(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程（ａ）〜（ｅ）を特徴とする、宿主植物に菌根を形成させる方法：
（ａ）菌従属栄養植物の共生菌定着部位を選抜し、
（ｂ）選抜した共生菌定着部位の表面を殺菌し、
（ｃ）殺菌した共生菌定着部位を破砕し、
（ｄ）破砕物中の菌糸塊を回収し、
（ｅ）回収した菌糸塊を宿主植物の根に接種して育成し、菌根を形成させる。
【請求項２】
工程（ｅ）において、宿主植物の根に菌糸塊保持手段を適用し、これに菌糸塊を接種することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
菌糸塊保持手段が、織布、綿、不織布、グラスウール、ナイロンウール、膜、ゲルからなる群より選択されるものである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
菌従属栄養植物がラン科植物である請求項１または２記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載の方法により菌根を形成させた宿主植物の近傍に菌従属栄養植物を植栽することを特徴とする、菌従属栄養植物、菌根菌および宿主植物の３者共生系を構築するための方法。
【請求項６】
菌従属栄養植物がラン科植物である請求項５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、菌従属栄養植物の移植・増殖技術に関する。詳細には、本発明は、宿主植物に菌根を形成させる方法、ならびに菌従属栄養植物、菌根菌および宿主植物の３者共生系を構築するための技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、環境意識の高まりの中で、山野に自生する希少野生植物の自生地内保全、および移植、増殖技術の確立が望まれている。このような植物種のなかには、特定の菌類と共生し、炭素源を獲得して生育するものもあり、菌従属栄養植物と言われている。菌従属栄養植物は希少なものが多く、医薬品原料として利用される植物もあり、有用な遺伝資源である。しかし、このような菌従属栄養植物は、近年の開発行為や大量盗掘などが原因で、その個体数を減らしているものも少なくない。そのような植物を保全・増殖させる場合には、その共生関係を充分に勘案し、必要な方策を講じる必要がある。
【０００３】
菌従属栄養植物の生態には２つのタイプがある。１つは、落葉落枝等を分解して生育する菌（腐生菌）から養分供給を受けて生育するタイプであり、もう１つは、宿主植物と相利共生して生育する菌から養分供給を受けて生育するタイプである。後者のタイプでは、菌従属栄養植物、菌根菌および宿主植物の３者共生系となっている。
【０００４】
なかでも３者共生系の人工構築は困難である。従来から提唱されている３者共生系の構築手法としては、菌従属栄養植物の根から菌糸塊を分離し、人工的に培養したものを、宿主植物の根に接種して菌根を形成させ、そこに菌従属栄養植物を植栽する方法（非特許文献１）、あるいは宿主植物を生育させ、その根に菌従属栄養植物の自生地の土壌を接種し、菌根を形成させ、そこに菌従属栄養植物を植栽する方法（非特許文献２）が例示される。しかし、前者の方法では、人工培養が可能な菌のみに適用可能であり、後者の方法では、菌従属栄養植物と共生する菌が、宿主植物に菌根を形成するとは限らないという問題があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Warcup 1985  （New Phytologist、99:273-280）
【非特許文献２】McKendrick et al. 2000  （New Phytologist、145:539-548）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
菌従属栄養植物を絶滅の危機から救い、その貴重な遺伝資源を守り、希少あるいは有用な菌従属栄養植物を保全、移植、あるいは増殖する技術の開発が急務である。そのために、宿主植物の根に共生菌を定着させる技術、ならびに菌従属栄養植物、共生菌および宿主植物の３者共生系を人工的に構築するための技術を開発することが、本発明の課題であった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決せんと鋭意研究を重ね、菌従属栄養植物体の共生菌定着部位を破砕することにより得た菌糸塊を、人工培養工程を経ずに宿主植物の根に直接接種したところ、菌根が形成されることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は下記を提供する。
（１）下記工程（ａ）〜（ｅ）を特徴とする、宿主植物に菌根を形成させる方法：
（ａ）菌従属栄養植物の共生菌定着部位を選抜し、
（ｂ）選抜した共生菌定着部位の表面を殺菌し、
（ｃ）殺菌した共生菌定着部位を破砕し、
（ｄ）破砕物中の菌糸塊を洗浄し、回収し、
（ｅ）回収した菌糸塊を宿主植物の根に接種して育成し、菌根を形成させる。
（２）工程（ｅ）において、宿主植物の根に菌糸塊保持手段を適用し、これに菌糸塊を接種することを特徴とする、（１）記載の方法。
（３）菌糸塊保持手段が、織布、綿、不織布、グラスウール、ナイロンウール、膜、ゲルからなる群より選択されるものである、（２）記載の方法。
（４）菌従属栄養植物がラン科植物である（１）または（２）記載の方法。
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載した方法により菌根を形成させた宿主植物の近傍に菌従属栄養植物を植栽することを特徴とする、菌従属栄養植物、菌根菌および宿主植物の３者共生系を構築するための方法。
（６）菌従属栄養植物がラン科植物である（５）記載の方法。
（７）菌従属栄養植物の共生菌定着部位を破砕するための手段、宿主植物の根に適用される菌糸塊保持手段のいずれかまたは両方を構成成分として含む、菌根を形成させるためのキット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明はすべての菌種に適用可能であり、確実に目的の菌種を宿主植物の根に定着させることが可能である。それゆえ、本発明を用いて菌従属栄養植物を絶滅の危機から救い、貴重な遺伝資源を守り、有用な菌従属栄養植物を増殖させることができる。例えば、有用な医薬品原料となる菌従属栄養植物を大量に増殖させることもできる。さらに本発明により山野に自生する希少野生植物の保全を行うこともでき、環境保全、環境破壊防止を行うこともできる。本発明は、希少植物と共生する菌類を高純度かつ十分量で抽出し、宿主植物に直接定着させる技術に関するものであり、特に、分離培養が困難な菌根菌と共生する菌従属栄養植物の３者共生系の構築に必要不可欠な技術を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、菌従属栄養植物、菌根菌および宿主植物の３者共生系を説明する模式図である。矢印は養分の受け渡しを示す。
【図２】図２は、本発明の菌根を形成させる方法における、菌従属栄養植物から菌糸塊を回収する工程を説明する図である。
【図３】図３は、本発明の菌根を形成させる方法における、宿主植物への菌糸塊の接種から宿主植物の根における菌根の形成に至る工程を説明する図である。図３中の左下の写真は接種１ヶ月後の宿主植物の根における菌糸塊（矢印）、右下の写真は接種３ヶ月後の宿主植物の根における菌根（矢印）の形成を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、１の態様において、宿主植物に菌根を形成させる方法を提供し、該方法は、下記工程（ａ）〜（ｅ）を特徴とする：
（ａ）菌従属栄養植物の共生菌定着部位を選抜し、
（ｂ）選抜した共生菌定着部位の表面を殺菌し、
（ｃ）殺菌した共生菌定着部位を破砕し、
（ｄ）破砕物中の菌糸塊を回収し、
（ｅ）回収した菌糸塊を宿主植物の根に接種して育成し、菌根を形成させる。
【００１２】
このように、本発明は、菌従属栄養植物に定着している共生菌を、人工的に培養することなく、直接宿主植物の根に適用することを特徴とする。したがって、人工的な培養によって生育が困難な共生菌種であっても使用することができ、宿主の根に確実に目的の共生菌を定着させることができる。しかも、作業に時間を要さず、共生菌の菌糸塊を大量に回収することができる。すなわち、本発明の方法は、すべての共生菌種に適用可能であり、共生菌を確実に宿主に定着させることができる。これらの点で、本発明の方法は画期的である。さらに本発明の方法により宿主に菌根を形成させたならば、目的の菌従属栄養植物を植栽して、３者共生系を構築することもできる。ここで、３者共生系とは、菌従属栄養植物、菌根菌および宿主植物の３者が構成要因となり、菌従属栄養植物は、宿主植物と共生し生育する菌根菌（共生菌）に生育に必要な養分を依存している系をいう（図１参照）。また、菌根菌とは宿主植物と相利共生し生育する菌をいう。
【００１３】
また本発明は、様々な事業・産業に応用することもできる。例えば、本発明を、開発事業に伴うキンラン、サカネランなどの希少植物の移植・増殖事業に用いてもよく、医薬品原料となる有用植物の栽培に用いてもよい。
【００１４】
本発明の各工程について説明する。先ず、採取した菌従属栄養植物の植物体の共生菌定着部位を選抜する（工程（ａ））。菌従属栄養植物の種類はいずれの種類であってもよく、例えば、３者共生系を構築し生育する植物（例、ラン科植物）、外生菌根菌と菌根共生し３者共生系を構築して生育する植物（例、シャクジョウソウ亜科植物）、アーバスキュラー菌根菌と共生し３者共生系を構築して生育する植物（例、ホンゴウソウ科、ヒナノシャクジョウ科植物）などが挙げられるが、これらの植物種に限定されることはない。菌従属栄養植物の植物体の共生菌定着部位は、肉眼、ルーペ、実体顕微鏡などを用いて観察・選抜し、カッターナイフ、はさみ、メスなどを用いて植物体から分離することができる。得られた共生菌定着部位を適当な大きさに切断して、以下の工程に使用してもよい。
【００１５】
選抜した共生菌定着部位の表面を殺菌することにより表面付着菌を除去する（工程（ｂ））。この工程は、目的とする共生菌の純度を上げるために重要である。表面殺菌は、定法により行うことができ、例えば、約７０％のエタノール、約１％の次亜塩素酸ナトリウム、約３０％の過酸化水素水などで適当時間（例えば数十秒間）洗浄することにより行うことができる。この工程において、あまり弱い条件で殺菌を行うと、表面菌が十分に死滅せず、共生菌の純度が低下する。また、あまり強い条件で殺菌を行うと、目的の共生菌まで死滅してしまうので、共生菌の回収率が低下する。
【００１６】
表面殺菌した共生菌定着部位を破砕する（工程（ｃ））。この工程は、共生菌定着部位の中で生育している共生菌を回収するもので、宿主への接種に十分な量の共生菌を得るために重要である。破砕工程も定法にて行うことができ、例えば、乳鉢と乳棒、らいかい器、ホモジナイザー、フレンチプレスなどを用いて行うことができる。この工程において、破砕が不十分だと共生菌の回収率が低下する。破砕が強すぎると目的の共生菌まで破砕されて死滅するので、やはり共生菌の回収率が低下する。
【００１７】
上記工程で得られた破砕物中の共生菌の菌糸塊を回収する（工程（ｄ））。一般的には、水、食塩水、緩衝液などに破砕物を懸濁し、その後、遠心分離、デカンテーション、濾過などの定法により、共生菌の菌糸塊を洗浄して、回収することができる。場合によっては、上で得られた破砕物を洗浄せずに、次工程に用いてもよい。ここまでの工程が図２に説明されている。
【００１８】
次に、回収された共生菌の菌糸塊を宿主植物の根に接種して育成し、菌根を形成させる（工程（ｅ））。好ましくは、宿主植物の細根に菌糸塊を接種する。この工程における接種は、菌糸塊を宿主植物の根に直接接種することである。ここで、直接接種するとは、菌糸塊と宿主植物の根とを接触させることをいう。直接接種することで、確実に目的の共生菌を宿主植物に定着させることが可能となる。接種効率を上げるために、宿主植物の根に菌糸塊保持手段を適用し、これに菌糸塊を接種して、菌糸塊と宿主植物の根との接触を確実ならしめることができる。菌糸塊保持手段は、菌糸塊を保持することができ、しかもそれ自体が宿主植物の根から脱離しにくいものであれば、いずれの材料であってもよい。好ましくは、菌糸塊保持手段は網状マトリクスを有するもの、あるいは粘着性を有するものである。菌糸塊保持手段は、天然素材、人工素材、あるいはそれらの混合物であってもよい。菌糸塊保持手段の例としては、織布、綿、不織布、グラスウール、ナイロンウール、ゲル（例、アルギン酸ゲル、カラギーナンゲル）、粘着テープなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
宿主植物としては、目的とする共生菌が菌根を形成しうる植物であればいずれの植物であってもよく、好ましくは、目的とする菌従属栄養植物の生育に適した共生菌が菌根を形成しうる植物であり、さらに好ましくは、目的とする菌従属栄養植物が本来構築している共生系の宿主植物である。換言すれば、本発明においては、目的とする菌従属栄養植物、共生菌、宿主植物の組合せは、目的の菌従属栄養植物が生育可能であれば本来の共生系にはない組合せであってもよい。なお、宿主植物は、通常は樹木であるが、草本等の他の種類の植物であってもよい。宿主植物は自然に生えている状態のものであってもよいが、根への共生菌の適用のし易さの観点から、苗を用いることが好ましい。
【００２０】
共生菌の菌糸塊を宿主植物の根に接種した後、共生菌や宿主植物の種類、ならびに土壌の温度や水分などの条件にもよるが、通常は、数週間〜数ヶ月で宿主植物の根に菌根が形成される。ここまでの工程が図３に説明されている。
【００２１】
本発明は、もう１つの態様において、上記の菌根形成方法により菌根を形成させた宿主植物の近傍に菌従属栄養植物を植栽することを特徴とする、菌従属栄養植物、菌根菌および宿主植物の３者共生系を構築するための方法を提供する。宿主植物の近傍に菌従属栄養植物を植栽するとは、菌従属栄養植物の根が、宿主植物の根に定着した菌根に接するように、あるいはその近くに位置するように、菌従属栄養植物（種子を含む）を植栽することをいう。
【００２２】
本発明は、さらにもう１つの態様において、上記の菌根形成方法を実施するための１またはそれ以上の手段を構成成分として含む、菌根を形成させるためのキットを提供する。本発明のキットは上記工程（ａ）〜（ｅ）の少なくとも１つを行うのに必要な手段を含む。本発明のキットの好ましい具体例としては、（ｉ）菌従属栄養植物の共生菌定着部位を破砕するための手段、（ｉｉ）宿主植物の根に適用される菌糸塊保持手段のいずれかまたは両方を構成成分として含む、菌根を形成させるためのキットが挙げられるが、これに限定されない。
【００２３】
本願の明細書、特許請求の範囲、図面および要約書に用いる用語は、特に断らないかぎり、植物学の分野で一般に理解されている意味に解される。これらは植物学の分野の教科書、辞書、論文等に広く用いられているものである。
【００２４】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００２５】
ラン科ツレサギソウ属オオバノトンボソウを埼玉県狭山市にて採取し、共生菌定着部位を肉眼および実体顕微鏡で観察・確認し、共生菌定着部位を約３ｃｍの長さの断片（４本）に切断した。得られた共生菌定着部位をバイアルに入れ、７０％エタノールおよび次亜塩素酸ナトリウムの有効塩素濃度１％中で３０秒間洗浄した後、乳鉢で破砕した。破砕物を滅菌水に懸濁し、バイアル中で洗浄した。バイアルを静置した後、沈殿部分を回収することにより、十分な量の純化された菌糸塊を得て、宿主への接種に用いた。以上の工程を図２に示す。
【００２６】
あらかじめコナラの苗をポットで育成させた。土壌の一部を取り、細根を露出させ、細根に不織布（３０ｘ４０ｍｍ、厚さ０．２ｍｍ）を直接固定した。上で得られた菌糸塊をすべて、スポイトを用いて不織布に移した。取り除いた土壌を戻し、十分に水分を与えながら３ヶ月育成し、菌根の形成を確認した。以上の工程を図３に示す。この実験における菌根形成の経時的変化は図３の左下の写真（接種１ヶ月後）および右下の写真（接種３ヶ月後）に示されている。接種１ヶ月後に菌糸塊が白色の粒として観察できた（左下の写真の矢印）。接種３ヶ月後に宿主植物に菌根が形成された（右下の写真の矢印）。
【００２７】
菌従属栄養植物（例、ラン科ツレサギソウ属オオバノトンボソウ）の根が、宿主植物の根に定着した菌根に接するように、あるいはその近くに位置するように、菌従属栄養植物（例、ラン科ツレサギソウ属オオバノトンボソウ）を植栽することにより、共生系を確立することができる。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明は、園芸、林業、医薬、環境保全、植物学の研究などの分野において利用可能である。
【図１】
0005612340.tif 000002
【図２】
0005612340.tif 000003
【図３】
0005612340.tif 000004