(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
メタクリル酸又はメタクリルエステルの製造方法であって、
ＩＡ）３−ヒドロキシイソ酪酸又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートが、炭素源から形成される条件下で、アミノ酸トランスフェラーゼ、２−オキソイソバレレートデヒドロゲナーゼ、２−メチルアシル−補酵素Ａデヒドロゲナーゼ、エノイル−補酵素Ａヒドラターゼ及び３−ヒドロキシイソブチリル−補酵素Ａヒドロラーゼを過剰発現した細胞と、炭素源としてＬ−バリンを含有する栄養培地とを接触する方法工程、又はメチルマロニル−補酵素Ａムターゼ及び３−ヒドロキシイソブチレートデヒドロゲナーゼを過剰発現した細胞と、炭素源としてグルコースを含有する栄養培地とを接触する方法工程、又はグリセロールデヒドラターゼ、グリセロールデヒドラターゼのための再活性化因子、プロピオニル−補酵素Ａシンターゼ、クロトニル−補酵素Ａカルボキシラーゼ／レダクターゼ、マロニル−ＣｏＡレダクターゼ及び３−ヒドロキシイソブチレートデヒドロゲナーゼを過剰発現した細胞と、炭素源としてグリセロールを含有する栄養培地とを接触する方法工程を含む方法によって３−ヒドロキシイソ酪酸を製造し、３−ヒドロキシイソ酪酸を栄養培地から分離し、かつ３−ヒドロキシイソ酪酸を中和する方法工程、
ＩＢ）３−ヒドロキシイソ酪酸を脱水してメタクリル酸を形成させ、メタクリル酸をエステル化する方法工程
を含む方法。
【請求項２】
３−ヒドロキシイソ酪酸の、又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートの形成が、前駆体としてメチルマロン酸セミアルデヒドを介して実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記の細胞が、中間体としてスクシニル−補酵素Ａを介して、３−ヒドロキシイソ酪酸又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートを形成することができる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記の細胞が、中間体としてプロピオニル−補酵素Ａを介して、３−ヒドロキシイソ酪酸又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートを形成することができる、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記の細胞が、中間体としてアクリロイル−補酵素Ａを介して、３−ヒドロキシイソ酪酸又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートを形成することができる、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
３−ヒドロキシイソ酪酸の、又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートの形成が、前駆体として３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａを介して実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記の細胞が、中間体としてイソブチリル補酵素Ａを介して、３−ヒドロキシイソ酪酸又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートを形成することができる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記の細胞が、該細胞中で、請求項１に記載の少なくとも１つの酵素の活性を増加する方法工程を含む、遺伝的に改変された細胞を製造するための方法によって得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ポリメタクリル酸又はポリメタクリルエステルを製造するための方法であって、
ＩＩＩＡ）請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法によるメタクリル酸の製造工程、
ＩＩＩＢ）メタクリル酸の遊離基重合工程、
を含み、その際、遊離基重合反応の前又は後に、少なくとも１部分のメタクリル酸のカルボキシル基又はメタクリレートのカルボキシレート基をエステル化することができる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メタクリル酸又はメタクリルエステルの製造方法に、及びポリメタクリル酸又はポリメタクリルエステルの製造方法に関する。
【０００２】
メタクリル酸は、ポリマーの、特にそのアルキルエステルの形での製造に使用される重要な中間体である。よく知られているメタクリル酸誘導体の例は、メタクリル酸のメチルエステルである。メチルメタクリレートの現在の世界年産高は、約１５０万トンに達する。ポリメタクリルエステルは、大量の使用を有するプラスチック部門における原材料である。
【０００３】
メタクリル酸は、通常、触媒としての固体多金属酸化物組成物に対する２工程触媒作用によるＣ4炭素化合物、例えばブチレン、イソブチレン、ブタン、イソブタン、ｔ−ブチルアルコール又はメタカオリンの不均質ガス相酸化によって工業的に製造される。メタクリル酸に加えて、多数の二次生成物も含有する、得られた生成物ガス混合物は、続いて、メタクリル酸水溶液を生じる全体の濃縮反応を受け、又は好適な溶剤混合物に吸収される。これは、通常、続いて、蒸留、結晶化、抽出、又はそれらの方法の組合せによる、得られた液体相のさらなる精製である。Ｃ4炭素化合物の触媒ガス相酸化に加えて、メタクリル酸は、例えばＥＰ−Ａ−０ ３５６ ３１５号において記載されているように、触媒酸化の脱水素反応によってイソ酪酸からも形成されうる。メタクリル酸を製造するための他の可能性は、アセトンシアノヒドリン及び硫酸を、中間体としてメタクリルアミドの形成体と反応し、そしてさらに水と反応して、メタクリル酸を得る、"ＡＣＨ法"として公知であるものである。続いて得られたメタクリル酸は、蒸留によって精製される。この方法は、例えばＥＰ−Ａ−１ ３５９ １３７号において記載されている。
【０００４】
メタクリル酸の製造のためのそれらの従来の方法の欠点は、とりわけ、メタクリル酸自体の製造中、及び蒸留による精製を含むその後の工程中の双方で、熱応力を生じる方法工程が、重合化に対するメタクリル酸の著しい感受性のために、ダイマー又はオリゴマーの形成をもたらすことであり、これは、追加の精製の努力だけでなく、収率の損失を伴う。
【０００５】
本発明の目的は、従来技術の欠点を克服することであった。
【０００６】
特に、本発明の目的は、熱応力を含む最小の工程でメタクリル酸を生じる、メタクリル酸の製造方法を提供することであった。
【０００７】
さらに、この方法は、再生可能な資源から、特に炭水化物及び／又はグリセロールからメタクリル酸の製造を可能にすることを意図する。
【０００８】
前記の目的を達成するための寄与は、
ＩＡ）３−ヒドロキシイソ酪酸又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートが、炭素源から形成される条件下で、細胞の野生型と比較してより多くの３−ヒドロキシイソ酪酸又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートを形成することができるように細胞の野生型と比較して遺伝的に改変された細胞と、炭素源として、炭水化物、グリセロール、二酸化炭素、メタン、メタノール、Ｌ−バリン又はＬ−グルタメートを含有する栄養培地とを接触する工程を含む方法によって、３−ヒドロキシイソ酪酸を製造し、適宜、３−ヒドロキシイソ酪酸を栄養培地から分離し、及び適宜、３−ヒドロキシイソ酪酸を中和する方法工程であり、その際、３−ヒドロキシイソ酪酸の又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートの形成が、有利には、前駆体として、メチルマロン酸セミアルデヒドを介して又は３−ヒドロキシイソブチリル−補酵素Ａを介して実施する方法工程、
ＩＢ）メタクリル酸、及びで、３−ヒドロキシイソ酪酸を脱水して、メタクリル酸を形成させ、適宜、メタクリル酸をエステル化する方法工程
を含む、メタクリル酸又はメタクリルエステルの製造方法によって提供される。
【０００９】
３−ヒドロキシイソ酪酸の、又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートの形成が、前駆体としてメチルマロン酸セミアルデヒドによって生じることにおいて、その形成は、さらに、他の中間体として、スクシニル−補酵素Ａ、プロピオニル−補酵素Ａ又はアクリロイル−補酵素Ａによって、特に有利にはスクシニル−補酵素Ａによって、生じることが好ましい。３−ヒドロキシイソ酪酸の、又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートの形成が、前駆体として３−ヒドロキシイソブチリル−補酵素Ａによって生じることにおいて、その形成は、さらに、他の中間体としてイソブチリル−補酵素Ａによって、又は３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａによって、有利には３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａによって生じることが好ましい。
【００１０】
本発明の記載内容において使用される"前駆体"と言う用語は、ただ一つの反応工程において酵素的に３−ヒドロキシイソ酪酸に転化されることができる化学化合物を定義する一方で、"中間体"と言う用語は、ただ一つの反応工程において酵素的に３−ヒドロキシイソ酪酸に転化されることができない化学化合物を定義する。
【００１１】
本発明の記載内容において使用される"３−ヒドロキシイソ酪酸"と言う用語は、常に、問題の微生物によって形成された後に、ｐＨの機能として存在する形での、対応するＣ4カルボン酸を記載している。結果として、常に、前記の用語は、純粋な酸形（３−ヒドロキシイソ酪酸）、純粋な塩基形（３−ヒドロキシイソブチレート）、並びに酸のプロトン化及び脱プロトン化の形の混合物を含む。さらに、"３−ヒドロキシイソ酪酸"という用語は、主に、（Ｒ）及び（Ｓ）の立体異性体を含み、その際（Ｓ）立体異性体が特に好ましい。
【００１２】
"その野生型と比較して、より多く３−ヒドロキシイソ酪酸、又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートを形成することができること"という言葉は、遺伝的に改変された細胞の野生型が、あらゆる３−ヒドロキシイソ酪酸、又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートを形成することができないが、しかしそれらの化合物の少なくとも検出可能ではない量であり、及びそれらの化合物の検出可能な量が、遺伝子改変後に形成されることだけができることにおいても適用する。
【００１３】
有利には、細胞の"野生型"は、そのゲノムが自然に進化の結果として生じるような状態で存在する細胞をいう。この用語は、全体の細胞のため及び個々の遺伝子のために使用される。結果として、"野生型"と言う用語は、特に、それらの細胞、又はそれらの遺伝子を含まず、その際、それらの遺伝子配列は、少なくとも一部分で、組換え法によって改変される。
【００１４】
続いて、３−ヒドロキシイソ酪酸は、穏やかな条件下で脱水反応を受けることによってメタクリル酸を生じる。３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートの場合において、ポリヒドロキシアルカノエートで満たされている細胞に存在する小胞体を分離することができ、かつそのポリマーを、続いて、開裂して、脱水してメタクリル酸を得ることができる３−ヒドロキシイソ酪酸を得ることができる。
【００１５】
本記載内容において、本発明によって、本発明による方法において使用される遺伝的に改変された細胞は、少なくとも２倍、特に有利には少なくとも１０倍、より有利には少なくとも１００倍、さらにより有利には少なくとも１０００倍、及び最も有利には少なくとも１００００倍の細胞の野生型よりも多くの３−ヒドロキシイソ酪酸又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートを、定義された時間間隔内で、有利には２時間以内で、さらにより有利には８時間以内で、及び最も有利には２４時間以内で形成する方法で、遺伝的に改変されることが好ましい。生成物の形成における増加は、本記載内容において、例えば、別々に、しかし同一の条件（同一の細胞密度、同一の栄養培地、同一の培養条件）下で、好適な栄養培地における特定の時間間隔で、本発明による方法において使用される細胞、及びそれぞれの場合における野生型の細胞を成長し、そして続いて栄養培地における標的の生成物（３−ヒドロキシイソ酪酸又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエート）の量を測定することによって、測定されうる。
【００１６】
本発明による方法において使用される細胞は、原核細胞又は真核細胞であって良い。該細胞は、哺乳動物細胞（例えばヒト細胞）の、植物細胞の、又は微生物、例えば酵母、菌又は細菌の形を取って良く、その際微生物が特に好ましく、かつ細菌及び酵母が最も好ましい。
【００１７】
好適な細菌、酵母又は菌は、特に、細菌、酵母又は菌の菌株として、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ （ＤＳＭＺ）、Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙで寄託されている細菌、酵母又は菌である。
【００１８】
本発明によって好適である細菌は、
http://www.dsmz.de/species/bacteria.htm
の元に詳述されている属に属し、
本発明によって好適である酵母は、
http://www.dsmz.de/species/yeasts.htm
の元に詳述されている属に属し、
かつ、本発明によって好適である菌は、
http://www.dsmz.de/species/fungi.htm
の元に詳述されているものである。
【００１９】
特に有利には、本発明によって使用される細胞は、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、ブレビバクテリウム属（Brevibacterium）、バチリス属（Bacillus）、アシネトバクター属（Acinetobacter）、ラクトバシラス属（Lactobacillus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、カンジダ属（Candida）、ピチア属（Pichia）、クルベロマイセス属（Kluveromyces）、サッカロマイセス属（Saccharomyces）、エシェリキア属（Escherichia）、ジモモナス属（Zymomonas）、ヤロウイア属（Yarrowia）、メチロバクテリウム属（Methylobacterium）、ラルストニア属（Ralstonia）、シュードモナス属（Pseudomonas）、バークホルデリア属（Burkholderia）、及びクロストリジウム属（Clostridium）であり、その際、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、大腸菌（Escherichia coli）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、クルベロマイセス・ラクティス（Kluveromyces lactis）、カンジダ・ブランキィ（Candida blankii）、カンジダ・ルゴサ（Candida rugosa）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）、ジモモナス・モビリス（Zymonomas mobilis）、ヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、メチロバクテリウム・エキストロクエンス（Methylobacterium extorquens）、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）、特にラルストニア・ユートロファＨ１６（Ralstonia eutropha H16）、ロドスピリルム・ルブラム（Rhodospirillum rubrum）、ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）、パラコッカス・ベルスタス（Paracoccus versutus）、シュードモナス・アエロギノーサ（Pseudomonas aeroginosa）、アシネトバクター・カルコアセチカス（Acinetobacter calcoaceticus）、及びピキア・パストリス（Pichia pastoris）が特に好ましい。
【００２０】
３−ヒドロキシイソ酪酸又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートの形成が、前駆体としてメチルマロン酸セミアルデヒドによって行われる、本発明による方法の第一の変異体に従って、細胞が使用される。
【００２１】
本発明による方法のこの第一の変異体の第一の特定の実施態様に従って、３−ヒドロキシイソ酪酸の、又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートの形成が、有利には、中間体としてスクシニル−補酵素Ａを介して行われることが好ましく、その際、本発明による方法のこの実施態様において使用される遺伝的に改変された細胞は、有利には、炭素源として炭水化物、グリセロール又はグルタメートを使用することができる。
【００２２】
本明細書で、本発明による方法の第一の変異体の第一の特定の実施態様の記載内容において、本発明による方法のこの実施態様において使用される遺伝的に改変された細胞は、その野生型と比較して、スクシニル−補酵素Ａのメチルマロニル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ1の増加させた活性を特徴とすることが有利であってよい（図１を参照）。
【００２３】
酵素Ｅ1と関連して、及び酵素Ｅ2等の本記載内容に従うものにおいて前記で使用されている"酵素の増加させた活性"と言う用語は、有利には、増加させた細胞内活性として理解されるべきである。
【００２４】
細胞における酵素活性を増加することから生じるものは、酵素Ｅ1の活性の増加、及び以下で挙げられる全ての酵素に適用し、その際その活性は、適宜増加されうる。
【００２５】
主に、酵素活性における増加は、強いプロモーターを使用することによって、又は増加された活性を有する対応する酵素に関してコードする遺伝子又は対立遺伝子を使用すること、適宜それらの測定を組み合わせることによって、酵素に関してコードする遺伝子配列のコピー数を増加することによって達せられうる。本発明に従って遺伝的に改変されている細胞は、例えば、所望の遺伝子、この遺伝子の対立遺伝子又はそれらの一部を含有するベクター、及び遺伝子の発現を可能にするベクターで、形質転換、形質導入、接合又はそれらの方法の組合せによってもたらされる。その異種発現は、特に、遺伝子の、もしくは対立遺伝子の、細胞の染色体への、又は染色体外複製ベクターへの組込みによって達せられる。
【００２６】
実施例の方法によってピルベートカルボキシラーゼで細胞における酵素活性を増加するための可能性についての概要は、参照をもって本明細書に組込まれるＤＥ−Ａ−１００ ３１ ９９９号において見出され、かつ細胞における酵素活性を増加するための可能性に関する開示の内容は、本発明の開示の一部を形成する。
【００２７】
前記で、及びそれぞれの場合において以下で挙げられている酵素又は遺伝子の発現は、１−及び２−次元タンパク質ゲル分離、及び続く好適な評価ソフトウェアを使用するタンパク質濃度の可視同定を使用してゲル中で検出されうる。酵素活性の増加が、排他的に、問題の遺伝子の発現における増加を基礎とする場合に、酵素活性における増加の定量化が、野生型と遺伝的に改変された細胞との１−又は２−次元タンパク質分離を比較することによる単純な方法で、測定されうる。コリネ型細菌における従来のタンパク質ゲルの製造方法及びタンパク質の同定方法は、Ｈｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２２：１７１２．２３（２００１年））によって記載されている方法である。そのタンパク質濃度は、検出されるべきタンパク質に特異的である抗体を使用するウェスタンブロットハイブリダイゼーション（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，第２版．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．ＵＳＡ，１９８９年）によって、続いて、濃度を決定するための好適なソフトウェアでの可視評価（Ｌｏｈａｕｓ及びＭｅｙｅｒ（１９８９年）Ｂｉｏｓｐｅｋｔｒｕｍ，５：３２〜３９；Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ（１９９９年），Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ １１１：２６３０〜２６４７）によっても分析されうる。ＤＮＡ結合タンパク質の活性は、ＤＮＡバンドシフトアッセイ（ゲル遅延とも言われる）によって測定されうる（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００１年）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１８３：２１５１〜２１５５）。他の遺伝子の発現に対するＤＮＡ結合タンパク質の効果は、レポーター遺伝子アッセイの、種々の広範に記載されている方法によって検出されうる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，第２版．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．ＵＳＡ，１９８９年）。細胞内の酵素活性は、記載されている種々の方法によって検出されうる（Ｄｏｎａｈｕｅ ｅｔ ａｌ．（２０００年）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １８２（１９）：５６２４〜５６２７； Ｒａｙ ｅｔ ａｌ．（２０００年）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １８２（８）：２２７７〜２２８４；Ｆｒｅｅｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９７３年）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １１５（３）： ８１６〜８２３）。特定の酵素の活性を測定する特異的な方法が、続くものにおいて詳細ではない場合には、酵素活性の増加の測定、及び酵素活性の低減の測定もまた、有利には、Ｈｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２２：１７１２〜２３（２００１年），Ｌｏｈａｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｐｅｋｔｒｕｍ ５ ３２〜３９（１９９８年），Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ １１１：２６３０〜２６４７（１９９９年）、及びＷｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ�� Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １８３：２１５１〜２１５５（２００１）において記載されている方法によって実施される。
【００２８】
酵素活性の増加が、およそ内在性遺伝子を突然変異することによってもたらされる場合に、かかる突然変異は、従来の方法を使用して、例えばＵＶ照射によって、もしくは変異原化学物質によって間接的に、又は組換え法、例えば欠失、挿入及び／又はヌクレオチド置換によって直接的に生じうる。それらの突然変異は、遺伝的に改変された細胞を生じさせる。酵素の特に好ましい突然変異体は、特に、野生型の酵素と比較して、もはやフィードバック阻害されることができず、又は少なくともほとんどフィードバック阻害されることができない酵素でもある。
【００２９】
酵素活性の増加が、およそ酵素の発現を増加することによってもたらされる場合に、その時、例えば、それぞれの遺伝子のコピー数が増加し、又は構造遺伝子の上流に位置するプロモーター及び調節領域もしくはリボソーム結合部位が突然変異される。構造遺伝子の上流で組込まれた発現カセットは、同様の方法で作用する。誘導性プロモーターによって、さらに、あらゆる所望の時点で発現を増加することが可能である。さらに、酵素遺伝子は、調節性配列としてのエンハンサー配列として公知であるものに割り当ててもよく、それらは、およそ、ＲＮＡポリメラーゼとＤＮＡとの間の改良された相互作用によって、増加させた遺伝子発現ももたらす。ｍＲＮＡの生存を延ばすための処置は、発現も改良する。さらに、酵素タンパク質の劣化を防ぐことは、酵素活性も高める。本明細書で、遺伝子又は遺伝子構成体は、種々のコピー数でプラスミドに存在し、又はそれらは染色体中に組込まれ、かつ増幅される。代わりとして、問題の遺伝子の過剰発現は、媒体組成物及び培地の制御を変更することによっても達せられてよい。
【００３０】
そうすることのための指示は、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５，１３７〜１４６（１９８７年））において、Ｇｕｅｒｒｅｒｏ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ １３８，３５〜４１（１９９４年））、Ｔｓｕｃｈｉｙａ及びＭｏｒｉｎａｇａ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６，４２８〜４３０（１９８８年））において、Ｅｉｋｍａｎｎｓ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ １０２，９３〜９８（１９９１年））において、ＥＰ−Ａ−Ｏ ４７２ ８６９号において、ＵＳ ４，６０１，８９３号において、Ｓｃｈｗａｒｚｅｒ及びＰｕｅｈｌｅｒ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９，８４〜８７（１９９１年）において、Ｒｅｉｎｓｃｈｅｉｄ ｅｔ ａｌ．（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎ− ｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６０，１２６〜１３２（１９９４年））において、ＬａＢａｒｒｅ ｅｔ ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７５，１００１〜１００７（１９９３年））において、ＷＯ−Ａ−９６／１５２４６号において、Ｍａｌｕｍｂｒｅｓ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ １３４，１５〜２４ （１９９３年）において、ＪＰ−Ａ−１０−２２９８９１号において、Ｊｅｎｓｅｎ及びＨａｍｍｅｒ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ５８，１９１〜１９５（１９９８年））において、当業者によって、特に、遺伝及び分子生物学の公知の教科書において、見出されうる。前記の処置は、突然変異を行うような、遺伝的に改変された細胞を生じる。
【００３１】
プラスミド、例えばエピソームプラスミドは、問題の遺伝子の発現を増加するために使用される。好適なプラスミドは、特に、コリネ型細菌に複製されるものである。多数の公知のプラスミドベクター、例えばｐＺ１（Ｍｅｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６４：５４９〜５５４（１９８９年））、ｐＥＫＥｘ１（Ｅｉｋｍａｎｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １０７：６９〜７４（１９９１年））、又はｐＨＳ２−１（Ｓｏｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １０７：６９〜７４（１９９１年））は、潜在プラスミドｐＨＭ１５１９、ｐＢＬｌ、又はｐＧＡｌに基づく。他のプラスミドベクター、例えばｐＣＧ４（ＵＳ ４，４８９，１６０号）、又はｐＮＧ２（Ｓｅｒｗｏｌｄ−Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ６６：１１９〜１２４（１９９０年））、又はｐＡＧ１（ＵＳ ５，１５８，８９１号）に基づくものは、同様の方法で使用されて良い。
【００３２】
好適である他のものは、染色体中への組込みによって遺伝子を増幅する方法が、例えばＲｅｉｎｓｃｈｅｉｄ ｅｔ ａｌ．（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６０：１２６〜１３２（１９９４年））によって記載されているように、ｈｏｍ−ｔｈｒＢオペロンを重複し、かつ増幅するための適用されうることを使用するプラスミドベクターである。この方法において、全体の遺伝子は、コリネバクテリウム・グルタミクム中ではなく、宿主（典型的に大腸菌）において複製することができるプラスミドベクター中にクローンを形成させる。好適なベクターは、例えば、ｐＳＵＰ３０１（Ｓｉｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １：７８４〜７９１（１９８３年））、ｐＫ１８ｍｏｂ又はｐＫ１９ｍｏｂ（Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １４５：６９〜７３ （１９９４年））、ｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｓｈｕｍａｎ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６９：３２６７８〜８４（１９９４年））、ｐＣＲ（登録商標）Ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，Ｎｉｅｄｅｒｌａｎｄｅ）、ｐＥＭ１（Ｓｃｈｒｕｍｐｆ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７３：４５１０〜４５１６））、又はｐＢＧＳ８（Ｓｐｒａｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ４１：３３７〜３４２（１９８６年））である。増幅されるべき遺伝子を含有するプラスミドベクターは、続いて、接合又は形質転換によって、所望のコリネバクテリウム・グルタミクム菌株中に伝達される。接合法は、例えば、Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６０：７５６〜７５９（１９９４年）において記載されている。形質転換法は、例えば、Ｔｈｉｅｒｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９：３５６〜３６２（１９８８年）、Ｄｕｎｉｃａｎ及びＳｈｉｖｎａｎ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１０６７〜１０７０（１９８９年）、並びにＴａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １２３：３４３〜３４７（１９９４年）において記載されている。交差法による均一な組換えに続いて、得られた菌株は、少なくとも２つの問題の遺伝子のコピーを有する。
【００３３】
前記で及び下記で使用される"細胞の野生型と比較して増加された酵素Ｅxの活性"の言葉は、有利には、常に、少なくとも２、特に有利には少なくとも１０、より有利には少なくとも１００、さらにより有利には少なくとも１０００、及び最も有利には少なくとも１００００の因数まで増加されたそれぞれの酵素Ｅxの活性を意味すると理解される。さらに、"細胞の野生型と比較して増加された酵素Ｅxの活性"を特徴とする本発明による方法において使用される遺伝的に改変された細胞、特に、細胞の野生型が、この酵素Ｅxの全く、又は少なくとも検出されない活性を特徴とし、かつ例えば過剰発現によって酵素活性を増加した後にのみ、この酵素Ｅxの検出可能な活性を示す細胞が含まれる。本記載内容において、下記で使用される"過剰発現"と言う用語、又は"発現の増加"と言う言葉は、酵素Ｅxの全く、又は少なくとも検出されない発現、及び検出される発現を特徴とする出発細胞、例えば、野生型細胞が、組換え法によってのみ誘発される場合も含む。
【００３４】
従って、以下で使用される"酵素Ｅxの低減された活性"と言う言葉は、有利には、少なくとも０．５、特に有利には少なくとも０．１、より有利には少なくとも０．０１、さらにより有利には少なくとも０．００１、及び最も有利には少なくとも０．０００１の因数まで低減される活性を意味すると理解される。特異的な酵素の活性における低減は、例えば、定方向突然変異によって、拮抗阻害剤もしくは非拮抗阻害剤の添加によって、又は当業者に公知である特異的な酵素の発現を低減するための他の方法によって、得られうる。
【００３５】
スクシニル−補酵素Ａのメチルマロニル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ1の場合において、これは、有利には、メチルマロニル−補酵素Ａムターゼ（ＥＣ ５．４．９９．２）の形を取る。この酵素は、有利には、ｍｕｔ、ｍｕｔＡ、ｍｕｔＢ、ｓｂｍ、ｓｂｍＡ、ｓｂｍＢ、ｓｂｍ５、ｂｈｂＡ、ｍｃｍＡ、ｍｃｍＡ１、ｍｃｍＡ２、ｍｃｍＢ、ｍｃｍ１、ｍｃｍ２、ｍｃｍ３、ｉｃｍＡ、ｍｅａＡ１及びｍｅａＡ２からなる群から選択される遺伝子によってコードされる。それらの遺伝子のヌクレオチド配列は、例えば、"Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ"（ＫＥＧＧデータベース）、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のデータベースにおいて、又はＥｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＥＭＢＬ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ及びＣａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）のヌクレオチド配列データベースから見出されうる。
【００３６】
本発明による方法の第一の変異体の特に好ましい実施態様に従って、酵素Ｅ1は、配列表番号０１において示されているようなＤＮＡ及び配列表番号０２において示されているようなアミノ酸を有する遺伝子によってコードされる、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３０３２からのメチルマロニル−補酵素Ａムターゼの形をとる。
【００３７】
さらに、３−ヒドロキシイソ酪酸の又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートの製造において、スクシニル−補酵素Ａが中間体として、かつ前駆体としてメチルマロン酸セミアルデヒドが形成される、遺伝的に改変された細胞を使用する本発明による方法の第一の変法に従って、本発明による方法のこの変法に従って使用される遺伝的に改変された細胞が、適宜酵素Ｅ1の増加された活性に加えて、その野生型と比較して増加された少なくとも１つの以下の酵素Ｅ2〜Ｅ4：
− メチルマロニル−補酵素Ａの、マロン酸メチルへの転化を触媒する酵素Ｅ2、
− マロン酸メチルの、メチルマロン酸セミアルデヒドへの転化を触媒する酵素Ｅ3、
− メチルマロン酸セミアルデヒドの、３−ヒドロキシイソ酪酸への転化を触媒する酵素Ｅ4、
の活性を特徴とすることが好ましい（図２を参照）。
【００３８】
本発明に従って、特に使用される細胞は、以下の酵素又は酵素の組合せ物：Ｅ2、Ｅ3、Ｅ4、Ｅ2Ｅ3、Ｅ2Ｅ4、Ｅ3Ｅ4、Ｅ2Ｅ3Ｅ4の活性を増加するものであり、その際Ｅ2Ｅ3Ｅ4が最も好ましい。さらに、酵素が、少なくとも２つの前記の反応工程を触媒することもできることが可能である。従って、例えば、配列表番号０３を有するＤＮＡ配列によってコードされ、かつ配列表番号０４において示されるようなアミノ酸配列を有する、酵素Ｅ2の活性及び酵素Ｅ3の活性の双方を特徴とする（並びに、従って、直接、メチルマロニル−補酵素Ａのメチルマロン酸セミアルデヒドへの転化を触媒する）酵素、例えばスルフォロバス・トコダイ（Sulfolobus tokodaii）からのマロニル補酵素Ａレダクターゼ、或いは、全ての３つの酵素活性Ｅ2、Ｅ3及びＥ4、例えばクロロフレクサス・オーランティアカス（Chloroflexus aurantiacus）からのマロニル補酵素Ａレダクターゼを特徴とする酵素を使用することが可能である（Ｈｕｅｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １８４、２４０４〜２４１０頁、２００２年）。
【００３９】
本記載内容において、特に、酵素
Ｅ2は、メチルマロニル−補酵素Ａヒドロラーゼ（ＥＣ ３．１．２．１７）であり、
Ｅ3は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．３）又はアルデヒドオキシダーゼ（ＥＣ １．２．３．１）であり、かつ
Ｅ4は、３−ヒドロキシイソブチレートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．３１）又は３−ヒドロキシアシル−補酵素Ａデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．３５）である
ことが好ましい。
【００４０】
酵素Ｅ2は、有利にはａｏｘ１遺伝子によってコードされる。ラットの肝臓からのメチルマロニル−補酵素Ａヒドロラーゼは、例えばＫｏｖａｃｈｙ ｅｔ ａｌ．、"Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ， ｉｓｏｌａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｔ ｌｉｖｅｒ Ｄ−ｍｅｔｈｙｌｍａｌｏｎｙｌ ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ"、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８（１９８３年）、１１４１５〜１１４２１頁において記載されている。
【００４１】
酵素Ｅ3は、有利には、ａｌｄｈ２、ａｌｄｈ３ａ１、ａｌｄｈ３ａ２、ａｌｄｈ１ｂ１、ａｌｄｈ９ａ１、ａｌｄｈ７ａ１、ａｌｄｈ１ａ４、ａｌｄｈ１ａ１、ａｌｄｈ１ａ２、ｍｇｃ８０７８５、ｍｇｃ８３３５２、ｍｇｃ８９０２０、ｄｍｅｌ−ＣＧ３１０７５、ｃｇ３７５２、ｃｇ９６２９、ａｌｈ−９、ａｌｈ−１、ａｌｈ−２、ｆ５Ｏ８．３５、ｔ７Ｏ２３．１５、ｆ１５Ｉ１．１９、ｔＴ１７Ｆ１５．１３０、ａｌｄ１、ａｌｄ２、ａｌｄ４、ａｌｄ５、ａｌｄ６、ａｃ１０４４Ｗｐ、ａｄｒ４１７ｗｐ、ｍｓｃ７、ｔｂ０６．５Ｆ５．７８０、ａｌｄＨ、ｐｕｕＣ、ｐｕｔＡ、ａｌｄＡ、ｂａｄＨ、ａｌｋＨ、ｐｃＤ、ｒｓｐ１５９１、ｒｓ０１０３１、ｅｘａＣ、ａｃｏＤ、ｄｈａＬ、ｐｃｈＡ、ａｌｄＢ、ｄｈａＳ、ｂｅｔＢ、ｙｗｄＨ、ｙｃｂＤ、ａｌｄＸ、ａｌｄＹ、ａｌｄＡ１、ａｌｄＡ２、ａｌｄＣ、ｐｃｄ、ｃｇ１０５４６、ｃｇ１２６６８、ｃｇ１２７９６、ｓｃｇ１１Ａ．０５、ｓｃｉ３０Ａ．２７ｃ、ｓｃｅ９．２７ｃ、ｓｃｋ１３．０５ｃ、ｓｃ５Ｈ４．０３、ｔｈｃＡ、ｇａｂＤ２、ａｌｋＨ、ａｌｄＨ、ａｌｄＨ１、ａｌｄＹ１、ａｌｄＹ２、ａｌｄＹ３、ａｌｄＹ４、ａｌｄＹ５、ａｌｄＹ６、ａｌｄＹ７及びａｌｄｈＴからなる群から選択される遺伝子によってコードされる。
【００４２】
酵素Ｅ4に関して好適な遺伝子は、ｈｉｂａｄｈ、ｃｇ１５０９３、ｃｇ１５０９３、ｃｇ４７４７、ｍｗＬ２．２３、ｔ１３ｋ１４．９０、ｆ１９ｂ１５．１５０、ｈｉｂＡ、ｙｇｂＪ、ｍｍｓＢ、ｍｍｓＢ、ｇａｒＲ、ｔｓａｒ、ｍｍｓＢ−１、ｍｍｓＢ−２、ｙｆｊＲ、ｙｋｗＣ、ｙｗｊＦ、ｈｉｂＤ、ｇｌｘＲ、ＳＣＭ１．４０ｃ、ｈｉｂＤ、ｅｈｈａｈｄ、ｈａｄｈ２、ｈａｄｈｓｃ、ｈｓｄ１７Ｂ４、ｌｏｃ４８８１１０、ｈａｄ、ｍｇＣ８１８８５、ｈａｄｈ２−ｐｒｏｖ、ｃｇ３４１５、ｃｇ７１１３、ｅｃｈ−１、ｅｃｈ−８、ｅｃｈ−９、ａｒｄ−１、ｙｆｃＸ、ｆａｄＢ、ｆａｏＡ、ｆａｄＢ２ｘ、ｈｂｄ−１、ｈｂｄ−２、ｈｂｄ−３、ｈｂｄ−４、ｈｂｄ−５、ｈｂｄ−６、ｈｂｄ−７、ｈｂｄ−８、ｈｂｄ−９、ｈｂｄ−１０、ｆａｄＪ、ｒｓ０４４２１、ｒｓ０２９４６、ｒｓ０５７６６、ｂｂｓＤ、ｂｂｓＣ、ｆａｄＢ１、ｆａｄＢ２、ｆａｄＢ５、ｈｂｄＡ、ｐｉｍＦ、ｆａｂＪ−１、ｆａｂＪ、ｓｃｂａｃ１９ｆ３．１１、ｓｃｉ３５．１３、ｓｃｂａｃ８ｄ１．１０ｃ、ｓｃ５ｆ２ａ．１５、ｓｃ６ａ５．３８、ｆａｄＣ２、ｆａｄＣ４、ｆａｄＣ５、ｆａｄＣ６、ｈａｄ及びｐａａＨからなる群から選択される。他の好適な３−ヒドロキシイソブチレートデヒドロゲナーゼは、例えば、Ｂａｎｎｅｒ ｊｅｅ ｅｔ ａｌ．（１９７０年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２４５、１８２８〜１８３５頁、Ｓｔｅｅｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９２年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７、１３５８５〜１３５９２頁、Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８８年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３、３２７〜３３１頁、Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｄａ、１６４５（１）、８９〜９５頁、Ｈａｗｅｓ ｅｔ ａｌ．（２０００年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、３２４、２１８〜２２８頁、Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７５（４９）、３８７８０〜３８７８６頁、Ｒｏｕｇｒａｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９８８年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３（１）、３２７〜３３１頁、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２２５、５１１〜５２１頁、Ｈａｗｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３４、４２３１〜４２３７頁、Ｈａｓｅｇａｗａ Ｊ．（１９８１年）、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、４５、２８０５〜２８１４頁、Ｈａｗｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９６年）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、３８９、２６３〜２６７頁、Ｈａｗｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９６年）、Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｃａｒｂｏｎｙｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、３９５〜４０２頁、Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４年）、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２、６５１〜６６８頁、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ｅｔ．（１９９９年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３８、１１２３１〜１１２３８頁、Ｍｉｒｎｙ ｅｔ ａｌ．、（１９９９年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２９１、１７７〜１９６頁、並びにＬｏｋａｎａｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００５年）、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌにおいて記載されている。それらの刊行物の開示は、参照をもって本明細書に組み込まれたものとし、かつ本発明の開示の一部を成す。
【００４３】
前記の遺伝子の、及び酵素Ｅ2〜Ｅ4に関する他の遺伝子のヌクレオチド配列は、特にＫＥＧＧデータベース、ＮＣＢＩデータベース、又はＥＭＢＬデータベースにおいても見出されうる。
【００４４】
３−ヒドロキシイソ酪酸の又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートの製造において、スクシニル−補酵素Ａが中間体として、及び前駆体としてメチルマロン酸セミアルデヒドが形成される場合に、遺伝的に改変された細胞が使用される、本発明による方法のこの変法の特に好ましい一実施態様に従って、配列表番号０３を有するＤＮＡ配列によってコードされ、かつ配列表番号０４において示されるようなアミノ酸配列を有するスルフォロバス・トコダイからのマロニル補酵素Ａレダクターゼが、メチルマロニル−補酵素Ａのメチルマロン酸セミアルデヒドへの転化にために使用されることが好ましい。この変異体の他の特に好ましい実施態様に従って、クロロフレクサス・オーランティアカスからのマロニル補酵素Ａレダクターゼ（Ｈｕｅｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １８４、２４０４〜２４１０頁、２００２年）は、メチルマロニル−補酵素Ａの３−ヒドロキシイソ酪酸への転化のために使用される。
【００４５】
さらに、本発明による方法の第一の特定の実施態様の第一の変法の記載内容において、この実施態様に従って使用される遺伝的に改変された細胞は、その野生型と比較して低減された、メチルマロン酸セミアルデヒドのプロピオニル−補酵素Ａへの転化を特徴とする酵素Ｅ5の活性を特徴とすることが好ましく、その際、この酵素は、有利には、メチルマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．２７）の形をとる。
【００４６】
３−ヒドロキシイソ酪酸の又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートの製造において、スクシニル−補酵素Ａが中間体として、及び前駆体としてメチルマロン酸セミアルデヒドが形成される、遺伝的に改変された細胞を使用する本発明による方法の第二の変法に従って、細胞は、適宜酵素Ｅ1の増加された活性に加えて、その野生型と比較して増加された少なくとも１つの次の酵素Ｅ4〜Ｅ7：
− （Ｒ）メチルマロニル−補酵素Ａの、（Ｓ）メチルマロニル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ6、
− （Ｓ）メチルマロニル−補酵素Ａの、プロピオニル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ7、
− プロピオニル−補酵素Ａの、メチルマロン酸セミアルデヒドへの転化を触媒する酵素Ｅ5、
− メチルマロン酸セミアルデヒドの、３−ヒドロキシイソ酪酸への転化を触媒する酵素Ｅ4
の活性を特徴とすることが好ましい（図３を参照）。
【００４７】
特に有利には、本発明に従って使用される細胞は、次の酵素又は酵素の組合せ物：Ｅ4、Ｅ5、Ｅ6、Ｅ7、Ｅ7、Ｅ4Ｅ5、Ｅ4Ｅ6、Ｅ4Ｅ7、Ｅ5Ｅ6、Ｅ5Ｅ7、Ｅ6Ｅ7、Ｅ4Ｅ5Ｅ6、Ｅ4Ｅ5Ｅ7、Ｅ4Ｅ6Ｅ7、Ｅ5Ｅ6Ｅ7及びＥ4Ｅ5Ｅ6Ｅ7の活性を増加するものであり、その際Ｅ4Ｅ5Ｅ6Ｅ7が最も好ましい。
【００４８】
本記載内容において、酵素
Ｅ6が、メチルマロニル−補酵素Ａエピメラーゼ（ＥＣ ５．１．９９．１）であり、
Ｅ7が、メチルマロニル−補酵素Ａデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．４１）であり、
Ｅ5が、メチルマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．２７）であり、かつ
Ｅ4が、３−ヒドロキシイソブチレートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．３１）、又は３−ヒドロキシアシル−補酵素Ａデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．３５）である
ことが特に好ましい。
【００４９】
本記載内容において、好ましい酵素Ｅ4は、本発明による方法の第一の好ましい実施態様の第一の変異体の記載内容において、既に前記で記載されているものである。
【００５０】
酵素Ｅ6は、有利にはｍｃｅｅ遺伝子によってコードされる。好適なメチルマロニル−補酵素Ａデカルボキシラーゼ（酵素Ｅ7）は、例えばＢｅｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．によるＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ．３９（２０００年）、４６３０〜４６３９頁において記載されている。
【００５１】
Ｅ5に関する好適な遺伝子は、有利には、ａｌｄｈ６ａ１、ｃｇ１７８９６、ｔ２２ｃ１２．１０、ａｌｄ６、ｐｕｔＡ１、ｍｍｓＡ、ｍｍｓＡ−１、ｍｍｓＡ−２、ｍｍｓＡ−３、ｍｍｓＡ−４、ｍｓｄＡ、ｉｏｌＡ及びｉｏｌＡＢからなる群から選択される。
【００５２】
酵素Ｅ7に関する好適な遺伝子は、有利には、ｍｍｄＡ、ｂｃｃ、ｏａｄＢ、ｏａｄＢ２、ｏａｄＢ３、ＳＣ１Ｃ２．１６、ＳＣ１Ｇ７．１０、ｐｃｃＢ１、ａｃｃＡ２、ｍｍｄＢ、ｍｍｄＣ及びｐｐｃＢからなる群から選択される。
【００５３】
酵素Ｅ5、Ｅ6及びＥ7に関する前記の遺伝子のヌクレオチド配列は、特に、ＫＥＧＧデータベースにおいても見出されてよい。
【００５４】
３−ヒドロキシイソ酪酸の又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートの製造において、スクシニル−補酵素Ａが中間体として、かつ前駆体としてメチルマロン酸セミアルデヒドが形成される、遺伝的に改変された細胞を使用する本発明による方法の第三の変法に従って、細胞は、適宜酵素Ｅ1の増加された活性に加えて、その野生型と比較して増加された少なくとも１つの次の酵素Ｅ4、Ｅ5及びＥ7：
− メチルマロニル−補酵素Ａの、プロピオニル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ7、
− プロピオニル−補酵素Ａの、メチルマロン酸セミアルデヒドへの転化を触媒する酵素Ｅ5、
− メチルマロン酸セミアルデヒドの、３−ヒドロキシイソ酪酸への転化を触媒する酵素Ｅ4
の活性を特徴とすることが好ましい（図４を参照）。
【００５５】
この経路は、実質的に、本発明による方法の第一の好ましい実施態様の第二の変異体に対応するが、しかし第二の変法に対して、プロピオニル−ＣｏＡが、メチルマロニル−補酵素Ａから直接製造される。酵素Ｅ4、Ｅ5及びＥ7に関する好ましい酵素及び遺伝子は、第二の変法に関して既に前記で挙げられている遺伝子又は酵素である。
【００５６】
さらに、本発明による方法の第一の特定の実施態様に従って（及びまだ以下に記載されている全ての実施態様にも従って）、形成された３−ヒドロキシイソ酪酸をポリヒドロキシアルカノエートに転化することができる、遺伝的に改変された細胞を使用することも好ましくてよい。かかるポリヒドロキシアルカノエートは、極めて屈折する顆粒の形で、多くの微生物によって細胞内に堆積される。本記載内容において、本発明による方法において使用される遺伝的に改変された細胞が、その野生型と比較して増加された、少なくとも１つの、有利には少なくとも２つの以下の酵素Ｅ8及びＥ9：
− ３−ヒドロキシイソ酪酸の、３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ8、
− ３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａの、３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートへの転化を触媒する酵素Ｅ9
の活性を特徴とすることが、特に好ましい（図５を参照）。
【００５７】
本記載内容において、酵素
Ｅ8が、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ ３．１．２．４）であり、かつ
Ｅ9が、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼである
ことが、特に好ましい。
【００５８】
既に前記で説明しているように、本発明による方法の第一の好ましい実施態様は、中間体としてスクシニル−補酵素Ａから及び前駆体としてメチルマロン酸セミアルデヒドから、３−ヒドロキシイソ酪酸又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートを生じる。本明細書で、原則として、１つ以上の前記の酵素活性Ｅ1〜Ｅ9だけでなく、細胞中でスクシニル−補酵素Ａの増加させた形成を導くそれらの酵素活性も作用した方がよい。
【００５９】
本発明による方法の第一の変異体の第一の特定の実施態様によって、３−ヒドロキシイソ酪酸の又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートの形成が、中間体としてスクシニル−補酵素Ａ及び前駆体としてメチルマロン酸セミアルデヒドによって炭水化物又はグリセロールから生じる場合に、本発明による方法の前記の第一の、第二の又は第三の変法の特定の実施態様によって、使用される遺伝的に改変された細胞が、その野生型と比較して増加された少なくとも１つの、有利には少なくとも２つの次の酵素Ｅ10及びＥ11：
− ホスホエノールピルベートの、オキサロ酢酸塩塩への転化を触媒する酵素Ｅ10、
− ピルベートの、オキサロ酢酸塩への転化を触媒する酵素Ｅ11
の活性を特徴とすることが好ましい（図６を参照）。
【００６０】
本記載内容において、酵素
Ｅ10が、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．３１）であり、かつ
Ｅ11が、ピルベートカルボキシラーゼ（ＥＣ ６．４．１．１）である
ことが、特に好ましい。
【００６１】
酵素Ｅ10は、有利には、ｆ１２ｍ１６．２１、ｆ１４ｎ２２．１３、ｋ１５ｍ２．８、ｐｐｃ、ｃｌｐＡ、ｐｅｐＣ、ｃａｐＰ、ｃｇｌ１５８５、ｐｅｐＣ、ｐｃｋ、ｐｐｃ及びｐｃｃＡからなる群から選択される遺伝子によってコードされ、その際ｐｐｃ遺伝子が、特に好ましい。本発明によって好ましいホスホエノールピルベートカルボキシラーゼは、特に、ＵＳ ４，７５７，００９号、ＵＳ ４，９８０，２８５号、ＵＳ ５，５７３，９４５号、ＵＳ ６，８７２，５５３号及びＵＳ ６，５９９，７３２号においても記載されている。ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼに関して、それらの文献の開示内容は、参照をもって本明細書に組み込まれたものとし、かつ本発明の開示の一部をなす。
【００６２】
酵素Ｅ11は、有利には、ｐｃ、ｐｃｘ、ｃｇ１５１６、ｃｇ１５１６、ｐｙｃ−１、ｐｙｃ−２、ａａｒ１６２Ｃｐ、ｐｙｒ１、ａｃｃＣ−２、ｐｙｃＡ、ｐｙｃＡ２、ｐｃａ、ｃｇ１０６８９、ｐｙｃ、ｐｙｃＢ、ａｃｃＣ、ｏａｄＡ、ａｃｃ及びａｃｃＣ１からなる群から選択される遺伝子によってコードされ、その際ｐｙｃ遺伝子が、特に好ましい。本発明によって好ましいピルベートカルボキシラーゼは、特に、ＵＳ ６，４５５，２８４号、ＵＳ ６，１７１，８３３号、ＵＳ ６，８８４，６０６号、ＵＳ ６，４０３，３５１号、ＵＳ ６，８５２，５１６号及びＵＳ ６，８６１，２４６号においても記載されている。本発明によって特に好ましい他のピルベートカルボキシラーゼは、"Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ｇｅｎｏｍｅ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ａ ｎｅｗ Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｍｕｔａｎｔ"、Ｏｈｎｉｓｈｉ Ｊ ｅｔ ａｌ．、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ． ５８ ，（２）、２１７〜２２３頁（２００２年）において記載されている突然変異体である。
【００６３】
酵素Ｅ10及びＥ11の好適な遺伝子のヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧデータベース、ＮＣＢＩデータベース、又はＥＭＢＬデータベースにおいて見出されうる。
【００６４】
オキサロ酢酸塩中間体工程からの出発は、最初に挙げられた３つの変異体によるメチルマロニル−補酵素Ａを介して３−ヒドロキシイソ酪酸に転化させることができる、スクシニル−補酵素Ａに達するためのいくつかの可能性がある。
【００６５】
最初の経路は、中間体としてフマレートを介して導く。この場合において、メチルマロン酸セミアルデヒドが前駆体として、及びスクシニル−補酵素Ａが中間体として形成される、遺伝的に改変された細胞が使用される、本発明による方法の前記の第一の、第二の又は第三の変法の第一の特定の実施態様に従って、細胞は、適宜酵素Ｅ10又はＥ11の増加された活性に加えて、その野生型と比較して増加された少なくとも１つの次の酵素Ｅ12〜Ｅ15：
− オキサロ酢酸塩の、マレートへの転化を触媒する酵素Ｅ12、
− マレートの、フマレートへの転化を触媒する酵素Ｅ13、
− フマレートの、スクシネートへの転化を触媒する酵素Ｅ14、
− スクシネートの、スクシニル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ15
の活性を特徴とすることが好ましい（図７を参照）。
【００６６】
本発明に従って、特に使用される細胞は、次の酵素又は酵素の組合せ物：Ｅ12、Ｅ13、Ｅ14、Ｅ15、Ｅ12Ｅ13、Ｅ12Ｅ14、Ｅ12Ｅ15、Ｅ13Ｅ14、Ｅ13Ｅ15、Ｅ14Ｅ15、Ｅ12Ｅ13Ｅ14、Ｅ12Ｅ13Ｅ15、Ｅ12Ｅ14Ｅ15、Ｅ13Ｅ14Ｅ15、Ｅ12Ｅ13Ｅ14Ｅ15の活性を増加させるものであり、その際Ｅ12Ｅ13Ｅ14Ｅ15が最も好ましい。
【００６７】
本記載内容において、酵素
Ｅ12が、マレートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．３７）又はマレートキノン酸化レダクターゼ（１．１．９９．１６）であり、
Ｅ13が、フマレートヒドラターゼ（ＥＣ ４．２．１．２）であり、
Ｅ14が、スクシネートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．３．９９．１もしくはＥＣ １．３．５．１）又はスクシネートキノン酸化レダクターゼ（１．３．５．１）であり、かつ
Ｅ15が、スクシネート補酵素Ａリガーゼ（ＥＣ ６．２．１．４又はＥＣ ６．２．１．５）である
ことが、特に好ましい。
【００６８】
酵素Ｅ12は、有利には、ｍｄｈ１、ｍｄｈ２、ｍｏｒ１、ｃｇ１０７４８、ｃｇ１０７４９、ｃｇ５３６２、ｍｄｈ−１、ｆ４６ｅ１０．１０、ｆ１９ｐ１９．１３、ｆ１２ｍ１６．１４、ｔ３０１２０．４、ｋ１５ｍ２．１６、ｆｌｐ２．７０、ｆ１７ｉ１４．１５０、ｍｎｌ１２．１８、ｍｉｋ１９．１７、ｍｄｈ３、ａｄｌ１６４ｃｐ、ａｄｒ１５２ｃｐ、ａｄｒ２５２ｗｐ、ｍｄｈＡ、ｍｄｈＣ、ｍｄｈＢ、ｙｂｉＣ、ｍｄｈ、ｙｉａＫ、ｙｂｉＣ、ａｌｌＤ、ｃｉｔＨ、ｙＪｍＣ、ｃｉｔＨ、ｃｇ１２３８０、ｌｄｈ、ｓｑｄＢ、ｍｑｏ、ｙｏｊＨ、ｍｑｏＡ、ｍｑｏＢ、ｍｑｏ１、ｍｑｏ２、ｍｑｏ３、ｍｑｏ４及びｃｇ１２００１からなる群から選択される遺伝子によってコードされ、その際ｍｑｏ遺伝子及びｍｄｈ遺伝子が、特に好ましい。
【００６９】
酵素Ｅ13は、有利には、ｆｈ、ｆｈ１、ｓｃ４０９４、ｓｃ４０９５、ｔ３０ｂ２２．１９、ｋ３ｋ７．１１、ａｃｒ０１３／ｃｐ、ｆｕｍ１、ｆｕｍ２、ｆｕｍ３、ｆｕｍ４、ｆｕｍＨ、ｆｕｍＡ、ｆｕｍＢ、ｆｕｍＣ、ｆｕｍＣ１、ｆｕｍＣ２、ｆｕｍ、ｔｔｄＡ、ｔｔｄＢ、ｆｕｍＢ−アルファ、ｆｕｍＢ−ベータ、ｃｉｔＧ、ｃｉｔＢ、ｆｕｍＸ、ｆｕｍ−１及びｆｕｍ−２からなる群から選択される遺伝子によってコードされ、その際ｆｕｍ遺伝子が、特に好ましい。
【００７０】
酵素Ｅ14は、有利には、ｓｄｈ１、ｓｄｈ２、ｓｄｈ３、ｓｄｈ４、ｓｄｈ５、ｓｄｈ６、ｏｓｍ１、ｏｓｍ２、ｓｄｈＡ、ｓｄｈＢ、ｓｄｈＣ、ｓｄｈＤ、ｆｒｄＡ、ｆｒｄＢ、ｆｒｄＣ、ｆｒｄＤ、ｉｆｃＡ−１、ｉｆｃＡ−２、ｓｄｈＢ−１、ｓｄｈＢ−２、ｆｒｄＣ２、ｃｇ１０３７０、ｃｇ１０３７１、ｃｇ１０３７２、ｓｃｍ１０．１０ｃ、ｓｃｍ１０．１１ｃ、ｓｃｍ１０．１２ｃ、ｓｃ５ｇ８．２５ｃ、ｓｃ５ｇ８．２６ｃ、ｓｃｂａｃ−３１ｅ１１．０２ｃ、ｓｃｂａｃ３１ｅ１１．０２ｃ、ｓｃ４ｂ１０．１０ｃ、ｓｄｈＡ２、ｓｄｈＢ２、ｓｄｈＡ１、ｓｄｈＢ１、ｑｃｒＢ２、ｓｄｈＡ３、ｓｄｈＢ３、ｆｒｄＢ１及びｆｒｄＢ２からなる群から選択される遺伝子によってコードされ、その際遺伝子ｓｄｈＡ、ｓｄｈＢ及びｓｄｈＣが、特に好ましい。
【００７１】
酵素Ｅ15は、有利には、ｓｕｃｌｇ１、ｓｕｃｌｇ２、ｌｏｃ４３４８８５、ｃｇ１０６２２、ｄｍｅｌ−ＣＧ６２５５、ｆ１１ａ３．３、ｆ８ｌ１５．３０、ｍｋｄ１５．１１、ｌｓｃ１、ｌｓｃ２、ａｅｌ２１１ｗｐ、ａｆｒ１３４ｃｐ、ｓｃｓＡ、ｓｃｓＢ、ｓｕｃＣ及びｓｕｃＤからなる群から選択される遺伝子によってコードされる。
【００７２】
さらに、酵素Ｅ12及びＥ15の好適な遺伝子のヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧデータベース、ＮＣＢＩデータベース、又はＥＭＢＬデータベースにおいても見出されうる。
【００７３】
１つ以上の酵素Ｅ12〜Ｅ15の活性が増加された場合に、有利には、細胞が、その野生型と比較して低減された次の酵素Ｅ16〜Ｅ23：
− オキサロ酢酸塩の、シトレートへの転化を触媒する酵素Ｅ16、
− マレートの、オキサロ酢酸塩への転化を触媒する酵素Ｅ17、
− スクシニル−補酵素Ａの、スクシネートへの転化を触媒する酵素Ｅ18、
− オキサロ酢酸塩の、ホスホエノールピルベートへの転化を触媒する酵素Ｅ19、
− オキサロ酢酸塩の、ピルベートへの転化を触媒する酵素Ｅ20、
− オキサロ酢酸塩の、アスパルテートへの転化を触媒する酵素Ｅ21、
− マレートの、ピルベートへの転化を触媒する酵素Ｅ22、
− ピルベートの、アセテートへの転化を触媒する酵素Ｅ23、
の１つの活性を特徴とすることを証明してもよい。
【００７４】
本発明に従って特に好ましい細胞は、次の酵素又は酵素の組合せ：Ｅ16、Ｅ17、Ｅ18、Ｅ19、Ｅ20、Ｅ21及びＥ16Ｅ17Ｅ18Ｅ19Ｅ20Ｅ21Ｅ22Ｅ23の活性を低減するものである。
【００７５】
本記載内容において、酵素
Ｅ16が、シトレートシンターゼ（ＥＣ ２．３．３．１又はＥＣ ２．３．３．８）であり、
Ｅ17が、マレートオキシダーゼ（ＥＣ １．１．３．３）であり、
Ｅ18が、スクシニルＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ ３．１．２．３）であり、
Ｅ19が、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．４９又は４．１．１．３２）であり、
Ｅ20が、オキサロ酢酸塩デカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．３）であり、
Ｅ21が、アスパルテートトランスアミナーゼ（ＥＣ ２．６．１．１）であり、
Ｅ22が、マレートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．３８、ＥＣ １．１．１．３９又はＥＣ １．１．１．４０）であり、
Ｅ23が、ピルベートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．５１）である
ことが、特に好ましい。
【００７６】
酵素Ｅ16は、有利には、ｇｌｔ、ｃｓ、ｃｓｌ、ｃｇ３８６１、ｃｔｓ−１、ｆ７ｆ１９．２１、ｆ４ｉ１．１６、ｔ２０ｎ１０．９０、ｔ２０ｎ１０．１００、ｔ２Ｏ９．８０、ｃｉｔ１、ｃｉｔ２、ｃｉｔ３、ａａｒ００４ｃｐ、ａｇｒ００２ｗｐ、ｃｓｈＡ、ｇｌｔＡ、ｃｉｔＺ、ｃｉｔ、ｐｒｐＣ、ｃｉｓＹ、ｃｉｓ、ｍｍｇＤ、ｃｉｔＡ、ｇｌｔＡ１、ｇｌｔＡ２、ｇｌｔＡ３、ｃｇ１０８２９、ｐｒｐＣ１、ｓｃｄ１０．２０、ｃｉｔＡ１、ｃｉｔＡ２、ｃｉｔＡ３、ａｃｌｙ、ｃｇ８３２２、ｆ５ｅ６．２、ｋ７ｊＪ８．１４及びｃｉｔＥからなる群から選択される遺伝子によってコードされ、その際ｇｌｔＡが、最も好ましい。
【００７７】
酵素Ｅ19は、有利には、ｐｃｋＡ、ｐｃｋ１、ｐｃｋ２、ｃｇ１０９２４、ｃｇ１７７２５、ｃｇ１７７２５、ｐｃｋＧ、ｐｐｃＫ、ｃｇ１２８６３、ｐｃｋ及び２ｓｃｋ３６．０２からなる群から選択される遺伝子によってコードされる。
【００７８】
酵素Ｅ20は、有利には、ｏａｄＡ、ｏａｄＢ、ｏａｄＣ、ｏａｄＧ、ｏａｇ３、ｅｄａ、ｄｃｏＡ、ｏａｄＡ１、ｏａｄＡ２、ｐｙｃＢ及びｍｍｄＢからなる群から選択される遺伝子によってコードされる。
【００７９】
酵素Ｅ21は、有利には、ｍｙｎ８．７、ｇｌｔ１、ａｄｒ２９０ｗｐ、ｇｌｔＢ、ｇｌｔＤ、ｇｌｔ１、ｇｌｓ１、ｇｌｔＡ、ｇｌｔ、ｇｌｘＤ、ｇｌｔＤ１、ｇｌｔＤ２、ｇｄｈ２、ａｇｌ０４０Ｃｐ、ｇｄｈＡ１、ｇｄｈＡ、ｇｄｈＡ２、ｇｌｕＤ、ｇｌｕＤ１、ｇｌｕＤ２、ｒｏｃＧ、ｙｐｃＡ、ｇｕｄＢ、ｔ１１ｉ１８．２、ｔ２ｉ１．１５０、ｍｒｇ７．１３、ｆ１９ｃ２４．７、ｇｄｈ、ｇｄｈ１、ｇｄｈ２、ｇｄｈ３、ｇｏｔ１、ｇｏｔ２、ｃｇ４２３３、ｃｇ８４３０、ｆ２３ｎ１９．１７、ｆ１３ｊ１１．１６、ｔ２６ｃ１９．９、ｆ７ｆ１．１８、Ｆ１０Ｎ７．２００、ｔ１６ｌ１．１７０、ｆ１５ｎ１８．１１０、ｔ２０ｄ１．７０、ａａｔ１、ａａｔ２、ａｂｌ０３８ｗｐ、ａｆｒ２１１ｃｐ、ａｇｘ１、ｂｎａ４、ａａｔＡ、ａａｔＢ、ｙｂｄＬ、ａｓｐＣ、ｙｆｂＱ、ａａｔ、ａｖｔＡ１、ａｖｔＡ２、ｔｙｒＢ、ａｖｔＡ、ａｖｔＢ、ａｒｇＤ１、ａｒｇＤ２、ａｓｐＢ１、ａｓｐＢ２、ａｓｐＢ３、ａｓｐＢ、ａｓｐＣ１、ａｓｐＣ２、ａｓｐＣ３、ａｓｐＣ４、ＲＳ０５１４３、ａｓｐＡＴ、ｙｗｆＧ、ｙｈｄＲ、ａｒｇＤ、ｍｔｎＶ、ａｌａＴ、ｈｉｓＣ、ａｖｔＡ１、ａｖｔＡ２、ａｖｔＡ３、ｃｇｌ０２４０、ｃｇｌ１１０３、ｃｇｌ２５９９、ｃｇｌ２８４４、２ｓｃｋ３６．０７ｃ、ｓｃ９ｅ１２．２１、ｓｃ２ｈ４．０４ｃ、ｔｙｒＢ、ｇｔｐ、ｇｔｐ１、ｇｔｐ２、ｃｇ１６４０、ｆ２０ｄ２３．３４、ｆ２６ｆ２４．１６、ｆ２４ｊ１３．１５、ｔ１０ｄ１０．２０及びａｇｒ０８５ｗｐからなる群から選択される遺伝子によってコードされ、その際ａｓｐＣ、ａａｔＡ、ｇｄｈ、ｇｕｄＢ、ｇｄｈＡ、ｇｌｔＢ及びｇｌｔＤが、特に好ましい。
【００８０】
酵素Ｅ21は、有利には、ｍｙｎ８．７、ｇｌｔ１、ａｄｒ２９０ｗｐ、ｇｌｔＢ、ｇｌｔＤ、ｇｌｔ１、ｇｌｓ１、ｇｌｔＡ、ｇｌｔ、ｇｌｘＤ、ｇｌｔＤ１、ｇｌｔＤ２、ｇｄｈ２、ａｇｌ０４０Ｃｐ、ｇｄｈＡ１、ｇｄｈＡ、ｇｄｈＡ２、ｇｌｕＤ、ｇｌｕＤ１、ｇｌｕＤ２、ｒｏｃＧ、ｙｐｃＡからなる群から選択された遺伝子によってコードされる。
【００８１】
酵素Ｅ22は、有利には、ｍｅ、ｍｅ１、ｍｅ２、ｍｅ３、ｍａｅ、ｍａｅ１、ｍａｅ２、ｓｆｃＡ、ｓｆｃＡ１、ｍａｅＡ、ｍａｅＢ、ｔｍｅ、ｙｑｋＪ、ｙｗｋＡ、ｙｑｋＪ、ｍａｌＳ、ｙｔｓＪ、ｍｌｅＡ、ｍｌｅＳ、ｍｅｚ、ｓｃｅ５９．１０ｃ、２ｓｃ７ｇ１１．２３、ｍａｌＳ１、ｍａｌＳ２、ｄｍｅ、ｍａｅＢ１、ｍａｅＢ２、ｍｄｈ、ｍｄｈ１、ｍｄｈ２、ｄｍｅｌ＿ｃｇ１０１２０、ｄｍｅｌ＿ｃｇ１０１２０、ｄｍｅｌ−ｃｇ５８８９、ｆ１９ｋ１６．２７、ｆ６ｆ２２．７、ｔ２２ｐ２２．６０、ｆ１８ａ１７．１、ｍｏｄ１、ｔｍｅ、ｍａｏ、ｃｇｌ３００７、ｍａｌＳ及びｍａｌＥからなる群から選択される遺伝子によってコードされる。
【００８２】
酵素Ｅ23は、有利には、ｍｅ、ｍｅ１、ｍｅ２、ｍｅ３、ｍａｅ、ｍａｅ１、ｍａｅ２、ｓｆｃＡ、ｓｆｃＡ１、ｍａｅＡ、ｍａｅＢ、ｔｍｅ、ｙｑｋＪ、ｙｗｋＡ、ｙｑｋＪ、ｍａｌＳ、ｙｔｓＪ、ｍｌｅＡ、ｍｌｅＳ、ｍｅｚ、ｓｃｅ５９．１０ｃ、２ｓｃ７ｇ１１．２３、ｍａｌＳ１、ｍａｌＳ２、ｄｍｅ、ｍａｅＢ１、ｍａｅＢ２、ｍｄｈ、ｍｄｈ１、ｍｄｈ２、ｄｍｅｌ＿ｃｇ１０１２０、ｄｍｅｌ＿ｃｇ１０１２０、ｄｍｅｌ−ｃｇ５８８９、ｆ１９ｋ１６．２７、ｆ６ｆ２２．７、ｔ２２ｐ２２．６０、ｆ１８ａ１７．１、ｍｏｄ１、ｔｍｅ、ｍａｏ、ｃｇｌ３００７、ｍａｌＳ及びｍａｌＥからなる群から選択される遺伝子によってコードされる。
【００８３】
さらに、本発明に従って、細胞中でスクシニル−補酵素Ａの増加させた供給が、前記の経路（オキサロ酢酸塩→マレート→フマレート→スクシニル−補酵素Ａ）によって実施する場合において、細胞中での還元当量の供給が、目的の方法でも増加されることが好ましい。
【００８４】
還元当量を増加することの１つの可能性は、酸化性のペントースリン酸経路を増加することにある。本記載内容において、有利にはｇｎｄ遺伝子によってコードされる、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．４９）の、及び／又は６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．４４）の活性が、適宜、例えばＷＯ−Ａ−０１／０７６２６号において記載されているように、グルコース６−リン酸イソメラーゼの活性を低減することによって、同時に解糖を阻害する場合に増加される。ペントースリン酸経路の直接的な促進に加えて、又はその代わりに、さらに、細胞に、炭素源としてエタノールを供給することによって、並びに細胞中で、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．１、ＥＣ １．１．１．２、ＥＣ １．１．１．７１又はＥＣ １．１．９９．８）によるエタノールのアセトアルデヒドへの転化を、及びさらにアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．１０）によるアセトアルデヒドのアセチル補酵素Ａへの転化を促進することによって、還元当量を提供することが好まれてよい。さらに、アルコールデヒドロゲナーゼ及びアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼに関する好適な遺伝子は、当業者に公知の遺伝子データベース、例えばＫＥＧＧデータベース、ＮＣＢＩデータベース、又はＥＭＢＬデータベースにおいて見出されうる。
【００８５】
オキサロ酢酸塩からスクシニル−補酵素Ａまでの第二経路は、中間体としてシトレートを導く。
【００８６】
この場合において、本発明による方法の前記の第一の、第二の又は第三の変法の第二の特定の実施態様に従って、適宜酵素Ｅ10又はＥ11の増加された活性に加えて、その野生型と比較して増加された、少なくとも１つの次の酵素Ｅ13〜Ｅ16及びＥ24〜Ｅ26：
− オキサロ酢酸塩の、シトレートへの転化を触媒する酵素Ｅ16、
− シトレートの、イソシトレートへの転化を触媒する酵素Ｅ24、
− イソシトレートの、グリオキサレート及びスクシネートへの転化を触媒する酵素Ｅ25、
− グリオキサレートの、マレートへの転化を触媒する酵素Ｅ26、
− マレートの、フマレートへの転化を触媒する酵素Ｅ13、
− フマレートの、スクシネートへの転化を触媒する酵素Ｅ14、
− スクシネートの、スクシニル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ15、
の活性を特徴とする、遺伝的に改変された細胞を使用することが好ましい。
【００８７】
本記載内容において、本発明に従って特に好ましい細胞は、次の酵素又は酵素の組合せ物：Ｅ13、Ｅ14、Ｅ15、Ｅ16、Ｅ24、Ｅ25、Ｅ26、Ｅ13Ｅ14、Ｅ13Ｅ15、Ｅ13Ｅ16、Ｅ13Ｅ24、Ｅ13Ｅ25、Ｅ13Ｅ26、Ｅ14Ｅ15、Ｅ14Ｅ16、Ｅ14Ｅ24、Ｅ14Ｅ25、Ｅ14Ｅ26、Ｅ15Ｅ16、Ｅ15Ｅ24、Ｅ15Ｅ25、Ｅ15Ｅ26、及びＥ13Ｅ14Ｅ15Ｅ16Ｅ24Ｅ25Ｅ26の活性を増加するものであり、特にＥ13Ｅ14Ｅ15Ｅ16Ｅ24Ｅ25Ｅ26が最も好ましい。
【００８８】
本記載内容において、酵素
Ｅ13が、フマレートヒドラターゼ（ＥＣ ４．２．１．２）であり、
Ｅ14が、スクシネートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．３．９９．１もしくはＥＣ １．３．５．１）又はスクシネートキノン酸化レダクターゼ（１．３．５．１）であり、
Ｅ15が、スクシネート補酵素Ａリガーゼ（ＥＣ ６．２．１．４又はＥＣ ６．２．１．５）であり、
Ｅ16が、シトレートシンターゼ（ＥＣ ２．３．３．１又はＥＣ ２．３．３．８）であり、
Ｅ24が、アコニテートヒドラターゼ（ＥＣ ４．２．１．３）であり、
Ｅ25が、イソシトレートリアーゼ（ＥＣ ４．１．３．１）であり、かつ
Ｅ26が、マレートシンターゼ（ＥＣ ２．３．３．９）である
ことが、特に好ましい。
【００８９】
酵素Ｅ13〜Ｅ16に関する好ましい遺伝子は、オキサロ酢酸塩からスクシニル−補酵素Ａまでの第一の経路に関して既に記載されているものである。
【００９０】
酵素Ｅ24は、有利には、ａｃｏ１、ａｃｏ２、ｒａｔｉｒｅｂ、ｄｍｅｌ−ＣＧ４７０６、ｄｍｅｌ−ＣＧ４９００、ｄｍｅｌ−ｃｇ６３４２、ｃｇ９２４４、ｔ３ｐ４．５、ｆ１０ｍ２３．３１０、ｆ４ｂ１４．１００、ａｄｌ０３２Ｗｐ、ａｆｒ６２９ｗｐ、ａｃｎＡ、ａｃｎＢ、ａｃｎＣ、ａｃｎＤ、ｒｐｆＡ、ａｃｎＡ１、ａｃｎＡ２、ａｃｎＭ、ｃｉｔＢ、ｌｅｕＣ、ｃｇｌ１５４０、ｓａｃＡ、ｃａｎ及びａｃｏからなる群から選択される遺伝子によってコードされ、その際ａｃｎＡ及びａｃｎＢが、特に好ましい。
【００９１】
酵素Ｅ25は、有利には、ｍｓｄ２１．４、ｉｃｌ１、ｉｃｌ２、ａｄｌ０６６ｃｐ、ａｇｌ０５７ｗｐ、ａｃｅＡ、ｉｃｌ、ａｃｅＡａ、ａｃｅＡｂ、ｃｇｌ００９７及びｃｇｌ２３３１からなる群から選択される遺伝子によってコードされ、その際ａｃｅＡが、特に好ましい。特定の一実施態様に従って、好ましい遺伝子は、遺伝子レベル又はタンパク質レベルを調整しないイソシトレートリアーゼに関してコードするものである。
【００９２】
酵素Ｅ26は、有利には、ｍｅｄ２４．５、ｍｌｓＳ１、ａｃｒ２６８ｃｐ、ｍａｓＡ、ｇｌｃＢ、ａｃｅＢ、ｍｌｓ、ｇｌｃＢ−１、ｇｌｃＢ−２、ｃｇｌ２３２９、ｍａｓＺ、ａｃｅＢ１、ａｃｅＢ２及びｍａｓからなる群から選択される遺伝子によってコードされ、その際ａｃｅＢ遺伝子が、特に好ましい。
【００９３】
さらに、酵素Ｅ24〜Ｅ26の好適な遺伝子のヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧデータベース、ＮＣＢＩデータベース、又はＥＭＢＬデータベースにおいて見出されうる。
ホスホエノールピルベートからの又はピルベートからのオキサロ酢酸塩の供給が、酵素Ｅ10又はＥ11の活性を増加することによって促進される場合に、グリオキサレートに加えて、イソシトレートリアーゼによるイソシトレートの開裂に対して形成されるスクシネートが、スクシニル−補酵素Ａの形成のために使用されてもよい。さらに、オキサロ酢酸塩からスクシネートまでのこの第二経路において、イソシトレートの２−オキソグルタレートへの転化を触媒し、かつ有利にはイソシトレートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．４１又はＥＣ １．１．１．４２）の形をとる、酵素Ｅ27の活性を低減することが有利であってよい。有利には、イソシトレートデヒドロゲナーゼは、ｉｄｈ１、ｉｄｈ２、ｃｇ７１７６、ｃｇ７１７６、ｃｇ７１７６、ｆ２０ｄ２１．１６、ｆ１２ｐ１９．１０、ｔ１５ｎ１．８０、ｉｄｐ１、ｉｄｐ２、ｉｄｐ３、ａａｌ０２２Ｗｐ、ａｅｒ０６１Ｃｐ、ｉｄｈＣ、ｉｄｈＭ、ｉｃｄＡ、ｉｃｄ、ｉｄｈ、ｉｃｄ１、ｉｃｄ２、ｌｅｕＢ、ｃｉｔＣ、ｃｉｔＣ、ｃｇｌ０６６４、ｌｅｕＢ２、ｉｄｈ３Ａ、ｉｄｇ３Ｂ、ｉｄｈ３Ｇ、ｃｇ１２２３３、ｄｍｅｌ−ＣＧ５０２８、ｄｍｅｌ−ＣＧ６４３９、ｆ６ｐ２３．１４、ｆ２３ｅ１２．１８０、ｆ８ｄ２０．１６０、ｆ１２ｅ４．２０、ａｄｌ２２３ｗｐ及びａｆｒ１３７ｃｐからなる群から選択される遺伝子によってコードされる酵素の形を取り、その際ｉｃｄＡ及びｃｉｔＣが、特に有利である。
【００９４】
オキサロ酢酸塩からスクシニル−補酵素Ａまでの第三経路は、中間体として２−オキソグルタレートを介して導く。この場合において、本発明による方法の前記の第一の、第二の又は第三の変法の第三の特定の実施態様に従って、適宜酵素Ｅ10又はＥ11の増加された活性に加えて、その野生型と比較して増加された少なくとも１つの次の酵素Ｅ16、Ｅ24、Ｅ27及びＥ28：
− オキサロ酢酸塩の、シトレートへの転化を触媒する酵素Ｅ16、
− シトレートの、イソシトレートへの転化を触媒する酵素Ｅ24、
− イソシトレートの、２−オキソグルタレートへの転化を触媒する酵素Ｅ27、
− ２−オキソグルタレートの、スクシニル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ28
の活性を特徴とする、遺伝的に改変された細胞を使用することが好ましい（図９を参照）。
【００９５】
本記載内容において、本発明に従って特に好ましい細胞は、次の酵素又は酵素の組合せ物：Ｅ16、Ｅ24、Ｅ27、Ｅ28、Ｅ16Ｅ24、Ｅ16Ｅ27、Ｅ16Ｅ28、Ｅ24Ｅ27、Ｅ24Ｅ28、Ｅ27Ｅ28、Ｅ16Ｅ24Ｅ27、Ｅ16Ｅ24Ｅ28、Ｅ24Ｅ27Ｅ28及びＥ16Ｅ24Ｅ27Ｅ28の活性を増加するものであり、その際、Ｅ16Ｅ24Ｅ27Ｅ28が最も好ましい。
【００９６】
本記載内容において、酵素
Ｅ16が、シトレートシンターゼ（ＥＣ ２．３．３．１又はＥＣ ２．３．３．８）であり、
Ｅ24が、アコニテートヒドラターゼ（ＥＣ ４．２．１．３）であり、
Ｅ27が、イソシトレートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．４１又はＥＣ １．１．１．４２）であり、かつ
Ｅ28が、２−オキソグルタレートシンターゼ（ＥＣ １．２．７．３）である
ことが、特に好ましい。
【００９７】
酵素Ｅ16、Ｅ24及びＥ27に関する好ましい遺伝子は、オキサロ酢酸塩からスクシニル−補酵素Ａまでの第一の及び第二の経路に関して既に記載されているものである。
【００９８】
酵素Ｅ28は、有利には、ｋｏｒＡ、ｋｏｒＢ、ｋｏｒＤ、ｋｏｒＡ１、ｋｏｒＡ２、ｋｏｒＢ１、ｋｏｒＢ２、ｏｏｒＡ、ｏｏｒＢ、ｏｏｒＣ、ｏｏｒＤ、ｏｆｏｒＡ、ｏｆｏｒＢ、ｐｏｒＡ、ｐｏｒＢ、ｐｏｒＡ１、ｐｏｒＡ２、ｐｏｒＡ３、ｐｏｒＡ４、ｐｏｒＧ、ｐｏｒＧ１、ｐｏｒＧ２、ｐｏｒＢ１、ｐｏｒＢ２、ｐｏｒＢ３、ＳＣＤ２０．１２ｃ、ＳＣＤ２０．１３ｃ、ＳＣＡＨ１０．３４ｃ、ＳＣＡＨ１０．３５Ｃ、ｋｏｒＧ、ｏｒＡ、ｏｒＢ、ｋｏｒＧ１及びｋｏｒＧ２からなる群から選択される遺伝子によってコードされる。さらに、Ｅ28は、種々の酵素活性を有する多数のサブユニットからなるデヒドロゲナーゼ複合体の形も取ってよい。特に、それは、オキソグルタレートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．４．２）、ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．８．１．４）及びジヒドロリポイルリジン−残基スクシニルトレンスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１．６１）を含むデヒドロゲナーゼ複合体の形を取ってよい。本記載内容において、オキソグルタレートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．４．２）は、有利には、ｏｇｄｈ、ｇｈｄｈｌ、ｌｏｃ２３９０１７、ｍｇｃ６８８００、ｍｇｃ８０４９６、ｃｇ１１６６１、ｔ２２ｅ１６．７０、ｍｐＡ２４．１０、ｋｇｄ１、ａｅｒ３７４ｃｐ、ｓｕｃＡ、ｏｄｈＡ、ｋｇｄＡ及びｃｇｌ１１２９からなる群から選択される遺伝子によってコードされ、その際ｓｕｃＡ及びｏｄｈＡが、特に好ましい。ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．８．１．４）は、有利には、ｄｌｄ、ｄｌｄ−ｐｒｏｖ、ｄｌｄｈ、ｃｇ７４３０、ｔ２ｊ１５．６、ｋ１４ａ１７．６、ａｔ３ｇ１７２４０、ｍｇｄ８．７１ｐｄ１、ａｆｒ５１２ｗｐ、ｄｌｄ１、ｌｐｄ、ｔｂ０３．２６ｊ７．６５０、ｔｂ０４．３ｍ１７．４５０、ｔｂ９２７．８．７３８０、ｔｂ０８．１０ｋ１０．２００、ｌｐｄＡ、ｌｐｄＧ、ｌｐｄＶ、ｌｐｄ３、ａｃｏＤ、ｌｐｄＡ１、ｌｐｄＡ２、ｌｐｄＡ３、ｏｄｈＬ、ｐｄｈＤ、ｐｄｈＤ１、ｐｄｈＤ２、ｐｄｈＤ３、ｐｄｈＤ４２、ｌｐｄＡｃｈ１、ｌｐｄＡｃｈ２、ｌｐｄＡｃ、ａｃｏＬ、ｂｆｍｂＣ、ｂｋｄＤ、ｃｇｌ０３６６、ｃｇｌ０６８８、ｓｃｍ１．１７ｃ、ｐｄｈＬ、ｓｃｋ１３．１１、ｌｐｄＢ２及びｄｌｄ１からなる群から選択される遺伝子によってコードされ、その際ｌｐｄが、特に好ましい。 本記載内容において、ジヒドロリポイルリジン−残基スクシニルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１．６１）は、有利には、ｄｌｓｔ、ｄｌｓｔ−ｐｒｏｖ、ｍｇｃ８９１２５、ｄｍｅｌ＿ＣＧ５２１４、ｆ１０ｍ２３．２５０、ｋ１３ｐ２２．８、ｋｇｄ２ａｇｌ２００ｗｐ、ｋｇｄ２、ｏｄｈＢ、ｓｕｃＢ、ａｃｅＦ、ｋｇｄＢ、ｓｕｃＢ１、ｓｕｃＢ２、ｐｄｈＣ、ｄｌａＴ、ｋｇｄ、ｓｃ５Ｆ７．２０及びｓｃ４Ｂ１０．２４ｃからなる群から選択される遺伝子によってコードされ、その際ｓｕｃＢ及びｏｄｈＢが、特に好ましい。
【００９９】
酵素Ｅ28の好適な遺伝子の、又は酵素Ｅ28の前記のサブユニットのヌクレオチド配列は、さらに、ＫＥＧＧデータベース、ＮＣＢＩデータベース又はＥＭＢＬデータベースにおいて見出されうる。
【０１００】
オキサロ酢酸塩からスクシニル−補酵素Ａまでの前記の経路は、基質前駆体としてのホスホエノールピルベートから又はピルベートからそれる。本記載内容において、さらに、炭水化物から及び／又はグリセロールから出発する特に大量のピルベート又はホスホエノールピルベートを提供することができるような方法で、細胞を遺伝的に改変することが好まれてよい。
【０１０１】
前記の細胞が、栄養源としてグリセロールを使用することができる場合に、本発明による方法において使用される遺伝的に改変された細胞は、その野生型と比較して増加された、少なくとも１つの、有利には全ての、次の酵素Ｅ29〜Ｅ42：
− グリセロールの、細胞中への拡散を促進する酵素Ｅ29、
− グリセロールの、グリセロール３−リン酸への転化を触媒する酵素Ｅ30、
− グリセロール３−リン酸の、ジヒドロキシアセトンリン酸への転化を触媒する酵素Ｅ31、
− 硫黄の、硫黄受容体チオレドキシン１への移動を触媒する酵素Ｅ32、
− アルコール及びグリセロールの形成でリン脂質の加水分解を触媒する酵素Ｅ33、
− リン酸塩と引き替えに、グリセロール３−リン酸の細胞中への輸送を触媒する酵素Ｅ34、
− ジヒドロキシアセトンリン酸の、グリセルアルデヒド３−リン酸への転化を触媒する酵素Ｅ35、
− グリセルアルデヒド３−リン酸の、１，３−ビスホスホグリセレートへの転化を触媒する酵素Ｅ36、
− １，３−ビスホスホグリセレートの、３−ホスホグリセレートへの転化を触媒する酵素Ｅ37、
− ３−ホスホグリセレートの、２−ホスホグリセレートへの転化を触媒する酵素Ｅ38、
− ２−ホスホグリセレートの、ホスホエノールピルベートへの転化を触媒する酵素Ｅ39、
− ホスホエノールピルベートの、ピルベートへの転化を触媒する酵素Ｅ40、
− グリセロールの、ジヒドロキシアセトンへの転化を触媒する酵素Ｅ41、
− ジヒドロキシアセトンの、ジヒドロキシアセトンリン酸への転化を触媒する酵素Ｅ42
の活性を示すことが有利である。
【０１０２】
本記載内容において、本発明に従って特に好ましい細胞は、次の酵素又は酵素の組合せ物：Ｅ29、Ｅ30、Ｅ31、Ｅ32、Ｅ33、Ｅ34、Ｅ35、Ｅ36、Ｅ37、Ｅ38、Ｅ39、Ｅ40、Ｅ41、Ｅ42、Ｅ29Ｅ30、Ｅ29Ｅ31、Ｅ29Ｅ32、Ｅ29Ｅ33、Ｅ29Ｅ34、Ｅ29Ｅ35、Ｅ29Ｅ36、Ｅ29Ｅ37、Ｅ29Ｅ38、Ｅ29Ｅ39、Ｅ29Ｅ40、Ｅ29Ｅ41、Ｅ29Ｅ42、Ｅ30Ｅ31、Ｅ30Ｅ32、Ｅ30Ｅ33、Ｅ30Ｅ34、Ｅ30Ｅ35、Ｅ30Ｅ36、Ｅ30Ｅ37、Ｅ30Ｅ38、Ｅ30Ｅ39、Ｅ30Ｅ40、Ｅ30Ｅ41、Ｅ30Ｅ42、Ｅ31Ｅ32、Ｅ31Ｅ33、Ｅ31Ｅ34、Ｅ31Ｅ35、Ｅ31Ｅ36、Ｅ31Ｅ37、Ｅ31Ｅ38、Ｅ31Ｅ39、Ｅ31Ｅ40、Ｅ31Ｅ41、Ｅ31Ｅ42、Ｅ32Ｅ33、Ｅ32Ｅ34、Ｅ32Ｅ35、Ｅ32Ｅ36、Ｅ32Ｅ37、Ｅ32Ｅ38、Ｅ32Ｅ39、Ｅ32Ｅ40、Ｅ32Ｅ41、Ｅ32Ｅ42、Ｅ33Ｅ34、Ｅ33Ｅ35、Ｅ33Ｅ36、Ｅ33Ｅ37、Ｅ33Ｅ38、Ｅ33Ｅ39、Ｅ33Ｅ40、Ｅ34Ｅ41、Ｅ33Ｅ42、Ｅ34Ｅ35、Ｅ34Ｅ36、Ｅ34Ｅ47、Ｅ34Ｅ38、Ｅ34Ｅ39、Ｅ34Ｅ40、Ｅ34Ｅ41、Ｅ34Ｅ42、Ｅ35Ｅ36、Ｅ35Ｅ37、Ｅ35Ｅ38、Ｅ35Ｅ39、Ｅ35Ｅ40、Ｅ35Ｅ41、Ｅ35Ｅ42、Ｅ36Ｅ37、Ｅ36Ｅ38、Ｅ36Ｅ39、Ｅ36Ｅ40、Ｅ36Ｅ41、Ｅ36Ｅ42、Ｅ37Ｅ38、Ｅ37Ｅ39、Ｅ37Ｅ40、Ｅ37Ｅ41、Ｅ37Ｅ42、Ｅ38Ｅ39、Ｅ39Ｅ40、Ｅ39Ｅ41、Ｅ39Ｅ42、Ｅ40Ｅ41、Ｅ40Ｅ42、Ｅ41Ｅ42及びＥ29Ｅ30Ｅ31Ｅ32Ｅ33Ｅ34Ｅ35Ｅ36Ｅ37Ｅ38Ｅ39Ｅ40Ｅ41Ｅ42の活性を低減するものである。
【０１０３】
本記載内容において、酵素
Ｅ29が、有利にはｇｌｐＦ遺伝子によってコードされるアクアグリセロポリン（グリセロール促進剤）であり、
Ｅ30が、有利にはｇｌｐＫ遺伝子によってコードされるグリセロールキナーゼ（ＥＣ ２．７．１．３０）であり、
Ｅ31が、グリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．９９．５）、有利にはＦＡＤ−依存のグリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼであり、その際グリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼが、有利にはｇｌｐＡ遺伝子、ｇｌｐＢ遺伝子、ｇｌｐＣ遺伝子又はｇｌｐＤ遺伝子によって、特に有利にはｇｌｐＤ遺伝子によってコードされ、
Ｅ32が、ｇｌｐＥ遺伝子によってコードされる硫黄トランスフェラーゼであり、
Ｅ33が、有利にはｇｌｐＱ遺伝子によってコードされるグリセロールホスホジエステラーゼ（ＥＣ ３．１．４．４６）であり、
Ｅ34が、有利にはｇｌｐＴ遺伝子によってコードされるグリセロール３−リン酸パーミアーゼであり、
Ｅ35が、トリオースホスフェートイソメラーゼ（ＥＣ ５．３．１．１）であり、
Ｅ36が、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．１２）であり、
Ｅ37が、ホスホグリセレートキナーゼ（ＥＣ ２．７．２．３）であり、
Ｅ38が、ホスホグリセレートムターゼ（ＥＣ ５．４．２．１）であり、
Ｅ39が、エノラーゼ（ＥＣ ４．２．１．１１）であり、
Ｅ40が、ピルベートキナーゼ（ＥＣ ２．７．１．４０）であり、
Ｅ41が、有利にはｇｌｄＡ遺伝子によってコードされるグリセロールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．６）であり、かつ
Ｅ42が、有利にはｄｈａＫ遺伝子によってコードされるジヒドロキシアセトンキナーゼ（ＥＣ ２．７．１．２９）である
ことが、特に好ましい。
【０１０４】
さらに、前記酵素の遺伝子配列は、当業者に公知である遺伝子データベース、特に、ＫＥＧＧデータベース、ＮＣＢＩデータベース又はＥＭＢＬデータベースにおいて見出されうる。
【０１０５】
さらに、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼに関してコードするｇａｐ遺伝子（Ｅｉｋｍａｎｎｓ（１９９２年）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７４：６０７６〜６０８６）、トリオースホスフェートイソメラーゼに関してコードするｔｐｉ遺伝子（Ｅｉｋｍａｎｎｓ（１９９２年）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７４：６０７６〜６０８６）、及び３−ホスホグリセレートキナーゼに関してコードするｐｇｋ遺伝子（Ｅｉｋｍａｎｎｓ（１９９２年）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７４：６０７６〜６０８６）は、他の情報源から公知でもある。
【０１０６】
酵素Ｅ29〜Ｅ42の公知の遺伝子を使用して、少なくとも１つの、有利には少なくとも２つの、さらに有利には少なくとも３つの、及び最も有利には全ての酵素Ｅ29〜Ｅ42の活性が、酵素Ｅ1に関連して最初に記載されている技術（酵素の突然変異又は酵素の発現における増加）によって増加された、遺伝的に改変された細胞を製造することができる。それらの細胞は、ただ炭素源としてグリセロールの存在下で（或いは、他の炭素源として炭水化物と共に）、培養することができる。
【０１０７】
１つ以上の酵素活性Ｅ29〜Ｅ42の増加に加えて、細胞が、炭素源としてグリセロールを使用することができる場合に、次の遺伝子が、本発明による方法において、使用される細胞中で発現される、有利には非相同的に発現される場合に有利でもある：
− ｇｌｐＧ遺伝子又は３９２５遺伝子、
− ｇｌｐＸ遺伝子、
− ｄｈａＲ遺伝子、ｙｃｇＵ遺伝子又はｂ１２０１遺伝子、
− ｆｓａ遺伝子、ｍｉｐＢ遺伝子、ｙｂｉＺ遺伝子又はＢ０８２５遺伝子、
− ｔａｌＣ遺伝子、ｆｓａＢ遺伝子、ｙｉｊＧ遺伝子又はｂ３９４６遺伝子。
【０１０８】
さらに、それら遺伝子のヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧデータベース、ＮＣＢＩデータベース、又はＥＭＢＬデータベースにおいて見出されうる。
【０１０９】
細胞が、栄養源として炭水化物を使用することができる場合に、本発明による方法において使用される細胞は、その野生型と比較して増加された、少なくとも１つの、有利には全ての次の酵素Ｅ43〜Ｅ45及びＥ36〜Ｅ40：
− α−Ｄ−グルコース６−リン酸の、β−Ｄ−フルクトース６−リン酸への転化を触媒する酵素Ｅ43、
− β−Ｄ−フルクトース６−リン酸の、β−Ｄ−フルクトース１，６−ビスリン酸への転化を触媒する酵素Ｅ44、
− β−Ｄ−フルクトース１，６−ビスリン酸の、グリセルアルデヒド３−リン酸及びジヒドロキシアセトンリン酸への転化を触媒する酵素Ｅ45、
− グリセルアルデヒド３−リン酸の、１，３−ビスホスホグリセレートへの転化を触媒する酵素Ｅ36、
− １，３−ビスホスホグリセレートの、３−ホスホグリセレートへの転化を触媒する酵素Ｅ37、
− ３−ホスホグリセレートの、２−ホスホグリセレートへの転化を触媒する酵素Ｅ38、
− ２−ホスホグリセレートの、ホスホエノールピルベートへの転化を触媒する酵素Ｅ39、及び
− ホスホエノールピルベートの、ピルベートへの転化を触媒する酵素Ｅ40
の活性を特徴とすることが好ましい。
【０１１０】
本記載内容において、本発明に従って特に好ましい遺伝的に改変された細胞は、次の酵素又は酵素の組合せ物：Ｅ36、Ｅ37、Ｅ38、Ｅ39、Ｅ40、Ｅ43、Ｅ44、Ｅ45、Ｅ36Ｅ37、Ｅ36Ｅ38、Ｅ36Ｅ39、Ｅ36Ｅ40、Ｅ36Ｅ43、Ｅ36Ｅ44、Ｅ36Ｅ45、Ｅ37Ｅ38、Ｅ37Ｅ39、Ｅ37Ｅ40、Ｅ37Ｅ43、Ｅ37Ｅ44、Ｅ37Ｅ45、Ｅ38Ｅ39、Ｅ38Ｅ40、Ｅ38Ｅ43、Ｅ38Ｅ44、Ｅ38Ｅ45、Ｅ39Ｅ40、Ｅ39Ｅ43、Ｅ39Ｅ44、Ｅ39Ｅ45、Ｅ40Ｅ43、Ｅ40Ｅ44、Ｅ40Ｅ45、Ｅ43Ｅ44、Ｅ43Ｅ45、Ｅ44Ｅ45及びＥ36Ｅ37Ｅ38Ｅ39Ｅ40Ｅ43Ｅ44Ｅ45の活性を増加するものである。
【０１１１】
本記載内容において、酵素
Ｅ43が、グルコース６−リン酸イソメラーゼ（ＥＣ ５．３．１．９）であり、
Ｅ44が、６−ホスホフルクトキナーゼ（ＥＣ ２．７．１．１１）であり、
Ｅ45が、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ ４．１．２．１３）であり、
Ｅ36が、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．１２）であり、
Ｅ37が、ホスホグリセレートキナーゼ（ＥＣ ２．７．２．３）であり、
Ｅ38が、ホスホグリセレートムターゼ（ＥＣ ５．４．２．１）であり、
Ｅ39が、エノラーゼ（ＥＣ ４．２．１．１１）であり、かつ
Ｅ40が、ピルベートキナーゼ（ＥＣ ２．７．１．４０）である
ことが、特に好ましい。
【０１１２】
さらに、それら遺伝子のヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧデータベース、ＮＣＢＩデータベース、又はＥＭＢＬデータベースにおいて見出されうる。
【０１１３】
細胞が、炭素源として炭水化物を使用することができる場合に、さらに、例えばホスホトランスフェーラゼ系の酵素、特にｐｔｓＩ、ｐｔｓＨ及びｐｔｓＭ遺伝子によってコードされるそれらの酵素の活性を増加することによって、又は有利にはｇｌｋ遺伝子によってコードされるグルコキナーゼ（ＥＣ ２．７．１．２）を高めることによって、前記の酵素Ｅ43〜Ｅ45及びＥ36〜Ｅ40の活性を増加するだけでなく、細胞中へのグルコースの取込を増加することが好ましい。本記載内容において、特に、ＵＳ ６，６８０，１８７号、ＵＳ ６，８１８，４３２号、ＵＳ ６，９１３，９１０号及びＵＳ ６，８８４，６１４号を参照し、その際ｐｔｓＩ、ｐｔｓＨ、ｐｔｓＭ及びｇｌｋ遺伝子を過剰発現するための可能性に関するそれらの開示内容は、参照をもって本発明に組み込まれたものとし、かつ本発明の開示の一部をなす。炭水化物が炭素源として作用する場合に、目的の方法でペントースリン酸経路を、例えば、有利にはｇｎｄ遺伝子によってコードされる、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．４９）の及び６−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．４４）の活性を増加することによって促進する一方で、適宜、例えばＷＯ−Ａ−０１／０７６２６号において記載されているように、グルコース６−リン酸イソメラーゼの活性を弱めることによって、解糖を同時に阻害することが有利であってもよい。
【０１１４】
メチルマロン酸セミアルデヒドが前駆体として、及びスクシニル−補酵素Ａが中間体として形成される、遺伝的に改変された細胞が使用される本発明による方法の特定の実施態様によって、該細胞が、中間体としてオキサロ酢酸塩及びピルベートを介して、３−ヒドロキシイソ酪酸又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートを形成する場合に、さらに、少なくとも１つの、有利には全ての、細胞における次の酵素活性：
− オキサロ酢酸塩の、ホスホエノールピルベートへの添加を触媒する酵素、例えばホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼ（ＥＣ ４．１．１．４９）（ＤＥ−Ａ−１９９ ５０ ４０９号も参照）、
− ピルベートの、アセテートへの転化を触媒する酵素、例えばピルベートオキシダーゼ（ＥＣ １．２．２．２）（ＤＥ−Ａ−１９９ ５１ ９７５号も参照）、
− α−Ｄ−グルコース６−リン酸の、β−Ｄ−フルクトース６−リン酸への転化を触媒する酵素（ＵＳ ０９／３９６，４７８号も参照）、
− ピルベートの、ラクテートへの転化を触媒する酵素、例えばｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．２７）又はラクテート−マレートトランスヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．９９．７）、
− ピルベートの、アセチル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素、例えばピルベートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．５１）、
− ピルベートの、アセチルホスフェートへの転化を触媒する酵素、例えばピルベートオキシダーゼ（ＥＣ １．２．３．３）、
− ピルベートの、アセテートへの転化を触媒する酵素、例えばピルベートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．２．２）、
− ピルベートの、ホスホエノールピルベートへの転化を触媒する酵素、例えばホスホエノールピルベートシンターゼ（ＥＣ ２．７．９．２）又はピルベート、フォスフェートジキナーゼ（ＥＣ ２．７．９．１）、
− ピルベートの、アラニンへの転化を触媒する酵素、例えばアラニントランスアミナーゼ（２．６．１．２）又はアラニン−オキソ−酸トランスアミラーゼ（ＥＣ ２．６．１．１２）、及び／又は
− ピルベートをアセトラクテートへ転化する酵素、例えばアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＥＣ ２．２．１．６）
の活性を低減することが好まれてよい。
【０１１５】
本発明に従って特に好ましく、及び中間体としてスクシニル−補酵素Ａを介して炭素源として炭水化物から３−ヒドロキシイソ酪酸又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートを形成することができ、かつ１つ以上の前記の酵素活性、特に酵素活性Ｅ1〜Ｅ45の１つ、最も有利には酵素活性Ｅ1、Ｅ1Ｅ2Ｅ3Ｅ4、Ｅ1Ｅ4Ｅ5Ｅ6Ｅ7又は及びＥ1Ｅ4Ｅ5Ｅ7を増加しうる細胞は、Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．（２００５年），７（３），２２９〜２３９頁、Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｌｏｅｎｇ．（２００５年），９０（６），７７５〜７７９頁、Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．（２００５年），２１（２），３５８〜３６５頁、Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００５年），Ａｐｐｉ．Ｍｉｃｒｏｂｌｏｌ．Ｂｌｏｔｅｃｈｎｏｌ．，６７（４），５１５〜５２３頁、Ｖｅｍｕｒｉ ｅｔ ａｌ．（２００２年），Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６８（４），１７１５〜１７２７頁によって、及びＵＳ ６，４５５，２８４号において記載されている微生物である。
【０１１６】
本発明による方法の第一の特定の実施態様によって、炭素源としてＬ−グルタメートから出発する３−ヒドロキシイソ酪酸の又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートの形成が、中間体としてスクシニル−補酵素Ａを介して実施される場合に、メチルマロン酸セミアルデヒドが前駆体として及び中間体としてスクシニル−補酵素Ａが形成される、遺伝的に改変された細胞が使用される、本発明による方法の他の特定の実施態様に従って、本発明に従って、さらに、使用される細胞が、その野生型と比較して増加された少なくとも１つの、有利には少なくとも２つの次の酵素Ｅ28及びＥ46：
− Ｌ−グルタメートの、２−オキソグルタレートへの転化を触媒する酵素Ｅ46、
− ２−オキソグルタレートの、スクシニル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ28
の活性を特徴とすることが、有利である（図１０を参照）。
【０１１７】
本記載内容において、酵素
Ｅ46が、グルタメートシンターゼ（ＥＣ １．４．１．１３もしくはＥＣ １．４．１．１４）、グルタメートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．２、ＥＣ １．４．１．３もしくはＥＣ １．４．１．４）、又はアスパルテートトランスアミナーゼ（ＥＣ ２．６．１．１又はＥＣ ２．６．１．２）であり、かつ
Ｅ28が、２−オキソグルタレートシンターゼ（ＥＣ １．２．７．３）である
ことが、特に好ましい。
【０１１８】
既に最初に好ましい酵素Ｅ28として挙げられているものが、酵素Ｅ28として好ましい。
【０１１９】
酵素Ｅ46は、有利には、ｍｙｎ８．、ｇｌｔ１、ａｄｒ２９０ｗｐ、ｇｌｔＢ、ｇｌｔＤ、ｙｅｉＴ、ａｅｇＡ、ｙｇｆＴ、ｇｌｔＤ−１、ｇｌｔＤ−２、ｇｌｔ１、ｇｌｔ２、ｇｌｓ１、ｇｌｔＡ、ｇｌｔ、ｇｌｘＤ、ｇｌｔＡ、ｙｅｒＤ、ｃｇｌ０１８４、ｃｇｌ０１８５、ｓｃ３ｃ９．１２、ｇｄｈ１、ｇｄｈ２、ａｇｌ４０ｃｐ、ｇｄｈＡ、ｇｄｈＡ１、ｇｄｈＡ２、ｇｌｕＤ、ｒｏｃＧ、ｙｐｃＡ、ｇｕｄＢ、ｇｌｕＤ、ｇｄｈＡ、ｇｄｈＡ２、ｇｄｈ、ｇｄｈＡ−１、ｇｄｈＡ２−２、ｇｄｈＡ−３、ｇｌｕＤ１、ｇｌｕＤ２、ｇｌｕｄ１−ｐｒｏｖ、ｇｌｕｄ１ａ、ｔ１１Ｉ１８．２、ｔ２Ｉ１．１５０、ｍｒｇ７．１３、ｇｏｔ１、ｇｏｔ２、ｃａｓｐａｔ、ｇｏｔ２−ｐｒｏｖ、ｘｒ４０６−ｐｒｏｖ、４０６−ｐｒｏｖ、ｃｇ４２３３、ｃｇ４２３３、ｃｇ８４３０、ｃｇ８４３０、ｆ２３ｎ１９．１７、ｆ１３ｊ１１．１６、ｔ２６ｃ１９．９、ｆ７ｆ１．１８、ｆ１０ｎ７．２００、ｔ１６１１．１７０、ｆ１５ｎ１８．１１０、ｔ２０ｄ１．７０、ａａｔ、ａａｔ１、ａａｔ２、ａｂｌ０３８ｗｐ、ａｆｒ２１１ｃｐ、ａｇｘ１、ｂｎＡ４、ａａｔＡ、ａａｔＢ、ｙｂｄＬ、ａｓｐＣ、ｙｆｂＱ、ｙｄｃＲ、ａｖｔＡ２、ａｓｐＣ−１、ａｓｐＣ−２、ａｓｐＣ−３、ａｓｐＣ−４、ａｓｐＢ、ａｓｐＢ−１、ａｓｐＢ−２、ａｓｐＢ−３、ａｓｐＢ−４、ａｒｇＤ１、ａｒｇＤ２、ａａｔＡｃ、ｙｗｆＧ、ｍｔｎＶ、ａｌａＴ、ａｖｔＡ１、ａｖｔＡ２、ａｖｔＡ３、ｃｇｌ０２４０、ｃｇｌ１１０３、ｃｇｌ２５９９、ｃｇｌ２８４４、ｄａｐＣ、２ｓｃｋ３６．０７ｃ、ｓｃ９ｅ１２．２１、ｓｃ２ｈ４．０４ｃ、ａｓｐＢ１、ａｓｐＢ２、ａｓｐＢ３、ｔｙｒＢ、ｇｐｔ、ｇｐｔ１、ｇｐｔ２、ｍｇｃ８２０９７、ｃｇ１６４０、ｃ３２ｆ１０．８、ｆ２０ｄ２３．３４、ｆ２６ｆ２４．１６、ｆ２４ｊ１３．１５、ｔ１０ｄ１０．２０及びａｇｒｗｐからなる群から選択される遺伝子によってコードされる。
【０１２０】
さらに、それら遺伝子のヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧデータベース、ＮＣＢＩデータベース、又はＥＭＢＬデータベースにおいて見出されうる。
【０１２１】
３−ヒドロキシイソ酪酸の又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートの形成が、前駆体としてメチルマロン酸セミアルデヒドを介して実施される、遺伝的に改変された細胞を使用する、本発明による方法の第二の特定の実施態様に従って、３−ヒドロキシイソ酪酸の又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートの形成が、使用される細胞が炭素源として炭水化物、グリセロール、メタン又はメタノールを選択的に使用することができる場合に、中間体としてプロピオニル−補酵素Ａを介して実施することが好ましい。本記載内容において、種々の経路は、プロピオニル−補酵素Ａから出発して、３−ヒドロキシイソ酪酸又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートに達するために存在する。
【０１２２】
本発明による方法の第二の特定の実施態様の第一の変法に従って、中間体プロピオニル−補酵素Ａの形成は、他の中間体としてアセチル−補酵素Ａを介して実施する。
【０１２３】
本記載内容において、使用される遺伝的に改変された細胞は、その野生型と比較して増加させた、少なくとも１つの次の酵素Ｅ4、Ｅ5及びＥ47〜Ｅ52：
− アセチル−補酵素Ａの、マロニル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ47、
− マロニル−補酵素Ａの、マロン酸セミアルデヒドへの転化を触媒する酵素Ｅ48、
− マロン酸セミアルデヒドの、３−ヒドロキシプロピオネートへの転化を触媒する酵素Ｅ49、
− ３−ヒドロキシプロピオネートの、３−ヒドロキシプロピオニル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ50、
− ３−ヒドロキシピロピオニル−補酵素Ａの、アクリロイル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ51、
− アクリロイル−補酵素Ａの、プロピオニル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ52、
− プロピオニル−補酵素Ａの、メチルマロン酸セミアルデヒドへの転化を触媒する酵素Ｅ5、
− メチルマロン酸セミアルデヒドの、３−ヒドロキシイソブチレートへの転化を触媒する酵素Ｅ4
の活性を特徴とすることが、特に好ましい（図１１及び１２を参照）。
【０１２４】
遺伝的に改変された細胞は、特に有利には、次の酵素又は酵素の組合せ物：Ｅ47、Ｅ48、Ｅ49、Ｅ50、Ｅ51、Ｅ52、Ｅ4、Ｅ5及びＥ47Ｅ48Ｅ49Ｅ50Ｅ51Ｅ52Ｅ4Ｅ5の活性を増加する、本発明に従って使用される。
【０１２５】
さらに、本記載内容において、酵素
Ｅ4が、３−ヒドロキシイソブチレートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．３１）又は３−ヒドロキシアシル−補酵素Ａデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．３５）であり、
Ｅ5が、メチルマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．２７）であり、
Ｅ47が、マロニル−補酵素デカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．９）、マロネート−補酵素Ａトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．８．３．３）、メチルマロニル−補酵素Ａカルボキシトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．１．３．１）又はアセチル−補酵素Ａカルボキシラーゼ（ＥＣ ６．４．１．２）であり、
Ｅ48が、マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．１８）であり、
Ｅ49が、３−ヒドロキシプロピオネートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．５９）であり、
Ｅ50が、３−ヒドロキシイソブチリル−補酵素Ａヒドロラーゼ（ＥＣ ３．１．２．４）であり、
Ｅ51が、エノイル−補酵素Ａヒドラターゼ（ＥＣ ４．２．１．１７）であり、かつ
Ｅ52が、アシル−補酵素Ａデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．３．９９．３）である
ことが、特に好ましい。
【０１２６】
酵素Ｅ4及びＥ5に関する好ましい遺伝子は、本発明による細胞の第一の特定の実施態様に関して、前記で既に記載されているものである。
【０１２７】
酵素Ｅ47は、有利には、ｍｌｙｃｄ、ｔ１９ｂ１７．４、ｔｂ０８．２９Ｏ４．１１０、ｍａｔＡ、ａｃａｃ、ａｃａｃａ、ａｃａｃｂ、ｆ５ｊ５．２１、ｆ１５ｃ２１．２、ｔ８ｐ２１．５、ａｃｃ１、ａａｒ０７１ｗｐ、ａｃｃＡ、ａｃｃＢ、ａｃｃＣ、ａｃｃＤ、ａｃｃＣ１、ａｃｃＣ２、ｍｍｄＡ、ｆａｂＧ、ａｃｃＤ１、ａｃｃＤ２、ａｃｃＤ３、ｃｇｌ０８３１、ａｃｃＢＣ、ｄｔｓＲ１、ａｃｃＤＡ、ｓｃｃ２４．１６ｃ及びｃｇｌ１３２７からなる群から選択される遺伝子によってコードされ、その際ａｃｃＡ、ａｃｃＣ及びａｃｃＤが、最も好ましい。
【０１２８】
酵素Ｅ48は、有利にはｉｏｌＤ遺伝子によってコードされる。
【０１２９】
酵素Ｅ51は、有利には、ｅｃｈＳ１、ｅｈｈａｄｈ、ｈａｄｈａ、ｅｃｈｓ１−ｐｒｏｖ、ｃｇ４３８９、ｃｇ４３８９、ｃｇ６５４３、ｃｇ６９８４、ｃｇ８７７８、ｅｃｈ−１、ｅｃｈ−２、ｅｃｈ−３、ｅｃｈ−４、ｅｃｈ−５、ｅｃｈ−６、ｅｃｈ−７、ＦＣＡＡＬＬ．３１４、ｆｃａａｌｌ．２１、ｆｏｘ２、ｅｃｉ１、ｅｃｉ２、ｐａａＦ、ｐａａＧ、ｙｆｃｘ、ｆａｄＢ、ｆａｏＡ、ｒｐｆＦ、ｐｈａＡ、ｐｈａＢ、ｅｃｈＡ１、ｅｃｈＡ２、ｅｃｈＡ３、ｅｃｈＡ４、ｅｃｈＡ５、ｅｃｈＡ６、ｅｃｈＡ７、ｅｃｈＡ８、ｅｃｈＡ９、ｅｃｈＡ９、ｅｃｈＡ１０、ｅｃｈＡ１１、ｅｃｈＡ１２、ｅｃｈＡ１３、ｅｃｈＡ１４、ｅｃｈＡ１５、ｅｃｈＡ１６、ｅｃｈＡ１７、ｅｃｈＡ１８、ｅｃｈＡ１９、ｅｃｈＡ２０、ｅｃｈＡ２１、ｆａｄ−１、ｆａｄ−２、ｆａｄ−３、ｄｃａＥ、ｈｃａＡ、ｆａｄＪ、ｒｓｐ０６７１、ｒｓｐ００３５、ｒｓｐ０６４８、ｒｓｐ０６４７、ｒｓ０３２３４、ｒｓ０３２７１、ｒｓ０４４２１、ｒｓ０４４１９、ｒｓ０２８２０、ｒｓ０２９４６、ｐａａＧ１、ｐａａＧ２、ｐａａＧ３、ｅｃｈ、ｐｋｓＨ、ｙｄｂＳ、ｅｃｃＨ１、ｅｃｃＨ２、ｐｉｍＦ、ｆａｂＪ１、ｆａｂＪ２、ｃａｉＤ２、ｙｓｉＢ、ｙｎｇＦ、ｙｕｓＬ、ｆｕｃＡ、ｃｇｌ０９１９、ｓｃｆ４１．２３、ｓｃｄ１０．１６、ｓｃｋ１３．２２、ｓｃｐ８．０７ｃ、ｓｔｂａｃ１６ｈ６．１４、ｓｃ５ｆ２ａ．１５、ｓｃ６ａ５．３８、ｈｂｄ−１、ｈｂｄ−２、ｈｄｂ−３、ｈｄｂ−４、ｈｄｂ−５、ｈｄｂ−６、ｈｄｂ−７、ｈｄｈ−８、ｈｄｂ−９、ｈｄｂ−１０、ｆａｄ−１、ｆａｄ−２、ｆａｄ−３、ｆａｄ−４、ｆａｄ−５、ｐａａＦ−１、ｐａａＦ−２、ｐａａＦ−３、ｐａａＦ−４、ｐａａＦ−５、ｐａａＦ−６、ｐａａＦ−７及びｃｒｔからなる群から選択される遺伝子によってコードされる。
【０１３０】
酵素Ｅ52は、有利には、ａｃａｄｌ、ａｃａｄｍ、ａｃａｄ１０、ａｃａｄ１１、ａｃａｄｍ−ｐｒｏｖ、ａｃａｄｌ−ｐｒｏｖ、ｍｇｃ８１８７３、ｃｇ１２２６２、ｃｇ４７０３、ｃｇ４８６０、ｆ３ｅ２２．５、ａｆｌ２１３ｗｐ、ａｃｄＣ、ｆａｄＥ１３、ａｃｄ−１、ａｃｄ−２、ａｃｄ−３、ａｃｄ−４、ａｃｄ−５、ａｃｄ−６、ａｃｄ−７、ａｃｄ−８、ａｃｄ−９、ａｃｄ−１０、ａｃｄ−１１、ａｃｄ−１２、ａｃｄ、ｆａｄＥ１、ｆａｄＥ２、ｆａｄＥ３、ｆａｄＥ４、ｆａｄＥ５、ｆａｄＥ６、ｆａｄＥ７、ｆａｄＥ１３、ｆａｄＥ１４、ｆａｄＥ１５、ｆａｄＥ１６、ｆａｄＥ１７、ｆａｄＥ１８、ｆａｄＥ１９、ｆａｄＥ２０、ｆａｄＥ２１、ｆａｄＥ２２、ｆａｄＥ２３、ｆａｄＥ２６、ｆａｄＥ２７、ｆａｄＥ３０、ｆａｄＥ３１、ｆａｄＥ３３、ｆａｄＥ３５、ｆａｄＥ３８、ｆａｄＥ４５、ｆａｄＥ、ｃａｉＡ、ａｉｄＢ、ＲＳｐ００３６、ＲＳ０３５８８、ｍｍｇＣ、ａｃｄＡ−３、ｂｃｄ、ａｃｄＡ、ａｃｄＨ１、ａｃｄＨ２、ａｃｄＨ３、ａｉｄＢ、ａｃｄＩ及びａｃｄＨからなる群から選択される遺伝子によってコードされる。
【０１３１】
酵素Ｅ47〜Ｅ52に関して好適な遺伝子の、特に酵素Ｅ49及びＥ50のヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧデータベース、ＮＣＢＩデータベース又はＥＭＢＬデータベースにおいて見出されうる。
【０１３２】
本発明による方法の第二の特定の実施態様の第二の変法によって、中間体プロピオニル−補酵素Ａの形成は、この変法に従って、プロピオニル−補酵素Ａが、直接メチルマロン酸セミアルデヒドに転化されない場合に、他の中間体としてアセチル−補酵素Ａを介してではなく、メチルマロニル−補酵素Ａを介して、実施される。本記載内容において、使用される遺伝的に改変された細胞は、その野生型と比較して増加された、少なくとも１つの次の酵素Ｅ2〜Ｅ4、Ｅ6、Ｅ7、及びＥ47〜Ｅ52：
− アセチル−補酵素Ａの、マロニル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ47、
− マロニル−補酵素Ａの、マロン酸セミアルデヒドへの転化を触媒する酵素Ｅ48、
− マロン酸セミアルデヒドの、３−ヒドロキシプロピオネートへの転化を触媒する酵素Ｅ49、
− ３−ヒドロキシプロピオネートの、３−ヒドロキシプロピオニル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ50、
− ３−ヒドロキシプロピオニル−補酵素Ａの、アクリロイル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ51、
− アクリロイル−補酵素Ａの、プロピオニル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ52、
− プロピオニル−補酵素Ａの、（Ｓ）−メチルマロニル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ7、
− （Ｓ）−メチルマロニル−補酵素Ａの、（Ｒ）−メチルマロニル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ6、
− （Ｒ）−メチルマロニル−補酵素Ａの、マロン酸メチルへの転化を触媒する酵素Ｅ2、
− マロン酸メチルの、メチルマロン酸セミアルデヒドへの転化を触媒する酵素Ｅ3、
− メチルマロン酸セミアルデヒドの、３−ヒドロキシイソブチレートへの転化を触媒する酵素Ｅ4
の活性を特徴とすることが、特に好ましい（図１３及び１４を参照）。
【０１３３】
遺伝的に改変された細胞は、特に有利には、次の酵素又は酵素の組合せ物：Ｅ2、Ｅ3、Ｅ4、Ｅ6、Ｅ7、Ｅ47、Ｅ48、Ｅ49、Ｅ50、Ｅ51、Ｅ52及びＥ2Ｅ3Ｅ4Ｅ6Ｅ7Ｅ47Ｅ48Ｅ49Ｅ50Ｅ51Ｅ52の活性を増加する、本発明によって使用される。
【０１３４】
好ましい酵素及びそれらの酵素の遺伝子は、酵素Ｅ2〜Ｅ4、Ｅ6、Ｅ7及びＥ47〜Ｅ52に関して既に前記で挙げられている遺伝子及び酵素である。
【０１３５】
本発明による方法の第二の特定の実施態様の第一の変法の第三の変法によって、中間体プロピオニル−補酵素Ａの形成は、この変法によって、プロピオニル−補酵素Ａが、さらに、直接メチルマロン酸セミアルデヒドに転化されるのではなく、（Ｒ）−メチルマロニル−補酵素Ａを介して（及び（Ｓ）−メチルマロニル−補酵素Ａを介さずに）転化される場合に、他の中間体としてアセチル−補酵素Ａを介して実施される。
【０１３６】
本記載内容において、使用される遺伝的に改変された細胞は、その野生型と比較して増加された、少なくとも１つの次の酵素Ｅ2〜Ｅ4、Ｅ7及びＥ47〜Ｅ52：
− アセチル−補酵素Ａの、マロニル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ47、
− マロニル−補酵素Ａの、マロン酸セミアルデヒドへの転化を触媒する酵素Ｅ48、
− マロン酸セミアルデヒドの、３−ヒドロキシプロピオネートへの転化を触媒する酵素Ｅ49、
− ３−ヒドロキシプロピオネートの、３−ヒドロキシプロピオニル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ50、
− ３−ヒドロキシプロピオニル−補酵素Ａの、アクリロイル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ51、
− アクリロイル−補酵素Ａの、プロピオニル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ52、
− プロピオニル−補酵素Ａの、メチルマロニル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ7、
− メチルマロニル−補酵素Ａの、マロン酸メチルへの転化を触媒する酵素Ｅ2、
− マロン酸メチルの、メチルマロン酸セミアルデヒドへの転化を触媒する酵素Ｅ3、
− メチルマロン酸セミアルデヒドの、３−ヒドロキシイソブチレートへの転化を触媒する酵素Ｅ4、
の活性を特徴とすることが、特に好ましい（図１５及び１６を参照）。
【０１３７】
遺伝的に改変された細胞は、特に有利には、次の酵素又は酵素の組合せ物：Ｅ2、Ｅ3、Ｅ4、Ｅ7、Ｅ47、Ｅ48、Ｅ49、Ｅ50、Ｅ51、Ｅ52及びＥ2Ｅ3Ｅ4Ｅ7Ｅ47Ｅ48Ｅ49Ｅ50Ｅ51Ｅ52の活性を増加する、本発明によって使用される。
【０１３８】
好ましい酵素及びそれらの酵素の遺伝子は、さらに、酵素Ｅ2〜Ｅ4、Ｅ7及びＥ47〜Ｅ52に関して既に前記で挙げられている遺伝子及び酵素である。
【０１３９】
本発明による方法の第二の特定の実施態様の第四の変法によって、中間体プロピオニル−補酵素Ａの形成は、この変法に従って、アセトアセチル−補酵素Ａが中間体として形成される場合に、他の中間体としてアセチル−補酵素Ａを介しても実施される。本記載内容において、使用される遺伝的に改変された細胞は、その野生型と比較して増加された、少なくとも１つの次の酵素Ｅ8及びＥ53〜Ｅ61：
− ２つのアセチル−補酵素Ａ単位の、アセトアセチル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ53、
− アセトアセチル−補酵素Ａの、３−ヒドロキシブタノイル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ54、
− ３−ヒドロキシブタノイル−補酵素Ａの、クロトニル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ55、
− クロトニル−補酵素Ａの、ブチリル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ56、
− ブチリル−補酵素Ａの、エチルマロニル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ57、
− エチルマロニル−補酵素Ａの、メチルスクシニル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ58、
− メチルスクシニル−補酵素Ａの、イソブチリル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ59、
− イソブチリル−補酵素Ａの、メタクリリル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ60、
− メタクリリル−補酵素Ａの、３−ヒドロキシイソブチリル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ61、
− ３−ヒドロキシイソブチリル−補酵素Ａの、３−ヒドロキシイソブチレートへの転化を触媒する酵素Ｅ8
の活性を特徴とすることが、好まれてよい。
【０１４０】
本記載内容において、本発明によって特に好ましい遺伝的に改変された細胞は、次の酵素又は酵素の組合せ物：Ｅ8、Ｅ53、Ｅ54、Ｅ55、Ｅ56、Ｅ57、Ｅ58、Ｅ59、Ｅ60、Ｅ61及びＥ8Ｅ53Ｅ54Ｅ55Ｅ56Ｅ57Ｅ58Ｅ59Ｅ60Ｅ61の活性を増加するものである。
【０１４１】
この代謝経路、及びこの代謝経路において役割を果たす酵素は、例えばＫｏｒｏｔｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（２００２年），１７５０〜１７５８頁において記載されている。
【０１４２】
本発明による方法の第二の特定の実施態様の第五の変法によって、中間体プロピオニル−補酵素Ａの形成は、さらに、この変法に従って、アセトアセチル−補酵素Ａが、他の中間体として形成されるが、この場合に、エチルマロニル−補酵素Ａが、クロトニル−補酵素Ａから直接形成される場合に、他の中間体としてアセチル−補酵素Ａを介して実施される。本記載内容において、細胞は、その野生型と比較して増加された、少なくとも１つの次の酵素Ｅ8、Ｅ53〜Ｅ55、Ｅ58及びＥ62〜Ｅ65：
− ２つのアセチル−補酵素Ａ単位の、アセトアセチル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ53、
− アセトアセチル−補酵素Ａの、３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ54、
− ３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａの、クロトニル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ55、
− クロトニル−補酵素Ａの、エチルマロニル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ62、
− エチルマロニル−補酵素Ａの、メチルスクシニル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ58、
− メチルスクシニル−補酵素Ａの、メサコニル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ63、
− メサコニル−補酵素Ａの、β−メチルマリル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ64、
− β−メチルマリル−補酵素Ａの、グリオキシレート及びプロピオニル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ65
の活性を特徴とすることが好ましくてよい（図１７を参照）。
【０１４３】
従って、プロピオニル−補酵素Ａから、３−ヒドロキシイソ酪酸が、前記の方法（１つ以上の酵素Ｅ7、Ｅ2、Ｅ3及びＥ4の活性を増加すること、１つ以上の酵素Ｅ7、Ｅ6、Ｅ2、Ｅ3及びＥ4の活性を増加すること、又は１つのもしくは双方の酵素Ｅ4及びＥ5の活性を増加すること）で形成されうる。
【０１４４】
本記載内容において、酵素
Ｅ53が、β−ケトチオラーゼ（ＥＣ ２．３．１．９）であり、
Ｅ54が、アセトアセチル−補酵素Ａレダクターゼ（ＥＣ １．１．１．３６）であり、
Ｅ55が、エノイル−補酵素Ａヒドラターゼ（ＥＣ ４．２．１．１７）であり、
Ｅ62が、クロトニル−補酵素Ａデカルボキシラーゼであり、
Ｅ58が、エチルマロニル−補酵素Ａムターゼ（ＥＣ ５．４．９９．２）であり、
Ｅ63が、メチルスクシニル−補酵素Ａデヒドロゲナーゼであり、
Ｅ64が、メサコニル−補酵素Ａヒドラターゼであり、かつ
Ｅ65が、β−メチルマリル／Ｌ−マリル−補酵素Ａリアーゼである
ことが、特に好ましい。
【０１４５】
酵素Ｅ53は、有利には、ａｃａｔ１、ａｃａｔ２、ｌｏｃ４８４０６３、ｌｏｃ４８９４２１、ｍｇｃ６９０９８、ｍｇｃ８１４０３、ｍｇｃ８１２５６、ｍｇｃ８３６６４、ｋａｔ−１、ｅｒｇ１０、ｙｇｅＦ、ａｔｏＢ、ｆａｄＡｘ、ｐｈｂＡ−１、ｐｈｂＡ−２、ａｔｏＢ−２、ｐｃａＦ、ｐｃａＦ−２、ｐｈｂ−Ａ、ｂｋｔＢ、ｐｈａＡ、ｔｉｏＬ、ｔｈｌＡ、ｆａｄＡ、ｐａａＪ、ｐｈｂＡｆ、ｐｉｍＢ、ｍｍｇＡ、ｙｈｆＳ、ｔｈｌ、ｖｒａＢ、ｔｈ１、ｍｖａＣ、ｔｈｉＬ、ｐａａＪ、ｆａｄＡ３、ｆａｄＡ４、ｆａｄＡ５、ｆａｄＡ６、ｃｇｌ１２３９２、ｃａｔＦ、ｓｃ８ｆ４．０３、ｔｈｉＬ１、ｔｈｉＬ２、ａｃａＢ１、ａｃａＢ２、ａｃａＢ３又はａｃａＢ４からなる群から選択される遺伝子によってコードされ、その際ａｃａｔ１、ａｃａｔ２、ａｔｏＢ及びｐｈｂＡ、並びにロドバクター・スフェロイデスからの対応する遺伝子が、特に好ましい。
【０１４６】
酵素Ｅ54は、有利には、ｐｈｂＢ、ｆａｂＧ、ｐｈｂＮ１、ｐｈｂＢ２又はｃｇｌ１２４４４からなる群から選択される遺伝子によってコードされ、その際、ｐｈｂＢが特に好ましく、かつロドバクター・スフェロイデスからの対応する遺伝子が、特に好ましい。
【０１４７】
酵素Ｅ55は、有利には、ｅｃｈＳ１、ｅｈｈａｄｈ、ｈａｄｈａ、ｅｃｈｓ１−ｐｒｏｖ、ｃｇ４３８９、ｃｇ４３８９、ｃｇ６５４３、ｃｇ６９８４、ｃｇ８７７８、ｅｃｈ−１、ｅｃｈ−２、ｅｃｈ−３、ｅｃｈ−４、ｅｃｈ−５、ｅｃｈ−６、ｅｃｈ−７、ＦＣＡＡＬＬ．３１４、ｆｃａａｌｌ．２１、ｆｏｘ２、ｅｃｉ１、ｅｃｉ２、ｐａａＦ、ｐａａＧ、ｙｆｃＸ、ｆａｄＢ、ｆａｏＡ、ｒｐｆＦ、ｐｈａＡ、ｐｈａＢ、ｅｃｈＡ１、ｅｃｈＡ２、ｅｃｈＡ３、ｅｃｈＡ４、ｅｃｈＡ５、ｅｃｈＡ６、ｅｃｈＡ７、ｅｃｈＡ８、ｅｃｈＡ９、ｅｃｈＡ９、ｅｃｈＡ１０、ｅｃｈＡ１１、ｅｃｈＡ１２、ｅｃｈＡ１３、ｅｃｈＡ１４、ｅｃｈＡ１５、ｅｃｈＡ１６、ｅｃｈＡ１７、ｅｃｈＡ１８、ｅｃｈＡ１９、ｅｃｈＡ２０、ｅｃｈＡ２１、ｆａｄ−１、ｆａｄ−２、ｆａｄ−３、ｄｃａＥ、ｈｃａＡ、ｆａｄＪ、ｒｓｐ０６７１、ｒｓｐ００３５、ｒｓｐ０６４８、ｒｓｐ０６４７、ｒｓ０３２３４、ｒｓ０３２７１、ｒｓ０４４２１、ｒｓ０４４１９、ｒｓ０２８２０、ｒｓ０２９４６、ｐａａＧ１、ｐａａＧ２、ｐａａＧ３、ｅｃｈ、ｐｋｓＨ、ｙｄｂＳ、ｅｃｃＨ１、ｅｃｃＨ２、ｐｉｍＦ、ｆａｂＪ１、ｆａｂＪ２、ｃａｉＤ２、ｙｓｉＢ、ｙｎｇＦ、ｙｕｓＬ、ｆｕｃＡ、ｃｇｌ０９１９、ｓｃｆ４１．２３、ｓｃｄ１０．１６、ｓｃｋ１３．２２、ｓｃｐ８．０７ｃ、ｓｔｂａｃ１６ｈ６．１４、ｓｃ５ｆ２ａ．１５、ｓｃ６ａ５．３８、ｈｂｄ−１、ｈｂｄ−２、ｈｄｂ−３、ｈｄｂ−４、ｈｄｂ−５、ｈｄｂ−６、ｈｄｂ−７、ｈｄｂ−８、ｈｄｂ−９、ｈｄｂ−１０、ｆａｄ−１、ｆａｄ−２、ｆａｄ−３、ｆａｄ−４、ｆａｄ−５、ｐａａＦ−１、ｐａａＦ−２、ｐａａＦ−３、ｐａａＦ−４、ｐａａＦ−５、ｐａａＦ−６、ｐａａＦ−７及びｃｒｔからなる群から選択される遺伝子によってコードされ、その際、ロドバクター・スフェロイデスからの対応する遺伝子が、特に好ましい。
【０１４８】
酵素Ｅ58に関する好適な遺伝子は、ｍｕｔ、ｍｕｔＡ、ｍｕｔＢ、ｓｂｍ、ｓｂｍＡ、ｓｂｍＢ、ｓｂｍ５、ｂｈｂＡ、ｍｃｍＡ、ｍｃｍＡ１、ｍｃｍＡ２、ｍｃｍＢ、ｍｃｍ１、ｍｃｍ２、ｍｃｍ３、ｉｃｍＡ、ｍｅａＡ１及びｍｅａＡ２からなる群から選択され、その際、さらに、ロドバクター・スフェロイデスからの対応する遺伝子が、特に好ましい。
【０１４９】
有利には、酵素Ｅ62として使用されうる酵素は、配列表番号０５を有するＤＮＡ配列によってコードされ、かつ配列表番号０６において示されるようなアミノ酸配列を有する、ロドバクター・スフェロイデスからの酵素である。
【０１５０】
酵素Ｅ63、Ｅ64及びＥ65に関して好適な遺伝子は、特に、ロドバクター・スフェロイデスからのそれらの酵素に関する遺伝子である。
【０１５１】
前記の遺伝子のヌクレオチド配列の他の例は、とりわけ、ＫＥＧＧデータベース、ＮＣＢＩデータベース、又はＥＭＢＬデータベースにおいても見出されうる。
【０１５２】
既に前記で説明しているように、本発明による方法の第二の好ましい実施態様の第一の変法は、中間体としてプロピオニル−補酵素Ａ及びアセチル−補酵素Ａを介して、３−ヒドロキシイソ酪酸又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートを生じる。本記載内容において、原則として、１つ以上の前記の酵素活性Ｅ2〜Ｅ8及びＥ47〜Ｅ65だけでなく、細胞中でアセチル−補酵素Ａの形成における増加を引き起こすそれらの酵素活性にも影響を及ぼすことを意味してよい。
【０１５３】
３−ヒドロキシイソ酪酸が、炭素源として炭水化物又はグリセロールから形成される場合に、その細胞は、ピルベートのアセチル−補酵素Ａへの転化を触媒する、酵素Ｅ66における増加された活性を特徴とすることが、好まれてよい。この酵素Ｅ66は、有利には、ピルベートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．５１）の形をとる。
【０１５４】
３−ヒドロキシイソ酪酸が、Ｃ1−炭素源、例えば、メタン又はメタノールから形成される場合に、その細胞は、その野生型と比較して増加された少なくとも１つの酵素Ｅ67〜Ｅ71：
− メタンの、メタノールへの転化を触媒する酵素Ｅ67、
− メタノールの、ホルムアルデヒドへの転化を触媒する酵素Ｅ68、
− ホルムアルデヒドの、５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸塩への転化を触媒する酵素Ｅ69、
− ５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸塩の、５−メチレンテトラヒドロ葉酸塩への転化を触媒する酵素Ｅ70、
− ５−メチレンテトラヒドロ葉酸塩の、アセチル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ71
の活性を特徴とすることが好まれてよい。
【０１５５】
本記載内容において、酵素：
Ｅ67が、メタンモノオキシゲナーゼ（ＥＣ １．１４．１３．２５）であり、
Ｅ68が、メタノールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．２４４）であり、
Ｅ69が、メチルマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．２７）であり、
Ｅ70が、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ（ＥＣ １．５．１．２０）であり、
Ｅ71が、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．９９．２）である
ことが、特に好ましい。
【０１５６】
酵素Ｅ63〜Ｅ67に関する好適な遺伝子のヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧデータベース、ＮＣＢＩデータベース、又はＥＭＢＬデータベースにおいて見出されうる。
【０１５７】
遺伝的に改変された細胞が使用される場合に、３−ヒドロキシイソ酪酸の又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートの形成が、前駆体としてメチルマロン酸セミアルデヒドを介して実施される、本発明による方法の第三の特定の実施態様に従って、３−ヒドロキシイソ酪酸の又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートの形成が、使用される細胞が炭素源として炭水化物、グリセロール、又はグルタメートを選択的に使用することができる場合に、中間体としてアクリロイル−補酵素Ａを介して実施されることが好ましい。
【０１５８】
本発明による方法の第三の特定の実施態様に関して、使用される遺伝的に改変された細胞が、その野生型と比較して増加された、少なくとも１つの次の酵素Ｅ2〜Ｅ4、Ｅ62、Ｅ72及びＥ73：
− ベータ−アラニンの、ベータ−アラニル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ72、
− ベータ−アラニル−補酵素Ａの、アクリリル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ73、
− アクリリル−補酵素Ａの、メチルマロニル−補酵素Ａへの転化（又はクロトニル−補酵素Ａの、エチルマロニル−補酵素Ａへの転化）を触媒する酵素Ｅ62、
− メチルマロニル−補酵素Ａの、マロン酸メチルへの転化を触媒する酵素Ｅ2、
− マロン酸メチルの、メチルマロン酸セミアルデヒドへの転化を触媒する酵素3、
− メチルマロン酸セミアルデヒドの、３−ヒドロキシイソ酪酸への転化を触媒する酵素Ｅ4
の活性を特徴とする場合に、特に好ましい（図１８を参照）。
【０１５９】
本記載内容において、本発明によって特に好ましい細胞は、次の酵素又は酵素の組合せ物：Ｅ62Ｅ2、Ｅ62Ｅ3、Ｅ62Ｅ4、Ｅ62Ｅ2Ｅ3及びＥ72Ｅ73Ｅ62Ｅ2Ｅ3Ｅ4の活性を増加するものである。本発明による方法の第四の特定の実施態様に関しても、少なくとも２つの前記の反応工程で触媒することができる酵素が、過剰発現される、遺伝的に改変された細胞を使用することが有利であってよい。
【０１６０】
本明細書でも、例えば、酵素Ｅ2の活性と酵素Ｅ3の活性の双方を特徴とする酵素、例えば配列表番号０３を有するＤＮＡ配列によってコードされ、かつ配列表番号０４において示されるようなアミノ酸配列を特徴とする、スルフォロバス・トコダイからのマロニル−補酵素Ａレダクターゼを使用することができる。さらに、原則として、本発明による細胞の第四の特定の実施態様の記載内容において、既に非常に多量のアクリリル−補酵素Ａを形成することができる細胞を使用することも可能である。
【０１６１】
本記載内容において、酵素
Ｅ72が、補酵素Ａトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．８．３．１）又は補酵素Ａシンターゼ、有利には補酵素Ａトランスフェラーゼであり、
Ｅ73が、ベータ−アラニル−補酵素Ａアンモニア−リアーゼ（ＥＣ ４．３．１．６）であり、
Ｅ62が、クロトニル−補酵素Ａデカルボキシラーゼであり、
Ｅ2が、メチルマロニル−補酵素Ａヒドロラーゼ（ＥＣ ３．１．２．１７）であり、
Ｅ3が、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．３）又はアルデヒドオキシダーゼ（ＥＣ １．２．３．１）であり、かつ
Ｅ4が、３−ヒドロキシイソブチレートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．３１）又は３−ヒドロキシアシル−補酵素Ａデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．３５）である
ことが、特に有利である。
【０１６２】
ＣｏＡトランスフェラーゼ活性を有する好ましい酵素Ｅ72は、メガスフェラ・エルスデニ（Megasphaera elsdenii）、クロストリジウム・プロピオニクム（Clostridium propionicum）、クロストリジウム・クルイベリ（Clostridium kluyveri）から、及び大腸菌からのものである。ＣｏＡトランスフェラーゼに関してコードするＤＮＡ配列の現時点で挙げられてよい例は、ＷＯ−Ａ−０３／０６２１７３号における配列表番号２４として参照されるメガスフェラ・エルスデニからの配列である。さらに好ましい酵素は、ＷＯ−Ａ−０３／０６２１７３号において記載されているＣｏＡトランスフェラーゼのそれらの変異体である。
【０１６３】
ベータ−アラニル−補酵素Ａアンモニア−リアーゼ活性を有する好適な酵素Ｅ73は、例えばクロストリジウム・プロピオニクムからのものである。かかる酵素に関してコードするＤＮＡ配列は、例えば、ＷＯ−Ａ−０３／０６２１７３号における実施例１０において記載されているクロストリジウム・プロピオニクムから得られうる。クロストリジウム・プロピオニクムからのベータ−アラニル−補酵素Ａアンモニア−リアーゼに関してコードするＤＮＡ配列は、配列表番号２２としてＷＯ−Ａ−０３／０６２１７３において記載されている。
【０１６４】
有利に使用される酵素Ｅ62は、さらに、配列表番号０５を有するＤＮＡ配列によってコードされ、かつ配列表番号０６において示されるようなアミノ酸配列を特徴とする、ロドバクター・スフェロイデスからのクロトニル−補酵素Ａデカルボキシラーゼである。この酵素は、クロトニル−補酵素Ａのエチルマロニル−補酵素Ａへの転化だけでなく、アクリリル−補酵素Ａのメチルマロニル−補酵素Ａへの転化もすることができる。
【０１６５】
酵素Ｅ2〜Ｅ4に関する好適な遺伝子は、既に本発明による方法の第一の変異体に関して挙げられており、これが、第二の変法に関しても好ましい場合に、スルフォロバス・トコダイからの前記の遺伝子が、酵素Ｅ3に関する遺伝子として特に好ましい
本発明による方法の第三の特定の実施態様の特に好ましい変異体によって、酵素Ｅ2又は酵素Ｅ2及びＥ3が、配列表番号０３において示されるようなＤＮＡ配列によってコードされ、かつ酵素Ｅ62が、配列表番号０５において示されるようなＤＮＡ配列によってコードされる場合に、その野生型と比較して増加された酵素Ｅ2及びＥ62、又は酵素Ｅ2、Ｅ3及びＥ62の少なくとも１つの活性を特徴とする、遺伝的に改変された細胞が使用される。本記載内容において、それらの２つの酵素の増加された活性が、細胞中で、配列表番号０４及び配列表番号０６を有するポリペプチドを過剰発現することによって達せられる場合に、それぞれ、配列表番号０４及び配列表番号０６において示されるようなアミノ酸配列との、少なくとも５０％、有利には少なくとも５５％、より有利には少なくとも６０％、より有利には少なくとも６５％、及び最も有利には７０％の同一性を有するアミノ酸配列が好ましい。本記載内容において、それら２つのＤＮＡ配列は、細胞のゲノム中へ組み込まれ、或いは細胞の中にベクター上で存在してよい。
【０１６６】
本発明による方法の前記の第三の特定の実施態様に関して、さらに、使用される遺伝的に改変された細胞が、酵素Ｅ62の活性、並びに／又は酵素Ｅ2のもしくは酵素Ｅ2及びＥ3の活性を増加するだけでなく、少なくとも１つの、有利には双方の、次の特性：
− その野生型と比較して増加された、ピルベートの、オキサロ酢酸塩への転化を触媒する酵素Ｅ11、又はホスホエノールピルベートの、オキサロ酢酸塩への転化を触媒する酵素Ｅ74の活性、しかし有利には、ピルベートの、オキサロ酢酸塩への転化を触媒する酵素Ｅ11、及び
− アスパルテートの、ベータ−アラニンへの転化を触媒する酵素Ｅ75の増加された活性
も特徴とする場合に有利であってよい。
【０１６７】
有利には、酵素Ｅ11は、ピルベートの、オキサロ酢酸塩への転化を触媒する、カルボキシラーゼの、特に有利にはピルベートカルボキシラーゼ（ＥＣ番号６．４．１．１）の形を取る。本記載内容において特に好ましいピルベートカルボキシラーゼは、"Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ｇｅｎｏｍｅ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ａ ｎｅｗ Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｍｕｔａｎｔ．" Ｏｈｎｉｓｈｉ Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ５８（２）、２１７〜２２３頁（２００２年）において記載されている突然変異体である。この突然変異において、４５８番目の位置のアミノ酸のプロリンが、セリンによって置き換えられている。ピルベートカルボキシラーゼ突然変異体を製造する可能性に関するこの文献の開示は、参照をもって本明細書に組み込まれたものとし、かつ本発明の開示の一部をなす。
【０１６８】
酵素Ｅ75は、有利にはデカルボキシラーゼの、特に有利にはグルタメートデカルボキシラーゼの、又はアスパルテートデカルボキシラーゼの形を取り、その際、ｐａｎＤ遺伝子によってコードされる１−アスパルテート１−カルボキシラーゼ（ＥＣ番号４．１．１．１１）が、最も好ましい。アスパルテートデカルボキシラーゼは、アスパルテートのベータ−アラニンへの転化を触媒する。特に大腸菌からの（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ， １４３，２４７〜２５２頁（１９９６年））， "Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ ｓｕｂｓｐ．Ｌａｕｍｏｎｄｉｉ， Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ ｓｕｂｓｐ．Ｂｏｖｉｓ"）、及び多数の他の微生物からのアスパルテートデカルボキシラーゼに関する遺伝子（ｐａｎＤ遺伝子）は、既に、クローン化され、そして配列を決定されている。ＤＥ−Ａ−１９８ ５５ ３１３号は、特に、コリネバクテリウム・グルタミクムからのｐａｎＤ遺伝子のヌクレオチド配列を記載している。原則として、たとえ細菌、酵母又は菌からでも、あらゆる可能な起源、のｐａｎＤ遺伝子を使用することが可能である。さらに、ｐａｎＤ遺伝子の全ての対立遺伝子を、特に遺伝暗号の縮重又は機能的に中立なセンス突然変異の結果である対立遺伝子も使用することが可能である。本発明による特に好ましいアスパルテートデカルボキシラーゼは、コリネバクテリウム・グルタミクムからのアスパルテートデカルボキシラーゼに加えて、大腸菌の突然変異体ＤＶ９（Ｖａｌｌａｒｉ ａｎｄ Ｒｏｃｋ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１６４，１３６〜１４２頁（１９８５年））である。前記の突然変異体に関するこの文献の開示は、参照をもって本明細書に組み込まれたものとし、かつ本発明の開示の一部をなす。ピルベートカルボキシラーゼの活性とアスパルテートデカルボキシラーゼの活性の双方が増加される組換え細胞の製造は、ＤＥ−Ａ−１０ ２００５ ０４８ ８１８号において記載されている。
【０１６９】
本発明による方法の第二の変異体によって、３−ヒドロキシイソ酪酸の又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートの形成は、前駆体として３−ヒドロキシイソブチリル−補酵素Ａを介して実施される。
【０１７０】
本発明による方法において、３−ヒドロキシイソ酪酸の又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートの形成が、第二の変異体において明記されているように、前駆体として３−ヒドロキシイソブチリル−補酵素Ａを介して生じる細胞が使用される場合に、第一の特定の実施態様によって、３−ヒドロキシイソ酪酸の又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートの形成は、中間体としてイソブチリル−補酵素Ａを介して実施される、その際その細胞は、優先的に、炭素源として炭水化物、グリセロール又はＬ−バリンを使用することができることが好ましい。
【０１７１】
炭水化物又はグリセロールが炭素源として作用する場合に、本発明による方法の第二の変異体の第一の特定の実施態様の第一の変法によって、その野生型と比較して増加された、少なくとも１つの次の酵素Ｅ76〜Ｅ79、Ｅ60、Ｅ61及びＥ8：
− ピルベートの、２−アセトラクテートへの転化を触媒する酵素Ｅ76、
− ２−アセトラクテートの、２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの転化を触媒する酵素Ｅ77、
− ２，３−ジヒドロキシイソバレレートの、２−オキソイソバレレートへの転化を触媒する酵素Ｅ78、
− ２−オキソイソバレレートの、イソブチリル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ79、
− イソブチリル−補酵素Ａの、メタクリリル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ60、
− メタクリリル−補酵素Ａの、３−ヒドロキシイソブチリル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ61、
− ３−ヒドロキシイソブチリル−補酵素Ａの、３−ヒドロキシイソブチレートへの転化を触媒する酵素Ｅ8
の活性を特徴とする、遺伝的に改変された細胞を使用することが好ましい（図１９を参照）。
【０１７２】
次の酵素又は酵素の組合せ：Ｅ8、Ｅ60、Ｅ61、Ｅ76、Ｅ77、Ｅ78、Ｅ79及びＥ8Ｅ60Ｅ61Ｅ76Ｅ77Ｅ78Ｅ79の活性を増加する、遺伝的に改変された細胞が、特に有利には、本発明に従って使用される。
【０１７３】
本記載内容において、酵素
Ｅ8が、３−ヒドロキシイソブチリル−補酵素Ａヒドロラーゼ（ＥＣ ３．１．２．４）であり、
Ｅ76が、アセトラクテートシンターゼ（ＥＣ ２．２．１．６）であり、
Ｅ77が、ジヒドロキシイソバレレートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．８６）であり、
Ｅ78が、２，３−ジヒドロキシイソバレレートデヒドラターゼ（ＥＣ ４．２．１．９）であり、
Ｅ79が、２−オキソイソバレレートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．２５又はＥＣ １．２．４．４）であり、
Ｅ60が、アシル−補酵素Ａデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．３．９９．３）、ブチリル−補酵素Ａデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．３．９９．２）又は２−メチルアシル−補酵素Ａデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．３．９９．１２）であり、かつ
Ｅ61が、エノイル−補酵素Ａデヒドラターゼ（ＥＣ ４．２．１．１７）である
ことが、特に好ましい。
【０１７４】
好ましい酵素Ｅ8、Ｅ60及びＥ61は、前記で既に記載されているものである。
【０１７５】
酵素Ｅ76は、有利には、ｉｖｂｌ、ｔ８ｐ１９．７０、ｉｌｖ１、ｉｌｖ２、ｉｌｖ６、ａａｌ０２１ｗｐ、ａｅｌ３０５ｃｐ、ｉｌｖＩ、ｉｌｖＨ、ｉｌｖＮ、ｉｌｖＢ、ｉｌｖＭ、ｉｌｖＧ、ｉｌｖＮ、ｂｕｄＢ、ｉｌｖＮ−１、ｉｌｖＮ−２、ａｔｒＣ、ｉｌｖＸ、ｉｏｌＤ、ｂｕｄＢ、ａｌｓＳ、ｉｌｖＫ、ｉｌｖＢ１、ｉｌｖＢ２、ｉｌｖＢ３、ｉｌｖＮ１、ｉｌｖＮ２、ｃｇｌ１２７１、ｃｇｌ１２７２、ｉｏｌＤ及びｓｃｃ５７Ａ．４０ｃからなる群から選択される遺伝子によってコードされる。
【０１７６】
酵素Ｅ77は、有利には、ｆ１４ｐ２２．２００、ｉｌｖ５、ａｃｌ１９８Ｗｐ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＹ、ｉｌｖＣ−１、ｉｌｖＣ−２、ｉｌｖＣ−３及びｃｇｌ１２７３からなる群から選択される遺伝子によってコードされ、その際ｉｌｖＣ遺伝子が、最も好ましい。
【０１７７】
酵素Ｅ78は、有利には、ｆ１４ｏ１３．１８、ｉｌｖ３、ａｃｌ１１７ｗｐ、ｉｌｖＤ、ｃｇｌ１２６８、ｉｌｖＤ１及びｉｌｖＤ２からなる群から選択される遺伝子によってコードされ、その際ｉｌｖＤが、最も好ましい。
【０１７８】
Ｌ−バリンが炭素源として作用する場合に、本発明による方法の第二の変法の第一の特定の実施態様の第二の改変によって、３−ヒドロキシイソ酪酸の又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートの形成が、前駆体として３−ヒドロキシイソブチリル−補酵素Ａ及び中間体としてイソブチリル−補酵素Ａを介して実施される、遺伝的に改変される細胞が使用される場合に、この使用される細胞は、その野生型と比較して増加された、少なくとも１つの次の酵素Ｅ79、Ｅ80、Ｅ60、Ｅ61及びＥ8：
− Ｌ−バリンの、２−オキソイソバレレートへの転化を触媒する酵素Ｅ80、
− ２−オキソイソバレレートの、イソブチリル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ79、
− イソブチリル−補酵素Ａの、メタクリリル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ60、
− メタクリリル−補酵素Ａの、３−ヒドロキシイソブチリル−補酵素Ａへの転化を触媒する酵素Ｅ61、
− ３−ヒドロキシイソブチリル−補酵素Ａの、３−ヒドロキシイソブチレートへの転化を触媒する酵素Ｅ8
の活性を特徴とすることが好ましい（図２０を参照）。
【０１７９】
、次の酵素又は酵素の組合せ物：Ｅ8、Ｅ60、Ｅ61、Ｅ79、Ｅ80及びＥ8Ｅ60Ｅ61Ｅ79Ｅ80の活性を増加する、遺伝的に改変された細胞は、特に有利には本発明に従って使用される。
【０１８０】
本記載内容において、酵素
Ｅ8は、３−ヒドロキシイソブチリル−補酵素Ａヒドロラーゼ（ＥＣ ３．１．２．４）であり、
Ｅ60は、アシル−補酵素Ａデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．３．９９．３）、ブチリル−補酵素Ａデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．３．９９．２）又は２−メチルアシル−補酵素Ａデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．３．９９．１２）であり、
Ｅ61は、エノイル−補酵素Ａヒドラターゼ（ＥＣ ４．２．１．１７）であり、
Ｅ79は、２−オキソイソバレレートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．２５又はＥＣ １．２．４．４）であり、かつ
Ｅ80は、アミノ酸トランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．４２）である
ことが、特に好ましい。
【０１８１】
好ましい酵素Ｅ8、Ｅ60、Ｅ61及びＥ79は、前記で既に記載されているものである。
【０１８２】
酵素Ｅ80は、有利には、ｂｃａｔ１、ｂｃａｔ２、ｔ２７Ｉ１．８、ｔ２７ｉ１．９、ｆ２ｊ１０．５、ｆ２ｊ１０．４、ｔ１２ｈ１．１６、ｍｍｂ１２．２０、ｔ９ｃ５．３、ｍｐａ２４．１３、ｂａｔ１、ｂａｔ２、ａｄｌ３８４ｗｐ、ｅｃａ３９、ｂｃａＡ、ｉｌｖＥ、ｉｌｖＥ１、ｉｌｖＥ２、ｉｌｖＥ３、ｙｗａＡ、ｙｂｇＥ、ｂｃａＴ及びｃｇｌ２２０４からなる群から選択される遺伝子によってコードされ、その際ｉｌｖＥが特に好ましい。
【０１８３】
酵素Ｅ80の好適な遺伝子のヌクレオチド配列は、さらに、ＫＥＧＧデータベース、ＮＣＢＩデータベース、又はＥＭＢＬデータベースにおいて見出されうる。
【０１８４】
本発明による方法の第二の変異体の第一の特定の実施態様のこの第二の変法に関して、さらに、メチルマロン酸セミアルデヒドの、３−ヒドロキシイソ酪酸への添加を触媒する酵素Ｅ4の活性を低減する遺伝的に改変された細胞を使用することが有利であってよく、その際この酵素Ｅ4は、有利には、３−ヒドロキシイソブチレートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．３１）の又は３−ヒドロキシアシル−補酵素Ａデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．３５）の形を取る。
【０１８５】
本発明による方法の第二の変異体の第一の特定の実施態様の第二の改変によって、３−ヒドロキシイソ酪酸の又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートの形成が、前駆体として３−ヒドロキシイソブチリル−補酵素Ａ及び中間体としてイソブチリル−補酵素Ａを介して、かつ炭素源としてＬ−バリンから出発して実施される遺伝的に改変された細胞が使用される場合に、さらに、既に多量のＬ−バリンを形成することができる細胞を使用することが好ましくてよい。本記載内容において、好適な細胞は、特に、Ｂｌｏｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．によって、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ７３（７） （２００７年），２０７９〜２０８４頁において記載されている細胞である。
【０１８６】
本発明による方法の特定の一実施態様によって、さらに、使用される遺伝的に改変された細が、その野生型と比較して増加されたｇｌｂ０遺伝子の発現を特徴とすることが好ましい。さらに、ある条件下で、使用される遺伝的に改変された細胞は、活性がその野生型と比較して低減された、ｄｃｔＡ遺伝子又はｃｉｔＰ遺伝子によってコードされたクエン酸輸送タンパク質の活性を特徴とすることが好ましくてよい。
【０１８７】
本発明による方法において使用される遺伝的に改変された細胞は、有利には、細胞中で、少なくとも１つの前記の酵素の、有利には１つ以上の酵素
− Ｅ1〜Ｅ4、
− Ｅ1、Ｅ4、Ｅ5、Ｅ6及びＥ7、
− Ｅ1、Ｅ4、Ｅ5及びＥ7、
− Ｅ4、Ｅ5及びＥ47〜Ｅ52、
− Ｅ2〜Ｅ4、Ｅ6、Ｅ7及びＥ47〜Ｅ52、
− Ｅ2〜Ｅ4、Ｅ7及びＥ47〜Ｅ52、
− Ｅ8及びＥ53〜Ｅ61、
− Ｅ8、Ｅ53〜Ｅ55、Ｅ58及びＥ62〜Ｅ64、
− Ｅ2〜Ｅ3、Ｅ62、Ｅ72及びＥ73、
− Ｅ8、Ｅ60、Ｅ61及びＥ76〜Ｅ79又は
− Ｅ8、Ｅ60、Ｅ61、Ｅ79及びＥ80
の活性を増加する工程を含む方法によって得られてよく、その際酵素活性を増加することは、有利には、初めに記載された方法によって実施される。
【０１８８】
本発明による方法の工程ＩＡ）において、遺伝的に改変された細胞を、連続的にもしくはバッチ式で、バッチ法で、又は流加法でもしくは反復流加法で、３−ヒドロキシイソ酪酸又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートを製造するために、栄養培地と接触し、かつ従って培養することができる。ＧＢ−Ａ−１００９３７０号において記載されている半連続的な方法が可能でもある。公知の培養方法に関する概要は、Ｃｈｍｉｅｌによる教科書（"Ｂｌｏｐｒｏｚｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋ １， Ｅｉｎｆｕｈｒｕｎｇ ｉｎ ｄｉｅ Ｂｌｏｖｅｒｆａｈｒｅｎｓｔｅｃｈｎｉｋ"［Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １． ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ］（Ｇｕｓｔａｖ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ， １９９１年））において、又はＳｔｏｒｈａｓによる教科書（"Ｂｉｏｒｅａｋｔｏｒｅｎ ｕｎｄ． ｐｅｒｌｐｈｅｒｅ Ｅｉｎｒｉｃｈｔｕｎｇｅｎ"［Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ］ Ｖｉｅｗｅｇ Ｖｅｒｌａｇ， Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ／Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，１９９４年）において記載されている。
【０１８９】
使用されるべき培地は、好適な、問題の菌株の要求を満たすべきである。種々の微生物に関する培地の説明は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙの"Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ"の教科書において見出されうる（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ， １９８１年）。
【０１９０】
使用されてよい炭素源は、炭水化物、例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプン及びセルロース、油及び脂肪、例えば大豆油、ヒマワリ油、ピーナッツ油及びココナッツ油、脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸、アルコール、例えばグリセロール及びメタノール、炭化水素、例えばメタン、アミノ酸、例えばＬ−グルタメート又はＬ−バリン、又は有機酸、例えば酢酸である。これらの物質は、単独で、又は混合物として使用されてよい。ＵＳ ６ ０１ ４９４号及びＵＳ ６ １３６ ５７６号において記載されている、炭水化物、特に単糖、オリゴ糖もしくは多糖、又はＣ5−糖、又はグリセロールを使用することが、特に好ましい。
【０１９１】
使用されうる窒素源は、有機窒素含有化合物、例えばペプトン、酵母抽出物、肉抽出物、麦芽抽出物、コーンスティープリカー、大豆ミール及び尿素、又は無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び窒化アンモニウムである。該窒素源は、単独で、又は混合物として使用されてよい。
【０１９２】
リン酸、リン酸二水素カリウムもしくはリン酸水素二カリウム、又は対応するナトリウム含有塩が、燐の源として使用されうる。培地は、さらに、成長のために要求される、金属の塩、例えば硫酸マグネシウム又は硫酸鉄を含有しなければならない。最終的に、必須発育因子、例えばアミノ酸及びビタミンが、前記の物質に加えて使用されてよい。さらに、好適な前駆体が、培地に添加されてよい。前記の投入物質は、単一バッチの形で培養物に添加され、或いは培養中に好適な方法で供給されてよい。
【０１９３】
培養物に関するｐＨは、好適な方法で、塩基性化合物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア及びアンモニア水、又は酸性化合物、例えばリン酸又は硫酸を使用することによって調整されうる。発泡は、消泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルを使用することによって調整されうる。プラスミドの安定性を維持するために、選択的な効果を有する媒体に好適な物質、例えば抗生物質に添加することができる。好気条件は、培養物中に、酸素又は酸素含有ガス混合物、例えば周囲空気を導入することによって維持される。培養温度は、通常２０℃〜４５℃、及び有利には２５℃〜４０℃である。特に基質としてグリセロールを転用することができる細胞を使用する場合に、細胞として、ＵＳ ６ ８０３ ２１８号において記載されている細胞を使用することが好ましくてよい。この場合において、該細胞は、４０〜１００℃の範囲の温度で培養されうる。
【０１９４】
栄養溶液からの３−ヒドロキシ酪酸の分離は、有利には、連続して実施され、その際、さらに、本記載内容において、連続法で発酵によって３−ヒドロキシイソ酪酸を製造することも好ましく、その結果、３−ヒドロキシイソ酪酸の製造から、発酵液からのその分離までの全体の方法が、連続して実施されうる。発酵液からの３−ヒドロキシイソ酪酸の製造の連続分離のために、固体／液体分離を実施する場合に、その形成は、有利には２０〜２００ｋＤａの範囲における排除レベルを有するフィルターを介して、発酵中に使用される微生物を取り除くための装置を連続して通過させる。遠心分離、好適な沈澱装置又はそれらの装置の組合せを使用することが可能でもあり、その際、最初に、沈澱によって少なくとも一部の微生物を分離し、続いて微生物の一部がない発酵液を限外濾過に、又は遠心分離装置に供給することが特に好ましい。
【０１９５】
微生物を取り出した後に、その３−ヒドロキシイソ酪酸の留分に関して富化された発酵生成物は、分離系、有利には多工程分離系に供給される。この分離形は、戻り管が発酵タンクに連れ去る又は連れ戻すそれぞれの場合における工程から連続して連続する多数の分離工程を提供する。さらに、吐き出し管は、それぞれの分離工程を導き出す。個々の分離工程は、電気透析、逆浸透、限外濾過又はナノ濾過法によって操作されてよい。原則として、それらは、個々の分離工程における膜分離装置である。個々の分離工程の選択は、発酵副産物及び基質残留物の天然の及び限界の機能である。
【０１９６】
電気透析、逆浸透、限外濾過又はナノ濾過によって分離された３−ヒドロキシイソ酪酸に加えて、３−ヒドロキシイソ酪酸水溶液が最終産物として得られる間に、３−ヒドロキシイソ酪酸は、抽出法によって微生物を有さない発酵溶液から分離されることもでき、その場合に、最終的に、純粋な３−ヒドロキシイソ酪酸が得られうる。３−ヒドロキシイソ酪酸を抽出によって分離するために、発酵溶液、例えばアンモニア化合物又はアミンに、３−ヒドロキシイソ酪酸のアンモニウム塩を形成するために添加することができる。このアンモニウム塩を、発酵溶液から、有機抽出物を添加し、続いて得られた混合物を加熱することによって分離することができ、それによってアンモニウム塩が、有機相中で濃縮される。そして、３−ヒドロキシイソ酪酸を、例えば他の抽出工程によってこの相から分離して、純粋な３−ヒドロキシイソ酪酸を得ることができる。分離法に関するさらなる詳述は、ＷＯ−Ａ−０２／０９０３１２号において見出されることができ、ヒドロキシカルボン酸の発酵溶液からの分離に関する開示は、参照をもって本明細書に組み込まれたものとし、かつ本明細書の開示の一部をなす。
【０１９７】
３−ヒドロキシイソ酪酸を発酵溶液から分離する方法に依存して、２〜９０質量％、有利には７．５〜５０質量％、及び特に有利には１０〜２５質量％の３−ヒドロキシイソ酪酸或いは純粋な３−ヒドロキシイソ酪酸を含有する３−ヒドロキシイソ酪酸の水溶液が得られる。
【０１９８】
さらに、本発明による方法の工程ＩＡ）において製造された３−ヒドロキシイソ酪酸は、塩基例えば水酸化カルシウム又は水酸化ナトリウムを使用しうる目的のために、精製前、精製中又は精製後のいずれかに中和されうる。
【０１９９】
本発明による方法の工程ＩＢ）の方法において、３−ヒドロキシイソ酪酸は、発酵溶液を後処理する場合に分離される、発酵溶液から分離された純粋な３−ヒドロキシイソ酪酸、或いは３−ヒドロキシイソ酪酸の水溶液を使用することが可能であるために、メタクリル酸の形成で脱水され、その際、適宜脱水工程前に、例えば蒸留によって、適宜好適な添加溶剤の存在下で、３−ヒドロキシイソ酪酸の水溶液を濃縮することもできる。
【０２００】
脱水反応は、原則として、液相中で又はガス相中で実施されうる。さらに、本発明に従って、脱水反応を、触媒の存在下で実施することが好ましく、その際使用される触媒の性質は、ガス相であろうと液相反応であろうと反応が実施されることに依存する。
【０２０１】
好適な脱水触媒は、酸性触媒とアルカリ性触媒である。酸性触媒が好ましく、それというのも、特に酸性触媒は、オリゴマーを形成する傾向をほとんど示さないからである。脱水触媒は、均一触媒として及び不均一触媒として使用されてよい。脱水触媒が不均一触媒の形で存在する場合に、該脱水触媒は、担持体ｘと接触することが好ましい。好適な担持体ｘは、当業者によって好適であるべきとされている全ての固体である。本記載内容において、該固体は、良好な結合及び脱水触媒の吸収に好適である、好適な細孔体積を有することが好ましい。さらに、ＤＩＮ ６６１３３によって明記されている０．０１〜３ｍｌ／ｇの範囲の合計の細孔体積が好ましく、かつ０．１〜１．５ｍｌ／ｇの範囲の合計の細孔体積が、特に好ましい。さらに、担持体ｘとして好適である固体が、ＤＩＮ ６６１３１において明記されているＢＥＴ試験によって測定される、０．００１〜１０００ｍ2／ｇの範囲、有利には０．００５〜４５０ｍ2／ｇの範囲、及びさらに有利には０．０１〜３００ｍ2／ｇの範囲の表面積を有することが好ましい。脱水触媒として使用されてよい担持体は、最初に、０．１〜４０ｍｍの範囲、有利には１〜１０ｍｍの範囲、及びさらに有利には１．５〜５ｍｍの範囲の平均粒子直径を有するバルク材料でありうる。脱水反応体の壁は、さらに、担持体として作用してよい。さらに、担持体は、それ自体酸性又はアルカリ性であってよく、或いは酸性又はアルカリ性の脱水触媒は、不活性担持体に適用されてよい。特に挙げられてよい適用技術は、浸漬又は含浸、或いは担持体マトリックス中への組込である。
【０２０２】
脱水触媒の機能を特徴としてよい好適な担持体ｘは、特に、天然又は合成シリケート、例えば特にモルデン沸石、モンモリロナイト、酸性ゼオライト；一塩基、二塩基又は多塩基の無機酸、特にリン酸で、又は無機酸の酸性塩、例えば酸化物又はシリケート型の物質、例えばＡｌ2Ｏ3、ＴｉＯ2で被覆された担持体；酸化物及び混合酸化物、例えばヘテロポリ酸のγ−Ａｌ2Ｏ3及びＺｎＯ−Ａｌ2Ｏ3混合酸化物である。
【０２０３】
本発明による一実施態様に従って、担持体ｘは、酸化物型の化合物の少なくとも一部を含有する。酸化物型のかかる化合物は、Ｓｉ、Ｔｉ、Ｚｒ、Ａｌ、Ｐの中から選択された少なくとも１つの元素又はそれらの少なくとも２つの組合せ物を特徴とするべきである。かかる担持体は、それらの酸性又はアルカリ性の特徴のために、それ自体脱水触媒として作用してもよい。ｘによる及び脱水触媒による担持体として化合物の好ましい種類は、ケイ素／アルミニウム／燐の酸化物を含有する。脱水触媒として、及び担持体ｘとしても作用する好ましいアルカリ物質は、アルカリ、アルカリ土類、ランタン、ランタノイド又はそれらの酸化物の形でそれらの少なくとも２つの組合せを含有する。かかる酸性又はアルカリ性脱水触媒は、Ｄｅｇｕｓｓａ ＡＧから及びＳｕｅｄｃｈｅｍｉｅ ＡＧから市販されている。他の種類は、イオン交換体である。さらに、該イオン交換体は、アルカリ性型及び酸性型の双方で存在してよい。
【０２０４】
好適な均一な脱水触媒は、特に、無機酸、有利にはリン含有酸、及びさらに有利にはリン酸である。それらの無機酸は、浸漬又は含浸によって担持体ｘ上に固定されうる。
【０２０５】
均一な触媒の使用は、特にガス相脱水の場合において、特に有利と証明されている。しかしながら、液相脱水の場合において、均一な及び不均一な脱水触媒が使用されうる。
【０２０６】
さらに、本発明による方法は、＋１〜−１０の範囲、有利には＋２〜−８．２の範囲、並びにさらに有利には、液相脱水の場合において、＋２〜−３の範囲、及びガス相脱水において−３〜−８．２の範囲のＨ0値を有する脱水触媒の使用を含むことが好ましい。Ｈ0値は、Ｈａｅｍｍｅｒｔによって決定された酸機能に対応し、アミン滴定として公知であるもの及び指示薬の使用によって、又はガス状基剤の吸収によって決定されうる（"Ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃａｔａｌｙｔｉｃｓ"、ｖｏｌ．５１，１９８９年："Ｎｅｗ ｓｏｌｉｄ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｂａｓｅｓ，ｔｈｅｉｒ ｃａｔａｌｙｔｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ"、Ｋ．Ｔａｎｎａｂｅ ｅｔ ａｌを参照）。
【０２０７】
本発明による方法の特定の一実施態様によって、使用される酸性の固体触媒は、有機酸と、有利にはリン酸と又は超酸、例えば硫化又はリン化させた酸化ジルコニウムと接触させた、並びに有利には少なくとも９０質量％、さらに有利には少なくとも９５質量％、及び最も有利には少なくとも９９質量％の酸化ケイ素、有利にはＳｉＯ2に基づく、多孔質担持体構造である。多孔質担持体構造と無機酸との接触は、有利には、担持体構造を酸で含浸することによって実施され、その際、担持体構造は、有利には、担持体構造の質量に対して、１０〜７０質量％の範囲、特に有利には２０〜６０質量％の範囲、及び最も有利には３０〜５０質量％の範囲の量で形成体と接触され、続いて乾燥によって実施される。乾燥後、その担持体構造は、有機酸を固定するために、有利には３００〜６００℃の範囲、より有利には４００〜５００℃の範囲の温度で加熱される。
【０２０８】
本発明による方法の特定の一実施態様によって、脱水反応は、ガス相で実施される。本明細書で、ガス相反応、例えば管形反応器の分野における当業者に公知であるような、従来の装置を使用することができる。熱交換器として平熱板を含む多管式熱交換器及び反応器を使用することが、特に好ましい。
【０２０９】
ガス相脱水反応の実施態様によって、純粋な３−ヒドロキシイソ酪酸は、前記の固定床触媒の１つを含有する反応器中へ導入される。他の実施態様によって、３−ヒドロキシイソ酪酸は、それぞれ水溶液の総質量に対して、２〜８０質量％、特に有利には５〜５０質量％、及びより有利には１０〜２５質量％の３−ヒドロキシイソ酪酸を含有する水溶液の形で、反応器中へ導入される。反応器の内部の圧力及び温度条件は、３−ヒドロキシイソ酪酸又はその水溶液が、反応器に入る場合にガス状で存在するように選択される。ガス相における脱水は、有利には、２００〜４００℃、特に有利には２５０〜３５０℃の温度範囲で実施される。ガス相脱水反応中の反応器の内部の圧力は、有利には、０．１〜５０ｂａｒの範囲、特に有利には０．２〜１０ｂａｒの範囲、及び最も有利には０．５〜５ｂａｒの範囲である。
【０２１０】
ガス相脱水反応において反応器中へ導入された３−ヒドロキシイソ酪酸の量は、有利には１０〜１００体積％の範囲、特に有利には２０〜１００体積％の範囲、及び最も有利には３０〜１００体積％の範囲である。
【０２１１】
本発明による方法の他の特定の一実施態様によって、脱水反応は、液相で実施される。液相脱水反応は、圧力が、所望の温度条件下で液体状態における反応成分を維持するために十分な装置に適用されうる過程の間に、当業者に公知である全ての装置中で、及び所望の反応温度まで加熱されうる液体中でも実施されうる。
【０２１２】
本発明による方法の特定の一実施態様によって、液相脱水方法は、純粋な３−ヒドロキシイソ酪酸、又は水溶液の総質量に対して、５〜１００質量％、特に有利には２０〜１００質量％、及び最も有利には５０〜１００質量％の３−ヒドロキシイソ酪酸を含有する水溶液が、反応器中に導入される、第一の方法の工程を含む。反応器の内部の圧力及び温度条件は、３−ヒドロキシイソ酪酸又はその水溶液が、反応器に入る場合に液状で存在するように選択される。脱水反応が液相中で実施される本発明による方法の特定の一実施態様によって、３−ヒドロキシイソ酪酸又はその水溶液は、液相が、触媒粒子の表面を覆ってしたたり落ちる脱水反応器の内部の固定された触媒床を覆う方法で通過される。かかる手法は、例えば細流床（ｔｒｉｃｋｌｅ−ｂｅｄ）反応器中で実施されてよい。
【０２１３】
液相における脱水は、有利には、２００〜３５０℃、特に有利には２５０〜３００℃の温度範囲で実施される。液相脱水の場合における反応器の内部の圧力は、有利には、１〜５０ｂａｒの範囲、特に有利には２〜２５ｂａｒの範囲、及び最も有利には３〜１０ｂａｒの範囲である。
【０２１４】
脱水反応の触媒は、ガス相脱水の場合において、及び液相脱水の場合において、均一又は不均一であってよい。
【０２１５】
均一な触媒反応の場合において、有利にはこの場合に無機酸、例えばリン酸又は硫酸の形を取る触媒を、最初に、純粋な３−ヒドロキシイソ酪酸と又は３−ヒドロキシイソ酪酸を含有する水溶液と接触させる。その後、得られた組成物を、反応器中に導入し、そして所望の圧力及び温度条件下でメタクリル酸に転化する。独立して３−ヒドロキシイソ酪酸又はその水溶液の無機酸を反応器中に導入することもできる。この場合において、該反応器は、３−ヒドロキシイソ酪酸又は３−ヒドロキシイソ酪酸を含有する水溶液のための、及び触媒のための、少なくとも２つの供給管を特徴とする。脱水反応が細流床反応器における液相中で実施される場合に、３−ヒドロキシイソ酪酸又は３−ヒドロキシイソ酪酸を含有する水溶液と共に、触媒を、反応器の頂部に導入することが好ましい。
【０２１６】
不均一な触媒反応の場合において、その触媒は、反応空間において配置される固体の基体の形で、例えば固定層の形で、反応器の内側に配置された触媒被覆された板、有利には平熱板の形で、或いは触媒被覆された反応器の壁の形である。可能な反応器は、例えばＤＥ−Ａ−１９８ ４８ ２０８号、ＤＥ−Ａ−１００ １９ ３８１号及びＥＰ−Ａ−Ｉ ２３４ ６１２号において記載されている。不均一な触媒の場合において、好ましい触媒は、無機酸と接触し、有利には多孔質担持体材料を含浸させる、担持体構造である。３−ヒドロキシイソ酪酸、又は３−ヒドロキシイソ酪酸を含有する水溶液は、蒸気の形で、又は液状で、固体の触媒材料の表面と接触する。
【０２１７】
本発明による方法の特に好ましい一実施態様によって、３−ヒドロキシイソ酪酸の脱水を、液相中で、２００〜５００ｍｂａｒの範囲の圧力で、２００〜３００℃の範囲の温度で、及び触媒としてアルカリ金属イオンの存在で実施する。
【０２１８】
脱水反応後に得られた反応混合物は、あらゆる触媒成分を含有しないメタクリル酸水溶液（かかる溶液は、不均一に触媒された脱水の場合に得られる）、或いは触媒を含有するメタクリル酸水溶液（かかる溶液は、均一に触媒された脱水の場合に得られる）のいずれかである。さらに、メタクリル酸水溶液は、液状（脱水反応が液相中で実施される場合）、又はガス状（脱水反応がガス相中で実施される場合）であってよい。
【０２１９】
適宜、得られたメタクリル酸溶液を、本発明による方法の特定の一実施態様によって、さらに加工することなくエステル化する。かかる場合において、メタクリル酸溶液を、加熱しながら、好適なアルコール、例えばメタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール又は１−ブタノール、及び当業者に公知な好適なエステル化触媒、例えば濃縮酸と接触させ、そしてメタクリル酸を、対応するエステルに転化する。しかしながら、付加的にエステル化前にメタクリル酸を精製することが有利であってよく、その際、原則として、当業者に公知であり、かつプロピレンの触媒ガス相酸化によって得られた汚染された（メタ）アクリル酸の精製のために通常使用されるあらゆる精製方法を使用することが可能である。
【０２２０】
脱水反応がガス相中で実施される場合に、メタクリル酸が、最初に濃縮されて、メタクリル酸水溶液を生じることが好ましい。本明細書で、当業者に公知のあらゆる濃縮方法は、原則として、例えばＷＯ−Ａ−２００４／０３５５１４号、ＷＯ−Ａ−０３／０１４１７２号又はＥＰ−Ａ−ＥＰ １ １６３ ２０１号において記載されている部分濃縮を、又はＥＰ−Ａ−０ ６９５ ７３６号において記載されている全濃縮によって、使用されてよい。できるだけ完全にメタクリル酸を吸収するための濃縮加工中に、追加の溶剤、特に水を添加することも可能である。
【０２２１】
濃縮後に得られたメタクリル酸水溶液、或いは液相脱水の場合に得られるメタクリル酸水溶液は、水及び他の不純物から他の精製工程で取り除かれうる。本明細書で、例えばＤＥ−Ａ−１９８ ５３ ０６４号において記載されているような添加溶剤の存在下で、最初に、共沸蒸留によって、水を取り除くことが可能である。例えばＥＰ−Ａ−０ ９７４ ５７４号において開示されているように、メタクリル酸を吸収するための高沸点有機溶剤を使用することも可能である。それらの蒸留方法に加えて、例えばＤＥ−Ａ−４４ ０１ ４０５号において提案されているように、脱水のための膜が使用されてもよい。液相脱水の場合において生じた、又は濃縮によって得られる、メタクリル酸水溶液を精製するための触媒法を使用することが、さらに可能である。
【０２２２】
脱水後に得られるメタクリル酸は、他の方法の工程においてでさえもさらに精製されうる。従って、未だ存在する高沸点不純物は、他の上流工程によって取り除かれうる。しかしながら、例えばＤＥ−Ａ−１０１ ４９ ３５３号において記載されているような結晶化法を使用する脱水によって得られたメタクリル酸をさらに精製することが特に好ましい。
【０２２３】
そして、得られた精製されたメタクリル酸は、適宜エステル化されうる。
【０２２４】
最初に挙げられた問題を解決することに対する寄与は、さらに、
ＩＩＡ）前記の方法による３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートの製造工程、
ＩＩＢ）３−ヒドロキシイソ酪酸の形成及び、適宜、３−ヒドロキシイソ酪酸の中和、及び／又は３−ヒドロキシイソ酪酸の分離での、３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートの開裂工程、
ＩＩＣ）３−ヒドロキシイソ酪酸を脱水してメタクリル酸を形成し、適宜、メタクリレート又はメタクリル酸をエステル化する工程
を含む、メタクリル酸又はメタクリルエステルを製造する方法によって提供される。
【０２２５】
最初に挙げられた問題を解決するための寄与は、
ＩＩＩＡ）前記の方法によるメタクリル酸の製造工程、
ＩＩＩＢ）メタクリル酸の遊離基重合工程、
を含む、ポリメタクリル酸又はポリメタクリルエステルを製造する方法によっても提供され、その際、適宜、遊離基重合反応の前又は後に、少なくとも１部分、メタクリル酸のカルボキシル基をエステル化することができる。
【０２２６】
本発明は、制限されることなく、図及び実施例の参照で、非常に詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【０２２７】
【図１】酵素Ｅ1による触媒作用での、スクシニル−補酵素Ａのメチルマロニル−補酵素Ａへの転化を示す図。
【図２】酵素Ｅ2〜Ｅ4による触媒作用での、メチルマロニル−補酵素Ａの３−ヒドロキシイソ酪酸への転化を示す図。
【図３】酵素Ｅ4、Ｅ6及びＥ7による触媒作用での、（Ｒ）−メチルマロニル−補酵素Ａの３−ヒドロキシイソ酪酸への転化を示す図。
【図４】酵素Ｅ4、Ｅ5及びＥ7による触媒作用での、メチルマロニル−補酵素Ａの３−ヒドロキシイソ酪酸への転化を示す図。
【図５】酵素Ｅ8及びＥ9による触媒作用で、３−ヒドロキシイソ酪酸のポリヒドロキシアルカノエートへの転化を示す図。
【図６】酵素Ｅ10又はＥ11による触媒作用での、ホスホエノールピルベート又はピルベートのオキサロ酢酸塩への転化を示す図。
【図７】酵素Ｅ12〜Ｅ15による触媒作用での、オキサロ酢酸塩のスクシニル−補酵素Ａへの転化を示す図。
【図８】酵素Ｅ13〜Ｅ16及びＥ24〜Ｅ26による触媒作用での、オキサロ酢酸塩のスクシニル−補酵素Ａへの転化を示す図。
【図９】酵素Ｅ16、Ｅ24、Ｅ27及びＥ28による触媒作用での、オキサロ酢酸塩のスクシニル−補酵素Ａへの転化を示す図。
【図１０】酵素Ｅ46及びＥ28による触媒作用での、Ｌ−グルタメートのスクシニル−補酵素Ａへの転化を示す図。
【図１１】酵素Ｅ4、Ｅ5及びＥ47〜Ｅ52による触媒作用での、アセチル−補酵素Ａの３−ヒドロキシイソ酪酸への転化を示す図。
【図１２】酵素Ｅ4、Ｅ5及びＥ47〜Ｅ52による触媒作用での、アセチル−補酵素Ａの３−ヒドロキシイソ酪酸への転化を示す図。
【図１３】酵素Ｅ2〜Ｅ4、Ｅ6、Ｅ7及びＥ47〜Ｅ52による触媒で作用の、プロピオニル−補酵素Ａの３−ヒドロキシイソ酪酸への転化を示す図。
【図１４】酵素Ｅ2〜Ｅ4、Ｅ6、Ｅ7及びＥ47〜Ｅ52による触媒で作用の、プロピオニル−補酵素Ａの３−ヒドロキシイソ酪酸への転化を示す図。
【図１５】酵素Ｅ2〜Ｅ4、Ｅ7及びＥ47〜Ｅ52による触媒作用での、プロピオニル−補酵素Ａの３−ヒドロキシイソ酪酸への転化を示す図。
【図１６】酵素Ｅ2〜Ｅ4、Ｅ7及びＥ47〜Ｅ52による触媒作用での、プロピオニル−補酵素Ａの３−ヒドロキシイソ酪酸への転化を示す図。
【図１７】酵素Ｅ53〜Ｅ55、Ｅ58及びＥ62〜Ｅ65による触媒作用での、２単位のアセチル−補酵素Ａのグリオキサレート及びプロピオニル−補酵素Ａへの転化を示す図。
【図１８】酵素Ｅ2〜Ｅ4、Ｅ62、Ｅ72及びＥ73による触媒作用での、β−アニリンの３−ヒドロキシイソ酪酸への転化を示す図。
【図１９】酵素Ｅ76〜Ｅ79、Ｅ60、Ｅ61及びＥ8による触媒作用での、ピルベートの３−ヒドロキシイソ酪酸への転化を示す図。
【図２０】酵素Ｅ8、Ｅ60、Ｅ61、Ｅ79及びＥ80による触媒作用での、Ｌ−バリンの３−ヒドロキシイソ酪酸への転化を示す図。
【図２１】実施例３のプラスミドｐＥＫＥｘ２ＭＣＭを示す図。
【図２２】実施例３のベクターｐＧＡ４＿３ＨＩＢＤＨを示す図。
【図２３】実施例３のベクターｐＧＡ５＿ＭＭＣｏＡＲ＿３ＨＩＢＤＨを示す図。
【図２４】実施例３のベクターｐＥＣＸＴ９９Ａを示す図。
【図２５】実施例３のベクターｐＥＣＸＴ９９Ａ＿ＭＭＣｏＡＲ＿３ＨＩＢＤＨを示す図。
【図２６】実施例３における組換え細胞による、３−ヒドロキシイソ酪酸の製造のイオンクロマトグラフィーによる検出を示す図。
【図２７】３−ヒドロキシイソ酪酸のピークとしてイオンクロマトグラフィーによって同定された図２６において示されたピークを示す図。
【０２２８】
図１は、酵素Ｅ1による触媒作用での、スクシニル−補酵素Ａのメチルマロニル−補酵素Ａへの転化を示す。
【０２２９】
図２は、３−ヒドロキシイソ酪酸の又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートの製造において、スクシニル−補酵素Ａが中間体として、かつメチルマロン酸セミアルデヒドが前駆体として形成される、遺伝的に改変された細胞が使用される場合に、本発明による方法の第一の変法に従って、酵素Ｅ2〜Ｅ4による触媒作用での、メチルマロニル−補酵素Ａの３−ヒドロキシイソ酪酸への転化を示す。
【０２３０】
図３は、３−ヒドロキシイソ酪酸の又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートの製造において、スクシニル−補酵素Ａが中間体として、かつメチルマロン酸セミアルデヒドが前駆体として形成される、遺伝的に改変された細胞が使用される場合に、本発明による方法の第二の変法に従って、酵素Ｅ4、Ｅ6及びＥ7による触媒作用での、（Ｒ）−メチルマロニル−補酵素Ａの３−ヒドロキシイソ酪酸への転化を示す。
【０２３１】
図４は、３−ヒドロキシイソ酪酸の又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートの製造において、スクシニル−補酵素Ａが中間体として、かつメチルマロン酸セミアルデヒドが前駆体として形成される、遺伝的に改変された細胞が使用される場合に、本発明による方法の第三の変法に従って、酵素Ｅ4、Ｅ5及びＥ7による触媒作用での、メチルマロニル−補酵素Ａの３−ヒドロキシイソ酪酸への転化を示す。
【０２３２】
図５は、酵素Ｅ8及びＥ9による触媒作用で、３−ヒドロキシイソ酪酸のポリヒドロキシアルカノエートへの転化を示す。
【０２３３】
図６は、３−ヒドロキシイソ酪酸の又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートの製造において、スクシニル−補酵素Ａが中間体として、かつメチルマロン酸セミアルデヒドが前駆体として形成される、遺伝的に改変された細胞が使用される場合に、本発明による方法の第一、第二又は第三の変法の特定の実施態様によって、酵素Ｅ10又はＥ11による触媒作用での、ホスホエノールピルベート又はピルベートのオキサロ酢酸塩への転化を示す。
【０２３４】
図７は、３−ヒドロキシイソ酪酸の又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートの製造において、スクシニル−補酵素Ａが中間体として、かつメチルマロン酸セミアルデヒドが前駆体として形成される、遺伝的に改変された細胞が使用される場合に、本発明による方法の第一、第二又は第三の変法の第一の特定の実施態様によって、酵素Ｅ12〜Ｅ15による触媒作用での、オキサロ酢酸塩のスクシニル−補酵素Ａへの転化を示す。
【０２３５】
図８は、３−ヒドロキシイソ酪酸の又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートの製造において、スクシニル−補酵素Ａが中間体として、かつメチルマロン酸セミアルデヒドが前駆体として形成される、遺伝的に改変された細胞が使用される場合に、本発明による方法の第一、第二又は第三の変法の第二の特定の実施態様によって、酵素Ｅ13〜Ｅ16及びＥ24〜Ｅ26による触媒作用での、オキサロ酢酸塩のスクシニル−補酵素Ａへの転化を示す。
【０２３６】
図９は、３−ヒドロキシイソ酪酸の又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートの製造において、スクシニル−補酵素Ａが中間体として、かつメチルマロン酸セミアルデヒドが前駆体として形成される、遺伝的に改変された細胞が使用される場合に、本発明による方法の第一、第二又は第三の変法の第三の特定の実施態様によって、酵素Ｅ16、Ｅ24、Ｅ27及びＥ28による触媒作用での、オキサロ酢酸塩のスクシニル−補酵素Ａへの転化を示す。
【０２３７】
図１０は、３−ヒドロキシイソ酪酸の又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートの製造において、スクシニル−補酵素Ａが中間体として、かつメチルマロン酸セミアルデヒドが前駆体として形成される、遺伝的に改変された細胞が使用される場合に、本発明による方法の第一、第二又は第三の変法の他の特定の実施態様に従って、酵素Ｅ46及びＥ28による触媒作用での、Ｌ−グルタメートのスクシニル−補酵素Ａへの転化を示す。
【０２３８】
図１１及び１２は、３−ヒドロキシイソ酪酸の又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートの製造において、プロピオニル−補酵素Ａが中間体として、かつメチルマロン酸セミアルデヒドが前駆体として形成される、遺伝的に改変された細胞が使用される場合に、本発明による方法の第二の特定の実施態様の第一の変法に従って、酵素Ｅ4、Ｅ5及びＥ47〜Ｅ52による触媒作用での、アセチル−補酵素Ａの３−ヒドロキシイソ酪酸への転化を示す。
【０２３９】
図１３及び１４は、３−ヒドロキシイソ酪酸の又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートの製造において、プロピオニル−補酵素Ａが中間体として、かつメチルマロン酸セミアルデヒドが前駆体として形成される、遺伝的に改変された細胞が使用される場合に、本発明による方法の第二の特定の実施態様の第二の変法に従って、酵素Ｅ2〜Ｅ4、Ｅ6、Ｅ7及びＥ47〜Ｅ52による触媒で作用の、プロピオニル−補酵素Ａの３−ヒドロキシイソ酪酸への転化を示す。
【０２４０】
図１５及び１６は、３−ヒドロキシイソ酪酸の又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートの製造において、プロピオニル−補酵素Ａが中間体として、かつメチルマロン酸セミアルデヒドが前駆体として形成される、遺伝的に改変された細胞が使用される場合に、本発明による方法の第二の特定の実施態様の第三の変法に従って、酵素Ｅ2〜Ｅ4、Ｅ7及びＥ47〜Ｅ52による触媒作用での、プロピオニル−補酵素Ａの３−ヒドロキシイソ酪酸への転化を示す。
【０２４１】
図１７は、３−ヒドロキシイソ酪酸の又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートの製造において、プロピオニル−補酵素Ａが中間体として、かつメチルマロン酸セミアルデヒドが前駆体として形成される、遺伝的に改変された細胞が使用される場合に、本発明による方法の第二の特定の実施態様の第五の変法に従って、酵素Ｅ53〜Ｅ55、Ｅ58及びＥ62〜Ｅ65による触媒作用での、２単位のアセチル−補酵素Ａのグリオキサレート及びプロピオニル−補酵素Ａへの転化を示す。
【０２４２】
図１８は、３−ヒドロキシイソ酪酸の又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートの製造において、アクリリル−補酵素Ａが中間体として、かつメチルマロン酸セミアルデヒドが前駆体として形成される、遺伝的に改変された細胞が使用される場合に、本発明による方法の第三の特定の実施態様によって、酵素Ｅ2〜Ｅ4、Ｅ62、Ｅ72及びＥ73による触媒作用での、β−アニリンの３−ヒドロキシイソ酪酸への転化を示す。
【０２４３】
図１９は、３−ヒドロキシイソ酪酸の又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートの製造において、イソブチル−補酵素Ａが中間体として、かつ３−ヒドロキシイソブチリル−補酵素Ａが前駆体として形成される、遺伝的に改変された細胞が使用される場合に、本発明による方法の第二の変異体の第一の特定の実施態様の第一の変法によって、酵素Ｅ76〜Ｅ79、Ｅ60、Ｅ61及びＥ8による触媒作用での、ピルベートの３−ヒドロキシイソ酪酸への転化を示す。
【０２４４】
図２０は、３−ヒドロキシイソ酪酸の又は３−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートの製造において、イソブチル−補酵素Ａが中間体として、かつ３−ヒドロキシイソブチリル−補酵素Ａが前駆体として形成される、遺伝的に改変された細胞が使用される場合に、本発明による方法の第二の変異体の第一の特定の実施態様の第二の変法によって、酵素Ｅ8、Ｅ60、Ｅ61、Ｅ79及びＥ80による触媒作用での、Ｌ−バリンの３−ヒドロキシイソ酪酸への転化を示す。
【０２４５】
図２１は、実施例３のプラスミドｐＥＫＥｘ２ＭＣＭを示す。
【０２４６】
図２２は、実施例３のベクターｐＧＡ４＿３ＨＩＢＤＨを示す。
【０２４７】
図２３は、実施例３のベクターｐＧＡ５＿ＭＭＣｏＡＲ＿３ＨＩＢＤＨを示す。
【０２４８】
図２４は、実施例３のベクターｐＥＣＸＴ９９Ａを示す。
【０２４９】
図２５は、実施例３のベクターｐＥＣＸＴ９９Ａ＿ＭＭＣｏＡＲ＿３ＨＩＢＤＨを示す。
【０２５０】
図２６は、実施例３における組換え細胞による、３−ヒドロキシイソ酪酸の製造のイオンクロマトグラフィーによる検出を示す。
【０２５１】
図２７は、３−ヒドロキシイソ酪酸のピークとしてイオンクロマトグラフィーによって同定された図２６において示されたピークを示す。
【０２５２】
実施例
実施例１
本発明は、炭素源としてＬ−バリンから出発する、前駆体として３−ヒドロキシイソブチリル−補酵素Ａを及び中間体としてイソブチリル−補酵素Ａを介して３−ヒドロキシイソ酪酸を製造することができる組換え細胞に関して、実施例１において説明される。本発明に従って、この細胞を、メタクリル酸の製造のために使用してよい。このために、酵素ＥＣ ２．６．１．４２及びＥＣ １．２．４．４（それぞれの場合においてシュードモナス・アエルギノーサ（Pseudomonas aeruglnosa）から）、並びに３つの酵素ＥＣ １．３．９９．１２、ＥＣ ４．２．１．１７及びＥＣ ３．１．２．４（アシネトバクター・カルコアセチカスから）を含有するクラスターを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中で過剰発現した。
【０２５３】
本明細書で、酵素ＥＣ １．２．４．４を、配列表番号０７及び０８において示されるようなＤＮＡ配列を有する遺伝子（α及びβサブユニット）によってコードする一方で、酵素ＥＣ ２．６．１．４２を、配列表番号０９において示されるようなＤＮＡ配列を有する遺伝子によってコードする。酵素ＥＣ １．３．９９．１２を、配列表番号１０を有するＤＮＡ配列を有する遺伝子によって、酵素ＥＣ ４．２．１．１７を、配列表番号１１において示されるようなＤＮＡ配列を有する遺伝子によって、及び酵素ＥＣ ３．１．２．４を、配列表番号１２において示されるようなＤＮＡ配列を有する遺伝子によってコードする。
【０２５４】
１．生物、プラスミド及びオリゴヌクレオチド
次の細菌株、ベクター、ゲノムＤＮＡ及びオリゴヌクレオチドを、この組換え細胞を製造するために使用した：
【表１】
0005449142.tif 000002
【表２】
0005449142.tif 000003
【表３】
0005449142.tif 000004
【表４】
0005449142.tif 000005
【０２５５】
２．ＰＣＲ断片１．２．４．４（２３１３ｋｂ）及び２．６．１．４２（９５８ｂｐ）の増幅
最初に、１．２．４．４及び２．６．１．４２の断片を、表４において詳述されている、配列表番号１５〜配列表番号１８において示されるようなプライマーを使用して、シュードモナス・アエロギノーサからの全ＤＮＡから開始するＰＣＲによって増幅した。
【０２５６】
３．ベクターｐＣＤＦ−Ｄｕｅｔ−１の、及びＰＣＲ断片２．６．１．４２（９５８ｂｐ）の消化
ベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ−１（ストレプトマイシン耐性／スペクチノマイシン耐性を特徴とする）を、ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩによって開裂し、同様にＰＣＲ断片２．６．１．４２を開裂し、そして従って得られた制限を、一昼夜Ｔ４リガーゼと連結した。これは、ベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ：：２．６．１．４２をもたらした。
【０２５７】
４．ベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ中へのＰＣＲ断片のクローニング
ベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯを使用して、断片２．６．１．４２又は断片１．２．４．４を含有するクローニングベクターの製造を、製造者の説明書において記載されているように実施した。大腸菌ＤＨ５α細胞を、得られたクローニングベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ：：１．２．４．４及びｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ：：２．６．１．４２で形質転換した。ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターが、カナマイシン耐性及びアンピシリン耐性を特徴とするために、その形質転換株を、２枚のＡＸＩ及びＫＸＩプレート（２０及び４０μｌ）上で培養した。得られたクローンのプラスミドを、単離しそして消化した：
ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ：：１．２．４．４        ＢｇＩＩＩ＋ＫｐｎＩ
断片サイズ２３１３ｂｐ
ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ：：２．６．１．４２      ＥｃｏＲＩ＋ＳａｌＩ
断片サイズ９５８ｂｐ。
【０２５８】
それぞれの断片を、ゲルから溶出し、そしてＱｉａｇｅｎ社製のＱＩＡｑｕｉｃｋキットで精製した（次の説明）。
【０２５９】
５．ベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ：２．６．１．４２−１．２．４．４の製造
ベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ：：２．６．１．４２及びベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ：：１．２．４．４を、ＢｇＩＩＩ／ＫｐｎＩで消化した。
【０２６０】
続いて、これを、ｐＣＤＦＤｕｅｔ：：２．６．１．４２（ＢｇＩＩＩ／ＫｐｎＩ）とｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ：：１．２．４．４とをライゲーションして、ベクターＣＤＦＤｕｅｔ：：２．６．１．４２−１．２．４．４を生じた。さらに、大腸菌ＤＨ５α細胞を、このクローニングベクターによって形質転換した。そのプラスミドを単離した。該プラスミドｐＣＤＦＤｕｅｔ：：２．６．１．４２−１．２．４．４は、配列表番号１９において示されるようなＤＮＡ配列を特徴とする。
【０２６１】
６．アシネトバクター・カルコアセチカスからのバリンクラスター（Ｖ−ＣｌｕｓAca）のクローニング
菌株ＡＴＣＣ ３３３０４アシネトバクター・カルコアセチカスを、全ＤＮＡの単離のために培養した（ＨＨ寒天培地又は培地）。全ＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ社製のＤＮＥａｓｙキット（Ｌ１及びＬ２）によって、及び工程ｉ）培養物１ｍｌの遠心分離、ｉｉ）Ｈ2Ｏ２００μｌのペレットへの添加、ｉｉｉ）１０分間９５℃での加熱、ｉｖ）遠心分離（１０分、１３０００ｒｐｍ）、及びｖ）ＰＣＲのための上清の取り除きの方法を含む方法によって、単離した。
【０２６２】
A. calcoaceticusからバリンクラスターを増幅するために、ＰＣＲを、表４において説明されている、配列表番号１３及び配列表番号１４において示されるようなプライマーを使用して実施した（ポリメラーゼＰｆｕ及びＴａｑをそれぞれ使用する製造者の説明書に従う）。
【０２６３】
ＰＣＲ生成物を、精製し、そして、説明書に従って、プラスミドｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯに連結し、そして大腸菌ＤＨ５ａ中に移入した。これは、プラスミドｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯ：：Ｖ−ＣｌｕｓｔｅｒAcaを生じる。プラスミドｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯ：：Ｖ−ＣｌｕｓｔｅｒAcaは、配列表番号２０において示されるようなＤＮＡ配列を特徴とする。
【０２６４】
７．Ｌ−バリンから３−ヒドロキシイソ酪酸を形成することができる組換え細胞の製造
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、プラスミドｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯ：：Ｖ−ＣｌｕｓｔｅｒAca及びｐＣＤＦ−Ｄｕｅｔ：：２．６．１．４２−１．２．４．４で形質転換した（ＬＢ ｓｐｅｃ．／ａｍｐ培地上に培養した）。得られた細胞は、Ｌ−バリンを含有する栄養培地中で、Ｌ−バリンを３−ヒドロキシイソ酪酸に転化することができた。対照的に、細胞の野生型（大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３））は、３−ヒドロキシイソ酪酸の検出可能な量をかかる栄養培地中で形成することができなかった。
【０２６５】
実施例２
この実施例において、遺伝子をコードするＤＮＡを単離し、そしてその遺伝子を、大腸菌中で過剰発現した。該ＤＮＡは、酵素Ｅ2の活性と酵素Ｅ3の活性との双方を有する酵素をコードした。
【０２６６】
１．スルフォロバス・トコダイの培養及び回収
スルフォロバス・トコダイを、少ない培養液量（４０〜２００ｍｌ）で、７５℃及びｐＨ３．０で、振盪（１５０ｒｐｍ）しながら増殖した。その成長は、５７８ｎｍ（ＯＤ578nm）で、光学密度を測定することによって測光法で観察した。改変されたスルフォロバス培地を使用した（Ｂｒｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ８４，５４〜６８頁，１９７２年；Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ，６，３９〜４４頁，２００２年によって記載されているように改変した）。使用したエネルギー源及び炭水化物源は、酵母抽出物、カザミノ酸及びグルコースであった。その培地は、次の成分からなった：基本培地、グルコース原液、鉄限度規準液及び微量元素原液。０．３〜０．５（対数期）のＯＤ578nmで、細胞を回収した。その遠心分離を、Ｓｏｒｖａｌｌ遠心分離機（ＳＳ３４ローター）中で、１５分間９０００ｒｐｍで実施した。その細胞ペレットを、直接、ＤＮＡ抽出のために使用した。
基本培地。ＫＨ2ＰＯ4（０．２８ｇ／ｌ）、（ＮＨ4）2ＳＯ4（１．３ｇ／ｌ）、ＭｇＳＯ4ｘ７ Ｈ2Ｏ（０．２５ｇ／ｌ）、ＣａＣｌ2ｘ６Ｈ2Ｏ（０．０７ｇ／ｌ）、酵母抽出物（１ｇ／ｌ）、及びカザミノ酸（１ｇ／ｌ）。オートクレーブ処理前に、そのｐＨを、Ｈ2ＳＯ4を使用して３．０にした。
グルコース原液（１００×）。グルコース（１００ｇ／ｌ）。その溶液を、濾過滅菌した。
鉄限度規準液（１０００ｘ）。ＦｅＣｌ3ｘ６ Ｈ2Ｏ（２０ｇ／ｌ）。その溶液を、濾過滅菌した。
微量元素原液（１０００×）。ＭｎＣｌ2ｘ４ Ｈ2Ｏ（１．８ｇ／ｌ）、Ｎａ2Ｂ4Ｏ7×１０ Ｈ2Ｏ（４．５ｇ／ｌ）、ＺｎＳＯ4ｘ７ Ｈ2Ｏ（２２０ｍｇ／ｌ）、ＣｕＣｌ2ｘ２ Ｈ2Ｏ（５０ｍｇ／ｌ）、Ｎａ2ＭｏＯ4ｘ２ Ｈ2Ｏ（３０ｍｇ／ｌ）、ＶＯＳＯ4ｘ５ Ｈ2Ｏ（３０ｍｇ／ｌ）、ＣｏＣｌ2ｘ６ Ｈ2Ｏ（８．４ｍｇ／ｌ）。それぞれの成分を、蒸留したＨ2Ｏ中で連続して溶解し、そのｐＨをＨＣｌを使用して３．０にし、そしてその溶液を濾過滅菌した。
【０２６７】
２．S. tokodaiiからのゲノムＤＮＡの単離
ゲノムＤＮＡを、Ｍｕｒｒａｙ及びＴｈｏｍｐｓｏｎ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，８，４３２１〜４３２５頁，１９８０年）の方法によって単離した。このために、新たに回収した細胞１０〜５０ｍｇ（生体量）を、１．５ｍｌエッペンドルフ反応管中へ秤量し、そしてＴＥ緩衝液５７０ｍｌ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＮａＥＤＴＡ）中で再懸濁した。１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ溶液（ドデシル硫酸ナトリウム溶液）３０μｌ及びプロテイナーゼＫ３μｌ（２０μｇ／μｌ）を添加し、そしてその混合物を１時間５２℃でインキュベートした。その後、５Ｍ ＮａＣｌ溶液１００μｌ及び予熱した１０％（ｗ／ｖ）臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）溶液８０μｌ（０．７Ｍ ＮａＣｌ中で１０％（ｗ／ｖ）ＣＴＡＢ）を添加した。１０分間６５℃でインキュベートした後、ＣＴＡＢ、細胞壁断片及びタンパク質の複合体を、クロロホルム／イソ−アミルアルコール（２４：１（ｖ／ｖ））７８０μｌで抽出し、１５分間１４０００ｒｐｍで遠心沈澱した。その水性の上相を、新しいエッペンドルフ反応管中に移し、そしてその抽出を繰り返した。  水性相が色素を有さなくなった後に、それを１００％イソプロパノール４００μｌの層で覆った。２つの相を注意深く混合することによって、染色体ＤＮＡは、境界面で沈澱した。そして、引き延ばしたパスツールピペットでＤＮＡを取り出すことが可能であり、そして７０％エタノール２００μｌで洗浄した。遠心分離（５分、１４０００ｒｐｍ）後に、その上清を分注し、そしてＤＮＡを、２時間室温で乾燥し、そして最終的にＴＥ緩衝液１００μｌ中で溶解した。
【０２６８】
３．マロニル−補酵素Ａレダクターゼ遺伝子の増幅
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ．， ５１，２６３〜２７３頁，１９８６年）を、実施例２において得られたゲノムスルフォロバス・トコダイＤＮＡから、標的目的でマロニル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子を増幅するために使用した。これは、サーモサイクラー（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）（Ｂｉｏｍｅｔｒａ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ）で実施した。
【０２６９】
Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｐｆｕｎｄｓ、Ｇｅｎａｘｘｏｎ）を使用する調製用ＰＣＲを使用した。Ｐｆｕポリメラーゼは、３’−５’エキソヌクレアーゼ（"校正"）機能を有する。
【０２７０】
次のポリマーを使用した：
５’−ＡＴＴＡＴＣＣＣＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＣＡＴＴＡＡＡＡＧＣ−３’
（"順方向プライマー"；ＮｃｏＩ開裂部位に下線を引く；配列表番号２１）及び
５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＡＴＣＣ−３’
（"逆方向プライマー"；ＢａｍＨＩ開裂部位に下線を引く；配列表番号２２）。
【０２７１】
以下の第１表において説明される反応混合物を、ＰＣＲ反応のために使用した。ＰＣＲを、ホットスタートＰＣＲとして実施した。すなわち、反応混合物を、２分間９５℃で、Ｐｆｕポリメラーゼを添加する前にインキュベートした。これは、それぞれの場合において、９５℃で１分、４５℃で１分及び７２℃で５分の３０サイクルであり、続いて少なくとも１工程の４５℃で３０秒、７２℃で１５分であり、そして最終的に６℃で停止した。
【０２７２】
【表５】
0005449142.tif 000006
【０２７３】
１．１ｋｂ長さを有する遺伝子断片を得た。
【０２７４】
４．マロニル−補酵素Ａレダクターゼ遺伝子のクローニング
スルフォロバス・トコダイからのマロニル−補酵素Ａレダクターゼ遺伝子をクローンするために、実施例３において増幅された遺伝子を、"ｐＣＲ Ｔ７ Ｔｏｐｏ ＴＡ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ"（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）を使用して、ベクターｐＣＲ Ｔ７／ＣＴ−Ｔｏｐｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）で非特異的にクローンした。これを、製造者の説明書に従って行った。
【０２７５】
プラスミドＤＮＡを単離するために、プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ （Ｈｉｌｄｅｎ）社製の"ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ"を使用して、形質転換した大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’細胞の一昼夜培養液５ｍｌから開始する、製造者の説明書に従って製造した。
【０２７６】
５．発現ベクターの発生
マロニル−補酵素Ａレダクターゼ遺伝子を含有する発現ベクターを発生するために、実施例４において得られた単離されたクローニングベクターを、制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで制限消化した。このために、プラスミドＤＮＡ（それぞれ、組み込まれたマロニル−補酵素Ａレダクターゼ遺伝子を有する発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａ及びｐＣＲ Ｔ７／ＣＴ−Ｔｏｐｏベクター）２５〜２７μｌを、反応緩衝液（１０×）５μｌ及び制限酵素（１０Ｕ／μｌ；Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｓｔ． Ｌｅｏｎ−Ｒｏｔ）２〜３μｌと完全に混合した。反応混合液を蒸留したＨ2Ｏで５０μｌにし、そして５時間、製造者によって指定された温度でインキュベートした。エタノール沈澱を、さらに使用する前に実施した。このために、ＤＮＡを、１００％エタノール３容量及び３Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．３）０．１容量と混合し、そして２時間又は一昼夜、−８０℃でインキュベートした。遠心分離工程（２０分、１４０００ｒｐｍ、４℃、エッペンドルフ卓上遠心機）後に、その上清を注意深く取り除き、そしてＤＮＡを、７０％（ｖ／ｖ）エタノール３容量で洗浄した。室温で１０分インキュベーションした後に、その混合液を、再度遠心分離（１０分、１４０００ｒｐｍ、４℃、エッペンドルフ卓上遠心機）し、そしてその上清を捨てた。そしてＤＮＡを、１時間室温で乾燥し、続いてＨ2Ｏ又はＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＮａＥＤＴＡ）の所望の容量で処理した。
【０２７７】
そして、アルカリホスファターゼを、線状の二本鎖ベクターの５’−リン酸基を取り除くために使用した。この方法において、クローニング効率を、ベクターの再連結を防ぐために増加した。仔牛の腸のアルカリホスファターゼを、消化ベクターを脱リンのために使用した。
【０２７８】
脱リンを、制限消化として同様の緩衝液中で実施した。制限混合液５０μｌを、ＣＩＡＰ（Ｃａｌｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ：仔牛の腸のアルカリホスファターゼ（１Ｕ／μｌ；Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｓｔ． Ｌｅｏｎ−Ｒｏｔ））１．５μｌと混合し、そしてその混合液を、３０分間３７℃でインキュベートした。開裂された及び脱リン酸化されたベクターのさらなる使用の前に、エタノール沈澱を、前記のように実施した。
【０２７９】
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを、挿入ＤＮＡと発現ベクターとのライゲーションを使用し、その際プラスミドＤＮＡ及び挿入ＤＮＡを、１：３〜１：６のモル比で使用した。
【０２８０】
原液：
ライゲーション緩衝液（１０×）：０．５Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１００ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、濾過滅菌、室温で貯蔵
５ｍＭ ＡＴＰ（アデノシントリホスフェート）常に新たな滅菌蒸留したＨ2Ｏ中で作る
５０ｍＭ ＤＴＥ（ジチオエリトリトール）常に新たなライゲーション緩衝液中で作る。
【０２８１】
ライゲーション混合液は、５０μｌの容量を有した。プラスミドＤＮＡ（２〜１０μｌ）、挿入ＤＮＡ（２〜２０μｌ）、ＤＴＥ（５０ｍＭ）を有するライゲーション緩衝液５μｇ、及び滅菌蒸留したＨ2Ｏの相当量を、共に分注し、ボルテックスし、短く遠心沈澱し、そして続いて５分間４５℃でインキュベートした。その混合液を氷上で冷却した。５ｍＭ ＡＴＰ５μｌ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（１Ｕ／μｌ；Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ；Ｓｔ． Ｌｅｏｎ−Ｒｏｔ）１．５μｌを添加し、そして全てを混合した。ライゲーションを、１６℃で一昼夜実施した。
【０２８２】
そのライゲーション混合液を、直接、化学的なコンピテントセルを形質転換するために使用した。
【０２８３】
６．発現ベクターを有する大腸菌細胞の形質転換
一昼夜培養した培養液５ｍｌを、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２細胞の単一コロニーから開始して増殖した。翌朝、ＬＢ培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ， ａｌ．， "Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ"， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９年）５０ｍｌを、この培養液の０．５〜１．０ｍｌで播種した。１．５〜２時間のインキュベーション（３７℃、振盪（１８０ｒｐｍ））後に、０．６のＯＤ578nmに達した。その細胞を、１０分間氷上で冷却し、そして続いて５分間５０００ｒｐｍで、及び４℃で遠心沈澱した（ＧＳＡローター、Ｓｏｒｖａｌｌ遠心機）。その上清を捨て、そして細胞ペレットを、冷却した０．１Ｍ ＣａＣｌ2溶液２．７ｍｌ中で再懸濁した。滅菌した５０％（ｖ／ｖ）グリセロール２．３ｍｌの添加後に、細胞懸濁液を、１．５ｍｌエッペンドルフ反応管中で一部（それぞれ場合において３００μｌ）に分けた。コンピテントセルを、すぐに液体窒素中で冷凍し、そして続いて−８０℃で貯蔵した。
【０２８４】
細胞を形質転換するために、化学的なコンピテントセル（３００μｌ）のアリコートを、氷上で解凍し、そしてライゲーション混合液２５μｌで処理した。全てを注意深く混合し、そして氷上で３０分間インキュベートした。熱ショック（４２℃、１分）後に、その混合液を、５分間氷上で再度インキュベートした。その後、ＬＢ培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、１９８９年）８００μｌを添加し、そしてその細胞を、１時間３７℃で振盪した（熱撹拌機、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５４３６）。その混合物を濃縮し、そしてＬＢ培地上で完全に撹拌した。このために、その混合物を、１分間１００００ｒｐｍで遠心沈澱し、その上清７５０μｌを捨て、そして細胞ペレットを再懸濁した。この濃縮混合物５０μｌ、１００μｌ及び２００μｌを、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを補ったＬＢプレート（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９年）上に画線培養し、そして３７℃でインキュベーター中で一昼夜インキュベートした。そのプレートを、ＬＢ培地１ｍｌで洗浄した。この細胞懸濁液を、続いてバッフルを有する５００ｍｌＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ中でＬＢ培地１５０ｍｌ（アンピシリン１００μｇ／ｍｌを補った）を播種するために使用した。その培養液は３７℃及び１８０ｒｐｍで増殖した。過剰発現を、０．６のＯＤ578nmで、０．５Ｍ ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を添加することによってｐＴｒｃ９９Ａ中でプロモーターを誘導することによって実施した。誘導された培養液を、３時間前記の条件下でインキュベートし、そして続いてＯＤ578nm＝２．７で回収した。
【０２８５】
７．酵素活性の検出
実施例６において得られた大腸菌株を、細胞粉砕によって粉砕した。粉砕した細胞を、１５分間８５℃で加熱した。この熱沈澱中に、非熱耐性酵素は凝固し、そして沈澱した。標的タンパク質が熱耐性であるため、これは上清中に残留する。マロニル−補酵素Ａレダクターゼ活性を測定するために、その上清を、ＴＭ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｃｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、ｐＨ８．１）中で１：５０で希釈した。希釈又は未希釈（メチルマロニル−補酵素Ａレダクターゼ活性を検出するため）の上清３０μｌを、ＨＩＰＳ緩衝液（０．５ｍＭ ＮＡＤＰＨを含有する１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭジチオエリトリトール）５００μｌに分注した。
【０２８６】
最初のバッチにおいて、反応を、マロニル−補酵素Ａを添加することによって開始し、その際最終濃度は０．５ｍＭであった。３６５ｎｍでのＮＡＤＰＨ吸収におけるドロップを測定した。測定された酵素活性は、１５．５μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ（タンパク質）（１５．５Ｕ／ｍｇ）であった。
【０２８７】
第二のバッチにおいて、反応を、メチルマロニル−補酵素Ａ（Ｆｌｕｋａ社製、製品番号：６７７６７）を添加することによって開始し、その際最終濃度は２．０ｍＭであった。３６５ｎｍでのＮＡＤＰＨ吸収におけるドロップを測定した。測定された酵素活性は、０．２４μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ（タンパク質）（０．２４Ｕ／ｍｇ）であった。
【０２８８】
これらの結果から、配列表番号０３を有するＤＮＡ配列に関してコードするポリペプチドが、マロニル−ＣｏＡの、及びメチルマロニル−補酵素Ａの転化を触媒することが、見出されうる。
【０２８９】
ＮＡＤＰＨ１ｍｏｌは、使用される１ｍｏｌ毎のマロニル−ＣｏＡ又はメチルマロニル−ＣｏＡを酸化させた。このことから、酵素反応が、対応するセミアルデヒドを導くことが結論されうる。
【０２９０】
実施例３
本発明は、炭素源としてグルコースから開始する、前駆体としてメチルマロン酸セミアルデヒドを介して３−ヒドロキシイソ酪酸を製造することができる組換え細胞によって、メタクリル酸の製造に基づいて実施例３においてさらに説明される。このために、とりわけ、酵素メチルマロニル−補酵素Ａムターゼ（Ｅ1）及び３−ヒドロキシイソブチレートデヒドロゲナーゼ（Ｅ4）を、C. glutamicum ＡＴＣＣ１３０３２中で過剰発現した。
【０２９１】
１．ｐＥＫＥｘ２における遺伝子ＮＣｇｌ１４７０、ＮＣｇｌ１４７１及びＮＣｇｌ１４７２（アルギニン／オルニチン輸送系ＡＴＰアーゼ、メチルマロニル−補酵素Ａムターゼ及びメチルマロニル−補酵素Ａムターゼ、Ｎ末端領域／サブユニット）のクローニング、ｐＥＫＥｘ２ＭＣＭ ｃｇｌの構築
ＤＮＡ操作は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．（１９８９年）， "Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ"、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋにおいて記載されている標準方法を使用した。ＤＮＡの増幅を、ＳＡＷＡＤＹ Ｐｗｏ−ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｑｌａｂ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ， Ｅｒｉａｎｇｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）又はＰｌａｔｉｎｕｍ Ｐｆｘ−ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して実施した。特に指定されない限り、ポリメラーゼを、製造者の説明書によって使用した。ＰＣＲ増幅及び制限開裂部位の導入のためのオリゴヌクレオチドを、ＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。改変菌株を、ＴａｑポリメラーゼＲＥＡＤＹＭＩＸ（Ｓｉｇｍａ， Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用したコロニーＰＣＲ及びプラスミド精製によって同定した。ＤＮＡ断片を精製し、そしてＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｑｕｉａｇｅｎ， Ｈｉｌｄｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、製造者の説明書によって単離した。プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｐｒｅｐ ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ， Ｈｉｌｄｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）によって単離した。構築された全てのプラスミドを、制限解析及び続くシーケンスによって照合した。
【０２９２】
ｐＥＫＥｘ２ＭＣＭ＿ｃｇｌを、クローンした遺伝子を、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）−誘導性ｔａｃプロモーター及びｌａｃリプレッサー系（ｌａｃＩｑ）の調整下で転写することができる、ｐＥＫＥｘ２ベクター（Ｋｌｅｉｎｅｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９１年Ｇｅｎｅ １０２：９３）を使用して構築した。遺伝子ＮＣｇｌ１４７０、ＮＣｇｌ１４７１及びＮＣｇｌ１４７２に関してコードする５．２ｋｂの大きさのＤＮＡ断片を、次のオリゴヌクレオチド及び鋳型としてのコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２ ＤＮＡによって増幅した：
ｐｃｇ１８５９−５７＿ｖｏｒｗａｅｒｔｓ（配列表番号２３）：
５’−ｃｇｇｔｃｇａｃａａｇｇａｇａｔａｔａｇａｔａＴＧＡＣＴＧＡＴＣＴＣＡＣＡＡＡＧＡＣＴＧＣ−３’
及び
ｐｃｇ１８５７−５９＿ｒｕｅｃｋｗａｅｒｔｓ（配列表番号２４）：
５’−ｃＴＴＡＧＧＣＴＴＴＧＴＣＧＡＡＣＧＣＣＴＣＣ−３’
（ゲノム配列に対する相補的な配列を、大文字で示す）。
【０２９３】
さらに、制限開裂部位（下線部）及び開始コドンの８ヌクレオチド上流のリボソーム結合部位（ａａｇｇａｇ）を、単位複製配列中に導入した。この方法において、元々の開始コドンＴＴＧを、ＡＴＧで置き換えた。ＰＣＲ単位複製配列を、ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｌｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を利用して脱リン酸化し、そしてｐＵＣ１９ベクター（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５年，Ｇｅｎｅ ３３：１０３〜１９）のＳｍａＩ開裂部位中に平滑末端でクローンした。５．２ｋｂ挿入の同定及び校正を、シーケンスによって確認した。そして５．２ｋｂ断片を、ｐＵＣ１９誘導体からのＳａｌＩ断片によって単離し、そしてｐＥＫＥｘ２ベクターのＳａｌＩ開裂部位に連結した。正確な配向を有するプラスミドを、制限消化に基づいて選択し、その際それらの１つがｐＥＫＥｘ２ＭＣＭ ｃｇｌに関連した。得られたプラスミドを、図２１に示した。
【０２９４】
２．ｐＥＫＥｘ２におけるサーマス・サーモフィルス(Thermus thermophilus)３−ヒドロキシイソブチレートデヒドロゲナーゼのクローニング、ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ＿ＭＭＣｏＡＲ＿３ＨＩＢＤＨの構築
サーマス・サーモフィルス（ＴＴＨＡ０２３７）３−ヒドロキシイソ酪酸脱水酵素（３ＨＩＢＤＨ）の遺伝子を、C. glutamicumのコドン使用頻度を考慮に入れて合成した。最適な遺伝子（配列表番号２５）のコンドン使用頻度を、ベクターｐＧＡ４（ｐＧＡ４＿３ＨＩＢＤＨ、図２２）中に合成した。ｐＧＡ４＿３ＨＩＢＤＨベクターを、エンドヌクレアーゼＫｐｎＩ及びＥｃｌ１３６ＩＩによって消化し、その結果として、３ＨＩＢＤＨ遺伝子を、既にＴ７プロモーターの機能的発現制御下でスルフォロバス・トコダイのメチルマロニル−補酵素Ａムターゼから誘導された配列を有し、かつ制限酵素ＢａｍＨＩ（続く充填（ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ）反応で）及びＫｐｎＩによって直線化されている、ベクターｐＧＡ５＿ＭＭＣｏＡＲ中に連結した。得られたベクターｐＧＡ５＿ＭＭＣｏＡＲ＿３ＨＩＢＤＨを、図２３に示す。
【０２９５】
メチルマロニル−補酵素Ａレダクターゼ及び３ＨＩＢＤＨを含有する挿入物を、ＫｐｎＩ及びＥｃｌ１３６ＩＩでの消化によるｐＧＡ５＿ＭＭＣｏＡＲ＿３ＨＩＢＤＨベクターからの制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ（続く充填反応で）及びＫｐｎＩでの消化によって直線化される、標的ベクターｐＥＣＸＴ９９Ａ（受入番号：ＡＹ２１９６８４、図２４）中にクローンした（得られたベクター：ｐＥＣＸＴ９９Ａ＿ＭＭＣｏＡＲ＿３ＨＩＢＤＨ、図２５）。
【０２９６】
３．ｐＥＫＥｘ３ＭＣＭ ｃｇｌ及びｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ ３ＨＩＢＤＨ ｖａｒＩＩＭＭＣｏＡＲで形質転換されたC. glutamlcum細胞の製造
C. glutamlcum ＡＴＣＣ１３０３２のコンピテントセルを、Ｔａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．（Ｃｕｒｒ Ｍｉｃｒｏｂｌｏｌ．２００２年，４５：３６２〜３６７）において記載されているように製造した。ｐＥＫＥｘ２ＭＣＭ＿ｃｇｌ及びｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ＿３ＨＩＢＤＨ＿ｖａｒＩＩＭＭＣｏＡＲのＤＮＡを、エレクトロポレーションによって導入し、そして形質転換体を、カナマイシン５０ｍｇ／ｌ及びテトラサイクリン５ｍｇ／ｌを補った、Ｍｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）からのブレインハート寒天上で選択した（Ｌｉｅｂｌ ｅｔ ａｌ． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｌｏｌ Ｌｅｔｔ．， １９８９年， ５３：２９９〜３０３）。プラスミドＤＮＡを、形質転換体から単離し、そして制限消化によって特徴付けられた。この方法において、C. glutamlcumのｐＥＫＥｘ２ＭＣＭ ｃｇｌ／ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ＿３ＨＩＢＤＨ＿ｖａｒＩＩＭＭＣｏＡＲを得た。
【０２９７】
４．培養及び３−ヒドロキシイソ酪酸の製造
C. glutamicumのｐＥＫＥｘ２ＭＣＭ＿ｃｇｌ／ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ＿３ＨＩＢＤＨ＿ｖａｒＩＩＭＭＣｏＡＲの単コロニーを、カナマイシン１５μｇ／ｌ及びテトラサイクリン５μｇ／ｌを含有するコンピテント培地（ブレインハート培地）２５ｍｌ中で播種するために使用し、そして３０℃及び２２０ｒｐｍで一昼夜培養した。その野生型を、対照として、抗生物質無しで培養した。
【０２９８】
その培養物を、遠心分離（１０分、４℃、５２９２×ｇ）によって取り出し、そして食塩水（０．９％ＮａＣｌ）で洗浄した。細胞を、抗生物質（カナマイシン１５μｇ／ｌ及びテトラサイクリン５μｇ／ｌ）を含有するＧＣＸＩＩ培地２５ｍｌ（２５０ｍｌフラスコ中で）で再懸濁した。プラスミド輸送株を、ＩＰＴＧ０．５ｍＭ（１Ｍ原液の１２．５μｌ）で誘導した。
【０２９９】
ＣＧＸＩＩ最少培地（Ｋｅｉｌｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １９９３年， １７５：５５９５〜５６０３による）：
２０ｇ    （ＮＨ4）2ＳＯ4
５ｇ      尿素
１ｇ      Ｋ2ＨＰＯ4
１ｇ      ＫＨ2ＰＯ4
４２ｇ    ＭＯＰＳ
１ｍｌ    ＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ（２５ｇ／１００ｍｌ、滅菌濾過した）
１ｍｌ    ＣａＣｌ2×２Ｈ2Ｏ（１．３２ｇ／１００ｍｌ、滅菌濾過した）。
【０３００】
その塩を、二重滅菌水約８００ｍｌで溶解し、そしてそのｐＨをＫＯＨで７に調整した。この目的のために、約２０〜２５ＫＯＨペレットを添加し、続いて１０Ｎ ＫＯＨでｐＨ７まで滴定した。そして二重滅菌水を、９００ｍｌまで媒質成分に添加し、続いてオートクレーブした。
【０３０１】
オートクレーブ後に、微量塩（ｔｒａｃｅ ｓａｌｔ）溶液１ｍｌを添加した。
【０３０２】
微量塩溶液：
１ｇ              ＦｅＳＯ4×７Ｈ2Ｏ
１ｇ              ＭｎＳＯ4×Ｈ2Ｏ
０．１ｇ          ＺｎＳＯ4×７Ｈ2Ｏ
０．０２ｇ        ＣｕＳＯ4
０．００２ｇ      ＮｉＣｌ2×６Ｈ2Ｏ。
【０３０３】
その塩を、脱イオンＨ2Ｏ１００ｍｌと溶解し、そしてＨＣｌで酸性化した（ｐＨ試験紙、約ｐＨ１）。そしてその溶液を、滅菌濾過した。
【０３０４】
その培地を、５０％濃度のグルコース１００ｍｌ（最終濃度５％）で混合し、その際５０％濃度のグルコース８０ｍｌと二重滅菌水２０ｍｌとを、最終濃度４％のために添加した。
【０３０５】
その培地を、ビオチン１ｍｌ（２０ｍｇ／１００ｍｌ）、補酵素Ｂ１２ ６０μｇ／ｌ（７時間後）、０．１ｍＭプロピオネート（２２時間後）、及び微量塩溶液で補った。
【０３０６】
２７時間後に、３−ヒドロキシイソ酪酸６ｍｇ／ｌを、試料中でイオンクロマトグラフィー（オートサンプラーを有するＭｅｔｒｏｈｍ Ｃｏｍｐａｃｔ ＩＣ ７６１、移動相：８ｍＭ ＮａＯＨ；カラム：Ｄｉｏｎｅｘ ＡＳ１５ ４ｘ２５０ｍｍ＋予備カラムＡＧ１５ ４ｘ５０ｍｍ；カラム温度；２５℃、流量：１．４ｍｌ／ｍｉｎ、検出器：伝導性；注入容量：１０μｌ；駆動時間：３０分）によって検出した（図２６）。３−ヒドロキシイソ酪酸の同定を、化学的に純粋な３−ヒドロキシイソ酪酸（３０ｍｇ／ｌ）を添加することによって確認した（図２７）。
【０３０７】
５．メタクリレートを得るための３−ヒドロキシイソ酪酸の脱水
前記の実施例４によって製造した３−ヒドロキシイソ酪酸の溶液５ｍｌ（０．２ｇ／ｌ）に、撹拌しながらＮａＯＨ（０．０６ｍｇ）を添加した。その溶液を、撹拌しながらインキュベートし、そして１８５〜１９５℃で減圧（３００ｔｏｒｒ）下で還流濃縮した。さらに、５ｍｌ中で３−ヒドロキシイソ酪酸０．５ｍｇを、１時間毎に、５時間にわたって添加した。その溶液は、メタクリレートを重合から防ぐために、ｐ−メトキシフェノール０．４質量％を含有した。反応を、インキュべーションの２４時間後に止めた。３−ヒドロキシイソ酪酸のメタクリレートへの転化は、約９０％であった。メタクリル酸を、反応混合液から蒸留によって除去した。
【０３０８】
実施例４
本発明を、前駆体としてメチルマロン酸セミアルデヒドを介して、及び中間体としてアクリロイル−補酵素Ａを介して３−ヒドロキシイソ酪酸を製造することができる組換え大腸菌細胞によって、メタクリル酸の製造に基づく実施例４においてさらに説明する。
【０３０９】
組換え大腸菌細胞を使用して、炭素源グリセロールを３−ヒドロキシイソ酪酸に転化するために、７種類の異なる酵素の遺伝子を、多数の発現プラスミド中にクローンした。これは、Ｄｕｅｔベクター（Ｍｅｒｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の使用を含んだ。これらは、全て、互いに相容性であり、かつさらに異なる抗生物質標識を有する、４つの発現ベクターの系である。
【０３１０】
１．詳細に、次の酵素に関してコードした遺伝子を、グリセロールを３−ヒドロキシイソ酪酸に転化する発現ベクター中にクローンした。
【０３１１】
ａ）クレブシエラ・ニューモニエ（Klebslella pneumoniae）グリセロールデヒドラターゼ（ＥＣ ４．２．１．３０）（ＧＤ）。酵素は、３−ＨＰＡ（３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド）に対するグリセロールのアデノシルコバラミン依存の脱水を触媒した。これは、単オペロンにおける３つの遺伝子（ｇｌｄＡ、ｇｌｄＢ及びｇｌｄＣ）によるK. pneumoniae中でコードされる３つのサブユニット（ＧＤ−アルファ、ＧＤ−ベータ及びＧＤ−ガンマ）からなる。
【０３１２】
ｂ）K. pneumoniae再活性化因子。アデノシルコバラミン依存のグリセロールデヒドラターゼが、グリセロールによって不活性化されるために、グリセロールの３−ＨＰＡへの転化は、さらに、再活性化因子の活性を要求する。K. pneumoniaeのグリセロールデヒドラターゼのための再活性化因子を、遺伝子ｇｄｒＡ及びｇｄｒＢによってコードした。
【０３１３】
ｃ）大腸菌アルデヒドデヒドロゲナーゼ、ＡｌｄＨ。３−ＨＰＡを３−ヒドロキシプロピオン酸（３−ＨＰ）に転化するために、大腸菌ａｌｄＨ−遺伝子を増幅した。
【０３１４】
ｄ）クロロフレクサス・オーランティアカスのプロピオニル−補酵素Ａシンターゼ（Ｐｃｓ）（ｐｃｓ遺伝子によってコードされる）。プロピオニル−補酵素Ａシンターゼは、３−ＨＰのプロピオニル−補酵素Ａへの転化を触媒する。これは、３機能酵素であり、かつ３機能領域を有する。アシル−補酵素Ａシンターゼ（ＡＣＳ）領域は、３−ＨＰの３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡへの活性化を触媒する。これは、続く、ＰＣＳのエノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣＨ）領域によって触媒されるアクリリル−ＣｏＡに対する脱水である。最終的に、Ｐｃｓのエノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣＲ）領域は、アクリリル−ＣｏＡのＮＡＤＰＨ−依存反応を触媒して、プロピオニル−ＣｏＡを得る。しかしながら、この反応は、記載された計画に関連性がない。それというのも、すぐにアクリリル−ＣｏＡが、さらに次の酵素（クロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ／レダクターゼ、以下を参照）によってここでで転化されるからである。
【０３１５】
ｅ）ロドバクター・スフェロイデスのクロトニル−補酵素Ａカルボキシラーゼ／レダクターゼ（酵素Ｅ62）（Ｃｃｒ）（ｃｃＲ遺伝子によってコードされる）。Ｃｃｒの主な活性は、クロトニル−補酵素Ａの還元型カルボキシル化であり、エチルマロニル−ＣｏＡを得る。しかしながら、この酵素は、特異的な広範囲の基質を示し、かつ非常に効率的にアクリリル−補酵素Ａをメチルマロニル−補酵素Ａへ転化する。
【０３１６】
ｆ）スルフォロバス・トコダイのマロニル−ＣｏＡレダクターゼ（Ｍｃｒ、Ｅ2及びＥ3）（ｍｃｒ遺伝子によってコードされる）。優先的にＭｃｒを、マロニル−補酵素ＡのＮＡＤＰＨ−依存還元をマロン酸セミアルデヒドへの転化を触媒する。しかしながら、これは、メチルマロン酸セミアルデヒドへ転化される、基質としてのメチルマロニル−補酵素Ａでの第二の活性も示す。
【０３１７】
ｇ）サーマス・サーモフィルスの３−ヒドロキシイソブチレートデヒドロゲナーゼ（Ｅ4）（３−ＨＩＢ−ＤＨ）（ＭｍｓＢ遺伝子によってコードされる）。この酵素は、ＮＡＤＰＨ−依存の、メチルマロン酸セミアルデヒドの３−ヒドロキシイソ酪酸（３−ＨＩＢ）への可逆性の転化を触媒する。
【０３１８】
２．前記の酵素の異種過剰発現に関するクローニング方法を以下で記載している。
【０３１９】
ａ）グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子（ＧＤＲＦ）の過剰発現のためのプラスミドｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−ＫｐＧＤＲＦの構築
最初に、K. pneumoniae ＧＤＲＦの２つのサブユニットをコードする遺伝子ｇｄｒＡ（別名：ＯＲＦ４）及びｇｄｒＢ（別名：ＯＲＦ２ｂ）を、ＰＣＲによって増幅した。使用した鋳型は、菌株K. pneumoniae ＤＳＭ２０２６の染色体ＤＮＡであった。
【０３２０】
ｇｄｒＡを、次のオリゴヌクレオチドを使用して増幅した：
ｏｒｆ４ｆｗ（配列表番号２６）：
５’−ＴＧＡＡＧＡＴＣＣＴＡＧＧＡＧＧＴＴＴＡＡＡＣＡＴＡＴＧＣＣＧＴＴＡＡＴＡＧＣＣＧＧＧＡＴＴＧ−３’
ｏｒｆ４Ｓａｌｒｖ（配列表番号２７）：
５’−ＴＡＴＡＴＡＧＴＣＧＡＣＴＴＡＡＴＴＣＧＣＣＴＧＡＣＣＧＧＣＣＡＧ−３’；
（ＳａｌＩ認識配列に下線をした）。
【０３２１】
ｇｄｒＢを、次のオリゴヌクレオチドを使用して増幅した：
ｏｒｆ２ｂＰｃｉｆｗ（配列表番号２８）：
５’−ＴＡＴＡＴＡＡＣＡＴＧＴＣＧＣＴＴＴＣＡＣＣＧＣＣＡＧＧＣ−３’
（ＰｃｉＩ認識配列に下線をした）
ｏｒｆ２ｂｂｒｖ（配列表番号２９）：
５’−ＣＡＴＡＴＧＴＴＴＡＡＡＣＣＴＣＣＴＡＧＧＡＴＣＴＴＣＡＧＴＴＴＣＴＣＴＣＡＣＴＴＡＡＣＧＧＧＣＡＧＧ−３’。
【０３２２】
そして得られたＰＣＲ生成物を、クロスオーバーＰＣＲによって互いに融合した。
【０３２３】
このために、次のオリゴヌクレオチドを使用した：
ｏｒｆ２ｂＮｃｏｆｗ（配列表番号３０）：
５’−ＴＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＴＴＴＣＡＣＣＧＣＣＡＧＧＣ−３’
（ＮｃｏＩ認識配列に下線した）
ｏｒｆ４Ｓａｌｒｖ（配列表番号３１）：
５’−ＴＡＴＡＴＡＧＴＣＧＡＣＴＴＡＡＴＴＣＧＣＣＴＧＡＣＣＧＧＣＣＡＧ−３’
（ＳａｌＩ認識配列に下線をした）。
【０３２４】
ＰＣＲ生成物（２２２０ｂｐ）を、製造者の説明書によってＱｉａｇｅｎ社（Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）製のＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットによって精製し、そしてｐｃｒ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクター中で連結して、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−Ｔｏｐｏ−ＫｐＧＤＲＦベクターをもたらした。大腸菌細胞中へのライゲーション及び続く形質転換を、製造業者、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ（Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ）による情報によって実施した。
【０３２５】
そしてＧＤＲＦ配列を、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−Ｔｏｐｏ−ＫｐＧＤＲＦをＰｃｉＩ及びＳａｌＩで消化することによってベクターから切断し、そしてＮｃｏＩ及びＳａｌＩ−切断のｐＡＣＹＣ−Ｄｕｅｔ発現ベクター中に連結して、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−ＫｐＧＤＲＦ（６１４２ｂｐ）をもたらした。
【０３２６】
ｂ）K. pneumoniaeグリセロールデヒドラターゼ（ＧＤ）及び大腸菌アルデヒドデヒドロゲナーゼ、ａｌｄＨの過剰発現のためのプラスミドｐＡＳ５０＿Ｅｃ＿ａｌｄＨの構築
K. pneumoniae ＧＤの３つのサブユニットを、自然に、単一オペロン中で形成した（遺伝子ｇｌｄＡ、ｇｌｄＢ及びｇｌｄＣ）。これらを、鋳型としてK. pneumoniae ＤＳＭ２０２６の染色体ＤＮＡを再度使用して、ＰＣＲによって増幅した。
【０３２７】
次のオリゴヌクレオチドを、増幅のために使用した：
ＫｐＧＤＮｄｅｆｗ（配列表番号３２）：
５’−ＴＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＧＡＴＣＡＡＡＡＣＧＡＴＴＴＧＣＡＧＴＡＣＴＧＧ−３’
（ＮｄｅＩ認識配列に下線をした）
ＫｐＧＤＳａｌｒｖ（配列表番号３３）：
５’−ＴＡＴＡＴＡＧＴＣＧＡＣＴＴＡＧＣＴＴＣＣＴＴＴＡＣＧＣＡＧＣＴＴＡＴＧＣ−３’
（ＳａｌＩ認識配列に下線をした）。
【０３２８】
単位複製配列を、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクター中に連結して、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−Ｔｏｐｏ−ＫｐＧＤベクターをもたらした。大腸菌細胞中へのライゲーション及び続く形質転換を、製造業者、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ（Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ）による情報によって実施した。
【０３２９】
ＧＤ−コード断片を、Ｘｂａｌ（Ｋｌｅｎｏｗ ｆｉｌｌ ｉｎによって鈍らせた）及びＮｄｅＩによってｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−Ｔｏｐｏ−ＫｐＧＤベクターから切断し、そしてＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＶで切断したｐＥＴ−Ｄｕｅｔ発現ベクター中連結して、プラスミドｐＡＳ５０（８１６１ｂｐ）をもたらした。
【０３３０】
そして大腸菌ａｌｄＨ遺伝子を増幅した。このために、大腸菌Ｋ１２の染色体ＤＮＡを、鋳型として使用し、その際使用したＰＣＲプライマーは、以下のオリゴヌクレオチドであった。
１２２８＿ａｌｄ＿ｆｐ（配列表番号３４）：
５’−ＡＡＡＡＣＡＴＡＴＧＡＡＴＴＴＴＣＡＴＣＡＴＣＴＧＧＣＴＴＡＣＴＧＧ−３’
（ＮｄｅＩ認識配列に下線をした）及び
１２２８＿ａｌｄ＿ｒｐ（配列表番号３５）：
５’−ＡＡＡＡＣＡＴＡＴＧＴＡＴＡＴＴＴＣＣＴＴＣＴＴＴＣＡＧＧＣＣＴＣＣＡＧＧＣＴＴＡＴＣＣＡＧＡＴＧ−３’
（ＮｄｅＩ認識配列に下線をした）。
【０３３１】
ＰＣＲ単位複製配列を、ゲル精製し、そしてＮｄｅＩの消化によってプラスミドｐＡＳ５０のＮｄｅＩ部位中に連結して、プラスミドｐＡＳ５０＿Ｅｃ＿ａｌｄＨ（９６６６ｂｐ）を製造した。
【０３３２】
ｃ）クロロフレクサス・オーランティアカスのプロピオニル−補酵素Ａシンターゼ（Ｐｃｓ）の、及びロドバクター・スフェロイデスのクロトニル−補酵素Ａカルボキシラーゼ／レダクターゼ（ＣＣＲ）の過剰発現のためのプラスミドｐＣＤＦＤｕｅｔ−１＿Ｒｓ−ｃｃＲ＿Ｃａｕ＿ｐｃｓの構築。
【０３３３】
大腸菌中での異形発現及びＣＲの精製のために、遺伝子を、ｐＥＴ３ｄ発現ベクター中にクローンして、プラスミドｐＴＥ１３をもたらした。そしてR. sphaeroides ｃｃｒ遺伝子を、鋳型として菌株T.sphaeroides ２．４．１．（ＤＳＭＺ １５８）の染色体ＤＮＡを使用して、オリゴヌクレオチド
ｃｃｒ−ｆｗ（配列表番号３６）：
５’−ＧＧＡＧＧＣＡＡＣＣＡＴＧＧＣＣＣＴＣＧＡＣＧＴＧＣＡＧＡＧ−３’
（ＮｃｏＩ認識配列に下線をした）及び
ｃｃｒ−ｒｅｖ（配列表番号３７）：
５’−ＧＡＧＡＣＴＴＧＣＧＧＡＴＣＣＣＴＣＣＧＡＴＣＡＧＧＣＣＴＴＧＣ−３’
（ＢａｍＨＩ認識配列に下線をした）
を使用してＰＣＲによって増幅した。そのＰＣＲ生成物を、ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ断片によってＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ−切断ベクターｐＥＴ３ｄ（Ｍｅｒｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中に連結して、プラスミドｐＴＥ１３を製造した。
【０３３４】
ｃｃｒ遺伝子を、ｐＴＥ１３からのＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ断片によって、ｐＣＤＦＤｕｅｔ−１プラスミド（Ｍｅｒｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ開裂部位中にサブクローンして、プラスミドｐＣＤＦＤｕｅｔ−１＿Ｒｓ＿ｃｃｒを製造した。
【０３３５】
そしてC. aurantiacus ｐｃｓ遺伝子を、鋳型として菌株C. aurantiacus ＯＫ−７０−ｆｌ（ＤＳＭ６３６）の染色体ＤＮＡを使用して、オリゴヌクレオチド
１２２８＿Ｃａｕ＿ｐｃｓ＿ｆｐ（７１）（配列表番号３８）：
５’−ＡＡＡＡＣＡＴＡＴＧＡＴＣＧＡＣＡＣＴＧＣＧＣＣＣＣＴＴＧＣ−３’
（ＮｄｅＩ認識配列に下線をした）及び
１２２８＿Ｃａｕ＿ｐｃｓ＿ｒｐ（７４）（配列表番号３９）：
５’−ＡＡＧＡＣＧＴＣＣＴＡＣＣＧＣＴＣＧＣＣＧＧＣＣＧＴＣＣ−３’
（ＡａｔＩＩ認識配列に下線をした）
を使用してＰＣＲによって増幅した。その単位複製配列を、ゲル抽出によって精製し、そして、ＮｄｅＩ／ＡａｔＩＩでの消化を介して、対応する切断ベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ−１＿Ｒｓ＿ｃｃｒ中に連結して、プラスミドｐＣＤＦＤｕｅｔ−１＿Ｒｓ＿ｃｃｒ＿Ｃａｕ＿ｐｃｓ（１０４７２ｂｐ）を製造した。
【０３３６】
ｄ）スルフォロバス・トコダイのマロニル−ＣｏＡレダクターゼ（Ｍｃｒ）の、及びサーマス・サーモフィルスの３−ヒドロキシイソブチレートデヒドロゲナーゼ（３−ＨＩＢ−ＤＨ）の過剰発現のためのプラスミドｐＣＯＬＡＤｕｅｔ＿Ｓｔ＿ｍｃｒ＿ｏＣｇ＿Ｔｔｈ＿ＨＩＢＤＨ＿ｏＣｇの構築
最初に、S. tokodail ｍｃｒ遺伝子の変異体を、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｓｔ＿ｍｃｒ＿ｏＣｇ）のコドン使用頻度を有する系列中で合成した。その合成を、ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙで実施し、そして人工遺伝子Ｓｔ＿ｍｃｒ＿ｏＣｇを、プラスミドｐＧＡ４＿ＭＭＣｏＡＲ＿ＳＴ（配列表番号４０）の形で提供した。ｐＧＡ４＿ＭＭＣｏＡＲ＿ＳＴ ＤＮＡを、オリゴヌクレオチド
１２２８＿ＭＭＣｏＡＲ＿ｆｐ（配列表番号４１）：
５’−ＡＡＣＣＡＴＧＧＧＣＣＧＣＡＣＣＣＴＧＡＡＧＧ−３’
（ＮｃｏＩ認識配列に下線をした）及び
１２２８＿ＭＭＣｏＡＲ＿ｒｐ（配列表番号４２）
５’−ＡＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＴＴＴＴＣＧＡＴＧＴＡＧＣＣＣＴＴＴＴＣＣ−３’
（ＢａｍＨＩ認識配列に下線をした）
を使用して、人工遺伝子Ｓｔ＿ｍｃｒ＿ｏＣｇを増幅するためにＰＣＲ鋳型として使用した。
【０３３７】
その単位複製配列を、ゲル抽出によって精製し、そしてＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩで消化し、そして対応するｐＣＯＬＡＤｕｅｔ＿１プラスミド（Ｍｅｒｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の開裂部位中に連結して、プラスミドｐＣＯＬＡＤｕｅｔ＿Ｓｔ＿ｍｃｒ＿ｏＣｇを製造した。
【０３３８】
コリネバクテリウム・グルタミクムのコドン使用頻度での系列である、T. thermophllus ＭｍｓＢ遺伝子の変異体（３−ＨＩＢ−ＤＨをコードする）を、同様に、遺伝子合成（ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって提供し、プラスミドｐＧＡ４＿３ＨＩＢＤＨ＿ＴＴ（配列表番号４３）の形で高精度であった。
【０３３９】
ｐＧＡ４＿３ＨＩＢＤＨ＿ＴＴを、ヌクレオチド
１２２８＿Ｔｔｈ＿ＨＩＢＤＨ＿ｆｐ（配列表番号４４）：
５’−ＡＡＡＡＣＡＴＡＴＧＧＡＡＡＡＧＧＴＧＧＣＡＴＴＣＡＴＣＧ−３’
（ＮｄｅＩ認識配列に下線をした）及び
１２２８＿Ｔｔｈ＿ＨＩＢＤＨ＿ｒｐ（配列表番号４５）：
５’−ＡＡＡＡＧＡＴＣＴＴＴＡＧＣＧＧＡＴＴＴＣＣＡＣＡＣＣＧＣＣ−３’
（ＢｇｌＩＩ認識配列に下線をした）
を使用して、人工遺伝子Ｔｔｈ＿ＨＩＢＤＨ＿ｏＣｇを増幅するために、ＰＣＲ鋳型として使用した。
【０３４０】
その単位複製配列を、ゲル抽出し、そしてＮｄｅＩ／ＢｇｌＩＩで切断し、そしてプラスミドｐＣＯＬＡＤｕｅｔ＿Ｓｔ＿ｍｃｒ＿ｏＣｇのＮｄｅＩ／ＢｇｌＩＩ開裂部位中に連結して、プラスミドｐＣＯＬＡＤｕｅｔ＿Ｓｔ＿ｍｃｒ＿ｏＣｇ＿Ｔｔｈ＿ＨＩＢＤＨ＿ｏＣｇ（５６２０ｂｐ）を製造した。
【０３４１】
ｅ）４つのプラスミド、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−ＫｐＧＤＲＦ、ｐＡＳ５０＿Ｅｃ−ａｌｄＨ、ｐＣＤＦＤｕｅｔ−１＿Ｒｓ＿ｃｃＲ＿Ｃａｕ＿ｐｃｓ及びｐＣＯＬＡＤｕｅｔ＿Ｓｔ＿ｍｃｒ＿ｏＣｇ＿Ｔｔｈ＿ＨＩＢＤＨ＿ｏＣｇを、市販の化学的なコンピテント大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｍｅｒｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中へ、製造者のプロトコルによって同時形質転換した。選別を、アンピシリン（２５μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（１７μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（２５μｇ／ｍｌ）で補ったＬＢ寒天上で実施した。
【０３４２】
ｆ）大腸菌中での発現プラスミドの誘導
前記のｅ）において記載されているプラスミド輸送大腸菌株を、改変したＭ９培地（６．８ｇ／ｌ Ｎａ2ＨＰＯ4ｘ２Ｈ2Ｏ；３ｇ／ｌ ＫＨ2ＰＯ4；０．５ｇ／ｌ ＮａＣｌ；１ｇ／ｌ ＮＨ4Ｃｌ；１．２５ｇ／ｌ 酵母抽出物；１％（ｖ／ｖ）グリセロール；１５ｍｇ／ｌ ＣａＣｌ2ｘ２Ｈ2Ｏ；２５０ｍｇ／ｌ ＭｇＳＯ4ｘ７Ｈ2Ｏ；１％（ｖ／ｖ）Ｇｉｂｃｏ ＭＥＭ ビタミン溶液；４１．９ｇ／ｌ ＭＯＰＳ）中で培養した。その培地を、アンピシリン（２５μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（１７μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（２５μｇ／ｍｌ）で補った。全体の培養（予備培養及び本培養）を３７℃で温度制御した振盪器中で実施した。その菌株を、最初に培地５ｍｌ中で一昼夜培養した。続いて、緩衝液を使用して１００ｍｌフラスコ中で培地２０ｍｌを、１：２０の比で一昼夜培養した物から播種し、そしてさらに培養した。約０．８のＯＤ600で、コバラミン６μＭ及びＩＰＴＧ１μＭを添加し、そしてその培養物をさらに４時間インキュベートした。その後、細胞懸濁液２．５ｍｌを取り出し、そして−２０℃で解析するまで貯蔵した。
【０３４３】
ｇ）３−ＨＩＢの検出及び定量化をイオンクロマトグラフィー（ＩＣ）及び伝導度検出によって実施した。このために、試料２．５ｍｌを、室温で解凍し、そして遠心分離した（１０分、１３２００ｒｐｍ）。その上清を、シリンジフィルター（孔サイズ０．４４μｍ）を使用して精製した。その測定を、オートサンプラーを有するＭｅｔｒｏｈｍ Ｃｏｍｐａｃｔ ＩＣ ７６を使用して実施した。移動相：８ｍＭ ＮａＯＨ。カラム：Ｄｉｏｎｅｘ ＡＳ１５ ４ｘ２５０ｍｍ、予備カラム：ＡＧ１５ ４ｘ５０ｍｍ。カラム温度：２５℃。流量速度：１．４ｍｌ／ｍｉｎ。注入量：１０μｌ。
【０３４４】
ｈ）３−ヒドロキシイソ酪酸のメタクリレートへの脱水
前記のｆ）において記載されている方法によって製造した３−ヒドロキシイソ酪酸の濃縮溶液５ｍｌ（０．２ｇ／ｌ）に、撹拌しながらＮａＯＨ（０．０６ｍｇ）を添加した。その溶液を、撹拌しながらインキュベートし、そして１８５〜１９５℃で減圧（３００ｔｏｒｒ）下で還流濃縮した。さらに、５ｍｌ中での３−ヒドロキシイソ酪酸０．５ｍｇを、１時間毎に、５時間にわたって添加した。その溶液は、メタクリレートを重合から防ぐために、ｐ−メトキシフェノール０．４質量％を含有した。その反応を、インキュベーションの２４時間後に止めた。３−ヒドロキシイソ酪酸のメタクリレートへの転化は、約９０％であった。メタクリル酸を、反応混合液から蒸留によって除去した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
0005449142.tif 000031
【図２６】
0005449142.tif 000032
【図２７】
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【配列表】
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