(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗血液凝固剤を含む血液からＨＬＡ−ＤＲ陽性単球を選択的に除去する、ＨＬＡ−ＤＲ陽性単球の選択除去器を製造するための抗酸化剤の使用であって、
前記ＨＬＡ−ＤＲ陽性単球の選択除去器は、表面を改質していないポリエステル不織布からなる細胞除去フィルターを備え、
前記細胞除去フィルターが、抗酸化剤を含む充填液で充填され、かつ、放射線滅菌され、
前記抗血液凝固剤は、クエン酸およびその塩からなる群から選択される少なくとも１種であり、
前記抗酸化剤は、ピロ亜硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸カリウム、チオ硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、次亜リン酸、アスコルビン酸、およびアスコルビン酸誘導体からなる群から選択される少なくとも１種である、ＨＬＡ−ＤＲ陽性単球の選択除去器を製造するための抗酸化剤の使用。
【請求項２】
前記充填液が、３００ｐｐｍ以上のピロ亜硫酸ナトリウムを含む、請求項１に記載の抗酸化剤の使用。
【請求項３】
前記放射線が、γ線または電子線である、請求項１または２に記載の抗酸化剤の使用。
【請求項４】
抗血液凝固剤を含む血液からＨＬＡ−ＤＲ陽性単球を選択的に除去するためのＨＬＡ−ＤＲ陽性単球の選択除去器であって、
表面を改質していないポリエステル不織布からなる細胞除去フィルターを備え、
前記細胞除去フィルターが、抗酸化剤を含む充填液で充填され、かつ、放射線滅菌され、
前記抗血液凝固剤は、クエン酸およびその塩からなる群から選択される少なくとも１種であり、
前記抗酸化剤は、ピロ亜硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸カリウム、チオ硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、次亜リン酸、アスコルビン酸、およびアスコルビン酸誘導体からなる群から選択される少なくとも１種である、ＨＬＡ−ＤＲ陽性単球の選択除去器。
【請求項５】
前記充填液が、３００ｐｐｍ以上のピロ亜硫酸ナトリウムを含む、請求項４に記載の選択除去器。
【請求項６】
前記放射線が、γ線または電子線である、請求項４または５に記載の選択除去器。
【請求項７】
表面を改質していないポリエステル不織布からなり、上流側の第１の流路および下流側の第２の流路に接続され、抗酸化剤を含む充填液を充填して放射線滅菌された細胞除去フィルターと、
前記第１の流路に接続され、かつ、抗血液凝固剤を含む血液を前記細胞除去フィルターに供給することができる、クエン酸およびその塩からなる群から選択される少なくとも１種の抗血液凝固剤を含む容器と、
を備えたＨＬＡ−ＤＲ陽性単球の選択除去器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＬＡ−ＤＲ陽性単球の選択除去器及び該選択除去器を製造するための抗酸化剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
白血球除去フィルターを用いて選択的に白血球を除去する技術は、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、及びクローン病などの自己免疫性疾患、並びに白血病などの治療を目的として、開発され改良されてきた。現在、不織布などをフィルターとして用いた白血球除去器が開発されている。
白血球除去療法の対象となる疾患には、さまざまな免疫細胞による免疫反応が深く関与している。免疫反応に大きな役割を担うＴ細胞は、その表面に存在する抗原レセプターに抗原が結合することによって活動を開始するが、Ｔ細胞の反応には抗原提示細胞の存在が必要である。Ｔ細胞は抗原提示細胞上の主要組織適合抗原（ＭＨＣ抗原）と抗原の組み合わせに反応する。【０００３】
ＭＨＣ抗原はヒトの場合ＨＬＡ抗原と呼ばれ、白血球のうち抗原提示細胞となる分画にはＨＬＡ−ＤＲ抗原が発現している。活動を開始したＴ細胞は、他の白血球分画により抗原提示を受け、さらに活性化され、免疫反応が進んでいく。活性化された白血球は腸上皮細胞の傷害や骨破壊を起こし、疾患の発症につながる。
このようにＨＬＡ−ＤＲ抗原陽性細胞である抗原提示細胞は、免疫反応の最初の段階から、さらに、それに続く反応にも深く関与する重要な免疫細胞であるといえる。
また、白血球除去器の対象疾患である関節リウマチや潰瘍性大腸炎の患者は、健常人に比べてＨＬＡ−ＤＲ抗原陽性細胞の割合が高いことも知られている（非特許文献１および２を参照）。【０００４】
白血球を白血球除去フィルターにて選択的に除去する技術として、特許文献１には、多量のクエン酸を血液に添加することにより、造血幹細胞の粘着性を適度に弱めて、造血幹細胞の回収率を向上させる方法が開示されている。
また、特許文献２には、単球および／または単球由来のマクロファージを選択的に除去するフィルター装置が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平１１−３２２６１８号公報
【特許文献２】特許第３８１２９０９号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Mottonen M. et.al., Immunology, 2000, vol.100, p.238-244
【非特許文献２】Sawada K. et.al., Jpn. J. Apheresis., 1995, vol.14. No.1, p.48-50
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
抗原提示細胞、Ｔ細胞を含むリンパ球以外の白血球分画としては顆粒球がある。顆粒球も活性酸素の産生による細胞傷害性などで疾患の発症に関与する。顆粒球の活性化にも抗原提示細胞である単球や、抗原提示により活性化されたリンパ球の関与は大きい。白血球による免疫反応の開始段階である抗原提示を制御することで、ほとんどの免疫反応を制御することができると考えられる。【０００８】
従来の白血球除去療法では、免疫細胞のさまざまな分画を除去しているに過ぎない。免疫反応に、より大きく関与する抗原提示細胞を選択的に除去することができれば、白血球除去の治療効果の効率がより向上すると考えられる。特に、白血球除去の治療効果の効率を上げるには、粒子状の大きな抗原を食作用（ファゴサイトーシス）により取り込んで抗原提示するＨＬＡ−ＤＲ陽性単球の選択的除去が重要であると考えられる。
しかしながら、臨床で使用できるＨＬＡ−ＤＲ陽性単球の選択除去器は未だ知られておらず、特許文献１および２にも、ＨＬＡ−ＤＲ陽性単球を選択的に除去することができる手段は開示されていない。【０００９】
上記事情に鑑みて、本発明が解決しようとする課題は、臨床で使用可能な、ＨＬＡ−ＤＲ陽性単球の選択除去器を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、抗酸化剤を含む充填液を接触させて放射線滅菌した細胞除去フィルターを備える除去器に、クエン酸またはその塩を含む抗凝固剤の存在下で血液を流すと、ＨＬＡ−ＤＲ陽性単球が選択的に除去されることを見出し、本発明を完成した。【００１１】
すなわち、本発明は、以下のＨＬＡ−ＤＲ陽性単球の選択的除去器を製造するための抗酸化剤の使用、ＨＬＡ−ＤＲ陽性単球の選択的除去器およびＨＬＡ−ＤＲ陽性単球を選択的に除去する方法を提供する。
（１）
抗血液凝固剤を含む血液からＨＬＡ−ＤＲ陽性単球を選択的に除去する、ＨＬＡ−ＤＲ陽性単球の選択除去器を製造するための抗酸化剤の使用であって、
前記ＨＬＡ−ＤＲ陽性単球の選択除去器は、表面を改質していないポリエステル不織布からなる細胞除去フィルターを備え、
前記細胞除去フィルターが、抗酸化剤を含む充填液で充填され、かつ、放射線滅菌され、
前記抗血液凝固剤は、クエン酸およびその塩からなる群から選択される少なくとも１種であり、
前記抗酸化剤は、ピロ亜硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸カリウム、チオ硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、次亜リン酸、アスコルビン酸、およびアスコルビン酸誘導体からなる群から選択される少なくとも１種である、ＨＬＡ−ＤＲ陽性単球の選択除去器を製造するための抗酸化剤の使用。
（２）
前記充填液が、３００ｐｐｍ以上のピロ亜硫酸ナトリウムを含む、前記（１）に記載の抗酸化剤の使用。
（３）
前記放射線が、γ線または電子線である、前記（１）または（２）に記載の抗酸化剤の使用。
（４）
抗血液凝固剤を含む血液からＨＬＡ−ＤＲ陽性単球を選択的に除去するためのＨＬＡ−ＤＲ陽性単球の選択除去器であって、
表面を改質していないポリエステル不織布からなる細胞除去フィルターを備え、
前記細胞除去フィルターが、抗酸化剤を含む充填液で充填され、かつ、放射線滅菌され、
前記抗血液凝固剤は、クエン酸およびその塩からなる群から選択される少なくとも１種であり、
前記抗酸化剤は、ピロ亜硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸カリウム、チオ硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、次亜リン酸、アスコルビン酸、およびアスコルビン酸誘導体からなる群から選択される少なくとも１種である、ＨＬＡ−ＤＲ陽性単球の選択除去器。
（５）
前記充填液が、３００ｐｐｍ以上のピロ亜硫酸ナトリウムを含む、前記（４）に記載の選択除去器。
（６）
前記放射線が、γ線または電子線である、前記（４）または（５）に記載の選択除去器。
（７）
上流側の第１の流路および下流側の第２の流路に接続され、抗酸化剤を含む充填液を充填して放射線滅菌された細胞除去フィルターと、
前記第１の流路に接続され、かつ、抗血液凝固剤を含む血液を前記細胞除去フィルターに供給することができる、クエン酸およびその塩からなる群から選択される少なくとも１種の抗血液凝固剤を含む容器と、
を備えたＨＬＡ−ＤＲ陽性単球の選択除去器。
（８）
表面を改質していないポリエステル不織布からなる細胞除去フィルターを備える選択除去器を用いて、抗血液凝固剤を含む血液からＨＬＡ−ＤＲ陽性単球を選択的に除去する方法であって、
前記細胞除去フィルターを、抗酸化剤を含む充填液で充填する工程、
前記充填液で充填された細胞除去フィルターを放射線滅菌する工程、および
クエン酸またはその塩を含む抗血液凝固剤を含有する血液を前記フィルター装置に通液して濾過する工程を含み、
前記抗血液凝固剤は、クエン酸およびその塩からなる群から選択される少なくとも１種であり、
前記抗酸化剤は、ピロ亜硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸カリウム、チオ硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、次亜リン酸、アスコルビン酸、およびアスコルビン酸誘導体からなる群から選択される少なくとも１種である、
ＨＬＡ−ＤＲ陽性単球を選択的に除去する方法。
（９）
前記充填液が、３００ｐｐｍ以上のピロ亜硫酸ナトリウムを含む、前記（８）に記載の方法。
（１０）
前記放射線が、γ線または電子線である、前記（８）または（９）に記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、臨床で安全に使用できる、ＨＬＡ−ＤＲ陽性単球の選択除去器を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本実施の形態の選択除去器の一例の概略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下に本発明を実施するための形態（以下、本実施の形態という。）について詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
【００１５】
本実施の形態のＨＬＡ−ＤＲ陽性単球の選択除去器を製造するための抗酸化剤の使用は、抗血液凝固剤を含む血液からＨＬＡ−ＤＲ陽性単球を選択的に除去する、ＨＬＡ−ＤＲ陽性単球の選択除去器の製造のための抗酸化剤の使用であって、
前記ＨＬＡ−ＤＲ陽性単球の選択除去器は、表面を改質していないポリエステル不織布からなる細胞除去フィルターを備え、
前記細胞除去フィルターが、抗酸化剤を含む充填液で充填され、かつ、放射線滅菌され、
前記抗血液凝固剤は、クエン酸およびその塩からなる群から選択される少なくとも１種であり、
前記抗酸化剤は、ピロ亜硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸カリウム、チオ硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、次亜リン酸、アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体からなる群から選択される少なくとも１種である、ＨＬＡ−ＤＲ陽性単球の選択除去器を製造するための抗酸化剤の使用である。
【００１６】
本実施の形態におけるＨＬＡ−ＤＲ陽性単球の選択除去器（以下、単に「選択除去器」と記載する場合がある。）は、従来の白血球除去器と比較してＨＬＡ−ＤＲ陽性単球の除去率が特に高いものであり、全血、血漿、または赤血球製剤もしくは血小板製剤などの血液由来製剤からＨＬＡ−ＤＲ陽性単球を選択的に除去するために使用することができる。
【００１７】
選択除去器として用いる容器としては、細胞除去フィルターを備えることができる容器であれば特に限定されるものではない。
選択除去器としては、特に限定されるものではないが、例えば、細胞除去フィルターを積層状に充填した容器や、円筒状に巻いた細胞除去フィルターを充填した容器などが挙げられる。
選択除去器の容器形状は、特に限定されるものではないが、例えば、円柱状、または三角柱状、四角柱状、六角柱状もしくは八角柱状などの角柱状などが挙げられる。
選択除去器の容器形状は、好ましくは円筒状である。好適な円筒状の選択除去器としては、血液の流れが円筒の外周より入り内側へと流れ、最も内側に集まり血液流出口より出ることを特徴とする容器が挙げられる。また、容器の断面積が血液の流れの入口から出口に向かうに従って、小さくなる形状を有する容器なども好適に用いられる。
本実施の形態において、選択除去器には、さらに、血液を処理する際や選択除去器を洗浄する際に液を流入または流出させるために使用するチューブ、回路などを設けることもできる。
選択除去器の容器の材質としては、ポリカーボネート樹脂などが挙げられる。
【００１８】
本実施の形態における細胞除去フィルターは、表面を改質していないポリエステル不織布からなる。
ポリエステル不織布を積層状にした積層体や、円筒状にポリエステル不織布を巻くことにより細胞除去フィルターとすることができる。
本実施の形態における「表面を改質していないポリエステル不織布」とは、血液とポリエステルが直接接触するように不織布の表面にポリエステルが配置されていることをいい、ポリエステル不織布の表面に親水化処理などが施されていないことを意味する。
親水化処理には、例えば、ポリマーによるコーティングなどが挙げられる。
【００１９】
本実施の形態におけるポリエステル不織布において、ポリエステル不織布の繊維径が吸着や濾過の能力に寄与するため、有効な平均繊維径を有するポリエステル不織布を用いることが好適である。
ポリエステル不織布の繊維径が、大きすぎる場合には接触効率が低下し、小さすぎる場合には凝集塊などの目詰まり物質の吸着量が増加する観点から、ポリエステル不織布の平均繊維径は、好ましくは０．５μｍ以上５０μｍ以下の範囲内であり、より好ましくは１μｍ以上４０μｍ以下の範囲内であり、さらに好ましくは１．５μｍ以上３５μｍ以下の範囲内である。
【００２０】
本実施の形態における「平均繊維径」とは、以下の方法に従って求められる値を意味する。
細胞除去フィルターを構成する１枚または複数枚のポリエステル不織布から目視で実質的に均一と認められる部分をサンプリングする。
サンプリングに際しては、ポリエステル不織布のうち、血液を濾過する際に、血液が透過する部分に該当する有効濾過断面積部分を、１辺が０．５ｃｍの正方形によって区分し、その中から６ケ所をランダムサンプリングする。ランダムサンプリングするには、例えば、区分した箇所の全てに番地を指定した後、乱数表を使うなどの方法で、必要な数の区分を選ぶことにより行う。３ケ所以上好ましくは５ケ所以上のサンプリングした各区分について、走査電子顕微鏡を用いて拡大倍率２５００倍で写真に撮る。
サンプリングした各区分について中央部分及びその近傍の箇所の写真を撮っていき、写真に撮られた繊維の合計本数が区分ごとに１００本を超えるまで写真を撮り、繊維の直径を測定する。
【００２１】
直径とは、繊維軸に対して直角方向の繊維の幅をいう。測定した全ての繊維の直径の和を、繊維の数で割った値を平均繊維径とする。
但し、複数の繊維が重なり合っており、他の繊維の陰になって繊維の幅が測定できない場合、複数の繊維が溶融するなどして、太い繊維になっている場合、著しく直径の異なる繊維が混在している場合等には、これらのデータは考慮せずに、繊維の幅を測定する。
「複数の繊維が重なり合っており、他の繊維の陰になって繊維の幅が測定できない場合」とは、走査電子顕微鏡写真において陰になっている場合を意味し、「複数の繊維が溶融するなどして、太い繊維になっている場合」とは、他の繊維径の平均の１．５倍以上となるものを溶融などしている場合を意味し、「著しく直径の異なる繊維が混在している場合」とは、他の繊維径の平均の２倍以上となる場合を意味する。
【００２２】
ポリエステル不織布の目付けは、目詰まりを抑制し、圧損の上昇を防ぎ、流れをスムーズにする観点から、好ましくは２０ｇ／ｃｍ２以上１１０ｇ／ｃｍ２以下であり、６０ｇ／ｃｍ２以上１００ｇ／ｃｍ２以下である。
【００２３】
本実施の形態における「容器への細胞除去フィルターの充填密度」は、容器中に細胞除去フィルターを充填した時の一定体積当たりの重さを意味するが、容器への細胞除去フィルターの充填密度は、好ましくは０．０１ｇ／ｃｍ３以上０．５ｇ／ｃｍ３以下である。該充填密度は、血液サンプルとの接触効率を上げ、目詰まりを抑制し、圧損の上昇を防ぎ、流れをスムーズにする観点から、より好ましくは０．０３ｇ／ｃｍ３以上０．３ｇ／ｃｍ３以下である。
【００２４】
本実施の形態における細胞除去フィルターは、抗酸化剤を含む充填液で充填される。
本実施の形態における「抗酸化剤」とは、他の分子などに電子を与え易い性質を持つ原子、分子またはイオンを意味し、抗酸化剤は、細胞除去フィルターが酸素により変化を受けるのを抑制する性質を有する。
抗酸化剤は、ピロ亜硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸カリウム、チオ硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、次亜リン酸、アスコルビン酸、およびアスコルビン酸誘導体からなる群から選択される少なくとも１種である。
アスコルビン酸誘導体としては、特に限定されるものではないが、例えば、５−メチル−３、４−ジヒドロキシテトロン（ＭＤＴ）などが挙げられる。
抗酸化剤は１種類で用いてもよいし、２種類以上を混合して用いてもよい。
抗酸化剤としては、取扱い性、安全性の観点から、好ましくはピロ亜硫酸ナトリウムである。
【００２５】
本実施の形態における「細胞除去フィルターが充填液で充填されている」とは、充填液は細胞除去フィルターに接触するように保持されており、充填液中に細胞除去フィルターが浸された状態を意味する。
本実施の形態における「充填液」とは、選択除去器の製造段階で、選択除去器の内部に充填される液体を意味し、充填液には抗酸化剤が添加されている。
抗酸化剤を含む充填液は、抗酸化剤を水、または生理食塩水などの生理的溶液などの充填液に直接添加して溶解するか、またはあらかじめ少量のアルコールなどの溶剤に抗酸化剤を溶解し、得られた溶液を充填液に添加して作成することができる。
抗酸化剤を含む溶液中の抗酸化剤の濃度は、選択除去器に用いられる抗酸化剤の種類および滅菌の条件によって最適な濃度が決定されるが、好ましくは１００ｐｐｍ以上１０００ｐｐｍ以下であり、より好ましくは３００ｐｐｍ以上１０００ｐｐｍ以下である。
【００２６】
本実施の形態における「放射線滅菌」とは、充填液で充填された細胞除去フィルター中に存在する微生物を殺滅または除去することを意味する。
本実施の形態における「放射線」とは、α線、β線、中性子線、または電子線などの粒子線や、Ｘ線またはγ線などの電磁波を含む電離放射線を意味し、放射線は、医療用具の滅菌に常用される観点から、好ましくは電子線またはγ線である。
【００２７】
電子線は荷電粒子線であり、荷電粒子線は照射対象物質の原子の軌道電子または分子に束縛された電子に直接電気的な力を及ぼして電離を起こさせる。
γ線は照射対象物質の原子あるいは原子核との相互作用を介して荷電粒子線を発生させ、二次的に発生した荷電粒子線が電離作用を持つ。
本実施の形態における電子線およびγ線による微生物の滅菌効果は、電離作用により生じたフリーラジカルが微生物のＤＮＡ鎖を損傷し、細胞分裂能を阻害することによるものであり基本的な滅菌原理は同一である。
【００２８】
放射線滅菌に用いる放射線の照射線量は、選択除去器に存在する菌の種類、菌の数、また意図する無菌性保証水準などによって異なり、Ｄ値を測定したり、バリデーションを実施するなどして個々に決定することができるが、一般に用いられる、１０ｋＧｙ以上１００ｋＧｙ以下であることが好適であり、中でも１０ｋＧｙ以上５０ｋＧｙ以下、特に１５ｋＧｙ以上４０ｋＧｙ以下が好適である。
本実施の形態における「Ｄ値」とは、特定の微生物数の９０％を死滅させる、または特定の微生物数を１０分の１に減少させる滅菌処理単位(時間又は吸収線量など)を意味する。
【００２９】
電子線はγ線と比較して短時間で一定線量の照射が終了するため、時間あたりの照射線量（線量率）が高く一般的にラジカルの生成量が少ないため、照射対象物質の酸化劣化を低減させることができる傾向がある。これは線量率が高いと表面で酸素が消費されて内部へ拡散されないうちに消費され尽くすためである。
電子線滅菌の方がγ線滅菌よりもポリエステルの分解が減少する可能性は考えられるが、ラジカルが生成しないわけではない。
【００３０】
本実施の形態のＨＬＡ−ＤＲ陽性単球の選択除去器を用いることにより、抗血液凝固剤を含む血液からＨＬＡ−ＤＲ陽性単球を選択的に除去することができる。ＨＬＡ−ＤＲ陽性単球を選択的に除去することにより、従来の白血球除去の治療効果に比して効率がより向上すると考えられる。
【００３１】
本実施の形態における「ＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞」とは、ヒト血液成分である白血球のうち細胞表面にＨＬＡ−ＤＲ抗原を発現している血球細胞を意味する。
本実施の形態における「ＨＬＡ−ＤＲ陽性単球」とは、単球であるＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞を意味し、「ＨＬＡ−ＤＲ陽性Ｂ細胞」とは、Ｂ細胞であるＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞を意味する。
【００３２】
本実施の形態における「抗血液凝固剤を含む血液」とは、ヒトより採取した新鮮血液に抗血液凝固剤を混合したものを意味する。
【００３３】
本実施の形態における「ＨＬＡ−ＤＲ陽性単球を選択的に除去することができる」とは、除去された白血球に占める除去されたＨＬＡ−ＤＲ陽性単球の割合が１２％以上であることを意味する。
【００３４】
本実施の形態における抗血液凝固剤とは、クエン酸またはその塩からなる群から選択される少なくとも１種である。
抗血液凝固剤としては、特に限定されるものではないが、例えば、クエン酸ナトリウム溶液、ＡＣＤ−Ａ液、ＣＰＤ液などが挙げられる。ＡＣＤ−Ａ(ａｃｉｄ−ｃｉｔｒａｔｅ−ｄｅｘｔｒｏｓｅ)液は、クエン酸ナトリウム、クエン酸、およびブドウ糖からなる溶液であり、ＣＰＤ（ｃｉｔｒａｔｅ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｄｅｘｔｒｏｓｅ）液はクエン酸ナトリウム、クエン酸、ブドウ糖、およびリン酸二水素ナトリウム二水和物からなる溶液である。
抗血液凝固剤は１種類で用いてもよいし、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００３５】
本実施の形態のＨＬＡ−ＤＲ陽性単球の選択除去器は、上流側の第１の流路および下流側の第２の流路に接続され、抗酸化剤を含む充填液を充填して放射線滅菌された細胞除去フィルターと、
前記第１の流路に接続され、かつ、抗血液凝固剤を含む血液を前記細胞除去フィルターに供給することができる、クエン酸およびその塩からなる群から選択される少なくとも１種の抗血液凝固剤を含む容器と、
を備えていることが好適である。
選択除去器10は、例えば図１に記載の構成をなす。第１の流路20は、抗血液凝固剤を含む容器30および細胞除去フィルター40を接続した流路である。第１の流路20は送液ポンプ50に取り付けられ、患者から採血された血液を細胞除去フィルター40に送液することができる。容器30中に貯留された抗血液凝固剤は第１の流路20に供給され、第１の流路20を流れる血液と混合される。そして、この抗血液凝固剤を含む血液が細胞除去フィルター40に導入され、濾過が行われる。第２の流路60は、細胞除去フィルターで濾過された血液を細胞除去フィルター外に導出する流路である。
【００３６】
本実施の形態の抗血液凝固剤を含む血液からＨＬＡ−ＤＲ陽性単球を選択的に除去する方法は、表面を改質していないポリエステル不織布からなる細胞除去フィルターを備える選択除去器を用いることにより血液からＨＬＡ−ＤＲ陽性単球を選択的に除去することのできる方法であり、以下の工程を含む：
前記細胞除去フィルターを、抗酸化剤を含む充填液で充填する工程、
前記充填液で充填された細胞除去フィルターを放射線滅菌する工程、および
クエン酸またはその塩を含む抗血液凝固剤を含有する血液を前記フィルター装置に通液して濾過する工程。
【００３７】
本実施の形態における第一の工程は、選択除去器内に充填液を通液することにより、細胞除去フィルターを充填する工程である。
【００３８】
本実施の形態における第二の工程は、第一の工程により充填液で充填された細胞除去フィルターを充填液の存在下放射線滅菌する工程である。
放射線滅菌の方法は、特に限定されるものではないが、例えば、ＨＬＡ−ＤＲ陽性単球の選択除去器を包装して照射する方法などが挙げられる。
【００３９】
放射線滅菌装置としては、特に限定されるものではないが、例えば、ＪＳ９５００型放射線滅菌装置（ＡＥＣＬ社）などが挙げられる。
【００４０】
本実施の形態における第三の工程は、第二の工程により放射線滅菌された細胞除去フィルターに、抗血液凝固剤を含有する血液を通液して濾過する工程である。
血液を細胞除去フィルターで濾過することにより、細胞除去フィルターにＨＬＡ−ＤＲ陽性単球が捕捉され、ＨＬＡ−ＤＲ陽性単球を選択的に除去することができる。
【００４１】
本実施の形態において、第三の工程において血液を通液する前に、充填液中の抗酸化剤を除くために、細胞除去フィルターをあらかじめ洗浄することが好適である。洗浄に使用する液としては、生理的溶液であれば各種のものを用いることができる。また、血液凝固因子への刺激を抑制するために生理的溶液に抗血液凝固剤を添加した溶液を用いることができ、中でも生理食塩水または生理食塩水に抗血液凝固剤を添加した溶液を好適に用いることができる。
【００４２】
本実施の形態の選択除去器を用いることにより、血液からＨＬＡ−ＤＲ陽性単球を選択的に除去した血液を製造することができる。
本実施の形態においてＨＬＡ−ＤＲ陽性単球を選択的に除去した血液を製造する方法は、
細胞除去フィルターを、抗酸化剤を含む充填液で充填する工程、
充填液で充填された細胞除去フィルターを放射線滅菌する工程、および
クエン酸またはその塩を含む抗血液凝固剤を含有する血液をフィルター装置に通液して濾過する工程を含む。
【００４３】
本実施の形態のＨＬＡ−ＤＲ陽性単球の選択除去器を製造するための抗酸化剤の使用は、前記抗酸化剤を含む充填液が３００ｐｐｍ以上のピロ亜硫酸ナトリウムを含む充填液であることが好適である。
本実施の形態のＨＬＡ−ＤＲ陽性単球の選択除去器を製造するための抗酸化剤の使用は、前記放射線がγ線または電子線であることが好適である。
【００４４】
本実施の形態において、ＨＬＡ−ＤＲ陽性単球の選択除去器の臨床での使用状況には以下のような状況が考えられるが特に限定されるものではない。
関節リウマチ患者または潰瘍性大腸炎患者を対象として臨床で使用される場合には、血液３ＬをＨＬＡ−ＤＲ陽性単球の選択除去器で処理することを週１回ずつ計５回繰り返すことが好適である。
【００４５】
本実施の形態において、血液３Ｌを処理するとは、以下のことを示す。
まず、採血回路、送液ポンプ、返血回路に接続したＨＬＡ−ＤＲ陽性単球の選択除去器に、採血回路に接続した生理的溶液１Ｌを流す。続いて、抗血液凝固剤を添加した生理的溶液５００ｍＬをＨＬＡ−ＤＲ陽性単球の選択除去器に流す。
続いて、採血回路を患者の肘静脈などに接続し、返血回路を患者の別の肘静脈などに接続する。採血回路の分岐には抗凝固剤入りの生理的溶液へつながる導管を接続する。
送液ポンプを５０ｍＬ／ｍｉｎの流速で１時間動かし、抗血液凝固剤を含む生理的溶液を添加した血液３Ｌを選択除去器に通す。血液３Ｌを通し終わったら、生理的溶液を採血回路に接続し、生理的溶液を選択除去器に５００ｍＬ流して患者に血液を返す。
抗血液凝固剤を含む生理的溶液の添加方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、４％（ｗ／ｖ）クエン酸ナトリウムを含む生理的溶液の１容量に対し、血液が５〜４０容量となるようにポンプを動かして血液に生理的溶液を添加する方法などが挙げられる。
【００４６】
採血回路は、肘静脈などに接続できる血液の導入部と、血液の導入部と選択除去器をつなぐ導管からなり、抗血液凝固剤を含む生理的溶液へ続く導管との分岐を有する。抗血液凝固剤を含む生理的溶液へと続く導管には、採血回路とは別に制御できる送液ポンプが接続される。
本実施の形態における「血液の導入部」とは血液を導管まで導く部分のことを意味する。
血液の導入部としては、特に限定されるものではないが、例えば、スパイク針、採血針などが挙げられる。
【００４７】
導管としては、血液および生理的溶液などを送液でき、生体にとって安全に送液できるものであればいかなる導管でも用いることができる。また、導管の材質としては、血液および生理的溶液などの溶液によって有害な物質が溶出しない材質であればいずれの材質でも用いることができる。
導管としては、特に限定されるものではないが、例えば、塩化ビニル、シリコン、ポリプロピレン、ポリエチレンなどが挙げられる。導管としては、強度の観点から、好ましくは塩化ビニルが用いられ、塩化ビニルの具体例としては、ＬＣ−３０００Ｎ（旭化成クラレメディカル社）が挙げられる。
【００４８】
送液ポンプとは、送液手段であればよく、例えば、ポンプなどを用いたあらゆる公知の手段を用いることができる。ポンプの構造としては、ローラーポンプ、フィンガーポンプなどが好適に用いられるが、２０ｍＬ／ｍｉｎ〜３００ｍＬ／ｍｉｎの流速範囲で精度よく送液できるポンプが好ましい。ポンプの具体例としては、プラソートＬＣ（旭化成クラレメディカル社）が挙げられる。
【００４９】
本実施の形態における「生理的溶液」とは、体液とほぼ等張な溶液であって、生きている細胞や組織ができるだけ正常な生理的機能を営むことができるように調製された溶液を意味する。
生理的溶液として、特に限定されるものではないが、例えば、生理食塩液（生理食塩水を含む）、リンゲル液、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、タイロード液などの生理的塩類溶液；ブドウ糖、デキストラン、ヘパリンなどの糖類含有液；抗凝固剤含有液などが挙げられる。
生理的溶液としては、上記に例示した生理的塩類溶液、糖類含有液、抗凝固剤含有液などを少なくとも一つ以上加えた混合液を希釈した液も好ましく用いられる。
生理的溶液は１種類で用いてもよいし、２種類以上を任意の割合で混合した混合液として用いてもよく、中でも、生理食塩液が用いられる。
【００５０】
本実施の形態において、患者から採取した血液をＨＬＡ−ＤＲ陽性単球の選択除去器により処理することにより、ＨＬＡ−ＤＲ陽性単球が選択的に除去された血液製剤を得ることができる。
患者から採取した血液としては、特に限定されるものではないが、例えば、全血、血漿、または赤血球製剤もしくは血小板製剤などの血液由来製剤などが挙げられる。
【実施例】
【００５１】
以下に、本実施の形態を実施例及び比較例によってさらに具体的に説明するが、本実施の形態はこれらの実施例のみに限定されるものではない。【００５２】
[実施例１]
ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）不織布（平均繊維径２．３μｍ、目付９０ｇ／ｍ２、厚み０．４５ｍｍ）を直径６．８ｍｍの円状に切り取り、１１枚を重ねて細胞除去フィルターとし、該細胞除去フィルターを直径６．８ｍｍで容器容量１ｍＬのポリエチレン製のカラム（モビコール（登録商標）、モビテック社）に積層した（充填密度  ０．１４ｇ／ｃｍ３）。カラム内をピロ亜硫酸ナトリウム水溶液（ピロ亜硫酸ナトリウム：林純薬）で充填し、該カラムを段ボールケースに入れて包装し、２５ｋＧｙのγ線を照射して滅菌処理した。得られたカラムを選択除去器とした。水溶液中のピロ亜硫酸ナトリウムの濃度は８００ｐｐｍとした。
健常人ボランティアより血液を採取し、抗血液凝固剤としてクエン酸ナトリウム水和物を４％（ｗ／ｖ）含むクエン酸ナトリウム液（チトラミン（登録商標）、扶桑薬品）が９．１％（ｖ／ｖ）含まれるようにクエン酸ナトリウム液を添加したヒト新鮮血液（クエン酸ナトリウム水和物の最終濃度０．３６ｇ／１００ｍＬ）を濾過前サンプルとした。
滅菌済みの選択除去器を生理食塩水（大塚生食注（登録商標）、大塚製薬）を通液することで洗浄し、濾過前サンプルを０．１８ｍＬ／分で１０分濾過した。その際出口より流出する血液を濾過後サンプルとして、以下の測定に用いた。
白血球除去率については濾過前後の白血球濃度を自動血球数測定装置（Ｓｙｓｍｅｘ  ＳＦ−３０００（東亜医用電子製））を用いて測定し次式（１）より算出した。
式（１）：
白血球除去率（％）＝［１−（濾過後白血球濃度／濾過前白血球濃度）］×１００【００５３】
[比較例１]
充填液として、水（ピロ亜硫酸ナトリウムを含まない）を充填する以外は、実施例１と同様の方法で白血球除去器を得た。
抗血液凝固剤としてメシル酸ナファモスタット１０ｍｇ／１００ｍＬの溶液が１２％（ｖ／ｖ）含まれるようにメシル酸ナファモスタット溶液（フサン（登録商標）、鳥居薬品、以下、同じ。）を添加したヒト新鮮血液（メシル酸ナファモスタットの最終濃度１．２ｍｇ／１００ｍＬ）を濾過前サンプルとした。上記白血球除去器を用い、実施例１と同様の方法で濾過前サンプルを濾過した。白血球濃度を測定して、白血球除去率を算出した。【００５４】
[比較例２]
抗血液凝固剤としてメシル酸ナファモスタット１０ｍｇ／１００ｍＬの溶液が１２％（ｖ／ｖ）含まれるようにメシル酸ナファモスタット溶液を添加したヒト新鮮血液（メシル酸ナファモスタットの最終濃度１．２ｍｇ／１００ｍＬ）を濾過前サンプルとした。実施例１の選択除去器を用い、実施例１と同様の方法で濾過前サンプルを濾過した。白血球濃度を測定して、白血球除去率を算出した。【００５５】
[比較例３]
比較例１と同様に作成した白血球除去器を用いた以外は、実施例１と同様の方法で濾過を行った。白血球濃度を測定して、白血球除去率を算出した。【００５６】
[実施例２〜４]
実施例１と同様に作成したカラム内を１００ｐｐｍ、３００ｐｐｍまたは１０００ｐｐｍのピロ亜硫酸ナトリウム水溶液で充填した以外は実施例１と同様の方法で白血球除去率を算出した。【００５７】
[実施例５]
抗血液凝固剤としてＡＣＤ−Ａ液（０．８％クエン酸、２．２％クエン酸ナトリウム、２．２％ブドウ糖溶液を含む、テルモ社）が１２％（ｖ／ｖ）含まれるようにＡＣＤ−Ａ液を添加したヒト新鮮血液を濾過前サンプルとした。実施例１の選択除去器を用い、実施例１と同様の方法で濾過前サンプルを濾過した。白血球濃度を測定して、白血球除去率を算出した。
実施例１〜５および比較例１〜３の結果を表１に示す。【００５８】
本実施の形態に用いられるＨＬＡ−ＤＲ陽性単球の選択的除去の試験方法は以下のとおりである。【００５９】
[試験例１]
濾過前、濾過後サンプルをそれぞれ蛍光標識された抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（ＢＤバイオサイエンス社）と反応させてフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ、ＢＤバイオサイエンス社）で解析した。抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体と反応したものをＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞とし、サンプルごとのＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞濃度を算出した。
各実施例および比較例における、除去されたＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞の白血球に占める割合を次式（２）により算出した。
式（２）：
除去されたＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞の白血球に占める割合（％）＝（濾過前ＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞濃度−濾過後ＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞濃度）／（濾過前白血球濃度−濾過後白血球濃度）×１００【００６０】
除去されたＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞の白血球に占める割合は、実施例１〜５でそれぞれ２０．８％、１７．２％、１９．５％、２６．９％、１５．７％であった。また、比較例１〜３でそれぞれ７．５％、７．５％、１６．０％であった。
算出された割合について、比較例１の値を１．０とした結果を表１に示す。【００６１】
【表１】
0005484354.tif 000002
【００６２】
[試験例２]
試験例１と同様に、サンプルをそれぞれ蛍光標識された抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、抗ＣＤ１４抗体（ＢＤバイオサイエンス社）と反応させてフローサイトメトリーで解析した。抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体および抗ＣＤ１４抗体と反応したものをＨＬＡ−ＤＲ陽性単球とし、サンプルごとのＨＬＡ−ＤＲ陽性単球濃度を算出した。
各実施例および比較例における、除去されたＨＬＡ−ＤＲ陽性単球の白血球に占める割合を次式（３）により算出した。
式（３）：
除去されたＨＬＡ−ＤＲ陽性単球の白血球に占める割合（％）＝（濾過前ＨＬＡ−ＤＲ陽性単球濃度−濾過後ＨＬＡ−ＤＲ陽性単球濃度）／（濾過前白血球濃度−濾過後白血球濃度）×１００【００６３】
除去されたＨＬＡ−ＤＲ陽性単球の白血球に占める割合は実施例１〜５でそれぞれ１８．３％、１２．２％、１６．５％、２８．４％、１８．６％であった。また、比較例１〜３でそれぞれ８．７％、８．７％、１０．３％であった。
算出された割合について、比較例１の値を１．０とした結果を表２に示す。【００６４】
【表２】
0005484354.tif 000003
【００６５】
[試験例３]
試験例１と同様に、サンプルをそれぞれ蛍光標識された抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、抗ＣＤ１９抗体（ＢＤバイオサイエンス社）と反応させてフローサイトメトリーで解析した。抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体および抗ＣＤ１９抗体と反応したものをＨＬＡ−ＤＲ陽性Ｂ細胞とし、サンプルごとのＨＬＡ−ＤＲ陽性Ｂ細胞濃度を算出した。
各実施例および比較例における、除去されたＨＬＡ−ＤＲ陽性Ｂ細胞の白血球に占める割合を次式（４）により算出した。
式（４）：
除去されたＨＬＡ−ＤＲ陽性Ｂ細胞の白血球に占める割合（％）＝（濾過前ＨＬＡ−ＤＲ陽性Ｂ細胞濃度−濾過後ＨＬＡ−ＤＲ陽性Ｂ細胞濃度）／（濾過前白血球濃度−濾過後白血球濃度）×１００【００６６】
除去されたＨＬＡ−ＤＲ陽性Ｂ細胞の白血球に占める割合は実施例１〜５でそれぞれ２４．６％、２４．６％、２４．６％、２４．６％、２４．８％であった。また、比較例１〜３でそれぞれ５．６％、５．６％、２４．６％であった。
算出された除去された各分画の白血球に占める割合について、比較例１の値を１．０とした結果を表３に示す。【００６７】
【表３】
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【００６８】
表１〜３の結果から、ピロ亜硫酸ナトリウムを含む充填液の存在下で選択除去器をガンマ線滅菌し、クエン酸および／またはクエン酸ナトリウムを含む抗血液凝固剤の存在下で血液を処理した実施例１〜５では、ＨＬＡ−ＤＲ陽性単球が選択的に除去されることがわかる。
ＨＬＡ−ＤＲ陽性単球の選択的除去には、クエン酸および／またはクエン酸の塩のカルシウムキレート作用による細胞の接着能低下が関与していると推定される。
また、充填液の抗酸化作用により、不織布表面の陰性荷電が減少した結果、ＨＬＡ−ＤＲ陽性単球に対する選択性が増加したと考えられる。【００６９】
本出願は、２００８年１１月２５日出願の日本特許出願（特願２００８−３００１７６号）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明のＨＬＡ−ＤＲ陽性単球の選択除去器は、ＨＬＡ−ＤＲ陽性単球を選択的に除去する際に有用に用いることができる。
本発明のＨＬＡ−ＤＲ陽性単球の選択除去器を製造するための抗酸化剤の使用、ＨＬＡ−ＤＲ陽性単球の選択除去器およびＨＬＡ−ＤＲ陽性単球を選択的に除去する方法は、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ（悪性関節リウマチを含む）、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、クローン病などの自己免疫性疾患、白血病などの治療に産業上の利用可能性を有する。
【符号の説明】
【００７１】
10  選択除去器
20  第１の流路
30  抗血液凝固剤を含む容器
40  細胞除去フィルター
50  送液ポンプ
60  第２の流路
【図１】
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