(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体のタンパク質混合物を濾過する方法であって、
第１の圧力（Ｐ１）で液体混合物を提供するステップであって、該液体混合物は、担体液体と、該担体液体に対して第１の濃度（Ｃ１）のタンパク質と、分散した混入物とを含む、ステップと、
該液体混合物をデッドエンドフィルタに通過させて、第２の圧力（Ｐ２）で濾液を形成するステップであって、該濾液は、該担体液体と、該担体液体に対して第２の濃度（Ｃ２）のタンパク質とを含み、Ｐ１およびＰ２は周囲圧力より高く、該フィルタは、該液体混合物から該分散した混入物の少なくとも一部を除去するサイズである、ステップと、
濾液の平均流速が少なくともフィルタ表面積の少なくとも３００ｇ／ｍｉｎ・ｍ２となり、かつ／または該第１の圧力と第２の圧力との圧力差（Ｐ１−Ｐ２）が０ｍｂａｒより大きく３００ｍｂａｒ以下にする逆圧を、濾液に対して加えるステップと
を含み、該液体混合物中に存在するタンパク質の少なくとも８５％が、該濾液中に回収される、方法。
【請求項２】
前記タンパク質が剪断に感受性のあるタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質が血液凝固カスケードのタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記圧力差が、９０ｍｂａｒ以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記液体混合物中に存在するタンパク質の少なくとも９５％が前記濾液中に回収される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記液体混合物中に存在するタンパク質の少なくとも９９％が前記濾液中に回収される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の圧力（Ｐ１）は、少なくともゲージ圧２００ｍｂａｒである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記担体液体は水を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記タンパク質は、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）、第ＶＩＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記分散した混入物は、微生物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記濾液は、前記分散した混入物を実質的に含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記フィルタは、多孔性メンブレンであり、該多孔性メンブレンは０．１μｍ〜０．５μｍのサイズの孔を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記孔は０．２μｍまたは０．２２μｍのサイズである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記液体混合物はさらに微生物個体群を含み、該個体群の少なくとも一部が、前記多孔性メンブレンフィルタによって水性混合物から除去される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記デッドエンドフィルタが逆圧調節バルブを含み、前記逆圧は該バルブを用いて加えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記圧力差は、１５０ｍｂａｒ以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記逆圧の付加は、低剪断性の環境を提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記タンパク質はｖＷＦである、請求項９に記載の方法。
【請求項１９】
前記タンパク質は第ＶＩＩＩ因子である、請求項９に記載の方法。
【請求項２０】
前記タンパク質は第ＸＩＩＩ因子である、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
米国特許法第１１９条（ｅ）項の下、２００７年１２月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／０１７，４１８号の利益が本明細書において主張され、この米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
開示の分野
本開示は全般的にはタンパク質を精製するための濾過方法に関する。本開示は特に、たとえば流体中で輸送されるときに剪断力による損傷の影響を受けやすいタンパク質（たとえば剪断に感受性のあるタンパク質（ｓｈｅａｒ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、血液凝固カスケードのタンパク質）の低剪断性の逆圧滅菌濾過に関する。
【０００３】
関連技術の簡単な説明
精製されたタンパク質混合物は、種々の治療上の使用のために患者に投与することができる。患者に注入するために調製された、精製されたタンパク質混合物は、使用の前に滅菌しなければならない。数種のタンパク質の好適な滅菌プロセスは、精製されたタンパク質混合物のメンブレン濾過を含む。フィルタメンブレンは、粒子、微生物、および数種のウイルスを保持（すなわち、タンパク質混合物から除去）する一方で、タンパク質がメンブレンを通過することができるように、サイズ調整することが可能である。
【０００４】
しかしメンブレン濾過などの従来の方法を用いると、精製され、滅菌されたタンパク質として効率的に回収されないタンパク質もある。このことは、剪断に感受性のあるタンパク質および／または血液凝固カスケードの一部であるタンパク質の濾過を試みたとき、最も顕著である。このようなタンパク質の例として、第ＶＩＩＩ因子と複合体を形成して血漿内を循環し、生物学的な血液凝固活性の調節を助けるフォンウィルブランド因子（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ：ｖＷＦ）がある。具体的には、特にｖＷＦタンパク質がフィルタメンブレンを通過したり、フィルタメンブレンに接近するときに（すなわち、フィルタメンブレンの孔の近辺で流れが狭窄したり、流路が遠回りになることによって、特に大きな速度勾配が発生するところで）、ｖＷＦタンパク質は輸送流体媒体の速度勾配によって誘導された剪断力に感受性がある。このため、望ましいプロセスの流速を理想的に生じさせるのに十分な圧力で濾過ユニットが操作されるとき、増加した流速（およびそれに伴う誘導された剪断力の増加）は、たとえばタンパク質を損傷したり破壊したりすること、および／または経時で濾過速度を減少させることによってプロセス収率を減少させる傾向がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、ｖＷＦタンパク質を実質的に損傷しない形で、精製されたｖＷＦの混合物を濾過する方法、さらになお経時で適切に高いプロセスの処理量（すなわち濾過速度）を可能にする方法を開発することは望ましいことであろう。加えて、タンパク質の実質的な損傷／損失を招くことなく効率的な速度で一般のタンパク質を濾過する（たとえば滅菌濾過する）ことができるような、概してどのタンパク質にも適用可能な濾過方法を開発することは望ましいことであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
要旨
開示される方法は、濾過の濾液中のタンパク質の回収を実質的に損傷せず、または別様に限定もせずに、バッチ方式または連続方式のいずれかで、液体混合物中のタンパク質を濾過するのに有用である。この方法は概して、濾液に逆圧を加えてフィルタの圧力差を正確に減少させ、調整する。開示される方法は、高い圧力差によってタンパク質の液体混合物の濾過流速が実際に減少するのとは対照的に、比較的低い圧力差で、比較的高い濾過流速が得られるという利点を備える。さらにこの方法は、液体混合物中に始めから存在するタンパク質のほぼ全てを回収することができる。
【０００７】
より具体的には、本開示は液体のタンパク質混合物を濾過する方法を提供する。一実施形態によると、この方法は、第１の圧力Ｐ１で液体混合物を提供することと、第２の圧力Ｐ２で液体混合物をフィルタに通過させて濾液を形成することと、圧力差Ｐ１−Ｐ２が約３００ｍｂａｒ以下であるような逆圧を濾液に対して加えることとを含む。別の実施形態では、この方法は、第１の圧力Ｐ１で液体混合物を提供するステップと、第２の圧力Ｐ２で液体混合物をフィルタに通過させて濾液を形成するステップと、濾液の平均流速が少なくともフィルタ表面積の約３００ｇ／ｍｉｎ・ｍ２となるのに十分な逆圧を濾液に対して加えるステップとを含む。液体混合物は、担体液体と、担体液体に対して第１の濃度Ｃ１のタンパク質と、分散した混入物とを含む。濾液は担体液体と、担体液体に対して第２の濃度Ｃ２のタンパク質とを含む。フィルタは、分散した混入物の少なくとも一部を液体混合物から除去するためにサイズ調整される。
【０００８】
さらに別の実施形態では、この方法は水性のタンパク質混合物を濾過することができ、第１の圧力Ｐ１で水性混合物を提供するステップと、第２の圧力Ｐ２で水性混合物を多孔性メンブレンフィルタに通過させて濾液を形成するステップと、圧力差Ｐ１−Ｐ２が約９０ｍｂａｒ以下になるような逆圧を濾液に対して加えるステップとを含む。水性混合物は、水と、水に対して第１の濃度Ｃ１のｖＷＦとを含む。濾液は水と、水に対して第２の濃度Ｃ２のｖＷＦとを含む。多孔性メンブレンフィルタは約０．１μｍ〜約０．５μｍにサイズ調整した孔を含む。
【０００９】
上記の実施形態のいずれにおいても、タンパク質は剪断に感受性のあるタンパク質および／または血液凝固カスケードのタンパク質であることが好ましい。さらに、回収率Ｃ２／Ｃ１が少なくとも約０．９５、より好ましくは少なくとも０．９９となるように、タンパク質が濾液中に回収されることが好ましい。加えて、圧力差Ｐ１−Ｐ２は約９０ｍｂａｒ以下であることが好ましく、第１の圧力Ｐ１は少なくともゲージ圧約２００ｍｂａｒであることが好ましい。上記の方法の好ましい実施形態は、担体液体が水であり、かつ／または分散した混入物が微生物を含む実施形態を含む。タンパク質はフォンウィルブランド因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、およびそれらの混合物を含むことができる。フィルタは、好ましくは約０．１μｍ〜約０．５μｍにサイズ調整した孔を有する多孔性メンブレンフィルタを含み、より好ましくは約０．２μｍまたは約０．２２μｍにサイズ調整した孔を有する多孔性メンブレンフィルタを含む。濾液生成物は分散した混入物を実質的に含まないことが好ましい。
【００１０】
逆圧の加圧下でのタンパク質の濾過によって、高い相対濃度、高い相対濾液流速、および逆圧がなければ他では得られない実質的に一定の濾液流速で、タンパク質の回収が可能になる。これは少なくとも濾液流速に関しては、フィルタの圧力差が増加すると（すなわち逆圧がないと）濾液流速は増加すると言われているフィルタ理論の一般的な適用とは対照的である。
【００１１】
図面と併せて以下の詳細な説明を検討すれば、当業者には、さらなる態様および利点が明らかになるであろう。本明細書に記載された組成物、フィルム、およびパケットは、種々の形態での実施形態が可能であるが、以下の説明は、本開示は説明のためであり、本発明を本明細書に記載した特定の実施形態に限定することを意図するものではないという理解に基づいて、特定の実施形態を含む。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
液体のタンパク質混合物を濾過する方法であって、該方法が
第１の圧力（Ｐ１）で液体混合物を提供するステップであって、該液体混合物が担体液体と、該担体液体に対して第１の濃度（Ｃ１）のタンパク質と、分散した混入物とを含むステップと、
該液体混合物をフィルタに通過させて第２の圧力（Ｐ２）で濾液を形成するステップであって、該濾液が、該担体液体と、該担体液体に対して第２の濃度（Ｃ２）の該タンパク質とを含み、該フィルタが、該液体混合物から該分散した混入物の少なくとも一部を除去するためにサイズ調整されたステップと、
該第１の圧力と該第２の圧力との間の圧力差（Ｐ１-Ｐ２）を確実に約３００ｍｂａｒ
以下にするために逆圧を該濾液に加えるステップと
を含む方法。
（項目２）
前記タンパク質が剪断に感受性のあるタンパク質を含む項目１に記載の方法。
（項目３）
前記タンパク質が血液凝固カスケードのタンパク質を含む項目１に記載の方法。
（項目４）
前記圧力差が約９０ｍｂａｒ以下である項目１に記載の方法。
（項目５）
前記液体混合物中に存在する前記タンパク質の少なくとも約９５％が前記濾液中に回収される項目１に記載の方法。
（項目６）
前記液体混合物中に存在する前記タンパク質の少なくとも約９９％が前記濾液中に回収される項目５に記載の方法。
（項目７）
前記逆圧がフィルタ表面積の少なくとも約３００ｇ／ｍｉｎ・ｍ２の平均濾液流速を生じさせるのに十分である項目１に記載の方法。
（項目８）
前記第１の圧力（Ｐ１）が少なくともゲージ圧約２００ｍｂａｒである項目１に記載の方法。
（項目９）
前記担体液体が水を含む項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記タンパク質がフォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）、第ＶＩＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子およびその混合物からなる群から選択される項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記分散した混入物が微生物を含む項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記濾液が前記分散した混入物を実質的に含まない項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記フィルタが多孔性メンブレンを含み、前記多孔性メンブレンが約０．１μｍ〜約０．５μｍにサイズ調整された孔を含む項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記孔が約０．２μｍまたは約０．２２μｍにサイズ調整された項目１３に記載の方法。
（項目１５）
液体のタンパク質混合物を濾過する方法であって、該方法が
第１の圧力（Ｐ１）で液体混合物を提供するステップであって、該液体混合物が担体液体と、該担体液体に対して第１の濃度（Ｃ１）でタンパク質と、分散した混入物とを含むステップと、
該液体混合物をフィルタに通過させて第２の圧力（Ｐ２）で濾液を形成するステップであって、該濾液が、該担体液体と、該担体液体に対して第２の濃度（Ｃ２）で該タンパク質とを含み、該フィルタが、該液体混合物から該分散した混入物の少なくとも一部を除去するためにサイズ調整されたステップと、
フィルタ表面積の少なくとも約３００ｇ／ｍｉｎ・ｍ２の平均濾液流速を生じさせるのに十分な逆圧を該濾液に加えるステップと
を含む方法。
（項目１６）
前記タンパク質が剪断に感受性のあるタンパク質を含む項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記タンパク質が血液凝固カスケードのタンパク質を含む項目１５に記載の方法。
（項目１８）
前記液体混合物中に存在する前記タンパク質の少なくとも約９５％が前記濾液中に回収される項目１５に記載の方法。
（項目１９）
前記液体混合物中に存在する前記タンパク質の少なくとも約９９％が前記濾液中に回収される項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記担体液体が水を含む項目１５に記載の方法。
（項目２１）
前記タンパク質がフォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）、第ＶＩＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、およびその混合物からなる群から選択される項目１５に記載の方法。
（項目２２）
前記分散した混入物が微生物を含む項目１５に記載の方法。
（項目２３）
前記濾液が前記分散した混入物を実質的に含まない項目１５に記載の方法。
（項目２４）
前記フィルタが多孔性メンブレンを含み、該多孔性メンブレンが約０．１μｍ〜約０．５μｍにサイズ調整された孔を含む項目１５に記載の方法。
（項目２５）
前記孔が約０．２μｍまたは約０．２２μｍにサイズ調整された項目２４に記載の方法。
（項目２６）
水性のタンパク質混合物を濾過する方法であって、該方法が
第１の圧力（Ｐ１）で水性混合物を提供するステップであって、該水性混合物が水と、該水に対して第１の濃度（Ｃ１）のフォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）とを含むステップと、
該水性混合物を多孔性メンブレンフィルタに通過させて第２の圧力（Ｐ２）で濾液を形成するステップであって、該濾液が、該水と、該水に対して第２の濃度（Ｃ２）の該ｖＷＦとを含み、該多孔性メンブレンフィルタが、約０．１μｍ〜約０．５μｍにサイズ調整された孔を含むステップと、
該第１の圧力と該第２の圧力との間の圧力差（Ｐ１-Ｐ２）を確実に約９０ｍｂａｒ以
下にするために逆圧を該濾液に加えるステップと
を含む方法。
（項目２７）
前記液体混合物中に存在する前記ｖＷＦの少なくとも約９５％が前記濾液中に回収される項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記液体混合物中に存在する前記ｖＷＦの少なくとも約９９％が前記濾液中に回収される項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記孔が約０．２μｍまたは約０．２２μｍにサイズ調整された項目２６に記載の方法。
（項目３０）
前記水性混合物が微生物の個体群をさらに含み、該微生物の個体群の少なくとも一部が該水性混合物から前記多孔性メンブレンフィルタによって除去される項目２６に記載の方法。
【００１２】
本開示の理解を容易にするために、２つの図面が本明細書に添付される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】タンパク質の逆圧濾過において使用するための軸対照のカートリッジフィルタの断面図である。
【図２】従来の濾過方法および逆圧濾過方法を用いて得られた濾過速度の比較データである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（詳細な説明）
本明細書に記載されている方法は、概して、濾過の間タンパク質の回収を実質的に損傷せず、または別様に限定もしない形で、液体混合物中のタンパク質を濾過精製するのに適用可能である。タンパク質に加えて、液体混合物はさらに、担体液体および分散した混入物を含む。担体液体はタンパク質用の懸濁媒体であり、概して限定されない。好ましい担体液体は水である。同様に、分散した混入物は特に限定されるわけではなく、最終的な精製されたタンパク質濾液の望ましくない成分である任意の分散した固体材料を含む可能性がある。滅菌濾過の操作に関しては、分散した混入物は概して液体混合物中に存在することがある任意の種々の微生物（すなわち細菌）を含む。
【００１５】
開示される方法は、剪断に感受性のあるタンパク質、ヒトの血液凝固カスケードの一部であるタンパク質、またはその両方（すなわち、数種の好適なタンパク質、たとえばｖＷＦは、剪断に感受性のあるタンパク質および血液凝固カスケードのタンパク質の両方と分類される場合がある）の濾過に適用されることが特に好ましい。
【００１６】
開示される逆圧濾過方法を用いる精製に好適な剪断に感受性のあるタンパク質は、担体液体中で懸濁液として輸送される場合、かなりの剪断力（すなわち比較的大きい速度勾配）によって特徴づけられる、損傷、破壊、活性の損失および／または濾過速度の減少に影響を受けやすいタンパク質を含む。概して剪断に感受性のあるタンパク質とは、加えられた剪断（または加圧力）が臨界を超えると、濾過速度と加えられた剪断（または加圧力）との間で反比例を示すタンパク質のことである。濾過速度および加えられた剪断（または加圧力）の正比例の関係と、反比例の関係との間の移行（すなわち、濾過速度が最大の場合に生じる移行）時の加えられた臨界剪断（または加圧力）は、剪断に感受性のある種々のタンパク質によって異なる場合がある。たとえば、加えられた臨界剪断は、少なくとも約２０００ｓ−１（または少なくとも約４０００ｓ−１）であり、かつ約８０００ｓ−１以下（または約１２０００ｓ−１以下）であり得る。しかし剪断に感受性のある異なるタンパク質の定性的な挙動は類似していると予想される。剪断に感受性のあるタンパク質としてはｖＷＦが挙げられるが、開示される方法は特にｖＷＦに限定されない。ｖＷＦは、５２０−ｋＤａの二量体ベースで約１，０００ｋＤａ（キロダルトン：ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ）〜約２０，０００ｋＤａの範囲の分子量を有する一連のオリゴマー／ポリマーの形態で血漿中に存在するが、開示される方法は、必ずしも特定の分子量の範囲に限定されるわけではない。
【００１７】
開示される方法はさらに、概してヒトの血液凝固カスケード中のタンパク質（すなわち凝固因子）の精製に適用可能である。たとえば、凝固第ＩＩ因子（約３７ｋＤａの分子量）、凝固第ＶＩＩ因子（約５０ｋＤａ）、凝固第ＶＩＩＩ：Ｃ因子（約２６０ｋＤａ）、凝固第ＩＸ因子（約５５ｋＤａ〜約７０ｋＤａ）、凝固第Ｘ因子（約１００ｋＤａ）、凝固第ＸＩＩＩ因子（約３５０ｋＤａ）、ｖＷＦ（上述）、およびそれらの組み合わせは、またそれらのうちの数種は、剪断に感受性であり、逆圧を用いて効率的に濾過し回収することができる。
【００１８】
精製された特に好ましい数種のタンパク質は、第ＸＩＩＩ因子またはｖＷＦなどの単一のタンパク質、および第ＶＩＩＩ：Ｃ因子／ｖＷＦ複合体などの複数のタンパク質の組み合わせを含む。特に剪断に感受性があるというわけではないが、逆圧を用いて濾過することがなお好都合な、好ましいタンパク質混合物は、自然発症の出血の調整、および／または血友病Ａ／Ｂの患者の処置に使用可能なＦＥＩＢＡ  ＶＨ（「第ＶＩＩＩ因子インヒビターバイパス活性（蒸気加熱処理）」、Ｂａｘｔｅｒ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬから入手可能）混合物である。ＦＥＩＢＡ  ＶＨ混合物は、第ＩＩ因子、第ＩＸ因子、および第Ｘ因子（主に非活性化）と、第ＶＩＩ因子（主に活性化）と、第ＶＩＩＩ：Ｃ因子（約１〜６単位／ｍｌ）とを含む。ＦＥＩＢＡ  ＶＨ混合物は、逆圧が加えられると比較的高い濾過速度で、タンパク質の活性をほとんどまたは全く損失せずに濾過することができるという点で、逆圧を用いることで利点が生じる。
【００１９】
タンパク質および分散した混入物を含む液体混合物はその後この液体混合物をフィルタに通過させることによって精製される。開示される方法によると、使用するのに好適なフィルタは特に限定されるわけではなく、表層フィルタを含んでもよい。例としてデッドエンドフィルタ（すなわち、フィルタ内で濾過対象の流体がフィルタの表面に垂直に接近する）およびクロスフローフィルタ（すなわち、フィルタ内で濾過対象の流体がフィルタの表面に平行に移動する）がある。たとえばＫｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１０，ｐｐ．７８８−８５３（「Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ」）（４ｔｈｅｄ．，１９９３）を参照されたい。フィルタはそのふるい分けのサイズ（すなわち、それを超すと分散した物質がフィルタ上に保持され、それを下回ると分散した物質が通過して濾液中に入るサイズ）に関しても特に限定されるわけではない。フィルタのふるい分けのサイズが特定の適用（すなわち、保持対象の分散した材料対通過して濾液中に入る分散した材料）のために選択されると、濾過される特定のタンパク質の剪断の感受性に対して、フィルタを通過して流れる担体液体によって生じる剪断の量を考慮に入れてフィルタは操作されるべきである。
【００２０】
好ましいフィルタ媒体は多孔性メンブレンであり、概して種々のサイズ（即ちフィルタ表面積、たとえば約０．００１ｍ２〜約５ｍ２の範囲）および形態（たとえばフィルタディスク、フィルタカートリッジ）で入手可能である。多孔性メンブレンはセルロースナイトレート、セルロースアセテート、ビニルポリマー、ポリアミド、フッ化炭素、およびポリエーテルスルホンなどの材料から形成可能である。多孔性メンブレンは、概して液体混合物から除去すべき分散した混入物のサイズによって選択された高度に均一なサイズを有する孔を含む。たとえば微生物の除去（タンパク質がフィルタメンブレンを通過して濾液中に入るのを可能にしながら）を意図した滅菌濾過の操作においては、孔は好ましくは約０．１μｍ〜約０．５μｍ、または約０．１５μｍ〜約０．２５μｍの範囲のサイズを有し、たとえば約０．２μｍまたは約０．２２μｍである。好適な多孔性メンブレンフィルタは０．２μｍ／０．２２μｍのフィルタと、より粗い（たとえば約０．４５μｍ）前置フィルタの両方を含んでもよく、処理量を高め、０．２μｍ／０．２２μｍのフィルタの表面でのケークの集積を限定することができる。タンパク質を含む液体混合物の滅菌濾過用に好適な市販の多孔性メンブレンフィルタの例としては、ＳＡＲＴＯＢＲＡＮ  Ｐ０．２μｍセルロースアセテートメンブレン（０．２μｍの濾過孔と、０．４５μｍの濾過孔を有する前置フィルタメンブレンとの両方を含み、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，ドイツから入手可能）およびＳＵＰＯＲ  ＥＫＶ０．２μｍポリエーテルスルホンメンブレン（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ，ＮＹから入手可能）を含む。
【００２１】
図１はフィルタ装置１００、たとえば多孔性メンブレンを備えたカートリッジフィルタを通過する液体混合物の流れを図示する。図示されているように、液体混合物は入口１１０を通って密閉したフィルタ装置１００に入り、入口チャンバ１２０内に入る。入口チャンバ１２０内の流体は加圧され、概して周囲圧力（すなわち絶対圧約１ｂａｒ）より高い第１の圧力Ｐ１を有する。入口チャンバ１２０内の第１の圧力Ｐ１は、担体液体と液体混合物中のタンパク質とを押しやって多孔性フィルタメンブレン１３０を通過させる。フィルタメンブレン１３０を通過する材料は、濾液チャンバ１４０内に担体液体とタンパク質の両方を含む濾液を形成する。濾液チャンバ１４０内の流体はここでも加圧され、第１の圧力Ｐ１より低いが概して周囲圧力より高い第２の圧力Ｐ２を有する。精製された濾液はその後出口１５０を通ってフィルタ装置１００から出る。出口１５０を通過する流速（および第２の圧力Ｐ２）は逆圧調節器１６０によって調節される。
【００２２】
フィルタメンブレン１３０の孔は、液体混合物中に含まれる分散した混入物の少なくとも一部分を除去するようにサイズ調整され、除去した分散した混入物をフィルタメンブレン１３０の入口側上（すなわち入口チャンバ１２０内）に保持する。好ましくは、フィルタメンブレン１３０は入口の液体混合物中に始めから含まれる分散した混入物のほぼ全てを除去するようにサイズ調整される。したがって、濾液は分散した混入物を実質的に含まない（または含まない）。具体的には濾液は、濾過され、精製されたタンパク質混合物を治療用組成物として使用するのに悪影響を与えるような量で分散した混入物を含むべきではない。たとえば、分散した混入物が微生物を含む場合、フィルタメンブレン１３０は少なくともフィルタ面積ｃｍ２当たり約１０７コロニー形成単位の除去が可能であるべきである。
【００２３】
入口の液体混合物の第１の圧力Ｐ１は、たとえば重力、圧縮ガス（たとえば圧縮空気）、またはポンプ（たとえば低剪断性ポンプ）など、好適な供給源のいずれによっても加えることができる。好ましくは、第１の圧力Ｐ１は少なくともゲージ圧約２００ｍｂａｒ、またはゲージ圧約２００ｍｂａｒ〜約１，０００ｍｂａｒ（すなわちゲージ圧約１ｂａｒ）の範囲であり、たとえばゲージ圧約３００ｍｂａｒである。出口の濾液の第２の圧力Ｐ２を得るために、逆圧（すなわち背圧）も、たとえば従来のバルブ（逆圧調節器１６０として図１に図示）など、好適な供給源のいずれによっても加えることができる。さらに逆圧は、出口１５０の通路の長手方向に沿った流れの狭窄、妨害などによって加えることもできる。第１の圧力Ｐ１および第２の圧力Ｐ２の結果として、加えられた逆圧は（正の）圧力差Ｐ１−Ｐ２を生じ、担体液体およびタンパク質をフィルタに通過させて濾液中に押しやる。圧力差は低く、種々の要因、たとえば濾過される特定のタンパク質および用いられる特定のフィルタによって、好適な最大圧力差を伴う。特に、圧力差は好ましくは約３００ｍｂａｒ以下、２００ｍｂａｒ以下、１５０ｍｂａｒ以下、または１２０ｍｂａｒ以下であり、より好ましくは約９０ｍｂａｒ以下または５０ｍｂａｒ以下であり、よりさらに好ましくは約２０ｍｂａｒ以下または１０ｍｂａｒ以下であり、たとえば約５ｍｂａｒ以下、または約３ｍｂａｒ以下である。
【００２４】
このような差圧では、フィルタの流速は十分低く、タンパク質の活性を実質的に損傷も破壊もせず減少もさせない低剪断性の環境を生じる。低剪断性の環境はさらに、濾過プロセスの収率を実質的に限定しない。
【００２５】
具体的には、低い差圧を用いると、比較的高くかつ実質的に一定の濾過速度が得られることが観察された。特に、低い差圧を加えると、少なくとも約３００ｇ／ｍｉｎ・ｍ２の平均濾過速度、たとえば約３００ｇ／ｍｉｎ・ｍ２〜約１０００ｇ／ｍｉｎ・ｍ２または約４００ｇ／ｍｉｎ・ｍ２〜約８００ｇ／ｍｉｎ・ｍ２が得られる。単位は、単位時間（すなわち分）当たりに得られ、フィルタの単位表面積（すなわちｍ２）当たりに標準化された濾液の質量（すなわち担体液体とタンパク質とを組み合わせたグラム）である。逆圧の加圧の結果として得られる低い差圧は、さらに、特に始動時の過渡応答の終了後に実質的に一定の濾過速度を生じさせることができ、これによってフィルタの正味処理可能量を向上させる。低い差圧で観察された濾過速度とは対照的に（かつ、濾過速度はフィルタの差圧に比例することを示す一般的な濾過理論とは対照的に）、より高い差圧（たとえば約１００ｍｂａｒ超）では濾過の速度を減少させる傾向がある。従って少なくとも約１００ｍｂａｒから少なくとも約３００ｍｂａｒの差圧を加える従来の濾過方法では、開示される方法で観察された平均濾過流速を得ることはできない。
【００２６】
低い差圧を用いると、タンパク質の回収を高くできることがさらに観察された。具体的には、液体混合物中に始めから存在するほぼ全てのタンパク質が好ましいことに濾液中に回収される。たとえば、第１の濃度Ｃ１が最初の液体混合物中の担体液体に対するタンパク質の濃度を表し、第２の濃度Ｃ２が最終的な濾液中の担体液体に対するタンパク質の濃度を表す場合、開示される濾過方法の回収率Ｃ２／Ｃ１は、好ましくは少なくとも約０．９５であり、より好ましくは少なくとも約０．９９である。
【００２７】
開示される逆圧濾過の方法は、本方法が正確な濾過流速の調整を提供するので、タンパク質に適用される場合に有用である。液体混合物をフィルタに通過させるために用いられる圧力源は、概して過度の圧力を提供し、高剪断率を引き起こし、さらにはフィルタの閉塞およびタンパク質の損傷の原因となる。周囲圧力に対して単一の圧力源を、タンパク質の損傷を回避するのに十分低く、実質的に一定のフィルタ通過の平均流速が得られるように、発生する差圧が十分低くかつ十分一定したものになるように調節することは、不可能ではないにしても概して困難である。しかしプロセスの流体の濾液側に逆圧を加えることによって、比較的高い圧力源（すなわち第１の圧力Ｐ１）が正確に釣り合い調整され（すなわち第２の圧力Ｐ２によって）、低い、実質的に一定の圧力差（すなわちＰ１−Ｐ２）が得られる。
【実施例】
【００２８】
以下の実施例は説明のために提供されるものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００２９】
実施例１〜８
剪断に感受性のある血液凝固カスケードのタンパク質ｖＷＦの水性の液体混合物を滅菌濾過し、圧力（および逆圧）およびプロセスの他の可変部分（すなわちフィルタのサイズおよびタイプ）が濾過の効力に及ぼす影響を、たとえば濾液中に回収されたｖＷＦの活性、濾液の平均流速、およびプロセスの拡大能力に基づいて測定した。
【００３０】
１２５ＩＵ／ｍｌの活性および１１５９μｇ／ｍｌの濃度（ビシンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  ａｃｉｄ：「ＢＣＡ」）アッセイ）を有する組換え型ｖＷＦ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖＷＦ：「ｒＶＷＦ：Ｒｃｏ」）の水性の液体混合物を、以下の実施例１〜８の各々で用いるために調製した。低分子量の塩を加えて、混合物のｐＨおよび容積モル浸透圧濃度がそれぞれ７．３および約４００ｍＯｓｍｏｌ／ｌ（ミリオスモル：ｍｉｌｌｉｏｓｍｏｌｅｓ／リットル：ｌｉｔｅｒ）の値になるように調整した。実施例１〜８は、フィルタの付近におけるタンパク質に対する流体の動的な影響（すなわち剪断）を切り離すことを意図したので、他の分散した混入物または材料（たとえば細菌、他の微生物、または他のタンパク質）は混合物に一切加えなかった。水性の液体混合物の成分は表１に概要を示す。
【００３１】
【表１】
0005466263.tif 000002
その後水性の液体混合物を以下の方法で試験した。少なくとも約５００ｍｌの試験用体積の混合物を圧力抵抗性のあるステンレス鋼の容器に入れた。シリコーンチューブの第１の部分を用いて、容器の出口を（蒸気滅菌した）滅菌フィルタの入口に接続した。長さ約１０ｃｍのシリコーンチューブの第２の部分を滅菌フィルタのハウジングの出口に取り付けた。滅菌フィルタから流出した濾液を秤上に設置したビーカー内に収集し、濾過速度をモニターした。秤をコンピュータに接続し、設定した時間間隔で、収集した濾液の総量を時間に応じて記録した。
【００３２】
実施例１〜７では、ＳＡＲＴＯＢＲＡＮ  Ｐ０．２μｍセルロースアセテートメンブレンフィルタ（０．４５μｍの前置フィルタを含む）を用いた。実施例８では、ＳＵＰＯＲ
ＥＫＶ０．２μｍポリエーテルスルホンメンブレンフィルタを用いた。実施例１〜３はディスクメンブレンフィルタを用い、実施例４〜８はカートリッジメンブレンフィルタを用いた。各フィルタのフィルタ表面積を表２に示す。
【００３３】
実施例１〜８の各々について、試験用体積の水性の液体混合物を一定の圧力で濾過した。実施例１では、滅菌フィルタに入る水性の液体混合物に、ステンレス鋼の容器から滅菌フィルタに送り込む流体のカラムの高さに基づいて、ゲージ圧約１００ｍｂａｒ（すなわち絶対圧約１．１ｂａｒ）の圧力を加えた。実施例２〜８では、滅菌フィルタに入る水性の液体混合物の圧力を供給するために清浄な圧縮空気が使用であり、圧力は、表２に示したように１５０ｍｂａｒ〜３００ｍｂａｒの範囲であった。実施例１〜４では、逆圧濾過を実施しなかった（すなわち濾液が出て収集ビーカー内へと入るとき、滅菌フィルタの出口管は外気に開放していた）。したがって濾過を促進する圧力差は事実上滅菌フィルタに入る水性の液体混合物の圧力とした。実施例５〜８については、滅菌フィルタの出口管にクランプを取り付け、締めることによって濾液に逆圧を加えた。実施例５〜８の圧力差は（表２に示すように）濾過中に計測した濾液の平均流速および使用した市販のフィルタの既知の圧力降下−流速の特徴に基づいて判断した。
【００３４】
概して各実施例においては、試験用体積の水性の液体混合物を調製した直後に混合物を濾過した。しかし実施例５では８時間遅れて混合物を濾過し、開示される方法に関して任意の潜在的な保存の影響を調べた。
【００３５】
表２は実施例１〜８の各々について試験パラメータの概要を示す。
【００３６】
【表２】
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濾過試験の結果の概要を表３に示す。表３において「濾液の量」とは、個々の試験中に得られた濾液の質量（すなわち水、および回収されたｖＷＦをどれも含む）を表す。実施例１〜４については、フィルタが閉塞して実質的な濾液の量がそれ以上は得られなくなるまで濾過試験を実施した。実施例５〜８については、数百グラムの濾液が得られるまで濾過試験を実施し、フィルタが閉塞せず、さらなる濾過がなお可能である状態で試験を終了した。表３の「フィルタの処理可能量」の項目は、フィルタ表面の単位面積当たりで標準化した濾液の量を表す。実施例５〜８の「＞」は、試験中にフィルタが閉塞しなかったので、フィルタの処理可能量が実際の処理可能量より低めの推定値であることを示す。表３の「平均流速」の項目は、試験を通して平均し、フィルタ表面の単位面積当たりで標準化した濾液の量を表す。
【００３７】
【表３】
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表３を見ると、タンパク質の逆圧濾過が濾過の処理可能量および流速を著しく増加させていることが明らかである。ｖＷＦに対して１００ｍｂａｒ〜３００ｍｂａｒの範囲の適度に低い加圧、および利用したフィルタ（利用したフィルタカートリッジは約２ｂａｒ〜約５．５ｂａｒの範囲の最大圧力に耐えられる）をもってしても、実施例１〜４ではフィルタの処理可能量が低く、圧力が増加すると急速に処理可能量が減少することがわかる。対照的に濾液に逆圧を加えて圧力差を減少させると、実施例５〜８では大幅により大きい濾過処理可能量および流速を示している。フィルタは概して濾過流速と圧力差との間の正比例によって特徴づけられるため、観察されたこの挙動は予想外であった。
【００３８】
【化１】
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数式（１）において、Ｑは濾過流速（単位時間当たりの体積または質量）、Ａはフィルタ表面積、Δｐはフィルタの圧力差、μは濾過される流体の粘稠性、Ｒはフィルタ媒体の実験による抵抗である。実施例５〜８の結果の類似性から、逆圧濾過の利点は種々のフィルタ媒体および／またはフィルタサイズを用いても得られることがさらにわかる。
【００３９】
実施例４および６の時間依存性の濾過データ（すなわち時間に応じて収集した濾液）を図２に示す。図２を見ると、濾過試験の最初の１０〜１５分の間は、圧力差がより高い実施例４の方が相対的に高い濾過速度を得ていることが明らかである。しかし、実施例４におけるより高い圧力差によってフィルタの閉塞もより速く生じる。対照的に実施例６で逆圧を用いると、圧力差および最初の濾過速度を低下させる。具体的には、最初の約１０分〜約１５分の過渡期を過ぎると、低い圧力差が低剪断性の濾過環境を創出してフィルタがｖＷＦによって閉塞するのを防ぎ、これによって、フィルタの寿命が続く間、フィルタの処理可能量および濾過流速が増加し、さらに濾過流速が実質的に一定になる。
【００４０】
表４に概要を示すように、実施例１〜３および５の各々の濾液をさらに分析して濾液中の組換え型ｖＷＦのレベルを計測し、濾過プロセスが最初の水性の液体混合物中に存在する組換え型ｖＷＦの濃度に悪影響を与えるか否かを判定した。逆圧を加えない場合、実施例１〜３では適度に低い圧力差でも濾過中のタンパク質を損傷または破壊しうることがわかり、濾過中に２００ｍｂａｒおよび３００ｍｂａｒの圧力差で組換え型ｖＷＦの約半分までが損失する。この濾過による損失は実施例５に示すように逆圧の使用によって回避される。実施例５では、ｒＶＷＦ：Ｒｃｏの濃度における計測可能な減少は発生せず、計測したタンパク質（ＢＣＡ）の含有量において４％の減少のみが発生した。したがって、水性の液体混合物に始めから存在するタンパク質のほぼ全てを濾液中に回収することができる。
【００４１】
【表４】
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実施例９〜２０
第ＶＩＩＩ因子を含む水溶液を、ＳＡＲＴＯＣＬＥＡＮ前置フィルタを備えたＳＡＲＴＯＢＲＡＮ（登録商標）フィルタ上で試験し、たとえば必要なフィルタ表面積に基づいて、濾過の効力に対する逆圧の影響を測定した。実施例９〜１３では逆圧濾過を実施せず、最初の加圧は１００ｍｂａｒ〜５００ｍｂａｒとした。実施例１４〜１６では圧力差を２００ｍｂａｒとし、実施例１７〜２０では圧力差を１５０ｍｂａｒ未満に減少させた。各フィルタの表面積は１．２ｍ２とした。表５は各実施例について濾過の前後の第ＶＩＩＩ因子の活性、および収率を含む。
【００４２】
【表５】
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上記のデータは、同量の活性物質に対して逆圧濾過が使用される場合、必要なフィルタ面積は非常に小さくてよいことを示す。逆圧濾過は濾過を安定化し、差圧が最適である場合に平均活性収率が高まる。
【００４３】
実施例２１〜２５
第ＸＩＩＩ因子を含む溶液をＰＡＬＬ（登録商標）ＰＯＳＩＤＹＮＥ（登録商標）Ｎ６６ナイロンフィルタ上で試験し、たとえば濾液中の第ＸＩＩＩ因子の回収された活性およびタンパク質の濃度に基づいて、濾過の効力に対する逆圧の影響を測定した。フィルタの面積は０．８２ｍ２とした。実施例２１〜２３では逆圧濾過を実施せず、これらの実施例の加圧は６００ｍｂａｒとした。実施例２４〜２６では圧力差を約１００ｍｂａｒとした。表６は各実施例について濾過の前後のタンパク質の濃度および活性、ならびに収率を含む。
【００４４】
【表６】
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表６に示すように、活性収率およびタンパク質収率は濾過中に逆圧を用いることで実質的に高まる。
【００４５】
本発明の範囲内での変更形態は当業者には明らかであろうが、上記の説明は理解を明確にするためにのみ提供され、そこから不必要な限定は一切理解されるべきではない。
【００４６】
本明細書を通して、組成物が成分または材料を含むものとして説明されているが、特に明記されていない限り、組成物は記述された成分もしくは材料の任意の組み合わせから実質的になる、または記述された成分もしくは材料の任意の組み合わせからなることも可能であると考えられる。
【００４７】
本明細書に記載されている方法およびその個々のステップの実施は、手作業、および／または電子装置の助けによって遂行可能である。特定の実施形態に関してプロセスを説明してきたが、本方法に関連する行為を遂行する他の手段を用いてもよいことは当業者なら容易に理解するであろう。たとえば、種々のステップの順番は、特に明記されていない限り、本方法の範囲も趣旨も逸脱することなく変更可能である。さらに、個々のステップのいくつかは組み合わせたり、省略したり、またはさらに細分して追加のステップにすることも可能である。
【図１】
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【図２】
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