(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トラスツズマブである抗ガン物質と、
(i)アルデヒド結合ポリ(エチレングリコール)および
(ii)モノマー(-)-エピガロカテキンガラートまたはオリゴマー(-)-エピガロカテキンガラートのいずれかであるフラボノイド
の結合体とを含むミセルナノ複合体であって、
ミセルナノ複合体がフラボノイドのA環のC6および/またはC8部位にて結合されているアルデヒド結合ポリ(エチレングリコール)を有し、
ここで、フラボノイドがモノマー(-)-エピガロカテキンガラートである場合は、ミセルナノ複合体がミセルナノ複合体の内核内の非-結合オリゴマー (-)-エピガロカテキンガラートをさらに含み、
抗ガン物質がオリゴマー(-)-エピガロカテキンガラートと複合体形成し、
細胞に送達されると、ミセルナノ複合体が抗ガン物質およびフラボノイドとの間で相乗的な抗ガン効果を示す、
ミセルナノ複合体。
【請求項２】
アルデヒド結合ポリ(エチレングリコール)と結合したフラボノイドが、オリゴマー(-)-エピガロカテキンガラートである、請求項1記載のミセルナノ複合体。
【請求項３】
アルデヒド結合ポリ(エチレングリコール)と結合したフラボノイドが、オリゴマー(-)-エピガロカテキンガラートであり、かつ(i)酵素触媒酸化カップリング;(ii)アルデヒド媒介オリゴマー化;または(iii)第一のモノマーユニットのA環上のC6またはC8部位と第二のモノマーユニットのA環上のC6またはC8部位との間の炭素-炭素結合により、オリゴマー化される、請求項2記載のミセルナノ複合体。
【請求項４】
アルデヒド結合ポリ(エチレングリコール)と結合したオリゴマー(-)-エピガロカテキンガラートが、第一のモノマーユニットのA環上のC6部位と第二のモノマーユニットのA環上のC8部位との間の炭素-炭素結合を介してオリゴマー化されている、または、
フラボノイドが、(-)-エピガロカテキンガラートモノマーの炭素-炭素C6-C6、C6-C8、C8-C6もしくはC8-C8結合によりオリゴマー化されたオリゴマー(-)-エピガロカテキンガラート(OEGCG)である、
請求項3記載のミセルナノ複合体。
【請求項５】
ミセルナノ複合体が、抗ガン物質と複合体形成した非-結合オリゴマー(-)-エピガロカテキンガラートを含有する内核、およびモノマー(-)-エピガロカテキンガラートと結合したアルデヒド末端化ポリ(エチレングリコール)を含む結合体を含有する外殻を含む、請求項1記載のミセルナノ複合体。
【請求項６】
内核内の非-結合オリゴマー(-)-エピガロカテキンガラートが、(i)酵素触媒酸化カップリング;(ii)アルデヒド媒介オリゴマー化;または(iii)第一のモノマーユニットのA環上のC6またはC8部位と第二のモノマーユニットのA環上のC6またはC8部位との間の炭素-炭素結合により、オリゴマー化される、請求項5記載のミセルナノ複合体。
【請求項７】
内核内の非-結合オリゴマー(-)-エピガロカテキンガラートが、第一のモノマーユニットのA環上のC6部位と第二のモノマーユニットのA環上のC8部位との間の炭素-炭素結合を介してオリゴマー化されている、または
内核内の非-結合オリゴマー(-)-エピガロカテキンガラートが、(-)-エピガロカテキンガラートモノマーの炭素-炭素C6-C6、C6-C8、C8-C6もしくはC8-C8結合によりオリゴマー化されている、
請求項6記載のミセルナノ複合体。
【請求項８】
内核内の非-結合オリゴマー(-)-エピガロカテキンガラートの生物学的活性が、非-結合オリゴマー(-)-エピガロカテキンガラートがミセルナノ複合体中に集合している場合には遮蔽され、
オリゴマー(-)-エピガロカテキンガラートの生物学的活性が、非-結合オリゴマー(-)-エピガロカテキンガラートがミセルナノ複合体から遊離された場合には遮蔽が解消される、
請求項5記載のミセルナノ複合体。
【請求項９】
アルデヒド結合ポリ(エチレングリコール)と結合したフラボノイドが、増強された生物学的フラボノイド特性を有する、請求項1〜8のいずれか一項記載のミセルナノ複合体。
【請求項１０】
内核内の非-結合オリゴマー(-)-エピガロカテキンガラートが、増強された生物学的フラボノイド特性を有する、請求項5記載のミセルナノ複合体。
【請求項１１】
抗ガン物質の生物学的活性が、抗ガン物質がミセルナノ複合体中に集合している場合には遮蔽され、
抗ガン物質の生物学的活性が、抗ガン物質がミセルナノ複合体から遊離された場合に遮蔽が解消される、
請求項5記載のミセルナノ複合体。
【請求項１２】
請求項1〜11のいずれか一項記載のミセルナノ複合体を細胞と接触させる段階を含む、インビトロ細胞に抗ガン物質を送達する方法。
【請求項１３】
請求項1〜11のいずれか一項記載のミセルナノ複合体を含む、薬学的組成物。
【請求項１４】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項13記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
対象中の細胞に抗ガン物質を送達するための薬学的組成物の製造における、請求項1〜11のいずれか一項記載のミセルナノ複合体の使用。
【請求項１６】
対象がヒトである、請求項15記載の使用。
【請求項１７】
ミセルナノ複合体が、注射、外科的移植または局所投与用に処方されている、請求項15または16記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2007年10月23日に出願された米国特許仮出願第60/960,969号に対する恩典および優先権を主張し、そこに記載される内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の技術分野
本発明は、概して、対象中の腫瘍細胞を含む細胞に生理活性物質を送達する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
フラボノイドは、植物ポリフェノールの最多数の、もっともよく研究された群の一つである。フラボノイドは、果物および野菜中に天然に存在する、低分子量ポリフェノール物質の大きな群からなり、ヒトの食事の不可欠な部分である。乾燥緑茶葉は、30重量%ほどのフラボノイドを含有することができ、(-)-エピカテキン、(-)-エピガロカテキン、(+)-カテキン、(-)-エピカテキンガラートおよび(-)-エピガロカテキンガラートを含む、カテキン(フラバン-3-オール誘導体またはカテキン-ベースのフラボノイド)として知られるフラボノイドを高い割合で含む。
【０００４】
ここ数年、緑茶葉カテキンが抗菌性、抗新生物性、抗血栓性、血管拡張性、抗酸化性、抗突然変異誘発性、抗発ガン性、高コレステロール血症、抗ウイルス性および抗炎症性特性を含む、生物学的および薬理学的特性を有することが認識されてきており、これが多数のヒト、動物およびインビトロ研究にて立証されたことから(Jankun J., et al. Nature 387, 561 (1997); Bodoni A. et al. J. Nutr. Biochem. 13, 103-111 (2002); Nakagawa K. et al. J. Agric. Food Chem. 47, 3967-3973 (1999))、これらの緑茶葉カテキンは、多くの注目を集めるようになっている。これらの生物学的および薬理学的特性は、病気の予防およびゲノムの安定性の保護において潜在的に有益である。
【０００５】
カテキンの有益な効果の多くは、カテキンの抗酸化作用に関連すると考えられる(Terao J., et al. Arch. Biochem. Biophys. 308, 278-284 (1994))。カテキンの中で、緑茶の主成分である(-)-エピガロカテキンガラート(EGCG)は、おそらくトリヒドロキシB環およびC3部位のガラートエステル部分により、最も高い活性を有すると考えられている(Isemura M., et al. Biofactors 13, 81-85 (2000); Ikeda I., et al. J. Nutr. 135, 155 (2005); Lill G., et al. FEBS Letters 546, 265-270 (2003); Sakanaka S. and Okada Y. J. Agric. Food Chem. 52, 1688-1692 (2004); Yokozawa T., et al., J. Agric. Food Chem. 48, 5068-5073 (2000))。
【０００６】
一般に、フラボノイドの活性半減期は体内では数時間に限定される。これらの化合物の代謝はいまだ明らかにされていない。EGCGを含むカテキンの好ましい抗酸化および抗ガン特性にもかかわらず、固有な容量の制約のため、緑茶を大量に直接摂取することにより体内でこの化合物の治療レベルに達することは、実際的ではない。すなわち、飲食物のみからフラボノイド由来の治療的または薬理学的利益を得るためには、実際的な消費量よりも多くの量の食物および飲料を摂取することが必要である。さらに、酸化促進活性がEGCGを含むいくつかのフラボノイドに関して報告されており、これにより、未加工の緑茶を直接摂取することは、EGCG送達のあまり効果的ではない手段となっている(Yen G. C., et al. J. Agric. Food Chem. 45, 30-34 (1997); Yamanaka N., et al. FEBS Lett. 401, 230-234 (1997); Roedig-Penman A. and Gordon M. H. J. Agric. Food Chem. 1997, 45, 4267-4270)。
【０００７】
一方、抽出された植物ポリフェノール(プロシアニジン)の比較的高分子量のフラクションならびに合成されたオリゴマー化(+)-カテキンおよびルチンは、低分子量フラボノイドと比較して抗酸化性および抗発ガン性活性などの生理学的特性が増強することが報告されている(Zhao J., et al. Carcinogenesis, 1999, 20, 1737-1745; Ariga T. and Hamano M. Agric. Biol. Chem. 54, 2499-2504 (1990); Chung J. E., et al. Biomacromolecules 5, 113-118 (2004); Kurisawa M., et al. Biomacromolecules 4, 1394-1399 (2003); Hagerman A. E., et al. J. Agric. Food Chem. 46, 1887 (1998)) and without pro-oxidant effects (Hagerman A. E., et al. J. Agric. Food Chem. 46, 1887 (1998); Li C. and Xie B. J. Agric. Food Chem. 48, 6362 (2000))。しかしながら、天然に存在するフラボノイドおよび合成された高分子量フラボノイドはどちらも、これらの化合物が典型的に大きく、タンパク質と強固な複合体を形成し、分解に耐性であることから、摂取後に吸収され、他の組織に移送されるとは考えられない(Zhao J., et al. Carcinogenesis, 1999, 20, 1737-1745)。
【０００８】
食物および飲料の経口摂取により消費されたフラボノイドの場合、フラボノイドは、抗酸化剤としての役割を果たし、消化の間、酸化的損傷から消化管を保護できる。しなしながら、フラボノイドは、消化管内にのみ残ることが予想され、それゆえ、それらの有益な生理学的活性はおそらく他の組織に利用されない。さらに、それらの強い疎水性ならびにそれらのタンパク質と複合体を形成する傾向は、これらの化合物の非経口送達を難しくしている。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、フラボノイド結合体および国際特許出願WO2006/124000および米国特許出願2008/102052において以前に記載されている送達ビヒクルを用いる、腫瘍細胞を含む細胞に生理活性抗ガン物質を送達する方法を提供する。
【００１０】
本発明は、フラボノイドベースの送達ビヒクルを細胞に抗ガン物質を送達するために使用すると、抗ガン生理活性物質およびフラボノイドとの間で相乗効果が生じるという驚くべき発見に基づく。それゆえ、これらの結合体および送達ビヒクルは、担体として作用するフラボノイド部分および送達される抗ガン物質から生じる相乗治療効果を兼ね備える。
【００１１】
一つの局面において、抗ガン物質と、遊離アルデヒドを含有する送達物質およびフラボノイドの結合体とを含み、該送達物質がフラボノイドのA環のC6および/またはC8部位にて結合されている、送達ビヒクルが提供される。
【００１２】
別の局面において、本明細書中に記載されるように、送達ビヒクルを細胞に接触させる段階を含む、細胞に抗ガン物質を送達する方法が提供される。
【００１３】
別の局面において、本明細書中に記載されるように、送達ビヒクルを含む、薬学的組成物が提供される。
【００１４】
別の局面において、本明細書中に記載されるように、対象中の細胞に抗ガン物質を送達するための送達ビヒクルの使用が提供される。
【００１５】
本発明の他の局面および特徴は、添付された図面と共に、本発明の特定の態様の以下の記載を参照することにより、当業者に明らかとなるであろう。
[請求項101]
抗ガン物質と、遊離アルデヒドを含有する送達物質およびフラボノイドの結合体とを含み、
該送達物質がフラボノイドのA環のC6および/またはC8部位にて結合されている、
送達ビヒクル。
[請求項102]
送達物質がポリマーであり、
フラボノイドがカテキンベースのフラボノイドである、
請求項101記載の送達ビヒクル。
[請求項103]
フラボノイドが、(-)-エピカテキン、(-)-エピガロカテキン、(+)-カテキン、(-)-エピカテキンガラートまたは(-)-エピガロカテキンガラートであるカテキンベースのフラボノイドである、請求項102記載の送達ビヒクル。
[請求項104]
フラボノイドがモノマーであるか、または
フラボノイドがオリゴマーである、
請求項101〜103のいずれか一項記載の送達ビヒクル。
[請求項105]
フラボノイドが、オリゴマーであり、かつ(i)酵素触媒酸化カップリング;(ii)アルデヒド媒介オリゴマー化;または(iii)第一のモノマーユニットのA環上のC6またはC8部位と第二のモノマーユニットのA環上のC6またはC8部位との間の炭素-炭素結合により、オリゴマー化される、請求項104記載の送達ビヒクル。
[請求項106]
フラボノイドが、第一のモノマーユニットのA環上のC6部位と第二のモノマーユニットのA環上のC8部位との間の炭素-炭素結合を介してオリゴマー化されている、または、
フラボノイドが、(-)-エピガロカテキンガラートモノマーの炭素-炭素C6-C6、C6-C8、C8-C6もしくはC8-C8結合によりオリゴマー化されたオリゴマー(-)-エピガロカテキンガラート(OEGCG)である、
請求項105記載の送達ビヒクル。
[請求項107]
ポリマーが、アルデヒド末端化ポリ(エチレングリコール)、アルデヒド誘導体化ヒアルロン酸、ヒアルロン酸アミノアセチルアルデヒドジエチルアセタール結合体、アルデヒド誘導体化ヒアルロン酸-チラミン、ヒアルロン酸アミノアセチルアルデヒドジエチルアセタール結合体-チラミン、シクロトリホスファゼンコアフェノキシメチル(メチルヒドラゾノ)デンドリマーまたはチオホスホリルコアフェノキシメチル(メチルヒドラゾノ)デンドリマーである、請求項101記載の送達ビヒクル。
[請求項108]
前記ポリマーがアルデヒド末端化ポリ(エチレングリコール)であり、
前記送達ビヒクルがミセルナノ複合体である、
請求項107記載の送達ビヒクル。
[請求項109]
ミセルナノ複合体が、オリゴマーカテキンベースのフラボノイドに結合したアルデヒド末端化ポリ(エチレングリコール)を含む、請求項108記載の送達ビヒクル。
[請求項110]
ミセルナノ複合体が、オリゴマーカテキンベースのフラボノイドを含有する内核、およびモノマーカテキンベースのフラボノイドと結合したアルデヒド末端化ポリ(エチレングリコール)を含む結合体を含有する外殻を含む、請求項109記載の送達ビヒクル。
[請求項111]
オリゴマーカテキンベースのフラボノイドが、(i)酵素触媒酸化カップリング;(ii)アルデヒド媒介オリゴマー化;または(iii)第一のモノマーユニットのA環上のC6またはC8部位と第二のモノマーユニットのA環上のC6またはC8部位との間の炭素-炭素結合により、オリゴマー化される、請求項110記載の送達ビヒクル。
[請求項112]
オリゴマーカテキンベースのフラボノイドが、第一のモノマーユニットのA環上のC6部位と第二のモノマーユニットのA環上のC8部位との間の炭素-炭素結合を介してオリゴマー化されている、または
オリゴマーカテキンベースのフラボノイドが、(-)-エピガロカテキンガラートモノマーの炭素-炭素C6-C6、C6-C8、C8-C6もしくはC8-C8結合によりオリゴマー化されたオリゴマー(-)-エピガロカテキンガラート(OEGCG)である、
請求項111記載の送達ビヒクル。
[請求項113]
オリゴマーカテキンベースのフラボノイドの生物学的活性が、オリゴマーカテキンベースのフラボノイドがミセルナノ複合体中に集合している場合には遮蔽され、
オリゴマーカテキンベースのフラボノイドの生物学的活性が、オリゴマーカテキンベースのフラボノイドがミセルナノ複合体から遊離された場合には遮蔽が解消される、
請求項110記載の送達ビヒクル。
[請求項114]
前記ポリマーが、アルデヒド誘導体化ヒアルロン酸、ヒアルロン酸アミノアセチルアルデヒドジエチルアセタール結合体、アルデヒド誘導体化ヒアルロン酸-チラミン、ヒアルロン酸アミノアセチルアルデヒドジエチルアセタール結合体-チラミンまたはそれらの組み合わせであり、
前記送達ビヒクルが、ヒドロゲルである、
請求項107記載の送達ビヒクル。
[請求項115]
架橋剤とともに架橋していないポリマー-フラボノイド結合体を注入することにより、インビボで形成される、請求項114記載の送達ビヒクル。
[請求項116]
フラボノイドが、増強された生物学的フラボノイド特性を有する、請求項101〜115のいずれか一項記載の送達ビヒクル。
[請求項117]
オリゴマーカテキンベースのフラボノイドが、増強された生物学的フラボノイド特性を有する、請求項110記載の送達ビヒクル。
[請求項118]
抗ガン物質の生物学的活性が、抗ガン物質がミセルナノ複合体中に集合している場合には遮蔽され、
生理活性物質の生物学的活性が、生理活性物質がミセルナノ複合体から遊離された場合に遮蔽が解消される、
請求項110記載の送達ビヒクル。
[請求項119]
抗ガン物質が、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、薬物、抗体、ホルモン、酵素、成長因子、サイトカイン、一本鎖DNA、二本鎖DNA、一本鎖RNA、二本鎖RNA、短ヘアピンRNA、siRNA、抗生物質、化学療法物質、血管形成阻害剤、腫瘍細胞表面マーカーに対する抗体、免疫調節性ペプチド、サイトカインまたは成長因子である、請求項101〜118のいずれか一項記載の送達ビヒクル。
[請求項120]
抗ガン物質が、腫瘍細胞表面マーカーに対する抗体である、請求項119記載の送達ビヒクル。
[請求項121]
抗体が、トラスツズマブである、請求項120記載の送達ビヒクル。
[請求項122]
請求項101〜121のいずれか一項記載の送達ビヒクルを細胞と接触させる段階を含む、細胞に抗ガン物質を送達する方法。
[請求項123]
前記細胞がインビトロである、請求項122記載の方法。
[請求項124]
前記細胞がインビボであり、
前記方法が抗ガン治療を必要とする対象に送達ビヒクルを投与する段階を含む、
請求項122記載の方法。
[請求項125]
対象がヒトである、請求項124記載の方法。
[請求項126]
投与する段階が、注射、外科的移植または局所適用を含む、請求項124または125記載の方法。
[請求項127]
請求項101〜121のいずれか一項記載の送達ビヒクルを含む、薬学的組成物。
[請求項128]
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項127記載の薬学的組成物。
[請求項129]
対象中の細胞に抗ガン物質を送達するための、請求項101〜121のいずれか一項記載の送達ビヒクルの使用。
[請求項130]
対象がヒトである、請求項129記載の使用。
[請求項131]
送達ビヒクルが、注射、外科的移植または局所投与用に処方されている、請求項129または130記載の使用。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
本発明の態様を、例示のみを目的として図面中に示す。
【図１】HMECにおける、(□)EGCG、(▲)OEGCGおよび(○)PEG-EGCGの細胞毒性を示すグラフである。試料ではN=5、対照ではN=8。
【図２】血清の非存在下(○)および存在下(●)でのミセル複合体の大きさを示すグラフである。N=3。
【図３】プロテイナーゼKの存在下での(□)遊離のFITC-BSA、(○)FITC-BSAおよびOEGCGの複合体、(△) PEG-EGCG複合体中の(FITC-BSA + OEGCG);ならびに(■)プロテイナーゼK非存在下での遊離のFITC-BSAの蛍光強度を示すグラフである。N=3。
【図４】(□)PEG-EGCG、(■)OEGCG、(△)ハーセプチン、(●)PEG-EGCG複合体中の(ハーセプチン + OEGCG)、(▲)PEG-EGCG複合体中の(BSA + OEGCG)、および(○)対照(非処理細胞)の存在下でのSKBR-3細胞のインビトロ細胞増殖を示すグラフである。試料ではN=5および対照ではN=8。
【図５】懸濁希釈されたPEG-EGCG複合体中の(ハーセプチン + OEGCG)の大きさを示すグラフである。N=3。
【図６】OEGCG、PEG-EGCG、ハーセプチン、PEG-EGCG複合体中の(ハーセプチン + OEGCG)、およびPEG-EGCG複合体中の(BSA + OEGCG)の存在下でのSKBR-3細胞のインビトロ増殖を示すグラフである(各群につき、バーは左から右方向)。細胞増殖のパーセンテージは、各時間点で対照を用いて標準化した。試料ではN=5、対照ではN=8。
【図７】(△)ハーセプチンを加えたミセル複合体、(□)ハーセプチン単独、または(○)PBS対照で1ヵ月間週に2回処置した腫瘍含有Balb/nudeマウスにおける腫瘍の大きさを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
詳細な説明
フラボノイドは、ガン細胞の成長を阻害する抗ガン効果を有することを含む、様々な生物学的特徴を有することが知られる。フラボノイドを含む送達ビヒクルは、国際特許出願WO2006/124000および米国特許出願2008/102052にすでに記載されている。
【００１８】
驚くべきことに、本発明者らは、フラボノイド送達ビヒクルおよび生理活性抗ガン物質の組み合わせが、単独で使用した場合のフラボノイド送達ビヒクルおよび生理活性抗ガン物質のそれぞれの効果を合わせたものよりも大きな相乗的な抗ガン効果を有することを見出した。それゆえ、抗ガン物質を付加したこのような送達ビヒクルは、送達ビヒクルのフラボノイド部位の抗ガン活性と抗ガン物質の抗ガン効果との相乗効果という利点を有する、細胞に抗ガン物質を送達する効果的な手段を提供する。
【００１９】
本発明者らは、フラボノイドおよびEGCGなどのフラボノイド結合体を用いる自己集合により、タンパク質、核酸または薬物などの抗ガン物質を含有する送達ビヒクルを開発した。この送達ビヒクルは、自己集合により形成した。例えば、送達ビヒクルを、(i)オリゴマー(-)-エピガロカテキン-3-O-ガラート(OEGCG)および抗ガン物質の集合、ならびにその後の、あらかじめ形成されたOEGCG-抗ガン物質複合体とポリ(エチレングリコール)(PEG)およびEGCG(PEG-EGCG)の結合体との集合を含む二段階自己集合工程、ならびに、(ii)PEGおよびOEGCG(PEG-OEGCG)の結合体と抗ガン物質の集合を含む、一段階自己集合工程により合成した。両方の送達ビヒクルは、マイルドな水溶液中に自発的自己集合を介して抗ガン物質を付加した、安定で高度に配向したミセル複合体として形成した。結果として得られるミセルナノ複合体は特徴的に、OEGCG-抗ガン物質複合体で成る内核を有する、PEG外殻を表す。
【００２０】
ミセルナノ複合体の形成は、主に疎水性相互作用および水素結合により行われるため、本明細書中に記載する送達ビヒクルを用いて、細胞への改良された送達のために、広範囲の種類の抗ガン物質を付加することができる。
【００２１】
送達ビヒクルは、増強された透過性および保持(EPR)効果の利点を有するように、ならびに、インビボ投与された場合に細網内皮系(RES)取り込みを避け、ガン部位に選択的に蓄積されるように設計される。理想的には、活性の損失および送達の間の分解からフラボノイド分子および抗ガン物質の両方の安定性を保護し、その結果送達ビヒクルは、細胞に送達された場合に相乗的治療効果を発揮する。送達ビヒクルは、フラボノイドの活性および抗ガン物質の活性を、これらの成分を送達ビヒクルの内核の中に隔離することにより、うまく細胞に送達され放出されるまで遮蔽でき、その結果細胞の部位での送達ビヒクルの解離時にのみ、それぞれの活性が回復する。
【００２２】
送達ビヒクルによる相乗的治療効果を示すために、以下の実施例1にて記載するように、抗ガンタンパク質であるハーセプチン(トラスツズマブ)をミセル複合体中に付加した。ミセル複合体は、その完全性を保持し、時間に応じた大きさの変化なしに血清の存在下で優れた安定性を示し、タンパク質は、ミセル複合体中でタンパク分解から安全に保護された。より強い阻害が、個々の成分(OEGCG、PEG-EGCGおよびハーセプチン)と比較して、ハーセプチン-付加送達ビヒクルで示された。
【００２３】
送達ビヒクルの形成は主に疎水性相互作用によってなされるので、それは両親媒性分子などの疎水性拮抗物により解離することができる。それゆえ、送達ビヒクルが標的細胞部位にて蓄積すると、送達ビヒクルは、生物両親媒性分子(血漿膜脂質など)により解離し、含有された治療的フラボノイドおよび抗ガン化合物を放出できる。
【００２４】
このように、抗ガン物質を細胞に送達する方法が提供される。フラボノイドおよび抗ガン物質を含有する送達ビヒクルは、国際特許出願WO2006/124000および米国特許出願2008/102052にこれまでに記載されているように、および以下に記載されるように使用する。その後、送達ビヒクルは、抗ガン物質が送達されるべき細胞と接触する。
【００２５】
フラボノイド結合体および送達ビヒクル
有益なフラボノイド化合物の有用性を高めるため、フラボノイドのA環に対する送達物質上の遊離アルデヒド基を介した、種々の送達物質へのフラボノイドの結合は、フラボノイドの生物学的および薬理学的特性を増加すると同時に、フラボノイドのポリフェノール構造を破壊することなしにフラボノイドの物理的な特性の改変を可能とする。
【００２６】
すなわち、フラボノイドへの送達物質のアルデヒド媒介結合は、フラボノイドのA環のC6および/またはC8位置での送達物質の結合を生じ、フラボノイドのBおよびC環またはフラボノイド上の種々のヒドロキシル基を破壊せずそれに作用することもない。
【００２７】
フラボノイドへの送達物質の結合により、送達物質と形成される特定のビヒクル内にフラボノイドを組み込むことにより、対象に投与するのに適した組成物が提供でき、飲食物から得られるよりも高いフラボノイド濃度の投与を可能にできる。送達物質は組成物に安定性を提供し、それにより組成物がよりゆっくりと代謝され分解されることとなり、それゆえ、非結合のフラボノイド単独の場合よりも、体内でより長い半減期を有することができる。例えば、送達物質は、フラボノイドの水溶性を増強する組成物中にフラボノイドが組み込まれるような性質の送達物質であり得、これは細網内皮系による取り込みおよび続く腎臓によるクリアランスを回避することができ、その結果体内でのより長い半減期をもたらす。他の送達物質の結合は、酵素分解からフラボノイドを保護することができる。
【００２８】
送達物質は、酸触媒の存在下で送達物質がフラボノイドと反応することによりフラボノイドと結合でき、この送達物質は遊離アルデヒド基または酸の存在下で遊離アルデヒド基に変換可能な基を有している。
【００２９】
フラボノイドは、コアのフェニルベンジルピロン構造由来の分子の一般的なクラスからの任意のフラボノイドであることができ、フラボン、イソフラボン、フラボノール、フラバノン、フラバン-3-オール、カテキン、アントシアニジンおよびカルコンを含む。特定の態様において、フラボノイドはカテキンまたはカテキンベースのフラボノイドである。カテキンまたはカテキンベースのフラボノイドは、カテキン(またはフラバン-3-オール誘導体)として一般的に知られるクラスに属する任意のフラボノイドであり、エピカテキン、エピガロカテキン、カテキン、エピカテキンガラートおよびエピガロカテキンガラートを含むカテキンおよびカテキン誘導体を含み、カテキンまたはカテキンベースのフラボノイドのすべての可能な立体異性体を含む。特定の態様において、カテキンベースのフラボノイドは、(+)-カテキンまたは(-)-エピガロカテキンガラートである。(-)-エピガロカテキンガラート(EGCG)は、おそらく、このフラボノイドのトリヒドロキシB環およびC3位のガラートエステル部分により、カテキンベースのフラボノイドの中で最も高い活性を有すると考えられる。
【００３０】
送達物質は、遊離のアルデヒドもしくは基、または、例えばアセタール基などの酸の存在下で遊離アルデヒド基に変換可能な官能基を含有する、任意の化学基または部分である。送達物質は、送達ビヒクル内に形成されることができるので、フラボノイドの生物学的または薬理学的特性を損なうことなく送達ビヒクル内への結合フラボノイドの組み込みを可能とする。なお、送達物質は生体適合性であるべきであり、いくつかの態様においては生体分解性であってもよい。
【００３１】
以下の考察は、フラボノイドがカテキンベースのフラボノイドであり、送達物質がポリマーである態様に関する。しかしながら、上述したように、アルデヒド含有化学基とフラボノイドとの間のアルデヒド縮合反応が、送達物質の酸処置後のものを含む遊離アルデヒド基を有する任意の送達物質と任意のフラボノイドとの結合に適用可能であることが理解されるであろう。
【００３２】
それゆえ、反応は、遊離アルデヒド基または酸の存在下で遊離アルデヒド基に変換可能な基を含有するポリマーとカテキンベースのフラボノイドとの結合を包含できる。
【００３３】
カテキンベースのフラボノイドは、カテキンベースのフラボノイドの単一のモノマーユニットであることができ、または、一つまたは複数のカテキンベースのフラボノイドのオリゴマーであることができる。上述したように、ポリマーのフラボノイドへの結合により、フラボノイドの生物学的または薬理学的特性の増強がもたらされる。そのうえ、カテキンベースのフラボノイドのオリゴマーは、カテキンベースのフラボノイドに関連した生物学的および薬理学的特性の増幅したまたは増強したレベルを有する傾向があり、しばしばモノマーのカテキンベースのフラボノイドに関連する酸化促進作用が減少してさえいる。それゆえ、カテキンベースのフラボノイドは、増幅したまたは増強したフラボノイド特性を有するオリゴマー化カテキンベースのフラボノイドである。
【００３４】
酵素触媒酸化カップリングおよびアルデヒド媒介オリゴマー化により調製されるオリゴマーを含む、カテキンベースのフラボノイドのオリゴマーが知られている。アルデヒド媒介オリゴマー化プロセスでは、例えば、適用可能な場合にはいずれの可能な立体配置も含む、一方のモノマーのA環上のC6またはC8部位と次のモノマーのA環上のC6またはC8部位とが結合したCH-CH3ブリッジなどの炭素-炭素結合を介して、限定的な結合を有する非分岐オリゴマーが生じる。それゆえ、CH-CH3結合は、一方のモノマーのA環のC6部位および次のモノマーのC6もしくはC8部位のいずれかとの間であることができ、または、それは第一のモノマーのA環のC8部位と次のモノマーのC6もしくはC8部位のいずれかとの間であることができる。
【００３５】
カテキンベースのフラボノイドのオリゴマーは、共に結合した2またはそれ以上のモノマーユニットであってよい。特定の態様において、カテキンベースのフラボノイドオリゴマーは、2から100のフラボノイドモノマーユニット、10から100、2から80、10から80、2から50、10から50、2から30、10から30、20から100、30から100または50から100のモノマーユニットを有する。
【００３６】
ポリマーは、カテキンベースのフラボノイドと結合する前に遊離アルデヒド基を有するか、または、例えばアセタール基などの酸の存在下でアルデヒド基に変換する基を有する任意のポリマーであることができる。さらに、ポリマーは、非毒性で、生体適合性で、薬理学的使用に適当でなければならないことが理解される。ポリマーはまた、他の所望の特性を有し、例えば、ポリマーは低い免疫原性を有し、例えば、生体内の特定の部位でのカテキンベースのフラボノイドおよび抗ガン物質の制御された放出のために、組成物の所望の生物学的用途に応じて生体分解性であるかまたは非生体分解性である。
【００３７】
ポリマーは、その特定の特徴および送達ビヒクルの特定のタイプを形成する能力に基づいて選択することができる。例えば、ポリマーはアルデヒド末端化ポリ(エチレングリコール)であってよく、または、アルデヒド基で誘導体化されたヒアルロン酸もしくはそのようなポリマーの誘導体であってもよい。あるいは、ポリマーは、例えば、シクロトリホスファゼンコアPMMHまたはチオホスホリルコアPMMHなどのフェノキシメチル(メチルヒドラゾノ)デンドリマー(PMMH)であってもよい。ポリマーは、例えば、アルデヒド修飾タンパク質、ペプチド、ポリサッカライドまたは核酸などの、遊離アルデヒド基または酸の存在下でアルデヒドに変換可能な基を含有するように修飾された任意の生物学的ポリマーであってもよい。特定の態様において、ポリマーは、アルデヒド末端化ポリ(エチレングリコール)(PEG-CHO)である。別の特定の態様において、ポリマーはアルデヒド誘導体化ヒアルロン酸、アミノアセチルアルデヒドジエチルアセタールと結合したヒアルロン酸、または、チラミンで誘導体化された前記のヒアルロン酸ポリマーのいずれかである。
【００３８】
ポリマー上の遊離アルデヒド基により、制御された方法で、フラボノイド構造のA環のC6もしくはC8部位のいずれかまたは両方へのポリマーの結合が可能となり、それゆえ、フラボノイド構造、特にフラボノイドのBおよびC環の破壊が妨げられ、それゆえ、フラボノイドの有利な生物学的および薬理学的特性が保持される。
【００３９】
ポリマーは、カテキンベースのフラボノイドのA環のC6および/またはC8部位とポリマーのアルデヒド基との反応を介して、カテキンベースのフラボノイドに結合する。
【００４０】
結合体は、ポリマーのアルデヒド基とカテキンベースのフラボノイドとの縮合の酸触媒を用いて、または、アルデヒド基とカテキンベースのフラボノイドとの縮合の前にポリマーの官能基を遊離アルデヒドに変換する酸を用いて、合成される。
【００４１】
ポリマーとカテキンベースのフラボノイドとを結合するために、ポリマーおよびカテキンベースのフラボノイドは、別々に適当な溶媒中に溶解される。遊離アルデヒドを有するポリマーは、カテキンベースのフラボノイドを含有する溶液に、酸の存在下で、例えば滴下により加えられる。反応は完了するまで行われる。結合反応に続き、過剰な未反応のポリマーまたはカテキンベースのフラボノイドを例えば、透析または分子ふるいにより、結合した組成物から除去できる。
【００４２】
ポリマーのカテキンベースのフラボノイド部分にポリマー部分が1つだけ結合するように、または、ポリマー上の１つより多くの位置でカテキンベースのフラボノイド部分が結合するように、または、カテキンベースのフラボノイド部分が二つのポリマー部分を有して、一つがカテキンベースのフラボノイドのC6およびC8部位のいずれかで結合するように、カテキンベースのフラボノイドのポリマーに対する比は変えることができる。
【００４３】
最終組成物におけるカテキンベースのフラボノイドに対するポリマーの比は、開始試薬の比により制御することができる。例えば、ポリマー部分の、カテキンベースのフラボノイド部分に対するモル比が約1の場合、単一のポリマー部分は単一のカテキンベースのフラボノイド部分(モノマーまたはオリゴマーのいずれも使用できる)に結合する。しかしながら、例えば、ポリマーの、カテキンベースのフラボノイドに対するモル比が10:1の場合など、ポリマーの濃度がより高い場合には、ポリマー-フラボノイド-ポリマーのトリ-ブロック構造を有する組成物が得られる。
【００４４】
ポリマーがフラボノイドのA環のC6および/またはC8部位にて結合されている、遊離アルデヒドを含有するポリマーとカテキンベースのフラボノイドとの結合体もまた意図される。
【００４５】
ポリマーの結合体はまた、種々の組成物またはビヒクル中にカテキンベースのフラボノイドを組み込むことを可能にする。ポリマーの物理的な特徴に基づいて、遊離アルデヒド基を含有する特定のポリマーを選択することにより、様々な異なるタイプのビヒクル中にフラボノイドを組み込むことが可能となり、生体の様々な標的領域に異なる状況でフラボノイドを高い濃度で送達することが可能となる。
【００４６】
このように、上述した反応により得られる結合体は、結合体のポリマー部分の性質に依存して、送達ビヒクル中に形成される。送達ビヒクルは、送達ビヒクルの性質に依存して、カテキンベースのフラボノイドを生体内の特定の標的部位を含む生体に送達するために用いられる。
【００４７】
抗ガン物質
抗ガン物質は送達ビヒクル中に含まれており、その後、抗ガン物質が送達される細胞と接触する。それゆえ、ポリマー上の遊離アルデヒド基を介してポリマーと結合したカテキンベースのフラボノイドを含む送達ビヒクルであり、抗ガン物質をさらに含む送達ビヒクルが提供される。
【００４８】
抗ガン物質は、細胞毒性、アポトーシス、抗有糸分裂 抗脈管形成、または転移効果の阻害などの抗腫瘍効果を含む、細胞に対する抗ガン効果を有する任意の物質であることができる。抗ガン効果は、腫瘍細胞成長の阻害もしくは減少、発ガンの阻害もしくは減少、腫瘍細胞の死滅、または、腫瘍細胞を含む細胞の発ガン性もしくは腫瘍生成特性の阻害もしくは減少を含むことを意図する。
【００４９】
抗ガン物質には、タンパク質、核酸、小分子または薬物が含まれる。タンパク質である抗ガン物質は、ペプチド、抗体、ホルモン、酵素、成長因子またはサイトカインであってもよい。核酸である抗ガン物質は、一本鎖または二本鎖のDNAまたはRNA、短ヘアピンRNA、siRNAであってもよく、または、抗ガン産物をコードする遺伝子を含んでいてもよい。また、抗ガン物質の範囲には、化学療法物質または脈管形成阻害剤も包含される。抗ガン物質は、腫瘍細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体を含む抗体、免疫調節性ペプチド、サイトカインまたは成長因子であってもよい。抗ガン物質は、ハーセプチン(トラスツズマブ)またはTNP470であってもよい。
【００５０】
抗ガン物質を含有する送達ビヒクルの形成
一つの特定の態様において、送達ビヒクルは、対象の生体内の特定の部位に位置する細胞を含む細胞への、カテキンベースのフラボノイドおよび抗ガン物質の非経口送達に適するミセルナノ複合体である。
【００５１】
抗ガン物質を含有する送達ビヒクルを形成するため、ポリマーは、組成物のカテキンベースのフラボノイド部分と集合可能で、溶液環境からフラボノイドを保護できる性質を有するように選択される。結合体のポリマー部分が可溶性であり、カテキンベースのフラボノイドよりも可溶性であるような適した溶媒が選択されると、結合体は自己集合し、フラボノイド核から溶液を除外し、それゆえ、ミセル複合体の集合を可能とする。
【００５２】
ミセルナノ複合体送達ビヒクルの特定の態様において、選択されるポリマーは、アルデヒド末端化PEGまたはそれらの誘導体である。PEGは、薬理学的成分として広く使用されているポリマーであり、優れた親水性、非毒性、非免疫原性、および低生分解性とともに生体親和性特徴を有する。
【００５３】
カテキンベースのフラボノイドにPEG-CHOが結合することにより、結合体は強い自己集合性傾向を有するように形成される。一つの態様において、PEGはカテキンベースのフラボノイドのモノマーと結合し、PEG-フラボノイドを形成する。送達ビヒクルは、非結合のカテキンベースのフラボノイドおよび抗ガン物質と共に形成される。それゆえ、中央核は、比較的高濃度のフラボノイドおよび抗ガン物質を含有し、一方、ミセルナノ複合体の外殻は、結合したPEG-モノマーフラボノイドを含み、二段階工程で集合する。特定の態様において、中央核はオリゴマーEGCG(OEGCG)であり、外核は結合したPEG-EGCGによって構成されている。
【００５４】
送達ビヒクルのこの二段階集合の形成により、送達ビヒクルの核中に組み込まれたオリゴマーフラボノイドの生物学的活性が一時的に部分的または完全に遮蔽され、同時に、細胞に送達される前の分解から抗ガン物質が保護される。例えば、送達ビヒクルの核中に集合されるので、オリゴマー化EGCGの増強された特性は、送達ビヒクルの集合した核部分の他の分子との物理的相互作用に起因して利用されにくい。例えば、細胞のリン脂質膜とビヒクルの融合により、送達ビヒクルから遊離されると、送達ビヒクルの成分は分離し、その結果オリゴマーカテキンベースのフラボノイドの生物学的特性の遮蔽を解消して、細胞内への送達のために抗ガン物質が放出される。
【００５５】
送達ビヒクルのこの態様は、抗ガン物質を送達するためにうまく適したものである。カテキンベースのフラボノイドが強固な、複数環の核構造を有しているため、これらの分子は、おそらく抗ガン物質上の1つまたは複数の環とカテキン環の積み重ねにより、タンパク質および核酸などの抗ガン物質、ならびに環構造を含有する他の分子とうまく結合する。それゆえ、オリゴマー化カテキンベースのフラボノイドは、ミセルナノ複合体中に集合する前に、抗ガン物質と結合するために使用することができる。
【００５６】
抗ガン物質の濃度は、生体内の特定の部位に送達されるべき抗ガン物質の全量に応じて、および、ミセル構造を不安定化させることなくミセルナノ複合体中に含ませることができる抗ガン物質の量に応じて選択される。特定の態様において、抗ガン物質は、ミセル複合体の50%または40% w/wまで構成できる。
【００５７】
抗ガン物質の生物学的活性もまた、本発明の送達ビヒクル中に組み込まれている間、一時的に部分的または完全に遮蔽される。オリゴマーカテキンベースのフラボノイドの場合と同様に、抗ガン物質の生物学的特性が遮蔽または隔離されると、抗ガン物質が送達ビヒクル内に集合している間は利用されにくくなり、結果として、送達ビヒクル内に含有されている間、抗ガン物質が抗ガン活性を発揮できないか、または、生物活性様式で他の分子と相互作用できず、他の分子の活性からも保護されることを意味する。送達ビヒクルから抗ガン物質が放出されると、抗ガン物質の生物学的特性が再度利用可能となり、抗ガン物質は細胞に一度送達されると、抗ガン効果を発揮できる。
【００５８】
他の態様において、PEGがオリゴマーカテキンベースのフラボノイドに結合する。この送達物質の態様は、強い自己集合特性を有し、一段階工程で自己集合できる。上記した二段階集合ミセルナノ複合体と同様に、一段階集合ミセルナノ複合体は、抗ガン物質を含む。
【００５９】
上記したミセルナノ複合体は、ナノスケールの大きさであり、直径が約1 nmから約10000 nm、または直径が約20 nmから約4000 nm、または直径が約20 nmから約100 nmであることができる。ミセルナノ複合体の大きさは、オリゴマー化カテキンベースのフラボノイドの長さ、ポリマーの長さ、および、非結合オリゴマー化カテキンベースのフラボノイドの濃度を変えることにより変えることができる。ミセルナノ複合体の大きさは、使用するポリマーに応じて、pH依存性であってもよい。例えば、結合したポリマーがPEGであるミセルナノ複合体において、ミセルの直径は、pHが増加すると減少する傾向がある。
【００６０】
一般に、抗ガン物質を含有するミセルナノ複合体は、自己集合を受け、そのため合成はほとんど必要ない。二段階工程の場合、抗ガン物質を含む核を形成する成分を、例えば希釈したDMSOまたはメタノールなどの適当な溶媒中に溶解し、集合させる。溶媒は、核成分が可溶性であり、および、水中に混和性であり、または、揮発性であり、またはそうでなければ、集合したミセルがそれから単離または抽出できる溶媒である。上記したように、核成分は抗ガン物質および例えばオリゴマーカテキンベースのフラボノイドなどのカテキンベースのフラボノイドを含む。次いで外郭を形成するポリマーカテキンベースのフラボノイド結合体を溶液に加え、ミセルナノ複合体を形成させる。
【００６１】
一段階自己集合工程の場合、抗ガン物質と一緒にポリマーカテキンベースのフラボノイド結合体を、二段階工程について記載したような適当な緩衝液中に溶解し、ミセルナノ複合体を集合させる。
【００６２】
このミセルナノ複合体システムは、PEG外殻による、カテキンベースのフラボノイドの制御された生体内分布および血流中での延長された循環の半減期の達成を可能とし、ならびに、カテキンベースのフラボノイド化合物の増強された病理学的活性を提供し、同時にこのような化合物にミセルの内核に付加された抗ガン物質の治療的効果が付随するさらなる利点を有する。抗ガン物質がタンパク質などの感受性分子である場合、ナノスケールミセルは、慣用的な技術がタンパク質などの感受性生理活性抗ガン物質の変性を引き起こす、現在使用されている慣用的なカプセル化技術に付随する、機械的、熱的および化学的ストレスを含まない、穏やかな、自己集合方法の利点を有する便利な送達ビヒクルを提供する。
【００６３】
別の特定の態様において、送達ビヒクルは、ハイドロゲルであり、抗ガン物質の持続的な放出送達のために包帯剤として、または、組織再生のための支持体として用いることができる。
【００６４】
ポリマーは、優れた膨張可能特性を有するように、および、ポリマー部分の架橋に利用可能な適切な基を有するように、および、非毒性で、生体適合性であり、かつある態様においては生体分解性であるように選択される。
【００６５】
ハイドロゲルの特定の態様において、ポリマーはアルデヒド誘導体化ヒアルロン酸もしくはヒアルロン酸アミノアセチルアルデヒドジエチルアセタール結合体などのヒアルロン酸の誘導体、または、アルデヒド誘導体化ヒアルロン酸もしくはヒアルロン酸アミノアセチルアルデヒドジエチルアセタール結合体のチラミン誘導体である。
【００６６】
ヒアルロン酸カテキンベースのフラボノイドを含む結合体は、フラボノイドの生物学的または薬理学的特性を破壊することなしに、容易に架橋してハイドロゲルを形成できる。このようなハイドロゲルはまた、ハイドロゲルが適用された部位にて細胞に抗ガン物質を放出するために、上述したような抗ガン物質を含む。
【００６７】
ヒアルロン酸-フラボノイド結合体を、例えば約1から約5、または、例えば約1のpHなどの酸性条件下で、ヒアルロン酸をカテキンベースのフラボノイドと反応させることにより合成する。ついで、例えば透析により、結合したポリマー-フラボノイドを精製し、その後、抗ガン物質および過酸化水素などの架橋剤と混合する。例えば西洋ワサビペルオキシダーゼなどの架橋触媒を添加し、ついで、ハイドロゲルをすばやく鋳型に注ぎ入れ、架橋反応が完了する前に所望の形状に形成する。例えば、ハイドロゲルを創傷被覆材としての適用に適したスラブに形成できる。
【００６８】
例えば、非架橋結合体を、抗ガン物質と共に、過酸化水素などの架橋剤、および、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼなどの架橋触媒とともに注入することによって、インビボで、ハイドロゲルの成分を注入し、反応させ、ハイドロゲルを形成することもできる。かかるハイドロゲルは、体内の特定部位への薬物送達、または、組織工学に有用である。
【００６９】
ヒアルロン酸は、結合反応の間にフラボノイドと反応できる複数の部位を有しているため、開始反応中のカテキンベースのフラボノイドの濃度を変えることにより、ヒアルロン酸ポリマーおよびカテキンベースのフラボノイド間の結合の度合いを変えることが可能である。例えば、得られる結合体が、フラボノイドと結合したポリマー上の約1%から約10%の部位を有するように、反応物質の比を調整できる。あるいは、ハイドロゲル中のポリマー分子のいくつかがフラボノイドに結合しないように、結合していないさらなるヒアルロン酸をハイドロゲルの架橋前に混合物に添加できる。
【００７０】
細胞への抗ガン物質の送達
フラボノイド含有送達ビヒクルを用いて細胞に抗ガン物質を送達するために、抗ガン物質を含む送達ビヒクルは、細胞と接触し、これにより、抗ガン物質の細胞への取り込みが可能となる。
【００７１】
それゆえ、細胞への抗ガン物質の送達は、抗ガン物質を含有する送達ビヒクルを細胞の表面と接触させることを含む。いずれの特定の理論に限定されることなく、送達システムは、細胞膜の脂質などの両親媒性分子により解離し、それゆえ、受動標的により細胞の部位にて抗ガン物質が放出され、細胞中に放出され得る。
【００７２】
抗ガン物質が送達される細胞は、任意の細胞であることができ、インビトロ細胞、培養中の細胞または対象内のインビボ細胞を含む。本明細書で用いる「細胞」という用語は、特記しない限り、単一細胞、複数の細胞、または、文脈が許可する細胞の集団を意味し、これらを含む。細胞は、対象から外植された細胞を含むインビトロ細胞であってもよく、または、対象中のインビボ細胞であってもよい。同様に、「細胞」の参照文献には、特記しない限り、文脈が許可する単一細胞の参照文献が含まれる。
【００７３】
細胞は、例えば人を含む哺乳動物を含む動物などの、任意の生物由来であることができる。
【００７４】
細胞に送達される時、上記したように抗ガン物質はその抗ガン機能を保持し、細胞中に送達される。当業者は、タンパク質検出方法、免疫アッセイおよび蛍光標識技術を含む、公知の方法および技術を用いて、細胞内に抗ガン物質が送達されたかどうかを容易に決定できる。
【００７５】
上記した組成物および送達ビヒクルは、カテキンベースのフラボノイドと一緒になった、対象の体内の特定の部位への抗ガン物質の制御されかつ標的を絞った送達に、非常に適している。フラボノイドは、標的部位にて、抗菌性、抗新生物性、抗血栓性、血管拡張性、酸化防止性、抗突然変異誘発性、抗発ガン性、高コレステロール血症、抗ウイルス性および抗炎症性活性を提供できる。加えて、送達ビヒクルは抗ガン物質を含み、そのため送達ビヒクルはガンの処置に有用である。例えば、サイトカインおよび成長因子を含む免疫調節性ペプチドおよびタンパク質は、ガンの治療のための薬物の重要なクラスとして、出現してきている。
【００７６】
それゆえ、抗ガン物質を対象に送達する方法であって、ポリマーがフラボノイドのA環のC6および/またはC8部位にて結合されている、遊離アルデヒドを含有するポリマーとカテキンベースのフラボノイドとの結合体を含む送達ビヒクルを投与する段階を含む方法が提供され、また、上述したように意図される。特定の態様において、結合体は、上記したようにミセルナノ複合体またはハイドロゲルなどの送達ビヒクル中に形成される。
【００７７】
対象は、抗ガン物質での治療を必要とするヒトを含む任意の動物である。
【００７８】
それゆえ、上記したような抗ガン物質およびフラボノイドを含有する送達ビヒクルを含む薬学的組成物が提供される。薬学的組成物は、薬学的に許容される希釈剤または担体をさらに含むことができる。薬学的組成物は、薬学的に許容される濃度の塩、緩衝剤、保存剤および種々の適合可能な担体を慣用的に含有することができる。送達のすべての形体用に、送達ビヒクルは生理食塩水中に処方されることができる。
【００７９】
薬学的に許容される希釈剤または担体の比率または同一性は、選択した投与経路、適当ならば生物学的に活性なタンパク質との適合性および標準的な薬学的実践により決定される。
【００８０】
薬学的組成物は、送達ビヒクルの有効量および単一もしくは複数の任意の付加的な活性物質を、薬学的に許容されるビヒクルと混合物中に混合するなどの、対象への投与に適した薬学的に許容される組成物の調製のための公知の方法により調製できる。送達ビヒクルの有効量を対象に投与する。本明細書で用いる「有効量」という用語は、例えば、対象中の標的細胞または細胞集団に抗ガン物質が送達されるための、所望の結果に達するために必要な投与量および期間で有効な量を意味し、抗ガン物質の効果、フラボノイドの効果、ならびに抗ガン物質およびフラボノイドを合わせた相乗効果を含む因子に基づく、細胞への抗ガン物質の所望な量を含む。
【００８１】
適当なビヒクルは、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA 1985)などに記載されている。これに基づき、組成物は、排他的ではないが、一つまたは複数の薬学的に許容されるビヒクルまたは希釈剤に関連し、かつ適当なpHでかつ生理的な液体と等浸透圧の緩衝剤溶液中に含まれる、送達ビヒクルの溶液を包含する。
【００８２】
保存および使用の通常の条件下で、このような薬学的組成物は、微生物の生育を防止するために保存剤を含有し、その結果、抗ガン物質の任意の生物学的活性が保持される。当業者にとって、適当な処方の調製方法は公知である。適当な処方の選択および調製のための通常の方法および成分は、例えば、1999年に発行されたRemington's Pharmaceutical Sciences and in The United States Pharmacopeia: The National Formulary (USP 24 NF19)に記載される。あるいは、送達ビヒクルを、保存剤の必要なしに、使用する直前に成分を混合することにより、処方することができる。
【００８３】
送達ビヒクルを、送達ビヒクルの形態に応じた公知の方法を用いて投与できる。非経口投与が好ましい。送達ビヒクルを溶液またはミセルナノ粒子の形態に処方した場合、送達ビヒクルは、静脈内、筋肉内を含む非経口的に、または、標的組織もしくは臓器への直接注入により送達できる。送達ビヒクルをハイドロゲルとして処方した場合、結合体を局所的に、または、創傷部位への外科的挿入により適用できる。
【００８４】
対象に投与される時、送達ビヒクルは、所望の結果に達するための投与量および十分な期間で有効な量で投与される。例えば、送達ビヒクルは、疾患もしくは障害を、緩和し、改善し、和らげ、回復し、安定させ、拡散を防ぎ、進行をゆっくりもしくは遅延させ、もしくは治療し、または、疾患関連酵素の活性を阻害し、減少させ、もしくは損なうように機能する抗ガン物質を送達するために必要な量および投与量で投与できる。疾患関連酵素は、代謝または生化学経路に関連する酵素であり、経路が妨げられると、または、酵素もしくは経路の調節制御が妨げられるかもしくは阻害されると、酵素の活性は、例えばガンなどの疾患または障害の開始もしくは進行に関連する。
【００８５】
対象に投与すべき送達ビヒクルの有効量は、抗ガン物質、ポリマー部分およびカテキンベースのフラボノイド部分を含む送達ビヒクルの薬力学的特性、投与様式、対象の年齢、健康および体重、障害または疾患状態の性質および程度、治療頻度およびもしあれば同時治療のタイプ、ならびに、送達ビヒクルの濃度および形態などの多くの因子に依存して変わり得る。
【００８６】
当業者は、上記の因子に基づいて適当な量を決定することができる。送達ビヒクルは、初めは、対象の臨床応答に応じて必要ならば調整可能な適当な量で、投与することができる。送達ビヒクルの有効量は、経験的に決定でき、安全に投与できる送達ビヒクルの最大量に依存する。しなしながら、投与される送達ビヒクルの量は、所望の結果を生じる最少量にするべきである。
【００８７】
抗ガン物質およびフラボノイドを包含する上記した送達ビヒクルもまた提供される。
【００８８】
細胞に抗ガン物質を送達するための上記した送達ビヒクルの使用、または、細胞が対象中のインビボ細胞である場合を含む、細胞に抗ガン物質を送達するための医薬の製造のための上記した送達ビヒクルの使用も提供される。
【００８９】
本発明をさらに以下の非限定的な実施例により説明する。
【００９０】
実施例
実施例1:緑茶誘導体で構成されるタンパク質付加ミセル複合体の相乗治療効果
材料および方法
OEGCGおよびPEG-EGCGの合成:
OEGCGをEGCG(Kurita Ltd.)およびアセトアルデヒド(pH2)のバイヤー(Baeyer)反応により合成した。PEG-EGCGを合成するため、アルデヒド末端化PEG(分子量5000、NOF Co.)およびEGCGをpH=2で反応させた。
【００９１】
ミセル複合体を、国際特許出願WO2006/124000および米国特許出願2008/102052にすでに記載されているように形成した。
【００９２】
細胞毒性試験:
EGCG誘導体の細胞毒性をヒト正常乳腺上皮細胞(HMEC、Cambrex、USA)を用いて調べ、無処置のEGCGの細胞毒性と比較した。96穴マイクロプレートに細胞を、試料および対照それぞれについて5通りおよび8通りで蒔き(乳腺上皮生育培地中1x104細胞/穴)、一晩付着させた。細胞を2日間、異なる濃度のEGCG、OEGCGまたはPEG-EGCGで処置した後、細胞のシトクロムC活性により減少する色素であるAlamar Blueを用いて細胞生存率を調べた。
【００９３】
タンパク質分解評価:
タンパク質分解を、蛍光分光計(Hitachi、Japan、λex= 490 nmおよびλem= 530 nm)を用いて、試料をプロテイナーゼK(0.05 mg/ml)に供した場合のFITC-BSAにおける蛍光強度の増加をモニタリングすることにより、決定した。すべての測定を三回行った。
【００９４】
ガン細胞増殖評価:
96穴マイクロプレートにSKBR-3細胞(ATCC、HTB3O、USA)を、試料および対照それぞれについて5通りおよび8通りで蒔き(McCoy's 5A培地中1x104細胞/穴)、一晩付着させた。次いで、培養培地を、試料(OEGCG、PEG-EGCG、ハーセプチン(0.5 mg/ml)、ハーセプチン付加ミセル複合体およびBSA付加ミセル複合体)を含む培地に置き換え、細胞を5%のCO2中、37℃にてインキュベートした。示した時間点で、培養培地を10%のAlamar Blue を含有するフェノールレッドを含まない培地に置き換えた。細胞増殖を、4時間のインキュベート後、570および600 nmでの色素の吸光度の減少から決定した。
【００９５】
結果
ミセル複合体を(i)適当な場合には関連するタンパク質(蛍光マーカータンパク質または抗ガン物質)との集合を含む、オリゴマー(-)-エピガロカテキン-3-O-ガラート(OEGCG)の集合、およびその後の、事前に形成したOEGCG(タンパク質が追加)複合体とポリ(エチレングリコール)(PEG)およびEGCGの結合体(PEG-EGCG)との集合を含む二段階自己集合工程;または(ii)PEGおよびOEGCGの結合体(PEG-OEGCG)(および適当な場合には関連するタンパク質)の集合を含む、一段階自己集合工程により合成した。両方の事例において、ミセル複合体は安定かつ高度に配向したミセル複合体として速やかに形成し、これは、穏やかな水溶液中での自発的自己集合を介して関連するタンパク質が付加されることを含み、OEGCG(タンパク質が追加)複合体から構成される内核を有するPEG外殻を示した。
【００９６】
OEGCGおよびEGCGがHMECに対し低い細胞毒性を示すのに対し、PEG-EGCGは細胞毒性をまったく示さなかった(図1参照)。ミセル複合体はその完全性を保ち、大きさの変化なしに血清の存在下で優れた安定性を示した(図2参照)。
【００９７】
ミセル複合体に蛍光標識タンパク質(FITC-BSA)を付加し、プロテアーゼ(プロテイナーゼK)に供して経時的にタンパク質分解を調べた(図3)。遊離FITC-BSAの蛍光強度は時間とともに大きく増加し、プロテイナーゼKによるタンパク質分解が示された。対照的に、ミセル複合体中に付加されたFITC-BSAの蛍光強度は非常に低いまま保持され(プロテイナーゼK非存在下での遊離FITC-BSAのものよりも低い)、タンパク質がこれらの系の中でタンパク質分解から強固に保護されていることを示した。
【００９８】
ガン細胞成長の阻害を、HER2-過剰発現転移性乳腺ガン腫瘍の退縮を誘導するHER2/neu(erB2)レセプターに対するヒト化モノクローナル抗体であるハーセプチン(トラスツズマブ)を付加したミセル複合体についてインビトロで調査した(図4)。ハーセプチン付加ミセル複合体は、1千倍希釈まで試験したところ、大きさの減少を示さなかった(図5)。SKBR-3(HER2-過剰発現ヒト乳腺ガン細胞系)を遊離ハーセプチンまたは担体成分(OEGCGまたはPEG-EGCG)のいずれかで処理した場合、細胞成長は阻害されることが観察された。BSAを付加したミセル複合体は、OEGCGまたはPEG-EGCG単独よりも高い阻害効果を示した(対して、BSAそのものは何ら効果を示さなかった)。特に、ハーセプチン付加ミセル複合体は、個々の送達された成分(OEGCG、PEG-EGCGまたはハーセプチン)およびBSA付加ミセル複合体と比較して、驚くような大きな阻害効果を示した。
【００９９】
ミセルナノ複合体の形成は主に疎水性相互作用により行われるので、複合体は界面活性剤の疎水性競合により解離する。複合体は、複合体が細胞に保持されている間、細胞膜の脂質などのバイオアンフィフィリック(bio-amphiphilic)分子との相互作用により徐々に解離して成分を放出することが可能であった。ミセル複合体は、治療効果を示す前にタイムラグを示し(図6)、すなわち、初期の時間点(例えば、10時間)においては何ら効果を示さず、一方、遊離タンパク質および個々の担体成分は、速やかに抗ガン効果を発揮し始めた。これにより、PEG外殻中にタンパク質が付加されたミセル複合体の構造的利点が示された。遅延型放出のほかに、ミセル複合体は、細胞との相互作用の結果である解離により、治療的分子(タンパク質および担体成分)の持続的な放出を提供した。これらの特徴は、担体が治療的活性を発揮する前に投与の部位から意図される標的部位まで移動する必要があるという事実に照らして、特に有用で有利である。
【０１００】
考察
核殻ミセルナノ複合体担体が、空間的に整った構造中でタンパク質と結合するように設計された2つのEGCG誘導体で合成された。これらの複合体は、水溶液中で自発的自己集合によりミセルナノ複合体を形成した(図1)。ミセルナノ複合体は、次の2つの自己集合工程により誘導された:(i)オリゴマー化EGCG(OEGCG)とタンパク質との複合体の形成による核の形成、および(ii)事前に形成した核を囲むポリ(エチレングリコール)-EGCG(PEG-EGCG)複合体の形成による殻の形成。得られたミセルナノ複合体は、OEGCG-タンパク質複合体の核を有するPEG殻を示した。この構造的特徴は、タンパク質免疫原性を減らし、急速な腎クリアランスと細網内皮系取り込みによるタンパク質のタンパク質分解とを防ぐように働くことができ、その結果、頻繁な注射または注入治療の必要性を減少させることができる。PEGの高度に水溶性な殻および調整された大きさ(<100 nm)は、血漿半減期を長くするだけでなく、増大した透過性および保持効果も提供し、これにより腫瘍ならびに感染および炎症の部位での選択的な蓄積がもたらされる。
【０１０１】
タンパク質に対するEGCGの親和性を、ミセル複合体に抗ガンタンパク質を付加するために利用した。タンパク質-付加複合体は、遊離タンパク質または担体それ自体よりも極めて大きな抗ガン効果を示した。このミセル系は、可変性フラボノイド誘導体化担体に関連する相乗的な治療効果および送達効果の利点を活用するように、様々な生物学的分子の改良された送達を提供する。
【０１０２】
実施例2:ハーセプチンを含有するミセル複合体によるBalb/ヌードマウスの処置
Balb/ヌードマウスに、以下のように腫瘍を誘導した。17β-エストラジオールペレット(0.72mg、60日放出)を皮下注射により各マウスに投与した。翌日、BT474細胞(8.1x106細胞/100uLのマトリゲル)の懸濁液を各マウスに皮下注射した。腫瘍が2週間で発達した。
【０１０３】
BT474細胞の注射から2週間後、マウスを、1ヵ月間にわたり1週間に2回、ハーセプチンを付加したミセルナノ複合体、ハーセプチン単独、または対照としてのPBSのうちの一つで静脈注射により処置した。治療レジメンの後、腫瘍サイズを評価した。結果を図7に示す。
【０１０４】
当業者に理解されるように、本明細書に記載した例示的態様に対して多くの改変が可能である。本発明は、特許請求の範囲に定義するように、すべてのそのような改変をその範囲内に包含することを意図する。
【０１０５】
本明細書中に引用したすべての文献は、完全に参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０６】
本発明の種々の態様が本明細書中に開示されるが、多くの調節および改変が、当業者の共通の一般的な知識にしたがって、本発明の範囲内で成されうる。そのような改変は、実質的に同じ方法で同じ結果を達成するための、本発明の任意の局面に対する公知の等価物の置き換えを含む。本明細書で用いるすべての技術的および科学的用語は、特記しない限り、当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【０１０７】
参考文献
0005612475.tif 000002
0005612475.tif 000003
0005612475.tif 000004
【図１】
0005612475.tif 000005
【図２】
0005612475.tif 000006
【図３】
0005612475.tif 000007
【図４】
0005612475.tif 000008
【図５】
0005612475.tif 000009
【図６】
0005612475.tif 000010
【図７】
0005612475.tif 000011