(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のi)からvi)の何れかを含む、神経障害性疼痛を処置するための医薬：
i) 下記のa)からc)の何れかの、単離されたポリペプチド
a) 配列番号4のアミノ酸配列; 又は
b) 配列番号4の配列と少なくとも90%同一である生物学的に活性な配列変異型;
ここで、当該生物学的活性は、神経細胞のアポトーシスからの保護、ニューロンの生存、神経前駆体細胞からの神経発生、神経前駆体細胞から神経細胞への分化、神経前駆体細胞の再生、神経前駆体細胞の移動、及び/又は神経前駆体細胞の増殖である、
ii) 上記i)で定義されたポリペプチドをコードする単離された核酸配列、
iii)上記i)で定義されたポリペプチドをコードする単離された核酸配列又は上記i)で定義されたポリペプチドをコードする配列に相補的な単離された核酸配列を含む発現ベクター、
iv) 上記iii)で定義されたベクターを用いて形質転換又は形質導入された、単離された宿主細胞の組成物、又は
v)上記i)で定義されたポリペプチドをコードする単離された核酸配列又は上記i)で定義されたポリペプチドをコードする配列に相補的な単離された核酸配列を含むパッケージング細胞系。
【請求項２】
前記ポリペプチドが配列番号3のアミノ酸配列からなる、請求項1に記載の医薬。
【請求項３】
前記変異型の配列が、配列番号4の配列からなるポリペプチドと少なくとも95%同一である、請求項1に記載の医薬。
【請求項４】
前記変異型の配列が、配列番号4の配列からなるポリペプチドと少なくとも98%同一である、請求項1に記載の医薬。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、分子間のシステイン結合を介して結合されたNsG33の二量体を含む、請求項1に記載の医薬。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、アフィニティータグをさらに含む、請求項1に記載の医薬。
【請求項７】
前記アフィニティータグが、ポリヒスタグ、GSTタグ、HAタグ、Flagタグ、C-mycタグ、HSVタグ、V5タグ、マルトース結合蛋白質タグ、及びセルロース結合ドメインタグからなる群から選択される、請求項6に記載の医薬。
【請求項８】
前記ベクターが、核酸分子と操作可能に連結されたプロモーターをさらに含む、請求項1に記載の医薬。
【請求項９】
前記プロモーターが、CMV、ヒトUbiC、JeT、RSV、Tet-調節プロモーター、Mo-MLV-LTR、Mx1、EF-1アルファからなる群から選択される、請求項8に記載の医薬。
【請求項１０】
前記ベクターが、レンチウイルス、HIV、SIV、FIV、EAIV、CIVを含むレトロウイルス科ファミリーから誘導されるベクターからなる群、又は、アルファウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルス、HSV、コロナウイルス、ウシパピローマウイルス、及びMo-MLVからなる群から選択される、請求項1に記載の医薬。
【請求項１１】
前記宿主細胞が、大腸菌、酵母、サッカロミセス・セレヴィシエ、アスペルギルス、Sf9昆虫細胞からなる群から選択される、請求項1に記載の医薬。
【請求項１２】
前記宿主細胞が、不死化した網膜色素上皮細胞、不死化したヒト繊維芽細胞、及び不死化したヒト星状細胞からなる群から選択される、請求項1に記載の医薬。
【請求項１３】
前記不死化した網膜色素上皮細胞が、ARPE-19細胞である、請求項12に記載の医薬。
【請求項１４】
前記宿主細胞が、マトリクスと結合されている、請求項1に記載の医薬。
【請求項１５】
前記宿主細胞が、幹細胞、ヒト神経幹細胞又は前駆細胞、ヒト・グリア幹細胞又は前駆細胞、胎児幹細胞、CHO、CHO-K1、HEI193T、HEK293、COS、PC12、HiB5、RN33b、及びBHK細胞からなる群から選択される、請求項1に記載の医薬。
【請求項１６】
前記パッケージング細胞系が、5'レトロウイルスLTR、tRNA結合部位、パッケージングシグナル、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と操作可能に連結されているプロモーター、第2鎖DNA合成の複製起点、及び3'レトロウイルスLTRを含むレトロウイルス科誘導ゲノムを含む感染性のウイルス粒子を産生することができる、請求項1に記載の医薬。
【請求項１７】
前記パッケージング細胞系の前記ゲノムがレンチウイルスから誘導され、LTRがレンチウイルスのものである、請求項16に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００４年５月２８日に出願された米国特許出願公開第６０／５７５，０８
６号明細書の利益を主張し、完全に出典明示により一部とされる。２００４年３月３０日
に出願されたデンマーク特許出願第ＰＡ  ２００４  ００５１０号、および２００４年３
月２８日に出願された第ＰＡ  ２００４  ００８４３号の優先権を主張する。本明細書お
よび本出願において引用される全ての引例は、完全に出展明示により本明細書の一部とさ
れる。
本発明は、蛋白質、遺伝子および細胞の治療上の使用の分野に関し、具体的には、分泌
される治療上の蛋白質、ＮｓＧ３３の生物学的機能に基づく治療に関し、具体的には神経
系の障害の処置および免疫学的障害の処置のためのものである。ＮｓＧ３３は神経生存お
よび／または神経発生効果を有する、神経生存および成長因子である。本発明は、対生物
作用ＮｓＧ３３ポリペプチド断片およびその対応するコードＤＮＡ配列にも関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞外蛋白質は、多細胞生物の形成、分化および維持、その他のものの間で重要な役割
を果たす。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、移動、分化、または他の細胞との相互
作用を含む成長は、典型的には、他の細胞から受け取る情報によっておよび／または周辺
の環境によって統制されている。この情報は、しばしば、分泌ペプチド（例えば、分裂促
進因子、生存因子、細胞毒性因子、分化因子、ニューロペプチド、およびホルモン）によ
り伝達され、次いで、種々の細胞受容体または膜結合蛋白質により受け取られ、判断され
る。これらの分泌ポリペプチドまたはシグナル分子は、通常、細胞の分泌経路を通過し、
細胞外環境に存在するそれらの活性部位に到達する。
【０００３】
パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、多発性および筋萎縮性側索硬化
症、脳卒中、統合失調症、癲癇および末梢神経障害、関連する疼痛などの障害は、数百万
人もの人々に影響を及ぼす。正常な神経細胞機能の喪失により、種々の神経障害の各々の
特徴である行動および身体的欠損を生じる。慢性および急性の神経変性障害に加えて、老
化過程、神経系に対する物理的外傷および代謝異常により、関連する行動および身体的欠
損に伴う神経細胞の喪失、機能不全または変性を生じる結果となり得る。これらの疾患の
多くは、現在のところ不治であり、非常に衰弱させ、そして伝統的な薬物治療はほとんど
役に立たない。従って、疾患を改善し、症候的使用に限られない、新たな治療蛋白質に対
して大きな医薬的必要性がある。
【０００４】
神経系または関連する標的領域において発現し分泌される種々の因子は、神経機能の低
下もしくは喪失と関連する種々の神経学指標において重要な治療上の使用を有する。例え
ば、ＮＧＦはアルツハイマー病処置の候補物質であり、ネウブラスチン（Neublastin）（
アルテミン（Artemin））は抹消神経障害処置の候補物質であり、ＧＤＮＦはパーキンソ
ン病処置の候補物質である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
第一の態様において、本発明は、医薬的使用のための単離されたポリペプチドに関し、
ａ）配列番号３、４、５、８、９、１０、１３、１４、１５、１９、２０、２１、２２
、２３および２４よりなる群から選択されるアミノ酸配列；
ｂ）配列番号３、４、５、８、９、１０、１３、１４、１５、１９、２０、２１、２２
、２３および２４よりなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一
性を有する配列変異型；ならびに
ｃ）ａ）からｂ）のいずれかに記載の少なくとも５０個の連続したアミノ酸の生物学的
に活性な断片、
よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。
【０００６】
本発明者らは、ＮｓＧ３３が、成長因子の特徴を有する分泌蛋白質であり、神経系およ
び眼、特に黒質、被殻および脊髄において、並びに発達中のヒト胎児の中脳において、高
レベルで且つ選択的に発現されていることを見出した。加えて、本発明者らは、ＮｓＧ３
３がアポトーシス性の細胞死から正常な細胞系を保護することができることを見出した（
実施例６）。アポトーシス性の細胞死は、虚血性発作、神経変性疾患または脳外傷などの
種々の神経障害を引き起こす成人の神経系における神経細胞喪失の一因である（Beckerお
よびBonni,  Prog  Neurobiol.  2004  Jan;72（1）：1-25）。
【０００７】
ＮｓＧ３３はまた、ヒト神経始原細胞系からの及びラット線条体細胞からのニューロン
および星状細胞の生成に基づく２種のアッセイにおいて、神経保護作用を示した。従って
、本発明者らは、中枢神経系の障害の処置において、特に、パーキンソン病、ハンチント
ン病およびＡＬＳなどの脊髄障害の処置において、ＮｓＧ３３の使用を考えた。神経保護
活性、並びに小脳、後根神経節および網膜における発現に基づいて、ＮｓＧ３３は、抹消
神経疾患の処置および関連する疼痛、並びに小脳障害および網膜症の処置における使用も
また考えられる。
【０００８】
他の治療に関連する分泌型成長因子は、神経系またはその部分領域において発現され、
限定されるものではないが、ＧＤＮＦ、ＮＧＦ、ニュートリン（Neurturin）、ＢＤＮＦ
、ＮＴ４／５、ＮＴ３、ネウブラスチン（アルテミン）が含まれる。
【０００９】
国際公開第93/22437号パンフレットにおいて開示された蛋白質との配列同一性に基づき
、ＮｓＧ３３の免疫学的障害の処置における使用が考えられる。
【００１０】
ＮｓＧ３３の治療効果は、標的細胞の増殖、生存、再生、回復もしくは改善および／ま
たは分化における効果を通じて媒介され得る。本発明者らは、ＮｓＧ３３がアポトーシス
性の細胞死に対して神経細胞型を保護することができることを示した（実施例６、図９）
。本発明者らはまた、ヒト神経始原細胞系および初期ラット線条体培養物の両方でＮｓＧ
３３に曝露された場合に、対照状態下よりも高い割合でニューロンが生成されることを示
した（実施例１４および１５）。後者の効果は、ニューロンの向上された生存により、ニ
ューロンの増大された分化により、および／または神経前駆体の増殖により生じた可能性
がある。
【００１１】
これらの生物学的アッセイに基づいて、本発明は哺乳動物の神経細胞におけるアポトー
シスを予防する方法であって、前記神経細胞を本発明のポリペプチドに曝露することを含
む方法に関する。本発明はまた、哺乳動物の神経細胞の生存を向上させる方法であって、
前記神経細胞を本発明のポリペプチドに曝露することを含む方法にも関する。本発明は、
さらに、ニューロンを生成する方法であって、神経前駆細胞または神経幹細胞を本発明の
ポリペプチドに曝露することを含む方法に関する。好ましくは、前記哺乳動物の神経細胞
および／または哺乳動物の神経前駆細胞もしくは神経幹細胞は、ヒト細胞である。
【００１２】
更なる態様において、本発明は、以下：
ａ）配列番号３、４、５、８、９、１０、１３、１４、１５、１９、２０、２１、２２
、２３および２４よりなる群から選択されるアミノ酸配列；
ｂ）配列番号３、４、５、８、９、１０、１３、１４、１５、１９、２０、２１、２２
、２３および２４よりなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一
性を有する配列変異型；および
ｃ）ａ）からｂ）のいずれかに記載の少なくとも５０個の連続したアミノ酸の生物学的
に活性な断片、
よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列、また
はそのコード配列の相補配列を含む、医薬的使用のための単離された核酸分子に関する。
【００１３】
さらなる態様において、本発明は、以下：
ａ）配列番号１、２、６、７、１１、１２、１６、１７および１８よりなる群から選択
されるヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号１、２、６、７、１１、１２、１６、１７および１８よりなる群から選択
されるヌクレオチド配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；
ｃ）配列番号１、２、６、７、１１、１２、１６、１７および１８よりなる群から選択
される配列の少なくとも１５０個の連続したヌクレオチドの核酸配列；
ｄ）配列番号１、２、６、７、１１、１２、１６、１７および１８よりなる群から選択
される配列を有する核酸と、非常に厳格な条件下でハイブリダイズすることができる核酸
の相補配列；および
ｅ）上記のいずれかの相補核酸配列、
よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、医薬的使用のための単離された核酸
分子に関する。
【００１４】
更なる態様において、本発明は本発明の核酸分子を含む発現ベクターに関する。
【００１５】
より更なる態様において、本発明は、本発明に係る発現ベクターを含む単離された宿主
細胞に関する。具体的には、本発明は、裸の細胞に基づく治療もしくはカプセル化細胞治
療のいずれかの、細胞に基づく治療に有用な宿主細胞に関する。
【００１６】
よりさらなる態様において、本発明は、5'レトロウイルスLTR、tRNA結合部位、パッケ
ージングシグナル、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と操作可能
に連結されたプロモーター、第2のDNA鎖合成の複製起点および3'レトロウイルスLTRを含
むレトロウイルス科誘導ゲノムを含む、感染性のウイルス粒子を産生することができるパ
ッケージング細胞系に関する。
【００１７】
さらなる態様において、本発明は、移植可能な生体適合性細胞装置であって、以下:
i)本発明の蛋白質の拡散を可能にする半透膜;および
ii)本発明に係る細胞の組成物、または本発明に係るパッケージング細胞系の組成物、
を含む装置に関する。
【００１８】
さらなる態様において、本発明は、
i)本発明のポリペプチド;または
ii)本発明の単離された核酸配列;または
iii)本発明の発現ベクター;または
iv)本発明に係る宿主細胞の組成物;または
v)本発明に係るパッケージング細胞系;または
vi)本発明に係る移植可能な生体適合性細胞装置;および医薬的に許容される担体、を含
む医薬組成物に関する。
【００１９】
さらなる態様において、本発明は、医薬製造のための、
i)本発明のポリペプチド;または
ii)本発明の単離された核酸配列;または
iii)本発明の発現ベクター;または
iv)本発明に係る宿主細胞の組成物;または
v)本発明に係るパッケージング細胞系;または
vi)本発明に係る移植可能な生体適合性細胞装置の使用に関する。
【００２０】
さらなる態様において、本発明は、被検体の病状の処置方法であって、それを必要とす
る被検体に、治療上有効量の:
i)本発明のポリペプチド;または
ii)本発明の単離された核酸配列;または
iii)本発明の発現ベクター;または
iv)本発明に係る宿主細胞の組成物;または
v)本発明に係るパッケージング細胞系;または
vi)本発明に係る移植可能な生体適合性細胞装置を投与することを含む方法に関する。
【００２１】
更なる態様において、本発明は、哺乳動物の細胞培養における成長因子としての
i)本発明のポリペプチド;または
ii)本発明の単離された核酸配列;または
iii)本発明の発現ベクター;または
iv)本発明に係る宿主細胞の組成物;または
v)本発明に係るパッケージング細胞系;の使用に関する。
【００２２】
１つの態様において、本発明は、本発明のポリペプチドと結合することができる抗体に
関する。
【００２３】
さらなる態様において、本発明は、本発明の抗体と、細胞毒剤、例えば、化学療法剤、
毒素もしくは放射性同位体、特異的な結合対のメンバー、例えばアビジンもしくはストレ
プとアビジンまたは抗原、検出可能な生成物を産生することができる酵素とを含む、免疫
抱合体に関する。
【００２４】
さらなる態様において、本発明は、配列番号３に記載のＡＡ１２８−ＡＡ２９３、配列
番号３に記載のＡＡ１２１−ＡＡ２９３、配列番号８に記載のＡＡ１２９−ＡＡ２９４、
配列番号８に記載のＡＡ１２２−ＡＡ２９４、配列番号１３に記載のＡＡ１２６−ＡＡ２
９１、配列番号１３に記載のＡＡ１１９−ＡＡ２９１、および選ばれる配列において特定
されるいずれかのアミノ酸が異なるアミノ酸に変更されており、その配列中の１５個を超
えないアミノ酸残基がそのように変更されている前記ポリペプチドの変異型、よりなる群
から選択される単離されたポリペプチドに関する。
【００２５】
さらなる態様において、本発明は、ＮｓＧ３３の特定の切断型に関する。１つの態様に
おいて、これらは、以下：
１）配列番号３記載のＡＡ３０−ＡＡ２８８、および天然配列由来の１個〜５個の余分な
アミノ酸を一端もしくは両端に有する、配列番号３記載のＡＡ２５−ＡＡ２９３までのポ
リペプチド；
２）配列番号１３記載のＡＡ２８−ＡＡ２８６、および天然配列由来の１個〜５個の余分
なアミノ酸を一端もしくは両端に有する、配列番号１３記載のＡＡ２３−ＡＡ２９１まで
のポリペプチド；
３）配列番号８記載のＡＡ３１−ＡＡ２８９、および天然配列由来の１個〜５個の余分な
アミノ酸を一端もしくは両端に有する、配列番号８記載のＡＡ２６−ＡＡ２９４までのポ
リペプチド；および
４）選ばれる配列において特定されるいずれかのアミノ酸が異なるアミノ酸に変更されて
おり、その配列中の２０個を超えないアミノ酸残基がそのように変更されている、該ポリ
ペプチドの変異型、よりなる群から選択される。ＮｓＧ３３のこれらの切断型は、最初か
ら最後までの保存されたシステインの対生物活性コア配列を構成する。
【００２６】
さらなる態様において、本発明は、ＮｓＧ３３の特定の切断型に関する。１つの態様に
おいて、これらは、以下：
１）配列番号３記載のＡＡ１７１−ＡＡ２８８、および天然配列由来の１個〜５個の余分
なアミノ酸を一端もしくは両端に有する、配列番号３記載のＡＡ１６５−ＡＡ２８８まで
のポリペプチド；
２）配列番号１３記載のＡＡ１６９−ＡＡ２８６、および天然配列由来の１個〜５個の余
分なアミノ酸を一端もしくは両端に有する、配列番号１３記載のＡＡ１６４−ＡＡ２９１
までのポリペプチド；
３）配列番号８記載のＡＡ１７２−ＡＡ２８９、および、天然配列由来の１個〜５個の余
分なアミノ酸を一端もしくは両端に有する、すなわち配列番号８記載のＡＡ１６７−ＡＡ
２９４までのポリペプチド；
４）選ばれる配列において特定されるいずれかのアミノ酸が異なるアミノ酸に変更されて
おり、その配列中の１０個を超えないアミノ酸残基がそのように変更されている、該ポリ
ペプチドの変異型、よりなる群から選択される。これらの切断型は、Ｃ末端ペプチド中の
最初から最後までの保存されたシステインのＣ末端ＮｓＧ３３ペプチドの対生物活性コア
配列を構成する。
【００２７】
さらなる態様において、本発明はＮｓＧ３３の特定の切断型に関する。１つの態様にお
いて、これらは、以下：
１）配列番号３記載のＡＡ３０−ＡＡ１１８、および天然配列由来の１個〜５個の余分な
アミノ酸を一端もしくは両端に有する、配列番号３記載のＡＡ２５−ＡＡ１２３までのポ
リペプチド；
２）配列番号１３記載のＡＡ２８−ＡＡ１１６、および天然配列由来の１個〜５個の余分
なアミノ酸を一端もしくは両端に有する、配列番号１３記載のＡＡ２３−ＡＡ１２１まで
のポリペプチド；
３）配列番号８記載のＡＡ３１−ＡＡ１１９、および、天然配列由来の１個〜５個の余分
なアミノ酸を一端もしくは両端に有する、配列番号８記載のＡＡ２６−ＡＡ１２４までの
ポリペプチド；および
４）選ばれる配列において特定されるいずれかのアミノ酸が異なるアミノ酸に変更されて
おり、その配列中の１０個を超えないアミノ酸残基がそのように変更されている、該ポリ
ペプチドの変異型、よりなる群から選択される。これらの切断型は、Ｎ末端ペプチド中の
最初から最後までの保存されたシステインのＮ末端ＮｓＧ３３ペプチドの対生物活性コア
配列を構成する。
【００２８】
本発明はまた、前記Ｃ末端、Ｎ末端および切断型ＮｓＧ３３をコードする核酸、同様に
それらをコードする核酸を含むベクター、それらを産生することができる細胞、並びに前
記C末端、Ｎ末端および切断型ＮｓＧ３３を調製する方法に関する。
【００２９】
（図面の詳細な説明）
図１．ヒトＮｓＧ３３におけるシグナルペプチドの存在および配置の予測。図１ａ：ヒ
トＮｓＧ３３のシグナルＰ  ＮＮ（神経回路）プロット。図１ｂ：ヒトＮｓＧ３３のシグ
ナルｐ  ＨＭＭ（隠れマルコフモデル）プロット。詳細は、実施例２を参照のこと。
【００３０】
図２：ヒトＮｓＧ３３の全長（配列番号３）、ヒトＮ末端ペプチド（配列番号１９）、
ヒトC末端ペプチド（配列番号５）におけるプロットファン２．１蛋白質機能予測サーバ
ーからの出力。説明については、実施例２を参照のこと。
【００３１】
図３ａ：ヒト、部分マウスおよびラットのＮｓＧ３３のＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ（１．８２
）多重配列アライメント。シグナル配列はボールド文字で示される。予想されるフリン（
ｆｕｒｉｎ）切断部位は下線である。
図３ｂ：ヒト、マウスおよびラットのＮｓＧ３３のＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ（１．８２）多
重配列アライメント。予測されるシグナル配列はボールド文字で示される。
＊は、単一の完全に保存的な残基を有する位置を示す。
：は、以下の「強い」群の１つが完全に保存されていることを示す：
−ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、Ｈ
Ｙ、ＦＹＷ。
．は、以下の「弱い」郡の１つが完全に保存されていることを示す：
−ＣＳＡ、ＡＴＶ、ＳＡＧ、ＳＴＮＫ、ＳＴＰＡ、ＳＧＮＤ、ＳＮＤＥＱＫ、Ｎ
ＤＥＱＨＫ、ＮＥＱＨＲＫ、ＶＬＩＭ，ＨＦＹ。
【００３２】
図４：ＮｓＧ３３におけるリアル−タイムＰＣＲ。詳細は実施例５を参照のこと。
図４、上部パネルは、同量のｃＤＮＡがｃＤＮＡ工程で用いられた等量の全ＲＮＡから
合成されたと仮定した場合の、ＮｓＧ３３の比発現（最も低い発現を示した組織との比較
）を示す。
図４、下部パネルは、β２ミクログロブリンについて規格化したＮｓＧ３３の比発現（
最も低い規格化された発現を示した組織との比較）を示す。結果は、β２ミクログロブリ
ンの発現レベルが幾つかの組織間で変化しているため、注意深く解釈されるべきである。
【００３３】
図５：国際公開第93/22437号パンフレット（Innogenetics  SA）からの全長のヒトポリ
ペプチド（Innog.）に対する全長のヒトＮｓＧ３３ポリペプチドのアライン０アライメン
ト。スコアリングマトリクス  ＢＬＯＳＵＭ５０、ギャップペナルティー：−１２／−２
。１０個の保存的システインが、アライメントされた配列の上もしくは下の星印とボール
ド文字で示されている。
【００３４】
図６：ヒトＮｓＧ３３ｃＤＮＡおよびコードされるプレ−プロ−ＮｓＧ３３。
【００３５】
図７ａ：部分マウスＮｓＧ３３ｃＤＮＡおよびコードされるプレ−プロ−ＮｓＧ３３。
【００３６】
図７ｂ：全長マウスＮｓＧ３３ｃＤＮＡおよびコードされるプレ−プロ−ＮｓＧ３３。
【００３７】
図８：ラットＮｓＧ３３ｃＤＮＡおよびコードされるプレ−プロ−ＮｓＧ３３。
【００３８】
図９：無血清培地中のＰＣ１２生存におけるＮｓＧ３３の効果。さらなる詳細について
は、実施例６を参照のこと。細胞を、コラーゲン被覆した４８ウェルプレートに、培養基
中２×１０４細胞／ウェルで撒いた。後日、細胞を、５μｇ／ｍｌポリブレンの存在下、
１０５形質導入単位ウイルス／ウェル（ＭＯＩ＝５）と共に一晩インキュベートすること
により形質導入した。形質導入後、培地を無血清ＤＭＥＭ（インビトロゲン）に交換し、
次いで細胞生存をＭＴＳアッセイを用いて４日後にアッセイした。示されるデータは、代
表実験からの平均±ＳＥＭであり、＊は、ＥＧＦＰのｃＤＮＡを用いて形質導入された細
胞からの有意差を示す（Ｐ＜０．０５、ワンウェイＡＮＯＶＡ、ダネット法）。ＬＶ−Ｅ
ＧＦＰ：レンチウイルスＥＧＦＰ形質導入されたｐＣ１２細胞。ＬＶ−ＮｓＧ３３：ヒト
全長ＮｓＧ３３で形質導入されたＰＣ１２細胞。
【００３９】
図１０Ａは、胎齢Ｅ１０．５、Ｅ１１．５およびＥ１３．５（それぞれ受胎後１０．５
、１１．５および１３．５日）の発生時の骨髄における並びに成人の骨髄におけるＧＡＰ
ＤＨに対して規格化した、定量ＰＣＲにより測定したｍＮｓＧ３３の比発現（最も低く発
現した組織との比較）を示す。詳細は、実施例１３に記載されている。
【００４０】
図１０Ｂは、２つの発育年齢（Ｐ１＝出産後１日および成人）におけるマウスの脳（Ｃ
ＴＸ＝大脳皮質、Ｃｂ＝小脳）の２つの領域中のＮｓＧ３３の比発現を示す。その発現は
、最も低い規格化された発現を示した組織と比較するｍＧＡＰＤＨの発現に対して規格化
された定量ＲＴ−ＰＣＲにより測定される。詳細は、実施例１３に記載されている。
【００４１】
図11Aは、無条件の無血清培地を与えた分化hNS1培養物(hNS1)、対照のARPE-19細胞から
の馴化培地(Mc C)またはNsG33形質導入されたARPE-19培養物(Mc 33)におけるGFAP陽性グ
リア細胞(灰色棒)およびβ-III-チューブリン(黒棒)の平均百分率を示す。さらなる詳細
は実施例14に記載されている。
【００４２】
図11Bは、無条件の無血清培地を与えた分化hNS1培養物(hNS1)、対照のARPE-19細胞から
の馴化培地(Mc C)またはNsG33形質導入されたARPE-19培養物(Mc 33)において、ヘキスト
染色した核を40×対物を用いて計数することにより決定される、領域あたりの細胞の総数
を示す。さらなる詳細は実施例14に記載されている。
【００４３】
図１２は、ＤＩＶ２での、無条件の無血清培地（ＵＣＭ）を与えられたラット線条体培
養物、ＭＯＣＫ形質導入されたＨＥＫ２９３もしくはＡＲＰＥ−１９細胞からの希釈され
た馴化培地（それぞれ、２９３Ｔ−ＣＭおよびＡＲＰＥ−ＣＭ）、または対応するＮｓＧ
３３形質導入された培養物からの希釈された馴化培養物（それぞれ、２９３Ｔ−ＣＭ３３
およびＡＲＰＥ−ＣＭ３３）における、β−ＩＩＩ−チューブリン陽性ニューロンの平均
百分率を示す。さらなる詳細は実施例１５に記載されている。
【００４４】
（定義）：
本明細書中で用いられる、ＮｓＧ３３は、いずれかの種、特にチンパンジー,  ウシ,  
羊,  ブタ,  ネズミ科の動物,  ウマ科の動物、および好ましくはヒトを含む哺乳動物か
ら、天然、合成、半合成または組換えのいずれかの供給源から得られる、実質的に精製さ
れているＮｓＧ３３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。この用語は、これ
らの種のいずれかから得られるＮｓＧ３３の生物学的に活性な断片、並びにそれらの生物
学的に活性な配列変異型および翻訳後修飾を受けた蛋白質もまた意味する。
【００４５】
本明細書中で用いられる成長因子特性は、受容体を通じて標的細胞に作用し、その標的
細胞において１つまたはそれ以上の次の応答：増殖、分化、生存、再生、移動、機能回復
、機能向上を含む成長、を引き起こす分泌蛋白質である、典型的な成長因子の特徴と類似
の配列関連の特徴を規定する。
【００４６】
本明細書中で用いられる「対立遺伝子」または「対立配列」は、ＮｓＧ３３をコードす
る遺伝子の代替形態である。対立遺伝子は、核酸配列における少なくとも１つの変異から
生じることがあり、その構造もしくは機能が変更されていてもいなくても良い、変更され
たｍＲＮＡまたはポリペプチドを生じることとなる。いずれかの所定の天然もしくは組換
え遺伝子は、１つまたは多くの対立遺伝子形態を有していても、いなくても良い。対立遺
伝子を生じる一般的な突然変異変化は、ヌクレオチドの自然な欠失、付加もしくは置換に
より一般に与えられる。これら変化形式のそれぞれは、単独でもしくは他のものと組み合
わされて、所定の配列において一度にもしくは複数時に生じてもよい。
【００４７】
本明細書中で用いられる「欠失」は、アミノ酸もしくはヌクレオチド配列における変更
を意味し、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基もしくはヌクレオチドがなくなる結果とな
る。
【００４８】
本明細書中で用いられる「挿入」もしくは「付加」は、それぞれ、天然分子と比較して
、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの追加を生じるアミノ酸もし
くはヌクレオチド配列の変更を意味する。
【００４９】
本明細書中で用いられる、用語「特異結合」または「特異的な結合」は、蛋白質もしく
はペプチドと結合分子、例えば抗体および受容体もしくはその断片との高親和性の相互作
用を意味する。その相互作用は、結合分子により認識される蛋白質の特定の構造（即ち、
抗原決定基もしくはエピトープ）の存在に依存する。例えば、ある抗体がエピトープ「Ａ
」に特異的である場合、標識化された「エピトープＡ」およびその抗体を含む反応中にエ
ピトープＡを含有する蛋白質（もしくは遊離、未標識Ａ）の存在により、抗体と結合した
標識化Ａの量が減少することとなる。
【００５０】
本明細書中で用いられる、用語「実質的に精製されている」は、それらの天然環境、か
ら取り出され、単離されもしくは分離され、そして天然に関連する他の成分から少なくと
も６０％純化、好ましくは７５％純化、より好ましくは９０％純化された核酸もしくはア
ミノ酸配列を意味する。
【００５１】
本明細書中で用いられる、「置換」は、１つまたはそれ以上のアミノ酸もしくはヌクレ
オチドの、それぞれ別のアミノ酸もしくはヌクレオチドにる置き換わりを意味する。
【００５２】
「配列同一性」
２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学アルゴリズムを用いて実施することが
できる。２つの配列の比較に利用される数学アルゴリズムの好ましい、非限定的な例には
、KarlinおよびAltschul（1990）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  87：2264-2268のア
ルゴリズム、KarlinおよびAltschul（1993）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  90：5873
-5877における改良型がある。そのようなアルゴリズムは、Altschulら、（1990）J.  Mol
.  Biol.  215：403-410のＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰプルグラムに組み込まれてい
る。
【００５３】
同一性を特徴づけるために、高位のホモロジー（マッチ）が得られるように、被検配列
を整列する。一般原則に基づいて、２つのアミノ酸配列の「同一性パーセント」は、Nati
onal  Center  for  Biotechnology  Information（ＮＣＢＩ）のウェブサイト（http：/
/www.ncbi.nlm.nih.gov）から利用できる、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズム  ［Tatiana  A.  
Tatusova,  Thomas  L.  Madden：  Ｂｌａｓｔ２  シークエンス−蛋白質およびヌクレ
オチド配列を比較するための新しいツール;  FEMS  Microbiol.  Lett.  1999  174  247
-250]を用い、本明細書中で言及される初期設定値（すなわち、マトリクス＝Ｂｌｏｓｕ
ｍ６２；オープンギャップ＝１１；エクステンションギャップ＝１；ペナルティーギャッ
プｘ＿ドロップオフ＝５０；エクスペクト＝１０；文字の大きさ＝３；フィルター  オン
）を用いて決定することができる。ＢＬＡＳＴ  アルゴリズムは、最初に設定値に基づい
て２つの配列を整理し、次いで、２つの整理された配列間の重なりの領域の配列同一性％
を決定する２段階の操作を実施する。配列一致性％に加えて、ＢＬＡＳＴＰは設定値に基
づいて配列類似性％もまた決定する。
【００５４】
同一性を特徴づけるために、高位のホモロジー（マッチ）が得られるように、被検配列
を整列する。一般原則に基づいて、２つの核酸配列の「同一性パーセント」は、National
Center  for  Biotechnology  Information（ＮＣＢＩ）のウェブサイト（http：//www
.ncbi.nlm.nih.gov）から利用できる、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズム  ［Tatiana  A.  Tatu
sova,  Thomas  L.  Madden：  Ｂｌａｓｔ２  シークエンス−蛋白質およびヌクレオチ
ド配列を比較するための新しいツール;  FEMS  Microbiol.  Lett.  1999  174  247-250
]を用い、本明細書中で言及される初期設定値（マッチの利得＝１；ミスマッチのペナル
ティー＝−２；ストランドオプション＝両鎖；オープンギャップ＝５；エクステンション
ギャップ＝２；ペナルティーギャップｘ＿ドロップオフ＝５０；エクスペクト＝１０；文
字の大きさ＝１１；フィルター  オン）を用いて決定することができる。
【００５５】
他の好ましい、配列の比較のために利用される非限定的な数学アルゴリズムの例には、
MyersおよびMiller,  CABIOS（1989）のアルゴリズムがある。そのアルゴリズムは、ＦＡ
ＳＴＡシークエンスアライメントソフトウェアパッケージ（Pearson  WR,  Methods  Mol
Biol,  2000,  132：185-219）の一部であるアラインプログラム（２．０版）中に組み
込まれている。アラインは、包括的アライメントに基づいて配列同一性を計算する。アラ
イン０は、配列の最後にペナルティーを科さない。アミノ酸配列の比較のためにＡＬＩＧ
Ｎ  ｏｇ  Ａｌｉｇｎ０プログラムを利用する場合、ギャップオープニング／エクステン
ション・ペナルティー−１２／−２を用いたＢＬＯＳＵＭ５０置換マトリクスが好ましく
は用いられる。
【００５６】
（詳細な説明）
本発明は、ＮｓＧ３３として定義されたポリペプチドおよびポリヌクレオチドの医薬的
使用に関する。ＮｓＧ３３蛋白質は、ヒト（配列番号．３）、マウス（配列番号．８）、
およびラット（配列番号．１３）において同定された。
【００５７】
ヒトＮｓＧ３３は、２９３アミノ酸前駆体として存在し、加工されて少なくとも１つお
よび潜在的に複数の生物学的に活性なペプチドを産生し得る。ＮｓＧ３３は、神経系およ
び眼において、および特に脳の小領域（図４ＡおよびＢ）において高レベルで発現してい
る。最も長いマウス（配列番号８）およびラット（配列番号１３）のＮｓＧ３３ポリペプ
チドは、それぞれ２９４および２９１アミノ酸から成り、ヒト蛋白質との同一性％はそれ
ぞれ８０．３および８０．２である（実施例２中の表１および２を参照のこと）。予想さ
れる全長のマウスおよびラットポリペプチド配列はいまだ立証されていないこと、および
少なくともマウスポリペプチド配列はＮ末端の一部であることには、留意すべきである。
ＮＣＢＩから受入番号ＸＭ１２８５５１のもとで入手できる相同ｃＤＮＡと、わずかに異
なるＮ末端を有する全長のマウス蛋白質配列が、Nishinoら（The  EMBO  Journal,  2004
,  23：2998-2008）において公表された。このマウス蛋白質のシグナルペプチドの切断は
、配列番号９を有する成熟蛋白質を生じる。
【００５８】
ヒトＮｓＧ３３は、２３アミノ酸のＮ末端シグナルペプチド配列を含み、配列モチーフ
ＡＲＡ−ＧＹで切断される。このシグナルペプチド切断部位は、ＳｉｇｎａｌＰ法（実施
例２を参照のこと）および図１において示される出力グラフから予測さる。しかしながら
、当業者であれば、実際の切断部位がコンピュータープログラムにより予測されるものと
異なり得ることは理解されよう。例えば、ラットＮｓＧ３３のシグナルペプチド予測は、
１６番目および２１番目でほぼ同じ可能性を持って予測されることとなる。シグナルペプ
チド切断部位は、マウスＮｓＧ３３（２４番目）およびラットＮｓＧ３３（１６または２
１番目）の類似の位置で見出される。このシグナルペプチドの切断により、それぞれ、ヒ
ト、マウスおよびラットについての配列番号４、９および１４を有するポリペプチドが生
じる。当分野で既知のように、シグナルペプチドプロセッシングは、常に予想されるよう
に厳密に行われるわけではなく、実際の切断は場合によって変更され得る。従って、成熟
ＮｓＧ３３のＮ末端が予測される切断部位から１個から２個もしくは３個のアミノ酸によ
り変わり得ることが予想される。成熟ＮｓＧ３３の実際のＮ末端は、後のポリ−ヒス−特
異抗体を用いた精製もしくはＮｉカラムでの精製、そして最終的に精製された成熟ポリペ
プチドのＮ末端配列決定する、例えばヒス−タグを用いてＣ末端にタグを付けることによ
り実験的に改変することができる。
【００５９】
一般的な形式の前駆蛋白質切断は、ＰｒｏＰ法（Prediction  of  proprotein  conver
tase  cleavage  sites.  Peter  Duckert,  Soren  Brunak  and  Nikolaj  Blom.  Pro
tein  Engineering,  Design  and  Selection：  17：  107-112,  2004）により、ヒト
ＮｓＧ３３において、０．８３１のスコアーを持って配列モチーフ「ＷＧＰＲＥＲＲ−Ａ
Ｌ」の１２７番目と予測される。類似の切断部位は、マウスＮｓＧ３３（１２５番目）に
おいて０．８３１のスコアーを持って配列モチーフ「ＷＧＰＲＥＲＲ−ＡＬ」、およびラ
ットのＮｓＧ３３（１２５番目）において０．８３１のスコアーを持って配列モチーフ「
ＷＧＰＲＥＲＲ−ＡＬ」の相同部位が予測される。可能なフリン（ｆｕｒｉｎ）プロペプ
チド切断部位もまた配列モチーフ「ＧＧＲＣＶＲ−ＷＧ」のヒトＮｓＧ３３中の１２１番
目、並びにラットおよびマウスＮｓＧ３３の対応する部位で見出される。シグナルペプチ
ド切断後のポリペプチドプロセッシングにより、Ｃ末端ペプチドおよびＮ末端ペプチドが
形成されることとなる。蛋白質がこれらの予想される部位で加工されるかどうかは、Ｃ末
端にヒスタグを付け、精製後にタグ付きのペプチドを配列決定することにより実験的に確
認することができる。
【００６０】
ＮｓＧ３３は、成長因子として作用する蛋白質の範疇に属する。この考えは、図２に示
されるようにこの種の範疇で１．０を超える見込みを与える、ＰｒｏｔＦｕｎ蛋白質機能
予測サーバー（protein  function  prediction  server）による予測により支持される
。
【００６１】
このＰｒｏｔＦｕｎ法は、配列類似性に対して、配列から導かれる特徴に基づいて、蛋
白質機能を予測する。「成長因子」クラスに対して他の全てのクラスを区別するために重
要な特徴は：蛋白質選別能力、蛋白質標的能力、シグナルペプチド能力、低複雑度領域（
low  complexity  regions）、蛋白質2次構造、負残基の数および原子の数である。一般
に、１の見込みスコアーは、偶然に生じることがある可能性を示す。１を超える見込みは
、その蛋白質が予測されるジーンオントロジーカテゴリーに属さない増大した確立である
ことを示す。より高い見込みスコアーであれば、その予測が正しい可能性がより大きくな
る。
【００６２】
定量リアル−タイムＰＣＲの結果を図４ＡおよびＢに示す。図に基づいて、ＮｓＧ３３
の発現レベルに関して、組織を分類することができる。
高発現を示す組織には：
被殻、黒質および脊髄
が含まれる。
中程度の発現を示す組織には：
全脳、小脳、網膜＊および後根神経節＊
が含まれる。
低度の発現を示す組織には：
心臓、腎臓、肺、前立腺、前立腺、骨格筋、精巣、胃、膵臓、胎児脳＊
が含まれる。
非常に低い発現を示すもしくは発現しない組織には：
胎児肝臓、胎盤、胸腺、気管、膵臓、子宮、結腸、小腸
が含まれる。
【００６３】
Ｂ２-ミクログロブリン発現に対する規格化後の結果を分析した場合に、＊を付けた組
織を除いて、同一の結果が見られた。
【００６４】
マウスＮｓＧ３３についてのリアル−タイムＰＣＲの結果を、図１０Ａおよび１０Ｂに
示す。ＣＴ値は１７〜２２の範囲にある。図１０Ａから、ＮｓＧ３３発現が、Ｅ１１．５
を頂点として脊髄分化の間に調節されることは明らかである。図１０ｂから、ＮｓＧ３３
は大脳皮質ではなく、小脳において出産後の発育中に調節されることは明らかである。
【００６５】
脊髄での一過性の発現パターンは、ＣＮＳのこの領域における神経前駆細胞の増殖、分
化および／または生存に役割を果たすことを示す。このことは、神経変性疾患および脊髄
損傷、ＡＬＳおよび脊髄性筋萎縮症を含む脊髄の損傷の処置に関連する治療と一致する。
さらに、この発現の側面は、例えば脊髄から誘導された神経前駆細胞の伸展および／また
は分化についての試験管内（インビトロ）試薬として有力であることを示している。
【００６６】
成人の小脳におけるＮｓＧ３３発現の上流調節は、１つまたはそれ以上の小脳細胞型の
維持および／または生存におけるこの因子の役割を示している。これは、限定するもので
はないが、感覚性運動失調症、多発性硬化症、神経変性脊髄小脳障害（neurodegenerativ
e  spinocerebellar  disorders）、遺伝性運動失調症、小脳萎縮（例えば、オリーブ橋
小脳萎縮症（ＯＰＣＡ）、シャイ・ドレーガー症候群（多系統萎縮症））およびアルコー
ル中毒を含む小脳障害に関する治療と一致する。
【００６７】
構造蛋白質と異なり、成長因子は、細胞のシグナリングおよび種々の機能、例えば、生
長、増殖、分化、生存、再生、移動、機能回復および機能向上に関与する。従って、成長
因子は、投与することができ、治療効果を長期にわたって持続させるために用いることが
できる。
【００６８】
組織特異的発現に基づいて、およびＮｓＧ３３が分泌型成長因子であると予測されると
いう事実、およびＮｓＧ３３が抗アポトーシス活性、神経保護活性および／またはニュー
ロン新生活性を有する（図９、１１および１２）という事実に基づいて、ＮｓＧ３３は、
一般的に神経系の障害（神経系特異的な発現に基づく）、特にパーキンソン病（黒質での
発現に基づく）、ハンチントン病（被殻および黒質での発現に基づく）、小脳障害（ヒト
小脳での発現および発生時のマウス小脳での特異な発現に基づく）、脊髄損傷（成人ヒト
脊髄での発現および発生時の脊髄での特異な発現に基づく）、ＡＬＳ（成人ヒト脊髄での
発現および発生時のマウス脊髄での特異な発現に基づく）、抹消神経疾患（後根神経節で
の発現に基づく）、並びに網膜症（網膜での発現に基づく）、を処置するのに使用するこ
とが考えられる。この種々示した機能は、実施例に記載のように試験管内および生体内（
インビボ）アッセイにおいて変化し得る。
【００６９】
同様に、ＧＤＮＦ、ＮＧＦおよびネウブラスチン（アルテミン）を含む治療上関係のあ
る分泌型成長因子の発現が、処置するために用いることができる神経障害の標的区画に見
られる。
【００７０】
ＮｓＧ３３の治療上の効果は、標的細胞の増殖、再生、機能回復、機能向上、生存、移
動、および／または分化を含む生長における効果を通じて媒介され得る。
【００７１】
ＮｓＧ３３の生物機能を確かめたものの１つが、ＰＣ１２（褐色細胞種）細胞における
飢餓誘導性のアポトーシスに対する神経保護効果である。褐色細胞腫は、副腎髄質の未成
熟および成熟クロム親和性細胞の特徴を有する腫瘍である。色素細胞（メラニン細胞）に
加えて、クロム親和性細胞、感覚および交感神経ニューロンは、神経堤の共通の前駆細胞
から誘導される。その特定の系統への分化は、分泌因子を含む外部シグナルに強く依存す
る。
【００７２】
ＰＣ１２は、クローン細胞系であり、もともと移植可能なラットの副腎髄質の褐色細胞
腫から確立された（GreeneおよびTischler,  1976  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.
73,  2424）。ＰＣ−１２細胞は、ＡＴＣＣ（American  Type  Culture  Collection；
受入番号ＣＲＬ−１７２１）から入手できる。ＰＣ１２細胞は、培養条件に応じて、成熟
クロム親和性細胞、交感神経ニューロンおよびメラニン細胞に分化する能力を有するため
、多能性のクロム親和性前駆細胞であると考えられる。ＰＣ１２細胞は、ニューロン分化
および生存の研究のためのモデル系として広く用いられている。血清を含む培地において
、ＰＣ１２細胞は増殖するが、ＮＧＦを含む特定の神経栄養因子の添加は、ＰＣ１２細胞
の交感神経ニューロンに非常に類似したニューロン表現型への分化を誘発する。無血清培
地においては、ＰＣ１２細胞は、生存因子として作用し得る特定の成長因子、ホルモンま
たは小分子を供給しない限り、アポトーシスを起こし死ぬ。
【００７３】
ニューロトロフィンの１つ（ＮＧＦ）およびセクレチン／グルカゴン／ＶＩＰファミリ
ーのメンバー（ＰＡＣＡＰ）を含む、ＰＣ１２細胞における分化および生存を誘発するこ
とができる因子もまた、抹消および中枢神経系の両方において類似の作用を示し、ＰＣ１
２細胞において発現されている受容体および応答系が、他の多くの神経細胞で共用されて
いることを示している。
【００７４】
ＮＧＦは、前脳基底部におけるコリン作動性ニューロンに加えて、敏感な交感神経およ
び感覚ニューロンの重要な分化および生存因子である。ＰＡＣＡＰは、ニューロンマーカ
ー陽性細胞の数と神経前駆細胞の増殖に影響を与えない軸作形成（axonogenesis）の両方
を増大させ、発生期の後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンの分化を促進する（Nielsenら、M
ol  Cell  Neurosci.  2004  Apr;25（4）：629-41）。ＰＡＣＡＰは、ＣＮＳの神経集団
において同様の活性もまた示す（Vaudryら、Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A.  2002  A
pr  30;99（9）：6398-403;  Dicicco-Bloomら、Ann  N  Y  Acad  Sci.  1998  Dec  11
;865：274-89）。
【００７５】
アポトーシス性細胞死は、虚血性発作、神経変性疾患または脳外傷のような種々の神経
障害を生じる成人の神経系における神経細胞の喪失に寄与する（BeckerおよびBonni,  Pr
og  Neurobiol.  2004  Jan;72（1）：1-25）。従って、アポトーシス性の細胞死から神
経細胞を保護することができる分泌型成長因子は、一般的に神経系の障害および具体的に
は神経変性疾患を処置するための候補物質である。このように、神経突起伸長を誘発する
および／またはアポトーシスを誘導する条件下で生存を促す分泌因子の能力は、その因子
が中枢および／または末梢神経系の他の神経細胞型でも同様の作用を有すること、並びに
この因子が神経系の障害、具体的には神経変性疾患を処置するための候補物資であること
の象徴である。
【００７６】
ＮｓＧ３３の別の生物学的機能は、ヒト神経幹細胞系（ｈＮＳ１、以前はＨＮＳＣ．１
００と称されていた）により生成されるニューロンの百分率における刺激作用がある。
ヒトＮｓＧ３３コード配列を用いて形質導入されたＡＲＰＥ−１９細胞からの馴化培地に
曝された細胞は、形質導入されていないＡＲＰＥ−１９細胞からの馴化培地に曝されたｈ
ＮＳ１細胞と比較して、星状細胞に比べてニューロンの高い百分率を示した。このことは
、ＰＣ１２アッセイにおいて見られる抗アポトーシス効果と一致する。この効果は、ニュ
ーロンの生存効果により、および／または神経発生、および／または神経前駆細胞の増殖
によって引き起こされ得る。ｈＮＳ１細胞系は、ヒト前脳神経幹細胞（neurosphere）培
養物から確立された。治療能を有する他の既知の栄養素は、ヒト神経幹細胞培養物から形
成されるニューロンの数を増大させることが示された。これらには、ＮＴ３およびＮＴ４
／５、および血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）（Caldwellら、Nature  Biotechnology,  
2001  May,  19（5）：475-9.  Growth  factors  regulate  the  survival  and  fate
of  cells  derived  from  human  neurospheres）が含まれる。従って、これらの結
果もまた、ＮｓＧ３３が神経系の障害、特に神経変性疾患を処置するための候補因子であ
ることを示す。
【００７７】
さらなる試験管内アッセイにおいて、ヒトＮｓＧ３３をコードするｃＤＮＡを用いてト
ランスフェクトされた２つの細胞系からの馴化培地は、ラット線条体細胞の初代培養にお
いてニューロンの百分率を増大させた。このアッセイもまた、ＮｓＧ３３の神経保護効果
と一致している。この効果は、ニューロンの生存効果により、および／または神経発生に
より、および／または神経前駆細胞の増殖により生じ得る。治療能を有する他の因子は、
塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、切断型インスリン様成長因子−１（ｔＩＧＦ）
、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、血小板由来
成長因子のＢＢアイソフォーム（ＰＤＧＦ−ＢＢ）、およびニューロトロフィン−４／５
（ＮＴ−４／５）を含むラット線条体培養において同様の効果を有する（Nakaoら、Exp  
Neurol  1996,  Mar  138（1）：144-57,  Differential  trophic  effects  of  basic
fibroblast  growth  factor,  insulin-like  growth  factor-1,  and  neurotrophi
n-3  on  striatal  neurons  in  culture;  Nakaoら、Brain  Res  Dev  Barin  Res,
1995,  Dec  21;  90（1-2）：92-101,  Trophic  and  protective  actions  of  br
ain-derived  neurotrophic  factor  on  striatal  DARPP-32-containing  neurons  i
n  vitro;  Widmerら、Eur  J  Neurosci,  1994  Nov  1;  6（11）：1669-79,  Neurot
rophin  4/5  promotes  survival  and  differentiation  of  rat  striatal  neuron
s  developing  in  culture）。この結果、これらの結果もまた、ＮｓＧ３３が、神経系
の障害および特に神経変性疾患を処置するための候補因子であることを示す。
【００７８】
ＮｓＧ３３は、国際公開第93/22437号パンフレット（Innogenetics  SA）に開示された
蛋白質で、ＢＬＡＳＴＰ調査において同定された蛋白質と構造的に関連している。全長の
ヒト蛋白質は国際公開第93/22437号パンフレットの図２に示されている。ＮｓＧ３３は、
１０個の保存的なシステイン残基を含むイノジェネティクス（Innnogenetics）蛋白質と
４２％の同一性（初期設定値を用いたアライン０）を共有する。４５残基のＮ末端シグナ
ルペプチドは、イノジェネティクス蛋白質（ＮｓＧ３４）において予測される。国際公開
第93/22437号パンフレットからの組換え発現データは、このイノジェネティクス蛋白質が
その公報中で用いられた条件下ではプロペプチドプロセッシングを受けないが、２６８ア
ミノ酸の蛋白質として分泌されることを示している。これは、少なくとも引例中で用いら
れた細胞以外では、予測されるＮｓＧ３３のプロペプチド切断が、遺伝子が発現された場
合に生じない可能性があることを示唆すると考えることができる。
【００７９】
ヒトＮｓＧ３３のヒトイノジェネティクス蛋白質に対する全長アライメントを図５にお
いて示す。１０個の保存的なシステインは、ボールド文字で表され、星印が付されている
。この２つの蛋白質は、保存的なシステイン残基および図５から明らかな高い保存の広が
りに基づき、蛋白質ファミリーを共に形成する。２つの蛋白質は、他の既知のヒト蛋白質
に対して優位な配列相同性をなんら示さない。２つの蛋白質が同じ小さな蛋白質ファミリ
ーであるが、この２つの蛋白質は実質的に性質が異なる。
【００８０】
このシステインの高い保存性のため、これらの残基が対生物作用蛋白質の２次構造およ
び３次構造において重要な役割を果たすことが期待される。１つまたはそれ以上のシステ
インが、分子内および／または分子間システイン結合の形成に関係し得る。
【００８１】
イノジェネティクス蛋白質は、とりわけ、Ｔ細胞およびＢ細胞の活性化に機能的であり
、免疫抑制細胞の誘導物質のようである。イノジェネティクス蛋白質の相同性に基づいて
、ＮｓＧ３３は免疫に関与する機能を同様に有することが予想される。
【００８２】
Ｉ  ＮＳＧ３３ポリペプチド
全長のＮｓＧ３３、実質的に全長のＮｓＧ３３、プロ−ＮｓＧ３３、ＮｓＧ３３のＣ末
端ペプチド、Ｎ末端ぺプチおよび切断型に加えて、本発明は、そのポリペプチドの生物学
的に活性な変異型を提供する。ＮｓＧ３３ポリペプチドまたは断片は、それが天然のＮｓ
Ｇ３３の生物学活性を示す場合、生物学的に活性である。本発明は、本明細書中に定義さ
れるように実質的に精製されたＮｓＧ３３に関することは理解される。
【００８３】
１つの生物活性は、受容体結合アッセイにおいて天然のＮｓＧ３３と競争する能力であ
る。
【００８４】
別の生物活性は、天然のＮｓＧ３３に存在するエピトープで示される、抗体と結合する
能力である。
【００８５】
生物学的に活性な変異型もまた、実施例に記載される１つまたはそれ以上の他の試験管
内および／または生体内の生物アッセイに関連して定義されることができる。
【００８６】
好ましい生物活性は、実施例および図９に記載されるＰＣ１２アッセイでの応答と実質
的に同じ応答を示す能力である。このアッセイにおいて、ＰＣ１２細胞は、全長のヒトＮ
ｓＧ３３コード配列を用いて形質導入される（図６）。ＰＣ１２アッセイにおける実質的
に同じ応答により、神経突起を有する細胞の数が実施例６において得られる数の少なくと
も１０％（全長のヒトＮｓＧ３３を用いた形質導入）、より好ましくは少なくとも２０％
、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは
少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％
、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは
少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％であることを意味する。ＰＣ１２ア
ッセイは、対照処置に対する生存における向上した百分率を実証するために用いられ得る
。実質的に、この文脈における同じ応答は、実施例６（図９）において得られた向上の少
なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、
より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少
なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、
より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少
なくとも９０％となる活性を意味する。ＮｓＧ３３の断片または変異型の生物活性はまた
、天然のＮｓＧ３３の活性よりも高くても良い。他の好ましい生物活性は、実施例１４お
よび１５において示される神経保護および／または神経発生効果を含む。
【００８７】
ＮｓＧ３３の特定の断片は、選ばれる配列において特定されるいずれかのアミノ酸が異
なるアミノ酸に変更され、その配列中の１５個を超えないアミノ酸残基がそのように変更
されている、配列番号３のＡＡ１２８−ＡＡ２９３、配列番号３のＡＡ１２１−ＡＡ２９
３、配列番号８のＡＡ１２９−ＡＡ２９４、配列番号８のＡＡ１２２−ＡＡ２９４、配列
番号１３のＡＡ１２６−ＡＡ２９１、配列番号１３のＡＡ１１９−ＡＡ２９１および前記
ポリペプチドの配列変異型よりなる群から選択されるポリペプチドでを含む。これらの単
離されたポリペプチドは、ＮｓＧ３３のＣ末端ペプチドを構成する。いずれかの変更され
たアミノ酸は、図３ａ中の非保存的、弱い保存的または強い保存的として定義されるもの
から選択されることが好ましい。ＰｒｏｔＦｕｎ２．１は、Ｃ末端ペプチドが遺伝子形而
上分類の成長因子に属することを高い見込み（８．０）で予測する（図２）。
【００８８】
さらに特定のポリペプチドは、選ばれる配列において特定されるいずれかのアミノ酸が異
なるアミノ酸に変更され、その配列中の１５個を超えないアミノ酸残基がそのように変更
されている、配列番号１９、２０、２１、２２、２３および２４、および前記ポリペプチ
ドの配列変異型よりなる群から選択される。これらの単離されたポリペプチドはＮｓＧ３
３のＮ末端を構成する。いずれかの変更されたアミノ酸は、図３ａ中の非保存的、弱い保
存的または強い保存的として定義されるものから選択されることが好ましい。好ましい実
施形態において、１０個未満のアミノ酸が変更されており、より好ましくは５個未満のア
ミノ酸、より好ましくは１個または２個のアミノ酸、より好ましくはアミノ酸が置換され
ていない。ＰｒｏｔＦｕｎ２．１は、Ｎ末端ペプチドが遺伝子形而上分類成長因子に属す
ること高い見込み（８．１）で予測する（図２）。
【００８９】
１つの態様においてＮｓＧ３３の特定の好ましい切断型は、選ばれる配列において特定
されるいずれかのアミノ酸配列が異なるアミノ酸に変更され、その配列中の２０個を超え
ないアミノ酸残基がそのように変更されている、以下：
１）配列番号３のＡＡ３０−ＡＡ２８８、および天然配列由来の１個〜５個の余分なア
ミノ酸を一端もしくは両端に有する、配列番号３のＡＡ２５−ＡＡ２９３までのポリペプ
チド；
２）配列番号１３のＡＡ２８−ＡＡ２８６、および天然配列由来の１個〜５個の余分な
アミノ酸を一端もしくは両端に有する、配列番号１３のＡＡ２３−ＡＡ２９１までのポリ
ペプチド；
３）配列番号８のＡＡ３１−ＡＡ２８９、および天然配列由来の１個〜５個の余分なア
ミノ酸を一端もしくは両端に有する、配列番号８のＡＡ２６−ＡＡ２９４までのポリペプ
チド；
４）前記ポリペプチドの配列変異型、
よりなる群から選択される。
これらのＮｓＧ３３の切断型は、最初から最後の保存されたシステインのコア配列を構
成する。好ましい実施形態において、１５未満のアミノ酸が変更され、より好ましくは１
０個未満のアミノ酸、より好ましくは５個未満のアミノ酸、例えば１個または２個のアミ
ノ酸、より好ましくはアミノ酸が変更されていない。
【００９０】
１つの態様において、ＮｓＧ３３の特定の切断型は、選ばれる配列において特定される
いずれかのアミノ酸配列が異なるアミノ酸に変更され、その配列中の１０個を超えないア
ミノ酸残基がそのように変更されている、以下：
１）配列番号３のＡＡ１７１−ＡＡ２８８、および天然配列由来の１個〜５個の余分な
アミノ酸を一端もしくは両端に有する、配列番号３のＡＡ１６５−ＡＡ２９３までのポリ
ペプチド；
２）配列番号１３のＡＡ１６９−ＡＡ２８６、および天然配列由来の１個〜５個の余分
なアミノ酸を一端もしくは両端に有する、配列番号１３のＡＡ１６４−ＡＡ２９１までの
ポリペプチド；
３）配列番号８のＡＡ１７２−ＡＡ２８９、および天然配列由来の１個〜５個の余分な
アミノ酸を一端もしくは両端に有する、配列番号８のＡＡ１６７−ＡＡ２９４までのポリ
ペプチド；
４）前記ポリペプチドの変異型、
よりなる群から選択される。
これらの切断型は、Ｃ末端ペプチド中の最初から最後の保存されたシステインの対生物
活性コア配列を構成する。好ましい実施形態において、１０未満のアミノ酸が変更され、
より好ましくは５個未満のアミノ酸、例えば１個または２個のアミノ酸、より好ましくは
アミノ酸が変更されていない。
【００９１】
１つの態様において、ＮｓＧ３３の特定の切断型は、選ばれる配列において特定される
いずれかのアミノ酸配列が異なるアミノ酸に変更され、その配列中の１０個を超えないア
ミノ酸残基がそのように変更されている、以下：
１）配列番号３のＡＡ３０−ＡＡ１１８、および天然配列由来の１個〜５個の余分なア
ミノ酸を一端もしくは両端に有する、配列番号３のＡＡ２５−ＡＡ１２３までのポリペプ
チド；
２）配列番号１３のＡＡ２８−ＡＡ１１６、および天然配列由来の１個〜５個の余分な
アミノ酸を一端もしくは両端に有する、配列番号１３のＡＡ２３−ＡＡ１２１までのポリ
ペプチド；
３）配列番号８のＡＡ３１−ＡＡ１１９、および天然配列由来の１個〜５個の余分なア
ミノ酸を一端もしくは両端に有する、配列番号８のＡＡ２８−ＡＡ１２４までのポリペプ
チド；
４）前記ポリペプチドの変異型、
よりなる群から選択される。
これらの切断型は、Ｎ末端ＮｓＧ３３ペプチド中の最初から最後の保存されたシステイ
ンのコア配列を構成する。好ましい実施形態において、１０未満のアミノ酸が変更され、
より好ましくは５個未満のアミノ酸、例えば１個または２個のアミノ酸、より好ましくは
アミノ酸が変更されていない。
【００９２】
変異型は、アミノ酸配列において、または配列に関与しない様式で、もしくはその両方
で、天然のＮｓＧ３３と異なっていても良い。アミノ酸配列における変異型（「配列変異
型））は、天然のＮｓＧ３３の１つまたはそれ以上のアミノ酸が異なる天然のアミノ酸、
アミノ酸誘導体もしくは非天然アミノ酸で置換されている場合に、産生される。特に好ま
しい変異型には、天然ＮｓＧ３３、または天然ＮｓＧ３３の生物学的に活性な断片が含ま
れ、その配列は、典型的には、その蛋白質もしくはペプチドの２次構造および３次構造、
および疎水的性質にほとんど影響を与えない、１つまたはそれ以上の保存的および／また
は半保存的アミノ酸置換により野生型の配列と異なっている。変異型もまた、１つまたは
それ以上の非保存的なアミノ酸置換、欠失もしくは挿入により異なっており、ＮｓＧ３３
の生物活性を損なわない配列を有することができる。図３ａまたは図３ｂ中のＣｌｕｓｔ
ａｌ  Ｗアライメントは、アミノ酸残基がその蛋白質の生物活性に実質的に影響を与える
ことなく置換できるかを予測するために用いることができる。
【００９３】
以下の基（Clustal  W、「強い」保存基）内の置換は、本発明の意図の範囲内にある同
類置換基として考えられる：
−ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹ、Ｆ
ＹＷ。
以下の基（Clustal  W、「弱い」保存基）内の置換は、本発明の意図の範囲内にある半−
同類置換基として考えられる：
−ＣＳＡ、ＡＴＶ、ＳＡＧ、ＳＴＮＫ、ＳＴＰＡ、ＳＧＮＤ、ＳＮＤＥＱＫ、ＮＤＥＱ
ＨＫ、ＮＥＱＨＲＫ、ＶＬＩＭ，ＨＦＹ。
【００９４】
本発明の範囲内の他の変異型は、ペプチドの安定性を増大させる修飾を有するものがあ
る。そのような変異型は、例えば、そのペプチド配列中に１つまたはそれ以上の非ペプチ
ド結合（ペプチド結合を置き換える）を有していても良い。また含まれるものとして：天
然のＬ−アミノ酸以外の残基、例えばＤ−アミノ酸または非−天然もしくは合成アミノ酸
、例えばベータもしくはガンマアミノ酸および環状変異型を含む変異型がある。米国特許
第５，２１９，９９０号明細書を参照のこと。スプライス変異型は、本発明に明確に含ま
れる。
【００９５】
所定の置換の結果を確実に予測できない場合、生物学的な活性の有無を決定するために
、本明細書中に記載の方法に基づいて、容易にその誘導体をアッセイすることができる。
ＰＣ−１２および／またはｈＮＳ１アッセイおよび／またはラット線条体培養アッセイに
おいてであることが好ましい。
【００９６】
１つの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号．３、４、５、８、９、１０、１
３、１４、１５、１９、２０、２１、２２、２３、および２４よりなる群から選択される
配列の、天然の対立遺伝子変異型である。このポリペプチドは、配列番号．  １、２、６
、７、１１、１２、１６、１７、および１８よりなる群から選択される核酸配列から単一
ヌクレオチドにより異なっている核酸配列の翻訳物であるアミノ酸配列を含み得る。
【００９７】
本明細書中に記載される変異型ポリペプチドは、１つの実施形態において、選ばれる配
列において特定されるいずれかのアミノ酸が、保存的な置換を提供するために変更されて
いるポリペプチドを含む。
【００９８】
シグナルペプチドが、異種のシグナルペプチドにより置換されていてもよい。
【００９９】
ある実施形態における本発明の範囲内の変異型は、ヒト、マウスまたはラットＮｓＧ３
３（配列番号５、１０および１５）と少なくとも６０パーセント同一のアミノ酸配列を有
する蛋白質およびペプチドを含む。より好ましくは、配列の同一性は少なくとも６５％、
より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少
なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、
より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％である。
【０１００】
好ましいある実施形態における本発明の範囲内の変異型は、配列番号４、９または１４
の配列を有するポリペプチドと少なくとも６０パーセント同一のアミノ酸配列を有する蛋
白質およびペプチドを含む。より好ましくは、配列同一性は、少なくとも６５％、より好
ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくと
も８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好
ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％である。配列番号４、９お
よび１４は、シグナルペプチドの切断後の成熟蛋白質に相当し、プロペプチド切断部のい
ずれをも含まない。
【０１０１】
ある実施形態における本発明の範囲内の変異型は、配列番号３、８または１３の配列を
有するポリペプチドと少なくとも６０パーセント同一のアミノ酸配列を有する蛋白質およ
びペプチドを含む。より好ましくは、配列同一性は、少なくとも６５％、より好ましくは
少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％
、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは
少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％である。
【０１０２】
ある実施形態における本発明の範囲内の変異型は、配列番号１９、２０、２１、２２、
２３および２４よりなる群から選択される配列を有する蛋白質と少なくとも７０％、より
好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なく
とも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有す
る蛋白質およびペプチドを含み、より好ましくは配列番号１９、２０、２１、２２、２３
および２４よりなる群から選択される配列を有する蛋白質を含む。
【０１０３】
ある実施形態における本発明の範囲内の変異型は、配列番号１９、２０または２１の配
列を有するポリペプチドと少なくとも６０パーセント同一のアミノ酸配列を有する蛋白質
およびペプチドを含む。より好ましくは、配列同一性は、少なくとも６５％、より好まし
くは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８
０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好まし
くは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％である。
【０１０４】
ある実施形態における本発明の範囲内の変異型は、配列番号２２、２３または２４の配
列を有するポリペプチドと少なくとも６０パーセント同一のアミノ酸配列を有する蛋白質
およびペプチドを含む。より好ましくは、配列同一性は、少なくとも６５％、より好まし
くは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８
０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好まし
くは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％である。
【０１０５】
好ましい実施形態において、変異型ＮｓＧ３３の配列同一性は、ヒトＮｓＧ３３ポリペ
プチド（配列番号３、４、５、１９または２２）を参照して決定される。
【０１０６】
相同性を決定する目的のために、最短の比較配列は、一般に少なくとも８個のアミノ酸
残基、通常少なくとも１２個のアミノ酸残基である。本発明の目的のために、このパーセ
ント配列同一性は、好ましくは少なくとも２５個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも
３０個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも３５個、より好ましくは少なくとも４０個
、より好ましくは少なくとも４５個、より好ましくは少なくとも５０個、より好ましくは
少なくとも５５個、より好ましくは少なくとも６０個、例えば少なくとも７０個、例えば
少なくとも８０個、例えば少なくとも９０個、例えば少なくとも１００個、例えば少なく
とも１１０個、例えば少なくとも１２０個、例えば少なくとも１３０個、例えば少なくと
も１５０個が重複する範囲で計算され、この範囲は初期設定のＢＬＡＳＴＰにより決定さ
れる。
【０１０７】
１つの実施形態において、このパーセント配列同一性は、変異型および配列番号の配列
を整列させ、同一のアミノ酸残基の総数を計算し、配列番号の長さで割る、グローバルア
ラインメントを用いて計算され（ギャップ（GAP）またはアライン）。
【０１０８】
１つの実施形態において、変異型ＮｓＧ３３は配列番号３、４、５、８、９、１０、１
３、１４および１５よりなる群から選択される天然の対立変異型である。前記対立変異型
の配列は、配列番号１、２、６、７、１１、１２、１６、１７および１８よりなる群から
選択される核酸配列と単一のヌクレオチドにより異なっている核酸配列の翻訳物であるア
ミノ酸配列であってもよい。
【０１０９】
１つの実施形態において、変異型は配列番号３と少なくとも６０％、より好ましくは少
なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、
より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少
なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％同
一のアミノ酸配列を有する蛋白質を含む。
【０１１０】
１つの実施形態において、好ましい変異型は配列番号４と少なくとも６０％、より好ま
しくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも
７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ま
しくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも
９８％同一のアミノ酸配列を有する蛋白質を含む。
【０１１１】
１つの実施形態において、変異型は配列番号５と少なくとも６０％、より好ましくは少
なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、
より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少
なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％同
一のアミノ酸配列を有する蛋白質を含む。
【０１１２】
１つの実施形態において、変異型は配列番号８と少なくとも６０％、より好ましくは少
なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、
より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少
なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％同
一のアミノ酸配列を有する蛋白質を含む。
【０１１３】
１つの実施形態において、好ましい変異型は配列番号９と少なくとも６０％、より好ま
しくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも
７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ま
しくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも
９８％同一のアミノ酸配列を有する蛋白質を含む。
【０１１４】
１つの実施形態において、変異型は配列番号１０と少なくとも６０％、より好ましくは
少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％
、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは
少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％
同一のアミノ酸配列を有する蛋白質を含む。
【０１１５】
１つの実施形態において、変異型は配列番号１３と少なくとも６０％、より好ましくは
少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％
、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは
少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％
同一のアミノ酸配列を有する蛋白質を含む。
【０１１６】
１つの実施形態において、好ましい変異型は配列番号１４と少なくとも６０％、より好
ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくと
も７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好
ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくと
も９８％同一のアミノ酸配列を有する蛋白質を含む。
【０１１７】
１つの実施形態において、変異型は配列番号１５と少なくとも６０％、より好ましくは
少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％
、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは
少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％
同一のアミノ酸配列を有する蛋白質を含む。
【０１１８】
１つの実施形態において、変異型は配列番号１９と少なくとも６０％、より好ましくは
少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％
、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは
少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％
同一のアミノ酸配列を有する蛋白質を含む。
【０１１９】
１つの実施形態において、変異型は配列番号２０と少なくとも６０％、より好ましくは
少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％
、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは
少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％
同一のアミノ酸配列を有する蛋白質を含む。
【０１２０】
１つの実施形態において、変異型は配列番号２１と少なくとも６０％、より好ましくは
少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％
、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは
少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％
同一のアミノ酸配列を有する蛋白質を含む。
【０１２１】
１つの実施形態において、変異型は配列番号２２と少なくとも６０％、より好ましくは
少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％
、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは
少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％
同一のアミノ酸配列を有する蛋白質を含む。
【０１２２】
１つの実施形態において、変異型は配列番号２３と少なくとも６０％、より好ましくは
少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％
、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは
少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％
同一のアミノ酸配列を有する蛋白質を含む。
【０１２３】
１つの実施形態において、変異型は配列番号２４と少なくとも６０％、より好ましくは
少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％
、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは
少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％
同一のアミノ酸配列を有する蛋白質を含む。
【０１２４】
１つの実施形態において、変異型は配列番号２６と少なくとも６０％、より好ましくは
少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％
、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは
少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％
同一のアミノ酸配列を有する蛋白質を含む。
【０１２５】
１つの実施形態において、対応する部位での変異型ＮｓＧ３３は、図３ａにおいて、完
全に保存的（＊）であるとして印を付された残基を含み、より好ましくは変異型ＮｓＧ３
３は対応する部位に図３ａにおて強く保存的（：強く保存的な基には、ＳＴＡ、ＮＥＱＫ
、ＮＨＱＫ、ＮＥＤＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹ  ＦＹＷが含まれる）とし
て印を付された残基も含み、より好ましくは、変異型ＮｓＧ３３は対応する部位に図３ａ
において弱く保存的（．低い保存的な基には、ＣＳＡ、ＡＴＶ、ＳＡＧ、ＳＴＮＫ、ＳＴ
ＰＡ、ＳＧＮＤ、ＳＮＤＥＱＫ、ＮＤＥＱＨＫ、ＮＥＱＨＫ、ＮＥＱＨＲＫ、ＶＬＩＭ、
ＨＦＹが含まれる）として印を付された残基もまた含む。特に、保存的なシステイン（図
５）は変異型ＮｓＧ３３の対応する部位に配置されていなければならないと考えられる。
【０１２６】
非−配列修飾は、例えば、生体内もしくは試験管内での天然のＮｓＧ３３の一部の化学
誘導体化、同様にアセチル化、メチル化、リン酸化、カルボキシル化、ＰＥＧ付加（PEG-
ylation）、またはグリコシル化を含み得る。同時に、その蛋白質の置換を交換する可能
性があり、類似の特性により特徴付けられる基でその蛋白質と結合する、官能基を置換す
る可能性もある。このような修飾は、１次配列を改変しない。これらは、初めは保存的で
ある、すなわち、置換基が、元の基とおよそ同じ大きさ、形、疎水性および電荷を有する
。
【０１２７】
末端アミノ酸を含む多くのアミノ酸は、天然の加工（プロセス）、例えば、グリコシル
化および他の翻訳後修飾によってか、または当分野で周知の化学修飾技術によって、所定
のポリペプチドにおいて修飾されることある。本発明のポリペプチドに存在し得る既知の
修飾は、いくつか例示的な例を挙げると、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、
アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ポリヌクレオチドまたはポリヌク
レオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシト
ールの共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱ジメチル化、共有結合架橋
の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル
化、糖化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、
ミリストイル化、酸化、蛋白質分解プロセッシング、ホスホリル化、プレニル化、ラセミ
化、セレノイル化（selenoylation）、硫酸化、蛋白質へのトランスファー−ＲＮＡ媒介
性アミノ酸付加、例えばアルギニン化（arginylation）、およびユビキチン化がある。
【０１２８】
そのような修飾は当業者には周知であり、科学雑誌により詳細に記載されている。幾つ
かの特定の一般的な修飾、例えば、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基
のガンマ−カルボキシル化は、最も基本的な資料、例えば、I.  E.  Creighton,  Protei
ns-Structure  and  Molecular  Properties,  第２版,  W.  H.  Freeman  and  Compan
y,  New  York,  1993.  Manyに記載されている。詳細な概要は、この題目において、例
えば、Wold,  F.,  in  Posttranslational  Covalent  Modification  of  Proteins,  
B.  C.  Johnson,  Ed.,  Academic  Press,  New  York,  pp  1-12,  1983;  Seifter
ら、Meth.  Enzymol.  182：  626-646,  1990およびRattanら、Protein  Synthesis：  
Posttranslational  Modifications  and  Aging,  Ann.  N.Y.  Acad.  Sci.  663：  4
8-62,  1992により提供されるものを利用できる。
【０１２９】
加えて、蛋白質は、後の精製および場合によってはエンドペプチターゼを用いたそのタ
グの除去を行うことができる、蛋白質タグを含んでいてもよい。タグはまた、後のタグの
除去を容易にするために、プロテアーゼ切断部位を含んでいてもよい。非限定的なアフィ
ニティータグの例としては、ポリヒスタグ、ＧＳＴタグ、ＨＡタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｃ−
ｍｙｃタグ、ＨＳＶタグ、Ｖ５タグ、マルトース結合蛋白質タグ、セルロース結合ドメイ
ンタグが挙げられる。産生および精製のために好ましくは、タグは、ポリヒスタグである
。好ましくは、タグは、蛋白質のＣ末端部分に存在する。
【０１３０】
ＮｓＧ３３の天然のシグナル配列もまた、他の哺乳動物細胞型での組換え産生における
蛋白質の分泌を増大させるために交換することもできる。
【０１３１】
ポリペプチドが、常に完全に直鎖でなくてもよいことは、周知であり前記のように、理
解されよう。例えば、ポリペプチドはユビキチン化の結果として分岐してもよく、それら
は、一般に、天然のプロセッシング事象および自然では生じないヒトの操作により導入さ
れる事象を含む、翻訳後修飾の結果としての分岐を含んで、もしくは含まずに、環化して
いてもよい。環化、分岐および分岐環状ポリペプチドは、翻訳でない自然の過程により、
および合成方法により合成されることもでき、同様に、そのすべては本発明の目的の範囲
内にある。
【０１３２】
修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノもしくはカルボキシル末端を含み、
ポリペプチドのいずれの部分でも生じ得る。実際に、ポリペプチド中のアミノまたはカル
ボキシル基、あるいはその両方が、共有結合修飾により、天然のポリペプチドおよび合成
ポリペプチドにおいて共通しており、そのような修飾は、同様に、本発明のポリペプチド
中に存在してもよい。例えば、大腸菌で作られたポリペプチドのアミノ末端残基は、蛋白
質分解プロセッシングの前に、ほぼＮ−ホルミルメチオニンが存在しよう。
【０１３３】
ポリペプチドに生じる修飾は、しばしば、それが作られる方法の作用であろう。宿主に
てクローン遺伝子を発現することにより作られるポリペプチドについて、例えば、大部分
の修飾の性質および範囲は、宿主細胞の翻訳後修飾能力およびそのポリペプチドアミノ酸
配列中に存在する修飾シグナルによって決定されるであろう。例えば、グリコシル化は、
細菌宿主、例えば大腸菌においてはほとんど起こらない。従って、グリコシル化を所望す
る場合には、ポリペプチドはグリコシル化する宿主、一般には真核細胞において発現させ
るべきである。昆虫細胞発現系は、とりわけ、天然のグリコシルパターンを有する哺乳動
物蛋白質を効率的に発現するために開発されたため、昆虫細胞は、哺乳動物細胞と同じ翻
訳後修飾のグリコシル化をしばしば生じる。
【０１３４】
同じ型の修飾が、所定のポリペプチドにおいて幾つかの部位で同じもしくは種々の程度
存在し得ることは理解されよう。また、所定のポリペプチドが、多種の修飾を有する場合
がある。
【０１３５】
一般的に、本明細書で用いられるように、用語「ポリペプチド」は、そのような修飾、
特に、宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現することにより合成されるポリペプチド
に存在する修飾の全てを包含する。
【０１３６】
また、本発明の範囲内に含まれるものに、本発明の蛋白質、または該蛋白質の断片に特
異的に結合する試薬がある。これらの試薬は、Ｉｇ融合蛋白質および抗体（一本鎖、二本
鎖、Ｆａｂ断片およびその他のもの、天然物、ヒト化、霊長類化（primatized）またはキ
メラ体）を含む。試薬のこれらの範疇のさらなる記載は、国際公報第95/16709号にあり、
その開示内容は出典明示により本明細書の一部とされる。
【０１３７】
抗体は、無傷な分子、並びに、そのエピトープ決定基と結合することができる、その断
片、たとえばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）、およびＦｖを意味する。ＮｓＧ３３ポリペプチドに
結合する抗体は、免疫抗原として無傷のポリペプチド、または興味ある短いペプチドを含
む断片を用いて調製することができる。動物を免疫するのに用いられるポリペプチドまた
はオリゴペプチドは、所望すれば、担体蛋白質と共役させることができる。ペプチドと化
学的に結合される、一般的に用いられる担体は、ウシ血清アルブミンおよびチログロブリ
ン、キーホールリンペットヘモシアニンを含む。次いで、共役ペプチドは動物（例えば、
マウス、ラットまたはウサギ）を免疫するために用いられる。
【０１３８】
本明細書にて用いられる、ヒト化抗体は、アミノ酸をヒト抗体により近づけるために非
抗原結合領域において置換されるが、元来の結合能を維持し続けている抗体分子を意味す
る。ヒト化抗体は、ＮｓＧ３３の作用を制限もしくは阻害することが望ましい状態を処置
するために治療上用いることができる。
【０１３９】
本発明の範囲内に含まれるものとして、抗体と以下：細胞毒剤、例えば化学療法剤、毒
素、または放射性同位体、特異的な結合対のメンバー、例えばアビジンまたはストレプト
アビジン、または抗原、検出可能な生成物を産生することができる抗体よりなる群から選
択される抱合体との免疫抱合体もある。これらの免疫抱合体は、ＮｓＧ３３受容体を発現
する細胞に対して抱合を目的として用いることができる。
【０１４０】
いずれかのＮｓＧ３３に対する特異抗体もまた、所定の抗体が特異的である物質を定量
するための免疫アッセイにも有用である。ＮｓＧ３３に対する特異抗体はまた、蛋白質を
精製するためか、または溶液から蛋白質を除去するためのいずれかの使用のために、固体
支持体、例えばビーズまたはディッシュに結合させ、溶液からリガンドを取り出すために
用いることもできる。それぞれの技術は、免疫学分野における当業者には周知である。
【０１４１】
本発明の範囲内にあるものとして、ＮｓＧ３３融合蛋白質もある。ＮｓＧ３３融合蛋白
質は、ＮｓＧ３３の受容体を発現する組織の画像化を可能とするために、もしくは免疫組
織学的方法またはＮｓＧ３３に対する抗体のための上記の調製方法に、用いることができ
る。ＮｓＧ３３を含む融合蛋白質は、ＮｓＧ３３受容体を発現する細胞に対する医薬療法
を特異的に標的化するために用いることができる。
【０１４２】
ＩＩ  ＮｓＧヌクレオチド配列
本発明は、例えば、ヒトゲノムヌクレオチド配列（配列番号１）、マウスおよびラット
ゲノム配列（配列番号６および１１）、ヒト、マウスおよびラットのＮｓＧ３３のｃＤＮ
Ａのヌクレオチド配列（配列番号２、７および１２）、シグナル配列を含まないＮｓＧ３
３のコード配列（配列番号２のヌクレオチド１８７−９９６、配列番号７のヌクレオチド
７４−８８３および配列番号１２のヌクレオチド６４−８７３）、およびヒト、マウスお
よびラット起源のＮ−末端ＮｓＧ３３断片のコード配列（配列番号１６、配列番号１７お
よび配列番号１８）を含む、ＮｓＧ３３をコードするゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの医薬
的使用を提供する。本発明は、全長のマウスＮｓＧ３３（配列番号２５）をコードするｃ
ＤＮＡ配列もまた提供する。
【０１４３】
これらの配列変異型もまた、本発明の目的の範囲内に含まれる。
【０１４４】
本発明は、医薬的使用のための、ポリペプチドまたはその相補的な配列をコードする核
酸配列を有する単離された核酸分子であって、
ａ）配列番号３、４、５、８、９、１０、１３、１４、１５、１９、２０、２１、２２、
２３および２４よりなる群から選択されるアミノ酸配列；
ｂ）配列番号３、４、５、８、９、１０、１３、１４、１５、１９、２０、２１、２２、
２３および２４よりなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性
を有する変異型；ならびに
ｃ）ａ）からｂ）のいずれかに記載の少なくとも５０個の連続したアミノ酸の生物学的に
活性な断片
よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１４５】
その核酸分子は、天然の対立遺伝子核酸変異型のヌクレオチド配列を含んでいてもよい
。
【０１４６】
本発明の核酸分子は、天然のポリペプチド変異型のポリペプチド配列を有する変異型ポ
リペプチドをコードしていてもよい。
【０１４７】
１つの実施形態において、核酸分子は、配列番号１、２、６、７、１１、１２、１６、
１７および１８よりなる群から選択される核酸配列と単一のヌクレオチドにより異なって
いる。
【０１４８】
好ましくは、コードされたポリペプチドは、配列番号５、１０および１５よりなる群か
ら選択される配列と少なくとも６０％の配列同一性、好ましくは少なくとも６５％の配列
同一性、より好ましくは少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、７５％の配列
同一性、より好ましくは少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８５
％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なく
とも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有し、より好
ましくはそのポリペプチドが前記配列番号よりなる群から選択される配列を有する。
【０１４９】
好ましい実施形態において、コードされたポリペプチドは、配列番号３および４よりな
る群から選択される配列と少なくとも６０％の配列同一性、好ましくはは少なくとも６５
％の配列同一性、より好ましくは少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、７５
％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは少なく
とも８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましく
は少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、より
好ましくはそのポリペプチドが前記配列番号よりなる群から選択される配列を有する。前
記配列はヒトＮｓＧ３３を構成する。
【０１５０】
好ましい実施形態において、コードされたポリペプチドは、配列番号１９および２２よ
りなる群から選択される配列と少なくとも６０％の配列同一性、好ましくはは少なくとも
６５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、
７５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは少
なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ま
しくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を
有し、より好ましくはそのポリペプチドが前記配列番号よりなる群から選択される配列を
有する。前記配列はヒトＮｓＧ３３を構成する。
【０１５１】
好ましい実施形態において、コードされたポリペプチドは配列番号５の配列と少なくと
も６０％の配列同一性、好ましくはは少なくとも６５％の配列同一性、より好ましくは少
なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、７５％の配列同一性、より好ましくは少
なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、より好ま
しくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、
より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有し、より好ましくはそのポリペプチド
が前記配列番号よりなる群から選択される配列を有する。前期配列はヒトＮ−末端ＮｓＧ
３３ポリペプチドを構成する。
【０１５２】
好ましい実施形態において、コードされたポリペプチドは配列番号４、９および１４よ
りなる群から選択される配列と少なくとも６０％の配列同一性、好ましくはは少なくとも
６５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、
７５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは少
なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ま
しくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を
有し、より好ましくはそのポリペプチドが前記配列番号よりなる群から選択される配列を
有する。前記配列はシグナルペプチドを含まないＮｓＧ３３を構成する。
【０１５３】
好ましい実施形態において、コードされたポリペプチドは配列番号３、８および１３よ
りなる群から選択される配列と少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、よ
り好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少な
くとも９８％の配列同一性を有し、より好ましくはそのポリペプチドが配列番号３、８お
よび１３よりなる群から選択される配列を有する。
【０１５４】
好ましい実施形態において、コードされたポリペプチドは配列番号１９、２０、２１、
２２、２３および２４よりなる群から選択される配列と少なくとも７０％、より好ましく
は少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９５
％、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有し、より好ましくはそのポリペプ
チドが配列番号１９、２０、２１、２２、２３および２４よりなる群から選択される配列
を有する。
【０１５５】
好ましい実施形態において、コードされたポリペプチドは配列番号３と少なくとも７０
％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましく
は少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有し、より好まし
くは前記ポリペプチドが配列番号３の配列を有する。
【０１５６】
好ましい実施形態において、コードされたポリペプチドは配列番号４と少なくとも７０
％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましく
は少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有し、より好まし
くは前記ポリペプチドが配列番号４の配列を有する。
【０１５７】
好ましい実施形態において、コードされたポリペプチドは配列番号１９と少なくとも７
０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好まし
くは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有し、より好ま
しくは前記ポリペプチドが配列番号１９の配列を有する。
【０１５８】
好ましい実施形態において、コードされたポリペプチドは配列番号２２と少なくとも７
０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好まし
くは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有し、より好ま
しくは前記ポリペプチドが配列番号２２の配列を有する。
【０１５９】
ある態様において、核酸分子は、以下：
ａ）  配列番号１、２、６、７、１１、１２、１６、１７および１８よりなる群から選択
されるヌクレオチド配列；
ｂ）  配列番号１、２、６、７、１１、１２、１６、１７および１８よりなる群から選択
されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；
ｃ）  配列番号１、２、６、７、１１、１２、１６、１７および１８よりなる群から選択
される配列の少なくとも１５０個の連続したヌクレオチドの核酸配列；
ｄ）  非常に厳格な条件下にて、配列番号１、２、６、７、１１、１２、１６、１７およ
び１８よりなる群から選択される配列を有する核酸とハイブリダイズすることができる核
酸の相補配列；および
ｅ）  前記のいずれかの相補核酸配列
よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【０１６０】
配列番号１６、１７および１８は、ヒト、マウスおよびラット由来のＣ−末端ＮｓＧ３
３ポリペプチドをコードする配列を表わす。真核生物の発現系における組換え発現の場合
、ＮｓＧ３３ポリペプチドが細胞から分泌されることを保証するため、それらは適当なシ
グナル配列をコードする配列と好ましくは連結される。
【０１６１】
ある好ましい実施形態において、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、配列番号２
、７、１２、１６、１７および１８よりなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なく
とも５０％、好ましくはは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好
ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、好ましくはは少なくとも
８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ま
しくは少なくとも９８％の配列同一性を有する。
【０１６２】
ある好ましい実施形態において、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１
６、１７および１８よりなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも５０％、好
ましくはは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なく
とも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、好ましくはは少なくとも８５％、より好
ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくと
も９８％の配列同一性を有する。
【０１６３】
ある好ましい実施形態において、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、配列番号２
および１６よりなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも５０％、好ましくは
は少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５
％、より好ましくは少なくとも８０％、好ましくはは少なくとも８５％、より好ましくは
少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％
の配列同一性を有する。
【０１６４】
ある好ましい実施形態において、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、配列番号２
のヌクレオチド１８７−９９６、配列番号７のヌクレオチド７４−８８３および配列番号
１２のヌクレオチド６４−８７３よりなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくと
も５０％、好ましくはは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ま
しくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、好ましくはは少なくとも８
５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好まし
くは少なくとも９８％の配列同一性を有する。これらの配列断片は、シグナルペプチドを
含まないＮｓＧ３３をコードする。
【０１６５】
１つの実施形態において、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１として存
在するポリヌクレオチド配列と少なくとも６０、より好ましくは少なくとも６５％、より
好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なく
とも８０％、好ましくはは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好
ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有する。
【０１６６】
ある好ましい実施形態において、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、配列番号２
として存在するヌクレオチド配列と少なくとも５０％、好ましくはは少なくとも６０％、
より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少
なくとも８０％、好ましくはは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、よ
り好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有する
。
【０１６７】
ある好ましい実施形態において、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１
６として存在するヌクレオチド配列と少なくとも５０％、好ましくはは少なくとも６０％
、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは
少なくとも８０％、好ましくはは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、
より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有す
る。
【０１６８】
１つの実施形態において、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、配列番号６として存
在するヌクレオチド配列と少なくとも５０％、好ましくはは少なくとも６０％、より好ま
しくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも
８０％、好ましくはは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好まし
くは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有する。
【０１６９】
ある好ましい実施形態において、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、配列番号７
として存在するヌクレオチド配列と少なくとも５０％、好ましくはは少なくとも６０％、
より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少
なくとも８０％、好ましくはは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、よ
り好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有する
。
【０１７０】
ある好ましい実施形態において、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１
７として存在するヌクレオチド配列と少なくとも５０％、好ましくはは少なくとも６０％
、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは
少なくとも８０％、好ましくはは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、
より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有す
る。
【０１７１】
１つの実施形態において、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１１として
存在するヌクレオチド配列と少なくとも５０％、好ましくはは少なくとも６０％、より好
ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくと
も８０％、好ましくはは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ま
しくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有する。
【０１７２】
ある好ましい実施形態において、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１
２として存在するヌクレオチド配列と少なくとも５０％、好ましくはは少なくとも６０％
、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは
少なくとも８０％、好ましくはは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、
より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有す
る。
【０１７３】
ある好ましい実施形態において、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１
８として存在するヌクレオチド配列と少なくとも５０％、好ましくはは少なくとも６０％
、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは
少なくとも８０％、好ましくはは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、
より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有す
る。
【０１７４】
ある好ましい実施形態において、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、配列番号２
５として存在するヌクレオチド配列と少なくとも５０％、好ましくはは少なくとも６０％
、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは
少なくとも８０％、好ましくはは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、
より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有す
る。
【０１７５】
単離されたポリヌクレオチドの好ましい群は、ヒトＮｓＧ３３ポリヌクレオチドである
配列番号１、２および１６を含む。他の好ましい単離されたポリヌクレオチドの群は、そ
のｃＤＮＡを表す、配列番号２、７および１２を含む。一般に、ｃＤＮＡ配列は、そのゲ
ノム配列よりもより短く、適当な発現ベクター中に容易に挿入でき、細胞内または生体外
（エックスビボ）で、産生細胞またはヒト細胞中に形質導入／トランスフェクションされ
る。
【０１７６】
加えて、本発明のヌクレオチド配列は、これらの配列の誘導物である配列を含む。本発
明は、それらの配列のいずれか、またはそれらの配列のいずれかの誘導物を含む、ベクタ
ー、リポソームおよび他の担体媒体もまた含む。本発明は、ヒトＮｓＧ３３および誘導物
および変異型に限定されることはないが、ＮｓＧ３３ｃＤＮＡ、好ましくはヒトＮｓＧ３
３ｃＤＮＡから転写、翻訳された蛋白質を含む。
【０１７７】
他の実施形態において、本発明は、本発明のＮｓＧ３３蛋白質の構造または機能的特徴
を有する蛋白質をコードする他の遺伝子を単離するためのプローブを設計するための、本
発明の核酸および蛋白質の使用に関する。そのプローブは、種々の塩基長であってよい。
例えば、核酸プローブは、約１０塩基長から約１５０塩基長であろう。
【０１７８】
別には、核酸プローブは約１５０塩基長以上であってもよい。実験方法は、Ausubelら
、"Current  Protocols  in  Molecular  Biology",  J.  Wiley（ed.）（1999）におい
て提供され、その教示内容は出典明示により完全に本明細書の一部とされる。
【０１７９】
オリゴヌクレオチド（本明細書中、核酸としても称される）プローブの設計は、好まし
くは以下のパラメータに従う：
ｉ）存在すれば、不明瞭な塩基が最も少ない配列領域に対して設計されるべきであり、
そして、
ｉｉ）約８０℃の計算されたＴｍ（それぞれＡまたはＴは２℃、それぞれＧまたはＣは
４℃と推定する）を有するように設計されるべきである。
【０１８０】
オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションの検出を容易にするために標識化され
ることが好ましいであろう。標識化は、γ−３２Ｐ  ＡＴＰ（特異活性６０００Ｃｉ／ミ
リモル）およびＴ４オリゴヌクレオチドキナーゼを用いて、一般的に用いられる標識化オ
リゴヌクレオチドの技術を用いて行うことができる。他の標識化技術もまた用いることが
できる。組み込まれなかった標識は、好ましくはゲル濾過クロマトグラフィーまたは他の
確立された方法により除去されるべきである。プローブ中に組み込まれた放射能は、シン
チレーション計数器にて測定し定量化すべきである。好ましくは、得られるプローブの特
異活性は、およそ４×１０６ｄｐｍ／ピコモルであろう。全長クローンのプールを含む細
菌培養物は、好ましくは溶解され、保存液の１００μＬを用いて、１００ｐｇ／ｍｌのア
ンピシリンを含む２５ｍｌの滅菌Ｌ−ブロスを含む滅菌培養フラスコに与える。
【０１８１】
培養は、好ましくは約３７℃で増殖させ、飽和培養物は好ましくは新鮮なＬ−ブロスで
希釈されるべきである。これらの希釈物の一部は、好ましくは、１５０ｍｍペトリ皿中の
１００ｐｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１．５％の寒天を含むＬ−ブロスを含有する固体
細菌培地上に撒き、約３７℃で一晩培養した場合におよそ５０００個の個別の、良く分離
されたコロニーを生じる希釈率および量を決定すべきである。個別の、良く分離されたコ
ロニーを得る他の既知方法もまた用いることができる。
【０１８２】
次いで、一般的なコロニーハイブリダイゼーション手順を用いて、コロニーをニトロセ
ルロースフィルターに移し、溶菌し、変性させそれらを破壊すべきである。非常に厳格な
条件（本明細書中、「非常に厳格」とも称される）は、少なくとも、例えば約６５℃での
１×ＳＳＣ、または約４２℃での１×ＳＳＣと５０％ホルムアミドのように厳格な条件で
ある。「極端に厳格な」条件は、少なくとも、例えば６５℃での約４×ＳＳＣ、および４
２℃での４×ＳＳＣおと５０％ホルムアミドのように厳格な条件である。「軽減された厳
格な」条件は、約５０℃での４×ＳＳＣ、または４０℃での６×ＳＳＣと５０％ホルムア
ミドのように厳格な条件である。
【０１８３】
次いで、そのフィルターは、好ましくは、０．５％のＳＤＳ、１００ｇ／ｍｌの酵母Ｒ
ＮＡ、および１０ｍＭのＥＤＴＡを含む６×ＳＳＣ（２０×保存液は、１７５．３ｇのＮ
ａＣｌ／リッター、８８．２ｇのクエン酸ナトリウム／リッター、ＮａＯＨでｐＨ７．０
に調整されている）中（１５０ｍｍのフィルター当たりおよそ１０ｍＬ）で、ゆっくり攪
拌しながら６５℃にて１分間インキュベートされる。好ましくは、次いで、プローブを１
×１０６ｄｐｍ／ｍＬ以上もしくは同等量でハイブリダイゼーション混液に添加する。次
いで、フィルターは、好ましくは、約６５℃でゆっくり攪拌しながらインキュベートされ
る。次いで、フィルターは、好ましくは攪拌せず室温で５００ｍＬの２×ＳＳＣ／０．５
％ＳＤＳ中で洗浄され、好ましくは続いて、ゆっくり攪拌しながら室温で５００ｍＬの２
×ＳＳＣ／０．５％ＳＤＳ中で１５分間洗浄される。０．１×ＳＳＣ／０．５％ＳＤＳを
用いた６５℃での３０分間の第３の洗浄を行っても良い。次いで、フィルターは好ましく
は乾燥され、Ｘ線フィルムに実像を可視化するために十分な時間、放射能写真にかける。
他の既知のハイブリダイゼーション方法もまた用いることができる。次いで、陽性コロニ
ーを選び、培地中で増殖させ、標準手順を用いてプラスミドＤＮＡを単離する。次いで、
そのクローンを制限分析、ハイブリダイゼーション分析、またはＤＮＡ配列決定により確
認することができる。
【０１８４】
別には、ヌクレオチドプローブと相同ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列とのハイブリダイゼー
ションを決定するための適切な実験条件は、５×ＳＳＣ［塩化ナトリウム／クエン酸ナト
リウム；Sambrookら、Molecular  Cloning：  A  Laboratory  Manual,  Cold  Spring  
Harbor  Lab.,  Cold  Spring  Harbor,  NY  1989を参照のこと］中で１０分間、ハイブ
リダイズするためのＤＮＡ断片およびＲＮＡを含むフィルターの予浸、そして５×ＳＳＣ
、５×デンハート（Denhardt）溶液［Sambrookら、；Op  cit.を参照のこと］、０．５％
ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌ  希釈された超音波処理サケ精子DNA［Sambrook  et  al.
;  Op  cit.を参照のこと］の溶液中でのフィルターの前ハイブリダイゼーション、次に
、濃度１０ｎｇ／ｍｌの無作為−感作（random-primed）［Feinberg  A  P  &  Vogelste
in  B;  Anal.  Biochem.  1983  132  6-13］、３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識化（特異活性＞１
×１０９ｃｐｍ／μｇ）プローブを含む同一の溶液中でおよそ４５℃で１２時間、ハイブ
リダイゼーションすること、を含む。次いで、フィルターを、温度が少なくとも６０℃（
中程度に厳格な条件）、より好ましくは少なくとも７０℃（非常に厳格な条件）、および
さらにより好ましくは少なくとも７５℃（極端に厳格な条件）で０．１×ＳＳＣ、０．５
％ＳＤＳ中にて３０分間２回洗浄する。これらの条件下でオリゴヌクレオチドプローブを
ハイブリダイズさせた分子をｘ線フィルムを用いて検出することができる。
【０１８５】
さらなる別の実施形態において、本発明は、ＮｓＧ３３の核酸とハイブリダイズする核
酸配列（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）に関する。特に、配列番号：１、配列番号：２、配列
番号：６、配列番号：７、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１６、配列番号１７ま
たは配列番号１８と、前記の中程度もしくは軽減された厳格な条件下でハイブリダイズす
る核酸に関する。
【０１８６】
さらなる別の実施形態において、本発明は、ＮｓＧ３３の核酸の相補鎖に関する。特に
、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：６、配列番号７、配列番号１１、配列番号１
２、配列番号１６、配列番号１７、および配列番号１８の相補鎖に関する。
【０１８７】
別の実施形態において、本発明は、ＮｓＧ３３のＤＮＡ核酸のＲＮＡ対応物に関する。
特に、配列番号：２、配列番号：７、配列番号：１２、配列番号１６、配列番号１７、お
よび配列番号１８のＲＮＡ対応物に関する。
【０１８８】
限定されるものではなく、大腸菌、酵母種、チャイニーズハムスター、胎児ハムスター
、昆虫および真菌を含む、選択された宿主細胞における増強された発現のためにコドンが
最適化された核酸分子もまた考えられる。
【０１８９】
種々の核酸は、人工的な変異誘発方法の状態によって作り出すことができる。ヒトから
のコード配列を、マウス、ラットもしくはチンパンジーのものとシャッフリングする方法
もまた考えられる。具体的には、シャッフルされた変異型は、一方が配列番号２と、他方
が配列番号７および／または１２の間であり得る。さらに、配列番号７と１２との間のシ
ャッフルされた変異型も含まれる。
【０１９０】
ＩＩＩ  神経系疾患の処置のための、ＮｓＧ３３ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよ
びＮｓＧ３３分泌細胞
１つの実施形態において、変異型ＮｓＧ３３、およびその断片および／またはＮｓＧ３
３を含む融合蛋白質は、哺乳動物の神経系疾患の処置のために提供される。ＮｓＧ３３は
、神経細胞が喪失または傷害をうける病状において、増殖を含む神経細胞生長、ニューロ
ン機能、ニューロン再生、ニューロン分化ニューロン移動および／またはニューロン生存
を刺激するために用いることができる。
【０１９１】
１つの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドは、
増殖、分化，機能、生存、および／または再生を含むニューロン生長が望ましい状態また
は疾患を処置するのに用いることができる。本発明のポリペプチドは、例えば、ＮｓＧ３
３ポリペプチドに対する病的過程の応答を処置するために、医薬組成物の注射、移植また
は摂取を介して、直接用いることができる。このことは、ＮｓＧ３３が分泌型の成長因子
であるこを示す生物情報分析、ＮｓＧ３３がアポトーシスから神経細胞を保護することが
出来る事実（実施例６）、ＮｓＧ３３がヒト神経前駆細胞分化アッセイおよび初代ラット
線条体培養におけるニューロンの増大した百分率の発生を引き起こす事実、およびＮｓＧ
３３が眼を含む神経系において優先的に発現されている事実によって、支持される。この
ＮｓＧ３３の抗アポトーシス効果により、ＮｓＧ３３はアポトーシス性の細胞死に関与す
る神経系傷害の処置のための候補蛋白質／遺伝子となる。そのような傷害には、脳卒中、
外傷および神経変性傷害が含まれる。ＮｓＧ３３の神経保護および／または神経発生効果
は、ニューロンの喪失、機能不全、変性またはその過程により生じる障害を処置するため
の使用を支持する。
【０１９２】
ＮｓＧ３３は、神経系に存在する種々の細胞型の範囲に作用し得る。本発明のこの内容
において、神経系は、中枢神経、末梢神経系、眼および蝸牛前庭複合体（cochleovestibu
lar  complex）を包含することを意図する。
【０１９３】
１つの実施形態において、ＮｓＧ３３ポリペプチドは、限定されるものではないが、運
動ニューロンおよび感覚ニューロンを含むニューロンに作用し得る。
【０１９４】
別の実施形態にいて、NsG33ポリペプチドの治療効果は、グリア細胞、例えば、オリゴ
デンドロサイトおよび/または星状細胞での作用を通じて生じ得る。これらグリア細胞で
の作用を通じて、NsG33ポリペプチドは、髄鞘形成およびニューロン機能および生存の維
持に関与し得る。
【０１９５】
別の実施形態において、ＮｓＧ３３ポリペプチドは、限定されるものではないが、網膜
神経節細胞、光受容細胞、支持組織、例えば、網膜上皮細胞および耳の有毛細胞を含む、
感覚細胞に作用し得る。
【０１９６】
さらなる実施形態において、ＮｓＧ３３ポリペプチドは、幹細胞および限定されるもの
ではないが、神経前駆細胞およびグリア前駆細胞を含む下流の前駆細胞に作用し得る。Ｎ
ｓＧポリペプチドは、幹細胞および／または神経もしくはグリア前駆細胞に作用し、増殖
を含む生長、分化および／または移動を引き起こす。幹細胞治療は、生体内もしくは生体
外遺伝子治療を通じて行われることができ、蛋白質は、幹細胞を用いて局所に投与するこ
とができる。これは、ヒト神経前駆細胞系におけるＮｓＧ３３の効果により支持される。
【０１９７】
傷害または疾患またはダメージは、外傷、手術、虚血、感染症、代謝疾患、栄養失調、
悪性腫瘍または毒物、および遺伝的もしくは突発的過程により生じる神経系のダメージで
あろう。
【０１９８】
本法の１つの実施形態において、疾患または傷害またはダメージは、脳卒中、外傷性脳
損傷（ＴＢＩ）、脊髄損傷（ＳＣＩ）、びまん性軸策損傷（ＤＡＩ）、癲癇、神経障害、
末梢神経障害および関連する疼痛などの状態、およびこれらの症状を引き起こし得る他の
症状に至る、脳、脳幹、脊髄および／または抹消神経に対する損傷を含む。
【０１９９】
別の実施形態において、疾患、障害またはダメージは、脳、脳幹，脊髄および／または
末梢神経におけるニューロンの機能不全および／または喪失、例えば、限定されるもので
はないが、パーキンソン病、アルツハイマー病、老人性痴呆、ハンチントン病、筋萎縮性
側索硬化症（ＡＬＳ），多発性硬化症（ＭＳ）に関連するニューロン／軸索損傷および関
連症候を含む神経変性障害に関連する。
【０２００】
別の実施形態において、疾患、傷害またはダメージは、脳、脳幹,脊髄および/または末
梢神経におけるニューロンの機能不全および/または喪失、例えば、代謝疾患、栄養失調
、中毒性損傷、悪性腫瘍、および/または限定されるものではないが、糖尿病、腎機能不
全、アルコール中毒、化学療法、化学試薬、薬物乱用、ビタミン欠乏症、感染症、および
関連症候を含む遺伝的または突発的状態を含む。
【０２０１】
別の実施形態において、疾患傷害またはダメージは、限定されるものではないが、多発
性硬化症(MS)、視神経炎、脳硬化症、感染後の脳脊髄炎および癲癇、および関連症候を含
む、脳、脳幹、脊髄および末梢神経系におけるグリア、例えば、オリゴデンドロサイト、
星状細胞およびシュワン細胞の変性または硬化に関連する。
【０２０２】
別の実施形態において、疾患、障害またはダメージは、網膜、光受容体および関連神経
に関連し、限定されるものではないが、色素性網膜炎、黄斑変性症、緑内障および関連症
候を含む。
【０２０３】
別の実施形態において、疾患、障害またはダメージは、感覚上皮および前庭聴覚（vest
ibuloacoustic）複合体の関連するガングリオンに関連し、限定されるものではないが、
騒音性難聴、難聴、耳鳴、耳炎、内耳炎、遺伝的および蝸牛前庭萎縮症（cochleovestibu
lar  atrophies）、メニエール病および関連症候を含む。
【０２０４】
好ましい実施形態において、本発明のポリペプチド、核酸、発現ベクター、カプセルお
よび医薬組成物は、パーキンソン病の処置に用いられる。この機能は、中枢の中脳、黒質
および被殻における高レベルな発現についての知見（実施例５を参照のこと）、ヒト胎児
発生時の中脳における発現についての知見（実施例３）、ＮｓＧ３３がヒト神経前駆細胞
分化アッセイおよび初代ラット線条体培養においてニューロンの増大した百分率の生成を
引き起こすという知見に基づいており、そして、アポトーシス性の細胞死から保護する知
見（実施例６）によって支持される。この機能は、ドーパミン作動性の神経栄養活性につ
いてのバイオアッセイを用いて（実施例１１）、および線条体内（intrastriatal）６−
ＯＨＤＡ損傷モデルを通じた生体内にて（実施例１２）、改変され得る。
【０２０５】
ハンチントン病（ＨＤ）は、脳内の種々の神経細胞集団、特に尾状核に位置するＧＡＢ
Ａ−作動仲介性突起ニューロン（GABA-ergic  medium  spiny  neuron）の進行性の変性
をもたらす常染色体優性疾患である。この変性に関連して、皮質のグルタミン性入力ニュ
ーロン（glutaminergic  input  neuron）もまた変性し、この組み合わされた変性により
、ほとんどの進行性の運動異常運動移動（dyskinetic  motor  movement）並びに痴呆の
特徴的症状が説明される。
【０２０６】
好ましい実施形態において、本発明のポリペプチド、核酸、発現ベクター、カプセルお
よび医薬組成物は、ハンチントン病の処置に用いられる。これは、ＮｓＧ３３の生物情報
分析および神経保護／神経発生活性の結果と組み合わせて、被殻での高発現の知見（具体
的には、実施例１５、さらに実施例６および１４）に基づく。ハンチントン病は、興奮毒
性疾患である。興奮毒性バイオアッセイは、本発明の実施例１２に記載のアッセイである
。ＮｓＧ３３のこの神経保護効果の確認のための他の例示的なバイオアッセイには、例え
ば、ＮＭＤＡの興奮毒性効果に対する初代海馬薄片培養の保護についてのバイオアッセイ
（国際公開第03/004527号パンフレット、実施例５）が挙げられる。
【０２０７】
他の好ましい実施形態において、本発明のポリペプチド、核酸、発現ベクター、カプセ
ルおよび医薬組成物は、抹消神経疾患の処置に用いられる。このことは、ＮｓＧ３３の生
物情報分析の結果および神経保護／神経発生活性および抗アポトーシス効果と組み合わせ
て、後根神経節における高発現についての知見（実施例６、１４および１５）に基づく。
この機能の確認は、実施例９に記載の後根神経節培養アッセイを用いて行うことができる
。本発明の分子を用いた処置について考えられる抹消神経疾患は、外傷誘導性の神経障害
、例えば、身体的損傷または疾患状態、末梢神経に対する物理的なダメージ、例えば椎間
板ヘルニア、および脳に対する物理的なダメージ、脊髄に対する物理的なダメージ、脳ダ
メージに関連する脳卒中および神経変性に関する神経障害により引き起こされるものがあ
る。我々は、化学療法誘導性の神経障害（例えば、化学療法剤、例えばタキソールまたは
シスプラチンの輸送により生じるもの）；毒素−誘導性の神経障害、薬物−誘導性の神経
損傷、ビタミン欠乏症−誘導性の神経損傷；突発性神経損傷；および糖尿病性神経損傷の
処置もまた考慮する。
【０２０８】
別の好ましい実施形態において、本発明のポリペプチド、核酸、発現ベクター、カプセ
ル、および組成物は、限定されるものではないが、感覚性運動失調症、多発性硬化症、神
経変性脊髄小脳障害、遺伝性運動失調症、小脳萎縮（例えば、オリーブ橋小脳萎縮症（Ｏ
ＰＣＡ）、シャイ・ドレーガー症候群（多系統萎縮症））、およびアルコール中毒を含む
、小脳に関連する傷害、疾患またはダメージの処置に用いられる。この機能は、ＮｓＧ３
３の生物情報分析、神経保護／神経発生活性および抗アポトーシス効果（実施例６、１４
および１５）と組み合わせて、成人のヒト小脳における高発現、および発生中のマウス小
脳に特異な発現により支持される。この機能の確認は、実施例７および８に記載のアッセ
イ（小脳顆粒細胞のグルタミン酸毒性およびカリウム欠乏からの保護）を用いて行うこと
ができる。
【０２０９】
別の好ましい実施形態において、本発明のポリペプチド、核酸、発現ベクター、カプセ
ルおよび組成物は、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、および脊髄損傷（例えば、虚
血または外傷）の処置に用いられる。これは、ＮｓＧ３３の生物情報分析、神経保護／神
経発生活性および抗アポトーシス効果の結果（実施例６、１４および１５）と組み合わせ
て、成人のヒト脊髄における高発現レベルおよび発生中のマウス脊髄に特異な発現につい
ての知見に基づく。この特異的な治療機能は、実施例１０に記載の運動ニューロンアッセ
イを用いて行うことができる。
【０２１０】
好ましい実施形態において、本発明のポリペプチド、核酸、発現ベクター、カプセルお
よび組成物は、限定されるものではないが、色素性網膜炎、黄斑変性症および緑内障を含
む、網膜に関連する疾患、傷害またはダメージの処置に用いられる。この特異的な治療上
の使用は、生物情報とＮｓＧが網膜において多く発現される分泌型の成長因子であること
を示した実験分析（図４）により支持される。
【０２１１】
他の成長因子は、中枢および末梢神経系の両方における、および網膜および／または角
膜における細胞の喪失と関連した種々の眼の適応症における重要な治療上の使用を有する
。例えば、ＮＧＦは、アルツハイマー病、角膜潰瘍（米国特許第6,063,757号明細書およ
び欧州特許第0  973  872号明細書）および網膜症の双方についての候補物質である。ニ
ュウブラスチン（アルテミン）は、末梢神経障害（国際公開第02/078730号パンフレット
）および角膜角膜創傷治癒（欧州特許第1  223  966号）の双方についての候補物質であ
る。ＧＤＮＦは、パーキンソン病、ＡＬＳ、脊髄損傷についての、および創傷治癒につい
て、特に角膜の創傷治癒（欧州特許第1  223  966号）についての候補物質である。
【０２１２】
そのような使用の確認は、当分野の試験管内アッセイ（網膜外植片アッセイ、角膜培養
）の種々の状態を用いることにより得ることができる。機能の確認は、角膜創傷（ウサギ
における角膜損傷）および網膜（マウスおよびラットについて利用可能な色素性網膜炎変
種モデル）についての動物モデルの状態において実施することもできる。
【０２１３】
他の実施形態において、神経性疾患は、損傷、心停止または脳卒中による虚血、癲癇、
および外傷よりなる群から選択される興奮毒性疾患である。この機能はまた、ＮｓＧ３３
の神経保護／神経発生活性および抗アポトーシス活性によっても支持される（実施例６、
１４および１５）。上記の海馬薄片培養アッセイおよび本発明の実施例７に記載のアッセ
イは、興奮毒性疾患の処置のための治療法の使用の生物学的効果、指標を実証するために
用いることができるアッセイの非限定的な実例である。
【０２１４】
本明細書で用いられる用語「被検体」は、ＮｓＧ３３ポリペプチドまたはポリヌクレオ
チド、治療細胞または生体適合性カプセルを投与することができる、いずれかの動物を意
味する。本発明の方法を用いた処置に特に向いている被検体には、ヒト並びにヒトでない
霊長類、ヒツジ、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ハムスタ
ー、アレチネズミ、ラットおよびマウス、同様にこれらの宿主から誘導されたもしくは起
源とする組織、腫瘍および細胞が含まれる。
【０２１５】
ＩＶ  免疫傷害の処置
１つの実施形態において、ＮｓＧ３３は、免疫傷害を処置するための使用が考えられる
。このＮｓＧ３３の特定の機能は、上記のように、国際公開第93/22437号に記載の免疫学
的機能を有する蛋白質に対するＮｓＧ３３の構造の類似性に基づいている。
【０２１６】
この実施形態に関して、ＮｓＧ３３は、限定するものではなく、本明細書に記載される
アッセイに関する活性を含む、免疫刺激または免疫抑制活性を示し得る。ＮｓＧ３３は、
種々の免疫不全および障害（重症複合免疫不全症（SCID）を含む）の処置に、Ｔおよび／
またはＢリンパ球の生長および増殖を調節（上方または下方）するのに、同様に、ＮＫ細
胞および他の細胞集団の細胞溶解活性をもたらすのに有用であろう。これらの免疫不全は
、遺伝的であることがあり、ウイルス（例えばＨＩＶ）並びに細菌もしくは真菌感染によ
って生じることがあり、あるいは、自己免疫疾患によって生じることもある。より詳細に
は、亜感染症は、ウイルス、細菌、真菌により生じ、あるいは、ＨＩＶ、肝炎ウイルス、
肝炎ウイルス、マイコバクテリア、リーシュマニア種、マラリア種および種々の真菌感染
症、例えば、カンジダ症を含む、他の感染症はＮｓＧ３３を用いて処理することができる
。これに関連して、ＮｓＧ３３は、免疫系に対して増強が一般的に望ましい場合、すなわ
ち癌の処置に有用でも有り得る。
【０２１７】
ＮｓＧ３３を用いて処置され得る自己免疫障害は、例えば、結合組織疾患、多発性硬化
症、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、自己免疫肺炎症、ギラン−バレー症候
群、自己免疫性甲状腺炎、インスリン依存性糖尿病、重症筋無力症、移植片対宿主病およ
び自己免疫炎症眼病（autoimmune  inflammatory  eye  disease）が含まれる。ＮｓＧ３
３蛋白質（または、抗体を含む、その拮抗薬）は、アレルギー反応および状態（例えば、
過敏症、血清病、薬物反応、食物アレルギー、昆虫毒アレルギー、肥満細胞症、アレルギ
ー性鼻炎、過敏性肺炎、じんま疹、血管浮腫、湿疹、アトピー性皮膚炎、アトピー性接触
皮膚炎、多形性紅斑、スティーヴンズ−ジョンソン症候群、アレルギー結膜炎、アトピー
性角結膜炎、性病性角結膜炎、巨大乳頭結膜炎および接触アレルギー）、例えば喘息（特
に、アレルギー性喘息）または他の呼吸困難の処置にも有用であろう。免疫抑制が望まれ
る他の状態（例えば、臓器移植を含む）もまた、ＮｓＧ３３蛋白質（または、その拮抗薬
）を用いた処置が可能であろう。アレルギー反応に治療法有効なポリペプチドまたはその
拮抗薬は、生体内動物モデル、例えば、累積接触増強試験（cumulative  contact  enhan
cement  test）（Lastbomら、Toxicology  125：  59-66,1998）,  皮プリック試験（ski
n  prick  test）（Hoffmannら、Allergy  54：  446-54,1999）、モルモット皮膚感作試
験（guinea  pig  skin  sensitization  test）（Vohrら、Arch.  Toxocol.  73：  501
-9）、およびネズミ科動物局所リンパ節試験（murine  local  lymph  node  assay）（K
imberら、J.  Toxicol.  Environ.  Health  53：  563-79）により評価することができ
る。
【０２１８】
ＮｓＧ３３を用いることで、免疫応答を、多くの様式で調整することもできる。下流調
節は、既に進行している免疫応答を阻害もしくはブロックする形式であってよく、あるい
は、免疫応答誘発を予防することを含み得る。活性化Ｔ細胞の機能は、Ｔ細胞応答を抑制
することによって、またはＴ細胞の特定の耐性を導入すること、もしくはその両方によっ
て阻害することができる。Ｔ細胞応答の免疫抑制は、一般に、抑制剤に対するＴ細胞の連
続的な曝露が必要な、活性、非抗原特異的な過程である。Ｔ細胞における非−敏感性また
はアネルギーを含む耐性は、一般的に抗原特異的であり、耐性化剤（tolerizing  agent
）に対する曝露を終えた後に持続する免疫抑制とは区別可能である。
【０２１９】
操作上、耐性は、耐性化剤非存在下で、特定の抗原に再曝露した後のＴ細胞応答の欠損
によって決定することができる。
【０２２０】
１つまたはそれ以上の抗原機能（限定するものではなく、Ｂリンパ球抗原機能を含む（
例えば、Ｂ７））を下方調節または予防すること、例えば、活性化Ｔ細胞による高レベル
のリンフォカイン合成を予防することは、組織、皮膚および臓器移植に、および移植片対
宿主病（ＧＶＨＤ）に有用であろう。例えば、Ｔ細胞機能の阻害は、組織移植における軽
減された組織破壊をもたらすはずである。
【０２２１】
典型的には、組織移植における、移植拒絶反応はＴ細胞により外来物としての認識を通
じて始まり、次いで、その移植片を破壊する免疫応答を生じる。本発明の医薬組成物の投
与は、免疫細胞、例えばＴ細胞によりサイトカイン合成を予防し、次いで、自己免疫抑制
剤として作用し得る。さらに、同時刺激を欠いても、Ｔ細胞をアレルギー化（anerrgize
）するのに十分であり、それにより、被検体に耐性を誘導することができる。Ｂリンパ球
の抗原阻害試薬による長期の耐性誘導は、これらの阻害試薬の投与の繰り返しの必要性を
避けることができる。被検体における十分な免疫抑制または耐性を達成するために、Ｂリ
ンパ球抗原の組み合わせの機能を阻害することも必要であろう。
【０２２２】
臓器移植拒絶反応またはＧＶＨＤを予防する特定の医薬組成物の効果は、ヒトでの効果
を推定可能な動物モデルを用いて評価するこができる。用いることができる適当な系の例
としては、ラットにおける同種の心臓移植片およびマウスにおける異種の膵島細胞が挙げ
られ、その両方ともが、Lenschowら、Science  257：  789-792（1992）、およびTurka  
ら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci  USA,  89：  11102-11105（1992）に記載されるように
、生体内でのＣＴＬＡ４Ｉｇ融合蛋白質の免疫抑制効果を試験するために用いられた。加
えて、ＧＶＨＤのネズミモデル（Paul  ed.,  Fundamental  Immunology,  Raven  Press
,  New  York,  1989,  pp.  846-847を参照のこと）は、その疾患の進行について本発明
の治療組成物の効果を決定するために用いることができる。
【０２２３】
抗原機能を阻害することは、自己免疫疾患を処置するのに治療上有用でもある。多くの
自己免疫障害は、自己組織に対して作用するＴ細胞の不適当な活性の結果であり、その障
害の病状に関連するサイトカインおよび自己抗体の産生を促進する。自己反応性Ｔ細胞の
活性化を予防することは、疾患症状を軽減もしくは排除することになろう。Ｔ細胞の刺激
を阻害する試薬の投与は、Ｔ細胞の活性化を抑制し、これらの疾患過程に関連し得る自己
抗体またはＴ細胞誘導性サイトカインの産生を抑制するために用いることができる。加え
て、阻害試薬は、疾患から長期の救済をもたらすことができる、自己反応性Ｔ細胞の抗原
特異的な耐性を誘発し得る。自己免疫障害を予防もしくは軽減することとなる阻害試薬の
効果は、多くの良く特徴付けられたヒト自己免疫疾患動物モデルを用いて決定することが
できる。例として、ネズミ科動物の実験用自己免疫性脳炎、ＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウ
スまたはＮＺＢハイブリッドマウスにおける全身性エリテマトーデス、ネズミ科動物の自
己免疫コラーゲン関節炎、ＮＯＤマウスおよびＢＢラットにおける真性糖尿病、並びにネ
ズミ科動物の実験用重症筋無力症（Paul  ed.,  Fundamental  Immunology,  Raven  Pre
ss,  New  York,  1989,  pp.  840-856を参照のこと）が挙げられる。
【０２２４】
免疫応答を上流調節する意味での、抗原機能の上流調節（例えば、Bリンパ球抗原機能
）は、治療に有用でもあろう。免疫応答の上流調節は、存在する免疫応答を増強するまた
は最初の免疫応答を顕在化する形式であってよい。例えば、免疫応答を増強することは、
全身ウイルス疾患、例えばインフルエンザ、感冒および脳炎を含むウイルス感染症の場合
に有用であろう。
【０２２５】
別には、感染した患者からＴ細胞を取り出し、そのＴ細胞を、試験管内でＮｓＧ３３を
発現するウイルス抗原−適用ＡＰＣまたは刺激様式の本発明の可溶性ＮｓＧ３３と同時に
ウイルス抗原−適用ＡＰＣを用いるかのいずれかで同時刺激し、該患者に試験管内で刺激
されたそのＴ細胞を再び導入することによって、該患者において抗−ウイルス免疫応答を
増強することができる。抗−ウイルス免疫応答を増強する別の方法は、患者から感染した
細胞を単離し、細胞表面に本明細書に記載のＮｓＧ３３蛋白質を全面または部分的に発現
するよう、それをコードする核酸を用いてその細胞をトランスフェクトし、該患者にその
トランスフェクトされた細胞を再び導入することがあろう。ここで、感染細胞は、同時刺
激シグナルを、およびそれによる活動を生体内にてＴ細胞に伝えることができるであろう
。
【０２２６】
ＮｓＧ３３は、トランスフェクトされた腫瘍細胞に対するＴ細胞媒介性の免疫応答を誘
導する、必要な刺激シグナルをＴ細胞に提供することができる。加えて、ＭＨＣクラスＩ
またはＭＨＣクラスＩＩ分子を欠損しているか、または十分量のＭＨＣクラスＩまたはＭ
ＨＣクラスＩＩ分子を発現していない腫瘍細胞を、ＭＨＣクラスＩα鎖蛋白質およびβ２
ミクログロブリン蛋白質またはＭＨＣクラスＩＩα鎖蛋白質およびＭＨＣクラスＩＩβ鎖
蛋白質の全部もしくは一部（例えば、細胞質ドメイン切断型部分）をコードする核酸を用
いてトランスフェクトし、それにより細胞表面にＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ
蛋白質を発現させることができる。Ｂリンパ球抗原の活性を有するペプチド（例えば、Ｂ
７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−３）と同時の適当なクラスＩまたはクラスＩＩＭＨＣの発現は
、トランスフェクトされた腫瘍細胞に対するＴ細胞媒介性の免疫応答を誘導する。所望に
より、ＭＨＣクラスＩＩ関連蛋白質、例えば不変鎖の発現を阻害するアンチセンス構築物
をコードする遺伝子もまた、腫瘍関連抗原の存在を増大させ、腫瘍特異的な免疫性を導入
するＢリンパ球抗原の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡを用いて同時トランスフ
ェクトとすることができる。従って、ヒト被験者におけるＴ細胞媒介性の免疫応答の導入
は、被験者における腫瘍特異的耐性を克服するのに十分であろう。
【０２２７】
ＮｓＧ３３の活性には、別の手段で、以下の方法：
胸腺細胞または脾細胞細胞毒性についての適切なアッセイには、限定するものではない
が、Current  Protocols  in  Immunology,  Ed  by  J.  E.  Coligan,  A.  M.  Kruis
beek,  D.  H.  Margulies,  E.  M.  Shevach,  W.  Strober,  Pub.  Greene  Publish
ing  AssociatesおよびWiley-Interscience（Chapter  3,  In  Vitro  assays  for  Mo
use  Lymphocyte  Function  3.1-3.  19;  Chapter  7,  Immunologic  studies  in  H
umans）；Herrmannら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  78：  2488-2492,1981；Herrm
annら、J.  Immunol.  128：  1968-1974,1982；Handaら、J.  Immunol.  135：  1564-1
572,1985；Takaiら、I.  Immunol.  137：  3494-3500,1986；Takaiら、J.  Immunol.  1
40：  508-512,1988；Bowmanら、J.  Virology  61：  1992-1998；Bertagnolliら、Cell
ular  Immunology  133：  327-341,1991；Brownら、J.  Immunol.  153：  3079-3092,
1994に記載のものが含まれる。
【０２２８】
Ｔ細胞依存的な免疫グロブリン応答およびアイソタイプ交換（とりわけ、Ｔ細胞依存的
抗体応答を調整し、Ｔｈｌ／Ｔｈ２側面に影響を及ぼす蛋白質、その他のものを同定する
）についてのアッセイは、限定するものではないが、Maliszewski,  J.  Immunol.  144
：  3028-3033,1990；およびAssays  for  B  cellfunction：  In  vitro  antibody  p
roduction,  Mond,  J.  J.  and  Brunswick,  M.  In  Current  Protocols  in  Immu
nology.  J.  E.  e.  a.  Coligan  eds.  Vol  1  pp.  3.8.  1-3.8.  16,  John  Wi
leyおよびSons,  Toronto.  1994に記載のものが含まれる。
【０２２９】
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイ（とりわけ、主なＴｈ１およびＣＴＬ応答を生じ
させる蛋白質を同定する）には、限定するものではないが、Current  Protocols  in  Im
munology,  Ed  by  J.  E.  Coligan,  A.  M.  Kruisbeek,  D.  H.  Margulies,  E.
M.  Shevach,  W.  Strober,  Pub.  Greene  Publishing  Associates  and  Wiley-I
nterscience（Chapter  3,  In  Vitro  assays  for  Mouse  Lymphocyte  Function  3
.1-3.  19;  Chapter  7,  Immunologic  studies  in  Humans）；Takaiら、J.  Immuno
l.  137：  3494-3500,1986；Takaiら、J.  Immunol.  140：  508-512,1988；Bertagnol
liら、J.  Immunol.  149：  3778-3783,  1992に記載のものが含まれる。
【０２３０】
樹状細胞依存的アッセイ（とりわけ、天然のＴ細胞を活性化する樹状細胞により発現さ
れる蛋白質を同定する）には、限定するものではないが、Gueryら、J.  Immunol.  134：
536-544,1995；Inabaら、Journal  of  Experimental  Medicine  173：  549-559,199
1；Macatoniaら、Journal  of  Immunology  154：  5071-5079,  1995；Porgadorら、Jo
urnal  of  Experimental  Medicine  182：  255-260,  1995；Nairら、Journal  of  V
irology  67：  4062-4069,1993；Huangら、Science  264：  961-965,1994；Macatonia
ら、Journal  of  Experimental  Medicine  169：  1255-1264,  1989；Bhardwajら、Jo
urnal  of  Clinical  Investigation  94：797-807,  1994；およびInabaら、Journal  
of  Experimental  Medicine  172：  631-640,1990に記載のものが含まれる。
【０２３１】
リンパ球生存／アポトーシスについてのアッセイ（とりわけ、強い導入後のアポトーシ
スを予防する蛋白質およびリンパ球ホメオスタシスを調節する蛋白質を同定する）には、
限定するものではないが、Darzynkiewiczら、Cytometry  13：  795‐808,1992；Gorczyc
aら、Leukemia  7：  659‐670,1993；Gorczycaら、Cancer  Research  53：  1945-1951
,  1993；Itohら、Cell  66：  233-243,  1991；Zacharchuk,  Journal  of  Immunolog
y  145：  4037-4045,  1990；Zamaiら、Cytometry  14：  891-897,  1993；Gorczycaら
、International  Journal  of  Oncology  1：  639-648,1992に記載のものが含まれる
。
【０２３２】
初期段階のＴ細胞コミットメントおよび発生に影響を及ぼす蛋白質についてのアッセイ
は、限定するものではないが、Anticaら、Blood  84：  111-117,  1994；Fineら、Cellu
lar  Immunology  155：  111-122,  1994；Galyら、Blood  85：  2770-2778,  1995；T
okiら、Proc.  Nat.  Acad  Sci.  USA  88：  7548-7551,  1991に記載のものが含まれ
る。
【０２３３】
V ポリペプチド投与および製剤化
NsG33治療のための標的組織は、NsG33に対するその持続した応答性について選択される脳
の領域である。ヒトにおいて、成人まで成長因子に対する応答性を持続するニューロンに
は、コリン作動性前脳基底部ニューロン、内側皮質ニューロン、視床ニューロン、青斑ニ
ューロン、脊髄感覚ニューロン、脊髄運動ニューロン、黒質のニューロン、交感神経ニュ
ーロン、後根神経節、網膜ニューロン、耳ニューロン、小脳ニューロンおよび毛様体神経
節がある。幹細胞、例えば、脳室下帯の幹細胞、ニューロンおよびグリア前駆細胞もまた
、成人まで成長因子に対する応答性を持続する。ミエリン形成オリゴデンドロサイトもま
た、成人まで成長因子に対する応答性を持続する。
【０２３４】
ＮｓＧ３３ポリペプチドは、医薬的に許容されるいずれの様式においても投与すること
ができる。これには、非経口経路、例えば静脈内、血管内、動脈内、皮下、筋肉内、腫瘍
内、腹腔内、血管内、硬膜外内、気管内、鞘内、脳室内、脳内、肺内またはその他の経路
、並びに鼻、眼、直腸または局所による注射が含まれる。蓄積注射または侵食性埋没物な
どの手段による徐放投与もまた、本発明に特に含まれる。経口投与もまた、考えられるが
、胃での消化に対して保護されていることを条件とする。
【０２３５】
本発明にかかるＮｓＧ３３の投与は、以下：
ポンプ（例えば、Annals  of  Pharmacotherapy,  27：912（1993）；Cancer,  41：1270
（1993）；Cancer  Research,  44：1698（1984）を参照のこと、出典明示により本明細
書の一部とされる）、
マイクロカプセル（例えば、米国特許第4,352,883号明細書；第4,353,888号明細書；およ
び第5,084,350号明細書を参照のこと、出典明示により本明細書の一部とされる）、
連続放出高分子埋没物（例えば、米国特許第4,883,666号明細書を参照のこと、出典明示
により本明細書の一部とされる）、
カプセル化細胞（Ｘ章を参照のこと）、
ＣＮＳに対する裸のまたは非カプセル化されていない細胞移植片（例えば、米国特許第5,
082,670号明細書および第5,618,531号明細書を参照のこと、それぞれ出典明示により本明
細書の一部とされる）；
皮下、静脈内、動脈内、筋肉内または他の適切な部位のいずれかへの注射；
吸入法；および
カプセル剤、液剤、錠剤、ピルまたは徐放製剤での経口投与
を含む、いずれかの適切な輸送手段を用いて達成することができる。
【０２３６】
投与は、調合剤の丸薬の周期的注射によってであってよく、または外部（例えば、ＩＶ
バック）もしくは内部（例えば、ＮｓＧ３３産生細胞の生体内分解性埋没物、生体利用人
工臓器、生体適合性カプセル、または埋め込まれたＮｓＧ３３産生細胞のコロニー）にあ
る貯蔵器からの静脈内または腹腔内投与により連続的に行われてもよい。例えば、米国特
許第4,407,957号明細書、第5,798,113号明細書および第5,800,828号明細書（それぞれ出
典明示により本明細書の一部とされる）を参照のこと。肺内の輸送方法および装置は、例
えば、米国特許第5,654,007号明細書、第5,780,014号明細書および第5,814,607号明細書
に記載されており、それぞれは出典明示により本明細書の一部とされる。
【０２３７】
全身輸送から離れて、ＣＮＳまたは血液脳関門もしくは血液網膜関門を越えた直接的な
輸送もまた考えられる。
【０２３８】
局所輸送は、１つまたはそれ以上の動脈、例えば、眼に対する眼動脈、ＣＮＳに対する
大脳動脈に対してカテーテルを介した輸送手段があり得る。ＣＮＳへの蛋白質製剤の局所
ポンプに基づく輸送は、米国特許第6,042,579号明細書（Medtronic）に記載されている。
局所輸送の他の形式は、カプセル化細胞を用いた輸送が含まれる（Ｘ章を参照のこと）。
局所輸送の更なる形式には、一般的に注射される、遺伝子治療ベクターの局所輸送が含ま
れる。
【０２３９】
眼疾患の処置について、輸送は、全身性、または局所、例えば眼動脈を介した輸送であ
ってよい。別の実施形式において、輸送は、カプセル化細胞治療（Encapsulated  Cell  
Therapy）を介するものであり、そのカプセル化細胞は硝子体内に埋め込まれている。蛋
白質製剤または遺伝子治療ベクターの輸送は、網膜下注射、硝子体内注射または経強膜注
射を用いて行うことができる。
【０２４０】
パーキンソン病の処置について、種々の輸送経路を用いることができる。蛋白質製剤は
、脳室内または柔組織内、好ましくは線条体および／または黒質、より好ましくは被殻内
にポンプを用いて投与することができる。しかしながら、より好ましい輸送方法は、カプ
セル化細胞治療を含み、そのカプセルは脳室内、柔組織内、好ましくは線条体および／ま
たは黒質中に、およびより好ましくは被殻中に埋め込まれる。パーキンソン病の処置に関
する１つの実施形態において、遺伝子治療ベクターは脳の線条体に投与される。線条体へ
の注射は、脳の種々の遠位領域、例えば、淡蒼球、小脳扁桃、視床下核または黒質に配置
されている標的部位を標識化することができる。淡蒼球中の細胞の形質導入は、一般に視
床細胞の逆行性標識を引き起こす。好ましい実施形態において、標的部位（群）（その一
部）は黒質である。
【０２４１】
ＨＤを処置するための実施形態において、線条体、好ましくは尾状核を変性から保護し
、尾状ニューロンと皮質インプットニューロンの両方を保護するために、ＮｓＧ３３は線
条体、好ましくは尾状核に適用される。好ましい実施形態において、適用は、主要な変性
の変化の発症前に施すべきである。この処置には、家族歴および血液のＤＮＡ分析を通じ
た疾患の遺伝的診断に続いて、ＮｓＧ３３の局所適用が含まれる。これは、医薬的に許容
される注射ポンプおよびカテーテル、例えばメドロニック・シンクロトロン・ポンプ（Me
dtronic  Synchrotron  pum）を用いた蛋白質のポンピングを介して、線条体にＮｓＧ３
３を輸送することによって達成されよう。第２の方策において、ウイルスまたは非ウイル
スベクターを用いた直接的遺伝子治療は、ＮｓＧ３３を分泌する線条体または他の影響を
受けたニューロン中の宿主細胞を改変するために利用することができる。第３の方策にお
いて、ＮｓＧ３３を産生し、分泌するように遺伝的に改変された裸の又はカプセル化細胞
は、血液脳関門を越えて、および疾患領域、好ましくは線条体、さらにより好ましくは尾
状核内にＮｓＧ３３を輸送するために局所的に適用されることができる。
【０２４２】
ＡＬＳにおいて、上流および下流の運動ニューロン変性の両方が、最も一般的には呼吸
器の合併症を通じ、結果として死につながる進行性の麻痺を引き起こす。ＡＬＳを処置す
るために、ＮｓＧ３３を、脊髄を含むＣＮＳにＮｓＧ３３の注射を通じて腰椎の鞘内空間
に輸送し、それにより脊髄および脳を浸す脳脊髄液（ＣＳＦ）と混合する。その輸送は、
ポンプおよびカテーテル、例えば、メドロニック・シンクロトロン・ポンプの移植を通じ
て、または腰椎の鞘内空間中に埋め込まれるカプセル化細胞装置の使用を通じて、実施さ
れることができる。直接の遺伝子治療は、ＤＮＡ運搬ベクターをＣＳＦ中に注射し、それ
によりＣＳＦ空間に沿って細胞に遺伝子を導入することによっても用いられ得る。加えて
、遺伝子導入ベクターは、頚部または腰椎脊髄または大脳内に注射し、それにより運動麻
痺および呼吸機能に関係する大部分の運動ニューロンを含む解剖学領域にＮｓＧ３３を分
泌させることができる。これらの注射は、外科的航法の下で行い、比較的安全に実施する
ことができる。
【０２４３】
神経変性疾患、例えば、ＡＤを患っている被験者において、神経成長因子（ＮＧＦ）受
容体を有するＣｈ４領域（マイネルト基底核）中のニューロンは、正常な対照と比較して
顕著な萎縮を受けている（例えば、Kobayashi,  et  al.,  Mol.  Chem.  Neuropathol.,
15：  193-206（1991）を参照のこと）
【０２４４】
正常な被験者において、ニューロトロフィンは、発生時の交感神経および感覚ニューロ
ンの死を予防し、成体ラットおよび霊長類におけるコリン作動性のニューロン変性を予防
する（Tuszynskiら、Gene  Therapy,  3  ：  305314（1996））。前脳基底部のこの領域
の機能性ニューロンの結果的な喪失は、神経変性状態、例えばＡＤに罹患している被験者
において経験される認知衰退と原因として結びつくと考えられている（Tuszynskiら（前
掲）およびLehericyら、J.  Comp.  Neurol.,  330：  15-31（1993））。
【０２４５】
一般に、ＡＤは、脳室内または柔組織内に輸送されるＮｓＧ３３蛋白質製剤を用いて処
置されることができると、考えられる。実質内領域内において、輸送は、前脳基底部にお
よび海馬にであることが好ましい。
【０２４６】
遺伝子治療ベクター、カプセル化または裸のＮｓＧ３３分泌細胞もまた、前脳基底部ま
たは海馬に投与することができる。
【０２４７】
脊髄損傷の処置について、蛋白質、遺伝子治療ベクターまたはカプセル化もしくは裸の
ＮｓＧ３３分泌細胞を、ＡＬＳの処置について上記したように損傷部位に鞘内輸送するこ
とができる。
【０２４８】
末梢神経障害の処置について、輸送は、蛋白質製剤、遺伝子治療ベクター、またはカプ
セル化もしくは裸のＮｓＧ３３分泌細胞を用いて、全身に（蛋白質製剤を用いて）、鞘内
、あるいは、脊髄に対する逆行性輸送に応じて筋肉内のいずれかである。
【０２４９】
癲癇の処置について、ＮｓＧ３３蛋白質は、癲癇病巣において柔組織内に輸送されるこ
とができる。これは、カプセル化もしくは裸の細胞を用いて、蛋白質製剤を用いて行うこ
とができ、カテーテルもしくはポンプを用いて、その部位に輸送される遺伝子治療ベクタ
ーを投与することができる。
【０２５０】
脳卒中または外傷の処置について、輸送は鞘内、脳室内、好ましくはレシオナー内（intr
alessionar）である。
【０２５１】
用語「医薬的に許容される担体」は、その適用を容易にするためにＮｓＧ３３ポリペプ
チドは組み合わされた、１つまたはそれ以上の有機または有機成分で、天然もしくは合成
物を意味する。適切な担体には、滅菌塩類液が含まれるが、医薬的に許容されることが知
られている水性および非水性等張滅菌溶液および滅菌懸濁液が当業者には既知である。「
有効量」は、疾患、変性またはダメージ状態の進行を改善もしくは遅延させることができ
る量を意味する。有効量は、個人基準に応じて決定されることができ、ある程度、処置さ
れる症状および要求される結果の考慮に基づくであろう。有効量は、前記要因を行い、慣
例の実験を用いる当業者により決定されることができる。
【０２５２】
リポソーム系は、種々の単層小胞、多重膜小胞または適切な多数膜（plurilamellar）
小胞のいずれかであってよく、当業者に周知の方法により、例えば、米国特許第5,169,63
7号明細書、第4,762,915号明細書、第5,000,958号明細書または第5,185,154号明細書に従
って、調製および投与されることができる。加えて、リポソームへの結合を増強するため
に、リポ蛋白質として、本発明の新規ポリペプチド並びに他の選択されたポリペプチドを
発現することが望ましいことがある。組換えＮｓＧ３３蛋白質は、例えば、ＣＨＯ細胞か
ら免疫親和クロマトグラフィーまたはいずれかの他の慣例の方法により精製され、次いで
、リポソームと混合され、細胞に高親和性のもと組み込まれる。リポソームカプセル化蛋
白質は、細胞成長を刺激するいずれかの効果を試験管内で試験することができる。
【０２５３】
本発明のＮｓＧ３３ポリペプチドのいずれも、医薬的に許容される塩の形式で用いるこ
とができる。ＮｓＧ３３ポリペプチドを用いて塩を形成することができる適切な酸および
塩基は当業者には周知であり、無機および有機酸および塩基が含まれる。
【０２５４】
活性成分に加えて、医薬組成物は、適切な成分を含んでいてもよい。製剤化および投与
についての技術に関する更なる詳細は、最新版のRemington's  Pharmaceutical  Science
s（Maack  Publishing  Co.,  Easton,  PA）において見出すことができる。
【０２５５】
全身投与についての種々の投薬レジュメが考えられる。１つの実施形態において、Ｎｓ
Ｇ３３を含む製剤を被検体に投与する方法には、投薬あたり１μｇ／ｋｇ（被検体の体重
）〜３０，０００μｇ／ｋｇの間の投薬量でＮｓＧ３３を投与することが含まれる。別の
実施形態において、投薬量は、投薬あたり１０μｇ／ｋｇ（被検体の体重）〜３０，００
０μｇ／ｋｇの間である。更なる実施形態において、投薬量は、投薬あたり１０μｇ／ｋ
ｇ（被検体の体重）〜１０，０００μｇ／ｋｇの間である。別の実施形態において、投薬
量は、投薬あたり２５μｇ／ｋｇ（被検体の体重）〜１０，０００μｇ／ｋｇの間である
。より別の実施形態において、投薬量は、投薬あたり２５μｇ／ｋｇ（被検体の体重）〜
３，０００μｇ／ｋｇの間である。最も好ましい実施形態において、投薬量は、投薬あた
り５０μｇ／ｋｇ（被検体の体重）〜３，０００μｇ／ｋｇの間である。
【０２５６】
特定の投薬量および輸送方法についての指導は、文献において提供され、例えば米国特
許第4,657,760号明細書；第5,206,344号明細書；または第5,225,212号明細書を参照のこ
と。異なる処置化合物および異なる障害について別の製剤が有効であることが、例えば、
さらに１つの臓器または組織を標的とする投与は、別の臓器または組織についての様式と
異なる様式での輸送が必要であり得ることが、考えられる。
【０２５７】
ＮｓＧ３３ポリペプチドの投与を必要とするいずれかの疾患または障害の処置に適切な
徐放特徴を有する製剤での、ＮｓＧ３３ポリペプチドの徐放投与が望ましい場合、ＮｓＧ
３３ポリペプチドのマイクロカプセル化が考えられる。徐放のための組換え蛋白質のマイ
クロカプセル化は、ヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）、インターフェロン−（ｒｈＩＦＮ）
、インターロイキン−２、およびＭＮｒｇｐ１２０を用いて首尾よく実施された（Johnso
nら、Nat.  Med.,  2：795-799（1996）；Yasuda,  Biomed.  Ther.,  27：1221-1223（1
993）；Horaら、Bio/Technology,  8：755-758（1990）；Cleland,  "Design  and  Prod
uction  of  Single  Immunization  Vaccines  Using  Polylactide  Polyglycolide  M
icrosphere  Systems,"  in  Vaccine  Design：  The  Subunit  and  Adjuvant  Appro
ach,  Powell  and  Newman,  eds,（Plenum  Press：  New  York,  1995）,  pp.  439
-462;  国際公開第97/03692号パンフレット、国際公開第96/40072号パンフレット、国際
公開第96/07399号パンフレット；および米国特許第5,654,010号明細書）。
【０２５８】
これらの蛋白質の徐放製剤は、その生体適合性および幅広い成体分解特性のため、ポリ
−乳酸−コグリコール酸（ＰＬＧＡ）を用いて開発された。ＰＬＧＡの分解産物、乳酸お
よびグリコール酸は、ヒトの体内で素早く排除される。さらに、このポリマーの分解性は
、その分子量および組成に応じて、月から年の間で調整することができる。Lewis,  "Con
trolled  release  of  bioactive  agents  from  lactide/glycolide  polymer,"  in
：  M.  Chasin  and  R.  Langer（Eds.）,  Biodegradable  Polymers  as  Drug  Del
ivery  Systems（Marcel  Dekker：  New  York,  1990）,  pp.  1-41。
【０２５９】
投与される用量は、年齢、体重および処置される個人の状態、並びに、投与経路、投薬
形式およびレジュメ、および所望される結果に対して慎重に調整され、正確な投薬量は医
師により決定されるべきである。
【０２６０】
ＶＩ  遺伝子治療のための医薬調製
本発明の遺伝子治療使用のためにＮｓＧ３３組成物を形成するために、ＮｓＧ３３コー
ド発現ウイルスベクターは、医薬的に許容される懸濁液、溶液または乳濁液中に含ませる
ことができる。適切な媒体には、塩類液およびリポソーム調製物が含まれる。
【０２６１】
より具体的には、医薬的に許容される担体は、滅菌水性の非水性溶液、懸濁液および乳
濁液が含まれよう。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール、植物油、例えばオリーブ油、および注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸
エチルがある。水性担体には、塩類液および緩衝媒体を含む、水、アルコール／水性溶液
、乳濁液または懸濁液が含まれる。非経口賦形剤には、塩化ナトリウム溶液、リンガーデ
キストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンガーまたは固定油が含
まれる。
【０２６２】
静脈内賦形剤には、流動性および栄養補液、電解質補充液（例えば、リンガーデキスト
ロースに基づくもの）、およびその類似物が含まれる。
【０２６３】
保存剤および他の添加剤、例えば抗菌薬、抗酸化剤、キレート化剤および不活性ガスお
よびその類似物もまた存在させることができる。さらに、ＮｓＧ３３トランス遺伝子は、
当分野で周知の手段を用いて凍結乾燥し、後に再構成し本発明に従って使用することがで
きる。
【０２６４】
コロイド分散系もまた、標的化遺伝子輸送に用いることができる。コロイド分散系には
、高分子複合体、ナノカプセル、微小球、ビーズおよび油中水乳濁液、ミセル、混合ミセ
ルおよびリポソームを含む脂質に基づく系が含まれる。リポソームは、試験管内および生
体内における輸送賦形剤として有用な人工膜小胞である。大きな単層小胞（ＬＵＶ）は、
０．２〜４．０μｍの大きさの範囲で、巨大分子を含む水性緩衝液の実質的な割合でカプ
セル化することができる。ＲＮＡ、ＤＮＡおよび無傷なウイルスは、水性内部（aqueous
interior）内にカプセル化することができ、生物学的に活性型で細胞に輸送することが
できる（Fraleyら、Trends  Biochem.  Sci.,  6：  77,1981）。哺乳動物細胞に加えて
、リポソームは、植物、酵母および細菌の細胞における適切に作用するコードトランス遺
伝子の輸送のために用いられる。リポソームが効率の良い遺伝子移動賦形剤であるために
、以下の特徴：（１）その生物活性を含むことのない、高効率にＮｓＧ３３をコードする
遺伝子のカプセル化；（２）標的でない細胞と比べて標的細胞に優先的な且つ十分な結合
；（３）高効率での標的細胞の細胞質への小胞の水性内容物の輸送；（４）遺伝子情報の
蓄積および有効な発現（Manninoら、Biotechniques,  6：  682,1988）を有するべきであ
る。
【０２６５】
リポソーム組成物は、通常、ステロイド、特にコレステロールと組み合わされる、リン
脂質、特に、高相転移温度（high-phase-transition-temperature）リン脂質の組成物で
ある。他のリン脂質または他の脂質もまた用いることができる。リポソームの物理的特徴
は、ｐＨ、イオン強度および２価のカチオンの存在に拠る。
【０２６６】
リポソーム産生に有用な脂質の例としては、ホスファチジル化合物、例えば、ホスファ
チジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエ
タノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシドおよびガングリオシドが含まれる。特に
有用なものに、脂質部分が１４個〜１８個の炭素原子、好ましくは１６個〜１８個の炭素
原子を含み、飽和ジアシルホスファチジルグリセロールがある。実例としてのリン脂質に
は、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイ
ルホスファチジルコリンがある。
【０２６７】
リポソームの標的化は、構造学上および機械論的因子に基づいて分類されることができ
る。構造学的分類は、選択性、例えば、臓器特異性、細胞特異性およびオルガネラ特異性
のレベルに基づいている。機械論的標的化は、受動的か又は能動的かによって区別するこ
とができる。受動的標的化は、シヌソイド（sinusoidal）毛細管を含む臓器中の細網内皮
系（ＲＥＳ）の細胞に配置するリポソームの自然の傾向を利用する。
【０２６８】
他方、能動的標的化は、リポソームに特異的なリガンド、例えば、モノクローナル抗体
、糖、糖脂質または蛋白質をカップリングすることによって、あるいは、天然の局在部位
以外の臓器および細胞型に対する能動的標的化のために、リポソームの組成または大きさ
を変更することによって、リポソームを改変することを含む。
【０２６９】
標的化遺伝子送達系の表面は、種々の様式で修飾することができる。リポソーム標的化
輸送系の場合には、脂質基は、リポロームの２重層と適切に関連して標的リガンドを維持
するために、リポソームの脂質２重層内に組み込まれてもよい。種々の連結基は、標的リ
ガンドに対して脂質鎖を連結するために用いることができる。
【０２７０】
輸送系のさらなる例として、本発明に記載のように、ベクター粒子を産生することがで
きるカプセル化細胞組成物の治療領域への移植が挙げられる。そのような細胞のカプセル
化および移植についての方法は、当分野で既知であり、特に国際公開第97/44065号パンフ
レット(Cytotherapeutics)にて知られている。レチンウイルス粒子を産生することができ
るパッケージング細胞系を選択することによって、治療領域における非-分裂細胞の形質
導入が得られる。単一の分裂細胞を形質導入することができるレトロウイルス粒子を用い
ることによって、形質導入は、治療領域における新生の(デノボ)分化細胞に制限される。
【０２７１】
ＶＩＩ  遺伝子治療についての用量必要量および輸送プロトコル
重要なパラメータは、標的組織に輸送されるＮｓＧ３３遺伝子治療ベクターの投与量で
ある。ウイルスベクターについて、その濃度は形質導入単位／ｍｌの数字によって決めら
れるであろう。ウイルス発現ベクターを用いた輸送について、最適には、各単位投薬は２
．５〜２５μＬの組成物を含み、その組成物は、医薬的に許容される流体中にウイルス発
現ベクターを含み、１０８から１０１０までのＮｓＧ３３形質導入単位／ｍｌを提供する
。
【０２７２】
重要なことは、特異的な新生の遺伝子輸送部位が、神経細胞、グリア細胞、網膜細胞、
感覚細胞、または幹細胞の喪失、ダメージまたは機能不全領域に集まるように選択される
ことである。そのような領域は、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）および生検を含む多くの既知技
術を用いて、臨床的に同定することができる。ヒトにおいて、非侵襲、生体内、画像化技
術、例えばＭＲＩが好ましいであろう。ひとたび、ニューロン喪失の領域が同定されると
、輸送部位は、定位分布で、ＮｓＧ３３の各ユニット投薬が、標的細胞に、またはそこか
ら５００μｍ以内で、他の輸送部位から１０ｍｍを超えないで、脳中に輸送されるよう選
択される。
【０２７３】
所定の標的部位内において、ベクター系は標的細胞を形質導入することができる。標的
細胞は、神経組織にて見出される細胞であってよく、例えば、ニューロン、星状細胞、オ
リゴデンドロサイト、小膠細胞、幹細胞、神経前駆細胞または小膠細胞であってよい。
【０２７４】
ベクター系は、好ましくは直接注射により投与される。脳中への注射方法は当分野で周
知である（Bilang-Bleuelら、（1997）Proc.  Acad.  Nati.  Sci.  USA  94：8818-8823
；Choi-Lundbergら、（1998）Exp.  Neurol.154：261-275；Choi-Lundbergら、（1997）S
cience  275：838-841；およびMandelら、（1997））Proc.  Acad.  Natl.  Sci.  USA  
94：14083-14088）。定位注射が施され得る。
【０２７５】
上記のように、組織、例えば脳での形質導入については、微少量を用いることが必要で
あるため、ウイルス調製は超遠心分離により濃縮される。得られた調製物は、少なくとも
１０８ｔ．ｕ．／ｍｌ、好ましくは１０８〜１０１０ｔ．ｕ．／ｍｌ、より好ましくは少
なくとも１０９ｔ．ｕ．／ｍｌ．有すべきである（このタイターは、実施例６に記載のよ
うに形質導入単位／ｍｌ（ｔ．ｕ．／ｍｌ）で表される）。トランス遺伝子発現の改善さ
れた分散は、注射部位の数を増加させ、注射頻度を減少させることによって、得ることが
できる（HorellouおよびMallet（1997）前掲）。通常、１から１０の間の注射部位が用い
られ、より一般的には２から６である。１−５×１０９ｔ．ｕ．／ｍｌを含む用量につい
て、注射頻度は、一般的に０．１から１０μｌ／分であり、一般には約１μｌ／分である
。
【０２７６】
ウイルス組成物は、顕微注射、注入、スクラップローディング、電気穿孔または外科的
切開を通じて輸送部位組織に直に組成物を直接輸送するのに適切な他の方法により、標的
組織のそれぞれの輸送細胞部位に輸送される。この輸送は、ゆっくり、例えば約５〜１０
分の時間をかけて実施される（輸送されるべきウイルス組成物の量に拠る）。
【０２７７】
ＶＩＩＩ  ウイルスベクター
おおまかには、遺伝子治療は、新しい遺伝的物質を患者の細胞に移入し、患者に治療上
の利益を与えようとするものである。そのような利益には、広範囲の疾患、障害および他
の状態の処置または予防が含まれる。
【０２７８】
生体外遺伝子治療アプローチは、単離された細胞（限定されるものではないが、幹細胞
、神経およびグリア前駆細胞、および胎児幹細胞が含まれる）の修飾に関し、それを後に
患者に注入、移植または別の方法で埋め込むことに関する。例えば、米国特許第4,868,11
6号明細書、第5,399,346号明細書および第5,460,959号明細書を参照のこと。生体内遺伝
子治療は、宿主患者組織を生体内で直接標的化するものである。
【０２７９】
遺伝子導入ベクターとして有用なウイルスは、パポーバウィルス、アデノウイルス、バ
キュロウイルス、アデノ随伴ウイルス、肝炎ウイルスおよびレトロウイルスが含まれる。
適切なレトロウイルスは、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＥＩＡＶ、ＭｏＭＬＶよりなる群を
含む。さらに適切なレトロウイルスの群は、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＥＡＩＶ、ＣＩＶ
よりなる群を含む。好ましいウイルスベクターの別の群は、アルファウイルス、アデノウ
イルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルス、ＨＳＶ、コロナウイルス、ウシパピロ
ーマウイルス、Ｍｏ−ＭＬＶよりなる群を含み、アデノ随伴ウイルスが好ましい。
【０２８０】
神経系の障害の処置に好ましいウイルスは、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルス
である。両方のウイルス型は、細胞分裂時以外のゲノムに集積することができ、両方の型
は、神経系、特に中枢神経系の指標について臨床前動物実験で試験されている。
【０２８１】
ＡＡＶの調製方法は、当分野で記載されており、例えば、米国特許第5,677,158号明細
書、米国特許第6,309,634号明細書および米国特許第6,683,058号明細書には中枢神経系に
対するＡＡＶの輸送の例が記載されている。
【０２８２】
好ましくは、レンチウイルスベクターは、複製欠損レンチウイルス粒子である。そのよ
うなレンチウイルス粒子は、5'レンチウイルスLTR、tRNA結合部位、パッケージングシグ
ナル、融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドシグナルと操作可能に連結されたプロモ
ーター、第2のDNA鎖合成の複製起点および3'レンチウイルスLTRを含むレンチウイルスベ
クターから調製することができる。レンチウイルスの調製方法および神経細胞への生体内
投与方法は、米国特許第20020037281号明細書(レンチウイルスベクターを用いて神経細胞
を形質導入する方法)に記載されている。
【０２８３】
レトロウイルスベクターは、それらが７〜８ｋｂを運搬するため、およびそれらが高効
率に宿主細胞中に安定に組み込まれる遺伝物質を有しているため、ヒトの臨床試験に最も
一般に使用されるベクターである。例えば、国際公開第5/30761号パンフレット、国際公
開第95/24929号パンフレットを参照のこと。オンコウイルスは、患者への外来核酸配列の
組み込みのために、少なくとも１回の標的細胞の増殖を必要とする。レトロウイルスベク
ターは、患者のゲノム中に無作為に組み込まれる。レトロウイルスは、極めて少ない細胞
分裂が神経系の他の細胞で行われるため（特にＣＮＳ）、神経系の幹細胞を標的化するの
に用いることができる。
【０２８４】
レトロウイルス粒子の３つのクラスが；効率よくネズミ科の動物の細胞を感染すること
ができる自己指向性、および多くの種の細胞を感染することができる両種性であると記載
されている。この第３のクラスは、そのウイルスを産生した種とは別の種の細胞を感染す
ることができる、異種指向性レトロウイルスを含む。分裂細胞のゲノム中にのみ集積する
能力は、発生研究において細胞系を確立するにあたって、および癌もしくは腫瘍に治療遺
伝子もしくは自殺遺伝子を輸送するにあたって、レトロウイルスを魅力あるものにしてい
る。
【０２８５】
ヒト患者における使用について、レトロウイルスベクターは、複製欠損でなければなら
ない。これは、標的組織中で感染性のレトロウイルス粒子のさらなる発生を防ぎ−代わり
に、複製欠損ベクターは、標的細胞ゲノム中に組み込まれる安定な「捕捉（captive）」
トランス遺伝子となる。一般的に、複製欠損ベクターでは、ｇａｇ、ｅｎｖおよびｐｏｌ
遺伝子が欠失されている（ウイルスゲノムの大部分の休止を伴う）。異種ＤＮＡを欠失さ
れたウイルスゲノムに変えて挿入する。異種遺伝子は、内因性の異種プロモーター、標的
細胞中での他の異種プロモーター活性、またはレトロウイルス５´ＬＴＲ（ウイルスＬＴ
Ｒは多様な組織中で活性がある）の制御下に置かれ得る。一般的に、レトロウイルスベク
ターは、約７〜８ｋｂのトランス遺伝子収容量を有する。
【０２８６】
複製欠損レトロウイルスベクターは、トランス形で、例えば、作成されたパッケージン
グ細胞系からの、複製および会合のために必要なウイルス蛋白質の供給を必要とする。パ
ッケージング細胞は、複製可能ウイルスおよび/またはヘルパーウイルスを放出しないこ
とが重要である。これは、ψシグナルを欠くRNAからウイルス蛋白質を放出すること、お
よびgag/pol遺伝子およびenv遺伝子を分離転写単位から発現することによって達成される
。加えて、ある2世代および3世代レトロウイルスにおいて、5'LTRがそれらの遺伝子の発
現を制御する非ウイルスプロモーターで置換されており、3'プロモーターは近位プロモー
ターのみを含むように最小化されている。これらの設計は、複製可能なベクター、または
ヘルパーウイルスの産生を引き起こす組換えの可能性を最小化する。
【０２８７】
ＩＸ  発現ベクター
本発明の使用のためのＮｓＧ３３ポリペプチドの組換え発現用ベクターの構築は、当業
者であれば詳細な説明を必要としない、慣用技術を用いて行うことができる。しかしなが
ら、概要について、当業者が望むのであれば、Maniatisら、in  Molecular  Cloning：  
A  Laboratory  Manual,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory,（NY  1982）を調べる。
発現ベクターは、医薬的使用のためのＮｓＧ３３ポリペプチドの組換え産生のための生成
細胞を作り出するために、および裸のまたはカプセル化治療のためのＮｓＧ３３ポリペプ
チドを分泌する治療用細胞を作り出すために、用いることができる。
【０２８８】
簡単には、組換え発現ベクターの構築は、一般的なライゲーション技術を用いる。構築
されたベクターの正確な配列を確かめるための分析について、遺伝子を、例えば、Messin
gら、（Nucleic  Acids  Res.,  9：  309-,  1981）の方法、Maxamら、（Methods  in  
Enzymology,  65：  499,  1980）の方法、または当業者であれば知っている適切な方法
を用いて、配列決定する。
【０２８９】
切断された断片のサイズ分離は、例えば、Maniatisら、（Molecular  Cloning,  pp.  
133-134,1982）に記載の慣例のゲル電気泳動を用いて行われる。
【０２９０】
効率的な発現ベクターの作製について、それらは、正しい読み取り枠にあるコード遺伝
子の発現に必要な調節配列を含むべきである。遺伝子の発現は、転写、翻訳または翻訳後
のレベルで制御される。転写開始は、遺伝子発現における初期かつ重要な事象である。そ
れは、プロモーターおよびエンハンサー配列に依存し、それらの配列と相互作用する特異
的な細胞因子により影響を受ける。多くの遺伝子の転写単位は、プロモーター、および場
合によっては、エンハンサーまたは調節エレメントから成る（Banerjiら、Cell  27：  2
99（1981）；Cordenら、Science  209：  1406（1980）；およびBreathnachおよびChambo
n,  Ann.  Rev.  Biochem.  50：  349（1981））。レトロウイルスについて、レトロウ
イルスゲノムの複製に関連する制御エレメントは、末端反復配列（ＬＴＲ）中に存在する
（Weissら著、The  molecular  biology  of  tumor  viruses：  RNA  tumor  viruses,
Cold  Spring  Harbor  Laboratory,（NY  1982））。モロニーマウス白血病ウイルス
（ＭＬＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のＬＴＲは、プロモーターおよびエンハ
ンサー配列を含む（Jollyら、Nucleic  Acids  Res.  11：  1855（1983）；Capecchiら
、In  ：  Enhancer  and  eukaryotic  gene  expression、GulzmanおよびShenk著、pp.
101-102,  Cold  Spring  Harbor  Laboratories（NY  1991））。他の潜在的なプロモ
ーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）および他の野生型ウイルスプロモーターから
誘導されたものを含む。
【０２９１】
多くの非−ウイルスプロモーターのプロモーターおよびエンハンサー領域もまた記載さ
れている（（Schmidtら、Nature  314：  285（1985）；RossiおよびdeCrombrugghe,  Pr
oc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  84：  5590-5594（1987））。静止細胞においてトラン
ス遺伝子の発現を維持および増大させる方法は、コラーゲンＩ型（１および２）（Procko
pおよびKivirikko,  N.  Eng.  J.  Med.  311：  376（1984）；SmithおよびNiles,  Bi
ochem.  19：  1820（1980）；de  Wetら、J.  Biol.  Chem.,  258：  14385（1983））
、ＳＶ４０およびＬＴＲプロモーターを含む。
【０２９２】
本発明の１つの実施形態に関して、プロモーターは、ユビキチンプロモーター、ＣＭＶ
プロモーター、ＪｅＴプロモーター（米国特許第6,555,674号明細書）、ＳＶ４０プロモ
ーター、伸長因子１アルファプロモーター（ＥＦ１−アルファ）、ＲＳＶ、Ｍｏ−ＭＬＶ
−ＬＴＲよりなる群から選択される構成的プロモーターである。誘導性／抑制性プロモー
ターの例としては：Ｔｅｔ−オン、Ｔｅｔ−オフ、ラバマイシン−誘導プロモーター、Ｍ
ｘ１が挙げられる。
【０２９３】
好ましいプロモーターの群には、ＣＭＶ、ヒトＵｂｉＣ、ＪｅＴ、ＲＳＶ、Ｔｅｔ−調
節プロモーター、Ｍｏ−ＭＬＶ−ＬＴＲ、Ｍｘ１およびＥＦ−１アルファが含まれる。
【０２９４】
トランス遺伝子発現を誘導するためのウイルスおよび非ウイルスプロモーターの使用に
加えて、エンハンサー配列もまたトランス遺伝子発現のレベルを増大させるために用いる
ことができる。エンハンサーは、その天然遺伝子だけでなく、複数の外来遺伝子の転写活
性を増大することができる（Armelor,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  70  ：  2702
（1973））。例えば、本発明において、コラーゲンエンハンサー配列を、コラーゲンプロ
モーター２（Ｉ）と共に、トランス遺伝子の発現を増大するために用いることができる。
加えて、ＳＶ４０ウイルスにおいて見出されたエンハンサーエレメントを用いて、トラン
ス遺伝子の発現を増大させることができる。このエンハンサー配列は、Grussら、Proc.  
Natl.  Acad.  Sci.  USA  78：  943（1981）；BenoistおよびChambon,  Nature  290：
304（1981）、およびFrommおよびBerg,  J.  Mol.  Appl.  Genetics,  1  ：  457（1
982）（その全ては出典明示により本明細書の一部とされる）に記載されるように、７２
塩基対の繰り返しから成る。この繰り返し配列は、多くの異なるウイルスの転写、および
同時に存在する場合には、種々のプロモーターと共に細胞遺伝子の転写を増大することが
できる。
【０２９５】
さらに発現増強配列は、限定されるものではないが、ウッドチャック肝炎ウイルスの転
写後調節エレメント、ＷＰＲＥ、ＳＰ１６３、ＣＭＶエンハンサーおよびチキン［ベータ
］−グロビン・インシュレーターまたは他のインシュレーターを含む。
【０２９６】
トランス遺伝子発現もまた、プロモーター活性を改変するサイトカインを用いた長期間
安定な発現を増大させることができる。幾つかのサイトカインが、コラーゲン２（Ｉ）お
よびＬＴＲプロモーターからトランス遺伝子の発現を改変することが報告された（Chuaら
、connective  Tissue  Res.,  25：  161-170（1990）；Eliasら、Annals  N.  Y.  Aca
d.  Sci.,  580  ：  233-244（1990））；Seligerら、J.  Immunol.  141：  2138-2144
（1988）およびSeligerら、J.  Virology  62：  619-621（1988））。例えば、形質転換
生長因子（ＴＧＦ）、インターロイキン（ＩＬ）−Ｉおよびインターフェロン（ＩＬＦ）
は、種々のプロモーター、例えばＬＴＲにより誘導されるトランス遺伝子の発現を下方調
節する。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびＴＧＦ１は、プロモーターにより誘導されるトラ
ンス遺伝子の発現を上方調節し、および制御するために用いることができる。有用性が判
明する可能性のある他のサイトカインには、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）およ
び上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）が含まれる。
【０２９７】
コラーゲンエンハンサー配列（Ｃｏｌｌ（Ｅ））を有するコラーゲンプロモーターもま
た、免疫保護された状態にも関わらず、処置された脳において生じ得るベクターに対する
何らかの免疫応答をさらに抑制することによって、トランス遺伝子の発現を増大するため
に用いれることができる。加えて、ステロイドを含む抗炎症剤、例えばデキサメタゾンは
、ベクター組成物輸送直後に処置された宿主に投与することができ、好ましくは、サイト
カイン媒介性の炎症反応が治まるまで続ける。免疫抑制剤、例えば、シクロスポリンもま
た、インターフェロンの産生を減少させ、ＬＴＲプロモーターおよびＣｏｌｌ（Ｅ）プロ
モーター−エンハンサーを下方調節し、トランス遺伝子の発現を減少させるために投与す
ることができる。
【０２９８】
ベクターは、Ｃｒｅ−リコンビナーゼ蛋白質およびＬｏｘＰ配列をコードする配列など
の配列をさらに含んでいてもよい。ＮｓＧ３３の一過性発現を保証する更なる方法として
、Ｃｒｅ−リコンビナーゼを細胞に投与すること（Daewoongら、Nature  Biotechnology
19：929-933）またはウイルス構築物中に該リコンビナーゼをコードする遺伝子を組み
込むこと（Pluck,  Int  J  Exp  Path,  77：269-278）のいずれかにより、挿入された
ＤＮＡ配列の一部を切除することとなる、Ｃｒｅ−ＬｏｘＰ系の使用も考えられる。Ｌｏ
ｘＰ部位と構造遺伝子（存在する場合にはＮｓＧ３３）を含むウイルス構築物に該リコン
ビナーゼの遺伝子を組み込むことで、しばしば、構造遺伝子がおよそ５日間の期間発現す
ることとなる。
【０２９９】
X 生体適合性カプセル
カプセル化細胞治療は、受容者の宿主免疫系から細胞を単離し、宿主内に埋め込む前に
、その細胞を半透膜の生体適合性材料で取り囲むという概念に基づいている。本発明は、
NsG33を発現し分泌することができる細胞を免疫遮断的(immunoisolatory)カプセル中に封
入した装置を含む。「免疫遮断的カプセル」は、受容者宿主に移植するにあたり、そのカ
プセルが、該装置の中心部にある細胞に対する宿主の免疫系の有害な作用を最小にするこ
とを意味する。細胞は、微細孔膜により形成された移植可能な重合カプセル内にそれらを
囲むことによって宿主から免疫遮断される。このアプローチは、宿主と移植された組織と
の細胞-細胞の接触を妨げ、直接の提示を通じた抗原認識を排除する。用いられる膜はま
た、分子、例えば抗体および成分の核酸を制御するために、その分子量に基づいて、作る
こともできる(Lysaghtら、56 J. Cell Biochem. 196(1996), Colton, 14 Trends Biotech
nol. 158(1996))。カプセル化技術を用いて、免疫抑制剤の使用を行うか若しくは行わず
に、細胞を免疫拒絶を起こすことなく宿主内に移植することができる。有用な生体適合性
ポリマーカプセルは、液体培地中に懸濁されるか、または固定化マトリクスに固定された
細胞、および単離された細胞を含まない、生体適合性である、そして中心にある細胞を有
害な免疫攻撃から保護するのに十分な、周囲もしくは周辺領域の選択透過性マトリクスま
たは膜(「ジャケット(jacket)」)を含む、中心部を通常有する。カプセル化は、免疫系の
エレメントが、カプセル内に進入することを妨げ、それにより、カプセル化細胞を免疫破
壊から保護する。カプセル膜の半透膜の性質は、興味ある生物活性分子が、カプセルから
周辺の宿主組織中に容易に分散することも可能にする。
【０３００】
カプセルは、生体適合性材料から作製され得る。「生体適合性材料」は、宿主への移植
後に、カプセルの拒絶となるのに十分な有害な宿主の応答を顕在化させない、または例え
ば分解を通じてそれを実施させない物質をである。生体適合性材料は、大きな分子、例え
ば、宿主免疫系の成分に対しては比較的不透性であるが、小さい分子、例えばインスリン
、成長因子、例えば、NsG33ポリペプチドおよび栄養は透過性であり、代謝廃物の除去を
可能にする。種々の生体適合性材料は、本発明の組成物による成長因子の輸送に適切であ
る。種々の外部表面形態および他の機械的なおよび構造的特徴を有する、多くの生体適合
性材料が知られている。好ましくは、本発明のカプセルは、国際公開第92/19195号パンフ
レットまたは国際公開第95/05452号パンフレット(出典明示により一部とされる);または
米国特許第5,639,275号明細書;第5,653,975号明細書;第4,892,538号明細書;第5,156,844
号明細書:第5,283,187号明細書;または米国特許第5,550,050号明細書(出典明示により一
部とされる)に記載されるものよりも小さいであろう。そのようなカプセルは、代謝、栄
養および治療物質の通過を可能にする一方で、宿主免疫系の有害な効果を最小限にする。
生体適合性材料の構成要素は、周囲の半透膜および内部の細胞支持用の足場を含む。好ま
しくは、遺伝的に改変された細胞は、その足場上に撒かれ、半透膜によりカプセル化され
る。繊維状細胞支持用の足場は、アクリル、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレ
ン、ポリアセトニトリル、ポリエチレン、テレフタレート、ナイロン、ポリアミド、ポリ
ウレタン、ポリブトエステル(polybutester)、シルク、コットン、キチン、カーボンまた
は生体適合性金属よりなる群から選択される、いずれかの生体適合性材料から作製される
ことができる(米国特許第5,512,600号明細書、出典明示により一部とされる)。生分解性
ポリマーは、ポリ(乳酸)PLA、ポリ(乳酸-コグリコール酸)PLGA、およびポリ(グリコール
酸)PGAおよびその同等物からなるものを含む。気泡性の足場は、移植された細胞が付着し
得る表面を提供するために用いられる(国際公開第98/05304号、出典明示により一部とさ
れる)。織り込まれた網目チューブは血管移植片として用いられる(国際公開第99/52573号
、出典明示により一部とされる)。加えて、その中心部は、細胞の位置を安定化する、ヒ
ドロゲルから形成された固定化マトリクスから構成されていてよい。ヒドロゲルは、ゲル
の形態で、実質的に水を含む、橋かけ構造の親水性ポリマーの3次元網状組織である。
【０３０１】
ポリアクリレート（アクリル共重合体）、ポリビニルデン、ポリ塩化ビニル共重合体、
ポリウレタン、ポリスチレン、ポリアミド、酢酸セルロース、硝酸セルロース、ポリスル
ホン（ポリエーテルスルホンを含む）、ポリホスファゼン、ポリアクリルニトリル、ポリ
（アクリルニトリル／塩化コビニル（covinyl  chloride））、並びにそれらの誘導体、
共重合体および混合物を含む、種々のポリマーおよびポリマー混成物を用いて、周囲の半
透膜を製造することができる。好ましくは、周囲の半透膜は、生体適合性中空繊維膜であ
る。そのような膜およびその作製方法は、米国特許第5,284,761号明細書および第5,158,8
81号明細書に記載されており、出典明示により一部とされる。周囲の半透膜は、ポリエー
テルスルホン中空繊維から形成され、例えば米国特許第4,976,859号明細書または米国特
許第4,968,733号明細書に記載されており、出典明示により一部とされる。代替の周囲の
半透膜物質は、ポリ（アクリルニトリル／塩化コビニル）である。
【０３０２】
カプセルは、例えば、円筒形、方形、円盤型、パッチ型、卵形、星形または球形を含む
、生物活性を維持するのに適し、かつ産物または機能輸送のための通過を提供するのに適
したいずれかの形態であり得る。さらに、カプセルは、網目様または入れ子構造中に渦巻
状に撒くこと又は巻き付けられることができる。カプセルを移植後に取り戻す場合、移植
部位からカプセルを移動させる傾向にある形状、例えば受容者宿主の血管中に入るのに十
分に小さい球形のカプセルは、好ましくない。特定の形、例えば、方形、パッチ、円形、
円筒、および平板は、重要な構造保全性を提供し、取り戻しが望まれる場合に好ましい。
【０３０３】
マイクロカプセルが用いられる場合、各々の装置中に１０３〜１０８の間の細胞をカプ
セル化することが好ましく、１０５〜１０７の細胞をカプセル化することがより好ましい
。投薬は、カプセルの数をより少なく又はより多く移植することにより制御することがで
き、患者あたり１〜１０個のカプセルが好ましい。
【０３０４】
足場は、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）分子で被覆されることができる。適切な細胞外マ
トリクス分子の例としては、例えば、コラーゲン、ラミニンおよびフィブロネクチンが挙
げられる。足場の表面はまた、細胞接着を増強するための電荷を与えるためにプラズマ照
射で処理することにより修飾することもできる。
【０３０５】
高分子接着剤の使用または圧縮、編み込み及び熱密封を含み、カプセルを密封する任意
の適切な方法を用いることができる。加えて、例えば米国特許第5,653,687号明細書（出
典明示により一部とされる）中に記載されるようにいずれかの適切な「乾燥」密封方法も
また用いることができる。
【０３０６】
カプセル化細胞装置は、既知技術に従って移植される。多くの移植部位が、本発明の装
置および方法について考えられる。これらの移植部位には、限定されるものではないが、
脳、脊髄を含む中枢神経系（米国特許第5,106,627号明細書、第5,156,844号明細書および
第5,554,148号明細書を参照のこと、出典明示により一部とされる）、および眼の房水お
よび硝子体液（国際公開第97/34586号パンフレットを参照のこと、出典明示により一部と
される）が含まれる。
【０３０７】
ＣＮＳへのカプセルの移植のための方法および装置は、米国特許第5,487,739号明細書
に記載されている。眼中へのカプセルの移植のための方法および装置は、米国特許第5,90
4,144号明細書、米国特許第6,299,895号明細書、米国特許第6,439,427号明細書および米
国特許第20030031700号明細書に記載されている。
【０３０８】
1つの態様において、本発明は:標的細胞の感染のための、本発明に係るベクターである
ウイルスベクターを分泌する生存パッケージング細胞を含む、中心部;および、その中心
部を囲む外部ジャケット、ここで、そのジャケットは、このカプセルから直径およそ100n
mのレトロウイルスベクターの放出を可能にするため、該ベクターのそれを横切った通過
を可能にするために選択された多孔度を有する透過性の生体適合性材料を含む、を含む生
体適合性カプセルに関する。
【０３０９】
好ましくは、中心部は、マトリクス、そのマトリクスに固定されたパッケージング細胞
をさらに含む。1つの実施形態に関して、ジャケットは、ヒドロゲルまたは熱可塑性物質
を含む。
【０３１０】
パッケージング細胞系について適切な細胞の例としては、HEK293、NIH3T3、PG13および
ARPE-19細胞が含まれる。好ましい細胞には、PG13および3T3細胞が含まれる。
【０３１１】
パッケージング細胞系は、米国特許第6,027,721号明細書および国際公開第97/01357号
パンフレットに記載の方法および成分を用いてカプセル化すること、および投与すること
ができ、それらの内容は出典明示により本明細書の一部とされる。
【０３１２】
ＸＩ  ＮｓＧ３３産生細胞のための支持マトリクス
本発明は、哺乳動物の神経系への移植の前に、支持マトリクスにて試験管内でＮｓＧ３
３産生細胞を培養することを含む。移植された細胞の長期の生存力を増大し、そして長期
の機能的利益を提供するために、移植前にマイクロキャリアに対する細胞の前接着が設計
される。
【０３１３】
移植される細胞、即ち移植されるＮｓＧ３３分泌細胞の長期の生存力を増加させるため
、移植される細胞を移植前に支持マトリクスに試験管内で固定することができる。支持マ
トリクスに含まれ得る物質は、後の試験管内インキュベーションで細胞が接着し、その上
で細胞が増殖でき、そして、移植された細胞を破壊または生物活性もしくは地上活性を妨
げる中毒反応または炎症反応を引き起こすことなく、哺乳動物の体内に移植することがで
きる、マトリクスを含む。そのような物質は、合成または天然の化学物質、または生体起
源の物質であってよい。
【０３１４】
マトリクス物質には、限定されるものではないが、ガラスまたは他の酸化シリコン、ポ
リスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリピニリデン、フッ化物、ポリウレタン
、ポリアルギン酸塩、ポリスルホン、ポリビニルアルコール、アクリルニトリル重合体、
ポリアクリルアミド、ポリカルボネート、ポリペンテン（polypentent）、ナイロン、ア
ミラーゼ、天然および改変ゼラチン、および天然および改変コラーゲン、デキストランお
よびセルロース（例えば、ニトロセルロース）を含む天然および改変多糖、寒天および磁
鉄鉱（magnetite）が含まれる。吸収または非吸収物質のいずれかを用いることができる
。また、当分野で周知の細胞外マトリクス物質も意図する。細胞外マトリクス物質は、商
業的に入手でき、および、そのようなマトリクスを分泌する細胞を増殖させ、その分泌細
胞を取り除き、そして移植される細胞を、該マトリクスと相互作用させ接着させることに
よって調製することができる。移植されるべき細胞が増殖する、または細胞が混合される
マトリクス物質は、ＲＰＥ細胞に特有の産物であってよい。従って、例えば、マトリクス
物質は、移植されるＲＰＥ細胞によって産生され、分泌される、細胞外マトリクスまたは
基底膜物質であってよい。
【０３１５】
細胞接着、生存および機能を向上させるため、固体マトリクスは、その外部表面が細胞
接着、増殖または生存を促進することが当分野で知られている因子で被覆されていること
があってよい。そのような因子は、細胞接着分子、細胞外マトリクス、例えば、フィブロ
ネクチン、ラミニン、コラーゲン、エラスチン、グリコサミノグリカンまたはプロテオグ
リカン、または成長因子を含む。
【０３１６】
別には、移植される細胞が結合する固体マトリクスが、多孔質物質で構成されており、
そのマトリクス物質中に、生体内への移植後に徐放される、成長または生存促進因子また
は因子群が組み込まれていてもよい。
【０３１７】
本発明に係る支持体に結合されている場合、移植のために用いられる細胞は、一般的に
、その支持体の「外部表面」にある。支持体は、固体または多孔質であってい。しかしな
がら、多孔質支持体においてさえ、細胞は、介在する膜または他の仕切りがなく、外部の
環境に直接接触する状態にある。従って、本発明に関し、細胞は、それらが接着する表面
が、粒子またはビーズそれ自体の外部に存在しない多孔質支持物質の内部折りたたみ若し
くは畳み込みの形態であったとしても、支持体の「外部表面」に存在すると考えられる。
【０３１８】
支持体の形態は、好ましくはビーズにおけるように球形であるが、円筒形、楕円形、平
板、または小板、針もしくは留め針の形状、およびその類似形であってよい。支持物質の
好ましい形状は、ガラスビーズである。他の好ましいビーズは、ポリスチレンビーズであ
る。
【０３１９】
ビーズの大きさは、直径が約１０μｍ〜１ｍｍ、好ましくは約９０μｍ〜約１５０μｍ
の範囲であってよい。種々のマイクロキャリアビーズの記載について、例えば、isher  B
iotech  Source  87-88,  Fisher  Scientific  Co.,  1987,  pp.  72-75；Sigma  Cell
Culture  Catalog,  Sigma  Chemical  Co.,  St,  Louis,  1991,  pp.  162-163；Ve
ntrex  Product  Catalog,  Ventrex  Laboratories,  1989を参照のこと、これらの引例
は出典明示により本明細書の一部とされる。ビーズの大きさの上限は、移植される細胞の
機能を妨げるか、または周辺組織にダメージを与え得る、望ましくない宿主反応のビーズ
刺激によって規定されることができる。
【０３２０】
ＸＩＩ  宿主細胞
１つの態様において、本発明は、本発明に係るベクターを用いて遺伝的に改変された単
離された宿主細胞に関する。
【０３２１】
１つの実施形態に関して、宿主細胞は、原核細胞、例えば、大量に組換え蛋白質を産生
することができ、産業規模まで容易にスケールアップすることができる大腸菌である。原
核生成細胞の使用は、生物学的に活性な蛋白質を得るために、ＮｓＧ３３の再折りたたみ
およびグリコシル化を必要とする場合がある。別の実施形態において、宿主細胞は、非哺
乳動物からの真核生成細胞であり、限定されるものではないが、例えば酵母（サッカロミ
セス・セレヴィシエ）、糸状菌、例えばコウジカビ、および昆虫細胞、例えばＳｆ９など
の既知の生成細胞を含む。
【０３２２】
別の実施形態に関して、細胞は、コードされたＮｓＧ３３の正確な分泌およびプロセッ
シングが可能であるため、好ましくは哺乳動物の宿主細胞である。好ましい種は、ヒト、
ネコ科の動物、ブタ、サル、イヌ科の動物、ネズミ科の動物、ラット、ラビット、マウス
およびハムスターよりなる群を含む。
【０３２３】
本発明のベクターを用いた形質導入またはトランスフェクションについて良い候補であ
る初期培養物および細胞系は、ＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＨＥＩ１９３Ｔ、ＨＥＫ２９３、
ＣＯＳ、ＰＣ１２、ＨｉＢ５、ＲＮ３３ｂ、神経細胞、胎児細胞、ＡＲＰＥ−１９、Ｃ２
Ｃ１２、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、線条体細胞、ニューロン、星状細胞および介在ニューロ
ンよりなる群を含む。哺乳動物組換え産生について好ましい細胞系は、ＣＨＯ、ＣＨＯ−
１、ＨＥＩ１９３Ｔ、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、ＰＣ１２、ＨｉＢ５、ＲＮ３３ｂおよびＢ
ＨＫ細胞よりなる群を含む。
【０３２４】
生体外遺伝子治療について、好ましい細胞の群は、神経細胞、神経前駆細胞（neuronal
precursor  cell）、神経前駆体細胞（neuronal  progenitor  cell）、幹細胞および
胎児細胞を含む。
【０３２５】
本発明はまた、ＮｓＧ３３を過剰発現するように遺伝的に改変され、そして局所的に対
生物活性ＮｓＧ３３ポリペプチドを患者に輸送するために移植されることができる、裸ま
たはカプセル化細胞を介したＮｓＧ３３の生物輸送（biodelivery）に適した細胞に関す
る。そのような細胞は、広く治療細胞（therapeutic  cell）と称され得る。
【０３２６】
本発明の好ましい実施形態において、治療細胞系は、異種の不死化遺伝子の挿入により
不死化されていない。本発明は、裸の細胞としてか、または好ましくはカプセル化細胞と
して、細胞移植するのに特に適した細胞に関するため、そのような不死化細胞系は、ヒト
の体内で無制御な様式で繁殖を始め、腫瘍を形成する潜在性を内在する危険性があるため
、好ましくない。
【０３２７】
好ましくは、細胞系は、接触阻害される細胞系である。接触阻害される細胞系には、２
−Ｄ培養において増殖させた場合に、コンフルエントにまで増殖すると、実質的に分裂を
停止する細胞系を意図するものである。これは、限られた数の細胞が２Ｄ層を脱出する可
能性を排除するものではない。接触阻害細胞もまた、３Ｄ、例えばカプセルの内部で増殖
することもできる。カプセルの内部においても、接触阻害細胞はコンフルエントにまで増
殖し、次いで顕著に増殖速度が低下するか、または完全に分裂を停止する。特に好ましい
細胞型は、天然の接触阻害に基づき、培養において安定な単層を形成する上皮細胞を含む
。
【０３２８】
より好ましくは、網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ細胞）である。ＲＰＥ細胞の供給源は、哺
乳動物の網膜からの初代細胞単離物に基づく。ＲＰＥ細胞を回収する手順は、良く規定さ
れており（LiおよびTurner,  1988,  Exp.  Eye  Res.  47：911-917；Lopezら、1989,  
Invest.  Ophthalmol.  Vis.  Sci.  30：586-588）、慣例の方法論が考えられる。ほと
んどの公開されたＲＰＥ細胞同時移植の報告書では、細胞はラットから誘導されたもので
ある（LiおよびTurner,  1988；Lopezら、1989）。本発明に関して、ＲＰＥ細胞は、ヒト
から誘導される。単離された初代ＲＰＥ細胞に加えて、培養されたヒトＲＰＥ細胞系は、
本発明の実施に用いることができる。
【０３２９】
カプセル化について、細胞は、ＣＮＳの低酸素分圧レベルで、生存し機能性ＮｓＧ３３
分泌を維持できることが必要である。好ましくは、本発明の細胞系は、５％以下の低酸素
分圧、より好ましくは２％以下、より好ましくは１％以下、で生存できる。１％酸素分圧
は、脳の酸素レベルにほぼ相当する。
【０３３０】
輸送系に基づくカプセル化細胞のためのプラットフォーム細胞系であるために、その細
胞系はできるだけ多くの以下の特徴を有するべきである：（１）細胞は、厳格な条件下で
丈夫であるべきである（カプセル化細胞は、血管および無血管組織、例えば中枢神経系柔
組織内、または脳質液または鞘内液空間または眼、特に眼内環境内において機能すべきで
ある）。（２）細胞は、ＮｓＧ３３を発現するよう遺伝的に改変されることができるべき
である。（３）細胞は、比較的長期の生存期間を有するべきである（細胞は、預けられ、
特徴づけされ、開発され、安全に試験され、そして臨床上の大量製造されるために、十分
な子孫を産生すべきである）。（４）細胞はヒト起源のものでなければならない（カプセ
ル化細胞と宿主との間の生体適合性を増加させる）。（５）細胞は、装置中、生体内で１
ヶ月以上の期間８０％以上の生存を示すべきである（長期の輸送を確実にする）。（６）
カプセル化細胞は、ＮｓＧ３３の効果的な量を輸送すべきである（処置の有効性を確実に
する）。（７）カプセル化された場合に、細胞は重大な宿主免疫応答を引き起こさないべ
きである（移植片の寿命を確実にする）。（８）細胞は非−腫瘍形成性（non-tumourigen
ic）であるべきである（装置漏水の場合に、宿主に対して付加的に安全を提供するため）
。
【０３３１】
カプセル化について、好ましい細胞には、ＡＲＰＥ−１９細胞；ヒト不死化繊維芽細胞
；およびヒト不死化星状細胞を含む、網膜色素上皮細胞が含まれる。
【０３３２】
ＡＲＰＥ−１９細胞系は、輸送技術に基づくカプセル化細胞に関して優れたプラットフ
ォーム細胞系であり、輸送技術に基づく非カプセル化細胞についても有用である。このＡ
ＲＰＥ−１９細胞系は、丈夫である（即ち、この細胞系は厳格な条件下で、例えば中枢神
経系または眼内環境への移植において生存可能である）。ＡＲＰＥ―１９細胞は、治療上
興味のある物質を分泌するよう遺伝的に修飾することができる。ＡＲＰＥ−１９細胞は、
比較的長期の生存期間を有する。ＡＲＰＥ−１９細胞は、ヒト起源である。さらに、カプ
セル化されたＡＲＰＥ―１９細胞は、よい生体内装置生存力を有する。ＡＲＰＥ−１９細
胞は、有効量の成長因子を輸送することができる。ＡＲＰＥ−１９細胞は、無視してよい
ほどの宿主免疫応答しか引き起こさない。さらに、ＡＲＰＥ−１９細胞は、非―腫瘍形成
性である。ＡＲＰＥ−１９細胞の培養方法およびカプセル化方法は、米国特許第6,361,77
1号明細書に記載されている。
【０３３３】
別の実施形態において、治療細胞系は、ヒト繊維芽細胞系、ヒト星状細胞系、ヒト中脳
細胞系、およびヒト内皮細胞系よりなる群から選択され、好ましくはＴＥＲＴ、ＳＶ４０
Ｔまたはｖｍｙｃを用いて不死化される。
【０３３４】
不死化ヒト星状細胞系を作り出す方法は、以前に記載された（Price  TN,  Burke  JF,
Mayne  LV.  A  novel  human  astrocyte  cell  line（A735）with  astrocyte-spec
ific  neurotransmitter  function.  In  Vitro  Cell  Dev  Biol  Anim.  1999  May;
35（5）：279-88）。この手順は、星状細胞系を作り出すのに用いることができる。
【０３３５】
さらなるヒト星状細胞系を作り出すために、その手順の以下の３つの改良点を行うこと
が好ましい。
５〜１２週齢胎児から切り出されたヒト胎児脳組織を、１２〜１６週齢組織からのもの
に代えて用いることができる。
不死化遺伝子ｖ―ｍｙｃまたはＴＥＲＴ（テロメラーゼ）をＳＶ４０Ｔ抗原に代えて用
いることができる。
レトロウイルス遺伝子導入を、リン酸カルシウム沈殿技術によるプラスミドのトランス
フェクショに代えて用いることができる。
【０３３６】
ＸＩＩＩ  本発明のＮｓＧ３３ポリペプチドの組換え産物および精製
本発明のＮｓＧ３３ポリペプチドは、人工の原核または真核発現系の形式を用いて産生
することができる。例示的方法は、国際公開第93/22437号パンフレット（innogenetics）
に記載されており、出典明示により本明細書の一部とされる。ＮｓＧ３３ポリペプチドと
国際公開第93/22437号パンフレットに記載されているポリペプチドの構造類似性のため、
ＮｓＧ３３ポリペプチドは、その公報に記載された産生方法を用いて産生され得る。国際
公開第93/22437号パンフレットに記載の手順は、推測される分子量２９ｋＤａを有する蛋
白質の精製を記載する。ＮｓＧ３３断片の発現の場合、可能性のあるプロペプチド切断の
ため非常に短くなる可能性があり、その手順は分子量の違いを考慮して改変されるべきで
ある。
【０３３７】
これらの例は、大腸菌での発現（実施例５または国際公開第93/22437号パンフレット）
、ＣＯＳ１細胞での発現（実施例６または国際公開第93/22437号パンフレット）、バキュ
ロウイルス発現系での発現（実施例７または国際公開第93/22437号パンフレット）、ワク
シニアウイルス発現系での発現（実施例８またはまたは国際公開第93/22437号パンフレッ
ト）を含む。引用された発現系のそれぞれは、国際公開第93/22437号パンフレットに記載
のポリペプチドの大量の発現となった。
【０３３８】
ＮｓＧ３３蛋白質の精製は、国際公開第93/22437号パンフレットに記載の精製方法を用
いて実施することができる。簡単には、本発明のｃＤＮＡでトランスフェクトされたＣＯ
Ｓ１細胞の馴化培地を４８時間後に集め、細胞残屑を取り除くために０．２２μｍのフィ
ルターを通じて濾過する。典型的な精製は、６００〜１０００ｍｌのＣＯＳ１トランスフ
ェクション培地から始める。これに、ＭｇＣｌ２および硫酸デキストラン５００．０００
（ファルマシア（Pharmacia）、ウプサラ、スウェーデン）を添加し、それぞれ終濃度６
０ｍＭおよび０．０２％にする。４℃で１時間のインキュベートの後、沈殿物を遠心分離
（１２．０００ｇ、３０分、４℃）によりペレット化する。ＮｓＧ３３を含む、その上清
画分をｐＨ７．０の５０ｍＭヘペス（Ｈｅｐｅｓ）、ｐＨ８．０に調整された４ｍＭ  Ｅ
ＤＴＡに対して透析し、ｐＨ８．５の５０ｍＭヘペスで平衡化した４ｍｌフェニルボロネ
ート（Phenylboronate）アガラーゼ（PBA  30,  アミコン（Amicon）、マサチューセッツ
州、米国）カラムに０．５ｍｌ／分の流速で流した。ＮｓＧ３３は、１００ｍＭソルビト
ールによりそのマトリクスから溶出される。
【０３３９】
次いで、ソルビトール溶出ピークを、ｐＨ８．５のヘペス中で平衡化された１ｍｌ  Ｆ
ＰＬＣ  ＭｏｎｏＱ陰イオン交換カラム（ファルマシア）を流速０．５ｍｌ／分で通過し
、流速１ｍｌ／分で０〜１Ｍ  ＮａＣｌの直線塩勾配を用いて溶出される。
【０３４０】
溶出液をセントリコン（Centricon）１０．０００（アミコン）により約４０倍濃縮し
、ＰＢＳで平衡化したＳＭＡＲＴスーパーデックス（Superdex）７５ゲル濾過カラム（フ
ァルマシア）にバッチ式（０．２５ｍｌを３回）で流す。
【０３４１】
人工蛋白質精製手順の別の状態を用いて、実施例に記載の試験管内および生体内アッセ
イを実施するのに十分純粋な蛋白質を提供することもできる。
【０３４２】
ＸＩＶ  ＮｓＧ３３の試験管内使用
ＮｓＧ３３ポリペプチドおよび／またはＮｓＧ３３コードポリヌクレオチドは、試験管
内で成長因子または栄養素として用いることができる。この使用は、本発明者らによる、
ＮｓＧが成長因子またはホルモンの構造特徴を有する分泌蛋白質であるという知見、およ
びＮｓＧ３３が種々の試験管内アッセイにおいて、ニューロンの発生および／または生存
、および／または神経前駆細胞の増殖を引き起こすという知見に基づいている。神経保護
および／または神経発生効果は、神経前駆細胞系（ｈＮＳ１）および初代培養物（ラット
線条体培養物）において見出された。加えて、抗アポトーシス効果が、ニューロン潜在性
を有する細胞系（ＰＣ１２）において見出された。
【０３４３】
ＮｓＧ３３は、蛋白質組成物として培養物中に投与することができ、または、細胞を、
ＮｓＧ３３をコードするｃＤＮＡを用いて形質導入またはトランスフェクトすることがで
きる。ＮｓＧ３３が特定の細胞型または組織の処置に有効であるかどうかは、当業者であ
れば当分野で既知の種々のアッセイのいずれかを用いて容易に決定することができる。例
えば、細胞の栄養補給の提供に関して、栄養素は有利な生物学的および形態学的効果を引
き起こすことができ、ある状況では、細胞の生存を促進することができる。ニューロンに
関して、ニューロンの栄養補給を欠乏させることで、代謝活性、即ちグルコース摂取、Ｒ
ＮＡ合成および蛋白質合成、正常な機能および成長についての要求性の低下を引き起こす
結果となり得ることは、当分野では既知である。DeckwerthおよびJohnson,  J.  Cell  B
iol.  123：1207-1222,  1993。栄養補給の削除もまた、ニューロンの細胞体の大きさの
減少をもたらし得る。おそらく、栄養素の代謝効果の喪失の結果として、栄養素欠乏が成
長過程の減少または休止をもたらすか、または神経突起の収縮をもたらし得る。ニューロ
ン生物学のこれらの態様についての栄養素の要求性に加えて、ニューロンは生存維持のた
めに神経栄養因子を必要とする；従って、生存アッセイは、しばしば神経栄養因子の活性
を検出または定量化する手段を用いる。しかしながら、栄養補給もまた、ニューロンの数
または生存におけるいずれかの効果から独立して；形態学的、生化学的および機能的変化
として明白であり得る。
【０３４４】
実施例
実施例１、ＮｓＧ３３配列
配列番号１、５’および３’端に加えられた余分な１００塩基対を有するヒトＮｓＧ３３
ゲノム配列。
配列番号２、ヒトＮｓＧ３３ｃＤＮＡ
配列番号３、ヒトＮｓＧ３３全長アミノ酸配列
配列番号４，シグナル配列を含まないヒトＮｓＧ３３蛋白質
配列番号５、ヒトＮｓＧ３３Ｃ末端ポリペプチド
配列番号６、５’および３’端に加えられた余分な１００塩基対を有するマウスＮｓＧ３
３ゲノム配列。
配列番号７、マウスＮｓＧ３３ｃＤＮＡの一部
配列番号８、マウスＮｓＧ３３アミノ酸配列の一部
配列番号９，シグナル配列を含まないマウスＮｓＧ３３蛋白質
配列番号１０、マウスＮｓＧ３３Ｃ末端ポリペプチド
配列番号１１、５’および３’端に加えられた余分な１００塩基対を有するラットＮｓＧ
３３ゲノム配列。
配列番号１２、ラットＮｓＧ３３ｃＤＮＡ
配列番号１３、ラットＮｓＧ３３全長アミノ酸配列
配列番号１４、シグナル配列を含まないラットＮｓＧ３３蛋白質
配列番号１５、ラットＮｓＧ３３Ｃ末端ポリペプチド
配列番号１６、ヒトＣ末端ペプチドＮｓＧ３３をコードするヌクレオチド配列
配列番号１７、マウスＣ末端ペプチドＮｓＧ３３をコードするヌクレオチド配列
配列番号１８、ラットＣ末端ペプチドＮｓＧ３３をコードするヌクレオチド配列
配列番号１９、ヒトＮ末端ペプチド
配列番号２０、マウスＮ末端ペプチド
配列番号２１、ラットＮ末端ペプチド
配列番号２２、ヒトＮ末端ペプチド
配列番号２３、マウスＮ末端ペプチド
配列番号２４、ラットＮ末端ペプチド
配列番号２５、マウスｃＤＮＡ
配列番号２６、マウス全長アミノ酸配列
この配列表において、イントロンは小文字で表され、エクソンは大文字で表されている。
ポリペプチド配列において、シグナルペプチドはボールド文字で表されている。
【０３４５】
ヒトＮｓＧ３３ゲノムヌクレオチド配列（配列番号１）
【表１】
0005514243.tif 000002
【０３４６】
ヒトＮｓＧ３３（１１０９ｂｐ；ＣＤＳ＝１１８−９９９）（配列番号２）
＞giｌ34147349ｌrefｌNM＿024042.2ｌ  ホモ・サピエンス仮想蛋白質MGC2601（MGC2601
）,  mRNA
【表２】
0005514243.tif 000003
【０３４７】
ヒトＮｓＧ３３Ｃ末端ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（配列番号１６）
【表３】
0005514243.tif 000004
【０３４８】
ヒトＮｓＧ３３全長アミノ酸配列（配列番号３）
＞IPI00031531.1  REFSEQ＿NP：NP＿076947  TREMBL：Q9UJH9  ENSEMBL：ENSP0000021954
2  Tax＿Id=9606  C380A1.2.1（新規蛋白質）
【表４】
0005514243.tif 000005
【０３４９】
シグナル配列を含まないヒトＮｓＧ３３蛋白質（配列番号４）
【表５】
0005514243.tif 000006
【０３５０】
ヒトＮｓＧ３３Ｃ末端ポリペプチド（配列番号５）
【表６】
0005514243.tif 000007
【０３５１】
ヒトＮ末端ペプチド（配列番号１９）
【表７】
0005514243.tif 000008
【０３５２】
ヒトＮ末端ペプチド（配列番号２２）
【表８】
0005514243.tif 000009
【０３５３】
マウスＮｓＧ３３ゲノムヌクレオチド配列（配列番号６）
Genomic  chr17（逆鎖（reverse  strand））：
【表９】
0005514243.tif 000010
【０３５４】
マウスＮｓＧ３３ｃＤＮＡの一部（１０４８ｂｐ；ＣＤＳ＝＜２−８８６）（配列番号７
）
【表１０】
0005514243.tif 000011
【０３５５】
マウスＮｓＧ３３ｃＤＮＡ、１３６３ｂｐ、ＣＤＳ８４．．９５９（配列番号２５）
NM＿133719.  ハツカネズミ  メテオリン（meteorin）.［gi：56550040]
【表１１】
0005514243.tif 000012
【０３５６】
マウスＣ末端ポリペプチドＮｓＧ３３をコードするヌクレオチド配列（配列番号１７）
【表１２】
0005514243.tif 000013
【０３５７】
マウスＮｓＧ３３一部分ＮｓＧ３３（配列番号８）、即ちＮ末端欠損
＞ｇｉｌ２３２７４２７４ｌｇｂｌＡＡＨ３７１８１．１ｌ  １８１００３４Ｂ１６Ｒｉ
ｋ蛋白質  ［ハツカネズミ］
【表１３】
0005514243.tif 000014
【０３５８】
マウスＮｓＧ３３全長アミノ酸配列（配列番号２６）
ｒｅｆｌＮＰ＿５９８４８０．１ｌ  メテオリン［ハツカネズミ］
【表１４】
0005514243.tif 000015
【０３５９】
シグナル配列を含まないマウスＮｓＧ３３蛋白質（配列番号９）
【表１５】
0005514243.tif 000016
【０３６０】
マウスＮｓＧ３３、Ｃ末端ポリペプチド（配列番号１０）
【表１６】
0005514243.tif 000017
【０３６１】
マウスＮｓＧ３３、Ｎ末端ポリペプチド（配列番号２０）
【表１７】
0005514243.tif 000018
【０３６２】
マウスＮｓＧ３３、Ｎ末端ポリペプチド（配列番号２３）
【表１８】
0005514243.tif 000019
【０３６３】
５’および３’末端に付加された１００個の余分な塩基対を有するラットＮｓＧ３３ゲノ
ム配列（配列番号１１）  ゲノムｃｈｒ１０（逆鎖）：
【表１９】
0005514243.tif 000020
【０３６４】
配列番号１２、ラットＮｓＧ３３（１０２６ｂｐ；ＣＤＳ＝１−８７６）
＞ｇｉｌ３４８７０５７０ｌｒｅｆｌＸＭ＿２１３２６１．２ｌ  １８１００３４Ｂ１６
Ｒｉｋ蛋白質に類似するドブネズミ  ［ＬＯＣ２８７１５１］、  ｍＲＮＡ
【表２０】
0005514243.tif 000021
【０３６５】
ラットＣ末端ポリペプチド  ＮｓＧ３３コード配列（配列番号１８）
【表２１】
0005514243.tif 000022
【０３６６】
ラットＮｓＧ３３全長アミノ酸配列（配列番号１３）
＞ＩＰＩ００３６９２８１．１    ｌＲＥＦＳＥＱ＿ＸＰ：ＸＰ＿２１３２６１ｌＥＮＳ
ＥＭＢＬ：ＥＮＳＲＮＯＰ００００００２６６７６
【表２２】
0005514243.tif 000023
【０３６７】
シグナル配列を含まないラットＮｓＧ３３蛋白質（配列番号１４）
［ＡＳＡＲＡ］ＧＹＳＥＤ  ＲＣＳＷＲＧＳＧＬＴ  ＱＥＰＧＳＶＧＱＬＴ  ＬＤＣＴＥ
ＧＡＩＥＷ  Ｌｙｐａｇａｌｒｌｔ  ＬＧＧＳＤＰＧＴＲＰ
【表２３】
0005514243.tif 000024
【０３６８】
ラットＮｓＧ３３、Ｃ末端ポリペプチド（配列番号１５）
【表２４】
0005514243.tif 000025
【０３６９】
ラットＮｓＧ３３、Ｎ末端ポリペプチド（配列番号２１）
【表２５】
0005514243.tif 000026
【０３７０】
ラットＮｓＧ３３、Ｎ末端ポリペプチド（配列番号２４）
【表２６】
0005514243.tif 000027
【０３７１】
実施例２、生物情報分析
概説
ヒトＮｓＧ３３は、中枢神経系、およびその小領域、末梢神経系、網膜およびヒト発生
時の中脳において、高レベルで２９３アミノ酸前駆体として発現される分泌型成長因子蛋
白質である。マウス（配列番号８）およびラット（配列番号１３）相同体は、全長２９４
および２９１アミノ酸であり、その同一性％は、それぞれ８０．３％および８０．２％で
ある。
【０３７２】
蛋白質プロセッシング
ヒトＮｓＧ３３は、２３アミノ酸のＮ末端シグナルペプチドを含み、配列モチーフＡＲ
Ａ−ＧＹにて切断される。このシグナルペプチド切断部位は、ＳｉｇｎａｌＰ方法（Niel
senら、1997）により予測され、その出力のグラフは図１Ａにて示され、シグナルペプチ
ド切断部位が、マウスＮｓＧ３３（２４番目）およびラットＮｓＧ３３（１６または２１
番目）の類似部分に見出される。ラットＮｓＧ３３の最も可能性のある切断部位はヒトお
よびマウスＮｓＧ３３の両方で予測される切断部位に相当する２１番目である。これは、
配列表に示される、配列番号１４、２１および２４のもっとも可能性の高いＮ末端はＧＹ
ＳＥＤＲＣＳであって、ＡＳＡＲＡＧＹＳＥＤでないことを意味している。
【０３７３】
このマウスＮｓＧ３３におけるシグナルペプチド予測は、一部分のＮｓＧ３３配列（配
列番号８）の切断部位をマウス全長ＮｓＧ３３配列（配列番号２６）として提供する。
【０３７４】
蛋白質プロセッシング
一般型の前駆蛋白質切断は、ヒトＮｓＧ３３（配列番号３）では、ＰｒｏＰ方法により
０．８３１のスコアーで１２７番目、配列モチーフ「ＷＧＰＲＥＲＲ−ＡＬ」と予測され
る。同様に、切断部位が、マウスＮｓＧ３３（配列番号８）では、０．８３１のスコアー
で１２８番目、配列モチーフ「ＷＧＰＲＥＲＲ−ＡＬ」と、およびラットＮｓＧ３３（配
列番号１３）では、０．８３１のスコアーで１２５番目、配列モチーフ「ＷＧＰＲＥＲＲ
−ＡＬ」と予測される。
【０３７５】
蛋白質機能
ＮｓＧ３３は、成長因子として作用する蛋白質の範疇に属する。この考えは、図２に示
されるようにこの種の範疇で正確に１を超える見込みを与える、ＰｒｏｔＦｕｎ蛋白質機
能予測サーバー（Jensenら、2002  &  2003）による予測により支持される。このＰｒｏ
ｔＦｕｎ法は、配列類似性に対して、配列から導かれる特徴に基づいて、蛋白質の機能を
予測する。「成長因子」クラスに対して他の全てのクラスを識別するのに重要な特徴は：
蛋白質選別能力、蛋白質標的能力、シグナルペプチド能力、低複雑度領域、蛋白質２次構
造、負残基の数および原子の数である（Jensenら、2003）。
【０３７６】
以下の配列一致性計算は、ＢＬＯＳＵＭ５０マトリクスおよびギャップペナルティー−
１２／−２を用いたアライン０プログラムを用いて、行った。
表１は、全長ヒトＮｓＧ３３に対するマウスおよびラット配列間の配列一致性％を示す
。
【表２７】
0005514243.tif 000028
表２は、Ｎ末端シグナル配列ペプチドを除いた後のヒトＮｓＧ３３に対するマウスおよ
びラット配列間の配列一致性％を示す。
【表２８】
0005514243.tif 000029
【０３７７】
参照
ＰｒｏＰ：蛋白質コンベルターゼ切断部位の予測。Peter  Duckert,  Soren  Brunak  
and  Nikolaj  Blom.  Protein  Engineering,  Design  and  Selection：  17：  107-
112,  2004。
【０３７８】
ＳｉｇｎａｌＰ：原核および真核シグナルペプチドの同一性およびそれら切断部位の予
測。Henrik  Nielsen,  Jacob  Engelbrecht,  Soren  Brunak  and  Gunnar  von  Heij
ne,  Protein  Engineering  10,  1-6（1997）。
【０３７９】
ＰｒｏｔＦｕｎ：翻訳後修飾および局在特徴からヒト孤立蛋白質（orphan  protein）
機能の非経験（ab  initio）予測。L.  Juhl  Jensen,  R.  Gupta,  N.  Blom,  D.  De
vos,  J.  Tamames,  C.  Kesmir,  H.  Nielsen,  H.  H.  Stafeldt,  K.  Rapacki,  
C.  Workman,  C.  A.  F.  Andersen,  S.  Knudsen,  A.  Krogh,  A.  Valencia  and
S.  Brunak.  J.  Mol.  Biol.,  319：1257-1265,  2002。
【０３８０】
ジーンオントロジーカテゴリー（Gene  Ontology  categories）に従ったヒト蛋白質機
能の予測、L.J.  Jensen,  R.  Gupta,  H.H.  Starfeldt,  S.  Brunak,  Bioinformati
cs,  19,  635-642（2003）。
【０３８１】
アライン（align）０線形空間における最適なアライメント。Myers,  E.W.  and  Mill
er,W.  Comput.  Appl.  Biosci.,  4,  11-17（1998）。
【０３８２】
実施例３、ジーンチップ実験
ヒト物質は、正規の真空吸引技術を用いて選択的に中絶した妊婦から得られた廃棄され
る組織片に由来する。研究のための遺残組織の採取は、カロリンスカ機関（Karolinska  
Institute）のハディング大学病院（Huddinge  University  Hospital）（Diary  Nr.  2
59/00）およびルンド大学（Lund  University  ）（970401）のヒューマン・エディック
ス・コミッティー（Human  Edics  Committee）により認可を受け、さらに中絶を望む妊
婦女性からのインフォームド・コンセントを含む、スウェーデンナショナルボード・オブ
・ヘルスアンドウェルフェアー（Socialstyrelsen）のガイドラインに沿ったものである
。回収された神経組織は、手術から２時間以内に極小切開し、適当な組織片を、細胞単離
のためにさらに分離した。
【０３８３】
ＲＮＡ単離：
ヒト胎児組織（８週齢）は２回得られ、両方の妊娠８週齢であった。ＶＭおよびＤＭ領
域に解剖したものを、良い結果および収量の全ＲＮＡ単離に用いた。
【０３８４】
全ＲＮＡは、製造元の取扱書（インビトロジェン（Invitrogen））に従って、トリゾー
ル（Trizol）抽出を用いて、妊娠８週齢のヒト胎児組織から細解剖された腹部および背部
の中脳領域から単離された。ＲＮＡを濃縮し、微少量の染色体ＤＮＡを取り除くために、
ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅセットと組み合わされたＲｎｅａｓｙカラムを、製造元の取
扱書に従って使用した。
【０３８５】
全ＲＮＡの５μｇから、ビオチン化ｃＤＮＡを調製し、製造元の取扱書に従って、アフ
ィメトリックス（Affymetrix）プロトコルに記載のように断片化し（ジーンチップ・エク
スプレッション・アナリシス（GeneChip  Expression  Analysis）、Technical  Manual
2000）、アフィメトリックス・ヒューマンU133Bジーンチップ（およそ２２，０００遺
伝子を含む）にハイブリダイズさせた（１５μｇ）。走査像を分析し、ジーンパブリッシ
ャー・アナリシス・ソフトウェアーパッケージ（GenePublisher  analysis  software  p
ackage）（Knudsen  S,  Workman  C,  Sicheritz-Ponten  T,  Friis  C.（2003）「Gen
ePublisher：  Automated  analysis  of  DNA  microarray  data.」,  Nucleic  Acids
Res.  31（13）：3471-6.））を用いて発現指標値に変換した。
【０３８６】
アフィメトリックスＵ１３３ジーンチップを用いて、ヒトＮｓＧ３３の発現を分析した
（acc.  232269＿x＿at  on  U133  B  およびacc.  219051＿x＿at  on  U133  A  ジー
ンチップ；アフィメトリックス,  Inc.,  Santa  Clara,  Calif.）。ヒトＮｓＧ３３の
発現は、ヒト８週齢胎児中脳（中央の脳）組織試料において観察され、このことは、ヒト
ＮｓＧ３３が初期の胎児脳の発生に機能を果たしている可能性を示している。胚発生中の
ヒト中脳における成長因子の発現は、パーキンソン病の処置において治療的に機能する可
能性を予測する。
【０３８７】
実施例４  全長コード配列の獲得
ＮｓＧ３３は、ＲＺＰＤ、ベルリン、ドイツ（RZPDクローンID：  IRALp962D105Q2）か
ら得られたＩＭＡＧＥクローン（The  I.M.A.G.E.  Consortium：「An  integrated  mol
ecular  analysis  of  genomes  and  their  expression」、Lennon,  Auffray,  Poly
meropoulos、およびSoares,  ［1996],  Genomics  33：  151-152）から、以下のプライ
マー：
５’プライマー：５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＡＧＣＧＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＣＣＣＣＧＡＣ
−３’
３’プライマー：５’−ＴＡＴＡＣＴＣＧＡＧＧＣＣＣＡＣＣＣＴＣＣＣＴＣＣＴＡＣＣ
ＡＧ−３’
を用いてＰＣＲ増幅された。
【０３８８】
３回の同一ＰＣＲ条件を、５０μｌ反応溶液中にＤＮＡ鋳型としてＲＺＰＤクローン５
０ｎｇ／μｌを含めて設定した。プルーフリーディングポリメラーゼ（pfu-turboポリメ
ラーゼ）をＰＣＲ増幅に適用し、以下の増幅プロフィール：前−変性工程：９５℃、１分
、続いて３５回の、３工程サイクル：変性工程９５℃、３０秒、アニーリング工程５７℃
、３０秒、伸長工程７２℃、９０秒、次いで、伸長工程：７２℃、２分、次に４℃に冷却
する、を用いた。
【０３８９】
ＰＣＲ反応物を集め、９８８ｂｐのＮｓＧ３３ＰＣＲ断片をアガロースゲル精製し、Ｂ
ａｍＨＩとＸｈｏＩで切断した。新たな９７６ｂｐのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ−制限切断Ｎ
ｓＧ３３のＰＣＲ断片をゲル精製した。５μｇのレンチウイル導入ベクター、ｐＨｓＣＸ
Ｗ（ジーンバンク（GenBank）受入番号AY468486）をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化し、ベ
クターバックボーンをゲル精製した。
【０３９０】
ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩのＮｓＧ３３  ＰＣＲ断片を、ｐＨｓＣＸＷレンチウイルス導入
ベクターのＢａｍＨＩ部位とＸｈｏＩ部位との中にライゲートし、続いてＸｌ１−Ｂ電気
穿孔用コンピテント細胞中に形質転換した。
【０３９１】
実施例５、ＮｓＧ３３におけるリアル−タイムＰＣＲ
ＮｓＧ３３の発現について調査した組織は、網膜、全脳、被殻、黒質、ガングリオン、
胎児肝臓、小脳、全脳、胎児肝臓、心臓、腎臓、肺、胎盤、前立腺、前立腺、骨格筋、膵
臓、精巣、胸腺、気管、子宮、結腸、小腸、脊髄、胃、膵臓、胎児脳からの全ＲＮＡであ
った。
【０３９２】
最初のｃＤＮＡ鎖は、一般的な手法を用いて、スーパースクリプト（Superscript）Ｉ
Ｉ逆転写酵素（ライフ・テクノロジーズ（Life  Technologies））およびＨＴ１１Ｖプラ
イマーを用いて、全ＲＮＡから調製された。リアル−タイムＰＣＲ発現分析について、そ
れぞれＲＮＡ２０ｎｇ等量の逆転写からの産物を、リアル−タイムＲＣＲ反応の鋳型とし
て用いた。
【０３９３】
リアル−タイムＰＣＲは、Ｏｐｔｉｃｏｎ―２サーモサイクラー（MJ  Research）にて
、ライトサイクラー−ファーストスタート（LightCycler-FastStart）DNA  マスター・サ
イバーグリーンＩキット（Master  SYBR  Green  I  kit）（ロシェ（Roche））を用いて
行った。実験は、プライマー５’−ＣＣＡＧＣＧＡＣＴＴＣＧＴＡＡＴＴＣＡＣ−３’（
５’プライマー）および５’−ＡＧＣＣＣＡＴＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＧ−３’（３’プラ
イマー）を用いて２回行った。リアル−タイムＰＣＲについて、標準曲線は上記のプライ
マーを用いて調製したゲル精製ＰＣＲ産物の系列希釈物により準備された。標準曲線は、
全ての試料の交差点（crossing-point）の値（ＣＴ）がＰＣＲ反応の指数関数領域の範囲
内にあることを確認するために、および最終の発現レベルを計算するために用いられた。
全てのＲＴ−ＰＣＲ増幅は、ライトサイクラーキットに含まれる、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、
１２％スクロースおよび１×反応緩衝液を含む１０μｌの総量において実施された。ＰＣ
Ｒサイクルプロフィールは、１０分の前−変性工程９８℃、および３５回の３工程サイク
ル、９８℃を１０秒、６２℃を２０秒、および７２℃を２０秒からなる。各サイクルの伸
長工程に続いて、プレートの読み取り工程を加え（８０℃、２秒）新たに形成されたＰＣ
Ｒ産物を定量化した。増幅反応の特異性は、計数値取得しながら５２℃から９５℃に温度
をゆっくり上昇させることによる、ＰＣＲ断片の融解曲線分析を実施することによって決
定した。
【０３９４】
規格化を目的として、全てのｃＤＮＡは、β２−ミクログロブリンに対するプライマー
（Ｂ２Ｍ、５’−ＴＧＴＧＣＴＣＧＣＧＣＴＡＣＴＣＴＣＴＣ−３’および５’−ＣＴＧ
ＡＡＴＧＣＴＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＴＴＣＴ−３’）を用いたリアル−タイムＰＣＲ
にかけた。β２−ミクログロブリンの標準曲線をＮｓＧ３３と同様に準備した。ハウスキ
ーピング遺伝子のリアル−タイムＰＣＲを、このハウスキーピング遺伝子に最適なアニー
リング温度を用いることを除いて、標的遺伝子に関して同じキットを用いて行った。
【０３９５】
ハウスキーピングの発現パターンは、それぞれの標準曲線から決定し、比発現レベルを
用いて、分析した組織中の標的遺伝子の発現レベルを規格化した。β２−ミクログロブリ
ンを用いた規格化に続いて、標的遺伝子の比発現レベルを、最も低い発現を示した組織を
参照値として計算した。β２−ミクログロブリンに関して規格化した結果は、β２−ミク
ログロブリンが試験した全ての組織で同じレベルで発現されていない可能性があるため、
注意して解釈されるべきである。
【０３９６】
全ＲＮＡ試料の分析（図４ＡおよびＢに示される）
高発現（Ｃ（Ｔ）値＜２２）
被殻、黒質、脊髄
中程度の発現（２２＜Ｃ（Ｔ）値＜２４）
全脳、小脳、網膜、ＤＲＧ
低度の発現（２４＜Ｃ（Ｔ）値＜２６）
心臓、腎臓、肺、前立腺、前立腺、骨格筋、精巣、胃、膵臓、胎児脳
非常に低度の発現または発現していない（Ｃ（Ｔ）値＞２６）
胎児肝臓、胎盤、胸腺、気管、膵臓、子宮、結腸、小腸。
【０３９７】
組織特異的発現、およびＮｓＧ３３が分泌型の成長因子であるという知見（実施例２を
参照のこと）に基づいて、ＮｓＧ３３は、一般に神経系の障害（神経系特異的な発現に基
づく）、特にパーキンソン病（黒質での発現に基づく）、ハンチントン病（被殻での発現
に基づく）、小脳障害（小脳での発現に基づく）、脊髄損傷およびＡＬＳ（脊髄での発現
に基づく）、抹消神経疾患（後根神経節での発現に基づく）、網膜症（網膜での発現に基
づく）を処置するにあたっての使用が考えられる。種々の適用についての効用を、以下に
記載するように試験管内および生体内アッセイで実証することができる。
【０３９８】
実施例６  一般的な神経保護効果についての試験（ＰＣ−１２アッセイ）
ウイルスストックの作成
ＮｓＧ３３をコードする配列を、実施例４に記載のように、適当な制限部位を用いてｐ
ＨｓＣＸＷ中にサブクローニングした。ウイルス保存液を作るために、得られたレンチウ
イルス導入細胞を、トランス形式で必要なウイルス遺伝子、ｇａｇ−ｐｏｌおよびｅｎｖ
，のそれぞれを提供する２つのヘルパープラスミド（ｐＭＤ．ＧおよびｐＢＲ８．９１）
を用いて、２９３Ｔ細胞を同時トランスフェクトした。簡単には、２ｘ１０６  ２９３Ｔ
細胞を、それぞれ２０個のＴ７５培養フラスコに撒いた。翌日に、それぞれのＴ７５フラ
スコを、製造元の取扱書（インビトロジェン）に従って、リポフェクトアミン（Lipofect
amine）＋を用いて、１５μｇのｐｐＢＲ８．９１、５μｇのｐＭＤ．Ｇおよび２０μｇ
の導入ベクターでトランスフェクトした。ウイルス含有培地をトランスフェクトの２〜３
日後に回収し、０．４５μｍの酢酸セルロースまたはポリスルホン酸フィルターを通して
濾過滅菌した。ウイルスを５０，０００×ｇ、９０分間、４℃の２回の超遠心によりペレ
ット化し、次いでＤＭＥＭ培地中に懸濁した。ウイルスは逆転写（ＲＴ）アッセイ（Curr
ent  Protocols  in  Molecular  Biology,  Editors：  Ausubelら、Willey）を用いて
滴定した。形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌの数字は、得られたＲＴ活性と、等量のＧＦＰレ
ンチウイルスで２９３Ｔ細胞を形質導入することによって得られた蛍光細胞の出現率から
計算された。ウイルス保存は、小分けにして使用するまで−８０℃で保存した。
【０３９９】
PC12細胞の形質導入
試験には、DMEM培地に馴化されたPC12細胞(ATCC受入番号:CRL-1721)を用いた。PC12細胞を、4.5g/lのグルコースおよびグルタマックス(glutamax)(ライフ・テクノロジーズ(Life Technologies)#32430-027)を含み、7.5%供与体ウマ血清(ライフ・テクノロジーズ#16050-098)および7.5%FBS(ライフ・テクノロジーズ# 10099-141)を含有する、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中、5%CO2のもと37℃で培養した。培地を2〜3日ごとに交換し、フラスコを軽くたたき、新しいフラスコに分散させることによって、細胞を週に2回、1:3〜1:6で継代した。形質導入の前日に、細胞を、コラーゲンで被覆された6ウェルプレートに撒いた。保存溶液からウイルスを、5μg/ml(終濃度)ポリブレンを用いて、または用いずに1mlの細胞培養基に加えた。ウイルスを細胞と一緒に、CO2インキュベーター中で少なくとも3日間インキュベートした。GFPレトロウイルスを、形質導入効率を評価するために、および対照として提示するために、対応する培養物に加えた。
【０４００】
ＰＣ１２分化における効果：
６ウェルプレート中の培養物は続けて、２〜５日後に神経突起を有する細胞の数を数え
た。
【０４０１】
ＰＣ１２生存における効果：
６ウェルプレートから形質導入された細胞を、コラーゲンで被覆された９６ウェルプレ
ートの培養基中に再び撒いた。翌日、培地を無血清ＤＭＥＭに交換し、細胞生存力を製造
元の取扱書に従って（プロメガ（Promega））ＭＴＳアッセイを用いて、２４から７２時
間後に測定した。実験の結果は図９に示す。全長のＮｓＧ３３ｃＤＮＡを含むレンチウイ
ルスで形質導入されたＰＣ１２におけるＭＴＳ活性は、標識遺伝子（ＥＧＦＰ）を運ぶレ
ンチウイルスで形質導入された対照のＰＣ１２細胞と比較して、有意に増加した。ＭＴＳ
は、全体の細胞集団の代謝活性の測定単位である。従って、対照培養物と比較したｒＬＶ
−ＮｓＧ３３におけるＭＴＳ活性の増加は、培養物中で生存可能な細胞の増加した数およ
び／または生存している細胞の増大した生存率の表れを反映していよう。
【０４０２】
神経突起伸長および／または生存アッセイのいずれにもおける明確な効果は、神経変性
障害を処置するにあたってＮｓＧ３３蛋白質の潜在的な治療効果を表示する。
【０４０３】
実施例７：グルタミン酸毒性からの小脳顆粒細胞の保護
生存効果試験は、次に（Daniels  and  Brown,  2001;  J.  Biol.  Chem.  276：  22
446-22452
）に本質的に記載されるようにグルタミン酸塩の毒物濃度に曝露される、小脳顆粒細胞の
培養物を形質導入することによって行われる。
【０４０４】
小脳顆粒ニューロン（ＣＧＮ）は、７−８日齢のマウスpupsから切り出された。細胞は
、トリプシンおよびＤＮａｓｅの存在下で酵素により破壊することによって、新鮮に切り
出された小脳から分離し、次いで、ポリ−Ｄ−リジンで予め被覆された２４ウェルプレー
ト（ヌンク（Nunc））中、密度１−２×１０６細胞／ｃｍ２で１０％熱失活胎児ウシ血清
を含むＤＭＥＭ培地中に撒いた。細胞を、給湿環境中３７℃で培養し、神経細胞でない細
胞の増殖を抑制するために、シトシンアラビノシド（１０μＭ）をその培養基に２４時間
後に加えた。
【０４０５】
培養物を、実施例６に記載のように調製されたＮｓＧ３３を含むレンチウイルスで、Ｄ
ＩＶ１で、１０％胎児ウシ血清および４μｇ／ｍｌポリブレンを含むＤＭＥＭ培地にウイ
ルス保存溶液の添加により、形質導入する。対応する対照培地を、緑色蛍光蛋白質（ＧＦ
Ｐ）レンチウイルスで形質導入する。形質導入の５時間後に、培地をＯＧＮに予め調整さ
れた培地に交換する。
【０４０６】
DIV5で、グルタミン酸塩(0.1〜1mM)を培養物に加え、さらに2日後に細胞の生存を、MTT
アッセイを用いて検定する。ホルマザン(formazane)に対するMTT減少の広がりは、570nm
の分光光度法により測定される。簡単には、培養基を取り除き、そして細胞を塩化ナトリ
ウム溶液(140mM NaCl、5mM KCl、1mM MgCl2・6H2O、1mM NaH2PO4、1.5mM CaCl2、5.6mMグ
ルコース、20mMヘペス、pH7.4)中で洗浄する。使用直前に調製し、暗所にて塩化ナトリウ
ム溶液中で維持したMTT(終濃度0.5mg/ml)を、次いで細胞に加える。37℃での3時間のイン
キュベーションの後、等量の酸-イソプロパノール(イソプロパノール中0.04M HCl)を加え
、室温ですべてのホルマザン結晶が溶解するまで完全に混合する。細胞生存力は、対照細
胞の最適密度の百分率として表される。対応する培養物は未処理のままにする。
【０４０７】
このアッセイは、興奮毒性ダメージに対する保護を試験するための一般的アッセイ、並
びに、小脳障害の処置における治療潜在性を有する因子の予想アッセイと考えることがで
きる。
【０４０８】
実施例８、カリウム欠乏により誘導されるアポトーシスからの小脳顆粒細胞の保護
生存効果の試験は、本質的に（Nomuraら、2001;  Dev.  Neurosci.  23：  145-152）
に記載されるようにカリウムを奪われた小脳顆粒細胞を形質導入することによって行われ
る。
【０４０９】
小脳顆粒ニューロン（ＣＧＮ）は、８日齢のスプレーグ−ドーリー（Sprague-Dawley）
ラットpupsから切り出された。細胞は、トリプシンおよびＤＮａｓｅの存在下で酵素によ
り破壊することによって、新鮮に切り出された小脳から分離し、次いで、ポリ−Ｄ−リジ
ンで予め被覆された９６ウェルプレート（ヌンク）中、密度３．５×１０５細胞／ｃｍ２
で１０％熱失活胎児ウシ血清、２ｍＭグルタミン酸塩を含む、２５ｍＭ  ＫＣｌ含有イー
グル基礎培地中に撒いた。細胞を、給湿環境中３７℃で培養し、神経細胞でない細胞の増
殖を抑制するために、シトシンアラビノシド（１０μＭ）をその培養基に２４時間後に加
えた。
【０４１０】
培養物を、実施例６［ＰＣ１２細胞における試験］に記載のように調製されたＮｓＧ３
３を含むレンチウイルスで、ＤＩＶ１で、１０％胎児ウシ血清および４μｇ／ｍｌポリブ
レンを含むＤＭＥＭ培地にウイルス保存溶液を添加することにより、形質導入する。対応
する対照培養物を、ＧＦＰレンチウイルスで形質導入する。形質導入の５時間後に、培地
をＯＧＮに予め馴化させた培地に交換する。
【０４１１】
ＤＩＶ２で、未成熟培養物中に、５ｍＭ  ＫＣｌを含む無血清培地に細胞を切り替える
ことによって、アポトーシスを誘導し、一方で、未処理細胞は２５ｍＭ  ＫＣｌ含む馴化
培地を与える。生存をＤＩＶ３に、ＭＴＳアッセイを用いて測定する。
【０４１２】
ＤＩＶ８で、分化（神経細胞）培養物中に、５ｍＭ  ＫＣｌを含む無血清培地に細胞を
切り替えることによって、アポトーシスを誘導し、一方で、未処理細胞は２５ｍＭ  ＫＣ
ｌ含む馴化培地を与える。生存を２４から７２時間後に、ＭＴＳアッセイを用いて測定す
る。
【０４１３】
ＭＴＳアッセイは、製造元の取扱書に従って、ザ・セルタイター９６（登録商標）アク
オス・ノン−ラジオアクティブセル・プロリフェレーション・アッセイ（CellTiter  96
AQueous  Non-Radioactive  Cell  Proliferation  Assay）（プロメガ）を用いて実施
される。
【０４１４】
このアッセイは、神経保護効果についての一般的アッセイ、並びに小脳障害の処置にお
ける治療潜在性を有する因子の予想アッセイと考えることができる。
【０４１５】
実施例９、ＤＲＧ培養物における効果
形質導入されたＡＲＰＥ−１９細胞からの馴化培地の調製。ＮｓＧ遺伝子をコードする
ｃＤＮＡを含むレンチウイルスを用いてＡＲＰＥ−１９細胞を形質導入するために、細胞
を、６ウェルプレート中、１０％胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中に密度１×
１０５細胞／ウェルで撒く。翌日、ウイルスを保存液から、５μｇ／ｍｌ（終濃度）ポリ
ブレンと共に細胞培養基に加える。ウイルスを、ＣＯ２インキュベーター中で一晩細胞と
共にインキュベートする。ＧＦＰレンチウイルスを、対応する培養物に加える。翌日、培
地を無血清ウルトラカルチャー（UltraCULTURE）培地（１ｍｌ／ウェル）に交換し、さら
に２日インキュベーションした後に、馴化培地を回収する。
【０４１６】
Ｐ１  ＤＲＧ細胞の単離および培養。全ての脊髄レベルからのＤＲＧは、Ｐ１（後−背
部１日）から取り出される。スプレーグ−ドーリー組織を、３７℃で３０分間の１２５〜
２５０Ｕ／ｍｌ１型コラゲネース（Worthington,  Freehold,  N.J.）において酵素によ
り分離する。試料は、先端熱加工されたパスツールピペットを用いて粉砕され、７０μｍ
の滅菌メッシュに通じて濾過し、単一細胞懸濁液を得る。細胞を、被覆されていない組織
培養製品皿にて予め培養し、神経細胞でない細胞を取り除く。非接着細胞は、ポリ−ｄ−
オルニチン（ライフ・テクノロジーズ）およびラミニン（コラボレイティブ・バイオメデ
ィカル（Collaborative  Biomedical））で被覆された２４ウェル組織培養皿中、１５，
０００細胞／ウェルで撒かれる。陰性対照は、２．５μｇ／ｍｌヒツジ中和性抗ＮＧＦ  
ｐＡｂ（ケミコン（Chemicon）、Temecula,  CA）を含む、ウルトラカルチャー（登録商
標）（UltraCULTURE）無血清培地（BioWhittaker,  Walkersville,  MD）にて培養される
。ＮＧＦ処置された陽性対象は、中和性抗ＮＧＦｐＡｂを含まない。ＮｓＧ３３形質導入
された、もしくはＧＦＰ形質導入されたＡＲＰＥ−１９細胞から集められた馴化培地の種
々の希釈物を、遠心分離し、０．４μｍ滅菌フィルターに通じて濾過した後に、培養物中
に加える。培養物は、２日置きに培地を交換することにより栄養を与える。
【０４１７】
免疫細胞化学。数日後、培養物中にて細胞を、室温で、１０分間のＰＢＳ中の４％ホル
ムアルデヒドにて固定する。細胞を、室温で３０分間、４％ヤギ血清、０．１％ＮＰ４０
にてで予めブロックし、次いでマウス抗−βＩＩＩチューブリン（１：１００）で４℃に
て一晩インキュベートする。前−ブロック溶液をゆすいだ後、培養物を、室温でＣｙ−３
抱合抗−ネズミ２次抗体を用いてインキュベートする。前−ブロック溶液の最後のゆすぎ
に続いて、各ウェルの中央部の小片からの細胞を、蛍光光学器を用いて計数する。全ての
βＩＩＩチューブリン陽性細胞は、ニューロンとして計算され、ウェルあたりに計数され
るニューロンの数によって、生存率が決定される。全ての抗体は、前−ブロック溶液にて
希釈される。
【０４１８】
結果の解釈
このアッセイにおける保護効果は、末梢神経疾患および神経障害性疼痛における治療潜
在性を示す。
【０４１９】
実施例１０、運動ニューロン培養物における効果
運動ニューロン培養物における生存効果試験は、本質的にCisterniら、200（J.  Neuro
chem.  74,  1820-1828）に記載されるように、ＮｓＧ３３を含むレチンウイルスを用い
て行われる。簡単には、胚日１４．５日（Ｅ１４．５）のスプレーグ−ドーリーラット胚
の腹側脊髄を切り出し、分離する。運動ニューロンは、ニューロトロフィン受容体、ｐ７
５の細胞外ドメインに対する抗体を用い、運動ニューロンの免疫親和性精製に基づくプロ
トコルを使用して精製され、次いで、磁性マイクロビーズを用いて細胞を選別する（Arce
ら、1999）。精製された運動ニューロンは、予めポリオルニチン／ラミニンで被覆された
４ウェル組織培養皿中、密度５００細胞／ウェルで撒かれる。培養基は、Ｂ２７補剤（ラ
イフ・テクノロジーズ）、ウマ血清（２％ｖ／ｖ）、Ｌ−グルタミン（０．５ｍＭ）およ
び２−メルカプトエタノール（２５μＭ）を含むニューロベーサル（Neurobasal）培養基
（ライフ・テクノロジーズ）である。Ｌ−グルタメート（２５μＭ）は、培養の最初の４
日間培地に加えられ、その後は除かれる。
【０４２０】
１６時間培養された運動ニューロンは、上記のように調製されたＮｓＧ３３を含むレチ
ンウイルスを用いて、培養基にウイルス保存溶液を添加することによって（ＭＯＩ＝４に
相当する）形質導入される。対応する対照培養物は、ＧＦＰレチンウイルスで形質導入さ
れる。形質導入後８時間、培地を新鮮な培地（ＤＩＶ１）で交換する。
【０４２１】
運動ニューロンの生存は、ＤＩＶ３にて、２重皿の中央に位置する予め定めておいた１
．５ｃｍ２の領域中で、長い軸索過程を有する大きな相−明白な（phase-bright）ニュー
ロンの数を計数することによって定量化される。
【０４２２】
結果の解釈
このアッセイの保護効果は、ＡＬＳ、脊髄損傷、ＳＭＡ（脊髄性筋萎縮症）、ＤＭＤ（
デュシェンヌ型筋ジストロフィー）を含む運動ニューロン疾患における治療潜在性を示す
。
【０４２３】
実施例１１：ドーパミン作動性神経栄養活性のバイオアッセイ
培養条件
分離された中脳細胞培養物は、僅かに修正を加えて、前記のように（Friedman  and  M
ytilineou  1987  Neurosci.  Lett.  79：65-72）、調製される。簡単には、妊娠１３〜
１６日齢のスプレーグ−ドーリーラット胚の脳からの頭側中脳被蓋を、滅菌条件にて顕微
鏡下で切り出し、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋不含ダルベッコリン酸緩衝塩（ギブコ（Gibco
）、ゲーサーズバーグ、モルドバ）中に集め、温和な粉砕により機械的に分離した。細胞
を、直径１６ｍｍの組織培養ウェル（ファルコン（Falcon）、リンカンパーク、ニュージ
ャージー州）に、４００μｌの培地を含むウェルあたり１００μｌ撒き、密度２．５〜３
．５×１０５細胞／ウェルを与える。培養物を、ｐＨ８．４の１０ｍＭボロン酸ナトリウ
ム中のポリ−Ｌ−オルニチン０．１ｍｇ／ｍｌ溶液に３７℃で３時間曝露し、ミリ（mill
i）−ＱＨ２Ｏ中で３回洗浄し、一回イーグル均衡塩類溶液（ギブコ）中で洗浄する。栄
養培地（１０／１０）は、グルコース（３３ｍＭ）、炭酸水素ナトリウム（２４．５ｍＭ
）、グルタミン（２ｍＭ）、ヘペス（１５ｍＭ）、ペニシリンＧ（５Ｕ／ｍｌ）、ストレ
プトマイシン（５μｇ／ｍｌ）、１０％熱不活化胎児ウシ血清（ギブコ）および１０％熱
不活化ウマ血清（ギブコ）を含む、最小必須培地（ＭＥＭ、ギブコ）からなる。培養物を
、６．５％ＣＯ２を含む水−飽和雰囲気にて３７℃にて維持する。３時間後に、大部分の
細胞はウェルの底に接着しており、培地を５００μｌの新鮮な培地に交換する。この時に
、ドーパミン作動性神経栄養活性についてアッセイされるべき試料の系列希釈物（馴化培
地）を、２重に、各ウェルに加え、そのプレートを３７℃のインキュベーターにてインキ
ュベートする。１週間後、細胞物を、過剰なグリア増殖を防ぐため、フルオロデオキシウ
リジン（１３μｇ／ｍｌ）およびウリジン（３３μｇ／ｍｌ）で２４時間処理し、次いで
胎児ウシ血清を除く上記の培地で栄養を与える。栄養供給培地は１週間で交換する。
【０４２４】
別には、血清が蛋白質混合物、ホルモンおよび塩の混合物により置換されている、化学
的に合成された無血清培地を用いる。合成培地（ＤＭ）は、トランスフェリン（１００μ
ｇ／ｍｌ）、インスリン（２５μｇ／ｍｌ）、プトレッシン（６０μＭ）、プロゲステロ
ン（２０ｎＭ）、亜セレン酸ナトリウム（３０ｎＭ）、ペニシリンＧ（５Ｕ／ｍｌ）およ
びストレプトマイシン（５μｇ／ｍｌ）が補充された、グルコース（３３ｍＭ）、グルタ
ミン（２ｍＭ）ＮａＨＣＯ３（２４．５ｍＭ）、ヘペス（１５ｍＭ）を含む、ＭＥＭおよ
びＦ１２栄養素混合物の混合物（両方ともギブコ、１：１vol/vol）から成る。ＤＭのモ
ル浸透圧濃度は、ミリ−Ｑ−Ｈ２Ｏ（１１０−１２５ｍｌＨ２Ｏ／ｌ）の添加により３２
５に調節される。
【０４２５】
ドーパミン作動性ニューロンの機能状態は、Karlssonら、2002,  Brain  Res.  2002  
Nov  15;955（1-2）：268-80に記載されるように、ドーパミン作動性ニューロンにおいて
特異的な「補足体」トランスポーターを通じたドーパミンの取り込みを測定することによ
って、および免疫組織学を用いた、ドーパミン合成酵素チロシン水酸化酵素に陽性なニュ
ーロンお数を計数することによって、アッセイすることができる。
【０４２６】
試料調製
中脳細胞培養物におけるドーパミン作動性神経栄養活性のアッセイ前に、全ての馴化培
地試料を以下のように脱塩する。１００μｌの培地１０／１０（担体として）をセントリ
コン−１０（アミコン）に加え、１０分間放置する。アッセイされるべき試料の一部をセ
ントリコンに加え、次に、重炭酸塩を含まないが、１０ｍＭヘペス、ｐＨ７．２を含む、
１ｍｌのダルベッコ高グルコース改変イーグル培地（溶液Ａ）を加え、５,０００×ｇで
７０分間遠心した。その残留物（retentate）（約０．１ｍｌ）を新鮮な１．１ｍｌの溶
液Ａに戻し、２回再濃縮する。試料を、培地ウェルに添加する前に、０．１１μｍのウル
トラフリーＭＣ滅菌デュラポア（Durapore）ユニット（ミリポア（Millipore）、ベッド
フォード、マサチューセッツ州）に通じて濾過する。
【０４２７】
３Ｈ−ドーパミン取り込み
トリチウム化ドーパミン（3H-DA）の取り込みは、（FriedmanおよびMytilineou（1987
）Neurosci.  Lett.  79：65-72）にてすでに記載された内容に少し修正を加えて、６日
または７日に培地中で行い、全ての溶液は３７℃で維持する。簡単には、培養基を取り除
き、５．６ｍＭグルコース、１．３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１ｍＭアスコルビン酸および０
．５ｍＭパルギリン、モノアミン酸化酵素の阻害剤を含むクレブス−リンゲル（Krebs-Ri
nger's）リン酸緩衝液、ｐＨ７．４からなる取り込み緩衝液０．２５ｍｌで２回ゆすぐ。
その培養物を、０．２５ｍｌの５０ｎＭ  ３Ｈ−ＤＡ（ニュー・イングランド・ニューク
レア（New  England  Nuclear）、ボストン、マサチューセッツ州.  sp.  act  36-37  
Ｃｉ／ｍｍｏｌ）と一緒に、３７℃で１５分間インキュベートする。３Ｈ−ＤＡの取り込
みは、インキュベーション混合物を取り除くことによって停止され、次いで、細胞を取り
込み緩衝液０．５ｍｌで２回洗浄する。細胞から３Ｈ−ＤＡを放出させるために、培養物
を０．５ｍｌの９５％エタノールを用いて、３７℃で３０分間インキュベートする。空試
験値は、取り込み緩衝液０．５ｍＭ  ＧＢＲ−１２９０９（ＲＢＩ）に、ドーパミン作動
性ニューロンの高親和性の取り込みポンプの特異的な阻害剤（Heikkilaら、1984  Euro  
J.  Pharmacol.  103：241-48）を加えることによって得られる。
【０４２８】
ＴＨ陽性ニューロン数の増加および／または対照処理と比較して３Ｈ−ドーパミンの取
り込みの増加は、パーキンソン病におけるＮｓＧ３３の可能性ある機能であることを示唆
する。
【０４２９】
実施例１２  線状体内（instrastriatal）６−ＯＨＤＡ損傷モデルにおける生体内での
黒質ドーパミンニューロンの神経保護の評価
ＶＳＶ−Ｇ偽型（ｒＬＶ）ベクターが以前に記載されたように作製される（Zufferey  
ら、1997,  J.  Virol,  73：2886-2892；Rosenbladら、In  vivo  protection  of  nig
ral  dopamine  neurons  by  lentiviral  gene  transfer  of  the  novel  GDNF-fam
ily  member  neublastin/artemin.    Mol  Cell  Neurosci.  2000  Feb;15（2）：199
-214.）。簡単には、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）またはＮｓＧ３３のｃＤＮＡを運搬する
導入プラスミドｐＨＲ’ＣＭＶ−Ｗを、ヘルパーファージミドｐＭＤ．ＧおよびｐＣＭＶ
ＤＲ８．９１と共に、２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトする。ビリオンを含む上清を
トランスフェクションの２日および３日後に回収し、１１６０００ｇの超遠心により濃縮
する。ｒＬＶ−ＧＦＰベクター保存液の力価は、２９３Ｔ細胞の濃縮された上清の系列希
釈物により決定され、１．１×１０８ＴＵ／ｍｌであった。ウイルス粒子の力価は、以前
記載されたように（von  Schwedler  ら、Vif  is  crucial  for  human  immunodefici
ency  virus  type  1  proviral  DNA  synthesis  in  infected  cells.    Virol.  
1993  Aug;67（8）：4945-55.）、ＲＮＡスロットブロット技術を用いてｒＬＶ−ＮｓＧ
３３およびｒＬＶ−ＧＦＰウイルス保存液について決定され、ｒＬＶ−ＧＦＰについて得
られたＴＵとウイルス粒子力価との比率から、ｒＬＶ−ＮｓＧ３３ベクターの力価が１．
２×１０８ＴＵ／ｍｌであると見積もられた。
【０４３０】
実験動物を含む全ての作業は、ルンド大学の実験動物の使用に関する倫理委員会（the
Ethical  Committee  for  Use  of  Laboratory  Animals  at  Lund  University）
により確立されたガイドラインに沿って行われた。動物は、ラット飼料および水を摂取で
きる、１２：１２時間の明／暗周期で飼育される。メスのスプレーグ−ドーリーラット（
手術時に〜２２０ｇ）が用いられる。定位手術のために、動物は、ハロタンを用いて麻酔
をかけられ、総量２μｌで、ｒＬＶ−ＧＦＰ（ｎ＝８）またはｒＬＶ−ＮｓＧ３３の１：
２のウイルス保存液（１．０−１．２×１０５ＴＵ）を以下の条件：（１）ＡＰ＝＋１．
０ｍｍ、ＭＬ＝−２．６ｍｍ、ＤＶ＝−５．０および４．５ｍｍ、Ｔｂ＝０．０、および
（２）ＡＰ＝０．０ｍｍ、ＭＬ＝−３．７ｍｍ、ＤＶ＝−５．０および−４．５ｍｍ、Ｔ
ｂ＝０．０、で右側線条体に２本の管中に注射される。２週間後に、動物を再び麻酔にか
け、定位台に置く。６−ヒドロキシドーパミン注射（３μｌ媒体［０．２％アスコルビン
酸を含む塩類液］あたり２０μｇ［遊離塩基として計算される］）を、以下の条件：ＡＰ
＝＋０．５ｍｍ、ＭＬ＝−３．４ｍｍ、ＤＶ＝−５．０および−４．５ｍｍ、Ｔｂ＝０．
０で、右側線条体中に施す。
【０４３１】
損傷後４週で、動物をペントバルビタール（７０ｍｇ／ｋｇ、Apoteksbolaget、スウェ
ーデン）を用いて深い麻酔にかけ、室温で５０ｍｌの塩類液で経心臓灌流し、次いで２０
０ｍｌの氷冷リン酸緩衝液４％パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．２−７．４）を灌流する
。脳を同じ固定剤にて３〜６時間固定した後に、３０％スクロースに２４時間移し、凍結
したミクロトームを厚さ４０μｍの断面に６枚に切断する。
【０４３２】
黒質緻密部（substanita  nigra）におけるチロシン水酸化酵素−免疫活性の検出につ
いての免疫組織学は、以前に記載のように行われた（Rosenbladら、In  vivo  protectio
n  of  nigral  dopamine  neurons  by  lentiviral  gene  transfer  of  the  novel
GDNF-family  member  neublastin/artemin.    Mol  Cell  Neurosci.  2000  Feb;15
（2）：199-214）。ＴＨ−ＩＲおよびＶＭＡＴ−ＩＲの黒質ニューロンの数は、以前に記
載されたように（Sauer  &  Oertel,  1994,  Neuroscience  59：401-415）、ＳＮを通
じた３つの連続断面における副視索経路（accessory  optic  tract）の内側の尾核に対
して外側の全ての免疫反応ニューロンを顕微鏡下で計数することによって評価される。
【０４３３】
ＧＦＰ対照と比較したＴＨ−ＩＲの数の増加は、パーキンソン病の処置における機能の
強い示唆である。ＶＭＡＴ−ＩＲの数の増加も、この結論をさらに強く支持する。
【０４３４】
実施例１３：発生中のネズミＣＮＳ組織におけるＮｓＧ３３のリアル−タイムＰＣＲ分
析
材料および方法
プライマー：
以下のプライマーをリアル−タイムＰＣＲに用いた：
ｍＮｓＧ３３：
ｍＮｓＧ３３  イントロンスパン  ｂｐ２８４  ５’：５’−ＧＴＣＴＴＣＧＣＴＧＡＡ
ＣＧＴＡＴＧＡＣ−３’
ｍＮｓＧ３３  イントロンスパン  ｂｐ６２３  ３’：５’−ＣＴＧＡＴＴＣＴＴＧＣＡ
ＧＣＴＣＴＧＴＧ−３’。
ＧＡＰＤＨ：
ｍＧＡＰＤＨ−ｓ９０４：５’−ＡＡＣＡＧＣＡＡＣＴＣＣＣＡＣＴＣＴＴＣ−３’
ｍＧＡＰＤＨ−ａｓ１０６７：５’−ＴＧＧＴＣＣＡＧＧＧＴＴＴＣＴＴＡＣＴＣ−３’
。
【０４３５】
発生段階および生体マウスの種々の脳領域からの組織を分離し、トリゾール抽出により
ＲＮＡを調製した。次に、ＲＮｅａｓｙスピンカラムを用いたカラム上でＤＮＡｓｅ処理
を行って、微少量のｇＤＮＡを除去して、さらにＲＮＡを純化した。ＭｏＭＬＶ（スパー
スクリプト）から誘導されたＲＮＡｓｅＨ欠損逆転写酵素およびポリ−ｄＴプライマーを
用い、ｃＤＮＡを合成するために、２．５μｇのＲＮＡの一部を鋳型として用いた。全試
料からのｃＤＮＡは、変動を避けるために同じ母液を用いて同時に合成した。ｃＤＮＡ反
応の最終量は１２０μｌであり、凍結融解の繰り返しを避けるため、それを小分けにして
−８０℃で保存した。発生段階の脊髄（ＳＣ）におけるＮｓＧ３３の発生時の発現を分析
するために、生体マウスからの組織に加えて、１０．５、１１．５および１３．５日齢の
胚（それぞれＥ１０．５、Ｅ１１．５およびＥ１３．５）の組織から誘導されたｃＤＮＡ
を調製した。小脳（Ｃｂ）および大脳皮質（ＣＴＸ）におけるＮｓＧ３３発現の発生時の
必要性は、Ｐ１および生体組織から誘導されたｃＤＮＡを用いて分析した。
【０４３６】
リアル−タイムＰＣＲについて、およそ２０ｎｇのｃＤＮＡを鋳型として用いた。リア
ル−タイムＰＣＲは、Ｏｐｔｉｃｏｎ―２サーモサイクラー（MJ  Research）にて、ライ
トサイクラー−ファーストスタートＤＮＡ  マスター・サイバーグリーンＩキット（ロシ
ェ）を用いて行った。実験は、上記のプライマーを用いて２回行った。リアル−タイムＰ
ＣＲについて、標準曲線を、上記のプライマーを用いて調製したゲル精製ＰＣＲ産物の系
列希釈物により準備した。標準曲線は、全ての試料の交差点（crossing-point）の値（Ｃ
Ｔ）がＰＣＲ反応の指数関数領域の範囲内にあることを確認するために、および最終の発
現レベルを計算するために用いた。全てのＲＴ−ＰＣＲ増幅は、ライトサイクラーキット
に含まれる、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１２％スクロースおよび１×反応緩衝液を含む１０μ
ｌの総量において実施された。ＰＣＲサイクルプロフィールは、１０分の前−変性工程９
８℃、および３５回の３工程サイクル、９８℃を１０秒、６２℃を２０秒、および７２℃
を２０秒からなる。各サイクルの伸長工程に続いて、プレートの読み取り工程を加え（８
０℃、２秒）、新たに形成されたＰＣＲ産物を定量化した。増幅反応の特異性は、計数値
取得しながら５２℃から９５℃に温度をゆっくり上昇させることによる、ＰＣＲ断片の融
解曲線分析を実施することによって決定した。
【０４３７】
規格化を目的として、全てのｃＤＮＡは、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対する
プライマーを用いたリアル−タイムＰＣＲにかけた。ＧＡＰＤＨのリアル−タイムＰＣＲ
分析を標的遺伝子に対して行った。ハウスキーピング発現パターンを、それぞれの標準曲
線から決定し、比発現レベルを用いて、分析した組織における標的遺伝子の発現レベルを
規格化した。ＧＡＰＤＨの規格化に続いて、標的遺伝子の比発現レベルを、参照値として
最も低い発現を示した組織を用いて計算した。
【０４３８】
結果：
比ＧＡＰＤＨ発現は、異なる日齢および組織間でわずか１．０から１．３にしか変化せ
ず、ＧＡＰＤＨが規格化に用いられ得ることを示した。
【０４３９】
マウスＮｓＧ３３についてのリアル−タイムＰＣＲの結果は、図１０Ａおよび１０Ｂに
示される。図１０Ａから、ＮｓＧ３３発現が、およそＥ１１．５で頂点に達したため、脊
髄の発達時に調節されていることは明らかである。図１０Ｂから、ＮｓＧ３３が、大脳皮
質ではなく小脳で出生後の発育時に調整されていることは明らかである。
【０４４０】
ＮｓＧ３３は、その別の特徴と組み合わせて、神経障害の処置のための治療上の使用を
強く示唆する発現パターンを示す成長因子またはホルモンの特徴を有し、種を超えて非常
に保存されている分泌型の分子である。
【０４４１】
脊髄における一時的な発現パターンは、ＣＮＳのこの領域での神経前駆細胞の増殖、分
化および／または生存における役割を示している。このことは、神経変性疾患、および脊
髄損傷、ＡＬＳおよび脊髄性筋萎縮症を含む背傷の損傷の処置についての治療上の関連性
と一致する。さらに、この発現プロフィールは、脊髄から誘導された神経前駆細胞の伸展
および／または分化についての試験管内試薬としての潜在能力を示している。
【０４４２】
生体小脳におけるＮｓＧ３３発現の上方調節は、１つまたはそれ以上の小脳型の維持お
よび／または生存におけるこの因子の役割を示している。これは、限定されるものではな
いが、感覚性運動失調症、多発性硬化症、神経変性脊髄小脳障害、遺伝性運動失調症、小
脳萎縮（例えば、オリーブ橋小脳萎縮症（ＯＰＣＡ）、シャイ・ドレーガー症候群（多系
統萎縮症））、およびアルコール中毒を含む小脳障害についての治療上の関連性と一致す
る。
【０４４３】
実施例１４：ヒト神経前駆細胞の分化におけるｈＮｓＧ３３の効果
馴化培地の生成
ｈＮｓＧ３３分泌細胞は、ＡＲＰＥ−１９細胞をｈＮｓＧ３３  ｃＤＮＡを含むレンチ
ウイルス構築物、ＬＶ−ｓＣ．ＮｓＧ３３を用いて形質導入することによって作られる。
簡単には、細胞を５０〜７０％細胞密集度（１×１０５細胞／ウェル）で６ウェル・プレ
ート中、１０％ＦＣＳを含む、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）に撒く。一晩、インキュベー
トした後に、ポリブレン（５μｇ／ｍｌ）およびウイルスを細胞に加えた。翌日、細胞を
Ｔ２５フラスコに継代した。形質導入された細胞の一部を、さらなる継代の後に凍結した
。
【０４４４】
形質導入されたおよび親(対照)ARPE-19培養から馴化培地を回収するために、細胞をT25
フラスコに撒いた。インキュベーションの4日後に、培地を無血清HSC培地に交換した。さ
らに24時間後に、対照およびNsG33 ARPE-19細胞から馴化培地を回収し、そしてhNS1培養
物に添加する前に、3000×g、5分の遠心分離にかけた。
【０４４５】
ｈＮＳ１細胞における試験
ｈＮＳ１（以前はＨＮＳＣ．１００と称される）は、胚前脳から誘導された多能性クロ
ーン細胞系であり、以前に記載されている（Villaら、Exp  Neurol,  2000,  161（1）：
67-84）。Villaら、2004,  Exp  Cell  Res.  Apr  1;294（2）：559-70）。細胞は、マ
ドリード、28049、スペインにあるアルベルト・マーティネス・セラーノ、分子生物学部
門、分子生物セヴェロ・オチョアセンター、マドリード−ＣＳＩＣ自治大学、カントブラ
ンコキャンパス（Alberto  Martinez  Serrano,  Department  of  Molecular  Biology,
Center  of  Molecular  Biology  Severo  Ochoa,  Autonomous  University  of  Ma
drid-CSIC,  Campus  Cantoblanco）から入手した。ｈＮＳ１培養は、２０ｎｇ／ｍｌの
ＥＧＦおよびｂＦＧＦを含む無血清ＨＳＣ培地にて、３７℃、５％ＣＯ２で、ポリ−リジ
ン被覆されたＴＣフラスコ中で行われた。ＨＳＣ培地は、Ｎ２および１％ＢＳＡを含むＤ
ＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）からなる。分化実験について、ｈＮＳ１細胞は、分裂促進剤を
含まない、０．５％ＦＢＳ含有ＨＳＣ培地中、密度１０５細胞／ｃｍ２で５０μｇ／ｍｌ
のポリ−リジンで予め被覆されたカバーガラスに撒いた。撒いた後１日で、分化培地を親
ＡＲＰＥ−１９細胞（Ｍｃ  Ｃ）またはレンチウイルス  ｈＮｓＧ３３で形質導入された
ＡＲＰＥ−１０細胞（Ｍｃ  ３３）のいずれかから回収した１００％馴化培地と交換した
。対照培地は、馴化ＨＳＣ培地を与えた。培地の３分の２を、翌日に交換し、次いで２日
または３日目に交換した。植えた後４日で、培養物を、４％パラホルムアルデヒド中で１
０分間固定化し、免疫組織学的に染色した。
【０４４６】
免疫組織学
10%正常ウマ血清でブロッキングした後、培養物をGFAP(pAbラビット抗-ウシ、1:1000、
DAKO)およびβ-チューブリン(mAbクローンSCL:3D10、1:1000、シグマ)に対する1次抗体と
共にインキュベートした。ゆすいだ後に、培養物をビオチン化ウマ-抗-マウス2次抗体(ベ
クター・ラボラトリーズ(Vector Laboratories)、1:200)と共にインキュベートし、次い
でStrep-Cy3(ジャクソン・イムノリサーチ(Jackson InmunoResearch)、1/200)およびアレ
クサ・フルオロ(Alexa Fluor)488-標識化ヤギ抗-ラビット(モレキュラー・プローブ(Mole
cular Probes)、1/200)それぞれを用いて検出した。細胞核を、0.2μg/mlのヘキスト(Hoe
chst)33258を用いて対比染色した(Villaら、2004)。分析のために、GFAPおよびβチュー
ブリン陽性細胞に加えて細胞(核)の総数を、63×対物レンズを用いた共焦点顕微鏡により
計数した。
【０４４７】
結果
図11Aにおいて示されるように、hNsG33cDNAを含むレンチウイルス構築物(Cm 33)を用い
て形質導入されたARPE-19細胞からの馴化培地の添加は、対照培養物(hNS1)に比べてβ-II
I-チューブリン陽性ニューロンの百分率を73%増加させたが、対照ARPEー9細胞からの馴化
培地(Cm C)は影響を与えなかった。hNS1培地およびCmC培地の両方と比較してCm33培地で
観察された増加は、t検定において統計学的に有意であった(P<0.05)。
【０４４８】
ＮｓＧ３３形質導入されたＡＲＰＥ−１９細胞からの馴化培地もまた、ｈＮＳ１倍地と
比較してＧＦＡＰ陽性グリア細胞の数を有意に増加させるようである（それぞれ１７対１
１％）。しかしながら、同様の増加が対照馴化培地（Ｃｍ  Ｃ）でも観察されたが（それ
ぞれ１６対１１％）、これは統計学的に有意ではかった。対照のＡＲＰＥ−１９細胞（Ｃ
ｍ  Ｃ）およびｈＮｓＧ３３  ｃＤＮＡを含むレンチウイルス構築物で形質導入されたＡ
ＲＰＥ−１９細胞の添加は、図１１Ｂに示されるように細胞の総数を有意に変化させなか
った。
【０４４９】
増加されたニューロン数は、培養物中に存在する神経前駆体細胞の増大された分化およ
び／または分化ニューロンの増大された生存効果から生じ得る。これらのデータは、Ｎｓ
Ｇ３３の神経保護および再生の潜在能力と一致する。
【０４５０】
実施例１５：線条体培養におけるＮｓＧ３３効果の試験
試験のための馴化培地の調製
馴化培地は、ｈＮｓＧ３３  ｃＤＮＡ（ｐＨｓＣ．ＮｓＧ３３．Ｗ）を含む発現構築物
で一過性トランスフェクトされたＡＲＰＥ−１９およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞、加えて、Ｍ
ＯＣＫトランスフェクトされたＡＲＰＥ−１９およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞から調製した。
【０４５１】
ＡＲＰＥ−１９細胞を、６ウェルプレート中、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ：Ｆ１２（
１：１）に撒いた（１×１０５細胞／ウェル）。一晩インキュベートした後、細胞を、製
造元の取扱書（ロッシュ）に従って、３μｇＤＮＡ／ウェルを使用して、ヒュージーン（
Fugene）でトランスフェクトした。
【０４５２】
ＨＥＫ２９３細胞を、６ウェルプレート中、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭに撒いた（３
×１０５細胞／ウェル）。一晩インキュベートした後、細胞を、製造元の取扱書（インビ
トロジェン）に従って、２μｇＤＮＡ／ウェルを使用して、リポフェクトアミン＋でトラ
ンスフェクトした。
【０４５３】
トランスフェクション後日に、培地を、無血清DMEM:F12倍地に変更した。馴化の24時間
後に、培地をトランスフェクトした細胞から回収し、3000×g、5分間の遠心分離にかけた
。純化した馴化培地を、線条体培養物に添加する前に、DMEM:F12で希釈した(6:16)。NsG3
3 mRNAの発現は、hNsG33 cDNAに特異的なプライマーを用いた定量RT-PCRにより分析した
。
【０４５４】
定量RT-PCR
全RNAを、トリアゾール抽出によりトランスフェクト培養物から調製し、次いでRNeasy
スピンカラムを用いてカラム上でDNAse処理し、微少量のgDNAを取り除き、RNAをさらに純
化した。cDNAは、逆転写酵素を用いて合成され、およそ20ngの全RNAに対応する各cDNAを
、実施例5に記載のように、hNsG33プライマーを用いたリアル-タイムPCR発現分析のため
の鋳型として用いた。
【０４５５】
規格化の目的のために、全てのｃＤＮＡを、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対す
るプライマー４８４２および４８４３［４８４２：５’−ＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣ
ＧＧＡＧＴＣＡＡ−３’および４８４３：５’−ＧＡＴＣＴＣＧＣＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡ
ＴＧＧＴ−３’］を用いたリアル−タイムＰＣＲにかけた。ＧＡＰＤＨを用いた規格化に
続いて、標的遺伝子の比発現レベルを、参照値として最も低いｈＮｓＧ３３発現を示した
ｃＤＮＡ試料を用いて計算した。
【０４５６】
線条体培養の生成および試験
胚のラット線条体の細胞培養物は、本質的に以前に記載されたように調製した（Nakao
ら、1996  Exp.  Neurol.  138,  144-157）。簡単には、側方のおよび中央の神経節隆起
を、Ｅ１４．５ラット胚から選択的に切り出した（Sprague-Dawley,  B&K  Universal,  
Sweden）。組織片をトリプリン／ＤＮＡｓｅと一緒に３７℃でインキュベートし、ゆすぎ
、機械的に分離させた。分離した細胞を、予め１５ｍＭヘペス、１ｍＭピルビン酸ナトリ
ウムおよび１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地中の５０μｇ／ｍｌのポリ−ｌ−リジンおよ
び１０μｇ／μｌのラミニンで被覆された４ウェルチャンバースライドに撒いた（１００
，０００細胞／ｃｍ２）。試験管内で２日後に、培地を、上記のように作製された、１．
５ｍＭヘペス、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよびＢ２７（１：５０）を含む、ＮｓＧ３
３−またはＭＯＣＫトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはＡＲＰＥ−１９に
より非馴化または馴化された、無血清ＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１）に交換した。無血清培
地中でのインキュベーションの４日後に、培養物を免疫組織学のために処理した。
【０４５７】
免疫組織学
簡単には、細胞を４％パラホルムアルデヒド中で２０分間固定化した。５％ブロッキン
グ血清中で前インキュベートした後、培養物を、抗−β−ＩＩＩ−チューブリン抗体（シ
グマ、１：３３３）と一緒に室温で一晩インキュベートした。ゆすいだ後に、培養物をＦ
ＩＴＣ抱合ロバ−抗−マウス２次抗体（１：２００、ジャクソン・ラボ）で２時間、ＲＴ
にてインキュベートした。細胞核をＤＡＰＩで対比染色した。分析のために、細胞（核）
の総数およびβ−ＩＩＩ−チューブリン−陽性細胞の数を、４０×倍率を用いて、条件ご
とに１６の無作為の領域で計数した（平均総細胞数＝２６０）。
【０４５８】
結果
一過性にトランスフェクトされた培養物中のｈＮｓＧ３３  ｍＲＮＡの発現は、定量逆
転写ＰＣＲを用いて確認された。ｐＨｓＣ．ＮｓＧ３３．Ｗを用いて一過性にトランスフ
ェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ培養物において、トランスフェクトされていない培養物のレ
ベルよりも４０〜６０００倍高いｈＮｓＧ３３  ｍＲＮＡの規格化レベルが、ｑＲＴ−Ｐ
ＣＲにより決定された。また、トランスフェクトされたＡＲＰＥ−１９培養物においても
、高レベルのｈＮｓＧ３３  ｍＲＮＡが検出された（ＭＯＣＫトランスフェクト培養物中
の対照レベルの３０〜３５倍）。
【０４５９】
図１２に示されるように、ｈＮｓＧ３３  ｃＤＮＡを含む発現構築物でトランスフェク
トされたＡＲＰＥ−１９細胞からの馴化培地の添加は、ＭＯＣＫトランスフェクトＡＲＰ
Ｅ−１９細胞からの馴化培地を与えた培養物と比較して、線条体培養物中でβ−ＩＩＩ−
チューブリン陽性ニューロンの百分率を４９％増加させた（４８％対３２％）。この増加
は、ｔ検定において統計学的に有意であった。
【０４６０】
同様に、ニューロン百分率において３４％統計学的に有意な増加が、ＭＯＣＫトランス
フェクトされたＨＥＫ２９３培養物と比べて、ｈＮｓＧ３３構築物でトランスフェクトさ
れたＨＥＫ２９３細胞からの馴化培地を与えた培養物におて観察された。（５０％対３７
％）。
【０４６１】
いずれのＭＯＣＫトランスフェクトされた培養物からの馴化培地の添加も、非馴化培地
（ＵＣＭ）を与えた対照培養物と比べて、影響を及ぼさないことが観察された。ニューロ
ン百分率の増加は、ＤＡＰＩ染色された核を計数することから決定された細胞の総数の増
加ではなく、ｈＮｓＧ３３を含む培地を与えた培養物中のニューロンの増加した数が原因
であった。増加したニューロン数は、培養物中に存在する神経前駆体細胞の増大された分
化および／または分化した線条体ニューロンの増大した生存効果による結果であろう。こ
れらのデータは、ＮｓＧ３３の一般的な神経保護および再生、並びにハンチントン病にお
けるＮｓＧ３３の特異的な治療能力と一致する。
【図面の簡単な説明】
【０４６２】
【図１】ヒトNsG33におけるシグナルペプチドの存在および配置の予測を示す図であ    る。
【図２】ヒトNsG33の全長(配列番号3)、ヒトN末端ペプチド(配列番号19)、ヒトC末端    ペプチド(配列番号5)におけるプロットファン2.1蛋白質機能予測サーバーからの出力    を示す図である。
【図３ａ】ヒト、部分マウスおよびラットのNsG33のClustalW(1.82)多重配列アライ    メントを示す図である。
【図３ｂ】ヒト、マウスおよびラットのNsG33のClustalW(1.82)多重配列アライメン    トを示す図である。
【図４】NsG33におけるリアル-タイムPCRを示す図である。
【図５】国際公開第93/22437号パンフレット(Innogenetics SA)からの全長のヒトポ    リペプチド(Innog.)に対する全長のヒトNsG33ポリペプチドのアライン0アライメント    を示す図である。
【図６】ヒトNsG33cDNAおよびコードされるプレプロ-NsG33を示す図である。
【図７ａ】部分マウスNsG33cDNAおよびコードされるプレ-プロ-NsG33を示す図である    。
【図７ｂ】全長マウスNsG33cDNAおよびコードされるプレ-プロ-NsG33を示す図である    。
【図８】ラットNsG33cDNAおよびコードされるプレ-プロ-NsG33を示す図である。
【図９】無血清培地中のPC12生存におけるNsG33の効果を示す図である。
【図１０Ａ】胎齢E10.5、E11.5およびE13.5(それぞれ受胎後10.5、11.5および13.5日    )の発生時の骨髄における並びに成人の骨髄におけるGAPDHに対して規格化した、定量    PCRにより測定したmNsG33の比発現(最も低く発現した組織との比較)を示す。
【図１０Ｂ】2つの発育年齢(P1=出産後1日および成人)におけるマウスの脳(CTX=大脳    皮質、Cb=小脳)の2つの領域中のNsG33の比発現を示す。
【図１１Ａ】無条件の無血清培地を与えた分化hNS1培養物(hNS1)、対照のARPE-19細    胞からの馴化培地(Mc C)またはNsG33形質導入されたARPE-19培養物(Mc 33)におけるG    FAP陽性グリア細胞(灰色棒)およびβ-III-チューブリン(黒棒)の平均百分率を示す。
【図１１Ｂ】無条件の無血清培地を与えた分化hNS1培養物(hNS1)、対照のARPE-19細    胞からの馴化培地(Mc C)またはNsG33形質導入されたARPE-19培養物(Mc 33)において    、ヘキスト染色した核を40×対物を用いて計数することにより決定される、領域あた    りの細胞の総数を示す。
【図１２】DIV2での、無条件の無血清培地(UCM)を与えられたラット線条体培養物、M    OCK形質導入されたHEK293もしくはARPE-19細胞からの希釈された馴化培地(それぞれ    、293T-CMおよびARPE-CM)、または対応するNsG33形質導入された培養物からの希釈さ    れた馴化培養物(それぞれ、293T-CM33およびARPE-CM33)における、β-III-チューブ    リン陽性ニューロンの平均百分率を示す。
【図１】
0005514243.tif 000030
【図２】
0005514243.tif 000031
【図３】
0005514243.tif 000032
【図４】
0005514243.tif 000033
【図５】
0005514243.tif 000034
【図６】
0005514243.tif 000035
【図７ａ】
0005514243.tif 000036
【図７ｂ】
0005514243.tif 000037
【図８】
0005514243.tif 000038
【図９】
0005514243.tif 000039
【図１０】
0005514243.tif 000040
【図１１】
0005514243.tif 000041
【図１２】
0005514243.tif 000042
【配列表】
0005514243000001.app