(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ククミス・サティブス植物由来の壊死抑制遺伝因子をそのゲノム内に含むうどんこ病耐性ククミス・サティブス（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ（キュウリ））植物であって、前記植物の露光量が２，０００Ｊ／ｃｍ２未満である条件下で、うどんこ病に耐性であり、壊死の生じない植物であって、前記壊死抑制遺伝因子の存在が、配列番号１（ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＡ）および配列番号２（ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＡＣＣＣ）によって同定される６５ｂｐの第１のＤＮＡマーカーの不在、ならびに配列番号３（ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＣ）および配列番号４（ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＡＴＣＧ）によって同定される１２３ｂｐの第２のＤＮＡマーカーの不在によって決定される植物であって、
種子がアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に受託番号ＰＴＡ−７３９４を付して２００６年２月１４日に受託されている植物。
【請求項２】
胚軸耐性遺伝子（ｓ）および葉耐性遺伝子（Ｒ）を含む、請求項１に記載の植物。
【請求項３】
前記耐性遺伝子の存在は、表３における配列番号５〜８によって同定されるヌクレオチド配列を含むマーカー、ならびにＡＦＬＰマーカーであるＥ１６／Ｍ５０−Ｆ−１９４、Ｅ１１／Ｍ４８−Ｆ−２５１、Ｅ２３／Ｍ３８−Ｍ００１、Ｅ２３／Ｍ４０−Ｍ００３、Ｅ２４／Ｍ４６−Ｍ００２、Ｅ２４／Ｍ４６−Ｍ００３、Ｅ１２／Ｍ４８−Ｍ００３、Ｅ２６／Ｍ４３−Ｍ００３、Ｅ１４／Ｍ５９−Ｆ−１３４およびＥ１４／Ｍ５９−Ｆ−２００からなる群から選択される１つまたは複数の特異的マーカーによって決定できる、請求項１または２に記載の植物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の植物の種子および／またはその他の植物部分。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の植物に由来するキュウリ果実。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、壊死の生じないうどんこ病耐性ククミス・サティブス（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ）植物に関する。さらに、本発明は、壊死の生じないうどんこ病耐性キュウリ植物を入手するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
キュウリ植物（即ち、植物種ククミス・サティブスの植物）は、メロンやカボチャと同様に、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅのウリ科に属する。キュウリは、約９６％が水分からなる、円筒形で表皮が緑色の果実である、植物の食用果実である。長年にわたり栽培されてきたキュウリ植物は、世界中で重要な園芸作物である。キュウリは、一般には未熟期に収穫され、酢漬け産業もしくは生鮮市場のために使用できる。
【０００３】
うどんこ病は、田畑および温室のどちらにおいても、キュウリ植物に知られている主要な真菌病の１つである。うどんこ病は、スフェロテカ・フリギネア（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｌｉｇｉｎｅａ（Ｓｃｈｌｅｃｈｔ．ｅｘ  Ｆｒ．）（近年、ポドスフェラ・キサンチイ（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ  ｘａｎｔｈｉｉ）と改名された）および／またはエリシフェ・シコラセアラム（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍ  ＤＣ）（ｅｘ  Ｍｅｒａｔ  ｅｍｅｎｄ．Ｓａｌｍ）（近年、ゴロビノマイセス・シコアセアラム（Ｇｏｌｏｖｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍ）と改名された）によって引き起こされ得る。温室栽培では、うどんこ病は、主として最初の種によって引き起こされる。これらの真菌は主として、開いてから２〜３週間後に最も感受性である葉において発生する。しかし重度の病害に冒された植物においては、これらの真菌は、茎や果実上でさえ発生する可能性がある。重度の病害に冒された葉は、乾燥して脆弱になることがある、またはしおれて枯死することがある。感染のために、果実はサイズが小さくなる、数が少なくなる、良好に保存することができなくなる、葉焼けする、成熟が不完全になる、そしていやな匂いを有する可能性がある。感染はさらに、植物が他の病原体に対してより脆弱になる素因を与えることもある。最終的には、その植物は枯死する場合がある。
【０００４】
現在まで、殺真菌剤の適用および真菌への耐性を備える品種の使用が主要な病害対策法であった。そこで、様々な商業的栽培品種において、両方の真菌に対する耐性が証明されてきた。胚軸耐性は劣性遺伝子（ｓ）に基づくが、葉耐性は優性葉遺伝子（Ｒ）によって制御されることが証明されている。全植物レベルでの高レベルの耐性のためには両方の遺伝子が必要である（Ｓｈａｎｍｕｇａｓｕｎｄａｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ６１：１２１８−１２２１，１９７１）。
【０００５】
しかしうどんこ病（ＰＭ）耐性栽培品種は、一般に弱光条件（即ち、植物の露光量が、植物によって２，０００Ｊ／ｃｍ２未満のエネルギーが摂取される＝２８６Ｊ／ｃｍ２／日未満である条件）下では、特に、高い着果負荷（ｆｒｕｉｔ  ｌｏａｄ）、即ち収穫期において１節当たり少なくとも１つの十分に成熟した果実が得られることと組み合わせると、壊死に苦しめられる。そのような条件は、特別には北欧諸国およびカナダにおける生産領域において、秋、冬および早春に発生することが多い。うどんこ病に対する耐性が植物の壊死に結び付いているという事実は、これらのうどんこ病耐性植物の実際的使用を制限する。
【０００６】
キュウリにおけるうどんこ病耐性に関連する壊死の症状は、葉の主葉脈間の黄変（退緑）から始まり、最終的には壊死（即ち、葉の枯死）を生じさせる。うどんこ病耐性と壊死感受性との間では正の相関が証明され、このことから両方の形質が遺伝的に密接に関連している、または壊死が１つまたは複数の耐性遺伝子の多面発現効果であるという提案が導かれた。
【０００７】
欧州特許第１４３３３７８号明細書では、１つのククミス・サティブス系統（ＤＣ−１）におけるうどんこ病耐性と葉の壊死との間の遺伝的連鎖の切り離しについて記載されている。しかし、うどんこ病耐性関連性壊死現象の遺伝子制御についてはまだ解明されておらず、多数のキュウリ生産者は、うどんこ病耐性キュウリ栽培品種における壊死の発生に苦しめられている。その結果として、キュウリ生産は依然としてうどんこ病への感染を制御するために作物保護用の殺真菌剤の使用を含み、これは関係経費を増加させるだけではなく、健全な環境という観点においても望ましくない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで殺真菌剤の使用を減少させるためには、うどんこ病に対して耐性であり、壊死の生じない植物を提供すること、またはそのような植物を提供するための新規な方法を見い出すことが不可欠である。
【０００９】
本発明の目的は、うどんこ病感染に対して耐性であり、壊死の生じないククミス・サティブス植物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
これは、本発明によって、そのゲノム内に壊死抑制遺伝因子を含む、うどんこ病に対して耐性であり、壊死が生じないうどんこ病耐性ククミス・サティブス植物を提供することによって達成される。本発明の植物は、弱光条件（即ち、植物の露光量が、植物によって２，０００Ｊ／ｃｍ２未満のエネルギーが摂取される＝２８６Ｊ／ｃｍ２／日未満である条件）下で、特に、高い着果負荷と組み合わせても、うどんこ病に対して耐性であり、葉の壊死の症状を全く示さない。
【００１１】
本発明によると、新規な壊死抑制遺伝因子が同定されている。さらに、うどんこ病に対して耐性であり、壊死の生じないククミス・サティブス植物を同定および提供するために使用できる適切な分子マーカーが開発されている。この新規な遺伝因子は、うどんこ病関連性壊死を抑制することが見い出されている。この壊死抑制遺伝因子は、不完全優性遺伝因子である。つまり、ヘテロ接合性形およびホモ接合性形で存在するどちらの場合でも、その表現型は「壊死が生じない」になる。
【００１２】
本発明によって証明されるように（以下に示す）、欧州特許第１４３３３７８号明細書に記載されているキュウリ植物は、壊死抑制遺伝因子を含んでいない。
【００１３】
本発明の好ましい実施形態では、本植物は、うどんこ病病原体に対する高レベルの耐性を付与する公知の胚軸耐性遺伝子（ｓ）および葉耐性遺伝子（Ｒ）を含む。
【００１４】
うどんこ病耐性遺伝子の存在は、これらの耐性遺伝子に特異的に連結している特異的分子マーカーを用いて決定することができる。適切なマーカーは当分野において公知であり、例えば国際公開第２００７／０５３０１５号パンフレットに記載されている。そこで国際公開第２００７／０５３０１５号パンフレットに開示されているように、胚軸耐性遺伝子（即ち、国際公開第２００７／０５３０１５号パンフレットにおいてｐｍ−ｈと呼ばれているうどんこ病耐性の原因となるゲノム領域）の存在は、前記植物における前記うどんこ病耐性遺伝子と結び付いている特異的単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）マーカーの存在によって示される。葉耐性遺伝子（即ち、国際公開第２００７／０５３０１５号パンフレットにおいてｐｍ−１と呼ばれるうどんこ病耐性の原因となるゲノム領域）は、特異的単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）マーカー、または５ｂｐインサートである５−ＡＡＴＴＴ−３’’と表示される特異的挿入変異マーカーの存在によって示される。うどんこ病耐性遺伝子の存在を検出するために使用できるまた別のマーカーは、この状況において明示的に参照する国際公開第２００７／０５３０１５号パンフレットによって詳細に記載されているように、ＡＦＬＰマーカーであるＥ１６／Ｍ５０−Ｆ−１９４、Ｅ１１／Ｍ４８−Ｆ−２５１、Ｅ２３／Ｍ３８−Ｍ００１、Ｅ２３／Ｍ４０−Ｍ００３、Ｅ２４／Ｍ４６−Ｍ００２、Ｅ２４／Ｍ４６−Ｍ００３、Ｅ１２／Ｍ４８−Ｍ００３、Ｅ２６／Ｍ４３−Ｍ００３、Ｅ１４／Ｍ５９−Ｆ−１３４およびＥ１４／Ｍ５９−Ｆ−２００である。
【００１５】
本発明によると、壊死抑制遺伝因子は、うどんこ病耐性遺伝子：ｓおよびＲと比較して別の染色体上に位置することが証明されている。これは、キュウリ染色体マップで、うどんこ病耐性遺伝子および壊死抑制遺伝因子各々について特異的マーカーをマッピングすることによって遂行された。
【００１６】
本発明の好ましい実施形態では、前記植物のゲノム内での壊死抑制遺伝因子はさらに１つまたは複数のＤＮＡマーカーにも連結し、前記ＤＮＡマーカーの１つまたは複数を用いて前記植物のゲノム内での壊死抑制遺伝因子を決定することができる。ＤＮＡマーカーを使用することによって、うどんこ病耐性および壊死抑制遺伝因子の所望の組み合わせを備える植物を、スペースおよび時間を消費する壊死試験を実施する必要を伴わずに、容易に同定できる。ＤＮＡマーカーにより、当業者には周知であるゲル電気泳動法および化学薬品（例えば、臭化エチジウム）を用いた染色もしくは放射性プローブを用いた検出によって可視化できる遺伝子の差異が解明される。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態によると、壊死抑制遺伝因子は、配列番号１（ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＡ）および配列番号２（ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＡＣＣＣ）によって同定される約６５ｂｐの第１のＤＮＡマーカー、ならびに配列番号３（ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＣ）および配列番号４（ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＡＴＣＧ）によって同定される約１２３ｂｐの第２のＤＮＡマーカーからなる群から選択される１つまたは複数のＤＮＡマーカーに連結していて、それらによって同定することができる。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態によると、前記植物のゲノム内の壊死抑制遺伝因子のホモ接合性の存在は、少なくとも１つの前記ＤＮＡマーカーの不在によって同定される。好ましくは、前記植物のゲノム内の前記壊死抑制遺伝因子のホモ接合性の存在は、第１のＤＮＡマーカーおよび第２のＤＮＡマーカー両方の不在によって同定される。
【００１９】
本発明を導いた研究では、耐性植物中での本発明の一または複数の前記特異的遺伝子マーカーの不在は、壊死の生じない表現形（ｆｅｎｏｔｙｐｅ）についての指標であることが証明されている。本発明の分子マーカーは、いわゆる「トランス」マーカーである。ＤＮＡフラグメント（対立遺伝子）のホモ接合性の存在は、壊死抑制遺伝因子の不在と相関し、このため望ましくない壊死性表現型の指標である。ＤＮＡマーカーの不在は、それゆえ壊死抑制遺伝因子のホモ接合性の存在の指標である。つまり、一または複数のＤＮＡマーカーが不在である場合は、これは壊死抑制遺伝因子が植物のゲノム内においてホモ接合性で存在することを意味している。
【００２０】
本発明のまた別の好ましい実施形態によると、壊死抑制遺伝因子のヘテロ接合性の存在は、一または複数のＤＮＡマーカーのヘテロ接合性の存在によって同定される。壊死抑制遺伝因子は、不完全優性遺伝因子であることが見い出されている。つまり、ホモ接合性形およびヘテロ接合性形のどちらで存在する場合でも、表現型は「壊死が生じない」。したがって、本発明による一または複数のＤＮＡマーカーのヘテロ接合性の存在は、植物中における壊死抑制遺伝因子のヘテロ接合性の存在についての指標である。一または複数のＤＮＡマーカーのヘテロ接合性の存在は、例えば、Ｋｅｙｇｅｎｅ社（オランダ国ヴァーゲニンゲン）によって開発されたＡＦＬＰ−Ｑｕａｎｔａｒ（登録商標）Ｐｒｏなどの適切なソフトウエアを用いて決定することができる。
【００２１】
特に好ましい実施形態では、この植物は、２００６年２月１４日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（米合衆国バージニア州  ２０１１０−２２０９、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、マナッサス）に受託番号ＰＴＡ−７３９４を付して受託されている種子であるククミス・サティブス植物に由来する壊死抑制遺伝因子を含む。
【００２２】
本発明は、上述した植物の種子および／またはその他の植物部分にさらに関する。本発明による植物部分は、植物に由来する、例えば植物細胞、花粉、胚珠、葉、胚、根、根端、葯、花、茎、種子、プロトプラストおよびカルスである。
【００２３】
好ましい実施形態では、本発明は、上述したような植物に由来するキュウリ果実に関する。
【００２４】
本発明は、壊死の生じない、うどんこ病耐性ククミス・サティブス植物を入手するための方法であって、壊死抑制遺伝因子をうどんこ病耐性植物のゲノム内に導入するステップを含む方法にさらに関する。
【００２５】
本発明によると、うどんこ病耐性遺伝子および壊死抑制遺伝因子は、伝統的な繁殖技術および／または分子生物学的技術のような周知の技術を用いて植物のゲノム内に導入することができる。
【００２６】
前記方法の好ましい実施形態によると、うどんこ病耐性遺伝子は、公知の胚軸耐性遺伝子（ｓ）および葉耐性遺伝子（Ｒ）を含む。上記に示したように、うどんこ病耐性遺伝子の存在は、これらの耐性遺伝子に特異的に連結している特異的マーカーを用いて決定することができる。適切なマーカーは当分野において公知であり、例えば上述されている。好ましい実施形態では、壊死抑制遺伝因子の存在は、１つまたは複数の特異的ＤＮＡマーカーを用いて決定される。そこで本発明は、任意の疾患耐性および／または壊死試験を実施する必要を伴わずに対象の植物を同定できることを保証する、単純かつ信頼性の高い方法を提供する。
【００２７】
好ましくは、壊死抑制遺伝因子を同定するためのＤＮＡマーカーは、配列番号１（ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＡ）および配列番号２（ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＡＣＣＣ）によって同定される約６５ｂｐの第１のＤＮＡマーカー、ならびに配列番号３（ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＣ）および配列番号４（ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＡＴＣＧ）によって同定される約１２３ｂｐの第２のＤＮＡマーカーからなる群から選択される。
【００２８】
好ましい実施形態では、壊死抑制遺伝因子のホモ接合性の存在は、少なくとも１つの前記ＤＮＡマーカーの不在によって同定される。好ましくは、壊死抑制遺伝因子のホモ接合性の存在は、第１のＤＮＡマーカーおよび第２のＤＮＡマーカー両方の不在によって同定される。
【００２９】
本発明のまた別の好ましい実施形態によると、壊死抑制遺伝因子のヘテロ接合性の存在は、一または複数のＤＮＡマーカーのヘテロ接合性の存在によって同定される。
【００３０】
特定の好ましい実施形態では、壊死抑制遺伝因子は、それらの種子がＰＴＡ−７３９４の番号を付してＡＴＣＣに受託されているククミス・サティブス植物に由来する。
【００３１】
本発明は、その植物が壊死の生じない、上述した方法によって入手可能なうどんこ病耐性ククミス・サティブス植物、および／または前記植物の他の植物部分および果実にさらに関する。
【００３２】
さらに、本発明は、ククミス・サティブス植物において壊死耐性を同定するための方法であって、前記植物のゲノム内で１つまたは複数のＤＮＡマーカーを使用して壊死抑制遺伝因子の存在を検出するステップを含み、このときＤＮＡマーカーは、配列番号１（ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＡ）および配列番号２（ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＡＣＣＣ）によって同定される約６５ｂｐの第１のＤＮＡマーカー、ならびに配列番号３（ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＣ）および配列番号４（ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＡＴＣＧ）によって同定される約１２３ｂｐの第２のＤＮＡマーカーからなる群から選択される方法に関する。本発明の方法を用いると、壊死耐性を、ククミス・サティブス植物において、既に実生および／または若い植物において容易に検出できる。
【００３３】
好ましい実施形態では、壊死抑制遺伝因子のホモ接合性の存在は、少なくとも１つの前記ＤＮＡマーカーの不在によって同定される。好ましくは、壊死抑制遺伝因子のホモ接合性の存在は、第１のＤＮＡマーカーおよび第２のＤＮＡマーカー両方の不在によって同定される。
【００３４】
本発明のまた別の好ましい実施形態によると、壊死抑制遺伝因子のヘテロ接合性の存在は、一または複数のＤＮＡマーカーのヘテロ接合性の存在によって同定される。
【００３５】
＜用語の定義の説明＞
うどんこ病耐性の症状は、以下の通りに分類できる。
【００３６】
本発明によると、うどんこ病（ＰＭ）耐性のレベルは、以下の通りに分類できる。
レベル１＝人工接種後に第１本葉の表面積の１０％未満がＰＭに冒されている、胞子形成なし、分類：Ｒ／耐性；
レベル２＝人工接種後に第１本葉の表面積の１０〜５０％未満がＰＭに冒されている、一部の胞子形成あり、分類：ＩＲ／中間耐性；
レベル３＝人工接種後に第１本葉の表面積の５０％超がＰＭに冒されている、胞子形成あり、分類：Ｓ／感受性。
【００３７】
本発明によると、壊死は、以下の通りに分類できる。
レベル１：葉は緑色であり、植物は良好に機能かつ発達している（分類：壊死が生じていない）；
レベル２：葉の上に黄斑が現れ、葉のある程度の成長減退が見られる（分類：中間レベルの壊死が生じている）；
レベル３：多数の黄斑を伴う黄緑の葉、極めて重篤な成長問題があり、最終的には葉が部分的もしくは完全に枯れる（壊死）および時には植物の枯死さえ生じる（分類：壊死）。
【００３８】
「弱光条件」という表現は、即ち植物の露光量が、植物によって２，０００Ｊ／ｃｍ２未満のエネルギーが摂取される＝２８６Ｊ／ｃｍ２／日未満である条件を意味する。これらの条件下では、壊死の症状は、本発明の壊死抑制遺伝因子を含んでいない植物において発生する。
【００３９】
本発明による高い着果負荷は、１節当たり少なくとも１つの十分に成熟した（即ち収穫可能期にある）果実の着果負荷に関する。
【００４０】
本発明によって使用される用語「壊死抑制遺伝因子」は、壊死抑制特性を決定して、壊死抑制特性を親から子孫へ伝達するＤＮＡフラグメントに関する。本発明によって、壊死の生じない遺伝因子は不完全優性である、即ちホモ接合性およびヘテロ接合性のどちらで存在する場合においても、壊死の生じない表現型が観察されることが見い出されている。
【００４１】
本発明によるＤＮＡマーカーは、ゲノムの推測される隣接伸長鎖の存在もしくは不在を許容する単純なアッセイによって、例えばＰＣＲの後に電気泳動を行うことによって同定できるＤＮＡ配列を指す。マーカーは、例えば、ＡＦＬＰマーカーであってよい。
【００４２】
以下に、本発明を実施例によって詳細に例示する。
【実施例】
【００４３】
本発明を導いた研究においては、ククミス・サティブス植物において新規な壊死減少因子が同定されている。
【００４４】
うどんこ病胚軸および葉耐性、壊死性ククミス・サティブス（コードＢ、表１を参照）×うどんこ病胚軸および葉耐性、壊死の生じないククミス・サティブス（コードＡ、ＰＴＡ−７３９４の番号を付してＡＴＣＣに２００６年２月１４日に受託された）の分離集団を生成した。壊死抑制遺伝因子に連結しているＡＦＬＰマーカーは、バルクセグレガント法（Ｂｕｌｋｅｄ  Ｓｅｇｒｅｇａｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：ＢＳＡ）アプローチ（Ｍｉｃｈｅｌｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ８８：９８２８−９８２３２，１９９１）を用いて同定された。壊死抑制因子に結合したマーカーを、うどんこ病耐性遺伝子を含む連鎖群とは別個の連鎖群上でマッピングすることができた。
【００４５】
壊死抑制遺伝因子に結合したマーカーのバリデーションは、周知の分子生物学的方法によって、分離集団の植物上のこれらのマーカーおよび特定パネルの育種系統をスクリーニングするステップによって実施された。
【００４６】
国際公開第２００７／０５３０１５号パンフレットに記載され、表３に同定された分子マーカーを使用して、うどんこ病耐性遺伝子の存在／不在を決定した。
【００４７】
【表１】
0005466504.tif 000002
【００４８】
そこで、本発明による植物（コードＡ）においては、本発明の新規な壊死抑制遺伝因子に結合していると同定されている両方のＤＮＡマーカーが不在であることが明白になり、これは壊死抑制遺伝因子、従って壊死の生じない表現形（ｆｅｎｏｔｙｐｅ）の存在を示している。これとは対照的に、コードＢ（耐性、壊死性）によって示される植物および上記に述べた欧州特許第１４３３３７８号明細書に記載された植物では、これらのＤＮＡマーカーの両方が存在し、これらの植物が本発明の壊死抑制遺伝因子を含んでいないことを示している。
【００４９】
これらの植物のうどんこ病耐性遺伝子の存在は、さらに分子マーカー（表３に列挙した）を用いて試験されている。両方のマーカーの分析結果を表２に要約した。
【００５０】
これらの結果によって、コードＡおよびコードＢ（遺伝子型ＡおよびＢ）によって同定された植物が、全うどんこ病マーカーに対してホモ接合性であると判定され、最高レベルのうどんこ病耐性を示すが、他方、園芸品種名（ｃｖ．）Ｆｌａｍｉｎｇｏ（即ち、欧州特許第１４３３３７８号明細書に記載の植物）は、配列番号７および８によって同定されるＰＭマーカーに対してヘテロ接合性であると判定され、低レベルのうどんこ病耐性を示すことが、明らかに示されている。
【００５１】
そこでこれらのマーカーについてのデータは、壊死マーカーと比較したうどんこ病耐性マーカーの独立した分離挙動を示している。これは、うどんこ病耐性および壊死抑制遺伝因子が結合していないことを明白に証明している。
【００５２】
＜結合ＰＭ／壊死実生試験のプロトコール：＞
＜植物材料＞
オランダ国において実験を実施するための期間は、１１月１日〜２月１日である（弱光条件、１週当たり２，０００Ｊ／ｃｍ２＝２８６Ｊ／ｃｍ２／日未満のエネルギー）。実生（試験植物および対照）を、砂で被覆した２４℃のバーミキュライト中で成長させる。（ちょうど子葉が広がる）４〜５日後に、実生をグランドテーブル（ｇｒｏｕｎｄ  ｔａｂｌｅ）内に移植する。対照は、壊死感受性、ＰＭ耐性植物である。
【００５３】
＜病原体＞
市販で入手できるＦ１雑種であるＫａｍａｒｏｎ上で増殖させたスフェロテカ・フリギネア（ポドスフェラ・キサンチイ）品種２。
【００５４】
【表２】
0005466504.tif 000003
【００５５】
＜接種菌の調製＞
明確に胞子形成している葉を採取し、胞子を水中へ擦り取った。完全に湿潤させたチーズクロスで被覆した漏斗を通して接種材料を注入することによって、接種材料をふるい分けする。
【００５６】
ＦＤＡ（フルオレセイン二酢酸）を用いて染色した後にＵＶ顕微鏡を用いて、胞子の生育性をチェックし、さらに計数した後に、生存胞子の濃度を、胚軸上への初回接種のためには約１×１０５生存胞子数／ｍＬに、および第１本葉上の第２回接種のためには約５×１０４生存胞子数／ｍＬに調整する。
【００５７】
＜接種＞
実生には、移植の１〜２日後に（噴霧器を用いて）接種する。第２感染は、第１本葉がちょうど広がった時点（移植４〜６日後）に行う。
【００５８】
接種直後に土壌を湿らせることによって湿度を増加させると、感染を促進することができる。夜間温度：１８〜２０℃、日中温度：２２〜２５℃。
【００５９】
＜増殖の測定＞
（感染）５日後に低湿度であれば、土壌を毎日１回もしくは２回湿らせることによって、胞子形成を促進することができる。
【００６０】
＜症状の発生＞
若い植物における壊死を、最終接種の約１４日後に判定する。壊死のスコアは、上記に規定したように決定される。胚軸上および葉上のうどんこ病感染も、また、最終接種の約１４日後に判定される。うどんこ病感染のスコアは、上記に規定したように決定される。
【００６１】
【表３】
0005466504.tif 000004