(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
モータリン−２ではない、４０ｋＤａの分子量を有し、配列番号８に規定されるアミノ酸配列を含む単離されたヒトＣＲＰ４０タンパク質又はドーパミンと結合でき、少なくとも９０％の配列同一性を示すその機能的に同等な変異体。
【請求項２】
請求項１に記載のヒトＣＲＰ４０タンパク質又はその機能的に同等な変異体をコードする核酸。
【請求項３】
ヒトにおいて神経学的疾患の検出を補助する方法であって、
１）ヒトから得られた生体サンプルを提供するステップと、
２）サンプル中の、請求項１に記載のヒトＣＲＰ４０タンパク質又は請求項２に記載の核酸を定量するステップと
を含み、
正常な対照サンプルと比較して、前記タンパク質又は前記核酸の少なくとも１０％の減少が疾患を示し、
前記神経学的疾患が統合失調症、双極性障害及びパーキンソン病からなる群から選ばれる、方法。
【請求項４】
前記神経学的疾患が、パーキンソン病である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記サンプルが血液サンプルである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
請求項１に記載のヒトＣＲＰ４０タンパク質又はその機能的に同等な変異体を含む、パーキンソン病の治療剤。
【請求項７】
請求項１に記載のヒトＣＲＰ４０タンパク質又はその機能的に同等な変異体に対する抗体。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
［０００１］本発明は、新規タンパク質に関する。より詳しくは、本発明は、神経発達疾患及び神経変性疾患をはじめとする神経学的疾患のバイオマーカー及び治療薬として有用である、モータリン−２を含むカテコールアミン調節性タンパク質に関する。さらに、これらのタンパク質はまた、循環器疾患のバイオマーカーとしても有用である。
【０００２】
［発明の背景］
［０００２］熱ショックタンパク質とも呼ばれる分子シャペロンタンパク質は、不安定なタンパク質と結合し、適当で安定なコンホメーションを維持するための再フォールディングを助ける遍在性の高度に保存されたタンパク質である（Ｍａｃａｒｉｏ及びＣｏｎｗａｙ  ２００２；Ｏｈｔｓｕｋａ及びＳｕｚｕｋｉ  ２０００；Ｓｈｅｒｍａｎ及びＧｏｌｄｂｅｒｇ  ２００１；Ｓｏｔｉ及び  Ｃｓｅｒｍｅｌｙ  ２００２ｂ；Ｓｏｔｉ及びＣｓｅｒｍｅｌｙ  ２００２ａ）。さらに、分子シャペロンタンパク質は、１）タンパク質を核に往復させる、２）細胞調節において転写因子として作用する、３）細胞ネットワークの要素を維持するために、細胞内で正常タンパク質との弱い結合能力を提供するなどのさらなる機能を有する（Ｓｈｅｒｍａｎ及びＧｏｌｄｂｅｒｇ  ２００１；Ｓｏｔｉ及びＣｓｅｒｍｅｌｙ  ２００２ｂ；Ｓｏｔｉ及びＣｓｅｒｍｅｌｙ  ２００２ａ）。環境及び酸化ストレスが、分子シャペロンタンパク質の発現をもたらし、これが損傷を受けたタンパク質及び変性したタンパク質の疎水性表面と結合し、これにより、それらの適切なフォールディング及びこれらのタンパク質の沈殿及び凝集の予防、最終的には細胞死の予防が可能となる（Ｍａｃａｒｉｏ及びＣｏｎｗａｙ  ２００２）。
【０００３】
［０００３］生物が老化するにつれ、細胞は突然変異、翻訳後異常、酸化及び環境ストレスの増大を起こしやすく、より多くのタンパク質の凝集をもたらす（Ｇｉｆｆａｒｄら  ２００４；Ｍｕｃｈｏｗｓｋｉ及びＷａｃｋｅｒ  ２００５）。生物の老化は、抗ストレス機構の欠損、例えば、分子シャペロン合成の減少及びユビキチン−プロテオソーム及びリソソーム媒介性オートファジー分解経路が無効であることをもたらし得る（Ｍｕｃｈｏｗｓｋｉ及びＷａｃｋｅｒ  ２００５）。最近の報告は、分子シャペロン補充の欠乏が、多数の神経変性疾患及び神経発達疾患、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病及び統合失調症の進行と関係していると見なしている（Ｏｈｔｓｕｋａ及びＳｕｚｕｋｉ  ２０００；Ｓｈｅｒｍａｎ及びＧｏｌｄｂｅｒｇ  ２００１；Ｓｏｔｉ及びＣｓｅｒｍｅｌｙ  ２００２ａ）。この概念は、ニューロンなどの分裂終了細胞において特に重要であり、凝集したタンパク質の広範囲の蓄積を引き起こす（Ｓｏｔｉ及びＣｓｅｒｍｅｌｙ  ２００２ａ）。
【０００４】
［０００４］ＤＡと結合し、構造的にカテコールアミンと関連している、独特の種類の脳特異的タンパク質の存在が最近報告された。これらのタンパク質は、カテコールアミン調節性タンパク質（ＣＲＰ）と呼ばれている（Ｒｏｓｓら  １９９３；Ｒｏｓｓら  １９９５）。３種のＣＲＰ（それぞれ分子量２６、４０及び４７ｋＤａ）が単離されている。薬理学的及び生化学的研究により、カテコールアミン結合タンパク質又は脳に存在する受容体として知られるこれらの特定のタンパク質間に類似性は示されなかった（Ｍｏｄｉら  １９９６；Ｒｏｓｓら  １９９３；Ｒｏｓｓら  １９９５）。しかし、これらの特定のタンパク質は、熱ショックタンパク質ファミリーと高い相同性を有している。例えば、ウシ脳ＣＲＰ４０（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＃ＡＦ０４７００９）の分子クローニングにより、このタンパク質は、熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（Ｈｓｐ７０）ファミリーと関連があるということが示された。先に論じたように、熱ショックタンパク質は、分子シャペロンとして作用し、細胞を酸化ストレス及びその他の種類のストレスから保護する（Ｂｅｎ  Ｚｖｉ及びＧｏｌｏｕｂｉｎｏｆｆ  ２００１；Ｇｒｏｖｅｒ  ２００２；Ｓｏｔｉ及びＣｓｅｒｍｅｌｙ  ２００２ｂ；Ｓｏｔｉ及びＣｓｅｒｍｅｌｙ  ２００２ａ）。
【０００５】
［０００５］モータリンは、マウス胚線維芽細胞において６６ｋＤａのタンパク質として１９９１年に発見されたミトコンドリア熱ショックタンパク質である（Ｗａｄｈｗａら  １９９１）。細胞不死化の分子機構を追跡するために、マウス胚線維芽細胞を用いる複数の研究が、モータリンを死亡マーカーとして同定した。マウス線維芽細胞の細胞質において、このタンパク質がクローニングされ、モータリン−１（ｍｏｔ−１）として特性決定された（Ｗａｄｈｗａら  １９９１）。ＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトされたｍｏｔ−１  ｃＤＮＡは、細胞質に分配され、細胞老化をもたらす。対照的に、ｍｏｔ−２  ｃＤＮＡアイソフォームは、核周辺領域にコードされ、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞の悪性形質転換をもたらし、最終的に正常ヒト線維芽細胞において細胞の不死化を誘導する（Ｋａｕｌら  ２００３）。興味深いことに、ｍｏｔ−１及びｍｏｔ−２タンパク質は、２個のアミノ酸残基しか互いに異なっておらず、２種のマウスモータリンアイソフォームは２つの別個の遺伝子から生じる（Ｘｉｅら  ２０００）。
【０００６】
［０００６］ｍｏｔ−２タンパク質は、そのさまざまな機能（シャペロン、アンカータンパク質及びシグナル伝達）のために多機能タンパク質として記載されている。最近の報告は、ｍｏｔ−２タンパク質のＮ末端は、腫瘍抑制遺伝子ｐ５３のカルボキシル末端と結合すると示した（Ｋａｕｌら  ２００２；Ｗａｄｈｗａら  ２００２）。この結合特性は、ｐ５３の核へのトランス活性化を阻害し、細胞不死化をもたらす。Ｍｏｔ−２は、癌腫瘍研究における重要な生物学的マーカーとして認識されている。
【０００７】
［０００７］ヒトゲノムプロジェクトは、ヒト種においておよそ３２０００個の遺伝子を発見した（ヒトゲノム配列決定コンソーシアム、Ｎａｔｕｒｅ、２０００）。ヒトゲノムを配列決定するハイスループット技術及び確立された配列タグ（ＥＳＴ）を用いることで、ヒトゲノムの複雑性が劇的に増大した（Ｇｒａｖｅｌｅｙ  ２００１；Ｍｏｄｒｅｋ及びＬｅｅ  ２００３；Ｗａｄｈｗａら  ２００２）。ＥＳＴは、５’キャッピングの導入、スプライシング及び３’末端のポリアデニル化後に生じる、完全にプロセシングされたｍＲＮＡに由来する（Ｍｏｄｒｅｋ及びＬｅｅ  ２００３；Ｗａｄｈｗａら  ２００２）。選択的スプライシングは、遺伝子内の特定のエキソンのエキソンスキッピングを含み、これは、種々のタンパク質をコードする複数の転写物の生成をもたらし、報告された研究の７０〜８８％において異なる機能を有する可能性がある（Ｇｒａｖｅｌｅｙ  ２００１；Ｗａｄｈｗａら  ２００２）。選択的スプライシングは、ヒトゲノムにおいて、３５〜５９％の間の頻度で起こり、報告される各遺伝子に対して、少なくとも１種のスプライス代替物をもたらす（Ｍｏｄｒｅｋ及びＬｅｅ  ２００３；Ｗａｄｈｗａら  ２００２）。
【０００８】
［０００８］ヒトゲノムプロジェクトから集められた情報を活用して、神経学的疾患、例えば、神経変性疾患及び神経発達疾患などの疾患を診断するのに有効なバイオマーカーを同定することが望ましいが、これは、特に、この情報を得るための神経組織へのアクセスが不可能であるためである。
【０００９】
［発明の概要］
［０００９］本明細書においてＣＲＰ４０と呼ばれる、新規カテコールアミン調節性タンパク質を同定し、神経学的疾患、例えば、神経変性障害及び神経発達障害、並びに循環器疾患の診断において有用であることを調べた。ＣＲＰ４０の細胞内発現の減少は、神経学的疾患を示し、一方、ＣＲＰ４０の細胞内発現の増大は、循環器疾患を示す。モータリン−２はまた、同様の診断用途を有することがわかった。
【００１０】
［００１０］したがって、本発明の一態様では、単離されたヒトＣＲＰ４０タンパク質又はその機能的に同等な変異体を提供する。
【００１１】
［００１１］本発明の別の態様では、
ａ）患者から生体サンプルを得るステップと、
ｂ）サンプル中に存在するＣＲＰ４０及びモータリン−２タンパク質の少なくとも一方の量を調べるステップとを含み、非疾患の患者において存在する対照量と比較した、タンパク質量の少なくとも約１０％の減少が神経学的疾患を示す、神経学的疾患を診断する方法を提供する。
【００１２】
［００１２］本発明の別の態様では、
ａ）患者から生体サンプルを得るステップと、
ｂ）サンプル中に存在するＣＲＰ４０及びモータリン−２タンパク質の少なくとも一方の量を調べるステップを含み、非疾患の患者において存在する対照量と比較して、タンパク質量の少なくとも約１０％の増大が循環器疾患を示す患者において、循環器疾患を診断する方法を提供する。
【００１３】
［００１３］本発明の別の態様では、
ａ）患者から生体サンプルを得るステップと、
ｂ）サンプル中に存在するＣＲＰ４０及びモータリン−２タンパク質の少なくとも一方をコードする核酸の量を調べるステップを含み、非疾患の患者において存在する対照量と比較して、ＣＲＰ４０又はモータリン−２核酸量の少なくとも約１０％の減少が疾患を示す、神経学的疾患を診断する方法を提供する。
【００１４】
［００１４］本発明の別の態様では、
ａ）患者から生体サンプルを得るステップと、
ｂ）サンプル中に存在するＣＲＰ４０及びモータリン−２タンパク質の少なくとも一方をコードする核酸の量を調べるステップを含み、非疾患の患者において存在する対照量と比較して、ＣＲＰ４０又はモータリン−２核酸量の少なくとも約１０％の増大が疾患を示す、循環器疾患を診断する方法を提供する。
【００１５】
［００１５］本発明の別の態様では、治療用組成物を提供する。本組成物は、ヒトＣＲＰ４０又はその機能的に同等な変異体を、製薬上有効なアジュバントと組み合わせて含む。
【００１６】
［００１６］別の態様では、神経学的疾患を治療する方法も提供する。本方法は、治療を必要とする哺乳動物に、ＣＲＰ４０又はモータリン−２の少なくとも一方又はそれらの機能的に同等な変異体の治療上有効な量を投与するステップを含む。
【００１７】
［００１７］別の態様では、哺乳動物において循環器疾患を治療する方法も提供する。本方法は、哺乳動物においてＣＲＰ４０及びモータリン−２の少なくとも一方の発現を阻害するステップを含む。
【００１８】
［００１８］本発明の別の態様では、製品を提供する。本製品は、組成物と、組成物を含む包装を含む。本組成物は、ＣＲＰ４０及びモータリン−２の少なくとも一方又はそれらの機能的に同等な断片を、製薬上許容される担体と組み合わせて含む。包装は、組成物が神経学的疾患を治療するのに有効であることを示すようラベルが付けられている。
【００１９】
［００１９］本発明の別の態様では、製品を提供する。本製品は、組成物と、組成物を含む包装を含む。本組成物は、ＣＲＰ４０及びモータリン−２の少なくとも一方又はそれらの機能的に同等な断片を、製薬上許容される担体と組み合わせて含む。包装は、組成物が循環器疾患を治療するのに有効であることを示すようラベルが付けられている。
【００２０】
［００２０］本発明のこれら及びその他の態様は、付随する説明及び図面を参照することにより明らかとなる。
【００２１】
［発明の詳細な説明］
［００２１］本明細書においてヒトＣＲＰ４０又はＣＲＰ４０と呼ばれる、新規に単離されたカテコールアミン調節性タンパク質を提供する。ＣＲＰ４０及びその機能的に同等な変異体を含めたＣＲＰ４０タンパク質は、神経学的疾患の診断におけるバイオマーカーとして、またこのような疾患の治療における治療薬としての両方で有用である。ＣＲＰ４０タンパク質はまた、循環器疾患の診断におけるバイオマーカーとしても有用である。
【００２２】
［００２２］本明細書において、用語「単離された」とは、本質的に純粋で、外来の細胞物質、例えば、その他のタンパク質又はペプチド断片を含まないＣＲＰ４０タンパク質を指すよう用いられる。
【００２３】
［００２３］本明細書において使用される用語「神経学的疾患」とは、統合失調症、双極性疾患及び自閉症などの神経発達疾患並びにパーキンソン病及びアルツハイマー病などの神経変性疾患並びにその他の自己免疫疾患及び遺伝性疾患、例えば、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、ＡＤＨＤ、トゥレット症候群、レット症候群、小児における微細脳機能障害及び関連神経障害及び精神障害を包含するものとする。
【００２４】
［００２４］本明細書において使用される用語「循環器疾患」とは、健常な個体において起こるよりも多い、血小板凝集を伴う疾患、例えば、アテローム性動脈硬化症、肥満症、虚血性低酸素症、狭窄、狭心症、糖尿病及びグルコース調節異常を包含するものとする。
【００２５】
［００２５］ＣＲＰ４０は、３５０個のアミノ酸のカテコールアミン調節性タンパク質であり、その具体的なアミノ酸配列は、図１３Ａに同定されている。ＣＲＰ４０の発現の少なくとも約１０％の減少が神経学的疾患を示すように、哺乳動物においてＣＲＰ４０の発現は、神経学的疾患と反比例して関連している。したがって、ＣＲＰ４０は、神経学的疾患のバイオマーカーとして有用である。さらに、これらの疾患においてこのタンパク質が欠乏していることを考えると、ＣＲＰ４０、ＣＲＰ４０の機能的に同等な変異体及びこれらをコードする核酸はまた、このような疾患の治療において有用である。
【００２６】
［００２６］対照的に、ＣＲＰ４０のレベルの増大、すなわち、健常な個体において通常見られるもの（正常値）よりも高いレベルへのＣＲＰ４０のレベルの増大は、循環器疾患を示す。ＣＲＰ４０のレベルの増大は、血小板凝集をもたらし、これが循環器疾患につながる。したがって、ＣＲＰ４０はまた、循環器疾患のバイオマーカーとしても使用でき、これでは、正常値からの少なくとも約１０％のＣＲＰ４０の増大の検出が心臓血管の状態を示す。
【００２７】
［００２７］モータリン−２又はｍｏｔ−２は、ＣＲＰ４０と関連があることが調べられ、ＣＲＰ４０はモータリン−２のスプライシング変異体である。モータリン−２は、６７９個のアミノ酸を含む。モータリン−２もまた、神経学的疾患のバイオマーカーとしての有用性、循環器疾患の診断において有用な有用性を有し、治療的有用性を有することがわかった。ｍｏｔ−２及びＣＲＰ４０の重複領域は９８％相同であるが、ｍｏｔ−２の診断的及び治療的有用性は、これまでは知られていなかった。この機能的重複を考えると、「ＣＲＰ４０／モータリン−２」とは、ＣＲＰ４０又はモータリン−２のいずれかを指すよう言及される。
【００２８】
［００２８］当業者には当然のことであるが、本明細書では「機能的に同等な変異体」と呼ばれる、ＣＲＰ４０機能を保持し、ひいては、神経学的疾患及び循環器疾患のバイオマーカーとして使用するための、また神経学的疾患の治療のための有用性を保持するＣＲＰ４０又はモータリン−２の修飾された形は、存在する場合もあるし、又は調製できる。変異体は、同一の活性を示す必要はないが、バイオマーカーとして及び／又は治療的使用のために有用であるのに十分な活性を示す。
【００２９】
［００２９］このような修飾は、例えば、転写の際の選択的スプライシングに、又は遺伝暗号の相違に自然に起因し得る。このような変異体は、ＣＲＰ４０／モータリン−２に由来するプライマーを用い、以下の具体的な実施例に、より詳細に記載される確立されたクローニング技術を用いて容易に同定できる。さらに、このような改変は、治療薬として使用するためにより望ましい特徴、例えば、増大した活性又は安定性を有し得る機能的に同等な変異体を提供するためにＣＲＰ４０／モータリン−２に行われる天然に生じない合成的変更に起因する場合もある。ＣＲＰ４０の天然に生じない変異体として、その類似体、断片及び誘導体が挙げられる。
【００３０】
［００３０］本発明に従うＣＲＰ４０／モータリン−２の機能的に同等な類似体は、１個又は複数のアミノ酸置換、付加又は欠失を取り込んでいる。一般に、アミノ酸置換又は欠失は、機能的に同等なペプチドを生じるペプチドのいずれかの末端の末端付加又は欠失であるが、内部のアミノ酸挿入又は欠失を組み込む類似体も本発明の範囲内にある。ＣＲＰ４０／モータリン−２内のアミノ酸置換、特に、保存的アミノ酸置換も、その機能的に同等な類似体を生成し得る。保存的置換の例として、１個の非極性（疎水性）残基、例えば、アラニン、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンの互いの置換；１個の極性（親水性）残基の互いの、例えば、アルギニン及びリジン間、グルタミン及びアスパラギン間、グルタミン及びグルタミン酸間、アスパラギン及びアスパラギン酸間並びにグリシン及びセリン間の置換；１個の塩基性残基、例えば、リジン、アルギニン又はヒスチジンの互いの置換又は１個の酸性残基、例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸の互いの置換が挙げられる。
【００３１】
［００３１］本発明に従う機能的に同等な断片は、ＣＲＰ４０／モータリン−２配列の一部を含む。断片は、ＣＲＰ４０／モータリン−２配列の内部の部分を含む場合もあるし、その末端部分を含む場合もある。
【００３２】
［００３２］本発明に従う機能的に同等なＣＲＰ４０誘導体は、１個又は複数のアミノ酸残基が化学的に誘導体化されているＣＲＰ４０／モータリン−２又はその類似体又は断片である。アミノ酸は、アミノ基若しくはカルボキシ基で誘導体化されている場合もあるし、或いは、その側鎖「Ｒ」基で誘導体化されている場合もある。ペプチド内のアミノ酸の誘導体化は、ペプチドをより望ましい特徴、例えば、増大された安定性又は活性を有するようにすることができる。このような誘導体化された分子として、例えば、アミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基又はホルミル基を形成するよう遊離アミノ基が誘導体化されている分子が挙げられる。遊離カルボキシ基は、例えば、塩、メチル及びエチルエステル又はその他の種類のエステル若しくはヒドラジドを形成するよう誘導体化できる。遊離ヒドロキシル基は、例えば、Ｏ−アシル又はＯ−アルキル誘導体を形成するよう誘導体化できる。ヒスチジンのイミダゾール窒素は、Ｎ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンを形成するよう誘導体化できる。また、誘導体として、１個又は複数の２０種の標準アミノ酸の天然に存在するアミノ酸誘導体を含むペプチドも含まれる。例えば、４−ヒドロキシプロリンは、プロリンと置換され得、５−ヒドロキシリジンがリジンと置換され得、３−メチルヒスチジンがヒスチジンと置換され得、ホモセリンがセリンと置換され得、オルニチンがリジンと置換され得る。化学的及び酵素的分解から保護するためのペプチドの末端修飾としてまた、ペプチドのＮ末端のアセチル化及びＣ末端のアミド化が挙げられる。
【００３３】
［００３３］本発明の診断的態様では、生体サンプル中のＣＲＰ４０／モータリン−２タンパク質（ＣＲＰ４０、モータリン−２又はその天然に存在する変異体）のレベル又はＣＲＰ４０若しくはモータリン−２をコードする核酸のレベルのいずれかを定量するのに適した生体サンプルを得る。この目的上、適した生体サンプルとして、血液（例えば、血小板及びリンパ球）、唾液、尿、精液、毛髪、皮膚及び脳脊髄液が挙げられる。サンプルは、サンプル種のための従来方法を用いて哺乳動物から得る。これらのサンプルの多くは、非侵襲性の方法で容易に得ることができる。脳脊髄液は、脊椎穿刺手順を用いて得る。必要とされる生体サンプルの量は、生体サンプル中のＣＲＰ４０タンパク質又はＣＲＰ４０をコードする核酸の定量を可能にするのに十分でなくてはならない。例えば、ＣＲＰ４０／モータリン−２の定量には、約５μｇのタンパク質という量が通常必要であり、ＣＲＰ４０／モータリン−２核酸定量には約１０ｎｇの核酸が通常必要である。
【００３４】
［００３４］生体サンプル中のＣＲＰ４０／モータリン−２タンパク質含量を定量するために、まず、標準単離及び分画技術、例えば、溶解／遠心分離、沈殿及び例えば、電気泳動及びＨＰＬＣ及びアフィニティーなどのクロマトグラフィーを用いる分離を用いてタンパク質画分を生体サンプルから単離する。次いで、当業者に理解される多くの方法でＣＲＰ４０／モータリン−２の定量を実施する。ＣＲＰ４０／モータリン−２は、分離法を用いて単離し、次いで標準に対して定量できる。ＣＲＰ４０／モータリン−２を同定及び定量するために、例えば、免疫学的技術も、それ自体で、又は分離技術と合わせて使用できる。ＣＲＰ４０／モータリン−２をサンプルから分離するためにＣＲＰ４０／モータリン−２一次抗体をアフィニティーカラムにおいて使用でき、同定目的で検出可能なように標識された二次抗体を使用できる。また、検出可能なように標識された（例えば、蛍光、比色、放射性）ＣＲＰ４０／モータリン−２抗体又は関連化合物を、サンプル中に曝露されたか、又はサンプルから分離され、定量されたＣＲＰ４０／モータリン−２と関連付けることができる。診断法において使用するための抗体を作製する方法を以下に詳述する。
【００３５】
［００３５］別の実施形態では、サンプル内のＣＲＰ４０／モータリン−２核酸の量を測定することによってサンプル中のＣＲＰ４０／モータリン−２を定量できる。例えば、以下の実施例に詳細に記載される既知技術によってｍＲＮＡコピー数を調べることができる。手短には、ｍＲＮＡコピー数は、ＰＣＲ、具体的には、プロトコールにおいてヒトＣＲＰ４０／モータリン−２フォワード及びリバースプライマーを用いて、純粋なＣＲＰ４０／モータリン−２ｍＲＮＡ標準に対する量を調べるためにＣＲＰ４０／モータリン−２ｍＲＮＡを増幅するワンステップリアルタイムＰＣＲプロトコールを用いて決定することができる。
【００３６】
［００３６］哺乳動物から得られた生体サンプル中のＣＲＰ４０／モータリン−２の量を調べ、正常な非疾患状態において存在すると調べられた対照値との比較を行う。ＣＲＰ４０又はモータリン−２タンパク質又は核酸のいずれかの量の、正常からの少なくとも約１０％の減少が、神経学的疾患を示すということが調べられた。ＣＲＰ４０又はモータリン−２タンパク質又は核酸のいずれかの量の、正常からの少なくとも約１０％の増大が、循環器疾患を示す。
【００３７】
［００３７］治療薬として使用するために、本発明に従うＣＲＰ４０／モータリン−２は、標準的な、十分に確立された固相ペプチド合成法（ＳＰＰＳ）を用いて作製することができる。固相ペプチド合成の２つの方法として、ＢＯＣ及びＦＭＯＣ法が挙げられる。
【００３８】
［００３８］ＣＲＰ４０／モータリン−２はまた、組換え技術に基づくいくつかの適した技術のうちいずれか１種を用いて作製できる。当然のことではあるが、このような技術は当業者によって十分に確立されており、遺伝子操作された宿主細胞におけるＣＲＰ４０／モータリン−２をコードする核酸の発現を含む。
【００３９】
［００３９］単離された、ＣＲＰ４０／モータリン−２及び本発明に従うその変異体をコードする核酸も、本発明に包含される。したがって、図１３Ａに示されるアミノ酸配列を有するＣＲＰ４０をコードするＤＮＡ及びＲＮＡを含めた核酸を提供する。当然のことではあるが、遺伝暗号に存在する縮重を考えると、２種以上の核酸配列が、ＣＲＰ４０及びその変異体をコードする。ＣＲＰ４０をコードする配列を図１３Ｂに提供する。モータリン−２のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいて寄託ＡＢＦ５０９７３のもとに示されるとおりであり、ヌクレオチド遺伝子配列は、寄託ＮＭ００４１３４に示されるとおりであり、完全ｃＤＮＡ配列は寄託ＤＱ５３１０４６に示されている。
【００４０】
［００４０］ＣＲＰ４０／モータリン−２タンパク質をコードするＤＮＡは、当技術分野で周知の自動化技術によってｄｅ  ｎｏｖｏ合成できる。通常、遺伝子合成は、自動化シンセサイザーにおける、適宜保護されたヌクレオチド試薬の３’から５’への連続カップリングと、それに続く、脱保護されたポリヌクレオチドの回収によって実施できる。或いは、ＷｏｓｎｉｃｋらＧｅｎｅ、１９８９、７６：１５３に記載されるように、ブロック連結法を使用でき、これによって、最大約８０個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド「ブロック」を、オーバーハング相補性によって連結する。ｄｅ  ｎｏｖｏ合成によって得られた配列は、米国特許第４，６８３，１９５号に記載されるように、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて増幅できる。
【００４１】
［００４１］ＣＲＰ４０又はモータリン−２をコードするＤＮＡを得ると、ＣＲＰ４０又はモータリン−２をコードするＤＮＡからＣＲＰ４０／モータリン−２を製造する組換え技術は、通常、適した発現ベクターへのＤＮＡ配列の挿入、続いて、これを発現のための適当な宿主細胞（例えば、Ｋ１系統のチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ６１）、マウス３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５８）又は２９３系統のヒト胎児腎臓細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５７３）など）へ導入することを含む。このような形質転換された宿主細胞は、本明細書では、それに「発現可能に」組み込まれたＣＲＰ４０  ＤＮＡを有すると特徴付けられている。適した発現ベクターとは、選択された宿主中に挿入されたＤＮＡの発現を駆動するベクターである。通常、発現ベクターは、発現ベクターへのＤＮＡ構築物の部位特異的挿入によって調製する。ＤＮＡ構築物は、選択された宿主にとって天然の遺伝子内、又は宿主にとって感染性のウイルスに由来する遺伝子中のコード領域又はその一部を、ＣＲＰ４０／モータリン−２ＤＮＡで置き換えることによって調製する。この方法では、宿主によって認識される、ＣＲＰ４０／モータリン−２ＤＮＡの発現を制御するために必要な領域、例えば、発現を駆動するためのＰＭＣＡ  ＣＲＰ４０  ＤＮＡの５’領域及び発現を終結するための３’領域が、ＤＮＡ構築物中に内在する。発現ベクターを用いて安定に形質転換された宿主細胞の選択を可能にするために、通常、形質転換体に何らかの生存優位性、例えば、抗生物質耐性を付与する遺伝子の形をとる選択マーカーがベクター中に含まれる。
【００４２】
［００４２］ＣＲＰ４０／モータリン−２ＤＮＡを含有するベクターを用いて安定に形質転換された細胞を、用いた特定の宿主細胞の増殖を促進する増殖条件下、培養培地で増殖させる。当業者ならば、選択した特定の宿主細胞によって必要とされる培地及びその他の増殖条件については、このような情報は当技術分野では十分に立証されているので、熟知している。組換えＣＲＰ４０／モータリン−２タンパク質は、多数の許容される方法のうち任意のもの、例えば、ＣＲＰ４０／モータリン−２に特異的に向けられる抗体を用いるアフィニティーカラム又は免疫原性法の使用によって宿主培養培地から単離し、次いで、当技術分野で周知の技術、例えば、ゲル電気泳動を用いて精製できる。治療的使用には、本発明のオリゴペプチド化合物は、望ましくは「製薬等級の」純度であり、この用語は、本明細書では、ＨＰＬＣで単一のピークとして移動し、その分析で均一の信頼のおけるアミノ酸組成及び配列を示すことがわかっているか、そうでなければ医薬品の品質を規制する種々の国家機関によって設定される基準を満たすオリゴペプチド調製物を表すために用いられる。
【００４３】
［００４３］本発明に従うＣＲＰ４０、モータリン−２及びそれらの機能的変異体は、調製され、適宜精製されると、神経学的疾患を治療するために利用できる。通常、ＣＲＰ４０／モータリン−２タンパク質及び少なくとも１種の製薬上許容されるアジュバントを含む薬剤組成物が用いられる。表現「製薬上許容される」とは、製薬及び獣医学の技術分野において使用するために許容されることを意味し、すなわち許容されない毒性、そうでなければ不適当でないことを意味する。製薬上許容されるアジュバントの例として、ペプチドベースの薬物とともに従来用いられているもの、例えば、希釈剤、賦形剤などがある。一般的な薬物製剤に関する指針については、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」第２１版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、２００５を参照できる。アジュバントの選択は、組成物の意図される投与様式に応じて変わる。本発明の一実施形態では、本化合物は、注入による、又は皮下若しくは静脈内いずれかの注射による投与用に製剤され、したがって、滅菌且つ発熱物質不含の形であり、場合により緩衝されるか、等張にされた水性溶液として利用される。したがって、本組成物は、蒸留水中で、より望ましくは生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水又は５％デキストロース溶液中で投与できる。錠剤、カプセル剤又は懸濁液による経口投与用組成物は、ラクトース、グルコース及びスクロースなどの糖、コーンスターチ及びジャガイモデンプンなどのデンプン、セルロース及びその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロース、粉末トラガカント、モルト、ゼラチン、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、硫酸カルシウム、ピーナッツオイル、綿実油、ゴマ油、オリーブ油及びコーン油などの植物油、プロピレングリコール、グリセリン、ソルビタール（ｓｏｒｂｉｔａｌ）、マンニトール及びポリエチレングリコールなどのポリオール、アガー、アルギン酸、水、等張食塩水及びリン酸バッファー溶液をはじめとするアジュバントを用いて調製する。湿潤剤、ラウリル硫酸ナトリウムなどの潤滑剤、安定化剤、錠剤化剤、抗酸化物質、保存料、着色剤及び矯味剤も存在し得る。局所適用用に、トリグリセリド基剤などの適当な基剤を用いてクリーム剤、ローション剤及び軟膏も調製できる。このようなクリーム剤、ローション剤及び軟膏は、界面活性剤も含み得る。例えば、経鼻送達のためのエアゾール製剤も調製でき、これでは、適した高圧ガスアジュバントが用いられる。どのように投与されるかに関わらず、その他のアジュバントも組成物に加えることができ、例えば、長期の保存期間にわたって微生物の増殖を防ぐために抗菌剤を組成物に加えることができる。
【００４４】
［００４４］本発明に従って、神経学的疾患の治療において、ＣＲＰ４０／モータリン−２タンパク質の治療上有効な量を哺乳動物に投与する。本明細書において使用される場合、用語「哺乳動物」とは、制限するものではないが、ヒト、家畜、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど並びに野生動物を包含するものとする。用語「治療上有効な量」とは、疾患の治療のために指示されるが、重大な副作用を引き起こし得る量を超えないＣＲＰ４０又はモータリン−２タンパク質の量である。ＣＲＰ４０又はモータリン−２タンパク質の投与量は、条件及び治療されている個体をはじめとする多数の因子によって変わる。適当な投与量は、約１μｇ〜１００ｍｇの範囲にあると期待される。
【００４５】
［００４５］本発明の別の態様では、製品を提供する。本製品は、包装材料及び薬剤組成物を含む。本組成物は、製薬上許容されるアジュバントと、治療上有効な量のＣＲＰ４０又はモータリン−２タンパク質とを含み、包装材料は組成物が神経学的疾患を治療するのに有効であることを示すようラベルが付けられている。
［００４６］包装材料は、医薬品を包装するために一般に用いられる任意の適した材料、例えば、ガラス、プラスチック、ホイル及びボール紙などであり得る。
【００４６】
［００４７］本発明の別の態様では、ＣＲＰ４０タンパク質に対する抗体も提供する。上記のように、抗体は、本発明の診断法において有用である。従来法を用いて、ポリクローナル抗血清又はモノクローナル抗体を含めた抗体を調製できる。ポリクローナル抗体を作製するために、哺乳動物（例えば、マウス、ハムスター又はウサギ）を、哺乳動物において抗体反応を引き出すタンパク質の免疫原性型で免疫化することができる。ペプチドに免疫原性を付与する技術は、当技術分野ではよく知られており、例えば、担体との結合が挙げられる。ペプチドは、アジュバントの存在下で投与できる。免疫化の進行は、血漿又は血清中の抗体価の検出によってモニターできる。標準ＥＬＩＳＡ又はその他のイムノアッセイ手順を、抗原として免疫原を用いて使用し、抗体値を評価できる。免疫化後、抗血清を得ることができ、必要に応じて、血清からポリクローナル抗体を単離できる。
【００４７】
［００４８］モノクローナル抗体を作製するために、免疫化された動物から抗体産生細胞（リンパ球）を回収し、標準体細胞融合手順によって骨髄腫細胞と融合して不死ハイブリドーマ細胞を形成する。このような技術（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６、４９５〜４９７頁（１９７５））によって最初に開発されたハイブリドーマ技術）並びにヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ４、７２（１９８３））、ヒトモノクローナル抗体を作製するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９８５）Ａｌｌｅｎ  Ｒ．Ｂｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、７７〜９６頁）及びコンビナトリアル抗体ライブラリーのスクリーニング（Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６、１２７５（１９８９））などのその他の技術）は、当技術分野ではよく知られている。ハイブリドーマ細胞は、選択されたＣＲＰ４０ペプチドと特異的に反応する抗体の産生について免疫化学的にスクリーニングでき、モノクローナル抗体を単離できる。
【００４８】
［００４９］本明細書において使用される用語「抗体」とは、本発明のＣＲＰ４０タンパク質と同様に特異的に反応するその断片を含むものとする。抗体は、従来技術を用いて断片化し、断片を上記と同様の方法でその有用性についてスクリーニングできる。例えば、断片は、抗体をペプシンで処理することによって作製できる。得られた断片をさらに処理してジスルフィド架橋を還元することができる。
【００４９】
［００５０］キメラ抗体誘導体、すなわち、可変非ヒト動物ペプチド領域及び定常ヒトペプチド領域の組合せに起因する抗体分子も、本発明の範囲内に考慮される。キメラ抗体分子は、例えば、マウス、ラット又はその他の種の抗体に由来する抗原結合ドメインを定常ヒトペプチド領域とともに含み得る。従来法を用いて、本発明のＣＲＰ４０タンパク質を認識する免疫グロブリン可変領域を含むキメラ抗体を作製できる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１、６８５１（１９８５）；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４、４５２（１９８５）、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｂｏｓｓら、米国特許第４，８１６，３９７号；Ｔａｎａｇｕｃｈｉら、欧州特許公報ＥＰ１７１４９６；欧州特許公報０１７３４９４、英国特許ＧＢ２１７７０９６Ｂ参照のこと）。
【００５０】
［００５１］本明細書に記載される本発明のＣＲＰ４０タンパク質と特異的に反応するモノクローナル又はキメラ抗体は、抗原結合ドメインの可変領域、特に保存されたフレームワーク領域の一部がヒト起源であり、超可変領域のみが非ヒト起源であるヒト定常領域キメラを作製することによって、さらにヒト化できる。このような免疫グロブリン分子は、当技術分野で公知の技術によって作製できる（例えば、Ｔｅｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８０、７３０８〜７３１２頁（１９８３）；Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、４、７２７９（１９８３）；Ｏｌｓｓｏｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、９２、３〜１６頁（１９８２））及びＰＣＴ国際公開第９２／０６１９３号パンフレット又はＥＰ０２３９４００）。ヒト化抗体はまた、商業的に製造され得る（Ｓｃｏｔｇｅｎ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、２  Ｈｏｌｌｙ  Ｒｏａｄ、Ｔｗｉｃｋｅｎｈａｍ、Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ、Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎ）。
【００５１】
［００５２］ＣＲＰ４０又はモータリン−２をコードする核酸分子又はオリゴヌクレオチドはまた、神経学的疾患を治療する遺伝子治療法において使用できる。ＣＲＰ４０／モータリン−２をコードするオリゴヌクレオチドの、このような疾患を患う患者への投与は、細胞ＣＲＰ４０／モータリン−２を高め、それによって疾患の症状の少なくとも一部を軽減するよう機能する。
【００５２】
［００５３］用語「オリゴヌクレオチド」とは、天然に存在する塩基、糖及び糖間（骨格）結合からなるヌクレオチド又はヌクレオシドモノマーのオリゴマー又はポリマーを指す。この用語はまた、天然に存在しないモノマー又はその一部を含むが同様に機能する、修飾されたか、置換されたオリゴヌクレオチドも含む。このような修飾されたか、置換されたオリゴヌクレオチドは、増強された細胞取り込み又はヌクレアーゼの存在下での高められた安定性などの特性のために、天然に存在する形を上回って好ましい場合がある。この用語はまた、２つ以上の化学的に別個の領域を含むキメラオリゴヌクレオチドを含む。例えば、キメラオリゴヌクレオチドは、有益な特性（例えば、高められたヌクレアーゼ耐性、高められた細胞への取り込み）を付与する修飾されたヌクレオチドの少なくとも１つの領域を含む場合もあるし、又は本発明の２つ以上のオリゴヌクレオチドを連結してキメラオリゴヌクレオチドを形成してもよい。
【００５３】
［００５４］本発明の治療用オリゴヌクレオチドは、リボ核酸又はデオキシリボ核酸であり得、天然に存在する塩基、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン及びウラシルを含み得る。オリゴヌクレオチドはまた、修飾された塩基、例えば、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル、２−プロピル及びその他のアルキルアデニン、５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、６−アザチミン、シュードウラシル、４−チオウラシル、８−ハロアデニン、８−アミノアデニン、８−チオールアデニン、８−チオールアルキルアデニン、８−ヒドロキシルアデニン及びその他の８−置換アデニン、８−ハログアニン、８−アミノグアニン、８−チオールグアニン、８−チオールアルキルグアニン、８−ヒドロジル（ｈｙｄｒｏｄｙｌ）グアニン及びその他の８−置換グアニン、その他のアザ及びデアザウラシル、チミジン、シトシン、アデニン又はグアニン、５−トリ−フルオロメチルウラシル及び５−トリフルオロシトシンを含み得る。
【００５４】
［００５５］本発明のその他の治療用オリゴヌクレオチドは、修飾されたリン酸、リン酸骨格中の酸素へテロ原子、短鎖アルキル又はシクロアルキル糖間結合又は短鎖へテロ原子若しくは複素環糖間結合を含み得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート及びホスホロジチオエートを含み得る。例えば、ホスホロチオエート結合は、４〜６個の３’末端塩基しか結合しない場合もあるし、すべてのヌクレオチドと結合する場合もあるし、１対の塩基しか結合しない場合もある。
【００５５】
［００５６］本発明の治療用オリゴヌクレオチドはまた、治療用又は実験用試薬としてより適している可能性があるヌクレオチド類似体を含み得る。本発明に従うオリゴヌクレオチド類似体の例として、ＤＮＡ（又はＲＮＡ）中のデオクスリボース（ｄｅｏｘｒｉｂｏｓｅ）（又はリボース）リン酸骨格が、ペプチド中に見られるものと同様のポリミド（ｐｏｌｙｍｉｄｅ）骨格で置換されているペプチド核酸（ＰＮＡ）がある（Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１、２５４、１４９７）。ＰＮＡ類似体は、酵素による分解に対して耐性であり、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて長い寿命を有することがわかっている。ＰＮＡはまた、ＰＮＡ鎖とＤＮＡ鎖の間の電荷斥力がないために、相補ＤＮＡ配列とより強い結合を形成する。その他のオリゴヌクレオチド類似体は、ポリマー骨格、環状骨格又は非環状骨格を含むヌクレオチドを含み得る。例えば、ヌクレオチドは、モルホリノ骨格構造を有し得る（米国特許第５，０３４，５０６号）。オリゴヌクレオチド類似体はまた、レポーター基、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改良する基又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良する基などの基を含み得る。当業者には当然であろうが、アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、糖模倣物を組み込むことができる。
【００５６】
［００５７］核酸分子は、先に記載された当技術分野で公知の手順を用い、化学合成及び酵素的連結反応を用いて構築できる。本発明の核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド又は分子の生物学的安定性を高めるよう、若しくはｍＲＮＡ若しくは天然の遺伝子とともに形成された二本鎖の物理的安定性を高めるよう設計された、さまざまに修飾されたヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチドを用いて化学合成できる。ＣＲＰ４０／モータリン−２は、ＣＲＰ４０／モータリン−２配列が高効率調節領域の制御下で産生される、組換えプラスミド、ファージミド又は弱毒化ウイルスの形で細胞に導入される発現ベクターを用いて生物学的に製造でき、その活性は、ベクターが導入される細胞種によって決まり得る。
【００５７】
［００５８］オリゴヌクレオチドは、ひとたび調製すると、当技術分野の技術、例えば、ベクター（レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びＤＮＡウイルスベクター）又はマイクロインジェクションなどの物理的技術を用いて組織又は細胞に導入できる。オリゴヌクレオチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏに直接投与してもよいし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞をトランスフェクトし、次いで、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与するために用いることもできる。
【００５８】
［００５９］循環器疾患の治療では、病的状態をもたらす血小板凝集の出現を減少させるためにＣＲＰ４０／モータリン−２の発現をダウンレギュレートすることが望ましい。当業者には当然であろうが、ＣＲＰ４０／モータリン−２発現は、タンパク質又は核酸レベルのいずれかで阻害できる。具体的な実施例に詳細に記載されるように、ＣＲＰ４０又はモータリン−２の合成阻害剤は、例えば、ＣＲＰ４０活性の減少を検出するよう設計されたアッセイ、例えば、血小板凝集についてのフローサイトメトリーを用いて調べることができる。
【００５９】
［００６０］ＣＲＰ４０及びモータリン−２はまた、例えば、アンチセンス、ｓｎｐ又はｓｉＲＮＡ技術を用いて核酸レベルで阻害できる。ＣＲＰ４０／モータリン−２をコードする核酸分子を用いて、ＣＲＰ４０又はモータリン−２を阻害するために治療的に有用であり得るＣＲＰ４０／モータリン−２に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを調製できる。したがって、本発明のＣＲＰ４０／モータリン−２をコードする核酸配列に対して相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドも提供する。本明細書において使用される用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、標的ＣＲＰ４０又はモータリン−２核酸配列に対して相補的であるヌクレオチド配列を意味する。
【００６０】
［００６１］用語「オリゴヌクレオチド」とは、天然に存在する塩基、糖及び糖間（骨格）結合からなるヌクレオチド又はヌクレオシドモノマーのオリゴマー又はポリマーを指す。この用語はまた、天然に存在しないモノマー又はその一部を含むが同様に機能する、修飾されたか、置換されたオリゴマーも含む。このような修飾されたか、置換されたオリゴヌクレオチドは、増強された細胞取り込み又はヌクレアーゼの存在下での高められた安定性などの特性のために、天然に存在する形を上回って好ましい場合がある。この用語はまた、２つ以上の化学的に別個の領域を含むキメラオリゴヌクレオチドを含む。例えば、キメラオリゴヌクレオチドは、有益な特性（例えば、高められたヌクレアーゼ耐性、高められた細胞への取り込み）を付与する修飾されたヌクレオチドの少なくとも１つの領域を含む場合もあるし、又は本発明の２つ以上のオリゴヌクレオチドを連結してキメラオリゴヌクレオチドを形成してもよい。
【００６１】
［００６２］本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボ核酸又はデオキシリボ核酸であり得、天然に存在する塩基、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン及びウラシルを含み得る。オリゴヌクレオチドはまた、修飾された塩基、例えば、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル、２−プロピル及びその他のアルキルアデニン、５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、６−アザチミン、シュードウラシル、４−チオウラシル、８−ハロアデニン、８−アミノアデニン、８−チオールアデニン、８−チオールアルキルアデニン、８−ヒドロキシルアデニン及びその他の８−置換アデニン、８−ハログアニン、８−アミノグアニン、８−チオールグアニン、８−チオールアルキルグアニン、８−ヒドロジル（ｈｙｄｒｏｄｙｌ）グアニン及びその他の８−置換グアニン、その他のアザ及びデアザウラシル、チミジン、シトシン、アデニン又はグアニン、５−トリ−フルオロメチルウラシル及び５−トリフルオロシトシンを含み得る。
【００６２】
［Ｏ０６３］本発明のその他のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾されたリン酸、リン酸骨格中の酸素へテロ原子、短鎖アルキル又はシクロアルキル糖間結合又は短鎖へテロ原子若しくは複素環糖間結合を含み得る。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート及びホスホロジチオエートを含み得る。例えば、ホスホロチオエート結合は、４〜６個の３’末端塩基しか結合しない場合もあるし、すべてのヌクレオチドと結合する場合もあるし、１対の塩基しか結合しない場合もある。
【００６３】
［００６４］本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、治療用又は実験用試薬としてより適している可能性があるヌクレオチド類似体を含み得る。オリゴヌクレオチド類似体の例として、ＤＮＡ（又はＲＮＡ）中のデオクスリボース（ｄｅｏｘｒｉｂｏｓｅ）（又はリボース）リン酸骨格が、ペプチド中に見られるものと同様のポリミド（ｐｏｌｙｍｉｄｅ）骨格で置換されているペプチド核酸（ＰＮＡ）がある（Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１、２５４、１４９７）。ＰＮＡ類似体は、酵素による分解に対して耐性であり、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて長い寿命を有することがわかっている。ＰＮＡはまた、ＰＮＡ鎖とＤＮＡ鎖の間の電荷斥力がないために、相補ＤＮＡ配列とより強い結合を形成する。その他のオリゴヌクレオチド類似体は、ポリマー骨格、環状骨格又は非環状骨格を含むヌクレオチドを含み得る。例えば、ヌクレオチドは、モルホリノ骨格構造を有し得る（米国特許第５，０３４，５０６号）。オリゴヌクレオチド類似体はまた、レポーター基、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改良する基又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良する基などの基を含み得る。当業者には当然であろうが、アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、糖模倣物を組み込むことができる。
【００６４】
［００６５］アンチセンス核酸分子は、提供されたものなどのＣＲＰ４０アミノ酸配列情報に基づいて、当技術分野で公知の手順を用い、化学合成及び酵素的連結反応を用いて構築できる。本発明のアンチセンス核酸分子、又はその断片は、天然に存在するヌクレオチド又は分子の生物学的安定性を高めるよう、若しくはｍＲＮＡ若しくは天然の遺伝子とともに形成された二本鎖の物理的安定性を高めるよう設計された、さまざまに修飾されたヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチドを用いて化学合成できる。アンチセンス配列は、アンチセンス配列が高効率調節領域の制御下で産生される、組換えプラスミド、ファージミド又は弱毒化ウイルスの形で細胞に導入される発現ベクターを用いて生物学的に製造でき、その活性は、ベクターが導入される細胞種によって決まり得る。
【００６５】
［００６６］アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当技術分野の技術、例えば、ベクター（レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びＤＮＡウイルスベクター）又はマイクロインジェクションなどの物理的技術を用いて組織又は細胞に導入できる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏに直接投与してもよいし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞をトランスフェクトし、次いで、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与するために用いることもできる。
【００６６】
［００６７］別の実施形態では、ｓｉＲＮＡ技術を、ＣＲＰ４０又はモータリン−２の発現を防ぐために適用できる。ＣＲＰ４０／モータリン−２中の領域に対応し、ＣＲＰ４０／モータリン−２遺伝子を選択的に標的とするｓｉＲＮＡ断片などの核酸断片の適用を用いて、ＣＲＰ４０／モータリン−２発現をブロックし、血小板凝集の減少をもたらすことができる。このようなブロッキングは、ｓｉＲＮＡ断片がＣＲＰ４０／モータリン−２遺伝子と結合し、それによって機能的ＣＲＰ４０／モータリン−２を生じる遺伝子の翻訳を妨げる場合に起こる。
【００６７】
［００６８］ＣＲＰ４０／モータリン−２に対応するＳｉＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ分子は、自動化システムを含む核酸合成の十分に確立された方法を用いて作製する。ＣＲＰ４０／モータリン−２遺伝子の構造は公知であるので、それに対応するＲＮＡの断片は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関して上記に概説したように、容易に作製できる。ＣＲＰ４０／モータリン−２活性をブロックするよう選択したｓｉＲＮＡの有効性は、ＣＲＰ４０／モータリン−２を発現する細胞株を用いて確認できる。手短には、選択されたｓｉＲＮＡを、適当な増殖条件下でＣＲＰ４０／モータリン−２を発現する細胞株とともにインキュベートする。ｓｉＲＮＡがＣＲＰ４０／モータリン−２ＤＮＡと結合し、ＣＲＰ４０／モータリン−２ＤＮＡの発現の減少をもたらすのに十分な反応時間の後、反応混合物を、このような発現の減少が起こったかどうかを調べるために試験する。適したｓｉＲＮＡは、機能的ＣＲＰ４０／モータリン−２を生じるためのＣＲＰ４０／モータリン−２遺伝子のプロセシングを妨げる。これは、反応混合物中のＣＲＰ４０／モータリン−２機能、例えば、ＣＲＥＢ活性を評価することによって検出できる。
【００６８】
［００６９］当業者には当然のことながら、本方法において有用なｓｉＲＮＡ断片は、ＣＲＰ４０又はモータリン−２をコードする核酸の特定の領域から導くことができる。さらに、適した修飾として、例えば、１個又は複数のヌクレオチド塩基の付加、欠失又は置換が挙げられ、ただし、修飾されたｓｉＲＮＡは、標的とされるＣＲＰ４０／モータリン−２遺伝子と結合するその能力を保持する。選択したｓｉＲＮＡ断片は、使用するのにより望ましい断片を生じるよう、さらに修飾できる。例えば、ｓｉＲＮＡ断片は、アンチセンスオリゴヌクレオチドについて記載されたものと同様の方法で安定性の増大を達成するよう修飾できる。
【００６９】
［００７０］本発明の実施形態は、制限とは考えられない、以下の具体的な実施例を参照して記載される。
【００７０】
［００７１］以下の実験研究は、用いた方法及び材料を参照して、並びに得られた結果を参照して記載されている。
【実施例】
【００７１】
実施例１−ヒトＣＲＰ４０の特性決定
方法及び材料
ＭＯＢＩＸ、マクマスター大学（ＭｃＭａｓｔｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）によって合成されたＢＱ２２４１９３プライマーの作製：
［００７２］ヒト脳ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ）を、ＭｕＬＶ逆転写酵素（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて逆転写し、ＭＯＢＩＸ、マクマスター大学によって設計された、５’ａｔｇ  ｇａｔ  ｔｃｔ  ｔｃｔ  ｇｇａ  ｃｃｃ  ａａｇ  ｃａｔ３’（センスプライマー、配列番号３）及び５’ｔｃｇ  ｔｔｃ  ｃｔｔ  ｃｔｔ  ｔｇｇ  ｃｃｇ  ｇｔｔ  ｔｔｔ  ｔ３’（アンチセンスプライマー、配列番号４）を用いて７２０塩基対の断片（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＢＱ２２４１９３）を増幅した。用いた条件は、９５℃、２．２５分（ｍｉｎ）、９５℃−１５秒、６０℃−３０秒、７２℃−５５秒、４０サイクル７２℃−７．０分とした。ＰＣＲ産物を、１×ＴＡＥ及び０．０５％エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）を含む１％アガロースゲルに流した。１００ｂｐマーカー（Ｂｉｏｒａｄ）に対する７２０のバンドを切り出し、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キットを用いて精製し、配列決定した。
【００７２】
ＢＱ２２４１９３クローニング
［００７３］クローニングを容易にするために、Ｂａｍ  Ｈ１及びＥｃｏＲ１制限酵素部位を、センス及びアンチセンスプライマーの５’にそれぞれ導入した。その後のＲＴ−ＰＣＲ及び産物の解析により、７４０ｂｐの断片が示され、これを上記のようにアガロースゲルから精製した。ＰＧＥＸ−２Ｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び７４０ｂｐ断片を、以下のとおりの制限酵素を用いて消化し：０．５μｇ（１μｌの５００μｇ／μｌ）ベクター、４．０μｌの１０×Ｙ＋／Ｔａｎｇｏバッファー、１．０μｌ  ＢａｍＨ１（５Ｕ）、ＥｃｏＲ１、１．０μｌ（５．０Ｕ）、１３．０μｌ  ＤＨ２Ｏ、３２μｌ  ＢＱ２２４１９３−７４０ｂｐ断片（０．６μｇ）、８μｌ  １０×Ｙ＋／Ｔａｎｇｏバッファー、２．０μｌ  ＢａｍＨ１（１０Ｕ）、２．０μｌ  ＥｃｏＲ１（１０Ｕ）、混合し、３７℃で１時間（ｈ）インキュベートし、７５℃、１５分で酵素を不活化した。消化したベクター及びヒトＣＲＰ４０断片を、０．０５％ＥｔＢｒを含む０．７％アガロースゲルに流し、別のレーンにマーカーとして１ＫＢラダーを用いた。１．８Ｋｂ及び７４０ｂｐのバンドを別個に切り出し、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。７４０ｂｐ断片を、以下のとおりＰＧＥＸ−２Ｔベクターに連結した：切り出した７４０ｂｐ  ＢＱ２２４１９３  ＤＮＡ、１４．０μｌ、切り出したｐＧＥＸ−２Ｔ、２．０μｌ、１０×リガーゼバッファー、２．０μｌ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を混合し、２２℃で１時間インキュベートし、６５℃で１０分間酵素を不活化した。産物を−２０℃で形質転換まで凍結した。
【００７３】
ＢＬ２１大腸菌細胞の調製及び形質転換
［００７４］コンピテント細胞を以下のとおりに調製した。ＢＬ−２１大腸菌（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）リフォライズド（ｌｙｐｈｏｌｉｚｅｄ）粉末を、シェーカーに入れた１．０ｍｌのＬＢ培地中、３７℃、２５０ｒｐｍで一晩再懸濁した。次いで、大腸菌を、ＬＢアガープレート上にプレーティングした。２４時間インキュベートした後、シングルコロニーを用いて１ｍｌのＬＢを１５ｍｌのファルコンチューブに播種し、３７℃、２５０ｒｐｍで一晩インキュベートした（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ．Ｉｎｃ，Ｓｅｒｉｅｓ  ２５Ｄ）。１８時間インキュベートした後、１００ｍｌのＬＢ培地に２００μｌの一晩培養物を播種し、３７℃、２００ｒｐｍでＯＤ６００が０．４〜０．５まで（約３．５時間）インキュベートした。培養物を２０００ｒｐｍで５分間沈降させ、１．０ｍｌのＣａＣｌ２溶液（５０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ８．０）及び２４ｍｌのＣａＣｌ２溶液にペレットを再懸濁した。次いで、この溶液を氷上で１５分間インキュベートし、２０００ｒｐｍで５分間沈降させ、ペレットを３ｍｌのＣａＣｌ２溶液に再懸濁した。その後の形質転換には新たなコンピテント細胞を用いた。形質転換：２０μｌの連結した混合物を、２００μｌのコンピテント細胞と混合し、氷上で４５分間、次いで、４２℃の水浴中で２分間インキュベートし、氷上で短期間に冷却した。形質転換された細胞（１００μｌ）を、９００μｌのＬＢＧ（ＬＢ培地中、２０ｍＭグルコース）と混合し、振盪せずに３７℃で１時間インキュベートした。切断されていないベクターも並行して形質転換した。１時間後、ＢＱによって形質転換された細胞１００μｌ、切断していないベクターによって形質転換された細胞１００μｌ及びコンピテント細胞を、アンピシリンを含むＬＢアガープレートにプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。
【００７４】
ＢＱタンパク質の調製：
［００７５］翌日、コロニーを選び取り、播種し（１．５ｍｌエッペンドルフチューブ）、シェーカー（２５０ｒｐｍ）上に置き、翌日、３．０ｍｌのＬＢアンピシリン培地を、５０μｌの、ＯＤ６００が０．５となるまで一晩増殖させた培養物と混合した。各チューブにＩＰＴＧ（１００ｍＭ）を加え、次いで、これを１４℃で２２時間インキュベートし、１３０００ｒｐｍで３０秒間沈降させた。上清を破棄した。ペレットを３００μｌの１×ＰＢＳに再懸濁し、１３０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離した。次いで、１×ＰＢＳで２回洗浄した。ビーズにグルタチオン溶出バッファー（１０μｌ）を加え、５分間インキュベートし、１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を新しいチューブに移し、それに１０μｌのローディングバッファーを加えた。上記の画分のすべてをＳＤＳ−ＰＡＧＥでロードした。
【００７５】
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
［００７６］ブラッドフォード法を用いてタンパク質濃度を調べた。手短には、１０μｇのタンパク質を、サンプルバッファー（０．６２５Ｍ  Ｔｒｉｓ、２％ＳＤＳ、０．０５％β−メルカプトエタノール、１０％グリセロール、０．０１％ブロモフェノールブルー、ｐＨ６．８）と混合し、４分間沸騰させた（Ｂｒａｄｆｏｒｄ  １９７６）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％アクリルアミド）を、以下の手順で用いた：ランニングバッファー（０．０２５Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．３、０．３Ｍグリシン、０．１％ＳＤＳ）及び６５Ｖを適用した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために、ペレットを２０μｌの１×ＰＢＳに再懸濁した。上清を、５０μｌの５０％グルタチオンセファロース４Ｂと室温で５分間混合した。１００μｌの１×−ＰＢＳを加え、次いで、混合物を１３０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離した。ペレットを１×−ＰＢＳで２回洗浄し、ビーズにグルタチオン溶出バッファー（１０μｌ）を加え、５分間インキュベートし、１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。最後に、上清を新たなチューブに移し、１０μｌのローディングバッファーを加えた。次いで、上記の画分のすべてをＳＤＳ−ＰＡＧＥでロードした。
【００７６】
ＢＱ融合タンパク質を用いるポリクローナル抗体の作製
［００７７］０．５μｇの純粋なＢＱタンパク質を、１０％アクリルアミドゲルの各レーンに流し、ニトロセルロースフィルターペーパーに移した（２６μｇ／ｃｍ２という結合能）。ポンソー−Ｓ染色されたＢＱバンドを切り出し、−２０℃で保存した。約３０μｇのＢＱタンパク質をホモジナイズし、最初の注射に要した。２匹のニュージーランドウサギを用い、以下のプロトコールを用いた：注射後、０、１４、４２、１３４日に、ＢＱスラリーを襟首に、４箇所の注射部位（各注射部位に２５０μｇ）で皮下（ｓ．ｃ．）注射し、１３、３２、５０、８９及び１４６日に出血を実施した。各ウサギから約１００ｍｌの血液を採取し、血清を採取し、遠心分離し、アリコートに０．２％のアジ化ナトリウムを加えた。
【００７７】
ＢＱ抗体の精製
［００７８］Ｓｉｇｍａ製のプロテインＡ抗体精製キットを用いた。手短に記載する。抗体精製には１０ｍｌの粗ＢＱ血清を用いた。カラムから１．０ｍｌの１０画分を集め、ＯＤ２８０ｎＭを調べ、精製したＢＱ抗体をアリコートに分け、−８０℃で保存した。
【００７８】
機能研究−タンパク質結合アッセイ
［００７９］非放射性ドーパミン（ＤＡ）の存在下、ＢＱ融合タンパク質を用いて、トリチウム化Ｎ−プロピルノルアポモルフィン（［３Ｈ］−ＮＰＡ）結合を実施した。手短には、アッセイを３連で実施し、以下の溶液及びプロトコールからなっていた：５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、５．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１００ｍｇ／ｍｌバシトラシン及び５．０ｍｇ／ｍｌダイズトリプシン；ＤＡ（ｍｗ＝１８９．６）を、０．１％アスコルビン酸に溶解し；各試験管を短時間ボルテックス処理し、振盪水浴中３７℃で２時間インキュベートし；受容体結合装置（Ｂｒａｎｄｅｌ、米国）を蒸留水で３回洗浄し；次いで、アッセイバッファー、５０ｎＭ  ＴＲＩＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ７．４での洗浄を繰り返し；１８本の試験管を結合プラットフォームにセットし、ガラス繊維濾紙をプラットフォーム上に置いた。サンプルを濾紙に通し、３連続洗浄を行い；シンチレーションチューブ中に入れ、５．０ｍｌの生分解性カウンティングシンチラント（Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）を加え、放射能カウントを測定した（Ａｍｅｒｓｈａｍ，米国）。
【００７９】
ＤＲＤ２でトランスフェクトされたＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽細胞腫細胞に関する研究
［００８０］この研究に用いたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞株（ＡＴＣＣから入手）は、十分に特性決定されている。この細胞株は、内因性ドーパミン受容体を発現せず、したがって、以下の方法を用いて細胞をドーパミンＤ２の長いアイソフォームでトランスフェクトした。Ｇｕｔｈｒｉｅ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｃｅｎｔｒｅ（ペンシルバニア、米国）によって寛大にも提供された、ドーパミンＤＲＤ２受容体を、哺乳動物発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１（＋））にサブクローニングした。このプラスミドＤＮＡを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＴＯＰＯ１０化学的コンピテント大腸菌を用いて大量に調製した。手短には、１コロニーを、５ｍｌのＬＢアンピシリンとともに播種し、３７℃、２５０ｒｐｍで８時間インキュベートした。培養物（０．５ｍｌ）を、５００ｍｌフラスコに入れた２５０ｍｌのＬＢアンピシリンに移し、３７℃、振盪機単位（２７５ｒｐｍ、２４時間）でインキュベートした（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ．Ｉｎｃ、Ｓｅｒｉｅｓ２５Ｄ）。培養物を回収し、移し、遠心分離し、残存するペレットを、先に記載されたようにＤＮＡの抽出のために処理した（ＱＩＡＧＥＮプラスミド精製プロトコール）。ＤＮＡをスペクトロホメトリー（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｒｙ）（Ｂｅｃｋｍａｎ６４０）によって定量し、アリコートに分け、−８０℃で保存した。
【００８０】
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞のトランスフェクション
［００８１］ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターを、リポフェクション法によってＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に導入した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．米国）。手短には、２４μｇのＤＲＤ２プラスミドＤＮＡを、１．５ｍｌのＯｐｔｉ  ＭＥＭ培地と混合し、６０μｌのリポフェクタミン２０００試薬を加え、１．５ｍｌのＯｐｔｉ  ＭＥＭ培地及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞と混合した。Ｄ２Ｌ受容体を安定に発現するジェネテイシン耐性クローンを、［３Ｈ］スピレロン（ｓｐｉｒｅｒｏｎｅ）結合アッセイによってスクリーニングし、２００μｇ／ｍｌのジェネテイシンを含むＲＰＭＩ培地（１０％胎児ウシ血清、１ｍＭ  グルタミン酸、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン及び５０Ｕ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ）で維持した。細胞を、新たなＲＰＭＩ培地においてコンフルエンスに増殖させた（サブクローニング後５〜６日）。
【００８１】
細胞成分画分：核、ミトコンドリア、上清（サイトゾル）のホモジナイズ
［００８２］ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を削り取り、この手順を２回繰り返した。細胞を５分間インキュベートし、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を破棄した。ペレットを０．５ｍｌの０．３５Ｍスクロースバッファー（ｗＰＭＳＦ）に再懸濁し、ホモジナイズし、１０００ｇで１０分間遠心分離した。上清を遠心分離し、ペレットを０．３２Ｍのスクロースバッファー（ｗＰＭＳＦ）に再懸濁し、ホモジナイズし、遠心分離した。ペレットを０．０５３ｍｌのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ  ＰＭＳＦに再懸濁し、核画分１と名づけた。上清を遠心分離し、得られた上清を保存し、サイトゾル画分１と名づけた。残ったペットを、０．１５０ｍｌのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ−ＰＭＳＦに再懸濁し、ミトコンドリア画分１と名づけた。
【００８２】
［００８３］各細胞画分を、１）１００μＭのＤＡ、２）１００μＭのハロペリドール、３）１００μＭのＤＡと１００μＭのハロペリドールの両方、４）負の対照に曝露した。細胞を神経伝達物質及び／又は神経遮断薬（抗精神病薬）に曝露し、一晩静置した。ＢＱ一次抗体を用いるウェスタンイムノブロッティングを実施し、続いて、ホースラディッシュペルオキシダーゼが結合したポリクローナル二次抗体を用いてイムノブロッティングを行った。
【００８３】
５’及び３’ｃＤＮＡ末端のＲＮＡリガーゼ媒介性迅速増幅（ＲＬＭ−ＲＡＣＥ  ＰＣＲ）
［００８４］ヒト脳由来の全ＲＮＡは、Ａｍｂｉｏｎから購入し、ＢＱ遺伝子特異的プライマーを増幅するためのｃＤＮＡライブラリーとして用いた。ＲＬＭ−ＲＡＣＥ−ＰＣＲキットは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア、米国）から購入した。まず、ヒト脳全ＲＮＡをウシ腸ホスファターゼで処理して、末端切断されたｍＲＮＡ及びすべてのその他の非ｍＲＮＡから５’リン酸を除去した。手短には、２．５μｌの全ＲＮＡ、１．０μｌの１０×ＣＩＰバッファー、１．０μｌのＲＮａｓｅ  ｏｕｔ、１．０μｌのＣＩＰ酵素及び４．５μｌのＤＥＰＣ水を、１．０μｌの微量遠心管中で混合し、ボルテックス処理し、遠心分離し、５０℃の水浴中で１時間インキュベートし、次いで、遠心分離し、氷上に置き、ＲＮＡを沈殿させ、９０μｌのＤＥＰＣ水及び１００μｌのフェノール：クロロホルムを加え、３０秒間ボルテックス処理し、ＲＴで５分間遠心分離し、移した水相に、１０ｍｇ／ｍｌムール貝グリコーゲン２μｌ及び３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２、１０μｌを加え、続いて、混合した。次いで、２２０μｌの９５％エタノールを加え、続いて、ボルテックス処理した。混合物をドライアイス上に１０分間置き、遠心分離し、上清を除去した。次いで、５００μｌの７０％エタノールを加えてＲＮＡペレットを可溶化した。次いで、溶液を４℃で２分間遠心分離した。上清を除去し、ペレットを７μｌのＤＥＰＣ水に再懸濁した。含まれる次の主要なステップは、脱リン酸化されたＲＮＡを、タバコ酸性ピロホスファターゼで処理して、全長ｍＲＮＡから５’キャップ構造を除去することであった。手短には、７μｌの脱リン酸化ＲＮＡ、１μｌの１０×ＴＡＰバッファー（４０Ｕ／μｌ）、１μｌのＲＮａｓｅＯｕｔ、１μｌ  ＴＡＰ（０．５ｕ／μｌ）を加え、混合し、ボルテックス処理し、遠心分離し、３７℃で１時間インキュベートした。上記の沈殿手順を正確に反復した。ｍＲＮＡをキャップ除去した後、次のステップは、遺伝子特異的Ｇｅｎｅ  Ｒａｃｅｒ  ＲＮＡ  Ｏｌｉｇｏを、Ａｍｂｉｏｎヒト脳全ＲＮＡの５’末端に連結することであった。手短には、予めアリコートに分けた凍結乾燥したＧｅｎｅＲａｃｅｒ  ＲＮＡ  Ｏｌｉｇｏ（０．２５μｇ）を含有する試験管に、７μｌのキャップ除去したＲＮＡを加え、混合し、遠心分離し、次いで、６５℃の水浴中でインキュベートし、混合物を氷上に２分間おいた。次いで、遠心分離した混合物に以下の試薬：１μｌの１０×溶解液バッファー、１μｌの１０ｍＭ  ＡＴＰ、１μｌのＲＮａｓｅＯｕｔ（４０Ｕ／μｌ）、１μｌのＴ４  ＲＮＡリガーゼ（５Ｕ／μｌ）を加え、３７℃で１時間インキュベートし、短時間遠心分離し、氷上に置いた。上記の沈殿手順を正確に反復した。５’連結ステップによって、キャップ除去したｍＲＮＡに連結されたＧｅｎｅＲａｃｅｒ  ＲＮＡ  Ｏｌｉｇｏを提供したが、これは相補ｃＤＮＡへの逆転写に必要であった。手短には、１μｌのヘキサマープライマー及び１μｌのｄＮＴＰを加え、混合してＲＮＡを連結し、６５℃で５分間インキュベートし、続いて、混合物を氷上に２分間置き、遠心分離した。次いで、以下の試薬：１２μｌの連結されたＲＮＡ及びプ���イマー混合物、４μｌの５×第１鎖バッファー、２μｌの０．１Ｍ  ＤＴＴ、１μｌのＲＮａｓｅＯｕｔ（４０Ｕ／μｌ）、１μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（２００Ｕ／μｌ）を加え、次いで、溶液を混合し、５０℃で５０分間インキュベートした。ＲＴ反応を７０℃で不活化し、遠心分離した。次いで、ＲＴ反応物に、１μｌのＲＮａｓｅ  Ｈ（２Ｕ）を３７℃で３０分間加えた。ＰＣＲのプロトコールは以下のとおりとした：９４℃、２．０分、１サイクル；９４℃、３０秒、５サイクル；７２℃、２．０分、５サイクル；９４℃、３０秒、５サイクル；７０℃、２．０分、５サイクル；９４℃、３０秒、２０サイクル；６５℃、３０秒、２０サイクル；６８℃、２．０分、１サイクル；６８℃、１０分、１サイクル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
【００８４】
トリゾール法を用いるＲＮＡ単離
［００８５］ＲＮＡ単離には、およそ５０〜１００ｍｇのウシ、ラット組織、リンパ球及び神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を用いた。組織を、１０００μｌのＴｒｉ−ｐｕｒｅ試薬と混合し、ホモジナイズした。次いで、この溶液を、１．５ｍｌの微量遠心管に注ぎ入れ、室温で５分間インキュベートした。直後に、２００μｌのクロロホルムを加え、１５秒間激しく振盪し、２０分間静置した。次いで、サンプルを１２０００、４℃で１５分間遠心分離し、遠心分離した無色の相を回収し、新しい試験管に移し、これに５００μｌのイソプロパノールを加えた。この溶液を室温で１０分間沈殿させ、次いで、１２０００ｇで１０分間遠心分離し、上清を破棄した。ペレットを、７５％エタノールに再懸濁し、５分間遠心分離し、乾燥させた。次いで、３０μｌのＤＥＰＣ処理したＲＮａｓｅ不含Ｈ２Ｏに懸濁した。ＲＮＡを５５℃で１５分間インキュベートし、Ｂｅｃｋｍａｎ分光光度計ＤＵ−６４０を用いてＲＮＡ濃度及び純度について分析した。
【００８５】
ポリ（Ａ）＋ＲＮＡの単離
［００８６］ウシ組織及び神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を回収し、トリゾール試薬（先に記載した）で処理して全ＲＮＡを単離した。２００μｇの全ＲＮＡを用いて、樹脂１グラムあたり１０ｍｇのＲＮＡの容量を含むＯｌｉｇｏ  Ｄｔセルロースを用いてポリＡ  ＲＮＡを単離した。ポリＡ  ＲＮＡ単離には、以下の試薬：１）結合バッファー（７．５のｐＨ最終溶液）、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）、０．５％ＳＤＳ；２）２×結合バッファー（７．５のｐＨ最終溶液）、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）、１％  ＳＤＳ；３）洗浄バッファー（７．５のｐＨ最終溶液）、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）；４）溶出バッファー（７．５のｐＨ最終溶液）、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡを用いた。溶出したポリ（Ａ）＋ＲＮＡを、５つの０．５ｍＬのアリコート溶出バッファーに加え、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｕ−６４０分光光度計を用いてＡ２６０を読み取り、最大ポリＡを含むアリコートを決定した。
【００８６】
ノーザンブロット
［００８７］神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞、ヒト組織及びウシ組織由来の２０マイクログラムのポリＡ  ＲＮＡを、１．０％ホルムアルデヒドアガロースゲルで分離し、Ｈｙｂｏｎｄナイロンフィルター（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃ、英国）にトランスファーし、これを８０℃で２時間ベイキングした。プレハイブリダイゼーションは、９５℃の７０μｌのサケ精子ＤＮＡ及びＥｘｐｒｅｓｓ−Ｈｙｂを含んでおり、６８℃で２時間回転させた。ブロットをα−３２Ｐ−ｄＣＴＰ−標識ｃＤＮＡプローブと４５℃で２２時間ハイブリダイズさせ、２×ＳＳＣで洗浄した。ブロットをＫｏｄａｋ  Ｘ線フィルムに曝露させた。ハイブリダイゼーションプローブは、ＢＱ２２４１９４プライマー由来の７２０ｂｐの断片から調製した。用いたプライマー対は、フォワードプライマー：５’ａｔｇ  ｇａｔ  ｔｃｔ  ｔｃｔ  ｇｇａ  ｃｃｃ  ａａｇ  ｃａｔ  ３’（配列番号３）及びリバースプライマー５’ｔｃｇ  ｔｔｃ  ｃｔｔ  ｃｔｔ  ｔｇｇ  ｃｃｇ  ｇｔｔ  ｔｔｔ  ｔ３’（配列番号４）からなるものであった。同一フィルターを、ＲＮＡの完全性及び量の両方の内部対照としてβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせた。
【００８７】
リアルタイムＰＣＲ実験の標準曲線の作製：
［００８８］６濃度（１ｐｇ〜１０ａｇ）のｃＤＮＡを含む未知ＳＨ−ＳＹ５Ｙ  ｃＤＮＡサンプルの絶対量測定のために標準曲線を用いた。以下のプロトコールを用いて第１及び第２のＰＣＲ反応を作製し、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ  ｃＤＮＡを含む純粋なｃＤＮＡアンプリコン及びフォワードＢＱプライマー、２及びリバースプライマー、４を作製した：第１のＰＣＲ反応、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．７５μｌ、１０×バッファー、２．５μｌ、２、４プライマーミックス、、２．０μｌ、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ  ｃＤＮＡサンプル番号１、２．５μｌ、プラチナＴａｑ、０．２μｌ、ＤＥＰＣ水、１４．５５μｌ；９５℃、２．２５分、９５℃、１５秒、６０℃、３０秒、７２℃、１．０分、７２℃、７．０分；第２のＰＣＲ反応、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．５μｌ、１０×バッファー、５．０μｌ、２、４プライマーミックス、４＋４μｌ、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ  ｃＤＮＡサンプル番号１、５．０μｌ、プラチナＴａｑ、０．４μｌ、ＤＥＰＣ水、２９．１０μｌ、同一条件でＰＣＲを実施した。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ  ｃＤＮＡ  ＰＣＲ産物ＱＩＡＧＥＮ  Ｍｉｎｉｅｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製キットの精製。
【００８８】
リアルタイムＰＣＲ実験のＲＮＡのマイクログラムあたりのコピー数の計算
［００８９］以下の式を用いて標準曲線のコピー数を求めた：
コピー数／μｌ＝濃度（ｇ／μｌ）×６．０３２×１０２３
塩基対の長さ×６６０
【００８９】
Ｄ２ＬでトランスフェクトされたＳＨ−ＳＹ５Ｙ  ｃＤＮＡを用いるリアルタイムＰＣＲプロトコール：
［００９０］ハロペリドールによって処理された、Ｄ２ＬでトランスフェクトされたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、対照として役目を果たすＨＡＬで処理されていない同様の神経芽細胞腫細胞と比較した。すべてのサンプルは２連で実施し、鋳型なし対照（ＮＴＣ）及び逆転写酵素なし対照（ＮＲＴ）としてのサンプルも２連で調製した。以下のプロトコールを用いた：２×ＳＹＢＲｇｒｅｅｎ、１０．０μｌ、フォワードプライマー、Ｐ２、１．２μｌ、リバースプライマー、Ｐ４、１．２μｌ、逆転写酵素ミックス、０．２μｌ、ＤＥＰＣ  Ｈ２Ｏ、６．４μｌ、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ  ｃＤＮＡ、１．０μｌ；リアルタイムＰＣＲ条件、５０℃、３０秒（１サイクル）、９５℃、１５分（１サイクル）、９５℃１５秒（４０サイクル）、６０℃３０秒（４０サイクル）、７２℃４０秒（４０サイクル）。
【００９０】
スタンレー財団神経病理学コンソーシアム（Ｓｔａｎｌｅｙ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）から得た側坐核の死後脳スライドサンプルを用いるヒトＣＲＰ４０免疫組織化学プロトコールの局在研究
［００９１］スタンレー財団（Ｔｈｅ  Ｓｔａｎｌｅｙ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）によって寛大にも提供された６０種のサンプルから３種のスライドを選択した。これらのスライドは、１）対照、２）薬物を使っていない統合失調症患者、３）１５０００Ｋ、ＨＡＬ治療を受けた統合失調症患者からなっていた。これらのスライドを、４％ホルムアルデヒドとともにインキュベートし、ＰＢＳに３０分間希釈した。直後に、薄片をＰＢＳで各回５分間で３回洗浄し、各スライドは組織にできる限り近く乾燥させ、疎水性のペンで薄片に輪郭を書いた。次いで、薄片を３％正常ヤギ血清＊（ＮＧＳ）（０．６％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＰＢＳに希釈した）とともに１時間インキュベートすることによってこの薄片をブロッキングした。次いで、このスライドを、０．６％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（及び必要に応じて３％ＮＧＳ）を含有するＰＢＳに希釈した一次ヒトＣＲＰ４０ポリクローナル抗体とともに、４℃で一晩インキュベートした（アルミホイルで包む）。翌日、スライドをＰＢＳで各回５分間で３回洗浄し、スライドを、０．６％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＰＢＳに希釈したＦＩＴＣ二次抗体とともに４時間インキュベートし、次いで、薄片をＰＢＳで６回洗浄し、スライドを適当なカバースリップでマウントし、マニキュア液で固定した。
【００９１】
結果
ＲＴ−ＰＣＲは、ＢＱ２２４１９３プライマーの組合せから３種の別個のバンドが生じ、すべてがｍｏｔ−２配列と相当な相同性を含むことを示した
［００９２］Ａｍｂｉｏｎヒト脳ｃＤＮＡを用いるＲＴ−ＰＣＲを、ＢＱ２２４１９３配列から得た２種のフォワードプライマー及び３種のリバースプライマーを種々の組合せで用いて実施し、その結果、３種の別個のバンドが得られた（図１参照のこと）。１．２％のアガロースゲル及び１５μｌのＥｔＢｒ（５ｍｇ／ｍｌ）を用いたその他のプライマー混合物と比較した、バンドの鮮明さ及びサイズの増大から、７２０ｂｐからなる最大のバンドを実験のクローニングパートにおいて用いた。このバンドを溶出し、ＭＯＢＩＸ、マクマスター大学での配列決定のために送った。配列決定解析結果は、一貫して、ｍｏｔ−２に対して９６％のヌクレオチド相同性を示した。
【００９２】
制限酵素ＢａｍＨ１及びＥｃｏＲ１を含む修飾されたプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲ断片、連結及びＢＬ−２１大腸菌細胞への形質転換
［００９３］既知の７２０ｂｐ  ＢＱ断片に制限酵素部位を組み込むために以下のプライマーを合成し、その結果、７４０ｂｐというわずかに大きいヌクレオチド断片が得られた（図２参照のこと）。以下のＢａｍＨ１部位を含む５’プライマー：ｔａｇ  ｇｇａ  ｔｃｃ  ａｔｇ  ｇａｔ  ｔｃｔ  ｔｃｔ  ｇｇａ  ｃｃｃ  ａａｇ  ｃａｔ（配列番号１）及びＥｃｏＲ１部位を含む３’プライマー、ｃｔａ  ｇａａ  ｔｔｃ  ｔｃａ  ｔｃｇ  ｔｔｃ  ｃｔｔ  ｃｔｔ  ｔｇｇ  ｃｃｇ  ｇｔｔ  ｔｔｔ（配列番号２）を用いてＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した。
【００９３】
［００９４］大腸菌における、ＢＱトランスジーンの組込み、融合タンパク質の発現、精製及び欠失は信頼の置けるものであり、速く、再現性があるので、これらの実験にはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子融合系を用いた。ｐＧＥＸプラスミドは、日本住血吸虫ＧＳＴを含む遺伝子及びトランスジーン融合物の高発現で誘導可能であるように機能する。さらに、ｐＧＥＸ−２Ｔベクターは、ＬａｃＩ遺伝子の高発現を化学的に誘導するためにＴａｑプロモーター部位を含む。イソプロピルβＤ−チオガラクトシダーゼ（ＩＰＴＧ）、ラクトース類似体を用いて、Ｌａｃ遺伝子の発現を誘導し、最終的に多量のＢＱ融合タンパク質を翻訳した。
【００９４】
［００９５］ベクターへの連結のための粘着末端を提供するために、７４０のＢＱ断片及びｐＧＥＸ−２Ｔの消化を、上記の特異的制限酵素を用いて実施した。連結及びＢＬ−２１大腸菌細胞への形質転換後、形質転換体をアンピシリン耐性アガープレート上、３７℃で一晩増殖させた。コロニーを選別し、アンピシリンを含むＬＢ培地で一晩増殖させた。融合タンパク質の製造は、バッフル付フラスコに入れた、５００ｍｌのＬＢ培地、１０ｍｌの一晩培養物、５００μｌのアンピシリンを用いることを含んでいた。翻訳は、５００μｌのＩＰＴＧの添加後に開始した。混合物を冷蔵された振盪機に、１２℃、２５０ｒｐｍで２３時間入れた。
【００９５】
［００９６］適切なタンパク質フォールディングを可能にし、それによって融合タンパク質が可溶性型のままであることを可能にし、活発に機能的であることを可能にするためには、ＢＱ融合タンパク質の最適温度は、１２℃であった。翌日、混合物を遠心分離し、細胞のペレットを、ミニ−Ｃプロテアーゼ阻害剤錠剤を含有する１×ＰＢＳに再懸濁した。細胞を、フレンチプレスを用いて溶解した。放出された融合タンパク質を、グルタチオンセファロース４Ｂビーズのマトリックスと一晩結合させた。結合された融合タンパク質−グルタチオンセファロースマトリックスを、アフィニティークロマトグラフィーカラムに加えた。図３からわかるように、融合タンパク質の大部分は可溶性型であり、このことは、タンパク質が適切な活性状態にあるということを示す。画分をカラムから溶出し、分光光度法によってタンパク質濃度を調べた。
【００９６】
［００９７］洗浄した後、酵素トロンビンプロテアーゼを加えることによって、結合している融合タンパク質を特定の部位でグルタチオンセファロースビーズから切断し、切断された生成物でＳＤＳ  ＰＡＧＥ電気泳動を実施した。このゲルでクマシー染色も実施した（図４参照のこと）。
【００９７】
タンパク質結合研究
［００９８］第１のタンパク質結合研究は、［３＋Ｈ］ＮＰＡ及び３種の異なる濃度の置換分子（ＤＡ、ＮＰＡ）、それぞれ１００μＭ、１０μＭ及び１μＭを含んでいた。タンパク質結合後、ＢｅｃｋｍａｎシンチレーションカウンターでＤＰＭカウントを実施した。各濃度の置換量は以下のとおりであった：１００μＭ  ＤＡ−７８．６％、１０μＭ  ＤＡ−７４．６％、１μＭ  ＤＡ−５５％及び１００μＭ  ＮＡＰ−７６．３％、１００μＭ  ＮＰＡ−７５％、１００μＭ  ６４．３％（図５参照のこと）。
【００９８】
［００９９］第２の結合研究は、［３＋Ｈ］ＤＡ及び４種の異なる濃度の置換分子ＤＡ、それぞれ１０００μＭ、１００μＭ、１０μＭ及び１μＭを含んでいた。タンパク質結合後、ＢｅｃｋｍａｎシンチレーションカウンターでＤＰＭカウントを実施した。各濃度の置換量は以下のとおりであった：１０００μＭ  ＤＡ−７５％、１００μＭ  ＤＡ−６５％、１０μＭ  ＤＡ−６０％。
【００９９】
ＢＱ融合タンパク質を用いるヒトＣＲＰ４０ポリクローナル抗体の作製
［００１００］３４μｌの純粋なＢＱタンパク質を、１２％アクリルアミドゲルにロードし、電気泳動を進行した。次いで、タンパク質をニトロセルロースペーパーにトランスファーし、約２３ｋＤａのはっきりと区別できる単一のバンドを、ポンソー−Ｓ染色を用いて同定した。このバンドを、鋭いはさみでできる限りバンドの近くを注意深く切り出した。次いで、このバンドを極めて小さな小片に切断し、１．５ｍｌのダウンスハンドホモジナイザーに入れ、１ｍｌの１×ＰＢＳ中でつぶした。この溶液は、完全に一貫性のある乳白色の混合物であった。約３０μｇを、２匹のニュージーランドウサギ各々に注射した。４回の注射と多数回の出血の後（方法及び材料に記載される）、動物を屠殺し、血清を回収し、精製した。多数のＢＱ抗体濃度を用いるウェスタンイムノブロッティングの後、１：４０００ＢＱ抗体濃度が最良の結果を示した。ウェスタンイムノブロットにより、約４０ｋＤａに強いはっきりと区別できるバンドと、７０ｋＤａにあまり区別できないバンドが示された（図５参照のこと）。
【０１００】
ＲＬＭ−ＲＡＣＥ  ＰＣＲ
［００１０１］Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＲＡＣＥキットを用いて、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリー（Ａｍｂｉｏｎ）から単離されたｃＤＮＡにより、ＢＱ遺伝子の３’末端の配列決定が成功した。ＭＯＢＩＸによる配列決定の結果は、この一続きのＰＣＲ産物は、ｍｏｔ−２遺伝子と９６％相同であるということを示した。ＰＣＲ条件の最適化、例えば、１）アニーリング温度を下げること、２）サイクル数を増大させること、３）還元剤、ＤＭＳＯを加えること、４）二次構造を正すためにベタインを加えること、５）熱性逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ）を用いてＲＡＣＥ  ｃＤＮＡを作製することは、すべて、ＢＱ遺伝子の５’末端の陽性バンドを生成することができなかった。
【０１０１】
陽性対照としてＢＱプライマー及びＨｅｌａ細胞を用いたＲＬＭ−ＲＡＣＥ  ＰＣＲ結果
［００１０２］ＤＡ  Ｄ２受容体を、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞にトランスフェクトしたが、これはこの特定の細胞株では、それらが内因性には見られないからである。１００μＭ  ＤＡ、１００μＭ  ハロペリドールのいずれか又は両方の組合せを添加した結果、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞における対照と比較してＢＱ発現が大幅に増大した（図６参照のこと）。
【０１０２】
ノーザンブロット
［００１０３］ノーザンブロットの最初の試みは、ラットＳＴＲ、ウシＳＴＲ、ヒトＳＴＲ、ヒト心臓、ヒト肝臓及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞由来の全ＲＮＡの使用を含んでいた。その後のブロットにより、標準と比較して２．８ｋｂレベルにはっきりと区別できるバンドが示され、ＢＱ転写物に相当する１．９ｋｂレベルにわずかなバンドを見ることができた（図７参照のこと）。２０μｇのポリＡ  ＲＮＡを用いてノーザンを繰り返し、結果は、モータリンに相当する２．８ｋｂ及びヒトＣＲＰ４０タンパク質に相当する１．９ｋｂに２つのはっきりと区別できるバンドを示し、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞では特に明白であった。これが、ヒトＣＲＰ４０は、モータリン遺伝子からの選択的にスプライスされた変異体であるということの第１の定量的証拠であった。さらに、ノーザンにより、スプライシング変異体は、モータリンよりも少量で発現され、ＣＮＳにおいて特異的であるという情報が提供された。
【０１０３】
リアルタイムＰＣＲ
［００１０４］正常ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞と比較した、ＨＡＬで処理した、ＤＡＤ２ＬでトランスフェクトされたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるｍＲＮＡの定量のために２ステップリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を実施した。２ステップＲＴ−ＰＣＲは、ＭＸ３０００ＰリアルタイムＰＣＲ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて各サンプルにつき２重に実施した。用いたプライマーは、フォワード：５’ＴＴＧＧＣＣＧＧＣＧＡＴＧＴＣＡＣＧＧＡＴＧＴＧ−３’（配列番号５）及びリバース：５’−ＡＣＡＣＡＣＴＴＴＡＡＴＴＴＣＣＡＣＴＴＧＣＧＴ−３’（配列番号６）。プライマー二量体は検出されず、転写物は最適ＰＣＲ効率を示した。１ｐｇ〜１０ａｇの範囲の対照ＳＨ−ＳＹ５Ｙ  ＲＮＡサンプルから得た対応する精製ｃＤＮＡを用いて、絶対標準曲線（図８）を構築した。ＭＸ３０００ＰリアルタイムＰＣＲを最適化し、増幅は対数期にあり、効率はＰＣＲの過程において保たれることを確実にした。増幅の結果、ＨＡＬ処理されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、より低いＣＴ値を有し、これは、対照細胞と比較して最初の鋳型コピーにおけるほぼ１００％の増大に相当するということが示された（図９）。これらの敏感な結果は、ＤＡ放出を増大させるＨＡＬ処理された細胞は、ヒトＣＲＰ４０転写物を直接調節するということを示す。先の実験と同一のＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を用いて相対定量を実施したが、ハウスキーピング遺伝子としてヒトシクロフィリンを用いた（図１０及び１１）。これらの結果は、ＤＡＤ２Ｌ処理されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ  ＲＮＡのＣＴ値は、対照ＳＨ−ＳＹ５Ｙ  ＲＮＡと同様であるということを示した。
【０１０４】
死後ＮＡ脳検体におけるヒトＣＲＰ４０の局在
［００１０５］ＮＡの死後脳検体を含む３種のスライドを、免疫組織化学研究に用いた。ヒトＣＲＰ４０に対する一次抗体を、１：２００希釈で加え、ＦＩＴＣ二次抗体を蛍光プローブとして用いた。翌日、共焦点顕微鏡（マクマスター大学）を用いてスライドを分析した。結果は、ヒトＣＲＰ４０は、対照及び薬物治療を受けていない統合失調症検体において核周辺領域に密に局在しているということを示した（図１２）。しかし、多量のＨＡＬで治療された検体を含むスライドは、抗体がほぼ核内にのみ局在することを示した。
【０１０５】
考察
［００１０６］ヒトＥＳＴ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＢＱ２２４１９３）を用いて、ヒト脳ＣＲＰ４０タンパク質を同定した。このＥＳＴから導いた核酸プライマーを、ＲＴ−ＰＣＲに用いてｃＤＮＡを増幅し、これをｐＧＥＸ−２Ｔ細菌発現ベクターにクローニングした。［３Ｈ］プロピルノルアポモルフィン及び［３Ｈ］ＤＡを用いる組換え融合タンパク質の機能研究により、ヒトＣＲＰ４０がカテコールアミンと結合するということが明確に実証された。さらに、ＲＡＣＥ−ＰＣＲを用い、このヒトＣＲＰ４０タンパク質の全長遺伝子配列を解明した。ノーザンブロッティングによって、ヒト−ＣＲＰ４０特異的プライマーを用いて、２つのはっきりと区別できるｍＲＮＡバンドを確認し、このことは、ヒトＣＲｐ４０が、ｍｏｔ−２遺伝子の選択的スプライシング変異体であるという証拠を与える。代表的な神経遮断薬、ハロペリドール（ＨＡＬ）で処理された神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を用いてリアルタイムＰＣＲ実験を実施し、ＣＲＰ４０  ｍＲＮＡコピー数が、正常対照細胞と比較して大幅に発現された。最後に、ヒトＣＲＰ４０発現が、ヒト血液のリンパ球と血小板の両方において（少なくとも）見られた。
【０１０６】
［００１０７］ヒト、ラット及びウシ線条体ｃＤＮＡを用い、特異的ＢＱ２２４１９３プライマーを用いて逆転写酵素ＰＣＲを利用し、アガロース電気泳動後に３つのはっきり区別できるバンドを解明し、ＰＣＲ断片の配列決定分析（ＭＯＢＩＸ）によって、ミトコンドリア熱ショックタンパク質７０ｋｄａ、モータリン−２（ｍｏｔ−２）（ＨＳＰＡ９）に対して９７％の相同性が示された（図１）。Ｍｏｔ−２は、多機能特性を含むことがわかっている６６ｋＤａのタンパク質である。このタンパク質は、腫瘍抑制遺伝子ｐ５３のｃ末端と結合し、その核へのトランス活性化を妨げ、最終的に細胞不死化を引き起こすことがわかっていることが最も重要である。
【０１０７】
［００１０８］ＢＱ２２４１９３断片がカテコールアミン機能特性を有するかどうかを調べるために、ＢＬ−２１大腸菌細胞に形質転換された、ｐＧＥＸ−２Ｔ細菌発現ベクター系を用いてクローニング実験を設計し、実施した。２３ｋＤａの組換え融合タンパク質を作製した後、カルガリー大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｇａｒｙ）からのタンパク質配列解析によって、ＢＱ２２４１９３融合タンパク質が、ｍｏｔ−２タンパク質と９７％の相同性を有することを確認した。
【０１０８】
［００１０９］組換えＢＱ２２４１９３融合タンパク質を用い、［３Ｈ］プロピルノルアポモルフィン及び［３Ｈ］ＤＡを用いて、タンパク質結合アッセイを用いる予備的機能研究を実施した。これらの実験の結果から、この新規タンパク質断片は、トリチウム化化合物を種々の濃度の非放射性ＤＡと大幅に置き換えるということが示され、このことは、ヒトＣＲＰ４０と呼ばれるこの新規融合タンパク質断片がカテコールアミンと低い親和性で、大容量で結合する能力を有するという直接的な証拠を与える（図５参照のこと）。
【０１０９】
［００１１０］この時点で、精製ヒトＣＲＰ４０融合タンパク質を用いてポリクローナル抗体を作製した。２匹のニュージーランドウサギにおいて多数回の融合タンパク質の注射及び出血の後、１５０日目に動物を屠殺した。ラット及びヒト線条体の両組織において、ポリクローナル抗体から、およそ４０ｋＤａに強いはっきりと区別できるバンド、およそ７０ｋＤａに弱い拡散したバンドが生じたことがウェスタンイムノブロッティングからわかる。
【０１１０】
［００１１１］１）細胞質、２）ミトコンドリア及び３）核画分を含む、細胞成分画分にホモジナイズされた、ＤＡＤ２ＬでトランスフェクトされたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を用いてさらなる機能研究を実施した。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ組織細画分を用いるウェスタンブロッティングは、４２℃という高温に曝された組織は、特に、核画分においてヒトＣＲＰ４０レベルの大幅な増大をもたらすということを示した。核画分組織は、ヒトＣＲＰ４０タンパク質の最も著しい増大を示し、このことは、ＣＲＰ４０タンパク質は、熱又はカテコールアミン曝露の増大などのストレスの存在下で核に転位置するということを示す。１００μＭのＨＡＬ及び１００μＭのＤＡに曝されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を用いてさらなる機能研究を実施したところ、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ対照細胞と比較して、核画分においてヒトＣＲＰ４０タンパク質発現の大幅な増大が得られた。
【０１１１】
［００１１２］新規タンパク質ヒトＣＲＰ４０のクローニング及び特性決定の後、ＲＬＭ−ＲＡＣＥ  ＰＣＲによって、ヒトＣＲＰ４０タンパク質の完全配列を確認した。配列決定結果は、全ＢＱ配列は、Ｃ末端でｍｏｔ−２遺伝子と９７％の相同性を有することを示した。この点から、ヒトＣＲＰ４０は、１７エキソンのｍｏｔ−２遺伝子（２．８ｋｂの転写物）からの選択的スプライシング変異体であるということが仮定された。Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ＥｘＰＡＳｙプログラムを用いることで、ヒトＣＲＰ４０ヌクレオチド配列を、翻訳されたタンパク質配列に変換することが可能となった。この結果は、新規ヒトタンパク質は、３７．５ｋＤａの分子量及び６．２１という理論値Ｐ．Ｉ．を有するということを示した。
【０１１２】
［００１１３］クローニング及びＲＡＣＥ  ＰＣＲ実験と同一のプライマーを用い、種々の種（ウシ、ラット、ヒト、ＳＨＳＹ５Ｙ細胞）由来の種々の全ＲＮＡ及びポリＡ  ＲＮＡサンプルを利用して、ノーザンブロッティング実験を実施したが、成功しなかった。新規スプライシング変異体ＣＲＰ４０は、少量で発現される可能性があるということが示唆され、ポリＡ  ＲＮＡの濃度を高めてノーザンを反復し、ウシ線条体組織、ヒト線条体組織及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞において２つのはっきりと区別できるバンドの確認が明らかにされた（図７参照のこと）。ゲル電気泳動後に、バンドをβ−アクチン転写物に対して正規化し、測定した。ノーザンブロットにより、それぞれ、６６ｋＤａモータリンタンパク質及びヒトＣＲＰ４０（４０ｋＤａ）タンパク質に対応する、約２．８ｋｂ及び１．９ｋｂに２つのはっきりと区別できるバンドが実証された。
【０１１３】
［００１１４］ＣＮＳ機能におけるその詳しい特性決定のために、神経芽細胞腫ＳＨＳＹ５Ｙ細胞を用いて、転写レベルでさらなる機能研究を実施した。リポフェクションによって、ＤＡ−Ｄ２Ｌ受容体をＳＨＳＹ５Ｙにトランスフェクトした。細胞培養物に、典型的な抗精神病薬、ＨＡＬを加え、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ対照細胞とともにこれらの細胞からＲＮＡを抽出した。ヒトＣＲＰ４０プライマーを用いるリアルタイムＰＣＲは、絶対定量によって、このモータリンの新規選択的スプライシング変異体は、ＨＡＬ処理された細胞対対照細胞において異なってアップレギュレートされるということを示した。さらに、ハウスキーピング遺伝子、ヒトシクロフィリンを用い相対定量及び正規化を用いたところ、処理及び非処理細胞間で有意な変化を示さなかった。
【０１１４】
［００１１５］スタンレー財団神経病理学コンソーシアム（Ｓｔａｎｌｅｙ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）（ＳＦＮＣ）から得た側坐核（ＮＡ）の死後脳サンプルで免疫組織化学を用いて、局在研究も実施した。結果は、ヒトＣＲＰ４０抗体は、正常対照では、ＮＡ領域内のニューロンの核周辺領域に局在するということを実証した。さらに、薬物を未投与の統合失調症検体スライドにおいて同様の染色が見られた。しかし、ＨＡＬ治療された統合失調症死後サンプルにおける免疫染色は、ヒトＣＲＰ４０抗体は明らかに核領域内に見られるということを示した。
【０１１５】
［００１１６］リアルタイムＰＣＲを、ＱＩＡＧＥＮワンステップ法を二重パラダイムアプローチで用い、コード化された形でＳＦＮＣから寛大にも提供された１０５の前頭前野（ＰＦＣ）領域の死後脳ＲＮＡ脳サンプルで、また、５０ｎｇのＤＮアーゼ処理されたＲＮＡで実施した。この研究は、ＡＮＯＶＡ試験は、年齢、性別及びＰＭＩは、ＳＦＮＣ間のＰＦＣヒトＣＲＰ４０発現に対して有意な効果を有さないということを示した。しかし、対照検体（ｎ＝３５）と比較して、双極性患者（ｎ＝３５）においてヒトＣＲＰ４０  ｍＲＮＡコピー数の大幅な減少が見られた。さらに、生涯の抗精神病薬治療の量に従って群を分けることによって、対照検体と最小用量の神経遮断薬（０〜５０Ｋ）を摂取した経歴を有していた検体の間で、ヒトＣＲＰ４０  ｍＲＮＡコピー数の大幅な減少が見られるということが示された。さらに、最大の生涯用量の抗精神病薬（＞４００Ｋ）を摂取した患者対最小の抗精神病薬（０〜５０Ｋ）を用いた検体において、ヒトＣＲＰ４０  ｍＲＮＡ発現の増大された傾向が見られ、このことは、より長い抗精神病薬使用に伴うヒトＣＲＰ４０  ｍＲＮＡ正規化効果を示した。上記の結果は、ヒトＣＲＰ４０  ｍＲＮＡ発現は、ＰＦＣ脳領域内で、統合失調症及び双極性患者の両方において機能障害性に挙動し、この新規タンパク質は、ＤＡ活性によって異なって調節されるということを実証する。遺伝子マッピング研究により、ｍｏｔ−２及びヒトＣＲＰ４０は、推定感受性統合失調症及び双極性遺伝子座であることがわかっている、染色体５バンドｑ３１上にあるということが示された。
【０１１６】
［００１１７］ヒトＣＲＰ４０プライマーを、リンパ球及び血小板の両方から作製したｃＤＮＡとともに用い、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。この実験によって、リンパ球及び血小板の両方においてはっきりと区別できるバンドが実証され、配列決定によって正確なヒトＣＲＰ４０配列が示された。この発見は、精神障害における病態生理学的変化を研究するためにニューロン組織にアクセスすることが可能ではないので、ＣＲＰ４０のバイオマーカーとしての使用にとって重要である。
【０１１７】
［００１１８］要約すれば、ヒトＣＲＰ４０タンパク質のクローニング、特性決定及び局在確認により、この新規タンパク質はカテコールアミン調節性機能を有するということが実証された。ヒトＣＲＰ４０は、ｍｏｔ−２遺伝子に由来する選択的スプライシング変異体であり、神経学的疾患状態ではダウンレギュレートされることがわかっている。
【０１１８】
実施例２−神経学的疾患におけるバイオマーカーとしてのＣＲＰ４０の有用性
［００１１９］本研究は、健常な対照、統合失調症及び双極性の死後脳検体におけるヒトＣＲＰ４０発現を調べるために行った。同様の研究を、モータリン−２に対するプライマーを用いて実施し、結果は同様であった。
【０１１９】
方法及び材料
死後ＲＮＡ  ＰＦＣサンプル
［００１２０］前頭前野の死後ＤＮアーゼ処理ＲＮＡ検体は、スタンレー財団神経病理学コンソーシアム（Ｓｔａｎｌｅｙ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）によって提供された。顕微鏡検査を、一貫性のある結果を提供するためにスタンレー財団で訓練を受けた２人の無関係の神経病理学者によってすべてのサンプルで実施した。患者の広範囲に及ぶ記録が入手可能であり、２人の精神科医によって再調査された。診断は、ＤＳＭ−ＩＶ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、第４版）基準（表１に示される人口動態）を用いて以下のとおりに確立された。対照患者は、精神病が認められないこと、薬物乱用がないことが確認され、同一の方法によって評価された。
【０１２０】
【表１】
0005514443.tif 000002
【０１２１】
［００１２１］死亡時の死因、薬物乱用歴、抗精神病薬摂取データ及びその他の医薬摂取に関するデータも提供された（表２〜５）。１０５人の患者に由来する対応セットＲＮＡ脳検体を得、３５人は統合失調症と診断されており、３５人は家族性双極性障害と診断されており、３５人は正常対照であり、ドライアイス下にすぐに保存した。各サンプルは、患者の年齢、性別、ｍＲＮＡの質及び脳ｐＨに対応していた。
【０１２２】
【表２】
0005514443.tif 000003
【０１２３】
【表３】
0005514443.tif 000004
【０１２４】
【表４】
0005514443.tif 000005
【０１２５】
【表５】
0005514443.tif 000006
【０１２６】
ＰＦＣ領域中のヒト死後脳ＲＮＡサンプルを用いるワンステップリアルタイムＰＣＲプロトコール
［００１２２］ＲＮＡサンプルは、１０μｇのＤＮアーゼ処理ＲＮＡからなるものであり、各サンプルの濃度及び純度（２６０／２８０）も提供された。ＭＸ−３０００ＰリアルタイムＰＣＲ機器（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国）において、５０ｎｇのＲＮＡを用いて、各サンプルにつき、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを３重で実施した。以下のヒトＣＲＰ４０プライマーを、すべてのリアルタイムＰＣＲ実験に用いた：５’−ＴＴＧＧＣＣＧＧＣＧＡＴＧＴＣＡＣＧＧＡＴＧＴＧ−３’（フォワード、センスプライマー）（配列番号５）及び５’−ＡＣＡＣＡＣＴＴＴＡＡＴＴＴＣＣＡＣＴＴＧＣＧＴ−３’（リバース、アンチセンスプライマー）（配列番号６）。ヒトＲＮＡサンプルを用い、これらのプライマーを用いるこれまでの研究により、プライマー二量体は実証されておらず、転写物は最適リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ効率を示した。１ｐｇ〜１０ｐｇの範囲の精製ＤＮＡ断片（スタンレー財団から得たサンプル番号１）を用いて、絶対標準曲線を、サンプルとともに流し、初期鋳型コピー数を算出した。ＭＸ−３０００ＰリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ条件を最適化して、増幅が指数増殖期にあり、その効率がリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ反応の過程において一定のままであるということを確実にした。この実験は、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎを、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＲＴ−ｍｉｘとともに１つのチューブ中に含む、ＱＩＡＧＥＮワンステップＲＴ−ＰＣＲ法を用いて実施した。ツーステップ法に対するワンステップ法の利点は、以下のとおりである：１）ピペッティングステップが少ないことで誤差及び汚染が最小になること、２）ＲＮＡ２次構造に関する問題を排除するための高温での感度及び特異性の向上及び３）最短の時間必要条件。すべてのサンプルを３重で実施し、ＮＲＴ及びＮＴＣも対照として流した。ハウスキーピング遺伝子であるヒトシクロフィリンを用いて、同じサンプルで実験を２重で反復し、相対定量においてサンプルを正規化した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲに用いた成分は、以下のとおりであった：２×  ＳＹＢＲｇｒｅｅｎ、１０μｌ；フォワードプライマー（３００ｎＭ）、Ｐ２、１．２μｌ（５μＭ）；リバースプライマー、（３００ｎＭ）、Ｐ４、１．２μｌ（５μＭ）；逆転写酵素混合物、０．２μｌ；ＤＥＰＣ  Ｈ２Ｏ、６．４μｌ；コード化されたスタンレーＲＮＡ、１μｌ（５０ｎｇ）。リアルタイムＰＣＲ条件は以下のとおりとした：５０℃３０秒（１サイクル）；９５℃１５分（１サイクル）、９５℃１５秒（４０サイクル）、６０℃３０秒（４０サイクル）、７２℃４０秒（４０サイクル）。
【０１２７】
統計分析
［００１２３］統計分析には、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ、ＳＰＳＳ及びＭｉｎｉＴａｂソフトウェアを用いた。測定した変数のすべての対（すなわち、ｍＲＮＡコピー数、年齢、性別、死後間隔（ＰＭＩ）、疾患及び薬物種類）について、ピアソンの積率相関係数を求め、相関の両側検定を実施し、直線関係の程度を判定した。統計分析は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）法と、それに続いて、チューキー事後比較検定を用いて、ＲＮＡ分子のコピー数でその他の変数に対して実施した（表１〜５参照のこと）。
【０１２８】
結果
ａ）年齢、性別及び死後間隔は、ヒトＣＲＰ４０発現に対して効果がない
［００１２４］変数の任意の対の間に有意な相関は見られなかった。したがって、材料の項に記載されたＡＮＯＶＡ手順を実施した。対照、統合失調症及び双極性被験体間で、年齢［Ｆ＝０．１４２  ｄｆ（１，３４）、ｐ＞０．０５］、性別［Ｆ＝１．５６  ｄｆ（１，３４）、ｐ＞０．０５］又は死後間隔［Ｆ＝０．３  ｄｆ（２，３４）＝、ｐ＞０．５］に関して、ＰＦＣにおけるヒトＣＲＰ４０発現において有意な相違はなかった。
【０１２９】
ｂ）双極性患者では内側前頭前野ヒトＣＲＰ４０発現は特異的に減少する
［００１２５］ＡＮＯＶＡ分析により、双極性障害に関してＰＦＣにおけるヒトＣＲＰ４０発現において有意な相違が示された［Ｆ＝８．８９、ｄｆ（２，１０４）、ｐ＜０．０１］（図１４参照のこと）。事後分析により、正常対照検体（ｎ＝３５）に対して約３１％の双極性検体におけるＰＦＣヒトＣＲＰ４０発現の大幅な減少が示された。
【０１３０】
ｃ）統合失調症及び双極性患者では、前頭前野ヒトＣＲＰ４０発現は、投与された生涯アンチスピコティクス（Ａｎｔｉｓｐｙｃｈｏｔｉｃｓ）の量に従って増大する
［００１２６］ＡＮＯＶＡ分析は、生涯累積薬物摂取用量に関して、ヒトＣＲＰ４０値において有意な相違（Ｆ６．０６２、ｄｆ（３，１０４）、Ｐ＝０．００８）が検出されることを示した。したがって、チューキー検定を用いて事後分析を実施した。事後分析により、対照及び最小生涯累積抗精神病薬摂取用量間で有意な相違が示された（Ｐ＜０．００１）。さらに、最小処理群と最大処理抗精神病薬群（＞１５０Ｋ）間に、抗精神病薬使用の増大に伴う、ヒトＣＲＰ４０発現の正常化作用の増大を示すはっきりとした傾向も見られたが、統計的に有意ではなかった。
【０１３１】
考察
［００１２７］ＰＦＣ領域の死後脳ＲＮＡ脳サンプルは、スタンレー財団神経病理学コンソーシアム（Ｓｔａｎｌｅｙ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）（ＳＦＮＣ）からコード化された形で寛大にも提供された。リアルタイムＰＣＲは、ＱＩＡＧＥＮワンステップ法及び５０ｎｇのＤＮアーゼ処理ＲＮＡを用いて１０５のＰＦＣ  ＲＮＡサンプルで実施した。本研究により、ＡＮＯＶＡ試験は、年齢、性別、ＰＭＩは、ＳＦＮＣ間のＰＦＣヒトＣＲＰ４０発現に対して有意な効果を有さないということを示した。しかし、双極性患者（ｎ＝３５）では、対照検体（ｎ＝３５）と比較して、ヒトＣＲＰ４０  ｍＲＮＡコピー数の大幅な減少が見られた（図１４参照のこと）。さらに、生涯抗精神病薬治療の量に従って群を分割することによって、対照検体と最小用量の神経遮断薬（０〜５０Ｋ）を摂取した経歴を有する検体の間で、ヒトＣＲＰ４０  ｍＲＮＡコピー数の大幅な低下が見られることがわかった。さらに、最大の生涯用量の抗精神病薬（＞１５０Ｋ）を摂取した患者対最小の抗精神病薬（０〜５０Ｋ）を使用した検体において、ヒトＣＲＰ４０  ｍＲＮＡ発現の増大された傾向が見られ、このことは、より多量の抗精神病薬使用に伴うヒトＣＲＰ４０  ｍＲＮＡ正常化作用を示した（図１４参照のこと）。上記の結果は、ヒトＣＲＰ４０  ｍＲＮＡ発現は、ＰＦＣ脳領域内で、統合失調症及び双極性患者の両方において機能障害性に挙動し、この新規タンパク質はＤＡ活性によって異なって調節されるということを実証する。
【０１３２】
［００１２８］統合失調症及び双極性障害は両方とも、ＰＦＣにおいて低ＤＡ機能を有することがわかっているので、ＣＲＰ４０はＤＡ活性によって調節されるという事実は、なぜ、双極性検体サンプルにおいてリアルタイムＰＣＲから明らかな、ヒトＣＲＰ４０  ｍＲＮＡコピー数の大幅な減少があったのかを説明できる。さらに、双極性群は、相当な生涯量の神経遮断薬で治療された、３５人のうち１人の患者からなっており、このことにより、これらのＤＡ枯渇ＰＦＣ脳検体における少ないＣＲＰ４０コピー数が説明される。対照的に、全統合失調症患者プロフィールは、５０Ｋ未満から＞４００Ｋまでの抗精神病薬使用の広い投与を有していた。統合失調症検体における抗精神病薬使用の増大は、ＤＡ放出の増大を引き起こすことがわかっており、これによって、統合失調症群におけるヒトＣＲＰ４０  ｍＲＮＡコピー数の正常化作用を説明できる（図１５参照のこと）。
【０１３３】
［００１２９］これらの患者におけるＣＲＰ４０発現レベルの観察された減少をさらに評価するために、全患者プロフィールを、生涯抗精神病薬投与の範囲に従って分け、ｍＲＮＡコピー数を統計分析に用いた。結果から、低用量の抗精神病薬（０〜５０Ｋ）を投与された患者は、対照よりも大幅に少ない、ヒトＣＲＰ４０の初期コピー数発現を示すということが示された（図１５参照のこと）。これらの結果は、ヒトＣＲＰ４０発現は、抗精神病薬使用量及びＤＡ放出の増大と直接関連しているという最初の仮説と関連している。生涯抗精神病薬治療が増大するにつれ、正常化された作用が見られた。
【０１３４】
実施例番号３−ＣＲＰ４０発現の減少の効果
［００１３０］この実験は、前頭前野におけるＣＲＰ４０の減少が、統合失調症様行動異常の発生と関連しているかどうか、又は統合失調症の患者におけるＣＲＰ４０の減少が疾患過程の結果であるかどうかを調べるために実施した。
【０１３５】
［００１３１］内側前頭前野におけるＣＲＰ４０の発現の減少が、推定動物モデルにおける行動異常の発生をもたらすかどうかを確立するために、以下の実験アプローチを用いた。
【０１３６】
［００１３２］各々４つの亜群（ｎ＝１２／亜群、全部で２４０匹のラット）からなるラットの５つの群に、両側２６ゲージステンレス鋼製ガイドカニューレ（Ｐｌａｓｔｉｃｓ  Ｏｎｅカタログ番号３２８０ＰＤ−２．０）を、前頭前野の上に移植した（定位座標：ブレグマの３．０ｍｍ前、正中線から０．７ｍｍ横及び頭蓋骨表面から２．５ｍｍ下）。ＡＤＯＮＳ溶液を、別のカテーテル（ＰＶＣ６０カニューレ管、Ｐｌａｓｔｉｃｓ  Ｏｎｅカタログ番号Ｃ３１２ＶＴ）によってそれぞれのカニューレと接続されたＳ．Ｃ．移植された浸透圧ミニポンプ（Ａｌｚｅｔモデル番号２００４）によって３週間連続注入した。群Ａ（亜群：Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４；ｎ＝１２／亜群）には、ヒトＣＲＰ４０アンチセンスデオキシオリゴヌクレオチド、５’−ｔｃｇ  ｔｔｃ  ｃｔｔ  ｃｔｔ  ｔｇｇ  ｃｃｇ  ｇｔｔ  ｔｔｔ  ｔ−３’（配列番号４）を与えた。群Ｂ（亜群：Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４；ｎ＝１２／亜群）には、センスデオキシオリゴヌクレオチド、１０ｎｍｏｌ／日を浸透圧ポンプによって与えた。群Ｃ（亜群Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４；ｎ＝１２／亜群）には、ＡＤＯＮＳ１０ｎｍｏｌ／日を浸透圧ポンプによって与えた。群Ｄ（亜群：Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４；ｎ＝１２／亜群）には、群Ｂと同様のミスセンス（ランダム）デオキシオリゴヌクレオチドを与えた。群Ｅ（亜群：Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４；ｎ＝１２／亜群）は正常対照として用いた。注入期間の最後に、すべての群のラットを、行動異常：１．聴覚性驚愕反応（７６）のＰＰＩの発生についてモニターした。これらの行動異常を、ドーパミン作用薬は全く投与せず、週１回の頻度で最大４週間記録した（統合失調症患者が、ベースライン並びに薬理学的投与に応じて異常を示すために（６；７６；８０；８１））。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによってＣＲＰ４０  ｍＲＮＡレベルを、またウェスタンブロッティングによってタンパク質レベルを推定できるよう、各群から１つの亜群を毎週（最大４週まで）屠殺した。前頭前野ＣＲＰ４０レベルの減少率は、週間隔で種々の群のラットによって示される行動異常の強度と相関があった。
【０１３７】
［００１３３］プレパルス抑制の測定：この技術は、ラットにおける行動尺度として短い刺激に対する反射驚愕反応を評価することによって、統合失調症の患者において観察される感覚運動ゲーティング欠陥を測定する。このモデルでは、強い音刺激又は触刺激（パルス）の前に、ラットに弱い閾値下の音刺激（プレパルス）を提供し、これが強い音刺激又は触刺激（パルス）に対する驚愕を抑制するよう機能する。ＰＰＩの乱れは、統合失調症患者において並びにドーパミノミメティクスによる動物において及びＡＰＤによってアンタゴナイズされた動物において見られた。２００３年Ｔｅｎｎら（６４）によって記載されるように、ＳＲ−Ｌａｂ  Ｓｔａｒｔｌｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、すべての群におけるＰＰＩを記録した。手短には、ラットを驚愕装置に入れ、バックグラウンドノイズ［６５ｄＢ］を用いて１０分間順応させる。次いで、ラットに、驚愕応答の馴化を制御するためにプレパルスは全く用いずに、一連の５回の驚愕パルスを提示した。この一連の刺激に、単独又は驚愕パルスに１００ｍｓ先行する、パルスなし［０ｄＢ］、驚愕パルス［１１０ｄＢ、４０ｍｓ］又は３回のプレパルス強度［７０、７５及び８０ｄＢ、２０ｍｓ］からなる６０回の無作為化試験を続けた。最後に、別の一連の５回の驚愕パルス単独試験を提示した。驚愕反応は、驚愕刺激の発生から１００ｍｓ間１ｍｓ毎に測定した。％ＰＰＩを、１００−［（Ｐ＋Ｓ）／Ｓ］１００として算出した。Ｐ＋Ｓは、プレパルス試験の平均応答振幅であり、Ｓは驚愕パルス試験単独の平均応答振幅である（６４）。
【０１３８】
［００１３４］図１６に示されるように、前述のＣＲＰ４０ノックダウン研究から有意なプレパルス抑制（ＰＰＩ）が得られた。ＰＰＩは、統合失調症を同定するために用いられる標準試験である。
【０１３９】
実施例番号４−ＣＲＰ４０による血小板凝集
［００１３５］ＣＲＰ４０はまた、血小板の凝集を引き起こすと決定された。以下のプロトコールに従ってこの効果を研究した。
１）確立された方法論を用いて全血から血小板を単離し、
２）血小板（５０００００／μｌ）をＦアゴニストを用いて洗浄し、
３）１％パラホルムアルデヒド−５０μｌ  反応混合物＋２００μｌ  ＰＦにおいて反応を停止し、
４）細胞をボトン（ｂｏｔｏｎ）（４．５ｍｌ）を用いて洗浄し、次いで、２２００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、細胞をイソトン（ｉｓｏｔｏｎ）＋１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ２５０μｌで再懸濁し、
５）染色−５０μｌ血小板＋２０μｌ  ＣＤ６２ＰＥ（１／１０希釈）を、暗所、室温で３０分間インキュベートし、
６）４．５ｍｌのイソトン（ｉｓｏｔｏｎ）で洗浄し、２２００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、
７）２５０μｌのイソトン（ｉｓｏｔｏｎ）に再懸濁する。
【０１４０】
［００１３６］次いで、フローサイトメトリーを実施した。
【０１４１】
［００１３７］結果により、１０μｌの純粋ＣＲＰ４０融合タンパク質の添加は、対照血小板と比較して、血小板凝集の８０％増大を引き起こすということが示された。
【０１４２】
［００１３８］血小板凝集剤としてのＣＲＰ４０のこの活性が、ＣＲＰ４０を循環器疾患の治療における標的にする。
【０１４３】
実施例番号５−神経学的疾患の診断的血液検査
血小板の単離
［００１３９］２．０ｍｌの新鮮ラット血液を、エッペンドルフチューブに集めた。血液を１０００ｒｐｍ（１９０ｇ）（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＴＪ−６ベンチ遠心機）で１０分間遠心分離した。血小板の豊富な血漿（ＰＲＰ）を、１５ｍｌのコニカルチューブに注意深く移した（汚染を避けるために、０．７５％の上清を注意深く移した）。血小板を２７５０ｒｐｍ（１６００ｇ）で７分間遠心分離し、上清をデカントした。血小板ボタンを、１％のＮａ２＋ＥＤＴＡ、０．１％ＢＳＡを含む１ｍｌのＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ）に再懸濁した。次いで、血小板懸濁液を２０ｍｌファルコンチューブに移し、ＰＢＳバッファー（ピペットミックス）で完全に満たし、２７５０ｒｐｍ（１６００ｇ）で７分間遠心分離した。上清をデカントし、洗浄をもう一度反復した。
【０１４４】
ラット血液からのリンパ球の単離
［００１４０］２．０ｍｌの新鮮なラット血液を得、滅菌５０ｍｌファルコンチューブに移し、１５ｍｌの１×ＰＢＳを加えた。次いで、パスツールピペットによって、この混合物に５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ  Ｐａｑｕｅサンプルを加えた。ＢｅｃｋｍａｎＴＪ−６遠心機で、１７００ｒｐｍで２０分間、このサンプルを遠心分離した。直後に、バフィーコートを回収し、新しい５０ｍｌファルコンチューブに移した。このチューブを５０ｍｌの印まで満たし、１８００ｒｐｍで１２分間遠心分離した。遠心分離後、水層を除去した。残存する懸濁液にイソプロピルアルコール（０．５ｍｌ）を加え、室温で１０分間インキュベートした。再度、溶液を最大速度で１５分間遠心分離し、ペレットを保持した。ペレットを１ｍｌの７５％エタノールで再懸濁し、４℃で８分間遠心分離した。次いで、上清を除去し、ペレットを５分間乾燥させた。乾燥したペレットを３０ｍｌのＤＥＰＣ  Ｈ２Ｏに再懸濁した。ＲＮＡをトリゾール法によって単離し、ｃＤＮＡに逆転写した。リアルタイムＰＣＲを先に記載したとおりに実施した。
【０１４５】
ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙミニキットを用いるＲＮＡの調製
［００１４１］血小板ペレットに、３００μｌのＲＬＴバッファーを加え、溶解物を、ＲＮアーゼフリーのシリンジに適合する２１ゲージニードルに通すことによって混合物を十分にホモジナイズした（５回）。１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに懸濁液を移した。等容積の７０％エタノールを加え、ピペッティングによって混合した。全量を、２ｍｌのコレクションチューブに入れたＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙミニカラムに適用した。このチューブを静かに閉じ、１００００ｒｐｍ（８０００ｇ）で１５秒間遠心分離した。フロースルーを廃棄し、再度、同じコレクションチューブを用いた。次いで、７００μｌのＲＷ１バッファーを加えた。このチューブを静かに閉じ、１００００ｒｐｍ（８０００ｇ）で１５秒間遠心分離した。フロースルーを再度廃棄した。ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙミニカラムに５００μｌのＲＰＥを加え、１００００ｒｐｍ（８０００ｇ）で１５秒間遠心分離した。フロースルーを破棄し、ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙミニカラムに別の５００μｌのＲＰＥを加え、１００００ｒｐｍ（８０００ｇ）で２分間遠心分離した。ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙミニカラムを、新しいコレクションチューブの上に位置させ、最大速度で１分間遠心分離し、溶出の間にエタノールが確実に持ち込まれないようにした。溶出するために、ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙミニカラムを新しい１．５ｍｌのコレクションチューブに移し、３０μｌのＲＮアーゼフリーＨ２Ｏを、ＲＮｅａｓｙシリカゲルメンブラン上に直接ピペットで乗せた。このチューブを静かに閉じ、１００００ｒｐｍ（８０００ｇ）で１分間遠心分離した。ＲＮＡ収率を高めるために、最初の溶出液でカラムを再溶出した。２６０及び２８０でＯＤを調べた。血小板ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、リアルタイムＰＣＲを先に記載したとおりに実施した。
【０１４６】
結果
［００１４２］特異的ヒトＣＲＰ４０プライマー（上記の実施例番号２において同定された）を用いるリアルタイムＰＣＲ後に、産物を１％アガロースゲルに流し、バンドを切り出し、配列決定のためにマクマスター大学のＭＯＢＩＸに送った。血小板及びリンパ球両方の配列結果は、先に報告されている脳組織ＲＮＡと同一であった。
【０１４７】
実施例番号６−神経学的疾患の診断的血液検査
［００１４３］ヒト血液を用いて上記の血液検査も実施した。血小板及びリンパ球を、実施例５に記載される方法で２０ｍｌのヒト血液から集め、ＣＲＰ４０  ＤＮＡを記載されたように定量した。
【０１４８】
［００１４４］リアルタイムＰＣＲ  ＣＲＰ４０定量の結果は、図１７〜１９に示されており、各々が、神経学的疾患を有する患者と、神経学的疾患を有さない対照患者の間の統計的に有意な相違を示す。具体的には、図１７は、統合失調症患者（ｎ＝６）対非統合失調症対照患者（ｎ＝４）におけるＣＲＰ４０レベルの減少の検出をグラフによって示す。ｃＤＮＡは、リンパ球から得た。図１８は、血小板から得たｃＤＮＡを用いる、統合失調症患者（ｎ＝４）及び対照（ｎ＝２）間のＣＲＰ４０レベルの減少をグラフによって示す。図１９は、グルコース調節不全の症状を有する薬物を未投与の統合失調症患者と対照の間のＣＲＰ４０レベルの減少をグラフによって示す。ｃＤＮＡは血小板から得た。図２０は、血小板から得たｃＤＮＡを用いるパーキンソン病の患者（ｎ＝３）及び対照（ｎ＝３）の間のＣＲＰ４０レベルの減少をグラフによって示す。
【０１４９】
実施例７−ＣＲＰ４０治療用組成物の調製
［００１４５］これまでの報告により、経鼻送達によるナノ粒子は脳の多数の領域に到達するということが示されている（Ｇａｏら  ２００６；Ｚｈａｎｇら  ２００６）。したがって、以下のプロトコールを用いて、経鼻スプレーのためのＣＲＰ４０ナノ粒子を製剤する。
【０１５０】
［００１４６］ナノ粒子の調製：モータリン遺伝子（ヒトＣＲＰ４０選択的スプライシング変異体）を、遍在性のプロモーターによって駆動される、安定で強力なトランスジーン発現を誘導することがわかっている哺乳動物発現プラスミドにクローニングする（Ｇｏｍｅｚ−Ｖａｒｇａｓら  ２００４）（例えば、番号９４６；−ｉｎ  ｖｉｖｏで抗原転写を駆動する安定な遺伝因子であることが示されているアクチン（Ｂｒｏｏｍｅら  ２００６）。この構築物の送達に用いるためのキトサンナノ粒子は、高分子量（約３９０，０００Ｄａ）のキトサンを、プラスミドＤＮＡと複合体形成して均一な粒子を得ることによって合成する。したがって、高速ボルテックス処理の間に、０．０２％キトサン、ｐＨ５．７、５５℃をプラスミドＤＮＡ（５０ｍＭ硫酸ナトリウム中、５０ｍｇ／ｍｌ）に加える。透過型走査電子顕微鏡を行って、粒径が１５０〜３００ｎｍの大きさを超えないよう調べる（Ｒｏｙら  １９９９）。この製剤では、プラスミドはＤＮアーゼ分解から部分的に保護され、そのゲル移動特性は、複合体の形成方法によって変化しない。
【０１５１】
［００１４７］前述の記載及び実施例は、本発明の実施形態を記載する。当業者には当然であろうが、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明のその他の実施形態が存在する。
【０１５２】
［００１４８］本明細書において参照されるすべての参照文献は、参照により組み込まれる。
【０１５３】
参考文献リスト
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Ｇａｂｒｉｅｌｅ，Ｊ．，  Ｃｕｌｖｅｒ，Ｋ．，  Ｓｈａｒｍａ，Ｓ．，  Ｚｈａｎｇ，Ｂ．，  Ｓｚｅｃｈｔｍａｎ，Ｈ．，  ａｎｄ  Ｍｉｓｈｒａ，Ｒ．，  ２００３．  Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｂｒａｉｎ，  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｑｕｉｎｐｉｒｏｌｅ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．  Ｓｙｎａｐｓｅ．  ４９，  ２６１−２６９．
Ｇａｂｒｉｅｌｅ，Ｊ．，  Ｒａｊａｒａｍ，Ｍ．，  Ｚｈａｎｇ，Ｂ．，  Ｓｈａｒｍａ，Ｓ．，  ａｎｄ  Ｍｉｓｈｒａ，Ｒ．Ｋ．，  ２００２．  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ４０−ｋＤａ  ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  Ｄ−ａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｎ  ｄｉｓｃｒｅｔｅ  ｂｒａｉｎ  ｒｅｇｉｏｎｓ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ４５３，  １３．
Ｇａｂｒｉｅｌｅ  Ｊ．，  Ｃｕｌｖｅｒ  Ｋ，  Ｚｈａｎｇ  Ｂ，  Ｓｚｅｃｈｔｍａｎ  Ｈ，  ａｎｄ  Ｍｉｓｈｒａ  Ｒ．Ｋ．  Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｒａｔ  ｂｒａｉｎ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｑｕｉｎｐｉｒｏｌｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．  Ｓｙｎａｐｓｅ  （ａｃｃｅｐｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｒｅｖｉｓｉｏｎｓ）．  ２００３．
Ｒｅｆ  Ｔｙｐｅ：  Ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ｗｏｒｋ
Ｇａｂｒｉｅｌｅ，Ｊ．Ｐ．，  Ｃｈｏｎｇ，Ｖ．Ｚ．，  Ｐｏｎｔｏｒｉｅｒｏ，Ｇ．Ｆ．，  ａｎｄ  Ｍｉｓｈｒａ，Ｒ．Ｋ．，  ２００５．  Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ４０−ｋＤａ  ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｖｅｎｔｒａｌ  ｓｔｒｉａｔｕｍ  ｏｆ  ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｓｔａｎｌｅｙ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ．  Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒ  Ｒｅｓ．  ７４，  １１１−１１９．
Ｇｉｆｆａｒｄ，Ｒ．Ｇ．，  Ｘｕ，Ｌ．，  Ｚｈａｏ，Ｈ．，  Ｃａｒｒｉｃｏ，Ｗ．，  Ｏｕｙａｎｇ，Ｙ．，  Ｑｉａｏ，  Ｙ．，  Ｓａｐｏｌｓｋｙ，Ｒ．，  Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，Ｇ．，  Ｈｕ，Ｂ．，  ａｎｄ  Ｙｅｎａｒｉ，Ｍ．Ａ．，  ２００４．  Ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ，  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｂｒａｉｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｈｙｐｏｘｉｃ／ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｉｎｊｕｒｙ．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ．  ２０７，  ３２１３−３２２０．
Ｇｏｔｏ，Ａ．，  Ｄｏｅｒｉｎｇ，Ｌ．，  Ｎａｉｒ，Ｖ．Ｄ．，  ａｎｄ  Ｍｉｓｈｒａ，Ｒ．Ｋ．，  ２００１．  Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ４０−ｋＤａ  ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｉｇｒｏｓｔｒｉａｔａｌ  ｐａｔｈｗａｙ．  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  ９００，  ３１４−３１９．
Ｇｒａｖｅｌｅｙ，Ｂ．Ｒ．，  ２００１．  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ：  ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ｗｏｒｌｄ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．  １７，  １００−１０７．
Ｇｒｏｖｅｒ，Ａ．，  ２００２．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｓｔｒｅｓｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ．  ７，  １−５．
Ｈｏｎｇ，Ｋ．Ｓ．，  ＭｃＩｎｎｅｓ，Ｌ．Ａ．，  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｓ．Ｋ．，  Ｓｏｎｇ，Ｔ．，  Ｌｕｃａｓ，Ｊ．，  Ｓｉｌｖａ，Ｓ．，  Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ｅ．，  Ｌｅｏｎ，Ｐ．，  Ｍｏｌｉｎａ，Ｊ．，  Ｒｅｕｓ，Ｖ．Ｉ．，  Ｓａｎｄｋｕｉｊｌ，Ｌ．Ａ．，  ａｎｄ  Ｆｒｅｉｍｅｒ，Ｎ．Ｂ．，  ２００４．  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅ  ａｎｄ  ｍｏｄｅｌ−ｆｒｅｅ  ｌｉｎｋａｇｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ｐｒｅｖｉｏｕｓ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  ｌｏｃｕｓ  ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｉｎｇ  ｔｏ  ｓｅｖｅｒｅ  ｂｉｐｏｌａｒ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ  ａｔ  ５ｑ３１−３３．  Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ  Ｂ  Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｉａｔｒ  Ｇｅｎｅｔ．  １２５，  ８３−８６．
Ｋａｕｌ，Ｓ．Ｃ．，  Ｔａｉｒａ，Ｋ．，  Ｐｅｒｅｉｒａ−Ｓｍｉｔｈ，Ｏ．Ｍ．，  ａｎｄ  Ｗａｄｈｗａ，Ｒ．，  ２００２．  Ｍｏｒｔａｌｉｎ：  ｐｒｅｓｅｎｔ  ａｎｄ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ．  Ｅｘｐ  Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．  ３７，  １１５７−１１６４．
Ｋａｕｌ，Ｓ．Ｃ．，  Ｙａｇｕｃｈｉ，Ｔ．，  Ｔａｉｒａ，Ｋ，  Ｒｅｄｄｅｌ，Ｒ．Ｒ．，  ａｎｄ  Ｗａｄｈｗａ，Ｒ．，  ２００３．  Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｓｅｄ  ｍｏｒｔａｌｉｎ  （ｍｏｔ−２）／ｍｔｈｓｐ７０／ＧＲＰ７５  ａｎｄ  ｈＴＥＲＴ  ｃｏｏｐｅｒａｔｅ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ｔｈｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｌｉｆｅｓｐａｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  ２８６，  ９６−１０１．
Ｋｎａｂｌｅ，Ｍ．Ｂ．，  １９９９．  Ｓｃｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ  ａｎｄ  ｂｉｐｏｌａｒ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ：  ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｆｒｏｍ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｔａｎｌｅｙ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ．  Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒ  Ｒｅｓ．  ３９，  １４９−１５２．
Ｋｎａｂｌｅ，Ｍ．Ｂ．，  Ｔｏｒｒｅｙ，Ｅ．Ｆ．，  Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ｍ．Ｊ．，  ａｎｄ  Ｂａｒｔｋｏ，Ｊ．Ｊ．，  ２００１．  Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｅｆｒｏｎｔａｌ  ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｄａｔａ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｓｔａｎｌｅｙ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ．  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｂｕｌｌ．  ５５，  ６５１−６５９．
Ｌｅｗｉｓ，Ｃ．Ｍ．，  Ｌｅｖｉｎｓｏｎ，Ｄ．Ｆ．，  Ｗｉｓｅ，Ｌ．Ｈ．，  ＤｅＬｉｓｉ，Ｌ．Ｅ．，  Ｓｔｒａｕｂ，Ｒ．Ｅ．，  Ｈｏｖａｔｔａ，Ｉ．，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｎ．Ｍ．，  Ｓｃｈｗａｂ，Ｓ．Ｇ．，  Ｐｕｌｖｅｒ，Ａ．Ｅ．，  Ｆａｒａｏｎｅ，Ｓ．Ｖ．，  Ｂｒｚｕｓｔｏｗｉｃｚ，Ｌ．Ｍ．，  Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｃ．Ａ．，  Ｇａｒｖｅｒ，Ｄ．Ｌ．，  Ｇｕｒｌｉｎｇ，Ｈ．Ｍ．，  Ｌｉｎｄｈｏｌｍ，Ｅ．，  Ｃｏｏｎ，Ｈ．，  Ｍｏｉｓｅｓ，Ｈ．Ｗ．，  Ｂｙｅｒｌｅｙ，Ｗ．，  Ｓｈａｗ，Ｓ．Ｈ．，  Ｍｅｓｅｎ，Ａ．，  Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｒ．，  Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，Ｆ．Ａ．，  Ｗａｌｓｈ，Ｄ．，  Ｋｅｎｄｌｅｒ，Ｋ．Ｓ．，  Ｅｋｅｌｕｎｄ，Ｊ．，  Ｐａｕｍｉｏ，Ｔ．，  Ｌｏｎｎｑｖｉｓｔ，Ｊ．，  Ｐｅｌｔｏｎｅｎ，Ｌ．，  Ｏ’Ｄｏｎｏｖａｎ，Ｍ．Ｃ．，  Ｏｗｅｎ，Ｍ．Ｊ．，  Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｍ．，  Ｃｒｏｗｅ，Ｒ．Ｒ．，  Ｃｌｏｎｉｎｇｅｒ，Ｃ．Ｒ．，  Ｔｓｕａｎｇ，Ｍ．Ｔ．，  Ｍａｌａｓｐｉｎａ，Ｄ．，  Ｈａｒｋａｖｙ−Ｆｒｉｅｎｄｍａｎ，Ｊ．Ｍ．，  Ｓｖｒａｋｉｃ，Ｄ．Ｍ．，  Ｂａｓｓｅｔｔ，Ａ．Ｓ．，  Ｈｏｌｃｏｍｂ，Ｊ．，  Ｋａｌｓｉ，Ｇ．，  ＭｃＱｕｉｌｌｉｎ，Ａ．，  Ｂｒｙｎｊｏｌｆｓｏｎ，Ｊ．，  Ｓｉｇｍｕｎｄｓｏｎ，Ｔ．，  Ｐｅｔｕｒｓｓｏｎ，Ｈ．，  Ｊａｚｉｎ，Ｅ．，  Ｚｏｅｇａ，Ｔ．，  ａｎｄ  Ｈｅｌｇａｓｏｎ，Ｔ．，  ２００３．  Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｃａｎ  ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ  ａｎｄ  ｂｉｐｏｌａｒ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ，  ｐａｒｔ  ＩＩ：  Ｓｃｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ．  Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ．  ７３，  ３４−４８．
Ｍａｃａｒｉｏ，Ａ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｃｏｎｗａｙ，ｄ．Ｍ，  ２００２．  Ｓｉｃｋ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ  ａｎｄ  ａｇｅｉｎｇ：  ａ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．  Ａｇｅｉｎｇ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ．１，  ２９５−３１１．
Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｍ．，  Ｗｅｉｃｋｅｒｔ，Ｃ．Ｓ．，  Ｂｅｌｔａｉｆａ，Ｓ．，  Ｋｏｌａｃｈａｎａ，Ｂ．，  Ｃｈｅｎ，Ｊ．，  Ｈｙｄｅ，Ｔ．Ｍ．，  Ｈｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｍ．，  Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，Ｄ．Ｒ．，  ａｎｄ  Ｋｌｅｉｎｍａｎ，Ｊ．Ｅ．，  ２００３．  Ｃａｔｅｃｈｏｌ  Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  （ＣＯＭＴ）  ｍＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｏｒｓｏｌａｔｅｒａｌ  ｐｒｅｆｒｏｎｔａｌ  ｃｏｒｔｅｘ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ．  Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．  ２８，  １５２１−１５３０．
Ｍｏｄｉ，Ｐ．Ｉ．，  Ｋａｓｈｙａｐ，Ａ．，  Ｎａｉｒ，Ｖ．Ｄ．，  Ｒｏｓｓ，Ｇ．Ｍ．，  Ｆｕ，Ｍ．，  Ｓａｖｅｌｌｉ，Ｊ．Ｅ．，  Ｍａｒｃｏｔｔｅ，Ｅ．Ｒ．，  Ｂａｒｌａｓｓ，Ｃ．，ａｎｄ  Ｍｉｓｈｒａ，Ｒ．Ｋ．，  １９９６．  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｒａｉｎ  ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅ  ａｂｓｏｒｂｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ  ａｇｅｎｔｓ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２９９，  ２１３−２２０．
Ｍｏｄｒｅｋ，Ｂ．  ａｎｄ  Ｌｅｅ，Ｃ．Ｊ．，  ２００３．  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ，  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｒａｔ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆ  ｅｘｏｎ  ｃｒｅａｔｉｏｎ  ａｎｄ／ｏｒ  ｌｏｓｓ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．  ３４，  １７７−１８０．
Ｍｕｃｈｏｗｓｋｉ，Ｐ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｗａｃｋｅｒ，Ｊ．Ｌ．，  ２００５．  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，  ６，  １１−２２．
Ｎａｉｒ，Ｖ．Ｄ．  ａｎｄ  Ｍｉｓｈｒａ，Ｒ．Ｋ．，  ２００１．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ４０−ｋＤａ  ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ７６，  １１４２−１１５２．
Ｏｈｔｓｕｋａ，Ｋ．  ａｎｄ  Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．，  ２０００．  Ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｂｕｌｌ．  ５３，  １４１−１４６．
Ｐｅｒｌｍａｎ，Ｗ．Ｒ．，  Ｗｅｉｃｋｅｒｔ，Ｃ．Ｓ．，  Ａｋｉｌ，Ｍ，  ａｎｄ  Ｋｌｅｉｎｍａｎ，Ｊ．Ｅ．，  ２００４．  Ｐｏｓｔｍｏｒｔｅｍ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｐｆｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ：  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｇｅｎｅｓ．  Ｊ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ２９，  ２８７−２９３．
Ｐｉｒａ，Ｌ．，  Ｍｏｎｇｅａｎ，Ｒ．，  ａｎｄ  Ｐａｎｉ，Ｌ．，  ２００４．  Ｔｈｅ  ａｔｙｐｉｃａｌ  ａｎｔｉｐｓｙｃｈｏｔｉｃ  ｑｕｅｔｉａｐｉｎｅ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｂｏｔｈ  ｎｏｒａｄｒｅｎａｌｉｎｅ  ａｎｄ  ｄｏｐａｍｉｎｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｐｒｅｆｒｏｎｔａｌ  ｃｏｒｔｅｘ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ５０４，  ６１−６４．
Ｒｏｓｓ，Ｇ．Ｍ．，  ＭｃＣａｒｒｙ，Ｂ．Ｅ．，  ａｎｄ  Ｍｉｓｈｒａ，Ｒ．Ｋ．，  １９９５．  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｂｒａｉｎ  ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅ−ａｂｓｏｒｂｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｈｉｇｈ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ−ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ６５，  ２７８３−２７８９．
Ｒｏｓｓ，Ｇ．Ｍ．，  ＭｃＣａｒｒｙ，Ｂ．Ｅ．，  Ｔｈａｋｕｒ，Ｓ．，  ａｎｄ  Ｍｉｓｈｒａ，Ｒ．Ｋ．，  １９９３．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅ  ａｂｓｏｒｂｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｊ  ｍｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ４，１４１−１４８．
Ｓｅａｍａｎｓ，Ｊ．Ｋ．，  ａｎｄ  Ｙａｎｇ，Ｃ．Ｒ．，  ２００４．  Ｔｈｅ  ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｄｏｐａｍｉｎｅ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｆｒｏｎｔａｌ  ｃｏｒｔｅｘ．  Ｐｒｏｇ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．  ７４，  １−５８．
Ｓｅｅｍａｎ，Ｐ．  ａｎｄ  Ｋａｐｕｒ，Ｓ．，  ２０００．  Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ：  ｍｏｒｅ  ｄｏｐａｍｉｎｅ，  ｍｏｒｅ  Ｄ２  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ９７，  ７６７３−７６７５．
Ｓｅｌｅｍｏｎ，Ｌ．Ｄ．  ａｎｄ  Ｒａｊｋｏｗｓｋａ，Ｇ．．，  ２００３．  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｏｒｓｏｌａｔｅｒａｌ  ｐｒｅｆｒｏｎｔａｌ  ｃｏｒｔｅｘ  ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｓ  ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ  ｆｒｏｍ  ｂｉｐｏｌａｒ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ．  Ｃｕｒｒ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．  ３，  ４２７−４３６．
Ｓｈａｒａｎ，Ｎ．，  Ｃｈｏｎｇ，Ｖ．Ｚ．，  Ｎａｉｒ，Ｖ．Ｄ．，  Ｍｉｓｈｒａ，Ｒ．Ｋ．，  Ｈａｙｅｓ，Ｒ．Ｊ．，  ａｎｄ  Ｇａｒｄｎｅｒ，Ｅ．Ｌ．，  ２００３．  Ｃｏｃａｉｎｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ４０  ｋＤａ  ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｄｅｓｃｒｅｔｅ  ｂｒａｉｎ  ｒｅｇｉｏｎｓ．  Ｓｙｎａｐｓｅ．  ４７，  ３３−４４．
Ｓｈａｒａｎ，Ｎ．，  Ｎａｉｒ，Ｖ．Ｄ．，  ａｎｄ  Ｍｉｓｈｒａ，Ｒ．Ｋ．，  ２００１．  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ４０−ｋＤａ  ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｙ  ｄｏｐａｍｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ４１３，  ７３−７９．
Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｙ．  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ａ．Ｌ．，  ２００１．  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｆｅｎｓｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  ａ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ  ｔｈｉｎｋｓ  ａｂｏｕｔ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｅｓｅａｓｅｓ．  Ｎｅｕｒｏｎ．  ２９，  １５−３２．
Ｓｋｌａｒ，Ｐ．，  Ｐａｔｏ，Ｍ．Ｔ．，  Ｋｉｒｂｙ，Ａ．，  Ｐｅｔｒｙｓｈｅｎ，Ｔ．Ｌ．，  Ｍｅｄｅｉｒｏｓ，Ｈ．，  Ｃａｒｖａｌｈｏ，Ｃ．，  Ｍａｃｅｄｏ，Ａ．，  Ｄｏｕｒａｄｏ，Ａ．，  Ｃｏｅｌｈｏ，Ｉ．，  Ｖａｌｅｎｔｅ，Ｊ．，  Ｓｏａｒｅｓ，Ｍ．Ｊ．，  Ｆｅｒｒｅｉｒａ，Ｃ．Ｐ．，  Ｌｅｉ，Ｍ．，  Ｖｅｒｎｅｒ，Ａ．，  Ｈｕｄｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．，  Ｍｏｒｌｅｙ，Ｃ．Ｐ．，  Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｊ．Ｌ．，  Ａｚｅｖｅｄｏ，Ｍ．Ｈ．，  Ｌａｎｄｅｒ，Ｅ．，  Ｄａｌｙ，Ｍ．Ｊ．，  ａｎｄ  Ｐａｔｏ，Ｃ．Ｎ．，  ２００４．  Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｓｃａｎ  ｉｎ  Ｐｏｒｔｕｇｕｅｓｅ  Ｉｓｌａｎｄ  ｆａｍｉｌｉｅｓｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ５ｑ３１−５ｑ３５  ａｓ  ａ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｌｏｃｕｓ  ｆｏｒ  ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ  ａｎｄ  ｐｓｙｃｈｏｓｉｓ．  Ｍｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．  ９，  ２１３−２１８．
Ｓｔｉｐ，Ｅ．，  Ｔｒａｎｕｌｉｓ，Ｃ．，  Ｌｅｇａｒｅ，Ｎ．，  ａｎｄ  Ｐｏｕｌｉｎ，Ｍ．Ｊ．，  ２００３．  ［Ａｎｔｉｐｓｙｃｈｏｔｉｃ  ｄｒｕｇｓ．  Ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｄｉａｂｅｔｅｓ］．  Ｐｒｅｓｓ  Ｍｅｄ．  ３２，  １６１２−１６１７．
Ｓｏｔｉ，Ｃ．  ａｎｄ  Ｃｓｅｒｍｅｌｙ，Ｐ．，  ２００２ａ．  Ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ  ａｎｄ  ａｇｉｎｇ：  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎ  ｏｔｈｅｒ  ｃｉｖｉｌｉｚａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｅａｓｅｓ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  Ｉｎｔ．  ４１，  ３８３−３８９．
Ｓｏｔｉ，Ｃ．  ａｎｄ  Ｃｓｅｒｍｅｌｙ，Ｐ．，  ２００２ｂ．  Ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ  ｃｏｍｅ  ｏｆ  ａｇｅ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ．  ７，  １８６−１９０．
Ｓｖｅｎｓｓｏｎ，Ｔ．Ｈ．，  ２００３．  Ａｌｐｈａ−ａｄｒｅｎｏｃｅｐｔｏｒ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｐｓｙｃｈｏｔｉｃ  ａｔｙｐｉｃａｌｉｔｙ．  Ｐｒｏｇ  Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．  ２７，  １１４５−１１５８．
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【図面の簡単な説明】
【０１５４】
【図１】ＢＱ２２４１９３ＥＳＴから作製したフォワード及びリバースプライマー３種の組合せを用いて実施した逆転写酵素連鎖反応のアガロースゲル電気泳動結果を示す。
【図２】ＢＱ２２４１９３断片のトランスフェクションの前に実施された、ＢＱ２２４１９３フォワード及びリバースプライマー（それぞれ、ｐｌ及びｐ５）の制限酵素消化でのゲル電気泳動によって７４０ｂｐのバンドが同定されたことを示す図である。
【図３】ＢＱ２２４１９３融合タンパク質断片を形質転換し、増殖させた後のクマシーブルーを用いたアクリルアミドゲル電気泳動結果によって示し、１２℃での融合タンパク質の増殖が、最大の融合タンパク質部分を可溶化状態でもたらす。
【図４】ベクターからのトロンビンプロテアーゼでの切断で、純粋な、単離された２３ｋＤａの融合タンパク質が生じたことを示す。
【図５】組換えヒトＣＲＰ４０が、ラット及びウシＣＲＰと同様の方法でカテコールアミンと結合することを示す、タンパク質結合アッセイの結果をグラフにより示す。
【図６】ＢＱプライマーのＲＬＭ−ＲＡＣＥ  ＰＣＲ結果及び正の対照として用いたＨｅｌａ細胞を示す。
【図７】ヒトＡｍｂｉｏｎ脳ＲＮＡ及びｐ１、ｐ５プライマーとともに、５０μｇのＳＨＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫ポリＡ  ＲＮＡ及びＰ３２ｃＤＮＡプローブを用いたノーザンブロット分析の結果を示す。ブロットをストリップし、適切な大きさを決定するためにβアクチンでリプローブした。
【図８】リアルタイムＰＣＲを用い、ＢＱ２、４プライマー及びＳＨＳＹ５Ｙ細胞を用いるリアルタイムＰＣＲによる標準曲線である。
【図９】リアルタイムＰＣＲを用いて、ＨＡＬ処理された細胞対正常対照と比較する、ＤＡ  Ｄ２Ｌ受容体でトランスフェクトされたＳＨＳＹ５Ｙ細胞の増幅プロットである。
【図１０】同じＳＨＳＹ５Ｙ細胞を用い、ハウスキーピング遺伝子、ヒトシクロフィリンを用いる相対定量をグラフによって示す。
【図１１】ＳＨＳＹ５Ｙ  ＲＮＡ由来の１００ｎｇのｃＤＮＡ及びシクロフィリンプライマーを用いるリアルタイムＰＣＲの増幅プロットである。
【図１２】一次抗体としてヒトＣＲＰ４０及び二次蛍光抗体としてＦＩＴＣを用いる死後脳検体での免疫組織化学を用いる局在研究の結果をグラフによって示す。
【図１３−１】図１３Ａは、ヒトＣＲＰ４０のアミノ酸配列（配列番号８）を示す。図１３Ｂは、ヒトＣＲＰ４０の核酸配列（配列番号７）を示す。図１３Ｃは、ヒトＣＲＰ４０アミノ酸配列の機能特性を示す。図１３Ｄは、ヒトＣＲＰ４０の仮想３Ｄモデルを示す。
【図１３−２】図１３Ａは、ヒトＣＲＰ４０のアミノ酸配列（配列番号８）を示す。図１３Ｂは、ヒトＣＲＰ４０の核酸配列（配列番号７）を示す。図１３Ｃは、ヒトＣＲＰ４０アミノ酸配列の機能特性を示す。図１３Ｄは、ヒトＣＲＰ４０の仮想３Ｄモデルを示す。
【図１４】正常個体、双極性疾患を患う個体及び統合失調症を患う個体のヒト死後ＲＮＡにおけるＣＲＰ４０のＲＮＡ発現をグラフによって示す。
【図１５】薬物治療を受けていない個体、種々の範囲の抗精神病薬薬物治療を受けた個体のヒト死後ＲＮＡにおけるＣＲＰ４０のＲＮＡ発現をグラフによって示す。
【図１６】ＣＲＰ４０ノックダウン動物研究におけるプレパルス抑制をグラフによって示す。
【図１７】ＣＲＰ４０レベルに関する、統合失調症患者（ｎ＝６）と対照（ｎ＝４）の間のリアルタイムＰＣＲ有意差をグラフによって示す。
【図１８】ＣＲＰ４０レベルに関する、統合失調症患者（ｎ＝４）と対照（ｎ＝２）の間のリアルタイムＰＣＲ有意差をグラフによって示す。
【図１９】ＣＲＰ４０レベルに関する、薬剤未投与の統合失調症患者と対照の間のリアルタイムＰＣＲ有意差をグラフによって示す。
【図２０】ＣＲＰ４０レベルに関する、パーキンソン患者と対照の間のリアルタイムＰＣＲ有意差をグラフによって示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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