(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式：
【化１】
0005518887.tif 000048
の化合物、又はその薬学的に許容できる塩
（式中、
Ｘは、Ｃ−Ｒ１又はＮであり、
Ｒ１は、水素、フルオロ、又はシアノであり、
Ｒ２は、
【化２】
0005518887.tif 000049
、ピペリジニル、又はｇｅｍ−ジ−Ｆ−置換シクロへキシルであり、
Ｒ３は、メチル又はトリフルオロメチルであり、
Ｒ４は、ピロリジニル、モルホリニル、ピリジル、アミノ、又はジメチルアミノであり、
Ｒ５は、トリフルオロメチル又はメチルスルホニルであり、
Ｒ６は、水素又はメチルであり、
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、及びＲ１１は、独立して、水素、フルオロ、シアノ、クロロ、メチル、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、又はメチルスルホニルであるが、但し、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、及びＲ１１のうちの少なくとも２つは、水素である）。
【請求項２】
ＸがＣ−Ｒ１であり、且つＲ１がフルオロである、請求項１に記載の化合物、又はその薬学的に許容できる塩。
【請求項３】
ＸがＣ−Ｒ１であり、且つＲ１がシアノである、請求項１に記載の化合物、又はその薬学的に許容できる塩。
【請求項４】
Ｒ２が、
【化３】
0005518887.tif 000050
である、請求項１に記載の化合物、又はその薬学的に許容できる塩。
【請求項５】
Ｒ２が、
【化４】
0005518887.tif 000051
である、請求項１に記載の化合物、又はその薬学的に許容できる塩。
【請求項６】
Ｒ５がトリフルオロメチルであり、且つＲ６がメチルである、請求項４に記載の化合物、又はその薬学的に許容できる塩。
【請求項７】
Ｒ７がトリフルオロメチルであり、且つＲ９、Ｒ１０、及びＲ１１が水素である、請求項５に記載の化合物、又はその薬学的に許容できる塩。
【請求項８】
Ｎ−（１−（６−（４−シアノフェニル）−４，５−ジメチルピリダジン−３−イル）ピペリジン−４−イル）−Ｎ−メチル−２−（トリフルオロメチル）ニコチンアミド二塩酸塩である、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
薬学的に許容できる担体、希釈剤、又は賦形剤と組み合わせて、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物、又はその薬学的に許容できる塩を含む医薬組成物。
【請求項１０】
癌の治療に使用するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物、又はその薬学的に許容できる塩を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘッジホッグ経路アンタゴニスト、より具体的には、新規四置換ピリダジン、及びその治療的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘッジホッグ（Ｈｈ）シグナル伝達経路は、細胞の分化及び増殖を導くことにより、胚のパターン形成、及び成体組織の維持において重要な役割を果たしている。ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）、インディアンヘッジホッグ（Ｉｈｈ）、及びデザートヘッジホッグ（Ｄｈｈ）を含むヘッジホッグ（Ｈｈ）タンパク質ファミリーは、自己触媒的切断及びコレステロールのアミノ末端ペプチドへのカップリングを含む翻訳後修飾を受けて、シグナル伝達活性を有する断片を形成する分泌糖タンパク質である。Ｈｈは、１２回膜貫通型タンパク質Ｐｔｃｈ（Ｐｔｃｈ１及びＰｔｃｈ２）に結合して、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（Ｓｍｏ）のＰｔｃｈ介在性抑制を軽減する。Ｓｍｏの活性化は、Ｇｌｉ転写因子（Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２、及びＧｌｉ３）を安定化させ、且つ細胞増殖、細胞生存、血管形成、及び侵入に関与するＧｌｉ依存性遺伝子を発現させる一連の細胞内事象を誘発する。
【０００３】
Ｈｈシグナル伝達は、近年、Ｓｈｈシグナル伝達の異常な活性化が、種々の腫瘍、例えば、膵癌、髄芽腫、基底細胞癌、小細胞肺癌、及び前立腺癌の形成を導くという発見に基づいて、大きな注目を集めている。ステロイド性アルカロイド化合物ＩＰ−６０９、アミノプロリン化合物ＣＵＲ６１４１４、及び２，４−二置換チアゾール化合物ＪＫ１８等の幾つかのＨｈアンタゴニストが、当該技術分野において報告されている。特許文献１は、ヘッジホッグアンタゴニストであると断定されている特定の１，４−二置換フタラジン化合物を開示している。同様に、特許文献２は、ヘッジホッグ経路関連病態の診断及び治療に関連する特定の１，４−二置換フタラジン化合物を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００５０３３２８８号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００８１１０６１１号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
強力なヘッジホッグ経路阻害剤、特に所望の薬理学的、薬物動態学的、及び毒物学的プロファイルを有するものが、依然として必要とされている。本発明は、この経路の強力なアンタゴニストである新規四置換ピリダジンを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、式Ｉ：
【化１】
0005518887.tif 000002
の化合物、又はその薬学的に許容できる塩
（式中、
Ｘは、Ｃ−Ｒ１又はＮであり、
Ｒ１は、水素、フルオロ、又はシアノであり、
Ｒ２は、
【化２】
0005518887.tif 000003
、ピペリジニル、又はｇｅｍジ−フルオロ置換シクロへキシルであり、
Ｒ３は、メチル又はトリフルオロメチルであり、
Ｒ４は、ピロリジニル、モルホリニル又はピリジル、アミノ又はジメチルアミノであり、
Ｒ５は、トリフルオロメチル、又はメチルスルホニルであり、
Ｒ６は、水素又はメチルであり、
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、及びＲ１１は、独立して、水素、フルオロ、シアノ、クロロ、メチル、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、又はメチルスルホニルであるが、但し、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、及びＲ１１のうちの少なくとも２つは、水素である）
を提供する。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明の化合物は、三級アミン部分を含み、且つ多くの無機酸及び有機酸と反応して、薬学的に許容できる酸付加塩を形成し得ることが、当業者には理解されるであろう。かかる薬学的に許容できる酸付加塩、及びそれを調製する慣用的な方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｐ．Ｓｔａｈｌら，ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＡＬＴＳ：ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，ＳＥＬＥＣＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＵＳＥ，（ＶＣＨＡ／Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００２）；Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅら，「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ６６，Ｎｏ．１，１９７７年，１月を参照。
【０００８】
本発明の具体的な実施形態としては、
（ａ）Ｘが、Ｃ−Ｒ１である、
（ｂ）Ｒ１が、フルオロである、
（ｃ）Ｒ１が、シアノである、
（ｄ）Ｒ２が、
【化３】
0005518887.tif 000004
である、
（ｅ）Ｒ２が、
【化４】
0005518887.tif 000005
である、
（ｆ）Ｒ２が、
【化５】
0005518887.tif 000006
である、
（ｆ）Ｒ２が、
【化６】
0005518887.tif 000007
である、
（ｇ）Ｒ２が、
【化７】
0005518887.tif 000008
である、
（ｈ）Ｒ１が、フルオロであり、且つＲ２が、
【化８】
0005518887.tif 000009
である、
（ｉ）Ｒ１が、シアノであり、且つＲ２が、
【化９】
0005518887.tif 000010
である、
式Ｉの化合物、又はその薬学的に許容できる塩が挙げられる。
【０００９】
本発明はまた、薬学的に許容できる賦形剤、担体、又は希釈剤と組み合わせて、式Ｉの化合物、又はその薬学的に許容できる塩を含む医薬組成物を提供する。
【００１０】
本発明の化合物は、様々な経路で投与される医薬組成物として処方されることが好ましい。かかる組成物は、経口投与又は静脈内投与用であることが好ましい。かかる医薬組成物及びそれを調製するプロセスは、当該技術分野において周知である。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ：ＴＨＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ  ＯＦ  ＰＨＡＲＭＡＣＹ（Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏら，ｅｄｓ．，第１９版，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，１９９５）を参照。
【００１１】
本発明はまた、患者の脳癌、基底細胞癌、食道癌、胃癌、膵癌、胆道癌、前立腺癌、乳癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、大腸癌、肝癌、腎癌、又は黒色腫を治療する方法であって、かかる治療を必要としている患者に、有効量の式Ｉの化合物、又はその薬学的に許容できる塩を投与することを含む方法を提供する。
【００１２】
実際に投与される化合物の量は、治療される状態、選択される投与経路、投与される実際の化合物（１又は複数）、個々の患者の年齢、体重、及び反応、並びに患者の症状の重篤度を含む、関連状況に基づいて、医師により決定されることが理解されるであろう。１日当たりの投与量は、通常、約０．１〜約５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内に入る。ある場合には、前述の範囲の下限を下回る投与量レベルでも十分な量を超えている場合もあり、他の場合には、更に多い投与量が用いられる場合もある。したがって、上記投与量範囲は、如何なる方法によっても本発明の範囲を限定することを意図するものではない。本発明はまた、医薬として使用するための、式Ｉの化合物、又はその薬学的に許容できる塩を提供する。
【００１３】
更に、本発明は、癌を治療するための医薬の製造における、式Ｉの化合物、又はその薬学的に許容できる塩の使用を提供する。具体的には、前記癌は、脳癌、基底細胞癌、食道癌、胃癌、膵癌、胆道癌、前立腺癌、乳癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、大腸癌、肝癌、腎癌、及び黒色腫から成る群から選択される。
【００１４】
更に、本発明は、脳癌、基底細胞癌、食道癌、胃癌、膵癌、胆道癌、前立腺癌、乳癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、大腸癌、肝癌、腎癌、又は黒色腫を治療するための活性成分として、式Ｉの化合物、又はその薬学的に許容できる塩を含む医薬組成物を提供する。
【００１５】
式Ｉの化合物、又はその塩は、当該技術分野において既知である様々な手順、並びに以下のスキーム、調製物、及び実施例に記載される手順により調製され得る。記載される各経路の具体的な合成工程を、異なる方法と組み合わせるか、又は異なるスキームの工程と併用して、式Ｉの化合物、又はその塩を調製してもよい。
【００１６】
置換基は、特に指示しない限り、既に定義した通りである。試薬及び出発物質は、概して、当業者が容易に入手可能なものである。他の試薬及び出発物質は、有機化学及び複素環化学の標準的な技術、既知の構造的に類似の化合物の合成に類似する技術、並びに任意の新規手順を含む以下の調製物及び実施例に記載される手順により作製され得る。
【００１７】
本明細書で使用するとき、以下の用語は、指定される意味を有する：「ｂｏｃ」又は「ｔ−ｂｏｃ」は、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルを指し、「ＢＯＰ」は、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェートを指し、「ＤＭＡ」は、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドを指し、「ＤＭＦ」は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを指し、「ＤＭＳＯ」は、メチルスルホキシドを指し、「ＥＤＣＩ」は、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩を指し、「Ｅｔ２Ｏ」は、ジエチルエーテルを指し、「ＥｔＯＡｃ」は、酢酸エチルを指し、「ｉＰｒＯＨ」は、イソプロパノールを指し、「ＭｅＯＨ」は、メタノールを指し、「ＴＦＡ」は、トリフルオロ酢酸を指し、「ＳＣＸ」は、強カチオン交換を指し、「ＰｙＢＯＰ」は、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェートを指し、「ＩＣ５０」は、ある剤が可能な最大阻害反応の５０％を生じさせる前記剤の濃度を指す。
【００１８】
【化１０】
0005518887.tif 000011
式Ｉの化合物は、スキーム１に図示されている反応に従って調製することができる。
【００１９】
スキーム１の工程１では、１００〜１４０℃に加熱しながら、トリエチルアミン及び／若しくはジイソプロピルエチルアミン等の有機塩基、並びに／又は炭酸カリウム等の無機塩基の存在下で、ＤＭＦ、ＤＭＡ、又はＤＭＳＯ等の極性非プロトン性溶媒中にて、芳香族求核置換反応（ＳＮＡｒ）によって、３，６−ジクロロ−４，５−ジメチルピリダジン（１）を、ｔｅｒｔ−ブチルメチル（ピペリジン−４−イル）カルバメート（２）で置換して、ｔｅｒｔ−ブチル１−（６−クロロ−４，５−ジメチルピリダジン−３−イル）ピペリジン−４−イル（メチル）カルバメート（３）を得る。工程２では、鈴木−宮浦クロスカップリング反応によって、ジメチルピリダジンの残りのクロリドを、アリールボロン酸（４）と反応させて、対応する４，５−ジメチル−６−置換アリールピリダジン−３−置換ピペリジン（５）を得ることができる。当業者は、かかるクロスカップリング反応を促進するために有用な様々な条件が存在することを認識するであろう。その反応条件では、約８０〜１６０℃の温度で、不活性雰囲気下にて、炭酸セシウム又はフッ化セシウム等の塩基と、（１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン）パラジウム（ＩＩ）クロリド又は（ＳＰ−４−１）−ビス［ビス（１，１−ジメチルエチル）（４−メトキシフェニル）ホスフィン−κＰ］ジクロロ−パラジウム（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００７，７２，５１０４−５１１２に従って調製）等のパラジウム触媒との存在下で、ジオキサン又はジオキサン／水等の好適な溶媒を利用して、式（５）の化合物を得る。アミンは、標準的な脱保護方法によって脱保護し得る。窒素保護基を導入及び除去する方法は、当該技術分野において周知である（例えば、ＧｒｅｅｎｅおよびＷｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第３版，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９９）を参照）。例えば、塩化水素又はトリフルオロ酢酸等の酸性条件下で、式（５）のアミンのｂｏｃ脱保護を行って、式（６）の化合物を得ることができる。ジクロロメタン等の不活性溶媒中にて置換酸塩化物（７）を用いて工程４におけるアミンのアシル化を行うか、或いはＤＭＦ及び／若しくはＤＭＳＯ、又はジクロロメタン等の好適な溶媒中で、置換カルボン酸と、ＰｙＢＯＰ、ペンタフルオロフェニルジフェニルホスフィネート、ＢＯＰ、又はＥＤＣＩ等の適切なカップリング試薬と、トリエチルアミン又はジイソプロピルエチルアミン等の適切な塩基とを用いて、式（６）の化合物をアシル化して、式Ｉの中性化合物を得ることができる。式Ｉの化合物は、Ｅｔ２Ｏ中にＨＣｌを添加する等の当業者に既知の方法によりＨＣｌ塩等の塩に変換することができる、又は０〜２０℃で、メタノール等のアルコール溶媒の溶液に塩化アセチルを滴加することによりインサイチュでＨＣｌを生成することができる。
【００２０】
【化１１】
0005518887.tif 000012
所望のカルボン酸（７）（Ｙ＝ＯＨ、スキーム１の工程４）は、スキーム２に示すように調製され得る。工程１に示すように、アセトニトリル等の適切な溶媒中にて、塩化銅及び亜硝酸イソペンチルを用いてザントマイヤー反応により、チアゾール（８）の２位における一級アミンを塩化物で置換して、２−クロロ−４，５−置換チアゾール（９）を得る。次いで、ＤＭＳＯ等の極性非プロトン性溶媒中にて、工程２において前記塩化物を所望のアミン（１０）で置換して、対応するアミノチアゾール（１１）を得る。ＭｅＯＨ又はジオキサン等の好適な溶媒中にて、水酸化ナトリウム水溶液又は水酸化リチウム水溶液等の好適な塩基を用いて、工程３においてエステルを加水分解して、所望のカルボン酸（１２）を得る。
【００２１】
【化１２】
0005518887.tif 000013
スキーム３に示すように、所望のカルボン酸（７）（Ｙ＝ＯＨ、スキーム１の工程４）を調製する更なる例では、アセトン等の溶媒中にて、炭酸カリウム等の無機塩基を用いて、工程１に示すように、ピラゾール（１３）を４−メトキシベンジル等の好適な保護基で保護して、保護ピラゾール（１４）を得る。次いで、工程３に示すように、好適な塩基を用いてエステルを加水分解して、式（１５）の化合物を得る。スキーム１の工程４におけるアシル化に続いて、ＴＦＡ等の酸性条件下でピラゾールの脱保護を行い、式１の化合物を得ることができる。
【００２２】
スキーム４は、カルボン酸（７）（Ｙ＝ＯＨ、スキーム１の工程４）を調製する更なる例を示す。
【００２３】
【化１３】
0005518887.tif 000014
工程１に示すように、アミノピラゾール（１６）及びジメチルジスルフィドの不活性溶媒溶液、例えば、クロロホルム溶液に亜硝酸イソペンチルを滴加して、一級アミンをチオメチル基に変換し、エチル１−メチル−５−（メチルチオ）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキシレート（１７）を形成し得る。工程２では、酢酸等の適切な溶媒中にて、過酸化水素等の酸化剤を用いて、化合物（１７）のチオメチル基をメチルスルホンに酸化して、式１８の化合物を得ることができる。既に記載した通り、エステルの加水分解により、工程３に示すように適切なカルボン酸である化合物（７）が得られる。
【００２４】
以下の調製物及び実施例は、本発明を更に詳細に例証し、式（１）の化合物の典型的な合成を示すために提供される。本発明の化合物の名称は、概して、ＣｈｅｍＤｒａｗ  Ｕｌｔｒａ（登録商標）１０．０により得られたものである。
【００２５】
調製物１
ｔｅｒｔ−ブチル１−（６−クロロ−４，５−ジメチルピリダジン−３−イル）ピペリジン−４−イル（メチル）カルバメート
【化１４】
0005518887.tif 000015
１２０℃で２日間、ＤＭＳＯ（３１０ｍＬ）中にて、３，６−ジクロロ−４，５−ジメチルピリダジン（１１．０ｇ、６２．１ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチルメチル（ピペリジン−４−イル）カルバメート（２３．３ｇ、１０９ｍｍｏｌ）、及び粉末化Ｋ２ＣＯ３（１７．２ｇ、１２４ｍｍｏｌ）の混合物を加熱する。反応混合物を冷却し、Ｈ２Ｏで希釈し、固体を濾しとる。前記固体をＨ２Ｏですすぎ、４５℃にて真空下で乾燥させる。ＣＨ２Ｃｌ２に前記固体を溶解させ、その溶液をシリカゲルのパッドに通し、ＣＨ２Ｃｌ２で溶出する。減圧下で有機層を濃縮して、黄色固体として標題の化合物を得る（１４．３ｇ、６５％）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ（３５Ｃｌ）３５５．０（Ｍ＋１）。
【００２６】
調製物２
ｔｅｒｔ−ブチル１−（６−（４−フルオロフェニル）−４，５−ジメチルピリダジン−３−イル）ピペリジン−４−イル（メチル）カルバメート
【化１５】
0005518887.tif 000016
Ｎ２下、９０℃で一晩、１，４−ジオキサン（３０ｍＬ）及びＨ２Ｏ（１０ｍＬ）の混合物中にて、ｔｅｒｔ−ブチル１−（６−クロロ−４，５−ジメチルピリダジン−３−イル）ピペリジン−４−イル（メチル）カルバメート（１．５ｇ、４．２３ｍｍｏｌ）、４−フルオロフェニルボロン酸（８８７ｍｇ、６．３４ｍｍｏｌ）、Ｃｓ２ＣＯ３（５．５１ｇ、１６．９ｍｍｏｌ、及び（ＳＰ−４−１）−ビス［ビス（１，１−ジメチルエチル）（４−メトキシフェニル）ホスフィン−κＰ］ジクロロ−パラジウム（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００７，７２，５１０４−５１１２）の混合物（２９ｍｇ、０．０４２ｍｍｏｌ）を加熱する。Ｈ２ＯとＣＨ２Ｃｌ２との間で反応混合物を分配する。層を分離させ、ＣＨ２Ｃｌ２で水層を抽出する。有機層をまとめ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。フラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（勾配０〜２％  ２Ｍ  ＮＨ３／ＭｅＯＨ、ＣＨ２Ｃｌ２中）により、残留物を精製して、白色発泡体として標題の化合物を得る（１．０５ｇ、６０％）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ４１５．２（Ｍ＋１）。
【００２７】
代替手順
１，４−ジオキサン（８０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル１−（６−クロロ−４，５−ジメチルピリダジン−３−イル）ピペリジン−４−イル（メチル）カルバメート（３．０１ｇ、８．４８ｍｍｏｌ）、４−フルオロフェニルボロン酸（１．２３ｇ、８．８０ｍｍｏｌ）、及びＣｓＦ（４．０８ｇ、２６．８ｍｍｏｌ）のＮ２脱気混合物を、（１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン）パラジウム（ＩＩ）クロリド（１．１０ｇ、１．３５ｍｍｏｌ）で処理する。Ｎ２下、９５℃で一晩、得られる混合物を加熱する。Ｈ２ＯとＥｔＯＡｃとの間で反応混合物を分配する。層を分離させ、有機層をブラインで洗浄する。前記有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。フラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（勾配２０〜８０％  ＥｔＯＡｃ、ヘキサン中）により、残留物を精製して、標題の化合物を得る（３．０５ｇ、８７％）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ４１５．２（Ｍ＋１）。
【００２８】
調製物３
ｔｅｒｔ−ブチル１−（６−（４−シアノフェニル）−４，５−ジメチルピリダジン−３−イル）ピペリジン−４−イル（メチル）カルバメート
【化１６】
0005518887.tif 000017
Ｎ２下、９０℃で一晩、１，４−ジオキサン（３０ｍＬ）及びＨ２Ｏ（１０ｍＬ）の混合物中にて、ｔｅｒｔ−ブチル１−（６−クロロ−４，５−ジメチルピリダジン−３−イル）ピペリジン−４−イル（メチル）カルバメート（１．５ｇ、４．２３ｍｍｏｌ）、４−シアノフェニルボロン酸（９３２ｍｇ、６．３４ｍｍｏｌ）、Ｃｓ２ＣＯ３（５．５１ｇ、１６．９ｍｍｏｌ）、及び（ＳＰ−４−１）−ビス［ビス（１，１−ジメチルエチル）（４−メトキシフェニル）ホスフィン−κＰ］ジクロロ−パラジウム（２９ｍｇ、０．０４２ｍｍｏｌ）の混合物を加熱する。ＥｔＯＡｃとＮａＨＣＯ３の溶解したＨ２Ｏとの間で反応混合物を分配する。層を分離させ、水層をＥｔＯＡｃで抽出する。有機層をまとめ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。フラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（勾配０〜２％  ２Ｍ  ＮＨ３／ＭｅＯＨ、ＣＨ２Ｃｌ２中）により、残留物を精製して、黄色固体として標題の化合物を得る（１．６８ｇ、９４％）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ４２２．２（Ｍ＋１）。
【００２９】
適切に置換されたアリールボロン酸を用いて、調製物３に記載された手順に本質的に従って、以下の表中の置換フェニルピリダジンを調製する。調製物５では、粗反応混合物をシリカゲルのパッドで直接濾過し、ＣＨ２Ｃｌ２中の５％Ｍ  ＮＨ３／ＭｅＯＨで溶出する。溶出液を濃縮し、水系後処理（ａｑｕｅｏｕｓ  ｗｏｒｋ−ｕｐ）を行うことなく精製する。
【表１】
0005518887.tif 000018
【００３０】
調製物６
１−（６−（４−フルオロフェニル）−４，５−ジメチルピリダジン−３−イル）−Ｎ−メチルピペリジン−４−アミン
【化１７】
0005518887.tif 000019
ｔｅｒｔ−ブチル１−（６−（４−フルオロフェニル）−４，５−ジメチルピリダジン−３−イル）ピペリジン−４−イル（メチル）カルバメート（１．０４ｇ、２．５１ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン溶液（１０ｍＬ）を、１，４−ジオキサン（１５．０ｍＬ）中の４Ｍ  ＨＣｌで処理する。周囲温度で２時間、得られる混合物を撹拌する。減圧下で反応混合物を濃縮する。残留物をＭｅＯＨに溶解させ、ＳＣＸカラム（Ｖａｒｉａｎ、１０ｇ）に注ぐ。ＭｅＯＨ及びＣＨ２Ｃｌ２でカラムをすすぎ、ＣＨ２Ｃｌ２と２Ｍ  ＮＨ３／ＭｅＯＨとの１：１混合物で生成物を溶出する。減圧下で濃縮して、オフホワイトの固体として標題の化合物を得る（７８４ｍｇ、９９％）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３１５．２（Ｍ＋１）。
【００３１】
調製物７
４−（４，５−ジメチル−６−（４−（メチルアミノ）ピペリジン−１−イル）ピリダジン−３−イル）ベンゾニトリル
【化１８】
0005518887.tif 000020
ｔｅｒｔ−ブチル１−（６−（４−シアノフェニル）−４，５−ジメチルピリダジン−３−イル）ピペリジン−４−イル（メチル）カルバメート（１．６８ｇ、３．９９ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン溶液（２０ｍＬ）を、１，４−ジオキサン（２０ｍＬ）中の４Ｍ  ＨＣｌで処理する。周囲温度で２時間、得られる混合物を撹拌する。減圧下で反応混合物を濃縮する。残留物をＭｅＯＨに溶解させ、ＳＣＸカラム（Ｖａｒｉａｎ、２０ｇ）に注ぐ。ＭｅＯＨ及びＣＨ２Ｃｌ２でカラムをすすぎ、ＣＨ２Ｃｌ２と２Ｍ  ＮＨ３／ＭｅＯＨとの１：１混合物で生成物を溶出する。減圧下で濃縮して、黄色固体として標題の化合物を得る（１．２８ｇ、定量）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３２２．２（Ｍ＋１）。
【００３２】
適切なｂｏｃ−保護ピペリジンを用いて、調製物７に記載された手順に本質的に従って、以下の表中の脱保護Ｎ−メチルアミノピペリジンを調製する。
【表２】
0005518887.tif 000021
【００３３】
調製物９
１−（４，５−ジメチル−６−（ピリジン−４−イル）ピリダジン−３−イル）−Ｎ−メチルピペリジン−４−アミン
【化１９】
0005518887.tif 000022
ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）及びトリフルオロ酢酸（２０ｍＬ）を、ｔｅｒｔ−ブチル−１−（４，５−ジメチル−６−（ピリジン−４−イル）ピリダジン−３−イル）ピペリジン−４−イル（メチル）カルバメート（１．１９ｇ、２．９９ｍｍｏｌ）に添加する。周囲温度で３日間撹拌する。減圧下で濃縮して、残留物を得る。ＣＨ２Ｃｌ２と１Ｎ  ＮａＯＨとの間で前記残留物を分配する。層を分離させ、水層をＣＨ２Ｃｌ２で２回抽出する。有機層をまとめ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、標題の化合物を得る（７９０ｍｇ、８９％）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ２９８．２（Ｍ＋１）。
【００３４】
調製物１０
エチル２−クロロ−４−（トリフルオロメチル）チアゾール−５−カルボキシレート
【化２０】
0005518887.tif 000023
アセトニトリル（１０ｍＬ）中のＣｕＣｌ２（６７１ｍｇ、４．９９ｍｍｏｌ）及び亜硝酸イソペンチル（７３２ｍｇ、６．２４ｍｍｏｌ）の０℃の混合物を、エチル２−アミノ−４−（トリフルオロメチル）チアゾール−５−カルボキシレート（１．０ｇ、４．１６ｍｍｏｌ）でゆっくりと処理する。周囲温度で１時間、得られる混合物を撹拌する。１時間、５０℃に加熱する。溶媒の大部分を除去し、氷と濃ＨＣｌとの混合物に注ぐ。ＣＨ２Ｃｌ２で抽出する。有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。フラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（２０：１  ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）により、得られる残留物を精製して、標題の化合物を得る（７６２ｍｇ、７１％）。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １．２６（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ），４．３１（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ）。
【００３５】
調製物１１
エチル２−モルホリノ−４−（トリフルオロメチル）チアゾール−５−カルボキシレート
【化２１】
0005518887.tif 000024
エチル２−クロロ−４−（トリフルオロメチル）チアゾール−５−カルボキシレート（４．００ｇ、１５．４ｍｍｏｌ）を、モルホリン（４．０３ｇ、４６．２ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ溶液（１０ｍＬ）に添加する。周囲温度で一晩、反応物を撹拌する。ＣＨ２Ｃｌ２を添加し、混合物をＨ２Ｏで洗浄する。有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。フラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（２０：５：１  ヘキサン：ＥｔＯＡｃ：２Ｍ  ＮＨ３／ＭｅＯＨ）により、残留物を精製して、標題の化合物を得る（４．５８ｇ、９６％）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３１１．０（Ｍ＋１）。
【００３６】
適切なアミンを用いて、調製物１１に記載される手順に本質的に従って、以下の表中のアミノチアゾールエステルを調製する。
【表３】
0005518887.tif 000025
【００３７】
調製物１５
２−モルホリノ−４−（トリフルオロメチル）チアゾール−５−カルボン酸
【化２２】
0005518887.tif 000026
ＭｅＯＨ（２０ｍＬ）中の１Ｎ  ＮａＯＨ（２０ｍＬ）混合物に、エチル２−モルホリノ−４−（トリフルオロメチル）チアゾール−５−カルボキシレート（４．５８ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）を添加し、５０℃で１時間反応物を加熱する。減圧下で反応物を濃縮し、残留物にＨ２Ｏを添加する。混合物をｐＨ４に酸性化し、固体を濾過する。前記固体をＨ２Ｏで洗浄し、乾燥させて、標題の化合物を得る（４．１３ｇ、９９％）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ２８３．０（Ｍ＋１）。
【００３８】
適切なエステルを用いて、調製物１５に記載される手順に本質的に従って、以下の表中のアミノチアゾール酸を調製する。
【表４】
0005518887.tif 000027
【００３９】
調製物１９
（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（（１−（６−（４−フルオロフェニル）−４，５−ジメチルピリダジン−３−イル）ピペリジン−４−イル）（メチル）カルバモイル）ピペリジン−１−カルボキシレート
【化２３】
0005518887.tif 000028
１−（６−（４−フルオロフェニル）−４，５−ジメチルピリダジン−３−イル）−Ｎ−メチルピペリジン−４−アミン（１００ｍｇ、０．３１８ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２溶液（３．２ｍＬ）を、（Ｓ）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピペリジン−２−カルボン酸（１０９ｍｇ、０．４７７ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．０６７ｍＬ、０．４７７ｍｍｏｌ）、及びＥＤＣＩ（９２ｍｇ、０．４７７ｍｍｏｌ）で順次処理する。周囲温度で２日間、得られる混合物を撹拌する。ＮａＨＣＯ３を含有するＨ２Ｏに反応混合物を注ぐ。層を分離させ、水層をＣＨ２Ｃｌ２で抽出する。有機層をまとめ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。フラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（勾配０〜２％  ２Ｍ  ＮＨ３／ＭｅＯＨ、ＣＨ２Ｃｌ２中）により、残留物を精製して、白色固体として標題の化合物を得る（８２ｍｇ、４９％）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ５２６．２（Ｍ＋１）。
【００４０】
調製物２０
エチル１−（４−メトキシベンジル）−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキシレート
【化２４】
0005518887.tif 000029
Ｎ２下、周囲温度で、エチル３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキシレート（５００ｍｇ、２．４０ｍｍｏｌ）のアセトン溶液（８ｍＬ）にＫ２ＣＯ３（５０３ｍｇ、３．６０ｍｍｏｌ）を添加する。１−ブロモメチル−４−メトキシベンゼン（０．５１ｍＬ、３．６ｍｍｏｌ）を混合物に滴加し、Ｎ２下で一晩撹拌する。Ｈ２Ｏで反応を停止させ、ＥｔＯＡｃで２回抽出する。まとめた有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。フラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（勾配０〜１５％ＥｔＯＡｃ、ヘキサン中）により、残留物を精製して、標題の化合物を得る（７８９ｍｇ、定量）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３５１．０（Ｍ＋Ｎａ）。
【００４１】
調製物２１
１−（４−メトキシベンジル）−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボン酸
【化２５】
0005518887.tif 000030
ＬｉＯＨ（１２２ｍｇ、５．０３ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ溶液（３ｍＬ）を、エチル１−（４−メトキシベンジル）−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキシレート（５５０ｍｇ、１．６８ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン撹拌溶液（１０ｍＬ）に添加する。周囲温度で一晩撹拌する。１Ｎ  ＨＣｌでｐＨ５に酸性化し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ＣＨＣｌ３中２０％  ｉＰｒＯＨで２回抽出する。まとめた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、白色固体として標題の化合物１４０ｍｇを得る。水層を１Ｎ  ＨＣｌでｐＨ２〜３に酸性化し、ＣＨＣｌ３中２０％  ｉＰｒＯＨで２回抽出する。まとめた有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、最初に得られた白色固体１４０ｍｇに溶液を添加する。濃縮して、白色固体として標題の化合物を得る（４２６ｍｇ、８５％）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ２９９．０（Ｍ−１）。
【００４２】
調製物２２
Ｎ−（１−（６−（４−フルオロフェニル）−４，５−ジメチルピリダジン−３−イル）ピペリジン−４−イル）−１−（４−メトキシベンジル）−Ｎ−メチル−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド
【化２６】
0005518887.tif 000031
ＰｙＢＯＰ（３４３ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（０．２１ｍＬ、１．５０ｍｍｏｌ）を、１−（６−（４−フルオロフェニル）−４，５−ジメチルピリダジン−３−イル）−Ｎ−メチルピペリジン−４−アミン（１５７ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）及び１−（４−メトキシベンジル）−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボン酸（１６５ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ撹拌溶液（２．５ｍＬ）に添加する。Ｎ２下、周囲温度で一晩、得られる混合物を撹拌する。濃縮し、ＭｅＯＨを添加し、固体を濾過し、濾液を濃縮する。残留物をＭｅＯＨで希釈し、ＳＣＸカラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１０ｇ）に注ぐ。ＭｅＯＨで洗浄し、次いで２Ｍ  ＮＨ３／ＭｅＯＨで生成物を溶出する。濃縮し、ヘキサン中０〜１０％の勾配（１０％  ２Ｍ  ＮＨ３／ＭｅＯＨ、ＥｔＯＡｃ中）を用いてフラッシュシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、白色固体として標題の化合物を得る（１７０ｍｇ、４３％）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ５９７．０（Ｍ＋１）。
【００４３】
調製物２３
エチル１−メチル−５−（メチルチオ）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキシレート
【化２７】
0005518887.tif 000032
温度計及び冷却器を備える３つ口フラスコ中、窒素下にて、５℃のエチル１−メチル−５−アミノ−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキシレート（１．６９ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）及びジメチルジスルフィド（１．７９ｍＬ、２０．０ｍｍｏｌ）のＣＨＣｌ３溶液に亜硝酸イソペンチル（０．５ｍＬ、３．７５ｍｍｏｌ）を添加する。反応物をＨ２Ｏ浴中で２０℃に加温し、更なる亜硝酸イソペンチル（１．５ｍＬ、１１．３ｍｍｏｌ）滴で処理する。１５分後、反応物を２０℃のＨ２Ｏ浴から取り出す（発熱により、約１分間にわたって温度が５０℃まで上昇する）。Ｎ２下、周囲温度で一晩撹拌する。Ｈ２Ｏで洗浄し、層を分離させる。水層をＣＨＣｌ３で抽出し、有機層をまとめ、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。フラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（勾配０〜３５％ＥｔＯＡｃ、ヘキサン中）により、残留物を精製して、標題の化合物を得る（１．９４ｇ、９７％）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ２０１．０（Ｍ＋１）。
【００４４】
調製物２４
エチル１−メチル−５−（メチルスルホニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキシレート
【化２８】
0005518887.tif 000033
エチル１−メチル−５−（メチルチオ）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキシレート（１．６８ｇ、８．３９ｍｍｏｌ）、氷酢酸（１１ｍＬ）、及び過酸化水素（５．１０ｍＬ、５０．３ｍｍｏｌ）を混合し、得られる混合物を１００℃で１．５時間加熱する。反応物を周囲温度まで冷却し、一晩撹拌する。氷を添加し、ＣＨ２Ｃｌ２で２回抽出する。有機層をまとめ、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。フラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（勾配０〜５０％ＥｔＯＡｃ、ヘキサン中）により、残留物を精製して、標題の化合物を得る（１．９５ｇ、１００％）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ２３３．０（Ｍ＋１）。
【００４５】
調製物２５
１−メチル−５−（メチルスルホニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボン酸
【化２９】
0005518887.tif 000034
周囲温度で、エチル１−メチル−５−（メチルスルホニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキシレート（１７５ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン急速撹拌溶液（３ｍＬ）に、ＬｉＯＨ（２２ｍｇ、０．９０ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ溶液（１ｍＬ）を添加する。反応混合物を更なるＬｉＯＨ（５ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）で処理し、一晩撹拌する。１Ｎ  ＨＣｌでｐＨ２に酸性化し、ＣＨ２Ｃｌ２で２回抽出する。有機層をまとめ、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、白色固体として標題の化合物を得る（９８ｍｇ、６４％）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ２０２．９（Ｍ−１）。
【実施例】
【００４６】
実施例１
４−シアノ−Ｎ−（１−（６−（４−シアノフェニル）−４，５−ジメチルピリダジン−３−イル）ピペリジン−４−イル）−Ｎ−メチルベンズアミド塩酸塩
【化３０】
0005518887.tif 000035
４−（４，５−ジメチル−６−（４−（メチルアミノ）ピペリジン−１−イル）ピリダジン−３−イル）ベンゾニトリル（９０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）、及びトリエチルアミン（０．１２ｍＬ、０．８４ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２溶液（２．８ｍＬ）を、４−シアノベンゾイルクロリド（５６ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）で処理する。周囲温度で一晩反応物を撹拌する。Ｈ２Ｏで洗浄し、層を分離させる。フラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（勾配０〜２％  ２Ｍ  ＮＨ３／ＭｅＯＨ、ＣＨ２Ｃｌ２中）により、有機層を直接精製する。濃縮して、白色固体を得る。ＭｅＯＨに物質を溶解させ、１．１当量のメタノールＨＣｌを添加する（塩化アセチルをＭｅＯＨに滴下することにより実施）。Ｎ２ガス流下で混合物を濃縮し、４５℃の真空オーブン中で残留物を乾燥させて、黄色固体として標題の化合物を得る（１３０ｍｇ、９５％）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ４５１．２（Ｍ＋１）。
【００４７】
６時間〜３日間の範囲の反応時間で、適切な酸塩化物を用いて、実施例１に記載される手順に本質的に従って、以下の表中のピペラジニルアミドを調製する。実施例７、８、及び１３では、過剰のＥｔ２Ｏ中１Ｍ  ＨＣｌを用いて、塩を形成する。実施例１０では、３当量の予め作製しておいたメタノールＨＣｌを用いて、塩を形成する。
【表５−１】
0005518887.tif 000036
【表５−２】
0005518887.tif 000037
【００４８】
実施例１４
Ｎ−（１−（６−（４−シアノフェニル）−４，５−ジメチルピリダジン−３−イル）ピペリジン−４−イル）−Ｎ−メチル−２−（トリフルオロメチル）ニコチンアミド二塩酸塩
【化３１】
0005518887.tif 000038
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中で４−（４，５−ジメチル−６−（４−（メチルアミノ）ピペリジン−１−イル）ピリダジン−３−イル）ベンゾニトリル（１０２ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）、２−（トリフルオロメチル）ニコチン酸（７０ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）、及びトリエチルアミン（０．１３ｍＬ、０．９６ｍｍｏｌ）を混合する。混合物にＰｙＢＯＰ（２００ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）を添加し、周囲温度で一晩撹拌する。ＣＨ２Ｃｌ２を反応混合物に添加し、ブラインで洗浄する。有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。フラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（２０：５：１  ヘキサン：ＥｔＯＡｃ：２Ｍ  ＮＨ３／ＭｅＯＨ）により、得られる残留物を精製する。過剰のＥｔ２Ｏ中１Ｍ  ＨＣｌを、遊離塩基のＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ溶液に添加し、Ｎ２ガス下で溶媒を蒸発させて、標題の化合物を得る（１０３ｍｇ、５７％）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ４９５．２（Ｍ＋１）。
【００４９】
代替カップリング手順：
ＤＭＦ及びＤＭＳＯの４：１混合物（２０ｍＬ）中で、４−（４，５−ジメチル−６−（４−（メチルアミノ）ピペリジン−１−イル）ピリダジン−３−イル）ベンゾニトリル（３００ｍｇ、０．９３ｍｍｏｌ）、２−（トリフルオロメチル）ニコチン酸（２１０ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）、及びジイソプロピルエチルアミン（０．７９ｍＬ、４．５１ｍｍｏｌ）を混合する。一時的に混合物を６０℃に加熱して固体を溶解させ、次いで０℃に冷却する。ペルフルオロフェニルジフェニルホスフィネート（７５０ｍｇ、１．９６ｍｍｏｌ）溶液を、ＤＭＦ及びＤＭＳＯの４：１混合物（１ｍＬ）に滴加する。得られる混合物を６０℃で一晩加熱する。ＮａＨＣＯ３水溶液とＣＨ２Ｃｌ２との間で反応混合物を分配する。有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。フラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（２０：５：１  ヘキサン：ＥｔＯＡｃ：２Ｍ  ＮＨ３／ＭｅＯＨ）により、得られる残留物を精製して、標題の化合物の遊離塩基を得る（３４６ｍｇ、７５％）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ４９５．２（Ｍ＋１）。上記のようにＨＣｌ塩を形成する。
【００５０】
適切なジメチルピリダジン及びカルボン酸を用いて、実施例１４の最初の手順に記載される手順に本質的に従って、以下の表中のピペリジニルアミドを調製する。実施例２８では、１．１当量のＭｅＯＨ中１Ｍ  ＨＣｌを用い（塩化アセチルをＭｅＯＨに滴下することにより実施）、次いで濃縮して、一塩酸塩を得る。実施例２８は、実施例１４の代替手順に従う。
【表６−１】
0005518887.tif 000039
【表６−２】
0005518887.tif 000040
【表６−３】
0005518887.tif 000041
【００５１】
実施例２９
Ｎ−（１−（６−（４−シアノフェニル）−４，５−ジメチルピリダジン−３−イル）ピペリジン−４−イル）−Ｎ−メチル−４−（トリフルオロメチル）ニコチンアミド塩酸塩
【化３２】
0005518887.tif 000042
４−（４，５−ジメチル−６−（４−（メチルアミノ）ピペリジン−１−イル）ピリダジン−３−イル）ベンゾニトリル（１０２ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）、４−（トリフルオロメチル）ニコチン酸（８１ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．０７ｍＬ、０．５ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２溶液（４ｍＬ）を、ＥＤＣＩ（９９ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ）で処理し、３日間撹拌する。反応混合物をＨ２Ｏに注ぎ、ＥｔＯＡｃで抽出する。有機層をＨ２Ｏで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。フラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（勾配０〜１０％ＭｅＯＨ、ＣＨ２Ｃｌ２中）により精製する。遊離塩基をＭｅＯＨ（２ｍＬ）に溶解させ、Ｅｔ２Ｏ中１Ｍ  ＨＣｌ（０．５ｍＬ）を添加する。濃縮して、標題の化合物を得る（８２ｍｇ、４９％）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ４９５．２（Ｍ＋１）。
【００５２】
適切なカルボン酸を用いて、実施例２９に記載される手順に本質的に従って、以下の表中のピペリジニルアミドを調製する。実施例３１〜３３では、一晩撹拌する。実施例３１〜３３においてＨＣｌ塩を形成するために、対応する遊離塩基をＭｅＯＨに溶解させ、１．１当量のメタノールＨＣｌを添加し（塩化アセチルをＭｅＯＨに滴下することにより実施）、次いで濃縮する。
【表７】
0005518887.tif 000043
【００５３】
実施例３４
（Ｓ）−Ｎ−（１−（６−（４−フルオロフェニル）−４，５−ジメチルピリダジン−３−イル）ピペリジン−４−イル）−Ｎ−メチルピペリジン−２−カルボキサミド二塩酸塩
【化３３】
0005518887.tif 000044
１，４−ジオキサン（１．００ｍＬ、４．００ｍｍｏｌ）中４Ｍ  ＨＣｌを、（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（（１−（６−（４−フルオロフェニル）−４，５−ジメチルピリダジン−３−イル）ピペリジン−４−イル）（メチル）カルバモイル）ピペリジン−１−カルボキシレート（８０ｍｇ、０．１５２ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２溶液（２ｍＬ）に添加する。周囲温度で４時間、得られる混合物を撹拌する。減圧下で濃縮し、４５℃の真空オーブン内で残留物を乾燥させて、淡黄色発泡体として標題の化合物を得る（７９ｍｇ、定量）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ４２６．２（Ｍ＋１）。
【００５４】
実施例３５
Ｎ−（１−（６−（４−フルオロフェニル）−４，５−ジメチルピリダジン−３−イル）ピペリジン−４−イル）−Ｎ，１−ジメチル−５−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド二塩酸塩
【化３４】
0005518887.tif 000045
１−（６−（４−フルオロフェニル）−４，５−ジメチルピリダジン−３−イル）−Ｎ−メチルピペリジン−４−アミン（８００ｍｇ、４．１２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２５ｍＬ）に溶解させる。１−メチル−５−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボン酸（１．０８ｇ、３．４４ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（１．４４ｍＬ、１０．３ｍｍｏｌ）、及びＰｙＢＯＰ（２．６８ｇ、５．１５ｍｍｏｌ）を添加する。周囲温度で３時間撹拌する。反応混合物を濃縮し、ヘキサン中勾配０〜１００％（５：１  ＥｔＯＡｃ：２Ｍ  ＮＨ３／ＭｅＯＨ）を用いてフラッシュシリカゲルクロマトグラフィーにより、残留物を精製する。単離された生成物をＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）に溶解させ、Ｅｔ２Ｏ中２Ｍ  ＨＣｌ（８ｍＬ）を添加する。Ｎ２流下で溶媒を除去し、一晩５０℃の真空オーブン内で乾燥させて、標題の化合物を得る（６１２ｍｇ、３２％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）４９１．２（Ｍ＋１）。
【００５５】
適切なカルボン酸を用いて、実施例３４に記載される手順に本質的に従って、以下の表中のアミドを調製する。実施例３６は、ＳＣＸカラム（２Ｍ  ＮＨ３／ＭｅＯＨで溶出）で精製し、次いでフラッシュクロマトグラフィーで精製する。
【表８】
0005518887.tif 000046
【００５６】
実施例３８
Ｎ−（１−（６−（４−フルオロフェニル）−４，５−ジメチルピリダジン−３−イル）ピペリジン−４−イル）−Ｎ−メチル−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド二塩酸塩
【化３５】
0005518887.tif 000047
トリフルオロ酢酸（１０ｍＬ）をＮ−（１−（６−（４−フルオロフェニル）−４，５−ジメチルピリダジン−３−イル）ピペリジン−４−イル）−１−（４−メトキシベンジル）−Ｎ−メチル−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（９９ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）に添加し、Ｎ２下で還流させながら一晩加熱する。減圧下で濃縮する。残留物をＣＨＣｌ３中２０％  ｉＰｒＯＨに溶解させ、飽和Ｎａ２ＣＯ３水溶液で洗浄する。水層をＣＨＣｌ３中２０％  ｉＰｒＯＨで抽出する。有機層をまとめ、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。フラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（勾配０〜１０％  ２Ｍ  ＮＨ３／ＭｅＯＨ、ＣＨ２Ｃｌ２中）により、残留物を精製する。精製された遊離塩基をＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ）に溶解させ、Ｅｔ２Ｏ中１Ｍ  ＨＣｌ（０．５ｍＬ）を滴加する。３０分間撹拌する。濃縮し、５０℃の真空オーブン内で一晩乾燥させて、標題の化合物を得る（５５ｍｇ、６０％）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ４７７．０（Ｍ＋１）。
【００５７】
生物学
ヘッジホッグは、以下の癌の生存因子として意味づけられてきた：基底細胞癌；上部消化管癌（食道、胃、膵臓、及び胆道）；前立腺癌；乳癌；小細胞肺癌；非小細胞肺癌；Ｂ細胞リンパ腫：多発性骨髄腫；胃癌；卵巣癌；大腸癌；肝癌；黒色腫；腎癌；及び脳癌。
【００５８】
ヘッジホッグ経路の要素は、癌治療の潜在的創薬標的であると断定されてきた。髄芽腫腫瘍から確立されたＤａｏｙ細胞株（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−１８６）は、Ｈｈリガンドに反応する。これら細胞を体外から添加されたＳｈｈ条件培地で処理すると、Ｈｈシグナル伝達経路が活性化され、Ｇｌｉ１の発現が増加する。イキシア（Ｖｅｒａｔｒｕｍ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃｕｍ）から単離されたアルカロイドであるシクロパミンは、弱いヘッジホッグアンタゴニストであり、Ｓｈｈ刺激に応答してＧｌｉ１の発現を抑制することが示されている。最近の研究によれば、シクロパミンが培養髄芽腫細胞及び同種移植片の増殖を阻害することが示唆されている。このＤａｏｙ細胞モデル系を用いて、ヘッジホッグシグナル伝達経路の強力な阻害剤を同定することができる。本発明の化合物は、ヘッジホッグアンタゴニストであるため、前述の種類の腫瘍の治療に好適である。
【００５９】
生物活性ＩＣ５０の測定
以下のアッセイプロトコル及びその結果は、本発明の化合物及び方法の有用性並びに有効性を更に示す。機能アッセイは、本発明の化合物がＳｈｈシグナル伝達阻害能を示すことを支持する。以下のアッセイで用いられるリガンド、溶媒、及び試薬は全て、商業的供給元から容易に入手可能であるか、又は当業者により容易に調製され得る。
【００６０】
生物活性は、Ｄａｏｙ神経細胞性癌細胞における機能アッセイを用いて測定され、ｂＤＮＡ（分岐デオキシリボ核酸）アッセイ系（Ｐａｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を用いて、Ｇｌｉ１リボ核酸の量を測定する。Ｇｌｉは、最初に神経膠芽腫細胞株で発見され、Ｓｈｈシグナル伝達により活性化されるジンクフィンガータンパク質をコードする。最大反応は、２４時間、条件培地（組換えＳｈｈを安定的に発現するヒト胚腎臓、ＨＥＫ２９３細胞）でＤａｏｙ細胞におけるＧｌｉ１転写を誘導し、次いで刺激されたＧｌｉ転写量を測定することにより得られる。最小反応は、２４時間、条件培地（組換えＳｈｈを安定的に発現するヒト胚腎臓、ＨＥＫ２９３細胞）で刺激されたＤａｏｙ細胞中にて、対照化合物で阻害されたＧｌｉ転写量である。
【００６１】
Ｄａｏｙ細胞におけるＧｌｉ１の阻害を測定するための機能アッセイ
ｂＤＮＡアッセイ系は、標的リボ核酸（転写物）を増幅させるために、分岐鎖ＤＮＡ技術を利用する。前記技術は、標的転写物と複合体としてハイブリダイズして、ハイブリダイゼーションシグナルを増幅させる、標的転写物の特異性を決定する３種の合成ハイブリッド短Ｇｌｉ１特異的ｃＤＮＡプローブ［キャプチャエキステンダ（ＣＥ）、ラベルエキステンダ（ＬＥ）、及びブロッカ（ＢＬ）］を用いる。増幅工程中、化学発光基質を添加することにより、発光を用いる検出が可能になる。
【００６２】
アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）から入手したＤａｏｙ細胞株は、Ｓｈｈ反応性ヒト神経細胞性腫瘍細胞株であり、線維形成性小脳髄芽腫腫瘍から１９８５年に確立された、生理学的に関連する腫瘍細胞株である。Ｇｌｉ転写量の体内レベルは、Ｄａｏｙ細胞では低いが、ヒトＳｈｈを安定的に過剰発現している細胞（ｈＳｈｈで安定的に形質転換されたＨＥＫ２９３細胞株）から取られた条件培地を用いることにより刺激することができる。
【００６３】
０．１ｎＭ  非必須アミノ酸及び１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウムを含む１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を加えた最小必須培地（ＭＥＭ）を含有するＤａｏｙ増殖培地中にて、組織培養用Ｔ２２５−フラスコ内で、コンフルエントになるまでＤａｏｙ細胞を増殖させる。トリプシンエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を用いてＴ−２２５フラスコから細胞を取り出し、遠心分離し、培地に再懸濁させ、次いで計数する。
【００６４】
次いで、Ｄａｏｙ細胞を、５０，０００細胞／ウェルで、Ｃｏｓｔａｒ９６ウェル透明組織培養プレート内の増殖培地に播種し、３７℃、５％二酸化炭素（ＣＯ２）下で一晩インキュベートする。細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄し、次いで１００μＬのＳｈｈ条件培地（Ｓｈｈ−ＣＭ）を添加して、Ｇｌｉ１発現量を刺激する。対照増殖培地（０．１％  ＦＢＳ／ＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地））を用いて最大刺激に達するまでＳｈｈ−ＣＭを希釈する。次いで、Ｓｈｈ−ＣＭで処理したＤａｏｙ細胞を、約１μＭ〜０．１ｎＭの範囲の様々な濃度のヘッジホッグ阻害剤で処理する。３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間、試験化合物をインキュベートする。
【００６５】
Ｇｌｉ１転写物の測定は、製造業者（Ｐａｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．）により記載されている通り、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ２．０  Ｇｌｉ１アッセイを用いて実施する。プロテイナーゼＫを含む希釈溶解混合物（ＤＬＭ）緩衝液を調製する。化合物と共に２４時間インキュベートした後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、１８０μＬのＤＬＭを前記細胞に添加する。溶解緩衝液を含む細胞プレートをシールし、５５℃で３０〜４５分間放置する。次いで、得られる細胞溶解物を５回すりつぶす。製造業者の指示に従ってプローブをＤＬＭで希釈し、次いで２０μＬのワーキングプローブセットを、８０μＬのＤａｏｙ溶解物と共にｂＤＮＡアッセイプレートに添加することにより、Ｇｌｉ１プローブを含むワーキングプローブセットを作製する。プレートをシールし、５５℃で一晩インキュベートする。次いで、製造業者の指示に従ってｂＤＮＡプレートを処理する。発光を検出するＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎリーダーを用いてプレートを読み取ることにより、シグナルを定量する。発光シグナルは、サンプル中に存在する標的転写物の量に正比例する。
【００６６】
機能アッセイから得られた発光シグナルデータを用いて、インビトロアッセイのＩＣ５０を算出する。データは、最大対照値（Ｓｈｈ−ＣＭで処理したＤａｏｙ細胞）及び最小対照値（Ｓｈｈ−ＣＭ、及び抑制濃度の対照化合物である１μＭのＮ−（３−（１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−２−イル）−４−クロロフェニル）−３，５−ジメトキシベンズアミドで処理したＤａｏｙ細胞）に基づいて算出される。４つのパラメータのロジスティック曲線適合を用いて、ＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅソフトウェアプログラムバージョン５．３、式２０５（Ａｓｓａｙ  Ｇｕｉｄａｎｃｅ  Ｍａｎｕａｌ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０，２００８，Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ及びＮＩＨ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｅｎｔｅｒ）を用いてＩＣ５０値を求める。
【００６７】
記載されたプロトコルに従うと、本明細書で例証される本発明の化合物は、１５ｎＭ未満のＩＣ５０を示す。例えば、上記アッセイにおいて、実施例１４の化合物は、約１．２７ｎＭのＩＣ５０（標準誤差０．１１４（ｎ＝４））を有し、実施例３４の化合物は、約１．２２ｎＭのＩＣ５０（標準誤差０．２９３（ｎ＝３））を有する。これらの結果は、本発明の化合物がヘッジホッグアンタゴニストであり、したがって、抗癌剤として有用であるという証拠を提供する。