(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）：
【化１】
0005469013.tif 000015
［式中、Ｒ１〜Ｒ５は、互いに独立して、Ｈ、ＯＨまたはＯＣＨ3であり、Ｒ１〜Ｒ５の少なくとも１つはＯＨである］
で示され、かつ、チロシナーゼ抑制活性を有する有効量のスペルミジン誘導体と、美容上または医薬上許容される賦形剤とを含有することを特徴とする皮膚美白用組成物。
【請求項２】
前記スペルミジン誘導体のＲ３がＯＨである請求項１に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項３】
前記スペルミジン誘導体のＲ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５がＨであり、Ｒ３がＯＨであるか、あるいは、前記スペルミジン誘導体のＲ１、Ｒ２およびＲ５がＨであり、Ｒ３がＯＨであり、Ｒ４がＯＣＨ3であるか、あるいは、前記スペルミジン誘導体のＲ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５がＨであり、Ｒ１がＯＨであるか、あるいは、前記スペルミジン誘導体のＲ１、Ｒ２およびＲ５がＨであり、Ｒ３およびＲ４がＯＨである請求項１に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項４】
前記スペルミジン誘導体が、濃度１００μｇ／ｍＬで、１０％より大きいチロシナーゼ抑制率を有する請求項１〜３のいずれか１項に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項５】
前記スペルミジン誘導体の５０％チロシナーゼ抑制濃度（ＩＣ50）が４５０μｇ／ｍＬより小さい請求項１〜４のいずれか１項に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項６】
前記スペルミジン誘導体が下記式（ＩＩ）：
【化２】
0005469013.tif 000016
で示される請求項１に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項７】
前記スペルミジン誘導体が、蓮心（ａ ｂｕｄ ｏｆ ａ Ｎｅｌｕｍｂｏ ｎｕｃｉｆｅｒａ Ｇａｅｒｔｎ）から少なくとも酢酸エチルを使って抽出した抽出物である請求項６に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項８】
前記スペルミジン誘導体が、濃度１００μｇ／ｍＬで、６０％以上のチロシナーゼ抑制率を有する請求項６または７に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項９】
前記スペルミジン誘導体の５０％チロシナーゼ抑制濃度（ＩＣ50）が３７μｇ／ｍＬより小さい請求項６〜８のいずれか１項に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項１０】
前記スペルミジン誘導体が下記式（ＩＩＩ）：
【化３】
0005469013.tif 000017
で示される請求項１に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項１１】
前記スペルミジン誘導体が、濃度１００μｇ／ｍＬで、６０％以上のチロシナーゼ抑制率を有する請求項１０に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項１２】
前記スペルミジン誘導体の５０％チロシナーゼ抑制濃度（ＩＣ50）が１９μｇ／ｍＬより小さい請求項１０または１１に記載の皮膚美白用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚美白用組成物に関し、より詳しくは、チロシナーゼ抑制活性を有するスペルミジン誘導体を含有する、皮膚美白用組成物、植物抽出皮膚美白組成物、および皮膚美白効果を有する組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
チロシナーゼの触媒作用により、メラニン細胞に元々存在するチロシンは、Ｌ−ドーパに変換され、次いで、Ｌ−ドーパは、Ｌ−ドパキノンに変換される。その後、Ｌ−ドパキノンは、一連の酸化作用により、メラニンを形成する。メラニンは、皮膚の黒ずみの原因である。チロシナーゼは、メラニンの合成反応における唯一の重要な酵素である。それゆえ、チロシナーゼを抑制すれば、チロシンがＬ−ドーパに変換され、Ｌ−ドーパがＬ−ドパキノンに変換されるという、この２つの酸化過程を遅延させることができる。したがって、メラニン細胞中のチロシナーゼを抑制することにより、メラニン合成を減少させて、美白効果を達成することができる。
【０００３】
メラニン合成を抑制するのに用いることが公知である化合物としては、例えば、ヒドロキノン、エラグ酸、コウジ酸、アルブチン、グリコペプチドおよびアゼライン酸などが挙げられる。
【０００４】
蓮は、スイレン科（Ｎｙｍｐｈａｅａｃｅａｅ）に属する花ハス（Ｎｅｌｕｍｂｏ  Ｎｕｃｉｆｅｒａ  Ｇａｅｒｔｎ）の植物全体である。文献記載によると、花ハスの化学成分は、アノナイン（ａｎｏｎａｉｎｅ）、アシミロビン（ａｓｉｍｉｌｏｂｉｎｅ）、デヒドロヌシフェリン（ｄｅｈｙｄｒｏｎｕｃｉｆｅｒｉｎｅ）、デヒドロレメリン（ｄｅｈｙｄｒｏｒｏｅｍｅｒｉｎｅ）、デヒドロアノナイン（ｄｅｈｙｄｒｏａｎｏｎａｉｎｅ）、ジメチルコクラウリン（ｄｅｍｅｔｈｙｌｃｏｃｌａｕｒｉｎｅ）、リエンシニン（ｌｉｅｎｓｉｎｉｎｅ）、イソリエンシニン  （ｉｓｏｌｉｅｎｓｉｎｉｎｅ）などである。本発明者らは、生物活性誘導分画法を用いることにより、皮膚美白成分として、スペルミジン誘導体のケアヤニジン（ｋｅａｙａｎｉｄｉｎｅ）化合物を見出した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】バイオロジカル・アンド・ファーマシューティカル・ブレティン（Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．），２００２年，第２５巻，第８号，ｐ．１０４５−１０４８
【非特許文献２】バイオロジカル・アンド・ファーマシューティカル・ブレティン（Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．），２００４年，第２７巻，第１２号，ｐ．１９７６−１９７８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、皮膚美白用組成物、植物抽出皮膚美白組成物、および皮膚美白効果を有する組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、下記式（Ｉ）：
【０００８】
【化１】
0005469013.tif 000002
【０００９】
［式中、Ｒ１〜Ｒ５は、互いに独立して、Ｈ、ＯＨまたはＯＣＨ３であり、Ｒ１〜Ｒ５の少なくとも１つはＯＨである］
で示され、かつ、チロシナーゼ抑制活性を有するスペルミジン誘導体と、美容上または医薬上許容される賦形剤を含有することを特徴とする皮膚美白用組成物を提供する。
【００１０】
また、本発明は、下記式（Ｉ）：
【００１１】
【化２】
0005469013.tif 000003
【００１２】
［式中、Ｒ１〜Ｒ５は、互いに独立して、Ｈ、ＯＨまたはＯＣＨ３であり、Ｒ１〜Ｒ５の少なくとも１つはＯＨである］
で示され、チロシナーゼ抑制活性を有し、かつ、植物材料から抽出された有効量のスペルミジン誘導体と、美容上または医薬上許容される賦形剤とを含有することを特徴とする植物抽出皮膚美白組成物を提供する。
【００１３】
さらに、本発明は、下記式（Ｉ）：
【００１４】
【化３】
0005469013.tif 000004
【００１５】
［式中、Ｒ１〜Ｒ５は、互いに独立して、Ｈ、ＯＨまたはＯＣＨ3であり、Ｒ１〜Ｒ５の少なくとも１つはＯＨである］
で示され、かつ、チロシナーゼ抑制活性を有する有効量の蓮心（ａ ｂｕｄ ｏｆ ａ Ｎｅｌｕｍｂｏ ｎｕｃｉｆｅｒａ Ｇａｅｒｔｎ）抽出物と、美容上または医薬上許容される賦形剤とを含有することを特徴とする皮膚美白効果を有する組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、皮膚美白成分として、チロシナーゼ抑制活性を有する有効量のスペルミジン誘導体を含有する皮膚美白用組成物、植物抽出皮膚美白組成物、および皮膚美白効果を有する組成物が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明においては、スペルミジン誘導体を含有する組成物が皮膚美白用組成物として用いられ、チロシナーゼを抑制し、皮膚を美白する。
【００１８】
本発明の組成物は、有効量のスペルミジン誘導体と美容上または医薬上許容される賦形剤とを含有する。スペルミジン誘導体は、チロシナーゼ抑制活性を有する。スペルミジン誘導体は、下記式（Ｉ）：
【００１９】
【化４】
0005469013.tif 000005
で示される。
【００２０】
上記式（Ｉ）において、Ｒ１〜Ｒ５は、互いに独立して、Ｈ、ＯＨまたはＯＣＨ３であり、Ｒ１〜Ｒ５の少なくとも１つはＯＨである。ある具体例では、Ｒ３はＯＨである。ある具体例では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５はＨであり、Ｒ３はＯＨである。別の具体例では、Ｒ１、Ｒ２およびＲ５はＨであり、Ｒ３はＯＨであり、Ｒ４はＯＣＨ３である。さらに別の具体例では、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はＨであり、Ｒ１はＯＨである。さらに別の具体例では、Ｒ１、Ｒ２およびＲ５はＨであり、Ｒ３およびＲ４はＯＨである。
【００２１】
上記スペルミジン誘導体は、植物の抽出物であってもよい。植物としては、例えば、蓮心（ａ ｂｕｄ ｏｆ ａ Ｎｅｌｕｍｂｏ ｎｕｃｉｆｅｒａ Ｇａｅｒｔｎ）、落花生（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）、青蒿（セイコウ）（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ｃａｒｕｉｆｏｌｉａ）、柏（Ｑｕｅｒｃｕｓ ｄｅｎｔａｔｅ）、バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）、キツネノマゴ科（Ａｃａｎｔｈａｃｅａｅ）、パンダ科（Ｐａｎｄａｃｅａｅ）などが挙げられる。これらの植物は、単独で用いても２種以上を併用してもよい。ある具体例では、植物は蓮心である。
【００２２】
植物からスペルミジン誘導体を抽出する方法は、適当な溶剤を用いて、植物に抽出プロセスを実行する。ある具体例では、アセトンを用いて、植物に抽出プロセスを実行する。別の具体例では、植物をアセトンで抽出した後、他の溶剤を用いて、さらに抽出する。他の溶剤としては、例えば、ｎ−へキサン、エチルエーテル、ジクロロメタン、酢酸エチルなどが挙げられる。これらの溶剤は、単独で用いても２種以上を併用してもよい。
【００２３】
上記スペルミジン誘導体の５０％チロシナーゼ抑制濃度（ＩＣ５０）は、約４５０μｇ／ｍＬより小さい。ある具体例では、スペルミジン誘導体の５０％チロシナーゼ抑制濃度（ＩＣ５０）は、約３７μｇ／ｍＬより小さい。別の具体例では、スペルミジン誘導体の５０％チロシナーゼ抑制濃度（ＩＣ５０）は、約１９μｇ／ｍＬより小さい。
【００２４】
上記スペルミジン誘導体は、濃度１００μｇ／ｍＬで、約１０％より大きいチロシナーゼ抑制率を有する。ある具体例では、スペルミジン誘導体は、濃度１００μｇ／ｍＬで、約１０％〜約６５％のチロシナーゼ抑制率を有する。
【００２５】
ある具体例では、スペルミジン誘導体は、下記式（ＩＩ）：
【００２６】
【化５】
0005469013.tif 000006
で示される。
【００２７】
上記式（ＩＩ）で示されるスペルミジン誘導体は、植物の抽出物であってもよい。植物としては、例えば、蓮心（ａ ｂｕｄ ｏｆ ａ Ｎｅｌｕｍｂｏ ｎｕｃｉｆｅｒａ Ｇａｅｒｔｎ）、落花生（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）、青蒿（セイコウ）（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ｃａｒｕｉｆｏｌｉａ）、柏（Ｑｕｅｒｃｕｓ ｄｅｎｔａｔｅ）、バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）、キツネノマゴ科（Ａｃａｎｔｈａｃｅａｅ）、パンダ科（Ｐａｎｄａｃｅａｅ）などが挙げられる。これらの植物は、単独で用いても２種以上を併用してもよい。ある具体例では、植物は蓮心である。
【００２８】
上記スペルミジン誘導体の５０％チロシナーゼ抑制濃度（ＩＣ５０）は、約３７μｇ／ｍＬより小さい。上記スペルミジン誘導体は、濃度１００μｇ／ｍＬで、６０％以上、好ましくは約６２％のチロシナーゼ抑制率を有する。
【００２９】
別の具体例では、スペルミジン誘導体は、下記式（ＩＩＩ）：
【００３０】
【化６】
0005469013.tif 000007
で示される。
【００３１】
上記スペルミジン誘導体の５０％チロシナーゼ抑制濃度（ＩＣ５０）は、約１９μｇ／ｍＬより小さい。上記スペルミジン誘導体は、濃度１００μｇ／ｍＬで、６０％以上、好ましくは約６３％のチロシナーゼ抑制率を有する。
【００３２】
別の様態で、本発明は、植物抽出美白組成物を提供する。植物抽出美白組成物は、植物から抽出された有効量のスペルミジン誘導体と美容上または医薬上許容される賦形剤とを含有する。スペルミジン誘導体は、下記式（Ｉ）：
【００３３】
【化７】
0005469013.tif 000008
で示される。
【００３４】
上記式（Ｉ）において、Ｒ１〜Ｒ５は、互いに独立して、Ｈ、ＯＨまたはＯＣＨ３であり、Ｒ１〜Ｒ５の少なくとも１つはＯＨである。ある具体例では、Ｒ３はＯＨである。ある具体例では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５はＨであり、Ｒ３はＯＨである。別の具体例では、Ｒ１、Ｒ２およびＲ５はＨであり、Ｒ３はＯＨであり、Ｒ４はＯＣＨ３である。さらに別の具体例では、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はＨであり、Ｒ１はＯＨである。さらに別の具体例では、Ｒ１、Ｒ２およびＲ５はＨであり、Ｒ３およびＲ４はＯＨである。
【００３５】
上記スペルミジン誘導体は、植物の抽出物であってもよい。植物としては、例えば、蓮心（ａ ｂｕｄ ｏｆ ａ Ｎｅｌｕｍｂｏ ｎｕｃｉｆｅｒａ Ｇａｅｒｔｎ）、落花生（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）、青蒿（セイコウ）（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ｃａｒｕｉｆｏｌｉａ）、柏（Ｑｕｅｒｃｕｓ ｄｅｎｔａｔｅ）、バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）、キツネノマゴ科（Ａｃａｎｔｈａｃｅａｅ）、パンダ科（Ｐａｎｄａｃｅａｅ）などが挙げられる。これらの植物は、単独で用いても２種以上を併用してもよい。ある具体例では、植物は蓮心である。
【００３６】
植物からスペルミジン誘導体を抽出する方法は、適当な溶剤を用いて、植物に抽出プロセスを実行する。ある具体例では、アセトンを用いて、植物に抽出プロセスを実行する。別の具体例では、植物をアセトンで抽出した後、他の溶剤を用いて、さらに抽出する。他の溶剤としては、例えば、ｎ−へキサン、エチルエーテル、ジクロロメタン、酢酸エチルなどが挙げられる。これらの溶剤は、単独で用いても２種以上を併用してもよい。
【００３７】
上記スペルミジン誘導体の５０％チロシナーゼ抑制濃度（ＩＣ５０）は、約４５０μｇ／ｍＬより小さい。ある具体例では、スペルミジン誘導体の５０％チロシナーゼ抑制濃度（ＩＣ５０）は、約１９μｇ／ｍＬより小さい。さらに、上記スペルミジン誘導体は、濃度１００μｇ／ｍＬで、約１０％より大きいチロシナーゼ抑制率を有する。ある具体例では、スペルミジン誘導体は、濃度１００μｇ／ｍＬで、約１０％〜約６５％のチロシナーゼ抑制率を有する。
【００３８】
ある具体例では、上記スペルミジン誘導体は、下記式（ＩＩ）：
【００３９】
【化８】
0005469013.tif 000009
で示される。
【００４０】
上記式（ＩＩ）で示されるスペルミジン誘導体は、植物の抽出物であってもよい。植物としては、例えば、蓮心（ａ ｂｕｄ ｏｆ ａ Ｎｅｌｕｍｂｏ ｎｕｃｉｆｅｒａ Ｇａｅｒｔｎ）、落花生（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）、青蒿（セイコウ）（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ｃａｒｕｉｆｏｌｉａ）、柏（Ｑｕｅｒｃｕｓ ｄｅｎｔａｔｅ）、バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）、キツネノマゴ科（Ａｃａｎｔｈａｃｅａｅ）、パンダ科（Ｐａｎｄａｃｅａｅ）などが挙げられる。これらの植物は、単独で用いても２種以上を併用してもよい。ある具体例では、植物は蓮心である。
【００４１】
上記スペルミジン誘導体の５０％チロシナーゼ抑制濃度（ＩＣ５０）は、約３７μｇ／ｍＬより小さい。上記スペルミジン誘導体は、濃度１００μｇ／ｍＬで、６０％以上、好ましくは約６２％のチロシナーゼ抑制率を有する。
【００４２】
さらに別の態様で、本発明は、有効量の蓮心抽出物と美容上または医薬上許容される賦形剤とを含有する皮膚の美白効果を有する組成物を提供する。
【００４３】
蓮心抽出物は、チロシナーゼ抑制活性を有する。蓮心抽出物の調製方法は、適当な溶剤を用いて、植物に抽出プロセスを実行する。ある具体例では、アセトンを用いて、植物に抽出プロセスを実行する。別の具体例では、植物をアセトンで抽出した後、他の溶剤を用いて、さらに抽出する。他の溶剤としては、例えば、ｎ−へキサン、エチルエーテル、ジクロロメタン、酢酸エチルなどが挙げられる。これらの溶剤は、単独で用いても２種以上を併用してもよい。
【００４４】
蓮心抽出物は、活性成分として、スペルミジン誘導体を含有する。スペルミジン誘導体は、下記式（Ｉ）：
【００４５】
【化９】
0005469013.tif 000010
で示される。
【００４６】
上記式（Ｉ）において、Ｒ１〜Ｒ５は、互いに独立して、Ｈ、ＯＨまたはＯＣＨ３であり、Ｒ１〜Ｒ５の少なくとも１つはＯＨである。ある具体例では、Ｒ３ＯＨである。ある具体例では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５はＨであり、Ｒ３はＯＨである。別の具体例では、Ｒ１、Ｒ２およびＲ５はＨであり、Ｒ３はＯＨであり、Ｒ４はＯＣＨ３である。さらに別の具体例では、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はＨであり、Ｒ１はＯＨである。さらに別の具体例では、Ｒ１、Ｒ２およびＲ５はＨであり、Ｒ３およびＲ４はＯＨである。
【００４７】
上記スペルミジン誘導体の５０％チロシナーゼ抑制濃度（ＩＣ５０）は、約４５０μｇ／ｍＬより小さい。ある具体例では、スペルミジン誘導体の５０％チロシナーゼ抑制濃度（ＩＣ５０）は、約１９μｇ／ｍＬより小さい。さらに、上記スペルミジン誘導体は、濃度１００μｇ／ｍＬで、約１０％より大きいチロシナーゼ抑制率を有する。ある具体例では、スペルミジン誘導体は、濃度１００μｇ／ｍＬで、約１０％〜約６５％のチロシナーゼ抑制率を有する。
【００４８】
ある具体例では、スペルミジン誘導体は、下記式（ＩＩ）：
【００４９】
【化１０】
0005469013.tif 000011
で示される。
【００５０】
上記スペルミジン誘導体の５０％チロシナーゼ抑制濃度（ＩＣ５０）は、約３７μｇ／ｍＬより小さい。上記スペルミジン誘導体は、濃度１００μｇ／ｍＬで、６０％以上、好ましくは約６２％のチロシナーゼ抑制率を有する。
【００５１】
さらに、上記した全ての組成物の美容上または医薬上許容される賦形剤は、活性成分の希釈剤、分散剤または担体となる。美容上または医薬上許容される賦形剤としては、スキンケア製品に一般的に用いられる材料、例えば、水、液体または固体の皮膚軟化剤、シリコーン油、乳化剤、溶媒、保湿剤、増粘剤、粉末剤、噴射剤などが挙げられる。
【００５２】
賦形剤は、上記した全ての組成物の各々１００質量％に対して、好ましくは５質量％〜９９．９質量％、より好ましくは２５質量％〜８０質量％の割合で含有され、他の添加物が存在しない状態では、上記した全ての組成物のうち、活性成分を除いた残りの部分を形成する。
【００５３】
また、上記した全ての組成物は、皮膚に有益な他の特定成分として、例えば、日焼け止め、皮膚美白剤、日焼け剤などを含有していてもよい。さらに、賦形剤は、酸化防止剤、着香料、乳白剤、保存料、着色剤、緩衝剤などを含有していてもよい。
【００５４】
さらに、ある具体例では、上記した全ての組成物は、クリーム、軟膏、ジェル、スプレー、ローション、トニック、シャンプー、ムースなどの皮膚塗布剤として製造されるが、これらに限定されるものではない。スキンスプレーは、一般に、ポリビニルピロリドン、ビニルアセテートなどのエアロゾル化コポリマーから構成され、セットローションとしても機能する。スキンゲルの調製品は、組成がスプレーと同様であるが、ジェル状であり、かつ、アルコール無添加で、皮膚をコーティングすることができる。スキンムースは、エアロゾル缶から圧力により放出されるフォームである。スキンクリームは、疎水性または親水性クリーム、軟膏、ジェル、皮膚軟化剤、スプレー、ローション、スキントニック、シャンプーまたはムースであってもよく、当該技術分野で公知のタイプのスキンクリームに用いるのに適当な他の成分を適宜含有する。このような他の成分としては、例えば、ワセリン、ワックス、ラノリン、シリコーン、リポソーム、植物油、鉱油、可塑剤、香料、保存料、浸透促進剤、ｐＨ調整剤、他の適当なスキンクリーム用成分などが挙げられる。このような成分は、皮膚に潤いを与え、活性化合物を安定化させ、組成物と皮膚との接触や組成物の局所濃度を増大させ、組成物の放出を制御することができる。
【実施例】
【００５５】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記の実施例により制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【００５６】
下記式（Ｉ）で示される共通構造を有する化合物１〜４は、植物から抽出するか、あるいは、合成により調製した。化合物１〜４の各構造を表１に示す。
【００５７】
【化１１】
0005469013.tif 000012
【００５８】
【表１】
0005469013.tif 000013
【００５９】
実施例では、チロシナーゼ抑制試験およびメラニン含量試験を用いて、以下に記載するように皮膚美白効果の分析を行った。
【００６０】
＜チロシナーゼ抑制試験＞
この試験については、非特許文献１および２を参照されたい。
【００６１】
１．  チロシナーゼ（シグマ  Ｔ３８２４）を０．１Ｍリン酸緩衝液で希釈して、０．１Ｕ／μＬチロシナーゼ溶液を得た。
【００６２】
２．  Ｌ−ドーパ（シグマ  Ｄ９６２８）を０．１Ｍリン酸緩衝液で希釈して、１ｍＭ  Ｌ−ドーパ溶液を得た。Ｌ−ドーパ溶液は、暗所で保存した。
【００６３】
３．  サンプル溶液を１００％ＤＭＳＯで希釈して、１０ｍｇ／ｍＬの試験サンプル溶液を調製した。次いで、試験サンプル溶液を０．１Ｍリン酸緩衝液バッファで所望の濃度に希釈した。
【００６４】
４．  ５０μＬ／ウェルの上記のように調製した試験サンプル溶液を９６ウェルプレートのウェルに加えた（注：試験サンプル溶液を希釈するのに用いた同一希釈濃度のＤＭＳＯを９６ウェルプレートのウェルに加えて、ブランク群として用いた）。次いで、９０μＬ／ウェルの０．１Ｕ／μＬチロシナーゼ溶液を加えた（ｄＣ対照群には、０．１リン酸緩衝液だけを加え、０．１Ｕ／μＬチロシナーゼ溶液を加えなかった）。９６ウェルプレートを温度３７℃下に置き、４５０ｒｐｍで５分間混合した後、ＥＬＩＳＡリーダー（モレキュラー・デバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）Ｍ２）に入れた。ＥＬＩＳＡリーダーの波長を４９２ｎｍに設定して、９６ウェルプレートに加えた溶液の吸光度値を測定した。吸光度値を２回測定し、その平均値をバックグラウンド値として用いた。次いで、６０μＬ／ウェルの上記のように調製した１ｍＭ  Ｌ−ドーパ溶液を９６ウェルプレートに加えた（ｄＤ対照群には、０．１Ｍリン酸緩衝液だけを加え、１ｍＭ  Ｌ−ドーパ溶液を加えなかった）。次いで、９６ウェルプレートを暗所で温度３７℃下に置き、４５０ｒｐｍで１５分間混合した後、ＥＬＩＳＡリーダーに入れた（モレキュラー・デバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）Ｍ２）。ＥＬＩＳＡリーダーの波長を４９２ｎｍに設定して、９６ウェルプレートに加えた溶液の吸光度値を測定した。吸光度値を２回測定し、その平均値を測定値として用いた。バックグラウンド値を測定値から差し引いた後、サンプルのチロシナーゼ抑制率を算出した。サンプルのチロシナーゼ抑制率を算出する式は、以下のとおりである：
［（Ａ−Ａ０）−（Ｂ−Ｂ０）−ｄＣ−ｄＤ］／（Ａ−Ａ０）×１００％
Ａ：ブランク群の吸光度値
Ｂ：サンプルの吸光度値
Ａ０：ブランク群のバックグラウンド値
Ｂ０：サンプルのバックグラウンド値
ｄＣ：Ｌ−ドーパだけと反応するサンプルの吸光度変化
ｄＤ：チロシナーゼだけと反応するサンプル吸光度変化
【００６５】
＜メラニン抑制試験＞
１．  細胞株培養
マウス黒色腫Ｂ１６−Ｆ０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−６３２２，食品工業発展研究所（ＦＩＲＤＩ）（中華民国３００台湾新竹市食品路３３１號（３３１  Ｓｈｉｈ−Ｐｉｎ  Ｒｏａｄ，Ｈｓｉｎｃｈｕ，３００  Ｔａｉｗａｎ  Ｒ．Ｏ．Ｃ．））を、１０％ウシ胎仔血清および  １％ペニシリン−ストレプトマイシンを含有する培地（ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＭＥＭ，ＤＭＥＭ）を用いて、温度３７℃、５％ＣＯ２培養器中で培養した。
【００６６】
２．  メラニン含量分析
抽出物によるＢ１６細胞メラニンの抑制
培地中のＢ１６細胞に試験サンプルに加えて、４８時間後、培地を除去した。Ｂ１６細胞をＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した後、温度７０℃に予備加熱した３００μＬの１Ｎ  ＮａＯＨをＢ１６細胞に加え、Ｂ１６細胞を温度６０℃の培養器中で６０分間静置した。次いで、２００μＬの１Ｎ  ＮａＯＨを９６ウェルプレートに加え、波長４０５ｎｍで吸光度値を測定した。メラニン含量を算出する式は、以下のとおりである：
メラニン含量＝（Ｍ／Ｍ０）×１００％
Ｍ：サンプルで処理したＢ１６細胞の吸光度値
Ｍ０：サンプルで処理していないＢ１６細胞の吸光度値
【００６７】
≪実施例１≫
＜植物からの化合物１の抽出および精製＞
蓮心をアセトンで抽出して抽出物を得た。次いで、４．５ｇの抽出物を２２．５ｍＬのメタノールおよび水に溶解・混合して混合溶液を得た。混合溶液を２２．５ｍＬのｎ−へキサン、エチルエーテル、ジクロロメタンおよび酢酸エチルで、それぞれ３回ずつ抽出して、それぞれ、ｎ−へキサン層抽出溶液、エチルエーテル層抽出溶液、ジクロロメタン層抽出溶液および酢酸エチル抽出溶液を得た。各層抽出溶液を濃縮・乾燥させた後、各層抽出物を得て、チロシナーゼ抑制試験を行った。
【００６８】
その結果は、酢酸エチル層抽出物がチロシナーゼ抑制活性を有することを示した。
【００６９】
酢酸エチル層抽出溶液を濃縮・乾燥させた後、１．７８８３ｇの酢酸エチル層抽出物を得た。酢酸エチル層抽出物のチロシナーゼ抑制率は、８６．９８±２．６％であった。
【００７０】
次いで、１．５ｇの酢酸エチル層抽出物を逆相オープンクロマトグラフィーカラム（３７．５ｇのＲＰ−１８シリカゲルを充填、２×３３ｃｍ）により分離した。カラムの移動相は、メタノール：水＝１：１０→１：８→１：４→１：２→１：１→メタノールの順に変化させた。酢酸エチル層抽出物をカラムクロマトグラフィーにより分離して、０．０８７５ｇの化合物を得た。この化合物について、スペクトル分析および質量分析を行った。その結果を以下に示す。
【００７１】
スペクトル分析：
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：７．５６−７．３４（ｍ，９Ｈ）；６．８８−６．７２（ｍ，７Ｈ），６．４４−６．３５（ｍ，２Ｈ）；３．５７−３．４７（ｍ，４Ｈ）；３．３６−３．３１（ｍ，４Ｈ）；１．９４−１．８４（ｍ，２Ｈ）；１．７４−１．５８（ｍ，４Ｈ）
質量分析：
ＥＳＩ＋−ＭＳ：６０６［Ｍ＋Ｎａ］＋；４３８；２０４
スペクトル分析および質量分析の結果によれば、この化合物は、化合物１である。
【００７２】
＜チロシナーゼ抑制試験＞
次いで、化合物１について、チロシナーゼ抑制試験および５０％チロシナーゼ抑制濃度（ＩＣ５０）の算出を行った。その結果を表２に示す。その結果によれば、化合物１は、濃度１００μｇ／ｍＬで、約６１．２±２．５％のチロシナーゼ抑制率を有する。また、化合物１の５０％チロシナーゼ抑制濃度（ＩＣ５０）は、３６．２±２．５μｇ／ｍＬである。さらに、化合物１について、メラニン含量試験を行ったところ、細胞内のメラニン含量に対して効果を示した。試験結果によれば、化合物１は、濃度１００μｇ／ｍＬで、約１９．９±４．２％のメラニン含量抑制率を有する。
【００７３】
≪実施例２≫
＜化合物２の合成＞
０．４４ｇのフェルラ酸、０．１ｇのスペルミジン、０．３３ｇの１−ヒドロキシベンゾトリアゾールおよび０．４７６ｇのＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドを１５ｍＬのテトラヒドロフランに加え、室温で１６時間反応させた。次いで、ロータリーエバポレーターを用いて、反応溶液からテトラヒドロフランを除去して、反応生成物を得た。次いで、反応生成物にメタノールを加え、攪拌し、濾過して、固形の不溶物を除去した。濾過したメタノール溶液をエバポレートして、１．２５０９ｇの残渣を得た。０．１２ｇの残渣を１ｍＬのメタノールに溶解させ、固形の不溶物を濾過により除去した。濾過したメタノール溶液を、セミ分取用逆相クロマトグラフィーカラム（移動相は水およびアセトニトリルからなる）により分離し、採取して、３．４ｍｇの化合物を得た。この化合物について、スペクトル分析を行った。その結果を以下に示す。
【００７４】
スペクトル分析：
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：７．７９−７．６９（ｍ，２Ｈ）；７．５５−７．３４（ｍ，４Ｈ）；７．２１−６．７２（ｍ，７Ｈ）；６．４７−６．３７（ｍ，２Ｈ）；３．９２−３．８６（ｍ，９Ｈ）；３．６２−３．４５（ｍ，４Ｈ）；３．３８−３．３４（ｍ，４Ｈ）；１．９５−１．８５（ｍ，２Ｈ）；１．７４−１．６０（ｍ，４Ｈ）
スペクトル分析の結果によれば、この化合物は、化合物２である。
【００７５】
＜チロシナーゼ抑制試験＞
次いで、化合物２について、チロシナーゼ抑制試験および５０％チロシナーゼ抑制濃度（ＩＣ５０）の算出を行った。その結果を表２に示す。その結果によれば、化合物２は、濃度１００μｇ／ｍＬで、１５．０±１．７％のチロシナーゼ抑制率を有し、濃度１２５μｇ／ｍＬで、２９．２±２．０％のチロシナーゼ抑制率を有する。また、化合物２の５０％チロシナーゼ抑制濃度（ＩＣ５０）は、２２５．４±１５．６μｇ／ｍＬである。
【００７６】
≪実施例３≫
＜化合物３の合成＞
０．３７ｇの２−ヒドロキシ桂皮酸、０．１ｇのスペルミジン、０．３３ｇの１−ヒドロキシベンゾトリアゾールおよび０．５ｇのＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドを１０ｍＬのテトラヒドロフランに加え、室温で１６時間反応させた。次いで、ロータリーエバポレーターを用いて、反応溶液からテトラヒドロフランを除去して、反応生成物を得た。次いで、反応生成物にメタノールを加え、攪拌し、濾過して、固形の不溶物を除去した。濾過したメタノール溶液をエバポレートして、０．２５４６ｇの残渣を得た。０．０６ｇの残渣を１ｍＬのメタノールに溶解させ、固形の不溶物を濾過により除去した。濾過したメタノール溶液を、セミ分取用逆相クロマトグラフィーカラム（移動相は水およびアセトニトリルからなる）により分離し、採取して、２．２ｍｇの化合物を得た。この化合物について、スペクトル分析を行った。その結果を以下に示す。
【００７７】
スペクトル分析：
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：７．８４−７．８０（ｍ，２Ｈ）；７．４９（ｔ，１Ｈ）；７．４８−７．４３（ｍ，３Ｈ）；７．２８−７．０９（ｍ，４Ｈ）；６．８３−６．６９（ｍ，８Ｈ）；３．５７−３．４９（ｍ，４Ｈ）；３．４５−３．３１（ｍ，４Ｈ）；１．９６−１．８８（ｍ，２Ｈ）；１．６７−１．６１（ｍ，４Ｈ）
スペクトル分析の結果によれば、この化合物は、化合物３である。
【００７８】
＜チロシナーゼ抑制試験＞
次いで、化合物３について、チロシナーゼ抑制試験および５０％チロシナーゼ抑制濃度（ＩＣ５０）の算出を行った。その結果を表２に示す。その結果によれば、化合物３は、濃度１００μｇ／ｍＬで、１０．４±０．１％のチロシナーゼ抑制率を有し、濃度１２５μｇ／ｍＬで、１３．２±１．１％のチロシナーゼ抑制率を有する。また、化合物３の５０％チロシナーゼ抑制濃度（ＩＣ５０）は、４３８．７±７７．４μｇ／ｍＬである。
【００７９】
≪実施例４≫
＜化合物４の合成＞
１０ｇのカフェイン酸を１２０ｍＬのテトラヒドロフランに溶解させて、溶液を得た。次いで、溶液を氷浴に入れ、この溶液に２４ｍＬのトリエチルアミンおよび１２ｍＬの塩化アセチルを加えた。溶液を２２時間攪拌した後、ロータリーエバポレーターを用いて、溶液の溶媒を除去した。反応生成物を２００ｍＬのジクロロメタンに加えて溶解させ、１００ｍＬの水で３回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた後、ロータリーエバポレーターを用いて、残りの溶媒を除去して、１３．４８１ｇの生成物を得た。
【００８０】
５．２５１ｇの生成物を４７ｍＬのメタノールに加え、加熱し、溶解させて、溶液を得た。この溶液を冷却した後、冷蔵庫に３日間静置した。次いで、溶液から分離した固形物を濾過し、少量のメタノールで洗浄し、乾燥させて、０．８７ｇの精製物を得た。
【００８１】
０．２５ｇの精製物および２ｍＬのＳＯＣｌ２を乾燥テトラヒドロフランに溶解させ、室温で２３時間反応させて、混合物を形成した。ロータリーエバポレーターを用いて、混合物から溶媒および過剰のＳＯＣｌ２を除去した。反応生成物を１０ｍＬのテトラヒドロフランに溶解させ、氷浴中の０．０４２ｇのスペルミジン、０．１３３ｍＬのトリエチルアミンおよび１０ｍＬのテトラヒドロフランからなる反応ボトル中に徐々に滴下した。次いで、反応溶液を４時間還流した。反応終了後、ロータリーエバポレーターを用いて、反応溶液中のテトラヒドロフランを除去した。反応生成物を２０ｍＬのジクロロメタンに加えて溶解させ、１０ｍＬの水で３回洗浄した後、ジクロロメタン層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、ロータリーエバポレーターを用いて濃縮して、０．２８２６ｇのアセチル化Ｏ−保護生成物を得た。
【００８２】
０．１ｇのアセチル化Ｏ−保護生成物、１ｍＬのテトラヒドロフラン、１ｍＬのメタノールおよび０．６ｍＬの濃塩酸を６０℃で３０分間反応させて、反応溶液を得た。次いで、反応溶液に１０ｍＬの水および１０ｍＬのジクロロメタンを加え、不溶物を分離した。
【００８３】
不溶物を１ｍＬのメタノールに加えて溶解させ、ＲＰ−１８薄層クロマトグラフィー（移動相は水およびアセトニトリルからなる）により分離し、精製して、６．４ｍｇの化合物を得た。この化合物について、スペクトル分析および質量分析を行った。その結果を以下に示す。
【００８４】
スペクトル分析：
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：７．４９−７．３６（ｍ，３Ｈ）；７．０８−６．７１（ｍ，１０Ｈ）；６．３９−６．３２（ｍ，２Ｈ）；３．６０−３．４６（ｍ，４Ｈ）；３．３６−３．３１（ｍ，４Ｈ）；１．９４−１．８２（ｍ，２Ｈ）；１．７３−１．５７（ｍ，４Ｈ）
質量分析：
ＥＳＩ＋−ＭＳ：６３２［Ｍ＋１］＋；４７０
スペクトル分析および質量分析の結果によれば、この化合物は、化合物４である。
【００８５】
＜チロシナーゼ抑制試験＞
次いで、化合物４について、チロシナーゼ抑制試験および５０％チロシナーゼ抑制濃度（ＩＣ５０）の算出を行った。その結果を表２に示す。化合物４は、濃度１００μｇ／ｍＬで、６２．２±２７．２％のチロシナーゼ抑制率を有し、濃度１２５μｇ／ｍＬで、７４．５±１６．１％のチロシナーゼ抑制率を有する。また、化合物４の５０％チロシナーゼ抑制濃度（ＩＣ５０）は、１８．６±２．９μｇ／ｍＬである。
【００８６】
【表２】
0005469013.tif 000014
【００８７】
本明細書では、好ましい実施例を上記の通り開示したが、これらは決して本発明を限定するものではなく、当業者であれば、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、様々な変更や変形を加えることができ、従って、本発明の保護範囲は、特許請求の範囲で指定した内容を基準とする。