(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
固形疎水性担体上に固定化された改質界面酵素であって、
前記酵素がリパーゼ、エステラーゼ、又はホスホリパーゼであり；
前記酵素が共有結合した脂質基でコーティングされ、その結果、疎水性ミクロ環境によって囲まれ、そして親水性の作用物質、基質、及び／又は反応生成物の存在下において不活性化及び／又は凝集から保護され、
ここで、該脂質基でのコーティングが脂質エポキシドを酵素の表面活性官能基に元々のエポキシ基を介して結合させることによってなされている；
上記改質界面酵素。
【請求項２】
前記担体が吸着又は官能基へ共有結合することによって前記酵素を結合することができ、そして多孔性のポリマーベースの担体であり、かつ
前記担体がエポキシ基、アルデヒド基及びイオン性基のいずれかを含んでいるか、又は、前記担体がイオン交換樹脂である、
請求項１に記載の改質界面酵素。
【請求項３】
前記担体が疎水性脂肪族及びアクリル架橋ポリマー及び疎水性芳香族架橋ポリマーからなる群から選択される疎水性ポリマーベースの担体であるか、又は前記担体がイオン交換樹脂である、請求項１及び２のいずれか一項に記載の改質界面酵素。
【請求項４】
前記脂質エポキシドが、脂肪酸エポキシド、脂肪酸アルキルエステルエポキシド、ショ糖脂肪酸エステルエポキシド、中鎖及び長鎖アルキルグルコシドエポキシド、リン脂質エポキシド、並びにポリエチレングリコール誘導体エポキシドから選択される、請求項１から３までのいずれか一項に記載の改質界面酵素。
【請求項５】
前記酵素が、カンディダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）、カンディダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、リゾプス・ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｎｉｖｅｕｓ）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、ムコール・ジャバニクス（Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａ  ｎｉｃｕｓ）、リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、黒麹カビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、ペニシリウム・カマンベルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．）、ブルクホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）、好熱性子嚢菌（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、クロモバクテリウム・ビスコスム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｓｃｏｓｕｍ）、パパイヤ種子、及びパンクレアチンのいずれか由来の酵素からなる群から選択される、請求項１から４までのいずれか一項に記載の酵素。
【請求項６】
（ａ）水性緩衝液と脂質エポキシドを含む少なくとも１種の有機溶媒とを含む系を提供するステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）で提供される二溶媒系と、前記界面酵素を混合するステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）の混合物に前記担体を添加し、混合するステップ、
（ｄ）ステップ（ｃ）において得られる混合物から、前記担体上に固定化された界面酵素を単離するステップを含む、
請求項１から５までのいずれか一項に規定された改質界面酵素の調製の方法。
【請求項７】
前記担体が多孔性疎水性担体である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記疎水性担体がエポキシ基、アルデヒド基及びイオン性基のいずれかを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記有機溶媒が、アルカン、エーテル、アルコール、アルデヒド及びケトン、並びにそれらのいずれかの混合物から選択される、請求項６から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記脂質エポキシドが、脂肪酸エポキシド、脂肪酸メチルエステルエポキシド、ショ糖脂肪酸エステルエポキシド、中鎖及び長鎖アルキルグルコシドエポキシド、リン脂質エポキシド、並びにポリエチレングリコール誘導体エポキシドから選択される、請求項６から９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１から５までのいずれか一項に定義される、又は請求項６から１０までのいずれか一項に記載の方法によって調製されるリパーゼを含む、植物油、動物油、藻類油、魚の油、又はこれらの油の少なくとも２つの混合物に、メタノールを添加するステップ、及び、
前記油トリグリセリドが脂肪酸メチルエステルに変換されるまで、適切な条件下で反応を進行させるステップを含む、
脂肪酸メチルエステルを調製する方法。
【請求項１２】
前記植物油が大豆油、キャノーラ油、菜種油、オリーブ油、ヤシ油、ヒマワリ油、ピーナッツ油、綿実油、廃料理油、又は非食用植物源由来のいずれかの油トリグリセリドである、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルコール、特に短鎖アルコール、及びその他の親水性物質に対する活性及び安定性を向上させた固定化界面酵素、特にリパーゼ及びホスホリパーゼ、並びにその他のヒドラーゼに関する。また、本発明は、そのような酵素の調製、並びにそれらの様々な産業的及び試験的使用の方法、特に、典型的にはバイオディーゼルとして使用されるメチルエステルなどの脂肪酸短鎖アルキルエステルの生成の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
界面酵素は、そのタンパク質構造の中に１つは親水性領域であり、もう１つは疎水性領域である２つの領域を含む１つのクラスの酵素である。この独自の特徴によって、このクラスの酵素は、二相系中に存在すると界面領域を好む。これらの条件下で、酵素分子の親水性領域が水層に面し、疎水性領域が疎水性層に面する活性立体配座が形成される。
【０００３】
リパーゼ及びホスホリパーゼは、界面系中に存在すると触媒活性を表す、最もよく知られた界面酵素である。リパーゼ（トリアシルグリセロールヒドロラーゼＥ．Ｃ．３．１．１．３）は、水溶液系においてトリアシルグリセロール中のエステル結合に作用し、遊離脂肪酸、部分グリセリド、及びグリセロールを生成する加水分解酵素として定義される。ホスホリパーゼもまた、加水分解酵素のクラスに属するが、水溶液系に存在するリン脂質のエステル結合を好んで特異的に開裂し、ホスホリパーゼの種類によって、遊離脂肪酸、リゾリン脂質、グリセロリン脂質、ホスファチジン酸、及び遊離アルコールを生成する。
【０００４】
リパーゼ及びホスホリパーゼは、動物、植物、及び微生物中に広く分布する。リパーゼ及びホスホリパーゼの産業上の利用に対する関心は、過去２０年間に急速に高まってきている。低水分活性下で、このクラスの酵素が、逆加水分解反応を触媒することが発見された。リパーゼ及びホスホリパーゼの逆触媒活性は、エステル及びアミド結合を含む貴重な化合物、又は、ヒドロキシル、カルボキシル、及びアミノ基などの官能基を含むその他の関連化学物質の合成のために広く利用されてきた。特に、リパーゼ及びホスホリパーゼは、脂肪、油、ロウ、リン脂質及びスフィンゴ脂質を改質し、新しい所望の機能特性を得るために、並びにそのラセミ混合物から光学活性化合物を分離するために使用されてきた。特に関心がもたれるのは、本明細書に開示される短鎖アルキルエステル（バイオディーゼル）の合成のための界面酵素の使用である。
【０００５】
現在、４０種を超える種々の市販のリパーゼ及びホスホリパーゼがあるが、それらのうちのほんの少数が、商業的量で調製される。最も産業的に有望な界面酵素のいくつかは、カンディダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）、カンディダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、リゾプス・ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｎｉｖｅｕｓ）、ムコール・ジャバニクス（Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａ  ｎｉｃｕｓ）、リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、黒麹カビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、ペニシリウム・カマンベルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．）、ブルクホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）、好熱性子嚢菌（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、クロモバクテリウム・ビスコスム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｓｃｏｓｕｍ）、パパイヤ種子、及びパンクレアチンから抽出される。
【０００６】
酵素の固定化は、方法全体における酵素のコスト負担を減らすこと、生成物からの酵素の回収を促進すること、及び方法の継続的作用を可能にすることを基本的に目指す多数の技術によって説明されてきた。固定化技術は、一般に、以下に従って分類される。
１．シリカ及び不溶性ポリマーなどの固形担体への酵素の物理吸着。
２．イオン交換樹脂上への吸着。
３．エポキシ化された無機担体又はポリマー担体などの固形担体材料への酵素の共有結合。
４．成長するポリマー内への酵素の封入。
５．膜反応器又は半浸透ゲル内への酵素の閉じ込め。
６．酵素結晶の架橋結合（ＣＬＥＣＳ）又は酵素凝集体の架橋結合（ＣＬＥＡＳ）。
【０００７】
前記酵素固定化手順の全ては、以下のステップを含む。
１．ｐＨ、温度、緩衝塩の種類、及びイオン強度に関して適切な緩衝系の中に酵素を溶解するステップ。
２．その酵素溶液中へ固形担体を添加し、酵素分子が固形担体に固定化されるまでのしばらくの間、混合するステップ。
３．固定化酵素を含むその固形担体を濾過して取り出すステップ。
４．適切な緩衝液でその担体を洗浄して、緩く結合した酵素分子を分離し、次にその固形担体を乾燥するステップ。
【０００８】
界面酵素、主にリパーゼは、前記の技術に従って固定化されてきた。これらは、低合成活性及び／又は短い作用半減期を有する固定化酵素調製を提供した。固定化リパーゼ及びその他の界面酵素の合成活性を増すことを企図して、種々の活性化法が適用されてきた。これらの方法は、
１．脂肪酸又はポリエチレングリコールなどの疎水性残基と、酵素の表面官能基を結合させるステップ、
２．ポリオール脂肪酸エステルなどの界面活性化剤で、酵素の表面をコーティングするステップ、
３．エタノール又はイソプロパノールなどの親水性溶媒で前処理した疎水性担体、典型的にはポリプロピレンに、酵素を接触させるステップ、
４．反応系中へ、低濃度、通常１パーセント未満で、食塩水、グリセロールなどの酵素活性化剤を添加するステップ
を含む。
【０００９】
前記方法のいずれも、産業的量で酵素の逆変換を実行するため、固定化界面酵素の活性化、安定化、コスト効率に関して、十分な結果を出さなかった。また、ほとんどの酵素は、前記手順に従って固定化される場合、その固定化手順によって課せられる特定の制約によって、その合成活性の有意な部分を喪失するか、又は、完全な活性能力を表さないことが報告されている。例えば、ポリオール脂肪酸エステルで、リパーゼ及びホスホリパーゼをコーティングすることでは、リパーゼ分子が活性化剤で完全にはコーティングされない深刻な課題に直面した。したがって、それらの酵素分子は活性化剤に接触せず、不活性のままであった。
【００１０】
リパーゼ及びホスホリパーゼの別の大きな欠点は、親水性基質、特に短鎖アルコール及び短鎖脂肪酸（Ｃ４未満）に対する低い耐性である。メタノール及び酢酸などの短鎖アルコール及び短鎖脂肪酸が、それらの酵素の四次構造から構造水分子を脱離する原因となっており、それらの変性、及び、その結果としての触媒活性の喪失を引き起こすことが、多くの研究で観察された。この欠点は、油トリグリセリド及びメタノールを基質として使用する、脂肪酸メチルエステル「バイオディーゼル」の商業的量の製造のためのリパーゼの利用を妨げてきた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、本発明の目的は、合成利用のために、高い活性及び安定性を有する固定化界面酵素、特にリパーゼ及びホスホリパーゼを得る新しい方法を提供することである。特に興味深いのは、「バイオディーゼル」として使用するための脂肪酸短鎖アルキルエステルの合成のための、これら酵素の使用である。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、メタノール、エタノール及びグリセロールなどの短鎖アルコール並びに酢酸などの短鎖脂肪酸に対する高い耐性を有する、高い活性の、安定した、固定化界面酵素を提供することである。
【００１３】
本発明のこれら及びその他の目的は、本記載が進むにつれて明白になる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、固形担体上に固定化された改質界面酵素に関するものであり、前記酵素は、疎水性ミクロ環境によって囲まれ、したがって、親水性の作用物質、基質、及び／又は反応生成物の存在下において不活性化及び／又は凝集から保護される。
【００１５】
本発明の改質界面酵素は、共有結合した脂質基でコーティングすることによって保護されてよい。
【００１６】
前記担体は、吸着によって、又は官能基への共有結合によって、前記酵素を結合することができる可能性がある。さらに具体的には、前記担体は有機又は無機でよく、好ましくは、シリカベース及びアルミナベースの担体などの無機担体、ポリマーベースの担体などの有機担体からなる群から選択され、前記担体は、エポキシ又はアルデヒド基などの活性官能基及びイオン性基を含んでよく、又は、前記担体はイオン交換樹脂である。
【００１７】
前記脂質エポキシドは、脂肪酸、脂肪酸アルキルエステル、ショ糖脂肪酸エステル、中鎖及び長鎖アルキルグルコシド、リン脂質、ポリエチレングリコール誘導体、並びに第四級アンモニウム塩から選択されてよい。
【００１８】
別の実施形態において、本発明の改質界面酵素は、疎水性ミクロ環境を供給する疎水性固形担体に、固定化又は包埋することによって保護される。
【００１９】
酵素は、リパーゼ、エステラーゼ、又はホスホリパーゼであってよい。さらに具体的には、その酵素は、カンディダ・アンタークティカ、カンディダ・ルゴサ、リゾムコール・ミエヘイ、シュードモナス属、リゾプス・ニベウス、ムコール・ミエヘイ、ムコール・ジャバニクス、リゾプス・オリザエ、黒麹カビ、ペニシリウム・カマンベルティ、アルカリゲネス属、ブルクホルデリア属、好熱性子嚢菌、クロモバクテリウム・ビスコスム、パパイヤ種子、及びパンクレアチンのいずれか１つであってよい。
【００２０】
さらなる態様において、本発明は、親水性の作用物質、基質及び／又は反応生成物の存在下において不活性化及び／又は凝集から保護される、不溶性担体上に固定化された改質界面酵素の調製の方法に関するものであり、
（ａ）水性緩衝液と脂質エポキシドを含む少なくとも１種の有機溶媒とを含む系を提供するステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）で提供される二溶媒系と、前記界面酵素を混合するステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）の混合物に前記担体を添加し、混合するステップ、
（ｄ）ステップ（ｃ）において得られる混合物から、前記担体上に固定化された界面酵素を単離するステップ
を含む。
【００２１】
１つの実施形態において、前記担体は、有機又は無機でよく、好ましくはシリカベース又はアルミナベースの担体などの多孔性無機担体、ポリマーベースの担体などの有機担体からなる群から選択される多孔性担体であり、前記担体は、エポキシ若しくはアルデヒド基などの活性官能基、又はイオン性基を場合により含んでよい。
【００２２】
別の実施形態において、前記有機溶媒は、アルカン（オクタンなど）、エーテル（ジイソプロピルエーテルなど）、アルコール（ｎ−オクタノールなど）、アルデヒド（デカンアルデヒドなど）及びケトン（２−オクタノンなど）、並びにそれらのいずれかの混合物から選択される。
【００２３】
さらなる実施形態において、前記脂質エポキシドは、脂肪酸、脂肪酸メチルエステル、ショ糖脂肪酸エステル、中鎖及び長鎖アルキルグルコシド、リン脂質、ポリエチレングリコール誘導体、並びに第四級アンモニウム塩から選択される。
【００２４】
さらに別の態様において、本発明は、固形担体上に固定化された改質界面酵素の調製の方法を提供し、前記酵素は疎水性ミクロ環境によって囲まれ、したがって、親水性の基質及び／又は反応生成物の存在下において不活性化及び／又は凝集から保護されており、
（ａ）水性緩衝液、及び脂質エポキシド、特に脂肪酸エポキシド又はトリグリセリドエポキシドを含む少なくとも１種の有機溶媒を含む二相系を提供するステップ、
（ｂ）エポキシド基と、酵素の求核表面反応基、特にアミノ基を反応させ、脂肪酸又はトリグリセリドと共有結合によりコーティングされた酵素を生成するため、ステップ（ａ）で提供された過剰なエポキシドを有する二相系と、前記界面酵素を混合するステップ（図１）、
（ｃ）ステップ（ｂ）の混合物に前記担体を添加し、混合するステップ、
（ｄ）ステップ（ｃ）において得られる混合物から、前記担体上に固定化された脂質界面酵素複合体を単離するステップを含む。
【００２５】
酵素二相溶液と混合する前に、塩と有機材料を分離するために、場合により前記担体を洗浄する。
【００２６】
本発明のこの方法において、不溶性担体は、物理吸着又は官能基への共有結合によって、界面酵素を結合することができる。担体は、好ましくは有機又は無機でよい多孔性担体であり、好ましくはシリカベース又はアルミナベースの担体などの多孔性無機担体、ポリマーベースの担体などの有機担体からなる群から選択され、前記担体は、エポキシ若しくはアルデヒド基などの活性官能基、又はイオン性基を場合により含んでよい。
【００２７】
本発明のエポキシ化処理のステップ（ａ）で使用される有機溶媒は、アルカン（オクタンなど）、アルコール（ｎ−オクタノールなど）、アルデヒド（デカンアルデヒドなど）、エーテル（ジイソプロピルエーテルなど）、又はケトン（２−オクタノンなど）、及びそれらのいずれかの混合物でよく、それらに限定されない。
【００２８】
本発明の方法によって調製される界面酵素は、好ましくはリパーゼ、エステラーゼ、又はホスホリパーゼである。具体的で非限定的な例は、カンディダ・アンタークティカ、カンディダ・ルゴサ、リゾムコール・ミエヘイ、シュードモナス属、リゾプス・ニベウス、ムコール・ジャバニクス、ムコール・ミエヘイ、リゾプス・オリザエ、黒麹カビ、ペニシリウム・カマンベルティ、アルカリゲネス属、ブルクホルデリア属、好熱性子嚢菌、クロモバクテリウム・ビスコスム、パパイヤ種子、及びパンクレアチンから抽出される酵素である。
【００２９】
固形多孔性担体上に固定化された本発明の界面酵素は、活性形態で固定され、（それらの元のエポキシ基によって、酵素の表面官能基に結合された）前記脂質の多数の分子により共有結合でコーティングされることによって改質され、短鎖アルコール及び短鎖脂肪酸などの親水性基質に対する高い耐性によって特徴付けられる。
【００３０】
本発明のエポキシ化処理において使用される担体は、物理吸着又は官能基への共有結合によって、前記脂質コーティング酵素を結合することができ、有機又は無機の担体でよく、好ましくは、シリカベース及びアルミナベースの担体などの無機担体、ポリマーベースの担体などの有機担体から選択されてよく、その担体は、エポキシ又はアルデヒド基などの活性官能基、及びイオン性基を含んでよく、又は、前記担体はイオン交換樹脂であってよい。
【００３１】
本発明のこの脂質コーティング酵素調製において、脂質は好ましくは、遊離脂肪酸若しくは脂肪酸アルキルエステルエポキシド、ショ糖脂肪酸エステルエポキシド、中鎖及び長鎖アルキルグルコシド、リン脂質エポキシド、ポリエチレングリコールエポキシド誘導体、又は第四級アンモニウム塩エポキシドであるが、それらに限定されない。不飽和脂質基質のエポキシドは、化学又は生化学触媒によって、例えば、超酸化水素の存在下におけるリパーゼによって、エポキシド基への二重結合の少なくとも１つを酸化することにより通常得られる。
【００３２】
別の実施形態において、本発明は、固形担体上に固定化された改質界面酵素を調製する方法に関するものであり、前記酵素は、疎水性ミクロ環境によって囲まれ、したがって、親水性の基質及び／又は反応生成物の存在下において不活性化及び／又は凝集から保護されており、（ｉ）水性緩衝液又は（ｉｉ）水性緩衝液及び有機溶媒を含む二相系を含む系を提供するステップ（ａ）、前記系（ｉ）又は（ｉｉ）のいずれかに、疎水性ポリマー担体を添加するステップ（ｂ）、ステップ（ｂ）において得られる混合物に、前記界面酵素を添加し、混合するステップ（ｃ）、及びステップ（ｃ）において得られる混合物から、前記疎水性担体上に固定化された界面酵素を単離するステップ（ｄ）を含む。
【００３３】
この方法において、前記有機溶媒は、ｎ−オクタン、イソ−オクタン、ｎ−ヘキサン、ｎ−オクタノール、ジイソプロピルエーテル、及び油トリグリセリドであってよく、それらに限定されない。疎水性ポリマー担体は、アンバーライト（登録商標）ＸＡＤ７ＨＰなどの疎水性脂肪族及びアクリル架橋ポリマー、又はアンバーライト（登録商標）ＸＡＤ１６００などの疎水性芳香族架橋ポリマーであってよく、それらに限定されない。
【００３４】
本発明の全ての方法において、酵素はリパーゼ、エステラーゼ、又はホスホリパーゼ、例えば、カンディダ・アンタークティカ、カンディダ・ルゴサ、リゾムコール・ミエヘイ、ムコール・ミエヘイ、シュードモナス属、リゾプス・ニベウス、ムコール・ジャバニクス、リゾプス・オリザエ、黒麹カビ、ペニシリウム・カマンベルティ、アルカリゲネス属、ブルクホルデリア属、好熱性子嚢菌、クロモバクテリウム・ビスコスム、パパイヤ種子、及びパンクレアチンであってよい。
【００３５】
本発明の、又は本発明の方法によって調製される改質固定化疎水化酵素は、バイオディーゼル、又は界面活性成分の調製のための中間体として使用するための、脂肪酸アルキルエステルの生成において有利に使用される可能性がある。
【００３６】
したがって、本発明の、又は本発明の方法によって調製される改質固定化酵素の存在下で、メタノールなどのアルコールと、遊離脂肪酸、トリグリセリド、脂肪酸エステル、部分グリセリド、リン脂質、又はその他の脂肪酸誘導体などの脂肪酸源を反応させるステップを含む、構造脂質の調製のための酵素的プロセスが、本発明で提供される。
【００３７】
さらに別の実施形態において、本発明は、ステップとして、本発明による、又は本発明の方法によって調製されるリパーゼを含む、植物、動物、藻類、若しくは魚の油、又は少なくとも２つのこれら油の混合物から得られる脂肪酸の供給源に、メタノールを添加するステップ、及び、前記脂肪酸アシル基又は脂肪酸が脂肪酸メチルエステルに変換するまで、適切な条件下で反応を進行させるステップを含む、脂肪酸の短鎖アルキルエステル、好ましくは脂肪酸メチルエステル（バイオディーゼル）の調製の方法に関する。この方法において、植物油は大豆油、キャノーラ油、菜種油、オリーブ油、ヒマシ油、ヤシ油、ヒマワリ油、ピーナッツ油、綿実油、南洋油桐（Ｊａｔｒｏｐｈａ）油、廃料理油、又は非食用植物源から抽出されるいずれかの油トリグリセリドであってよく、それらに限定されない。
【００３８】
本発明を、以下の図面によって、さらに詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】脂肪酸エポキシドで酵素を共有結合によりコーティングするプロセスの略図である。
【図２Ａ】緩衝液中での、本発明の固定化ムコール・ミエヘイ（Ｍ．ミエヘイ）リパーゼの加水分解活性を、固定化された、界面活性化剤又は脂質の非共有結合でコーティングされた同酵素の合成活性と比較した図である。
【図２Ｂ】緩衝液中で、本発明の固定化Ｍ．ミエヘイリパーゼの合成活性を、固定化された、界面活性化剤又は脂質の非共有結合でコーティングされた同酵素の合成活性と比較した図である。
【図３Ａ】アセトン中での、本発明の固定化Ｍ．ミエヘイリパーゼの加水分解活性を、固定化された、界面活性化剤又は脂質の非共有結合でコーティングされた同酵素の加水分解活性と比較した図である。
【図３Ｂ】アセトン中での、本発明の固定化Ｍ．ミエヘイリパーゼの合成活性を、固定化された、界面活性化剤又は脂質の非共有結合でコーティングされた同酵素の合成活性と比較した図である。
【図４Ａ】ｎ−へキサン中での、本発明の固定化Ｍ．ミエヘイリパーゼの加水分解活性を、固定化された、界面活性化剤又は脂質の非共有結合でコーティングされた同酵素の加水分解活性と比較した図である。
【図４Ｂ】ｎ−へキサン中での、本発明の固定化Ｍ．ミエヘイリパーゼの合成活性を、固定化された、界面活性化剤又は脂質の非共有結合でコーティングされた同酵素の合成活性と比較した図である。
【図５】逐次エステル交換反応で、同じバッチの生体触媒を使用する様々なマトリックス上に固定化された好熱性子嚢菌リパーゼを使用する脂肪酸メチルエステルへの反応変換（％）の図である。反応条件：大豆油（２．５ｇ）、メタノール（０．３ｇを１時間おきに３回に分け添加）、及び３０℃で４時間、恒温攪拌器中で固定化リパーゼ（２５０ｍｇ）を混合した。
【図６】逐次エステル交換反応で、同じバッチの生体触媒を使用する様々なマトリックス上に固定化されたカンディダ・アンタークティカＢリパーゼを使用する脂肪酸メチルエステルへの反応変換（％）の図である。反応条件は図５の通りであった。
【図７】逐次エステル交換反応で、同じバッチの生体触媒を使用する様々なマトリックス上に固定化されたシュードモナス・セパシアリパーゼを使用する脂肪酸メチルエステルへの反応変換（％）の図である。反応条件は図５の通りであった。
【図８】逐次エステル交換反応で、同じバッチの生体触媒を使用する様々なマトリックス上に固定化されたアルカリゲネス属リパーゼを使用する脂肪酸メチルエステルへの反応変換（％）の図である。反応条件は図５の通りであった。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
短鎖アルコール及び短鎖脂肪酸などの親水性基質に対する高い耐性を有する、新しい高い活性の安定した固定化界面酵素、特にリパーゼ及びホスホリパーゼを探求して、本発明者は、酵素の活性部位近傍のエステル交換反応媒体の疎水性ミクロ環境が、リパーゼの活性を強化し、親水性短鎖アルコール及び酸、並びに反応混合物中に存在する可能性のある、その他の親水性作用物質に対する抵抗性を増す手段として作用する可能性があることを発見した。
【００４１】
したがって、本発明者は、酵素を不溶性マトリックス上に固定化し、疎水性とした種々の酵素調製物を開発した。酵素は、下記に示すように、例えば、脂質エポキシドでのエポキシ化などの脂溶性残基の結合、又は、酵素が囲まれている、若しくは酵素が包埋されている疎水性ミクロ環境を供給する疎水性マトリックス上への固定化の、いずれかによって、直接疎水性になる可能性がある。本発明において、酵素の活性部位近傍の疎水性ミクロ環境は、親水性部分を有する抑制濃度の基質及び生成物に対する曝露から、酵素を保護することができる緩衝領域として機能することが証明される。酵素のために提供される疎水性ミクロ環境は、酵素の活性部位への、非抑制濃度範囲の短鎖アルコールのアクセスを調節することに関与しており、また、反応媒体中への酵素の活性部位近傍で形成される親水性反応生成物の分離に関与している。
【００４２】
したがって、本発明の一態様に従って、疎水性固定化酵素は、おおむね下記のように、２つのステップの技術によって調製されることができる。
【００４３】
ステップ１：全ての界面酵素分子を水相及び脂質エポキシドを有する有機相を含む二相系中の脂質エポキシドと反応させることによって、全ての界面酵素分子にその活性形態を採用させるステップ（図１を参照）。脂質エポキシドは大過剰に存在し、したがって、各酵素分子は多数の脂質分子で共有結合的にコーティングされる。
ステップ２：共有結合によりコーティングされた酵素をすでに含む二相系の中へ、適切な担体を添加するステップ。
【００４４】
これらの条件下で、二相界面に位置する脂質残基又は複合体で共有結合によりコーティングされた酵素分子は、単純な物理吸着、エポキシ又はアルデヒド基などの官能基を含む活性化された樹脂との共有結合によって、又はイオン交換樹脂上での吸着によって、担体に容易に固定化することができる。
【００４５】
この２つのステップの技術は、本発明による活性改質固定化界面酵素の調製において使用される。
【００４６】
この態様に従って、本発明は、安定した高い活性の改質固定化界面酵素、特にリパーゼ、エステラーゼ、及びホスホリパーゼを調製する方法に関するものであり、その方法では、水性緩衝液と脂質エポキシドを含む少なくとも１種の有機溶媒とを含む二相系が提供され、過剰な二相系と界面酵素を混合し、その混合物に固形担体を添加し、その担体上に固定化された共有結合により脂質コーティングされた界面酵素を単離する。
【００４７】
固形担体は、好ましくは有機又は無機でよく、シリカベース又はアルミナベースの担体などの多孔性無機担体、ポリマーベースの担体などの有機担体からなる群から特に選択される多孔性担体であり、前記担体は、エポキシ若しくはアルデヒド基などの活性官能基、又はイオン性基を場合により含んでよい。いくつかの具体的な担体は、下記の実施例、特に表１に示される。
【００４８】
二相系は、適切な水性緩衝液及び有機溶媒から調製される。この有機溶媒は、アルカン（オクタンなど）、エーテル（ジイソプロピルエーテルなど）、アルコール（ｎ−オクタノールなど）、アルデヒド（デカンアルデヒドなど）、ケトン（２−オクタノンなど）、及びそれらのいずれかの混合物であってよく、それらに限定されない。
【００４９】
本発明の、又は本発明の前記エポキシ化法によって調製された固定化酵素は、非常に活性が高く、特に安定していて、短鎖アルコール及び短鎖脂肪酸などの親水性基質に対して高い耐性を有する。１０回の反応サイクル後でさえも約９０パーセントの活性が保持される。この安定性は、大きな経済的重要性を有する。
【００５０】
別の態様において、本発明は、エポキシ化の必要性を避け、脂質部分で酵素をコーティングする、リパーゼ疎水化の代替方法に関する。水溶液又は種々のリパーゼを含む水−有機溶媒二層［別称二相］系に、疎水性多孔ポリマーマトリックスを接触させることによって、疎水性ミクロ環境に物理的に付着した固定化酵素を生成した。バイオディーゼル及びグリセロールの生成のために、油トリグリセリド及びメタノールの間のエステル交換反応において、そのように生成した固定化酵素を試験し、本発明における反応モデルとして、そのエステル交換反応を使用した。理論にとらわれることなく、ミクロ環境の疎水性は、酵素分子近傍の親水性物質の濃度を低下させる原因であることが示唆される。これらの親水性物質は、反応に使用される基質（単数又は複数）又は、その反応によって形成される生成物のいずれでもよい。そのような「疎水化された」生体触媒は、酵素近傍に到達する親水性短鎖アルコール及び酸の反応物質の調節された濃度、及び／又は、酵素分子の近傍で形成されるいずれかの親水性物質の急速な分離を保証する。重要な結果として、酵素分子は、固定化酵素の近傍に到達する反応物質の濃度を調節すること、及び、反応によって形成された親水性生成物の急速な分離によって、親水性基質及び生成物から保護される。この示唆は、例５に示すように、疎水性に関して異なる４つの担体上に、それぞれ別々に固定化された４つの異なるリパーゼで試験された。
【００５１】
さらなる実施形態において、本発明は、脂肪酸短鎖アルキルエステル、特に脂肪酸メチルエステル（バイオディーゼル）の調製の方法に関する。一般的に、この方法において、植物、動物、藻類、魚の油、若しくは真菌類から抽出されるいずれかの油、又はこれらの油の少なくとも２つの混合物などの脂肪酸の供給源に、メタノールを、ステップの最初として添加する。メタノール／脂肪酸源混合物に、例えば本発明の方法によって調製されるように、脂質で共有結合によりコーティングされた固形担体上に固定化された改質リパーゼ、又は、本発明に従った疎水性マトリックス上に固定化されたリパーゼを添加し、脂肪酸源が脂肪酸メチルエステルに変換するまで、その反応を進行させる。
【００５２】
本出願の文脈内で、担体、マトリックス、吸着剤という用語は、同義に使用され、交換可能である。
【００５３】
本発明を開示し説明したが、本発明は、本明細書に開示されるプロセスステップ及び材料が多少異なる場合があるので、本明細書に開示される特定の実施例、プロセスステップ、及び材料に限定されないことを理解されたい。また、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲及びその均等物によってのみ限定されるのであるから、本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的でのみ使用されており、限定的であることを意図されていないことを、理解されたい。
【００５４】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用されている通り、文脈が明らかに別途指示しない限り、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は複数形の指示対象を含むことに留意しなければならない。
【００５５】
本明細書及び次の特許請求の範囲全体を通じて、文脈が別途要求しない限り、単語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、並びに「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などの変形は、述べられた整数若しくはステップ、又は整数若しくはステップの群の包含を意味し、その他のいかなる整数若しくはステップ、又は整数若しくはステップの群の除外を意味しないと理解される。
【００５６】
以下の実施例は、本発明の態様を実行するとき、本発明者らによって使用される技術の代表である。これらの技術は本発明の実施のための好ましい実施形態の典型であるが、当業者は、本開示に鑑みて、本発明の意図された範囲から逸脱することなく、多数の変更がなされることができると認めることを、理解されたい。
【実施例】
【００５７】
（例１）
固定化リパーゼ（リポザイムＴＬ）の調製
０．０５Ｍ及びｐＨ６．５のリン酸緩衝液１ｍｌ、並びに、脂質エポキシドを含むｎ−へキサン１０ｍｌを含む二溶媒系中に、好熱性子嚢菌（デンマーク、ノボザイムズ社のリポザイムＴＬ１００Ｌ、１ｍｌ）から抽出されたリパーゼを混合した。その混合物を４８時間攪拌した。その系に担体（１ｇ）を添加し、混合物を８時間攪拌した。改質固定化酵素を含む担体を濾過して取り出し、デシケーターで１晩乾燥すると、高い活性の共有結合による脂質コーティング固定化リパーゼが生成された。
【００５８】
表１は、異なる担体上に固定化されたリポザイムＴＬ１００Ｌの相対エステル交換活量を示す。固定化リパーゼ（０．２ｇ）を大豆油（２．５ｇ）及びメチルアルコール（０．３ｇ）に添加することによって、反応を実行した。磁気的に、又は、３０℃で振動させることによって、反応系を混合する。上記の条件下で、１時間後に生成された脂肪酸メチルエステルを測定することで、反応率を決定する。
【００５９】
表１：大豆油トリグリセリドのエステル交換のために異なる脂肪酸エポキシド改質リポザイムを使用し、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を得る反応率。反応条件：異なる担体（０．２ｇ）上に改質固定化されたリパーゼＴＬ１００Ｌと、オリーブ油（２．５ｇ）及びメタノール（０．２ｇ）を１時間混合する。３００ｒｐｍ及び３０℃で反応混合物を振動させる。
【表１】
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【００６０】
（例２）
固定化リパーゼの調製
異なるリパーゼ（１００ｍｇ）を使用し、トリグリセリドエポキシドを使用して、例１の固定化手順を反復した。前記条件下での脂肪酸メチルエステルの生成の反応率を、表２に記載する。
【００６１】
表２：大豆油トリグリセリドのエステル交換のために異なる脂肪酸エポキシド改質リパーゼを使用し、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を得る反応率。反応条件：トリグリセリドエポキシドで共有結合によりコーティングされ、アンバーライトＸＡＤ４（０．２ｇ）上に固定化された異なるリパーゼと、大豆油（２．５ｇ）及びメタノール（０．３ｇ）を１時間混合する。３００ｒｐｍ及び３０℃で反応混合物を振動させる。
【表２】
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【００６２】
（例３）
脂肪酸メチルエステル（バイオディーゼル）の調製のための固定化リパーゼ
担体としてアンバーライトＸＡＤ８又はセライト（粉末）、及び有機溶媒として緩衝液（対照）、ｎ−ヘキサン又はアセトン（Ａｃ）を使用し、例１の手順に従って、固定化改質Ｍ．ミエヘイリパーゼの調製物を調製した。
【００６３】
脂肪酸メチルエステル（バイオディーゼル）の調製のために、これらの調製物を使用した。固定化リパーゼ（１００ｍｇ）を添加し、３０℃で６時間、反応媒体を振動させることにより、反応を開始する。
【００６４】
異なる酵素調製物［酵素が共有結合によりオレイン酸でコーティングされた緩衝液−エポキシド−ＯＡ、及び、酵素が共有結合により油（トリグリセリド、例えばトリオレイン）でコーティングされた緩衝液−エポキシド−油］の加水分解及び合成の活性を、（共有結合により脂質でコーティングされていない）その他の酵素の調製物、すなわち、酵素が単純に担体に固定化されている緩衝液（対照）、担体固定化酵素が脂肪酸でコーティングされた緩衝液オレイン酸（緩衝液−ＯＡ）、担体固定化酵素がソルビタンモノステアレートでコーティングされた緩衝液−ＳＭＯと比較した。
【００６５】
図２から４までに結果を示す。見てわかる通り、共有結合により脂質成分でコーティングされた本発明の酵素の加水分解及び合成の活性は両者とも、大幅に、有意に、その他の酵素の調製物よりも高かった。
【００６６】
さらに、酵素のほとんどの活性は、１０回以上の反応サイクル後ですら保持される（データ示さず）。
【００６７】
本発明のエポキシド改質酵素調製物は、このように高い活性及び向上した安定性を示す。
【００６８】
（例４）
緩衝液又は二相系におけるリパーゼの固定化
リパーゼ（デンマーク、ノボザイム社の好熱性子嚢菌リパーゼ、同社のカンディダ・アンタークティカリパーゼＢ、日本、天野エンザイム株式会社のシュードモナス・セパシアリパーゼ、又は日本、名糖産業株式会社のアルカリゲネス属リパーゼ、３０００ユニット）を、ポリマー担体（１ｇ）を含む緩衝液（１０ｍｌ、ｐＨ７）中に室温で８時間混合した。固定化された酵素を濾過して取り出し、デシケーター中のシリカ上で乾燥した。同様の量の緩衝液及び有機溶媒、例えばイソオクタンを含む二相系において、同じ手順を実行することができる。
【００６９】
全て、米国、ロームアンドハース社によって製造される以下の担体を使用した。
−疎水性吸着剤として定義されるアンバーライトＸＡＤ１６００、
−親水性吸着剤として定義されるアンバーライトＸＡＤ７６１、
−極性及び非極性吸着剤として定義されるアンバーライトＸＡＤ７ＨＰ、及び
−極性陰イオン交換樹脂として定義されるアンバーライトＩＲＡ−９５８。
【００７０】
（例５）
バイオディーゼルの生成における例４の固定化リパーゼの使用
バイオディーゼル及び副産物としてのグリセロールの生成のため油トリグリセリドとメタノールのエステル交換を使用して、例４で調製される固定化リパーゼの活性を評価した。（０．３ｇを、１時間おきに４時間かけて３回に分け添加した）メタノールを含む磁気的に攪拌した大豆油（２．５ｇ）に、１０％ｗ／ｗ固定化リパーゼを添加することで、反応を開始した。
【００７１】
４時間後に反応媒体を交換する一方、同じバッチの生体触媒を使用した、様々なマトリックス上に固定化された異なるリパーゼについて、油の脂肪酸メチルエステルへの変換（％）を、図５から８までに示す。アンバーライト（登録商標）ＸＡＤ１６００などの疎水性担体（吸着剤）上に固定化されたリパーゼは、どのように他の種類の担体に固定化されているとしても、その他の同様の酵素と比較して、はるかにより高い数のバッチのための反復使用において、エステル交換活性を維持した。また、この種類の反応のために、親水性担体に固定化された全てのリパーゼは、低いエステル交換活性、及び、連続的バッチにおける低い反復使用を示したことを、明らかに見ることができる。アンバーライト（登録商標）ＸＡＤ７６１及びアンバーライト（登録商標）ＩＲＡ−９５８のような親水性担体上に固定化されたリパーゼは、反応の形成された親水性生成物、すなわちグリセロールで飽和した生体触媒の凝集体を形成したことが、知られた。形成された生成物の集積によって、また、固定化酵素近傍の高濃度メタノールのために、生体触媒は低い活性及び少ない数の反復使用を示した。
【００７２】
対照的に、リパーゼ、特に、アンバーライト（登録商標）ＸＡＤ１６００及びアンバーライト（登録商標）ＸＡＤ７ＨＰのような疎水性担体上に固定化された好熱性子嚢菌及びシュードモナス・セパシアリパーゼは、より高いエステル交換活性を生み出し、また、生体触媒の同じバッチを使用して、５０回を超える反復サイクルで、そのエステル交換活性を維持した。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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