(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
不均一な赤血球細胞集団中の小さな赤血球細胞集団を定量するため、赤血球細胞上に低濃度で存在する分析物を検出するために、ヘマトクリット値を決定するため、および／またはｍｉｘｅｄ−ｆｉｅｌｄ反応において赤血球の細胞結合分析物(cellularly bound analytes)を同時に決定するための方法であって、
ａ）一定量の血液サンプルと、該血液サンプルの量よりも少ない量の希釈剤とを混合して液体サンプルを調製するステップと、
ｂ）ステップａ）の、細胞を含有する液体サンプルを２００μｌ〜５００μｌ前記供給ゾーンに適用するステップと、
ｃ）希釈剤を適用するステップと、
ｄ）アッセイを実施するステップであって、適用されたサンプルが供給ゾーンから指標ゾーンを通って吸収領域まで移動するように、ステップａ）の液体サンプルをテスト装置でインキュベートすることを含むステップと、
ｅ）指標ゾーンに結合させることによって小さな赤血球細胞集団を濃縮し、他の赤血球細胞集団の量を指標ゾーンにおいて減少させるステップと、
ｆ）赤血球細胞が指標ゾーンと結合しているかどうかを決定することによって前記アッセイを評価するステップと、を含み、
−液体サンプルを適用するための、少なくとも１つの供給ゾーン（５）と、
−細胞成分が透過するのに適しており、少なくとも１つの指標ゾーンを膜上に含み、前記指標ゾーンが、細胞結合分析物と相互作用でき、細胞結合分析物に対する少なくとも１種の結合要素を含む、多孔質膜（２）と、
−液体が前記指標ゾーンを通過した後に液体を吸収する、膜上の少なくとも１つの吸収領域（３）とを含んでなり、
−少なくとも１つの指標ゾーンが、前記供給ゾーン（５）と前記吸収領域（３）の間に位置する、装置を用いて実施される方法。
【請求項２】
前記不均一な細胞集団が胎児母体間出血（ＦＭＨ）またはキメラに起因する請求項１記載の方法。
【請求項３】
胎児母体間出血（ＦＭＨ）を決定するために実施され、前記サンプルが赤血球を含み、指標ゾーンが抗体または抗体混合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
細胞上に低濃度で存在する分析物を決定するために実施され、前記分析物がＤＥＬであり、前記指標ゾーンが、抗体または抗体混合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ａ）の前に、血液サンプルを遠心分離することによって赤血球沈降物を調製するステップと、沈降物をブロメライン、パパインまたはフィシン溶液とともにインキュベートするステップと、酵素処理した沈降物を再懸濁するステップとをさらに含んでなる、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
１００μｌ〜２００μｌの希釈剤が、ステップｃ）で適用される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
抗Ｄ抗体が、ＲＵＭ−１、ＬＤＭ−３、ＥＳＤ１Ｍ、ＴＨ−２８、ＭＳ−２０１、ＭＳ−２６およびＬＤＭ−１から選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記装置が、前記液体サンプルが各フロートラックにおいて２以上指標ゾーンを通過するような方法でフローの方向に縦に並んで配置される少なくとも２つの指標ゾーンを含み、前記指標ゾーンが、細胞結合分析物に対する結合要素を含み、
ａ）一定量の血液サンプルと、該血液サンプルの量よりも少ない量の希釈剤とを混合して液体サンプルを調製するステップと、
ｂ）ステップａ）の、細胞を含有する液体サンプルを２００μｌ〜５００μｌ前記供給ゾーンに適用するステップと、
ｃ）希釈剤を適用するステップと、
ｄ）アッセイを実施するステップであって、適用されたサンプルが供給ゾーンから指標ゾーンを通って吸収領域まで移動するように、ステップａ）の液体サンプルをテスト装置でインキュベートすることを含むステップと、
ｅ）指標ゾーンに結合させることによって小さな赤血球細胞集団を濃縮し、他の赤血球細胞集団の量を指標ゾーンにおいて減少させるステップと、
ｆ）赤血球細胞が指標ゾーンと結合しているかどうかを決定することによって前記アッセイを評価するステップと、
を含んでなり、
胎児母体間出血（ＦＭＨ）の場合に細胞結合分析物を同時に決定するために、Ｍｉｘｅｄ−ｆｉｅｌｄ反応において決定するために、同種血輸血を検出するために、またはヘマトクリット値を決定するために実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ヘマトクリット値を決定するために実施され、前記指標ゾーンが、抗体または抗体混合物を含み、ステップｆ）において赤血球が前記指標ゾーンに結合されている全体パターンが決定される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記装置が、単一のフロートラック中に配置される少なくとも２つの指標ゾーンを含み、前記指標ゾーンが、赤血球の同じ細胞結合分析物に対する同一の結合要素を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記装置が、少なくとも２つの指標ゾーンを含有する少なくとも２つのフロートラックを有し、結合要素の濃度が、前記供給ゾーンに関して近位から遠位に増加または減少する、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記装置が、少なくとも２つの指標ゾーンを含有する少なくとも２つのフロートラックを有し、第１のフロートラック中の抗体の濃度が、第２のフロートラック中の濃度と異なる、請求項９から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ｍｉｘｅｄ−ｆｉｅｌｄ反応において細胞結合分析物を同時に決定するために、または同種血輸血を検出するために実施され、前記装置が、サンプル液体が各フロートラックにおいて２以上指標ゾーンを通過するような方法でフローの方向に縦に並んで配置される少なくとも２つの指標ゾーンを含み、前記指標ゾーンが異なる細胞結合分析物に対する結合要素を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞結合分析物が、Ａ、Ｂ、ＡＢ、Ｄ、Ｃ、ｃ、Ｅ、ｅ、Ｃｗ、Ｋ、ｋ、Ｊｋａおよび／またはＪｋｂなどの血液型抗原から選択される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記血液型抗原が、反応対Ａ，Ｂ；Ｄ＋，Ｄ−；Ｋ，ｋ；Ｃ，ｃおよび／またはＥ，ｅによって決定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記分析物に対する結合要素が、抗体、抗体フラグメント、レクチン、レクチン断片またはそれらの混合物から選択される、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記膜または複数の膜（２）が、ポリエチレン、ニトロセルロースまたはナイロンからなる、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも１つの密閉要素（４）が、前記供給ゾーン（５）の下流かつ前記膜（２）上の指標ゾーンの上流に配置されている、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記装置の構成要素が、機械補強のために支持層（１）に適用される、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記装置の構成要素が、ハウジングに組み込まれている、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不均一な細胞集団中の小さい細胞集団を決定する(determine)方法に関する。前記方法は、例えば、胎児母体間出血の場合において、不均一な細胞集団中の小さな細胞集団を濃縮および定量するために；細胞結合分析物(cellularly bound analytes)を同時に決定するために；従って、輸血後のｍｉｘｅｄ−ｆｉｅｌｄ反応、胎児母体間出血の場合、あるいはキメラにおいて、両細胞集団を決定するために；細胞上に低濃度で存在する分析物を検出するために；および／または、ヘマトクリット値を決定するために適している。本発明はさらに、前記方法に適した装置を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ＦＭＨ
妊娠の間に、血液は、通常、胎児循環から母体循環へ通過する（胎児母体間出血、ＦＭＨ）。文献によれば、これは、およそ０．１ｍｌ〜３０ｍｌに達する。妊娠の９６〜９８％では、ＦＭＨは、＜２ｍｌであるが、妊娠の０．３％では、３０ｍｌを超える量が移行される。母体血液の量が５０００ｍｌと推定されると、これは、０．００２％〜０．６％の、母親のものから逸脱する抗原プロフィールを有する第２の型の赤血球が母体循環へ入ったことを意味し、それが免疫化をもたらす場合、これは臨床的に意義があることとなる。最も顕著な例として、Ｄ＋胎児を妊娠しているＤ母親がある。母親が抗Ｄ抗体を産生する場合、これは、別のＤ＋胎児の妊娠において致命的な結果を有し得る（新生児溶血性疾患、ＨＤＮ）。このため、これらの状況では、母親に「抗Ｄ予防薬」が投与される。しかしながら、例えば、＞３０ｍｌのＦＭＨでは、標準抗Ｄ治療が、もはや十分な保護を与えることができないために、ＦＭＨの量を推定できることには大きな関心が寄せられている。したがって、ＵＳＡでは標準免疫化は、２５０〜３００μｇの抗Ｄ（ＩｇＧ）を含んでなり、これは、その循環に、１５ｍｌの胎児赤血球、すなわち、２５〜３０ｍｌの胎児血液が入った妊婦に対して十分な予防を達成する。欧州で投与される標準用量は、より少ない、すなわち、１００〜１５０μｇの抗Ｄ（ＩｇＧ）であることが多く、これは８〜１０ｍｌのＦＭＨで保護を与える。抗Ｄ予防薬を投与する各機関は、通常よりも多量のＦＭＨを検出する方法を使用しなければならない（非特許文献１）。
【０００３】
例えば、Ｄ抗原を検出するための従来の血液型血清学アッセイは、上記のような少量の第２の集団の検出に近づくことさえもできない。
【０００４】
したがって、ＦＭＨを検出するために特に開発された、いくつかの別個のアッセイがある。前記アッセイは、胎児赤血球、血液型Ｄ抗原またはヘモグロビンＦを検出する。
【０００５】
ＦＭＨ検出アッセイ：ＦＭＨ検出限界
ロゼット試験：約１０ｍｌ
このアッセイは、赤血球凝集を検出することおよびその顕微鏡的評価に基づいている。胎児Ｄ抗原の検出。
（非特許文献２〜４）
【０００６】
クライハウエル−ベツケ試験：約５ｍｌ
このアッセイは、酸での溶出に対する胎児赤血球の高い抵抗性およびその顕微鏡的評価に基づいている。胎児細胞の検出。
（非特許文献５）
【０００７】
フローサイトメトリー  約１ｍｌ
Ｄ抗原またはヘモグロビンＦを対応する抗体で標識し、蛍光二次抗体によって検出する。胎児Ｄ抗原／ヘモグロビンの検出。
（非特許文献６および７）
【０００８】
抗体消費アッセイ：約１５ｍｌ
このアッセイは、ＦＭＨを決定するための第１のアッセイであり、血液型を決定する常法（ゲル技術）に基づいて設計されている。胎児赤血球による抗Ｄ試薬の消費に基づいている。ゲル試験では、反応上清を、Ｄ陽性試験細胞とともにインキュベートし、遠心分離する。胎児Ｄ抗原の検出。
（非特許文献８および９）
【０００９】
これらのアッセイは、赤血球抗原、胎児赤血球または胎児赤血球に特徴的であるヘモグロビンＦを検出するために用いられる。これらの方法のすべては、それらを実施するには、多数の試薬並びに時間と労力の両方が必要であるという事実を共有する。さらに、すべての方法は、それらを実施するには、機器が必要であり、そのいくつかは非常に高価である（顕微鏡、遠心機、フローサイトメーター）ということを特徴とする。前記方法はまた、それらを実施するには、特別に訓練されたスタッフが必要であるという事実を共有する。クライハウエル−ベツケアッセイは、結果を評価することが極めて主観的であるというさらなる不利点を有する。
【００１０】
弱いＤ特徴発現（（Ｄｗｅａｋ）、特に、ＤＥＬ
ドナーおよびレシーバーの血清学のもう１つの課題として、Ｄ抗原の弱いまたは部分的な発現がある。特に弱いＤ発現を有するＤＥＬ表現型が記載されるまでは、モノクローナル抗体および間接クームス試験における確認によって、このような弱い血液型でさえ分類することは確実であると思われていた（「正常」Ｄ：１０〜３００００の赤血球あたりの抗原（ＲＢＣ）；Ｄ  ｗｅａｋ：４００〜１０００；ＤＥＬ：＜３０）。
【００１１】
血清学的に、ＤＥＬは、最大１０の洗浄ステップを含んでなる非常に複雑な吸着−溶出試験を用いて間接的にのみ検出され得る。ＤＥＬは、輸血医学と関連性があるが、これは、ＤＥＬであるヒトの貯蔵血のＤレシーバーが、抗Ｄ抗体を形成する可能性があるためである。この問題は深刻であり、その結果、現在、すべての（血清学的に）ＤドナーのＤ状態を分子的方法で確認すべきかどうかについて専門家の間で議論がある。
（非特許文献１０）
【００１２】
Ｍｉｘｅｄ−ｆｉｅｌｄ反応、同種血輸血、血液ドーピング
輸血は、常に、同一または適合するＡＢＯおよび適合するＤを用いて投与されなければならない。ある場合、例えば、以前輸血された患者に関する場合には、その他の抗原についても同一血液型を輸血するよう臨床的に指示される。しかし、すべての血液型において同一の血液型を輸血することは決して可能ではない（例外：自家輸血）。このことが、通常、あるヒトが、特定の血液型の特徴について診断上陽性かつ陰性であるという輸血後状態をもたらす。診断では、「ｍｉｘｅｄ−ｆｉｅｌｄ反応」が見られ、例えば、高感度法、特に、検出の間に個々の赤血球および凝集物を空間的に分離できるものによって容易に検出できる。例えば、３００ｍｌ（６７％）の赤血球濃縮物が、循環（４５％のヘマクリット）が５０００ｍｌの血液を有するＫ陰性のヒト（血液型ｋｋ）に投与され、濃縮物がＫ＋（血液型ＫｋまたはＫＫ）である場合、名目上、前記ヒトの約８％の赤血球がＫ＋であり、赤血球の９２％がＫ−である。
【００１３】
このような状態は、例えば、現在広く用いられているＤｉａＭｅｄおよびＢｉｏ−Ｒａｄ製のゲルシステムによってさらに検出できる。この技術は、底が閉じられた、種々の特異性を有する抗体試薬を含み得るゲル−クロマトグラフィーカラムを通して決定できる、ヒトの赤血球の希釈懸濁液を遠心分離することを含む。遊離した、凝集していない細胞は、ゲルを通過し、反応容器の底に沈降物を形成することができ、一方で、凝集物はゲル上またはゲル中に保持される（非特許文献１１）。例の赤血球が、このような抗Ｋ含有カラムを通して遠心分離される場合、細胞のほとんどは、Ｋ−であるので底に沈降し、一部がゲル上またはゲル中に保持され（Ｋ＋）、上記に示されるｍｉｘｅｄ  ｆｉｅｌｄの検出に対応する。上記のような赤血球がＭＤｍｕｌｔｉｃａｒｄ  （Ｍｅｄｉｏｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）に適用されると、抗Ｋで弱いバンドが同様に検出できる。しかし、ゲル技術とは対照的に、ＷＯ２００５／００５９９１（特許文献１）に開示される方法では、負に反応する細胞集団を同時に可視化できない。先行技術のすべてのその他の方法は、ｍｉｘｅｄ−ｆｉｅｌｄ反応を検出するためのゲルシステムおよびＭＤｍｕｌｔｉｃａｒｄに匹敵する特性を全く有さない。
【００１４】
同種血輸血および血液ドーピング：
Ｎｅｌｓｏｎ  Ｍ．、Ｐｏｐｐ  Ｈ．、Ｓｈａｒｐｅ  Ｋ．、Ａｓｈｅｎｄｅｎ  Ｍ．  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ２００３年；８８：１２８４頁（非特許文献１２）
【００１５】
輸血後Ｍｉｘｅｄ−ｆｉｅｌｄ反応：
Ｉｓｓｉｔｔ  Ｐ．Ｄ．およびＡｎｓｔｅｅ  Ｄ．Ｊ．  Ｉｎ：  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｏｌｏｇｙ（第４版）、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ．第３章：Ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｗｂｏｒｎ．  １０４５〜１０５０頁（非特許文献１３）
【００１６】
ヘマトクリット
ヘマトクリットまたは赤血球の総容積は、全血の総容積に対する赤血球の容積の割合であり、パーセンテージとして表される。全血に対する赤血球の容積割合は、赤血球の容積および数によって影響を受ける。
【００１７】
ヘマトクリットは、遠心分離後、全容積に対する沈降した細胞成分の割合の比が形成されるという点で、通常、血液で満たされた毛細管を遠心分離することによって決定することができる（非特許文献１４）。ヘマトクリットはまた、電気インピーダンス法を用いて決定することもできる。ここで、陽極および陰極間の電解質溶液中を流れる電流は、前記電流に入れられている種々の伝導性の粒子によって影響を受ける。電流の変化はパルスとして記録される。特定の粒径、したがって、血液学では、特定の細胞種、例えば、赤血球は、特定のパルス振幅から推測され得る。細胞数およびヘマトクリットは、測定される容積あたりのパルスを合算することによって導くことができる（非特許文献１５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００５／００５９９１号
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｏｌｏｇｙ［第４版］、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、第４１章：Ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｗｂｏｒｎ、１０４５〜１０５０頁中、Ｉｓｓｉｔｔ  ＰＤおよびＡｎｓｔｅｅ  ＤＪ．
【非特許文献２】Ｊｏｎｅｓ  Ａ．Ｒ．、Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓ．Ｂｌｏｏｄ  １９５８年；１３：７６３
【非特許文献３】Ｓｅｂｒｉｎｇ  Ｅ．Ｓ．、Ｐｏｌｅｓｋｙ  Ｈ．Ｆ．Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  １９８２年；２２：４６８
【非特許文献４】Ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｗｂｏｒｎ中、Ｓｅｂｒｉｎｇ  Ｅ．Ｓ．  Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＶＡ；Ａｍ  Ａｓｓｏｃ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋｓ  １９８４年：８７
【非特許文献５】Ｋｌｅｉｈａｕｅｒ  Ｅ．、Ｂｒａｕｎ  Ｈ．、Ｂｅｔｋｅ  Ｋ．Ｋｌｅｉｎ  Ｗｓｃｈｒ  １９５７年；３５：６３７頁
【非特許文献６】Ｇａｒｒａｔｔｙ  Ｇ．、Ａｒｎｄｔ  Ｐ．Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  １９９５年；３５：１５７頁
【非特許文献７】Ｄａｖｉｄ  Ｂ．Ｈ．Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ  ２００１年；２１：８２９頁
【非特許文献８】Ｌａｐｉｅｒｒｅ  Ｙ．、Ｒｉｇａｌ  Ｄ．、Ａｄａｍ  Ｊ．、Ｊｏｓｅｆ  Ｄ．、Ｍｅｙｅｒ  Ｆ．、Ｇｒｅｂｅｒ  Ｓ．、Ｄｒｏｔ  Ｃ．Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  １９９０年；３０：１０９頁
【非特許文献９】Ｄａｖｉｄ  Ｍ．、Ｓｔｅｌｚｅｒ  Ａ．、Ｗｉｔｔｍａｎｎ  Ｇ．、Ｄｕｄｅｎｈａｕｓｅｎ  Ｊ．Ｗ．、Ｓａｌａｍａ  Ａ．Ｚ．  Ｇｅｂｕｒｔｓｈｉｌｆｅ  Ｎｅｏｎａｔｏｌ  １９９９年；２０３：２４１頁
【非特許文献１０】Ｗａｇｎｅｒ  Ｔ．、Ｋｏｒｍｏｃｚｉ  Ｇ．Ｆ．、Ｂｕｃｈｔａ  Ｃ．、Ｖａｄｏｎ  Ｍ．、Ｌａｎｚｅｒ  Ｇ．、Ｍａｙｒ  Ｗ．Ｒ．、Ｌｅｇｌｅｒ  Ｔ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ２００５年；４５：５２０頁
【非特許文献１１】Ｌａｐｉｅｒｒｅ  Ｙ．、Ｒｉｇａｌ  Ｄ．、Ａｄａｍ  Ｊ．、Ｊｏｓｅｆ  Ｄ．、Ｍｅｙｅｒ  Ｆ．、Ｇｒｅｂｅｒ  Ｓ．、Ｄｒｏｔ  Ｃ．Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  １９９０年；３０：１０９頁
【非特許文献１２】Ｎｅｌｓｏｎ  Ｍ．、Ｐｏｐｐ  Ｈ．、Ｓｈａｒｐｅ  Ｋ．、Ａｓｈｅｎｄｅｎ  Ｍ．  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ２００３年；８８：１２８４頁
【非特許文献１３】Ｉｓｓｉｔｔ  Ｐ．Ｄ．およびＡｎｓｔｅｅ  Ｄ．Ｊ．  Ｉｎ：  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｏｌｏｇｙ（第４版）、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ．第３章：Ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｗｂｏｒｎ．  １０４５〜１０５０頁
【非特許文献１４】Ｓｔｒｕｍｉａ  Ｍ．Ｍ．、Ｓａｍｂｌｅ  Ａ．Ｂ．、Ｈａｒｔ  Ｅ．Ｄ．、１９５４年；Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈ；２４：１０１６頁
【非特許文献１５】Ｓｙｓｍｅｘ  ＫＸ−２１Ｎ  Ｏｐｅｒａｔｏｒ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ、１９９９年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
したがって、本発明の目的は、胎児母体間出血の場合、またはキメラにおけるように、不均一な集団中の小さい細胞集団を決定するために結果を迅速に送達する、簡単な、費用効率が高い、自動化可能な方法を提供することである。本発明はまた、細胞上に低濃度で存在する分析物を検出するための、ヘマトクリット値を決定するための、および／またはｍｉｘｅｄ−ｆｉｅｌｄ反応において細胞結合分析物を同時に決定するための、簡単な、迅速で、高感度法を提供することを意図する。前記方法は、好ましくは、既存の方法を超える高い感度を有するべきである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
上記の目的は、
−液体サンプルを適用するための、少なくとも１つの供給ゾーン（５）と、
−細胞成分が透過するのに適しており、少なくとも１つの指標ゾーンを膜上に含み、指標ゾーンが、細胞結合分析物と相互作用でき、細胞結合分析物に対する少なくとも１種の結合要素を含む、多孔質膜（２）と、
−液体が指標ゾーンを通過した後に液体を吸収する、膜上の少なくとも１つの吸収領域（３）と
を含んでなる装置を用いて実施され、
少なくとも１つの指標ゾーンが、供給ゾーン（５）と吸収領域（３）の間に位置し、例えば、胎児母体間出血の場合において、またはキメラにおいて、不均一な細胞集団中の小さな細胞集団を濃縮および定量するために、細胞上に低濃度で存在する分析物を検出するために、ヘマトクリット値を決定するために、および／またはｍｉｘｅｄ−ｆｉｅｌｄ反応において細胞結合分析物を同時に決定するために実施される、液体サンプル中の１種以上の細胞結合分析物を決定する方法を提供することによって解決される。
【００２２】
好ましい実施形態では、本方法は、以下のステップを含んでなる：
ａ）細胞を含有するサンプルを供給ゾーンに適用するステップと、
ｂ）希釈剤を適用するステップと、
ｃ）アッセイを実施するステップと、
ｄ）細胞が指標ゾーンに結合しているかどうかを決定することによってアッセイを評価するステップ。
【００２３】
本方法は、この好ましい実施形態によれば、例えば、胎児母体間出血の場合において、不均一な細胞集団中の小さな細胞集団を濃縮するために、および定量するために、または細胞上に低濃度で存在する分析物を検出するために、実施されることが好ましい。
【００２４】
前記実施形態はまた、本明細書において以下「インキュベーション法」と呼ぶ。
【００２５】
ＤＥ１０３３０９８２Ａ１およびＷＯ２００５／００５９８６には、側方流動装置が開示されている。後者は、それでは、赤血球抗原および血清成分、例えば、抗体を同時に決定するために用いられている。この刊行物に開示される側方流動装置は、本発明に記載される方法に適している。ＤＥ１０３３０９８２Ａ１およびＷＯ２００５／００５９８６の開示内容は、その全文が本明細書に組み込まれる。
【００２６】
前記側方流動装置は、不均一な細胞混合物中に少量で存在する第２の細胞集団を最大に濃縮できるよう、フローサイトメーターとして本発明に従って利用される。前記濃縮は、血液の最大の総量を使用することによって定量的に、容積の増大によって引き起こされるインキュベーション効果によって定性的に実施されることが好ましい。側方流動装置中の読み取りフィールドは、フローサイトメーター中のフローセルと同様である。バックグラウンドは、高濃度で存在する細胞種を洗い流すことおよび読み取り窓中の低濃度細胞種を固定化することによって低く保たれる。
【００２７】
結果として、低い割合の集団でさえ十分に多数が、抗体バンドを通過し、その結果、この集団も目に見えるようになる。これは、著しく高い割合の集団の大部分を洗い流すことによって可能になる。
【００２８】
ＦＭＨを決定するために適用される本方法は、高度に感受性であり、母体血液中、約０．１％〜０．２％の胎児Ｄ＋細胞が検出されるのを可能にする。
【００２９】
別の好ましい実施形態によれば、本方法に用いられる装置は、サンプル液体が各フロートラックにおいて２以上指標ゾーンを通過するような方法でフローの方向に縦に並んで配置される少なくとも２つの指標ゾーンを含み、指標ゾーンが細胞結合分析物に対する結合要素を含み、本方法は、
ａ）赤血球を含有する血液サンプルを供給ゾーン適用するステップと、
ｂ）希釈剤を供給ゾーンに適用するステップと、
ｃ）アッセイを実施するステップと、
ｄ）赤血球が指標ゾーン（複数の指標ゾーン）と結合しているかどうかを決定することによってアッセイを評価するステップと
を含んでなり、
本方法は、胎児母体間出血（ＦＭＨ）の場合に細胞結合分析物を同時に決定するために、Ｍｉｘｅｄ−ｆｉｅｌｄ反応における決定のために、同種血輸血を検出するために、またはヘマトクリット値を決定するために実施される。
【００３０】
この実施形態はまた、本明細書において以下「２指標ゾーン法」と呼ばれる。
【００３１】
本発明のさらなる態様によれば、装置は、液体サンプル中の細胞結合分析物を直接決定するために提供され、
−液体サンプルを適用するための、供給ゾーン（５）と、
−細胞成分が透過するのに適しており、少なくとも２つの指標ゾーンを膜上に含み、指標ゾーンが、細胞結合分析物（複数の分析物）と相互作用でき、細胞結合分析物に対する結合要素を含む、多孔質膜と、
−液体が指標ゾーンを通過した後に液体を吸収する、少なくとも１つの吸収領域（３）と
を含んでなり、
指標ゾーンが、供給ゾーン（５）と吸収領域（３）の間に位置し、少なくとも２つの指標ゾーンが、サンプル液体が各フロートラックにおいて２以上指標ゾーンを通過するような方法でフローの方向に縦に並んで配置される。
【００３２】
本発明に従って提供される側方流動装置は、本明細書に例示される好ましい実施形態において、本発明に従って、ｍｉｘｅｄ  ｆｉｅｌｄ中の両細胞集団を同時に可視化するのを可能にするように縦に並んで位置づけられた２つの指標ゾーンを有する点で、ＷＯ２００５／００５９９１のものとは異なる。ｍｉｘｅｄ  ｆｉｅｌｄを検出するための感度は、ｍｉｘｅｄ  ｆｉｅｌｄを検出できる唯一のこれまでの常法、すなわち、ゲル技術（ＤｉａＭｅｄ）のものよりも高い。本発明の方法の感度によって、小さい細胞集団が、その集団が全集団の約１〜２％である場合も検出することが可能となる。
【００３３】
本方法および装置は、ｍｉｘｅｄ−ｆｉｅｌｄ凝集が高感度で検出されることを可能にする。当業者は、第１の指標ゾーンは、分析物が結合している細胞を結合した後、第２の指標ゾーンとの結合に対する拡散障壁として作用すると考えたであろうから、この有用性は驚くべきことでもある。
【００３４】
側方流動装置は、ヘマトクリット測定のために、血液サンプルの赤血球濃度を検出するのを可能にするよう縦に並んで位置づけられた少なくとも２つの指標位置を有するフローサイトメーターとして利用できる。前記濃度が高いほど、ラインのより多くの点が陽性シグナルを示す。本方法は、例えば、各場合において５つの抗赤血球の点を含む複数のフロートラックを並べて置き、個々のフロートラックが漸増または漸減する抗赤血球濃度を有することによって２Ｄアッセイに広げることができる。
側方流動装置の使用によってまた、血液型およびヘマトクリットを同時に決定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】上記のインキュベーション法を実施するのに適した装置の図表示を表す図である。引用符号は、以下の意味を有する；（１）支持層、（２）多孔性膜、（３）吸収領域、（４）密閉要素、（５）供給ゾーンおよび（６）指標ゾーン領域。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
定義
本発明との関連では、以下の用語は、以下に示されるように理解されなければならない：
用語「不均一な細胞集団中の小さい細胞集団」とは、細胞集団が、同様に不均一な細胞集団中に存在する１種以上のその他の細胞集団と比較して、少量または低濃度で存在することを意味する。不均一な細胞集団全体に基づく、小さい細胞集団の濃度は、これでは、５０％未満、好ましくは、１０％未満、特に好ましくは、１％未満、特には、０．１％未満である。
【００３７】
用語「同種血輸血」とは、本質的特徴において適合している輸血を意味し、このような輸血後により多くの特徴が決定されると、輸血が起こったことをｍｉｘｅｄ  ｆｉｅｌｄによって検出できる可能性が高い。この可能性は、決定する特徴を選択することによって最大にすることができる。このような決定は、同種血輸血による違法な血液ドーピングを確信するために用いられる。
【００３８】
用語「自己輸血」とは、血液の自己提供を意味し、これでは、定義上、ドナーおよびレシーバーはすべての特徴において同一である。
【００３９】
用語「ｍｉｘｅｄ  ｆｉｅｌｄ」：輸血は、自己輸血は別として、すべての抗原に関して同一の血液群を有することができないので、ｍｉｘｅｄ  ｆｉｅｌｄは、血清学では、保存血液とレシーバーの間の抗原が異なることに関して生じる。
【００４０】
用語「ＤＥＬ」：これは特に弱く発現されるＤ特徴であり、＜３０抗原／細胞である。これは、市販の血清学法によってではもはや検出できない。
【００４１】
用語「ヘマトクリット」は、全血液容積の赤血球の割合［％］を意味する。以下の平均が観察される：男性：４４〜５２％；女性：３７〜４７％。
【００４２】
用語「キメラ」は、細胞が２以上接合子を表す生物に用いられる。
【００４３】
側方流動装置の調製
原則として、ＤＥ１０３３０９８２Ａ１およびＷＯ２００５／００５９８６に明記される側方流動装置はいずれも適している。
【００４４】
本発明に従って用いられる装置の膜は、多孔性膜である。膜材料の好ましい例として、ニトロセルロース（例えば、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ製のＵｎｉＳａｒｔｙ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製のＨｉＦｌｏｗ、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ製のＷｈａｔｍａｎ、ＡＥ９９およびＦＦ８５／１００）、ポリエチレン（Ｐｏｒｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製のＬａｔｅｒａｌ  Ｆｌｏまたはナイロン（ＣＵＮＯ製のＮｏｖｙｌｏｎ）がある。膜は、極めて大きなポアサイズを有することが好ましいが、これは、膜の高い多孔度が、特に、測定されるサンプルの細胞成分の、例えば、赤血球の、孔構造中への浸透に役立つためである。吸収性膜を使用することが特に有利である。しかし、本発明の装置は、これらの特徴に制限されない。高い毛細管流速（毛細管速度）を有する膜はいずれも好ましく、毛細管流速（毛細管速度）とは、色素溶液が所与の膜上を４０ｍｍ移動するのに必要なこれは時間である。毛細管流速が＜１００である膜が特に好ましい。
【００４５】
本発明の好ましい実施形態では、密閉要素は、本発明の装置の供給ゾーンの下流の多孔性膜上にフローの方向に配置される。多孔性膜上に置かれ、多孔性膜の残りの表面と分離されるサンプル適用ゾーンを生じさせるために使用される２または３次元密閉要素が使用される。本発明によれば、密閉要素は、主に液体障壁として作用し、サンプル液体および試験試薬が指定の方法で多孔性膜中に分配されることを可能にする。さらに、本発明によれば、密閉要素は、サンプル適用ゾーンを密閉して、側方流動装置のその他の領域への液体の望ましくない移動を防ぐ。
【００４６】
好ましい実施形態では、密閉要素は、クモの巣状の形またはおけのような形および／または漏斗の形である。密閉要素は、密閉要素を製造するために用いられる材料からの切断過程によって形成される。密閉要素は、漏斗およびおけの形の場合には、内部の開口部が提供され、その好ましい実施形態変動として、円形、正方形または長方形があり、漏斗の形の場合には、密閉要素の底側（膜接触側）に向かって次第に細くなる。
【００４７】
密閉要素の好ましい材料として、水を吸収しない材料（疎水性材料）がある。特定の実施形態では、材料は、一側面が接着フィルム、例えば、加圧接着または粘着アクリレート接着剤で被覆される。したがって、密閉要素は、多孔性膜の表面上に直接接着させることができる。あるいは、密閉要素を、側方流動ハウジングに接続、例えば、結合してもよく、この実施形態では、側方流動ハウジングが、密閉要素を多孔性膜の表面上に押し付け、それによって、前記密閉要素の機能が達成される。
【００４８】
二次元密閉要素を製造するのに好ましい材料として、任意の形の接着テープまたは接着フィルム（例えば、Ｂｅｉｅｒｓｄｏｒｆ  ＡＧ製のＴｅｓａ４１２４、Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ製のＡＲｃａｒｅ７８１５）がある。
【００４９】
三次元密閉要素を製造するのに好ましい材料として、種々の材料厚、好ましくは、３〜５ｍｍを有する、可動性の、閉鎖孔の、エラストマー材料または可動性のシリコン材料（例えば、Ｐｉｔｚｎｅｒ製のクローズドセルゴムＥＰＤＭ１４０、シリコンゴムまたはＣａｓｔａｎ製の非セルラーラバー、硬度４０°以下）がある。
【００５０】
さらなる好ましい一実施形態では、例えば、２０個の個々の空洞（おけのような形）を含む１部品からなる複数の密閉要素が膜上に配置されている。
【００５１】
本発明によるこの設計のために、本発明の装置は、例えば、白血球などの細胞を含有する液体サンプルを取り込むことができ、前記細胞はこの過程で濾去されない。密閉要素はさらに、大きなサンプル容積が多孔性膜（供給ゾーン）に、多孔性膜（供給ゾーン）が浸水することなく適用されるのを可能にする。したがって、密閉要素は、多孔性膜の吸収特性の利用を支持する。密閉要素はさらに、指定のサンプルフローを保証する。しかし、本発明の装置は、密閉要素があってもなくても上手く働くことができる。
【００５２】
本発明の装置の吸収領域（吸収パッド）には、機械的に安定な材料が好ましく、２０〜３０ｇ／１００ｃｍ２の水吸収能を有することが好ましい（例えば、Ｗｉｃｋｉｎｇ  Ｐａｐｅｒ、Ｔｙｐｅ３００、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｌ）。本発明の装置の吸収パッドおよび側方流動膜の間の接触は、押し下げ、多孔性膜と重なることによって達成される。膜上の吸収パッドの正確な位置は、吸収パッドを、側方流動膜を支持する支持層（裏打ちシート）に結合させることによって達成される。
【００５３】
さらなる実施形態では、本発明の装置の構成要素は、機械補強を目的として裏打ちシートまたは支持層に適用される。しかし、本発明の装置は、支持層があってもなくても機能し得る。水を吸収せず、１００μｍ以上の材料厚を有することが好ましく、一側面が、または両面が接着フィルム、例えば、加圧接着または粘着アクリレート接着剤（例えば、０．００５’’ポリエステルＷ／ＧＬ−１８７、Ｇ＆Ｌ）で被覆されている、機械的に安定な材料が好ましい。多孔性膜および吸収パッドは、支持層に固定されている。両面接着支持層の場合には、接着性の第２の面は、積み重なったものをその他の表面、例えば、側方流動ハウジングの内側に固定するために用いられる。
【００５４】
さらなる実施形態では、本発明の装置の構成要素が適用された支持層を含むまたは含まない本発明の装置が、ハウジング中に組み込まれ、それによって膜構成要素が、互いに押し付けられ、前記ハウジングが密閉要素機能を支持する。しかし、本発明の装置は、ハウジングを含んでも含まなくても両方で同様に良好に機能し得る。
【００５５】
インキュベーション法
好ましい実施形態によれば、本方法は、胎児母体間出血（ＦＭＨ）を決定するために実施され、これでは、サンプルは、赤血球を含み、指標ゾーンは、抗体または抗体混合物を含むことが好ましい。
【００５６】
細胞を含有するサンプルは、いずれのサンプルであってもよい。細胞は、血中に存在する細胞、例えば、赤血球、白血球または血小板であることが好ましい。細胞は赤血球であることが好ましい。ここで、赤血球を含有するサンプルは、全血または血球濃縮物から選択される。ここで、血球濃縮物は、再懸濁された赤血球沈降物であってもよい。
【００５７】
側方流動装置に通常適用される細胞数を著しく超える、２００μｌを超える全血を用いることが好ましい。本システムに利用可能になった多数の細胞のために、フローサイトメーターを通過する小さい細胞集団の総数も増大し、したがって、より良好な検出能がもたらされる。
【００５８】
希釈剤は、原則として、先行技術において知られているいずれの希釈剤であってもよい。希釈剤は、生理食塩水、希釈剤１、希釈剤２（ＤｉａＭｅｄ）、希釈剤Ｆ（Ｍｅｄｉｏｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）から選択されることが好ましい。細胞を、好ましくは、１００μｌ〜２００μｌの範囲に希釈するために用いられる。これまでに開示された方法とは対照的に、比較的高い細胞濃度および少ない赤血球のフローを達成するよう、総懸濁液の希釈剤の割合は、用いられる全血または赤血球沈降物のものよりも低いことが好ましい。
【００５９】
アッセイを実施することは、適用されたサンプルが供給ゾーンから指標ゾーン（複数の指標ゾーン）を通って、吸収領域まで移動するのに十分な期間にわたってインキュベートすることを含んでなる。
【００６０】
アッセイは、肉眼によって評価してもよいし、自動化された方法で評価してもよい。
【００６１】
本発明の装置の指標ゾーンは、膜上に位置し、サンプル中の決定すべき分析物を捕獲または結合する結合要素を含んでなる。指標ゾーンにおいて、分析物と結合要素の間の結合反応が検出される。多孔性膜に付着されている特に好ましい結合要素として、抗体または抗体断片またはレクチンがある。指標ゾーンは、各場合において、決定すべき分析物に対する結合要素を含んでなることが好ましい。指標ゾーンは、スポット、ラインおよび／または楔の形であり得る。フローの方向のラインの形の構造が好ましい。小さい細胞集団は、優れた認知性を可能にする、楔の形の構造の指標ゾーンによって検出されることが好ましい。
【００６２】
さらなる好ましい実施形態によれば、本方法は、細胞上に低濃度で存在する分析物、好ましくは、血液型ＤＥＬを決定するために実施され、指標ゾーンは、抗体または抗体混合物を含むことが好ましい。
【００６３】
本発明の方法は、ステップａ）の前に、血液サンプルを遠心分離することによって赤血球沈降物を調製するステップと、沈降物を、ブロメライン、パパインまたはフィシン溶液とともにインキュベートするステップと、酵素処理された沈降物を再懸濁するステップをさらに含む場合もある（例えば、ＡＡＢＢ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ、第１４版、２００３年、６９３ｆｆに記載されるように）。インキュベーションは、５〜６０分の期間にわたって実施される。使用される酵素は、一般に市販されている。
【００６４】
酵素的前処理の利点は、赤血球に対するＤ抗原のより強力な曝露であり、ひいては、測定のより高い感度である。
【００６５】
本発明の方法（変形インキュベーション法）では、ステップａ）において、約１００μｌ〜５００μｌの血液サンプルまたは再懸濁された赤血球沈降物を適用することが好ましい。これは、側方流動装置に通常適用される粒子の量および容積を著しく超える。
【００６６】
本発明の方法では、ステップｂ）において、約１００μｌ〜２００μｌの希釈剤を適用することが好ましい。液体の容積の拡大は、より遅いフローをもたらし、指標ゾーンでの分析物の準インキュベーションにつながる。
【００６７】
指標ゾーンが抗Ｄ抗体を含む場合には、抗Ｄ抗体は、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅまたはＡｌｂａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから市販されているような、ＲＵＭ−１、ＬＤＭ−３、ＥＳＤ１Ｍ、ＴＨ−２８、ＭＳ−２０１、ＭＳ−２６およびＬＤＭ−１から選択されることが好ましい。しかしまた、抗体混合物あるいはアフィニティー精製されたポリクローナル抗血清を使用することも可能である。
【００６８】
２指標ゾーン法および装置
インキュベーション法に関する上記の説明はまた、特に断りのない限り、２指標ゾーン法にも当てはまる。
【００６９】
好ましい実施形態では、本方法は、ヘマトクリット値を決定するために実施され、指標ゾーンは、抗体または抗体混合物を含むことが好ましく、ステップｄ）において赤血球が指標ゾーンに結合される全体パターンが決定される。
【００７０】
本方法のさらに好ましい実施形態では、本装置は、単一のフロートラック中に配置される少なくとも２つの指標ゾーンを含み、指標ゾーンが、同じ細胞結合分析物に対する同一の結合要素を含む。
【００７１】
本発明のこの実施形態は、２以上のこのような一連の指標ゾーンを含む。指標ゾーンは、スポット、ラインおよび／または楔の形であり得る。フローの方向の線の形の構造が好ましい。小さい細胞集団は、優れた認知性を可能にする、楔の形の構造の指標ゾーンによって検出されることが有利である。２指標ゾーン法によって、主要な細胞集団に加え、小さい細胞集団が表され、小さい細胞集団に対して向けられる指標ゾーンが供給ゾーンに関して近位にあることが可能になる。各場合において、単一のフロートラック中の２つの指標ゾーンのうち近位指標ゾーンが、フローの方向にラインとして適用され、各場合において遠位の指標ゾーンがスポットとして適用される配置が特に好ましい。
【００７２】
好ましい実施形態では、各場合において、異なる結合要素で満たされた少なくとも２つの指標ゾーンを含有する少なくとも２つのフロートラックが、膜上に位置づけられる。
【００７３】
本発明のさらに好ましい一実施形態では、装置は、少なくとも２つの指標ゾーンを含有する少なくとも２つのフロートラックを有し、結合要素の濃度が、供給ゾーンに関して近位から遠位に増加または減少する。これによってサンプル中に存在する赤血球の量が、総容積に対して定量的に評価され、それによって、ヘマトクリットをおおよそ決定することが可能となる。
【００７４】
さらに、少なくとも２つの指標ゾーンを含有する少なくとも２つのフロートラックを有し、第１のフロートラック中の抗体スポットの濃度が、第２のフロートラック中の濃度と異なる装置が好ましい。
【００７５】
さらなる好ましい一実施形態によれば、本発明の方法は、ｍｉｘｅｄ−ｆｉｅｌｄ反応において細胞結合分析物を同時に決定するために、または同種血輸血を検出するために実施され、これでは、装置は、サンプル液体が、各フロートラック中の２以上指標ゾーンを通過し、指標ゾーンが、異なる細胞結合分析物に対する結合要素を含むような方法でフローの方向に縦に並んで配置される少なくとも２つの指標ゾーンを含む。
【００７６】
細胞結合分析物が、Ａ、Ｂ、ＡＢ、Ｄ、Ｃ、ｃ、Ｅ、ｅ、Ｃｗ、Ｋ、ｋ、Ｊｋａおよび／またはＪｋｂなどの血液型抗原から選択されることが好ましい。血液型抗原が、反応対Ａ，Ｂ；Ｄ＋，Ｄ−；Ｋ，ｋ；Ｃ，ｃおよび／またはＥ，ｅによって決定されることが好ましい。
【００７７】
インキュベーション法について上記で定義されるような、分析物に対する結合要素が、抗体、抗体フラグメント、レクチン、レクチン断片またはそれらの混合物から選択されることが好ましい。
【００７８】
本発明のさらなる態様によれば、本装置は、上記の２指標ゾーン法を実施するために提供される。
【実施例１】
【００７９】
ｍｉｘｅｄ−ｆｉｅｌｄ反応の測定
試験ストリップの調製：２種の異なる抗体の各場合における連続適用を行う  
試験ストリップは、中央の供給ゾーン、２つの指標ゾーン領域および２つの吸収領域からなる。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＨｉＦｌｏｗ  Ｐｌｕｓ  ０７５種類の膜を、１０対の設計のために大きさ１９×７５ｍｍ（幅／長さ；ｙ／ｘ）のストリップに切断し、支持層（例えば、Ｇ＆Ｌによる裏打ちシート）に貼り付ける。中央供給ゾーン（双方向フロー）を用い、それぞれ、種々の血液型特異的モノクローナル抗体の溶液の０．３μｌラインおよび０．１μｌスポットを、供給ゾーンの両側で平行列の指標ゾーン領域に、ディスペンサー、例えば、ＡＤ３２００（Ｂｉｏｄｏｔ）を用いて適用し、各場合において２種の異なる抗体（一方はスポットとして、もう一方はラインとして）の連続適用を行う：
【００８０】
抗Ａ−クローン  Ｂｉｒｍａ−１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＴＬ）；抗Ｂ−クローン  ＬＢ−２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＴＮ）；抗Ｄ−クローン  ＬＤＭ３（Ａｌｂａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｚ７１８０１００）；抗Ｃ−クローン  ＭＳ−２４（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＦＦＭＵ、ＫＧ）；抗ｃ−クローン  ＭＳ−３３（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＫＮ）；抗Ｅ−クローン  ＭＳ−８０＋ＭＳ−２５８（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＴＡ）；クローン抗ｅ  ＭＳ−２１＋ＭＳ−６３（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＦＦＭＵ、ＫＬ＋ＫＱ）；抗Ｋ−クローン  ＭＳ−５６、（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＫＯ）；抗−ｋ（ＡｌｂａＣｌｏｎｅ、Ａｌｂａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。抗ＲＢＣ（抗ヒトＲＢＣのウサギＩｇＧ画分、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、２０９−４１３９）。
【００８１】
スポットとして適用される抗体は、各場合においてｙ軸に沿って３ｍｍの間隔で、膜の上側３．５ｍｍを出発して、位置ｘ＝２２ｍｍ（供給ゾーンの左に）または位置ｘ＝５３ｍｍ（供給ゾーンの右に）に位置づける。ラインとして適用される抗体は、各場合においてｙ軸に沿って３ｍｍの間隔で、膜の上側３．５ｍｍを出発して、位置ｘ＝２５〜２８ｍｍ（供給ゾーンの左に）または位置ｘ＝３７〜５０（供給ゾーンの右に）に位置づける。抗体は、１５ｍＭリン酸カリウムバッファーｐＨ７．５、１０％（ｖ／ｖ）メタノールに以下のとおりに希釈する：抗Ａ抗体１：３、抗Ｂ抗体１：２、抗ＡＢ抗体１：４、抗Ｄ抗体１：４、抗ＲＢＣ抗体１：３。すべてのその他の抗体溶液は、予備希釈しないが、１０％（ｖ／ｖ）にメタノールと混合する。抗体を分配した後、膜を４０℃で２０分間乾燥させ、次いで、試験を実施するまで一定湿度で保存する。膜と３ｍｍ重なる１９×２０ｍｍ吸収バッド（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｌｌ、３００）を、供給ゾーンから遠位の両末端に貼り付ける。位置ｙ＝３２．５〜３７．５ｍｍに、おけのような形の密閉要素（Ｐｉｔｚｎｅｒ製のクローズドセルラバーＥＰＤＭ１４０）を貼り付けることによって前記膜の幅全体にわたって、供給ゾーンを残りの膜から分離する。
【００８２】
近位（ライン）      遠位（スポット）
供給ゾーンの左に：
抗Ａ            →  抗Ｂ
抗Ｂ            →  抗Ａ
抗Ｄ            →  抗ＲＢＣ
抗ＲＢＣ        →  抗Ｄ
抗Ｋ            →  抗ｋ
供給ゾーンの右に：
抗Ｃ            →  抗ｃ
抗ｃ            →  抗Ｃ
抗Ｅ            →  抗ｅ
抗ｅ            →  抗Ｅ
抗ｋ            →  抗Ｋ
【００８３】
ｍｉｘｅｄ−ｆｉｅｌｄ反応を検出するのに適した側方流動装置の設計：適した寸法は、例として理解されなければならない。
【００８４】
全血試験混合物：
５０μｌの抗凝固処理全血または新たに採取した未変性血を、２００μｌの希釈剤Ｆ（Ｍｅｄｉｏｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）と混合する。１００μｌの得られた懸濁液を供給ゾーンに適用する。供給ゾーンが「乾いてしまっている（ｒｕｎ  ｄｒｙ）」場合には、３００μｌの希釈剤Ｆを適用する。
赤血球沈降物試験混合物：
５０μｌの赤血球沈降物（抗凝固処理全血を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、赤血球沈降物は、下部の赤い相中に位置する）を、４００μｌの希釈剤Ｆと混合する。１００μｌの得られた懸濁液を、供給ゾーンに適用する。供給ゾーンが「乾いてしまっている」場合は、３００μｌの希釈剤Ｆを適用する。
【００８５】
結果は、約５分後に読み取ることができ、わずかに赤色の楔（「半月」−小さい細胞集団）から強力な赤色のバンドまたは強力な赤色のスポット（主要な細胞集団）によって示される。
【００８６】
本発明の２指標ゾーン法を用いるｍｉｘｅｄ−ｆｉｅｌｄ反応の検出：血液サンプルの検査の結果、１００％Ａ ｃｃ Ｄ． ｅｅおよび０％Ｂ ＣＣ Ｄ． ＥＥ；  血液サンプルの検査の結果、９８％Ａ ｃｃ Ｄ． ｅｅおよび２％Ｂ ＣＣ Ｄ． ＥＥ。
【００８７】
主要な細胞集団の上のわずかな楔（半月）の形の小さい細胞集団が検出された。
【実施例２】
【００８８】
同種血輸血（血液ドーピング）
試験ストリップを、実施例１と同様の方法で調製した。
【００８９】
近位（ライン）      遠位（スポット）
抗Ｄ            →  抗ＲＢＣ
抗ＲＢＣ        →  抗Ｄ
抗Ｋ            →  抗ｋ
抗ｋ            →  抗Ｋ
抗Ｃ            →  抗ｃ
抗ｃ            →  抗Ｃ
抗Ｅ            →  抗ｅ
抗ｅ            →  抗Ｅ
抗Ｊｋａ        →  抗Ｊｋｂ
抗Ｊｋｂ        →  抗Ｊｋａ
抗Ｃｗ          →  抗ＲＢＣ
抗ＲＢＣ        →  抗Ｃｗ
【００９０】
全血試験混合物：
５０μｌの抗凝固処理全血または新たに採取した未変性血を、２００μｌの希釈剤Ｆと混合する。１００μｌの得られた懸濁液を供給ゾーンに適用する。供給ゾーンが「乾いてしまっている（run dry）」場合には、３００μｌの希釈剤Ｆを適用する。
【００９１】
赤血球沈降物試験混合物：
５０μｌの赤血球沈降物を、４００μｌの希釈剤Ｆと混合する。１００μｌの得られた懸濁液を、供給ゾーンに適用する。供給ゾーンが「乾いてしまっている」場合は、３００μｌの希釈剤Ｆを適用する。
【００９２】
結果は、約５分後に読み取ることができ、わずかに赤色の楔（「半月」−小さい細胞集団）から強力な赤色のバンドまたは強力な赤色のスポット（主要な細胞集団）によって示される。
【実施例３】
【００９３】
胎児母体間出血（ＦＭＨ）の検出
試験ストリップを、実施例１におけるように調製し、抗Ｄのみを適用する。抗体混合物よりも個々の抗体を適用することが好ましい。好ましい抗体：ＲＵＭ−１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＬＤＭ−３（Ａｌｂａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）またはＥＳＤ１Ｍ（Ａｌｂａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＴＨ−２８、ＭＳ−２０１、ＭＳ−２６（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＬＤＭ−１（Ａｌｂａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。
【００９４】
試験混合物ａ）：
４００μｌの抗凝固処理全血または新たに採取した未変性血を、１００μｌの希釈剤Ｆと混合する。３００μｌの得られた懸濁液を供給ゾーンに適用する。供給ゾーンが「乾いてしまっている」場合には、４００μｌの希釈剤Ｆを適用する。
【００９５】
結果は、約２０分後に読み取ることができ、わずかに赤色の楔（小さい細胞集団）から強力な赤色のバンドまたは強力な赤色のスポット（主要な細胞集団）によって示される。
【００９６】
試験混合物ｂ）：ａ）と同様であるが、血液をブロメラーゼ（Ｂｒｏｍｅｌａｓｅ）で前処理する。
３ｍｌの抗凝固処理全血または新たに採取した未変性血を、１５００ｒｐｍで３分間遠心分離する。その後、６００μｌの細胞沈降物を、第２の容器に移し、そこで、６００μｌの市販のブロメライン溶液（例えば、Ｍｅｄｉｏｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ製のブロメラーゼ（Ｂｒｏｍｅｌａｓｅ））と混合し、３７℃で１５分間インキュベートする。これに続いて、０．９％ＮａＣｌで３回洗浄する。
【００９７】
実際のアッセイについては、１００μｌのこのようにブロメライズされ、洗浄された赤血球沈降物を、２００μｌのＡＢ血漿および２００μｌの希釈剤Ｆ（Ｍｅｄｉｏｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）と混合する。３００μｌの得られた懸濁液を、供給ゾーンに適用する。供給ゾーンが、「乾いてしまっている」場合は、４５０μｌの希釈剤Ｆを適用する。
【００９８】
結果は、約１５分後に読み取ることができ、わずかに赤色の楔（小さい細胞集団）から強力な赤色のバンド（主要な細胞集団）によって示される。
【実施例４】
【００９９】
極めて低い抗原密度で存在する赤血球の特徴：ＤＥＬの検出
試験ストリップを、実施例３においてと同様に調製した。混合物よりもむしろ個々の抗体を適用することが好ましい。好ましい抗体：ＲＵＭ−１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）；ＬＤＭ−３（Ａｌｂａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。
【０１００】
試験混合物ａ）：
４００μｌの抗凝固処理全血または新たに採取した未変性血を、１００μｌの希釈剤Ｆと混合する。３００μｌの得られた懸濁液を供給ゾーンに適用する。供給ゾーンが、「乾いてしまっている」場合は、４００μｌの希釈剤Ｆを適用する。
【０１０１】
結果は、約２０分後に読み取ることができ、わずかに赤色の楔（小さい細胞集団）から強力な赤色のバンド（主要な細胞集団）によって示される。
【０１０２】
試験混合物ｂ）：ａ）と同様であるが、血液はブロメラーゼ（Ｂｒｏｍｅｌａｓｅ）で前処理する。
３ｍｌの抗凝固処理全血または新たに採取した未変性血を、１５００ｒｐｍで３分間遠心分離する。その後、６００μｌの細胞沈降物を、第２の容器に移し、そこで６００μｌの市販のブロメライン溶液（例えば、Ｍｅｄｉｏｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ製のブロメラーゼ（Ｂｒｏｍｅｌａｓｅ））と混合し、３７℃で１５分間インキュベートする。これに続いて、０．９％ＮａＣｌで３回洗浄する。
【０１０３】
実際のアッセイについては、１００μｌのこのようにブロメライズされ、洗浄された赤血球沈降物を、２００μｌのＡＢ血漿および２００μｌの希釈剤Ｆ（Ｍｅｄｉｏｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）と混合する。３００μｌの得られた懸濁液を、供給ゾーンに適用する。供給ゾーンが、「乾いてしまっている」場合は、４５０μｌの希釈剤Ｆを適用する。
【０１０４】
結果は、約１５分後に読み取ることができ、わずかに赤色の楔（小さい細胞集団）から強力な赤色のバンド（主要な細胞集団）によって示される。
【実施例５】
【０１０５】
ヘマトクリット
試験ストリップを、実施例１においてと同様に調製し、各場合において、同一抗体（抗ＲＢＣ）の少なくとも２の（好ましくは５の）アリコートを連続適用する。変形１：抗体の濃度は、近位から遠位に向けて低下する：変形２：複数のフロートラックがあり、各場合において、２（５）の抗体スポットを有し、抗体濃度はフロートラックからフロートラックへと低下する；変形３：変化１および変化２の組み合わせ；変形４：近位抗体適用はライン、続いて、複数のスポットである：
【０１０６】
変形２の適用例：
フロートラック１  抗ＲＢＣ  抗ＲＢＣ  抗ＲＢＣ  抗ＲＢＣ  抗ＲＢＣ（ｃ＝「１．０」）
フロートラック１：抗ＲＢＣ  抗ＲＢＣ  抗ＲＢＣ  抗ＲＢＣ  抗ＲＢＣ（ｃ＝「０．８」）
フロートラック１：抗ＲＢＣ  抗ＲＢＣ  抗ＲＢＣ  抗ＲＢＣ  抗ＲＢＣ（ｃ＝「０．６」）
フロートラック１：抗ＲＢＣ  抗ＲＢＣ  抗ＲＢＣ  抗ＲＢＣ  抗ＲＢＣ（ｃ＝「０．４」）
フロートラック１：抗ＲＢＣ  抗ＲＢＣ  抗ＲＢＣ  抗ＲＢＣ  抗ＲＢＣ（ｃ＝「０．２」）
【０１０７】
全血試験混合物：
５０μｌの抗凝固処理全血または新たに採取した未変性血を、２００μｌの希釈剤Ｆと混合する。１００μｌの得られた懸濁液を供給ゾーンに適用する。供給ゾーンが「乾いてしまっている」場合には、３００μｌの希釈剤Ｆを適用する。
結果は、約５分後に読み取ることができる。
【０１０８】
赤血球沈降物試験混合物：
５０μｌの赤血球沈降物を、４００μｌの希釈剤Ｆと混合する。１００μｌの得られた懸濁液を供給ゾーンに適用する。供給ゾーンに適用する。供給ゾーンが「乾いてしまっている」場合は、３００μｌの希釈剤Ｆを適用する。
結果は、約５分後に読み取ることができる。
【図１】
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