(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞壁を有する微生物を含む血液試料から、該微生物の核酸を抽出するための方法であって、
（１）該微生物を含む血液試料に対して、微生物細胞壁分解酵素および非イオン性界面活性剤を作用させて、該微生物由来の核酸を血液試料中に分散させる工程と、
（２）血液試料中に分散した該微生物由来の核酸を固相担体に結合させる工程と、
（３）核酸を結合させた該固相担体と血球細胞とを分離する工程と、
（４）該固相担体に結合させた核酸を溶出液に溶出する工程と、
を有し、前記非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタントリオレエート、アルキルポリグルコシド類、脂肪酸ジエタノールアミド類、およびアルキルモノグリセリルエーテル類から選択される少なくとも１種を有し、
且つ前記非イオン性界面活性剤の作用濃度は、前記血球細胞の溶解または破砕を低減させ、かつ微生物のみ溶解または破砕を促進する０．５から０．９％（ｗ/ｗ）の濃度であることを特徴とする微生物の核酸抽出方法。
【請求項２】
前記微生物が、真正細菌、酵母または糸状菌である請求項１記載の核酸抽出方法。
【請求項３】
前記微生物細胞壁分解酵素が、Ｎ−アセチルムラミダーゼ、ラビアーゼ、アクロモペプチダーゼ、ぺプチダーゼ、リゾチーム、エンド−β−１，４−グルカナーゼ、エキソ−β−１，４−グルカナーゼ、エンド−β−１，３−グルカナーゼ、エキソ−β−１，３−グルカナーゼ、β−１，６−グルカナーゼ、エンド−β−１，４−キシラナーゼ、エキソ−β−１，４−キシラナーゼ、エンド−β−１，３−キシラナーゼ、エキソ−β−１，３−キシラナーゼのいずれか、または２以上の組み合わせである請求項１記載の核酸抽出方法。
【請求項４】
前記非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルである請求項１記載の核酸抽出方法。
【請求項５】
前記微生物に対し、微生物細胞壁分解酵素および非イオン性界面活性剤を作用させる温度が２０から４０℃である請求項１記載の核酸抽出方法。
【請求項６】
前記溶出液がリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、トリス酢酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液のいずれかまたは２つ以上の組み合わせである請求項１記載の核酸抽出方法。
【請求項７】
細胞壁を有する微生物を含む血液試料から、該微生物の核酸を抽出するための装置であって、
（１）該微生物を含む血液試料に対して、微生物細胞壁分解酵素および非イオン性界面活性剤を作用させる手段と、
（２）前記手段によって血液試料中に分散した該微生物由来の核酸を固相担体に結合させる手段と、
（３）核酸を結合させた該固相担体と血球細胞とを分離する手段と、
（４）該固相担体に結合させた核酸を溶出液に溶出する手段と、
を備え、前記非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタントリオレエート、アルキルポリグルコシド類、脂肪酸ジエタノールアミド類、およびアルキルモノグリセリルエーテル類から選択される少なくとも１種を有し、且つ前記非イオン性界面活性剤の作用濃度は、前記血球細胞の溶解または破砕を低減させ、かつ微生物のみ溶解または破砕を促進する０．５から０．９％（ｗ/ｗ）の濃度である
ことを特徴とする核酸抽出装置。
【請求項８】
細胞壁を有する微生物を含む血液試料から、該微生物の核酸を抽出するための試薬キットであって、
（１）該微生物を含む血液試料に対して添加される、微生物細胞壁分解酵素および非イオン性界面活性剤と、
（２）血液試料中に分離した該微生物由来の核酸を結合させるための固相担体と、
（３）該固相担体に結合させた核酸を溶出する溶出液と、
を備え、前記非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタントリオレエート、アルキルポリグルコシド類、脂肪酸ジエタノールアミド類、およびアルキルモノグリセリルエーテル類から選択される少なくとも１種を有し、且つ前記非イオン性界面活性剤の作用濃度は、前記血球細胞の溶解または破砕を低減させ、かつ微生物のみ溶解または破砕を促進する０．５から０．９％（ｗ/ｗ）の濃度である
ことを特徴とする核酸抽出用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液からの感染症原因菌由来の核酸抽出方法およびその方法を用いる装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子工学、分子生物学の急速な進歩に伴い、医療分野においても感染症診断、遺伝子疾患等について核酸を用いた診断が行われるようになってきた。検査対象である検体は、血液、膿汁、痰、髄液、精液、唾液、胃液、膣分泌物、口腔内粘液等の体液、尿及び糞便等多種に渡るが、それぞれについて目的の核酸以外に含まれる侠雑物の特徴に応じた核酸抽出法が提案されている。その中で、血液感染症検査における検体は、感染症の疑いのある患者より採血された血液であるが、核酸を抽出するには、検体中の侠雑物の大部分を占める赤血球、白血球、リンパ球、血小板といった血液成分に合わせた核酸抽出法が主に採用されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
現在、血液感染症検査は主に血液培養検査が採用されているが、検査結果が出るまでに数日から１週間を要するために、血液感染症の初期治療では、血液培養の検査結果を反映させた投薬治療が行なわれていないのが現状である。
【０００４】
この課題を解決するために、より迅速な検査が可能な遺伝子核酸検査により、感染症原因菌の特定をしようとする試みが行なわれている。しかしながら、実際、重篤な血液感染症である敗血症の場合を例に挙げると、患者血液中の感染症原因菌の数は患者血液１ｍＬ当たり数個から数百個という少ない数であると言われている（非特許文献１参照）。核酸増幅系にこの数個の核酸が入ってくれば増幅は可能である。ところが、血液検体からの一般的な核酸抽出を行った場合、微生物の細胞壁を溶解または破砕する際に、同時に患者血液由来の白血球やリンパ球を溶解または破砕をし、内包するヒト核酸を溶液中に遊離させてしまう。その結果、抽出液中に微生物由来の微生物核酸に対して患者由来のヒト核酸が大過剰に混入し、これが核酸増幅の阻害物質として働いてしまい、核酸増幅の効率は著しく低下する（非特許文献１参照）。
【０００５】
これらの課題に対し、核酸抽出後のヒト核酸と微生物の核酸の混合物から微生物の核酸を選択的に抽出する方法が提案されている。例えば、特許文献１および２には、抽出過程において、微生物が有する標的核酸に相補的なプローブ担体を用いて標的核酸を選択的に濃縮させる方法が開示されている。しかし、これらの方法では、ある特定の感染症原因菌の核酸を抽出することはできても、非特異的に菌を抽出してから菌種を同定する感染症同定検査などには適用が難しい。
【０００６】
また、核酸抽出をする前処理として、血液検体から病原性微生物のみを抗体を用いて選択的に分離する方法が提案されている。例えば特許文献３には、病原性微生物、特に病原性真菌を、菌特異的抗体を固定した担体を用いて捕捉した後、液層から分離させ、その後にその遺伝子を抽出する方法が提案されている。しかし、この方法においても、ある特定の感染症原因菌の抗体を用いることになるので、汎用性の高い感染症同定検査への適用は難しい。
【特許文献１】特開平０１−２１１５００号公報
【特許文献２】特開昭６３−１８８３９９号公報
【特許文献３】特開平１１−１４２４０９号公報
【非特許文献１】日本臨床  Ｖｏｌ.６２, Ｎｏ.１２, Ｐ２２７６〜２２８０, ２００４年
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は鋭意検討した結果、微生物細胞壁分解酵素および非イオン性界面活性剤を作用させることにより、患者血液由来の血球細胞の溶解または破砕を低減させ、かつ微生物のみを溶解または破砕することを見出した。そして、この血液中に溶出させた微生物由来の核酸を抽出および精製することにより、溶出試料液中に混入してくるヒト核酸量を低減し、核酸増幅時の増幅阻害が大幅に抑えられることに成功し、上記課題を解決することを見出した。
【発明の効果】
【０００８】
本発明は、血液感染症検査における微生物核酸情報を得ることに特に有用である。本発明の核酸抽出方法を用いて、微生物由来のＤＮＡを含む核酸集団中に含まれる大過剰の白血球やリンパ球由来のヒト核酸量を低減させることで、少ない数の微生物核酸ＤＮＡでも核酸増幅のテンプレートとして利用することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
細胞壁を有する微生物を含む血液試料から、該微生物の核酸を抽出するための方法であって、
（１）該微生物を含む血液試料に対して、微生物細胞壁分解酵素および非イオン性界面活性剤を作用させて、該微生物由来の核酸を血液試料中に分散させる工程と、
（２）血液試料中に分散した該微生物由来の核酸を固相担体に結合させる工程と、
（３）核酸を結合させた該固相担体と血球細胞とを分離する工程と、
（４）該固相担体に結合させた核酸を溶出液に溶出する工程と、
を有することを特徴とする。
【００１０】
以下に、ヒト由来の検体、特に血液にかかる具体的な構成例について記載するが、本発明は下記方法に限定されるものではない。
【００１１】
まず患者より血液の採取を行うが、採取した血液は、抽出操作を行うまでの間に凝固してしまうことを防止するため、血液凝固防止剤をすみやかに添加することが好ましい。凝固防止剤としては、エチレンジアミン四酢酸のアルカリ金属塩、クエン酸ナトリウム群、ヘパリンのいずれでもよいが、特にエチレンジアミン四酢酸のアルカリ金属塩が好ましい。また、上記凝固防止剤入りの真空採血管を用いて採血を行ってもよい。
【００１２】
本発明における血液試料に含まれる対象の微生物は、細胞壁を有する微生物であり、真正細菌、酵母、糸状菌などを挙げることができる。
【００１３】
本発明における微生物の溶解を行う際に添加する微生物細胞壁分解酵素は、Ｎ−アセチルムラミダーゼ、ラビアーゼ、アクロモペプチダーゼ、ぺプチダーゼ、リゾチーム、エンド−β−１，４−グルカナーゼ、エキソ−β−１，４−グルカナーゼ、エンド−β−１，３−グルカナーゼ、エキソ−β−１，３−グルカナーゼ、β−１，６−グルカナーゼ、エンド−β−１，４−キシラナーゼ、エキソ−β−１，４−キシラナーゼ、エンド−β−１，３−キシラナーゼ、エキソ−β−１，３−キシラナーゼのいずれでもよいが、これらの酵素を２以上組み合わせることがより好ましい。特に、Ｎ−アセチルムラミダーゼとリゾチームの組み合わせが好ましい。さらに、Ｎ−アセチルムラミダーゼ、リゾチームに、エンド−β−１，４−グルカナーゼ、エンド−β−１，３−グルカナーゼを加えてもよい。
【００１４】
本発明における微生物の溶解を行う際、上記微生物細胞壁分解酵素と同時に非イオン性界面活性剤を添加して作用させる。非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類であるポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル類であるポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、脂肪酸ソルビタンエステル類であるソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタントリオレエート、アルキルポリグルコシド類、脂肪酸ジエタノールアミド類、アルキルモノグリセリルエーテル類などを挙げることができるが、特にポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルを添加することが好ましい。なお、上記非イオン性界面活性剤濃度は患者血液由来の血球細胞の溶解または破砕を低減させ、かつ微生物のみを溶解または破砕を促進する理由から、反応中の濃度を０．５から０．９％（ｗ/ｗ）の間の一定濃度に保つことが好ましい。特に０．５％（ｗ/ｗ）に保つことが好ましい。
【００１５】
本発明における微生物の溶解を行う反応温度は、反応時間中は２０℃から４０℃の間の一定温度に保つことが好ましい。細胞壁分解酵素および界面活性剤の作用効果を十分に発揮するため、３０℃から３７℃の間の一定温度に保つことがより好ましい。特に３７℃の一定温度に保つことが好ましい。
すなわち、本願発明の好ましい実施形態は、細胞壁を有する微生物を含む血液試料から、該微生物の核酸を抽出するための方法であって、
（１）該微生物を含む血液試料に対して、微生物細胞壁分解酵素および非イオン性界面活性剤を作用させて、該微生物由来の核酸を血液試料中に分散させる工程と、
（２）血液試料中に分散した該微生物由来の核酸を固相担体に結合させる工程と、
（３）核酸を結合させた該固相担体と血球細胞とを分離する工程と、
（４）該固相担体に結合させた核酸を溶出液に溶出する工程と、
を有し、前記非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタントリオレエート、アルキルポリグルコシド類、脂肪酸ジエタノールアミド類、およびアルキルモノグリセリルエーテル類から選択される少なくとも１種を有し、
且つ前記非イオン性界面活性剤の作用濃度は、前記血球細胞の溶解または破砕を低減させ、かつ微生物のみ溶解または破砕を促進する０．５から０．９％（ｗ/ｗ）の濃度であることを特徴とする。
【００１６】
このような条件で微生物の溶解を行い、微生物由来の核酸のみを血液中に分離させる。続いて、血液中に分離した微生物由来の核酸を固相担体に結合させる。固相担体としては、上記微生物由来の核酸に対して特異的親和性を有するものであれば、いずれの担体を用いることが可能である。本発明において、例えばカオトロピック物質およびシリカまたはその誘導体を含む核酸結合性の固相粒子を用いることが好ましい。次いで、固相担体と細胞膜を維持させた血球細胞とを分離させることにより、微生物由来の核酸と血球細胞とを分離することができる。
【００１７】
続いて、上記固相担体に結合させた核酸を溶出液に溶出する。本発明で用いられる上記溶出液は、例えば、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、トリス酢酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液等、核酸の溶出を促進しかつ核酸保存に適した緩衝液であれば特に限定されるものではないが、特にトリス塩酸緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ ８．５）が好ましい。
【００１８】
本発明はさらに、上記核酸抽出方法を用い、微生物を含む血液試料から微生物の核酸を抽出するための核酸抽出装置、および核酸抽出用試薬キットをも提供する。
【実施例】
【００１９】
（実施例１）
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、以下に述べる実施例は本発明にかかる最良の実施形態の一例ではあるが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２０】
＜血液感染モデルからのStaphylococcus aureus  ＤＮＡの調製＞
（微生物の培養、血液感染モデルの作製）
はじめにStaphylococcus aureus strain ＡＴＣＣ ２９２１３を羊血液寒天培地(ニッスイ社製)にて、３７℃で１２時間培養した。培養後の微生物集落(コロニー)を、１つを１０8個として、滅菌リン酸緩衝液(ｐＨ７．０)(インビトロジェン社製)を用いて段階希釈し、菌量が１０2個／１０μＬの希釈液を１．５ｍＬマイクロチューブ(エッペンドルフ社製)に作製した。この希釈液１０μＬを健常人より真空採血管（ＥＤＴＡ２Ｋ採血管：ベクトンデッキンソン社製）にて採血した血液試料９９０μＬに混合して菌量が１０2個／１ｍＬ血液の血流感染モデルを作製した。
【００２１】
（微生物溶解処理）
血液感染モデル９００μＬに、微生物溶解酵素であるＮ−アセチルムラミデイスＳＧ（生化学工業社製）溶液（１０ｍｇ／ｍＬ：１０ｍＭ トリス−マレイン酸緩衝液（ｐＨ５．５））１００μＬと非イオン性界面活性剤であるトリトンＸ−１００(キシダ化学社製)を１％濃度で含有した２０ｍＭトリス−マレイン酸緩衝液（ｐＨ５．５）とを１ｍＬ加え、緩やかに混合させた（トリトンＸ−１００の作用濃度０．５％(ｗ/ｗ））。その後、３７℃で３０分間加温した。
【００２２】
（Staphylococcus aureus  ＤＮＡの抽出）
次に、ＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ ｇＤＮＡ ５０−１００μＬ Ｂｌｏｏｄ ｋｉｔ（インビトロジェン社製）付属のＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄｓを２００μＬ加え、さらにＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ／Ｎ５（インビトロジェン社製）を２５０μＬ加えて、緩やかに攪拌した。その後、３分間放置し、Staphylococcus aureus 由来のＤＮＡを固相担体のＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄｓに吸着させた。
【００２３】
Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄｓ分離用スタンド（Ｍａｇｎａ−Ｓｅｐ）（インビトロジェン社製）にマイクロチューブをセットし、１分間放置後、Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄｓをマイクロチューブの壁面に集めたまま、溶液を捨てた。
【００２４】
残ったＭａｇｎｅｔｉｃ ＢｅａｄｓにＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ／Ｗ１２（インビトロジェン社製）を１ｍＬ加え、緩やかに攪拌した後、１分間放置した。
【００２５】
Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄｓ分離用スタンド（Ｍａｇｎａ−Ｓｅｐ）（インビトロジェン社製）にマイクロチューブをセットし、１分間放置後、Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄｓをマイクロチューブの壁面に集めたまま、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ／Ｗ１２を捨てた。
【００２６】
残ったＭａｇｎｅｔｉｃ ＢｅａｄｓにＥｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ／Ｅ５（インビトロジェン社製）を２００μＬ加え、緩やかに攪拌した後、３分間放置した。
【００２７】
Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄｓ分離用スタンド（Ｍａｇｎａ−Ｓｅｐ）にマイクロチューブをセットし、１分間放置後、Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄｓをマイクロチューブの壁面に集めたまま、Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ／Ｅ５を新しいマイクロチューブに移し、ＤＮＡ抽出液を得た。
【００２８】
（ＤＮＡ抽出液の精製・濃縮）
先に得られたＤＮＡ抽出液をさらに精製、濃縮を行った。
【００２９】
まず、ＤＮＡ抽出液にＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ／Ｌ１２を１ｍＬ、ＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄｓを４０μＬ、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ／Ｎ５を５０μＬ加えて、緩やかに攪拌し、ＢｅａｄｓにＤＮＡを吸着させた。
【００３０】
Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄｓ分離用スタンドにマイクロチューブをセットし、１分間放置後、Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄｓをマイクロチューブの壁面に集めたまま、溶液を捨てた。
【００３１】
次に、残ったＭａｇｎｅｔｉｃ ＢｅａｄｓにＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ／Ｗ１２を１ｍＬ加え、緩やかに攪拌した後、１分間放置した。
【００３２】
次に、Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄｓ分離用スタンドにマイクロチューブをセットし、１分間放置後、Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄｓをマイクロチューブの壁面に集めたまま、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ／Ｗ１２を捨てた。
【００３３】
次に、残ったＭａｇｎｅｔｉｃ ＢｅａｄｓにＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ／Ｌ１２を１ｍＬ加え、緩やかに攪拌した後、１分間放置した。そしてさらにＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ／Ｎ５を５０μＬ加えて、緩やかに懸濁し、ＢｅａｄｓにＤＮＡを吸着させた。
【００３４】
次に、Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄｓ分離用スタンドにマイクロチューブをセットし、１分間放置後、Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄｓをマイクロチューブの壁面に集めたまま、溶液を捨てた。
【００３５】
次に、残ったＭａｇｎｅｔｉｃ ＢｅａｄｓにＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ／Ｗ１２を１ｍＬ加え、緩やかに攪拌した後、１分間放置した。
【００３６】
次に、Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄｓ分離用スタンドにマイクロチューブをセットし、１分間放置後、Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄｓをマイクロチューブの壁面に集めたまま、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ／Ｗ１２を捨てた。
【００３７】
残ったＭａｇｎｅｔｉｃ ＢｅａｄｓにＥｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ／Ｅ５を５０μＬ加え、緩やかに攪拌した後、３分間放置した。
【００３８】
Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄｓ分離用スタンドにマイクロチューブをセットし、１分間放置後、Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄｓをマイクロチューブの壁面に集めたまま、Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ／Ｅ５を新しいマイクロチューブに移し、ＤＮＡ精製、濃縮液を得た。
【００３９】
以上の手順により得られたＤＮＡ精製、濃縮液中の微生物由来の核酸の存在を、以下に示すＰＣＲ増幅およびそのＰＣＲ産物の電気泳動を行うことにより確認した。
【００４０】
＜検体増幅用ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒの準備＞
感染症菌検出用の１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（標的遺伝子）増幅用ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒとして表１に示す核酸配列を設計した。具体的には、１６ｓ ｒＲＮＡをコーディングしている核酸部分を特異的に増幅するプローブセット、つまり約１５００塩基長の１６ｓ ｒＲＮＡコーディング領域の両端部分で、特異的な融解温度をできるだけ揃えたプライマーを設計した。なお、変異株や、核酸上に複数存在する１６ｓ ｒＲＮＡコーディング領域も同時に増幅できるように複数種類のプライマーを設計した。
【００４１】
【表１】
0005599013.tif 000002
【００４２】
＜検体のＰＣＲ増幅＞
Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｇｅｎｏｍｅとして、上記ＤＮＡ抽出液の精製・濃縮手順後に得られたＤＮＡ溶液を用いた。検体となる微生物遺伝子のＰＣＲ増幅試薬組成を以下に示す。
Premix ExTaq  （タカラバイオ社製） ：２５μＬ
Forward Primer mix (20pmol/tube each) ：２．５μＬ
Reverse Primer mix (20pmol/tube each) ：２．５μＬ
Template Genome                    ：７μＬ
H20                         ：１３μＬ
Total：                            ：５０μＬ。
【００４３】
上記組成の反応液を以下のＰＣＲプロトコールに従って、サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で増幅反応を行った。
（１）９５℃：１０分
（２）９２℃：４５秒
（３）６５℃：４５秒
（４）７２℃：４５秒
（５）７２℃：１０分
（６）４℃：∞
反応ステップ（１）を行なってから反応ステップ（２）〜（４）を４０サイクル繰り返してから反応ステップ（５）、（６）を行った。
【００４４】
＜ＰＣＲ産物の検出確認＞
上記、検体のＰＣＲ増幅手順後に得られたＰＣＲ産物をバイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて電気泳動を行い、ＰＣＲ産物の検出確認を行った。なお、ＰＣＲ産物および泳動試薬は、ＤＮＡ ７５００ ＬａｂＣｈｉｐ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）の手順に従い調製した。その結果、図１のように産物長約１５００ｂｐ付近にＰＣＲ増幅産物が確認され、血液感染モデルからのStaphylococcus aureus  ＤＮＡの抽出が確認された。
【００４５】
（実施例２）
微生物溶解酵素処理において、Ｎ−アセチルムラミダーゼおよびリゾチームの組み合わせによる分解を用いた核酸抽出の実施例を示す。
【００４６】
＜血液感染モデルからのStaphylococcus aureus  ＤＮＡの調製＞
（微生物の培養、血液感染モデルの作製）
実施例１と同様の手順に従って微生物培養を行い、１０2個／１ｍＬ血液の血流感染モデルを作製した。
【００４７】
（微生物溶解処理）
血液感染モデル８００μＬに、微生物溶解酵素であるＮ−アセチルムラミデイスＳＧ（生化学工業社製）溶液（１０ｍｇ／ｍＬ：１０ｍＭ トリスーマレイン酸緩衝液（ｐＨ５．５））１００μＬおよびリゾチーム（生化学工業社製）溶液（１μｇ／ｍＬ：５０ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ６．０)）１００μＬ加え、さらにトリトンＸ−１００ (キシダ化学社製)を１％濃度で含有した２０ｍＭトリス−マレイン酸緩衝液（ｐＨ５．５）を１ｍＬ加え、緩やかに混合させた（トリトンＸ−１００の作用濃度０．５％（ｗ／ｗ））。その後、３７℃で３０分間加温した。
【００４８】
（Staphylococcus aureus  ＤＮＡの抽出）
実施例１と同様の手順に従い、Staphylococcus aureusよりＤＮＡの抽出を行なった。
【００４９】
（ＤＮＡ抽出液の精製・濃縮）
上記のようにして得られたＤＮＡ抽出液を、実施例１と同様の手順に従って、精製および濃縮を行った。上記手順により得られたＤＮＡ精製、濃縮液中の微生物由来の核酸の存在を、以下に示すＰＣＲ増幅およびそのＰＣＲ産物の電気泳動を行うことにより確認した。
【００５０】
＜検体増幅用ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒの準備＞
実施例１と同様の手順に従い、本実施例にて使用するプライマーを設計した。
【００５１】
＜検体のＰＣＲ増幅＞
実施例１と同様の手順に従い、検体のＰＣＲ増幅を行なった。
【００５２】
＜ＰＣＲ産物の検出確認＞
実施例１と同様の手順に従い、ＰＣＲ産物の検出確認を行なった。その結果、図２のように産物長約１５００ｂｐ付近にＰＣＲ増幅産物が確認され、血液感染モデルからのStaphylococcus aureus  ＤＮＡの抽出が確認された。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】実施例１に示す方法にて抽出を行ったＤＮＡ抽出液を、該実施例に示す方法にてＰＣＲ増幅したＰＣＲ産物を電気泳動を行い、産物の存在を確認した電気泳動像である。
【図２】実施例２に示す方法にて抽出を行ったＤＮＡ抽出液を、該実施例に示す方法にてＰＣＲ増幅したＰＣＲ産物を電気泳動を行い、産物の存在を確認した電気泳動像である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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