(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミオイノシトールの製造方法であって、以下の工程：
１）  内因性イノシトール‐１‐リン酸合成酵素を発現しない微生物の形質転換体であって、少なくとも該形質転換体内に発現可能に導入されたイノシトール‐１‐リン酸合成酵素をコードする外来遺伝子を含み、且つ該形質転換体内での機能的なイノシトールモノフォスファターゼの過剰生産又はイノシトールモノフォスファターゼの活性化を誘導する遺伝子組換又は変異を有する前記形質転換体を用意する工程；及び
２）  前記形質転換体の生育及び／又は維持に適した条件下で、該形質転換体と該形質転換体によりミオイノシトールに変換され得る炭素源を接触させる工程を含む、前記製造方法。
【請求項２】
前記内因性イノシトール‐１‐リン酸合成酵素を発現しない微生物が原核生物である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記内因性イノシトール‐１‐リン酸合成酵素を発現しない微生物が、内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を有する微生物である、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記内因性イノシトール‐１‐リン酸合成酵素を発現しない微生物が、大腸菌、バチルス属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ザイモモナス属細菌からなる群から選択される細菌である、請求項１ないし３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
前記細菌が大腸菌である、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
前記イノシトールモノフォスファターゼの過剰生産が、前記微生物に対して、
ａ）  外来イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を導入する、
ｂ）  内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子のコピー数を増加させる、
ｃ）  内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域に変異を導入する、
ｄ）  内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域を高発現誘導性外来調整領域で置換する、又は
ｅ）  内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域を欠失させる、
ことにより誘導される、請求項１ないし５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
前記イノシトールモノフォスファターゼの過剰生産が、前記微生物に対して外来イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を導入することにより誘導される、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
前記イノシトールモノフォスファターゼの活性化が、前記微生物に対して、
ｆ）  内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子に変異を導入する、
ｇ）  内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の一部又は全部を置換する、
ｈ）  内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の一部を欠失させる、
ｉ）  イノシトールモノフォスファターゼ活性を低下させる他のタンパク質を減少させる、
ｊ）  イノシトールモノフォスファターゼ活性を低下させる化合物の生成を減少させる、
ことにより誘導される、請求項１ないし５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項９】
前記炭素源が、前記形質転換体内でグルコース‐６‐リン酸へと変換され得る化合物を含む請求項１ないし８のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１０】
前記炭素源が、Ｄ‐グルコース、スクロース、オリゴ糖、多糖、でんぷん、セルロース、米ぬか、廃糖密、及びＤ‐グルコースを含有するバイオマスからなる群から選択される１つ以上である、請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
更に、前記炭素源との接触下で生育及び／又は維持された前記形質転換体の培養物中に蓄積したミオイノシトールを分離する工程を含む、請求項１ないし１０のいずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミオイノシトールの製造における遺伝子組換技術の応用に関する。特に、原核微生物の形質転換体を利用したミオイノシトールの工業的製造方法に関する。更に本発明は、新規ミオイノシトール誘導体及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミオイノシトールは、多くの高等動物にとって必要不可欠な物質であるため、栄養食品、飼料、医薬品等の成分として広範に利用されている。例えば、ミオイノシトールは、脂肪やコレステロール類の代謝において重要な役割を担っていることが知られており、特に高コレステロール血症等の予防や治療に有効とされている。従って、ミオイノシトールの工業的スケールでの製造プロセスについて、多くの改良が提案されてきている。
【０００３】
従来、ミオイノシトールは、米糠、コーンスティープリカーなどから直接抽出されていたが、当該抽出方法では、ミオイノシトールの収率が低い上に不純物が多く生成するために、ミオイノシトールの精製が困難であり、生産効率が極めて低かった。そこで、ミオイノシトール生産能を有するパン酵母を培養し、当該培養物からミオイノシトールを生成する方法も考案されたが、依然としてその生産性は低く、経済的に成り立たないため工業的に実施されてはいない。
【０００４】
従って、より効率的にイノシトールを生産する微生物の検索がなされた。特許文献１は、イノシトールを菌体外に分泌し得るキャンディダ属酵母の発見及びその利用を開示している。特許文献２及び３は、それぞれ、前記キャンディダ属酵母にグルコース代謝拮抗物質及び抗生物質に対する耐性を付与する突然変異を導入することを開示している。特許文献４、５及び６もまた、それぞれ、イノシトール生産能を有するキャンディダ属酵母に対して３級アミン、ヘキサクロロシクロヘキサン及びセチルトリメチルアンモニウム塩に対する耐性を付与する突然変異を導入することで、イノシトールの収率を向上させることを開示している。特許文献７は、同じくイノシトール生産能を有するキャンディダ属酵母に対して６‐ハロゲノ‐６‐デオキシグルコースに対する耐性を付与する突然変異を導入することを開示している。特許文献８も、イノシトール生産能を有するキャンディダ属酵母に対してハロゲン化ピルビン酸に対する耐性を付与する突然変異を導入することを開示している。
【０００５】
更に、先行技術は、遺伝子組換による酵母の形質転換についても記載している。特許文献９は、一連のミオイノシトール生合成反応においてイノシトール‐１‐リン酸合成酵素が律速反応を担うとの妥当な推論の下で、イノシトール分泌能を有さないキャンディダ属酵母を前記イノシトール‐１‐リン酸合成酵素コード化ＤＮＡの単独によって形質転換することで、当該酵母に対してイノシトール生産能を付与できたことを開示している。特許文献１０は、酵母に対して、グリセロール‐３‐リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターの制御下におかれたイノシトール‐１‐リン酸合成酵素コード化ＤＮＡを単独で導入することにより、該酵母のイノシトール生産性を向上させることを開示している。
【０００６】
更に、特許文献１１も、メタノール資化性酵母ピシァ・パストリスのイノシトール生産に関するものであり、該酵母にミオイノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子を導入することと同時にイノシトールリン酸フォスファターゼ遺伝子を導入することを開示するが、当該追加的なイノシトールリン酸フォスファターゼ遺伝子導入の意義及び効果は明らかにされていない。
【０００７】
従って、上記の酵母に関するいずれの文献も、一連のミオイノシトール生合成反応においてイノシトール‐１‐リン酸合成酵素が律速反応を担うことを前提にしており、ミオイノシトール生合成経路に存在するそれ以外の酵素の重要性を示唆するところはない。
【０００８】
一方、大腸菌に代表される原核微生物は、その旺盛な増殖能や発酵管理における様々な優位性により、酵母に比べて極めて魅力的な工業生産用生物である。しかしながら、内因性ミオイノシトール生合成経路を持った原核微生物は知られていない。
【０００９】
従って、原核微生物によりミオイノシトールを工業的に生産させるためには、原核微生物宿主内に外来性のミオイノシトール生合成経路を構築することが不可欠である。
【００１０】
具体的に、原核微生物宿主内で機能的なミオイノシトール生合成経路を構築するためには、次の触媒活性が必要である：
活性１：  適当な炭素源からグルコース‐６‐リン酸を生成させる活性；
活性２：  グルコース‐６‐リン酸をミオイノシトール‐１‐リン酸へ変換する活性、つまり、イノシトール‐１‐リン酸合成酵素活性；及び
活性３：  ミオイノシトール‐１‐リン酸を基質としたフォスファターゼ活性。
但し、活性１の生成物であるグルコース‐６‐リン酸は、原核微生物が普遍的に生成する代謝中間体であるので、当該活性を原核微生物に付与することは必須ではない。また、活性３についても、本発明者らの知る限りにおいて、従来の遺伝子組換手法による工業的生産に適する原核微生物宿主細胞の大多数は、内因性イノシトールモノフォスファターゼを発現しているか、ミオイノシトール‐１‐リン酸を基質とできる汎用モノフォスファターゼ活性を有している。他方、活性２について見ると、原核微生物はイノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子を有していない例が多い。また、前記のとおり、ミオイノシトール生合成反応においてイノシトール‐１‐リン酸合成酵素が律速反応を担うと考えられている。従って、原核微生物宿主内で機能的なミオイノシトール生合成経路を構築するためには、イノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子を該細胞に導入することが必要十分であると考えられてきた。
【００１１】
実際に、非特許文献１は、大腸菌形質転換体内でのミオイノシトール生産を開示しているが、当該形質転換体にはイノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子が導入されているだけである。
【００１２】
特許文献１２も、大腸菌宿主細胞にイノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子のみを導入して形質転換体を作製し、それにより当該形質転換体内に外来性ミオイノシトール生合成経路を構築することを開示している。但し、当該文献が目的とする最終生成物はＤ-グルカル酸であり、ミオイノシトールは中間体として生産される。特筆すべきは、該文献も、「我々がｓｕｈＢ遺伝子または相同のフォスファターゼを過剰発現させなかったこともまた、注目すべきである。しかし、培養産物の中にミオイノシトール‐１‐リン酸は検出されず、一方、ミオイノシトールは蓄積した。従って、我々は、フォスファターゼ活性は、経路を通る代謝の流れ（ｆｌｕｘ）を制限しないと結論付けた。」（第３３頁、第２〜５行）と記載している。
【００１３】
従って、先行技術は、組換微生物によるミオイノシトール生産におけるイノシトールモノフォスファターゼの決定的な役割を開示も示唆もしてはいない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特開平８‐００２５８号公報
【特許文献２】特開平８‐３８１８８号公報
【特許文献３】特開平８‐８９２６２号公報
【特許文献４】特開平９‐１１７２９５号公報
【特許文献５】特開平１０‐４２８６０号公報
【特許文献６】特開平１０‐４２８８２号公報
【特許文献７】特開平１０‐４２８８３号公報
【特許文献８】特開２０００‐４１６８９公報
【特許文献９】特開平９‐２２００９３号公報
【特許文献１０】特開平１０‐２７１９９５号公報
【特許文献１１】特開２０１１‐５５７２２号公報
【特許文献１２】ＷＯ２００９/１４５８３８号パンフレット
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９９，Ｖｏｌ．１２１，３７９９‐３８００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
内因性ミオイノシトール生合成経路を持たない微生物は、遺伝子組換技術と連携した合成生物学的手法を用いることで、ミオイノシトール生産性を制御しやすいという利点を持つ。殊に大腸菌などの原核微生物宿主は、内因性ミオイノシトール生合成経路を持たないことに加えて、多くの酵母が有しているイノシトール資化能（分解能）も持たないため、合成生物学的手法の適用をいっそう容易にする。また、大腸菌は、その迅速な生育能力や発酵管理の容易さ故に工業的発酵生産の観点から極めて魅力的であるとともに、遺伝子組換技術の適用における実績、確立した安全性の観点からも利点を有する。
【００１７】
従って、本発明が解決しようとする課題は、内因性ミオイノシトール生合成経路を持たない宿主微生物に対し、有意に改善されたミオイノシトール及び関連する誘導体の生産能を付与することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
前記のように、これまでのいずれの研究も、ミオイノシトール生合成反応においてイノシトール‐１‐リン酸合成酵素が律速反応を担うことを示唆してきた。また、いずれの研究も、イノシトールモノフォスファターゼ活性に特別の注意を払うことはなかった。
【００１９】
しかしながら、驚くべきことに、本発明者らは、内因性ミオイノシトール生合成経路を持たない宿主微生物内にミオイノシトール生合成経路を導入して得られる形質転換体では、イノシトールモノフォスファターゼ活性が重大な役割を持つことを発見した。予期せぬことに、イノシトールモノフォスファターゼ活性を強化することにより、そのような形質転換体のミオイノシトール生産能が大幅に向上した。更に、本発明者らは、そのような形質転換体の培養物中に新規のミオイノシトール誘導体を発見した。
従って、本発明の第１の局面は：
（１）ミオイノシトール又はミオイノシトール誘導体の製造方法であって、以下の工程：
１）  内因性イノシトール‐１‐リン酸合成酵素を発現しない微生物の形質転換体であって、少なくとも該形質転換体内に発現可能に導入されたイノシトール‐１‐リン酸合成酵素をコードする外来遺伝子を含み、且つ該形質転換体内での機能的なイノシトールモノフォスファターゼの過剰生産又はイノシトールモノフォスファターゼの活性化を誘導する遺伝子組換又は変異を有する前記形質転換体を用意する工程；及び
２）  前記形質転換体の生育及び／又は維持に適した条件下で、該形質転換体と該形質転換体によりミオイノシトールに変換され得る炭素源を接触させる工程を含む、前記製造方法である。
より特定的には、内因性イノシトール‐１‐リン酸合成酵素を発現しない微生物内に発現可能に導入されたイノシトール‐１‐リン酸合成酵素をコードする外来遺伝子を有する形質転換体を用いたミオイノシトール又はミオイノシトール誘導体の製造方法において、前記形質転換体が、機能的なイノシトールモノフォスファターゼの過剰生産又はイノシトールモノフォスファターゼの活性化を誘導する遺伝子組換又は変異を有する形質転換体であることを特徴とする、前記製造方法である。
【００２０】
前記（１）の培養物中に生産されたミオイノシトール誘導体は新規化合物であり、当該誘導体ではグルコースとミオイノシトールがβ１→４結合していた。従って、本発明の一態様は：
（２）前記ミオイノシトール誘導体が、下記の構造式：
【化１】
0005563143.tif 000002
で示される化合物である、上記（１）に記載の製造方法である。
【００２１】
合成生物学的手法の適用及び発酵生産における原核微生物、特に大腸菌の利点は既に述べた。従って、本発明の好適な態様は：
（３）前記内因性イノシトール‐１‐リン酸合成酵素を発現しない微生物が原核生物である、上記（１）又は（２）に記載の製造方法；
（４）前記内因性イノシトール‐１‐リン酸合成酵素を発現しない微生物が、内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を有する微生物である、上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の製造方法；
（５）前記内因性イノシトール‐１‐リン酸合成酵素を発現しない微生物が、大腸菌、バチルス属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ザイモモナス属細菌からなる群から選択される細菌である、上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の製造方法；及び
（６）前記細菌が大腸菌である、上記（５）に記載の製造方法、を含む。
【００２２】
宿主微生物が内因性イノシトールモノフォスファターゼ活性を有しているか否かに関わらず、該細胞内でイノシトールモノフォスファターゼを過剰生産させることで、該細胞のイノシトールモノフォスファターゼ活性を強化できる。様々な公知の技術を適用して細胞にイノシトールモノフォスファターゼを過剰生産させることができる。従って、本発明は以下の態様：
（７）前記イノシトールモノフォスファターゼの過剰生産が、前記微生物に対して、
ａ）  外来イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を導入する、
ｂ）  内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子のコピー数を増加させる、
ｃ）  内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域に変異を導入する、
ｄ）  内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域を高発現誘導性外来調整領域で置換する、又は
ｅ）  内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域を欠失させることにより誘導される、上記（１）ないし（６）のいずれかに記載の製造方法；及び
（８）前記イノシトールモノフォスファターゼの過剰生産が、前記微生物に対して外来イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を導入することにより誘導される、上記（７）に記載の製造方法、を含む。
【００２３】
また、宿主細胞が内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を有している場合は、以下の態様によっても該細胞のイノシトールモノフォスファターゼ活性を強化できる。
（９）前記イノシトールモノフォスファターゼの活性化が、前記微生物に対して、
ｆ）  内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子に変異を導入する、
ｇ）  内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の一部又は全部を置換する、
ｈ）  内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の一部を欠失させる、
ｉ）  イノシトールモノフォスファターゼ活性を低下させる他のタンパク質を減少させる、又は
ｊ）  イノシトールモノフォスファターゼ活性を低下させる化合物の生成を減少させることにより誘導される、上記（１）ないし（６）のいずれかに記載の製造方法。
【００２４】
本発明のミオイノシトールの発酵生産においては、イノシトール‐１‐リン酸合成酵素の基質であるグルコース‐６‐リン酸の生成に適した化合物を含んだ炭素源を培養基材として用いることが好適である。さらに、本発明の製造方法は、当該炭素源との接触下で生育及び／又は維持された前記形質転換体の培養物からミオイノシトール又はミオイノシトール誘導体を分離する追加の工程を含んでよい。従って、本発明の更なる好適な態様は：
（１０）前記炭素源が、前記形質転換体内でグルコース‐６‐リン酸へと変換され得る化合物を含む上記（１）ないし（９）のいずれかに記載の製造方法；
（１１）前記炭素源が、Ｄ‐グルコース、スクロース、オリゴ糖、多糖、でんぷん、セルロース、米ぬか、廃糖密、及びＤ‐グルコースを含有するバイオマスからなる群から選択される１つ以上である、上記（１０）に記載の製造方法；及び
（１２）更に、前記炭素源との接触下で生育及び／又は維持された前記形質転換体の培養物中に蓄積したミオイノシトール又はミオイノシトール誘導体を分離する工程を含む、上記（１）ないし（１１）のいずれかに記載の製造方法、を含む。
【００２５】
また、本発明は、前記ミオイノシトールの製造方法に用いるための形質転換体も意図する。従って、本発明の第２の局面は：
（１３）内因性イノシトール‐１‐リン酸合成酵素を発現しない微生物の形質転換体であって、少なくとも該形質転換体内に発現可能に導入されたイノシトール‐１‐リン酸合成酵素をコードする外来遺伝子を含み、且つ該形質転換体内での機能的なイノシトールモノフォスファターゼの過剰生産又はイノシトールモノフォスファターゼの活性化を誘導する遺伝子組換又は変異を有する前記形質転換体である。
より特定的には、内因性イノシトール‐１‐リン酸合成酵素を発現しない微生物内に発現可能に導入されたイノシトール‐１‐リン酸合成酵素をコードする外来遺伝子を有する形質転換体において、機能的なイノシトールモノフォスファターゼの過剰生産又はイノシトールモノフォスファターゼの活性化を誘導する遺伝子組換又は変異を有することを特徴とする、前記形質転換体である。
【００２６】
また、本発明の第１の局面について記載した態様は、本発明の第２の局面についても当てはまる。それらの態様は：
（１４）前記内因性イノシトール‐１‐リン酸合成酵素を発現しない微生物が原核生物である、上記（１３）に記載の形質転換体；
（１５）前記内因性イノシトール‐１‐リン酸合成酵素を発現しない微生物が、内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を有する微生物である、上記（１３）又は（１４）に記載の形質転換体；
（１６）前記内因性イノシトール‐１‐リン酸合成酵素を発現しない微生物が、大腸菌、バチルス属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ザイモモナス属細菌からなる群から選択される細菌である、上記（１３）ないし（１５）のいずれかに記載の形質転換体；
（１７）前記細菌が大腸菌である、上記（１６）に記載の形質転換体；
（１８）前記イノシトールモノフォスファターゼの過剰生産が、前記微生物に対して、
ａ）  外来イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を導入する、
ｂ）  内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子のコピー数を増加させる、
ｃ）  内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域に変異を導入する、
ｄ）  内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域を高発現誘導性外来調整領域で置換する、又は
ｅ）  内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域を欠失させる、
ことにより誘導される、上記（１３）ないし（１７）のいずれかに記載の形質転換体；
（１９）前記イノシトールモノフォスファターゼの過剰生産が、前記微生物に対して外来イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を導入することにより誘導される、上記（１８）に記載の形質転換体；及び
（２０）前記イノシトールモノフォスファターゼの活性化が、前記微生物に対して、
ｆ）  内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子に変異を導入する、
ｇ）  内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の一部又は全部を置換する、
ｈ）  内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の一部を欠失させる、
ｉ）  イノシトールモノフォスファターゼ活性を低下させる他のタンパク質を減少させる、
ｊ）  イノシトールモノフォスファターゼ活性を低下させる化合物の生成を減少させる、
ことにより誘導される、上記（１３）ないし（１７）のいずれかに記載の形質転換体、を含む。
【００２７】
本発明の第３の局面は、前記形質転換体の培養物中に生産されることが見出された、新規ミオイノシトール誘導体である。従って、本発明は：
（２１）下記の構造式：
【化２】
0005563143.tif 000003
で示される化合物である。
【００２８】
更に、本発明の新規ミオイノシトール誘導体は、β‐グリコシド結合を加水分解する反応を触媒できる酵素（ＥＣ  ３．２．１．２１など）により、容易にグルコースとミオイノシトールに分解されることも確認された。当該酵素分解は、上記（１）で得られた培養物を当該酵素で直接処理すること、当該培養物の粗精製物を当該酵素で処理すること、或いは単離した本発明のミオイノシトール誘導体を当該酵素で処理することのいずれによっても達成できる。従って、本発明の第４の局面は：
（２２）ミオイノシトールの製造方法であって、上記（２１）のミオイノシトール誘導体を、β‐グリコシド結合を加水分解する反応を触媒できる酵素により分解し、ミオイノシトールを生成させることを特徴とする、前記方法である。
【００２９】
更に、本発明は、本発明の新規ミオイノシトール誘導体を含む組成物を意図する。例えば、ミオイノシトールは、栄養食品、飼料、医薬品等の成分として広範に利用されている。しかしながら、環境中には、ミオイノシトールを資化する、酵母、バシラス属細菌及び腸内細菌等が存在する。従って、ミオイノシトールを栄養食品、飼料、医薬品等のための組成物として利用する際には、ミオイノシトールが、その生理的作用を発揮することが求められるときまで、前記のミオイノシトール資化性細菌等から保護されることが好ましい。しかるに、本発明の第５は：
（２３）上記（２１）のミオイノシトール誘導体を含む組成物である。
【発明の効果】
【００３０】
本発明によれば、微生物培養技術による工業的ミオイノシトール生産の効率化が達成できる。また、本発明では新規なミオイノシトール誘導体が提供される。本発明の新規なミオイノシトール誘導体は容易にミオイノシトールに変換されるが、ミオイノシトールを資化する微生物等に対して抵抗性である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ＩＮＯ１遺伝子のコード領域を示す（配列番号１）。
【図２】ｓｕｈＢ遺伝子のコード領域を示す（配列番号３）。
【図３】本発明のミオイノシトール誘導体の生産例を示す。図中、矢印は、本発明のミオイノシトール誘導体を含む画分を示す。ＫＳ−Ｇ（ガードカラム）、Ｓｕｇａｒ  ＫＳ−８０１及びＳｕｇａｒ  ＫＳ−８０２（いずれも商品名、昭和電工株式会社製）を連結したＨＰＬＣ（移動相：水、カラム温度：７０℃、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、検出器：ＲＩ）で分析した結果である。
【図４】本発明のミオイノシトール誘導体の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図５】本発明のミオイノシトール誘導体の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
【図６】本発明のミオイノシトール誘導体のβ‐グルコシダーゼによる分解例を示す。Ｓｈｏｄｅｘ  Ａｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２Ｐ−５０  ４Ｅ（商品名、昭和電工株式会社製）を用いたＨＰＬＣ（移動相：水／アセトニトリル＝２５／７５、カラム温度：４０℃、流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ、検出器：ＲＩ）による分析結果である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明の課題は、内因性ミオイノシトール生合成経路を持たない宿主微生物内にミオイノシトール生合成経路を導入して得られる形質転換体中で、つまり、内因性イノシトール‐１‐リン酸合成酵素を発現しない宿主微生物に当該酵素の外来遺伝子を導入した形質転換体中で、イノシトールモノフォスファターゼ活性を強化することにより解決される。なお、本明細書において、「外来」ないし「外来性」という用語は、形質転換前の宿主微生物が、本発明により導入されるべき遺伝子を有していない場合、その遺伝子によりコードされる酵素を実質的に発現しない場合、及び異なる遺伝子により当該酵素のアミノ酸配列をコードしているが、形質転換後に匹敵する内因性酵素活性を発現しない場合において、本発明に基づく遺伝子ないし核酸配列を宿主に導入することを意味するために用いられる。
【００３３】
前述のように、本発明の宿主微生物の、「内因性イノシトール‐１‐リン酸合成酵素を発現しない」との特性は、該宿主細胞内にミオイノシトール生合成経路を新たに構築（つまり、既存の内因性経路の影響がない。）することを可能にするので、合成生物学的手法の適用において極めて魅力的である。例示される原核微生物は：エッシェリシア、シュードモナス、バチルス、ゲオバチルス、メタノモナス、メチロバシラス、メチロフィリウス、プロタミノバクター、メチロコッカス、コリネバクテリウム、ブレビバクテリウム、ザイモモナスおよびリステリア属の細菌である。工業的発酵生産において好適な原核微生物の非限定的な例示は、大腸菌、バチルス属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ザイモモナス属細菌を含む。大腸菌は、その迅速な生育能力や発酵管理の容易さ故に特に好ましい本発明の宿主微生物の例である。
【００３４】
また、本発明の宿主細胞として利用できる細胞株は、通常の意味での野生型であってよく、或いは、栄養要求性変異株、抗生物質耐性変異株であってもよい。更に、本発明の宿主細胞として利用できる細胞株は、上記のような変異に関する各種マーカー遺伝子を有するように既に形質転換されていてもよい。これらの変異や遺伝子は、本発明の形質転換体の作製・維持・管理に有益な性質を提供し得る。好ましくは、クロラムフェニコール、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン等の抗生物質に耐性を示す株を用いることにより、本発明のミオイノシトール及びミオイノシトール誘導体の生産を簡便に行うことができる。
【００３５】
合成生物学を指向する本発明においては、宿主細胞において新たなミオイノシトール生合成経路を構築するために、上記の内因性イノシトール‐１‐リン酸合成酵素を発現しない宿主微生物に対して外来イノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子を導入する。イノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子は公知であり（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏs．ＡＢ０３２０７３、ＡＦ０５６３２５、ＡＦ０７１１０３、ＡＦ０７８９１５、ＡＦ１２０１４６、ＡＦ２０７６４０、ＡＦ２８４０６５、ＢＣ１１１１６０、Ｌ２３５２０、Ｕ３２５１１）、そのいずれも本発明の目的に使用することができる。特に、酵母由来のＩＮＯ１遺伝子（配列番号１）は、よく知られているイノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子の例であり、本発明においても好適に使用することができる。但し、本発明に利用できるイノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子は酵母由来のものに限られず、他の真核微生物やそれ以外の生物に由来するものであっても、或いは人工的に合成したものであっても、前記宿主微生物細胞内で実質的なイノシトール‐１‐リン酸合成酵素活性を発現できるものであればよい。
【００３６】
従ってまた、本発明の目的に利用できるイノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子は、前記宿主微生物細胞内で実質的なイノシトール‐１‐リン酸合成酵素活性を発現できるものであれば、自然界で発生し得るすべての変異や、人工的に導入された変異及び修飾を有していてもよい。例えば、特定のアミノ酸をコードする種々のコドンには余分のコドン（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）が存在することが知られている。そのため本発明においても同一のアミノ酸に最終的に翻訳されることになる代替コドンを利用してよい。つまり、遺伝子コードは縮重しているので、ある特定のアミノ酸をコードするのに複数のコドンを使用でき、そのためアミノ酸配列は任意の１セットの類似のＤＮＡオリゴヌクレオチドでコードされ得る。そのセットの唯一のメンバーだけが天然型酵素の遺伝子配列に同一であるが、ミスマッチのあるＤＮＡオリゴヌクレオチドでさえ適切な緊縮条件下（例えば、３ｘＳＳＣ、６８℃でハイブリダイズし、２ｘＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ及び６８℃で洗浄）で天然型配列にハイブリダイズでき、天然型配列をコードするＤＮＡを同定、単離でき、更にそのような遺伝子も本発明において利用できる。特に、ほとんどの生物は特定のコドン（最適コドン）のサブセットを優先的に用いることが知られているので（Ｇｅｎｅ、Ｖｏｌ．１０５、ｐｐ．６１−７２、１９９１等）、宿主微生物に応じて「コドン最適化」を行うことは本発明においても有用であり得る。
【００３７】
しかして、本発明においても、イノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子が「発現カセット」として宿主微生物細胞内に導入されることにより、より安定的で高レベルのイノシトール‐１‐リン酸合成酵素活性が得られることを当業者は理解するであろう。本明細書において、「発現カセット」とは、発現対象の核酸または発現対象の遺伝子に機能的に結合された転写および翻訳をレギュレートする核酸配列を含むヌクレオチドを意味する。典型的に、本発明の発現カセットは、コード配列から５’上流にプロモーター配列、３’下流にターミネーター配列、場合により更なる通常の調節エレメントを機能的に結合された状態で含み、そのような場合に、発現対象の核酸または発現対象の遺伝子が宿主微生物に「発現可能に導入」される。
【００３８】
プロモーターは、構造性プロモーターであるか調節プロモーターであるかに拘わらず、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合させ、ＲＮＡ合成を開始させるＤＮＡ配列と定義される。強いプロモーターとはｍＲＮＡ合成を高頻度で開始させるプロモーターであり、本発明においても好適に使用される。ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ又はＴＲＣ系、λファージの主要オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、解糖系酵素（例えば、３−ホスホグリセレートキナーゼ、グリセルアルデヒド‐３‐リン酸脱水素酵素）、グルタミン酸デカルボキシラーゼＡ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼに対するプロモーター等が、その宿主細胞の性質等に応じて利用可能である。プロモーターおよびターミネーター配列のほかに、他の調節エレメントの例として挙げられ得るのは、選択マーカー、増幅シグナル、複製起点などである。好適な調節配列については、例えば、”Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５”、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９０）に記載されている。
【００３９】
上記で説明した発現カセットは、例えば、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、ＩＳエレメント、ファスミド、コスミド、又は線状もしくは環状のＤＮＡ等から成るベクターに組み入れて、宿主微生物中に挿入される。プラスミドおよびファージが好ましい。これらのベクターは、宿主微生物中で自律複製されるものでもよいし、また染色体により複製されてもよい。好適なプラスミドは、例えば、大腸菌のｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＨＥ１９．２、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ−ＩＩＩ１１３−Ｂ１、λｇｔ１１又はｐＢｄＣＩ；桿菌のｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４又はｐＢＤ２１４；コリネバクテリウム属のｐＳＡ７７又はｐＡＪ６６７などである。これらの他にも使用可能なプラスミド等は、”Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ”、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１９８５に記載されている。ベクターへの発現カセットの導入は、適当な制限酵素による切り出し、クローニング、及びライゲーションを含む慣用の方法によって可能である。
【００４０】
上記ようにして本発明の発現カセットを有するベクターが構築された後、該ベクターを宿主微生物に導入する際に適用できる手法として、例えば、共沈、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクションなどの慣用のクローニング法およびトランスフェクション法が使用される。それらの例は、「分子生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｆ．  Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｐｕｂｌ．Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９７、またはＳａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験室マニュアル」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９に記載されている。
【００４１】
驚くべきことに、本発明者らは、内因性ミオイノシトール生合成経路を持たない宿主微生物内にミオイノシトール生合成経路を導入して得られる形質転換体では、イノシトールモノフォスファターゼ活性が重大な役割を持つことを発見した。前記のように、これまでのいずれの研究も、イノシトールモノフォスファターゼ活性に特別の注意を払うことはなかった。しかしながら、予期せぬことに、イノシトールモノフォスファターゼ活性を強化することにより、そのような形質転換体のミオイノシトール生産能が大幅に向上した。また、そのような形質転換体は、実質的な量で本発明のミオイノシトール誘導体を生産していた。
【００４２】
従って、本発明の一態様は、前記したイノシトール‐１‐リン酸合成酵素をコードする外来遺伝子により形質転換された宿主微生物細胞において、イノシトールモノフォスファターゼを過剰生産させることを包含する。
【００４３】
本発明で意図される、イノシトールモノフォスファターゼとは、イノシトール‐１‐リン酸に対して高い基質特異性を示すものの他にも、広範な基質に対して作用し得るリン酸モノエステル加水分解酵素活性を示すことにより、イノシトール‐１‐リン酸を実質的に加水分解化できるタンパク質を含む。典型的なイノシトールモノフォスファターゼとしては、例えば、イノシトール‐１‐モノフォスファターゼが知られており、多くの生物由来の当該遺伝子（ｓｕｈＢ遺伝子）はＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏs．ＺＰ＿０４６１９９８８、ＹＰ＿００１４５１８４８等で公表されている。特に、大腸菌由来のｓｕｈＢ遺伝子（配列番号３：ＡＡＣ７５５８６（ＭＧ１６５５））の使用は、大腸菌を宿主細胞とする場合に便利である。
【００４４】
イノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子について記載した、変異や修飾及びコドン最適化、並びに発現カセット、プロモーター等のレギュレーター配列及びプラスミド等とそれによる形質転換の説明は、全て本発明のイノシトールモノフォスファターゼ遺伝子について当てはまることを当業者は容易に理解するであろう。従って、本発明におけるイノシトールモノフォスファターゼの過剰生産は、外来イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の発現カセットにより前記宿主微生物を形質転換することにより達成し得ることも明らかである。
【００４５】
更にまた、多くの微生物細胞は本発明で意図されるイノシトールモノフォスファターゼ活性を発現している（つまり、イノシトールモノフォスファターゼ活性をコードする内因性遺伝子を有している）と考えられる。従って、本発明におけるイノシトールモノフォスファターゼの過剰生産は、内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子のコピー数を増加させる；内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域に変異を導入する；内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域を高発現誘導性外来調整領域で置換する；及び内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域を欠失させることによっても誘導し得る。具体的にイノシトールモノフォスファターゼの過剰発現を達成するためには、内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を含むか、或いは当該内因性遺伝子のコード化領域に好適な調整領域を付加した発現カセットを含む構築物により前記宿主微生物を形質転換して、当該形質転換体内での当該イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子のコピー数を元の宿主細胞に比べて実質的に増加させるか、内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を有する元の宿主細胞に関して、染色体の変異、付加および欠失を公知の遺伝子組換え技術により実施するか、あるいは、変異剤などを用いて染色体にランダムに変異導入を行うことで達成することができる。イノシトールモノフォスファターゼの過剰生産の確認には、公知のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析法などを用いることができる
【００４６】
更に、イノシトールモノフォスファターゼ活性を強化するための本発明の別の態様は、前記したイノシトール‐１‐リン酸合成酵素をコードする外来遺伝子により形質転換された宿主微生物細胞において、イノシトールモノフォスファターゼの活性化を誘導することを含む。その目的のために、１）内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子に変異を導入する、２）内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の一部又は全部を置換する、３）内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の一部を欠失させる、４）イノシトールモノフォスファターゼ活性を低下させる他のタンパク質を減少させる、及び／又は５）イノシトールモノフォスファターゼ活性を低下させる化合物の生成を減少させる、といった手法を例示できる。
【００４７】
上記イノシトールモノフォスファターゼ活性を強化するための１）〜５）の手法に関して、具体的には、イノシトールモノフォスファターゼの遺伝子に変異、付加あるいは欠失を施した後に当該遺伝子をコードするイノシトールモノフォスファターゼの活性を評価することで、イノシトールモノフォスファターゼ活性の強化されたイノシトールモノフォスファターゼを得ることができる。
【００４８】
上記のようにして得られる形質転換体、例えば、外来イノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子の発現カセット及びイノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の発現カセットを有するベクター（各々の発現カセットは、別個の又は同じベクター上に配置されてよい。）によりトランスフェクトされた形質転換体は、本発明のミオイノシトール及びミオイノシトール誘導体生産のために、前記形質転換体の生育及び／又は維持に適した条件下で培養及び維持される。各種の宿主微生物細胞に由来する形質転換体のための好適な培地組成、培養条件、培養時間は当業者に公知である。
【００４９】
培地は、1つ以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン、及び場合により微量元素ないしビタミン等の微量成分を含む天然、半合成、合成培地であってよい。しかし、使用する培地は、培養すべき形質転換体の栄養要求を適切に満たさなければならないことは言うまでもない。更に、前記形質転換体と該形質転換体によりミオイノシトール及びミオイノシトール誘導体に変換され得る炭素源を接触させるために、本発明の培地は、究極的にミオイノシトール生産の基質として利用可能な炭素源、すなわち形質転換体内でグルコース‐６‐リン酸へと変換され得る化合物を含有すべきである。炭素源は、Ｄ‐グルコース、スクロース、オリゴ糖、多糖、でんぷん、セルロース、米ぬか、廃糖密であり得、更にＤ‐グルコースを含有するバイオマスであり得る。好適なバイオマスとしては、トウモロコシ分解液やセルロース分解液を例示できる。また、培地は、形質転換体が有用な付加的形質を発現する場合、例えば抗生物質への耐性マーカーを有する場合、対応する抗生物質を含んでいてよい。それにより、発酵中の雑菌による汚染リスクが低減される。
【００５０】
上記、セルロースや多糖類などの炭素源を宿主微生物が資化できない場合は、当該宿主微生物に外来遺伝子を導入するなどの公知の遺伝子工学的手法を施すことで、これら炭素源を使用したミオイノシトール生産に適応させることができる。外来遺伝子としては、例えば、セルラーゼ遺伝子やアミラーゼ遺伝子などを挙げることができる。
【００５１】
培養は、バッチ式であっても連続式であってもよい。また、いずれの場合にも、培養の適切な時点で追加の前記炭素源等を補給する形式であってもかまわない。更に、培養は、好適な温度、酸素濃度、ｐＨ等を維持しながら継続されるべきである。一般的な微生物宿主細胞に由来する形質転換体の好適な培養温度は、通常１５℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜３７℃の範囲である。宿主微生物が好気性の場合、発酵中の適切な酸素濃度を確保するために振盪（フラスコ培養等）、攪拌／通気（ジャー・ファーメンター培養等）を行う必要がある。それらの培養条件は、当業者にとって容易に設定可能である。
【００５２】
上記の培養物からミオイノシトールを精製する方法は当業者に公知である。原核微生物宿主細胞の形質転換体の場合、ミオイノシトールは培養上清中または菌体内に存在するが、必要であれば培養菌体から抽出してもよい。培養菌体から抽出する場合、例えば、培養物を遠心分離して上清と菌体を分離し、ホモジナイザーを利用しつつ、界面活性剤、有機溶媒、酵素等により菌体を破壊し得る。培養上清、及び場合により菌体抽出液からもミオイノシトールを精製する方法としては、ｐＨ調整等によるタンパク質沈澱を利用した除タンパク処理、活性炭を利用した不純物の吸着による除去、イオン交換樹脂等を利用したイオン性物質の吸着による除去を実施した後に、乾燥して得られた固体を、例えば水−エタノール系から再結晶することが挙げられる。勿論、製品により目的とされる純度に応じて一部の工程を削除したり、或いはクロマトグラフィーなどの追加の精製工程を実施したりしてもよいことは言うまでもない。
【００５３】
更にまた、適切な条件で培養された上記培養物からは、本発明の新規なミオイノシトール誘導体も得ることができる。典型的な本発明のミオイノシトール誘導体は、１−４−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌと称され、以下の構造を有する。
【化３】
0005563143.tif 000004
【００５４】
上記のミオイノシトール誘導体は、本発明の形質転換体を、比較的多量のミオイノシトール（例えば、約３０〜１２０ｇ／Ｌ程度）を生成させ得る培地内で培養することにより生産させることが有利である。すなわち、通常、本発明の形質転換体は、本発明のミオイノシトール誘導体に比べて、ミオイノシトールを多量に生産する。しかしながら、本発明の形質転換体は、下記の実施例で示すように、培地に添加されたグルコースの量に応じて、より多くのミオイノシトールのみならずミオイノシトール誘導体も生産することができるので、そのような培養条件は、本発明のミオイノシトール誘導体を得るのにも適している。
【００５５】
本発明のミオイノシトール誘導体は、ミオイノシトールについて前記した方法に従うことで培養物から粗精製することができる。例えば、本発明のミオイノシトール誘導体は、培養上清を活性炭処理し、次にイオン交換樹脂（陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂）で処理することで粗精製することができる。
【００５６】
しかしながら、上記の粗精製物は、本発明のミオイノシトール誘導体とミオイノシトールの両方を含んでいるので、本発明のミオイノシトール誘導体を単離するには、そこからミオイノシトールを分離する必要がある。例えば、前記の粗精製した培養液が多量のミオイノシトールを含んでいるような場合には、当該粗精製液を減圧濃縮することでミオイノシトールの一部を析出させて、濾過などにより除去することができる。更に、当該濾液にエタノールを添加すると残りのミオイノシトールを析出（晶析）させることができる。従って、エタノールによる晶析を適宜繰り返せば、所望の純度の本発明のミオイノシトール誘導体を得ることができる。或いは、晶析とともに又は単独で、クロマトグラフィー、例えば、ＳＵＧＡＲ  ＫＳ−８０１及びＳＵＧＡＲ  ＫＳ−８０２、並びにＳｈｏｄｅｘ  Ａｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２Ｐ−５０  ４Ｅ（いずれも商品名で、昭和電工株式会社製。）を用いた分取ＨＰＬＣ等により、本発明のミオイノシトール誘導体とミオイノシトールを別々に得ることができる。
【００５７】
本発明のミオイノシトール誘導体は、β１→４結合を加水分解する能力を有するβ‐グルコシダーゼにより容易に分解されて、対応するモル数のグルコースとミオイノシトールを生成することも確認された。本発明のミオイノシトール誘導体をβ‐グルコシダーゼ等により酵素的に分解するには、例えば水や緩衝液（酢酸緩衝液、燐酸緩衝液等）による本発明のミオイノシトール誘導体の溶液に対して適当量の酵素を添加し、その酵素反応に適切な条件及び時間にて、該溶液をインキュベーションすればよい。そのような目的において有利に使用できるβ‐グルコシダーゼは市販されており、そのいずれも使用できるが、例えばアスペルギルス属のカビ由来のＣｅｌｌｏｂｉａｓｅ（ＳＩＧＭＡ社）を利用すればよい。添加する酵素の量は、製造元の指示を参考にしながら、本発明のミオイノシトール誘導体の溶液中の濃度等に基づいて、適宜決定すればよい。また、反応時のｐＨは、一般的にはｐＨ４．０〜９．０の範囲であるが、要は、使用する酵素の至適ｐＨとすればよい。また、反応時の温度も、使用する酵素の至適温度範囲とすればよく、例えば、約２０〜５０℃程度の範囲とすればよい。反応時間は、本発明のミオイノシトール誘導体の分解率を定量的に追跡しつつ、ほぼ全ての本発明のミオイノシトール誘導体がミオイノシトールに変換された時点とすればよい。
【００５８】
なお、前記のように、本発明の形質転換体は、典型的な培養条件下では、本発明のミオイノシトール誘導体をミオイノシトールとともに、ミオイノシトールに比べて有意に少ない量で生産するから、むしろ、当該形質転換体の培養物をそのまま前記酵素で処理するか、又は当該培養物を活性炭処理程度で粗精製した後に酵素処理することにより、本発明のミオイノシトール誘導体をミオイノシトールへと変換して、ミオイノシトールの生産性を更に高めることができる。或いは、本発明のミオイノシトール誘導体を単離した後に、β‐グルコシダーゼにより処理して、ミオイノシトールを得てもよい。その際に、本発明のミオイノシトール誘導体は、ミオイノシトールを資化することができる偏在菌（酵母、枯草菌、腸内細菌）に対して抵抗性であるから、使用まで（又は、生理作用を発現するときまで）、ミオイノシトールを本発明のミオイノシトール誘導体の形態に保っておくことの利点を当業者は理解するであろう。
【００５９】
従って、医薬品、食品、化粧品等の有効成分や機能性成分として用いることも、本発明のミオイノシトール誘導体の潜在的な用途の一つである。つまり、前記のとおりにミオイノシトールは多くの高等動物にとって必要不可欠な物質であるため、栄養食品、飼料、医薬品等の成分として広範に利用されている。例えば、ミオイノシトールは、脂肪やコレステロール類の代謝において重要な役割を担っていることが知られており、特に高コレステロール血症等の予防や治療に有効とされている。そして、本発明のミオイノシトール誘導体は酵素的に分解されて容易にミオイノシトールを生成することから、本発明のミオイノシトール誘導体が生体内で酵素的に分解されてミオイノシトールを産生することを期待して、本発明のミオイノシトール誘導体自体を医薬品等に添加することは、極めて興味深い本発明の利用態様である。
【００６０】
例えば、本発明のミオイノシトール誘導体を有効成分として含有する医薬組成物は、錠剤、粉末、顆粒、カプセル、糖衣錠、液剤、又はシロップ剤等の経口投与形態とすることができ、或いは注射剤、点滴剤、坐剤、経皮又は吸収剤などの非経口投与形態とすることも可能である。これらの製剤に応じた各種担体が使用される。たとえば、経口剤の担体としては、賦形剤（例えば、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニトール、エリスリトール、キシリトール、マルチトール、ソルビトール、各種デンプン、結晶セルロース、粉末セルロース等）、結合剤（例えば、デキストリン、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、ポビドン、ポリビニルアルコール、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルメロースナトリウム等）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク等）、流動性促進剤（例えば、含水二酸化ケイ素、軽質無水ケイ酸、酸化チタン等）、着色剤を挙げることができる。
【００６１】
医薬組成物の投与量は特に限定されないが、例えば、一般的には成人１日あたり０．０１〜２０００ｍｇの有効成分を１回から数回に分けて投与することができる。投与頻度は月１回から連日投与が可能であり、好ましくは１回／週から３回／週、又は５回／週、若しくは連日投与である。１日投与量、投与期間、及び投与頻度も患者の年齢、体重、身体的健康度、及び治療すべき疾患やその重症度などにより、共に適宜増減させてよい。
【００６２】
以上の説明を与えられた当業者は、本発明を十分に実施できる。以下、更なる説明の目的として実施例を与え、従って、本発明は当該実施例に限定されるものではない。なお、本明細書において得に断りのない限りヌクレオチド配列は５’から３’方向に向けて記載される。
【実施例】
【００６３】
実施例１：プラスミドの構築
１−a）イノシトールモノフォスファターゼ発現カセット
大腸菌株Ｗ３１１０（ＮＢＲＣ  １２７１３）をＬＢ培地中（２ｍｌ）で３７℃にて振盪培養した。培養終了後、培養液から菌体を回収し、Ｎｕｃｌｅｏ  Ｓｐｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ（製品名、ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ社製）を使用してゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に用い、以下のプライマーによりＰＣＲ増幅し（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（製品名、タカラバイオ製）  反応条件：９８℃  １０ｓｅｃ，５５℃  ５ｓｅｃ，７２℃  ２０ｓｅｃ，２８ｃｙｃｌｅ）、ｓｕｈＢ遺伝子のコード領域（配列番号３）をクローニングした。
【化４】
0005563143.tif 000005
得られたｓｕｈＢコード領域は下記配列のプロモーターの下流に転写可能に挿入した。
【化５】
0005563143.tif 000006
すなわち、プラスミドｐＮＦＰ−Ａ５１（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１５１５として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに２０１１年１０月２５日に寄託した。）のマルチクローニングサイトにターミネーター配列及び前記プロモーター配列を挿入した。
導入されたプロモーター配列の下流に上記でクローニングされたｓｕｈＢコード領域をライゲーションして、ｐＮＦＰ−Ａ５４を構築した。構築したｐＮＦＰ−Ａ５４を、塩化カルシウム法（羊土社  遺伝子工学実験ノート  上  田村隆明著、参照）により大腸菌ＡＫＣ−０１６株（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１５１２として、独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに２０１１年４月２０日に寄託した。）にトランスフェクトした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより当該大腸菌の可溶性画分でのイノシトールモノフォスファターゼの高発現を確認した。
【００６４】
１−ｂ）  イノシトール‐１‐リン酸合成酵素発現カセット
単離した酒精酵母の培養液から菌体を回収し、Ｎｕｃｌｅｏ  Ｓｐｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ（製品名、ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ社製）を使用してゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に用い、以下のプライマーによりＰＣＲ増幅し（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（製品名、タカラバイオ製）  反応条件：９８℃  １０ｓｅｃ，５５℃  ５ｓｅｃ，７２℃  ２０ｓｅｃ，２８ｃｙｃｌｅ）、ＩＮＯ１遺伝子のコード領域（配列番号１）をクローニングした。
【化６】
0005563143.tif 000007
得られたｉｎｏ１コード領域は下記配列のプロモーターの下流に転写可能に挿入した。
【化７】
0005563143.tif 000008
すなわち、上記プラスミドｐＮＦＰ−Ａ５１のマルチクローニングサイトにターミネーター配列及び前記プロモーター配列を挿入した。
導入されたプロモーター配列の下流に上記でクローニングされたｉｎｏ１コード領域をライゲーションして、ｐＮＦＰ−Ｄ７８を構築した。構築したｐＮＦＰ−Ｄ７８を、塩化カルシウム法（羊土社  遺伝子工学実験ノート  上  田村隆明著、参照）により大腸菌ＡＫＣ−０１６株（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１５１２として、独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに２０１１年４月２０日に寄託した。）にトランスフェクトした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより当該大腸菌の可溶性画分でのイノシトール‐１‐リン酸合成酵素の高発現を確認した。
【００６５】
１−ｃ）  形質転換のためのプラスミドの構築
ｐＮＦＰ−Ｄ７８をＳａｌＩで消化し、平滑末端化及び５’末端脱リン酸化した。ｐＮＦＰ−Ａ５４中のｓｕｈＢ発現カセットをクローニングして、ｐＮＦＰ−Ｄ７８にライゲーションした。ｐＮＦＰ−Ｄ７８中のＩＮＯ１発現カセットと順方向にｓｕｈＢ発現カセットがライゲーションしていたｐＮＦＰ−Ｇ２２を取得した。
【００６６】
実施例２：ミオイノシトール生産
２−ａ）  発現カセット含有プラスミドでトランスフェクトした形質転換体によるミオイノシトール生産
実施例１の手順に従って構築したプラスミドｐＮＦＰ−Ｇ２２を、大腸菌ＡＫＣ−０１６株（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１５１２として、独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに２０１１年４月２０日に寄託した。）に塩化カルシウム法（羊土社  遺伝子工学実験ノート  上  田村隆明著、参照）を用いてトランスフェクトした。当該形質転換体をＡＫＣ−０１６−Ｇ２２株と命名した。
一方、対照の形質転換は、ＩＮＯ１発現カセットのみを含んだプラスミドｐＮＦＰ−Ｄ７８でトランスフェクトして得、当該対照の形質転換体をＡＫＣ−０１６−Ｄ７８株と命名した。得られた各々の形質転換体を、アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）含有ＬＢプレート上で、３７℃、一日間培養して、コロニーを形成させた。アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢ培地２ｍＬを１５ｍＬ容の試験管に入れ、上記プレートからコロニーを白金耳で植菌し、３７℃で、３〜５時間、ＯＤ（６００ｎｍ）が０．５程度になるまで１８０ｒｐｍで培養を行い、これを本培養のための前培養液とした。
２５０ｍＬ容のＪａｒ培養装置（機種名  バイオＪｒ．８、バイオット製）に、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ/Ｌ又は３０ｇ／Ｌのグルコースと、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含む合成培地（下表）、又はＬＢ培地を１００ｍＬ入れ、２ｍＬの前培養液を添加し本培養（ミオイノシトール生産試験）を行った。培養条件は次のとおり；培養温度  ３０℃；培養ｐＨ  ６．７；アルカリ添加  １０％（重量／容量）アンモニア水；攪拌  １２００ｒｐｍ；通気  ０．１ｖｖｍ。
【表１】
0005563143.tif 000009
上記の培養液を、４℃で、１０，０００ｇ×１０分間遠心分離して上清を回収し、培養上清のミオイノシトール濃度を測定した。具体的に、ＫＳ−Ｇ（ガードカラム）、Ｓｕｇａｒ  ＫＳ−８０１及びＳｕｇａｒ  ＫＳ−８０２（いずれも商品名、昭和電工株式会社製）を連結してＨＰＬＣ（検出器：ＲＩ、カラム温度：７０℃、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ）を行うことで、培養上清中のミオイノシトール濃度を定量した。本発明の形質転換体（ＡＫＣ−０１６−Ｇ２２株）と対照株（ＡＫＣ−０１６−Ｄ７８株）を比較した結果を表２（合成培地）及び表３（ＬＢ培地）に示した。
【表２】
0005563143.tif 000010
【表３】
0005563143.tif 000011
【００６７】
２−ｂ）  発現カセットを染色体上に有する形質転換体によるミオイノシトール生産
本実施例では、更にＩＮＯ１発現カセット及びｓｕｈＢ発現カセットの双方を染色体上に有する形質転換体も作製した（大腸菌ＡＫＣ−０１８株、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１５１４として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに２０１１年１０月２５日に寄託した。）。
一方、対照の形質転換は、ＩＮＯ１発現カセットのみを染色体上に組み込んで得た（大腸菌ＡＫＣ−０１７株、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１５１３として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに２０１１年１０月２５日に寄託した。）。
各々の形質転換体を、アンピシリンを含まないＬＢ培地で前培養し、また、アンピシリンを含ませず且つグルコースの添加量を１０ｇ／Ｌ又は３０ｇ／Ｌとした以外は実施例２−ａ）と同じ合成培地及びＬＢ培地を用いて、当該形質転換体により実施例２−ａ）と同様の培養条件下でミオイノシトールを生産させた。次いで、実施例２−ａ）と同様の方法により培養上清中のミオイノシトール濃度を定量した。本発明の形質転換体（ＡＫＣ−０１８株）と対照株（ＡＫＣ−０１７株）を比較した結果を表４（合成培地）及び表５（ＬＢ培地）に示した。
【表４】
0005563143.tif 000012
【表５】
0005563143.tif 000013
【００６８】
上記実施例２−ａ）及び２−ｂ）の結果は、大腸菌宿主（対照株）における内因性イノシトールモノフォスファターゼ活性の存在を確認するものの、合成生物学的手法による従来のミオイノシトール生産において当該活性が十分でなかったことを示した。驚くべきことに、当該宿主におけるイノシトールモノフォスファターゼ活性の亢進は、対照と比較しておよそ１．５〜５倍もミオイノシトール生産性を向上させた。更に驚くべきことに、イノシトールモノフォスファターゼ活性が亢進させられた微生物において、ミオイノシトール生産量は仕込みグルコース量に正比例して増加した。このことは、従来の技術常識に反して、合成生物学的手法によるミオイノシトール生産において、イノシトールモノフォスファターゼ活性の重要な役割を実証している。
【００６９】
実施例３：新規ミオイノシトール誘導体
３−ａ）  新規ミオイノシトール誘導体の生産
本実施例では、実施例２−ａ）で得た本発明の形質転換体であるＡＫＣ−０１６−Ｇ２２株による新規ミオイノシトール誘導体の生産を示す。
アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢ培地１００ｍＬを５００ｍＬ容の試験管に入れ、ＡＫＣ−０１６−Ｇ２２株を培養したプレートからコロニーを白金耳で植菌し、３７℃で、３〜５時間、ＯＤ（６００ｎｍ）が０．５程度になるまで１８０ｒｐｍで培養を行い、これを本培養のための前培養液とした。
１０Ｌ容のＪａｒ培養装置（丸菱バイオエンジ社製）に、１５ｇ／Ｌのグルコースと、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含む下記の合成培地（表６）を３Ｌ入れ、６０ｍＬの前培養液を添加し本培養を行った。培養条件は次のとおり培養温度  ３２℃；培養ｐＨ  ６．０〔下限〕；アルカリ添加  ２８％（重量／容量）アンモニア水；攪拌  ８５０ｒｐｍ；通気  １ｖｖｍ。原料となるグルコースフィード溶液（表７）は、培養液中のグルコース濃度が０〜５ｇ／Ｌとなるように適宜添加した。
【表６】
0005563143.tif 000014
【表７】
0005563143.tif 000015
培養時間６９．５時間後、上記の培養液の一部を、４℃で、１０，０００ｇ×１０分間遠心分離して上清を回収した。上清を、ＫＳ−Ｇ（ガードカラム）、Ｓｕｇａｒ  ＫＳ−８０１及びＳｕｇａｒ  ＫＳ−８０２（いずれも商品名、昭和電工株式会社製）を連結したＨＰＬＣ（移動相：水、カラム温度：７０℃、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、検出器：ＲＩ）で分析した結果、ミオイノシトール濃度は１０２ｇ／Ｌであった。
一方、本発明の新規ミオイノシトール誘導体（１−４−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ）は、Ｓｈｏｄｅｘ  Ａｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２Ｐ−５０  ４Ｅ（商品名、昭和電工株式会社製）を用いたＨＰＬＣ（移動相：水／アセトニトリル＝２５／７５、カラム温度：４０℃、流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ、検出器：ＲＩ）による分析で、リテンションタイムが１７．４分となり（なお、当該分析時のミオイノシトールのリテンションタイムは１３分であった。）、前記上清中に０．３ｇ／Ｌの濃度で含まれていた。
【００７０】
３−ｂ）  新規ミオイノシトール誘導体の単離
上記のようにして得た培養液の１０００ｍＬを、大型遠心機を用い８，８００ｒｐｍで２０分間遠心後、さらに小型遠心機を用い１３，０００ｒｐｍで５分間遠心した。得られた上清から、０．４５μｍのフィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社  オムニポアメンブレン  型番ＪＨＷＰ０９０２５）を用い、減圧濾過で固形物を濾別した。フィルター濾過後の濾液１０００ｍＬに活性炭白鷺Ａ（商品名、日本エンバイロケミカルズ社製）を５ｇ添加し、スターラーで３０分間撹拌した。その液から、０．４５μｍのフィルターを用い、減圧濾過で活性炭を濾別した。活性炭処理後の濾液に陽イオン交換樹脂（オルガノ社製アンバーライトＩＲ１２０Ｂ  Ｈ＋型）を５００ｍＬ添加し、スターラーで３０分間撹拌した。その液から、０．４５μｍのフィルターを用い、減圧濾過で陽イオン交換樹脂を濾別した。陽イオン交換処理後の濾液に陰イオン交換樹脂（オルガノ社製アンバーライトＩＲＡ９６ＳＢ  ＯＨ−型）を５００ｍＬ添加し、スターラーで３０分間撹拌した。その液から、０．４５μｍのフィルターを用い、減圧濾過で陰イオン交換樹脂を濾別した。
【００７１】
陰イオン交換処理後の濾液１０００ｍＬについて、エバポレータで７０℃、１００ｍｂａｒで水を留去し、４倍に濃縮し２５０ｍＬとした。室温まで自然に冷却した後４℃で保存し、ミオイノシトールを析出させた後、減圧濾過でミオイノシトールを濾別した。濾液１８９ｍＬの組成は、ミオイノシトールが５．８３％、及び本発明のミオイノシトール誘導体が０．１３１％であった（ともに、Ｗ/Ｖ）。室温でこの液にエタノールを１８９ｍＬ添加し、さらにミオイノシトールを析出させた後、減圧濾過でミオイノシトールを濾別した。濾液３７３ｍＬの組成は、ミオイノシトールが１．４１％、及び本発明のミオイノシトール誘導体が０．０６７％であった。更に濾液から、エバポレータ（７０℃、１００ｍｂａｒ）を用いてエタノールを留去し、ミオイノシトールが８．４６％で、本発明のミオイノシトール誘導体が０．４０１％の水溶液６２ｍＬを得た。これにさらに室温でエタノールを１８６ｍＬ添加し、ミオイノシトールを析出させた後、減圧濾過でミオイノシトールを濾別した。濾液２４４ｍＬの組成は、ミオイノシトールが０．３３％、及び本発明のミオイノシトール誘導体が０．１００％であった。濾液から、エバポレータ（７０℃、１００ｍｂａｒ）を用いてエタノールと水を留去し、ミオイノシトールが３．３０％、及び本発明のミオイノシトール誘導体が０．９９８％の溶液を、２４ｍＬを得た。
【００７２】
上記の溶液中に、ミオイノシトール及び本発明のミオイノシトール誘導体とは別の物質（構造は未同定。）であり、両者からの分離が困難な複数の不純物の存在が認められたので、種々の精製方法を検討した結果、酵素処理が有効であった。すなわち、上記のミオイノシトール及び本発明のミオイノシトール誘導体の混合液５００μＬに対して、１５０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）バッファーの３００μＬと、１００ＵＮ／ｍＬのα−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来）の２００μＬを添加し、インキュベーター（ＡＳ  ＯＮＥ  ＳＩ−３００Ｃ）を用いて、反応温度４０℃、１，２００ｒｐｍで撹拌しながら２２時間反応を行った。反応後、ＨＰＬＣ分析により、前記の不純物の１つが分解されたことを確認した。その後、反応液を９９℃のドライブロックバス（ＳＩＢＡＴＡ製  ＢＩ−１２００）で５分間加温し、酵素を失活させた。反応済みの液を遠心分離後、上清を０．４５μｍのフィルターを用い濾過した。濾液を凍結乾燥させた後、水を加え５ｍＬの水溶液とした。この液５００μＬにさらに１５０ｍＭの  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）バッファーの３００μＬと、１００ＵＮ／ｍＬのβ−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ（オリエンタル酵母工業株式会社製、アーモンド由来）の２００μＬを添加し、インキュベーターを用いて反応温度４０℃、１，２００ｒｐｍで撹拌しながら、０．５時間の短時間での反応を行った。反応後、ＨＰＬＣ分析により、もう１つの不純物が分解されたことを確認した。その後、反応液を９９℃のドライブロックバスで５分間加温し、酵素を失活させた。遠心分離後、上清を０．４５μｍのフィルターを用い濾過した。濾液を凍結乾燥させた後、水を加えて、本発明のミオイノシトール誘導体を約０．９９％含む水溶液（２．５ｍＬ）とした。
【００７３】
上記の酵素分解による精製後の水溶液を用いて、１回の打込み量を１０μＬとし、２００回のＨＰＬＣ分取を行った。分取の際のＨＰＬＣ条件は以下のとおりであった：
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  Ａｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２Ｐ−５０  ４Ｅ、
移動相：水／アセトニトリル＝２５／７５
流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
温度：４０℃
検出器：ＲＩ
オートサンプラ：島津ＳＩＬ−２０Ａ形  全量試料注入式
【００７４】
ＨＰＬＣ分取後のサンプルから、エバポレータ（７０℃、１００ｍｂａｒ）によりアセトニトリルを留去し、さらに凍結乾燥により水も留去して、本発明のミオイノシトール誘導体の乾燥固形物を得た（収量：１９ｍｇ）。
【００７５】
３−ｃ）  新規ミオイノシトール誘導体の構造決定
実施例３−ｂ）で分取した化合物を、以下のＮＭＲ分析によって構造決定した。
装置          ：Ａｖａｎｃｅ６００（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｂｉｏｓｐｉｎ社製）
プローブ      ：クライオプローブ（１３Ｃ高感度）
測定温度      ：１８℃（試料劣化防止と１Ｈ−ＮＭＲの際に水シグナルを移動させるため、全て２９１Ｋ（１８℃）とした。）
溶媒：        ：Ｄ２Ｏ（ＡＬＤＲＩＣＨ社製）
内部標準      ：ＴＳＰ
１Ｈ観測周波数：６００．１３ＭＨｚ
１３Ｃ観測周波数：１５０．９２ＭＨｚ
測定結果及びピークの帰属は以下のとおりであった。なお、表中、ピーク番号の「ＧＨ−１」とは、グルコース残基の１位水素であることを示す。また「ＩＨ−１」とは、ミオイノシトール残基の１位水素であることを示す。他も同様である。
【化８】
0005563143.tif 000016
【表８】
0005563143.tif 000017
【表９】
0005563143.tif 000018
また、ピークの帰属は、ＣＯＳＹ、ＣＨ−ＣＯＳＹ、ＨＭＢＣ、Ｊ分解二次元ＮＭＲにより確認した。
【００７６】
３−ｄ）  新規ミオイノシトール誘導体の酵素分解
実施例３−ｂ）で分取した化合物を、アスペルギルス属のカビ由来のβ‐グルコシダーゼである、Ｃｅｌｌｏｂｉａｓｅ（ＳＩＧＭＡ社）により分解した。具体的に、当該化合物を、４００μＬの１５０ｍＭ  Ｂｉｓ‐Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ＝７．０）に、６ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。当該溶液に、２５Ｕ／ｍＬのＣｅｌｌｏｂｉａｓｅを１００μＬ加え、４０℃で２２時間までインキュベート（１２００ｒｐｍ、Ｂｉｏｓｈａｋｅｒ  Ｍ・ＢＲ０２２、ＴＡＩＴＥＣ社）して反応させた。反応０時間、３時間、２２時間目に反応液をサンプリングし、ＨＰＬＣ（カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  Ａｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２Ｐ−５０  ４Ｅ（商品名）、移動相：水／アセトニトリル＝２５／７５、流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：４０℃、検出器：ＲＩ）で反応状況を確認した。
【００７７】
図６に示した結果のとおり、反応開始から３時間目には、本発明のミオイノシトール誘導体がほとんど分解して、対応する量のグルコースとシロ‐イノシトールが生成した。また、反応開始から２２時間後には、本発明のミオイノシトール誘導体は完全に分解していた。このことから、本発明のミオイノシトール誘導体が、β‐グルコシダーゼにより容易に分解されることが判った。また、本酵素実験からも、本発明のミオイノシトール誘導体の構造決定の正しさが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明は、ミオイノシトール及びその誘導体の工業的発酵生産に利用できる。
【図１】
0005563143.tif 000019
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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