(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
口腔内の歯欠損部を修復するために用いられる修復材料の製造方法であって、
いずれか一方が歯胚由来である間葉系細胞と上皮系細胞とのいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体及び第２の細胞集合体を、混合することなく密着させて支持担体内部に配置して培養し、再構成された歯胚を形成させること、
歯の先端部を口腔内側として前記歯欠損部に埋設し得るように、前記培養によって形成された前記再構成された歯胚の方向性を確認すること、
を含み、方向性が確認された前記歯胚は、前記歯欠損部において、欠損した歯の等価物を得るための修復材料として用いられるものであり、前記歯の等価物は、対合歯と咬合可能な歯の長さを有する当該製造方法。
【請求項２】
前記欠損した歯の等価物が、３００〜６００ＫＨＮのエナメル質のヌープ硬度及び６０〜１２０ＫＨＮの象牙質のヌープ硬度を備えたものである請求項１記載の修復材料の製造方法。
【請求項３】
前記培養が器官培養であり、前記修復材料が、器官培養後の再構成された歯胚と支持担体とを含む請求項１又は請求項２記載の修復材料の製造方法。
【請求項４】
前記間葉系細胞及び上皮系細胞が共に歯胚由来である請求項１〜請求項３のいずれかに記載の修復材料の製造方法。
【請求項５】
前記第１の細胞集合体及び第２の細胞集合体が共に単一細胞集合体である請求項１〜請求項４のいずれかに記載の修復材料の製造方法。
【請求項６】
前記支持担体が、コラーゲン、アガロースゲル、カルボキシメチルセルロース、ゼラチン、寒天、ハイドロゲル、エラスチン、フィブリン、ファイブロネクチン、ラミニン、細胞外マトリクス混合物、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、乳酸／グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、セルマトリクス（商品名）、メビオールゲル（商品名）及びマトリゲル（商品名）からなる群より選択された少なくとも１種である請求項１〜請求項５のいずれかに記載の修復材料の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、歯欠損部の修復方法及び修復材料の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
歯は、最外層にエナメル質、その内層に象牙質という硬組織を有し、さらに象牙質の内側に象牙質を産生する象牙芽細胞、その更に中心部に歯髄を有する器官である。また、歯は齲蝕や歯周病等によって失われることがあり、歯の有無は外見や食べ物の味覚に大きく影響し、また健康維持や質の高い生活を維持するという観点から歯の再生技術が種々開発されている。【０００３】
例えば、J. Dent. Res., 2002, Vol.81(10), pp.695-700には、歯胚から単離された上皮系細胞や間葉系細胞などの細胞を、生体吸収性の担体と共にラットの腹腔内に移植することで歯様の組織が再生されることが開示されている。
歯胚の再生方法としては、例えば、特開２００４−３３１５５７号公報には、生体から単離された歯胚細胞を、線維芽細胞増殖因子等の生理活性物質の存在下で培養することが記載されている。また、特開２００４−３５７５６７号公報には、生体から単離された歯胚細胞及びこれらの細胞に分化可能な細胞のうち少なくとも１種類を、フィブリンを含む担体と一緒に培養することが提案されており、ここでフィブリンを含む担体は、歯胚の目的形状のものを使用して、特有の形態を有する「歯」を形成すると記載されている。【０００４】
また、国際公開第２００６／１２９６７２号パンフレットには、歯胚由来の上皮系細胞と間葉系細胞とをそれぞれ細胞集合体とした上で、コラーゲンゲルの内部に細胞集合体同士を密着させ、その状態を保持しながら培養することによって、歯特有の細胞配置を備えた歯を製造する技術が開示されている。【０００５】
一方、国際公開第２００３／１０１５０３号パンフレットでは、歯胚細胞及びこれらの分化可能な細胞に機械的な刺激与えて培養することにより歯胚を再生する方法と、これにより再生された歯胚を、歯胚欠損又は損傷する患者の顎骨に移植する治療方法を開示している。
また特開２００５−０１３２６１号公報では、生体内に埋め込まれた使用されるインプラント材料として、コロイダルシリカ粒子を材料表面に付着させた人工生体材料を開示している。【０００６】
しかしながら、現在のインプラント治療におけるスクリュータイプのチタンなどの材料による人工歯根の埋入は、顎成長期における顎骨の成長を抑制するほか、歯が移動できないなどの問題点が指摘されている。また、正常な歯と同じ機能を有するには、正常な咬合が取れていることが必要であるが、生体から単離された細胞を用いた上記技術ではこのような咬合について充分に確認されていない。また歯根膜内部の神経は、圧迫などの歯に対する侵害刺激に対する応答能しており、これは食べ物に対する感触などの知覚という点で生物学的には重要である。正常な歯と同じ機能を有するには、正常に咬合がとれ、正常な歯と同等の硬度を有すること、神経の侵入により、歯として正常な刺激応答性を有するように歯欠損部を修復することが期待されている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
従って本発明の目的は、正常な歯と同等の硬度を有し、正常に咬合をとれ、正常な歯と同等の刺激応答性を有するように歯欠損部を修復するための修復材料の製造方法及び歯欠損部の修復方法を提供することである。【０００８】
本発明は、口腔内の歯欠損部を修復するために用いられる修復材料の製造方法及び歯欠損部の修復方法を提供する。
本発明の第一の態様は、口腔内の歯欠損部を修復するために用いられる修復材料の製造方法であって、いずれか一方が歯胚由来である間葉系細胞と上皮系細胞とのいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体及び第２の細胞集合体を、混合することなく密着させて支持担体内部に配置して培養し、再構成された歯胚又は歯を形成させること、歯の先端部を口腔内側として埋設し得るように、前記培養によって形成された前記再構成された歯胚又は歯の方向性を確認すること、を含み、方向性が確認された前記歯胚又は歯は、前記歯欠損部において、欠損した歯の等価物を得るための修復材料として用いられるものであり、前記歯の等価物は、対合歯と咬合可能な歯の長さを有する当該製造方法を提供する。
【０００９】
本発明の第二の態様は、口腔内の歯欠損部の修復方法であって、いずれか一方が歯胚由来である間葉系細胞と上皮系細胞とのいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体及び第２の細胞集合体を、混合することなく密着させて支持担体内部に配置して培養し、再構成された歯胚又は歯を形成させること、前記歯欠損部に、前記再構成された歯胚又は歯を埋設すること、を含む歯欠損部の修復方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明の実施例２にかかる歯の萌出期（左）、萌出後から咬合までの時期（中央）及び咬合後の時期（右）にそれぞれ確認した写真像であって、上顎移植部位の斜め４５度から撮影した外見を示すものである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明の実施例２にかかる歯の萌出期（左）、萌出後から咬合までの時期（中央）及び咬合後の時期（右）にそれぞれ確認した写真像であって、上顎移植部位の垂直方向から撮影した外見を示すものである。
【図１Ｃ】図１Ｃは、本発明の実施例２にかかる歯の萌出期（左）、萌出後から咬合までの時期（中央）及び咬合後の時期（右）にそれぞれ確認した咬み合わせ図の写真像である。
【図１Ｄ】図１Ｄは、本発明の実施例２にかかる歯の萌出期（左）、萌出後から咬合までの時期（中央）及び咬合後の時期（右）にそれぞれ確認した外見ＣＴ写真像である。
【図１Ｅ】図１Ｅは、本発明の実施例２にかかる歯の萌出期（左）、萌出後から咬合までの時期（中央）及び咬合後の時期（右）にそれぞれ確認した断面ＣＴ写真像（Ｅ）である。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明の実施例２にかかる萌出した歯のエナメル質のヌープ硬度を示すグラフである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明の実施例２にかかる萌出した歯の象牙質のヌープ硬度を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の実施例２にかかる萌出直前の再生歯のヘマトキシリン−エオジン染色像である（２０倍）。
【図４Ａ】図４Ａは、発明の実施例２にかかる矯正力を負荷したときの歯根膜（Ｂ：圧迫側、Ｃ：牽引側）の骨における骨のリモデリング現象を確認するヘマトキシリン−エオジン染色像（２０倍）。
【図４Ｂ】図４Ｂは、図４Ａにおける圧迫側（黒枠Ｂ）の拡大図（２００倍）である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、図４Ａにおける牽引側（黒枠Ｃ）の拡大図（２００倍）である。
【図５Ａ】図５Ａは、本発明の実施例２にかかる矯正未刺激の延髄でのc-fosの発現を示す免疫染色像である。１００倍。
【図５Ｂ】図５Ｂは、本発明の実施例２にかかる矯正刺激後２時間目の延髄でのc-fosの発現を示す免疫染色像である。１００倍。
【図５Ｃ】図５Ｃは、矯正刺激後４８時間目の延髄でのc-fosの発現を示す免疫染色像である。１００倍。
【図５Ｄ】図５Ｄは、露髄処理後２時間目の延髄でのc-fosの発現を示す免疫染色像である。１００倍。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の修復材料の製造方法は、口腔内の歯欠損部を修復するために用いられる修復材料の製造方法であって、いずれか一方が歯胚由来である間葉系細胞と上皮系細胞とのいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体及び第２の細胞集合体を、混合することなく密着させて支持担体内部に配置して培養し、再構成された歯胚又は歯を形成させること（以下、「再構成歯胚形成工程」）、歯の先端部を口腔内側として埋設し得るように、前記培養によって形成された前記再構成された歯胚又は歯の方向性を確認すること（以下、方向確認工程）を含み、方向性が確認された前記歯胚又は歯は、前記歯欠損部において、欠損した歯の等価物を得るための修復材料として用いられるものである。【００１２】
また、本発明の歯欠損部の修復方法は、口腔内の歯欠損部の修復方法であって、いずれか一方が歯胚由来である間葉系細胞と上皮系細胞とのいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体及び第２の細胞集合体を、混合することなく密着させて支持担体内部に配置して培養し、再構成された歯胚又は歯を形成させること（以下、再構成歯胚形成工程）、前記歯欠損部に、前記再構成された歯胚又は歯を埋設すること（以下、埋設工程）、を含むものである。【００１３】
本発明の修復材料の製造方法及び歯欠損部の修復方法では、再構成歯胚形成工程において第１の細胞塊と第２の細胞塊を混合することなく密着させて支持担体の内部に配置し培養して得られた再構成歯胚又は歯を、欠損部に埋設するために修復材料として使用する。この再構成歯胚又は歯を修復材料として欠損部に埋設すると、埋設された部位から萌出した歯の等価物は、対合歯と咬合する歯の長さ及び硬さを示すものであり、また神経の侵入も生じうる。このため、周囲の歯と同様の正常な歯と同等の硬度を有し、正常に咬合をとれ、正常な歯と同等の刺激応答性を有することができる。【００１４】
本発明において「歯の等価物」などの表現は、埋設された歯欠損部から萌出したときに対合歯と咬合可能となる長さ及び硬さを示す歯を意味するために用いられる。
なお本発明における「再構成歯胚形成工程」は、修復材料の製造方法及び歯欠損部の修復方法の双方で適用される。
また、本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。
また本明細書における数値範囲を示す表現は、その前後の数値を含むものとする。
以下、本発明について説明する。【００１５】
本発明において、「歯」とは、内側に象牙質及び外側にエナメル質の層を連続して備えた組織をいい、歯冠や歯根を有する方向性を備えた組織を意味する。歯の方向性は、歯冠や歯根の配置によって特定することができる。歯冠や歯根は、形状や組織染色などに基づいて目視にて確認することができる。歯冠とは、エナメル質と象牙質の層構造を有する部分をいい、歯根にはエナメル質の層は存在しない。【００１６】
象牙質及びエナメル質は、当業者には、組織染色などによって形態的に容易に特定することができる。また、エナメル質は、エナメル芽細胞の存在によって特定することができ、エナメル芽細胞の存在は、アメロジェニンの有無によって確認することができる。一方、象牙質は、象牙芽細胞の存在によって特定することができ、象牙芽細胞の存在は、デンチンシアロプロテインの有無によって確認することができる。アメロジェニン及びデンチンシアロプロテインの確認はこの分野で周知の方法によって容易に実施することができ、例えば、in situ ハイブリダイゼーション、抗体染色等をあげることができる。
また、歯の方向性は、歯冠や歯根の配置によって特定することができる。歯冠や歯根は、形状や組織染色などに基づいて目視にて確認することができる。【００１７】
本発明において「歯胚」及び「歯芽」は、発生段階に基づいて区別されたものに特に言及する場合に用いられる表現である。この場合の「歯胚」とは、将来歯になることが決定付けられた歯の初期胚であり、歯の発生ステージで一般的に用いられる蕾状期（Bud stage）から鐘状期（Bell stage）までの段階のものを指し、特に歯の硬組織としての特徴である象牙質、エナメル質の蓄積が認められない組織である。一方、「歯芽」とは、本発明で用いられる「歯胚」の段階移行の、歯の硬組織の特徴である象牙質、エナメル質の蓄積が始まった段階から、歯が歯肉から萌芽して一般的に歯としての機能を発現する前の段階の組織をいう。歯胚から歯への発生は、蕾状期、帽状期、鐘状前期及び後期の各ステージを経て行われる。ここで、蕾状期では、上皮系細胞が間葉系細胞を包むように陥入する。鐘状前期及び鐘状後期に至ると、上皮系細胞部分が外側のエナメル質となり、間葉系細胞部分が内部に象牙質を形成するようになる。従って、上皮系細胞と間葉系細胞との細胞間相互作用によって歯胚から歯が形成される。【００１８】
なお本発明において「間葉系細胞」とは、間葉組織由来の細胞を意味し、「上皮系細胞」とは上皮組織由来の細胞を意味する。
また本発明において「歯周組織」とは、歯の主として外層の形成された歯槽骨及び歯根膜をいう。歯槽骨及び歯根膜は、当業者には、組織染色などによって形態的に容易に特定することができる。【００１９】
本発明における再構成歯胚形成工程では、いずれか一方が歯胚由来である間葉系細胞と上皮系細胞とのいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体及び第２の細胞集合体を、混合することなく密着させて支持担体内部に配置し、培養し、再構成された歯胚を形成する。
この再構成歯胚形成工程としては、国際公開第２００６／１２９６７２号に記載されている方法をそのまま適用することができる。【００２０】
ここで第１の細胞集合体及び第２の細胞集合体は、それぞれ間葉系細胞のみ、又は上皮系細胞のみで構成されており、個々の細胞集合体は、これらのいずれかの細胞で実質的に構成されている。「細胞集合体」とは、細胞が密集した状態をいい、組織の状態であっても、単一細胞の状態から調製された細胞集合体（細胞凝集体）であってもよい。また「実質的になる」とは、対象となる細胞以外のものをできるだけ含まないことを意味する。この細胞集合体を構成する細胞の数は、動物の種類や、支持担体の種類、硬さ及び大きさによって異なるが、細胞集合体１個あたり、一般に１０１〜１０８個、好ましくは１０３〜１０８個とすることができる。【００２１】
本製造方法で用いられる間葉系細胞及び上皮系細胞は、生体内での細胞配置を再現して特有の構造及び方向性を有する歯を効果的に形成するために、少なくともいずれか一方が歯胚に由来するものであればよいが、確実に歯を形成させるためには、間葉系細胞及び上皮系細胞が共に歯胚由来であることが最も好ましい。歯胚としては、細胞の分化段階の幼若性と均質性の観点から蕾状期から帽状期からのものであることが好ましい。【００２２】
歯胚以外に由来する間葉系細胞としては、生体内の他の間葉系組織に由来する細胞であり、好ましくは、血液細胞を含まない骨髄細胞や間葉系幹細胞、さらに好ましくは口腔内間葉系細胞や顎骨の内部の骨髄細胞、頭部神経堤細胞に由来する間葉系細胞、前記間葉系細胞を生み出しうる間葉系前駆細胞やその幹細胞等を挙げることができる。
また、歯胚以外に由来する上皮系細胞としては、生体内の他の上皮系組織に由来する細胞であり、好ましくは、皮膚や口腔内の粘膜や歯肉の上皮系細胞、更に好ましくは皮膚や粘膜などの分化した、例えば角化した、あるいは錯角化した上皮系細胞を生み出しうる未熟な上皮系前駆細胞、たとえば非角化上皮系細胞やその幹細胞等を挙げることができる。【００２３】
歯胚及び他の組織は、哺乳動物の霊長類、例えばヒト、サルなど、有蹄類、例えば豚、牛、馬など、小型哺乳類の齧歯類、例えばマウス、ラット、ウサギなど、その他イヌ、ネコなどの種々の動物の顎骨等から採取することができる。歯胚及び組織の採取は、通常、組織の採取で用いられる条件をそのまま適用すればよく、無菌状態で取り出し、適当な保存液に保存すればよい。なお、ヒトの歯胚としては、第３大臼歯いわゆる親知らずの歯胚の他、胎児歯胚を挙げることができるが、自家組織の利用との観点から、親知らず歯胚を用いることが好ましい。また、マウスの場合、胎日齢１０日から１６日の歯胚を用いることが好ましい。【００２４】
この歯胚からの間葉系細胞及び上皮系細胞の調製は、まず周囲の組織から単離された歯胚を、形状に従って歯胚間葉組織及び歯胚上皮組織に分けることによって行われる。この際、分離を容易に行うため酵素を用いてもよい。このような用途に用いられる酵素としては、ディスパーゼ、コラーゲナーゼ、トリプシン等を挙げることができる。【００２５】
間葉系細胞及び上皮系細胞は、それぞれ間葉組織及び上皮組織から単一細胞の状態に調製してもよい。単一の細胞に容易に分散可能とするために、ディスパーゼ、コラーゲナーゼ、トリプシン等の酵素を用いてもよい。【００２６】
なお、間葉系細胞及び上皮系細胞は、それぞれ充分な細胞数を得るために、予備的な培養を経たものであってもよい。
培養に用いられる培地としては、一般に動物細胞の培養に用いられる培地、例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）等を用いることができ、細胞の増殖を促進するための血清を添加するか、あるいは血清に代替するものとして、例えばＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ等の細胞増殖因子やトランスフェリン等の既知血清成分を添加してもよい。なお、血清を添加する場合の濃度は、そのときの培養状態によって適宜変更することができるが、通常１０％とすることができる。細胞の培養には、通常の培養条件、例えば３７℃の温度で５％ＣＯ２濃度のインキュベーター内での培養が適用される。また、適宜、ストレプトマイシン等の抗生物質を添加したものであってもよい。【００２７】
本発明で用いられる支持担体としては、細胞を内部で培養可能なものであればよく、好ましくは、上記培地との混合物である。このような支持担体としては、コラーゲン、アガロースゲル、カルボキシメチルセルロース、ゼラチン、寒天、ハイドロゲル、エラスチン、フィブリン、ファイブロネクチン、ラミニン、細胞外マトリクス混合物、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、乳酸／グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、セルマトリクス（商品名 新田ゼラチン株式会社製）、メビオールゲル（商品名 株式会社池田理化製）、マトリゲル（商品名 ベクトンディッキンソン社製）等、又はこれらの組み合わせを挙げることができる。これらの支持担体は、細胞を内部に配置したときに配置した位置をほぼ維持可能な程度な硬さを有するものであればよく、ゲル状、繊維状、固体状のものを挙げることができる。中でも適切な硬さや保持力を提供しやすいといった観点から、コラーゲン、アガロースゲル、カルボキシメチルセルロース、ゼラチン、寒天、ハイドロゲル、セルマトリクス、メビオールゲル、マトリゲル、細胞外マトリクス混合物、エラスチン、フィブリン、ファイブロネクチン、ラミニン、又はこれらの組み合わせがより好ましく、コラーゲン、フィブリン、ファイブロネクチン、ラミニン、細胞外マトリクス混合物、セルマトリクス、メビオールゲル、マトリゲル、又はこれらの組み合わせが更に好ましい。これらの支持担体であれば、それぞれの細胞集合体を構成する間葉系細胞及び上皮系細胞の細胞間及び細胞集合体同士の相互作用を良好なものにすることができる。ここで、細胞の位置を維持可能な硬さとは、通常、三次元培養として適用される硬さ、即ち、細胞の配置を保持できると共に増殖による肥大化を阻害しない硬さであればよく、容易に決定することができる。
なお、ここで支持担体は、第１及び第２の細胞集合体が担体内部で成育することができる程度の厚みを有すればよく、目的とする組織の大きさ等によって適宜設定することができる。【００２８】
また、支持担体は、細胞が分散することなく細胞の接触状態を保持可能な保持力を備えていればよい。ここでいう「接触状態」とは、各細胞集合体において、また細胞集合体間において、確実に細胞相互作用させるために緊密（高密度）の状態であることが好ましく、このような高密度の状態とは、細胞凝集体の場合には、例えば、単に触れ合うよりも強く密着した状態を維持可能な保持力で細胞を培養可能なものとすることができる。例えば、コラーゲンの場合、最終濃度２〜３ｍｇ／ｍｌの濃度、即ちJIS-K6503-1996に準拠した方法（１２．７ｍｍ径のプランジャーで４ｍｍ押し下げるのに必要な荷重として測定）によって１２０ｇ〜２５０ｇのゼリー強度となる濃度での使用が適切な硬さを提供する。また、このゼリー強度は限定されず、他の種の支持担体においても、同様の評価方法によって同様の強度があれば本発明の支持担体として好ましく用いられる。また１種又は複数種の支持担体を混合することによって、目的とするゼリー強度に相当する硬さの支持担体を得てもよい。【００２９】
高密度の状態とは、組織を構成する際の密度と同等程度であることをいい、例えば、細胞集合体の場合、細胞配置時で５×１０7〜１×１０9個／ｍｌ、細胞の活性を損なわずに確実に細胞相互作用させるため好ましくは１×１０8〜１×１０9個／ｍｌ、最も好ましくは２×１０8〜８×１０8個／ｍｌの密度をいう。このような細胞密度に細胞集合体を調製するには、細胞を遠心によって凝集させ沈殿化することが細胞の活性を損なわずに簡便に高密度化できるため好ましい。このような遠心は、細胞の生存を損ねない３００〜１２００×ｇ、好ましくは５００〜１０００×ｇの遠心力に該当する回転数で３〜１０分間おこなえばよい。３００×ｇよりも低い遠心では、細胞の沈殿が不十分となって細胞密度が低くなる場合があり、一方、１２００×ｇよりも高い遠心では細胞が損傷を受ける場合があるため、それぞれ好ましくない。【００３０】
遠心分離によって高密度の細胞を調製する場合には、通常、細胞遠心分離するために用いられるチューブ等の容器に単一細胞の懸濁液を調製した後に遠心分離し、沈殿物としての細胞を残して上清をできるだけ取り除けばよい。
遠心分離による沈殿物とした場合には、沈殿物をそのまま支持担体の内部に配置すればよい。このとき、目的とする細胞以外の成分（例えば、培養液、緩衝液、支持担体等）は、細胞の容量と等量以下であることが好ましく、目的とする細胞以外の成分を含まないことを最も好ましい。このような高密度の細胞集合体では、細胞が緊密に接触しており、細胞間相互作用が効果的に発揮される。特に目的とする細胞以外の成分が極端に少ない細胞集合体を支持担体の内部に配置すると、支持担体の固化等によって更に凝集し、より一層緊密状態となる。【００３１】
また、第１の細胞集合体と第２の細胞集合体の接触は密接であるほど好ましく、第１の細胞集合体に対して第２の細胞集合体を押し付けて配置することが特に好ましい。また、第１の細胞集合体と第２の細胞集合体との周囲を培養液、酸素透過を阻害しない固形物で包み込むことも、細胞集合体同士の接触を密接にするのに有効であり、粘度の異なる溶液に密度の高い細胞懸濁液を入れて配置させ、溶液をそのまま固化することも、細胞の接触の保持を容易に達成できるため、好ましい。このとき、第１の細胞集合体を歯胚間葉系細胞の単一細胞集合物とし、第２の細胞集合体を歯胚上皮組織とした場合には、歯胚上皮組織のエナメル結節が第１の細胞集合体に接触するように配置することが好ましいが、これに限定されない。【００３２】
支持担体がゲル状、あるいは溶液状等の場合には、支持担体の内部に配置した後に支持担体を固化する固化工程を設けてもよい。支持担体の固化には、一般に用いた支持担体の固化条件をそのまま適用すればよい。例えば支持担体にコラーゲン等の固化可能な化合物を用いた場合には、通常適用される条件で、例えば培養温度下で数分〜数十分間静置させることにより、固化することができる。これにより、支持担体内部における細胞間の結合を固定化できると共に、強固なものにすることができる。【００３３】
再構成歯胚を形成させるための培養期間としては、支持担体内部に配置された細胞数及び細胞集合体の状態、培養の実施条件、更には動物種によって異なるが、一般に、少なくとも１日の期間とすることが好ましく、３日以上の培養期間とすることがより好ましい。この期間培養することにより得られた再構成歯胚又は歯であれば、欠損部へ埋設しても機能的な歯として萌出することができる。
また、この培養期間を延長させることによって、象牙質及びエナメル質の蓄積、歯冠形成、及び歯根の形成のように、再構成歯胚の形成過程が進行する。このため、この再構成歯胚形成のための培養期間は、実施条件、動物種、再構成歯胚の状態等に応じて適宜調整可能であり、例えば、後述する器官培養の場合には７日、場合によって６日で次の埋設工程に移行してもよく、或いは、再構成歯胚の状態や他の培養法によっては３０日超、場合によって５０日超、１００日超又は３００日超としてもよい。【００３４】
支持担体内部における培養は、第１及び第２の細胞集合体を内包する支持担体単独による培養であっても、他の動物細胞の存在下での培養であってもよい。
支持担体内部における培養を支持担体のみによる培養とした場合には、動物細胞の培養に用いられる通常の条件下での培養とすることができる。ここでの培養は、一般に動物細胞での培養条件をそのまま適用すればよく、前述した条件をそのまま適用することができる。また培養には、哺乳動物由来の血清を添加してもよく、またこれらの細胞の増殖や分化に有効であることが既知の各種細胞因子を添加してもよい。このような細胞因子としては、ＦＧＦ、ＢＭＰ等を挙げることができる。【００３５】
また、組織や細胞集合体のガス交換や栄養供給の観点及び、他の動物細胞との接触がなく且つ全行程in vitroで調製することができるという観点から、支持担体内部における培養を器官培養とすることが好ましい。器官培養では、一般に、動物細胞の増殖に適した培地上に多孔性の膜をフロートさせ、その膜上に支持担体で包埋された第１及び第２の細胞集合体を置いて培養を行う。ここで用いられる多孔性の膜には、０．３〜５μｍ程度の孔を多数有した膜であることが好ましく、具体的にはセルカルチャーインサート（商品名）、アイソポアフィルター（商品名）を挙げることができる。
器官培養による培養期間としては、１日間から７日間程度とすればよく、好ましくは３〜６日とすることができる。【００３６】
支持担体内部における培養を他の動物細胞の存在下での培養の場合には、動物細胞からの各種サイトカイン等の作用を受けて、早期に特有の細胞配置を有する歯を形成することができる。このような他の動物細胞の存在下での培養は、単離細胞や培養細胞を用いて生体外での培養によって行ってもよい。【００３７】
この用途に利用可能な動物は、哺乳動物、例えばヒト、豚、マウス等を好ましく挙げることができ、歯胚組織と同一の種、又は免疫不全に改変した他種であることが好ましい。生体を用いる場合には、好適な生体部位としては、動物細胞の器官や組織をできる限り正常に発生させるためには、腎臓皮膜下、腸間膜、皮下移植等を挙げることができる。このような動物細胞存在下での培養期間は、前記器官培養等と同様に、細胞の由来、培養条件、移植用動物種等によって適宜調整することができる。【００３８】
このような再構成歯胚形成工程によって、内側に象牙質、外側にエナメル質という歯としての特有の細胞配置（構造）を有しうる歯胚又はこれらを有する歯を得ることができる。また好ましくは、更に歯の先端（歯冠）と歯根という方向性も備えているものである。
また、第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を共に単一細胞の集合体とした場合には、歯特有の細胞配置を有する複数の歯による歯の集合体が得られるため好ましい。この歯の集合体が得られた場合には、個々の歯を集合体から分離して用い得る。【００３９】
本発明の修復材料の製造方法における方向確認工程では、歯の先端部を口腔内側として歯欠損部に埋設し得るように、上記再構成歯胚形成工程により得られた歯胚又は歯の方向性を確認する。【００４０】
歯胚又は歯の方向性は、歯欠損部へ埋設するための方向性を意味し、歯冠の形成が認められれば歯冠を、歯冠の形成が認められない場合には、歯冠相当部の上皮細胞層又は再構成歯胚の上皮細胞層を口腔内側と確認する。或いは再構成歯胚の上皮・間葉細胞層の開放部分を口腔内とは反対側と確認してもよい。ここで確認された方向性に従って歯胚又は歯を歯の欠損部に配置することにより、歯の先端部（歯冠）が口腔内側となって、周囲の歯と同様の向きに揃う。【００４１】
この方向性確認工程で方向性が確認された歯胚又は歯は、前記歯欠損部において、欠損した歯の等価物を得るための修復材料として用いられる。
即ち、方向性確認後の歯胚又は歯を含む修復材料は、歯欠損部への埋設に用いられる。修復材料中の歯胚又は歯は、その後、時間の経過と共に欠損部内で成長し、歯の等価物として萌出する。修復材料中の歯胚又は歯の状態や大きさ等によって異なるが、萌出した歯等価物の先端部（咬頭）は周囲の歯の先端部とほぼ同じ位置（咬合平面）に達し、それ以上、延長することはない。萌出、咬合までの埋設期間は、動物種又は埋設された歯胚若しくは歯の状態によって異なる。【００４２】
萌出した歯等価物は、生来の歯と同様の硬さ（硬度）を備えたものである。硬度は、歯等価物の象牙質及びエナメル質が圧入や擦過等による変形に耐える尺度であり、ヌープ硬度による測定で確認することができる。成体マウスの正常歯のエナメル質のヌープ硬度は、３００〜６００ＫＨＮ、好ましくは３００〜５００ＫＨＮであり、正常の象牙質のヌープ硬度は６０〜１２０ＫＨＮであり、本発明により得られた歯等価物は、この範囲にヌープ硬度を示す。これにより、正常な歯と同等の咀嚼機能が発揮される。【００４３】
また萌出した歯等価物は、エナメル質、象牙質に加えて歯髄、歯根膜を備えたものであり、正常な歯と同様の組織構成を示すものである。歯に歯根膜が備えられているので、神経の侵入も生じ、圧迫などの歯に対する侵害刺激に対する応答能も保持される。このような組織構成は、目視による確認の他、常法に従って組織学的解析、免疫学的染色及び遺伝子発現等によって確認することができる。【００４４】
このように本発明の修復材料の製造方法により得られた修復材料は、対合歯と咬合可能な歯の長さ及び硬さを備えた歯の等価物の原材料として使用することができる。【００４５】
また本発明の歯欠損部の修復方法における埋設工程では、上記再構成歯胚形成工程により得られた歯胚又は歯を修復材料として欠損部に埋設する。
この際、歯胚又は歯の埋設方向としては、上述した修復材料の製造方法の方向確認工程と同様に、歯冠の形成が認められれば歯冠を、歯冠の形成が認められない場合には、歯冠相当部の上皮細胞層又は再構成歯胚の上皮細胞層を口腔内側となるように配置すること、或いは再構成歯胚の上皮・間葉細胞層の開放部分を口腔内とは反対側となるように配置することが好ましい。これにより、歯等価物の先端部（歯冠）が口腔内側となって、周囲の歯と同様の向きに揃えることができる。【００４６】
欠損部の大きさ及び深さは、通常、抜歯等により歯肉に設けられたものであればよく、形状には特に制限はない。再生した歯胚が埋設可能であれば、欠損場所、対象となる動物種、目的とする歯の種類等によって適宜調整することが可能である。
このような欠損部は、通常、顎骨、口腔の歯槽骨などに位置する。また歯が喪失することによって歯槽骨量が低下している場合には、この欠損部位に対して、ＧＴＲ法（guided tissue regeneration：組織再生誘導法）など、インプラントの埋設のために臨床で用いられている公知の方法により骨の再生を行って骨量を増加させてもよい。歯胚又は歯を孔部へ配置した後は、通常の処理に従って縫合等を行うことが好ましい。【００４７】
埋設後の歯胚は、その後、時間の経過と共に欠損部内部で歯に成長し、歯等価物として萌出する。前述の修復材料の製造方法について記載した事項と同様に、埋設する歯胚の状態や大きさ等によって異なるが、萌出した歯等価物の先端部（咬頭）は周囲の歯の先端部とほぼ同じ位置（咬合平面）に達し、それ以上、延長することはない。これにより、対合歯と咬合可能な歯の長さとすることができる。萌出、咬合までの埋設期間は、動物種又は埋設された歯胚若しくは歯の状態によって異なる。【００４８】
萌出した歯等価物は、前述の修復材料の製造方法について記載した事項と同様に、生来の歯と同様の硬さ（硬度）を備えたものである。硬度は、歯等価物の象牙質及びエナメル質が圧入や擦過等による変形に耐える尺度であり、ヌープ硬度による測定で確認することができる。成体マウスの正常歯のエナメル質のヌープ硬度は、３００〜６００ＫＨＮ、好ましくは３００〜５００ＫＨＮであり、正常の象牙質のヌープ硬度は６０〜１２０ＫＨＮであり、本発明で修復された歯等価物は、この範囲にヌープ硬度を示す。これにより、正常な歯と同等の咀嚼機能が発揮される。【００４９】
また萌出した歯は、前述の修復材料の製造方法について記載した事項と同様に、エナメル質、象牙質に加えて歯髄、歯根膜を備えたものであり、正常な歯と同様の組織構成を示すものである。歯に歯根膜が備えられているので、神経の侵入も生じ、圧迫などの歯に対する侵害刺激に対する応答能も保持される。このような組織構成は、目視による確認の他、常法に従って組織学的解析、免疫学的染色及び遺伝子発現等によって確認することができる。【００５０】
本発明の歯の欠損部の修復方法は、上記のように再構成された歯胚又は歯を用いて歯欠損部を修復することにより、正常な歯と同等の硬度を有し、正常に咬合をとれ、正常な歯と同等の刺激応答性を有するように歯欠損部を修復することができる。この結果、欠損部に再生した歯等価物は機能的な歯として作用し、長期間にわたって修復状態を維持することができる。
このため、生活の質を維持することができるので、審美分野において良好に用いられる。また口腔内の歯欠損部の存在に起因した健康状態の悪化を避けることができるので、ウシ、ウマ、ブタなどの家畜や、イヌ、ネコなどのペットなど、ヒト以外の哺乳動物の健康状態を維持することができる。
【実施例】
【００５１】
以下に本発明の実施例について説明するが、これに限定されるものではない。また実施例中の％は、特に断らない限り、重量（質量）基準である。【００５２】
［実施例１］
（１）歯胚上皮系細胞と歯胚間葉系細胞の調製
歯の形成を行うために歯胚の再構築を行った。この実験モデルとしてマウスを用いた。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（日本クレアから購入）の胎齢１４．５日、胚仔から下顎臼歯歯胚組織を顕微鏡下で常法により摘出した。下顎臼歯歯胚組織をＣａ２＋，Ｍｇ２＋不含リン酸緩衝液（ＰＢＳ（−））で洗浄し、ＰＢＳ（−）に最終濃度１．２Ｕ／ｍｌのDispase II (Roche, Mannheim, Germany)を添加した酵素液で室温にて１２．５分間処理した後、１０％ＦＣＳ（JRH Biosciences, Lenexa, KS)を添加したＤＭＥＭ（Sigma, St. Louis, MO)で３回洗浄した。さらにDNase Ｉ溶液 (Takara, Siga, Japan)を最終濃度７０Ｕ／ｍｌになるよう添加し歯胚組織を分散させ、２５Ｇ注射針 (Terumo, Tokyo, Japan)を用いて外科的に歯胚上皮組織と歯胚間葉組織を分離した。【００５３】
歯胚上皮系細胞は、上記により得られた歯胚上皮組織をＰＢＳ（−）で３回洗浄し、ＰＢＳ（−）に最終濃度１００Ｕ／ｍｌのCollagenase Ｉ（Worthington, Lakewood, NJ）を溶解した酵素液で３７℃にて２０分間の処理を２回繰り返した。遠心分離によって沈殿回収した細胞を、さらに０．２５％ Trypsin (Sigma)−ＰＢＳ（−）で３７℃、５分間処理した。１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭで、細胞を３回洗浄した後、細胞に最終濃度７０Ｕ／ｍｌのDNase Ｉ溶液を添加して、ピペッティングにより単一の歯胚上皮系細胞を得た。
一方、歯胚間葉系細胞は、歯胚間葉組織をＰＢＳ（−）で３回洗浄し、０．２５％Trypsin (Sigma)、５０Ｕ／ｍｌのCollagenase I （Worthington）を含むＰＢＳ（−）で処理した。７０Ｕ／ｍｌのDNase I (Takara)を添加して、ピペッティングにより単一の歯胚間葉系細胞を得た。【００５４】
（２）再構成歯胚の作製
次に、上記で調製された歯胚上皮系細胞及び歯胚間葉系細胞を用いて、歯胚再構築を行った。シリコングリースを塗布した１．５ｍＬマイクロチューブ (Eppendorf, Hamburg, Germany）に、１０％ＦＣＳ（JRH) 添加ＤＭＥＭ（Sigma）で懸濁した歯胚上皮系細胞、あるいは歯胚間葉系細胞を入れ、遠心分離により細胞を沈殿として回収した。遠心後の培養液の上清をできる限り除去し、再度遠心操作を行い、実体顕微鏡で観察しながら細胞の沈殿周囲に残存する培養液を GELoader Tip ０．５−２０μＬ (eppendorf) を用いて完全に除去した。その後、タッピングあるいはピペッティングにより細胞を分散させて、再構成歯胚作製に用いる細胞を準備した。【００５５】
シリコングリースを塗布したペトリディッシュにCellmatrix type I-A (Nitta gelatin, Osaka, Japan) を３０μＬ滴下してコラーゲンゲルドロップを作製した。この溶液に、上記歯胚上皮系細胞、あるいは歯胚間葉系細胞を、０．１−１０μＬのピペットチップ (Quality Scientific plastics)を用いて、０．２μＬ〜０．３μＬアプライして、細胞凝集塊を作製した（細胞数：約５×１０４個／凝集塊）。再構成歯胚は、先に作製した歯胚間葉系細胞の細胞凝集塊に接するように、歯胚上皮系細胞を同様の方法によりアプライして細胞凝集塊を作製し、両者が互いに密接するようにして再構成歯胚を作製した。【００５６】
ゲル中で作製した再構成歯胚は、ＣＯ２インキュベーターに１０分間静置してCellmatrix type I-A (Nitta Gelatin)を固形化し、１０％ＦＣＳ（JRH) 添加ＤＭＥＭ（Sigma）にセルカルチャーインサート（ポアサイズが０．４ミクロンのＰＥＴメンブレン；BD, Franklin Lakes, NJ）が接するようにセットした培養容器のセルカルチャーインサートの膜上に、細胞塊を支持担体である周囲のゲルと共に移して、１８〜２４時間、器官培養した。培養後、セルカルチャーインサート上での器官培養を継続し、歯の発生を解析した。【００５７】
（３）個別分離の方法
器官培養２〜５日目において歯胚が複数発生している再構成歯胚を、実体顕微鏡下で注射針とピンセットを用いて外科的に個別の歯胚に分離した。シリコングリースを塗布したペトリディッシュにCellmatrix type I-A (Nitta gelatin, Osaka, Japan) を３０μＬ滴下してコラーゲンゲルドロップを作製した。この溶液に、上記個別分離歯胚を入れ、ＣＯ２インキュベーターに１０分間静置してCellmatrix type I-A (Nitta Gelatin)を固形化し、１０％ＦＣＳ（JRH) 添加ＤＭＥＭ（Sigma）にセルカルチャーインサート（ポアサイズが０．４ミクロンのＰＥＴメンブレン；BD, Franklin Lakes, NJ）が接するようにセットした培養容器のセルカルチャーインサートの膜上に、個別分離歯胚を支持担体である周囲のゲルと共に移して、１８〜２４時間、器官培養した。【００５８】
（４）口腔内移植
上記に従って作製した個別分離歯胚から周囲のゲルを注射針とピンセットで外科的に除去し、個別分離歯胚を、腎皮膜下へ移植せずにそのまま７〜１０週齢Ｃ５７ＢＬ／６の上顎第一臼歯（Ｍ１）部歯槽骨に移植した。本発明により口腔内において個別の歯を萌出させ、咀嚼などの口腔機能を実現させた。【００５９】
［実施例２］
（１）個別分離歯胚の作製
実施例１（１）〜（２）と同様にして器官培養を行い、器官培養２〜５日目において歯胚が複数発生している再構成歯胚を、実体顕微鏡下で注射針とピンセットを用いて外科的に個別に分離した。個別分離歯胚の場合、シリコングリースを塗布したペトリディッシュにCellmatrix type I-A (Nitta gelatin, Osaka, Japan) を３０μＬ滴下してコラーゲンゲルドロップを作製した。この溶液に、上記個別分離歯胚を入れ、ＣＯ２インキュベーターに１０分間静置してCellmatrix type I-A (Nitta Gelatin)を固形化し、１０％ＦＣＳ（JRH) 添加ＤＭＥＭ（Sigma）にセルカルチャーインサート（ポアサイズが０．４ミクロンのＰＥＴメンブレン；BD, Franklin Lakes, NJ）が接するようにセットした培養容器のセルカルチャーインサートの膜上に、個別分離歯胚を支持担体である周囲のゲルと共に移して、５日間、器官培養し、複数の再構成歯胚が形成された場合には、外科的に単一の再生歯胚に分離した。培養後、周囲のゲルを注射針とピンセットで外科的に除去し、８週齢Ｃ５７ＢＬ／６の上顎Ｍ１部歯槽骨に移植した。【００６０】
（２）口腔内移植方法
口腔内移植の３日前にジエチルエーテルで吸引麻酔した８週齢Ｃ５７ＢＬ／６に、５ｍｇ／ｍｌのペントバルビタールナトリウムを含む生理食塩水を、体重２０ｇに対して２４０μｌの割合で腹腔注射した。痛覚の麻痺したマウスの上顎Ｍ１を、ピンセットを用いて上顎からＭ１を抜歯し、残根のないことを確認し、噴出してくる血液を脱脂綿で拭き取り止血した。食物摂取について、粉末状に砕いた飼育用の餌を毎日与えた。３週間以上、飼育して抜歯窩の治癒をはかり、Ｍ１欠損のＣ５７ＢＬ／６を作製した。【００６１】
上記方法により作製したＭ１欠損のＣ５７ＢＬ／６をジエチルエーテルで吸引麻酔し、５ｍｇ／ｍｌのペントバルビタールナトリウムを含む生理食塩水を、体重２０ｇに対して２４０μｌの割合で腹腔注射した。痛覚の麻痺したマウスを仰向位にて解剖台に固定し、最大開口させた状態で、ゴムまたは糸を用いて上下顎を固定した。上顎M1部歯槽骨頂部歯肉を、メスを用いて切開し、骨膜とともに剥離し下顎骨を明示した。ピンバイス(極細ドリル)を用いてＭ１相当部下顎骨に、直径１ｍｍの穴を上顎洞穿孔に注意して作製し、個別分離歯胚を移植した。移植後、骨膜歯肉弁にて創部を閉鎖し、針付の糸を用いて縫合した。移植する個別分離歯胚の向きを調節するため、個別分離歯胚の咬頭部にメチレンブルーを用いて標識して、標識を萌出方向に一致させて移植した。口腔内移植した８週齢Ｃ５７ＢＬ／６には粉末状に砕いた飼育用の餌を毎日与えた。【００６２】
上記方法により個別歯胚を移植したＣ５７ＢＬ／６を５ｍｇ／ｍｌのペントバルビタールナトリウムを含む生理食塩水を、体重２０ｇに対して２４０μｌの割合で腹腔注射した。痛覚の麻痺したマウスを仰向位にて解剖台に固定し、最大開口させた状態でゴムを用いて上下顎を固定して、萌出前、萌出直前、萌出直後、萌出中、咬合面到達のそれぞれの状態における再生歯と遠心部のＭ２、Ｍ３と周囲歯肉を観察した。観察結果を図１に示す。図１Ａ〜図１Ｅにおいて左図が萌出期（萌出前から萌出直後）、中央図は萌出後から咬合までの時期、右図は咬合後の時期を示し、それぞれ右端が再生した歯である。【００６３】
移植後約２０日から５０日経過すると、Ｍ１歯肉部より再生歯の咬頭が認められ、萌出が開始した。再生歯は、時間経過とともに歯冠長を増し、最終的に咬合平面まで到達した。咬合平面まで到達した再生歯は対合歯と咬頭嵌合した（図１Ａ〜図１Ｃ参照）。
これらの結果から、再生歯は正常歯と同様に安定した咬合関係を形成し咀嚼機能を有することが明らかになった。【００６４】
（３）ＭｉｃｒｏＣＴ解析
個別分離歯胚を移植した上顎骨を含んだ頭部を摘出し、頭部全体を４％パラホルムアルデヒド−リン酸緩衝液で１２時間固定した後、inspeXio SMX-90CT（島津製作所  社製）でＣＴ撮影を行った。ＣＴ撮影時の設定は、ビュー数を６００、アベレージを１０、スキャンを１、画像を５１２×５１２、スケーリングを５０、スライス厚を１、ＢＨＣをなしに設定し、撮影を行った。ＣＴ撮影して得たデータは、解析ソフトＩｍａｒｉｓ（Ｚｅｉｓｓ社製）を用いて３次元立体再構築し、マイクロＣＴの断面画像の作成を行った。【００６５】
ＭｉｃｒｏＣＴ解析の結果、図１Ｄ及び図１Ｅのように萌出過程の再生歯は、歯根を形成しながら長軸方向に移動し歯槽骨頂から萌出し、咬合平面まで到達することが明らかになった。歯根部では、歯根膜に相当する空隙が歯槽骨との間に認められ、歯の断面図では正常歯と同様に歯髄腔が存在し根尖で根尖口が開放していることが認められた。咬合状態では、対合歯と咬頭嵌合していることが明らかになった。これらの結果から、萌出の過程において再生歯は正常歯と同様に歯根膜や歯髄腔を保持しながら歯槽骨内で長軸方向に移動し、咬合平面まで到達することが明らかになった。【００６６】
また、同様に４％パラホルムアルデヒド−リン酸緩衝液で固定された頭部の上下顎Ｍ３を露出して、水平的角度は下顎Ｍ３と下顎Ｍ１の咬合面を結んだ平面を基準とし、上下的角度は側方から下顎Ｍ１の近心頬側咬頭と近心舌側咬頭を見た時のそれぞれの重なり方を基準として、中心咬合位口腔内写真を常法に従って撮影した。【００６７】
その結果、再生歯は下顎のＭ１の遠心咬頭と咬合していることが認められ、上顎のＭ２，Ｍ３とともに水平な咬合平面を確立していることが明らかになった。これらの結果から、萌出した再生歯は下顎顎位の誘導に適切な咬合平面を確立していることが示唆された。【００６８】
（４）ヌープ硬度
実施例２（１）において口腔内に発生させた個別の歯を摘出し、その歯のエナメル質と象牙質の硬度を同一歯で３点以上測定した。
測定は微小硬さ試験機（HM-102 ミツトヨ社製）に二つの対稜角１７２°３０′と１３０°のヌープ硬さ測定用四角錐ダイヤモンド圧子（19BAA061 ミツトヨ社製）を装着したもので行った。再生歯へ圧子を負荷１０ｇ、１０秒間圧接して、それにより生じた７．１１：１の菱形圧痕の長辺の長さから硬度を求めた。再生歯は金属板に歯科用レジン（ユニファストIII  ジーシー社製）を用いて固定した。エナメル質は地面と水平な部分において測定を行い、象牙質は歯科技工用エンジン（ULTIMATE 500  ナカニシ社製）にて地面と水平に切削し、被検面を露出させて測定を行った。ヌープ硬度測定の結果を図２に示す。【００６９】
図２に示されるように、正常歯のエナメル質の平均ヌープ硬度は３週齢が３４１．０８３ＫＨＮ，６週齢が４５７．５ＫＨＮ，９週齢が４３６ＫＨＮであり、再生歯のエナメル質は４６９．８１ＫＨＮという硬度であった（図２Ａ参照）。正常歯の象牙質平均ヌープ硬度は３週齢が６６．８７ＫＨＮ，６週齢が７６．５３ＫＨＮ，９週齢が８８．５８ＫＨＮであり、再生歯の象牙質は８１．８３ＫＨＮという硬度であった（図２Ｂ参照）。このようにエナメル質、象牙質ともに再生歯は、正常な咀嚼機能に適応する硬度を有する歯であることが示唆された。【００７０】
（５）組織学的解析
移植後約２０日から５０日経過すると、Ｍ１歯肉部より再生歯の咬頭が認められ、萌出が開始した。萌出状況を観察して、萌出前、萌出直前、萌出直後、萌出中、咬合面到達状態の上顎骨を摘出した。４％パラホルムアルデヒド−リン酸緩衝液で１６時間固定した後、２２．５％のギ酸で７２時間脱灰し、常法によりパラフィン包埋して、１０μｍの切片を作製した。脱灰液は上顎骨２つにつき５０ｍｌとし、脱灰４８時間目に全量を交換した。組織学的解析のためには常法に従い、ヘマトキシリン−エオジン染色を行った。【００７１】
図３は萌出直前の再生歯を示す（図３、白矢印）。図３のように、組織学的解析によって、エナメル質、象牙質、歯髄、歯根膜を有する正常歯と同等の組織構造が認められた。それぞれの組織においても、エナメル質はエナメル小柱が放射状に併走し、象牙質にも象牙細管が認められた。歯根膜は十分な厚みを有しており、咀嚼圧を緩衝しうる構造が認められた。萌出経過の再生歯は、歯根を形成しながら長軸方向に移動し歯槽骨頂から萌出し、咬合平面まで到達することが認められ、この過程において歯根膜が保持され、歯周組織と調和していることが示唆された。【００７２】
（６）矯正力による骨のリモデリング解析
歯は歯根膜を介して周囲の歯槽骨と結合しているため、歯に矯正力を与えると、歯根膜によってメカニカルストレスが周囲環境に伝達される。矯正力によって圧迫された歯根膜部位では歯槽骨の破骨細胞による吸収が、牽引された歯根膜部位では骨芽細胞による骨形成が行われ、歯と歯槽骨の間の空間的距離を一定に保つようになっている。このような歯根膜の機能を評価するために、再生歯に矯正力を加え、正常な歯の移動で見られる圧迫側での破骨細胞の出現、牽引側での骨芽細胞の出現といった骨のリモデリングを確認するために、以下の解析を行った。【００７３】
直径０．０１２インチのニッケルチタンワイヤー(VIM-NT 矯正用線丸型  オーラルケア株式会社)を用いて片方のワイヤー端にループを屈曲し、ループが上顎両側切歯歯頚部に適合し装着できるように頬側移動矯正用ワイヤーを成形した。上記方法により個別歯胚を移植したＣ５７ＢＬ／６を５ｍｇ／ｍｌのペントバルビタールナトリウムを含む生理食塩水を、体重２０ｇに対して２４０μｌの割合で腹腔注射した。痛覚の麻痺したマウスを仰向位にて解剖台に固定し、最大開口させた状態で、ゴムまたは糸を用いて上下顎を固定した。ループの反対側のワイヤー端の長さは装着時に萌出歯の遠心部に到達するようにあわせた。頬側移動矯正用ワイヤーのループを、反対側のワイヤー端を矯正する歯の頬側歯頚部に適合させ、上顎両側切歯歯頚部に装着しユニフィルフロー(光重合用レジン  ジーシー社製)にて接着し固定した。頬側歯頚部に適合させていたワイヤー端を舌側歯頚部に移動させ、矯正力を活性化させ、その後、歯根膜が惹起した骨のリモデリング現象を解析するために、骨のリモデリング現象が特に顕著になる矯正６日後に組織学的解析を行った。結果を図４Ａ〜図４Ｃに示す。【００７４】
メカニカルストレスに対する再生歯歯根膜の応答機能を解析するために、再生歯に頬側移動の矯正力をかけて骨のリモデリングの組織像をヘマトキシリン−エオジン染色像によって観察した。
その結果、頬側において、歯根膜腔が狭窄して歯根膜線維が圧縮する歯根膜の圧迫が認められた（図４Ａの黒枠Ｂと図４Ｂ参照）。一方、逆側の舌側では、歯根膜腔が拡大して歯根膜線維が緊張する歯根膜の牽引が認められた（図４Ａの黒枠Ｃと図４Ｃ参照）。また、歯根膜の牽引側の歯槽骨壁に添って一層の細胞の配列が認められたため、骨を形成する骨芽細胞（図４Ｃ矢印頭  参照）の出現が示唆された。さらに、牽引側の反対側の圧迫側では、細胞体に多数の核を含む多核巨細胞が歯槽骨に認められ、窩状な骨の吸収像が認められたので、破骨細胞（図４Ｂ矢印  参照）の発現と骨の吸収が示唆された。
これらの結果から、再生歯が正常歯と同様に、矯正力などのメカニカルストレスによって歯根膜が応答し、骨のリモデリング現象が誘起されることが示唆された。【００７５】
（８）痛み刺激の解析
歯の圧迫による痛みは矯正などによってよく知られており、特に歯根膜に存在する神経が媒介し、延髄三叉神経脊髄路核尾側亜核領域の神経細胞でのc-Fosタンパク質の産生が上昇することが明らかにされている（Byers MR. et al., Crit Rev Oral Biol Med 10, 4-39, 1999.  Deguchi T. et al. J Dent Res 82:677−681, 2003.、Fujiyoshi, Y. et al., Neuroscience Letters 283, 205-208, 2000.）。また歯髄の露出による痛みは露髄処理などによってよく知られており、矯正による痛みと同様に、特に歯髄に存在する神経が媒介し、延髄三叉神経脊髄路核尾側亜核領域の神経細胞でのc-Fosタンパク質の産生が上昇することが明らかにされている（Byers MR. et al., Crit Rev Oral Biol Med 10, 4-39, 1999.  Deguchi T. et al. J Dent Res 82:677−681, 2003.）そこで再生歯の神経機能を解析する目的で、マウスの再生歯に矯正と同様の圧迫刺激、および象牙質に歯科用ドリルで穴をあける露髄処理を行い、延髄三叉神経脊髄路核尾側亜核領域においてc-Fosタンパク質の発現が上昇するかどうかを解析した。【００７６】
上記方法により個別歯胚を移植したＣ５７ＢＬ／６に５ｍｇ／ｍｌのペントバルビタールナトリウムを含む生理食塩水を、体重２０ｇに対して２００μｌの割合で腹腔注射した。痛覚の麻痺したマウスを仰向位にて解剖台に固定した。
上記の方法にて矯正力活性後２時間と４８時間、および露髄処理を行った２時間後で、Ｃ５７ＢＬ／６を４％パラホルムアルデヒド−リン酸緩衝液で灌流固定した。摘出した延髄を４％パラホルムアルデヒド−リン酸緩衝液で１６時間固定した後、常法によりOCT compound（Miles Inc., Naperville, IL）に包埋して、クリオスタット (Leica, Wetzlar, Germany)で５０μｍの切片を作製した。作製した切片は、c-fos(SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC., Santa Cruz, Calfornia, USA)を１次抗体として、Goat IgG fraction to rabbit IgG (CAPPEL, Aurora, Ohio, USA)を２次抗体、Rabbit peroxidase anti-Peroxidase を(CAPPEL, Aurora, Ohio, USA)３次抗体として用いて免疫染色し、延髄の三叉神経路核における発現を比較した。【００７７】
OCT compound除去後、０．３％過酸化水素水−８０％メタノールにて室温で１時間インキュベートして、内在性の酵素活性をブロッキングした。続いてブロッキング液(3% Goat Serum-TBS）にて室温で１時間ブロッキングした後、１次抗体を４℃で７２時間反応させた。洗浄後、ブロッキング液にて室温で１時間ブロッキングを行い、２次抗体を室温で１時間反応させた。洗浄後、さらにブロッキング液にて室温で１時間ブロッキングを行い、３次抗体を室温で1時間反応させた。十分な洗浄を行い、ＤＡＢ／ＮＡＳ基質溶液（０．０８〜０．１％ nickel ammonium sulfate含有０．０４％ＤＡＢ−０．００３％過酸化水素−ＴＢＳ）を滴下して発色させた。発色後の切片は、十分な洗浄の後、グリセロールにて封入した。正立顕微鏡（Axioimager, Zeiss社製）にて観察した。結果を図５に示す。【００７８】
その結果、図５Ａのように、再生歯を矯正も露髄もしていないＣ５７ＢＬ／６の延髄三叉神経脊髄路核尾側亜核領域では、ｃ−Fosタンパク質の発現が認められないものの、図５Ｂ及び図５Ｃのように再生歯を矯正したＣ５７ＢＬ／６の延髄三叉神経脊髄路核尾側亜核領域では、２時間後にｃ−Fosタンパク質の高レベルの発現が誘導され、図５Ｃに示すように、その発現は４８時間後まで維持されていた。また図５Ｄのように再生歯を露髄処理したＣ５７ＢＬ／６の延髄三叉神経脊髄路核尾側亜核領域では、２時間後にｃ−Fosタンパク質の高レベルの発現が誘導されていた。これらの結果から、再生歯に矯正による圧迫刺激を与えたときに発生する圧迫刺激、ならびに痛み刺激を歯根膜領域に存在する神経線維が感知し、正常歯と同様に、その刺激を中枢に伝達していることが示唆された。【００７９】
このように本発明の修復方法を用いることによって、正常な歯と同等の硬度を有し、正常に咬合をとれ、正常な歯と同等の刺激応答性を有するように歯欠損部を修復できることがわかった。【００８０】
日本出願番号第２００８−２１１８７０号の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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