(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）〜（８）の形質を有し、下記（９）に示すコラーゲン分解酵素を産生し、
菌名が、シュワネラ・エスピー・ストレイン  Ｃ３５（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  Ｃ３５）であり、
独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターの受託番号が、ＮＩＴＥ  Ｐ−５２０である低温細菌。
（１）運動性の桿菌
（２）大きさは、３μｍ×１μｍ
（３）グラム陰性
（４）集菌時の菌体色は、赤色
（５）生育可能温度の範囲は、４〜３７℃
（６）最適生育温度の範囲は、２０〜３３℃
（７）好気的条件下で、硫化水素を産生しない
（８）１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、下記（ａ）に記載の塩基配列
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列
（９）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分子量が６０〜７２ｋＤａであり、
０〜５０℃の温度範囲でコラーゲン分解活性を有し、最適温度が２０〜４０℃の範囲にあり、
ｐＨ５〜９のｐＨ範囲でコラーゲン分解活性を有し、最適ｐＨがｐＨ６〜８の範囲にあり、
ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡおよび１，１０−フェナントロリン一水和物によって、コラーゲン分解活性が阻害され、
(7-メトキシクマリン-4-イル）アセチル-プロリル-ロイシル-グリシル-ロイシル-[Nβ-(2,4-ジニトロフェニル）-2,3-ジアミノプロピオニル]-アラニル-アルギニンアミドを分解するコラーゲン分解酵素
【請求項２】
請求項１記載の低温細菌由来の酵素であり、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分子量が６０〜７２ｋＤａであり、
０〜５０℃の温度範囲でコラーゲン分解活性を有し、最適温度が２０〜４０℃の範囲にあり、
ｐＨ５〜９のｐＨ範囲でコラーゲン分解活性を有し、最適ｐＨがｐＨ６〜８の範囲にあり、
ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡおよび１，１０−フェナントロリン一水和物によって、コラーゲン分解活性が阻害され、
(7-メトキシクマリン-4-イル）アセチル-プロリル-ロイシル-グリシル-ロイシル-[Nβ-(2,4-ジニトロフェニル）-2,3-ジアミノプロピオニル]-アラニル-アルギニンアミドを分解し、
ミオシン重鎖を分解しないコラーゲン分解酵素。
【請求項３】
請求項２記載のコラーゲン分解酵素を製造する方法であって、
請求項１記載の低温細菌を培養して、前記コラーゲン分解酵素を産生させる培養工程を有するコラーゲン分解酵素の製造方法。
【請求項４】
さらに、前記低温細菌の培養液から前記コラーゲン分解酵素を含む上清を回収する回収工程を有する請求項３記載のコラーゲン分解酵素の製造方法。
【請求項５】
酵素処理によって食肉を軟化させる軟化食肉の製造方法であって、
酵素として、請求項２記載のコラーゲン分解酵素を使用する軟化食肉の製造方法。
【請求項６】
０〜３７℃の温度条件下で前記酵素処理を行う請求項５記載の軟化食肉の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲン分解酵素を産生する低温細菌、コラーゲン分解酵素、その製造方法、およびその酵素を用いた軟化食肉の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食肉は、家畜や家禽類等の筋肉を食用に加工したものであり、主要なタンパク質摂取源として利用されている。しかし、家畜や家禽類等の筋肉には、スジ肉や乳用牛の肉のように、部位や飼育方法により肉質が硬いために、食肉として利用価値の低いものがある。このような硬い肉を軟らかくできれば、タンパク質資源として有効活用でき、咀嚼しやすい食品の開発等が可能になり、硬い肉の食肉としての商品価値を高められる。
【０００３】
一方、食肉に含まれるタンパク質は、ミオシンやアクチン等の筋原線維タンパク質、コラーゲン等の結合組織タンパク質、ミオグロビン等の筋形質タンパク質に大別できる。これらの中でも、筋原線維タンパク質の主成分であるミオシンやアクチンは、食肉のテクスチャー（軟らかさ、風味および多汁性）に関わるタンパク質である。また、結合組織タンパク質の主成分であるコラーゲンは、食肉の硬さに関わるタンパク質である。食肉の硬さは、アルドール縮合やシッフ塩基の形成による、コラーゲン分子間の架橋結合状態の複雑化および増大化が原因である。そこで、従来、食肉を軟らかくする方法（食肉軟化法）として、プロテアーゼ処理が汎用されてきた。前記プロテアーゼとしては、植物由来のパパイン、ブロメライン等が用いられている（非特許文献１）。しかしながら、前記プロテアーゼは、コラーゲンよりも、筋原線維タンパク質に対する基質特異性が高いため、筋原繊維タンパク質を優先的に分解してしまい、食肉のテクスチャーを損ねてしまう。また、前記プロテアーゼは、低温における酵素活性が低く、食肉の熟成や貯蔵を行う４℃以下の環境下では作用しない。したがって、低温条件下での前記プロテアーゼの利用は、多量の酵素が必要となり、効率が低く、かつ呈味も悪化する。また、酵素活性を有する３０℃付近での前記プロテアーゼの利用は、微生物が繁殖しやすく、安全性面からも好ましくない。
【０００４】
【非特許文献１】Ｐｒｕｓａ，Ｋ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．、１９８１、Ｖｏｌ．４６、ｐ．１６８４−１６８６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明の目的は、低温でコラーゲン分解活性を有し、コラーゲンを優先的に分解するコラーゲン分解酵素を産生する低温細菌、その産生されたコラーゲン分解酵素、その製造方法およびそれを用いた軟化食肉の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するために、本発明の低温細菌は、下記（１）〜（８）の形質を有し、下記（９）に示すコラーゲン分解酵素を産生し、菌名が、シュワネラ・エスピー・ストレイン  Ｃ３５（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  Ｃ３５）であり、
独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターの受託番号が、ＮＩＴＥ  Ｐ−５２０である。
（１）運動性の桿菌
（２）大きさは、約３μｍ×約１μｍ
（３）グラム陰性
（４）集菌時の菌体色は、赤色
（５）生育可能温度の範囲は、約４〜約３７℃
（６）最適生育温度の範囲は、約２０〜約３３℃
（７）好気的条件下で、硫化水素を産生しない
（８）１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、下記（ａ）または（ｂ）に記載の塩基配列
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列
（９）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分子量が６０〜７２ｋＤａであり、
約０〜約５０℃の温度範囲でコラーゲン分解活性を有し、最適温度が約２０〜約４０℃の範囲にあり、
ｐＨ約５〜約９のｐＨ範囲でコラーゲン分解活性を有し、最適ｐＨがｐＨ約６〜約８の範囲にあり、
ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡおよび１，１０−フェナントロリン一水和物によって、コラーゲン分解活性が阻害され、
(7-メトキシクマリン-4-イル）アセチル-プロリル-ロイシル-グリシル-ロイシル-[Nβ-(2,4-ジニトロフェニル）-2,3-ジアミノプロピオニル]-アラニル-アルギニンアミドを分解するコラーゲン分解酵素
【０００７】
本発明のコラーゲン分解酵素は、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分子量が６０〜７２ｋＤａであり、
約０〜約５０℃の温度範囲でコラーゲン分解活性を有し、最適温度が約２０〜約４０℃の範囲にあり、
ｐＨ約５〜約９のｐＨ範囲でコラーゲン分解活性を有し、最適ｐＨがｐＨ約６〜約８の範囲にあり、
ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡおよび１，１０−フェナントロリン一水和物によって、コラーゲン分解活性が阻害され、
(7-メトキシクマリン-4-イル）アセチル-プロリル-ロイシル-グリシル-ロイシル-[Nβ-(2,4-ジニトロフェニル）-2,3-ジアミノプロピオニル]-アラニル-アルギニンアミドを分解し、
ミオシン重鎖を分解しないコラーゲン分解酵素である。
【０００８】
本発明のコラーゲン分解酵素の製造方法は、本発明のコラーゲン分解酵素を製造する方法であって、本発明の低温細菌を培養して、前記コラーゲン分解酵素を産生させる培養工程を有する。
【０００９】
本発明の軟化食肉の製造方法は、酵素処理によって食肉を軟化させる軟化食肉の製造方法であって、酵素として、本発明のコラーゲン分解酵素を使用する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の低温細菌を用いれば、その培養によって容易に本発明のコラーゲン分解酵素を製造できる。そして、本発明のコラーゲン分解酵素を用いれば、低温条件下でも、少ない酵素量で、食肉の軟化が可能である。また、本発明のコラーゲン分解酵素を用いれば、コラーゲンに特異的に作用することから、食肉のテクスチャーを損ねずに、食肉を軟らかくすることができる。さらに、本発明のコラーゲン分解酵素を用いた軟化食肉の製造方法は、低温条件で実施できるため、例えば、微生物の繁殖を抑制でき、食品安全性に優れる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
一般に、低温細菌とは、高山、深海、冷蔵庫等の低温環境において増殖可能な細菌をいう。また、Ｍｏｒｉｔａらの定義（Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、１９７５、Ｖｏｌ．３９、ｐ．１４４−１６７）では、低温細菌は、最適温度が１５℃以下かつ生育上限温度が２０℃以下の好冷細菌（ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｅ）と、生育上限温度が２０℃以上の低温増殖細菌（ｐｓｙｃｈｒｏｔｒｏｐｈｉｃ）とに分類される。なお、本発明における低温細菌とは、前述の形質を有していればよい。
【００１２】
本発明の低温細菌は、菌名が、シュワネラ・エスピー・ストレイン  Ｃ３５（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ． ｓｔｒａｉｎ Ｃ３５）であり、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターの受託番号が、ＮＩＴＥ  Ｐ−５２０である。
【００１３】
本発明のコラーゲン分解酵素は、特に限定されず、例えば、本発明の低温細菌由来の酵素であってもよい。
【００１４】
本発明のコラーゲン分解酵素の製造方法は、特に限定されず、例えば、さらに、前記低温細菌の培養液から前記コラーゲン分解酵素を含む上清を回収する回収工程を有していてもよい。
【００１５】
本発明の軟化食肉の製造方法は、特に制限されないが、例えば、０〜３７℃の温度条件下で前記酵素処理を行うのが好ましい。
【００１６】
以下に、本発明について詳しく説明する。
【００１７】
＜低温細菌＞
本発明の低温細菌は、前記（１）〜（８）の形質を有し、前記（９）に示すコラーゲン分解酵素を産生する細菌であり、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−５２０のシュワネラ・エスピー・ストレイン  Ｃ３５（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ． ｓｔｒａｉｎ Ｃ３５）である。この菌体は、後述するように、本発明者らによって単離された新規の菌体であり、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−５２０で寄託されている。
【００１８】
本発明において、前記シュワネラ属（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）の種は、特に限定されず、例えば、シュワネラ・プトレファシエンス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）種、シュワネラ・バルティカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｂａｌｔｉｃａ）種等が挙げられる。また、前記シュワネラ属（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）の細菌は、前記シュワネラ属（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）の近縁種であってもよい。
【００１９】
本発明の低温細菌の生育可能温度は、前述のように、約４℃〜約３７℃の範囲であるが、これには制限されず、例えば、約−５℃〜約５０℃の範囲であってもよい。また、本発明の低温細菌は、これらの温度範囲外でも生育可能であってもよい。また、本発明の低温細菌の生育最適温度は、前述のように、約２０℃〜約３３℃の範囲であるが、これには制限されず、例えば、約１０〜約４０℃の範囲であってもよい。また、これらの温度範囲外においても、本発明の低温細菌は、生育最適性を示してもよい。
【００２０】
＜コラーゲン分解酵素＞
本発明のコラーゲン分解酵素は、前述の特性を有していればよく、その由来は、特に制限されないが、例えば、本発明の低温細菌由来の酵素が挙げられる。
【００２１】
本発明のコラーゲン分解酵素は、前述のように、０〜５０℃の温度範囲でコラーゲン分解活性を有する。すなわち、本発明のコラーゲン分解酵素は、一般的な冷蔵温度である２〜１０℃の温度範囲において、コラーゲン分解活性を有する。また、本発明のコラーゲン分解酵素は、氷温温度である０〜２℃の温度範囲内においても、コラーゲン分解活性を有する。なお、本発明のコラーゲン分解酵素は、これらの温度範囲外でも活性を有してもよい。
【００２２】
また、本発明のコラーゲン分解酵素は、例えば、５０℃以下で温度安定性を有し、また、６０℃以下でも温度安定性を有してもよい。このため、本発明のコラーゲン分解酵素は、例えば、前記温度範囲に一定時間維持された後にでも、尚、コラーゲン分解活性が残存する。
【００２３】
本発明のコラーゲン分解酵素は、例えば、二価カチオンの存在下で反応されることが好ましく、具体例としては、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋等が挙げられる。
【００２４】
前述のとおり、本発明のコラーゲン分解酵素のコラーゲン分解活性は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡおよび１，１０−フェナントロリン一水和物により阻害される。ただし、前記コラーゲン分解活性の阻害は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡおよび１，１０−フェナントロリン一水和物以外のプロテアーゼ阻害剤で生じてもよい。
【００２５】
本発明のコラーゲン分解酵素は、前述のように、(7-メトキシクマリン-4-イル）アセチル-プロリル-ロイシル-グリシル-ロイシル-[Nβ-(2,4-ジニトロフェニル）-2,3-ジアミノプロピオニル]-アラニル-アルギニンアミドを分解する。この基質は、例えば、MOCAc-Pro-Leu-Gly-Leu-A2pr(Dnp)-Ala-Arg-NH2（株式会社ペプチド研究所製）で表わされるが、以下、「ＰＬＧＬ(Ｄ)ＡＲ」という。前記ＰＬＧＬ(Ｄ)ＡＲは、蛍光合成基質であり、(7-メトキシクマリン-4-イル）アセチル基（MOCAc）は蛍光基、Nβ-(2,4-ジニトロフェニル）-2,3-ジアミノプロピオニル基（A2pr(Dnp)）は消光基である。そして、テトラペプチドPro-Leu-Gly-LeuのＣ末端側に、蛍光基MOCAcが、前記テトラペプチドのＮ末端側に、消光基A2pr(Dnp)を介して、ジペプチドAla-Argがそれぞれ結合している。本発明のコラーゲン分解酵素の前記ＰＬＧＬ(Ｄ)ＡＲに対する反応速度定数（ｋｃａｔ／Ｋｍ）は、特に限定されないが、例えば、１５０，０００〜２００,０００Ｍ−１・ｓ−１の範囲であってもよい。
【００２６】
本発明のコラーゲン分解酵素は、例えば、コラーゲン分解活性以外の酵素活性を有していてもよい。また、後述するような食肉の軟化に使用する場合、本発明のコラーゲン分解酵素は、例えば、ミオシンやアクチン等の筋原線維タンパク質に対する分解活性が低いことが好ましく、前記筋原線維タンパク質の分解活性を有さないことがより好ましい。
【００２７】
＜コラーゲン分解酵素の製造方法＞
本発明のコラーゲン分解酵素の製造方法は、特に限定されないが、例えば、前述のように、本発明の低温細菌を培養して、コラーゲン分解酵素を産生させることによって製造できる。
【００２８】
前記低温細菌の培養方法は、特に制限されず、従来公知の培養方法に基づいて、適宜実施できる。
【００２９】
前記低温細菌の培養に使用する培地の形態は、特に限定されず、例えば、固体培地、液体培地等、従来公知の培地を適宜使用できる。前記培地に含まれる成分は、特に限定されず、例えば、窒素源、糖類、塩類等が挙げられる。前記窒素源としては、特に限定されず、例えば、カゼイン、ゼラチン、魚由来タンパク質、豆由来タンパク質等のタンパク質が挙げられる。また、前記糖類は、特に限定されず、例えば、グルコース、スクロース、フルクトース、ラフィノース等が挙げられる。前記塩類も、特に限定されず、例えば、塩化ナトリウム、リン酸水素二カリウム、塩化マグネシウム等が挙げられる。前記培地は、例えば、市販培地を含んでもよい。前記市販培地としては、特に限定されず、例えば、トリプティックソイブロス（Ｄｉｆｃｏ社製）、Ｂａｃｔｅｒｉｏ−Ｎ  ＫＮ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ−Ｎ  ＫＳ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ−Ｎ  ＳＨ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ−Ｎ  ＰＦ（マルハ株式会社製）、ポリペプトン（和光純薬株式会社製）、ゼラチンペプトン（ナカライテスク株式会社製）等が挙げられる。これらは、一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。前記培地のｐＨは、特に限定されず、例えば、ｐＨ３〜１１の範囲、好ましくは、ｐＨ５〜８の範囲である。
【００３０】
前記低温細菌の培養方法は、特に制限されず、前記固体培地を用いた場合には、例えば、平板培養法、斜面培養法等が挙げられる。また、前記液体培地を用いた場合にも、特に限定されず、例えば、静置培養法、通気培養法、振とう培養法等が挙げられる。
【００３１】
培養温度は、特に限定されないが、例えば、前述した前記低温細菌の生育可能温度や、前記生育最適温度等が挙げられる。具体的には、例えば、−５〜５０℃の範囲、１０〜４０℃の範囲等で行うことができる。
【００３２】
前記低温細菌は、例えば、好気的条件下で培養してもよく、嫌気的条件下で培養してもよい。前記好気的条件または嫌気的条件は、特に制限されず、従来公知の方法を用いて設定できる。
【００３３】
本発明のコラーゲン分解酵素の製造方法は、例えば、さらに、コラーゲン分解酵素の回収工程等を有していてもよい。
【００３４】
前記回収工程は、特に制限されないが、本発明の低温細菌は、本発明のコラーゲン分解酵素を菌体外に放出することから、例えば、前記低温細菌を培養した培養液から本発明のコラーゲン分解酵素を含む上清（液体画分）を回収する工程を含んでもよい。前記上清の回収方法は、何ら制限されず、例えば、遠心分離やろ過等によって培養細菌を除去することによって、回収できる。前記遠心分離およびろ過処理は、従来公知の方法を用いて適宜実施でき、特に制限されない。
【００３５】
前記回収工程は、例えば、さらに、本発明のコラーゲン分解酵素を精製する工程を含んでもよい。酵素の精製は、例えば、部分精製でもよいし、完全な精製であってもよい。本発明のコラーゲン分解酵素の精製方法としては、特に制限されず、従来公知の手法を採用できる。具体例としては、例えば、塩析、限外ろ過、疎水性相互作用クロマトグラフィー、分子篩クロマトグラフィーおよびアフィニティクロマトグラフィー等のクロマトグラフィー、その他従来公知の精製手法が採用できる。本発明のコラーゲン分解酵素を精製する手法としては、一例として、塩析、疎水性相互作用クロマトグラフィー、および、分子篩クロマトグラフィーであるゲルろ過クロマトグラフィーを順次行う方法が挙げられるが、これには何ら制限されない。
【００３６】
本発明の製造方法に用いる菌体としては、特に限定されず、本発明の低温細菌の他に、例えば、本発明のコラーゲン分解酵素遺伝子を導入して形質転換させた微生物、植物細胞、動物細胞等も挙げられる。前記形質転換させる微生物および細胞は、特に限定されず、また、形質転換方法も、特に限定されず、遺伝子を導入する宿主の種類等に応じて、適宜決定できる。
【００３７】
＜軟化食肉の製造方法＞
本発明の軟化食肉の製造方法は、食肉の酵素処理に、本発明のコラーゲン分解酵素を使用することが特徴である。このため、本発明のコラーゲン分解酵素を使用する以外は、例えば、その他の工程や条件等は、何ら制限されない。
【００３８】
本発明の軟化食肉の製造方法において、前記コラーゲン分解酵素の形態は、特に限定されず、例えば、粉末状、酵素を溶解または分散した液体状等が挙げられる。
【００３９】
前記コラーゲン分解酵素の食肉への適用方法は、特に制限されず、例えば、塗布、注入、浸漬等が挙げられる。前記塗布方法としては、特に制限されず、例えば、前記コラーゲン分解酵素を、食肉表面に直接振りかけ、擦り込んでもよい。また、前記注入方法としては、特に制限されず、例えば、注射筒等を用いて、液体状のコラーゲン分解酵素を、食肉内に注入してもよい。そして、前記浸漬方法も、特に制限されず、例えば、本発明のコラーゲン分解酵素を含む溶液中に、前記食肉を浸漬してもよい。なお、前記食肉に対する前記コラーゲン分解酵素の酵素量は、特に制限されない。
【００４０】
前記酵素処理の温度は、特に限定されないが、例えば、０〜３７℃の範囲、好ましくは、０〜２０℃の範囲である。なお、前記酵素処理は、この温度範囲には限られず、例えば、０℃以下、例えば、−５〜０℃でも処理可能である。
【００４１】
前記酵素処理の日数は、特に限定されないが、例えば、１〜１０００日の範囲であり、好ましくは、１〜１０日の範囲である。
【００４２】
本発明において、酵素処理する食肉の種類は、特に限定されず、例えば、牛、豚、鶏、羊、鯨等の食用の獣肉およびその臓器、イカ、エビ、マグロ等の食用の魚肉およびその臓器等が挙げられる。前記食肉は、例えば、生肉、冷凍肉、加工肉であってもよく、特に限定されない。前記獣肉の部位は、特に限定されず、例えば、ネック、かた、ばら、ヒレ、リブロース、サーロイン、すねが挙げられる。前記臓器の部位も、特に限定されず、例えば、舌、心臓、横隔膜、アキレス腱、胃、腸、肝臓、子宮、精巣、卵巣、卵、皮等が挙げられる。本発明の軟化食肉の製造方法は、例えば、ローストビーフ等の加工肉、ソーセージのケーシングに用いる羊腸および豚腸等を軟化させ、高品質化する用途で用いることも可能である。
【実施例】
【００４３】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００４４】
（実施例１）
本例の低温細菌は、以下の手順により作製した。
【００４５】
（１）低温細菌の単離
まず、寒冷地の土壌サンプルおよび冷蔵庫中に長期間保存された食品（米飯、南瓜、もやし、栗皮シロップ）を準備した。前記土壌および食品サンプル各約０．５ｇに、生理食塩水（０．８８（ｗ／ｖ）％ＮａＣｌ）１ｍＬを加えて懸濁後、さらに、生理食塩水を加えて１×１０４〜１×１０６倍に希釈した。各希釈溶液を、常法により作製したトリプティックソイ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ製）に塗抹し、４℃で１０日間培養した。培養終了後、形成したコロニーを画線培養で単離した。
【００４６】
（２）コラーゲンゲル培地によるスクリーニング
まず、参考文献（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００３、Ｖｏｌ．５１、Ｎｏ．２７、ｐ．８０８８−８０９２）記載のコラーゲン調製方法に基づいて、豚皮から調製した酸可溶性コラーゲンを、酢酸溶液（ｐＨ４．０）に１０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、コラーゲン溶液を調製した。４５ｍｇ／ｍＬトリプティックソイブロス溶液および前記コラーゲン溶液を、ペトリ皿または９６ウェルプレート内で等量ずつ混合後、３７℃で１時間保温し、コラーゲンゲル培地を作製した。前記コラーゲンゲル培地を紫外線（２５４ｎｍ）に１時間照射して殺菌した。そして、前記コラーゲンゲル培地を４℃で一晩静置後、前記単離した低温細菌のコロニーから、少量の菌体をかき取り、前記コラーゲンゲル培地上に移し、４℃で３〜５日間培養した。培養終了後、前記コラーゲンゲル培地の変化を観察した。前記コラーゲンゲル培地を溶解し、透明に変化させた細菌を、本例の低温細菌とした。
【００４７】
下記表１に、本例の低温細菌のスクリーニング結果を示す。低温環境から採取した土壌および食品５５サンプルから、６９２コロニーの低温細菌を単離した。これらの単離した低温細菌の内、１０コロニーの低温細菌が、培養に用いたコラーゲンゲル培地を透明に液化させ、コラーゲン分解活性を示した。このうち、短期間で、最も広範囲にコラーゲンゲル培地を液化させた低温細菌を、Ｃ３５株とした。また、集菌した前記Ｃ３５の菌色は、赤色であった。
【００４８】
（表１）
採取源            サンプル数        細菌数        活性を有する細菌数
寒冷地域の土壌１          １７          １６９                ８
寒冷地域の土壌２          １０          １２０                ０
寒冷地域の土壌３            ５            ３０                ０
寒冷地域の土壌４            ７          ２３３                ２
寒冷地域の土壌５          １１          １２６                ０
冷蔵庫内の食品              ５            １４                ０        
合計                ５５          ６９２              １０
【００４９】
（３）位相差顕微鏡観察
前記Ｃ３５株を、位相差顕微鏡で観察するために、以下のようにして、寒天コートスライドグラスを作製した。まず、寒天粉末（和光純薬株式会社製）２．２ｇに、純水２００ｍＬを加えて１０分間混合後、寒天粉末を沈降させて上清を除去し、寒天に含まれる水溶性不純物を除去した。この除去工程を３回行った後、不純物を除去した寒天粉末に、純水１００ｍＬを加えて加熱し、寒天を溶解させた。得られた寒天溶液を、ピペットを用いてスライドグラス上に塗抹後、一晩乾燥させ、寒天コートスライドグラスを作製した。一方、本例の低温細菌を、水溶液中に懸濁し、菌体懸濁液を調製した。前記寒天コートスライドグラス上に、前記菌体懸濁液を滴下し、カバーガラスで覆い、倒立顕微鏡（ＥＣＬＩＰＳＥ  ＴＥ２０００−Ｕ、ニコン社製）により観察した。なお、前記観察に用いるレンズ倍率は、接眼レンズを１０倍、対物レンズを１００倍とした。
【００５０】
その結果、前記Ｃ３５株は、大きさが約３μｍ×約１μｍの桿菌であり、運動性を示すことが確認された。
【００５１】
（４）グラム染色観察
Ｃ３５株のグラム染色は、以下のようにして行った。まず、下記組成のクリスタルバイオレット液およびルゴール液を調製した。また、エタノールにサフラニンを２．５％の濃度で溶解させ、さらに純水で１０倍に希釈し、サフラニン溶液を調製した。
【００５２】
（クリスタルバイオレット液の組成）
成分                        配合量    
クリスタルバイオレット            ２ｇ
エタノール                      ２０ｍＬ
シュウ酸アンモニウム              ０．８ｇ
純水                            ８０ｍＬ  
【００５３】
（ルゴール液の組成）
成分                        配合量  
ヨウ素                            １ｇ
ヨウ化カリウム                    ２ｇ
純水                          ３００ｍＬ
【００５４】
前記寒天コートスライドグラス上に、前記菌体懸濁液を塗布し、乾燥させた。乾燥後、前記スライドグラスを、ガスバーナーの炎の上方を２〜３度通過させて、前記菌体懸濁液の水分を蒸発させ、菌体を前記スライドグラス上に固定させた。そして、前記スライドグラスに前記クリスタルバイオレット液を滴下し、固定した前記菌体を１分間染色した。つぎに、前記スライドグラスを水洗後、前記菌体に前記ルゴール液を１分間適用し、色素を不溶化させた。さらに、前記スライドグラスを水洗後、９５％エタノールを用いて脱色した。再度水洗し、風乾後、前記サフラニン溶液を滴下して１分間染色した。水洗および風乾後、グラム染色した菌体を、倒立顕微鏡（ＥＣＬＩＰＳＥ  ＴＥ２０００−Ｕ、ニコン社製）を用いて観察した。なお、前記顕微鏡のレンズ倍率は、接眼レンズを１０倍、対物レンズを１００倍とした。
【００５５】
前記Ｃ３５株をグラム染色した結果を図１に示す。その結果、前記Ｃ３５株は、赤色に染色され、グラム陰性菌であることが確認された。
【００５６】
（５）ＤＨＬ培地培養
ＤＨＬ寒天培地「ダイゴ」（日本製薬社製）６４ｇとグルコース１０ｇを精製水１Ｌに加熱溶解し、高圧蒸気滅菌後、ペトリ皿または９６ウェルプレートに分注して平板に固め、ＤＨＬゲル培地を作製した。前記単離した低温細菌のコロニーから、少量の菌体をかき取り、前記ＤＨＬゲル培地上に移し、２８℃で２日間培養した。培養後、コロニー色を目視観察し、硫化水素産生の有無を確認した。
【００５７】
ＤＨＬ培地を用いて培養した前記Ｃ３５株は、赤いコロニーを形成した。この結果から、前記Ｃ３５株は、好気的条件下では硫化水素を産生しないことが確認された。
【００５８】
（６）１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の解析
本例の低温細菌について、以下のようにして、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を解析した。
【００５９】
（６−ａ）ゲノムＤＮＡの抽出
まず、以下に示す組成のバッファー溶液、ＲＮａｓｅ溶液、ＣＴＡＢ／ＮａＣｌ溶液を調製した。また、クロロホルムとイソアミルアルコールを２４：１の割合で混合し、ＣＩ溶液を調整した。また、トリプティックソイブロス（Ｄｉｆｃｏ社製）３０ｇを精製水１Ｌに溶解し、トリプティックソイブロス培地を調製した。
【００６０】
（バッファー溶液の組成）
成分                                  濃度  
トリス塩酸バッファー溶液（ｐＨ８．０）  １０ｍＭ
ＥＤＴＡ                                  １ｍＭ
ＮａＣｌ                                  ５Ｍ
酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．２）          ３Ｍ  
【００６１】
（ＲＮａｓｅ溶液の組成）
成分                                  濃度        
トリス塩酸バッファー溶液（ｐＨ７．５）  １０ｍＭ
ＮａＣｌ                                １５ｍＭ
ＲＮａｓｅ（和光純薬株式会社）          １０ｍｇ／ｍＬ
【００６２】
（ＣＴＡＢ／ＮａＣｌ溶液の組成）
成分                                  濃度    
ＣＴＡＢ                              １０ｗ／ｖ％
ＮａＣｌ                                ０．７Ｍ  
【００６３】
本例の低温細菌を、前記トリプティックソイブロス培地を用いて、２８℃、１１０ｒｐｍ（往復）の条件で１２時間振とう培養した。培養後の培養液５００μＬをマイクロチューブに入れ、遠心分離後、上清を除去した。得られた菌体に、生理食塩水を１ｍＬ加えて懸濁し、遠心分離後、上清を除去する工程を３度行い、前記菌体を洗浄した。洗浄後の菌体に滅菌超純水を加え、−２０℃で凍結保存した。凍結保存した菌体懸濁液４０μＬを氷上で融解させ、前記バッファー溶液５６７μＬを添加した。さらに、１０ｗ／ｖ％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）３０μＬ、２０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ（和光純薬株式会社製）３μＬを加え、ボルテックス後、３７℃で１時間インキュベートした。
【００６４】
インキュベートした菌体懸濁液に、５Ｍ  ＮａＣｌを１００μＬ加え、ボルテックスして混合した。さらに、前記ＣＴＮＢ／ＮａＣｌ溶液８０μＬを加えて混合し、６５℃で１０分間インキュベートした。インキュベート後、等量の前記ＣＩ溶液を加え、２０秒間ボルテックスし、２５℃、２００００×ｇ（ｇは重力加速度（９．８０６６５ｍ／ｓｅｃ２）を表す。以下同じ。）の条件で５分間遠心分離した。上層の水層を採取し、等量の前記ＣＩ溶液を加えて、前記条件でさらに５分間遠心分離した。上層の水層を採取し、１．５倍容量のイソプロパノールを加え、室温で１０分間静置した。静置後、前記条件で１０分間遠心分離した。上清を除去し、沈殿したＤＮＡに７０ｗ／ｗ％エタノール１ｍＬを加え、混合後、さらに、４℃、２００００×ｇの条件で５分間遠心分離した。得られた沈殿物を遠心凍結乾燥機を用いて乾燥し、ゲノムＤＮＡを調製した。前記ゲノムＤＮＡを、前記バッファー溶液１００μＬに溶解し、前記ＲＮａｓｅ溶液１μＬを加え、３７℃で１時間インキュベートした。さらに、等量のＣＩ溶液を添加し、２０秒間ボルテックスした後、２５℃、２００００×ｇの条件で１５秒間遠心分離した。遠心分離後、上層の水層を採取して、別のチューブに移した。下層の沈殿物に、前記バッファー溶液１００μＬを加え、２０秒間ボルテックスした後、２５℃、２００００×ｇの条件で１５秒間遠心分離した。遠心分離後、上層の水層を採取し、前記別のチューブに移しておいた水層に加えた。得られた水層２００μＬに、３Ｍ  酢酸ナトリウム溶液２０μＬおよび１００％エタノール５００μＬを加えて混合し、室温で１０分間静置した。静置後、４℃、２００００×ｇの条件で１０分間遠心分離し、上清を除去した。得られた沈殿物に７０ｗ／ｗ％エタノール１ｍＬを添加して混合後、４℃、２００００×ｇの条件で５分間遠心分離した。上清を除去し、得られた沈殿物を乾燥し、前記バッファー溶液１００μＬに溶解してＤＮＡ溶液を調製した。前記ＤＮＡ溶液は、使用時まで−２０℃で凍結保存した。
【００６５】
（６−ｂ）アガロースゲル電気泳動
まず、以下に示す組成の泳動バッファーおよびローディングバッファーを調製した。
【００６６】
（泳動バッファー（×５０ＴＡＥ）の組成）
成分                              配合量      
トリス                              ２４２ｇ
酢酸                                  ５７．１ｍＬ
ＥＤＴＡ・２Ｎａ（２Ｈ２Ｏ）          １８．６ｇ    
上記三成分を混合し、純水で１０００ｍＬにメスアップした。
【００６７】
（ローディングバッファーの組成）
成分                                  配合量    
ブロモフェノールブルー                    ２５ｍｇ
キシレンシアノールＦＦ                    ２５ｍｇ
グリセロール                                ３ｍＬ
０．５Ｍ  ＥＤＴＡ水溶液（ｐＨ８．０）  １００μＬ
上記四成分を混合し、純水で１０ｍＬにメスアップした。
【００６８】
アガロース（ナカライテスク社製）に前記泳動バッファーを加えて加熱し、０．６％アガロースゲル溶液を調製した。前記アガロースゲル溶液を、５０〜６０℃まで冷却後、ゲルトレイとコームをセットしたゲル形成トレイに流し込んだ。アガロースゲルの固化後、コームを除去し、電気泳動槽（製品名「ジーニアス」、エスケーバイオ・インターナショナル株式会社製）に前記アガロースゲルをセットした。前記電気泳動槽に、アガロースゲル表面が浸漬する程度まで前記バッファー溶液を加えた。一方、前記ＤＮＡ溶液と前記ローディングバッファーを、５：１の割合で混合し、泳動サンプルを調製した。前記泳動サンプルを、ウェルに適用後、１００Ｖの電圧で、ブロモフェノールブルーがゲル長の７割程度移動するまで電気泳動した。
【００６９】
電気泳動後、アガロースゲルを、０．５μｇ／ｍＬのエチジウムブロマイド溶液に３０分間浸漬した。浸漬後、紫外線照射装置を用いて、アガロースゲルに３０２ｎｍの紫外線を照射し、デジタルカメラで撮影した。
【００７０】
（６−ｃ）１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の増幅
本例の低温細菌について、以下のようにして、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を解析した。
【００７１】
まず、抽出した前記ＤＮＡ溶液を用いて、ＰＣＲ反応を行った。前記ＰＣＲ反応において、ＤＮＡポリメラーゼには、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（登録商標、タカラバイオ株式会社製）を用い、プライマーには、以下のプライマーセット（配列番号２〜７）を用いた。また、ＰＣＲ反応は、サーマルサイクラーを用い、以下のＰＣＲ条件で行った。
【００７２】
（プライマーセット１）
フォワードプライマー  １６ｓ  Ｆ１−１：5´-agagtttgatcctggctcag-3´（配列番号２）
リバースプライマー  １６ｓ  ｒ３：5´-ttaccgcggctgctggc-3´（配列番号３）
【００７３】
（プライマーセット２）
フォワードプライマー  １６ｓ  Ｆ３：5´-gccagcagccgcggtaa-3´（配列番号４）
リバースプライマー  １６ｓ  ｒ４：5´-ccgtcaattcctttgagttt-3´（配列番号５）
【００７４】
（プライマーセット３）
フォワードプライマー  １６ｓ  Ｆ４：5´-aaactcaaaggaattgacgg-3´（配列番号６）
リバースプライマー  １６ｓ  ｒ１：5´-aaggaggtgatccagcc-3´（配列番号７）
【００７５】
（プライマーセット４）
フォワードプライマー  １６ｓ  Ｆ１−１：5´-agagtttgatcctggctcag-3´（配列番号２）
リバースプライマー  １６ｓ  ｒ１：5´-aaggaggtgatccagcc-3´（配列番号７）
【００７６】
（ＰＣＲ条件：反応液の組成）
配合物                                                配合量        
１０×Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ                      ２．５μＬ
ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）                  ２．０μＬ
フォワードプライマー（１０ｐＭ）                          １．２５μＬ
リバースプライマー（１０ｐＭ）                            １．２５μＬ
ＤＮＡ溶液（０．２８７５μｇ／ｍＬ）                      ０．３５μＬ
滅菌超純水                                              １５．４５μＬ
Ｅｘ  ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μＬ）  ０．２μＬ
ＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）                                      ２．０μＬ  
【００７７】
（ＰＣＲ条件：反応条件）
サイクル１：９４℃で３分間変性、５５℃で１分間アニーリング、７２℃で２分間伸長
サイクル２：９４℃で１分間変性、５５℃で１分間アニーリング、７２℃で２分間伸長
サイクル３：９４℃で１分間変性、５５℃で１分間アニーリング、７２℃で１０分間伸長
前記サイクル１を１回、前記サイクル２を３０回、前記サイクル３を１回の順に、ＰＣＲ反応を行った。
【００７８】
（６−ｄ）１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の精製
前記ＰＣＲ反応により増幅させたＤＮＡ断片を、０．６％アガロースゲル上で電気泳動した。アガロースゲル電気泳動は、アガロースゲル濃度を０．６％としたこと以外は、前述と同様にして行った。泳動後のアガロースゲルは、０．５μｇ／ｍＬエチジウムブロマイド溶液に３０分間浸漬後、３０２ｎｍの紫外線を照射しながら、目的のバンドを含むゲルを切り出した。切り出したゲルを、パラフィルム（登録商標、Ｐｅｃｈｉｎｅｙ  Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ社製）を用いて潰し、ＤＮＡ溶液を回収した。回収したＤＮＡ溶液と等量の前記ＣＩ溶液を加えてボルテックス後、４℃、２００００×ｇの条件で１分間遠心分離した。上層の水層を別のチューブに分取し、残った下層に前記バッファー溶液を等量加え、前記条件で１分間遠心分離した。得られた上層の水層を採取し、先に分取した水層に加えた。さらに、全量の１／１０量の３Ｍ  酢酸ナトリウムおよび３倍量の１００％エタノールを加え、−６０℃で１５分間静置後、前記条件で１５分間遠心分離した。遠心分離後、得られた沈殿物を、遠心凍結乾燥機により乾燥し、前記バッファー溶液８μＬに溶解させた。前記ＤＮＡ溶解液１μＬを、２％アガロースゲル上で電気泳動し、純度を確認した。前記アガロースゲル電気泳動は、アガロースゲル濃度を２％としたこと以外は、前述と同様にして行った。
【００７９】
（６−ｅ）ダイレクトシークエンス反応
前記ＤＮＡ溶解液および下記反応液を用いて、精製したＣ３５株由来ＤＮＡについてダイレクトシークエンス反応を行った。前記シークエンス反応には、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社製）を用いた。前記反応液におけるプライマーとしては、前記プライマーセット１を用いて増幅したＤＮＡには、前記プライマーセット１を用い、前記プライマーセット２を用いて増幅したＤＮＡには、前記プライマーセット２を用い、前記プライマーセット３を用いて増幅したＤＮＡには、前記プライマーセット３を用いた。前記シークエンス反応は、サーマルサイクラーを用い、以下に示す反応条件で行った。
【００８０】
（反応液組成）
配合物                    配合量    
ＤＮＡ溶解液                  ３μＬ
プライマー（１０ｐＭ）        ２μＬ
Ｐｒｅ−Ｍｉｘ※              ２．５μＬ
滅菌超純水                    ２．５μＬ
※Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１
【００８１】
（反応条件）
前記反応液を、９６℃で１分間処理（変性）した後、５℃で３０秒間（変性）、５０℃で１５秒間（アニーリング）および６０℃で４分間（伸長）を１セットとして合計３５セット繰り返し、さらに、４℃で冷却した。
【００８２】
前記シークエンス反応後、２０ｍｇ／ｍＬグリコーゲン溶液を１μＬ添加し、さらに全量の７０％濃度になるようエタノールを加え、−２０℃で一晩静置した。これを、４℃、２００００×ｇの条件で１５分間遠心分離後、回収した沈殿物に７０％エタノールを１ｍＬ加えて軽く混合し、前記条件で、再度遠心分離した。得られた沈殿物を遠心凍結乾燥機により乾燥させ、オートシークエンサー(ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１００−Ａｖａｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、アプライドバイオシステムズジャパン社製)により、塩基配列を調べた。
【００８３】
前記Ｃ３５株から抽出した１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡをアガロースゲル電気泳動した結果を、図２に示す。同図中のレーン１は、抽出したゲノムＤＮＡ、レーン２は、前記プライマーセット１を用いて増幅させたＤＮＡ断片、レーン３は、前記プライマーセット２を用いて増幅させたＤＮＡ断片、レーン４は、前記プライマーセット３を用いて増幅させたＤＮＡ断片、レーン５は、前記プライマーセット４を用いて増幅させたＤＮＡ断片の泳動結果である。さらに、レーン６〜９は、前記増幅したＤＮＡ断片の精製ＤＮＡを、電気泳動した結果である。レーン６は、前記レーン２の精製ＤＮＡ、レーン７は、前記レーン３の精製ＤＮＡ，レーン８は、前記レーン４の精製ＤＮＡ、レーン９は、前記レーン５の精製ＤＮＡを、それぞれ泳動した結果である。
【００８４】
前記レーン６〜８の精製ＤＮＡについて、前記プライマーセット１〜３を用いてダイレクトシークエンスを行い、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列（配列番号１）を決定した。前記部分配列の塩基長は、１５３６塩基であった。
【００８５】
前記１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列（配列番号１）について、日本ＤＮＡデータバンクの情報を基にＢＬＡＳＴ検索を行い、系統分析を行った結果を図３に示す。なお、図中の０．０１で示すバーは、全塩基配列の１％の誤差を示す。同図に示すように、前記Ｃ３５株は、シュワネラ属（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）に分類され、シュワネラ・プトレファシエンス（Ｓ.ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）、シュワネラ・ダブリュ３−１８−１（Ｓ.Ｗ３−１８−１）、シュワネラ・バルティカ（Ｓ.ｂａｌｔｉｃａ）の近縁種であった。前記Ｃ３５株を、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ. ｓｔｒａｉｎ Ｃ３５と命名した。
【００８６】
（実施例２）
本例では、前記Ｃ３５株の生育最適温度を確認した。
【００８７】
（培養）
前記Ｃ３５株を、前記トリプティックソイブロス培地を用いて、２８℃、１１０ｒｐｍ（往復）の条件で１２時間振とう培養した。得られたＣ３５株培養液を、前記トリプティックソイブロス培地２５ｍＬに加え、前記培地の６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６００）を０．３６０に調整した。前記吸光度を調整したＣ３５株培養液を六つ準備し、各々、所定温度（４、１０、２０、２８、３３、３７℃）、４時間、１１０ｒｐｍ（往復）の条件で振とう培養した。
【００８８】
（生育率の測定）
所定温度（４、１０、２０、２８、３３、３７℃）で培養した各Ｃ３５株培養液のＯＤ６００を、各々測定した。最もＯＤ６００値の高い温度条件の生育率を１００％として、各温度条件における相対生育率（％）を算出した。
【００８９】
各温度条件下におけるＣ３５株の相対生育率の結果を、下記表２および図４に示す。同グラフの横軸は、各培養液の培養温度（℃）であり、縦軸は、相対生育率（％）である。同グラフに示すように、前記Ｃ３５株の生育最適温度は、２８℃であった。また、前記Ｃ３５株は、４℃から３７℃の温度条件で、生育可能であった。
【００９０】
【表２】
0005515057.tif 000002
【００９１】
（実施例３）
本例では、前記Ｃ３５株を、種々の培地を用いて培養し、生育率を確認した。
【００９２】
（培地組成）
成分                  配合量    
基本培地                ２０．０ｇ
グルコース                ２．５ｇ
ＮａＣｌ                  ５．０ｇ
Ｋ２ＨＰＯ４              ２．５ｇ
純水                  １０００ｍＬ  
【００９３】
（基本培地）
基本培地（略称、製造会社）                  窒素源（タンパク質）の由来
トリプティックソイブロス（ＴＳＢ、Ｄｉｆｃｏ社）            カゼイン・動物
ポリペプトン（ＰＰ，和光純薬株式会社）                      カゼイン
ゼラチンペプトン（ＧＰ、ナカライテスク株式会社）            ゼラチン
Ｂａｃｔｅｒｉｏ−Ｎ  ＫＳ（ＫＳ、マルハ株式会社）          マグロ
Ｂａｃｔｅｒｉｏ−Ｎ  ＫＮ（ＫＮ、マルハ株式会社）          カツオ・マグロ
Ｂａｃｔｅｒｉｏ−Ｎ  ＳＨ（ＳＨ、マルハ株式会社）          ダイズ
Ｂａｃｔｅｒｉｏ−Ｎ  ＰＦ（ＰＦ、マルハ株式会社）          エンドウ
【００９４】
（培養）
前記表に示す培地を用いて、前記Ｃ３５株を、２８℃、１１０ｒｐｍ（往復）の条件で１２時間振とう培養した。得られたＣ３５株培養液を、前記培地を用いて、６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６００）が、１．０００となるように調整した。前記吸光度を調整したＣ３５株培養液５０μＬを、前記培地２５ｍＬに加え、４℃、１１０ｒｐｍ（往復）の条件で３日間振とう培養した。
【００９５】
（生育率の測定）
得られた各Ｃ３５株培養液について、ＯＤ６００を測定した。基本培地としてＴＳＢを用いた際のＯＤ６００値を生育率１００％とし、各例の相対生育率（％）を算出した。
【００９６】
各培養液の相対生育率（％）の算出結果を、下記表３および図５に示す。同図において、グラフの各バーは、基本培地の種類を示し、縦軸は、各培養液の相対生育率（％）を示す。同図に示すように、ＴＳＢを基本培地として用いた場合の生育率（１００％）に対し、ＧＰ、ＫＳおよびＫＮをそれぞれ用いた場合、２倍以上の高い生育率を示した。一方、ＰＰ、ＳＨおよびＰＦをそれぞれ基本培地として用いた場合、これらの生育率は、ＴＳＢを用いた場合の約２０％以下であった。これらの結果から、前記Ｃ３５株の生育に好ましい基本培地は、ＴＳＢ、ＧＰ、ＫＳおよびＫＮであることがわかった。
【００９７】
【表３】
0005515057.tif 000003
【００９８】
（実施例４）
本例では、種々の培地を用いてＣ３５株の培養を行い、コラーゲン分解活性を確認した。
【００９９】
（培養）
培養期間を９日間としたこと以外は、実施例３と同様にして、ＴＳＢ、ＰＰ、ＧＰ、ＫＳ、ＫＮ、ＳＨまたはＰＦを含む培地を使用して前記Ｃ３５株を培養した。
【０１００】
（コラーゲン分解活性測定）
得られた各Ｃ３５株培養液を遠心分離して。各上清を回収し、以下の手順で、コラーゲン分解活性を測定した。
【０１０１】
まず、下記表４および５に示す組成のコラーゲン基質液およびＳＤＳ溶液を調製した。下記コラーゲン基質液は、前記実施例１の（２）と同様に調製したコラーゲン溶液を使用して調製した。前記コラーゲン基質液３０μＬに、前記上清１０μＬを加え、２５℃で３時間インキュベートした。さらに、前記ＳＤＳ溶液８μＬおよびメルカプトエタノール２μＬを加え、１００℃で２分間加熱し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルを調製した。なお、コントロールとして、前記上清未添加のサンプルを準備した。
【０１０２】
（表４）コラーゲン基質液
成分                                                          配合量    
１０ｍｇ／ｍＬ  コラーゲン溶液                                      １０μＬ
１０ｍＭ  ＣａＣｌ２含有１０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５）  ２０μＬ
【０１０３】
（表５）ＳＤＳ溶液
成分                                        配合量        
ＳＤＳ                                          ２．５ｇ
グリセロール                                  １５ｍＬ
０．２％  ブロモフェノールブルー              １０ｍＬ
５０ｍＭ  トリス塩酸バッファー（ｐＨ６．７）  １０ｍＬ
ＴＥＭＥＤ（テトラメチルエチレンジアミン）      ０．０４６ｍＬ
純水                                            所定量        
計  ５０ｍＬ
【０１０４】
一方、上層ゲル濃度を４％、下層ゲル濃度を１１％とした、ポリアクリルアミドゲルを作製した。前記コントロールおよび前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルを、前記ポリアクリルアミドゲルに適用し、Ｌａｅｍｍｌｉ法により１２ｍＡで１２０分間電気泳動した。泳動終了後、ポリアクリルアミドゲルをＣＢＢ染色法により染色した。
【０１０５】
図６に、各Ｃ３５株培養液のコラーゲン分解活性を表す電気泳動の結果を示す。同図において、Ｃｔは、コントロール、ＴＳＢ、ＰＰ、ＧＰ、ＫＳ、ＫＮ、ＳＨおよびＰＦは、それぞれ、各基本培地を使用した培養液の上清についての結果である。コントロールレーンに見られる３つの太いバンドは、上から順に、コラーゲンのγ鎖、β鎖およびα鎖である。前記Ｃ３５株培養液が、コラーゲン分解活性を有する場合には、前記三つの鎖が分解されるため、各位置のバンドの発色が弱くなり、低分子側（図内下側）に別のバンドが確認される。同図に示すように、前記コラーゲン分解活性は、ＴＳＢ、ＫＮの順に、特に高い活性が見られた。その他の培地を用いた場合には、活性の高い順に、ＫＳ、ＰＦ、ＰＰ、ＧＰ、ＳＨにコラーゲン分解活性が見られた。
【０１０６】
（実施例５）
本例では、前記Ｃ３５株が産生するコラーゲン分解酵素を精製した。なお、各精製段階で得られた酵素サンプルは、つぎに示す手順により、タンパク質濃度およびコラーゲン分解活性を測定した。
【０１０７】
（タンパク質濃度の測定）
Ｌｏｗｒｙ法を用いてタンパク質濃度を測定した。基準のタンパク質は、牛血清アルブミンを用いた。得られたタンパク質濃度および各酵素液量から、各精製段階で得られた酵素サンプルの総タンパク質量（ｍｇ）を算出した。
【０１０８】
（コラーゲン分解活性の測定）
酵素サンプルについて、以下のようにして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によるポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。酵素サンプル１０μＬに、前記ＳＤＳバッファー８μＬを加え、１００℃で２分間加熱し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルを調製した。前記実施例４と同様にして、前記サンプルについて、電気泳動およびＣＢＢ染色を行った。得られたゲルを乾燥させ、ゲルをスキャンし、コラーゲンのバンド面積を、Ｉｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を用いて測定した。あわせて、酵素サンプル未添加のＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルをコントロールとし、同様に測定を行った。コラーゲンのβ鎖のバンド面積を１％減少させる酵素量を、コラーゲン分解活性１Ｕと定義し、下記式（１）に基づいて算出した。また、比活性は、下記式（２）に基づいて算出した。
【０１０９】
【数１】
0005515057.tif 000004
【０１１０】
【数２】
0005515057.tif 000005
【０１１１】
（１）Ｃ３５株の培養
前記Ｃ３５株を、前記ＴＳＢ培地を用いて、２８℃、１１０ｒｐｍ（往復）の条件で１２時間振とう培養した。得られたＣ３５株培養液０．５ｍＬを、前記ＴＳＢ培地２５０ｍＬに加え、４℃、１１０ｒｐｍ（往復）の条件で、８４時間振とう培養した。培養後、４℃、１０,０００×ｇの条件で１５分間遠心分離し、培養上清液を得た。前記培養上清液について、前述の方法を用いて、タンパク質濃度およびコラーゲン分解活性を測定した。
【０１１２】
前記培養上清液は、総タンパク質量が１３５４３．５４９ｍｇであり、４Ｕ／ｍｇの比活性を有した。
【０１１３】
（２）硫酸アンモニウムによる分画
前記培養上清液に、４０％濃度になるように硫酸アンモニウムを加え、０％−４０％飽和の沈澱物を除去した後、さらに、４５％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加え塩析させた。４℃、２００００×ｇの条件で１５分間遠心分離し、塩析した沈殿物（以下、「４０〜４５％塩析物」とする）を回収した。前記４０〜４５％塩析物を、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む１０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５）に溶解し、その溶解液を前記ＣａＣｌ２含有トリス塩酸バッファーで透析した。透析後、得られた透析液に、３０％濃度になるように硫酸アンモニウムを加え、０％−３０％飽和の沈殿物を除去した後、さらに、４０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて塩析させた。４℃、２００００×ｇの条件で１５分間遠心分離し、塩析した沈殿物（以下、「３０〜４０％塩析物」とする）を回収した。前記３０〜４０％塩析物を、前記ＣａＣｌ２含有トリス塩酸バッファーに溶解し、粗酵素液を得た。この粗酵素液について、前述の方法を用い、タンパク質濃度およびコラーゲン分解活性を測定した。また、前記４０〜４５％塩析物についても同様に、タンパク質濃度およびコラーゲン分解活性を測定した。
【０１１４】
塩析の結果、前記４０〜４５％塩析物は、総タンパク質量１０．８４７ｍｇ、比活性４３９Ｕ／ｍｇであった。また、さらに塩析させた３０〜４０％塩析物から得られた粗酵素液は、総タンパク質量１．７６１ｍｇ、比活性９７４Ｕ／ｍｇのコラーゲン分解活性であった。
【０１１５】
（３）疎水性相互作用クロマトグラフィーによる精製
前記粗酵素液に、１Ｍ濃度になるように硫酸アンモニウムを加え、ＨｉＴｒａｐ  Ｂｕｔｙｌ−Ｓ  ＦＦ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィーにより、さらに精製を行った。前記疎水性相互作用クロマトグラフィーにおいて、タンパク質の溶出操作、２８０ｎｍにおける吸光度の測定、および伝導度の測定は、ＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０Ｓ(ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製)を用いて行った。前記タンパク質の溶出は、以下に示す溶出バッファーおよび溶出条件を用いて行った。
【０１１６】
（溶出バッファー）
（Ａ）：１Ｍ硫酸アンモニウム、および
１０ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む１０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５）
（Ｂ）：１０ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む１０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５）
【０１１７】
（溶出条件）
カラムサイズ（ゲル容量）：１ｃｍ３
濃度勾配：溶出バッファー（Ａ）１００％から溶出バッファー（Ｂ）１００％へのグラジエントで、合計１０ｍＬで溶出
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
分画量：１ｍＬ
【０１１８】
（タンパク質精製度の確認）
得られた各フラクションについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法を用いてタンパク質の精製度を確認した。まず、各フラクション１００μＬを遠心濃縮器で濃縮した濃縮フラクション１０μＬに、前記ＳＤＳバッファー８μＬを加え、１００℃で２分間加熱し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルを調製した。そして、前記実施例４と同様にして、前記サンプルについて電気泳動を行った。泳動終了後、ゲルを銀染色法により染色した。
【０１１９】
（タンパク質濃度およびコラーゲン分解活性の測定）
得られた各フラクションについて、前述の方法を用いて、タンパク質濃度およびコラーゲン分解活性を測定した。
【０１２０】
疎水性相互作用クロマトグラフィーによるタンパク質溶出パターンおよび各フラクションのコラーゲン分解活性のチャートを、図７に示す。同図において、△のプロットは、２８０ｎｍにおけるフラクションの吸光度であり、溶出されたタンパク質量を示し、○のプロットは、コラーゲン分解活性であり、□のプロットは、溶出バッファーの伝導率である。その結果、図７に示すように、フラクション１〜８のうち、フラクション２〜８に、コラーゲン分解活性が見られた。また、フラクション１〜８のタンパク質精製度を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を、図８に示す。同図において、レーンＭは、分子量マーカー、レーン１からレーン８は、順に、フラクション１からフラクション８の電気泳動結果を示す。その結果、図８に示すように、分子量７０ｋＤａの位置に、前記フラクション２〜８に共通するバンドが見られた。さらに、他のフラクションに比べ、フラクション５〜８の精製度が高かった。そこで、前記フラクション５〜８を回収し、次のゲルろ過クロマトグラフィーに用いた。前記フラクション５〜８の分画物は、総タンパク質量０．３１６ｍｇ、比活性１．７２×１０３Ｕ／ｍｇであった。
【０１２１】
なお、図示しないが、塩析工程の途中で得られた前記４０〜４５％塩析物についても、前記粗酵素液（３０〜４０％塩析物）と同様に疎水性相互作用クロマトグラフィーを行った。その結果、粗酵素液の図８の結果と比較して、前記タンパク質の溶出位置が、溶出バッファーの硫酸アンモニウム低濃度側（低伝導率側）に移動した。この移動は、前記４０〜４５％塩析物には、Ｃａ２＋が含まれないことが原因と考えられる。すなわち、前記粗酵素液（３０〜４０％塩析物）の精製では、Ｃａ２＋が酵素に作用し、分子表面の疎水性が増大していると推測される。また、Ｃａ２＋の存在下では、コラーゲン分解酵素が安定した活性を示した。哺乳類の生体内に存在するコラーゲン分解酵素であるマトリクスメタロプロテナーゼ（ＭＭＰ）では、Ｃａ２＋による酵素の立体構造保持および基質との結合促進による酵素活性の増強が知られている（Ａｒｃｈｉｖｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、１９７６、Ｖｏｌ．１７３、ｐ．３５５−３６１）。すなわち、前記Ｃａ２＋に対するＣ３５株由来コラーゲン分解酵素の挙動は、前記マトリクスメタロプロテナーゼ（ＭＭＰ）と類似している。
【０１２２】
（４）ゲルろ過クロマトグラフィーによる精製
前記工程で回収したコラーゲン分解活性を有するフラクション５〜８を、分画分子量１０００のウルトラフィルターユニット（製品名「ＵＳＹ−１」、東ソー株式会社製）により濃縮し、濃縮酵素液２００μＬを得た。ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＳｕｐｅｒＳＷ３０００（東ソー株式会社製）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより、前記濃縮酵素液を精製した。前記ゲルろ過クロマトグラフィーにおいて、タンパク質の溶出操作は、ＨＰＬＣ−ｓｙｓｔｅｍ（日本分光株式会社製）を用い、以下に示す条件で行った。得られた各フラクションについて、２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０１２３】
（溶出条件）
カラムサイズ（ゲル容量）：２０ｃｍ３
溶出バッファー：０．１Ｍ  Ｎａ２ＳＯ４、および
１０ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む０．１Ｍトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５）
流速：０．３５ｍＬ／ｍｉｎ
【０１２４】
吸光度ピークが確認されたフラクションについて、疎水性相互作用クロマトグラフィーと同様にして、タンパク質精製度の確認、タンパク質濃度およびコラーゲン分解活性の測定を行った。
【０１２５】
前記ゲルろ過クロマトグラフィーによるタンパク質の溶出パターンの結果を、図９に示す。同図に示すように、高い吸光度を示す三つのピーク（ピーク１〜３）が得られた。これらのピークのうち、ピーク１および３にはコラーゲン分解活性が確認されず、ピーク２には同活性が確認できた。前記ピーク２のタンパク質精製度の確認結果を、図１０に示す。同図において、レーン１が分子量マーカーであり、レーン２がピーク２の結果である。同図に示すように、レーン２においては、分子量約７０ｋＤａの位置に一本のバンドが確認された。この結果から、Ｃ３５株由来のコラーゲン分解酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分子量約７０ｋＤａのタンパク質であることが確認できた。前記ピーク２の酵素液は、総タンパク質量０．１６９ｍｇ、比活性８７９Ｕ／ｍｇであった。
【０１２６】
下記表６に、前記Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素の各精製工程において得られた酵素サンプルについて、総タンパク質量（ｍｇ）、コラーゲン分解活性（Ｕ）、比活性（Ｕ／ｍｇ）、精製度（倍）および収率（％）をあわせて示す。精製度（倍）は、培養上清の比活性を１とした場合の、相対値として求めた。収率（％）は、培養上清のコラーゲン分解活性（Ｕ）を１００％とした場合の、相対割合（％）として求めた。同表に示すように、前述の精製工程によって、最終的に、０．０６４％の収率で、精製度５２倍のコラーゲン分解酵素を得た。
【０１２７】
【表６】
0005515057.tif 000006
【０１２８】
（実施例６）
実施例５で得られたＣ３５株由来コラーゲン分解酵素について、蛍光合成基質を用いて、基質特異性、最適温度、最適ｐＨ、温度安定性、各種プロテアーゼ阻害剤によるコラーゲン分解活性への影響、酵素反応速度、筋肉タンパク質に対する作用を確認した。
【０１２９】
（１）基質特異性の測定
コラーゲン分解酵素の基質となりうることが報告されている、下記２種類の合成基質を用いて、Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素の基質特異性を確認した。まず、コラーゲン分解活性を測定するため、合成基質を含む測定用試薬を調製した。具体的に、前記測定用試薬は、合成基質を０．０４ｍＭとなるように溶解したＤＭＳＯ  ５０μＬと、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２および０．０５％Ｂｒｉｊ−３５を含有する０．１Ｍトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５）８００μＬとを混合して調製した。前記合成基質としては、前述のＭＯＣＡｃ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａ２ｐｒ(Ｄｎｐ)−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＮＨ２（株式会社ペプチド研究所製）およびＧｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ.Ｔｏｓ（株式会社ペプチド研究所製）を使用した。前者は、前述のＰＬＧＬ(Ｄ)ＡＲである。ＰＬＧＬ(Ｄ)ＡＲは、ＭＯＣＡｃ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａ２ｐｒ(Ｄｎｐ)間が分解されることによって発光する。また、後者は、以下、ｐＮＡＴＯｓとする。後者は、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ.Ｔｏｓが分解されることによって発色する。そして、前記各測定用試薬に、前記Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素を加え、２５℃で３０分間インキュベートして酵素反応を行った。インキュベート後、この反応液に、さらに０．１Ｍ  ＥＤＴＡ１００μＬを添加して反応を停止させ、測定液を得た。前記ｐＮＡＴＯｓを含む前記測定液については、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。また、前記ＰＬＧＬ(Ｄ)ＡＲを含む前記測定液については、分光蛍光光度計(Ｆ−２５００、ＨＩＴＡＣＨＩ)を用いて、励起波長３２８ｎｍ、吸収波長３９３ｎｍの条件で、蛍光強度を測定した。また、コントロールとして、前記Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素を未添加とした以外は、同様にして酵素反応ならびに蛍光強度または吸光度の測定を行った。そして、前記測定液の蛍光強度または吸光度から、コントロールの対応する値を差し引いて、真の蛍光強度または吸光度を算出した（以下、同様）。
【０１３０】
その結果、ｐＮＡＴＯｓを含む測定液には発色が観察されず、Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素は、ｐＮＡＴＯｓには作用しないことがわかった。一方、ＰＬＧＬ（Ｄ）ＡＲを含む測定液には蛍光が観察され、Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素は、ＭＯＣＡｃ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａ２ｐｒ(Ｄｎｐ)に作用することが確認できた。
【０１３１】
（２）最適温度の測定
酵素反応のインキュベート温度を、所定温度（０、４、１０、２０、２５、３０、４０、５０℃）とし、蛍光合成基質としてＰＬＧＬ（Ｄ）ＡＲを使用した以外は、前記（１）基質特異性の測定と同様にして、測定用試薬の調製、蛍光強度の算出を行った。そして、算出した蛍光強度のうち、最も高い蛍光強度を相対活性率１００％として、各測定液の蛍光強度の相対値（％）を求めた（以下、同様）。
【０１３２】
種々の温度条件における、前記Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素のコラーゲン分解活性を、下記表７および図１１に示す。同図に示すように、前記Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素は、０〜５０℃の温度範囲で、コラーゲン分解活性を示した。前記Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素が、最も高いコラーゲン分解活性を示す最適温度は、３０℃であった。例えば、市販コラーゲン分解酵素のコラゲナーゼＮ−２（新田ゼラチン株式会社製）の最適温度は、同社の報告によると、３７℃である。すなわち、前記Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素の最適温度は、市販の前記コラゲナーゼＮ−２と比較して低いことがわかった。また、０℃における前記相対活性率は、６．４％であり、４℃における前記相対活性率は、７．３％であった。この結果から、Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素によれば、一般的な冷蔵貯蔵の温度範囲においてもコラーゲン活性を有することがわかった。
【０１３３】
【表７】
0005515057.tif 000007
【０１３４】
（３）温度安定性の測定
酵素反応のインキュベート温度を、所定温度（０、１０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０℃）とし、蛍光合成基質としてＰＬＧＬ（Ｄ）ＡＲを使用した以外は、前記（１）基質特異性の測定と同様にして、測定用試薬の調製、蛍光強度の算出を行った。そして、算出した蛍光強度のうち、最も高い蛍光強度を相対活性率１００％として、各測定液の蛍光強度の相対値（％）を求めた（以下、同様）。
【０１３５】
前記Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素の温度安定性の測定結果を、図１２に示す。同図に示すように、前記Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素は、３０℃以下の温度範囲で、高い温度安定性を有した。また、前記Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素は、５０℃までは活性が残存し、６０℃で完全に失活した。
【０１３６】
（４）最適ｐＨの測定
前記測定試薬の調製において、０．１Ｍ  トリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５）に代えて以下に示す各バッファーを使用し、蛍光合成基質としてＰＬＧＬ（ｄ）ＡＲを使用した以外は、前記（１）基質特異性の測定と同様にして、測定用試薬の調製、蛍光強度の算出を行った。そして、算出した蛍光強度から、前述と同様にして相対活性率を求めた。
【０１３７】
（バッファー）
ｐＨ    ：                種類                    
ｐＨ５  ：０．１Ｍ  酢酸ナトリウム／酢酸バッファー
ｐＨ６  ：０．１Ｍ  酢酸ナトリウム／酢酸バッファー
ｐＨ６  ：０．１Ｍ  ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨバッファー
ｐＨ７  ：０．１Ｍ  ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨバッファー
ｐＨ７  ：０．１Ｍ  トリス塩酸バッファー
ｐＨ８  ：０．１Ｍ  トリス塩酸バッファー
ｐＨ９  ：０．１Ｍ  トリス塩酸バッファー
【０１３８】
種々のｐＨ条件における、前記Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素のコラーゲン分解活性を、図１３に示す。同図に示すように、ｐＨ５〜９のｐＨ範囲において、前記Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素は、コラーゲン分解活性を示した。前記Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素が、最も高いコラーゲン分解活性を示す最適ｐＨは、ｐＨ７であった。この結果から、前記Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素は、中性のコラーゲン分解酵素であるといえる。
【０１３９】
（５）プロテアーゼ阻害剤の影響
プロテアーゼ阻害剤が、Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素のコラーゲン分解活性に与える影響を測定した。前記プロテアーゼ阻害剤として、下記表８記載の各種阻害剤を使用した。まず、阻害剤をＤＭＳＯに溶解して、阻害剤溶液を調製した。この阻害剤溶液を、阻害剤の最終濃度が下記表に示す濃度、ＤＭＳＯの最終濃度が２．５％となるように、蛍光合成基質ＰＬＧＬ（Ｄ）ＡＲを含む前記測定用試薬に添加した。また、コントロールとしては、前記阻害剤が無添加であり、ＤＭＳＯを終濃度２．５％で含む前記測定用試薬を調製した。このように前記測定用試薬に前記阻害剤溶液を添加した以外は、前記（１）基質特異性の測定と同様にして、測定用試薬の調製、蛍光強度の算出を行った。そして、算出した蛍光強度から、前述と同様にして相対活性率を求めた。
【０１４０】
【表８】
0005515057.tif 000008
【０１４１】
各プロテアーゼ阻害剤存在下における、前記Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素の相対活性率の測定結果を、下記表９に示す。同表に示すように、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡおよび１，１０−フェナントロリン一水和物の適用により、前記Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素の相対活性率は、それぞれ、４．６％、７．７％および２３％に減少した。このように、前記Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素は、メタロプロテアーゼ阻害剤である前記ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡおよび１，１０−フェナントロリン一水和物により阻害されたことから、前記Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素は、メタロプロテアーゼであることが示唆される。
【０１４２】
【表９】
0005515057.tif 000009
【０１４３】
（６）酵素反応速度の解析
基質として、前記ＰＬＧＬ(Ｄ)ＡＲを使用し、所定濃度（０．３２、０．１６、０．０８、０．０４、０．０２、０．０１、０．００５、０．００２５ｍＭ）となるように調製した以外は、前記（１）基質特異性の測定と同様にして、測定用試薬の調製を行った。前記Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素の最終濃度を１．３３６μｇ／ｍＬとした以外は、前記（１）基質特異性の測定と同様にして、酵素反応による生成物ＭＯＣＡｃ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙの蛍光強度を測定した。そして、予め作成したＭＯＣＡｃ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙの濃度と蛍光強度との関係を示す検量線を用いて、前述の測定値から、酵素反応により生成した生成物の濃度を算出した。なお、前記ＭＯＣＡｃ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙの基準物質には、(7-メトキシクマリン-4-イル）アセチル-プロリル-ロイシル-グリシン（ＭＯＣＡｃ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、株式会社ペプチド研究所製）を用いた。そして、下記式（３）を用いて、各基質濃度における反応速度（ｍＭ／ｍｇタンパク質・分）を算出し、得られた反応速度から、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットを作成した。得られた直線式の傾きおよび切片から、Ｋｍ、Ｖｍａｘを算出し、さらに、ｋｃａｔおよびｋｃａｔ／Ｋｍを算出した。
【０１４４】
【数３】
0005515057.tif 000010
【０１４５】
前記ＰＬＧＬ(Ｄ)ＡＲを基質としたときの、前記Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素の酵素反応速度を示すグラフを、図１４に示す。同図において、横軸は、基質濃度（ｍＭ）であり、縦軸は、反応速度（ｍＭ／ｍｇタンパク質・分）である。また、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットを図１５に示す。さらに、前記Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素と他の酵素のＫｍ、ｋｃａｔ、ｋｃａｔ／Ｋｍの比較結果を、下記表１０に示す。前記他の酵素としては、アルメリシン（Ａｌｍｅｌｙｓｉｎ）、ビメリシン（Ｖｉｍｅｌｙｓｉｎ）およびサーモリシン（Ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ）を列挙した。前記アルメリシンおよび前記ビメリシンは、低温で活性を有するメタロプロテナーゼであり、前記サーモリシンは、耐熱性タンパク質分解酵素である。これらの他の酵素は、既に同じ温度条件によるデータが報告されている。前記アルメリシンのデータは、シバタらの報告（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９７、Ｖｏｌ．６１、Ｎｏ．４、ｐ．７１０−７１５）から引用し、前記ビメリシンおよびサーモリシンのデータは、タカハシらの報告（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９９２、Ｖｏｌ．２９４、ｐ．２６３−２６６）から引用した。下記表に示すように、前記Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素のｋｃａｔ／Ｋｍは、ビメリシンおよびサーモリシンよりやや大きく、アルメリシンよりかなり大きい値であった。この結果から、前記基質に対する前記Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素の触媒効率は、他の酵素より高いことがわかった。
【０１４６】
【表１０】
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【０１４７】
（７）筋肉タンパク質（コラーゲン）に対する作用
前記Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素および市販のタンパク質分解酵素を、コラーゲンと反応させ、前記各酵素のコラーゲンに対する分解活性を測定した。前記市販のタンパク質分解酵素としては、以下に示す３種類を使用した。
【０１４８】
（市販のタンパク質分解酵素）
コラゲナーゼＮ−２（ストレプトマイセス・パブラス由来、新田ゼラチン株式会社製）
コラゲナーゼＧＲＡＤＥＩＩ（クロストリジウム・ヒストリティキュム由来、和光純薬株式会社製）
パパイン（シグマ社製）
【０１４９】
実施例４と同じコラーゲン基質液３０μＬに、０．０１ｍｇ／ｍＬの各酵素液１０μＬを添加し、２５℃で１時間、または、４℃で２４時間反応させた。パパインは、パパイン粉末０．０１ｍｇを、予め、５ｍＭ  Ｌ−システインを含む２ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液１ｍＬと混合し、３７℃で１５分間インキュベートして活性化したものを、前記酵素液として使用した。そして、得られた各反応液に、前記表５記載のＳＤＳ溶液８μＬおよびメルカプトエタノール２μＬを添加し、１００℃で２分間加熱して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルを調製した。そして、各ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルを、前記実施例４と同様にして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色を行った。
【０１５０】
コラーゲンに対する各酵素の分解活性を表す電気泳動写真を図１６に示す。同図において、各レーンは、下記表１１に示すとおりである。同図に示すように、４℃で２４時間反応させた場合、Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素は、コラーゲンを強く分解した。これに対して、市販のパパイン、コラゲナーゼＮ−２およびコラゲナーゼＧＲＡＤＥＩＩは、低い分解活性であった。また、２５℃で１時間反応させた場合も、４℃で２４時間反応させた場合と同様の結果であった。
【０１５１】
（表１１）
レーン番号    反応温度    反応時間          反応に用いた酵素            
１          ４℃      ２４時間    コントロール（酵素なし）
２          ４℃      ２４時間    パパイン
３          ４℃      ２４時間    コラゲナーゼＮ−２
４          ４℃      ２４時間    コラゲナーゼＧＲＡＤＥＩＩ
５          ４℃      ２４時間    Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素
６        ２５℃        １時間    パパイン
７        ２５℃        １時間    コラゲナーゼＮ−２
８        ２５℃        １時間    コラゲナーゼＧＲＡＤＥＩＩ
９        ２５℃        １時間    Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素    
【０１５２】
（８）筋肉タンパク質（アクトミオシン）に対する作用
前記Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素をアクトミオシンと反応させ、前記各酵素のアクトミオシンに対する分解活性を測定した。具体的には、コラーゲンに代えて、アクトミオシンを用いて前記基質液を調製した以外は、前記（７）筋肉タンパク質（コラーゲン）に対する作用の測定と同様にして行った。なお、アクトミオシンは、参考文献（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８６、Ｖｏｌ．５１、Ｎｏ．４、ｐ．９４６−９５０）に基づいて、自家製造したものを用いた。
【０１５３】
前記４種類の各酵素のアクトミオシンに対する分解活性を示す電気泳動写真を図１７に示す。同図において、各レーンは、前記表１１と同様である。同図に示すように、４℃で２４時間反応させた場合、全ての酵素について、分解物をほとんど確認できなかった。一方、２５℃で１時間反応させた場合、パパインは、アクトミオシンを分解し、特にミオシン重鎖を強く分解した。一方、Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素、コラゲナーゼ  Ｎ−２およびコラゲナーゼ  ＧＲＡＤＥＩＩは、２５℃においても、分解物がほとんど確認できなかった。
【０１５４】
前記（７）および（８）の結果に示すように、前記Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素は、筋肉タンパク質のうち、コラーゲンに対しては低温度下でも強く作用し、アクトミオシンに対しては、温度に関わらずほとんど作用しなかった。このことから、前記Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素は、筋肉タンパク質のなかでも、食肉の硬化に関わるコラーゲンを優先的に分解し、筋繊維を構成するアクトミオシンへの作用活性が低いことがわかった。したがって、前記Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素を用いれば、肉質のテクスチャーが損なわれず、低温度下で、肉質を軟化させることができるといえる。
【産業上の利用可能性】
【０１５５】
本発明の低温細菌を用いれば、その培養によって容易に本発明のコラーゲン分解酵素を製造できる。そして、本発明のコラーゲン分解酵素を用いれば、低温条件下で、食肉のテクスチャーを損ねずに、食肉の軟化が可能である。さらに、本発明のコラーゲン分解酵素を用いた軟化食肉の製造方法は、低温条件下で実施できるため、例えば、微生物の繁殖を抑制でき、食品安全性に優れる。本発明のコラーゲン分解酵素の用途は、例えば、獣肉加工、イカや魚卵の皮むき等の魚介類加工、皮革製品加工、コラーゲンペプチドの製造にも利用でき、またこれらに限られず、食品、洗浄剤等の化成品等の幅広い分野に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】図１は、グラム染色した本発明における低温細菌Ｃ３５株を、倒立顕微鏡を用いて観察した像の写真である。
【図２】図２は、本発明における低温細菌Ｃ３５株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動したゲルの写真である。
【図３】図３は、本発明における低温細菌Ｃ３５株の系統分析の結果を示す系統樹である。
【図４】図４は、本発明における低温細菌Ｃ３５株の生育可能温度範囲を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明における低温細菌Ｃ３５株を、異なる培地を用いて培養したときの生育率を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明における低温細菌Ｃ３５株を、異なる培地を用いて培養したときのコラーゲン分解活性を示す写真である。
【図７】図７は、疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて、本発明における低温細菌Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素を精製したときのタンパク質の溶出チャートである。
【図８】図８は、疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて精製した、本発明における低温細菌Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素のタンパク精製度を示す電気泳動写真である。
【図９】図９は、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いて、本発明における低温細菌Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素を精製したときのタンパク質の溶出チャートである。
【図１０】図１０は、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いて精製した、本発明における低温細菌Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素のタンパク精製度を示す電気泳動写真である。
【図１１】図１１は、本発明における低温細菌Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素の異なる温度条件下でのコラーゲン分解活性を示すグラフである。
【図１２】図１２は、本発明における低温細菌Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素の温度安定性を示すグラフである。
【図１３】図１３は、本発明における低温細菌Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素の異なるｐＨ条件下でのコラーゲン分解活性を示すグラフである。
【図１４】図１４は、本発明における低温細菌Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素の酵素反応速度を示すグラフである。
【図１５】図１５は、本発明における低温細菌Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素のＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットを示すグラフである。
【図１６】図１６は、本発明における低温細菌Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素のコラーゲンに対する作用を示す電気泳動写真である。
【図１７】図１７は、本発明における低温細菌Ｃ３５株由来コラーゲン分解酵素のアクトミオシンに対する作用を示す電気泳動写真である。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図２】
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【図６】
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【図８】
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【図１０】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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