(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
βアミロイドタンパク質またはその断片を抗βアミロイド免疫グロブリンから解離させるのに十分であるpH11.25〜11.75にて抗βアミロイド免疫グロブリンを処置するステップを含んでなる、抗βアミロイド免疫グロブリンを調製する方法。
【請求項２】
抗βアミロイド免疫グロブリンがヒト血漿中から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
可溶性βアミロイドタンパク質を形成することなく、少なくとも部分的に中和してより低いｐＨにするステップをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
不溶性βアミロイドタンパク質を濾過、クロマトグラフィーまたは遠心分離により除去するステップをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ｐＨ約４．８に中和するステップをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
（ｉ）１１．２５〜１１．７５の範囲のｐＨにおいてジエチルアミンＨＣｌ緩衝液で初期段階抗βアミロイド免疫グロブリンを処置し、それによって結合βアミロイドタンパク質を前記抗βアミロイド免疫グロブリンから実質的に解離させるステップと、
（ii）（ｉ）のｐＨを部分的に中和してｐＨ約９にするステップと、
（iii）βアミロイドタンパク質を除去するステップと、
（iv）（ii）のｐＨを中和してｐＨ約４．０〜７．４の範囲にするステップと、
（v）抗βアミロイド免疫グロブリンを収集するステップ
を含んでなる、請求項１記載の抗βアミロイド免疫グロブリンを調製する方法。
【請求項７】
（ｉ）調製される抗βアミロイド免疫グロブリンが実質的にβアミロイドタンパク質を含まない、
（ii）抗βアミロイド免疫グロブリンがβアミロイド斑に付随する疾患または病状に対して治療活性を有する、および／または、
（iii）ウィルス不活性化ステップをさらに含む、
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
βアミロイドタンパク質、またはその断片を抗βアミロイド免疫グロブリンから解離させるのに十分であるpH11.25〜11.75にて、前記抗βアミロイド免疫グロブリンを処置するステップと、前記抗βアミロイド免疫グロブリンと許容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤とを合わせるステップとを含む、抗βアミロイド免疫グロブリン組成物を調製する方法。
【請求項９】
組成物が、哺乳類においてβアミロイド斑に付随する疾患または病状を処置するのに適する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
哺乳類がヒトである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
疾患または病状がアルツハイマー病である、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫グロブリンの調製に関する。より詳しくは、本発明はアルツハイマー病の免疫療法に適し得る抗βアミロイド免疫グロブリンの調製に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病は神経変性疾患であり、その最も一般的な形態では６５歳を超えた人々に見られる。世界的におよそ1500万人の人々が、アルツハイマー病に罹患している。
アルツハイマー病の臨床徴候は、日常生活に付随する活動の低下、および神経精神症状または行動上の変化と共に、進行性の認知衰退によって特徴づけられる。
アルツハイマー病は、βアミロイドペプチドから構成される脳組織内の斑の蓄積によって特徴づけられる。アルツハイマー病のマウスモデルへの抗βアミロイド抗体の投与は、マウス脳内のβアミロイド沈着を減少させて認知機能を復元または増大させる、または少なくとも認知衰退速度を低下させるようである。
【０００３】
βアミロイドペプチドに対する天然抗体はヒト血清中に存在する。ヒト血清から得られるヒト免疫グロブリン製剤のヒトへの投与は、脳脊髄液中のβアミロイド−ペプチドレベルの低下と関連付けられている［ＵＳ２００２／０００９４４５］。最近の臨床試験データは、静脈内免疫グロブリン（「ＩＶＩｇ」）で治療されたアルツハイマー病患者の行動および認知力の双方における有益な結果を示す（http://www.news-medical.net/?id=40383）。
しかしこのようなＩＶＩｇ製剤は顕著な量の神経毒性βアミロイドペプチドを含有し、抗体親和性および力価に顕著な多様性を示す。
【発明の概要】
【０００４】
抗βアミロイド免疫グロブリン製剤はアルカリ性条件下で提供され、βアミロイドタンパク質はやや溶けにくいため、抗βアミロイド免疫グロブリンとの再結合が低下する。
一態様では、抗βアミロイド免疫グロブリンを調製する方法は、βアミロイドタンパク質、またはその断片を初期段階抗βアミロイド免疫グロブリンから解離させるのに十分なアルカリ性条件下で、前記初期段階抗βアミロイド免疫グロブリンを処置するステップを伴う。
適切には、方法に従って調製された抗βアミロイド免疫グロブリンは、結合したβアミロイドタンパク質を実質的に含まない。
【０００５】
別の態様では、前記組成物を調製する方法は、βアミロイドタンパク質、またはその断片を初期段階抗βアミロイド免疫グロブリンから解離させるのに十分なアルカリ性条件下で、前記初期段階抗βアミロイド免疫グロブリンを処置することによって抗βアミロイド免疫グロブリンを調製するステップと、抗βアミロイド免疫グロブリンと許容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤とを合わせるステップとを伴う。
【０００６】
さらに別の態様では、βアミロイドタンパク質、またはその断片を初期段階抗βアミロイド免疫グロブリンから解離させるのに十分なアルカリ性条件下で、前記初期段階抗βアミロイド免疫グロブリンを処置することによって調製される、単離または精製された抗βアミロイド免疫グロブリンが提供される。
なおもさらに別の態様では、組成物は、βアミロイドタンパク質、またはその断片を初期段階抗βアミロイド免疫グロブリンから解離させるアルカリ性条件下で、前記初期段階抗βアミロイド免疫グロブリンを処置することによって調製される抗βアミロイド免疫グロブリンと、許容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤とを含んでなる。
一実施態様では、組成物は、アルツハイマー病などのβアミロイド斑に付随する疾患または病状を処置するのに適する。
さらなる態様では、哺乳類においてβアミロイド斑に付随する疾患または病状を処置する方法は、βアミロイドタンパク質、またはその断片を初期段階抗βアミロイド免疫グロブリンから解離させるアルカリ性条件下で、前記初期段階抗βアミロイド免疫グロブリンを処置することによって調製される抗βアミロイド免疫グロブリンを前記哺乳類に投与することで、前記哺乳類において前記疾患または病状を処置するステップを伴う。
【０００７】
一実施態様では、βアミロイド斑に付随する疾患または病状はアルツハイマー病である。
その他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。当業者には、この詳細な説明から本発明の趣旨と範囲内の様々な変更および修正が明らかになるので、詳細な説明および具体例は例示のためにのみ提供される。さらに実施例は本発明の原理を実証するものであり、先行技術に係る技術者にとって明らかに有用である全ての実施例に対する本発明の応用を具体的に例示することは期待できない。
本明細書全体を通じて特に断りのない限り、「含む（comprise）（comprises）」、および「含んでなる（comprising）」という単語は、述べられた整数または整数群の包含を意味するが、あらゆるその他の整数または整数群の排除を意味しないものと理解される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】（Ａ）グリシンＨＣｌ（ｐＨ２．５）、グリシンＮａＯＨ（ｐＨ１０．２５）、グリシンＮａＯＨ（ｐＨ１０．７５）、グリシンＮａＯＨ（ｐＨ１１．２５）、およびグリシンＮａＯＨ（ｐＨ１１．７５）のグリシン緩衝液存在下で、抗βアミロイド免疫グロブリン製剤を比較するＥＬＩＳＡである。
【図２】グリシンＨＣｌ（ｐＨ２．５）の対照と共に、ｐＨ１０．２５、ｐＨ１０．７５、ｐＨ１１．２５、およびｐＨ１１．７５のジエチルアミンＨＣｌ緩衝液の存在下で、抗βアミロイド免疫グロブリン製剤を比較するＥＬＩＳＡである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
特異的に結合したβアミロイドタンパク質は、抗βアミロイド免疫グロブリン製剤からアルカリ性条件下で除去できる。酸性条件（例えばｐＨ約２）下におけるＩＶＩｇ抗βアミロイド免疫グロブリンの精製は、特に中性に戻し始めると抗βアミロイド免疫グロブリンに再結合できる可溶性βアミロイドタンパク質をもたらす。
抗βアミロイド免疫グロブリンのアルカリ処置は、ｐＨ約１０．５程度に低くあってもβアミロイドタンパク質を抗βアミロイド免疫グロブリンから解離させ、その条件下ではβアミロイドタンパク質は実質的に不溶性のままであり抗βアミロイド免疫グロブリンは再結合できない。本方法は、特にヒトＩＶＩｇからの抗βアミロイド免疫グロブリンの大規模調製および／または工業的調製に適している。
工業規模でのアルカリ性条件下における処理後の抗βアミロイド免疫グロブリンの改善された効率は、抗βアミロイド免疫グロブリンを生産するためのより商業的に実現可能な方法を提供する。
【００１０】
一態様では、抗βアミロイド免疫グロブリンを調製する方法は、免疫グロブリン−結合βアミロイドタンパク質、またはその断片を初期段階抗βアミロイド免疫グロブリンから解離させるのに十分なアルカリ性条件下で、前記初期段階抗βアミロイド免疫グロブリンを処置するステップを伴う。
他の態様では、上で述べられている方法によって調製される単離または精製された抗βアミロイド免疫グロブリンが提供される。
【００１１】
「単離された」とは、自然状態から離れた環境中に存在する、または人的操作を受けていることを意味する。単離された物質は、常態ではその自然状態でそれに伴う構成要素を実質的または本質的に含まなくてもよく、または常態ではその自然状態でそれに伴う構成要素と共に人工的状態にあるように操作されてもよい。
「精製された」とは、富化され、濃縮されまたは他のやり方で初期状態または形態を超える比活性、量または濃度を有することを意味する。
単離または精製された抗βアミロイド免疫グロブリンは、実質的にβアミロイドタンパク質を含まなくてもよい。
【００１２】
「実質的に含まない」とは、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５〜９９％の抗βアミロイド免疫グロブリン分子が、βアミロイドタンパク質またはその断片に結合しておらず、またはそれによって結合されていないことを意味する。
【００１３】
本明細書では「タンパク質」は、ペプチドまたはポリペプチドであってもよいアミノ酸ポリマーである。一般に「ペプチド」という用語は、ここでの用法では６０個を超えない連続アミノ酸を有するタンパク質である。
【００１４】
「βアミロイドタンパク質」という用語は、例えば米国公開公報２００６／００９９２１１で述べられているペプチド断片を含む、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）およびその断片をその範囲内に含むが、これに限定されるものではない。
【００１５】
ここでの用法では、「免疫グロブリン」という用語は、ヒト免疫グロブリンアイソタイプＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、およびＩｇＥとその抗原結合断片をはじめとするヒト免疫グロブリン遺伝子複合体のあらゆる抗原結合タンパク質生成物を含むことが理解されるであろう。抗原結合断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）2、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。
好ましくは、上で述べられているように調製される抗βアミロイド免疫グロブリンはＩｇＧであり、またはそれを含んでなる。
【００１６】
初期段階、すなわち出発抗βアミロイド免疫グロブリンの好ましい原料は、ヒト血清または血漿である。この原料から得られる免疫グロブリン製剤は、典型的に筋肉内、静脈内、および皮下をはじめとする様々な経路によって投与され、したがって「ＩＭＩｇ」、「ＩＶＩｇ」、「ＳＣＩｇ」またはこれと類似に称されることが多い。方法で使用するための原料の１つの特定の非制限的例は、血漿、またはコーン分画法によって得られる、コーン上清Ｉ（フィブリノーゲン枯渇血漿）または可溶化清澄画分ＩＩ＋ＩＩＩなどの血漿画分である。
ＩＶＩｇ形態などの初期段階抗βアミロイド免疫グロブリンは、後で実施例で述べられるように、当該技術分野でよく理解されている方法によって脱脂できおよび／または真性グロブリンを除去できる。
【００１７】
初期段階抗βアミロイド免疫グロブリンは、アルカリ処置前に、少なくとも１つのアニオン交換クロマトグラフィーステップを施すことができる。特定の実施態様では、第１および第２の逐次アニオン交換クロマトグラフィーステップを使用してもよい。別の実施態様では、アニオンおよびカチオン交換クロマトグラフィーステップの組み合わせを使用してもよい。
抗βアミロイド免疫グロブリンからのβアミロイドタンパク質の解離のためのアルカリ性ｐＨを達成するために、典型的に緩衝溶液形態のあらゆる適切なアルカリを使用してもよい。このようなアルカリ性緩衝液については当該技術分野で良く知られており、当業者によって容易に選択されるであろう。
【００１８】
ほんの一例として、アルカリ性緩衝液としては、炭酸塩緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、リン酸水素三ナトリウム緩衝液、ジエチルアミンＨＣｌ、トリエチルアミンＨＣｌ、グリシンＮａＯＨ、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール（ＡＭＰＤ）、Ｎ−ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）メチル−４−アミノブタンスルホン酸（ＴＡＢＳ）、３−［（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）アミノ］−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳＯ）、２−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、３−（シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（ＡＭＰ）、３−シクロヘキシルアミノ−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、および４−（シクロヘキシルアミノ）−１−ブタンスルホン酸（ＣＡＢＳ）が挙げられる。
【００１９】
好ましいアルカリ性緩衝液は、ジエチルアミンＨＣｌである。
好ましいアルカリ性条件としては、８．５〜１１．７５の範囲のｐＨが挙げられる。
より好ましくは、ｐＨは１０．７５〜１１．７５の範囲である。
有利には、ｐＨは１１．２５〜１１．７５の範囲である。
アルカリ性ｐＨ（例えばｐＨ約１１以上）における溶出は、抗βアミロイド免疫グロブリンと再結合できないβアミロイドタンパク質の不溶性凝集体を生じる。次に可溶性βアミロイドタンパク質を形成することなく、ｐＨを中和してより低いｐＨ（例えばｐＨ約９）にすることができる。典型的には、そのｐＨで不溶性のβアミロイドタンパク質を除去してからｐＨ４．０〜７．４の範囲である適切な製剤ｐＨにさらに中和することができる。非限定的例は、ＩＶＩｇ製剤についてはｐＨ約４．８である。より低いｐＨは二量体／凝集体形成を最小化するのを助けるので、ＩＶＩｇ製剤のためには、ｐＨ４．８などのより低いｐＨ条件が典型的に使用されることが理解されるであろう。しかしＩＭＩｇ製剤（より高い二量体／凝集体レベルが許容できる）は、中性ｐＨ（例えばｐＨ約６．５）により近くあってもよいと諒解される。
【００２０】
次に当該技術分野で知られているあらゆる方法によって、βアミロイドタンパク質の除去を実施してもよい。このような方法の非限定的例としては、ナノ濾過などの濾過、および例えば疎水性相互作用クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーが挙げられる。あるいはβアミロイド凝集体は、連続流遠心分離などの遠心分離によって除去できる。βアミロイドタンパク質の可溶性形態もまた、例えば約１０〜３０ｋＤａカットオフの適切な分画分子量メンブレンを使用して、ダイアフィルトレーションによって除去されてよいものと理解される。
【００２１】
非限定的な一実施態様では、抗βアミロイド免疫グロブリンを調製する方法は、
（ｉ）１０．７５〜１１．７５の範囲のｐＨにおいてジエチルアミンＨＣｌ緩衝液で初期段階抗βアミロイド免疫グロブリンを処置し、それによって結合βアミロイドタンパク質を前記抗βアミロイド免疫グロブリンから実質的に解離させるステップと、
（ｉｉ）（ｉ）のｐＨを部分的に中和してｐＨ約９にするステップと、
（ｉｉｉ）βアミロイドタンパク質を除去するステップと、
（ｉｖ）（ｉｉ）のｐＨを中和してｐＨ約４．０〜７．４の範囲にするステップと、
（ｖ）抗βアミロイド免疫グロブリンを収集するステップ
を含んでなる。
【００２２】
さらなる一実施態様では、抗βアミロイド免疫グロブリン製剤にウィルス不活性化が施される。好ましくはウィルス不活性化は、エンベロープウイルスおよび非エンベロープウイルスの双方を除去する。非限定的な一実施態様では、サイズ排除を使用しておよそ２０ナノメートル程度に小さいウィルスを除去してもよい。
いくつかの実施態様ではウィルスとβアミロイドタンパク質またはその断片の双方を除去できるようにする条件下で、βアミロイド沈殿物にウィルス濾過ステップを施す。
上で述べられるようにして調製される抗βアミロイド免疫グロブリンは、アルツハイマー病、およびβアミロイド斑に付随するその他の疾患または病状を処置するための組成物および／または方法において特に有効かもしれない。
したがって一態様では、哺乳類においてβアミロイド斑に付随する疾患または病状を処置する方法は、βアミロイドタンパク質、またはその断片を初期段階抗βアミロイド免疫グロブリンから解離させるアルカリ性条件下で、前記初期段階抗βアミロイド免疫グロブリンを処置することによって調製される抗βアミロイド免疫グロブリンを前記哺乳類に投与するステップを伴う。
【００２３】
他の態様では、組成物を調製する方法は、βアミロイドタンパク質またはその断片を初期段階抗βアミロイド免疫グロブリンから解離させるのに十分なアルカリ性条件下で、前記初期段階抗βアミロイド免疫グロブリンを処置するステップと、抗βアミロイド免疫グロブリンと許容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤とを合わせるステップを含む、抗βアミロイド免疫グロブリンを調製するステップとを伴う。
さらに別の態様では、組成物は、βアミロイドタンパク質、またはその断片を初期段階抗βアミロイド免疫グロブリンから解離させるアルカリ性条件下で、前記初期段階抗βアミロイド免疫グロブリンを処置することによって調製される抗βアミロイド免疫グロブリンと、許容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤とを含んでなる。
キャリア、希釈剤、および賦形剤は、当該技術分野でよく理解されているように、薬学的、獣医学的および／または免疫学的に許容可能であってもよい。
一般に「キャリア、希釈剤または賦形剤」という用語は、動物、好ましくはヒトに安全に投与されてもよい、固体または液体増量剤、バインダー、希釈剤、封入物質、コーティングまたは潤滑剤を意味する。特定の投与経路に応じて、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．Ｎ．Ｊ．ＵＳＡ，１９９１）で述べられているような、当該技術分野で良く知られている多様な許容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤を使用してもよい。
ほんの一例として、これらは糖、デンプン、セルロースおよびその誘導体、モルト、ゼラチン、滑石、硫酸カルシウム、植物油、合成油、低級アルコール、ポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝溶液、乳化剤、湿潤剤、ステアリン酸ナトリウムまたはマグネシウムなどの潤滑剤、等張食塩水、および発熱物質非含有水を含む群から選択されてもよい。
【００２４】
抗βアミロイド免疫グロブリン製剤は、アルツハイマー病がある患者に投与した場合、治療効果の改善および／またはβアミロイドタンパク質毒性リスクの低下を有する。
非限定的な一実施態様では、本発明の抗βアミロイド免疫グロブリン製剤を患者に静脈内または皮下に投与して、アルツハイマー病を予防または治療できる。
抗βアミロイド免疫グロブリン製剤は、単回投与で、または特定期間にわたって１回または数回繰り返される用量で投与できる。適切な投薬量は様々なパラメーターに応じて変動する。このようなパラメーターとしては、治療される個人の生理学的状態、免疫グロブリン製剤、投与様式、および投与頻度などが挙げられる。
抗βアミロイド免疫グロブリン製剤の投薬量は、患者の年齢、体重、および生理学的状態に応じて変動し得る。ほんの一例として、本発明に従って調製される免疫グロブリンは、週に１回、または２週間毎に１回、または４、５、６週間以上毎に１回投与してもよい。投与される免疫グロブリンの量は変動でき、免疫グロブリン製剤の純度、親和力、および結合活性に左右されるかもしれない。
【００２５】
ほんの一例として、量は、患者への１回あたりの投与量が、体重１ｋｇあたり約０．００１ｇ〜約１０ｇ、体重１ｋｇあたり約０．０１ｇ〜約５ｇ、体重１ｋｇあたり約０．１ｇ〜約３ｇ、体重１ｋｇあたり約０．５ｇ〜約２ｇ、または体重１ｋｇあたり約０．８〜約１．５ｇの抗βアミロイド免疫グロブリンであってもよい。
臨床的に効果的なヒト投薬計画の非限定的な例は、２週間毎に１回約０．２ｇ／ｋｇ、または４週間毎に１回０．８ｇ／ｋｇである。
ヒトにおけるアルツハイマー病以外にも、免疫グロブリン製剤は、家畜、飼育ペット、演技動物などの非ヒト哺乳類の免疫療法に関連した多様な獣医学用途で使用できる。
【実施例】
【００２６】
結合βアミロイドを除去するように処理されたＩＶＩｇの大規模調製
抗βアミロイド免疫グロブリン製剤は、下述の工程に従って製造できる。
本発明の方法で使用するのに特に好ましい出発原料は、血漿、またはコーン分画法によって得られる、コーン上清Ｉ（フィブリノーゲン欠失血漿）または可溶化清澄画分ＩＩ＋ＩＩＩなどの血漿画分である。
典型的に1,250kg〜10,000kgの血漿／血漿同等物（6,250〜50,000 全血献血）である凍結血漿を１２〜２４時間かけて解凍する直前に、−５℃の温度で軟化させる。解凍された血漿は、寒冷沈殿物および免疫グロブリン含有寒冷上清を形成する。寒冷上清は典型的に、溶出物温度が５℃を超えない連続流遠心分離によって寒冷沈殿物から分離される。
次にフィブリノーゲン（画分Ｉ）を沈殿させるため、−２℃でインキュベートする前に、寒冷上清溶液を４〜６％ｗ／ｖに希釈して、十分な冷エタノール（９５％ｖ／ｖ）を中性ｐＨで添加し、８％ｖ／ｖのエタノール濃度を達成してもよい。画分Ｉは、遠心分離および／または濾過によって免疫グロブリン含有上清（上清Ｉ）から除去できる。
【００２７】
代案の実施態様では、免疫グロブリン構成要素を画分ＩＩ＋ＩＩＩとして沈殿させるために上清Ｉをより高濃度のエタノールに曝露してもよい。次に出発原料を調製するために画分ＩＩ＋ＩＩＩを再度可溶化し、濾過によって清澄化できる。
出発原料が、上清Ｉなどのリポタンパク質を含有する血漿またはその他の免疫グロブリン含有材料である場合、免疫グロブリンの損失を回避また最小化するために、リポタンパク質は好ましくは適切な条件下での吸着または沈殿によって出発原料から除去される。本発明に従って使用するための特に好ましい吸着材は、例えば５〜５０ｎｍの範囲の粒度を有するＡｅｒｏｓｉｌなどの超微粒子二酸化ケイ素（シリカ）吸着材である。
上清Ｉは、Ａｅｒｏｓｉｌが添加される前に、２〜８℃でＤｉａｃｅｌ  １５０などの濾過助剤と混合される。圧搾濾過器装置を使用して濾過する前に、ＤｉａｃｅｌおよびＡｅｒｏｓｉｌが分散するまで混合物を撹拌する。圧搾濾過器装置中に保持される容積は、０．５ＭのＮａＣｌを使用してフラッシングによって回収してもよい。
【００２８】
アニオン交換クロマトグラフィーのための溶液を調製するために、脱脂上清Ｉの導電率を低下させる。これは１０，０００ダルトン以上の名目上のカットオフがある限外濾過膜を使用して達成されてもよい。この後、真性グロブリン様タンパク質を沈殿させるために、ｐＨをｐＨ５．２に調節する。圧搾濾過器装置を使用して濾過する前に、Ｄｉａｃｅｌなどの濾過助剤を混合物に添加して、真性グロブリン含有沈殿物を除去する。圧搾濾過器装置中に保持される容積は、０．５ＭのＮａＣｌを使用してフラッシングによって回収してもよい。
上述のようにして調製された脱脂真性グロブリン欠失材料をアニオン交換クロマトグラフィーによって分画し、第１の免疫グロブリン含有画分を精製する。第２のアニオン交換クロマトグラフィーのステップによる第１の免疫グロブリン含有画分の精製は、精製免疫グロブリン含有溶液を提供する。
【００２９】
好ましくは、このステップで得られる免疫グロブリン（粗製ＩｇＧ）の純度を最大化する、装入、ｐＨ、およびイオン強度条件下における、ＤＥＡＥ−セファロースＦＦを使用したアニオン交換クロマトグラフィーによる分画前に、脱脂材料をダイアフィルター処理してｐＨ調節し、真性グロブリンを欠失させた。好ましくは脱脂真性グロブリン欠失材料の分画は、ｐＨ５．２および導電率０．５〜１．０ｍＳ／ｃｍにおいてＤＥＡＥ−セファロースＦＦカラム上で行われる。トランスフェリンの物理化学的特性は免疫グロブリンと酷似しているにも関わらず、特にこれらの条件は免疫グロブリンからのトランスフェリンの最大の分離を確実にする。このステップにおける比較的純粋な免疫グロブリン製剤の産生は、実用的な商業的プロセスのために樹脂の装填量が適切であり、サブクラス回収率が適切であることを確実にするｐＨ条件下において、純粋な最終製品を作り出す引き続く第２のアニオン交換ステップの使用を容易にする。
【００３０】
第２のアニオン交換クロマトグラフィーのステップは、完全なサブクラス分布、低ＩｇＡおよびＩｇＭ濃度、および容認された薬局方制限内の抗Ａおよび抗Ｂレベルがある、高度に精製された産物を作り出すような装入、イオン強度、およびｐＨ条件下における、マクロ孔質アニオン交換樹脂による、免疫グロブリン含有画分の精製を含んでなる。具体的には、孔径が１００ｎｍを超えるマクロ孔質樹脂（Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  ＨＱ、ＭａｃｒｏＰｒｅｐ  Ｑ、Ｐｏｒｏｓ  ＨＱ、Ｑ  Ｈｙｐｅｒ  ＤＭなど）の使用は、６．０〜６．６のｐＨおよび０．７〜１．５ｍＳ／ｃｍの導電率で使用して、汚染タンパク質を除去し、純粋免疫グロブリンＧ（純粋ＩｇＧ）含有製剤を提供するのに適した吸着能力を提供できる。
【００３１】
出発原料が、再度可溶化された画分ＩＩ＋ＩＩＩ、または既にリポタンパク質が欠失して部分的に精製されたその他の免疫グロブリン含有材料である別の実施態様では、材料は上述のようなマクロ孔質アニオン交換樹脂カラムに単に通過させることで最終精製される。
次に純粋ＩｇＧ溶液を限外濾過によって約２％ｗ／ｖに濃縮し、適切な緩衝剤（グリシン−ＮａＯＨ、エタノールアミン−ＨＣｌまたはリン酸水素二ナトリウムなど）を添加する。２〜８℃における連続的混合下で、約２時間かけて０．２ＭジエチルアミンＨＣｌを使用してｐＨを１１．７５に調節することで、純粋ＩｇＧ溶液中に含有される抗βアミロイド免疫グロブリンからβアミロイドを解離させる。ｐＨ調節された純粋ＩｇＧをｐＨ１１．７５で少なくとも３０分間、混合しながらインキュベートする。次に可溶性βアミロイドタンパク質を形成することなく、ｐＨをより低いｐＨ（例えばｐＨ約９）に中和できる。
１Ｌの樹脂あたり４０ｇ未満のタンパク質で、溶液を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラム（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｃ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ＨＩＣ、Ｓｏｕｒｃｅ  ＨＩＣまたはＭａｃｒｏＰｒｅｐ  ＨＩＣなど）に装荷することで、βアミロイドを含有する不溶性沈殿物を純粋ＩｇＧから除去する。カラムはｐＨ約９．０、１．５ＭのＮａＣｌ存在下でリン酸緩衝液などの適切な緩衝液で事前平衡化される。６０〜２００ｃｍ／時間の流速で、１．５Ｍから０ＭのＮａＣｌへの６０分間直線濃度勾配を使用して、ＩｇＧをＨＩＣカラムから引き続いて溶出する。次に０．１Ｍ塩酸または０．１Ｍ水酸化ナトリウムを使用して溶出タンパク質をｐＨ４．８に調節し、さらなる処理の前に２〜８℃で保存する。
【００３２】
代案の実施態様では、１Ｌの樹脂あたり２０ｇ未満のタンパク質で、溶液を疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）カラム（ＭＥＰ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌなど）に装荷することで、βアミロイドを含有する不溶性の沈殿物を純粋ＩｇＧから除去する。カラムは中性または塩基性ｐＨで、リン酸またはトリス緩衝液などの適切な緩衝液で事前平衡化される。ｐＨ４．８で２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を使用して、ＩｇＧを引き続いて溶出する。溶出したＩｇＧ含有調製品はさらなる処理の前に２〜８℃で保存することもある。
代案の実施態様では、濾過助剤（Ｄｉａｃｅｌなど）、および任意に２ＭのＮａＣｌおよびＨＩＣ樹脂（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｃ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ＨＩＣ、Ｓｏｕｒｃｅ  ＨＩＣまたはＭａｃｒｏＰｒｅｐ  ＨＩＣなど）の添加によって、βアミロイドを含有する不溶性の沈殿物を純粋ＩｇＧから除する。ＨＩＣ樹脂は１Ｌのタンパク質あたり４０ｍｇ未満の樹脂で添加される。混合物を遠心分離および／または濾過によって清澄化する前に、２〜８℃で少なくとも３０分間撹拌する。次に０．１Ｍ塩酸または０．１Ｍ水酸化ナトリウムを使用して清澄化溶液をｐＨ４．８に調節し、さらなる処理の前に２〜８℃で保存する。
【００３３】
さらに別の実施態様では、溶液をＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ４００ＨＲなどの樹脂を含有するサイズ排除カラムに装入することで、βアミロイドを含有する不溶性の沈殿物を純粋ＩｇＧから除去する。ｐＨ４．８、１０〜５０ｃｍ／時間で、５０ｍＭ酢酸ナトリウムなどの緩衝液を使用して、免疫グロブリン画分をカラムから溶出する。次に０．１Ｍ塩酸または０．１Ｍ水酸化ナトリウムを使用して溶出タンパク質をｐＨ４．８に調節し、さらなる処理の前に２〜８℃で保存する。
さらに別の実施態様では、連続流遠心分離によってβアミロイドを含有する不溶性沈殿物を純粋ＩｇＧから除去する。
【００３４】
好ましくは抗βアミロイド免疫グロブリン製剤には、例えばエンベロープウィルスを不活性化するｐＨ４、３７℃で１０時間のインキュベーション、およびおよそ２０ナノメートル程度に小さいエンベロープおよび非エンベロープウィルスの双方をサイズ排除によって除去するウィルス濾過の２つの専用ウィルス除去ステップにより、ウィルス不活性化が施される。
いくつかの実施態様では、βアミロイド沈殿物を含有する純粋ＩｇＧには、ウィルスとβアミロイド双方を除去できるようにする条件下でウィルス濾過ステップが施される。
次に０．１Ｍ水酸化ナトリウムおよび０．１Ｍ塩酸を使用して、ウィルス不活性化抗βアミロイド免疫グロブリン製剤をｐＨ４．８にｐＨ調節し、少なくとも３０，０００ダルトンの名目上のカットオフがある膜を使用して、限外濾過によりおよそ１２％ｗ／ｖに濃縮する。０．１Ｍ塩酸または０．１Ｍ水酸化ナトリウムの添加によってｐＨを４．８に保ちながら、溶液を少なくとも６容積の水中でダイアフィルター処理する。安定剤としておよそ２５０ｍｍｏｌ／ＬのＬ−プロリンを添加し、希釈して最終生成物中に１０％ｗ／ｖの濃度をもたらして最終調合物を得る。浄化用フィルターの通過に続いて、調合されたバルク免疫グロブリンを０．２２μｍ以下の孔径を有する予め滅菌されたオートクレーブ滅菌膜カートリッジに通過させて容器に入れ、定量供給する前に２〜８℃で保存してもよい。生成物は、無菌の１ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬ、および５０ｍＬバイアルに無菌的に分注される。
【００３５】
ＩＶＩｇのｐＨ処理のＥＬＩＳＡ分析
本明細書でＡβ１−４０と称されるアミロイドβ−タンパク質断片１−４０アミド（ＳＩＧＭＡ，ＭＯ）１μｇ／ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液により、９６ウェルＮｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｂプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＮＹ）をウェルあたり５０μｌ、４℃で一晩被覆した。ウェルを３５０μｌの０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）、ＰＢＳ（ＴＰＢＳ）で洗浄して、非結合抗原を除去した。抗原被覆プレートおよび空試験未被覆プレートを２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）、ＰＢＳ、ウェル当たり５０μｌで２時間室温でブロックした。ウェルを３５０μｌのＴＰＢＳで洗浄して、非結合ＢＳＡを除去した。
本明細書でＩＶＩｇと称されるＩｎｔｒａｇａｍＰ（ＣＳＬ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）をＰＢＳ中で２０ｍｇ／ｍｌに希釈し、次にｐＨ２．５、１０．２５、１０．７５、１１．２５、および１１．７５において０．２Ｍグリシン（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）中で１／５に、またはｐＨ１０．２５、１０．７５、１１．２５、および１１．７５において０．２Ｍジエチルアミン（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）中で１／５に希釈した。室温で２０分間のインキュベーション後、ｐＨ処理されたＩＶＩｇを等容積の２．０Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）で中和し、次に１％ＢＳＡ、ＴＰＢＳ中で１／２に希釈した。９６ウェルＮｕｎｃ  Ｖ−ｂｏｔｔｏｍプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＮＹ）内でＩＶＩｇを１％ＢＳＡ、ＴＰＢＳで３倍に段階希釈して、１００μｌをＢＳＡブロックプレートに移した。ウェルを３５０μｌのＴＰＢＳで２回洗浄して非結合ＩＶＩｇを除去する前に、プレートを室温で１時間インキュベートした。
【００３６】
ヒツジで生じさせアフィニティー単離された二次抗体抗ヒトＩｇＧ（γ鎖）ＨＲＰコンジュゲート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡ）を１％ＢＳＡ、ＴＰＢＳ中で１／２０００に希釈し、ウェルあたり５０μｌを移して室温で２０分間インキュベートした。ウェルを３５０μｌのＴＰＢＳで２回洗浄して、非結合二次抗体を除去した。ウェルあたり５０μｌのＴＭＢ／Ｅ溶液（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡ）でアッセイを発色させ、発色させるために室温で１０分間インキュベートして、ウェルあたり２５μｌの２．０Ｍリン酸で停止させた。発色したプレートをＷａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ  ２（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，ＭＡ）プレートリーダーで４５０ｎｍの吸光を０．１秒間スキャンした。結果を図１および図２に示す。
図１および図２について述べると、グリシンＮａＯＨおよびジエチルアミンＨＣｌアルカリ性緩衝液は、どちらも抗βアミロイドＩｇＧを初期段階ＩＶＩｇサンプルから解離させた。ジエチルアミンＨＣｌは、特に１１．２５を超えるｐＨでグリシンＮａＯＨよりも優れていた。これらのデータは、ジエチルアミンＨＣｌアルカリ性緩衝液が１１．２５を超えるｐＨ（特にｐＨ１１．７５）で、初期段階ＩＶＩｇサンプルからの抗βアミロイドＩｇＧの解離において、グリシンＨＣｌ  ｐＨ２．５緩衝液よりも優れていることもまた実証する。
【００３７】
したがって抗βアミロイド免疫グロブリンをβアミロイドタンパク質から解離させるのに、アルカリ性緩衝液が適することが提案される。
特に注目すべきなのは、ジエチルアミンＨＣｌのアルカリ性緩衝液がｐＨ１１．２５〜１１．７５の範囲のｐＨにおいて、これらの実験で試験されたグリシンＨＣｌ  ｐＨ２．５酸性緩衝液よりも良く機能することである。
前述される範囲（例えばｐＨ、投薬量など）に関して、ここで述べられる範囲内のあらゆる表示値が、必要に応じて別の範囲を構築するための上限または下限値としてとして使用されてもよいことが理解されるであろう。
【００３８】
本明細書全体を通じて、目的は、本発明をいかなる１つの実施態様または特定の特徴群にも限定することなく、本発明の好ましい実施態様について述べることである。本発明から逸脱することなく、記述され例示されている実施態様に様々な変更と修正がなされてもよい。
各特許および科学文献の開示、本明細書で参照されるコンピュータプログラムおよびアルゴリズムは、参照によってその全体を援用する。
【図１】
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【図２】
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