(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトBST2D抗原に結合し、かつヒトBST2H抗原とは実質的に結合しないことを特徴とする抗ヒトBST2抗体であって、配列番号：３７のアミノ酸配列をエピトープとして認識する抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
【請求項２】
モノクローナル抗体である請求項１に記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
【請求項３】
受託番号FERM BP-10964として寄託されたハイブリドーマBST2#4LDが産生するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
【請求項４】
重鎖可変領域と軽鎖可変領域において、以下のアミノ酸配列をCDR1、CDR2およびCDR3として含む請求項１に記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片；
重鎖可変領域のCDR1:SGYYWN（配列番号：４）；
重鎖可変領域のCDR2:YISYDGSNNYNPSLKNR（配列番号：５）；および
重鎖可変領域のCDR3:ILGRGY（配列番号：６）；
軽鎖可変領域のCDR1:RASQSVSTSSYSYMH（配列番号：７）；
軽鎖可変領域のCDR2:YASNLES（配列番号：８）；および
軽鎖可変領域のCDR3:QHSWEIPYT（配列番号：９）。
【請求項５】
重鎖可変領域および軽鎖可変領域として、以下に記載するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片；
配列番号：１１の重鎖可変領域と配列番号：１３の軽鎖可変領域。
【請求項６】
請求項３に記載の抗体が結合するBST2Dタンパク質のエピトープと同じエピトープに結合する抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
【請求項７】
モノクローナル抗体である請求項４に記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
【請求項８】
細胞表面にヒトBST2D抗原を発現している細胞に対してCDC活性を有することを特徴とする請求項１から７のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
【請求項９】
細胞表面にヒトBST2D抗原を発現している細胞に対してADCC活性を有することを特徴とする請求項１から８のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
【請求項１０】
該抗体または断片がヒトBST2D抗原を発現している骨髄腫細胞移植マウスモデルに対して抗腫瘍効果を有する、請求項１から９のいずれかに記載の抗体または断片。
【請求項１１】
請求項４に記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片、をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項４に記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片、をコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載のベクターを発現可能に保持した形質転換細胞。
【請求項１４】
請求項１３に記載の形質転換細胞を培養し、その培養物から抗体、またはその抗原結合領域を含む断片、を回収する工程を含む請求項４に記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片、の製造方法。
【請求項１５】
請求項２に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項１６】
受託番号FERM BP-10964として寄託されたハイブリドーマBST2#4LD。
【請求項１７】
請求項１６に記載のハイブリドーマを培養し、培養物から抗体を採取する工程を含む抗体の製造方法。
【請求項１８】
ヒトBST2D抗原を発現している組織の増殖に起因する疾患に対する治療剤であって、請求項１０に記載の抗体または断片を有効成分として含む治療剤。
【請求項１９】
請求項１０に記載の抗体または断片を有効成分として含む、ヒトBST2D抗原を発現している腫瘍に対する治療剤。
【請求項２０】
腫瘍が、骨髄に存在する細胞から派生した腫瘍であることを特徴とする請求項１９に記載の治療剤。
【請求項２１】
骨髄に存在する細胞から派生した腫瘍が、骨髄腫であることを特徴とする請求項２０に記載の治療剤。
【請求項２２】
骨髄腫が、多発性骨髄腫であることを特徴とする請求項２１に記載の治療剤。
【請求項２３】
請求項１に記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片を含む、ヒトBST2D抗原を発現している組織を検出する診断薬。
【請求項２４】
請求項１に記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片を含む、ヒトBST2D抗原を発現している腫瘍を検出するための診断薬。
【請求項２５】
腫瘍が、骨髄に存在する細胞から派生した腫瘍であることを特徴とする請求項２４に記載の診断薬。
【請求項２６】
骨髄に存在する細胞から派生した腫瘍が、骨髄腫であることを特徴とする請求項２５に記載の診断薬。
【請求項２７】
骨髄腫が、多発性骨髄腫であることを特徴とする請求項２６に記載の診断薬。
【請求項２８】
請求項１０に記載の抗体または断片の、ヒトBST2D抗原を発現している腫瘍の治療のための医薬組成物の製造における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトBST2抗原と結合する抗体とその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
BST2は、骨髄腫を始めとする各種の癌細胞に高発現する膜貫通糖タンパク質であることが知られている（非特許文献１から４）。これまでにBST2抗原には数種のスプライシングバリアントの存在が報告（特許文献１、特許文献５）されている。これらのなかでもBST2Dは腫瘍に高発現していることが報告されている（非特許文献１）。さらに、抗BST2モノクローナル抗体は、細胞表面に発現しているBST2（分子種としてはBST2Dに相当）と結合することにより、当該細胞に対して細胞傷害活性を有することも知られている（非特許文献２）。そして、この原理を利用し、生体内の腫瘍細胞を標的とした抗腫瘍薬を開発することが試みられている。たとえばヒト骨髄腫細胞移植マウスモデルにおいて、腫瘍の縮小・治癒が期待できる優れた抗腫瘍効果が得られている（非特許文献３、４）。
【特許文献１】ＷＯ１９９９／０４３８０３
【特許文献２】ＷＯ１９９８／０３５６９８
【特許文献３】ＷＯ２００２／０６４１５９
【特許文献４】ＷＯ２００５／０３４９９４
【特許文献５】ＷＯ２００６／００８８８６
【特許文献６】ＷＯ２００６／０１３９２３
【非特許文献１】Goto T. et al, Blood 84(6):1922-30, 1994
【非特許文献２】Ohtomo T. et al. Biochem Biophys Res Commun. ;258(3):583-91, 1999
【非特許文献３】Ozaki S. et al. Blood 90(8): 3179-86, 1997
【非特許文献４】Koishihara Y. et al. Blood 92(s): 107, 1998
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
これまでにヒトBST2抗原にはつぎのような数種のスプライシングバリアントの存在が報告されている。
塩基配列        アミノ酸配列      アミノ酸配列の長さ
ヒトBST2D    配列番号：１      配列番号：２        （１８０）
ヒトBST2H    配列番号：２０    配列番号：２１      （１５８）
ヒトBST2HS   配列番号：２２    配列番号：２３      （１００）
これらのスプライシングバリアントのうち、ヒトBST2Dを認識する抗体が骨髄腫などの一部の腫瘍の治療に利用する試みが報告されている。たとえば、抗BST2モノクローナル抗体である「HM1.24抗体」は、骨髄腫に対する治療効果が確認された代表的なモノクローナル抗体である。「HM1.24抗体」は、ヒト骨髄腫細胞を免疫原として樹立されたモノクローナル抗体である。その後のエピトープ解析により、「HM1.24抗体」は、配列番号：２で表されるヒトBST2Dの、アミノ酸番号１１６〜１２７（配列番号：２４）を認識していることが確認されている。ところがこの領域は、ヒトBST2Hに共通するアミノ酸配列からなっている（図１）。【０００４】
このような抗原認識特性を有する抗体は、BST2Hを発現する細胞や組織にも結合する可能性がある。すなわち、たとえば診断においては、ヒトBST2Dを発現する腫瘍に加えて、BST2Hを発現する細胞が検出される恐れがある。あるいは、治療においても、BST2Hを発現する細胞にも抗体が結合することから、抗体の血中濃度が低下しやすい可能性がある。本発明は、この課題を解決しようとするものである。すなわち、ヒトBST2Dに特異的に結合する抗体と、その用途を提供することが本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、HM1.24抗体がヒトへの投与時にヒト生体内の腫瘍外組織に非特異的に吸着することによってHM1.24抗体の血中濃度低下をもたらすと考え、HM1.24抗体が認識しているエピトープ以外の配列を認識する抗体を見出すことを試み、鋭意検討を行い本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明者らは、BST2抗体とヒトBST2抗原の各種スプライシングバリアントとの結合性を指標にしてBST2抗体を選別し、治療及び診断目的外組織への非特異的吸着を抑えた、特異的な抗BST2抗体を得ることに成功した。当該抗体を用いることにより、投与後の血中濃度の低下を防止し、従来よりも少ない抗体投与量で目的の治療効果を得る、又は当該治療効果を有効に予測できる診断を可能とする効果を得ることが期待できるものである。【０００６】
すなわち、本発明は、以下のような抗ヒトBST2抗体、その製造方法並びにその用途に関する。
〔１〕ヒトBST2D抗原に結合し、かつヒトBST2H抗原とは実質的に結合しないことを特徴とする抗ヒトBST2抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
〔２〕配列番号：３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを認識することを特徴とする〔１〕に記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
〔３〕配列番号：３のうちの全部または少なくとも５個以上の連続するアミノ酸配列を有するペプチドを免疫原として作製した抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
〔４〕〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の抗体が結合するBST2Dタンパク質のエピトープと同じエピトープに結合する抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
〔５〕モノクローナル抗体である〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
〔６〕受託番号FERM AP-21303として寄託されたハイブリドーマBST2#4LDが産生するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
〔７〕重鎖可変領域と軽鎖可変領域において、以下のアミノ酸配列をCDR1、CDR2およびCDR3として含む〔１〕に記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片；
重鎖可変領域のCDR1:SGYYWN（配列番号：４）；
重鎖可変領域のCDR2:YISYDGSNNYNPSLKNR（配列番号：５）；および
重鎖可変領域のCDR3:ILGRGY（配列番号：６）；
軽鎖可変領域のCDR1:RASQSVSTSSYSYMH（配列番号：７）；
軽鎖可変領域のCDR2:YASNLES（配列番号：８）；および
軽鎖可変領域のCDR3:QHSWEIPYT（配列番号：９）。
〔８〕重鎖可変領域および軽鎖可変領域として、以下に記載するアミノ酸配列を含む、〔１〕に記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片；
配列番号：１１の重鎖可変領域と配列番号：１３の軽鎖可変領域。
〔９〕次の(A)または(B)のいずれかに記載の抗体において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入された抗体であって、(A)または(B)のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体、またはその抗原結合領域を含む断片；
(A)重鎖可変領域と軽鎖可変領域において、以下のアミノ酸配列をCDR1、CDR2およびCDR3として含む抗体、；
重鎖可変領域のCDR1:SGYYWN（配列番号：４）；
重鎖可変領域のCDR2:YISYDGSNNYNPSLKNR（配列番号：５）；および
重鎖可変領域のCDR3:ILGRGY（配列番号：６）；
軽鎖可変領域のCDR1:RASQSVSTSSYSYMH（配列番号：７）；
軽鎖可変領域のCDR2:YASNLES（配列番号：８）；および
軽鎖可変領域のCDR3:QHSWEIPYT（配列番号：９）、または
(B)重鎖可変領域および軽鎖可変領域として、以下に記載するアミノ酸配列を含む抗体、；
配列番号：１１の重鎖可変領域と配列番号：１３の軽鎖可変領域。
〔１０〕〔７〕から〔９〕のいずれかに記載の抗体が結合するBST2Dタンパク質のエピトープと同じエピトープに結合する抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
〔１１〕モノクローナル抗体である〔７〕から〔１０〕のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
〔１２〕細胞表面にヒトBST2D抗原を発現している細胞に対してCDC活性を有することを特徴とする〔１〕から〔１１〕のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
〔１３〕細胞表面にヒトBST2D抗原を発現している細胞に対してADCC活性を有することを特徴とする〔１〕から〔１１〕のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
〔１４〕〔７〕から〔９〕のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片、をコードするポリヌクレオチド。
〔１５〕〔７〕から〔９〕のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片、をコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
〔１６〕〔１５〕に記載のベクターを発現可能に保持した形質転換細胞。
〔１７〕〔１６〕に記載の形質転換細胞を培養し、その培養物から抗体、またはその抗原結合領域を含む断片、を回収する工程を含む〔７〕から〔９〕のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片、の製造方法。
〔１８〕〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
〔１９〕受託番号FERM AP-21303として寄託されたハイブリドーマBST2#4LD。
〔２０〕〔１９〕に記載のハイブリドーマを培養し、培養物から抗体を採取する工程を含む抗体の製造方法。
〔２１〕次の工程を含む、抗ヒトBST2D特異抗体の製造方法；
(1)抗ヒトBST2D抗体をヒトBST2HおよびヒトBST2HSのいずれか、または両方と接触させる工程；、および
(2)以下のiおよびiiのいずれか、または両方の反応特性を有する抗ヒトBST2D抗体を抗ヒトBST2D特異抗体として回収する工程；
i. ヒトBST2Hに結合しない抗体、および
ii.ヒトBST2HSに結合しない抗体。
〔２２〕次の工程を含む抗ヒトBST2D特異抗体の製造方法；
(1)配列番号：３のアミノ酸配列、または配列番号：３のアミノ酸配列から選択された少なくとも５個以上の連続するアミノ酸配列を含むペプチドを非ヒト動物に免疫する工程、および
(2)(1)の非ヒト動物から抗体を回収するか、または抗体産生細胞を回収して該抗体産生細胞が産生する抗体を回収する工程。
〔２３〕ヒトBST2D抗原を発現している組織の増殖に起因する疾患に対する治療剤であって、〔１〕から〔１３〕のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片、を有効成分として含む治療剤。
〔２４〕〔１〕から〔１３〕のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片を有効成分として含む、ヒトBST2D抗原を発現している腫瘍に対する治療剤。
〔２５〕腫瘍が、骨髄細胞から派生した腫瘍であることを特徴とする〔２４〕に記載の治療剤。
〔２６〕骨髄細胞から派生した腫瘍が、骨髄腫であることを特徴とする〔２５〕に記載の治療剤。
〔２７〕骨髄腫が、多発性骨髄腫であることを特徴とする〔２６〕に記載の治療剤。
〔２８〕〔１〕から〔１３〕のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片を含む、ヒトBST2D抗原を発現している組織を検出する診断薬。
〔２９〕〔１〕から〔１３〕のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片を含む、ヒトBST2D抗原を発現している腫瘍を検出するための診断薬。
〔３０〕腫瘍が、骨髄細胞から派生した腫瘍であることを特徴とする〔２９〕に記載の診断薬。
〔３１〕骨髄細胞から派生した腫瘍が、骨髄腫であることを特徴とする〔３０〕に記載の診断薬。
〔３２〕骨髄腫が、多発性骨髄腫であることを特徴とする〔３１〕に記載の診断薬。
〔３３〕〔１〕から〔１３〕のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片を投与する工程を含む、ヒトBST2D抗原を発現している腫瘍の治療方法。
〔３４〕〔１〕から〔１３〕のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片の、ヒトBST2D抗原を発現している腫瘍の治療のための医薬組成物の製造における使用。【０００７】
あるいは本発明は、〔１〕から〔１３〕のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片の、ヒトBST2D抗原を発現している腫瘍の治療における使用に関する。また本発明は、〔１〕から〔１３〕のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片の、ヒトBST2D抗原を発現している腫瘍を治療するための医薬組成物の製造における使用に関する。更に本発明は、〔１〕から〔１３〕のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片を患者に投与する工程を含む、ヒトBST2D抗原を発現している腫瘍を治療するための方法を提供する。
また本発明は、〔１〕から〔１３〕のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片の、ヒトBST2D抗原を発現している腫瘍の診断における使用に関する。あるいは本発明は、〔１〕から〔１３〕のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片の、ヒトBST2D抗原を発現している腫瘍を診断するための診断剤の製造における使用に関する。更に本発明は、〔１〕から〔１３〕のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片を患者に投与する工程を含む、ヒトBST2D抗原を発現している腫瘍を生体内において検出するための方法を提供する。
加えて本発明は、〔１〕から〔１３〕のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片と、薬学的に許容される担体を配合する工程を含む、ヒトBST2D抗原を発現している腫瘍を治療するための医薬組成物の製造方法を提供する。あるいは本発明は、〔１〕から〔１３〕のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片を薬学的に許容される担体を配合する工程を含む、ヒトBST2D抗原を発現している腫瘍を生体内において検出するための診断剤の製造方法に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、抗ヒトBST2D特異抗体が提供された。本発明の抗体は、ヒトBST2の複数のバリアントのうち、ヒトBST2Dを発現する細胞に特異的に結合する。ヒトには、BST2Hなどのスプライシングバリアントが知られているが、本発明の抗体は、ヒトBST2H発現細胞には実質的に結合しない。したがって、本発明の抗体を治療に用いることによって、より少量の抗体で治療効果を達成することができる。あるいは、診断に用いたときには、骨髄腫などのBST2D発現細胞を、より特異的に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】BST2のスプライシングバリアント蛋白質の構造を示した図である。
【図２】ヒトBST2抗体の特異性の検討：ヒトBST2蛋白質のスプライシングバリアントBST2(D)及びBST2(H)を強制発現したCHO細胞株を作製し、HM1.24, マウス#4LD, マウス#19LD 抗体の結合をフローサイトメトリー法を用いて測定した結果を示した図である。
【図３】HM1.24,マウス#4LD抗体のBST2発現細胞に対するCDC活性を測定した結果を示した図である。；CDC活性の測定は、 (BST2(D)-CHO, BST2(H)-CHO, ヒトミエローマ由来RPMI8226)を用いた。ラビット補体を添加し、抗体濃度を0.01-10μg/mL にて37℃ 2時間培養後培養液中に放出されたLDH量を測定し、細胞毒性（％）とした。
【図４】HM1.24,マウス#4LD,キメラ#4LD,マウス#19LD抗体のBST2発現細胞に対するADCC活性を測定した結果を示した図である。；ADCC活性の測定には、ターゲットはBST2(D)-CHO及びRPMI8226細胞を用いた。ヒトPBMCをエフェクター細胞としE/T ratio として12.5-100 までの間で細胞殺傷の結果上清に漏出したLDH量を測定し、ADCC活性（％）とした。ヒト型化抗体HM1.24 (AHM抗体)を比較のために加えた。
【図５】ヒト脾臓組織の凍結切片を#４LD抗体または#19LD抗体を用いて免疫染色を行ったときの組織染色像を示した写真である。
【図６】Hisタグの付いたリコンビナントヒトBST2タンパク質を#４LD抗体（上）または抗Hisタグ抗体（下）を用いて検出したウェスタンブロッティングの結果を示した写真である。
【図７】RPMI8226細胞株を移植したマウスモデルにおいて、4LDを投与した際の腫瘍体積の変化を示した図である。矢印は抗体投与を示す。統計解析は最終測定日の腫瘍体積を用いて、Dunnett型多重比較法にて行った。**:P＜0.005, *:P＜0.05
【図８】ARH77細胞株を移植したマウスモデルにおいて、4LDを投与した際の生存期間を示した図である。統計解析はKaplan-Meier method logrank testにて行った。*:P＜0.05
【００１０】
発明の詳細な説明：
これまでに報告されているヒトBST2抗原のスプライシングバリアントの例は、図１に示す通りである。各バリアントのアミノ酸配列を、それぞれ次の配列番号に示した。
塩基配列        アミノ酸配列      アミノ酸配列の長さ
ヒトBST2D    配列番号：１      配列番号：２        （１８０）
ヒトBST2H    配列番号：２０    配列番号：２１      （１５８）
ヒトBST2HS   配列番号：２２    配列番号：２３      （１００）【００１１】
本発明で用いるモノクローナル抗体の調製においては、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質、またはその断片を免疫原として利用することができる。本発明のモノクローナル抗体は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質を抗原として認識していることが明らかにされた。したがって、これらの蛋白質を免疫原として用いることによって、本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。【００１２】
本発明のモノクローナル抗体は、その抗原結合領域を含む断片であっても良い。抗原結合領域を含む断片とは、抗体の抗原結合部位を含み、その抗原との結合活性を維持している断片を言う。たとえばIgGの酵素的な消化によって生成される、抗原結合部位を含む抗体断片も、本発明における抗体として利用することができる。具体的には、パパインあるいはペプシンによる消化によって、FabあるいはF(ab')2などの抗体断片を得ることができる。これらの抗体断片は、抗原との結合親和性を有する抗体分子として利用しうることは周知である。【００１３】
抗原結合領域を含む断片は、酵素的な切断のみならず、遺伝子工学的な手法によって得ることもできる。たとえば、抗原結合領域をコードする遺伝子を単離し、当該遺伝子を発現させることによって、抗原結合領域を含む抗体の断片を得ることもできる。すなわち本発明においては、必要な抗原結合活性を維持している限り、遺伝子組み換えによって構築された抗体を用いることもできる。
たとえば酵素的な消化によって得られる断片は、酵素が認識する特定のアミノ酸配列で切断されている。他方、遺伝子工学的な手法で得られる抗体断片は、抗体の任意の位置で断片化することができる。したがって、FabあるいはF(ab')2などの抗体断片とは異なる位置で断片化されている抗体断片であっても、その抗原結合活性を維持する限り、本発明における抗原結合領域を含む断片に含まれる。更に、抗原結合領域を含む断片を、再び定常領域と接合することによって再構成された抗体分子も、本発明における抗体に含まれる。したがって、遺伝子組み換えによって構築された抗体とは、たとえばキメラ抗体、CDR移植抗体、シングルチェインFv、diabody (diabodies)、線状抗体、及び抗体断片より形成された多特異性抗体等を示すことができる。モノクローナル抗体、あるいはそれを産生する抗体産生細胞をもとに、これらの抗体を得る方法は公知である。
強いエフェクター作用を示す抗体のサブクラスは公知である。したがって、本発明に基づくキメラ抗体やCDR移植抗体においては、定常領域として、エフェクター作用に優れるサブクラスを選択することによって、その治療効果を高めることができる。【００１４】
配列番号：２記載のアミノ酸配列を含む蛋白質は、組み換え体として得ることができる。たとえば配列番号：１に記載の塩基配列は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列をコードしている。したがって、これらの塩基配列からなるDNAを適当な宿主−ベクターを使って発現させれば、目的とする蛋白質を得ることができる。あるいは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列から選択された連続するアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを免疫原とすることもできる。免疫原として選択すべきアミノ酸配列は、たとえば７−５０、好ましくは５−２０程度のアミノ酸からなる。【００１５】
本発明において、免疫原として特に好ましいオリゴペプチドはヒトBST2D特異的配列（配列番号：３）から選択されたアミノ酸配列を含むオリゴペプチドである。ヒトBST2D特異的配列とはBST2Dアミノ酸配列（配列番号：２）に特徴的に見られ、他のBST2スプライシングバリアント、具体的にはBST2Hアミノ酸配列（配列番号：２１）やBST2HSアミノ酸配列（配列番号：２３）には見られないアミノ酸配列のことである。より具体的には、配列番号：３に記載のアミノ酸配列（１９残基）から選択される少なくとも５以上の連続するアミノ酸配列を含むオリゴペプチドは、本発明におけるヒトBST2D特異抗体を得るための好ましい免疫原である。免疫原とするペプチドは、BST2Dに特異的な抗体を誘導しうるものであれば、BST2Dから選択されたアミノ酸配列に対して、更に付加的なアミノ酸配列を含むことができる。すなわち本発明は、次の工程を含む抗ヒトBST2D特異抗体の製造方法に関する。
(1)配列番号：３のアミノ酸配列、または配列番号：３のアミノ酸配列から選択された少なくとも５個以上の連続するアミノ酸配列を含むペプチドを非ヒト動物に免疫する工程、および
(2)(1)の非ヒト動物から抗体を回収するか、または抗体産生細胞を回収して該抗体産生細胞が産生する抗体を回収する工程。
ヒトBST2D特異的配列（配列番号：3）はClustalWアルゴリズム（http://www.ebi.ac.uk/clustalW/）を利用した、BST2D, BST2H, BST2HS 蛋白質のアミノ酸配列のマルチプルアラインメントにより特定した。成熟BST2D蛋白質のC末端の予測はGPI modification site prediction programを用いた（1. GPI modification site prediction:http://mendel.imp.ac.at/sat/gpi/gpi_server.html、2.DGPI: http://129.194.185.165/dgpi/DGPI_demo_en.html）3.GPI-SOM: http://gpi.unibe.ch/)。【００１６】
任意のアミノ酸配列を有するオリゴペプチドを得る方法は公知である。たとえば、化学的にアミノ酸を結合させて、目的とするアミノ酸配列を有するオリゴペプチドを得ることができる。あるいは、上記組み換え体として得られた全長アミノ酸配列を有する蛋白質を切断することによって、所定のアミノ酸配列を有する断片を得ることもできる。得られたオリゴペプチドは、適当なキャリアー蛋白質と結合することによって、より免疫原性を高めることができる。キャリアー蛋白質には、キーホールリンペットヘモシアニンやウシ血清アルブミンなどが用いられる。【００１７】
続いて免疫原を、適当な免疫動物に免疫する。配列番号：２に記載の蛋白質、若しくはその部分アミノ酸配列からなるペプチドを、アジュバントとともに免疫動物に投与することができる。【００１８】
更に、配列番号：２に記載のアミノ酸配列をコードするDNAを発現可能に保持した形質転換細胞を免疫原として利用することができる。たとえば配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を構成する塩基配列を含むDNAは、上記DNAとして好ましい。これらのDNAを適当な発現ベクターに組み込み、宿主細胞を形質転換すれば免疫原として有用な形質転換細胞を得ることができる。【００１９】
免疫原とするための宿主細胞は、免疫動物と同じ種に由来する細胞とすることができる。同種の細胞を用いることにより、外来性の蛋白質に対する特異的な免疫応答を誘導することができる。たとえば、免疫動物にラットを用いるのであれば、ラットに由来する宿主細胞を用いることができる。上記蛋白質を含む形質転換細胞の分画を免疫原として用いることもできる。実施例に示したように、配列番号：２に記載のアミノ酸配列には、膜貫通ドメインが見られた（図１の膜貫通領域;transmembrane region）。したがって、これらのアミノ酸配列を有する蛋白質は、細胞膜に発現する可能性がある。上記蛋白質を発現する細胞の、細胞膜分画を免疫原として利用できる。【００２０】
BST2Dを発現する細胞の表面には、図１に示すように、BST2Dの細胞膜外領域が提示されている。この領域には、BST2の他のバリアントと共通の構造も含まれている。したがって、BST2D発現細胞を免疫原に用いた場合には、他のバリアントに結合する抗体も産生される可能性はある。しかし、各バリアントとの結合特異性を指標に抗体を選択することによって、目的とする抗体を得ることはできる。すなわち本発明は、次の工程を含む、抗ヒトBST2D特異抗体の製造方法を提供する。抗体の各バリアントに対する反応特異性は、別途説明するような方法によって確認することができる。
(1)抗ヒトBST2D抗体をヒトBST2HおよびヒトBST2HSのいずれか、または両方と接触させる工程；、および
(2)以下のiおよびiiのいずれか、または両方の反応特異性を有する抗ヒトBST2D抗体を抗ヒトBST2D特異抗体として回収する工程；
i. ヒトBST2Hに結合しない抗体、および
ii.ヒトBST2HSに結合しない抗体。【００２１】
本発明における免疫動物としてはあらゆる非ヒト脊椎動物を利用することができる。モノクローナル抗体を得るためには、ハイブリドーマとするための融合パートナーの入手が容易な動物が有利である。たとえば、マウス、ラット、ラビット、ウシ、ヤギなどの細胞に由来するハイブリドーマの樹立が確立されている。これらの免疫動物を、本発明に用いることができる。一方アジュバントには、フロイントの完全アジュバントやフロイントの不完全アジュバント等が用いられる。【００２２】
免疫動物は、３〜１０日間隔で複数回免疫される。１回の免疫に用いられる形質転換細胞の数は、任意である。通常、103〜108、たとえば106の形質転換細胞が免疫される。また蛋白質やペプチドによる免疫においては、一般に１〜１００μgが免疫される。複数回の免疫を経た免疫動物から免疫担当細胞を回収し、目的とする抗体を産生する細胞をクローニングすることにより、本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。免疫担当細胞とは、免疫動物において抗体産生能を有する細胞を言う。【００２３】
免疫担当細胞は、たとえばハイブリドーマ法によってクローニングすることができる。免疫担当細胞は、１つの細胞が１種類の抗体を産生している。したがって、１つの細胞に由来する細胞集団を確立すること（すなわちクローニング）ができれば、モノクローナル抗体を得ることができる。ハイブリドーマ法とは、免疫担当細胞を適当な細胞株と融合させ、不死化(immortalize)した後にクローニングする方法を言う。ハイブリドーマ法に有用な多くの細胞株が知られている。これらの細胞株は、リンパ球系細胞の不死化効率に優れ、かつ細胞融合に成功した細胞の選択に必要な各種の遺伝マーカーを有している。更に抗体産生細胞の取得を目的とする場合には、抗体産生能を欠落した細胞株を用いることもできる。【００２４】
たとえばマウスミエローマP3x63Ag8.653(ATCC CRL-1580)は、マウスやラットの細胞融合を行う際に有用な細胞株として広く用いられている。一般にハイブリドーマは、同種の細胞の融合によって作成されるが、近縁の異種間でのヘテロハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得することもできる。【００２５】
細胞融合の具体的なプロトコルは公知である。すなわち、免疫動物の免疫担当細胞を適当な融合パートナーと混合し、細胞融合させる。免疫担当細胞には、脾細胞や末梢血B細胞などが用いられる。融合パートナーとしては、先に述べた各種の細胞株を利用することができる。細胞融合には、ポリエチレングリコール法や、電気融合法が用いられる。【００２６】
次に、融合細胞が有する選択マーカーに基づいて、細胞融合に成功した細胞が選択される。たとえばHAT感受性の細胞株を細胞融合に用いた場合には、HAT培地において成育する細胞を選択することによって、細胞融合に成功した細胞が選択される。更に選択された細胞が産生する抗体が、目的とする反応性を有していることを確認する。【００２７】
各ハイブリドーマは、抗体の反応性に基づいて、スクリーニングされる。すなわち、配列番号：２で表すヒトBST2Dの、アミノ酸番号１１６〜１２７（配列番号：２４）をエピトープとして認識していない抗ヒトBST2Dモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが選択される。ハイブリドーマの選択に際しては、ハイブリドーマの産生した抗体がまずヒトBST2D抗原と結合することを確認し、さらに、配列番号：２４に示すエピトープを結合領域として認識していないことを確認する。本願において、「エピトープとして認識していない」又は「エピトープを結合領域として認識していない」とは、次のようにして配列番号：２４に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する結合活性を評価して確認することができる。
具体的に配列番号：２４に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する結合活性を評価する手段としては、ELISA法（酵素結合免疫吸着検定法）、RIA法（放射免疫測定法）、EIA法（酵素免疫測定法）、FACS（フローサイトメトリー法）その他の当業者に周知な方法から適宜適した方法を用いることができる。【００２８】
より具体的な例示としては、BST2Hとの結合性を有しないことを確認する、またはBST2HSとの結合性を有することを確認する手段が挙げられる。酵素標識抗体を使ったELISA法を用いた当該手段としては、BST2D又はBST2H抗原を適当な固相に結合し、抗原に結合するモノクローナル抗体を、免疫動物のイムノグロブリンを認識する標識抗体によって検出することもできる。マイクロプレートの内壁にBST2D又はBST2H抗原を結合させ、ELISA法を利用すれば、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを迅速にスクリーニングすることができる。さらにBST2D抗原に結合するモノクローナル抗体の中から、適当な固相に結合されたBST2Hに対する結合性を前記と同様にELISA法によって測定することによって所望の結合活性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。【００２９】
以上のようにして、ヒトBST2Dに結合し、ヒトBST2Hとは実質的に結合しない抗体を選択することができる。本発明においてヒトBST2Hとは実質的に結合しない抗体とは、より具体的には、ヒトBST2H発現細胞とは実質的に結合しない抗体を言う。ある抗体が、ヒトBST2H発現細胞とは実質的に結合しないことは、別に説明するような方法によって確認することができる。【００３０】
選択されたハイブリドーマは、好ましくは更にサブクローニングによって、最終的に目的とする抗体の産生が確認された場合に、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマとして選択することができる。抗原に対する抗体の結合活性を測定・評価する方法として前記ELISA法の他にFACS法等の方法も適宜用いることができる。FACSを用いる方法は、特に緩衝液等に懸濁した細胞表面上に発現している抗原に対する抗体の結合を測定、評価する方法として好適である。FACS法に用いられるフローサイトメーターとしては、例えば、次のような装置が知られている。
FACSCantoTM II
FACSAriaTM
FACSArrayTM
FACSVantageTM SE
FACSCaliburTM
（いずれもBD Biosciences社の商品名）
EPICS ALTRA HyPerSort
Cytomics FC 500
EPICS XL-MCL ADC     EPICS XL ADC
Cell Lab Quanta / Cell Lab Quanta SC
（いずれもBeckman Coulter社の商品名）【００３１】
BST2抗体の抗原に対する結合活性の好適な測定方法の一例として、次の方法を挙げることができる。まず、BST2D、BST2H、又はBST2HSを発現する細胞と反応させた被験抗体を認識するFITC標識した二次抗体で染色する。次に、FACSCalibur (BD社) により蛍光強度と細胞数を測定する。当該細胞に対する抗体の結合量は、CELL QUEST Software (BD社) を用いて解析することにより得られた蛍光強度、すなわちGeometric Meanの値に反映する。すなわち、当該Geometric Meanの値を得ることにより、抗体の結合量によって表される抗体の結合活性を測定することができる。【００３２】
本方法において、例えば「BST2H発現細胞に実質的に結合しない」ことは、以下の方法によって判断することができる。まず、前記BST2H分子を発現する細胞に対して結合した被験抗体を、二次抗体で染色する。たとえば、被験抗体がマウスの抗体であれば、FITC標識した抗マウスイムノグロブリン抗体を二次抗体として利用することができる。次いで細胞の蛍光強度を検出する。蛍光検出にフローサイトメトリーとしてFACSCaliburを用いた場合、得られた蛍光強度はCELL QUEST Softwareを用いて解析することができる。被験抗体存在下および非存在下でのGeometric Meanの値から、この比（ΔGeo-Mean）を下記の計算式に基づいて算出することにより、被験抗体の結合による蛍光強度の増加割合を求めることができる。
ΔGeo-Mean＝Geo-Mean（被験抗体存在下）／Geo-Mean（被験抗体非存在下）
解析によって得られる被験抗体のBST2H発現細胞に対する結合量が反映されたGeometric Mean比値（BST2HΔGeo-Mean値）を、被験抗体のBST2D又はBST2H発現細胞に対する結合量が反映されたΔGeo-Mean比値と比較する。対照抗体としては、HM1.24抗体を利用することができる。【００３３】
本発明においては、被験抗体のBSH2H発現細胞に対するΔGeo-Mean比値が、被験抗体のBST2D又はBST2HS発現細胞に対するΔGeo-Mean比値の、少なくとも50％、好ましくは30％、更に好ましくは20％、特に好ましくは10％より小さければ、「BST2H発現細胞に実質的に結合しない」ものとする。Geo-Mean値 (Geometric Mean) を求める計算式は、CELL QUEST Software User’s Guide (BD biosciences社)に記載されている。BST2H発現細胞に対する結合活性も同様にして評価することができる。公知の結合活性の評価に用いる、BST2HS分子、BST2H分子、そしてBST2Dの各分子を発現する細胞は、いずれも共通の発現ベクターと宿主細胞を利用して調製し、それぞれの細胞での発現量が同等程度であることが好ましい。【００３４】
本発明のモノクローナル抗体は、BST2D発現細胞に結合し、かつBST2H分子を発現する細胞に対する結合活性が、前記BST2D発現細胞に対する結合活性よりも低いモノクローナル抗体を含む。あるいは本発明の好ましいモノクローナル抗体は、前記BST2D発現細胞に結合し、かつBST2H分子を発現する細胞に対して実質的に結合しないモノクローナル抗体を含む。【００３５】
また本発明は、本願発明で開示されたモノクローナル抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体もまた提供する。すなわち本発明は、本発明のモノクローナル抗体が認識するエピトープと同一のエピトープを認識する抗体と、その用途に関する。たとえば本発明における好ましいモノクローナル抗体である4LDは、配列番号：３７；EVERLRRENQVLSVRのアミノ酸配列をエピトープとして認識する。より具体的には、配列番号：２に示すヒトBST2Dの全長アミノ酸配列中の細胞外ドメインを構成するアミノ酸配列(47-180)から選択された連続するアミノ酸配列で構成された合成ペプチドのうち、K(47)---R(147)は本発明の4LD抗体によって認識されるが、K(47)--V(146)は同じ条件で4LD抗体の結合が検出できない。また、E(133)---Q(180)は本発明の4LD抗体によって認識されるが、V(134)----Q(180)は同じ条件で4LD抗体の結合が検出できない。
したがって、配列番号：３７；EVERLRRENQVLSVRで構成されるエピトープを認識するモノクローナル抗体は、本発明のモノクローナル抗体として好ましい。より具体的には、配列番号：２に示すヒトBST2Dの全長アミノ酸配列中の細胞外ドメインを構成するアミノ酸配列(47-180)から選択された連続するアミノ酸配列で構成された合成ペプチドのうち、K(47)---R(147)およびE(133)---Q(180)からなるペプチドには結合し、K(47)--V(146)およびV(134)---Q(180)への結合が同じ条件で検出できない抗体は、本発明におけるBST2D抗体として好ましい。このような抗体は、例えば、以下の方法により得ることができる。
【００３６】
被験抗体が、ある抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合すること、すなわちある抗体とエピトープを共有することは、両者の同じエピトープに対する競合によって確認することができる。本発明において、抗体間の競合は、FACSや交叉ブロッキングアッセイなどによって検出することができる。FACSにおいては、まず本発明のモノクローナル抗体をBST2D発現細胞に結合させて蛍光シグナルが測定される。次に、候補の競合抗体を反応後に本発明のモノクローナル抗体を同じ細胞と反応させて、同様にFACSにより解析する。あるいは、本発明のモノクローナル抗体と被験競合抗体とを同時に同じ細胞に反応させることもできる。競合抗体を反応させたときに、本発明のモノクローナル抗体のFACSの解析パターンが変化すれば、競合抗体が本発明のモノクローナル抗体と同じエピトープを認識することが確認できる。【００３７】
その他、例えば競合ELISAアッセイは、好ましい交叉ブロッキングアッセイである。具体的には、交叉ブロッキングアッセイにおいては、マイクロタイタープレートのウェル上にBST2Dを発現した細胞が固定される。候補の競合抗体の存在下、または非存在下でプレインキュベートした後に、本発明のモノクローナル抗体が添加される。ウェル中のBST2D発現細胞に結合した本発明のモノクローナル抗体の量は、同じエピトープへの結合に対して競合する候補競合抗体（被験抗体）の結合能と逆相関している。すなわち同一エピトープに対する被験抗体の親和性が大きくなればなる程、本発明のモノクローナル抗体のBST2Dタンパク質発現細胞を固定したウェルへの結合量は低下する。あるいは逆に、同一エピトープに対する被験抗体の親和性が大きくなればなる程、被験抗体のBST2Dタンパク質発現細胞を固定したウェルへの結合量は増加する。【００３８】
ウェルに結合した抗体量は、予め抗体を標識しておくことによって、容易に測定することができる。たとえば、ビオチン標識された抗体は、アビジンペルオキシダーゼコンジュゲートと適切な基質を使用することにより測定できる。ペルオキシダーゼなどの酵素標識を利用した交叉ブロッキングアッセイを、特に競合ELISAアッセイという。抗体は、検出あるいは測定が可能な他の標識物質で標識することができる。具体的には、放射標識あるいは蛍光標識などが公知である。【００３９】
更に被験抗体が本発明のモノクローナル抗体と異なる種に由来する定常領域を有する場合には、ウェルに結合したいずれかの抗体を、いずれかの種に由来する定常領域を特異的に認識する標識抗体によって測定することもできる。あるいは同種由来の抗体であっても、クラスが相違する場合には、各クラスを特異的に識別する抗体によって、ウェルに結合した抗体を測定することができる。【００４０】
候補の競合抗体非存在下で実施されるコントロール試験において得られる結合活性と比較して、候補抗体が、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも２０-５０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、本発明のモノクローナル抗体の結合をブロックできるならば、該候補競合抗体は本発明のモノクローナル抗体と実質的に同じエピトープに結合するか、又は同じエピトープへの結合に対して競合する抗体である。【００４１】
モノクローナル抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体としては、例えば、上記〔４〕または〔１０〕に記載の抗体が挙げられる。
また、上記〔４〕又は〔１０〕に記載の抗体には、上述の通り、一価抗体だけでなく、多価抗体も含まれる。本発明の多価抗体には、全て同じ抗原結合部位を有する多価抗体、または、一部もしくは全て異なる抗原結合部位を有する多価抗体が含まれる。【００４２】
本発明の抗体としては、BST2Dを認識する任意の抗体を利用することができる。たとえば以下（１）から（５）に記載の抗体が好ましい抗体として例示できる。これらの抗体は、例えば、全長抗体、低分子化抗体、動物抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、あるいはヒト抗体であってよい。
（１）重鎖可変領域と軽鎖可変領域において、以下のアミノ酸配列をCDR1、CDR2およびCDR3として含む抗体、またはその抗原結合領域を含む断片；
重鎖可変領域のCDR1:SGYYWN（配列番号：４）；
重鎖可変領域のCDR2:YISYDGSNNYNPSLKNR（配列番号：５）；および
重鎖可変領域のCDR3:ILGRGY（配列番号：６）；
軽鎖可変領域のCDR1:RASQSVSTSSYSYMH（配列番号：７）；
軽鎖可変領域のCDR2:YASNLES（配列番号：８）；および
軽鎖可変領域のCDR3:QHSWEIPYT（配列番号：９）。
（２）重鎖可変領域および軽鎖可変領域として、以下に記載するアミノ酸配列を含む、上記〔１〕に記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片；
配列番号：１１の重鎖可変領域と配列番号：１３の軽鎖可変領域。
（３）（１）または（２）のいずれかに記載の抗体において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入された抗体であって、（１）または（２）のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体；
（４）（１）から（３）のいずれかに記載の抗体が結合するBST2Dタンパク質のエピトープと同じエピトープに結合する抗体、またはその抗原結合領域を含む断片；
（５）モノクローナル抗体である（１）から（５）のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片；【００４３】
上記（３）に記載の抗体の好ましい態様は、CDRに改変が生じていない抗体である。一例として、上記（３）に記載の抗体のうち、「（１）に記載の抗体において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入された抗体であって、（１）に記載の抗体と同等の活性を有する抗体」の好ましい態様は、「（１）に記載の抗体と同等の活性を有し、（１）に記載の抗体において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入された抗体であって、CDR1として配列番号：４に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：５に記載のアミノ酸配列、およびCDR３として配列番号：６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖と、CDR1として配列番号：７に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：８に記載のアミノ酸配列、およびCDR３として配列番号：９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体」である。上記（３）に記載の抗体のうち、その他の抗体の好ましい態様も同様に表現することができる。【００４４】
本発明において「同等の活性を有する抗体」とは「機能的に同等な抗体」のことである。「同等の活性」または「機能的に同等」とは、例えば、抗体のBST2DまたはBST２Hへの結合活性、結合親和性や抗体のBST2Dタンパク質を発現している細胞へのCDC活性（補体依存性細胞傷害活性）またはADCC活性(抗体依存性細胞介在性細胞傷害活性)などが同等であることを意味する。【００４５】
ポリペプチドに変異を導入する方法は、あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製するための、当業者によく知られた方法の一つである。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275、Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-500、Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、Kramer W, and Fritz HJ(1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367、Kunkel,TA(1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492、Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766）などを用いて、本発明の抗体に適宜変異を導入することにより、該抗体と機能的に同等な抗体を調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。このように、本発明の抗体のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を有し、該抗体と機能的に同等な抗体もまた本発明の抗体に含まれる。【００４６】
このような変異体における、変異するアミノ酸数は、通常、50アミノ酸以内であり、好ましくは30アミノ酸以内であり、さらに好ましくは10アミノ酸以内（例えば、5アミノ酸以内）である。【００４７】
変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質に基づいて、次のような分類が確立している。
疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、
親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、
脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、I、P）、
水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、Y）、
硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、
カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、E、Q）、
塩基含有側鎖を有するアミノ酸（R、K、H）、
芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）
（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）【００４８】
あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666 、Zoller, M. J. and Smith, M., Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500 、Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433 、Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413 ）。すなわち、一般に、あるポリペプチドを構成するアミノ酸配列中、各群に分類されたアミノ酸は、相互に置換したときに、当該ポリペプチドの活性が維持される可能性が高いとされている。本発明において、上記アミノ酸群の群内のアミノ酸間の置換を保存的置換と言う。【００４９】
本発明の抗体としては、抗体遺伝子を適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた遺伝子組換え型抗体を用いることができる（例えば、Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照）。具体的には当該ハイブリドーマから抗体の抗原結合領域をコードするcDNAを取得し、これを適当な発現ベクターに挿入することによって発現させることができる。抗体の可変領域をコードするcDNAを取得し、発現ベクターに組み込み、次にこのベクターで適当な宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる技術は公知である。また抗原結合領域を含む可変領域を、定常領域と結合させることによってキメラ抗体とする手法も公知である。【００５０】
また、本発明は、本発明のベクターが導入された宿主細胞を提供する。本発明のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを用いることが可能である。本発明の宿主細胞は、例えば、本発明の抗体の製造や発現のための産生系として使用することができる。ポリペプチド製造のための産生系は、in vitroおよびin vivoの産生系がある。in vitroの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。【００５１】
真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、CHO（J. Exp. Med. (1995) 108, 945）、COS、NIH3T3、ミエローマ、BHK（baby hamster kidney）、HeLa、Vero、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Valle, et al., Nature (1981) 291, 358-340）、あるいは昆虫細胞、例えば、Sf9、Sf21、Tn5が知られている。CHO細胞としては、特に、DHFR遺伝子を欠損したCHO細胞であるdhfr-CHO（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220）やCHO K-1（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275）を好適に使用することができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にCHO細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、カチオニックリポソームDOTAP（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポーレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。【００５２】
真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Aspergillus）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）が知られている。【００５３】
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（E. coli）、例えば、JM109、DH5α、HB101等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。【００５４】
これらの細胞を目的とするポリヌクレオチドにより形質転換し、形質転換された細胞をin vitroで培養することにより抗体が得られる。培養は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができる。その際、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のpHは、約6〜8であるのが好ましい。培養は、通常、約30〜40℃で約15〜200時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。【００５５】
これにより得られた本発明の抗体は、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一な抗体として精製することができる。抗体の分離、精製は、通常の抗体の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせれば抗体を分離、精製することができる。【００５６】
クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばHPLC、FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインAカラム、プロテインGカラムが挙げられる。例えば、プロテインAを用いたカラムとして、Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia)等が挙げられる。本発明は、これらの精製方法を用い、高度に精製された抗体も包含する。【００５７】
更に、モノクローナル抗体の抗原結合領域を他のイムノグロブリンに移植することもできる。イムノグロブリンの抗原結合領域は、相補性決定領域（CDR)と、フレーム領域で構成されている。各イムノグロブリンの抗原結合特性はCDRによって決定されており、フレームは抗原結合領域の構造を維持している。CDRのアミノ酸配列がきわめて多様性に富むのに対して、フレーム部分のアミノ酸配列は高度に保存されている。CDRを構成するアミノ酸配列を他のイムノグロブリン分子のフレーム領域に組み込むことによって、抗原結合特性も移植できることが知られている。この方法を利用して、異種のイムノグロブリンが有する抗原結合特性をヒト・イムノグロブリンに与える方法が確立されている。【００５８】
このようにして作成されたモノクローナル抗体はいずれも本発明に利用することができる。すなわち、当該モノクローナル抗体の抗原結合領域をコードするcDNAに由来するポリヌクレオチドによってコードされた抗原結合領域を含むイムノグロブリンからなるモノクローナル抗体を本発明に利用することができる。【００５９】
本発明に利用することができるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマとして、たとえば、ハイブリドーマ#4LD、#3LD、#9LDを示すことができる。ハイブリドーマ#4LDは、２００７年６月６日付けで独立行政法人産業技術総合研究所内特許生物寄託センターに対して、受託番号FERM AP-21303として寄託され、更にブダペスト条約に基づく国際寄託として受託番号FERM BP-10964を与えられた。以下に、寄託を特定する内容を記載する。
(a)寄託機関の名称・あて名
名称：独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号中央第６（郵便番号305-8566）
(b)寄託日：２００７年６月６日
(c)受託番号：FERM BP-10964（ハイブリドーマ#4LD）【００６０】
本発明に利用するためのモノクローナル抗体は、それを産生するハイブリドーマを培養しその培養物から回収することができる。ハイブリドーマは、in vitroまたはin vivoで培養することができる。in vitroにおいては、RPMI1640などの公知の培地を用いて、ハイブリドーマを培養することができる。培養上清には当該ハイブリドーマが分泌したイムノグロブリンが蓄積される。したがって、培養上清を採取し、必要に応じて精製することにより、本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。培地には、血清を添加しない方が、イムノグロブリンの精製が容易である。しかし、ハイブリドーマのより迅速な増殖と、抗体産生の促進を目的として、１０%程度のウシ胎児血清を培地に加えることもできる。【００６１】
ハイブリドーマは、in vivoにおいて培養することもできる。具体的には、ヌードマウスの腹腔にハイブリドーマを接種することにより、腹腔内でハイブリドーマを培養することができる。モノクローナル抗体は、腹水中に蓄積する。したがって、腹水を採取し、必要に応じて精製すれば、必要なモノクローナル抗体を得ることができる。得られたモノクローナル抗体は、目的に応じて適宜、修飾、あるいは加工することができる。
キメラ抗体としてもかまわないし、モノクローナル抗体としてもかまわない。【００６２】
本発明において、BST2Dを特異的に認識するモノクローナル抗体としては、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質を認識し、配列番号：２１記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を認識しないモノクローナル抗体を利用することができる。このような抗体は、たとえば、ある条件下で配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合し、同じ条件下で配列番号：２１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに対する結合が検出できない抗体を選択することによって得ることができる。より具体的には、たとえば、配列番号：２または配列番号：２１のアミノ酸配列コードするDNAを含む発現ベクターで形質転換した細胞に対する抗体の結合特性を比較することによって、目的とする抗体を選択することができる。形質転換細胞への抗体の結合特性を比較するために、FACSなどの公知の方法を利用することができる。
BST2Dを特異的に認識する抗体を、その抗体が由来する生物種とは異なる宿主に投与する場合には、当該宿主にとって異物と認識されにくい形に加工するのが望ましい。たとえば、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（chimeric）抗体、ヒト化（humanized）抗体などが挙げられる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするDNAをヒト抗体の定常領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。【００６３】
ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（CDR; complementarity determining region）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。次のような分子に加工することにより、イムノグロブリンを異物として認識されにくくすることができる。イムノグロブリン分子を以下のように加工する手法は公知である。
−定常領域を欠失した抗原結合領域を含む断片(Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, third edition, Academic Press Limited. 1995; Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996)
−モノクローナル抗体の抗原結合領域と宿主のイムノグロブリンの定常領域とで構成されるキメラ抗体(遺伝子発現実験マニュアル  講談社  1994年  （石田  功、安東  民衛  編）
−宿主のイムノグロブリンにおける相補性決定領域(CDR)をモノクローナル抗体のCDRに置換したCDR置換抗体(遺伝子発現実験マニュアル  講談社  1994年  （石田  功、安東  民衛  編）【００６４】
また、ヒトに対する異種抗原性がないヒト抗体の取得方法も知られている。たとえばヒト抗体遺伝子を組み込まれた非ヒト動物を免疫動物として用いることにより、非ヒト動物を用いながら、ヒト抗体を得ることができる。より具体的には、たとえば、ヒト抗体遺伝子を組み込んだトランスジェニックマウスが、ヒト抗体を製造するための免疫動物として実用化されている(Ishida et al., Cloning and Stem Cells, 4:85-95,2002)。このような動物を用いることにより、ヒトのBST2を抗原として、BST2を認識するヒト抗体を得ることができる。ヒト抗体は、ヒトに投与する抗体として好ましい抗体である。【００６５】
あるいは、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。すなわちファージディスプレー法(McCafferty J. et al., Nature 348:552-554,1990; Kretzschmar T et.al., Curr Opin Biotechnol. 2002 Dec;13(6):598-602.)によって、ヒトのイムノグロブリン可変領域遺伝子を取得することもできる。ファージディスプレー法においては、ヒトイムノグロブリン可変領域をコードする遺伝子がファージ遺伝子に組み込まれる。多様なイムノグロブリン遺伝子をソースとして、ファージライブラリーを作成することもできる。ファージは自身を構成する蛋白質の融合蛋白質として、当該可変領域を発現する。ファージによって発現されたファージ表面の可変領域は、抗原との結合活性を維持している。したがって、抗原あるいは抗原を発現した細胞などに結合するファージを選択することによって、ファージライブラリーから、目的とする結合活性を有する可変領域を発現したファージをスクリーニングすることができる。更に、こうして選択されたファージ粒子の中には、目的とする結合活性を有する可変領域をコードする遺伝子が保持されている。すなわち、ファージディスプレー法においては、可変領域の結合活性を指標として、目的とする結合活性を有する可変領域をコードしている遺伝子を取得することができる。【００６６】
本発明で使用される抗体は、好ましくは細胞傷害活性を有する抗体である。
本発明における細胞傷害活性としては、例えば抗体依存性細胞介在性細胞傷害（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity：ADCC）活性、補体依存性細胞傷害（complement-dependent cytotoxicity：CDC）活性などを挙げることができる。本発明において、CDC活性とは補体系による細胞傷害活性を意味する。一方ADCC活性とは標的細胞の細胞表面抗原に特異的抗体が付着した際、そのFc部分にFcγ受容体保有細胞（免疫細胞等）がFcγ受容体を介して結合し、標的細胞に傷害を与える活性を意味する。【００６７】
抗BST2D抗体がADCC活性を有するか否か、又はCDC活性を有するか否かは公知の方法により測定することができる（例えば、Current protocols in Immunology, Chapter7. Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc.,(1993)等）。【００６８】
具体的には、まず、エフェクター細胞、補体溶液、標的（ターゲット）細胞の調製が実施される。
（１）エフェクター細胞〔ヒト末梢単核細胞〕の調製
ヒト健常ドナーより得た末梢血よりフィコール法を用いて単離した末梢単核細胞を用いる。
（２）補体溶液の調製
Baby Rabbit Complement（CEDARLANE社製）をCDCメディウムで希釈し、最終補体濃度を６％として使用できる。
（３）標的（ターゲット）細胞の調製
BST2Dタンパク質またはBST2Hタンパク質を発現したCHO細胞やヒトミエローマ由来RPMI8226細胞などのようなBST2タンパク質を発現した細胞が標的細胞として用いることが出来る。
BST2タンパク質を発現する細胞としては、BST2タンパク質をコードする遺伝子で形質転換された細胞、各種腫瘍細胞等を利用することができる。【００６９】
CDC活性、又はADCC活性は下記に述べる方法により測定できる。
CDC活性の測定の場合は、96ウェルU底プレートに、標的細胞と、抗BST2抗体を50μlずつ加え、その後、補体溶液50μlを加え、炭酸ガスインキュベーター内で３７℃で２時間培養する。抗体の終濃度は0.01μg/ml,0.1 μg/ml,1 μg/mlまたは10μg/mlとする。培養後、培養上清を回収し、培養上清中のLDH量をCytoTox96（登録商標）Assay（PROMEGA社）により測定し、「補体活性によってターゲット細胞から漏出したLDH量(Experimental Sample)」とする。
CDC活性は以下のようなコントロールを設定して、アッセイを行う。
（1） 実験区におけるLDH放出量（ターゲット細胞に対する補体の傷害作用）
（2） ターゲット細胞の自然LDH放出量
（3） ターゲット細胞からの最大LDH放出量
（4） Lysis Solutionの添加による液量補正用コントロール
（5） 培養液のみのバックグラウンド（ブランク）
(1)、（2）、（3）、で得られたそれぞれの吸光値の平均値から （5） のブランクの平均値を差し引く。そして以下の計算式にしたがってCDC活性を算出する。
CDC活性(%) =（実験区における放出量−ターゲット自然放出量）／（ターゲット最大放出量−ターゲット液量補正コントロール−ターゲット自然放出量）× 100
ADCC活性測定の場合には、９６ウエルU底プレートに標的細胞（BST2(D)-CHO細胞、ヒトミエローマ由来RPMI8226株）（4 X 105/ml）を50 ml づつ分注する。抗BST2抗体溶液を最終濃度10μg/mL となるように加え4℃ 30min.インキュベートし、エフェクター細胞（PBMC）をターゲット細胞の12.5, 25, 50, 100倍加え37℃ 4 時間培養する。細胞上清のLDH量を測定し細胞傷害活性により、ターゲット細胞から漏出したLDH量を測定する（Experimental sample）。ADCC 活性をCDC活性の測定と同様なコントロールを設定して、アッセイを行う。【００７０】
本発明によるBST2D特異抗体を投与することにより、BST2Dを発現している各種腫瘍を治療あるいは予防することができる。すなわち本発明は、BST2Dに結合し、BST2Hには実質的に結合しない抗体、またはその抗原結合領域を含む断片を患者に投与する工程を含む、ヒトBST2Dを発現している腫瘍を治療するための方法を提供する。本発明によって治療することができる血液腫瘍として、次のような腫瘍を示すことができる。なお血液腫瘍は、造血器腫瘍を含む。
白血病 (leukemia)、
骨髄異形成症候群 (myelodysplastic syndrome;MDS)、
悪性リンパ腫 (malignant lymphoma)、
慢性骨髄性白血病 (chronic myeloid leukemia)、
形質細胞異常症 (plasma cell dyscrasia)、
骨髄増殖性疾患 (myeloproliferative disorder)
上記の血液腫瘍のうち、形質細胞異常症は、骨髄腫 (myeloma)、多発性骨髄腫 (multiple myeloma)、マクログロブリン血症 (macroglobulinemia )を含む。また、骨髄増殖性疾患には、真性赤血球増加症 (primary polycythemia)、本態性血小板血症 (essential thrombocythemia)、特発性骨髄線維症 (agnogenic myeloid metaplasia)などが含まれる。これらの血液腫瘍のうち、治療の対象として好ましいのは、骨髄腫、より具体的には、多発性骨髄腫である。また、本発明の抗体は生体内で治療および診断目的外組織への非特異的吸着を生じず、特異的に治療および診断目的の細胞へ結合することが可能と考えられる為、生体に投与する際には特に有効であると考えられる。【００７１】
本発明者らは、本発明の抗体がCDC活性およびADCC活性を有することを見出した。この知見に基づき、本発明の抗体を有効成分として含有する、腫瘍治療剤を提供する。更に、治療あるいは予防を目的として本発明による抗体を用いるときには、必要に応じて抗体を修飾することもできる。本発明によれば、ヒトBST2Dの細胞外ドメインを特異的に認識する抗体は、BST2Dを発現する細胞に対して細胞障害作用を有する。あるいは、抗体を細胞障害物質(cytotoxic agent)によって修飾することによって、BST2Dを発現する細胞に対する障害作用を更に増強することができる。細胞障害物質としては、以下のような物質を示すことができる。
トキシン類：緑膿菌毒素(Pseudomonas Endotoxin; PE)、ジフテリアトキシン、リシン
放射性同位元素：99mTc、89Sr、131I、90Y
抗癌剤：カリキアマイシン、マイトマイシン、パクリタキセル
蛋白質からなるトキシン類は、２官能性試薬によって抗体あるいはその断片などに結合することができる。あるいは、抗体をコードする遺伝子にトキシン類をコードする遺伝子を接合し、両者の融合蛋白質を得ることもできる。放射性同位元素を抗体に結合する方法も公知である。たとえば、キレート剤を利用して、抗体を放射性同位元素で標識する方法が公知である。更に抗癌剤は、糖鎖あるいは２官能性試薬などの利用により、抗体に結合することができる。
本発明は、本発明の抗体を有効成分として含有する、腫瘍治療剤を提供する。本発明の抗体はCDC活性およびADCC活性を有するので、癌などの腫瘍（特に血液腫瘍）の治療や予防に特に有効であると考えられる。【００７２】
本発明の抗体を治療剤として用いる場合には、例えば、本抗体の溶液製剤を、単独で、または他の治療剤との併用にて、静脈内または皮下などに投与する形態が考えられる。併用に用いられる治療剤としては、例えば、多発性骨髄腫の治療に用いられる公知の治療剤を組み合わせることができる。たとえば次のような治療剤が骨髄腫の治療に用いられている。
ボルテゾミブ          サリドマイド            レナリドマイド
メルファラン          デキサメサゾン          ビンクリスチン
ドキソルビシン        インターフェロンα      リツキシマブ
更に、骨髄腫の治療剤に加えて、抗体の作用を増強するための治療剤を併用することもできる。たとえば、エフェクター作用を高める薬剤として、免疫増強剤を本発明の抗体とともに投与することができる。具体的には、インターフェロン−γ、インターロイキン−２、インターロイキン−１２などとともに抗体を投与することによって、抗体のエフェクター機能の増強作用が期待できる。あるいは、CpGオリゴヌクレオチドなどを含むToll様受容体アゴニストにも免疫増強作用が期待できる。【００７３】
本発明による腫瘍の治療剤において、BST2Dを特異的に認識する抗体またはその断片、あるいはその少なくとも抗原結合領域を含む抗体は、蛋白質として、あるいはそれをコードするポリヌクレオチドとして、投与することができる。ポリヌクレオチドを投与するには、目的とする蛋白質を発現できるように、適当なプロモーターの制御下に目的とする蛋白質をコードするポリヌクレオチドを配置したベクターを利用するのが望ましい。ベクターには、エンハンサーやターミネーターを配置することもできる。イムノグロブリンを構成する重鎖と軽鎖の遺伝子を保持し、イムノグロブリン分子を発現することができるベクターが公知である。【００７４】
イムノグロブリンを発現することができるベクターは、細胞に導入することにより投与することができる。生体への投与にあたっては、生体への投与によって細胞に感染させることができるものはそのまま投与することができる。あるいは、いったん生体から分離したリンパ球にベクターを導入して再び生体に戻すこともできる(ex vivo)。 【００７５】
更に、イムノグロブリンを発現するベクターとして生体に投与する場合には、重鎖と軽鎖を別のプラスミドとしてコトランスフェクトするとして、体重１kgあたり各プラスミドを０．１〜１０mg、たとえば１〜５mgを投与することができる。またin vitroにおいて細胞に導入するためには、１〜５μg/106cellのベクターが用いられる。【００７６】
本発明の治療剤は、医薬品の形態で投与することが可能であり、経口的または非経口的に全身あるいは局所的に投与することができる。例えば、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐薬、注腸、経口性腸溶剤などを選択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。生体に投与される治療剤の量はモノクローナル抗体の量とすると、イムノグロブリンとして体重１kgあたり、通常０．５mg〜１００mg、たとえば１mg〜５０mg、好ましくは２mg〜１０mgである。生体への抗体の投与間隔は、治療期間中の生体内におけるイムノグロブリンの有効濃度が維持できるように適宜調節することができる。具体的には、たとえば、１〜２週間間隔で投与することができる。
投与経路は、任意である。当業者は、治療に際して効果的な投与経路を適宜選択することができる。具体的には、経口的に、あるいは非経口的な投与を示すことができる。たとえば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、あるいは皮下注射等により、全身あるいは局所に抗体を投与することができる。本発明における非経口投与に適当な製剤として、注射剤、座剤、噴霧剤などがあげられる。また細胞に与える場合には、培養液中に通常１μg/mL、好ましくは１０μg/mL以上、より好ましくは５０μg/mL以上、更に好ましくは０．５mg/mL以上のイムノグロブリンを与える。【００７７】
本発明における腫瘍の治療剤は任意の方法により生体に投与することができる。通常モノクローナル抗体は、薬学的に許容される担体と配合され治療剤として使用される。本発明の治療剤には、必要に応じて増粘剤、安定剤、防腐剤および可溶化剤などの添加剤を配合することができる。このような担体または添加剤としては、ラクトース、クエン酸、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、スクロース、デンプン、タルク、ジェラチン、寒天、植物油、エチレングリコールなどが挙げられる。
「薬学的に許容される」という用語は、各国政府の監督当局により承認されているか、または各国の薬局方もしくは一般的に認知されている薬局方に動物、哺乳動物、および特にヒトへの使用に関して列記されていることを言う。本発明の治療剤は、1回または複数回の用量の凍結乾燥粉末または錠剤の形態で供給することもできる。凍結乾燥粉末または錠剤には、更に、投与の前に該組成物を所望の濃度となるように溶解するための注射用の滅菌済みの水、生理的食塩水または緩衝液を組み合わせることもできる。【００７８】
本発明によって提供されたヒトBST2Dを特異的に認識する抗体は、ヒトBST2Dを発現する細胞の検出に利用することができる。たとえば、ヒトから採取された組織や、生体中において、ヒトBST2D発現細胞を検出することによって、BST2D発現細胞に起因する疾患を診断することができる。すなわち本発明は、本発明のヒトBST2Dを特異的に認識する抗体、またはその抗原結合領域を含む断片を含む、ヒトBST2D抗原を発現している組織を検出する診断薬に関する。あるいは本発明は、本発明のヒトBST2Dを特異的に認識する抗体、またはその抗原結合領域を含む断片の、ヒトBST2D抗原を発現している組織を検出するための診断薬の製造における使用に関する。また本発明は、本発明のヒトBST2Dを特異的に認識する抗体、またはその抗原結合領域を含む断片の、ヒトBST2D抗原を発現している組織を検出するための診断における使用に関する。
本発明において、ヒトBST2D抗原を発現している組織とは、たとえばヒトBST2D抗原を発現している腫瘍を示すことができる。骨髄に存在する細胞から派生した腫瘍、より具体的には、骨髄腫におけるヒトBST2D抗原の高発現が確認されている。本発明において、診断の対象として特に好ましい骨髄腫は、多発性骨髄腫である。
【００７９】
本発明において、ヒトBST2Dを特異的に認識する抗体、またはその抗原結合領域を含む断片は、in vitroあるいはin vivoにおいて、診断に用いることができる。たとえば、患者から採取された試料を対象として、in vitroで骨髄腫などのヒトBST2D抗原を発現している細胞や組織を同定することができる。このような診断に用いられる生体組織としては、骨髄組織を挙げることができる。あるいは、ヒトBST2Dを特異的に認識する抗体を患者に投与し、その集積を追跡することによって、生体内におけるヒトBST2D抗原を発現している細胞や組織の局在を明らかにすることができる。【００８０】
in vitroにおいて抗体の細胞や組織への結合を検出する方法は周知である。たとえば、抗体を蛍光色素や酵素で予め標識しておき、固定標本への結合を標識を指標に追跡することができる。あるいは、アビジンービオチン系を利用して、抗体を間接的に標識することもできる。一方、in vivoにおいては、放射性核種で抗体を標識し、生体内における抗体の挙動を追跡する方法を利用することができる。たとえば、テクネシウム99m(99mTc)などの放射性核種で標識した腫瘍抗原を認識する抗体で、生体内の腫瘍組織を診断するための画像診断法が実用化されている。抗体やその抗原結合部位を含む断片は、還元により99mTcで直接標識することができる。生体内に投与された放射性核種は、シンチレーションカメラやシングルフォトンCT（ＳＰＥＣＴ）装置で画像化することができる。このような方法を本発明に応用し、ヒトBST2Dを発現する腫瘍組織の局在を明らかにすることができる。より具体的には、骨髄腫の原発巣や転移巣の診断に利用することができる。【００８１】
たとえば、本発明のヒトBST2Dを特異的に認識する抗体、またはその抗原結合領域を含む断片を99mTc等で標識し、当該標識された抗体または抗体断片を被験者に投与して生体外から99mTcの放射線を追跡することによって、体内のBST2発現組織を検出することができる（シンチグラフィー）。腫瘍でのヒトBST2D抗原の発現を確認することにより、治療目的で本発明のヒトBST2Dを特異的に認識する抗体、またはその抗原結合領域を含む断片の投与に適した患者の選定に利用することもできる。【００８２】
本発明のモノクローナル抗体は、ヒトBST2Dを発現する細胞や組織を特異的に認識する。したがって、in vitroにおいては、骨髄腫などのBST2Dを発現する細胞や組織を特異的に同定することができる。あるいは、in vivoにおいても同様に、BST2Dを発現する組織や細胞を選択的に検出することができる。BST2には、BST2Hのような骨髄腫以外の細胞における発現が確認されるバリアントも存在する。したがって、特に生体内においては、BST2D特異的な抗体の利用によって、バックグランドノイズや非特異的なシグナルを防ぐことができる。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
以下、実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００８３】
実施例１  マウス抗ヒトBST2抗体産生ハイブリドーマの作製
Ａ．免疫原の作製
免疫原とする細胞は、以下のように293T細胞にヒトBST2D遺伝子を導入して調製した。100mm / Collagen Coated Dish（IWAKI）の底面全体にいきわたらせたopti-MEM（GIBCO） 3mLに導入遺伝子を含む発現ベクターpCDNA3.1-hBST2D 4μｇを添加し、混合した。次に、該発現ベクター溶液とは別に、3mLのopti-MEMで58μLのLipofectamineTM2000（Invitrogen）を希釈し、室温で5分間静置してリポフェクトアミン溶液を調製した。その後、該発現ベクター溶液が入っているディッシュに、リポフェクトアミン溶液を静かに添加し混合した。室温で20分間静置した後、10%FBS（牛胎児血清）を含む DMEM培地（SIGMA）で1×106cells/mLに希釈した293T細胞 10mLをディッシュへ静かに添加した。37℃ CO2インキュベーターで48時間静置培養後、ピペッティングにより細胞を回収し、免疫原用トランスフェクタントとした。【００８４】
B．ハイブリドーマの作製
Ｂ−１）免疫
ヒトBST2D遺伝子を導入した293T細胞を免疫する前日に、PBS200μLとアジュバント200μL（complete adjuvant (FREUND) 三菱化学ヤトロン RM606-1）を混合しエマルジョンにしたものを、Balb/cマウス雌（4週齢）4匹の両足の裏に各50μLずつ免疫した。翌日、2×107個の細胞をPBS 400μLでサスペンドしたものを50μLずつ免疫した。3日おきに2回目、3回目の免疫を行い、3回目の免疫の3日後に、次のように細胞融合を行なった。【００８５】
Ｂ−２）細胞融合
免疫したマウスの両足リンパ節より細胞を採取し、10％FBSを含むRPMI1640培地（SIGMA）で培養したマウスミエローマ細胞P3-X63-Ag8-U1と、マウスリンパ節由来細胞の比が2：1〜10：1になるように混和して、遠心分離により細胞を回収した。得られた細胞画分に、RPMI1640培地により等量希釈したPEG4000（MERCK）を加えて、細胞融合を行なった。細胞を洗浄した後、supplementを含む15％FBS-HAT培地160mLで懸濁し、96穴プレート16枚に、200μL/ウェルで播種した。3日後に培地を交換し、コロニー形成が確認された1〜2週間後に、１次スクリーニングを行なった。【００８６】
C．Cell ELISA法によるハイブリドーマの１次スクリーニング
目的の抗体を産生するハイブリドーマの第一次スクリーニングはCell ELISA法を用い以下のように行った。実施例１のAで作製した細胞1×107個を0.5% BSA/2mM EDTA/PBS10mLに懸濁して、Cell ELISA用プレート（NUNC 249570 96V NW PS）を用いウェルあたり100μlずつ分注した。2000rpmで2分間、遠心し上清を除去した後、ハイブリドーマ培養上清を各ウェルあたり50μL添加し、室温にて30分間反応させた。洗浄操作（0.5％BSA/2mM・EDTA/PBS）を2回行い、洗浄後のウェルに、10000倍希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスIgG抗体（MBL;Code330）を50μL添加し、30分間反応させた。洗浄操作を3回行なった後、発色溶液を添加して、OD 450nm-620nmを測定して、陽性反応を示すウェルを選択した。【００８７】
D．フローサイトメトリー（FCM）解析による抗体の結合性の検討
フローサイトメトリー（FCM）解析により、ハイブリドーマ培養上清の解析を行った。実施例１のAで作製した細胞を0.5％BSA/2mM EDTA/PBSに懸濁して、1サンプルあたり1×105個として遠心チューブに回収した後、ハイブリドーマ培養上清各40μl を添加して、室温にて30分間反応させた。その後、0.5％BSA/2mM・EDTA/PBSを1mlずつ各チューブに添加して1200rpmで3分間、4℃で遠心した後に上清を捨てる、という洗浄操作を2回繰り返した。洗浄後のチューブに、100倍希釈したFITC標識ヤギ抗マウスIgG抗体（Beckman coulter;IM0819）を40μLずつ添加し、室温で30分間反応させた。洗浄操作を2回行なった後、フローサイトメーターFC500（Beckman coulter）を用いてハイブリドーマ培養上清に含まれる抗体がヒトBST2Dを特異的に認識するかどうかを解析した。FCMの解析においてヒトBST2Dを発現していない293T細胞には結合しないが、発現している293T細胞に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択した。選択したハイブリドーマを、限外希釈法によりクローニングし、マウス抗ヒトBST2抗体産生ハイブリドーマ#3LD、#4 LD、#7 LD、#9 LD、#19 LDを取得した。【００８８】
実施例２  マウス抗ヒトBST2モノクローナル抗体の作製と特異性の検討
Ａ．ハイブリドーマの培養
実施例１で得られたマウス抗ヒトBST2抗体産生ハイブリドーマ#3LD、#4 LD、#7 LD、#9 LD、#19 LD を、各々下記組成の５％FBS添加RPMI培地で培養した。培養温度は37℃、培養時間は96時間とした。
５％ FBS添加RPMI培地：
RPMI1640培地 (Sigma社、カタログ番号：R8758)
5% FBS
0.01M HEPES
1mM ピルビン酸ナトリウム 
2mM  L−グルタミン 
100 U/mL ペニシリン 
100 μg/mL ストレプトマイシン 
55μM  ２−メルカプトエタノール
pH 7.2-pH 7.4
96時間培養後に各ハイブリドーマの培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去し、粗抗体液とした。【００８９】
Ｂ．抗体の精製
Ａで得られた粗抗体液を、それぞれプロテイン Aアフィニティーカラム（rProtein A Sepharose FF, Amershram Pharmacia社、カタログ番号：17-1279-01）で精製した。精製条件は以下の通りである。カラム付属の説明書に従い吸着バッファーとして下記組成のPBS(-)バッファー、溶出バッファーとして0.1Mクエン酸ナトリウムバッファー(pH 3)を用いてアフィニティー精製した。溶出画分は1M Tris-HCl (pH 8.0)を添加してpH7.2付近に調整した。調整された抗体溶液は、透析膜（10000カット、PIERCE社製）を用いてPBS(-)に置換し、精製マウス抗ヒトBST2モノクローナル抗体#3LD、#4 LD、#7 LD、#9 LD、#19 LD （以下、「マウス#3LD抗体」、「マウス#4LD抗体」等と略記する）を得た。精製抗体の濃度は280 nmの吸光度を測定し、１mg/mLを1.38 ODとして算出した。
PBS(-) バッファー:
0.2ｇ/L  リン酸二水素一カリウム
0.2ｇ/L  塩化カリウム
8ｇ/L  塩化ナトリウム
1.15g/L  無水リン酸一水素二ナトリウム【００９０】
Ｃ．抗体の特異性の検討
Ｃ−１）ターゲット細胞株（BST2D-CHO細胞株）の作製
前日に、6cmφディッシュ1枚あたり6×105個になるように播種しておいたCHO-K1細胞にヒトBST2D遺伝子を含む発現ベクターをEffectene Transfection Reagent (QIAGEN社)を用いて導入し、800μg/ml Zeocin (invitrogen社)処理し、ベクターが導入されたZeocin耐性株を選択した。
導入したヒトBST2D発現ベクター： pCDNA3.1-hBST2D   2μg
その後さらにセルソーター（BD FACSAria（Becton Dickinson社））を用い、BST2Dを高発現している細胞株（BST2D-CHO細胞株）を得た。選択した細胞株はFCM解析によってBST2Dを高発現している事を確認した。FCMにBD FACSCaliber (BD社)を用いる以外は、FCM解析の操作は実施例１のＤに従った。解析用の抗体として、下記の抗体を使用した。
FCM解析用抗体： 488-conjugated rat anti-human BST2-5C11抗体（human BST2-5C11抗体はWO2006/013923に記載されている。）【００９１】
Ｃ−２）ターゲット細胞株（BST2H-CHO細胞株）の作製
ヒトBST2H発現ベクター（pCDNA3.1-hBST2H）を導入する以外はＣ−１）と同様にし、BST2Hを高発現している細胞株（BST2H-CHO細胞株）を得た。FCM解析用の抗体としては、下記の抗体を使用した。
FCM解析用抗体： 488-congjugated rat- anti-human BST2-3D3抗体（human BST2-3D3抗体は受託番号：FERM BP-10339のハイブリドーマが産生する抗体であり、WO2006/013923に記載されている。）【００９２】
Ｃ−３）精製マウス抗ヒトBST2モノクローナル抗体の結合特異性の検討
Ｃ−１）で得られたBST2D-CHO細胞株および、Ｃ−２）で得られたBST2H-CHO細胞株を用い、上記Bで得られた５種の精製マウス抗ヒトBST2モノクローナル抗体について、結合特異性を検討した。検討は、定法に従いFCM解析で行った。FCM解析の結果よりマウス#3LD抗体、マウス#4LD抗体、マウス#9LD抗体は、BST2D-CHO細胞とは結合するが、BST2H-CHO細胞とは結合しないことが認められた。他方、マウス#7LD抗体、マウス#19LD抗体は、BST2D-CHO細胞とも、BST2H-CHO細胞とも結合する抗体であることが認められた。したがって、以下の実験では、マウス#3LD抗体、マウス#4LD抗体、マウス#9LD抗体は、D型のBST2にのみ結合する抗体（以下、「抗ヒトBST2(D+/H-)抗体」と記載）として扱い、マウス#7LD抗体、マウス#19LD抗体は、D型・H型いずれのBST2にも結合する抗体（以下、「抗ヒトBST2(D+/H+)抗体」と記載）として取り扱った。マウス#4LD抗体およびマウス#19LD抗体のFCM解析結果を、図２に例示する。【００９３】
Ｃ−４）マウス抗ヒトHM1.24抗体の反応性の確認
マウス抗ヒトBST2抗体であるHM1.24抗体（中外製薬社製）について、Ｃ−３）の方法と同様にFCM解析により結合特異性の確認を行った。FCM解析結果をＣ−３）の結果とともに図２に示す。マウス抗ヒトHM1.24抗体も、BST2D-CHO細胞株とBST2H-CHO細胞株の両者に結合する抗体であることが改めて確認された。【００９４】
実施例３  抗ヒトBST2(D+/H-)抗体のＣＤＣ活性およびADCC活性の測定
A．抗体
実施例２で得られた、マウス#4LD抗体を用い、以下の通りＣＤＣ活性を測定した。【００９５】
Ｂ．ＣＤＣ活性の測定
Ｂ−１）ターゲット細胞株
以下の細胞をターゲット株として使用した。
・ BST2D-CHO細胞株 ： 実施例２のＣ−１）と同様に作製
・ BST2H-CHO細胞株 ： 実施例２のＣ−２）と同様に作製
ヒト・ミエローマ由来RPMI8226細胞株
Ｂ−２）ターゲット細胞と抗ヒトBST2(D+/H-)抗体との反応
上記Ｂ−１）記載のBST2D-CHO細胞およびBST2H-CHO細胞を、5mM EDTA/PBS溶液を用いて各々回収し、下記組成のCDCメディウムで4×105個/mlになるように懸濁した。また、ヒト・ミエローマ由来RPMI8226細胞も、下記組成のCDCメディウムで4×105個/mlになるように懸濁した。これらの懸濁液をＵ底96穴プレートに、1ウェル当たり50μlずつ分注した。
ＣＤＣメディウム：
RPMI1640
0.1% BSA
100units/mL Penicillin
100μg/mL Streptomycin
10mM Hepes（pH7.6）
2mM L-Glutamin【００９６】
ここに、抗体の最終濃度が0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、および10μg/mLになるよう、CDC メディウムで調整した50μlの抗BST2（D+/H-）抗体溶液（マウス#４LD抗体溶液）を加え混合した。さらに、最終補体濃度が6%になるように50μlの下記組成の補体含有ＣＤＣメディウムを加え混合した後、37℃で２時間培養した。このとき、抗BST2（D+/H-）抗体の代わりにマウスIgG2aを用いたものを同時に作成し、コントロールとして用いた。マウス#４LD抗体の比較対象として、抗BST(D+/H+)抗体であるHM1.24抗体を用いたCDC活性測定も同時に行った。
補体含有ＣＤＣメディウム：
1ml幼令ウサギ補体（CEDARLANE社製、カタログ番号：CL3441）
ＣＤＣメディウム（上記参照）【００９７】
その後、懸濁液の入ったＵ底96穴プレートを遠心操作（遠心条件：250G、4分間）し、細胞の混入がないように留意しつつ培養上清を回収した。この培養上清中のLDH量をCytoTox96（登録商標）Assay（PROMEGA社）により測定し、「補体活性によってターゲット細胞から漏出したLDH量(Experimental Sample)」とした。【００９８】
ＣＤＣ活性を求める為に、以下のパラメーターも準備した。
・ターゲット細胞から自然に放出されるLDH量（Target Cell Spontaneous LDH Release）：ターゲット細胞のみを試料と同じ容量で培養し、調製した。
・ターゲット細胞が最大に放出した場合のLDH量(Target Cell Maximum LDH Release)：ターゲット細胞のみを試料と同じ容量で培養し、上清回収６０分前に、最終濃度が0.8%になるようにキット付属のTritonX-100溶液を添加して調製した。
・液量補正用コントロール（Volume Correction Control）：ターゲット細胞が最大に放出した場合のLDH量を調製した際に添加したTritonX-100と同じ量を、試料と同じ容量の培養液に加えて調製した。なお以下のＣＤＣ活性（％）を算出するための式中では、Volume Correction ControlをVolume Controlと記載した。
・培養液のバックグラウンドコントロール(Culture Medium Background)：試料と同じ容量の培養液と、培養液に補体含有CDC mediumを加えて試料と同じ容量にした溶液を調製した。【００９９】
Target MaximumとTarget Spontaneousの吸光度からは、試料と同じ容量の培養液を差し引き、Experimental Sampleの吸光度からは、培養液に補体含有CDC mediumを加えて試料と同じ容量にした溶液を差し引いて補正をした。
ＣＤＣ活性は、測定したそれぞれのLDH量より下式により算出した。
【式１】
【０１００】
0005558825.tif 000002
結果を、図３に示す。マウス#４LD抗体（抗ヒトBST2(D＋/H-)抗体）は、BST2(H)-CHO細胞にはほとんどCDC活性を示さないが、一方BST2(D)-CHO細胞には強いCDC活性を示した。
【０１０１】
C．ADCC活性の測定
C−１）ターゲット細胞株とエフェクター細胞
以下の細胞をターゲット株として使用した。
・ BST2D-CHO細胞株 ： 実施例２のＣ−１）と同様に作製
・ ヒト・ミエローマ由来RPMI8226株
以下の細胞をエフェクター細胞として使用した。
・ ヒト末梢単核細胞：ヒト末梢血よりフィコール法を用いて単離した末梢単核細胞を用いた。
【０１０２】
C−２）ターゲット細胞、抗ヒトBST2(D)抗体とエフェクター細胞との反応
上記Ｂ−１）記載のBST2D-CHO細胞およびヒト・ミエローマ由来RPMI8226細胞を、5mM EDTA/PBS溶液を用いて各々回収し、下記組成の10％ FBS添加RPMI培地で4×105個/mlになるように懸濁した。これらの懸濁液をU底96穴プレートに、1ウェル当たり50μlずつ分注した。
【０１０３】
ここに、抗体の最終濃度が10μg/mlになるよう、10％ FBS添加RPMI培地で調整した50μlの抗BST2抗体溶液を加えて混合し、４℃で３０分間培養した。その後、エフェクター細胞をターゲット細胞の２５、５０、１００倍になるように調製した細胞混合液を50μl加えて混合した後、そのプレートを遠心（遠心条件：250G、4分間）してターゲット細胞とエフェクター細胞を近づけた。それから37℃で４時間培養した。抗BST2抗体としては、マウス#４LD抗体（抗ヒトBST2(D＋/H-)抗体）、キメラ#4LD抗体（キメラ抗ヒトBST2(D＋/H-)抗体,実施例５,６参照）、HM1.24マウス抗体、HM1.24ヒト化抗体(特許文献３：WO2002/064159、特許文献４：WO2005/034994)を用いた。このとき、抗BST2抗体の代わりにマウスIgG2aを用いたものサンプルを同時に作成し、コントロールとして用いた。
【０１０４】
その後、懸濁液を遠心分離（遠心条件：250G、4分間）し、細胞の混入がないように留意しつつ上清を回収した。この上清中のLDHを定法により測定し、「細胞傷害活性によってターゲット細胞から漏出したLDH量(Experimental Sample)」とした。
【０１０５】
ADCC活性を求める為に、B-２）と同様の以下のパラメーターも準備した。
・ターゲット細胞から自然に放出されるLDH量（Target Cell Spontaneous LDH Release）：ターゲット細胞のみを試料と同じ容量で培養し、調製した。
・ターゲット細胞が最大に放出した場合のLDH量(Target Cell Maximum LDH Release)：ターゲット細胞のみを試料と同じ容量で培養し、上清回収６０分前に、最終濃度が0.8%になるようにキット付属のTritonX-100溶液を添加して調製した。
・エフェクター細胞から自然に放出されるLDH量（Effector Cell Spontaneous LDH Release）：エフェクター細胞のみを試料と同じ容量で培養し、調製した。
・液量補正用コントロール（Volume Correction Control）：ターゲット細胞が最大に放出した場合のLDH量を調製した際に添加したTritonX-100と同じ量を、試料と同じ容量の培養液に加えて調製した。なお以下のADCC活性（％）を算出するための式中では、Volume Correction ControlをVolume Controlと記載した。
・培養液のバックグラウンドコントロール(Culture Medium Background)：試料と同じ容量の培養液を加えて調製した。
【０１０６】
Target Spontaneous、Target Maximum、Effector SpontaneousとExperimental Sampleの吸光度からは、培養液のバックグラウンドコントロールを差し引いて補正をした。
ADCC活性は、下式により算出した。
【式２】
【０１０７】
0005558825.tif 000003
結果を、図４に示す。BST2D-CHO細胞に対して、マウス#４LD抗体は強いADCC活性を示し、その強さはHM1.24ヒト化抗体とほぼ同程度であった。一方PRMI8266細胞に対して、マウス#4LD抗体はほとんどADCC活性を示さなかったが、キメラ#4LD抗体はHM1.24ヒト化抗体と同程度の強いADCC活性を示すことが分かった。
【０１０８】
比較例１  抗ヒトBST2(D+/H+) 抗体のＣＤＣ活性
マウス抗ヒトHM1.24抗体を用い、実施例３と同様にしてCDC活性を測定した。
結果を、実施例３とともに図３に示す。マウス抗ヒトHM1.24抗体（抗ヒトBST2(D+/H+)抗体）はBST2(H)-CHO細胞とBST2(D)-CHO細胞の両方の細胞に同程度の強いCDC活性を示した。一方マウス抗ヒトBST2 #4LD抗体（抗ヒトBST2(D+/H-)はBST2(D)-CHO細胞に対して特異的にCDC活性を示したがBST2(H)-CHO細胞に対しては殺傷活性を示さなかった。
【０１０９】
実施例４  抗ヒトBST2(D+/H-)抗体と各種生体組織との結合性
Ａ．ヒトおよびカニクイザルの末梢血単核球画分（以下、「PBMC」と記載する）との結合性
マウス#4LD抗体をPE-標識ヤギ抗マウス抗体で標識し、PBMCを染色して定法に従いフローサイトメトリー法による解析を行った。 試薬、装置は下記のものを使用した。
Flow cytometory (FACSCalibur etc) [Becton Dickinson]
2nd antibody R-PE-Conjugated Goat Anti-Mouse Immunoglobulin Specific Polyclonal Antibody (Multiple Adsorption); (BD Biosciences: 550589)
HISTOPAQUE-1077(SIGMA H8889)
FcR Blocking Reagent (Milteny Biotec 130-059-901)
RPMI1640medium 5%FCS/penicillin-streptmycin/L-glutamin
ACK Lysis solution（0.15M  NH4Cl、10ｍM  KHCO3、0.1ｍM  Na2EDTA、ｐH7.2〜7.4）
血液をRPMI1640(no FCS)にて希釈し、HISTOPAQUE-1077へ重層した後、1800rpmで20分間、遠心分離した。中間層を回収してRPMI1640meduimを加え、1800rpmで10分間遠心分離した。上清を吸引し、細胞ペレットにACK Lysis solution１mlを加えて懸濁して、氷上に３分間静置した後、RPMI1640meduimを加え、1200rpmで5分間遠心分離した。上清を吸引し細胞ペレットをPBMCとし、これにRPMI1640meduimを加え懸濁して、細胞数をカウントして1200rpmで5分間遠心分離した。 20%FCR blocking reagent/1%FCS/PBS にPBMCが5×107cells/mlになるように調整して、Ｕ底96 穴プレートに10μl(5×105cells)入れ、さらに1μg/mlのマウス#４LD抗体を25μlずつ加え、4℃で遮光して15分間静置した後、150μlの1%FCS /PBSを加えて、2000rpmで2分間遠心分離した。上清を捨てた後、1%FCS /PBSを加えて、2000rpmで2分間遠心分離して、上清を捨てた。2nd antibodyを20μlずつ加え、4℃で遮光して15分間静置した後、150 μlの1%FCS /PBSを加えて、2000rpmで2min遠心分離して、上清を捨てた。150μlの1%FCS /PBSを加えて、2000rpmで2分間遠心分離し、上清を捨てた。ペレットを150μlの1%FCS /PBS溶液に懸濁してFACSチューブへと移し、さらに150μlの1%FCS /PBSを加えFACSCalibur にて解析した。さらに、FlowJo softwareを使って、PBMCの染色率（％）を求めて表１に示した。
【０１１０】
Ｂ． ヒト脾臓組織の凍結切片に対する組織染色
マウス#4LD抗体をポリマー試薬（DAKO K5007）で標識し、定法に従いヒト脾臓組織の凍結切片を染色した。組織の顕微鏡写真を図５に示した。マウス#4LD抗体はヒト脾臓組織にほとんど結合していないが、一方比較例のマウス#19LD抗体はヒト脾臓組織によく結合していた。このことよりマウス#4LD抗体は#19LD抗体に比べ特異性が高いことがしめされた。
【０１１１】
Ｃ．ミエローマ由来RPMI8226細胞との結合性
RPMI8226細胞を、マウス#4LD, マウス#19LD,HM1.24抗体0.01, 0.1, 1, 10μg/mlの濃度で染色して、その時の染色率からPrism 4 softwareを使ってKd値（平衡解離定数）を算出した。
試薬、装置は以下のものを使用した。
Prism 4 software [GraphPad Software, Inc.]
・ FlowJo software [Tree Star, Inc.]
・ Flow cytometory (FACSCalibur etc) [Becton Dickinson]
・ 2nd antibody (mouse Ig-FITC [Fluorescein isothiocyanate-Conjugated Goat Anti-Mouse Immunoglobulin Specific Polyclonal Antibody (Multiple Adsorption); BD Biosciences: 554001], etc)
細胞を回収して細胞数をカウントし、1%FCS/PBSで細胞を懸濁して、細胞数を1×106 cells / mlにした。100μl(1×10５ cells / well)ずつ96 well v-bottom plateに入れて、2000rpmで 2分間遠心分離し、上清を捨てた。0.01, 0.1, 1, 10μg/mlのマウス#4LD,マウス#19LD,HM1.24抗体を25 μlずつ加え、4℃で遮光して15分間静置した後、150μlの1%FCS /PBSを加えて、2000rpmで 2分間遠心分離し、上清を捨てた。1%FCS /PBSを加えて、2000rpmで 2分間遠心分離し、上清を捨てた。2nd antibodyを20μlずつ加え、4℃で遮光して15分間静置した後、150 μlの1%FCS /PBSを加えて、2000rpmで 2分間遠心分離し、上清を捨てた。150 μlの1%FCS /PBSを加えて、2000rpmで 2分間遠心分離し、上清を捨てた。ペレットを150μlの1%FCS /PBS溶液に懸濁してFACSチューブへと移し、さらに150 μlの1%FCS /PBSでwellを共洗いしてチューブへと移してFACSCalibur にて解析した。さらに、FlowJo softwareを使って、染色率の割合を求めた。また、その時の染色率からPrism 4 softwareを使ってKd値を算定した。その結果を表２に示した。マウス#４LD抗体は、HM1.24抗体とマウス#19LD抗体と比べて、RPMI8226細胞に対して高い結合親和性を示した。
【０１１２】
比較例２  抗ヒトBST2(D+/H+) 抗体と各種生体組織との結合性
マウス#4LD抗体の代わりに、マウス#19LD抗体またはＨＭ１．２４抗体を用い、実施例４と同様にした。結果を、実施例４とともに、表１、表２、および図５に示した。
[表１]  ヒトおよびカニクイザルのPBMCと抗ヒトBST2抗体との結合性
0005558825.tif 000004
[表２]  ヒト・ミエローマ由来RPMI8226細胞に対する結合能（Kd値）
0005558825.tif 000005
【０１１３】
抗ヒトBST2(D+/H-)抗体であるマウス#4LD抗体は、PBMCやHUVECのような本発明で治療ターゲットとしない細胞への結合は非常に弱いが、一方、ミエローマ細胞といった治療ターゲットとなる細胞への強い結合が認められた。したがって、抗ヒトBST2抗体として、抗ヒト BST2(D+/H-)抗体を使用した場合は、投与後の抗体血中濃度の低下を防ぎ、治療目的の組織により高い濃度の抗体を供給することが可能と推察される。
【０１１４】
実施例５  キメラ抗BST2 (D+/H-) 抗体(キメラ#4LD抗体)の作製
Ａ．定常領域のアイソタイプ確認
ハイブリドーマ培養上清について、市販のmouse monoclonal antibody isotypingキット（Serotec Product社、カタログ番号：MMT1）を用い、産生されたマウス#4LD抗体の定常領域のアイソタイプを確認した。重鎖定常領域はIgγ2aであり、軽鎖定常領域はIgκであった。
【０１１５】
Ｂ．マウス#4LD抗体の可変領域をコードするcDNAのクローニング
Ｂ−１） 使用するハイブリドーマについて
ハイブリドーマとして、マウス抗ヒトBST2D抗体産生ハイブリドーマ#4LDを使用した。
【０１１６】
Ｂ−２） total RNAの単離
市販のキット「RNeasy  Mini Kit」（Qiagen社、カタログ番号：74106）を用いてキット添付の指示書に従い、上記Ａ−１）に示すハイブリドーマからtotal RNAを単離した。いずれも、1×107個のハイブリドーマから、約200μｇのtotal RNAが得られた。
【０１１７】
Ｂ−３） マウス重鎖可変領域をコードするcDNAの増幅および断片化
Ｂ−２）で単離したtotal RNAのうち5μgを使用し、5’RACE法によって、マウス重鎖可変領域をコードするcDNAを増幅した。増幅にあたっては、市販キット「5’RACE System for Rapid Amplification of cDNA ENDs, Version 2.0Kit」（インビトロジェン社、カタログ番号：18374-058）を用いた。詳細は以下の通りである。まず、Ａ−２）で得られたtotal RNAから逆転写酵素によって、第1鎖cDNAを合成した。このとき、アンチセンスプライマー（GSP1）は下記のものを用いた（配列番号：１４）。次に、RNaseHでtotal RNA を分解し、1本鎖となって残った第1鎖cDNAを、1.5％低融点アガロース法によって精製した。さらに、第1鎖cDNAの3’-末端に、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）を用いて、ヌクレオチドホモポリマーであるdCを付加した。そして、dC（アンカー配列）に相補的なヌクレオチドポリマーを3’-末端に有しているアンカープライマー（配列番号：１６）と、下記のアンチセンスプライマー（GSP2）（配列番号：１５）を用いて、PCR法によってｃDNAを増幅した。更に、得られたPCR産物をテンプレートとし、AUAPプライマー（配列番号：１７）とアンチセンスプライマー（GSP2）（配列番号：１５）を用いて、Nested PCR法によりcDNAを増幅した。さらに、このPCR産物を1.5％低融点アガロース法によって精製した。
Mu IgG2aVH5RACE-GSP1 （配列番号：１４）
5' TCC AGA GTT CCA GGT CAA GGT CAC 3'  (24-mer)
Mu IgG2aVH5RACE-GSP2  （配列番号：１５）
5' GCC AGT GGA TAG ACC GAT GG 3'  (20-mer)
５'RACE用アンカープライマー（配列番号：１６）
5'-GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGI IGG GII GGG IIG-3'  (36-mer)
５'RACE用AUAPプライマー（配列番号：１７）
5'-GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC-3'  (20-mer)
【０１１８】
Ｂ−４） マウス軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡの増幅および断片化
Ｂ−２）で単離したtotal RNA から、Ｂ−３）と同様にして、マウス軽鎖可変領域をコードするcDNAを増幅した。このとき、アンチセンスプライマーは、下記のものを使用した。得られたPCR産物を1.5％低融点アガロース法によって精製した。
Mu IgVL5RACE-GSP1  （配列番号：１８）
5' TTC ACT GCC ATC AAT CTT CCA CTT 3'  (24-mer)
Mu IgVL5RACE-GSP2  （配列番号：１９）
5' GAT GGA TAC AGT TGG TGC AGC 3'  (21-mer)
【０１１９】
Ｂ−５） cDNAの塩基配列の確認とCDR領域の決定
Ｂ−３）で得られた重鎖可変領域、およびＢ−４）で得られた軽鎖可変領域のcDNA断片を、それぞれ、市販キット「Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit」（インビトロジェン社、カタログ番号：1325137）を用い、キット添付の指示書に従ってpCR4Blunt-TOPO ベクターにクローニングし、大腸菌コンピテント細胞に導入して大腸菌形質転換体を得た。この形質転換体から上記プラスミドを得て、プラスミド中のcDNA塩基配列を自動ＤＮＡシークエンサー「PCR-based ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer」（Applied Biosystems社）を用いて確認した。相補性決定領域（以下、「CDR領域」と記す）周辺に、フレームシフト、ナンセンス変異等を生じているために不活性RNAとなったものの転写物は除外し、正しい配列のものを抽出した。さらに、当該プラスミド中に含まれるcDNA塩基配列について、カバットデータベースと相同性を確認して、各々の可変領域内のCDR領域と可変領域の配列を決定した。
Ｂ−３）で得られたマウス#4LD抗体の重鎖可変領域の核酸配列は配列番号：１０、アミノ酸配列は配列番号：１１である。  マウス#4LD抗体の重鎖可変領域内のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：4、配列番号：５、配列番号：６である。
Ｂ−４）で得られたマウス#4LD抗体の軽鎖可変領域の核酸配列は配列番号：１２、アミノ酸配列は配列番号：１３である。マウス#4LD抗体の軽鎖可変領域内のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９である。
【０１２０】
Ｃ．ヒトIgG定常領域をコードするcDNAのクローニング
ヒトインターフェロン産生細胞(Interferon Producing cells; IPC)のcDNAライブラリーから、ヒトIgG1重鎖定常領域とヒトIg kappa軽鎖定常領域を選択し、それぞれ、市販キット「Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit」（インビトロジェン社、カタログ番号：1325137）を用い、キット添付の指示書に従ってpCR4Blunt-TOPO ベクターにクローニングし、大腸菌コンピテント細胞に導入して大腸菌形質転換体を得た。この形質転換体から上記プラスミドを得て、プラスミド中のcDNA塩基配列を自動ＤＮＡシークエンサー「PCR-based ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer」（Applied Biosystems社）を用いて確認した。
【０１２１】
Ｄ．可変領域と定常領域の連結とクローニング
Ｂ−５）で得られたマウス#４LD抗体重鎖可変領域と、Ｃで得られたヒトIgG重鎖定常領域は、DNA配列がオーバーラップする領域を持つ。そこで、この領域を用い、オーバーラップ伸長法によって二本鎖DNAを得た。詳細な方法は下記の通りである。
Ｄ−１）キメラ#4LD抗体の重鎖をコードするcDNAの調製
Ｂ−５）で得られた、「マウス#４LD抗体重鎖可変領域をコードするcDNAを有するプラスミド」をNotIとXbaI制限酵素で消化し、1.5％アガロースゲル法で精製した。これを、各100pmol/μLとなるように、下記組成のTEバッファーで溶解し、マウス#４LD抗体重鎖可変領域をコードするcDNA断片の溶液とした。
TEバッファー：
10mM Tris-HCl
1mM EDTA
pH7.5〜8.0
また、Ｃで得られた「ヒトIgG重鎖定常領域をコードするcDNAを有するプラスミド」も同様に処理し、100pmol/μLの溶液とした。次に、両者を混合し、まず70℃で10分、その後37℃で５分保持することによって、オーバーラップ領域に水素結合を形成させた。その後、PCR法によってcDNAを増幅後、得られたcDNAを、NotIとXbaI制限酵素で処理した後、1.5％低融点アガロース法によって精製した。
キメラ#4LD抗体重鎖および軽鎖cDNA発現用ベクター作成のため、PCR増幅で使用したprimer配列は、それぞれ次の通りである。
キメラ#4LD抗体重鎖用PCR primer
4LD-VH NotI-1F（配列番号：２９）
5' AAA GCG GCC GCG CCG CCA CCA TGA AAG TGT TGA GTC TGT TGT ACC TGT TG 3' (50-mer)
4LD-VH XbaI-2R （配列番号：３０）
5' CTA GTC TAG ATG AGG AGA CTG TGA GAG TGG TGC CTT GGC 3' (39-mer)
4LD-VH-3F（配列番号：３１）
5' GTC TCC TCA GCC TCC ACC AAG GGC CCA TCG GTC 3' (33-mer)
4LD-VH-4R （配列番号：３２）
5' TGA TCA TCA TTT ACC CGG AGA CAG GGA GAG GCT CTT C 3' (37-mer)
キメラ#4LD抗体軽鎖用PCR primer
4LD-VL NotI-1F（配列番号：３３）
5' AAA GCG GCC GCG CCG CCA CCA TGG AGA CAG ACA CAC TCC TGC 3' (42-mer)
4LD-VL XbaI-2R （配列番号：３４）
5' CTA GTC TAG ACG TTT TAT TTC CAG CTT GGT CCC CCC TCC G 3' (40-mer)
4LD-VL-3F （配列番号：３５）
5' AAA TAA AAC GAA CTG TGG CTG CAC CAT CTG TCT TCA TCT TCC C 3' (43-mer)
4LD-VL-4R （配列番号：３６）
5' TGA TCA CTA GCA CTC TCC CCT GTT GAA GCT CTT TGT GAC 3' (39-mer)
【０１２２】
Ｄ−２）キメラ#4LD抗体の軽鎖をコードするcDNAの調製
Ｂ−５）で得られたマウス#4LD抗体軽鎖可変領域と、Ｃで得られたヒトIg kappa軽鎖定常領域についても、Ｄ−１）と同様にし、キメラ#4LD抗体の軽鎖をコードするcDNAを得た。
【０１２３】
Ｄ−３）クローニング
Ｄ−１）で得られたcDNAを、NotIとXbaIをクローニングサイトとして、プラスミドベクターpcDNA3.1-ゼオシン（インビトロジェン社）にクローニングし、キメラ#4LD抗体重鎖発現ベクターとした。また、Ｄ−２）で得られたcDNAを、NotIとXbaIをクローニングサイトとして、プラスミドベクターpcDNA3.1-ハイグロマイシン(インビトロジェン社)にクローニングし、キメラ#4LD抗体軽鎖発現ベクターとした。各ベクターの名称は、下記の通りである。
キメラ#4LD抗体重鎖発現用ベクター ： pcDNA-4LDVH
キメラ#4LD抗体軽鎖発現用ベクター ： pcDNA-4LDVL
【０１２４】
Ｅ．キメラ#4LD抗体の発現
Ｅ−１）一過性形質転換
Ｄ−３）で得られた、キメラ#4LD抗体重鎖発現ベクター（pcDNA-4LDVH）1μgとキメラ#4LD抗体軽鎖発現ベクター（pcDNA-4LDVL）1μgを、effectine transfection kit （Qiagen社、カタログ番号：301427）を用いて293T細胞にコトランスフェクションした。その後、下記組成の2% Low IgG FBS添加DMEM培地を用い、37℃で培養した。
2% Low IgG FBS添加DMEM培地：
DMEM培地(Sigma社、カタログ番号：D5796)
2% Low IgG FBS (HyClone社、カタログ番号：SH30151.03)
2mM L−グルタミン 
100 U/ml ペニシリン 
100 μg/ml ストレプトマイシン
ｐH 7.2-pH 7.4
ベクター導入後96時間培養し、培養上清を集めて遠心分離により細胞破片を除去し、粗抗体液とした。
【０１２５】
Ｆ．抗体の精製
Ｅ−１）で得られた粗抗体液を、それぞれプロテインAアフィニティーカラム（rProtein A Sepharose FF, Amershram Pharmacia社、カタログ番号：17-1279-01）で精製した。カラム精製条件は以下の通りである。カラム付属の説明書に従い吸着バッファーとして下記組成のPBS(-)バッファー、溶出バッファーとして0.1Mクエン酸ナトリウムバッファー(pH 3)を用いて抗体をアフィニティー精製した。溶出画分は1M Tris-HCl (pH 8.0)を添加してpH7.2付近に調整した。調整された抗体溶液は、透析膜（10000カット、PIERCE社製）を用いてPBS(-)に置換し、精製抗キメラ#4LD抗体を得た。
精製抗体の濃度は280 nmの吸光度を測定し、１mg/mlを1.38 ODとして算出した。
PBS(-) バッファー:
0.2ｇ/L  リン酸二水素一カリウム
0.2ｇ/L  塩化カリウム
8ｇ/L  塩化ナトリウム
1.15g/L  無水リン酸一水素二ナトリウム
作成されたキメラ#4LD抗体の重鎖、および軽鎖の塩基配列とアミノ酸配列は、それぞれ次の配列番号の通りである。
重鎖                                  軽鎖
配列番号：25（塩基配列）          配列番号：27（塩基配列）
配列番号：26（アミノ酸配列）      配列番号：28（アミノ酸配列）
【０１２６】
実施例６  抗ヒトBST2(D+)抗体のエピトープの決定
A.ヒトBST2タンパク質の発現ベクターの構築とリコンビナントヒトBST2タンパク質の作成
ヒトBST2Dの全長配列（配列番号：２）中の、細胞外ドメイン４７位−１８０位のアミノ酸配列を対象として、そのN末端側またはC末端側からアミノ酸残基を１つずつ削ったアミノ酸配列をコードするcDNAをPCR法によって合成した。目的とするアミノ酸配列のデザイン方法を以下に示した。
N末端側解析用アミノ酸配列のデザイン：
0005558825.tif 000006
C末端側解析用アミノ酸配列のデザイン：
0005558825.tif 000007
PCR法には、ヒトBST2DをコードするcDNAの塩基配列（配列番号：１）の、目的とするアミノ酸配列をコードする領域の両端にアニールするプライマーを利用した。各プライマーにはEcoR IおよびXhoIサイトを付加した。全長のヒトBST2のcDNAを組み込んだベクターを鋳型として、東洋紡社製のKOD DNA polymeraseによってPCR反応を行った。得られたPCR産物をEcoR IとXho I（TaKaRa社製）で切断してアガロースゲルで電気泳動し、それをQiagen社製のMinEluteで精製した。その精製したPCR産物を、Hisタグの付いたpET32発現ベクター（Novagen社製）のEcoR I/Xho Iサイトにクローニングした。それら発現ベクターを大腸菌（BL21(DE3)）に形質導入し、それぞれの大腸菌からN末端にHisタグが付加された各ヒトBST2タンパク質をNovagen社のオーバーナイトエクスプレスシステムで作成した。
【０１２７】
B.抗体
実施例２で得られた、マウス#4LD抗体を用い、以下の通りウェスタンブロッティング法でエピトープを決定した。
【０１２８】
C.ウェスタンブロッティング法
それぞれのHisタグの付いたヒトBST2タンパク質（Aで合成されたもの）をサンプルバッファーで溶解し、70℃10分間加熱した。その溶解させたタンパク質を4-20%グラジエントSDS-PAGEゲル（Invitrogen社製）を使って分離し、PVDFメンブレン（Millipore社製）に転写した。それから、BSAでブロッキングをし、1μg/mL 4LD抗体か2000倍希釈した抗Hisタグ抗体（Novagen社製）で反応させた。HRPでラベル化された抗マウスIgG抗体（Jackson社製）と反応後、ECL検出試薬（GE Healthcare社製）を用いて化学発光させ、富士フィルム社製のLAS-1000でHisタグの付いたヒトBST2タンパク質を検出した。
サンプルバッファー：
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) [Invitrogen社製]
NuPAGE Reducing Agent (10X) [Invitrogen社製]
を滅菌蒸留水で調製した。
【０１２９】
その結果は図６に示した通りである。各レーンのリコンビナントヒトBST2タンパク質のアミノ酸配列は以下のとおりである。以下のアミノ酸の位置を示す数字は、配列番号：２におけるN末端のMを１とする数値である。N末端側（上左）のレーン３−９、およびC末端側（上右）のレーン４−１０のうち、#４LD抗体でシグナルが検出されたレーンを＋で、されなかったレーンを−で示した。
【０１３０】
N末端側
0005558825.tif 000008
C末端側
0005558825.tif 000009
【０１３１】
図６から明らかなように、4LD抗体のK(47)---R(147)／N末端側のレーン７への結合は検出されたが、K(47)--V(146)／N末端側のレーン８への結合は検出できなかった。したがって、4LD抗体の抗原認識には、１４７位のRが必要であることが確認された。一方、C末端側の結果（図６上右）から、4LD抗体は、E(133)---Q(180)／レーン６には結合したが、V(134)----Q(180)への結合は検出できなかった。したがって、4LD抗体の抗原認識には、１３３位のEが必要であることが確認された。4LDのエピトープは、EVERLRRENQVLSVR （配列番号：３７）の15アミノ酸であることがわかった。配列番号：３７のアミノ酸配列は、BST2Dの全長アミノ酸配列（配列番号：２）の、１３３−１４７位に相当する。図１に示すとおり、このエピトープは、ヒトBST2Dに特異的なアミノ酸配列によって構成されていた。
【０１３２】
実施例７  in vivo薬効試験
（１）細胞株
ヒトのミエローマ由来細胞株であるRPMI8226細胞（ATCC）およびヒトＢ細胞株ARH77細胞（ATCC）を用いた。細胞は10%FBS（BIONET社製）を含むRPMI1640培地（SIGMA社製）にて維持継代した。
【０１３３】
（２）RPMI8226ヒト癌細胞株移植マウスモデルの作製
細胞を継代用培地にて5×107個/mLになるように調製した。細胞の移植前日に、あらかじめ抗アシアロＧＭ１抗体（和光純薬社製、１バイアルを５ｍLで溶解）１００μLを腹腔内へ投与したＳＣＩＤマウス（オス、5週齢）（日本クレア）の腹部皮下へこの細胞懸濁液100 μL（5×106個／マウス）を移植した。腫瘍体積は以下の式にて算出し、腫瘍体積が140〜240 mm3になった時点でモデル成立とした。
腫瘍体積＝長径×短径×短径/2
腫瘍体積をもとに群分けを行った。
【０１３４】
（３）ARH77ヒト癌細胞株移植マウスモデルの作製
細胞を継代用培地にて2.5×107個/mLになるように調製した。細胞の移植前日に、あらかじめ抗アシアロＧＭ１抗体（和光純薬社製、１バイアルを５mLで溶解）１００μLを腹腔内へ投与したＳＣＩＤマウス（オス、5週齢）（日本クレア）の尾静脈よりこの細胞懸濁液200 μL（5×106個／マウス）を移植した。腫瘍移植後10日目に、マウス血清中のARH77細胞が産生するhuman IgG（Mタンパク）量をELISAで測定し（血清Mタンパク量の測定の項参照）、Mタンパクが検出されたことからモデル成立とした。血清Mタンパク量を基に群分けを行った。
【０１３５】
（４）血清Mタンパク量の測定
背中足静脈により血液を採取し、血清を分離し、マウス血清中のMタンパク量の測定は、抗human IgG抗体を用いたサンドイッチELISAで行った。すなわち、抗human IgG抗体（Biosource）を固相化した96 well plate（Nunc）を希釈緩衝液(D.B.)でブロッキング処理した後、D.B.を用いて適宜希釈した血清サンプル添加した。D.Bの組成は次のとおりである。
Dilution Buffer;  1 mmol/L MgCl2, 
150 mmol/L NaCl, 
0.02 w/v% NaN3, 
0.05 vol % Tween20, 
1 w/v% bovine serum albumin(BSA)
含有50 mmol/L Tris-HCl緩衝液 pH8.1
また抗体濃度算出のためのスタンダードとして、1000 ng/mLから2倍系列で11段階希釈したhuman IgG（ICN/cappel）を同様に添加した。アルカリフォスファターゼ標識抗human IgG抗体（Biosource）を反応させた後、Sigma104（Sigma-Aldrich）を基質として発色させ、吸光度リーダーにより405 nmの吸光度を測定した（参照波長635 nm）。スタンダードhuman IgGの検量線から血清サンプル中のhuman IgG（Mタンパク）量を算出した。なお、本ELISAの検出限界は検量線から判断して1 ng/mLとした。
【０１３６】
（５）投与抗体の調製
４LD抗体を投与当日、濾過滅菌したＰＢＳ（−）を用いて、0.5 mg/mL（5 mg/kg投与群）および0.15 mg/mL（1.5 mg/kg投与群）、0.1 mg/mL（1 mg/kg投与群）、0.05 mg/mL（0.5 mg/kg投与群）になるように調製し、投与試料とした。
【０１３７】
（６）抗体投与
（２）で作製したRPMI8226細胞移植マウスモデルは移植後27日目より 週に2回、三週間、上記（５）で調製した投与試料を10 mL/kgにて、尾静脈より投与した（投与量：5 mg/kg, 1.5 mg/kg, 0.5 mg/kg）。陰性対照として、ＰＢＳ（−）（vehicle）を同様に週に2回、三週間、10 mL/kgにて、尾静脈より投与した。１群6匹で行った。また、（３）で作製したARH77細胞移植マウスモデルは移植後10日より、週に1回、三週間、上記（５）で調製した投与試料を10 mL/kgにて、尾静脈より投与した。（投与量：5 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.05 mg/kg）陰性対照として、ＰＢＳ（−）（vehicle）を同様に週に1回、三週間、10 mL/kgにて、尾静脈より投与した。１群5匹で行った。
【０１３８】
（７）抗腫瘍効果の評価
4LD抗体のRPMI8226細胞移植マウスモデルにおける抗腫瘍効果については腫瘍体積の継時変化（図７）で評価した。その結果、4LD抗体投与群ではvehicle投与群と比較して腫瘍の増殖抑制が認められた。また、ARH77細胞移植マウスモデルにおける抗腫瘍効果については生存期間（図８）で評価した。その結果、4LD抗体投与群ではvehicle投与群と比較して抗体投与群で生存期間の延長が認められた。
以上より、4LD抗体が有するヒト骨髄腫細胞移植マウスモデルに対する抗腫瘍効果が示された。
【産業上の利用可能性】
【０１３９】
本発明により、ヒトBST2抗原の各種スプライシングバリアントの中で、BST2Dを特異的に認識する抗体が提供された。従来のHM1.24抗体に比べ、BST2Dに対する特異性が高い本発明の抗BST2抗体は、骨髄腫などのBST2Dを発現する組織や細胞の治療や診断に利用することができる。たとえば、骨髄腫の治療において、BST2HとBST2Dを免疫学的に識別しない抗体と比べて、本発明の抗体は、血中においてより長い期間にわたって抗体の血中濃度を維持する。したがって、より低い投与量で、治療効果を達成することができる。あるいは本発明の抗体は、骨髄腫などのBST2Dを発現する細胞を特異的に検出することができる診断剤として利用することができる。特に、生体内における骨髄腫の画像診断において、BST2分子の他のバリアントを免疫学的に識別する本発明の抗体は、バックグランドノイズの低い、より病巣に特異的なイメージを与える診断ツールとして有用である。
【図１】
0005558825.tif 000010
【図２】
0005558825.tif 000011
【図３】
0005558825.tif 000012
【図４】
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【図５】
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【図６】
0005558825.tif 000015
【図７】
0005558825.tif 000016
【図８】
0005558825.tif 000017
【配列表】
0005558825000001.app