(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光測定ＰＣＲ装置であって、
反応溶液を保持するウェルと、
前記ウェルの外周部に配置され、反応溶液の温度を調整可能なヒータと、
前記ウェル内の反応溶液に光を照射する光源と、
前記ウェルの下方に接続される導波路と、
前記ウェル内で発生する蛍光を測定する蛍光測定器と、を具備し、
前記ウェルは、少なくとも外部樹脂層と、内部樹脂層の二層構造であり、
前記内部樹脂層の屈折率は、前記外部樹脂層の屈折率よりも大きく、
前記導波路は、内部に前記内部樹脂層と同一の材質からなるコア部と、外部に前記外部樹脂層と同一の材質からなるクラッド部を有し、前記ウェルの下部において前記外部樹脂層が除去され、露出する前記内部樹脂層に前記コア部が接合され、
前記ヒータによって温度を調整することで、反応溶液中でＤＮＡの分離、抽出および増幅を行うことができ、前記ウェル内で発生した蛍光を、前記内部樹脂層に封じ込めて前記コア部に導出し、さらに光学フィルタを介して前記蛍光測定器によって測定可能であることを特徴とする蛍光測定装置。
【請求項２】
前記ウェルは複数配置され、
前記導波路は光スイッチに接続され
前記光スイッチによって、それぞれの前記ウェルからの蛍光を切り替えることで、前記蛍光測定器で複数の前記ウェルの蛍光を測定可能であることを特徴とする請求項１記載の蛍光測定装置。
【請求項３】
前記ウェルの上端面又は外部樹脂層の外周面の少なくともいずれかには、反射膜が形成されることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の蛍光測定装置。
【請求項４】
前記ウェルのコアを構成する樹脂は、ポリカーボネート、変性ポリカーボネート、高Ｔｇ成分モノマーとのアクリル系重合体、ノルボルネン系樹脂、シリコーン樹脂のいずれかであることを特徴とする請求項１から請求項３のいずれかに記載の蛍光測定装置。
【請求項５】
蛍光測定ＰＣＲ装置で用いられるウェルの製造方法であって、
外部樹脂層と、前記外部樹脂層よりも屈折率が大きな内部樹脂層の二層構造となるように、ウェル本体の形状を成形し、
前記ウェル本体の下部の前記外部樹脂層を除去して、前記内部樹脂層を露出させ、
内部に前記内部樹脂層と同一の材質からなるコア部と、外部に前記外部樹脂層と同一の材質からなるクラッド部を有する導波路を用い、
露出した前記内部樹脂層に前記コア部を接合し、前記外部樹脂層に前記クラッド部を接合することを特徴とするウェルの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光測定ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）装置等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＲ法は、ごく微量のＤＮＡから目的とするＤＮＡ領域を短時間で増殖する方法として知られている。その原理は、２本鎖ＤＮＡ上の２つの既知配列を利用して、相互いの合成方向が向かい合うような２つのプライマＤＮＡを設計する。
これらのプライマに挟まれた領域のＤＮＡが合成されると、それが次のサイクルでは鋳型になる。このような反応を繰り返すことで、ＤＮＡ鎖を幾何級数的に増幅することができる。１９８５年に発見されたこの方法は、耐熱性酵素の利用により、爆発的に普及した。
【０００３】
図１１は、ＰＣＲ法によりＤＮＡ増幅の態様を示す概念図である。まず、図１１（ａ）に示すような増幅させたいＤＮＡ領域を有する鋳型ＤＮＡが、２種のプライマと、例えば耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの混合物）をバッファ液とともに反応溶液中に入れられる。
【０００４】
この状態で、例えば９５℃で２分程度保持することで、図１１（ｂ）に示すように、熱変性により鋳型ＤＮＡが一本鎖に分離される。
【０００５】
その後、温度を下げて、例えば５０℃で１分間保持することで、図１１（ｃ）に示すように、プライマ１０１ａ、１０１ｂをＤＮＡ鎖に結合（ハイブリダイズ）させる。
【０００６】
次に、ＤＮＡポリメラーゼの酵素反応の最適温度（例えば７２℃）で１分保持することで、プライマ１０１ａ、１０１ｂで挟まれたＤＮＡ領域に、ＤＮＡポリメラーゼによる相補ＤＮＡ鎖が合成される。以上により、プライマ１０１ａ、１０１ｂで挟まれたＤＮＡ領域を２倍に増幅することができる。
【０００７】
以上のサイクルを繰り返すことで、当初反応液中に存在していたＤＮＡ分子の中で、二つのプライマで挟まれた特定の領域のみを大量に増幅することができる。
【０００８】
このような反応中にＰＣＲ反応を検知することが可能なリアルタイムＰＣＲ法という。また、蛍光標識を用いたリアルタイムＰＣＲ法には、インターレーション法やハイブリダイゼーション法があるが、ハイブリダイゼーション法の方がインターカレション法よりも非特異的増幅の確立が低く、目的とする遺伝子鎖の増幅効率が高くなることが知られている。以上の他、以下のヘアピンプライマＰＣＲ法などが、知られている。
【０００９】
図１２は、ヘアピンプライマＰＣＲ法の概念図である。この方法では、図１２（ａ）に示すように、プライマの末端にヘアピン構造を形成するＤＮＡ配列を付加したヘアピンプライマ１０３が用いられる。ヘアピン領域には低分子が特異的に結合するシトシンバルジ領域が導入されている。また、ＰＣＲ前には、シトシンバルジに結合すると蛍光を発する低分子化合物が結合されている。
【００１０】
図１２（ｂ）に示すように、ポリメラーゼ１０７によるＤＮＡ鎖の合成が進行し、ＰＣＲによりヘアピンプライマ１０３のヘアピン構造が開かれると、シトシンバルジ構造が消失する。このため蛍光色素１０５が遊離する。したがって、蛍光強度が低下する。すなわち、反応系の蛍光を検出することで、ＰＣＲの進行を把握することができる。
【００１１】
リアルタイムＰＣＲに関しては、例えば、伸長性の優れたＤＮＡポリメラーゼをＰＣＲに用いることにより、より短時間で遺伝子を検出することが可能な遺伝子の増幅方法が開示されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２０１０−２３９８８０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
図１３は、このようなリアルタイムＰＣＲによって、蛍光を測定するためのウェル近傍を示す概略図である。まず、図１３（ａ）に示すように、ウェル１０９内に前述した各種の構成を含む反応溶液１１３が入れられる。この状態で、上方より照射・受光部１１１より光を照射する（図中矢印Ｉ方向）。照射・受光部１１１は、例えば光ファイバであり、図示を省略した光源および蛍光測定器に接続されている。
【００１４】
光が照射された反応溶液からは、ＰＣＲの進行に応じた蛍光が発生（消失）する。図１３（ｂ）は、仮に蛍光発生中心１１５を蛍光の発生する中心であるとした場合に、蛍光の発生する状態を示す模式図である。蛍光発生中心１１５から発生する蛍光は、蛍光発生中心１１５を中心に全方向に（蛍光発生中心１１５を中心とする球体を仮定した場合の球面方向に対して）略均一に発生する（図中矢印Ｊ方向）。
【００１５】
この際、例えば照射・受光部１１１の受光面と蛍光発生中心１１５との距離をＬとすると、仮想受光面１１７（半径Ｌの球体の表面積）は、４πＬ２で表わされる。すなわち、ウェル１０９での反射等を無視すれば、反応溶液から発生した蛍光は、４πＬ２の表面積を有する仮想受光面１１７の表面全体に均一に到達する。
【００１６】
ここで、照射・受光部１１１の受光面の面積をａとすれば、実際に発生した蛍光の内、受光できる蛍光の量は、全体の４πＬ２の面積の内、面積ａの受光可能領域１１９（図中におけるハッチング部）のみとなる。すなわち、それ以外の方向に進んだ蛍光は、受光されることなく散逸する。
【００１７】
ここで、照射・受光部１１１の径を５ｍｍΦとし、距離Ｌを１０ｍｍとする。すると、仮想受光面１１７の全表面積（４×π×１０２）は、１２５７ｍｍ２程度となる。また、受光面の面積は（π×２．５２）は、約２０ｍｍ２程度となる。したがって、発生した蛍光に対して、２０／１２５７＝約１．６％程度となる。
【００１８】
このように、従来の蛍光測定装置においては、実際に生じた蛍光のほとんどが外部に漏れ出しており、発生した蛍光の内、わずかしか受光することができない。すなわち、蛍光を受光する効率が極めて悪い。したがって、例えば、医療分野において、被検査サンプル中の抗原（例えばウィルス）量が十分でないと検出精度を確保することが困難である。
【００１９】
本発明は、このような問題に鑑みてなされたもので、例えばＴａｑ  Ｍａｎ  ＰＣＲ法で実現されているようなウィルス感染検査の感度（１５ＩＵ／μＬ）と同等の感度を実現可能な蛍光測定装置等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
前述した目的を達するために第１の発明は、蛍光測定ＰＣＲ装置であって、反応溶液を保持するウェルと、前記ウェルの外周部に配置され、反応溶液の温度を調整可能なヒータと、前記ウェル内の反応溶液に光を照射する光源と、前記ウェルの下方に接続される導波路と、前記ウェル内で発生する蛍光を測定する蛍光測定器と、を具備し、前記ウェルは、少なくとも外部樹脂層と、内部樹脂層の二層構造であり、前記内部樹脂層の屈折率は、前記外部樹脂層の屈折率よりも大きく、前記導波路は、内部に前記内部樹脂層と同一の材質からなるコア部と、外部に前記外部樹脂層と同一の材質からなるクラッド部を有し、前記ウェルの下部において前記外部樹脂層が除去され、露出する前記内部樹脂層に前記コア部が接合され、前記ヒータによって温度を調整することで、反応溶液中でＤＮＡの分離、抽出および増幅を行うことができ、前記ウェル内で発生した蛍光を、前記内部樹脂層に封じ込めて前記コア部に導出し、さらに光学フィルタを介して前記蛍光測定器によって測定可能であることを特徴とする蛍光測定装置である。
【００２１】
前記ウェルは複数配置され、前記導波路は光スイッチに接続され前記光スイッチによって、それぞれの前記ウェルからの蛍光を切り替えることで、前記蛍光測定器で複数の前記ウェルの蛍光を測定可能であることが望ましい。
【００２２】
前記ウェルの上端面には、反射膜が形成されてもよい。前記ウェルを構成する樹脂は、内部樹脂層としては、たとえば、耐熱性を有するポリカーボネート樹脂、変性ポリカーボネート樹脂、ポリアミド、高Ｔｇ成分モノマーとのアクリル系重合体、ノルボルネン系樹脂、シリコーン樹脂、架橋アクリル樹脂などを用いることができ、また、外部樹脂層には、一般的にはフッ素系樹脂やポリアミドを用いることができる。また、耐熱性としての使用温度条件が厳しくない場合には、内部樹脂層としてポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレンなどの汎用熱可塑樹脂を用いることもあるが、ＰＣＲ用としては、上記の耐熱樹脂を用いることが望ましい。
【００２３】
第１の発明によれば、ウェルの周囲に温調可能なヒータが設けられるため、ＤＮＡの分離、抽出、増幅および蛍光の測定を連続して行うことができる。ここで、用いるヒータは、ウェル毎に独立した形状のヒータでも、ウエルを収納するブロック全体をほぼ均一に加熱するヒータブロックであっても良い。
【００２４】
また、ウェルが二層構造で構成され、内部樹脂層の屈折率を外部樹脂層の屈折率よりも大きくすることで、ウェル内に入れられた反応溶液中からの蛍光をウェルの内部樹脂層に封じ込めることができる。また、内部樹脂層がウェルの下部で導波路に接続されるため、蛍光を導波路に導入することができる。したがって、導波路に接続された蛍光測定器で蛍光を効率良く測定することができる。
【００２５】
また、複数のウェルで発生する蛍光を、光スイッチで切り替えることで、高価な光学フィルタおよび蛍光測定器を各ウェルごとに設置する必要がない。
【００２６】
また、ウェルの上端面に反射膜を形成することで、内部樹脂層内の蛍光がウェルの上端面から漏れてしまうことがない。また、ウェルを構成する樹脂として、コア材の樹脂としては、ポリカーボネート（耐熱温度１２５−１３５℃）、変性ポリカーボネート（耐熱温度１４５℃）、高Ｔｇ成分モノマーとのアクリル系重合体、ノルボルネン系樹脂（耐熱温度１５０℃）、シリコーン樹脂（１５０−１７０℃）、架橋アクリル樹脂（耐熱温度１７５℃）から選択することで、ＰＣＲにおける熱でウェルが損傷することがない。また、コア材にＰＭＭＡを用いても、クラッド材にα―フルオロアクリレート系樹脂を用いたプラスチック光ファイバを用いれば、耐熱性を向上させることができる。
【００２７】
尚、本装置を加熱の必要がない試験に用いる場合には、コア材として、最も一般的に使用されているＰＭＭＡ、ポリスチレンなどを用いた汎用プラスチックファイバを用いることができる。
【００２８】
上述のコア材に対しては、各樹脂材料より、屈折率が低く、コア材との相溶性あるいは親和性に優れ、さらに耐熱性に優れる樹脂ならば、いかなる樹脂をも用いることができる。
【００２９】
第２の発明は、蛍光測定ＰＣＲ装置で用いられるウェルの製造方法であって、外部樹脂層と、前記外部樹脂層よりも屈折率が大きな内部樹脂層の二層構造となるように、ウェル本体の形状を成形し、前記ウェル本体の下部の前記外部樹脂層を除去して、前記内部樹脂層を露出させ、内部に前記内部樹脂層と同一の材質からなるコア部と、外部に前記外部樹脂層と同一の材質からなるクラッド部を有する導波路を用い、露出した前記内部樹脂層に前記コア部を接合し、前記外部樹脂層に前記クラッド部を接合することを特徴とするウェルの製造方法である。
【００３０】
第２の発明によれば、高感度な測定が可能なウェルを容易に製造することができる。
【発明の効果】
【００３１】
本発明によれば、例えばＴａｑ  Ｍａｎ  ＰＣＲ法で実現されているようなウィルス感染検査の感度（１５ＩＵ／μＬ）と同等の感度を実現可能な蛍光測定装置等を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】蛍光測定装置１を示す概略図。
【図２】（ａ）はウェル３の拡大図であり、（ｂ）は屈折率の分布図。
【図３】ウェルの断面拡大図であり、（ａ）は図１のＡ部拡大図、（ｂ）は図２のＢ部拡大図。
【図４】ウェルで受光可能な領域を示す概念図。
【図５】ウェルの製造方法を示す図。
【図６】ＰＣＲ測定の温度サイクルを示す概念図。
【図７】他の実施形態を示す図で、蛍光測定装置１ａを示す概略図。
【図８】光スイッチ４７を示す図。
【図９】（ａ）は図８のＥ−Ｅ線断面図、（ｂ）は図８のＦ−Ｆ線断面図。
【図１０】導波路９ａとファイバ５７との接続部の拡大図。
【図１１】ＰＣＲの工程を示す概念図。
【図１２】ヘアピンプライマを用いたＰＣＲの工程を示す概念図。
【図１３】従来の受光領域を示す概念図。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下、図面を参照しながら、本発明の実施形態について説明する。図１は、蛍光測定装置１を示す概略図である。蛍光測定装置１は主に、複数のウェル３ａ、３ｂ、・・・、３ｎと、複数の光源５ａ、５ｂ、・・・、５ｎと、導波路９ａ、９ｂ、・・・、９ｎと、光学フィルタ１１ａ、１１ｂ、・・・、１１ｎと、蛍光測定器１３ａ、１３ｂ、・・・、１３ｎおよび各ウェルの温度調整を行うヒータ７等から構成される。なお、簡単のため、図ではウェルは３つのみ示すが、例えば、一つのプレート上には９６個のウェルが配置される。
【００３４】
ウェル３ａ、３ｂ、・・・、３ｎ（以下、総称してウェル３とする）は、内部に反応溶液１５を保持可能である。ウェル３は、反応溶液を保持する部位の高さが約１０ｍｍであり、外径が約８〜１０φ程度である。また、ウェル３の下部にはそれぞれ約３〜４ｍｍ程度の導波路９ａ、９ｂ、・・・、９ｎ（以下、総称して導波路９とする）が接合される。
【００３５】
ウェル３の上方には光源５ａ、５ｂ、・・・、５ｎ（以下、総称して光源５とする）がそれぞれ配置される。光源５は、それぞれのウェル３内の反応溶液に所定の波長の光を照射する。光源５としては、レーザやＬＥＤ等を用いることができる。
【００３６】
図２（ａ）は、ウェル３の拡大図であり、図２（ｂ）はウェルを含む屈折率の分布図である。また、図３（ａ）は、図２のＡ部拡大図である。ウェル３は、反応溶液と接する側から、内部樹脂層１９および外部樹脂層２３の二層構造で構成される。ここで、図２（ｂ）に示すように、内部樹脂層１９の屈折率は、外部樹脂層２３よりも高い。
【００３７】
図２（ｂ）のＬは反応溶液１５の領域の屈折率であり、Ｍは内部樹脂層１９の屈折率であり、Ｎは外部樹脂層２３の屈折率である。なお、Ｎの両側は空気層であり、屈折率は１．０である。反応溶液１５の屈折率は、使用する溶液によるが、例えば、１．４〜１．５５程度である。また、内部樹脂層１９の屈折率は、例えば１．５０〜１．７０程度であり、外部樹脂層２３の屈折率は、例えば、１．４８以下程度である。すなわち、内部樹脂層１９の内部に光を封じ込めることが可能である。
【００３８】
なお、ウェル３は、例えば、内部樹脂層は、耐熱性を有するポリカーボネート樹脂、変性ポリカーボネート樹脂、ポリアミド、高Ｔｇ成分モノマーとのアクリル系重合体、ノルボルネン系樹脂、シリコーン樹脂、架橋アクリル樹脂等の例えば１１０℃以上（さらに望ましくは１２０℃以上）の耐熱性を有する樹脂中から、反応溶液等に対する耐薬品性を考慮して選定した材質で構成する。外部樹脂層には、一般的にはフッ素系樹脂やポリアミドを用いる。また、屈折率の調整は、各層を構成する樹脂材質を変更することにより行ってもよく、または、同材質の母材に適宜添加剤を添加してもよい。
【００３９】
また、図３（ｂ）は図２のＢ部拡大図である。導波路９は、中央部にコア部２５が設けられ、コア部２５を覆うように外周部にクラッド部２７が設けられる。コア部２５を構成する樹脂の屈折率は、クラッド部２７を構成する樹脂の屈折率よりも高い。例えば、コア部２５は内部樹脂層１９と同一の材質で構成され、クラッド部２７は外部樹脂層２３と同一の材質で構成される。なお、導波路９としてはプラスチックファイバを用いてもよい。
【００４０】
ウェル３と導波路９との接合部では、内部樹脂層１９とコア部２５とが接合される。また、外部樹脂層２３とクラッド部２７とが接合される。したがって、内部樹脂層１９内に封じ込められた光は、コア部２５に導出され、コア部２５内を伝播する。
【００４１】
ウェル３の上端面には、反射膜１７が設けられる。反射膜１７は、ウェル３（内部樹脂層１９）内の光が、ウェル３の上端から漏れだすことを防止するものである。反射膜１７としては、酸化ケイ素、酸化チタン、酸化ニオブなどの物質を蒸着などによって形成すればよい。または、反射膜成分を塗布してもよい。反射膜１７の形成方法は問わない。
【００４２】
ウェル３の外周部には、ヒータ７が設けられる。ヒータ７は、図示を省略した制御部に接続されており、ウェル３内部の反応溶液の温度調整が可能である。ヒータ７としてはヒータブロックを配置してもよく、抵抗加熱などのヒータを用いてもよい。
【００４３】
導波路９には、それぞれ光学フィルタ１１ａ、１１ｂ、・・・、１１ｎ（以下、総称して光学フィルタ１１とする）が接続され、さらに光学フィルタ１１を介して蛍光測定器１３ａ、１３ｂ、・・・、１３ｎ（以下、総称して蛍光測定器１３とする）と接続される。光学フィルタ１１は、反応溶液１５内で発生する蛍光成分以外の光（例えば照射光成分）を除去するものである。光学フィルタ１１を通過した蛍光は、各蛍光測定器１３で測定される。
【００４４】
すなわち、ウェル３内部の反応溶液１５では、ヒータ７による温度調整によって、前述したＤＮＡの増幅が行われる。この際観察される蛍光成分はウェル３内部の内部樹脂層１９内に封じ込められる。内部樹脂層１９内の蛍光は、導波路９に導出されて光学フィルタ１１を介して光測定器１３で測定される。以上により、蛍光の増減をリアルタイムで監視することができる。
【００４５】
図４は、図１３と同様に、ウェル３を用いた場合における反応溶液中から発生した蛍光の拡散状態を示す図である。ここで、光源５から蛍光発生中心２９までの距離をＬとする。光源５から光を反応溶液に照射すると、反応溶液から発生する蛍光は、蛍光発生中心２９から全方向に略均一に拡散する（図中矢印Ｃ）。
【００４６】
蛍光発生中心２９から発生した蛍光は、半径Ｌの球体表面である仮想受光面３１の表面全体に略均一に到達する。しかしながら、光源５が受光部を兼ねる場合（図１３のように従来の測定の場合）には、受光可能な蛍光は、前述したように受光部の面積に対応する部位のみとなる。
【００４７】
一方、本発明では、ウェル３の内面から上方に向かって拡散する蛍光以外は、全てウェル３（内部樹脂層１９）に蛍光が封じ込められる。また、前述のように、ウェル３の上面方向には反射膜１７が形成されるため、ウェル３内部に封じ込められた光は全てウェル３の下部の導波路９へ出光される。
【００４８】
すなわち、本発明のウェル３を用いることで、仮想受光面３１において、ウェル３の開口から漏れだす光以外の光を全てウェル３内に封じ込めることができる。このため、仮想受光面３１において、受光可能領域３３は、ウェル３の開口部以外の全ての方向（図中ハッチングで示した領域）となる。したがって、従来と比較して、極めて効率良く発生した蛍光を測定することができる。
【００４９】
次に、ウェル３の製造方法を説明する。図５は、ウェル３の製造工程を示す図である。まず、図５（ａ）に示すように、ウェル本体３５を形成する。ウェル本体３は、前述の通り、内部樹脂層１９および外部樹脂層２３の二層構造であり、例えば射出成型、あるいはプレス成形、又は樹脂を金型への樹脂の注入より成形されるが、成形方法は、樹脂の種類により、適宜選定すればよい。また、外部樹脂層が２層に構成されていても良い。
【００５０】
次に、図５（ｂ）に示すように、ウェル本体３５下面の一部を切削して外部樹脂層除去部３７を形成する。外部樹脂層除去部３７では、内部の内部樹脂層１９が露出する。
【００５１】
次に、図５（ｃ）に示すように、外部樹脂層除去部３７に導波路９を接合する（図中矢印Ｄ）。導波路９は、内部にコア部２５を有し、外部にクラッド部２７を有するように別途、プラスチックファイバと同様に溶融樹脂の線引き工程又は押出成形や射出成型により成形される。導波路９とウェル本体３５とは例えば融着によって接合される。また、導波路９には、マルチコア形のプラスチック光ファイバを用いることができる。ここで、マルチコア形のプラスチック光ファイバとして、例えば、コアの周りに第１のクラッドが薄くリング状に取り巻き、その外周に第２のクラッドが海となって取り囲んでいる構造の２重クラッド型マルチクラッドファイバを用いると、ファイバの急峻な曲げに対しても、損失が大幅に減少する。この際、シングルコア型のプラスチックファイバを用いる時には、導波路９の先端には、コア部２５が突出するように、あらかじめクラッド部２７を僅かにテーパ状に加工してもよい。このようにすることにより、ウェル本体３５と導波路９の接続部を滑らかにすることができる。
【００５２】
図５（ｄ）に示すように、内部樹脂層１９とコア部２５とが融着され、同時に、外部樹脂層２３とクラッド部２７とが融着されることで、ウェル３が製造される。なお、導波路９のコア部２５と内部樹脂層１９とが、光学的に接合されれば、導波路９とウェル本体との接合方法はこれに限られない。また、導波路９の先端の形状は必ずしもこれに限るものではなく、その他の形状であっても良く、あるいは特に形状加工を行なわずに、そのまま融着しても良い。さらに、導波路のクラッドの外側には、保護用被覆材が設けることもできる。この場合、保護用被覆材としては、ポリエチレン、難燃ポリ塩化ビニル、塩素化ポリエチレン、ＰＶＣ，ナイロン、フッ素化エチレン、ポリプロピレンなどから使用条件に合わせて適宜選定して用いる。
【００５３】
次に、ヒータ７による反応溶液の温度調整のサイクルについて説明する。図６はＰＣＲ測定の温度サイクルを示す概念図である。前述したように、増幅サイクル３９は、変性工程４１、アニーリング工程４３、ポリメラーゼ伸長工程４５からなる。
【００５４】
変性工程４１は、約９５℃の温度で鋳型ＤＮＡを一本鎖に分離する工程である。アニーリング工程４３は、約５０℃に降温し、プライマをＤＮＡにハイブリダイズする工程である。ポリメラーゼ伸長工程４５は、約７０℃に昇温し、ＤＮＡポリメラーゼの酵素反応により、プライマに挟まれたＤＮＡ領域を増幅する工程である。前述したウェル３等を用いたリアルタイム蛍光測定によって、ポリメラーゼ伸長工程の進行を把握することができる。蛍光測定によってプライマに挟まれたＤＮＡ領域が２倍に増幅されたと判断されると、増幅サイクル３９をさらに繰り返し、ＤＮＡの増幅を行うことができる。
【００５５】
以上説明したように、本実施の形態によれば、ウェル３の周囲にヒータ７が配置されるため、反応溶液１５の温度を各工程に適した温度に調整することができる。このため、ウェル３の内部のみで増幅サイクルを繰り返すことができる。
【００５６】
また、ウェル３が、屈折率の異なる二層構造で形成され、さらにウェル３の下部に導波路９が接合されるため、ウェル３内部から浸入した光をウェル３に封じ込め、導波路９に導出することができる。このため、微量の蛍光であっても従来と比較して極めて感度良く検出することができる。
【００５７】
また、ウェル上端面に反射膜１７が設けられるため、光がウェル外に漏れ出すことを防止することができる。反射膜１７は、ウェルの形状によっては、ウェル底部の曲率の大きな部分において、ウェル外周部に蛍光が外部樹脂層の外周面から漏光した場合でも、外部樹脂層の外周面に反射膜を形成することにより、光がウェル外に漏れ出すことを防止できることから、ウェル底部の曲率の設計の自由度を広げることができる。
【００５８】
次に、他の実施の形態について説明する。図７は、第２の実施の形態にかかる蛍光測定装置１ａを示す概略図である。なお、以下の説明において、蛍光測定装置１と同様の機能を奏する構成については、図１〜図３等と同様の符号を付し、重複する説明を省略する。
【００５９】
蛍光測定装置１ａは、蛍光測定装置１と略同様の構成であるが、光スイッチ４７が用いられる点で異なる。光スイッチ４７の一方の側には、複数のウェルからの導波路９が接続される。光スイッチ４７の他方の側には、光学フィルタ１１が接続されており、さらに光学フィルタ１１の後方に蛍光測定器１３が配置される。
【００６０】
光スイッチ４７は、入射側の光を切り替えることが可能である。すなわち、導波路９ａ、９ｂ、・・・、９ｎのいずれかの導波路と光学フィルタ１１（蛍光測定器１３）とを光接続するものである。したがって、光スイッチ４７を切り替えることで、一つの光学フィルタ１１および蛍光測定器１３で、複数のウェル内の蛍光を測定することができる。
【００６１】
図８は、光スイッチ４７の構成を示す概略図であり、図９（ａ）は図８のＥ−Ｅ線断面図、図９（ｂ）は図８のＦ−Ｆ線断面図である。光スイッチ４７は、主に、モータ５９、プーリ６１、ベルト６３、回転体４９、軸受け５５、固定部５１等から構成される。モータ５９は、プーリ６１、ベルト６３を介して回転体を駆動させる駆動部である。モータ５９としては、ステッピングモータが使用できるが、位置フィードバック機能を有するサーボモータ等を用いることが望ましい。
【００６２】
プーリ６１は、モータ５９の動力をベルト６３に伝達する部位である。なお、ベルト６３は歯付きベルトを用いることが望ましく、この場合、プーリ６１および後述する回転体４９の外周に歯付きベルトに対応した歯型を形成すればよい。
【００６３】
回転体４９は、軸受け５５を介して固定部５１の中央に設けた回転軸５３に取り付けられる。固定部５１は、モータ５９によっては動作せず、固定される部位であり、モータ５９とは分離して配置される。固定部とモータとを直接接触させると、固定部にモータからの振動が伝達するためである。固定部５１と回転体４９とは対向するように設けられ、固定部５１の回転体４９に対する対向面に垂直に形成された軸を中心に回転体４９が正逆方向に回転可能である。
【００６４】
軸受け５５は、回転体４９と固定部５１との距離が変動することを防ぐため、回転軸方向への変位が少ないものが望まれ、例えば、アンギュラ玉軸受けを用いることができる。
【００６５】
なお、回転体４９の駆動は、モータでなくてもよく、アクチュエータ等の種々の機器を適用することもできる。また、駆動部と回転体との動力の伝達は、ベルト６３に代えて、ギア等を用いてもよい。いずれにしても、回転体４９を、固定部５１に対して正逆方向に回転させることができればよい。
【００６６】
図９（ａ）に示すように、固定部５１側には、回転体４９の回転軸５３を中心として、同一径の同心円上に、所定間隔をあけて複数の穴が形成される。また、固定部５１を貫通するように、導波路９が設けられる。なお、図では簡単のため、導波路９ａ、９ｂ、９ｃの３本の例を示すが、光スイッチで切り替えることが可能な導波路数はこれに限定されない。導波路９ａ、９ｂ、９ｃは、固定部５１の外面側から挿入され、回転体との対向面側の面位置に端面が来るように配置される。
【００６７】
また、図９（ｂ）に示すように、回転体４９の固定部５１との対向面側には、ファイバ５７が設けられる。ファイバ５７は、固定部５１との対向面側の面位置に端面が来るように配置され、さらに、固定部５１との対向面における導波路９ａ、９ｂ、９ｃの径方向位置と対応する位置に設けられる。すなわち、回転体４９を所定の位置に回転させることで、ファイバ５７の端部を導波路９ａ、９ｂ、９ｃのいずれかの端部位置に対向配置させることができる。
【００６８】
図１０は、図８のＧ部拡大断面図である。回転体４９内に設けられ、固定部側の端面と同一面にファイバ５７の端面が配置される。同様に、固定部５１を貫通し、回転体側の端面と同一面に導波路９ａ（９ｂ、９ｃ）の端面が配置される。回転体４９を所定の位置に回転させると、図１０に示すように、導波路９ａとファイバ５７とが対向するように位置する。また、回転体４９と固定部５１との間には、ギャップ６５が形成されるため、回転体４９の回転時に回転体４９と固定部５１とが接触することがない。なお、回転体４９と光学フィルタ１１との間も同様の構成としてもよい。
【００６９】
導波路９ａとファイバ５７とが対向する位置で回転体４９の動作を止め、導波路９ａ側から蛍光が送られると（図中矢印Ｈ方向）、ファイバ５７の端面から光が入光する（図中矢印Ｉ方向）。すなわち、導波路９ａとファイバ５７とが光学的に接続される。
【００７０】
なお、ギャップ６５は、部材や動作の精度から、数１０μｍ〜数１００μｍであり、望ましくは１０〜１００μｍ程度である。
【００７１】
なお、ギャップ６５において、導波路９ａから対向する位置のファイバ５７に入光せずに、ギャップ６５で漏れた光が、隣り合う他の導波路９ｂ、９ｃに入光することを防ぐため、回転体４９と固定部５１との対向面には、光の反射を抑制する反射防止膜のコーティングや梨時処理等を施すことが望ましい。
【００７２】
また、図８に示すように、ファイバ５７は、固定部５１との対向面側の導波路９ａ、９ｂ、９ｃとの対向位置から、固定部５１との対向面と逆側の面の回転中心位置まで、回転体４９内部で略Ｓ字状に湾曲して内蔵される。なお、ファイバ５７のそれぞれの端部においては、ファイバ５７は回転体４９の回転軸方向に平行に向けて配置されている。また、回転体４９内部におけるファイバ５７の曲率半径は、ファイバ５７の光の伝送損失を考慮して決定される。また、ファイバ５７の曲率半径は、直線部を除き一定で、滑らかな曲線であることが望ましい。
【００７３】
回転体４９の、固定部５１との対向面と逆側の面の略中央には光学フィルタ１１が設けられる。また光学フィルタ１１の後方には蛍光測定器１３が設けられる。ファイバ５７の端部は、光学フィルタ１１と光接続される。したがって、ファイバ５７に導入された光は、光学フィルタ１１を介して蛍光測定器１３で測定される。
【００７４】
この状態から、所定角度（導波路９ａ、９ｂ、９ｃの配置角度）ずつ回転体４９を回転させ、対応するそれぞれの導波路９ａ、９ｂ、９ｃを順次ファイバ５７との対向面で停止して、各導波路からの光をファイバ５７に導入することで、全ての導波路９ａ、９ｂ、９ｃをファイバ５７に光接続することが可能となる。
【００７５】
以上説明したように、第２の実施の形態によれば、蛍光測定装置１と同様の効果を得ることができる。また、光スイッチ４７を用いることで、各ウェル毎に高価な光学フィルタおよび蛍光測定器が不要となるため、コンパクトで低コストである蛍光測定装置を得ることができる。
【００７６】
以上、添付図を参照しながら、本発明の実施の形態を説明したが、本発明の技術的範囲は、前述した実施の形態に左右されない。当業者であれば、特許請求の範囲に記載された技術的思想の範疇内において各種の変更例または修正例に想到し得ることは明らかであり、それらについても当然に本発明の技術的範囲に属するものと了解される。
【００７７】
例えば、上述の実施形態では、ヒータ７を用いて、熱サイクルによって反応溶液中でＤＮＡの分離、抽出および増幅と、ウェル内で発生した蛍光の測定を行う方法について説明したが、本発明はこれに限られない。例えば、ヒータを用いずに、細胞等の蛍光測定やそれを用いた細胞のスクリーニングにも利用することもできる。さらに、ヒータを有さずその他の本発明の構成を備えた装置によっても、蛍光で標識した細胞や化学染色した細胞のスクリーグなどの測定にも利用できる。
【符号の説明】
【００７８】
１、１ａ………蛍光測定装置
３ａ、３ｂ、３ｎ………ウェル
５ａ、５ｂ、５ｎ………光源
７………ヒータ
９ａ、９ｂ、９ｎ………導波路
１１ａ、１１ｂ、１１ｎ………光学フィルタ
１３ａ、１３ｂ、１３ｎ………蛍光測定器
１５………反応溶液
１７………反射膜
１９………内部樹脂層
２３………外部樹脂層
２５………コア部
２７………クラッド部
２９………蛍光発生中心
３１………仮想受光面
３３………受光可能領域
３５………ウェル本体
３７………外部樹脂層除去部
３９………増幅サイクル
４１………変性工程
４３………アニーリング工程
４５………ポリメラーゼ伸長工程
４７………光スイッチ
４９………回転体
５１………固定部
５３………回転軸
５５………軸受け
５７………ファイバ
５９………モータ
６１………プーリ
６３………ベルト
６５………ギャップ
１００………鋳型ＤＮＡ
１０１ａ、１０１ｂ………プライマ
１０３………ヘアピンプライマ
１０５………蛍光色素
１０７………ポリメラーゼ
１０９………ウェル
１１１………照射・受光部
１１３………反応溶液
１１５………蛍光発生中心
１１７………仮想受光面
１１９………受光可能領域
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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