(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
流路の吐出口から液滴を発生させる液滴発生手段と、
前記流路に微小粒子が流通される前に、前記吐出口から吐出されるコントロール液の液滴の吐出方向を、流路に対し上流方向および／または下流方向から確認する吐出方向確認手段と、
前記吐出口の下流に配置された対向電極と、
前記吐出方向確認手段により確認した吐出方向に基づいて、前記対向電極の位置を制御する対向電極位置制御手段と、
前記液滴を荷電する荷電手段と、
が少なくとも備えられた微小粒子分取装置。
【請求項２】
前記液滴を収容する受容器が更に備えられた請求項１記載の微小粒子分取装置。
【請求項３】
電圧が印加された前記対向電極によって移動する前記液滴の移動方向に基づいて、前記受容器の位置を制御する受容器位置制御手段が更に備えられた請求項２記載の微小粒子分取装置。
【請求項４】
前記吐出方向確認手段は、液体センサーにより吐出液の吐出位置を確認する手段である請求項１から３のいずれか一項に記載の微小粒子分取装置。
【請求項５】
前記吐出方向確認手段は、吐出液の吐出位置を撮像する手段である請求項１から４のいずれか一項に記載の微小粒子分取装置。
【請求項６】
流路の吐出口から液滴を発生させる液滴発生手段と、
前記流路に微小粒子が流通される前に、前記吐出口から吐出されるコントロール液の液滴の吐出方向を、流路に対し上流方向および／または下流方向から確認する吐出方向確認手段と、
前記吐出口の下流に配置された対向電極と、
前記吐出方向確認手段により確認した吐出方向に基づいて、前記対向電極の位置を制御する対向電極位置制御手段と、
前記流路を通流中の微小粒子に光を照射する光照射手段と、
該光照射手段による光照射によって、前記微小粒子から発せられる光学的情報を検出する光検出手段と、
前記光検出手段により検出された光学的情報に基づいて、前記液滴を荷電する荷電手段と、
が少なくとも備えられたフローサイトメーター。
【請求項７】
吐出口が設けられた流路にコントロール液を通流するコントロール通流工程と、
前記吐出口から吐出されるコントロール液の液滴の吐出方向を、流路に対し上流方向および／または下流方向から確認する吐出方向確認工程と、
前記吐出方向確認工程において確認した吐出方向に基づいて、前記吐出口の下流に配置された対向電極の位置を制御する対向電極位置制御工程と、
該対向電極位置制御工程を経た後に、前記流路に微小粒子を通流させる微小粒子通流工程と、
前記吐出口から前記微小粒子を含む液滴を発生させる液滴発生工程と、
前記液滴を荷電する荷電工程と、
前記対向電極に電圧を印加する電圧印加工程と、
を少なくとも行う微小粒子分取方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、流路を用いて微小粒子を分取する微小粒子分取装置に関する。より詳しくは、流路内を通流する微小粒子を分取するための微小粒子分取装置、および該微小粒子分取装置を用いたフローサイトメーターに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、分析手法の発展に伴い、細胞や微生物等の生体微小粒子、マイクロビーズなどの微小粒子等を流路中に通流させ、通流させる工程において前記微小粒子を個々に測定したり、測定した微小粒子を解析し、分取したりする手法が開発されつつある。このような流路を用いた微小粒子の解析又は分取の手法の代表的な一例として、フローサイトメトリーと呼ばれる分析手法の技術改良が急速に進んでいる。
【０００３】
フローサイトメトリーとは、解析の対象となる微小粒子を流体中に整列させた状態で流路中に流し込み、該微小粒子にレーザー光等を照射することにより、各微小粒子から発せられた蛍光や散乱光を検出することで微小粒子の解析、分取を行う分析手法である。
【０００４】
このように、フローサイトメトリーでは、各種の測定を終えた微小粒子は、その測定結果に応じて、分離、回収されるが、具体的な方法としては、以下の方法が一般的に用いられている。
【０００５】
例えば、微小粒子を含むサンプル流が流路から吐出される際、超音波発生装置などを用いて微小粒子を含む液滴を発生させ、この液滴にプラス又はマイナスの電荷を加える。そして、この液滴を、落下の途中において電位差を有する２つの偏向板で挟み込み、帯電された微小粒子を含む液滴を、その電荷に応じていずれかの偏向板に引き寄せることにより、分取する方法が挙げられる。
【０００６】
このフローサイトメトリーのような流路中の微小粒子の解析及び分取技術は、医療分野、創薬分野、臨床検査分野、食品分野、農業分野、工学分野、法医学分野、犯罪鑑識分野等、様々な分野で広く利用されている。特に医療分野においては、病理学、腫瘍免疫学、移植学、遺伝学、再生医学、化学療法などで重要な役割を担っている。
【０００７】
このように、非常に広い分野で流路中の微小粒子を解析及び分取する技術が必要とされており、分取プロセスに関わる技術も、日々、開発が進められている。例えば、特許文献１では、液滴のブレークオフポイントの位置及びブレークオフポイントの下流の位置に、補助の照明と検出ユニットを配置することにより、液滴が意図された流路に分取されたか否かを確認することができる、フローサイトメーターの作動を制御する方法が提案されている。
【０００８】
このように、微小粒子の分取プロセスにおいて、様々な技術が提案されているが、微小粒子を正確に分取するためには、微小粒子が流路から吐出される際の最初の吐出方向を制御することが非常に重要である。特に、近年では、プラスチックやガラスなどの基板内に形成した流路を用いたり、量産された流路を用いたりする場合が多いため、流路の出口の形状が精度よく加工されていないと、吐出方向にバラつきが生じることが多い。
【０００９】
例えば、図９は、プラスチック基板に形成した流路を、流路出口（吐出口）方向から見た図面代用写真であるが、図９に示すように、吐出口の形状は各様であり、量産時の切削加工において、吐出口の形状精度をコントロールすることは現実的には難しく、コストがかかる。
【００１０】
出荷前に、各流路にサンプルなどを通流させて、吐出方向の確認をする方法も考えられるが、微小粒子の分取に用いる流路は、予め滅菌などの処理がされる場合が多く、出荷前にサンプルを通流させることは不可能である場合が多い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特表２００７−５３２８７４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
前記のように、微小粒子の分取プロセスにおいて、微小粒子が流路から吐出される際の最初の吐出方向を制御することは、非常に重要である。しかし、近年用いられる流路のように、プラスチックやガラスなどの基板内に形成した流路や、量産された流路においては、吐出口の形状精度をコントロールすることは、現実的には不可能である。
【００１３】
微小粒子の分取プロセスにおいては、例えば、図１０（Ａ）に示すようにソーティング用の対向電極１３ａ、１３ｂを用いて分取する場合、流路１１から吐出された液滴Ｄが、対向電極１３ａ、１３ｂ間の中央を通過することが好ましい。しかし、流路１１の吐出口の形状が、図９に示すように各様である場合、図１０（Ｂ）に示すように、液滴Ｄの進路が対向電極１３ａ、１３ｂ間の中央部より大きく外れてしまう場合がある。この場合、対向電極１３ａ、１３ｂを用いて、液滴Ｄを所望の方向へ、正確に分取することが不可能になってしまう。
【００１４】
そこで、本発明では、如何なる形状の吐出口を有する流路を用いた場合であっても、正確に微小粒子を分取することが可能な技術を提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
即ち、本発明では、まず、流路の吐出口から液滴を発生させる液滴発生手段と、
前記流路に微小粒子が流通される前に、前記吐出口から吐出されるコントロール液の液滴の吐出方向を確認する吐出方向確認手段と、
前記吐出口の下流に配置された対向電極と、
前記吐出方向確認手段により確認した吐出方向に基づいて、前記対向電極の位置を制御する対向電極位置制御手段と、
前記液滴を荷電する荷電手段と、
が少なくとも備えられた微小粒子分取装置を提供する。
本発明に係る微小粒子分取装置には、前記対向電極位置制御手段が備えられているため、様々な吐出方向に応じて、対向電極の位置を変更することが可能である。
本発明に係る微小粒子分取装置には、前記液滴を収容する受容器を更に備えることもできる。
この場合、電圧が印加された前記対向電極によって移動する前記液滴の移動方向に基づいて、前記受容器の位置を制御する受容器位置制御手段を更に備えることが好ましい。
前記吐出方向確認手段は、吐出液の吐出方向が確認できれば、その構成は特に限定されないが、液体センサーにより吐出液の吐出位置を確認する手段や吐出液の吐出位置を撮像する手段を用いることができる。
【００１６】
本発明では、次に、流路の吐出口から液滴を発生させる液滴発生手段と、
前記流路に微小粒子が流通される前に、前記吐出口から吐出されるコントロール液の液滴の吐出方向を確認する吐出方向確認手段と、
前記吐出口の下流に配置された対向電極と、
前記吐出方向確認手段により確認した吐出方向に基づいて、前記対向電極の位置を制御する対向電極位置制御手段と、
前記流路を通流中の微小粒子に光を照射する光照射手段と、
該光照射手段による光照射によって、前記微小粒子から発せられる光学的情報を検出する光検出手段と、
前記光検出手段により検出された光学的情報に基づいて、前記液滴を荷電する荷電手段と、
が少なくとも備えられたフローサイトメーターを提供する。
【００１７】
本発明では、更に、吐出口が設けられた流路にコントロール液を通流するコントロール通流工程と、
前記吐出口から吐出されるコントロール液の液滴の吐出方向を確認する吐出方向確認工程と、
前記吐出方向確認工程において確認した吐出方向に基づいて、前記吐出口の下流に配置された対向電極の位置を制御する対向電極位置制御工程と、
該対向電極位置制御工程を経た後に、前記流路に微小粒子を通流させる微小粒子通流工程と、
前記吐出口から前記微小粒子を含む液滴を発生させる液滴発生工程と、
前記液滴を荷電する荷電工程と、
前記対向電極に電圧を印加する電圧印加工程と、
を少なくとも行う微小粒子分取方法を提供する。
【００１８】
ここで、本発明で用いる技術用語の定義付けを行う。本発明における「微小粒子」とは、細胞や微生物、リポソーム、ＤＮＡ、タンパク質などの生体関連微小粒子、あるいはラテックス粒子やゲル粒子、工業用粒子などの合成粒子など、流路内を通流可能な物質であれば、全て包含する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明に係る微小粒子分取装置には、前記対向電極位置制御手段が備えられているため、様々な吐出方向に応じて、対向電極の位置を変更することが可能である。そのため、どのような形状の吐出口を有する流路を用いた場合であっても、正確に微小粒子を分取することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明に係る微小粒子分取装置１の一実施形態を模式的に示す模式概念図である。
【図２】本発明に係る微小粒子分取装置１の図１とは異なる実施形態を模式的に示す模式概念図である。
【図３】本発明に係る微小粒子分取装置１の吐出方向確認手段の一例を模式的に示す模式概念図である。
【図４】本発明に係る微小粒子分取装置１の図１および図２とは異なる実施形態を模式的に示す模式概念図である。
【図５】本発明に係る微小粒子分取装置１の図１、図２および図４とは異なる実施形態を模式的に示す模式概念図である。
【図６】本発明に係る微小粒子分取装置１の図１、図２、図４および図５とは異なる実施形態を模式的に示す模式概念図である。
【図７】本発明に係るフローサイトメーター１０の一実施形態を模式的に示す模式概念図である。
【図８】本発明に係る微小粒子分取方法のフロー図である。
【図９】プラスチック基板に形成した流路を、流路出口（吐出口）方向から見た図面代用写真である
【図１０】流路から吐出された吐出液と対向電極との位置関係の一例を示す模式概念図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。なお、説明は以下の順序で行う。
１．微小粒子分取装置１
（１）流路１１
（２）吐出方向確認手段１２
（３）対向電極１３ａ、１３ｂ
（４）対向電極位置制御手段１４
（５）液滴発生手段１５
（６）荷電手段１６
（７）受容器１７
（８）受容器位置制御手段１８
２．フローサイトメーター１０
（１）光照射手段１９
（２）光検出手段２０
３．微小粒子分取方法１００
（１）コントロール通流工程Ｉ
（２）吐出方向確認工程II
（３）対向電極位置制御工程III
（４）微小粒子通流工程IV
（５）液滴発生工程Ｖ
（６）荷電工程VI
（７）電圧印加工程VII
（８）受容器位置制御工程VIII
（９）光照射工程IX
（１０）光検出工程Ｘ
【００２２】
＜１．微小粒子分取装置＞
図１は、本発明に係る微小粒子分取装置１の一実施形態を模式的に示す模式概念図である。本発明に係る微小粒子分取装置１は、様々な形状の吐出口１１１を有する流路１１から吐出される微小粒子を分取可能な装置であって、大別すると、吐出方向確認手段１２、対向電極１３ａ、１３ｂ、対向電極位置制御手段１４、液滴発生手段１５、荷電手段１６、を少なくとも備える。また、必要に応じて、受容器１７、受容器位置制御手段１８、などを備えることも可能である。以下、各々について、詳細に説明する。
【００２３】
（１）流路１１
本発明に係る微小粒子分取装置１には、様々な形状の吐出口１１１を有する流路１１が適用可能である。即ち、量産等により吐出口１１１の形状が一定でなく、流路１１から吐出される吐出液の吐出方向が予測不能な流路１１であっても、本発明に係る微小粒子分取装置１を用いれば、そこから吐出される微小粒子を正確に分取することが可能である。
【００２４】
流路１１には微小粒子が通流し、吐出口１１１から、微小粒子を含む液滴Ｄが吐出される。流路１１では、例えば、後述のように、本発明に係る微小粒子分取装置１をフローサイトメーター１０に用いる場合などには、その所定部位において、各種光学的情報検出が行われる。
【００２５】
本発明に係る微小粒子分取装置１に適用可能な流路１１の形態は特に限定されず、自由に設計することができる。例えば、図１に示すような２次元又は３次元のプラスチックやガラス等の基板Ｔ内に形成した流路１１に限らず、図２に示すように、従来のフローサイトメーターで用いられているような流路１１も、本発明に係る微小粒子分取装置１に用いることができる。
【００２６】
また、前記流路１１の流路幅、流路深さ、流路断面形状も、層流を形成し得る形態であれば特に限定されず、自由に設計することができる。例えば、流路幅１ｍｍ以下のマイクロ流路においても、本発明に係る微小粒子分取装置１に用いることが可能である。特に、流路幅１０μｍ以上１ｍｍ以下程度のマイクロ流路を用いれば、後述する本発明に係る微小粒子分取方法をより好適に行うことができる。
【００２７】
なお、基板Ｔ上に形成した流路１１を採用する場合には、基板Ｔを透視性のある材料で形成することが好ましい。例えば、後述のように、本発明に係る微小粒子分取装置１をフローサイトメーター１０に用いる場合などに、光照射と光検出を、基板Ｔを挟んで両側からできるようにするためである。
【００２８】
（２）吐出方向確認手段１２
吐出方向確認手段１２は、流路１１の吐出口１１１から吐出される吐出液の吐出方向を確認する手段である。量産された流路１１などにおいては、吐出口１１１の形状精度をコントロールすることは、現実的には不可能であるため、この吐出口１１１から吐出される吐出液の吐出方向を予測することも不可能である。しかし、本発明に係る微小粒子分取装置１では、吐出方向確認手段１２を設けているため、実際に微小粒子を分取する前に、コントロール液を流路１１に通流させることで、予め、吐出方向の確認をすることが可能である。その結果、微小粒子を無駄にすることなく、正確な分取が可能となる。
【００２９】
吐出方向確認手段１２における具体的な確認方法は、吐出液の吐出方向が確認できれば特に限定されないが、例えば、液体センサーにより吐出液の吐出位置を確認する方法を挙げることができる。より具体的に説明すると、複数のセル１２１が特定のパターン（図１では格子状（図１（Ｂ）参照））に形成された容器を用い、この各セル１２１内部に液体センサー１２１１を設置し（図３（Ａ）参照）、この液体センサー１２１１によって、液体の侵入を感知する方法が挙げられる（図３（Ｂ）参照）。
【００３０】
また、図４に示すように、吐出位置を撮像する方法を用いることも可能である。より具体的に説明すると、前記の各セル１２１内部に、液体で変色する試薬などを導入しておき、変色したセル１２１位置を、例えば上部から撮像することで、吐出位置の確認を行うことができる。また、図示しないが、セル１２１を形成した容器を用いず、吐出液自体を着色し、その吐出方向を撮像することで、吐出位置を確認することも可能である。
【００３１】
前記の容器を用いる場合、複数のセル１２１が形成するパターンの形状は、吐出位置を確認できる形状であれば、特に限定されず、自由に設計することができる。また、撮像方向は、上部方向からの撮像に限らず、例えば図示しないが、容器の底面を、透視性を有する材料で形成し、下部方向から撮像することも可能である。
【００３２】
なお、吐出方向確認手段１２により吐出液の吐出方向が確認される際、コントロール液などの吐出液は、図１〜４に示すように、液滴Ｄを形成した状態には限られない。例えば、図５に示すように、流路１１の吐出口１１１から、液滴を形成せずに吐出液Ｌを吐出させ、その方向を吐出方向確認手段１２により確認してもよい。
【００３３】
（３）対向電極１３ａ、１３ｂ
対向電極１３ａ、１３ｂは、吐出口１１１の下流に配置され、後述する液滴発生手段１５によって発生し、後述する荷電手段１６により荷電された、微小粒子を含む液滴Ｄの進行方向を、変更させて分取する手段である。
【００３４】
対向電極１３ａ、１３ｂに印加する電圧を変化することで、液滴Ｄとの間の電気的な反発力または吸引力の強度を調整することにより、液滴Ｄの進行方向を、任意の方向へ変更させることができる。
【００３５】
（４）対向電極位置制御手段１４
対向電極位置制御手段１４は、吐出方向確認手段１２により確認した吐出方向に基づいて、対向電極１３ａ、１３ｂの位置を制御する手段である。
【００３６】
前記のように対向電極１３ａ、１３ｂを用いて液滴Ｄを正確に分取するためには、流路１１から吐出された液滴Ｄを、対向電極１３ａ、１３ｂ間の中央部へ向かって吐出させる必要がある（図１０（Ａ）参照）。液滴Ｄが、対向電極１３ａ、１３ｂ間の中央部より大きく外れた方向に吐出されると、対向電極１３ａ、１３ｂに電圧を印加した際、所望の方向へ液滴Ｄの進行方向を変更することが不可能になってしまうからである。
【００３７】
そこで、本発明に係る微小粒子分取装置１では、対向電極位置制御手段１４によって、吐出液の吐出方向に基づいた対向電極１３ａ、１３ｂの位置の制御が行われる。対向電極位置制御手段１４により、予め、対向電極１３ａ、１３ｂの位置を制御することで、微小粒子を含む液滴Ｄを、対向電極１３ａ、１３ｂの中央に向かって吐出させることができる。その結果、どのような形状の吐出口１１１を有する流路１１を用いた場合であっても、無駄なく正確に微小粒子を分取することが可能である。
【００３８】
対向電極１３ａ、１３ｂの位置は、吐出液の吐出方向に基づいて、図１中の破線で示すような回転移動に限らず、上下移動、左右移動などにより、あらゆる位置へ変更することが可能である。なお、用いる流路１１によっては、吐出液の吐出方向が、最初から対向電極１３ａ、１３ｂの中央に向かっていることが確認できる場合もあるが、その場合には、対向電極位置制御手段１４により、対向電極１３ａ、１３ｂの位置は、変更されないように制御される。
【００３９】
（５）液滴発生手段１５
液滴発生手段１５は、前記吐出口１１１から液滴を発生させる手段である。前記対向電極位置制御手段１４により対向電極１３ａ、１３ｂの位置が制御された後、前記流路１１には、目的の微小粒子が通流される。そして液滴発生手段１５により、この微小粒子を一定量ずつ含むように、液滴が発生される。
【００４０】
液滴発生手段１５における具体的な液滴発生方法は特に限定されず、公知の方法を自由に選択して用いることができる。例えば、所定の振動数で振動する振動素子などを用いて、流路１１の全体若しくは一部に振動を加えることで、流路１１の吐出口１１１から液滴を発生させることができる。なお、この場合、用いる振動素子も特に限定されず、公知のものを自由に選択して用いることができる。一例としては、ピエゾ振動素子などを挙げることができる。
【００４１】
液滴発生手段１５では、流路１１への送液量、吐出口１１１の径、振動素子の振動数などを調整することにより、液滴Ｄの大きさを調整し、微小粒子を一定量ずつ含む液滴を発生させることができる。
【００４２】
（６）荷電手段１６
荷電手段１６は、前記液滴発生手段１５により発生した液滴Ｄを荷電する手段である。荷電手段１６では、液滴Ｄが発生する寸前に、圧電素子などを用いてシース流全体に電圧供給し、次の瞬間、荷電された液滴Ｄが発生する。圧電素子が電圧供給を解除すると、シース流はアースにより電荷を放出する。
【００４３】
荷電手段１６では、例えば、本発明に係る微小粒子分取装置１をフローサイトメーター１０に用いる場合などには、流路１１を移動中の微小粒子の大きさ、形態、内部構造などの情報を取得し、この情報に基づいて、プラスまたはマイナスの電荷を荷電する。
【００４４】
帯電された液滴Ｄは、電圧を印加された前記対向電極１３ａ、１３ｂによって、その進路が所望の方向へ変更され、分取される。
【００４５】
（７）受容器１７
受容器１７は、液滴Ｄを収容するために用いる（図６参照）。受容器１７の形態は、微小粒子を含む液滴Ｄを収容することができれば特に限定されず、自由に設計することができる。個々にコレクションチューブなどを用いることもできるし、前述の吐出方向確認手段１２で用いたような、複数のセル１２１が特定のパターンに形成された容器などを用いることも可能である。
【００４６】
（８）受容器位置制御手段１８
受容器位置制御手段１８は、電圧が印加された対向電極１３ａ、１３ｂによって移動する液滴Ｄの移動方向に基づいて、前記受容器１７の位置を制御する手段である。本発明に係る微小粒子分取装置１には、対向電極位置制御手段１４が備えられているため、受容器１７の位置を制御しなくても、対向電極１３ａ、１３ｂの位置を制御することで、微小粒子の正確な分取は可能である。しかし、対向電極１３ａ、１３ｂに印加する電圧の強度によっては、想定外の位置へ液滴Ｄが移動する場合も考えられる。そこで、より正確な分取を行うために、本発明に係る微小粒子分取装置１には、受容器位置制御手段１８を備えることで、電圧が印加された対向電極１３ａ、１３ｂによって移動する液滴Ｄの移動方向に基づいて、受容器１７の位置を制御することができる。
【００４７】
受容器１７の位置は、液滴Ｄの移動方向に基づいて、図６中の破線で示すような回転移動に限らず、上下移動、左右移動などにより、あらゆる位置へ変更することが可能である。なお、用いる流路１１や対向電極１３ａ、１３ｂにおける印加電圧の強度によっては、受容器１７の位置の変更が必要ない場合もあるが、その場合には、受容器位置制御手段１８により、受容器１７の位置は、変更されないように制御される。
【００４８】
＜２．フローサイトメーター＞
本発明に係る本発明に係る微小粒子分取装置１は、その分取精度の高さを利用してフローサイトメーターに好適に用いることができる。図７は、本発明に係るフローサイトメーター１０の一実施形態を模式的に示す模式概念図である。
【００４９】
本発明に係るフローサイトメーター１０は、様々な形状の吐出口１１１を有する流路１１が適用可能であって、大別すると、吐出方向確認手段１２、対向電極１３ａ、１３ｂ、対向電極位置制御手段１４、光照射手段１９、光検出手段２０、液滴発生手段１５、荷電手段１６、を少なくとも備える。また、必要に応じて、受容器１７、受容器位置制御手段１８、などを備えることも可能である。以下、各々について、詳細に説明する。なお、適用可能な流路１１、吐出方向確認手段１２、対向電極１３ａ、１３ｂ、対向電極位置制御手段１４、液滴発生手段１５、荷電手段１６、受容器１７、受容器位置制御手段１８については、前記微小粒子分取装置１と同様であるため、ここでは説明を割愛する。
【００５０】
（１）光照射手段１９
光照射手段１９は、流路１１を通流中の微小粒子の大きさ、形態、内部構造などの情報を取得するために、微小粒子に対して光を照射するための手段である。
【００５１】
光照射手段１９から照射される光の種類は特に限定されないが、微小粒子から蛍光や散乱光を確実に発生させるためには、光方向、波長、光強度が一定の光が望ましい。一例としては、レーザー、ＬＥＤ等を挙げることができる。レーザーを用いる場合、その種類も特に限定されないが、アルゴンイオン（Ar）レーザー、ヘリウム−ネオン（He-Ne）レーザー、ダイ（dye）レーザー、クリプトン（Cr）レーザー等を、１種又は２種以上、自由に組み合わせて用いることができる。
【００５２】
（２）光検出手段２０
光検出手段２０は、光照射手段１９による光照射によって、微小粒子から発せられた光学的情報を検出する手段である。
【００５３】
本発明に係るフローサイトメーター１０に用いることができる光検出手段２０は、光学的情報の検出ができれば、その種類は特に限定されず、公知の光検出器を自由に選択して採用することができる。例えば、蛍光測定器、散乱光測定器、透過光測定器、反射光測定器、回折光測定器、紫外分光測定器、赤外分光測定器、ラマン分光測定器、ＦＲＥＴ測定器、ＦＩＳＨ測定器その他各種スペクトラム測定器、複数の光検出器をアレイ状に並べた、いわゆるマルチチャンネル光検出器、などを１種又は２種以上自由に組み合わせて採用することができる。
【００５４】
また、本発明に係るフローサイトメーター１０における光検出手段２０の設置箇所は、微小粒子から発せられた光学的情報が検出できれば特に限定されず、自由に設計することができる。例えば、図７に示すように、流路１１を挟んで光照射手段１９と逆側に配置することが好ましい。光検出手段２０を、流路１１を挟んで光照射手段１９と逆側に配置することで、光照射手段１９をより自由な構成で配置させることができる。
【００５５】
光検出手段２０により取得した光学的情報は、電気的信号（電圧パルス等）に変換され数値化される。更に、得られた電気的信号（電圧パルス等）は、適当な増幅率で増幅され、アナログ−デジタル変換（ＡＤ変換）された後、得られた数値データをもとに、解析用コンピュータや各種ソフトウエアを用いてヒストグラムを抽出し、統計解析が行われる。解析された結果に基づいて、微小粒子を含む液滴Ｄには前記荷電手段１６によりプラスまたはマイナスの電荷が荷電され、前記対向電極１３ａ、１３ｂにより、液滴Ｄの進行方向が変更されて分取される。
【００５６】
＜３．微小粒子分取方法＞
図８は、本発明に係る微小粒子分取方法のフロー図である。
本発明に係る微小粒子分取方法１００は、大別して、コントロール通流工程Ｉ、吐出方向確認工程II、対向電極位置制御工程III、微小粒子通流工程IV、液滴発生工程Ｖ、荷電工程VI、電圧印加工程VIIを少なくとも行う方法である。また、必要に応じて、受容器位置制御工程VIII、光照射工程IX、光検出工程Ｘをそれぞれ行うことも可能である。以下、各工程について、詳細に説明する。
【００５７】
（１）コントロール液通流工程Ｉ
コントロール液通流工程Ｉは、後述する対向電極位置制御工程IIIにおいて、対向電極の位置を制御するために、分取目的の微小粒子を通流させる前に、予め、コントロール液を流路１１に通流する工程である。
【００５８】
コントロール液として用いることができる液体は、後述の微小粒子の通流に影響がなければ特に限定されず、例えば、水、生理食塩水などを自由に選択して用いることができる。また、後述する吐出方向確認工程IIにおいて、吐出方向の確認を容易にするために、着色されたコントロール液を通流させることも可能である。
【００５９】
（２）吐出方向確認工程II
吐出方向確認工程IIは、流路１１の吐出口１１１から吐出されるコントロール液の吐出方向を確認する工程である。量産された流路１１などにおいては、吐出口１１１の形状精度をコントロールすることは、現実的には不可能であるため、この吐出口１１１から吐出されるコントロール液の吐出方向を予測することも不可能である。しかし、本発明に係る微小粒子分取方法１００では、吐出方向確認工程IIを行うため、実際に微小粒子を分取する前に、コントロール液を流路１１に通流させることで、予め、吐出方向の確認をすることが可能である。その結果、目的の微小粒子を無駄にすることなく、正確な分取が可能となる。
【００６０】
吐出方向確認工程IIにおける具体的な確認方法は、吐出液の吐出方向が確認できれば特に限定されないが、例えば、液体センサーによりコントロール液の吐出位置を確認する方法を挙げることができる。より具体的に説明すると、複数のセル１２１が特定のパターン（図１（Ｂ）参照）に形成された容器を用い、この各セル１２１内部に液体センサー１２１１を設置し（図３（Ａ）参照）、この液体センサー１２１１によって、液体の侵入を感知する方法が挙げられる（図３（Ｂ）参照）。
【００６１】
また、図４に示すように、吐出位置を撮像する方法を用いることも可能である。より具体的に説明すると、前記の各セル１２１内部に、液体で変色する試薬などを導入しておき、変色したセル１２１位置を、例えば上部から撮像することで、吐出位置の確認を行うことができる。また、図示しないが、セル１２１を形成した容器を用いず、コントロール液自体を着色し、その吐出方向を撮像することで、吐出位置を確認することも可能である。
【００６２】
前記の容器を用いる場合、複数のセル１２１が形成するパターンの形状は、吐出位置を確認できる形状であれば、特に限定されず、自由に設計することができる。また、撮像方向は、上部方向からの撮像に限らず、例えば図示しないが、容器の底面を、透視性を有する材料で形成し、下部方向から撮像することも可能である。
【００６３】
なお、吐出方向確認工程IIにおいてコントロール液の吐出方向が確認される際、コントロール液は、図１〜４に示すように、液滴Ｄを形成した状態には限られない。例えば、図５に示すように、流路１１の吐出口１１１から、液滴を形成せずにコントロール液Ｌを吐出させ、その方向を吐出方向確認工程IIにおいて確認してもよい。
【００６４】
（３）対向電極位置制御工程III
対向電極位置制御工程IIIは、吐出方向確認工程IIにおいて確認したコントロール液の吐出方向に基づいて、吐出口１１１の下流に配置され対向電極１３ａ、１３ｂの位置を制御する工程である。
【００６５】
前記のように対向電極１３ａ、１３ｂを用いて液滴Ｄを分取するためには、流路１１から吐出された液滴Ｄを、対向電極１３ａ、１３ｂ間の中央部へ向かって吐出させる必要がある（図１０（Ａ）参照）。液滴Ｄが、対向電極１３ａ、１３ｂ間の中央部より大きく外れた方向に吐出されると、対向電極１３ａ、１３ｂに電圧を印加した際、所望の方向へ液滴Ｄの進行方向を変更することが不可能になってしまうからである。
【００６６】
そこで、本発明に係る微小粒子分取方法１００では、対向電極位置制御工程IIIを行って、予め、対向電極１３ａ、１３ｂの位置を制御することで、微小粒子を含む液滴Ｄを、対向電極１３ａ、１３ｂの中央に向かって吐出させることができる。その結果、どのような形状の吐出口１１１を有する流路１１を用いた場合であっても、無駄なく正確に微小粒子を分取することが可能である。
【００６７】
対向電極１３ａ、１３ｂの位置は、コントロール液の吐出方向に基づいて、図１中の破線で示すような回転移動に限らず、上下移動、左右移動などにより、あらゆる位置へ変更することが可能である。なお、用いる流路１１によっては、コントロール液の吐出方向が、対向電極１３ａ、１３ｂの中央に向かっていることが確認できる場合もあるが、その場合には、対向電極位置制御工程IIIでは、対向電極１３ａ、１３ｂの位置は、変更されないように制御する。
【００６８】
（４）微小粒子通流工程IV
微小粒子通流工程IVは、流路１１に微小粒子を通流させる工程である。
【００６９】
微小粒子の流路１１中への通流方法は特に限定されないが、例えば、従来のフローサイトメトリーのように、整流を促す流体媒体（シース流）で、微小粒子を含むサンプル流を挟み込みながら搬送する方法が挙げられる。このように搬送すれば、微小粒子を含むサンプル流の層流を形成することができ、より好適である。前記流体媒体は、微小粒子を含むサンプル流の整流を促す機能を有すれば、その種類は特に限定されないが、例えば、微小粒子が細胞である場合には、生理食塩水等を用いることができる。
【００７０】
微小粒子には、後述する光照射工程VIIIおよび光検出工程IXにおいて、光学的情報が検出できるように、蛍光色素等の蛍光物質、放射性物質、インターカレーター、またはマイクロビーズなどの標識物質で修飾しておくことが好ましい。例えば、蛍光色素を用いる場合、その種類は特に限定されず、公知のあらゆる蛍光色素を用いることができる。例えば、Cascade Blue、Pacific Blue、Fluorescein isothiocyanate(FITC)、Phycoerythrin(PE)、Propidium iodide(PI)、Texas red(TR)、Peridinin chlorophyll protein(PerCP)、Allophycocyanin(APC)、4’,6-Diamidino-2-phenylindole(DAPI)、 Cy3、Cy5、Cy7等を、１種又は２種以上自由に組み合わせて用いることができる。
【００７１】
なお、蛍光タンパク質のように、微小粒子自体が発光する場合には、標識物質で修飾する必要はない。また、流路１１内で物質間相互作用を進行させることにより、ＦＲＥＴの原理のように、その物質の蛍光色等を変化させることができる物質等を微小粒子として用いる場合も、標識物質で微小粒子を修飾する必要はない。
【００７２】
（５）液滴発生工程Ｖ
液滴発生工程Ｖは、流路１１の吐出口１１１から、微小粒子を一定量ずつ含むように液滴を発生させる工程である。
【００７３】
液滴発生工程Ｖにおける具体的な液滴発生方法は特に限定されず、公知の方法を自由に選択して用いることができる。例えば、所定の振動数で振動する振動素子などを用いて、流路１１の全体若しくは一部に振動を加えることで、流路１１の吐出口１１１から液滴を発生させることができる。なお、この場合、用いる振動素子も特に限定されず、公知のものを自由に選択して用いることができる。一例としては、ピエゾ振動素子などを挙げることができる。
【００７４】
液滴発生工程Ｖでは、流路１１への送液量、吐出口１１１の径、振動素子の振動数などを調整することにより、液滴Ｄの大きさを調整し、微小粒子を一定量ずつ含む液滴を発生させることができる。
【００７５】
（６）荷電工程VI
荷電工程VIは、前記液滴発生工程Ｖにおいて発生させた液滴Ｄを荷電する工程である。
【００７６】
荷電工程VIにおける具体的な荷電方法は特に限定されず、公知の方法を自由に選択して用いることができる。例えば、液滴Ｄが発生する寸前に、圧電素子などを用いてシース流全体に電圧供給し、次の瞬間、荷電された液滴Ｄが発生させる方法などが挙げられる。
【００７７】
荷電工程VIでは、例えば、後述する光照射工程VIIIおよび光検出工程IXにおいて検出された微小粒子の光学的情報（大きさ、形態、内部構造などの情報）に基づいて、プラスまたはマイナスの電荷を荷電することが可能である。
【００７８】
（７）電圧印加工程VII
電圧印加工程VIIは、前記対向電極位置制御工程IIIにおいて位置制御された対向電極１３ａ、１３ｂに電圧を印加する工程である。対向電極１３ａ、１３ｂに電圧を印加することにより、前記荷電工程VIにおいて荷電された液滴Ｄの進行方向を変更させて、液滴Ｄ中の微小粒子を分取することができる。
【００７９】
電圧印加工程VIIでは、対向電極１３ａ、１３ｂに印加する電圧を変化させることで、液滴Ｄとの間の電気的な反発力または吸引力の強度を調整することにより、液滴Ｄの進行方向を、所望の方向へ変更させ、分取することができる。
【００８０】
（８）受容器位置制御工程VIII
受容器位置制御工程VIIIは、電圧が印加された前記対向電極１３ａ、１３ｂによって移動する前記液滴Ｄの移動方向に基づいて、受容器１７の位置を制御する工程である。本発明に係る微小粒子分取方法１００では、対向電極位置制御工程IIIを行うため、受容器１７の位置を制御しなくても、対向電極１３ａ、１３ｂの位置を制御することで、微小粒子の正確な分取は可能である。しかし、前記電圧印加工程VIIにおける対向電極１３ａ、１３ｂへの印加電圧の強度によっては、想定外の位置へ液滴Ｄが移動する場合も考えられる。そこで、より正確な分取を行うために、本発明に係る微小粒子分取方法１００では、受容器位置制御工程VIIIを行うことで、電圧が印加された対向電極１３ａ、１３ｂによって移動する液滴Ｄの移動方向に基づいて、受容器１７の位置を制御することができる。
【００８１】
受容器１７の位置は、液滴Ｄの移動方向に基づいて、図６中の破線で示すような回転移動に限らず、上下移動、左右移動などにより、あらゆる位置へ変更することが可能である。なお、用いる流路１１や対向電極１３ａ、１３ｂにおける印加電圧の強度によっては、受容器１７の位置の変更が必要ない場合もあるが、その場合には、受容器位置制御工程VIIIでは、受容器１７の位置を変更しないように制御する。
【００８２】
（９）光照射工程IX
光照射工程IXは、流路１１を通流中の微小粒子の大きさ、形態、内部構造などの情報を取得するために、微小粒子に対して光を照射する工程である。本発明に係る微小粒子分取方法１００では必須の工程ではないが、微小粒子の各種光学的情報（大きさ、形態、内部構造などの情報）に基づいて、微小粒子の分取を行う場合には、目的の微小粒子が流路１１を通流中に、この光照射工程IXを行うことが可能である。
【００８３】
光照射工程IXにおいて照射される光の種類は特に限定されないが、微小粒子から蛍光や散乱光を確実に発生させるためには、光方向、波長、光強度が一定の光が望ましい。一例としては、レーザー、ＬＥＤ等を挙げることができる。レーザーを用いる場合、その種類も特に限定されないが、アルゴンイオン（Ar）レーザー、ヘリウム−ネオン（He-Ne）レーザー、ダイ（dye）レーザー、クリプトン（Cr）レーザー等を、１種又は２種以上、自由に組み合わせて用いることができる。
【００８４】
（１０）光検出工程Ｘ
光検出工程Ｘは、光照射工程IXによる光照射によって、微小粒子から発せられた光学的情報を検出する手段である。本発明に係る微小粒子分取方法１００では必須の工程ではないが、微小粒子の各種光学的情報（大きさ、形態、内部構造などの情報）に基づいて、微小粒子の分取を行う場合には、目的の微小粒子が流路１１を通流中に、この光検出工程Ｘを行うことが可能である。
【００８５】
光検出工程Ｘでは、微小粒子からの光学的情報が検出できれば、その取得方法は特に限定されず、公知の方法を自由に選択して採用することができる。例えば、蛍光測定法、散乱光測定法、透過光測定法、反射光測定法、回折光測定法、紫外分光測定法、赤外分光測定法、ラマン分光測定法、ＦＲＥＴ測定法、ＦＩＳＨ測定法その他各種スペクトラム測定法、複数の色素を検出できる、いわゆるマルチカラー検出法等を用いた方法等を、１種又は２種以上自由に組み合わせて採用することができる。
【００８６】
光検出工程Ｘにおいて取得した光学的情報は、電気的信号（電圧パルス等）に変換され数値化される。更に、得られた電気的信号（電圧パルス等）は、適当な増幅率で増幅され、アナログ−デジタル変換（ＡＤ変換）された後、得られた数値データをもとに、解析用コンピュータや各種ソフトウエアを用いてヒストグラムを抽出し、統計解析が行われる。解析された結果に基づいて、荷電工程VIにおいて微小粒子を含む液滴Ｄにプラスまたはマイナスの電荷を荷電し、前記電圧印加工程VIIにおいて、荷電された液滴Ｄの進行方向を変更して分取することができる。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明によれば、どのような形状の吐出口を有する流路を用いた場合であっても、無駄なく正確に微小粒子を分取することが可能である。そのため、プラスチックやガラスなどの基板内に形成した流路を用いたり、量産された流路を用いたりする場合、即ち、流路の出口の形状が精度よく加工されず、吐出方向にバラつきが生じる場合であっても、正確に微小粒子を分取することが可能である。
【００８８】
この技術を用いることで、医療分野（病理学、腫瘍免疫学、移植学、遺伝学、再生医学、化学療法など）、創薬分野、臨床検査分野、食品分野、農業分野、工学分野、法医学分野、犯罪鑑識分野、など様々な分野における分析・解析技術の向上に貢献することができる。
【符号の説明】
【００８９】
１  微小粒子分取装置
１１  流路
１１１  吐出口
１２  吐出方向確認手段
１２１  セル
１２１１  液体センサー
１３ａ、１３ｂ  対向電極
１４  対向電極位置制御手段
１５  液滴発生手段
１６  荷電手段
１７  受容器
１８  受容器位置制御手段
１０  フローサイトメーター
１９  光照射手段
２０  光検出手段
Ｌ  吐出液
１００  微小粒子分取方法
Ｉ  コントロール通流工程
II  吐出方向確認工程
III  対向電極位置制御工程
IV  微小粒子通流工程
Ｖ  液滴発生工程
VI  荷電工程
VII  電圧印加工程
VIII  受容器位置制御工程
IX  光照射工程
Ｘ  光検出工程
【図１】
0005446563.tif 000002
【図２】
0005446563.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0005446563.tif 000008
【図８】
0005446563.tif 000009
【図１０】
0005446563.tif 000010
【図９】
0005446563.tif 000011