(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞を有する個体の治療のための医薬の製造における、複数の組織培養プラスチック接着CD200+、CD10+、CD34-、及びCD105+胎盤幹細胞の使用であって、前記胎盤幹細胞が、前記胎盤幹細胞と接触していない複数の前記腫瘍細胞と比べて複数の前記腫瘍細胞の増殖を検出可能に抑制するのに十分な量で存在する、前記使用。
【請求項２】
前記医薬が、前記個体へ、前記腫瘍細胞の部位に又は腫瘍細胞の部位近傍に投与されるように製剤化されている、請求項1記載の使用。
【請求項３】
前記医薬が、静脈内投与されるように製剤化されている、請求項1記載の使用。
【請求項４】
前記腫瘍細胞が、固形腫瘍の一部である、請求項1記載の使用。
【請求項５】
前記腫瘍細胞が、血液癌の細胞である、請求項1記載の使用。
【請求項６】
前記腫瘍細胞が、組織球性リンパ腫細胞、慢性骨髄性白血病細胞、急性T細胞白血病細胞、急性骨髄性白血病細胞、結腸腺癌細胞、網膜芽細胞腫細胞又は肺癌細胞である、請求項1記載の使用。
【請求項７】
複数の前記胎盤幹細胞の少なくとも1が、サイトカインを発現するように操作されている、請求項1記載の使用。
【請求項８】
前記サイトカインが、IFN-β又はIL-2である、請求項7記載の使用。
【請求項９】
前記医薬が、骨髄由来の間葉系幹細胞を追加的に含む、請求項1記載の使用。
【請求項１０】
前記医薬が、少なくとも1×108個の前記胎盤幹細胞を含む、請求項1記載の使用。
【請求項１１】
前記胎盤幹細胞が、10回以下の集団倍加のためにインビトロで増殖されている、請求項1記載の使用。
【請求項１２】
インビトロ又は非ヒト哺乳類において腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、前記腫瘍細胞を複数のCD200+、CD10+、CD34-、及びCD105+胎盤幹細胞と、胎盤幹細胞と接触していない複数の前記腫瘍細胞と比べて前記胎盤幹細胞が複数の前記腫瘍細胞の増殖を検出可能に抑制するのに十分な時間、接触させることを含む、前記方法。
【請求項１３】
前記接触が、前記腫瘍細胞を含む非ヒト哺乳類において実施される、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
前記接触が、前記胎盤細胞を前記非ヒト哺乳類に静脈内投与することを含む、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
前記接触が、前記胎盤細胞を前記非ヒト哺乳類の腫瘍部位に又は腫瘍部位近傍に投与することを含む、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
複数の前記胎盤幹細胞の少なくとも1が、サイトカインを発現するように操作されている、請求項12記載の方法。
【請求項１７】
前記サイトカインが、IFN-β又はIL-2である、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
前記腫瘍細胞を、複数の骨髄由来の間葉系幹細胞と接触させることを追加的に含む、請求項12記載の方法。
【請求項１９】
前記胎盤幹細胞の数が、少なくとも1×108個である、請求項12記載の方法。
【請求項２０】
前記胎盤幹細胞が、10回以下の集団倍加のためにインビトロで増殖されている、請求項12記載の方法。
【請求項２１】
前記胎盤幹細胞が、前記胎盤幹細胞の非存在下での同等数の腫瘍細胞の増殖と比べて少なくとも50％、前記腫瘍細胞の増殖を抑制する、請求項12記載の方法。
【請求項２２】
前記胎盤幹細胞が、前記胎盤幹細胞の非存在下での同等数の腫瘍細胞の増殖と比べて少なくとも75％、前記腫瘍細胞の増殖を抑制する、請求項12記載の方法。
【請求項２３】
前記胎盤幹細胞が、前記接触前に、試料腫瘍細胞の増殖を検出可能に抑制することを決定することを含む、請求項12記載の方法。
【請求項２４】
前記試料腫瘍細胞が、前記胎盤幹細胞と接触された前記腫瘍細胞と同じ組織起源の腫瘍細胞である、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
前記試料腫瘍細胞が、個体の腫瘍細胞である、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
前記決定が、前記試料腫瘍細胞が、前記胎盤幹細胞との直接接触により検出可能に抑制されることを決定することを含む、請求項23記載の方法。
【請求項２７】
前記決定が、前記試料腫瘍細胞が、前記胎盤幹細胞と該試料腫瘍細胞との間の直接接触を伴わずに、前記胎盤幹細胞により検出可能に抑制されることを決定することを含む、請求項23記載の方法。
【請求項２８】
複数の胎盤幹細胞を含む医薬組成物であって、前記胎盤幹細胞が外因性IFN-β又はIL-2を発現するように操作されており；前記胎盤幹細胞が、
(a)基材に接着し、
(b) CD200+、CD10+、CD34-、及びCD105+であり；かつ
(c)腫瘍細胞もしくは腫瘍細胞の集団の増殖、又は腫瘍の成長を検出可能に抑制することが同定されている；前記医薬組成物。
【請求項２９】
前記医薬が、少なくとも約1×105個の前記胎盤幹細胞を含む、請求項１記載の使用。
【請求項３０】
前記医薬が、少なくとも約1×106個の前記胎盤幹細胞を含む、請求項１記載の使用。
【請求項３１】
前記医薬が、少なくとも約1×107個の前記胎盤幹細胞を含む、請求項１記載の使用。
【請求項３２】
少なくとも約1×105個の前記胎盤幹細胞を含む、請求項28記載の組成物。
【請求項３３】
少なくとも約1×106個の前記胎盤幹細胞を含む、請求項28記載の組成物。
【請求項３４】
少なくとも約1×107個の前記胎盤幹細胞を含む、請求項28記載の組成物。
【請求項３５】
少なくとも約1×108個の前記胎盤幹細胞を含む、請求項28記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(1.発明の分野)
本発明は、腫瘍細胞の増殖、及び腫瘍の成長を抑制するために、胎盤幹細胞を使用する方法を提供するものである。本発明は、腫瘍細胞増殖及び腫瘍成長の抑制において使用するための胎盤幹細胞を含有する化合物、胎盤幹細胞の腫瘍-抑制性集団の単離された集団、及びそのような集団の製造方法も提供する。
【背景技術】
【０００２】
(2.発明の背景)
ヒト幹細胞は、多様な成熟したヒト細胞系統を生成することのできる、全能性又は多能性前駆細胞である。幹細胞を、全部ではないが、数多くの組織を再増殖し、生理学的かつ解剖学的な機能性を回復するために採用することができることを示す証拠が存在している。
【０００３】
数多くの異なる型の哺乳類の幹細胞が、特徴付けられている。例えば、Caplanらの米国特許第5,486,359号(ヒト間葉系幹細胞)；Boyseらの米国特許第5,004,681号(胎児と新生児の造血幹細胞及び前駆細胞)；Boyseらの米国特許第5,192,553号(胎児と新生児の造血幹細胞及び前駆細胞)；Cell 114(6)：第763〜766頁(2003)に掲載された、Beltramiらの論文(心臓幹細胞)；J.Pathol.197(4)：第510〜518頁(2002)に掲載された、Forbesらの論文(肝幹細胞)を参照。臍帯血及び、臍帯血由来の全体の有核細胞は、切除治療を受けた患者に対して、造血機能を部分的に或いは全体的に回復させるために、移植されて用いられてきた。
【０００４】
胎盤は、幹細胞の特に魅力的な給源である。哺乳類胎盤は、豊富であり、かつ通常は医療廃棄物として廃棄されるので、これらは医学的に有用な幹細胞の独自の給源を示している。
【０００５】
骨髄由来の間葉系幹細胞は、最近、遺伝的に修飾された場合に、ある種の腫瘍細胞へ移動しかつ浸潤する能力を有することが示された。例えば、Hungらの論文、「微視的腫瘍を標的化する間葉系幹細胞及び非侵襲的インビボポジトロン放出断層撮影によりモニタリングされた腫瘍間質発達(Mesenchymal Stem Cell Targeting of Microscopic Tumors and Tumor Stroma Development Monitored by Noninvasive In vivo Positron Emission tomography Imaging)」、Clin. Cancer Res. 11(21):7749-7756 (2005)を参照されたい。ある遺伝子操作された骨髄由来の間葉系幹細胞株は、腫瘍増殖を抑制することが示されている。例えば、Studneyらの論文、「インターフェロン-βの腫瘍への送達のビヒクルとしての骨髄由来間葉系幹細胞(Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells as Vehicles for Interferon-β Delivery into Tumors)」、Cancer Res. 62:3603-3608 (2002)(メラノーマ細胞株)；Nakamuraらの論文、「ラット神経膠腫モデルにおける遺伝子操作された間葉系幹細胞の抗腫瘍作用(Antitumor Effect of Genetically Engineered Mesenchymal Stem Cells in a Rat Glioma Model)」、Gene Therapy 11:1155-1164 (2004)(間葉系幹細胞は組換えIL-2を発現した)を参照されたい。しかし間葉系幹細胞は、インビボにおいて少なくとも1種の腫瘍成長を促進することが示されている。Zhuらの論文、「インビボにおける腫瘍細胞成長に好ましい骨髄由来の間葉系幹細胞(Mesenchymal Stem Cells Derived from Bone Marrow Favor Tumor Cell Growth In Vivo)」、Exp. Mol. Pathol.(出版前電子版論文, 2005)(結腸腺癌細胞)を参照されたい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし今日まで、胎盤由来の幹細胞の腫瘍成長を抑制する能力又は腫瘍細胞の増殖を抑制する能力は説明されていない。本発明は、胎盤幹細胞及びそれらの集団のそのような使用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
(3. 発明の概要)
本発明は、胎盤幹細胞、胎盤幹細胞の集団、及び胎盤幹細胞を含有する組成物を使用する、腫瘍細胞増殖の抑制、及び腫瘍成長の抑制の方法を提供する。また、本発明は、腫瘍細胞増殖抑制特性を有する胎盤幹細胞を含有する組成物を含む、組成物を提供する。本発明は、腫瘍細胞増殖を抑制するそれらの能力を基に選択された胎盤細胞の集団、及びそのような特性を有する組成物を更に提供する。
【０００８】
ひとつの態様において、本発明は、複数の腫瘍細胞と複数の胎盤幹細胞とを、胎盤幹細胞と接触していない複数の該腫瘍細胞と比べて該胎盤幹細胞が該複数の腫瘍細胞の増殖を検出可能に抑制するのに十分な時間、接触することを含む、該複数の腫瘍細胞の増殖を抑制する方法を提供する。具体的な実施態様において、前記腫瘍細胞は、固形腫瘍の一部である。別の具体的な実施態様において、前記腫瘍細胞は、非固形腫瘍細胞型である。別の具体的な実施態様において、前記腫瘍細胞は、組織球性リンパ腫細胞、慢性骨髄性白血病細胞、急性T細胞白血病細胞、急性骨髄性白血病細胞、結腸腺癌細胞、網膜芽細胞腫細胞又は肺癌細胞である。本方法の別の具体的な実施態様において、前記接触は、インビトロにおいて実行される。別の具体的な実施態様において、前記接触は、インビボ個体において実行される。この個体は、哺乳類、例えばヒトであることができる。別の具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、該個体にマッチしたHLAである。別の具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、該個体にマッチしていないHLAである。別の具体的な実施態様において、前記接触は、該胎盤細胞を該個体へ静脈内投与することを含む。別のより具体的な実施態様において、前記接触は、該胎盤細胞を該個体へ、腫瘍部位に又は腫瘍部位近傍に投与することを含む。具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は：CD200及びHLA-Gを発現し；CD73、CD105、及びCD200を発現し；CD200及びOCT-4を発現し；CD73、CD105、及びHLA-Gを発現し；CD73及びCD105を発現し、かつ該幹細胞を含む胎盤細胞の集団が胚様体様組織体の形成を可能にする条件下で培養される場合に、該集団において1個以上の胚様体様組織体の形成を促進する；及び/又は、OCT-4を発現し、かつ該幹細胞を含む胎盤細胞の集団が胚様体様組織体の形成を可能にする条件下で培養される場合に、該集団における1個以上の胚様体様組織体の形成を促進する。
【０００９】
別の具体的な実施態様において、前記複数の胎盤幹細胞の少なくとも一部は、サイトカインを発現するように操作されている。より具体的な実施態様において、前記サイトカインは、IFN-β又はIL-2である。
【００１０】
別の具体的な実施態様において、本方法は、前記腫瘍細胞を、1種以上の抗癌化合物と接触することを追加的に含む。別の具体的な実施態様において、本方法は、該腫瘍細胞を、複数の間葉系幹細胞と、例えば骨髄由来の間葉系幹細胞とを接触することを追加的に含む。別の具体的な実施態様において、本方法は、前記腫瘍細胞を、複数の線維芽細胞と接触することを追加的に含む。
【００１１】
別の具体的な実施態様において、本方法は、前記腫瘍細胞を、1種以上の幹細胞化学誘引物質と接触することを追加的に含む。より具体的な実施態様において、前記化学誘引物質は、ストロマ細胞由来因子-1(SDF-1)である。
【００１２】
本方法は、例えば個体において、腫瘍細胞増殖又は腫瘍成長を検出可能に抑制するように作用するのに必要であるほど多くの胎盤幹細胞を使用することができる。例えば、複数の腫瘍細胞と接触するために使用される複数の胎盤幹細胞は、約1×105個の胎盤幹細胞、約1×106個の胎盤幹細胞、約1×107個の胎盤幹細胞、又は約1×108個の胎盤幹細胞、又はそれよりも多くを含むことができる。様々なより具体的な実施態様において、本方法は、少なくとも約1×105、少なくとも約1×106、少なくとも約1×107、又は少なくとも約1×108個の胎盤幹細胞を、該個体へ投与することを含む。様々なより具体的な実施態様において、本方法は、個体の腫瘍細胞数よりも約1倍、2倍、3倍、4倍、5倍又は5倍よりも多い胎盤幹細胞数を投与することを含む。任意の公知の方法を使用し、個体における腫瘍細胞の数を決定することができる。腫瘍細胞定量法の例は、米国特許第6,365,362号及び第6,645,731号；Mehesらの論文、Haematologia, 31(2):97-109 (2001)；及び、Hardinghamらの論文、Cancer Research, 53:3455-3458 (1993)に開示されており、それらの内容は全体が引用により本明細書中に組み込まれている。様々なより具体的な実施態様において、本方法は、個体の体重を基にした数の胎盤幹細胞を投与することを含む。例えば、本方法は、約1×103個胎盤幹細胞/kg、5×103個胎盤幹細胞/kg、1×104個胎盤幹細胞/kg、5×104個胎盤幹細胞/kg、1×105個胎盤幹細胞/kg、5×105個胎盤幹細胞/kg、1×106個胎盤幹細胞/kg、5×106個胎盤幹細胞/kg、1×107個胎盤幹細胞/kg、5×107個胎盤幹細胞/kg、又は1×108個胎盤幹細胞/kgを、該個体へ投与することを含む。様々なより具体的な実施態様において、本方法は、少なくとも約1×103個胎盤幹細胞/kg、少なくとも約5×103個胎盤幹細胞/kg、少なくとも約1×104個胎盤幹細胞/kg、少なくとも約5×104胎盤幹細胞/kg、少なくとも約1×105胎盤幹細胞/kg、少なくとも約5×105個胎盤幹細胞/kg、少なくとも約1×106個胎盤幹細胞/kg、少なくとも約5×106個胎盤幹細胞/kg、少なくとも約1×107個胎盤幹細胞/kg、少なくとも約5×107個胎盤幹細胞/kg、又は少なくとも約1×108個胎盤幹細胞/kgを、該個体へ投与することを含む。
【００１３】
様々な他のより具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、30回以下の集団倍加、20回以下の集団倍加、10回以下の集団倍加、又は5回以下の集団倍加のためにインビトロにおいて増殖される。別の具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、凍結保存され、及び該接触前に解凍される。より具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、該胎盤幹細胞の非存在下での同等数の腫瘍細胞の増殖と比べ、少なくとも約20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、又は95％インビトロにおける腫瘍細胞の増殖を抑制することが確認される。
【００１４】
別の具体的な実施態様において、本方法は、前記胎盤幹細胞が、該胎盤幹細胞の該個体への投与前に、腫瘍細胞増殖抑制活性を有することを決定すること、例えば、代表的試料腫瘍細胞の増殖の検出可能な抑制について該胎盤幹細胞をスクリーニングすることを追加的に含む。本方法のより具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、該個体への投与前に、該胎盤幹細胞の非存在下での同等数の腫瘍細胞の増殖と比べ、腫瘍細胞増殖を、インビトロにおいて例えば少なくとも約20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、又は95％抑制することが確認される。ある実施態様において、胎盤幹細胞は、腫瘍細胞を含む個体への投与前に、直接接触、非直接接触(例えば、可溶性因子を介して)、又はこれら両方により腫瘍細胞の増殖が抑制されることが決定される。例えば本方法の具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、該個体への投与前に、直接培養アッセイにおいて、例えばトランスウェルアッセイにおいて、又はより好ましくは直接培養アッセイ及びトランスウェルアッセイの両方において、例えば少なくとも約20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、又は95％、インビトロにおいて腫瘍細胞増殖を抑制することが決定される。別の具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、例えば上皮、扁平などの同じ細胞型、例えば乳房、前立腺などの同じ組織起源を共有する腫瘍細胞、又はより好ましくは本方法に従い該胎盤幹細胞が投与される個体に対し内因性である腫瘍細胞と同じ細胞型及び組織起源の両方である腫瘍細胞に対し、腫瘍細胞の増殖又は腫瘍成長の抑制に関して、インビトロにおいてスクリーニングされる。別のより具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、該個体の生検から得られた腫瘍細胞、又は該個体の血液試料から精製もしくは単離された腫瘍細胞に対する腫瘍成長抑制活性について、インビトロにおいてスクリーニングされる。本方法の様々なより具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、羊膜、絨毛膜、羊膜-絨毛膜、臍帯又は潅流液に由来することができ、並びに腫瘍細胞の増殖をインビトロにおいて、該個体への投与前に、該胎盤幹細胞の非存在下での同等数の腫瘍細胞の増殖と比べて、例えば少なくとも約20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、又は95％抑制することが確認される。
【００１５】
本発明は、前記複数の腫瘍細胞を、馴化培養培地又は上清と接触しない複数の腫瘍細胞と比べて該馴化培養培地又は上清が該複数の腫瘍細胞の増殖を検出可能に抑制するのに十分な時間、複数の胎盤幹細胞の馴化培養培地又は培養からの上清を含有する組成物と接触することを含む、例えば血液癌細胞のような、複数の腫瘍細胞の成長又は増殖を抑制する方法を更に提供する。具体的な実施態様において、前記接触は、インビトロにおいて実行される。別の具体的な実施態様において、前記接触は、インビボにおいて実行される。別の具体的な実施態様において、前記馴化培養培地又は上清は、複数の腫瘍細胞と同時培養される複数の胎盤幹細胞から得られる。
【００１６】
様々な具体的な実施態様において、前記馴化培養培地又は上清は、複数の腫瘍細胞と、胎盤幹細胞対腫瘍細胞比約1:1、約2:1、約3:1、約4:1、又は約5:1で共培養された複数の胎盤幹細胞から得られる。本方法は、腫瘍細胞増殖又は腫瘍成長の検出可能な抑制を実行するのに必要なように、単独で又は複数の腫瘍細胞と共培養された、数多くの胎盤幹細胞由来の馴化培養培地又は上清を使用することができる。例えば、この馴化培養培地又は上清は、約1×105個の胎盤幹細胞、約1×106個の胎盤幹細胞、約1×107個の胎盤幹細胞、又は約1×108個の胎盤幹細胞、又はそれよりも多くを含有する培養から得ることができる。別の具体的な実施態様において、馴化培養培地又は上清は、約1×105〜約5×105個の胎盤幹細胞及び約1×105個の腫瘍細胞；約1×106〜約5×106個の胎盤幹細胞及び約1×106個の腫瘍細胞；約1×107〜約5×107個の胎盤幹細胞及び約1×107個の腫瘍細胞；又は、約1×108〜約5×108個の胎盤幹細胞及び約1×108個の腫瘍細胞を含む共培養から得ることができる。
【００１７】
腫瘍細胞の成長又は増殖を抑制する方法の別の具体的な実施態様において、馴化培養培地又は上清は、単独で又は腫瘍細胞と共培養された数多くの胎盤幹細胞を含む培養培地又は培養由来の上清であり、ここで馴化培地を産生する細胞の数は、その馴化培地が投与される個体の体重を基にしている。例えば、馴化培養培地又は上清は、約1×103個の胎盤幹細胞/kgレシピエント体重、5×103個の胎盤幹細胞/kg、1×104個の胎盤幹細胞/kg、5×104個の胎盤幹細胞/kg、1×105個の胎盤幹細胞/kg、5×105個の胎盤幹細胞/kg、1×106個の胎盤幹細胞/kg、5×106個の胎盤幹細胞/kg、1×107個の胎盤幹細胞/kg、5×107個の胎盤幹細胞/kg、又は1×108個の胎盤幹細胞/kgを含有する培養により産生された馴化培地又は上清であることができる。別の具体的な実施態様において、馴化培養培地又は上清は、約1×103〜約5×103個の胎盤幹細胞/kg及び約1×103個の腫瘍細胞/kg；約1×104〜約5×104個の胎盤幹細胞/kg及び約1×104個の腫瘍細胞/kg；約1×105〜約5×105個の胎盤幹細胞/kg及び約1×105個の腫瘍細胞/kg；約1×106〜約5×106個の胎盤幹細胞/kg及び約1×106個の腫瘍細胞/kg；約1×107〜約5×107個の胎盤幹細胞/kg及び約1×107個の腫瘍細胞/kg；又は、約1×108〜約5×108個の胎盤幹細胞/kg及び約1×108個の腫瘍細胞/kgを含む共培養由来の培養培地又は上清である。
【００１８】
本発明は、腫瘍細胞もしくは腫瘍細胞の集団の増殖又は腫瘍の成長を抑制するそれらの能力を基に選択された胎盤幹細胞を含む、細胞集団を製造する方法を更に提供する。一実施態様において、例えば本発明は、胎盤幹細胞を選択すること、ここで該胎盤幹細胞は、(a)基材に接着し；(b)CD200及びHLA-Gを発現し、もしくはCD73、CD105、及びCD200を発現し、もしくはCD200及びOCT-4を発現し、もしくはCD73、CD105、及びHLA-Gを発現し、もしくはCD73及びCD105を発現し、かつ該胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団が胚様体様組織体の形成を可能にする条件下で培養される場合に、該集団において1個以上の胚様体様組織体の形成を促進するか、又は、OCT-4を発現し、かつ該胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団が胚様体様組織体の形成を可能にする条件下で培養される場合に、該集団における1個以上の胚様体様組織体の形成を促進し；かつ(c)腫瘍細胞もしくは複数の腫瘍細胞の増殖、又は腫瘍成長を検出可能に抑制する；並びに、該胎盤幹細胞を他の細胞から単離し、細胞集団を形成することを含む、細胞集団を製造する方法を提供する。
【００１９】
別の実施態様において、本発明は、(a)基材に接着し、(b)CD200及びHLA-Gを発現し、かつ(c)腫瘍細胞増殖を検出可能に抑制する、胎盤幹細胞を選択すること、ここで該腫瘍細胞は、組織球性リンパ腫細胞、慢性骨髄性白血病細胞、急性T細胞白血病細胞、急性骨髄性白血病細胞、結腸腺癌細胞、網膜芽細胞腫細胞又は肺癌細胞である；並びに、該胎盤幹細胞を、他の細胞から単離し、細胞集団を形成することを含む、単離された細胞集団を製造する方法を提供する。別の実施態様において、本方法は、(a)基材に接着し、(b)CD73、CD105、及びCD200を発現し、かつ(c)腫瘍細胞増殖を検出可能に抑制する、胎盤幹細胞を選択すること、ここで該腫瘍細胞は、組織球性リンパ腫細胞、慢性骨髄性白血病細胞、急性T細胞白血病細胞、急性骨髄性白血病細胞、結腸腺癌細胞、網膜芽細胞腫細胞又は肺癌細胞である；並びに、該胎盤幹細胞を、他の細胞から単離し、細胞集団を形成することを含む。別の実施態様において、本方法は、(a)基材に接着し、(b)CD200及びOCT-4を発現し、かつ(c)腫瘍細胞増殖を検出可能に抑制する、胎盤幹細胞を選択すること、ここで該腫瘍細胞は、組織球性リンパ腫細胞、慢性骨髄性白血病細胞、急性T細胞白血病細胞、急性骨髄性白血病細胞、結腸腺癌細胞、網膜芽細胞腫細胞又は肺癌細胞である；並びに、該胎盤幹細胞を、他の細胞から単離し、細胞集団を形成することを含む。別の実施態様において、本方法は、(a)基材に接着し、(b)CD73及びCD105を発現し、(c)胚様体様組織体の形成を可能にする条件下で培養された場合に、胚様体様組織体を形成し、かつ(d)腫瘍細胞増殖を検出可能に抑制する、胎盤幹細胞を選択すること、ここで該腫瘍細胞は、組織球性リンパ腫細胞、慢性骨髄性白血病細胞、急性T細胞白血病細胞、急性骨髄性白血病細胞、結腸腺癌細胞、網膜芽細胞腫細胞又は肺癌細胞である；並びに、該胎盤幹細胞を、他の細胞から単離し、細胞集団を形成することを含む。別の実施態様において、本方法は、(a)基材に接着し、(b)CD73、CD105、及びHLA-Gを発現し、かつ(c)腫瘍細胞増殖を検出可能に抑制する、胎盤幹細胞を選択すること、ここで該腫瘍細胞は、組織球性リンパ腫細胞、慢性骨髄性白血病細胞、急性T細胞白血病細胞、急性骨髄性白血病細胞、結腸腺癌細胞、網膜芽細胞腫細胞又は肺癌細胞である；並びに、該胎盤幹細胞を、他の細胞から単離し、細胞集団を形成することを含む。別の実施態様において、本方法は、(a)基材に接着し、(b)OCT-4を発現し、(c)胚様体様組織体の形成を可能にする条件下で培養された場合に、胚様体様組織体を形成し、かつ(d)腫瘍細胞増殖を検出可能に抑制する、胎盤幹細胞を選択すること、ここで該腫瘍細胞は、組織球性リンパ腫細胞、慢性骨髄性白血病細胞、急性T細胞白血病細胞、急性骨髄性白血病細胞、結腸腺癌細胞、網膜芽細胞腫細胞又は肺癌細胞である；並びに、該胎盤幹細胞を、他の細胞から単離し、細胞集団を形成することを含む。前記方法のより具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、羊膜、絨毛膜、羊膜及び絨毛膜、又は臍帯に主に由来する。別のより具体的な実施態様において、本方法において使用される幹細胞は、臍帯幹細胞である。
【００２０】
胎盤幹細胞の単離された集団を産生する前記方法において、ある実施態様において、本方法は、間葉系幹細胞に特異的な少なくとも1つの特徴を示す細胞を選択することを含むことができる。より具体的な実施態様において、前記間葉系幹細胞に特異的な特徴は、CD29の発現、CD44の発現、CD90の発現、それらの組み合わせの発現である。別の本方法の具体的な実施態様において、前記選択は、抗体を用いて達成される。別の具体的な実施態様において、前記選択は、フローサイトメトリーを用いて達成される。別の具体的な実施態様において、前記選択は、磁気ビーズを用いて達成される。別の具体的な実施態様において、前記選択は、蛍光標示式細胞分取器により達成される。前記方法の別の具体的な実施態様において、前記細胞集団は増殖される。
【００２１】
また本発明は、例えば前記方法のいずれかに従い産生又は単離された、胎盤幹細胞の単離された集団も提供する。一実施態様において、例えば本発明は、胎盤幹細胞を含む単離された細胞集団を提供し、ここで該胎盤幹細胞は：(a)基材に接着し；(b)CD200及びHLA-Gを発現し、もしくはCD73、CD105、及びCD200を発現し、もしくはCD200及びOCT-4を発現し、もしくはCD73、CD105、及びHLA-Gを発現し、もしくはCD73及びCD105を発現し、かつ該胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団が胚様体様組織体の形成を可能にする条件下で培養される場合に、該集団において1個以上の胚様体様組織体の形成を促進するか、又は、OCT-4を発現し、かつ該胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団が胚様体様組織体の形成を可能にする条件下で培養される場合に、該集団における1個以上の胚様体様組織体の形成を促進し；かつ(c)胎盤幹細胞と接触されない複数の腫瘍細胞と比べて複数の腫瘍細胞の増殖を検出可能に抑制することが決定されている。
【００２２】
具体的な実施態様において、単離された胎盤細胞集団は、(a)基材に接着し；(b)CD200及びHLA-Gを発現し；かつ(c)胎盤幹細胞と接触されない複数の腫瘍細胞と比べて該複数の腫瘍細胞の増殖を検出可能に抑制することが決定されている、胎盤幹細胞を含み、ここで該腫瘍細胞は、組織球性リンパ腫細胞、慢性骨髄性白血病細胞、急性T細胞白血病細胞、急性骨髄性白血病細胞、結腸腺癌細胞、網膜芽細胞腫細胞又は肺癌細胞である。別の具体的な実施態様において、単離された胎盤細胞集団は、(a)基材に接着し；(b)CD73、CD105、及びCD200を発現し；かつ(c)胎盤幹細胞と接触されない複数の腫瘍細胞と比べて該複数の腫瘍細胞の増殖を検出可能に抑制することが決定されている、胎盤幹細胞を含み、ここで該腫瘍細胞は、組織球性リンパ腫細胞、慢性骨髄性白血病細胞、急性T細胞白血病細胞、急性骨髄性白血病細胞、結腸腺癌細胞、網膜芽細胞腫細胞又は肺癌細胞である。別の具体的な実施態様において、単離された胎盤細胞集団は、(a)基材に接着し；(b)CD200及びOCT-4を発現し；かつ(c)胎盤幹細胞と接触されない複数の腫瘍細胞と比べて該複数の腫瘍細胞の増殖を検出可能に抑制することが決定されている、胎盤幹細胞を含み、ここで該腫瘍細胞は、組織球性リンパ腫細胞、慢性骨髄性白血病細胞、急性T細胞白血病細胞、急性骨髄性白血病細胞、結腸腺癌細胞、網膜芽細胞腫細胞又は肺癌細胞である。
【００２３】
別の具体的な実施態様において、単離された胎盤細胞集団は、(a)基材に接着し；(b)CD73及びCD105を発現し；(c)胚様体様組織体の形成を可能にする条件下で培養された場合に、胚様体様組織体を形成し；かつ(d)胎盤幹細胞と接触されない複数の腫瘍細胞と比べて該複数の腫瘍細胞の増殖を検出可能に抑制することが決定されている、胎盤幹細胞を含み、ここで該腫瘍細胞は、組織球性リンパ腫細胞、慢性骨髄性白血病細胞、急性T細胞白血病細胞、急性骨髄性白血病細胞、結腸腺癌細胞、網膜芽細胞腫細胞又は肺癌細胞である。別の具体的な実施態様において、単離された胎盤細胞集団は、(a)基材に接着し；(b)CD73、CD105、及びHLA-Gを発現し；かつ(c)胎盤幹細胞と接触されない複数の腫瘍細胞と比べて該複数の腫瘍細胞の増殖を検出可能に抑制することが決定されている、胎盤幹細胞を含み、ここで該腫瘍細胞は、組織球性リンパ腫細胞、慢性骨髄性白血病細胞、急性T細胞白血病細胞、急性骨髄性白血病細胞、結腸腺癌細胞、網膜芽細胞腫細胞又は肺癌細胞である。更に別の具体的な実施態様において、単離された胎盤幹細胞集団は、(a)基材に接着し；(b)OCT-4を発現し；(c)胚様体様組織体の形成を可能にする条件下で培養された場合に、胚様体様組織体を形成し；かつ(d)胎盤幹細胞と接触されない複数の腫瘍細胞と比べて該複数の腫瘍細胞の増殖を検出可能に抑制することが決定されている、胎盤幹細胞を含み、ここで該腫瘍細胞は、組織球性リンパ腫細胞、慢性骨髄性白血病細胞、急性T細胞白血病細胞、急性骨髄性白血病細胞、結腸腺癌細胞、網膜芽細胞腫細胞又は肺癌細胞である。
【００２４】
また本発明は、前述の単離された胎盤幹細胞集団のいずれかを含有する組成物も提供する。具体的な実施態様において、本組成物は、複数の非胎盤細胞、例えば非胎盤幹細胞、例えば間葉系幹細胞、例えば骨髄由来の間葉系幹細胞も含む。具体的な実施態様において、本組成物は、複数の線維芽細胞も含む。一部の実施態様において、線維芽細胞は、本明細書に説明された胎盤幹細胞組成物が投与される被験者に対し自家である。
【００２５】
前述の方法、単離された胎盤幹細胞集団及び組成物において、胎盤幹細胞は、追加マーカーを基に規定又は選択されてよい。例えば、CD200及びHLA-Gを発現する前記胎盤幹細胞は、CD73及びCD105も発現し、すなわちCD73+及びCD105+である。別の具体的な実施態様において、前記胎盤細胞は、CD34-、CD38-又はCD45-である。より具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD34-、CD38-、CD45-、CD73+及びCD105+である。別の具体的な実施態様において、前記複数の胎盤幹細胞は、胎盤幹細胞を含む単離された胎盤細胞の集団が胚様体様組織体の形成を可能にする条件下で培養される場合に、該集団からの1個以上の胚様体様組織体の発達を促進する。
【００２６】
別のより具体的な実施態様において、また、CD73、CD105、及びCD200を発現する該胎盤幹細胞は、HLA-G+である。別の具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD34-、CD38-又はCD45-である。別の具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD34-、CD38-及びCD45-である。より具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD34-、CD38-、CD45-、及びHLA-G+である。別の具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、胎盤幹細胞を含む単離された胎盤細胞の集団が胚様体様組織体の形成を可能にする条件下で培養される場合に、該集団からの1個以上の胚様体様組織体の発達を促進する。
【００２７】
別のより具体的な実施態様において、また、CD200及びOCT-4を発現する前記胎盤幹細胞は、CD73+及びCD105+も発現する。別の具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、HLA-G+である。別の具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD34-、CD38-又はCD45-である。別の具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD34-、CD38-及びCD45-である。より具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD34-、CD38-、CD45-、CD73+、CD105+及びHLA-G+である。別の具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、胎盤幹細胞を含む単離された胎盤細胞の集団が胚様体様組織体の形成を可能にする条件下で培養される場合に、該集団からの1個以上の胚様体様組織体の形成を促進する。
【００２８】
別のより具体的な実施態様において、また、CD73、CD105、及びHLA-Gを発現する前記胎盤幹細胞は、CD34-、CD38-又はCD45-である。別の具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD34-、CD38-及びCD45-である。別の具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、OCT-4+である。別の具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD200+である。より具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD34-、CD38-、CD45-、OCT-4+及びCD200+である。別の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、胎盤幹細胞を含む単離された胎盤細胞の集団が胚様体様組織体の形成を可能にする条件下で培養される場合に、該集団からの1個以上の胚様体様組織体の形成を促進する。
【００２９】
別のより具体的な実施態様において、CD73及びCD105を発現し、かつ胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団が胚様体様組織体の形成を可能にする条件下で培養される場合に、該集団中の1個以上の胚様体様組織体の形成を促進する該胎盤幹細胞は、CD34-、CD38-又はCD45-でもある。別の具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、OCT-4+である。別の具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD200+である。別の具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、OCT-4+、CD200+、CD34-、CD38-及びCD45-である。
【００３０】
別のより具体的な実施態様において、OCT-4を発現し、かつ胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団が胚様体様組織体の形成を可能にする条件下で培養される場合に、該集団中の1個以上の胚様体様組織体の形成を促進する該胎盤幹細胞は、CD73+及びCD105+でもある。別の具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD34-、CD38-及びCD45-である。別の具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD200+である。別の具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD73+、CD105+、CD200+、CD34-、CD38-及びCD45-である。
【００３１】
本方法において使用される胎盤幹細胞、本明細書における単離された集団及び組成物は、全胎盤に、又は胎盤の一部に由来することができる。例えば、様々な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、羊膜、又は羊膜と絨毛膜に、主として、又はこれらのみに由来している。別の実施態様において、本発明の方法において使用される幹細胞は、臍帯から得られる。
【００３２】
本発明は、腫瘍細胞抑制性胎盤細胞集団を選択するために、本明細書において説明された方法のいずれかにより産生される胎盤幹細胞を含む、単離された細胞集団を、更に提供する。例えば一実施態様において、本発明は、単離された胎盤幹細胞を含む細胞集団を提供し、ここで該胎盤幹細胞は：(a)基材に接着し；(b)CD200及びHLA-Gを発現し、もしくはCD73、CD105、及びCD200を発現し、もしくはCD200及びOCT-4を発現し、もしくはCD73、CD105、及びHLA-Gを発現し、もしくはCD73及びCD105を発現し、かつ該胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団が胚様体様組織体の形成を可能にする条件下で培養される場合に、該集団中の1個以上の胚様体様組織体の形成を促進するか、又は、OCT-4を発現し、かつ該胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団が胚様体様組織体の形成を可能にする条件下で培養される場合に、該集団中の1個以上の胚様体様組織体の形成を促進し；かつ(c)腫瘍細胞もしくは複数の腫瘍細胞の増殖、又は腫瘍の成長を、検出可能に抑制する。
【００３３】
本発明は、凍結保存された幹細胞集団、例えば胎盤幹細胞を含む細胞集団を更に提供し、ここでこの細胞集団は、腫瘍細胞抑制性であり、これは本明細書に説明されている。例えば本発明は、該複数の腫瘍細胞の増殖を、胎盤幹細胞と接触されない複数の腫瘍細胞と比べて検出可能に抑制する、CD200+、HLA-G+胎盤幹細胞の集団を提供し、ここで該細胞は凍結保存されており、並びにここで該集団は容器内に含まれる。本発明は、前記複数の腫瘍細胞の増殖を、胎盤幹細胞と接触されない複数の腫瘍細胞と比べて検出可能に抑制する、CD73+、CD105+、CD200+胎盤幹細胞の集団も提供し、ここで該幹細胞は凍結保存されており、並びにここで該集団は容器内に含まれる。本発明は、前記複数の腫瘍細胞の増殖を、胎盤幹細胞と接触されない複数の腫瘍細胞と比べて検出可能に抑制する、CD200+、OCT-4+胎盤幹細胞の集団も提供し、ここで該幹細胞は凍結保存されており、並びにここで該集団は容器内に含まれる。本発明は、前記複数の腫瘍細胞の増殖を、胎盤幹細胞と接触されない複数の腫瘍細胞と比べて検出可能に抑制する、CD73+、CD105+胎盤幹細胞の集団も提供し、ここで該細胞は凍結保存されており、並びにここで該集団は容器内に含まれ、並びにここで該幹細胞は、胎盤細胞の集団と共に胚様体様組織体の形成を可能にする条件下で培養される場合に、1個以上の胚様体様組織体の形成を促進する。本発明は、前記複数の腫瘍細胞の増殖を、胎盤幹細胞と接触されない複数の腫瘍細胞と比べて検出可能に抑制する、CD73+、CD105+、HLA-G+胎盤幹細胞の集団を更に提供し、ここで該細胞は凍結保存されており、並びにここで該集団は容器内に含まれる。本発明は、前記複数の腫瘍細胞の増殖を、胎盤幹細胞と接触されない複数の腫瘍細胞と比べて検出可能に抑制する、OCT-4+胎盤幹細胞の集団も提供し、ここで該細胞は凍結保存されており、ここで該集団は容器内に含まれ、並びにここで該幹細胞は、胎盤細胞の集団と共に胚様体様組織体の形成を可能にする条件下で培養される場合に、1個以上の胚様体様組織体の形成を促進する。
【００３４】
任意の前述の凍結保存された集団の具体的な実施態様において、前記容器は、バッグである。様々な具体的な実施態様において、前記集団は、約、少なくとも、又は多くとも1×106個の該幹細胞、5×106個の該幹細胞、1×107個の該幹細胞、5×107個の該幹細胞、1×108個の該幹細胞、5×108個の該幹細胞、1×109個の該幹細胞、5×109個の該幹細胞、又は1×1010個の該幹細胞を含む。任意の前述の凍結保存された集団の他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、約、少なくとも、又は5回以下、10回以下、15回以下、又は20回以下継代されている。任意の前述の凍結保存された集団の別の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、該容器内で増殖される。
【００３５】
本発明は、腫瘍細胞抑制性組成物、すなわち腫瘍細胞もしくは腫瘍細胞の集団の増殖を検出可能に抑制するか、又は腫瘍の成長を抑制する組成物を更に提供する。一実施態様において、本発明は、本明細書に説明された単離された胎盤細胞集団のいずれかの培養物由来の上清を含有する組成物を提供する。別の実施態様において、本発明は、単離された胎盤幹細胞の培養物由来の培養培地を含有する組成物を提供し、ここで該胎盤細胞は、(a)基材に接着し；(b)CD200及びHLA-Gを発現し、もしくはCD73、CD105、及びCD200を発現し、もしくはCD200及びOCT-4を発現し、もしくはCD73、CD105、及びHLA-Gを発現し、もしくはCD73及びCD105を発現し、かつ該胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団が胚様体様組織体の形成を可能にする条件下で培養される場合に、該集団中の1個以上の胚様体様組織体の形成を促進するか、又は、OCT-4を発現し、かつ該胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団が胚様体様組織体の形成を可能にする条件下で培養される場合に、該集団中の1個以上の胚様体様組織体の形成を促進し；かつ(c)腫瘍細胞もしくは腫瘍細胞の集団の増殖、又は腫瘍の成長を、検出可能に抑制し、ここで該胎盤幹細胞の培養物は、該培地において、24時間以上培養される。
【００３６】
別の具体的な実施態様において、前述の任意の組成物は、マトリックスを含む。より具体的な実施態様において、前記マトリックスは、三次元足場である。別のより具体的な実施態様において、前記マトリックスは、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、ペクチン、オルニチン、又はビトロネクチンを含む。別のより具体的な実施態様において、本マトリックスは、羊膜又は羊膜由来の生体物質である。別のより具体的な実施態様において、前記マトリックスは、細胞外膜タンパク質を含む。別のより具体的な実施態様において、前記マトリックスは、合成化合物を含む。別のより具体的な実施態様において、前記マトリックスは、生体活性化合物を含む。別のより具体的な実施態様において、前記生体活性化合物は、増殖因子、サイトカイン、抗体、又は5,000ダルトン未満の有機分子である。
【００３７】
また、本発明は、腫瘍抑制に関連した組換え又は外因性サイトカインを生成するように遺伝子操作された胎盤幹細胞を含有する医薬組成物を提供する。例えば一実施態様において、本発明は、複数の胎盤幹細胞を含有する医薬化合物を提供し、ここで該胎盤幹細胞は、外因性IFN-β又はIL-2を発現するように操作されている。具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、前記腫瘍細胞が該胎盤幹細胞と接触された場合に、外因性IFN-β又はIL-2を発現しない胎盤幹細胞と比べて腫瘍細胞増殖の検出可能により大きい抑制を生じる量の、外因性IFN-β又はIL-2を発現する。より具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、(a)基材に接着し；(b)CD200及びHLA-Gを発現し、もしくはCD73、CD105、及びCD200を発現し、もしくはCD200及びOCT-4を発現し、もしくはCD73、CD105、及びHLA-Gを発現し、もしくはCD73及びCD105を発現し、かつ、その幹細胞を含む胎盤細胞の集団が胚様体様組織体の形成を可能にする条件下で培養される場合に、該集団中の1個以上の胚様体様組織体の形成を促進するか、又は、OCT-4を発現し、かつ、その幹細胞を含む胎盤細胞の集団が胚様体様組織体の形成を可能にする条件下で培養される場合に、該集団中の1個以上の胚様体様組織体の形成を促進し；かつ(c)腫瘍細胞もしくは複数の腫瘍細胞の増殖、又は腫瘍の成長を、検出可能に抑制する。
【００３８】
(3.1 定義)
本明細書において使用する用語「約」とは、例えば言及された値から±10％の偏差を意味する。
【００３９】
本明細書において使用する用語「SH2」とは、マーカーCD105上のエピトープに結合されている抗体を意味する。したがって、SH2+と称される細胞は、CD105+である。例えば、米国特許第5,486,359号を参照されたい。
【００４０】
本明細書において使用する用語「SH3」及び「SH4」とは、マーカーCD73上のエピトープに結合されている抗体を意味する。したがって、SH3+及び/又はSH4+と称される細胞は、CD73+である。例えば、米国特許第5,486,359号を参照されたい。
【００４１】
本明細書において使用する用語「単離された幹細胞」とは、他のもの、すなわち幹細胞が由来する、例えば、胎盤などの組織の非幹細胞から実質的に分離された幹細胞を意味する。例えば、幹細胞を回収及び/又は培養する間に、その幹細胞が天然に会合している非幹細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、95％、又は少なくとも99％が該幹細胞から除去された場合、幹細胞は「単離される」。
【００４２】
本明細書において使用する用語「単離された細胞の集団」とは、細胞の集団が由来する、例えば、胎盤などの組織の他の細胞から実質的に分離されている細胞の集団を意味する。例えば、幹細胞を回収及び/又は培養する間に、その細胞の集団又は細胞の集団が由来する細胞が天然に会合されている細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、95％、又は少なくとも99％が該幹細胞から除去されるた場合、幹細胞は「単離される」。
【００４３】
本明細書において使用する用語「胎盤幹細胞」は、組織培養基材(例えば、組織培養用プラスチック又はフィブロネクチンがコーティングされた組織培養プレート)に接着している、形態学、細胞表面マーカー、又は初代培養後の継代の回数に関係なく、哺乳類の胎盤由来の幹細胞や前駆細胞を意味する。用語「胎盤幹細胞」は、羊膜、絨毛膜、羊膜-絨毛膜板、及び/又は臍帯を含む哺乳類の胎盤の任意の部位に由来する幹細胞又は前駆細胞、更には胎盤の潅流液に由来する細胞を包含している。しかし、本明細書において使用する用語「胎盤幹細胞」は、栄養膜又は臍帯血から得られた細胞を意味しない。若し、細胞が、少なくとも1つの幹細胞の特徴、例えば少なくとも1つの他の細胞型に分化する能力を保有していれば、細胞は「幹細胞」として見なされる。
【００４４】
本明細書において使用されているように、特定マーカーが検出可能である場合、幹細胞は、該マーカーに対して「陽性」である。例えば、胎盤幹細胞は、例えばCD73に対して陽性であり(すなわち、CD73+である)、なぜなら、CD73は、胎盤幹細胞の上でバックグラウンド(例えば、アイソタイプ対照と比較して)よりも検出可能なほど多量に検出することができるからである。遺伝マーカーを使用して、細胞を少なくとも1つの他の細胞型と区別することができる場合、又は細胞によって示されるか又は発現される場合に、マーカーを使用して細胞を選択するか単離することができる場合も、細胞は該マーカーに対して陽性である。
【００４５】
本方法の文脈において「腫瘍細胞」は、正常でない成長パターンを示す任意の細胞を意味し、これは良性であるが過形成性の細胞、癌細胞、転移性細胞などを含む。「腫瘍細胞」は、例えば固形腫瘍の細胞、又は固形腫瘍を形成する可能性もしくは能力を有する細胞、又は非固形腫瘍の細胞、例えば血液癌の細胞であることができる。ある実施態様において、腫瘍細胞は、上皮細胞、腺細胞、又は造血起源の細胞に由来する。ある実施態様において、腫瘍細胞は、組織球性リンパ腫細胞、慢性骨髄性白血病細胞、急性T細胞白血病細胞、急性骨髄性白血病細胞、結腸腺癌細胞、網膜芽細胞腫細胞又は肺癌細胞である。
【００４６】
本明細書において使用する用語「腫瘍細胞、又は複数の腫瘍細胞の増殖の抑制」は、腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞の増殖の量を、対照又は標準と比べて、低下することを意味する。例えば、腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞の、例えば複数の胎盤幹細胞の存在下での増殖は、同じ型の腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞の、胎盤幹細胞の非存在下での増殖と比較される。この用語は、腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞の増殖の検出可能な低下、増殖の停止、又は腫瘍細胞数の減少を包含している。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
(4. 図面の簡単な説明)
【図１】(A)潅流、(B)羊膜、(C)絨毛膜、(D)羊膜-絨毛膜板からの胎盤幹細胞；又は(E)臍帯幹細胞の生存能力を示す。X軸上の数字は、幹細胞が採取される胎盤を示している。
【００４８】
【図２】FACS Caliburによって決定されるものとして、(A)潅流、(B)羊膜、(C)絨毛膜、(D)羊膜-絨毛膜板又は(E)臍帯からのHLA ABC-/CD45-/CD34-/CD133+細胞の百分率である。X軸上の数字は、幹細胞が採取される胎盤を示している。
【００４９】
【図３】FACS Ariaによって決定されるものとして、潅流(A)、羊膜(B)、絨毛膜(C)、羊膜-絨毛膜板(D)又は臍帯(E)からのHLA ABC-/CD45-/CD34-/CD133+細胞の百分率である。X軸上の数字は、幹細胞が採取される胎盤を示している。
【００５０】
【図４】胎盤潅流液から採取される幹細胞内のHLA-G、CD10、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200の発現である。
【００５１】
【図５】羊膜から採取される幹細胞内のHLA-G、CD10、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200の発現である。
【００５２】
【図６】絨毛膜から採取される幹細胞内のHLA-G、CD10、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200の発現である。
【００５３】
【図７】羊膜-絨毛膜板から採取される幹細胞内のHLA-G、CD10、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200の発現である。
【００５４】
【図８】臍帯から採取される幹細胞内のHLA-G、CD10、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200の発現である。
【００５５】
【図９】(A)潅流、(B)羊膜、(C)絨毛膜、(D)羊膜-絨毛膜板又は(E)臍帯から採取された幹細胞内のHLA-G、CD10、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200の発現の平均発現である。
【００５６】
【図１０】胎盤幹細胞及び臍帯幹細胞は、リンパ芽球細胞株(LCL)腫瘍細胞成長を阻害する。LCLは、単独で、又は羊膜-絨毛膜(AC)もしくは羊膜(AM)由来の胎盤幹細胞、又は臍帯(UC)由来の幹細胞と共にのいずれかで、17日間培養した。胎盤幹細胞のLCLに対する比は、2:1であった。大AAD-細胞をカウントした(UCについてn＝3)。
【００５７】
【図１１】胎盤幹細胞は、骨髄由来の間葉系幹細胞(BM-MSC)と同じくらい有効に、腫瘍細胞を死滅する。LCLの、BM-MSC又は臍帯(UC)幹細胞のいずれかとの6日間の共培養を示している(n＝1)。
【００５８】
【図１２】胎盤幹細胞腫瘍抑制の用量依存性。組織球性癌腫、慢性骨髄性白血病(CML)、乳癌、急性リンパ性白血病(ALL)及び結腸癌の細胞を、単独で、又は胎盤幹細胞と共に1:2、1:1、1.5:1及び2:1の比のいずれかで、インキュベーションした。共培養後、生存7-AAD-細胞の数を決定した。その後自由増殖培養の胎盤幹細胞抑制を、算出した。自在増殖する腫瘍細胞の絶対数を、凡例の各細胞株の説明の後ろの括弧内に記した(数値は、105個細胞を示す)。LCLがn＝4であること以外は、N＝2。
【００５９】
【図１３】図１３A及び図１３B：胎盤幹細胞の腫瘍抑制の抑制及び接触依存性。A：トランスウェル(黒色バー)又はオープンウェル(A、白色バー)において、組織球性癌腫、慢性骨髄性白血病、乳管癌、LCL、網膜芽細胞腫、肺癌、乳癌、及びALLの細胞を、単独で、又は胎盤幹細胞と共に1:1の比でのいずれかでインキュベーションした。6日後、生存7-AAD-細胞をカウントし、抑制を、自由増殖培養中の細胞カウントを基に算出した(B, 番号挿入)。B：抑制データから、接触依存性を算出した。トランスウェル： LCLがn＝2であること以外は、n＝1。
【００６０】
【図１４】結果が図13A及び13Bに示された実験の上清中で高度に発現されたサイトカイン。試験した25種のサイトカインの中で、IL-6、IL-8及びMCP-1が、LCL及び組織球性リンパ腫について示されている。図15A及び15Bと比較のこと。
【００６１】
【図１５】図１５A及び図１５B：LCL/胎盤幹細胞共培養のサイトカイン分泌プロファイル。A；LCLは、単独で、又は胎盤幹細胞と共にのいずれかで、オープンウェル(LCL PDAC)又はトランスウェル(LCL PDAC TW)において培養した。生存CD23+細胞を、フローサイトメーターにおいてカウントした。B；Aの実験から得た上清を、Luminex上で分析した。N＝2。
【００６２】
【図１６】図１６A及び図１６B： A：胎盤幹細胞及び骨髄間葉系幹細胞(BM-MSC)による腫瘍細胞株の抑制。巨核球白血病細胞株MEG-01、組織球性リンパ腫、網膜芽細胞腫、及び慢性骨髄性白血病細胞は、単独で、又は臍帯幹細胞(UC)、羊膜-絨毛膜胎盤幹細胞(AC)、もしくはBM-MSCと共にのいずれかで、インキュベーションした。6日間共培養した後、生存AAD-細胞の数を、各共培養について決定した。B：胎盤幹細胞による腫瘍細胞抑制の時間経過。MEG-01細胞を、単独でインキュベーションするか、又はヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)、BM-MSC、もしくは胎盤幹細胞(PDAC)と共に共培養した。生存(アナキシンV-, 7-AAD-)細胞の数を、各培養について、共培養の開始後1、2、3、4及び6日目に決定した。
【００６３】
【図１７】MEG-01細胞の胎盤幹細胞腫瘍抑制の接触依存性。MEG-01/臍帯幹細胞共培養物からの馴化培地は、巨核球白血病細胞株(MEG-01)腫瘍細胞成長を阻害した。MEG-01細胞は、単独で培養するか、臍帯幹細胞と直接共培養する(MEG/UC)か、又は抑制されたMEG-01/臍帯幹細胞共培養物(UC)、MEG-01/骨髄間葉系幹細胞共培養物(BM)、もしくはMEG-01/HUVEC共培養物(H)から収集した馴化培地(分割(split)1:2又は1:10)において培養した。6日間共培養した後、生存(アナキシンV-, 7-AAD-)細胞の数を決定した。
【００６４】
【図１８】MEG-01/胎盤幹細胞共培養物におけるサイトカイン分泌プロファイル。MEG-01、胎盤幹細胞(PDAC)、BM-MSC、及びHUVEC細胞を、単独で培養するか、又は以下の組み合せで共培養した：MEG-01/HUVEC；MEG-01/BM-MSC；又は、MEG-01/PDAC。7日間培養物の上清を収集し、血小板由来増殖因子-AA(PDGF-AA)、顆粒球-単球コロニー刺激因子(GM-CSF)、成長関連癌遺伝子-α(GROα)、及び白血病抑制因子(LIF)の分泌について、Luminex上で分析した。量は、pg/mlで示した。
【００６５】
【図１９】ストロマ細胞由来因子1(SDF-1)に反応した、臍帯幹細胞(UC1)の遊走。UC1胎盤幹細胞は、単に無血清培地(基本)において、又は10％FBS、SDF-1、もしくはSDF-1＋CXCR4阻害因子AMD3100を含有する培地において、24時間インキュベーションした。CYQUANT(登録商標)GR色素の細胞への添加後、蛍光を、蛍光プレートリーダーにより480nm/520nmで測定した。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
(5. 発明の詳細な説明）
(5.1 胎盤幹細胞を使用する腫瘍細胞抑制)
本発明は、胎盤幹細胞を使用する、腫瘍細胞の増殖の抑制、及び腫瘍の成長の抑制を提供する。一実施態様において、本発明は、腫瘍細胞又は細胞又は腫瘍を、該胎盤幹細胞が腫瘍細胞もしくは細胞の増殖又は腫瘍の成長を検出可能に抑制するのに十分な時間、複数の胎盤幹細胞と接触することを含む、腫瘍細胞もしくは複数の腫瘍細胞の増殖、又は腫瘍の成長、又は非固形腫瘍細胞もしくは複数の非固形腫瘍細胞の増殖を抑制する方法を提供する。
【００６７】
胎盤幹細胞は、例えば本明細書の別所に記載された胎盤幹細胞である(5.2節を参照されたい)。腫瘍細胞抑制に使用される胎盤幹細胞は、単独の胎盤又は複数の胎盤に由来するか又はそれらから得ることができる。また、腫瘍細胞抑制に使用される胎盤幹細胞は、その機能が低下又は抑制される、単独の種、例えば意図されたレシピエントの種もしくは該腫瘍細胞の種に由来することもでき、又は複数の種に由来することができる。胎盤幹細胞は、胎盤全体に由来するか、又はそれらの任意の部分、例えば羊膜、絨毛膜、羊膜-絨毛膜板、又は臍帯に由来することができる。胎盤の任意の部分に由来した胎盤幹細胞は、本発明の方法において使用することができる。胎盤幹細胞は、例えば潅流又は酵素消化などの、当業者に公知の任意の手段により、胎盤、又はそれらの一部から回収することができる。
【００６８】
腫瘍細胞は、悪性又は良性のいずれかの、新形成性細胞成長及び増殖を示す任意の細胞であり、並びに癌細胞に加え前癌細胞も含むことができる。腫瘍細胞の例は、癌腫細胞、リンパ腫細胞、芽腫細胞、肉腫細胞、及び白血病細胞を含むが、これらに限定されるものではない。腫瘍細胞のより特定の例は、乳癌細胞、前立腺癌細胞、結腸癌細胞、扁平上皮癌細胞、小細胞肺癌細胞、非小細胞肺癌細胞、消化管癌細胞、膵臓癌細胞、膠芽細胞腫、子宮頸癌細胞、卵巣癌細胞、肝臓癌細胞、膀胱癌細胞、肝細胞癌細胞、結腸直腸癌細胞、子宮内膜癌細胞、唾液腺癌細胞、腎臓癌細胞、肝臓癌細胞、外陰部癌細胞、甲状腺癌細胞、肝癌細胞及び頭頚部癌細胞の様々な形を含む。具体的な実施態様において、腫瘍細胞は、巨核芽球性リンパ腫細胞、急性リンパ芽球性白血病細胞、急性T細胞白血病細胞、組織球性リンパ腫細胞、骨髄急性骨髄性白血病細胞、慢性骨髄性白血病細胞、結腸腺癌細胞、網膜芽細胞腫細胞又は肺癌細胞である。
【００６９】
個体における腫瘍細胞の存在は、癌であることが疑われる組織に対し生検を実行することにより決定するか、又は体液試料から、例えば血液試料から精製又は単離された細胞から決定することができる。癌細胞又は組織を次に、様々な生物学的、分子的、形態学的、及び細胞学的手段を用い特徴づけることができる。具体的には、生物学的マーカー及び分子マーカーを使用し、細胞起源の型(上皮細胞など)、具体的細胞型(乳房又は前立腺のような臓器型など)、細胞成長又は細胞成長の可能性、細胞成長停止、及び高倍数性状態などの特徴を評価することができる。これらの細胞マーカーは、単独で又は組み合わせて使用される分子マーカー、生化学マーカー、及び生物学的マーカー及びプローブから選択されるが、これらに限定されるものではない。
【００７０】
本発明の文脈における「接触」は、インビトロにおいて、例えば単独の容器(例えば培養皿、フラスコ、バイアルなど)において、胎盤幹細胞と腫瘍細胞を一緒にすることを包含している。また、「接触」は、例えば腫瘍部位への直接注射などにより、胎盤幹細胞を個体へ静脈内提供することにより、インビボにおいて、例えば同じ個体(例えば、哺乳類、例えば、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ヒトなど)において、胎盤幹細胞と腫瘍細胞とを接合することを包含する。インビボ接触のある実施態様において、前記胎盤幹細胞及び前記腫瘍細胞は、細胞培養物中の細胞である。ある他の実施態様において、前記細胞は、同じ物理的空間において、例えば同じ培養皿又は培養皿内のウェルにおいて共培養される。別の実施態様において、前記接触は、該胎盤幹細胞と該腫瘍細胞の間の直接の物理的接触を必要としない。例えば前記接触は、該胎盤幹細胞及び該腫瘍細胞を個別の物理的空間において、例えば細胞培養皿の個別のウェルにおいて培養することを含むことができ、ここで該胎盤幹細胞及び該腫瘍細胞が入った培地は、胎盤幹細胞と腫瘍細胞の間で共有される。インビボ接触のある実施態様において、胎盤幹細胞及び腫瘍細胞の両方は、その個体に対し外因性であり、すなわちその個体を起源とするいずれの細胞型でもない。別の実施態様において、腫瘍細胞は、腫瘍発生を通じて個体内において生じる腫瘍細胞であり、すなわちこの腫瘍細胞は、その個体に対し内因性である。好ましい実施態様において、接触(インビトロ又はインビボのいずれか)は、この接触後の期間に、腫瘍細胞又は腫瘍細胞類の増殖の検出可能な抑制を引き起こすのに十分な時間、及び十分な胎盤幹細胞の数とのものである。より好ましくは、様々な実施態様において、前記接触は、腫瘍細胞又は腫瘍細胞類の増殖を、該接触後の期間に、胎盤幹細胞の非存在下での免疫機能と比べて少なくとも50％、60％、70％、75％、80％、90％又は95％抑制するのに十分である。更により好ましくは、腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞の増殖は、完全に抑制され、その結果この腫瘍細胞は、該接触後の期間に、増殖しないか、又は腫瘍細胞の総数を増加するのに十分には増殖しない。様々な実施態様において、この期間は、1、2、3、4、5、6もしくは7日間、又は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10週間もしくはそれよりも長い。
【００７１】
例えば個体内の腫瘍細胞のような、腫瘍細胞の抑制は、腫瘍細胞の増殖又は腫瘍の成長の検出可能な抑制を実行するために必要なものと同じ程多くの胎盤幹細胞を利用することができる。例えば、本方法の様々な実施態様において、複数の胎盤幹細胞は、複数の腫瘍細胞、例えば個体内の腫瘍細胞と接触され、ここで複数の胎盤幹細胞は、約1×105個胎盤幹細胞、約1×106個胎盤幹細胞、約1×107個胎盤幹細胞、約1×108個胎盤幹細胞、約1×109個胎盤幹細胞、約1×1010個胎盤幹細胞、約1×1011個胎盤幹細胞、約1×1012個胎盤幹細胞又はそれよりも多くを含む。
【００７２】
他の実施態様において、本方法は、個体の体重1kg当たり、少なくとも約1×105、少なくとも約1×106、少なくとも約1×107、又は少なくとも約1×108個の胎盤幹細胞を、該個体へ投与することを含む。具体的な実施態様において、個体の体重1kg当たり、約100万個の胎盤幹細胞が、複数の腫瘍細胞を含む個体へ投与される。
【００７３】
様々なより具体的な実施態様において、本方法は、個体内の腫瘍細胞数の約1倍、2倍、3倍、4倍、又は5倍以上と多くの胎盤幹細胞を投与することを含む。任意の当該技術分野において公知の方法を使用し、個体において腫瘍細胞数を決定することができる。腫瘍細胞定量の例示的方法は、米国特許第6,365,362号及び第6,645,731号；Mehesらの論文、Haematologia, 31(2):97-109 (2001)；及び、Hardinghamらの論文、Cancer Research, 53:3455-3458 (1993)に開示されており、これらの内容は全体が引用により本明細書中に組み込まれている。様々なより具体的な実施態様において、本方法は、個体の体重を基にした多くの胎盤幹細胞を投与することを含む。例えば本方法は、前記個体へ、約1×103個胎盤幹細胞/kg、5×103個胎盤幹細胞/kg、1×104個胎盤幹細胞/kg、5×104個胎盤幹細胞/kg、1×105個胎盤幹細胞/kg、5×105個胎盤幹細胞/kg、1×106個胎盤幹細胞/kg、5×106個胎盤幹細胞/kg、1×107個胎盤幹細胞/kg、5×107個胎盤幹細胞/kg、又は1×108個胎盤幹細胞/kgを投与することを含む。様々なより具体的な実施態様において、本方法は、前記個体へ少なくとも約1×103個胎盤幹細胞/kg、少なくとも約5×103個胎盤幹細胞/kg、少なくとも約1×104個胎盤幹細胞/kg、少なくとも約5×104個胎盤幹細胞/kg、少なくとも約1×105個胎盤幹細胞/kg、少なくとも約5×105個胎盤幹細胞/kg、少なくとも約1×106個胎盤幹細胞/kg、少なくとも約5×106個胎盤幹細胞/kg、少なくとも約1×107個胎盤幹細胞/kg、少なくとも約5×107個胎盤幹細胞/kg、又は少なくとも約1×108個胎盤幹細胞/kgを投与することを含む。
【００７４】
様々な他のより具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、30回以下の集団倍加、20回以下の集団倍加、10回以下の集団倍加、又は5回以下の集団倍加のために、インビトロにおいて増幅される。別の具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、凍結保存され、該接触の前に解凍される。本方法の他の具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、該胎盤幹細胞の非存在下での同等数の腫瘍細胞の増殖と比べて該腫瘍細胞の増殖を約20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、又は95％抑制する。
【００７５】
有利なことに、胎盤幹細胞、例えば特定の個体もしくは個体プール由来の、又は特定の組織由来などの胎盤幹細胞は、例えば個体における腫瘍細胞の成長又は増殖を抑制するために使用する前に、腫瘍-抑制活性についてスクリーニングされる。従って具体的な実施態様において、胎盤幹細胞を使用し腫瘍細胞増殖又は成長を抑制する方法は、該胎盤幹細胞を該個体へ投与する前に、該胎盤幹細胞を、インビトロにおいて、腫瘍細胞成長抑制活性についてスクリーニングすることを含む。本方法のより具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、腫瘍細胞増殖をインビトロにおいて、該個体への投与前に該胎盤幹細胞の非存在下での同等数の腫瘍細胞の増殖と比べ、例えば少なくとも約20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、又は95％抑制することが確認され、ここでこの増殖は、同等の条件下である期間に生成された細胞数により測定される。これらの胎盤幹細胞は、直接接触によるか、可溶性因子を介して、又はこれら両方により、腫瘍細胞を抑制することができる。従って本方法の他のより具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、該個体への投与前に、直接培養アッセイ、トランスウェルアッセイにおいて、又はより好ましくは直接培養アッセイ及びトランスウェルアッセイの両方において、腫瘍細胞増殖をインビトロにおいて抑制することが確認される。
【００７６】
これらの胎盤幹細胞は、任意の腫瘍細胞を使用し、腫瘍細胞の増殖又は成長の抑制に関してスクリーニングすることができるが、より有用なスクリーニングは、罹患した個体内の腫瘍抑制を反復できるもの、又は反復を試みるものである。例えば別の具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、該胎盤幹細胞が投与される個体における腫瘍細胞と、例えば上皮、扁平など同じ細胞型の腫瘍細胞、例えば乳房、前立腺など同じ組織起源の腫瘍細胞、又はより好ましくは同じ細胞型及び組織起源の両方の腫瘍細胞に対する、腫瘍成長抑制活性についてインビトロにおいてスクリーニングされる。別のより具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、該個体の腫瘍細胞生検から得られた腫瘍細胞、又は該個体の血液試料から精製もしくは単離された腫瘍細胞に対する、腫瘍成長抑制活性について、インビトロにおいてスクリーニングされる。
【００７７】
本方法の様々なより具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、羊膜、絨毛膜、羊膜-絨毛膜、もしくは臍帯に由来するか、又は胎盤の潅流液に由来し、並びに該個体への投与前に、該幹細胞の非存在下での同等数の腫瘍細胞の増殖と比べ、腫瘍細胞増殖をインビトロにおいて、例えば少なくとも約20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、又は95％抑制することが確認される。
【００７８】
胎盤幹細胞及び内因性腫瘍、例えば固形腫瘍又は血液癌のインビボ接触に関して、本胎盤幹細胞は、生存細胞を個体へ導入する際に有効である当業者に公知の任意の方法により、個体へ導入することができる。例えば、胎盤幹細胞は、静脈注入により個体へ導入することができるか、又は筋肉内、腹腔内、皮内などに導入することができる。好ましい実施態様において、胎盤幹細胞は、腫瘍又は腫瘍細胞へ、その部位に又はその周辺へと、個体へ注射される。細胞は、例えばその中に胎盤幹細胞が包埋され、一旦移植されるとその外側で該細胞が成長することができる、天然又は人工のマトリックス、例としてゼラチンの移植により導入することもできる。そのようなマトリックスの非限定的例は、下記5.6.1 4節に示されている。
【００７９】
これらの任意の方法又は当業者に公知の他の方法による本胎盤幹細胞の個体への導入は、該胎盤幹細胞と腫瘍細胞の間の接触を促進するのに十分である。この胎盤幹細胞の個体へ、特に内因性腫瘍細胞を有する個体への導入は、単回の導入、又は数時間、数日間、数週間、数ヶ月間、又は数年間にわたる複数回の導入を含むことができる。胎盤幹細胞の各導入は、それ自体複数の腫瘍細胞の増殖を検出可能に抑制するのに十分な数多くの幹細胞を含むことができるか、又は凝集に十分であることができる。インビボ投与に関して、本胎盤幹細胞は、下記5.6.1節に説明されるように、医薬組成物として製剤することができる。
【００８０】
インビボの状況における抑制の程度は、インビトロアッセイ、例えば、ある期間最適成長条件下で腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞により生成された腫瘍細胞の数を、同じ期間胎盤幹細胞と接触された同等数の腫瘍細胞により生成された腫瘍細胞の数と比較することにより、決定することができる。腫瘍細胞を含む細胞の増殖は、任意の当該技術分野において公知の方法により評価することができる。例えば培養内又は個体内の細胞は、様々な時点で採取し、血球計又は同様の装置によりカウントすることができる。本腫瘍細胞は、例えばブロモデオキシウリジン(BrDU)、カルボキシフルオレセイン二酢酸塩(CFSE)又はオレゴングリーン488(Oregon Green 488)カルボン酸二酢酸塩(Invitrogen社)による染色のような、娘細胞を分離するようにデザインされた非分解性色素により染色し、染色の程度は血球計算器により決定することができる。胎盤幹細胞は、胎盤幹細胞と接触している腫瘍細胞が、胎盤幹細胞と接触していない腫瘍細胞よりも、細胞1個あたり検出可能により低い染色量(例えば細胞1個あたり検出可能なより低い平均染色量)を示す場合に、腫瘍細胞成長を抑制する。インビトロアッセイにおける抑制の程度は、個体における腫瘍又は腫瘍細胞の抑制の程度に対し、特定数の胎盤幹細胞及び数多くの腫瘍細胞について外挿することができる。
【００８１】
腫瘍の成長の抑制は、インビボにおいて腫瘍を造影又は検出するための当該技術分野において公知の手段のいずれかにより評価することができる。例えば腫瘍細胞は、腫瘍-特異抗体で標識され、例えばPET走査もしくはCAT走査を用い造影されるか、又はX-線を用い撮影することができる。腫瘍成長の抑制の決定は、例えば腫瘍の画像の目視検査により、腫瘍の標識の強度の決定により、腫瘍の画像中の腫瘍面積の決定などにより、解明され得る。また、インビボにおける腫瘍成長の抑制の決定は、その腫瘍に関連した症状の排除、改善、又は増悪の軽減のいずれかを検出又は注目することにより行うことができる。
【００８２】
この個体は、哺乳類、例えばヒトであることができる。別のより具体的な実施態様において、前記接触は、該胎盤細胞を該個体へ静脈内投与することを含む。別のより具体的な実施態様において、前記接触は、該胎盤細胞を該個体へ、腫瘍部位に又はその近傍に投与することを含む。
【００８３】
また。本胎盤幹細胞は、1種以上の第二の型の幹細胞、例えば骨髄由来の間葉系幹細胞と共に投与することもできる。そのような第二の幹細胞は、胎盤幹細胞と共に、例えば約1:10〜約10:1の比で、個体へ投与することができる。
【００８４】
また、本胎盤幹細胞は、幹細胞でない1種以上の細胞型と共に投与することもできる。具体的な実施態様において、本胎盤幹細胞は、個体にとって自家である第二の複数の細胞と共に、個体へ投与される。更に具体的な実施態様において、本胎盤幹細胞は、線維芽細胞と同時投与される。ある実施態様において、本線維芽細胞は、自家線維芽細胞である。この線維芽細胞は、胎盤幹細胞と共に、例えば約1:10〜約10:1の比で、個体へ投与することができる。
【００８５】
また、本胎盤幹細胞は、1種以上の幹細胞化学誘引物質と共に投与され得る。具体的な実施態様において、幹細胞化学誘引物質はSDF-1である。
【００８６】
(5.2胎盤幹細胞及び胎盤幹細胞集団)
本発明の腫瘍細胞増殖の抑制の方法は、胎盤幹細胞、すなわち胎盤又はその一部から得られる幹細胞であり、これは、(1)組織培養基材に付着し；(2)非胎盤細胞型に分化する能力を有し；並びに、(3)十分な数で、腫瘍細胞もしくは複数の腫瘍細胞の増殖を検出可能に抑制するか、又は腫瘍の成長を検出可能に抑制する能力を有する。胎盤幹細胞は、血液、例えば胎盤の血液又は臍帯血に由来しない。本発明の方法及び組成物において使用される胎盤幹細胞は、インビトロ又はインビボにおいて癌細胞もしくは複数の癌細胞の増殖を抑制するか、又はインビボにおいて腫瘍の成長を抑制する能力を有し、及びそれらのその能力について選択される。
【００８７】
胎盤幹細胞は、由来において胎児系又は母系のいずれかであることができる(すなわち、胎児又は母親のいずれかの遺伝子型を有することができる)。胎盤幹細胞の集団及び胎盤幹細胞を含む細胞の集団は、由来において単独で胎児系又は母系である胎盤幹細胞を含むか、又は胎児と母親由来の両方の胎盤幹細胞が混合された集団を含むことができる。胎盤幹細胞又は胎盤幹細胞を含む細胞の集団は、以下において説明される形態学的、マーカー及び培養特性によって同定し、選択することができる。
【００８８】
(5.2.1 物理的及び形態学的特性)
本発明において使用される胎盤幹細胞は、初代培養中に又は細胞培養中に培養されるとき、組織培養基材、例えば、組織培養容器の表面(例えば、組織培養プラスチック)に付着する。培養において胎盤幹細胞は、一般に、中心細胞本体から伸びる数多くの細胞質の突起とともに、星型のような外観の、線維芽細胞型と推定される。しかし、胎盤幹細胞は線維芽細胞よりも非常に多い数のそのような突起を示すので、胎盤幹細胞は、同一の条件下において培養される線維芽細胞から形態学的に区別することができる。形態学的に、胎盤幹細胞は、更に造血幹細胞から区別することができ、この際、一般に、培養状態で、より丸いか又は敷石形態と推定される。
【００８９】
(5.2.2 細胞表面、分子及び遺伝マーカー)
本発明の方法及び組成物において有用な胎盤幹細胞及び胎盤幹細胞の集団は、幹細胞又は幹細胞を含む細胞の集団を同定及び/又は単離するために使用することができる、多くのマーカーを発現する。本発明の胎盤幹細胞及び幹細胞集団(すなわち、2つ以上の胎盤幹細胞)は、胎盤又はその任意の部位(すなわち、羊膜、絨毛膜、羊膜-絨毛膜板、胎盤子葉、臍帯など)から直接得られる、幹細胞及び幹細胞を含む細胞集団を含む。また、胎盤幹細胞の集団は、培養状態の胎盤幹細胞の集団(すなわち2つ以上の)と、例えばバッグのような容器内の集団を含む。しかし、胎盤幹細胞は、栄養膜ではない。
【００９０】
胎盤幹細胞は、一般に、マーカー類CD73、CD105、CD200、HLA-G、及び/又はOCT-4を発現し、CD34、CD38、又はCD45を発現しない。胎盤幹細胞は、更に、HLA-ABC(MHC-1)及びHLA-DRを発現することもできる。これらのマーカーは、胎盤幹細胞を同定して、胎盤幹細胞を他の幹細胞型から区分するために用いることができる。胎盤幹細胞は、CD73及びCD105を発現することができるため、それらは、間葉系幹細胞のような特徴を有することができる。しかし、胎盤幹細胞は、胎児-特異性マーカーである、CD200及びHLA-Gを発現することができるため、それらは、CD200もHLA-Gも発現することができない、例えば骨髄由来の間葉系幹細胞のような間葉系幹細胞から区分することができる。同様に、CD34、CD38及び/又はCD45の発現不足は、胎盤幹細胞を非造血幹細胞として同定する。
【００９１】
一実施態様において、本発明は、CD200+、HLA-G+である複数の胎盤幹細胞を含む単離された細胞集団を提供し、ここで該幹細胞は、癌細胞増殖又は腫瘍成長を検出可能に抑制する。単離された集団の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD73+及びCD105+でもある。別の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34-、CD38-又はCD45-でもある。より具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34-、CD38-、CD45-、CD73+及びCD105+でもある。別の実施態様において、前記単離された集団は、胚様体様組織体の形成が可能となる条件下において培養される場合に、1個以上の胚様体様組織体を形成する。
【００９２】
別の実施態様において、本発明は、CD73+、CD105+、CD200+である複数の胎盤幹細胞を含む単離された細胞集団を提供し、ここで該幹細胞は、癌細胞増殖又は腫瘍成長を検出可能に抑制する。前記集団の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、HLA-G+である。別の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34-、CD38-又はCD45-である。別の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34-、CD38-及びCD45-である。より具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34-、CD38-、CD45-、及びHLA-G+である。別の具体的な実施態様において、前記細胞の集団は、胚様体様組織体の形成が可能となる条件下において培養される場合に、1個以上の胚様体様組織体を形成する。
【００９３】
また、本発明は、CD200+、OCT-4+である複数の胎盤幹細胞を含む単離された細胞集団を提供し、ここで該幹細胞は、癌細胞増殖又は腫瘍成長を検出可能に抑制する。具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD73+及びCD105+である。別の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、HLA-G+である。別の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34-、CD38-及びCD45-である。より具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34-、CD38-、CD45-、CD73+、CD105+及びHLA-G+である。別の具体的な実施態様において、前記集団は、胚様体様組織体の形成が可能となる条件下において培養される場合に、1個以上の胚様体様組織体を生成する。
を含む
【００９４】
また、本発明は、CD73+、CD105+及びHLA-G+である複数の胎盤幹細胞を含む単離された細胞集団を提供し、ここで該幹細胞は、混合リンパ球反応(MLR)アッセイにおいてT細胞増殖を検出可能に抑制する。上記複数の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34-、CD38-又はCD45-でもある。別の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34-、CD38-及びCD45-でもある。別の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、OCT-4+でもある。別の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD200+でもある。より具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34-、CD38-、CD45-、OCT-4+及びCD200+でもある。
【００９５】
また、本発明は、CD73+、CD105+幹細胞である複数の腫瘍細胞抑制性胎盤幹細胞を含む単離された細胞集団を提供し、ここで多数のものは、胚様体様組織体の形成が可能となる条件下において、1個以上の胚様体様組織体を形成し、並びにここで、該幹細胞は、癌細胞増殖又は腫瘍成長を検出可能に抑制する。具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34-、CD38-又はCD45-でもある。別の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34-、CD38-及びCD45-でもある。別の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、OCT-4+でもある。より具体的な実施態様において、前記幹細胞は、OCT-4+、CD34-、CD38-及びCD45-でもある。
【００９６】
また、本発明は、OCT-4+幹細胞である複数の胎盤幹細胞を含む単離された細胞集団を提供し、ここで該集団は、胚様体様組織体の形成が可能となる条件下において培養される場合に、1個以上の胚様体様組織体を形成し、並びにここで、該幹細胞は、癌細胞増殖又は腫瘍成長を検出可能に抑制することが同定されている。
【００９７】
様々な実施態様において、前記単離された胎盤細胞の少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、又は少なくとも95％は、OCT4+幹細胞である。前記集団の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD73+及びCD105+である。別の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34-、CD38-、又はCD45-である。別の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD200+である。より具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD73+、CD105+、CD200+、CD34-、CD38-、及びCD45-である。別の具体的な実施態様において、前記集団は、例えば少なくとも1回、少なくとも3回、少なくとも5回、少なくとも10回、少なくとも15回、又は少なくとも20回継代され、増殖される。
【００９８】
前述の実施態様のいずれかにおいて、本方法は、ABC-p(胎盤-特異性ABC輸送タンパク質；例えば、Allikmetsらの論文、Cancer Res. 58(23):5337-9 (1998)を参照されたい)を発現する胎盤細胞を選択することを追加的に含むことができる。本方法は、例えば、CD29の発現、CD44の発現、CD90の発現又は前述の組み合わせの発現などの、間葉系幹細胞に特異的な特徴を少なくとも1種示している細胞を選択することも含むことができる。
【００９９】
別の実施態様において、本発明は、CD29+、CD44+、CD73+、CD90+、CD105+、CD200+、CD34-及びCD133-である複数の腫瘍細胞-抑制性胎盤幹細胞を含む単離された細胞集団を提供する。
前述の胎盤幹細胞の具体的な実施態様において、胎盤幹細胞は、IL-6、IL-8及び単球化学誘引タンパク質(MCP-1)を構成的に分泌する。
前述の複数の胎盤幹細胞の各々は、哺乳類の胎盤から得られた及び直接単離された胎盤幹細胞、又は培養され及び少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30回以上継代された胎盤幹細胞、又はそれらの組み合わせを含むことができる。
【０１００】
前述の腫瘍細胞抑制性の複数の胎盤幹細胞は、約、少なくとも、又は1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1010個以下、又はそれ以上の胎盤幹細胞を含むことができる。
【０１０１】
(5.2.3 胎盤幹細胞集団の選択及び生成)
別の実施態様において、また、本発明は、前記細胞の少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、又は少なくとも95％がCD200+、HLA-G+胎盤幹細胞である胎盤細胞の集団を選択することを含み、ここで該胎盤幹細胞は、癌細胞増殖又は腫瘍成長を検出可能に抑制する、複数の胎盤細胞から複数の胎盤幹細胞を選択する方法も提供する。具体的な実施態様において、前記選択は、またCD73+及びCD105+である幹細胞を選択することを含む。別の具体的な実施態様において、前記選択は、またCD34-、CD38-、又はCD45-である幹細胞を選択することを含む。別の具体的な実施態様において、前記選択は、またCD34-、CD38-、CD45-、CD73+及びCD105+である胎盤幹細胞を選択することを含む。別の具体的な実施態様において、前記選択はまた、胚様体様組織体の形成が可能となる条件下において培養される場合に、1個以上の胚様体様組織体を形成する複数の胎盤幹細胞を選択することを含む。
【０１０２】
別の実施態様において、また、本発明は、該細胞の少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、又は少なくとも95％がCD73+、CD105+、CD200+胎盤幹細胞である複数の胎盤細胞を選択することを含み、ここで該胎盤幹細胞は、癌細胞増殖又は腫瘍成長を検出可能に抑制する、複数の胎盤細胞から複数の胎盤幹細胞を選択する方法も提供する。具体的な実施態様において、前記選択は、HLA-G+である幹細胞を選択することも含む。別の具体的な実施態様において、前記選択は、CD34-、CD38-又はCD45-である胎盤幹細胞を選択することも含む。別の具体的な実施態様において、前記選択は、CD34-、CD38-及びCD45-である胎盤幹細胞を選択することも含む。別の具体的な実施態様において、前記選択は、CD34-、CD38-、CD45-、及びHLA-G+である胎盤幹細胞を選択することも含む。別の具体的な実施態様において、前記選択は、該集団が胚様体様組織体の形成が可能となる条件下において培養される場合に、1個以上の胚様体様組織体を形成する胎盤幹細胞の集団を選択することを追加的に含む。
【０１０３】
別の実施態様において、また、本発明は、該細胞の少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、又は少なくとも95％がCD200+、OCT-4+胎盤幹細胞である複数の胎盤細胞を選択することを含み、ここで該胎盤幹細胞は、癌細胞増殖又は腫瘍成長を検出可能に抑制する、複数の胎盤細胞から複数の胎盤幹細胞を選択する方法も提供する。別の実施態様において、前記選択は、CD73+及びCD105+である胎盤幹細胞を選択することも含む。別の具体的な実施態様において、前記選択は、HLA-G+である胎盤幹細胞を選択することも含む。別の具体的な実施態様において、前記選択は、CD34-、CD38-及びCD45-である胎盤幹細胞を選択することも含む。別の具体的な実施態様において、前記選択は、CD34-、CD38-、CD45-、CD73+、CD105+及びHLA-G+である胎盤幹細胞を選択することも含む。
【０１０４】
別の実施態様において、また、本発明は、該細胞の少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、又は少なくとも95％がCD73+、CD105+及びHLA-G+胎盤幹細胞である複数の胎盤細胞を選択することを含み、ここで該胎盤幹細胞は、混合リンパ球反応(MLR)アッセイにおいてT細胞増殖を検出可能に抑制する、複数の胎盤細胞から複数の胎盤幹細胞を選択する方法も提供する。具体的な実施態様において、前記選択は、CD34-、CD38-又はCD45-である胎盤幹細胞を選択することも含む。別の具体的な実施態様において、前記選択は、CD34-、CD38-及びCD45-である胎盤幹細胞を選択することも含む。別の具体的な実施態様において、前記選択は、CD200+である胎盤幹細胞を選択することも含む。別の具体的な実施態様において、前記選択は、CD34-、CD38-、CD45-、OCT-4+及びCD200+である胎盤幹細胞を選択することも含む。
【０１０５】
別の実施態様において、また、本発明は、該細胞の少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、又は少なくとも95％がCD73+、CDl05+胎盤幹細胞である複数の胎盤細胞を選択することを含み、及びここで多数のものは、胚様体様組織体の形成が可能となる条件下において、1個以上の胚様体様組織体を形成し、ここで該幹細胞は、癌細胞増殖又は腫瘍成長を検出可能に抑制する、複数の胎盤細胞から複数の胎盤幹細胞を選択する方法も提供する。具体的な実施態様において、前記選択は、CD34-、CD38-又はCD45-である胎盤幹細胞を選択することも含む。別の具体的な実施態様において、前記選択は、CD34-、CD38-及びCD45-である胎盤幹細胞を選択することも含む。別の具体的な実施態様において、前記選択は、OCT-4+である胎盤幹細胞を選択することも含む。より具体的な実施態様において、前記選択は、OCT-4+、CD34-、CD38-及びCD45-である胎盤幹細胞を選択することも含む。
【０１０６】
別の実施態様において、また、本発明は、該単離された胎盤細胞の少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、又は少なくとも95％がOCT4+幹細胞である複数の胎盤細胞を選択することを含み、及びここで多数のものは、胚様体様組織体の形成が可能となる条件下において、1個以上の胚様体様組織体を形成し、ここで該幹細胞は、癌細胞増殖又は腫瘍成長を検出可能に抑制する、複数の胎盤細胞から複数の胎盤幹細胞を選択する方法も提供する。具体的な実施態様において、前記選択は、CD73+及びCD105+である胎盤幹細胞を選択することも含む。別の具体的な実施態様において、前記選択は、CD34-、CD38-、又はCD45-である胎盤幹細胞を選択することも含む。別の具体的な実施態様において、前記選択は、CD200+である胎盤幹細胞を選択することも含む。より具体的な実施態様において、前記選択は、CD73+、CD105+、CD200+、CD34-、CD38-、及びCD45-である胎盤幹細胞を選択することも含む。
【０１０７】
本発明は、腫瘍細胞の増殖を抑制することができる胎盤幹細胞の集団を生成する方法も提供する。例えば、本発明は、先に説明されたいずれかの複数の胎盤幹細胞を選択し、及びこの複数の胎盤幹細胞を他の細胞、例えば他の胎盤細胞から単離することを含む、細胞集団を生成する方法を提供する。具体的な実施態様において、本発明は、前記胎盤細胞が、(a)基材に接着し；(b)CD200及びHLA-Gを発現し、もしくはCD73、CD105、及びCD200を発現し、もしくはCD200及びOCT-4を発現し、もしくはCD73、CD105、及びHLA-Gを発現し、もしくはCD73及びCD105を発現し、かつ該幹細胞を含む胎盤細胞の集団が胚様体様組織体の形成を可能にする条件下で培養される場合に、該集団において1個以上の胚様体様組織体の形成を促進するか、又はOCT-4を発現し、かつ該幹細胞を含む胎盤細胞の集団が胚様体様組織体の形成を可能にする条件下で培養される場合に、該集団における1個以上の胚様体様組織体の形成を促進し；かつ(c)癌細胞増殖又は腫瘍成長を検出可能に抑制する、胎盤幹細胞を選択すること；及び、該胎盤細胞を他の細胞から単離し、細胞集団を形成することを含む、細胞集団を生成する方法を提供する。
【０１０８】
より具体的な実施態様において、本発明は、(a)基材に接着し；(b)CD200及びHLA-Gを発現し；かつ(c)癌細胞増殖又は腫瘍成長を検出可能に抑制する、胎盤幹細胞を選択すること；及び、該胎盤幹細胞を他の細胞から単離し、細胞集団を形成することを含む、細胞集団を生成する方法を提供する。別の具体的な実施態様において、本発明は、(a)基材に接着し；(b)CD73、CD105、及びCD200を発現し；かつ(c)癌細胞増殖又は腫瘍成長を検出可能に抑制する、胎盤幹細胞を選択すること；及び、該胎盤幹細胞を他の細胞から単離し、細胞集団を形成することを含む、細胞集団を生成する方法を提供する。別の具体的な実施態様において、本発明は、(a)基材に接着し；(b)CD200及びOCT-4を発現し；かつ(c)癌細胞増殖又は腫瘍成長を検出可能に抑制する、胎盤幹細胞を選択すること；及び、該胎盤幹細胞を他の細胞から単離し、細胞集団を形成することを含む、細胞集団を生成する方法を提供する。別の具体的な実施態様において、本発明は、(a)基材に接着し；(b)CD73及びCD105を発現し；(c)胚様体様組織体の形成が可能となる条件下で培養される場合に、胚様体様組織体を形成し；かつ(d)癌細胞増殖又は腫瘍成長を検出可能に抑制する、胎盤幹細胞を選択すること；及び、該胎盤幹細胞を他の細胞から単離し、細胞集団を形成することを含む、細胞集団を生成する方法を提供する。別の具体的な実施態様において、本発明は、(a)基材に接着し；(b)CD73、CD105、及びHLA-Gを発現し；かつ(c)MLRにおいて、CD4+又はCD8+ T細胞増殖を検出可能に抑制する、胎盤幹細胞を選択すること；及び、該胎盤幹細胞を他の細胞から単離し、細胞集団を形成することを含む、細胞集団を生成する方法を提供する。細胞集団を生成する方法は、(a)基材に接着し；(b)OCT-4を発現し；(c)胚様体様組織体の形成が可能となる条件下で培養される場合に、胚様体様組織体を形成し；かつ(d)癌細胞増殖又は腫瘍成長を検出可能に抑制する胎盤幹細胞を選択すること；及び、該胎盤幹細胞を他の細胞から単離し、細胞集団を形成することを含む。
【０１０９】
前述の胎盤幹細胞集団の選択法に関して、この選択は、該胎盤幹細胞の試料が、癌細胞増殖を抑制するか、又は腫瘍成長を抑制するかどうかを決定すること、並びに胎盤幹細胞の試料が、癌細胞増殖又は腫瘍成長を検出可能に抑制する場合に、胎盤幹細胞の集団を選択することを含むことができる。
【０１１０】
(5.2.4 培養における成長) 
本明細書に記述された胎盤幹細胞の成長は、部分的に、任意の哺乳類細胞に関する限り、成長のために選択された特定の培地に依存している。最適の条件下において、胎盤幹細胞は、典型的には、3〜5日で数値的には2倍となる。培養の間に、本発明の胎盤幹細胞は、培養基内の基材、例えば、組織培養容器の表面(例えば、組織培養皿プラスチック、フィブロネクチンがコーティングされたプラスチックなど)に付着して、単分子層を形成する。
【０１１１】
本発明の胎盤幹細胞を含む単離された胎盤細胞の集団は、適切な条件下において培養されるとき、胚様体様組織体を形成し、すなわち、細胞の3次元的なクラスターが、付着した幹細胞層の上に成長する。胚様体様組織体の内の細胞は、極初期の幹細胞と関連したマーカー、例えば、OCT-4、Nanog、SSEA3及びSSEA4を発現する。胚様体様組織体内の細胞は、本明細書に記述された胎盤幹細胞のように、典型的には培養基材に対する付着力がないが、培養の間、付着された細胞に付着した状態のままである。胚様体様組織体は、付着した幹細胞がなければ形成されないので、胚様体様組織体の細胞は、生存能力に関して、付着された胎盤幹細胞に依存的である。付着された胎盤幹細胞は、従って、該付着された胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団において、１個以上の胚様体様組織体の形成を促進する。理論に縛られることなく、該胚様体様組織体の細胞は、胚性幹細胞が細胞のフィーダー層上で生育するように、数多くの該付着された胎盤幹細胞の上に生育するものと考えられる。間葉系幹細胞、例えば、骨髄由来の間葉系幹細胞は、培養状態で胚様体様組織体を発達させることがない。
【０１１２】
(5.3胎盤幹細胞を得る方法)
(5.3.1幹細胞回収した組成物)
本発明は、更に、胎盤幹細胞を回収して、単離する方法を提供する。一般的に、幹細胞は、生理的に許容し得る溶液、例えば、幹細胞回収した組成物を使用して、哺乳類の胎盤から得られる。幹細胞回収した組成物は、2005年12月29日付で出願された、「胎盤幹細胞を回収し保存するための改善された組成物及び組成物の使用法(Improved Composition for Collecting and Preserving Placental Stem Cells and Methods of Using the Composition)」と題された米国仮出願第60/754,969号に詳しく説明されている。
【０１１３】
幹細胞回収した組成物は、幹細胞の回収及び/又は培養に適した任意の生理的に許容し得る溶液、例えば、食塩水(例えば、リン酸緩衝生理食塩水、クレブス溶液、又は改質されたクレブス溶液、イーグル溶液、0.9％NaClなど)、培養培地(例えば、DMEM、H.DMEMなど)を含むことができる。
【０１１４】
幹細胞回収した組成物は、回収時点から培養時点まで、胎盤幹細胞を保護しようとする傾向がある、すなわち、細胞死から胎盤幹細胞を保護したり、或いは胎盤幹細胞の死を遅延させたり、死滅する細胞の集団において胎盤幹細胞の数を減少したりする、１種以上の成分を含むことができる。そのような成分は、例えば、アポトーシス阻害剤(例えば、カスパーゼ阻害剤又はJNK阻害剤)；血管拡張剤(例えば、硫酸マグネシウム、抗高血圧薬、心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)、副腎皮質刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、ニトロプルシドナトリウム、ヒドララジン、アデノシン三リン酸、アデノシン、インドメタシン又は硫酸マグネシウム、ホスホジエステラーゼ阻害剤など)；壊死阻害剤例えば、2-(1H-インドール-3-イル)-3-ペンチルアミノ-マレイミド、ピロリジンジチオカルバメート、又はクロナゼパム)；TNF-α阻害剤；及び/又は酸素運搬ペルフルオロカーボン(例えば、ペルフルオロオクチルブロミド、ペルフルオロデシルブロミドなど)がある。
【０１１５】
幹細胞回収した組成物は、１種以上の組織分解酵素を含むことができ、このようなものの例として、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、リボヌクレアーゼ、又はデオキシリボヌクレアーゼ等がある。そのような酵素は、コラゲナーゼ(例えば、コラゲナーゼI、II、III又はIV、ヒストリチクム菌(Clostridium histolyticum)由来のコラゲナーゼ等)；ディスパーゼ、サーモリシン、エラスターゼ、トリプシン、リベラーゼ、ヒアルロニダーゼ等を含むが、これに限定されるものではない。
【０１１６】
幹細胞回収した組成物は、細菌を殺すか、細菌の発育を阻止するのに効果的な量の抗生物質を含むことができる。ある一定の制限のない実施態様において、抗生物質は、マクロライド(例えば、トブラマイシン)、セファロスポリン(例えば、セファレキシン、セフラジン、セフロキシム、セフプロジル、セファクロール、セフィキシム又はセファドロキシル)、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、ペニシリン(例えば、ペニシリンV)又はキノロン(例えば、オフロキサシン、シプロフロキサシン又はノルフロキサシン)、テトラサイクリン、ストレプトマイシン等である。特定の実施態様において、抗生物質は、グラム陽性菌及び/又はグラム陰性菌、例えば緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)等に対して有効である。
【０１１７】
幹細胞回収した組成物は、また、下記化合物を１種以上含むことができる:アデノシン(約1mM〜約50mM)；D-グルコース(約20mM〜約100mM)；マグネシウムイオン(約1mM〜約50mM)；一実施態様において、内皮保全と細胞の生存能力を維持するために十分な量の分子量が20,000ダルトンよりも大きい巨大分子(例えば、合成又は天然のコロイド、約25g/l〜約100g/l又は約40g/l〜約60g/lの、デキストラン又はポリエチレングリコールなどの多糖類)；酸化防止剤(例えば、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、グルタチオン、約25μM〜約100μMのビタミンC又はビタミンE)；還元剤(例えば、約0.1mM〜約5mMのN-アセチルシステイン)；細胞内へのカルシウムの侵入を防止する薬剤(例えば、約2μM〜約25μMベラパミル)；ニトログリセリン(例えば、約0.05g/L〜約0.2g/L)；一実施態様において、残留血液の凝固を防止するのに十分な量の抗凝血剤(例えば、約1000ユニット/l〜約100,000ユニット/lの濃度のヘパリンやヒルジン)；又は、化合物を含むアミロライド(例えば、約1.0μM〜約5μMのアミロライド、エチルイソプロピルアミロライド、ヘキサメチレンアミロライド、ジメチルアミロライド又はイソブチルアミロライド)。
【０１１８】
(5.3.2 胎盤の回収及び取り扱い)
一般に、ヒトの胎盤は、出産後の胎盤の放出後に直ぐ回収される。好ましい実施態様において、胎盤と関連した患者の全病歴を記録した後、そして患者からのインフォームドコンセントを得た後に、胎盤は、患者から回収される。好ましくは、この病歴は分娩後にも続く。そのような病歴は、胎盤やそれから収集された幹細胞の後続的使用を調整することに用いることができる。例えば、ヒト胎盤幹細胞は、その病歴を踏まえて、該胎盤と関連した幼児のための、親や兄弟姉妹、又は幼児の他の血縁者のための個人用薬として使用することができる。
【０１１９】
胎盤幹細胞の回収前に、臍帯血及び胎盤血液は除去される。ある実施態様において、分娩後に、胎盤にある臍帯血は回収される。胎盤は、従来の臍帯血の回収過程で処理することができる。典型的に針又はカニューレが、重力の補助で胎盤を放血するために利用される(例えば、Andersonの米国特許第5,372,581号；Hesselらの米国特許第5,415,665号を参照)。針又はカニューレは、通常、臍帯静脈内に留置し、胎盤からの臍帯血の排出を補助するために、胎盤は、穏やかにマッサージすることができる。そのような臍帯血の回収は、例えば、LifeBank社、Cedar Knolls、N.J.社，ViaCord社、Cord Blood Registry and Cryocell社などで商業的に実行される。好ましくは、胎盤は、臍帯血を回収する間、組織崩壊を最小化するために、これ以上の操作無しに重力排出される。
【０１２０】
典型的に、胎盤は、分娩室(the delivery and birthing room)から別の場所、例えば実験室まで、臍帯血の回収のために、及び、例えば潅流や組織解離による幹細胞の回収のために輸送される。胎盤は、好ましくは、無菌の断熱された(20〜28℃の間に胎盤の温度を維持する)輸送装置内、例えば、臍帯あたりをクランプで締めた状態で、無菌のジップロックプラスチックバッグの中に入れて、その後、断熱容器内に胎盤を置いて、輸送される。別の実施態様において、胎盤は、2005年9月19日に出願された係属中の米国特許出願第11/230,760号に開示されているように、実質的に臍帯血の回収キット内で輸送される。好ましくは、胎盤は、分娩後、実験室へ4〜24時間内に移送される。ある実施態様において、臍帯近傍の部分は、好ましくは、臍帯血の回収前に胎盤本体の中に、好ましくは4〜5cmの範囲で挿入され、クランプで締められる。他の実施態様において、臍帯近傍の部分は、臍帯血の回収後に、しかし、胎盤のさらなる処理の以前にクランプで締められる。
【０１２１】
幹細胞の回収前に、胎盤は、無菌条件下、かつ室温又は5〜25℃(摂氏)で保存することができる。胎盤は、ある残留臍帯血を除去するために胎盤を潅流する前に、48時間よりも長い期間、好ましくは4〜24時間の期間保存されることもある。胎盤は、好ましくは、5〜25℃の温度で、抗凝血剤溶液中に保存される。好適な抗凝血剤溶液は、当該技術分野において周知である。例えば、ヘパリンやワルファリンナトリウム溶液を使用することができる。好ましい実施態様において、抗凝血剤薬は、ヘパリン溶液(例えば、1:1000溶液中で1％w/w)を含む。血液を抜かれた胎盤は、胎盤幹細胞が回収される前に、好ましくは36時間を超えない程度の時間保存される。
【０１２２】
一般的に上記のように一度回収され及び調製された哺乳類の胎盤又はその一部は、任意の当該技術分野における公知の方法で処理することができ、例えば、潅流させ、又は崩壊させることができ、例えば、幹細胞を得るために、１つ以上の組織崩壊酵素で消化させることができる。
【０１２３】
(5.3.3胎盤組織の物理的崩壊及び酵素による消化)
一実施態様において、幹細胞は、臓器の物理的な崩壊、例えば酵素消化により、哺乳類の胎盤から回収される。例えば、胎盤又はその一部は、例えば、圧搾されたり、せん断されたり、細かく切り刻まれたり、さいの目状に切られたり、刻んだり、液体に浸して柔らかくなるようにしたりすることができる一方で、本発明の幹細胞回収した組成物と接触し、その組織は引き続き1種以上の酵素により消化される。また、胎盤又はその一部は、物理的に崩壊され及び1種以上の酵素により消化され、その後得られた材料が、本発明の幹細胞回収した組成物中に含浸又はそれと混合される。任意の物理的崩壊の方法は、その崩壊法は、例えばトリパンブルー排除試験により決定されるように、多数の、より好ましくは大半の、より好ましくは少なくとも60％、70％、80％、90％、95％、98％、もしくは99％の該臓器中の細胞を生存可能とするという条件で、この崩壊法を使用することができる。
【０１２４】
胎盤は、物理的な崩壊及び/又は酵素による消化並びに幹細胞の回収前に、構成材に解剖されることができる。例えば胎盤幹細胞は、羊膜、絨毛膜、胎盤葉、又はこれらのいずれかの組み合わせから、得ることができる。臍帯幹細胞も、本発明の方法において使用することができる。具体的な実施態様において、胎盤幹細胞は、羊膜と絨毛膜とを含む胎盤組織から得ることができる。臍帯幹細胞も、本発明の方法において使用することができる。具体的な実施態様において、胎盤幹細胞は、羊膜と絨毛膜とを含む胎盤組織から得ることができる。別の具体的な実施態様において、胎盤幹細胞は、臍帯から得られる。典型的に、胎盤幹細胞は、胎盤組織の小さなブロック、例えば、体積で、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900又は約1000立方ミリメートルの胎盤組織のブロックの崩壊から得ることができる。
【０１２５】
好ましい幹細胞回収した組成物は、１種以上の組織崩壊酵素を含む。酵素による消化は、好ましくは、酵素の組み合わせ、例えば、マトリックスメタロプロテアーゼ及び神経プロテアーゼの組み合わせ、例えば、コラゲナーゼとディスパーゼの組み合わせを用いることができる。一実施態様において、胎盤組織の酵素による消化は、ヒアルロン酸の消化のために、マトリックスメタロプロテアーゼ、神経プロテアーゼ及び粘液質溶解剤酵素の組み合わせ、例えば、コラゲナーゼ、ディスパーゼ及びヒアルロニダーゼの組み合わせ又はリベラーゼ(Boehringer Mannheim社、インディアナポリス、インディアナ州)とヒアルロニダーゼの組み合わせを使用する。胎盤組織を崩壊させるために使用することができる他の酵素は、パパイン、デオキシリボヌクレアーゼ、セリンプロテアーゼ、例えば、トリプシン、キモトリプシン、又はエラスターゼを含む。セリンプロテアーゼは、血清中にあるα2マイクログロブリンによって阻止されることもでき、これにより、消化に使用される培地は、一般に、血清のないものである。EDTAとDNaseは、細胞の回収効果を増加させるために、通常、酵素消化過程において使用される。粘性の消化物内に幹細胞がトラップされることを避けるために、消化性物質は、好ましくは希釈される。
【０１２６】
組織消化酵素のいずれの組み合わせであっても使用することができる。組織消化酵素の典型的な濃度は、コラゲナーゼIとコラゲナーゼIVについて50〜200U/mL、ディスパーゼについて1〜10U/mL、更に、エラスターゼについて10〜100U/mLを含む。プロテアーゼは、組み合わせて使用することができ、すなわち、2種以上のプロテアーゼが、胎盤幹細胞を遊離するために、同じ消化反応において、又は順次使用することができる。例えば一実施態様において、胎盤又はその一部分は、最初に適量のコラゲナーゼIによって2mg/mlで30分間消化され、その後、約0.25％のトリプシンで、37℃で10分間消化される。セリンプロテアーゼは、好ましくは、他の酵素の使用後に連続して使用される。
【０１２７】
別の実施態様において、幹細胞回収した組成物で幹細胞を単離する前に、例えば、エチレングリコールビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N'N'-テトラ酢酸(EGTA)又はエチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)などのキレート剤を、幹細胞を含む幹細胞回収した組成物に又は組織が崩壊及び/もしくは消化された溶液に添加することにより、組織は、更に崩壊することができる
【０１２８】
胎盤全体又は胎盤の一部が胎児系と母系の両細胞を含む場合(例えば、胎盤の一部が絨毛膜又は子葉を含む場合)、回収された胎盤幹細胞は、胎児系と母系の両方の胎盤幹細胞の混合を含むようになることが理解されるだろう。胎盤の一部分が母系細胞(例えば、羊膜)を含まないか、ごくわずかの母系細胞の数を含む場合に、回収された胎盤幹細胞は、ほぼ独占的に胎児系幹細胞を含むことになる。
【０１２９】
(5.3.4 胎盤潅流)
更に、胎盤幹細胞は、哺乳類の胎盤の潅流によって得ることができる。幹細胞を得るために哺乳類の胎盤を潅流させる方法は、例えば、2005年12月29日付で出願された「胎盤幹細胞を回収し保存するための改善された組成物及び組成物の使用法(Improved Composition for Collecting and Preserving Placental Stem Cells and Methods of Using the Composition)」と題された、Haririの米国特許第7,045,148号及び関連した米国特許仮出願第60/754,969号に開示されている。
【０１３０】
胎盤幹細胞は、例えば潅流液として幹細胞回収した組成物を使用して、例えば胎盤血管系を通じた潅流により回収することができる。一実施態様において、哺乳類の胎盤は、臍帯動脈と臍帯静脈のいずれか又は両方を通じた潅流液の通過により潅流される。胎盤を通じた潅流液の流れは、例えば、胎盤の中への重力流れを用いて達成することができる。好ましくは、潅流液は、ポンプ、例えば蠕動ポンプの使用により、胎盤を通じて流れることになる。臍帯静脈に、例えば、無菌チューブなどの無菌の連結装置に接続されるTEFLON(登録商標)又はプラスチックカニューレなどの、カニューレを挿入することができる。無菌の連結装置は、潅流多岐連絡管に接続される。
【０１３１】
潅流に関する調製において、胎盤は、好ましくは、臍帯動脈と臍帯静脈が胎盤の最も高い位置に配置されるような方法で向けられる(例えば、ぶら下げられる)。胎盤は、胎盤血管系を通じた、又は胎盤血管系及び周囲組織を通じた、潅流流体、例えば本発明の幹細胞回収した組成物の通過により潅流することができる。一実施態様において、例えば、臍帯動脈と臍帯静脈は、例えば、柔軟な接続具を介して潅流液の貯留槽に接続されたピペットに同時に接続される。潅流液は、臍帯静脈及び動脈を通過する。潅流液は、胎盤を取り囲む組織の中へ血管壁から滲み出て、及び/又は血管壁を通じて通過し、姙娠期間中に母親の子宮に付着されていた胎盤表面から適した開放血管中で回収される。潅流液は、また、臍帯を開放して導入することができ、母体の子宮壁と境界を成す胎盤壁内の開口部の外に流れるか、浸出することを可能にできる。別の実施態様において、潅流液は、臍帯静脈を通過して臍帯動脈から回収されるか、臍帯動脈を通過して臍帯静脈から回収される。
【０１３２】
一実施態様において、臍帯近傍は、潅流の間にクランプで締められ、より好ましくは、胎盤本体の中への臍帯挿入の4〜5cm(センチメートル)の範囲内をクランプで締められる。
【０１３３】
放血過程の間、哺乳類の胎盤からの潅流流体の第一の回収物は、一般的に、臍帯血及び/又は胎盤血液の残りの赤い血液細胞により染まっている。潅流が進行して、残りの臍帯血細胞が胎盤の外に洗い流されることで、潅流流体は、より一層無色に変わる。一般に、30〜100ml（ミリリットル）の潅流流体が、最初に胎盤を放血するために好適であるが、それ以上又はそれ以下の潅流流体を、観察結果によって使用してもよい。
【０１３４】
胎盤幹細胞を回収することに使用される潅流液体の体積は、回収された幹細胞の個数、胎盤の大きさ、１つの胎盤からなされる回収の回数などに応じて変わることがある。多様な実施態様において、潅流液体の体積は、50mL〜5000mL、50mL〜4000mL、50mL〜3000mL、100mL〜2000mL、250mL〜2000mL、500mL〜2000mL、又は750mL〜2000mLであってもよい。典型的に、胎盤は、放血後、700〜800mLの潅流液体で潅流される。
【０１３５】
胎盤は、数時間又は数日間の過程の間に複数回潅流することができる。胎盤が複数回潅流される場合、これは、容器や他の適した管内で、無菌条件下で維持されるか又は培養されてよく、抗凝血剤(例えば、ヘパリン、ワルファリンナトリウム、クマリン、ビスヒドロキシクマリン)の有無、及び/又は抗菌剤(例えば、β-メルカプトエタノール(0.1mM)；ストレプトマイシン(例えば、40〜100g/ml)、ペニシリン(例えば、40U/ml)、アンホテリシンB(例えば、0.5g/ml)などの抗生物質)の有無に係わらず、幹細胞回収した組成物又は標準的な潅流液(例えば、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)などの一般食塩水)により潅流することができる。一実施態様において、単離された胎盤は、潅流液を回収することなく、一定の時間に維持され、培養され、すなわち、潅流及び潅流液の回収前に、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、又は24時間、或いは2又は3日間以上の間、該胎盤は維持され、又は培養される。潅流された胎盤は、１以上の追加的な時間、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24時間以上の時間、維持されることができ、例えば、700〜800mLの潅流流体により第2回目潅流されることができる。胎盤は、1、2、3、4、5回以上の回数で、例えば、1、2、3、4、5又は6時間毎に一回潅流することができる。好ましい実施態様において、胎盤の潅流及び潅流液、例えば、幹細胞回収した組成物の回収は、回収された有核細胞の数が100細胞/ml未満に減るまで繰り返される。異なる時点における潅流液は、更に個別に処理されて、時間依存的な細胞の集団、例えば、幹細胞を回収することができる。異なる時点の潅流液は、また、プールすることができる。
【０１３６】
理論に縛られることなく、放血後、かつ胎盤を充分に潅流した後に、胎盤幹細胞は、放血されて、潅流された該胎盤の微小循環系内に移動するものと考えられ、この微小循環系は、本発明の方法に従って、好ましくは潅流によって回収管内に洗浄されることで、幹細胞が回収される箇所である。単離された胎盤を潅流させることは、残りの臍帯血を除去することだけではなく、更に、胎盤に、酸素を含め、適切な栄養物質を提供することである。胎盤は、また、好ましくは、抗凝血剤を添加することなく、残りの臍帯血細胞を除去するために使用される類似の溶液と共に、培養して、潅流することができる。
【０１３７】
本発明の方法にかかる潅流は、前記溶液で潅流されていない、そして幹細胞を得るために他の方法(例えば、組織崩壊や酵素による消化)で未処理の哺乳類の胎盤から得ることができる数よりも、有意により多くの胎盤幹細胞の回収をもたらす。この文脈において「有意により多く」は、少なくとも10％より多いことを意味する。本発明の方法にかかる潅流は、例えば、胎盤又はその一部が培養された培養培地から得ることができる胎盤幹細胞の数と比較して、有意により多くの胎盤幹細胞を産出する。
【０１３８】
幹細胞は、胎盤から潅流によって１種以上のプロテアーゼや他の組織崩壊酵素を含む溶液と共に単離することができる。具体的な実施態様において、胎盤又はその一部(例えば、羊膜、羊膜及び絨毛膜、胎盤小葉もしくは子葉、臍帯、又はそれらのいずれかの組み合わせ)は、25〜37℃に達し、そして１種以上の組織崩壊酵素とともに、200mLの培養培地中において30分間培養される。潅流液の細胞は回収され、4℃とされ、また5mM EDTA、2mM ジチオスレイトール及び2mM β-メルカプトエタノールを含む低温の阻害剤混合物により洗浄される。幹細胞は、数分後に、冷たい(例えば、4℃)本発明の幹細胞回収した組成物により洗浄される。
【０１３９】
潅流液が胎盤の母親側から染み出た後に回収されるパン方法を用いた潅流は、胎児系と母系の細胞の混合をもたらすことが理解されるだろう。その結果として、該方法で回収された細胞は、胎児系と母系由来の両方の胎盤幹細胞が混合された集団を含む。逆に、潅流流体が1つ又は2つの胎盤血管を通過し、残りの血管を通じて単独に回収される、胎盤血管系を通じた単独潅流は、ほぼ独占的に胎児系由来の胎盤幹細胞の集団の回収をもたらす。
【０１４０】
(5.3.5胎盤幹細胞の単離、選別及び特徴付け)
潅流や酵素的消化によって得られた、哺乳類の胎盤から採取した幹細胞は最初に、Ficoll勾配遠心分離により、他の細胞から精製(すなわち、単離)することができる。そのような遠心分離は、遠心分離速度等に対する任意の標準的なプロトコールに従うことができる。一実施態様において、例えば、胎盤から回収された細胞は、15分間、室温、5000×gでの遠心分離により潅流液から回収され、この遠心分離は、細胞を例えば、夾雑しているデブリ及び血小板から分離する。別の実施態様において、胎盤潅流液は、約200mlに濃縮され、Ficoll上で穏やかに層を形成し、そして、22℃で、20分間、1100×gで遠心分離をし、該細胞の低密度の界面層は、更に処理に供するために回収される。
【０１４１】
新しい幹細胞回収した組成物又は幹細胞の維持に適した培地、例えば、2U/mlのヘパリンと2mM EDTA(GibcoBRL社、NY)を含むIMDM無血清培地において、細胞のペレットは、再懸濁することができる。全体の単核細胞画分は、例えば、製造者の推奨の手順に従って、Lymphoprep(登録商標)(Nycomed Pharma社，オスロ，ノルウェー)を用いて単離することができる。
【０１４２】
本明細書で使用されているように、胎盤幹細胞を「単離すること」は、無傷の哺乳類の胎盤において、幹細胞が正常に関連する細胞の少なくとも20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％又は99％を除去することを意味する。幹細胞が、無傷の臓器において、幹細胞が正常に関連する細胞の50％未満を含む細胞の集団に存在するとき、臓器由来の幹細胞は、「単離されている」。
【０１４３】
潅流や消化によって得られた胎盤細胞は、例えば、0.2％EDTA(Sigma社、セントルイス、ミズーリ州)と共に0.05％のトリプシン溶液を用いて、示差的トリプシン処理により、例えば、更に、又は初期に単離することができる。胎盤幹細胞は、典型的には、約5分以内でプラスチックの表面から剥がれるが、他の付着性のある集団は、典型的には20〜30分以上の培養を必要とするため、示差的トリプシン処理が可能である。剥がれた該胎盤幹細胞は、トリプシン処理後、例えばトリプシン中和溶液(TNS、Cambrex社)を用いるトリプシン中和を経て収穫することができる。付着細胞の単離の一実施態様において、例えば、約5〜10×106個細胞の一定分量が、それぞれいくつかのT−75フラスコ、好ましくは、フィブロネクチンがコーティングされたT−75フラスコの中に置かれる。そのような実施態様において、前記細胞は、市販の間葉系幹細胞成長培地(MSCGM)(Cambrex社)で培養され、組織培養インキュベーター(37℃、5％CO2)内に置かれる。10〜15日後に、非付着細胞は、PBSで洗浄され、フラスコから除去される。該PBSは、その後、MSCGMに代替される。フラスコは、多様な付着細胞型の存在について、そして特に、線維芽細胞様細胞のクラスターの確認及び増殖のために、好ましくは毎日調査される。
【０１４４】
哺乳類の胎盤から回収された細胞の数と型は、モニタリングすることができ、例えば、フローサイトメトリー、細胞選別、免疫細胞化学(例えば、組織に特異的な又は細胞マーカーに特異的な抗体による染色)、蛍光標示式細胞分取器(FACS)、磁気活性化細胞分取器(MACS)などの標準的な細胞検出技術を利用して、形態学的に及び細胞表面マーカーにおける変化を測定することにより、光学顕微鏡又は共焦点顕微鏡法を利用して細胞の形態を調査することにより、及び/又は、PCRと遺伝子発現プロファイリングなどの当該技術分野において周知の技術を利用して遺伝子発現の変化を測定することにより、モニタリングを行うことができる。このような技術は、同様に、１種以上の特定のマーカーに対して陽性である細胞を同定するために使用することができる。例えば、CD34に対する抗体を用いて、上記技術を使用し、細胞が、CD34を検出することができるほどの量で含むかどうかが分かる；若しそうである場合、該細胞は、CD34+である。同様に、若し細胞がRT−PCRで検出されるのに十分なOCT-4 RNAを生成する場合、又は、成体細胞よりも有意により多くのOCT-4 RNAを生成すれば、該細胞は、OCT-4+である。細胞表面マーカー(例えば、CD34のようなCDマーカー)に対する抗体とOCT-4のように幹細胞に特異的な遺伝子の配列は、当該技術分野において周知である。
【０１４５】
胎盤細胞、特に、Ficoll分離によって単離された細胞、示差的付着、又はこれらの組み合わせは、蛍光標示式細胞分取器(FACS)を用いて選別することができる。蛍光標示式細胞分取器(FACS)は、粒子の蛍光特性に基づいた、細胞を含む粒子を分離する周知の方法である(Kamarchの文献、1987、Methods Enzymol、151:150-165)。個別の粒子における蛍光部分のレーザ刺激は、小さな電気的変化を誘発して、混合物から陽性粒子と陰性粒子の電気−磁場分離が発生する。一実施態様において、細胞表面マーカーに特異的な抗体又はリガンドは、明らかな蛍光標識で標識される。細胞は、細胞分取器を通じて処理され、それらの使用された抗体に対する結合能力に基づいて細胞の分離が可能となる。FACSで選別された粒子は、直接に96-ウェル、又は384-ウェルプレートの個別のウェル内に置かれ、分離とクローニングを促進することができる。
【０１４６】
１つの選別スキームにおいて、胎盤から採取した幹細胞は、マーカーCD34、CD38、CD44、CD45、CD73、CD105、OCT-4及び/又はHLA-Gの発現に基づいて選別される。これは、培養状態においてそれらの付着特性に基づき、幹細胞を選択する過程に関連して達成することができる。例えば、マーカーの発現に基づいて、選別の前又は後に、幹細胞(stem)の付着選択は達成することができる。一実施態様において、細胞は、最初は、CD34の発現に基づいて選別され；CD34-細胞は保有され、そして、CD200+、HLA-G+である細胞は、すべての他のCD34-細胞から分離される。別の実施態様において、胎盤からの細胞は、マーカーCD200及び/又はHLA-Gの発現に基づいており；例えば、このようなマーカーのうちのいずれかを表示する細胞が、追加の使用のために単離される。例えば、CD200及び/又はHLA-Gを発現する細胞は、具体的な実施態様において、CD73及び/又はCD105の発現、又は抗体SH2、SH3又はSH4によって認識されるエピトープ、或いはCD34、CD38又はCD45の発現の欠損に基づいて更に選別されることができる。例えば、一実施態様において、胎盤細胞は、CD200、HLA-G、CD73、CDl05、CD34、CD38及びCD45の発現やそれらの欠損によって選別され、CD200+、HLA-G+、CD73+、CD105+、CD34-、CD38-及びCD45-である胎盤細胞が、追加の使用のために、他の胎盤細胞から単離される。
【０１４７】
別の実施態様において、磁気ビーズは細胞を分離することに使用することができる。細胞は、それらの磁気ビーズ(直径0.5〜100μm)を結合する能力に基づいて粒子を分離する方法である、磁気活性化細胞分取(MACS)技術を用いて分離することができる。特定の細胞表面分子又はハプテンを特異的に認識する抗体に共有結合の添加を含む、多様で有用な修飾を磁気マイクロスフェア上で行うことができる。ビーズは、その後、細胞と混合されて、結合される。細胞は、次いで、磁場を通過して、特異的細胞表面マーカーを有する細胞を分離する。一実施態様において、このような細胞は、その後に単離され、追加的な細胞表面マーカーに対する抗体と結合された磁気ビーズと、再び混合されることができる。これらの細胞は、また、磁場を通過して、両方の抗体と結合した細胞を単離する。そのような細胞は、その後、クローン単離のためのマイクロタイター皿のような分離皿内に希釈されることができる。
【０１４８】
胎盤幹細胞は、また、細胞形状及び成長特徴に基づいて特徴付けされ、及び/又は選別されることができる。例えば、胎盤幹細胞は、例えば、培養状態で線維芽細胞のような外観を有することで特徴付けされることができ、及び/又はそのような外観に基づいて選択されることができる。胎盤幹細胞は、例えば、胚様体様組織体を形成するそれらの能力に基づいて、それを有することで特徴付けされ、及び/又は選択されることができる。一実施態様において、例えば、形態において線維芽細胞状であり、CD73及びCD105を発現し、かつ培養基内に１個以上の胚様体様組織体を生成する胎盤細胞は、他の胎盤細胞から単離される。別の実施態様において、培養基内に１個以上の胚様体様組織体を生成するOCT-4+胎盤細胞は、他の胎盤細胞から単離される。
【０１４９】
別の実施態様において、胎盤幹細胞は、コロニー形成単位アッセイによって同定されて、特徴付けされることができる。コロニー形成単位アッセイは、通常、当該技術分野においてMESEN CULT(商標)培地(Stem Cell Technologies社、バンクーバー、ブリティッシュコロンビア州)のように周知である。
【０１５０】
胎盤幹細胞は、当該技術分野において公知である、トリパンブルー排除アッセイ、フルオレセインジアセテート取込みアッセイ、ヨウ化プロピジウム取込みアッセイ(生存能力を評価するために)；及び、チミジン取込みアッセイ、MTT細胞増殖アッセイ(増殖を評価するために)などの標準技術を用いて、生存能力、増殖能力、および寿命について評価することができる。寿命は、増量した培養基において集団倍加の最大数を決定するなどの、当該技術分野において周知の方法により、測定することができる。
【０１５１】
胎盤幹細胞は、当該技術分野において公知の以下のような方法で他の胎盤細胞から分離することができる：例えば、所望の細胞の選択的成長(陽性選択)、不要な細胞の選択的破壊(陰性選択)；例えば、ダイズ凝集素のように、混合された集団における示差的細胞凝集力に基づいた分離；冷凍−解凍過程；ろ過；従来のゾーン遠心分離；遠心洗浄(向流遠心分離)；単位重力分離；向流分配；電気泳動法；など。
【０１５２】
(5.4 胎盤幹細胞の培養)
(5.4.1 培養培地)
単離された胎盤幹細胞、又は胎盤幹細胞の集団、又は胎盤幹細胞が成長した細胞もしくは胎盤組織は、細胞培養を開始するか、播種するために使用することができる。細胞は、一般的に、ラミニン、コラーゲン(例えば、自己由来又は変性された)、ゼラチン、フィブロネクチン、オルニチン、ビトロネクチン及び細胞外膜タンパク質(例えば、MATRIGEL(BD Discovery Labware社、ベッドフォード、マサチューセッツ州))などの細胞外マトリックス又はリガンドでコーティングされているか或いはコーティングされていない無菌の組織培養容器に移される。
【０１５３】
胎盤幹細胞は、幹細胞の培養に適したものとして当該技術分野において認識されている任意の条件下で、かつ任意の培地中で培養することができる。好ましくは、培養培地は、血清を含む。胎盤幹細胞は、例えば、以下のような培地中で培養することができる：例えば、ITS(インスリン-トランスフェリン-セレニウム)、LA＋BSA(リノール酸-ウシ血清アルブミン)、デキストロース、L-アスコルビン酸、PDGF、EGF、IGF−I、及びペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM-LG(Dulbeccoの変法必須培地、低グルコース)/MCDB201(ニワトリ線維芽細胞基礎培地)；10％ウシ胎仔血清(FBS)を含むDMEM-HG(高グルコース)；15％FBSを含むDMEM-HG；10％FBS、10％ウマ血清、及びヒドロコルチゾンを含むIMDM(Iscove変法Dulbecco培地)；10％FBS、EGF、及びヘパリンを含むM199；10％FBS、GLUTAMAX(商標)及びゲンタマイシンを含むα-MEM(最小必須培地)；10％FBS、GLUTAMAX（商標）及びゲンタマイシンを含むDMEM、など。好ましい培地は、2％FBS、ITS、LA+BSA、デキストロース、L-アスコルビン酸、PDGF、EGF、及びペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM-LG/MCDB-201である。
【０１５４】
胎盤幹細胞の培養に使用することができる他の培地は、DMEM(高又は低グルコース)、Eagle's基本培地、Ham's F10培地(F10)、Ham's F-12培地(F12)、Iscove変法Dulbecco培地、間葉系幹細胞成長培地(MSCGM)、LiebovitzのL-15培地、MCDB、DMEM/F12、RPMI 1640、高度DMEM(Gibco社)、DMEM/MCDB201(Sigma社)、及びCELL-GRO FREEである。
【０１５５】
培養培地は、例えば、以下を含む１種以上の成分が補充されていてもよい:血清(例えば、ウシ胎仔血清(FBS)、好ましくは、約2〜15％(v/v)；ウマ血清(ES)；ヒト血清(HS))；β-メルカプトエタノール(BME)、好ましくは、約0.001％(v/v)；１種以上の成長因子、例えば、血小板由来の成長因子(PDGF)、上皮成長因子(EGF)、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)、インスリン様成長因子-1(IGF−1)、白血病抑制因子(LIF)、血管内皮成長因子(VEGF)、及びエリスロポエチン(EPO)；L-バリンを含むアミノ酸；および、微生物汚染を制御する、例えば、ペニシリンG、ストレプトマイシンスルフェート、アンホテリシンB、ゲンタマイシン、及びニスタチン、これらを単独で或いは組み合わせて用いる、１種以上の抗生物質及び/又は抗真菌剤。
【０１５６】
(5.4.2胎盤幹細胞の拡大と増殖)
一度単離された胎盤幹細胞、又は幹細胞の単離された集団(例えば、幹細胞又は幹細胞の集団が、インビボで正常に関連する胎盤細胞の少なくとも50％から分離された幹細胞の集団又は幹細胞)が得られる場合、該幹細胞又は幹細胞の集団は、インビトロで増殖され、拡大することができる。例えば、胎盤幹細胞の集団は、例えば、皿、フラスコ、マルチウェルプレートなどの組織培養容器の中で、該幹細胞が70〜90％集密度に増殖するのに十分な時間、すなわち該幹細胞及びそれらの子孫が、組織培養容器の培養表面エリアの70〜90％を占有するまで、培養されることができる。
【０１５７】
胎盤幹細胞は、培養容器内で細胞成長可能な密度で、播種することができる。例えば、細胞は、低密度(約1000〜約5000細胞/cm2)から高密度(例えば、約50,000又はそれ以上の細胞/cm2)まで播種されてよい。好ましい実施態様において、細胞は、空気中の二酸化炭素体積で約0〜約5％の状態で培養される。一部の好ましい実施態様において、細胞は、空気中に酸素が約2〜約25％存在するか、好ましくは、空気中に酸素が約5〜20％存在するときに、培養される。細胞は、好ましくは、約25℃〜約40℃で、好ましくは37℃で培養される。細胞は、好ましくは、インキュベーター内で培養される。培養培地は、静止しているか、又は例えばバイオリアクターを利用して撹拌することができる。胎盤幹細胞は、好ましくは、低い酸化的ストレス(例えば、グルタチオン、アスコルビン酸、カタラーゼ、トコフェロール、N-アセチルシステイン、等の添加と共に)下で成長させられる。
【０１５８】
一度70〜90％の集密度が得られると、細胞は、継代される。例えば、細胞は、それらを組織培養表面から分離するために、当該技術分野に周知の技術を用いて、酵素によって処理すること、例えば、トリプシン処理することができる。細胞をピペットで除去し、細胞を計数した後、約20,000〜100,000個の幹細胞、好ましくは、約50,000個の幹細胞が、新しい培養培地を含む新しい培養容器に継代される。典型的には、該新しい培地は、幹細胞が除去された培地と同じ種類である。本発明は、少なくとも、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、又は20回以上継代された胎盤幹細胞の集団を包含する。
【０１５９】
(5.4.3胎盤幹細胞集団)
本発明は、胎盤幹細胞の集団を提供する。胎盤幹細胞の集団は、１個以上の胎盤から直接単離することができ；すなわち、胎盤幹細胞の集団は、潅流液から得られるか、潅流液中に含まれた、又は消化物から得られるか、消化物中に含まれた胎盤幹細胞(すなわち、胎盤やその一部の酵素による消化によって得られる細胞の回収)を含む胎盤細胞の集団であってもよい。本発明の単離された胎盤幹細胞は、更に、培養され、増殖し、胎盤幹細胞集団を作成することができる。胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団は、また、培養され、増殖し、胎盤幹細胞集団を作成することができる。
【０１６０】
本発明の胎盤幹細胞の集団は、胎盤幹細胞、例えば、本明細書に記載の胎盤幹細胞を含む。多様な実施態様において、単離された胎盤幹細胞集団の中の細胞の少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、又は99％は、胎盤幹細胞である。すなわち、胎盤幹細胞の集団は、例えば、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％程度の非幹細胞を含むことができる。
【０１６１】
本明細書の実施態様において、基材は、細胞、例えば、胎盤幹細胞の培養及び/又は選択を行うことができる任意の表面であることができる。典型的に、基材は、プラスチック、例えば、組織培養皿又はマルチウェルプレートプラスチックである。組織培養プラスチックは、例えば、ラミニンやフィブロネクチンのような生体分子でコーティングすることができる。
【０１６２】
細胞、例えば胎盤幹細胞は、胎盤幹細胞の集団のために、細胞選択の分野において公知の任意の方法で選択することができる。例えば、細胞は、１種以上の細胞表面マーカーに対する抗体又は抗体類を使用して、例えば、フローサイトメトリー又はFACSにおいて選択することができる。選択は、磁気ビーズと複合された抗体を用いて達成することができる。ある一定の幹細胞と関連のマーカーに特異的な抗体は、当該技術分野において公知である。例えば、OCT-4に対する(Abcam社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州)、CD200に対する(Abcam社)、HLA-Gに対する(Abcam社)、CD73に対する(BD Biosciences Pharmingen社、サンディエゴ、カリフォルニア州)、CD105に対する(Abcam社；Bio Design International社、ソーコ、メイン州)抗体がある。他のマーカーに対する抗体も市販されており、例えば、CD34、CD38及びCD45が、例えば、StemCell Technologies社又はBio Design International社から入手可能である。
【０１６３】
単離された胎盤幹細胞の集団は、更に、幹細胞ではない胎盤細胞又は胎盤細胞ではない細胞を含むことができる。
【０１６４】
単離された胎盤幹細胞の集団は、１種以上の非幹細胞又は非胎盤細胞の集団と組み合わせることができる。例えば、胎盤幹細胞の単離された集団は、血液(例えば、胎盤血液又は臍帯血)、血液由来の幹細胞(例えば、胎盤血液又は臍帯血由来の幹細胞)、血液由来の有核細胞の集団骨髄由来の間葉系細胞、骨由来の幹細胞集団、生骨髄(crude bone marrow)、成体(体性)幹細胞、組織内に含まれた幹細胞の集団、培養された幹細胞、完全に分化された細胞の集団(例えば、軟骨細胞、線維芽細胞、羊膜細胞、骨芽細胞、筋細胞、心臓細胞等)などと組み合わせることができる。単離された胎盤幹細胞集団における細胞は、それぞれの集団において全有核細胞の数を比較して、約100,000,000:1、50,000,000:1、20,000,000:1、10,000,000:1、5,000,000:1、2,000,000:1、1,000,000:1、500,000:1、200,000:1、100,000:1、50,000:1、20,000:1、10,000:1、5,000:1、2,000:1、1,000:1、500:1、200:1、100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1；1:2；1:5；1:10；1:100；1:200；1:500；1:1,000；1:2,000；1:5,000；1:10,000；1:20,000；1:50,000；1:100,000；1:500,000；1:1,000,000；1:2,000,000；1:5,000,000；1:10,000,000；1:20,000,000；1:50,000,000；又は約1:100,000,000の割合で、他の種類の複数の細胞と組み合わせることができる。単離された胎盤幹細胞集団内における細胞は、また、複数の細胞型の複数の細胞と組み合わせることができる。
【０１６５】
一つにおいて、胎盤幹細胞の単離された集団は、複数の造血幹細胞と組み合わせられる。そのような造血幹細胞は、例えば、未処理の胎盤、臍帯血又は末梢血内に；胎盤血液、臍帯血又は末梢血からの全有核細胞内に；胎盤血液、臍帯血又は末梢血からのCD34+細胞の単離された集団内に；未処理の骨髄内に；骨髄からの全有核細胞内に；骨髄からのCD34+細胞の単離された集団内に、含まれることができる。
【０１６６】
(5.5 胎盤幹細胞の保存)
胎盤幹細胞は、保存することが、すなわち、長期間の貯蔵が可能となる条件、又は、例えばアポトーシスもしくは壊死などの細胞死を抑制する条件下に置くことができる。
【０１６７】
胎盤幹細胞は、例えば、2005年12月25日付で出願された「胎盤幹細胞を回収し保存するための改善された組成物及び組成物の使用法(Improved Composition for Collecting and Preserving Placental Stem Cells and Methods of Using the Composition)」と題された米国仮出願第60/754,969号に開示されたように、アポトーシス阻害剤、壊死阻害剤及び/又は酸素運搬ペルフルオロカーボンを含む組成物を使用して保存することができる。一実施態様において、本発明は、幹細胞の集団を保存する方法を提供するが、該方法は、アポトーシス阻害剤及び酸素運搬ペルフルオロカーボンを含む幹細胞回収した組成物と前記幹細胞の集団とを接触させることを含み、ここで前記アポトーシス阻害剤は、アポトーシス阻害剤と接触しない幹細胞の集団と比較して、幹細胞の集団においてアポトーシスを低減させるか、防止するのに十分な量及び時間存在する。具体的な実施態様において、前記アポトーシス阻害剤は、カスパーゼ阻害剤である。別の具体的な実施態様において、前記アポトーシス阻害剤は、JNK阻害剤である。より具体的な実施態様において、前記JNK阻害剤は、該幹細胞の分化又は増殖を調節しない。別の実施態様において、前記幹細胞回収した組成物は、分離された相で前記アポトーシス阻害剤及び前記酸素運搬ペルフルオロカーボンを含む。別の実施態様において、前記幹細胞回収した組成物は、前記アポトーシス阻害剤及び前記酸素運搬ペルフルオロカーボンをエマルジョン状で含む。別の実施態様において、前記幹細胞回収した組成物は、追加に、レシチンなどの乳化剤を含む。別の実施態様において、前記アポトーシス阻害剤及び前記ペルフルオロカーボンは、幹細胞と接触するとき、約0℃〜約25℃の間にある。別のより具体的な実施態様において、前記アポトーシス阻害剤及び前記ペルフルオロカーボンは、幹細胞と接触するとき、約2℃〜約10℃の間、又は約2℃〜約5℃の間にある。別のより具体的な実施態様において、前記接触は、前記幹細胞の集団を運搬する間に達成される。別のより具体的な実施態様において、前記接触は、前記幹細胞の集団を冷凍及び解凍する間に達成される。
【０１６８】
別の実施態様において、本発明は、胎盤幹細胞の集団を保存する方法を提供するが、該方法は、前記幹細胞の集団を、アポトーシス阻害剤及び臓器保存化合物と接触させることを含み、ここで前記アポトーシス阻害剤は、アポトーシス阻害剤と接触しない幹細胞の集団と比較して、幹細胞の集団においてアポトーシスを低減するか防止させるのに十分な量及び時間で存在する。具体的な実施態様において、前記臓器保存化合物は、UW溶液(米国特許第4,798,824号に開示され；またViaSpanとして知られており；Southardらの論文、Transplantation, 49(2):251-257(1990)も参照されたい)又はSternらの米国特許第5,552,267号に開示された溶液である。別の実施態様において、前記臓器保存化合物は、ヒドロキシエチルスターチ、ラクトビオン酸、ラフィノース、又はこれらの組み合わせである。別の実施態様において、前記幹細胞回収した組成物は、更に、酸素運搬ペルフルオロカーボンを、2相で或いはエマルジョンとして含む。
【０１６９】
本方法の別の実施態様において、潅流する間に、胎盤幹細胞は、アポトーシス阻害剤及び酸素運搬ペルフルオロカーボン、臓器保存化合物、又はこれらの組み合わせを含む幹細胞回収した組成物と接触される。別の実施態様において、前記幹細胞は、例えば、酵素による消化などの組織崩壊過程の間に接触される。別の実施態様において、胎盤幹細胞は、潅流による回収の後、又は酵素による消化などの組織崩壊による回収の後に、前記幹細胞回収化合物と接触される。
【０１７０】
典型的に、胎盤細胞回収、濃縮及び単離の間、酸素欠乏又は機械的ストレスによる細胞ストレスを最小化するか、除去することが好ましい。本方法の別の実施態様において、したがって、幹細胞又は幹細胞の集団は、前記保存時に、6時間未満で、回収、濃縮及び単離の間に酸素欠乏状態に曝露され、ここで酸素欠乏状態とは、酸素の濃度が、正常血液酸素濃度よりも低いことを意味する。より具体的な実施態様において、前記幹細胞の集団は、前記保存時に、2時間未満で、酸素欠乏状態に曝露される。別のより具体的な実施態様において、前記幹細胞の集団は、回収、濃縮又は単離の間に1時間未満又は30分未満で酸素欠乏状態に曝露されるか、或いは酸素欠乏状態に曝露されない。別の具体的な実施態様において、前記幹細胞の集団は、回収、濃縮又は単離の間にせん断応力に曝露されない。
【０１７１】
本発明の胎盤幹細胞は、例えば、アンプルなどの小型容器内の凍結保存培地において、凍結保存することができる。好適な凍結保存培地は、例えば、成長培地を含む培養培地、或いは細胞冷凍培地、例えば市販のC2695、C2639又はC6039(Sigma社)などの市販の細胞冷凍培地を含むが、これに限定されるものではない。凍結保存培地は、好ましくは、DMSO(ジメチルスルホキシド)を、例えば約10％(v/v)の濃度で含む。凍結保存培地は、追加的な試薬、例えば、メチルセルロース及び/又はグリセロールを含む。凍結保存時に、胎盤幹細胞は、好ましくは約1℃/分で冷却される。好ましい凍結保存温度は、約-80℃〜約-180℃、より好ましくは、約-125℃〜約-14O℃である。凍結保存した細胞は、使用のために解凍する前に、液体窒素に移すことができる。一部の実施態様において、例えば、アンプルが約-90℃に到逹すれば、それらは、液体窒素保存領域に移される。凍結保存した細胞は、好ましくは、約25℃〜約40℃の温度で、より好ましくは約37℃の温度で解凍される。
【０１７２】
(5.6胎盤幹細胞の使用)
(5.6.1 胎盤幹細胞を含む組成物)
本発明の腫瘍細胞抑制方法は、胎盤幹細胞、又はそれからの生体分子を含む組成物を使用することができる。同様に、複数の及び集団の本発明の胎盤幹細胞は、
任意の生理学的に許容し得る或いは医学的に許容し得る化合物、組成物又は研究や治療において使用するための装置と組み合わせることができる。
【０１７３】
(5.6.1.1凍結保存した胎盤幹細胞)
本発明の腫瘍細胞抑制性胎盤幹細胞集団は、保存すること、例えば、後続の使用のために凍結保存することができる。幹細胞などの細胞の凍結保存方法は、当該技術分野において周知である。胎盤幹細胞の集団は、個体に容易に投与可能な形態で調製することができる。例えば、本発明は、医療用として適切な容器内に収容されている胎盤幹細胞集団を提供する。そのような容器は、例えば、胎盤幹細胞の集団が容易に分注されることのできる無菌のプラスチック製バッグ、フラスコ、瓶又はその他の容器であってもよい。例えば、該容器は、血液バッグ又は他のプラスチック製のレシピエントへの液体の静脈投与に適した、医療用に許容し得るバッグであってもよい。容器は、好ましくは、組み合わせられた幹細胞集団の凍結保存を可能とするものである。
【０１７４】
凍結保存した腫瘍細胞抑制性胎盤幹細胞の集団は、単一ドナー由来の、又は複数のドナー由来の胎盤幹細胞を含むことができる。胎盤幹細胞の集団は、意図されたレシピエントに完全にHLAがマッチすることができ、又は部分的にもしくは完全にHLAがマッチしないこともある。
【０１７５】
したがって、一実施態様において、本発明は、容器内に腫瘍細胞抑制性胎盤幹細胞の集団を含む組成物を提供する。具体的な実施態様において、前記幹細胞集団は、凍結保存される。別の具体的な実施態様において、容器は、バッグ、フラスコ、又は瓶であってもよい。より具体的な実施態様において、前記バッグは、無菌のプラスチックバッグであってもよい。より具体的な実施態様において、前記バッグは、該胎盤幹細胞集団の静脈投与に好適であるか、静脈投与を可能とし、又は促進する。バッグは、投与の前又は投与の間に、該胎盤幹細胞が１種以上の他の溶液、例えば、薬物と混合されることを可能にする、互いに接続された複数の内腔(lumen)や区画を備えることができる。別の具体的な実施態様において、前記組成物は、組み合わせられた幹細胞集団の凍結保存を促進する、１種以上の化合物を含む。別の具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞の集団は、生理的に許容し得る水溶液の中に含まれている。より具体的な実施態様において、前記生理的に許容し得る水溶液は、0.9％NaCl溶液である。別の具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞の集団は、前記幹細胞集団のレシピエントにHLAマッチしている胎盤細胞を含む。別の具体的な実施態様において、前記組み合わせられた幹細胞集団は、前記幹細胞集団のレシピエントに少なくとも部分的にHLAがマッチしていない胎盤細胞を含む。別の具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、多数のドナー由来のものである。
【０１７６】
(5.6.1.2医薬組成物)
胎盤幹細胞の腫瘍細胞抑制性集団、又は胎盤幹細胞を含む細胞の集団は、インビボでの使用のための医薬組成物に製剤することができる。そのような医薬組成物は、インビボ投与のために、医薬として許容し得る担体、例えば食塩水又は他の許可された生理的に許容し得る溶液中に胎盤幹細胞の集団又は胎盤幹細胞を含む細胞の集団を含む。本発明の医薬組成物は、本明細書に記述された胎盤幹細胞の集団又は胎盤幹細胞類型のいずれかを含むことができる。この医薬組成物は、胎児、母親、又は胎児と母親の両方である胎盤幹細胞を含むことができる。本発明の医薬組成物は、更に、単一個体もしくは単一胎盤から得た胎盤幹細胞、又は複数の個体もしくは胎盤から得た胎盤幹細胞を含むことができる。
【０１７７】
本発明の医薬組成物は、胎盤幹細胞の腫瘍細胞抑制性の任意の数を含むことができる。例えば、胎盤幹細胞の単一単位量は、多様な実施態様において、約、少なくとも、又はわずかに1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011又はそれ以上の胎盤幹細胞を含むことができる。
【０１７８】
本発明の医薬組成物は、50％生存可能な細胞又はそれ以上を含む細胞の集団(すなわち、集団における前記細胞の少なくとも50％は、機能的であるか或いは生きている)を含む。好ましくは、集団における細胞の少なくとも60％は、生存可能である。より好ましくは、医薬組成物中の集団における細胞の少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％は、生存可能である。
【０１７９】
(5.6.1.3 胎盤幹細胞の馴化培地)
本発明の胎盤幹細胞は、腫瘍細胞抑制性である馴化倍地、すなわち複数の1種以上の腫瘍細胞型に対し検出可能な腫瘍細胞抑制作用を有する幹細胞によって分泌されるか排泄された１種以上の生体分子を含む培地を生成するのに使用することができる。多様な実施態様において、馴化倍地は、胎盤幹細胞が少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14日以上の間成長した培地を含むことができる。他の実施態様において、馴化倍地は、胎盤幹細胞がある少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％の集密度、又は最大100％の集密度まで成長した培地を含む。そのような馴化倍地は、胎盤幹細胞又は他の種類の幹細胞の分離された集団の培養を維持するために使用することができる。別の実施態様において、馴化倍地は、胎盤幹細胞が成体細胞型に分化されてきた培地を含む。別の実施態様において、本発明の馴化倍地は、胎盤幹細胞と非胎盤幹細胞が培養されてきた培地を含む。
【０１８０】
従って、一実施態様において、本発明は、胎盤幹細胞の培養から得られた培養培地を含有する組成物を提供し、ここで該胎盤幹細胞は、(a)基材に接着し；(b)CD200及びHLA-Gを発現し、もしくはCD73、CD105、及びCD200を発現し、もしくはCD200及びOCT-4を発現し、もしくはCD73、CD105、及びHLA-Gを発現し、もしくはCD73及びCD105を発現し、かつ該胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団が胚様体様組織体の形成を可能にする条件下で培養される場合に、該集団において1個以上の胚様体様組織体の形成を促進するか、又は、OCT-4を発現し、かつ該胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団が胚様体様組織体の形成を可能にする条件下で培養される場合に、該集団における1個以上の胚様体様組織体の形成を促進し；かつ(c)腫瘍細胞又は腫瘍細胞の集団の成長又は増殖を検出可能に抑制する。具体的な実施態様において、本組成物は、複数の該胎盤幹細胞を更に含む。別の具体的な実施態様において、本組成物は、複数の非胎盤細胞を含む。より具体的な実施態様において、前記非胎盤細胞は、CD34+細胞、例えば末梢血造血前駆細胞、臍帯血造血前駆細胞、もしくは胎盤血造血前駆細胞などの造血前駆細胞を含む。前記非胎盤細胞は、例えば骨髄由来の間葉系幹細胞などの間葉系幹細胞のような、他の幹細胞も含むことができる。前記非胎盤細胞は、成体細胞又は細胞株の1種以上の型であることもできる。別の具体的な実施態様において、本組成物は、抗増殖剤、例えば抗-MIP-1α又は抗-MIP-1β抗体を含む。
【０１８１】
具体的な実施態様において、胎盤幹細胞-馴化培養培地又は上清は、胎盤幹細胞の腫瘍細胞に対する比が約1:1、約2:1、約3:1、約4:1、又は約5:1で、複数の腫瘍細胞と共培養された複数の胎盤幹細胞から得られる。例えば、馴化培養培地又は上清は、約1×105個の胎盤幹細胞、約1×106個の胎盤幹細胞、約1×107個の胎盤幹細胞、又は約1×108個以上の胎盤幹細胞を含む培養物から得ることができる。別の具体的な実施態様において、馴化培養培地又は上清は、約1×105〜約5×105個の胎盤幹細胞及び約1×105個の腫瘍細胞；約1×106 〜約5×106個の胎盤幹細胞及び約1×106個の腫瘍細胞；約1×107〜約5×107個の胎盤幹細胞及び約1×107個の腫瘍細胞；又は、約1×108〜約5×108個の胎盤幹細胞及び約1×108個の腫瘍細胞を含む、共培養物から得られる。
【０１８２】
腫瘍細胞の成長又は増殖を抑制する方法の別の具体的な実施態様において、馴化培養培地又は上清は、単独で、又は腫瘍細胞と共培養された数多くの胎盤幹細胞を含む培養物由来の培養培地又は上清であり、ここで馴化培地を生成する胎盤細胞の数は、その馴化培地が投与される個体の体重を基にしている。例えば、馴化培養培地又は上清は、レシピエント体重1kg当たり約1×103個の胎盤幹細胞、5×103個の胎盤幹細胞/kg、1×104個の胎盤幹細胞/kg、5×104個の胎盤幹細胞/kg、1×105個の胎盤幹細胞/kg、5×105個の胎盤幹細胞/kg、1×106個の胎盤幹細胞/kg、5×106個の胎盤幹細胞/kg、1×107個の胎盤幹細胞/kg、5×107個の胎盤幹細胞/kg、又は1×108個の胎盤幹細胞/kgを含む培養物により生成される馴化培地又は上清であることができる。別の具体的な実施態様において、馴化培養培地又は上清は、約1×103〜約5×103個の胎盤幹細胞/kg及び約1×103個の腫瘍細胞/kg；約1×104〜約5×104個の胎盤幹細胞/kg及び約1×104個の腫瘍細胞/kg；約1×105〜約5×105個の胎盤幹細胞/kg及び約1×105個の腫瘍細胞/kg；約1×106〜約5×106個の胎盤幹細胞/kg及び約1×106個の腫瘍細胞/kg；約1×107〜約5×107個の胎盤幹細胞/kg及び約1×107個の腫瘍細胞/kg；又は、約1×108〜約5×108個の胎盤幹細胞/kg及び約1×108個の腫瘍細胞/kgを含有する共培養物から得ることができる。
【０１８３】
具体的な実施態様において、70kgの個体への投与に適した馴化培地は、培養培地約200mL中に胎盤幹細胞約7000万個で馴化された上清を含む。
【０１８４】
馴化培地は、投与可能な医薬等級の製品を調製するために、濃縮することができる。例えば、馴化培地は、例えば蒸発、凍結乾燥などにより、水を除去することにより、約90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％以上に濃縮することができる。具体的な実施態様において、例えば約7000万個の胎盤幹細胞からの200mL馴化培地を、容積約180mL、160mL、140mL、120mL、100mL、80mL、60mL、40mL、20mL又はそれ未満に濃縮することができる。この馴化培地は、例えば粉末にまで、実質的に乾燥することもできる。
【０１８５】
(5.6.1.4 胎盤幹細胞を含有するマトリックス)
本発明は更に、胎盤幹細胞の腫瘍細胞抑制性集団、又は腫瘍抑制量の胎盤幹細胞-馴化培地を含有する、例えばヒドロゲル、足場等のマトリックスを含む。
【０１８６】
本発明の胎盤幹細胞は、天然マトリックス、例えば、羊膜物質などの胎盤生体材料上に播種することができる。そのような羊膜物質は、例えば、哺乳類の胎盤から直接切除された羊膜；固定されたり、又は熱処理された羊膜、実質的に乾燥した(すなわち＜20％H2O)羊膜、絨毛膜、実質的に乾燥した絨毛膜、実質的に乾燥した羊膜及び絨毛膜などであり得る。その上に胎盤幹細胞を播種することのできる好ましい胎盤生体材料は、Haririによる米国特許出願第2004/0048796号に開示されている。ヒドロゲルのようなマトリックスは、胎盤幹細胞-馴化培地に浸すか又はこれを用いて調製することができる。
【０１８７】
本発明の胎盤幹細胞は、例えば、注射に適したヒドロゲル溶液中に懸濁されている。そのような組成物に適したヒドロゲルは、RAD16などの自己組織化ペプチドを含む。一実施態様において、これらの細胞を含むヒドロゲル溶液は、例えば金型内で硬化し、移植のためにその中に分散された細胞を含むマトリックスを形成する。そのようなマトリックス内の胎盤幹細胞は、更に培養することができ、よって、これらの細胞は、移植前に有糸分裂的に増殖される。ヒドロゲルは、例えば、ゲルを形成するために水分子をトラップする3次元的に開放格子構造を形成する共有結合、イオン結合、又は水素結合を介して架橋された有機高分子(天然又は合成)である。ヒドロゲルを形成する物質は、イオン的に架橋されるアルギン酸とその塩などの多糖類、ペプチド、ポリホスファジン、及びポリアクリレート、又は各々温度もしくはpHによって架橋されるポリエチレンオキシド-ポリプロピレングリコールブロック共重合体などのブロック重合体を含む。一部の実施態様において、本発明のヒドロゲル又はマトリックスは、生分解可能である。
【０１８８】
本発明の一部の実施態様において、製剤は、その場で重合反応を起こすことができるゲルを含む(例えば、米国特許出願第2002/0022676；Ansetheらの論文、J．Control Release，78(1-3): 199-209(2002)；Wangらの論文、Biomaterials、24(22): 3969-80(2003)を参照されたい)。
【０１８９】
一部の実施態様において、前記高分子は、少なくとも部分的に、水、緩衝塩溶液、又は帯電した側基もしくはそれらの1価のイオン塩を有するアルコール水溶液などの水溶液に溶解可能である。カチオンと反応することのできる酸性側基を含む高分子の例としては、ポリ(ホスファジン)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(メタクリル酸)、アクリル酸とメタクリル酸の共重合体、ポリ(酢酸ビニル)、及びスルホン化されたポリスチレンなどのスルホン化重合体が挙げられる。アクリル酸又はメタクリル酸とビニルエーテル単量体又は重合体の反応によって形成される酸性側基を含む共重合体が、また使用可能である。酸性基の例としては、カルボン酸基、スルホン酸基、ハロゲン化(好ましくは、フッ化)アルコール基、フェノールOH基、及び酸性OH基が挙げられる。
【０１９０】
本発明の胎盤幹細胞又はそれらの共培養物は、インビボに移植された3次元の骨組み又は足場上に播種することができる。そのような骨組みは、１種以上の成長因子、細胞、薬物又は組織形成を刺激するか、そうでなければ本発明の実施を強化もしくは改善する他の成分のうちのいずれかと組み合わせて、移植することができる。
【０１９１】
本発明で使用することができる足場の例としては、不織布マット、多孔性フォーム、又は自己組織化ペプチドを含む。不織布マットは、グリコール酸と乳酸の合成吸収性共重合体で構成された繊維を用いて形成することができる(例えば、PGA/PLA)(VICRYL、Ethicon社、サマービル、ニュージャージー州)。例えば、ポリ(ε-カプロラクトン)/ポリ(グリコール酸)(PCL/PGA)共重合体で構成されるフォームは、冷凍して乾燥(freeze-drying)もしくは凍結乾燥(lyophilization)などの方法(例えば、米国特許No.6,355,699を参照)により形成され、また足場として使用することができる。
【０１９２】
本発明の胎盤幹細胞は、更に、生理的に許容し得るセラミック物質上に播種するか、或いはこのようなセラミック物質と接触することができ、このようなセラミック物質は、以下を含むが、これらに限定されるものではない：モノ-、ジ-、トリ-、アルファ-トリ-、ベータ-トリ-、及びテトラ-カルシウムリン酸塩、ヒドロキシアパタイト、フルオロアパタイト、硫酸カルシウム、フッ化カルシウム、酸化カルシウム、炭酸カルシウム、マグネシウムカルシウムリン酸塩、BIOGLASS(登録商標)などの生物学的に活性であるガラス、及び、これらの混合物。現在市販の多孔性の生体適合性セラミック物質は、SURGIBONE(登録商標)(CanMedica社，カナダ)、ENDOBON(登録商標)(Merck Biomaterial France、フランス)、CEROS(登録商標)(Mathys、AG社、Bettlach、スイス)、並びにHEALOS（商標）(DePuy社、Raynham、マサチューセッツ州)及びVITOSS(登録商標)、RHAKOSS（商標）、及びCORTOSS(登録商標)(Orthovita社、マルヴァーン、ペンシルベニア州)などの無機物を含むコラーゲン骨移植製品を含む。骨組みは、天然及び/又は合成物質の混合物、配合物、又は複合物であってもよい。
【０１９３】
別の実施態様において、胎盤幹細胞は、例えば、PGA、PLA、PCL共重合体もしくは配合物、又はヒアルロン酸などの生体に吸収される物質からなるマルチフィラメント糸で構成することができるフェルト上に播種したり、又はフェルトと接触することができる。
【０１９４】
本発明の胎盤幹細胞は、別の実施態様において、複合構造であってもよいフォーム足場上に播種することができる。そのようなフォーム足場は、修復されるか、代替されるか又は増強されなければならない体内において特別な構造の部分のような、有用な形状に成形することができる。一部の実施態様において、骨組みは、例えば、0.1M酢酸で処理し、その後細胞付着を強化するために、本発明の細胞の接種前に、ポリリジン、PBS及び/又はコラーゲンの中での培養が伴われる。細胞の付着又は成長及び組織の分化を改善するために、マトリックスをプラズマ-コーティングすることにより、又は以下の物質のうちの１種以上を添加することにより、マトリックスの外部表面は修飾されてよい：タンパク質(例えば、コラーゲン、弾性纎維、細網繊維)、糖タンパク質、グリコサミノグリカン(例えば、ヘパリン硫酸、コンドロイチン-4-硫酸、コンドロイチン-6-硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸など)、細胞マトリックス、及び/又はゼラチン、アルギン酸、寒天、アガロース、植物ゴム等の他の物質、しかしこれらに限定されるものではない。
【０１９５】
一部の実施態様において、足場は、それを非血栓形成性とする物質を含むか、又はこれにより処理される。このような処理と物質は、また、内皮成長、移動、及び細胞外マトリックスの沈着を促進して、維持することができる。このような物質及び処理の例としては、ラミニン及びIV型コラーゲン等の基底膜タンパク質などの天然物質、並びにEPTFE及びPURSPAN(商標)(The Polymer Technology Group社、バークリー、カリフォルニア州)などの分断されたポリウレタン尿素シリコーンなどの合成物質を含むが、これらに限定されるものではない。この足場は、更に、ヘパリンなどの抗血栓剤を含むことができ；足場は、また、胎盤幹細胞とともに播種する以前に、処理されて、表面電荷を変更することができる(例えば、プラズマによるコーティング)。
【０１９６】
(5.6.2 併用療法)
本明細書において記述された胎盤幹細胞、及び胎盤幹細胞組成物は、1種以上の他の抗癌剤を含む、癌治療投薬計画の一部であることができる。そのような抗癌剤は、当該技術分野において周知である。癌を有する個体へ投与することができる具体的な抗癌剤は、以下を含むが、これらに限定されるものではない：アシビシン；アクラルビシン；塩酸アコダゾール；アクロニン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン；アンボマイシン；酢酸アメタントロン；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；塩酸ビサントレン；ジメシル酸ビスナフィド；ビゼレシン；硫酸ブレオマイシン；ブレキナルナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カルベチマー；カルボプラチン；カルムスチン；塩酸カルビシン；カルゼレシン；セデフィンゴール；セレコキシブ(COX-2阻害剤)；クロラムブシル；シロレマイシン；シスプラチン；クラドリビン；メシル酸クリスナトール；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；塩酸ダウノルビシン；デシタビン；デキソルマプラチン；デザグアニン；メシル酸デザグアニン；ジアジクォン；ドセタキセル；ドキソルビシン；塩酸ドキソルビシン；ドロロキシフェン；クエン酸ドロロキシフェン；プロピオン酸ドロモスタノロン；デュアゾマイシン；エダトレキサート；塩酸エフロミチン；エルサミツルシン；エンロプラチン；エンプロマート；エピプロピジン；塩酸エピルビシン；エルブロゾール；塩酸エソルビシン；エストラムスチン；リン酸エストラムスチンナトリウム；エタニダゾール；エトポシド；リン酸エトポシド；エトプリン；塩酸ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フロキシウリジン；リン酸フルダラビン；フルオロウラシル；フルロシタビン；ホスキドン；ホストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；塩酸ゲムシタビン；ヒドロキシ尿素；塩酸イダルビシン；イホスファミド；イルモホシン；イプロプラチン；イリノテカン；塩酸イリノテカン；酢酸ランレオチド；レトロゾール；酢酸ロイプロリド；塩酸リアロゾール；ロメトレキソールナトリウム；ロムスチン；塩酸ロソキサントロン；マソプロコール；マイタンシン；塩酸メクロレタミン；酢酸メゲストロール；酢酸メレンゲステロール；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキセート；メトトレキセートナトリウム；メトプリン；メツレデパ；ミチンドミド；ミトカルシン；ミトクロミン；ミトギリン；ミトマルシン；マイトマイシン；ミトスペル；ミトタン；塩酸ミトキサントロン；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン；パクリタキセル；ペガスパルガーゼ；ペリオマイシン；ペンタムスチン；硫酸ペプロマイシン；ペルホスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；塩酸ピロキサントロン；プリカマイシン；プロメスタン；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；塩酸プロカルバジン；ピューロマイシン；塩酸ピューロマイシン；ピラゾフリン；リボプリン；サフィンゴール；塩酸���フィンゴール；セムスチン；シムトラゼン；スパルフォセートナトリウム；スパルソマイシン；塩酸スピロゲルマニウム；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェヌル；タリソマイシン；テコガランナトリウム；タキソテレ；テガフル；塩酸テロキサントロン；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；クエン酸トレミフェン；酢酸トレストロン；リン酸トリシリビン；トリメトレキサート；グルクロン酸トリメトレキサート；トリプトレリン；塩酸ツブロゾール；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン；硫酸ビンブラスチン；硫酸ビンクリスチン；ビンデシン；硫酸ビンデシン；硫酸ビネピジン；硫酸ビングリシネート；硫酸ビンロイロシン；酒石酸ビノレルビン；硫酸ビンロシジン；硫酸ビンゾリジン；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；及び、塩酸ゾルビシン。
【０１９７】
他の抗癌剤は、以下を含むが、これらに限定されるものではない：20-エピ-1,25ジヒドロキシビタミンD3；5-エチニルウラシル；アビラテロン；アクラルビシン；アシルフルベン；アデシペノール；アドゼレシン；アルデスロイキン；ALL-TKアンタゴニスト；アルトレタミン；アンバムスチン；アミドックス； アミホスチン；アミノレブリン酸；アムルビシン；アムサクリン；アナグレリド；アナストロゾール；アンドログラホリド；血管新生阻害剤；アンタゴニストD；アンタゴニストG；アンタレリックス；抗-背方化形態形成タンパク質-1；抗男性ホルモン物質、前立腺癌；抗エストロゲン；アンチネオプラストン；アンチセンスオリゴヌクレオチド；グリシン酸アフィディコリン；アポトーシス遺伝子モジュレーター；アポトーシス調節因子；アプリン酸；アラ-CDP-DL-PTBA；アルギニンデアミナーゼ；アスラクリン；アタメスタン；アトリムスチン；アキシナスタチン1；アキシナスタチン2；アキシナスタチン3；アザセトロン；アザトキシン；アザチロシン；バッカチンIII誘導体；バラノール；バチマスタット；BCR/ ABLアンタゴニスト；ベンゾクロリン；ベンゾイルスタウロスポリン；βラクタム誘導体；β-アレチン；ベタクラマイシンB；ベツリン酸；bFGF阻害剤；ビカルタミド；ビサントレン；ビスアジリジニルスペルミン；ビスナフィド；ビストラテンA；ビゼレシン；ブレフレート；ブロピリミン；ブドチタン；ブチオニンスルホキシミン；カルシポトリオール；カルホスチンC；カンプトテシン誘導体；カペシタビン；カルボキシアミド-アミノ-トリアゾール；カルボキシアミドトリアゾール；CaRest M3；CARN 700；軟骨由来阻害因子；カルゼレシン；カゼインキナーゼ阻害剤(ICOS)；カスタノスペルミン；セクロピンB；セトロレリックス；クロリン類(chlorlns)；クロロキノキサリンスルホンアミド；シカプロスト；シス-ポルフィリン；クラドリビン；クロミフェン類似体；クロトリマゾール；コリスマイシンA；コリスマイシンB；コンブレタスタチンA4；コンブレタスタチン類似体；コナゲニン；クラムベシジン816；クリスナトール；クリプトフィシン8；クリプトフィシンA誘導体；キュラシンA；シクロペンタンセラキノン；シクロプラタム；シペマイシン；シタラビンオクフォスフェート；細胞溶解因子；サイトスタチン；ダクリキシマブ；デシタビン；デヒドロジデンミンB；デスロレリン；デキサメタゾン；デキシホスファミド；デキスラゾキサン；デクスベラパミル；ジアジクォン；ジデムニンB；ジドックス；ジエチルノルスペルミン；ジヒドロ-5-アザシチジン；ジヒドロタキソール, 9-；ジオキサマイシン；ジフェニルスピロムスチン；ドセタキセル；ドコサノール；ドラセトロン；ドキシフルリジン；ドキソルビシン；ドロロキシフェン；ドロナビノール；デュオカルマイシンSA；エブセレン；エコムスチン；エデルホシン；エドレコロマブ；エフロルニチン；エレメネ；エミテフル；エピルビシン；エプリステリド；エストラムスチン類似体；エストロゲンアゴニスト；エストロゲンアンタゴニスト；エタニダゾール；リン酸エトポシド；エクセメスタン；ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フィルグラスチム；フィナステリド；フラボピリドール；フレゼラスチン；フルアステロン；フルダラビン；塩酸フルオロダウノルビシン；ホルフェニメクス；ホルメスタン；ホストリエシン；ホテムスチン；ガドリニウムテキサフィリン；硝酸ガリウム；ガロシタビン；ガニレリックス；ゼラチナーゼ阻害剤；ゲムシタビン；グルタチオン阻害剤；ヘプスルファム；ヘレグリン；ヘキサメチレンビスアセトアミド；ヒペリシン；イバンドロン酸；イダルビシン；イドキシフェン；イドラマントン；イルモホシン；イロマスタット；イマチニブ(例えば、GLEEVEC(登録商標))、イミキモド；免疫賦活ペプチド；インスリン-様増殖因子-1受容体阻害剤；インターフェロンアゴニスト；インターフェロン；インターロイキン；イオベングアン；ヨードドキソルビシン；イポメアノール, 4-；イロプラクト；イルソグラジン；イソベンガゾール；イソホモハリコンドリンB；イタセトロン；ジャスプラキノリド；カハラリドF；ラメラリン-N三酢酸；ランレオチド；レイナマイシン；レノグラスチム；硫酸レンチナン；レプトールスタチン；レトロゾール；白血病抑制因子；白血球αインターフェロン；ロイプロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン；ロイプロレリン；レバミソール；リアロゾール；直鎖ポリアミン類似体；親油性二糖ペプチド；親油性白金化合物；リソクリナミド7；ロバプラチン；ロンブリシン；ロメトレキソール；ロニダミン；ロソキサントロン；ロキソリビン；ルルトテカン；ルテチウムテキサフィリン；リソフィリン；細胞溶解性ペプチド；マイタンシン；マンノスタチンA；マリマスタット；マソプロコール；マスピン；マトリリシン阻害剤；マトリクスメタロプロテイナーゼ阻害剤；メノガリル；メルバロン；メテレリン；メチオニナーゼ；メトクロプラミド；MIF阻害剤；ミフェプリストン；ミルテホシン；ミリモスチム；ミトグアゾン；ミトラクトール；マイトマイシン類似体；ミトナフィド；マイトトキシン線維芽細胞増殖因子-サポリン；ミトキサントロン；モファロテン；モルグラモスチム；エルビタックス, ヒト絨毛膜ゴナドトロピン；モノホスホリルリピドA＋ミオバクテリウム細胞壁sk；モピダモール；マスタード系抗癌剤；マイカペルオキシドB；マイコバクテリア細胞壁抽出物；ミリアポロン；N-アセチルジナリン；N-置換ベンズアミド；ナファレリン；ナグレスチップ；ナロキソン＋ペンタゾシン；ナパビン；ナフテルピン；ナルトグラスチム；ネダプラチン；ネモルビシン；ネリドロン酸；ニルタミド；ニサマイシン；一酸化窒素モジュレーター；ニトロキシド抗酸化剤；ニトルリン；オブリメルセン(GENASENSE(登録商標))；O6-ベンジルグアニン；オクトレオチド；オキセノン；オリゴヌクレオチド；オナプリストン；オンダンセトロン；オンダンセトロン；オラシン；経口サイトカイン誘導薬；オルマプラチン；オサテロン；オキサリプラチン；オキサウノマイシン；パクリタキセル；パクリタキセル類似体；パクリタキセル誘導体；パラウアミン；パルミトイルリゾキシン；パミドロン酸；パナキシトリオール；パノミフェン；パラバクチン；パゼリプチン；ペガスパルガーゼ；ペルデシン；ペントサンポリ硫酸ナトリウム；ペントスタチン；ペントロゾール；ペルフルブロン；ペルホスファミド；ペリリルアルコール；フェナジノマイシン；酢酸フェニル；ホスファターゼ阻害剤；ピシバニール；塩酸ピロカルピン；ピラル���シン；ピリトレキシム；プラセチンA；プラセチンB；プラスミノーゲン活性化因子阻害剤；白金錯体；白金化合物；白金-トリアミン錯体；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニソン；プロピルビスアクリドン；プロスタグランジンJ2；プロテアソーム阻害剤；プロテインA-ベースの免疫調節因子；プロテインキナーゼC阻害剤；プロテインキナーゼC阻害剤, 微細藻類；タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤；プルプリン；ピラゾロアクリジン；ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレン複合体；rafアンタゴニスト；ラルチトレキセド；ラモセトロン；rasファルネシルタンパク質転移酵素阻害剤；ras阻害剤；ras-GAP阻害剤；脱メチル化レテリプチン；レニウムRe186エチドロン酸；リゾキシン；リボザイム；RIIレチナミド；ロヒツキン；ロムルチド；ロキニメクス；ルビギノンB1；ルボキシル；サフィンゴール；サイントピン；SarCNU；サルコフィトールA；サルグラモスチム；Sdi 1模倣薬；セムスチン；老化由来インヒビター1；センスオリゴヌクレオチド；シグナル伝達阻害剤；シゾフィラン；ソブゾキサン；ボロカプタートナトリウム；フェニル酢酸ナトリウム；ソルベロール；ソマトメジン結合タンパク質；ソネルミン；スパルホス酸；スピカマイシンD；スピロムスチン；スプレノペンチン；スポンジスタチン1；スクアラミン；スチピアミド；ストロメライシン阻害剤；スルフィノシン；超反応性血管作用性腸ペプチドアンタゴニスト；スラジスタ；スラミン；スワインソニン；タリムスチン；タモキシフェンメチオジド；タウロムスチン；タザロテン；テコガランナトリウム；テガフル；テルラピリリウム；テロメラーゼ阻害剤；テモポルフィン；テニポシド；テトラクロロデカオキシド；テトラゾミン；タリブラスチン；チコラリン；トロンボポエチン；トロンボポエチン模倣薬；チマルファシン；チモポイエチン受容体アゴニスト；チモトリナン；甲状腺刺激ホルモン；スズエチルエチオプルプリン；チラパザミン；二塩化チタノセン；トプセンチン；トレミフェン；翻訳阻害剤；トレチノイン；トリアセチルウリジン；トリシリビン；トリメトレキサート；トリプトレリン；トロピセトロン；ツロステリド；チロシンキナーゼ阻害剤；チルホスチン；UBC阻害剤；ウベニメクス；尿生殖洞-由来増殖阻害因子；ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト；バプレオチド；バリオリン(variolin)B；ベラレソール；ベラミン；ベルジン；ベルテポルフィン；ビノレルビン；ビンキサルチン；ビタキシン；ボロゾール；ザノテロン；ゼニプラチン；ジラスコルブ；及び、ジノスタチンスチマラマー。
【０１９８】
(5.6.3 アッセイ)
本発明の胎盤幹細胞は、胎盤幹細胞の腫瘍細胞増殖を抑制する能力を増強する化合物又は組成物を同定するためのアッセイにおいて使用することができる。好ましくは、本アッセイは、その増殖がそのような化合物又は組成物の非存在下で腫瘍細胞により抑制され得る癌型について使用される。
【０１９９】
好ましい実施態様において、本発明の胎盤幹細胞は、被験化合物及び腫瘍細胞、例えば腫瘍細胞株と一緒にされ、並びに例えば被験化合物の存在及び非存在下で、胎盤幹細胞の腫瘍細胞に対する作用が決定される。被験化合物が存在時に、その非存在時と比べ、腫瘍細胞増殖が検出可能に低下された場合に、被験化合物は、胎盤幹細胞の腫瘍細胞を抑制する能力を増強する。一実施態様において、例えば、本発明は、胎盤幹細胞による腫瘍抑制を増強する化合物を同定する方法を提供するが、該方法は、第一の複数の幹細胞を、第二の複数の腫瘍細胞と、該化合物の存在下、腫瘍細胞増殖を可能にする条件で接触することを含み、ここで該化合物は、該化合物と接触していない複数の腫瘍細胞と比べ腫瘍細胞増殖において検出可能な変化を引き起こし、該化合物は、胎盤幹細胞による腫瘍抑制を増強する化合物として同定される。第一の複数及び第二の複数は、同じ数の細胞、又は異なる数の細胞であることができる。具体的な実施態様において、前記腫瘍細胞は、生検由来の腫瘍細胞である。別の具体的な実施態様において、前記腫瘍細胞は、腫瘍細胞株由来の細胞である。
【０２００】
また、本発明は、化合物のパネル又はセットから、胎盤幹細胞による腫瘍細胞増殖の抑制を最も良く増強する化合物又は複数の化合物を同定する方法を提供する。様々な癌は異なる遺伝的及び生化学的起源及び特徴を有し、並びに病因は異なるので、異なる化合物は、胎盤幹細胞による腫瘍細胞抑制の増強においてより効果的であるか又は余り効果的でないことがある。例えばこのような化合物のパネル又はセットは、先の5.6.2節に列記された抗癌化合物又は抗新生物形成化合物などであるが、これらに限定されるものではない、抗癌化合物又は抗新生物形成化合物のパネル又はセットであることができる。このような実施態様において、例えば癌を有する個体から得られた腫瘍細胞は、胎盤幹細胞の存在下で、化合物のパネルで試験し、該個体を治療するのに最も適している1つ又は複数の該抗癌化合物又は抗新生物化合物を同定することができる。
【０２０１】
従って一実施態様において、本発明は、複数の化合物中の各化合物について、第一の複数の幹細胞と第二の複数の腫瘍細胞を、腫瘍細胞増殖を可能にする条件で、該複数の化合物中の化合物の存在下で接触すること、及び該化合物と接触されない複数の腫瘍細胞と比べ、腫瘍細胞増殖を予め決定された標準よりもより大きい程度まで増強する、該複数の化合物中の1種以上の該化合物を同定することを含む、複数の化合物から化合物を選択する方法を提供する。このような予め決定された標準は、例えば該複数の化合物において該化合物の最大程度の増強を示す該複数の化合物中の化合物であることができ；該複数の化合物の中の2、3、4、5、6、7、8、9又は10種の化合物は、最大程度の増強を示し；該複数の化合物中の該化合物の上位5％、10％、15％、20％は、最大程度の増強を示し；該複数の化合物のいずれかは、胎盤幹細胞の腫瘍細胞抑制作用を増強する。好ましくは本方法は、前記癌を有する個体へ投与するための1、2、3、4又は5種の化合物を選択するために使用される。
【実施例】
【０２０２】
(6. 実施例)
(6.1 実施例1：胎盤幹細胞の培養)
胎盤幹細胞は、潅流によるか又は物理的崩壊、例えば、酵素による消化によって、分娩後の哺乳類の胎盤から得られる。これらの細胞は、以下を含む培養培地内で培養する：60％DMEM-LG(Gibco社)、40％MCDB-201(Sigma社)、2％ウシ胎仔血清(FCS)(Hyclone Laboratories)、1×インスリン-トランスフェリン-セレニウム(ITS)、1×リノール酸-ウシ血清-アルブミン(LA-BSA)、10-9Mデキサメタゾン(Sigma社)、10-4Mアスコルビン酸2-リン酸塩(Sigma社)、上皮成長因子(EGF)10ng/ml(R&D Systems社)、血小板由来の成長因子(PDGF-BB)10ng/ml(R&D Systems社)、及び100Uペニシリン/1000Uストレプトマイシン。
【０２０３】
その中で該細胞が培養される培養フラスコは、下記のように調製する。T75フラスコは、5ng/mlヒトFN(Sigma社 F0895)を含む5mlPBSをフラスコに添加することにより、フィブロネクチン(FN)でコーティングされる。FN溶液と共に該フラスコは、37℃で30分間放置する。FN溶液は、その後、細胞培養の前に除去する。処理後、フラスコを乾燥する必要はない。或いは、フラスコは、FN溶液と接触した状態で、4℃で一晩又はより長い時間放置し；培養前に、フラスコを温め、FN溶液は除去する。
【０２０４】
（潅流により単離された胎盤幹細胞）
胎盤潅流液からの胎盤幹細胞の培養は、次のようにして確立する。Ficoll勾配遠心分離で得た細胞は、FNがコーティングしたT75フラスコ中に播種し、上記の通り、15mlの培養培地において50〜100×106個細胞/フラスコで調製する。典型的には、5〜10フラスコに播種する。フラスコは、37℃で12〜18時間培養し、付着細胞の付着を可能にする。10mlの温PBSを、それぞれのフラスコに添加し懸濁状態の細胞を除去し、穏やかに混合する。その後15mLの培地を除去し、15mLの新しい培養培地に取り替える。すべての培地は、培養開始後3〜4日おきに変える。後続の培養培地の交換は、培地の50％又は7.5mlが除去される間に達成する。
【０２０５】
約12日目にスタートし、培養物は、顕微鏡の下でチェックし付着細胞コロニーの成長を検査する。細胞培養が約80％集密となり始めた時点で、典型的には培養開始後の13日目〜18日目の間に、付着細胞がトリプシン消化によって採取される。このような初代培養から採取された細胞は、継代0(ゼロ)と称する。
【０２０６】
（物理的崩壊及び酵素消化によって単離された胎盤幹細胞）
胎盤幹細胞の培養物は、以下のように消化された胎盤組織から確立する。潅流された胎盤は、無菌のペーパシート上に母体側が上方に向かうように置く。胎盤の母体側の約0.5cmの表面層をブレードで擦り落とし、このブレードを用い、約1×2×1cmの胎盤組織ブロックを除去する。この胎盤組織は、その後、約1mm3小片に細かく切る。このような小片は、50mlファルコンチューブ内に回収し、コラゲナーゼIA(2mg/ml、Sigma社)で30分間消化し、続いて、トリプシン-EDTA(0.25％、GIBCOBRL社)によって10分間、37℃の水浴中で処理する。得られる溶液は、室温で10分間、400gで遠心分離し、消化液を除去する。ペレットは、PBSにより約10倍体積に再懸濁し(例えば、5mlペレットは45ml PBSにより再懸濁する)、更に、チューブを、室温で、10分間400gが遠心分離する。組織/細胞ペレットは、130mL培養培地の中で再懸濁し、細胞は、フィブロネクチンがコーティングされたT-75フラスコ当たり13mlで播種する。細胞は、5％CO2を含む湿気のある環境において37℃で培養する。胎盤幹細胞は、この段階において任意に凍結保存する。
【０２０７】
(胎盤幹細胞の継代培養及び増殖）
凍結保存した細胞は、直ちに37℃の水浴内で解凍する。胎盤幹細胞は、直ちに冷凍容器から10mlの温培地とともに除去し、15mlの無菌チューブに移す。細胞は、400gで10分間室温で遠心分離を行う。細胞は、ピペッティングすることにより、10mlの温培養培地内に穏やかに再懸濁し、生存可能な細胞の総数を、トリパンブルー排除試験によって測定する。細胞は、その後、1cm2当たり6000〜7000個細胞で、上記の通りに調製された、FNコーティングフラスコ内に播種する(T-75フラスコ1個当たり約5×105個細胞)。細胞は、37℃、5％CO2及び90％湿度で培養する。細胞が75〜85％の集密度に到逹したとき、すべての使用済みの培地は、フラスコから無菌状態で除去し、廃棄する。3mlの0.25％トリプシン/EDTA(w/v)溶液を添加し、細胞層を覆い、これらの細胞は、37℃、5％CO2及び90％湿度で5分間培養する。フラスコは、1、2回軽く叩いて、細胞剥離を促進する。95％より多い細胞が丸くなって剥離されると、7mlの温培養培地がそれぞれのT-75フラスコに添加し、溶液を、数回、細胞層表面にピペッティングで分散する。
【０２０８】
上記のように細胞をカウントし、生存能力を測定した後、細胞は、1000RPMで5分間、室温で遠心分離を行う。細胞は、培養培地と共に１つのT-75フラスコから細胞ペレットを穏やかに再懸濁して、2個のFNコーティングT-75フラスコ上に細胞を平らに平板培養することにより継代する。
【０２０９】
上記の方法を用いて、付着胎盤幹細胞の集団は、マーカーCD105、CD117、CD33、CD73、CD29、CD44、CD10、CD90及びCD133は発現するが、CD34又はCD45は発現しないことが同定された。これらの細胞は、HLA-ABC及び/又はHLA-DRは、発現しても発現しなくともよい。
【０２１０】
(6.2 実施例2：胎盤構造からの幹細胞の単離)
(6.2.1 材料及び方法）
(6.2.1.1 対象の表現型の単離）
胎盤細胞の5種の個別の集団は、正常な満期妊娠の胎盤から採取した。すべてのドナーは、研究目的のための彼女らの胎盤の使用に対して、完全な書面による同意書を提供した。以下の5種の胎盤細胞の集団を試験した:(1)胎盤潅流液(胎盤血管系の潅流から)；並びに、(2)羊膜、(3)絨毛膜、(4)羊膜-絨毛膜板；及び、(5)臍帯の酵素による消化。多様な胎盤組織は、無菌のPBS(Gibco-Invitrogen社、カールズバッド、カリフォルニア州)において洗浄し、個別の無菌のペトリ皿上に置いた。多様な組織は、無菌の外科用メスを使用して細かく切り刻み、50mLのファルコンコニカルチューブ内に置いた。細かく切り刻んだ組織は、1×コラゲナーゼ(Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州)で20分間、37℃の水浴中で消化し、遠心分離し、その後、0.25％トリプシン-EDTA(Gibco-Invitrogen社)で10分間、37℃の水浴中で消化した。多様な組織は、消化後に遠心分離し、無菌のPBS(Gibco-Invitrogen社)で一回洗浄した。次に再構成された細胞は、2回ろ過するが、一回は、100μm細胞ろ過器で、もう一回は30μmの分離フィルタでろ過し、残存する細胞外マトリックス又は細胞片を除去した。
【０２１１】
(6.2.1.2 細胞生存能力評価及び細胞数)
手作業のトリパンブルー排除法を、消化後に使用し、細胞数を計算し、細胞の生存能力を評価した。細胞は、トリパンブルー染料(Sigma-Aldrich社)と1:1の比率で混合され、細胞の生存能力は、血球計を用いて決定した。
【０２１２】
(6.2.1.3細胞表面マーカーの特徴付け)
HLA ABC-/CD45-/CD34-/CD133+である細胞を、特徴付けのために選択した。このような表現型を有する細胞は、2種のBecton-Dickinsonフローサイトメトリー、FACS Calibur及びFACS Aria(Becton-Dickinson社、サンノゼ、カリフォルニア州、米国)によって同定し、定量し、特徴付けした。多様な胎盤細胞を、100万個の細胞当たり抗体約10μLの比で、振盪機上で、室温で30分間染色した。以下の抗ヒト抗体を使用した：フルオレセインイソチオシアネート(FITC)が結合された、HLA-Gに対するモノクローナル抗体(Serotec社、ローリー、ノースカロライナ州)、CD10に対するモノクローナル抗体(BD Immunocytometry systems社、サンノゼ、カリフォルニア州)、CD44に対するモノクローナル抗体(BD Biosciences Pharmingen社、サンノゼ、カリフォルニア州)、及びCD105に対するモノクローナル抗体(R&D Systems社、ミネアポリス、ミネソタ州)；フィコエリトリン(PE)が結合されたCD44、CD200、CD117、及びCD13に対するモノクローナル抗体(BD Biosciences Pharmingen社)；フィコエリトリン-Cy5(PECy5)が結合されたストレプトアビジンとCD117に対するモノクローナル抗体(BD Biosciences Pharmingen社)；フィコエリトリン-Cy7(PECy7)が結合されたCD33及びCD10に対するモノクローナル抗体(BD Biosciences社)；アロフィコシアニン(APC)が結合されたストレプトアビジンとCD38に対するモノクローナル抗体(BD Biosciences Pharmingen社)；及び、ビオチン化CD90(BD Biosciences Pharmingen社)。培養後に、細胞を一回洗浄し、結合されていない抗体を除去し、4％パラホルムアルデヒド(USB社、クリーブランド、オハイオ州)により、4℃で一晩固定した。翌日、細胞を2回洗浄し、30μm分離フィルタを通じてろ過し、フローサイトメトリー上で評価した。
【０２１３】
抗マウスIgG抗体(BD Biosciences Pharmingen社)で染色された試料は、陰性対照として使用し、光電管(PMT)を調節するために使用した。抗ヒト抗体で一回染色した試料は、陽性対照として使用し、スペクトルの重複/補償を調節するために使用した。
【０２１４】
(6.2.1.4 細胞選別及び培養)
(潅流液、羊膜、又は絨毛膜から採取した)胎盤細胞の1つのセットを、7-アミノ-アクチノマイシンD(7AAD；BD Biosciences Pharmingen社)及び対象とする表現型に対して特異的なモノクローナル抗体で染色した。これらの細胞は、細胞100万個当たり抗体10μLの比で染色し、振盪機上室温で30分間培養した。次いで、これらの細胞は、BD FACS Aria上で対象とする表現型を発現する生きている細胞に対して陽性に選別され、培養基中で平板培養した。選別された(対象とする集団)及び「全」(選別されない)胎盤細胞集団を、比較のために平板培養した。これらの細胞を、フィブロネクチン(Sigma-Aldrich社)がコーティングされた96ウェルプレート上で、表1に示された細胞密度(細胞/cm2)で平板培養した。細胞密度、並びに細胞が2回反復で或いは3回反復で平板培養されたかどうかが判定され、対象とする表現型を発現した細胞の数を決定した。
【表１】
0005469457.tif 000002
【０２１５】
完全培地(60％DMEM-LG(Gibco社)及び40％MCDB-201(Sigma社)；2％ウシ胎仔血清(Hyclone Labs社)；1×インスリン-トランスフェリン-セレン(ITS)；1×リノール酸-ウシ血清アルブミン(LA-BSA)；10-9Mデキサメタゾン(Sigma社)；10-4Mアスコルビン酸2-リン酸塩(Sigma社)；上皮成長因子10ng/mL(R&D Systems社)；及び、血小板由来の成長因子(PDGF-BB)10ng/mL(R&D Systems社))を、96ウェルプレートのそれぞれのウェルに添加し、プレートは、5％CO2/37℃インキュベーター内に置いた。7日目に、完全培地100μLを、それぞれのウェルに添加した。96ウェルプレートは、約2週間モニタリングし、培養の最終評価は、12日目に完了した。
【０２１６】
(6.2.1.5 データ解析)
FACS Caliburデータは、FlowJo(Tree star社)で標準的なゲーティング技術を用い解析した。BD FACS Ariaデータは、FACSDivaソフトウェア(Becton-Dickinson社)を用いて解析した。FACS Ariaデータは、標準的なゲーティング技術だけではなく、ダブレット(doublet)を最小化する、ダブレット識別ゲーティング技術を用いて解析した。すべての結果は、マイクロソフトエクセルに集計されており、ここで、すべての値は、平均±標準偏差(数、平均標準誤差)で示されている。
【０２１７】
(6.2.2 結果)
(6.2.2.1 細胞生存能力)
消化後の生存能力は、手検査トリパンブルー排除法を用いて評価した(図1)。大多数の(羊膜、絨毛膜又は羊膜-絨毛膜板からの)消化された組織から得た細胞の平均生存能力は、約70％であった。羊膜は、74.35％±10.31％(n＝6、SEM＝4.21)の平均生存能力を有し、絨毛膜は、78.18％±12.65％(n＝4、SEM＝6.32)の平均生存能力を有し、羊膜-絨毛膜板は、69.05％±10.80％(n＝4、SEM＝5.40)の平均生存能力を有し、臍帯は、63.30％±20.13％(n＝4、SEM＝10.06)の平均生存能力を有した。消化過程を経ていない潅流からの細胞は、最高の平均生存能力、89.98±6.39％(n＝5、SEM＝2.86)を維持した。
【０２１８】
(6.2.2.2細胞定量化)
胎盤由来の細胞の5種の個別の集団を、HLA ABC-/CD45-/CD34-/CD133+細胞の数を測定するために解析した。BD FACS Caliburデータの解析から、羊膜、潅流液及び絨毛膜は、最大合計数のこのような細胞、それぞれ30.72±21.80細胞(n＝4、SEM＝10.90)、26.92±22.56細胞(n＝3、SEM＝13.02)、及び18.39±6.44細胞(n＝2、SEM＝4.55)を含むものと観察された。羊膜-絨毛膜板及び臍帯は、対象とする表現型を発現する、最も少ない合計数の細胞、それぞれ、4.72±4.16細胞(n＝3、SEM＝2.40)と3.94±2.58細胞(n＝3、SEM＝1.49)とを含んでいた。
【０２１９】
同様に、対象とする表現型を発現する全体細胞の割合を解析した場合、羊膜と胎盤潅流液が、この表現型を発現する細胞のもっとも高い百分率を含むものと観察された(それぞれ、0.0319％±0.0202％(n＝4、SEM＝0.0101)及び0.0269％±0.0226％(n＝3、SEM＝O.0130)(図2))。臍帯は、少数の対象とする表現型を発現する細胞を含んでいるが(図2)、臍帯は、対象とする表現型を発現する細胞の第3番目で高い百分率、0.020±0.0226％(n＝3、SEM＝0.0131)を含んでいた(図2)。絨毛膜と羊膜-絨毛膜板は、対象とする表現型を発現する細胞のもっとも低い百分率、それぞれ、0.0184±0.0064％(n＝2、SEM＝0.0046)及び0.0177±0.0173％(n＝3、SEM＝0.010)を含んでいた(図2)。
【０２２０】
BD FACSCalibur解析結果と一致するように、BD FACS Ariaデータも、また、羊膜、潅流液及び絨毛膜が、残りの給源と比較して、HLA ABC-/CD45-/CD34-/CD133+細胞の高い数を提供するものと確認された。羊膜、潅流液及び絨毛膜の中で対象とする表現型を発現する細胞の平均合計数は、それぞれ、126.47±55.61細胞(n＝15、SEM＝14.36)、81.65±34.64細胞(n＝20、SEM＝7.75)、及び51.47±32.41細胞(n＝15、SEM＝8.37)であった。羊膜-絨毛膜板及び臍帯は、対象とする表現型を発現する、最も少ない合計数の細胞、それぞれ、44.89±37.43細胞(n＝9、SEM＝12.48)と11.00±4.03細胞(n＝9、SEM＝1.34)とを含んでいた。
【０２２１】
BD FACS Ariaデータは、B及びA細胞給源がもっとも高い百分率のHLA ABC-/CD45-/CD34-/CD133+細胞を含む、すなわち、それぞれ0.1523±0.0227％(n＝15、SEM＝0.0059)及び0.0929±0.0419％(n＝20、SEM＝0.0094)を含むことを明らかにした(図3)。D細胞給源は、対象とする表現型を発現する細胞の3番目に高い百分率、0.0632±0.0333％(n＝9、SEM＝0.0111)を含んでいた(図3)。C及びE細胞給源は、対象とする表現型を発現する細胞のもっとも低い百分率、それぞれ、0.0623±0.0249％(n＝15、SEM＝0.0064)及び0.0457±0.0055％(n＝9、SEM＝0.0018)を含んでいた(図3)。
【０２２２】
HLA ABC-/CD45-/CD34-/CD133+細胞が、それぞれの細胞給源から同定されて、定量された後に、その細胞は、更に、細胞表面マーカーHLA-G、CD10、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200、及びCD105の発現に対して解析し、特徴付けた。
【０２２３】
(6.2.2.3胎盤潅流液由来の細胞)
潅流液由来の細胞は、一貫して、HLA-G、CD33、CD117、CD10、CD44、CD200、CD90、CD38、CD105、及びCD13に対して陽性であった(図4)。潅流液由来の細胞に対するそれぞれのマーカーの平均発現は、以下のとおりである:細胞の37.15％±38.55％(n＝4、SEM＝19.28)は、HLA-Gを発現し；細胞の36.37％±21.98％(n＝7、SEM＝8.31)は、CD33を発現し；細胞の39.39％±39.91％(n＝4、SEM＝19.96)は、CD117を発現し；細胞の54.97％±33.08％(n＝4、SEM＝16.54)は、CD10を発現し；細胞の36.79％±11.42％(n＝4、SEM＝5.71)は、CD44を発現し；細胞の41.83％±19.42％(n＝3、SEM＝11.21)は、CD200を発現し；細胞の74.25％±26.74％(n＝3、SEM＝15.44)は、CD90を発現し；細胞の35.10％±23.10％(n＝3、SEM＝13.34)は、CD38を発現し；細胞の22.87％±6.87％(n＝3、SEM＝3.97)は、CD105を発現し；そして、細胞の25.49％±9.84％(n＝3、SEM＝5.68)は、CD13を発現した。
【０２２４】
(6.2.2.4羊膜由来の細胞)
羊膜由来の細胞は、一貫して、HLA-G、CD33、CD117、CD10、CD44、CD200、CD90、CD38、CD105、及びCD13に対して陽性であった(図5)。羊膜由来の細胞に対するそれぞれのマーカーの平均発現は、以下のとおりである:細胞の57.27％±41.11％(n＝3、SEM＝23.73)は、HLA-Gを発現し；細胞の16.23％±15.81％(n＝6、SEM＝6.46)は、CD33を発現し；細胞の62.32％±37.89％(n＝3、SEM＝21.87)は、CD117を発現し；細胞の9.71％±13.73％(n＝3、SEM＝7.92)は、CD10を発現し；細胞の27.03％±22.65％(n＝3、SEM＝13.08)は、CD44を発現し；細胞の6.42％±0.88％(n＝2、SEM＝0.62)は、CD200を発現し；細胞の57.61％±22.10％(n＝2、SEM＝15.63)は、CD90を発現し；細胞の63.76％±4.40％(n＝2、SEM＝3.11)は、CD38を発現し；細胞の20.27％±5.88％(n＝2、SEM＝4.16)は、CD105を発現し；そして、細胞の54.37％±13.29％(n＝2、SEM＝9.40)は、CD13を発現した。
【０２２５】
(6.2.2.5絨毛膜由来の細胞)
絨毛膜由来の細胞は、一貫して、HLA-G、CD117、CD10、CD44、CD200、CD90、CD38、及びCD13に対して陽性であったが、一方、CD33及びCD105に対する発現は、様々であった(図6)。絨毛膜細胞に対するそれぞれのマーカーの平均発現は、以下のとおりである:細胞の53.25％±32.87％(n＝3、SEM＝18.98)は、HLA-Gを発現し；細胞の15.44％±11.17％(n＝6、SEM＝4.56)は、CD33を発現し；細胞の70.76％±11.87％(n＝3、SEM＝6.86)は、CD117を発現し；細胞の35.84％±25.96％(n＝3、SEM＝14.99)は、CD10を発現し；細胞の28.76％±6.09％(n＝3、SEM＝3.52)は、CD44を発現し；細胞の29.20％±9.47％(n＝2、SEM＝6.70)は、CD200を発現し；細胞の54.88％±0.17％(n＝2、SEM＝0.12)は、CD90を発現し；細胞の68.63％±44.37％(n＝2、SEM＝31.37)は、CD38を発現し；細胞の23.81％±33.67％(n＝2、SEM＝23.81)は、CD105を発現し；そして、細胞の53.16％±62.70％(n＝2、SEM＝44.34)は、CD13を発現した。
【０２２６】
(6.2.2.6羊膜-絨毛膜板の胎盤細胞)
羊膜-絨毛膜板由来の細胞は、一貫して、HLA-G、CD33、CD117、CD10、CD44、CD200、CD90、CD38、CD105、及びCD13に対して陽性であった(図7)。羊膜-絨毛膜板由来の細胞に対するそれぞれのマーカーの平均発現は、以下のとおりである:細胞の78.52％±13.13％(n＝2、SEM＝9.29)は、HLA-Gを発現し；細胞の38.33％±15.74％(n＝5、SEM＝7.04)は、CD33を発現し；細胞の69.56％±26.41％(n＝2、SEM＝18.67)は、CD117を発現し；細胞の42.44％±53.12％(n＝2、SEM＝37.56)は、CD10を発現し；細胞の32.47％±31.78％(n＝2、SEM＝22.47)は、CD44を発現し；細胞の5.56％(n＝1)は、CD200を発現し；細胞の83.33％(n＝1)は、CD90を発現し；細胞の83.52％(n＝1)は、CD38を発現し；細胞の7.25％(n＝1)は、CD105を発現し；そして、細胞の81.16％(n＝1)は、CD13を発現した。
【０２２７】
(6.2.2.7臍帯由来の細胞)
臍帯由来の細胞は、一貫して、HLA-G、CD33、CD90、CD38、CD105、及びCDl3に対して陽性であったが、一方、CD117、CD10、CD44、及びCD200の発現は、様々であった(図8)。臍帯由来の細胞に対するそれぞれのマーカーの平均発現は、以下のとおりである:細胞の62.50％±53.03％(n＝2、SEM＝37.50)は、HLA-Gを発現し；細胞の25.67％±11.28％(n＝5、SEM＝5.04)は、CD33を発現し；細胞の44.45％±62.85％(n＝2、SEM＝44.45)は、CD117を発現し；細胞の8.33％±11.79％(n＝2、SEM＝8.33)は、CD10を発現し；細胞の21.43％±30.30％(n＝2、SEM＝21.43)は、CD44を発現し；細胞の0.0％(n＝1)は、CD200を発現し；細胞の81.25％(n＝1)は、CD90を発現し；細胞の64.29％(n＝1)は、CD38を発現し；細胞の6.25％(n＝1)は、CD105を発現し；そして、細胞の50.0％(n＝1)は、CDl3を発現した。
【０２２８】
すべてのマーカーの発現平均のまとめを、図9に示した。
【０２２９】
(6.2.2.8 BD FACS Aria選別報告)
HLA ABC、CD45、CD34、及びCD133のもっとも高い百分率を発現した胎盤細胞の3つの異なる集団(潅流液、羊膜及び絨毛膜由来の細胞)を、このようなマーカーに対する抗体及び7AADで染色した。これら3つの集団は、対象とする表現型を発現する生存細胞に対して陽性に選別された。BD FACS Aria選別の結果は、表2に示している。
【表２】
0005469457.tif 000003
【０２３０】
陽性に選別された細胞(「選別」)の3つの異なる集団及びそれらの対応する非選別の細胞は、平板培養し、培養結果は、12日目に評価した(表3)。選別された潅流液由来の細胞は、40,600/cm2の細胞密度で平板培養し、その結果として小さくて丸い非付着細胞が形成された。非選別潅流液由来の細胞の3つのセットのうち2つは、それぞれ、40,600/cm2の細胞密度で平板培養し、その結果として、大半が小さくて丸い非付着細胞がいくつかの付着細胞と共にウェル周辺に位置するように形成された。非選別潅流液由来の細胞は、93,800/cm2の細胞密度で平板培養し、その結果として、大半が小さくて丸い非付着細胞がいくつかの付着細胞と共にウェル周辺に位置して形成された。
【０２３１】
選別された羊膜由来の細胞は、6,300/cm2の細胞密度で平板培養し、その結果として、小さくて丸い非付着細胞が形成された。非選別羊膜由来の細胞は、6,300/cm2の細胞密度で平板培養し、その結果として、小さくて丸い非付着細胞が形成された。非選別羊膜由来の細胞は、62,500/cm2の細胞密度で平板培養し、その結果として、小さくて丸い非付着細胞が形成された。
【０２３２】
選別された絨毛膜由来の細胞は、6,300/cm2の細胞密度で平板培養し、その結果として、小さくて丸い非付着細胞が形成された。非選別絨毛膜由来の細胞は、6,300/cm2の細胞密度で平板培養し、その結果として、小さくて丸い非付着細胞が形成された。非選別絨毛膜由来の細胞は、62,500/cm2の細胞密度で平板培養し、その結果として、小さくて丸い非付着細胞が形成された。
【０２３３】
他の実験において、先に説明された丸い非付着細胞の最初の集団は、更なる培養時に、組織培養表面に付着し、特徴的な線維芽細胞様細胞の形状を呈した。典型的には、この付着細胞は、CD117の発現を喪失し、一貫してCD10+、CD34-、CD105+及びCD200+であった。
【０２３４】
(6.3 実施例3：胎盤幹細胞の分化)
付着胎盤幹細胞は、いくつかの異なる細胞系統へ分化された。付着胎盤幹細胞は、羊膜、絨毛膜、胎盤子葉、又はそれらの任意の組み合わせを含む胎盤内の解剖学的部位からの組織の物理的崩壊により、胎盤から単離し、臍帯幹細胞は、臍帯組織の物理的崩壊により得た。
【０２３５】
胎盤幹細胞及び臍帯幹細胞は、低濃度のウシ胎仔血清及び限られた成長因子を含有する培地内で確立した。フローサイトメーター解析は、胎盤幹細胞は典型的には、y％の割合で、CD200+ CD105+ CD73+ CD34- CD45-表現型を発揮することを示した。胎盤幹細胞は、脂肪細胞、軟骨細胞及び骨細胞系列に分化することがわかった。
【０２３６】
IBMX、インスリン、デキサメタゾン及びインドメタシンを含有する誘導培地において、胎盤幹細胞は、3〜5週間で脂肪蓄積脂肪細胞へ変わった。骨形成性の誘導培養条件下で、胎盤幹細胞は、骨結節を形成し、それらの細胞外マトリックス内にカルシウム沈着を有することがわかった。PDACの軟骨形成性分化は、マイクロペレット中で行い、組織凝集体中のグリコサミノグリカンの形成により確認した。
【０２３７】
(6.4 実施例4：胎盤幹細胞を使用する腫瘍細胞抑制)
本明細書に説明された胎盤幹細胞は、腫瘍細胞成長及び増殖を抑制する能力を有する。
【０２３８】
(6.4.1 材料及び方法)
使用した腫瘍細胞株は、臨床検査ドナー由来のリンパ芽球細胞株(LCL)、及びATCCから購入したヒト細胞株(CML-CRL-2099；乳管癌-CRL-2343；急性リンパ芽球性白血病-CCL-119；結腸癌CRL-5942)を含んだ。使用した細胞株は、ヒト網膜芽細胞腫、組織球性リンパ腫、肺癌、急性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸腺癌、及び乳癌の細胞株を含んだ。LCLは、末梢血単核細胞の、B95.8溶解感染(lytic)EBV株由来のEBV及びシクロスポリンAの存在下での培養により得た。R20培地(RPMI 1640及びウシ胎仔血清(Celgro社))中で2週間培養後、この癌細胞を、R10培地において維持した。腫瘍細胞株は、R10培地において維持した。
【０２３９】
臍帯組織の酵素による消化により得た臍帯幹細胞(継代3)は、トランスウェルインサートを伴う又は伴わない、96ウェルプレート又は24ウェルプレートにおいて平板培養した。胎盤幹細胞及び腫瘍細胞の共培養を、具体的実験について指定された細胞数を用いて行った(下記参照のこと)。培養後、非付着腫瘍細胞を回収し、7-アミノ-アクチノマイシンD(7-AAD)で染色し、生存能力を評価した。
【０２４０】
上清サイトカイン分析に関して、培養上清50μLを回収し、以下の25種のサイトカインアレイを使用し、LUMINEX(登録商標)分析装置上で分析した：IL-1β、IL-Ira、IL-2R、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12p40、IL-13、IL-15、IL-17、TNF-α、IFN-α、IFN-γ、GM-CSF、MIP-1α、MIP-1β、IP-10、MIG、エオタキシン、RANTES及びMCP-1。
【０２４１】
(6.4.2 結果)
(6.4.2.1 様々な腫瘍細胞株の抑制)
胎盤幹細胞の腫瘍抑制能を調べるために、EBVで形質転換された腫瘍細胞を、単独で又は異なる胎盤部位に由来した胎盤幹細胞と共にのいずれかで培養した。LCL細胞は単独で、17日間にわたる培養で約40,000個細胞に成長した。しかしLCL細胞が羊膜-絨毛膜(AC)又は羊膜(AM)又は臍帯幹細胞(UC)由来の胎盤幹細胞の存在下で比1:2で培養された場合、その成長は、約10,000個細胞に抑制され、約75％の抑制であった(図10)。
【０２４２】
胎盤幹細胞によるLCL増殖の抑制は骨髄由来の間葉系幹細胞(BM-MSC)による抑制と比較した。LCLは、単独で、又は胎盤幹細胞もしくはUC幹細胞の存在下で、又はBM-MSCと共に、6日間培養し、その時点で、各条件下の細胞をカウントした。6日間の培養コースにわたり、LCL単独では、約23,000個細胞に増殖した。対照的に、LCL＋BM-MSCは比1:2で、約38,000個のLCL細胞を生じた。しかし際だって、LCL＋胎盤幹細胞(1:2)条件は、6日間培養においてわずかに約5,000個のLCL細胞を生じ、このことは胎盤幹細胞又は臍帯幹細胞は、BM-MSCのよりもLCL成長を有意により抑制性であることを示した。図11参照のこと。
【０２４３】
胎盤幹細胞による腫瘍抑制の特異性を決定するために、腫瘍細胞株のパネルを、ヒト癌疫学へのそれらの関連に従いデザインした。全ての腫瘍細胞株を、懸濁液中で成長させ、付着胎盤幹細胞からの分離を促進した。滴定実験を行い、比0:1、1:2、1:1、1.5:1又は2:1で一緒にした、組織球性リンパ腫細胞、白血病(CML)細胞、乳管癌細胞、急性リンパ芽球性白血病細胞又は結腸癌細胞に対する、胎盤幹細胞の腫瘍細胞抑制作用を決定した(図12)。胎盤細胞株は、組織球性リンパ腫及びCMLを最大程度に抑制し、結果として胎盤幹細胞の腫瘍細胞に対する比2:1で、各々約60％及び48％の抑制を生じるように見えた。しかしこれらの細胞株は、試験した比では、単に弱い用量反応性であるように見えた。乳管癌細胞株は、急性リンパ芽球性白血病(ALL)株と同様に、用量反応のより強力な傾向を示した。明白に結腸癌細胞は、より大きい数の胎盤幹細胞でより弱い抑制を示した。
【０２４４】
引き続きの実験(図13A)を、より大きい腫瘍細胞株の収集及び胎盤幹細胞の腫瘍細胞に対する比1:1を用い、同じ様式で行い、前述の結果を確認し拡大した。乳癌及びALL以外の全ての腫瘍細胞株は、胎盤幹細胞の非存在下で成長された腫瘍細胞と比べて50％〜75％抑制された。しかし乳癌及びALLは、先の実験では中程度に抑制された(10％〜20％)が、これらは共培養時には胎盤幹細胞により活性化されるように見えた。すなわち共培養は、乳癌細胞及びALL細胞の数を増大するように見えた。
【０２４５】
この抑制の接触依存性は、トランスウェル実験により評価した(図13B)。HLは、抑制の最低の接触依存性12％を示した。CMLの抑制は、22％接触依存したのに対し、CACの抑制は42％、及びLCLは51％の接触依存性であった。結果は概して、腫瘍細胞株の成長速度と抑制の接触依存性の間の逆相関を示した。
【０２４６】
まとめると、このデータは、網膜芽細胞腫、組織球性リンパ腫、及びCMLは、胎盤幹細胞により最も安定して抑制されることを示唆している。
【０２４７】
(6.4.2.2 サイトカイン分泌プロファイル)
胎盤幹細胞腫瘍抑制の分泌プロファイルを調べるために、上清を、胎盤幹細胞の培養物から回収し、この上清を、25種のサイトカインアレイを用い、LUMINEX(登録商標)分析装置上で分析した。ふたつの実験を行い、ひとつはLCLのみを使用し、ふたつめはLCL細胞を含む8種の腫瘍細胞株のパネルを使用した。第一の実験において、胎盤幹細胞のLCL細胞との6日間培養後、抑制状態の腫瘍細胞を回収し、生存7-AAD-細胞をカウントした。図14Aに認められるように、胎盤幹細胞は、オープンウェル共培養においてLCL増殖を抑制したが、トランスウェル共培養は抑制しなかったので、胎盤幹細胞によるLCL増殖の抑制は、強力に接触依存性であった。しかしサイトカイン分泌プロファイルは、オープンウェルとトランスウェル条件の間で、ごくわずか変化した(図14B)。LCLは単独で、MIP-1α及びMIP-1βをナノグラム/ml範囲で分泌したのに対し、共培養は、胎盤幹細胞単独について認められるものに対応する量でIL-6、IL-8及びMCP-1を含んだ。MIP-1α及びMIP-1βの値は、有意には変化しなかった。
【０２４８】
腫瘍株の広範な試料のサイトカイン分泌プロファイルを決定するために、図15A及び15Bに説明した共培養実験からの上清について、同じ25種のサイトカインアレイを用い分析した。LCL/PDAC共培養物の共培養分泌プロファイルは、IL-6、IL-8及びMCP-1の予想された量が検出された点で非常に類似していた。しかし有意な量のMIP-1α/βは認められなかった。スクリーニングした他の7種の株において、組織球性リンパ腫は、LCLに類似したプロファイルを示したのに対し、他の6種の株は、全体的に抑えられた分泌プロファイルを有した。
【０２４９】
(6.4.2.3 結論)
本実施例において示されたデータから、胎盤幹細胞は、組織球性リンパ腫、慢性骨髄性白血病、結腸腺癌、網膜芽細胞腫、及び肺癌を含む、広範な腫瘍細胞株に対し、腫瘍細胞成長抑制作用を示すと結論づけることができる。これらの腫瘍細胞株は、例えば上皮性、腺性及び造血性のように、様々な起源の細胞型に由来し、このことは、胎盤幹細胞は臨床状況において広範な腫瘍型に対し有効であり得ることを示している。これらの作用は、一部接触依存性であり、その接触依存性は、腫瘍成長の速度と相関することがある。試験した8種の腫瘍株のうち、乳癌及びALL細胞は、胎盤幹細胞との共培養により活性化されるように見える。
【０２５０】
(6.5 実施例5：胎盤幹細胞を使用する慢性骨髄性白血病細胞の抑制)
本発明の胎盤幹細胞は、接触依存様式で巨核芽球性白血病細胞の成長を抑制する能力を明らかにした。
【０２５１】
(6.5.1 材料及び方法)
これらの研究において使用された腫瘍細胞株は、慢性骨髄性白血病細胞株MEG-01(巨核芽球性白血病細胞；ATCC # CRL-2021)、組織球性リンパ腫、及び網膜芽細胞腫細胞株を含んだ。
【０２５２】
臍帯幹細胞(UC)、羊膜-絨毛膜幹細胞(AC)、骨髄間葉系幹細胞(BM-MSC)、又はヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を、24-ウェル組織培養プレート上で、出発細胞数5×104個細胞/ウェルで、6日間、単独で培養するか又は腫瘍細胞と共に共培養した。その結果胎盤幹細胞が腫瘍細胞と比1:1で共培養される場合には、各細胞型の5×104個細胞を1つのウェルに播種した。比5:1を使用する場合、25×104個の胎盤幹細胞を、5×104個の腫瘍細胞と共に播種した。腫瘍細胞の抑制は、共培養物中の生存(アナキシン-V- 7-AAD-)細胞の数を対照培養物(腫瘍細胞のみ)中の生存細胞と比較することにより算出した。
【０２５３】
アポトーシス試験に関して、共培養したMEG-01細胞を回収し、アナキシンV及びヨウ化プロピジウムで、共培養開始後0、3及び6日目に染色し、フローサイトメトリーにより分析した。細胞周期分析に関して、共培養された細胞を固定し、透過性とし、ヨウ化プロピジウムで、共培養開始後0、1、2、3、4及び6日目に染色し、フローサイトメトリーによりDNA含量分布を分析した。
【０２５４】
上清サイトカイン分析に関して、培養上清50μlを回収し、以下のサイトカインについて、LUMINEX(登録商標)分析装置上で分析した：血小板由来増殖因子-AA(PDGF-AA)、顆粒球単球コロニー刺激因子(GM-CSF)、成長関連癌遺伝子-α(GROα)、及び白血病抑制因子(LIF)分泌、腫瘍壊死因子-α(TNF-α)、線維芽細胞成長因子-2(FGF-2)、上皮成長因子(EGF)、可溶性インターロイキン-2(sIL2)、及び血管内皮増殖因子(VEGF)。
【０２５５】
(6.5.2 結果)
追加の腫瘍細胞株におけるBM-MSC細胞に対する胎盤幹細胞による腫瘍細胞成長の増強された抑制を裏付けるために、胎盤幹細胞による成長抑制を、慢性骨髄性白血病(CML)細胞について決定した。MEG-01(巨核芽球性白血病)細胞は、単独で培養するか、又はBM-MSC、臍帯幹細胞(UC)又は羊膜-絨毛膜幹細胞(AC)と共に6日間、比1:1で共培養した。式：100-([共培養中のアナキシン-V-, 7-AAD-細胞の数／単独培養中のアナキシン-V-, 7-AAD-細胞の数]×100)に従い、抑制率を決定した。MEG-01細胞のBM-MSCとの共培養は、6日間の共培養後約25％の成長抑制を生じた。しかし、MEG-01細胞の臍帯又はAC胎盤幹細胞のいずれかとの共培養は、6日後に75％よりも大きい抑制を生じ；羊膜-絨毛膜細胞との共培養は、90％よりも大きい抑制を生じた(図16A)。組織球性リンパ腫細胞及び網膜芽細胞腫細胞も、臍帯幹細胞との共培養により抑制されたが；しかし、これらの細胞株の抑制(HL：〜20％；Rb：〜50％)は、MEG-01細胞において認められた抑制と比べて中等度であった。
【０２５６】
BM-MSCによる抑制に対する胎盤幹細胞によるMEG-01抑制の時間経過は、図16Bに示した。MEG-01細胞の劇的抑制は、BM-MSC及び臍帯幹細胞の両方の共培養について2日目に認められたが；しかし、成長抑制は、UC共培養では6日目に強力に維持されたのに対し、BM-MSCとの共培養では、成長は中程度にのみ抑制された。これらの結果は、BM-MSCと比べ慢性骨髄性白血病(CML)細胞における胎盤幹細胞により増強された腫瘍細胞増殖抑制を明らかにし、LCL細胞において認められた胎盤幹細胞の増強された腫瘍抑制作用を裏付けた。これらの結果は、CML細胞は、他の血液腫瘍細胞型、例えば組織球性リンパ腫、又は固形腫瘍細胞型、例えば網膜芽細胞腫と比べて胎盤幹細胞により特に抑制されやすいことも示唆している。
【０２５７】
いずれか特定の機序又は理論に縛られることを欲するものではないが、腫瘍細胞増殖抑制が臍帯幹細胞により実行される方式の研究が行なわれた。特に臍帯細胞と6日間共培養されたMEG-01細胞を、アポトーシスマーカーの存在について試験し、細胞周期停止の誘導について分析し、かつ巨核球系列に沿った成熟について評価した。単独で培養されたMEG-01細胞又はHUVEC細胞と共培養されたMEG-01と比べ、臍帯幹細胞と共培養された生存(アナキシンV-, PI-)、アポトーシス(アナキシンV+, PI-)及び壊死(アナキシンV+, PI+)のMEG-01細胞の割合に有意差は認められなかった(データは示さず)ので、成長抑制は、アポトーシスの誘導により生じるようには考えられなかった。更に、臍帯幹細胞、HUVEC、BM-MSCと共培養されたMEG-01細胞、又は単独培養されたMEG-01細胞において、DNA含量分布に有意差は認められなかった(データは示さず)ので、臍帯幹細胞との共培養は、細胞周期停止を誘導するようには考えられなかった。加えて、臍帯幹細胞、BM-MSC及びHUVEC細胞と共培養されたMEG-01細胞は全て同様の巨核芽球性成熟マーカーCD36の誘導レベルを示した(データは示さず)ので、臍帯幹細胞によるMEG-01成長抑制は、巨核球系列に沿った成熟から生じるようには考えられなかった。従って臍帯幹細胞によるMEG-01成長抑制は、アポトーシス、細胞周期、及び成熟とは独立した方式で生じると考えられる。
【０２５８】
(6.5.2.1 胎盤幹細胞による接触独立したMEG-01成長抑制)
胎盤幹細胞によるMEG-01成長抑制の接触依存性を調べるために、抑制されたMEG-01/胎盤幹細胞共培養物由来の馴化培地を利用する、成長抑制アッセイを行った(図17)。MEG-01細胞を、RPMI-基剤とする培地で増殖し、培地をMEG-01/臍帯幹細胞共培養、MEG-01/BM-MSC共培養、又はMEG-01/HUVEC共培養由来の馴化培地と、1:2又は1:10(馴化培地対非馴化培地)で交換した。陰性対照細胞(MEG単独)は、出発培地を、馴化培地と交換せずに成長させた。MEG-01細胞は、陽性対照(MEG/UC)として臍帯幹細胞と直接共培養した。MEG-01/臍帯幹細胞共培養馴化培地(1:2)で処理したMEG-01細胞は、臍帯幹細胞と直接共培養されたMEG-01細胞(MEG/UC)と、同程度抑制され、このことは臍帯幹細胞により生成された可溶性成長因子は、MEG-01細胞の成長抑制に寄与することを示唆している。
【０２５９】
(6.5.2.2 サイトカイン分泌プロファイル)
共培養培地に存在する可溶性因子は、MEG-01細胞の抑制に関与するかどうかを調べるために、単独培養したMEG-01、UC幹細胞、BM-MSC、及びHUVEC細胞、又はUC幹細胞、BM-MSC及びHUVECと共培養したMEG-01細胞の上清を、各々、6日間培養後回収し、以下のサイトカインの存在について分析した：FGF-2、TNF-α、GM-CSF、PDGF、EGF、GRO-α、sIL-2、VEGF、及びLIF。PDAC細胞がMEG-01細胞と共培養された場合に、PDGF-AA及びGM-CSFは、いずれかの細胞株が単独で培養される場合に認められるレベルを超えるレベルで、高度に分泌されることがわかった(図18)。GRO-αは、PDAC/MEG-01共培養において高度に分泌され、同様のレベルのGRO-αが、PDAC細胞単独培養において認められた。
【０２６０】
(6.5.2.3 結論)
巨核芽球性白血病細胞株MEG-01の成長抑制試験の結果は、胎盤幹細胞との共培養は、骨髄間葉系幹細胞との共培養と比べて増強された腫瘍細胞成長抑制を生じたことを示唆している。特定の操作理論に結びつけることを意図するものではないが、抑制は、成長阻害の結果であり、アポトーシスの誘導、細胞周期の停止又は巨核球系列に沿ったMEG-01細胞の成熟の結果ではないと考えられる。胎盤幹細胞による抑制は、可溶性成長因子の作用に関連することがある。候補因子は、PDGF-AA、GM-CSF、GRO-α、及びLIFを含む。いずれかの理論に縛られることを意図するものではないが、これらの因子の分泌は、生来の及び養子免疫機構の誘起(attraction)を通じた胎盤幹細胞の成長抑制作用を増強することにより、有益なインビボ作用に役立つことが考えられる。
【０２６１】
巨核芽球性白血病細胞は、試験された他の腫瘍細胞株(組織球性リンパ腫、網膜芽細胞腫)と比べ、胎盤幹細胞共培養に対するより高い感受性を示し、このことは慢性骨髄性白血病は、胎盤幹細胞組成物の治療的適用に対し特に反応することを示唆している。
【０２６２】
(6.6 実施例6：胎盤幹細胞を使用する白血病細胞及びリンパ腫細胞の抑制)
(6.6.1 材料及び方法)
前述のMEG-01慢性骨髄性リンパ腫株において得られた結果の更なる確認及び拡大のために、追加の白血病及びリンパ腫細胞株を、臍帯幹細胞及び羊膜絨毛膜幹細胞による接触非依存型抑制について試験した。本試験において使用した細胞株は、以下のATCCから入手可能な数多くの白血病細胞株を含んだ：巨核芽球性リンパ腫株MEG-01 (ATCC# CRL-2021)；急性リンパ芽球性白血病株CCRF-CEM (ATCC# CCL-119)；急性T細胞白血病株J.RT3-T3.5 (ATCC# TIB-153)；組織球性リンパ腫U937 (ATCC# CRL-1593.2)；骨髄急性骨髄性白血病株KG-1 (ATCC# CRL-8031)；及び、慢性骨髄性白血病株KU812 (ATCC# CRL-2099)。
【０２６３】
簡単に述べると、腫瘍細胞株は、24-ウェル組織培養プレート(特に指定されない限りは)において、単独で培養するか、又は、1:1及び5:1の比(幹細胞対腫瘍細胞)で、直接共培養(DC)及びトランスウェル(TW)フォーマットの両方で、臍帯(UC)幹細胞又は羊膜-絨毛膜(AC)胎盤幹細胞と共培養した。7日間培養した後、腫瘍細胞を懸濁液から回収し、リン酸緩衝食塩水200μl中に再懸濁し、アナキシンV及びヨウ化プロピジウムで染色した。生存細胞(アナキシンV-, PI-細胞)の数を、Becton Dickinson FACS Caliburフローサイトメーターを用いて決定した。
【０２６４】
(6.6.2 結果)
白血病及びリンパ腫細胞株に対する成長抑制アッセイの結果を、表3に示している。割合は、7日間の共培養後に残存する生存細胞の、単独で培養された対照細胞に対する、割合を示している。
【表３】
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【０２６５】
CCRF-CEM細胞株は、直接培養及びトランスウェルフォーマットの両方において、胎盤細胞株UC1及びAC1により抑制された。胎盤幹細胞との直接培養は、CCRF-CEM成長の抑制で、トランスウェルフォーマットと比べわずかにより効果的であった。培養比5:1は、直接及びトランスウェルフォーマットの両方におけるCCRF-CEM成長の抑制においてより効果的であった。
【０２６６】
同様の結果が、U937株について認められた。直接共培養による抑制は、トランスウェル抑制よりもわずかにより効果的であるのみであり、最適培養比は5:1であった。KG-1細胞は一般に、臍帯幹細胞又は胎盤幹細胞との共培養に対しより低い感度を示したが；しかし、成長抑制は、臍帯幹細胞株UC1、UC3及びUC4と共培養した場合に、直接培養及びトランスウェルフォーマットの両方において依然認められた。KG-1細胞の直接培養による抑制は、トランスウェルによる抑制よりも、より効果的であり、培養比5:1は、1:1よりもより大きい抑制作用を示した。KU812細胞は、胎盤幹細胞との共培養に対し最高の感受性を示し、この抑制は、試験したほぼ全ての条件において、50％よりも大きかった。直接培養による抑制は、トランスウェル抑制よりもより効果的であったが；しかしKU812のトランスウェル抑制は、培養比1:1で、50％よりも大きかった。
【０２６７】
成長抑制がT24組織培養ウェル中での7日間共培養後の栄養物質枯渇に起因する可能性を排除するために、共培養を、24-ウェルアッセイにおいて使用したものと同数の出発細胞(50×103個MEG-01細胞)を用い、T25フラスコにおいて実行した。その結果共培養は、T24プロトコールに提供されたものの10×量の栄養物質中で効果的に実行した。UC幹細胞と比1:1で7日間共培養されたMEG-01細胞は、51％抑制され；比5:1で培養した場合、MEG-01細胞は、69％抑制された。同様にMEG-01細胞がAC胎盤幹細胞と7日間比1:1で共培養された場合、53％抑制が認められ；比5:1で共培養された場合、66％抑制が認められた(データは示さず)。これらの結果は、MEG-01細胞の胎盤幹細胞によるインビトロにおける抑制は、培養環境の栄養物質の枯渇に起因しないことを示している。
【０２６８】
(6.6.2.1 結論)
まとめると、これらの結果は、臍帯幹細胞及び羊膜-絨毛膜幹細胞による白血病及びリンパ腫細胞株の成長抑制は、強固でありかつ接触非依存様式で生じ得ることを明らかにしている。同じ腫瘍細胞型における抑制の程度においては実験毎に変動性が認められるが、これらの結果は、概して胎盤幹細胞、例えば臍帯幹細胞及び羊膜-絨毛膜幹細胞の、様々な血液腫瘍細胞型の成長を直接又は接触非依存様式で抑制する能力を反映している。臍帯幹細胞及び羊膜-絨毛膜幹細胞の両方とも、幹細胞対腫瘍細胞の比5:1で直接共培養した場合、試験した各腫瘍株における50％より大きい抑制作用を一貫して明らかにした(AC1幹細胞株処理したKG1細胞の場合を除く；38％抑制が観察された)。従って、これらのデータは更に、様々な腫瘍の治療に関する治療的状況における胎盤幹細胞の利用を裏付け、特に巨核芽球性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、急性T細胞白血病、組織球性リンパ腫、骨髄急性骨髄性白血病、及び慢性骨髄性白血病を含む、様々な細胞型の血液腫瘍の治療に関する胎盤幹細胞の使用を裏付けている。
【０２６９】
(6.7 実施例7：SDF-1に反応した胎盤幹細胞の遊走)
本発明の胎盤幹細胞は、化学誘引物質SDF-1の存在に反応して遊走する能力を示している。
(6.7.1 材料及び方法)
化学誘引物質に反応した胎盤幹細胞の遊走能を試験するために、胎盤幹細胞遊走を、ストロマ細胞由来因子-1(SDF-1)の存在下で、Cell Biolabs CYTOSELECT(商標)細胞遊走アッセイキットを使用し測定した。このアッセイは、24-ウェルプレート内にポリカーボネート膜インサート(細孔サイズ8μm)を備える。この膜は、遊走細胞を非遊走細胞から隔離するための障壁として働く。遊走細胞は、化学誘引物質へと突起を伸ばすことができ(アクチン細胞骨格再組織化を介して)、最終的には、ポリカーボネート膜の細孔を通過する。その後これらの遊走細胞は、膜から解離し、引き続き細胞核酸への結合時に蛍光を発する色素(CYQUANT(登録商標)GR色素；Invitrogen社, カールズバッド, CA)を用い、剥離される。簡単に述べると、臍帯胎盤幹細胞は、血清非含有培地内の細胞懸濁液中に調製した。SDF-1は、単独で、又はSDF-1受容体CXCR4遮断薬(AMD3100)と組み合わせて、細胞懸濁液へ直接添加した。細胞は、細胞培養器内で24時間培養後にアッセイした。
【０２７０】
(6.7.2 結果)
図19は、臍帯胎盤幹細胞は、ウシ胎仔血清及びSDF-1へ遊走したことを示している。血清又はSDF-1を添加せずに培養した胎盤幹細胞は、24時間培養後に、6.0蛍光単位と同等の細胞の遊走を示した。10％FBSをこの細胞懸濁液へ添加すると、24時間後に、12.7蛍光単位と同等の細胞の遊走を生じた。1μg/ml SDF-1の添加は、24時間後に、15.0蛍光単位と同等の細胞の遊走を生じた。しかしSDF-1受容体CXCR4の阻害剤であるAMD3100の添加は、SDF-1に反応した胎盤幹細胞の遊走を有意に抑制した。SDF-1及びAMD3100の両方の存在下での胎盤幹細胞の遊走は、24時間後に、7.0蛍光単位に達し、これはSDF-1又は血清を添加しない遊走のレベルに近い。
【０２７１】
(結論)
これらの結果は、胎盤幹細胞は、特異的化学誘引物質に反応する遊走能を有することを明らかにしている。SDF-1受容体CXCR4は、数多くの腫瘍細胞において発現されている。従ってこれらの結果は、SDF-1及び胎盤幹細胞の腫瘍部位への同時投与は、胎盤幹細胞の標的化された腫瘍部位への局在化を延長し、胎盤幹細胞-腫瘍細胞の相互作用を促進し、これにより胎盤幹細胞の腫瘍細胞成長抑制作用を増強することができることを示している。
【０２７２】
(同等物)
本発明は、本明細書に開示された具体的な実施態様により範囲が限定されるものではない。実際開示されたものに加え、本発明の様々な修飾が、前述の説明及び添付図面から、当業者には明らかになるであろう。このような修飾は、添付された「特許請求の範囲」内であることが意図されている。
【０２７３】
様々な刊行物、特許及び特許出願が、本明細書に引用されているが、その開示は、それら全体が引用により本明細書中に組み込まれている。
【図１】
0005469457.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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