(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
３−アミノチロシン（ＮＨ２Ｙ）残基を含む組換えレダクターゼ酵素であって、
レダクターゼが、大腸菌リボヌクレオチドレダクターゼ又はこれに由来するレダクターゼであると共に、
（ａ）大腸菌リボヌクレオチドレダクターゼのα２サブユニットのＹ７３０、
（ｂ）大腸菌リボヌクレオチドレダクターゼのα２サブユニットのＹ７３１、又は
（ｃ）大腸菌リボヌクレオチドレダクターゼのβ２サブユニットのＹ１２２
の１以上にＮＨ２Ｙ変異を含む、組換えレダクターゼ。
【請求項２】
レダクターゼがクラスＩ又はクラスIVリボヌクレオチドレダクターゼである請求項１に記載の組換えレダクターゼ。
【請求項３】
レダクターゼ酵素の１本以上のポリペプチド鎖をコードするレダクターゼ核酸に由来する組換え核酸を含む細胞であって、組換え核酸がセレクターコドンを含み、
前記細胞が更に直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含み、Ｏ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡを３−アミノチロシンで優先的にアミノアシル化し、
レダクターゼが、大腸菌リボヌクレオチドレダクターゼ又はこれに由来するレダクターゼであると共に、
（ａ）大腸菌リボヌクレオチドレダクターゼのα２サブユニットのＹ７３０、
（ｂ）大腸菌リボヌクレオチドレダクターゼのα２サブユニットのＹ７３１、又は
（ｃ）大腸菌リボヌクレオチドレダクターゼのβ２サブユニットのＹ１２２
の１以上にＮＨ２Ｙ変異を含む、細胞。
【請求項４】
核酸がクラスＩ又はクラスIVリボヌクレオチドレダクターゼのポリペプチド鎖に相同の１本以上のポリペプチド鎖をコードする請求項３に記載の細胞。
【請求項５】
３−アミノチロシンを含む請求項３に記載の細胞。
【請求項６】
３−アミノチロシン（ＮＨ２Ｙ）残基を含む組換えレダクターゼ酵素の細胞ペースト又は抽出液であって、前記細胞ペースト又は抽出液が少なくとも２〜４ｍｇ／ｇのレダクターゼ酵素を含有し、
レダクターゼが、大腸菌リボヌクレオチドレダクターゼ又はこれに由来するレダクターゼであると共に、
（ａ）大腸菌リボヌクレオチドレダクターゼのα２サブユニットのＹ７３０、
（ｂ）大腸菌リボヌクレオチドレダクターゼのα２サブユニットのＹ７３１、又は
（ｃ）大腸菌リボヌクレオチドレダクターゼのβ２サブユニットのＹ１２２
の１以上にＮＨ２Ｙ変異を含む、細胞ペースト又は抽出液。
【請求項７】
細胞ペーストが４〜６ｍｇ／ｇのレダクターゼ酵素を含有する請求項６に記載の細胞抽出液。
【請求項８】
レダクターゼにおける選択されたアミノ酸残基の機能の判定方法であって、
選択されたアミノ酸残基を３−アミノチロシン（ＮＨ２Ｙ）に突然変異させ、選択されたアミノ酸に対応する位置にＮＨ２Ｙを含む組換え突然変異体レダクターゼを作製する段階と；
組換えレダクターゼをレダクターゼの１種以上の基質又はエフェクターと混合する段階と；
ＮＨ２Ｙ・の形成を検出する段階を含み、
レダクターゼが、大腸菌リボヌクレオチドレダクターゼ又はこれに由来するレダクターゼであると共に、
（ａ）大腸菌リボヌクレオチドレダクターゼのα２サブユニットのＹ７３０、
（ｂ）大腸菌リボヌクレオチドレダクターゼのα２サブユニットのＹ７３１、又は
（ｃ）大腸菌リボヌクレオチドレダクターゼのβ２サブユニットのＹ１２２
の１以上にＮＨ２Ｙ変異を含む、方法。
【請求項９】
基質がＣＤＰ、ＡＤＰ、ＧＤＰ又はＵＤＰを含み、エフェクターがＡＴＰを含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記混合の前にレダクターゼを還元する段階を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
組換えレダクターゼを還元する段階が、組換えレダクターゼを発現する細胞又は細胞培養物から組換えレダクターゼを精製する段階と、得られた精製レダクターゼを還元剤の存在下でインキュベートする段階を含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＮＨ２Ｙの形成を検出する段階がレダクターゼにおけるＮＨ２Ｙ残渣のＥＰＲスペクトルを測定する段階を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
ＮＨ２Ｙの形成を検出する段階が前記混合後にストップトフロー分光法を実施してＮＨ２Ｙ・形成の反応速度を測定する段階を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
ＮＨ２Ｙの形成を検出する段階が前記混合後に急速凍結クエンチＥＰＲを実施してＮＨ２Ｙ・形成の反応速度を測定する段階を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
組換えレダクターゼが、野生型レダクターゼに由来するものであって、組換えレダクターゼ酵素内の３−アミノチロシン残基が、野生型レダクターゼ酵素のアミノ酸配列内のチロシン残基を置換する、請求項１に記載の組換えレダクターゼ酵素。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願とのクロスリファレンス）
本願は米国予備特許出願第６１／０００，４９１号（出願日２００７年１０月２５日）及び予備特許出願第６１／００１，２６５号（出願日２００７年１０月３０日）の優先権と特典を主張し、その開示内容全体を全目的で本願に援用する。
【０００２】
（支援研究開発）
本発明は国立衛生研究所助成番号５Ｒ０１  ＧＭ６２１５９及びＧＭ２９５９５として米国政府助成下に創出された。米国政府は本発明に所定の権利をもつ。
【０００３】
（発明の技術分野）
本発明は蛋白質化学、例えば翻訳生化学及び突然変異分析の分野に関する。本発明は３−アミノチロシン残基を組込んだレダクターゼ酵素を作製し、レダクターゼにおける選択されたアミノ酸残基の機能を判定するための方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
全生物において、リボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＮＲ）はヌクレオチドから２’−デオキシヌクレオチドへの変換を触媒し、ＤＮＡ生合成及び修復で使用される前駆体を提供する１−３。ヌクレオチド還元のメカニズムは全ＲＮＲで保存されており、過渡的活性部位チイルラジカル（Ｃ４３９・，本明細書の随所で使用する大腸菌ＲＮＲナンバリング）の形成を必要とする４，５。しかし、ラジカル開始イベントである活性部位チイルラジカル生成のメカニズムは保存されておらず、ＲＮＲの４クラスの分類の基準となる６−９。主要な未解決のメカニズムの問題はクラスＩ  ＲＮＲと、恐らく最近同定されたクラスＩＶ  ＲＮＲにおけるチイルラジカル形成のメカニズムの問題である。
【０００５】
大腸菌クラスＩ  ＲＮＲは代謝回転中に活性な１：１複合体を形成する２つのホモダイマーサブユニットα２及びβ２から構成される１０−１２。α２は複合体の実働部分である。このサブユニットはチイルラジカルに介在されるヌクレオチド還元が生じる活性部位と、基質特異性と代謝回転率を調節する複数のアロステリックエフェクター結合部位を含む１３。β２はα２の活性部位で過渡的Ｃ４３９・の形成に必要な安定な二核鉄（ＩＩＩ）チロシルラジカル（Ｙ１２２・）１４−１６補因子を含む４−６。α２６，１７とβ２１８，１９の構造は解明されており、両方のサブユニットを含む構造も報告されている２０。しかし、活性なα２β２複合体の構造は謎のままである。α２とβ２の個々の構造から、ＵｈｌｉｎとＥｋｌｕｎｄは形状及び電荷の相補性と残基保存に基づいてα２β２複合体のドッキングモデルを作製した６。このモデルによると、β２のＹ１２２・はα２のＣ４３９から＞３５Åの位置にあるらしい（図１）２１−２３。この長距離にわたるラジカル成長には過渡的アミノ酸中間体の関与が必要である２４−２６。この経路に関与していると提唱されている残基は全クラスのＩ  ＲＮＲで広く保存されている。
【０００６】
パルス電子−電子二重共鳴分光測定２７とメカニズムベースの阻害剤２８−３２からＹ１２２・とＣ４３９間の長距離を裏付ける証拠が最近得られている。この試験から得られた距離はドッキングモデルと一致し、β２のＹ１２２・がα２のＣ４３９の近くになるような大きな立体配座変化は生じないことを証明している３２。
【０００７】
提唱された経路の有効性を試験するために、部位特異的突然変異誘発３３，３４と相補試験３５が実施されている。これらの試験は図１の各残基がＲＮＲ機能に重要な役割を果たすことを立証している。しかし、これらの突然変異体には活性がないため、機構調査は不可能である３３，３４。現時点では、提唱されている経路残基のうちのただ１個であるＹ３５６が関与していることは例えば本明細書の他の箇所に詳述する多くの証拠により証明されている。他方、ラジカル成長におけるα２残基Ｙ７３０及びＹ７３１の役割はまだはっきりしていない。突然変異誘発試験はＲＮＲ機能におけるそれらの重要性を立証している３４，４４，４５。しかし、β２の残基Ｙ３５６と同様に、これらの突然変異体（Ｙ７３０Ｆ−α２及びＹ７３１Ｆ−α２）は不活性であるため、ラジカル成長におけるＹ７３０及びＹ７３１の役割の機構調査は不可能であった。
【０００８】
非天然アミノ酸残基を組込んだレダクターゼ酵素でラジカル成長に関与すると提唱されているアミノ酸残基の部位特異的置換方法及び組成物として、機構情報を提供する突然変異体、例えばラジカル成長における置換アミノ酸の機能を例えばレダクターゼ酵素で調査するために使用可能な突然変異体を作製する方法及び組成物が当分野で必要とされている。本発明はＲＮＲ反応メカニズムを解明するための新規ツール及び方法を提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は３−アミノチロシン（ＮＨ２Ｙ）残基を組込んだ組換えレダクターゼ酵素と、このようなレダクターゼ酵素を作製するための直交成分システムに関する。これらのツールを使用し、大腸菌ＲＮＲでＲＮＲのβ２サブユニットのＹ１２２・からサブユニット界面を通って反応速度的にコンピテントなラジカル移動が生じることと、ＮＨ２Ｙ７３０・又はＮＨ２Ｙ７３１・のラジカルトラップが生じることを実証した。このイベントは基質とエフェクターが大腸菌ＲＮＲと結合することにより開始することが判明した。定常状態活性アッセイに自殺型阻害剤であるＮ３ＡＤＰとの反応結果を加味すると、Ｙ７３０ＮＨ２Ｙ−α２とＹ７３１ＮＨ２Ｙ−α２はヌクレオチド還元でコンピテントであると考えられる。従って、ＮＨ２Ｙ７３０によるＣ４３９の酸化には水素原子移動メカニズムが関係していると考えられる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
従って、第１の側面において、本発明は３−アミノチロシン（ＮＨ２Ｙ）残基を組込んだ組換えレダクターゼ酵素を提供する。好ましい１態様において、本発明のレダクターゼはクラスＩ又はクラスＩＶリボヌクレオチドレダクターゼ等のリボヌクレオチドレダクターゼに由来する。例えば、レダクターゼは大腸菌リボヌクレオチドレダクターゼ、ヒトリボヌクレオチドレダクターゼ、マウスリボヌクレオチドレダクターゼ、酵母リボヌクレオチドレダクターゼ、単純ヘルペスウイルスリボヌクレオチドレダクターゼ等に由来する組換えレダクターゼとすることができる。例えば、レダクターゼは大腸菌リボヌクレオチドレダクターゼのα２サブユニットのＹ７３０、大腸菌リボヌクレオチドレダクターゼのα２サブユニットのＹ７３１、大腸菌リボヌクレオチドレダクターゼのβ２サブユニットのＹ１２２、又は大腸菌リボヌクレオチドレダクターゼのβ２サブユニットのＹ３５６の１個以上にＮＨ２Ｙ突然変異を含む大腸菌リボヌクレオチドレダクターゼとすることができる。
【００１１】
１関連側面において、本発明は本発明のレダクターゼを発現する細胞を提供する。本発明の細胞はレダクターゼ酵素の１本以上のポリペプチド鎖をコードするレダクターゼ核酸に由来する組換え核酸と、直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む。場合により、細胞は３−アミノチロシンを含むことができる。細胞中の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）はＯ−ｔＲＮＡを細胞中の３−アミノチロシンで優先的にアミノアシル化し、レダクターゼをコードする組換え核酸は直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）により認識されるセレクターコドンを含む。コードされるレダクターゼは場合によりクラスＩもしくはクラスＩＶリボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＮＲ）及び／又は大腸菌に由来するＲＮＲを含むことができる。
【００１２】
更に、本発明はＮＨ２Ｙ残基を組込んだ高収率のレダクターゼを提供する。例えば、３−アミノチロシン（ＮＨ２Ｙ）残基を組込んだ組換えレダクターゼ酵素、例えば組換えリボヌクレオチドレダクターゼを含む細胞ペースト又は抽出液を作製することができる。細胞ペースト又は抽出液は少なくとも約２及び約４ｍｇ／ｇのレダクターゼ酵素を含有する。本発明の１例において、細胞ペーストは約４〜約６ｍｇ／ｇのレダクターゼ酵素を含有する。
【００１３】
別の側面において、本発明はレダクターゼにおける選択されたアミノ酸残基の機構的機能の判定方法を包含する。このような方法は選択されたアミノ酸残基を３−アミノチロシン（ＮＨ２Ｙ）に突然変異させ、選択されたアミノ酸（例えばＹ残基）に対応する位置にＮＨ２Ｙを組込んだ組換え突然変異体レダクターゼを作製する段階と、組換えレダクターゼをレダクターゼの１種以上の基質又はエフェクターと混合する段階と、ＮＨ２Ｙ・の形成を検出する段階を含む。例えば、レダクターゼがＲＮＲである場合には、基質は場合によりＣＤＰ、ＡＤＰ、ＧＤＰ又はＵＤＰを含むことができ、エフェクターはＡＴＰを含むことができる。前記混合の前に場合によりレダクターゼを還元（又は用途によっては酸化）することができる。組換えレダクターゼを還元する段階は場合により、組換えレダクターゼを発現する細胞、細胞ペースト又は細胞培養物から組換えレダクターゼを精製する段階と、得られた精製レダクターゼを還元剤と共にインキュベートする段階を含むことができる。
【００１４】
ＮＨ２Ｙの形成を検出する段階は各種技術のいずれかを使用することができ、レダクターゼにおけるＮＨ２Ｙ残渣のＥＰＲスペクトルを測定する方法、混合後にストップトフロー分光法を実施してＮＨ２Ｙ・形成の反応速度を測定する方法、又は混合後に急速凍結クエンチ（ＲＦＱ）ＥＰＲを実施してＮＨ２Ｙ・形成の反応速度を測定する方法が挙げられる。
【００１５】
当然のことながら、本発明により提供される方法と組成物は単独で使用してもよいし、併用してもよい。
【００１６】
キットも本発明の特徴である。例えば、このようなキットはキットコンポーネントを保持するための容器、レダクターゼ酵素（例えば１個以上の３−アミノチロシンを組込んだ本明細書に記載するレダクターゼ酵素のいずれか）を作製（例えば発現及び／又は精製）するための説明書、Ｏ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸、Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含む核酸、３−アミノチロシン、及び／又はＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳの発現と３−アミノチロシンを組込んだレダクターゼ酵素の作製に適した大腸菌宿主細胞株から選択される各種コンポーネントを含むことができる。追加又は代替態様として、本発明のキットは、例えばフリーラジカル成長における選択されたアミノ酸残基の機能をレダクターゼで判定するための説明書及び／又は試薬を含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】スキーム１として、ＮＨ２Ｙの一電子酸化と推定ラジカル開始経路を示す。
【００１８】
【図２】Ｋ７ＮＨ２Ｙ−Ｚ−ドメインのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ及びＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。
【００１９】
【図３】Ｙ７３１ＮＨ２Ｙ−α２の発現を示す。指定通りにＩＰＴＧとＮＨ２Ｙ／ＤＴＴの存在下又は不在下で細胞を増殖させ、発現レベルをＰＡＧＥにより評価した。
【００２０】
【図４】ＥＰＲ分光法によりモニターしたＹ７３０ＮＨ２Ｙ−α２／ＡＴＰとｗｔβ２／ＣＤＰの反応を示すスペクトルトレースである。
【００２１】
【図５】Ｙ１２２・及びＮＨ２Ｙ７３０・シグナル強度のマイクロ波出力依存性を示すグラフである。
【００２２】
【図６】ＮＨ２Ｙ７３０・（点線，図４）とＮＨ２Ｙ７３１・（破線，図１５）の比較。
【００２３】
【図７】ＮＨ２Ｙ７３０・（丸）とＮＨ２Ｙ７３１・（四角）のＵＶ−ｖｉｓスペクトルのポイントバイポイント再構成。
【００２４】
【図８】ＮＨ２Ｙ７３０・形成のストップトフローによる反応速度測定を示すグラフである。
【００２５】
【図９】Ｙ７３０ＮＨ２Ｙ−α２，β２とｄＧＴＰの存在下でインキュベーション後のＮ３ＡＤＰからのＮ・の形成を示す二重スペクトルである。
【００２６】
【図１０】Ｎ・（黒）、Ｙ１２２・（点線）及びＮＨ２Ｙ７３０・（破線）のスペクトル比較。
【００２７】
【図１１】ＮＨ２Ｙ７３０・によるＣ４３９の酸化機構候補を示す。
【００２８】
【図１２】大腸菌リボヌクレオチドレダクターゼのα２サブユニットのアミノ酸Ｙ７３０及びＹ７３１の機構的役割を判定するために使用したストラテジーの模式図である。
【００２９】
【図１３】Ｙ７３０ＮＨ２Ｙ−α２の発現。指定通りにＩＰＴＧとＮＨ２Ｙ／ＤＴＴの存在下又は不在下に２５℃又は３７℃で細胞を増殖させ、発現レベルをＳＤＳ  ＰＡＧＥにより評価した。全長型α及び短縮型αの蛋白質バンドの位置を矢印で示す。
【００３０】
【図１４】精製Ｙ７３０ＮＨ２Ｙ−α２（Ａ）及びＹ７３１ＮＨ２Ｙ−β２（Ｂ）のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。
【００３１】
【図１５】ＥＰＲによりモニターしたＹ７３１ＮＨ２Ｙ−α２／ＡＴＰとｗｔβ２／ＣＤＰの反応の結果を示す。
【００３２】
【図１６】ＮＨ２Ｙ７３１・形成のストップトフローによる反応速度測定を示す。
【００３３】
【図１７】Ｙ７３１ＮＨ２Ｙ−α２のＮ３ＡＤＰアッセイの結果を示す。
【００３４】
【図１８】本発明で利用される各種ヌクレオチド配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明は３−アミノチロシン（ＮＨ２Ｙ）残基を組込んだリボヌクレオチドレダクターゼ等のレダクターゼに関する。ＮＨ２Ｙ残基は３−アミノチロシン（ＮＨ２Ｙ）に特異的なアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと、Ｏ−ｔＲＮＡと、場合により非天然アミノ酸３−アミノチロシンを含む直交成分システムを使用してレダクターゼに組込むことができる。以下、このような組換えレダクターゼを作製するための方法及び組成物と、高収率のこれらの組換えレダクターゼを含有する組成物について更に詳述する。
【００３６】
レダクターゼ（例えば以下に記載するレダクターゼのいずれか１種）に組込むと、ＮＨ２Ｙはレダクターゼ酵素中においてラジカル成長で置換した天然アミノ酸の機構的役割を分析するためのプローブとして有利に利用することができる（例えば、図１と対応する記載参照）。一般に、これは例えばＥＰＲ、急速凍結クエンチＥＰＲ、及び／又はストップトフロー分光法により非天然アミノ酸残基中間体ＮＨ２Ｙ・の形成を検出することにより実施することができる。
ＮＨ２Ｙ組込み用直交成分システム
【００３７】
例えばＮＨ２Ｙの組込み用直交成分は従来記載されている。ＷＯ２００６／１１０１８２Ａ２（発明者Ｓｃｈｕｌｔｚら）「非天然アミノ酸のインビボ組込み用直交翻訳成分（ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ  ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」参照。一般に、既存シンテターゼの活性部位をランダム又は選択的に突然変異させ、得られた突然変異体シンテターゼライブラリーを選択し、所望のＮＨ２Ｙ組込み活性についてスクリーニングすることにより、所望のＮＨ２Ｙ特異性をもつシンテターゼを作製することができる。通例では、ＮＨ２Ｙ組込みについてライブラリーをポジティブスクリーニングした後にネガティブスクリーニングし、ｔＲＮＡを天然アミノ酸でアミノアシル化するメンバーを除外する。シンテターゼ（例えばＮＨ２Ｙに対して特異性をもつシンテターゼ）を得るためにポジティブ選択とネガティブ選択のサイクルを繰返し実施することができる。コグネイトＯ−ｔＲＮＡをＮＨ２Ｙでアミノアシル化するシンテターゼを同定するためのＯ−ＲＳのスクリーニングと選択に関する更に詳細については下記実施例に記載する。
【００３８】
本発明のレダクターゼ酵素は場合によりＮＨ２Ｙ非天然アミノ酸以外に他の非天然アミノ酸を含む。一般に、直交成分システムを使用すると、例えば所望のセレクターコドンを対応する核酸に付加することにより、蛋白質の例えば１、２、３、４、５個、又はそれ以上の選択部位に例えば１、２、３、４、５種、又はそれ以上の異なる非天然アミノ酸を導入することが可能である。各々異なる所定のセレクターコドンを認識する例えば１、２、３、４、５組又はそれ以上の異なるコグネイト直交成分を細胞１個に含むことができる（終止コドンと４塩基以上のコドンをセレクターコドンとして使用することができる）。
【００３９】
ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳ、非天然アミノ酸、セレクターコドン、並びに１個以上の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質の作製に適した直交翻訳系を作製及び／又はその特異性を改変するための方法に関する詳細は一般に例えば国際公開番号ＷＯ２００２／０８６０７５、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ｔＲＮＡ−ＡＭＩＮＯＡＣＹＬ−ｔＲＮＡ  ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ  ＰＡＩＲＳ）」；ＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」；ＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」；ＷＯ２００５／０１９４１５（出願日２００４年７月７日）；ＷＯ２００５／００７８７０（出願日２００４年７月７日）；及びＷＯ２００５／００７６２４（出願日２００４年７月７日）に記載されている。これらの各出願の開示内容全体を本願に援用する。各々その開示内容全体を本願に援用するＷａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，”Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４４（１）：３４−６６（２００５）；Ｄｅｉｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １５：１５２１−１５２４（２００５）；Ｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００２，１２４，９０２６−９０２７；及び国際公開ＷＯ２００６／０３４３３２（出願日２００５年９月２０日）も参照。その他の詳細は米国特許第７，０４５，３３７号、第７，０８３，９７０号、第７，２３８，５１０号、第７，１２９，３３３号、第７，２６２，０４０号、第７，１８３，０８２号、第７，１９９，２２２号、及び第７，２１７，８０９号に記載されている。
【００４０】
レダクターゼ
レダクターゼは還元反応を触媒する酵素である。しかし、大半のレダクターゼは適正な条件下ではレダクターゼとしてもオキシダーゼとして挙動することができる。従って、いずれも例えば１個以上のＮＨ２Ｙ残基を組込むように本発明に従って改変することができるこの広義の酵素ファミリーを表すためにオキシドレダクターゼなる用語も使用する。一般に、これはレダクターゼをコードする核酸に適切なセレクターコドンを組込み、ＮＨ２Ｙに特異的な適切なＯ−ＲＳと、セレクターコドンを認識するコグネイトＯ−ｔＲＮＡと、ＮＨ２Ｙを含む細胞でレダクターゼを発現させることにより実施される。
【００４１】
ＮＨ２Ｙ残基を組込むようにこうして改変することができるレダクターゼ酵素の例としては、酵素番号（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＥＣ番号）「ＥＣ１」で表されるものが挙げられる。この例としては、ＥＣ１．１（供与体のＣＨ−ＯＨ基に作用するオキシドレダクターゼ（例えばアルコールオキシドレダクターゼ））；ＥＣ１．２（供与体のアルデヒド又はオキソ基に作用するオキシドレダクターゼ）；供与体のＣＨ−ＣＨ基に作用するＥＣ１．３オキシドレダクターゼ（例えばＣＨ−ＣＨオキシドレダクターゼ）；ＥＣ１．４（供与体のＣＨ−ＮＨ２基に作用するオキシドレダクターゼ（アミノ酸オキシドレダクターゼ，モノアミンオキシダーゼ））；ＥＣ１．５（供与体のＣＨ−ＮＨ基に作用するオキシドレダクターゼ）；ＥＣ１．６（ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨに作用するオキシドレダクターゼ）；ＥＣ１．７（供与体としての他の窒素化合物に作用するオキシドレダクターゼ）ＥＣ１．８（供与体の硫黄基に作用するオキシドレダクターゼ）；ＥＣ１．９（供与体のヘム基に作用するオキシドレダクターゼ）；ＥＣ１．１０（供与体としてのジフェノール及び関連物質に作用するオキシドレダクターゼ）；ＥＣ１．１１（受容体としての過酸化物に作用するオキシドレダクターゼ（例えばペルオキシダーゼ））；ＥＣ１．１２（供与体としての水素に作用するオキシドレダクターゼ）；ＥＣ１．１３（分子状酸素の取込みにより単一供与体に作用するオキシドレダクターゼ（例えばオキシゲナーゼ））；ＥＣ１．１４（分子状酸素の取込みにより供与体対に作用するオキシドレダクターゼ）；ＥＣ１．１５（受容体としてのスーパーオキシドラジカルに作用するオキシドレダクターゼ）；ＥＣ１．１６（金属イオンを酸化するオキシドレダクターゼ）；ＥＣ１．１７（ＣＨ又はＣＨ２基に作用するオキシドレダクターゼ）；ＥＣ１．１８（供与体としての鉄−硫黄蛋白質に作用するオキシドレダクターゼ）；ＥＣ１．１９（供与体としての還元型フラボドキシンに作用するオキシドレダクターゼ）；ＥＣ１．２０（供与体中のリン又はヒ素に作用するオキシドレダクターゼ）；ＥＣ１．２１（Ｘ−ＨとＹ−Ｈに作用してＸ−Ｙ結合を形成するオキシドレダクターゼ）；ＥＣ１．９７（他のオキシドレダクターゼ）；ＥＣ１．９８（Ｈ２を還元剤として使用する酵素）；及びＥＣ１．９９（Ｏ２を酸化剤として使用する酵素）が挙げられる。
【００４２】
本発明の特に好ましい１態様はＥＣ１．１７のレダクターゼ（ＣＨ又はＣＨ２基に作用するレダクターゼ）へのＮＨ２Ｙの組込みに関し、このようなレダクターゼとしてはキサンチンオキシダーゼと、特にリボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＮＲ）が挙げられる。リボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＮＲ）は全生物でリボヌクレオチド（例えばＣＤＰ、ＡＤＰ、ＧＤＰ、及びＵＤＰ）からデオキシリボヌクレオチドへの還元を触媒することができる。ＲＮＲは細胞内ｄＮＴＰ濃度の相対比を維持するので、これらの酵素は核酸代謝、ＤＮＡ修復、ゲノム維持、及び細胞増殖に中心的な役割を果たす（Ｓｊｏｂｅｒｇ（１９９７）“Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅｓ−ａ  ｇｒｏｕｐ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｍｅｔａｌｌｏｓｉｔｅｓ  ａｎｄ  ａ  ｓｉｍｉｌａｒ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．”Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｏｎｄｉｎｇ（Ｂｅｒｌｉｎ）８８：１３９−１７３；Ｒｅｉｃｈａｒｄ（１９９３）“Ｆｒｏｍ  ＲＮＡ  ｔｏ  ＤＮＡ，ｗｈｙ  ｓｏ  ｍａｎｙ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅｓ？”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：１７７３−１７７７）。（ｄＴＤＰはチミジル酸シンターゼにより産生される）。ＲＮＲがＮＤＰを還元するメカニズムは複雑で高度に制御されたラジカル依存性酸化還元反応を伴う（Ｓｔｕｂｂｅ（１９９０）“Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅｓ：ａｍａｚｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｏｎｆｕｓｉｎｇ．”Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６５：５３２９−５３３２；Ｊｏｒｄａｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）“Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅｓ．”Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６７：７１−９８）。一般に、ヘルペスウイルスに由来するもの以外のＲＮＲは個々のゲノムの塩基組成に応じてバランスのとれたプールとしてＤＮＡ前駆体を供給するようにデオキシリボヌクレオシド三リン酸とＡＴＰによりアロステリック調節される（Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）“Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ４  ｐｈａｇｅ  ａｅｒｏｂｉｃ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ａｓｓａｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｏｕｒ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．”Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２：２８６１−２８６５；Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）“Ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ａｎａｌｙｚｅｄ  ｂｙ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｆｏｕｒ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．”Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３：２９５１２−２９５１８）。ＲＮＲ活性の制御に加え、アロステリックメカニズムは基質特異性も制御する（Ｊｏｒｄａｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）“Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅｓ．”Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６７：７１−９８）。
【００４３】
ＲＮＲは構造的に多様であり、それらが必要とする金属補因子（例えば電子供与体）も同様に構造的及び化学的に多様である。実際には、ＲＮＲはその金属補因子に基づいて４分類することができる。クラスＩ  ｒＲＮＲは二核鉄（ＩＩＩ）中心によるＯ２の活性化により安定なチロシルラジカルを蛋白質上に生成する。クラスＩレダクターゼは更に酵素調節の相違によりクラスＩＡとクラスＩＢに分けられる。クラスＩＡレダクターゼは真核生物、真正細菌、バクテリオファージ及びウイルスに分布している。クラスＩＢレダクターゼは真正細菌に存在し、マンガンを使用してラジカルを生成することができる。クラスＩＩ  ＲＮＲはＯ２の有無に関係なく機能することができ、アデノシルコバラミン（ＡｄｏＣｂｌ）中のＣ−ＣＯ結合の開裂により過渡的な５’−デオキシアデノシルラジカルを生成する。クラスＩＩＩ  ＲＮＲは一般に嫌気性であり、Ｓ−アデノシルメチオニンの開裂により蛋白質上に安定なグリシルラジカルを生成する。クラスＩＶ  ＲＮＲはチロシルラジカルの近くにマンガン補因子を含むと提唱されている。
【００４４】
クラスＩ  ＲＮＲは相互に結合して活性なヘテロダイマーテトラマーを形成することができるＲＮＲ１サブユニットとＲＮＲ２サブユニットを含む。クラスＩ  ＲＮＲの一般的な機構モデルは、１）サブユニットＲ２の二核鉄中心によるチロシルラジカルの生成と；２）サブユニットＲ１に結合した基質付近に提唱されたチイルラジカルを生成するラジカル移動と；３）結合したリボヌクレオチドの触媒還元の３段階を含む。アミノ酸又は基質に由来するラジカルが主要な全３段階に関与している。本発明の好ましい態様では、例えばラジカル成長における各天然チロシン残基の機構的機能を解明するためにクラスＩ  ＲＮＲのチロシン残基を非天然アミノ酸ＮＨ２Ｙで有利に置換することができる。本発明により提供される方法を使用して例えば大腸菌クラスＩ  ＲＮＲにおいて置換することができるチロシン残基としては、β２サブユニットのＹ７３０、Ｙ７３１、Ｙ１２２、及び／又はＹ３５６に１個以上にＮＨ２Ｙ突然変異を含むリボヌクレオチドレダクターゼが挙げられる。
【００４５】
リボヌクレオチドレダクターゼの構造、メカニズム、及び／又は調節に関する更に詳細は例えばＳｔｕｂｂｅ  ＆  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｄｏｎｋ（１９９５）“Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅｓ：ｒａｄｉｃａｌ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｗｉｔｈ  ｓｕｉｃｉｄａｌ  ｔｅｎｄｅｎｃｉｅｓ．”Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ２：７９３−８０１；Ｔｏｒｒｅｎｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）“Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅｓ：Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ａｎｃｉｅｎｔ  Ｅｎｚｙｍｅ”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ５５：１３８−１５２；Ｎｏｒｌｕｎｄ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）“Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅｓ．”Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ７５：６８１−７０６；Ｋｏｌｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅｓ．”Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １６９９：１−３４に記載されている。クラスＩ  ＲＮＲにおけるラジカル成長メカニズムの解明に関する更に詳細については下記実施例に説明する。
【００４６】
ＮＨ２Ｙ残基を組込んだレダクターゼの発現、精製及び単離
本発明の核酸（例えば、セレクターコドンを含み、例えばレダクターゼ酵素の１本以上のポリペプチド鎖をコードするレダクターゼ核酸に由来する核酸）は標準クローニング法に従って作製することができる。核酸を単離、クローニング及び増幅する手順と、細胞及び無細胞系に核酸構築物を供給して発現させる手順は文献に詳細に記載されており、セレクターコドンを含む核酸を提供し、発現させるため、例えばＮＨ２Ｙ残基を組込んだレダクターゼ蛋白質、例えばクラスＩ又はクラスＩＶリボヌクレオチドレダクターゼを作製するために本発明で使用することができる。組換えレダクターゼ酵素は真核生物（例えばヒト、マウス、酵母等）、原核生物、古細菌及びウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス）等の各種起源の任意のものに由来することができる。好ましい態様において、本発明の核酸はα２サブユニットのＹ７３０、Ｙ７３１、Ｙ１２２、及び／又はＹ３５６にＮＨ２Ｙ突然変異を含む組換え大腸菌リボヌクレオチドレダクターゼをコードすることができる。あるいは、本発明の核酸は本明細書の他の箇所に記載するように、場合によりクラスＩ〜ＩＶに含まれる任意リボヌクレオチドレダクターゼ又はＥＣ番号１．１〜１．９９で表される任意レダクターゼをコードすることができる。
【００４７】
核酸クローニング及び発現技術の更に詳細については、Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌｕｍｅ  １５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  Ｅｄ．），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０００（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）；Ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｒａｌｐｈ  Ｒａｐｌｅｙ（ｅｄ）（２０００）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ（Ｒａｐｌｅｙ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（２００７年補遺版）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」）；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）（Ｉｎｎｉｓ）；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ）ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ  １９２）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｖｉｌｊｏｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ＰＣＲ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ；及びＤｅｍｉｄｏｖ  ａｎｄ  Ｂｒｏｕｄｅ（ｅｄｓ）（２００５）ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｙｍｏｎｄｈａｍ，ＵＫに記載されている。例えば細胞単離及び培養（例えばその後の核酸単離）に関する他の有用な参考文献としては、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋとその引用文献；Ｐａｙｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇａｍｂｏｒｇ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（ｅｄｓ）（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）及びＡｔｌａｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｓ（ｅｄｓ）Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬが挙げられる。
【００４８】
レダクターゼ酵素（例えば大腸菌由来リボヌクレオチドレダクターゼ）におけるアミノ酸（例えばチロシンアミノ酸）の機構的役割を評価するには、該当天然アミノ酸をＮＨ２Ｙ残基で置換した組換えレダクターゼの精製が必要である。例えば本発明の組換えレダクターゼを発現させた細胞に由来する細胞ペースト又は抽出液から高収率の組換えレダクターゼを得ることができる。細胞ペースト又は抽出液は例えばレダクターゼ約２ｍｇ／ｇ、又はより好ましくは組換えレダクターゼ４〜６ｍｇ／ｇを含有することができる。種々の蛋白質精製法が当分野で周知であり、少なくとも１個のＮＨ２Ｙ残基を組込んだレダクターゼ変異体の精製分析に適用することができる。これらの技術及びポリペプチド分析に必要な他の技術としては、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１８２：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｓａｎｄａｎａ（１９９７）Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｏｌｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ＮＹ；Ｗａｌｋｅｒ（１９９６）Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ；Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ａｎｇａｌ（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ａｎｇａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｓｃｏｐｅｓ（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ；Ｊａｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｒｙｄｅｎ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，ＮＹ；及びＷａｌｋｅｒ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ＣＤ−ＲＯＭ版  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ；とその引用文献に記載されているものが挙げられる。
【００４９】
大腸菌ＲＮＲ等のレダクターゼ蛋白質の発現及び単離プロトコールに関する更に詳細については下記実施例に記載する。
【００５０】
レダクターゼ酵素におけるＮＨ２Ｙの検出方法
下記実施例１は例えばＮＨ２Ｙ残基組込みを検出するため、及び例えばラジカル形成検出用分子プローブとして、レダクターゼ酵素におけるＮＨ２Ｙ残基の検出について詳細に記載する。使用可能な２種類の一般的な方法として、ＥＰＲ分光法と、例えばＵＶ−ｖｉｓ分光法を使用するスペクトル分析が挙げられる。これらの方法は広く利用可能であり、アミノ酸残基、ラジカル及び他の該当部分の検出におけるその使用は当業者に周知である。
【００５１】
電子常磁性共鳴法（ＥＰＲ）は電子スピン共鳴法（ＥＳＲ）及び電子磁気共鳴法（ＥＭＲ）とも呼ばれ、フリーラジカルと常磁性中心を検出及び同定するために使用することができる１種の分光法である。ＥＰＲ分光法は不対電子を強い静磁場Ｂ０に置き、Ｂ０に垂直な低振幅高周波数磁場Ｂ１に暴露した場合のマイクロ波放射の吸収を測定する。非常に不安定なフリーラジカルは多くの場合にＥＰＲ特性決定のためにスピントラップにより安定化させることができる。実際に、本願に記載するように、所定のＲＮＲレダクターゼ等の金属蛋白質により生成されたフリーラジカル中間体の検出と分析にはＥＰＲスピントラップを有利に適用することができる。
【００５２】
これに関連して、ＥＰＲで活性な反応中間体（例えばフリーラジカル）の形成と減衰の反応速度を測定するために急速凍結クエンチ（ＲＦＱ）ＥＰＲを使用することができる。ＲＦＱ  ＥＰＲでは反応を指定時間進行させた後に急速凍結と低温維持により、例えばＲＮＲにより触媒される反応を停止させる。その後、トラップされた種をＥＰＲにより分析する。この方法は本発明の組換えレダクターゼによる例えばＮＨ２Ｙラジカル形成の検出に有益に適用することができる。要約すると、ＲＦＱ  ＥＰＲでは、反応体を迅速に混合し、例えばミリ秒から秒のタイムスケールで所定時間反応を実施する。例えば−１４０℃に維持した液体イソペンタン中に混合物を急速に噴射することにより反応を停止ないしクエンチする。反応のクエンチ後に形成された結晶をＥＰＲ管に充填した後、ＥＰＲスペクトルを取得し、モニターするラジカルの反応速度と構造を決定する。
【００５３】
ＥＰＲ技術に関する更に詳細については、Ｗｅｉｌ  ａｎｄ  Ｂｏｌｔｏｎ（２００７）Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：Ｅｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ；及びＧｒａｓｌｕｎｄ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）“Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  Ｃｌａｓｓ  Ｉ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ．”Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃ  Ｓｔｒｕｃｔ  ２５：２５９−２８６に記載されている。核磁気共鳴法（ＮＭＲ）等の他の共鳴法を使用してレダクターゼ蛋白質中のＮＨ２Ｙ残基を分析することもできる。ＮＭＲ技術の一般論については、例えばＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｓｏｌｉｄ−Ｓｔａｔｅ  ＮＭＲ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（２００４）Ｍｅｌｉｎｄａ  Ｊ．Ｄｕｅｒ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｗｉｌｅｙ参照。
【００５４】
例えばＲＮＲに触媒される反応中の例えばフリーラジカル形成及び／又は成長の反応速度に関する速度データを取得するために、ストップトフロー分光法等の他の分光法も使用できる。ＵＶ−ｖｉｓ分光法と、レダクターゼ蛋白質におけるＮＨ２Ｙ残基の機構的役割を分析するため、及び／又はレダクターゼ反応速度をモニターするために使用することができる他の分光技術については、例えばＴｏｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｙ１２２Ｆ  Ｒ２  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｂｙ  Ｔｉｍｅ−Ｒｅｓｏｌｖｅｄ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｘ−ｒａｙ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ．”Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３７：５８４０−５８４８；Ｌａｓｓｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）“Ａｎ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ＥＰＲ  ｓｔｏｐｐｅｄ−ｆｌｏｗ  ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａ  ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｒｉｎｇ  ｒｅｓｏｎａｔｏｒ．”Ｊ  Ｍａｇ  Ｒｅｓ  １７２：３１２−３２３；Ｐａｖｉａ（１９９６）Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｓｔｕｄｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｈａｒｃｏｕｒｔ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｐｕｂ；Ｓｏｒｒｅｌ（１９９８）Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔｉｎｇ  Ｓｐｅｃｔｒａ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｏｏｋｓ；及びＭｏｈａｎ（２００７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ＩＳＢＮ：９７８−８１−７３１９−５４９−５参照。
【００５５】
用語定義に関する他の詳細
「レダクターゼ酵素」とは還元反応を触媒する酵素である。このような酵素は両方向の反応を触媒するので、大半のレダクターゼは適正な条件下ではレダクターゼとしてもオキシダーゼとして挙動することができ、従って、構造的に多様な酵素のこの広義のファミリーを表すためにオキシドレダクターゼなる用語も使用する。本発明で使用することができるレダクターゼ酵素の例としては、酵素番号（ＥＣ番号）「ＥＣ１」で表されるものが挙げられる。レダクターゼのクラスに関する更に詳細については本明細書の他の箇所に記載する。
【００５６】
から誘導：本明細書で使用する「から誘導」なる用語は特定分子もしくは生物から単離された成分、あるいは特定分子もしくは生物又は特定分子もしくは生物からの情報を使用して作製された成分を意味する。例えば、第２のポリペプチドから誘導されるポリペプチドは、例えば第２のポリペプチドへの非天然アミノ酸の組込み以外は、第２のポリペプチドのアミノ酸配列と同一又は実質的に同様のアミノ酸配列を含むことができる。ポリペプチドの場合には、誘導種は例えば突然変異誘発により得ることができる。ポリペプチドを誘導するために使用される突然変異誘発は意図的に特異的でも意図的にランダムでもよいし、各々の混合でもよい。第１のポリペプチドから誘導される別のポリペプチドを作製するためのポリペプチドの突然変異誘発は（例えばポリメラーゼの非忠実性に起因する）ランダムなイベントとすることができ、誘導されたポリペプチドの同定は例えば本明細書に記載するような適当なスクリーニング法により実施することができる。ポリペプチドの突然変異誘発は一般にポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの操作を伴う。
【００５７】
ある蛋白質又は核酸配列が別の配列から誘導されているか否は分子間の相同性検出により同定することができる。２分子は共通の祖先分子に由来するときに相同である。相同性は通常では配列一致度又は類似度を検出することにより検出される。配列一致度又は類似度を評価することにより相同性を認識するための厳密なカットオフは変動するが、一般には配列類似度が約２５％程度であれば相同であると同定する。相同性を同定するにはもっと高い類似度百分率、例えば３５％、４５％、５５％、６５％、７５％、８５％  ９５％、９８％又はそれ以上が有用である。配列類似度／一致度はＢＬＡＳＴＰ（蛋白質の場合）やＢＬＡＳＴＮ（核酸の場合）等の公共入手可能なプログラムを使用し、例えばデフォルトパラメータを使用して同定することができる（ＢＬＡＳＴＰとＢＬＡＳＴＮは例えばＮＣＢＩから例えばワールドワイドウェブ上でｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔから広く入手可能である）。
【００５８】
直交：本明細書で使用する「直交」なる用語は細胞又は翻訳系に内在する対応分子（ｔＲＮＡ又はＲＳ）に比較した場合に細胞の内在成分と良好に共働しないか又は全く共働しない機能性分子（例えば直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）及び／又は直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ））を意味する。直交成分は相互に良好に共働するコグネイト成分として役立つように提供され、例えばＯ−ｔＲＮＡが細胞の内在ＲＳの基質として良好に機能しないか又は全く機能せず、Ｏ−ＲＳが細胞の内在ｔＲＮＡと良好に共働しないか又は全く共働しないとしても、細胞中のコグネイトＯ−ｔＲＮＡを効率的にアミノアシル化することができるＯ−ＲＳを提供することができる。直交成分と内在成分の種々の比較効率を評価することができる。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡは一般に典型的な生理的条件下で内在ＲＳに対する基質としての活性が不良又は不在であり、例えばＯ−ｔＲＮＡは基質としての効率が内在ＲＳに対する内在ｔＲＮＡの効率の１０％未満であり、一般に基質としての効率が５％未満、通常は１％未満になる。同時に、ｔＲＮＡはＯ−ＲＳに対する基質として非常に効率的にすることができ、例えばアミノアシル化基質としての効率がその内在ＲＳに対する内在ｔＲＮＡの効率の少なくとも５０％、多くの場合には７５％、９５％、又は１００％以上である。
【００５９】
直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ：本明細書で使用する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）とは該当翻訳系においてＯ−ｔＲＮＡをアミノ酸で優先的にアミノアシル化する酵素である。Ｏ−ＲＳが本発明においてＯ−ｔＲＮＡに負荷するアミノ酸は３−アミノチロシン（ＮＨ２Ｙ）である。
【００６０】
直交ｔＲＮＡ：本明細書で使用する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）とは該当翻訳系に直交性のｔＲＮＡである。ｔＲＮＡは例えば３−アミノチロシンを負荷した状態で存在することもできるし、負荷しない状態で存在することもできる。更に当然のことながら、Ｏ−ｔＲＮＡは場合によりコグネイト直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼにより３−アミノチロシンを負荷（アミノアシル化）される。実際に、当然のことながら、本明細書に記載するＯ−ｔＲＮＡは翻訳中にセレクターコドンに応答して成長中のポリペプチドに３−アミノチロシンを挿入するために使用される。
【００６１】
コグネイト：「コグネイト」なる用語は共働する成分、例えば直交ｔＲＮＡと直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを意味する。これらの成分は相補的であると言うこともできる。
【００６２】
優先的にアミノアシル化する：本明細書で直交翻訳系に関して使用する場合に、Ｏ−ＲＳはＯ−ＲＳが発現システムで任意内在ｔＲＮＡに負荷するよりも効率的にＯ−ｔＲＮＡに３−アミノチロシンを負荷するときにコグネイトＯ−ｔＲＮＡを「優先的にアミノアシル化する」。即ち、Ｏ−ｔＲＮＡと所与の任意内在ｔＲＮＡがほぼ等モル比で翻訳系に存在するとき、Ｏ−ＲＳは内在ｔＲＮＡに負荷するよりも高頻度でＯ−ｔＲＮＡに負荷する。Ｏ−ＲＳにより負荷されるＯ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳにより負荷される内在ｔＲＮＡの相対比は高いことが好ましく、従って、Ｏ−ｔＲＮＡと内在ｔＲＮＡが等モル濃度で翻訳系に存在する場合にはＯ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡに排他的、又はほぼ排他的に負荷することが好ましい。Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳが等モル濃度で存在する場合にＯ−ＲＳにより負荷されるＯ−ｔＲＮＡと内在ｔＲＮＡの相対比は１：１を上回り、好ましくは少なくとも約２：１、より好ましくは５：１、更に好ましくは１０：１、更に好ましくは２０：１、更に好ましくは５０：１、更に好ましくは７５：１、更に好ましくは９５：１、９８：１、９９：１、１００：１、５００：１、１，０００：１、５，０００：１又はそれ以上である。（ａ）Ｏ−ＲＳが内在ｔＲＮＡに比較してＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化するとき、及び（ｂ）Ｏ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡを任意天然アミノ酸でアミノアシル化する場合に比較してそのアミノアシル化が３−アミノチロシンに特異的であるときにＯ−ＲＳは「Ｏ−ｔＲＮＡを３−アミノチロシンで優先的にアミノアシル化する」。例えば、３−アミノチロシンと天然アミノ酸が本明細書に記載する配列表の該当Ｏ−ＲＳと本明細書に記載する配列表の該当Ｏ−ｔＲＮＡを含む翻訳系に等モル量で存在するとき、Ｏ−ＲＳは天然アミノ酸よりも高頻度で３−アミノチロシンをＯ−ｔＲＮＡに負荷する。３−アミノチロシンを負荷されたＯ−ｔＲＮＡと天然アミノ酸を負荷されたＯ−ｔＲＮＡの相対比は高いことが好ましい。Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡに排他的、又はほぼ排他的に３−アミノチロシンを負荷することがより好ましい。天然アミノ酸と３−アミノチロシンの両者が等モル濃度で翻訳系に存在するとき、Ｏ−ｔＲＮＡの３−アミノチロシン負荷とＯ−ｔＲＮＡの天然アミノ酸負荷の相対比は１：１を上回り、好ましくは少なくとも約２：１、より好ましくは５：１、更に好ましくは１０：１、更に好ましくは２０：１、更に好ましくは５０：１、更に好ましくは７５：１、更に好ましくは９５：１、９８：１、９９：１、１００：１、５００：１、１，０００：１、５，０００：１又はそれ以上である。
【００６３】
セレクターコドン：「セレクターコドン」なる用語は翻訳プロセスでＯ−ｔＲＮＡにより認識され、内在ｔＲＮＡにより認識されないコドンを意味する。Ｏ−ｔＲＮＡアンチコドンループはｍＲＮＡ上のセレクターコドンを認識し、負荷されたアミノ酸（例えば３−アミノチロシン）をポリペプチドのこの部位に組込む。セレクターコドンとしては例えば終止コドン（例えばアンバー、オーカー及びオパールコドン）等のナンセンスコドン、４塩基以上のコドン、レアコドン、ノンコーディングコドン、天然又は非天然塩基対から誘導されるコドン及び／又は同等物を挙げることができる。
【００６４】
抑圧活性：本明細書で使用する「抑圧活性」なる用語は一般に、読み飛ばさないと翻訳終結又は誤訳（例えばフレームシフト）をもたらすコドン（例えばアンバーコドンや４塩基以上のコドンであるセレクターコドン）の翻訳読み飛ばしを行うｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ）の能力を意味する。サプレッサーｔＲＮＡの抑圧活性は第２のサプレッサーｔＲＮＡ又は対照系（例えばＯ−ＲＳをもたない対照系）に比較して観測される翻訳読み飛ばし活性の百分率として表すことができる。
【００６５】
サプレッサーｔＲＮＡ：サプレッサーｔＲＮＡとは、一般にポリペプチドの翻訳中に終止コドンに応答してアミノ酸の組込み（即ち「読み飛ばし」）を可能にすることにより、所与翻訳系でメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の読取りを変更するｔＲＮＡである。所定側面において、本発明のセレクターコドンはサプレッサーコドンであり、例えば終止コドン（例えばアンバー、オーカー又はオパールコドン）、４塩基コドン、レアコドン等である。
【００６６】
翻訳系：「翻訳系」なる用語は成長中のポリペプチド鎖（蛋白質）にアミノ酸を組込む成分を意味する。翻訳系の成分としては例えばリボソーム、ｔＲＮＡ、シンテターゼ、ｍＲＮＡ等を挙げることができる。本発明のＯ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳは、例えば非真核細胞（例えば大腸菌等の細菌）、又は真核細胞（例えば酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、昆虫細胞、及び／又は同等物）でｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ翻訳系に付加するか又はその一部とすることができる。
【００６７】
非天然アミノ酸：本明細書で使用する「非天然アミノ酸」なる用語は２０種類の標準天然アミノ酸の１種以外の任意アミノ酸、修飾アミノ酸、及び／又はアミノ酸類似体を意味する。例えば、本発明では非天然アミノ酸３−アミノチロシンを利用する。
（実施例１）
大腸菌リボヌクレオチドレダクターゼのサブユニットα２への３−アミノチロシンの部位特異的挿入：ラジカル成長におけるＹ７３０及びＹ７３１の関与の直接証拠
【００６８】
大腸菌リボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＮＲ）は複雑なラジカル反応を使用してデオキシヌクレオチドの生産を触媒する。活性なＲＮＲはα２及びβ２の２つのサブユニットの１：１複合体から構成される。α２はヌクレオシド二リン酸基質とデオキシヌクレオチド／ＡＴＰアロステリックエフェクターとに結合し、ヌクレオチド還元部位である。β２はデオキシヌクレオチド形成を開始する安定な二核鉄チロシルラジカル（Ｙ１２２・）補因子である。このプロセスはβ２のＹ１２２・とα２の活性部位のＣ４３９間の＞３５Åにわたる可逆的ラジカル移動を伴うと提唱されている。個々のサブユニットの構造に基づくα２β２のドッキングモデルによると、ラジカル開始はα２のＹ７３０とＹ７３１を含む過渡的な芳香族アミノ酸ラジカル中間体の経路を介すると思われる。本試験では、３−アミノチロシン（ＮＨ２Ｙ）で部位特異的に置換することにより残基Ｙ７３０及びＹ７３１の機能を検討する。ｉｎ  ｖｉｖｏサプレッサーｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ法を使用した処、細胞ペースト１ｇ当たり４〜６ｍｇの収率でＹ７３０ＮＨ２Ｙ−α２とＹ７３１ＮＨ２Ｙ−α２が高い忠実度で生成された。これらの突然変異体をβ２、ＣＤＰ及びＡＴＰの存在下でストップトフローＵＶ−ｖｉｓ及びＥＰＲ分光法により試験した。その結果、ＮＨ２Ｙラジカル（ＮＨ２Ｙ７３０・又はＮＨ２Ｙ７３１・）が反応速度的にコンピテントに形成されることが判明した。活性アッセイによると、どちらのＮＨ２Ｙ−α２もデオキシヌクレオチドを形成する。これらの結果からＮＨ２Ｙ・はＣ４３９を酸化できることが明らかであり、α２内のラジカル成長経路には水素原子移動メカニズムが関与しているのではないかと考えられる。確認されたＮＨ２Ｙ・は代謝回転中の提唱されたラジカル成長経路におけるアミノ酸ラジカル中間体の最初の発見に相当すると思われる。
【００６９】
緒言
全生物において、リボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＮＲ）はヌクレオチドから２’−デオキシヌクレオチドへの変換を触媒し、ＤＮＡ生合成及び修復に必要な前駆体を提供する１−３。ヌクレオチド還元のメカニズムは全ＲＮＲで保存されており、過渡的活性部位チイルラジカル（Ｃ４３９・，本明細書の随所で使用する大腸菌ＲＮＲナンバリング）の形成を必要とする４，５。しかし、ラジカル開始イベントである活性部位チイルラジカル生成のメカニズムは保存されておらず、ＲＮＲの４クラスの分類の基準となる６−９。主要な未解決のメカニズム問題のはクラスＩ  ＲＮＲと、恐らく最近同定されたクラスＩＶ  ＲＮＲにおけるチイルラジカル形成のメカニズムの問題である。本願では、大腸菌ＲＮＲのサブユニットの１つへの３−アミノチロシン（ＮＨ２Ｙ）の部位特異的組込みを報告すると共に、これらの突然変異体によりラジカル開始のメカニズムを洞察する。
【００７０】
大腸菌クラスＩ  ＲＮＲは代謝回転中に活性な１：１複合体を形成する２つのホモダイマーサブユニットα２及びβ２から構成される１０−１２。α２は複合体の実働部分である。このサブユニットはチイルラジカルに介在されるヌクレオチド還元が生じる活性部位と、基質特異性と代謝回転率を調節する複数のアロステリックエフェクター結合部位を含む１３。β２はα２の活性部位で過渡的Ｃ４３９・の形成に必要な安定な二核鉄（ＩＩＩ）チロシルラジカル（Ｙ１２２・）１４−１６補因子を含む４−６。α２６，１７とβ２１８，１９の構造は解明されており、両方のサブユニットを含む構造も報告されている２０。しかし、活性なα２β２複合体の構造は謎のままである。α２とβ２の個々の構造から、ＵｈｌｉｎとＥｋｌｕｎｄは形状及び電荷の相補性と残基保存に基づいてα２β２複合体のドッキングモデルを作製した６。このモデルによると、β２のＹ１２２・はα２のＣ４３９から＞３５Åの位置にあるらしい（図１）２１−２３。この長距離にわたるラジカル成長には過渡的アミノ酸中間体の関与が必要である２４−２６。この経路に関与していると提唱されている残基は全クラスのＩ  ＲＮＲで広く保存されている。
【００７１】
パルス電子−電子二重共鳴分光測定２７とメカニズムベースの阻害剤２８−３２からＹ１２２・とＣ４３９間の長距離を裏付ける証拠が最近得られている。この試験から得られた距離はドッキングモデルと一致し、β２のＹ１２２・がα２のＣ４３９の近くになるような大きな立体配座変化は生じないことを証明している３２。
【００７２】
提唱された経路の有効性を試験するために、部位特異的突然変異誘発３３，３４と相補試験３５が実施されている。これらの試験は図１の各残基がＲＮＲ機能に重要な役割を果たすことを立証している。しかし、これらの突然変異体には活性がないため、機構調査は不可能である３３，３４。
【００７３】
現時点では、提唱されている経路残基のうちのただ１個であるＹ３５６が関与していることは多くの証拠により証明されている。この残基はβ２の無秩序領域内に位置しているので、β２のＷ４８とα２のＹ７３１までの距離が長く不明であるため、この残基の関与を立証することは特に重要である（図１）。本発明者らは最近、機構情報を提供する突然変異体を作製するために、発現蛋白質ライゲーション法を使用して非天然アミノ酸を残基３５６に組込むことができた３６，３７。１変異体では、Ｙ３５６をラジカルトラップ３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）で置換した３８。基質及び／又はエフェクターの存在下にＤＯＰＡ３５６−β２及びα２で試験した処、反応速度的にコンピテントにＤＯＰＡラジカル（ＤＯＰＡ・）が形成されることが判明し、まさに残基３５６はレドックス活性であることが立証された３８。本発明者らは残基３５６からＹ１２２への可逆的正孔移動を示すためにＤＯＰＡヘテロダイマーＤＯＰＡ−ββ’（ここでβ’モノマーはＣ末端２２残基を欠失する）も使用した３９。しかし、Ｙ３５６のレドックス活性な役割を証明する最も有力な証拠はフルオロチロシン類似体（ＦｎＹｓ，ｎ＝２，３又は４）をこの残基に部位特異的に挿入した一連の半合成ＦｎＹ３５６−β２から得られた４０，４３。これらのＦｎＹ３５６−β２誘導体はこの残基の還元電位とｐＫａの体系的変調を可能にし、経路内のプロトン共役電子移動の役割を解明する鍵となった２１，４０。ＦｎＹ３５６−β２の活性アッセイの結果、ラジカル開始、従ってヌクレオチド還元はＦｎＹとＹ間の還元電位差に基づいてオンオフされることが判明した４３。更に、ＦｎＹ−β２におけるｐＫａの変調の結果、ラジカル輸送中にこの残基における電子とプロトンの強制カップリングはないことが分かった４３。こうして、半合成β２を使用した試験の結果、ラジカル成長における残基３５６の機能とメカニズムが明らかになった。
【００７４】
他方、ラジカル成長におけるα２残基Ｙ７３０及びＹ７３１の役割はまだはっきりしていない。突然変異誘発試験はＲＮＲ機能におけるそれらの重要性を立証している３４，４４，４５。しかし、β２の残基Ｙ３５６と同様に、これらの突然変異体（Ｙ７３０Ｆ−α２及びＹ７３１Ｆ−α２）は不活性であるため、ラジカル成長におけるＹ７３０及びＹ７３１の役割の機構調査は不可能であった。更に、これらの残基の位置が決まっているときに発現蛋白質ライゲーションにより非天然アミノ酸をα２に組込むことは実現不能である。そこで、本発明者らは非天然アミノ酸を部位特異的に組込むための代替方法を検討した。
【００７５】
本願では、ＮＨ２Ｙをα２サブユニットの残基Ｙ７３０及びＹ７３１に組込むために、ＮＨ２Ｙに特異的なＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＮＨ２Ｙ−ＲＳ）の進化と、適切なＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアンバーサプレッサーｔＲＮＡとのそのｉｎ  ｖｉｖｏ併用について報告する４６−５０。その還元電位（ｐＨ７．０で０．６４Ｖ，図１，スキーム１参照）５１がＹよりも０．１９Ｖ低く、ＤＯＰＡと同様にラジカルトラップとして機能すると考えられることから、ＮＨ２Ｙをプローブとして選択し、正孔移動における残基Ｙ７３０及びＹ７３１の関与について直接報告する（図１）。更に、ＮＨ２ＹはＤＯＰＡよりも酸化に対して安定であるため、より実際的なターゲットとなる５１，５２。この手法を使用し、各ＮＨ２Ｙ−α２を１００ｍｇずつ作製した。Ｙ７３０ＮＨ２Ｙ−α２（又はＹ７３１ＮＨ２Ｙ−α２）をβ２、基質及びアロステリックエフェクターと共にインキュベートした結果、反応速度的にコンピテントにＮＨ２Ｙラジカル（ＮＨ２Ｙ・）が形成されることがストップトフロー（ＳＦ）ＵＶ−ｖｉｓ及びＥＰＲ分光法により立証された。ＮＨ２Ｙ−α２はデオキシヌクレオチド産生能を維持しているので、確認されたＮＨ２Ｙ・はヌクレオチド還元でコンピテントな複合体におけるラジカル成長中に発生すると考えられた。これらの結果から、直接水素原子移動がα２内の正孔移動の有効なメカニズムであると予想される。
【００７６】
材料と方法
材料。ルリア・ベルターニ（ＬＢ）培地、ＢａｃｔｏＡｇａｒ、２ＹＴ培地、及び大小直径（１００ｍｍと１５０ｍｍ）ペトリ皿プレートはＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから入手した。ＮＨ２Ｙ、Ｍ９塩、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）、カナマイシン（Ｋａｎ）、アンピシリン（Ａｍｐ）、Ｌ−アラビノース（Ｌ−Ａｒａ）、クロラムフェニコール（Ｃｍ）、Ｌ−ロイシン（Ｌｅｕ）、Ｄ−ビオチン、チアミンＨＣｌ、ＡＴＰ、シチジン−５’−二リン酸（ＣＤＰ）、ＮＡＤＰＨ、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、グリセロール、ブラッドフォード試薬、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５、フェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、硫酸ストレプトマイシン、ヒドロキシ尿素、２’−デオキシシチジン及び２’−デオキシグアニジン−５’−三リン酸（ｄＧＴＰ）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、ＤＬ−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）及びＴ４  ＤＮＡリガーゼはＰｒｏｍｅｇａから入手した。ＤＨ１０Ｂコンピテント細胞とオリゴヌクレオチドはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。部位特異的突然変異誘発はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ製品Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ  Ｋｉｔを使用して実施した。ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＡＰ，２０Ｕ／μＬ）はＲｏｃｈｅから入手した。ＫｐｎＩ及びＸｂｏＩ制限酵素はＮＥＢから入手した。ｐＴｒｃベクターはＳｉｎｓｋｅｙ博士（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍ．Ｉ．Ｔ．）の寄贈品とした。大腸菌チオレドキシン５３（ＴＲ，４０単位／ｍｇ）、大腸菌チオレドキシンレダクターゼ５４（ＴＲＲ，１４００単位／ｍｇ）、及びｗｔβ２５５（６２００〜７２００ｎｍｏｌ／ｍｉｎ・ｍｇ，二量体１個当たりラジカル１〜１．２個）の精製は文献に記載されている。α２、Ｙ７３０ＮＨ２Ｙ−α２及びＹ７３１ＮＨ２Ｙ−α２の濃度はε２８０ｎｍ＝１８９  ｍＭ−１ｃｍ−１を使用して測定した。グリセロール最少培地ロイシン（ＧＭＭＬ）は終濃度で１％（ｖ／ｖ）グリセロール、１×Ｍ９塩、０．０５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２及び０．３ｍＭ  Ｌ−ロイシンを含有する。ＲＮＲアッセイバッファーは５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，１５ｍＭ  ＭｇＳＯ４，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．６から構成される。
【００７７】
ＬＣ−ＭＳによるＮＨ２Ｙの細胞取込みの定量的アッセイ。取込みアッセイは多少変更した以外は以前に記載した通りに実施した４８。ＤＨ１０Ｂ大腸菌細胞を３７℃にてＧＭＭＬ中で１ｍＭ  ＮＨ２Ｙと０．１ｍＭ  ＤＴＴの存在下に飽和まで増殖させた後、以前に概説した通りに回収し、溶解させた。０．５ｍＬ／ｍｉｎで８分間０．１％  ＴＦＡ溶液中５％→２５％  ＭｅＣＮの直線勾配を使用してＺｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ｃ１８（５μｍ，４．６×１５０ｍｍ）カラムで粗抽出液のクロマトグラフィーを実施した。これらの条件下で、ＮＨ２Ｙは〜１３％  ＭｅＣＮで溶出する。ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ分析には、ＮＨ２Ｙ標準溶液を水溶液として調製した。
【００７８】
大腸菌におけるＮＨ２Ｙ−ＲＳの指向進化。先に詳述したようにポジティブ及びネガティブ選択サイクルを実施した４８。要約すると、プラスミドｐＢＫ−ＪＹＲＳは大腸菌ＧｌｎＲＳプロモーターの制御下でＴｙｒ結合溝から６．５Å以内の６残基をランダム変異させたＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳ変異体のライブラリーをコードし、ＫａｎＲマーカーを含む４６。ポジティブ選択にはプラスミドｐＲＥＰ／ＹＣ−Ｊ１７を使用し５６、これは非必須アンバー突然変異Ａｓｐ１１２ＴＡＧを含むクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子と、Ｍｅｔ１ＴＡＧとＧｌｎ１０７ＴＡＧの２箇所の非必須アンバー突然変異を含むＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７  ＲＮＡＰ）遺伝子をコードする。このプラスミドは更にＴｙｒＲＳライブラリーにより負荷されないコグネイト突然変異体ｔＲＮＡＣＵＡ（ｍｕｔＲＮＡＣＵＡ）の遺伝子と、Ｔ７  ＲＮＡＰにより発現誘導されるＧＦＰｕｖ遺伝子と、ＴｅｔＲマーカーも含む。ネガティブ選択にはプラスミドｐＬＷＪ１７Ｂ３を使用し５７，５８、これはＡｒａプロモーターの制御下でＧｌｎ２ＴＡＧ、Ａｓｐ４４ＴＡＧ及びＧｌｙ６５ＴＡＧの３箇所の非必須アンバー突然変異を含む毒性バルナーゼ遺伝子をコードする。このプラスミドは更にｍｕｔＲＮＡＣＵＡ遺伝子とＡｍｐＲマーカーも含む（表１）。
【００７９】
各ポジティブ選択サイクルで、突然変異体ＴｙｒＲＳライブラリーを含むｐＢＫ−ＪＹＲＳプラスミドライブラリーを、プラスミドｐＲＥＰ／ＹＣ−Ｊ１７を含む大腸菌ＤＨ１０Ｂコンピテント細胞にエレクトロポレーションにより形質転換した４８。細胞をＳＯＣ培地に回収し、３７℃で１時間増殖させた。次にＧＭＭＬで２回洗浄し、Ｔｅｔ  １２μｇ／ｍＬ，Ｋａｎ  ２５μｇ／ｍＬ，クロラムフェニコール（Ｃｍ）６０μｇ／ｍＬ，１ｍＭ  ＮＨ２Ｙ，及び１００μＭ  ＤＴＴを加えたＧＭＭＬ寒天プレート（１５０ｍｍ）６〜８枚に撒いた。還元環境を維持するために、ＮＨ２Ｙを含む全溶液又はプレートにＤＴＴを加えた。プレートを３７℃で７２時間インキュベートした。生存細胞をプレートから掻き取り、ＧＭＭＬ液体培地にプールした。次にＱｉａｇｅｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを使用して細胞からプラスミド単離を実施した。アガロースゲル電気泳動によりｐＢＫ−ＪＹＲＳライブラリー（〜３ｋｂ）をｐＲＥＰ／ＹＣ−Ｊ１７（〜１０ｋｂ）から分離し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用してゲルから抽出した。ＯＤ２６０ｎｍを使用してプラスミドＤＮＡを定量した。
【００８０】
ネガティブ選択を実施するために、ポジティブ選択から単離したプラスミドＤＮＡを、ｐＬＷＪ１７Ｂ３を含む大腸菌ＤＨ１０Ｂコンピテント細胞にエレクトロポレーションにより形質転換した４８。細胞をＳＯＣ培地に回収し、３７℃で１時間増殖させ、Ａｍｐ  １００μｇ／ｍＬ，Ｋａｎ  ５０μｇ／ｍＬ及び０．２％  Ｌ−Ａｒａを加えたＬＢ寒天プレートに撒いた。プレートを３７℃で１０〜１２時間インキュベートした。生存細胞を回収し、上記のようにプラスミド単離を実施した。
【００８１】
合計６サイクル（ポジティブ選択３回とネガティブ選択３回）後、細胞をプレート２組に撒くことにより４回目のポジティブ選択を実施した。一方の組にはポジティブサイクルについて記載したようにＮＨ２Ｙ／ＤＴＴを加え、他方にはＤＴＴのみを加えた。ポジティブ選択プラスミドでＴ７  ＲＮＡＰにより発現誘導されるＧＦＰｕｖから発光する緑色蛍光の差について２組のプレートを試験した（表１）。ＮＨ２Ｙ／ＤＴＴを加えたプレートから合計４８個のシングルコロニーを選択し、９６ウェルプレートでＧＭＭＬ  １００μＬに接種した。１ｍＭ  ＮＨ２Ｙの存在下及び不在下で０、２０、４０、６０、８０及び１１０μｇ／ｍＬのＣｍと０．１ｍＭ  ＤＴＴを加えた２組のＧＭＭＬ寒天プレートに得られた各細胞懸濁液から１μＬを接種した。プレートを３７℃で７２〜１２０時間インキュベートした。候補クローンはＮＨ２Ｙ／ＤＴＴと高濃度のＣｍ（〜１００μｇ／ｍＬ）を加えたプレートでは生存し、ＵＶ光下で緑色蛍光を発光することができるが、ＮＨ２Ｙを加えず、Ｃｍ濃度の低い（２０μｇ／ｍＬ）プレートでは死滅する。Ｔｅｔ  ２４μｇ／ｍＬとＫａｎ  ５０μｇ／ｍＬを加えた２ＹＴ培地５ｍＬに候補クローンを接種し、飽和まで増殖させた。次にプラスミドＤＮＡを上記のように単離し、ＤＮＡシーケンシングにより分析した。上記方法により選択したＮＨ２Ｙ−ＲＳ遺伝子を含むプラスミドはｐＢＫ−ＮＨ２Ｙ−ＲＳである。
【００８２】
Ｋ７ＮＨ２Ｙ−Ｚ−ドメインの発現。先に記載したように、プロテインＡのＣ末端にＨｉｓタグを付加したＺ−ドメイン（Ｚ−ドメイン）を使用してｐＢＫ−ＮＨ２Ｙ−ＲＳによるＮＨ２Ｙ組込み効率を試験した４８。残基７にアンバー終止コドンをもつＺ−ドメインとｍｕｔＲＮＡＣＵＡをコードするＬＥＩＺ５７，５９と、ｐＢＫ−ＮＨ２Ｙ−ＲＳをＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞に同時形質転換した。全増殖はＫａｎ（５０μｇ／ｍＬ）とＣｍ（３５μｇ／ｍＬ）の存在下に３７℃で実施した。シングルコロニーを２ＹＴ培地５ｍＬに接種し、飽和まで（〜１３時間）増殖させた。この飽和培養液１ｍＬを２ＹＴ培地２５ｍＬで希釈し、飽和まで一晩（〜１１時間）増殖させた。次にこの培養液１０ｍＬをＧＭＭＬ培地２×２５０ｍＬで希釈した。ＯＤ６００ｎｍが０．６５に達したら（９時間）、培養液の一方にＮＨ２ＹとＤＴＴ（夫々終濃度１ｍＭ及び０．１ｍＭ）を添加し、他方にはＤＴＴ（０．１ｍＭ）のみを添加した。ＮＨ２Ｙ／ＤＴＴ（又はＤＴＴ）の添加から１５分後に、ＩＰＴＧを各培養液に終濃度１ｍＭまで加えた。５時間後に、遠心により細胞を回収した。次にＮＨ２Ｙの存在下と不在下で増殖させたＺ−ドメインを先に記載したようにＮｉ２＋アフィニティークロマトグラフィーにより精製し、ＳＤＳ  ＰＡＧＥとＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析に付した４８。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析では、透析によりＺ−ドメインを水に交換した後、Ｓｃｒｉｐｐｓ質量分析センターにて陽イオン化モードで質量スペクトルを得た。
【００８３】
ｐＴｒｃ−ｎｒｄＡのクローニング。ベクターｐＴｒｃ−ｎｒｄＡを作製するために、Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏポリメラーゼを使用してｎｒｄＡ遺伝子をプライマー１、例えば配列番号１（５’−ＡＴ  ＡＡＴ  ＴＧＧ  ＴＡＣ  ＣＣＡ  ＡＡＡ  ＡＣＡ  ＧＧＴ  ＡＣＧ  ＡＣＡ  ＴＡＣ  ＡＴＧ  ＡＡＴ  Ｃ−３’）とプライマー２、例えば配列番号２（５’−ＧＣＴ  ＧＣＡ  ＧＧＴ  ＣＧＡ  ＣＴＣ  ＴＡＧ  ＡＧＧ  ＡＴＣ  ＣＣＣ  ＣＣＴ  ＴＣＴ  ＴＡＴ  Ｃ−３’）で増幅した。これらのプライマーは夫々遺伝子の５’及び３’末端（下線部）にＫｐｎＩ及びＸｂｏＩ切断部位を含む。Ｑｉａｇｅｎ製品であるＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用してフラグメントを精製した。次に単離したＤＮＡをＫｐｎＩ及びＸｂｏＩと共にインキュベートし、得られた産物をアカロースゲルで分離し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔで抽出した。同一制限酵素で切断しておいたｐＴｒｃに遺伝子フラグメントをライゲーションした。インサート−ベクターを３：１比でインキュベートし、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用して１６℃で３０分間ライゲーションし、ｐＴｒｃ−ｎｒｄＡを得た。
【００８４】
プラスミドｐＭＪ１−ｎｒｄＡからの発現について先に記載したようにＢＬ２１（ＤＥ３）細胞でベクターｐＴｒｃ−ｎｒｄＡからｗｔα２の発現を実施し、培養液１Ｌ当たり３ｇの湿潤細胞ペーストを得た５５，６２。α２を精製（下記参照）し、＞９５％純度で湿潤細胞ペースト１ｇ当たり１０ｍｇのα２を得、分光ＲＮＲアッセイ（下記参照）により比活性を測定した処、２５００ｎｍｏｌ／ｍｉｎ・ｍｇであった。
【００８５】
ｐＴｒｃ−ｎｒｄＡ７３０ＴＡＧ及びｐＴｒｃ−ｎｒｄＡ７３１ＴＡＧの作製。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ  Ｋｉｔを使用してベクターｐＭＪ１−ｎｒｄＡのｎｒｄＡ遺伝子の７３０又は７３１位にＴＡＧコドンを挿入した。α２の７３０位にＴＡＧを組込むためにプライマー３、例えば配列番号３（５’−Ｇ  ＧＴＣ  ＡＡＡ  ＡＣＡ  ＣＴＧ  ＴＡＧ  ＴＡＴ  ＣＡＧ  ＡＡＣ  ＡＣＣ  ＣＧ−３’）とプライマー４、配列番号４（５’−ＣＧ  ＧＧＴ  ＧＴＴ  ＣＴＧ  ＡＴＡ  ＣＴＡ  ＣＡＧ  ＴＧＴ  ＴＴＴ  ＧＡＣ  Ｃ−３’）を使用し、α２の７３１位にＴＡＧを組込むためにプライマー５、例えば配列番号５（５’−Ｇ  ＧＴＣ  ＡＡＡ  ＡＣＡ  ＣＴＧ  ＴＡＴ  ＴＡＧ  ＣＡＧ  ＡＡＣ  ＡＣＣ  ＣＧ−３’）とプライマー６、例えば配列番号６（５’−ＣＧ  ＧＧＴ  ＧＴＴ  ＣＴＧ  ＣＴＡ  ＡＴＡ  ＣＡＧ  ＴＧＴ  ＴＴＴ  ＧＡＣ  Ｃ−３’）を使用した。ＭＩＴバイオポリマー研究所にて全長遺伝子を配列決定することにより突然変異を確認した。次にｎｒｄＡ７３０ＴＡＧ及びｎｒｄＡ７３１ＴＡＧ遺伝子をプライマー１及び２で増幅し、ｗｔ  ｎｒｄＡについて上述したようにベクターｐＴｒｃにライゲーションした。
【００８６】
ｐＡＣ−ＮＨ２Ｙ−ＲＳのクローニング。ｐＡＣベクターはＣｍＲマーカーの代わりにＴｅｔＲ選択マーカーを含む点を除き、先に記載したベクターｐＳｕｐと同様である６３。更に、ｐＡＣ−ＮＨ２Ｙ−ＲＳはｇｌｎＳ’プロモーター及びｒｒｎＢターミネーターの制御下のＮＨ２Ｙ−ＲＳ遺伝子と、ｐｒｏＫプロモーター及びターミネーターの制御下のｍｕｔＲＮＡＣＵＡ遺伝子６コピーを含む。ｐＡＣ−ＮＨ２Ｙ−ＲＳを作製するために、ＮＨ２Ｙ−ＲＳ遺伝子の夫々３’及び５’のＰｓｔＩ及びＮｄｅＩ制限部位を使用してｐＢＫ−ＮＨ２Ｙ−ＲＳからＮＨ２Ｙ−ＲＳ遺伝子をｐＡＣベクターにサブクローニングした。
【００８７】
Ｙ７３０ＮＨ２Ｙ−α２及びＹ７３１ＮＨ２Ｙ−α２の発現。ベクターｐＴｒｃ−ｎｒｄＹ７３０ＴＡＧがｔｒｐ／ｌａｃ（ｔｒｃ）プロモーター及びｒｒｎＢターミネーターの制御下で７３０位にアンバーコドンをもつｎｒｄＡ遺伝子と、ＡｍｐＲマーカーを含むｐＴｒｃ−ｎｒｄＹ７３０ＴＡＧ／ｐＡＣ−ＮＨ２Ｙ−ＲＳ発現システムでＹ７３０ＮＨ２Ｙ−α２の発現に成功した。大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞をベクターｐＴｒｃ−ｎｒｄＹ７３０ＴＡＧ及びｐＡＣ−ＮＨ２Ｙ−ＲＳで形質転換し、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍＬ）とＴｅｔ（２５μｇ／ｍＬ）を添加したＬＢ／寒天プレートで３７℃にて２日間増殖させた。全液体培養増殖はＡｍｐ（１００μｇ／ｍＬ）とＴｅｔ（２５μｇ／ｍＬ）を加え、３７℃及び２００ｒｐｍのシェーカー／インキュベーターで実施した。プレートからのシングルコロニーを２ＹＴ培地５ｍＬに接種し、飽和まで（〜２日間）増殖させた。次に飽和培養液５ｍＬを２ＹＴ培地１８０ｍＬで希釈し、飽和まで（〜１日間）増殖させた。次にＤ−ビオチン（１μｇ／ｍＬ）、チアミン（１μｇ／ｍＬ）及び１倍重金属ストック溶液を添加したＧＭＭＬ培地１Ｌを各々加えた６Ｌ三角フラスコ６本の各々にこの培養液２５ｍＬを接種した。１０００倍重金属ストック溶液は文献６４に記載されているように、１Ｌ当たり、ＭｏＮａ２Ｏ４・Ｈ２Ｏ  ５００ｍｇ、ＣｏＣｌ２  ２５０ｍｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  １７５ｍｇ、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ８．７５ｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １．２５ｇ、ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  １．２５ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ２．５ｇ、Ｈ３ＢＯ３  １ｇ及び１Ｍ  ＨＣｌを含有する。ＯＤ６００ｎｍが０．６に達したら（１２〜１８時間）、ＮＨ２ＹとＤＴＴを夫々終濃度１ｍＭ及び０．１ｍＭまで加えた。１５分後にＩＰＴＧを終濃度１ｍＭまで加え、増殖を４．５時間続け、この時点で細胞を遠心により回収し、液体Ｎ２で凍結させ、−８０℃で保存した。典型例では、培養液１Ｌ当たり湿潤細胞ペースト１．５ｇが得られた。ベクターｐＴｒｃ−ｎｒｄＡ７３１ＴＡＧ及びｐＡＣ−ＮＨ２Ｙ−ＲＳを使用してＹ７３１ＮＨ２Ｙ−α２の発現を同様に実施した。
【００８８】
Ｙ７３０ＮＨ２Ｙ−α２及びＹ７３１ＮＨ２Ｙ−α２の精製。典型例では湿潤細胞ペースト１０ｇからＮＨ２Ｙ−α２を精製した。全精製段階は４℃で実施した。１ｍＭ  ＰＭＳＦと５ｍＭ  ＤＴＴを添加したα２バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．６）５ｍＬに湿潤細胞ペースト１ｇを再懸濁した。１４，０００ｐｓｉのフレンチプレス細胞破砕機に通すことにより細胞を溶解させた。遠心（１５，０００×ｇ，３５分，４℃）により細胞破片の除去後、８％（ｗ／ｖ）硫酸ストレプトマイシンを加えたα２バッファー０．２容量を滴下することによりＤＮＡを沈降させた。混合物を更に１５分間撹拌し、沈降したＤＮＡを遠心（１５，０００×ｇ，３５分，４℃）により除去した。次に上清１０ｍＬ当たり固体（ＮＨ４）２ＳＯ４  ３．９ｇを１５分間かけて加えた（６６％飽和）。溶液を更に３０分間撹拌し、沈降した蛋白質を遠心（１５，０００×ｇ，４５分，４℃）により単離した。ペレットを最少容量のα２バッファーに再懸濁し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（１．５×２５ｃｍ，４５ｍＬ）を使用して脱塩した。脱塩した蛋白質を予めα２バッファーで平衡化しておいたｄＡＴＰカラム（１．５×４ｃｍ，６ｍＬ）に流速０．５ｍＬ／分で直接ロードした。カラムをα２バッファー１０カラム容量で洗浄した。次に１０ｍＭ  ＡＴＰ，１５ｍＭ  ＭｇＳＯ４及び１０ｍＭ  ＤＴＴを加えたα２バッファー３〜４カラム容量でＮＨ２Ｙ−α２を溶出させた。次にＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５クロマトグラフィーによりＡＴＰを除去した。蛋白質を液体Ｎ２の小アリコートで急速凍結させ、−８０℃で保存した。典型例では、湿潤細胞ペースト１ｇ当たり４〜６ｍｇの純粋なＮＨ２Ｙ−α２が得られた。
【００８９】
ＥＰＲ分光法によりモニターしたＮＨ２Ｙ−α２とβ２、ＣＤＰ及びＡＴＰの反応。各変異体（４０μＭ）を３５ｍＭ  ＤＴＴの存在下で室温にて４０分間インキュベートとすることにより、予備還元したｗｔ−α２又はＮＨ２Ｙ−α２を作製した。ヒドロキシ尿素と更にＤＴＴを終濃度１５ｍＭまで加え、インキュベーションを室温で更に２０分間続けた。次に、予めアッセイバッファー（材料の項参照）で平衡化しておいたＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（１．５×２５ｃｍ，４５ｍＬ）で各蛋白質を脱塩した。
【００９０】
予備還元したＮＨ２Ｙ−α２及びＡＴＰをアッセイバッファー中でｗｔβ２及びＣＤＰと混合し、夫々終濃度２０〜２４μＭ、３ｍＭ、２０〜２４μＭ及び１ｍＭとした。反応を液体Ｎ２で１０秒〜１２分間手動クエンチした。Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｆａｃｉｌｉｔｙにて液体Ｎ２を充填した石英フィンガーデュワーを取付けたＢｒｕｋｅｒ  ＥＳＰ−３００  Ｘバンド分光器でＥＰＲスペクトルを７７Ｋで記録した。ＥＰＲパラメータは以下の通りとした：マイクロ波周波数＝９．３４ＧＨｚ，出力＝３０μＷ，変調振幅＝１．５Ｇ，変調周波数＝１００ｋＨｚ，時間定数＝５．１２ｍｓ，走査時間＝４１．９ｓ。ＷｉｎＥＰＲ（Ｂｒｕｋｅｒ）と社内で作成したＥｘｃｅｌプログラムを使用し、得られたスペクトルの分析を行った。これらのプログラムは記録したスペクトルからの未反応Ｙ１２２・シグナルのフラクショナルサブトラクションを容易にし、ＮＨ２Ｙ・−α２のスペクトルを得易くする。各トレースの二重積分強度を比較することによりＹ・シグナルとＮＨ２Ｙ・シグナルの比を評価した。ＣｕＩＩを標準として使用してＥＰＲスピン定量を実施した６５。
【００９１】
ストップトフロー（ＳＦ）ＵＶ−ｖｉｓ分光法によるβ２、ＣＤＰ及びＡＴＰとのＮＨ２Ｙ・−α２形成の反応速度測定。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃｓ  ＤＸにてＳＦ反応速度測定を実施した。１７ＭＶ機器にＰｒｏ−Ｄａｔａアップグレードを搭載し、図面の説明に示すλでＰＭＴ検出を使用した。Ｌａｕｄａ  ＲＥ１０６循環水浴で温度を２５℃に維持した。第１のシリンジ内の予備還元したＹ７３０ＮＨ２Ｙ−α２（又はＹ７３１ＮＨ２Ｙ−α２）とＡＴＰを第２のシリンジからのｗｔβ２及びＣＤＰと１：１比で混合し、アッセイバッファー中の終濃度を夫々８〜１０μＭ、３ｍＭ、８〜１０μＭ及び１ｍＭとした。時分割モードでデータを採取した。図面の時間経過は少なくとも６本の独立したトレースの平均である。Ｙ７３０ＮＨ２Ｙ・−α２及びＹ７３１ＮＨ２Ｙ・−α２吸収プロファイルのポイントバイポイント再構成には、２〜４本のトレースを３０５〜３６５ｎｍで５ｎｍ間隔で平均した。これらのλで発表されているε６５−６８に基づいてこの領域のＹ１２２・の吸収について吸収変化を補正した後、λに対してプロットした。Ｙ１２２・のε（ε４１０ｎｍ＝３７００Ｍ−１ｃｍ−１）６８を使用し、Ｙ１２２・１モルの消費によりＮＨ２Ｙ・１モルがα２で形成されると仮定してＹ７３０ＮＨ２Ｙ・−α２（１０５００Ｍ−１ｃｍ−１）及びＹ７３１ＮＨ２Ｙ・−α２（１１０００Ｍ−１ｃｍ−１）のεの計算を行った。ＯｒｉｇｉｎＰｒｏ又はＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ  Ｓｏｆｔｗａｒｅで曲線フィットを行った。
【００９２】
ＲＮＲの分光及び放射性活性アッセイ。先に記載したように分光及び放射性ＲＮＲアッセイを実施した３６，４３。ＮＨ２Ｙ−α２の濃度は０．２、１又は３μＭとし、β２は５倍モル過剰とした。放射性アッセイでは［５−３Ｈ］−ＣＤＰ（１１９０ｃｐｍ／ｎｍｏｌ）を使用した。
【００９３】
ＥＰＲ分光法によりモニターしたＮＨ２Ｙ−α２とβ２、Ｎ３ＡＤＰ及びｄＧＴＰの反応。２’−アジド−２’−デオキシアデノシン−５’−二リン酸（Ｎ３ＡＤＰ）はＳｃｏｔｔ  Ｓａｌｏｗｅにより従来製造されている６２。予備還元したＹ７３０ＮＨ２Ｙ−α２（Ｙ７３１ＮＨ２Ｙ−α２又はｗｔα２）及びｄＧＴＰをアッセイバッファー中でｗｔβ２及びＮ３ＡＤＰと混合し、夫々終濃度２０μＭ、１ｍＭ、２０μＭ及び５０μＭとした。２０秒後に反応を液体Ｎ２で手動クエンチした。ＥＰＲデータ取得とＣｕＩＩによるスピン定量を上記のように実施した。得られたスペクトルをＷｉｎＥＰＲ（Ｂｒｕｋｅｒ）と社内で作成したＥｘｃｅｌプログラムで分析した。報告され、今回ｗｔα２／β２反応で再生されたＮ・シグナルを先ず差し引くことにより、これらの実験で実測された３個のシグナルの逆重畳を行った。次に、未反応Ｙ１２２・をこのスペクトルから差し引き、ＮＨ２Ｙ・−α２スペクトルを得た。各トレースの二重積分強度を比較することにより３個のシグナルの比を評価した。
【００９４】
結果
ＮＨ２Ｙの毒性と取込み。ＮＨ２Ｙ特異的アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）の進化には、ＮＨ２Ｙが大腸菌により取込まれることと、非毒性であることと、内在ＲＳにより蛋白質に組込まれないことが必要である。ＮＨ２Ｙは全３要件を満たした。ＤＨ１０Ｂ大腸菌細胞を液体ＧＭＭＬ培地でＮＨ２Ｙ（１ｍＭ）又はＮＨ２ＹとＤＴＴ（夫々１ｍＭ及び０．１ｍＭ）の存在下に増殖させた処、ＮＨ２Ｙは全細胞抽出液に認められることがＨＰＬＣとＥＳＩ−ＭＳにより確認された４８。ＤＨ１０Ｂ大腸菌細胞を液体ＧＭＭＬ培地と寒天プレートでＮＨ２Ｙ又はＮＨ２Ｙ／ＤＴＴの存在下に増殖させることによりＮＨ２Ｙの毒性を評価した。増殖速度はＮＨ２Ｙの存在によりさほど影響を受けなかった。他方、ＤＴＴの存在下では、細胞はＮＨ２Ｙ単独の存在下又はＮＨ２Ｙ／ＤＴＴの不在下よりも２５〜３５％遅い速度で増殖した。
【００９５】
ＮＨ２Ｙ特異的ＲＳの進化。シュルツ研究所は非天然アミノ酸を任意標的蛋白質に組込むための堅牢なインビボ法を開発している４６−５０。この方法では、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳ突然変異体ライブラリーからＲＳを選択する。ｍｕｔＲＮＡＣＵＡとこのライブラリーのＲＳの相互作用領域は変動しないので、コグネイトアンバーサプレッサーＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ｔＲＮＡであるｍｕｔＲＮＡＣＵＡは改変の必要がない６９。Ｙ結合溝とその周囲のＴｙｒ３２，Ｌｅｕ６５，Ｐｈｅ１０８，Ｇｌｎ１０９，Ａｓｐ１５８及びＬｅｕ１６２の６個の残基をランダムに変異させたＲＳライブラリーでポジティブ選択とネガティブ選択の反復サイクルを実施する。ポジティブ選択はＮＨ２Ｙ／ＤＴＴとコグネイトｔＲＮＡの存在下のＣＡＴ遺伝子の許容部位におけるアンバー終止コドンの抑圧に基づく（表Ｉ）４６。生存するクローンは宿主細胞翻訳機構で機能的であり、アンバー終止コドンに応答してＮＨ２Ｙ又は他のアミノ酸を組込むＲＳをもつ。ネガティブ選択はＮＨ２Ｙの不在下の毒性バルナーゼ遺伝子における３個のアンバーコドンの抑圧不在に基づく（表Ｉ）７０。生存するクローンはアンバー終止コドンに応答して天然アミノ酸を組込まないＲＳをもつ。
【００９６】
７回の選択サイクル後、アンバー終止コドンを抑圧する能力について４８個のコロニーを試験した。ｐＢＫ−ＮＨ２Ｙ−ＲＳとｐＲＥＰ／ＹＣ−Ｊ１７を含むシングルコロニーを最後のポジティブ選択（７回目）から取出し、ＮＨ２Ｙの存在下又は不在下で種々の濃度のＣｍ（０〜１１０μｇ／ｍＬ）を加えたＧＭＭＬ寒天に撒いた。ＮＨ２Ｙ／ＤＴＴの存在下で増殖できるならば、ＣＡＴ遺伝子のアンバーコドンはＮＨ２Ｙの組込みにより抑圧されていると判断される。更に、Ｔ７  ＲＮＡＰ遺伝子のアンバーコドンも同様に抑圧され、ＧＦＰｕｖの発現を誘導し、その結果、細胞にＵＶ光を照射すると、緑色蛍光を発光する。望ましいコロニーは高濃度のＣｍ（〜１００μｇ／ｍＬ）とＮＨ２Ｙ／ＤＴＴの存在下で増殖し、照射すると緑色蛍光を発光するが、ＮＨ２Ｙの不在下でＣｍ濃度が低い（〜２０μｇ／ｍＬ）と死滅するコロニーである。試験した４８個のコロニーのうち、２個がこれらの基準を満たしたため、更に続行した。
【００９７】
これらのコロニーからのプラスミドのＤＮＡシーケンシングの結果、ランダムに突然変異させた位置に以下の残基：Ｇｌｎ３２、Ｇｌｕ６５、Ｇｌｙ１０８、Ｌｅｕ１０９、Ｓｅｒ１５８及びＴｙｒ１６２をもつ同一のＲＳであることが判明した。興味深いことに、残基３２はｗｔ  Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳではＴｙｒであり、結合したＴｙｒリガンドのヒドロキシル基に対してオルト位のＣ原子から２Å以内に位置するが、選択したＲＳではＧｌｎである７１，７２。ｗｔ  Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳの結晶構造によると、Ｇｌｎはｏ−ＮＨ２基の受容を可能にし、恐らく、好ましい水素結合相互作用を生じると予想される。これらのクローンから同定されたＲＳをその後の全実験で使用した。
【００９８】
Ｋ７ＮＨ２Ｙ−Ｚ−ドメインの発現。選択したＲＳによるＮＨ２Ｙ組込みの効率と忠実度を試験するために、許容可能なＬｙｓ７残基にアンバー終止コドンをもち、Ｃ末端にＨｉｓタグを付加したＺ−ドメイン蛋白質（Ｚ−ドメイン）をモデルとして使用した５７，７３。ＧＭＭＬ培地でＮＨ２Ｙ／ＤＴＴの存在下に発現させると、精製後に培地１Ｌ当たり５ｍｇのＺ−ドメインが得られた。ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析（図２，挿入図）の結果、ＮＨ２Ｙの不在下では、Ｚ−ドメイン蛋白質の発現量は検出レベル未満であることが判明した。精製蛋白質をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析に付した。従来の試験によると、Ｚ−ドメインはＮ末端Ｍｅｔの除去後、得られたＮ末端アミノ酸のアセチル化により翻訳後修飾されることが分かっている５７。従って、ＮＨ２Ｙ／ＤＴＴの存在下で発現させたＺ−ドメインのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析の結果、ＭＷ＝７８１２、７８５４、７９４３及び７９８５Ｄａの４個のピークが判明した（図２）。これらの特徴は夫々Ｋ７ＮＨ２Ｙ−Ｚ−ドメインから最初のＭｅｔを引いたもの（ＭＷｅｘｐ＝７８１３Ｄａ）、そのアセチル化形態（ＭＷｅｘｐ＝７８５５Ｄａ）、全長型Ｋ７ＮＨ２Ｙ−Ｚ−ドメイン（ＭＷｅｘｐ＝７９４４Ｄａ）及びそのアセチル化形態（ＭＷｅｘｐ＝７９８６Ｄａ）に対応する。重要な点として、Ｋ７Ｙ−Ｚ−ドメインは検出されなかった（全長形態ではＭＷｅｘｐ＝７９２９Ｄａ）。以上をまとめると、Ｚ−ドメインによる試験の結果、進化型ＲＳはＮＨ２Ｙに特異的であり、この標的蛋白質へのその組込みに有効であることが明らかである。
【００９９】
ＮＨ２Ｙ−α２の発現と精製。ＮＨ２Ｙ特異的ＲＳを進化させ、ＮＨ２Ｙ挿入の効率と忠実度を確認したので、次にＮＨ２Ｙ組込みのプラスミド／宿主要件に適合可能なα２の過剰発現システムを追求した。α２産生と残基７３０へのＮＨ２Ｙ挿入を最大にするように数種の異なる増殖条件と発現システムを検討した。ＮＨ２Ｙ・の早期トラップとプローブの破壊をもたらす可能性のあるｗｔβ２とＮＨ２Ｙ−α２の反応を最小限にするように、嫌気性条件下又はヒドロキシ尿素の存在下の増殖を検討した。前者の場合には、嫌気性クラスＩＩＩ  ＲＮＲは大腸菌中で作用するので、ｗｔクラスＩβ２は発現されない１，７４。後者の場合には、ヒドロキシ尿素の存在により、クラスＩβ２の必須Ｙ１２２・の還元を生じるため、ＮＨ２Ｙ−α２と反応することができない５７５，７６。封入体を最小限にするように温度操作も検討した。
【０１００】
（１）ｐＢＫ−ＮＨ２Ｙ−ＲＳ／ｐＢＡＤ−ｎｒｄＡ，（２）ｐＢＫ−ＮＨ２Ｙ−ＲＳ／ｐＭＪ１−ｎｒｄＡ及び（３）ｐＡＣ−ＮＨ２Ｙ−ＲＳ／ｐＭＪ１−ｎｒｄＡ（表１参照）の３種類の異なる発現システムについて検討した（詳細については下記参照）。システム（１）では、内在α２の１．５倍のレベルの全長型α２の発現が認められた。システム（２）では、短縮型α２しか認められず、システム（３）では、短縮型α２の過剰産生と共に、α２の内在レベルと同等の全長型α２の発現を生じた。発現の失敗又は低レベルの発現は細胞内のｍｕｔＲＮＡＣＵＡが制限されているため、及び／又はｐＢＡＤ−ｎｒｄＡ及びｐＭＪ１−ｎｒｄＡからのα２の発現レベルが低いためであると思われる。
【０１０１】
ｐＴｒｃを使用した非天然アミノ酸の発現と大腸菌ニトロレダクターゼへの組込みの成功が最近報告されたことに触発され７７、本発明者らはｐＡＣ−ＮＨ２Ｙ−ＲＳ／ｐＴｒｃ−ｎｒｄＡ発現システムを検討することにした。ｐＴｒｃ−ｎｒｄＡベクターはｔｒｐ／ｌａｃ（ｔｒｃ）プロモーターの制御下で望ましい残基にアンバー終止コドンをもつα２遺伝子を含む７８。重要な点として、ｐＡＣ−ＮＨ２Ｙは細胞内のコグネイトｔＲＮＡ濃度を増加するｍｕｔＲＮＡＣＵＡ６コピーを含む６３。
【０１０２】
先ず、ｐＴｒｃ−ｎｒｄＡからのｗｔα２の発現を試験した。過剰産生とその後の精製により、湿潤細胞ペースト１ｇ当たり１０ｍｇの純粋なα２を得た。この発現レベルはα２及びα２突然変異体を発現させるために当研究所で日常的に使用しているｐＭＪ１からのα２の発現の２〜４倍であった。更に、α２の比活性はｐＭＪ１−ｎｒｄＡからの活性（２５００ｎｍｏｌ／ｍｉｎ・ｍｇ）と同等であった。
【０１０３】
ｐＡＣ−ＮＨ２Ｙ−ＲＳとｐＴｒｃ−ｎｒｄＡで二重形質転換したＤＨ１０Ｂ細胞におけるＹ７３１ＮＨ２Ｙ−α２の発現を図３に示す。ＩＰＴＧインデューサーとＮＨ２Ｙ／ＤＴＴの存在下では、アンバー終止コドンは抑圧され、ＮＨ２Ｙ−α２は過剰発現される。ＮＨ２Ｙの不在下では、短縮型α２のみの過剰産生が認められる。最後に、インデューサーＩＰＴＧとＮＨ２Ｙの不在下では、α２の過剰発現は生じない。Ｙ７３０ＮＨ２Ｙ−α２の発現にも同様のプロファイルが得られた（図１３）。ｄＡＴＰアフィニティークロマトグラフィーを使用してＮＨ２Ｙ−α２を精製すると、＞９０％均質度で培養液１Ｌ当たり４〜６ｍｇの目的蛋白質が得られる５５，６２。突然変異蛋白質は精製処理中にｗｔα２と同様に挙動した（図１４）。
【０１０４】
ＥＰＲ分光法によりモニターしたＮＨ２Ｙ−α２とｗｔβ２、ＣＤＰ及びＡＴＰの反応。ＮＨ２Ｙ−α２を入手できるため、本発明者らはβ２−α２界面をまたがるラジカル成長におけるＹ７３０及びＹ７３１の関与を評価することができた。実験デザインはＤＯＰＡ−β２で従来確立されたラジカルトラップ法に基づく３８， ３９。この方法では、Ｙよりも酸化し易い非天然Ｙ類似体で安定なラジカルをトラップする。トラップにβ２、基質及びアロステリックエフェクターが必要な場合には、ラジカル成長中にこの残基がレドックス活性であることを示す直接証拠となる。ラジカル形成が生じない場合には、残基がレドックス活性ではないか又は酸化産物が不安定であると判断できる。本発明者らは、ＮＨ２Ｙが酸化し易い（Ｅ°はｐＨ７でＹよりも１９０ｍＶ低い）ためにＮＨ２Ｙ・が生成され、ＵＶ−ｖｉｓ及びＥＰＲ法により検出できるのではないかと提唱した５１。ＮＨ２Ｙ・の分光特性決定は従来報告されていない。
【０１０５】
ＤＯＰＡ−β２での自身の試験３８に基づき、本発明者らはＮＨ２Ｙ・がある程度まで蛋白質環境により安定化されるのではないかと予想した。ＤＯＰＡ−β２では、最大量のＤＯＰＡ・が５秒までに生成され、２．５分間安定であった３８，３９。そこで、Ｙ７３０ＮＨ２Ｙ−α２（又はＹ７３１ＮＨ２Ｙ−α２）をｗｔβ２、基質（ＣＤＰ）及びエフェクター（ＡＴＰ）と混合し、２５℃で種々の時間（１０秒〜１２分間）インキュベートし、液体Ｎ２で手動クエンチした。これらの反応のＥＰＲスペクトルの結果、１０秒時点で最大量で存在する新規シグナルが判明した（図４）。ＣＤＰとＡＴＰの不在下の対照ではＹ１２２・しか認められなかった（図４，挿入図）。従って、新規シグナルの形成はＤＯＰＡ−β２での同様の試験で従来観測されたように、基質とエフェクターにより制御される３８。
【０１０６】
実測スペクトルは未反応Ｙ１２２・と推定ＮＨ２Ｙ７３０・の少なくとも２種の合成である。新規ラジカルの特徴を解明するために、識別可能な十分に特性決定された低磁場特徴をもつＹ１２２・１４のスペクトルを合成シグナルから差し引いた。得られたほぼ等方的なシグナル（図４，破線）は見掛けのｇａｖが２．００４３であり、ピーク・トラフ幅が２４Ｇである７９。本発明者らはこの新規シグナルをＮＨ２Ｙ７３０・に帰属させる。
【０１０７】
１０秒時点におけるスピン定量の結果、（出発時のＹ１２２・に対して）合計初期スピンの８％が失われていることが判明した。残りのスピンのうち、４７％はＹ１２２・に帰属し、５３％は新規シグナルに帰属する。このシグナルを更に特性決定するために、出力飽和試験を実施した。Ｙ１２２・はその弛緩特性を劇的に変化させる二核鉄（ＩＩＩ）クラスターに隣接している。新規ラジカルが実際にドッキングモデルにより示されるように二核鉄（ＩＩＩ）クラスターから＞３５Åの距離でα２の内側に位置するならば、そのＰ１／２は著しく低下するであろう。出力依存性試験の結果を図５に示す。データを式１８０にフィットさせた（式中、Ｋはサンプルと機器に依存性の倍率であり、Ｐはマイクロ波出力であり、ｂは均質（ｂ＝３）又は不均質（ｂ＝１）なスペクトル広幅化を示し、Ｐ１／２はＥＰＲシグナルの半飽和時のマイクロ波出力である）７９，８１。Ｙ１２２・では、従来の測定と同様にＰ１／２は２８±４ｍＷであった８１，８２。新規シグナルの飽和プロファイルによると、Ｐ１／２は０．４２±０．０８であり、二核鉄中心から遠いラジカルに一致する。
【数１】
0005643100.tif 000002
【０１０８】
Ｙ７３１ＮＨ２Ｙ−α２でも同様の実験を実施した。ＣＤＰ／ＡＴＰの存在下のみに、推定ＮＨ２Ｙ７３１・である新規シグナルも観測される（図１５）。Ｙ１２２・スペクトルを差し引くと、ＮＨ２Ｙ７３０・のスペクトルに類似するが、同一ではないスペクトルが得られる（図６）。ＮＨ２Ｙ７３１・に帰属するほぼ等方的なシグナルは２．００４４のｇａｖと２２Ｇのピーク・トラフ幅から構成される。１０秒時点では、合計初期スピンの１４％が失われている。残りのスピンのうち、４５％はＮＨ２Ｙ７３１・に帰属し、５５％はＹ１２２・に帰属する。
【０１０９】
ＳＦ  ＵＶ−ｖｉｓ分光法によりモニターしたＮＨ２Ｙ・α２形成の反応速度測定。ＮＨ２Ｙ・−α２形成がｗｔＲＮＲにおけるヌクレオチド還元でコンピテントとなるために十分に速い速度定数で生じるか否かを調べるために予備定常状態実験を実施した。ヌクレオチド還元をモニターした大腸菌ＲＮＲの従来の定常状態及び予備定常状態反応速度分析によると、ラジカル成長の前にはゆっくりとした立体配座変化のあることが分かっている８３。このゆっくりした物理的段階は成長プロセスで形成される中間体を隠蔽する。ＣＤＰ／ＡＴＰの存在下と、本試験で使用したα２及びβ２の濃度で、この立体配座変化の速度定数は〜４〜１７ｓ−１である８３。ｄＣＤＰ形成の定常状態速度定数は２ｓ−１のオーダーであり、ｄＣＤＰ形成に伴う活性部位ジスルフィドの再還元、又は再還元に伴う立体配座変化により制限されると考えられる。ＤＯＰＡ−β２、α２及びＣＤＰ／ＡＴＰによる従来の試験では、ＤＯＰＡ・形成は２つの速い反応速度相（３８．０及び６．８ｓ−１）と遅い相（０．７ｓ−１）で生じた。従って、ＤＯＰＡ−β２実験の２つの速い相と、潜在的に第３相８４は第１の代謝回転におけるｄＣＤＰ形成を制限する立体配座変化に関して反応速度的にコンピテントであった８３。
【０１１０】
ＮＨ２Ｙ・の濃度変化をモニターするためには、そのスペクトルと消光係数を求める必要がある。本発明者らの当初の予想では、そのＵＶ−ｖｉｓスペクトルはＤＯＰＡ・のスペクトルに類似するというものであった（３１５ｎｍでλｍａｘ及びε〜１２０００Ｍ−１ｃｍ−１）３８，８５。３１０〜３６５ｎｍのＹ１２２・に結び付けられる消光係数は低く（ε〜５００〜１９００Ｍ−１ｃｍ−１）、スペクトル逆重畳で使用することができる６６，６７。そこで、ＳＦ分光法を使用し、本発明者らは新規ラジカルのＵＶ−ｖｉｓ特性のポイントバイポイント分析を実施した。第１のシリンジ内のＹ７３０ＮＨ２Ｙ−α２（又はＹ７３１ＮＨ２Ｙ−α２）とＡＴＰを第２のシリンジからのｗｔβ２及びＣＤＰと混合し、３０５〜３６５ｎｍの吸光度を５ｎｍ間隔でモニターした。次に各λで１．５秒の吸光度変化をＹ１２２・による吸収について補正し６６，６７、λに対してプロットした。結果を図７に示す通り、ＮＨ２Ｙ７３０・とＮＨ２Ｙ７３１・は類似するが、異なる吸収プロファイルをもつ。ＮＨ２Ｙ７３０・のＵＶ−ｖｉｓスペクトルは３２５ｎｍでλｍａｘをもつ広幅特徴から構成される（ε〜１０５００Ｍ−１ｃｍ−１）。ＮＨ２Ｙ７３１・スペクトルは３２０ｎｍでλｍａｘ（ε〜１１０００Ｍ−１ｃｍ−１）と、３５０ｎｍでより明確なショルダーを示す。４１０ｎｍのＹ１２２・のε６８と、Ｙ１２２・１モルの消滅がＮＨ２Ｙ・１モルの形成につながるという仮定を使用し、ＮＨ２Ｙ・−α２の消光係数を求めた。
【０１１１】
Ｙ７３０ＮＨ２Ｙ−α２についてＹ１２２・の消滅（４１０ｎｍ）とＮＨ２Ｙ・の形成（３２５ｎｍ）の反応速度をモニターするために実施したＳＦ  ＵＶ−ｖｉｓ実験を図８に示す。４１０ｎｍでは、３２５ｎｍでのＮＨ２Ｙ・の形成で得られた速度定数（１３．６±０．１ｓ−１及び２．５±０．１ｓ−１）と同様に、速度定数１２．０±０．１ｓ−１及び２．４±０．１ｓ−１の二重指数関数的反応速度が観測された。Ｙ７３１ＮＨ２Ｙ−α２で同様の実験を実施した処、ＮＨ２Ｙ７３１・の形成（２１．０±０．１ｓ−１及び３±０．１ｓ−１，図１６）と同時に二重指数関数的にＹ１２２・の消滅（１７．３±０．２及び２．３±０．１ｓ−１）が生じることが分かった。両者の反応の速度定数と振幅を表２にまとめる。Ｙ７３０ＮＨ２Ｙ−α２（又はＹ７３１ＮＨ２Ｙ−α２）及びβ２で基質とエフェクターの不在下に対照実験を実施した。ＥＰＲ実験により明らかなように、同一条件下でＹ１２２・の消滅又はＮＨ２Ｙ・の形成は生じなかった。
【０１１２】
上記のように、ＮＨ２Ｙ−α２で観測された速い速度定数はＲＮＲ代謝回転で反応速度的にコンピテントである。従って、これらの突然変異体による試験は、ラジカル成長におけるそれらの関与を証明する最初の直接証拠を提供する。ＤＯＰＡ−β２実験で同時に観測される遅い速度定数はＲＮＲ代謝回転の定常状態速度定数と似ている。この遅い相の可能な説明について以下に論じる。
【０１１３】
最後に、２秒における各ラジカルの量の分析によると、Ｙ７３０ＮＨ２Ｙ−α２及びＹ７３１ＮＨ２Ｙ−α２では、合計初期Ｙ１２２・の夫々３９％と３５％が消費されることが明らかである。ＤＯＰＡ−β２とは対照的に、ＮＨ２Ｙ・は安定性が低い。この不安定性を詳細に評価し、その機構的意味を解明するために急速凍結クエンチ法を使用した反応速度分析が必要である。
【０１１４】
ＮＨ２Ｙ−α２の活性。最近、一連のＦｎＹ３５６−β２を使用し、本発明者らはその電位がチロシンの電位よりも８０〜２００ｍＶ高いときに残基３５６のヌクレオチド還元活性と還元電位には相関があることを発見した４０，４３。ＤＯＰＡの還元電位はＹ（ｐＨ７）の還元電位よりも２６０ｍＶ低く、ＤＯＰＡ−β２３８では、デオキシヌクレオチド形成は我々の検出下限を下回る。ＮＨ２Ｙ−α２では、ＮＨ２Ｙの電位はＹ（ｐＨ７）の電位よりも１９０ｍＶ低い５１。このエネルギー障壁がＣ４３９へのラジカル移動を停止させ、従って、ヌクレオチド還元を停止させるために十分に大きいか否かを試験するために、ＮＨ２Ｙ−α２で活性アッセイを実施した。
【０１１５】
ＣＤＰ形成を間接的（分光分析アッセイ）又は直接的（放射性アッセイ）にモニターすることにより活性を測定した。これらのアッセイを使用して測定した活性を表３にまとめる。その結果、Ｙ７３０ＮＨ２Ｙ−α２及びＹ７３１ＮＨ２Ｙ−α２のヌクレオチド還元活性はｗｔα２の活性の夫々４％及び７％であることが分かった。観測された活性はＮＨ２Ｙ−α２に固有であるとも考えられるし、共精製する内在ｗｔα２又はＮＨ２Ｙを負荷したｔＲＮＡＣＵＡの代わりにＴｙｒを負荷したｍｕｔＲＮＡＣＵＡによるアンバーコドン抑圧の結果として宿主細胞により生成されるｗｔα２に起因するとも考えられる。
【０１１６】
これらの２つの仮説を見極めるために、Ｎ３ＡＤＰによるアッセイを実施した。Ｎ３ＡＤＰはクラスＩ  ＲＮＲのメカニズムベースの阻害剤であり、ヌクレオチドとα２の活性部位のシステインに共有結合した中度に安定なＮを核とするヌクレオチドラジカル（Ｎ・）を生成する２８−３１，８６。このラジカルはＣ４３９・を生成してヌクレオチドで反応を開始するＮＨ２Ｙ・の能力のレポーターとして使用することができる。Ｎ３ＡＤＰ／ｄＧＴＰによるｗｔα２β２の不活性化に関する従来の試験によると、２０秒タイムスケールでは、初期Ｙ１２２・の５０〜６０％が失われ、等量のＮ・の形成をもたらすと思われる３０，６２。従って、ＮＨ２Ｙ−α２で観測される活性がｗｔα２に相当するならば、合計初期Ｙ１２２・の〜２％及び〜３．５％が夫々Ｙ７３０ＮＨ２Ｙ−α２及びＹ７３１ＮＨ２Ｙ−α２とＮ・を形成すると予想される。
【０１１７】
各ＮＨ２Ｙ−α２（又はｗｔα２）及びｄＧＴＰをｗｔβ２及びＮ３ＡＤＰと混合することによりＮ３ＡＤＰによるアッセイを実施した。２０秒後に反応を液体Ｎ２で手動クエンチした。Ｙ７３０ＮＨ２Ｙ−α２に得られたＥＰＲスペクトルを図９に示す。実測スペクトルは少なくとも３個のラジカルＹ１２２・、ＮＨ２Ｙ７３０・、及びＮ・の合成である。スペクトルはスペクトル幅の差とこれらの領域内の固有スペクトル特徴を使用して脱重畳することができる（図１０）。そこで、まず３個のシグナルのうちで最も広幅のものを含むＮ・スペクトルを差し引くことによりデータを分析した。次に得られたスペクトルをＹ１２２・成分のフラクショナルサブトラクションに付し、ＮＨ２Ｙ７３０・シグナルを得た。標準ＥＰＲ定量法を使用してラジカルの各々の濃度を測定した６５。
【０１１８】
この定量分析の結果を表４に示す。この結果によると、合計スピンの１８％が２０秒時点で失われている。残りのスピンのうち、１９±２％はＮ・に帰属し、４３％はＹ１２２・に帰属し、３９％はＮＨ２Ｙ７３０・に帰属する。２０秒後に失われたスピンを考慮すると、合計初期Ｙ１２２・（即ちｔ＝０）の１５±２％がＮ・形成をもたらす。Ｙ７３１ＮＨ２Ｙ−α２（図１７及び表４）では、合計スピンの２５％が２０秒後に失われ、２０±２％がＮ・として存在し、４１％がＹ１２２・として存在し、３９％がＮＨ２Ｙ７３１・として存在する。２０秒後に失われるスピンを考慮すると、合計初期Ｙ１２２・の１５±２％がＮ・の形成をもたらす。従って、どちらの突然変異体でも、観測されるＮ・の量は定常状態活性が汚染性ｗｔα２に起因する場合に予想される（夫々Ｙ７３０ＮＨ２Ｙ−α２及びＹ７３１ＮＨ２Ｙ−α２）２％又は３．５％Ｎ・を上回る。これらの結果はＮＨ２Ｙ−α２がＣ４３９・形成、従ってヌクレオチド還元でコンピテントであることを強く示唆している。
【０１１９】
【表１】
0005643100.tif 000003
【０１２０】
【表２】
0005643100.tif 000004
【０１２１】
【表３】
0005643100.tif 000005
【０１２２】
【表４】
0005643100.tif 000006
【０１２３】
ｐＢＡＤ−ｎｒｄＡのクローニングとＴＡＧコドンの挿入。ベクターｐＢＡＤ−ＪＹＣＵＡはシュルツ研究所から入手した（参考文献６１，本文）。ＮｃｏＩ及びＫｐｎＩ制限部位を使用して標準方法によりｎｒｄＡ遺伝子をｐＭＪ１−ｎｒｄＡからｐＢＡＤ−ＪＹＣＵＡにクローニングし、ｐＢＡＤ−ｎｒｄＡを得た。プライマー３〜６を使用してｐＴｒｃ−ｎｒｄＡについて記載したように７３０位と７３１位へのＴＡＧコドンの挿入を実施した（方法の項参照）。ＭＩＴバイオポリマー研究所にて全長遺伝子を配列決定することにより突然変異を確認した。
【０１２４】
ｐＭＪ１−ｎｒｄＡ７３０ＴＡＧ及びｐＭＪ１−ｎｒｄＡ７３１ＴＡＧの作製。ベクターｐＭＪ１−ｎｒｄＡについては以前に報告している（参考文献６０，本文）。プライマー３〜６を使用してｐＴｒｃ−ｎｒｄＡについて記載したように７３０位と７３１位へのＴＡＧコドンの挿入を実施した（方法の項参照）。ＭＩＴバイオポリマー研究所にて全長遺伝子を配列決定することにより突然変異を確認した。
【０１２５】
Ｙ７３０ＮＨ２Ｙ−α２の発現の試み。ＮＨ２Ｙ・の生成を伴わずにＮＨ２Ｙを含むα２の産生を最大にしようとして、ｗｔβ２のＹ１２２・を還元するように培地にヒドロキシ尿素を加え、好気性条件下と嫌気性条件下で種々の温度にて増殖条件を試験した。
【０１２６】
各場合に、ＤＨ１０Ｂ又はＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞のシングルコロニーを使用し、５ｍＬの２ＹＴ小培養液に接種した。飽和後、この培養液をＧＭＭＬ培地２×１００ｍＬで１００倍に希釈した。ＯＤ６００ｎｍが〜０．６〜０．８になったら、以下に詳述する変異後、一方のフラスコにＮＨ２ＹとＤＴＴを夫々終濃度１ｍＭ及び０．１ｍＭまで加えた。他方の増殖を対照として利用した。１５分後に両方の１００ｍＬ培養液にＩＰＴＧ（又は発現システム（１）では０．２％（ｗ／ｖ）Ｌ−アラビノース−下記参照）を添加することによりＮＨ２Ｙ−α２の発現を誘導した。規定時間（５〜１２時間）後に各フラスコから小アリコートを取出し、ＮＨ２Ｙ／ＤＴＴの存在下と不在下でＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析によりα２の発現を評価した。
【０１２７】
Ｙ７３０ＮＨ２Ｙ−α２の発現に及ぼす温度の影響を試験した場合には、小培養液の増殖条件を上記と同一とした。ＯＤ６００ｎｍが〜０．６〜０．８になったら、温度設定を２５又は３０℃に変更した。１５分後にＮＨ２ＹとＤＴＴを加え、上記のように増殖を続けた。
【０１２８】
Ｙ７３０ＮＨ２Ｙ−α２の発現に及ぼすＹ１２２・−β２の影響を試験した場合には、小培養液の増殖条件を上記と同一とした。ＯＤ６００ｎｍが０．６〜０．８になったら、ヒドロキシ尿素を終濃度６５ｍＭまで加えた。１５分後にＮＨ２ＹとＤＴＴを夫々終濃度１ｍＭ及び０．１ｍＭまで加えた。更に１５分後に上記のように誘導を実施した。誘導後１時間毎に培養液に更に１５ｍＭヒドロキシ尿素を補充した。
【０１２９】
Ｙ７３０ＮＨ２Ｙ−α２の発現に及ぼすＯ２の影響を試験した場合には、小培養液の増殖条件を上記と同一とした。小培養液が飽和したら、１Ｌ三角フラスコで適切な抗生物質を添加した２ＹＴ培地２５０ｍＬで１００倍に希釈した。飽和に達したら、適切な抗生物質を添加したファーメンターフラスコで培養液をＧＭＭＬ培地５〜７Ｌで５０倍に希釈した。ＯＤ６００ｎｍが０．６〜０．８になったら、空気をＮ２（ｇ）で置換した。１５分後にＮＨ２ＹとＤＴＴを夫々終濃度１ｍＭ及び０．１ｍＭまで加え、上記のように増殖を続けた。
【０１３０】
数種類の発現システムを試験した：（１）構成的大腸菌Ｇｌｎ−ＲＳプロモーター及びターミネーターの制御下のＮＨ２Ｙ−ＲＳ遺伝子とＫａｎＲマーカーをｐＢＫ−ＮＨ２Ｙ−ＲＳに組込み、Ｌ−Ａｒａ誘導プロモーター及びｒｒｎＢターミネーターの制御下の適切なアンバーコドンをもつα２遺伝子と、ｌｐｐプロモーター及びｒｒｎＣターミネーターの制御下のｍｕｔＲＮＡＣＵＡ遺伝子と、ＴｅｔＲマーカーをベクターｐＢＡＤ−α２に組込んだｐＢＫ−ＮＨ２Ｙ−ＲＳ／ｐＢＡＤ−α２発現システムを検討した。（２）Ｔ７プロモーター及びターミネーターの制御下のアンバーコドンをもつｎｒｄＡ遺伝子と、ＡｍｐＲマーカーをベクターｐＭＪ１−ｎｒｄＡに組込んだｐＢＫ−ＮＨ２Ｙ−ＲＳ／ｐＭＪ１−ｎｒｄＡベクター組み合わせを試験した。（３）ｇｌｎＳ’プロモーター及びｒｒｎＢターミネーターの制御下のＮＨ２Ｙ−ＲＳ遺伝子と、ｐｒｏＫプロモーター及びターミネーターの制御下のｍｕｔＲＮＡＣＵＡ遺伝子６コピーと、ＴｅｔＲマーカーをｐＡＣ−ＮＨ２Ｙ−ＲＳに組込んだｐＡＣ−ＮＨ２Ｙ−ＲＳ／ｐＭＪ１−ｎｒｄＡシステムも試験した（表１）。
【０１３１】
考察
Ｙ７３０ＮＨ２Ｙ−α２及びＹ７３１ＮＨ２Ｙ−α２の作製。本試験では、ＮＨ２Ｙで部位特異的に置換することにより、ラジカル成長における残基Ｙ７３０及びＹ７３１の提唱される役割について評価した。本発明者らはシュルツ研究所により創始４６開発４７−５０され、蛋白質生化学に計り知れない効果があると期待されるインビボサプレッサーｔＲＮＡ／ＲＳ法を使用した。この技術を使用し、本発明者らは湿潤細胞ペースト１ｇ当たり４〜６ｍｇの収率でＹ７３０ＮＨ２Ｙ−α２及びＹ７３１ＮＨ２Ｙ−α２を作製することができる望ましいｔＲＮＡ／ＲＳ対を進化させた。α２の寸法が大きく（１７２ｋＤａ）、ＮＨ２ＹとＹの寸法差が小さいため、直接ＥＳＩ又はＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ質量分光法によるα２へのＮＨ２Ｙ組込みの定量的評価は不可能であった。ＮＨ２Ｙ−α２中のＹに対するＮＨ２Ｙのレベルを評価するためにこの１７２ｋＤａ蛋白質のトリプシン消化産物のＬＣ／ＭＳを使用する分析法が現在開発中である。しかし、モデルＺ−ドメイン蛋白質を用いた本発明者らの試験によると、ＮＨ２Ｙの組込みは効率的で特異的であることが分かっている。更に、Ｎ３ＡＤＰ及びｄＣＤＰアッセイを使用して本発明者らのＮＨ２Ｙ−α２調製物を評価すると、低レベルのｗｔα２の存在も予想される。
【０１３２】
ＮＨ２Ｙを蛋白質に部位特異的に組込むことができるならば、一般に利用されよう。ＮＨ２Ｙ・のＵＶ−ｖｉｓ及びＥＰＲ分光特性の本発明者らの特性決定によると、触媒反応又は金属中心間の電子移動で過渡的Ｙ・を利用すると考えられる酵素のプローブとしてＮＨ２Ｙを利用できるはずである。更に、Ｆｒａｎｃｉｓらは最近、ＮＨ２Ｙを蛍光色素で誘導体化できることを示している８７，８８。従って、該当プローブを標的蛋白質に部位特異的に結合するためのツールとしてＮＨ２Ｙを使用することもできる。
【０１３３】
新規ラジカルの構造帰属。ＣＤＰ／ＡＴＰの存在下でＮＨ２Ｙ−α２をβ２と反応させると、新規ＥＰＲ活性シグナルが観測される。しかし、上記のように、ＮＨ２Ｙ・のＵＶ−ｖｉｓスペクトル特性もＥＰＲスペクトル特性も従来報告されていない。ＳＦ  ＵＶ−ｖｉｓ及びＥＰＲ分光測定に、ＤＯＰＡ、カテコール及びｏ−アミノフェノールラジカルの性質の認識を加味し、本発明者らは新規シグナルをＮＨ２Ｙ・に帰属させる８９，９０。先ず、ＳＦ法により新規ラジカルのＵＶ−ｖｉｓスペクトルのポイントバイポイント再構成の結果、これらの２種類のアミノ酸の構造類似性に基づいて予想されるＤＯＰＡ・と類似する吸収スペクトルが明らかになった。第２に、実測ＥＰＲシグナルからＹ１２２・ＥＰＲスペクトルを差し引くと、ｇａｖが有機ラジカルに典型的な２．００４３±０．０００１であるスペクトルが得られる。環プロトンとアミン窒素からの小さい超微細カップリング（＜１０Ｇ）はｏ−アミノフェノールラジカルについて従来報告されているカップリングと似ている８９。第３に、二核鉄（ＩＩＩ）クラスターに対する新規ラジカルの位置に関する情報が出力飽和試験により得られた。これらの試験によると、Ｙ１２２・は二核鉄（ＩＩＩ）クラスターに近接する（クラスター内の最近接する鉄までの距離４．６Å）ため、２８ｍＷのＰ１／２で飽和する１９。クラスターから＞３５Åのα２の活性部位を共有結合的に標識するメカニズムベースの阻害剤はＰ１／２値が０．１６ｍＷである８２。新規ラジカルはＰ１／２が０．４２±０．０８ｍＷであり、二核鉄中心から遠い種に一致する。これらのデータを総合すると、新規ラジカルはＮＨ２Ｙ・である可能性が高い（図１，スキーム１）９１。この帰属を更に裏付けるために、高磁場ＥＰＲ及びＥＮＤＯＲ実験、１５Ｎ及び２Ｈによる同位体標識試験とコンピュータ試験の組合せが進行中である。
【０１３４】
ＮＨ２Ｙ・−α２形成の反応速度。ＳＦ反応速度試験によると、速度定数はＹ７３０ＮＨ２Ｙ−α２では１２．８及び２．５ｓ−１であり、Ｙ７３１ＮＨ２Ｙ−α２では１９．２及び２．７ｓ−１である。速い速度定数は、シングルターンオーバー条件下でｗｔβ２におけるラジカル成長に先行することが従来分かっていた律速立体配座変化を意味する８３。従って、ＮＨ２Ｙ・の形成はＹ１２２・を犠牲にして反応速度的にコンピテントに生じる３８。更に、ＤＯＰＡと同様に、ＮＨ２Ｙは立体配座プローブとして作用し、この物理的段階の直接検出を可能にし、ＮＨ２Ｙ−α２β２複合体の調節状態について報告する。ＤＯＰＡ３５６・形成のモニター時には、これらの反応速度試験で観測される遅い速度定数も認められている（各種基質／エフェクター対で０．４〜０．８ｓ−１）３８，８４。これらの速度定数はいずれもこれらの実験で使用した蛋白質濃度でのＲＮＲの代謝回転数と同様に同一範囲である。本発明者らの従来の試験によると、定常状態においてジスルフィドの再還元又はこのプロセスに伴う立体配座変化は律速性であると予想された。後者の場合には、この２〜３ｓ−１の速度定数はＲＮＲのある形態がより活性な形態にゆっくりと変換することを意味すると思われる。あるいは、ＮＨ２Ｙの組込みの結果、迅速に相互変換しないチロシン類似体の２種類の立体配座又はα２自体の２種類の異なる立体配座をもつα２となる可能性もある。ＮＨ２Ｙ・形成の個々の反応速度相は、これらの２種類の立体配座がＳＦ実験のタイムスケールで相互変換しないことを示す。他の反応速度分析により、観測される遅い速度定数の性質を更に決定させることができる。
【０１３５】
ＮＨ２Ｙ−α２の活性アッセイ。定常状態代謝回転測定によると、どちらの突然変異蛋白質もｄＮＤＰを産生することができる。上記のように、この活性はＮＨ２Ｙ−α２と共精製される内在ｗｔα２又はＮＨ２Ｙの代わりにＴｙｒを負荷したｔＲＮＡＣＵＡによるアンバーコドンの抑圧により生成されるｗｔα２と結び付けることができる。あるいは、活性はＮＨ２Ｙ−α２に固有であるとも考えられる。
【０１３６】
これらの仮説を見極めるために、メカニズムベースの阻害剤Ｎ３ＡＤＰによる実験を実施した。その結果、Ｙ７３０ＮＨ２Ｙ−α２及びＹ７３１ＮＨ２Ｙ−α２で１５±２％のＮ・形成が判明した。定常状態代謝回転がｗｔα２のバックグラウンドレベルに起因したならば、これらの値は夫々予想値２％及び３．５％を上回る。従って、この結果からＮＨ２Ｙ−α２はヌクレオチド産生でコンピテントであると予想される。これは推定ＮＨ２Ｙ・が活性ラジカル輸送中の中間体であることを意味する。ミリ秒タイムスケールでの詳細な反応速度分析によりこの仮説は更に試験されよう。真実であるならば、これらの知見はｄＮＤＰ形成でコンピテントなＲＮＲ変異体における長距離正孔移動中のアミノ酸ラジカルの最初の発見となろう。
【０１３７】
酸化メカニズムの意味。ヌクレオチド還元におけるコンピテンスはＹ７３０ＮＨ２Ｙ−α２内のラジカル成長に興味深い機構的意味をもつ。ＮＨ２Ｙ７３０・によるＣ４３９の酸化には３種類のメカニズムを想定することができる。この反応は（１）段階的プロセス、即ち電子移動後のプロトン移動、（２）直交性プロトン共役電子移動（ＰＣＥＴ）又は（３）共直線性ＰＣＥＴ（即ち水素原子移動，図１１）により生じると考えられる９２−９４。段階的プロセスの仮説は非極性α２活性部位における高エネルギー負荷中間体の形成に対する負の熱化学的バイアスと、ＮＨ２Ｙ・／ＮＨ２Ｙ−対によるシステインカチオンラジカルの形成の乗り越えられないエネルギー障壁により排除することができる（図１１Ａ）９３。直交性ＰＣＥＴにはＮＨ２Ｙ・（ｐＨ７でＥ°０．６４Ｖ）によるＣ４３９（ｐＨ７で溶液還元電位１．３３Ｖ）の酸化が必要である（図１１Ｂ）１，５１。従って、２番目の仮説には１６ｋｃａｌ／ｍｏｌ不利な熱力学的に困難なプロセスが必要になる。他方、水素原子移動メカニズムは熱力学的に利用し易い（図１１Ｃ）。その実現可能性はＲ−ＳＨ（８８〜９１ｋｃａｌ／ｍｏｌ）とｏ−アミノフェノール（計算値７８〜８３ｋｃａｌ／ｍｏｌ）のホモリティックな結合解離エネルギーの認識に基づく１，９５−９７。つまり、蛋白質媒体中に摂動がないと仮定するならば、水素原子移動メカニズムに基づくＮＨ２Ｙ７３０・によるＣ４３９の酸化は５〜１３ｋｃａｌ／ｍｏｌ「しか」不足しない。従って、Ｙ７３０ＮＨ２Ｙ−α２におけるヌクレオチド還元活性はＮＨ２Ｙ７３０・によるＣ４３９・形成の水素原子移動メカニズムに熱力学的に有利である。
【０１３８】
興味深いことに、カテコールの結合解離エネルギー（８２〜８３ｋｃａｌ／ｍｏｌ）はｏ−アミノフェノールと同等である９５。しかし、ＤＯＰＡ３５６−β２はヌクレオチド還元で不活性である。ＤＯＰＡ−β２直交ＰＣＥＴの場合、この残基における酸化の機能的メカニズム（即ち図１１Ｂと同様のメカニズム）は効率的なラジカル成長とヌクレオチド還元にレドックス電位を整合させる必要がある。Ｙ７３０ＮＨ２Ｙ−α２では、レドックス電位が整合していない（〜０．６９Ｖの差）にも拘わらず、ヌクレオチド還元でコンピテンスが認められるが、これは経路においてこの残基で機能すると思われる水素原子移動を介する別の酸化メカニズムによるものと思われる。
【０１３９】
結論として、本発明者らは非天然アミノ酸ＮＨ２Ｙに特異的なサプレッサーｔＲＮＡ／ＲＳ対の進化について報告する。ＮＨ２Ｙの部位特異的挿入は触媒反応でＹ・ｓを使用する他のシステムや、該当プローブを標的蛋白質に結合するのに有用であろう。この技術を使用し、本発明者らはＹ７３０ＮＨ２Ｙ−α２とＹ７３１ＮＨ２Ｙ−α２を作製し、長距離ラジカル成長におけるこれらの残基の関与について試験した。その結果、β２のＹ１２２・からサブユニット界面を通って反応速度的にコンピテントなラジカル移動が生じることと、ＮＨ２Ｙ７３０・又はＮＨ２Ｙ７３１・のトラップが生じることが判明した。このイベントは基質とエフェクターの結合により開始される。定常状態活性アッセイに自殺型阻害剤であるＮ３ＡＤＰとの反応結果を加味すると、Ｙ７３０ＮＨ２Ｙ−α２とＹ７３１ＮＨ２Ｙ−α２はヌクレオチド還元でコンピテントであると考えられる。従って、ＮＨ２Ｙ７３０によるＣ４３９の酸化には水素原子移動メカニズムが関係していると考えられる。ＮＨ２Ｙ−α２の活性の最終的な立証にはメカニズムベースのＮ３ＮＤＰによるＮＨ２Ｙ・の減衰とＮ・の形成の詳細な反応速度分析が必要である。これらの試験は現在進行中である。
【０１４０】
支援情報。各種条件下でベクターｐＢＡＤ−ｎｒｄＡ及びｐＭＪ１−ｎｒｄＡからＹ７３０ＮＨ２Ｙ−α２を発現させる試み、ｐＴｒｃ−ｎｒｄＡによるＹ７３０ＮＨ２Ｙ−α２の発現ゲル、ＮＨ２Ｙ−α２の精製用ゲル、Ｙ７３１ＮＨ２Ｙ−α２とβ２の反応のＳＦ  ＵＶ−ｖｉｓ特性決定及び１０秒ＥＰＲスペクトル、Ｙ７３１ＮＨ２Ｙ−α２／β２とＮ３ＡＤＰ及びｄＧＴＰの反応のＣＤＰ／ＡＴＰ及びＥＰＲスペクトル。この資料はインターネットでｈｔｔｐ：／／ｐｕｂｓ．ａｃｓ．ｏｒｇから無料閲覧可能である。
【０１４１】
図面の説明
図１：α２及びβ２のドッキングモデルから作成した推定ラジカル開始経路６。Ｙ３５６はβ２の無秩序Ｃ末端テールに位置するので、どの構造でも見えていない。従って、Ｙ３５６からβ２−Ｗ４８とα２−Ｙ７３１までの距離は不明である。α２側の距離はＵｈｌｉｎとＥｋｌｕｎｄ６により決定された構造に基づき、β２側の距離は酸化したβ２の高分解能構造に基づく１９。
【０１４２】
図２：Ｋ７ＮＨ２Ｙ−Ｚ−ドメインのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ及びＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析。陽イオン化モードで得られた精製Ｋ７ＮＨ２Ｙ−Ｚ−ドメインのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ。スペクトルの主ピークのｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋を示す。これらはＫ７ＮＨ２Ｙ−Ｚ−ドメインのＮ末端開裂Ｍｅｔ形態（ｅｘｐ．７８１４）とそのアセチル化形態（ｅｘｐ．７８５６）、全長型Ｋ７ＮＨ２Ｙ−Ｈｉｓ−Ｚ−ドメイン（ｅｘｐ．７９４５）とそのアセチル化形態（ｅｘｐ．７９８７）に対応する。挿入図はＮＨ２Ｙの不在下（レーン２）又は存在下（レーン３）における発現後の精製Ｚ−ドメインのＳＤＳゲルを示す。矢印はＫ７ＮＨ２Ｙ−Ｚ−ドメインバンドを示す。蛋白質ラダーと対応するＭＷをレーン１に示す。
【０１４３】
図３：Ｙ７３１ＮＨ２Ｙ−α２の発現。指定通りにＩＰＴＧとＮＨ２Ｙ／ＤＴＴの存在下又は不在下で細胞を増殖させ、ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより発現レベルを評価した。全長型αと短縮型αの蛋白質バンドの位置を矢印で示す。
【０１４４】
図４：ＥＰＲ分光法によりモニターしたＹ７３０ＮＨ２Ｙ−α２／ＡＴＰとｗｔβ２／ＣＤＰの反応。反応成分を２５℃で混合し、終濃度２０μＭ  Ｙ７３０ＮＨ２Ｙ−α２β２、１ｍＭ  ＣＤＰ、及び３ｍＭ  ＡＴＰとした。１０秒後に液体Ｎ２で反応をクエンチした後、ＥＰＲスペクトル（実線）を７７Ｋで記録した。未反応Ｙ１２２・（点線，合計スピンの４７％）を差し引き、ＮＨ２Ｙ７３０・のスペクトル（破線，合計スピンの５３％）を得た。挿入図はＣＤＰ／ＡＴＰの不在下のＹ７３０ＮＨ２Ｙ−α２とｗｔβ２の反応を示す。
【０１４５】
図５：Ｙ１２２・及びＮＨ２Ｙ７３０・シグナル強度のマイクロ波出力依存性。マイクロ波出力の関数としてＹ１２２・とＮＨ２Ｙ７３０・のＥＰＲスペクトルを記録し、各シグナルの積分強度を出力の平方根に対してプロットした。黒線は式１８０を使用したデータへのフィットを表し、Ｙ１２２・（丸）とＮＨ２Ｙ７３０・（四角）のＰ１／２は夫々２８±４ｍＷ（ｂ＝１．３±０．２）及び０．４２±０．０８ｍＷ（ｂ＝１．２±０．２）となる。
【０１４６】
図６：ＮＨ２Ｙ７３０・（点線，図４）とＮＨ２Ｙ７３１・（破線，図１５）の比較。
【０１４７】
図７：ＮＨ２Ｙ７３０・（丸）とＮＨ２Ｙ７３１・（四角）のＵＶ−ｖｉｓスペクトルのポイントバイポイント再構成。１本のシリンジ内の予備還元したＹ７３０ＮＨ２Ｙ−α２とＡＴＰを別のシリンジからのｗｔβ２及びＣＤＰと混合し、夫々終濃度１０μＭ、３ｍＭ、１０μＭ、及び１ｍＭとした。Ｙ７３１ＮＨ２Ｙ−α２では、９μＭ  Ｙ７３１ＮＨ２Ｙ−α２β２、１ｍＭ  ＣＤＰ、及び３ｍＭ  ＡＴＰの終濃度で反応を実施した。５ｎｍ間隔で吸収変化をモニターし、各λで２〜４回の時間経過を平均し、このスペクトル範囲で予め決定したεを使用してＹ１２２・の吸収について補正した６６，６７。補正したΔＯＤをε６８に変換した後、λに対してプロットした。
【０１４８】
図８：ＮＨ２Ｙ７３０・形成のＳＦ反応速度。１本のシリンジ内の予備還元したＹ７３０ＮＨ２Ｙ−α２（２０μＭ）とＣＤＰ（２ｍＭ）を別のシリンジからのβ２（２０μＭ）及びＡＴＰ（３ｍＭ）と１：１比で混合した。合計７本のトレースを３２５ｎｍと４１０ｎｍで平均し、ＮＨ２Ｙ７３０・形成とＹ１２２・消滅をモニターした。黒線はデータへの二重指数関数によるフィットを示す（反応速度パラメータについては表２参照）。
【０１４９】
図９：Ｙ７３０ＮＨ２Ｙ−α２、β２及びｄＧＴＰの存在下のインキュベーション後のＮ３ＡＤＰからのＮ・の形成。反応成分は終濃度で２０μＭ  Ｙ７３０ＮＨ２Ｙ−α２／β２（１．２  Ｙ１２２・／β２）、１ｍＭ  Ｎ３ＡＤＰ及び０．２５ｍＭ  ｄＧＴＰとした。２０秒後に液体Ｎ２で凍結クエンチし、そのＥＰＲスペクトルを記録した。（Ａ）実測スペクトル（破線）からＮ・（点線，合計スピンの１９％）を差し引くと、Ｙ１２２・及びＮＨ２Ｙ７３０・シグナルを含む黒色トレースが得られる。（Ｂ）（Ａ）で得られたスペクトルからＹ１２２・（点線，合計スピンの４３％）を差し引くと、ＮＨ２Ｙ７３０・のスペクトル（破線，合計スピンの３９％）が得られる。各ラジカル種の濃度の定量については表４参照。
【０１５０】
図１０：Ｎ・（黒線）、Ｙ１２２・（点線）、及びＮＨ２Ｙ７３０・（破線）のスペクトル比較。スペクトルの低磁場側のＮ・とＹ１２２・の識別可能な特徴は図４、９、１５及び１７の複雑なスペクトルの逆重畳を容易にする。
【０１５１】
図１１：ＮＨ２Ｙ７３０・によるＣ４３９の酸化機構候補。（Ａ）段階的電子移動／プロトン移動。初期電子移動イベントはチイルカチオンラジカルと３−アミノチロシネート（ＮＨ２Ｙ７３０−）を含む識別可能な中間体を生成する。その後のプロトン移動により中性チイルラジカルとＮＨ２Ｙ７３０が生じる。この反応は非常に好ましくない（本文参照）。（Ｂ）直交性ＰＣＥＴ。ＥＴとプロトン移動は共役するが、電子とプロトンは目的地が異なる。Ｃ４３９のプロトンは塩基性残基に直交して移動し、その電子はＮＨ２Ｙ７３０・に向かって移動し、Ｃ４３９・とＮＨ２Ｙ７３０を生じる。（Ｃ）共直線性ＰＣＥＴ。Ｃ４３９からＮＨ２Ｙ７３０・への水素原子移動。プロトンと電子は起点と終点が同一部分である。
【０１５２】
図１２は大腸菌リボヌクレオチドレダクターゼのα２サブユニットにおけるアミノ酸Ｙ７３０及びＹ７３０の機構的役割を調べるために使用したストラテジーの模式図である
【０１５３】
図１３：Ｙ７３０ＮＨ２Ｙ−α２の発現。指定通りにＩＰＴＧとＮＨ２Ｙ／ＤＴＴの存在下又は不在下で２５℃又は３７℃にて細胞を増殖させ、ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより発現レベルを評価した。全長型αと短縮型αの蛋白質バンドの位置を矢印で示す。
【０１５４】
図１４：精製Ｙ７３０ＮＨ２Ｙ−α２（Ａ）及びＹ７３１ＮＨ２Ｙ−α２（Ｂ）のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析。（Ａ）レーン（１）及び（４），ＭＷマーカー。各バンドのＭＷを示す。レーン（２），精製Ｙ７３０ＮＨ２Ｙα２（１．５μｇ）。レーン（３），精製ｗｔα２（１．５μｇ）。（Ｂ）レーン（１），ＭＷマーカー。各バンドのＭＷを示す。レーン（２），精製Ｙ７３１ＮＨ２Ｙ−α２（１．５μｇ）。
【０１５５】
図１５：ＥＰＲによりモニターしたＹ７３１ＮＨ２Ｙ−α２／ＡＴＰとβ２／ＣＤＰの反応。反応成分を２５℃で混合し、２０μＭ  Ｙ７３１ＮＨ２Ｙ−α２β２複合体、１ｍＭ  ＣＤＰ及び３ｍＭ  ＡＴＰの終濃度とした。１０秒後に液体Ｎ２で手動凍結させることにより反応をクエンチした後、方法のセクションに記載したように７７ＫでＥＰＲスペクトルを記録した。未反応Ｙ１２２・（点線，合計スピンの５５％）を差し引き、ＮＨ２Ｙ７３０・のスペクトル（破線，合計スピンの４５％）を得た。挿入図：ＣＤＰ／ＡＴＰの不在下のＹ７３０ＮＨ２Ｙ−α２とｗｔβ２の反応。
【０１５６】
図１６：ＮＨ２Ｙ７３１・形成の反応速度。１本のシリンジ内の予備還元したＹ７３１ＮＨ２Ｙ−α２（１８μＭ）とＣＤＰ（２ｍＭ）を別のシリンジからのβ２（１８μＭ）及びＡＴＰ（３ｍＭ）と１：１比で混合した。合計６本のトレースを３２０ｎｍと４１０ｎｍで平均し、ＮＨ２Ｙ７３１・形成とＹ１２２・消滅をモニターした。黒線はデータへの二重指数関数によるフィットを示す。反応速度パラメータについては表２参照。
【０１５７】
図１７：Ｙ７３１ＮＨ２Ｙ−α２のＮ３ＡＤＰアッセイ。反応成分は終濃度で２０μＭ  Ｙ７３１ＮＨ２Ｙ−α２β２（１．２Ｙ１２２・／β２）、１ｍＭ  Ｎ３ＡＤＰ及び２５０μＭ  ｄＧＴＰとした。２０秒後に液体Ｎ２で手動凍結クエンチし、そのＥＰＲスペクトルを記録した。（Ａ）実測スペクトル（破線）からＮ・（点線，合計スピンの２０％）を差し引くと、Ｙ１２２・及びＮＨ２Ｙ７３１・シグナルを含む黒実線トレースが得られる。（Ｂ）（Ａ）で得られたスペクトルからＹ１２２・（点線，合計の４１％）を差し引くと、ＮＨ２Ｙ７３１・のスペクトル（破線，合計スピンの３９％）が得られる。各ラジカル種の濃度の定量については、表４参照。
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２８．Ｔｈｅｌａｎｄｅｒ，Ｌ．；Ｌａｒｓｓｏｎ，Ｂ．；Ｈｏｂｂｓ，Ｊ．；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７６，２５１，１３９８．
２９．Ｓｊｏｂｅｒｇ，Ｂ．−Ｍ．；Ｇｒａｓｌｕｎｄ，Ａ．；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８３，２５８，８０６０．
３０．Ｓａｌｏｗｅ，Ｓ．；Ｂｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｍ．Ｊｒ．；Ａｔｏｒ，Ｍ．；Ｓｔｕｂｂｅ，Ｊ．；ＭｃＣｒａｋｅｎ．Ｊ．；Ｐｅｉｓａｃｈ，Ｊ．；Ｓａｍａｎｏ，Ｍ．Ｃ．；Ｒｏｂｉｎｓ，Ｍ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９３，３２，１２７４９．
３１．Ｆｒｉｔｓｃｈｅｒ，Ｊ．；Ａｒｔｉｎ，Ｅ．；Ｗｎｕｋ，Ｓ．；Ｂａｒ，Ｇ．；Ｒｏｂｂｌｅｅ，Ｊ．Ｈ．；Ｋａｃｐｒｚａｋ，Ｓ．；Ｋａｕｐｐ，Ｍ．；Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｒ．Ｇ．；Ｂｅｎｎａｔｉ，Ｍ．；Ｓｔｕｂｂｅ，Ｊ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００５，１２７，７７２９．
３２．Ｂｅｎｎａｔｉ，Ｍ．；Ｒｏｂｂｌｅｅ，Ｊ．Ｈ．；Ｍｕｇｎａｉｎｉ，Ｖ．；Ｓｔｕｂｂｅ，Ｊ．；Ｆｒｅｅｄ，Ｊ．Ｈ．；Ｂｏｒｂａｔ，Ｐ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００５，１２７，１５０１４．
３３．Ｃｌｉｍｅｎｔ，Ｉ．；Ｓｊｏｂｅｒｇ，Ｂ．−Ｍ．；Ｈｕａｎｇ，Ｃ．Ｙ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９２，３１，４８０１．
３４．Ｅｋｂｅｒｇ，Ｍ．；Ｓａｈｌｉｎ，Ｍ．；Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，Ｍ．；Ｓｊｏｂｅｒｇ，Ｂ．−Ｍ．；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６，２７１，２０６５５．
３５．Ｅｋｂｅｒｇ，Ｍ．；Ｂｉｒｇａｎｄｅｒ，Ｐ．；Ｓｊｏｂｅｒｇ，Ｂ．−Ｍ．；Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００３，１８５，１１６７．
３６．Ｙｅｅ，Ｃ．Ｓ．；Ｓｅｙｅｄｓａｙａｍｄｏｓｔ，Ｍ．Ｒ．；Ｃｈａｎｇ，Ｍ．Ｃ．；Ｎｏｃｅｒａ，Ｄ．Ｇ．；Ｓｔｕｂｂｅ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００３，４２，１４５４１．
３７．Ｓｅｙｅｄｓａｙａｍｄｏｓｔ，Ｍ．Ｒ．；Ｙｅｅ，Ｃ．Ｓ．；Ｓｔｕｂｂｅ，Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２００７，２，１２２５．
３８．Ｓｅｙｅｄｓａｙａｍｄｏｓｔ，Ｍ．Ｒ．；Ｓｔｕｂｂｅ，Ｊ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００６，１２８，２５２２．
３９．Ｓｅｙｅｄｓａｙａｍｄｏｓｔ，Ｍ．Ｒ．；Ｓｔｕｂｂｅ，Ｊ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００７，１２９，２２２６．
４０．Ｓｅｙｅｄｓａｙａｍｄｏｓｔ，Ｍ．Ｒ．；Ｒｅｅｃｅ，Ｓ．Ｙ．；Ｎｏｃｅｒａ，Ｄ．Ｇ．；Ｓｔｕｂｂｅ，Ｊ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００６，１２８，１５６９．
４１．Ｙｅｅ，Ｃ．Ｓ．；Ｃｈａｎｇ，Ｍ．Ｃ．；Ｇｅ，Ｊ．；Ｎｏｃｅｒａ，Ｄ．Ｇ．；Ｓｔｕｂｂｅ  Ｊ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，１２５，１０５０６．
４２．Ｒｅｅｃｅ，Ｓ．Ｙ．；Ｓｅｙｅｄｓａｙａｍｄｏｓｔ，Ｍ．Ｒ．；Ｓｔｕｂｂｅ，Ｊ．；Ｎｏｃｅｒａ，Ｄ．Ｇ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００６，１２８，１３６５４．
４３．Ｓｅｙｅｄｓａｙａｍｄｏｓｔ，Ｍ．Ｒ．；Ｙｅｅ，Ｃ．Ｓ．；Ｒｅｅｃｅ，Ｓ．Ｙ．；Ｎｏｃｅｒａ，Ｄ．Ｇ．；Ｓｔｕｂｂｅ，Ｊ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００６，１２８，１５６２．
４４．Ｃｈａｎｇ，Ｍ．Ｃ．；Ｙｅｅ，Ｃ．Ｓ．；Ｓｔｕｂｂｅ，Ｊ．；Ｎｏｃｅｒａ，Ｄ．Ｇ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００４，１０１，６８８２．
４５．Ｒｅｅｃｅ，Ｓ．Ｙ．；Ｓｅｙｅｄｓａｙａｍｄｏｓｔ，Ｍ．Ｒ．；Ｓｔｕｂｂｅ，Ｊ．；Ｎｏｃｅｒａ，Ｄ．Ｇ  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００７，１２９，８５００．
４６．Ｗａｎｇ，Ｌ．；Ｂｒｏｃｋ，Ａ．；Ｈｅｒｂｅｒｉｃｈ，Ｂ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００１，２９２，４９８．
４７．Ｗａｎｇ，Ｌ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２００４，４４，３４．
４８．Ｘｉｅ，Ｊ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００５，３６，２２７．
４９．Ｗａｎｇ，Ｌ．；Ｘｉｅ，Ｊ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２００６，３５，２２５．
５０．Ｘｉｅ，Ｊ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００６，７，７７５．
５１．ＤｅＦｅｌｉｐｐｉｓ，Ｍ．Ｒ．；Ｍｕｒｔｈｙ，Ｃ．Ｐ．；Ｂｒｏｉｔｍａｎ，Ｆ．；Ｗｅｉｎｒａｕｂ，Ｄ．；Ｆａｒａｇｇｉ，Ｍ．；Ｋｌａｐｐｅｒ，Ｍ．Ｈ．Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１９９１，９５，３４１６．
５２．Ｊｏｖａｎｏｖｉｃ，Ｓ．Ｊ．；Ｓｔｅｅｎｋｅｎ，Ｓ．；Ｔｏｓｉｃ，Ｍ．；Ｍａｒｊａｎｏｖｉｃ，Ｂ．；Ｓｉｍｉｃ，Ｍ．Ｇ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９４，１１６，４８４６．
５３．Ｃｈｉｖｅｒｓ，Ｐ．Ｔ．；Ｐｒｅｈｏｄａ，Ｋ．Ｅ．；Ｖｏｌｋｍａｎ，Ｂ．Ｆ．；Ｋｉｍ，Ｂ．−Ｍ．；Ｍａｒｋｌｅｙ，Ｊ．Ｌ．；Ｒａｉｎｅｓ，Ｒ．Ｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９７，３６，１４９８５．
５４．Ｒｕｓｓｅｌ，Ｍ．；Ｍｏｄｅｌ，Ｐ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８５，１６３，２３８．
５５．Ｓａｌｏｗｅ，Ｓ．Ｐ．；Ｓｔｕｂｂｅ，Ｊ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８６，１６５，３６３．
５６．Ｓａｎｔｏｒｏ，Ｓ．Ｗ．；Ｗａｎｇ，Ｌ．；Ｈｅｒｂｅｒｉｃｈ，Ｂ．；Ｋｉｎｇ，Ｄ．Ｓ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２，２０，１０４４．
５７．Ｗａｎｇ，Ｌ．；Ｚｈａｎｇ，Ｚ．；Ｂｒｏｃｋ，Ａ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００３，１００，５６．
５８．Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．；Ｍａｒｔｉｎ，Ａ．Ｂ．；Ｋｉｎｇ，Ｄ．Ｓ．；Ｗａｎｇ，Ｌ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００２，９９，１１０２０．
５９．Ｚｈａｎｇ，Ｚ．；Ｗａｎｇ，Ｌ．；Ｂｒｏｃｋ，Ａ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２００２，４１，２８４０．
６０．Ｍａｏ，Ｓ．Ｓ．；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｍ．Ｉ．；Ｂｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｍ．；Ｓｔｕｂｂｅ  Ｊ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９８９，８６，１４８５．
６１．Ｚｈａｎｇ，Ｚ．；Ｓｍｉｔｈ，Ｂ．Ａ．Ｃ．；Ｗａｎｇ，Ｌ．；Ｂｒｏｃｋ，Ａ．；Ｃｈｏ，Ｃ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００３，４２，６７３５．
６２．Ｓａｌｏｗｅ，Ｓ．Ｐ．Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ．Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，１９９２．
６３．Ｒｙｕ，Ｙ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００６，３，２６３．
６４．Ｆａｒｒｅｌｌ，Ｉ．Ｓ．；Ｔｏｒｏｎｅｙ，Ｒ．；Ｈａｚｅｎ，Ｊ．Ｌ．；Ｍｅｈｌ，Ｒ．Ａ．；Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００５，２，３７７．
６５．Ｐａｌｍｅｒ，Ｇ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９６７，１０，５９５．
６６．Ｇｒａｓｌｕｎｄ，Ａ．；Ｓａｈｌｉｎ，Ｍ．；Ｓｊｏｂｅｒｇ，Ｂ．−Ｍ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．１９８５，６４，１３９．
６７．Ｎｙｈｏｌｍ，Ｓ．；Ｔｈａｌａｎｄｅｒ，Ｌ．；Ｇｒａｓｌｕｎｄ，Ａ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９３，３２，１１５６９．
６８．Ｂｏｌｌｉｎｇｅｒ  Ｊｒ．，Ｊ．Ｍ．；Ｔｏｎｇ，Ｗ．Ｈ．；Ｒａｖｉ，Ｎ．；Ｈｕｙｎｈ，Ｂ．Ｈ．；Ｅｄｍｏｎｄｓｏｎ，Ｄ．Ｅ．；Ｓｔｕｂｂｅ，Ｊ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９５，２５８，２７８−３０３．
６９．Ｗａｎｇ，Ｌ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００１，Ｓ，８８３．
７０．Ｌｉｕ，Ｄ．Ｒ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｏｃ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９９，９６，４７８０．
７１．Ｚｈａｎｇ，Ｙ．；Ｗａｎｇ，Ｌ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．；Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．Ａ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２００５，１４，１３４０．
７２．Ｔｕｒｎｅｒ，Ｊ．Ｍ．；Ｇｒａｚｉａｎｏ，Ｊ．；Ｓｐｒａｇｇｏｎ，Ｇ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｏｃ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００６，１０３，６４８３．
７３．Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｂ．；Ｍｏｋｓ，Ｔ．；Ｊａｎｓｓｏｎ，Ｂ．；Ａｂｒａｈｍｓｅｎ，Ｌ．；Ｅｌｍｂｌａｄ，Ａ．；Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，Ｅ．；Ｈｅｎｒｉｃｈｓｏｎ，Ｃ．；Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．Ａ．；Ｕｈｌｅｎ，Ｍ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１９８７，１，１０７．
７４．Ｆｏｎｔｅｃａｖｅ，Ｍ．；Ｍｕｌｌｉｅｚ，Ｅ．；Ｌｏｇａｎ  Ｄ．Ｔ．Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００２，７２，９５．
７５．Ｒｏｓｅｎｋｒａｎｚ，Ｈ．Ｓ．；Ｇａｒｒｏ，Ａ．Ｊ．；Ｌｅｖｙ，Ｊ．Ａ．；Ｃａｒｒ，Ｈ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １９６６，１１４，５０１．
７６．Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｍ．；Ｓａｈｌｉｎ，Ｍ．；Ｓｊｏｂｅｒｇ，Ｂ．−Ｍ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９２，２６７，１２６２２．
７７．Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．；Ｄｕｆｆｙ，Ｓ．Ｐ．；Ｈｅｓｓ，Ｋ．Ｒ．；Ｍｅｈｌ，Ｒ．Ａ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００６，１２８，１１１２４．
７８．Ａｍａｎｎ，Ｅ．；Ｏｃｈｓ，Ｂ．；Ａｂｅｌ，Ｋ．Ｊ．Ｇｅｎｅ  １９８７，６１，４１．
７９．新規ラジカル種のより詳細な分析については追って発表されよう。
８０．Ｃｈｅｎ−Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｙ．；Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｐ．Ｍ．；Ｔｒｅｆｆｒｙ，Ａ．；Ｑｕａｉｌ，Ｍ．Ａ．；Ａｒｏｓｉｏ，Ｐ．；Ｓａｎｔａｍｂｒｏｇｉｏ，Ｐ．；Ｃｈａｓｔｅｅｎ，Ｎ．Ｄ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９５，２４，７８４７．
８１．Ｓａｈｌｉｎ，Ｍ．；Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ，Ｌ．；Ｇｒａｓｌｕｎｄ，Ａ．；Ｅｈｒｅｎｂｅｒｇ，Ａ．；Ｓｊｏｂｅｒｇ，Ｂ．−Ｍ．；Ｔｈｅｌａｎｄｅｒ，Ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８７，２６，５５４１．
８２．Ｇｅｒｆｅｎ，Ｇ．Ｊ．；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｄｏｎｋ，Ｗ．Ａ．；Ｙｕ，Ｇ．；ＭｃＣａｒｔｈｙ，Ｊ．Ｒ．；Ｊａｒｖｉ，Ｅ．Ｔ．；Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｄ．Ｐ．；Ｆａｒｒａｒ，Ｃ．；Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｒ．Ｇ．；Ｓｔｕｂｂｅ，Ｊ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９８，１２０，３８２３．
８３．Ｇｅ，Ｊ．；Ｙｕ，Ｇ．；Ａｔｏｒ，Ｍ．Ａ．；Ｓｔｕｂｂｅ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ  ２００３，４２，１００７１．
８４．インテインで作製したｗｔβ２によるｄＣＤＰ形成をモニターする急速化学クエンチ試験では、（ｗｔβ２の場合と同様に）突発的なｄＣＤＰ形成は見られなくなり、〜１ｓ−１の単一速度定数を示す（Ｍ．Ｓｅｙｅｄｓａｙａｍｄｏｓｔ，Ｊ．Ｓｔｕｂｂｅ，未発表結果）。従って、ＤＯＰＡ−β２で観測される遅い相も代謝回転で反応速度的にコンピテントであり得る。
８５．Ｃｒａｗ，Ｍ．；Ｃｈｅｄｅｋｅｌ，Ｍ．Ｒ．；Ｔｒｕｓｃｏｔｔ，Ｔ．Ｇ．；Ｌａｎｄ，Ｅ．Ｊ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．１９８４，３９，１５５−１５９．
８６．ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｄｏｎｋ，Ｗ．Ａ．；Ｓｔｕｂｂｅ，Ｊ．；Ｇｅｒｆｅｎ，Ｇ．Ｊ．；Ｂｅｌｌｅｗ，Ｂ．Ｆ．；Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｒ．Ｇ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９５，１１７，８９０８．
８７．Ｈｏｏｋｅｒ，Ｊ．Ｍ．；Ｋｏｖａｃｓ，Ｅ．Ｗ．；Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｍ．Ｂ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００４，１２６，３７１８．
８８．Ｋｏｖａｃｓ，Ｅ．Ｗ．；Ｈｏｏｋｅｒ，Ｊ．Ｍ．；Ｒｏｍａｎｉｎｉ，Ｄ．Ｗ．；Ｈｏｌｄｅｒ，Ｐ．Ｇ．；Ｂｅｒｒｙ，Ｋ．Ｅ．；Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｍ．Ｂ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．２００７，１８，１１４０．
８９．Ｆｅｌｉｘ，Ｃ．Ｃ．；Ｓｅａｌｙ，Ｒ．Ｃ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８１，１０３，２８３１．
９０．Ｎｅｔａ，Ｐ．；Ｆｅｓｓｅｎｄｅｎ，Ｒ．Ｗ．Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１９７４，７８，５２３．
９１．ｏ−アミノフェノールに関する従来のコンピュータ試験によると、フェノールヒドロキシル基のＢＤＥはアミンのＢＤＥよりも低いことが分かっている。ｏ−アミノフェノールに関するＥＰＲ試験もこれらの計算に一致しており、Ｎに結合した２個のプロトンが酸化状態で存在することが明らかである（参考文献８８及び９４参照）。本発明者ら自身の以前のＥＰＲシミュレーションとＤＦＴ計算からもこのラジカルの構造はスキーム１に示す構造であると予想される（Ｍ．Ｓｅｙｅｄｓａｙａｍｄｏｓｔ，Ｍ．Ｂｅｎｎａｔｉ，Ｊ．Ｓｔｕｂｂｅ，未発表結果）。
９２．Ｃｕｋｉｅｒ，Ｒ．Ｉ．；Ｎｏｃｅｒａ，Ｄ．Ｇ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１９９８，４９，３３７．
９３．Ｍａｙｅｒ，Ｊ．Ｍ．；Ｒｈｉｌｅ，Ｉ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ２００４，１６５５，５１．
９４．Ｒｅｅｃｅ，Ｓ．Ｙ．；Ｈｏｄｇｋｉｓｓ，Ｊ．Ｍ．；Ｓｔｕｂｂｅ，Ｊ．；Ｎｏｃｅｒａ  Ｄ．Ｇ．Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ  Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．２００６，３６１，１３５１．
９５．Ｂｏｒｇｅｓ  ｄｏｓ  Ｓａｎｔｏｓ，Ｒ．Ｍ．；Ｍａｒｔｉｎｈｏ  Ｓｉｍｏｅｓ，Ｊ．Ａ．Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｆ．Ｄａｔａ  １９９８，２７，７０７．
９６．Ｗｒｉｇｈｔ，Ｊ．Ｓ．；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅ．Ｒ．；ＤｉＬａｂｉｏ，Ｇ．Ａ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００１，１２３，１１７３．
９７．Ｂａｋａｌｂａｓｓｉｓ，Ｅ．Ｇ．；Ｌｉｔｈｏｘｏｉｄｏｕ，Ａ．Ｔ．；Ｖａｆｉａｄｉｓ，Ａ．Ｐ．Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ａ  ２００６，１１０，１１１５１．
【０１５８】
当然のことながら、本願に記載する実施例と態様は例証のみを目的とし、これらの記載に鑑みて種々の変形又は変更が当業者に想到され、このような変形又は変更も本願の精神及び範囲と特許請求の範囲に含むものとする。
【０１５９】
以上、明確に理解できるように本発明を多少詳細に記載したが、本発明の真の範囲を逸脱することなく形態や細部に種々の変更が可能であることは以上の開示から当業者に自明である。例えば、上記全技術及び装置は種々の組合せで使用することができる。本願に引用する全刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献はその開示内容全体を全目的で本願に援用し、各刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献を全目的で本願に援用すると個々に記載しているものとみなす。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０１６０】
【特許文献１】ＷＯ２００６／１１０１８２
【特許文献２】ＷＯ２００２／０８６０７５
【特許文献３】ＷＯ２００２／０８５９２３
【特許文献４】ＷＯ２００５／０１９４１５
【特許文献５】ＷＯ２００５／００７８７０
【特許文献６】ＷＯ２００６／００７６２４
【特許文献７】ＷＯ２００６／０３４３３２
【特許文献８】米国特許第７，０４５，３３７号
【特許文献９】米国特許第７，０８３，９７０号
【特許文献１０】米国特許第７，２３８，５１０号
【特許文献１１】米国特許第７，１２９，３３３号
【特許文献１２】米国特許第７，２６２，０４０号
【特許文献１３】米国特許第７，１８３，０８２号
【特許文献１４】米国特許第７，１９９，２２２号
【特許文献１５】米国特許第７，２１７，８０９号
【図１】
0005643100.tif 000007
【図２】
0005643100.tif 000008
【図３】
0005643100.tif 000009
【図４】
0005643100.tif 000010
【図５】
0005643100.tif 000011
【図６】
0005643100.tif 000012
【図７】
0005643100.tif 000013
【図８】
0005643100.tif 000014
【図９】
0005643100.tif 000015
【図１０】
0005643100.tif 000016
【図１１】
0005643100.tif 000017
【図１２】
0005643100.tif 000018
【図１３】
0005643100.tif 000019
【図１４】
0005643100.tif 000020
【図１５】
0005643100.tif 000021
【図１６】
0005643100.tif 000022
【図１７】
0005643100.tif 000023
【図１８】
0005643100.tif 000024