(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３または４３に対して少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列を含み、以下の（Ａ）及び（Ｂ）から選択される少なくとも１つの変異を有し、凝乳活性を有する改良型プロテアーゼ：
（Ａ）配列番号３または４３の２６５位のグルタミンに相当するグルタミンの酸性アミノ酸への置換、及び
（Ｂ）配列番号３または４３の２６６位のグルタミンに相当するグルタミンの酸性アミノ酸への置換。
【請求項２】
以下の（Ａ）および（Ｂ）からなる群より選択される請求項１に記載の改良型プロテアーゼ：
（Ａ）配列番号３または４３のアミノ酸配列において、２６５位のグルタミン及び／又は２６６位のグルタミンが酸性アミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質、
（Ｂ）配列番号３または４３のアミノ酸配列において、２６５位のグルタミン及び／又は２６６位のグルタミンが酸性アミノ酸に置換され、かつ、２６５位及び２６６位以外の位置において１０個以下のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質。
【請求項３】
前記酸性アミノ酸が、グルタミン酸又はアスパラギン酸である、請求項１または２に記載の改良型プロテアーゼ。
【請求項４】
配列番号３のアミノ酸配列において、１９位のアミノ酸が、バリン、アラニン、イソロイシン又はロイシンに置換されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の改良型プロテアーゼ。
【請求項５】
配列番号３のアミノ酸配列において、８１位のアミノ酸がグルタミン又はアスパラギン酸に置換されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の改良型プロテアーゼ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の改良型プロテアーゼをコードするＤＮＡ。
【請求項７】
請求項６に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の発現ベクターが導入された形質転換細胞。
【請求項９】
前記形質転換細胞がサッカロマイセス・セレビシエである、請求項８に記載の形質転換細胞。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載の形質転換細胞を培養し、該培養液中に凝乳活性を有するプロテアーゼを蓄積させる工程を含む、凝乳活性を有する改良型プロテアーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物由来の凝乳活性が向上したプロテアーゼに関する。同プロテアーゼは、チーズ製造に好適に用いられる。
【背景技術】
【０００２】
古くからチーズ製造に用いる凝乳酵素として、仔ウシレンネットが使用されている。仔ウシレンネットの凝乳活性の大部分は酸性プロテアーゼであるキモシンが占めており、乳中のカゼインに対する位置特異性が高いこと、すなわち、非特異的なプロテアーゼ活性（κ-カゼインのアミノ酸配列における１０５位のアミノ酸であるフェニルアラニンと１０６位のアミノ酸であるメチオニン間以外のペプチド結合を消化する活性）が低いという特徴を有している。この非特異的プロテアーゼ活性は、チーズ製造時の収量低下や熟成中の苦味ペプチド産生に影響するとされ、キモシンが優れた凝乳酵素である理由とされている。
【０００３】
しかし、仔ウシの屠畜数の減少、チーズ需要の増加に伴い、仔ウシレンネットの安定した供給が困難となり、現在ではリゾムコール・ミーハイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）及びリゾムコール・プシルス（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｐｕｓｉｌｌｕｓ）の生産する微生物由来の凝乳酵素や仔ウシキモシンの遺伝子をカビや酵母に導入し生産させた遺伝子組換えキモシンが凝乳酵素として多用されるようになっている。
【０００４】
上記微生物由来の凝乳酵素は、仔ウシキモシンや組換えキモシンに比べて非特異的なプロテアーゼ活性が高く、凝乳酵素の性質として重要なＣ／Ｐ比（タンパク質分解活性に対する凝乳活性の比）が低い点が問題とされているが、このような欠点を解決するために、リゾムコール・プシルスでは、遺伝子工学的手法により部位特異的変異を施した凝乳酵素の変異遺伝子を酵母で発現させて評価されている。その変異体では、凝乳酵素のアミノ酸配列における１９位のアミノ酸をグルタミン酸からアラニンに置換させることによってＣ／Ｐ比が野生型よりも向上した（非特許文献１）。
【０００５】
しかし、このアミノ酸置換によって凝乳酵素の比活性が約４割も低下することから実用化は困難であり、Ｃ／Ｐ比が高く、かつ比活性が維持され又は向上している微生物由来の凝乳酵素が望まれている。
【０００６】
また、リゾムコール・プシルス及びリゾムコール・ミーハイの微生物由来の凝乳酵素をジカルボン酸無水物でアシル化し、Ｃ／Ｐ比を向上させること等が試みられているが（特許文献１）、この方法もある程度の成果は得られているが、未だ十分なものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特公平２−１８８３４号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】J. Biochem. 129, 791-794, 2001
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、κ-カゼインのアミノ酸配列における１０５位のアミノ酸であるフェニルアラニンと１０６位のアミノ酸であるメチオニン間以外のペプチド結合を消化する活性（以
下、「非特異的プロテアーゼ活性」ともいう）が低く、凝乳酵素の比活性が維持され、又は向上した、凝乳に適したプロテアーゼを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、凝乳酵素生産菌の突然変異体の内から、非特異的プロテアーゼ活性が低下しているためにＣ／Ｐ比が向上した凝乳酵素を生産する変異株を見出し、該凝乳酵素の遺伝子を単離して塩基配列を決定し、該遺伝子を発現させて、その凝乳酵素の比活性及びＣ／Ｐ比を確認し、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち本発明は、凝乳酵素の比活性が維持され、又は向上し、かつ、Ｃ／Ｐ比が向上した微生物由来の凝乳活性を有するプロテアーゼ、これをコードするＤＮＡ及び該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターが導入された形質転換細胞を提供するものである。
【００１２】
本発明の一つの態様は、配列番号３に対して少なくとも７５％同一性を有するアミノ酸配列を含み、以下の（Ａ）及び（Ｂ）から選択される少なくとも１つの変異を有し、凝乳活性を有する改良型プロテアーゼを提供することである。
（Ａ）配列番号３の２６５位のグルタミンに相当するグルタミンの酸性アミノ酸への置換、及び
（Ｂ）配列番号３の２６６位のグルタミンの酸性アミノ酸への置換。
本発明の他の態様は、以下の（Ａ）および（Ｂ）からなる群より選択される前記改良型プロテアーゼを提供することである。
（Ａ）配列番号３または４３のアミノ酸配列において、２６５位のグルタミン及び／又は２６６位のグルタミンが酸性アミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質、
（Ｂ）配列番号３または４３のアミノ酸配列において、２６５位のグルタミン及び／又は２６６位のグルタミンが酸性アミノ酸に置換され、かつ、２６５位及び２６６位以外の位置において１０個以下（好ましくは５個以下、より好ましくは３個以下、さらに好ましくは２個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質。
本発明の他の態様は、前記酸性アミノ酸が、グルタミン酸又はアスパラギン酸である、前記改良型プロテアーゼを提供することである。
本発明の他の態様は、配列番号３のアミノ酸配列において、１９位のアミノ酸が、バリン、アラニン、イソロイシン又はロイシンに置換されている、前記改良型プロテアーゼを提供することである。
本発明の他の態様は、配列番号３のアミノ酸配列において、８１位のアミノ酸がグルタミン又はアスパラギン酸に置換されている、前記改良型プロテアーゼを提供することである。
本発明の他の態様は、前記改良型プロテアーゼをコードするＤＮＡを提供することである。
本発明の他の態様は、前記ＤＮＡを含む発現ベクターを提供することである。
本発明の他の態様は、前記発現ベクターが導入された形質転換細胞を提供することである。
本発明の他の態様は、前記形質転換細胞がサッカロマイセス・セレビシエである、前記形質転換細胞を提供することである。
本発明の他の態様は、前記形質転換細胞を培養し、該培養液中に凝乳活性を有するプロテアーゼを蓄積させる工程を含む、凝乳活性を有する改良型プロテアーゼの製造方法を提供することである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係る改良型酵素は、凝乳酵素の比活性が維持され、又は向上し、かつ、Ｃ／Ｐ比が高いので、収量の高いチーズの製造が可能になる。また、Ｃ／Ｐ比が高いので、改良
型酵素により凝乳過程における苦味ペプチド等の生成が抑えられ、質の高いチーズの生産が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は発現ベクターＪＳ４の構造を示す図である。
【図２】図２は、リゾムコール・プシルス（RMPP）由来のプロテアーゼとリゾムコール・ミーハイ（RMMP）由来のプロテアーゼの配列アラインメントを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下に、本発明を詳細に説明する。
１．本発明に係る改良型プロテアーゼ（凝乳酵素）
本発明に係る改良型プロテアーゼは、配列番号３と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、（A）配列番号３のアミノ酸配列における２６５位のグルタミンに対応するグルタミンの酸性アミノ酸への置換、及び（B）配列番号３のアミノ酸配列における２６６位のグルタミンの酸性アミノ酸への置換、からなる群より選ばれる少なくとも１つの変異を有し、凝乳活性を有している。
【００１６】
前記酸性アミノ酸としては、グルタミン酸又はアスパラギン酸が挙げられる。
本発明の改良型プロテアーゼは配列番号３の全体に対して好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の配列同一性を有する。
【００１７】
一態様において、本発明の改良型プロテアーゼはリゾムコール・ミーハイの野生型プロテアーゼ（配列番号３）に変異を導入することにより得られる。この態様では、本発明の改良型プロテアーゼは（Ａ）配列番号３または４３のアミノ酸配列において、２６５位のグルタミン及び／又は２６６位のグルタミンが酸性アミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質、および（Ｂ）配列番号３または４３のアミノ酸配列において、２６５位のグルタミン及び／又は２６６位のグルタミンが酸性アミノ酸に置換され、かつ、２６５位及び２６６位以外の位置において１０個以下のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、凝乳活性を有するタンパク質からなる群より選択される。
【００１８】
図２はリゾムコール・プシルス由来のプロテアーゼとリゾムコール・ミーハイ由来のプロテアーゼの配列アラインメントを示す。両配列において、２６５位と２６６位のアミノ酸は保存されている。したがって、本発明の改良型プロテアーゼはリゾムコール・プシルスの野生型プロテアーゼ（配列番号４３）に変異を導入することによっても得られる。すなわち、別の態様では、本発明の改良型プロテアーゼは配列番号４３において２６５位のグルタミンおよび／または２６６位のグルタミンが酸性アミノ酸に置換された配列を含む蛋白質であってもよい。さらに、改良型プロテアーゼは凝乳活性を有する限り、２６５位のグルタミンおよび／または２６６位のグルタミンの置換以外に、別の変異（１０アミノ酸以下の置換、欠失、挿入または付加）を有してもよい。
【００１９】
また、本発明に係る改良型プロテアーゼは、さらに、配列番号３または４３のアミノ酸配列における１９位のグルタミン酸及び／又は８１位のスレオニンが他のアミノ酸に置換されていてもよいが、１９位のグルタミン酸については、バリン、アラニン、イソロイシン又はロイシンに置換されていることが好ましく、８１位のスレオニンについては、グルタミン又はアスパラギン酸に置換されていることが好ましい。
【００２０】
本発明において、「２６５位」、「２６６位」、「１９位」、及び「８１位」とは、必ずしもプロテアーゼのＮ末端からの絶対的な位置を示すものではなく、配列番号３または４３のアミノ酸配列における相対的な位置を示すものである。例えば、配列番号３または４３に示すアミノ酸配列を有するプロテアーゼにおいて、２６５位よりＮ末端側の位置で
１アミノ酸欠失した場合、前記２６５位は２６４位となる。このような場合であっても、Ｎ末端から２６４番目のアミノ酸は、本発明における「２６５位」のアミノ酸である。アミノ酸の絶対的な位置は、対象のプロテアーゼのアミノ酸配列と配列番号３または４３のアミノ酸配列とのアラインメントにより、決定することができる。「相当する」という用語によって示されるアミノ酸は配列番号３または４３のアミノ酸配列と比較した相対的な位置のアミノ酸を意味する。
【００２１】
配列番号３および４３は成熟型プロテアーゼのアミノ酸配列である。本発明に係る改良型プロテアーゼは、シグナルペプチドやプロペプチド等のアミノ酸配列を含んでいても良い。
【００２２】
本発明に係る改良型プロテアーゼは、本明細書の実施例に記載するような方法で、凝乳活性を有するがＣ／Ｐ比の比較的低い野生型プロテアーゼを生産する微生物から、Ｃ／Ｐ比が高い改良型プロテアーゼを生産する突然変異株を作製し、該突然変異株を培養することにより、該突然変異株の細胞内又は培養液中に得ることができる。Ｃ／Ｐ比の比較的低いプロテアーゼを生産する微生物としては、リゾムコール・ミーハイの野生株（ＡＴＣＣ１６４５７）、リゾムコール・プシルス（ＡＴＣＣ１６４５８）及びそれらの誘導株などが挙げられる。これらの株はアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ：P.O.Box 1549 Manassas, VA 20108 USA）から購入することができる。前記突然変異株から変異プロテアーゼをコードするＤＮＡを単離し、該ＤＮＡを発現させることで本発明に係る改良型プロテアーゼを得ることもできる。
【００２３】
また、本発明に係る改良型プロテアーゼは、リゾムコール・ミーハイの野生株（ＡＴＣＣ１６４５７）、リゾムコール・プシルス（ＡＴＣＣ１６４５８）又はそれらの誘導株から配列番号３または４３のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを単離し、該ＤＮＡに部位特異的変異（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を導入することで本発明に係るプロテアーゼをコードするように改変し、該改変ＤＮＡを発現させて得ることもできる。
【００２４】
前記ＤＮＡの発現は、前記ＤＮＡを含む発現ベクターを作製し、これを宿主細胞に導入することで行うことができる。宿主細胞は原核細胞であっても真核細胞であってもよいが、真核細胞であることが好ましい。真核細胞としては、酵母、カビ、植物細胞などが挙げられるが、酵母であることが好ましく、サッカロマイセス・セレビシエであることが特に好ましい。
また、前記ＤＮＡの発現は、無細胞系で行うこともできる。
【００２５】
本発明に係る改良型プロテアーゼのＣ／Ｐ比は対応する野生型プロテアーゼ（配列番号３または４３）のＣ／Ｐ比はより高い。本発明に係る改良型プロテアーゼのＣ／Ｐ比は、野生型プロテアーゼ（配列番号３または４３）のＣ／Ｐ比の１．２倍以上であることが好ましく、１．５倍以上であることがより好ましく、２．０倍以上であることがさらに好ましい。
ここで、Ｃ／Ｐ比とは、［凝乳活性（ＭＣＡ）］／［タンパク質分解活性（ＰＡ）］を示し、ＰＡ及びＭＣＡの測定は以下の方法で行うことができる。尚、ＭＣＡの測定は、国際標準法（ＩＳＯ１５１７４, ＩＤＦ１７６；ｆｉｒｓｔ  ｅｄｔｉｏｎ  ２００２−０９−０１、食品添加物自主規格に記載）が存在するが、本明細書におけるＭＣＡの値は、以下の方法（便宜上、名糖法と呼ぶ）で算出したものである。
【００２６】
［１］ＰＡの測定
０．０５Ｍリン酸水素二ナトリウム溶液に乳製カゼイン（和光純薬工業株式会社製）を溶解させ、１ｍｏｌ／ｌ 塩酸試液によりｐＨ６．０に調製し、０．６％カゼイン基質溶
液を調製する。この基質溶液１ｍｌに適時希釈した試験試料０．２ｍｌを加えて３７℃、１０〜３０分間反応後、反応停止液（０．１１ｍｏｌ／ｌトリクロロ酢酸、０．２１ｍｏｌ／ｌ無水酢酸ナトリウム、０．３３ｍｏｌ／ｌ酢酸の混合溶液）を１ｍｌ加えて反応を停止させる。さらに遠心分離により得られた上澄み液０．４ｍｌに０．５５ｍｏｌ／ｌ無水炭酸ナトリウム１ｍｌを加えた後、２倍に希釈した和光純薬工業株式会社製フェノール試薬（フォーリン・チオカルトー試薬）を０．２ｍｌ加える。３７℃、３０分間反応させた後、６６０ｎｍで吸光度（光路長：１ｃｍ）を測定する。別途、基質溶液１ｍｌに反応停止液１ｍｌを加えた後、試験試料０．２ｍｌを加えて、以下同様の手順で調製したものをブランクとする。試験サンプルの吸光度からブランクにおける吸光度を差し引いた値を遊離チロシン量に換算し、ＰＡの値を求める。ＰＡの単位はＵｎｉｔ／ｍｌで表す。この１Ｕｎｉｔとは、上記操作法にて１分間にチロシン１μｍｏｌに相当するフェノール試薬呈色物質の増加をもたらす酵素量とする。また、チロシンとフェノール試薬呈色物質の相関式は下記のようにチロシン検量線を作成することにより求められる。
【００２７】
チロシン検量線
チロシン標準品（分子量１８１．２、和光純薬工業株式会社製）を１０５℃で３時間乾燥し、その０．０５０ｇを正確に量り、０．２ｍｏｌ／ｌ塩酸試液に溶かし、正確に５０ｍｌとする。この液１、２、３及び４ｍｌを正確に量り、それぞれに０．２ｍｏｌ／ｌ塩酸試液を加え、正確に１００ｍｌとする。それぞれの液２ｍｌを正確に量り、０．５５ｍｏｌ／ｌ炭酸ナトリウム試液５ｍｌ及び２倍希釈したフェノール試薬１ｍｌをそれぞれ正確に加え、直ちに振り混ぜ、３７±０．５℃で３０分間放置した後、これらの液につき、０．２ｍｏｌ／ｌ塩酸試液２ｍｌを正確に量り、同様に操作して得た液を対照とし、波長６６０ｎｍに於ける吸光度Ａ１、Ａ２、Ａ３及びＡ４を測定する。縦軸に吸光度Ａ１、Ａ２、Ａ３及びＡ４を、横軸にそれぞれの液２ｍｌ中のチロシン量（μｍｏｌ）をとり、検量線を作成し、吸光度差１に対するチロシン量（μｍｏｌ）を求める。
【００２８】
［２］ＭＣＡの測定法（名糖法）
０．０１Ｍ塩化カルシウムに溶解した１０％還元脱脂粉乳（ｐＨ６．０）、好ましくはＣＨＲ．ＨＡＮＳＥＮ社製のものを基質として用い、この基質５ｍｌに対して２〜５分間、好ましくは２分３０秒でカードフラグメントを形成するような濃度に調製した試験試料溶液０．５ｍｌを加え、３５℃に保温する。時折、ガラス棒で攪拌しながらカードフラグメント形成を観察し、形成時間を測定する。同様に測定した、ＭＣＡが既知である標準品の値と比較して、単位量の試験試料が単位時間に何倍量の基質を凝固させることができるか計算することでＭＣＡを求める。計算式は以下の通りである。
ＭＣＡ（Ｍｕ／ｍｌ）＝Ｓ×（ＴS×ＷS）／Ｔ×Ｗ
Ｓ：標準品の凝乳酵素の比活性（Ｍｕ／ｇ）
ＴS：標準品溶液の凝乳時間（秒）
ＷS：標準品溶液１ｍｌ中の標準品の量（ｇ）
Ｔ：試験試料溶液の凝乳時間（秒）
Ｗ：試験試料溶液１ｍｌ中の試験試料の量（ｍｌ）
【００２９】
尚、試験試料に含まれる総タンパク質量を定量することで、ＭＣＡを単位タンパク質量当たりで算出することもできる。後に記載する実施例１３においては、ＭＣＡはタンパク質１ｍｇ当たり（Ｍｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）で算出されている。
【００３０】
上記の方法で算出したＭＣＡの値は、国際標準規格（ＩＳＯ１５１７４, ＩＤＦ１７６；ｆｉｒｓｔ  ｅｄｔｉｏｎ  ２００２−０９−０１、食品添加物自主規格に記載）により算出したＭＣＡの値と相関がある。当該相関関係は以下の式で表すことができる。
１国際標準単位（ＩＭＣＵ／ｍｌ）≒１名糖法単位（Ｍｕ／ｍｌ）／１００
【００３１】
本発明に係るプロテアーゼは好ましくは、野生型プロテアーゼのＭＣＡと同等又はそれ以上であることが望ましい。本発明に係るプロテアーゼと野生型プロテアーゼ（配列番号３または４３）とを、同一の条件により調製してＭＣＡを比較した場合、本発明に係る改良型プロテアーゼのＭＣＡは、野生型プロテアーゼのＭＣＡの０．８倍以上であることが好ましく、０．９倍以上であることがより好ましく、１．０倍以上であることがさらに好ましい。
本発明に係るプロテアーゼと、配列番号３のアミノ酸配列からなるプロテアーゼとを、同一の条件により調製する例としては、各プロテアーゼをコードするＤＮＡを、それぞれ同一の遺伝子発現用ベクターに組み込み、該発現ベクターそれぞれを、同一株の細胞に同一の条件で導入し、該細胞を同一の培養条件で培養した培養液を各プロテアーゼ溶液とすることが挙げられる。該培養液は、同一の条件で濃縮して使用してもよいし、同一の条件で精製して使用してもよい。
【００３２】
２．本発明に係るプロテアーゼをコードするＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、本発明の改良型プロテアーゼをコードするＤＮＡである。本発明のＤＮＡとして具体的には、配列番号１の塩基番号２０８〜１２９０の塩基配列を含むＤＮＡ、又は、配列番号１の塩基番号２０８〜１２９０の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る配列を有し、かつ、上記性質を有する改良型プロテアーゼをコードするＤＮＡが挙げられる。また、本発明のＤＮＡとして具体的には、配列番号４２の塩基配列を含むＤＮＡ、又は、配列番号４２の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る配列を有し、かつ、上記性質を有する改良型プロテアーゼをコードするＤＮＡが挙げられる。ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件は、塩基配列やその長さによって異なるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００３３】
本発明に係るプロテアーゼをコードするＤＮＡは、前記変異プロテアーゼを有する突然変異株から通常の遺伝子クローニング方法により単離することができる。例えば、配列番号１または４２の塩基配列をもとに合成オリゴヌクレオチドプローブを作製し、ハイブリダイゼーションにより前記突然変異株の遺伝子ライブラリーから選択することで単離することができる。
【００３４】
また、既に知られている野生型のプロテアーゼ遺伝子のゲノムＤＮＡやｃＤＮＡの塩基配列に基づきプライマーを設計し、該プライマーを用いて、前記突然変異体のゲノムＤＮＡやｃＤＮＡライブラリーから増幅することで、本発明に係るプロテアーゼをコードするＤＮＡを得ることもできる。
【００３５】
野生型ＤＮＡに部位特異的変異を導入することによって得られるＤＮＡも本発明のプロテアーゼをコードするＤＮＡに含まれる。
【００３６】
例えば、本発明の改良型プロテアーゼをコードするＤＮＡは、リゾムコール・ミーハイの野生株（ＡＴＣＣ１６４５７）又はその誘導株から、配列番号３のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを単離し、これに部位特異的変異を導入することで容易に得ることができる。本発明の改良型プロテアーゼをコードするＤＮＡは、リゾムコール・プシルスの野生株（ＡＴＣＣ１６４５８）又はその誘導株から、配列番号４２のアミノ酸配列をコードする
ＤＮＡを単離し、これに部位特異的変異を導入することで容易に得ることもできる。
【００３７】
部位特異的変異の導入は当業者に周知の方法で行うことができる。例えば、両末端に制限酵素切断末端を持ち、変異点の両側を含む配列を合成し、未変異遺伝子の相当する部分と入れ換える事により、変異を導入することができる（カセット変異法）。
【００３８】
また、部位特異的変異導入法としては、例えばＧａｐｐｅｄ  ｄｕｏｌｅｘ法、ｋｕｎｋｅｌ法が知られており、ｋｕｎｋｅｌ法は、未変異の遺伝子を１本鎖ファージにクローン化しておき、変異点にミスマッチを含む合成ＤＮＡをプライマーとしてこれの相補鎖を合成し、得られた変異を含む相補鎖だけを鋳型として、新しいファージ及び複製型ＤＮＡを作るという原理に則っている。部位特異的変異は市販のキットを使用して行うことができる。
【００３９】
３．本発明に係る発現ベクター
本発明に係る発現ベクターは、本発明に係る改良型プロテアーゼを発現させるために用いられる。本発明に係る改良型プロテアーゼをコードするＤＮＡの上流に、該ＤＮＡの発現を制御するプロモーター配列を連結した構造にすることができる。さらに、該遺伝子の下流にターミネーターを連結させることもできる。
【００４０】
前記プロモーターとしては、宿主が大腸菌であれば、ｔｒｐ、ｌａｃ、ｔａｑ、λＰL等を使用することができる。宿主が酵母であればＧＡＬ７、ＡＤＨ、ＴＰＩ、ＰＨＯ５等のプロモーターが好ましく、これらの中では、ＧＡＬ７(Nogi Y. et al. Nucl. Acids Res. 11,8555-8568 (1983)) が強力に遺伝子発現を誘導するので特に好ましい。
【００４１】
ターミネーターとしては、ＴＰＩ、ＧＡＰＤＨ、ＧＡＬ１０等を挙げることができる。上記プロモーター、本発明に係るプロテアーゼをコードするＤＮＡ、上記ターミネーターを、５’側上流から３’側下流に向けてこの順序で連結したものをベクターに挿入することによって、本発明に係る発現ベクターを作製することができる。
【００４２】
酵母中で複製可能なベクターとしては、いわゆるＹＩｐ、ＹＲｐ、ＹＥｐ、ＹＣｐのいずれのタイプのプラスミドも使用することができるが、コピー数及び安定性の面からＹＥｐタイプが好ましい。これらのプラスミドは一般に不要な配列を含んでいるので、プラスミドの安定性を考慮し、あるいはプラスミドの改変を容易にするために、必要でない配列を削除して用いることが好ましい。
【００４３】
本発明に係る発現ベクターには、組換体を選抜するための選抜マーカー遺伝子や導入された遺伝子の発現を確認するためのレポーター遺伝子を挿入することもできる。選抜マーカー遺伝子としては、例えばハイグロマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子等が挙げられ、レポーター遺伝子としては、例えばβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子や、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）遺伝子、ＧＦＰ遺伝子等が挙げられる。また、本発明に係るプロテアーゼを分泌型として発現させたり、発現させたプロテアーゼの精製を容易にするために、本発明に係る発現ベクターには付加配列が含まれていてもよい。この場合には、本発明に係るプロテアーゼは、付加配列にコードされるタンパク質又はペプチドとの融合タンパク質として発現される。付加配列としては、シグナルペプチドやプロペプチドをコードする塩基配列や、His-tagやGST-tagをコードする塩基配列等が挙げられる。
【００４４】
４．本発明に係る形質転換細胞
本発明に係る形質転換細胞は、本発明に係る発現ベクターが導入された細胞であって、本発明に係るプロテアーゼを生産し得る細胞である。細胞は、原核細胞であっても真核細
胞であってもよいが、真核細胞であることが好ましい。
真核細胞としては、酵母、カビ、植物細胞などが挙げられるが、酵母であることが好ましく、サッカロマイセス・セレビシエであることが特に好ましい。
サッカロマイセス・セレビシエとしては、ＳＨＹ３、Ｄ１３−１Ａ、ＭＣ１６等の株を挙げることができる。
【００４５】
発現ベクターの宿主細胞への導入方法は宿主細胞の種類によって適宜選択することができ、このような方法は当業者に周知である。サッカロマイセス・セレビシエの形質転換体の場合は、例えば以下の方法で得ることができる。
【００４６】
ＹＰＤ培地（１％イースト・エキストラクト(ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ)（ディフコ社製）、２％バクトペプトン(ｂａｃｔｏｐｅｐｔｏｎｅ)（ディフコ社製）、２％グルコース）で１晩培養したサッカロマイセス・セレビシエを、新鮮なＹＰＤ培地に１０％接種し、３０℃で４時間培養する。培養液１．５ｍｌを卓上遠心機で軽く遠心して集菌し、０．２Ｍ  ＬｉＳＣＮ（関東化学株式会社製）でリンスしたのち、０．０２ｍｌの１Ｍ  ＬｉＳＣＮに懸濁する。
【００４７】
次いで、発現ベクターを含む溶液０．０１ｍｌ（約１〜１０μｇ）と０．０３ｍｌの７０％ ＰＥＧ４０００を加えてよく混合し、３０℃で１時間保温する。これに０．１４ｍｌの滅菌水を加え、希釈した後２枚のＳＤａｈプレート（０．６７％ バクト・イースト・ナイトロジェンベースｗ／ｏアミノ酸(Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ)、２％ グルコース、０．００２％アデニン硫酸塩（ａｄｅｎｉｎｅ  ｓｕｌｆａｔｅ）、０．００２％ヒスチジン塩酸塩（Ｌ−ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ＨＣｌ）、２％寒天）にプレーティングする。３０℃で２〜３日インキュベートすることで、形質転換体を得ることができる。
【００４８】
５．本発明に係る凝乳活性を有する改良型プロテアーゼの生産方法
本発明に係る形質転換細胞を培養することで、本発明に係る改良型プロテアーゼを生産することができ、本発明に係る改良型プロテアーゼを分泌のためのシグナルペプチドとの融合タンパク質として発現させることで、本発明に係るプロテアーゼを培養液中に蓄積させることができる。培養に際しては、誘導可能なプロモーターを使用した場合には、誘導を行うことが好ましい。形質転換細胞の培養方法は、細胞の種類によって異なるが、そのような方法は当業者によく知られた方法を用いることができる。
以下に、サッカロマイセス・セレビシエの形質転換体の培養方法の一例を説明する。
【００４９】
形質転換体を５００ｍｌ容坂口フラスコに入れた５０ｍｌのＹＰＤ培地で３０℃、２日間振盪培養し、菌体を増殖させる。培養液を１０００×ｇで５分間遠心して集菌し、１００ｍｌのＹＰＧａｌ培地（１％イースト・エキストラクト,２％バクトペプトン,４%ガラクトース(和光純薬工業株式会社製)）に再び懸濁し、５００ｍｌ容坂口フラスコで３０℃で３日間振盪培養する。
【００５０】
培養液中に生産された凝乳活性を有するプロテアーゼは、培養上清中に存在している状態でそのまま使用することもできるし、培養上清を濃縮して使用することもできる。培養液中に生産された凝乳活性を有するプロテアーゼは精製又は部分精製して使用してもよく、一般的なタンパク質の精製方法を用いて精製又は部分精製することができる。例えば、イオン交換、ゲル濾過等のクロマトグラフィー、硫安塩析、有機溶媒沈澱等の手法を用いることができる。
【００５１】
精製された酵素は、凍結乾燥、限外濾過膜、有機溶媒沈澱等により濃縮することもできる。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。なお全体的な遺伝子操作は、Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))に記載されているように行うことができる。
【００５３】
［実施例１］
Ｃ／Ｐ比が向上したプロテアーゼを生産するリゾムコール・ミーハイ突然変異株の取得
プロテアーゼを生産するリゾムコール・ミーハイ元株（ＣＢＳ１８２−６７（ＡＴＣＣ１６４５７の誘導株））に変異処理を施し、Ｃ／Ｐ比の向上したプロテアーゼを分泌する変異株を取得した。以下、詳細に説明する。
（１）変異処理リゾムコール・ミーハイ元株（親株）をマルトプレート（２％マルト・エキストラクト，２％グルコース，０．１％ペプトン，２％寒天）上に生育させ、３７℃で３日から１週間保温することにより胞子を形成させた。この胞子をガラス製スプレダーを用いて滅菌水に懸濁させた。
【００５４】
この胞子懸濁液に、終濃度２００μｇ／ｍｌのニトロソグアニジン（N-methyl-N'-nitro- N-nitrosoguanidine，シグマ（SIGMA CHEMICAL CO.）社製）を加え、死滅率９０％となるように室温で５〜２０分処理した。これを、マルトプレートに適量蒔き、３７℃で保温した。翌日生じた微小な菌糸をひと塊づつ、８ｍｌのＹＰＤ培地（１％イースト・エキストラクト，２％ペプトン，２％グルコース）に植菌し、３７℃で４日間振とう培養した培養上清をタンパク質分解活性（ＰＡ）及び凝乳活性（ＭＣＡ）測定用の試料とした。また菌体は−８０℃で保存した。
【００５５】
（２）変異株の検索
先に記載した方法により、ＭＣＡ及びＰＡを測定した結果、元株と比べてＰＡが大きく下回りＣ／Ｐ比（ＭＣＡ／ＰＡ）が４．６倍と大幅に増加した変異株が取得された。
【００５６】
［実施例２］
突然変異株からのプロテアーゼ遺伝子の単離
（１）変異株及び元株の染色体ＤＮＡの取得
実施例１で得た変異株と元株をマルトプレート上に生育させ、３７℃で３日から１週間保温することにより胞子を形成させた。この胞子をガラス製スプレダーを用いて滅菌水に懸濁させた。この胞子懸濁液を２００ｍｌのＹＰＤ液体培地を入れた５００ｍｌ容坂口フラスコに約１０8個となるように植えて、３７℃で２日間培養した。菌体が０．５〜２ｍｍ程度の大きさのペレットを形成したところで、培養液を濾過し余分な水分を除いて、湿重量約５ｇの菌体を得た。
【００５７】
この菌体を液体窒素で凍結させた後冷やした乳鉢に移し、３ｇの海砂（８５０〜１４００μｍ）を加えて液体窒素冷却下で乳棒を用いて細かく破砕し粉末化した。これを６８℃に保温した１５ｍｌの０．０５Ｍ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．５、０．２％  ＳＤＳ溶液に懸濁し、６８℃で１５分間保温した。その後、室温まで放置冷却し、遠心分離で白濁した上清を回収した。回収液に１／１０倍量の３Ｍ酢酸ナトリウムを添加後穏やかに混合し、遠心分離で上清を回収した。次に回収した上清に１５ｍｌのイソプロパノールを添加し穏やかに混合するとゲノムＤＮＡと蛋白質の塊が出現した。生じた析出物を７０％エタノールリンスした後、減圧乾燥させて４００μｌのＴＥに溶解し、１０μｌのＲＮａｓｅ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加、３７℃で１時間保温した。ＲＮａｓｅ処理終了後、フェノール・クロロホルム処理、クロロホルム処理、エタノール沈殿を行いゲノムＤＮＡを取得した。
【００５８】
（２）変異株及び元株染色体ＤＮＡからのプロテアーゼ遺伝子の単離
上記で得た変異株及び元株由来の染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法によってプロテアーゼ遺伝子の単離を行った。遺伝子バンクに登録されているリゾムコール・ミーハイのプロテアーゼ（ＤＤＢＪアクセス番号：Ｅ０１２６４）の配列をもとに、配列番号５と配列番号６で示されるプライマーを作製した。ＰＣＲ条件は（ａ）９４℃で２分、（ｂ）９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３分、を２８サイクル、（ｃ）７２℃で５分であり、ポリメラーゼとしてはＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を、サーマルサイクラーはＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ（タカラバイオ社製）を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片の塩基配列決定を行った結果、元株の染色体ＤＮＡを鋳型として増幅したＤＮＡがコードするアミノ酸配列は配列番号３のアミノ酸配列を含み、変異株の染色体ＤＮＡを鋳型として増幅したＤＮＡがコードするアミノ酸配列は、配列番号３のアミノ酸配列において、１９位のアミノ酸がＶａｌ、２６６位のアミノ酸がＧｌｕに置換されている配列を含むことが判った。
以下、リゾムコール・ミーハイの元株由来のプロテアーゼを野生型ＲＭＭＰと呼び、改良型プロテアーゼを「改良型ＲＭＭＰ」、改良型プロテアーゼをコードする遺伝子を「改良型ＲＭＭＰ遺伝子」と呼ぶ。
【００５９】
［実施例３］
出芽酵母（サッカロマイセス・セレビシエ）ＭＣ１６を宿主として異種蛋白を発現するためのプラスミドベクターＪＳ４の作製
該プラスミドベクターを構築するための出発材料としてＪＳ５（特許第３０１２３７７号公報[０１０９]に記載）を用いた。
初めに、ＪＳ５を鋳型として、配列番号７及び８で示したプライマーＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、ＧＡＬ７プロモーター領域を含む鎖長０．５５ｋｂｐのＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲの条件は（１）９４℃で２分（２）９８℃で1０秒、５２℃で３０秒、７２℃で１分、を３０サイクル、（３）７２℃で５分であり、ポリメラーゼはＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を、サーマルサイクラーはＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ（タカラバイオ社製）を用いた。
【００６０】
次に、得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化し、同じくＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化したｐＵＣ１８へ挿入した。これを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αへ形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、０．１ｍＭのＩＰＴＧ並びに０．０４ｍｇ／ｍｌのＸ−ＧＡＬを含むＬＢ寒天培地上で３７℃にて１６時間静置培養した。生育した白色のコロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地で３７℃にて１４〜１６時間振とう培養し、遠心して回収した形質転換体よりＱＩＡｐｒｅｐ
Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン社、以降のプラスミド抽出は全て本キットを用いて行った）を用いてプラスミドを抽出後、その挿入断片についてシーケンシングを行い望まない変異が導入されていないことを確認した。
【００６１】
続いて、その挿入断片を含むプラスミドをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化して０．５５ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得し、このＤＮＡ断片と、ＪＳ５をＢａｍＨＩで消化しＥｃｏＲＩで部分消化して得た約６ｋｂｐのＤＮＡ断片を連結して大腸菌ＤＨ５αに形質転換後、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で３７℃にて１６時間培養した。生育したコロニーを同液体培地にて３７℃で１４〜１６時間振とう培養後、遠心して回収した形質転換体についてプラスミドを抽出した。このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ並びにＰｓｔＩで消化した後にアガロース電気泳動分析にて泳動パターンを確認した。こうして発現ベクターＪＳ４を作製した。
尚、該プラスミドベクターの構築のための出発材料として、ＪＳ５の他、例えば特許第３０１２３７７号公報[０１１２]に記載のＪＳ５２（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８９８）を用いてもＪＳ４を得ることが出来る。
【００６２】
［実施例４］
野生型ＲＭＭＰ遺伝子及び変異型ＲＭＭＰ遺伝子を発現させるためのプラスミドベクターの作製
実施例２で得られた、野生型ＲＭＭＰ及びＧｌｕ１９Ｖａｌ/Ｇｌｎ２６６Ｇｌｕの変異を有する変異型ＲＭＭＰをコードするＤＮＡを含む塩基配列の両末端にＢａｍＨＩ部位が付加されるよう設計したプライマーＤＮＡ（配列番号９及び１０）を用いてＰＣＲを行い、そのＰＣＲ産物についてＢａｍＨＩで消化後、同じくＢａｍＨＩで消化し脱リン酸化したＪＳ４に挿入し、大腸菌ＤＨ５αへ形質転換した。
【００６３】
ＧＡＬ７プロモーターにアニールするフォワードプライマー及びＲＭＭＰ遺伝子３’末端にアニールするリバースプライマー（配列番号１１及１０）を用いてコロニーダイレクトＰＣＲを行い当該挿入遺伝子の方向が正しい向きであることを確認できたプラスミドベクターを保持する大腸菌の形質転換体を先述の様にして液体培養しプラスミドを抽出後、シーケンシングを行い、望まないエラーが導入されていないことを確認することで、野生型ＲＭＭＰ遺伝子及び改良型ＲＭＭＰ遺伝子を発現するためのプラスミドベクターを作製した。
【００６４】
［実施例５］
部位特異的変異を導入したＲＭＭＰ遺伝子の発現ベクターの作製（Ｉ）
実施例４に記載の方法で得た、両末端にＢａｍＨＩ部位を付加したプレプロ配列を含む野生型ＲＭＭＰ遺伝子のＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ消化し、同じくＢａｍＨＩ消化して脱リン酸化したｐＵＣ１８へ挿入して大腸菌ＤＨ５αへ形質転換後、得られた形質転換体より先述のようにしてプラスミドを抽出し、塩基配列を確認することでｐＲＭＭＰ−ｗｔを作製した。
【００６５】
次に、ｐＲＭＭＰ−ｗｔを鋳型として、配列番号１２及び１３、配列番号１４及び１５、配列番号１６及び１７、配列番号１８及び１９、配列番号２０及び２１、配列番号２２及び２３、配列番号２４及び２５で示したプライマーＤＮＡ、並びにＰｒｉｍｅＳＴＡＲ
Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｂａｓａｌ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社、以降はキットと略す）を用いて、ＰＣＲ法により、配列番号３における１９位のグルタミン酸又は２６６位のグルタミンの一ヶ所について別のアミノ酸に置換するよう変異を導入した。変異導入用プライマーの設計並びにＰＣＲ反応条件は、本キット付属のマニュアルを参考にして行った。以降の変異導入実験も本マニュアルに準拠して行った。
【００６６】
得られたＰＣＲ産物を大腸菌ＤＨ５αへ形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に撒き３７℃で１６時間静置培養して形質転換体を取得した。この形質転換体より、先述と同じ方法でプラスミドを抽出してシーケンシングを行い、望まない変異が導入されていないことを確認した。
【００６７】
このような手順により、Ｇｌｕ１９Ｖａｌ、Ｇｌｕ１９Ａｌａ、Ｇｌｕ１９Ｉｌｅ、Ｇｌｕ１９Ｌｅｕ、Ｇｌｕ１９Ｐｈｅ、Ｇｌｎ２６６Ｇｌｕ、Ｇｌｎ２６６Ａｓｐのアミノ酸置換を有する改良型ＲＭＭＰをコードする遺伝子を作製した。これらの改良型ＲＭＭＰ遺伝子を含むプラスミドベクターを便宜上、それぞれｐＲＭＭＰ−Ｅ１９Ｖ、ｐＲＭＭＰ−Ｅ１９Ａ，ｐＲＭＭＰ−Ｅ１９Ｉ，ｐＲＭＭＰ−Ｅ１９Ｌ，ｐＲＭＭＰ−Ｅ１９Ｆ，ｐＲＭＭＰ−Ｑ２６６Ｅ，ｐＲＭＭＰ−Ｑ２６６Ｄとした。
【００６８】
さらに、ｐＲＭＭＰ−Ｑ２６６Ｅ又はｐＲＭＭＰ−Ｑ２６６Ｄを鋳型にして、配列番号１２及び１３、配列番号１４及び１５、配列番号１６及び１７、配列番号１８及び１９に示したプライマーＤＮＡ、並びに上述のキットを用いてＰＣＲを行って得たＰＣＲ産物を大腸菌ＤＨ５αへ形質転換後、得られた形質転換体より先述と同様にしてプラスミドを抽
出してシーケンシングを行うことにより、Ｇｌｕ１９Ｖａｌ／Ｇｌｎ２６６Ａｓｐ、Ｇｌｕ１９Ａｌａ／Ｇｌｎ２６６Ｇｌｕ、Ｇｌｕ１９Ａｌａ／Ｇｌｎ２６６Ａｓｐ、Ｇｌｕ１９Ｉｌｅ／Ｇｌｎ２６６Ｇｌｕ、Ｇｌｕ１９Ｉｌｅ／Ｇｌｎ２６６Ａｓｐ、Ｇｌｕ１９Ｌｅｕ／Ｇｌｎ２６６Ｇｌｕのアミノ酸置換を有する改良型ＲＭＭＰをコードする遺伝子を作製した。これらの改良型ＲＭＭＰ遺伝子を含むプラスミドベクターを便宜上、ｐＲＭＭＰ−Ｅ１９ＶＱ２６６Ｄ，ｐＲＭＭＰ−Ｅ１９ＡＱ２６６Ｅ，ｐＲＭＭＰ−Ｅ１９ＡＱ２６６Ｄ，ｐＲＭＭＰ−Ｅ１９ＩＱ２６６Ｅ，ｐＲＭＭＰ−Ｅ１９ＩＱ２６６Ｄ，ｐＲＭＭＰ−Ｅ１９ＬＱ２６６Ｅとした。
【００６９】
このようにして得たプラスミドベクターをＢａｍＨＩ消化して得られる上記フラグメントを、先に述べた方法でＪＳ４へ挿入することにより、上記の各改良型ＲＭＭＰ遺伝子の発現ベクターを作製した。
【００７０】
［実施例６］
部位特異的変異を導入した改良型ＲＭＭＰ遺伝子の発現ベクターの作製（ＩＩ）
ｐＲＭＭＰ−ｗｔを鋳型にして、配列番号２６及び２７、配列番号２８及び２９、配列番号３０及び３１、配列番号３２及び３３、配列番号３４及び３５、配列番号３６及び３７に示したプライマーＤＮＡ、並びに上述のキットを用いてＰＣＲを行って得たＰＣＲ産物を大腸菌ＤＨ５αへ形質転換し、得られた形質転換体より先述と同様にしてプラスミドを抽出してシーケンシングを行うことにより、Ｇｌｎ２６５Ｇｌｕ，Ｇｌｎ２６５Ａｓｐ，Ｇｌｎ２６５Ｇｌｕ／Ｇｌｎ２６６Ｇｌｕ，Ｇｌｎ２６５Ｇｌｕ／Ｇｌｎ２６６Ａｓｐ，Ｇｌｎ２６５Ａｓｐ／Ｇｌｎ２６６Ｇｌｕ，Ｇｌｎ２６５Ａｓｐ／Ｇｌｎ２６６Ａｓｐのアミノ酸置換を有する改良型ＲＭＭＰをコードする遺伝子を作製した。これらの改良型ＲＭＭＰ遺伝子を含むプラスミドベクターを便宜上、ｐＲＭＭＰ−Ｑ２６５Ｅ，ｐＲＭＭＰ−Ｑ２６５Ｄ，ｐＲＭＭＰ−Ｑ２６５ＥＱ２６６Ｅ，ｐＲＭＭＰ−Ｑ２６５ＥＱ２６６Ｄ，ｐＲＭＭＰ−Ｑ２６５ＤＱ２６６Ｅ，ｐＲＭＭＰ−Ｑ２６５ＤＱ２６６Ｄとした。
【００７１】
このようにして得た、上記各改良型ＲＭＭＰ遺伝子を含むプラスミドベクターをＢａｍＨＩ消化して得られる上記改良型ＲＭＭＰ遺伝子を、先に述べた方法によりＪＳ４へ挿入することで、上記の改良型ＲＭＭＰ遺伝子の発現ベクターを作製した。
【００７２】
［実施例７］
部位特異的変異を導入した改良型ＲＭＭＰ遺伝子の発現ベクターの作製（ＩＩＩ）
ｐＲＭＭＰ−Ｅ１９Ｖ、ｐＲＭＭＰ−Ｅ１９Ａ又はｐＲＭＭＰ−Ｅ１９Ｉを鋳型にして、配列番号３０及び３１、配列番号３２及び３３、配列番号３４及び３５、配列番号３６及び３７に示したプライマーＤＮＡ、並びに上述のキットを用いてＰＣＲを行って得たＰＣＲ産物を大腸菌ＤＨ５αへ形質転換し、得られた形質転換体より先述と同様にしてプラスミドを抽出してシーケンシングを行うことにより、Ｇｌｕ１９Ｖａｌ／Ｇｌｎ２６５Ｇｌｕ／Ｇｌｎ２６６Ｇｌｕ，Ｇｌｕ１９Ｖａｌ／Ｇｌｎ２６５Ｇｌｕ／Ｇｌｎ２６６Ａｓｐ，Ｇｌｕ１９Ｖａｌ／Ｇｌｎ２６５Ａｓｐ／Ｇｌｎ２６６Ｇｌｕ，Ｇｌｕ１９Ｖａｌ／Ｇｌｎ２６５Ａｓｐ／Ｇｌｎ２６６Ａｓｐ，Ｇｌｕ１９Ａｌａ／Ｇｌｎ２６５Ｇｌｕ／Ｇｌｎ２６６Ｇｌｕ，Ｇｌｕ１９Ａｌａ／Ｇｌｎ２６５Ｇｌｕ／Ｇｌｎ２６６Ａｓｐ，Ｇｌｕ１９Ａｌａ／Ｇｌｎ２６５Ａｓｐ／Ｇｌｎ２６６Ｇｌｕ，Ｇｌｕ１９Ａｌａ／Ｇｌｎ２６５Ａｓｐ／Ｇｌｎ２６６Ａｓｐ，Ｇｌｕ１９Ｉｌｅ／Ｇｌｎ２６５Ｇｌｕ／Ｇｌｎ２６６Ｇｌｕ，Ｇｌｕ１９Ｉｌｅ／Ｇｌｎ２６５Ｇｌｕ／Ｇｌｎ２６６Ａｓｐ，Ｇｌｕ１９Ｉｌｅ／Ｇｌｎ２６５Ａｓｐ／Ｇｌｎ２６６Ｇｌｕ，Ｇｌｕ１９Ｉｌｅ／Ｇｌｎ２６５Ａｓｐ／Ｇｌｎ２６６Ａｓｐのアミノ酸置換を有する改良型ＲＭＭＰをコードする遺伝子を作製した。これらの改良型ＲＭＭＰ遺伝子を含むプラスミドベクターを便宜上、ｐＲＭＭＰ−Ｅ１９ＶＱ２６５ＥＱ２６６Ｅ，ｐＲＭＭＰ−Ｅ１９ＶＱ２６５ＥＱ２６６Ｄ，ｐＲＭＭＰ−Ｅ１９ＶＱ２６５ＤＱ２６６Ｅ，ｐＲＭＭＰ−Ｅ１９ＶＱ２６５ＤＱ２６６Ｄ，ｐ
ＲＭＭＰ−Ｅ１９ＡＱ２６５ＥＱ２６６Ｅ，ｐＲＭＭＰ−Ｅ１９ＡＱ２６５ＥＱ２６６Ｄ，ｐＲＭＭＰ−Ｅ１９ＡＱ２６５ＤＱ２６６Ｅ，ｐＲＭＭＰ−Ｅ１９ＡＱ２６５ＤＱ２６６Ｄ，ｐＲＭＭＰ−Ｅ１９ＩＱ２６５ＥＱ２６６Ｅ，ｐＲＭＭＰ−Ｅ１９ＩＱ２６５ＥＱ２６６Ｄ，ｐＲＭＭＰ−Ｅ１９ＩＱ２６５ＤＱ２６６Ｅ，ｐＲＭＭＰ−Ｅ１９ＩＱ２６５ＤＱ２６６Ｄとした。
【００７３】
このようにして得た、上記改良型ＲＭＭＰ遺伝子を含むプラスミドベクターをＢａｍＨＩ消化して得られる上記改良型ＲＭＭＰ遺伝子について、先に述べた方法でＪＳ４へ挿入することで、上記の改良型ＲＭＭＰ遺伝子の発現ベクターを作製した。
【００７４】
［実施例８］
野生型並びに変異型ＲＭＭＰ遺伝子を含む発現ベクターによる出芽酵母ＭＣ１６の形質転換
上述のようにして作製した発現ベクターを、ＧｉｅｔｚとＳｃｈｉｅｓｔｌ（１９９５）の方法にて出芽酵母ＭＣ１６株（ＭＡＴα、ｌｅｕ２，ｈｉｓ４，ａｄｅ２）へ形質転換し、ＳＤａｈプレートへ撒いて３０℃で３日間、静置培養することにより形質転換体を得た。
【００７５】
［実施例９］
野生型並びに変異型ＲＭＭＰ遺伝子の分泌発現
上に記述した方法で得た形質転換体を、予め５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコで調製した１００ｍｌのＹＰＤ液体培地にて３０℃２４時間２００ｒｐｍで振とう培養を行った後、遠心して得た菌体を２倍量のＹＰＧａｌ液体培地に再懸濁し、滅菌済み同フラスコに移してさらに７２〜９６時間同様にして振とう培養を行い分泌発現させた。培養終了後、培養液を遠心することにより、当該ＲＭＭＰを含む培養上清を得た。
【００７６】
［実施例１０］
ＭＣＡ及びＰＡの測定、ならびにＣ／Ｐ比の評価
上記のようにして得られた当該ＲＭＭＰを含む培養上清について、ＭＣＡ及びＰＡを測定し、Ｃ／Ｐ比を算出した。結果を表１に示す。
【００７７】
【表１】
0005643766.tif 000002
【００７８】
リゾムコール・ミーハイ（変異株）に由来するＧｌｕ１９Ｖａｌ/Ｇｌｎ２６６Ｇｌｕの変異を有するＲＭＭＰのＣ／Ｐ比は野生型の３．８倍であった。
【００７９】
１９位のアミノ酸残基のみ置換したところ、Ｇｌｕ１９Ｖａｌ、Ｇｌｕ１９Ａｌａ及びＧｌｕ１９Ｉｌｅの変異を有するＲＭＭＰのＣ／Ｐ比が高かった。尚、リゾムコール・プシルスにおいて、Ｇｌｕ１９Ａｌａの変異が既に知られている（J. Biochem. 129, 791-7
94, 2001）。
【００８０】
野生型のＲＭＭＰにおいては、配列番号３に示すように２６５位と２６６位のアミノ酸は共にグルタミンであるが、２６５位のアミノ酸のみ酸性アミノ酸に置換された、Ｇｌｎ２６５Ｇｌｕ及びＧｌｎ２６５Ａｓｐの変異を有するＲＭＭＰのＣ／Ｐ比（表１中のｍｕｔａｎｔ１４及び１５）が共に、野生型のそれと比較して高いことが確認でき、２６６位のアミノ酸のみ酸性アミノ酸に置換された、Ｇｌｎ２６６Ｇｌｕ及びＧｌｎ２６６Ａｓｐの変異を有するＲＭＭＰのＣ／Ｐ比（表１中のｍｕｔａｎｔ６及び７）についても同様に、野生型のそれと比較して高かった。
２６５位又は２６６位のアミノ酸を置換することでＣ／Ｐ比が高まることが本発明により初めて見出されたものである。
【００８１】
また、２６６位のアミノ酸の酸性アミノ酸への置換と、１９位のアミノ酸の置換とを組み合わせた場合のＣ／Ｐ比（表１中のｍｕｔａｎｔ８〜１３）は、２６６位のアミノ酸を単独で置換した場合よりも高くなることも確認できた。
【００８２】
さらに、２６５位及び２６６位のアミノ酸残基が同時に酸性アミノ酸に置換された、Ｇｌｎ２６５Ｇｌｕ／Ｇｌｎ２６６Ｇｌｕ、Ｇｌｎ２６５Ｇｌｕ／Ｇｌｎ２６６Ａｓｐ、Ｇｌｎ２６５Ａｓｐ／Ｇｌｎ２６６Ｇｌｕ及びＧｌｎ２６５Ａｓｐ／Ｇｌｎ２６６Ａｓｐの変異を有するＲＭＭＰのＣ／Ｐ比（表１中のｍｕｔａｎｔ１６〜１９）は、２６５位のアミノ酸のみ又は２６６位のアミノ酸のみが酸性アミノ酸に置換された変異を有するＲＭＭＰのそれよりも顕著に高く、２６５位及び２６６位のいずれか一方のみのアミノ酸が酸性アミノ酸に置換されたＲＭＭＰよりも顕著に高いことが認められた。
【００８３】
さらに、２６５位、２６６位及び１９位のアミノ酸残基が同時に置換された、Ｇｌｕ１９Ｖａｌ／Ｇｌｎ２６５Ｇｌｕ／Ｇｌｎ２６６Ｇｌｕ、Ｇｌｕ１９Ｖａｌ／Ｇｌｎ２６５Ｇｌｕ／Ｇｌｎ２６６Ａｓｐ、Ｇｌｕ１９Ｖａｌ／Ｇｌｎ２６５Ａｓｐ／Ｇｌｎ２６６Ｇｌｕ及びＧｌｕ１９Ｖａｌ／Ｇｌｎ２６５Ａｓｐ／Ｇｌｎ２６６Ａｓｐの変異を有するＲＭＭＰのＣ／Ｐ比（表１中のｍｕｔａｎｔ２０〜２３）は、Ｃ／Ｐ比が野生型のＲＭＭＰと比べて５倍前後まで顕著に高まっており、極めて優れた凝乳酵素であることが確認できた。
【００８４】
［実施例１１］
部位特異的変異を導入した改良型ＲＭＭＰ遺伝子の発現ベクターの作製（ＩＶ）
続いて、配列番号３のアミノ酸配列において、８１位のアミノ酸であるスレオニンがグルタミン又はアスパラギン酸に置換された変異を有するＲＭＭＰ遺伝子の発現ベクターを作製した。
【００８５】
ｐＲＭＭＰ−ｗｔ又はｐＲＭＭＰ−Ｑ２６５ＥＱ２６６Ｅを鋳型にして、配列番号３８及び３９に示したプライマーＤＮＡ並びに上述のキットを用いＰＣＲを行って得たＰＣＲ産物を大腸菌ＤＨ５αへ形質転換し、得られた形質転換体より先述と同様にしてプラスミドを抽出してシーケンシングを行うことにより，Ｔｈｒ８１Ｇｌｎ、Ｔｈｒ８１Ｇｌｎ／Ｇｌｎ２６５Ｇｌｕ／Ｇｌｎ２６６Ｇｌｕのアミノ酸置換を有する改良型ＲＭＭＰをコードする遺伝子を作製した。これらの改良型ＲＭＭＰ遺伝子を含むプラスミドベクターを便宜上、ｐＲＭＭＰ−Ｔ８１Ｑ、ｐＲＭＭＰ−Ｔ８１ＱＱ２６５ＥＱ２６６Ｅとした。
【００８６】
続いて、ｐＲＭＭＰ−Ｑ２６５ＥＱ２６６Ｄを鋳型にして、配列番号４０及び４１に示したプライマーＤＮＡ並びに上述のキットを用いＰＣＲを行って得たＰＣＲ産物を大腸菌ＤＨ５αへ形質転換し、得られた形質転換体より先述と同様にしてプラスミドを抽出してシーケンシングを行うことにより，Ｔｈｒ８１Ａｓｐ／Ｇｌｎ２６５Ｇｌｕ／Ｇｌｎ２６
６Ａｓｐのアミノ酸置換を有する改良型ＲＭＭＰをコードする遺伝子を作製した。この改良型ＲＭＭＰ遺伝子を含むプラスミドベクターを便宜上、ｐＲＭＭＰ−Ｔ８１ＤＱ２６５ＥＱ２６６Ｄとした。
【００８７】
さらに、ｐＲＭＭＰ−Ｅ１９ＶＱ２６５ＥＱ２６６Ｅ，ｐＲＭＭＰ−Ｅ１９ＶＱ２６５ＥＱ２６６Ｄ，ｐＲＭＭＰ−Ｅ１９ＶＱ２６５ＤＱ２６６Ｅ，ｐＲＭＭＰ−Ｅ１９ＶＱ２６５ＤＱ２６６Ｄ，ｐＲＭＭＰ−Ｅ１９ＡＱ２６５ＥＱ２６６Ｅ，ｐＲＭＭＰ−Ｅ１９ＡＱ２６５ＥＱ２６６Ｄ，ｐＲＭＭＰ−Ｅ１９ＩＱ２６５ＥＱ２６６Ｅ，ｐＲＭＭＰ−Ｅ１９ＩＱ２６５ＥＱ２６６Ｄ，ｐＲＭＭＰ−Ｅ１９ＩＱ２６５ＤＱ２６６Ｅ，ｐＲＭＭＰ−Ｅ１９ＩＱ２６５ＤＱ２６６Ｄを鋳型にして、配列番号３８及び３９に示したプライマーＤＮＡ並びに上述のキットを用いＰＣＲを行って得たＰＣＲ産物を大腸菌ＤＨ５αへ形質転換し、得られた形質転換体より先述と同様にしてプラスミドを抽出してシーケンシングを行うことにより，Ｇｌｕ１９Ｖａｌ／Ｔｈｒ８１Ｇｌｎ／Ｇｌｎ２６５Ｇｌｕ／Ｇｌｎ２６６Ｇｌｕ，Ｇｌｕ１９Ｖａｌ／Ｔｈｒ８１Ｇｌｎ／Ｇｌｎ２６５Ｇｌｕ／Ｇｌｎ２６６Ａｓｐ，Ｇｌｕ１９Ｖａｌ／Ｔｈｒ８１Ｇｌｎ／Ｇｌｎ２６５Ａｓｐ／Ｇｌｎ２６６Ｇｌｕ，Ｇｌｕ１９Ｖａｌ／Ｔｈｒ８１Ｇｌｎ／Ｇｌｎ２６５Ａｓｐ／Ｇｌｎ２６６Ａｓｐ，Ｇｌｕ１９Ａｌａ／Ｔｈｒ８１Ｇｌｎ／Ｇｌｎ２６５Ｇｌｕ／Ｇｌｎ２６６Ｇｌｕ，Ｇｌｕ１９Ａｌａ／Ｔｈｒ８１Ｇｌｎ／Ｇｌｎ２６５Ｇｌｕ／Ｇｌｎ２６６Ａｓｐ，Ｇｌｕ１９Ｉｌｅ／Ｔｈｒ８１Ｇｌｎ／Ｇｌｎ２６５Ｇｌｕ／Ｇｌｎ２６６Ｇｌｕ，Ｇｌｕ１９Ｉｌｅ／Ｔｈｒ８１Ｇｌｎ／Ｇｌｎ２６５Ｇｌｕ／Ｇｌｎ２６６Ａｓｐ，Ｇｌｕ１９Ｉｌｅ／Ｔｈｒ８１Ｇｌｎ／Ｇｌｎ２６５Ａｓｐ／Ｇｌｎ２６６Ｇｌｕ，Ｇｌｕ１９Ｉｌｅ／Ｔｈｒ８１Ｇｌｎ／Ｇｌｎ２６５Ａｓｐ／Ｇｌｎ２６６Ａｓｐのアミノ酸置換を有する改良型ＲＭＭＰをコードする遺伝子を作製した。
これらの改良型ＲＭＭＰ遺伝子を含むプラスミドベクターを便宜上、ｐＲＭＭＰ−Ｅ１９ＶＴ８１ＱＱ２６５ＥＱ２６６Ｅ，ｐＲＭＭＰ−Ｅ１９ＶＴ８１ＱＱ２６５ＥＱ２６６Ｄ，ｐＲＭＭＰ−Ｅ１９ＶＴ８１ＱＱ２６５ＤＱ２６６Ｅ，ｐＲＭＭＰ−Ｅ１９ＶＴ８１ＱＱ２６５ＤＱ２６６Ｄ，ｐＲＭＭＰ−Ｅ１９ＡＴ８１ＱＱ２６５ＥＱ２６６Ｅ，ｐＲＭＭＰ−Ｅ１９ＡＴ８１ＱＱ２６５ＥＱ２６６Ｄ，ｐＲＭＭＰ−Ｅ１９ＩＴ８１ＱＱ２６５ＥＱ２６６Ｅ，ｐＲＭＭＰ−Ｅ１９ＩＴ８１ＱＱ２６５ＥＱ２６６Ｄ，ｐＲＭＭＰ−Ｅ１９ＩＴ８１ＱＱ２６５ＤＱ２６６Ｅ，ｐＲＭＭＰ−Ｅ１９ＩＴ８１ＱＱ２６５ＤＱ２６６Ｄとした。
【００８８】
このようにして得た、上記改良型ＲＭＭＰ遺伝子を含むプラスミドベクターをＢａｍＨＩ消化して得られる上記改良型ＲＭＭＰ遺伝子について、先に述べた方法でＪＳ４へ挿入することで、上記の改良型ＲＭＭＰ遺伝子の発現ベクターを作製した。
【００８９】
［実施例１２］
実施例８〜１０に記載した方法に従って、実施例１１で作製した発現ベクターで出芽酵母ＭＣ１６を形質転換し、該形質転換体を液体培養して改良型ＲＭＭＰを含む培養上清を取得した。この培養上清を用いてＣ／Ｐ比の評価を行った結果を表２に示す。
【００９０】
【表２】
0005643766.tif 000003
【００９１】
表２に示すように、８１位のアミノ酸であるスレオニンのグルタミン又はアスパラギン酸への置換と、２６５位及び２６６位のアミノ酸の酸性アミノ酸への置換とを組み合わせた変異を有するＲＭＭＰが、野生型のＲＭＭＰと比べて高いＣ／Ｐ比（表１中のｍｕｔａｎｔ３３〜３４）を示すことが確認でき、特に、Ｔｈｒ８１Ａｓｐ／Ｇｌｎ２６５Ｇｌｕ／Ｇｌｎ２６６Ａｓｐの変異を有するＲＭＭＰにおいては、Ｃ／Ｐ比が野生型のＲＭＭＰに比べて４．４倍も上昇していた。
さらに１９位のアミノ酸残基の置換と組み合わせた場合にも、野生型のＲＭＭＰと比べて高いＣ／Ｐ比（表１中のｍｕｔａｎｔ３５〜４４）を示すことが確認でき、特に、Ｇｌｕ１９Ｖａｌ／Ｔｈｒ８１Ｇｌｎ／Ｇｌｎ２６５Ａｓｐ／Ｇｌｎ２６６Ｇｌｕの変異を有するＲＭＭＰにおいては、Ｃ／Ｐ比が野生型のＲＭＭＰに比べて４．８倍も上昇していることが確認できた。
【００９２】
以上のように、表１及び表２に示された結果は、配列番号３のアミノ酸配列における２６５位及び／又は２６６位のアミノ酸残基が酸性アミノ酸に置換されると、Ｃ／Ｐ比が、野生型のＲＭＭＰと比べて高くなることを示しており、さらに、１９位及び／又は８１位のアミノ酸残基の置換を組み合わせることによって、Ｃ／Ｐ比がさらに向上することを示している。
【００９３】
［実施例１３］
野生型及び変異型ＲＭＭＰの精製、ならびに精製標品の評価
野生型ＲＭＭＰ遺伝子、及び、Ｇｌｕ１９Ｖａｌ／Ｇｌｎ２６６Ｇｌｕ,Ｇｌｕ１９Ｖａｌ，Ｇｌｕ１９Ａｌａ，Ｇｌｎ２６６Ｇｌｕ，Ｇｌｎ２６６Ａｓｐ，Ｇｌｕ１９Ａｌａ／Ｇｌｎ２６６Ｇｌｕ，Ｇｌｎ２６５Ｇｌｕ，Ｇｌｎ２６５Ａｓｐ，Ｇｌｎ２６５Ｇｌｕ／Ｇｌｎ２６６Ｇｌｕ，Ｇｌｎ２６５Ｇｌｕ／Ｇｌｎ２６６Ａｓｐ，Ｇｌｎ２６５Ａｓｐ／Ｇｌｎ２６６Ｇｌｕ，Ｇｌｎ２６５Ａｓｐ／Ｇｌｎ２６６Ａｓｐ，Ｇｌｕ１９Ｖａｌ／Ｇｌｎ２６５Ｇｌｕ／Ｇｌｎ２６６Ａｓｐ並びにＧｌｕ１９Ｖａｌ／Ｇｌｎ２６５Ａｓｐ／Ｇｌｎ２６６Ａｓｐのアミノ酸置換を有する変異型ＲＭＭＰ遺伝子を含む発現ベクター
を保持する出芽酵母ＭＣ１６を、先に述べた方法により培養し、該ＲＭＭＰを分泌発現させた。遠心して得られた培養上清について、５０ｍＭ  酢酸ナトリウムｐＨ５．５の緩衝液で平衡化したＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰ（ＧＥ  ヘルスケア社製）を充填したカラムを通し、ＲＭＭＰタンパクを吸着させた。同緩衝液でカラムを洗浄した後、０．３Ｍ  ＮａＣｌの緩衝液にて溶出した。ＲＭＭＰを含む画分はスキムプレート（１％スキムミルク（ディフコ社製）、１００ｍＭ  酢酸緩衝液  ｐＨ５．２、１％寒天）に２μｌを乗せ、３７℃で１０分間インキュベートし、タービットハローの出現で検出した。
【００９４】
得られた活性画分を限外濾過膜にて濃縮後、Ｓｕｐｅｒ  ＳＷ３０００（東ソー株式会社製）ゲル濾過カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにより精製を行った。活性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析したところ、単一のバンドとなった。
このようにして得られた精製ＲＭＭＰについて、ＭＣＡを測定した結果を表３に示す。尚、タンパク質の定量はＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ製）で行った。
【００９５】
【表３】
0005643766.tif 000004
【００９６】
この結果から、１９位のグルタミン酸の置換のみでは、ＭＣＡが低下するが、２６５位又は２６６位のグルタミンの置換では、ＭＣＡが上昇した。１９位及び２６６位の２箇所の置換、並びに１９位、２６５位及び２６６位の３箇所の置換でもＭＣＡが増加した。
【００９７】
［実施例１４］
乳清乾燥物重量測定試験
チーズの収量は、凝乳酵素を商業的に用いる際に重要な性質の一つである。ミルクを凝固させる際に流出される乳清中に含まれる乾燥物重量はチーズの収量を比較する上で有効で
あり、乾燥重量が少ないということは、チーズの収率が高いことを示している。
そこで、酵母にて発現させた野生型ＲＭＭＰとＥ１９Ｖ／Ｑ２６６Ｅ ＲＭＭＰを用いた乳性乾燥物重量測定試験を挙げる。
【００９８】
野生型ＲＭＭＰ遺伝子及びＧｌｕ１９Ｖａｌ／Ｇｌｎ２６６Ｇｌｕのアミノ酸置換を有する変異型ＲＭＭＰ遺伝子を含む発現ベクターを保持する出芽酵母ＭＣ１６を、先に述べた方法により培養し、該ＲＭＭＰを分泌発現させた。遠心して得られた培養上清について、限外濾過膜にて濃縮し、凝乳酵素として用いた。
【００９９】
（１）凝乳操作
市販の低温殺菌無調製牛乳（タカナシ乳業）５００ｇをビーカーに入れ、３２℃に保温する。保温した牛乳が３２℃に達した所で、Ｄ‐（＋）グルコノ‐１，５‐ラクトン（Ｄ‐グルコン酸δ‐ラクトン、和光純薬製）を０．４ｇ添加、攪拌後、塩化カルシウム（和光純薬製）を終濃度１ｍＭになるよう徐々に添加し、攪拌する。試薬を添加後、凝乳酵素を２，０００Ｍｕ添加し、1分間攪拌し、保温する。凝乳酵素を添加してから３０分後をＲｅｎｎｅｔｉｎｇ  ｔｉｍｅとし、カードを１〜１．５ｃｍ角に切断し、１０分間放置する。放置後、カードを緩やかに崩す。時折カードを穏やかに攪拌しながら、２０分間保温する。保温後、ビーカーを３７℃のインキュベーターへ移し、内部の温度を３７℃まで上昇させる（1分間に０．５℃上昇）。カードが３７℃に達した所で、時折緩やかに攪拌しながら更に３０分間放置する。放置後、ガーゼにてカードと乳清を分離させる。回収したカードはガーゼに包み、チーズ作製用モールドに入れ、加圧（５ ＭＰａ、９０分間）し、更に乳清を流出させ、回収する。回収した全ての乳清を混合し、定性濾紙Ｎｏ．１（ADVANTEC）により濾過したものを全乳清とする。
【０１００】
（２）乳性乾燥物重量測定
予めビーカーを乾熱機にて１０５℃で乾燥させておく。乾熱機から取り出したビーカーをデシケーターに入れ、３０分以上経過した後に、重量を測定する。そのビーカーに上記で得た乳性約２５ｇを入れ、乾熱機にて１０５℃, １２〜１５時間以上乾燥させる。乾燥後、ビーカーをデシケーターに入れ、３０分以上経過した後に、重量を測定する。予め測定したビーカー重量を差し引いた値を乾燥重量とする。尚、全て２連で行った。
このようにして得られた１５ロットの乳性中の乾燥物含有量、及び全乾燥物重量を表４に示した。
【０１０１】
【表４】
0005643766.tif 000005
【０１０２】
野生型ＲＭＭＰ、Ｇｌｕ１９Ｖａｌ／Ｇｌｎ２６６ＧｌｕＲＭＭＰの全乾燥重量はそれぞれ２８．４８１０ｇ、２８．０５１１ｇであった。スチューデントのｔ検定（両側検定）を用いて有意差の有無を確認したところ、両者には有意差が認められた（ｐ＜０．０１）。つまり、Ｇｌｕ１９Ｖａｌ／Ｇｌｎ２６６Ｇｌｕ ＲＭＭＰは野生型ＲＭＭＰよりも高いチーズの収量を得ることができ、野生型ＭＲＳよりも約１．５１％多くチーズを生産できる。これは１００トンのミルクを用いてチーズを生産する際の８５．９７ｋｇに相当する。
【図１】
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【図２】
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