(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＤＣＡ−４（ニューロピリン−１）に結合する抗体又はＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ’、及びＳｃＦｖから選ばれるそのフラグメントによって血液から分離されたエキソビボ又はインビトロ樹状細胞集団であって、ＤＣ１ｃ-であることを特徴とする細胞集団。
【請求項２】
前記抗体が、二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、モノクローナル抗体、ハイブリッド抗体、組換え抗体、又はヒト化抗体から選択される、請求項１に記載の細胞集団。
【請求項３】
前記抗体又はＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ’、及びＳｃＦｖから選ばれるそのフラグメントが、検出標識又は常磁性標識に結合されている、請求項１に記載の細胞集団。
【請求項４】
前記検出標識が、放射性同位体、酵素、蛍光化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、基質コファクター、又は基質インヒビターである、請求項３に記載の細胞集団。
【請求項５】
前記抗体又はＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ’、及びＳｃＦｖから選ばれるそのフラグメントが、コロイド状超常磁性ビーズに結合される、請求項１に記載の細胞集団。
【請求項６】
配列番号１のエキソン１−６；エキソン１及び３−６；エキソン１−２及び４−６；又はエキソン１−３及び５−６によりコードされるＢＤＣＡ−２タンパク陽性である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞集団。
【請求項７】
ヒト細胞の混合物から樹状細胞を検出し、数え上げ、単離し、又は濃縮するための方法であって、
ａ）ヒト細胞の混合物中の細胞を、ＢＤＣＡ−４（ニューロピリン−１）に結合する抗体又はＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ’、及びＳｃＦｖから選ばれるそのフラグメントと、前記抗体又はそのフラグメントがＢＤＣＡ−４+細胞を特異的に認識する条件下で、接触させる工程、及び
ｂ）前記混合物中の他の細胞から、前記抗体又はそのフラグメントによって結合される樹状細胞を分離する工程
を含む方法。
【請求項８】
前記樹状細胞が、免疫磁気細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）によって分離される請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記樹状細胞が、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって分離される請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ヒト細胞の混合物から樹状細胞を単離するための方法であって、
ａ）ヒト細胞の混合物中の細胞を、ＢＤＣＡ−４（ニューロピリン−１）に結合する抗体又はＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ’、及びＳｃＦｖから選ばれるそのフラグメントと、抗体又はそのフラグメントがＢＤＣＡ−４+細胞を特異的に認識する条件下で、接触させる工程、及び
ｂ）前記混合物中の他の細胞から、前記抗体又はそのフラグメントによって結合される樹状細胞を分離する工程
を包含し、前記ヒト細胞の混合物が、骨髄、末梢血、又は細胞培養物に由来することを特徴とする方法。
【請求項１１】
前記ヒト細胞の混合物が、末梢血の白血球搬出（leukapheresis）によって得られる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヒト細胞の混合物が、臍帯血、扁桃、リンパ節、鼻粘膜、脾臓、皮膚、気道上皮、肺、肝臓、腸、胸腺、及びパイヤー班から選択される供給源に由来する、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
樹状細胞（ＤＣ）の亜集団に特異的な抗体およびその誘導体に関する。組成物およびその使用方法がまた提供され、その方法は、ＤＣおよびその亜集団の単離および精製、ならびに抗体またはリガンド媒介免疫療法を含む。本発明はまた、実質的に単離されたＤＣ亜集団を提供する。その使用の方法がまた、提供され、この方法には、ＤＣベースの免疫療法、種々の疾患の特徴づけ、および例えば、ｆｌｔ３−リガンドを用いるインビボの数的なＤＣ増大を含む。
【背景技術】
【０００２】
強力な抗原提示細胞（ＡＰＣ）である、樹状細胞の造血性の発達は明白であり、そして単球にいくらか密接に関連したいくつかの前駆経路に続き得る。ＤＣは、リンパ球前駆体から誘導され得る。Ｔｈｏｍａｓら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８２１〜８３４。血中と同様、胸腺に存在するＤＣの３つの異なるサブセットが存在し得る：１）プラスマ細胞様ＣＤ４＋ＣＤ１１ｃ−ＤＣ；２）ＣＤ４＋ＣＤ１１ｃ＋ＤＣ、および３）互いに嵌め込み合うＤＣ。胸腺ＤＣおよびＴ細胞が共通の幹細胞から生じることが提唱されている。Ｔｈｏｍａｓら（１９９６）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  １４：１９６〜２０６。
【０００３】
潜在的な臨床用途のための多数のＤＣの生成は、近年では、サイトカインの前駆体のインビトロ培養を通じて達成されている。種々のストラテジーを適合させて、樹状細胞へ抗原を導入し、それにより、それらは、同時刺激の場合にはＴ細胞に対して、より効率的に提示され得る。樹状細胞が抗原に対するＴ細胞応答に影響して体液性または全身性の経路のいずれかが続くことがまた示されている。
【０００４】
Ｔ細胞は、プロセシングされていないタンパク質には反応できず、むしろ、Ｔ細胞は、ＭＨＣ分子と組み合わせて細胞表面で提示されるペプチドエピトープとして抗原を提示するためのアクセサリー細胞を必要とする。細胞の細胞質に内因性に生成された抗原は、代表的にはクラスＩ経路に存在し、そして細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）反応を刺激する。一方、外因性タンパク質は、ＭＨＣクラスＩＩコンパートメントでプロセシングされて、ヘルパーＴ（ＣＤ４）細胞応答を誘導する。ナイーブなＴ細胞の刺激は、初回免疫の活性化における二次シグナルとして働く同時刺激分子の存在を必要とする。Ｂ細胞およびマクロファージのようなＡＰＣは、代表的に初回応答を誘導し得ない。対照的に、樹状細胞は、同時刺激の接着ならびにＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子（効果的細胞免疫の開始に必須）の構成的な上方制御（アップレギュレーション）発現からその力価を駆動する。概説については、Ａｖｉｇａｎ（１９９９）Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｖ．１３：５１〜６４を参照のこと。
【０００５】
ＤＣは、初回免疫応答の開始および耐性の発達に必須であるＡＰＣである。ＤＣは、ナイーブなＴ細胞集団の刺激に必要なＭＨＣを発現する。ＤＣの造血性の発達は、明白であり、そしていくつかの前駆経路を伴い得、そのいくつかは単球に密接に関連している。概説については、Ａｖｉｇａｎ（１９９９）Ｂｏｌｌｄ  Ｒｅｖ．１３：５１〜６４を参照のこと。異なるＤＣサブセットは、異なる発達経路を有する。新たな概念は、１つのＤＣサブセットが、自己抗原に対する耐性の誘導に寄与し得る調節性機能を有するということである。Ａｕｓｔｙｎ（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．５：３〜１５。逆に、ＤＣまたはそのサブセットはまた、自己タンパク質に対する免疫応答の誘導に関与し得る。特定の自己免疫応答は、微小環境組織損傷、その後の局所ＤＣ活性化および引き続くＴ細胞との相互作用（免疫応答を誘導する）に起因し得る。Ｉｂｒａｈｉｍら（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １６：１８１〜１８６。
【０００６】
ＤＣがＴ細胞応答を開始する能力は、ＤＣ癌ワクチンにおいて用いられている。Ｈａｒｔら（１９９９）Ｓｅｍ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３６：：２１〜２５．例えば、ＤＣは、ＣＤ３４＋細胞または単球からインビトロで生成され、腫瘍由来ペプチドまたはタンパク質でパルスされ、そして患者に戻されて癌特異的Ｔ細胞誘導においてＡＰＣとして働く。Ｂｒｕｇｇｅｒら（１９９９）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７２：３６３〜３７１。動物モデルは、ＤＣ腫瘍ワクチンがＴ細胞アネルギーを逆にし、引き続く腫瘍拒絶を生じることを実証した。Ａｖｉｇａｎ（１９９９）；またＴａｒｔｅら（１９９９）Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １３：６５３〜６６３；Ｃｏｌａｃｏ（１９９９）Ｍｏｌｅｃ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ  ５：１４〜１７；Ｔｉｍｍｅｒｍａｎら（１９９９）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５０：５０７〜５２９；Ｈａｒｔら（１９９９）Ｓｅｍｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３６：２１〜２５；Ｔｈｕｒｎｈｅｒら（１９９８）Ｕｒｏｌ．Ｉｎｔ．６１：６７〜７１；およびＨｅｒｍａｎｓら（１９９８）Ｎ．Ｚ．Ｍｅｄ．Ｊ．１１１：１１１〜１１３を参照のこと。ｆｌｔ−リガンドの投与によりインビボでＤＣを増大する１つのアプローチが存在する。これは、ＶＥＧＦ−誘導ＤＣ抑制を補償する効果を有する。Ｏｈｍら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：３２６０〜３２６８。ＤＣは、ワクチン接種および組み換えワクチンにおけるアジュバントとしての用途について提唱されている。Ｆｅｍａｎｄｅｚら（１９９８）Ｃｙｔｏ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：５３〜６５；およびＧｉｂｃｏら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４６：８２〜８７。ＤＣはまた、幹細胞移植の後の免疫を増強する用途についても提唱されている。Ｂｒｕｇｇｅｒら（１９９９）Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３６３〜３７１。ＤＣは、免疫学において多数の潜在的役割を果たす。例えば、ＤＣは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染に関与する。Ｚｏｅｔｅｗｅｉｊら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．５：２５３〜２５９。ＤＣはまた、ＨＩＶ治療における用途に適切であることが提唱されている。Ｗｅｉｓｓｍａｎら（１９９７）Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１０：３５８〜３６７。
【０００７】
さらなる免疫学的機能が、ＤＣに関連している。これは、例えば、Ｔｈ１またはＴｈ２応答の示差的誘導、自己免疫反応およびアレルギーである。Ｒｉｓｓｏａｎら（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：１１８３〜１１８６；Ｈｅｒｍａｎｓら（１９９８）ＮＺ  Ｍｅｄ．Ｊ．１１１：１１１〜１１３；およびＤｅ  Ｐａｌｍａら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：１９８２〜１９８７。
【０００８】
循環するＩＦＮ−αのレベルの増大およびＩＦＮ−α誘導因子（抗ＤＮＡ抗体およびＤＮＡの複合体のようなもの）のレベルの増大が、ＳＬＥ患者において見出され、そして疾患活性に関連している。さらに、ＩＦＮ−αで処置された非自己免疫障害を有する患者は、しばしば自己抗体を、そして時にはＳＬＥを発生させる。Ｒｏｎｎｂｌｏｍら、からのいくつかの報告（（１９９９）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１５：１９６〜２０２；（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：６３０６〜６３１６；および（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：３５１９〜３５２６））から、患者から誘導されたＩＦＮ−α誘導因子が健常ドナー由来のＰＢＭＣにおいてＩＦＮ−αの分泌を誘導すること、およびそれらが天然のＩＦＮ−α産生細胞を選択的に活性化することが示される（ＮＩＰＣ＝プラスマ細胞様（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ）ＤＣ）。
【０００９】
血中でのＤＣに対する研究は、細胞の不足およびＤＣ特異的細胞表面マーカーの相対的欠失によって阻害されている。ＤＣ単離の方法は、短時間培養後の成熟変化（低浮遊密度の獲得など）か、またはＤＣ活性化／成熟抗原（ＣＤ８３、ＣＭＲＦ−４４およびＣＭＲＦ−５６）の発現のいずれかに基づく。Ｙｏｕｎｇら（１９８８）Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１１：１６７；Ｖａｎ  Ｖｏｏｒｈｉｓら（１９８２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５５：１１７２；Ｚｈｏｕら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：３８２１〜３８３５；Ｆｅａｒｎｌｅｙら（１９９７）Ｂｌｏｏｄ  ８９：３７０８〜３７１６；Ｍａｎｎｅｒｉｎｇら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔ．２１９：６９〜８３；Ｈｏｃｋら（１９９９）Ｔｉｓｓ．Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ５３：３２０〜３３４；およびＨｏｃｋら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．８３：５７３〜５８１。
【００１０】
機能的ＣＤ１ａ＋ＤＣは、代表的には、単球からエキソビボで、そしてＣＤ３４＋造血前駆細胞から生成される。Ｂｅｎｄｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔ．１９６：１２１〜１３５；Ｐｉｃｋｌら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：３８５０〜３８５９；Ｒｏｍａｎｉら（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：８３〜９３；Ｓａｌｌｕｓｔｏら（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１１０９−１１１８；Ｃａｕｘら（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ  ３６０：２５８〜２６１；Ｍａｃｋｅｎｓｅｎら（１９９５）Ｂｌｏｏｄ  ８６：２６９９〜２７０７；Ｓｚａｂｏｌｃｓら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５８５１〜５８６１；Ｈｅｒｂｓｔら（１９９６）Ｂｌｏｏｄ  ８８：２５４１−２５４８；ｄｅ  Ｗｙｎｔｅｒら（１９９８）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  １６：３８７〜３９６；Ｓｔｒｕｎｋら（１９９６）Ｂｌｏｏｄ  ８７：１２９２−１３０２  米国特許番号第６，０１０，９０５号；および同第６，００４，８０７号。ＤＣが単球および造血前記細胞からインビトロで生成される場合、インビボのＤＣの特徴の全てが保持または得られることは知られていない。
【００１１】
さらに、ヒトＤＣに特異的なｍＡｂを生成するいくつかの試みは失敗しており、ＤＣおよび他の白血球の両方によって発現される抗原に結合するｍＡｂのみを生じている。ヒトＤＣは、他の血球と、多数の免疫原性細胞表面構造を共有する。これには、ＨＬＡ分子、ＣＤ１８、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、およびＣＤ５８が挙げられる。これらの抗原は、注射されたＤＣに対する免疫応答を、ＤＣ特異的抗原に対する特異性を有するＢ細胞が、骨髄腫細胞との融合の能力を有するＢ細胞の間で、全く発現されないか、ごくまれにしか発現されないレベルまで支配し得る。
【００１２】
多くの研究者らが、共有された抗原についての特異性を有するＢ細胞を除去するために、非ＤＣおよびシクロフォスファミドを成体マウスに注射することにより、または共有された抗原のついての特異性を有するＢ細胞を寛容化するために非ＤＣを新生仔マウスに注射することにより、この問題を克服しようと努力してきた。Ｏ'Ｄｏｈｅｒｔｙら（１９９３）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３２９：１６５〜１７２；およびＹａｍａｇｕｃｈｉら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔ．１８１：１１５〜１２４。
【００１３】
ＣＭＲＦ４４と名づけられたｍＡｂは、幹細胞移植患者におけるＤＣのモニターに用いられてきた。Ｆｅａｒｎｌｅｙら（１９９９）Ｂｌｏｏｄ  ９３：７２８〜７３６。これらのＣＭＲＦ４４＋細胞は、免疫応答を開始、維持、および指向するのにおける用途に適切であることが提唱された。Ｆｅａｒｎｌｅｙら（１９９７）。ＤＣは、ほとんどの場合、細胞表面マーカーの組み合わせを用いることにより単離されてきた。例えば、米国特許第５，９７２，６２７号は、「少なくとも８０％、ＣＤ３４、ＣＤ４５ＲＡ、およびＣＤ１０を発現するが、ＣＤ１９、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２０、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ５６およびグリコホリン（ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ）は発現しない」として、「ヒト造血樹状前駆細胞について富化された造血細胞」を記載している。
【００１４】
血液からのＤＣの単離は、多数の免疫表現型基準、例えば、リンパ球系列（ｌｉｎ）−特異的抗原（例えば、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、およびＣＤ５６）のパネルの非存在、ならびにＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４またはＣＤ３３の存在などに依存する。Ｒｏｍａｎｉら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔ．１９６：１３７〜１５１；Ｔｈｏｍａｓら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８２１〜８３４；Ｔｈｏｍａｓら（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：４０１６〜４０２８；Ｏ'Ｄｏｈｅｒｔｙら（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｌ．８２：４８７〜４９３；Ｏ'Ｄｏｈｅｒｔｙら（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：１０６７〜１０７６；Ｎｉｊｍａｎら（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：１６３〜１７４；Ｆｅｒｂａｓら（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：４６４９〜４６６２；Ｈｅｕｆｌｅｒら（１９９６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：６５９〜６６８；Ｉｔｏら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：１４０９〜１４１９；Ｃｅｌｌａら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．５：９１９〜９２３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（１９９９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：２７６９〜２７７８；Ｏｌｗｅｕｓら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１２５５１〜１２５５６；Ｒｏｂｅｒｔら（１９９９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：６２７〜６３６；およびＫｏｈｒｇｒｕｂｅｒら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：３２５０〜３２５９。
【００１５】
非培養血液から単離されたＤＣの分析から、血液ＤＣが、均一な細胞集団ではなく、少なくとも２つの集団の混合物であることが証明された。Ｔｈｏｍａｓら（１９９４）；Ｏ'Ｄｏｈｅｒｔｙら（１９９４）；Ｉｔｏら（１９９９）；Ｃｅｌｌａら（１９９９）；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（１９９９）；Ｏｌｗｅｕｓら（１９９７）；Ｋｏｈｒｇｒｕｂｅｒら（１９９９）；Ｓｔｒｏｂｌら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：７４０〜７４８；およびＲｉｓｓｏａｎら（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：１１８３〜１１８６。最初の血液ＤＣ亜集団は、ＣＤ１２３brightＣＤｌｌｃ-ＤＣであり、これは、プラスマ細胞様の形態および強力なＴ細胞刺激機能を有する。第二の血液ＤＣ亜集団は、ＣＤ１２３dim、ＣＤ１１ｃbrightであり、これは、むしろ単球様の外観であり、ＣＤ４５ＲＯを発現し、そして外因性サイトカインなしに培養された場合でさえ、自然に、代表的な成熟ＤＣに発達する。プラスマ細胞様ＣＤ１２３brightＣＤｌｌｃ-ＤＣは、いくつかの特徴（プレＴ細胞レセプターα鎖の発現など）を示し、これは、その細胞がリンパ前駆体から生じ得ることを示す。Ｓｔｒｏｂｌら（１９９８）；Ｒｉｓｓｏａｎら（１９９９）；およびＢｒｕｎｏら（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：８７５〜８８４。ＣＤ１２３dimＣＤ１１ｃbrightＤＣは、骨髄腫ＤＣの全ての基準を示す。Ｏ'Ｄｏｈｅｒｔｙら（１９９４）；およびＩｔｏら（１９９９）。Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（１９９９）；Ｋｏｈｒｇｒｕｂｅｒら（１９９９）；およびＳｔｒｏｂｌら（１９９８）。プラスマ細胞様ＣＤ１２３brightＣＤｌｌｃ-ＤＣと似ているＤＣは、リンパの組織のＴ細胞富化領域で検出され、そしてその形態および表現型に起因して、最初に誤って、プラスマ細胞様Ｔ細胞またはプラスマ細胞様単球と名づけられた。Ｇｒｏｕａｒｄら（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：１１０１〜１１１１；Ｌｅｎｎｅｒｔら（１９７５）Ｌａｎｃｅｔ  １：１０３１〜１０３２；Ｌｅｎｎｅｒｔら（１９８４）Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｔｙｐｉｎｇ．Ｈｕｍａｎ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｂｅｒｎａｒｄら編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ；およびＦａｃｃｈｅｔｔｉら（１９８８）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３３：１５。ＣＤ１２３dimＣＤｌｌｃbright血液ＤＣと似ているＤＣは、胚中心の黒いゾーンおよび明るいゾーンにおいて見出されている。Ｇｒｏｕａｒｄ（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  ３８４：３６４〜３６７。
【００１６】
（スプライシング改変体（バリアント））
発現された遺伝子の総数は、４０，０００〜１５０，０００を超える範囲にわたると見積もられる。この数は、コードされるタンパク質の数の正確な反映ではない。なぜなら、多くの場合、これらの遺伝子からは、このｍＲＮＡ（転写物）から１つより多いスプライシング改変体が生じるからである。再度、見積もりは変化するが、おそらく５００，０００程度の多さの異なるｍＲＮＡがヒトにおいて産生される。ヒト遺伝子の少なくとも３０％がいくつかのスプライシング改変体を有すると推定される。Ｍｉｒｏｎｏｖら（１９９９）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９：１２８８〜１２９３）。これらの数は、ある程度保存されるべきであると考えられる。類似の数がマウスおよびラットについても正しく、そして下等な生物体（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、およびＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）でもまたオルタネーティブスプライシングが生じると考えられる。異なるスプライシング改変体（バリアント）から翻訳されたタンパク質は、研究論文の数が増加していることによって証明されるように、有意に異なる機能を有し得る。異なるスプライシング改変体が、異なる組織、異なる発生段階、および異なる疾患状態で発現され得る。
【００１７】
（Ｃ型レクチン）
Ｃ型レクチンは、炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）においてアミノ酸配列類似性を示し、そしてＣａ2+依存性様式において選択された炭水化物に結合する糖タンパク質のファミリーである。Ｃ型レクチンは、４つのカテゴリーに下位分類される（Ｖａｓｔａら、１９９４；およびＳｐｉｅｓｓ  １９９０）。第１の群は、ＩＩ型膜結合タンパク質（例えば、アシアロ糖タンパク質レセプター、マクロファージガラクトースおよびＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）特異的レクチン、およびＣＤ２３（ＦｃεＲＩＩ））を含む。この群の多くのメンバーは、ガラクトース／フコース、ガラクトサミン／ＧａｌＮＡｃまたはＧｌｃＮＡｃ残基に対する特異性を示す。第２の群は、軟骨および線維芽細胞のプロテオグリカンコアタンパク質を含む。第３の群は、いわゆる「コレクチン」（例えば、血清マンノース結合タンパク質、肺界面活性剤タンパク質ＳＰ−Ａ、およびコングルチニン）を含む。第４の群は、ＬＥＣ−ＣＡＭ（例えば、Ｍｅｌ−１４、ＧＭＰ−１４０およびＥＬＡＭ−１）として公知の特定の接着分子を含む。
【００１８】
Ｃ型レクチンは、アグルチニン、オプソニン、補体アクチベーターおよび細胞関連認識分子として機能することが公知である（Ｖａｓｔａら、１９９４；Ｓｐｉｅｓｓ  １９９０；およびＫｅｒｙ  １９９１）。例えば、マクロファージマンノースレセプターは、スカベンジャー機能（Ｓｈｅｐｈｅｒｄら、１９９０）および病原性生物（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ（Ｅｚｅｋｏｗｉｔｚら、１９９１）およびＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ（Ｅｚｅｋｏｗｉｔｚら、１９９０）を含む）の取り込みの媒介を果たす。血清マンノース結合タンパク質は、古典的経路を介して補体を活性化する能力において、Ｃ１ｑを模倣する。このレクチンにおける遺伝的変異は、重篤な再発感染、下痢および成長不全（ｆａｉｌｕｒｅ  ｔｏ  ｔｈｒｉｖｅ）についての素因を与える（Ｒｅｉｄら、１９９４）。従って、Ｃ型レクチンは、生物学的重要性を伴うさまざまな機能を示す。
【００１９】
炭水化物部分は、必ずしもＣ型レクチンに対する「天然の」リガンドとして働くわけではない。例えば、ＣＤ２３（ＦＣεＲＩＩ）（Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｎａｃの結合（Ｋｉｊｉｍｏｔｏ−Ｏｃｈｉａｉら、１９９４）およびＣＲＤ配列により証明されるように、Ｃ型レクチンファミリーに属する）は、現在、炭水化物非依存性様式でＩｇＥを認識することが公知である；酵素的に脱グリコシル化された形態のＩｇＥおよびＥ．ｃｏｌｉにおいて生成された組換え（非グリコシル化）ＩｇＥは、ともに、ＣＤ２３に結合する（Ｖｅｒｃｅｌｌｉら、１９８９）。従って、いくつかのＣ型レクチンは、それらの天然のリガンドにおけるポリペプチド配列を認識する。
【００２０】
いくつかのＣ型レクチンは、ＤＣの表面で同定された。第１に、Ｊｉａｎｇらは、最も広範に用いられる、マウスＤＣに対するｍＡｂの１つであるＮＬＤＣ−１４５  ｍＡｂ（Ｊｉａｎｇら、１９９５）により認識されるタンパク質をクローニングした。このタンパク質（現在は、ＤＥＣ−２０５とよばれる）は、Ｃ型レクチンファミリーの新たなメンバーであることがわかった（これは、１０の異なるＣＲＤを含む）。第２に、Ｓａｌｌｕｓｔｏらは、ヒトＤＣが、マクロファージマンノースレセプター（ＭＭＲ）を発現することを報告した。このマクロファージマンノースレセプターはまた、複数のＣＲＤを含む（Ｓａｌｌｕｓｔｏら、１９９５）。両方のレセプターは、以下の観察に基づいて、ＤＣによるグリコシル化分子のエンドサイトーシスを媒介すると提唱されている：ａ）ＤＥＣ−２０５に対するポリクローナルウサギ抗体が、ＤＣ表面上のＤＥＣ−２０５に結合するのみならず、実質的にインターナライズされること；ｂ）これらのＤＣは、ウサギＩｇＧと反応性のＴ細胞株を有効に活性化したこと；およびｃ）ＤＣによるＦＩＴＣ−デキストランのインターナリゼーションが、マンナン、マンノースレセプター競合体（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）で有効にブロックされたこと（Ｊｉａｎｇら、１９９５；およびＳａｌｌｕｓｔｏら、１９９５）。細胞型特異性に関して、ＤＥＣ−２０５は、現在、低レベルではあるが、胸腺、腸、および肺においてＢ細胞および内皮細胞により発現されることもまた公知であり（Ｗｉｔｍｅｒ−Ｐａｃｋら、１９９５；およびＩｎａｂａら、１９９５）、そしてＭＭＲもまた、マクロファージによって、さらにより豊富に発現される（Ｓｔａｈｌ  １９９２）。他もまた、ＤＣ表面上で見出され、これらのものとしては、以下が挙げられる：ＤＣＩＲ、ＭＤＬ−１、ＮＵＲＰＩＡ、Ｄｅｃｔｉｎ−１、Ｄｅｃｔｉｎ−２、ＣＬＥＣ−１、ＣＬＥＣ−２、Ｌａｎｇｅｒｉｎ；およびＤＣ−ｓｉｇｎ。
【００２１】
（アレルギー）
アレルギー性応答（アレルギー性喘息およびアレルギー性鼻炎の応答を含む）は、初期応答により特徴付けられ、この応答は、アレルゲン曝露の数秒から数分以内に発生し、そしてアレルゲン曝露の部位への好酸球の浸潤により特徴付けられる。具体的には、アレルギー性応答の初期の間にＴｈ２型リンパ球の活性化により、抗原特異的ＩｇＥ抗体の生成が刺激される。抗原特異的ＩｇＥ抗体は、続いて、ヒスタミン、ならびに肥満細胞および好塩基球からの炎症の他のメディエーターの放出を誘発する。遅延型応答の間に、ＣＤ４＋  ＴＨ２細胞によるＩＬ−４およびＩＬ−５生成が上昇する。これらのサイトカインは、アレルゲン曝露の部位（ここで、組織損傷および機能不全が生じる）へ好酸球を補充することにおいて重要な役割を果たすようである。
【００２２】
現在、アレルギー性障害のための抗原免疫療法は、少量であるが、徐々に漸増量の抗原を脱感作療法といわれるプロセスにおいて皮下注射することを含む。抗原免疫療法は、現段階では、一時的に抑えるに過ぎず、治療的ではない。Ｗｅｂｅｒ（１９９７）ＪＡＭＡ  ２７８：１８８１−１８８７；Ｓｔｅｖｅｎｓ（１９９８）Ａｃｔａ  Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｂｅｌｉｇｉｃａ  ５３：６６−７２；およびＣａｎａｄｉａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９５）Ｃａｎ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．Ｊ．１５２：１４１３−１４１９。
【００２３】
治療を始める多くの患者は、レジメンを完了せず、そして注射を１週間しそこなった場合、患者は、再び処置レジメン全体を開始しなければならない。種々の抗原が同定されており、組換え手段により生成されている。総説については、Ｂａｌｄｏら（１９８９）Ａｌｌｅｒｇｙ  ４４：８１−９７；Ｂａｌｄｏ（１９９１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：８４１−８５０；Ｂｌａｓｅｒ（１９９４）Ｔｈｅｒ．Ｕｍｓｃｈ  ５１：１９−２３；およびＶａｌｅｎｔａら（１９９６）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏ．４０９：１８５−１９６を参照のこと。
【００２４】
抗原免疫療法処置は、潜在的に、致死的なＩｇＥ媒介性アナフィラキシーを誘導する危険性を示し、そしてアレルギー性遅延型応答のサイトカイン媒介性事象に対処しない。この治療は、「失敗の可能性を有する」と記載されている。Ｗｅｂｅｒ（１９９７）。抗原免疫療法に伴う別の重大な問題は、有害反応（特に、アナフィラキシー）の危険性が、１回の投与あたりに与えられる量および時間に対して与えられる量の両方に関して、抗原の投与量を有意に減少させることである。従って、伝統的なアレルギー免疫療法は長引くため、時間がかかり、不便、かつ高価である。
【００２５】
ＩｇＥ関連障害（例えば、アレルギー）の処置のための代替的アプローチは、ヒスタミン放出を阻害する化合物の投与を含む。多くのこのような薬物は、医師の処方箋なしで購入できる治療薬として入手可能である。他の薬物は、抗ＩｇＥ結合抗体を含む。しかし、このアプローチの欠点は、症状がごまかされるに過ぎず、いずれの種類の恒久的な治癒も防御ももたらさない。
【発明の概要】
【００２６】
（発明の簡単な説明）
本発明は、ＤＣおよびそのサブセットが富化された造血細胞集団を富化するための方法に関する。この方法から得られた細胞および細胞集団が富化された組成物はまた、本発明により提供される。遺伝的に改変したＤＣを作製する方法もまた、提供される。遺伝的に改変したＤＣの組成物もまた、提供される。これらの細胞を使用する方法もまた含まれる。ＢＤＣＡ−２およびＢＤＣＡ−３に特異的な抗原結合フラグメントおよびこれらにより認識される抗原もまた提供される。
【００２７】
本発明は、ＡＣ１４４、ＡＤ５−１３１１、ＡＤ５−２０Ｅ５、ＡＤ５−１７Ｆ６、ＡＤ５−４Ｂ８、ＡＤ５−５Ｅ８、ＡＤ５−１４Ｈ１２またはＡＤ５−８Ｅ７と名付けられた抗体により特異的に認識されるＤＣのサブセットに特異的な抗原結合フラグメントを含む。本発明は、ＢＤＣＡ−２（配列番号２）と名付けられた抗原のエピトープに特異的な抗原結合フラグメントを含む。本発明は、ＢＤＣＡ−３と名付けられた抗原のエピトープに特異的な抗原結合フラグメントを含む。
【００２８】
本発明は、本発明の抗原結合フラグメントにより特異的に認識される、実質的に単離または濃縮されたＤＣ集団または亜集団をさらに含む。これらの抗原結合フラグメントは、ＡＣ１４４、ＡＤ５−１３１１、ＡＤ５−２０Ｅ５、ＡＤ５−１７Ｆ６、ＡＤ５−４Ｂ８、ＡＤ５−５Ｅ８、ＡＤ５−１４Ｈ１２またはＡＤ５−８Ｅ７、あるいはＢＤＣＡ−１、ＢＤＣＡ−２、ＢＤＣＡ−３またはＢＤＣＡ−４に特異的な抗原結合フラグメントのいずれか１つであり得る。ニューロピリン（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ）−１を認識する抗原結合フラグメントもまた、ＢＤＣＡ−４を認識し、そして本明細書中における使用に適切である。
【００２９】
本発明はさらに、細胞の実質的に全てが発現するか、またはＢＤＣＡ−１、ＢＤＣＡ−２、ＢＤＣＡ−３およびＢＤＣＡ−４のうちの少なくとも１つの発現に基づいて単離、濃縮もしくは数え上げられたＤＣの集団または亜集団を含む。これらの細胞は、任意の生理学的に受容可能な賦形剤中に懸濁され得る。好ましくは、この賦形剤は、薬理学的に受容可能である。
【００３０】
本発明はさらに、ヒト造血細胞の混合物を画分に分離することによりＤＣが富化された造血細胞の組成物を得るための方法を包含し、この画分中の細胞の少なくとも８０％がＢＤＣＡ−１+である。
【００３１】
本発明はさらに、ヒト造血細胞の混合物を画分に分離することによりＤＣが富化された造血細胞の組成物を得るための方法を包含し、この画分中の細胞の少なくとも８０％がＢＤＣＡ−２+である。
【００３２】
本発明はさらに、ヒト造血細胞の混合物を画分に分離することによりＤＣが富化された造血細胞の組成物を得るための方法を包含し、この画分中の細胞の少なくとも８０％がＢＤＣＡ−３+である。
【００３３】
本発明はさらに、ヒト造血細胞の混合物を画分に分離することによりＤＣが富化された造血細胞の組成物を得るための方法を包含し、この画分中の細胞の少なくとも８０％がＢＤＣＡ−４+である。
【００３４】
本発明はさらに、以下の工程によりＤＣの実質的に純粋なサブセットを単離するための方法を包含する：ａ）ヒト造血細胞の混合物を得る工程；およびｂ）この混合物から、ＢＤＣＡ−２と名付けられた抗原に特異的な抗原結合フラグメントにより特異的に認識される細胞を実質的に単離する工程。
【００３５】
本発明はさらに、以下の工程によりＤＣの実質的に純粋なサブセットを単離するための方法を包含する：ａ）ヒト造血細胞の混合物を得る工程；およびｂ）この混合物から、ＢＤＣＡ−３と名付けられた抗原に特異的な抗原結合フラグメントにより特異的に認識される細胞を実質的に単離する工程。
【００３６】
本発明はさらに、以下の工程によりＤＣの実質的に純粋なサブセットを単離するための方法を包含する：ａ）ヒト造血細胞の混合物を得る工程；およびｂ）この混合物から、ＢＤＣＡ−４と名付けられた抗原に特異的な抗原結合フラグメントにより特異的に認識される細胞を実質的に単離する工程。
【００３７】
本発明はさらに、以下の工程によりＤＣを数え上げるための方法を包含する：ａ）細胞の混合物を得る工程；およびｂ）この細胞を、抗原ＢＤＣＡ−１、ＢＤＣＡ−２、ＢＤＣＡ−３、およびＢＤＣＡ−４のいずれか１以上に特異的な抗原結合フラグメントで標識する工程。
【００３８】
本発明はさらに、以下の工程によるＤＣの免疫能力を調節する方法を含む：ＤＣの実質的に純粋な集団または亜集団を単離する工程；およびこのＤＣのカルシウム動員を調節する工程。
【００３９】
本発明はさらに、以下の工程により薬学的に有効な薬剤の存在について試験薬剤をスクリーニングする方法を包含する：抗原ＢＤＣＡ−１、ＢＤＣＡ−２、ＢＤＣＡ−３、およびＢＤＣＡ−４のいずれか１以上に特異的な抗原結合フラグメントを有するＤＣの実質的に純粋な集団または亜集団を単離する工程；これらの単離された細胞を上記の試験薬剤を用いてスクリーニングする工程；この薬剤に対する細胞の応答をモニターする工程；上記の薬剤に曝した細胞の応答と、コントロール薬剤に曝した細胞の応答とを比較する工程；およびこの試験薬剤が単離された細胞のいずれか１つの免疫学的特性を調節したか否かを決定する工程。
【００４０】
本発明はさらに、ＤＣがカルシウムを動員する能力を改変することによるＤＣの免疫学的特性を調節する方法を含む。
【００４１】
本発明はさらに、好ましくは生理学的に受容可能な賦形剤中のＤＣの免疫原性組成物および免疫調節組成物を含む。
【００４２】
本発明はさらに、ＤＣの免疫原性組成物および免疫調節組成物の有効量を、必要とする被験体に投与する工程により、生理学的状態を処置する方法を含む。
【００４３】
本発明はさらに、以下の工程によりＤＣサイトカインを生成する方法を含む：ＢＤＣＡ−１、ＢＤＣＡ−２、ＢＤＣＡ−３、およびＢＤＣＡ−４のいずれか１以上に特異的な抗原結合フラグメントを有するＤＣの実質的に純粋な集団または亜集団を単離する工程；およびこの細胞または細胞生成物または上清からサイトカインを単離する工程。
【００４４】
本発明はさらに、以下の工程によりＤＣサイトカイン生成を調節する方法を含む：ＢＤＣＡ−１、ＢＤＣＡ−２、ＢＤＣＡ−３、およびＢＤＣＡ−４のいずれか１以上に特異的な抗原結合フラグメントを有するＤＣの実質的に純粋な集団または亜集団を単離する工程；およびＤＣサイトカイン生成を調節する薬剤で細胞を処理する工程。
【００４５】
本発明はさらに、ＤＣサイトカイン生成を調節する薬剤の有効量を、必要とする被験体に投与する工程により、ＤＣサイトカイン生成をインビボで調節する方法を含む。
【００４６】
本発明はさらに、以下の工程により抗原に特異的な抗体を生成する方法を含む：抗原を負荷し、そしてＢＤＣＡ−１、ＢＤＣＡ−２、ＢＤＣＡ−３、およびＢＤＣＡ−４のいずれか１以上に特異的な抗原結合フラグメントで単離したＤＣの実質的に純粋な集団または亜集団の有効量を、必要な被験体に投与する工程であって、このＤＣがＴｈ２応答を誘導するように調節される、工程。
【００４７】
本発明はさらに、以下の工程により抗原に特異的なＴ細胞または体液性免疫応答を生成する方法を含む：抗原を負荷し、そしてＢＤＣＡ−１、ＢＤＣＡ−２、ＢＤＣＡ−３、およびＢＤＣＡ−４のいずれか１以上に特異的な抗原結合フラグメントで単離したＤＣの実質的に純粋な集団または亜集団の有効量を、必要な被験体に投与する工程であって、この細胞がＴｈ１応答を誘導するように調節される、工程。
【００４８】
本発明はさらに、組換え宿主細胞において、ポリペプチドを発現させ、この発現されたポリペプチドを総組換え宿主細胞成分から精製することにより調製されたポリペプチドを含み、ここで、このポリペプチドは、配列番号２の由来する約５つの連続したアミノ酸残基を含む。
【００４９】
本発明はさらに、精製したポリペプチドおよびそれらの組成物を含み、このポリペプチドは、配列番号２由来の約５個連続したアミノ酸残基を含む。
【００５０】
本発明はさらに、配列番号２でないポリペプチドのアミノ酸配列に連結するポリペプチドアミノ酸配列の融合タンパク質を含み、このアミノ酸配列は、配列番号２由来の約５個連続したアミノ酸残基を含む。
【００５１】
本発明はさらに、少なくとも１つのＢＤＣＡ−２スプライス改変体を含むポリペプチドを含む。
【００５２】
本発明はさらに、ＢＤＣＡ−２、そのスプライス改変体またはフラグメントの少なくとも５個連続したアミノ酸残基をコードするポリヌクレオチドまたはその相補体を含む。
【００５３】
本発明はさらに、ＢＤＣＡ−２、そのスプライス改変体またはフラグメントの少なくとも５個連続したアミノ酸残基をコードするポリヌクレオチドまたはその相補体を含む組換え宿主細胞を含む。
【００５４】
本発明はさらに、ＤＣとＴ細胞を含む組成物をＢＤＣＡ−２、ＢＤＣＡ−３またはＢＤＣＡ−４とＴ細胞との相互作用を阻害する有効量の薬剤と接触させることによって、ＤＣとＴ細胞の相互作用を阻害する方法を包含する。
【００５５】
本発明はさらに、被験体の炎症を減少させるのに有効なＴ細胞とＢＤＣＡ−２、ＢＤＣＡ−３またはＢＤＣＡ−４の相互作用を阻害する薬剤量を、それが必要な患者に投与することにより炎症を処置する方法を包含する。
【００５６】
本発明はさらに、細胞でＢＤＣＡ−２アンチセンスポリヌクレオチドを発現することによって、細胞におけるＢＤＣＡ−２発現を抑制する方法を包含する。
【００５７】
本発明はさらに、ＢＤＣＡ−２、そのスプライス改変体またはフラグメントの少なくとも５個連続したアミノ酸残基をコードするポリヌクレオチドまたはその相補体を含むトランスジェニック動物を含む。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図１は、フィコールパック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ）密度勾配遠心分離によって単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のフローサイトメトリー分析からの点プロットを示す。図１において、ＰＢＭＣ上のＢＤＣＡ−２、ＢＤＣＡ−３およびＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）を示す。図１Ａは、それぞれ、ＢＤＣＡ−２（ＡＣ１４４）、ＢＤＣＡ−３（ＡＤ５−５Ｅ８）およびＣＤ１ｃ（ＡＤ５−８Ｅ７）に対するＦＩＴＣ結合ｍＡｂ、およびＴＣＲαβヘテロダイマー、ＣＤ１４、ＣＡ１９およびＣＤ５６に対するＰＥ結合ｍＡｂによるＰＢＭＣの染色を示す。数は、それぞれの象現の細胞の百分率を示す。ヨウ化プロピジウム蛍光および光散乱シグナルを、生細胞のゲーティングのために使用した。図１Ｂは、（ａ）ＰＢＭＣ，（ｂ）ゲーティングされたＢＤＣＡ−２+細胞、（ｃ）ゲーティングされたＢＤＣＡ−３+細胞および（ｄ）ゲーティングされたＣＤ１ｃ+細胞、の散乱プロフィールを示す。
【図２】図２は、ＢＤＣＡ−２、ＢＤＣＡ−３、ＢＤＣＡ−４およびＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）が、３つの別の血液ＤＣサブセットで発現することを示す。血液ＤＣは、ＣＤ３、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ１６ポジティブ細胞の枯渇、続いてＣＤ４ポジティブ細胞の富化によってＰＢＭＣから単離された。血液ＤＣの精製は、光散乱特性（左上点プロット）および抗−ＨＬＡ−ＤＲ−Ｃｙ５  対  抗−Ｌｉｎ−ＦＩＴＣ（抗−ＴＣＲαβ、ＣＤ１４、ＣＤ１９およびＣＤ５６）染色（上中央点プロット）によって示される。わずかなｌｉｎ+細胞しか存在しないことに注意をすること。血液ＣＤ上のＢＤＣＡ−２、ＢＤＣＡ−３、ＢＤＣＡ−４およびＣＤ１ｃの発現は、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１２３および抗原自身に対するＰＥ結合ｍＡｂおよびＦＩＴＣ結合ｍＡｂによる一連の二色染色で特徴付けられる。ＢＤＣＡ−２、ＢＤＣＡ−３、ＢＤＣＡ−４およびＣＤ１ｃは、３つの別の血液ＤＣサブセットのうち１つのみ排他的に発現することに注意すること。サブセットは、ＣＤ１２３−ＰＥ  対  ＣＤ１１ｃ−ＦＩＴＣ（左上部点プロット）：ＣＤ１１ｃ-ＣＤ１２３bright血液ＤＣ；ＣＤ１１ｃbrightＣＤ１２３dim血液ＤＣ；およびＣＤ１１ｃdimＣＤ１２３-血液ＤＣによる血液ＤＣの染色にしたがって規定される。
【図３】図３は、ＰＢＭＣでのＢＤＣＡ−４の発現を示す。ＢＤＣＡ−２（ＡＣ１４４）に対するＦＩＴＣ結合ｍＡｂおよびＢＤＣＡ−４（ＡＤ５−１７Ｆ６）に対するＰＥ結合ｍＡｂによるＰＢＭＣの二色染色を示す。いくつかの単一のポジティブ（ＢＤＣＡ−２＋ＢＤＣＡ−４−およびＢＤＣＡ−２−ＢＤＣＡ−４＋）なＰＲＭＣが検出されることに注意すること。
【図４】図４は、ＩＬ−３の存在下における種々の培養期間後に精製された血液ＤＣでのＢＤＣＡ−２、ＢＤＣＡ−３およびＢＤＣＡ−４の発現を示す。精製された血液ＤＣを、ｒＩＬ−３の存在下で、０時間、１時間、３時間、６時間、９時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間、および４８時間培養し、次いで、ＣＤ１１ｃ、ＢＤＣＡ−３、ＢＤＣＡ−２およびＢＤＣＡ−４の発現についてフローサイトメトリーにより分析した。（Ａ）ヒストグラムは、それぞれ、ＰＥ結合抗−ＢＤＣＡ−２ｍＡｂ（ＡＣ１４４）および抗−ＢＤＣＡ−４ｍＡｂ（ＡＤ−５−１７Ｆ６）（太線）、およびＰＥ結合アイソタイプ対応コントロールｍＡｂ（薄罫線）でゲーティングされたＣＤ１１ｃ-、ＣＤ１１ｃ+血液ＤＣの染色を示す。点プロットは、抗−ＢＤＣＡ−３（ＡＤ５−５Ｅ８）ビオチン／ストレプトアビジン−ＡＰＣに対するＣＤ１１ｃ−ＰＥによる血液ＤＣの染色を示す。（Ｂ）ダイアグラムは、それぞれ、ＣＤ１１ｃ−（黒三角）およびＣＤ１１ｃ＋（黒四角）ＤＣの抗−ＢＤＣＡ−２−ＰＥ、抗−ＢＤＣＡ−４−ＰＥおよび抗ＢＤＣＡ−３ビオチン／ストレプトアビジン−ＡＰＣ染色についての平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を示す。ＢＤＣＡ−２およびＢＤＣＡ−４について、ＭＦＩ値は、それぞれ、ＡＣ１４４およびＡＤ−１７Ｆ６で得られた値からアイソタイプコントロールｍＡｂによって得られた値を減算することによって計算された。ＢＤＣＡ−３について、ＭＦＩ値は、いずれの染色ｍＡｂ（自己蛍光）もなしで得られた値をＡＤ５−５Ｅ８によって得られた値から減算することによって計算された。
【図５】図５は、６つのエキソン全てが発現されているＢＤＣＡ−２の１つのアイソフォームのアミノ酸配列を示す（配列番号２）。
【図６】図６は、ＢＤＣＡ−１−特異的ｍＡｂ  ＡＤ５−８Ｅ７がＭＯＬＴ−４細胞へのＣＤ１ｃ  ｍＡｂ  Ｍ２４１の結合をブロックすることを示す。ＭＯＬＴ−４細胞を、飽和量のＡＤ５−８Ｅ７  ｍＡｂ（太線）またはアイソトープコントロールｍＡｂ（薄罫線）とプレインキュベートし、次いで、ＰＥ結合ＣＤ１ｃ  ｍＡｂ（Ｍ２４１）で染色した。
【図７】図７は、Ｍｏ−ＤＣおよびＣＤ３４+細胞由来ＤＣ（ＣＤ３４−ＤＣ）におけるＢＤＣＡ−２、ＢＤＣＡ−３およびＢＤＣＡ−４の発現を示す。ＣＤ１４+単球およびＣＤ３４+造血前駆細胞を、それぞれ、ＣＤ１４およびＣＤ３４  ｍＡｂ結合ミクロビーズでの直接磁気標識を介して免疫磁性的に精製した。精製した単球を、ｒＧＭ−ＣＳＦおよびｒＩＬ−４の存在下で７日間培養し、そして精製したＣＤ３４−ＤＣをｒｆｌｔ３−リガンド、ｒＴＧＦ−β１、ｒＴＮＦ−α、ｒＳＣＦおよびｒＧＭ−ＣＳＦの存在下で１１日間培養した。培養期間後、細胞をＣＤ１ａーＦＩＴＣ、ＣＤ１ｃ−ＰＥ（ＡＤ５−８Ｅ７）、抗−ＢＤＣＡ−２ＰＥ（ＡＣ１１４）、抗−ＢＤＣＡ−３−ＰＥ（ＡＤ５−５Ｅ８）および抗−ＢＤＣＡ−４−ＰＥ（ＡＤ５−１７Ｆ６）で染色した。ヒストグラムは、それぞれ、（Ａ）Ｍｏ−ＤＣおよび（Ｂ）ＣＤ３４−ＤＣ（太線）を示す。薄罫線は、アイソタイプコントロールｍＡｂによる染色を示す。最も左部分のヒストグラムを除いて（ＣＤ１ａ染色）、ゲーティングされたＣＤ１ａ+細胞を（Ｂ）に示す。
【図８】図８は、抗−ＢＤＣＡ−２ｍＡｂ標識されたＢＤＣＡ２+細胞の培養が、急速なｍＡｂインターナリゼーションを引き起こすことを示す。ＰＢＭＣを、４℃でＦＩＴＣ結合抗−ＢＤＣＡ−２ｍＡｂ（ＡＣ１４４、ＩｇＧ１）で標識し、３７℃で示される時間インキュベートした。次いで、４℃でＰＥ結合ラット抗−マウスＩｇＧ１  ｍＡｂ（Ｘ５６）およびＣｙ５結合ＣＤ１２３  ｍＡｂ（ＡＣ１４５、ＩｇＧ２ａ）で染色した。ゲーティングされたＢＤＣＡ−２+ＣＤ１２３細胞の抗−ＤＢＣＡ−２−ＦＩＴＣ（黒四角）およびラット抗−マウスＩｇＧ１  ｍＡｂ−ＰＥ（黒三角）染色のＭＦＩ値を示す。
【図９】図９は、免疫磁性的に精製したＣＤ１ｃ+、ＢＤＣＡ−２+およびＢＤＣＡ−３+血液ＤＣの形態を示す。ＤＣ１ｃ+、ＢＤＣＡ−２＋およびＢＤＣＡ−３+細胞を、ＰＥ結合１次ｍＡｂ（ＡＤａ５−８Ｅ７、ＡＣ１４４およびＡＤ５−５Ｅ８）および抗−ＰＥ  ｍＡｂ結合ミクロビーズで間接磁性標識することによってＰＢＭＣから単離し、続いて、ＭＡＣＳによって標識した細胞の富化を行った。点プロットは、それぞれ、ＣＤ１ｃ+（上点プロット）、ＢＤＣＡ−２+（中点プロット）およびＢＤＣＡ（下点プロット）の磁性的な富化の前（左点プロット）および後（右点プロット）のＨＬＡ−ＤＲ−ＦＩＴＣおよびＰＥ結合ｍＡｂによるＰＢＭＣの染色を示す。右側の３つの像は、細胞遠心分離後の単離されたＣＤ１ｃ+（上点プロット）、ＢＤＣＡ−２+（中点プロット）およびＢＤＣＡ３+細胞のメイ−グリュンヴァルト／ギームザ染料を示す。富化されたＣＤ１ｃ+細胞の像において小さなリンパ球が見られ得ることに注意をすること。これらは，ＣＤ１ｃ+Ｂ細胞である。
【図１０】図１０は、培養時の、ＣＤ１ｃ+、ＢＤＣＡ−２+およびＢＤＣＡ−３+血液ＤＣ上のＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８３および同時刺激分子のアップレギュレーションを示す。精製したＣＤ１ｃ+（Ａ）、ＢＤＣＡ−２+（Ｃ）およびＢＤＣＡ−３+（Ｂ）を、それぞれ、培地中で１日間（ＣＤ１ｃ+およびＢＤＣＡ−３+ＢＤＣ）またはＣＤ３２−形質導入Ｌ細胞上のｒＩＬ−３および抗−ＣＤ４０ｍＡｂを含む培地で２日間（ＢＤＣＡ−２+）培養した。単球をｒＧＭ−ＣＳＦおよびｒＩＬ−４の存在下で培地中で７日間培養することによって、「未熟な」Ｍｏ−ＤＣ（Ｄ）を作製した。ＴＮＦαの存在下で未熟なＭｏ−ＤＣを培地中でさらに３日間培養することによって、「成熟した」Ｍｏ−ＤＣ（Ｅ）を作製した。ヒストグラムは、それぞれ、ＣＤ１ａ−ＦＩＴＣ、ＣＤ８０−ＰＥ、ＣＤ８３−ＰＥ、ＣＤ８６−ＰＥおよびＨＬＡ−ＤＲ−ＰＥによる細胞染色を示す（太線）。薄罫線は、アイソタイプおよび蛍光染色対応コントロールｍＡｂによる細胞染色を示す。
【図１１】図１１は、精製したＣＤ３+Ｔ細胞と比較した、新たに単離されたＣＤ１ｃ+、ＢＤＣＡ−２+およびＢＤＣＡ−３+血液ＤＣのエンドサイトーシス容量を示す。単離されたＣＤ１ｃ+ＤＣ（黒菱形）、ＢＤＣＡ−２+ＢＤＣ（黒三角）、ＢＤＣＡ−３+ＤＣ（黒四角）およびＣＤ３+Ｔ細胞（＊）を、３７℃で１ｍｇ／ｍｌのルシファーイエロー（ＬＹ）を含む培地中で０、１５、４５および７５分間インキュベートし、氷冷のＰＢＳ／ＥＤＴＡ／ＢＳＡ中で３度洗浄し、次いでフローサイトメトリーで分析した。ＭＦＩ値を減算後のＬＹ蛍光についてＭＦＩ値を示す。これはＬＹ非存在下での４℃でのインキュベーションで得られた。
【図１２】図１２は、ＢＤＣＡ−２のｃＤＮＡ配列を示す（配列番号１）。
【図１３】図１３は、抗−ＢＤＣＡ−２ｍＡｂ単独（Ａ）および／または抗ＢＤＣＡ−２および架橋二次ｍＡｂ（Ｂ、Ｄ、Ｅ）を介する細胞内Ｃａ２+動員が、免疫磁性的に精製したＢＤＣＡ−２+ＢＤＣＡ−４+血液ＤＣ（Ａ、Ｂ）およびＢＤＣＡ−２トランスフェクトＵ９３７細胞（Ｄ）において誘導されるが、非トランスフェクトＵ９３７細胞（Ｅ）において誘導されないことを示す。免疫磁性的に精製したＢＤＣＡ−２+ＢＤＣＡ−４+ＢＤＣにおけるＢＤＣＡ−４の抗−ＢＤＣＡ−４ｍＡｂおよび架橋二次ｍＡｂとの連結は、細胞内Ｃａ２+動員を誘導しない。時間（Ｘ−軸、１０２４の値は、２０４，８０秒に対応する）に対するインド−１−フルオレッセンス（Ｙ−軸）Ｃａ２+依存性の４０５ｎｍ／５２５ｎｍ比が示される。Ａは、ＢＤＣＡ−２＋ＢＤＣＡ−４＋血液ＤＣ、抗−ＢＤＣＡ−２（ＡＣ１４４、ＩｇＧ１）である。Ｂは、ＢＤＣＡ−２＋ＢＤＣＡ−４＋血液ＤＣ、抗−ＢＤＣＡ−２（ＡＣ１４４、ＩｇＧ１）およびラット抗−マウスＩｇＧ１（Ｘ５６）である。Ｃは、ＢＤＣＡ−２＋ＢＤＣＡ−４＋血液ＤＣ、抗ＢＤＣＡ−４（ＡＤ５−１７Ｆ６、ＩｇＧ１）およびラット抗マウスＩｇＧ１（Ｘ５６）である。Ｄは、ＢＤＣＡ−２トランスフェクトＵ９３７細胞、抗−ＢＤＣＡ−２（ＡＣ１４４、ＩｇＧ１）およびラット抗−マウスＩｇＧ１（Ｘ５６）である。Ｅは、非トランスフェクトＵ９３７細胞、抗−ＢＤＣＡ−２（ＡＣ１４４、ＩｇＧ１）およびラット抗−マウスＩｇＧ１（Ｘ５６）である。
【図１４】図１４は、特異的ｍＡｂ、続いて二次架橋ｍＡｂとのＢＤＣＡ−２の連結（しかしＢＤＣＡ−４は連結していない）が、インフルエンザウイルス株ＰＲ８による刺激に応答して、血液または扁桃由来のプラスマ細胞様  ＢＤＣＡ−２+ＢＤＣＡ−４+ＤＣによるＩ型インターフェロンの分泌を阻害することを示す。新たに単離された血液（Ａ）または扁桃（Ｂ）由来のプラスマ細胞様  ＢＤＣＡ−２+ＢＤＣＡ−４+ＤＣをＩＬ−３単独（コントロール）；ＩＬ−３、抗−ＢＤＣＡ−２ｍＡｂおよびラット抗−マウスＩｇＧ１  ｍＡｂ（ＡＣ１４４＋ＲａｍＧ１）；ＩＬ−３、抗−ＢＤＣＡ−２ｍＡｂ、ラット抗−マウスＩｇＧ１  ｍＡｂおよびインフルエンザウイルス株ＰＲ８（ＡＣ１４４＋ＲａｍＧ１＋ＦＬＵ）；ＩＬ−３およびインフルエンザウイルス株ＰＲ８（ＦＬＵ）；ＩＬ−３、抗−サイトケラチンｍＡｂ、ラット抗−マウスＩｇＧ１  ｍＡｂおよびインフルエンザウイルス株ＰＲ８（ＣＫ３＋ＲａｍＧ１＋ＦＬＵ）；ＩＬ−３、抗−ＢＤＣＡ−４ｍＡｂ、ラット抗−マウスＩｇＧ１  ｍＡｂおよびインフルエンザウイルス株ＰＲ８（１７Ｆ６＋ＲａｍＧ１＋ＦＬＵ）の存在下で２４時間培養した。培養上清中の分泌されたＩ型インターフェロン（Ｕ／ｍｌ）を、Ｉ型インターフェロン（Ｕ／ｍｌ）標準曲線を参照にしてバイオアッセイによって測定した。
【図１５】図１５は、単離されたＢＤＣＡ−２およびＢＤＣＡ−４発現プラスマ細胞様  ＤＣによるマウスＩｇＧ１に特異的なＴ細胞クローンに対する抗−ＢＤＣＡ−２−ｍＡｂ（ＡＣ１４４、ＩｇＧ１）の存在を示す。ＢＤＣＡ−２+ＢＤＣＡ−４+プラスマ細胞様  ＤＣは、Ｔ細胞に対して、抗−ＩＬＴ−３ｍＡｂ（ＺＭ３．８、ＩｇＧ１、黒三角）および抗−サイトケラチンｍＡｂ（ＣＫ３−１１Ｄ５、ＩｇＧ１、黒丸）よりも抗−ＢＤＣＡ−２ｍＡｂ（ＡＣ１４４、ＩｇＧ１、黒四角）をずっと効果的に提示する。
【図１６】図１６は、扁桃プラスマ細胞様ＣＤ１２３+ＤＣにおけるＢＤＣＡ−２およびＢＤＣＡ−４の発現を示す。
【図１７】図１７は、ニューロピリン（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ）−１（ジーンバンク受託番号００３８７３）は、抗−ＢＤＣＡ−４ｍＡｂ  ＡＤ５−１７Ｆ６（抗−ＮＲＰ−１（ＭＬ））により、ニューロピリン−１−トランスフェクトＰＥＡ細胞（ＮＰ）の細胞溶解産物から免疫沈澱するが、非トランスフェクトＰＡＥ細胞（Ｐ）の細胞溶解産物から免疫沈澱しないことを示す。沈殿タンパク質を、Ｓｈａｙ  Ｓｏｋｅｒ、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ'ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ（Ｓ）からのＢＤＣＡ−４特異的ｍＡｂ  ＡＤ５−１７Ｆ６（ＭＬ）またはニューロピリン−１特異的ｍＡｂを用いＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングによって分析した。
【図１８】図１８は、特異的ｍＡｂ、続いて二次架橋ｍＡｂとのＢＤＣＡ−２の連結（しかしＢＤＣＡ−４は連結していない）が、ポリＩ：Ｃによる刺激に応答して血液または扁桃由来のプラスマ細胞様ＢＤＣＡ−２+ＢＤＣＡ−４+ＤＣによるＩＮＦ−αの分泌を阻害することを示す。血液由来のプラスマ細胞様  ＢＤＣＡ−２＋ＢＤＣＡ−４＋ＤＣを、１０μｇ／ｍｌのＡＣ１４４  ｍＡｂ（２および４）またはマウスＩｇＧ１  ｍＡｂ（ＣＦ６Ｂ、抗−ＴＰＯ、１および３）で３７℃で３０分間培養した。
【図１９】図１９は、ＢＤＣＡ−２ｃＤＮＡについての、ＣＬＯＮＴＥＣＨから得たヒトの複数の組織のｃＤＮＡパネルの分析（レーン１：心臓；レーン２：脳；レーン３：胎盤；レーン４：肺；レーン５：肝臓；レーン６：骨格筋；レーン７：腎臓；レーン８：膵臓；レーン９：脾臓；レーン１０：胸腺；レーン１１：精巣；レーン１２：卵巣；レーン１３：小腸；レーン１４：リンパ節；レーン１５：骨髄；レーン１６：胎児の肝臓；レーン１７：扁桃）および血液白血球の異なる集団から調製されたｃＤＮＡの分析（レーン１８：Ｔ細胞；レーン１９：Ｂ細胞；レーン２０：ＮＫ細胞；レーン２１：単球；レーン２２：ＣＤ１１ｃbrightＣＤ１２３lowＢＤＣ；レーン２３：ＣＤ１１ｃ−ＣＤ１２３birhgtプラスマ細胞様  ＤＣ）を示す。コントロールは、Ｇ３ＰＤＨである。
【図２０】図２０は、ＢＤＣＡ−２転写物のスプライス改変体を示す。スプライス改変体を、発現分析において使用するＢＤＣＡ−２に対して特異的なプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲによって分析した。増幅したフラグメントはプラスミドベクターにクローニングし、そして配列決定された。
【図２１】図２１は、デクチン−２転写物のスプライス改変体を示す。
【図２２】図２２は、ＢＤＣＡ−２およびマウスデクチン−２のｍＲＮＡ配列の配列を示される推定イントロンの正確な位置とともに示す。図２３において、＊は、全ての整列された配列における同一の保存された残基を表し、：は保存的置換を表し、．は、半保存的置換を表し、影付き領域は、保存的炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）を示し、イタリックは、推定膜貫通ドメインを示す。以下のシンボルは、ＣＲＤにおいてＣ型レクチン間で強く保存された残基を強調表示する。
【化１】
0005599834.tif 000002
【図２３】図２３は、ヒトＢＤＣＡ−２、ヒトＤＣＩＲおよびマウスデクチン−２のアミノ酸配列の配列を示す。
【図２４】図２４は、ＢＤＣＡ−３特異的ｍＡｂ  ＡＤ５−１４Ｈ１２（ＩｇＧ１）を用いて表面ビオチン化ＨＤ−ＭＹ−Ｚ細胞の細胞溶解産物から免疫沈澱したＢＤＣＡ−３を示す。特異性のコントロールのために、ＣＤ１９−特異的ｍＡｂ  ＳＪ２５−Ｃ１（ＩｇＧ１）を使用した。沈殿タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１２％）およびストレプトアビジンペルオキシダーゼを用いたウエスタンブロッティングによって分析した。ＢＤＣＡ−３特異的ｍＡｂ  ＡＤ５−１４Ｈ１２は、ＨＤ−ＭＹ−Ｚ細胞由来の約１００ｋＤの細胞表面タンパク質を特異的に免疫沈殿することに注意すること。従って、ＢＤＣＡ−３は、見かけの１００ｋＤの分子量を有する。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ＤＣにおいて富化された細胞集団およびそれらのサブセットについて富化する方法に関する。ＤＣについて富化された組成物およびそれらから得られた細胞集団もまた、本発明によって提供される。改変された細胞についての方法および組成物も提供される。遺伝的に改変された細胞を含む、改変された細胞の組成物もまた提供される。改変と非改変の両方の細胞の使用方法が提供される。抗原結合フラグメントおよびそれらによって認識される抗原も提供される。
【００６０】
免疫磁性的に精製したＣＤ４+ｌｉｎ-ＤＣ（これらは、３つのＤＣ抗原を同定する：ＢＤＣＡ−２、ＢＤＣＡ−３およびＢＤＣＡ−４）に対して惹起される新規のｍＡｂのパネルが本明細書中に記載される。ＢＤＣＡ−２、ＢＤＣＡ−３は新規である。ＢＤＣＡ−４の場合、ＤＣ特異的抗原として以前に記載されていないが、抗原はニューロピリン（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ）−１（神経細胞誘導を媒介するコラプシン／セマホリンファミリーに対するレセプター）として同定された。Ｈｅら（１９９７）Ｃｅｌｌ  ９０：７３９−７５１。
【００６１】
非培養ヒト血液において、ＢＤＣＡ−２およびＢＤＣＡ−４の発現は、プラスマ細胞様  ＣＤ１２３brightＣＤ１１ｃ-ＤＣに厳密に制限され、一方、ＢＤＣＡ−３は、ＣＤ１２３-ＣＤ１１ｃdimＤＣの小集団に制限される。このＢＤＣＡ−３+集団は、伝統的なＣＤ１２３dimＣＤ１１ｃbrightＤＣと多くの免疫表現型特性を共有するが、ＣＤ１２３dimＣＤ１１ｃdimＤＣと異なって、ＢＤＣＡ−３+ＤＣはＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）、ＣＤ２およびいくつかのＦｃレセプターの発現を欠く。
【００６２】
精製されていないＤＣの供給源は、当該分野において公知の任意のもの（例えば、骨髄、胎児、新生児または成体あるいは他の造血細胞供給源（例えば、胎児の肝臓、末梢血または臍帯血液扁桃、リンパ節、鼻粘膜、脾臓、皮膚、気道上皮、肺、肝臓消化管、パイエル腺叢など））であり得る。ＤＣはまた、前駆細胞由来のＤＣのような培養細胞から単離され得る。種々の技術が細胞を分離するために利用され得る。例えば、ネガティブ選択法によって、非ＤＣを最初に除去し得る。ｍＡｂは、ポジティブ選択とネガティブ選択との両方に対して特定の細胞系統および／または分化の段階に関する同定マーカーとして特に有用である。
【００６３】
所望される場合、最終的に分化した細胞の大集団が、比較的粗いネガティブ分離を用いて最初に除去され得る。例えば、磁気ビーズ分離は、多くの関連しない細胞を除去するために最初に使用され得る。全細胞の少なくとも約８０％、通常少なくとも約７０％が、ＤＣの単離前に除去される。好ましくは、ＤＣは、ポジティブ選択によって細胞供給源から直接単離される。
【００６４】
分離のための手順としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：密度勾配遠心分離；ロゼッティング（ｒｏｓｅｔｔｉｎｇ）；細胞密度を改変する粒子とのカップリング；抗体でコーティングされた磁気ビーズまたは抗体でコーティングされたｆｅｒｏ流体（非粒子（ｎｏｎｏｐｏｒｔｉｃｌｅ））を用いた磁性分離；アフィニティークロマトグラフィー；ｍＡｂに結合するか、またはｍＡｂと組み合わせて使用される細胞毒性剤（相補体および細胞毒素を含むが、これらに限定されない）；および固体マトリックス（例えば、プレート）に付着した抗体によるパニング、洗浄または任意の他の便利な技術。
【００６５】
正確な分離および分析を提供する技術としては、以下があげられるが、これらに限定されない：磁気ビーズ分離およびフローサイトメトリー（これらは、洗練さの程度を変化し得る（例えば、複数の色チャネル、ローアングルおよび鋭い光散乱検出チャネル、インピーダンスチャネルなど）。
【００６６】
細胞は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）のような死細胞に関連する染料を利用して、死細胞と対比して選択され得る。好ましくは、細胞は、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）のような２％血清、またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む培地、あるいは任意の他の適切な、好ましくは、無菌の等張培地中を収集される。生理学的指標として、ＨＡＳが好ましい。細胞の遺伝的改変は、ＲＮＡでトランスフェクトされた組換えＤＮＡ構築物を有する実質的に均質な細胞組成物の形質導入、細胞融合、抗原の充填および当該分野において公知の種々の方法および／または本明細書に中で記載される種々の方法よってそれらが維持される間の任意の点で達成され得る。
【００６７】
細胞の改変のために、レトロウイルスベクターが利用され得るが、任意の他の適切なベクター、送達システムまたは細胞改変が利用され得る。これらは、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、人工染色体、酵母または腫瘍のような抗原供給抗原由来のＲＮＡを含む。遺伝子改変は、あるならば、成熟ＤＣが有限の寿命を有するので永続する必要がない。遺伝子アプローチは、免疫または寛容を誘導するために、ＤＣにおいて外来（腫瘍、ウイルス、寄生物など）の抗原または自己抗原を発現するために使用される。改変の寿命はまた、（Ｔ細胞によるように）治療を制限する自殺遺伝子によって制御され得る。
【００６８】
形質導入の方法としては、当該分野において周知の任意の以下のものが挙げられるが、これらの限定されない：例えば、Ｂｒｅｇｎｉら（１９９２）Ｂｌｏｏｄ  ８０：１４１８−１４２２によって記載される方法によって、プロデューサー細胞と共に細胞を直接同時培養する方法、または、例えば、Ｘｕら（１９９４）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔ．２２：２２３−２３０；およびＨｕｇｈｅｓら（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８９：１８１７によって記載される方法によって、適切な増殖因子およびポリカチオンと共に、あるいはそれらなしで、ウイルス上清のみと共に培養すること。
【００６９】
宿主への抗原を発現するための抗原を発現するか、または抗原を充填された改変細胞の再導入実施形態に、Ｔ細胞は活性化されるか、アネルギー（ａｎｅｒｇｉｚｅ）されるか、または除去され、そして抗原に対して特異的に指向する。通常、適切な抗原としては、ウイルス的に感染された細胞、または癌細胞によって発現された抗原、微生物、酵母、原生動物、自己抗原（寛容源）およびアレルギー源が挙げられる。より具体的に、適切な抗原としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない；ウイルスタンパク質、癌細胞のタンパク質、組織特異的タンパク質または免疫寛容タンパク質。Ｔ細胞の「誘導」は、欠失またはアネルギーによるような抗原特異的Ｔ細胞の不活性化を含み得る。不活性化は、それぞれ器官移植および自己免疫疾患におけるような寛容を確立または再確立するために特に有用である。改変されたＤＣは、当該分野において公知の任意の方法によって投与され得、これは、静脈内、皮下内、結節内および胸腺に直接を含むが、これらに限定されない。好ましくは、投与は静脈内（ＩＶ）である。
【００７０】
しばしば、細胞免疫治療は、骨髄血球搬出収集物またはヒト宿主由来の他の細胞の供給源の除去、供給源からの細胞の単離を含む。一方、宿主は、造血幹細胞移植が行われる場合、ネイティブの造血能力を部分的、実質的または完全に除去するために処置され得る。単離された細胞は、所望の改変を有する細胞を提供するために、この時間の間改変され得る。完全な造血除去の場合、幹細胞増強がまた必要とされる。次いで、細胞または改変された細胞は、宿主に貯蔵され、新規の能力を提供する。細胞除去の方法、宿主除去および幹／前駆細胞再増殖が当該分野において公知である。
【００７１】
改変された細胞は、通常、静脈内、結節内および皮下内に、任意の生理学的に受容可能なビヒクルの形態で投与され得る。通常、少なくとも、１×１０5の細胞、好ましくは、１×１０6以上の細胞が投与される。細胞は、注射、カテーテルなどによって導入され得る。所望される場合、因子はまた以下を含み得るが、これらに限定されない；インターロイキン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１２およびｆｌｔ−リガンド）および他のインターロイキン、コロニー刺激因子（例えば、Ｇ−、Ｍ−およびＧＭ−ＣＳＦ）インターフェロン（例えば、γ−インターフェロン）。
【００７２】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸残基のポリマーをいうために、本明細書中で交換可能に使用される。ポリマーは、直鎖または分枝であり得、これは、改変されたアミノ酸残基またはアミノ酸アナログを含み得、そしてこれは、アミノ酸残基以外の化学的部分によって中断され得る。この用語はまた、自然にまたは介入によって改変されたアミノ酸ポリマーを含み、これは以下を含むが、これらに限定されない：ジスルフィド結合フォーメーション、グリコシル化、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）、アセチル化、リン酸化、あるいは任意の他の操作または改変（例えば、標識または生物活性化成分との結合）。他に記述または示されない場合、用語、抗原結合フラグメントは、免疫学的な特異性を有する任意のポリペプチドモノマーまたはポリマー（これは、インタクトな抗体を含む）、および本明細書中に記載されるような、より小さい、およびより大きい機能的に等価なポリペプチドを含む。
１．抗原結合フラグメントおよびそれらの組成物
本発明は、ＤＣを特異的に認識する抗原結合フラグメントを含む。すなわち、抗原は、ＤＣ上で見出され、その結果、抗原を認識する抗原結合フラグメントは優先的にＤＣまたはそれらのサブセットを認識するか、または結合する。あるいは、ＢＤＣＡ−４によるように、抗原は、他の細胞型で見出される；しかし、造血細胞内で、抗原はＤＣ上に主に発現する。
【００７３】
本発明はさらに、少なくとも１つのＤＣ抗原に結合する単離された抗原結合フラグメントを含む物質の組成物を包含する。好ましくは、抗原結合フラグメントは、ＡＣ１４４、ＡＤ５−１３Ａ１１、ＡＤ５−２０Ｅ５、ＡＤ５−１７Ｆ６、ＡＤ５−４Ｂ８、ＡＤ５−５Ｅ８、ＡＤ５−１４Ｈ１２およびＡＤ５−８Ｅ７と命名されたｍＡｂであるか、またはこれに由来する。表１は、各ｍＡｂによって認識される抗原およびエピトープ、ならびにＤＣに特異的なｍＡｂのアイソタイプを示す。
【００７４】
【表１】
0005599834.tif 000003
非培養ヒト血液において、ＢＤＣＡ−２およびＢＤＣＡ−４はＣＤ１２３brightＣＤＣ１１ｃ-ＤＣ集団により発現される。このＤＣ集団は、現在一般にプラスマ細胞様ＤＣ（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ  ＤＣ）といわれている。ＢＤＣＡ−２またはＢＤＣＡ−４をプラスマ細胞様ＤＣの免疫磁気性単離および／またはフローサイトメトリー同定のための表面マーカーとして用いることで、本明細書に記載されるこれらの細胞の頻度、免疫表現型、形態、エンドサイトーシス能および成熟化についての結果は、白血球抗原のラージパネルが用いられる以前の報告と完全に一致した。このことは、両方の抗原が、非培養ヒト血液中のプラスマ細胞様ＤＣに対する有用なマーカーであることをはっきりと説明する。扁桃細胞の染色は、末梢リンパ器官のプラスマ細胞様ＤＣに関連するＴ細胞域がまた、他のリンパ組織関連ＤＣ集団（例えば、ＢＤＣＡ−２およびＢＤＣＡ−４の発現に基づく、胚中心ＤＣ、樹枝状ＤＣ（ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｔｉｎｇ  ＤＣ）、および小胞ＤＣ）からも区別され得ることを示す（図１６）。
【００７５】
ＢＤＣＡ−２と異なり、ＢＤＣＡ−４はまた、インビトロでの種々の分化型ＤＣ集団で発現される：（１）ＢＤＣＡ−２と対比して、ＢＤＣＡ−４は、Ｍｏ−ＤＣおよびＣＤ３４−ＤＣの両方で発現される；（２）ＢＤＣＡ−２の発現は、培養中でいったんＩＬ−３媒介成熟化を受けると、プラスマ細胞様ＤＣにおいて完全にダウンレギュレートされるが、ＢＤＣＡ−４の発現は、培養されたプラスマ細胞様ＤＣにおいて実際にアップレギュレートされる；および（３）ＢＤＣＡ−２と対比して、ＢＤＣＡ−４は、培養されたＣＤ１１ｃ+ＤＣの大部分によって１２時間以内に発現される。これにより、このことが、ＣＤ１ｃ+ＤＣ１１ｃbrightの大集団にとってのみ事実なのか、またはＣＤ１ｃ-ＣＤ１１ＣdimＣＤ１２３-の小集団にとってもまた事実なのか不明確にしている。プラスマ細胞様ＤＣ以外のＢＤＣＡ−４+細胞が非培養ヒト血液に存在しないという発見は、実際に、上述の分化型ＢＤＣＡ−４+ＤＣ集団のインビトロでの対応物が血液中に存在しないことを示す。
【００７６】
抗ＢＤＣＡ−２ｍＡｂを用いたＢＤＣＡ−２の架橋は、抗原−Ａｂ複合体の急速なインターナリゼーションを誘導する。ＤＣに対する他のエンドサイトーシスレセプターと類似して、これらは、ランゲリン（Ｌａｎｇｅｒｉｎ）のように成熟に対してダウンレギュレートされる（Ｖａｌｌａｄｅａｕら、（２０００）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １２：７１−８１）。したがって、ＢＤＣＡ−２は抗原捕捉機能を有するレセプターであり得る。ＢＤＣＡ−２は、Ｃ型レクチンであり、連結後に急速にインターナリゼーションされ（図８）、そしてＢＤＣＡ−２リガンドはプロセスを受けてＴ細胞に対して提示される（図１５）。従って、ＤＥＣ−２０５のように、ＢＤＣＡ−２は、Ｔ細胞に対するリガンドとして抗原取り込み機能および提示機能を有する。
【００７７】
ＢＤＣＡ−３の発現は、非培養ヒト血液中でＣＤ１ｃ-ＣＤ１１ｃdimＣＤ１２３-ＤＣの小集団に限定される。表現型、形態、エンドサイトーシスの能力および成熟の必要条件に関して、このＤＣ集団はＣＤ１+ＣＤ１１ｃbrightＣＤ１２３dimＤＣ集団と全く同一である。しかし、ＢＤＣＡ−３およびＣＤ１ｃ発現自体は別にして、免疫表現型分析により、いくつかの決定的な相違が明らかにされた。：ＣＤ１ｃ+ＢＤＣと対比して、ＢＤＣＡ−３+は、ＦｃレセプターＣＤ３２、ＣＤ６４、およびＥｃｏＲＩを発現しない、そしてこれらはＣＤ２を発現しない。Ｆｃレセプター発現の欠損は、ＣＤ１ｃ+ＢＤＣと異なりＢＤＣＡ−３+は、Ｉｇ媒介の抗原取り込み能を有しないことを示す（Ｆａｎｇｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：５４１−５４８；Ｆａｎｇｅｒら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：３０９０−３０９８；およびＭａｕｒｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：６０７−６１６）。本明細書で示されるように、ＢＤＣＡ−３は１００ｋＤのタンパク質である。
【００７８】
ＣＤ１ｃ-ＣＤ１１ｃdimＤＣと対比して、ＤＣ１ｃ+ＣＤ１１ｃbrightＤＣが、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４およびＴＧＦ−β１と共に培養された場合、ランゲルハルス細胞の特性（Ｌａｇ抗原、Ｅ−カドヘリン、およびランゲリンの発現、ならびにバーベック顆粒の存在）を取得する能力を有することについての証拠がある。ＢＤＣＡ−３+ＤＣおよびＣＤ１ｃ+ＤＣが小細胞型の成熟工程を示す場合、このことは、ＢＤＣＡ−３+ＤＣがランゲルハルス細胞に分化する能力をすでに失っているかまたはまだ獲得していないかのいずれかであることを示す。
【００７９】
本明細書で示される結果とは逆に、Ｉｔｏら（１９９９）は、ＣＤ１ｃ-ＣＤ１１ｃdimＤＣと異なり、ＣＤ１ｃ+ＣＤ１１ｃbrightＤＣが、ＣＤ１ａを発現することを報告した。ＢＬ−６およびＢ５の２つのｍＡｂは、ＣＤ１ａの染色のために使用され、そしてこの２つのｍＡｂを比較した場合、染色強度の違いが実際に観察された（Ｂ−Ｂ５での染色がおそらくより鮮やかであった）。本明細書中で示されるように、ＤＣの染色は、ＣＤ１ａ  ｍＡｂであるＢＬ−６およびＨＩ４９の至適滴定量を用いた場合明らかに陰性であったが、Ｂ−Ｂ５を用いた場合陽性であった。さらに、ＢＬ−６およびＨＩ１４９と異なり、Ｂ−Ｂ５は血液中の高い割合のＣＤ１９+Ｂ細胞を染色した。従って、Ｂ−Ｂの染色パターンは、ＣＤ１ａ  ｍＡｂよりもＣＤ１ｃ  ｍＡｂのはっきりとした暗示であり、そして実際にＣＤ１ｃ  ｍＡｂ  ＡＤ５−８Ｅ７は、Ｂ−Ｂ５のＭＯＬＴ−４細胞への結合を阻害する。従って、本発明者らは、Ｂ−５がＣＤ１ｃを認識すること、およびＣＤ１ｃ+ＤＣがＣＤ１ａを発現しないことを結論づける。
【００８０】
ＣＤ１ｃ、ＣＤ２およびＣＤ１４についてのＣＤ１ｃ+ＤＣの染色は、低い割合のＤＣが、変動し得る程度でＣＤ１４を発現すること、およびこれらの細胞でのＣＤ１ｃおよびＣＤ２の発現レベルが、ＣＤ１４の発現レベルと反比例することを明らかにした。この観察は、直系の分化モデル従い、ＣＤ１ｃ+ＣＤ２+ＣＤ１１ｃbrightＣＤ１４-ＤＣは、両方の細胞型の共通の前駆体の子孫というよりはＣＤ１４+ＣＤ１ｃ-ＣＤ２-単球の子孫である。かなりの割合のＣＤ１４＋単球がすでに非常に低レベルのＣＤ２を発現し、そしてＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４と共に培養された場合に、代表的な樹枝状の形態および強力なＴ細胞刺激性を有する成熟ＤＣに急速に分化する能力を有することの観察によりこの概念はさらに支持される（Ｃｒａｗｆｏｒｄら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：５９２０−５９２８）。
【００８１】
ＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）、ＢＤＣＡ−２、ＢＤＣＡ−３およびＢＤＣＡ−４のｍＡｂの使用は利便性、および明白な機能的摂動なしにＰＢＭＣ、白血球搬出物質、全血、扁桃などからＤＣを迅速に検出、列挙および単離する簡便でかつ有効な方法を提供する。これは、これらのさらなる機能的および分子的な特徴付けに対する補助として価値があり、これらの相互関係を明らかにする際に有用であり得る。さらに、非常に均質にＤＣ集団を容易に単離する能力はこれらの病理的な使用を容易にする。この抗原結合フラグメントはまた、組織（非造血組織（限定することなく、気道上皮、皮膚、腸、肺および肝臓が挙げられる）および造血組織（限定することなく、扁桃、脾臓、リンパ節および胸腺が挙げられる）の両方）からのＤＣの検出、列挙および／または単離の際に有用である。
【００８２】
抗体を分泌するハイブリドーマもまた、本発明に含まれ、それらの抗原結合フラグメントを発現する他の細胞についても同様に本発明に含まれる。ＢＣＤＡ−２またはＢＣＤＡ−３またはＢＣＤＡ−４を特異的に認識する任意の抗原フラグメントもまた本発明に含まれる。表１および本発明で提供される実施例に見られるように、これらの抗原を特異的に認識する複数のタイプのｍＡｂが産生され得る。また、本明細書に示される結果に見られるように、抗原結合フラグメントは、同じ抗原に対する同じエピトープであると認識する必要はない。このような全ての抗原結合フラグメントおよびこれらの組成物は、本発明に含まれる。
【００８３】
用語「抗原結合フラグメント」は、優先的にＤＣまたはこれらの亜集団に結合する任意の一部分を含む。適切な一部分としては、所望の標的分子と結合するアプトマーとして公知のオリゴヌクレオチド（ＨｅｒｍａｎｎおよびＰａｎｔｅｌ（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９：８２０−８２５）、炭水化物、レクチン、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）2、Ｆａｂ'、ｓｃＦｖ（単量体形態および多量体形態の両方）および単離されたＨ鎖およびＬ鎖のようなＩｇフラグメント、が挙げられるがこれらに限定されない。抗原結合フラグメントは、インタクトなＩｇの特異性を保持するが、アビディティーおよび／またはアフィニティーは変化され得る。
【００８４】
該して、本明細書中に記載される特定の化合物、組成物および方法は、含有する抗原決定基が提供されれば、標準的な免疫化学技術により慣用的に生成され得る抗体およびこれらの誘導体に関する。これらとしては、例えば、化学結合により、もしくは賦形剤またはアジュバンドと混合することにより結合した別の化合物と結合した抗原結合フラグメントが挙げられるがこれらに限定されない。特異的な結合パターンおよびこれらを作製する方法は、本明細書中に記載されており、そして当該分野で公知である。
【００８５】
抗原結合フラグメント（これらの「誘導体」もまた含む）は、代表的に遺伝子操作により生成されるが、これらは他の方法および方法の組み合わせにより代替的に獲得され得る。これらの種別としては、加工ペプチドフラグメントおよび融合タンパク質が挙げられるがこれらに限定されない。好ましい化合物として、抗ＤＣ  ＣＤＲを含むポリペプチドフラグメント、サイトカインエフェクター要素を含む抗体融合タンパク質、アジュバンドまたは薬剤を含む抗体融合タンパク質、腫瘍細胞由来の抗原を含む抗体融合タンパク質、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、酵母抗原、自己抗原またはそれから誘導された抗原性ペプチド（Ｔ細胞エピトープ）、および単鎖Ｖ領域タンパク質が挙げられる。抗原結合フラグメントは、これらがヒト供給源から単離された場合、ヒト起源の抗原結合フラグメントであると考えられ、そして直接使用されるかあるいは他の細胞型およびこれらの誘導体またはヒト染色体全体もしくはその一部分（例えば、ＶH、ＤH、ＪH、ＶL、ＪL、ＣH、ＣLの遺伝子セグメントをコードするヒト染色体を有するマウス）おいてクローン化されそして発現される。
【００８６】
「融合ポリペプチド」は、天然で見出されるものとは異なる位置で連続するペプチド領域を含むポリペプチドである。この領域は、通常別々のタンパク質に存在し得、１つにされて融合タンパク質となる；これらは通常同じタンパク質内に存在し得るが、この融合ポリペプチドにおいて新しい配置に置かれる；またはこれらは合成的に配置され得る。例えば、本発明は、抗原結合フラグメントの機能的部分およびトキシンのような別のペプチドからなる組換えタンパク質（およびこのタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはこれに相補なポリヌクレオチド）を含む。これらの融合タンパク質を作製する方法は当該分野で公知であり、例えばこれらは、ＷＯ９３／０７２８６に記載される。
【００８７】
ポリペプチドの「機能的に等価なフラグメント」は、付加、欠損、置換の任意の組み合わせによりネイティブの配列と異なるが、用いられる状況に関連するフラグメントの少なくとも１つの機能的特性は保護されている。
【００８８】
抗原結合フラグメントは、免疫性疾患に関連する臨床的状態を緩和する際に有用である。本発明はさらに、抗原結合フラグメントのポリペプチド誘導体および診断、処置、および新規薬剤の製造においてこれらの組成物を使用するための方法を包含する。
【００８９】
本発明はまた、科学的機能部分と結合した抗原結合フラグメントを包含する。代表的には、この部分は、検出可能なシグナルを生成し得る標識である。これらの複合化した抗原結合フラグメントは、例えば、幹細胞移植後および化学療法のような免疫切除療法後の種々の組織、種々の疾患におけるＤＣの定量、ならびに例えば化学療法または自己免疫療法後のＤＣの照射および画像化のような決定システムにおいて有用である。このような標識は当該分野で公知であり、放射性同位体、酵素、蛍光化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、基質コファクターおよび基質インヒビターならびに磁粉が挙げられるがこれらに限定されない。これらの標識の使用を教示する特許の例については、例えば、米国特許番号第３，８１７，８３７号；３，８５０，７５２号；３，９３９，３５０号；３，９９６，３４５号；４，２２７，４３７号；４，２７５，１４９号；および４，３６６，２４１号を参照のこと。この部分は、共有結合され得るか、組換え的に結合され得るか、または第２の薬剤（例えば、二次抗体、プロテインＡ、またはビオチン−アビジン複合体）を通じて（共有的にまたは非共有的に）結合され得る。
【００９０】
他の機能的部分としては、シグナルペプチド、免疫学的応答性を増強する薬剤、固体支持体との結合を容易にする薬剤、ワクチンキャリアー、生物応答修飾因子、常磁性標識および常磁性薬物が挙げられるがこれらに限定されない。シグナルペプチドは、原核生物形態および真核生物形態を含む。免疫学的応答性を増強する薬剤としては、細菌スーパー抗原およびアジュバンドが挙げられるがこれらに限定されない。固体支持体との結合を容易にする薬剤としては、ビオチン、アビジンまたはこれらの誘導体が挙げられるがこれらに限定されない。免疫原キャリアとしては、任意の生理学的に受容可能なバッファーが挙げられるがこれに限定されない。生物応答修飾因子としては、サイトカイン、特定の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＩＬ−２、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、ＧＭ−ＣＳＦ；ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＴＧＦ−βおよび特定のインターフェロン、ならびにケモカイン（ＭＩＰ−３β、ＳＤＦ−１、リンホタクチン、ＤＣ−ＣＫ１、エオタキシン、ＩＰ−１０、ＴＡＲＣ、ランテス、ＭＩＰ−１ｘ、ＭＩＰ−１Ｂ、ＳＬＣ、１−ＴＡＣ、ＭＩＧ、ＭＤＣ、ＭＣＰ−１、ＴＣＡ−３、ＭＣＰ−２、−３、−１）が挙げられるがこれらに限定されない。米国特許第５，７５０，１１９号；およびＷＯ特許公開：９６／１０４１１；９８／３４６４１；９８／２３７３５；９８／３４６４２；９７／１００００；９７／１０００１；および９７／０６８２１もまた参照のこと。このように、ケモカインは、Ｔ細胞のような他の細胞を誘引するのに有用であり得る。
【００９１】
「シグナルペプチド」または「リーダー配列」は、細胞膜（通常は真核生物細胞における小胞体（ＥＲ）で）ならびに細菌の内膜か、もしくは内膜および外膜の両方のいずれかを通じて、新たに合成されたタンパク質を指向する短いアミノ酸配列である。シグナルペプチドは、代表的にポリペプチドのＮ末端に存在し、そして生合成と細胞からまたはＥＲ膜を通じたポリペプチドの分泌との間に酵素的に除去される。従って、シグナルペプチドは、分泌タンパク質には存在しないが、タンパク質産生時にのみ存在する。
【００９２】
単鎖複合体を含む免疫毒素は、組換え手段により生成され得る。種々の免疫毒素の生成は、当該分野で公知であり、そして例えばその方法は、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ａｉｍｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍａｇｉｃ  Ｂｕｌｌｅｔ」、Ｔｈｏｒｐｅら（１９８２）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１６８−１９０頁；Ｖｉｔａｔｔａ（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８−１１０４；およびＷｉｎｔｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３−２９９で見出される。適切な毒素としては、リシン、放射性核種、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ジフテリア毒素、リシンＡ鎖、真菌毒素（例えば、真菌リボソーム不活性化タンパク質（例えば、ゲロニン、レストリクトシンおよびホスホリパーゼ酵素））が挙げられるがこれらに限定されない。該して、「Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｔｏｘｉｎｓ」、ＯｌｓｅｎｓおよびＰｉｈｌ、Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．１５：３５５−３９１（１９８１）；および「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、ＢａｌｄｗｉｎおよびＢｙｅｒｓ編、１５９−１７９頁、２２４−２６６頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８５）を参照のこと。
【００９３】
化学的に機能的な部分は、例えば抗原結合フラグメントおよび機能領域をコードする融合遺伝子を、他の遺伝子から作製することにより（例えば、酵素）、組換え的に作製され得る。遺伝子融合の場合、２つの成分が同じ遺伝子内に存在することになる。あるいは、抗原結合フラグメントは、周知の種々の化学的手順にいずれかにより、この部分に化学的に結合され得る。例えば、この部分がタンパク質である場合、この結合は、ホモ二機能性クロスリンカーまたはヘテロ二機能性クロスリンカー（例えば、ＳＰＤＰ、ＳＭＣＣ、カルボジイミド、グルタラルデヒドなど）によりなされ得る。この部分は、二次的な薬剤（二次抗体、プロテインＡ、またはビオチン−アビジン複合体が挙げられるがこれらに限定されない）を通じて共有的に結合または複合化され得る。常磁性部分および抗体に対するこれらの複合体は当該分野で周知である。例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉら（１９９０）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  １１：２３１−２３８を参照のこと。
【００９４】
ここで、本出願人は、当該分野において記載される問題（Ｏ'Ｄｏｈｅｒｔｙら（１９９３）；およびＹａｍａｇｕｃｈｉら（１９９５））を、近年記載された対側性（ｃｏｎｔｒａｌａｔｅｒａｌ）フットパッド免疫化手順を用いて克服した。Ｙｉｎら、（１９９７）Ｂｌｏｏｄ  ９０：５００２−５０１２を参照のこと。このシステムは、抗原に遭遇しない限り末梢リンパ器官を継続的に再循環するが、いったん抗原により活性化された場合１週間でないとしても、数日間末梢リンパ器官に直ちに保持されるナイーブな抗原特異的Ｔ細胞およびＢ細胞を使用する。ＰＩＣＫＥＲら（１９９２）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：５６１−５９１；Ｂｕｔｃｈｅｒら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：６０―６６；Ｂｒａｄｌｅｙら（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：３１２：３２０；Ｗａｔｓｏｎら（１９９８）Ｃｅｌｌ．Ａｄｈｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．６：１０５−１１０；Ｋｅａｒｎｅｙら（１９９４）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １：３２７−３３９；Ｊａｃｏｂら（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：６７９−６８７；Ｒｉｄｄｅｒｓｔａａｄら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：４６８８−４６９５；およびＴａｒｌｉｎｔｏｎ（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：２４５−２５１を参照のこと。本明細書で提供される実施例において、−３、０、４、７、１１および１４日目にブリストロール−８Ｂリンパ芽球腫細胞をマウスの左フットパッドに注射し、一方で０、４、７、１１および１４日目にＤＣを右フットパッドに注射した。共有抗原に対する特異性を有するナイーブなＢ細胞およびＴ細胞（例えば、ＨＬＡクラスＩＩ分子）は、−３日目と０日目との間の左膝窩リンパ節において、ブリストール−８細胞により活性化され、その上そこで保持される。他方、ＤＣに対する固有の抗原に対して特異性を有する全てのリンパ球は０日目以降の右膝窩リンパ節において活性化について利用可能なまま維持される。
【００９５】
この免疫化技術を、大多数のＤＣの迅速な単離のための強力な手順と組み合わせ、そして３つの新規のＤＣ抗原（ＢＤＣＡ−２、ＢＤＣＡ−３およびＢＤＣＡ−４）を認識するｍＡｂのパネルの生成を可能にした。さらなるＤＣ特異的抗体を生成する際でのこの抗原の使用により、より多くの成功の機会を有する抗体生成のより伝統的な方法の使用が可能になる。
【００９６】
抗体の産生および単離の方法は当該分野で周知である。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。一般的な抗体精製方法としては、塩析（例えば、硫酸アンモニウムを用いる塩析）；イオン交換クロマトグラフィー（例えば、カチオンまたはアニオン交換カラムを中性ｐＨで行い、そして漸増イオン強度の段勾配で溶出するイオン交換クロマトグラフィー）、ゲル濾過クロマトグラフィー（ゲル濾過ＨＰＬＣを含む）；およびアフィニティー樹脂（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、ヒドロキシアパタイトまたは抗Ｉｇ）でのクロマトグラフィーが挙げられるがこれらに限定されない。抗原結合フラグメントはまた、ＤＣまたはこれらの抗原部分を含むアフィニティーカラムで精製され得る。好ましくは、フラグメントは、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ−ＣＬ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅTM４Ｂクロマトグラフィー、その後にＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅTM４Ｂイオン交換カラムを用いて精製される。
【００９７】
本発明はまた、ハイブリッド抗体を包含する。この抗体において、一対のＨ鎖およびＬ鎖は一次抗体からえられ、他の対のＨ鎖およびＬ鎖は異なる二次抗体から得られる。本発明の目的のためには、一対のＬ鎖およびＨ鎖は抗ＤＣ抗体由来である。１つの例において、それぞれのＬ−Ｈ鎖は、ＤＣ特異的抗原の異なるエピトープに結合する。このようなハイブリッドはまた、ヒト化したＨ鎖またはＬ鎖を用いて形成し得る。本発明はまた、他の二特異性抗体（例えば、定常領域を通じて共有結合した２つの別々の抗体を含む抗体）を包含する。
【００９８】
本発明に包含される他の抗原特異的フラグメントは、Ｈ鎖またはＬ鎖が付加的な特性を提供するため改変された抗体である。例えば、アミノ酸配列の変化は、生じたポリペプチドの免疫原性の減少を引き起こし得る。この変化は、１つ以上のアミノ酸残基からＣ領域ドメインのような領域の完全な再設計までの範囲に及ぶ。代表的な変化としては、補体結合、膜レセプターとの相互作用および他のエフェクター機能に関与する変化が挙げられるがこれらに限定されない。組換え抗体はまた、基質（例えば、サイトカイン）の細胞への特異的な送達を補助するために設計され得る。種々のＩｇドメインが天然で存在するものとは異なる秩序に置かれたペプチドもまた、本発明に包含される。
【００９９】
抗原結合フラグメントの大きさは、所望の機能を提供するために必要な最小限の大きさのみであり得る。これは、必要に応じてさらなるアミノ酸配列（望ましくは、この抗原結合フラグメントにネイティブなアミノ酸配列またはヘテロ供給源由来のアミノ酸配列のいずれか）を含み得る。抗ＤＣ抗原結合フラグメントは、抗体Ｖ領域配列由来の５つの連続したアミノ酸残基のみを含み得る。抗体Ｌ鎖またはＨ鎖Ｖ領域由来の７個のアミノ酸残基、より好ましくは約１０個のアミノ酸残基、より好ましくは約１５個のアミノ酸残基、より好ましくは約２５個のアミノ酸残基、より好ましくは約５０個のアミノ酸残基、より好ましくは約７５個のアミノ酸残基を含むポリペプチドもまた含まれる。抗体Ｌ鎖またはＨ鎖Ｖ領域の全体を含むポリペプチドでさえ、より好ましい。
【０１００】
置換は、１つ以上のアミノ酸残基の交換または改変からＶ領域のような領域の完全な再設計までの範囲に及び得る。もし存在する場合、アミノ酸残基の置換は、好ましくはペプチドのフォールディングまたは機能的性質が悪化するように影響を及ぼさない保存的置換である。保存的置換がなされ得る機能的に関連するアミノ酸残基のグループは、グリシン／アラニン；バリン／イソロイシン／ロイシン；アスパラギン／グルタミン；アスパラギン酸／グルタミン酸；セリン／スレオニン／メチオニン；リジン／アルギニン；およびフェニルアラニン／チロシン／トリプトファンである。抗原結合フラグメントは、グリコシル化され得るかもしくはグリコシル化され得ないか、翻訳後に改変され得るか（例えば、アセチル化およびリン酸化）または合成的に改変され得る（例えば、標識基の結合）。
【０１０１】
Ｌ鎖およびＨ鎖の両方を含むポリペプチド誘導体は、Ｌ鎖およびＨ鎖を分離し、次いで合成されて形成され得るか、またはインサイチュで両鎖の発現系により合成されて形成され得る。このような発現系は、Ｌ鎖およびＨ鎖について別々に転写可能な領域を含有するプラスミドでトランスフェクトするか、またはそれぞれの鎖に対するプラスミドで同じ細胞を同時トランスフェクトするかにより作製され得る。第３の方法では、Ｈ鎖をコードする領域を有する適切なプラスミドを、Ｈ鎖欠損変異体にトランスフェクトする。
【０１０２】
Ｈ鎖欠損変異体は、フルオレセイン標識ウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ鎖特異的、ＤＡＫＯ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）を有する細胞が産生する抗ＤＣ抗体を販売元の説明書に従って処理することにより獲得され得る。染色した細胞集団および染色していない細胞集団を、フローサイトメトリーにより分析する。染色していない細胞を滅菌チューブに回収し、そして限界希釈により１細胞／ウェルで９６ウェルプレートに置く。次いで培養上清を、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ鎖特異的）およびヤギ抗マウスκを用いてＥＬＩＳＡでアッセイする。κポジティブ、ＩｇＧネガティブの表現型を有するクローンを少なくとも３回サブクローニングし、安定な抗ＤＣ(-H)変異体を得た。推定Ｈ鎖欠損変異体由来のｍＲＮＡを単離し得、そしてＬ鎖Ｖ領域ｃＤＮＡの配列を決定する。ＶHについてのｍＲＮＡのリバースＰＣＲを、２セットの５'プライマーおよび３'プライマーを用いて行い、抗ＤＣ(-H)ｃＤＮＡのクローニングに用いた。Ｈ鎖欠損変異体は、これらのプライマーを含む検出可能なＤＮＡを産生しなかった。この細胞のトランスフェクションを、適切なＨ鎖プラスミドを用いて進めた。
【０１０３】
本発明に包含される別の抗原結合フラグメント融合体は、Ｈ鎖およびＬ鎖の定常領域が改変されて付加的な特性を提供する抗体である。例えば、アミノ酸配列の変化は、生じたポリペプチドの免疫原性の変化を引き起こし得る。この変化は、１つ以上のアミノ酸残基から定常領域ドメインの完全な再設計までの範囲に及ぶ。予想される変化は、補体結合、膜レセプターとの相互作用、および他のエフェクター機能に影響を及ぼすものである。組換え抗体はまた、基質（例えば、リンホカインまたは抗原もしくは腫瘍、ウイルス、寄生虫または細菌由来の抗原性ペプチド、あるいは寛容原（自己抗原））の細胞への特異的な送達を補助するよう設計され得る。種々のＩｇドメインが天然とは異なる順序で配置されているタンパク質もまた、本発明に包含される。
【０１０４】
本発明はまた、抗ＤＣ抗体の単鎖Ｖ領域フラグメント（「ｓｃＦｖ」）を包含する。単鎖Ｖ領域フラグメントは、短い連結ペプチドを用いてＬ鎖および／またはＨ鎖Ｖ領域を連結することにより作製される（Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６）。十分な可撓性および長さを有する任意のペプチドがｓｃＦｖのリンカーとして用いられ得る。通常このリンカーは、免疫原性がほとんど有さないか全く有さないよう選択される。連結ペプチドの例は、（ＧＧＧＧＳ）3である。これは、あるＶ領域のカルボキシ末端と別のＶ領域のアミノ末端との間の約３．５ｎｍを橋渡しする。他のリンカー配列もまた用いられ得、そしてさらなる機能（例えば、薬物または固体支持体との結合あるいは基質（例えば、リンホカインまたは抗原もしくは腫瘍、ウイルス、寄生虫または細菌由来の抗原ペプチド、あるいは寛容原（自己抗原））の細胞への特異的な送達）が提供され得る。
【０１０５】
全てのまたは任意のＨ鎖またはＬ鎖が任意の組み合わせで用いられ得る。代表的に、Ｖ領域全体が、ｓｃＦｖに含まれる。例えば、Ｌ鎖Ｖ領域は、Ｈ鎖Ｖ領域と連結され得る。あるいは、Ｌ鎖Ｖ領域の一部は、Ｈ鎖Ｖ領域またはその一部と連結され得る。Ｈ鎖Ｖ領域は、本明細書中に記載される抗体に由来し、そしてＬ鎖Ｖ領域が別のＩｇに由来するようなｓｃＦｖもまた意図される。１つの成分が抗原結合フラグメントであり、そして別の成分がＴ細胞エピトープのような異なるポリペプチドである二相性のｓｃＦｖが作製され得る。
【０１０６】
このｓｃＦｖは、任意の順序で合成され得る（例えば、ＶH−（リンカー）−ＶLまたはＶL−（リンカー）−ＶH）。特定の発現系におけるこれら２つの構成の発現レベルにおいて差異があり得る。この場合、これらの形態の１つが優先され得る。（Ｘ）−（リンカー）−（Ｘ）−（リンカー）−（Ｘ）のような直列ｓｃＦｖもまた作成され得る（ここで，ＸはｓｃＦｖまたはこれらの他のポリペプチドとの組み合わせである）。別の実施形態において、単鎖抗体ポリペプチドは、リンカーポリペプチドを有さないか、またはごく短い、可撓性のないリンカーを有する。可能な構成は、ＶL−ＶHおよびＶH−ＶLである。この連結は、短すぎてこの鎖内のＶLとＶHとの間の相互作用を許さず、そしてこの鎖は、それぞれの末端にＶL／ＶH抗原結合部位を有するホモ二量体を形成する。このような分子は、「二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）」と呼ばれる。
【０１０７】
ｓｃＦｖは、組換え的にかまたは合成的に生成され得る。ｓｃＦｖの合成的な生成に関して、自動合成装置が用いられ得る。ｓｃＦｖの組換え生成に関して、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含有する適切なプラスミドが、適切な宿主細胞（真核生物細胞（例えば、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞）かまたは原核細胞生物（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のいずれか）に導入され得、そして発現したタンパク質が、標準的なタンパク質精製技術を用いて単離され得る。ｓｃＦｖはまた、ファージ提示ライブラリーから獲得され得る。
【０１０８】
ｓｃＦｖの生成について特定の有用な系は、プラスミドｐＥＴ−２２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）である。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｐＥＴ−２２ｂ（＋）は、６個の連続するヒスチジン残基からなるニッケルイオン結合ドメインを含有し、これは適切なアフィニティー樹脂上で、発現したタンパク質を精製することを可能にする。適切なベクターの別の例は、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）である。
【０１０９】
遺伝子発現の条件は、好ましくはｓｃＦｖが適切な三次構造をとることを保証する。用いられるプラスミド（特にプロモーター活性）および宿主細胞に依存して、生成率を改変することが必要であり得る。例えば、原核細胞系においてより弱いプロモーターの使用、またはより低い温度での発現が、適切に折り畳まれたｓｃＦｖの産生を最適化するために必要であり得る；またはこれは真核生物細胞においてｓｃＦｖを発現するために用いられ得る。
【０１１０】
本発明はまた、複数のＤＣ特異的抗原結合フラグメントを含む抗原結合フラグメントのポリマー形態を包含する。１つの実施形態は、抗原結合フラグメントの直鎖ポリマーであり、必要に応じてキャリアと複合体化される。これらの直鎖ポリマーは、単一抗原結合フラグメントポリペプチドの複数のコピーまたは異なるポリペプチドの組み合わせを含み得、そして直列ポリペプチドまたは他のアミノ酸配列により切り離されるポリペプチドを有し得る。
【０１１１】
別の実施形態は、多抗原ペプチド（ＭＡＰ）である。ＭＡＰは、放射状にリシン樹状突起に枝分かれした免疫学的な小インサートコアを有し、ここに多くの抗原結合フラグメントポリペプチドが共有結合している。例えば、Ｐｏｓｎｅｔｔら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１７１９−１７２５；およびＴａｍ（１９８９）Ｍｅｔ．Ｅｎｚ．１６８：７−１５を参照のこと。この結果は、コアに対して高モル比の抗原結合フラグメントポリペプチドを有する大きな高分子である。ＭＡＰは有効な免疫原であり、そして免疫アッセイについての有用な抗原である。ＭＡＰを生成するためのコアは、標準的なペプチド合成技術により作製され得るか、または商業的に獲得され得る（Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）。代表的なコアマトリックスは３つのレベルでのリシンおよび８つのアミノ酸残基から構成される。
【０１１２】
本発明はさらに、本発明のＤＣ特異的抗原結合フラグメントに対する抗イディオタイプ抗原結合フラグメントを含む。このような抗イディオタイプは、当該分野で公知の任意の方法によって作成され得る。
【０１１３】
癌患者は、しばしば免疫抑制されており、そしていくつかの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対して耐性である。このようなＴＡＡに対する活性な免疫応答を誘引することは、癌治療における重要なチャレンジを示す。所定の抗原での免疫化は、ＣＴＬ応答を含む免疫応答、好ましくは強力なＣＴＬ応答を生成する。この抗原に対する抗体の産生は、腫瘍細胞がＡＤＣＣ（抗体依存性細胞性細胞傷害）によって殺傷される場合に、役立ち得る。本発明は、当該分野で公知の方法により特定の免疫応答を誘導するにおける、本発明の抗原結合フラグメントの使用によって、同定および単離されたＤＣの使用を包含する。免疫応答は、癌、感染性ウイルス、感染性細菌、感染性寄生生物、感染性酵母、および自己免疫疾患（耐性誘導）に関連したものを含むが、これに限定されない、任意の抗原に対して特異的であり得る。このような応答を誘導するのに特に適している小集団を単離する能力により、小集団の混合物よりも効果的なＤＣの調製を生じる。ハイブリッド細胞（例えば、ＤＣ／腫瘍細胞）はまた、癌特異的療法として用いられ得る。改変細胞（細胞のヘルパーＴ細胞分極能力に関して活性化された、インビトロ成熟された、調節された（Ｔｈ１  ｖ  Ｔｈ２  ｖ  Ｔｈ３／Ｔｈ−Ｒ）、そして細胞のＴ細胞刺激、またはアネルギー化、または欠失能力に関して調節された、細胞を含むがこれに限定されない）が、同様に、本発明に包含され、そして遺伝子改変された細胞またはトランスフェクトされた細胞、および抗原提示または内部移行について適切なペプチドまたはタンパク質とともにインキュベートされた細胞を含むがこれに限定されない。小集団は、分化の１つの系列および別の系列の１つにおける特定の分化の段階を含むがこれに限定されない。
【０１１４】
本発明はさらに、ＤＣ、その小集団およびその混合物を提供する。この細胞は、当該分野で公知の任意の分別方法によって、本明細書で提供される抗原結合フラグメントを用いて選択される。単離された細胞を含む組成物はまた、本発明によって包含される。これらは、薬学的組成物および治療組成物、ならびに単離された細胞を含む任意の他の組成物を含む。本明細書に記載の方法によって単離されたＤＣ小集団は、好ましくは実質的に均質である。すなわち、ＢＤＣＡ特異的抗原結合フラグメントによって単離された細胞は、好ましくは、約８０％ＢＤＣＡ＋を超え、より好ましくは約９０％ＢＤＣＡ＋を超え、そして最も好ましくは約９５％ＢＤＣＡ＋を超える。当然ながら、この細胞と他のＤＣ、または他の造血細胞との引き続く組み合わせは、ＢＤＣＡ＋細胞のパーセンテージを減少させ得、このような組み合わせがまた、本発明によって包含される。
【０１１５】
同様に、本明細書に記載の方法によって得られるＤＣは、当該分野で公知の任意の処置方法における使用に適切である。これらの方法を達成するために変更されたＤＣはまた、本発明によって包含される。これらの方法としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：
ａ）自己免疫疾患、アレルギー、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、異種同種移植変拒絶における、特定のＴ細胞耐性（刺激の代わりの殺傷またはアネルギー）を誘導するための、単離されたＤＣを用いた治療。例えば、このようなＴ細胞に特異的なＤＣは、溶解、不活性化、または死誘導部分を含み、これにより、例えば、ＣＤ９５Ｌトランスフェクションにおけるような抗原標識または遺伝子改変による望ましくない免疫反応に関与するＴ細胞を特異的に標的するように、改変され得る。Ｔ細胞に対するＤＣ特異性は、主に、ＭＨＣ  ＩおよびＩＩを介した適切なＴ細胞エピトープ（ペプチド）の提示により生じる。耐性誘導機能を有するＤＣの特定のサブセットは、患者に直接投与され得る。末梢耐性は、改変されたＤＣによって媒介され得、Ｔ細胞の欠失（殺傷）、アネルギーおよび抑制／調節を誘導し得る；
ｂ）特定のＴ細胞において、特定のサイトカイン発現プロフィールを誘導するための、単離されたＤＣを用いる免疫調節。これは、Ｔｈ１（特定の炎症性免疫応答についてのサイトカイン）、Ｔｈ２（特定の体液性免疫応答のサイトカイン）、またはＴｈ３（特定の免疫抑制のサイトカイン）の産生に影響するのに特に有用である。例えば、アレルギーおよび喘息の場合、Ｔｈ１応答の誘導は、Ｔｈ２応答を生じる兆候を減少または排除し得る；
ｃ）腫瘍抗原、ウイルス抗原、および細胞抗原を含むがこれに限定されない、ＤＣ提示抗原での治療；
ｄ）免疫反応を誘導するのに十分な量および条件下での、ＤＣ（提示抗原とともにまたは提示抗原なしに）および種々のコファクター（補助因子）（これは、サイトカイン、同時刺激分子、およびエフェクター分子を含むがこれに限定されない）を用いた治療；および
ｅ）抗原提示細胞を得るためのインビトロでのＴ細胞刺激。
【０１１６】
本明細書に記載される抗原結合フラグメントはまた、多くの処置方法に適切である。これらとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：
ａ）自己免疫あるいは至適のおよび選択的な取り込み／トランスフェクションについてＤＣに対する抗原または核酸（ウイルス、プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡなど）のインビボ標的化に関与するＤＣ（例えば）のリガンド−またはリガンド媒介免疫治療を模倣する抗体。ＢＤＣＡ−２が、抗原取り込みおよびプロセシング機能を有する分子であるらしいのと同様に、この文脈において特に有用であり得る。
【０１１７】
ｂ）免疫モニタリング：例えば、種々の疾患においておよび、例えば、増殖誘導リガンド（例えば、ｆｌｔ３−リガンドまたはＧ−ＣＳＦ）を用いた、動員の際の、ＢＤＣＡ−２+、ＢＤＣＡ−３+、およびＢＤＣＡ−４+ＤＣの列挙および特徴付け。
【０１１８】
宿主に対して有害でない任意のキャリアが、ＤＣに用いられ得る。適切なキャリアは、代表的には、大きく、緩徐に代謝された高分子（例えば、タンパク質）；ポリサッカライド（例えば、ラテックス機能化セファロース、アガロース、セルロース、セルロースビーズなど）；ポリマー性（重合体）アミノ酸残基（例えば、ポリグルタミン酸、ポリリジンなど）；アミノ酸コポリマー；および不活性なウイルス粒子または弱毒化細菌（例えば、サルモネラ）である。
【０１１９】
２．さらなるＤＣ特異的抗原結合フラグメントの獲得方法。
【０１２０】
本発明は、ＤＣ特異的抗原結合フラグメントを得る方法を包含する。
【０１２１】
詳細には以下に記載のように、新しいＤＣ特異的抗原結合フラグメントを生成する方法としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：１）ファージディスプレイ技術の使用（これにより抗体レパートリーをコードするｃＤＮＡは、好ましくは、ＰＣＲおよび種特異的Ｖ領域に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、リンパ球または脾臓ＲＮＡから増幅される）；２）抗原を用いた哺乳動物の免疫、およびポリクローナル抗体またはｍＡＢの生成工程；ならびに３）ファージ（非常に大きく多様なＶ遺伝子レパートリー）上での提示による、事前免疫なしに抗体を作成するためのファージディスプレイの使用。一般に、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：１〜２０を参照のこと。好ましくは、治療目的のために、非ヒト抗原結合フラグメントが用いられるべき場合、これらは、当該分野で公知の方法によってヒト化され得る。
【０１２２】
Ｍｅｄｅｚら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １８：４１０により記載の方法が用いられ得る。要するに、精製した抗原を用いて、ナイーブなマウス抗体レパートリーを欠き、代わりに生殖細胞系においてほとんどのヒト抗体Ｖ遺伝子を有するトランスジェニックマウスを免疫する。続いて、ヒト抗体がマウスＢ細胞により産生される。この抗体遺伝子は、ＰＣＲライブラリー選択または古典的ハイブリドーマ技術によりＢ細胞から回収される。
【０１２３】
あるいは、抗体は、精製されたＤＣ特異的抗原での注射後、マウス（例えば、ＢＡＬＢ／ｃ）マウスから得られ得る。ｍＡｂは、標準的ハイブリドーマ技術を用いて生成される。Ｍａｌｔｉら（１９９７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｉｎｔ．１：８５〜９３（ヒトハイブリドーマ）；およびＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５〜４９７（マウスハイブリドーマ）。引き続き、マウス抗体は、例えば、Ｒｏｓｏｋら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１〜２２６１８；Ｂａｃａら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８〜１０６８４；Ｒａｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：８９１０〜８９１５；およびＷｉｎｔｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３〜２９９に記載の方法により、ヒト化され得る。
【０１２４】
ファージディスプレイアプローチをまた用いて、ＤＣに対するヒト抗体を迅速に生成し得る。このアプローチは、Ｈｅｎｄｅｒｉｋｘら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：４３２４〜３２によって記載の方法を使用し得る。ファージ上で提示された抗体フラグメントは、固定された抗原またはＤＣに結合する抗体を分離することにより、異なる単鎖抗体を含む大きいナイーブなファージ抗体／フラグメントライブラリーから選択される。ヒト抗体フラグメントを、生殖系列Ｖドメインから構築するか、またはフレームワークおよびＣＤＲ領域の両方において、多くの変異（変異は、相同遺伝子再配列（ｒｅ−ａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ）またはエラープローン（ｅｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲのいずれかによって標的される）により合成したナイーブなレパートリーから選択する。ＤＣと特異的に反応性の抗原結合フラグメントは、本明細書に記載のように、腫瘍および正常細胞に対するスクリーニングによって同定され、ＤＣ特異的抗原結合フラグメントを同定し得る。
【０１２５】
本発明はまた、適切なファージディスプレイライブラリーを作成することにより、ＤＣに特異的な抗原結合フラグメントを同定する方法；ＤＣ特異的抗原を単離する方法；ＤＣに特異的に結合する抗原結合フラグメントを提示するファージを得るための標準的免疫化学技術による、抗原を用いたファージディスプレイライブラリーのスクリーニング方法；またはＤＣおよび他の関連細胞（例えば、ＡＰＣ）に対するスクリーニングおよびＤＣに優先的に結合するファージの選択によって、ＤＣ特異的抗原結合フラグメントについて得られたファージディスプレイライブラリーをスクリーニングする方法、を包含する。ファージディスプレイによる抗原結合フラグメントを生成する方法は、当該分野で周知である。Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９８）。
【０１２６】
リンパ球（ＰＢＬ）または脾臓ＲＮＡを代表的には用いて、抗体フラグメントレパートリーを作成する。相同体再整列（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ）またはエラープローン（ｅｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲを用いる変異誘発が多様性を増大する。当該分野で公知の任意の方法を用い得る。
【０１２７】
抗体遺伝子のレパートリーは、ＰＣＲを用いて、免疫したマウスまたはヒトから増幅され得る。そしてそれによって得られたｓｃＦｖまたはＦａｂ抗体フラグメントが、クローニングされてバクテリオファージの表面上で発現され得る。抗体遺伝子レパートリーは、ＰＣＲおよび宿主動物特異的Ｖ領域に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、リンパ球または脾臓ＲＮＡから増幅される。ファージディスプレイをまた用いて、ファージ上で非常に大きくかつ多様なＶ遺伝子レパートリーを提示することにより、事前免疫なしに、抗体を作成し得る。ＰＢＬに存在する天然のＶ遺伝子レパートリーが、ＰＣＲ増幅によって単離され、そしてＶＨおよびＶＬ領域が、ＰＣＲを用いて一緒にランダムにスプライシングされる。変異は、相同遺伝子再配列番号またはエラープローンＰＣＲによって、Ｖ−ドメイン遺伝子に対して標的化され得る。Ｚｈａｏら（１９９８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：２５８；およびＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９８）。合成ヒトライブラリーをまた全体的に作成し、そしてＤＣ特異的抗体フラグメントをスクリーニングするために用い得る。ファージディスプレイライブラリーを操作するために用いた方法にかかわらず、得られたファージの各々は、その表面に提示された機能的抗体フラグメントを有し、そしてファージゲノムにおいて抗体フラグメントをコードする遺伝子を含む。例えば、ＷＯ９７／０２３４２を参照のこと。
【０１２８】
結合抗体が非結合抗体から差引きされ得るアフィニティークロマトグラフィーは、かねて確立されている。Ｎｉｓｓｉｍら（１９９４）ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：６９２〜６９８；およびＶａｕｇｈａｍら（１９９６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：３０９〜３１４．成功に影響する重大なパラメーターは、特定の抗原に対して生成された抗体フラグメントの数およびアフィニティーである。最近まで、多くの多様なライブラリーの産生は、いくらか困難なままであった。歴史的に、ｓｃＦｖレパートリーは、ＶＨおよびＶＬ  ＲＴ−ＰＣＲ産物から直接アセンブルされてきた。ＲＮＡのアベイラビリティーおよびＲＴ−ＰＣＲの効率は、利用可能なＶ遺伝子の数という因数を制限している。また、アセンブルには、３つのフラグメント（すなわち、ＶＨおよびＶＬならびにリンカー領域）を連結することが必要であった。Ｍａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１〜５９７。
【０１２９】
改善されたライブラリー構築方法は、別のプラスミドベクターにおいて、クローニングされたＶＨおよびＶＬ遺伝子レパートリーを用いて、ｓｃＦｖアセンブリのための物質の安定かつ無限の適用をもたらす。Ｓｈｅｅｔｓら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：６１７５〜６１６２。また、効率性は、ＶＬライブラリーの５'末端でリンカー領域をコードするＤＮＡを有することにより増大される。従って、３つでなく、連結されるべき２つのフラグメントしか有さない。
【０１３０】
抗ＤＣ抗原結合フラグメントをまた、送達または操作し得る。例えば、Ｌ鎖およびＨ鎖のＶ領域の免疫原性活性は、一連の短いポリペプチド（Ｖ領域アミノ酸配列全体にまたがる）を調製することによりスクリーニングされ得る。２０または５０アミノ酸残基長の一連のポリペプチドを用いて、各Ｖ領域が、有用な機能的特性について調査され得る。タンパク質配列のコンピューター分析を実行して潜在的に免疫原性のポリペプチドを同定することも可能である。次いで、このようなペプチドを合成して試験し得る。
【０１３１】
本発明はさらに、所望の特性を有する他の抗ＤＣ抗原結合フラグメントを生成するために種々の様式で合わされた、本明細書に記載の抗原結合フラグメントの種々の適合を包含する。例えば、改変残基を有する抗原結合フラグメントが、ＭＡＰに含まれ得る。別の例において、ｓｃＦｖをサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）に融合する。このような組み合わせの全てが本発明によって包含される。
【０１３２】
抗原結合フラグメントは、任意の適切な手順（タンパク質分解、組み換え方法または化学的合成）によって作成され得る。これらの方法は、当該分野で公知であるので詳細に記載する必要はない。タンパク質分解酵素の例としては、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、スブチリシン、プラスミン、およびトロンビンが挙げられるがこれらに限定されない。インタクトな抗原結合フラグメントは、同時にまたは引き続いて、１つ以上のプロテアーゼとともにインキュベートされ得る。あるいは、またはさらに、インタクトな抗体は、ジスルフィド還元剤で処理され得る。次いで、ペプチドは、当該分野で公知の技術（ゲルろ過クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、および逆相ＨＰＬＣが挙げられるがこれらに限定されない）によって互いに分離され得る。
【０１３３】
抗ＤＣ抗原結合フラグメントがまた、当該分野で公知の任意の方法による適切な発現系において、このペプチドをコードするポリヌクレオチドからの発現によって作成され得る。代表的には、適切なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、適切なプロモーターの制御下で発現ベクターに連結され、そして意図される宿主細胞を遺伝子的に変更するために用いられる。真核生物および原核生物の両方の宿主系を用い得る。次いで、ポリペプチドが溶解した細胞から、または培養培地から単離され、そしてその意図される用途に必要な程度まで精製される。本発明の用途に適切な原核生物宿主細胞の例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｓｔｉｌｉｓ、および任意の他の適切な宿主細胞が挙げられる。真核生物宿主細胞の例としては、酵母、鳥類、昆虫、植物、および動物細胞（例えば、ＣＯＳ７細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＣＨＯ細胞）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１３４】
必要に応じて、マトリックスコートしたチャネルまたはビーズおよび細胞同時培養が、抗原結合フラグメント産生細胞の増殖を強化するために含まれ得る。大量のｍＡｂの産生のため、腹水を得ることが一般に、より都合がよい。腹水を得る方法は、免疫学的にナイーブな、組織適合性または免疫耐性の哺乳動物（特にマウス）にハイブリドーマ細胞を注射する工程を一般的に含む。この哺乳動物は、適切な組成物；例えば、Ｐｒｉｓｔａｎｅの事前投与による腹水産生のためにプライミングされ得る。腹水を動物から取り出し、そして抗体を単離するために処理する。
【０１３５】
あるいは、抗原結合フラグメントは、タンパク質合成の標準的方法と組み合わせて、アミノ酸配列データおよび本開示において提供される他の情報を用いて化学的に合成され得る。適切な方法は固相メリフィールド法である。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）により製造されたような、自動ペプチドシンセサイザーは商業的に入手可能である。
【０１３６】
抗ＤＣ抗原結合フラグメントを得る別の方法は、ＢＤＣＡ−２、ＢＤＣＡ−３、および／またはＢＤＣＡ−４を用いて適切な宿主動物を免疫し、次にポリクローナル抗体またはｍＡｂ産生および単離の標準的な技術を行うことである。このように産生されたｍＡｂは、当該分野で公知の方法によって「ヒト化」され得る。従って、本発明はヒト化ｍＡｂを包含する。
【０１３７】
「ヒト化された」抗体においては、配列の少なくとも一部がその最初の形態から変更され、それは、よりヒトＩｇらしくされている。１つのバージョンでは、Ｈ鎖領域およびＬ鎖領域が、ヒト配列で置換される。これは、抗ＤＣ  Ｖ領域および異種Ｉｇ（Ｃ）領域を含む融合ポリペプチドである。別のバージョンでは、ＣＤＲ領域は、抗ＤＣアミノ酸配列を含み、一方Ｖフレームワーク領域はまた、ヒト配列に変換されている。例えば、ＥＰ  ０３２９４００を参照のこと。第三のバージョンでは、Ｖ領域は、ヒトおよびマウスＶ領域のコンセンサス配列を設計することにより、ならびにコンセンサス配列の間で異なるＣＤＲ外側の残基を変換することにより、ヒト化される。
【０１３８】
ヒト化抗体の作成において、フレームワーク残基の選択が、高い結合親和性を保持することを助け得る。原理的には、任意のヒト抗体由来のフレームワーク配列が、ＣＤＲ接合（グラフティング）のためのテンプレートとして働き得る；しかし、このようなフレームワークへの直鎖状ＣＤＲ置換は、抗原結合アフィニティーの有意な損失を導き得る。Ｇｌａｓｅｒら（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：２６０６；Ｔｅｍｐｅｓｔら（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：２６；およびＳｈａｌａｂｙら（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７：２１７。元来のマウス抗体に対してより相同なヒト抗体であればあるほど、ヒトフレームワークは、アフィニティー（親和性）を減じ得るマウスＣＤＲへと歪みを誘導する可能性が低くなる。抗体配列データベースに対する配列相同性検索に基づいて、ヒト抗体ＩＣ４は、ｍｕＭ４ＴＳ．２２に対して良好なフレームワーク相同体を提供するが、他の高度に相同なヒト抗体（特にヒトサブグループＩ由来のκＬ鎖またはヒトサブグループＩＩＩ由来のＨ鎖）が同様に適切である。Ｋａｂａｔら（１９８７）。種々のコンピュータープログラム（例えば、ＥＮＣＡＤ）は、Ｖ領域の理想的配列を予想する。Ｌｅｖｉｔｔら（１９８３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６８：５９５。従って、本発明は、異なるＶ領域を有するヒト抗体を包含する。適切なＶ領域配列を決定し、そしてこれらの配列を至適化することは、当業者の範囲内である。免疫原性の低下した抗体を得るための方法はまた、米国特許第５，２７０，２０２号およびＥＰ６９９，７５５に記載されている。
【０１３９】
特定の適用（例えば、抗原結合フラグメントまたはＤＣＡが、植物種子のような適切な貯蔵媒体で発現される場合）において、抗原結合フラグメントが、精製なしに保存され得る。Ｆｉｅｌｄｅｒら（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：１０９０〜１０９３。ほとんどの適用について、このポリペプチドが他の細胞性成分から少なくとも部分的に精製されていることが一般に好ましい。好ましくは、このペプチドは、総タンパク質の少なくとも約５０重量％程度までの純度である。より好ましくは、このペプチドは少なくとも５０〜７５％純粋である。臨床使用には、このペプチドは好ましくは少なくとも約８０％純粋である。
【０１４０】
このペプチドが個体に投与されるべき場合、好ましくはそれは、少なくとも８０％純粋であり、より好ましくは少なくとも９０％純粋、なおより好ましくは少なくとも９５％純粋、そして発熱物質（パイロジェン）および他の混入物を含まない。この文脈では、純度％は、調製物の総タンパク質含量の重量パーセントとして算出され、そして組成物精製に意図的に添加される成分を含まない。
【０１４１】
本発明はまた、生物学的サンプルにおいて、ＤＣおよびそのサブセットを検出、列挙、および／または同定する方法、ならびに体液中で可溶性ＢＤＣＡ−２、ＢＤＣＡ−３もしくはＢＤＣＡ−４のような抗原および／またはＤＣを測定する工程を包含する。この方法は、生物学的サンプルを獲得する工程、コントロールの生物学的サンプルに対して比較した場合、このサンプルに対する抗体の抗体−抗原結合および結合の検出（もしあれば）を可能にする条件下で、本明細書に記載の抗原結合フラグメントとこのサンプルを接触する工程を包含する。
【０１４２】
生物学的サンプルが、例えば、ＤＣ濃度または抗原濃度について富化することにより、適切に調製された後、ＤＣまたは抗原と抗体との間の複合体の形成を可能にする条件下で、過剰の抗原結合フラグメントとこれを混合する。次いで、形成された複合体の量または複合体の数（ＤＣを保有する）を決定し、そして予期されるまたは既知のＤＣ濃度の範囲に既知の量の標的抗原を含む標準的サンプルと形成された複合体と最終的に比較する。複合体形成は、免疫沈澱または比濁法によって観察され得るが、これは、標識（例えば、125Ｉのような放射性同位体、ペルオキシダーゼおよびβガラクトシダーゼのような酵素、またはフルオレセインのような蛍光色素）で標識した試薬を用いて、一般により高感度である。細胞および抗原を検出する方法は、当該分野で周知である。細胞検出のためには、フローサイトメトリーが特に有用であり、抗原を用いる、ＥＬＩＳＡが好ましい。
【０１４３】
抗原に対する抗ＤＣ抗原結合フラグメントの特異的認識は、当該分野で公知の任意の免疫アッセイによって試験され得る。直接結合アッセイの任意の形式が適切である。このようなアッセイの１つでは、結合パートナーの１つ、抗原または推定抗原結合フラグメントが標識される。適切な標識としては、125Ｉのような放射性同位体、ペルオキシダーゼのような酵素、フルオレセインのような蛍光標識および化学発光標識が挙げられるがこれらに限定されない。代表的には、他の結合パートナーが、（例えば、マイクロタイタープレートのような固相へのコーティングによって）不溶化され、未結合の可溶性結合パートナーの除去を容易にする。標識した結合パートナーと未標識の結合パートナーを合わせた後、固相を洗浄し、そして結合した標識の量を決定する。
【０１４４】
免疫療法に用いる場合、本明細書に記載の抗原結合フラグメントは、本明細書で記載の、および当該分野で公知の治療剤で、未標識であってもまたは標識されていてもよい。これらの試薬は、本発明の抗原結合フラグメントに直接または間接的にのいずれかで結合され得る。間接結合の１例は、スペーサー部分の使用による。これらのスペーサー部分は、順に、不溶性または可溶性のいずれかであり得（Ｄｉｅｎｅｒら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３１：１４８）、そして標的部位で薬物を放出できるように選択され得る。免疫療法のための抗原結合フラグメントに結合され得る治療剤の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：抗原（腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生生物由来抗原、および自己抗原を含む）、生体反応修飾因子、薬物、放射性同位体、レクチンおよび毒素。生体反応修飾因子としては、サイトカインおよびケモカインが挙げられ、これには、以下：ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＴＧＦ−β、ＭＴＰ−ＡＢ、ＳＤＦ−１、リンホタクチン、ＤＣ−ＣＫ１、エオトキシン（Ｅｏｔｏｘｉｎ）、ＩＰ−１０、ＴＡＲＣ、Ｒａｎｔｅｓ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＳＬＣ、ＩＴＡＣ、ＭＩＥ、ＭＤＣ、ＭＣＰ−１、ＴＣＡ−３、ＭＣＰ−２、−３、−４およびインターフェロンが挙げられるがこれらに限定されない。それによって抗原結合フラグメントが標識され得るインターフェロンとしては、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、およびＩＦＮ−γ、ならびにそれらのサブタイプが挙げられ得る。
【０１４５】
免疫療法のための放射性同位体的に結合体化された抗原結合フラグメントを用いることにおいて、特定の同位体が、同位体の安定性および放射のような因子に依存して他のものよりも好ましくあり得る。所望の場合、抗原結合フラグメントによる細胞集団認識は、以下に記載されるインビボ診断技術により評価され得る。一般に、αおよびβ粒子を放射する放射性同位体が免疫療法に好ましい。例えば、組織に数ミリメートル浸透し得る高エネルギーβエミッター（例えば、90Ｙ）が、好ましくあり得る。一方ではショートレンジの高エネルギーαエミッター（例えば、212Ｂｉ）が、好ましくあり得る。治療目的のため、本発明の抗原結合フラグメントに結合し得る放射性同位体の例としては、125Ｉ、131Ｉ、90Ｙ、67Ｃｕ、212Ｂｉ、211Ａｔ、212Ｐｂ、47Ｓｃ、109Ｐｄ、および188Ｒｅが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１４６】
レクチンは、植物材料から通常単離されるタンパク質であり、これは、特定の糖部分に結合する。多くのレクチンがまた、細胞を凝集させ、そしてリンパ球を刺激する。しかし、リシンは免疫療法的に用いられる毒性のレクチンである。これは、好ましくは、リシンのαペプチド（これが毒性を担う）を抗体分子に結合して、毒性効果の特異的送達を可能にすることによって達成される。
【０１４７】
毒素は、植物、動物、または微生物によって産生される毒性物質であり、十分な用量ではしばしば致死性である。ジフテリア毒素は、治療的に用いられ得るＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａにより産生される物質である。この毒素は、αサブユニットおよびβサブユニット（適切な条件下では分離可能である）からなる。この毒性のＡ鎖成分は、本明細書に記載される抗原結合フラグメントに結合し得、そしてＤＣの特定のサブユニットへの部位特異的送達に用いられ得る。
【０１４８】
組み換え方法が当該分野で周知である。本発明の実行は、他に示さない限り、当業者の範囲内である、分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生物化学および免疫学の従来の技術を用いる。このような技術は、文献、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第二版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｇａｉｔ編、１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ）；「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｗｅｉ＆Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）；「Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ」（Ｍｉｌｌｅｒ＆Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｐｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）「ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ」（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）；および「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１）。これらの技術は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に適用され、そしてそれ自体、本発明を作成および実施するのに考慮され得る。特に有用な技術は、以下の節に考察される。
【０１４９】
本発明は、ＢＤＣＡ抗原をコードする種々のポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、これらの抗原およびその機能的に等価なフラグメントの機能的に等価な改変体および誘導体をコードするポリヌクレオチドを包含する。これらは、これによってコードされるポリペプチドの特性を強化し得るか、減少し得るか、または有意に影響しない。これらの機能的に等価な改変体、誘導体およびフラグメントは、そのそれぞれの抗体に特異的に結合する能力を示し得る。例えば、コードされたポリペプチドの特性に有意に影響しない変化としては、コードされたアミノ酸配列を変化しないＤＮＡ配列における変化、ならびにアミノ酸残基の保存的置換、１または数個のアミノ酸残基の欠失または付加、およびアミノ酸アナログによるアミノ酸残基の置換を生じる変化が挙げられるがこれらに限定されない。保存的置換は、保存的アミノ酸置換がグリシン／アラニン；バリン／イソロイシン／ロイシン；アスパラギン／グルタミン；アスパラギン酸／グルタミン酸；セリン／トレオニン／メチオニン；リジン／アルギニン；およびフェニルアラニン／チロシン／トリプトファンである、保存的置換である。
【０１５０】
本発明のポリヌクレオチドは、以下のようなさらなる配列を含み得る：同じ転写単位内のさらなるコード配列、プロモーターのような制御エレメント、リボソーム結合部位、およびポリアデニル化部位、同じまたは異なるプロモーターの制御下のさらなる転写単位、宿主細胞のクローニング、発現および形質転換を可能にする配列、ならびに本発明の実施形態を提供するのに所望され得るような任意の構築物。
【０１５１】
本発明は、ＢＤＣＡ−２およびＢＤＣＡ−３をコードするポリヌクレオチド（好ましくは、図１２に見い出されるｃＤＮＡ配列）と安定なハイブリッドを形成する、少なくとも約１５個連続するヌクレオチド、好ましくは、少なくとも約２０ヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも約２５個連続するヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも約３５連続するヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも約５０個連続するヌクレオチド、さらにより好ましくは、少なくとも約７５ヌクレオチド、なおより好ましくは、少なくとも約１００ヌクレオチド、なおより好ましくは、少なくとも約２００ヌクレオチド、そしてさらにより好ましくは、少なくとも約３００ヌクレオチドのポリヌクレオチドを包含する。任意の条件設定が、この試験に使用され得るが、ただし、少なくとも１つの設定は、この試験ポリヌクレオチドが、その必要とされる特異性を示すところに存在する。
【０１５２】
ハイブリダイゼーション反応は、異なる「ストリンジェンシー」の条件下で行われ得る。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを増加する条件は、開示されている。例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＭａｎｉａｔｉｓを参照のこと。関連する条件の例（ストリンジェンシーを増加するための）は、以下を含む：２５℃、３７℃、５０℃および６８℃でのインキュベーション温度；１０×ＳＳＣ、６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ（ここで、ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭ  クエン酸緩衝液）および他の緩衝液系を使用するそれらの等価物の緩衝液濃度；０％、２５％、５０％および７５％のホルムアミド濃度；５分〜２４時間のインキュベーション時間；１回、２回またはそれ以上の洗浄工程；１分、２分または１５分の洗浄インキュベーション時間；ならびに６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣまたは脱イオン水の洗浄溶液。
【０１５３】
本発明はまた、ＢＤＣＡポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。好ましくは、これらのポリヌクレオチドは、図１２のポリヌクレオチドであるかまたは図１２のポリヌクレオチドから誘導される。
【０１５４】
本発明はまた、検出可能な標識を共有結合連結したポリヌクレオチドを提供する。このようなポリヌクレオチドは、例えば、関連するヌクレオチド配列の検出のためのプローブとして有用である。
【０１５５】
本発明のポリヌクレオチドは、化学合成、組換えクローニング方法、ＰＣＲ、またはそれらの任意の組み合わせを使用して得られる。化学ポリヌクレオチド合成の方法は、当該分野で周知であり、そして本明細書中に詳細に記載する必要はない。当業者は、本明細書中に提供されるデータを使用して、ＤＮＡ合成機を使用するかまたは商業的サービスへ注文することによって、所望のポリヌクレオチドを獲得し得る。
【０１５６】
あるいは、ＢＤＣＡをコードするヌクレオチドおよびそれらにコードされるペプチドは、プロデューシング細胞株、クローニングベクターまたは発現ベクターから得られ得る。所望の配列をコードするＲＮＡまたはＤＮＡは、標準的な組換え技術によって単離、増幅およびプロセシングされ得る。このような技術としては、制限ヌクレアーゼでの消化、およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅、またはそれらの適切な組み合わせが挙げられる。ＰＣＲ技術は、米国特許第４，６８３，１９５号；同第４，８００，１５９号；同第４，７５４，０６５号；および同第４，６８３，２０２号、ならびにＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｍｕｌｌｉｓら編、Ｂｉｒｋａｕｓｗｅｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓｔｏｎ（１９９４）に記載される。それによってコードされるペプチドの単離および精製は、当該分野で公知の任意の方法により得る。
【０１５７】
所望の配列を含むポリヌクレオチドは、適切なベクターに挿入され得、次いで、このベクターは、複製および増幅のために適切な宿主細胞に導入され得る。ポリヌクレオチドは、当該分野で公知の任意の手段によって宿主細胞に挿入され得る。細胞は、直接的な取り込み、エンドサイトーシス、トランスフェクション、ｆ−接合またはエレクトロポレーションにより外因性ポリヌクレオチドを導入することによって、形質転換される。一旦導入されると、外因性ポリヌクレオチドは、非組み込みベクター（例えば、プラスミド）として細胞内に維持されるか、または宿主細胞ゲノムに組み込まれ得る。増幅されたＤＮＡは、標準的な方法によって宿主細胞から単離され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）を参照のこと。ＲＮＡもまた、形質転換された宿主細胞から得られ得、これは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用することによって得られ得る。
【０１５８】
本発明はさらに、ＢＤＣＡ−２および／またはＢＤＣＡ−３をコードするポリヌクレオチドを含む種々の発現ベクターを包含する。これらのベクターは、組換えポリペプチドの発現ならびにＢＤＣＡコードポリヌクレオチドの供給源のために使用され得る。クローニングベクターは、ポリヌクレオチドの複製コピーを得るためか、または将来の回収のために寄託機関でこれらのポリヌクレオチドを保存するために使用され得る。発現ベクター（およびこれらの発現ベクターを含む宿主細胞）は、それらが含むポリヌクレオチドから産生されるポリペプチドを得るために使用され得る。これらはまた、個体中でＢＤＣＡ−２および／またはＢＤＣＡ−３を発現し、そしてこれによって、このポリペプチドを合成し得るインタクトな細胞を有することが所望される場合（例えば、遺伝子治療において）に、使用され得る。適切なクローニングベクターおよび発現ベクターとしては、例えば、細菌、哺乳動物、酵母および昆虫の発現系における使用のための、当該分野で公知のベクターが挙げられる。特定のベクターおよび適切な宿主細胞は、当該分野で公知であり、そして本明細書中に詳細に記載しない。例えば、ＧａｃｅｓａおよびＲａｍｊｉ、Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９４）を参照のこと。
【０１５９】
クローニングベクターおよび発現ベクターは、代表的に、選択マーカー（例えば、そのベクターで形質転換された宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子）を含むが、このようなマーカー遺伝子は、宿主細胞に同時導入される別のポリヌクレオチド配列に保持され得る。選択遺伝子が導入されている宿主細胞のみが、選択条件下で増殖する。代表的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒性物質（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート）に対する耐性を付与するか；（ｂ）栄養要求性の欠損を相補するか；または（ｃ）複合培地から利用可能でない重要な栄養素を供給する。適切なマーカー遺伝子の選択は、宿主細胞に依存し、そして異なる宿主について適切な遺伝子が、当該分野で公知である。ベクターはまた、代表的に、宿主によって認識される複製系を含む。
【０１６０】
適切なクローニングベクターは、標準的な技術に従って構築され得るか、または当該分野で利用可能な多くのクローニングベクターから選択され得る。選択されるクローニングベクターは、使用されることが意図される宿主細胞に従って変更し得るが、有用なクローニングベクターは、一般に、自律複製能力を有するか、特定の制限エンドヌクレアーゼに対する単一の標的を保有し得るか、またはそのベクターを含むクローンの選択において使用され得るマーカーの遺伝子を保持し得る。適切な例としては、プラスミドおよび細菌ウイルス、例えば、ｐＵＣ１８、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、ならびにｐＳＡ３およびｐＡＴ２８のようなシャトルベクターが挙げられる。これらのクローニングベクターおよび多くの他のクローニングベクターが、市販業者（例えば、ＢｉｏＲａｄ、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅおよびＩｎｖｉｔｒｏｅｎ）から入手可能である。
【０１６１】
発現ベクターは、一般に、目的のＢＤＣＡをコードするポリヌクレオチドを含む、複製可能なポリヌクレオチド構築物である。ＢＤＣＡをコードするポリヌクレオチドは、適切な転写制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサーおよびターミネーター）に作動可能に連結される。発現（すなわち、翻訳）のために、１以上の翻訳制御エレメントがまた、通常必要とされる（例えば、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、および終止コドン）。これらの制御エレメント（転写および翻訳の）は、ＢＤＣＡをコードする遺伝子に由来し得るか、またはそれらは、異種（すなわち、他の遺伝子または他の生物に由来する）であり得る。シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列もまた、ＢＤＣＡを、細胞膜を横切るかまたは細胞膜中に留まるか、あるいは細胞から分泌されるのを可能にするために、含まれ得る。真核生物細胞（酵母、鳥類および哺乳動物細胞を含む）における発現に適切な多くの発現ベクターが、当該分野で公知である。発現ベクターの１例は、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）であり、ここでは、転写は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期プロモーター／エンハンサーによって駆動される。このベクターはまた、目的のポリヌクレオチドの挿入のための、複数の制限酵素認識部位を含む。発現ベクター（系）の別の例は、バキュロウイルス／昆虫系である。ＢＤＣＡをコードするポリヌクレオチドを含む、抗体標的化遺伝子治療における使用に適切な他のベクターも存在する。適切な系は、例えば、Ｂｒｏｗｎら（１９９４）Ｖｉｒｏｌ．１９８：４７７−４８８；およびＭｉｙａｍｕｒａら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：８５０７−８５１１によって記載される。
【０１６２】
目的のポリヌクレオチドを含むベクターは、以下を含む多くの適切な手段のいずれかによって、宿主細胞に導入され得る：エレクトロポレーション、あるいは塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストランまたは他の物質を使用するトランスフェクション、；微粒子銃；リポフェクション；および感染。ＢＤＣＡをコードするベクターまたはポリヌクレオチドを導入する手段の選択は、しばしば、宿主細胞の特徴に依存する。
【０１６３】
一旦適切な宿主細胞に導入されると、ＢＤＣＡの発現は、当該分野で公知の任意のアッセイを使用して決定され得る。例えば、それらの存在は、培養上清（ポリペプチドが分泌される場合）または細胞溶解物のＲＩＡまたはＥＬＩＳＡによって検出され得る。
【０１６４】
本発明のベクターは、ＢＤＣＡをコードする１以上のポリヌクレオチドを含み得る。これはまた、所望の結果を増強、促進または調節する他のポリペプチド（例えば、サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γを含むが、これらに限定されない））をコードするポリヌクレオチド配列を含み得る。組換えＢＤＣＡをコードするワクシニアベクターもまた、本発明に含まれる。
【０１６５】
本発明の他の実施形態は、上記のような、ＢＤＣＡをコードするポリヌクレオチドで形質転換した宿主細胞およびこのポリヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換した宿主細胞である。原核生物細胞および真核生物細胞の両方が、使用され得る。原核生物宿主としては、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）が挙げられるが、これらに限定されない。真核生物宿主としては、酵母、昆虫、鳥類、植物および哺乳動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。宿主系は、当該分野で公知であり、そして本明細書中に詳細に記載する必要はない。哺乳動物宿主細胞の例としては、ＣＨＯおよびＮＳ０（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｅｎｇｌａｎｄ）から入手可能）が挙げられるが、これらに限定されない。プラスミド（例えば、ＣＭＶプロモーターによって駆動される）でのＮＳ０細胞のトランスフェクション、その後の、グルタミンシンセターゼを使用におけるこのプラスミドの増幅は、タンパク質産生の有用な系を提供する。Ｃｏｃｋｅｔｔら（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：６６２−６６７。
【０１６６】
本発明の宿主細胞は、とりわけ、ＢＤＣＡをコードするポリヌクレオチドの貯蔵所として、またはその産生のためのビヒクルとして、使用され得る。これらは、ＢＤＣＡのインビボ発現のためのビヒクルとしてもまた使用され得る。
【０１６７】
本発明のポリヌクレオチドは、いくつかの用途を有する。これらは、例えば、ＢＤＣＡの産生のための発現系において有用である。これらはまた、当該分野で周知の方法を使用してサンプル中のＢＤＣＡまたは関連する配列をコードするポリヌクレオチドの存在についてアッセイするためのハイブリダイゼーションプローブとして有用である。さらに、これらのポリヌクレオチドはまた、所望のポリヌクレオチドの増幅をもたらすためのプライマーとして有用である。本発明のポリヌクレオチドはまた、薬学的組成物（ワクチンを含む）において、および遺伝子治療のために有用である。
【０１６８】
これらのポリヌクレオチドはまた、ＢＤＣＡコード配列の検出のためのハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。適切なハイブリダイゼーションサンプルとしては、遺伝子治療における使用のためにエキソビボで形質転換された細胞が挙げられる。１つの例において、ＤＮＡまたはＲＮＡは、サンプルから抽出され、そして必要に応じて、ゲル上で泳動しそして／または制限ヌクレアーゼで消化する。この処理したサンプルポリヌクレオチドは、代表的に、洗浄に適切な媒体に移される。次いで、このサンプルポリヌクレオチドに、ＢＤＣＡコードポリヌクレオチドプローブを接触させる。これは、このサンプルが相補的ポリヌクレオチド配列を含む場合に安定な二重鎖が形成するのを可能にする条件下で行う。形成される任意の適切な二重鎖を、任意の適切な手段によって検出する。例えば、ポリヌクレオチドプローブは、標識された形態で供給され得、そして洗浄後にサンプルと共に残存する標識は、形成された安定な二重鎖の量を反映する。第２の例において、ハイブリダイゼーションを、インサイチュで行う。適切に調製された組織サンプルに、標識プローブを被せて、ＢＤＣＡコード配列の位置を示す。
【０１６９】
短いポリヌクレオチドもまた、ＰＣＲ反応のためのプライマー（特に、このプライマーとハイブリダイズする領域を含む長い配列を増幅するための）として使用され得る。これは、さらなる遺伝子操作のためのポリヌクレオチドを産生するために、分離目的で行われる。これはまた、ＢＤＣＡコードポリヌクレオチドが、例えば、診断目的のサンプルに存在するか否かを決定するために、分析目的で行われる。
【０１７０】
これらのポリヌクレオチドの別の用途は、ワクチンおよび遺伝子治療における。一般原理は、このポリヌクレオチドを投与して、その結果、これによってコードされるポリペプチドの発現を促進するかまたは減弱することである。従って、本発明は、免疫応答を誘導する方法および処置方法を包含し、これらは、ＢＤＣＡをコードする有効量のポリヌクレオチドを個体に投与する工程を包含する。これらの方法において、ＢＤＣＡをコードするポリヌクレオチドは、直接的にかまたはこのポリヌクレオチドをトランスフェクトした細胞を介して、個体に投与される。好ましくは、このポリヌクレオチドは、環状プラスミド（好ましくは、スーパーコイル形態にある）の形態にある。好ましくは、このポリヌクレオチドは、細胞内で複製される。従って、このポリヌクレオチドは、適切なプロモーター（例えば、標的組織型の細胞において内因的に活性である異種プロモーター）に作動可能に連結されている。好ましくは、一旦細胞核に存在すると、プラスミドは、環状の非複製エピソーム分子として存続する。インビトロ変異は、例えば、より高い親和性および／または結合力を有する分子をコードするように、プラスミド構築物に対して行われ得る。
【０１７１】
ＢＤＣＡポリヌクレオチドを含有するプラスミドが、真核生物細胞において発現可能であるか否かを決定するために、細胞（例えば、ＣＯＳ−７、ＣＨＯまたはＨｅＬａ）を、これらのプラスミドでトランスフェクトし得る。次いで、発現を、イムノアッセイ；例えば、ウエスタンブロットによって、決定する。小さいＢＤＣＡは、例えば、得られたポリペプチドがタグ（例えば、標的エピトープまたは酵素標識）と融合されるようなプラスミドを構築することによって、検出され得る。発現されたポリペプチドのさらなる特徴づけは、ポリペプチドを精製し、次いで、本明細書中に記載の機能的アッセイの１つを行うことによって、達成され得る。
【０１７２】
遺伝子治療の１つの様式において、本発明のポリヌクレオチドは、エキソビボで細胞を遺伝的に改変するために使用される。このストラテジーにおいて、ドナーから取り出した細胞または細胞株から得た細胞を、ＢＤＣＡベクターで形質導入またはトランスフェクトし、次いで、レシピエントに投与する。トランスフェクションのために適切な細胞株としては、末梢血単核細胞が挙げられる。
【０１７３】
遺伝子治療の別の様式において、本発明のポリヌクレオチドは、インビボで細胞を改変するために使用される。この目的には、種々の型の癌を処置することが含まれ得るが、これらに限定されない。
【０１７４】
これらのポリヌクレオチドはまた、ＢＤＣＡ−２を発現しない細胞、およびＢＤＣＡ−２を発現するトランスジェニック動物を産生するために使用され得る。
【０１７５】
本発明から、ＢＤＣＡ−２を発現しないかまたは有意に減少されたレベルでＢＤＣＡ−２を発現するように操作された細胞が得られる。このような細胞は、細胞（好ましくは、ＤＣ）を選択し、そしてその細胞にＢＤＣＡ−２をコードするポリヌクレオチドを含む発現構築物を提供することによって産生され、ここで、このポリヌクレオチドは、アンチセンスの状態でありかつプロモーターに作動可能に連結される。このようなポリヌクレオチドの発現は、ＢＤＣＡ−２欠損性の細胞を効果的に産生する。
【０１７６】
他の実施形態において、本発明は、ＢＤＣＡ−２を有意に減少された量で産生するかまたはさらにＢＤＣＡ−２の産生を「ノックアウト」する、組換え宿主細胞を調製するために方法を提供する。これらの組換え宿主細胞は、当該分野で周知の１以上の手段を使用することによって調製され得る。例えば、遺伝子発現は、ゲノム内へのアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡの構築物の組み込みによって阻害され得る。内因性ＢＤＣＡ−２遺伝子の欠失または変異は、これらを非機能的にし得る。ＢＤＣＡ−２  ｍＲＮＡを特異的に切断するリボザイム（ＲＮＡ切断酵素）をコードする核酸を、この組換え宿主細胞に導入し得る。
【０１７７】
用語「ノックアウト」とは、細胞中の内因性ＤＮＡ配列（例えば、ＢＤＣＡ−２）によってコードされるタンパク質の少なくとも一部の発現の、部分的または完全な抑制をいう。用語「ノックアウト構築物」とは、細胞中の内因性ＤＮＡによってコードされるタンパク質の発現を減少または抑制するように設計された核酸配列をいう。
【０１７８】
これらの組換え構築物は、ノックアウト動物に組み込まれ、その結果、ＢＤＣＡ−２の産生がＤＣにおいて抑制される。ノックアウトおよびトランスジェニック動物の調製は、当該分野で公知であり、そして米国特許第５，４３４，３４０号、同第５，５３０，１７９号および同第５，５５７，０３２号に記載される。
【０１７９】
本発明はさらに、ＢＤＣＡ−２を過剰発現する動物を産生するための方法およびＢＤＣＡ−２を過剰発現するように産生された動物を提供する。これらの方法は、一般に、動物に細胞を導入する工程を包含し、これらの動物細胞は、その中にＢＤＣＡ−２ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントを挿入するためにインビトロで処置され、これらの動物細胞は、この動物中でインビボにてＢＤＣＡ−２を発現する。
【０１８０】
（Ｄ．キット）
本発明は、血清および他の供給源におけるＢＤＣＡ−２（可溶性ＢＤＣＡ−２（そのアイソフォームを含む）を含む）を測定するための、抗ＤＣ特異的抗原結合フラグメントを含むキットを包含する。これらのキットを使用する診断手順は、診断室、実験室、医師、または個人によって行われ得る。臨床サンプルは、試験される標的の富化のために、必要に応じて前処理される。次いで、使用者は、キットに含まれる試薬を適用して、その診断成分における変化したレベルまたは変更を検出する。
【０１８１】
必要に応じて、試薬は、標識と結合体化され得、サンプル中の標的と共に形成される任意の複合体の検出を可能にする。別の選択肢において、第１の試薬がその標的を見出した後にその第１の試薬と結合し得そしてそれによって検出可能な標識を供給し得る、第２の試薬が、提供される。例えば、標識した抗マウスＩｇＧは、二次試薬として提供され得る。標識したアビジンは、一次試薬が、ビオチンと結合体化されている場合の、二次試薬である。
【０１８２】
これらのキットは、種々の生物学的サンプル（液体サンプル、細胞懸濁物および組織サンプルを含む）に対して使用され得る。キット形態で供給され得る適切なアッセイとしては、本明細書中に記載のアッセイが含まれる。
【０１８３】
各試薬は、固体形態で供給されるか、または貯蔵およびその後に試験を行う時の反応媒体の交換または反応媒体への添加のために適切な液体緩衝液中に溶解／懸濁されている。適切なパッケージングが提供される。このキットは、必要に応じて、この手順に有用なさらなる成分を提供する。これらの任意の成分としては、緩衝液、捕捉試薬、発色試薬、標識、反応表面、検出手段、コントロールサンプル、指示書および説明書が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８４】
（Ｅ．治療組成物）
（１．合成物）
本明細書中に記載される薬学的組成物の調製は、薬学的調製物の調製のための一般に受け入れられた手順に従って行われる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１８版（１９９０）、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，ＰＡを参照のこと。意図される用途および投与形態に依存して、薬学的組成物の調製において活性成分をさらに処理することが望ましくあり得る。適切な処理としては、滅菌、適切な非イオン性かつ非干渉成分との混合、用量単位への分割、および送達デバイスへの封入が挙げられる。１つの実施形態において、治療組成物は、ＤＣ、その亜集団またはその混合物を含む。別の実施形態において、組成物は、本明細書中に記載される抗原結合フラグメントを含む。好ましくは、この抗原結合フラグメントは、表１に列挙したｍＡｂであるか、またはこれらのｍＡｂに由来する。好ましくは、これらのＤＣ組成物は、これらの抗原結合フラグメントのうちの１つで単離されたＤＣを含む。
【０１８５】
（ａ）一般的な投与形態
本発明の薬学的組成物は、この形態の組成物に適切な様式によって投与される。代表的な経路としては、静脈内、皮下、筋内、腹腔内、経皮、経口、鼻内、皮内、および肺内（すなわち、エアロゾルによる）が挙げられる。ヒトのための薬学的組成物は、代表的には、非経口経路、最も代表的には、静脈内、皮下、筋内で投与される。必要ではないが、薬学的組成物は、好ましくは、正確な量の投与のために適切な単位投薬形態で供給される。徐放形態または持続放出形態もまた本発明によって意図され、これによって、比較的一定レベルの活性化合物が、長期間にわたって提供される。
【０１８６】
（ｂ）液体処方物
液体の薬学的に受容可能な組成物は、例えば、液体賦形剤（例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロールまたはエタノール）中に、本発明の実施形態のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを溶解または分散させることによって調製され得る。組成物はまた、必要に応じて、他の医療因子、薬学的因子、キャリアおよび補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、およびｐＨ緩衝剤）を含み得る。注射用組成物は、液体の溶液または懸濁液として、エマルジョンとして、または注射前の液体中での溶解または懸濁に適切な固体形態として供給され得る。
【０１８７】
経口、鼻内または局所投与のための薬学的組成物は、固体、半固体または液体形態（錠剤、カプセル、粉末、液体および懸濁液を含む）で供給される。気道を介する投与のために、好ましい組成物は、適切なエアロゾルデバイスを用いたときに固体、粉末または液体エアロゾルを提供する組成物である。
【０１８８】
本発明はまた、腫瘍細胞または新生物細胞の領域あるいは免疫系にリポソームを特異的に送達するための、膜に結合したペプチドを有するリポソームを含有する組成物を包含する。これらのリポソームは、これらが、ペプチドに加えて、上記のような免疫療法剤を含むように産生され得、これらの免疫療法剤は、次いで、認識部位に放出される。Ｗｏｌｆｆら（１９８４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ８０２：２５９。別のこのような送達系は、抗原結合フラグメントの提示のために、キメラパルボウイルスＢ１９キャプシドを利用する。Ｂｒｏｗｎら（１９９４）Ｖｉｒｏｌ．１９８：４７７−４８８；およびＭｉｙａｍｕｒａら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：８５０７−８５１１。このようなキメラ系は、本明細書中に記載の使用のために包含される。
【０１８９】
本発明の実施形態の組成物は、多くの方法でそれらの効力について評価され得る。従って、試験化合物は、適切な薬学的組成物として調製され、そして試験被験体に投与される。初期研究は、好ましくは、小動物（例えば、マウスまたはウサギ）においてなされ、必要に応じて、次に、非ヒト霊長類において、そして最後に、ヒトにおいてなされる。免疫原性は、好ましくは、以前に抗体応答を有さない個体において試験される。適切な試験用量の試験組成物が、適切な処置スケジュールで投与される。予測される範囲内の異なる用量およびスケジュールを比較することが適切であり得る。抗原結合フラグメントの投与についての投薬範囲は、所望の効果を生じるのに十分大きく、ここで、疾患の症状は、過度の副作用（例えば、望ましくない交差反応およびアナフィラキシー反応）を引き起こすことなく回復される。一般に、投薬は、患者の年齢、状態、性別および疾患の程度に伴い変化し、そして当業者によって決定され得る。投薬は、任意の合併症が生じる場合に個々の医師によって調整され得る。一般に、これらの組成物が、治療因子と共に結合体化されて投与される場合に、より低用量（インビボ免疫診断画像化に使用される用量に匹敵する）で使用され得る。
【０１９０】
（２．抗原結合フラグメント）
本発明は、本明細書中に記載の抗原結合フラグメントを含む薬学的組成物を包含する。このような薬学的組成物は、単独でかまたは他の治療形態（化学療法、放射線療法または免疫療法（ＷＯ９８／２３７３５；ＷＯ９８／３４６４２；ＷＯ９７／１００００；ＷＯ９７／１０００１；およびＷＯ９７／０６８２１に記載される））と組み合わせて、免疫応答の誘導または補助および新生物疾患の処置、あるいは自己免疫疾患（ＧｖＨＤ、同種移植片拒絶、アレルゲンなど）の寛容および処置に有用である。他の処置方法は、本明細書中に記載され、そして／または当該分野で公知である。適切な疾患としては、ウイルス疾患、寄生生物疾患、細菌疾患、真菌疾患、新生物疾患および自己免疫疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９１】
マウス乳癌モデルにおいて、Ｆｌｔ３−Ｌｉｇａｎｄ（Ｆｌｔ３−Ｌ）（ＤＣおよびＢ細胞を含む種々の造血系統に対する刺激性サイトカイン）は、ワクチンとして、マウス乳癌細胞と組み合わせて使用されている。Ｃｈｅｎら（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：３５１１−６。ＤＣはまた、腫瘍抗原で負荷され得るかまたは腫瘍抗原を発現するように形質導入され得；次いで、これらの細胞は、腫瘍ワクチン接種に対するアジュバントとして使用される。ＤＣは、適切なＭＨＣ拘束状況下で輸入リンパ系に、内因的に腫瘍関連抗原を提示する。Ｗａｎら（１９９７）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：１３５５−６３；Ｐｅｉｐｅｒら（１９９７）Ｓｕｒｇｅｒｙ  １２２：２３５−４１；およびＳｍｉｔｈら（１９９７）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：１０８５−９３．現在の黒色腫ワクチンは、抗原提示網を操作し、そして腫瘍保護免疫の媒介に効果的な最良の細胞性免疫応答と抗体抗腫瘍免疫応答を合わせる。これらの治療は、副作用を伴わずに、いくつかの場合において、後退、疾患の進行の遅延、または生存の改善を生じた。Ｋｕｈｎら（１９９７）Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｕｒｇ．２３：６４９−５４。黒色腫ワクチンはまた、Ｃｏｎｆｏｒｔｉら（１９９７）Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．６６：５５−６４に概説される。
【０１９２】
ワクチンは、薬学的に受容可能なキャリアにパッケージングされ得るか、当該分野で公知のアジュバントまたは他の成分（例えば、サイトカイン）と混合される。獣医学用途のワクチンは、細菌および細菌成分を含むアジュバント（フロイント完全アジュバントまたはフロイント不完全アジュバント）が、処方物において許容されるという例外を除いて、実質的にヒトのワクチンと類似する。
【０１９３】
（Ｆ．処置方法）
種々の障害（本明細書中に記載され、そして／または当該分野で公知のような）を処置するための方法もまた、本発明に含まれる。これらの方法は、所望の効果を達成する（既存の状態を軽減するかまたは再発を防止する）のに有効量の本発明の組成物を含有する、ある量の薬学的組成物を投与する工程を包含する。癌の処置について、投与される薬学的組成物の量は、その所望の効果を精製するのに有効な量である。有効量は、１回または一連の投与において提供され得る。有効量は、ボーラスでまたは連続灌流によって提供され得る。適切な活性薬剤としては、抗新生物薬剤、生物応答（ｂｉｏｒｅｓｐｏｎｓｅ）変更因子およびエフェクター細胞（例えば、Ｄｏｕｉｌｌａｒｄら（１９８６）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ（補遺１：５１３９）に記載されるような）が挙げられる。
【０１９４】
薬学的組成物および処置様式は、新生物に対する免疫応答を直接的または間接的に誘導することによって患者を処置するために適切である。「個体」、「患者」または「被験体」は、脊椎動物、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ヒトである。哺乳動物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ヒト、野生動物（ｗｉｌｄ  ａｎｉｍａｌ）、野生動物（ｆｅｒａｌ  ａｎｉｍａｌ）、家畜動物、スポーツ用動物、およびペット。「癌被験体」は、悪性疾患または新生物を有するかあるいはそれらの危険性があると診断された、哺乳動物、好ましくは、ヒトである。
【０１９５】
本明細書中で使用される場合、「処置」とは、処置される個体または細胞の疾患経過を変更する試みにおける、臨床的介入をいい、そして予防的にかまたは臨床的病状の経過中に行われ得る。処置の治療的効果としては、疾患の発生または再発の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的結果の減少、転移の防止、疾患進行速度の減少、疾患状態の回復または軽減、および環開または予後の改善が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９６】
疾患状態に関係する「病理学」とは、罹患した個体の生活の幸福、正常な生理学、または生活の質を含む任意の状態である。これは、以下を含み得るがこれらに限定されない：以前に罹患していない領域への罹患した組織の破壊的挿入、正常な組織機能を犠牲にする増殖、不規則な生物学的活性もしくは抑制された生物学的活性、炎症応答もしくは免疫学的応答の悪化もしくは抑制、他の病原性生物または因子に対する増加した感受性、ならびに望ましくない臨床的症状（例えば、痛み、熱、悪心、疲労、気分の変化ならびに主治医により決定され得るような他の疾患特徴）。
【０１９７】
「有効量」とは、処置の際の有益な臨床結果または所望の臨床結果をもたらすに十分な量である。有効量は、１用量以上で患者に投与され得る。処置に関して、有効な量は、疾患の進行を緩和、軽減、安定化、逆行または遅延するに十分であるか、あるいは疾患の病理学的結果を減少するに十分である、量である。この有効量は、一般的に、症例に応じて医師により決定され、この有効量は、当業者の範囲内である。いくつかの因子が、有効量を達するために適切な投薬量を決定する場合に、代表的に考慮される。これらの因子としては、患者の年齢、性別、および体重、処置する状態、その状態の重篤度、および投与される抗原結合フラグメントの形態および有効濃度が挙げられる。
【０１９８】
用語「免疫調節性」または「免疫応答を調節する」は、本明細書中で使用される場合、免疫刺激効果ならびに免疫抑制効果を含む。免疫刺激効果としては、細胞性免疫応答または体液性免疫応答を直接的または間接的増強する効果が、挙げられるがこれらに限定されない。免疫刺激効果の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：増加した抗原特異的抗体産生；リンパ球集団（例えば、ＮＫ細胞、ＣＤ４+細胞、ＣＤ８+細胞、マクロファージなど）の活性化または増殖；サイトカインまたはケモカイン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、インターフェロン、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−βなどを含むが、これらに限定されない）の増加した合成。免疫抑制効果としては、細胞性免疫応答または体液性免疫応答を直接または間接的に減少する効果が挙げられる。免疫抑制効果の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗原特異的抗体産生の減少（例えば、減少したＩｇＥ生成）；免疫抑制活性（例えば、免疫寛容を生じる活性）を有するリンパ球または他の細胞集団の活性化；ならびに特定の細胞機能に対する抑制効果を有するサイトカイン（ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βを含むが、これらに限定されない）の増加した合成。この１つの例は、ＩＦＮ−γであり、これは、ＩｇＥおよびＩｇＧ１へのＩＬ−４誘導性クラス変換をブロックし、それによりこれらの抗体サブクラスのレベルを減少するようである。
【０１９９】
癌治療に適切なヒト被験体は、２つの処置群をさらに含み、これらの群は、臨床基準により区別され得る。「進行した疾患」または「高腫瘍負荷」を有する患者は、臨床的に測定可能な腫瘍を保有する患者である。臨床的に測定可能な腫瘍は、腫瘍塊に基づいて（例えば、触診により、ＣＡＴスキャンによるか、ソノグラムによるか、乳房Ｘ線像によるか、またはＸ線により；生化学的ポジティブマーカーまたは組織病理学的マーカーそれ自体では、この集団を同定するために不十分である）検出され得る腫瘍である。本発明において具体化される薬学的組成物は、その状態を緩和する目的で、抗腫瘍応答を惹起するためにこれらの患者に投与される。理想的には、腫瘍塊の減少が、結果として生じるが、任意の臨床的改善が利益を構成する。臨床的改善は、腫瘍の進行の危険もしくは進行の減少、または腫瘍の病理学的結果の減少を含む。
【０２００】
適切な被験体の第２の群は、「アジュバント群」として当該分野で公知である。これらは、癌の病歴を有したが別の治療様式に応答した個体である。事前治療は、外科的切除、放射線療法、および従来の化学療法を含み得た（が、これらに限定されない）。結果として、これらの個体は、臨床的に測定可能な腫瘍を有さない。しかし、これらは、もとの腫瘍部位付近でかまたは転移によってのいずれかで、疾患の進行の危険があると疑われる。
【０２０１】
「アジュバント」とは、本明細書中で使用される場合、いくつかの意味を有し、そのすべてが、この用語が使用される状況に依存して明らかである。薬学的調製物の状況において、アジュバントは、抗原とともに（皮下にかまたは他の方法で）与えられるか、または抗原に組換え融合されて、その抗原の免疫原性を増強する、化学的因子または生物学的因子である。概説について、Ｓｉｎｇｈら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１０７５〜１０８１を参照のこと。単離されたＤＣもまた、アジュバントとしての使用について示唆されている。その中における使用のための組成物が、本発明中に包含される。癌診断または癌処置の状況で、アジュバントは、臨床的に検出可能な腫瘍塊を有さないが、再発の危険が疑われる、癌患者の種類をいう。
【０２０２】
この群は、さらに高リスク個体および低リスク個体へと部分分割され得る。この部分分割は、最初の処置の前または後に観察される特徴に基づいてなされる。これらの特徴は、臨床的分野で公知であり、そして種々の各癌について適切に規定される。高リスク部分群を代表する特徴は、腫瘍が隣接組織に侵襲したか、リンパ節の関与を示す、特徴である。
【０２０３】
別の適切な群は、癌に対する遺伝的素因を有するが、なお癌の臨床的徴候を有未だ示さない、群である。例えば、乳癌に関連する遺伝子変異について試験の結果がポジティブであるがなお妊娠可能な年齢である女性は、予防手術を実施するのが適切であるまで、癌の発症を予防するような予防的処置において本明細書中に記載される抗原結合フラグメントの１つ以上を受けることを望み得る。
【０２０４】
ヒト癌患者（神経膠芽細胞、黒色腫、神経芽細胞腫、腺癌、神経膠腫、軟部組織肉腫および種々の癌腫（小細胞肺癌を含む）を含むが、これらに限定されない）は、特に適切な被験体である。適切な癌腫は、さらに、以下を含むがこれらに限定されない、腫瘍学の分野で公知の任意の癌腫を含む：神経膠星状細胞腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、乏突起神経膠腫、脳室上衣細胞腫、髄芽細胞腫、未分化神経外胚葉性腫瘍（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｎｅｕｒａｌ  ｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ  ｔｕｍｏｒ）（ＰＮＥＴ）、軟骨肉腫、骨原性肉腫、膵管腺癌、小細胞肺腺癌および大細胞肺腺癌（ｓｍａｌｌ  ａｎｄ  ｌａｒｇｅ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、扁平上皮癌、気管支肺胞癌腫（ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａ）、上皮腺癌（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、およびその肝臓転移、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、肝細胞癌、胆管癌、骨膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫（ｃｏｌｏｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、基底細胞癌、汗腺癌、乳頭状癌、汗腺癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、胆管癌腫（ｂｉｌｅｄｕｃｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、精巣腫瘍、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、およびＨ鎖病、腺管癌および小葉癌のような乳癌、子宮頚の扁平上皮癌および子宮頚の腺癌、子宮上皮癌腫瘍、卵巣上皮癌腫瘍、前立腺腺癌、膀胱の移行性扁平上皮癌、Ｂ細胞リンパ腫およびＴ細胞リンパ腫（結節性およびびまん性）プラスマ細胞腫、急性および慢性白血病、悪性黒色腫、軟部組織肉腫ならびに平滑筋肉腫。
【０２０５】
患者は、疾患の進行形態を有し得、その症例において、処置目標は、疾患進行の緩和もしくは逆転、および／または副作用の軽減を含み得る。その患者は、処置された状態の病歴を有し得、その症例において、治療目標は、代表的には、再発の危険の減少または遅延を含む。
【０２０６】
自己免疫障害は、種々の細胞、組織および器官の自己破壊を生じる、方向を誤った免疫応答により生じる。これらの障害の原因は、未知である。ＭＨＣを介する自己の認識は、免疫応答において重要であることが公知である。しかし、自己免疫応答の予防および自己免疫を担う細胞は、十分には理解されていない。
【０２０７】
自己免疫は、因子（遺伝的影響、体液性影響および環境的影響を含む）の組み合わせから生じる。多くの自己免疫障害は、Ｂ細胞機能亢進により特徴付けられ、これは、Ｂ細胞および自己抗体の増殖ならびに高ガンマグロブリン血症により顕著である。Ｂ細胞機能亢進は、おそらくＴ細胞異常に関連する。ホルモン因子および遺伝的因子は、自己免疫障害の発症に強力に影響する（例えば、エリテマトーデスは、妊娠可能な年齢の女性に優勢に影響し、そして特定のＨＬＡハプロタイプは、特定の自己免疫障害の危険の増加と関連する）。
【０２０８】
一般的自己免疫障害としては、慢性関節リウマチ、若年性慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、シェーグレン症候群、エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、ライター症候群、強皮症、脈管炎、多発性筋炎および皮膚筋炎が挙げられるが、これらに限定されない。これらの状態の多くは、免疫学的障害に関連する異常な炎症反応を含む。本明細書中に記載されるＤＣは、特に、その障害に関与するＴ細胞を不活性化するかまたはＴ細胞における寛容原化を誘導するために使用される場合、これらの障害の処置における使用に適切である。処置の方法は、当該分野で公知である。本明細書中で考察されるように、本明細書中に記載の方法により得られるＤＣのサブセットの１つ以上が、自己免疫の処置における使用に適切である。
【０２０９】
抗原結合フラグメントの「免疫原性活性」は、インタクトな抗体が認識する抗原に特異的に結合することをいう。このような結合は、免疫応答を惹起しても惹起しなくてもよい。特定の免疫応答は、抗体、Ｂ細胞応答、Ｔ細胞応答、それらの任意の組み合わせ、ならびにこれらから生じ得るエフェクター機能を惹起し得る。限定はしないが、抗体媒介性機能ＡＤＣＣおよび補体媒介性細胞溶解（ＣＤＣ）が含まれる。Ｔ細胞応答としては、Ｔヘルパー細胞機能、細胞傷害性Ｔ細胞機能、炎症／誘導物質Ｔ細胞機能、およびＴ細胞媒介性免疫抑制が挙げられるが、限定はしない。直接または間接的のいずれかで、これらの基準のいずれかに従う特定の免疫応答を惹起し得る化合物（単独またはキャリアもしくはアジュバントとの組み合わせてのいずれかで）は、「免疫原性」と呼ばれる。抗原結合フラグメント「活性」または「機能」は、抗体の免疫学的活性のいずれか（癌の検出、改善または緩和を含む）をいう。
【０２１０】
「免疫応答」は、悪性組織または疾患組織、身体が曝露される疾患原因因子および他の外来因子に対する免疫学的応答の誘導または増強をいう。免疫応答は、抗体産生により示されるように、体液性であり得；そして／またはナチュラルキラー細胞または細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）およびそれらにより産生されるサイトカインのような細胞によって示される細胞溶解性応答によって示されるように、細胞媒介性であり得る。免疫応答は、感染または悪性疾患の部位の単核細胞浸潤によりモニターされ得る。代表的には、このようなモニタリングは、組織病理学による。「癌特異的免疫応答」は、悪性疾患に対して生じるが非癌性細胞に対しては生じない、免疫応答である。本明細書中に記載の処置は、代表的には、細胞媒介性免疫応答を誘導または増強するが、抗体媒介性免疫応答もまた誘導または増強し得る。この処置はまた、抗原に対する免疫応答の型に影響し得る。
【０２１１】
本発明による組成物はまた、抗原特異的Ｔｈ１免疫応答を誘導する際の使用に適切である。Ｔｈ１型免疫応答を刺激することは、本発明に従って処置される宿主において測定され得、そして以下を含むがこれらに限定されない、当該分野で公知の任意の方法により決定され得る：抗原チャレンジ前後に測定したＩＬ−４のレベルの減少；あるいは抗原刺激したかもしくは刺激およびチャレンジした、本発明の組成物を用いずに処置したコントロールと比較して、処置した宿主におけるＩＬ−４のより低いレベル（またはレベルを欠く）の検出；抗原刺激したかもしくは刺激およびチャレンジしたコントロールと比較して、処置した宿主におけるＩＬ−１２、ＩＬ−１８および／もしくはＩＦＮ（α、βもしくはγ、好ましくはＩＦＮ−γ）のレベルにおける増加；未処置のコントロールと比較して、処置した宿主におけるＩｇＧ２ａ抗体生成；抗原刺激したかもしくは刺激およびチャレンジした、未処置宿主と比較して、抗原チャレンジ前後に測定した抗原特異的ＩｇＥのレベルの減少、あるいは処置した宿主における抗原特異的ＩｇＥのより低いレベル（またはレベルを欠く）の検出。種々のこれらの決定は、ＡＰＣおよび／またはリンパ球、好ましくはＤＣおよび／またはＴ細胞により生成されるサイトカインを、本明細書中に記載されそして当該分野で公知の方法を使用してインビトロまたはエキソビボで測定することによって、なされ得る。抗体産生を決定するための方法としては、当該分野で公知の任意のものが挙げられる。
【０２１２】
Ｔｈ１に偏ったサイトカイン誘導は、増強した細胞性免疫応答（例えば、ＮＫ細胞、細胞傷害性キラー細胞、Ｔｈ１ヘルパーおよび記憶細胞によって行われる免疫応答）を生成する。これらの応答は、ウイルス、真菌、原生動物寄生生物、細菌、アレルギー性疾患および喘息、ならびに腫瘍に対する予防的または治療的ワクチン接種における使用に特に有益である。
【０２１３】
本発明は、BDCA-2の連結を介するＩ型インターフェロン産生のダウンレギュレーション、BDCA-2の連結を介するＴｈ１免疫応答のダウンレギュレーション、およびBDCA-2の連結を介するTh2への免疫応答の分極（偏向：polarization）をさらに含む。これらの指標は、BDCA-2の連結を妨害することによって逆転され得る。本発明はさらに、BDCA-2の連結を妨害するために適切な部分およびこれらの部分の組成についてスクリーニングすることを包含する。
【０２１４】
抗原結合フラグメントは、種々の治療薬剤と組み合わせて使用され、両方の投与は、通常、実質的に同時に生じる。用語「実質的に同時に」は、それらが時間に関して合理的に近接して投与されることを意味する。治療薬剤の投与は、毎日であってもまたは他の適切な任意の間隔であってもよく、例えば、病気の性質、患者の状態および薬剤の半減期のような因子に依存する。
【０２１５】
治療組成物は、注射によってか、または経時的な漸次灌流によって、投与され得る。抗原結合フラグメントは、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内（ｉｎｔｒａｃａｖｉｔｙ）、結節内（ｉｎｔｒａｎｏｄａｌ）、鞘内または経皮的に、単独でかまたは他の治療剤と組み合わせて、投与され得る。
【０２１６】
投与の別の方法は、例えば、腫瘍中への直接の注射による、病変内局注である。癌患者への種々の形態の免疫療法の病変内局注投与は、免疫学的因子の全身投与に伴って観察される毒性を生じない。Ｆｌｅｔｃｈｅｒら（１９８７）Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．６：４５；Ｒａｂｉｎｏｗｉｃｈら（１９８４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：１７３；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：１３１８；およびＰｉｚｚら（１９８４）Ｊ．Ｉｎｔ．Ｃａｎｃｅｒ  ３４：３５９。
【０２１７】
さらに、処置が必要な領域へ局所的にその組成物を投与することが望ましくあり得；これは、例えば、注射、カテーテル、または移植片による手術の間の局所注入によって達成され得、その移植片は、多孔性、非多孔性またはゼラチン状の物質であり、これらとしては、シラスチック膜または繊維のような、膜が挙げられる。そのような適切な膜は、Ｇｕｉｌｆｏｒｄ  ｓｃｅｉｎｃｅｓにより提供されるＧｌｉａｄｅｌ（登録商標）である。
【０２１８】
抗ＢＤＣＡ−２モノクローナル抗体（ＡＣ１４４）とのＢＤＣＡ−２の連結が細胞内Ｃａ２+移動を誘導するという事実は、プラスマ細胞様ＤＣ（およびＢＤＣＡ−２を発現する他のすべての細胞）は、ＢＤＣＡ−２シグナル伝達の誘発またはＢＤＣＡ−２シグナル伝達の誘発の阻害によって、機能的に調節され得ることを示す。ＤＣの機能的調節に関して、以下の局面が、特許請求の範囲によって包含される：
Ａ）ＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞応答の誘導およびダウンレギュレーション。
Ｂ）寛容または免疫への免疫応答の分極（polarization）。
Ｃ）Th1細胞発達（development）、Th2細胞発達またはTh3/T調節性-1 CD4+T細胞発達への、CD4+T細胞応答の分極（polarization）。後者は、おそらくTGF-βおよび/またはIL-10の分泌を介して、免疫応答をダウンレギュレートする。
【０２１９】
Ｄ）ＤＣは、通常、Ｔ細胞についての抗原提示細胞と考えられる。しかし、いくつかの実験室からの最近の研究は、これらがＢ細胞活性化および抗体合成の調節において、重要な役割を有すると示された。従って、Ｂ細胞応答は、ＤＣ上のＢＤＣＡ−２を介して調節され得る。同じことが、ＮＫ細胞応答についても真であり得る。
【０２２０】
Ｉ型インターフェロンはヒトにおいてTh1型免疫応答を誘導し得るので（Parronchiら(1996) Eur. J. Immunol. 26: 697〜703）、BDCA-2の誘発は、Th2細胞発達（development）にCD4+T細胞応答を分極する（polarize）が、BDCA-2シグナル伝達の阻害は、Th1細胞発達にCD4+T細胞応答を分極する。従って、本発明は、それぞれBDCA-2シグナル伝達の誘発またはBDCA-2シグナル伝達の誘発の阻害による、Th2細胞発達またはTh1細胞発達へのCD4+T細胞応答の分極を包含する。
【０２２１】
本明細書中に引用されるすべての刊行物は、本明細書中においてその全体が参考として援用される。以下の実施例は、本発明を例示するために提供されるが、本発明を限定はしない。
【０２２２】
（実施例１）
（ＤＣ特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の生成）
６〜８週齢の５匹の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇｉｌｒｏｙ、ＣＡ）に、麻酔下で、右足蹠に約５×１０5〜１×１０6の精製ＨＬＡ−ＤＲ+ｌｉｎ-血液ＤＣを０日目、４日目、７日目、１１日目および１４日目に、そして左足蹠に約１×１０6のＨＬＡ−Ａ２+Ｂｒｉｓｔｏｌ−８  Ｂリンパ芽球腫を、−３日目、０日目、４日目、７日目、１１日目、および１４日目に接種した。両方の細胞型を、室温で１０分間１：１００ＰＨＡ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）とともにインキュベートし、そして注射前にＰＢＳで洗浄した。この処置は、非特異的アジュバント効果を提供し、そしてフロイントアジュバントのようなアジュバントについての必要性を除去する。
【０２２３】
１５日目、ＨＬＡ−ＤＲ+ｌｉｎ-ＤＣの５回目の注射の１日後、マウス右脚の膝窩リンパ節を除去した。リンパ球懸濁物を調製し、そして細胞を、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５により記載される方法の改変形を使用して、ＳＰ２／０  Ａｇ１４黒色腫細胞に融合した。融合細胞を、２０％  ＦＣＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）、２ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｌグルタミン、１５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｈｅｐｅｓ、１０-4ｍｍｏｌ／Ｌヒポキサンチン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を補充したＤＭＥＭ中で９６ウェルプレート上にプレートし、そして９％  ＣＯ2を含む３７℃インキュベーター中に配置した。
【０２２４】
目に見えるハイブリドーマコロニーが明らかな場合、これらのウェルからの上清を、抗体分泌およびＰＢＭＣに対する非反応性（＜１％ポジティブ細胞）についてフローサイトメトリーによってスクリーニングした。簡単には、ラット抗マウスκ  ｍＡｂ結合体化ポリスチレンビーズ（直径２．５μｍ、Ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ）とＰＢＭＣの混合物を、室温で２０分間５０μｌハイブリドーマ上清とともにインキュベートした。次いで、ビーズ／細胞混合物を、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡおよび０．５％  ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）（ＰＢＳ／ＥＤＴＡ／ＢＳＡ）で２回洗浄し、そしてビーズおよび試験細胞へのこの上清由来のマウスＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂの結合を、ＰＥ結合体化ラット抗マウスＩｇＭ  ｍＡｂ（クローンＸ５４、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）、ＰＥ結合体化ラット抗マウスＩｇＧ１  ｍＡｂ（クローンＸ５６、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＰＥ結合体化ラット抗マウスＩｇＧ２  ｍＡｂ（クローンＸ５７、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色することによって、検出した。ＰＢＭＣおよびポリスチレンビーズを、スキャッターシグナルによりフローサイトメトリー分析において容易に区別し得る。
【０２２５】
次いで、第１回のスクリーニング基準を満たした培養上清を、有意な比率の血液ＤＣに対する反応性についてのフローサイトメトリー分析によってスクリーニングした。手短かには、ラット抗マウスｍＡｂ結合体化ポリスチレンビーズおよび富化した血液ＤＣ（Ｂ細胞、Ｔ細胞および単球を除去した、ＰＢＭＣ）の混合物を、室温で２０分間、５０μｌハイブリドーマ上清とともにインキュベートした。次いで、この混合物を２回、ＰＢＳ／ＥＤＴＡ／ＢＳＡで洗浄し、そしてＰＥ結合体化ラット抗マウスＩｇＭ  ｍＡｂ、ＰＥ結合体化ラット抗マウスＩｇＧ１  ｍＡｂおよびＰＥ結合体化ラット抗マウスＩｇＧ２  ｍＡｂで染色して、ビーズおよび富化した血液ＤＣへのこの上清由来のマウスＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂの結合を検出した。フローサイトメトリー分析におけるＨＬＡ−ＤＲ-細胞からのＨＬＡ−ＤＲ+ＤＣ細胞の識別のために、ビーズ／細胞混合物を１回洗浄し、ＰＥ結合体化ラット抗マウスＩｇＧ２  ｍＡｂの遊離結合部位およびビーズ結合体化ラット抗マウスκ  ｍＡｂの遊離結合部位（ｆｒｅｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ）を、室温で５分間、１００μｇ／ｍｌのマウスＩｇＧ２ａとのインキュベーションによって飽和させ、そしてこの混合物を、抗ＨＬＡ−ＤＲ−ＦＩＴＣ（クローンＡＣ１２２、ＩｇＧ２ａ）により対比染色した。
【０２２６】
選択したハイブリドーマ細胞を培養中で増殖して、ストックを液体窒素中で凍結し、サブクローンを、限界希釈によって確立し、そして一連のポジティブサブクローンもまた液体窒素中で凍結した。ｍＡｂのアイソタイプを、ＩＳＯＴＹＰＥ  Ａｂ−ＳＴＡＴ  Ｋｉｔ（ＳａｎｇＳｔａｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）により決定した。
【０２２７】
ｍＡｂ生成のために、ハイブリドーマ細胞を、ｍＡｂリッチな腹水のコレクションを用いてＢａｌｂ／ｃマウスにおける腹水腫瘍としてか、またはｍＡｂリッチな培養上清のコレクションを用いて細胞培養（ローラー培養または中空線維培養）中でのいずれかで、増殖させた。純粋なＩｇＧ  ｍＡｂを、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａアフィニティークロマトグラフィーにより、いくつかの場合ではその後に疎水性相互作用クロマトグラフィーにより、腹水または細胞培養上清から調製し、そして５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡおよび０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中に４℃で貯蔵した。精製ｍＡｂを、標準的技術に従って、ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、ＰＥ（Ｃｙａｎｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐ．、Ｋａｉｌｕａ  Ｋｏｎａ、ＨＩ）、Ｃｙ５（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）、ＡＰＣ（Ｅｕｒｏｐａ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｌｔｄ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）、ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）およびコロイド状超常磁性ビーズ（直径約５０ｍｍ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に結合体化した。Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（１９９６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、７８５頁；Ａｓｌａｍら（１９９８）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ：ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ．、Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．、Ｌｏｎｄｏｎ、８３３頁、；ならびにＫａｎｔｏｒら（１９９７）Ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．、Ｃｅｌｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｒｅｃｋｔｅｎｗａｌｄｓら編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１５３〜１７３頁。
【０２２８】
（細胞調製物）
正常な健常なボランティアからのバフィコートを、ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｍｅｒｈｅｉｍ、Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙから得た。ＰＢＭＣを、標準的Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）密度勾配遠心分離によりバフィコートから調製した。
【０２２９】
末梢血白血球を、等張性塩化アンモニウム緩衝液（１５５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮＨ4Ｃｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＨＣＯ3および０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中での赤血球の溶解によって、バフィコートから調製した。Ｈａｎｓｅｌら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔ．１４５：１０５〜１１０。ＣＤ４+ｌｉｎ-血液ＤＣを、本明細書の他の場所に詳細に記載されるような２工程免疫磁気細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）により、ＰＢＭＣから単離した。Ｒｏｂｅｒｔら（１９９９）；およびＭｉｌｔｅｎｙｉら（１９９９）Ｈｉｇｈ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ、Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ、Ｒａｄｂｒｕｃｈ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ、２１８〜２４７頁。簡単には、単球、Ｔ細胞およびＮＫ細胞を、ＣＤ３（クローンＢＷ２６４／５６）、ＣＤ１１ｂ（クローンＭ１／７０．１５．１１．５）、ＣＤ１６（クローンＶＥＰ−１３）に対するｍＡｂを使用し、いくつかの実験においては、Ｂ細胞および単球上で発現する不十分にしか規定されていない抗原（クローンＬ１７９）に対するｍＡｂを使用して、除去した。除去した細胞画分から、その後、血液ＤＣを、ＣＤ４（Ｍ−Ｔ３２１）に対する抗体を使用して、高純度に濃縮した。ハイブリドーマ培養上清（上記を参照のこと）をスクリーニングするために、血液ＤＣを、ＣＤ３およびＬ１７９抗原発現に基づくＴ細胞、Ｂ細胞および単球の免疫磁気除去によって、部分的にのみ濃縮した。
【０２３０】
ＣＤ１ｃ発現細胞、ＢＤＣＡ−２発現細胞、およびＢＤＣＡ−３発現細胞を、一次試薬としてＰＥ結合体化ｍＡｂもしくはＦＩＴＣ結合体化ｍＡｂ（それぞれ、ＡＤ５−８Ｅ７、ＡＣ１４４およびＡＤ６−５Ｅ８）を用い、そして二次試薬として抗ＰＥｍＡｂ結合体化マイクロビーズもしくは抗ＦＩＴＣｍＡｂ結合体化マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ）を用いる間接的磁気標識、ならびにＭＡＣＳによる標識細胞の濃縮によって、ＰＢＭＣまたは扁桃から単離した。いくつかの実験において、ＢＤＣＡ−３＋細胞を、抗ＢＤＣＡ−３  ｍＡｂ（ＡＤ５−５Ｅ８）結合体化マイクロビーズを用いる直接的磁気標識に基づいて単離した。ＣＤ１ｃ+Ｂ細胞を含まない高度に純粋なＣＤ１ｃ+血液ＤＣ細胞を、ＣＤ１９  ｍＡｂ結合体化マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ）を使用するＣＤ１８＋Ｂ細胞の免疫磁気除去、続いてのＣＤ１ｃ+細胞の免疫磁気濃縮によって得た。好塩基細胞を、磁気標識キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いる、ＣＤ３発現細胞、ＣＤ７発現細胞、ＣＤ１４発現細胞、ＣＤ１５発現細胞、ＣＤ３６発現細胞、ＣＤ４５ＲＡ発現細胞、およびＨＬＡ−ＤＲ発現細胞の間接的磁気標識に基づく、非好塩基細胞の免疫磁気除去によって、ＰＢＭＣから精製した。ＣＤ１４+単球、ＣＤ３４+造血前駆細胞およびＣＤ３+Ｔ細胞を、それぞれＣＤ１４  ｍＡｂ結合体化マイクロビーズ、ＣＤ３４  ｍＡｂ結合体化マイクロビーズおよびＣＤ３  ｍＡｂ結合体化マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ）を用いる直接磁気標識に基づいて、免疫磁気精製した。
【０２３１】
（細胞培養）
「未成熟」単球由来ＤＣ（Ｍｏ−ＤＣ）の生成のために、精製ＣＤ１４+単球を、培地［２ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｌ−グルタミン、１０％  ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ）、１００ｍｍｏｌ／Ｌピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、１００  Ｕ／ｍｌペニシリン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を補充した、ＲＰＭＩ  １６４０（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）］中で５×１０5〜１×１０6細胞／ｍｌの細胞密度で、５００〜１０００Ｕ／ｍｌ  ｒＩＬ−４（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ）および１００ｎｇ／ｍｌ  ｒＧＭ−ＣＳＦ（ＰｅｐｔｏＴｅｃｈ）の存在下で、加湿５％ＣＯ2含有雰囲気下で３７℃で７日間培養した。「成熟」Ｍｏ−ＤＣの生成のために、「未成熟」Ｍｏ−ＤＣを１回洗浄し、そして２０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦ−α（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）の存在下でさらに３日間培地中で培養した。ＣＤ３４+造血前駆細胞由来ＤＣ（ＣＤ３４−ＤＣ）の生成のために、精製ＣＤ３４＋細胞を、１００ｎｇ／ｍｌ  ｒＦｌｔ３−Ｌｉｇａｎｄ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、０．５ｎｇ／ｍＬ  ｒＴＧＦ−β１（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、１０ｎｇ／ｍｌ  ｒＴＮＦ−α、２０ｎｇ／ｍｌ  ｒＳＣＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）および１００ｎｇ／ｍｌ  ｒＧＭ−ＣＳＦの存在下で、培地中で１１日間、細胞密度５×１０4細胞／ｍｌで培養した。新鮮に単離したＣＤ４+ｌｉｎ-血液ＤＣを、１０ｎｇ／ｍｌ  ｒＩＬ−３（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）の存在下で４８時間まで、培地中で細胞密度５×１０5〜１×１０6細胞／ｍｌで培養した。単離したＣＤ１ｃ発現ＤＣ、ＢＤＣＡ−２発現ＤＣ、およびＢＤＣＡ−３発現ＤＣを、いかなるサイトカインも含まないか、または１０ｎｇ／ｍｌ  ｒＩＬ−３、２０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−４（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）および１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦの存在下で、培地中で４８時間まで、細胞密度５×１０5〜１×１０6細胞／ｍｌで培養した。
【０２３２】
（実施例２）
（血液ＤＣのフローサイトメトリー分析）
ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、１色フローサイトメトリー、２色フローサイトメトリー、３色フローサイトメトリーまたは４色フローサイトメトリーのために使用した。５×１０3〜２×１０5細胞／サンプルのデータを、リスト様式で得、そしてＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。
【０２３３】
以下のｍＡｂ（クローン名）を、フローサイトメトリーについてのこの研究において使用した：ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡからのＣＤ１ａ（ＨＩ１４９）、ＣＤ１０（ＨＩ１０ａ）、ＣＤ１１ａ（Ｇ４３−２５Ｂ）、ＣＤ１１ｃ（Ｂ−ｌｙ６）、ＣＤ２５（Ｍ−Ａ２６１）、ＣＤ２７（Ｍ−Ｔ２７１）、ＣＤ３２（ＦＬ１８．２６）、ＣＤ３８（ＨＩＴ２）、ＣＤ４０（５Ｃ３）、ＣＤ４３（ＩＧ１０）、ＣＤ５４（ＨＡ５８）、ＣＤ６２Ｌ（Ｄｒｅｇ５６）、ＣＤ６４（１０．１）、ＣＤ６９（ＦＮ５０）、ＣＤ９８（ＵＭ７Ｆ８）、抗ＨＬＡ−ＤＱ（ＴＵ１６９）、および抗ＴＣＲαβ  Ｔ１ＯＢ９．１Ａ−３１；ＢＤ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのＣＤ２（Ｓ５．２）、ＣＤ８（ＳＫ１）、ＣＤ１３（Ｌ１３８）、ＣＤ１４（ＭＦＰ９）、ＣＤ１９（ＳＪ２５−Ｃｌ）、ＣＤ３３（Ｐ６７．６）、ＣＤ３４（８Ｇ１２）、ＣＤ４５ＲＯ（ＵＣＨＬ−１）、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ１６．２）、ＣＤ７１（Ｌ０１．１）、ＣＤ１２３（９Ｆ５）、抗ＩｇＤ（ＴＡ４．１）、抗マウスＩｇＧ１（Ｘ５６）、抗マウスＩｇＧ２（Ｘ５７）、および抗マウスＩｇＭ（Ｘ５４）；ＣＬＢ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓからのＣＤ５（ＣＬＢ−Ｔ１１／１１、６Ｇ４）、ＣＤ７（ＣＬＢ−Ｔ−３Ａ１／１、７Ｆ３）、ＣＤ１６（ＣＬＢ−ＦｃＲ  ｇｒａｎ／１、５Ｄ２）、ＣＤ４５ＲＡ（Ｆ８−１１−１３）、ＣＤ８０（ＣＬＢ−ＤＡＬＩ）；ＣＤ１８（７Ｅ４）、ＣＤ２３（９Ｐ２５）；Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，Ｍａｒｓｅｉｌｌｅｓ，ＦｒａｎｃｅからのＣＤ５８（ＡＩＣＤ５８）、ＣＤ７７（３８．１３）、ＣＤ８３（ＨＢ１５Ａ）、ＣＤ８６（ＨＡ５．２Ｂ７）、ＣＤ１１６（ＳＣ０６）；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨからのＣＤ４（Ｍ−Ｔ３２１）、ＣＤ１１ｂ（Ｍｌ／７０．１５．１１．５）、ＣＤ１４（ＴＵＫ４）、ＣＤ１５（ＶＩＭＣ６）、抗ＨＬＡ−ＤＲ（９１０／Ｄ７）、抗ＡＣ１３３（ＡＣ１３３／１）、および抗ＴＣＲαβ（ＢＷ２４２／４１２）；Ａｍｃｅｌｌ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡからのＣＤ３６（ＡＣ１０６）、ＣＤ１２３（ＡＣ１４５）、抗ＨＬＡ−ＤＲ（ＡＣ１２２およびＡＣ１２３）および抗ＧＰＡ（ＡＣ１０７）；Ａｎｃｅｌｌ，Ｂａｙｐｏｒｔ，ＭＮからのＣＤ１ｃ（Ｍ２４１）；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａｂａｍａからのポリクローナル抗ＩｇＧ、抗ＩｇＭ（ＳＡ−ＤＡ４）、ポリクローナル抗κ、およびポリクローナル抗λ；Ｗ．Ｋｎａｐｐ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｖｉｅｎｎａ，Ｖｉｅｎｎａ，ＡｕｓｔｒｉａからのＣＤ６１（ＶＩＰＬ２）；Ｊ．Ｍｏｌｌ，Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｚｅｎｔｒｕｍ  Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，ＧｅｒｍａｎｙからのＣＤ４４（ＩＭ７）；Ｃａｌｔａｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡからのＣＤ２０（Ｈ１４７）；Ｅ．Ｂｕｔｃｈｅｒ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ，ＣＡからの抗ＣＬＡ（ＨＥＣＡ−４５２）；Ｊ．Ｐ．Ｋｉｎｅｔ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｓｅｃｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄからの抗ＦｃεＲＩ（１５−１）；Ｍ．Ｒ．Ｐａｒｗａｒｅｓｃｈ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  Ａｌｂｒｅｃｈｔｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋｉｅｌ，ＧｅｒｍａｎｙからのＣＤ１１ｃ（Ｋｉ−Ｍ１）；Ｄ．Ｎ．Ｈａｒｔ，Ｍａｔｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｍａｔｅｒ  Ｍｉｓｅｒｉｃｏｒｄｉａｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌｓ，Ｓｏｕｔｈ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ，Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ，ＡｕｓｔｒａｌｉａからのＣＭＲＦ−４４およびＣＭＲＦ−５６；ならびにＳｉｇｍａからの抗ＨＬＡ−Ａ、抗ＨＬＡ−Ｂ、抗ＨＬＡ−Ｃ（Ｗ６／３２）。
【０２３４】
全ての抗体を、ＦＩＴＣ、ＰＥ、ビオチンまたはＣｙ５と結合体化したｍＡｂとして使用した。ビオチン化ｍＡｂでの間接的な免疫蛍光染色のために、ストレプトアビジン−ＡＰＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。フローサイトメトリー分析において死細胞を排除するために、細胞をプロピジウムヨージドで染色した。Ｆｃレセプター媒介ｍＡｂ結合を最小にするために、細胞を、大部分の実験において、ヒトＩｇＧを含むＦｃＲ遮断薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ）の存在下で染色した。
【０２３５】
（顕微鏡分析）
細胞を、細胞遠心機（Ｃｙｔｏｓｐｉｎ  ３，Ｓｈａｎｄｏｎ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）において、スライド上にスピンダウンさせた。蛍光顕微鏡検査のために、細胞遠心分離の後に、スライドを一晩風乾し、そしてＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ  Ｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）で封入した。メイ−グリュンヴァルト／ギームザ染色のために、スライドを、細胞遠心分離の後に少なくとも２時間に間にわたって風乾し、メイ−グリュンヴァルト／ギームザ溶液（Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で２分間、室温で染色し、蒸留水中で徹底的にリンスし、ギームザ溶液（Ｍｅｒｃｋ）中で１５分間、室温で染色し、蒸留水中で繰り返し洗浄し、そして少なくとも２時間風乾した。Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｃｏｐ（顕微鏡）（Ｚｅｉｓｓ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、分析のために使用した。デジタル写真を、Ｘｉｌｌｉｘ  Ｍｉｃｒｏｌｍａｇｅｒ  Ｍｌ１４００−１２Ｘ（Ｘｉｌｌｉｘ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を使用して作成した。
【０２３６】
（実施例３）
（交差阻害、同時キャッピングおよび同時インターナリゼーションの分析）
２つの異なるｍＡｂクローンが同じ（かまたは密接に関連する）抗原エピトープを認識するか否かを分析するために、交差阻害結合アッセイを実施した。１×１０6と２×１０6との間の細胞を、これら２つのｍＡｂクローンのうちの一方とともに、約１００μｇ／ｍｌの濃度で１０分間、４℃で予備インキュベートし、次いで、他方のｍＡｂクローンのＰＥ結合体で、その最適な力価でさらに５分間、４℃で染色した。ＰＢＭＣを使用して、ＢＤＣＡ−２、ＢＤＣＡ−３、およびＢＤＣＡ−４に特異的なｍＡｂクローンの交差阻害を分析し、そしてＭＯＬＴ−４細胞を使用して、ＣＤ１ｃ特異的ｍＡｂクローンの交差阻害を分析した。細胞染色を、フローサイトメトリーによって分析した。
【０２３７】
ＡＤ５−５Ｅ８およびＡＤ５−１４Ｈ１２が同じ抗原（または同じ抗原複合体）を認識するか否かを確認するために、同時キャッピングアッセイを実施した。簡単に言えば、ＢＤＣＡ−３発現細胞を、ＰＥ結合体化ＡＤ５−１４ＨＩ２  ｍＡｂおよび抗ＰＥ  ｍＡｂ結合体化マイクロビーズを用いて間接的に磁気により標識することによって、ＰＢＭＣから単離し、そして単離した細胞を、３０分間３７℃でインキュベートして、ｍＡｂ−抗原複合体のキャッピングを誘導した。その後、細胞を、０．１％アジ化ナトリウムを補充した氷冷ＰＢＳ／ＥＤＴＡ／ＢＳＡ（ＰＢＳ／ＥＤＴＡ／ＢＳＡ／アジド）で洗浄し、そしてＰＢＳ／ＥＤＴＡ／ＢＳＡ／アジド中のＦＩＴＣ結合体化ＡＤ５−５Ｅ８  ｍＡｂで１０分間４℃で染色した。細胞染色を、蛍光顕微鏡検査によって分析した。
【０２３８】
同時インターナリゼーションアッセイを使用して、ＡＣ１４４およびＡＤ５−１７Ｆ６が同じ抗原（または同じ抗原複合体）を認識するか否かを調査した。簡単に言えば、１×１０6のＰＢＭＣを、５０μｇ／ｍｌのＡＣ１４４  ｍＡｂとともに、１５分間室温で、ＰＢＳ／ＢＳＡ中でインキュベートし、ＰＢＳ／ＢＳＡ中で２回洗浄し、次いで細胞培養培地中で、３７℃で３０分間インキュベートした。ＡＣ１４４  ｍＡｂが培養の際にインターナリゼーションされるか否かを分析するために、細胞のアリコートを、培養期間の前後に、ラット抗マウスＩｇＧ１−ＰＥで染色した。全てのＡＣ１４４  ｍＡｂ結合部位が非結合体化ＡＣ１４４  ｍＡｂで培養前に飽和されたか否か、およびいずれかの遊離の結合部位が培養後に再出現したか否かを決定するために、細胞のアリコートを、培養期間の前後に、ＡＣ１４４−ＰＥで染色した。ＡＤ５−１７Ｆ６抗原が同時インターナリゼーションされたか否かを分析するために、アリコートを、培養期間の前後に、ＡＤ５−１７Ｆ６−ＰＥで染色した。全ての細胞を、フローサイトメトリー分析においてＣＤ１２３brightＨＬＡ−ＤＲ+プラスマ細胞様（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ）ＤＣをゲートオンし得るように、ＣＤ１２３−ＦＩＴＣおよびＨＬＡ−ＤＲ−Ｃｙ５で対比染色した。
【０２３９】
（実施例４）
（エンドサイトーシスアッセイ）
血液ＤＣサブセットのエンドサイトーシスを評価するために、精製したＣＤ１ｃ+、ＢＤＣＡ−２+およびＢＤＣＡ−３+血液ＤＣ、ならびに（コントロールとして）精製したＣＤ３+Ｔ細胞を、３７℃で、１ｍｇ／ｍｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒイエロー（ＬＹ）を含む培地中で、０分間、１５分間、４５分間、および７５分間インキュベートした。その後、細胞を氷冷ＰＢＳ／ＥＤＴＡ／ＢＳＡ中で３回洗浄し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。
【０２４０】
（実施例５）
（単離された血液ＤＣの非培養血液細胞との反応性）
表１に列挙するｍＡｂの血液細胞との反応性によって、これらを以下の４つの群に分割し得る：（１）ＡＣ１４４、ＡＤ５−１３Ａ１１およびＡＤＢ−４Ｂ８；（２）ＡＤ５−１７Ｆ６；（３）ＡＤ５−５Ｅ８およびＡＤ５−１４Ｈ１２；ならびに（４）ＡＤ５−８Ｅ７。
【０２４１】
第１群のｍＡｂ（ＡＣ１４４、ＡＤ５−１３Ａ１１およびＡＤＢ−４Ｂ８）は、全てのＰＢＭＣの約０．４１±０．１７％（ｎ＝１０）を染色する（図１Ａ）。前方向散乱シグナルと側方向散乱シグナルとのドットプロットにおいて、これらの希少な細胞は、小さな休止リンパ球と単球との間に位置する均一な細胞集団を構成する（図１Ｂ）。従って、これらの希少な細胞は、αβＴ細胞レセプター（ＴＣＲαβ）、ＣＤ１４、ＣＤ１９およびＣＤ５６（それぞれＴ細胞、単球、Ｂ細胞およびＮＫ細胞において発現される系列マーカー）を発現しない（図１Ａ）。高度に精製された血液ＤＣ（９５％より多いＨＬＡ−ＤＲ+、ＴＣＲαβ-、ＣＤ１４-、ＣＤ１９-およびＣＤ５６-）の染色は、第１群のｍＡｂが、ＣＤ１１ｃ-ＣＤ１２３bright血液ＤＣと反応性である（図２）がＣＤ１１ｃ+血液ＤＣとは反応性ではないことを明らかにする。これらの全てが単一の抗原と反応するか否かを分析するために、本発明者らは、二色染色および交差阻害研究を実施した。その結果は、この群の全てのｍＡｂが、同じ抗原の単一のエピトープを認識することを示す。この抗原を、ＢＤＣＡ−２と命名した。
【０２４２】
図３に示すように、第２群のｍＡｂ（ＡＤ５−１７Ｆ６）は、ＡＣ１４４（第１群のＢＤＣＡ−２特異的ｍＡｂの１つ）と同じＰＢＭＣの間で細胞を認識する。それにもかかわらず、ＡＤ５−１７Ｆ６は、ＢＤＣＡ−２とは異なる抗原を染色する。このことは、ＡＤ５−１７Ｆ６がＢＤＣＡ−２の抗ＢＤＣＡ−２  ｍＡｂ媒介インターナリゼーションの前後で等強度の表面染色を示した同時インターナリゼーション実験によって、ならびにＡＣ１４４  ｍＡｂおよびＡＤ５−１７Ｆ６  ｍＡｂが全体的に異なる染色パターンを示した培養後のＤＣの染色によって、明らかに実証された（図４）。ＡＤ５−１７Ｆ６によって認識される抗原を、ＢＤＣＡ−４と命名した。これは、ニューロピリン−１（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１）と同一である。Ｈｅら（１９９７）。
【０２４３】
第３群のｍＡｂ（ＡＤ５−５Ｅ８およびＡＤ５−１４Ｈ１２）は、全てのＰＢＭＣの約０．０４±０．０１％（ｎ＝１０）を染色する（図ｌＡ）。散乱シグナル（図１Ｂ）ならびにＴＣＲαβ、ＣＤ１４、ＣＤ１９およびＣＤ５６に対するｍＡｂでの対比染色（図１Ａ）によれば、これらの細胞は、リンパ球および単球とは異なり、そして第１群の抗体によって認識される細胞よりわずかに大きい。従って、血液ＤＣの染色は、異なるサブセットが、ＡＤ５−５Ｅ８およびＡＤ５−１４Ｈ１２によって認識されること（すなわち、ＣＤ１１ｃdimＣＤ１２３-血液ＤＣ）を示す（図２）。二色染色、交差ブロッキング研究および同時キャッピング実験によれば、両方のｍＡｂが、同じ抗原の、空間的に関連していない２つのエピトープを認識するようである。本発明者らは、この抗原をＢＤＣＡ−３と命名した。
【０２４４】
第４の群（ｍＡｂ  ＡＤ５−８Ｅ７）は、２．３９±０．９６％（ｎ＝１０）までの分画されていないＰＢＭＣと反応する（図１Ａ）。系列マーカーＴＣＲαβ、ＣＤ１４、およびＣＤ１９の光散乱分析（図１Ｂ）および対比染色は、ｍＡｂが、Ｔ細胞および単球とは反応性ではなく、小さな休止ＣＤ１９+Ｂ細胞の主要なサブセットと反応性であることを明らかにする。精製したＤＣの染色は、ＡＤ５−８Ｅ７が、Ｂ細胞に加えて、第１群および第２群のｍＡｂによって認識されるサブセットとは異なる、血液ＤＣの第３のサブセット（すなわち、ＣＤ１１ｃbrightＣＤ１２３dim血液ＤＣ）を染色することを示す。かなりの割合のＣＤ１１ＣbrightＣＤ１２３dim血液ＤＣが、ＣＤ５６を発現する（以下を参照のこと）。この理由により、いくらかのＡＤ５−８Ｅ７反応性ＰＢＭＣは、ＣＤ５６（図１Ａ）を染色する。ＡＤ５−８Ｅ７は、精製したＮＫ細胞に対して反応性ではない。ＡＤ５−８Ｅ７によって認識される抗原を、最初は、ＢＤＣＡ−１と命名した。なぜならこれは、新たな抗原であるようであったからである。しかし、ＡＤ５−８Ｅ７はＣＤ１ｃ  ｍＡｂ  Ｍ２４１のＭＯＬＴ−４細胞に対する結合を完全にブロックすることが、後に明らかとなった（図６）。従って、ＡＤ５−８Ｅ７によって認識される抗原は、ＣＤ１ｃである。
【０２４５】
表１に列挙されるｍＡｂのいずれも、顆粒球、血小板、赤血球、精製した好塩基性細胞および精製したＣＤ３４+造血前駆細胞と反応性ではない。
【０２４６】
（実施例６）
（培養された血液ＤＣ、Ｍｏ−ＤＣおよびＣＤ３４−ＤＣにおける、ＢＤＣＡ−２、ＢＤＣＡ−３およびＢＤＣＡ−４の発現）
新たに単離されたプラスマ細胞様ＣＤ１１ｃ-血液ＤＣは、生存および変異に関してＩＬ−３に依存するが、一方でＣＤ１１ｃ+血液ＤＣの生存および変異は、サイトカイン依存性がはるかに低い。ＣＤ１１ｃ-およびＣＤ１１ｃ+血液ＤＣにおける、ＢＤＣＡ−２、ＢＤＣＡ−３およびＢＤＣＡ−４の発現を、ｒＩＬ−３の存在下での全血液ＤＣの培養の０時間、１時間、３時間、６時間、９時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間、および４８時間後に、分析した。この結果を図４に示す。ＢＤＣＡ−２の発現は、ＣＤ１１ｃ-血液ＤＣにおいて、４８時間以内に完全にダウンレギュレーションされる。対照的に、ＢＤＣＡ−４は、ＣＤ１１ｃ-血液ＤＣにおいてなおさらにアップレギュレートされ、そしてＢＤＣＡ−２とは異なり、これはまた、全てでなければ大部分のＣＤ１１ｃ+ＤＣにおいて、高レベルに発現される。ＢＤＣＡ−３の発現は、ＣＤ１１ｃ-血液ＤＣにおいて迅速に誘導され、２４時間後に最も高い発現レベルに達する。その後、ＢＤＣＡ−３発現は、再度ダウンレギュレートされるようである。ＣＤ１１ｃ+血液ＤＣにおけるＢＤＣＡ−３の発現の分析は、ＢＤＣＡ−３-ＣＤ１１ｃbrightおよびＢＤＣＡ−３+ＣＤ１１ｃdimサブセットが培養の開始時に存在するという事実によって、複雑になる。ＢＤＣＡ−３の発現は、ＢＤＣＡ−３+ＣＤ１１ｃdim血液ＤＣ集団における培養の少なくとも６時間まで変化しないままであり、そしてＢＤＣＡ−３-ＣＤ１１ｃbright血液ＤＣサブセットの少なくともいくらかの細胞において、３時間以内で誘導される。
【０２４７】
（Ｍｏ−ＤＣおよびＣＤ３４-ＤＣにおける、ＢＤＣＡ−２、ＢＤＣＡ−３およびＢＤＣＡ−４の発現）
機能的ＣＤ１ａ+ＤＣを、エキソビボで、単球およびＣＤ３４+造血前駆細胞から生成した。Ｂｅｎｄｅｒら（１９９６）；Ｐｉｃｋｌら（１９９６）；Ｒｏｍａｎｉら（１９９４）；Ｓａｌｌｕｓｔｏら（１９９４）；Ｃａｕｘら（１９９２）；Ｍａｃｋｅｎｓｅｎら（１９９５）；Ｓｚａｂｏｌｃｓら（１９９５）；Ｈｅｒｂｓｔら（１９９６）；ｄｅ  Ｗｙｎｔｅｒら（１９９８）；およびＳｔｒｕｎｋら（１９９６）。図７は、Ｍｏ−ＤＣ（これらは、ｒＧＭ−ＣＳＦの存在下で単球を７日間培養することによって生成した）ならびにＩＬ−４およびＣＤ３４−ＤＣ（ｒＦｌｔ３リガンド、ｒＴＧＦ−β１、ｒＴＮＦ−α、ｒＳＣＦおよびｒＧＭ−ＣＳＦの存在下でＣＤ３４+造血前駆細胞を１１日間培養することによって生成した）が、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｃおよびＢＤＣＡ−４を発現するが、ＢＤＣＡ−２もＢＤＣＡ−３もいずれも発現しないことを示す。
【０２４８】
（実施例７）
（抗ＢＤＣＡ−２  ｍＡｂ媒介架橋の際のＢＤＣＡ−２のインターナリゼーション）
抗ＤＣＡ−２  ｍＡｂ標識ＢＤＣＡ−２+細胞の３７℃でのインキュベーションがｍＡｂインターナリゼーションを生じる可能性を、ＦＩＴＣ結合体化ＡＣ１４４  ｍＡｂ（ＩｇＧ１）でのＰＢＭＣの染色によって、検討した。次いで、３７℃でのインキュベーションに続いて、残っている細胞表面関連ｍＡｂを、ＰＥ結合体化ラット抗マウスＩｇＧ１  ｍＡｂでの染色によって検出した。図８に示すように、細胞を３７℃でインキュベートした場合に、ラット抗マウスＩｇＧ１−ＰＥ染色の強度は、バックグラウンドレベルまで非常に迅速に低下する。対照的に、ＡＣ１４４−ＦＩＴＣ染色の強度は、約５０％のレベルまで一時的にのみ低下するが、その後、ほぼインキュベーション前のレベルまで戻る。このことは、ＢＤＣＡ−２が、レセプター媒介エンドサイトーシスと類似の速度論で、抗ＢＤＣＡ−２  ｍＡｂ架橋の際にインターナリゼーションされることを実証する。ＡＣ１４４−ＦＩＴＣ染色強度の一時的な低下は、恐らく、エンドサイトーシス前のＢＤＣＡ−２／抗ＢＤＣＡ−２  ｍＡｂ複合体のパッチングおよびキャッピングに起因する。
【０２４９】
（実施例８）
（単離されたＣＤ１ｃ+、ＢＤＣＡ−２+およびＢＤＣＡ−３+血液ＤＣの形態）
ＣＤ１ｃ+、ＢＤＣＡ−２+およびＢＤＣＡ−３+細胞を、ＰＥ結合体化一次ｍＡｂおよび抗ＰＥ  Ａｂ結合体化マイクロビーズで間接的に磁気によって標識すること、ならびに標識した細胞をＭＡＣＳによって濃縮することによって、ＰＢＭＣから単離した（図９）。細胞遠心分離スライドのメイ−グリュンヴァルト／ギームザ染色（図９）の際に、新たに単離されたＢＤＣＡ−２発現細胞は、血液および扁桃由来のＣＤ１１ｃ-ＣＤ４+ｌｉｎ-ＤＣの代表的なリンパプラスマ細胞様形態を示す：すなわち、楕円形または湾入した核を有する、中程度の大きさの円形細胞。対照的に、新たに単離されたＣＤ１ｃ+血液ＤＣと新たに単離されたＢＤＣＡ−３+血液ＤＣとの両方が、血液または扁桃由来のＣＤ１１ｃ+ＣＤ４+ｌｉｎ-ＤＣの代表的な形態学的特性を示す：すなわち、短い細胞プロセスおよびさらに過度に小裂片に分かれた核を有する、あまり円形ではない細胞。ＣＤ１ｃ+ＢＤＣに加えて、小さな休止リンパ球の代表的な形態を有するＣＤ１ｃ+Ｂ細胞は、単離されたＣＤ１ｃ+ＰＢＭＣの細胞遠心分離スライドにおいて、見られ得る。高度に純粋なＣＤ１ｃ+ＢＤＣは、ＣＤ１ｃ+細胞の濃縮の前に、ＣＤ１９+Ｂ細胞が磁気的にＰＢＭＣから除去された場合に、得られる。
【０２５０】
（実施例９）
（ＣＤ１ｃ+、ＢＤＣＡ−２+およびＢＤＣＡ−３+血液ＤＣの表面表現型）
ＢＤＣＡ−２+およびＢＤＣＡ−３+血液ＤＣの表現型を、ＰＥ結合体化ｍＡｂおよびＦＩＴＣ結合体化ｍＡｂを用いる二色免疫蛍光によって分析した。ＣＤ１ｃ+血液ＤＣの分析のために、Ｂ細胞の排除のために、ＣＤ１９−Ｃｙ５を使用して、三色染色を実施した。表現型分析の結果を表２に示し、そして以下のように要約し得る：血液ＤＣサブセットのいずれも、ＣＤ１ａ、ＣＤ８、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３４、ＣＤ６１、ＣＤ６９、ＣＤ７．１、ＣＤ７７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）、ＴＣＲαβ、ＡＣ１３３、ＩｇＤ、ＩｇＭおよびＣＭＲＦ−５６抗原を発現しない。全ての血液ＤＣサブセットが、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ５４およびＭＨＣクラスＩ分子を、類似のレベルで発現する。ＢＤＣＡ−２+血液ＤＣは、これらがＣＤ４５ＲＡおよび少量のＣＤ１０除いて、ＣＤ１３、ＣＤ４０、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５６を発現しない点、ならびにこれらが、より高レベルのＣＤ４を除いて、より低レベルのＣＤ１８、ＣＤ３８、ＣＤ５８、ＣＤ９８、ＣＤ１１６およびＣＬＡを発現する点で、他の２つのサブセットとは異なる。ＣＤ１ｃ+血液ＤＣは、これらが、より低レベルのＣＤ６２Ｌを除いて、ＣＤ２、より高レベルのＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する点、ならびにこれらが、ＦｃレセプターＣＤ３２、ＣＤ６４およびＦｃεＲ１を発現する点で、他の２つのサブセットとは異なる。恐らく、Ｆｃレセプター発現に起因して、ＣＤ１ｃ+血液ＤＣはまた、ＩｇＧ、κおよびλに対してポジティブである。さらに、いくらかのＣＤ１ｃ+ＤＣは、ＣＤ１４およびＣＤ１１ｂに対してポジティブであり、これによって、発現レベルは、ＣＤ１ｃ発現とＣＤ２発現との両方のレベルに逆に相関する。ＢＤＣＡ−３+血液ＤＣは、これらがＣＤ３６をずっと低いレベルで発現する点、およびこれらが低レベルのＣＤ５を発現するようである点で、他の２つのサブセットとは異なる。最後に、ＣＤ１１ｃおよびＣＤ１２３を除いて、少なくとも１つのさらなる抗原（ＣＤ３３）は、３つ全てのサブセットの識別に有用である：ＣＤ３３は、ＢＤＣＡ−２+ＤＣにおいて低レベルで、ＢＤＣＡ−３+ＤＣにおいて中程度のレベルで、そしてＣＤ１ｃ+ＤＣにおいて高レベルで、発現される。
【０２５１】
【表２】
0005599834.tif 000004
0005599834.tif 000005
0005599834.tif 000006
【０２５２】
（実施例１０）
（培養後のＣＤ１ｃ+、ＢＤＣＡ−２+およびＢＤＣＡ−３+血液ＤＣにおける、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８３、および同時刺激分子の発現）
新たに単離されたＣＤ１ｃ+血液ＤＣおよびＢＤＣＡ−３+血液ＤＣを、いかなるサイトカインをも補充しない培地中で１日間培養し、そして新たに単離されたＢＤＣＡ−２+血液ＤＣを、ＩＬ−３およびＣＤ４０  ｍＡｂを補充した培地中で、ＣＤ３２トランスフェクトした線維芽細胞上で２日間培養した。この培養期間の後に、細胞を、ＣＤ１ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲの発現に関して分析した。比較のために、いわゆる「未熟」Ｍｏ−ＤＣ（単球を７日間、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下で培養することによって生成した）およびいわゆる「成熟」Ｍｏ−ＤＣ（「未熟」Ｍｏ−ＤＣの、３日間のＴＮＦ−αの存在下での培養によって生成した）もまた、含めた。Ｓａｌｌｕｓｔｏら（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：３８９−４００；ならびにＳａｌｌｕｓｔｏら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２７６０−２７６９。図１０に示すように、「未熟」Ｍｏ−ＤＣおよび「成熟」Ｍｏ−ＤＣとは対照的に、血液ＤＣサブセットのいずれも、この培養期間の後に、ＣＤ１ａを発現しない。しかし、同時刺激分子であるＣＤ８０およびＣＤ８６、ＤＣ活性化抗原ＣＤ８３（Ｚｈｏｕら（１９９５）；Ｚｈｏｕら（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：７３５−７４２；およびＺｈｏｕら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：２５８８−２５９２）、ならびにＨＬＡ−ＤＲ分子は、培養の際に、３つ全ての血液ＤＣサブセットにおいて、成熟Ｍｏ−ＤＣと比較して類似のレベルまで、アップレギュレートされる。これらの結果は、３つ全ての血液ＤＣサブセットをＩＬ−３、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦで補充した培地中で２日間培養した別の実験と有意には異ならなかった。血液および扁桃由来のＣＤ１１-ｃＣＤ４+ｌｉｎ-ＤＣに関して以前に示されたように、ＢＤＣＡ−２+血液ＤＣは、ＩＬ−３を含まない培地中で培養される場合に、急速に死滅する。
【０２５３】
（実施例１１）
（新たに単離されたＣＤ１ｃ+、ＢＤＣＡ−２+およびＢＤＣＡ−３+血液ＤＣのエンドサイトーシス能力）
精製したＣＤ１ｃ+、ＢＤＣＡ−２+およびＢＤＣＡ−３+血液ＤＣ、ならびにコントロールとして、精製したＣＤ３+Ｔ細胞のエンドサイトーシス能力を、これらの細胞を３７℃で、ＬＹの存在下で培養し、そして種々の時間の後のＬＹの取込みをフローサイトメトリーによって分析することによって、試験した。図１１に示すように、精製したＣＤ３+Ｔ細胞とは異なり、精製したＣＤ１ｃ+血液ＤＣ、ＢＤＣＡ−３+血液ＤＣ、およびいくらかの程度まではＢＤＣＡ−２+血液ＤＣもまた、ＬＹをエンドサイトーシスする能力を有する。類似の結果が、ＦＩＴＣ−デキストランを使用して得られた。全ての血液ＤＣ集団のエンドサイトーシス能力は、Ｍｏ−ＤＣと比較した場合に、ずっと低い。
【０２５４】
ＢＤＣＡ−４のアミノ酸配列を、この抗原をＡＤ５−１７Ｆ６  ｍＡｂ（ＡＤ５−１７Ｆ６アフィニティーカラム）で精製し、そしてこの精製した抗原をＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ質量分析によって分析することによって、得た。ＢＤＣＡ−４は、ニューロピリン−１と同一である。Ｈｅら（１９９７）。
【０２５５】
（実施例１２）
（ＢＤＣＡ−２の抗ＢＤＣＡ−２モノクローナル抗体（ＡＣ１４４）との連結は、細胞内Ｃａ2+移動を誘導するが、ＢＤＣＡ−４（ニューロピリン−１）の抗ＢＤＣＡ−４との連結は、Ｃａ2+移動を誘導しない。）
（材料および方法）：
ＢＤＣＡ−２+ＢＤＣＡ−４+ＢＤＣおよびＢＤＣＡ−２でトランスフェクトしたかまたはトランスフェクトしていないＵ９３７細胞における、細胞質ゾルカルシウムの測定。ＢＤＣＡ−２+ＢＤＣＡ−４+血液ＤＣおよびＢＤＣＡ−２でトランスフェクトしたかまたはトランスフェクトしていないＵ９３７細胞を、Ｉｎｄｏ−１  ＡＭ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とともに、Ｖａｌｉｔｕｔｔｉら（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：７９０−７９５によって記載されるように、装填した。抗ＢＤＣＡ−２（ＡＣ１４４、ＩｇＧ１）または抗ＢＤＣＡ−４（ＡＤ５−１７Ｆ６、ＩｇＧ１）ｍＡｂを、それぞれ新たに単離されたＢＤＣＡ−２+ＢＤＣＡ−４+ＢＤＣおよびＢＤＣＡ−２でトランスフェクトされたかまたはトランスフェクトされていないＵ９３７細胞に添加し、続いて架橋剤としてラット抗マウスＩｇＧ１  ｍＡｂ（Ｘ５６）を添加したか、または添加しなかった。細胞を、フローサイトメーターで分析して、Ｃａ2+フラックスを検出した。生存細胞（散乱基準に基づく）およびＩｎｄｏ−１で標識した細胞（４０５ｎｍ対５２５ｎｍの発光スペクトルに基づく）のみを、この分析に含んだ。
【０２５６】
図１３は、細胞内移動が、抗ＢＤＣＡ−２  ｍＡｂ単独（Ａ）ならびにまたは抗ＢＤＣＡ−２および架橋している二次ｍＡｂ（Ｂ、Ｄ、Ｅ）を介して、免疫磁気的に精製したＢＤＣＡ−２+ＢＤＣＡ−４+ＢＤＣ（Ａ、Ｂ）およびＢＤＣＡ−２でトランスフェクトしたＵ９３７細胞（Ｄ）においては誘導されるが、トランスフェクトされていないＵ９３７細胞（Ｅ）においては誘導されないことを示す。
【０２５７】
免疫磁気的に精製したＢＤＣＡ−２+ＢＤＣＡ−４+ＢＤＣにおけるＢＤＣＡ−４の、抗ＢＤＣＡ−４  ｍＡｂおよび架橋二次ｍＡｂとの連結は、細胞質ゾルＣａ2+移動を誘導しない。時間（Ｘ軸、２０４，８０秒に対応する１０２４の値）に対するＩｎｄｏ−１蛍光（Ｙ軸）の、Ｃａ2+依存性の４０５ｎｍ／５２５ｎｍ比を示す。
【０２５８】
図１３に示すように、プラスマ細胞様ＢＤＣ（図１３ＡおよびＢ）およびＢＤＣＡ−２でトランスフェクトされたＵ９３７細胞（図１３Ｄ）の上の表面ＢＤＣＡ−２の、特定のｍＡｂ（ＡＣ１４４、ＩｇＧ１）との連結、続いて二次架橋ｍＡｂ（ラット抗マウスＩｇＧ１、Ｘ５６）との連結あり（図１３ＢおよびＤ）またはなし（図１３Ａ）は、細胞質ゾルカルシウム濃度の迅速かつ一時的な上昇を惹起した。対照的に、プラスマ細胞様ＤＣの、抗ＢＤＣＡ−４  ｍＡｂ（ＡＤ５−１７Ｆ６）とのインキュベーション、続いて、二次架橋ｍＡｂ（ラット抗マウスＩｇＧ１、Ｘ５６）とのインキュベーション（図１４Ｃ）、またはトランスフェクトされていないＵ９３７細胞の、抗ＢＤＣＡ−２  ｍＡｂ（ＡＣ１４４、ＩｇＧ１）とのインキュベーション、続いて、二次架橋ｍＡｂ（ラット抗マウスＩｇＧ１、Ｘ５６）とのインキュベーション（図１３Ｅ）は、細胞質ゾルカルシウム濃度の迅速かつ一時的な上昇を誘導しなかった。
【０２５９】
（実施例１３）
（ウイルス刺激（インフルエンザウイルス株ＰＲ８）に応答しての、精製したＢＤＣＡ−２+ＢＤＣＡ−４+ＢＤＣによるＩ型インターフェロンの生成は、抗ＢＤＣＡ−２  ｍＡｂでのＢＤＣＡ−２の誘発によって阻害される）
ＣＤ４+ＣＤ１２３brightＣＤ１１ｃ-プラスマ細胞様ＤＣは、エンベロープされたウイルス、細菌、および腫瘍細胞に応答して、主要なＩ型インターフェロンプロデューサーであることが示された。Ｆｉｔｇｅｒａｌｄ−Ｂｏｃａｒｓｌｙら（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．６０：３９−６２；Ｓｉｅｇａｌら（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４：１８３５−１８３７；Ｃｅｌｌａら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．５：９１９−９２３。この理由によって、これらはまた、天然Ｉ型インターフェロン産生細胞（ＮＩＰＣ）と呼ばれてきた。プラスマ細胞様ＤＣは、ＢＤＣＡ−２およびＢＤＣＡ−４を発現する。図１４に示すように、プラスマ細胞様ＤＣにおける表面ＢＤＣＡ−２の、特定のｍＡｂとの連結、続いて二次架橋ｍＡｂ（ラット抗マウスＩｇＧ１、Ｘ５６）との連結は、インフルエンザウイルス株ＰＲ８（５ＨＡＵ／ｍｌ）での刺激に応答して、血液または扁桃由来の、免疫磁気的に精製したプラスマ細胞様ＢＤＣＡ−２+ＢＤＣＡ−４+ＤＣによって、Ｉ型インターフェロンの分泌を阻害する。抗ＢＤＣＡ−２、インフルエンザウイルスおよび架橋ｍＡｂを含む培養物における、Ｉ型インターフェロン産生のレベル（図１４、ＡＣ１４４＋ＲａｍＧ１＋ＦＬＵ）は、インフルエンザウイルス単独（図１４、ＦＬＵ）またはアイソタイプコントロールｍＡｂ（抗サイトケラチンｍＡｂ  ＣＫ３−１１Ｄ５、ＩｇＧ１）、インフルエンザウイルスおよび架橋ｍＡｂ（図１４、ＣＫ３＋ＲａｍＧ１＋ＦＬＵ）を含む培養物よりずっと低い。
【０２６０】
対照的に、プラスマ細胞様ＤＣにおける表面ＢＤＣＡ−４の、特定のｍＡｂとの連結、続いて二次架橋ｍＡｂ（ラット抗マウスＩｇＧ１、Ｘ５６）との連結は、血液または扁桃由来の、免疫磁気的に精製したプラスマ細胞様ＢＤＣＡ−２+ＢＤＣＡ−４+ＤＣによって、インフルエンザウイルス株ＰＲ８（５ＨＡＵ／ｍｌ）での刺激に応答して、Ｉ型インターフェロンの分泌を阻害しない。抗ＢＤＣＡ−４、インフルエンザウイルスおよび架橋ｍＡｂを含む培養物における、Ｉ型インターフェロン産生のレベル（図１４、１７Ｆ６＋ＲａｍＧ１＋ＦＬＵ）は、アイソタイプコントロールｍＡｂ（抗サイトケラチンｍＡｂ  ＣＫ３−１１Ｄ５、ＩｇＧ１）、インフルエンザウイルスおよび架橋ｍＡｂ（図１４、ＣＫ３＋ＲａｍＧ１＋ＦＬＵ）を含む培養物におけるレベルと同じである。
【０２６１】
（材料および方法）：
ＢＤＣＡ−２発現およびＢＤＣＡ−４発現のプラスマ細胞様（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ）ＤＣを、ＰＢＭＣ（図１４Ａ）または扁桃細胞（図１４Ｂ）から、抗ＢＤＣＡ−４（ＡＤ５−１７Ｆ６）結合体化微小ビーズを用いた直接的な磁気標識およびＭＡＣＳによる標識細胞の富化によって単離した。単離したＢＤＣＡ−２発現およびＢＤＣＡ−４発現のプラスマ細胞様ＤＣを、２４時間培地中で、ａ）ＩＬ−３単独（図１４、コントロール）；ｂ）ＩＬ−３、抗ＢＤＣＡ−２  ｍＡｂ（ＡＣ１４４、ＩｇＧ１）およびラット抗マウスＩｇＧ１  ｍＡｂ（図１４、ＡＣ１４４＋ＲａｍＧｌ）；ｃ）ＩＬ−３、抗ＢＤＣＡ−２  ｍＡｂ（ＡＣ１４４、ＩｇＧ１）、ラット抗マウスＩｇＧ１  ｍＡｂ、およびインフルエンザウイルス菌株ＰＲ８（図１４、ＡＣ１４４＋ＲａｍＧｌ＋ＦＬＵ）；ｄ）ＩＬ−３およびインフルエンザウイルス菌株ＰＲ８（図１４、ＦＬＵ）；ｅ）ＩＬ−３、抗サイトケラチン  ｍＡｂ（ＣＫ３−１１Ｄ５、ＩｇＧ１）、ラット抗マウスＩｇＧ１  ｍＡｂ、およびインフルエンザウイルス菌株ＰＲ８（図１４、ＣＫ３＋ＲａｍＧｌ＋ＦＬＵ）；およびｆ）ＩＬ−３、抗ＢＤＣＡ−４  ｍＡｂ（ＡＤ５−１７Ｆ６）、ラット抗マウスＩｇＧ１  ｍＡｂ、およびインフルエンザウイルス菌株ＰＲ８（図１４、１７Ｆ６＋ＲａｍＧｌ＋ＦＬＵ）の存在下で培養した。
【０２６２】
培地上清中の分泌Ｉ型インターフェロンを、標準ＩＦＮ−α曲線を参照して、Ｄａｕｄｉ細胞増殖の阻害を評価することによって測定した（Ｎｅｄｅｒｍａｎら（１９９０）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  １８：２９−３４）。
【０２６３】
ＢＤＣＡ−２+ＢＤＣＡ−４+プラスマ細胞様ＤＣによるＩ型インターフェロン産生の阻害に関して、増加したレベルの循環しているＩ型インターフェロンおよび増加したレベルのＩ型インターフェロン誘導因子（抗ＤＮＡ抗体およびＤＮＡの複合体のようなもの）は、ＳＬＥ患者に見出され、疾患の活性と相関している。さらに、Ｉ型インターフェロンで処置された非自己免疫障害を有する患者は、頻繁に自己抗体を発生し、そして時々ＳＬＥを発生する。Ｒｏｎｎｂｌｏｍらからのいくつかの論文（（１９９９）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１５：１９６−２０２；（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：６３０６−６３１３；および（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：３５１９−３５２６）は、患者由来のＩ型インターフェロン誘導因子が、健康なドナー由来のＰＢＭＣにおけるＩ型インターフェロンの分泌を誘導し、そしてこれらが、選択的に天然のＩ型インターフェロン産生細胞（ＮＩＰＣ＝プラズマ細胞様  ＤＣ）を活性化することを示した。
【０２６４】
本明細書中に示される、ＢＤＣＡ−２の連結がウイルス刺激によって誘導されるＩ型インターフェロンの産生を抑制するという知見は、ＢＤＣＡ−２に対する結合が、単にＢＤＣＡ−２の連結によってだけではなく、ＮＩＰＣ（＝ＢＤＣＡ−２＋ＢＤＣＡ−４＋プラスマ細胞様ＤＣ）を枯渇することによってもまた疾患を処置するために、適用され得ることを示す。従って、本発明は、ＮＩＰＣのインビボ、インビトロ、およびエキソビボ枯渇をさらに含む。このような枯渇は、自己免疫疾患の処置または予防における使用に適切である。
【０２６５】
図１４は、ＢＤＣＡ−４ではなくＢＤＣＡ−２と特定のｍＡｂとの連結、続く、２次架橋ｍＡｂとの連結が、インフルエンザウイルス菌株ＰＲ８を用いた刺激に応答した血液または扁桃由来のプラスマ細胞様ＢＤＣＡ−２+ＢＤＣＡ−４+ＤＣによる、Ｉ型インターフェロンの分泌を阻害することを示す。血液（Ａ）または扁桃（Ｂ）由来のプラスマ細胞様ＢＤＣＡ−２+ＢＤＣＡ−４+ＤＣを、ＩＬ−３単独（コントロール）；ＩＬ−３、抗ＢＤＣＡ−２  ｍＡｂおよびラット抗マウスＩｇＧ１  ｍＡｂ（ＡＣ１４４＋ＲａｍＧｌ）；ＩＬ−３、抗ＢＤＣＡ−２  ｍＡｂ、ラット抗マウスＩｇＧ１  ｍＡｂ、およびインフルエンザウイルス菌株ＰＲ８（ＡＣ１４４＋ＲａｍＧｌ＋ＦＬＵ）；ＩＬ−３およびインフルエンザウイルス菌株ＰＲ８（ＦＬＵ）；ＩＬ−３、抗サイトケラチン  ｍＡｂ、ラット抗マウスＩｇＧ１  ｍＡｂ、およびインフルエンザウイルス菌株ＰＲ８（ＣＫ３＋ＲａｍＧｌ＋ＦＬＵ）；ＩＬ−３、抗ＢＤＣＡ−４  ｍＡｂ、ラット抗マウスＩｇＧ１  ｍＡｂ、およびインフルエンザウイルス菌株ＰＲ８（１７Ｆ６＋ＲａｍＧｌ＋ＦＬＵ）の存在下で２４時間培養した。培養上清中の分泌されたＩ型インターフェロン（Ｕ／ｍｌ）を、標準Ｉ型インターフェロン曲線を参照してバイオアッセイによって測定した。
【０２６６】
（実施例１４）
（ＢＤＣＡ−２は、リガンドをエンドサイトーシスし得るだけでなく、リガンドを抗原プロセシングおよびローディング区画に送達して、リガンドをＣＤ4+クラスＩＩ制限Ｔ細胞に対して提示し得る。）
（材料および方法）
ＢＤＣＡ−２発現およびＢＤＣＡ−４発現のプラスマ細胞様ＤＣを、ＰＢＭＣから、抗ＢＤＣＡ−４（ＡＤ５−１７Ｆ６）結合体化微小ビーズを用いた直接的な磁気標識およびＭＡＣＳによる標識細胞の富化によって単離した。単離したＢＤＣＡ−２発現およびＢＤＣＡ−４発現のプラスマ細胞様ＤＣを、９６ウェル平底マイクロプレート中ＩｇＧ１  ｍＡｂｓ（０．２μｇ／ｍｌ）の存在下で、Ｂ１３  Ｔ細胞クローンの４×１０4細胞／ウェルと共に共培養した（Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａら（１９８８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：３４５−３５２）。アッセイに使用したｍＡｂは以下であった：ＡＣ１４４（抗ＢＤＣＡ−２、ＩｇＧ１）、ＺＭ３．８（抗ＩＬＴ３、ＩｇＧ１）およびＣＫ３−１１Ｄ５（抗サイトケラチン、ＩｇＧ１）。４８時間後、培養物を、（3Ｈ）チミジン（１μＣｉ／ウェル）を用いてパルスし、そして取り込まれた放射能を、さらに１６時間後に測定した。（３Ｈ）チミジン取り込み（ｃｐｍ）を、培養物中の単離ＢＤＣＡ−２発現およびＢＤＣＡ−４発現プラスマ細胞様ＤＣの数に対してプロットした（図１５）。
【０２６７】
図１５は、単離されたＢＤＣＡ−２発現およびＢＤＣＡ−４発現プラスマ細胞様ＤＣによる、マウスＩｇＧ１に特異的なＴ細胞クローンに対する抗ＢＤＣＡ−２  ｍＡｂ（ＡＣ１４４、ＩｇＧ１）の提示を示す。ＢＤＣＡ−２+ＢＤＣＡ−４+プラスマ細胞様ＤＣは、抗ＩＬＴ−３  ｍＡｂ（ＺＭ３．８、ＩｇＧ１、黒三角）および抗サイトケラチンｍＡｂ（ＣＫ３−１１Ｄ５、ＩｇＧ１、黒丸）よりもはるかに効果的に、Ｔ細胞に対して抗ＢＤＣＡ−２  ｍＡｂ（ＡＣ１４４、ＩｇＧ１、黒四角）を提示した。
【０２６８】
抗ＢＤＣＡ−２  ｍＡｂ（ＡＣ１４４、ＩｇＧ１）標識ＢＤＣＡ−２+ＢＤＣＡ−４+プラスマ細胞様ＤＣの３７℃でのインキュベーションは、細胞表面上で抗ＢＤＣＡ−２  ｍＡｂ／ＢＤＣＡ−２複合体の極めて急速なインターナリゼーションを生じた（図８を参照のこと）。ここで、抗ＢＤＣＡ−２  ｍＡｂ（ＡＣ１４４、ＩｇＧ１）は抗原プロセシングおよびローディング区画にアクセスし、そして抗体由来のペプチドは、マウスＩｇＧ１ペプチドエピトープに特異的なＣＤ４+クラスＩＩ制限Ｔ細胞クローン（Ｂ１３）に効果的に提示されることを示す。抗ＢＤＣＡ−２  ｍＡｂの提示を、ＩｇＧ１  ｍＡｂリガンドをプロセシングおよびペプチドローディング区画に標的化し得ることが公知のレセプター（ＩＬＴ３）に結合するＩｇＧ１  ｍＡｂの提示、および、ＢＤＣＡ−２+ＢＤＣＡ−４+プラスマ細胞様ＤＣ上の細胞表面分子に結合しないが、流体相を占め得るＩｇＧ１  ｍＡｂ（抗サイトケラチンｍＡｂ  ＣＫ３−１１Ｄ５、ＩｇＧ１）の提示に対して比較した。図１５に示されるように、ＢＤＣＡ−２+ＢＤＣＡ−４+プラスマ細胞様ＤＣは、抗ＩＬＴ−３  ｍＡｂおよび抗サイトケラチンｍＡｂよりもはるかに効果的に、Ｔ細胞に対して抗ＢＤＣＡ−２  ｍＡｂ（ＡＣ１４４）を提示した。
【０２６９】
（実施例１５）
（扁桃細胞において、ＢＤＣＡ−２の発現は、ＣＤ１２３＋Ｔ細胞−ゾーン関連プラスマ細胞様ＤＣに対して制限され、一方ＢＤＣＡ−４はまた、数個の他の細胞に対して低いレベルで発現され得る）
図１６は、扁桃プラスマ細胞様ＣＤ１２３＋  ＤＣに対するＢＤＣＡ−２およびＢＤＣＡ−４の発現を示す。それぞれ、ＢＤＣＡ−２に対するＦＩＴＣ結合体化ｍＡｂ（ＡＣ１４４）ならびにＣＤ１２３およびＢＤＣＡ−４に対するＰＥ結合体化ｍＡｂ（ＡＤ５−１７Ｆ６）を用いた扁桃細胞の２色染色を示す。ＢＤＣＡ−２の発現がＣＤ１２３ｂｒｉｇｈｔプラスマ細胞様ＤＣに対して制限され、一方、ＢＤＣＡ−４がまた数個の他の細胞に対して低いレベルで発現されることに注意する。
【０２７０】
（実施例１６）
（ＢＤＣＡ−４  ｍＡｂ（ＡＤ５−１７Ｆ６）は、ニューロピリン１を認識する）
ニューロピリン１は、神経細胞ガイダンスを媒介するコラプシン／セマホリン（ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ）ファミリーに対するレセプターである。ニューロピリン１はまた、血管内皮増殖因子に対するアイソフォーム特異的レセプターとして内皮細胞および腫瘍細胞によって発現される。しかし、以前は、ニューロピリン１が血液および扁桃のプラスマ細胞様  ＤＣに対して発現されること、およびニューロピリン１が少なくとも新鮮な非培養血液においてプラスマ細胞様ＤＣに対して優れたマーカーを示すことは、知られていなかった。
【０２７１】
（材料および方法）
ニューロピリン１を、抗ＢＤＣＡ−４  ｍＡｂ  ＡＤ５−１７Ｆ６（抗ＮＲＰ−１（ＭＬ））を用いて、トランスフェクトされていないＰＡＥ細胞（Ｐ）およびニューロピリン１をトランスフェクトしたＰＥＡ細胞（ＮＰ）の細胞溶解物から免疫沈降した（Ｓｏｋｅｒら（１９９８）Ｃｅｌｌ  ９２：７３５−７４５）。沈降したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＢＤＣＡ−４特異的ｍＡｂ  ＡＤ５−１７Ｆ６（ＭＬ）またはニューロピリン１特異的ｍＡｂ（Ｓｈａｙ  Ｓｏｋｅｒ、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ'ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ（Ｓ）より）を用いるウエスタンブロットにより分析した。
【０２７２】
図１７は、ニューロピリン１を、ニューロピリン１をトランスフェクトしたＰＡＥ細胞（ＮＰ）の細胞溶解物から、抗ＢＤＣＡ−４  ｍＡｂ  ＡＤ５−１７Ｆ６（抗ＮＲＰ−１（ＭＬ））を用いて免疫沈降したが、トランスフェクトされていないＰＡＥ細胞（Ｐ）では免疫沈降されなかったことを示す。沈降したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＢＤＣＡ−４特異的ｍＡｂ  ＡＤ５−１７Ｆ６（ＭＬ）またはニューロピリン１特異的ｍＡｂ（Ｓｈａｙ  Ｓｏｋｅｒ、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ'ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ（Ｓ）より）を用いるウエスタンブロットにより分析した。
【０２７３】
ＢＤＣＡ−４特異的ｍＡｂ  ＡＤ５−１７Ｆ６が、ニューロピリン１トランスフェクトしたＰＥＡ細胞（ＮＰ）からは約１３０〜１４０ｋＤａの特異的バンドを免疫沈降するが、トランスフェクトしていないＰＡＥ細胞（Ｐ）からはそうでないことに注意する。このバンドは、ニューロピリン１特異的ｍＡｂ（Ｓｈａｙ  Ｓｏｋｅｒ（Ｓ）より）で検出し得るが、抗ＢＤＣＡ−４  ｍＡｂ  ＡＤ５−１７Ｆ６（ＭＬ）では検出し得なかった。従って、本発明者らの抗ＢＤＣＡ−４  ｍＡｂ  ＡＤ５−１７Ｆ６は、標準的な免疫沈降実験においてネイティブ形態のニューロピリン１を認識するが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロット実験に使用される場合、ニューロピリン１の変性形態を検出できない。
【０２７４】
興味深いことに、ニューロピリン１はまた、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対するアイソフォーム特異的レセプターとして内皮細胞および腫瘍細胞によって発現される。より興味深いことには、いくつかの論文（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．２：１２６７；Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．２：１０９６−１０３；Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈら（１９９９）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５：２９６３−７０；Ｏｈｍら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：３２６０−８；Ｏｙａｍａら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１２２４−３２；Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈら（１９９８）Ｂｌｏｏｄ  ９２：４１５０−６６；Ｉｓｈｉｄａら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：４８４２−５１）は、大きなパーセンテージの腫瘍によって産生されるＶＥＧＦが、インビボにおいてＤＣ生成および機能を減少したことを示す。これらのＤＣに対する効果がニューロピリン１（ＢＤＣＡ−４）によって媒介されるか否かは明らかではないが、本発明はニューロピリン１に媒介されるＤＣの機能調節を含む。
【０２７５】
（実施例１７）
（ポリＩ：Ｃでの刺激に応答した精製ＢＤＣＡ−２+ＢＤＣＡ−４+ＢＤＣによるＩ型インターフェロン（ＩＦＮ−α）の産生は、抗ＢＤＣＡ−２  ｍＡｂを用いてＢＤＣＡ−２を誘発することによって阻害される）
ＣＤ４+ＣＤ１２３brightＣＤ１１ｃ-プラスマ細胞様ＤＣは、エンベロープウイルス、細菌および腫瘍細胞に応答した主要なＩ型インターフェロンインデューサーであることが示された。Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ−Ｂｏｃａｒｓｌｙら（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．６０：３９−６２；Ｓｉｅｇａｌら（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４：１８３５−１８３７；Ｃｅｌｌａら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．５：９１９−９２３。こういうわけで、これらはまた、天然Ｉ型インターフェロン産生細胞（ＮＩＰＣ）と呼ばれる。プラスマ細胞様ＤＣは、ＢＤＣＡ−２およびＢＤＣＡ−４を発現する。図１９に示されるように、プラスマ細胞様ＤＣ上での表面ＢＤＣＡ−２と特異的ｍＡｂとの連結、続く２次架橋ｍＡｂ（ヤギ抗マウスＩｇＧ）との連結は、ポリＩ：Ｃでの刺激に応答した血液または扁桃から免疫磁気的に精製されたプラスマ細胞様ＢＤＣＡ−２+ＢＤＣＡ−４+ＤＣによるＩＦＮ−αの分泌を阻害する。抗ＢＤＣＡ−２、ポリＩ：Ｃおよび架橋ｍＡｂを用いた培養物中のＩＦＮ−αの産生レベル（図１８、ＡＣ１４４＋ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ポリＩ：Ｃ）は、マウスＩｇＧ１、ポリＩ：Ｃおよび架橋ｍＡＢを用いた培養物（図１８、マウスＩｇＧ１＋ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ポリＩ：Ｃ）と同様に低かった。
【０２７６】
（材料および方法）
ＣＤ１１ｃ-ＣＤ１２３brightプラスマ細胞様ＤＣを、ＢＤＣＡ−４微小ビーズを用いてヒト末梢血単核球から分離した。ＣＤ１１ｃ-Ｃ１２３brightプラスマ細胞様ＤＣ（１×１０6細胞／ｍｌ）を、１０μｇ／ｍｌのＡＣ１４４  ｍＡｂまたはマウスＩｇＧ１  ｍＡｂ（ＣＦ６Ｂ、抗ＴＰＯ）を用いて、ＲＰＭＩ、１０％  ＦＣＳ、ｌ０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５０μＭ  ２−ＭＥ、２０μｇ／ｍｌ  ジェネティシン中、３７℃で３０分間インキュベートした。２０μｇ／ｍｌのヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を添加し、そして細胞を、再び３７℃で３０分間インキュベートした。これらの細胞を、２０μｇのポリＩ：Ｃ（Ｓｉｇｍａ）の有りまたは無しで、３７℃で２４時間培養した。細胞上清を収集し、そしてＩＦＮ−α濃度を、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｄｏｇｅｎ）によって決定した。アッセイの感度は、３ｐｇ／ｍｌである。
【０２７７】
図１８は、ＢＤＣＡ−４ではなくＢＤＣＡ−２と特定のｍＡｂとの連結、続く、２次架橋ｍＡｂとの連結が、ポリＩ：Ｃを用いた刺激に応答した血液または扁桃由来のプラスマ細胞様ＢＤＣＡ−２+ＢＤＣＡ−４+ＤＣによる、ＩＦＮ−αの分泌を阻害することを示す。血液由来のプラスマ細胞様ＢＤＣＡ−２＋ＢＤＣＡ−４＋ＤＣを、１０μｇ／ｍｌのＡＣ１４４  ｍＡｂ（２および４）またはマウスＩｇＧ１  ｍＡｂ（ＣＦ６Ｂ、抗ＴＰＯ、１および３）を用いて３７℃で３０分間培養した。２０μｇのヤギ抗マウスＩｇＧを添加し、そしてこの細胞をさらに３７℃で３０分間インキュベートした。これらの細胞を、２０μｇのポリＩ：Ｃの有り（３および４）または無し（１および２）で、３７℃で２４時間培養した。培養上清を収集し、そしてＩＦＮ−α濃度を、ＥＬＩＳＡによって決定した。
（実施例１８）
（種々の組織および精製血球集団におけるＲＴ−ＰＣＲによるＢＤＣＡ−２  ｍＲＮＡの発現分析）
（核酸配列およびアミノ酸配列）
ＢＤＣＡ−２をコードするｃＤＮＡを、ＣＯＳ細胞における発現クローニングによって得た。図５は、ＢＤＣＡ−２のアミノ酸配列（発現される６個のエキソンを有するアイソフォーム）を示す。ＢＤＣＡ−２は、Ｃ型レクチンＩＩ型膜タンパク質である。このようなレクチンは、例えば、Ｂａｔｅｓら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：１９７３−１９８３に記載される。既知のＣ型レクチンに対するＢＤＣＡ−２の比較を、実施例２０に示す。
【０２７８】
図１９は、ＢＤＣＡ−２  ｃＤＮＡの存在に関する、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈからのヒトの複数組織のｃＤＮＡパネルの分析（レーン１：心臓；レーン２：脳；レーン３：胎盤；レーン４：肺；レーン５：肝臓；レーン６：骨格筋；レーン７：腎臓；レーン８：膵臓；レーン９：脾臓；レーン１０：胸腺；レーン１１：精巣；レーン１２：卵巣；レーン１３：小腸；レーン１４：リンパ節；レーン１５：骨髄；レーン１６：胎児肝臓；レーン１７：扁桃）、および異なる集団の白血球から調製されたｃＤＮＡの分析（レーン１８：Ｔ細胞；レーン１９：Ｂ細胞；レーン２０：ＮＫ細胞；レーン２１：単球；レーン２２：ＣＤ１１ｃbrightＣＤ１２３低ＤＣ；レーン２３：ＣＤ１１ｃ−ＣＤ１２３brightプラスマ細胞様ＢＤＣ）を示す。
【０２７９】
全てのｃＤＮＡをいくつかの異なるハウスキーピング遺伝子（グリセルアルデヒド−３リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホリパーゼＡ２、α−チューブリン、およびβ−アクチン）のｍＲＮＡ発現レベルに対して標準化した。標準化は、組織特異性および相対的な標的ｍＲＮＡの量の正確な評価を確実にする。同じ量のｃＤＮＡ（約５０ｐｇ）を、各ＲＴ−ＰＣＲ反応に使用した。ＲＴ−ＰＣＲ反応を、ＢＤＣＡ−２に特異的なプライマー（順方向：５'−ＴＴＧＡＡＡＧＡＡＣＣＡＣＡＣＣＣＣＧＡＡＡＧＴ（配列番号７）および逆方向：５'−ＴＡＧＣＴＴＴＣＴＡＣＡＡＣＧＧＴＧＧＡＴＧＣＣ（配列番号８））ならびに上記の４つのハウスキーピング遺伝子に対するプライマー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用いて、ＡｄｖａｎＴａｑ  Ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を使用して実施した。
【０２８０】
サイクル条件を以下のようにした：９４℃で３０秒および６８℃で２分。３４サイクルをＢＤＣＡ−２に関して使用し、そして３８サイクルをグリセルアルデヒド−３リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）に関して使用した。ＢＤＣＡ−２  ｍＲＮＡシグナルを、ＣＤ１１ｃ-ＣＤ１２３brightプラスマ細胞様ＤＣのみに検出することに注意する。さらに４回のＰＣＲサイクルをＢＤＣＡ−２  ｃＤＮＡの増幅に対して使用した場合（３４サイクルの代わりに３８サイクル）、弱いシグナルをまた、膵臓、精巣、卵巣、骨髄および扁桃に検出した。精巣由来のｃＤＮＡを用いて（３８ＰＣＲサイクル）、より短い転写物（スプライス改変体）のシグナルが、ＣＤ１１ｃ-ＣＤ１２３brightプラスマ細胞様ＤＣ由来のシグナルに対して比較した場合より顕著であり、そして全長転写物由来のシグナルは、実際には、さらにより多くのＰＣＲサイクルでのみ検出可能であった。
【０２８１】
（実施例１９）
（ＢＤＣＡ−２およびＢＤＣＡ−２スプライス改変体のエキソン／イントロン構造）
ＢＤＣＡ−２スプライス改変体に関する情報を、開始コドンの前のｍＲＮＡ配列に相補的なプライマー（順方向プライマー：５'−ＴＴＧＡＡＡＧＡＡＣＣＡＣＡＣＣＣＣＧＡＡＡＧＴ（配列番号７））および終止コドンの後ろのｍＲＮＡ配列に相補的なプライマー（逆方向：５'−ＴＡＧＣＴＴＴＣＴＡＣＡＡＣＧＧＴＧＧＡＴＧＣＣ（配列番号８））を用いたプラスマ細胞様ＤＣ由来のＲＴ−ＰＣＲ増幅、生じるフラグメントのプラスミドへのクローニング、および挿入物の配列決定によって得た。結果を図２０に示す。比較に関して、マウス樹状細胞関連Ｃ型レクチン２（デクチン−２（Ｄｅｃｔｉｎ−２））のスプライス改変体を、図２１に示す。
【０２８２】
図２２は、示される推定イントロンの位置と共に、ＢＤＣＡ−２とマウスデクチン−２とのｍＲＮＡ配列のアラインメントを示す。表３は、エキソンのパラメーターを示す。
【０２８３】
【表３】
0005599834.tif 000007
【０２８４】
イントロンの位置は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １２  Ｃｌｏｎｅ  ＲＰ１１−  ２７７Ｊ２４，  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｄｒａｆｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ，２１  ｕｎｏｒｄｅｒｅｄ  ｐｉｅｃｅｓ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＣ００６５１７）および転写物のスプライシングに関する規則に基づく。ＢＤＣＡ−２のイントロン／エキソン構造は、デクチンのイントロン／エキソン構造に類似する。
【０２８５】
少なくとも４個のＢＤＣＡ−２スプライス改変体が生成される。６個のエキソン全てを有するタンパク質をコードするｍＲＮＡ；エキソン１、３、４、５、および６を含むタンパク質をコードするｍＲＮＡ；エキソン１、２、４、５、および６を含むタンパク質をコードするｍＲＮＡ、ならびにエキソン１、２、３、５、および６を含むタンパク質をコードするｍＲＮＡが存在する。
【０２８６】
（実施例２０）
（ＢＤＣＡ−２相同性およびタンパク質ドメイン）
ヒトＢＤＣＡ−２、ヒトＤＣＩＲ（樹状細胞免疫レセプター）、およびマウスデクチン−２（樹状細胞関連Ｃ型レクチン２）のアミノ酸配列のアラインメントを、図２３に示す。
【０２８７】
ヒトＤＣＩＲ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ１３３５３２）は、約５１％のａａが１９１ａａのストレッチにわたって同一である、ヒト分子間でＢＤＣＡ−２に対する最も高い相同性を有する分子である（Ｂａｔｅｓら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３  ：１９７３を参照のこと）。
【０２８８】
マウスデクチン−２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２４０３５７）は、約５１％のａａが２１１ａａのストレッチにわたって同一である、おそらくヒトＢＤＣＡ−２のホモログである（Ａｒｉｉｚｕｍｉら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１６：１１９５７；ＷＯ  ９８／２８３３２；ＰＣＴ／ＵＳ９７／２３７６１；および米国特許第６，０４６，１５８号を参照のこと）。
【０２８９】
ＢＤＣＡ−２（２１３ａａ）、ＤＣＩＲ（２３７ａａ）およびＤｅｃｔｉｎ−２（２０９ａａ）は全て、カルシウム依存（Ｃ型）レクチンファミリーのＩＩ型膜糖タンパク質である。各分子は、推定細胞質ドメイン（ＢＤＣＡ−２：ａａ１−２１；ＤＣＩＲ：ａａ１−４４；デクチン−２：ａａ１−１７）、推定膜貫通ドメイン（ＢＤＣＡ−２：ａａ２２−４１；ＤＣＩＲ：４４−６９；デクチン−２：１８−４０）、および推定細胞外ドメイン（ＢＤＣＡ−２：ａａ４２−２１３；ＤＣＩＲ：７０−２３７；デクチン−２：４０−２０９）を含む。推定細胞外ドメイン内において、各分子は、ＣＯＯＨ−末端に単一炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）を含む（ＢＤＣＡ−２：ａａ８３−２０６；ＤＣＩＲ：１０６−２３０；デクチン−２：７９−２０２）。図２３は、ヒトＢＤＣＡ−２、ヒトＤＣＩＲおよびマウスデクチン−２のアラインメントを示す。
【０２９０】
ＰＲＯＳＩＴＥデータベースを用いて見いだされる推定タンパク質ドメイン／モチーフを、表４に示す。
【０２９１】
【表４】
0005599834.tif 000008
【０２９２】
ＢＤＣＡ−２は、３つの推定Ｎ−グリコシル化部位を含み（ａａ１１０−１１３  ＮＣＳＶ；ａａ１３７−１４０  ＮＳＳＹ；ａａ１６４−１６７  ＮＶＴＦ）、一方、デクチン−２（ａａ１３１−１３４  ＮＥＳＬ）およびＤＣＩＲ（ａａ１８５−１８８  ＮＥＳＳ）は、１つの推定Ｎ−グリコシル化部位のみを含む。ＢＤＣＡ−２およびデクチン−２の全ての推定リン酸化部位は、推定細胞外ドメインに位置する。従って、これらは細胞内キナーゼによってリン酸化されるようにはあまりならないようである。ナチュラルキラー遺伝子複合体にコードされる多くのＣ型レクチン（例えば、ＣＤ９４、Ｌｙ−４９、およびＮＫＧ２）と同様に、ＤＣＩＲは、コンセンサス免疫レセプターチロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭモチーフ；（Ｉ／Ｖ）ＸＹＸＸ（Ｌ／Ｖ））を細胞質ドメイン（ａａ５〜１０  ＩＴＹＡＥＶ）に含む。興味深いことに、このＩＴＩＭモチーフは、ＢＤＣＡ−２およびデクチン−２の相対的に短い細胞質テイル（ＢＤＣＡ−２：２１ａａ；デクチン−２：１７ａａ）には見出されない。
【０２９３】
（実施例２１）
（ＢＤＣＡ−３タンパク質分析）
ＢＤＣＡ−３発現ＨＤ−ＭＹ−Ｚ細胞を、ＢＤＣＡ−３発現をアップレギュレートするために１０ｎｇ／ｍｌ  ＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ）および０．５ｍｇ／ｍｌ  イオノマイシンを用いて２４時間刺激した。３×１０7個のＰＭＡ／イオノマイシン刺激ＨＤ−ＭＹ−Ｚ細胞を、１ｍｇ／ｍｌ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いた１５分間４℃でのインキュベーションによって表面ビオチン化し、そして２回洗浄した。細胞を、１０％  スクロースおよびプロテイナーゼインヒビター（フェニルメチルスルホニルフルオライド、ペプスタチンＡ、ロイペプチン、アプロチニン（Ｓｅｒｖａより））を補充した５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．０中に再懸濁し、そして０℃で超音波処理した（５×４秒、７０％  アウトプット）。超音波処理した細胞を、９００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離して、核およびインタクトな細胞を除去した。この上清を、３０，０００×ｇ、４℃で２時間遠心分離して、精製細胞膜を得た。膜を、プロテイナーゼインヒビターおよび１％  ＮＰ−４０を補充した５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中で１時間０℃でインキュベートすることによって溶解した。不溶性膜フラグメントを、３０，０００×ｇ、４℃で遠心分離することによって除去した。上清に対して、ＭｎＣｌ2およびＣａＣｌ2を、各々１ｍＭの終濃度で添加した。溶解物を、ＣｏｎＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（１ｍｌ）上で吸着させ、そして結合タンパク質を、１０ｍｌの溶出緩衝液（０．５Ｍ  Ｄ（＋）マンノース、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７．４）、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１％  ＮＰ−４０）を用いて溶出し、そしてＣｅｔｒｉｐｒｅｐ−１０遠心分離濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて１ｍｌの容積に濃縮した。
【０２９４】
タンパク質を、１５０μｌの抗ＮＩＰ  ｍＡｂ結合体化ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いた３０分間、４℃でのインキュベート、およびμＭＡＣＳカラム分離によって、予備切断した。ＢＤＣＡ−３の特異的な免疫沈降に関して、タンパク質を、２μｇのＮＩＰ結合体化ＢＤＣＡ−３特異的ｍＡｂ  ＡＤ５−１４Ｈ１２（ＩｇＧ１）、または特異性のコントロールのために一次試薬として２μｇのＮＩＰ結合体化ＣＤ１９特異的ｍＡｂ  ＳＪ２５−Ｃ１（ＩｇＧ１）を用いるかのいずれかで１４時間４℃でインキュベートし、そして二次試薬として抗ＮＩＰ  ｍＡｂ結合体化ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓを用いて３時間４℃でインキュベートした。沈降したタンパク質を、μＭＡＣＳカラム分離によって単離した。保持されたタンパク質を、ＤＴＴを含む７０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液を用いて溶出した。沈降されたタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１２％）およびストレプトアビジン−ペルオキシダーゼを用いたウエスタンブロティングによって分析した。
【０２９５】
図２４の結果は、ＢＤＣＡ−３特異的ｍＡｂ  ＡＤ５−１４Ｈ１２が、ＨＤ−ＭＹ−Ｚ細胞から約１００ｋＤの細胞表面タンパク質を特異的に免疫沈降することを示す。従って、ＢＤＣＡ−３は、見かけ上１００ｋＤの分子量を有する。
【産業上の利用可能性】
【０２９６】
上述の本発明は、明確さおよび理解のために例示および実施例によっていくらか詳細に記載されているが、特定の変化および改変が実施され得ることは当業者に明らかである。従って、説明および実施例は、本発明の範囲の制限として解釈されるべきではなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって線引きされる。
【図１】
0005599834.tif 000009
【図２】
0005599834.tif 000010
【図３】
0005599834.tif 000011
【図４】
0005599834.tif 000012
【図５】
0005599834.tif 000013
【図６】
0005599834.tif 000014
【図７】
0005599834.tif 000015
【図８】
0005599834.tif 000016
【図９】
0005599834.tif 000017
【図１０】
0005599834.tif 000018
【図１１】
0005599834.tif 000019
【図１２】
0005599834.tif 000020
【図１３】
0005599834.tif 000021
【図１４】
0005599834.tif 000022
【図１５】
0005599834.tif 000023
【図１６】
0005599834.tif 000024
【図１７】
0005599834.tif 000025
【図１８】
0005599834.tif 000026
【図１９】
0005599834.tif 000027
【図２０】
0005599834.tif 000028
【図２１】
0005599834.tif 000029
【図２２】
0005599834.tif 000030
【図２３】
0005599834.tif 000031
【図２４】
0005599834.tif 000032
【配列表】
0005599834000001.app