(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Iのペプチド核酸誘導体又はその薬学的に許容可能な塩：
0005620282.tif 000135
前記式で、
nは5又は5より大きい整数であり；
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1、及びTnは独立して、ヒドリド、デューテリド(deuterido)、置換された又は置換されていないアルキル、又は置換された又は置換されていないアリールラジカルを表し；
X及びYは、独立して、ヒドリド、デューテリド、置換された又は置換されていないアルキル、置換された又は置換されていないアシル、置換された又は置換されていないスルホニル、又は置換された又は置換されていないアリールラジカルを表し；
Zは、ヒドロキシ、置換された又は置換されていないアルキルオキシ、置換された又は置換されていないアリールオキシ、又は置換された又は置換されていないアミノラジカルを表し；
B1、B2、...、Bn-1、及びBnは、独立して、アデニン、チミン、グアニン、シトシン及びウラシルを含む天然核酸塩基、及び非天然核酸塩基の中から選択され；かつ、
B1、B2、...、Bn-1、及びBnの少なくとも1つは、独立して、下記の式II、式III、又は式IVによって表される非天然核酸塩基の中から選択され：
0005620282.tif 000136
前記式で、
R1、R2、R3、R4、R5及びR6は、独立して、置換された又は置換されていないアルキルおよびヒドリドラジカルの中から選択され；かつ、
L1、L2及びL3は、塩基性アミノ基を核酸塩基対形成の性質を有する部分に連結させる下記の式Vによって表される共有結合性リンカーであり：
0005620282.tif 000137
前記式で、
Q1及びQmは、置換された又は置換されていないメチレン(−CH2−)ラジカルで、Qmは塩基性アミノ基に直接連結され；
Q2、Q3、...、及びQm-1は独立して、置換された又は置換されていないメチレン、酸素(−O−)、硫黄(−S−)、及び置換された又は置換されていないアミノラジカル[−N(H)−、又は−N(置換体)−]の中から選択され；かつ、
mは、2〜15の整数である。
【請求項２】
請求項1に記載のペプチド核酸誘導体又はその薬学的に許容可能な塩：
前記式で、
nは、8〜30の整数であり；
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1、及びTnはヒドリドラジカルであり；
X及びYは、独立して、ヒドリド、置換された又は置換されていないアルキル、置換された又は置換されていないアシル、又は置換された又は置換されていないスルホニルラジカルの中から選択され；
Zは、ヒドロキシ、置換された又は置換されていないアルキルオキシ、置換された又は置換されていないアリールオキシ、又は置換された又は置換されていないアミノラジカルを表し；
B1、B2、...、Bn-1、及びBnは、独立して、アデニン、チミン、グアニン、シトシン及びウラシルを含む天然核酸塩基、及び非天然核酸塩基の中から選択され；かつ、
B1、B2、...、Bn-1、及びBnの少なくとも2つが独立して、式II、式III、又は式IVによって表される非天然核酸塩基の中から選択される。
【請求項３】
請求項1に記載のペプチド核酸誘導体又はその薬学的に許容可能な塩：
前記式で、
nは、8〜25の整数であり；
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1、及びTnはヒドリドラジカルであり；
X及びYは、独立して、ヒドリド、置換された又は置換されていないアルキル、及び置換された又は置換されていないアシルラジカルの中から選択され；
Zは、ヒドロキシ、又は置換された又は置換されていないアミノラジカルを表し；
B1、B2、...、Bn-1、及びBnは、独立して、アデニン、チミン、グアニン、シトシン及びウラシルを含む天然核酸塩基、及び非天然核酸塩基の中から選択され；
B1、B2、...、Bn-1、及びBnの少なくとも2つが独立して、式II、式III、又は式IVによって表される非天然核酸塩基の中から選択され；
R1、R2、R3、R4、R5及びR6は独立して、置換された又は置換されていないアルキル、及びヒドリドラジカルの中から選択され；
Q1及びQmは、置換された又は置換されていないメチレンラジカルで、かつQmは塩基性アミノ基に直接連結され；
Q2、Q3、...、及びQm-1は、独立して、置換された又は置換されていないメチレン、酸素、及びアミノラジカルの中から選択され；かつ、
mは、2〜12の整数である。
【請求項４】
請求項1に記載のペプチド核酸誘導体又はその薬学的に許容可能な塩：
前記式で、
nは、10〜25の整数であり；
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1、及びTnはヒドリドラジカルであり；
X及びYは、独立して、ヒドリド、及び置換された又は置換されていないアシルラジカルの中から選択され；
Zは、ヒドロキシ、又は置換された又は置換されていないアミノラジカルを表し；かつ、
B1、B2、...、Bn-1、及びBnは、独立して、アデニン、チミン、グアニン、シトシン及びウラシルを含む天然核酸塩基、及び非天然核酸塩基の中から選択され；
B1、B2、...、Bn-1、及びBnの少なくとも3つが独立して、式II、式III、又は式IVによって表される非天然核酸塩基の中から選択され；
R1、R2、R3、R4、R5及びR6は、独立して、置換された又は置換されていないアルキル、及びヒドリドラジカルの中から選択され；
Q1及びQmはメチレンラジカルで、かつQmは塩基性アミノ基に直接連結され；
Q2、Q3、...、及びQm-1は、独立して、メチレン、酸素、及びアミノラジカルの中から選択され；かつ、
mは、2〜10の整数である。
【請求項５】
請求項1に記載のペプチド核酸誘導体又はその薬学的に許容可能な塩：
前記式で、
nは、10〜20の整数であり；
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1、及びTnはヒドリドラジカルであり；
X及びYは、独立して、ヒドリド、及び置換された又は置換されていないアシルラジカルの中から選択され；
Zは、ヒドロキシ、又は置換された又は置換されていないアミノラジカルを表し；
B1、B2、...、Bn-1、及びBnは、独立して、アデニン、チミン、グアニン、シトシン及びウラシルを含む天然核酸塩基、及び非天然核酸塩基の中から選択され；
B1、B2、...、Bn-1、及びBnの少なくとも3つが独立して、式II、式III、又は式IVによって表される非天然核酸塩基の中から選択され；
R1、R3、及びR5はヒドリドラジカルで、かつR2、R4、及びR6は独立して、ヒドリド、又は置換された又は置換されていないアミジニルラジカルを表し；
Q1及びQmはメチレンラジカルであり、かつQmは塩基性アミノ基に直接連結され；
Q2、Q3、...、及びQm-1は独立して、メチレン、酸素、及びアミノラジカルの中から選択され；かつ、
mは、2〜20の整数である。
【請求項６】
請求項1に記載のペプチド核酸誘導体又はその薬学的に許容可能な塩：
前記式で、
nは、10〜20の整数であり；
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1、及びTnはヒドリドラジカルであり；
X及びYは、独立して、ヒドリド、及び置換された又は置換されていないアシルラジカルの中から選択され；
Zは、ヒドロキシ、又は置換された又は置換されていないアミノラジカルを表し；
B1、B2、...、Bn-1、及びBnは、独立して、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、及び非天然核酸塩基の中から選択され；
B1、B2、...、Bn-1、及びBnの少なくとも3つが独立して、式II、式III、又は式IVによって表される非天然核酸塩基の中から選択され；
R1、R3、及びR5はヒドリドラジカルで、かつR2、R4、及びR6は独立して、ヒドリド又はアミジニルラジカルを表し；
Q1及びQmはメチレンラジカルで、かつQmは塩基性アミノ基に直接連結され；
Q2、Q3、...、及びQm-1は独立して、メチレン、及び酸素ラジカルの中から選択され；かつ、
mは、2〜8の整数である。
【請求項７】
請求項1に記載のペプチド核酸誘導体又はその薬学的に許容可能な塩
前記式で、
nは、8〜20の整数であり；
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1、及びTnはヒドリドラジカルであり；
Xはヒドリドラジカルであり；
Yはヒドリド、又は置換された又は置換されていないアシルラジカルを表し；
Zはヒドロキシ、又は置換された又は置換されていないアミノラジカルを表し；
B1、B2、...、Bn-1、及びBnは、独立して、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、及び非天然核酸塩基の中から選択され；
B1、B2、...、Bn-1、及びBnの少なくとも3つが独立して、式II、式III、又は式IVによって表される非天然核酸塩基の中から選択され；
R1、R3、及びR5はヒドリドラジカルで、かつR2、R4、及びR6は独立して、ヒドリド又はアミジニルラジカルを表し；
L1は、右端が塩基性アミノ基と直接連結された−(CH2)2−O−(CH2)2−、−CH2−O−(CH2)2−、又は−CH2−O−(CH2)3−を表し；かつ、
L2及びL3は、独立して、右端が塩基性アミノ基と直接連結された−(CH2)2−O−(CH2)2−、−(CH2)3−O−(CH2)2−、−(CH2)2−O−(CH2)3−、−(CH2)2−、−(CH2)3−、−(CH2)4−、−(CH2)5−、−(CH2)6−、−(CH2)7−、及び−(CH2)8−の中から選択される。
【請求項８】
治療目的のために、請求項1〜7のいずれか一項記載のペプチド核酸誘導体又はその薬学的に許容可能な塩の治療的に有効な量を含む、薬学的組成物。
【請求項９】
診断目的のための、請求項1〜7のいずれか一項記載のペプチド核酸誘導体又はその塩を含む、組成物。
【請求項１０】
細胞の蛋白質発現のインビトロ調節のために、請求項1〜7のいずれか一項記載のペプチド核酸誘導体又はその塩を使用する方法。
【請求項１１】
式VIの化合物：
0005620282.tif 000138
前記式で、
R7は、ヒドリド、N−スクシニル、又は置換された又は置換されていないアルキルラジカルであり；
P1は、ヒドリド、t−ブトキシカルボニル、(9H−フルオレン−9−イル)メトキシ−カルボニル、置換された又は置換されていないベンジルオキシカルボニル、及び置換された又は置換されていないアリールスルホニルラジカルの中から選択され；
P2は、ヒドリド、t−ブトキシカルボニル、(9H−フルオレン−9−イル)メトキシ−カルボニル、置換された又は置換されていないベンジルオキシカルボニル、置換されたアルキルオキシカルボニル、置換された又は置換されていないアルキル、アミジニル、1,3−ビス(t−ブトキシ−カルボニル)アミジニル、1,3−ビス−(ベンジルオキシカルボニル)アミジニルラジカルの中から選択され；かつ、
L1は式Vによって表されるリンカーであり：
0005620282.tif 000139
前記式で、
Q1及びQmは、置換された又は置換されていないメチレンラジカルで、かつQmはアミノラジカルに直接連結され；
Q2、Q3、...、及びQm-1は、独立して、置換された又は置換されていないメチレン、酸素、硫黄、及び置換された又は置換されていないアミノラジカルの中から選択され；かつ、
mは、2〜15の整数である。
【請求項１２】
式VIIの化合物：
0005620282.tif 000140
前記式で、
R8は、ヒドリド、N−スクシニル、又は置換された又は置換されていないアルキルラジカルであり；
P1は、ヒドリド、t−ブトキシカルボニル、(9H−フルオレン−9−イル)メトキシ−カルボニル、置換された又は置換されていないベンジルオキシカルボニル、及び置換された又は置換されていないアリールスルホニルラジカルの中から選択され；
P2は、ヒドリド、t−ブトキシカルボニル、(9H−フルオレン−9−イル)メトキシ−カルボニル、置換された又は置換されていないベンジルオキシカルボニル、置換されたアルキルオキシカルボニル、置換された又は置換されていないアルキル、アミジニル、1,3−ビス(t−ブトキシ−カルボニル)アミジニル、1,3−ビス−(ベンジル−オキシカルボニル)アミジニルラジカルの中から選択され；
P3は、ヒドリド、t−ブトキシカルボニル、(9H−フルオレン−9−イル)メトキシ−カルボニル、および置換された又は置換されていないベンジルオキシカルボニルラジカルの中から選択され；
P4は、ヒドリド、及びt−ブトキシカルボニルラジカルの中から選択され；かつ、
L2は、式Vによって表されるリンカーであり：
0005620282.tif 000141
前記式で、
Q1及びQmは、置換された又は置換されていないメチレンラジカルで、かつQmはアミノラジカルに直接連結され；
Q2、Q3、...、及びQm-1は、独立して、置換された又は置換されていないメチレン、酸素、硫黄、及び置換された又は置換されていないアミノラジカルの中から選択され：かつ、
mは、2〜15の整数である。
【請求項１３】
式VIIIの化合物：
0005620282.tif 000142
前記式で、
R9は、ヒドリド、N−スクシニル、又は置換された又は置換されていないアルキルラジカルであり；
P1は、ヒドリド、t−ブトキシカルボニル、(9H−フルオレン−9−イル)メトキシ−カルボニル、置換された又は置換されていないベンジルオキシカルボニル、及び置換された又は置換されていないアリールスルホニルラジカルの中から選択され；
P2は、ヒドリド、t−ブトキシカルボニル、(9H−フルオレン−9−イル)メトキシ−カルボニル、置換された又は置換されていないベンジルオキシカルボニル、置換されたアルキルオキシカルボニル、置換された又は置換されていないアルキル、アミジニル、1,3−ビス(t−ブトキシ−カルボニル)アミジニル、1,3−ビス−(ベンジル−オキシカルボニル)アミジニルラジカルの中から選択され；かつ、
L3は、式Vによって表されるリンカーであり：
0005620282.tif 000143
前記式で、
Q1及びQmは、置換された又は置換されていないメチレンラジカルであり、かつQmはアミノラジカルに直接連結され；
Q2、Q3、...、及びQm-1は、独立して、置換された又は置換されていないメチレン、酸素、硫黄、及び置換された又は置換されていないアミノラジカルの中から選択され；かつ、
mは、2〜15の整数である。
【請求項１４】
式IXの化合物：
0005620282.tif 000144
前記式で、
R10は、ヒドロキシ、置換された又は置換されていないアルキルオキシ、又は置換された又は置換されていないアミノラジカルであり；
P2は、ヒドリド、t−ブトキシカルボニル、(9H−フルオレン−9−イル)メトキシ−カルボニル、置換された又は置換されていないベンジルオキシカルボニル、置換されたアルキルオキシカルボニル、置換された又は置換されていないアルキル、アミジニル、1,3−ビス(t−ブトキシ−カルボニル)アミジニル、1,3−ビス−(ベンジルオキシカルボニル)アミジニルラジカルの中から選択され；かつ、
L1は、式Vによって表されるリンカーであり：
0005620282.tif 000145
前記式で、
Q1及びQmは、置換された又は置換されていないメチレンラジカルであり、かつQmはアミノラジカルに直接連結され；
Q2、Q3、...、及びQm-1は、独立して、置換された又は置換されていないメチレン、酸素、硫黄、及び置換された又は置換されていないアミノラジカルの中から選択され；かつ、
mは、2〜15の整数である。
【請求項１５】
式Xの化合物：
0005620282.tif 000146
前記式で、
R11は、ヒドロキシ、置換された又は置換されていないアルキルオキシ、又は置換された又は置換されていないアミノラジカルであり；
P2は、ヒドリド、t−ブトキシカルボニル、(9H−フルオレン−9−イル)メトキシ−カルボニル、置換された又は置換されていないベンジルオキシカルボニル、置換されたアルキルオキシカルボニル、置換された又は置換されていないアルキル、アミジニル、1,3−ビス(t−ブトキシ−カルボニル)アミジニル、1,3−ビス−(ベンジル−オキシカルボニル)アミジニルラジカルの中から選択され；
P3は、ヒドリド、t−ブトキシカルボニル、(9H−フルオレン−9−イル)メトキシ−カルボニル、および置換された又は置換されていないベンジルオキシカルボニルラジカルの中から選択され；
P4は、ヒドリド、及びt−ブトキシカルボニルラジカルの中から選択され；かつ、
L2は、式Vによって表されるリンカーであり：
0005620282.tif 000147
前記式で、
Q1及びQmは置換された又は置換されていないメチレンラジカルであり、かつQmはアミノラジカルに直接連結され；
Q2、Q3、...、及びQm-1は、独立して、置換された又は置換されていないメチレン、酸素、硫黄、及び置換された又は置換されていないアミノラジカルの中から選択され；かつ、
mは、2〜15の整数である。
【請求項１６】
式XIの化合物：
0005620282.tif 000148
前記式で、
R12は、ヒドロキシ、置換された又は置換されていないアルキルオキシ、もしくは置換された又は置換されていないアミノラジカルであり；
P2は、ヒドリド、t−ブトキシカルボニル、(9H−フルオレン−9−イル)メトキシ−カルボニル、置換された又は置換されていないベンジルオキシカルボニル、置換されたアルキルオキシカルボニル、置換された又は置換されていないアルキル、アミジニル、1,3−ビス(t−ブトキシ−カルボニル)アミジニル、1,3−ビス−(ベンジル−オキシカルボニル)アミジニルラジカルの中から選択され；かつ、
L3は、式Vによって表されるリンカーであり：
0005620282.tif 000149
前記式で、
Q1及びQmは置換された又は置換されていないメチレンラジカルで、かつQmはアミノラジカルに直接連結され；
Q2、Q3、...、及びQm-1は、独立して、置換された又は置換されていないメチレン、酸素、硫黄、及び置換された又は置換されていないアミノラジカルの中から選択され；かつ、
mは、2〜15の整数である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、優れた細胞透過性と強い核酸親和性を示すように化学的に修飾されたペプチド核酸誘導体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
オリゴヌクレオチドは、アンチセンス遺伝子発現抑制、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)、遺伝子チップによる診断分析、等を含む様々な生物学的目的のために用いられて来た。オリゴヌクレオチドは、核酸、例えば、DNA及びRNAと配列特異的方式で相互作用するため、細胞内でDNA又はRNAが関与する生物学的過程を予測可能に調節するのに非常に有用である。しかし、低分子医薬とは異なり、オリゴヌクレオチドは容易に哺乳動物細胞膜を通過できないため、原形質膜を通過し易くするように適切に修飾させたり剤形化しなければ、細胞内の生物学的過程に殆ど影響を及ぼし難い。
【０００３】
医薬ターゲットとしての蛋白質：蛋白質は様々な細胞作用を媒介する。現在市販されている医薬のうち、大部分が蛋白質の作用を調節することにより治療活性を示すということを見付けることは驚くことではない。例えば、非ステロイド性消炎鎮痛剤であるアスピリンは、シクロオキシゲナーゼと呼ばれる酵素を阻害して抗炎症効能を示す。ロサルタンは、アンジオテンシンII受容体と呼ばれる膜貫通受容体に結合し、この受容体の活性を抑制して血圧降下作用を示す。ロシグリタゾンは、ペルオキシソーム増殖因子−活性化受容体ガンマ(PPARγ)と呼ばれる細胞内受容体を選択的に活性化させて抗糖尿活性を引き出す。エタネルセプトは、腫瘍壊死因子−α(TNF-α)と呼ばれるサイトカインに結合し、TNF-αの生物学的活性を中和して抗リウマチ活性を示す融合蛋白質である。ハーセプチンは、特定タイプの乳癌細胞内に過発現したerbB2に選択的に結合して乳癌を治療するためのモノクローナル抗体である。
【０００４】
蛋白質合成のアンチセンス抑制：蛋白質は、DNA(2−デオキシリボース核酸)によってコードされる。細胞刺激に対応して、DNAは転写されて核でプレ−mRNA(プレ-メッセンジャーリボ核酸)を産生する。プレ−mRNAのイントロン部分が酵素によって切り離されてmRNA(伝令リボ核酸)を生成し、mRNAは細胞質区画に移動することになる。細胞質内で、リボソームと称される蛋白質を合成する複合体がmRNAに結合し、mRNAに従い、コードされた遺伝子情報をスキャンしながら蛋白質合成を遂行する(Biochemistry vol 41, 4503-4510, 2002; Cancer Res. vol 48, 2659-2668, 1988)。
【０００５】
配列特異的な方式でmRNA又はプレ−mRNAに結合するオリゴヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌクレオチド(AO)と称する。AOは、mRNAに強く結合して細胞質でmRNAに従いリボソームによる蛋白質合成を阻害できる。AOは、ターゲット蛋白質の合成を阻害するために、細胞内に存在する必要がある。AOは、核内でプレ−mRNAに強く結合してプレ−mRNAのスプライシングに影響を及ぼし、修飾された配列のmRNAと、結果的に修飾された蛋白質を産生できる。
0005620282.tif 000002
【０００６】
非天然オリゴヌクレオチド：DNA又はRNAのオリゴヌクレオチドは、生体内に存在するヌクレアーゼによって容易に分解されるため、治療的用途に限界がある。今まで多くの型の非天然オリゴヌクレオチドが開発され集中的に研究されて来た(Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540, 2006)。そのうち幾つかはDNA及びRNAと比較して長い代謝安定性を示す。上に提供したのは、代表的な非天然オリゴヌクレオチドのうち、幾つかの化学構造である。これらのオリゴヌクレオチドは、予想通りDNA又はRNAのように相補的な核酸に結合する。
【０００７】
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド(PTO)は、モノマー当り、骨格のホスフェート酸素原子中の一つが硫黄原子で置換されたDNA類似体である。このような小さい構造的変化は、PTOをヌクレアーゼによる分解に比較的よく耐えるようにした(Ann. Rev. Biochem. vol 54, 367-402, 1985)。
【０００８】
PTO及びDNAの構造的類似性を反映させるように、それらは全て大部分の哺乳動物細胞の型において細胞膜透過性が良くない。しかし、DNAのためのトランスポーターを豊富に発現する細胞の幾つかの型に対して、DNA及びPTOは優れた細胞透過性を示す。全身性に投薬されたPTOは、肝臓および腎臓に分布し易いことで知られている(Nucleic Acids Res. vol 25, 3290-3296, 1997)。
【０００９】
インビトロでPTOの細胞透過を容易にするために、リポフェクション方法が広く用いられて来た。しかし、リポフェクション方法は物理的に細胞膜を修飾させて細胞毒性を誘発するため、長時間の治療的用途には理想的ではない。
【００１０】
去る20余年間、アンチセンスPTO及びPTOの修飾体は、癌、免疫疾患、代謝性疾患等を治療するために臨床的に評価されて来た(Biochemistry vol 41, 4503-4510, 2002; Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540, 2006)。多くのアンチセンス医薬の候補物質は、部分的にPTOの良くない細胞透過性のため成功的ではなかった。このような良くない細胞透過性を克服するために、PTOを治療的活性のための高容量で投与する必要がある。しかし、PTOは容量依存的な毒性、例えば増加した血液の凝固時間、補体活性化、細尿管腎症、クッパー細胞活性化、及び免疫刺激、例えば脾臓肥大、リンパ球過形成、単核細胞浸潤などを伴うことで知られている(Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540, 2006)。
【００１１】
多くのアンチセンスPTOが肝臓又は腎臓が相当な寄与をする疾患に臨床的活性を示すことが明らかになっている。ISIS-301012(ミポメルセン(mipomersen))は、LDLコレステロールの運搬に関与する蛋白質apoB-100の合成を阻害するPTO類似体である。ミポメルセンは、一部のアテローム性動脈硬化症患者群で臨床的活性を表したが、これは主に肝臓に優先的に分布することに起因すると思われる(www.medscape.com/viewarticle/556073：2009年2月19日接続)。ISIS-113715は、蛋白質チロシンホスファターゼ1B(PTP1B)の合成を阻害するアンチセンスPTO誘導体であり、第2型糖尿患者に治療的活性を示すことが見い出された(Curr. Opin. Mol. Ther. vol 6, 331-336, 2004)。
【００１２】
ホスホロアミダイトモルホリノオリゴヌクレオチド(PMO)において、DNAの骨格ホスフェート及び2−デオキシリボースは、ホスホアミダイト及びモルホリンでそれぞれ置換された(Appl. Microbiol. Biotechnol. vol 71, 575-586, 2006)。DNA骨格は負電荷を有するのに対し、PMO骨格は電荷を有さない。よって、PMOとmRNA間の結合は骨格間に静電気的反発がないため、DNAとmRNA間の結合よりも更に強い傾向がある。PMOは、構造的にDNAと非常に異なるため、PMOはDNAを認識する肝臓のトランスポーターによって認識されない。しかし、PMOは細胞膜を容易に通過できない。
【００１３】
ペプチド核酸(PNA)は、単位骨格としてN−(2−アミノエチル)グリシンを有するポリペプチドであり、Nielsen等によって発見された(Science vol 254, 1497-1500, 1991)。DNA及びRNAのように、PNAはまた選択的に相補的核酸と結合する[Nature(London) vol 365, 566-568, 1992]。PMOのように、PNAの骨格は電荷を有さない。よって、PNAとRNA間の結合は、DNAとRNA間の結合より強い傾向がある。PNAは、構造的にDNAと著しく異なるため、PNAはDNAを認識する肝臓のトランスポーターによって認識されず、DNA又はPTOのものとは非常に異なる組織分布プロファイルを示す。ところが、PNAはまた、哺乳動物細胞膜をうまく通過できない(Adv. Drug Delivery Rev. vol 55, 267-280, 2003)。
【００１４】
ロックト核酸(LNA)において、RNAの骨格リボース環は、構造的に制限されてRNA又はDNAに対する結合親和性を増加させる。よって、LNAは高い親和性のDNA又はRNA誘導体と見なされ得る(Biochemistry vol 45, 7347-7355, 2006)。
【００１５】
アンチセンス作用メカニズム：アンチセンス作用メカニズムは、AOの型によって異なる。RNAse Hは、DNA、RNA、又はPTOとmRNAのデュープレックスを認識してmRNAのデュープレックス部分を分解する。よって、PTOのアンチセンス活性は、RNAse Hによってかなり増幅される。一方、RNAse Hは、PMO、PNA、又はLNAとmRNAのデュープレックスを認識できない。すなわち、PMO、PNA及びLNAは純粋にそれらのアンチセンス活性のためのmRNAの立体障害に依存する(Biochemistry vol 41, 4501-4510, 2002)。
【００１６】
mRNAに対して同一な結合親和性を有するオリゴヌクレオチドのために、PTOはPMO、PNA、及びLNAより強いアンチセンス活性を示さなければならない。立体障害AO、例えば、PMO、PNA、及びLNAに関して、mRNAに対する強い親和性はアンチセンス活性のために好ましい。
【００１７】
PNAのアンチセンス活性：mRNAに対するPNAの結合親和性は、ある程度まではPNAの長さの増加に伴い増加する。しかし、PNAのアンチセンス活性は、常にPNAの長さに伴い増加するとは限らない。PNAのアンチセンス活性が12〜13-merで最大活性に至り、その後減少するケースがあった(Nucleic acids Res. vol 32, 4893-4902, 2004)。その反面、特定mRNAに対して15〜18-mer PNAで最適アンチセンス活性に到達し、これはmRNAのターゲット結合部位の構造的接近性が重要であることを反映する(Biochemistry vol 40, 53-64, 2001)。
【００１８】
多くの場合、PNAは優れた細胞透過条件下でマイクロモルレベルでリボソームによる蛋白質合成を阻害すると報告されて来た(Science vol 258, 1481-85, 1992; Biochemistry vol 40, 7853-7859, 2001; Nucleic acids Res. vol 32, 4893-4902, 2004)。しかし、mRNAの非常に接近性の良い部位をターゲットとするPNAは、優れた細胞導入条件下にサブ−マイクロモルレベルで(Neuropeptides vol 38, 316-324, 2004; Biochemistry vol 40, 53-64, 2001)、又は、更にはサブ−ナノモルレベルで(Nucleic Acids Res. vol 36, 4424-4432, 2008)アンチセンス活性を示すことが明らかになった。
【００１９】
mRNAで非常に接近性の良い部位をターゲットとするだけでなく、mRNAに対するPNAの強い結合親和性が優れたアンチセンス活性のために要求される。DNA、PTO、及びLNAと異なり、PNAの骨格は電荷を有さない。PNAは、大きくなるにつれ凝集し、mRNAに対する結合にやや適さなくなる。PNAの長さを長くせず、mRNAに対するPNAの結合親和性を向上させることが好ましい。点電荷をPNAモノマーに導入することは、PNAの凝集防止に役立つ。
【００２０】
PNAに関する細胞透過の方法：PNAは容易に細胞膜を透過できず、適切に細胞透過されない場合は良くないアンチセンス活性を示す傾向がある。初期にPNAのアンチセンス活性は微量注入法(Science vol 258, 1481-85, 1992)、又は電気穿孔法 (Biochemistry vol 40, 7583-7589, 2001)によって評価された。微量注入法および電気穿孔法は侵襲的であるため、治療的目的として用いるのに適していない。細胞透過性を向上させるために様々な方法が開発された(Adv. Drug Delivery Rev. vol 55, 267-280, 2003; Curr. Top. Med. Chem. vol 7, 727-737, 2007)。
【００２１】
PNAは、細胞透過ペプチドの共有結合(covalent incorporation)(Neuropeptides vol 38, 316-324, 2004)、相補的DNAとデュープレックス形成後のリポフェクション(Biochemistry vol 40, 53-64, 2001)、共有結合された9−アミノアクリジンを有するPNAのリポフェクション(Nucleic Acids Res. vol 32, 2695-2706, 2004)、共有結合されたホスホナートアニオンを有するPNAのリポフェクション(Nucleic Acids Res. vol 36, 4424-4432, 2008)等によって効果的に細胞内に伝達された。また、細胞透過性は、PNAにアダマンタンのような親脂質性部分を導入したり(Bioconjugate Chem. vol 10, 965-972, 1999)、テトラフェニルホスホニウムのような両親媒性基を導入して(Nucleic Acids Res. vol 29, 1852-1863, 2001)向上させた。しかし、このような共有結合的修飾は、細胞透過性は著しく改善したが、mRNAに対する結合親和性を向上させるとは見なせない。
【００２２】
共有結合されたCPPを有するPNA：細胞透過ペプチド(CPP)は、優れた細胞透過性を示すポリペプチドであり、アルギニン又はリジン残基から多数の正電荷を有する。今まで多くのCPP、例えばトランスポータン、ペネトラチン、NLS(核移行シグナル)、及びTat等が発見された。CPPは、共有結合されたカーゴを細胞内に効果的に伝達することで知られている。共有結合されたCPPを有するPNAもまた、優れた細胞透過性を示す。
【００２３】
共有結合されたCPPを有する幾つかのPNAは、100nM程度のアンチセンスIC50を示すにもかかわらず(Neuropeptides vol 38, 316-324, 2004)、マイクロモルアンチセンスIC50がPNAにおいて、むしろ一般的である。
【００２４】
共有結合で連結されたCPPを有するPNAは、疎水性PNAドメイン及び正電荷を有するCPPドメインの二つの部分から構成される。前記PNAは、凝集して細胞内エンドソームに閉じ込められる傾向があり、蛋白質合成のアンチセンス阻害に有用でない(Curr. Top. Med. Chem. vol 7, 727-737, 2007; Nucleic acids Res. vol 33, 6837-6849, 2005)。さらに、前記の共有結合されたCPPは、mRNAに対するPNAの結合親和性を殆ど増加させることができない。
【００２５】
キラル骨格を有するPNA：キラル置換体を2−アミノエチル−グリシン(Aeg)のPNA骨格に導入しようとする試みがあった。例えば、PNAの水溶解度を、Aegの代わりに2−アミノエチル−リジンの骨格を有するPNAモノマーを導入して著しく向上させた(Angew. Chem. Int. Ed. Endl. vol 35, 1939-1941, 1996)。
【００２６】
Aegの代わりにL−(2−アミノ−2−メチル)エチル−グリシンの骨格を導入して、DNA及びRNAに対するPNAの結合親和性は著しく向上した。2−アミノエチル−グリシンの代わりにL−(2−アミノ−2−メチル)エチル−グリシンの骨格を有する10-mer PNAは、相補的なDNA及びRNAのそれぞれに対してTmにおいて19℃及び10℃の増加を見せた。しかし、このような増加は、L−(2−アミノ−2−メチル)エチル−グリシンを有する置換体の数に比例するようには見えない(J. Am. Chem. Soc. vol 128, 10258-10267, 2006)。
【００２７】
GPNA：PNAの細胞透過性は、Aegの代わりに2−アミノエチル−アルギニンの骨格を有するPNAモノマーを導入して著しく向上すると報告されている(J. Am. Chem. Soc. vol 125, 6878-6879, 2003)。前記PNAは、骨格にグアニジニウム部分を有しているため、「GPNA」と命名された。
【００２８】
2−アミノエチル−D−アルギニンの骨格を有するGPNAは、2−アミノエチル−L−アルギニンの骨格を有する対応するGPNAより、DNA及びRNAに対してより強い親和性を有すると報告されている(Chem. Commun. 244-246, 2005)。2−アミノエチル−D−アルギニンの骨格を有する5GPNAモノマーを有する10-mer GPNAに対して対応する、修飾されていないPNAと比べ、相補的なDNAに対してTm(融解温度)において7℃の増加があった(Bioorg. Med. Chem. Lett. vol 16, 4931-4935, 2006)。
【００２９】
インビトロのアンチセンス活性は従来技術ではアンチセンスGPNAについては報告されていないが、ヒトEGFR-TKに対する16-merアンチセンスGPNAは、無胸腺ヌードマウスに腹腔内投与によって抗癌活性を示すと報告されている(WO2008/061091)。
【００３０】
修飾された核酸塩基を有するPNA：DNAのケースのように、核酸塩基の修飾は核酸に対するPNAの親和性を向上させるために続けられて来た。
【００３１】
アデニンが2,6−ジアミノプリンで置換されたPNAは、相補的DNA又はRNAに対する親和性について評価された。2,6−ジアミノプリンでの置換は、置換1つ当りTmにおいて2.5〜6℃の増加をもたらすことが発見された(Nucleic Acids Res. vol 25, 4639-4643, 1997)。
0005620282.tif 000003
【００３２】
シトシンが、9−(2−アミノエトキシ)フェノキサジンで置換されたPNAは、相補的DNA又はRNAに対する親和性に対して評価された。9−(2−アミノエトキシ)フェノキサジンの一つの置換は、Tmにおいて10.7〜23.7℃の上昇をもたらした。しかし、前記の上昇は、ヌクレオチド配列に相当依存的だった。核酸塩基9−(2−アミノプロポキシ)フェノキサジンはまた、Tmにおいて大きな上昇を誘導した。Tmにおける大きな上昇によって、シトシン置換として9−(2−アミノエトキシ)フェノキサジン又は9−(2−アミノプロポキシ)フェノキサジンを有するPNAモノマーは、「G−クランプ」と称された(Org. Lett. vol 4, 4395-4398, 2002)。しかし、細胞透過データは、G−クランプを有するPNAに対して報告されていない。
【００３３】
シトシンが6−{2−(2−アミノエトキシ)フェニル}ピロロシトシン又は6−{2,6−ジ(2−アミノエトキシ)フェニル}ピロロシトシンで置換されたPNAは、相補的DNA又はRNAに対する親和性に対して評価された。6−{2−(2−アミノエトキシ)フェニル}ピロロシトシン又は6−{2,6−ジ(2−アミノエトキシ)フェニル}ピロロシトシンでの置換は、Tmを3〜11.5℃まで上昇させた(J. Am. Chem. Soc. vol 130, 12574-12575, 2008)。しかし、前記PNAは細胞透過性に対して評価されなかった。
【００３４】
PNAの他の用途：マイクロRNAに強く結合することにより、PNAは前記マイクロRNAの調節作用を阻害でき、これはマイクロRNAによって直接調節される蛋白質の発現水準の増加をもたらす(RNA vol 14, 336-346, 2008)。テロメラーゼのようなリボ核蛋白質に強く結合することにより、PNAはリボ核蛋白質の細胞作用を調節できる(Bioorg. Med. Chem. Lett. vol 9, 1273-78, 1999)。核内で遺伝子の特定部位に強く結合することによって、PNAは遺伝子の転写水準を調節できる(Biochemistry vol 46, 7581-89, 2007)。
【００３５】
PNAがDNA及びRNAに強く結合し、単一塩基対のミスマッチを敏感に区分するため、PNAは単一塩基多型(SNP)を高い正確度で検出することに適している。PNAは、DNA及びRNAに高い配列特異性を有し、且つ強く結合するため、PNAはDNA又はRNAを含む様々な異なる治療及び診断の応用分野を見付けることができる(FASEB vol 14, 1041-1060, 2000)。
【発明の概要】
【００３６】
発明の要約
本発明は、下記の式Iによって表される新たな種類のPNAオリゴマー又はその薬学的に許容可能な塩を提供する：
0005620282.tif 000004
前記式で、
nは5又は5より大きい整数であり；
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1、及びTnは独立して、ヒドリド、デューテリド(deuterido)、置換された又は置換されていないアルキル、又は置換された又は置換されていないアリールラジカルを表し；
X及びYは、独立して、ヒドリド、デューテリド、ヒドロキシ、置換された又は置換されていないアルキルオキシ、置換された又は置換されていないアリールオキシ、置換された又は置換されていないアミノ、置換された又は置換されていないアルキル、置換された又は置換されていないアシル、置換された又は置換されていないスルホニル、又は置換された又は置換されていないアリールラジカルを表し；
Zは、ヒドリド、デューテリド、ヒドロキシ、置換された又は置換されていないアルキルオキシ、置換された又は置換されていないアリールオキシ、置換された又は置換されていないアミノ、置換された又は置換されていないアルキル、又は置換された又は置換されていないアリールラジカルを表し；
B1、B2、...、Bn-1、及びBnは、独立して、アデニン、チミン、グアニン、シトシン及びウラシルを含む天然核酸塩基及び非天然核酸塩基の中から選択され；そして、
B1、B2、...、Bn-1、及びBnの少なくとも1つは独立して、核酸塩基対形成の性質を有する部分に共有結合で連結された置換された又は置換されていないアミノラジカルを有する非天然核酸塩基を表す。
【００３７】
式IのPNAオリゴマーは、対応する「修飾されていない」PNAオリゴマーに比べて向上した核酸結合親和性及び細胞透過性を示す。本発明のPNAオリゴマーは、核酸、又はリボ核蛋白質のような核酸ドメインを有する生理学的活性分子によって媒介された細胞機能及び生理学的機能を配列特異的に阻害したり調節するのに有用である。また、本発明のPNAオリゴマーは、核酸に対する配列特異的結合能力によって診断目的に有用である。
[請求項1001]
式Iのペプチド核酸誘導体又はその薬学的に許容可能な塩：
0005620282.tif 000005
前記式で、
nは5又は5より大きい整数であり；
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1、及びTnは独立して、ヒドリド、デューテリド(deuterido)、置換された又は置換されていないアルキル、又は置換された又は置換されていないアリールラジカルを表し；
X及びYは、独立して、ヒドリド、デューテリド、ヒドロキシ、置換された又は置換されていないアルキルオキシ、置換された又は置換されていないアリールオキシ、置換された又は置換されていないアミノ、置換された又は置換されていないアルキル、置換された又は置換されていないアシル、置換された又は置換されていないスルホニル、又は置換された又は置換されていないアリールラジカルを表し；
Zは、ヒドリド、デューテリド、ヒドロキシ、置換された又は置換されていないアルキルオキシ、置換された又は置換されていないアリールオキシ、置換された又は置換されていないアミノ、置換された又は置換されていないアルキル、又は置換された又は置換されていないアリールラジカルを表し；
B1、B2、...、Bn-1、及びBnは、独立して、アデニン、チミン、グアニン、シトシン及びウラシルを含む天然核酸塩基、及び非天然核酸塩基の中から選択され；かつ、
B1、B2、...、Bn-1、及びBnの少なくとも1つは、独立して、核酸塩基対形成の性質を有する部分に共有結合で連結された置換された又は置換されていないアミノラジカルを有する非天然核酸塩基を表す。
[請求項1002]
請求項1001に記載のペプチド核酸誘導体又はその薬学的に許容可能な塩：
前記式で、
nは、5又は5より大きいが、30又は30より小さい整数であり；
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1、及びTnはヒドリドラジカルであり；
X及びYは、独立して、ヒドリド、置換された又は置換されていないアルキル、置換された又は置換されていないアシル、置換された又は置換されていないスルホニル、及び置換された又は置換されていないアリールラジカルの中から選択され；
Zは、ヒドリド、ヒドロキシ、置換された又は置換されていないアルキルオキシ、置換された又は置換されていないアミノ、置換された又は置換されていないアルキル、又は置換された又は置換されていないアリールラジカルを表し；
B1、B2、...、Bn-1、及びBnは、独立して、アデニン、チミン、グアニン、シトシン及びウラシルを含む天然核酸塩基、及び非天然核酸塩基の中から選択され；かつ、
B1、B2、...、Bn-1、及びBnの少なくとも1つが独立して、下記の式II、式III、又は式IVによって表される非天然核酸塩基の中から選択され：
0005620282.tif 000006
前記式で、
R1、R2、R3、R4、R5及びR6は、独立して、置換された又は置換されていないアルキル、ヒドリド、ヒドロキシ、及び置換された又は置換されていないアルキルオキシラジカルの中から選択され；かつ、
L1、L2及びL3は、塩基性アミノ基を核酸塩基対形成の性質を有する部分に連結させる下記の式Vによって表される共有結合性リンカーであり：
0005620282.tif 000007
前記式で、
Q1及びQmは、置換された又は置換されていないメチレン(−CH2−)ラジカルで、Qmは塩基性アミノ基に直接連結され；
Q2、Q3、...、及びQm-1は独立して、置換された又は置換されていないメチレン、酸素(−O−)、硫黄(−S−)、及び置換された又は置換されていないアミノラジカル[−N(H)−、又は−N(置換体)−]の中から選択され；かつ、
mは、2又は2より大きいが、15又は15より小さい整数である。
[請求項1003]
請求項1002に記載のペプチド核酸誘導体又はその薬学的に許容可能な塩：
前記式で、
nは、8又は8より大きいが、25又は25より小さい整数であり；
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1、及びTnはヒドリドラジカルであり；
X及びYは、独立して、ヒドリド、置換された又は置換されていないアルキル、及び置換された又は置換されていないアシルラジカルの中から選択され；
Zは、ヒドロキシ、又は置換された又は置換されていないアミノラジカルを表し；
B1、B2、...、Bn-1、及びBnは、独立して、アデニン、チミン、グアニン、シトシン及びウラシルを含む天然核酸塩基、及び非天然核酸塩基の中から選択され；
B1、B2、...、Bn-1、及びBnの少なくとも2つが独立して、式II、式III、又は式IVによって表される非天然核酸塩基の中から選択され；
R1、R2、R3、R4、R5及びR6は独立して、置換された又は置換されていないアルキル、及びヒドリドラジカルの中から選択され；
Q1及びQmは、置換された又は置換されていないメチレンラジカルで、かつQmは塩基性アミノ基に直接連結され；
Q2、Q3、...、及びQm-1は、独立して、置換された又は置換されていないメチレン、酸素、及びアミノラジカルの中から選択され；かつ、
mは、2又は2より大きいが、12又は12より小さい整数である。
[請求項1004]
請求項1002に記載のペプチド核酸誘導体又はその薬学的に許容可能な塩：
前記式で、
nは、10又は10より大きいが、25又は25より小さい整数であり；
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1、及びTnはヒドリドラジカルであり；
X及びYは、独立して、ヒドリド、及び置換された又は置換されていないアシルラジカルの中から選択され；
Zは、ヒドロキシ、アルキルオキシ、又は置換された又は置換されていないアミノラジカルを表し；かつ、
B1、B2、...、Bn-1、及びBnは、独立して、アデニン、チミン、グアニン、シトシン及びウラシルを含む天然核酸塩基、及び非天然核酸塩基の中から選択され；
B1、B2、...、Bn-1、及びBnの少なくとも3つが独立して、式II、式III、又は式IVによって表される非天然核酸塩基の中から選択され；
R1、R2、R3、R4、R5及びR6は、独立して、置換された又は置換されていないアルキル、及びヒドリドラジカルの中から選択され；
Q1及びQmはメチレンラジカルで、かつQmは塩基性アミノ基に直接連結され；
Q2、Q3、...、及びQm-1は、独立して、メチレン、酸素、及びアミノラジカルの中から選択され；かつ、
mは、2又は2より大きいが、10又は10より小さい整数である。
[請求項1005]
請求項1002に記載のペプチド核酸誘導体又はその薬学的に許容可能な塩：
前記式で、
nは、10又は10より大きいが、20又は20より小さい整数であり；
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1、及びTnはヒドリドラジカルであり；
X及びYは、独立して、ヒドリド、及び置換された又は置換されていないアシルラジカルの中から選択され；
Zは、ヒドロキシ、又は置換された又は置換されていないアミノラジカルを表し；
B1、B2、...、Bn-1、及びBnは、独立して、アデニン、チミン、グアニン、シトシン及びウラシルを含む天然核酸塩基、及び非天然核酸塩基の中から選択され；
B1、B2、...、Bn-1、及びBnの少なくとも3つが独立して、式II、式III、又は式IVによって表される非天然核酸塩基の中から選択され；
R1、R3、及びR5はヒドリドラジカルで、かつR2、R4、及びR6は独立して、ヒドリド、又は置換された又は置換されていないアミジニルラジカルを表し；
Q1及びQmはメチレンラジカルであり、かつQmは塩基性アミノ基に直接連結され；
Q2、Q3、...、及びQm-1は独立して、メチレン、酸素、及びアミノラジカルの中から選択され；かつ、
mは、2又は2より大きいが、10又は10より小さい整数である。
[請求項1006]
請求項1002に記載のペプチド核酸誘導体又はその薬学的に許容可能な塩：
前記式で、
nは、10又は10より大きいが、20又は20より小さい整数であり；
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1、及びTnはヒドリドラジカルであり；
X及びYは、独立して、ヒドリド、及び置換された又は置換されていないアシルラジカルの中から選択され；
Zは、ヒドロキシ、又は置換された又は置換されていないアミノラジカルを表し；
B1、B2、...、Bn-1、及びBnは、独立して、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、及び非天然核酸塩基の中から選択され；
B1、B2、...、Bn-1、及びBnの少なくとも3つが独立して、式II、式III、又は式IVによって表される非天然核酸塩基の中から選択され；
R1、R3、及びR5はヒドリドラジカルで、かつR2、R4、及びR6は独立して、ヒドリド又はアミジニルラジカルを表し；
Q1及びQmはメチレンラジカルで、かつQmは塩基性アミノ基に直接連結され；
Q2、Q3、...、及びQm-1は独立して、メチレン、及び酸素ラジカルの中から選択され；かつ、
mは、2又は2より大きいが、8又は8より小さい整数である。
[請求項1007]
請求項1002に記載のペプチド核酸誘導体又はその薬学的に許容可能な塩
前記式で、
nは、8又は8より大きいが、20又は20より小さい整数であり；
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1、及びTnはヒドリドラジカルであり；
Xはヒドリドラジカルであり；
Yはヒドリド、又は置換された又は置換されていないアシルラジカルを表し；
Zはヒドロキシ、又は置換された又は置換されていないアミノラジカルを表し；
B1、B2、...、Bn-1、及びBnは、独立して、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、及び非天然核酸塩基の中から選択され；
B1、B2、...、Bn-1、及びBnの少なくとも3つが独立して、式II、式III、又は式IVによって表される非天然核酸塩基の中から選択され；
R1、R3、及びR5はヒドリドラジカルで、かつR2、R4、及びR6は独立して、ヒドリド又はアミジニルラジカルを表し；
L1は、右端が塩基性アミノ基と直接連結された−(CH2)2−O−(CH2)2−、−CH2−O−(CH2)2−、又は−CH2−O−(CH2)3−を表し；かつ、
L2及びL3は、独立して、右端が塩基性アミノ基と直接連結された−(CH2)2−O−(CH2)2−、−(CH2)3−O−(CH2)2−、−(CH2)2−O−(CH2)3−、−(CH2)2−、−(CH2)3−、−(CH2)4−、−(CH2)5−、−(CH2)6−、−(CH2)7−、及び−(CH2)8−の中から選択される。
[請求項1008]
治療目的のために、請求項1001〜1007のいずれか一項記載のペプチド核酸誘導体又はその薬学的に許容可能な塩の治療的に有効な量を含む、薬学的組成物。
[請求項1009]
診断目的のために、請求項1001〜1007のいずれか一項記載のペプチド核酸誘導体又はその塩を使用する方法。
[請求項1010]
細胞の蛋白質発現のインビトロ調節のために、請求項1001〜1007のいずれか一項記載のペプチド核酸誘導体又はその塩を使用する方法。
[請求項1011]
式VIの化合物：
0005620282.tif 000008
前記式で、
R7は、ヒドリド、N−スクシニル、又は置換された又は置換されていないアルキルラジカルであり；
P1は、ヒドリド、t−ブトキシカルボニル、(9H−フルオレン−9−イル)メトキシ−カルボニル、置換された又は置換されていないベンジルオキシカルボニル、及び置換された又は置換されていないアリールスルホニルラジカルの中から選択され；
P2は、ヒドリド、t−ブトキシカルボニル、(9H−フルオレン−9−イル)メトキシ−カルボニル、置換された又は置換されていないベンジルオキシカルボニル、置換されたアルキルオキシカルボニル、置換された又は置換されていないアルキル、アミジニル、1,3−ビス(t−ブトキシ−カルボニル)アミジニル、1,3−ビス−(ベンジルオキシカルボニル)アミジニルラジカルの中から選択され；かつ、
L1は式Vによって表されるリンカーであり：
0005620282.tif 000009
前記式で、
Q1及びQmは、置換された又は置換されていないメチレンラジカルで、かつQmはアミノラジカルに直接連結され；
Q2、Q3、...、及びQm-1は、独立して、置換された又は置換されていないメチレン、酸素、硫黄、及び置換された又は置換されていないアミノラジカルの中から選択され；かつ、
mは、2又は2より大きいが、15又は15より小さい整数である。
[請求項1012]
式VIIの化合物：
0005620282.tif 000010
前記式で、
R8は、ヒドリド、N−スクシニル、又は置換された又は置換されていないアルキルラジカルであり；
P1は、ヒドリド、t−ブトキシカルボニル、(9H−フルオレン−9−イル)メトキシ−カルボニル、置換された又は置換されていないベンジルオキシカルボニル、及び置換された又は置換されていないアリールスルホニルラジカルの中から選択され；
P2は、ヒドリド、t−ブトキシカルボニル、(9H−フルオレン−9−イル)メトキシ−カルボニル、置換された又は置換されていないベンジルオキシカルボニル、置換されたアルキルオキシカルボニル、置換された又は置換されていないアルキル、アミジニル、1,3−ビス(t−ブトキシ−カルボニル)アミジニル、1,3−ビス−(ベンジル−オキシカルボニル)アミジニルラジカルの中から選択され；
P3は、ヒドリド、t−ブトキシカルボニル、(9H−フルオレン−9−イル)メトキシ−カルボニル、置換された又は置換されていないベンジルオキシカルボニル、及び置換されたベンジルオキシカルボニルラジカルの中から選択され；
P4は、ヒドリド、及びt−ブトキシカルボニルラジカルの中から選択され；かつ、
L2は、式Vによって表されるリンカーであり：
0005620282.tif 000011
前記式で、
Q1及びQmは、置換された又は置換されていないメチレンラジカルで、かつQmはアミノラジカルに直接連結され；
Q2、Q3、...、及びQm-1は、独立して、置換された又は置換されていないメチレン、酸素、硫黄、及び置換された又は置換されていないアミノラジカルの中から選択され：かつ、
mは、2又は2より大きいが、15又は15より小さい整数である。
[請求項1013]
式VIIIの化合物：
0005620282.tif 000012
前記式で、
R9は、ヒドリド、N−スクシニル、又は置換された又は置換されていないアルキルラジカルであり；
P1は、ヒドリド、t−ブトキシカルボニル、(9H−フルオレン−9−イル)メトキシ−カルボニル、置換された又は置換されていないベンジルオキシカルボニル、及び置換された又は置換されていないアリールスルホニルラジカルの中から選択され；
P2は、ヒドリド、t−ブトキシカルボニル、(9H−フルオレン−9−イル)メトキシ−カルボニル、置換された又は置換されていないベンジルオキシカルボニル、置換されたアルキルオキシカルボニル、置換された又は置換されていないアルキル、アミジニル、1,3−ビス(t−ブトキシ−カルボニル)アミジニル、1,3−ビス−(ベンジル−オキシカルボニル)アミジニルラジカルの中から選択され；かつ、
L3は、式Vによって表されるリンカーであり：
0005620282.tif 000013
前記式で、
Q1及びQmは、置換された又は置換されていないメチレンラジカルであり、かつQmはアミノラジカルに直接連結され；
Q2、Q3、...、及びQm-1は、独立して、置換された又は置換されていないメチレン、酸素、硫黄、及び置換された又は置換されていないアミノラジカルの中から選択され；かつ、
mは、2又は2より大きいが、15又は15より小さい整数である。
[請求項1014]
式IXの化合物：
0005620282.tif 000014
前記式で、
R10は、ヒドロキシ、置換された又は置換されていないアルキルオキシ、又は置換された又は置換されていないアミノラジカルであり；
P2は、ヒドリド、t−ブトキシカルボニル、(9H−フルオレン−9−イル)メトキシ−カルボニル、置換された又は置換されていないベンジルオキシカルボニル、置換されたアルキルオキシカルボニル、置換された又は置換されていないアルキル、アミジニル、1,3−ビス(t−ブトキシ−カルボニル)アミジニル、1,3−ビス−(ベンジルオキシカルボニル)アミジニルラジカルの中から選択され；かつ、
L1は、式Vによって表されるリンカーであり：
0005620282.tif 000015
前記式で、
Q1及びQmは、置換された又は置換されていないメチレンラジカルであり、かつQmはアミノラジカルに直接連結され；
Q2、Q3、...、及びQm-1は、独立して、置換された又は置換されていないメチレン、酸素、硫黄、及び置換された又は置換されていないアミノラジカルの中から選択され；かつ、
mは、2又は2より大きいが、15又は15より小さい整数である。
[請求項1015]
式Xの化合物：
0005620282.tif 000016
前記式で、
R11は、ヒドロキシ、置換された又は置換されていないアルキルオキシ、又は置換された又は置換されていないアミノラジカルであり；
P2は、ヒドリド、t−ブトキシカルボニル、(9H−フルオレン−9−イル)メトキシ−カルボニル、置換された又は置換されていないベンジルオキシカルボニル、置換されたアルキルオキシカルボニル、置換された又は置換されていないアルキル、アミジニル、1,3−ビス(t−ブトキシ−カルボニル)アミジニル、1,3−ビス−(ベンジル−オキシカルボニル)アミジニルラジカルの中から選択され；
P3は、ヒドリド、t−ブトキシカルボニル、(9H−フルオレン−9−イル)メトキシ−カルボニル、置換された又は置換されていないベンジルオキシカルボニル、及び置換されたベンジルオキシカルボニルラジカルの中から選択され；
P4は、ヒドリド、及びt−ブトキシカルボニルラジカルの中から選択され；かつ、
L2は、式Vによって表されるリンカーであり：
0005620282.tif 000017
前記式で、
Q1及びQmは置換された又は置換されていないメチレンラジカルであり、かつQmはアミノラジカルに直接連結され；
Q2、Q3、...、及びQm-1は、独立して、置換された又は置換されていないメチレン、酸素、硫黄、及び置換された又は置換されていないアミノラジカルの中から選択され；かつ、
mは、2又は2より大きいが、15又は15より小さい整数である。
[請求項1016]
式XIの化合物：
0005620282.tif 000018
前記式で、
R12は、ヒドロキシ、置換された又は置換されていないアルキルオキシ、又は置換された
P2は、ヒドリド、t−ブトキシカルボニル、(9H−フルオレン−9−イル)メトキシ−カルボニル、置換された又は置換されていないベンジルオキシカルボニル、置換されたアルキルオキシカルボニル、置換された又は置換されていないアルキル、アミジニル、1,3−ビス(t−ブトキシ−カルボニル)アミジニル、1,3−ビス−(ベンジル−オキシカルボニル)アミジニルラジカルの中から選択され；かつ、
L3は、式Vによって表されるリンカーであり：
0005620282.tif 000019
前記式で、
Q1及びQmは置換された又は置換されていないメチレンラジカルで、かつQmはアミノラジカルに直接連結され；
Q2、Q3、...、及びQm-1は、独立して、置換された又は置換されていないメチレン、酸素、硫黄、及び置換された又は置換されていないアミノラジカルの中から選択され；かつ、
mは、2又は2より大きいが、15又は15より小さい整数である。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】逆相HPLCによるオリゴ17の精製前および後のHPLCクロマトグラムを提供する。
【図２】オリゴ17の精製されたバッチに関するMALDI-TOF質量スペクトルを提供する。
【図３】相補的又はミスマッチDNAに対するオリゴ17の温度による吸光度の変化グラフを提供する。
【図４】(a)及び(b)は、HeLa細胞をそれぞれ5μMのオリゴ1及びオリゴ2で処理し、1、2、3及び24時間後の共焦点顕微鏡イメージ(63x対物レンズで)を提供する。
【図５】(a)及び(b)は、MCF-7細胞をそれぞれ2.5μMのオリゴ6及びオリゴ7で処理し、0.5及び1時間後の共焦点顕微鏡イメージ(63x対物レンズで)を提供する。
【図６】(a)及び(b)は、HeLa細胞をそれぞれ1μMのオリゴ1及びオリゴ6で処理し、6または24時間後の共焦点顕微鏡イメージ(40x対物レンズで)を提供する。
【図７−１】(a)及び(b)は、JAR細胞をそれぞれ2μMのオリゴ21及びオリゴ28で処理し、24時間後の共焦点顕微鏡イメージ(40x対物レンズで)を提供する。(c)及び(d)は、A549細胞をそれぞれ2μMのオリゴ21及びオリゴ28で処理し、24時間後の共焦点顕微鏡イメージ(40x対物レンズで)を提供する。
【図７−２】(e)及び(f)は、HeLa細胞をそれぞれ2μMのオリゴ21及びオリゴ28で処理し、12時間後の共焦点顕微鏡イメージ(40x対物レンズで)を提供する。(g)は、HeLa細胞を2μMのオリゴ21で処理し、24時間後の共焦点顕微鏡イメージ(40x対物レンズで)を提供する。
【図８】(a)、(b)及び(c)は、HeLa、A549、及びJAR細胞をそれぞれ2μMのオリゴ22で処理し、24時間後の共焦点顕微鏡イメージ(40x対物レンズで)を提供する。
【図９】5μM又は10μMのオリゴ9、5μM又は10μMのオリゴ10、それぞれ5μM又は10μMでオリゴマーで併用処理、及びブランク(オリゴマー処理なし)で処理されたJAR細胞に対するウェスタンブロッティング結果を提供する。
【図１０】本発明のPNAオリゴマーに関する代表的な構造である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
発明の詳細な説明
本発明は、下記の式Iによって表される新たな種類のPNAオリゴマー又はその薬学的に許容可能な塩を提供する：
0005620282.tif 000020
前記式で、
nは5又は5より大きい整数であり；
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1、及びTnは独立して、ヒドリド、デューテリド、置換された又は置換されていないアルキル、又は置換された又は置換されていないアリールラジカルを表し；
X及びYは、独立して、ヒドリド、デューテリド、ヒドロキシ、置換された又は置換されていないアルキルオキシ、置換された又は置換されていないアリールオキシ、置換された又は置換されていないアミノ、置換された又は置換されていないアルキル、置換された又は置換されていないアシル、置換された又は置換されていないスルホニル、又は置換された又は置換されていないアリールラジカルを表し；
Zは、ヒドリド、デューテリド、ヒドロキシ、置換された又は置換されていないアルキルオキシ、置換された又は置換されていないアリールオキシ、置換された又は置換されていないアミノ、置換された又は置換されていないアルキル、又は置換された又は置換されていないアリールラジカルを表し；
B1、B2、...、Bn-1、及びBnは、独立して、アデニン、チミン、グアニン、シトシン及びウラシルを含む天然核酸塩基及び非天然核酸塩基の中から選択され；かつ、
B1、B2、...、Bn-1、及びBnの少なくとも1つは、独立して、核酸塩基対形成の性質を有する部分に共有結合で連結された置換された又は置換されていないアミノラジカルを有する非天然核酸塩基を表す。
【００４０】
本発明のPNAオリゴマーは、対応する「修飾されていない」PNAオリゴマーと比べて向上した細胞透過性と核酸に対する結合を示す。本発明で、「修飾されていない」PNAオリゴマーとは、式IのPNAオリゴマーを表し、ここで、S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1、及びTnはヒドリドラジカル；及びB1、B2、...、Bn-1、及びBnは、独立して、アデニン、チミン、グアニン、及びシトシンを含む天然核酸塩基の中から選択される。
【００４１】
本発明のPNAオリゴマーは、哺乳動物の細胞膜を容易に通過し、細胞内核酸又は核蛋白質に配列特異的に結合して細胞機能に影響を及ぼしたり、又は変化させることができる。
【００４２】
式IのPNAオリゴマーは、mRNAに強く結合してリボソームによる蛋白質合成を強く阻害できる。本発明のPNAオリゴマーはプレ−mRNAに強く結合でき、mRNA生成時のプレ−mRNAのスプライシングを変えることができる。また、本発明のPNAオリゴマーはマイクロRNAに強く結合でき、マイクロRNAによって誘導されたmRNA分解を阻害できる。
【００４３】
式IのPNAオリゴマーは、リボ核蛋白質、例えばテロメラーゼの核酸ドメインに予測可能に結合して生理学的機能を調節できる。本発明のPNAオリゴマーは、遺伝子に結合して遺伝子の転写を調節できる。式IのPNAオリゴマーは、ウイルス遺伝子又はその転写物に結合してウイルスの増殖を抑制できる。本発明のPNAオリゴマーは、哺乳動物細胞内において、核酸又は核蛋白質に配列特異的に結合して上述のものと異なる細胞機能に影響を及ぼすことができる。また、本発明のPNAオリゴマーは、バクテリアmRNA、核酸、又は遺伝子に強く結合してバクテリア増殖を抑制したりバクテリアの生合成プロファイルを変化させることができる。
【００４４】
本発明のPNAオリゴマーが相補的DNA対応部分に結合する場合、塩基ミスマッチに非常に敏感で且つ高い正確度で単一塩基多型(SNP)を検出するのに適している。本発明のPNAオリゴマーは、高い配列特異性を有し、且つ相補的DNAに強く結合するため、遺伝子プロファイリングに有用である。式IのPNAオリゴマーは、もし発色団、例えば蛍光体で適当にタグ付けされる場合、細胞内にテロメアのように核酸部位を有する分子の位置を探したり検索するのに有用である。本発明のPNAオリゴマーは、上述のもの以外の様々な診断や分析目的で有用であり得る。
【００４５】
本発明のPNAオリゴマーは、対応する「修飾されていない」PNAオリゴマーに比べて優れた水溶解度を有するため、水、食塩水、又は緩衝溶液に溶かして使用できる。式IのPNAオリゴマーは、カチオン性脂質、例えばリポフェクタミンと一緒に剤形化できる。本発明のPNAオリゴマーは、相補的DNAとデュープレックスを作ることができ、その結果生じたデュープレックスは、カチオン性脂質と一緒に剤形化できる。
【００４６】
本発明のPNAオリゴマーは、様々な投薬形態、例えば非制限的に、注射剤、鼻腔スプレー、錠剤、顆粒、硬質カプセル、軟質カプセル、リポゾーム剤形、経口用懸濁液、経皮剤形、等に剤形化できる。
【００４７】
本発明のPNAオリゴマーを治療学的に効果的な容量で被検者に投与でき、投与容量は適応症、投薬経路、投薬スケジュール、被検者の状態等によって様々である。
【００４８】
本発明のPNAオリゴマーを様々な経路、例えば、非制限的に静脈注射、皮下注射、腹腔注射、鼻吸入、経口投与、経皮投与、等によって被検者に投与できる。
【００４９】
式IのPNAオリゴマーを薬学的に許容可能な補助剤、例えば非制限的にクエン酸、塩酸、酒石酸、ステアリン酸、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エタノール、重炭酸ナトリウム、蒸留水、ヒアルロン酸、リポフェクタミンのようなカチオン性脂質、デンプン、ゼラチン、タルク、アスコルビン酸、オリーブ油、ヤシ油、メチルセルロース、酸化チタニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、甘味料、防腐剤、等と一緒に被検者に投与できる。
【００５０】
本発明のPNAオリゴマーは、塩基又は酸の官能基の存在に依存して、薬学的に許容可能な酸又は塩基、例えば、非制限的に水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、塩酸、メタンスルホン酸、クエン酸、等の当量で中和させて使用できる。
【００５１】
好ましいPNAオリゴマーは、式IのPNAオリゴマー又はその薬学的に許容可能な塩を含み：
前記式で、
nは5又は5より大きく、30又は30より小さい整数であり；
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1、及びTnはヒドリドラジカルで；
X及びYは、独立して、ヒドリド、置換された又は置換されていないアルキル、置換された又は置換されていないアシル、置換された又は置換されていないスルホニル、及び置換された又は置換されていないアリールラジカルの中から選択され；
Zはヒドリド、ヒドロキシ、置換された又は置換されていないアルキルオキシ、置換された又は置換されていないアミノ、置換された又は置換されていないアルキル、又は置換された又は置換されていないアリールラジカルを表し；
B1、B2、...、Bn-1、及びBnは、独立して、アデニン、チミン、グアニン、シトシン及びウラシルを含む天然核酸塩基、及び非天然核酸塩基の中から選択され；かつ、
B1、B2、...、Bn-1、及びBnの少なくとも1つが独立して、下記の式II、式III、又は式IVによって表される非天然核酸塩基の中から選択され：
0005620282.tif 000021
前記式で、
R1、R2、R3、R4、R5及びR6は、独立して、置換された又は置換されていないアルキル、ヒドリド、ヒドロキシ、及び置換された又は置換されていないアルキルオキシラジカルの中から選択され；かつ、
L1、L2及びL3は、塩基性アミノ基を核酸塩基対形成の性質を有する部分に連結させる下記の式Vによって表される共有結合性リンカーであり：
0005620282.tif 000022
前記式で、
Q1及びQmは置換された又は置換されていないメチレン(−CH2−)ラジカルで、Qmは塩基性アミノ基に直接連結され；
Q2、Q3、...、及びQm-1は、独立して、置換された又は置換されていないメチレン、酸素(−O−)、硫黄(−S−)、及び置換された又は置換されていないアミノラジカル[−N(H)−、又は−N(置換体)−]の中から選択され；かつ、
mは、2又は2より大きいが、15又は15より小さい整数である。
【００５２】
特に興味深いPNAオリゴマーは、式IのPNAオリゴマー又はその薬学的に許容可能な塩を含み：
前記式で、
nは8又は8より大きいが、25又は25より小さい整数であり；
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1、及びTnはヒドリドラジカルで；
X及びYは、独立して、ヒドリド、置換された又は置換されていないアルキル、及び置換された又は置換されていないアシルラジカルの中から選択され；
Zは、ヒドロキシ、又は置換された又は置換されていないアミノラジカルを表し；
B1、B2、...、Bn-1、及びBnは、独立して、アデニン、チミン、グアニン、シトシン及びウラシルを含む天然核酸塩基、及び非天然核酸塩基の中から選択され；
B1、B2、...、Bn-1、及びBnの少なくとも2つが独立して、式II、式III、又は式IVによって表される非天然核酸塩基の中から選択され；
R1、R2、R3、R4、R5及びR6は、独立して、置換された又は置換されていないアルキル、及びヒドリドラジカルの中から選択され；
Q1及びQmは置換された又は置換されていないメチレンラジカルで、Qmは塩基性アミノ基に直接連結され；
Q2、Q3、...、及びQm-1は独立して、置換された又は置換されていないメチレン、酸素、及びアミノラジカルの中から選択され；かつ、
mは2又は2より大きいが、12又は12より小さい整数である。
【００５３】
興味深いPNAオリゴマーは、式IのPNAオリゴマー、又はその薬学的に許容可能な塩を含み：
前記式で、
nは10又は10より大きいが、25又は25より小さい整数であり；
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1、及びTnはヒドリドラジカルで；
X及びYは、独立して、ヒドリド、及び置換された又は置換されていないアシルラジカルの中から選択され；
Zは、ヒドロキシ、アルキルオキシ、又は置換された又は置換されていないアミノラジカルを表し；かつ、
B1、B2、...、Bn-1、及びBnは、独立して、アデニン、チミン、グアニン、シトシン及びウラシルを含む天然核酸塩基、及び非天然核酸塩基の中から選択され；
B1、B2、...、Bn-1、及びBnの少なくとも3つが独立して、式II、式III、又は式IVによって表される非天然核酸塩基の中から選択され；
R1、R2、R3、R4、R5及びR6は、独立して、置換された又は置換されていないアルキル、及びヒドリドラジカルの中から選択され；
Q1及びQmはメチレンラジカルで、Qmは塩基性アミノ基に直接連結され；
Q2、Q3、...、及びQm-1は、独立して、メチレン、酸素、及びアミノラジカルの中から選択され；かつ、
mは、2又は2より大きいが、10又は10より小さい整数である。
【００５４】
さらに興味深いPNAオリゴマーは、式IのPNAオリゴマー、又はその薬学的に許容可能な塩を含み：
前記式で、
nは10又は10より大きいが、20又は20より小さい整数であり；
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1、及びTnはヒドリドラジカルで；
X及びYは、独立して、ヒドリド、及び置換された又は置換されていないアシルラジカルの中から選択され；
Zは、ヒドロキシ、又は置換された又は置換されていないアミノラジカルを表し；
B1、B2、...、Bn-1、及びBnは、独立して、アデニン、チミン、グアニン、シトシン及びウラシルを含む天然核酸塩基、及び非天然核酸塩基の中から選択され；
B1、B2、...、Bn-1、及びBnの少なくとも3つが独立して、式II、式III、又は式IVによって表される非天然核酸塩基の中から選択され；
R1、R3、及びR5はヒドリドラジカルで、R2、R4、及びR6は独立して、ヒドリド、又は置換された又は置換されていないアミジニルラジカルを表し；
Q1及びQmはメチレンラジカルで、Qmは塩基性アミノ基に直接連結され；
Q2、Q3、...、及びQm-1は、独立して、メチレン、酸素、及びアミノラジカルの中から選択され；かつ、
mは、2又は2より大きいが、10又は10より小さい整数である。
【００５５】
最も興味深いPNAオリゴマーは、式IのPNAオリゴマー、又はその薬学的に許容可能な塩を含み：
前記式で、
nは、10又は10より大きいが、20又は20より小さい整数であり；
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1、及びTnはヒドリドラジカルで；
X及びYは、独立して、ヒドリド、及び置換された又は置換されていないアシルラジカルの中から選択され；
Zは、ヒドロキシ、又は置換された又は置換されていないアミノラジカルを表し；
B1、B2、...、Bn-1、及びBnは、独立して、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、及び非天然核酸塩基の中から選択され；
B1、B2、...、Bn-1、及びBnの少なくとも3つが独立して、式II、式III、又は式IVによって表される非天然核酸塩基の中から選択され；
R1、R3、及びR5はヒドリドラジカルで、R2、R4、及びR6は独立して、ヒドリド又はアミジニルラジカルを表し；
Q1及びQmはメチレンラジカルで、Qmは塩基性アミノ基に直接連結され；
Q2、Q3、...、及びQm-1は、独立して、メチレン、及び酸素ラジカルの中から選択され；かつ、
mは、2又は2より大きいが、8又は8より小さい整数である。
【００５６】
強い興味のある具体的なPNAオリゴマーは、式IのPNAオリゴマー、又はその薬学的に許容可能な塩を含み：
前記式で、
nは8又は8より大きいが、20又は20より小さい整数であり；
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1、及びTnはヒドリドラジカルで；
Xはヒドリドラジカルで；
Yは、ヒドリド、又は置換された又は置換されていないアシルラジカルを表し；
Zは、ヒドロキシ、又は置換された又は置換されていないアミノラジカルを表し；
B1、B2、...、Bn-1、及びBnは、独立して、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、及び非天然核酸塩基の中から選択され；
B1、B2、...、Bn-1、及びBnの少なくとも3つが独立して、式II、式III、又は式IVによって表される非天然核酸塩基の中から選択され；
R1、R3、及びR5はヒドリドラジカルで、R2、R4、及びR6は独立して、ヒドリド又はアミジニルラジカルを表し；
L1は、右端が塩基性アミノ基と直接連結された−(CH2)2−O−(CH2)2−、−CH2−O−(CH2)2−、又は−CH2−O−(CH2)3−を表し；かつ、
L2及びL3は、独立して、右端が塩基性アミノ基と直接連結された−(CH2)2−O−(CH2)2−、−(CH2)3−O−(CH2)2−、−(CH2)2−O−(CH2)3−、−(CH2)2−、−(CH2)3−、−(CH2)4−、−(CH2)5−、−(CH2)6−、−(CH2)7−、及び−(CH2)8−の中から選択される。
【００５７】
本発明のPNAオリゴマーに対して、前記に使用された用語及び略語は、下記の表に説明した。
0005620282.tif 000023
【００５８】
一般的な合成方法
本発明の分子の特性に関するNMRスペクトルは、Varian Mercury 300MHz, Bruker Avance 400MHz、又はVarian Inova 500MHz NMR分光計で記録した。Bruker Daltonics Ultraflex MALDI-TOF、又はAgilent LC/MS Ion Trap Systemを分子量測定のために利用した。PNAオリゴマーは、Hewlett Packard 1050 HPLC、又はShimazu LC-6AD HPLCにおけるC18−逆相HPLCによって分析し精製した。特に断らない場合、シリカゲルは本発明で製造された低分子のクロマトグラフィー分離のために使用した。融点は補正せず報告する。
【００５９】
本発明のPNAモノマーの合成のために使用された非天然核酸誘導体は、実際の合成実施例で特に他の説明がない場合は、下記に提供した合成法(合成法A、B、及びC)のいずれかによって、又は若干の修飾を通じて製造した。
【００６０】
合成法A：6−アルキル−ピロロシトシン誘導体は、反応式1に従うか、これを若干修飾して適切に保護しながら合成した。前記6−アルキル−ピロロシトシン誘導体は、シトシン等価物として式IIによって表される核酸塩基を含むPNAモノマーを合成するために使用した。
【００６１】
先ず、化合物aをNaHで脱プロトン化させ、次いでエチルブロモアセテートでアルキル化して化合物bを得た。化合物bをパラジウム触媒下に末端のアセチレン誘導体とカップリングさせ、反応中に環化させて化合物cを得た(Nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids vol 22, 1029-1033, 2003)。
0005620282.tif 000024
【００６２】
合成法B：2,6−ジアミノプリン誘導体は、反応式2に従うか、これを若干修飾して適切に保護しながら合成した。前記2,6−ジアミノプリン誘導体は、アデニン等価物として式IIIによって表される核酸塩基を含むPNAモノマーを合成するために使用した。
【００６３】
先ず、2−ハロアデニンを高温でジアミンと反応させ化合物dを得た後、Boc2Oと反応させて化合物eを得た。化合物eをNaHで脱プロトン化させ、エチルブロモアセテートでアルキル化して化合物fを得た。化合物fの芳香族アミノ基をCbz又はBoc基で保護させて化合物gを得た。
0005620282.tif 000025
【００６４】
合成法C：N−アルキル化されたグアニン誘導体は、反応式3に従うか、これを若干修飾して適切に保護しながら合成した。前記グアニン誘導体は、グアニン等価物として式IVによって表される核酸塩基を含むPNAモノマーを合成するために使用した。
0005620282.tif 000026
【００６５】
先ず、2−ハロヒポキサンチンをジアミンと高温で反応させて化合物hを得た後、Boc2Oと反応させて化合物iを得た。化合物iをNaHで脱プロトン化させ、エチルブロモアセテートでアルキル化して化合物jを得た。
【００６６】
式IのPNAオリゴマーを製造するために、合成法D又は合成法Eに従い二つの型のPNAモノマーを合成した。シーティアイバイオの要請に従い、反応式4の型oのPNAモノマーを使用してパナジン社(www.panagene.com、テジョン、韓国)によってPNAオリゴマーを製造した。一方、反応式5の型qのPNAモノマーは、従来技術に開示されている方法に従って、又はこれを若干修飾してPNAオリゴマーの合成のために自体的に使用した(米国特許6,133,444)。
【００６７】
合成法D：修飾された核酸塩基を有するPNAモノマーは、反応式4に従って、又はこれを若干修飾し、文献で開示されたPNAオリゴマー合成方法のために適切に保護されるように製造した(Org. Lett. vol 9, 3291-3293, 2006)。反応式4で化合物kは、反応式1の化合物c、反応式2の化合物g、又は反応式3の化合物jに該当し得るが、必ずしもこれらエステル化合物のいずれか1つに限定されるのではない。
0005620282.tif 000027
【００６８】
先ず、エステルkをアルカリ加水分解して酸Iを得た後、IをエチルN−[2−{N−(2−ベンゾチアゾリニル)スルホニルアミノ}エチル]−グリシナートとカップリングして化合物mを得た。化合物mをLiOHで注意深く加水分解して酸nを得た後、nをEDCIカップリング反応によって環化して修飾されたPNAモノマーoを得た。PNAモノマーoに関する化学的構造を本発明では反応式4でのように仮定しているが、文献によるとこのように指定された(assigned)構造のPNAモノマーから成功的にPNAオリゴマーが得られた(Org. Lett. vol 9, 3291-3293, 2006)。
【００６９】
合成法E：一方、修飾された核酸塩基を有するPNAモノマーは、反応式5に従うか、これを若干修飾して従来技術で提供されたPNAオリゴマー合成方法のために適切に保護されるように製造した(米国特許6,133,444)。反応式5で化合物kは、反応式1の化合物c、反応式2の化合物g、又は反応式3の化合物jに該当し得るが、必ずしもこれらエステル化合物のいずれかに限定されるのではない。
0005620282.tif 000028
【００７０】
先ず、酸IをエチルN−[2−{N−(9H−フルオレン−9−イル)アミノ}エチル]−グリシナートとカップリングしてEDCIカップリング反応によって化合物pを得た。次いで、化合物pをLiOHで注意深く加水分解して修飾された核酸塩基を有するPNAモノマーqを得た。
【実施例】
【００７１】
下記の実施例は、本発明の化合物に関する製造方法の細部的な技術を含む。このような実施例の細部的な技術は、単に例示的な目的で示すだけで、本発明を制限して解釈してはならない。このような細部的技術の大部分は本発明の範囲に属し、本発明の一部を成す上述の一般的な合成方法を例示するために提供する。下記の実施例に使用されている略語は下表に定義する。
0005620282.tif 000029
【００７２】
実施例1：3−{(t−ブトキシカルボニル)アミノ}−1−プロパノール(1)の製造
0005620282.tif 000030
150mlのTHF及び150mlの水に溶かした14gの3−アミノ−1−プロパノールに、100mlのTHFに溶かした40.7gのBoc2Oを30分に亘り滴加した。反応混合物を24時間攪拌した後、前記THFを減圧下で除去した。生成された水溶液層を200mlのEAで抽出し、有機層を0.5Mクエン酸水溶液と蒸留水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで脱水した。硫酸マグネシウムをろ過して除去し、残ったろ液を真空で濃縮して無色液体で25gの化合物1を得た。
0005620282.tif 000031
【００７３】
実施例2：エチル{(N−ベンゾイル)−5−ヨードシトシン−1−イル}アセテート(2)の製造
60mlのDMFに溶かした8.3gのN−ベンゾイル−5−ヨードシトシンの溶液を、0℃で攪拌しながら55%のNaH／ミネラルオイル1.06gを添加し、前記溶液を2時間室温で攪拌した。2.7mlのエチルブロモアセテートを前記反応混合物に添加した後、前記反応溶液を室温で24時間さらに攪拌し、減圧下で溶媒を除去した。得られた残留物を溶かし、溶けていない物質をろ過して除去した。前記ろ液を塩化アンモニウム飽和水溶液で2回洗浄し、無水硫酸マグネシウムで脱水した後、真空で濃縮した。生成された残留物をカラムクロマトグラフィー(1：1ヘキサン／EA)によって精製して黄色固体で6.5gの化合物2(反応式1で化合物b)を得た。融点154−5度。
0005620282.tif 000032
【００７４】
実施例3：3−{3−(t−ブトキシカルボニルアミノ)プロピルオキシ}−1−プロピン(3)の製造
0005620282.tif 000033
55%のNaH／ミネラルオイル6.5gを0℃で150mlのTHFに分散させた後、25gの化合物1を15分に亘り滴加し、前記混合物を1時間攪拌した。17.5mlのプロパルギルブロマイド(80%のトルエン溶液)を30分間滴加した後、前記反応混合物を室温で20時間攪拌した。250mlの水をゆっくり添加しながら前記反応を終了させ、THFを減圧下で除去した。次いで、残った水溶液混合物を250mlのEAで抽出し、250mlの水で3回洗浄した。前記有機層を無水硫酸マグネシウムで脱水し、硫酸マグネシウムをろ過して除去した。得られたろ液を真空で濃縮させ、カラムクロマトグラフィー(5：1ヘキサン／EA)によって黄色液体で22.7gの化合物3を得た。
0005620282.tif 000034
【００７５】
実施例4：4−{2−(t−ブトキシカルボニルアミノ)エトキシ}−1−ブチン(4)の製造
0005620282.tif 000035
17mlのTHFに溶かした3.8gの4−(2−アジドエトキシ)−1−ブチンに7.2gのトリフェニルホスフィン及び0.7mlの水を添加し、前記反応混合物を8時間攪拌した後、減圧下で溶媒を除去した。次いで、得られた残留物を20mlのEAに溶かし、10mlの1M HCl水溶液で2回抽出した。炭酸ナトリウム水溶液を水溶液層に加えてpHを9〜10に調節した。15mlのTHFに溶かした5.96gのBoc2Oを溶液に加え、前記反応混合物を12時間攪拌した。THFを真空で除去した後、得られた溶液をEAで抽出した。有機層を0.5Mのクエン酸水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで脱水した。前記有機層をカラムクロマトグラフィー(9：1ヘキサン／EA)によって濃縮し、精製して黄色オイルで3.4gの化合物4を得た。
0005620282.tif 000036
【００７６】
実施例5：3−{2−(t−ブトキシカルボニルアミノ)エトキシ}−1−プロピン(5)の製造
0005620282.tif 000037
20gの2−{(t−ブトキシカルボニル)アミノ}−1−エタノールを実施例3で記述した方法と同様に反応させ、精製して淡い黄色のオイルで23.7gの化合物5を得た。
0005620282.tif 000038
【００７７】
実施例6：3−[N−{3−(t−ブトキシカルボニルアミノ)プロピル}−N−(t−ブトキシ−カルボニル)アミノ]−1−プロピン(6)の製造
0005620282.tif 000039
83mlのTHF及び95mlの水に溶かしたN−[3−(t−ブトキシカルボニルアミノ)プロピル]−N−(2−プロピニル)アミンの溶液を攪拌しながら室温で42gのBoc2Oを滴加した。前記反応溶液を1.5時間攪拌した後、真空で濃縮した。得られた水溶液層をEAで抽出した。EA層を連続して0.5Mのクエン酸水溶液及び塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで脱水し減圧下で濃縮して、カラムクロマトグラフィー(1：1ヘキサン／EA)によって精製し黄色オイルで19gの化合物6を得た。
0005620282.tif 000040
【００７８】
実施例7：3−[2−{2,3−ビス(ベンジルオキシカルボニル)グアニジノ}エトキシ]−1−プロピン(7)の製造
0005620282.tif 000041
110mlのMCに溶かした10.9gの化合物5の溶液を攪拌しながら、2時間、0℃で110mlのTFAを滴加し、前記反応混合物を3時間さらに攪拌した。前記反応溶液を減圧下で濃縮させ、得られた残留物を0℃で40mlのMCに溶かし、12.3mlのTEAを加えた後、室温で8.8gの1,3−ビス(ベンジルオキシカルボニル)−2−(メチルチオ)シュードウレアを加えた。前記反応溶液を4時間攪拌し、水で2回洗浄した。前記有機層を無水硫酸マグネシウムで脱水し、真空で濃縮してカラムクロマトグラフィー(5：1ヘキサン／EA)によって白色固体で9.8gの化合物7を得た。
0005620282.tif 000042
【００７９】
実施例8：2−{(t−ブトキシカルボニル)アミノ}−1−(2−プロピニル−1−オキシ)}−(R)−プロパン(8)の製造
0005620282.tif 000043
10.8gのt−ブチル−(R)−1−ヒドロキシ−（プロパン−2−イル）カーバメートを実施例3で記述された方法と同様に反応させ、精製させて黄色オイルで10.1gの化合物8を得た。
0005620282.tif 000044
【００８０】
実施例9：N−[2−{2−(t−ブトキシカルボニル)アミノエトキシ}エチル]−N−[2−{3−ブチニル)−1−オキシ}エチル]−N−(t−ブトキシカルボニル)アミン(9)の製造
0005620282.tif 000045
60mlのアセトニトリルに溶かした5gの2−{(3−ブチニル)−1−オキシ}エチルメタンスルホナート、及び5.32gの2−[2−{2−(t−ブトキシカルボニル)アミノ}エチル−1−オキシ]エチルアミン溶液を攪拌しながら水に溶かした3.6gの炭酸カリウムを0℃で滴加した。反応溶液が室温になるよう徐々に暖め、24時間さらに攪拌した後、減圧下で濃縮させた。得られた残留物をMCに溶かして水に洗浄した。有機層を濃縮し80mlのTHF及び80mlの水に溶かした後、50mlのTHFに溶かした8.4gのBoc2Oを付加した。前記反応混合物を16時間室温で攪拌した後、真空でTHFを除去しEAで抽出した。前記有機層を0.5Mのクエン酸水溶液、水、及び塩水で連続的に洗浄した。前記有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水し、濃縮させ、カラムクロマトグラフィー(ヘキサン→1：4 EA／ヘキサン)によって精製し淡い黄色オイルで2.45gの化合物9を得た。
0005620282.tif 000046
【００８１】
実施例10：エチル2−[6−{3−(t−ブトキシカルボニルアミノ)プロピル−1−オキシ}−メチル−2−オキソ−2H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−3(7H)−イル]アセテート(10)の製造
0005620282.tif 000047
120mlのDMFに溶かした6.5gの化合物2の溶液を攪拌しながら、580mgのCuI、4.2mlのTEA、9.74gの化合物3、及び1.76gのPd(PPh3)4を連続的に加えた。次いで、前記反応混合物を50℃で24時間、光を遮断して攪拌した後、減圧下で濃縮させた。得られた残留物を250mlのEtOHに溶かし、18時間還流攪拌した。次いで、前記溶液を真空下で濃縮し、クロマトグラフィー分離(95：5 EA/EtOH)によって赤黒い泡／固体で2.3gの化合物10を得た。
0005620282.tif 000048
【００８２】
実施例11：2−[6−{3−(t−ブトキシカルボニルアミノ)プロピル−1−オキシ}メチル−2−オキソ−2H−ピロロ−[2,3−d]ピリミジン−3(7H)−イル]酢酸(11)の製造
0005620282.tif 000049
3.3gの化合物10に15mlのTHF、30mlの水、及び次いで760mgのLiOHを加え、前記混合物を室温で20分間攪拌した。THFを減圧下で除去した後、得られた水溶液をジエチルエーテルで洗浄した。水溶液層を1M HClの水溶液でpH3まで酸性化し、EAで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水し、真空で濃縮させて白色固体で2.46gの化合物11を得た。
0005620282.tif 000050
【００８３】
実施例12：エチルN−[2−{(ベンゾ[d]チアゾール−2−スルホニル)アミノ}エチル]−N−[2−[6−{3−(t−ブトキシカルボニルアミノ)プロピル−1−オキシ}メチル−2−オキソ−2H−ピロロ−[2,3−d]ピリミジン−3(7H)−イル]アセチル]グリシナート(12)の製造
0005620282.tif 000051
30mlのDMFに溶かした4.0gの化合物11及び3.6gのエチルN−[2−{(ベンゾ[d]チアゾール−2−スルホニル)アミノ}エチル]グリシナートに室温で2.42gのEDCI及び1.70gのHOBtを加えた。前記反応混合物を8時間攪拌した。溶媒を真空下で除去した後、得られた残留物をMCに溶かし、1M HCl水溶液及び水で順に洗浄した。MC層を減圧下で濃縮させ、カラムクロマトグラフィー(95：5 MC/MeOH)によって精製させて黄色泡／固体で4.6gの化合物12を得た。
0005620282.tif 000052
【００８４】
実施例13：N−[2−{(ベンゾ[d]チアゾール−2−スルホニル)アミノ}エチル]−N−[2−[6−{3−(t−ブトキシカルボニルアミノ)プロピル−1−オキシ}メチル−2−オキソ−2H−ピロロ−[2,3−d]−ピリミジン−3(7H)−イル]アセチル]グリシン(13)の製造
0005620282.tif 000053
4.5gの化合物12及び670mgのLiOHを20mlのTHF及び20mlの水に分散させ、20分間室温で攪拌した。THFを真空下で除去し、得られた水溶液をジエチルエーテルで洗浄した。水溶液層を1M HCl水溶液でpH3まで酸性化し、EAで抽出した。EA層を無水硫酸ナトリウムで脱水させ、減圧下で濃縮させて暗黄色固体で4.4gの化合物13を得た。
0005620282.tif 000054
【００８５】
実施例14：1−{(ベンゾ[d]チアゾール−2−スルホニル)}−2−オキソ−4−[6−{3−(t−ブトキシカルボニルアミノ)プロピル−1−オキシ}メチル−2−オキソ−2H−ピロロ[2,3-d]ピリミジン−3(7H)−イル]アセチル]ピペラジン(14)の製造
0005620282.tif 000055
50mlのDMF中に4.4gの化合物13及び1.49gのEDCIを室温で16時間攪拌した。前記反応混合物を真空下で濃縮させた後、得られた残留物を50mlのMCに溶かした。MC溶液を1M HCl水溶液及び水に連続的に洗浄し、真空下で濃縮させた後、カラムクロマトグラフィー(アセトン)によって精製させて褐色泡／固体で1.5gの化合物14を得た。
0005620282.tif 000056
【００８６】
アセチレン誘導体4〜9から出発し、ピロロシトシン誘導体15〜20を実施例10に記述した方法と同様に製造した。化合物15〜20に関するスペクトル及び物理的データを下記の表に提供した。
【００８７】
実施例15〜20：ピロロシトシン誘導体15〜20に関する分析データ
0005620282.tif 000057
0005620282.tif 000058
【００８８】
ピロロシトシン誘導体15、16、17、及び20から出発して、修飾されたシトシンPNAモノマー21〜24を実施例11〜14に記述した方法と同様に製造した。化合物21〜24に関するスペクトル及び物理的データを下記の表に提供した。
【００８９】
実施例21〜24：シトシンPNAモノマー21〜24に関する分析データ。
0005620282.tif 000059
0005620282.tif 000060
【００９０】
実施例25：2−{3−(t−ブトキシカルボニルアミノ)プロピル}アミノアデニン(25)の製造。
0005620282.tif 000061
68mlの1,3−ジアミノプロパン及び68mlのモノメトキシエタノールに溶かした6.8gの2−クロロアデニンを24時間還流攪拌し、前記反応混合物を真空下で濃縮させた。得られた残留物を100mlのTHF及び100mlの水に溶かした後、70mlのTHFに溶かした60gのBoc2Oをゆっくり加えた。前記反応混合物を6時間室温で攪拌した後、有機溶媒を減圧下で除去した。得られた水溶液層を100mlのEAで2回抽出した。有機層を0.5Mのクエン酸水溶液及び塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで脱水した。前記有機層を減圧下で濃縮させ、クロマトグラフィー分離(1：10 MeOH/MC)によって二つのBoc基で保護された4.07gの化合物を得た。この化合物を100mlのMeOHに溶かした後、45mlの炭酸ナトリウム飽和水溶液をゆっくり加えた。前記反応溶液を1時間、50℃で攪拌した後、真空下で濃縮させた。得られた残留物を50mlのMeOHに溶かし、溶けない物質をろ過して除去した。次いで、ろ液を濃縮させて白色固体で3.16gの化合物25を得た。
0005620282.tif 000062
【００９１】
2−クロロアデニン及び適切なジアミンから出発して、2,6−ジアミノプリン誘導体26〜30を実施例25に記述した方法と同様に製造した。化合物26〜30に関するスペクトル及び物理的データを下記の表に提供した。
【００９２】
実施例26〜30：2,6−ジアミノプリン誘導体26〜30に関する分析データ。
0005620282.tif 000063
0005620282.tif 000064
【００９３】
実施例31：2−[2−{2−(t−ブトキシカルボニルアミノ)−2−メチル}エチル]アミノ−1H−プリン−6(9H)−オン(31)の製造。
0005620282.tif 000065
11gの2−クロロヒポキサンチン及び4.96mlの1,2−ジアミノプロパン(ラセミック)を33mlのモノメトキシエタノールに分散させ、24時間、130℃で攪拌した。溶媒を真空下で除去し、得られた残留物を97mlのTHF及び97mlの水に溶かした後、64mlのTHFに溶かしたBoc2Oの22.8gをゆっくり加えた。前記反応混合物を室温で6時間攪拌し、EAを溶液に加えた。得られた沈殿物を濾取して灰色固体で化合物31を得た。
0005620282.tif 000066
【００９４】
実施例32：エチル2−[6−アミノ−2−{3−(t−ブトキシカルボニルアミノ)プロピル}アミノ−9H−プリン−9−イル]アセテート(32)の製造。
0005620282.tif 000067
100mlのDMFに溶かした3.16gの化合物25の溶液を攪拌しながら480mgの55% NaH／ミネラルオイルを加えた。前記反応溶液を2時間攪拌した後、1.98mlのエチルブロモアセテートをゆっくり加えた。2時間後、前記反応混合物を真空下で濃縮させ、カラムクロマトグラフィー(1：10 EtOH/EA)によって精製させて淡い黄色固体で2.92gのジアミノプリン類似体32を得た。
0005620282.tif 000068
【００９５】
実施例33：エチル2−[6−(ベンジルオキシカルボニル)アミノ−2−{3−(t−ブトキシ−カルボニルアミノ)プロピル}アミノ−9H−プリン−9−イル]アセテート(33)の製造。
0005620282.tif 000069
100mlのDMFに溶かした4.68gの化合物32の溶液を攪拌しながら室温で13.2gのN−(ベンジルオキシカルボニル)−N'−メチル−イミダゾリウムトリフレートを加えた。12時間後、前記反応混合物を減圧下で濃縮させ、カラムクロマトグラフィーによって(5% MeOH/MC)白色固体で5.4gの化合物33を得た。
0005620282.tif 000070
【００９６】
実施例34：エチルN−[2−{2−(ベンゾ[d]チアゾール)スルホニル}アミノエチル]−N−[2−[6−(ベンジルオキシカルボニル)アミノ−2−{3−(t−ブトキシカルボニルアミノ)プロピル}アミノ−9H−プリン−9−イル]アセチル]グリシナート(34)の製造。
0005620282.tif 000071
5.4gの化合物33及び950mgのLiOHを40mlのTHF及び40mlの水に溶かし、1時間室温で攪拌した。THFを真空下で除去し、得られた水溶液を1M HCl水溶液でpH3まで酸性化した後、EAで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水させ、減圧下で濃縮させた。得られた残留物及び2.92gのエチル2−N−[2−{(ベンゾ[d]チアゾール−2−スルホニル)アミノ}エチル]グリシナートを240mlのDMFに溶かし、室温で1.95gのEDCI及び1.38gのHOBtを加えた。前記反応混合物を20時間攪拌し、減圧下で濃縮させて、MCに溶かした。前記MC溶液を1M HCl水溶液で洗浄し、真空下で濃縮させた後、カラムクロマトグラフィー(5% MeOH/MC)によって精製して淡い黄色泡で2.7gの化合物34を得た。
0005620282.tif 000072
【００９７】
実施例35：1−(ベンゾ[d]チアゾール−2−スルホニル)−2−オキソ−4−[[6−(ベンジル−オキシカルボニル)アミノ−2−{3−(t−ブトキシカルボニルアミノ)プロピルアミノ}−9H−プリン−9−イル]−アセチル]ピペラジン(35)の製造。
0005620282.tif 000073
2.7gの化合物34及び340mgのLiOHを15mlのTHF及び20mlの水に分散させ、室温で30分間攪拌した。THFを減圧下で除去した。得られた水溶液層を1M HCl水溶液でpH3まで酸性化した後、EAで抽出した。前記EA層を無水硫酸ナトリウムで脱水させ、真空下で濃縮させて2.48gの粗生成物を得た。70mlのDMFに溶かした前記粗生成物及び716mgのEDCIを20時間室温で攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、得られた残留物をMCに溶かし1M HCl水溶液及び水で順に洗浄した。有機層を真空下で濃縮させ、カラムクロマトグラフィー(アセトン)によって精製させて白色泡で1.4gの化合物35を得た。
0005620282.tif 000074
【００９８】
2,6−ジアミノプリン誘導体26〜30から出発して、修飾されたアデニンPNAモノマー36〜40を実施例32〜35に記述した方法と同様に製造した。化合物36〜40に関するスペクトル及び物理的データを下記の表に提供した。
【００９９】
実施例36〜40：アデニンPNAモノマー36〜40に関する分析データ。
0005620282.tif 000075
0005620282.tif 000076
0005620282.tif 000077
【０１００】
実施例41：エチル2−[2−[2−{2−(t−ブトキシカルボニルアミノ)−2−メチル}エチル]アミノ−6−オキソ−6,9−ジヒドロ−1H−プリン−2−イル]アセテート(41)の製造。
0005620282.tif 000078
47mlのDMFに溶かした4.69gの化合物31の溶液を攪拌しながら790mgの55% NaH／ミネラルオイルを加え、前記反応溶液を2時間攪拌した。1.85mlのエチルブロモアセテートをゆっくり加えた後、前記反応溶液を2時間さらに攪拌した。前記反応混合物を真空下で濃縮させ、カラムクロマトグラフィー(5：95 MeOH/MC)によって精製して淡い黄色固体で5.04gの化合物41を得た。
0005620282.tif 000079
【０１０１】
実施例42：2−{2−(t−ブトキシカルボニルアミノ)エトキシ}エチルアミン(42)の製造。
0005620282.tif 000080
500mlのDMFに溶かした146gの[2−{2−(t−ブトキシカルボニルアミノ)エトキシ}エチル]メタンスルホナートに134gのアジ化ナトリウムを加えた。前記反応混合物を70℃で20時間攪拌した後、減圧下で濃縮させた。得られた残留物を1,200mlの水に溶かし、EAで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水させ、真空下で濃縮させた。得られた残留物を2,000mlのTHFに溶かし、162gのトリフェニルホスフィンを加えた。前記反応混合物を室温で2時間攪拌した後、200mlの水を加えた。前記反応混合物を18時間室温で攪拌し、減圧下で500mlに濃縮させた。次いで、得られた沈殿物をろ過して除去した。ろ液を減圧下でさらに濃縮させてTHFを除去し、MCで洗浄した。水溶液層を濃縮させて液体で86.2gの化合物42を得た。
0005620282.tif 000081
【０１０２】
実施例43：2−[2−{2−(t−ブトキシカルボニルアミノ)エトキシ}エチル]アミノ−1H−プリン−6(9H)−オン(43)の製造。
0005620282.tif 000082
6.3gの化合物42及び2.0gの2−ブロモヒポキサンチンを55mlのモノメトキシエタノール及び17.5mlの水に分散させた。前記反応混合物を16時間還流攪拌し、溶媒を減圧下で除去した。次いで、濃縮物を20mlのMC及び10mlの水中で30分間攪拌し、得られた沈殿物を濾取して淡い黄色固体で2.1gの化合物43を得た。
0005620282.tif 000083
【０１０３】
実施例44：2−[2−[3−(t−ブトキシカルボニルアミノ)プロピルオキシ}エチル]]−アミノ−1H−プリン−6(9H)−オン(44)の製造。
0005620282.tif 000084
2−{3−(t−ブトキシカルボニルアミノ)プロピルオキシ}エチルアミン及び2−ブロモヒポキサンチンを実施例43に記述した方法と同様に反応させて白色固体で化合物44を得た。
0005620282.tif 000085
【０１０４】
実施例45：2−{3−(t−ブトキシカルボニルアミノ)プロピル}アミノ−1H−プリン−6(9H)−オン(45)の製造。
0005620282.tif 000086
40mlのモノメトキシエタノールに分散された10gのクロロヒポキサンチン及び19.6mlの1,3−ジアミノプロパン混合物を130℃で10時間攪拌した。次いで、溶媒を減圧下で除去し、得られた残留物を150mlのTHF及び150mlの水に溶かして、100mlのTHFに溶かした19.2gのBoc2Oをゆっくり加えた。前記混合物を6時間室温で攪拌した。EAを加えた後、得られた沈殿物を濾取し、暗緑色固体で6.31gの化合物45を得た。
0005620282.tif 000087
【０１０５】
グアニン誘導体46〜47を実施例45に記述した方法と同様に適切なジアミンを使用して製造した。化合物46〜47に関するスペクトル及び物理的データを下記の表に提供した。
【０１０６】
実施例46〜47：グアニン誘導体46〜47に関する分析データ。
0005620282.tif 000088
0005620282.tif 000089
【０１０７】
化合物43〜46を実施例32に記述した方法と同様に化合物48〜51に変換した。化合物48〜51に関するスペクトル及び物理的データを下記の表に提供した。
【０１０８】
実施例48〜51：グアニン誘導体48〜51に関する分析データ。
0005620282.tif 000090
0005620282.tif 000091
【０１０９】
グアニン誘導体48、49及び51から出発して、修飾されたグアニンPNAモノマー52〜54を、実施例34〜35に記述した方法と同様に製造した。化合物52〜54に関するスペクトル及び物理的データを下記の表に提供した。
【０１１０】
実施例52〜54：グアニンPNAモノマー52〜54に関する分析データ。
0005620282.tif 000092
0005620282.tif 000093
【０１１１】
実施例55：エチル2−[6−アミノ−2−{2−(t−ブトキシカルボニルアミノ)エチル}−アミノ−9H−プリン−9−イル]アセテート(55)の製造。
0005620282.tif 000094
化合物55を実施例32に関する方法と同様に化合物26から製造した。淡い黄色固体。
0005620282.tif 000095
【０１１２】
実施例56：エチル2−[6−アミノ−2−[2−{2,3−ビス(ベンジルオキシカルボニル)グアニジノ}エチル]アミノ−9H−プリン−9−イル]アセテート(56)の製造。
0005620282.tif 000096
22mlのMCに溶かした4.42gの化合物55に0℃で22mlのTFAをゆっくり加え、前記溶液を2.5時間攪拌した。前記反応溶液を減圧下で濃縮させ、100mlのジエチルエーテルを加えた。得られた沈殿物を濾取して5.79gの淡い褐色固体中間体を得た。3.9gの前記中間体を39mlのMCに溶かし、0℃で6.9mlのTEAをゆっくり加えた。前記溶液を15分間室温で攪拌し、2.48gの1,3−ビス(ベンジルオキシカルボニル)−2−(メチルチオ)シュードウレアを加えた。次いで、前記反応混合物を24時間さらに攪拌し、0.5M HCl水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで脱水させ、減圧下で濃縮させて淡い黄色固体で4.58gの化合物56を得た。
0005620282.tif 000097
【０１１３】
実施例57：エチル2−[6−(ベンジルオキシカルボニルアミノ)−2−[2−{2,3−ビス−(ベンジルオキシカルボニル)グアニジノ}エチル]アミノ−9H−プリン−9−イル]アセテート(57)の製造。
0005620282.tif 000098
4.54gの化合物56及び8.22gのN−(ベンジルオキシカルボニル)−N'−メチル−イミダゾリウムトリフラートを90mlのDMFに溶かし、29時間室温で攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、得られた残留物をカラムクロマトグラフィー(1：3ヘキサン／EA)によって精製して白色泡／固体で3.06gの化合物57を得た。
0005620282.tif 000099
【０１１４】
実施例58：エチル2−[6−アミノ−2−{4−(t−ブトキシカルボニルアミノ)ブチル}アミノ−9H−プリン−9−イル]アセテート(58)の製造。
0005620282.tif 000100
化合物58を実施例32で記述した方法と同様に橙色泡／固体で化合物27から製造した。
0005620282.tif 000101
【０１１５】
実施例59：エチル2−[6−(ベンジルオキシカルボニルアミノ)−2−[4−{2,3−ビス−(ベンジルオキシカルボニル)グアニジノ}ブチル]アミノ−9H−プリン−9−イル]アセテート(59)の製造。
0005620282.tif 000102
化合物59を実施例56〜57に記述した方法と同様に淡い黄色泡／固体で化合物58から製造した。
0005620282.tif 000103
【０１１６】
実施例60：エチル2−[6−アミノ−2−{5−(t−ブトキシカルボニルアミノ)ペンチル}アミノ−9H−プリン−9−イル]アセテート(60)の製造。
0005620282.tif 000104
化合物60を実施例32に記述した方法と同様に橙色泡／固体で化合物28から製造した。
0005620282.tif 000105
【０１１７】
実施例61：エチル2−[6−{ジ−(t−ブトキシカルボニル)}アミノ−2−[5−{(t−ブトキシカルボニル)アミノ}ペンチル]アミノ−9H−プリン−9−イル]アセテート(61)の製造。
0005620282.tif 000106
100mlのTHFに溶かした6.98gの化合物60に7.95gのBoc2O及び186mgの4−(N,N−ジメチルアミノ)ピリジンを加え、前記溶液を10分間攪拌した。次いで、前記溶液を4.62mlのTEAに混合し、30分間攪拌して、50℃までゆっくり加熱した後、その温度で再度24時間攪拌した。前記反応溶液を真空下で濃縮させ、得られた残留物を170mlのEAに溶かして0.5M HCl水溶液及び水で順に洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水させ、濃縮させて、クロマトグラフィー分離(1：1ヘキサン／MC→MC)によって黄色泡／固体で化合物61を得た。
0005620282.tif 000107
【０１１８】
実施例62：エチル2−[2−[2−{2,3−ビス−(ベンジルオキシカルボニル)グアニジノ}エチル]アミノ−6−オキソ−6,9−ジヒドロ−1H−プリン−2−イル]アセテート(62)の製造。
0005620282.tif 000108
化合物50を実施例57に記述した方法と同様に白色固体で化合物62に変換した。
0005620282.tif 000109
【０１１９】
実施例63：2−[6−(ベンジルオキシカルボニルアミノ)−2−[2−{2,3−ビス(ベンジルオキシカルボニル)グアニジノ}エチル]アミノ−9H−プリン−9−イル]酢酸(63)の製造。
0005620282.tif 000110
7.1mlのTHF及び7.1mlの水に溶かした2.57gの化合物57に340mgのLiOHを0℃で加え、前記溶液を室温で40分間攪拌した。前記反応溶液を0℃で1N HCl水溶液にてpH5〜6まで酸性化し、得られた固体を濾取して白色固体で2.33gの化合物63を得た。
0005620282.tif 000111
【０１２０】
実施例64：t−ブチルN−[2−{(9H−フルオレン−9−イル)メトキシカルボニルアミノ}エチル]−N−[2−{6−(ベンジルオキシカルボニルアミノ)−2−[2−{2,3−ビス−(ベンジルオキシカルボニル)−グアニジノ}エチル]アミノ−9H−プリン−9−イル}アセチル]グリシナート(64)の製造。
0005620282.tif 000112
30mlのDMFに溶かした1.6gの化合物63に0℃で660mgのEDCI及び910mgのFmoc-Aeg-OtBuを加えた。前記反応溶液を2時間室温で攪拌した後、減圧下で濃縮させた。得られた残留物を50mlのMCに溶かして0.5M HCl水溶液で洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水させた。次いで、有機層を濃縮させクロマトグラフィー分離(65：1 MC／MeOH)によって白色固体で500mgの化合物64を得た。
0005620282.tif 000113
【０１２１】
実施例65：N−[2−{(9H−フルオレン−9−イル)メトキシカルボニルアミノ}エチル]−N−[2−{6−(ベンジルオキシカルボニルアミノ)−2−[2−{2,3−ビス(ベンジルオキシカルボニル)グアニジノ}エチル]アミノ−9H−プリン−9−イル}アセチル]グリシン(65)の製造。
0005620282.tif 000114
3.6mlのMCに溶かした460mgの化合物64に、0℃で3.6mlのTFAをゆっくり加えた。反応溶液を3.5時間室温で攪拌した後、50mlのジエチルエーテルを加えた。得られた沈殿物を濾取し、白色固体で430mgの化合物65を得た。
0005620282.tif 000115
【０１２２】
実施例66：N−[2−{(9H−フルオレン−9−イル)メトキシカルボニルアミノ}エチル]−N−[2−{6−(ベンジルオキシカルボニルアミノ)−2−[4−{2,3−ビス(ベンジルオキシカルボニル)グアニジノ}−ブチル]アミノ−9H−プリン−9−イル}アセチル]グリシン(66)の製造。
0005620282.tif 000116
化合物59を実施例63〜65に記述した方法と同様に白色泡／固体で化合物66に変換した。
0005620282.tif 000117
【０１２３】
実施例67：N−[2−{(9H−フルオレン−9−イル)メトキシカルボニルアミノ}エチル]−N−[2−[6−[2−{2,3−ビス(ベンジルオキシカルボニル)グアニジノ}エトキシ]メチル−2−オキソ−2H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−3(7H)−イル]アセチル]グリシン(67)の製造。
0005620282.tif 000118
化合物18を実施例63〜65に記述した方法と同様に淡い黄色固体で化合物67に変換した。
0005620282.tif 000119
【０１２４】
実施例68：N−[2−{(9H−フルオレン−9−イル)メトキシカルボニルアミノ}エチル]−N−{2−[2−{2,3−ビス−(ベンジルオキシカルボニル)グアニジノ}エチル]アミノ−6−オキソ−6,9−ジヒドロ−1H−プリン−2−イル]アセチル}グリシン(68)の製造。
0005620282.tif 000120
化合物62を実施例63〜65で記述した方法によって白色泡／固体で化合物68に変換した。
0005620282.tif 000121
【０１２５】
実施例69：2−[6−{2−(t−ブトキシカルボニルアミノ)エトキシ}メチル−2−オキソ−2H−ピロロ−[2,3−d]ピリミジン−3(7H)−イル]酢酸(69)の製造。
0005620282.tif 000122
化合物16を実施例11に記述した方法と同様に淡い褐色固体で化合物69に加水分解した。
0005620282.tif 000123
【０１２６】
実施例70：メチルN−[2−{(9H−フルオレン−9−イル)メトキシカルボニルアミノ}エチル]−N−{2−[6−{2−(t−ブトキシカルボニルアミノ)エトキシ}メチル−2−オキソ−2H−ピロロ−[2,3−d]ピリミジン−3(7H)−イル]アセチル}グリシナート(70)の製造。
0005620282.tif 000124
3.6gの化合物69、3.6gのFmoc-Aeg-OMe、2.5gのEDCI、1.73gのHOBt、及び2.24mlのDIEAを70mlのDMFに溶かし、室温で1.5時間攪拌した。前記反応溶媒を減圧下で除去し、得られた残渣を100mlのMCに溶かし、1M HCl水溶液、蒸留水、及び塩水で順に洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水させ、真空下で濃縮させて、カラムクロマトグラフィー(100：2 MC/MeOH)によって精製し黄色泡／固体で2.5gの化合物70を得た。
0005620282.tif 000125
【０１２７】
実施例71：N−[2−{(9H−フルオレン−9−イル)メトキシカルボニルアミノ}エチル]−N−{2−[6−{2−(t−ブトキシカルボニルアミノ)エトキシ}メチル−2−オキソ−2H−ピロロ−[2,3−d]ピリミジン−3(7H)−イル]アセチル}グリシン(71)の製造。
0005620282.tif 000126
75mlの1:1:1アセトニトリル／アセトン／水に溶かした5.0gの化合物70に0℃で28.5mlの2.5N LiOH水溶液をゆっくり加えた。前記反応溶液を10分間攪拌し、20%クエン酸水溶液で中和させた。重炭酸ナトリウム飽和水溶液で前記溶液のpHを8に調節した後、516mgのFmoc-OSuを溶液に加え、前記溶液を室温で2時間攪拌した。次いで、前記溶液を20%クエン酸水溶液でpH3に酸性化し、0℃で90分間攪拌した。得られた沈殿物を濾取し、黄緑色固体で4.0gの化合物71を得た。
0005620282.tif 000127
【０１２８】
実施例72：N−[2−{(9H−フルオレン−9−イル)メトキシカルボニルアミノ}エチル]−N−{2−[5−{(t−ブトキシカルボニル)アミノ}ペンチル]アミノ−6−オキソ−6,9−ジヒドロ−1H−プリン−2−イル]アセチル}グリシン(72)の製造。
0005620282.tif 000128
化合物51を実施例69〜71で記述した方法と同様に白色泡／固体で化合物72に変換した。
0005620282.tif 000129
【０１２９】
実施例73：N−[2−{(9H−フルオレン−9−イル)メトキシカルボニルアミノ}エチル]−N−[2−[6−{ビス(t−ブトキシカルボニル)アミノ}−2−{5−(t−ブトキシカルボニルアミノ)ペンチル}アミノ−9H−プリン−9−イル]アセチル]グリシン(73)の製造。
0005620282.tif 000130
化合物61を実施例69〜71に記述した方法と同様に白色泡／固体で化合物73に変換した。
0005620282.tif 000131
【０１３０】
PNAオリゴマーの製造：反応式4に従って合成されたPNAモノマーoをパナジン社(www.panagene.com、テジョン、韓国)に送り文献に記述された方法に従って、又はこれを若干修飾してパナジンによって式IのPNAオリゴマーを製造した(Org. Lett. vol 9, 3291-3293, 2006)。PNAオリゴマーは、MALDI-TOFによって同定され、C18−逆相HPLCによって分析されてパナジンから受け取った。パナジンから受け取ったPNAオリゴマーを追加精製せず使用した。
【０１３１】
反応式5のPNAモノマーqを使用して従来技術に開示されている方法に従って、又はこれを若干修飾して式IのPNAオリゴマーを合成した(米国特許6,133,444)。前記PNAオリゴマーをC18−逆相HPLC(0.1% TFAを有するアセトニトリル水溶液)によって精製し、MALDI-TOFによって同定した。図1は、逆相HPLCによってオリゴ17の精製前及び後のHPLCクロマトグラムを提供する。図2は、オリゴ17の精製されたバッチ)に関するMALDI-TOF質量スペクトルを提供する。図1及び2は例示的な目的として提供するだけで、本発明に対する制限と解釈してはならない。
【０１３２】
本発明のために合成されたPNAオリゴマーをMALDI-TOFによる分子量データと一緒に表1に提供する。表1に使用された略語のうち、A、T、G及びCは、修飾されていない核酸塩基アデニン、チミン、グアニン、及びシトシンをそれぞれ表す。修飾された核酸塩基C(mXn)、C(mXng)、A(mXn)、A(m)、A(mg)、及びG(m)は、Lys、Fam、L(1)、及びL(2)と一緒に下記の表1に定義する。このようなPNAオリゴマーは、例示的な目的として示すだけで、本発明に対する制限と解釈してはならない。
【０１３３】
（表1）本発明のPNAオリゴマーと質量スペクトルデータa
0005620282.tif 000132
a.モノマーに対して使用された略語は下記の通り定義する。
b.他の言及がない限り、MH+に関して測定されたイオンピーク。
0005620282.tif 000133
【０１３４】
DNAに対する結合親和性：本発明のPNAオリゴマーを下記の通りTm値を測定することにより、DNAに対する結合親和性を評価した。
【０１３５】
4μM PNAオリゴマー及び4μM DNAを緩衝水溶液(pH7.16, 10mMリン酸ナトリウム, 100mM NaCl)に混合し、数分間90℃でインキュベーションして、室温にゆっくり冷却させた。次いで、前記溶液を4mlの石英キュベットに移し、キュベットをしっかり封印した。前記キュベットをAgilent8453UV/Visible分光光度計に載せて260nmでの吸光度変化を1分当り0.5又は1.0℃ずつキュベットの温度を上げながら記録した。吸光度対温度の曲線から、吸光度で最も大きい増加率を表す温度をPNAとDNA間の融解温度(Tm)と読み取った。Tm測定のためのDNAをバイオニア社(www.bioneer.com、テジョン、韓国)又はアーラムバイオシステムズ(www.ahrambio.com、ソウル、韓国)から購入し追加精製せず使用した。
【０１３６】
図3は、相補的又はミスマッチDNAに対するオリゴ17の温度による吸光度変化のグラフを提供する。オリゴ17に対するミスマッチDNAの配列については、表2を参照すればよい。図3に曲線に関するTm値と読み取られる各曲線での変曲点温度がある。
【０１３７】
本発明のPNAオリゴマーに関するTm値を表2で提供した。これらのTm値は例示的な目的として示すだけで、本発明に対する制限と解釈してはならない。
【０１３８】
（表2）PNAと相補的またはミスマッチDNA間のTm値
0005620282.tif 000134
【０１３９】
シトシンの代わりに本発明の非天然核酸塩基ピロロシトシン誘導体での置換は、相補的DNAに対するPNAオリゴマーの親和性を著しく増加させる。例えば、3個の「修飾された」シトシン「C(102)」モノマーを有するオリゴ10は、85℃を超えるTmを示す反面、対応する「修飾されていない」オリゴ11は58℃のTmを表した。他の修飾されたシトシンモノマー、例えば「C(103)」又は「C(202)」もまた、オリゴ3及びオリゴ8の例でのように相補的DNAに対するPNAオリゴマーの親和性を著しく増加させた。
【０１４０】
本発明の「修飾された」アデニン核酸塩基もまた、相補的DNAに対するPNAオリゴマーの親和性を著しく増加させた。例えば、4個の「修飾された」アデニンA(7)モノマーを有するオリゴ15は、71℃のTmを表し、これは「修飾されていない」オリゴ27で観察された55℃のTmより著しく高い。他の「修飾された」アデニンモノマー、例えばA(4)、及びA(5)もまた、相補的DNAに対して著しく親和性を増加させた。
【０１４１】
本発明の修飾されたPNAモノマーは、塩基ミスマッチに相当敏感なことが明らかになった。例えば、オリゴ17でA(5)モノマーの単一塩基ミスマッチによりTmで11〜14℃の減少が観察された。オリゴ20でC(102)モノマーに対する単一塩基ミスマッチは、Tmで19〜22℃の減少をもたらした。
【０１４２】
細胞透過性：本発明のPNAオリゴマーの細胞透過力を評価するために、ヒト由来の癌細胞がフルオレセインを共有結合でタグ付けしたPNAオリゴマーで処理された。適用した方法は、下記に簡略に提供する。
【０１４３】
24−ウェルプレートの各ウェルに置かれた(滅菌された)それぞれのカバーグラスに、使用した細胞株の成長速度に応じて20,000〜100,000個の細胞を播種し、前記細胞を37℃及び5%CO2で16〜24時間培養した。次いで、培地を500μlの新鮮なOpti-MEM培地(1% FBSを含むか含まない)に交替した後、フルオレセインを共有結合でタグ付けしたPNAオリゴマーのストック溶液の分取液を加えた。細胞を指定した時間培養した後、前記細胞をPBSで洗浄し、3.7%又は4%パラホルムアルデヒドでインキュベーションすることにより固定させた。前記細胞をPBS又は0.1%Tween-20を含むPBSで数回徹底的に洗浄した。次いで、カバーガラスをマウンティング溶液を使用してスライドガラス上に載せ、共焦点蛍光顕微鏡法のためにマニキュアで封印した。蛍光イメージをZeiss LSM 510共焦点顕微鏡(ドイツ、63X対物レンズ)又はNikon C1Si共焦点顕微鏡(40X対物レンズ)で撮影した。
【０１４４】
図4〜8の細胞透過イメージは、例示的な目的として提供するだけで、本発明に対する制限と解釈してはならない。
【０１４５】
図4の(a)及び(b)では、オリゴ1及びオリゴ2を5μMでHeLa細胞にそれぞれ(FBSなく)処理し、1、2、3及び24時間後の共焦点顕微鏡イメージ(63x対物レンズで)を提供した。蛍光強度は、図4の(a)で24時間に亘って明確且つ強くなる反面、図4の(b)では蛍光強度が弱い。これは、オリゴ1が「修飾されていない」オリゴ2よりHeLa細胞を著しく早く透過することを示す。
【０１４６】
図5の(a)及び(b)では、オリゴ6及びオリゴ7を2.5μMでMCF-7細胞にそれぞれ(FBSなく)処理し、0.5及び1時間後の共焦点顕微鏡イメージ(63x対物レンズで)を提供した。蛍光強度は、図5の(a)で1時間に亘って明確且つ強くなる反面、図5の(b)では蛍光強度が弱い。これは、オリゴ6が「修飾されていない」オリゴ7よりMCF-7細胞を著しく早く透過することを示す。
【０１４７】
図6の(a)及び(b)では、オリゴ1及びオリゴ6を1μMでHeLa細胞にそれぞれ(FBS 1%と一緒に)処理し、6または24時間後の共焦点顕微鏡イメージ(40x対物レンズで)を提供した。蛍光強度は、図6の(a)では24時間でさえ弱い反面、図6の(b)では24時間に亘り蛍光強度が明確且つ強くなる。これは、オリゴ6がオリゴ1よりHeLa細胞を著しく早く透過することを示す。
【０１４８】
図7の(a)及び(b)では、オリゴ21及びオリゴ28を2μMでJAR細胞にそれぞれ(FBSなく)処理し、24時間後の共焦点顕微鏡イメージ(40x対物レンズで)を提供した。蛍光強度は、図7の(a)で強い反面、図7の(b)では意味のある蛍光強度がない。これは、オリゴ21が「修飾されていない」オリゴ28よりJAR細胞を著しく早く透過することを示す。
【０１４９】
図7の(c)及び(d)では、オリゴ21及びオリゴ28を2μMでA549細胞にそれぞれ(FBSなく)処理し、24時間後の共焦点顕微鏡イメージ(40x対物レンズで)を提供した。蛍光強度は図7の(c)で強い反面、図7の(d)では意味のある蛍光強度がない。これは、オリゴ21が「修飾されていない」オリゴ28よりA549細胞を著しく早く透過することを示す。
【０１５０】
図7の(e)及び(f)では、オリゴ21及びオリゴ28を2μMでHeLa細胞にそれぞれ(FBSなく)処理し、12時間後の共焦点顕微鏡イメージ(40x対物レンズで)を提供した。蛍光強度は、図7の(e)で明らかな反面、図7の(f)では意味のある蛍光強度がない。これは、オリゴ21が「修飾されていない」オリゴ28よりHeLa細胞を著しく早く透過することを示す。
【０１５１】
図7の(g)では、オリゴ21を2μMでHeLa細胞にそれぞれ(FBSなく)処理し、24時間後の共焦点顕微鏡イメージ(40x対物レンズで)を提供した。図7の(g)で細胞内蛍光が図7の(e)で細胞内蛍光より著しくより強いことから、オリゴ21は12時間よりは24時間に亘り透過することを示す。 
【０１５２】
図8の(a)、(b)及び(c)では、オリゴ22を2μMでHeLa、A549及びJAR細胞にそれぞれ(FBSなく)処理し、24時間後の共焦点顕微鏡イメージ(40x対物レンズで)を提供した。全てのイメージで細胞内に蛍光があるが、これは、オリゴ22は試験された細胞で優れた細胞透過性を有するということを示す。
【０１５３】
アンチセンス実施例：オリゴ9及びオリゴ12は、それぞれT1-12及びT5-12として同一な塩基配列を有し、これは文献でリボソームによるmdm2合成を阻害すると報告された(Nucleic Acids Res. vol 32, 4893-4902, 2004)。オリゴ9及びオリゴ12は、下記の通りJAR細胞でリボソームによるmdm2合成阻害効能に対して評価した。下記のアンチセンス実施例は、例示的な目的で示すだけで、本発明に対する制限と解釈してはならない。
【０１５４】
JAR細胞(ATCCカタログ#HTB-144)を37℃及び5%CO2で、10%FBS及び1%ペニシリン−ストレプトマイシンを添加したRPMI-1640培地で培養した。細胞を1mlの同一な培地を含む12−ウェルプレートの各ウェルに分注し、指定濃度のオリゴ9又はオリゴ12の水溶性ストック溶液の分取液で処理した。次いで、前記細胞を37℃及び5%CO2で15時間インキュベーションした。
【０１５５】
各ウェルにある細胞を冷たいPBSで洗浄して1%プロテアーゼ阻害剤カクテルを含むRIPA緩衝溶液80μlで処理し、プレートを4℃でインキュベーションし、15分間ゆっくり攪拌した。各ウェルの内容物を掻き集めマイクロチューブに移した。前記マイクロチューブを氷中で10分間インキュベーションし、10,000gで遠心分離した。得られた上澄液を回収してブラッドフォード法によって蛋白質を定量し、ウェスタンブロット分析した。電気泳動のために20μgの蛋白質をミニジェル装置中のジェルの各レーンにロードして分離し、PVDFメンブレン(0.45μ, Millipore)上に及び移動させた。ウェスタンブロッティングのために使用した主なmdm2抗体は、SC-965(Santa Cruz Biotechnology)だった。
【０１５６】
図9は、5μM又は10μMのオリゴ9、5μM又は10μMのオリゴ12、それぞれ5μM又は10μMのオリゴマーで併用処理、及びブランク(オリゴマー処理なし)で処理したJAR細胞に対するウェスタンブロッティング結果を提供する。図9でオリゴ9又はオリゴ12で処理、又はオリゴ9及びオリゴ12で併用処理したものは、5μM及び10μM共にJAR細胞でリボソームによるmdm2合成を著しく阻害した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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