(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔質の疎水性コア体及び前記コア体の外部全体を覆う多孔質の親水性リッドを含んでなるクロマトグラフィー媒体であって、前記リッドが一定サイズ未満の分子のみを透過させ前記コア体の内部と相互作用させ、前記コア体及びリッドが多糖類から作製されており、前記疎水性コア体がＣ4〜Ｃ16疎水性相互作用リガンドで官能化されている、クロマトグラフィー媒体。
【請求項２】
前記疎水性コア体がアガロースから作製され、前記疎水性相互作用リガンドが脂肪族又は芳香族炭化水素である、請求項１記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項３】
前記疎水性相互作用リガンドがオクチルリガンドである、請求項１又は請求項２記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項４】
前記疎水性コア体が前記疎水性相互作用リガンドのほかに追加のリガンドを含んでおり、前記追加のリガンドが前記疎水性コア体上に位置し、及び／又は前記疎水性コア体と結合し、及び／又は疎水性相互作用リガンド上に結合している、請求項２記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項５】
前記追加のリガンドが静電的相互作用リガンドである、請求項４記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項６】
前記親水性リッド及び／又は疎水性コア体が層活性化によって官能化されたものである、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項７】
前記親水性リッドの細孔内にヒドロゲルが充填されていて、細孔径がさらに減少され、高分子量分子が細孔に入らないように調整されている、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項８】
前記疎水性コア体中に磁性粒子が組み込まれている、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項９】
当該クロマトグラフィー媒体が別のクロマトグラフィー媒体と混合され、当該クロマトグラフィー媒体が総媒体体積の最大１０％までを占める、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項１０】
当該クロマトグラフィー媒体がオクチルリガンドを含み、前記別のクロマトグラフィー媒体が陽イオン交換媒体である、請求項９記載のクロマトグラフィー媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はクロマトグラフィーの分野内にある。さらに正確には、本発明は新規なクロマトグラフィー媒体、即ち疎水性媒体の多孔度及び／又はリッド（蓋）の多孔度によって一定サイズを超える分子を排除する様々なリッドを備えた疎水性媒体に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオテクノロジーの分野では、これまでに提唱されたクロマトグラフィー方法は、標的との様々な相互作用モードに基づいている。即ち、例えばイオン交換クロマトグラフィーでは、官能基は反対電荷の対イオンを有する永久的に結合したイオン基である一方、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）では、固定相と分離すべき成分との相互作用は疎水性に基づいている。
【０００３】
疎水性相互作用に基づくクロマトグラフィーは、一般にＨＩＣ及びＲＰＣと呼ばれる２つのタイプに分けられる。
【０００４】
ＨＩＣとは、分離されたタンパク質の変性を回避するため、疎水性リガンドを非常に低い程度に固定化した高親水性マトリックスを用いるタンパク質の疎水性相互作用クロマトグラフィーをいう。分離すべきタンパク質を吸着させるためには、水中に高濃度の無機塩を使用することが必要である。脱着は、通常、溶離段階においてイオン強度を徐々に低下させることで達成される。
【０００５】
ＲＰＣとは、疎水性の無極性分子／リガンド（通常は４〜１８の炭素原子を含む脂肪族炭素鎖）で非常に高い程度に官能化されたマトリックス（通常はシリカ系マトリックス）を用いるクロマトグラフィーをいう。脱着は、通常、添加塩の必要なしに達成される。脱着又は溶離は、大抵の場合、溶離液中における有機溶媒の含有量を徐々に増加させることで行われる。
【０００６】
１８の炭素鎖を有するＲＰＣ媒体は、タンパク質を強く結合する。タンパク質はまた、結合プロセス中に様々な程度に変性する。タンパク質を溶離するためには、異常な条件を使用することが必要である。しかし、短い炭素鎖（４炭素）を有するＲＰＣ媒体を、タンパク質分離のためにトリフルオロ酢酸のような添加剤を含む水／アセトニトリル系溶離剤と共に使用することもできる。
【０００７】
分離マトリックスとしても知られる固定相は、普通は複数の本質的に球状の粒子である支持体と、支持体に結合したリガンドとを含んでいる。大抵の分離マトリックスでは、支持体は、各粒子中により多くの量のリガンド、したがってより多くの結合標的化合物を導入するために多孔質である。支持体は大抵の場合に天然又は合成ポリマーであり、球状粒子はいくつかの異なる方法で製造できる。シリカ及びガラスビーズも使用される。この目的のためにしばしば使用される天然ポリマーは、多糖類のデキストラン及びアガロースである。
【０００８】
クロマトグラフィー操作及びバッチ操作によって生体分子を分離するためには、マトリックス（ビーズ、モノリス、充填膜など）の多孔度が非常に重要である。ポリマー媒体の利点は、細孔径を広範囲にわたって変えるのが容易であること、及びその高い化学的安定性（例えば、高いｐＨ値に対する許容性）である。文献全体にわたって認められている原則は、大きい分子に対しては細孔径の大きい媒体を使用することである。これらの細孔中における物質移動は拡散プロセスの結果であり、対流の結果ではない。
【０００９】
同時係属中のスウェーデン特許出願第ＳＥ０８００２６３−６号には、大きい分子を排除するために選択された多孔度を有するアガロースビーズを製造するためのスピニングディスク技術（Ｗａｌｔｅｒ  ａｎｄ  Ｐｒｅｗｅｔｔ（Ｗａｌｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．；Ｐｒｅｗｅｔｔ，Ｗ．Ｃ．（１９４９）Ｐｒｏｃ．Ｐｈｙｓ．Ｓｏｃ．Ｂ．６２，３４１−３５０））に基づく方法が記載されている。
【００１０】
ヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）は、生物医薬品として大いに有望である。ｍＡｂｓの精製に際して直面する最大の問題の１つは、細胞培養液中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰｓ）からそれを分離することである。今日、プロテインＡ上でのアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を含む多種多様のｍＡｂｓ単離技法が利用可能である。これらの技法のすべてが移動相（吸着緩衝液）の使用を伴っていて、移動相はｍＡｂ分子とリガンドとの相互作用を達成するように調整しなければならない。例えば、ＨＩＣでは多量の塩を移動相に添加しなければならず、イオン交換クロマトグラフィーの場合にはｍＡｂｓがイオン交換リガンドに比べて反対の電荷を有するように移動相のｐＨを調整しなければならない。さらに、ｍＡｂｓがリガンドに吸着されている場合には、ｍＡｂｓの脱着を達成するように移動相を調整しなければならない。
【００１１】
ｍＡｂｓのような大きい分子がビーズに入るのを防止する細孔径分布及び表面特性を有すると共に、内部には緩衝液条件に関係なくタンパク質及び他のペプチド又は生体分子を吸着できるクロマトグラフィー媒体が得られれば望ましいであろう。生体分子の分離を目的とするイオン交換体は低いイオン強度で大抵の帯電生体分子を吸着できるが、イオン強度が一定レベルを超えて増加した場合、これらの媒体は試料分子を吸着する能力を失う。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
米国特許第６５３１５２３号明細書
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、タンパク質が広いｐＨ範囲において非常に低いイオン強度及び高いイオン強度の両方で相互作用し又は吸着され得るような高い疎水性をコア実体中に有する媒体を提供する。
【００１４】
第１の態様では、本発明は、多孔質の疎水性コア実体及びコア実体の外部全体を覆う多孔質の親水性リッドを含んでなる分離媒体であって、リッドが一定サイズ未満の分子のみを透過させて分離媒体のコア実体の内部と相互作用させる分離媒体に関する。
【００１５】
好ましい実施形態では、疎水性コア実体も一定サイズ未満の分子のみを透過させて分離媒体のコア実体の内部と相互作用させることが好ましい。
【００１６】
多孔質の親水性リッド（蓋）は、コア実体を包囲する多孔質外層又は外被／シェルである。
【００１７】
分離媒体は、試料の性質に関係なく、かつクロマトグラフィーの場合にはイオン強度及びｐＨのような運転条件或いはバッチ操作の場合には上澄み液に関係なく、タンパク質及び他の疎水性分子を結合するため、好ましくは高疎水性のコアを備えている。分離媒体は好ましくはビーズ形状を有するが、膜であってもよい。
【００１８】
媒体のサイズ排除性は、その多孔質成分の一方又は両方の多孔度によって決定される。上記に述べた一定サイズとは、細胞、細胞粒子、ウイルス、ウイルス様粒子、プラスミド、任意タイプの抗体、脂質、タンパク質、ペプチド及び核酸のような標的分子／有機体／粒子を除外するサイズ未満のものである。この媒体は、上述したタイプの大きい分子から小サイズの分子を効率的に分離する。
【００１９】
疎水性コア実体はそれ自体で疎水性であってよく、疎水性ポリマーに基づくことができる。例えば、疎水性ポリマーは、疎水性置換基を含むスチレン／エチルスチレン／ＤＶＢ、ビニルエーテル及びアクリレートのポリマー並びにフルオロアルカン含有ポリマーである。
【００２０】
別法として、疎水性コア実体がそれ自体では親水性であり、疎水性相互作用リガンドで官能化された親水性ポリマーに基づいている。疎水性相互作用リガンドは、Ｃ１〜Ｃ３０アルキル、好ましくはＣ４〜Ｃ１６アルキルのような脂肪族炭化水素、及び／又はフェニル、アントラセン、ナフタレンのような芳香族炭化水素からなり得る。リガンドにかかわらず、リガンド密度は低いイオン強度での吸着及び媒体の所望の高い疎水性を得る目的のため常に最適化すべきである。好ましくは、リガンド密度は通常のＨＩＣレベル（即ち、９０μｍｏｌ／ｍｌコア実体）より高くすべきである。
【００２１】
疎水性コア実体は、ｐＨ区間２〜１１において低いイオン強度（例えば、０〜１Ｍ、好ましくは０〜０．４Ｍ、最も好ましくは０〜０．１Ｍ）でリッドを透過し得る試料中の（最低の分子量及び／又は最小のサイズを有する）分子の吸着を可能にする。
【００２２】
一実施形態では、コア実体は前記疎水性リガンドのほかに追加のリガンドを含み、かかる追加のリガンドはコア実体上に位置し及び／又はコア実体と結合していてもよいし、及び／又は疎水性リガンド上に結合していてもよい。かかる追加のリガンドは疎水性であり得ると共に、非支配的な帯電基を含み得る。好ましくは、前記追加のリガンドは静電的相互作用リガンド（即ち、負電荷リガンド及び／又は正電荷リガンド）である。例えば、これらの追加のリガンドは正の電荷を有するオクチルアミンリガンドであってよく、かかる正の電荷はコア実体に対する負に帯電した小分子の結合を増加させる。追加される帯電リガンドの量は、主たる疎水性リガンドに対する疎水性相互作用を過度に妨害しないように調整すべきである。
【００２３】
好ましい実施形態では、コア実体及びリッドはアガロースから作製され、疎水性リガンドは４〜１６の炭素原子を含む炭化水素リガンド、好ましくはオクチルリガンドである。
【００２４】
好ましくは、コア実体は一定サイズを超える分子が細孔に入るのを防止する細孔径を有する。別法として、又はそれに加えて、リッド中にポリマーヒドロゲル（例えば、デキストラン）を供給して細孔を充填することで、細孔径をさらに減少させ、高分子量分子が細孔に入るのを防止するように調整する。
【００２５】
さらに他の実施形態では、親水性リッドは、最高の分子量及び／又は最大のサイズを有する試料中の分子と可逆的に結合する任意タイプのクロマトグラフィーリガンドを含む。小さい分子の一部も恐らくはリッドに結合するであろうが、溶離段階中にこれらはほぼ確実にリッドを透過してコアに結合するであろう。
【００２６】
プロテオーム分析のような特定の用途のためには、分離媒体のコア実体中に磁性粒子が組み込むことができる。
【００２７】
本発明はまた、上述したリッドビーズ媒体を、ＨＩＣ、ＩＥ又はアフィニティー媒体のような通常のクロマトグラフィー媒体と混合してなる分離媒体にも関する。好ましくは、リッドビーズ媒体は総媒体体積の最大１０％までを占める。このような混合媒体の好ましい実施形態では、リッドビーズ媒体はオクチルリガンドを含み、クロマトグラフィー媒体は陽イオン交換媒体からなる。このような混合媒体の利益は、大きい分子と小さい分子との分離が向上することである。
【００２８】
第２の態様では、本発明は、ｐＨ２〜１１において低いイオン強度で試料から一定サイズ未満の分子を好ましくは単一段階で吸着させるための、上述した分離媒体の使用に関する。かかる操作は、前記サイズを超える分子又は前記サイズ未満の分子を精製するために使用できる。かくしてこの態様は、分子を吸着させる段階及び任意の追加段階を含んでなる分離媒体の使用方法を含む。
【００２９】
上記に述べた細孔径は、特定の用途における標的分子のサイズと共に変化しかつそれによって決定される。この一定サイズ範囲は、好ましくは細胞、細胞粒子、細菌、ウイルス、ウイルス様粒子、プラスミド、抗体、脂質、タンパク質、ペプチド及び核酸から選択される分子／有機体／粒子のサイズ範囲に対応している。試料は例えば培養上清であり、高分子量分子はモノクローナル抗体であり得る。分離媒体は、プロテアーゼ、ペプチダーゼ及びヌクレアーゼ（例えば、トリプシン、キモトリプシン、ＤＮアーゼ及びＲＮアーゼ）のような不要の酵素を迅速に除去するため、細胞収穫時に添加するのに非常に有用である。分離媒体はクロマトグラフィーモード又はバッチモードで使用できる。任意のカラム又はバッチフォーマットが使用できる。臨床フェーズＩ及びII試験用の生物医薬品の精製のような若干の用途のためには、ＲＴＰ（レディー・トゥー・プロセス）フォーマットの使い捨てカラムが好ましい。
【００３０】
代わりの実施形態では、吸着される低分子量分子（例えば、６００００Ｄ未満の分子）が所望の分子（例えば、バイオマーカー又は薬物マーカー）であってもよい。かかる分子は、例えば溶離剤中の極性を減少させることでコア実体から溶離され、次いでさらに分析される。別の例は、脂質除去の場合のように、標的分子がコア実体中に吸着されるが、さらなる分析のためには使用されない場合である。
【００３１】
標的分子が細胞、細胞粒子、細菌、ウイルス、ウイルス様粒子、プラスミド、抗体又はタンパク質のような大きい分子／有機体／粒子である場合、それは通過画分中に得られ、したがって分離媒体によって吸着されない。
【００３２】
別法として、標的分子は、リッド上に吸着される、細胞、細胞粒子、細菌、ウイルス、ウイルス様粒子、プラスミド、抗体又はタンパク質のような大きい分子／有機体／粒子である。次いで、標的分子は選択された吸着モードに適する技法（例えば、イオン交換：塩及び／又はｐＨ勾配、ＩＭＡＣ：イミダゾール勾配、ボロネート：糖又はｐＨ勾配、ＨＩＣ：塩濃度の低下）によって溶離される。
【００３３】
本発明に係る分離媒体の好ましい使用は、モノクローナル抗体の精製のためのものである。別の好ましい使用は、標的分子が１０００ｋＤ未満の分子又は粒子である場合である。この実施形態はインフルエンザウイルスのようなウイルスの精製のために適するばかりでなく、ＩｇＭ抗体のような他の大きい分子に対しても適している。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、試験した３種のビーズデザインを図示したものである。１Ａ：Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ２０  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（２０％アガロース粒子）及びスピニングディスク媒体、並びに１Ｂ：デキストランリッドＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ。ＩｇＧ＝モノクローナル抗体、Ｐ＝約７００００未満の分子量を有するタンパク質。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明は、マトリックス中に親水性領域及び疎水性領域の両方を有するクロマトグラフィー媒体であって、それ自体では疎水性であるマトリックス又は疎水性リガンドを有する親水性マトリックスに基づくことができ、親水性の外層を具備しているクロマトグラフィー媒体に関する。かかる媒体はまた、疎水性リガンド（例えば、ビーズ中の疎水性内部コア）で内部が官能化された親水性マトリックスに基づくこともできる。
【００３６】
合成経路の例は下記の通りである。
●それ自体で疎水性の出発原料（例えば、ＤＶＢビーズ）を親水性の多孔質層で覆う。
●それ自体では親水性の出発原料を疎水性官能基で完全に官能化し、次いで親水性の多孔質層で覆う。親水性マトリックスの層活性化を行い、内部に疎水性リガンドを結合する（図１）。
●疎水性マトリックスの層活性化を行い、外部を親水性官能化する。
【００３７】
本発明はまた、抗体のような高分子量分子を液体の他の成分から分離する方法であって、要求される時間及びプロセス段階が先行技術の方法より少ない方法を提供する。これは、抗体のような所望の高分子量分子を含む液体をクロマトグラフィー媒体に接触させ、実質的に純粋な高分子量分子を非結合モード又は可逆的結合モードで回収する方法によって達成される。別の利点は、宿主細胞タンパク質のような低分子量分子が非常に低いイオン強度でも媒体の内部に吸着することである。
【００３８】
クロマトグラフィー媒体の支持体マトリックス及びコア実体は、有機又は無機材料に基づくことができる。それは好ましくは、水に不溶であるが水中で多少とも膨潤し得る有機ポリマーからなる。好適なポリマーは、例えば多糖類に基づく、アガロース、デキストラン、セルロース、デンプン、プルランなどのポリヒドロキシポリマー、並びにポリアクリル酸アミド、ポリメタクリル酸アミド、ポリ（ヒドロキシアルキルビニルエーテル）、ポリ（ヒドロキシアルキルアクリレート）、ポリメタクリレート（例えば、ポリグリシジルメタクリレート）、ポリビニルアルコール、スチレンやジビニルベンゼンに基づくポリマー、及び上述のポリマーに対応するモノマーの２種以上を含むコポリマーのような完全合成ポリマーである。水に可溶なポリマーを、例えば架橋により、及び吸着又は共有結合を介して不溶性物体に結合することにより、不溶性になるように誘導体化することができる。ＯＨに転化し得る基を示すモノマーのグラフト重合により、或いは例えば親水性ポリマー及び他の親水性化合物のような適当な化合物の結合又は吸着による最終ポリマーの親水化により、疎水性ポリマー（例えば、モノビニル及びジビニルベンゼンのコポリマー）上に親水基を導入することができる。エポキシド又は反応性ハロゲン化物を含む反応も使用できる。
【００３９】
支持体マトリックス中に使用すべき好適な無機材料は、シリカ、ガラス、酸化ジルコニウム、黒鉛、酸化タンタルなどである。
【００４０】
好ましい支持体マトリックスは、シラノール基、エステル基、アミド基及びシリカ自体の中に存在する基のような、加水分解に対して不安定な基を含まない。
【００４１】
本発明の特に興味深い実施形態では、支持体マトリックスは、高性能用途のためには１〜１０００μｍ、好ましくは５〜５０μｍの範囲内のサイズ、そして調製目的のためには５０〜３００μｍの範囲内のサイズをもった不規則粒子又は球状粒子の形態を有する。
【００４２】
興味深い形態の支持体マトリックスは、発酵供給液のような使用すべき液体試料又は緩衝液より高い密度又は低い密度を有する。この種のマトリックスは、流動床又は膨張床クロマトグラフィー並びに（例えば、撹拌槽内での）様々なバッチ操作のための大規模作業において特に適用可能である。流動床及び膨張床操作は、国際公開第９２／１８２３７号及び同第９２／００７９９号に記載されている。これらのマトリックスの最も実際的な使用は、流動化液体の密度より高い密度をもった粒子／ビーズを上昇流と組み合わせることであった。膨張床モードにおけるこの種の支持体マトリックスは、試料溶液が粒状で粘着性の物質を含む場合に特に有益である。
【００４３】
「親水性支持体マトリックス」という用語は、実際問題としては、マトリックスのアクセス可能な表面が親水性であってタンパク質にやさしいこと（即ち、表面がタンパク質を不可逆的に吸着して変性させないこと）を意味している。通例、親水性ベースマトリックス上のアクセス可能な表面は、例えば酸素及び／又は窒素原子を含む複数の極性基を暴露している。かかる極性基の例は、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシ、スルホネート（Ｓ及びＳＰリガンド）、エステル、低級アルキルのエーテル（例えば、(−ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−)nＨ（式中、ｎは２、３、４又はそれ以上の整数である。））である。
【００４４】
場合によっては親水性増量剤からなる親水性表面コートは、概念的には支持体マトリックスに属する。
【００４５】
通常／既定のＨＩＣ媒体では、タンパク質の結合を達成するため、移動相への塩の添加による極性の増加が必要とされる。次いで、結合したタンパク質は塩の濃度を低下させることでマトリックスから分離される。このように、この方法の欠点は原料への塩の添加が必要なことである。これは、大規模ユーザーにとって問題を引き起こし、結果としてコストの増加をもたらすことがある。通常のＨＩＣ媒体へのタンパク質の吸着は、０．７５〜４Ｍの塩濃度で実施されるのが普通である（Ｊａｎｓｓｏｎ，Ｊ．−Ｃ．ａｎｄ  Ｒｙｄｅｎ，Ｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，ｐｐ．２２０−２２１）。
【００４６】
本発明は、分離マトリックスの疎水性コア中に浸透するのに十分なだけ小さい分子（例えば、ＨＣＰ）との相互作用を最大にすると共に、試料中の最も大きいタンパク質（例えば、ＭＡｂ精製プロセスにおけるＭＡｂ分子及びＭＡｂ二量体）との相互作用を最小にする媒体に関する。さらに、本発明の一実施形態は、余分の塩添加を行わない移動相を使用できること、及び中性又はほぼ中性のリッド（非結合性のリッド）を有する実施形態に関して所望の高分子量分子又は有機体を回収するために溶離緩衝液（脱着緩衝液）を必要としないことを可能にする。
【００４７】
宿主細胞タンパク質を捕獲するが大きいモノクローナル抗体は捕獲しないことを目標とするビーズの設計に関して３つの異なるアプローチを試験した。１つのアプローチでは、大きいタンパク質（モノクローナル抗体）を排除する多孔度をもったビーズを得るため、高いアガロース含有量（２０％）に基づくアガロースビーズが設計された（図１Ａ）。別のアプローチでは、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ及びゲル濾過リッドに基づく原型が製造された。リッドは、ビーズの外部セグメントにデキストランをカップリングすることで得られた。デキストランを充填したセグメント中に得られる細孔径は、ｍＡｂｓのような大きい分子がビーズのコアに入るのを防止するように設計される（図１Ｂ）。第３のアプローチは、同時係属中のスウェーデン特許出願第ＳＥ０８００２６３−６号に記載されたスピニングディスク媒体に基づいている。この場合にも、ビーズは、同一所有権者の層活性化特許第ＥＰ０９６６４８８号（Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）に記載されたようにして達成される中性外部セグメントの導入により、大きいタンパク質を排除するように設計された（図１Ａ）。
【００４８】
様々な原型に疎水性リガンドを結合する際には、合成方法を用いてリガンドがビーズの表面に結合するのを防止し、かくしてビーズの外部に対するモノクローナル抗体の疎水性相互作用による吸着も排除する。原型はリッド−ＯＨ／コア−オクチル媒体と呼ばれるが、これはオクチルリガンドがビーズのコア中にのみ結合していることを意味する。さらに、ビーズのコア中におけるリガンドの量は、生体分子のクロマトグラフィーにとって適切な任意のｐＨの調整された非常に低いイオン強度を有する吸着緩衝液を用いて宿主細胞タンパク質が吸着されるように調整される。
【実施例】
【００４９】
実験の部
本実施例は例示目的のためにのみ示されるものであり、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明を限定するものと解すべきでない。
【００５０】
実施例１：Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ２０  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａ）、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ｂ）及びスピニングディスク媒体（Ｃ）に基づくオクチル媒体の製造
マトリックスの体積とは沈降層の体積をいい、グラム単位で示したマトリックスの重量とは真空乾燥重量をいう。大規模反応の場合、磁石棒撹拌機の使用はビーズを痛めやすいので、撹拌とは懸垂型電動撹拌機のことをいう。小規模反応（最大２０ｍＬまでのゲル）は密閉バイアル内で実施され、撹拌とは振動テーブルの使用をいう。
【００５１】
官能性の分析及びアリル化度、エポキシ化度又はビーズ上のイオン交換基の置換度の測定のためには通常の方法を使用した。
【００５２】
Ａ：リッド−ＯＨ／コア−オクチルＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ２０  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗの製造
Ａ１：Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ２０  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗの製造
アガロース（５０ｇ）を、９５℃で約１０時間加熱することで水（２５０ｇ）に溶解した。溶液を乳化容器内のトルエン（３７５ｍＬ）及びエチルセルロース（３５ｇ）に添加し、温度を７０℃に保った。乳化容器は羽根撹拌機を備えていた。温度を７０℃に保ちながら、撹拌機の速度を１５０ｒｐｍから３４０ｒｐｍまで段階的に増加させた。顕微鏡によってアガロース粒子が所望のサイズを有すると判定された時点で、速度を１５０ｒｐｍに減少させた。その後、乳濁液を冷却し、ビーズをゲル化させた。ビーズをエタノール及び水で洗浄した。
【００５３】
２５０ｍＬのビーズに水を添加して総重量を３１０ｇにした。この懸濁液に、３８ｇのＮａ2ＳＯ4、３．０ｍＬの５０％ＮａＯＨ及び０．２５ｇのＮａＢＨ4を添加し、温度を４７℃に上昇させた。次いで、エピクロロヒドリン（３１．４ｍＬ）及び水酸化ナトリウム溶液（２１．６ｍＬ）をポンプで６時間かけて添加した。添加の完了後、反応を４７℃で一晩続けた。次いで、スラリーを冷却し、６０％酢酸でｐＨ５〜６に中和した。最後に、ゲルをガラスフィルター上において蒸留水で注意深く洗浄した。その後、ビーズを４３μｍ及び１６６μｍの濾布上にふるい分けした。
【００５４】
Ａ２：ＯＨ−リッドアリルＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ２０  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗの製造
アリル活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ２０  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ。５０ｇの水切りしたＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ２０  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ウプサラ、スウェーデン）を１５ｍＬの５０％ＮａＯＨ溶液、６ｇのＮａ2ＳＯ4及び０．１ｇのＮａＢＨ4と混合した。混合物を５０℃で１時間撹拌し、次いで３０ｍＬのアリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）を添加した。反応スラリーを５０℃で１７時間撹拌した。次いで、ゲルをガラスフィルター上において蒸留水、エタノール及び最後に再び蒸留水で洗浄した。
【００５５】
部分臭素化及びＮａＯＨ処理（ＯＨ−リッドの形成）。１０ｍＬの水切りしたアリル化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ２０  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを５ｍＬの蒸留水及び０．４ｇの酢酸ナトリウム中で撹拌した。キャップ付きバイアル内で１０ｍＬの蒸留水に溶解した１２５μＬの臭素を添加し、撹拌を５分間続けた。水で洗浄した後、水切りしたゲルを７．５ｍＬの２Ｍ  ＮａＯＨと共に５０℃で１５時間撹拌し、次いで水で洗浄した。ビーズのコア中における残留アリル含有量を滴定によって測定したところ、０．３７ｍｍｏｌ／ｍＬであった。
【００５６】
Ａ３：コアカップリング
ビーズのコア中におけるオクチルのカップリング。４．５ｍＬのＯＨ−リッドアリルＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ２０  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（上記参照）を完全に臭素化して洗浄した。水切りしたゲルを４．５ｍＬの２Ｍ  ＮａＯＨ及び１ｍＬのエタノール中における１．２５ｍＬのオクタンチオールの溶液と混合し、次いで５０℃で１６時間撹拌した。水、エタノール及び水で洗浄した後、ゲルを２０％エタノール中で貯蔵した。
【００５７】
Ｂ：リッド−デキストラン／コア−オクチルＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗの製造
Ｂ１：デキストランリッドアリルＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗの製造
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗのアリル化。Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを上記に従ってアリル化し、アリル含有量を滴定によって測定したところ２５９μｍｏｌ／ｍＬであった。
【００５８】
部分臭素化。アリル化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（１００ｍＬ）をフラスコ内に秤取し、９００ｍＬの蒸留水及び１．３ｇの硫酸ナトリウムを添加した。次いで、激しく撹拌しながら０．３当量の臭素（４００μＬ）をピペットで添加した。（臭素が消費された）約５分後、ゲルをガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。
【００５９】
デキストランカップリング。５１ｍＬの部分臭素化ゲルをフラスコに移し、１２５ｍＬの蒸留水中における３０ｇのＤｅｘｔｒａｎ  ＡＢの溶液を添加した。３０分間撹拌した後、１０ｇのＮａＯＨ及び０．５ｇのＮａＢＨ4を添加し、スラリーを５０℃に加熱し、一晩撹拌し続けた。約１８時間後、ｐＨを酢酸（６０％溶液）で約７に調整した。次いで、ゲルをガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。
【００６０】
Ｂ２：コアカップリング
ビーズのコア中におけるオクチルのカップリング。１０ｍＬの水切りしたゲル（デキストラン結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、上記参照）を蒸留水と共にビーカーに入れ、激しいオーバーヘッド撹拌を開始した。スラリーが残留する濃いオレンジ色／黄色を示すまで臭素を添加した。１０分間の撹拌後、スラリーが完全に退色するまでギ酸ナトリウム（約１．５ｇ）を添加した。次いで、ゲルをガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。水切りした臭素化ゲルをフラスコ内に秤取し、１０ｍＬの蒸留水及び２．３ｍＬのオクタンチオールを添加した。次いで、ｐＨをＮａＯＨ（５０％溶液）で約１２．５に調整した。次いで、混合物を５０℃で一晩撹拌し続けた。２０時間後、ゲルを蒸留水及びエタノールで洗浄した。
【００６１】
Ｃ：リッド−ＯＨ／コア−オクチルスピニングディスク媒体の製造
Ｃ１：スピニングディスク媒体の製造
６％アガロース溶液を出発原料として使用した。多孔性応答に関連して温度、冷却速度、粘度、回転速度及び（ディスクへの）アガロース流量を検討した。
【００６２】
スピニングディスク装置は、所定の仕様（下記参照）に従ってＡＢＢ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｓｅｒｖｉｃｅ社により製造された。
鋼品質：ＳＳ  ２３４３−０２（すべての規定品目について）
ポリマー材料：ＰＴＦＥ、ポリカーボネート（ドーム保護）、ＥＰＤＭ（エチレンプロピレンジエンモノマー）、シリコーンゴム
ドーム高さ：９００ｍｍ
捕獲ベースン直径：排水路を含めて２４００ｍｍ
捕獲ベースン勾配：３°
ディスク数：６
ディスク直径：２００ｍｍ
全体のディスク厚さ：最大５．２ｍｍ
エッジでのディスク厚さ：１３５°の勾配を含めて１２．４ｍｍ
上部圧力補償室の直径（アガロース溶液用）：７３ｍｍ
上部圧力補償室の高さ：６ｍｍ
分配ニードルの数：６
ニードルの内径：０．７ｍｍ
アガロース溶液をニードルによって６枚のディスクに供給した。１枚でなく６枚のディスクを使用することで、能力の増大が得られる。６枚のディスクの各々に対するアガロース流量は同一であった。これは、各ディスクに由来するビーズサイズが同一であることを意味する。ディスクの回転速度範囲は３００１〜３０１０ｒｐｍ以内に調整され、ドーム内の相対湿度は１００％であった。相対湿度が１００％未満であれば、アガロース液滴から水が蒸発するリスクが存在する。
【００６３】
６９．７℃及び３９７〜４２１ｍＰａｓの範囲内の粘度に調整された６％アリル化アガロース溶液を用いてスピニングディスクに供給した。ディスクへのアガロース溶液の流量は、１７０ｍＬ／分に調整した。捕獲水温は２０．１℃であった。
【００６４】
エピクロロヒドリンで架橋させた後のスピニングディスクビーズの多孔度を表１に示す。多孔度は様々なデキストランを用いて推定し、ボイド容積はブルーデキストラン２０００を用いて求めた。スピニングディスク原型は、免疫グロブリンをビーズに浸透させない多孔度が得られるように製造した。これは、約１５００００ｇ／ｍｏｌより大きい分子量をもった分子はビーズ中に拡散するはずがないことを意味している。
【００６５】
【表１】
0005643747.tif 000002
粒度は１９０μｍ±５μｍであった。スピニングディスク原型を用いて、約７００００ｇ／ｍｏｌ未満の分子量をもったタンパク質を捕獲するための媒体を製造したが、免疫グロブリン（ヒトＩｇＧ）のようなそれより大きい分子はビーズ中に拡散してビーズのコア中のリガンドと相互作用することはできないはずであった。
【００６６】
Ｃ２：ＯＨ−リッドアリルスピニングディスク媒体の製造
アリル活性化スピニングディスク媒体。スピニングディスク媒体をガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。ゲル（２５ｍＬ）をフィルター上で水切りし、三つ口丸底フラスコ内に秤取した。ＮａＯＨ（２０ｍＬ、５０％溶液）を添加し、機械的撹拌を開始した。水素化ホウ素ナトリウム（０．１ｇ）及び硫酸ナトリウム（２．９ｇ）をフラスコに添加し、スラリーを水浴上で５０℃に加熱した。約１時間後、２７．５ｍＬのアリルグリシジルエーテルを添加した。次いで、スラリーを一晩激しく撹拌し続けた。約２０時間後、スラリーをガラスフィルターに移し、ｐＨを酢酸（６０％）で約７に調整した。次いで、ゲルを蒸留水（×４）、エタノール（×４）及び蒸留水（×４）で洗浄した。次いで、アリル含有量を滴定によって測定したところ、３２１μｍｏｌ／ｍＬであった。
【００６７】
部分臭素化及びＮａＯＨ処理（ＯＨ−リッドの形成）。アリル化ゲル（１１．６ｍＬ）をフラスコ内に秤取し、９０ｍＬの蒸留水及び１ｇの硫酸ナトリウムを添加した。次いで、激しく撹拌しながら０．３当量の臭素（５７μＬ）をピペットで添加した。（臭素が消費された）約５分後、ゲルをガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。５ｍＬの部分臭素化ゲルを水溶液としてフラスコに移した。次いで、ＮａＯＨ（５０％溶液）を添加してｐＨ＞１３とし、スラリーを５０℃に加熱し、一晩撹拌し続けた。約１８時間後、ｐＨを酢酸（６０％溶液）で約７に調整した。次いで、ゲルをガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。
【００６８】
Ｃ３：コアカップリング
ビーズのコア中におけるオクチルのカップリング。５ｍＬの水切りしたＯＨ−リッドスピニングディスク媒体を蒸留水と共にビーカーに入れ、激しいオーバーヘッド撹拌を開始した。スラリーが残留する濃いオレンジ色／黄色を示すまで臭素を添加した。１０分間の撹拌後、スラリーが完全に退色するまでギ酸ナトリウム（約１．５ｇ）を添加した。次いで、ゲルをガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。
【００６９】
水切りした臭素化ゲルをフラスコ内に秤取し、１０ｍＬの蒸留水及び２ｍＬのオクタンチオールを添加した。次いで、ｐＨをＮａＯＨ（５０％溶液）で約１２．５に調整した。次いで、混合物を５０℃で一晩撹拌し続けた。２０時間後、ゲルを蒸留水及びエタノールで洗浄した。
【００７０】
実施例２：ビーズのコア中のオクチルリガンドに基づく３種の原型のクロマトグラフィー評価
ブレイクスルー容量に関して検討すべき３種のオクチル媒体（原型：リッド−ＯＨ／コア−オクチルＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ２０  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、リッド−ＯＨ／コア−オクチルスピニングディスク及びリッド−デキストラン／コア−オクチルＳｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ）をＨＲ５／５カラムに充填し、緩衝液で平衡化した後、カラム中に試料溶液を０．３又は１．０ｍＬ／分の流量でポンプ輸送した。ブレイクスルー容量は、最大ＵＶ検出器信号（２８０ｎｍ）の１０％で評価した。最大ＵＶ信号は、試験溶液を検出器内部に直接ポンプ輸送することで推定した。最大吸光度の１０％でのブレイクスルー容量（Ｑb10%）は下記の式に従って計算した。
Ｑb10%＝（ＴR10%−ＴRD）×Ｃ／Ｖc
式中、ＴR10%は最大吸光度の１０％での保持時間（分）、ＴRDは系中の空隙時間（分）、Ｃは試料の濃度（４ｍｇタンパク質／ｍＬ）、Ｖcはカラム容積（ｍＬ）である。ブレイクスルー容量測定で使用した吸着緩衝液は、２５ｍＭ  ＴＲＩＳ（ｐＨ８．０）又は５０ｍＭ酢酸塩（ｐＨ４．７５）であった。
【００７１】
リッド−ＯＨ／コア−オクチルＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ２０  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ原型はまた、通過モードで清澄供給液を用いて試験した。原型を充填したＨＲ５／５カラムに供給液（３２ｍＬ）をポンプ輸送し、通過画分（３６ｍＬ）を宿主細胞タンパク質（ＨＩＣ）の量及びモノクローナル抗体の回収量に関して分析した。これらの実験で使用した吸着緩衝液は、ｐＨ７．２に調整された２５ｍＭリン酸緩衝液であった。
【００７２】
Ａ：試料
ブレイクスルー測定のために使用した試料は、ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ、Ｇａｍｍａｎｏｒｍ）、オボアルブミン及びリゾチームであった。タンパク質は４ｍｇ／ｍＬの濃度で吸着緩衝液に溶解し、一度に１種のタンパク質のみをカラムに適用した。
【００７３】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＮＳ０細胞で発現させたＩｇＧ１であった（ＩＥＦに基づき、そのｐｌは７．５〜８．４の範囲内にある）。濾過した非精製細胞培養上清を試料として使用した。試料中のｍＡｂ濃度は１．３ｍｇ／ｍＬであり、３２ｍＬの試料をカラム（リッド−ＯＨ／コア−オクチルＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ２０  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ原型を充填したＨＲ５／５カラム）に適用した。モノクローナル抗体の製造で使用した増殖培地は、ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社）及び１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、Ｇｉｂｃｏ社）であった。
【００７４】
Ｂ：機器
装置
ＬＣシステム：ＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０ＸＴ又は同等品
ソフトウェア：ＵＮＩＣＯＲＮ
カラム：ＨＲ５／５
機器パラメーター
流量：０．３、０．５又は１．０ｍＬ／分
検出器セル：１０ｍｍ
波長：２８０ｎｍ
Ｂ１：ＵＮＩＣＯＲＮ法
ブレイクスルー実験で使用した主な方法を以下に記載する。
０．００  ベースＣＶ１．００｛ｍＬ｝＃カラム容積｛ｍＬ｝任意
０．００  ブロック  開始条件
０．００  ベース  メインと同じ
０．００  波長２８０｛ｎｍ｝２５４｛ｎｍ｝２１５｛ｎｍ｝
０．００  平均化時間２．５６｛秒｝
０．００  アラーム圧力エネーブル３．００｛ＭＰａ｝０．００｛ＭＰａ｝
０．００  エンドブロック
０．００  ブロック  カラム位置
０．００  ブロック  平衡化
０．００  ベース  メインと同じ
０．００  ポンプＡ入口  Ａ１
０．００  緩衝液弁Ａ１  Ａ１１
０．００  流量０．３｛ｍＬ／分｝
１．００  セットマーク（）＃カラム名
３．９    オートゼロＵＶ
５．０    ＃平衡化体積  エンドブロック
０．００  ブロック  試料ローディング
０．００  ベース容積
０．００  流量（１）＃流量｛ｍＬ／分｝
０．００  セットマーク（）＃試料
０．００  注入弁  注入
０．００  監視（１００）＃２０％最大吸光度超ＵＶ｛ｍＡｕ｝エンドブロック
４９．００  注入弁  ロード
４９．００  エンドブロック
０．００  ブロック  カラム洗浄
０．００  ベース  メインと同じ
０．００  注入弁ロード
０．００  監視オフＵＶ
０．００  ポンプＡ入口  Ａ１
０．００  緩衝液弁Ａ１  Ａ１１
０．００  監視（２０）＃５％未満ＵＶ｛ｍＡｕ｝エンドブロック
２０．００  エンドブロック
０．００  ブロック  勾配溶出
０．００  ベース  メインと同じ
０．００  ポンプＢ入口  Ｂ１
０．００  勾配１００｛％Ｂ｝２．００｛ベース｝
０．００  流量０．３０｛ｍＬ／分｝
１０．００  勾配０．００｛％Ｂ｝０．００｛ベース｝
１０．００  エンドブロック
０      ブロック  再平衡化
０．００  エンドメソッド
Ｃ：宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）分析
ＥＬＩＳＡ用の試料を、１０％  ２．０Ｍ  Ｔｒｉｓ，１％  ＢＳＡ，０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ８．０（４５０μＬの試料に５０μＬのＢＳＡ溶液）の添加によって予備処理した。試料を「試料希釈緩衝液（Ｓａｍｐｌｅ  Ｄｉｌｕｅｎｔ  Ｂｕｆｆｅｒ）」（カタログ番号Ｆ２２３Ａ、Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で希釈し、キット中性に規定された「高感度プロトコル」を使用しながらＮＳ／０  ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号Ｆ２２０、Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で分析した。プレートの読取り及び評価のためには、分光光度計ＶＥＲＳＡ  ｍａｘ及びソフトウェアＳｏｆｔＭａｘ（商標）を使用した。
【００７５】
Ｄ：結果
Ｄ１：リッド−ＯＨ／コア−オクチルＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ２０  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ
リッド−ＯＨ／コア−オクチルＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ２０  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗは、コアリガンドとしてオクチルを有するＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ２０  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗに基づいている。基礎マトリックスＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ２０  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗは、モノクローナル抗体がビーズに浸透するのを防止する多孔度を得るため、高いアガロース含有量を有するように設計されている。この場合、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ２０  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗは高度のアリル基（０．３７ｍｍｏｌ／ｍＬ）で活性化されたが、これはビーズのコア中に高いリガンド含有量が得られたことを意味している。
【００７６】
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ２０  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗに基づく原型（リッド−ＯＨ／コア−オクチルＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ２０  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ）に関するリゾチーム及びＩｇＧのブレイクスルー容量を試験した。吸着緩衝液としては２５ｍＭ  ＴＲＩＳ（ｐＨ＝８．０）を使用し、１．０Ｍ  ＮａＯＨ＋３０％イソプロパノールを脱着緩衝液として使用し、流量は１．０ｍＬ／分に調整した。原型をＨＲ５／５カラムに充填した。
【００７７】
試験の結果、ＩｇＧは吸着されなかった（Ｑb10＝０）のに対し、リゾチームは約１０ｍｇ／ｍＬのブレイクスルー容量（Ｑb10）を有していた。これらの結果は２５ｍＭ  ＴＲＩＳ（ｐＨ＝８．０）を移動相として使用して得られ、したがって小さいタンパク質の吸着を達成するために余分の塩添加が不要であることを明確に示している点に注目できる。
【００７８】
このタイプの媒体は、主としてただ１回のサイクルのために使用することを目指している。しかし、吸着された宿主細胞タンパク質を溶離することも可能である。これを立証するため、１．０Ｍ  ＮａＯＨ＋３０％イソプロパノールを脱着緩衝液として使用することで吸着されたリゾチームを溶離した。
【００７９】
Ｄ２：リッド−デキストラン／コア−オクチルＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ
この原型は、ＩｇＧがマトリックス中に拡散することを可能にする多孔度を有するＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗに基づいている。したがって、図１に従い、デキストランを付着させることでビーズの外部の細孔径を縮小させ、かくしてＩｇＧがビーズ中に拡散するのを防止した。表２によれば、ＩｇＧのブレイクスルー容量は０ｍｇ／ｍＬであったが、これはＩｇＧがビーズ中に拡散しないことを明確に証明している。しかし、オボアルブミンに関しては比較的高いブレイクスルー容量（１６ｍｇ／ｍＬ）が認められた。オボアルブミン及びＩｇＧの分子量は、それぞれ約４３０００ｇ／ｍｏｌ及び１５００００ｇ／ｍｏｌである。これは、デキストランリッドが高い「サイズ選択性」を有していて、オボアルブミンをビーズ中に拡散させ得るのに対し、ＩｇＧがコアリガンドと相互作用するのは防止することを意味している。
【００８０】
【表２】
0005643747.tif 000003
Ｄ３：リッド−ＯＨ／コア−オクチルスピニングディスク
ブレイクスルー測定。リッド−ＯＨ／コア−オクチルスピニングディスクは、コアリガンドとしてオクチルを有するスピニングディスクビーズに基づいている。スピニングディスク媒体は、モノクローナル抗体がビーズに浸透するのを防止する多孔度を得るように設計された。スピニングディスク原型は高度のアリル基（０．３２ｍｍｏｌ／ｍＬ）で活性化されたが、これはビーズのコア中に高いリガンド含有量が得られたことを意味している。さらに、ビーズの外部にはいかなるリガンドも結合されなかった（ビーズの製法を参照されたい）。表１によれば、ＩｇＧのブレイクスルー容量は非常に低かった（０．６ｍｇ／ｍＬ）のに対し、オボアルブミンの容量は２３倍高かった。これらの結果が示す通り、スピニングディスク原型の多孔度は非常に少ない量のＩｇＧがビーズのコア中に拡散し得ることを意味している。
【００８１】
ｍＡｂ供給液の適用。いかなる他のクロマトグラフィーカラムにも通したことのない清澄供給液を、リッド−ＯＨ／コア−オクチルスピニングディスク原型を充填したＨＲ５／５カラムに適用した。カラムを通過モードで操作し、通過画分を試料採取し、ｍＡｂの回収率及び宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の量について分析した。
【００８２】
３２ｍＬのｍＡｂ（１．３ｍｇ  ｍＡｂ／ｍＬ）を、リッド−ＯＨ／コア−オクチルスピニングディスク原型を充填したＨＲ５／５カラムに適用した。吸着緩衝液としては２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ＝７．２）を使用し、１．０Ｍ  ＮａＯＨ＋３０％イソプロパノールを脱着緩衝液として使用した。流量は０．５ｍＬ／分に調整し、３６ｍＬの通過画分を試料採取した。
【００８３】
表３中に、回収率及びＨＣＰ測定から得られた結果を示す。ＨＣＰ含有量は５０％以上も減少し、ｍＡｂの回収率は８９％であった。
【００８４】
【表３】
0005643747.tif 000004
実施例３：インフルエンザウイルスの精製
インフルエンザワクチンを目標にしてインフルエンザウイルスを大規模に製造する場合、最終製剤中のタンパク質及びＤＮＡのレベルを低下させることが重要である。
【００８５】
本発明の粒子はウイルスの精製のために良く適している。ウイルス粒子は、大部分の夾雑物よりサイズが顕著に大きいからである。
【００８６】
これを以下の実施例で例示する。
【００８７】
分析方法
ウイルス濃度
ＤｏｔＢｌｏｔ  ＨＡアッセイを標準プロトコルに従って使用した。
【００８８】
ＤＮＡ濃度
ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ＤＮＡアッセイを（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から入手できる）製造者の取扱説明書に従って使用した。
【００８９】
タンパク質濃度
Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社から入手できる）製造者の取扱説明書に従って使用した。
【００９０】
ＤＮＡ試料中の分子量分布の分析のためのアガロースゲル電気泳動
Ｅ−Ｇｅｌ（登録商標）Ａｇａｒｏｓｅ  Ｇｅｌ  ０．８％（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）プレキャストゲルを製造者の取扱説明書に従って使用した。
【００９１】
使用したＤＮＡラダーは１ｋｂ  Ｐｌｕｓ  ＤＮＡマーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）であった。
【００９２】
試料
自家製造したインフルエンザウイルス試料を本実験で使用した。ウイルスは、細胞溶解が起こるまでＭＤＣＫ細胞中で増殖させた。インフルエンザウイルス株Ａ／Ｈ１Ｎ１／Ｓｏｌｏｍｏｎ  Ｉｓｌａｎｄｓを使用した。細胞溶解後、材料を限外濾過（ＵＦ）段階で約１０×に濃縮し、ダイアフィルトレーション（ＤＦ）段階（Ｈｏｌｌｏｗ  Ｆｉｂｅｒ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ  ５００ｋＤａ）でさらに約２×に濃縮した。ダイアフィルトレーション緩衝液は５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．３であり、試料は使用時まで凍結した。
【００９３】
クロマトグラフィー方法及び結果
カラム：厚さ７μｍの中性外層及び内部にリガンドとしてオクチルアミンを有する本発明の粒子を充填した２ｍＬ  Ｔｒｉｃｏｒｎ  ５／１００カラム。この実施例での粒子はアガロース粒子である。
【００９４】
１０ｍＬのインフルエンザウイルス試料を７５ｃｍ／時の流量で適用した。通過画分を集めた。
【００９５】
出発原料及び通過画分をウイルス濃度、ＤＮＡ濃度及びタンパク質濃度について分析した。ウイルス回収率、ＤＮＡ除去率及びタンパク質除去率を計算した。結果を表４及び表５に示す。
【００９６】
【表４】
0005643747.tif 000005
【００９７】
【表５】
0005643747.tif 000006
上記の結果は、この精製段階の主な機能である良好なタンパク質除去率が得られることを示している。ＤＮＡ除去率は低く、これはこの特定の試料中に高分子量ＤＮＡが存在することによって説明できる。
【００９８】
約５００塩基対までの分子量を有するＤＮＡは効率的に除去される一方、それより大きいＤＮＡは細孔構造に入り、粒子の内部に位置する正に帯電したオクチルアミンリガンドに結合することができない。
【００９９】
このような場合には、通常の陰イオン交換段階のような第２の精製段階で大きいＤＮＡを除去することができよう。
【０１００】
別法として、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）のようなヌクレアーゼで試料を処理することで、分子量を５００塩基対より十分に低く低下させることができる。かくして、本発明の粒子を充填したカラムにインフルエンザウイルス試料を通した場合にほとんど完全なＤＮＡ及びタンパク質除去を達成することができる。
【図１】
0005643747.tif 000007