(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式を有しているペプチド:
H-His-D(2)-Nal-Arg-Trp-Cha-Lys-Phe-Val-NH2 
H-His-D(2)-Nal-Arg-Trp-Aic-Lys-Phe-Val-NH2 、
ここでChaはシクロヘキシルアラニン、Aicは2-アミノインダン-2-カルボン酸を意味する。
【請求項２】
請求項1に記載のペプチドからなる医薬。
【請求項３】
抗微生物性の医薬である請求項2に記載の医薬。
【請求項４】
殺カンジダ薬である請求項 2または3に記載の医薬。
【請求項５】
Candida albicans, Candida glabrata およびCandida kruseiに対する医薬である請求項 2〜4に記載の医薬。
【請求項６】
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）または緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）に対する医薬である請求項 2または3に記載の医薬。
【請求項７】
請求項 1に記載の一または二のペプチドを含んでいる薬学的製剤。
【請求項８】
請求項 7に記載の薬学的製剤であって、さらに抗細菌剤, 抗真菌剤, 抗ウイルス剤, 抗寄生虫剤を含んでいる群から選択される一または二以上の有効成分（active principle）を含んでいる薬学的製剤。
【請求項９】
請求項 8に記載の薬学的製剤であって、前記抗真菌剤がクロトリマゾール, ニスタチン, フルコナゾール, ケトコナゾール, アンホテリシン B, カスポファンギン, ボリコナゾールを含んでいる群から選択される薬学的製剤。
【請求項１０】
請求項 7〜9に記載の薬学的製剤であって、さらに賦形剤および希釈剤, 溶媒剤, バルク剤（bulking agents）, 充填剤, レオロジー修飾因子（reological modifier）, 安定化剤, 結合剤, 潤滑剤, 崩壊剤, 保存剤, pH 調整剤, 緩衝剤, 抗酸化剤, キレート化剤, 可塑剤, ポリマー剤, 乳化剤, 甘味剤, 矯味剤を単独で又は組み合わせて含んでいる群から選択される添加物を含んでいる薬学的製剤。
【請求項１１】
請求項 7〜10に記載の薬学的製剤であって、経口、直腸、経鼻、局所、膣または非経口投与のための薬学的製剤。
【請求項１２】
請求項 7〜11に記載の薬学的製剤であって、硬または軟カプセル, タブレッツ, 粉剤または顆粒剤, 水性または非水性の液体中の溶液剤 シロップ剤または懸濁剤, 食用の泡剤またはホイップ剤, オイルインウォーターまたはウォーターインオイルの液体エマルジョン剤, 軟膏, クリーム剤, 懸濁剤, ローション剤, 粉剤, 溶液剤, ペースト剤, ゲル剤, スプレー剤, エアロゾルまたは油剤, スプレー剤または点滴剤, ペッサリー, タンポン（tampons）, クリーム剤, ゲル剤, ペースト剤, 泡剤;水性および非水性の無菌の注射可能な溶液剤または懸濁剤の形態の薬学的製剤。
【発明の詳細な説明】
【発明の説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、治療の分野における用途の発見である。特に、抗微生物活性が改善された新しい合成メラノコルチンペプチドに関する。
【０００２】
［背景］
副腎皮質刺激ホルモン (ACTH) および α, βおよび γ-メラニン細胞刺激ホルモン (α, βおよびγ-MSH)は、一般にプロ-オピオメラノコルチン(POMC)の翻訳後の誘導体として起源が共通するためメラノコルチン ペプチドまたはメラノコルチンと称される。
【０００３】
α-MSHはトリデカペプチドであり、幾つかの生理的な経路において多面的な作用を呈し、これには発熱（fever）および炎症のモデュレーション, 摂食行動およびエネルギーホメオスタシスの制御, 自律神経機能の制御およびメラニン形成の増加が含まれる。α-MSHが確立された抗炎症活性、また抗感染活性の範囲を超えて機能を発揮するかもしれないとの考えを研究者は調査した。このようにして、α-MSHが特にカンジダアルビカンス（Candida albicans）および黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に対する強力な抗微生物活性を有することが発見された。
【０００４】
カンジダアルビカンスは、特に、例えば、C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. Lusitaniae, C. stellatoidea, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. pseudotropicalis, C. guilliermondiiも含んでいる重篤な感染（即ち、カンジダ症）の原因となりえる真菌のグループに属する。生理的な条件下、この遍在するサプロファイト（saprophytes）は、健康な生物体の粘膜（health organism mucosa）の天然の無害なホストである。しかしながら、自然防御（主に免疫系により代表される）がストレスが原因で弱まっている場合、抗生物質, コルチゾン, 免疫抑制薬, 細胞分裂停止剤, 避妊用品（contraceptives）,または放射線治療, カテーテルの挿入を必要とする外科的な処置または長期の輸液または透析, 挿入されたプロテーゼ, 病気, 例えば, 糖尿病, 肥満または栄養不良, 甲状腺機能亢進症, 腫瘍,または熱傷（burnings）または外傷（trauma）などの他のイベントなどの薬物療法では、特に乳児または高齢者の患者において、カンジダが危険な感染性の因子となりえる。特に, 感染は皮膚, 気道, 口, 咽喉（throat） および 咽頭（pharynx）, 消化器に影響し、泌尿生殖器への感染または循環器系への全身性の感染（おそらく心内膜炎を生じる）の原因となりえる。
【０００５】
メラニン細胞刺激ホルモンペプチドの分析によって、配列 (6-13)がインバリアントなコア配列 His-Phe-Arg-Trp (6-9)を含むことが実証され、これは全てのメラノコルチン ペプチドに共通し、メラノコルチンレセプターへの結合にかかわる。そのＣ末端側のトリペプチド Lys-Pro-Val (11-13)は、cAMPの増加によるレセプター活性化および抗微生物活性の双方に関連性のあることが判明した。これに対して、Ｎ末端が殺カンジダ活性（candidacidal activity）に影響を有していることは同定されなかった。さらなる研究（例えば、例を挙げると、アラニンスキャン）によって、ポジション 12におけるプロリン残基が係る活性に重要な役割をもつことが示された。
【０００６】
加えて、Lys-11 および Pro-12は抗微生物活性に必須であると証明され、実際にこれらの置換により活性がほとんど無効（abolished）となる。
【０００７】
他方で、コア配列のポジション 7の置換は、メラノコルチンの作用強度を増強しえる。ポジション 7における置換（例えば、例を挙げると、D-Nalでの置換）によって、メラノコルチン レセプター MC4Rへのα-MSHの親和性が増加する。ポジション 12を親油性アミノ酸（Pheのような）で置換することによって、殺カンジダ活性の著しい増加が生じる。
【０００８】
すでに全てのペプチドを試験したが、従来技術ではさらに活性な化合物に関する必要性はなおも満たされていなく、この化合物により患者への副作用が低くなるので、より容認しえることとなり、さらにより安全で、患者に容易に投与でき、より安定であるので、工業生産が許容される。
【０００９】
［発明の概要］
本発明は、カンジダに対抗する驚くべき活性を有する新しいペプチド化合物に関する。その予想外の効果は、既知の化合物の構造の非天然アミノ酸の導入での修飾と関連する。
【００１０】
［発明の課題］
一般式 (1)、また一般式の部分式（general subformula） (1a)に対応するアミノ酸配列を有している合成メラノコルチンペプチドを提供することが本発明の課題である。
【００１１】
更なる態様において、好適なペプチドは従属請求項 2〜8のものである。好適な態様において、前記ペプチドは請求項 9のものである。より好適な態様において、前記ペプチドは請求項 10のものである。
【００１２】
なお更なる態様において、本発明のペプチドは一般式 (1b)のものであり、好適な態様としてそれらは請求項 11 および 12のペプチドである。
【００１３】
第二の課題として、本発明は、請求項13に記載の医薬としての前記合成メラノコルチンペプチドに関する。
【００１４】
第三の課題において、本発明のメラノコルチン ペプチドは、請求項 14による抗微生物薬である。
【００１５】
好適な態様において、本発明のメラノコルチンペプチドは、請求項 15 および 16のとおり殺カンジダ活性を有し、これらは請求項 17のとおりS. aureusまたはP.aeruginosaに対する抗微生物活性を有する。
【００１６】
更に好適な態様として、本発明は、請求項 18〜23に記載の薬学的製剤に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図1は、本発明による非通常のアミノ酸を表す。
【００１８】
［発明の詳細な記述］
第一の態様において、本発明は、一般式 (1)のアミノ酸配列を有しているメラノコルチン ペプチドに関する:
W-A1-A2-A3-A4-X-A5-A6-A7-Y (1)
式中：
Xは非通常のアミノ酸である又はXは一または二以上の天然の芳香族アミノ酸である、好ましくはPhe,またはGly-Gly二量体
【００１９】
【化１】
0005518899.tif 000002
【００２０】
又はAla-Ala二量体
【００２１】
【化２】
0005518899.tif 000003
【００２２】
である。
【００２３】
代わりに, Xは、Gly o 単結合であってもよい。
【００２４】
本発明の好適な態様において、Xは、非通常のアミノ酸である。
【００２５】
本発明において、「非通常のアミノ酸（non-conventional amino acids）」には、自然発生的でゲノムのトリプレットによりコードされた「天然のアミノ酸（natural amino acids）」に関連して任意の非天然のアミノ酸（即ち、ヌクレオチドのトリプレットにより遺伝的にコードされたものではない）が含まれる。「D」および「L」は、アミノ酸の配置を示す。
【００２６】
「芳香族アミノ酸（Aromatic amino acid）」は、例えば、フェニルアラニン, トリプトファン および チロシンなどの天然の芳香族アミノ酸に関して使用される。
【００２７】
好適な態様において、Xは、Aib, β-Ala, Cha, Cpa, Acpc, tBuGly, Aic, Cybu, β-AA, Sar, (3,4-Cl)Ph, TicまたはAocaから選択される。
【００２８】
さらなる好適な態様において、Xは、ChaまたはAicである。
【００２９】
上記の天然 および 非天然アミノ酸の略語の意味は以下の表 1に記載され、明細書の残りをその記載と一致させる。
【００３０】
[表1]
Table 1
Nal(1)または(1)Nal         3-(1-ナフチル)アラニン
Nal(2)または(2)Nal         3-(2-ナフチル)アラニン
Orn                        オルニチン
Cit                        シトルリン
Dap                        2,3-アミノ-プロピオン酸
Dab                        2,4-ジアンミン酪酸（2,4-diammino-butiryc acid）
Dpm                        2,2'-ジアミノピメリン酸
Cha                        シクロヘキシル-アラニン
Aib                        2-アミノイソブチル酸（2-aminoisobutiryc acid）またはα-メチルアラニン
β-Ala                     ベータ-アラニン;
Abu                        2-アミノ酪酸
Cpa                        1-アミノ-シクロペンタン カルボン酸;
Acpc                       1-アミノ-シクロプロパン カルボン酸;
tBuGly                     α-t-ブチルグリシンまたはtert-ロイシン
Aic                        2-アミノインダン-2-カルボン酸;
Cybu                       1-アミノ-シクロブタン カルボン酸
Aoca                       1-アミノ-シクロヘキサン カルボン酸
β-AA                      2-アミノシクロペンタン カルボン酸
Sar                        サルコシン
(3,4-Cl)Phe                       3,4-ジクロロ-L-フェニルアラニン
Tic                        テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸
Ac                         アセチル基
Nle                        ノルロイシン
(α-Me)Trp                 α-メチルトリプトファン
Trp(CHO)                   ホルミル-トリプトファン
Trp(Me)                    メチルトリプトファン
tert-Leu                   tert-ブチルグリシン
他のアミノ酸は、通常の三文字コードを用いて開示される。
【００３１】
上記の式 (1)において、Wは、Hまたは任意の適切なカルボキシル保護基、例えば、例を挙げると、C1-C8 アルキルまたはアルカノイルであってもよい;またはWは、任意のD-またはL-アミノ酸、例えば、例を挙げると、Ala, Nle, Gly,またはGly-Gly二量体またはAla-Ala二量体であってもよい。
【００３２】
代わりに, WはH-Glu-Thr-Pro-Asp テトラペプチドであってもよく, それゆえ本来（native）のペプチドの全Ｃ末端が提供される。
【００３３】
本来のペプチドＣ末端から開始して1から4 アミノ酸までの欠失によって、ペプチドの活性は影響されない;従って、Wは:
- H-Thr-Pro-Asp 
- H-Pro-Asp;又はさらに
- H-Asp
であってもよい。
【００３４】
代わりに, Wは、H-Phe-Phe-His トリペプチドであってもよい。
【００３５】
上記の任意のアミノ酸残基は、D-またはL型の何れであってもよい。
【００３６】
カルボキシル-末端に関する好適な保護基は、例えば、アシル基であってもよく、例えば、例を挙げると、C1-C8 直鎖状または分枝状の飽和または不飽和のカルボ鎖（carbo chain）であってもよい。当業者は、最も適切なカルボキシル保護基を選択することができる。或いは、他のカルボキシル保護基は、本発明の分野において知られているとおり使用しえる。
【００３７】
A1 残基は、ヒスチジンの又は任意のヒスチジンアナログ、例えば、例を挙げると、メチルヒスチジンまたは6-カルボキシル-1,2,3,4-テトラヒドロ-イミダゾピリジンまたは任意の他のヒスチジン代謝性の前駆体または荷電したアミノ酸、例えば、オルニチンまたはリジンのD-またはL-異性体の何れであってもよい。代わりに, A1は、任意の天然のアミノ酸であってもよい。好適な態様において、A1は、Hisである。
【００３８】
A2残基はD(2)Nalである又はA2残基はPhe, D-Phe, Nal(1), D-Nal(1), Nal(2), Tyr, D-Tyrまたは任意の他の芳香族アミノ酸（D-およびL-異性体の双方）であってもよい。代わりに, A2は、イソロイシンであってもよい。好適な態様において、A2は、D(2)Nalである。
【００３９】
A3 残基はArg, Lys, Orn, Pro, Phe, (p-アミノ)Pheである又はA3 残基はDap, DabまたはDpmであってもよい。好適な態様において、A3は、アルギニンである。
【００４０】
A4 残基はTrpであってもよい、或いは、代わりに、A4 残基は(α-Me)Trp, Trp(Me), Trp(CHO)またはArgであってもよく, その全ては D-またはL- 配置の何れであってもよい。或いは、A4はD-Nal(1)またはD-Nal(2)であってもよい。好適な態様において、A4は、L-(α-Me)Trp, L-Trp(Me), L Trp(CHO)であり、又は最も好適な態様としてはL-Trpである。
【００４１】
A5 残基はLys, OrnのD-またはL-異性体の何れであってもよい。或いは、A5 残基は、DapまたはDabであってもよい。好適な態様において、A5は、リジンである。
【００４２】
A6 残基はPhe, Pro, Nal(1), Nal(2)のD-またはL-異性体の何れであってもよい、又は任意の他の芳香族アミノ酸であってもよい。好適な態様において、A6は、Pheである。
【００４３】
A7 残基は、D-またはL-異性体の何れであってもよく、またVal, Thr, Leu, Ile, tert-Leu, Nleであってもよく、或いはA7 残基はAbuであってもよい。好適な態様において、A7は、Valである。
【００４４】
Yは、一般式 (1)のペプチドのＮ末端であり、任意の適切な保護基、例えば、例を挙げると、ヒドロキシル基(-OH)であってもよく〔それゆえ、オキシム末端(-NHOH)が導かれる〕またはアシル基〔それゆえ、アミド末端が導かれる〕であってもよい。
【００４５】
好適な態様において、本発明のペプチドは、以下の一般式 (1a)のものである:
W-His-D(2)Nal-Arg-Trp-X-Lys-Phe-Val-Y (1a)
式中のX, W および Yは、任意の上記の意味を有する。さらに好適な態様において、本発明のペプチドは、以下の表 2にリストされるものである:
【００４６】
【表２】
0005518899.tif 000004
【００４７】
特に、MSH0704 および MSH0708は、好適なペプチドである。
【００４８】
さらなる好適な態様において、本発明は、以下の一般式(1b)を有しているペプチドに関する:
W-A1-A2-A3-A4-X-A5-A6-A7-Y  (1b)
式中で
Wは、H-Phe-Phe-Hisであり;
Yは、上記の開示のとおりアミノ末端基であり;
A1 は、Hisであり;
A2 は、Ile, Phe, (D)2-Nalであってもよく;
A3 は、Arg またはPheであってもよく;
A4 は、Arg, Trp,またはGlyであってもよく;
A5 は、Lysであり;
X は、Gly または単結合（single bond）であってもよく;
A6 は、Pro またはPheであってもよく;
A7 は、Valであってもよい。
【００４９】
特に、一般式 (1b)を有している式 (1)の範囲内の化合物は、次の式の一つを有しえる:
H-Phe-Phe-His-His-Ile-Phe-Arg-Gly-Lys-Pro-Val-NH2 
H-Phe-Phe-His-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Phe-Val-NH2 
H-Phe-Phe-His-His-(D)2-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Phe-Val-NH2 
H-Phe-Phe-His-His-Phe-Arg-Gly-Lys-Pro-Val-NH2 。
【００５０】
第二の態様によると、本発明のペプチドは、医薬として使用しえる。
【００５１】
特に、本発明の第三の課題により、開示されたペプチドは、予想外にも従来技術で知られたペプチドより優れた抗微生物活性（特に、殺カンジダ活性）を示す。
【００５２】
実際に, 本発明の化合物は、驚くことにカンジダに対し非常に活性があることが発見された。従って、それらは、カンジダ真菌が原因の病気の治療に有用でありえる。
【００５３】
本発明の化合物は、特にC. albicans, C. glabrata およびC. kruseiに対し活性があることが認められた。
【００５４】
特に, C. albicansに関して株ATCC 76615, ATCC 24433 または株995439, 995147, 000954, 991185, 994199, 983201-R1, 011587; C. glabrataに関して株18012, 995667, 995651、C. kruseiに関して株995668, 991388, 004490である。
【００５５】
特に、結果は例 2に示され、化合物 MSH0704 および MSH0708が最も活性なものであることを示す。
【００５６】
特に、それら化合物は最も低いMIC(最小阻止濃度)を有し、株の数に関して最大の広域スペクトルで活性があり、殺傷する能力がある。
【００５７】
従って、MSH0704 および MSH0708は、本発明の好適なペプチドである。
【００５８】
本発明のさらなる課題として、本発明のペプチドは、微生物（microbes）に対しても活性がある。特に、それらを試験したところ、それらは特に黄色ブドウ球菌に対し、また緑膿菌に対し活性があるとの結果が得られた。
【００５９】
さらなる課題として、本発明は、本発明の一または二以上のペプチドを含んでいる薬学的製剤に関する。特に、前記製剤は、抗微生物剤としての又は特に殺カンジダ薬としての使用を見出しえる。
【００６０】
そのうえ、本発明の薬学的製剤（pharmaceutical preparation）は、一または二以上の他の有効成分（どちらも、殺カンジダ薬）を含んでもよく、おそらく相乗効果を示す,または示さない。特に、抗微生物薬、例えば、抗細菌剤, 抗真菌剤, 抗ウイルス剤, 抗寄生虫剤, など又は特に他の既知の殺カンジダ薬、例えば、例を挙げると、クロトリマゾール, ナイスタチン, フルコナゾール, ケトコナゾール又は、より重篤な感染の場合において、アンホテリシン B, カスポファンギン,またはボリコナゾールが含まれてもよい。
【００６１】
用量（Dosages）および投与計画（dosage regimes）は、選択された病状（pathology）および薬学的形態（pharmaceutical form）の種類に応じて確立されるだろう。
【００６２】
特に、本発明の製剤は、頬または舌下投与を含む経口; 直腸; 経鼻; 頬, 舌下または経皮を含む局所; 膣;または皮下, 筋肉内, 静脈内または皮内の経路を含む非経口での適切な投与の薬学的形態に製剤化されえる。
【００６３】
特に、経口投与に関して、それらは硬または軟カプセル, タブレッツ, 粉剤または顆粒剤; 水性または非水性の液体中の溶液剤  シロップ剤または懸濁剤; 食用の泡剤またはホイップ剤;またはオイルインウォーターまたはウォーターインオイルの何れかの液体エマルジョンの形態に調製できる;  局所投与に関して、それらは軟膏, クリーム剤, 懸濁剤, ローション剤, 粉剤, 溶液剤, ペースト剤, ゲル剤, スプレー剤, エアロゾルまたは油剤（oils）として調製できる;  経鼻投与に関して、スプレー剤または点滴剤（drops）を調製しえる;  膣投与に関して、それらはペッサリー, タンポン（tampons）, クリーム剤, ゲル剤, ペースト剤, 泡剤（foams）または噴霧剤として調製しえる;  非経口投与に関して、水性および非水性の無菌の注射可能な溶液剤または懸濁剤を調製しえる。
【００６４】
上記の開示された薬学的形態は、本発明の一または二以上のペプチドに加えて、製剤のタイプに応じて、当該技術の従来の他の添加物または賦形剤、例えば、例を挙げると, 希釈剤, 溶媒剤（solvents）, バルク剤（bulking agents）, 充填剤, レオロジー修飾因子（reological modifier）, 安定化剤, 結合剤, 潤滑剤, 崩壊剤, 保存剤, pH 調整剤, 緩衝剤, 抗酸化剤, キレート化剤, 可塑剤, ポリマー剤（polymers）, 乳化剤, 甘味剤, 矯味剤などを単独で又は組み合わせて含んでいてもよい。
【００６５】
［例1］
阻害活性アッセイ
二つのカンジダアルビカンス（Candida albicans）を、ATCC (No. 24433および76615)から取得した。他の酵母を、Fondazione Ospedale Maggiore Policlinico, Mangiagalli e Regina Elena, Milanoのコレクションから得た。コレクションには、C. albicans (7 単離体), C. glabrata (3 単離体), およびC. krusei (3 単離体)が含まれる。抗真菌感受性試験（Antifungal susceptibility testing）を、NCCLS M27-A ガイドライン (National Committee for Clinical Laboratory Standards. 1997, Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts and approved standard NCCLS document M27-A. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Wayne, Pa.)によるブロス微量希釈法（broth microdilution method）を用いて行った。生物体を、凍結したグリセロール貯蔵物(-70°Cで貯蔵した無菌の10%グリセロール懸濁物)から取り出し、Sabouraudのデキストロースプレートにサブカルチャーし、35°Cでインキュベーションした。48 hのインキュベーション後、プレートを純度（purity）について検査した。定常的な成長期（stationary growth phase）の酵母を調製するために、コロニーを寒天プレートからとり、5 mLのSabouraud-デキストロースブロスに移し、35°Cで48 hインキュベーションした。細胞を1,000 x gで10 min遠心分離し、ペレットを蒸留水で二回洗浄した。細胞を計数し、0.165 mol l-1 モルホリンプロパンスルホン酸(MOPS)緩衝剤(Sigma)でpH 7.0に緩衝したRPMI 1640培地に懸濁して二回（two times）の検査種菌(1x103 〜5 x 103 CFU/mL)を得た。96 U-型ウェルプレートの各ウェルに、100 μlの各抗真菌ペプチドを10-4〜7.8 x 10 -7 Mの濃度で、また100 μlの二回の種菌酵母を最終的に0.5 x 10〜2.5 x 10 細胞 ml-1 の濃度でいれた。
【００６６】
プレートを35°Cでインキュベーションし、成長を48 h観察した。MIC90（即ち、濁度の90%減少として決定される最小阻害濃度のエンドポイント）は、分光光度計 (Titertek multiscan  波長690 nm)を用いて測定された。
【００６７】
［例2］
阻害活性
上記の例 1により行われたアッセイの結果は、以下の表 3に報告され、本発明のペプチド化合物に関する48時間でのMIC 90を示している（μg/ml 濃度として表わされる）。
【００６８】
【表３】
0005518899.tif 000005
【００６９】
上記データは、最も活性な化合物がMSH0704 および MSH0708であることを示す。
【００７０】
［例3］
抗細菌活性
本発明をさらに開発するにあたって、我々はペプチド MSH 704 および 708の抗細菌活性（antibacterial activity）を決定した。
【００７１】
細菌株 緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa） ATCC 27853 および 黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus） ATCC 29213を、成長が指数関数的であるまで2% Bacto ペプトン 水 (Difco 1807-17-4)において成長させた。2 x 106 CFU/mLの種菌で標準の微量希釈技術（microdilution technique）を使用した。ペプチドの最小阻止濃度 (MIC)を、一晩、37°Cでインキュベーション後に1% Bacto ペプトン水で決定した。ペプチドに使用した濃度範囲は、10-4 〜7.8 x 10 -7 Mであった。黄色ブドウ球菌に関して31 μg/mL、また緑膿菌に関して61 μg/mLのMIC 値がMSH 704 および 708双方に関して見出された。
以下に、本願の出願当初の請求項を実施の態様として付記する。
（１）
一般式 (1)を有しているペプチド:
W-A1-A2-A3-A4-X-A5-A6-A7-Y (1)
式中で
A1は、ヒスチジン又は任意のヒスチジンアナログ、例えば、メチルヒスチジンまたは6-カルボキシル-1,2,3,4-テトラヒドロ-イミダゾピリジンまたは任意の他のヒスチジン代謝性の前駆体または荷電したアミノ酸、例えば、オルニチンまたはリジンおよび任意の天然アミノ酸のD-またはL-異性体の何れかを含んでいる群から選択され;
A2は、D(2)NalまたはPhe, D-Phe, Nal(1), D-Nal(1), Nal(2), Tyr, D-Tyrおよび任意の他の芳香族アミノ酸, D-およびL-異性体の双方, を含んでいる群から選択される,またはA2はイソロイシンであり;
A3は、Arg, Lys, Orn, Pro, Phe,(p-アミノ)Pheを含んでいる群から選択される又はDap, Dab, Dpmであってもよい;
A4は、Trp, (α-Me)Trp, Trp(Me), Trp(CHO), Arg, D-Nal(1) および D-Nal(2)のD-またはL-異性体の何れかを含んでいる群から選択され;
A5は、リジン, オルニチンのD-またはL-異性体の何れかを含んでいる群から選択される又はDapまたはDabであってもよい;
A6は、Phe, Pro, Nal(1), Nal(2)または任意の他の芳香族アミノ酸のD-またはL-異性体の何れかを含んでいる群から選択され;
A7は、Val, Thr, Leu, Ile, tert-Leu, NleのD-またはL-異性体を含んでいる群から選択される又はAbuであってもよい;
Wは、Hまたは任意の適切なカルボキシル保護基、例えば、飽和または不飽和の直鎖状または分枝状のC1-C8 アシル基またはアルカノイルであってもよい;またはWは、任意のD-またはL-アミノ酸、例えば、Ala, Nle, Gly,またはGly-Gly二量体またはAla-Ala二量体であってもよい;またはWは、H-Glu-Thr-Pro-Asp, H-Thr-Pro-Asp, -H-Pro-AspまたはH-Aspであってもよい,またはWは、H-Phe-Phe-Hisであってもよい;
Y は、任意の適切な保護基、例えば、ヒドロキシル基(-OH)またはアシル基であり;
Xは、非通常のアミノ酸を含んでいる群から選択される又はXは、一または二以上の天然の芳香族アミノ酸または単結合またはGlyまたはGly-Gly二量体またはAla-Ala 二量体である。
（２）
（１）に記載のペプチドであって、A1はHisであり、A2, A3, A4, A5, A6, A7, W, Y および Xは（１）の記載と同じ意味を有するペプチド。
（３）
（１）または（２）に記載のペプチドであって、A2 はD(2)Nalであり、A1, A3, A4, A5, A6, A7, W, Y および Xは（１）の記載と同じ意味を有するペプチド。
（４）
（１）〜（３）に記載のペプチドであって、A3 はArgであり、A1, A2, A4, A5, A6, A7, W, Y および Xは（１）の記載と同じ意味を有するペプチド。
（５）
（１）〜（４）に記載のペプチドであって、A4 はL-Trpであり、A1, A2, A3, A5, A6, A7, W, Y および Xは（１）の記載と同じ意味を有するペプチド。
（６）
（１）〜（５）に記載のペプチドであって、A5 はLysであり、A1, A2, A3, A4, A6, A7, W, Y および Xは（１）の記載と同じ意味を有するペプチド。
（７）
（１）〜（６）に記載のペプチドであって、A6 はPheであり、A1, A2, A3, A4, A5, A7, W, Y および Xは（１）の記載と同じ意味を有するペプチド。
（８）
（1〜7に記載のペプチドであって、A7 はValであり、A1, A2, A3, A4, A5, A6, W, Y およびXは（１）の記載と同じ意味を有するペプチド。
（９）
一般式 (1a)を有している先行する何れかの（に記載のペプチド:
W-His-D(2)Nal-Arg-Trp-X-Lys-Phe-Val-Y (1a)
式中のW, Y および Xは（１）と同じ意味を有する。
（１０）
以下の式を有している（１）〜（９）に記載のペプチド:
H-His-D(2)-Nal-Arg-Trp-Gly-Gly-Lys-Phe-Val-NH2 
H-His-D(2)-Nal-Arg-Trp-Aib-Lys-Phe-Val-NH2 
H-His-D(2)-Nal-Arg-Trp-β-Ala-Lys-Phe-Val-NH2 
H-His-D(2)-Nal-Arg-Trp-Cha-Lys-Phe-Val-NH2 
H-His-D(2)-Nal-Arg-Trp-Cpa-Lys-Phe-Val-NH2 
H-His-D(2)-Nal-Arg-Trp-Acpc-Lys-Phe-Val-NH2 
H-His-D(2)-Nal-Arg-Trp-tBuGly-Lys-Phe-Val-NH2 
H-His-D(2)-Nal-Arg-Trp-Aic-Lys-Phe-Val-NH2 
H-His-D(2)-Nal-Arg-Trp-Cybu-Lys-Phe-Val-NH2 
H-His-D(2)-Nal-Arg-Trp-β-AA-Lys-Phe-Val-NH2 
H-His-D(2)-Nal-Arg-Trp-Aoca-Lys-Phe-Val-NH2 
H-His-D(2)-Nal-Arg-Trp-Phe-Lys-Phe-Val-NH2 。
（１１）
式 (1b)を有している（１）に記載のペプチド:
W-A1-A2-A3-A4-X-A5-A6-A7-Y (1b)
式中で
W は、H-Phe-Phe-Hisであり;
Y は、アミノ末端基であり;
A1 は、Hisであり;
A2 は、Ile, Phe, (D)2-Nalであり;
A3 は、ArgまたはPheであり;
A4 は、Arg, Trp,またはGlyであり;
A5 は、Lysであり;
X は、Glyまたは単結合であり;
A6 は、ProまたはPheであり;
A7 は、Valである。
（１２）
以下の式を有している（１１）に記載のペプチド:
H-Phe-Phe-His-His-Ile-Phe-Arg-Gly-Lys-Pro-Val-NH2 
H-Phe-Phe-His-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Phe-Val-NH2 
H-Phe-Phe-His-His-(D)2-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Phe-Val-NH2 
H-Phe-Phe-His-His-Phe-Arg-Gly-Lys-Pro-Val-NH2 。
（１３）
医薬としての（１）〜（１２）に記載のペプチド。
（１４）
抗微生物性の医薬としての（１３）に記載のペプチド。
（１５）
殺カンジダ薬としての（１３）または（１４）に記載のペプチド。
（１６）
Candida albicans, Candida glabrata およびCandida kruseiに対する医薬としての（１３） 〜（１５）に記載のペプチド。
（１７）
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）または緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）に対する医薬としての（１３）〜（１４）に記載のペプチド。
（１８）
（１）〜（１２）の何れか一項に記載の一または二以上のペプチドを含んでいる薬学的製剤。
（１９）
（１８）に記載の薬学的製剤であって、さらに抗細菌剤, 抗真菌剤, 抗ウイルス剤, 抗寄生虫剤を含んでいる群から選択される一または二以上の有効成分（active principle）を含んでいる薬学的製剤。
（２０）
（１９）に記載の薬学的製剤であって、前記抗真菌剤がクロトリマゾール, ニスタチン, フルコナゾール, ケトコナゾール, アンホテリシン B, カスポファンギン, ボリコナゾールを含んでいる群から選択される薬学的製剤。
（２１）
（１８）〜（２０）に記載の薬学的製剤であって、さらに賦形剤および希釈剤, 溶媒剤, バルク剤（bulking agents）, 充填剤, レオロジー修飾因子（reological modifier）, 安定化剤, 結合剤, 潤滑剤, 崩壊剤, 保存剤, pH 調整剤, 緩衝剤, 抗酸化剤, キレート化剤, 可塑剤, ポリマー剤, 乳化剤, 甘味剤, 矯味剤を単独で又は組み合わせて含んでいる群から選択される添加物を含んでいる薬学的製剤。
（２２）
（１８）〜（２１）に記載の薬学的製剤であって、経口、直腸、経鼻、局所、膣または非経口投与のための薬学的製剤。
（２３）
（１８）〜（２２）に記載の薬学的製剤であって、硬または軟カプセル, タブレッツ, 粉剤または顆粒剤, 水性または非水性の液体中の溶液剤 シロップ剤または懸濁剤, 食用の泡剤またはホイップ剤, オイルインウォーターまたはウォーターインオイルの液体エマルジョン剤, 軟膏, クリーム剤, 懸濁剤, ローション剤, 粉剤, 溶液剤, ペースト剤, ゲル剤, スプレー剤, エアロゾルまたは油剤, スプレー剤または点滴剤, ペッサリー, タンポン（tampons）, クリーム剤, ゲル剤, ペースト剤, 泡剤;水性および非水性の無菌の注射可能な溶液剤または懸濁剤の形態の薬学的製剤。
【００７２】
[配列表フリーテキスト]
<110>  Fondazione Ospedale Maggiore Policlinico Mangiagalli e Regina Elena
<120>  抗微生物活性を有する新規メラノコルチン
<130>  E0071494
<160>  16    
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工配列
<220>
<223>  抗微生物性メラノコルチンインヒビター
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (2)..(2)
<223>  Alaは、3-(2-ナフチル)-D-アラニン
<400>  1
His Ala Arg Trp Gly Gly Lys Phe Val 
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<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工配列
<220>
<223>  抗微生物性メラノコルチンペプチド
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (2)..(2)
<223>  Alaは、3-(2-ナフチル)-D-アラニン
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (5)..(5)
<223>  Alaは、アルファ-メチル-アラニン
<400>  2
His Ala Arg Trp Ala Lys Phe Val 
1               5               
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<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工配列
<220>
<223>  抗微生物性メラノコルチンペプチド
<220>
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<222>  (2)..(2)
<223>  Alaは、3-(2-ナフチル)-D-アラニン
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (5)..(5)
<223>  Alaは、ベータ-アラニン
<400>  3
His Ala Arg Trp Ala Lys Phe Val 
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<212>  PRT
<213>  人工配列
<220>
<223>  抗微生物性メラノコルチンペプチド
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (2)..(2)
<223>  Alaは、3-(2-ナフチル)-D-アラニン
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (5)..(5)
<223>  Alaは、シクロヘキシル-アラニン
<400>  4
His Ala Arg Trp Ala Lys Phe Val 
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<220>
<223>  抗微生物性メラノコルチンペプチド
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (2)..(2)
<223>  Alaは、3-(2-ナフチル)-D-アラニン
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<221>  MISC_FEATURE
<222>  (5)..(5)
<223>  Xaaは、1-アミノ-シクロペンタン カルボン酸
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His Ala Arg Trp Xaa Lys Phe Val 
1               5               
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<213>  人工配列
<220>
<223>  抗微生物性メラノコルチンペプチド
<220>
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<222>  (2)..(2)
<223>  Alaは、3-(2-ナフチル)-D-アラニン
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (5)..(5)
<223>  Xaaは、1-アミノ-シクロプロパン カルボン酸
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His Ala Arg Trp Xaa Lys Phe Val 
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<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工配列
<220>
<223>  抗微生物性メラノコルチンペプチド
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<222>  (2)..(2)
<223>  Alaは、3-(2-ナフチル)-D-アラニン
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (5)..(5)
<223>  Glyは、アルファ-t-ブチルグリシン
<400>  7
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<211>  8
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<223>  抗微生物性メラノコルチンペプチド
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<222>  (2)..(2)
<223>  Alaは、3-(2-ナフチル)-D-アラニン
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (5)..(5)
<223>  Xaaは、2-アミノインダン-2-カルボン酸
<400>  8
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1               5               
<210>  9
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工配列
<220>
<223>  抗微生物性メラノコルチンペプチド
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (2)..(2)
<223>  Alaは、3-(2-ナフチル)-D-アラニン
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (5)..(5)
<223>  Xaaは、1-アミノ-シクロブタン カルボン酸
<400>  9
His Ala Arg Trp Xaa Lys Phe Val 
1               5               
<210>  10
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工配列
<220>
<223>  抗微生物性メラノコルチンペプチド
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (2)..(2)
<223>  Alaは、3-(2-ナフチル)-D-アラニン
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (5)..(5)
<223>  Xaaは、2-アミノシクロペンタン  カルボン酸
<400>  10
His Ala Arg Trp Xaa Lys Phe Val 
1               5               
<210>  11
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工配列
<220>
<223>  抗微生物性メラノコルチンペプチド
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (2)..(2)
<223>  Alaは、3-(2-ナフチル)-D-アラニン
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (5)..(5)
<223>  Xaaは、1-アミノ-シクロヘキサン カルボン酸
<400>  11
His Ala Arg Trp Xaa Lys Phe Val 
1               5               
<210>  12
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工配列
<220>
<223>  抗微生物性メラノコルチンペプチド
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (2)..(2)
<223>  Alaは、3-(2-ナフチル)-D-アラニン
<400>  12
His Ala Arg Trp Phe Lys Phe Val 
1               5               
<210>  13
<211>  11
<212>  PRT
<213>  人工配列
<220>
<223>  抗微生物性メラノコルチンペプチド
<400>  13
Phe Phe His His Ile Phe Arg Gly Lys Pro Val 
1               5                   10      
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<211>  11
<212>  PRT
<213>  人工配列
<220>
<223>  抗微生物性メラノコルチンペプチド
<400>  14
Phe Phe His His Phe Arg Trp Gly Lys Phe Val 
1               5                   10      
<210>  15
<211>  11
<212>  PRT
<213>  人工配列
<220>
<223>  抗微生物性メラノコルチンペプチド
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (5)..(5)
<223>  Alaは、3-(2-ナフチル)-D-アラニン
<400>  15
Phe Phe His His Ala Arg Trp Gly Lys Phe Val 
1               5                   10      
<210>  16
<211>  10
<212>  PRT
<213>  人工配列
<220>
<223>  抗微生物性メラノコルチンペプチド
<400>  16
Phe Phe His His Phe Arg Gly Lys Pro Val 
1               5                   10  
【図１】
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【配列表】
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