(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）一方の末端の近傍に試料台が形成されており、前記一方の末端に接触突出部が取り付けられており、他方の末端が下記の断熱容器部の冷却管内部を往復動自在に、且つ気密的に内挿され、軸回転が不可能な試料棒と、一方が前記断熱容器部と結合されており、観察状態のときに試料台部分を除く試料棒部分を取り囲んでいる断熱材質の断熱管とを有する試料支持台と、
（Ｂ）内部に冷却媒体が入れられる二重容器であって、その内部を貫通して冷却管が形成されている断熱容器部と、
（Ｃ）前記試料棒の他方の末端が突出される側面の断熱容器部と結合されており、ユーザーの外力によって前記試料棒を断熱容器部に対して相対的に往復動させる棒往復動手段と、
を備え、
前記棒往復動手段は、
試料棒の他方の末端が突出される側面の断熱容器部と結合されており、突出された試料棒の他方の末端を収容し、下記の回転部と回転噛合する回転支持部と、
前記試料棒の他方の末端と相対的に回転自在に結合されており、前記回転支持部と回転噛合する回転部と、
を備えてなることを特徴とする透過型電子顕微鏡用クライオトランスファーホルダ。
【請求項２】
（Ａ）一方の末端の近傍に試料台が形成されており、前記一方の末端に接触突出部が取り付けられており、他方の末端が下記の断熱容器部の冷却管内部を往復動自在に、且つ気密的に内挿され、軸回転が不可能な試料棒と、一方が前記断熱容器部と結合されており、観察状態のときに試料台部分を除く試料棒部分を取り囲んでいる断熱材質の断熱管とを有する試料支持台と、
（Ｂ）内部に冷却媒体が入れられる二重容器であって、その内部を貫通して冷却管が形成されている断熱容器部と、
（Ｃ）前記試料棒の他方の末端が突出される側面の断熱容器部と結合されており、ユーザーの外力によって前記試料棒を断熱容器部に対して相対的に往復動させる棒往復動手段と、
を備え、
前記棒往復動手段は、
試料棒の他方の末端が突出される側面の断熱容器部と結合されており、突出された試料棒の他方の末端を収容するとともに、下記の回転部をその場回転するように収容する回転支持部と、
前記試料棒の他方の末端と相対的に回転自在に回転噛合する回転部と、
を備えてなることを特徴とする透過型電子顕微鏡用クライオトランスファーホルダ。
【請求項３】
（Ａ）一方の末端の近傍に試料台が形成されており、前記一方の末端に接触突出部が取り付けられており、他方の末端が下記の断熱容器部の冷却管内部を往復動自在に、且つ気密的に内挿され、軸回転が不可能な試料棒と、一方が前記断熱容器部と結合されており、観察状態のときに試料台部分を除く試料棒部分を取り囲んでいる断熱材質の断熱管とを有する試料支持台と、
（Ｂ）内部に冷却媒体が入れられる二重容器であって、その内部を貫通して冷却管が形成されている断熱容器部と、
（Ｃ）前記試料棒の他方の末端が突出される側面の断熱容器部と結合されており、ユーザーの外力によって前記試料棒を断熱容器部に対して相対的に往復動させる棒往復動手段と、
を備え、
前記棒往復動手段は、
試料棒の他方の末端が突出される側面の断熱容器部にその場回転するようと結合されており、突出された試料棒の他方の末端を収容し、下記の回転部と回転噛合する回転支持部と
前記試料棒の他方の末端と結合されており、前記回転支持部と回転噛合する回転部と、
を備えてなることを特徴とする透過型電子顕微鏡用クライオトランスファーホルダ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、冷却法によって（生体）試料を透過型電子顕微鏡（以下、「ＴＥＭ」と称する）で観察するに際して、冷却試料の熱損傷を防ぐことのできる新規な構造のＴＥＭ用クライオトランスファーホルダに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＥＭにおいて生体（試料）を観察する方法には、化学固定化法とクライオ法がある。化学固定化法は、固定液を微細な細胞構造に浸透して固定化した後、薄膜状に切断して観察する方法である。この方法によれば、固定液が細胞まで浸透する速度が遅く、化学的固定液によって細胞が変形されるため、原形そのままの細胞構造を観察することが困難である。
【０００３】
一方、生体試料は、そもそも非常に軽い元素から構成されている。このため、未染色の状態であれば、散乱による明暗効果が非常に少ない。ところが、氷での電子散乱効果は、液体状態での電子散乱効果よりも卓越しているため、水分含有生体の凍結試料における水分は明暗効果を増大させる効果を示す。なお、水分含有生体の凍結試料は、化学的固定やさらなる染色過程によって生体が影響を受けることがないため、自然状態の試料に極めて類似している。このため、クライオＴＥＭは、生命科学分野の研究において非常に重要な役割を果たしている。
【０００４】
クライオＴＥＭ法により生体試料を観察するために、通常、以下の手順を踏む。先ず、試料を液体（水、バッファーなど）に混濁させた後、ピペットにより所定の前処理の施された支持膜（グリッド）に載せ、ろ紙などにより水気を切る。液体窒素温度のレベルまで冷却されたエタン溶液に試料グリッドを漬けて凍結晶が生じないように急速冷却させる。急速冷却された試料グリッドを液体窒素入りの作業槽からクライオトランスファーホルダ（以下、「ホルダー」という）の末端の試料台に移す（ここまでを「試料準備ステップ」という）。ホルダーをＴＥＭに取り付けて撮像を行う。
【０００５】
試料準備ステップ後に、ＴＥＭの取付けステップ及び観察ステップに亘って、取り付けられた試料の温度が変化したり、ホルダーとＴＥＭ鏡筒内部との間に温度差がある場合、試料に結晶質氷が生じて試料組織が破損される結果、試料の観察に多大な影響を及ぼすことがある。このため、ホルダー（試料台）の温度を最大限に安定的に維持するために、前記ホルダーは、図１に示すように、熱伝導率が良好な材質からなり、一方の末端の近傍に試料台が形成されている試料棒、及び内部に液体窒素が入れられ、内部を貫通して試料棒の他方の末端が挿着されている断熱容器部を主な構成部とする構造となっている。このとき、試料台を除く試料棒は、断熱材質の断熱管に収まっている。もちろん、ホルダーの種類や用途に応じて、ヒーターやクーラー、試料台回転手段などが試料台の周りに微細に取り付けられることもある。このような構造の試料ホルダーは、液体窒素の冷気が試料棒を介して試料台に効率よく伝わるので、冷却試料が低温状態を維持し易い。
【０００６】
一方、ホルダーがＴＥＭの鏡筒に取り付けられると、試料棒が長尺であるため、試料棒が上下左右に微細に振動するが、このような微細な振動を放置すると、試料台の位置も変化し続けるため、ＴＥＭ観察を行えなくなる。統制不可能な微振動を防ぐために、試料棒の試料台側の末端にクリスタル製の接触突出部が取り付けられており、鏡筒の内部の対応する位置には、ホルダーが鏡筒に取り付けられたときに前記接触突出部と接しつつ試料棒を支持して固定する接触収容部（図示せず）が設けられている。［このとき、接触収容部は、ＴＥＭのゴニオメータによって動きが制御されるが、これは本発明の内容とは無関係であるため、その具体的な構造や運動方法についての説明を省く］。このため、ホルダーが鏡筒に取り付けられると、ホルダーの前記接触突出部を鏡筒の接触収容部が把持するので、任意の微振動が防がれるのである。
【０００７】
従来、ＴＥＭ用クライオトランスファーホルダを鏡筒に取り付け［このとき、ホルダーの接触突出部が鏡筒の接触収容部に接し、これによって、ホルダーが任意に振動することが防がれる］、鏡筒を減圧し、さらに冷却する準備過程を経て所定の内部圧力と温度に達してはじめてイメージの観察を行うこととなる。しかしながら、ホルダーを鏡筒に取り付けてホルダーの接触突出部と鏡筒の接触収容部とを接触させたとたん、さらに高い温度状態である鏡筒の熱が接触収容部と接触突出部を介して試料台に伝わり、その結果、冷却試料に損傷を負わせるケースがしばしば生じていた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、鏡筒に取り付けられた後、鏡筒の内部圧力と温度が所定の状態に達してから接触収容部と接触突出部とを接触させることにより、突然な熱伝達による冷却試料の損傷が防がれる新規な構造のクライオトランスファーホルダを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、（Ａ）一方の末端の近傍に試料台が形成されており、前記一方の末端に接触突出部が取り付けられており、他方の末端が下記の断熱容器部の冷却管内部を往復動自在に、且つ気密的に内挿され、軸回転が不可能な試料棒と、一方が前記断熱容器部と結合されており、観察状態のときに試料台部分を除く試料棒部分を取り囲んでいる断熱材質の断熱管とを有する試料支持台と、（Ｂ）内部に冷却媒体が入れられる二重容器であって、その内部を貫通して冷却管が形成されている断熱容器部と、（Ｃ）前記試料棒の他方の末端が突出される側面の断熱容器部と結合されており、ユーザーの外力によって前記試料棒を断熱容器部に対して相対的に往復動させる棒往復動手段と、を備えるＴＥＭ用クライオトランスファーホルダに関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、従来とは異なり、ＴＲホルダーの取り付けに際して、初期に試料棒の接触突出部が鏡筒の接触収容部に接触することがなくなり、冷却試料が熱損傷されることが生じなくなる結果、ＴＥＭ観察効率を大幅に増大させることが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】従来の技術によるＴＥＭ用ＴＲホルダーの概念的断面図である。
【図２Ａ】ＡからＤは、それぞれ本発明によるクライオトランスファーホルダ状態別の概念的断面図および設計断面図である。
【図２Ｂ】ＡからＤは、それぞれ本発明によるクライオトランスファーホルダ状態別の概念的断面図および設計断面図である。
【図２Ｃ】ＡからＤは、それぞれ本発明によるクライオトランスファーホルダ状態別の概念的断面図および設計断面図である。
【図２Ｄ】ＡからＤは、それぞれ本発明によるクライオトランスファーホルダ状態別の概念的断面図および設計断面図である。
【図３Ａ】本発明によるクライオトランスファーホルダの概念的斜視図である。
【図３Ｂ】本発明によるクライオトランスファーホルダの試料台が露出された状態の部分斜視図である。
【図３Ｃ】本発明によるクライオトランスファーホルダの試料台が断熱管の内部に収まった状態の一部透明部分斜視図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
図２Ａ及び図２Ｂは、本発明によるクライオトランスファーホルダ状態別の概念的断面図および設計断面図である。
【００１３】
従来には前記試料棒が前記断熱容器部の内部に導入されて直接的と結合されるのに対し、本発明における試料棒は、前記断熱容器部を貫通し、且つ、所定距離（通常、１〜３ｃｍ以内）往復動可能に設けられる。このため、試料棒は断熱容器部と直接的に接触することができず、熱伝導率に優れた材質の冷却管を介して間接的に接触している。
【００１４】
ＴＲホルダーにおいて、断熱容器部の前端（試料支持台）までが電子顕微鏡の鏡筒に取り付けられる。従来のＴＲホルダーとは異なり、本発明によるホルダーにおいては、鏡筒の内部に取り付けられる試料棒の一部が断熱容器部を貫通して鏡筒の外部に位置する。このため、試料棒と断熱容器部との接触面を介して空気が漏れる（流れ込む）ことがあるため、これを防ぐために、試料棒と冷却管との間が気密状態を維持する必要がある。
【００１５】
本発明における試料支持台と断熱容器部の基本的な機能（試料の冷却維持機能）は、従来の技術とは大差なく、前記断熱管の機能、材質と規格、結合位置は従来の技術によるホルダーの断熱管と同様である。
【００１６】
本発明において、棒往復動手段は、従来の技術には見られないユニークなものであり、前記試料棒の他方の末端が突出される側面の断熱容器部と結合されており、外力によって前記試料棒を断熱容器部に対して相対的に、且つ精度よく往復動させる。すなわち、棒往復動手段は、試料台の反対側において、試料棒を押したり引っ張ったりする。このとき、試料棒は断熱容器部に対して相対的に往復動するが、中心軸に対して回転が防がれる必要がある。このために、本発明においては、試料棒と断熱管との間、または、試料棒と冷却管との間に、軸方向に互いに対応する軸回転防止用の凹凸を形成することが好ましい。
【００１７】
棒往復動手段を用いてユーザーが試料棒を押し込むと、試料台領域が断熱管の外に押し出されて観察状態の位置に達し（図２Ａ）、前記試料棒を引っ張ると、試料台領域が前記断熱管の内部に収まる（図２Ｂ）。図中、上図が概念的断面であり、下図が設計断面図である。
【００１８】
本発明において、前記棒往復動手段は、試料棒の軸回転を防ぎつつ試料棒を往復動させるものであり、従来公知の種々の手段が採用可能である。
【００１９】
例えば、本発明による棒往復動手段は、（１）試料棒の他方の末端が突出される側面の断熱容器部と結合されており、突出された試料棒の他方の末端を収容し、下記の回転部と回転噛合する回転支持部と、（２）前記試料棒（試料棒は、軸回転が防がれている）の他方の末端と相対的に回転自在に結合（すなわち、前記試料棒を押したり引っ張ることはできるものの、回転させることはできないように結合）されており、前記回転支持部と回転噛合する回転部とを備えていてもよい［回転支持部と回転部とが噛合される構造］。この場合、「回転噛合」は、回転支持部と回転部とが接する面が、ネジ山とネジが互いに対応して形成されることが好ましい。この例において、前記回転部を一方向に回転させると、回転部が断熱容器部に向かって移動するとともに、結合されている試料棒を押し出して試料台が観察状態の位置に達し、前記回転部を他方に回転させると、回転部が断熱容器部から遠ざかるとともに、結合されている試料棒を引っ張って試料台が前記断熱管の内部に収まることとなる。
【００２０】
あるいは、例えば、本発明による棒往復動手段は、（１）試料棒の他方の末端が突出される側面の断熱容器部と結合されており、突出された試料棒の他方の末端を収容するとともに、下記の回転部をその場回転するように収容する回転支持部と、（２）前記試料棒（試料棒は、軸回転が防止されている）の他方の末端と相対的に回転自在に回転噛合する回転部とを備えていてもよい［回転部と試料棒の他方の末端とが噛合するような構造］。このとき「回転噛合」は、回転支持部と回転部とが接する面が、ネジ山とネジが互いに対応して形成されることが好ましい。この例において、前記回転部を一方向または他方向に回転させると、回転部はその場回転しつつ回転噛合されている試料棒を押したり引っ張り、その結果、試料棒末端の試料台が前記断熱管の外部に露出されるか、あるいは、内部に収まるのである。
【００２１】
あるいは、例えば、本発明による棒往復動手段は、（１）試料棒の他方の末端が突出される側面の断熱容器部にその場回転するようと結合されており、突出された試料棒の他方の末端を収容し、下記の回転部と回転噛合する回転支持部と、（２）前記試料棒（試料棒は、軸回転が防止されている）の他方の末端と結合（これにより、軸回転が防止される）されており、前記回転支持部と回転噛合する回転部とを備えていてもよい。この例において、前記回転支持部を一方向または他方向に回転させると、回転支持部のその場回転運動が回転部（及びそれと結合されている試料棒）の直線往復動に切り換わって試料棒を押したり引っ張り、その結果、試料棒末端の試料台が前記断熱管の外部に露出されるか、あるいは、内部に収まるのである。図２Ｃは、このような棒往復動手段が採用された例において、試料台が断熱管の内部に収まった状態の棒往復動手段の状態部分断面図（上図）及び外部に露出された状態の棒往復動手段の状態部分断面図（下図）であり、図２Ｄは、内部の構造を示す部分断面図である。図中、混同を防ぐために、Ｏリングなどの気密手段や、試料台の角度や位置を微調節するための通常の制御手段などの図示は省略されている。図中、Ｓは回転噛合（ネジ山）の部分を、Ａは回転支持部を断熱容器部に対してその場回転させるための回転支持部の周りの溝及び断熱容器部側の固定ピンを、Ｂは回転部の軸回転を防ぎ、直線往復動可能にする回転部軸方向の溝及び断熱容器部側の固定ピンをそれぞれ示す。
【００２２】
図３Ａから図３Ｃは、本発明によるクライオトランスファーホルダの概念的斜視図であり、試料台が露出された状態部分斜視図及び試料台が断熱管の内部に収まった状態の一部透明部分斜視図である。
【００２３】
本発明によるＴＥＭ用クライオトランスファーホルダは、下記の方式により用いることができる。先ず、液体窒素を断熱容器部に満たし、所定期間静置して試料棒が十分に冷却されると、棒往復動手段を用いて試料台を断熱管の外部に露出させる。予め用意した冷却試料（グリッド）を試料台に載置し、さらに棒往復動手段を用いて試料台を断熱管内に収める。この状態のクライオトランスファーホルダを通常の方法によりＴＥＭの鏡筒に取り付け［このときにも、試料台は、断熱管内に収まっている］、鏡筒の内部を減圧して冷却する。適切な温度と圧力に達すると、棒往復動手段を用いて試料台を断熱管の外部に露出させて、試料棒の接触突出部を鏡筒の接触収容部に合致させる。通常の方法によりＴＥＭ観察を行う。
【符号の説明】
【００２４】
１０…試料支持台
１１…試料台
１２…接触突出部
１３…断熱管
２０…断熱容器部
２１…冷却管
３０…棒往復動手段
３１…回転支持部
３２…回転部
Ｓ…回転噛合部
Ａ…その場回転溝及び固定ピン
Ｂ…往復動溝及び固定ピン
0005522546.tif 000002
【図１】
0005522546.tif 000003
【図２Ａ】
0005522546.tif 000004
【図２Ｂ】
0005522546.tif 000005
【図２Ｃ】
0005522546.tif 000006
【図２Ｄ】
0005522546.tif 000007
【図３Ａ】
0005522546.tif 000008
【図３Ｂ】
0005522546.tif 000009
【図３Ｃ】
0005522546.tif 000010