として不利であった。さらに、これまでにリボフラビンとリン酸供与体に作用し、５’−ＦＭＮを生成する活性を有する酸性ホスファターゼ及びこれを用いた５’−ＦＭＮの製造方法は知られていない。また、リン酸供与体としてＡＴＰを使用した酵素法によるパントテン酸類の４’−リン酸エステル製造方法は知られているが（非特許文献１〜３）、パントテン酸類とピロリン酸等の安価なリン酸供与体に作用し、パントテン酸類の４’−リン酸エステルを生成する活性を有する酸性ホスファターゼ及びこれを用いたパントテン酸類の４’−リン酸エステルの製造方法は知られていない。
【０００７】
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、５’−ＦＭＮの製造において有用な新規な酸性ホスファターゼ、該酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えＤＮＡ及び該組換えＤＮＡを保有する微生物を提供することを目的とする。また、本発明の別の課題は、上記の特徴を有する酸性ホスファターゼを用いた５’−ＦＭＮの効率的な製造方法を提供することを目的とする。また、本発明は、上記の特徴を有する酸性ホスファターゼを用いたパントテン酸類の４’−リン酸エステルの効率的な製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、リボフラビンとリン酸供与体に作用し、リボフラビン−５’−リン酸を生成する活性を有する酸性ホスファターゼであるタンパク質を提供する。
【０００９】
これまでに本発明者らは、リボフラビンとピロリン酸等の安価なリン酸供与体とから５’−ＦＭＮを生成する活性を有する微生物を見出し、従来よりも高純度な５’−ＦＭＮを製造する方法を見出した（特許文献８）。従来の課題を解決すべく鋭意研究した結果、本発明者らは、ブレブンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属に属する微生物から酸性ホスファターゼを単離精製し、この酸性ホスファターゼを用いることにより、リボフラビンとピロリン酸等の安価なリン酸供与体とから５’−ＦＭＮを効率よく製造できること、及び、パントテン酸類とピロリン酸等の安価なリン酸供与体とからパントテン酸類の４’−リン酸エステルを効率よく製造できることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
本発明のタンパク質は、ポリリン酸、フェニルリン酸及びそれらの塩をリン酸供与体として用いることができる。利用可能なリン酸供与体が従来用いられているＡＴＰよりも安価であるため、５’−ＦＭＮ等の製造コストを安価に抑えることができる。また、酵素反応の特異性が高いため５’−ＦＭＮの異性体であるリボフラビン−４’−リン酸及びリボフラビン−３’−リン酸、複数のリン酸基が付加されたリボフラビンジホスフェート及びリボフラビンポリホスフェート等の副生を伴うことがなく、効率的に高純度な５’−ＦＭＮを得ることができる。これにより、目的とする５’−ＦＭＮとこれらの副生物とを分離するための煩雑な精製を行う必要がなく、製造コストを安価に抑えることができる。また、基質として、リボフラビン又はその塩に加えてパントテン酸類又はその塩が利用でき、パントテン酸類の４’位リン酸エステルを製造することができる。
【００１１】
また、本発明のタンパク質は、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする。
【００１２】
さらに、本発明のタンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、リボフラビンとリン酸供与体に作用し、リボフラビン−５’−リン酸を生成する活性を有することを特徴とする。
【００１３】
ここで、上記タンパク質の塩も本発明に包含される。
【００１４】
本発明は、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸を提供する。また、本発明は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有する核酸を提供する。
【００１５】
さらに、本発明の核酸は、上記核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、リボフラビンとリン酸供与体に作用し、リボフラビン−５’−リン酸を生成する活性を有する酸性ホスファターゼをコードする核酸であってもよく、上記核酸と６５％以上の相同性を有し、且つ、リボフラビンとリン酸供与体に作用し、リボフラビン−５’−リン酸を生成する活性を有する酸性ホスファターゼをコードする核酸であってもよい。
【００１６】
これらの核酸をプラスミドに導入することにより、本発明のベクターを得ることができる。また、上記ベクターを宿主に導入することにより、本発明の形質転換体を得ることができる。このような形質転換体を用いて製造した酸性ホスファターゼも本発明に包含される。
【００１７】
また、本発明の酸性ホスファターゼの製造方法は、上記の形質転換体を形質転換体が増殖可能な培地中で培養する工程と、上記培養工程で得られた形質転換体から本発明のタンパク質を精製する精製工程とを含むことを特徴とする。
【００１８】
さらに、本発明の酸性ホスファターゼの製造方法は、リボフラビンとリン酸供与体に作用し、リボフラビン−５’−リン酸を生成する活性を有するブレブンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属に属する微生物を培養する培養工程と、上記培養工程で得られた微生物から本発明のタンパク質を精製する工程とを含むことを特徴とする。中でも、上記微生物がブレブンディモナス  ディミヌータ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ）ＩＡＭ  １２５５７であることが好ましい。
【００１９】
本発明は、リボフラビン又はその塩に、上記本発明のタンパク質を作用させて、リボフラビン−５’−リン酸を生成させる工程を含む、リボフラビン−５’−リン酸の製造方法を提供する。また、本発明は、リボフラビン又はその塩に、上記本発明の形質転換体を作用させて、リボフラビン−５’−リン酸を生成させる工程を含む、リボフラビン−５’−リン酸の製造方法を提供する。
【００２０】
本発明のリボフラビン−５’−リン酸の製造方法は、ポリリン酸、フェニルリン酸及びそれらの塩をリン酸供与体として用いることができる。利用可能なリン酸供与体が従来用いられているＡＴＰよりも安価であるため、５’−ＦＭＮの製造コストを安価に抑えることができる。また、酵素反応の特異性が高いため５’−ＦＭＮの異性体であるリボフラビン−４’−リン酸及びリボフラビン−３’−リン酸、複数のリン酸基が付加されたリボフラビンジホスフェート及びリボフラビンポリホスフェート等の副生を伴うことがなく、効率的に高純度な５’−ＦＭＮを得ることができる。これにより、目的とする５’−ＦＭＮとこれらの副生物とを分離するための煩雑な精製を行う必要がなく、製造コストを安価に抑えることができる。
【００２１】
本発明は、パントテン酸類又はその塩に、上記本発明のタンパク質を作用させて、パントテン酸類の４’位リン酸エステルを生成させる工程を含む、パントテン酸類の４’位リン酸エステルの製造方法を提供する。また、本発明は、パントテン酸類又はその塩に、上記本発明の形質転換体を作用させて、パントテン酸類の４’位リン酸エステルを生成させる工程を含む、パントテン酸類の４’位リン酸エステルの製造方法を提供する。
【００２２】
パントテン酸類は、パントテン酸、パンテチン、パンテテイン、パンテテイン−Ｓ−スルホン酸、パンテノール及びパントテニルエチルエーテルからなる群より選ばれることが好ましい。
【００２３】
本発明のパントテン酸類の４’位リン酸エステルの製造方法は、ポリリン酸、フェニルリン酸及びそれらの塩をリン酸供与体として用いることができる。利用可能なリン酸供与体が従来用いられているＡＴＰよりも安価であるため、パントテン酸類の４’位リン酸エステルの製造コストを安価に抑えることができる。本発明により、使用する基質に応じて、効率的に高純度なパントテン酸−４’−リン酸、パンテチン−４’，４’’−ジリン酸、パンテチン−４’−リン酸、パンテテイン−４’−リン酸、パンテテイン−Ｓ−スルホン酸−４’−リン酸、パンテノール−４’−リン酸、パントテニルエチルエーテル−４’−リン酸を製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
なお、本明細書及び図面において、塩基及びアミノ酸等を略号で表示する場合は、ＩＵＰＡＣ−ＩＣＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによるか、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。また、アミノ酸に光学異性体が存在する場合は、特に限らないかぎりＬ−体を示す。
【００２５】
まず、本発明のタンパク質について説明する。
本発明のタンパク質は、リボフラビンとリン酸供与体に作用し、リボフラビン−５’−リン酸を生成する活性を有し、且つ、以下の理化学的性質を有する酸性ホスファターゼである。
分子量：ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより３０〜３１ｋＤａ、ゲルろ過法により２４２ｋＤａ
基質に対するＫｍ値：リボフラビン＝０．０５ｍＭ、Ｄ−パンテチン＝０．４９ｍＭ、ピロリン酸＝１．５７ｍＭ
至適ｐＨ：５．５
至適温度：３５℃
【００２６】
本発明のタンパク質は、リン酸供与体の存在下において、リボフラビンに作用して、５’−ＦＭＮを生成する作用を有するのみならず、Ｄ−パントテン酸、Ｄ−パンテノール、Ｄ−パンテチン、Ｄ−パントテニルエチルエーテル、アスコルビン酸等に対してリン酸転移活性を示す。
【００２７】
前述した理化学的性質以外の性質として、本発明者らは、各種金属イオン又は阻害剤による影響について検討しており、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）、ｐ−クロロ水銀安息香酸、８−キノリノール、Ｍｏ６＋、Ａｇ２＋、Ｈｇ２＋で阻害されることを確認している。
【００２８】
本発明のタンパク質は、リン酸転移活性を有する微生物を培養し、得られた菌体から精製することにより得られる。また、上記リン酸転移活性を有する微生物としては、ブレブンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属に属する微生物であり、好ましくはブレブンディモナス  ディミヌータ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ）が挙げられる。
【００２９】
さらに、本発明に係るリン酸転移活性を有する微生物の一種であり、特に効果的なリン酸転移活性を有する微生物として、ブレブンディモナス  ディミヌータ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ）ＩＡＭ  １２５５７が挙げられる。なお、東京大学分子細胞生物学研究所（ＩＡＭ）にて保管されていた微生物は、２００７年４月１日から独立行政法人理化学研究所  バイオリソースセンター  微生物材料開発室（ＪＣＭ）に移管されており、ＩＡＭ  １２５５７株は、現在ＪＣＭよりＪＣＭ  ２０６３６株として入手することができる。
【００３０】
微生物は、野生株、変異株、又は細胞融合若しくは遺伝子操作法等の手法によって誘導される組換え体等、いずれの株であってもよく、少なくとも一種を使用すればよい。
【００３１】
培養の方法としては、使用する微生物が生育可能な条件であれば特に制限はなく公知の方法が使用でき、通常、炭素源、窒素源、その他養分を含む液体培地が使用できる。培地の炭素源としては、上記微生物が利用可能であればいずれでも使用できる。具体的には、グルコース、フルクトース、シュクロース、デキストリン、デンプン、ソルビトール等の糖類、メタノール、エタノール、グリセロール等のアルコール類、フマル酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸等の有機酸類及びその塩類、パラフィン等の炭化水素類、あるいはこれらの混合物等が使用できる。窒素源としては、上記微生物が利用可能であればいずれでも使用できる。具体的には、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等の硝酸塩、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン等の無機又は有機含窒素化合物、あるいはこれらの混合物等が使用できる。また、培地には、無機塩、微量金属塩、ビタミン類等の通常の培養に用いられる栄養源を適宜添加してもよい。また、必要に応じて、培地には、微生物の増殖を促進する物質、培地のｐＨ保持に有効な緩衝物質等を添加してもよい。
【００３２】
微生物の培養は、生育に適した条件下で行うことができる。具体的には培地のｐＨ  ３〜１０、好ましくは４〜９、温度０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃で行うことができる。微生物の培養は、好気的又は嫌気的条件下で行うことができる。培養時間は１０〜１５０時間が好ましいが、それぞれの微生物によって適宜決められるものである。このようにして培養された微生物は、その培養液をろ過又は遠心分離して菌体を得、その菌体を水又は緩衝液でよく洗浄する。洗浄した菌体は、適量緩衝液に懸濁し、菌体を破砕する。破砕の方法としては特に制限はないが、例えば、乳鉢、ダイノミル、フレンチプレス、超音波破砕機等の機械的破砕法が挙げられる。得られた菌体の破砕液中より、固形物をろ過又は遠心分離によって除去して得られた無細胞抽出液中の酸性ホスファターゼは酵素単離の常法によって採取される。
【００３３】
このような酵素単離の方法としては特に制限はなく、公知の方法を用いることができるが、例えば、硫酸アンモニウム沈殿等の塩析、セファデックス等によるゲルろ過法、ジエチルアミノエチル基あるいはカルボキシメチル基等を持つ担体等を用いたイオン交換クロマトグラフィー法、ブチル基、オクチル基、フェニル基等疎水性基を持つ担体等を用いた疎水性クロマトグラフィー法、色素ゲルクロマトグラフィー法、電気泳動法、透析、限外ろ過法、アフィニティクロマトグラフィー法、高速液体クロマトグラフィー法等により精製することができる。
【００３４】
さらに、得られた本発明のタンパク質を固定化酵素として用いることもできる。このような方法としては特に制限はなく、公知の方法を用いることができるが、酵素又は酵素産生細胞を固定化する方法が挙げられる。固定化方法としては、共有結合法や吸着法といった担体結合法、架橋法、包括法等が挙げられる。また、グルタルアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソチオシアネート等の縮合剤を必要に応じて使用してもよい。また、例えば、モノマーを重合反応でゲル化させて行うモノマー法；通常のモノマーよりも大きな分子を重合させるプレポリマー法；ポリアクリルアミドを用いた固定化；アルギン酸、コラーゲン、ゼラチン、寒天、κ−カラギーナン等の天然高分子を用いた固定化；光硬化性樹脂、ウレタンポリマー等の合成高分子を用いた固定化が挙げられる。
【００３５】
このようにして精製された本発明のタンパク質は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等）によって単一バンドが確認されれば精製が十分に行われたものと判断される。
【００３６】
本発明のタンパク質は、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であり、且つ、リボフラビンとリン酸供与体に作用し、リボフラビン−５’−リン酸を生成する活性を有する酸性ホスファターゼである。また、本発明のタンパク質は、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列と好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であり、且つ、リボフラビンとリン酸供与体に作用し、リボフラビン−５’−リン酸を生成する活性を有する酸性ホスファターゼである。
【００３７】
本発明のタンパク質は、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質及び該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸配列が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、リボフラビン、パントテン酸類又はその塩に対するリン酸転移活性を有するタンパク質である。
【００３８】
このような欠失、挿入、置換、付加を施す方法としては特に制限はなく、公知の方法が使用できる。例えば、日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法ＩＩ」、ｐ．１０５（広瀬進）、東京化学同人（１９８６）；日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸ＩＩＩ（組換えＤＮＡ技術）」、ｐ．２３３（広瀬進）、東京化学同人（１９９２）；Ｗ．  Ｋｒａｍｅｒ  ａｎｄ  Ｈ．−Ｊ．  Ｆｒｉｔｚ，“ＭＥＴＨＯＤＳ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１５４，ｐ．３５０−３６７（１９８７）；Ｄ．  Ｓｈｏｒｔｌｅ  ａｎｄ  Ｄ．  Ｂｏｔｓｔｅｉｎ，“ＭＥＴＨＯＤＳ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１００，ｐ．４５７−４６８（１９８３）；Ｊ．  Ａ．  Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｇｅｎｅ”,Ｖｏｌ．３４，ｐ．３１５（１９８５）；Ｔ．  Ｇｒｕｎｄｓｔｒｏｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ”,Ｖｏｌ．１３，ｐ．３３０５（１９８５）；Ｊ．  Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．”Ｖｏｌ．１３，ｐ．８７６５（１９８５）；Ａ．  Ｒ．  Ｏｌｉｐｈａｎｔ  ａｎｄ  Ｋ．  Ｓｔｒｕｈｌ，“ＭＥＴＨＯＤＳ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”,Ｖｏｌ．１５５，ｐ．５６８（１９８７）；Ａ．  Ｒ．  Ｏｌｉｐｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｇｅｎｅ”，Ｖｏｌ．４４，ｐ．１７７（１９８６）に記載の方法が挙げられる。具体的には、例えば、合成オリゴヌクレオチド等を利用する位置指定変異導入法（部位特異的変異導入法）、Ｋｕｎｋｅｌ法、ｄＮＴＰ［αＳ］法（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ法）、亜硫酸や亜硝酸等を用いる領域指定変異導入法等の方法が挙げられる。
【００３９】
また、多くのタンパク質には糖鎖が付加されている場合があり、アミノ酸を１若しくは複数置換することにより糖鎖の付加を調節することができる。したがって、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、糖鎖の調節されたタンパク質も上述のリン酸転移活性を有する限りは、本発明のタンパク質に包含される。
【００４０】
さらに得られた本発明のタンパク質は、化学的な手法でその含有されるアミノ酸残基を修飾することもできるし、ペプチダーゼ、例えば、ペプシン、キモトリプシン、パパイン、ブロメライン、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ等の酵素を用いて修飾したり、部分分解したりしてその誘導体に改変することができる。
【００４１】
また、遺伝子組換え法で製造する時に融合タンパク質として発現させ、生体内あるいは生体外で天然の酸性ホスファターゼと実質的に同等の生物学的活性を有しているものに変換・加工してもよい。この場合、遺伝子工学的に常用される融合産生法を用いることができるが、こうした融合タンパク質はその融合部を利用してアフィニティクロマトグラフィー等で精製することも可能である。タンパク質の構造の修飾・改変等は、例えば日本生化学会編、「新生化学実験講座１、タンパク質ＶＩＩ、タンパク質工学」、東京化学同人（１９３３）を参考にし、そこに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法、さらにはそれらと実質的に同様な方法で行うことができる。
【００４２】
さらに、本発明のタンパク質は、１個以上のアミノ酸残基が同一性の点で天然のものと異なるもの、１個以上のアミノ酸残基の位置が天然のものと異なるものであってもよい。本発明のタンパク質は、天然の酸性ホスファターゼに特有なアミノ酸残基が１個以上（例えば、１〜８０個、好ましくは１〜６０個、さらに好ましくは１〜４０個、さらに好ましくは１〜２０個、特に好ましくは１〜１０個等）欠けている欠失類縁体、特有のアミノ酸残基の１個以上（例えば、１〜８０個、好ましくは１〜６０個、さらに好ましくは１〜４０個、さらに好ましくは１〜２０個、特に好ましくは１〜１０個等）が他の残基で置換されている置換類縁体、１個以上（例えば、１〜８０個、好ましくは１〜６０個、さらに好ましくは１〜４０個、さらに好ましくは１〜２０個、特に好ましくは１〜１０個等）のアミノ酸残基が付加されている付加類縁体も包含する。天然の酸性ホスファターゼの特徴であるドメイン構造を有しているものも包含されてよい。また、同質のリン酸転移酵素活性を有するものも挙げられる。
【００４３】
天然の酸性ホスファターゼの特徴であるドメイン構造が維持されていれば、上記の変異体は、全て本発明に包含される。また、本発明の天然の酸性ホスファターゼと実質的に同等の一次構造コンフォメーション又はその一部を有しているものも含まれてよいと考えられ、さらに天然の酸性ホスファターゼと実質的に同等の生物学的活性を有しているものも含まれてよいと考えられる。さらに天然に生ずる変異体の一つであることもできる。こうした本発明の酸性ホスファターゼは、下記で説明するように分離・精製処理されることができる。一方は、本発明は、上記のタンパク質をコードするＤＮＡ配列、そして天然の特性の全部あるいは一部を有する酸性ホスファターゼのポリペプチド、さらにその類縁体あるいは誘導体をコードするＤＮＡ配列も包含する。該酸性ホスファターゼの塩基配列は、修飾（例えば、付加、除去、置換等）されることもでき、そうした修飾されたものも包含されてよい。
【００４４】
次に、本発明の核酸について説明する。
本発明の核酸は、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードすることを特徴とする。
【００４５】
すなわち、一つのアミノ酸をコードする塩基配列（コドン）は複数存在するため、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸は多数存在する。したがって、このような核酸も本発明の核酸に包含される。ここで、「タンパク質をコードする」とは、ＤＮＡが２本鎖である場合には、相補２本鎖のいずれか一方がタンパク質をコードする塩基配列を有するものを含むことを意味するため、本発明の核酸には配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を直接コードする塩基配列からなる核酸又はその相補的な塩基配列からなる核酸も包含される。
【００４６】
また、本発明の核酸は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有することを特徴とする。配列表の配列番号１に記載の塩基配列は、上述した微生物から染色体ＤＮＡを抽出し、酸性ホスファターゼのアミノ酸配列に基づいて設計した合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により得られたＤＮＡの塩基配列である。
【００４７】
ここで、上記微生物から染色体ＤＮＡを抽出する方法としては特に制限はないが、例えば、培養して得られた微生物（例えば、ブレブンディモナス  ディミヌータ  ＩＡＭ  １２５５７）の菌体を破砕し、常法により染色体ＤＮＡを遠心分離後、ＲＮＡを分解除去し、除タンパク操作を行って、ＤＮＡを精製する。これらの操作については「植物バイオテクノロジー実験マニュアル：農村文化社、２５２頁」を参照できる。またブレブンディモナス属に属する酸性ホスファターゼ産生能をもつ微生物であれば、ＤＮＡ源として好適に用いることができる。
【００４８】
また、ＰＣＲに用いるオリゴヌクレオチドプライマーの作製方法としては、公知の方法を用いることができ、酸性ホスファターゼのアミノ酸情報に基づいて合成オリゴヌクレオチドプライマーを作製する。
【００４９】
例えば、上記の微生物であり、且つ、酸性ホスファターゼ産生能を有する微生物から得られた精製酸性ホスファターゼのアミノ酸情報に基づいて合成オリゴヌクレオチドプライマーを作製することができる。一般的には、アミノ酸配列を基に、縮重プライマー等を作製する。プライマーの作製は、当該分野で公知の方法で行うことができ、例えばＤＮＡ自動合成装置を用い、ホスホジエステル法、ホスホトリエステル法、ホスホアミダイト法等により合成できる。具体的には、ブレブンディモナス  ディミヌータを栄養培地中で培養して得られた菌体から酸性ホスファターゼを精製し、必要に応じペプチド加水分解酵素等で断片化し、その酵素のアミノ酸配列の情報を収集する。こうして得られたアミノ酸配列の情報より、好ましい合成オリゴヌクレオチドプライマーを作製する。このプライマーを用い、酸性ホスファターゼの染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行う。ＰＣＲ反応は、当該分野で公知の方法、あるいはそれと実質的に同様な方法や改変法により行うことができるが、例えばＲ．  Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２３０，ｐ．１３５０（１９８５）；Ｒ．  Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２３９，ｐ．４８７（１９８８）；Ｈ．  Ａ．  Ｅｒｌｉｃｈ，ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ等に記載された方法に従って行うことができる。反応は、例えば、市販のキットや試薬を利用して行うことが出来る。
【００５０】
得られた増幅ＤＮＡ断片をシークエンスし、精製酵素のアミノ酸配列と相同な配列を含むことを確認し、それをアイソトープ等で標識しプローブとしてその後の実験等に使用する。塩基配列の決定は、ダイデオキシ法、例えばＭ１３ダイデオキシ法等、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法等を用いて行うことができるが、例えばＴａｑダイプライマーサイクルシークエンシングキット等の市販のシークエンシングキット、及び、例えば蛍光ＤＮＡシーケンサー装置等の自動塩基配列決定装置を用いて行うことが出来る。プローブ等をアイソトープ等によって標識するには、例えばランダムプライムドＤＮＡラベリングキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）等の市販の標識キットを使用して行うことが出来る。
【００５１】
また、本発明の核酸に係る酸性ホスファターゼ遺伝子は、例えば次の方法でクローニングできる。具体的には、遺伝子組換え技術は、例えばＴ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ”，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ（１９８９）;日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法ＩＩ」、東京化学同人（１９８６）；日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸ＩＩＩ（組換えＤＮＡ技術）」、東京化学同人（１９９２）；Ｒ．  Ｗｕ  ｅｄ．，“ＭＥＴＨＯＤＳ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．６８（１９８０）；Ｒ．  Ｗｕ  ｅｄ．，“ＭＥＴＨＯＤＳ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１００＆１０１（１９８３）；Ｒ．  Ｗｕ  ｅｄ．，“ＭＥＴＨＯＤＳ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１５３，１５４＆１５５（１９８７）；等に記載の方法あるいはこれら文献において引用された文献記載の方法、あるいはそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる。それらの手法は、本発明の目的に合わせて公知の手法に独自の改変改良を加えたものであってもよい。
【００５２】
また、本発明の核酸は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、リボフラビンとリン酸供与体に作用し、リボフラビン−５’−リン酸を生成する活性を有する酸性ホスファターゼをコードすることを特徴とする。
【００５３】
さらに、本発明の核酸は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列の一部からなることを特徴とする核酸である。
【００５４】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸としては、配列表の配列番号１に記載の塩基配列と６５％以上の相同性を有する核酸である。
【００５５】
ここで、本発明にかかる「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、二つのＤＮＡ断片がサムブルックら（Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．）の「大腸菌におけるクローン遺伝子の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅ．  ｃｏｌｉ）」（“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ”，２ｎｄ  ｅｄ．，）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ（１９８９），９．４７−９．６２及び１１．４５−１１．６１に記載されたハイブリダイゼーション条件下で、相互にハイブリダイズすることを意味する。
【００５６】
より具体的には、「ストリンジェントな条件」とは約４５℃にて６．０×ＳＳＣでハイブリダイゼーションを行うことを指す。ストリンジェンシーの選択のため、洗浄工程における塩濃度を、例えば低ストリンジェンシーとしての約２．０×ＳＳＣ、５０℃から、高ストリンジェンシーとしての約０．１×ＳＳＣ、５０℃まで選択することができる。さらに、洗浄工程の温度を低ストリンジェンシー条件の室温、約２２℃から、高ストリンジェンシー条件の約６５℃まで増大させることができる。
【００５７】
本発明の核酸は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列と６５％以上の相同性を有し、且つ、リボフラビンとリン酸供与体に作用し、リボフラビン−５’−リン酸を生成する活性を有する酸性ホスファターゼをコードする核酸である。また、本発明の核酸は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列と好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有し、且つ、リボフラビンとリン酸供与体に作用し、リボフラビン−５’−リン酸を生成する活性を有する酸性ホスファターゼをコードする核酸である。
【００５８】
次に、本発明のベクターについて説明する。
本発明のベクターは、前述した核酸を含有することを特徴とするベクターである。
【００５９】
ここで、核酸を組込むプラスミドとしては遺伝子工学的に常用される宿主細胞（例えば、大腸菌、枯草菌等の原核細胞宿主、酵母、等の真核細胞宿主）中で核酸にコードされているタンパク質が発現できるプラスミドであればどのようなプラスミドでもよい。こうした配列内には、例えば選択した宿主細胞で発現するのに好適なコドンを導入することや、制限酵素部位を設けることも可能である。また、目的とする遺伝子の発現を容易にするための制御配列、促進配列等、目的とする遺伝子を結合するのに役立つリンカー、アダプター等、さらには抗生物質耐性等の制御、代謝の制御、菌体の選別等に有用な配列等を含ませることが可能である。
【００６０】
上記プラスミドに含まれるプロモーターとしては、大腸菌を宿主とするプラスミドでは、例えば、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ラクトース（ｌａｃ）プロモーター、トリプトファン・ラクトース（ｔａｃ）プロモーター、リポプロテイン（ｌｐｐ）プロモーター、λファージＰＬプロモーターが挙げられ、酵母を宿主とするプラスミドでは、例えば、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーターが挙げられる。
【００６１】
また、大腸菌を宿主とするプラスミドとしては、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＳＰ６４、ｐＳＰ６５、ｐＴＺ−１８Ｒ／−１８Ｕ、ｐＴＺ−１９Ｒ／−１９Ｕ、ｐＧＥＭ−３、ｐＧＥＭ−４、ｐＧＥＭ−３Ｚ、ｐＧＥＭ−４Ｚ、ｐＧＥＭ−５Ｚｆ（−）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳＴＭ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）が挙げられる。大腸菌での発現に適したプラスミドベクターとしては、ｐＱＥ（ＱＩＡＧＥＮ）、ｐＥＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｐＡＳ、ｐＫＫ２２３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＭＣ１４０３、ｐＭＣ９３１、ｐＫＣ３０等も挙げられる。
【００６２】
酵母を宿主とするプラスミドとしては、例えば、ＹＩｐ型ベクター、ＹＥｐ型ベクター、ＹＲｐ型ベクター、ＹＣｐ型ベクター、ｐＧＰＤ−２が挙げられる。
【００６３】
宿主細胞としては、宿主細胞が大腸菌の場合、例えば、大腸菌Ｋ１２株に由来するものが挙げられ、具体的には、ＮＭ５３３ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｃ６００、ＤＨ１、ＤＨ５、ＨＢ１０１、ＪＭ１０９等が挙げられる。
【００６４】
本発明の遺伝子工学的手法においては、当該分野で知られたあるいは汎用されている制限酵素、逆転写酵素、ＤＮＡ断片をクローン化するのに適した構造に修飾又は変換するための酵素であるＤＮＡ修飾酵素、ＤＮＡ分解酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ＤＮＡリガーゼ等を用いることが出来る。制限酵素としては、例えば、Ｒ．  Ｊ．  Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．１３，Ｓｕｐｐｌ：ｒ１６５−２００（１９８５）；Ｓ．  Ｌｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，ｐ．１０９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８２に記載のものが挙げられる。逆転写酵素としては、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ｍｏｕｓｅ  ｍｏｌｏｎｅｙ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ；ＭＭＬＶ）由来の逆転写酵素、ニワトリ骨髄芽球症ウイルス（ａｖｉａｎ  ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ；ＡＭＶ）由来の逆転写酵素が挙げられ、特にはＲＮａｓｅＨ欠損体を好ましく用いることが出来る。ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ、その誘導体であるクレノウ・フラグメント、大腸菌ファージＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ファージＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ、耐熱菌ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【００６５】
末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼとしては、例えば、Ｇ．−Ｒ．Ｄｅｎｇ  ａｎｄ  Ｒ．  Ｗｕ，“ＭＥＴＨＯＤＳ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１００，ｐ．９６（１９８３）に記載の３’−ＯＨ末端にデオキシヌクレオチド（ｄＮＭＰ）を付加するＴｄＴａｓｅが挙げられる。
【００６６】
ＤＮＡ修飾・分解酵素としては、例えば、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼが挙げられ、具体的には、例えば、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ、脾臓ホスホジエステラーゼ、大腸菌ＤＮＡエキソヌクレアーゼＩ、大腸菌ＤＮＡエキソヌクレアーゼＩＩＩ、大腸菌ＤＮＡエキソヌクレアーゼＶＩＩ、λエキソヌクレアーゼ、ＤＮａｓｅＩ、ヌクレアーゼＳ１、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）ヌクレアーゼが挙げられる。
【００６７】
ＤＮＡリガーゼとしては、例えば、大腸菌ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼが挙げられる。ＤＮＡ遺伝子をクローニングしてＤＮＡライブラリーを構築するのに適したベクターとしては、例えば、プラスミド、λファージ、コスミド、Ｐ１ファージ、Ｆ因子、ＹＡＣが挙げられる。中でも、λファージ由来のベクターが好ましく、具体的には、例えば、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＤＡＳＨＩＩ、λＦＩＸＩＩ、λＥＭＢＬ３、λＺＡＰＩＩＴＭ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）が挙げられる。
【００６８】
本発明のベクターを前述したような宿主細胞に導入することにより、本発明の酸性ホスファターゼを産生可能な微生物又は動物細胞等の形質転換体が得られる。このような形質転換体も本発明に包含される。
【００６９】
形質転換の方法としては特に制限はなく、公知の方法を用いて行うことができるが、例えば、適当な細胞壁溶解酵素を用いて調製したプロトプラスト化した細胞に、塩化カルシウム、ポリエチレングリコール等の存在下でＤＮＡを接触させる方法や、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法（例えば、Ｅ．  Ｎｅｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，“ＥＭＢＯ  Ｊ”,Ｖｏ．１，ｐ．８４１（１９８２））、マイクロインジェクション法、遺伝子銃により打ち込む方法が挙げられる。
【００７０】
また、上記形質転換体を用いることにより、本発明のタンパク質を組換えタンパク質として製造することが可能である。このような組換えタンパク質の製造方法も本発明に包含される。
【００７１】
また本発明のタンパク質が封入体として得られた場合には、可溶化処理、例えば、塩酸グアニジン、尿素等の変成剤、さらには必要に応じ、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール等の還元剤存在下に処理して活性型酵素として精製することもできる。酵素としては酵素産生細胞をそのまま用いることが出来る。
【００７２】
上記組換えタンパク質の製造に用いられる形質転換体としては、例えば酸性ホスファターゼ遺伝子を導入したベクター（ｐＡＣＰ１２５５７−Ｅ１）を保有する大腸菌（ＪＭ１０９／ｐＡＣＰ１２５５７−Ｅ１）が挙げられる。
【００７３】
次に、本発明の５’−ＦＭＮの製造方法及びパントテン酸類の４’位リン酸エステルの製造方法について説明する。
本発明の５’−ＦＭＮの製造法は、リン酸供与体存在下において、リボフラビン又はその塩に上記本発明のタンパク質を作用させて５’−ＦＭＮを生成させる工程を備える。さらに、本発明の５’−ＦＭＮの製造法は、リン酸供与体存在下において、リボフラビン又はその塩に上記本発明の形質転換体を作用させて５’−ＦＭＮを生成させる工程を備える。
【００７４】
また、本発明のパントテン酸類の４’位リン酸エステルの製造方法は、パントテン酸、パンテチン、パンテテイン、パンテテイン−Ｓ−スルホン酸、パンテノール、パントテニルエチルエーテル等のパントテン酸類又はその塩を基質として使用し、リン酸供与体存在下において基質に上記本発明のタンパク質又は形質転換体を作用させてパントテン酸類の４’位リン酸エステルを生成させる工程を備える。
【００７５】
本発明のパントテン酸類の４’位リン酸エステルの製造方法おいて、パントテン酸、パンテチン、パンテテイン、パンテテイン−Ｓ−スルホン酸、パンテノール、パントテニルエチルエーテル等のパントテン酸類又はその塩を基質として使用して反応させると、それぞれ対応する生成物である、パントテン酸−４’−リン酸、パンテチン−４’，４’’−ジリン酸（及びパンテチン−４’−リン酸）、パンテテイン−４’−リン酸、パンテテイン−Ｓ−スルホン酸−４’−リン酸、パンテノール−４’−リン酸、パントテニルエチルエーテル−４’−リン酸を製造することができる。
【００７６】
上記反応を行う際の反応条件としては、例えば液体培地で振盪培養した形質転換体を集菌し、得られた菌体にリボフラビン等の基質（０．１〜１０％濃度）とリン酸化合物（０．１〜５０％）の水溶液を加え、ｐＨ  ４〜６に調整しながら温度２０〜４０℃で１時間から５０時間、反応させればよい。反応終了後、菌体を分離し、反応液中の生成物を単離することにより、５’−ＦＭＮ等の生成物を得ることができる。ここで、形質転換体の処理菌体（乾燥菌体や固定化菌体等）や形質転換体から得られた酵素、又は、固定化酵素等も同様にして行うことも可能である。
【００７７】
リボフラビン−５’−リン酸は、リボフラビンの５’位リン酸化物である。また、本明細書における「リボフラビン−５’−リン酸」という用語は、化合物であるリボフラビン−５’−リン酸のみに限定されず、リボフラビン−５’−リン酸及びその塩を包含するものである。リボフラビン−５’−リン酸の塩とは、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩等を指す。リボフラビン−５’−リン酸又はその塩は、水溶液中で電離した状態で存在していてもよく、また、タンパク質等の分子中に取り込まれた状態のものであってもよい。本実施形態のリボフラビン−５’−リン酸又はその塩は、ポリリン酸、フェニルリン酸及びそれらの塩からなる群より選ばれるリン酸供与体とリボフラビンとを反応させて得られる。
【００７８】
リン酸供与体としては、ポリリン酸、フェニルリン酸及びそれらの塩が挙げられる。具体的には、ポリリン酸及びその塩としては、ピロリン酸、トリポリリン酸、テトラポリリン酸、ペンタポリリン酸、トリメタリン酸、テトラメタリン酸、ヘキサメタリン酸等、若しくはそれらのナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、又は、それらの混合物等が使用できる。フェニルリン酸及びその塩としては、フェニルリン酸、ｐ−ニトロフェニルリン酸等、それらの無水物、若しくはナトリウム塩若しくはカリウム塩等のアルカリ金属塩、又は、それらの塩混合物等が使用できる。
【００７９】
ここで、本実施形態における反応工程、すなわち形質転換体、形質転換体の処理菌体（乾燥菌体や固定化菌体等）や形質転換体から得られた酵素、又は、固定化酵素等の存在下で、ポリリン酸、フェニルリン酸及びそれらの塩からなる群より選ばれるリン酸供与体とリボフラビンとを反応させる工程において、反応条件は特に限定されず、形質転換体、形質転換体の処理菌体（乾燥菌体や固定化菌体等）や形質転換体から得られた酵素、又は、固定化酵素等がリボフラビン等の基質及びリン酸供与体と十分に接触でき、その結果、５’−ＦＭＮ等の生成物を生成する条件であればいかなる条件を選択することもできる。例えば、基質（リボフラビン等）及びリン酸供与体を含む水溶液に、形質転換体、形質転換体の処理菌体（乾燥菌体や固定化菌体等）や形質転換体から得られた酵素、又は、固定化酵素等を混合すればよい。上記の混合工程は、水性の均一系中、又は、水に実質的に不溶性若しくは水に難溶性の有機溶媒と水との二相系中で行うことができるが、一般的には、水のみを溶媒として用いるか、又は、水と混合する適当な有機溶媒（例えば、エタノール、メタノール、ジオキサン、ジメチルスルホキシド等）に基質を溶解し、得られた溶液を上記の微生物の菌体又は処理物を含む水溶液又は水中懸濁液に添加して用いてもよい。必要に応じて、形質転換体、形質転換体の処理菌体（乾燥菌体や固定化菌体等）や形質転換体から得られた酵素、又は、固定化酵素等及び／又は基質を一度に、逐次又は連続的に反応液中に添加することもできる。
【００８０】
形質転換体、形質転換体の処理菌体（乾燥菌体や固定化菌体等）や形質転換体から得られた酵素、又は、固定化酵素等の使用量は、５’−ＦＭＮ等の生成物の生成反応が進行する条件であれば特に限定されない。形質転換体、形質転換体の処理菌体（乾燥菌体や固定化菌体等）や形質転換体から得られた酵素、又は、固定化酵素等の調製方法によって、その重量に対する活性が大きく異なるが、目安として、リボフラビン等の基質との重量比にして、０．０１〜１０００倍、好ましくは０．１〜１００倍である。また、リボフラビン等の基質の使用濃度は、反応系の全重量に対して０．０１〜２０重量％、好ましくは、０．１〜１０重量％である。リン酸供与体の使用濃度は、リン酸受容体であるリボフラビン等の基質の濃度によって決定される。例えば、リボフラビンに対して０．１〜１０倍、好ましくは１〜５倍である。
【００８１】
反応液のｐＨは、ｐＨ  ３〜８、好ましくはｐＨ  ４〜６であり、反応温度は、１０〜６０℃、好ましくは２０〜４０℃である。ｐＨを安定させるために緩衝液を使用することもできる。緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液等を用いることができる。さらに、ｐＨを調整するために、酸、塩基を使用することもできる。また、反応時間は、０．１〜２００時間、好ましくは１〜５０時間であるが、それぞれのタンパク質、基質又はリン酸供与体により適宜選択することができる。必要に応じて界面活性剤、有機溶剤等を反応液に添加することにより、５’−ＦＭＮ等の生成物の生成率を向上させることができる。５’−ＦＭＮ等の生成物を連続的に取り出しながら、形質転換体、形質転換体の処理菌体（乾燥菌体や固定化菌体等）や形質転換体から得られた酵素、又は、固定化酵素等及び／又は基質を逐次又は連続的に添加する等によって、反応を継続させ、反応速度を高めることもできる。
【００８２】
本実施形態における精製工程では、反応によって生成した５’−ＦＭＮ等を慣用の分離精製手段によって単離精製する。例えば、反応工程で得られた反応溶液又は反応溶液から菌体を分離した後の溶液を用いることができる。精製方法としては、膜分離、有機溶媒（例えば、トルエン、クロロホルム等）による抽出、カラムクロマトグラフィー、減圧濃縮、蒸留、晶析、再結晶等の通常の精製方法を使用することができる。また、反応溶液のｐＨ調整により析出した目的物を含む析出物をろ過及び回収することにより、粗精製物を得ることができる。粗精製物は、必要により、吸着クロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、再結晶（メタノール、エタノール、２−プロパノール、酢酸エチル等）等によりさらに精製することができる。
【実施例】
【００８３】
以下、実施例にて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００８４】
実施例１（リボフラビンに対するリン酸転移活性の検出）
ブレブンディモナス  ディミヌータ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ）ＩＡＭ  １２５５７をペプトン１．０％、酵母エキス０．５％及びＮａＣｌ１．０％を含む培地４ｍＬに接種し、３０℃で２４時間、振盪培養を行った。遠心分離によって得られた菌体をリボフラビン５ｍｇ、酸性ピロリン酸ナトリウム１２．５ｍｇ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ４．０）０．５ｍＬに懸濁し、３０℃で１６時間、振盪し反応を行った。反応終了後、反応液を遠心分離して菌体を除去し、５’−ＦＭＮを含む溶液を得た。５’−ＦＭＮの生成量を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、下記の条件にて測定した。
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３
（粒子径３μｍ、直径４．６ｍｍ×７５ｍｍ、ＧＬサイエンス社製）
溶離液：ＣＨ３ＣＮ：５０ｍＭ  ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４（ｐＨ  ６．０）＝１２：８８
流速：２．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ  ４５０ｎｍ
温度：４０℃
【００８５】
その結果、５’−ＦＭＮ２６６．７μｇ／ｍＬが生成蓄積していた。なお、リボフラビン−４’−リン酸、リボフラビン−３’−リン酸、リボフラビンジホスフェート、リボフラビンポリホスフェート等の副生物は全く生成しなかった。したがって、酸性条件下で、リボフラビンの５’位を特異的にリン酸化する活性が確認された。また、そのようなリン酸転移活性を有する新規なリン酸化酵素がＢｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ  ＩＡＭ  １２５５７に存在することが示唆された。以下の実施例２及び３に示す通り、そのようなリン酸転移活性を有するリン酸化酵素として、新規な酸性ホスファターゼＡＣＰ１２５５７（又は単にＡＣＰと呼ぶことがある）を単離同定した。
【００８６】
実施例２（酸性ホスファターゼの精製）
リン酸転移活性を指標として、以下の（１）〜（７）の手順により新規な酸性ホスファターゼを精製した。リン酸転移活性の測定は、リボフラビンを基質として次の条件で行った。０．１％リボフラビン、０．５％ピロリン酸二水素二ナトリウム、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ  ４．０）、２ｍＭ塩化マグネシウム及び酵素液を含む反応液（５００μＬ）で、３０℃で３０分間、反応を行った。５０μＬの２Ｎ過塩素酸水を添加して反応を停止した後、遠心分離により沈殿を除き、リン酸転移反応により生成した５’−ＦＭＮを上記条件のＨＰＬＣにより定量した。
【００８７】
（２−１）培養
ＬＢ培地（ポリペプトン１．０％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム１．０％、ｐＨ  ７．０）５ｍＬを試験管に入れ、１２１℃で２０分間、加熱滅菌した。これに、Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ  ＩＡＭ  １２５５７を接種し、３０℃で１６時間、振盪培養した。この培養液を、５００ｍＬ三角フラスコに入れて１２１℃で２０分間、加熱滅菌したＬＢ培地２００ｍＬに接種し、３０℃で１６時間、振盪培養した。
【００８８】
（２−２）無細胞抽出液の調製
この培養液２０Ｌから遠心分離により回収した湿菌体を１０％グリセロール、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０．２％ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ  ７．０）からなる緩衝液Ａ  １１００ｍＬに懸濁し、超音波破砕機（１９ＫＨｚ、インソネーター  ２０１Ｍ、クボタ社製）により２０分間、超音波破砕後、遠心分離により得られた不溶性画分に１５０ｍＬの緩衝液Ａを加え、懸濁した後、遠心分離し、不溶性画分を除き、無細胞抽出液を得た。
【００８９】
（２−３）硫安分画
（２−２）で得られた無細胞抽出液に終濃度が０．５ｍＭになるようにエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）を加え、さらに緩衝液Ａを加えて６００ｍＬとした後、硫酸アンモニウム９９．６ｇを加え、４℃で３０分間、攪拌後、遠心分離し、得られた沈澱画分を１０％グリセロール、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ  ７．０）からなる緩衝液Ｂ  ２５０ｍＬに溶解した。
【００９０】
（２−４）ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムクロマトグラフィー
（２−３）で得られた粗酵素液５０ｍＬに１Ｍ塩化マグネシウム０．５ｍＬと０．１Ｍ  ＡＴＰ（ｐＨ  ７．０）２．５ｍＬを加え、３７℃で１時間、放置した後、緩衝液Ｂに対して透析を行った後、緩衝液Ｂで平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラム（直径２．５ｃｍ×１８ｃｍ）に添加し、２００ｍＬの緩衝液Ｂで洗浄後、０ｍＭから５００ｍＭ塩化ナトリウムの直線濃度勾配（５００ｍＬ）により溶出した。残りの酵素液についても、同じ操作を５回繰り返した。
【００９１】
（２−５）Ｍｏｎｏ  Ｑ  ＨＲ  １０／１０カラムクロマトグラフィー
（２−４）で得られた粗酵素液５０ｍＬを緩衝液Ｂに対し透析し、緩衝液Ｂで平衡化したＭｏｎｏ  Ｑ  ＨＲ  １０／１０（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス製）に添加し、０ｍＭから３００ｍＭ塩化ナトリウムの直線濃度勾配（１２０ｍＬ）により溶出した。残りの酵素液についても、同じ操作を５回繰り返した。
【００９２】
（２−６）Ｍｏｎｏ  Ｑ  ＨＲ  ５／５カラムクロマトグラフィー
（２−５）で溶出した活性画分を緩衝液Ｂに対し透析し、緩衝液Ｂで平衡化したＭｏｎｏ  Ｑ  ＨＲ  ５／５（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス製）に添加し、０ｍＭから３００ｍＭ塩化ナトリウムの直線濃度勾配（３０ｍＬ）により溶出し、酵素溶液を得た。残りの酵素液についても、同じ操作を５回繰り返した。
【００９３】
（２−７）コハク酸アフィニティカラムクロマトグラフィー
（２−６）で得られた酵素活性画分を合わせて、緩衝液Ｂに対し透析し、緩衝液Ｂで平衡化したコハク酸をリガンドとしたアフィニティカラムに添加した。カラムの作製はＥＡＨ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス製）を使用し、添付説明書に従って作製した。溶出は、０ｍＭから３００ｍＭ塩化ナトリウムの直線濃度勾配（３０ｍＬ）により溶出した。
【００９４】
活性画分を集め、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより解析した結果、３０ｋＤａ付近に単一のバンドを確認した。
【００９５】
実施例３（酸性ホスファターゼ遺伝子のクローニング）
（３−１）部分アミノ酸配列の決定
実施例２で得られた精製酵素の部分アミノ酸配列の解析をアプロサイエンス社に委託し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離ゲル片をＩｎ  ｇｅｌ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ法に基づきトリプシンを用いて酵素消化した後、逆相ＨＰＬＣにより生成ペプチドを分離精製し、Ｐｒｏｃｉｓｅ  ４９４  ＨＴ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により配列解析した。
【００９６】
その結果、目的のリン酸転移活性を有する酸性ホスファターゼ由来の２種類のペプチドについてアミノ酸配列を決定できた。そのアミノ酸配列は以下の通りであった。
ペプチド１：ＡＫＥＥＦＤＡＡＲ（配列番号３）
ペプチド２：ＡＤＮＥＩＥＴＰＧＡＰＲ（配列番号４）
【００９７】
（３−２）染色体ＤＮＡの調製
Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ  ＩＡＭ  １２５５７の培養菌体からＭｕｒｒａｙ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍｓｏｎの方法（Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，  １９８０年,８巻，ｐｐ．４３２１−４３２５）に従い、染色体ＤＮＡを調製した。
【００９８】
（３−３）酸性ホスファターゼ遺伝子の増幅
酸性ホスファターゼの内部部分アミノ酸配列（ペプチド１及び２のアミノ酸配列）を基にプライマー１及び２を合成した。
プライマー１：５’−ＮＧＣＮＧＣＲＴＣＲＡＡＹＴＣＹＴＣ−３’（配列番号５）
プライマー２：５’−ＧＣＮＧＡＹＡＡＹＧＡＲＡＴＨＧＡＲＡＣ−３’（配列番号６）
【００９９】
上記染色体ＤＮＡを鋳型とし、プライマー１及び２を用いて、ＴａＫａＲａ  ＥＸ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を使用し、添付説明書に従いＰＣＲを行った。アガロース電気泳動により増幅ＤＮＡを確認した結果、０．５ｋｂｐ近辺にバンドを確認した。この増幅ＤＮＡをｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ社製）にサブクローニングし、その塩基配列を決定した。
【０１００】
得られた塩基配列をアミノ酸配列に変換したところ、酸性ホスファターゼの内部ペプチドの部分アミノ酸配列と同じ箇所が見出された。
【０１０１】
決定された塩基配列の上流及び下流に存在する未知の塩基配列を決定するためにインバースＰＣＲを行った。まず、決定済みの塩基配列を基にプライマー３〜５を合成した。
プライマー３：５’−ＧＡＲＡＴＧＡＴＨＣＡＲＡＣＮＣＣＮＧＣ−３’（配列番号７）
プライマー４：５’−ＧＣＴＣＧＡＡＣＴＴＧＡＡＧＣＣＡＡＧＧ−３’（配列番号８）
プライマー５：５’−ＧＣＮＧＡＹＣＣＮＧＣＮＴＴＹＣＡＲＡＣ−３’（配列番号９）
次に、染色体ＤＮＡをＢａｎ  ＩＩで消化し、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅでセルフライゲーションした。ライゲーションしたＤＮＡを鋳型とし、ＴａＫａＲａ  ＥＸ  Ｔａｑ、プライマー３及び４を用いてＰＣＲを行った。アガロース電気泳動により増幅ＤＮＡを確認し、ｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒにサブクローニングし、その塩基配列を決定した。この塩基配列を基に新たにプライマー６を合成した。
プライマー６：５’−ＡＣＡＧＣＧＡＡＧＣＴＴＴＡＡＧＧＡＧＧＡＡＴＡＧＣＣＣＡＴＧＡＣＣＡＣＧＣＣＧＣＧＣＣＴＴＧＣＧＴＣＣＴＣ−３’（配列番号１０）
【０１０２】
染色体ＤＮＡをＳａｌ  Ｉで消化し、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅでセルフライゲーションした。ライゲーションしたＤＮＡを鋳型とし、ＴａＫａＲａ  ＥＸ  Ｔａｑ、プライマー４及び５を用いてＰＣＲを行った。アガロース電気泳動法によりＲＣＲ産物を確認し、ｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒにサブクローニングし、その塩基配列を決定した。決定された塩基配列をつなぎ合わせることによって、ブレブンディモナス  ディミヌータ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ）ＩＡＭ  １２５５７の新規酸化ホスファターゼ遺伝子の全塩基配列（８４０ｂｐ）を決定した。決定した塩基配列を配列番号１に示す。また、これに対応するアミノ酸配列を配列番号２に示す。また、アミノ酸配列から当該酵素タンパクの分子量は２９．９ｋＤａとなる。この塩基配列を基に新たにプライマー７を合成した。
プライマー７：５’−ＣＣＴＡＣＧＴＣＴＡＧＡＴＴＴＧＣＡＣＴＣＡＣＧＣＣＡ−３’（配列番号１１）
【０１０３】
染色体ＤＮＡを鋳型とし、ＴａＫａＲａ  ＥＸ  Ｔａｑ、プライマー６及び７を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をＨｉｎｄ  III及びＸｂａ  Iを使用して消化し、ｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）のＨｉｎｄ  III及びＸｂａ  Iサイトに挿入したプラスミドを構築した（ｐＵＣ−ＡＣＰ）。
【０１０４】
（３−４）配列類似性検索プログラム
本酵素遺伝子の塩基配列（配列番号１）についてホモロジー検索を、ＤＤＢＪ（ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）によるＢＬＡＳＴ検索で行った。その結果、本酵素遺伝子の塩基配列（配列番号１）は、以下に示す微生物に由来する遺伝子の塩基配列に対して、それぞれ以下に示す塩基配列相同性（％）を示した。カウロバクター  クレスセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）６１．５％、メチロバクテリウム  ラジオトレランス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ）６１．４％、フェニロバクテリウム  ズシネウム（Ｐｈｅｎｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｚｕｃｉｎｅｕｍ）６０．４％、及び、クプリアビダス  タイワネンシス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓ）６０．３％。
【０１０５】
また、本酵素遺伝子のアミノ酸配列（配列番号２）についてホモロジー検索を、ＤＤＢＪによるＢＬＡＳＴ検索で行ったところ、本酵素遺伝子のアミノ酸配列（配列番号２）は、ブレブンディモナス属菌（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｓｐ．）由来の酸性ホスファターゼ様遺伝子がコードするアミノ酸配列と最も高いアミノ酸相同性（６５．５％）を示した。また、本酵素遺伝子のアミノ酸配列（配列番号２）は、以下に示す微生物に由来する酸性ホスファターゼ様遺伝子がコードするアミノ酸配列に対して、それぞれ以下に示す相同性（％）を示した。フェニロバクテリウム  ズシネウム（Ｐｈｅｎｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｚｕｃｉｎｅｕｍ）４５．９％、マリン  ガンマ  プロテオバクテリウム（Ｍａｒｉｎｅ  ｇａｍｍａ  ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）４５．１％、及び、シュードモナス  フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）４４．２％。
【０１０６】
実施例４（組換えベクターの作製）
実施例３で明らかとなった酸性ホスファターゼをコードするＤＮＡ配列に基づいて、以下のＰＣＲプライマー８及び９を作製した。プライマー８にはＳｐｈ  I切断サイトが、プライマー９にはＢｇｌ  II切断サイトがそれぞれ付与されている。
プライマー８：５’−ＡＴＡＧＣＧＣＡＴＧＣＣＣＡＣＧＣＣＧＣＧＣＣＴＴＧＣＧＴＣＣＴＣＴＣＴＣＡＴＣ−３’（配列番号１２）
プライマー９：５’−ＧＣＧＣＣＡＧＡＴＣＴＧＧＧＣＴＧＧＣＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＧＣＧＧＧＧＣＡＧ−３’（配列番号１３）
ｐＵＣ−ＡＣＰを鋳型とし、ＫＯＤ−ＰＬＵＳ−（東洋紡社製）、プライマー８及び９を使用して添付説明書に従いＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をＳｐｈ  I及びＢｇｌ  IIを使用して消化し、ｐＱＥ−７０（キアゲン社製）のＳｐｈ  I及びＢｇｌ  IIサイトに挿入したプラスミドｐＡＣＰ１２５５７−Ｅ１を構築した。
【０１０７】
実施例５（組換え大腸菌の作製）
ｐＡＣＰ１２５５７−Ｅ１をＣｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｈｉｇｈ  ＪＭ１０９（東洋紡社製）を用いて大腸菌ＪＭ１０９に遺伝子導入し、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＡＣＰ１２５５７−Ｅ１を作製した。
【０１０８】
実施例６（組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＡＣＰ１２５５７−Ｅ１からの酵素精製）
大腸菌ＪＭ１０９／ｐＡＣＰ１２５５７−Ｅ１を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地５ｍＬに接種し、３０℃で１２時間、振盪培養した。この培養液を０．１ｍＭイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含むＬＢ培地２００ｍＬに植え継ぎ、３０℃で５時間、振盪培養を行った。この培養液を１Ｌ調製し、遠心分離した後、沈殿画分に５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ８．０）、３００ｍＭ塩化ナトリウム及び１０ｍＭイミダゾールを含む溶液に懸濁し、氷水中で超音波破砕機（３００μＡ、ＵＳ−３００、日本精機社製）により、１０分間、超音波破砕後、遠心分離により得られた沈殿画分に５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ８．０）、３００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭイミダゾール及び０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む溶液に懸濁した。遠心分離後、上清をＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ  Ｔｙｐｅ  ＡＴＧ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を使用し、添付説明書に従い酵素精製を行った。酵素溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した結果、単一のバンドが確認された。また、酵素溶液の活性測定を行った結果、活性収率４８．５％で精製できた。精製酵素をＡＣＰ１２５５７と名付けた。
【０１０９】
実施例７（酸性ホスファターゼの酵素学的性質）
実施例６で得た精製酵素の酵素学的性質について検討した。リン酸転移活性の測定の為の標準的な反応条件は、以下の通りであった。５ｍＭリボフラビン、１１２ｍＭピロリン酸二水素二ナトリウム、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．５）及び１．６８μｇ／ｍＬ酵素液を含む反応液（５００μＬ）で、３０℃で３０分間、反応を行った。２Ｎ過塩素酸水５０μＬを添加して反応を停止した後、遠心分離により沈殿を除き、リン酸転移反応により生成した５’−ＦＭＮを定量した。尚、上記反応条件にて１分間に１μｍｏｌの５’−ＦＭＮを生成する酵素量を１ｕｎｉｔ（Ｕ）と定めた。
【０１１０】
なお、５’−ＦＭＮは、ＨＰＬＣにより下記条件にて分析した。
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３（粒子径３μｍ、直径４．６ｍｍ×７５ｍｍ、ＧＬサイエンス社製）
溶離液：ＣＨ３ＣＮ：５０ｍＭ  ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４（ｐＨ  ６．０）＝１２：８８
流速：２．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ  ４５０ｎｍ
温度：４０℃
【０１１１】
（７−１）作用
ポリリン酸等のリン酸供与体よりリボフラビンやパントテン酸類（パントテン酸、パンテチン、パンテノール、パントテニルエチルエーテル）にリン酸を転移し、リボフラビン−５’−リン酸エステル及びパントテン酸類−４’−リン酸エステル（パントテン酸−４’−リン酸、パンテチン−４’，４’’−ジリン酸、パンテチン−４’−リン酸、パンテノール−４’−リン酸、パントテニルエチルエーテル−４’−リン酸）を生成する。逆にリン酸エステルを加水分解する作用も示す。
【０１１２】
（７−２）基質特異性
各種リン酸供与体をピロリン酸二水素二ナトリウムと同様の反応条件で反応した。結果は、ピロリン酸二水素二ナトリウムをリン酸供与体とした場合を１００とした相対活性として表１に示す。
【０１１３】
【表１】
0005619400.tif 000002
【０１１４】
リン酸受容体として、各種ビタミン及び核酸を基質としてリボフラビンと同様の反応条件で反応した。結果は、リボフラビンを基質とした場合を１００とした相対活性として表２に示す。
【０１１５】
生成物の分析は、ＨＰＬＣにより下記の条件にて分析した。
ピリドキシン、ピリドキサール
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３（粒子径３μｍ、直径４．６ｍｍ×７５ｍｍ、ＧＬサイエンス社製）
溶離液：Ａ；０．１％トリフルオロ酢酸水、Ｂ；０．１％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル
グラジエント：Ｂ；１％→９０％
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
検出：２８０ｎｍ
温度：４０℃
アスコルビン酸
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３（粒子径３μｍ、直径４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、ＧＬサイエンス社製）
溶離液：１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ  ３．０）−０．１Ｍリン酸二水素カリウム
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出：２５４ｎｍ
温度：２５℃
ＡＤＰ、ＡＭＰ、ＧＤＰ、ＧＭＰ
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３（粒子径３μｍ、直径４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、ＧＬサイエンス社製）
溶離液：０．１Ｍリン酸水素二ナトリウム（ｐＨ  ６．０）
流速：１．０  ｍＬ／ｍｉｎ
検出：２６０ｎｍ
温度：２５℃
Ｄ−パンテチン、Ｄ−パントテン酸カルシウム、Ｄ−パンテノール及びＤ−パントテニルエチルエーテル
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３（粒子径３μｍ、直径４．６ｍｍ×７５ｍｍ、ＧＬサイエンス社製）
溶離液：Ａ；０．１％トリフルオロ酢酸水、Ｂ；０．１％トリフルオロ酢酸/アセトニトリル
グラジエント：Ｂ；１％→９０％
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出：２３０ｎｍ
温度：５０℃
【０１１６】
【表２】
0005619400.tif 000003
【０１１７】
（７−３）至適ｐＨ
標準反応条件のうちｐＨを酢酸ナトリム緩衝液（ｐＨ  ３．０−５．５）、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ６．０−８．０）、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ  ９．０−１０．０）を用いてｐＨを変化させて、リン酸転移活性を測定した。反応の至適ｐＨは５．５付近であった。
【０１１８】
（７−４）ｐＨ安定性
グリシン緩衝液（ｐＨ  ２．０）、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ３．０−５．５）、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ６．０−８．０）、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ  ９．０−１０．０）、リン酸水素二ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ  １１．０−１３．０）の種々の緩衝液で３０℃、３０分間処理し、残存活性を標準条件の酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．５）を酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ４．０）に変えて測定した。ｐＨ  ４．０から１１．０では、処理前の８５％以上の活性が残存していた。
【０１１９】
（７−５）至適温度
標準反応条件のうち温度だけを変化させてリン酸転移活性を測定した。反応の至適温度は３５℃付近であった。
【０１２０】
（７−６）温度安定性
精製酵素を０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．５）中で種々の温度にて６０分間処理し、残存活性を標準反応条件で測定した。４０℃以下では、処理前の９０％以上の活性が残存していた。
【０１２１】
（７−７）金属イオン及び阻害剤の影響
標準反応液に各種金属イオン又は阻害剤を添加して、リン酸転移活性を測定した。結果は、無添加条件を１００とした相対活性として以下の表３及び表４に示した。
【０１２２】
【表３】
0005619400.tif 000004
【０１２３】
【表４】
0005619400.tif 000005
【０１２４】
（７−８）分子量
精製酵素のサブユニットの分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％ポリアクリルアミドゲル）により求めた結果、約３１ｋＤａであった。また、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ５／１０  （ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）によるゲルろ過クロマトグラフィーで測定した分子量は、約２４２ｋＤａであった。これらの結果より、本発明の酸性ホスファターゼは、ホモヘキサマーと予想された。
【０１２５】
（７−９）Ｋｍ値とＶｍａｘ
５ｍＭリボフラビン、１１２ｍＭピロリン酸二水素二ナトリウム、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．５）及び０．２１μｇ／ｍＬ酵素液を含む反応液（５００μＬ）のリボフラビン濃度を変化させて、３０℃で３０分間、反応を行い、ミカエリス定数Ｋｍをラインウエーバー・バークのプロットにより得た。得られたＫｍは０．０５３ｍＭであった。また、最大速度Ｖｍａｘは４．５Ｕ／ｍｇであった。さらに、ピロリン酸二水素二ナトリウムの濃度を変化させて、同様にＫｍを求めた。この場合のＫｍは１．５７ｍＭ、Ｖｍａｘは４．５Ｕ／ｍｇであった。
【０１２６】
さらに、５ｍＭパンテチン、１１２ｍＭピロリン酸二水素二ナトリウム、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．５）及び０．１７μｇ／ｍＬ酵素液を含む溶液を３０℃で１５分間、反応を行い、同様にパンテチンに対するＫｍを求めた。この場合のＫｍは０．４９ｍＭ、Ｖｍａｘは７３Ｕ／ｍｇであった。
【０１２７】
実施例８（大腸菌ＪＭ１０９／ｐＡＣＰ１２５５７−Ｅ１を用いたリボフラビンのリン酸化）
大腸菌ＪＭ１０９／ｐＡＣＰ１２５５７−Ｅ１を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地５ｍＬに接種し、３７℃で１２時間、振盪培養を行った。この培養液を０．１ｍＭ  ＩＰＴＧを含むＬＢ培地５ｍＬに植え継ぎ、３７℃で１４時間、振盪培養を行った。培養液１ｍＬを遠心分離し、得られた菌体に１％リボフラビン、２．５％ピロリン酸二水素二ナトリウム、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ  ４．０）及び２ｍＭ塩化マグネシウムを含む反応液（１ｍＬ）で、３０℃で１時間、反応した後、２Ｎ過塩素酸１００μＬを加え、反応を停止した。反応生成物はＨＰＬＣで検出した。
【０１２８】
また、Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ  ＩＡＭ  １２５５７をＬＢ培地５ｍＬに接種し、３０℃で３６時間、振盪培養した。この培養液を大腸菌ＪＭ１０９／ｐＡＣＰ１２５５７−Ｅ１と同様の方法で反応した。Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ  ＩＡＭ  １２５５７は培養液１ｍＬあたり１．２ｎｍｏｌ／ｍｉｎの活性であった。一方、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＡＣＰ１２５５７−Ｅ１は培養液１ｍＬあたり８．４ｎｍｏｌ／ｍｉｎの活性を示し、７倍の活性上昇が見られた。また、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＡＣＰ１２５５７−Ｅ１を使用して行った反応では、Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ  ＩＡＭ  １２５５７の場合と比較して、副生成物は少なかった。
【０１２９】
実施例９（大腸菌ＪＭ１０９／ｐＡＣＰ１２５５７−Ｅ１を用いたパンテチンのリン酸化）
大腸菌ＪＭ１０９／ｐＡＣＰ１２５５７−Ｅ１を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地５００ｍＬに接種し、３７℃で１２時間、振盪培養を行った。この培養液を０．１ｍＭ  ＩＰＴＧを含むＬＢ培地１８Ｌに植え継ぎ、３０℃で２４時間、振盪培養を行った。培養液を遠心分離して得られた菌体を５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ  ４．０）１．８Ｌに懸濁し、８０％パンテチン（第一三共プロファーマ社製）６７．５ｇ（９７．４ｍｍｏｌ）、ピロリン酸二水素二ナトリウム２７０ｇ（１．２２ｍｏｌ）を加え、３０℃で４時間、反応した。反応液は、７０℃で１０分間、加熱処理後、遠心分離及びメンブランろ過（０．２μｍ）により菌体を除去し、反応ろ液を得た。反応ろ液１．６７Ｌには、パンテチン−４’，４’’−ジリン酸４８ｇ（６７．２ｍｍｏｌ）及びパンテチン−４’−リン酸が含まれていた。
【０１３０】
実施例１０（パンテチン−４’，４’’−ジリン酸及びパンテチン−４’−リン酸の製造）
実施例９で得られた反応ろ液１．６７Ｌ（パンテチン−４’，４’’−ジリン酸４８ｇ含有）を逆相カラムクロマトグラム（Ｃｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ  ＯＤＳ−１０２０Ｔ；１ｋｇ）に供し、水で溶出することによりパンテチン−４’，４’’−ジリン酸４７．６ｇ（収率６８．４％）を得た。さらに、２０％アセトニトリルで溶出することによりパンテチン−４’−リン酸１０．６ｇ（収率１７．２％）を得た。なお、パンテチン−４’，４’’−ジリン酸の融点は、１６０〜１７０℃（分解）である。
【０１３１】
実施例１１（パンテチン−４’，４’’−ジリン酸ジナトリウムの製造）
実施例１０で得られたパンテチン−４’，４’’−ジリン酸１０．３ｇ（１４．４ｍｍｏｌ）を精製水１００ｍＬに溶解し、撹拌下、２８％水酸化ナトリウムを滴下し、ｐＨ  ７．０とし、反応液を濃縮乾固した。残渣をメタノール１００ｍＬに溶解し、酢酸エチル１Ｌを撹拌中に加え、析出した粉末をろ過、酢酸エチルで洗浄し、４０℃で６時間、減圧乾燥し、白色粉末のパンテチン−４’，４’’−ジリン酸ジナトリウム１０．３ｇ（収率８９．０％）を得た。なお、パンテチン−４’，４’’−ジリン酸ジナトリウムの融点は、１８５〜１９０℃である。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）  δｐｐｍ；０．８５（６Ｈ，ｓ，−ＣＨ３)，０．９９（６Ｈ，ｓ，−ＣＨ３)，２．５２（４Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，−ＣＨ２−ＣＯＮＨ），２．８５（４Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，−ＣＨ２−Ｓ−），３．４−３．８（４Ｈ，ｍ，−ＣＨ２−Ｐ−），３．５２（８Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，−ＣＨ２−ＮＨ−），４．１０（２Ｈ，ｓ，−ＣＨ−ＯＨ），４．７９（２Ｈ，ｓ，−ＯＨ）
【０１３２】
実施例１２（パンテチン−４’，４’’−ジリン酸カルシウムの製造）
実施例１０で得られたパンテチン−４’，４’’−ジリン酸２．１０ｇ（２．９４ｍｍｏｌ）を精製水５０ｍＬに溶解し、撹拌下、飽和水酸化カルシウム水を滴下し、ｐＨ  ７．０とし、反応液を濃縮乾固した。残渣をメタノールに懸濁後、粉末をろ過し、４０℃で２時間、減圧乾燥し、白色粉末のパンテチン−４’，４’’−ジリン酸カルシウム２．０２ｇ（収率９３．５％）を得た。
【０１３３】
実施例１３（パンテチン−４’，４’’−ジリン酸マグネシウムの製造）
実施例１０で得られたパンテチン−４’，４’’−ジリン酸１．３２ｇを精製水５０ｍＬに溶解し、攪拌下、水酸化マグネシウムを添加し、ｐＨ  ７．０とし、反応液を減圧濃縮した。残渣をメタノールに懸濁後、粉末をろ過し、４０℃で６時間、減圧乾燥し、白色粉末のパンテチン−４’，４’’−ジリン酸マグネシウム１．２２ｇ（収率８６．９％）を得た。
【配列表】
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