(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（3）の化合物：
0005399410.tif 000044
式中、
R1はC5〜C15アルキル基、C5〜C15アルケニル基、またはC5〜C15アルキニル基であり；
R2はC5〜C15アルキル基、C5〜C15アルケニル基、またはC5〜C15アルキニル基であり；かつ
R3はC5〜C15アルキル基、C5〜C15アルケニル基、またはC5〜C15アルキニル基である。
【請求項２】
R1がC5〜C12アルキル基であり、
R2がC7〜C14アルキル基であり、かつ
R3がC7〜C14アルキル基である、
請求項1記載の化合物。
【請求項３】
R1がC7アルキル基であり、
R2がC11アルキル基であり、かつ
R3がC11アルキル基である、
請求項2記載の化合物。
【請求項４】
R1がn-ヘプチル基であり、
R2がn-ウンデシル基であり、かつ
R3がn-ウンデシル基である、
請求項3記載の化合物。
【請求項５】
R1、R2およびR3のうちの少なくとも1つが他と異なる、請求項1記載の化合物。
【請求項６】
式（3a）
0005399410.tif 000045
の立体化学を有する、請求項1、2、3、4、または5記載の化合物。
【請求項７】
化合物22
0005399410.tif 000046
である、請求項6記載の化合物。
【請求項８】
以下に示す、式（1）の化合物と式（2）の化合物との反応による、式（3）の化合物の調製法：
0005399410.tif 000047
式中、
R1はC5〜C15アルキル基、C5〜C15アルケニル基、またはC5〜C15アルキニル基であり；
R2はC5〜C15アルキル基、C5〜C15アルケニル基、またはC5〜C15アルキニル基であり；
R3はC5〜C15アルキル基、C5〜C15アルケニル基、またはC5〜C15アルキニル基であり；かつ
Xは脱離基である。
【請求項９】
R1がC5〜C12アルキル基であり、
R2がC7〜C14アルキル基であり、
R3がC7〜C14アルキル基であり、かつ
XがOH、Cl、F、イミダゾリジル、トリメチルアセトキシ、炭酸エチル、炭酸メチル、炭酸イソブチル、または式Zの基：
0005399410.tif 000048
であり、
R7および式（2）のR3が、式（2）の化合物が対称ベータケトエステル無水物であるように、同一である、
請求項8記載の方法。
【請求項１０】
R1がC7アルキル基であり、
R2がC11アルキル基であり、かつ
R3がC11アルキル基である、
請求項9記載の方法。
【請求項１１】
R1がn-ヘプチル基であり、
R2がn-ウンデシル基であり、かつ
R3がn-ウンデシル基である、
請求項10記載の方法。
【請求項１２】
R1、R2およびR3のうちの少なくとも1つが他と異なる、請求項8記載の方法。
【請求項１３】
イソプロパノール中で式Y
0005399410.tif 000049
の化合物を水素化して式（1）の化合物を生成する段階をさらに含む、請求項8記載の方法。
【請求項１４】
式（4）の化合物：
0005399410.tif 000050
式中、
R4はそれぞれの場合に独立にアルキル基、置換アルキル基、アルケニル基、置換アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、2-置換エチル基、ハロエチル基、ベンジル基、置換ベンジル基、アリール基、置換アリール基、またはシリル基であり；
R5はそれぞれの場合に独立にC1〜C6アルキル基、C3〜C6アルケニル基もしくはC3〜C6アルキニル基であり；かつ
R6はそれぞれの場合に独立にC1〜C6アルキル基、C3〜C6アルケニル基もしくはC3〜C6アルキニル基であるか；またはR5およびR6はそれらが結合している窒素と一緒になって5もしくは6員複素環を形成する。
【請求項１５】
R4がそれぞれの場合に独立にC3〜C5アルケニル基、2-シアノエチル基、2-(トリメチルシリル)エチル基、または2,2,2-トリクロロエチル基であり；
R5がそれぞれの場合に独立にC3〜C6アルキル基であり；かつ
R6がそれぞれの場合に独立にC3〜C6アルキル基である、
請求項14記載の化合物。
【請求項１６】
R4がそれぞれの場合にアリル基であり；
R5がそれぞれの場合にイソプロピル基であり；かつ
R6がそれぞれの場合にイソプロピル基である、
請求項15記載の式（4）の化合物。
【請求項１７】
化合物25
0005399410.tif 000051
である、請求項16記載の化合物。
【請求項１８】
以下に示す、縮合反応による式（4）の化合物の調製法：
0005399410.tif 000052
式中、
R4はそれぞれの場合に独立にアルキル基、置換アルキル基、アルケニル基、置換アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、2-置換エチル基、ハロエチル基、ベンジル基、置換ベンジル基、アリール基、置換アリール基、またはシリル基であり；
R5はそれぞれの場合に独立にC1〜C6アルキル基、C3〜C6アルケニル基もしくはC3〜C6アルキニル基であり；かつ
R6はそれぞれの場合に独立にC1〜C6アルキル基、C3〜C6アルケニル基もしくはC3〜C6アルキニル基であるか；またはR5およびR6はそれらが結合している窒素と一緒になって5もしくは6員複素環を形成する。
【請求項１９】
R4がそれぞれの場合に独立にC3〜C5アルケニル基、2-シアノエチル基、2-(トリメチルシリル)エチル基、または2,2,2-トリクロロエチル基であり；
R5がそれぞれの場合に独立にC3〜C6アルキル基であり；かつ
R6がそれぞれの場合に独立にC3〜C6アルキル基である、
請求項18記載の方法。
【請求項２０】
R4がそれぞれの場合にアリル基であり；
R5がそれぞれの場合にイソプロピル基であり；かつ
R6がそれぞれの場合にイソプロピル基である、
請求項18記載の方法。
【請求項２１】
式（6）の化合物の調製法であって、
（i）以下
0005399410.tif 000053
に示すように、式（3）の化合物を式（4）の化合物と反応させて式（5）の化合物を生成する段階；および
（ii）以下
0005399410.tif 000054
に示すように、生成した式（5）の化合物を酸化して式（6）の化合物を生成する段階
を含む方法：
式中、
R1はC5〜C15アルキル基、C5〜C15アルケニル基、またはC5〜C15アルキニル基であり；
R2はC5〜C15アルキル基、C5〜C15アルケニル基、またはC5〜C15アルキニル基であり；
R3はC5〜C15アルキル基、C5〜C15アルケニル基、またはC5〜C15アルキニル基であり；
R4はそれぞれの場合に独立にアルキル基、置換アルキル基、アルケニル基、置換アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、2-置換エチル基、ハロエチル基、ベンジル基、置換ベンジル基、アリール基、置換アリール基、またはシリル基であり；
R5はそれぞれの場合に独立にC1〜C6アルキル基、C3〜C6アルケニル基もしくはC3〜C6アルキニル基であり；かつ
R6はそれぞれの場合に独立にC1〜C6アルキル基、C3〜C6アルケニル基もしくはC3〜C6アルキニル基であるか；またはR5およびR6はそれらが結合している窒素と一緒になって5もしくは6員複素環を形成する。
【請求項２２】
R1がC5〜C12アルキル基であり；
R2がC7〜C14アルキル基であり；
R3がC7〜C14アルキル基であり；
R4がそれぞれの場合に独立にC3〜C5アルケニル基、2-シアノエチル基、2-(トリメチルシリル)エチル基、または2,2,2-トリクロロエチル基であり；
R5がそれぞれの場合に独立にC3〜C6アルキル基であり；かつ
R6がそれぞれの場合に独立にC3〜C6アルキル基である、
請求項21記載の方法。
【請求項２３】
R1がC7アルキル基であり；
R2がC11アルキル基であり；
R3がC11アルキル基であり；
R4がアリル基であり；
R5がイソプロピル基であり；かつ
R6がイソプロピル基である、
請求項21記載の方法。
【請求項２４】
R1がn-ヘプチル基であり；
R2がn-ウンデシル基であり；
R3がn-ウンデシル基であり；
R4がアリル基であり；
R5がイソプロピル基であり；かつ
R6がイソプロピル基である、
請求項23記載の方法。
【請求項２５】
R1、R2およびR3のうちの少なくとも1つが他と異なる、請求項21記載の方法。
【請求項２６】
式（5）の化合物の生成が下記の段階を含む、請求項21記載の方法：
（i）ヘプタンおよびアセトニトリルの共溶媒混合物中で、式（3）の化合物および式（4）の化合物を一緒に、全ての固体が溶解するまで撹拌する段階；
（ii）1.0から2.0当量の間の酢酸を、温度を20から25℃の間に維持しながら、ゆっくり加える段階；および
（iii）得られた混合物を反応が完了するまで撹拌する段階。
【請求項２７】
用いるヘプタンの重量が、用いる式（3）の化合物の重量の4から6倍の間である、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
用いるアセトニトリルの重量が、用いる式（3）の化合物の重量の1から2倍の間である、請求項26記載の方法。
【請求項２９】
式（6）の化合物を生成するための生成した化合物（5）の酸化が下記の段階を含む、請求項21〜28のいずれか一項記載の方法：
（i）生成した式（5）の化合物を含む反応混合物にヘプタンを加える段階；
（ii）得られた混合物を-5℃から10℃まで冷却する段階；
（iii）30重量％H2O2水溶液を、反応混合物の温度が-5℃から10℃の間に維持されるような速度でゆっくり加える段階；および
（iv）得られた混合物を-5℃から10℃の間の温度で反応が完了するまで撹拌する段階。
【請求項３０】
段階（ii）の混合物を0から5℃の間まで冷却し；
段階（iii）の混合物を0から2℃の間に維持し；
段階iv）の混合物を-1から2℃の間に維持する、
請求項29記載の方法。
【請求項３１】
結晶性化合物22：
0005399410.tif 000055
【請求項３２】
1.54Åの銅波長を用いた測定により、12.3±0.2°2Θ、14.5±0.2°2Θ、16.2±0.2°2Θ、17.8±0.2°2Θ、22.2±0.2°2Θ、および23.8±0.2°2Θにピークを有するx線粉末回折パターンによってさらに特徴付けられる、請求項31記載の結晶性化合物22。
【請求項３３】
41℃の融点を有することによってさらに特徴付けられる、請求項32記載の結晶性化合物22。
【請求項３４】
結晶性化合物25：
0005399410.tif 000056
【請求項３５】
1.54Åの銅波長を用いた測定により、6.6±0.3°2Θ、14.0±0.3°2Θ、17.3±0.3°2Θ、および19.4±0.3°2Θにピークを有するx線粉末回折パターンによってさらに特徴付けられる、請求項34記載の結晶性化合物25。
【請求項３６】
65℃の融点を有することによってさらに特徴付けられる、請求項35記載の結晶性化合物25。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、35 U.S.C. § 119の下、2007年12月18日提出の米国特許仮出願第61/014,648号に対する優先権を主張し、その内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、免疫アジュバントE6020の、前駆体のβ-ケトアミド中間体を介する合成に関する。本発明は、その合成における中間体化合物、および2つの化合物について、それらの結晶型にも関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ワクチンは感染症予防のための成功した方法であることが証明されている。一般に、ワクチンは費用効果が高く、標的病原体の抗生物質耐性を誘導したり、宿主に存在する正常な菌叢に影響をおよぼすことがない。抗ウイルス免疫を誘導する場合などの、多くの場合、ワクチンは実行可能な治癒的または改善的治療がない疾患を予防することができる。
【０００４】
ワクチンは、物質、すなわち抗原、典型的には非感染性または非病原性の形で体内に導入される感染性生物またはその一部に対する応答を開始するための免疫系を誘発することにより機能する。いったん免疫系が「初回抗原刺激される」すなわち生物に対して感作されると、後に免疫系が感染性病原体としてのこの生物に曝露されることにより、病原体生物が増殖して宿主生物における疾患症状を引き起こすのに十分な細胞に感染しうる前に、病原体を破壊する迅速かつ強力な免疫応答を起こすことになる。免疫系を初回抗原刺激するために用いられる物質、すなわち抗原は、弱毒化生物として公知の、感染性が低い状態での生物丸ごと、またはいくつかの場合には、生物の様々な構造成分である炭水化物、タンパク質またはペプチドなどの、生物の成分でありうる。
【０００５】
多くの場合、ワクチンを有効にする、すなわち免疫性を与えるのに十分な程度まで免疫系を刺激するために、ワクチン中に存在する抗原への免疫応答を増強する必要がある。多くのタンパク質ならびにほとんどのペプチドおよび炭水化物抗原は、単独で投与した場合に、免疫性を与えるのに十分な抗体応答を誘発しない。そのような抗原は、それらが異物として認識され、免疫応答を誘発するような様式で、免疫系に提示されなければならない。このために、選択した抗原に対する免疫応答を刺激し、増強し、かつ/またはその抗原に向ける、添加物（アジュバント）が考案されている。
【０００６】
最も良い公知のアジュバントであるフロイントの完全アジュバントは、油/水乳濁液中のマイコバクテリアの混合物からなる。フロイントのアジュバントは以下の2つの様式ではたらく：第一に、細胞性および液性免疫を増強することによる様式、および第二に、抗原攻撃の急速な分散を阻止すること（「貯蔵効果」）による様式。しかし、この材料に対する有毒な生理的および免疫反応がしばしば起こるため、フロイントのアジュバントはヒトでは用いることができない。
【０００７】
免疫賦活またはアジュバント活性を有することが判明している別の分子はエンドトキシンで、リポ多糖（LPS）としても公知である。LPSは「先天性」免疫応答、すなわち生物が以前に曝露されている必要なしにエンドトキシン（およびエンドトキシンを成分とする侵入細菌）を認識しうるように進化した応答を誘発することにより、免疫系を刺激する。LPSは実行可能なアジュバントとするには毒性が強すぎるが、モノホスホリルリピドA（「MPL」）などのエンドトキシンに構造的に関連する分子がアジュバントとして臨床試験にかけられている。LPSおよびMPLはいずれも、ヒトtoll様受容体-4（TLR-4）に対するアゴニストであることが明らかにされている。しかしながら、現在のところ、ヒトでの使用についてFDAに承認されている唯一のアジュバントはアルミニウム過硫酸塩のミョウバンで、これは抗原の沈降により抗原を「貯蔵」するために用いられる。ミョウバンは抗原に対する免疫応答も刺激する。
【０００８】
E6020は強力なTLR-4受容体アゴニストであり、したがって細菌性およびウイルス性疾患に対するワクチンなどの抗原と同時投与する場合に、免疫アジュバントとして有用である。例えば、E6020は任意の適当な抗原またはワクチン成分、例えば、病原性および非病原性の生物、ウイルス、および真菌由来の抗原からなる群より選択される抗原性物質との組み合わせで用いてもよい。さらなる例として、E6020は、天然痘、黄熱病、癌、ジステンパー、コレラ、鶏痘、猩紅熱、ジフテリア、破傷風、百日咳、インフルエンザ、狂犬病、おたふく風邪、麻疹、口蹄疫、および灰白髄炎、ならびにヘルペスおよびヘルペス関連疾患や肝炎および肝炎関連疾患などのウイルス性疾患などの、疾患状態および状態に対して薬理学的に活性なタンパク質、ペプチド、抗原およびワクチンとの組み合わせで用いてもよい。ワクチンとして用いる場合、E6020および抗原はそれぞれ、それらでワクチン接種する宿主動物、胚、または卵子に投与すると、免疫応答を誘発するのに有効な量で存在する。
0005399410.tif 000002
【０００９】
抗原単独によるよりも強力な抗体応答を刺激する能力を有するため、E6020などの化合物は重要な免疫化合物である。ワクチン中で抗原と同時投与することができる、E6020などの化合物、およびそれらの合成前駆体を調製する合成法を開発することが必要とされている。新しい合成法は、中間体としての新しい化合物および方法の段階としての新しい反応を含む。本発明は、E6020などのTLR-4受容体アゴニストの中間体および前駆体を合成するための、改善された方法を提供する。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、β-ケトアミド中間体化合物22を介してE6020前駆体化合物26をもたらす、新しい合成、中間体および前駆体に関する。本発明の合成は化合物14から出発して化合物22を調製し、次いでこれを、免疫アジュバントE6020への終わりから2番目の前駆体である化合物26の調製において化合物25と反応させる。化合物22および化合物25、ならびにそれらの結晶型は、本発明の別の態様である。
【００１１】
もう一つの態様において、本発明は、式（3）の化合物に関する：
0005399410.tif 000003
式中、R1、R2およびR3はそれぞれの場合に独立にC5〜C15アルキル基、C5〜C15アルケニル基、またはC5〜C15アルキニル基である。本発明は、式（3）の化合物の調製法にも関する。β-ケトアミド中間体化合物22は式（3）の化合物である。
【００１２】
本発明のもう一つの態様は、式（4）の化合物である：
0005399410.tif 000004
式中、R4はそれぞれの場合に独立に、C1〜C6アルキル基、C3〜C5アルケニル基、アリール基、ベンジル基または別の適当な保護基などの保護基であり；かつ各R5およびR6は、それぞれの場合に独立に、C1〜C6アルキル基であるか、またはそれらが結合している窒素と一緒になって5もしくは6員複素環を形成する。本発明は、式（4）の化合物の調製法にも関する。化合物25は式（4）の化合物である。
以下に、本発明の基本的な諸特徴および種々の態様を列挙する。
［１］
式（3）の化合物：
0005399410.tif 000005
式中、
R1はC5〜C15アルキル基、C5〜C15アルケニル基、またはC5〜C15アルキニル基であり；
R2はC5〜C15アルキル基、C5〜C15アルケニル基、またはC5〜C15アルキニル基であり；かつ
R3はC5〜C15アルキル基、C5〜C15アルケニル基、またはC5〜C15アルキニル基である。
［２］
R1がC5〜C12アルキル基であり、
R2がC7〜C14アルキル基であり、かつ
R3がC7〜C14アルキル基である、
［1］記載の化合物。
［３］
R1がC7アルキル基であり、
R2がC11アルキル基であり、かつ
R3がC11アルキル基である、
［2］記載の化合物。
［４］
R1がn-ヘプチル基であり、
R2がn-ウンデシル基であり、かつ
R3がn-ウンデシル基である、
［3］記載の化合物。
［５］
R1、R2およびR3のうちの少なくとも1つが他と異なる、［1］記載の化合物。
［６］
式（3a）
0005399410.tif 000006
の立体化学を有する、［1］、［2］、［3］、［4］、または［5］記載の化合物。
［７］
化合物22
0005399410.tif 000007
である、［6］記載の化合物。
［８］
以下に示す、式（1）の化合物と式（2）の化合物との反応による、式（3）の化合物の調製法：
0005399410.tif 000008
式中、
R1はC5〜C15アルキル基、C5〜C15アルケニル基、またはC5〜C15アルキニル基であり；
R2はC5〜C15アルキル基、C5〜C15アルケニル基、またはC5〜C15アルキニル基であり；
R3はC5〜C15アルキル基、C5〜C15アルケニル基、またはC5〜C15アルキニル基であり；かつ
Xは脱離基である。
［９］
R1がC5〜C12アルキル基であり、
R2がC7〜C14アルキル基であり、
R3がC7〜C14アルキル基であり、かつ
XがOH、Cl、F、イミダゾリジル、トリメチルアセトキシ、炭酸エチル、炭酸メチル、炭酸イソブチル、または式Zの基：
0005399410.tif 000009
であり、
R7および式（2）のR3が、式（2）の化合物が対称ベータケトエステル無水物であるように、同一である、
［8］記載の方法。
［１０］
R1がC7アルキル基であり、
R2がC11アルキル基であり、かつ
R3がC11アルキル基である、
［9］記載の方法。
［１１］
R1がn-ヘプチル基であり、
R2がn-ウンデシル基であり、かつ
R3がn-ウンデシル基である、
［10］記載の方法。
［１２］
R1、R2およびR3のうちの少なくとも1つが他と異なる、［8］記載の方法。
［１３］
イソプロパノール中で式Y
0005399410.tif 000010
の化合物を水素化して式（1）の化合物を生成する段階をさらに含む、［8］記載の方法。
［１４］
式（4）の化合物：
0005399410.tif 000011
式中、
R4はそれぞれの場合に独立に保護基であり；
R5はそれぞれの場合に独立にC1〜C6アルキル基、C3〜C6アルケニル基もしくはC3〜C6アルキニル基であり；かつ
R6はそれぞれの場合に独立にC1〜C6アルキル基、C3〜C6アルケニル基もしくはC3〜C6アルキニル基であるか；またはR5およびR6はそれらが結合している窒素と一緒になって5もしくは6員複素環を形成する。
［１５］
R4がそれぞれの場合に独立にC3〜C5アルケニル基、2-シアノエチル基、2-(トリメチルシリル)エチル基、または2,2,2-トリクロロエチル基であり；
R5がそれぞれの場合に独立にC3〜C6アルキル基であり；かつ
R6がそれぞれの場合に独立にC3〜C6アルキル基である、
［14］記載の化合物。
［１６］
R4がそれぞれの場合にアリル基であり；
R5がそれぞれの場合にイソプロピル基であり；かつ
R6がそれぞれの場合にイソプロピル基である、
［15］記載の式（4）の化合物。
［１７］
化合物25
0005399410.tif 000012
である、［16］記載の化合物。
［１８］
以下に示す、縮合反応による式（4）の化合物の調製法：
0005399410.tif 000013
式中、
R4はそれぞれの場合に独立に保護基であり；
R5はそれぞれの場合に独立にC1〜C6アルキル基、C3〜C6アルケニル基もしくはC3〜C6アルキニル基であり；かつ
R6はそれぞれの場合に独立にC1〜C6アルキル基、C3〜C6アルケニル基もしくはC3〜C6アルキニル基であるか；またはR5およびR6はそれらが結合している窒素と一緒になって5もしくは6員複素環を形成する。
［１９］
R4がそれぞれの場合に独立にC3〜C5アルケニル基、2-シアノエチル基、2-(トリメチルシリル)エチル基、または2,2,2-トリクロロエチル基であり；
R5がそれぞれの場合に独立にC3〜C6アルキル基であり；かつ
R6がそれぞれの場合に独立にC3〜C6アルキル基である、
［18］記載の方法。
［２０］
R4がそれぞれの場合にアリル基であり；
R5がそれぞれの場合にイソプロピル基であり；かつ
R6がそれぞれの場合にイソプロピル基である、
［18］記載の方法。
［２１］
式（6）の化合物の調製法であって、
（i）以下
0005399410.tif 000014
に示すように、式（3）の化合物を式（4）の化合物と反応させて式（5）の化合物を生成する段階；および
（ii）以下
0005399410.tif 000015
に示すように、生成した式（5）の化合物を酸化して式（6）の化合物を生成する段階
を含む方法：
式中、
R1はC5〜C15アルキル基、C5〜C15アルケニル基、またはC5〜C15アルキニル基であり；
R2はC5〜C15アルキル基、C5〜C15アルケニル基、またはC5〜C15アルキニル基であり；
R3はC5〜C15アルキル基、C5〜C15アルケニル基、またはC5〜C15アルキニル基であり；
R4はそれぞれの場合に独立に保護基であり；
R5はそれぞれの場合に独立にC1〜C6アルキル基、C3〜C6アルケニル基もしくはC3〜C6アルキニル基であり；かつ
R6はそれぞれの場合に独立にC1〜C6アルキル基、C3〜C6アルケニル基もしくはC3〜C6アルキニル基であるか；またはR5およびR6はそれらが結合している窒素と一緒になって5もしくは6員複素環を形成する。
［２２］
R1がC5〜C12アルキル基であり；
R2がC7〜C14アルキル基であり；
R3がC7〜C14アルキル基であり；
R4がそれぞれの場合に独立にC3〜C5アルケニル基、2-シアノエチル基、2-(トリメチルシリル)エチル基、または2,2,2-トリクロロエチル基であり；
R5がそれぞれの場合に独立にC3〜C6アルキル基であり；かつ
R6がそれぞれの場合に独立にC3〜C6アルキル基である、
［21］記載の方法。
［２３］
R1がC7アルキル基であり；
R2がC11アルキル基であり；
R3がC11アルキル基であり；
R4がアリル基であり；
R5がイソプロピル基であり；かつ
R6がイソプロピル基である、
［21］記載の方法。
［２４］
R1がn-ヘプチル基であり；
R2がn-ウンデシル基であり；
R3がn-ウンデシル基であり；
R4がアリル基であり；
R5がイソプロピル基であり；かつ
R6がイソプロピル基である、
［23］記載の方法。
［２５］
R1、R2およびR3のうちの少なくとも1つが他と異なる、［21］記載の方法。
［２６］
式（5）の化合物の生成が下記の段階を含む、［21］記載の方法：
（i）ヘプタンおよびアセトニトリルの共溶媒混合物中で、式（3）の化合物および式（4）の化合物を一緒に、全ての固体が溶解するまで撹拌する段階；
（ii）1.0から2.0当量の間の酢酸を、温度を20から25℃の間に維持しながら、ゆっくり加える段階；および
（iii）得られた混合物を反応が完了するまで撹拌する段階。
［２７］
用いるヘプタンの重量が、用いる式（3）の化合物の重量の4から6倍の間である、［26］記載の方法。
［２８］
用いるアセトニトリルの重量が、用いる式（3）の化合物の重量の1から2倍の間である、［26］記載の方法。
［２９］
式（6）の化合物を生成するための生成した化合物（5）の酸化が下記の段階を含む、［21］〜［28］のいずれか一項記載の方法：
（i）生成した式（5）の化合物を含む反応混合物にヘプタンを加える段階；
（ii）得られた混合物を-5℃から10℃まで冷却する段階；
（iii）30重量％H2O2水溶液を、反応混合物の温度が-5℃から10℃の間に維持されるような速度でゆっくり加える段階；および
（iv）得られた混合物を-5℃から10℃の間の温度で反応が完了するまで撹拌する段階。
［３０］
段階（ii）の混合物を0から5℃の間まで冷却し；
段階（iii）の混合物を0から2℃の間に維持し；
段階iv）の混合物を-1から2℃の間に維持する、
［29］記載の方法。
［３１］
結晶性化合物22：
0005399410.tif 000016
。
［３２］
12.3±0.2°2Θ、14.5±0.2°2Θ、16.2±0.2°2Θ、17.8±0.2°2Θ、22.2±0.2°2Θ、および23.8±0.2°2Θにピークを有するx線粉末回折パターンによってさらに特徴付けられる、［31］記載の結晶性化合物22。
［３３］
約41℃の融点を有することによってさらに特徴付けられる、［32］記載の結晶性化合物22。
［３４］
結晶性化合物25：
0005399410.tif 000017
。
［３５］
6.6±0.3°2Θ、14.0±0.3°2Θ、17.3±0.3°2Θ、および19.4±0.3°2Θにピークを有するx線粉末回折パターンによってさらに特徴付けられる、［34］記載の結晶性化合物25。
［３６］
約65℃の融点を有することによってさらに特徴付けられる、［35］記載の結晶性化合物25。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明のE6020のβ-ケトアミド合成の概要である。
【図２】結晶性化合物22の粉末X線回折パターンである。
【図３】結晶性化合物22のDSC温度記録である。
【図４】結晶性化合物25の粉末X線回折パターンである。
【図５】結晶性化合物25のDSC温度記録である。
【図６】様々な原子ラベル付きの結晶性化合物25のORTEP描画である。
【図７】c軸に沿った結晶性化合物25の結晶充填図である。
【図８】結晶性化合物25の模擬粉末X線回折パターンである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
発明の詳細な説明
2006年6月30日提出の米国特許出願第11/477,936号「Compounds For Preparing Immunological Adjuvant」（米国特許第2007-0082875 A1号として2007年4月12日公開）は、E6020の合成を記載しており、参照により本明細書に組み入れられる。その合成はリン酸エステルウレイド二量体である化合物19を通して進行する。米国特許第2007-0082875 A1号のスキーム1〜3は、化合物19を介してのE6020の合成を示している。スキーム1に示す出発原料はER-028694（1,3-デカンジオール；販売者Mitsui & Co. (US), New York, NYから市販；製造者Nippon Fine Chemicals）およびER-807277（4-オキサゾールメタノール, 4,5-ジヒドロ-2-フェニル-, (4R)-プロパンジオール；Catalytica Pharmaceuticals, Boonton, NJから市販）である。E6020への終わりから2番目の前駆体は化合物26である。
【００１５】
本発明は、β-ケトアミド中間体化合物22を介してE6020前駆体化合物26に導く、新しい合成、中間体および前駆体に関する。本発明の合成は化合物14から出発して化合物22を調製し、次いでこれを、免疫アジュバントE6020への前駆体である化合物26の調製において化合物25と反応させる。本発明の合成のこれらの段階、すなわちβ-ケトアミド中間体（3）の調製と、続くβ-ケトアミド（3）の尿素ジホスホラミダイト（4）との縮合をスキーム4に示し、以下に詳細に記載する。化合物22および化合物25、ならびにそれらの結晶型は、本発明の別の態様である。
【００１６】
化合物22および25などの、化合物の結晶型を得ることは、薬物開発において非常に有用である。化合物の固体型（結晶またはアモルファス）は異なる物理的および化学的性質、例えば、溶解性、安定性、または再生される能力を有しうる。これらの性質は、特に結晶性中間体が得られる場合には、製造工程の最適化を可能にすることが多い。本明細書に記載するものなどの、多段階合成では、中間体を調製し、不要な副生成物または不純物を初期の段階から繰り越すこともできる。ろ過、分離、および/または精製段階を導入して、不要な副生成物または不純物を除去することも多い。そのような段階を導入することは、製造コストを高めることがあるだけでなく、合成の全収率を下げることもある。多段階合成内に結晶性中間体を有することで、これらの問題に対処することができる。結晶性中間体は特定の利点を提供し、すなわち高純度の中間体は他の精製段階の必要性を低減し、合成工程のコストを下げることができる。
スキーム1
0005399410.tif 000018
ステージ1：TsCl、Et3N、THF。
ステージ2：NaHMDS、THF、クロマトグラフィ、結晶化。
ステージ3：ラウリン酸、EDC、DMAP、CH2Cl2、クロマトグラフィ。
ステージ4：H2、10％Pd/C、EtOH。
ステージ5：Boc2O、THF、クロマトグラフィ。
スキーム2
0005399410.tif 000019
ステージ6：a.  ジイソプロピルアミン、Py・TFA、((iPr)2N)2P(Oアリル)、CH2Cl2
b.  HOAc、Py・TFA、FmocNH(CH2)2OH
c.  H2O2、クロマトグラフィ
ステージ7：ジメチルアミン、THF。
ステージ8：トルエン中20％ホスゲン、飽和NaHCO3水溶液、クロマトグラフィ
スキーム3
0005399410.tif 000020
ステージ9：TFA、CH2Cl2。
ステージ10：3-オキソ-テトラデカン酸、EDC、DMF、クロマトグラフィ。
ステージ11：Pd(PPh3)4、PPh3、PhSiH3、THF、クロマトグラフィ。
スキーム4 
0005399410.tif 000021
ステージ1：H2、Pd/C、IPA
ステージ2：3-オキソ-テトラデカン酸、CDI、ACN、結晶化
ステージ3：Py.TFA、ACN、結晶化
ステージ4：ACN、ヘプタン、HOAc、H2O2、Na2S2O3、クロマトグラフィ
【００１７】
β-ケトアミドアルコール中間体（3）の調製
化合物26、および類似の化合物の合成は、まず式（1）のα-ヒドロキシルアミンを式（2）の化合物と適当な反応条件下で反応させて、式（3）のβ-ケトアミドを生成する段階を含む。これをスキーム5に示す。
スキーム5
0005399410.tif 000022
【００１８】
スキーム5に従っての化合物（3）の調製は、異なる調製を用いて達成しうる。基R1、R2およびR3は以下に定義するとおりである。R1、R2およびR3は互いに独立に変動しうるため、化合物（3）はR1、R2およびR3に対称または不斉の基を有しうる。化合物（2）において、Xは、例えば、OH、Cl、F、イミダゾリジル、カーボネート、およびエステルなどの適当な脱離基である。好ましい脱離基には、OH、Cl、F、イミダゾリジル、トリメチルアセトキシ、炭酸エチル、炭酸メチル、炭酸イソブチルまたは式Zの基が含まれる：
0005399410.tif 000023
ここで、R7および式（2）のR3は、式（2）の化合物が対称ベータケトエステル無水物であるように、同一である。そのような無水物は、2つの同一のベータ-ケト酸分子の縮合から得ることができる。
【００１９】
一つの調製において、化合物（3）は、化合物（1）とXがイミダゾリドである化合物（2）との縮合から得ることができた。後者は、アセトニトリルなどの極性非プロトン性溶媒中、XがOHである化合物（2）（カルボン酸）のCDI（カルボニルジイミダゾール）試薬による活性化から得る。
【００２０】
第二の調製において、化合物（3）は、DMFまたはCH2Cl2などの溶媒中、HBTU（O-(ベンゾトリアゾル-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート）のようなアミド結合カップリング試薬、または同じファミリーの他のカップリング試薬および3級アミン塩基（例えば、ヒューニッヒ塩基、N,N-ジイソプロピルエチルアミン）存在下、化合物（1）とXがOHである化合物（2）（カルボン酸）との縮合からも得ることができた。加えて、EDC（N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N-エチルカルボジイミド塩酸塩）などのカルボジイミド試薬を用いて、XがOHである化合物（2）（カルボン酸）を活性化することもできる。
【００２１】
化合物（3）を調製するための第三の調製は、CH2Cl2のような溶媒中、3級アミン塩基（例えば、ヒューニッヒ塩基）存在下、化合物（1）とXがFである化合物（2）（フッ化アシル）との縮合である。XがFである化合物（2）（フッ化アシル）は、CH2Cl2などの溶媒中、XがOHである化合物（2）（カルボン酸）のTFFH（フルオロ-N,N,N',N'-テトラメチルホルムアミジニウムヘキサフルオロホスファート）試薬による活性化から生成することができる。
【００２２】
化合物（3）は、CH2Cl2などの溶媒中、3級アミン塩基（例えば、ヒューニッヒ塩基）存在下、化合物（1）とXがClである化合物（2）（塩化アシル）との縮合からの、第四の調製を介して得ることもできた。XがClである化合物（2）（塩化アシル）は、CH2Cl2などの溶媒中、XがOHである化合物（2）（カルボン酸）の塩化オキサリル試薬による活性化から生成することができる。
【００２３】
第五の調製は、CH2Cl2などの溶媒中、3級アミン塩基（例えば、ヒューニッヒ塩基）存在下、化合物（1）とXがカーボネートであるアルカン酸炭酸無水物化合物（2）との縮合から化合物（3）を調製することができる。後者は、CH2Cl2などの溶媒中、3級アミン塩基（例えば、トリエチルアミン）存在下、XがOHである（2）（カルボン酸）のクロロギ酸エチル試薬による活性化から得る。
【００２４】
第六の調製は、CH2Cl2などの溶媒中、3級アミン塩基（例えば、ヒューニッヒ塩基）存在下、化合物（1）とXがエステルである混合無水物化合物（2）との縮合から化合物（3）を調製することができる。後者は、CH2Cl2などの溶媒中、3級アミン塩基（例えば、トリエチルアミン）存在下、XがOHである（2）（カルボン酸）の塩化ピバロイル試薬による活性化から得る。
【００２５】
化合物（3）は、CH2Cl2などの溶媒中、XがOHである化合物（2）（カルボン酸）を塩化オキサリル試薬および3級アミン塩基（例えば、トリエチルアミン）の作用により対称無水物にまず変換する、第七の調製を介して得ることもできた。得られた無水物を、CH2Cl2などの溶媒中、3級塩基（例えば、トリエチルアミン）存在下、化合物（1）と縮合させる。
【００２６】
以下の実施例1に示すとおり、式（1）の化合物は式Yの化合物を水素化することにより調製してもよい：
0005399410.tif 000024
式中、R1およびR2は上で定義したとおりである。水素化は任意の適当な溶媒、例えば、エタノール、イソプロパノールおよび当技術分野において公知の他の溶媒中で実施してもよいが、好ましくはイソプロパノール中で行う。
【００２７】
式（1）、（2）、および（3）において、各R1、R2およびR3は、それぞれの場合に独立に、C5〜C15アルキル基、C5〜C15アルケニル基、またはC5〜C15アルキニル基でありうる。アルキル基、アルケニル基、およびアルキニル基は置換されていても無置換でもよく、直鎖または分枝であってもよく、好ましくは直鎖である。好ましい態様において、R1はC5〜C12アルキル基、C5〜C12アルケニル基、またはC5〜C12アルキニル基、より好ましくはC5〜C9アルキル基、C5〜C9アルケニル基またはC5〜C9アルキニル基であり、その一方で、各R2およびR3は、それぞれの場合に独立に、C7〜C14アルキル基またはC7〜C14アルケニル基、より好ましくはC9〜C13アルキル基またはC9〜C13アルケニル基である。好ましくは、R1はC7アルキル基、最も好ましくは無置換n-ヘプチル基であり、かつR2およびR3はいずれもC11アルキル基、最も好ましくは無置換n-ウンデシル基である。
【００２８】
本発明に関して前述のR1、R2、およびR3の様々な基について言及されるアルキル、アルケニル、アルキニル基は置換されていても無置換でもよい。置換基の例には、ハロ置換基（例えば、F、Cl、Br、およびI）；C1〜C6アルコキシ基（例えば、-OCH3、-OCH2CH3、-OCH(CH3)2など）；C1〜C6ハロアルキル基（例えば、-CF3、-CH2CF3、-CHCl2など）；C1〜C6アルキルチオ；アミド；-NO2；および-CNが含まれるが、それらに限定されるわけではない。特に記載がないかぎり、アルキル、アルケニル、およびアルキニル基は直鎖または分枝であってもよく、直鎖が一般に好ましい。
【００２９】
式（3）のβ-ケトアミドアルコール化合物は新規化合物で、特に、E6020などの化合物の調製における中間体として有用である。式（3）の化合物は本発明の別の態様である。式（3a）に示す立体化学を有するβ-ケトアミドアルコール化合物が特に好ましい。
0005399410.tif 000025
【００３０】
E6020の合成において、β-ケトアミドアルコールは化合物22である。化合物22およびその結晶型も、本発明の別の態様である。化合物14から出発しての化合物22の合成を以下の実施例1に記載し、結晶性22の固体状態の特徴づけを以下の実施例2に記載する。
0005399410.tif 000026
【００３１】
尿素ジホスホラミダイト（4）の調製
式（4）の尿素ジホスホラミダイト化合物は、E6020のβ-ケトアミドアルコール合成におけるもう一つの新規中間体化合物である。したがって、式（4）の化合物は本発明の別の態様である。式（4）の尿素ジホスホラミダイト化合物は、スキーム6に示すとおり、1,3-ビス(2-ヒドロキシエチル)尿素を2つの式（7）のホスホロジアミダイト化合物と反応させることによって調製してもよく、式中、R4、R5、およびR6は以下に記載するとおりである。
スキーム6
0005399410.tif 000027
【００３２】
いくつかの態様において、1,3-ビス(2-ヒドロキシエチル)尿素とホスホロジアミダイトとの反応を、ビス-ヒドロキシ化合物を当技術分野において公知のものなどの適当な活性化剤と反応させ、次いでホスホロジアミダイト化合物を反応混合物に加えることによって行う。いくつかの態様において、活性化剤は(1H)-テトラゾールおよびトリフルオロ酢酸ピリジニウムからなる群より選択される。いくつかの態様において、活性化剤はトリフルオロ酢酸ピリジニウムである。いくつかの態様において、スキーム6の反応はアセトニトリル、ジクロロメタン、ジクロロエタン、およびtert-ブチルメチルエーテルからなる群より選択される溶媒を含む溶媒中で行う。いくつかの態様において、スキーム6の反応は溶媒としてのアセトニトリル中で行う。
【００３３】
β-ケトアミドアルコール（3）と尿素ジホスホラミダイト（4）との縮合
上のスキーム4に示すとおり、化合物26の合成は式（3）のβ-ケトアミドアルコールを式（4）の尿素ジホスホラミダイト化合物と縮合反応させて、式（5）のβ-ケトアミド尿素ホスファイト化合物を生成し、これを次いで酸化して式（6）のβ-ケトアミド尿素ホスフェート化合物を生成する段階を含む。これを以下のスキーム7に示す。
スキーム7
0005399410.tif 000028
【００３４】
式（4）、（5）、および（6）において、R1、R2およびR3は、それらの好ましい態様を含む、前述のものと同じであり、互いに無関係である。それぞれの場合に、R1、R2およびR3は同じでも異なっていてもよい。すなわち、式（6）の化合物は、各R1、R2またはR3位に同じまたは異なるアルキル、アルケニルおよび/またはアルキニル基を有していてもよい。各R4基は独立に、以下の基を含むが、それらに限定されるわけではない、保護基でありうる：メチル、エチル、イソプロピル、tert-ブチルなどのアルキルまたは置換アルキル基、好ましくはC1〜C6アルキル基；アリル、2-メチルプロペニル、ブテニルなどのアルケニルまたは置換アルケニル基、好ましくはC3〜C5アルケニル基；アルキニル、好ましくはC3〜C5アルキニル基；シクロヘキシルなどのシクロアルキル基；2-シアノエチル、2-シアノ-1,1-ジメチルエチル、2-(トリメチルシリル)エチルなどの2-置換エチル基；2,2,2-トリクロロエチル、2,2,2-トリクロロ-1,1-ジメチルエチル、2,2,2-トリブロモエチルなどのハロエチル基；ベンジル、4-ニトロベンジル、4-クロロベンジルなどのベンジルまたは置換ベンジル基；フェニル、4-ニトロフェニル、4-クロロフェニル、2-クロロフェニル、2-メチルフェニル、2,6-ジメチルフェニル、2-ブロモフェニルなどのアリールまたは置換アリール基；およびトリメチルシリルなどのシリル基。R4のための特に好ましい保護基は、メチル、エチル、tert-ブチル、アリル、2-メチルプロペニル、ブテニル、2-シアノエチル（NCCH2CH2-）、2-(トリメチルシリル)エチル（(CH3)3SiCH2CH2-）、および2,2,2-トリクロロエチル（Cl3CCH2-）である。R1、R2およびR3と同様、R4の各出現はR4の定義の範囲内で互いに変動しうる。
【００３５】
R5およびR6はそれぞれの場合に独立にC1〜C6アルキル基、C3〜C6アルケニル基またはC3〜C6アルキニル基であり、ここで該アルキル、アルケニル、およびアルキニル基は置換されていても無置換でもよく、またはそれらが結合している窒素と一緒になって5もしくは6員複素環を形成する。複素環は追加のヘテロ原子、例えば、N、O、および/またはSを含んでいてもよく；飽和でも不飽和でもよく、かつ無置換でも置換されていてもよい。置換基の例には、ハロ置換基（例えば、F、Cl、Br、およびI）；C1〜C6アルコキシ基（例えば、-OCH3、-OCH2CH3、-OCH(CH3)2など）；C1〜C6ハロアルキル基（例えば、-CF3、-CH2CF3、-CHCl2など）；C1〜C6アルキルチオ；-NO2基；および-CN基が含まれるが、それらに限定されるわけではない。適当な複素環基には、ピペリジル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピロリジルなどが含まれるが、それらに限定されるわけではない。R4、R5およびR6のアルキル、アルケニル、およびアルキニル基は置換されていても無置換でもよく、直鎖または分枝であってもよい。置換基の例には、ハロ置換基（例えば、F、Cl、Br、およびI）；C1〜C6アルコキシ基（例えば、-OCH3、-OCH2CH3、-OCH(CH3)2など）；C1〜C6ハロアルキル基（例えば、-CF3、-CH2CF3、-CHCl2など）；C1〜C6アルキルチオ；-NO2基；および-CN基が含まれるが、それらに限定されるわけではない。好ましい態様において、R4はC3〜C5アルケニル基であり、かつR5およびR6はそれぞれ独立に分枝C1〜C6アルキル基である。好ましくは、R4はアリル基であり、かつR5およびR6はイソプロピル基である。
【００３６】
いくつかの態様において、式(3）の化合物および式（4）の化合物の混合物に溶媒を加え、すべての固体が溶解するまで撹拌し、混合物に酢酸を加えることによって、式（3）の化合物を式（4）の化合物と反応させる。いくつかの態様において、溶媒は無水であり、共溶媒混合物であってもよい。いくつかの態様において、共溶媒混合物はアセトニトリルおよび炭化水素溶媒を含み、好ましい態様において、溶媒は、例えば、無水アセトニトリルおよび無水ヘプタンの混合物であってもよい。いくつかの態様において、共溶媒混合物はヘプタンおよびアセトニトリルを含む。いくつかの態様において、共溶媒混合物中のヘプタンの重量は式（3）の化合物の重量の4から6倍の間である。いくつかの態様において、共溶媒混合物中のヘプタンの重量は式（3）の化合物の重量の4.5から5.5倍の間である。いくつかの態様において、共溶媒混合物中のアセトニトリルの重量は式（3）の化合物の重量の1から2倍の間である。いくつかの態様において、共溶媒混合物中のアセトニトリルの重量は式（3）の化合物の重量の1.2から1.5倍の間である。いくつかの態様において、用いる酢酸の重量は用いる式（3）の化合物の量の1から2モル当量の間である。いくつかの態様において、用いる酢酸の量は用いる式（3）の化合物の量の1.2から5モル当量の間である。いくつかの態様において、反応混合物の温度は酢酸の添加中、約20〜25℃に維持する。
【００３７】
いくつかの態様において、スキーム7の方法によって生成する式（5）の化合物を、酸化剤によって式（6）の化合物に酸化する。いくつかの態様において、酸化剤は過酸化水素、Oxone(登録商標)酸化剤、mCPBA（メタ-クロロ過安息香酸）などである。いくつかの態様において、過酸化水素は30重量％H2O2水溶液である。いくつかの態様において、生成した式（5）の化合物を含む反応混合物を、酸化段階の前に追加のヘプタンで希釈する。いくつかの態様において、加える追加のヘプタンの重量は用いる式（3）の化合物の重量の5から10倍の間である。いくつかの態様において、加える追加のヘプタンの重量は用いる式（3）の化合物の重量の約8倍である。いくつかの態様において、生成した式（5）の化合物を含む反応混合物を、追加のヘプタンを加えた後、酸化剤を加える前に、-5〜10℃に冷却する。いくつかの態様において、生成した式（5）の化合物を含む反応混合物を、追加のヘプタンを加えた後、酸化剤を加える前に、0〜5℃に冷却する。いくつかの態様において、酸化剤を加えた後、反応混合物の温度を約-5〜10℃に維持する。いくつかの態様において、酸化剤を加えた後、反応混合物の温度を約0〜2℃に維持する。いくつかの態様において、酸化剤を加えた後、反応が完了するまで、反応混合物を約-5〜10℃の温度で撹拌する。いくつかの態様において、酸化剤を加えた後、反応が完了するまで、反応混合物を約-1〜2℃の温度で撹拌する。いくつかの態様において、反応をHPLCでモニターして完了を判定する。いくつかの態様において、反応が完了した後、過剰の過酸化物を分解するためにチオ硫酸ナトリウム5水和物で反応停止する。
【００３８】
化合物26の合成において、式（4）の化合物は化合物25である。化合物25およびその結晶型も、本発明の別の態様である。ジヒドロキシ尿素化合物24から出発しての化合物25の合成を以下の実施例4に記載し、結晶性化合物25の固体状態の特徴づけを以下の実施例5に記載する。
【００３９】
以下の実施例6は、化合物22および化合物25の反応からのE6020前駆体化合物26（R1がn-ヘプチルであり、R2およびR3がいずれもn-ウンデシルであり、かつR4がアリルである、式（6）の化合物の種）の調製を記載する。
【００４０】
本明細書において記載する合成法を、化合物26およびしたがってE6020の任意のすべての可能な立体異性体、例えば、以下の一般式をそれぞれ有する化合物（A）および（B）の調製に適合させてもよい：
0005399410.tif 000029
【００４１】
以下の実施例は特定の立体異性体の調製を開示するが、化合物26の他の立体異性体の調製法は本発明の範囲内に入ると考えられる。本発明の合成法は純粋な立体異性体を提供するために非常に適しており、そのために、スキーム7（上）に示すとおり、出発原料（3）の最初の立体化学が規定され、尿素ジホスホラミダイト（4）に対して2当量の比で用いられる。この方法は、1、6、22、27位に(R,R,R,R)立体化学を有するE6020；ER-824156 (S,S,S,S)；ER-804053 (R,S,S,R)；およびER-824095 (S,R,R,S)を含む、4つの純粋な立体異性体を調製することを可能にするであろう。他の立体異性体（ER-826685 (R,R,S,R)；ER-824887 (R,R,R,S)；ER-826682 (R,R,S,S)；ER-827905 (R,S,R,S)；ER-826683 (R,S,S,S)；ER-804097 (S,S,R,S)）を調製するために、生成物の混合物を得ることになり、そのために2および7位に規定された立体化学を有する出発原料（3）の1当量を用いる一方で、出発原料（3）の第二の当量は2および7位に異なるように規定された立体化学を有する。その結果としての反応（スキーム7を用いて）は、化合物（6）の3つの異なる立体異性体を提供し、これはカラムクロマトグラフィで分離し、前述の第一の合成法および米国特許第6,290,973号に記載の分離法によって前に調製した確証のある立体異性体との1H-NMRおよびHPLC比較により構造決定することができる。米国特許第6,551,600号；第6,290,973号；および第6,521,776号は、E6020および関連化合物への他の合成経路を開示しており、特定の試薬および出発原料を調製する上で有用な背景情報を提供し、参照により本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００４２】
以下の実施例において、反応器（例えば、反応容器、フラスコ、ガラス反応器など）を記載するために「不活性化した（inerted）」なる用語を用いる場合、反応器内の空気が本質的に水分を含まない、または乾燥した不活性ガス（窒素、アルゴンなど）で置き換えられていることを意味する。本明細書において用いられる「当量」（略記：eq）なる用語は、あらかじめ設定された出発原料との比較による、試薬または反応化合物の化学量論（モル比）を記載する。本明細書において用いられる「重量」（略記：wt）なる用語は、以下の実施例において具体的に言及する反応または精製の特定の化学成分の質量との比較による、物質または物質群の質量の比に対応する。比はg/gまたはKg/Kgとして算出する。本明細書において用いられる「体積」（略記：vol）なる用語は、反応または精製のあらかじめ設定された化学成分の質量または体積に対する、所与の物質または物質群の体積の比に対応する。式において用いる単位は桁をマッチさせることを含む。例えば、比はmL/mL、mL/g、L/LまたはL/Kgとして算出する。以下の略記を本明細書において用いる：
0005399410.tif 000030
【００４３】
実施例1：化合物22の調製
0005399410.tif 000031
化合物15の調製（段階1）
一般手順：上のステージ1に示すとおり、化合物15を以下のとおりに調製してもよい。不活性化した反応容器に、化合物14（1wt、1eq）、Pd/C（好ましくは約0.1〜0.2wt、0.025〜0.050eq）、および適当な水素化溶媒（例えば、THFなどの非水性極性溶媒、好ましくは極性プロトン性溶媒、より好ましくは低分子量アルコール；最も好ましくはエタノールまたはイソプロパノール）（約6〜7vol）を加える。容器中の不活性ガスを水素（好ましくは約1気圧から約120psiの圧で）で置き換え、反応混合物を室温で反応が本質的に完了するまで（約3〜8日間）撹拌する。次いで、反応容器中の水素を不活性ガスで置き換え、触媒をろ去（例えば、セライトを用いて）する。次いで、ろ液を濃縮して、化合物15（約0.8wt）を淡黄色油状物で得る。以下の手順はエタノールおよびイソプロパノール中での化合物14の化合物15への水素化を記載する。
【００４４】
段階1（a1）：エタノール中での水素化：
磁気撹拌装置を備え、不活性化した丸底フラスコに、化合物14（3.00g、1.0wt、1.0eq）、10％Pd/C（Degussa type E101 NE/W、0.300g、0.10wt、0.024eq、Aldrich）、およびエタノール（20.0mL、6.7vol）を加えた。容器中の不活性ガス、すなわち窒素を水素（1気圧）で置き換え、反応混合物を室温でTLC分析により反応が完了したと判明するまで（約4日間）撹拌した。次いで、反応容器中の水素を窒素で置き換え、触媒をセライト上でろ去し、少量のエタノールを洗液として用いた。
【００４５】
段階1（a2）化合物15は一般に、化合物22を調製するためにインサイチューで用いてもよい。特徴づけのために、化合物15/エタノールろ液を濃縮して化合物15（2.5g、0.83wt）を淡黄色油状物で得、最少量の10％メタノール/ジクロロメタンに再度溶解し、シリカゲルカラム（KP-Sil、13.0wt）にロードし、10％メタノール/ジクロロメタンで溶出した。少数の純粋な分画を合わせ、減圧濃縮して、精製した化合物15（0.1wt）を得た。
【００４６】
精製した化合物15の分析データ：
0005399410.tif 000032
。ESI-MS (M+H)+ C25H52NO4の理論計算値：430.4；実測値：430.4。
【００４７】
段階1（b1）イソプロパノール中での水素化：
不活性化した12Lガラスフラスコに化合物14（2.0kg、1.0wt）およびイソプロパノール（8.0kg、4.0wt）を加え、混合物を化合物14が溶解するまで撹拌した。撹拌機を備えた5ガロン（約18.9L）の不活性化した反応器に、Pd/C（Johnson Matthey type A402028-10、10％Pd/C、50％含水；0.411kg、0.206wt、0.05eq）および化合物14/イソプロパノール溶液を加えた。イソプロパノール（1.1kg、0.55wt）を用いて、残りの化合物14を5ガロン反応器に洗い込んだ。次いで、5ガロン反応器を約750rpmで撹拌しながら、窒素で10〜15psiまで加圧した。約250rpmで撹拌しながら窒素を排気した。窒素加圧-および-排気サイクルをさらに2回繰り返した。反応器を約750rpmで撹拌しながら、水素（等級5.0）で25psiまで加圧し、次いで約250rpmで撹拌しながら水素を排気した。次いで、反応器を約750rpmで撹拌しながら、水素で120psiまで加圧した。次いで、反応混合物を周囲温度で65時間撹拌し、その後水素を排気した。次いで、反応器を窒素で10〜15psiまで加圧し、その後窒素を排気した。窒素加圧-排気工程をさらに2回繰り返した。HPLCモニタリングにより、完全な反応が示された。次いで触媒を、イソプロパノール（3.9kg、1.95wt）であらかじめ洗浄した2つのCUNOフィルターハウジング（直列に連結したCUNO CTG Klean 1.0μmフィルターカートリッジおよびCUNO CTG Klean 0.2μmフィルターカートリッジ）を通してろ去した。反応器をイソプロパノール（5.0kg、2.5wt）で洗浄し、得られた洗浄溶液をCUNOハウジングを通してろ過した。ろ液を合わせ、化合物15/イソプロパノールの無色澄明溶液（15.8kg、7.9wt）を生成した。この溶液の約15kg（7.5wt）（それぞれ0.95×15.8および7.9）を6.55kg（3.28wt）まで減圧下で濃縮し、精製せずに段階2aで用いた。
【００４８】
化合物22の調製（段階2a）
一般手順：上のステージ2に示すとおり、以下の一般手順を用いて化合物22を調製してもよい（すべての重量、当量および体積は段階1で用いた化合物14の質量に対するものである）：撹拌装置を備え、不活性化したガラス反応器に、カルボニルジイミダゾール（CDI）（0.34wt、1.1eq）および無水アセトニトリル（7.4wt）を加える。撹拌を開始し、混合物を約0℃に冷却する。3-オキソ-テトラデカン酸（0.514wt、1.1eq）を加え、温度を約0℃に維持しながら撹拌を続ける。イミダゾリド生成をHPLCでモニターする。完了と判定されれば、段階1で得た化合物15/IPA溶液（3〜8wt）を温度を約0℃に保ちながら加える。反応混合物を約0℃で撹拌し、HPLCでモニターする。完了後、反応温度を≦15℃に保ちながら、氷酢酸（0.24wt、2.1eq）を加える。反応混合物を約20℃にし、20〜25℃の減圧下で溶媒を部分的に蒸発させて、体積を約5〜7.5volまで減少させ、澄明な橙色溶液を得る。ヘプタン（8.5wt）を加え、得られた混合物をNH4Cl（0.15wt）および水（5.2wt）からなる溶液で洗浄する。次いで、ヘプタン層を塩化ナトリウム（1.0wt）および水（3.2wt）からなる溶液で洗浄する。ヘプタン層を約25〜30℃の減圧下で約2.2〜4.4volまで濃縮し、次いで酢酸イソプロピル（9.0wt）を加え、得られた溶液を約25〜30℃の減圧下で濃縮して、澄明な橙色油状物（2.2〜5.6volまたは2.0〜5.0wt）を得る。
【００４９】
具体例：以下の手順は、段階1（b1）で2.0Kgの化合物14を用いて生成した化合物15の量の95％を含む規模での、化合物22の調製を記載する。したがって、本実施例に関して、1.9Kg＝1.0wtである。撹拌機を備えた50Lの不活性化したガラス反応器に、カルボニルジイミダゾール (CDI）（0.65Kg、0.34wt、1.1eq）および無水アセトニトリル（14.1Kg、7.4wt）を加えた。撹拌を開始し、混合物を0℃まで冷却した。次いで、温度を約0℃に維持しながら、持続的撹拌下で3-オキソ-テトラデカン酸（0.98Kg、0.516wt、1.1eq.；DSM Pharmaceutical Products, Parsippany, NJから購入）を加えた。イミダゾリド生成をHPLCでモニターした。約10.5時間後に完了した後、段階1（b1）で得た化合物15/IPA溶液（6.55kg、3.45wt）を1分間で加え、温度は約0℃のままであった。IPA（1.7Kg、0.89wt）を洗浄溶液として用いた。反応混合物を0〜3℃で終夜撹拌した。HPLCにより反応が完了したことが確認された。次いで、反応温度を≦15℃に保ちながら、氷酢酸（0.46Kg、0.24wt、2.1eq）を加えた。（酢酸の添加は化合物15の添加の約12.25時間後に行った。）反応混合物を20℃にし、20〜22℃の減圧下で溶媒を部分的に蒸発させて、体積を約13L（6.8vol）まで減少させ、澄明な橙色溶液を得た。ヘプタン（16.2Kg、8.53wt）を加え、得られた混合物をNH4Cl（0.29Kg、0.15wt）および水（9.9Kg、5.2wt）からなる溶液で洗浄し、続いて塩化ナトリウム（1.9Kg、1.0wt）および水（6.1Kg、3.2wt）からなる溶液で洗浄した。ヘプタン層を25〜30℃の減圧下で約7L（3.7vol）まで濃縮した。次いで、酢酸イソプロピル（17.0Kg、8.95wt）を加え、得られた溶液を25〜30℃の減圧下で濃縮して、澄明な橙色油状物約7L（3.7vol、純度（HPLC）：83.8面積％）を生成した。化合物22の分析のためのHPLC条件（化合物22のHPLC TM1）：
0005399410.tif 000033
【００５０】
化合物22の結晶化（段階2b）
一般手順：化合物22を酢酸イソプロピル/アセトニトリル混合物から結晶化させてもよい。例えば、ガラス容器中、化合物22（2.2〜5.6vol、化合物14に基づいて）を酢酸イソプロピル（3.5wt）に溶解する。得られた溶液をろ過し、酢酸イソプロピルで全重量を約7.4wtに調節する。次いで、撹拌機を備え、ジャケットで覆った、適当なサイズのガラス反応器に溶液を移し、アセトニトリル（5.0wt）を加える。不活性窒素雰囲気下、得られた混合物を約5〜8℃まで冷却して、化合物22の結晶を生成する。温度を約15℃まで上げて、小さい結晶を溶解する。温度を15℃で約2時間維持し、約-12℃までゆっくり冷却し、次いで、好ましくは-12℃でさらに1時間維持する。化合物22をろ過し、固体を冷却した（約-20℃）酢酸イソプロピル/アセトニトリル混合物（1：1（v/v）、1〜2wt）で洗浄する。湿ケークを乾燥して、化合物22を白色固体で得る（約0.9〜1.5wt）。
【００５１】
具体例：以下の手順は、1.9Kgの化合物14出発原料（すなわち、1.9Kg＝1.0wt）を含む規模での、化合物22の結晶化法を示す：ガラス容器中、段階2aからの化合物22の粗製油状物（化合物14に基づき3.7vol）を酢酸イソプロピル（6.7Kg、3.5wt）に溶解した。得られた溶液をろ過し、過剰の溶媒を25〜30℃の減圧下で除去した。次いで、残りの溶液（7.23Kg、（3.8wt））を、撹拌機を備え、ジャケットで覆った50Lのガラス反応器に移し、酢酸イソプロピル（6.27Kg、3.3wt）を加えて、質量を約14.0Kg（7.4wt）に調節した。次いで、アセトニトリル（9.6Kg、5.1wt）を加えた。不活性窒素雰囲気下、撹拌を開始し、得られた混合物を7.3℃まで冷却して、化合物22の結晶を生成した。次いで、温度を15.1℃まで上げて、小さい結晶を溶解した。温度を15℃で約2時間維持し、-11.7℃まで終夜かけてゆっくり冷却し、次いで約-12℃で約1時間維持した。得られた組成物をろ過し、固体を冷却した（約-20℃）酢酸イソプロピル/アセトニトリル混合物（1：1（v/v）、2.6Kg、1.4wt）で洗浄した。湿ケークを減圧下で乾燥して、化合物22を白色固体で得た（1.83Kg、0.96wt；純度：92.5面積％（化合物22のHPLC TM1）；収率：化合物14から69％）。
【００５２】
化合物22の再結晶（段階2c）
一般手順：撹拌装置を備え、ジャケットで覆い、不活性化した、適当なサイズのガラス反応器中、化合物22（1.0wt（化合物22に基づいて））、酢酸イソプロピル（4.4〜4.9wt）およびアセトニトリル（3.9〜4.5wt）を混合する。得られた混合物を撹拌し、20〜25℃まで加温して、澄明溶液を得る。澄明溶液を5〜10℃に冷却して、結晶を生成する。次いで、温度を16〜20℃に上げて、小さい結晶を溶解し、約17℃で約2時間維持する。温度を約-3から-8℃まで約10〜11時間かけて直線的にゆっくり冷却する。好ましくは、温度を-3から-8℃でさらに2時間維持する。固体をろ過し、酢酸イソプロピル/アセトニトリル（1：1（v/v）、1〜3wt）の冷（-20℃）溶液で洗浄し、減圧下で乾燥して、化合物22を白色粉末で得る（約0.8〜0.95wt）。
【００５３】
具体例：以下の手順は化合物22の再結晶を記載する：1.79Kgの段階2bの結晶化からの化合物22（純度92.5％＝化合物1.65Kg；1.65Kg＝1.0wt）を酢酸イソプロピル（8.0Kg、4.8wt）およびアセトニトリル（7.37Kg、4.5wt）と、撹拌機を備え、ジャケットで覆い、不活性化した、30Lのガラス反応器中で混合した。得られた混合物を撹拌し、24.3℃まで加温して、澄明溶液を得た。澄明溶液を10.4℃に冷却して、結晶を生成した。次いで、小さい結晶を溶解するために温度を16.2℃に上げ、16.2〜17.3℃で約2時間維持した。温度を-3.4℃まで終夜かけてゆっくり冷却した。翌日、その温度でさらに20分間維持した。固体をろ過し、酢酸イソプロピル/アセトニトリル（1：1（v/v）、4.6Kg、2.8wt）の冷（約-20℃）溶液で洗浄し、減圧下で乾燥（18〜25℃、5時間）して、化合物22を白色固体で得た（1.54Kg、0.93wt；純度：99.4％（化合物22のHPLC TM1）；収率：92.8％）。
【００５４】
化合物22の分析データ：
0005399410.tif 000034
。ESI-MS (M+H)+ C39H76NO6の理論計算値：654.6；実測値：654.6。
【００５５】
実施例2：結晶性化合物22の固体状態の特徴づけ
A.  粉末X線回折
Scintag Diffractometer上でガラスプレートを用い、銅照射を用いての2-シータの範囲3〜40度の、通常の粉末回折条件下で、データを収集した。バックグラウンド補正は適用しなかった。図2は、結晶性化合物22のPXRDパターンを示す。PXRDパターンは10.3±0.2°2Θ、12.3±0.2°2Θ、14.5±0.2°2Θ、15.3±0.2°2Θ、16.2±0.2°2Θ、17.8±0.2°2Θ、22.2±0.2°2Θ、22.9±0.2°2Θ、23.8±0.2°2Θ、25.3±0.2°2Θ、および26.8±0.2°2Θにピークを示す。結晶性化合物22は図2に示すピークのサブセットによって特徴づけてもよい。例えば、以下のピークは結晶性化合物22に特徴的である：12.3±0.2°2Θ、14.5±0.2°2Θ、16.2±0.2°2Θ、17.8±0.2°2Θ、22.2±0.2°2Θ、および23.8±0.2°2Θ。図2に挙げる、または示すピークの他の組み合わせも、化合物22を同定するために用いうる。
【００５６】
（表１）測定条件
X線回折計：Scintag
標的：Cu
検出器：シンチレーション計数器
チューブ電圧：40kV
チューブ電流：20mA
スリット：DS 1°、RS 0.3mm、SS 1°
スキャン速度：2°/分
サンプリング幅：0.02°
スキャン範囲：3から40°
試料ホルダー：ガラスホルダー
ゴニオメーター：水平ゴニオメーター
フィルター：使用しない
【００５７】
B.  DSC特徴づけ
結晶性化合物22の固体状態の特徴づけを、示差走査熱量測定（DSC、アルミパン法）で行った。DSCを、2920 DSC V2.5F熱量計により、結晶性化合物22の試料2.91mgを用い、50mL/分の窒素パージ下、アルミパンで10℃/分で150℃まで加熱して行った。図3は、結晶性化合物22の温度記録を示し、41℃（開始温度）で融解した。
【００５８】
融点実験をFluke 51 II Digital Thermometerを備えたElectrothermal Mel.Temp Apparatusを用いても実施した。化合物22（2〜3mg）を毛細管（1.5〜1.8×90mm、Kimble Product KIMAX-51、part no. 34505）に充填した。融点測定値は41〜42℃であった。
【００５９】
実施例3：化合物25の合成および種晶の生成
A.  化合物25の合成および粗製結晶調製（段階3a）
化合物25の合成：撹拌機を備え、ジャケットで覆い、不活性化した、ガラス反応器に、化合物24（N,N'-ビス(2-ヒドロキシエチル)尿素；8.00g、1.00wt、1.00eq；販売者Mitsui & Co. (USA), Inc., New York, NYから購入；製造者Yoyu Labs）、トリフルオロ酢酸ピリジニウム（0.5g、0.063wt、0.05eq）およびアセトニトリル（59.7g、7.5wt）を加えた。撹拌を開始し、アリルテトライソプロピルホスホロジアミデート（35.0g、4.4wt、2.24eq；Digital Specialty Chemicals, Inc., Dublin, NHから購入）を加えた。次いで、得られた混合物を20〜25℃で終夜（17時間）撹拌した。HPLCモニタリングにより、完全に反応したことが明らかとなった。温度を0℃まで冷却し、沈澱が生じた。温度を2時間かけて16℃までゆっくり加温し、生じた固体のほとんどを溶解した。次いで、混合物を16℃で1.5時間撹拌し、5℃/時間の割合で-17.4℃まで冷却し、その温度で終夜撹拌して、粘稠懸濁液を得た。次いで、温度を2.3時間かけて16℃まで上げ、16℃で2.25時間維持した。温度を1.2時間かけて3.5℃に下げ、次いで10℃まで急速に（約5〜10分）加温した。温度を10℃で2時間維持し、約1.5℃/時間の割合で最終温度-16℃まで終夜冷却した。生じた固体をろ過し、冷アセトニトリル（2×6.3g、2×0.79wt）で洗浄し、減圧下で乾燥した。化合物25（19.7g、2.46wt）を白色固体で得た。
【００６０】
B.  化合物25の再結晶（段階3b）
撹拌機を備え、ジャケットで覆い、不活性化した、ガラス反応器に、段階3aからの化合物25（19.5g、1.00wt）およびアセトニトリル（55.0g、2.8wt）を加えた。得られた混合物を20〜25℃で15分間撹拌した。温度を10℃まで冷却し、その時点で撹拌が困難になった。温度を20℃に上げ、その温度で2時間維持した。10℃までの冷却を約2℃/時間の割合で再開した。冷却を3℃/時間の割合で1℃まで継続し、続いて約5℃/時間の割合で-19℃まで冷却した。生成した固体をろ過し、冷アセトニトリル（32g、1.6wt）で洗浄し、減圧下で乾燥した。化合物25（16.06g、0.82wt）を白色固体で得た。
【００６１】
C.  化合物25の種晶の生成（段階3c）
以下の段階4aおよび段階4bにおいて言及する種晶を調製するために、以下の手順を用いることができ、用いた：撹拌機を備え、ジャケットで覆い、不活性化した、ガラス反応器に、段階3bからの化合物25（5.59g、1.00wt）ならびにヘプタンおよびTBMEからなる溶液（9：1（v/v）、120mL、21.5vol）を加えた。得られた混合物を20〜25℃で撹拌し、さらにTBME（3.0mL、0.54vol）を加えて、化合物25を完全に溶解した。温度を約1.5時間かけて10℃まで下げ、白色沈澱が生じた。温度を16℃に加温し、その温度で約2時間維持した。反応器を約2℃/時間の割合で0℃まで冷却し、続いて約3℃/時間の割合で-18.8℃まで冷却し、次いで約-18.8で維持した。この冷却状態を終夜実施した。生成した固体をろ過し、ヘプタンおよびTBMEからなる冷溶液（9：1（v/v）、16g、2.9wt）で洗浄し、減圧下で乾燥した。化合物25（5.23g、0.936wt；純度：94.7％（面積パーセント））を白色固体で得た。化合物25の分析のためのHPLC条件（化合物25のHPLC TM2）
0005399410.tif 000035
【００６２】
実施例4：化合物25の調製
0005399410.tif 000036
ステージ3：Py.TFA、ACN、結晶化。
【００６３】
化合物25の調製（段階4a）
化合物25を調製するための一般手順：（注：本明細書における1.0wtは、化合物25のバッチを生成するための出発原料として用いた化合物24の質量を意味する）。撹拌装置を備え、ジャケットで覆い、不活性化した、適当なサイズのガラス反応器中、尿素化合物24（1.0wt、1.0eq）、トリフルオロ酢酸ピリジニウム（0.07wt、0.05eq）および無水アセトニトリル（7.0wt）を混合する。撹拌を開始し、アリルテトライソプロピルホスホロジアミダイト（4.4wt、2.3eq）を加える。反応混合物を18〜26℃で完了まで数時間撹拌する。得られた混合物を約9〜11℃まで冷却し、好ましくは結晶性化合物25（約0.005wt；化合物25の種晶の調製は上の実施例3に記載している）を種として加え、温度を約2時間維持する。次いで、混合物を約1.5℃/時間の割合で0から-15℃まで冷却し、続いて約2.5℃/時間の割合で-20℃まで冷却する。温度を約2時間安定に保った後、固体を窒素雰囲気下でろ過し、冷却した（-20℃）無水アセトニトリル（2〜3wt）で洗浄し、窒素雰囲気下で乾燥する。このようにして、化合物25（約2.3〜2.5wt）を白色固体で生成する。化合物25は、好ましくは、乾燥窒素雰囲気下、低温（例えば、-20℃）で精製まで保存する。
【００６４】
具体例：以下の手順は、化合物24（0.50Kg、本明細書において1.0wtとする）から出発しての化合物25の合成を記載する：撹拌機を備え、ジャケットで覆い、不活性化した、30Lのガラス反応器中、尿素化合物24（0.50Kg、1.0wt、1.0eq）、トリフルオロ酢酸ピリジニウム（0.035Kg、0.07wt、0.05eq）および無水アセトニトリル（3.5Kg、7.0wt）を混合した。撹拌を開始し、アリルテトライソプロピルホスホロジアミダイト（2.22Kg、4.4wt、2.3eq）を加えた。反応混合物を18.4〜25.6℃で撹拌した。これをHPLCでモニターし、18時間後に反応完了が確認された。得られた混合物を11.1℃まで冷却し、温度を9.3〜11.1℃で約50分間維持した。混合物に結晶性化合物25（1.9g、0.004wt；化合物25の種晶の調製は上の実施例3に記載している）を種として加え、9〜11℃の温度範囲で約2時間維持した。次いで、混合物を約1.5℃/時間の割合で-7.9℃まで冷却した。次いで、冷却速度を約2.5℃/時間まで加速し、温度を-18℃とした。温度を-18から-19.2℃で約2時間保った後、生成した固体を窒素雰囲気下でろ過し、冷却した（約-20℃）無水アセトニトリル（1.5Kg、3.0wt）で洗浄し、窒素気流下で乾燥した。化合物25（1.18Kg、2.36wt；純度：93.6％面積パーセント（化合物25のHPLC TM2））を白色固体で得、乾燥窒素雰囲気下、約-20℃で精製まで保存した。
【００６５】
化合物25の再結晶（段階4b）
化合物25の再結晶の一般手順：撹拌装置を備え、不活性化した、適当なサイズのガラス反応器中、尿素ジホスホラミダイト化合物25（1.0wt、本明細書における1.0wtは、それを生成した反応混合物から沈澱した粗製化合物25の質量を意味する）をTBME（1.5〜2.0wt）に溶解する。不溶性微粒子をろ去する。ろ液を、撹拌装置を備え、ジャケットで覆い、不活性化した、適当なサイズのガラス反応器に移す。ヘプタン（13.2wt）を加え、得られた溶液を約9〜11℃に冷却し、その温度範囲で約1.5〜2.5時間撹拌する。白色懸濁液が生成する（化合物25の結晶化を促進するために種の添加が有用となることもある；化合物25の種晶の調製は上の実施例3に記載している）。混合物を約1.5℃/時間の割合で約0から約-15℃の間まで冷却し、続いて約2.5℃/時間の割合で約-20℃まで冷却する。温度を約2時間安定に保った後、固体をろ過し、ヘプタンおよびTBMEからなる冷溶液（約-20℃）（7：1（vol/vol）、1.3〜1.5wt）で洗浄し、窒素気流下で乾燥する。化合物25を白色固体で得る（約0.5〜0.6wt）。ろ液を約20〜30℃の減圧下で濃縮し、前述の手順に従って再結晶する。このようにして、化合物25の第二収量（0.2〜0.3wt）を得てもよい。
【００６６】
具体例：以下の手順は、化合物25（1.18Kg、本明細書において1.0wtとする）の再結晶を記載する。22LのRotavapガラス容器中、窒素雰囲気下で、段階4aからの尿素ジホスホラミダイト化合物25（1.18Kg、1.0wt）をTBME（1.81Kg、1.5wt）に溶解した。不溶性微粒子を、TBME（0.60Kg、0.50wt）を洗液として用いてろ去した。ろ液を、撹拌機を備え、ジャケットで覆い、不活性化した、30Lのガラス反応器に移した。ヘプタン（15.54Kg、13.2wt）を加え、得られた溶液を10.3℃に冷却した。化合物25は約5分後に沈澱し始めた。撹拌を9〜11℃で約130分間継続した。次いで、混合物を約1.5℃/時間の割合で約-15℃の温度まで終夜冷却した。翌日、冷却を約1.5℃/時間の割合で約-17.2℃の温度まで継続し、その後温度を-17.0から-20℃の間で約2時間保った。次いで、生成した固体をろ過し、ヘプタンおよびTBMEからなる冷溶液（約-20℃）（7：1（vol/vol）、1,56Kg、1.3wt）で洗浄し、窒素気流下で約22.5時間乾燥した。化合物25を白色固体で得た（0.675Kg、0.57wt、純度：93.9％面積パーセント（化合物25のHPLC TM2）；収率：化合物24から36.0％）。ろ液を20〜30℃の減圧下で濃縮し、前述の手順に従って再結晶した。このようにして、化合物25の第二収量を白色固体で得た（0.225Kg、0.19wt、純度：92.6％面積パーセント（化合物25のHPLC TM2）；収率：化合物24から11.8％）。
【００６７】
化合物25の分析データ：
0005399410.tif 000037
。ESI-MS (M+Na)+ C23H48N4NaO5P2の理論計算値：545.3；実測値：545.4
【００６８】
実施例5：結晶性化合物25の固体状態の特徴づけ
A.  粉末X線回折
粉末X線回折（PXRD）パターンを、実施例2Aにおいて前述したものと同じ手順を用いて得た。図4は、再結晶した化合物25のPXRDパターンを示す。PXRDパターンは6.6±0.3°2Θ、13.2±0.3°2Θ、14.0±0.3°2Θ、17.3±0.3°2Θ、19.4±0.3°2Θ、21.8±0.3°2Θ、22.4±0.3°2Θ、23.6±0.3°2Θおよび27.2±0.3°2Θにピークを示す。結晶性化合物25は図4に示すピークのサブセットによって特徴づけてもよい。例えば、以下のピークは結晶性化合物25に特徴的である：6.6±0.3°2Θ、14.0±0.3°2Θ、17.3±0.3°2Θ、19.4±0.3°2Θ。図2に挙げる、または示すピークの他の組み合わせも、化合物25を同定するために用いうる。
【００６９】
B.  DSC特徴づけ
結晶性化合物25の固体状態の特徴づけを、示差走査熱量測定（DSC、毛細管法）で行った。DSCを、2920 DSC V2.5F熱量計により、結晶性化合物25の試料1.88mgを用い、窒素雰囲気下、アルミパンで約10℃/分で100℃まで加熱して行った。図5は、結晶性化合物25の温度記録を示し、化合物25の試料は65℃（開始温度）で融解した。
【００７０】
融点実験をFluke 51 II Digital Thermometerを備えたElectrothermal Melt Temp Apparatusを用いても実施した。化合物25（2〜3mg）を毛細管（1.5〜1.8×90mm、Kimble Product KIMAX-51、part no. 34505）に充填した。融点測定値は65〜67℃であった。
【００７１】
C.  単結晶X線回折
150mgの化合物25を1mLのアセトニトリルに約25℃で溶解した。溶液を約425分間かけて約0℃まで冷却し、次いで約1000分間維持した。X線回折に適した単結晶を得た。結晶構造は、0.18×0.06×0.06mmの径を有する無色針状結晶構造を示した。結晶を少量のパラトーン油を用いて0.2nmナイロンループに載せた。
【００７２】
データを、Oxford Cryostream低温装置を備えたBruker SMART CCD（電荷結合素子）に基づく回折計を用い、約193°Kで操作して収集した。データを、半球が収集されるように、約45秒間のフレームごとに0.3°のオメガスキャンを用いて測定した。合計1271フレームを0.76Åの最大分解能で収集した。減衰についてモニターするために、最初の50フレームを、データ収集の最後に再度収集した。格子パラメーターをSMARTソフトウェア（SMART V 5.625 (NT) Software for the CCD Detector System；Bruker Analytical X-ray Systems, Madison, WI (2001)）を用いて検索し、観察されたすべての反射においてSAINTを用いて精密化した。データ縮小を、Lpおよび減衰について補正する、SAINTソフトウェア（SAINT V 6.22 (NT) Software for the CCD Detector System Bruker Analytical X-ray Systems, Madison, WI (2001)）を用いて実施した。吸収補正をSADABSマルチスキャン技術を用いて適用した（SADABS, Program for absorption corrections using Siemens CCD,Blessing, R.H. Acta Cryst. A51 1995, 33-38参照）。構造をSHELXS-97プログラムを用いての直接法によって解析し（Sheldrick, G. M. SHELXS-90, Program for the Solution of Crystal Structure, University of Gottingen, Germany, 1990参照）、SHELXTL-PC V 6.10,（SHELXTL 6.1 (PC-Version), Program library for Structure Solution and Molecular Graphics; Bruker Analytical X-ray Systems, Madison, WI, 2000）に組み込まれた、F2における最小二乗法、SHELXL-97によって精密化した（Sheldrick, G. M. SHELXL-97, Program for the Refinement of Crystal Structure, University of Gottingen, Germany, 1997参照）。構造は、初期格子パラメーターおよびピーク特性によって明示される、双晶である徴候を示した。Cell_Nowなるプログラムを用いて、2倍の回転、すなわち逆格子の軸-0.010 1.000-0.040および実際の格子の軸0.001 1.000-0.002に沿う向きの、およびそれらの周りを回転する、少量の双晶成分があることが示された。双晶のデータを統合して、精密化した。双晶精密化のパーセンテージは1.5％未満であることが判明した。
【００７３】
構造を空間群P21/c（# 14）において解析した。すべての非水素原子を異方性に精密化した。水素を幾何学的方法で計算し、ライディング（riding）モデルとして精密化した。回折試験に用いた結晶は、データ収集中に分解をまったく示さなかった。すべての描画は50％の楕円体で行う。様々な原子ラベル付きの結晶性化合物25のORTEP描画を図6に示す。図7は、c軸に沿った結晶充填図を示す。結晶データおよび構造精密化パラメーターを表2に報告する。
【００７４】
（表２）結晶性化合物25の結晶データおよび構造精密化
0005399410.tif 000038
【００７５】
化合物25の単結晶データに基づく模擬XRPDパターンを図8に示す。粉末回折データを、プログラムXPOWを用いて観察された単結晶強度データから模擬した。（XPOW, Simulated Powder Diffraction Pattern, Version 5.101, Bruker-AXS, 1997-1998.）計算の鍵となるパラメーターには、1.54Åの銅波長を用いた波長、および最終の精密化から検索した格子パラメーターが含まれる。線幅および強度は以下の式に依存する：
0005399410.tif 000039
x＝2θ/2θ0、ここで2θ0は反射のブラッグ角である。変数wおよびvは線の形のパラメーターである。これらの計算のために、wおよびvの両方に0.02を用いた。以下の表に強度が最も高い9つのピークを示す。
0005399410.tif 000040
【００７６】
実施例6：化合物26の調製
0005399410.tif 000041
ステージ4：ACN、ヘプタン、HOAc、H2O2、Na2S2O3、クロマトグラフィ。
【００７７】
化合物26の調製（段階5a）
化合物26の合成の一般手順：（注：本明細書における1.0wtは、化合物26のバッチを生成するための出発原料として用いた化合物22の質量を意味する）。撹拌装置を備え、不活性化した、適当なサイズのガラス反応器に、化合物22、例えば、段階2b〜2c、好ましくは段階2cから得た化合物22（1.0wt、1.0eq）および化合物25、例えば、段階4a〜4bのいずれか、好ましくは段階4bから得た化合物25（0.42wt、0.52eq）を加える。無水アセトニトリル（5.0wt）および無水ヘプタン（1.4wt）を加え、撹拌を開始する。すべての固体を溶解するために、混合物を約20〜25℃に加温する。酢酸（0.12wt、1.3eq）を、温度を約20〜25℃に維持しながらゆっくり加える。反応混合物を約20〜25℃で完了するまで数時間撹拌する。無水ヘプタン（8.0wt）を反応器に加え、温度を約0〜5℃まで冷却する。30重量％のH2O2水溶液（0.17wt、1.1eq）を、温度を≦5℃に維持しながら、約0.5時間かけてゆっくり加える。反応混合物を≦5℃で完了するまで撹拌する。次いで、反応混合物を約0℃まで冷却し、残留過酸化物をチオ硫酸ナトリウム5水和物の水溶液（1/1（w/w）、0.26wt、0.34eq）を加えて失活させる。撹拌を約0〜4℃でヘプタン層が過酸化物試験で陰性になるまで続ける。温度を室温まで上げ、次いで塩をろ去し、ヘプタン（2.3wt）で洗浄する。得られたろ液を新しいガラス反応器に加え、約15分間、層を分離させる。三層が形成され、下の二層（水層およびアセトニトリル層）を排出して廃棄する。上のヘプタン層をアセトニトリル（1.8wt）で2回洗浄し、約18〜25℃で濃縮乾固する。粗製化合物26（1.2〜1.5wt）を粘稠性のわずかに琥珀色の油状物で得る。
【００７８】
具体例：以下の手順は、0.565Kgの純度99.4％の化合物22を含む規模での、化合物26の調製を記載する。（本実施例における「1.0wt」なる用語は0.56Kgを意味し、これは化合物26を生成するための出発原料として用いた化合物22の実際の質量であった。）撹拌機を備え、ジャケットで覆い、不活性化した、30Lのガラス反応器中、段階2cからの化合物22（0.56Kg（＝0.565×0.994）、1.0wt、1.0eq）および段階4bからの化合物25（0.248Kg、純度：93.9％、0.42wt、0.52eq）を加えた。無水アセトニトリル（2.8Kg、5.0wt）および無水ヘプタン（0.79Kg、1.4wt）を加え、撹拌を開始した。すべての固体を溶解するために、混合物を撹拌し、約20〜22℃に加温した。酢酸（0.068Kg、0.12wt、1.3eq）を、温度を約22〜24℃に維持しながら約5分かけて加えた。反応混合物を約20〜24℃で約24時間撹拌し、完了をHPLCで確認した。無水ヘプタン（4.49Kg、8.0wt）を反応器に加え、温度を約0〜5℃まで冷却した。30重量％H2O2水溶液（0.106Kg、0.19wt、1.1eq）を約26分間かけてゆっくり加え、温度は0〜2℃の間にとどまった。反応混合物を、温度を-1から2℃の間で維持しながら、約3.5時間撹拌した。酸化の完了をHPLCで確認した。残留過酸化物を、約0℃でチオ硫酸ナトリウム5水和物の水溶液（1/1（wt/wt）、0.146Kg、0.26wt、0.34eq）を加えて失活させた。撹拌を約0〜2℃で終夜（17.25時間）続けた。ヘプタン層を過酸化物の存在について試験し（EM Quant過酸化物試験、EM Science, Gibbstown, NJ）、陰性の結果を得た。温度を約20℃まで上げた。塩をろ去し、ヘプタン（1.26Kg、2.25wt）で洗浄した。得られたろ液を新しいガラス反応器に加え、約15分間、層を分離させた。三層が形成され、下の二層（水層およびアセトニトリル層）を排出して廃棄した。上のヘプタン層をアセトニトリル（1.0Kg、1.8wt）で2回洗浄し、約18〜23℃の減圧下で濃縮乾固した。粗製化合物26（0.79Kg、＜1.4wt；純度91.1％面積パーセント）を、5.6％の残留ヘプタンを含む、粘稠性のわずかに琥珀色の油状物で得た。化合物26の分析のためのHPLC条件（化合物26のHPLC TM3）：
0005399410.tif 000042
【００７９】
化合物26の精製（段階5b）
化合物26の精製のための一般手順：（注：本明細書における1.0wtは、粗製化合物26を生成するために用いた化合物22の量を意味する）。粗製化合物26、例えば、段階5aから得たもの（約1.2〜1.5wt）をイソプロパノールおよび酢酸エチルの混合物（1/99（vol/vol）、2wt）に溶解し、得られた溶液を、イソプロパノールおよび酢酸エチルの混合物（1/99（vol/vol）、約55wt）であらかじめ平衡化したBiotageシリカゲルカラム（約10wtのSiO2）にロードする。イソプロパノール/酢酸エチル（3/97（vol/vol）、約80wt）と、続いてイソプロパノール/酢酸エチル（10/90（vol/vol）、約110wt）を用いて分離を実施する。好ましくは、例えば、化合物26の理論収率≧1％（化合物26の≧0.0127wt、（HPLC評価））を含む分画を含む、約4wtの分画を約35集める。望まれる分画を合わせ、約20〜30℃の減圧下で濃縮して、澄明油状物を得る。澄明油状物をヘプタン（約7.0wt）に溶解し、得られた溶液を約20〜30℃の減圧下で濃縮乾固する。ヘプタン処理をもう一度繰り返し、化合物26（1.0〜1.15wt；収率：75〜85％）を無色澄明油状物で得る。
【００８０】
具体例：粗製化合物26（0.79Kg）の精製。注：本明細書における1.0wtは、粗製化合物26を生成するために用いた化合物22の量（0.56Kg）を意味する。段階5aからの粗製化合物26（0.79Kg、＜1.4wt）をイソプロパノールおよび酢酸エチルの混合物（1/99（vol/vol）、1.18Kg、2.1wt）に溶解し、得られた溶液を、イソプロパノールおよび酢酸エチルの混合物（1/99（vol/vol）、31.5Kg、56.3wt）であらかじめ平衡化したBiotage KP-Sil 150L（5.0Kgのシリカ、8.9wt）のカラムにロードした。カラムをイソプロパノール/酢酸エチル（3/97（vol/vol）、43.9Kg、78.4wt）と、続いてイソプロパノール/酢酸エチル（10/90（vol/vol）、62.3Kg、111.3wt）で実施した。それぞれ約2.3kg（約4.1wt）の36分画を集めた。化合物26の理論収率≧1％（化合物26の≧7.1g）を含む分画、この場合、分画7から31を合わせ、21〜28℃の減圧下で濃縮して、澄明油状物を得た。澄明油状物をヘプタン（3.9Kg、7.0wt）に溶解し、得られた溶液を24〜30℃の減圧下で濃縮乾固した。ヘプタン処理をもう一度繰り返し、化合物26（0.60Kg、1.07wt；純度：93.4％（化合物26のHPLC TM3）；収率＝78.8％）を無色澄明油状物で得た。
【００８１】
化合物26の分析データ：
0005399410.tif 000043
。ESI-MS (M+Na)+ C89H168N4NaO19P2の理論計算値：1682.2；実測値：1682.3。
【００８２】
本発明をその具体的態様に関して記載してきたが、当業者であれば、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更を行ってもよく、等価物を代わりに用いてもよいことが理解されるべきである。加えて、特定の状況、材料、物質の組成物、工程、工程段階を本発明の精神および範囲に適合させるために多くの改変を行ってもよい。すべてのそのような改変は、本明細書に添付の特許請求の範囲内であることが意図される。
【００８３】
上で引用したすべての特許および出版物は、参照により本明細書に組み入れられる。
【図１】
0005399410.tif 000057
【図２】
0005399410.tif 000058
【図３】
0005399410.tif 000059
【図４】
0005399410.tif 000060
【図５】
0005399410.tif 000061
【図６】
0005399410.tif 000062
【図７】
0005399410.tif 000063
【図８】
0005399410.tif 000064