(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ配糖体がリポソームに閉じ込められた、リポソーム性アミノ配糖体製剤であって、
前記リポソームがホスファチジルコリン及びコレステロールを含み、かつ前記リポソームが陰イオン性脂質を含まず、
前記製剤中における脂質対アミノ配糖体の重量比が０．７５：１以下であり、かつ
前記リポソームが０．１μｍから１．０μｍの平均直径を有する、
リポソーム性アミノ配糖体製剤。
【請求項２】
前記アミノ配糖体がストレプトマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ネチルマイシン及びカナマイシンからなる群から選ばれる、請求項１に記載のリポソーム性アミノ配糖体製剤。
【請求項３】
前記アミノ配糖体がアミカシンである、請求項１に記載のリポソーム性アミノ配糖体製剤。
【請求項４】
前記アミノ配糖体がトブラマイシンである、請求項１に記載のリポソーム性アミノ配糖体製剤。
【請求項５】
前記アミノ配糖体がゲンタマイシンである、請求項１に記載のリポソーム性アミノ配糖体製剤。
【請求項６】
前記ホスファチジルコリンがジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）である、請求項１に記載のリポソーム性アミノ配糖体製剤。
【請求項７】
前記アミノ配糖体がアミカシンであり、かつ前記ホスファチジルコリンがジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）である、請求項１に記載のリポソーム性アミノ配糖体製剤。
【請求項８】
前記リポソームが、０．２μｍから０．５μｍの平均直径を備えたリポソームであり、かつ前記アミノ配糖体がアミカシンである、請求項１に記載のリポソーム性アミノ配糖体製剤。
【請求項９】
ホスファチジルコリン及びコレステロールを含む、脂質−アルコールの溶液又は混合物とともに、前記アミノ配糖体の水性若しくはアルコール性溶液又は混合物を、前記脂質の少なくとも一つの相転移の温度未満で注入するステップを包含し、前記アミノ配糖体の前記水性若しくはアルコール性溶液又は混合物の注入が上方からなされる、ステップを含む、請求項１に記載のリポソーム性アミノ配糖体製剤を調製する方法。
【請求項１０】
前記脂質−アルコールの溶液又は混合物が１０ｍｇ／ｍＬから３０ｍｇ／ｍＬの濃度である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗感染薬の前記水性若しくはアルコール性溶液又は混合物が２０ｍｇ／ｍＬから７０ｍｇ／ｍＬの濃度である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記脂質−アルコールの溶液又は混合物が１０ｍｇ／ｍＬから３０ｍｇ／ｍＬの濃度であり、かつ前記アミノ配糖体の前記水性若しくはアルコール性溶液又は混合物が２０ｍｇ／ｍＬから７０ｍｇ／ｍＬの濃度である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記アミノ配糖体がアミカシンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記アミノ配糖体がストレプトマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ネチルマイシン及びカナマイシンからなる群から選ばれる、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記脂質−アルコールの溶液又は混合物がジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記脂質対アミノ配糖体の比が０．５：１以下である、請求項１に記載のリポソーム性アミノ配糖体製剤。
【請求項１７】
アミノ配糖体がリポソームに閉じ込められた、リポソーム性アミノ配糖体製剤を調製する方法であって、前記リポソームが陰イオン性脂質を含まず、前記方法は、
ホスファチジルコリン及びコレステロールを含む脂質溶液の流れをアミノ配糖体溶液の流れと混合するステップを包含し、
前記二つの流れをインラインで混合し、
得られたリポソームが、０．７５：１以下の脂質対アミノ配糖体の重量比及び０．１μｍから１．０μｍの平均直径を有する、ステップを含む、方法。
【請求項１８】
前記二つの流れをインラインで混合する前に、Ｙ字型の連結器に入れる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記の溶液又は混合物が水性又はアルコール性である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記アミノ配糖体の溶液がストレプトマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ネチルマイシン及びカナマイシンの溶液からなる群から選ばれる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記アミノ配糖体がアミカシンである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記アミノ配糖体がゲンタマイシンである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記アミノ配糖体がトブラマイシンである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記脂質の溶液又は混合物の流れ及び前記アミノ配糖体の溶液又は混合物の流れが、７００から９００ｍＬ／ｍｉｎの全流速で混合される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
前記脂質の溶液又は混合物の流れ及び前記アミノ配糖体の溶液又は混合物の流れが、８００ｍＬ／ｍｉｎの全流速で混合される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
前記脂質の溶液又は混合物の流れが２００から４００ｍＬ／ｍｉｎの流速で加えられる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２７】
前記脂質の溶液又は混合物の流れが３００ｍＬ／ｍｉｎの流速で加えられる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２８】
前記アミノ配糖体の溶液又は混合物の流れが４００から６００ｍＬ／ｍｉｎの流速で加えられる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２９】
前記アミノ配糖体の溶液又は混合物の流れが５００ｍＬ／ｍｉｎの流速で加えられる、請求項１７に記載の方法。
【請求項３０】
前記脂質の溶液又は混合物の流れが３００ｍＬ／ｍｉｎの流速で加えられ、かつ前記アミノ配糖体の溶液又は混合物の流れが５００ｍＬ／ｍｉｎの流速で加えられる、請求項１７に記載の方法。
【請求項３１】
前記の結合された流れの温度が、３０℃〜４０℃である、請求項１７に記載の方法。
【請求項３２】
前記脂質の溶液又は混合物の温度が３０℃であり、かつ前記アミノ配糖体の溶液又は混合物の温度が３０℃である、請求項１７に記載の方法。
【請求項３３】
前記脂質の溶液又は混合物の温度が５０℃であり、かつ前記アミノ配糖体の溶液又は混合物の温度が室温である、請求項１７に記載の方法。
【請求項３４】
前記の結合された流れを混合後少なくとも２０秒後に水で希釈するステップをさらに包含する、請求項１７に記載の方法。
【請求項３５】
前記アミノ配糖体の溶液又は混合物の前記濃度が３０〜５０ｍｇ／ｍＬである、請求項１７に記載の方法。
【請求項３６】
前記アミノ配糖体の溶液又は混合物の前記濃度が４０〜５０ｍｇ／ｍＬである、請求項１７に記載の方法。
【請求項３７】
前記脂質の溶液又は混合物の流れが３００ｍＬ／ｍｉｎの流速で加えられ、かつ前記アミノ配糖体の溶液又は混合物の流れが５００ｍＬ／ｍｉｎの流速で加えられ、前記結合された流れの温度が３０℃〜４０℃であり、前記結合された流れが混合後少なくとも２０秒後に水で希釈され、かつ前記アミノ配糖体の溶液又は混合物の前記濃度が４０〜５０ｍｇ／ｍＬである、請求項１７に記載の方法。
【請求項３８】
前記ホスファチジルコリンがジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）である、請求項１７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ホスファチジルコリンがジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）であり、かつ前記アミノ配糖体がアミカシンである、請求項１７に記載の方法。
【請求項４０】
前記脂質対アミノ配糖体の比が０．５：１以下である、請求項１７に記載の方法。
【請求項４１】
前記リポソームの平均直径が０．２μｍ乃至０．５μｍである、請求項１に記載のリポソーム性アミノ配糖体製剤。
【請求項４２】
前記アミノ配糖体がアミカシンである、請求項４１に記載のリポソーム性アミノ配糖体製剤。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００２年１０月２９日に出願された米国特許出願第６０／４２１，９２３号の利益の権利を主張している、２００３年１０月２９日に出願された米国特許出願第１０／６９６，３８９号の部分継続出願である、２００４年１２月２８日に出願された米国特許出願第１１／０２３，９７１号の部分継続出願である。
【０００２】
序論
吸入法による投与に適した、ある徐放性のテクノロジーは、そして肺において、全身的に徐放性及び目的とする部位に向けそして病巣への薬の取り込みを促進する能力により、薬の持続性のある治療効果を提供する、リポソーム及び脂質複合体を採用している。本発明は、リポソーム化された抗感染薬、及びリポソーム化された抗感染薬、又は脂質と複合体化された抗感染薬を使用する、肺感染症の治療方法を包含する。
【０００３】
グッドマン及びギルマン共著（Goodman and Gilman's）「The Pharmaceutical Basis of Therapeutics,Eighth Edition」において報告されているように、「腎毒性及び聴器毒性の発生は、アミノ配糖体類が蓄積する濃度と関連しているので、腎機能が損なわれている患者におけるこれらの薬の維持投与量を減らすことが欠く事ができない。」アミノ配糖体類は、患者の欠陥に関係なく耳の前庭又は聴覚の機能不全を引き起こすので、一般的に維持投薬量を減らすことが重要である。本発明は、劇的に毒性を減らすことができるので、通常の投与量よりも高い投与量が可能になる。
【０００４】
嚢胞性線維症（ＣＦ）患者は、肺において濃い粘液及び／又は痰を分泌し、頻繁に重篤な感染症に罹り、そして細菌のコロニーから生じたバイオフィルムを保有する。全てのこれらの流体及び成分は、抗感染薬による効果的に感染症を狙い打つことに対して障壁を作り出す。本発明は、これらの障壁を乗り越え、そして削減された投与量（投与量又は投与頻度において）さえ可能にするので、患者への前記の薬の投与量を減らす。一般的に肺感染症に対する、本発明により提供される投薬計画は、投薬量を減らす手段を提供する。
【０００５】
リポソーム・ドラッグ・デリバリーシステムのためには、生体内における飽和効果を避けるために前記の脂質負荷を最小限にするために、出来る限り薬に対する脂質の比（Ｌ／Ｄ）を下げることがしばしば望ましい。吸入法による肺での薬の放出のためには、長期に亘る使用のためには、リポソームの投与量は、クリアランス量を超えうるので前記の薬の投与及び薬の有効性を制限することから、このことはとりわけ事実に合致しているかもしれない。より低いＬ／Ｄ比は、前記の投与量／クリアランス閾値が出現する前により多くの薬を投与することを可能にする。
【０００６】
発明の概略
ここで開示された注入法によって、典型的には脂質／抗感染薬の重量比が約４：１から約５：１で抗感染薬を封入する適度の大きさ（＜１μｍ）の陰イオン脂質を実質的に含まないリポソームが創製された。リポソームの捕捉された量は定量されており、これらの数値に基づいて、その理論封入量が前記の抗感染薬が理想的な溶質として振舞う（すなわち、リポソーム膜と相互作用することなく、水と共に理想的に封入される）かどうかをを算出することができる。この比較によれば、予測より３〜５倍高い封入数が観察される。これは、特殊な相互作用が起こり、予測した封入より大きな封入と、低い脂質／抗感染薬比が可能になることを示すものである。リポソームが形成する溶液は、ある濃度の抗感染薬を含有している。このリポソーム中の抗感染薬の濃度は、溶液中の抗感染薬の濃度とほぼ同じであるはずである。しかしながら、内部の抗感染薬の濃度は、少なくとも３倍高いことが計算されている。
【０００７】
部分的には、本発明は、脂質製剤および抗感染薬を含むリポソーム抗感染製剤を特徴とする。該脂質製剤は、陰イオン脂質を実質的に含まず、かつ抗感染薬に対する脂質の重量比は、約４：１から約１：１である。いくつかの態様において、抗感染薬に対する脂質の重量比は、約３：１〜約１：１、２：１〜約１：１、または約１：１である。
【０００８】
別の実施態様において、本発明は、抗感染薬に対する脂質の重量比が約１：１以下、約０．７５：１以下、または約０．５：１以下である、抗感染薬を含む脂質製剤に関する。
【０００９】
いくつかの態様において、抗感染脂質製剤は、平均直径が約０．２μｍ乃至１．０μｍであるリポソームを含む。別のいくつかの実施態様において、該平均直径は、０．２μｍ乃至約０．５μｍである。別のいくつかの実施態様において、該平均直径は、０．２μｍ乃至約０．３μｍである。
【００１０】
いくつかの実施態様において、該抗感染薬は、当業で公知の抗感染薬のいずれかであることができる。いくつかの実施態様において、該抗感染薬は、限定されないが、アミカシン、トブラマイシン、またはゲンタマイシン、または薬学的に許容可能なそれらの塩を含むアミノ配糖体であることができる。
【００１１】
いくつかの実施態様において、脂質製剤は、中性脂質を含む。いくつかの実施態様において、脂質製剤は、陰イオン脂質を含まない。別のいくつかの実施態様において、該脂質は、限定されないが、ジパルミトイルホスファチジルコリンもしくはジオレイルホスファチジルコリンといったホスファチジルコリンを含むリン脂質である。または、該脂質は、限定されないが、コレステロールをはじめとしたステロールなどのステロイドであることができる。または、該脂質は、それらの組み合わせであることができる。
【００１２】
部分的に、本発明は、水性またはアルコール性溶液、もしくは脂質−アルコールの溶液と抗感染薬との混合物、または中性脂質の脂質成分の少なくとも１つの相転移の温度未満での混合物を注入するステップを含む、上記抗感染脂質製剤を調製する方法を特徴とする。ここで、注入は、上記のように行われる。いくつかの実施態様において、アルコールはエタノールである。
【００１３】
いくつかの実施態様において、脂質−アルコールの溶液またはその混合物の濃度は、約１０乃至約３０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施態様において、抗感染薬の水性もしくはアルコール性溶液または混合物の濃度は、約２０乃至約７０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施態様において、中性脂質−アルコールの溶液または混合物の濃度は、約１０乃至約３０ｍｇ／ｍＬであり、その抗感染薬の水性もしくはアルコール性溶液または混合物の濃度は、約２０乃至約７０ｍｇ／ｍＬである。しかしながら、当業者であれば、濃度は、含まれる脂質および／または抗感染薬によって変えてもよいこと、あるいは、最適化してもよいことを理解するであろう。
【００１４】
いくつかの実施態様において、本発明は、抗感染薬が下記から選択される上記脂質製剤に関する。アミノ配糖体、テトラサイクリン、スルホンアミド、ｐ−アミノ安息香酸、ジアミノピリミジン、キノロン、β−ラクタム、β−ラクタムおよびβ−ラクタマーゼ阻害剤、クロラムフェニコール、マクロライド、リノマイシン（原語：ｌｉｎｏｍｙｃｉｎ）、クリンダマイシン、スペクチノノマイシン、ポリミキシンＢ、コリスチン、バンコマイシン、バシトラシン、イソニアジド、リファンピン、エタンブトール、エチオナミド、アミノサリチル酸、サイクロセリン、カプレオマイシン、スルホン（原語：sulfone）、クロファジミン、サリドマイド、ポリエン抗真菌剤、フルシトシン、イミダゾール、トリアゾール、グリセオフルビン、テルコナゾール、ブトコナゾールシクロピラックス（原語：butoconazole ciclopirax）、シクロピロクスオラミン、ハロプロジン、トルナフタート、ナフティフィン（naftifine）、テルビナフィン、またはそれらの組合せ。いくつかの実施態様において、本発明は、抗感染薬がアミノ配糖体である、上記脂質製剤に関する。更なる実施態様において、該抗感染薬は、アミカシン、ゲンタマイシン、またはトブラマイシンから選択されるアミノ配糖体である。更なる実施態様において、該抗感染薬はアミカシンである。更なる実施態様において、該抗感染薬はゲンタマイシンである。更なる実施態様において、該抗感染薬はトブラマイシンである。
【００１５】
いくつかの実施態様において、本発明は、脂質製剤がリポソームである、上記脂質製剤に関する。
【００１６】
いくつかの実施態様において、脂質製剤がリン脂質を含む、上記脂質製剤に関する。いくつかの実施態様において、該脂質製剤は、ステロイドを含む。いくつかの実施態様において、該脂質製剤は、ステロールを含む。いくつかの実施態様において、該脂質製剤は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）を含む。いくつかの実施態様において、該脂質製剤は、コレステロールを含む。いくつかの実施態様において、該脂質製剤は、リン脂質およびステロイドを含む。いくつかの実施態様において、該脂質製剤は、リン脂質およびステロールを含む。いくつかの実施態様において、該脂質製剤は、ＤＰＰＣおよびコレステロールを含む。いくつかの実施態様において、本発明は、脂質製剤がＤＰＰＣ、ジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、およびコレステロールを含む、上記製剤に関する。
【００１７】
いくつかの実施態様において、脂質製剤が、ＤＰＰＣおよびコレステロールを約２０：１、１０：１、５：１、２：１、または１：１のモル比で含む、上記製剤に関する。
【００１８】
いくつかの実施態様において、本発明は、脂質製剤は、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＣ、およびコレステロールを約５〜２０：１〜２０：０．５〜１のモル比で含む、上記製剤に関する。.
【００１９】
いくつかの実施態様において、本発明は、脂質製剤がリポソームであり、抗感染薬がアミカシンである、上記脂質製剤に関する。
【００２０】
いくつかの実施態様において、本発明は、脂質製剤がリポソームであり、抗感染薬がアミカシンであり、脂質製剤が、リン脂質およびステロールを含む、上記脂質製剤に関する。
【００２１】
いくつかの実施態様において、本発明は、脂質製剤がリポソームであり、抗感染薬がアミカシンであり、脂質製剤がＤＰＰＣおよびコレステロールを含む、上記脂質製剤に関する。
【００２２】
別の実施態様において、本発明は、抗感染薬を含む脂質製剤を調製する方法に関し、該方法は、脂質の溶液または混合物の液流と、抗感染薬の溶液または混合物の液流とを混合させるステップを含む。そこでは、２つの液流が１つのラインに混合される。いくつかの実施態様において、この２つの液流を１つのラインに混合する前にＹ字コネクターに入れる。
【００２３】
いくつかの実施態様において、本発明は、脂質の溶液または混合物の液流、および抗感染薬の溶液または混合物の液流を、合計流速約７００乃至約９００ｍＬ／分で混合する、上記脂質製剤に関する。いくつかの実施態様において、脂質の溶液または混合物の液流および抗感染薬の溶液または混合物の液流を、合計流速約８００ｍＬ／分で混合する。いくつかの実施態様において、脂質の溶液または混合物の液流を、合計流速約２００乃至約４００ｍＬ／分で添加する。いくつかの実施態様において、脂質の溶液または混合物の液流を、流速約３００ｍＬ／分で添加する。いくつかの実施態様において、抗感染薬の溶液または混合物の液流を、流速約４００乃至６００ｍＬ／分で添加する。いくつかの実施態様において、抗感染薬の溶液または混合物の液流を、流速約５００ｍＬ／分で添加する。いくつかの実施態様において、脂質の溶液または混合物の液流を、流速約３００ｍＬ／分で添加し、抗感染薬の溶液または混合物を流速約５００ｍＬ／分で添加する。
【００２４】
いくつかの実施態様において、本発明は、液流の組み合わせの温度が約３０〜４０℃である、上記方法に関する。いくつかの実施態様において、脂質の溶液または混合物の温度が約３０℃であり、抗感染薬の溶液のまたは混合物の温度が約３０℃である。いくつかの実施態様において、脂質の溶液または混合物の温度が約５０℃であり、抗感染薬の溶液または混合物の温度が室温である。
【００２５】
いくつかの実施態様において、本発明は、抗感染薬を含む脂質製剤を調製する方法が、混合後、組み合わせの液流を水で少なくとも約２０秒間希釈するステップを更に含む、上記方法に関する。
【００２６】
いくつかの実施態様において、本発明は、抗感染薬の溶液または混合物の濃度が約３０乃至約５０ｍｇ／ｍＬである、上記方法に関する。いくつかの実施態様において、該抗感染薬の溶液または混合物の濃度は、約４０乃至約５０ｍｇ／ｍＬである。
【００２７】
いくつかの実施態様において、本発明は、脂質の溶液または混合物の液流を流速約３００ｍＬ／分で添加し、抗感染薬の溶液または混合物の液流を流速約５００ｍＬ／分で添加し；液流の組み合わせの温度が約３０〜４０℃であり；組み合わせの液流を、混合を行った少なくとも約２０後に水で希釈し；そして、抗感染薬の溶液または混合物の濃度を約４０乃至約５０ｍｇ／ｍＬとした、上記方法に関する。．
【００２８】
いくつかの実施態様において、本発明は、溶液または混合物が水性もしくはアルコール性である、上記方法に関する。いくつかの実施態様において、本発明は、脂質製剤がリポソームである、上記方法に関する。
【００２９】
いくつかの実施態様において、本発明は、抗感染薬が下記から選択される、上記方法に関する。アミノ配糖体、テトラサイクリン、スルホンアミド、ｐ−アミノ安息香酸、ジアミノピリミジン、キノロン、β−ラクタム、β−ラクタムおよびβ−ラクタマーゼ阻害剤、クロラムフェニコール、マクロライド、リノマイシン（原語：ｌｉｎｏｍｙｃｉｎ）、クリンダマイシン、スペクチノノマイシン、ポリミキシンＢ、コリスチン、バンコマイシン、バシトラシン、イソニアジド、リファンピン、エタンブトール、エチオナミド、アミノサリチル酸、サイクロセリン、カプレオマイシン、スルホン（原語：sulfone）、クロファジミン、サリドマイド、ポリエン抗真菌剤、フルシトシン、イミダゾール、トリアゾール、グリセオフルビン、テルコナゾール、ブトコナゾールシクロピラックス（原語：butoconazole ciclopirax）、シクロピロクスオラミン、ハロプロジン、トルナフタート、ナフティフィン（naftifine）、テルビナフィン、またはそれらの組合せ。いくつかの実施態様において、抗感染薬は、アミノ配糖体である。いくつかの実施態様において、該抗感染薬は、アミカシン、ゲンタマイシン、またはトブラマイシンから選択されるアミノ配糖体である。いくつかの実施態様において、該抗感染薬は、アミカシンである。いくつかの実施態様において、該抗感染薬は、ゲンタマイシンである。いくつかの実施態様において、該抗感染薬は、トブラマイシンである。
【００３０】
いくつかの実施態様において、本発明は、脂質がリン脂質である、上記方法に関する。いくつかの実施態様において、該脂質は、ステロイドを含む。いくつかの実施態様において、該脂質は、ステロールを含む。いくつかの実施態様において、該脂質は、ＤＰＰＣを含む。いくつかの実施態様において、該脂質は、コレステロールを含む。いくつかの実施態様において、該脂質は、リン脂質およびステロールを含む。いくつかの実施態様において、該脂質は、ＤＰＰＣおよびコレステロールを含む。
【００３１】
いくつかの実施態様において、本発明は、脂質製剤がリポソームであり、抗感染薬がアミカシンである、上記方法に関する。
【００３２】
いくつかの実施態様において、本発明は、脂質製剤がリポソームであり、抗感染薬がアミカシンであり、該脂質がリン脂質およびステロールを含む、上記方法に関する。
【００３３】
いくつかの実施態様において、本発明は、脂質製剤がリポソームであり、抗感染薬がアミカシンであり、該脂質がＤＰＰＣおよびコレステロールを含む、上記方法に関する。
【００３４】
いくつかの実施態様において、本発明は、該脂質製剤における、脂質対抗感染薬の比率が約１：１以下である、上記方法に関する。
【００３５】
いくつかの実施態様において、本発明は、該脂質製剤における、脂質対抗感染薬の比率が約０．７５：１以下である、上記方法に関する。
【００３６】
いくつかの実施態様において、本発明は、該脂質製剤における、脂質対抗感染薬の比率が約０．５：１以下である、上記方法に関する。
【００３７】
いくつかの実施態様において、本発明は、脂質製剤がリポソームであり、抗感染薬がアミカシンであり、脂質がＤＰＰＣおよびコレステロールを含み、脂質対抗感染薬の比率が約１：１以下である、上記方法に関する。
【００３８】
別の実施態様において、本発明は、それを必要とする患者における肺感染症を治療する方法に関する。該方法は、該患者に対し、脂質製剤と抗感染とを含むリポゾーム抗感染製剤の治療学的に有効な量を投与するステップを包含する。ここでは、抗感染薬の投与量は、約１００ｍｇ／日以下である。さらなる実施態様において、抗感染薬の投与量は、１日おきに約３０ｍｇ以下乃至約５０ｍｇである。ささらなる実施態様において、抗感染薬の投与量は、３日おきに約３０ｍｇ以下乃至約５０ｍｇである。
【００３９】
別の実施態様において、本発明は、上記治療方法に関する。該リポソームは、平均直径が約０．２μｍ乃至約１．０μｍである。さらなる実施態様において、該リポソームは、平均直径が約０．２μｍ乃至約０．５μｍであり、または約０．２μｍ乃至約０．３μｍである。
【００４０】
別の実施態様において、本発明は、肺感染症が嚢胞性線維症の結果起こるものである、上記方法に関する。
【００４１】
別の実施態様において、本発明は、脂質対抗感染薬の重量比が、約４：１乃至約０．５：１、約３：１乃至約０．５：１、約２：１乃至約０．５：１
、または約１：１乃至約０．５：１である、上記治療方法に関する。
【００４２】
別の実施態様において、本発明は、抗感染薬が下記から選択される、上記治療方法に関する。アミノ配糖体、テトラサイクリン、スルホンアミド、ｐ−アミノ安息香酸、ジアミノピリミジン、キノロン、β−ラクタム、β−ラクタムおよびβ−ラクタマーゼ阻害剤、クロラムフェニコール、ペニシリン類、セファロスポリン類、マクロライド、リノマイシン（原語：ｌｉｎｏｍｙｃｉｎ）、クリンダマイシン、コルチコステロイド（原語：coricosteroids）、プロスタグランジン、スペクチノノマイシン、ポリミキシン  Ｂ、コリスチン、バンコマイシン、バシトラシン、イソニアジド、リファンピン、エタンブトール、エチオナミド、アミノサリチル酸、サイクロセリン、カプレオマイシン、スルホン（原語：ｓｕｌｆｏｎｅ）、クロファジミン、サリドマイド、ポリエン抗真菌剤、フルシトシン、イミダゾール、トリアゾール、グリセオフルビン、テルコナゾール、ブトコナゾールシクロピラックス（原語：ｂｕｔｏｃｏｎａｚｏｌｅ  ｃｉｃｌｏｐｉｒａｘ）、シクロピロクスオラミン、ハロプロジン、トルナフタート、ナフティフィン（原語：ｎａｆｔｉｆｉｎｅ）、テルビナフィン、またはその組み合わせ。別の実施態様において、該抗感染薬は、アミノ配糖体である。別の実施態様において、抗感染薬はアミカシンである。
【００４３】
別の実施態様において、本発明は、脂質製剤が中性脂質を含む、上記治療方法に関する。別の実施態様において、脂質製剤を構成する脂質は、全て中性脂質である。別の実施態様において、リポソームは、陰イオン脂質を含まない。別の実施態様において、脂質製剤は、リン脂質を含む。別の実施態様において、脂質製剤はステロールを含む。別の実施態様において、脂質製剤は、ＤＰＰＣおよびコレステロールを含む。
【００４４】
別の実施態様において、本発明は、抗感染薬がアミカシンであり、脂質製剤がＤＰＰＣおよびコレステロールを含む、上記治療方法に関する。  
【００４５】
別の実施態様において、本発明は、抗感染薬がアミカシンであり、脂質対抗感染薬の重量比が約４：１乃至約１：１であり、そして脂質製剤がＤＰＰＣおよびコレステロールを含む、上記治療方法に関する。更なる実施態様において、該重量比は、約３：１乃至約１：１、２：１乃至約１：１、または約１：１である。
【００４６】
別の実施態様において、本発明は、抗感染薬がアミカシンであり、脂質対抗感染薬の重量比が約４：１乃至約１：１であり、脂質製剤がＤＰＰＣおよびコレステロールを含み、そして肺感染症が嚢胞性線維症を原因とするものである、上記治療方法に関する。さらなる実施態様において、該重量比は、約３：１乃至約１：１、２：１乃至約１：１、または約１：１である。
【００４７】
別の実施態様において、本発明は、抗感染薬がアミカシンであり、脂質対抗感染薬の重量比が約４：１乃至約０．５：１であり、脂質製剤がＤＰＰＣおよびコレステロールを含み、そして、リポソームの平均直径が約０．１μｍ乃至約０．５μｍである、上記治療方法に関する。さらなる実施態様において、該平均直径は０．２μｍ乃至約０．４μｍであり、または約０．２μｍ乃至約０．３μｍである。
【００４８】
別の実施態様において、本発明は、抗感染薬がアミカシンであり、脂質対抗感染薬の重量比が約４：１乃至約０．５：１であり、脂質製剤がＤＰＰＣおよびコレステロールを含み、肺感染症が嚢胞性線維症を原因とするものであり、リポソームの平均直径が約０．１μｍ乃至約１．０μｍである、上記治療方法に関する。さらなる実施態様において、該平均直径は０．２μｍ乃至約０．５μｍであり、または約０．２μｍ乃至約０．３μｍである。
【００４９】
本発明のこれらの実施態様、他の実施態様、ならびにそれらの特徴および特性を、以下の明細書、図面、および請求項により明らかにする。
【００５０】
発明の詳細な説明
本発明は、その大きさおよび脂質対薬物の比率が、これまでに知られているものより小さい、抗感染薬を含む脂質製剤を開示している。さらに本発明は、これらの脂質製剤を調製する方法を開示している。
【００５１】
１.定義
本発明をさらに説明する前に、便宜上、本明細書、実施例および添付の請求の範囲において用いられるいくつかの用語をここに集めている。これらの定義を、当業者は本開示の他の部分に照らして読み取り、理解するであろう。他に特に規定しない限り、ここで用いられる全ての技術および科学用語は、当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。
【００５２】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書においては、該冠詞の文法上の目的語が１または１より多い（すなわち、少なくとも１である）ことをを意味する。例えば、「an element」は、１つのエレメントまたは１より多くのエレメントを意味する。
【００５３】
「バイオアベイラブル」は技術的に認識されており、それが投与された患者または被験者が、投与された量、またはその一部を吸収し、組み込み、そうでなければ、生理学的に利用することができる、本発明の形態を表す。
【００５４】
用語「comprise（含む）」および「comprising（含んでいる）」は、包括的な、オープンな意味で用いられ、さらに追加的なエレメントを含んでもよいことを意味する。
【００５５】
用語「閉じ込められた」および「閉じ込められている」は、脂質ベースの製剤の表面への抗感染薬の吸着、二重層もしくは２つの単層間の内部領域への抗感染薬の結合、２つの二重層間の空間での抗感染薬の捕捉、または最内層の二重層もしくは炭層によって囲まれた空間内での抗感染薬の捕捉を意味する。
【００５６】
本明細書において用いられている用語「including（含んでいる）」は、「including but not
limited to（限定されないが、〜を含んでいる）」の意味で用いられている。「including（含んでいる）」は、「including but not limited to（限定されないが、〜を含んでいる）」は、交換可能に用いられる。
【００５７】
本明細書において説明している、用語「脂質抗感染薬製剤」または「Ｌｉｐ抗感染薬」または「Ｌｉｐ−Ａｐ」は、脂質との複合体の一部として、あるいは、抗生物質が水性相もしくは疎水性二重層の相もしくはリポソーム二重層の界面頭部基の領域でとなりうるリポソームとして存在する、少なくとも約１重量％の抗感染薬が脂質に結合している、もしくはあらゆる形態の抗感染薬組成物を意味する。好ましくは、少なくとも約５％、または少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約２５％を結合させることができる。結合は、脂質と脂質結合抗感染薬が保持され、フリーの抗感染薬が濾過物中に存在する場合、フィルターを介して分離することによって測定することができる。「リポソーム抗感染薬製剤」は、脂質製剤がリポソームの形態の抗感染脂質製剤である。
【００５８】
用語「哺乳動物」は、当業で公知である。哺乳動物の例としては、ヒト、霊長類、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、および齧歯類（例えば、マウスおよびラット）があげられる。
【００５９】
当該方法によって治療される「患者」、「被験者」、または「ホスト」は、ヒトあるいは非ヒト動物であってよい。
【００６０】
用語「薬学的に許容可能な塩」は、当業で認識されており、例えば、本発明の組成物に含有される形態のものを含めた、比較的非毒性の、無機および有機の酸添加塩の化合物を意味する。
【００６１】
用語「溶媒注入」は、１以上の脂質を少量、好ましくは微量のプロセス適合性溶媒に溶解して、脂質懸濁液もしくは溶液（好ましくは、溶液）を作製し、その後該溶液を、生物活性物質を含有する水性媒体に添加することを含むプロセスである。典型的には、プロセス適合性溶媒は、水性プロセス、例えば、透析法によって洗い流すことができるものである。冷却／加温のサイクルをを繰り返す組成物は、溶媒注入によって作製されることが好ましく、エタノール注入が好ましい。溶媒として、アルコールが好ましい。「エタノール注入」は、溶媒注入の１つのタイプであり、１以上の脂質を少量、好ましくは微量のエタノールに溶解して、脂質溶液を作製し、その後該溶液を、生物活性物質を含有する水性媒体に添加することを含むプロセスである。溶媒の「小」量とは、注入プロセスにおけるリポソームまたは脂質複合体の作製に適合する量である。さらに、用語「溶媒注入」は、製剤成分の２つの流れを最初に１つのラインに混合しておく、インライン注入プロセスを含む。
【００６２】
用語「実質的に含まない」は、当業で認識されており、些細な量以下を意味する。
【００６３】
用語「治療薬」は、当業で認識されており、被験者において局所的もしくは全身的に作用を及ぼす、生物学的、生理学的、または薬理学的活性物質である、任意の化学的部分を意味する。「薬物」と称されることもある治療薬の例としては、Merck Index, the Physicians Desk Reference, and The Pharmacological
Basis of Therapeuticsなどの公知の参考文献に記載があり、限定されないが、医薬品；ビタミン類；ミネラルサプリメント類；疾患もしくは疾病の治療、予防、診断、治癒もしくは軽減のために用いられる物質；または生物学的に活性のある、もしくはそれらが生理学的環境におかれたときにより活性的になるプロドラッグがあげられる。
【００６４】
本明細書において用いられているフレーズ「治療的有効量」は、肺感染症を阻害することによって望ましい治療効果をもたらすのに有効な、本発明の抗感染脂質製剤を含む、化合物、物質、または組成物の量を意味する。
【００６５】
用語「治療」は、当業で認識されており、あらゆる状態および疾患の少なくとも１つの症状を治癒ならびに軽減させることを言う。用語「治療する」は、状態または疾患から防御または予防の機能を果たす予防的治療をも意味する。
【００６６】
２．抗感染薬
抗感染薬は、細菌性、ミコバクテリア性、真菌性、ウイルス性、または原生動物性感染などの感染に対して作用する作用物質である。本発明で論じる抗感染薬としては、限定されないが、アミノ配糖体類（例えば、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ネチルマイシン、カナマイシン、など）、テトラサイクリン類（例えば、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、メタサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、など）、スルホンアミド類（例えば、スルファニルアミド、スルファジアジン、スルファメタジン、スルフイソキサゾール、スルファセタミド、など）、パラアミノ安息香酸、ジアミノピリミジン（例えば、トリメトプリム、スルファメトキサゾール、ピラジンアミド、などと組み合わせて使用されることが多い）、キノロン類（例えば、ナリジキシ酸、シノキサシン、シプロフロキサシン、およびノルフロキサシン、など）、ペニシリン類（例えば、ペニシリンＧ、ペニシリンクロルＶ、アンピシリン、アモキシシリン、バカンピシリン、カルベニシリン、カルベニシリンインダニル、チカルシリン、アズロシリン、メズロシリン、ピペラシリン、など）、ペニシリナーゼ耐性ペニシリン（例えば、メチシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、ナフシリン、など）、第１世代セファロスポリン系物質（例えば、セファドロキシル、セファレキシン、セフラジン、セファロチン、セファピリン、セファゾリン、など）、第２世代セファロスポリン系物質（例えば、セファクロール、セファマンドール、セフォニシド、セフォキシチン、セフォテタン、セフロキシム、セフロキシムアクセチル；セフメタゾール、セフプロジル（原語：cefprozil）、ロラカルベフ（原語：loracarbef）、セホラニド、など）、第三世代セファロスポリン系物質（例えば、セフェプリム（原語：cefepime）、セホペラゾン、セフォタキシム、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフタジジム、セフィキシム、セフポドキシム、セフチゾキシム、など）、他のベータ−ラクタム系物質（例えば、イミペネム、メロペネム（原語：meropenem）、アズトレオナム、クラブラン酸、スルバクタム、タロバクタム（原語：tazobactam）、など）、ベータ−ラクタマーゼ阻害剤（例えば、クラブラニン酸）、クロラムフェニコール、マクロライド類（例えば、エリスロマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、など）、リンコマイシン、クリンダマイシン、スペクチノマイシン、ポリミキシンＢ、ポリミキシン類（例えば、ポリミキシンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅｌ（コリスチンＡ）、もしくはＥ２、コリスチンＢもしくはＣ、など）、
コリスチン、バンコマイシン、バシトラシン、イソニアジド、リファンピン、エタンブトール、エチオナミド、アミノサリチル酸、サイクロセリン、カプレオマイシン、スルホン類（例えば、ダプソン、スルホキソンナトリウム、など）、クロファジミン、サリドマイド、または他の脂質カプセル化が可能な抗細菌剤が含まれる。抗感染薬は、抗真菌性物質を含むことができ、それは、ポリエン抗真菌性物質（例えば、アンホテリシンＢ、ナイスタチン、ナタマイシン、など）、フルシトシン、イミダゾール類（例えば、ｎ−チコナゾール（原語：ticonazole）、クロトリマゾール、エコナゾール、ケトコナゾール、など）、トリアゾール類（例えば、イトラコナゾール、フルコナゾール、など）、グリセオフルビン、テルコナゾール、ブトコナゾール（原語：butoconazole）、シクロピロックス、シクロピロクスオラミン、ハロプロジン、トルナフテート、ナフチフィン、テルビナフィン、または他の脂質カプセル化もしくは複合体化することが可能な抗真菌性の物質が含まれる。説明と例は、主にアミカシンについて行うが、適用範囲はこの抗感染薬に限定されることを意図するものではない。薬物の併用も可能である。
【００６７】
特に好ましい抗感染薬は、アミノ配糖体類、キノロン類、ポリエン抗真菌性物質およびポリミキシン類を含む。
【００６８】
本発明の抗感染脂質製剤に用いられる好適な抗感染薬には、薬学的に許容される添加塩および抗感染薬の複合体も含まれる。化合物が１以上のキラル中心を持つ場合、特に明記しない限り、本発明は、それぞれの独自のラセミ化合物、ならびに独自の非ラセミ化合物を含む。
【００６９】
抗感染薬が不飽和の炭素−炭素二重結合を有する場合、ｃｉｓ（Ｚ）およびｔｒａｎｓ（Ｅ）双方のアイソマーが本発明の範囲に含まれる。抗感染薬が、例えば、下記式（化１）で表されるような、ケト−エノール互変異性体などの互変異性型で存在する場合、各互変異性型について、それが均衡を保って存在するか、１つの型にロックされているかを、Ｒ’で適切な置換を行って本発明に記載のように検討される。いずれか１つに対する置換基の意味は、その意味において、または他の置換基の意味において、それぞれ独立している。
【００７０】
【化１】
0005415759.tif 000002
【００７１】
本発明の抗感染脂質製剤に用いられる好適な抗感染薬には、白金化合物のプロドラッグも含まれる。プロドラッグは、活性親化合物をin vivoで放出する、共有結合したあらゆる担体であると考えられている。
【００７２】
３．肺感染症
本発明の方法を用いて治療することができる肺感染症（例えば、嚢胞性線維症患者）には、シュードモナス（例えば、シュードモナス・アエルギノーザ（P. aeruginosa）、シュードモナス・パウシモビリス（Ｐ.
Paucimobilis）、シュードモナス・プチダ（P. putida）、シュードモナス-フルオレッセンス（P. fluorescens）、およびシュードモナス・アシドボランス（P. acidovorans）、ブドウ球菌（staphylococcal）、耐性黄色ブドウ球菌（Methicillinresistant Staphylococcus aureus （ＭＲＳＡ））、連鎖球菌（streptococcal）（連鎖球菌性肺炎（Streptococcus
pneumoniae）によるものを含む）、大腸菌（Escherichia coli）、クレブシエラ（Klebsiella）、エンテロバクター（Enterobacter）、セラチア属（Serratia）、ヘモフィルス属（Haemophilus）、エルシニア属ペソス（Yersinia pesos）、ブルクホルデリア・プセウドマレイ（Burkholderia pseudomallei）、ブルクホルデリア・セパシア（B. cepacia）、ブルクホルデリア・グラディオリ（B. gladioli）、ブルクホルデリア・マルチボランス（B. multivorans）、ブルクホルデリア・ベトナミエンシス（B. vietnamiensis）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）、マイコバクテリウムアビウム複合体（M. avium（ＭＡＣ）（マイコバクテリウム・アビウム（M avium）およびマイコバクテリウム・イントラセルラーレ（M. intracellular））、マイコバクテリウム・カンサシイ（M.
kansasii）、マイコバクテリウム-キセノピー（M.
xenopi）、マイコバクテリウム・マリナム（M. marinum）、マイコバクテリウム-ウルセランス（M. ulcerans）、またはマイコバクテリウム・フォルツイタム複合体（M. fortuitum complex）（マイコバクテリウム・フォルツイタム（M. fortuitum）およびマイコバクテリウム・ケロネイ（M. chelonei））感染がある。
【００７３】
４．治療方法
ある実施態様において、本発明は、抗感染脂質製剤の治療的有効量を投与することを含む治療方法を含む。 
【００７４】
以下に特別の投与量を規定しない限り、１４日間の治療クールでの用量による肺おけるＣＦＵ数を減らすために、ネブライザーで肺に送達する場合、本発明の好ましい用量は、最小量のフリーの薬物（もちろん、塩であってもよい）の有効量の５０％以下、３５％以下、２０％以下、または１０％以下である。比較のフリー薬物の量は、本発明の薬物治療を適用する投与期間に使用されることになる累積量である。このパラグラフに定義するフリー薬物の比較の最小量は、「比較のフリー薬物量」である。
【００７５】
本発明の非ＣＦ治療態様の使用は、好ましくはヒトであるが、あらゆる動物を用いて行うことができる。所与の動物における相対量は、その動物について測定される。
【００７６】
投与計画は、好ましくは１日１回以下である。好ましい実施態様において、投与計画は、１日おき、３日おき、毎週、以下であり、例えば、投与計画は、１日おき以下で、比較フリー薬物量の５０％以下を用いて行うことができる。あるいは、例えば、投与は、比較フリー薬物量の３５％以下を用いて行うことができる。図３および４の動物データを参照されたい。それは、本発明の抗感染脂質製剤がフリーの薬物より有効であることを示している。
【００７７】
感染症を治療するための抗感染薬の有効量を臨床医師は認識しているであろうが、その有効量とは、治療することが求められている疾患、または避けること、もしくは治療することが求められている状態の１以上の徴候を治療、減少、寛解、除去もしくは予防するための有効量、またはそうでなければ疾患もしくは状態の病理学的状態に臨床的に認識可能な変化をもたらすための有効量である。寛解は、予防的に治療される動物において感染症の発生もしくは重篤度を減らすことが含まれる。いくつかの実施態様において、該有効量は、肺感染症の徴候が現れてから後に治療もしくは寛解するために有効な量である。別のいくつかの実施態様において、該有効量は、予防的に治療される動物における感染症の平均的な発生率もしくは重篤度を治療または寛解するために有効な量である（統計学的研究に基づいて測定される）。
【００７８】
リポソームまたは他の脂質の送達システムは、ネブライザースプレー、パウダー、もしくはエアゾールのいずれかを用いた吸引によって、または、くも膜下腔内投与によって、投与することができる。吸引投与が好ましい。全体的な結果は、フリー薬物もしくは非経口形態の薬物と比較して、少ない投与頻度で治療指数を高められる。リポソームまたは他の脂質製剤は、肺の裏打ちまたは肺の界面活性物質と適合可能でありながら、薬物を保護する能力をもつことから、特に有利である。
【００７９】
本発明は、肺のグラム陰性菌感染を治療するための方法を含む。通常治療される感染の一例として、ＣＦ患者における慢性シュードモナス感染がある。アミノ配糖体を用いた肺の感染症（例えば、ＣＦ患者におけるもの）の公知の治療は、通常、約２００〜６００ｍｇ／日のアミカシンまたはトブラマイシンを吸引によって投与することを含む。本発明は、好ましい実施態様において、１００ｍｇ／日以下のアミカシン（または、投与頻度が少ない場合、１００ｍｇ／日以下に正規化）を投与することによって治療することができる。さらに別の実施態様においては、６０ｍｇ／日以下のアミカシンを毎日投与する。さらに別の実施態様においては、約３０乃至５０ｍｇを２日おき以下で投与する。最も好ましい実施態様は、１日おき、または３日に１回、約３０乃至５０ｍｇを投与する。
【００８０】
５．脂質およびリポソーム
本発明の組成物に用いられる資質は、合成脂質、半合成脂質、または天然に存在する脂質であることができ、リン脂質類、トコフェロール類、ステロイド類、脂肪酸類、アルブミンなどのグリコプロテイン類、陰イオン脂質および陽イオン性脂質があげられる。該脂質は、陰イオン性でも、陽イオン性でも、中性でもよい。ある実施態様において、当該脂質製剤は、実質的に陰イオン脂質を含まない。ある実施態様において、当該脂質製剤は、中性脂質のみを含む。別の実施態様において、当該脂質製剤は、陰イオン脂質を含まない。別の実施態様において、当該脂質は、リン脂質である。リン脂質は、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、卵ホスファチジルグリセロール（ＥＰＧ）、卵ホスファチジルイノシトール（ＥＰＩ）、卵ホスファチジルセリン（ＥＰＳ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＥＰＥ）、および卵ホスファチド酸（ＥＰＡ）；その大豆の対応物、大豆ホスファチジルコリン（ＳＰＣ）；ＳＰＧ，ＳＰＳ、ＳＰＩ、ＳＰＥ、およびＳＰＡ；その硬化卵および大豆対応物（例えば、ＨＥＰＣ、ＨＳＰＣ）、炭素数１２〜２６の鎖を含有する２および３のグリセロール位置における脂肪酸のエステル結合、およびコリン、グリセロール、イノシトール、セリン、エタノールアミンを含むグリセロールの１位置における異なる頭基（head group）から構成された他のリン脂質、ならびに対応するホスファチジン酸があげられる。これらの脂肪酸の鎖は、飽和であっても不飽和であってもよく、そのリン脂質は、異なる鎖長および異なる不飽和度の脂肪酸で構成してもよい。特に、製剤の組成物は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、天然に存在する肺表面活性剤の主要な構成要素、ならびにジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）を含むことができる。他の例としては、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）およびジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）およびジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）およびジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジオレイルホスファチジル−エタノールアミン（ＤＯＰＥ）およびパルミトイルステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）やパルミトイルステアロイルホスファチジルグリセロール（ＰＳＰＧ）のような混合リン脂質、トリアシルグリセロール（原語：driacylglycerol）、ジアシルグリセロール、セラニド（原語：seranide）、スフィンゴシン、スフィンゴミエリンおよびモノオレイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＭＯＰＥ）のような単一アシル化リン脂質を含むことができる。
【００８１】
用いられる脂質は、脂肪酸のアンモニウム塩、リン脂質およびグリセリド類、ステロイド類、ホスファチジルグリセロール類（ＰＧ）、ホスファチジン酸類（ＰＡ）、ホスファチジルコリン類（ＰＣ）、ホスファチジルイノシトール類（ＰＩ）、ホスファチジルセリン類（ＰＳ）を含むことができる。脂肪酸は、炭素数１２〜２６の鎖長の飽和もしくは不飽和脂肪酸を含む。いくつかの具体例としては、ミリスチルアミン、パルミトイルアミン、ラウリルアミン、およびステアリルアミン、ジラウロイルエチルホスホロチオエート（ＤＬＥＰ）、ジミリストイルエチルホスホコリン（ＤＭＥＰ）、ジパルミトイルエチルホスホコリン（ＤＰＥＰ）およびジステアロイルエチルホスホコリン（ＤＳＥＰ）、Ｎ−（２，３−ジ−（９（Ｚ）−オクタデセニルオキシ）−プロ−ｌ−ピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）および１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニウム）プロパン（ＤＯＴＡＰ）が含まれる。ステロイドの例としては、コレステロールおよびエルゴステロールが含まれる。ＰＧ、ＰＡ、ＰＩ、ＰＣおよびＰＳの例としては、ＤＭＰＧ、ＤＰＰＧ、ＤＳＰＧ、ＤＭＰＡ、ＤＰＰＡ、ＤＳＰＡ、ＤＭＰＩ、ＤＰＰＩ、ＤＳＰＩ、ＤＭＰＳ、ＤＰＰＳ、およびＤＳＰＳ、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＧ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、卵ＰＣがある。
【００８２】
リポソームまたはＤＰＰＣなどのホスファチジルコリンの抗感染脂質製剤化合物は、肺、肺胞マクロファージなどにおける細胞の摂取を助け、抗感染薬物質の肺での放出を助ける（Gonzales-Rothi et al. （1991））。負に帯電したＰＧ、Ｐａ、ＰＳ、およびＰＩなどの脂質は、粒状凝集物を減少させることに加えて、吸引用製剤の徐放の特徴ならびに肺への製剤の輸送において役割を果たす（全身における取り込みのためのトランスサイトーシス）。該ステロール化合物は、製剤の放出および漏洩の特徴に影響を及ぼすと考えられている。
【００８３】
リポソームは、水性容積を閉じ込めた完全に閉じた脂質二重層である。リポソームは、ユニラメラ小胞（単一の膜二重層を保有する）、または多層ラメラ小胞（多数の膜二重層をもち、そのそれぞれが隣の水性層と分離したタマネギ状構造を特徴とする）であることができる。当該二重層は、疎水性の「尾部」領域、と親水性の「頭部」領域を持つ２つの脂質単層膜からなる。当該膜二重層の構造は、脂質単層の疎水性（非極性）の「尾部」が二重層の中心に向かい、親水性の「頭部」が水相に向かうような構造になっている。抗感染脂質製剤は、脂質と抗感染薬剤の結合である。この結合は、共有結合、イオン結合、静電結合、または立体結合である。これらの複合体は、さらなる水溶性の溶質を閉じ込めることができない。そのような複合物の例としては、アンフォトテンシン（原語：amphotencin）の脂質複合体（Janoff et al., Proc. Nat
Acad. ScL, 85:6122 6126, 1988）、およびカルジオリピンのドキソルビシンとの複合体がある。
【００８４】
脂質クラスレートは、１以上の脂質を有する３次元のケージ状構造で、該構造は、生物活性物質を閉じ込めている。こうしたクラスレートは本発明に包含される。
【００８５】
プロリポソームは、水性液と接触するとリポソームまたは脂質複合物となり得る製剤である。攪拌またはその他の混合を行う必要がある。そのようなプロリポソームは本発明の範囲に含まれる。
【００８６】
リポソームは、種々の方法で作製することができる（例えば、Bally, Cullis et al,
Biotechnol Adv. 5（1）: 194, 1987を参照されたい）。Bangham's 処置（J. MoI. Biol., J MoI Biol. 13（l）:238-52, 1965）は、通常のマルチラメラ小胞（ＭＬＶ）を作製する。Lenk et al. （米国特許第４，５２２，８０３号、第５，０３０，４５３号および第５，１６９，６３７号）、Fountain et al.（米国特許第４，５８８，５７８号）ならびにCullis
et al.（米国特許第４，９７５，２８２号）は、各水性コンパートメント内の溶質の分散がラメラ間で実質的に等しいマルチラメラリポソームを形成する方法を開示している。Paphadjopoulos et al.（米国特許第４，２３５，８７１号）は、逆相エバポレーションによってオリゴラメラを調製することを開示している。
【００８７】
ユニラメラ小胞は、いくつかの技術、例えば、Cullis et al.（米国特許第５，００８，０５０号）やLoughrey et al.（米国特許第 ５，０５９，４２１号）の押出法によってＭＬＶから作製することができる。超音波処理および超音波処理を用いて、大きなユニラメラリポソームから小さなユニラメラリポソームを形成することもできる（例えば、Paphadjopoulos et al.、Biochim. Biophys.
Acta., 135:624-638, 1967; Deamer, 米国特許第４，５１５，７３６号；およびChapman
et al., Liposome technol.、1984, pp. 1-18）。
【００８８】
Bangham et al（J. MoI.
Biol., 1965, 13:238- 252）のオリジナルのリポソーム調製は、リン脂質を有機溶媒に懸濁化し、次いで、それを蒸発させ、乾燥させてリン脂質膜を反応容器上に取り出すことができる。次に、適量の水性相を添加し、該混合物を「膨張」させ、残りのマルチラメラ小胞（ＭＬＶ）からなるリポソームを、機械的手段によって分散させる。この調製は、Papahadjopoulos et al. （Biochim. Biophys,
Acta., 1967, 135:624- 638）に記載の、超音波処理した小さなユニラメラ小胞および大きなユニラメラ小胞の開発に基づいている。
【００８９】
大きなユニラメラ小胞（ＬＵＶ）を作製する技法、例えば、逆相エバポレーション、注入処理、および界面活性剤希釈などを用いて、リポソームを使用することができる。リポソームを形成するためのこれらおよび他の方法は、テキスト、Lipoxomes, Marc Ostro, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1983,
Chapter 1に記載がある。その関連部分を本明細書に引用を以って援用する。さらに、Szoka, Jr.
et al.（1980, Ann. Rev. Biophys. Bioeng.、9:467）を参照されたい。その関連部分を本明細書に引用を以って援用する。
【００９０】
小胞を調製するための他の方法としては、逆相エバポレーション小胞（ＲＥＶ）からのものが挙げられる。Papahadjopoulosらの米国特許第４，２３５，８７１号を参照されたい。使用可能な別のクラスのリポソームは、ラメラ溶質分散とほぼ等しい特徴を持つ。このリポソームは、米国特許第４，５２２，８０３号（Lenk, et al.）に記載されているように、安定な複室小胞（ＳＰＬＶ）、米国特許第４，５８８，５７８号（Fountain, et al.）に記載されているように１相性小胞、そして、上記のように凍結および解凍マルチラメラ小胞（ＦＡＴＭＬＶ）とそれぞれ命名されている。
【００９１】
種々のステロールおよびそれらの水溶性誘導体、例えば、コレステロールヘミスクシナートを用いてリポソームが作製されてきた；具体的には、Janoffらの米国特許第４，７２１，６１２号（１９９８年１月２６日発行、発明の名称：「ステロイド性リポソーム」）を参照されたい。Mayhewらは、アルファトコフェロールおよびその誘導体を含むリポソームをカプセル化することによって抗細菌剤および抗ウイルス性物質の毒性を減少させる方法について述べている。さらに、種々のトコフェロールおよびそれらの水溶性誘導体を用いてリポソームが形成されている。例えば、Janoff らの米国特許第５，０４１，２７８号を参照されたい。
【００９２】
６．調製方法
リポソームまたは抗感染脂質製剤を作製するプロセスには、「溶媒注入」プロセスが含まれる。これは、１以上の脂質を少量、好ましくは微量のプロセス適合性溶媒に溶解して、脂質懸濁液もしくは溶液（好ましくは、溶液）を作製し、その後該溶液を、抗感染薬を含有する水性媒体に注入することを含むプロセスである。典型的には、プロセス適合性溶媒は、水性プロセス、例えば、透析法によって洗い流すことができるものである。「エタノール注入」は、溶媒注入の１つのタイプであり、１以上の脂質を少量、好ましくは微量のエタノールに溶解して、脂質溶液を作製し、その後該溶液を、抗感染薬を含有する水性媒体に添加することを含むプロセスである。溶媒の「少」量とは、注入プロセスにおけるリポソームまたは脂質複合体の作製に適合する量である。こうしたプロセスについては、２００３年８月４日に出願されたLee らの米国特許第１０／６３４，１４４号、２００３年３月５日に出願されたPilkiewicz
らの米国特許第１０／３８３，１７３号、および２００３年３月５日に出願されたBoniらの米国特許第１０／３８３，００４号に記載がある。その全てを、引用を以って本明細書に引用する。
【００９３】
脂質−アルコールの溶液を、抗感染薬を含有する水性またはアルコール性溶液または混合物に注入するステップは、抗感染薬を含有する水性またはアルコール性溶液または混合物の表面の上または下で行うことができる。好ましくは、このステップは、溶液または混合物の表面の上または下で行われる。
【００９４】
リポソームはまた、２００３年３月５日に出願された米国特許第１０／３８３，００４号、２００３年８月４日に出願された米国特許第１０／６３４，１４４号、２００２年８月２０日に出願された米国特許第１０／２２４，２９３号、および２００３年１０月２９日に出願された米国特許第１０／６９６，３８９号に記載の方法によって調製することができる。これらの特許明細書の全てを、引用を以って本明細書に援用する。
【００９５】
リポソームまたは脂質製剤のサイジングは、例えば、押し出し法、超音波処理、および超音波処理技法など、当業者に公知であり、容易に行うことができるいくつかの方法によって行うことができる。押し出し法は、加圧しながらリポソームを１回以上、規定された孔サイズのフィルターに通すことを含む。フィルターは通常ポリカーボネート製であるが、該フィルターは、リポソームと相互作用しない、圧力がかかった状態での押し出し法に耐える十分な強度を持つ、あらゆる耐性材料で作製することができる。好ましいフィルターは、「直接通す」フィルターである。なぜなら、それらは、通常、本発明の好ましい押し出し法の高圧に対して耐性があるからである。「蛇行経路」フィルターを使ってもよい。さらに押し出し法は、例えば、リポソームを枝分かれした孔タイプの酸化アルミニウム孔フィルターを通して押し出す、Anopore（登録商標）フィルターなどの非対称フィルターを用いることもできる。
【００９６】
リポソームまたは脂質製剤は、超音波処理によってサイズを小さくすることもできる。これは、超音波エネルギーを用いて、リポソームを分裂またはせん断するものであり、同時により小さなリポソームに作製しなおすものである。超音波処理は、リポソーム懸濁液を含有するガラスを、浴タイプの超音波処理器内にできた超音波の震央に浸漬することによって行われる。別法として、リポソーム懸濁液に接触させたチタンプローブの振動によって超音波エネルギーを発生させるプローブタイプの超音波処理器を用いてもよい。Gifford Wood ホモジナイザーなどの、超音波処理装置や製粉処理機を用いて、より大きなリポソームもしくは脂質製剤をより小さなリポソームもしくは脂質製剤にすることができる。
【００９７】
得られたリポソーム製剤は、接線方向に流す濾過などの、当業で公知の方法を用いて均質の集団に分離することができる。この処置においては、大きさの不均一なリポソームまたは脂質製剤の集団を接線方向に流してフィルターを通過させ、大きさの上限および／または下限をもつリポソーム集団とする。サイズの異なる、すなわち、ポアサイズの異なる、２つのフィルターを用いた場合、最初のポア径より小さなリポソームは、該フィルターを通過する。次いで、この濾過物に接線方向の濾過処理を施し、第１のポアサイズより小さいポアサイズをもつ第２のフィルターに通す。このフィルターの濃縮水は、それぞれ第１および第２のフィルターのポアサイズの大きさによって定義された上限と下限をそれぞれ有するリポソーム／複合体集団である。
【００９８】
Mayer らは、抗癌剤、アントラサイクリン、またはビンカアルカロイドなどの親油性イオン性生物活性物質を効率的に閉じ込めることに関する諸問題が、膜貫通イオン勾配によって軽減されることを見出した。摂取を大きくすることとは別に、そのような膜貫通勾配はまた、リポソーム製剤中での抗感染薬の保留を増加させる。
【００９９】
抗感染脂質製剤は、持続的な抗感染効果および低い毒性を有し、投与回数を減らしながら、治療指数を高めることができる。前臨床動物実験、および等しい用量レベルで吸入されたトブラマイシン（非リポソームまたは脂質ベース）との比較試験においては、リポソーム性アミカシンは、投与直後から２４時間後までの間に、肺における薬物濃度が、トブラマイシンのそれの２倍乃至数百倍になることがわかっている。追加的に、リポソーム性アミカシンは、これらのレベルを２４時間良好に保つ。ＣＦ患者のシュードモナス感染を模倣して設計した動物モデルにおいては、リポソーム性アミカシンが、フリーのアミノ配糖体と比較して、有意に動物肺における感染を減らすことがわかっている。
【０１００】
肺の界面活性物質は、呼吸中の肺の拡張および収縮を可能にする。これは、肺を脂質とタンパク質の組み合わせを用いて被覆することに伴って起こるものである。該脂質は、外側へ向いた疎水性鎖をもつ単層として存在する。該脂質は、肺の界面活性物質の８０％を占める。脂質の大半は、ホスファチジルコリンであり、その５０％は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）（Veldhuizen et al, 1998）である。当該界面活性物質たんぱく質（ＳＰ）は、構造を維持するための機能を示し、呼吸中におこる肺の界面活性物質の拡張および収縮を容易にする。もちろん、ＳＰ−ＢおよびＳＰ−Ｃは、特にリポソームを分解する（Hagwood et al., 1998; Johansson, 1998）。この分解の振る舞いは、リポソームを徐々に分解することを容易にするであろう。さらにリポソームはまた、ファゴサイトーシスを介してマクロファージによって直接的に消化されることもある（Couveur et al., 1991; Gonzales-Roth et al., 1991; Swenson et al,
1991）。肺胞マクロファージによるリポソームの取り込みは、薬物が疾患部位に送達される別の手段である。
【０１０１】
吸引用のリポソーム製剤もしくは脂質製剤に用いられる該脂質は、好ましくは、肺の界面活性物質に見出される内因性脂質に共通している。リポソームは、所望の薬剤を閉じ込める二重層からなる。これらは、異なる層のいずれかの脂質、または層間の水性空間に薬剤を閉じ込めた、同心の二重層としてのマルチラメラ小胞によって構成することができる。本発明は、独自のリポソーム性または抗感染脂質製剤を創製する独自の方法を用いる。プロセスおよびこれらのプロセスによって得られる生成物のどちらも本発明に包含される。
【０１０２】
６．１  インライン注入法
ある特に好ましい実施態様において、本発明のリポソーム性抗感染薬製剤は、インライン注入法によって作製される。そこでは、脂質溶液の流れと抗感染薬溶液の流れとを１つの流れに混合する。例えば、２つの溶液を、図８に示すように、先の方がＹ字コネクターになった混合チューブ内のインラインに混合するとよい。このようにインライン注入法は、上記注入法とは異なり、そこでは、脂質溶液は、大量の抗感染薬用液の流れの中に注入される。驚くべきことに、この注入法の結果、脂質対薬物の比率を低くし、閉じ込め効果を高めることができる。該プロセスは、流速、温度、抗感染薬濃度、注入ステップ後の塩添加といったパラメーターを最適化することによって、さらに改良することができる。
【０１０３】
６．１ａ  流速の効果
流速の合計を８００ｍＬ／分に保ちながら、個別の流速を変化させた。そうするために、ポンピングスピードの異なる２つの別々のポンプを用いた。ＮａＣｌの最終濃度が１．５％、エタノールの最終濃度が３０％を超えないようにしながら、ＮａＣｌ溶液の入ったビーカーに、混合溶液を１０秒間注入した。混合後、１ｍＬのアリコートをセファデックス（Sephadex）Ｇ−７５ゲル濾過カラムに通して、閉じ込められたものから遊離アミカシンを分離させた。（視覚混濁度による測定によって）密度の最も高い１ｍＬの画分を回収し、さらに分析した。得られた結果を表１に示す。脂質/アミカシン流速比率が増加した結果、３００／５００ｍＬ／分までほぼＬ/Ｄは一定であった。さらに脂質率を増やしたところ、Ｌ／Ｄは、上昇し、粒径は大きくなり始めた。同時に脂質の流速が大きくなり、脂質の質量を大きくするにつれて、アミカシン回収率（カプセル化効率）が上昇した。
【０１０４】
表１：流速がアミカシンのカプセル化に及ぼす影響*
【表１】
0005415759.tif 000003
【０１０５】
*：脂質およびアミカシン溶液は４０℃に維持した。アミカシン保存溶液は５０ｍｇ／ｍＬとした。注入前にＮａＣｌの１０％溶液を添加し、最終的に１．５％とした。注入時間は、１０秒に設定した。混合チューブを１０ｃｍ、６−エレメントインラインミキサーを０ｃｍのところに位置づけた。
【０１０６】
脂質/アミカシン流速が３００／５００ｍＬ／分のバッチ３は、合理的に高度なアミカシン回収率と合わせて、Ｌ／Ｄおよび粒径が最もよかった。したがって、今後の実験ではすべて、これらの流速を用いることとした。
【０１０７】
選択された条件で、結果を再現するために、よく洗浄したバッチ（バッチ６）を表２に示すように、ダイアフィルトレーションを用いて準備した。１０％ＮａＣｌ溶液を、注入前にビーカーに添加し、（表１のバッチの１．５％と比較して）最終濃度を２％とした。得られたＬ／Ｄ（１．７１）は、表１のバッチ３ほどよくなかったが、粒径は高かった。これは、リポソーム作製の早期にリポソームと接触するＮａＣｌが高いことによる悪影響かもしれない。ゲル濾過カラムを用いて分離した（洗浄した）サンプルは、ダイアフィルトレーションによって洗浄したものに比べて、より良好なＬ／Ｄを持つ傾向にあった。これは、異なる程度の応力でリポソーム、または単に、集団全体ではない良好なＬ／Ｄをもつリポソームの画分を含有するゲル濾過カラム上に分離したサンプルを、処理しなければならないかもしれない。
【０１０８】
表２：よく洗浄したバッチのまとめ。プロセスパラメーターである、温度、アミカシン保存濃度、その他（下の表３を参照されたい）を変化させた。すべてのバッチを、ほぼ最大限に濃縮し、内圧を１０ＰＳＩとした。
【表２】
0005415759.tif 000004

【０１０９】
３番目のカラムは、注入直前の脂質およびアミカシンの温度、および洗浄（ダイアフィルトレーション）中の温度を表す。ＲＴ＝室温。「ＶＯＬサイズ」は、体積加重粒径である。
【０１１０】
表３：バッチ１〜１８のプロセス条件
【表３】
0005415759.tif 000005
【０１１１】
＊脂質およびアミカシン溶液を、３００/５００ｍＬ／分の速度で３０秒間注入した（実施例６乃至１０）、または３０秒間注入した（実施例１１乃至１８）。追加の水性液（ＮａＣｌまたは水）を添加した（５００部のアミカシン体積に対する部）。
【０１１２】
６．１．ｂ  プロセス温度の影響
各種設定は、添加するＮａＣｌ溶液の量を少なくし、最終濃度を１．０％とした以外は、バッチ３と同じとした。注入開始前に溶液を再び添加した。注入時間が短いと、注入中に添加することが難しいからである。さらに、注入中に、インラインミキサーを流れの圧力の下で混合チューブの端に移動させた。ミキサーの位置は、バッチ３では０ｃｍとしていたが、ここではチューブの前端から５ｃｍのところとした。バッチ２０において同じ温度条件（４０／４０℃）で得られたＬ／Ｄ比率が０．５５、すなわち、バッチ３のほぼ半分であったことから、このことは重要かもしれない。異なる注入温度で、アミカシンカプセル化の比較を行ったところ、驚くべきことに、温度が低いほど、Ｌ／Ｄが良好であった。試験した温度のうち、脂質／アミカシン温度３０／３０℃および５０／ＲＴのとき、類似のＬ／Ｄ比率０．３２および０．３７が得られた。また、バッチ１〜５に見られるように、より低いゲル濾過で洗浄したものは、おそらくバッチをダイアフィルトレーションで洗浄した場合よりも低いであろう。
【０１１３】
表４：アミカシンカプセル化に及ぼす温度の影響*
【表４】
0005415759.tif 000006
【０１１４】
*：脂質およびアミカシン溶液は、３００／５００ｍＬ／分で１０秒間注入した。アミカシン保存溶液は５０ｍｇ／ｍＬとした。注入する前にＮａＣｌの１０％溶液を添加し、最終濃度を１．０％とした。混合チューブ１０ｃｍ；６−エレメントインラインミキサーを５ｃｍのところに位置づけた。
【０１１５】
別個の実験において、それぞれ３０℃および３０℃または５０℃および２２℃いずれかの９０％エタノールおよび水を混合したところ、類似の最終温度、約３６℃が得られた。このことは、別個の成分よりむしろ最終的な混合物の温度がアミカシンのカプセル化にとって重要であることを示唆するものである。実施例６〜１５においては、温度を５０℃/ＲＴとした。２つの流れについて温度を３０℃/３０℃とした実施例１６〜１８においては、、アミカシンカプセル化がやや低かったものの、同等の結果が得られた。
【０１１６】
６．１．ｃ  注入後の水性体積の追加の影響
次にＮａＣｌ溶液添加および洗浄プロセスのステップに注目した。プロセスパラメーターは、種々の方向において変化させた。流速３００／５００で注入ステップを行った直後、混合物中のエタノール濃度は、３４％に達する。この濃度においては、アミカシンの安定性は限定されていた（図９参照）。
【０１１７】
５０ｍｇ／ｍＬのアミカシン保存溶液を用いて開始した場合、脂質溶液と混合後、アミカシン合計は、３０ｍｇ／ｍＬを超えるであろう。その場合、少なくとも半分（１５ｍｇ／ｍＬ）は、遊離アミカシンであり、カプセル化効率は５０％であると推測される。これは、３４％エタノールの溶解性より高い。この問題に対する１つの可能な解決策は、脂質／アミカシン混合物の入った容器により多くの水を添加し、エタノールおよびアミカシン双方の濃度を下げることである。例えば、２００部の水（またはＮａＣｌ溶液）を、８００部の脂質／アミカシンに添加すると、エタノールは２７％まで減少するであろう（図９）。これは、温度次第で、アミカシンを１５ｍｇ／ｍＬさらには、それ以上で溶解させるものである。
【０１１８】
さらに、ＮａＣｌを添加させることによって、浸透圧条件を最適化してもよい。リポソームを形成し、アミカシンを内部濃度２００〜３００ｍｇ／ｍＬでカプセル化した場合、カプセル化されなかったのは、わずか〜１５ｍｇ／ｍＬほどのアミカシンだけである。食塩の不存在下では、これは、浸透性の不均衡をもたらし、ひいては、アミカシンの漏れをひきおこすかもしれない。１５０部の１０％ＮａＣｌ乃至８００部の脂質／アミカシンを添加した場合、最終濃度は、約１．５％ＮａＣｌとなるであろう（外部のリポソーム）。
【０１１９】
ＮａＣｌ溶液（またはいくつかのバッチ中の水）を、注入ごとに異なる濃度で添加した（表２および３から編集した表５を参照されたい）。いくつかのバッチを作製した。これらの表から、一般的な傾向が見て取れる。そこから以下のように結論付けた。
【０１２０】
-  Ｌ／Ｄを低くするには（短い混合チューブが必要である場合）、水性ボリュームの注入と添加の間に、ある時間間隔が必要である。バッチ６〜１５では、２０秒以上の間隔があれば、Ｌ/Ｄが低下した。１つの可能な説明は、流れの混合直後には、リポソームは完全には作製されないということである。より長い混合時間を可能にする、長い混合チューブを用いた場合（バッチ１６〜１８）、時間間隔は必要でない。
【０１２１】
-  高濃度のＮａＣｌ溶液を添加して、浸透圧を均衡化させることは、実際、アミカシンを保留する助けとはならない。実際、純水を、適切な時間間隔で添加したところ、Ｌ/Ｄとアミカシン濃度の合計は低かった。
【０１２２】
-  注入後、１００部の１０％ＮａＣｌ（バッチ９）を５分間添加したところ、競合的なＬ／Ｄ比率が得られたが、合計のアミカシン濃度は良好ではなかった。比較的エタノール濃度が高い早期に存在するＮａＣｌは、凝集と粘性を増加させるかもしれない。
【０１２３】
表５：エタノール濃度を調整するために脂質／アミカシン混合物に添加された水性体積とＮａＣｌ濃度の役割。すべての変数を示しているわけではない。図２および３を参照されたい。
【表５】
0005415759.tif 000007
【０１２４】
６．１．ｄ  抗感染薬保存溶液の影響
これまで、５０ｍｇ／ｍＬのアミカシンの保存溶液を用いることで、最もよく閉じ込めを行うことがわかっている。アミカシン保存濃度を４０ｍｇ／ｍＬまで下げると、従来のプロセスにおいて用いられた場合、Ｌ／Ｄが上昇する。２つの流れのインライン注入プロセスによって、エタノール濃度が高いレベルに達することから、現在の５０ｍｇ／ｍＬアミカシンは、最適濃度ではないかもしれない。
【０１２５】
表６は、種々のアミカシン保存濃度を用いることの影響をまとめたものである。４０ｍｇ／ｍＬは、比較的に、または良好なＬ／Ｄ値を示し、さらにアミカシン回収率を向上させた。一定量の脂質に対してアミカシンを少なくし、類似のＬ／Ｄがもたらされ、その結果、カプセル化のパーセンテージがより高くなる（バッチ１２）。さらにアミカシン保存濃度を３０ｍｇ／ｍＬまで下げたところ、回収率は依然著明であったが、Ｌ／Ｄはわずかに上昇しただけであった（バッチ１３）。
【０１２６】
表６：効率を高めながら、アミカシン保存濃度を減少させることができる。アミカシン回収率は、得られたＬ／Ｄに基づいて計算される。脂質の回収率を１００％とする。
【表６】
0005415759.tif 000008
【０１２７】
アミカシン保存濃度を減少させることには、別の意味がある。それは、注入後脂質／アミカシン混合物における遊離アミカシン濃度を減少させ、より高いエタノール濃度で可溶化することができる。脂質およびアミカシンを３００／５００比率で混合すると、アミカシン保存は、５０ｍｇ／ｍＬであり、カプセル化効率は３７％である。その後当初の遊離アミカシンは、２０ｍｇ／ｍＬまでとなる。同様にカプセル化が５２％の４０ｍｇ／ｍＬアミカシン保存液では、遊離アミカシンは、１２ｍｇ／ｍＬまでとなる。カプセル化率が４６％の３０ｍｇ／ｍＬアミカシン保存では、遊離アミカシンは、１０ｍｇ／ｍＬまでとなる。
【０１２８】
７．脂質対薬物の比率
抗感染薬（例えば、アミカシン、トブラマイシン、ゲンタマイシンなどのアミノ配糖体）のリポソームへの閉じ込めを増加させるための方法がいくつかある。１つの方法は、脂質の量あたりの閉じ込めの体積が大きい場合、より大きなリポソーム（＞１μｍ）とすることである。より小さなＬ／Ｄ比率を達成するためのこのアプローチは、リポソームの吸引（噴霧）には適用できない。なぜなら、１）より大きなリポソーム（＞０．５μｍ）が大きな放出をしようとした場合、噴霧中の剪断応力がリポソームをサイズ依存的に破裂させる可能性があるからである。２）肺での良好な蓄積のために必要なより小さな液滴のサイズは、約３μｍまでである。だから、吸引の場合、放出しすぎることを避けるために、リポソームサイズをできるだけ小さくすることが望ましい。現在、ここに開示しているリポソームの平均粒径は、約０．４μｍ未満である（表４を参照されたい）。
【０１２９】
Ｌ／Ｄ比率を小さくするための別のアプローチは、負に帯電した脂質を用いることである。上に挙げたアミノ配糖体は、高度に正に帯電しており、化合物ごとに４〜５のアミンを持つ。通常、これらのアミノ配糖体の表面の塩が治療薬に用いられる。多価陽イオン性の特徴が、負に帯電したリポソームとの強い結合となる。この結果、リポソーム作製中の閉じ込めが大きくなる。抗感染薬製剤の目的は、肺環境での持続的な放出である。リポソームのマクロファージ取り込みによる急速なクリアランスは、これとは相容れない。負に帯電したリポソームが、中性のリポソームよりマクロファージによる取り込みの程度が高いことはこのことをよく説明するものである。いたがって、中性のリポソームを用いることが望ましい。
【０１３０】
小さなリポソームへの薬物閉じ込めを高めることを可能とする１群の技術は、ｐＨ勾配、硫酸アンモニウム勾配、または硫酸マグネシウム勾配を用いてアミン系薬物をリポソームに装填するの勾配装填に基づく。米国特許第５，５７８，３２０号、第５，７３６，１５５号、第５，８３７，２７９号、第５，９２２，３５０号（ｐＨ勾配）；第５，８３７，２８２号、第５，７８５，９８７号（硫酸マグネシウム勾配）；および第５，３１６，７７１号（硫酸アンモニウム勾配）を参照されたい。これらの技術は、膜貫通アミンについてのみ機能する（ドキソルビシンのように中立の形状が透過性である場合はモノアミン）。勾配装填アミノ配糖体のような特定の抗感染薬では、それらが（大きすぎたり、負荷が高すぎたりのため）不透過性であるため、機能しないであろう。
【０１３１】
ここに記載の全てのプロセスは、大規模かつ無菌の製造に容易に適用することができる。最終的なリポソームサイズは、脂質組成物、濃度、付加剤、およびプロセスパラメーターを改善することによって調整することができる。
【０１３２】
本発明のプロセスを用いる脂質対薬物の比率は、約４：１乃至約１：１である。別の実施態様において脂質対薬物の比率は、約３：１乃至約１：１、約２：１乃至約１：１、約１：１未満、約０．７５：１未満、または約０．５：１未満である。さらに、生成物を特定期間、透析した後のフリーの抗感染薬のパーセンテージは減少している。
【０１３３】
８．結果
８．１  肺感染のバイオフィルム障壁
シュードモナス-アエルギノーザなどの感染の疾患の治療にとっての障害である、嚢胞性線維症患者における慢性疾患の主な原因は、上皮細胞上の喀痰／バイオフィルム関門内の薬物調製である（図１）。図１において、ドーナツ形は、リポソーム性抗感染薬製剤を表している。「+」印は、遊離状態の抗感染薬を表し、「−」印は、ムチン、アルギン酸塩およびＤＮＡを表し、太線は、シュードモナス・アエルギノーザを表している。この関門は、アルギン酸塩に埋設した、コロニー化した、またはプランクトン様のシュードモナス・アエルギノーザ、または、細菌からのエキソポリサッカライド、ならびに損傷した白血球からのＤＮＡ、および肺上皮細胞からのムチンからなり、これらは全て正味で負に帯電している（Costerton, et al., 1999）。この負の電荷は、正に帯電した薬物、例えば、アミノ配糖体に結合し、その通過を阻止し、それらが生物学的に影響力を持たないようにしている（Mendelman et al., 1985）。抗感染薬をリポソーム性製剤または脂質製剤に閉じ込めることによって、抗感染薬が、喀痰／バイオフィルムに非特異的な結合をするのを遮断したり、または部分的に遮断したりすることができ、リポソーム性製剤または脂質製剤を（閉じ込めたアミノ配糖体とともに）貫通するようにしている（図１）。
【０１３４】
アミカシンは、細菌性酵素に対して高い耐性を示し、それによって、トブラマイシンやゲンタマイシンを含むアミノ配糖体に認められるものより高いパーセンテージの感受性のある臨床的分離菌を提供する（Price et al., 1976）。特に、Ｐ．アエルギノーザ分離菌は、他のアミノ配糖体よりアミカシンに対してはるかに高い感受性を示しつつ、クロス耐性を示さない（Damaso et al., 1976）。
【０１３５】
リポソーム性のアミカシン製剤の徐放およびデポー効果は、図２より明らかである。この研究では、ラットにトブラマイシンを、気管内投与および静脈内投与によって投与した。該ラットに、同じ用量（ラット１匹あたり４ｍｇ）のリポソーム性のアミカシン製剤を、気管内投与した。データは、リポソーム性のアミカシン製剤を用いた場合のみ、徐放性とデポー効果を達成することを示している。実際、投与の２４時間後、リポソーム性のアミカシン製剤のみ動物の肺において有意な濃度を示していた。一方、トブラマイシン製剤は、無視しうるほどのレベルであり、主に、急速な合成吸収によるものと思われる。リポソーム性抗感染薬製剤による、この１００倍を超えるアミノ配糖体の肺での増加は、現在認可されているＴＯＢＩ（登録商標）製剤（トブラマイシン吸引溶液、Chiron Corporation製、Ameryville, CA）より有意に用いられることが少ない、抗感染薬の徐放性リポソーム製剤の考え方を支持するものである。
【０１３６】
さらに、喀痰／バイオフィルムの存在によって、遊離状態のアミノ配糖体は、抗感染薬がその表面と結合することにより、その貫通が阻害される（図１）。したがって、ＣＦ患者において治療効果を発揮するようにするためには、肺組織のトブラマイシン／グラムを１，０００ｇｍと、過剰に投与する必要がなる。リポソーム性のアミカシン製剤によって克服される。したがって、リポソーム性のアミカシン製剤においては、遊離のトブラマイシンと比較して、より長い時間薬物の治療レベルが維持される。この結合と貫通の促進は、さらにリポソーム性のアミカシン製剤が、通常in vivoで抗菌薬が最低阻害剤濃度以下で存在する場合に発生することがわかっている細菌耐性を有意に減らす手段でもありうる。
【０１３７】
８．２  薬物動態
遊離のトブラマイシンまたはリポソーム性のアミカシン製剤のいずれかを気管内（ＩＴ）投与した後のラットにおいて、アミカシンの薬物動態を測定した。これらのデータを、トブラマイシンを尾の静脈注射した後の肺で得られた分散と比較した。全てのケースにおいて、ラット１匹あたり４ｍｇを投与した。図２から、注射と比較して、ＩＴによるとアミノ配糖体をはるかに多く送達可能であることがわかる。リポソーム性抗感染薬技術のデポー効果はさらに、ＩＴもしくはＩＶで投与されたトブラマイシンと比較した場合、投与の２４時間後に肺に残留するリポソーム性のアミカシン製剤は１００倍であることを示す。したがって、薬物の肺での治療効果は、遊離のトブラマイシンと比較した場合、リポソーム性のアミカシン製剤では長時間持続する。
【０１３８】
ＣＦ患者におけるアミノ配糖体と喀痰との結合が問題である。特に、この結合が抗感染薬の生物活性を減少させる場合に問題である（Hunt et al., 1995）。リポソーム性のアミカシン製剤が長時間生物活性を持続することができるかどうかを測定するために、正常ラットに気管内吸引によってリポソーム性のアミカシン製剤を投与した。これは、気管支肺胞洗浄法（ＢＡＬ）によって２または２４時間後に除去した後に引き続いて行い、生物学的活性を測定した。サンプルを濾過（０．２ミクロン）により濃縮して、混在する肺の微生物を除去した。アミカシン濃度を測定し、Mueller Hintonブロス希釈アッセイ（シュードモナス・アエルギノーザ）を用いて、生物活性を測定した。この結果を表７に示す。
【０１３９】
表７：リポソーム性のアミカシン製剤が生物活性を長時間維持することを示す結果
【表７】
0005415759.tif 000009

【０１４０】
上の表からわかるように、回収した濾過したリポソーム性のアミカシン製剤は、２４時間後でさえ、ＭＩＣ４で、Mueller Hintonブロスアッセイにおいて、Ｐ．アエルギノーザを殺傷可能であった。２時間後、ＭＩＣ＝２が得られた。それは、濾過したリポソーム性／複合体アミカシン保存のために取得したものと類似している。肺において、２４時間後もリポソーム性のアミカシン製剤は依然として活性であった。２４時間後、同じ用量の遊離のトブラマイシンは、ＢＡＬにおいて発見できなかった。このことは、肺においてリポソーム性抗感染薬製剤が維持されているということを示すのみならず、時間をかけて喀痰／バイオフィルムを自由に通過するということも示すものである。これらのデータと、図２および表９（下に示す）に示された事実とを組み合わせて、肺において、抗感染薬の高いレベルを維持しながら、リポソーム性のアミカシン製剤が時間をかけて遊離の抗感染薬を放出することを示している。これは、この系が抗感染薬の持続性効果を長時間発揮するという理論を裏付けるものである。この効果は、シュードモナス属の生物負荷および抗感染薬のレベルを通して耐性を発達させることを減少させる上で重要である。
【０１４１】
リポソーム性アミカシン製剤の放出を遅らせること、およびその抗感染薬の徐放効果がin vitroで証明されているように、該製剤をＰＡＯＩムコイドシュードモナスを含有する慢性の閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の患者からの喀痰中でインキュベートした。該リポソーム性のアミカシン製剤をさらに、ＰＡＯｌムコイドシュードモナス属を含有するアルギン酸塩中でインキュベートした。両方のケースにおいて、表８に示すように、シュードモナス属に対する時間をかけた、持続的かつ増強された殺傷が認められた。
【０１４２】
表８：In vitroでのシュードモナス属の経時的殺傷
【表８】
0005415759.tif 000010

【０１４３】
古典的な殺傷曲線は、リポソーム性抗感染薬製剤の技術には適用することができない。なぜなら、リポソーム製剤は、抗感染薬効果を高めながら、抗感染薬の遅放を示すからである。該リポソーム製剤は、喀痰および／またはアルギン酸塩からアミカシンを、それが放出を行うまで保護する。時間内に、完全な殺傷が観察される。それは、抗感染薬の阻害または不活性化をおこさない抗感染薬の徐放性効果モデルと一致する。
【０１４４】
慢性肺感染症のモデルを用いて、リポソーム性アミカシン製剤の有効性を検討した（Cash et al., 1979）。そこでは、アガロースビーズマトリックスに包埋したＰ．アエルギノーザをラットの気管支に点滴注入した。ＣＦ患者におけるシュードモナス感染に類似した、ムコイドシュードモナス属の動物モデルを開発した。ＣＦと臨床的に相関を成すものとしては、肺の病理学的状態の類似；免疫複合体障害；およびＰ．アエルギノーザ株によるムコイド表現型への変換（CantinとWoods、1999）がある。ラット肺を、ＣＦ患者分離菌から採取した１０７ＣＦＵのムコイドシュードモナス属（株ＰＡＯｌ）で感染させ、次いで、（ａ）フリーのアミノ配糖体、（ｂ）非毒性対照としての脂質賦形剤のみ、および（ｃ）リポソーム性アミカシン製剤を用いて試験した。さらに、まず製剤を、改良したKirby-Bauerプレート上で in vitroでＰ．アエルギノーザを殺傷する能力に基づいてスクリーニングした。
【０１４５】
種々のリポソーム性アミカシン製剤を、異なる脂質組成物または製造パラメーターに基づいて試験した。その結果、in vitro実験において異なる殺傷ゾーンが得られた。この実験は、リポソーム性アミノ配糖体製剤によって得られた有効性が遊離のアミノ配糖体と比較して上昇することを測定するようにデザインされている。ブランク対照脂質組成物、２つの異なるリポソーム性アミカシン製剤、ならびに遊離アミカシンおよび遊離トブラマイシンを、同じアミノ配糖体濃度、リポソーム性抗感染薬製剤として、測定した。さらに、１０倍高い投与量の遊離アミカシンおよび１０倍高い投与量の遊離トブラマイシンも投与した。投与は、ＩＴで７日間毎日行った。結果（図３）は、２つの製剤（脂質組成物において異なる）中のリポソーム性アミカシンは、１０倍高い投与量での遊離アミカシンまたは遊離トブラマイシンよりＣＦＵ濃度を有意に減少させた。図３において、Ｌｉｐ−Ａｎ−１４は、ＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＣ／ＤＯＰＧ（４２：４５：４：９）および１０ｍｇ／ｍＬアミカシンであり、Ｌｉｐ−Ａｎ−１５は、ＤＤＰＣ／Ｃｈｏｌ（１：１）（同じく１０ｍｇ／ｍＬ）である。ＡＵ脂質−脂質および脂質−薬物比率は、ここでは重量−重量で示している。
【０１４６】
次の実験（図４）は、リポソーム性アミカシン製剤が、抗感染薬製剤を遅く、持続的に放出することができることを証明するためにデザインされたものである。前述の実験では、７日間毎日投与を行ったのに対して、本実験では１４日間毎日投与を行った。結果は、２つの製剤（脂質組成物が異なる）中のリポソーム性アミカシンは、遊離アミカシンまたは遊離トブラマイシンと比較して１０〜１００倍力価が高かった（より高いレベルでＣＦＵレベルを減少させた）。毎日のヒト用量は、６００ｍｇのＴＯＢＩ（登録商標）製剤（トブラマイシン吸引溶液、Chiron Corporation製、Ameryville, CA）、または約３７５ｍｇ／ｍ２である。これは、ラット用量の９．４ｍｇに相当する。したがって、該データは、１０〜１００倍増強させたヒトでの有効性に直接的に相関させることができる。２ログ減少がこのモデルにおいて観察され得る最も良好なものであることに留意すべきである。喀痰アッセイにおけるＰ．アエルギノーザにおいて１００倍減少が、改良された肺機能に相当する（Ramsey et al., 1993）。リポソーム性アミカシン製剤のこの徐放によって、フリーのアミノ配糖体を用いた場合に比べて、低い用量および／または低い頻度の投与回数で、細菌の成長をよりよく抑えることができる。
【０１４７】
慢性肺感染症のモデルを用いて、リポソーム性アミカシン製剤の有効性を研究した。そこでは、Ｐ．アエルギノーザを、Sprague/Dawleyラットの気管支に点滴注入したアガロースビーズマトリックスに包埋した。ラットを５匹ずつにグループ分けして、３日後、アミカシンまたはリポソーム性アミカシンを毎日（図３）または１日おき（図４）、１ｍｇ／匹もしくは１０ｍｇ／匹の所与のアミノ配糖体または１ｍｇ／匹のリポソーム性アミカシンを投与した。ならびに、対照としてブランクリポソーム（脂質賦形剤）を投与した。
【０１４８】
実験開始１４日後から、均質化したラット肺（凍結）を分析して、アミノ配糖体含有率および活性を調べた。ＴＤＸ機器を用いて臨床化学アッセイを行い、一方、バシラス・サチリスを包埋した寒天プレート上で阻害ゾーンを測定することによって、バイオアッセイを行った。その結果を表９に示す。
【０１４９】
表９：Ｐ．アエルギノーザ感染ラット肺をリポソーム性アミカシン製剤で治療した結果
【表９】
0005415759.tif 000011

【０１５０】
薬物の重量は、あらゆる塩形態が存在しない場合に正規化された薬物のものである。
【０１５１】
表１０の結果は、アミノ配糖体が存在し、リポソーム性抗感染薬製剤に活性を持つが、一方、フリーのアミノ配糖体では、たとえ用量が１０倍であっても、あまり検出できないことを示す。これらのさらなる結果は、リポソーム性抗感染薬製剤の標準的な放出特性を示し、また残留する抗感染薬が未だに活性を有していることを示している。上記製剤の中で、遊離トブラマイシン（０．１マイクログラム／ｍＬ）のみが、腎臓での検出可能なアミノ配糖体を示していた。
【０１５２】
リポソーム性アミカシン製剤の徐放およびデポー効果を図５においてさらに証明する。ラットを慢性肺感染症にする。そこでは、有効性の研究において用いられたものと同じビーズを用いて、気管支に浸透させたＰ．アエルギノーザをアガロースビーズマトリックスに包埋した。次いでそのラットに遊離トブラマイシンまたはリポソーム性アミカシン（製剤Ｌｉｐ−Ａｎ−１４）を気管内投与によって、同じ投与量（ラットあたり２ｍｇ）投与した。抗生物質（マイクログラム）／肺組織（グラム）を経時的に測定した該データから、リポソーム性抗感染薬は徐放およびデポー効果を発揮するが、一方遊離トブラマイシンでは、２４時間後の肺においては無視しうるほどのレベルしかないことがわかる。これは主に急速な系吸収によるものであると思われる。リポソーム性アミカシン製剤の、感染ラット肺における抗感染薬のこの１００倍を超えるアミノ配糖体の肺での増加は、現在認可されているＴＯＢＩ（登録商標）製剤（トブラマイシン吸引溶液、Chiron Corporation製、Ameryville, CA）より有意に用いられることが少ない、抗感染薬の徐放性リポソーム製剤の考え方を支持するものである。
【０１５３】
遊離トブラマイシンまたはリポソーム性のアミカシン製剤のいずれかを気管内（ＩＴ）投与した後のラットにおいてアミカシンの薬物動態を測定した。ラットあたり２ｍｇの用量を投与した。リポソーム性抗感染薬技術のデポー効果は、遊離トブラマイシンをＩＴ投与した場合に比べて、リポソーム性アミカシンの１００倍を超える薬物の増加が、投与の２４時間後も依然として感染肺に残留していた。したがって、リポソーム製剤での薬物の治療レベルは、遊離トブラマイシンと比べて、維持されていた。
【０１５４】
図７は、著明な残留時間、および有効量の抗感染薬の肺での蓄積の結果を示すものである。比較的頻度の少ない用量を確立する結果を用いることができる。各投与は、４時間、１５ｍｇ／ｍＬアミカシンでリポソーム性アミカシン製剤噴霧剤（ＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ．、１：１）の吸引（ラットを上記のように３匹ずつのグループに分けた）で行った。投与は、１日目；１，３および５日目；または１、２、３、４、５日目に行った。データバーのそれぞれの投与後、所与のデータバーを示したラットを屠殺した。実施例に示したように製剤を行った。
【０１５５】
類似の抗感染薬を用いることができる。肺の炭疽病や野兎病のような細胞内感染の治療に用いることができる。肺の炭疽病において、該炭疽病の胞子は、エーロゾル剤の気胞に達する。吸入された胞子は、気胞中の肺のマクロファージによって注入され、気管支の気管領域のリンパ節または縦隔のリンパ節に、リンパ管を介して運ばれる（Pile et al., 1998; Gleiser et al., 1968）。該マクロファージは、感染経路の中心に存在し、全身性の（吸引）炭疽病におけるホストの自己破壊の主な原因となっている。徐放および標的化というそれがもつ属性に加えて、リポソーム性抗感染薬製剤技術は、薬物標的化と送達において細胞の取り込みを高め、肺胞マクロファージと肺上皮細胞を用いることができる。これらの特徴を持つことは、これらの、肺でおこり、マクロファージによって輸送される細胞内感染を促進する。より重要なことは、これらの特徴は、抗感染薬をより有効なものとするはずであるということである。リポソーム性抗感染薬が、疾患を含有するまさにその細胞によって食作用を受けるはずである。該抗感染薬は、標的化されて細胞内に放出され、それによって、散剤する前に感染を攻撃することができるであろう。カプセル化された薬物は、既に認可されている製剤シプロフロキサシン、テトラサイクリン、エリスロマイシン（原語：erthyromycin）またはアミカシンであってよい。リポソーム性シプロフロキサシン製剤が開発された。 
【０１５６】
この研究においては、この化合物をマウスに投与し、遊離のシプロフロキサシンを気管内投与したものと、遊離のシプロフロキサシンを経口投与したものを比較した。３つの場合すべてで、同じ用量を投与した（図６）。マウスを３群に分け、各マウスの用量を１５ｍｇ／ｋｇとした。リポソーム性シプロフロキサシンは、ＤＰＰＣ／コレステロール（９：１）、３ｍｇ／ｍＬのシプロフロキサシンで、実施例に示したようにして作製された製剤として存在している。脂質対薬物の比率は、重量比で１２．５：１とした。経口投与のシプロフロキサシンと比較した場合、リポソーム性シプロフロキサシンは、遊離のシプロフロキサシンより２オーダーの大きさ以上の量で肺に存在していた。さらに、リポソーム性シプロフロキサシンのみが、２４時間後の肺において濃度を示した。一方、経口投与薬物は、２時間未満で検出できなくなった。このデータは、リポソーム性シプロフロキサシン製剤や、アミノ配糖体、テトラサイクリンおよびマクロライドなどの他の抗感染薬を、バイオテロリストによる細胞内疾患の治療および予防的阻止での使用を支持するものである。
【０１５７】
８．３  リポソームパラメーター
適用する脂質をエタノールに溶解し、脂質−エタノール溶液を作製する。該脂質−エタノール溶液を、閉じ込められた生物活性物質の分子を含有する水溶性またはエタノール性溶液中に注入する。該脂質は、自発的に小胞を形成する。
【０１５８】
表１０は、リポソーム性抗感染薬製剤パラメーターを開示している。
【０１５９】
表１０：追加的リポソーム性抗感染薬製剤のパラメーター
【表１０】
0005415759.tif 000012
【０１６０】
＊：ＤＰＰＣ／コレステロールのモル比率が約１：１である、ＤＰＰＣ／コレステロールリポソーム
＊＊：Ｌ/Ｄの計算においては、閉じ込められたアミカシンの量のみを考慮した。
【０１６１】
リポソーム性抗感染薬製剤の作製に関するさらなる情報については、ＰＣＴ国際公開公報第ＰＣＴ／ＵＳ０３／０６８４７号（２００３年３月５日出願）を参照されたい。その全てを引用によって明細書中に援用する。
【０１６２】
閉じ込め量は、リポソーム製剤の基本的な特徴であり、脂質の単位あたりのリポソーム内水性相として測定される。それは通常、μリットル／μモルの単位で表される。リポソームが形成されるとき、リポソーム内の溶質の濃度は、大量の溶液の外部と等しい。閉じ込められた体積が大きいと、薬物／脂質比率、すなわち、最終的な製剤における全体の薬物濃度が高くなる。
【０１６３】
しかしながら、リポソーム性アミカシンの製剤においては、製剤することができる実際の薬物/脂質比率は、閉じ込められた体積に基づいて予測したものより３倍以上高い。表１１は、抗感染脂質製剤の４つの異なるサンプル製剤の結果を示している（例えば、実施例のセクションの実施例２）。
【０１６４】
表１１：異なる方法で調製されたリポソームへのアミカシンの装填
【表１１】
0005415759.tif 000013

【０１６５】
サンプル１および２は、本明細書に記載のエタノール注入によって作製した。サンプル３および４は、当業で公知のリポソーム製剤技術によって作製した。
【０１６６】
ＴＤｘアナライザー上に設定されたINNOFLUO Seradyn 試薬を用いた免疫蛍光アッセイによって、アミカシンの濃度を測定した。Ｃ−８カラムと光散乱デテクターを用いた逆相ＨＰＬＣによって脂質を測定した。
【０１６７】
サンプル＃１〜３におけるリポソームの体積（合計体積の単位あたりのリポソームが占める体積の割合）を、合計体積中、およびCentriSart濾過装置で遠心分離して得た濾過物の体積中の、蛍光プローブ（スルホロダミン１０１またはカルボキシフルオレセイン）の濃度を測定することによって測定した。濾過物中のプローブ濃度は、リポソームが占める体積からのプローブの押し出しにより、平均より高かった。
【０１６８】
サンプル＃４においては、リポソームの体積は、固定量を添加した後にサンプル中のカリウムイオンを測定することによって測定した。１０ｍＬリポソーム懸濁液（Ｖ０）中に２５０μｌのＫＣｌ（Ｖａｄｄ）を入れる。その後、サンプルを４０００ｒｐｍで３０分遠心分離し、上清を取り出し、カリウムイオン（Ｋ）をCole-Parmer カリウム感受性電極によって測定した。測定したカリウム濃度は、リポソームが占める体積からのプローブの押し出しにより、予想していたよりも通常高かった。対照においては、等しい用量のＫＣｌを、１０ｍＬの食塩水に添加した。対照におけるカリウム濃度Ｋｃを測定した。水溶性体積およびリポソーム性体積は、以下の式により推定される。
【０１６９】
【数１】
0005415759.tif 000014
【０１７０】
リポソームの体積と脂質の濃度を知ることによって、下記数式２で表される、閉じ込められた体積を測定することができる。
【数２】
0005415759.tif 000015
【０１７１】
但し、式中、ＬｗおよびＬｍは、重量および脂質のモル濃度をそれぞれ表す。脂質密度は、１ｍｇ/ｍＬに近似していると仮定される。
【０１７２】
その結果、サンプルが持つであろう予測される脂質/薬物比率は、薬物がリポソーム内部および外部の水性のスペース理想的に分散されているとすれば、下記数式３によって推定することができる。
【数３】
0005415759.tif 000016

【０１７３】
但し、式中、Ｄｏは、リポソーム作製中の製薬物のバルク濃度を表し、ＭＬは、脂質の平均のモル重量を表す。
【０１７４】
サンプル＃１および＃２（１．８および１．９）の実際のＬ/Ｄは、アミカシン（５．６および６．０）がさらに分散している場合から予測されるものよりかなり低い。一方、例えば、サンプル＃３および＃４のＬ/Ｄは、理論値に近い。
【０１７５】
ゲンタマイシンサルフェートが抗感染薬である抗感染脂質製剤の２つのサンプル製剤で同様の比較を行った（実施例のセクションの実施例３を参照）。表１２のデータは、本明細書に示されたデータによれば、当該方法がゲンタマイシンの予期せぬ高い閉じ込めを提供することを示している。サンプル＃５および＃６において、実際の脂質／薬物比率は、予測される理論値のほぼ２倍である。
【０１７６】
表１２：異なる方法で調製されたリポソームへのゲンタマイシンの装填
【表１２】
0005415759.tif 000017
【０１７７】
８．４  Ｐ．アエルギノーザ感染により媒介される薬物放出
感染の近隣での活性形態の薬物の放出は、本発明のリポソーム性の薬物の活性の局面において重要である。そのような標的化された放出の可能性は、ＣＦ患者からの喀痰とともにインキュベートしたときの薬物の放出、Ｐ．アエルギノーザとともにプレインキュベートしたときのラット肺での薬物の放出、ならびにＰ．アエルギノーザの培養に対する活性をモニターすることによって、試験した。
【０１７８】
Ｐ．アエルギノーザの培養物を本発明のリポソーム性アミカシン製剤とともに直接的にインキュベートすることによるアミカシンの放出は、先に述べた。この現象をさらに調べるために、リポソーム性アミカシン製剤を、Ｐ．アエルギノーザ感染した嚢胞性線維症患者からの喀痰試料とともにインキュベートした。吐き出された痰をウシDNase Iおよびアルギン酸塩リアーゼを用いて、３７℃で２時間液状化した。リポソーム性アミカシン製剤または可溶性アミカシン（１ｍｇ／ｍＬのアミカシン）を、液状化した痰または対照と、１：１で混合し、穏やかに振りながら、３７℃でインキュベートした。アリコートを分析して、Abbott TDx Analyzerを用いてアミカシン濃度を調べた。インタクトのリポソームを、界面活性剤である１％Triton X-IOOを用いて、サンプルごとの分離したアリコート中で溶解させた。各サンプルからの上清を用いて分析した。こうした条件のもとでは、４８時間かけて（８０〜９０％の）アミカシンが脂質組成物から時間依存的に放出された。このことは、薬物放出が、ＣＦ肺の感染部位において起こることかもしれないことを示すものである。
【０１７９】
リポソームからの遊離の薬物のin vivoでの放出を、Ｐ．アエルギノーザ（ラット１匹あたり３．５×１０４ＣＦＵ）を含有する寒天ビーズを用いて浸透させたラットのものと、そうでないものとで比較した。ビーズ浸透の３日後、ラットに本発明のリポソーム性アミカシン製剤（１日用量、約６ｍｇ／ｋｇ）を毎日吸引させた（非細菌群）。または１４日間、１日おきに吸引させた（ビーズ浸透群）。最終治療の２４時間後、合計アミカシンおよび遊離アミカシンを上記のようにして測定した。細菌を投与されたラットにおいては、検出されたアミカシンの平均約５０〜７０％は、フリーの形態であった。すなわち、リポソームから放出されていた。細菌を投与されていないラットにおいては、検出された薬物の２０〜２５％が遊離形態であった。これらのデータは、リポソームからの遊離アミカシンの放出がin vivoでのＰ．アエルギノーザの存在によって媒介されるかもしれないことを強く示唆するものである。
【０１８０】
遊離形態の構成物質が数時間のタイムスケールで取り除かれることが既に証明されている、肺での薬物動態に類似した条件下で、放出および活性のin vitroでの試験を行った。遊離アミカシンまたはリポソーム性アミカシン製剤を、０．５ｍＬの無菌Slide-A-Lyzerカートリッジ中Ｐ．アエルギノーザＰＡ０１（〜１０８／ｍＬ）を用いて、薬物の濃度を変化させながら、インキュベートした。フリーの薬物は、こうした条件下で数時間のタイムスケールでカートリッジを透析する。２４時間後、該サンプルをカートリッジから取り除き、播種し、ＣＦＵを測定した。予備実験においては、遊離アミカシンのみが、これらのサンプルのＣＦＵをわずかに減少させた。一方、同じアミカシン濃度（５０μｇ／ｍＬ）で脂質組成物を含むアミカシンでは、ＣＦＵの２対数減少が観察された。これらのデータから、アミカシンは実際には、細菌の存在下で放出されること、そして、その徐放によって薬物をより効果的に使用することができることを示唆している。
【０１８１】
本発明のリポソーム性アミカシン製剤とＰ．アエルギノーザまたはその毒性ファクターとの相互作用によって、感染部位に向かって放出することが可能なアミカシンが放出される。アミカシンが放出されるとき、それはＰ．アエルギノーザに対して活性を示し、細菌の近くでの徐放は、非特異的な分散および急速なクリアランスに対して利点を持つかもしれない。
【０１８２】
８．５．  吸入されたリポソーム性薬物製剤が肺胞マクロファージの機能に及ぼす影響
ある実施態様においては、本発明のリポソーム性アミカシン製剤は、嚢胞性線維症患者の慢性Ｐ．アエルギノーザ感染を治療するために製剤されたナノスケール（２００〜３００ｎｍ）のリポソームカプセル化形態のアミカシンである。吸引に際しては、肺でアミカシンが持続的に放出されることが好ましい。なぜなら、肺胞マクロファージは、このサイズ範囲で積極的に粒子を取り込むことが知られており、リポソーム製剤がこれらの細胞に及ぼす影響は、特に興味深い。洗浄法によって取得したラット肺胞マクロファージの基本的かつ刺激的な機能を、リポソーム性アミカシン製剤を投与して、および投与せずに研究し、種々の対照と比較した。
【０１８３】
リポソーム性アミカシン製剤、アミカシン、プラセボリポソームおよび食塩水のエアロゾールを、PARI
LC Star 噴霧器を用いて生成し、ＣＤ（登録商標）ＩＧＳ雌ラットに鼻のみの吸引チャンバーで吸引させた。吸引治療を４時間ずつ１４日間連続して行った結果、合計脂質の１日の肺の投与量は、リポソーム性アミカシン群で約１２ｍｇ／ｋｇ、プラセボリポソーム群で１１ｍｇ／ｋｇであった。１５日目に半数のラットを安楽死させた。残りのラットは、４３日目に安楽死させた。各ラットから気管支の肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を回収し、続く窒素酸化物（硝酸塩の合計によって表す）および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）のアッセイを行うために−８０℃で保存した。ＢＡＬＦからの細胞を遠心分離によって回収し、計測し、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）を用いて、または用いてないで２４時間培養した。これらの培養物からの上清を遠心分離によって回収し、窒素酸化物およびＴＮＦ−αがあるかどうか調べた。オプソニン化した蛍光ミクロスフェａ（０．２μｍ、２（１０９）／ｍＬ）の一晩の取り込みを測定することによって、ＢＡＬマクロファージ（（１０６）／ｍＬ）の食細胞を調べた。
【０１８４】
リポソーム性アミカシン製剤、空のリポソーム、可溶性アミカシン、または食塩水の１４日間連続の吸引では、対照とは有意に異なる、ＢＡＬＦ中の窒素酸化物（硝酸塩）およびＴＮＦ−αの濃度によって示されているように、ラット肺において有意な急性もしくは遅延性炎症反応は起こらなかったが、吸入剤を投与された全ての群において早期に高いＮＯレベルに向かう傾向があった。細胞の合計回収率は、吸入剤を投与された全ての群のより多くの多形核白血球へ向かう早期の傾向を持つ全ての群で有意差が認められた。ラット肺胞マクロファージは、上記試験粒子のエアロゾールに曝露後、リポソームを吸引した群では、１５日目に拡大したように見えたことにもかかわらず、正常の機能を果たした。研究の１５日目もしくは４３日目に培地で肺胞マクロファージ培養して、検出された硝酸塩およびＴＮＦ−αの濃度は、対照とは有意に異なっていた。ＬＰＳで刺激したとき、マクロファージは正常に反応し、窒素酸化物（２０−４０ｎｍｏｌ／１０６細胞）およびＴＮＦ−α（５−２０ｎｇ／１０６細胞）の実質的な濃度を生じさせた。未処置の対照と比較して傾向ビーズの同一の取り込みからわかるように、これらのマクロファージはさらに、正常の食細胞機能を果たした。
【０１８５】
リポソーム性アミカシン製剤の１４日間連続の吸引では、オプソニン化されたビーズの食作用に関しては、肺胞マクロファージの機能、炎症性媒介物質であるＴＮＦおよびＮＯに実質的な影響を及ぼさなかった。
【０１８６】
９．投与量
本発明の組成物の投与量は、患者の徴候、年齢および体重、治療もしくは予防すべき障害の性質および重篤度、投与経路、ならびに対象組成物の形態によって変わる。対象となる製剤は全て、単回投与でもよいし、分けて投与してもよい。本発明の組成物の投与は、当業で公知の技術または本明細書において教示している技術によって容易に決定すればよい。
【０１８７】
いくつかの実施態様において、対象となる化合物の投与量は、一般的に、体重１ｋｇあたり約０．０１ｎｇ乃至約１０ｇの範囲、特に、体重１ｋｇあたり約１ｎｇ乃至約０．１ｇの範囲、さらに特に、体重１ｋｇあたり約１００ｎｇ乃至約５０ｍｇの範囲である。
【０１８８】
有効な投与量または量、および製剤の投与のタイミングにおよぼす可能なあらゆる影響を、本発明の特定の組成物について確認しておく必要がある。これは本明細書に記載の、１群以上の動物（好ましくは、各群少なくとも５例）を用いたルーチンの実験、または適切であればヒトの治験によって成されうる。対象となる全ての組成物および治療もしくは予防方法の有効性は、組成物を投与し、１以上の適用可能なインデックスを測定し、これらのインデックスの治療後の値と治療前の同じインデックスを比較することによって、投与の効果を評価すればよい。
【０１８９】
所与の患者における最も効果的な治療をもたらす特定の組成物の正確な投与時間および量は、対象となる組成物の活性、薬物動態およびバイオアベイラビリティー、患者の生理的状態（年齢、性別、疾患の種類および病期、一般的な身体状態、所与の投与に対する応答性、治療の種類を含む）、投与経路などに依存するであろう。本明細書に提示したガイドラインを用いて治療を最適化すればよい。例えば、最適投与時間および／または投与量の決定をすればよい。それに必要なことは、被験者をモニターし、投与量および／またはタイミングを調整するだけのルーチンの実験に過ぎない。
【０１９０】
被験者を治療しながら、治療期間の特定の時間に１以上の関連するインデックスを測定することによって、該患者の健康状態をモニターすることができる。組成物、量、投与時間および製剤を含めた治療は、そのようなモニターによって最適化することができる。該患者を、周期的に再検査し、同じパラメーターを測定することによって改善の程度を決定してもよい。対象となる組成物の量、そしておそらく投与時間の調整は、これらの再検査に基づいて行えばよい。
【０１９１】
治療は、該化合物の最適投与量未満の少量の投与量から始めるとよい。その後、最適な治療効果が得られるまで、少しずつ投与量を増やすとよい。
【０１９２】
異なる作用物質の効果の開始および持続性が補い合う（原語：complimentary）ため、対象組成物を使用することによって、組成物（例えば、抗感染薬）中に含有される個別の作用物質はいずれも、その必要投与量を減少させることができる。
【０１９３】
対象組成物の毒性および有効性は、細胞培養もしくは実験動物において、標準的な薬学的処置によって決定すればよい（例えば、ＬＤ５０およびＥＤ５０の測定）。
【０１９４】
細胞培養アッセイおよび動物実験から得たデータを用いて、ヒトでの使用に関する投与範囲を公式化できる。対象組成物の全ては、毒性が殆どないＥＤ５０をもつ循環濃度内にあることが好ましい。該投与量は、採用される投与形態および用いられる投与経路に基づいて、この範囲内で変わるであろう。本発明の組成物にとっての治療的有効投与量は、細胞培養アッセイにおいてまず推定すればよい。
【０１９５】
１０．製剤
本発明の抗感染脂質製剤は、リポソームの水性分散液を含んでもよい。該製剤は、脂質添加剤を含有し、リポソームおよび塩／緩衝剤を形成して、適切な浸透圧およびｐＨを提供することもできる。該製剤は、薬学的添加剤を含んでもよい。薬学的添加剤は、いずれかの対象の組成物またはその成分の、ある器官または身体部分から別の器官または身体部分への運搬または輸送に関与する、流体、希釈液、溶媒、またはカプセル化剤であることができる。各添加剤は、対象組成物およびその成分と相溶性があるという意味において、「許容可能」でなければならず、患者にとって有害であってはならない。好適な添加剤としては、トレハロース、ラフィノース、マンニトール、スクロース、ロイシン、トリロイシン、および塩化カルシウムがある。他の好適な添加剤の例には：（１）乳糖、ブドウ糖およびショ糖などの糖類；（２）コーンスターチおよびいもでんぷんなどのでんぷん；（３）セルロースおよび、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのその誘導体；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）ココアバターおよび座薬用ろうなどの添加物；（９）ピーナッツ油、綿実油、紅花油、ごま油、オリーブ油、コーン油および大豆油などの油類；（１０）プロピレングリコールなどのグリコール；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール；（１２）オレイン酸エチルおよびラウリル酸エチルなどのエステル；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）無発熱源水；（１７）等張生理食塩水；（１８）リンガー液；（１９）エチルアルコール；（２０）リン酸緩衝液；および（２１）薬剤処方に用いられる他の無毒性の適合性物質、がある。
【実施例１】
【０１９６】
以下は、１５０ｍＬのリポソーム製／複合アミカシンの製造についての詳細な説明である。
当初の合計体積＝１．５Ｌ
エタノール成分＝２３．５％（ｖ／ｖ）
脂質組成物：ＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ（１：１モル比）
当初［脂質］＝７．６ｍｇ／ｍＬ
当初［アミカシンスルフェート］＝５７．３ｍｇ／ｍＬ
最終生成物体積＝１５０ｍＬ
【０１９７】
Ｉ）化合および注入
７．４７ｇのＤＰＰＣおよび３．９３ｇのコレステロールを、５０Ｃ水浴中３５２．５ｍＬのエタノールに直接溶解した。８５．９５ｇのアミカシンスルフェートを１１４７．５ｍＬのＰＢＳ緩衝剤中に直接溶解した。次いで該溶液を、ＩＯＮ
ＮａＯＨまたはＫＯＨを用いて滴定し、ｐＨを約６．８とした。
【０１９８】
３５２．５ｍＬのエタノール／脂質を、１１４７．５ｍＬのアミカシン／緩衝剤に添加または注入し、当初体積の合計を１．５Ｌとした。該エタノール／脂質を＠−３０ｍＵｍｉｎ（注入率ともいう）でアミカシン／緩衝剤中に、ぜん動ポンプを用いてポンピングし、それを攪拌プレート上の反応容器中で１５０ＲＰＭで、室温で高速撹拌した。
【０１９９】
生成物を室温で２０〜３０分間撹拌した。
【０２００】
ＩＩ）ダイアフィルトレーションまたは「洗浄」ステップ
混合容器をぜん動ポンプおよびダイアフィルトレーションカートリッジに引っ掛けた。該ダイアフィルトレーションカートリッジは、分子量の遮断が５００キロダルトンの中空膜ファイバーである。該生成物を反応容器からダイアフィルトレーションカートリッジを介してポンピングし、室温で混合容器に戻した。カートリッジを介して約７ｐｓｉの逆圧が生じる。リポソーム性のアミカシン（生成物）を残しながら、遊離アミカシンおよびエタノールを、逆圧によって中空ファイバー膜に通した。該生成物を室温で８回洗浄した。浸透除去を補填し、一定の生成物の体積を維持するために、新鮮なＰＢＳ緩衝剤を（別のぜん動ポンプを介して）反応容器に添加した。該生成物を濃縮した。
【実施例２】
【０２０１】
リポソーム性のアミカシンの高い捕捉。以下の手順に従って、脂質と抗感染薬の濃度を様々に変えて、抗感染脂質製剤の４つのサンプルを準備した。
【０２０２】
サンプル＃１。アミカシンスルフェート１．７２ｋｇを２３リットルの食塩水溶液に溶解し（０．９％ＮａＣｌ）、必要量のＮａＯＨを加えてｐＨを６．５に調整した。脂質−９８．２ｇのＤＰＰＣおよび５１．８ｇのコレステロールを７リットルのエタノールに溶解した。脂質溶液をアミカシン溶液に注入し（〜６００ｍＬ／分）、一定に撹拌しながらリポソームを形成した。次いで得られた懸濁液を洗浄して、エタノールおよび捕捉されていないアミカシンを、Amersham Hollow Fiber カートリッジ（ポアサイズ＝５００ｋＤ）を用いたダイアフィルトレーションによって除去した。該懸濁液を最終体積が〜３．５Ｌとなるように濃縮した。
【０２０３】
サンプル＃２。全ての物質の量を１００分の１として、サンプル１と同様の処置を行った。アミカシンスルフェート１７．２ｇを２３０ミリリットルの食塩水溶液に溶解し（０．９％ＮａＣｌ）、必要量のＮａＯＨを加えてｐＨを６．６に調整した。脂質−０．９８２ｇのＤＰＰＣおよび０．５１８ｇのコレステロールを７０ミリリットルのエタノールに溶解した。脂質溶液を〜３００ｍＬ／分の速度でアミカシン溶液に注入し、一定に撹拌しながらリポソームを形成した。次いで得られた懸濁液を洗浄して、エタノールおよび捕捉されていないアミカシンを、Amersham Hollow Fiber カートリッジを用いたダイアフィルトレーションによって除去した。該懸濁液を最終体積が〜３５ｍＬとなるように濃縮した。
【０２０４】
サンプル＃３。ＳＰＬＶとして知られている処置によってリポソームを形成した。アミカシンスルフェート１．４ｇを２０ｍＬの食塩水溶液に溶解し（０．９％ＮａＣｌ）、ｐＨを３．３とした。脂質−０．６６６ｇのＤＰＰＣおよび０．３３３ｇのコレステロールを４０ｍＬのジクロロメタンに溶解した。アミカシンおよび脂質の溶液を５００ｍＬの丸底フラスコ内で混合し、手短に超音波処理し、エマルションを形成した。次いで、フラスコをBUCHI Rotavaporシステムに結合し、低真空下（−５インチＨｇ）で、５０℃でジクロロメタンを除去し、アミカシン−脂質混合物がゲル状になるまで一定に回転させた。該ゲルが徐々に崩壊すると、真空度が−２０インチＨｇまで徐々に上昇した。３０分より長い間乾燥を続けた。得られたリポソーム性の懸濁液の最終体積は２２ｍＬとなった。
【０２０５】
サンプル＃４。サンプル＃３と同様の処置を行った。アミカシンスルフェート１．３ｇを２０ミリリットルの食塩水溶液に溶解し、ＮａＯＨを加えてｐＨを６．５に調整した。脂質、０．５８３ｇのＤＰＰＣおよび０．２９１ｇのコレステロールを３５ミリリットルのジクロロメタンに溶解した。超音波処理は行わなかった。Rotavaporシステム上での除去ステップは、４０℃で２時間行った。最終体積は２０ｍＬであった。
【実施例３】
【０２０６】
リポソーム性のゲンタマイシンの高捕捉率
サンプル＃５。ゲンタマイシンスルフェート２０．０ｇを２３０ｍＬの食塩水溶液に溶解し（０．９％ＮａＣｌ）、必要量の硫酸を加えてｐＨを６．５に調整した。脂質−０．９８２ｇのＤＰＰＣおよび０．５１８ｇのコレステロールを７０ｍＬのエタノールに溶解した。脂質溶液をゲンタマイシン溶液に注入し（〜５００ｍＬ／分）、一定に撹拌しながらリポソームを形成した。捕捉されていないアミカシンおよびエタノールを、Amersham Hollow Fiber カートリッジを用いたダイアフィルトレーションによって除去した。該懸濁液を最終体積が〜３５ｍＬとなるように濃縮した。
【０２０７】
サンプル＃６。ゲンタマイシンスルフェート１７．０ｇを、２３０ｍＬのＮａ２ＳＯ４の１００ｍＭ溶液中に溶解し、必要量のＨ２ＳＯ４を加えてｐＨを６．５に調整したこと、ならびに脂質−０．９８２ｇのＤＰＰＣおよび０．５１８ｇのコレステロールを７５ｍＬのエタノールに溶解したこと以外はサンプル＃５の処置と同様の処置を行った。
【実施例４】
【０２０８】
他の塩形態のアミカシンの捕捉
サンプル＃７。実施例２のサンプル＃２と同様の処置を行った。アミカシン塩基１０．７ｇおよびクエン酸４．２ｇを２３０ｍＬの食塩水溶液に溶解し（０．９％ＮａＣｌ）、得られたアミカシン−クエン酸塩溶液のｐＨを６．２に調整した。脂質−０．９８２ｇのＤＰＰＣおよび０．５１８ｇのコレステロールを７０ミリリットルのエタノールに溶解した。脂質溶液を〜５００ｍｌ／分の速度でアミカシン溶液に注入し、一定に撹拌しながらリポソームを形成した。捕捉されていないアミカシンおよびエタノールをAmersham Hollow Fiber カートリッジを用いたダイアフィルトレーションによって除去した。該懸濁液を最終体積が〜３５ｍＬとなるように濃縮した。
【０２０９】
実際の脂質／薬物比率は、サンプル＃２と同様にしたところ、ここでも予測より低かった（薬物捕捉が予測より高かった）。サンプル＃７の捕捉された体積がわずか１．５であったこと（尚、サンプル＃２は２．５であった）を考慮すると、予測された／実際のＬ／Ｄ比率は、５．２と高かった。したがって、アミカシンスルフェートのようなリポソーム性のアミカシンクエン酸塩も高い捕捉率で製剤することができる。
【０２１０】
表１３：サンプル５〜７のパラメーターのまとめ
【表１３】
0005415759.tif 000018
【実施例５】
【０２１１】
ラットにおける、吸入されたリポソーム性アミカシン製剤のアミカシンのバイオアベイラビリティー
ラットで吸引後のリポソームからのアミカシンの放出速度を測定し、吸入された可溶性アミカシンと比較した。
【０２１２】
試験品を鼻専用吸引チャンバーに取り付けられたPari LC Star噴霧器を介して噴霧状にした。ＣＤ（登録商標）ＩＧＳラットに、肺に蓄積されると推定される用量の、６ｍｇ／ｋｇのリポソーム製剤の形態のアミカシン、または５ｍｇ／ｋｇの可溶性アミカシンを単回投与または１４日間連続投与で投与した。肺または他の組織を、ポリトロン装置を用いてホモジナイズした。単回投与治療後、複数回投与の１日目および２８日目の、異なる時点で肺ホモジネートを分析することによって、肺からのアミカシンのクリアランスのカイネティクスを調べた。リポソームからアミカシンを放出する１％Triton X-IOOの存在下または不存在下で、アミカシンレベルをAbbott TDx（登録商標）アナライザー上で蛍光抗体法の偏光によって測定した。超音波処理を行う前に全肺サンプルをリポソームでスパイクし、これらの条件下でのアミカシンの放出を調べた。遊離アミカシンおよび合計アミカシンを１％Triton X-IOOを用いて、および用いずに測定し、薬物の漏出を調べた。
【０２１３】
全肺サンプルにスパイクしたリポソーム性のアミカシンは、界面活性剤の不存在下ではPolytronホモジナイザーを用いた組織超音波処理の結果としての有意なアミカシンの放出を示さなかった。
しかしながら、ｌ％のTriton X-100を添加することで、全ての期待された薬物が回収された。したがって、アミカシン（および界面活性剤）の合計レベルと、肺組織において自由に入手可能なレベルとを直接的に比較することができるであろう。
【０２１４】
６ｍｇ／ｋｇのリポソーム性アミカシンの単回投与直後に、高い合計濃度のアミカシン（肺組織の約５００〜６００μｇ／ｇ）が認められた。それは、７日以上かけてゆっくりと約５０％低下した。これらのリポソームからの遊離アミカシンの放出の時間的プロファイルは、おそらく噴霧化の結果遊離したアミカシンからの遊離薬物の高い当初濃度を示した。この段階の後、約２４時間で最下点を示し、その後上昇し、投与後９６時間で２７９μｇ／ｇの最高点に達した。７日間の実験が終わるまでに、肺に残留する薬物の実質的な部分が遊離形態となった（約５０〜７０％）。吸引によって投与された可溶性薬物の少量部分も肺に長く残留するようであった。しかしながら、可溶性形態で投与されたアミカシンの大半は、数時間でなくなり、７日後の見かけ上の遊離アミカシンＡＵＣは、投与された可溶性アミカシンを処理したものより、動物のリポソーム性アミカシンの方が、少なくとも２倍以上高かった。この振る舞いのいくつかの局面は、クリアランスとリポソームからの徐放について、適切な速度定数を用いて、定性的にモデル化することができる。
【０２１５】
連続１４日間の投与後（最終投与の２４時間後）、リポソーム性アミカシンを投与されたラット肺における合計アミカシンの２０％より多くが、遊離の薬物として存在していた（約６５０μｇ／ｇ）。合計の遊離の薬物のレベルは、可溶性アミカシンを吸引によって投与されたラットにおける量と同じぐらい高かった（約５００μｇ／ｇ）。
【０２１６】
遊離のアミカシンは、健康な動物の肺で、リポソーム性アミカシン製剤のリポソームから数日のタイムスケールでゆっくりと放出される。放出される遊離の薬物は、肺での遊離の薬物の標準的なデポーからわかるように、肺での残留時間が比較的長かった。
【実施例６】
【０２１７】
インライン注入プロセス
インライン注入プロセスの本質は、脂質溶液の流れと、抗感染薬溶液の流れとが、例えば、そこでさらなる混合を行うことができる混合チューブと呼ばれるチュービングの長手方向に結合するＹ字コネクターによって「インライン」に混合することである。この意味で、この新たなプロセスは、大量のアミカシン溶液の流れとして脂質溶液を注入する「従来の」エタノール注入プロセスとは異なる。
【０２１８】
アミカシンおよび脂質溶液の調製
アミカシンスルフェート１２．０ｇを２００ｍＬの水に溶解し、必要量の２５％のＮａＯＨ溶液を加えてｐＨを６．５に調整した。脂質、１．４８０ｇのＤＰＰＣおよび０．５２０ｇのコレステロールを６０ｍＬのエタノールと１０ｍＬの水の混合物中に溶解した。これらの量は、脂質／アミカシンの流速をそれぞれ３００／５００ｍＬ／分で注入した後、３００ｍＬのバッチとする。より大きなスケールまたは異なる流速が望ましければ、それにあわせて体積を調整することができる。
【０２１９】
上記のようにして調製したアミカシン溶液は、約４０ｍｇ／ｍＬのアミカシン（塩基に対して）溶液となる。提示されているように、脂質溶液は、脂質合計が約２０ｍｇ／ｍＬの溶液（９０％エタノール）であるＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ（モル比６０／４０）であった。溶解を速くするため脂質を〜４０℃まで加熱した。
【０２２０】
３００ｍＬのバッチに必要とされる正確な量は、アミカシン１５０ｍＬ、脂質９０ｍＬそして、最終エタノール濃度を調整するために注入後もしくは注入中に添加するの追加食塩水（もしくは水）６０ｍＬである。
【０２２１】
製造手順
注入システムの一実施態様を図８に示す。
【０２２２】
脂質溶液およびアミカシン溶液を、Ｙ字コネクター（ＩＤ３．２ｍｍ、ＯＤ６．４ｍｍ）を用いたインラインに、流速〜３００／５００ｍＬ／分（すなわち、従来のプロセスの〜１／３．３５ではなく、〜１／１．６７体積比）で混合した。脂質溶液の送達にはMasterFlexチューブＬ／Ｓ２５（ＩＤ４．８ｍｍ）を用い、アミカシン溶液の送達にはＬ／Ｓ１７チューブ（ＩＤ６．４ｍｍ）を用いた。流速を同期させるために、１つのMasterFlexドライブを備えた２つのポンプヘッドを用いた。チューブの断面積に基づけば、流速比の理論値は、４．８２／６．４２＝０．５６２＝１／１．７８となるはずである。アミカシンチューブＬ／Ｓ１７については、ポンプドライブを５００ｍＬ／ｍｉｎに設定した場合、流速の測定値は、〜３００／５００＝１／１．６７となった。
【０２２３】
脂質溶液は、９０％のエタノールを含有するので、インライン混合物のエタノールは〜３４％であった。アミカシンの蓄積を防ぐために、流速１００〜２００ｍＬ／分で注入後および注入中、ＮａＣｌ溶液を添加することができる（この点で、リポソームが既に形成されていると想定される）。したがって、最終的な混合物は〜２７％のエタノールを有することになり、その全てにおいて遊離のアミカシンが可溶性であることが予測される。
【０２２４】
注入の流速の合計、８００〜１０００ｍＬ／ｍｉｎは、２つの大きなダイアフィルトレーションカートリッジを用いて透過流速と比較可能である。これによって、ダイアフィルトレーションによる注入と濃縮を同時に行うことが可能になる。
【０２２５】
得られたリポソーム懸濁液を洗浄して、Ａｍｅｒｓｈａｍ製の中空ファイバーカートリッジＵＦＰ−５００−Ｃ−３ＭＡ（膜面積：１４０ｃｍ２、ファイバーＩＤ：０．５ｍｍ）を用いたダイアフィルトレーションによって遊離アミカシンを除去した。第１のステップにおいて、該懸濁液を当初の体積の半分（１５０ｍＬ）に濃縮した。その後、ダイアフィルトレーションで洗浄中、懸濁液を再度循環し、浸透率に合致させ、一定体積を維持するために、新鮮な食塩水溶液を混合物中に〜６ｍＬ／分の速度で供給した。ダイアフィルトレーションは、懸濁液の体積が、供給する食塩水溶液の懸濁液体積の４倍に分散されるまで続けた（すなわち、４＊１５０ｍＬ＝６００ｍＬ）。このダイアフィルトレーション／洗浄の手順を４「洗浄」と呼ぶことにする。最終的に、該懸濁液を濃縮し（食塩水を入れないダイアフィルトレーション）、所望のアミカシンおよび脂質の濃度で最終的な生成物を得た。ダイアフィルトレーションステップ中のこの再循環の流速は〜３５０ｍＬ／分であった。１０ＰＳＩ以下の入口圧力を維持するために、最終濃縮ステップ中、徐々に減少させ、〜１５０ｍＬ／分まで減少させた。
【０２２６】
引用文献
１．Veldhuizen, R., Nag, K., Orgeig, S. and Possmayer, F., The Role of
Lipids in Pulmonary Surfactant, Biochim. Biophys. Acta 1408:90-108 （1998）.
2．Hagwood, S., Derrick, M. and Poulain, F., Structure
and Properties of Surfactant Protein B, Biochim. Biophys. Acta 1408:150-160 （1998）. 
３．Johansson, J., Structure and Properties of Surfactant ProteinC,
Biochim. Biophys. Acta 1408:161-172 （1998）.
４．Ikegami, M. and Jobe, A.H., Surfactant Protein Metabolism in vivo,
Biochim. Biophys. Acta 1408:218-225 （1998）. 
５．Couveur, P., Fattel, E. and Andremont,A., Liposomes and
Nanoparticles in the Treatment of Intracellular Bacterial Infections, Pharm.
Res. 8:1079-1085 （1991）.
６．Gonzales-Rothi, RJ., Casace, J., Straub, L., and Schreier, H.,
Liposomes and Pulmonary Alveolar Macrophages: Functional and Morphologic
Interactions, Exp. Lung Res. 17:685-705 （1991）. 
７．Swenson, C.E., Pilkiewicz, F. G., and Cynamon, M.H., Liposomal
Aminoglycosides and TLC-65 Aids Patient Care 290-296 （Dec,
1991）.
８．Costerton, J.W., Stewart, P. S., and Greenberg, E.P., Bacterial
Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections, Science 284:1318-1322 （1999）.
９．Cash, H.A., Woods, D.E., McCullough, W.G., Johanson, J.R., and Bass,
J.A., A Rat Model of Chronic Respiratory Infection with Pseudomonas aeruginosa,
American Review of Respiratory Disease 119:453-459 （1979）.
１０．Cantin, A.M. and Woods, D. E. Aerosolized Prolastin Suppresses
Bacterial Proliferation in a Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Lung
Infection, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 160:1130-1135 （1999）. 
１１．Ramsey, B.W., Dorkin, H.L., Eisenberg, J.D., Gibson, R.L., Harwood,
LR. , Kravitz, R.M., Efficacy of Aerosolized Tobramycin in Patients with cystic
Fibrosis. New England J. of Med. 328:1740-1746
（1993）.
１２．Mendelrnan, P.M., Smith, A.L., Levy, J., Weber, A., Ramsey, B.,
Davis, R.L., Aminoglycoside Penetration, Inactivation, and Efficacy in Cystic
Fibrosis Sputum, American Review of Respiratory Disease 132:761-765 （1985）.
１３．Price, K.E., DeFuria, M.D., Pursiano, T.A. Amikacin, an
aminoglycoside with marked activity against antibiotic-resistant clinical
isolates. J Infect Dis 134:S249261（1976）.
１４．Damaso, D., Moreno-Lopez, M., Martinez-Beltran, J., Garcia-Iglesias,
M.C. Susceptibility of current clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa and
enteric gram-negative bacilli to Amikacin and other aminoglycoside antibiotics.
J Infect Dis 134:S394-90 （1976）.
１５．Pile, J.C., Malone, J.D., Eitzen, E.M., Friedlander, A.M., Anthrax
as a potential biological warfare agent. Arch. Intern. Med. 158:429-434 （1998）. 
１６． Gleiser, C. A., Berdjis, CC, Hartman, H. A., & Glouchenour,
W.S., Pathology of experimental respiratory anthrax in Macaca mulatta. Brit. J.
Exp. Path., 44:416-426 （1968）.
【０２２７】
引用による援用
限定されないが特許および特許出願を含む、本明細書に引用されている文献および引例を、個々の出願または引例が特別に、かつ個別に引用によって本明細書に援用されるのと同程度に、その全体、その部分全体を引用によってここに援用する。この出願が優先権を主張する特許出願もまた、出願および引例について上記したように、ここに引用を以って援用する。
【０２２８】
均等物
好ましい実施態様を強調して本発明を説明してきたが、好ましいデバイスおよび方法における変形を用いてもよいこと、ならびに本発明は本明細書に特に記載したもの以外の方法で行ってもよいことが意図されていることが当業者には明らかであろう。したがって、本発明は、以下に示す請求項によって定義されている本発明の精神および範囲に包含されるすべての変形を含む。
【図面の簡単な説明】
【０２２９】
【図１】図１は、嚢胞性線維症患者において見られる喀痰／バイオフィルムの断面図である。
【図２】図２は、本発明の薬物の標的およびデポー効果を表すグラフである。
【図３】図３は、種々の形態のアミカシンの細菌学的性質を示すグラフである。
【図４】図４は、種々の形態のアミカシンの細菌学的性質を示すグラフである。
【図５】図５は、リポソーム性／複合体化アミカシンおよびトブラマイシンの徐放を示すグラフである。
【図６】図６は、遊離の、または複合体化された、シプロフロキサシンについてのデータを示す図である。
【図７】図７は、種々の投与計画が施された肺での、薬物残留を示すグラフである。
【図８】図８は、リポソーム性抗感染薬製剤を調製するための２つの流れによるインライン注入プロセスをグラフィカルに示した図である。
【図９】図９は、アミカシンスルフェートとエタノール／水との混和性を示す図である。直線は、室温（ＲＴ）および４０℃でエタノールと混和する、最大アミカシン濃度（ベース）をそれぞれ示している。より高濃度で、アミカシンは、後に結晶として析出する分離した液相（コアセルベート）を形成する。水平方向の線は、脂質／アミカシン注入混合物（３００／５００部）および水２００部を添加後ののエタノール濃度を示している。
【図１】
0005415759.tif 000019
【図２】
0005415759.tif 000020
【図３】
0005415759.tif 000021
【図４】
0005415759.tif 000022
【図５】
0005415759.tif 000023
【図６】
0005415759.tif 000024
【図７】
0005415759.tif 000025
【図８】
0005415759.tif 000026
【図９】
0005415759.tif 000027