(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドライアイの治療用医薬組成物であって、式Ｄ３：
【化１】
0005480242.tif 000027
で表されるβターンペプチド模倣環式化合物またはその薬学的に許容される塩を含む、医薬組成物。
【請求項２】
ムチン分泌の増強用医薬組成物であって、式Ｄ３：
【化２】
0005480242.tif 000028
で表されるβターンペプチド模倣環式化合物またはその薬学的に許容される塩を含む、医薬組成物。
【請求項３】
ドライアイがレーザー角膜屈折矯正手術（ＬＡＳＩＫ）に伴うものである、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項４】
ドライアイの治療用医薬の製造における、式Ｄ３：
【化３】
0005480242.tif 000029
で表されるβターンペプチド模倣環式化合物またはその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項５】
ムチン分泌の増強用医薬の製造における、式Ｄ３：
【化４】
0005480242.tif 000030
で表されるβターンペプチド模倣環式化合物またはその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項６】
ドライアイがレーザー角膜屈折矯正手術（ＬＡＳＩＫ）に伴うものである、請求項４記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００９年２月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／２０８，８７３号ならびに、２００８年４月４日に出願された米国仮特許出願第６１／１２３，０３６号の優先権の利益を主張するものである。上記の出願の教示内容全体を本明細書に援用する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
乾性角結膜炎としても知られるドライアイは、眼表面損傷のおそれのある不快感、視覚障害、涙液層不安定といった症候を生じる、涙液および眼表面の多因子疾患である。ドライアイには、涙液層の浸透圧上昇や眼表面の炎症を伴う（Ｔｈｅ  Ｏｃｕｌａｒ  Ｓｕｒｆａｃｅ，  “Ｔｈｅ  Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｒｙ  Ｅｙｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ：  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｕｂｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｒｙ  Ｅｙｅ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  （２００７），”  ５（２）：  ７５〜９２  （２００７））。ドライアイは、涙腺機能単位すなわち、涙腺、眼表面（角膜、結膜、マイボーム腺）、眼瞼ならびに、これらをつなぐ感覚神経と運動神経を含む一体構造の乱れであるとされている。涙腺機能単位は、涙液層の主な成分を調節するよう制御し、環境や内分泌、皮質の影響に応答する。この単位の機能は、涙液層の完全性、角膜の透明度、網膜に投影される像の質を保つことにある。涙腺機能単位のいずれかの構成要素（求心性感覚神経、遠心性自律神経および運動神経、涙液を分泌する腺）に疾患または損傷が生じると、涙液層が不安定になり、それ自体がドライアイと呼ばれる眼表面疾患につながる可能性がある。
【０００３】
ドライアイには主に、涙液欠乏性ドライアイ（ＡＤＤＥ）と蒸発性ドライアイ（ＥＤＥ）がある。ＡＤＤＥは、涙腺からの涙液分泌に障害があって生じるもので、さらにシェーグレン症候群性ドライアイ（関節リウマチなど、涙腺および唾液腺が自己免疫過程の標的になる）と非シェーグレン症候群ドライアイ（加齢に伴うドライアイなど、涙腺の機能不全であるが、シェーグレン症候群の全身性自己免疫の特徴は除外される）とに分けられる。ＥＤＥは、涙腺の正常な分泌機能がある状態で、露出している眼表面から水分が過剰に失われることによるものである。その原因は内因性（マイボーム腺の機能不全など、眼瞼の構造または動態に影響する内因性疾患によるもの）のこともあれば、外因性（ビタミンＡ欠乏症など、何らかの外的要因がゆえに眼表面疾患が発生する場合）のこともある（Ｔｈｅ  Ｏｃｕｌａｒ  Ｓｕｒｆａｃｅ，  “Ｔｈｅ  Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｒｙ  Ｅｙｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ：  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｕｂｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｒｙ  Ｅｙｅ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  （２００７），”  ５（２）：  ７５〜９２  （２００７）を参照のこと）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ドライアイは最も一般的な眼の病気のひとつであり、米国では５０歳以上の女性３２３万人、男性１６８万人前後に発症して推定有病率は４９１万人にものぼる（Ｔｈｅ  Ｏｃｕｌａｒ  Ｓｕｒｆａｃｅ，  “Ｔｈｅ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｄｒｙ  Ｅｙｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ，”  ５（２）：  ９３〜１０７  （２００７））。ドライアイに対する現行の治療法は、涙液を交換して症候を抑えることに焦点を合わせた対症療法的なものである。店頭販売の人工涙液製剤を入手可能である。また、水性の涙液層の内容を改善するための非薬理学的手法に、涙点プラグ挿入術がある。しかしながら、涙点プラグ挿入術は、涙液産生量、クリアランス、眼表面の感覚を損なう危険性をはらんでいる。これらの対症療法的な治療法には、短期的にみれば利点もあるが、ドライアイに対する長期にわたるコントロール療法では用途が限られている。ドライアイ治療用の最初の処方薬は、ＲＥＳＴＡＳＩＳ（登録商標）（シクロスポリンＡ）である。ＲＥＳＴＡＳＩＳ（登録商標）は、ドライアイ疾患と関連した眼の炎症の結果として涙液産生量が減少している患者で、涙液産生量を増やすものである。しかしながら、抗炎症薬よりも幅広い用途の見込める治療法に需要がある。
【０００５】
ドライアイを外科的に誘発したイヌでの研究で、ＮＧＦを局所使用するとドライアイの角膜感度が改善され、結膜杯細胞密度が増すことが、いくつかの臨床研究で明らかになっている（Ｂｏｎｉｎｉ，Ｓ．ら，  “Ｔｏｐｉｃａｌ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  Ｎｅｒｖｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｋｅｒａｔｉｔｉｓ，”    Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，  １０７：  １３４７〜１３５２  （２０００））。しかしながら、ＮＧＦは神経細胞による神経突起形成を刺激することから、ＮＧＦを局所投与することに伴う副作用のひとつに、眼疼痛がある（Ｂｏｎｉｎｉ，Ｓ．ら，  “Ｔｏｐｉｃａｌ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  Ｎｅｒｖｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｋｅｒａｔｉｔｉｓ，”  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，  １０７：  １３４７−１３５２  （２０００））。また、ＮＧＦは、薬物動態およびバイオアベイラビリティが悪く、製造コストが高い。従来技術では、ドライアイを治療する別の方法に対する需要が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の開示
本発明は、ドライアイの治療が必要な被検体においてドライアイを治療する方法であって、βターンペプチド模倣環式化合物を前記被検体に有効量で投与することを含む、方法を提供するものである。一実施形態では、βターンペプチド模倣環式化合物が、１３〜１７個の炭素原子で構成される大環状環を含む。一層特定の実施形態では、βターンペプチド模倣環式化合物が構造式（Ｉ）で表され、
【化１】
0005480242.tif 000002
式中、Ｒ１およびＲ３は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アリールまたはいずれかの対掌配置で２０種類のタンパク質−アミノ酸に見られるアミノ酸側鎖置換基から独立に選択され、Ｒ２およびＲ４は独立に、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであるか、Ｒ１およびＲ２が、それらが結合する炭素原子と一緒になって、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基またはシクロヘキシル基を形成するか、Ｒ３およびＲ４が、それらが結合する炭素原子と一緒になって、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基またはシクロヘキシル基を形成し、Ｒ５およびＲ６は、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｙは、水素であるか、１個または２個の芳香族置換基であり、Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐ、Ｓｅ、Ｃ、１〜６個の炭素原子で構成されるアルキレン、ＳＯ、ＳＯ２またはＮＨから選択され、ｎは、０、１、２、３、４または５であり、リンカーは、ホモ二官能性化合物との反応によって、式（Ｉ）で表される化合物のダイマーを形成するのに効果的な連結基である。好適なリンカー基としては、ＮＨ２、ＯＨ、ＳＨ、ＣＯＯＨ、ＣＨ３ＣＯ、ＣＨＯ、ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯＯＨがあげられるが、これに限定されるものではない。
【０００７】
本発明のもうひとつの実施形態では、Ｘが、Ｏ、ＳまたはＮＨであり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６が各々水素原子であり、大環状環が、１４個、１５個または１６個の環原子を有する。
【０００８】
もうひとつの実施形態では、Ｒ１およびＲ３が、異なるタンパク質新生アミノ酸側鎖の配列由来である。
【０００９】
本発明のもうひとつの実施形態では、Ｘが、Ｏ、ＳまたはＮＨである。
【００１０】
特定の実施形態では、式Ｉのβターンペプチド模倣環式化合物が、以下の式
【化２】
0005480242.tif 000003
で表されるか、その薬学的に許容される塩である。この化合物を本明細書ではＤ３と呼ぶ。Ｄ３は、Ｔｒｋモジュレーター活性を持つことが実証されている。
【００１１】
もうひとつの実施形態では、βターン環式化合物が、
【化３】
0005480242.tif 000004
【化４】
0005480242.tif 000005
【化５】
0005480242.tif 000006
【化６】
0005480242.tif 000007
【化７】
0005480242.tif 000008
【化８】
0005480242.tif 000009
【化９】
0005480242.tif 000010
【化１０】
0005480242.tif 000011
からなる群から選択されるか、上記のいずれかの薬学的に許容される塩である。これらの化合物が、Ｔｒｋモジュレーター活性を持つこともある。
【００１２】
一実施形態において、本発明は、ドライアイの治療が必要な被検体においてドライアイを治療する方法であって、以下の構造式（Ｄ３）
【化１１】
0005480242.tif 000012
で表されるβターンペプチド模倣環式化合物またはその薬学的に許容される塩を前記被検体に有効量で投与することを含む、方法に関するものである。
【００１３】
もうひとつの実施形態では、本発明は、ドライアイの治療が必要な被検体においてドライアイを治療する方法であって、式３Ａａ
【化１２】
0005480242.tif 000013
で表されるβターンペプチド模倣環式化合物またはその薬学的に許容される塩を前記被検体に有効量で投与することを含む、方法に関するものである。
【００１４】
さらにもうひとつの実施形態では、本発明は、ドライアイの治療が必要な被検体においてドライアイを治療する方法であって、式３Ａｋ
【化１３】
0005480242.tif 000014
で表されるβターンペプチド模倣環式化合物またはその薬学的に許容される塩を前記被検体に有効量で投与することを含む、方法に関するものである。
【００１５】
一実施形態において、本発明は、ムチン分泌の刺激が必要な被検体においてムチン分泌を刺激する方法であって、本明細書に記載のβターンペプチド模倣環式化合物を前記被検体に有効量で投与することを含む、方法に関するものである。
【００１６】
本発明はさらに、治療が必要な被検体においてドライアイ治療用の薬の製造に、本明細書に記載の化合物（βターンペプチド模倣環式化合物など）を使用することに関するものである。
【００１７】
本発明はさらに、治療が必要な被検体におけるドライアイの治療に有用な製剤組成物に関するものである。この製剤組成物は、本明細書に記載の化合物（βターンペプチド模倣環式化合物など）と、薬学的に許容されるキャリアとを含む。
【００１８】
上記の内容は、添付の図面に示したような、本発明の実施形態の例に関する以下の一層具体的な説明から明らかになろう。これらの図において、同じ構成要素には同様の参照符号を付す。図面はかならずしも原寸に比例した縮尺ではなく、本発明の実施形態を示すにあたって強調した部分もある。
【００１９】
図面ならびに裏付けとなる実験の説明では、化合物表記に接頭辞ＭＩＭを含む。この接頭辞のある化合物表記は、接頭辞のない化合物表記と同じである。たとえば、化合物Ｄ３、Ｄ３、ＭＩＭ−Ｄ３は、同じ化合物を示す。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】Ｔｒｋモジュレーター化合物に１、２、３の番号を付した、βターン主鎖についてのコードである。
【図１Ｂ】Ｔｒｋモジュレーター化合物にＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄの文字を付した、主鎖のＸ置換基についてのコードである。
【図１Ｃ】Ｔｒｋモジュレーター化合物に対する主鎖のジペプチドＲ１およびＲ２置換基のコードである。
【図１Ｄ】主鎖（１、２または３）、Ｘ置換基（Ａ、Ｂ、ＣまたはＤ）、ジペプチドアミノ酸（Ｒ１およびＲ２）を含むβターンペプチド模倣環式化合物の完全な文字コードを示す。
【図２】３０μＭ（マイクロモル）、１０μＭ、１μＭ、０．３μＭの用量で、神経成長因子（ＮＧＦ）、カルバコール（ＣＣｈ）、化合物Ｄ３、化合物３Ａａ、化合物３Ａｋを試験している、ラット（ラット１〜４）の結膜杯細胞での４回の実験で得られたデータを示す表である。この表には、平均（Ａｖｇ）と測定の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。
【図３】ラット（ラット１〜４）の結膜杯細胞での実験で得られたデータについての棒グラフである。Ｙ軸は、複合糖質分泌に関する基礎より上の倍増分を示す。Ｘ軸は、３０μＭ（マイクロモル）、１０μＭ、１μＭ、０．３μＭの用量での神経成長因子（ＮＧＦ）、カルバコール（ＣＣｈ）、化合物Ｄ３、化合物３Ａａ、化合物３Ａｋを示す。
【図４】ラット（ラット１〜３）の結膜杯細胞での実験で得られたデータについての棒グラフである。Ｙ軸は、細胞増殖の基礎より上の倍増分を示す。Ｘ軸は、３０μＭ（マイクロモル）、１０μＭ、１μＭ、０．３μＭの用量でのウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、神経成長因子（ＮＧＦ）１ｎＭ、化合物Ｄ３、化合物３Ａａ、化合物３Ａｋを表す。
【図５】図５Ａ〜図５Ｃは、培養での杯細胞の成長形態を示す。図５Ａは、９日目までには接着細胞が組織全体で目視確認されることを示す。図５Ｂは、組織培養ウェルに付着している単一の細胞が玉石の形態を呈し、細胞質ベシクルに小さな半透明の液滴を含有していることを示す。図５Ｃの開いた矢印は、培養で細胞が増殖する際に、杯細胞表面で粘液様の分泌生成物を示唆する小さな液滴の形成が観察されたことを示す。図５Ｃの塗りつぶし矢印は、これらの液滴含有細胞が培養で成長するにつれて液滴がプールにマージされたことを示す。
【図６】図６Ａ〜図６Ｃは、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色に対する杯細胞の一次培養の組織化学的分析を示す。図６Ａは、細胞がＰＡＳに対して陽性反応を持つことを示す。図６Ｂの開いた矢印は、多くの細胞質核周囲ベシクルが観察されたことを示す。図６Ｂおよび図６Ｃの塗りつぶし矢印は、これらのベシクルのうちいくつかがＰＡＳで著しく染色されたことから、分泌顆粒内に中性の複合糖質が存在することを示す。
【図７】ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）（０．１、１、１０ｎＭ）、ＮＧＦ（０．１、１、１０ｎＭ）、化合物Ｄ３（２、１０、５０Ｍμ）が複合糖質分泌に対しておよぼす影響に関する、基礎を上回る倍増分（±ｓｅｍ）での棒グラフである。Ｙ軸は、複合糖質分泌の基礎より上の倍増分（±ｓｅｍ）を表す。Ｘ軸は、基礎、ＮＧＦ（０．１、１、１０ｎＭ）、ＰＭＡ（０．１、１、１０ｎＭ）、化合物Ｄ３（２、１０、５０μＭ）を表す。
【図８】ＮＧＦ（０．０１、０．１、１、１０ｎＭ）および化合物Ｄ３（３、１０、３０、１００μＭ）が杯細胞増殖に対しておよぼす影響についての棒グラフである。Ｙ軸は、細胞増殖の基礎を上回る倍増分（±ＳＤ）を表す。Ｘ軸は、ＦＢＳ、ＮＧＦ（０．０１、０．１、１、１０ｎＭ）および化合物Ｄ３（３、１０、３０、１００μＭ）を表す。
【図９】ＰＭＡ（１００ｎＭ）、ＮＧＦ（１ｎＭおよび１０ｎＭ）、化合物Ｄ３（１０μＭおよび５０μＭ）がマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）活性に対しておよぼす影響についてのウエスタンブロットを示す。
【図１０】基礎、ＰＭＡ（１００ｎＭ）、ＮＧＦ（１ｎＭおよび１０ｎＭ）、化合物Ｄ３（１０μＭおよび５０μＭ）についての総アクチンタンパク質に対するＭＡＰＫ活性化の定量化に関する棒グラフである。Ｙ軸は、ＭＡＰＫ活性化の倍増分（±ｓｅｍ）を表す。Ｘ軸は、基礎、ＰＭＡ（１００ｎＭ）、ＮＧＦ（１および１０ｎＭ）、化合物Ｄ３（１０および５０μＭ）を表す。
【図１１】陰性対照ラット（未処理；ｎ＝ラット６匹）、１４日間連続の全身スコポラミンで誘導したドライアイモデルのラット（スコポラミン；ｎ＝ラット５匹）、８日目に生理食塩水で局所的に１回処理したドライアイモデルのラット（スコポラミン＋生理食塩水；ｎ＝ラット６匹）、８日目に５０ｕｇの１％化合物Ｄ３で局所的に１回処理したドライアイモデルのラット（スコポラミン＋１％化合物Ｄ３；ｎ＝ラット７匹）における、スコポラミン植込み後１４日目のフルオレセイン角膜染色スコア（スコア±ｓｅｍ）の棒グラフである。
【図１２】陰性対照ラット（未処理；ｎ＝ラット６匹）、１４日間連続の全身スコポラミンで誘導したドライアイモデルのラット（スコポラミン；ｎ＝ラット５匹）、８日目に生理食塩水で局所的に１回処理したドライアイモデルのラット（スコポラミン＋生理食塩水；ｎ＝ラット６匹）、８日目に５０ｕｇの１％化合物Ｄ３で局所的に１回処理したドライアイモデルのラット（スコポラミン＋１％化合物Ｄ３；ｎ＝ラット７匹）における、スコポラミン植込み後数日（Ｘ軸）の涙液産生スコア（シルマーテスト）（ｍｍ±ｓｅｍ）（Ｙ軸）のグラフである。
【図１３】陰性対照ラット（未処理；ｎ＝ラット６匹）、１４日間連続の全身スコポラミンで誘導したドライアイモデルのラット（スコポラミン；ｎ＝ラット５匹）、８日目に生理食塩水で局所的に１回処理したドライアイモデルのラット（スコポラミン＋生理食塩水；ｎ＝ラット６匹）、８日目に５０ｕｇの１％化合物Ｄ３で局所的に１回処理したドライアイモデルのラット（スコポラミン＋１％化合物Ｄ３；ｎ＝ラット７匹）における、スコポラミン植込み後数日（Ｘ軸）の涙液フルオレセインクリアランススコア（ＦＵ／ｍｍ±ｓｅｍ）（Ｙ軸）のグラフである。
【図１４】健常なラットにおける化合物Ｄ３およびＮＧＦ処置薬の投与前後のムチン濃度を示す棒グラフである。Ｙ軸は、ムチン濃度（ｎｇ／μＬ±ｓｅｍ）を表す。Ｘ軸は、生理食塩水および化合物Ｄ３（０．４、１．０および２．５％）およびＮＧＦを表す。
【図１５】健常なラットにおける化合物Ｄ３およびＮＧＦ処置薬の局所投与後の基線からのムチン濃度の変化を示す棒グラフである。Ｙ軸は、ムチン濃度の変化を表す（ｎｇ／μＬ±ｓｅｍ）。Ｘ軸は、生理食塩水および化合物Ｄ３（０．４、１．０および２．５％）およびＮＧＦを表す。
【図１６】実施例３での端点評価の研究設計とスケジュールのグラフである。
【図１７Ａ】無処置のラットならびに、生理食塩水、０．０００５３％のＮＧＦ、２．５％、１．０％、０．４％の化合物Ｄ３（それぞれ、２５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬの化合物Ｄ３に相当）で処理したスコポラミン植込みラットにおける、１３日目、２１日目、２８日目の涙液破壊時間（ＴＢＵＴ）（秒、平均±ｓｅｍ）の棒グラフである。Ｙ軸は、ＴＢＵＴ（秒、平均±ｓｅｍ）を表す。Ｘ軸は、１３日目、２１日目、２８日目の、無処置のラットならびに、生理食塩水、０．０００５３％のＮＧＦ、２．５％、１．０％、０．４％の化合物Ｄ３で処理したスコポラミン植込みラットを示す。
【図１７Ｂ】無処置のラットならびに、生理食塩水、０．４％、１．０％、２．５％の化合物Ｄ３および０．０００５３％のＮＧＦで処理したスコポラミン植込みラットにおいて、スコポラミン植込み後数日（Ｘ軸）の涙液破壊時間（ＴＢＵＴ）（ｓｅｃ±ｓｅｍ）（Ｙ軸）のプロットである。
【図１８Ａ】無処置のラットならびに、生理食塩水、０．０００５３％のＮＧＦ、２．５％、１．０％、０．４％の化合物Ｄ３（それぞれ、２５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬの化合物Ｄ３に相当）で処理したスコポラミン植込みラットにおける、１３日目、２１日目、２８日目の角膜染色（平均±ｓｅｍ）の棒グラフである。Ｙ軸は、角膜染色（ＣＳ）（秒、平均±ｓｅｍ）を表す。Ｘ軸は、１３日目、２１日目、２８日目の、無処置のラットならびに、生理食塩水、０．０００５３％のＮＧＦ、２．５％、１．０％、０．４％の化合物Ｄ３で処理したスコポラミン植込みラットを示す。
【図１８Ｂ】無処置のラットならびに、生理食塩水、０．４％、１．０％、２．５％の化合物Ｄ３および０．０００５３％のＮＧＦで処理したスコポラミン植込みラットにおいて、スコポラミン植込み後数日（Ｘ軸）の角膜染色（スコア±ｓｅｍ）（Ｙ軸）のプロットである。
【図１９Ａ】無処置のラットならびに、生理食塩水、０．０００５３％のＮＧＦ、２．５％、１．０％、０．４％の化合物Ｄ３（それぞれ、２５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬの化合物Ｄ３に相当）で処理したスコポラミン植込みラットにおける、１２日目、１９日目、２８日目のムチン産生（ｎｇ／μＬ±ｓｅｍ）の棒グラフである。Ｙ軸は、ムチン産生（ｎｇ／μＬ±ｓｅｍ）を表す。Ｘ軸は、１３日目、２１日目、２８日目の、無処置のラットならびに、生理食塩水、０．０００５３％のＮＧＦ、２．５％、１．０％、０．４％の化合物Ｄ３で処理したスコポラミン植込みラットを示す。
【図１９Ｂ】無処置のラットならびに、生理食塩水、０．４％、１．０％、２．５％の化合物Ｄ３および０．０００５３％のＮＧＦで処理したスコポラミン植込みラットにおいて、スコポラミン植込み後数日（Ｘ軸）のムチン産生（ｎｇ／μＬ±ｓｅｍ）（Ｙ軸）のプロットである。
【図２０】図２０Ａ〜図２０Ｃは、棒グラフ、化合物Ｄ３が選択された端点測定に対しておよぼす影響を示す。図２０Ａは、未処理群、生理食塩水群、１％化合物Ｄ３で処理した群について、２８日目と１３日目でのＴＢＵＴ（ｓｅｃ）の変化を示す。図２０Ｂは、未処理群、生理食塩水群、１％化合物Ｄ３で処理した群について、２８日目と１３日目での角膜染色（スコア）の変化を示す。図２０Ｃは、未処理群、生理食塩水群、１％化合物Ｄ３で処理した群について、２８日目と１３日目でのムチン産生（ｎｇ／μＬ）の変化を示す。
【図２１】図２１Ａ〜図２１Ｃは、１％化合物Ｄ３が選択された端点測定に対しておよぼす影響についてのプロットを示す。図２１Ａは、スコポラミン植込み後数日（Ｘ軸）における生理食塩水群および１％化合物Ｄ３で処理した群について、ＴＢＵＴ（ｓｅｃ±ｓｅｍ）の変化（Ｙ軸）を示す。図２１Ｂは、スコポラミン植込み後数日（Ｘ軸）における生理食塩水群および１％化合物Ｄ３で処理した群について、角膜染色（スコア±ｓｅｍ）の変化（Ｙ軸）を示す。図２１Ｃは、スコポラミン植込み後数日（Ｘ軸）における生理食塩水群および１％化合物Ｄ３で処理した群について、ムチン産生の変化（ｎｇ／μＬ±ｓｅｍ）（Ｙ軸）を示す。
【図２２】無処置のラットならびに、生理食塩水、０．４％、１．０％、２．５％の化合物Ｄ３および０．０００５３％のＮＧＦで処理したスコポラミン植込みラットにおいて、スコポラミン植込み後数日（Ｘ軸）の涙液産生（ｍｍ±ｓｅｍ）（Ｙ軸）のプロットである。
【図２３】無処置のラットならびに、および生理食塩水、０．４％、１．０％、２．５％の化合物Ｄ３および０．０００５３％のＮＧＦで処理したスコポラミン植込みラットにおいて、スコポラミン植込み後数日（Ｘ軸）の涙液フルオレセインクリアランス（Ｌｏｇ  ＦＵ／ｍｍ±ｓｅｍ）のプロットである。
【図２４】無処置の未処理対照ラットならびに、生理食塩水、０．４％、１．０％、２．５％の化合物Ｄ３および０．０００５３％のＮＧＦで処理したスコポラミン植込みラットにおいて、スコポラミン植込み後数日（Ｘ軸）の体重のグラフ（ｇ±ｓｅｍ）（Ｙ軸）。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明は、ドライアイの治療を必要とする被検体においてドライアイを治療する方法であって、βターンペプチド模倣環式化合物を前記被検体に投与することを含む、方法に関する。本明細書で使用する場合、「βターンペプチド模倣環式化合物」は、ニューロトロフィン受容体リガンド（ＮＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＢＤＮＦなど）のβターン領域を模倣する環式化合物を示す。特定の実施形態では、本発明のβターンペプチド模倣環式化合物は、ニューロトロフィンチロシンキナーゼ（Ｔｒｋ）受容体モジュレーターであってもよい。もうひとつの特定の実施形態では、βターンペプチド模倣環式化合物がｐ７５受容体モジュレーターであってもよい。さらにもうひとつの実施形態では、βターンペプチド模倣環式化合物がｐ７５受容体モジュレーターとＴｒｋ受容体モジュレーターの両方であってもよい。
【００２２】
一実施形態では、βターンペプチド模倣環式化合物が構造式Ｉで表される。特定の実施形態では、βターンペプチド模倣環式化合物が化合物Ｄ３または化合物Ｄ３の誘導体である。
【００２３】
もうひとつの実施形態では、βターンペプチド模倣環式化合物が、１Ａｄ、３Ａａ、３Ａｋ、３Ｂａ、３Ｂｇ、３Ｂｉ、３Ｃａ、３Ｃｅ、３Ｃｇ、３Ｃｋ、１Ａａ、１Ｂａ、３Ａｃ、３Ａｅからなる群から選択される化合物であってもよい。
【００２４】
本発明のβターンペプチド模倣環式化合物は、Ｔｒｋ受容体モジュレーター化合物またはｐ７５受容体モジュレーターであってもよいが、ドライアイを治療する上でのβターンペプチド模倣環式化合物の有用性が、ドライアイを治療する上で調節すると有用なＴｒｋＢ受容体または他の任意の受容体の調節など、他の活性に依存する場合がある。また、ドライアイを治療する上での本発明のβターンペプチド模倣環式化合物の有用性が、走化性の白血球動員に対する作用、顆粒球分化に対する作用、好中球、肥満細胞、好酸球に対する作用、角膜上皮細胞増殖に対する作用、上方制御される選択的感覚ニューロペプチド、サブスタンスＰおよびカルシトニン遺伝子関連ペプチドなど、ニューロトロフィン様活性の他の調節に依存することもある。
【００２５】
本明細書で使用する場合、「Ｔｒｋ受容体モジュレーター化合物」は、ＴｒｋＡ受容体アゴニスト、ＴｒｋＣ受容体アゴニストあるいは、ＴｒｋＡ受容体アゴニストとＴｒｋＣ受容体アゴニストの両方である化合物である。
【００２６】
本明細書で使用する場合、「調節する」または「モジュレーター」とは、受容体を刺激または受容体に拮抗することを示す。
【００２７】
本明細書で使用する場合、「ｐ７５受容体モジュレーター」は、ｐ７５受容体アゴニストまたはアンタゴニストである。
【００２８】
ニューロトロフィンおよびニューロトロフィン受容体
ニューロトロフィン（ＮＴＦ）は、あらゆる脊椎動物種でニューロンの増殖、生存、分化を制御するダイマータンパク質のファミリである。ＮＴＦは、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）を含む。これらのＮＴＦは、２種類の膜貫通受容体すなわち高親和性受容体ファミリのチロシンキナーゼ（Ｔｒｋ）（ＴｒｋＡ、Ｔｒｋ  Ｂ、Ｔｒｋ  Ｃ）（Ｋｄ＝１０〜１００ｐＭ）およびｐ７５受容体（Ｋｄ＝１ｎＭ）と結合する。Ｔｒｋファミリの受容体リガンドは極めて選択性が高い（ＮＧＦがＴｒｋＡと結合し、ＢＤＮＦがＴｒｋＢと結合し、ＮＴ−３が主にＴｒｋＣと結合するなど）。
【００２９】
ニューロトロフィンとその受容体は、結膜杯細胞（ＣＧＣ）で同定されている（Ｒｉｏｓ，  Ｊ．  Ｄ．ら，  “Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎｓ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｒａｔ  Ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖａｌ  Ｇｏｂｌｅｔ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ４８：  １５４３〜１５５１  （２００７））。ＣＧＣは、涙液層における大きな可溶性ムチンの一次源である。これらのムチンは、角膜と結膜を外的要因（細菌または化学物質）から保護する物理的障壁および化学的障壁を提供し、かつ鮮やかな視界を得るのに必要な滑らかな屈折面を得やすくするものである。
【００３０】
βターンペプチド模倣環式化合物
一実施形態では、βターンペプチド模倣環式化合物が、１３〜１７個の炭素原子で構成される大環状環を含む。一層特定の実施形態では、βターンペプチド模倣環式化合物が構造式（Ｉ）で表され、
【化１４】
0005480242.tif 000015
式中、Ｒ１およびＲ３は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アリールまたはいずれかの対掌配置で２０種類のタンパク質−アミノ酸に見られるアミノ酸側鎖置換基から独立に選択され、Ｒ２およびＲ４は独立に、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであるか、Ｒ１およびＲ２が、それらが結合する炭素原子と一緒になって、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基またはシクロヘキシル基を形成するか、Ｒ３およびＲ４が、それらが結合する炭素原子と一緒になって、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基またはシクロヘキシル基を形成し、Ｒ５およびＲ６は、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｙは、水素であるか、１個または２個の芳香族置換基であり、Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐ、Ｓｅ、Ｃ、１〜６個の炭素原子で構成されるアルキレン、ＳＯ、ＳＯ２またはＮＨから選択され、ｎは、０、１、２、３、４または５であり、リンカーは、ホモ二官能性化合物との反応によって、式（Ｉ）で表される化合物のダイマーを形成するのに効果的な連結基である。好適なリンカー基としては、ＮＨ２、ＯＨ、ＳＨ、ＣＯＯＨ、ＣＨ３ＣＯ、ＣＨＯ、ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯＯＨがあげられるが、これに限定されるものではない。
【００３１】
２０種類のアミノ酸側鎖置換基としては、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、チロシンの側鎖があげられる。たとえば、グルタミン酸の側鎖は
【化１５】
0005480242.tif 000016
である。
【００３２】
本発明のもうひとつの実施形態では、Ｘが、Ｏ、ＳまたはＮＨであり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６が各々水素原子であり、大環状環が、１４個、１５個または１６個の環原子を有する。
【００３３】
もうひとつの実施形態では、Ｒ１およびＲ３が、異なるタンパク質アミノ酸側鎖の配列由来である。
【００３４】
本発明のもうひとつの実施形態では、Ｘが、Ｏ、ＳまたはＮＨである。
【００３５】
特定の実施形態では、βターンペプチド模倣環式化合物がＤ３（Ｍａｌｉａｒｔｃｈｏｕｋら，  Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍｃｏｌ  ５７（２）：３８５〜３９１，  ２０００（全体を本明細書に援用する）ならびに米国特許第６，８８１，７１９号明細書（全体を本明細書に援用する）を参照のこと）またはＤ３の誘導体である。本発明の方法で使用するのに、Ｄ３および式Ｉで表される他の化合物の多数の誘導体が想定され、このような単位２つがダイマーで連結されたビオチニル化形態および分子などの単純な修飾を含む。Ｄ３および式Ｉで表される他の化合物の他の誘導体として、２０種類のタンパク質−アミノ酸に見られるアミノ酸側鎖置換基を有する側鎖Ｒ１〜Ｒ６があげられる。
【００３６】
タンパク質アミノ酸に特有の側鎖（Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓなど）は、Ｄ３および式Ｉで表される他の化合物の容易に生成される誘導体である多様な構造の形成／設計を可能にし、多くのタイプの官能基を含み得る。
【００３７】
置換基Ｙは、水素であってもよいし、ニトロ、アミノ、ハロ、アルキル（たとえば、１〜６個、好ましくは１〜４個の炭素原子で構成されるアルキル）、アリール（たとえば、フェニルまたはナフチル）などの１個または２個の芳香族置換基であってもよい。アルキルおよびアリール置換基Ｙは、未置換であっても置換されていてもよく、好適な置換基には、１〜６個の炭素原子で構成されるニトロおよびアルキルがある。また、Ｙは、ビオチンなどの官能基で誘導体化されてもよい。基Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐ、Ｓｅといったどのような求核原子であってもよいが、Ｃなどの他の原子でもよく、あるいは、メチレンなどの一般に１〜６個の炭素原子で構成されるアルキレンラジカル、ＳＯ、ＳＯ２またはＮＨであってもよい。ベンゾイルカルボニルのオルトまたはメタを連結点にすることが可能である。「ｎ」の許容可能な値は、０、１、２、３、４、５である。Ｘを取り込む連結側鎖は、構造（Ｉ）に示すように脂肪族である。
【００３８】
側鎖アルキル基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６は、これらの化合物の生物活性を高める目的でさまざまに変えられるものである。一般に、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、２０種類のタンパク質−アミノ酸に見られるアミノ酸側鎖置換基であり、たとえば、いずれかの対掌配置でのグルタミン酸、リジン、オルニチン、スレオニンの側鎖である。Ｒ１置換基がアミノ酸側鎖である場合、その炭素上の他の置換基であるＲ２は一般に水素であるが、メチル、エチルまたはベンジルであってもよい。あるいは、Ｒ１およびＲ２がその介在原子と一緒になって接合し、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロヘキサン残基を与える形であってもよい。Ｒ３およびＲ４は、上述したようなＲ１およびＲ２と同じように関連している。すなわち、多くの場合、このうちの一方がアミノ酸側鎖になり、２つの置換基のうちの他方は水素であるが、メチル、エチル、プロピルまたはベンジルであってもよい。また、Ｒ３およびＲ４が介在原子と一緒になって接合し、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロヘキサン残基を与える形であってもよい。
【００３９】
これらの位置における最も一般的な置換基が水素またはメチルであるＲ５およびＲ６のバリエーションについては、かなりの幅がある。これらの置換基は、２０種類のタンパク質−アミノ酸の側鎖のうちの１つ、特にメチルと対応するようにも設計可能である。
【００４０】
特に生物活性の助けとなることが明らかな側鎖が、リジン、グルタミン酸、チロシン、イソロイシン、アスパラギン、スレオニンの側鎖としてのＲ１およびＲ３、水素としてのＲ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６である。特に側鎖のうちの１つ以上を選択し、ＮＧＦのターン領域内の側鎖に対応させる。
【００４１】
通常、大環状化合物は１３員環から１６員環であり、Ｘ置換基はＯ、Ｎ、Ｓ、ＳＯまたはＳＯ２である。
【００４２】
もうひとつの実施形態では、βターンペプチド模倣環式化合物が、１Ａｄ、３Ａａ、３Ａｋ、３Ｂａ、３Ｂｇ、３Ｂｉ、３Ｃａ、３Ｃｅ、３Ｃｇ、３Ｃｋ、１Ａａ、１Ｂａ、３Ａｃ、３Ａｅからなる群から選択される。
【００４３】
さらにもうひとつの実施形態では、βターンペプチド模倣環式化合物が、環状アミノ、エーテルまたはスルフィド足場を含む化合物（図１Ａ参照）であり、さまざまな置換基（アミン、グアニジンまたはメチルスルホンアミドなど）（図１Ｂ参照）ならびにＲ１基およびＲ２基が、ジペプチドアミノ酸フラグメントを含む（図１Ｃ参照）。（図１Ｄも参照）。
【００４４】
一実施形態において、本発明は、ムチン分泌の刺激が必要な被検体においてムチン分泌を刺激する方法であって、本明細書に記載のβターンペプチド模倣環式化合物を前記被検体に有効量で投与することを含む、方法に関するものである。
【００４５】
本発明の化合物は有効量で存在する。本明細書で使用する場合、「有効量」という用語は、適切な投与計画で投与した場合に、標的となる機能障害を治療（治療的または予防的に）するのに十分な量を示す。たとえば、有効量は、治療対象となる機能障害の重症度、期間または進行を低減または寛解し、治療対象となる機能障害の進展を防止し、治療対象となる機能障害を退行させ、あるいは別の治療法の予防効果または治療効果を亢進または改善するのに十分である。
【００４６】
本明細書で使用する場合、「ドライアイ」は、涙液欠乏性ドライアイ、蒸発性ドライアイ、閉経関連ドライアイ、涙液減少症、涙液欠乏、眼球乾燥症、シェーグレン症候群、乾性角結膜炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、眼類天疱瘡、眼瞼縁炎、閉瞼障害および感覚神経麻痺、アレルギー性結膜炎関連ドライアイ、ウイルス感染後結膜炎ドライアイ、白内障手術後ドライアイ、レーザー角膜屈折矯正手術（ＬＡＳＩＫ）後の慢性ドライアイ、ＶＤＴ手術関連ドライアイ、コンタクトレンズ装着関連ドライアイ、加齢によるドライアイ、角膜損傷、感染、ライリー・デイ症候群、先天性無涙症、栄養障害または栄養不足（ビタミンを含む）、薬理学的副作用、眼のストレスおよび腺や組織の破壊、スモッグ、煙、異常に乾燥した空気、空気中の微粒子などへの環境曝露、自己免疫および他の免疫不全障害、まばたきができなくなっている昏睡患者を含むことを想定した広い概念である。また、「ドライアイ」には、角結膜上皮病変、角膜上皮の痛み、角膜潰瘍（角膜実質層の潰瘍など）、眼感染症など、ドライアイによって引き起こされる疾患も含む。
【００４７】
被検体とは、本明細書で使用する場合、霊長類（ヒトなど）、雌ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、ネズミまたは種としての他のウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコ、齧歯類またはネズミを含むがこれに限定されるものではない、哺乳動物などの動物を示す。一実施形態では、被検体がヒトである。
【００４８】
「治療する」という表現には、療法的な治療と予防的な治療（発生尤度の低減）の両方を含む。この表現は、疾患（本明細書に記載の疾患または機能障害など）の発生または進行を低減、抑制、減弱、減少、抑止または安定させ、疾患の重症度を下げるまたは疾患に関連した症候を改善することを意味する。
【００４９】
本明細書で使用する場合、薬学的に許容される塩という表現は、薬学的に許容される無毒の酸（その無機酸および有機酸を含む）から調製される投与対象化合物の塩を示す。このような無機酸の例として、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸があげられる。適切な有機酸については、たとえば、脂肪族、芳香族、カルボン酸およびスルホン酸クラスの有機酸から選択すればよく、その一例として、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、カンファースルホン酸、クエン酸、フマル酸、グルコン酸、イセチオン酸、乳酸、リンゴ酸、ムチン酸、酒石酸、パラ−トルエンスルホン酸、グリコール酸、グルクロン酸、マレイン酸、フロ酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、サリチル酸、フェニル酢酸、マンデル酸、エンボン酸（パモ酸）、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、パントテン酸、ベンゼンスルホン酸（ベシレート）、ステアリン酸、スルファニル酸、アルギン酸、ガラクツロン酸などがあげられる。
【００５０】
本発明はさらに、治療を必要とする被検体においてドライアイを治療するための製剤組成物に関するものである。この製剤組成物は、本発明の１つ以上のβターンペプチド模倣環式化合物と、薬学的に許容されるキャリアとを含む。薬学的に許容されるキャリアは、組成物中の制御／活性物質と相互作用しない不活性成分を含有するものであってもよい。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡに記載されているものなどの標準的な製剤処方技術を採用可能である。非経口投与用の好適な製剤キャリアとしては、たとえば、滅菌水、生理食塩液、静菌生理食塩水（約０．９％ｍｇ／ｍｌのベンジルアルコールを含有する生理食塩水）、リン酸緩衝生理食塩水、ハンクス液、乳酸リンゲル液、デキストロース、エタノール、グリセロールなどの界面活性剤または賦形剤があげられる。
【００５１】
別の実施形態では、製剤組成物が（１種類以上の）他の治療剤をさらに含む。本明細書に記載の方法および製剤組成物で用いるのに適した他の治療剤は、抗炎症剤（ＲＥＳＴＡＳＩＳ（登録商標）（Ａｌｌｅｒｇａｎ）など）、ムチン刺激薬（ジクアホソル（Ｉｎｓｐｉｒｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）１５−（Ｓ）−ＨＥＴＥ（Ａｌｃｏｎ）、レバミピド（Ｏｔｓｕｋａ）、エカベト（ＩＳＴＡ）など）、ホルモン剤、涙腺刺激薬（アンドロゲン涙液（Ａｌｌｅｒｇａｎ）など）、人工涙液などであり得るが、これに限定されるものではない。
【００５２】
投与モード
この組成物は、たとえば、溶液、軟膏、クリーム、ローション、眼軟膏、最も好ましくは、点眼薬または点眼ゲルの形で眼科用局所塗布向けに処方可能であり、保存剤、薬剤の浸透を助ける溶媒、軟膏およびクリームの皮膚軟化薬などの従来の適切な添加剤を含有するものであってもよい。このような局所製剤は、相溶可能な従来のキャリア、たとえばクリームまたは軟膏基剤、ローション用のエタノールまたはオレイルアルコールを含有するものであってもよい。
【００５３】
あるいは、活性化合物をリポソームによって眼に適用してもよい。さらに、ポンプ−カテーテル系によって活性化合物を涙液層に注入してもよい。本発明のもうひとつの実施形態は、ピロカルピン（Ｏｃｕｓｅｒｔ（商標））Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐ．，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  Ｃａｌｉｆ．）に用いられているものなどであるが、これに限定されるものではない、膜などの連続または選択的放出装置に入れた活性化合物を対象とする。他の実施形態として、活性化合物を、眼内に装着されるコンタクトレンズに含ませる、コンタクトレンズに保持させる、あるいはコンタクトレンズに結合させてもよい。本発明のもうひとつの実施形態は、眼表面に適用可能なスワブまたはスポンジに含ませた活性化合物を対象とする。本発明のもうひとつの実施形態は、眼表面に塗布可能な液体スプレーに含有させた活性化合物を対象とする。本発明のもうひとつの実施形態は、涙腺組織内へあるいは眼表面に対する活性化合物の直接的な注射を対象とする。
【００５４】
ドライアイ治療用の本発明の製剤組成物を点眼液として用いる場合、水性点眼液、水性懸濁点眼液、粘性点眼液および可溶化点眼液などの水性点眼薬あるいは、非水性点眼液および非水性懸濁点眼液などの非水性点眼液といった、点眼液に用いられている任意の剤形で提供される。このうち、水性点眼液が好ましい。
【００５５】
ドライアイ治療用の本発明の製剤組成物を水性点眼液に調製する場合、水性点眼液で普通に用いられているさまざまな添加剤を、本発明の目的に悪影響がおよばない範囲で適宜含有させる。このような添加剤の例として、緩衝液、等張化剤、保存剤、可溶化剤（安定剤）、ｐＨ調整剤、増粘剤、キレート化剤があげられる。
【００５６】
緩衝液については、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酒石酸緩衝液、酢酸緩衝液（たとえば酢酸ナトリウム）、アミノ酸を含む群から選択すればよいが、これに限定されるものではない。
【００５７】
等張化剤については、ソルビトール、グルコース、マンニトールなどの糖類、グリセリン、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールなどの多価アルコール、塩化ナトリウムなどの塩を含む群から選択すればよいが、これに限定されるものではない。
【００５８】
保存剤については、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、パラオキシ安息香酸メチルおよびパラオキシ安息香酸エチルなどのパラオキシ安息香酸アルキル、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、ソルビン酸およびその塩、チメロサール、クロロブタノールを含む群から選択すればよいが、これに限定されるものではない。
【００５９】
可溶化剤（安定剤）については、シクロデキストリンおよびその誘導体、ポリ（ビニルピロリドン）などの水溶性ポリマー、ポリソルベート８０（商品名：Ｔｗｅｅｎ  ８０）などの界面活性剤を含む群から選択すればよいが、これに限定されるものではない。
【００６０】
ｐＨ調整剤については、塩酸、酢酸、リン酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウムを含む群から選択すればよいが、これに限定されるものではない。
【００６１】
増粘剤については、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースおよびこれらの塩を含む群から選択すればよいが、これに限定されるものではない。
【００６２】
キレート化剤については、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、縮合リン酸ナトリウムナトリウムを含む群から選択すればよいが、これに限定されるものではない。
【００６３】
ドライアイ治療用の本発明の製剤組成物を眼科用軟膏に調製する場合、基剤化合物が存在しなければならない。眼科用軟膏の基剤については、精製ラノリン、ＶＡＳＥＬＩＮＥ（登録商標）、ｐｌａｓｔｉｂａｓｅ、液体パラフィン、ポリエチレングリコールを含む群から選択すればよいが、これに限定されるものではない。
【００６４】
あるいは、ラクトース、微結晶性セルロース、コーンスターチ、ステアリン酸などの薬学的に許容される打錠用賦形剤を用いて、本発明の組成物を経口投与用に処方することも可能である。経口投与には、水、グリコール、油、アルコールなどで製剤化した液体組成物も含み得る。
【００６５】
同時投与
本発明の方法が同時投与を含む場合、同時投与とは、第１の量のβターンペプチド模倣環式化合物またはその薬学的に許容される塩と、抗炎症剤（ＲＥＳＴＡＳＩＳ（登録商標）（Ａｌｌｅｒｇａｎ）など）、ムチン刺激薬（ジクアホソル（Ｉｎｓｐｉｒｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）１５−（Ｓ）−ＨＥＴＥ（Ａｌｃｏｎ）、レバミピド（Ｏｔｓｕｋａ）、エカベト（ＩＳＴＡ）など）、ホルモン剤および涙腺刺激薬（アンドロゲン涙液（Ａｌｌｅｒｇａｎ）など）、人工涙液からなる群から選択される第２の量の少なくとも１種の作用剤との投与を示し、第１および第２の量が一緒に、治療を必要とする被検体においてドライアイを治療するための有効量を含む。同時投与には、単一の製剤組成物に含めるか、複数の製剤組成物に含めるかして本質的に同時期になるように、第１および第２の量の化合物を投与することも包含される。また、このような同時投与には、順不同で各化合物を逐次的に用いることも包含される。同時投与が第１の量のβターンペプチド模倣環式化合物またはその薬学的に許容される塩と、抗炎症剤（たとえば、ＲＥＳＴＡＳＩＳ（登録商標）（Ａｌｌｅｒｇａｎ）など）、ムチン刺激薬（たとえば、ジクアホソル（Ｉｎｓｐｉｒｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）１５−（Ｓ）−ＨＥＴＥ（Ａｌｃｏｎ）、レバミピド（Ｏｔｓｕｋａ）、エカベト（ＩＳＴＡ）など）、ホルモン剤および涙腺刺激薬（たとえば、アンドロゲン涙液（Ａｌｌｅｒｇａｎ）など）、人工涙液からなる群から選択される第２の量の少なくとも１種の作用剤とを別々に投与することを対象とする場合、化合物は、所望の治療効果が得られるよう時間的に十分に近いタイミングで投与される。たとえば、所望の治療効果が得られるそれぞれの投与間の時間は、数分から数時間の範囲を取り得るものであり、効力、可溶性、バイオアベイラビリティ、血漿半減期、動態プロファイルなどの各化合物の特性を考慮して決定可能である。
【００６６】
投与量
βターンペプチド模倣環式化合物の有効量は、患者の年齢、性別、体重、患者の現時点の病状、治療対象となるドライアイ疾患の性質に左右される。当業者であれば、これらの要因および他の要因に応じて適切な薬用量を判断できるであろう。たとえば、ドライアイの治療を必要とする被検体で本発明の製剤組成物をドライアイ治療用の点眼液として用いる場合、水溶液の点眼薬が本発明の化合物の活性成分を、０．０２〜２．０（ｗ／ｖ）、たとえば約０．０３〜１．５（ｗ／ｖ）％、たとえば約０．０５〜１．０（ｗ／ｖ）％などの約０．００１〜２．５（ｗ／ｖ）％の量で含有するのが望ましい。本明細書で使用する場合、重量／容量（ｗ／ｖ）は、最終比容積（ｇ／ｍｌなど）における溶質の比質量を意味する。投与する際、本発明の化合物および組成物は、１日１回あるいは、１日２回、１日３回、１日４回など、一日量を複数に分けて投与可能である。特に好ましい実施形態では、本発明の化合物および組成物を、１〜５滴、たとえば、１滴、２滴、３滴、４滴または５滴の用量で投与可能である。
【００６７】
本発明の製剤組成物を眼用軟膏として用いる場合、本発明の化合物の活性成分を、０．０２〜２．０（ｗ／ｗ）、たとえば約０．０３〜１．５（ｗ／ｗ）％、たとえば約０．０５〜１．０（ｗ／ｗ）％などの約０．００１〜２．５（ｗ／ｗ）％の量で眼用軟膏に含有すると望ましい。本明細書で使用する場合、重量／重量（ｗ／ｗ）は、ｇ／ｇなど、溶液の最終重量における溶質の重量を意味する。投与する際、本発明の化合物および組成物は、１日１回あるいは、１日２回、１日３回、１日４回など、一日量を複数に分けて投与可能である。
【実施例】
【００６８】
以下、本発明の実施例について説明する。
【００６９】
本明細書に引用する特許、公開公報、参考文献の教示内容に関しては、その全体を本明細書に援用する。
【００７０】
本発明についてその実施例を参照して図示し、説明しているが、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲から逸脱することなく、形態および詳細に対してさまざまな変更が可能である旨は当業者であれば理解できよう。
【００７１】
例証
実施例１
βターンペプチド模倣環式化合物がラットの結膜杯細胞からの複合糖質分泌に対しておよぼす影響
動物：
２５０〜３００ｇのオスのスプラーグドーリーラット（ｎ＝４）のラット下結膜組織を収集した。
【００７２】
細胞培養：
Ｒｉｏｓ，  Ｊ．  Ｄ．ら，  “Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎｓ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｒａｔ  Ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖａｌ  Ｇｏｂｌｅｔ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ４８：  １５４３〜１５５１  （２００７）に記載された細胞培養およびアッセイ手順と同様にして、ラット下結膜組織から組織片培養を確立した。外植片由来の細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）およびペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）／ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を加えたＲＰＭＩ  １６４０にて、５％ＣＯ２加湿雰囲気中３７℃で７２時間成長させた。汚染源となる非杯細胞をプレートから掻爬して除去した。このとき、杯細胞が切片から遊走し、増殖しはじめた。１週間後、杯細胞をトリプシン処理し、１０％ＦＢＳ加ＲＰＭＩ−１６４０培地の入った２４ウェルの培養プレートに蒔いた。
【００７３】
複合糖質分泌の測定：
複合糖質分泌を測定するために、結膜杯細胞をコンフルエンスの状態まで成長させ、２時間血清欠乏させた上で、神経成長因子（ＮＧＦ）、カルバコール（Ｃｃｈ）、化合物Ｄ３、化合物３Ａａ、化合物３Ａｋを２時間加えた。化合物Ｄ３、３Ａａ、３Ａｋを３０μｍ（マイクロモル）、１０μＭ、１μＭ、０．３μＭの濃度で投与した。化合物を溶解させるのに用いたビヒクルであるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）も含めた。ＤＭＳＯについては、３０μＭ濃度の化合物に対する基礎対照として使用し、これは０．１％（ｖ／ｖ）であった。コリン作動薬であるカルバコール（Ｃｃｈ）を１００μＭ（マイクロモル）で加え、複合糖質分泌の陽性対照とした。酵素結合レクチンアッセイ（ＥＬＬＡ）によって培地に分泌される複合糖質の量の測定した。培地を回収し、ムチンをはじめとしてレクチン検出可能な複合糖質の量を分析した。ラット結膜杯細胞ムチンに特異的なレクチンＵＥＡ−Ｉを用いて分泌量を測定した。Ｒｉｏｓ，  Ｊ．  Ｄ．ら，  “Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎｓ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｒａｔ  Ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖａｌ  Ｇｏｂｌｅｔ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ４８：  １５４３〜１５５１  （２００７）（その内容全体を本明細書に援用する）に記載されているようにして、ビオチニル化ＵＥＡ−Ｉレクチンおよびアルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンを使用した。細胞を取り出して超音波処理し、細胞ホモジネートのタンパク質総量をＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイで分析した。このアッセイによって、各ウェルに等しい量のタンパク質があることが明らかになった。複合糖質分泌を、基礎を上回る増分（ｘ倍）として表した。
【００７４】
細胞増殖の測定：
結膜杯細胞を２４ウェルの培養プレートでサブコンフルエンス状態まで成長させた後、２４時間血清欠乏させた。タンパク質源として０．５％ＢＳＡを加えた無血清ＲＰＭＩ中にて、化合物Ｄ３、化合物３Ａａ、化合物３Ａｋの濃度を高めてまたは高めずに、細胞を２４時間インキュベートした（図４）。化合物Ｄ３、３Ａａ、３Ａｋを、３０μＭ（マイクロモル）、１０μＭ、１μＭ、０．３μＭの濃度で投与した。細胞増殖研究では、１０％ＦＢＳ加ＲＰＭＩを陽性対照として用いた。細胞数を測定する非放射性の比色ＷＳＴ−８増殖アッセイで、ＣＧＣ増殖を求めた。この手順では、２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、一ナトリウム塩（ＷＳＴ−８）を使用する。これは、成長中の生きたミトコンドリアによって切断され、蛍光ＥＬＩＳＡリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ，  Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，  ＶＴ）を用いて４６０ｎｍで検出される濃青色のホルマザン生成物を形成する。
【００７５】
データの提示：
ＣＧＣ複合糖質分泌と増殖についてのデータを、基礎値より上の増分（ｘ倍）として表し、これを１．０に標準化した。たとえば、０．３μＭ（マイクロモル）、１μＭ、１０μＭの用量の場合、ＣＧＣ複合糖質分泌と増殖を未処理細胞に対する被験化合物として表した。３０μＭの用量の場合は、ＣＧＣ複合糖質分泌と増殖をＤＭＳＯ未処理細胞に対する被験化合物として表した。結果については平均±ｓｅｍとして表す。
【００７６】
結果：
複合糖質分泌の結果を図２および図３に示す。ＮＧＦはＣＧＣ複合糖質分泌を基礎より上に１．３±０．１倍増加させた。周知の杯細胞アゴニストであるＣｃｈは、ＣＧＣ複合糖質分泌を基礎より上に１．３±０．３倍増加させた。
【００７７】
化合物Ｄ３は、ＣＧＣ複合糖質分泌を増加させ、濃度依存性の傾向を示した。化合物Ｄ３はＣＧＣ複合糖質分泌を以下のように増加させた：基礎より上に１．７±０．７倍（３０μＭ）、基礎より上に１．６±０．３倍（１０μＭ）、基礎より上に１．６±０．２倍（１μＭ）、基礎より上に１．３±０．２倍（０．３μＭ）。
【００７８】
化合物３Ａａは、ＣＧＣ複合糖質分泌を以下のように増加させた：基礎より上に２．１±０．７倍（３０μＭ）、基礎より上に１．７±０．４倍（１０μＭ）、基礎より上に１．６±０．３倍（１μＭ）、基礎より上に２．１±０．３倍（０．３μＭ）。化合物３Ａａのほうが、ＮＧＦおよびＣｃｈよりも大きなＣＧＣ複合糖質分泌の増加を示した。
【００７９】
化合物３Ａｋは、化合物Ｄ３および３Ａａほどしっかりとした作用を示さなかったが、活性は実証された。化合物３ＡｋのＣＧＣ複合糖質分泌の結果は以下のとおりである：基礎より上に１．１±０．３倍（３０μＭ）、基礎より上に１．２±０．１倍（１０μＭ）、基礎より上に１．１±０．３倍（１μＭ）、基礎より上に１．４±０．３倍（０．３μＭ）。
【００８０】
細胞増殖の結果を図４に示す。増殖アッセイでは、試験した濃度では、どの化合物も２４時間のインキュベーション後に杯細胞増殖を示さなかった。対照として、ウシ胎仔血清１０％（ＦＢＳ）でもＣＧＣ増殖が基礎より上に３．４±１．０倍になり、ＮＧＦはＣＧＣ増殖を基礎より上に１．６±０．３倍に増加させた。
【００８１】
試験したβターンペプチド模倣環式化合物は、ムチン分泌を刺激し、よってドライアイの治療を必要とする被検体でドライアイ疾患を治療する方法に有用なものとなり得る。
【００８２】
実施例２
ラット結膜杯細胞での複合糖質分泌、増殖、シグナル伝達における化合物Ｄ３の影響
この研究の目的は、複合糖質分泌と培養ラット結膜杯細胞の増殖における化合物Ｄ３の有効性を判断することならびに、化合物Ｄ３が分泌を刺激するのに用いるシグナル伝達経路を研究調査することであった。
【００８３】
動物：
６〜８週齢のオスのスプラーグドーリーラットをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，  ＭＡ）から入手した。動物を、一定の光の条件（１２時間明／１２時間暗サイクル）下にて室温（２２±１℃）および相対湿度（４０〜７０％）で、１ケージあたり２匹ずつで収容した。この研究での手順はすべて、ＭｃＧｉｌｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの動物福祉方針に準じており、Ｌａｄｙ  Ｄａｖｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＬＤＩ）Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの承認を受けた。動物の飼育と使用に関する標準は、Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ（ＣＣＡＣ）によって規定されているものに準じるか、それを上回るようにした。
【００８４】
結膜組織の単離：
イソフルオラン９９．９％ＵＳＢ（Ａｂｒａｘｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｒｉｃｈｍｏｎｄ  Ｈｉｌｌ，  Ｏｎｔ）チャンバでの安楽死前に動物を麻酔した。致死用量のナトリウムペントバルビタール２ｍＬ／０．４ｋｇまたは３００ｍｇ／ｋｇ（Ｃｅｖａ  Ｓａｎｔｅ  Ａｎｉｍａｌｅ，  Ｌｉｂｏｕｒｎｅ，  Ｆｒａｎｃｅ）を用いて動物を安楽死させた。結膜組織、特に瞬膜および円蓋部を切除し、３Ｘペニシリン−ストレプトマイシン（３００ｕｇ／ｍＬ）を含有するハンクス平衡塩溶液にすみやかに入れた。眼球と眼瞼結膜との接合部で折れ曲がりの最後方部に沿って走っているバンドとして、円蓋部を特定した。円蓋部の鼻下側をつかんで持ち上げ、結膜から切り取った。
【００８５】
結膜杯細胞の培養：
ＲＰＭＩ−１６４０培養液、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ペニシリン−ストレプトマイシン、ハンクス平衡塩溶液をＷｉｓｅｎｔ（Ｓｔ．  Ｂｒｕｎｏ，  Ｑｕｅｂｅｃ）から入手した。Ｌ−グルタミンおよび０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡをＧｉｂｃｏ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，  ＮＹ）から入手した。組織培養フラスコと培養皿はＣｏｒｎｉｎｇ（Ｌｏｗｅｌｌ，  ＭＡ）から、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＴｅｋチャンバのスライドはＮｕｎｃ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，  ＮＹ）から入手した。
【００８６】
組織片培養からの結膜杯細胞の培養については、Ｓｈａｔｏｓ，  Ｍ．ら，  “Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒａｔ  Ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖａｌ  Ｇｏｂｌｅｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ，”  ＩＯＶＳ  ４２：１４５５〜１４６４  （２００１）（その内容全体を本明細書に援用する）に説明されているようにした。組織を細かく刻み、０．５ｍＬの完全ＲＰＭＩ−１６４０（１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、１００μｇ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシンを補充）にて、スコアを付けた６ウェルの培養皿に個々の切片を固着させ、５％ＣＯ２加湿雰囲気にて３７℃でインキュベートした。組織片培養を２日ごとに再供給した。数日以内に、杯細胞が切片から遊走し、増殖しはじめた。ほぼ１週間後、組織プラグを除去し、杯細胞をコンフルエンスの状態まで成長させた。接着細胞を０．０５％トリプシン−０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）でトリプシン処理して細胞を１回継代し、完全ＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて、８ウェルのＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｋチャンバのスライド（組織化学）または９６ウェル（増殖）、２４ウェル（分泌）または６ウェル（ウエスタンブロット）の培養プレートに蒔いた。
【００８７】
組織化学：
細胞を固定し、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色用に処理して、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｇｉｌｌ  Ｎｏ．３キット（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）で製造業者の指示に従って対比染色した。すべての手順を室温で実施した。簡単に説明すると、細胞をメタノール中に１５分間固定した。スライドを水道水で１分間すすぎ、過ヨウ素酸溶液で５分間染色し、蒸留水で５回すすぎ、シッフ試薬に１５分間浸漬し、水道水で５分間線上し、ヘマトキシリン溶液で９０秒間染色し、水道水で１５〜３０秒間すすぎ、空気乾燥させ、Ｖｅｃｔａｍｏｕｎｔ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ，  Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，  ＣＡ）に装着した。スライドを調べ、Ｌｅｉｃａ  ＤＦＣ４８０カメラを取り付けたＬｅｉｃａ  ＤＭ  ＬＢ  ２顕微鏡で写真を撮った。
【００８８】
被験物品と溶液の調製：
Ｍｉｍｅｔｏｇｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ，  Ｑｕｅｂｅｃ，  Ｃａｎａｄａ）製の化合物Ｄ３（塩酸塩、ロット番号１２−９５）を生理食塩水に溶解させ、１０ｍＭのストック溶液を得た。
【００８９】
ＮＧＦ（組換えヒト）は、緩衝液［２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１３６ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．５］中の３．１６ｍｇ／ｍＬ溶液であり、冷凍保存（２〜８℃）してある。この溶液の生物活性を、ナノモル濃度でＰＣ１２細胞の分化を引き起こす機能について試験した
【００９０】
ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）をＤＭＳＯ中１０−ｍｇ／ｍＬ（１６．２ｍＭ）ストック溶液として調製した。
【００９１】
実験の前に、被験物品を培地で図に示したような最終濃度に希釈した。基礎培養については、生理食塩水ビヒクル対照を用いてインキュベートした。
【００９２】
培養杯細胞の成長、形態およびキャラクタリゼーション
組織プラグ確立から早くも２日で細胞が組織から成長を開始して成長しつづけるため、９日目までには接着細胞が組織全体で目視確認される（図５Ａ）。倍率を上げると、組織培養ウェルに付着している単一の細胞が玉石の形態を呈し、細胞質ベシクルに小さな半透明の液滴を含有している（図５Ｂ）。培養で細胞が増殖する際には頻繁に、杯細胞表面で粘液様の分泌生成物を示唆する小さな液滴の形成が観察された（図５Ｃ、開いた矢印）。これらの液滴含有細胞が培養で成長するにつれて液滴がプールにマージされ、大きさが大きくなって数も増えた（図５Ｃ、塗りつぶし矢印。結果はすでに刊行物に記載のあるものと類似している（Ｓｈａｔｏｓ，  Ｍ．ら，  “Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒａｔ  Ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖａｌ  Ｇｏｂｌｅｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ，”  ＩＯＶＳ  ４２：１４５５〜１４６４  （２００１）（その内容全体を本明細書に援用する））。
【００９３】
これらの細胞はＰＡＳに対して陽性反応を示すと判断され、これらの細胞が中性タイプのムチン分泌生成物と関連していることを示していた（図６Ａ）。さらに高い倍率にすると（１００×）、多くの細胞質核周囲ベシクルが観察された（図６Ｂ、開いた矢印）。検査時、これらのベシクルのうちいくつかがＰＡＳで著しく染色されたことから、分泌顆粒内に中性（桃色から赤）の複合糖質が存在することを示していた（図６Ｂおよび図６Ｃ、塗りつぶし矢印）。細胞をヘマトキシリン／エオシン染色で青く対比染色する。
【００９４】
端点と結果：
詳細については後述するように、化合物Ｄ３は結膜杯細胞でのムチン分泌を増加させ、用量２μＭのときに増加量が多かった。また、最大１００μＭまでの濃度では、化合物Ｄ３は４日目まで杯細胞増殖を刺激せず、用量間に差異は認められなかった。最後に、結膜杯細胞を化合物Ｄ３で５分間処理すると、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）リン酸化が増加した。
【００９５】
複合糖質分泌：
細胞分泌を測定するために、杯細胞をコンフルエンスの状態まで成長させた後、２時間血清欠乏させた上で、刺激した。２、１０、５０μＭの化合物Ｄ３、０．１、１、１０ｎＭのＮＧＦ、０．１、１、１０ｎＭのＰＭＡを用いて、無血清ＲＰＭＩにて２時間、細胞をインキュベートした。杯細胞分泌を、酵素結合レクチンアッセイ（ＥＬＬＡ）で測定した。簡単に説明すると、細胞培養上清のアリコートを、三重にした９６ウェルのポリスチレンマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＃２５９２、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｎｅｐｅａｎ，  Ｏｎｔ）に移した。ウシ顎下ムチン（ＢＳＭ）（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）の希釈系列を標準（標準曲線データならびに、ＢＳＭの検出が０．００３から０．１μｇの間で線形であることを示すデータは図示していない）として各プレートに含めた。プレートを３７℃で一晩の蒸発によってコーティングした。その後、プレートを洗浄緩衝液［０．３％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ］で３回洗浄した後、３％ＢＳＡと０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで、３７℃で１時間、非特異的結合をブロックした。ウェルを洗浄緩衝液で３回すすいだ後、洗浄緩衝液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ，  Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，  ＣＡ）で希釈した２μｇ／ｍＬビオチニル化ＵＥＡ−１中、３７℃で１時間インキュベートした。ウェルを洗浄緩衝液で３回すすいだ後、洗浄緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ）で希釈した１μｇ／ｍＬのＨＲＰ−コンジュゲートニュートラアビジン中、３７℃で１時間インキュベートした。ウェルを洗浄緩衝液で３回すすぎ、ＴＭＢ（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）で発色させ、０．５Ｎ硫酸で停止させた。Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  Ｐｌｕｓ（Ｂｉｏｒａｄ）にて４５０ｎｍで吸光度を読み取った。培養ウェルに残っているをＲＩＰＡ緩衝液［１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１％デオキシコール酸Ｎａ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ、１０％グリセロール、１ｍＭバナジン酸Ｎａ、１０ｍＭフッ化Ｎａ、１０ｍＭピロリン酸Ｎａ、完全ミニＥＤＴＡフリープロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＮ）］または１Ｍ  Ｔｒｉｓ−緩衝液（ｐＨ７．５）のいずれかで掻爬し、回収し、超音波処理した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の希釈系列を標準（ＢｉｏＲａｄ，  Ｍｏｎｔｒｅａｌ，  ＰＱ）として用いるＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイキットを使用して、細胞ホモジネートにおけるタンパク質の量を分析した。複合糖質分泌をホモジネート中の総タンパク質に対して正規化した。その後、データを基礎より上の倍増分として表した。
【００９６】
化合物Ｄ３が杯細胞ムチン分泌を刺激するか否かを判断するために、化合物Ｄ３（２、１０、５０μＭ）またはＮＧＦ（０．１、１、１０ｎＭ、陽性対照（Ｒｉｏｓ，  Ｊ．ら，  “Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎｓ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｒａｔ  Ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖａｌ  Ｇｏｂｌｅｔ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，”  ＩＯＶＳ  ４８：１５４３〜１５５１  （２００７）（その内容全体を本明細書に援用する））またはＰＭＡ（０．１、１および１０ｎＭ、別の陽性対照（Ｄａｒｔｔ，  Ｄ．ら，  “Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖａｌ  Ｇｏｂｌｅｔ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｃａ２＋  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ，”  Ｃ．  Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ  ７１：６１９〜６２８  （２０００）（その内容全体を本明細書に援用する））の存在下にて、培養継代杯細胞を２時間インキュベートした。Ｒｉｏｓ，  Ｊ．ら，  “Ｉｍｍｕｎｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｕｓｃａｒｉｎｉｃ  ａｎｄ  ＶＩＰ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｓｕｂｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｏｌｅ  ｉｎ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｇｏｂｌｅｔ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ，”  ＩＯＶＳ  ４０：１１０２〜１１１１  （１９９９）（その内容全体を本明細書に援用する））に説明されているようにして、ＥＬＬＡによって、ビオチニル化レクチンＵＥＡ−１を用いて培地に分泌された高分子量糖タンパク質の量を求めた。４匹の独立したラットからの培養杯細胞で得られたムチン分泌の生データを表１にあげておく。
【００９７】
【表１】
0005480242.tif 000017
【００９８】
ムチン分泌にラット間でほとんど差異はなく、基礎の分泌が複合糖質２．０〜９．９μｇ／タンパク質ｍｇの範囲であった。陽性対照ＮＧＦは、用量依存的にムチン分泌を増加させた（最大は１０ｎＭで１．５５±０．１８倍）（表２）。他の陽性対照であるＰＭＡもムチン分泌を約１．４倍増加させたが、これは用量依存性ではなかった。化合物Ｄ３はムチン分泌を増加させ、２μＭで一層大きな増加が認められた（１．４９±０．３３倍）。どの処理も互いに統計的に有意ではなかった（Ｐ＝０．７４２９）。このデータのグラフ表示を図７にあげておく。
【００９９】
【表２】
0005480242.tif 000018
【０１００】
細胞増殖：
Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）から入手したＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅを用いて、製造業者のプロトコールに従って細胞増殖を測定した。２匹のラットからの培養杯細胞を、１０または１００μＭ  ＭＩＭ−Ｄ３の存在下、ＦＢＳ（１０％、陽性対照）、ＮＧＦ（１０ｐＭ〜１０ｎＭ）、化合物Ｄ３（０．１〜１００μＭ）またはＮＧＦ（１０ｐＭ〜１０ｎＭ）添加の２４時間前に、０．５％ＢＳＡ加無血清ＲＰＭＩで血清不足とし、さらに５％ＣＯ２加湿雰囲気にて３７℃でインキュベートした。２４時間後、１０％Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅを６時間加え、Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  Ｐｌｕｓ  （Ｂｉｏｒａｄ）にて吸光度を５７０ｎｍおよび６００ｎｍで読み取った。Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ還元の比率を製造業者の指示どおりに算出した。Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ含有プレートをさらに３７℃で４８時間、７２時間、９６時間インキュベートし、プレートを毎日再読み取りした。
【０１０１】
１０％ＦＢＳの存在下、最大４日間にわたって杯細胞増殖を測定した。増殖の統計的に有意な増加が１０％ＦＢＳで経時的に得られた（３日目で２４７±２倍、Ｐ＜０．０００１）。１０％ＦＢＳを用いる３日間のインキュベーション後、細胞数が多いかインキュベーション時間が長いことが原因で、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅの還元率が低下した。化合物Ｄ３およびＮＧＦが杯細胞増殖を刺激するか否かを判断するために、化合物Ｄ３（図８）またはＮＧＦの濃度を増し、最大４日間にわたって杯細胞を無血清培地でインキュベートした。ＮＧＦは、どの濃度でも最大４日間は増殖を増さず、化合物Ｄ３は最大１００μＭの濃度で４日目までに杯細胞増殖を刺激せず（３μＭ未満の濃度は図示せず）、用量応答間の差異はなかった（Ｐ＝０．１０９８）。ＮＧＦと１０μＭまたは１００μＭの化合物Ｄ３とを組み合わせても、増殖に対する影響はなかった（データ図示せず）。
【０１０２】
ＭＡＰＫ：
ｐ４２／４４  ＭＡＰＫの活性化を、ウエスタンブロット技術で調べた。ＰＭＡ（１００ｎＭ）、ＮＧＦ（１または１０ｎＭ）またはＭＩＭ−Ｄ３（１０または５０μＭ）添加の４〜６時間前に、３７℃で５分間杯細胞を無血清ＲＰＭＩで血清不足とした。その後、細胞を冷ＰＢＳで１回すすぎ、１００μＬの１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液［６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８、１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、５％β−メルカプトエタノール、０．０２ｍｇ／ｍＬブロモフェノールブルー］にて掻爬し、２０分間超音波処理した。ホモジネートを４℃にて１４，９００ｇで１５分間遠心処理した。上清の３０μＬアリコート中のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８％アクリルアミドゲル）で分離し、ニトロセルロース膜に移した。２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ）を含有する緩衝液に入れた５％脱脂粉乳で、膜を２時間ブロックした。次に、５％ＢＳＡを含有するＴＢＳＴ中、ブロットを０．１μｇ／ｍＬでＭＡＰＫ１／２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）のホスホリル化形態に対して指向された抗体を用いて４℃で一晩プローブした後、５％脱脂粉乳含有ＴＢＳＴ中、ＨＲＰ−コンジュゲート二次抗マウス抗体（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）で室温にて１時間インキュベーションした。高感度化学ルミネッセンス法（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，  Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ）を用いて免疫反応バンドを可視化した。ブロットをストリップ緩衝液［６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％ＳＤＳ、０．１Ｍβ−メルカプトエタノール］にて５５℃で３０分間ストリップした後、５％脱脂粉乳含有ＴＢＳＴ中、アクチン（１：５０００希釈、Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）に指向された抗体で再プローブし、ＨＲＰ−コンジュゲート二次抗ウサギ抗体でインキュベーションした。免疫反応バンドをＥＰＳＯＮスキャナでデジタル的に走査し、ＮＩＨ  ＩｍａｇｅＪ  ｖ１．３８ｘを用いて解析した。各試料のホスホリル化ＭＡＰＫの量を、試料中の総アクチンタンパク質量に対して標準化した。
【０１０３】
化合物Ｄ３およびＮＧＦがＭＡＰＫ経路の活性化によって複合糖質分泌を誘導したのか否かを判断するために、３匹の独立したラットから得た培養杯細胞を１０μＭと５０μＭの化合物Ｄ３、１ｎＭと１０ｎＭのＮＧＦまたはＰＭＡ（１００ｎＭ、陽性対照）で５分間刺激し、ウエスタンブロット解析でＭＡＰＫ活性を測定した。３匹の独立したラットの杯細胞培養から得られた代表的なウエスタンブロットを図９に示し、定量化を図１０に示す。この処理ではＭＡＰＫ活性化に対して統計的に有意な影響があった（Ｐ＜０．０００１）。化合物Ｄ３は、ＭＡＰＫ活性を基礎より上に１０μＭで２．５±０．３倍、５０μＭで２．２±０．５倍増加させ、ＮＧＦはＭＡＰＫ活性を１ｎＭで２．８±０．５（Ｐ＜０．０５）、１０ｎＭで１．７±０．２増加させた。陽性対照ＰＭＡは、ＭＡＰＫ活性を６．１±０．７倍と統計的に有意に増加させた（Ｐ＜０．０１）。
【０１０４】
データの提示と統計解析：
データについては、基礎値より上の増分（ｘ倍）として表す。これを１．０に標準化した。結果については平均±ＳＥＭで表す。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ４．０ｃ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）を用いてＡＮＯＶＡでデータを一方向に解析する。Ｐ＜０．０５を統計的に有意であるとみなす。基礎対照との比較のために、ダネット検定での調整を利用した。
【０１０５】
実施例３
スコポラミン誘導ドライアイモデル（化合物Ｄ３）
この研究の目的は、ドライアイのスコポラミンモデルを用いて、化合物Ｄ３の有効性を研究することであった。スコポラミンモデルの選択は、制御環境チャンバ（ＣＥＣ）とドライアイのスコポラミンモデルとを比較する先の研究調査に基づいて実施した。
【０１０６】
動物：
体重３００ｇ〜３５０ｇのオスのスプラーグドーリーラットをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，  ＭＡ）から入手した。動物を、一定の室温（２２±１℃）と光の条件（１２時間明／１２時間暗サイクル）下にて湿度（４０〜６０％）で、アニマルクオーター（ａｎｉｍａｌ  ｑｕａｒｔｅｒ）に収容した。外科的実験と臨床検査の前に動物をイソフルオランで麻酔した。
【０１０７】
コリン作動性遮断によるドライアイの誘導
スコポラミンを充填して、肩甲骨の間の背側部分中央に皮下移植した浸透圧ポンプ（２ＭＬ４  Ａｌｚｅｔ（登録商標）；  ＣｅｄａｒＬａｎｅ，  Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，  Ｏｎｔａｒｉｏ）を用いて動物に連続的かつ全身に送達させたスコポラミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）を用いて、ドライアイを誘導した。２〜３の創傷クリップで創傷を閉じた。手術後と翌日に再度、非ステロイド抗炎症薬であって齧歯類で長期にわたって作用する強力な鎮痛剤のカプロフェン（０．５ｍｇ／１００ｇ）を動物に皮下注射した。外科的なポンプ植込み前かつすべての臨床端点試験の前に、イソフルオラン９９．９％ＵＳＰ（Ａｂｒａｘｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｒｉｃｈｍｏｎｄ  Ｈｉｌｌ，  Ｏｎｔａｒｉｏ）チャンバで動物を麻酔した。スコポラミンを１２．５ｍｇ／日で送達し、技術的な理由で、データを１４日目に評価した。
【０１０８】
臭化水素酸スコポラミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）０．１７５ｇ／ｍＬの滅菌溶液を生理食塩水（０．９％）で調製し、０．２２ｕｍのシリンジ−エンドフィルタ（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＣ，  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．，  Ｂｅｄｆｏｒｄ，  ＭＡ）で濾過した。２ＭＬ４  Ａｌｚｅｔ（登録商標）ポンプに２ｍＬの０．１７５ｇ／ｍＬスコポラミン溶液を製造業者の指示に従って充填した。
【０１０９】
処理群：
ラットの被験眼の群は以下のとおりとした。
・群１：対照ラット（ｎ＝ラット６匹から１２の眼）。
・群２：スコポラミンを連続的に全身投与してラット（ｎ＝ラット６匹から１２の眼）にドライアイを誘導し、フルオレセイン染色の測定値を１４日目に得た。
・群３：スコポラミンを連続的に全身投与してラット（ｎ＝ラット７匹から１４の眼）にドライアイを誘導し、８日目に生理食塩水で１回局所処理した。
・群４：スコポラミンを連続的に全身投与してラット（ｎ＝ラット７匹から１４の眼）にドライアイを誘導し、８日目に１％（１０ｍｇ／ｍＬ）の化合物Ｄ３を５μｌ点眼して１回局所処理した。
【０１１０】
ドライアイの臨床端点と結果
詳細については後述するように、８日目に１％化合物Ｄ３で局所処理した群に、１４日目に生理食塩水処理対照に比して平均スコア１．１±０．１で角膜フルオレセイン染色の有意な減少が認められ（ｐ＜０．０００１）たが、１３日目に測定した水性涙液産生と水性涙液代謝回転には、未処理またはスコポラミン処理対照に比して何ら影響がなかった。
【０１１１】
死亡例はなかったが、切開創傷部位が噛まれて再び開いてしまい、ポンプが露出した羅患例が２例（一方は群２、他方は群３）あった。これらの２匹の動物については、臨床徴候データを排除した。すべてのスコポラミン処理動物（群２〜４）に、２日目以降に軽度から重度の眼刺激が観察された。ほとんどのスコポラミン処理動物の眼に、結膜の鬱血、腫れ、結膜の血性分泌物が認められた。結膜の鬱血と血性分泌物は通常、消散する。しかしながら、結膜の腫れは研究中ずっと続いた。麻酔下でありながら、動物への投薬時に眼刺激が観察された。
【０１１２】
処置前、平均体重は約３５０ｇであり、統計的に群間の差がなかった（Ｐ＝０．３９９９）。未処理対照群（群１）の平均体重が１４日目までに約４２０ｇに増えた。スコポラミンを投与された３つの群（群２〜群４）では、平均体重が約３７５ｇに増えた。７日目から開始して１４日目まで続く、体重を減らすための統計的に有意な処理効果があった（Ｐ＝０．００４２）。
【０１１３】
角膜染色：
角膜のフルオレセイン含浸によって、角膜乾燥の臨床徴候を評価した。滅菌生理食塩水を用いて生成した１％フルオレセインナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）溶液１滴を、麻酔した動物の結膜嚢に滴下した。その後、ブルーコバルトフィルタ（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ  Ｏｐｔｈａｌｍｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｄｅｐｅｗ，  ＮＹ）付きのＰｏｒｔａｂｌｅ  Ｓｌｉｔ  Ｌａｍｐ検眼鏡を用いて、フルオレセイン点眼の３分後に青色光の下で角膜を観察した。それぞれの動物で、眼表面にある点状の蛍光陽性部分を盲検的に記録した。この試験のスコアに、０＝染色なし、１＝＜２５％表面染色、２＝２５〜５０％表面染色、３＝５０〜７５％表面染色および４＝＞７５％表面染色として、０〜４の評点を付けた。
【０１１４】
図１１に示すように、対照群（無処置）では、角膜フルオレセイン染色がほぼ完全に認められず、平均スコア（スコア±ＳＤ）は０．８±０．１であった。未処理のドライアイ群（スコポラミンのみ）では、点状で拡散した角膜フルオレセイン染色が有意な度合いで認められ、スコポラミンポンプ植込み後１４日目の平均スコアは２．３±０．３であった。スコポラミンポンプ植込み後８日目に局所的に生理食塩水で処理した群でも、１４日目に未処理のドライアイ群と同様の角膜フルオレセイン染色が有意な度合いで認められ、平均スコアは２．９±０．３であった。８日目に局所的に１％化合物Ｄ３で処理した群では、１４日目に生理食塩水処理対照に対して角膜フルオレセイン染色が有意に減少し（ｐ＜０．０００１）、平均スコアは１．１±０．１であった。また、１４日目に、局所的に１％化合物Ｄ３で処理した群の平均値（１．１±０．１）は、群１（未処理対照、０．８±０．１、ｐ  ＞０．０５）と統計的に違いがなかった。
【０１１５】
シルマーテスト：
イソフルランを用いて軽く鎮静させた動物で、Ｚｏｎｅ−Ｑｕｉｃｋ標準化フェノールレッド糸（ＦＣＩ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃｓ，  Ｍａｒｓｈｆｉｅｌｄ  Ｈｉｌｌｓ，  ＭＡ）を用いて、涙液産生を測定した。糸を下眼瞼外側部に挿入し、そのまま３０秒おいた。糸に１ｍｍの精度で付けられた目盛りを使って、糸の染色された湿った部分の長さをミリメートル刻みで測定した。以下のセクションで説明するように、涙液フルオレセインクリアランスにシルマーテストを定法により組み合わせた。
【０１１６】
基線では、すべての群で処置前の平均シルマースコアが１３．７±４．２ｍｍ（Ｐ＝０．６９４３）であった。６日後、スコポラミン処理動物は、ドライアイの誘導に対応して未処理対照よりもシルマースコアが下がった（すなわち涙液が減った）（１６．０±５．４ｍｍに対して９．２±２．５ｍｍ、Ｐ＜０．０００１）。８日目の生理食塩水（群３）または１％化合物Ｄ３（群４）での単回局所用量に続いて、５日日の処置なし期間を設けた。１３日目に、スコポラミンを投与された群でシルマースコアが未処理対照（群１）より統計的に有意に低く（Ｐ＜０．０００１）、用量群との間に統計的に有意な差異は認められなかった（図１２）。８日目に１％化合物Ｄ３を１回点眼したところ、未処理またはスコポラミン処理対照と比較して１３日目（５日後）に測定した水性涙液産生に影響はなかった。
【０１１７】
涙液フルオレセインクリアランス：
ヒトで説明されている方法（Ａｆｏｎｓｏ，  ＡＡ．ら，  “Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｅａｒ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  Ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｒｍｅｒ  Ｔｅｓｔ  Ｓｃｏｒｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｏｃｕｌａｒ  Ｉｒｒｉｔａｔｉｏｎ  Ｓｙｍｐｔｏｍｓ，”  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  １０６：８０３〜８１０  （１９９９）（その内容全体を本明細書に援用する））とラットで改変された方法（Ｃｈｅｎ，  Ｗ．ら，  “Ｋｅｒａｔｏｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｉｔｉｓ  Ｓｉｃｃａ  Ｍｏｄｉｆｉｅｓ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｉｎ  Ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖａ，”  Ｃｏｒｎｅａ  ２６：１１０１〜１１０６  （２００７）（その内容全体を本明細書に援用する））で、涙液フルオレセインクリアランスを評価した。動物をイソフルランで軽く鎮静させ、２マイクロリットルの１％ナトリウムフルオレセイン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）溶液（滅菌生理食塩水中）を下側結膜嚢に適用した。動物は２分以内で目覚めた。１５分後、動物を再度鎮静させ、フルオレセイン染色涙液流体をフェノールレッド綿糸で回収した（シルマーテストの場合とまったく同じ）。この糸を、蛍光光度分析まで、遮光した１．５ｍＬのポリプロピレンエッペンドルフチューブに入れてすみやかに密閉した。湿っている綿の長さ（ｍｍ）で、回収された涙液流体の容積を判断した。
【０１１８】
その後、１００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加え、管を１２，０００ｒｐｍで５分間スピンさせた後、流体を９６ウェルのポリスチレンマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＃２５９２、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｎｅｐｅａｎ，  Ｏｎｔ．）に移した。各プレート上で標準ウェルを調製した。これは、２μｌの１％ナトリウムフルオレセイン溶液を含有する１００μｌのＰＢＳにフェノールレッド糸を入れて構成されたものであった。標準ウェルに対するゲインを設定した後、蛍光マイクロプレートリーダー（ＦＬＵＯｓｔａｒ  ＯＰＴＩＭＡ，  ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてすみやかに蛍光を測定した。蛍光単位（ＦＵ）を湿った綿の長さ（ｍｍ）で割って、涙液中のフルオレセイン濃度を算出した（ＦＵ／ｍｍ）。
【０１１９】
水性涙液の代謝回転をフルオレセインクリアランスによって測定した。基線で、平均フルオレセインクリアランス値は６０６±４９６ＦＵ／ｍｍ（Ｐ＝０．８９２０）であった。以後、６日目と１３日目の検査で、数値的に、群１（未処理対照）よりもスコポラミンを投与された群の値が高くなった（すなわち、涙液の代謝回転が減った）。この差異は、１３日目には統計的に有意（０．０３０４）であったが、６日目には有意でなかった（Ｐ＝０．１１１７）（図１３）。８日目に１％化合物Ｄ３を１回点眼したところ、未処理またはスコポラミン処理対照と比較して１３日目（５日後）に測定した水性涙液の代謝回転に影響はなかった。
【０１２０】
統計解析：
平均および標準偏差（ＳＤ）を使用して、各研究群のデータをキャラクタライズした。治療群の体重および眼科的な徴候について、観察をするごとにＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４．０ｃ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）を用いて分散の一方向解析（ＡＮＯＶＡ）を実施した。検査日に層別化した際、治療群が統計的に有意（ｐ≦０．０５、両側）だった場合に対比較を実施した。未処理対照（群１またはＡ）との比較のために、ダネット検定での調整を用いた。群のうち、複数の比較に対する補正はしなかった。Ｐ値が示されず、一対の平均各々間の差異（＞０．０５、＜０．０５、＜０．０１または＜０．００１としての報告Ｐ値）は示していない。
【０１２１】
実施例４
化合物Ｄ３点眼後の無処置ラットにおける涙液ムチン産生
無処置ラットでのムチン産生の刺激にあたり、化合物Ｄ３の点眼時に用量範囲研究を実施した。３０匹のオスのスプラーグドーリーラットを各群ラット６匹ずつの５つの群に分け、連続した６時間のあいだ１時間に１回、生理食塩水、０．４％の化合物Ｄ３、１．０％の化合物Ｄ３、２．５％の化合物Ｄ３、０．０００５３％のＮＧＦのいずれかで、両側を処理した。麻酔後、較正したマイクロピペットを用いて各動物の両眼の下側結膜嚢に被験物品５μＬを点眼した。
【０１２２】
処理前と、生理食塩水、化合物Ｄ３およびＮＧＦでの１時間ごと６回の点眼後に、両方の眼からの涙液流体洗液をプールし、回収した。涙液流体洗液すべてのムチン濃度を酵素結合レクチンアッセイ（ＥＬＬＡ）で評価した。
【０１２３】
平均および標準偏差（ＳＤ）を用いて、データをキャラクタライズした。ラット群からの処理マイナス基線で、ムチン濃度の差異を算出した。基線からの２つの群間のムチンの連続変化を対応ｔ検定で評価した。分散解析を用いて、３以上の治療群間のムチンの変化を解析した。ウィルコクソン順位和検定を使用して、治療群間の中央値のムチン変化を理論中央値ゼロと比較した。Ｐ＜０．０５での両側検定を統計的に有意とみなした。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４．０Ｃ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）を使用して、統計解析を実施した。
【０１２４】
結果から、処理後、群間の差異は統計的に有意ではなかった（ｐ＝０．１４３０）ことが分かった。処理対基線で対比較を行うと、２．５％化合物Ｄ３で処理した動物のムチン濃度に統計的に有意な増加が認められた（図１４）（３．０±１．９ｎｇ／μＬから７．０±４．５ｎｇ／μＬ、ｐ＝０．０４１３）が、他の群には認められなかった（ｐ＝０．１７９９から８４５４）。また、群間の差異は統計的に有意ではなかった（ｐ＝０．０８１８）。群間の差異を理論中央値ゼロと比較すると、２．５％の化合物Ｄ３で処理した群に統計的に有意な増加が認められた（４．０±３．５ｎｇ／μＬ  ｐ−０．０３１２）が、他の群には認められなかった（ｐ＝０．１５６２から１．１２５０）。数値的に、化合物Ｄ３で処理したすべての群でのムチン濃度の平均変化の増加は用量依存性であった（図１５）。
【０１２５】
実施例５
スコポラミン誘導ラットドライアイモデル（化合物Ｄ３および神経成長因子）
動物：
体重３６０ｇ〜４７０ｇのオスのスプラーグドーリーラット（６〜８週齢）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，  ＭＡ）から入手した。動物を、一定の室温（２２±１℃）と光の条件（１２時間明／１２時間暗サイクル）下にて相対湿度（３２〜６１％）で、アニマルクオーターに収容した。外科的なポンプ植込み前かつすべての臨床端点試験の前に、イソフルラン９９．９％（Ａｂｒａｘｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｒｉｃｈｍｏｎｄ  Ｈｉｌｌ，  Ｏｎｔａｒｉｏ）チャンバで動物を麻酔した。
【０１２６】
コリン作動性遮断によるドライアイの誘導：
スコポラミンを充填して、肩甲骨の間の背側部分中央に皮下移植した浸透圧ポンプ（２ＭＬ４  Ａｌｚｅｔ（登録商標）；  ＣｅｄａｒＬａｎｅ，  Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，  Ｏｎｔａｒｉｏ）を用いて動物に連続的かつ全身に送達させた塩酸スコポラミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）を用いて、ドライアイを誘導した。スコポラミンを２８日間の期間にわたって１２．５ｍｇ／日で送達した。これは、浸透圧ポンプで３０．０±１．５ｍｇ／ｋｇ相当であった。
【０１２７】
塩酸スコポラミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）０．１７５ｇ／ｍＬの滅菌溶液を生理食塩水で調製した。この溶液を０．２２ｕｍのシリンジ−エンドフィルタ（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＣ，  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ，  Ｂｅｄｆｏｒｄ，  ＭＡ）で濾過し、冷蔵庫で一晩保管した。Ａｌｚｅｔ（登録商標）浸透圧ポンプ（Ｍｏｄｅｌ  ２ＭＬ４，  ロット番号１０１８７−０８，  ＣｅｄａｒＬａｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，  Ｏｎｔａｒｉｏ）に２ｍＬのスコポラミン溶液を製造業者の指示に従って充填した。充填とポンプの取り扱い時には滅菌技術を使用した。
【０１２８】
手術後と翌日に再度、非ステロイド抗炎症薬であって齧歯類で長期にわたって作用する強力な鎮痛剤のカプロフェン（０．５ｍｇ／１００ｇ）を動物に皮下注射した。−１日目にポンプ植込み前に動物の体重を計った後、４週間にわたって週に１回体重を計った。この投与量計画をラットでドライアイを誘導するものとして報告した（Ｖｉａｕ  Ｓら，  “Ｔｉｍｅ  ｃｏｕｒｓｅ  ｏｆ  ｏｃｕｌａｒ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｄ  ｌａｃｒｉｍａｌ  ｇｌａｎｄ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ａ  ｎｅｗ  ｓｃｏｐｏｌａｍｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｒｙ  ｅｙｅ  ｍｏｄｅｌ，”  Ｇｒａｅｆｅｓ  Ａｒｃｈ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．，  ２４６：８５７〜８６７  （２００８）（その内容全体を本明細書に援用する））。
【０１２９】
処理群：
表３および図１６から明らかなように、被験ラット眼の群は以下のとおりとした。
・ポンプ植込みなしの対照ラット（ｎ＝ラット５匹から１０の眼）であり、研究中をとおして何ら処理しなかった（この群を本明細書では「Ｇ１」とも呼ぶ）。
・スコポラミンを連続的に全身投与してラット（ｎ＝ラット５匹から１０の眼）にドライアイを誘導し、５日目から開始して２１日目まで継続的に、５μＬの生理食塩水で毎日局所処理した（この群を本明細書では「Ｇ２」とも呼ぶ）。
・スコポラミンを連続的に全身投与してラット（ｎ＝ラット５匹から１０の眼）にドライアイを誘導し、５日目から開始して２１日目まで継続的に、５μＬの０．４％（４ｍｇ／ｍＬ）化合物Ｄ３溶液で毎日局所処理した（この群を本明細書では「Ｇ３」とも呼ぶ）。
・スコポラミンを連続的に全身投与してラット（ｎ＝ラット５匹から１０の眼）にドライアイを誘導し、５日目から開始して２１日目まで継続的に、５μＬの１．０％（１０ｍｇ／ｍＬ）化合物Ｄ３溶液で毎日局所処理した（この群を本明細書では「Ｇ４」とも呼ぶ）。
・スコポラミンを連続的に全身投与してラット（ｎ＝ラット５匹から１０の眼）にドライアイを誘導し、５日目から開始して２１日目まで継続的に、５μＬの２．５％（２５ｍｇ／ｍＬ）化合物Ｄ３溶液で毎日局所処理した（この群を本明細書では「Ｇ５」とも呼ぶ）。
・スコポラミンを連続的に全身投与してラット（ｎ＝ラット５匹から１０の眼）にドライアイを誘導し、５日目から開始して２１日目まで継続的に、５μＬの０．０００５３％（０．００５２６ｍｇ／ｍＬ）ＮＧＦ溶液で毎日局所処理した（この群を本明細書では「Ｇ６」とも呼ぶ）。
【０１３０】
Ｇ２〜Ｇ６の処理を１７日間にわたって毎日継続した（２１日目を含む日まで）。その後、処理を終えたが研究はさらに１週間続けた。処理時、各動物をイソフルランチャンバで麻酔した。一度眠ったら、較正したマイクロピペットを用いて各動物の両眼の下側結膜嚢に被験物品５μＬを点眼した。臨床端点も試験するのであれば、試験の最後に被験物品を局所的に滴下した。
【０１３１】
【表３】
0005480242.tif 000019
【０１３２】
投与溶液の調製：
約ｐＨ７（ｐＨ指示片で判断、ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の緩衝生理食塩水であるＭｉｍｅｔｏｇｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって設計された製剤を用いて、化合物Ｄ３を調製した。３種類の局所投与溶液を以下のようにして調製した。
・４．０ｍｇの化合物を用いて８４５μＬの滅菌ｍｉｌｌｉＱ水に溶解させ、０．４％の局所投与溶液を調製した。この溶液を、６．５μＬの１．０Ｎ  ＮａＯＨ（ＶＷＲ）で約ｐＨ７に調整（ｐＨ指示片を使用）し、１４８．５μＬの滅菌１．０Ｍ  ＮａＣｌを加えて等張（０．９％ＮａＣｌ）にした。
・１０．０ｍｇの化合物を用いて８４５μＬの滅菌ｍｉｌｌｉＱ水に溶解させ、１．０％の局所投与溶液を調製した。この溶液を、２０μＬの１．０Ｎ  ＮａＯＨで約ｐＨ７に調整し、１３５μＬの滅菌１．０Ｍ  ＮａＣｌを加えて等張にした。
・２５．０ｍｇの化合物を用いて８４５μＬの滅菌ｍｉｌｌｉＱ水に溶解させ、２．５％（最大溶解性）の溶液を調製した。この溶液を、２０μＬの１．０Ｎ  ＮａＯＨで約ｐＨ７に調整した。１３５μＬの滅菌１．０Ｍ  ＮａＣｌを加えて溶液を等張にした。すべての溶液を５分間超音波処理した。研究期間中、すべての化合物Ｄ３溶液を冷蔵庫で保管（２〜８℃）した。
【０１３３】
１μＬの３．１６ｍｇ／ｍＬストック溶液を６００μＬの滅菌０．９％塩化ナトリウム注射、ＵＳＰ（ＬＯＴ  ６３−９２２−ＦＷ  ＥＸＰ  ２０１００３０１）で希釈し、０．０００５３％ＮＧＦの１つの局所投与溶液を調製した。新たに希釈した投与溶液を毎週生成し、冷蔵庫で保管（２〜８℃）した。この濃度のＮＧＦは、ｉ）第三眼瞼涙腺切除後にドライアイが発生したイヌ（Ｃｏａｓｓｉｎ  Ｍ，  Ｌａｍｂｉａｓｅ  Ａ，  Ｃｏｓｔａ  Ｎら：  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｔｏｐｉｃａｌ  ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｎ  ｄｏｇｓ  ａｆｆｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ｄｒｙ  ｅｙｅ．  Ｇｒａｅｆｅ’ｓ  Ａｒｃｈｉｖｅ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ２００５；２４３：１５１〜１５５（その内容全体を本明細書に援用する））およびｉｉ）レーザー屈折矯正角膜切除術（ＰＲＫ）後に角膜神経損傷が発生したウサギ（Ｅｓｑｕｅｎａｚｉ  Ｓ，  Ｂａｚａｎ  ＨＥＰ，  Ｂｕｉ  Ｖら：  Ｔｏｐｉｃａｌ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＧＦ  ａｎｄ  ＤＨＡ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  Ｒａｂｂｉｔ  Ｃｏｒｎｅａｌ  Ｎｅｒｖｅ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  Ｐｈｏｔｏｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  Ｋｅｒａｔｅｃｔｏｍｙ．  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００５；４６：３１２１〜３１２７（その内容全体を本明細書に援用する））で有効性を有すると報告された。
【０１３４】
滅菌０．９％塩化ナトリウム注射、ＵＳＰ（ＬＯＴ  ６３−９２２−ＦＷ  ＥＸＰ  ２０１００３０１）の局所投与溶液を用いた。生理食塩水溶液を室温で保管した。
【０１３５】
ドライアイの臨床端点と結果：
詳細については後述するように、７日間の回復期間後における０．４、１．０または２．５％用量の化合物Ｄ３の影響に関する評価では、未処理対照に比して１％用量の化合物Ｄ３が涙液破壊時間（ＴＢＵＴ）を延長させ、ムチン産生量を増やし、角膜染色からほぼ完全に回復させることが示されたが、涙液産生（シルマーテスト）、タンパク質判定またはフルオレセインクリアランスについて、対照と比して統計的に有意な差異は認められなかった。
【０１３６】
ＴＢＵＴ：
１３日目（８日間、毎日の処理後）、２１日目（１６日間、毎日の処理後）、２８日目（７日間処理を停止した後）に、涙液破壊時間を試験した。ＴＢＵＴについては、１０μＬのナトリウムフルオレセイン溶液（滅菌生理食塩水中０．２％）を麻酔した動物の上側結膜嚢に点眼して評価した。瞼を手で瞬目させ、フルオレセインを涙液層に分散させた。携帯型スリットランプ検眼鏡（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｄｅｐｅｗ，  ＮＹ）のコバルトブルーの光で、眼を開いた状態に保って１つ以上の黒い線条が前角膜涙液層に現れるまでの時間を記録した。それぞれの眼で、新鮮なフルオレセイン溶液を用いて最低でも三重の読み取りを実施した。
【０１３７】
スコポラミン（表４および図１７Ａおよび図１７Ｂ）を投与された他のどの群よりも群１（未処理対照）で涙液破壊時間が最大となった（すなわち、より良い）。すべての観察で、統計的に有意な処理効果が認められた（それぞれｐ＜０．０００１、０．０３４９、＜０．０００１）。処理時（１３日目）、スコポラミンを投与された群ではすべて、群１とは統計的に有意に異なっていた（ｐ＜０．０００１〜０．００１２）。群５（７．０±２．３秒、２．５％化合物Ｄ３）についてさらに対比較を実施すると、群４（３．９±１．２秒、１．０％化合物Ｄ３、ｐ＝０．０１６０）とは統計的に有意な差異が認められた。処理時（２１日目）、群４および群５（１．０％および２．５％化合物Ｄ３）以外、スコポラミンを投与された群ではすべて、群１とは統計的に有意に異なっていた（ｐ＝０．０１６７〜０．０２８９）。２８日目、スコポラミンを投与された群ではすべて、群１とは統計的に有意に異なっていた（ｐ＜０．０００１〜０．００５４）。群４（６．４±１．２秒、１．０％化合物Ｄ３）についてさらに対比較を実施すると、群３（４．３±０．８秒、０．４％化合物Ｄ３、ｐ＝０．０２０４）および群６（４．２±０．８秒、ＮＧＦ、ｐ＝０．０１６５）とは統計的に有意な差異が認められた。７日間の回復期間後、未処理対照に比して１％用量の化合物Ｄ３でＴＢＵＴが増加した。これとは対照的に、０．４％および２．５％用量の化合物Ｄ３について７日間の回復期間後にＴＢＵＴに差異はなかった。用量を増やすと、杯細胞でのＮＧＦ受容体が脱感作され、化合物Ｄ３のアゴニスト活性に対して自らを抵抗性にすることがあった。用量を減らすと、単に最適ではなくなることがあった。
【０１３８】
ＴＢＵＴに基線値はないが、１３日目との比較で２８日目のＴＢＵＴの変化を評価することで、未処理対照群および生理食塩水群に比した１％用量の化合物Ｄ３の影響をそれに用いることが可能である。１％用量の化合物Ｄ３は、未処理対照群および生理食塩水対照群に比してＴＢＵＴを統計的に有意に改善した（ｐ＝０．０００１）（図２０Ａ）。また、図２１Ａは、生理食塩水対照群および１％用量の化合物Ｄ３で処理した群において、１３日目との比較でＴＢＵＴの経時的な端点測定データを示す。
【０１３９】
【表４】
0005480242.tif 000020
【０１４０】
角膜染色：
ＴＢＵＴ評価の直後に、１３日目（８日間、毎日の処理後）、２１日目（１６日間、毎日の処理後）、２８日目（７日間処理を停止した後）に、角膜のフルオレセイン染色によって角膜乾燥の臨床徴候を評価した。滅菌生理食塩水を用いて生成した０．２％ナトリウムフルオレセイン溶液１滴を、麻酔した動物の上側結膜嚢に点眼した。その後、ブルーコバルトフィルタ（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｄｅｐｅｗ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）付きのＰｏｒｔａｂｌｅ  Ｓｌｉｔ  Ｌａｍｐ検眼鏡を用いて、フルオレセイン点眼の２〜３分後に青色光の下で角膜を観察した。それぞれの動物で、角膜にある点状のフルオレセイン染色部分をマスク記録した。この試験のスコアに、０は染色なし、１は２５％未満の表面染色、２は２５〜５０％表面染色、３は５０〜７５％表面染色、４は７５％を超えて表面染色として、０〜４の評点を付けた。
【０１４１】
数値的に、群１（未処理対照）よりもスコポラミンを投与された群のほうが値が大きかった（すなわち、損傷が多い）（表５および図１８Ａ〜図１８Ｂ）。群間の差異は１３日目と２８日目に統計的に有意であった（ｐ＜０．０００１）が、２１日目にはそうでなかった（ｐ＝０．０６８２）。１３日目、スコポラミンを投与された群は各々、群１と統計的に有意に異なっていた（ｐ＜０．０００１〜０．０００３）が、他の各群とは異なっておらず（ｐ＞０．０６７７）、例外は群４と統計的に有意に異なっていた群５であった（ｐ＝０．０３５２）。２８日目、群２、３、５、６が群１と統計的に有意に異なっていた（ｐ＜０．０００１〜０．０００７）。群４（１％化合物Ｄ３）の平均値１．３±０．３は、群１とは統計的に有意に異ならなかった（未処理対照、０．９±０．７、ｐ＝０．５１３６）。同様に、この検査で、群４が値の大きい群２、３、５、６とは統計的に有意に異なっていた（ｐ＜０．０００１〜０．００４７）。７日間の回復期間後、１％用量の化合物Ｄ３で、未処理対照群に比してほぼ完全に角膜染色が消えた。対照的に、０．４％および２．５％用量の化合物Ｄ３の用量では、７日間の回復期間後の用量で角膜染色に差異はなかった。用量を増やすと、杯細胞でのＮＧＦ受容体が脱感作され、化合物Ｄ３のアゴニスト活性に対して自らを抵抗性にすることがあった。用量を減らすと、単に最適ではなくなることがあった。
【０１４２】
角膜染色に基線値はないが、１３日目との比較で２８日目の角膜染色の変化を評価することで、未処理対照群および生理食塩水群に比した１％用量の化合物Ｄ３の影響をそれに用いることが可能である。１％用量の化合物Ｄ３の用量は、未処理対照群および生理食塩水対照群に比して角膜染色を統計的に有意に改善した（ｐ＜０．０００１）（図２０Ｂ）。また、図２１Ｂは、生理食塩水対照群および１％用量の化合物Ｄ３で処理した群において、１３日目との比較で角膜染色の経時的な端点測定データを示す。
【０１４３】
【表５】
0005480242.tif 000021
【０１４４】
すべての検査で、群間のｔＢＵＴ値と角膜染色スコアに有意な逆相関が認められた。角膜染色スコアが大きくなるにつれてｔＢＵＴ値が小さくなった（スピアマンｒ＝−０．７６０６、ｐ＜０．０００１、ｎ＝８７ＸＹ対）。
【０１４５】
ムチン産生量の判定：
麻酔した動物の５μＬの下側結膜嚢に滅菌生理食塩水を点眼した後、１２日目（７日間、毎日の処理後）、１９日目（１４日間、毎日の処理後）、２８日目（７日間処理を停止した後）に、６群のラットすべてから涙液流体洗液を回収した。瞼をしずかに瞬目させ、涙液層を生理食塩水と混合した。５μＬ容のガラス製毛細管（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ，  Ｂｒｏｏｍｈａｌｌ，  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）を使用し、眼瞼外側部の涙三角からの毛管作用によって希釈涙液流体を回収した。約４〜５μＬを定常的に回収した。強いドライアイでは、回収前に第２の５μＬアリコートの生理食塩水を点眼した。
【０１４６】
希釈涙液流体洗液中のムチン糖タンパク質の濃度を酵素結合レクチンアッセイ（ＥＬＬＡ）で求めた。総タンパク質含有量３μｇの試料をカーボネート緩衝液（ｐＨ９．２）にて１００μＬまで希釈し、９６ウェルのポリスチレンマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＃２５９２、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｎｅｐｅａｎ，  Ｏｎｔａｒｉｏ）に移した。ウシ顎下ムチンの希釈系列（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）を標準として各プレートに含めた。プレートを３７℃で一晩の蒸発によってコーティングした。その後、プレートを洗浄緩衝液［０．３％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ］で３回洗浄した後、３％ＢＳＡと０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで、３７℃で１時間、非特異的結合をブロックした。ウェルを洗浄緩衝液で３回すすいだ後、洗浄緩衝液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ，  Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，  ＣＡ）で希釈した２μｇ／ｍＬビオチニル化ＵＥＡ−１中、３７℃で１時間インキュベートした。ウェルを洗浄緩衝液で３回すすいだ後、洗浄緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）で希釈した１μｇ／ｍＬのＨＲＰ−コンジュゲートニュートラアビジン中、３７℃で１時間インキュベートした。ウェルを洗浄緩衝液で３回すすぎ、ＴＭＢ（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）で発色させ、０．５Ｎ硫酸で停止させた。総タンパク質３μｇになる涙液流体洗液（μＬ）の容積で割って、涙液流体洗液中のムチン濃度をｎｇムチンとして算出した。
【０１４７】
ムチン産生を測定したところ、群間の差異はどの観察でも統計的に有意ではなかった（ｐ＝０．１０６６〜０．７８４４）（表６および図１９Ａ〜図１９Ｂ）。数値的に、群１（それぞれ未処理対照、２．９、６．８、１．５ｎｇ／μＬ）に比して、これらの訪問（３．３、９．１および６．８ｎｇ／μＬ）の都度どの処置群でも群４（１％用量の化合物Ｄ３）で最高平均値が見られた。この差異は、２８日目（ｐ＝０．０３１２）に統計的に有意であったが、他の日にはそうではなかった（ｐ＝０．６９９２〜０．９９７３）。７日間の回復期間後、１％用量の化合物Ｄ３によるムチン産生のこの統計的に有意な増加が、涙液層の品質と安定性を改善した場合がある。対照的に、０．４％および２．５％用量の化合物Ｄ３の用量では、７日間の回復期間後の用量でムチン産生に差異はなかった。用量を増やすと、杯細胞でのＮＧＦ受容体が脱感作され、化合物Ｄ３のアゴニスト活性に対して自らを抵抗性にすることがあった。用量を減らすと、単に最適ではなくなることがあった。
【０１４８】
ムチン産生に基線値はないが、１２日目との比較で２８日目のムチン産生染色の変化を評価することで、未処理対照群および生理食塩水群に比した１％用量の化合物Ｄ３の影響をそれに用いることが可能である。１％用量の化合物Ｄ３は、未処理対照群および生理食塩水対照群に比してムチン産生を統計的に有意に増した（ｐ＝０．００１３）（図２０Ｃ）。また、図２１Ｃは、生理食塩水対照群および１％用量の化合物Ｄ３で処理した群において、１２日目との比較でムチン産生の経時的な端点測定データを示す。
【０１４９】
【表６】
0005480242.tif 000022
【０１５０】
シルマーテスト：
ドライアイ誘導の５、７、１４、２０、２９日後に、シルマーテストを用いて涙液産生を観察した。イソフルランを用いて軽く鎮静させた動物で、Ｚｏｎｅ−Ｑｕｉｃｋ標準化フェノールレッド糸（ＦＣＩ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃｓ，  Ｍａｒｓｈｆｉｅｌｄ  Ｈｉｌｌｓ，  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて、涙液産生を測定した。糸を下眼瞼外側部に挿入し、そのまま３０秒おいた。糸に１ｍｍの精度で付けられた目盛りを使って、糸の染色された湿った部分の長さをミリメートル刻みで測定した。
【０１５１】
３０匹のラット（眼６０個）での平均術前シルマー涙液試験は１１．９±３．８ｍｍ（ｐ＝０．７２２８）であった。２日後、未処理対照よりもスコポラミン処理動物のほうがシルマースコアが小さく（すなわち涙液が少なく）（１５．２±５．４ｍｍに対して９．６±３．２ｍｍ、ｐ＝０．１６７１）、動物を群に振り分けた（表７）。５日目に、未処理対照（１７．７±４．４ｍｍ）に対して処理動物の平均シルマースコアは８．５±２．２ｍｍであり、この差異は、ドライアイの誘導に対応する統計的に有意なものであった（ｐ＜０．０００１）。以後の検査では、未処理対照（Ｇ１）よりもスコポラミンを投与された群のほうがシルマースコアが統計的に有意に低く（ｐ＜０．０００１〜０．０５４１−１４日目のボーダーライン）、スコポラミンを投与された群間に統計的に有意な差異は認められなかった（表８および図２２）。
【０１５２】
【表７】
0005480242.tif 000023
【０１５３】
【表８】
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【０１５４】
涙液フルオレセインクリアランス：
フルオレセインクリアランス試験を使用して、ドライアイの誘導後５日目、７日目、１４日目、２０日目に、涙液流体の代謝回転を測定した。ヒトで説明されている方法（Ａｆｏｎｓｏ，  Ａ．Ａ．ら，  “Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｅａｒ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  Ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｒｍｅｒ  Ｔｅｓｔ  Ｓｃｏｒｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｏｃｕｌａｒ  Ｉｒｒｉｔａｔｉｏｎ  Ｓｙｍｐｔｏｍｓ，”  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  １０６：８０３〜８１０  （１９９９）（その内容全体を本明細書に援用する））とラットで改変された方法（Ｃｈｅｎ，  Ｗ．ら，  “Ｋｅｒａｔｏｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｉｔｉｓ  Ｓｉｃｃａ  Ｍｏｄｉｆｉｅｓ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｉｎ  Ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖａ，”  Ｃｏｒｎｅａ  ２６：１１０１〜１１０６  （２００７）（その内容全体を本明細書に援用する））で、涙液フルオレセインクリアランスを評価した。動物をイソフルランで軽く鎮静させ、２マイクロリットルの１％ナトリウムフルオレセイン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）溶液（滅菌生理食塩水中）を下側結膜嚢に適用した。動物は２分以内で目覚めた。１５分後、動物を再度鎮静させ、（シルマーテストで説明したようにして）フルオレセイン染色涙液流体をフェノールレッド綿糸で回収した。この糸を、蛍光光度分析まで、遮光した１．５ｍＬのポリプロピレンエッペンドルフチューブに入れてすみやかに密閉した。回収された涙液流体の容量を、湿っている綿の長さ（ｍｍ）で求めた。その後、１００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加え、管を１２，０００ｒｐｍで５分間スピンさせた後、流体を９６ウェルのポリスチレンマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＃２５９２、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｎｅｐｅａｎ，  Ｏｎｔａｒｉｏ）に移した。各プレート上で標準ウェルを調製した。これは、２μｌの１％ナトリウムフルオレセイン溶液を含有する１００μｌのＰＢＳにフェノールレッド糸を入れて構成されたものであった。標準ウェルに対するゲインを設定した後、蛍光マイクロプレートリーダー（ＦＬＵＯｓｔａｒ  ＯＰＴＩＭＡ，  ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてすみやかに蛍光を測定した。蛍光単位を湿った綿の長さ（ｍｍ）で割って、涙液中のフルオレセイン濃度を算出した（ＦＵ／ｍｍ）。
【０１５５】
基線で、平均フルオレセインクリアランス値は３８７±４２７ＦＵ／ｍｍ（Ｐ＝０．７５０６）であった。その後の検査で、数値的に、群１（未処理対照）よりもスコポラミンを投与された群の値が高くなった（すなわち、涙液の代謝回転が減った）。この差異は７日目には統計的に有意（０．０３７８）であったが、他の日には有意でなかった（ｐ＝０．１２４２〜０．４４７２）。スコポラミンを投与された群間で統計的に有意な差異は認められなかった（表９および図２３）。
【０１５６】
【表９】
0005480242.tif 000025
【０１５７】
すべての検査で、群間の涙液フルオレセインクリアランス値とシルマーテスト値に有意な逆相関が認められた。水性涙液産生が少なくなるにつれて涙液フルオレセイン濃度が高くなった（スピアマンｒ＝−０．３３０６、ｐ＜０．０００１、ｎ＝１８０ＸＹ対）。
【０１５８】
ラットにおけるスコポラミンの効果：
羅患例はなかった。すべてのスコポラミン処理動物（Ｇ２〜６）に、２日目以降に軽度から重度の眼刺激が観察された。ほとんどのスコポラミン処理動物の眼に、結膜の鬱血、腫れ、結膜の血性分泌物が認められた。結膜の鬱血と結膜の血性分泌物は通常、翌日には消散するが、結膜の腫れは研究中ずっと続いた。処置前、平均体重は約４００ｇであり、統計的に群間の差がなかった（ｐ＝０．３９２７）（表１０）。未処理対照群（Ｇ１）の平均体重が研究中に約５７５ｇに増えた。スコポラミンを投与された５つの群（Ｇ２〜Ｇ６）では、平均体重が約４２５〜４５０ｇに増えた。１４日目から開始して２８日目まで続く、体重を減らすための統計的に有意な処理効果があった（ｐ＜０．０００１〜０．０４２６）（図２４）。
【０１５９】
【表１０】
0005480242.tif 000026
【０１６０】
統計解析
適用可能な場合、眼でのデータをラットごとに平均したため、実験動物は分析対象単位となった（ｎ＝５）。平均および標準偏差（ＳＤ）を使用して、各研究群のデータをキャラクタライズした。治療群、検査日、治療群検査日を要素として、体重および眼科的な徴候に対する分散の二方向解析を実施（ＰＲＯＣ  ＧＬＭ）（ＰＣ−ＳＡＳ、バージョン９．１．、ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  Ｃａｒｙ  ＮＣ）。検査日に層別化した際、治療群が統計的に有意（ｐ≦０．０５、両側）だった場合に対比較を実施した。未処理対照（群１）との比較のために、ダネット調整ありのＬＳＭＥＡＮＳを使用した。他の群との比較のために、ＬＳＭＥＡＮＳを使用した。群のうち、データテーブルにｐ値を示し、すべての対比較の推論ｐ値を評価した（データ含めず）。スピアマンの相関係数順位を使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４．０ｃ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）を用いてさまざまな端点測定間の相関を評価した。
【０１６１】
帰納的な検出力計算を実施した。Ｗｈｉｔｌｅｙ，  Ｅ．  ａｎｄ  Ｂａｌｌ，  Ｊ．，  “Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  Ｒｅｖｉｅｗ  ４：  Ｓａｍｐｌｅ  Ｓｉｚｅ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ，”  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ，  ６：３３５〜３４１  （２００２）（その内容全体を本明細書に援用する）。体重で５４ｇ、シルマースコアで４．９ｍｍ、フルオレセインクリアランスで８３０ＦＵ／ｍｍ、ｔＢＵＴで２．８秒、角膜染色で０．９スコア、４．５ｎｇ／μＬムチンという小さな差異を検出するために、検定の検出力を８０％（β）（α＝０．０５、両側）とした。
【図１Ａ】
0005480242.tif 000031
【図１Ｂ】
0005480242.tif 000032
【図１Ｃ】
0005480242.tif 000033
【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
0005480242.tif 000038
【図６】
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【図７】
0005480242.tif 000040
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
0005480242.tif 000046
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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