(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分子であって、該分子が、少なくとも２４ｂｐの二本鎖部分を含み、少なくとも１つの遊離末端を有し、ＣｐＧを欠いており、ヒトゲノムにおける任意の遺伝子に対して７０％未満の配列同一性を有し、各鎖の末端にまたは少なくとも鎖の３’末端に１または数個のホスホロチオエートまたはメチルホスホネート骨格を有するヌクレオチドを含み、かつ、該分子が、二本鎖切断ＤＳＢ修復のＮＨＥＪ経路に関与する少なくともＫｕタンパク質による結合についての基質であり、ここで該分子は、配列番号１７のＤｂａｉｔ３２Ｈｃの配列の二本鎖部分を有する、核酸分子。
【請求項２】
該分子が、ヘアピン核酸分子である、請求項１記載の分子。
【請求項３】
該遊離末端が、平滑であるかまたは５’もしくは３’突出している、請求項１〜２のいずれか１項記載の分子。
【請求項４】
Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ（配列番号１７）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ−３’ｍｐ（配列番号１９）、およびＤｂａｉｔ３２Ｈｃ−５’３’ｍｐ（配列番号２０）より選択される、請求項１〜３のいずれか１項記載の分子。
【請求項５】
Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ（配列番号１７）である、請求項４記載の分子。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載の分子および薬学的に許容される担体もしくは賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項７】
経口経路、または静脈内、腫瘍内もしくは皮下注射、または頭蓋内もしくは動脈内注射もしくは注入、または局所投与に好適である、請求項６記載の薬学的組成物。
【請求項８】
ガンを治療するための使用のための併用調製物としての、請求項１〜５のいずれか１項記載の分子と、ＤＮＡの二本鎖切断を直接または間接的に引き起こし得る化学薬剤とを含む、医薬品。
【請求項９】
該分子が、化学薬剤より前にまたは化学薬剤と同時に投与される、請求項８記載の医薬品。
【請求項１０】
ＤＮＡ損傷性抗ガン療法に対する腫瘍感受性を増強するための医薬の製造のための、請求項１〜５のいずれか１項記載の分子の使用。
【請求項１１】
ＤＮＡ損傷性抗ガン療法と併用して使用されるガンを処置するための医薬の製造のための、請求項１〜５のいずれか１項記載の分子の使用。
【請求項１２】
該ＤＮＡ損傷性抗ガン療法が、放射線療法および化学療法より選択される、請求項１０または１１記載の使用。
【請求項１３】
該分子が、放射線療法より前に投与される、請求項１０〜１２のいずれか１項記載の使用。
【請求項１４】
該分子が、化学療法より前または化学療法と同時に投与される、請求項１０〜１２のいずれか１項記載の使用。
【請求項１５】
該ガンが、ＣＮＳガン、頭頸部ガン、結腸直腸ガン、肝臓ガン、消化管ガン、尿生殖路ガン、肺ガン、皮膚ガン、乳ガンおよび子宮頸ガンより選択される、請求項１０〜１４のいずれか１項記載の使用。
【請求項１６】
該分子が、経口経路、または静脈内、腫瘍内もしくは皮下注射、または頭蓋内もしくは動脈内注射もしくは注入、または局所投与によって投与される、請求項１０〜１５のいずれか１項記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物細胞におけるＤＮＡ修復経路を妨げる組成物および方法に関するものである。本発明は、特に、ＤＮＡ損傷感知、シグナル伝達および／または修復経路、特に二本鎖切断（ＤＳＢ）修復の非相同末端連結（ＮＨＥＪ）経路を妨げる核酸分子、ならびに特に抗ガン療法へ提示された腫瘍の細胞致死をトリガーするための、それらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
放射線療法および化学療法は、単独でまたは手術と併用される、ヒトガンに対する必要不可欠な療法である。
【０００３】
電離放射線は、直接または間接的に二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こし、そして細胞／組織死（壊死またはアポトーシス）をトリガーする。電離放射線の細胞傷害効果は、ヒトガンの治療において広く使用されている、放射線療法の基礎を形成する。放射線療法の効能は、特定の腫瘍（例えば、膠芽腫、頭頸部扁平上皮癌）の放射線耐性、および（例えば、乳ガンおよび子宮頸ガンの治療における）正常組織付近の放射線照射によって引き起こされる副作用によって、現在、制限されている。
【０００４】
ここ数年において、多くの研究が、腫瘍細胞の放射線感受性または放射線耐性の基礎をなす現象の複雑さを理解するために、電離放射線反応に関連する生物学的機構に注目してきた。電離放射線に対する反応を細かく調節する種々の経路の理解が、放射線療法と共同して、放射線に対して高度に耐性である腫瘍（例えば、脳腫瘍または頭頸部腫瘍）からの回復の見込みを改善し得る、新規の薬物および療法についての分子ターゲットの同定への重要なステップである。
【０００５】
化学療法剤の使用は、直接的または間接的なＤＳＢを含む、ＤＮＡ損傷を引き起こし得る。化学療法剤（細胞傷害剤）の主に使用されるファミリー例は、以下である：ＩまたはＩＩ型トポイソメラーゼの阻害剤（カンプトテシン／トポテカン、エピルビシン／エトポシド）、ＤＮＡ架橋剤（シスプラチン／カルボプラチン／オキサリプラチン）、ＤＮＡアルキル化剤（カルムスチン／ダカルバジン）または抗代謝剤（５−フルオロウラシル／ゲムシタビン／カペシタビン）、ならびに紡錘体の阻害剤（パクリタキセル／ドセタキセル／ビノレルビン）。
【０００６】
生物学的薬物（モノクローナル抗体、サイトカイン／キナーゼ阻害剤、免疫療法／ワクチン）を開発することにおける最近の進歩は、それらの効率および腫瘍のサブセットへの特異性を証明した。しかし、それらは、しばしば、細胞傷害剤と併用して使用されている。新規の細胞傷害薬の開発における多くの進歩にもかかわらず、化学療法に対する薬剤耐性は、依然としてガン治療において主要な臨床的懸念である。薬物取り込み／排出、代謝分解、ターゲットの突然変異誘発、増強された修復、細胞死（アポトーシスおよび壊死）のシグナル伝達に関する薬剤耐性の機構の理解は、化学療法の効率を保証するために必須であり、特に、ある治療耐性腫瘍において、治療指数を改善する。
【０００７】
化学療法および放射線療法の共同は、ガン治療において広く使用された。依然として完全には解明されていないが、細胞傷害剤の作用の生物学的基礎は、細胞周期またはＤＮＡ損傷などの、細胞機構に依存しており、これはまた、放射線誘導細胞死について重要であり、ガン療法において種々の治療を併用することによって、付加的なまたはより十分な相乗的な利益へ導く。
【０００８】
ここ１０年において、多くの研究がこの分野において行われ、そして放射線に対する反応におけるシグナル伝達の複雑さが描かれ始めた。この点で、電離放射線でターゲッティングされる特に興味深い遺伝子は、アポトーシスまたはＤＮＡ修復などの放射線誘導致死機構の調節に関与するものである。ＤＳＢは最も致死性の高いＤＮＡ損傷であるので、電離放射線の効能は、ＤＳＢ修復のそれが増加するについて、低下する。
【０００９】
２つの機構がＤＳＢの修復に関与している：非相同末端連結（ＮＨＥＪ、配列非依存性経路）および相同組換え（ＨＲ、配列依存性経路）（Ｊａｃｋｓｏｎ，２００２によって概説される）。これら２つの主要なＤＢＳ修復経路に関与する遺伝子をターゲッティングすることは、今までのところ、使用されるアプローチおよびガン細胞株に依存して、少しのまたは中程度の放射線感受性へと導いた（Ｂｅｌｅｎｋｏｖら，２００２；Ｍａｒａｎｇｏｎｉら，２０００；Ｏｈｎｉｓｈｉら，１９９８）。
【００１０】
Ｋｕ（例えば、Ｋｕ７０およびＫｕ８０）ならびにＤＮＡ−ＰＫｃｓタンパク質は、放射線または化学物質で誘導されるＤＮＡ  ＤＳＢの修復において重要である。損傷が時間通りに修復され得ない場合、細胞は死滅する。従って、それらは、放射線療法および化学療法に対してターゲット細胞および組織を増感させるための潜在的に興味深い分子ターゲットを示す。従って、哺乳動物細胞において優勢である、ＮＨＥＪ経路に関与するこれらの重要なタンパク質（Ｋｕ７０／Ｋｕ８０、ＤＮＡ−ＰＫｃｓなど）を阻害しようとして、多くのアプローチが考え出されそして行われてきた：
１）ＰＩ３Ｋの阻害剤（ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ）（即ち、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ、ＡＴＭ、ＡＴＲ）（Ｂｏｕｌｔｏｎら，２０００；ＤｕｒａｎｔおよびＫａｒｒａｎ，２００３；Ｗｉｌｌｍｏｒｅら，２００４；Ｖａｕｇｅｒら，２００４）；
２）ネガティブドミナントおよびペプチド（ＫＵ８０のＣ末端）（Ｍａｒａｎｇｏｎｉら，２０００；Ｋｉｍら，２００２）；
３）一本鎖抗体可変フラグメント（ｓｃＦｖ）（ＤＮＡ−ＰＫｃｓ）（Ｌｉら、２００３）；
４）ＲＮＡアプタマー（ＳＥＬＥＸ：ＲＮＡ結合Ｋｕ）（ＹｏｏおよびＤｙｎａｎ，１９９８）；
５）アンチセンス（Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ）（Ｌｉら，２００３ｂ；Ｍａｒａｎｇｏｎｉら，２０００；Ｓａｋら，２００２）；
６）ｓｉＲＮＡ（ＤＮＡ−ＰＫｃｓ）（Ｐｅｎｇら，２０００）。
【００１１】
これらのすさまじい努力にもかかわらず、ＤＮＡ修復経路に関与する遺伝子のターゲッティングとガン療法との併用は、依然として、初期実験段階にあり、臨床研究は、証明された利益を今まで示していない。上述のアプローチが共通の特徴を共有していることは、注目に値する：それらは、可能なバイパスまたは補償を有する複雑なカスケード経路（例えば、ＮＨＥＪ）に関与する単一のエフェクター（タンパク質）をターゲッティングしている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の概要
本発明は、哺乳動物細胞におけるＤＮＡ修復経路を妨げる新規の組成物および方法に関する。本発明は、特に、非遺伝子特異的様式で、ＤＮＡ損傷感知、シグナル伝達および／または修復経路を妨げる核酸分子、ならびに、特に抗ガン療法へ提示された腫瘍の細胞致死をトリガーするための、それらの使用に関する。
【００１３】
本発明者は、直接または間接的なＤＮＡ損傷療法への細胞の感受性が、切断されたＤＮＡフラグメントの模倣物として作用し、そして、ＤＮＡ損傷治療によって誘導されたＤＳＢ部位として認識される（化学的に修飾されているかまたは修飾されていない）短いｄｓＤＮＡ分子（即ち、ＤＳＢの基質模倣物）を使用することによって増強され得ることを見出した。
【００１４】
実施例において示されるように、本発明の分子は、インビトロおよびin vivoで有効であり、ＤＮＡ損傷ガン療法に対して任意の腫瘍細胞の感受性を与えるかまたは増加させるために使用され得る。
【００１５】
従って、本発明の目的は、放射線療法および化学療法に対する治療耐性腫瘍の反応を増強することができる、「ＤＳＢベイト（DNA bait）」分子（つまり、Ｄｂａｉｔ）という名称でも呼ばれる、このようなｄｓＤＮＡ分子に関する。下記にさらに開示するように、Ｄｂａｉｔ分子は、ＤＮＡ修復酵素のホロ複合体（holocomplex）をベイトしそしてハイジャックすることによって作用し、そしてそれによってＤＮＡ損傷感知、シグナル伝達および／または修復プロセスを妨げる。この新規のアプローチを、「ＤＮＡベイト」と名付ける。
【００１６】
好ましい態様において、本発明は、核酸分子であるＤｂａｉｔ分子であって、該分子が、少なくとも２４ｂｐの二本鎖部分を含み、少なくとも１つの遊離末端を有し、ＣｐＧを欠いており、ヒトゲノムにおける任意の遺伝子に対して７０％未満の配列同一性を有し、各鎖の末端にまたは少なくとも３’末端鎖に１または数個のホスホロチオエートまたはメチルホスホネート骨格を有するヌクレオチドを含み、かつ、該分子が、二本鎖切断（ＤＳＢ）修復のＮＨＥＪ経路に関与する少なくともＫｕタンパク質による結合についての基質である、Ｄｂａｉｔ分子に関する。好ましくは、Ｄｂａｉｔ分子は、Ｄｂａｉｔ３２Ｈａ、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｂ、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｄ、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ−３’ｍｐ、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ−５’３’ｍｐ、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ−Ｃｙ３、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ−Ｃｙ５、およびＤｂａｉｔ３２Ｈｄ−ＦＩＴＣからなる群より選択される。なおより好ましくは、Ｄｂａｉｔ分子は、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃである。
【００１７】
本発明のさらなる目的は、Ｄｂａｉｔ分子および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む組成物にある。特定の態様において、組成物は、経口経路、または静脈内、腫瘍内もしくは皮下注射、または頭蓋内もしくは動脈内注射もしくは注入、または局所投与に好適である。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、ＤＮＡのＤＳＢを直接的または間接的に引き起こし得る物理および／または化学薬剤と併用されるＤｂａｉｔ分子にある。特に、本発明は、ガンを治療するための使用のための併用調製物としての、本発明のＤｂａｉｔ分子と、ＤＮＡの二本鎖切断を直接または間接的に引き起こし得る化学薬剤とを含む、医薬品に関する。好ましくは、Ｄｂａｉｔ分子は、化学薬剤より前にまたは化学薬剤と同時に投与される。
【００１９】
本発明のさらなる目的は、Ｄｂａｉｔ分子とＤＮＡ損傷を直接的または間接的に引き起こす療法との併用を使用する、増殖性障害（例えば、ガン）を治療するための方法である。従って、本発明は、ＤＮＡ損傷性抗ガン療法と併用して使用されるガンを治療するための医薬の製造のための本発明のＤｂａｉｔ分子の使用に関する。特に、ＤＮＡ損傷性抗ガン療法は、放射線療法および化学療法より選択される。好ましくは、Ｄｂａｉｔ分子は、放射線療法より前に投与される。または、Ｄｂａｉｔ分子は、化学療法より前または化学療法と同時に投与される。特定の態様において、分子は、経口経路、または静脈内、腫瘍内もしくは皮下注射、または頭蓋内もしくは動脈内注射もしくは注入、または局所投与によって投与される。好ましくは、ガンは、ＣＮＳガン、頭頸部ガン、結腸直腸ガン、肝臓ガン、消化管ガン、尿生殖路ガン（genitor-urinary tract cancer）、肺ガン、皮膚ガン、乳ガンおよび子宮頸ガンより選択される。
【００２０】
本発明の別の目的は、特に放射療法および／または化学療法に対してほとんど反応しない腫瘍について、ガン治療の効率を増強するための抗ガン療法アジュバントを作製するためのＤｂａｉｔ分子の使用に関する。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、上記で定義されるＤｂａｉｔ分子を被験体へ投与することを含む、ＤＮＡ損傷性抗ガン療法に対する腫瘍感受性を増強する方法である。
【００２２】
従って、本発明は、ＤＮＡ損傷性抗ガン療法に対する腫瘍感受性を増強させるための医薬の製造のための、本発明のＤｂａｉｔ分子の使用に関する。特に、ＤＮＡ損傷性抗ガン療法は、放射線療法および化学療法より選択される。好ましくは、Ｄｂａｉｔ分子は、放射線療法より前に投与される。または、Ｄｂａｉｔ分子は、化学療法より前または化学療法と同時に投与される。特定の態様において、分子は、経口経路、または静脈内、腫瘍内もしくは皮下注射、または頭蓋内もしくは動脈内注射もしくは注入、または局所投与によって投与される。好ましくは、ガンは、ＣＮＳガン、頭頸部ガン、結腸直腸ガン、肝臓ガン、消化管ガン、尿生殖路ガン、肺ガン、皮膚ガン、乳ガンおよび子宮頸ガンより選択される。
【００２３】
本発明のさらなる目的は、ＤＮＡ損傷性抗ガン療法と併用してＤｂａｉｔ分子を被験体へ投与することを含む、ガンを治療する方法である。
【００２４】
本発明のさらなる目的は、ＤＮＡ切断治療、特に放射線療法または化学療法と共同しての使用のための組成物であり、該組成物は、腫瘍細胞の核に導入されるに有効な量で、少なくとも１つのＤｂａｉｔ分子を薬学的に許容される担体と組み合わせて含む。
【００２５】
本発明は、哺乳動物被験体における、特にヒト被験体における、種々のタイプのガン、例えば、固形ガンおよび白血病、特に放射線または化学物質耐性ガンにおけるガン療法に対する感受性を与えるために使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１．１】Ｈｅｐ２細胞由来の種々の量の核抽出物（０、１０、２０、４０、８０、１６０、３２０ｎｇ／μｌ）の存在下で種々の３２Ｐ放射標識Ｄｂａｉｔ分子について行ったバンドシフトアッセイ。シフトされたバンドは、番号１および２であった。バンド３は、十分にロードしている（loading well）。
【図１．２】Ｈｅｐ２細胞核抽出物（０、２０、８０、３２０ｎｇ／μｌ）中のタンパク質を含む種々の３２Ｐ放射標識Ｄｂａｉｔ分子の遅延バンドにおけるＫｕタンパク質の存在の同定。ラインα−Ｋｕにおいて、それは、ゲル上にサンプルをロードする前の結合反応へ抗Ｋｕ抗体を添加した場合は（＋）または添加しなかった場合は（−）と示される。シフトされたバンドは番号１、２および３であり、抗Ｋｕ結合後にシフトされた移動を示すバンドについて、星印を番号に付加した。
【図１．３】２０μｇ  Ｈｅｐ２核タンパク質抽出物を用いてのＤＮＡ末端連結アッセイ。上パネル：種々の時間にわたる２０μｌアッセイ緩衝液中２０μＭ  Ｄｂａｉｔの非存在および存在下での０．２μＭ  ３２Ｐ標識ＤＮＡフラグメントの連結。バンド１〜４は、初期６０５ｂｐ  ＤＮＡフラグメント（単量体［１］）、二量体［２］、三量体［３］または四量体［４］として移動する連結生成物を示す。下パネル：連結生成物のパーセンテージを定量化し、時間の関数（菱形、Ｄｂａｉｔ無し；円、２００ｎＭ  Ｄｂａｉｔ３２Ｈ有り）として、およびＤｂａｉｔ分子の化学構造の関数（２００ｎＭの種々のＤｂａｉｔと共の２時間のインキュベーション後）として示した。
【図１．４】種々の長さ、配列および化学構造（修飾された骨格を含む）を有する多数のＤｂａｉｔ分子２μｇの、Ｈｅｐ２核タンパク質抽出物１．５μｇ中におけるＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＤＮＡ−ＰＫ）活性アッセイ：Ｄｂａｉｔ３２ｓｓおよびＤｂａｉｔ３２ｃｓｓは、２つの３２ｎｔ一本鎖ＤＮＡであり；Ｄｂａｉｔ３２Ｃは、ダンベル３２ｂｐ二本鎖ＤＮＡ（平滑末端を有さない）であり；Ｄｂａｉｔ８Ｈ、Ｄｂａｉｔ１６Ｈ、Ｄｂａｉｔ２４ＨおよびＤｂａｉｔ３２Ｈは、それぞれ、８、１６、２４および３２ｂｐの幹を有するヘアピン二本鎖ＤＮＡであり；Ｄｂａｉｔ３２Ｈ、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｂ、Ｄｂａｉｔ３２ＨｃおよびＤｂａｉｔ３２Ｈｄは、異なる配列を有するが同一の塩基組成を有する３２ｂｐヘアピンＤＮＡであり；Ｄｂａｉｔ３２ｄ−ＦおよびＤｂａｉｔＨｃ−ｃｙ３は、それぞれ、フルオレセインおよびシアニン３タグされたＤｂａｉｔ３２ＨｄおよびＤｂａｔ３２Ｈｃであり；Ｄｂａｉｔ３２Ｈ−ｐｏは、それぞれ３’末端または５’および３’末端の両方に３ｎｔメチルホスホネートを有するＤｂａｉｔＨｃ−３’ｍｐおよびＤｂａｉｔ３２Ｈｃ−５’３’ｍｐを除いて、遊離平滑末端に３ｂｐホスホロチオエートを有する他のＤｂａｉｔ分子と比較した場合、全長ホスホジエステルＤｂａｉｔ３２Ｈである。Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ５’５’は、３’−３’結合を有し、従って、５’／５’平滑末端を提示している；これらのＤｂａｉｔ分子の詳細については表１．１および１．２を参照のこと。データは、少なくとも３つの独立した実験の平均値および標準偏差を示す。
【図２．１Ａ】種々のＤｂａｉｔ分子の存在下で１３７セシウム源由来のγ線で行った４×０．５Ｇｙ（２時間間隔）放射線照射後のＨｅｌａ細胞のクローン原性生存アッセイ（clonogenic survival assay）。パネルＡ：Ｄｂａｉｔ３２およびＤｂａｉｔ３２Ｈの存在下での標準化生存クローン数の用量依存性。パネルＢ：８３ｎＭ（培養培地中の濃度）での異なるＤｂａｉｔ分子の存在下での標準化生存クローン数。
【図２．１Ｂ】種々のＤｂａｉｔ分子の存在下で１３７セシウム源由来のγ線で行った４×０．５Ｇｙ（２時間間隔）放射線照射後のＨｅｌａ細胞のクローン原性生存アッセイ（clonogenic survival assay）。パネルＡ：Ｄｂａｉｔ３２およびＤｂａｉｔ３２Ｈの存在下での標準化生存クローン数の用量依存性。パネルＢ：８３ｎＭ（培養培地中の濃度）での異なるＤｂａｉｔ分子の存在下での標準化生存クローン数。
【図２．２】種々のＤｂａｉｔ分子の存在下で１３７セシウム源由来のγ線で行った４×０．５Ｇｙ（２時間間隔）放射線照射後のＨｅｌａ細胞のさらなるクローン原性生存アッセイ。上パネル：Ｄｂａｉｔ３２ＨおよびＤｂａｉｔ８Ｈの存在下での標準化生存クローン数の用量依存性。下パネル：異なるＤｂａｉｔ分子２μｇの存在下での標準化生存クローン数。
【図２．３】２μｇ  Ｄｂａｉｔ３２Ｈ分子による、ネオマイシン耐性をコードする遺伝子を有する線状プラスミドフラグメント（２μｇ）の放射線増強異常組込みの阻害。
【図２．４】種々のＤｂａｉｔ３２分子（２μｇ）による、プロマイシン耐性をコードする遺伝子を有する線状プラスミドフラグメント（２μｇ）の放射線増強異常組込みの阻害のさらなるアッセイ。上パネル：細分された（４×０．５Ｇｙ）放射線照射の存在下（黒丸）または放射線照射の非存在下（黒三角）でのＤａｉｔ３２Ｈ分子の用量依存性；下パネル：放射線照射有り（黒色）または放射線照射無し（灰色）での、２μｇの種々のＤｂａｉｔ分子または２００μＭ  ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤（ワートマニンまたはＮＵ７０２６）の存在下でのプラスミド組込みの効率。
【図２．５】２Ｇｙ放射線照射の２時間後での蛍光性Ｄｂａｉｔ３２Ｈ−ＦＩＴＣ分子によってトランスフェクションされたＨｅｌａ細胞中におけるγ−Ｈ２ＡＸフォーカスによって明らかにされた二本鎖切断（ＤＳＢ）部位の免疫検出。左パネル：Ｄｂａｉｔ３２Ｈ−ＦＩＴＣの蛍光（明るいドットおよび斑点）および核中のγ−Ｈ２ＡＸ抗体の免疫蛍光検査によって検出されたＤＳＢ部位；右パネル：γ−Ｈ２ＡＸ抗体の免疫蛍光検査およびＤＡＰＩ対比染色によって検出されたＤＳＢ部位を有する核の同一の画像。左下角の矢印は、核中にＤｂａｉｔ３２Ｈ−ＦＩＴＣおよびγ−Ｈ２ＡＸシグナルが存在しないことを示す。右上角の矢印は、共局在化されたＤｂａｉｔ３２Ｈ−ＦＩＴＣおよびγ−Ｈ２ＡＸシグナルを示す。
【図２．６】上パネル：ＰＩＫＫによるヒストンＨ２ＡＸリン酸化。総細胞抽出物を、総Ｈ２ＡＸタンパク質と比較して、ヒストンＨ２ＡＸのリン酸化形態（γ−Ｈ２ＡＸ）のレベルについて、ウエスタンブロッティングによって分析した。Ｈｅｐ２細胞に、５時間、種々のＤｂａｉｔ分子、３２Ｈｃ、２４Ｈ、１６Ｈおよび８Ｈを５時間トランスフェクションしたか、またはトランスフェクションしなかった。トランスフェクションの終わりに、それらに放射線照射し、１時間インキュベーションし、次いで分析した。結果を、γ−Ｈ２ＡＸ／Ｈ２ＡＸの標準化比率のヒストグラムとして示す。下パネル：放射線照射された（ＩＲ）細胞におけるＦＡＣＳによるγ−Ｈ２ＡＸフォーカスによって明らかにされたＤＳＢ部位の存続の動態：Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ＋ＩＲ（実線）、ＩＲのみ（破線）、および未処理（点線）。
【図３．１】未処理ＧＭＡ３２細胞、リポフェクタミンのみによってトランスフェションされた細胞、またはリポフェクタミンによって種々のＤｂａｉｔ分子がトランスフェクションされた細胞のＦＡＣＳ分析；但し、さらなる放射線照射または有糸分裂阻害剤処理無し。Ｍ１相は、細胞死を示すｓｕｂ−Ｇ１段階にある細胞のパーセンテージを示す。
【図３．２】未処理ＧＭＡ３２細胞、リポフェクタミンのみによってトランスフェションされた細胞、またはリポフェクタミンによって種々のＤｂａｉｔ分子がトランスフェクションされた細胞におけるγ−Ｈ２ＡＸ標識化によるＤＮＡ修復フォーカスの免疫検出（核中の明るいドットまたは斑点）。細胞膜および核の対比染色を、ＦＩＴＣ−ＤｉＯＣ６およびＤＡＰＩによって達成した。
【図３．３】未処理ＧＭＡ３２細胞、リポフェクタミンのみによってトランスフェションされた細胞、またはリポフェクタミンによって種々のＤｂａｉｔ分子がトランスフェクションされた細胞のｐ５３セリン１５残基のリン酸化状態のウエスタンブロット分析；但し、さらなる放射線照射または有糸分裂阻害剤処理無し。
【図３．４】種々のＤｂａｉｔ分子の存在下で４Ｇｙ放射線照射によってまたは種々の有糸分裂阻害剤（２００ｎＭノコダゾール、１００ｎＭナベルビン（ビノレルビン）または２００ｎＭタキソール（パクリタキセル））によって処理したＧＭＡ３２細胞ならびに未処理のＧＭＡ３２細胞のクローン原性生存。
【図４．１Ａ】治療有りまたは無しでの、初期体積に対する時間ｔでの腫瘍体積の比率（Ｖｔ／Ｖｉ）としてモニタリングした、マウス上における異種移植されたヒト喉頭腫瘍の増殖。パネルＡ：未治療のアーム（ｎ＝３８）；パネルＢ：２０μｌ培養培地（ＭＥＭ）＋３×２Ｇｙ／週  放射線照射で治療したコントロールアーム（ｎ＝３０）；パネルＣ：１ｎｍｏｌ（２０μｇ）Ｄｂａｉｔ３２Ｈ＋３×２Ｇｙ／週  放射線照射で治療したアーム（ｎ＝３５）。ＭＥＭまたはＤｂａｉｔ３２Ｈを、放射線照射の５時間前に腫瘍内注射によって送達した。分割した放射線照射線量（２Ｇｙ）を、２日毎に１回、１週間に３回与えた。治療を５週間続け、合計で３０Ｇｙ放射線照射となった。ドットは、各マウスの腫瘍体積の時間的経過を示す。実線は、最良の多項式フィッティング（best polynomial fitting）である。パネルＤは、腫瘍体積の増加（Ｖｔ／Ｖｉ）＜５である全てのマウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットを示す。
【図４．１Ｂ】治療有りまたは無しでの、初期体積に対する時間ｔでの腫瘍体積の比率（Ｖｔ／Ｖｉ）としてモニタリングした、マウス上における異種移植されたヒト喉頭腫瘍の増殖。パネルＡ：未治療のアーム（ｎ＝３８）；パネルＢ：２０μｌ培養培地（ＭＥＭ）＋３×２Ｇｙ／週  放射線照射で治療したコントロールアーム（ｎ＝３０）；パネルＣ：１ｎｍｏｌ（２０μｇ）Ｄｂａｉｔ３２Ｈ＋３×２Ｇｙ／週  放射線照射で治療したアーム（ｎ＝３５）。ＭＥＭまたはＤｂａｉｔ３２Ｈを、放射線照射の５時間前に腫瘍内注射によって送達した。分割した放射線照射線量（２Ｇｙ）を、２日毎に１回、１週間に３回与えた。治療を５週間続け、合計で３０Ｇｙ放射線照射となった。ドットは、各マウスの腫瘍体積の時間的経過を示す。実線は、最良の多項式フィッティング（best polynomial fitting）である。パネルＤは、腫瘍体積の増加（Ｖｔ／Ｖｉ）＜５である全てのマウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットを示す。
【図４．１Ｃ】治療有りまたは無しでの、初期体積に対する時間ｔでの腫瘍体積の比率（Ｖｔ／Ｖｉ）としてモニタリングした、マウス上における異種移植されたヒト喉頭腫瘍の増殖。パネルＡ：未治療のアーム（ｎ＝３８）；パネルＢ：２０μｌ培養培地（ＭＥＭ）＋３×２Ｇｙ／週  放射線照射で治療したコントロールアーム（ｎ＝３０）；パネルＣ：１ｎｍｏｌ（２０μｇ）Ｄｂａｉｔ３２Ｈ＋３×２Ｇｙ／週  放射線照射で治療したアーム（ｎ＝３５）。ＭＥＭまたはＤｂａｉｔ３２Ｈを、放射線照射の５時間前に腫瘍内注射によって送達した。分割した放射線照射線量（２Ｇｙ）を、２日毎に１回、１週間に３回与えた。治療を５週間続け、合計で３０Ｇｙ放射線照射となった。ドットは、各マウスの腫瘍体積の時間的経過を示す。実線は、最良の多項式フィッティング（best polynomial fitting）である。パネルＤは、腫瘍体積の増加（Ｖｔ／Ｖｉ）＜５である全てのマウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットを示す。
【図４．１Ｄ】治療有りまたは無しでの、初期体積に対する時間ｔでの腫瘍体積の比率（Ｖｔ／Ｖｉ）としてモニタリングした、マウス上における異種移植されたヒト喉頭腫瘍の増殖。パネルＡ：未治療のアーム（ｎ＝３８）；パネルＢ：２０μｌ培養培地（ＭＥＭ）＋３×２Ｇｙ／週  放射線照射で治療したコントロールアーム（ｎ＝３０）；パネルＣ：１ｎｍｏｌ（２０μｇ）Ｄｂａｉｔ３２Ｈ＋３×２Ｇｙ／週  放射線照射で治療したアーム（ｎ＝３５）。ＭＥＭまたはＤｂａｉｔ３２Ｈを、放射線照射の５時間前に腫瘍内注射によって送達した。分割した放射線照射線量（２Ｇｙ）を、２日毎に１回、１週間に３回与えた。治療を５週間続け、合計で３０Ｇｙ放射線照射となった。ドットは、各マウスの腫瘍体積の時間的経過を示す。実線は、最良の多項式フィッティング（best polynomial fitting）である。パネルＤは、腫瘍体積の増加（Ｖｔ／Ｖｉ）＜５である全てのマウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットを示す。
【図４．２】ヌードマウスにおけるＨｅｐ２異種移植腫瘍におけるシアニンＣ３標識Ｄｂａｉｔ３２Ｈの分布。Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（トランスフェクション剤）を配合した２０μｇ  Ｄｂａｉｔ３２Ｈ−Ｃｙ３を、１．５ｃｍ３  Ｈｅｐ２腫瘍中へ注射した。マウスを注射の６時間後に犠牲にした。腫瘍を取り出し、そして固定せずに分析のためクライオスライスした。ＤＡＰＩを核染色のために使用した。
【図４．３】ヌードマウスにおけるＨｅｐ２異種移植した腫瘍の放射線増感。腫瘍増殖を、種々の治療での１０匹の動物の４つの群における治療の間（３５日内に１５セッション；灰色の背景）および治療後（白色の背景）、モニタリングした。個々の腫瘍増殖を各動物について示す。治療プロトコルを上部に示した。各治療セッションについて、トランスフェクション剤（ＰＥＩ）を配合した２μｇ  Ｄｂａｉｔ３２Ｈを、２Ｇｙ放射線照射の５時間前に腫瘍中へ注射した。各群の腫瘍体積の５倍増加についての平均期間もまた示す。放射線照射のみを受けた群と比較しての、併用治療を受けた群について、ｐ値を算出した。
【図４．４】上パネル：Ｈｅｐ２腫瘍によって皮下に異種移植されたヌードマウスの生存のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ表示。治療プロトコルを図４．３に記載した。５つの群を含めた：未治療；偽トランスフェクションそして放射線照射；組み合わせた放射線照射および増加する量のＤｂａｉｔ３２Ｈ（２０、６０および１２０μｇ／セッション）によって治療。各群についての動物の数を、表３．２に示す。灰色の背景は、治療の期間を示す。下パネル：治療の開始後１５日、治療の終了時（３５日）、および治療の終了後１３日（３５＋１３日）で撮影した３つの群（未治療；２Ｇｙ放射線照射と合わされた２０および６０μｇ  Ｄｂａｉｔ３２Ｈ／セッションで治療）を示す腫瘍の写真。
【図４．５Ａ】中間段階治療（７セッション）での異種移植されたＨｅｐ２腫瘍の組織学的分析。腫瘍を、記載される種々の治療プロトコルの開始の２０日後に採取した。それらをホルマリンに固定し、そして組織切片をヘマトキシリン、エオシンおよびサフラン（safran）で染色した。各治療プロトコルについて２つの腫瘍を顕微鏡検査によって分析した。パネルａ：各プロトコルの代表的な領域の写真。スケールバーは、４００ｍｍ（パネル１〜４）および１００ｍｍ（パネル５〜８）を示す。カラー写真は要請に応じて入手可能である。パネルｂ：壊死の程度を、壊死であると分析された組織切片の表面積の割合として表す。有糸分裂細胞およびアポトーシス細胞の数を、高出力で分析された約１０００個の細胞の代表的な非壊死領域から推定した。
【図４．５Ｂ】中間段階治療（７セッション）での異種移植されたＨｅｐ２腫瘍の組織学的分析。腫瘍を、記載される種々の治療プロトコルの開始の２０日後に採取した。それらをホルマリンに固定し、そして組織切片をヘマトキシリン、エオシンおよびサフラン（safran）で染色した。各治療プロトコルについて２つの腫瘍を顕微鏡検査によって分析した。パネルａ：各プロトコルの代表的な領域の写真。スケールバーは、４００ｍｍ（パネル１〜４）および１００ｍｍ（パネル５〜８）を示す。カラー写真は要請に応じて入手可能である。パネルｂ：壊死の程度を、壊死であると分析された組織切片の表面積の割合として表す。有糸分裂細胞およびアポトーシス細胞の数を、高出力で分析された約１０００個の細胞の代表的な非壊死領域から推定した。
【図４．６】中間段階治療（７セッション）での異種移植されたＨｅｐ２腫瘍のＮＭＲイメージング。３つの代表的な断面画像を、未治療腫瘍、放射線照射（２Ｇｙ／セッション）によって治療した腫瘍、ならびに組み合わされたＤｂａｉｔ３２Ｈ（２０μｇ／セッション）および放射線照射（２Ｇｙ／セッション）によって治療した腫瘍について示した。腫瘍の輪郭が白色の円によって描かれている。腫瘍内の灰色の塊は壊死領域を示した。
【図４．７】種々の腫瘍（Ｈｅｐ２：扁平上皮癌；Ｕ８７：膠芽腫；ＬＵ１２０５およびＳＫ２８：２タイプの黒色腫）によって皮下に異種移植されたヌードマウスの生存のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ表示。治療期間を灰色の領域によって示す。
【図５．１Ａ】パネルＡ：平均週齢１２週のＫ−Ｒａｓｖ１２Ｇ×Ａｐｃ１６３８Ｎトランスジェニックマウスの３つの群／アームについての治療プロトコル：コントロール群（未治療）、５ＦＵ＋ＣＰＴ１１によって治療した群、５ＦＵ＋ＣＰＴ１１およびＤｂａｉｔ３２Ｈによって治療した群。それを３サイクルの治療によって行った。各サイクルは、経口投与による０．１ｍｇ  Ｄｂａｉｔ３２Ｈと共の、０．６ｍｇ  ５ＦＵおよび０．６ｍｇ  ＣＰＴ１１の腹腔内注射、１週間に３回、続いて１週休息からなる。各群に含まれるマウスの数を括弧内に示す。終点は生存期間である；パネルＢ：３つの群の生存曲線のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒプロット；パネルＣ：パネルＢに示される３つの群の中央値生存期間。
【図５．１Ｂ】パネルＡ：平均週齢１２週のＫ−Ｒａｓｖ１２Ｇ×Ａｐｃ１６３８Ｎトランスジェニックマウスの３つの群／アームについての治療プロトコル：コントロール群（未治療）、５ＦＵ＋ＣＰＴ１１によって治療した群、５ＦＵ＋ＣＰＴ１１およびＤｂａｉｔ３２Ｈによって治療した群。それを３サイクルの治療によって行った。各サイクルは、経口投与による０．１ｍｇ  Ｄｂａｉｔ３２Ｈと共の、０．６ｍｇ  ５ＦＵおよび０．６ｍｇ  ＣＰＴ１１の腹腔内注射、１週間に３回、続いて１週休息からなる。各群に含まれるマウスの数を括弧内に示す。終点は生存期間である；パネルＢ：３つの群の生存曲線のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒプロット；パネルＣ：パネルＢに示される３つの群の中央値生存期間。
【図５．１Ｃ】パネルＡ：平均週齢１２週のＫ−Ｒａｓｖ１２Ｇ×Ａｐｃ１６３８Ｎトランスジェニックマウスの３つの群／アームについての治療プロトコル：コントロール群（未治療）、５ＦＵ＋ＣＰＴ１１によって治療した群、５ＦＵ＋ＣＰＴ１１およびＤｂａｉｔ３２Ｈによって治療した群。それを３サイクルの治療によって行った。各サイクルは、経口投与による０．１ｍｇ  Ｄｂａｉｔ３２Ｈと共の、０．６ｍｇ  ５ＦＵおよび０．６ｍｇ  ＣＰＴ１１の腹腔内注射、１週間に３回、続いて１週休息からなる。各群に含まれるマウスの数を括弧内に示す。終点は生存期間である；パネルＢ：３つの群の生存曲線のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒプロット；パネルＣ：パネルＢに示される３つの群の中央値生存期間。
【図５．２】５ＦＵ＋ＣＰＴ１１によってならびに５ＦＵ＋ＣＰＴ１１およびＤｂａｉｔ３２Ｈによって治療された群の肉眼検査または組織学検査による動物１匹当たりの消化管中の腫瘍の平均数。各群における動物数を括弧内に示した。全てのマウスを、上パネルに示すプロトコルの２週間後（第１８週）に犠牲にした。コントロールアーム（未治療群、ｎ＝１０１）の平均数は、３０．８／動物である（データを示さず）。
【図５．３Ａ】消化管組織の蛍光顕微鏡検査分析。パネルＡ：プロトコル概要（ｉ．ｐ．：腹腔内注射；ｏ．：経口投与）。パネルＢ：パネルＡに与えられるプロトコルに従って治療された動物の腫瘍組織からの５μｍ切片上におけるＤｂａｉｔ３２Ｈ−ＦＩＴＣ分子（左）および免疫蛍光標識γ−Ｈ２ＡＸ（右）の蛍光。下部は、上部（１０×レンズを使用、白色のボックス）において示される領域の詳細（６３ｘレンズを使用）を示す。蛍光性Ｄｂａｉｔ３２Ｈ−ＦＩＴＣおよび標識されたγ−Ｈ２ＡＸの共局在化は、ＤＡＰＩ対比染色された核の上の明るいドットとして現れている。
【図５．３Ｂ】消化管組織の蛍光顕微鏡検査分析。パネルＡ：プロトコル概要（ｉ．ｐ．：腹腔内注射；ｏ．：経口投与）。パネルＢ：パネルＡに与えられるプロトコルに従って治療された動物の腫瘍組織からの５μｍ切片上におけるＤｂａｉｔ３２Ｈ−ＦＩＴＣ分子（左）および免疫蛍光標識γ−Ｈ２ＡＸ（右）の蛍光。下部は、上部（１０×レンズを使用、白色のボックス）において示される領域の詳細（６３ｘレンズを使用）を示す。蛍光性Ｄｂａｉｔ３２Ｈ−ＦＩＴＣおよび標識されたγ−Ｈ２ＡＸの共局在化は、ＤＡＰＩ対比染色された核の上の明るいドットとして現れている。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
上述したように、本発明は、哺乳動物細胞におけるＤＮＡ修復システムを非遺伝子特異的様式で妨げ得る新規のクラスの治療分子を開示する。Ｄｂａｉｔ分子と呼ばれる、これらの新規の分子は、ＮＨＥＪ経路（配列非依存性経路）に関与するタンパク質、特に、Ｋｕおよび／またはＤＮＡ−ＰＫｃｓタンパク質、のホロ複合体についての基質であり、細胞のＤＮＡ修復能を中和し、それによってＤＮＡ損傷治療に対するそれらの感受性を増大させ得る。
【００２８】
従って、本発明は、このような分子、それらの製造、ならびに、特にＤＮＡ損傷治療と併用して増殖性疾患を治療するための、それらの治療的使用に関する。
【００２９】
本発明のＤｂａｉｔ分子は、それらの最小の長さ、少なくとも遊離末端の存在、および二本鎖部分の存在などの、多数の特徴によって定義され得る。下記に議論されるように、Ｄｂａｉｔ分子の重要な特徴は、それらの正確なヌクレオチド配列が、それらの活性に実質的に影響を与えないことである。さらに、Ｄｂａｉｔ分子は、未修飾および／または非天然骨格を含み得る。
【００３０】
従って、本発明の第１目的は、核酸分子にあり、該核酸分子は、少なくとも約１６ｂｐを含み、少なくとも１つの遊離末端を有し、かつ、ＮＨＥＪ経路に関与するＫｕ複合体に少なくとも結合する。
【００３１】
前記分子は、好ましくは、非ヒト起源のもの（即ち、そのヌクレオチド配列および／またはコンフォメーション（例えば、ヘアピン）はヒト細胞中にそうゆうものとして存在しない）、最も好ましくはリコンビナントおよび／または合成起源のものである。
【００３２】
Ｄｂａｉｔ分子の作用機構によれば、Ｄｂａｉｔ分子の配列は、あったとしてもほとんど役割を果たさない。従って、遺伝子／タンパク質特異的ターゲッティングについて先行技術において使用された分子（例えば、アンチセンス、アンチジーン、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、リボザイムなど）とは対照的に、Ｄｂａｉｔ分子は、公知の遺伝子、プロモーター、エンハンサー、５’−または３’−上流配列、エキソン、イントロンなどに対して顕著な程度の配列相同性または同一性を有さないかもしれない。言い換えれば、ＮＨＥＪ経路を妨げるＤｂａｉｔ分子の作用は配列非依存性であり、Ｄｂａｉｔ分子は、ヒトゲノム中の任意の遺伝子に対して７０％未満、さらには５０％未満の配列同一性を有し得る。
【００３３】
この配列非依存性作用機構は、Ｄｂａｉｔ分子の特徴であり、このため、それらは、他の遺伝子特異的またはタンパク質特異的（配列依存性）治療薬剤、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ）、および免疫刺激性ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ならびに特定のタンパク質を捕捉するように設計されたアプタマーとは明らかに異なる。
【００３４】
好ましい態様において、Ｄｂａｉｔ分子の配列は、約７０％、６０％、５５％または５０％未満である、ヒト核酸配列に対する全体的な同一性程度を有する。配列同一性を測定する方法は、当該分野において周知であり、例えばＢｌａｓｔが挙げられる。
【００３５】
特定の態様において、Ｄｂａｉｔ分子は、ストリンジェントな条件下で、ヒトゲノムＤＮＡとハイブリダイズしない。典型的なストリンジェントな条件は、それらが完全に相補的な核酸と部分的に相補的な核酸とを区別することを可能にさせるようなものである（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋらを参照のこと）。
【００３６】
好ましい態様において、Ｄａｉｔ分子の配列は、このような効果が望ましくない場合、周知のｔｏｌｌ様レセプター媒介免疫学的反応を回避するために、ＣｐＧを欠いている。ＣｐＧは、シトシン続いてグアニンからなるジヌクレオチドを指す。
【００３７】
それらの作用機構を考慮して、Ｄｂａｉｔ分子の長さは、それがＫｕタンパク質複合体の適切な結合を可能にするに十分である限り、可変であり得る。実験セクションによって、Ｄｂａｉｔ分子の最小の長さは、Ｋｕ複合体への結合を確実にするためには、約１６ｂｐであることが示されている。好ましくは、Ｄｂａｉｔ分子は、１６〜２００ｂｐ、最も好ましくは２４〜１００ｂｐを含む。Ｄｂａｉｔ分子の具体例は、２４ｂｐ、最も好ましくは３２ｂｐを含む。実施例に示されるように、このような長さは、ＫｕおよびＤＮＡ−ＰＫｃタンパク質を含むＫｕ複合体の結合を可能にするに十分である。
【００３８】
特に好ましいＤｂａｉｔ分子は、２４〜１００ｂｐ、より有利には３２〜１００ｂｐを含む。
【００３９】
本発明に従うＤｂａｉｔ分子は、ＤＳＢの模倣物として、少なくとも１つの遊離末端を有さなければならない。遊離末端は、遊離平滑末端または５’−／３’−突出末端のいずれかであり得る。特定の態様において、それらは、たった１つの遊離末端を含む。別の特定の態様において、それらは２つの遊離末端を含む。
【００４０】
Ｄｂａｉｔ分子は、線形であり得、または、好ましくは、ヘアピン二本鎖核酸から作製され得る。このような場合、ループは、核酸、または当業者に公知の他の化学基、好ましくはリンカー、例えば、ヘキサエチレングリコールまたはテトラデオキシチミジレート（Ｔ４）であり得る。
【００４１】
好ましい態様において、Ｄｂａｉｔ分子は、以下のようなものである：
１）二本鎖Ｄｂａｉｔ分子は、薬学的に許容される担体／賦形剤と共に使用される場合、細胞／組織体によって細胞核中へ取り込まれ得る；
２）Ｄｂａｉｔ分子の少なくとも１つの遊離末端が、ＤＳＢ損傷感知、シグナル伝達および／または修復プロセスに関与する酵素のホロ複合体によって認識可能である；
３）Ｄｂａｉｔ分子の少なくとも１つの遊離末端が、該複合体によって腫瘍細胞ゲノムＤＮＡに組み入れられやすい。
【００４２】
特定の態様において、Ｄｂａｉｔ分子は、それらの構造および／または骨格に起因して、非複製性構造を有する。
【００４３】
この点で、本発明に従うＤｂａｉｔ分子は、排他的にあるいは主として（５０％超）ネイティブなホスホジエステル骨格もしくは化学的に修飾されたホスホジエステル骨格、または化学基もしくは化学基の混合物を有する別の骨格を有し得、但し、修飾されたｄｓＤＮＡは、ＮＨＥＪ経路（特にＫｕおよびＤＡ−ＰＫｃｓタンパク質）ならびにＤＳＢ損傷感知またはシグナル伝達経路に関与するホロ複合体についての基質のままである。有利には、化学的修飾は、Ｄｂａｉｔ分子へ化学的安定性を与えるおよび／または起こるならばそれらのゲノム組込み時にそれらをさらなる複製（変異原性効果の可能性のある原因）から防止するように意図される。
【００４４】
それらはまた、ペントフラノシル基の代わりに、糖模倣物、例えば、２’−Ｏ−アルキルリボース、２’−Ｏ−アルキル−Ｃ４’分岐リボース、シクロブチル類または他の炭素環式物またはヘキシトールを有し得る。
【００４５】
好ましいＤｂａｉｔは、各鎖の末端に（at the end of one or of each strand）１または数個の化学基を含む。好ましい化学基は、ホスホロチオエートを含む。または、好ましいＤｂａｉｔは、メチルホスホネート骨格を含むヌクレオチドを有する。
【００４６】
本発明の他の修飾された骨格は、ホスホルアミデート、モルホリノ核酸、２’−Ｏ，４’−Ｃメチレン／エチレン架橋固定化核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、および短鎖アルキル、またはシクロアルキル糖間結合、または可変長の短鎖ヘテロ原子もしくはヘテロ環式糖間結合、または当業者に公知の任意の修飾ヌクレオチドを含む。
【００４７】
米国特許第５，６７７，４３７号は、ヘテロ芳香族オリゴヌクレオシド結合を記載している。窒素リンカーまたは窒素含有基もまた、オリゴヌクレオチド模倣物を作製するために使用され得る（米国特許第５，７９２，８４４号および第５，７８３，６８２号）。米国特許第５，６３７，６８４号は、ホスホルアミデートおよびホスホロチオアミデートオリゴマー化合物を記載している。モルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドも想定されている（米国特許第５，０３４，５０６号）。他の態様、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格において、オリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格は、ポリアミド骨格によって置換され得、塩基はポリアミド骨格のアザ窒素原子へ直接的または間接的に結合されている。他の合成オリゴヌクレオチドは、２位に以下のうちの１つを含む置換糖部分を含有し得る：ＯＨ、ＳＨ、ＯＣＨ３、ＳＣＨ３、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２またはＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、ここで、ｎは１〜約１０である；Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリールまたはアラルキル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ３；ＯＣＦ３；Ｏ−Ｓ−；またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ；ＮＯ；Ｎ３。
【００４８】
前記非複製性エレメントは、二本鎖フラグメントの内部位置または末端に組み入れられ得る。それ（それら）は、以下を含み得る：ａ）ＤＮＡ複製のためのテンプレートとして使用され得ない単位、例えば、ポリエチレングリコール鎖、好ましくはヘキサエチレングリコール鎖、または、１つまたは複数のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、窒素によって、または、１または複数のヘテロ原子を含む、ヘテロ原子基もしくはヘテロ環式基によって、最終的に（eventually）中断されたおよび／または置換された、任意の炭化水素鎖；ｂ）ＤＮＡポリメラーゼまたはエキソヌクレアーゼによって影響されやすくないので、ブロッキングエレメントである単位、例えば、任意の３’−修飾ヌクレオチド、または当業者に公知の他のもの；ｃ）ネイティブなオリゴヌクレオチド、例えば、ヘアピンフラグメントのループにおいて使用される場合、Ｔｎ、好ましくはテトラデオキシチミジレート（Ｔ４）。
【００４９】
前記鎖は、化学合成、半生合成または生合成、任意の増幅方法、続いて任意の抽出および調製方法および任意の化学的修飾によって作製され得る。
【００５０】
Ｄｂａｉｔ分子の生物活性は、例えば実施例２および３に記載されるように、インビトロおよび培養細胞に基づくアッセイによって、および／または、例えば実施例４および５に記載されるように、in vivoアッセイによって、評価され得る。最も容易かつ妥当であるアッセイは、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ活性アッセイである（実施例２、図１．４を参照のこと）。この簡易なアッセイは、Ｄｂａｉｔ分子のin vivo活性を今まで予測してきた。しかし、他の培養細胞に基づくアッセイ、例えば、放射線増強異常組込みの阻害のアッセイもまた、妥当である（実施例３、図２．３および図２．４を参照のこと）。
【００５１】
特定の態様において、本発明のＤｂａｉｔ分子は、ＤＮＡ−ＰＫを活性化することができる。
【００５２】
特定の態様において、本発明のＤｂａｉｔ分子は、放射線増強異常ＤＮＡ組込みを阻害することができる。
【００５３】
別の特定の態様において、本発明のＤｂａｉｔ分子は、例えばゲルシフトアッセイによって測定されるように、インビトロでＫｕ複合体に結合する。このようなＫｕ複合体は、１または数個のＫｕタンパク質のみ、例えばＫｕ７０および／またはＫｕ８０、または１または数個のＫｕタンパク質と少なくともＤＮＡ−ＰＫｃタンパク質との組み合わせを含み得る。
【００５４】
別の特定の態様において、本発明のＤｂａｉｔ分子は、核に浸透する。
【００５５】
本発明の最も好ましいＤｂａｉｔ分子は、数個または全ての上記特徴を兼ね備える。
【００５６】
培養細胞においてならびにヌードマウスおよび遺伝子操作されたマウス上の異種移植腫瘍において行われた実験によって、本発明のＤｂａｉｔ分子は、放射線および／または化学療法へ提示された腫瘍の細胞／組織致死をトリガーすることが示された。
【００５７】
従って、本発明はまた、ＤＮＡ切断治療と共同して使用されるアジュバント組成物に関し、該組成物は、腫瘍細胞の核中に導入されるに有効な量で、薬学的に許容される担体／賦形剤と組み合わせて、上記に定義されるようなＤｂａｉｔ分子を含む。
【００５８】
本発明はまた、抗ガン療法に対する腫瘍感受性を促進するための方法に関し、該方法は、共同して、
−ガン細胞／組織中へ上記に定義されるようなＤｂａｉｔ分子を導入すること、および
−ＤＮＡ損傷法によってＤＮＡ切断を細胞内において誘導すること
を含む。
【００５９】
本発明のある態様によれば、トランスフェクション剤が、前記導入工程に使用される。
【００６０】
in vivo研究において使用されるプロトコルに基づいて、本発明は、放射線療法または化学療法と併用してのＤｂａｉｔ分子の使用の臨床プロトコルを確立するための理論を提供する。プロトコルの基礎をなす理論は、Ｄｂａｉｔ分子が、ＤＮＡ損傷事象が生じる場合に、細胞の核中へ送達されることである。従って、Ｄｂａｉｔ分子は、好ましくは、放射線療法より前に投与されるのに対して、それらは、各薬物の投与様式および薬物動態に依存して化学療法剤と共に提供され得る。
【００６１】
典型的なプロトコルは、放射線照射より前に、例えば５時間前に、Ｄｂａｉｔ分子を投与することを含む。細分された放射線照射の使用が、特に有効である；例えば、６週間に１５×２Ｇｙ、または２週間に６×５Ｇｙ。
【００６２】
有利には、前記方法は、Ｄｂａｉｔ分子での治療と２つの化学療法とを合わせることを含む。例えば、５ＦＵおよびＣＰＴ１１が、丸１週間の休息によって間隔を空けて、３連続日、３回、一緒に注射される。または、Ｄｂａｉｔ分子での治療は、放射線療法と合わせられる。
【００６３】
それは、特に患者の体重／体表面に依存して、当業者によってヒトに容易に適応される。
【００６４】
好ましい態様において、Ｄｂａｉｔ分子は、上記で定義されるような化学的に修飾されたＤｂａｉｔ分子である；およびヒト療法における他の実務。
【００６５】
別の態様において、Ｄｂａｉｔ分子は、化学的に修飾されておらず、ネイティブな核酸フラグメントに対応し、しかし化学的に修飾されたフラグメントの特徴を示し、特に、前記化学的に修飾されたＤｂａｉｔ分子に関して定義された塩基対の数および特性を有する。
【００６６】
より特には、ＤＮＡ鎖切断は、電離放射線（放射線療法）または化学反応（化学療法）によって達成される。
【００６７】
このような方法は、制御されない細胞増殖に由来する疾患、特にガンを治療するためのＤＮＡ損傷療法と併用しての新規の治療アジュバントである。言い換えれば、Ｄｂａｉｔは、抗ガン療法において使用されるように主として意図とされるが、それはまた、多くの抗増殖治療において、例えば、乾癬を治療するために使用され得る。
【００６８】
この方法は、増殖性障害を治療するために扱い可能である：
【００６９】
それらは、非悪性、例えば、乾癬および血管増殖性狭窄／再狭窄であり得る。
【００７０】
それらは、悪性であり得る。
【００７１】
関係のある器官または領域は以下であり得る：肺および気管支、頭部および頸部、消化管、結腸直腸ガン、尿生殖路、婦人科学的器官、胸部、内分泌、皮膚、網膜、ＣＮＳ、血液学的器官、既知または未知の原発部位の転移、レムナント（例えば、胸腺）。
【００７２】
組織学的性質は、上皮、扁平上皮癌、腺癌、移行性癌（transitional carcinoma）、線維芽細胞／血管芽細胞由来（肉腫）、ニューロン、グリア由来、内分泌、カルチノイド、消化管支質、内皮、造血、胚であり得る。
【００７３】
本発明はまた、腫瘍、特に、放射線療法および／または化学療法に対して高度に耐性である腫瘍を治療するための抗ガン剤を作製するための、前記化学的に修飾されていないＤｂａｉｔ分子の使用に関し、該抗ガン剤は、ＤＮＡ切断（例えば、損傷）治療、特に放射線療法または化学療法と共同して使用される。
【００７４】
in vivoにおいて、化学的に修飾されたまたは修飾されていないＤｂａｉｔ分子は、好適な許容される担体／賦形剤と共に、任意の好適な経路によって、例えば、経口、または静脈内、もしくは腫瘍内投与、または皮下注射、または局所投与などによって、投与される。
【００７５】
本発明のさらなる目的は、ＤＮＡ切断治療、特に放射線療法または化学療法と共同しての使用のための組成物であり、該組成物は、腫瘍細胞の核に導入されるに有効な量で、少なくとも１つのＤｂａｉｔ分子を、薬学的に許容される担体と組み合わせて含む。例えば、腫瘍内投与が使用される場合、前記有効量は、腫瘍１ｃｍ３当たり少なくとも０．０１ｍｇ、好ましくは腫瘍１ｃｍ３当たり少なくとも０．１ｍｇ、最も好ましくは腫瘍１ｃｍ３当たり少なくとも０．５ｍｇである。有効量は、デイリー治療プロトコル（例えば、３〜６連続週について１週間当たり５日、または３〜６連続週について１週間当たり３回）で投与され得る。または、腫瘍１ｃｍ３当たり少なくとも０．１ｍｇ、好ましくは腫瘍１ｃｍ３当たり少なくとも０．５ｍｇ、最も好ましくは腫瘍１ｃｍ３当たり少なくとも１ｍｇの有効量が、例えば、３〜６連続週について、ウィークリー治療プロトコルで投与され得る。他の投与経路が使用される場合、特にデイリー治療プロトコルにおいて、腫瘍１ｃｍ３当たり少なくとも０．０１ｍｇ、好ましくは腫瘍１ｃｍ３当たり少なくとも０．１ｍｇ、最も好ましくは腫瘍１ｃｍ３当たり少なくとも０．５ｍｇの、腫瘍中におけるＤｂａｉｔ分子の有効量を得るために、または、特にウィークリー治療プロトコルにおいて、腫瘍１ｃｍ３当たり少なくとも０．１ｍｇ、好ましくは腫瘍１ｃｍ３当たり少なくとも０．５ｍｇ、最も好ましくは腫瘍１ｃｍ３当たり少なくとも１ｍｇの、腫瘍中におけるＤｂａｉｔ分子の有効量を得るために、当業者は前記量を適応させることができる。当然ながら、投薬量およびレジメンは、化学療法および／または放射線療法レジメンを考慮して当業者によって適応され得る。
【００７６】
本発明のさらなる目的は、ＤＮＡ損傷療法に対する細胞（例えば、腫瘍）感受性を増強するための医薬の製造のための、上記に定義されるＤｂａｉｔ分子の使用にある。
【００７７】
本発明のさらなる目的は、ＤＮＡ損傷性抗ガン療法と併用してガンを治療するための医薬の製造のための、上記に定義されるＤｂａｉｔ分子の使用にある。
【００７８】
好ましくは、ＤＮＡ損傷性抗ガン療法は、放射線療法および化学療法より選択される。さらに好ましくは、前記分子は、放射線療法より前におよび／または化学療法より前におよび／または化学療法と同時に投与される。
【００７９】
本発明の他の特徴および利点は、添付の図および表を参照して、以下の実施例において与えられる。
【００８０】
実施例
分子および細胞研究、ならびにヌードマウス上の異種移植されたヒト放射線耐性腫瘍（頭頸部扁平上皮癌、膠芽腫、黒色腫）における、およびトランスジェニックマウスの消化管中のＲａｓｖ１２Ｇ×Ａｐｃ１６３８Ｎ二重突然変異誘発腫瘍におけるアッセイを以下のために行った：
ｉ）Ｄｂａｉｔ分子の生物学的活性を評価するため；
ｉｉ）抗ガン療法を増感させることにおいてＤｂａｉｔ分子を使用することによるＤＮＡベイトアプローチを検証するため；
ｉｉｉ）観察されたＤｂａｉｔ媒介増感の基礎となる分子および細胞機構を解明するため。これらの研究の結果を、実施例において概説しそして要約する。
【００８１】
実施例１：Ｄｂａｉｔ分子の設計、合成および作製
２タイプのＤｂａｉｔ分子を設計した：線形またはヘアピンｄｓＤＮＡフラグメント。ヘアピンＤｂａｉｔ分子について、ヘキサエチレングリコールリンカーまたはテトラデオキシチミジレートをループとして使用した。
【００８２】
ｄｓＤＮＡ幹の末端は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートまたは３’−３’ヌクレオチド結合の組み入れによって、３’−エキソヌクレアーゼによる化学分解から保護され得る。原則として、他の化学的修飾は、Ｋｕ７０／Ｋｕ８０結合およびＤＮＡ−ＰＫｃｓ活性化と適合性であるならば、使用され得る（ＭａｒｔｅｎｓｓｏｎおよびＨａｍｍａｒｔｅｎ，２００２）。種々の幹長さ、８ｂｐ（Ｄｂａｉｔ８Ｈ）、１６ｂｐ（Ｄｂａｉｔ１６Ｈ）、２４ｂｐ（Ｄｂａｉｔ２４Ｈ）および３２ｂｐ（Ｄｂａｉｔ３２Ｈ）、ならびに異なる幹配列を有する異なるＤｂａｉｔ分子をアッセイした。両末端が２つのヘキサエチレンループによってシールされたダンベル（dumbell）ｄｓＤＮＡフラグメント（Ｄｂａｉｔ３２Ｃ）もまた、コントロールとして設計した。いくつかのＤｂａｉｔ分子を、フルオレセイン（Ｄｂａｉｔ３２Ｈ−ＦＩＴＣ）、シアニン３（Ｄｂａｉｔ３２Ｈ−Ｃｙ３）、シアニン５（Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ−Ｃｙ５）、またはビオチン（Ｄｂａｉｔ３２Ｈ−Ｂｉｏｔ）でタグされたＴを介して標識した。表１．１、１．２および１．３に、この研究において使用したＤｂａｉｔ分子の配列および化学構造を要約した。
【００８３】
【表１】
0005415952.tif 000002
表１．１：Ｄｂａｉｔ分子の配列および化学構造。大文字は、ホスホジエステル骨格を有するヌクレオチドである。ボールドの大文字は、ホスホロチオエート骨格を有するヌクレオチドである。半円の実線は、ヘキサエチレングリコールリンカーを象徴する。Ｄｂａｉｔ３２−Ｔ４は、ヘキサエチレングリコールリンカーの代わりにリンカーとして４つのチミン（Ｔ４）を含む。Ｄｂａｉｔ３２Ｃは、ダンベル（クローズド）分子である。Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ−５’５’は、シャッフルされた配列（同一の塩基組成、しかし異なる順序；表１．１中のＤｂａｉｔ３２Ｈｂを参照のこと）および３’−３’結合を有する。Ｄｂａｉｔ３２Ｈａ、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｂ、Ｄｂａｉｔ３２ＨｃおよびＤｂａｉｔ３２Ｈｄは、Ｄｂａｉｔ３２Ｈの配列と比べた場合、同一の塩基組成を有し、しかし順序が異なる。
【００８４】
【表２】
0005415952.tif 000003
表１．２：記載される種々の標識されたＤｂａｉｔ分子の配列および化学構造。大文字は、ホスホジエステル骨格を有するヌクレオチドである。ボールドの大文字は、ホスホロチオエート骨格を有するヌクレオチドである。ボールドの小文字は、メチルホスホネート骨格を有するヌクレオチドである。半円の実線は、ヘキサエチレングリコールリンカーを象徴する。種々の標識された（シアニン３または５、ＦＩＴＣ）Ｄｂａｔ８Ｈｃ、Ｄｂａｉｔ３２Ｈ、Ｄｂａｉｔ３２ＨｃおよびＤｂａｉｔ３２Ｈｄ分子が記載されている。
【００８５】
【表３】
0005415952.tif 000004
表１．３：６４−ｂｐ  Ｄｂａｉｔ６４およびＤｂａｉｔ６４Ｌ分子の配列および化学構造。大文字は、ホスホジエステル骨格を有するヌクレオチドである。ボールドの大文字は、ホスホロチオエート骨格を有するヌクレオチドである。実線は、ヘキサエチレングリコールリンカーを象徴する。
【００８６】
全てのＤｂａｉｔ分子は、自動固相オリゴヌクレオチド合成（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ，  Ｂｅｌｇｉｕｍ）によって作製された。それらは、変性逆相ＨＰＬＣによって精製された。変性キャピラリーゲル電気泳動。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＬＣ−ＭＳが品質管理のために使用された。９０％を超えるオリゴヌクレオチドが全長である。全てのサンプルは出荷前に凍結乾燥された。
【００８７】
受け取ると、全てのサンプルを、二重蒸留水に溶解した。Ｄｂａｉｔ分子の濃度を、変性条件（Ｄｂａｉｔ分子の熱安定性に依存して６０℃〜９０℃）下で、２６０ｎｍでの吸光度から算出した（ＣａｎｔｏｒおよびＷａｒｓｈａｗ，１９７０）。蛍光色素でタグされたＤｂａｉｔ分子の濃度を、特定の色素の適切な波長での吸光度から算出した（ＦＩＴＣ：ε＝４９０ｎｍで８００００Ｍ−１・ｃｍ−１；Ｃｙ３：ε＝５５０ｎｍで１５００００Ｍ−１・ｃｍ−１；Ｃｙ５：ε＝６５０ｎｍで２５００００Ｍ−１・ｃｍ−１）。ダンベルｄｓＤＮＡフラグメント（Ｄｂａｉｔ３２Ｃ）を、アニーリング、および、３’−突出および相補末端とヘキサエチレングリコールリンカーとを有する２つのセミヘアピンのＤＮＡ  Ｔ４リガーゼ（ＢｉｏＬａｂｓ）による連結によって作製した。
【００８８】
熱力学および速度論を考慮して、以下のプロトコルを、それらの分子性に従って、Ｄｂａｉｔ分子のサンプルを作製するために使用した：
【００８９】
−  二分子（bi-molecular）Ｄｂａｉｔ分子（Ｄｂａｉｔ３２、Ｄｂａｉｔ３２−ＮＨ２、Ｄｂａｉｔ６４およびＤｂａｉｔ６４Ｌ）について：
二重蒸留水中の各鎖の１：１ストック溶液（可能な限り最も高い濃度）の混合物を、各鎖の完全な変性のために、９０℃で５分間加熱しなければならない。アニーリングを、滑らかに室温へ戻すことによって行い（サンプルを典型的に水浴中に置く）、そして得られた二本鎖分子を−２０℃においてアリコートで保存した。
【００９０】
−  一分子（mono-molecular）Ｄｂａｉｔ分子（ヘアピン）について：
二重蒸留水中の２００μＭのヘアピンＤｂａｉｔ分子を含有する溶液を、完全な変性のために、９０℃で５分間加熱しなければならない。アニーリングを、氷水（０℃）中へサンプルを冷やすことによって行った。アリコートを−２０℃で保存した。
【００９１】
実施例２：Ｄｂａｉｔ分子の生化学分析
Ｄｂａｉｔ分子の作用機構を分析する第１工程として、一連のバンドシフトアッセイを、標準プロトコルに従って、Ｈｅｐ２細胞由来の核タンパク質抽出物の存在下において種々の３２Ｐ放射標識Ｄｂａｉｔ分子を用いて行った。典型的に、１０ｎＭ  ３２Ｐ放射標識Ｄｂａｉｔ分子を、ＴＢＥ緩衝液中、３０℃で１０分間、種々の濃度の核タンパク質（０、１０、２０、４０、８０、１６０、および３２０ｎｇ／μＬ）の存在下でインキュベーションした。次いで、サンプルを５％アクリルアミドネイティブゲル上にロードした。電気泳動を４℃にて２時間９５Ｖで行った。ゲルを乾燥し、そしてホスホルイメージャー（phosphorimager）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）によってスキャンした。
【００９２】
図１．１は、異なる長さの種々のＤｂａｉｔ分子でのＨｅｐ２核タンパク質抽出物の滴定の遅延バンドパターンを示している。最も短い８ｂｐ長のＤｂａｉｔ分子（Ｄｂａｉｔ８Ｈ）を除いて、２つまでの遅延バンドが、より長いＤｂａｉｔ分子について観察された：１６、２４ｂｐ長のＤｂａｉｔ分子（Ｄｂａｉｔ１６ＨおよびＤｂａｉｔ２４Ｈ）について１つの遅延バンドが観察され、一方、３２ｂｐ長のＤｂａｉｔ分子（Ｄｂａｉｔ３２Ｈ、Ｄｂａｉｔ３２Ｈ−ｐｏおよびＤｂａｉｔ３２）について２つの遅延バンドが観察された。３２ｂｐ  Ｄｂａｉｔ分子について、遅延バンド１の強度は、タンパク質の濃度が増加するにつれ、増加しそして次いで減少し、一方、遅延バンド２の強度は、核タンパク質抽出物の濃度の関数として増加する。
【００９３】
マウスモノクローナル抗Ｋｕ７０抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）での免疫結合およびバンドシフトアッセイの組み合わせによって、遅延バンド１および２が、Ｋｕ複合体を含むことがわかった。バンド１および２は、抗Ｋｕ７０抗体の添加時にバンド１＊および２＊へさらにシフトされた（図１．２）。バンド１は１６〜３２ｂｐ  Ｄｂａｉｔへ結合された１つのＫｕ７０／８０複合体を有し、一方、バンド２は、３２ｂｐ  Ｄｂａｉｔ分子へ結合された２つのＫｕ７０／８０複合体を有するようである。精製したＫｕタンパク質を用いて行ったコントロール実験によって、この解釈が確認された。
【００９４】
Ｋｕタンパク質の同定は、Ｄｂａｉｔ分子は、長さ依存様式でＮＨＥＪ機構と相互作用することを示している。
【００９５】
ＤＮＡ末端連結を、種々のＤｂａｉｔ分子の存在下においてＨｅｐ２抽出物と共に３２Ｐ標識６０５ｂｐ線形ＤＮＡフラグメントをインキュベーションすることによってモニタリングした。連結生成物は、６０５ｂｐ単量体から出発して、二量体、三量体または四量体として移動する。
【００９６】
図１．３は、Ｈｅｐ２細胞の核抽出物中におけるＤＮＡ末端連結反応に対する種々のＤｂａｉｔ分子の効果を示している。３２Ｐ標識平滑線形二本鎖ＤＮＡ分子の約１６％が、インキュベーションの最初の２時間の間に二量体および三量体へ連結された。高分子量連結生成物の量は、１６時間後、総投入ＤＮＡの３０％まで増加した。Ｄｂａｉｔ３２Ｈを線形３２Ｐ標識フラグメントと比べて１００倍モル過剰量で反応へ添加すると、反応は強力に阻害された。末端連結活性の同様の阻害が、ＨｅＬａ細胞から調製した抽出物でも観察された（データを示さず）。大抵の実験において、Ｄｂａｉｔ３２Ｈを、核抽出物へ、標識ＤＮＡフラグメントと同時に添加した。Ｄｂａｉｔ３２Ｈを、フラグメントの添加前に３０分間、前記抽出物と共にインキュベーションした場合、阻害の程度は同様であった。対照的に、Ｄｂａｉｔ３２Ｈを核抽出物の３０分後に添加した場合、連結の阻害はなかった（データを示さず）。これらのデータは、Ｄｂａｉｔ分子は、ＤＮＡ末端連結反応の競争相手ではあるが、結合された複合体を置換しないことを示している。
【００９７】
種々のＤｂａｉｔ分子を、該分子を核抽出物へ添加しそしてＤＮＡフラグメントと共に２時間インキュベーションすることによって、無細胞アッセイに対するそれらの効果について試験した。連結は、短い分子（Ｄｂａｉｔ８Ｈ）、一本鎖３２ｎｔ長の分子（Ｄｂａｉｔ３２ｓｓ）、またはダンベル分子（Ｄｂａｉｔ３２Ｃ）によって大きく影響されなかた。Ｋｕヘテロ二量体にのみ結合する、Ｄｂａｉｔ２４ＨおよびＤｂａｉｔ１６Ｈは、Ｄｂａｉｔ３２Ｈと同じぐらい効果的に連結を阻害した。これらのデータは、ＤＮＡフラグメント再連結が、Ｋｕをリクルートし得るＤｂａｉｔ分子によって強力に阻害されることを示している。
【００９８】
ＤＮＡ−ＰＫ活性を、キットＳｉｇｎａＴＥＣＴ  ＤＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ）を使用してモニタリングした。増加する量のＨｅｐ２核抽出物（ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ濾過によって内因性ＤＮＡを除去）を、２５０ｎＭ  Ｄｂａｉｔの存在下においてアッセイした。抽出物、ビオチン化ペプチド基質および種々の量の核抽出物を、製造業者の指示に従って、（γ−３２Ｐ）ＡＴＰと共に３０℃で５分間インキュベーションした。ビオチン化基質を、ストレプトアビジン膜上に捕捉し、洗浄し、そしてシンチレーションカウンターにおいてカウントした。リン酸化のパーセンテージを、結合された放射能を１サンプル当たりの（γ−３２Ｐ）ＡＴＰの総カウントによって割ることによって算出する。反応（１０μｌ）を、６０ｍＭ  ＫＯＡｃ、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．５ｍＭ  Ｍｇ（Ｃｌ）２、１μｌ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ）中において行った。核抽出物およびＤｂａｉｔを、３２Ｐ標識ＤＮＡ（１０ｎｇ）の添加の２分前に、インキュベーションした。サンプルを３７℃で種々の時間インキュベーションし、その後、連結を２０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１ｍｇ／ｍｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ添加によって停止させた。連結生成物を、０．７％アガロースゲルによる電気泳動、続いてオートラジオグラフィー、およびホスホルイメージングによる定量によって、分析した。
【００９９】
図１．４は、Ｈｅｐ２核タンパク質抽出物１．５μｇ中における、種々の長さ、配列および化学構造（修飾された骨格を含む）を有する多数のＤｂａｉｔ分子２μｇのＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＤＮＡ−ＰＫ）活性を示している。キナーゼ活性は、Ｄｂａｉｔ分子の二本鎖の「幹」の長さおよび構造に直接依存した。高いＤＮＡ−ＰＫ活性化が、２つのＫｕ二量体複合体によって結合された３２ｂｐ長のＤｂａｉｔ分子で観察された。たった１つのＫｕ二量体に結合するＤｂａｉｔ分子（Ｄｂａｉｔ１６ＨおよびＤｂａｉｔ２４Ｈ）は、Ｋｕに結合しない短いＤｂａｉｔ８Ｈと同じぐらい非効果的であった。同様に、一本鎖Ｄｂａｉｔ３２ｓｓ／Ｄｂａｉｔ３２ｃｓｓおよびダンベルＤｂａｉｔ３２Ｃ（これは、遊離の二本鎖末端を有さない）は、ＤＮＡ−ＰＫを活性化しなかった。さらに、遊離平滑末端（３ｂｐまで）での種々の骨格修飾物（ホスホチオエート（phosphothioate）、メチホスホネート（methyphosphonate）、３’−３’結合）、ならびに内部にタグされたリガンド（例えば、蛍光色素）は、ＤＮＡ−ＰＫ活性を活性化し得る。Ｄｂａｉｔ３２Ｈ、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｂ、Ｄｂａｉｔ３２ＨｃおよびＤｂａｉｔ３２Ｈｄによって示されるように、ＤＮＡ−ＰＫ活性は、たとえあったとしても顕著にはＤｂａｉｔ分子の配列に依存しないことは、注目するに値する。
【０１００】
この簡易な無細胞ＤＮＡ−ＰＫ活性アッセイは、Ｄｂａｉｔ分子の遊離末端を有する二本鎖ＤＮＡおよび長さ（少なくとも約３２ｂｐ）のみが、ある程度のそれらの配列および化学的修飾に関わらず、キナーゼ活性化のために必要とされることを指摘している。これは、配列非依存性ＤＮＡ末端連結機構である、ＮＨＥＪ経路におけるＤＮＡ−ＰＫの意味合いと一致している。
【０１０１】
実施例３：Ｄｂａｉｔ分子のインビトロ活性
培養細胞中におけるＤｂａｉｔ分子の活性を、外因性ＤＮＡフラグメントの異常組込みの阻害によって、およびＤｂａｉｔ分子によってトランスフェクションされた細胞における放射線照射後の存続するＤＳＢフォーカス（DSB foci）を検出することによって、電離放射線と共同しての、子宮頸癌（ＨｅＬａ）およびＨＮＳＣＣ（Ｈｅｐ２）から誘導された２つの放射線耐性ヒトガン細胞株におけるクローン原性生存アッセイによって研究した。
【０１０２】
確立されたヒト細胞株Ｈｅｐ２（頭頸部扁平上皮癌、ＨＮＳＣＣ）、ＬＵ１２０５およびＳＫ２８（黒色腫）を、動物実験について使用した。培養における細胞の研究を、Ｈｅｐ２、ＨｅＬａ  Ｓ３（子宮頸部上皮癌）、ＭＯ５９ＫおよびＭＯ５９Ｊ（膠芽腫）を使用して行った。細胞を、１００％湿度、９５％空気および５％ＣＯ２の条件下で、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；インビトロｇｅｎ，Ｃｅｒｇｙ  Ｐｏｎｔｏｉｓｅ，Ｆｒａｎｃｅ）および抗生物質（１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１００μｇ／ｍｌペニシリン）を含有する完全ＤＭＥＭ中において単層培養で３７℃にて増殖させた。ＬＵ１２０５を、４％熱不活性化ＦＢＳ、１％グルタミンおよび抗生物質（１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１００μｇ／ｍｌペニシリン）を含有するＭＣＤＢ中において増殖させた。
【０１０３】
６ウエルプレート中において指数関数的に増殖している細胞を収穫し、そして１μｇ  ＤＮＡ当たり１０μｌ  Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔの比率でＤｂａｉｔ分子およびＳｕｐｅｒｆｅｃｔ試薬（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ，Ｆｒａｎｃｅ）の混合物を含有する完全ＤＭＥＭ  ７００ｍｌと共にインキュベーションした。標準条件下において３７℃で５時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、そして完全ＤＭＥＭを添加した。示される場合、細胞を、トランスフェクションの開始の５時間後に１セッション（１０Ｇｙ）で、またはトランスフェクションの開始の３、４、５および６時間後に１３７Ｃｓ単位（１Ｇｙ／分）で投与される０．５Ｇｙの４セッションで、放射線照射へ曝露し、そして２週間増殖させた。プラスミド組込みが測定された場合、２μｇのプラスミドをＤｂａｉｔトランスフェクションへ添加し、そしてトランスフェクションの４８時間後にプロマイシン（１．７μｇ／ｍｌ）を増殖培地へ添加した。プラスミドトランスフェクション効率を、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（ＦＡＣＳａｌｉｂｕｒ，Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＵＳＡ）においてＧＦＰ発現について１０，０００個の細胞を分析することによって評価した。
【０１０４】
３．１）誘導された細胞致死
Ｈｅｌａ細胞中におけるＤｂａｉｔ分子の８時間トランスフェクション、および１３７Ｃｓ源由来のγ線で行った２時間間隔を置いた０．５Ｇｙの細分された放射線照射での４回の放射線照射（４×０．５Ｇｙ）によって、クローン原性生存の顕著な減少が、トランスフェクションされていない細胞と比較して観察された。結果を図２．１に与え、ここで、パネルＡは、Ｄｂａｉｔ３２およびＤｂａｉｔ３２Ｈの存在下での標準化生存クローン数の用量依存性を与え、パネルＢは、８３ｎＭ（培養培地中の濃度）での異なるＤｂａｉｔ分子の存在下での標準化生存クローン数。細胞培養は、１０％血清が補充されたＭＥＭにおいてであった。Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎｅ）を、製造業者の指示に従って、トランスフェクション剤として使用した。クローン原性生存を、未処理細胞の数に対するコロニーを形成する処理細胞の数として評価した。
【０１０５】
前記効果は、用量依存性様式で、Ｄｂａｉｔ分子の長さおよび化学的性質に依存する。このアッセイにおいて、ヘアピンＤｂａｉｔ分子（Ｄｂａｉｔ３２Ｈ、Ｄｂａｉｔ３２−Ｔ４およびＤｂａｉｔ２４Ｈ）および線形二本鎖Ｄｂａｉｔ分子（Ｄｂａｉｔ６４およびＤｂａｉｔ６４Ｌ）は、クローン原性生存を顕著に減少させた。遊離ｄｓＤＮＡ末端を欠いている（両末端でヘキサエチレングリコールリンカーによってキャッピングされた）ダンベルＤｂａｉｔ３２Ｃ分子はいかなる効果も示さなかったことは、注目する価値がある。ループの化学的性質は重要ではなかった（Ｄｂａｉｔ３２Ｈ対Ｄｂａｉｔ３２−Ｔ４）。これらの観察は、Ｄｂａｉｔ分子のいくつかが、培養細胞において電離放射線に対して細胞を効果的に増感し得ることを示している。
【０１０６】
図２．２は、前の観察を確認し、かつ、一本鎖または短い８ｂｐ  Ｄｂａｉｔ分子はいかなる効果も有さなかったという追加のデータを提供している。さらに、それは、効果は配列依存性ではなかったことを示している（Ｄｂａｉｔ３２Ｈ対Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ）。
【０１０７】
【表４】
0005415952.tif 000005
表２：放射線およびＤｂａｉｔでの処理後のＤＮＡ−ＰＫコンピテント細胞（ＭＯ５９Ｋ）およびＤＮＡ−ＰＫ欠損細胞（ＭＯ５９Ｊ）における細胞生存。細胞を希釈し、そして平板培養し、フラスコ上にコロニーを形成させ、次いでこれらに１０Ｇｙで放射線照射したおよび／または２μｇ  Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃをトランスフェクションした。両方の処理を合わせた場合、放射線照射をトランスフェクションの５時間後に行った。生存を、非処理サンプル中におけるクローン形成細胞数で割った処理後のクローン形成細胞数として算出する。平均値および標準偏差（括弧中）を、３つの独立した実験から算出した。
【０１０８】
γ放射線照射後のＤＮＡ−ＰＫ野生型および突然変異細胞生存に対するＤｂａｉｔ３２Ｈｃトランスフェクションの効果を、コロニー形成によって評価した。放射線照射後の生存は、トランスフェクションされていないＭＯ５９Ｋ細胞における９．８３％から、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃがトランスフェクションされた細胞における３．４７％へ低下した。対応のＤＮＡ−ＰＫヌル突然変異細胞株、ＭＯ５９Ｊにおいて、対照的に、生存は、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃでのトランスフェクションによって影響されなかった。生存のレベルは、放射線照射のみの後のＤＮＡ−ＰＫヌル突然変異細胞において観察されたものと比べて、放射線照射されかつＤｂａｉｔ３２Ｈｃがトランスフェクションされた野生型細胞株において同様であった（３．９７％と比べて３．４７％）。これは、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃが、野生型トランスフェクション細胞においてＤＮＡ−ＰＫ依存性修復を阻害することを示唆している。
【０１０９】
３．２）Ｄｂａｉｔ分子による外因性ＤＮＡの異常組込みの阻害
電離放射線は、放射線増強組込みと呼ばれるプロセスである、外因性ＤＮＡの異常組込みを増進することが公知である。Ｈｅｌａ細胞培養をこのアッセイのために使用した。細胞を、ネオマイシン耐性をコードする遺伝子を有する線状プラスミド２μｇ、および３つの異なる比率のＤＮＡ／Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（１：２、１：５、１：１０）によって８時間の間トランスフェクションした。トランスフェクション時間の間、細胞を種々の放射線照射プロトコルへ曝露した：放射線照射無し、１Ｇｙおよび２Ｇｙの単回放射線照射、ならびに２時間毎に０．５Ｇｙの細分された線量によって送達した２Ｇｙ放射線照射（４×０．５Ｇｙ）。プラスミドの組込みを、０．６ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含有する培地において増殖するＮｅｏＲ細胞の選択によってモニタリングした。プラスミド組込みは、細分された放射線照射プロトコルによって顕著に増強された。２μｇのＤｂａｉｔ３２Ｈ分子をトランスフェクションミックスへ添加すると、放射線増強組込みはなくなった（図２．３）。
【０１１０】
図２．４は、３２ｂｐ  Ｄｂａｉｔ分子（Ｄｂａｉｔ３２ＨおよびＤｂａｉｔ３２Ｈｃ）のみが、プロマイシン耐性をコードする遺伝子を有する環状プラスミドの放射線増強異常組込みを阻害することができ、一方、より短いＤｂａｉｔ分子（Ｄｂａｉｔ１６Ｈ、Ｄｂａｉｔ８Ｈ）、一本鎖またはダンベルＤｂａｉｔ分子（Ｄｂａｉｔ３２ｓｓおよびＤｂａｉｔ３２Ｃ）は有効ではなかったことを示す追加のデータを提供している。ＰＩ３Ｋ（ＤＮＡ−ＰＫを含む）の公知の阻害剤であるＷｏｒｔｍａｎｎ（Ｗｏｒｔ）およびＮＵ７０２６（ＮＵ）をコントロールとして使用した。
【０１１１】
これらの実験は、Ｋｕ、ＤＮＡ−ＰＫおよびＡＴＭタンパク質を必要とする外因性ＤＮＡの放射線増強異常組込みが（Ｎｉｍｕｒａら，２００２）、これらのＤｂａｉｔ分子の作用機構がＮＨＥＪ経路に関与するタンパク質をさらうことによって作用するので、予想されるように、配列非依存性様式で３２ｐ  Ｄｂａｉｔ分子によって阻害されることを示した。
【０１１２】
３．３）Ｄｂａｉｔ分子によってトランスフェクションされた細胞中における放射線照射後のＤＳＢ部位の残存
核中のＤＳＢ部位は、リン酸化Ｈ２ＡＸ（ヒストンＨ２Ａの変異体）上に結合するγ−Ｈ２ＡＸ抗体の免疫蛍光検査によってモニタリングされ得る。大部分のγ−Ｈ２ＡＸフォーカスが、放射線照射後、迅速に出現し、そしてＤＳＢ修復プロセスが進行するにつれ消滅する。
【０１１３】
トランスフェクションおよび放射線照射プロトコルは、上記のものと同様であった。免疫検出のために、細胞を、５ｃｍ直径ペトリ皿中の表面カバースリップ上において増殖させ、製造業者の指示に従って、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎｅ）を用いて、ＦＩＴＣで標識されたＤｂａｉｔ３２Ｈ−ＦＩＴＣ分子２μｇをトランスフェクションした。トランスフェクションの開始の４時間後、細胞に放射線照射し（２Ｇｙ）、次いで、３７℃で培地において２時間休息させた。３洗浄サイクル後、細胞を１０分間２％ＰＦＡで固定した。１追加洗浄後、γ−Ｈ２ＡＸの存在を、１×ＰＢＳ，１％ＢＳＡ中に１／１００希釈したウサギ抗γ−Ｈ２ＡＸ抗体（４４１１−ＰＣ，Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）で検出した。細胞を１×ＰＢＳ，０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で３回洗浄し、次いで、１×ＰＢＳ，１％ＢＳＡ中に１／１００希釈したローダミン結合ヤギ抗ウサギ抗体と共に、室温で１時間インキュベーションした。細胞を落射蛍光顕微鏡検査によって視覚化した。
【０１１４】
図２．５は、２Ｇｙ放射線照射の２時間後、蛍光性Ｄｂａｉｔ３２Ｈ−ＦＩＴＣ分子によってトランスフェクションされたＨｅｌａ細胞で得られた結果を示している。左パネル：Ｄｂａｉｔ３２Ｈ−ＦＩＴＣの蛍光（明るいドットおよび斑点）および核中のγ−Ｈ２ＡＸ抗体の免疫蛍光検査によって検出されたＤＳＢ部位；右パネル：γ−Ｈ２ＡＸ抗体の免疫蛍光検査およびＤＡＰＩ対比染色によって検出されたＤＳＢフォーカスを有する核の同一の画像。左下角の矢印は、核中にＤｂａｉｔ３２Ｈ−ＦＩＴＣおよびγ−Ｈ２ＡＸシグナルが存在しないことを示す。右上角の矢印は、共局在化されたＤｂａｉｔ３２Ｈ−ＦＩＴＣおよびγ−Ｈ２ＡＸシグナルを示す。図２．５において示されるように、Ｄｂａｉｔ３２Ｈ−ＦＩＴＣおよびγ−Ｈ２ＡＸ抗体のそれでの二重蛍光標識によって示されるように、ＤＳＢ部位は、Ｄｂａｉｔ３２Ｈ−ＦＩＴＣ分子によってトランスフェクションされたＨｅｌａ細胞中において、放射線照射（２Ｇｙ）の２時間後に、残存していた。Ｄｂａｉｔ３２Ｈ−ＦＩＴＣによって効果的にトランスフェクションされなかった細胞において、ＤＳＢフォーカスはほとんど検出不可能であったことは、注目するに値する。これらのデータは、ＤＳＢ修復は、Ｄｂａｉｔ３２Ｈによって効率的にトランスフェクションされた細胞中において害され、一方、ＤＳＢ修復は、あまりトランスフェクションされなかった細胞中において完全であったことを示唆している。
【０１１５】
ウエスタンブロッティングを、ウサギモノクローナル抗ホスホＴｈｒ６８−Ｃｈｋ２（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄｅｎｖｅｒ，ＵＳＡ）、モノクローナル抗β−アクチンクローンＡＣ−１５（Ｓｉｇｍａ，ＭＳ，ＵＳＡ）、抗Ｈ２ＡＸ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄｅｎｖｅｒ，ＵＳＡ）およびマウス抗ホスホ−ヒストンＨ２ＡＸ（Ｓｅｒ１３９）（Ｕｐｓｔａｔｅ，Ｔｅｍｐｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して行った。
【０１１６】
図２．６上パネルは、ＰＩＫＫによるヒストンＨ２ＡＸの総Ｈ２ＡＸタンパク質リン酸化と比べた場合の、ヒストンＨ２ＡＸのリン酸化形態（γ−Ｈ２ＡＸ）のウエスタンブロット分析を示している。Ｈｅｐ２細胞に、５時間、種々のＤｂａｉｔ分子、３２Ｈｃ、２４Ｈ、１６Ｈおよび８Ｈを５時間トランスフェクションしたか、またはトランスフェクションしなかった。トランスフェクションの終わりに、それらに放射線照射し、１時間インキュベーションし、次いで分析した。Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃは、コントロール（両方とも放射線照射細胞、または無し）と比較した場合、Ｈ２ＡＸのリン酸化形態（γ−Ｈ２ＡＸ）を大いに増強したことが示されている。他のより短いＤｂａｉｔ分子は、遥かに少ないかまたは全くない効果を有した。
【０１１７】
電離放射線誘導されるγ−Ｈ２ＡＸフォーカス形成および消失に対するＤｂａｉｔの効果を調べるために、Ｄｂａｉｔ３２Ｈ−Ｃｙ３を、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）によってＨｅｐ２細胞中にトランスフェクションした。トランスフェクションされたまたはトランスフェクションされなかったＨｅｐ２細胞に１０Ｇｙで放射線照射した。細胞を種々の時間（０分、３０分、１時間、５時間、２４時間、４８時間、７２時間、および７日）で固定した。ｇ−Ｈ２ＡＸについての一次マウスモノクローナル抗体（ｓｅｒ１３９）（Ｕｐｓｔａｔｅ，Ｔｅｍｐｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を、１／５００希釈で使用し、そして０℃で２時間インキュベーションし、次いでＰＢＳ緩衝液で洗浄し、そして、１／２００希釈したＡｌｅｘａ４８８結合二次抗体抗マウスＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）と共に暗室で１時間インキュベーションした。
【０１１８】
ＤＳＢ部位の残存の動態を、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（ＦＡＣＳａｌｉｂｕｒ，Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＵＳＡ）によって、放射線照射した細胞中においてγ−Ｈ２ＡＸによって明らかにした。図２．６下パネルは、γ−Ｈ２ＡＸのレベルが、コントロール（放射線照射されたがトランスフェクションされなかった細胞、または未処理細胞）と比較して、Ｄｂａｉｔ３２Ｈがトランスフェクションされた細胞において高くかつ長いままであったことを示している。この実験によって、Ｄｂａｉｔ３２Ｈは、電離放射線誘導されたＤＳＢの修復を実質的に遅延させたことが示された。
【０１１９】
実施例４：ＧＭＡ３２細胞株におけるＤｂａｉｔ分子の効果ならびに放射線照射または有糸分裂阻害剤とのそれらの共同
【０１２０】
ＤＮＡ切断を許容するＧＭＡ３２チャイニーズハムスター線維芽細胞を、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭグルタミン、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸、１×ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１０％ウマ血清が補充されたＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）に維持した。典型的に、製造業者の指示に従って、種々のＤｂａｉｔ分子（４．５μｇ）をトランスフェクション剤としてのリポフェクタミン２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（１：３の比）でトランスフェションする２４時間前に、２×１０５〜４×１０５細胞を、５ｃｍ直径ペトリ皿中の、抗生物質を含まない培地中に播種した。トランスフェクションの終了時に、細胞に放射線照射するか（４Ｇｙ）または細胞を有糸分裂阻害剤：ノコダゾール（２００ｎＭ）、ナベルビン（１００ｎＭ）もしくはタキソール（２００ｎＭ）で処理した。
【０１２１】
約１６時間後、薬物を除去し、そして細胞を回復させた。細胞放射線照射は、１３７Ｃｓ源由来のγ線で行った。２４時間回復後、細胞を回収し、そしてＦＡＣＳ、ウエスタンブロット分析のためにまたはクローン原性（生存）および各処理の効果を測定するために、使用した。
【０１２２】
図３．１は、未処理ＧＭＡ３２細胞、リポフェクタミンによってのみトランスフェクションされた細胞、またはリポフェクタミンによって種々のＤｂａｉｔ分子がトランスフェクションされた細胞のＦＡＣＳ分析を示しており、但し、追加の放射線照射または有糸分裂阻害剤処理はない。Ｍ１相は、細胞死を示すｓｕｂ−Ｇ１期にある細胞のパーセンテージを示す。顕著な細胞死は、二本鎖Ｄｂａｉｔ３２およびヘアピンＤｂａｉｔ３２Ｈ分子の存在下においてのみ観察され、一方、ヘアピンＤｂａｉｔ１６Ｈおよび一本鎖Ｄｂａｉｔ３２ｓｓは、それぞれ、中間のおよび適度な細胞死を誘導した。最も短いヘアピンＤａｉｔ８Ｈは、コントロール（リポフェクタミンのみによってトランスフェクションされた細胞）と比べて、細胞死をトリガーしなかった。
【０１２３】
ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて実験を行った。細胞を回収し、１ｍｌの冷ＧＭ緩衝液（６．５ｍＭグルコース、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ  ＫＨＰＯ４、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に懸濁し、そして３ｍｌの冷１００％エタノールを添加した後、４℃で少なくとも２時間保存した。
【０１２４】
その段階で、細胞を最終的に１×ＰＢＳで洗浄し、次いでＰＩ溶液（５０μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム、２５μｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ  Ａ、１×ＰＢＳ緩衝液中）中において室温で３０分間染色した。１０，０００事象をＣｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウエアで分析し、そして細胞凝集物をゲートアウトした。ＤＮＡのｓｕｂ−Ｇ１コンテントを有する細胞のパーセンテージをスコアリングした。
【０１２５】
同一の条件下で、γ−Ｈ２ＡＸ標識化によるセリン１３９上のリン酸化されたγ−Ｈ２ＡＸのＤＳＢフォーカスの免疫検出（核内の明るいドットまたは斑点）を、未処理ＧＭＡ３２細胞、リポフェクタミンによってのみトランスフェクションされた細胞、またはリポフェクタミンによって種々のＤｂａｉｔ分子がトランスフェクションされた細胞において行った。細胞膜および核の対比染色をＦＩＴＣ−ＤｉＯＣ６およびＤＡＰＩによって達成した。Ｄｂａｉｔ分子の同様の効果が観察された（図３．２）。この実験は、二本鎖Ｄｂａｉｔ３２およびヘアピンＤｂａｉｔ３２Ｈが両方とも、ＤＮＡ損傷が核内で引き起こされたかのように同様の細胞反応を効果的にトリガーし得ることを示している。これは、これらのＤｂａｉｔ分子が、ＮＨＥＪ経路を介してのＤＳＢ修復に関与するタンパク質を捕捉するために使用され得るという物的証拠を提供している。
【０１２６】
免疫検出のために、種々のＤｂａｉｔ分子をトランスフェクションする２４時間前に、細胞を５ｃｍ直径ペトリ皿中のカバースリップ上において増殖させた。トランスフェクションの１日後、ＦＩＴＣ−ＤｉＯＣ６（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ）を、３７℃で５分間、培地に添加した（膜を対比染色するため）。３洗浄サイクル後、細胞を２０分間４％ＰＦＡで固定した。
【０１２７】
さらに洗浄した後、セリン１３９上のリン酸化されたγ−Ｈ２ＡＸ（γ−Ｈ２ＡＸ）を、１×ＰＢＳ，１％ＢＳＡ中に１／１００希釈したウサギ抗γ−Ｈ２ＡＸ抗体（４４１１−ＰＣ，Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）で検出した。細胞を１×ＰＢＳ，０．５％，ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で３回洗浄し、次いで、１×ＰＢＳ，１％ＢＳＡ中に１／１００希釈したヤギ抗ウサギ抗体Ａｌｅｘａ５９４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と共に室温で１時間インキュベーションした。細胞を落射蛍光顕微鏡検査によって視覚化した。
【０１２８】
さらなる実験を、ＤＮＡ損傷シグナル伝達の証拠を探すために行った。タンパク質ｐ５３は、そのリン酸化状態を変化させることによって、ＤＮＡ損傷シグナル伝達を媒介することおよび適切な反応（ＤＮＡ修復、アポトーシスなど）を調整することにおいて、周知の主要なタンパク質である。特に、セリン１５残基のリン酸化は、フィードバック制御として作用するＭＤＭ２タンパク質との相互作用に関与する。従って、ｐ５３のセリン１５のリン酸化状態を、ウエスタンブロットによって評価した。図３．３は、細胞が二本鎖Ｄｂａｉｔ３２分子またはヘアピンＤｂａｉｔ３２Ｈ分子のいずれかによってトランスフェクションされた場合に、ｐ５３セリン１５が高度にリン酸化され、一方、より短いヘアピンＤｂａｉｔ１６Ｈは適度のリン酸化を誘導したことを示している。最も短いＤｂａｉｔ８Ｈ分子および一本鎖Ｄｂａｕｔ３２ｓｓ分子はいずれも、ｐ５３タンパク質のセリン１５において顕著なリン酸化を誘導することができなかった。この実験は、ＧＭＡ３２細胞中における二本鎖Ｄｂａｉｔ３２およびヘアピンＤｂａｉｔ３２Ｈの両方の存在が、ＤＮＡ損傷の場合に検出され、そして、恐らくＡＴＭ活性化経路を介して、ｐ５３タンパク質リン酸化などのトランスデューサ反応に対するシグナルを誘導したという追加の証拠を提供している。
【０１２９】
ウエスタンブロット分析のために、細胞をＬａｅｍｍｌｉ緩衝液中において溶解させた。等量の溶解物を、１２％ポリアクリルアミドゲル中に再溶解した。タンパク質を、ニトロセルロース膜へ移し、これを５％脱脂乳でブロックし（１時間）、その後、５％脱脂乳を含有するＴＢＳＴ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）中に５００倍に希釈した抗ｐ５３Ｓｅｒ１５抗体（９２８４，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）と共に一晩インキュベーションした。次いで、ブロットを、ＴＢＳＴ中において１／５０００に希釈したホースラディシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗体（Ｐ０４４８，Ｄａｋｏ）と共にインキュベーションした。タンパク質−抗体複合体を、増強された化学発光（ＲＰＮ２１０６  ＥＣＬ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって検出した。
【０１３０】
ＧＭＡ３２細胞中におけるＤｂａｉｔ分子の放射線増感および化学増感の効果を、クローン原性（クローン生存）アッセイによって評価した。クローン原性アッセイのために、細胞をカウントした後、連続希釈を行い、種々の量の細胞を５ｃｍペトリ皿に播種した。細胞の数は、１００〜２００（コントロール細胞）から３０００（トランスフェクションされたおよび／または処理された細胞）までの範囲である。１０日後、細胞（クローンを形成する）を４％パラホルムアルデヒドで固定し（２０分）、次いで、メチレンブルー（１５分）で着色し、そして各プレート（三重で）中のクローンの数をスコアリングした。
【０１３１】
図３．４は、４Ｇｙ放射線照射に対する放射線増感が、二本鎖Ｄｂａｉｔ３２分子またはヘアピンＤｂａｉｔ３２Ｈ分子のいずれかがトランスフェクションされたＧＭＡ３２細胞において観察されたことを示している。さらに、化学増感もまた、有糸分裂阻害剤（２００ｎＭノコダゾール、１００ｎＭナベルビン（ビノレルビン）または２００ｎＭタキソール（パクリタキセル））によって処理した場合、二本鎖Ｄｂａｉｔ３２分子またはヘアピンＤｂａｉｔ３２Ｈ分子がトランスフェクションされたＧＭＡ３２細胞について観察された。これらの薬物は、微小管の重合または脱重合の強力な阻害剤として公知である。Ｄｂａｉｔ３２およびＤａｉｔ３２Ｈは、これらの有糸分裂阻害剤の細胞傷害性活性を増強することができた。
【０１３２】
実施例５：ヌードマウス上の異種移植ヒト腫瘍の治療の放射線増感
放射線療法と共同してのＤｂａｉｔ分子のin vivo活性を、放射線耐性細胞株（頭頸部扁平上皮癌ＨＮＳＣＣ由来のＨｅｐ２）または腫瘍フラグメント（膠芽腫由来のＵ８７細胞株の皮下注射によって予め得た）の皮下注射によってヒト腫瘍が異種移植されたヌードマウスを使用して評価した。
【０１３３】
in vivoで概念実証を確立するために、研究を、主に、放射線耐性ヒトＨＮＳＣＣ腫瘍が異種移植されたマウスにおいて行った。腫瘍の局所放射線照射を行うために、マウスを適切に保護しながら、放射線照射を１３７Ｃｓ源由来のγ線で行った。典型的なアッセイ条件は、放射線照射の５時間前に、製造業者の指示に従って、トランスフェクション剤（カチオン性デンドリマー（Ｓｕｐｅｒｅｆｃｔ，Ｑｉａｇｅｎｅ）、ジオクタデシルアミドグリシル−スペルミン（ＤＯＧＳ，Ｐｏｌｙｐｌｕｓ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ，Ｐｏｌｙｐｌｕｓ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を含む１ｎｍｏｌ  Ｄｂａｉｔ分子の好適な調製物の腫瘍内注射からなる。総線量３０Ｇｙを５週間で送達した：ｉ）３×２Ｇｙ／週（２日毎に約１回）；ｉｉ）５Ｇｙ／週；ｉｉｉ）１５Ｇｙ／２週。
【０１３４】
腫瘍のサイズを１週間に２〜３回測定した。放射線照射およびＭＥＭ培地（Ｄｂａｉｔ希釈緩衝液）の腫瘍内注射による治療を、Ｄｂａｉｔ無しでの放射線照射治療のコントロールとして使用した。腫瘍の体積を算出した（Ｖ＝２×ａ×ｂ２、式中、ａ＝長さ、ｂ＝幅）。初期体積に対する時間ｔで測定された体積の比率（Ｖｔ／Ｖｉ）を、腫瘍進行の指標として使用した。マウスを１００日まで追跡した。６匹の動物の少なくとも４つの独立したシリーズを試験した。
【０１３５】
結果を図４．１に示す（パネルＡ：未治療のアーム（ｎ＝３８）；パネルＢ：２０μｌ培養培地（ＭＥＭ）＋３×２Ｇｙ／週  放射線照射のコントロールアーム（ｎ＝３０）；パネルＣ：１ｎｍｏｌ（２０μｇ）Ｄｂａｉｔ３２Ｈ＋３×２Ｇｙ／週  放射線照射のアーム（ｎ＝３５）。
【０１３６】
ＭＥＭまたはＤｂａｉｔ３２Ｈを、放射線照射の５時間前に腫瘍内注射によって送達した。細分した放射線照射線量（２Ｇｙ）を、２日毎に１回、１週間に３回与えた。治療を５週間続け、合計で３０Ｇｙ放射線照射となった。ドットは、各マウスの腫瘍体積の時間的経過を示す。実線は、最良の多項式フィッティングである。パネルＤは、腫瘍体積の増加（Ｖｔ／Ｖｉ）＜５である全てのマウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒプロットを示す。
【０１３７】
有意な量のデータを、Ｄｂａｉｔ３２Ｈ＋３×２Ｇｙ／週  放射線照射（パネルＣ、ｎ＝３５）のアームについて蓄積し、これは、コントロールアーム：未治療（パネルＡ、ｎ＝３８）、ＭＥＭ＋３×２Ｇｙ（パネルＢ、ｎ＝３０）と比較して、放射線増感を明らかに示した。Ｍａｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ統計的検定によって、ＭＥＭ＋３×２Ｇｙに対するＤｂａｉｔ３２Ｈ＋３×２Ｇｙのアームについてｐ値＝０．０００６７が得られた。同一の傾向が、５倍の初期体積よりも小さい腫瘍体積（Ｖｔ／Ｖｉ＜５）を有するマウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒプロットにおいて観察された（パネルＤ）。
【０１３８】
引き続いて、さらなる研究を、Ｄａｉｔ分子の分子特徴およびin vivo活性についての最適なプロトコルを規定するために、異種移植されたヒトＨＮＳＣＣ、Ｕ８７、ＬＵ１２０５およびＳＫ２８腫瘍を有するマウスにおいて行った。研究したコホートから得られたデータは、生化学およびインビトロ研究（実施例２、３および４を参照のこと）において観察されたＤｂａｉｔ分子の分子特徴と一致した。さらに、放射線増感は、Ｄｂａｉｔ３２Ｈの腫瘍内注射と電離放射線との間の休止時間に依存することが示された：５時間＞＞１時間。
【０１３９】
放射線増感は、ヒト膠芽腫腫瘍が異種移植されたマウスにおいても観察された。膠芽腫は、最も高いグレードの脳腫瘍であり、迅速な致死的な結果を伴うその異常で攻撃的な進行ならびに放射線療法および化学療法に対する耐性を特徴とする。ヒト膠芽腫由来のＵ８７細胞２〜３百万個を、先ず、ヌードマウスに皮下注射した。次いで、移植された腫瘍を取り出し、そして、約８ｍｍ３膠芽腫腫瘍の皮下移植によって引き続いて他のヌードマウスに接種するために使用した。
【０１４０】
表３．１は、ヌードマウス上の異種移植されたヒト膠芽腫のパイロットシリーズのデータを示す。腫瘍内注射によってＤｂａｉｔ３２Ｈ（１ｎｍｏｌ）および放射線照射（１×１５Ｇｙ／週または３×５Ｇｙ／週、続いて１週間休息、続いて第２治療サイクル；電離放射線の総線量は３０Ｇｙであった）を受けたアームのうち５０％のマウスが、治療開始後の第２５日に＜４ｃｍ３の腫瘍体積を有し、一方、コントロールアーム（未治療、または放射線照射しかつ食塩水（ＰＢＳ）を注射した）のうちの１００％のマウスが、４ｃｍ３を十分に超える腫瘍体積を有し、そして、治療終了前に動物倫理に関する現在の規則に従ってアッセイ終了前に殺した。
【０１４１】
【表５】
0005415952.tif 000006
表３．１：Ｄｂａｉｔ３２Ｈ（１ｎｍｏｌ／腫瘍内注射）によるヌードマウスにおける異種移植ヒト膠芽腫の放射線増感のアッセイ。２つのプロトコルの放射線照射（腫瘍内注射後５時間）を使用した：１×１５Ｇｙ／週または３×５Ｇｙ／週、続いて１週間休息、第２治療サイクル。総放射線照射線量は、３０Ｇｙであった。コントロール群は、未治療群、または食塩水（ＰＢＳ）注射を受容した群であった。
【０１４２】
Ｄｂａｉｔ分子が放射線療法の効能を効果的に増強し得るという証拠を提供したこれらの心強いin vivoデータに基づいて、放射線療法を増感するためのアジュバント剤としてのＤｂａｉｔ分子の使用に関する追加のデータを得、そして従って抗ガン療法におけるＤＮＡベイトアプローチの原理の証明を補強するために、さらなる実験を設計し、そして行った。
【０１４３】
図４．２は、ヌードマウスにおけるＨｅｐ２（ＨＮＳＣＣ細胞株）異種移植腫瘍中における、シアニン３標識Ｄｂａｉｔ３２Ｈの分布を示している。Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（トランスフェクション剤）が配合された２０μｇ  Ｄｂａｉｔ３２Ｈ−Ｃｙ３を、１．５ｃｍ３  Ｈｅｐ２腫瘍中へ注射した。注射の６時間後にマウスを犠牲にした。腫瘍を取り出し、そして固定せずに分析のためにクライオスライスした。ＤＡＰＩを核染色のために使用した。シアニン３の蛍光は、Ｄｂａｉｔ３２Ｈ−Ｃｙ３分子が、毛細血管から腫瘍組織中に分布され、そして細胞核中に局在化されたことを示している。
【０１４４】
図４．３は、図４．１に記載されるＨｅｐ２異種移植腫瘍についての別の実験を示している。種々の治療（未治療、Ｄｂａｉｔ３２Ｈのみで治療、放射線照射のみによって治療、ならびに組み合わされたＤｂａｉｔ３２Ｈおよび放射線照射）での治療の間および後、１０匹の動物の４つの群において、腫瘍増殖をモニタリングした。個々の腫瘍増殖を、各動物について示す。治療プロトコルは図４．１に記載されるものと同一であった。Ｈｅｐ２腫瘍の体積が１５０〜２００ｍｍ３に達した際に、実験を開始した。各治療セッションについて、製造業者に指示に従って、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ，Ｐｏｌｙｐｌｕｓ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ，Ｆｒａｎｃｅ）と配合した２０μｇ  Ｄｂａｉｔ３２Ｈを、２Ｇｙ放射線照射の５時間前に、腫瘍へ注射した。腫瘍増殖は、放射線照射またはＤｂａｉｔ３２Ｈのみによって治療した群と比較して、組み合わされたＤｂａｉｔ３２Ｈおよび放射線照射によって治療した群において大幅に減少された。
【０１４５】
図４．４は、Ｈｅｐ２腫瘍によって皮下に異種移植されたヌードマウスの生存のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ表示を示している。倫理的理由のため、動物を、それらの腫瘍が２ｃｍ３に到達した際に犠牲にした。この終点を、生存分析において死として使用した。治療プロトコルを図４．３に示した。５つの群を含めた：未治療群、偽トランスフェクションしそして放射線照射した群、組み合わせた放射線照射および増加する量のＤｂａｉｔ３２Ｈ（２０、６０および１２０μｇ／セッション）によって治療した群。各群についての動物の数を、表３．２に示す。明確な用量依存性効果が、Ｄｂａｉｔ３２Ｈおよび２Ｇｙ放射線照射によって治療された群において観察された。治療の開始の１５日後、治療の終了時（３５日）、および治療の終了の１３日後（３５＋１３日）に撮影した群（未治療；２Ｇｙ放射線照射と合わされた２０および６０μｇ  Ｄｂａｉｔ３２Ｈ／セッションで治療）を示す腫瘍の写真。それらは、組み合わされたＤｂａｉｔ３２Ｈおよび放射線照射治療の利点の明確な視覚的比較を提供した。
【０１４６】
図４．５は、中間段階治療（７セッション）での異種移植Ｈｅｐ２腫瘍の組織学的分析を示す。図４．３に記載される種々の治療プロトコルの開始の２０日後に、腫瘍を採取した。それらをホルマリン中に固定し、そして組織切片をヘマトキシリン、エオシンおよびサフランで染色した。各治療プロトコルについて２つの腫瘍を顕微鏡検査によって分析した。壊死およびアポトーシスの増強が、放射線照射のみによって治療された腫瘍と比べて、組み合わせられたＤｂａｉｔ３２Ｈおよび放射線照射によって治療された腫瘍において観察された。
【０１４７】
図４．６は、中間段階治療（７セッション）での異種移植Ｈｅｐ２腫瘍のＮＭＲイメージングを示す。３つの代表的な断面画像を、未治療腫瘍、放射線照射によって治療した腫瘍、ならびに組み合わされたＤｂａｉｔ３２Ｈ（２０μｇ／セッション）および放射線照射（２Ｇｙ／セッション）によって治療した腫瘍について示した。壊死領域は、放射線のみによって治療された腫瘍よりも、Ｄｂａｉｔ３２Ｈおよび放射線照射によって治療された腫瘍においてより重要であった。これは、腫瘍の細胞学的分析（図４．５を参照のこと）と一致している。
【０１４８】
図４．７は、Ｈｅｐ２、Ｕ８７、ＬＵ１２０５およびＳＫ２８腫瘍によって皮下に異種移植されたヌードマウス、ならびにそれらのコントロール群（未治療、放射線照射のみによって治療）の生存のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ表示を示す。Ｈｅｐ２のプロトコルを図４．３に示した。他の腫瘍を修飾したプロトコルによって治療し、ここで、５Ｇｙ細分化放射線照射を３連続日適用し、続いて４日休息し、そして治療を１回繰り返した。総放射線照射線量（６×５Ｇｙ）は、Ｈｅｐ２腫瘍を治療するために使用したプロトコルのそれ（１５×２Ｇｙ）と等しい。
【０１４９】
組み合わせられたＤｂａｕｔ３２Ｈおよび放射線照射の利益結果が、４つ全ての異種移植したヒト腫瘍において観察された。Ｄｂａｉｔ分子の基礎をなす作用機構は、全ての細胞に偏在するＮＨＥＪ経路であるので、これは、異なる組織構造を有する他の腫瘍についても当てはまることが予想される。
【０１５０】
腫瘍反応の記述的な分析を、各治療および各腫瘍タイプについて行った。第１日は、第１治療セッションの日であった。全ての動物を、少なくとも１５０日間またはそれらの倫理的犠牲まで追跡した。中央値の寿命を、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法に従って評価した。各治療群における個々のマウスの腫瘍体積四倍化時間からコントロール群の平均腫瘍体積四倍化時間を差し引くことによって、ＴＧＤを算出した。個々の測定値を使用して、平均ＴＧＤを各治療群について算出した。
【０１５１】
データは正規分布に従わないため、全体的生存曲線を、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ推定値によって評価し、そしてノンパラメトリックＬｏｇ  Ｒａｎｋ検定を使用して比較した。分析には、Ｓ−Ｐｌｕｓ  ６．２バージョンソフトウエア（ＭａｔｈＳｏｆｔ  Ｉｎｃ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）およびｓｔａｔＥＬ（ａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用した。グローバルＬｏｇ  Ｒａｎｋを、先ず、同一の腫瘍タイプを有する各群について行った。次いで、Ｄｂａｉｔでの治療を、偽治療コントロールと比較した。動物数（ｎ）、相対リスク（ＲＲ）およびＰ値を表３．２に報告する。全ての検定を、０．０５有意水準で有意と考えた。
【０１５２】
【表６】
0005415952.tif 000007
表３．２は、上記のデータの一部を要約しており、かつ、ヌードマウスにおいて皮下に異種移植された３つのヒト腫瘍細胞株における異なるプロトコル（種々のＤｂａｉｔ３２分子＋放射線照射  対  放射線照射＋偽注射）によって治療された異種移植された動物の生存の比較を提供している。さらに、それは、Ｄｂａｉｔ３２Ｈと比べてのＤｂａｉｔ３２Ｈｃの同様の結果によって証明されるように、Ｄｂａｉｔ分子の配列は重要ではないことを示している。それはまた、一本鎖Ｄｂａｕｔ３２ｓｓは高用量であっても不活性であったことを示している。
【０１５３】
Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃは、周知のＴｏｌｌ様レセプター媒介免疫刺激に起因する免疫反応の効果を避けるために、その配列においてＣｐＧを欠いていることが指摘されるべきである。
【０１５４】
結論として、ヌードマウス上に異種移植されたヒト放射線耐性腫瘍（ＩＨｅｐ２、Ｕ８７およびＳＫ２８）および放射線感受性腫瘍（ＬＵ１２０５）の腫瘍増殖の顕著な減少は、Ｄｂａｉｔ分子がこれらの浸潤性腫瘍に対する放射線療法の効果を効果的に放射線増感し得るという証拠を提供している。従って、ＤＮＡベイトアプローチの概念実証がin vivoで達成された。
【０１５５】
実施例６：Ｋ−Ｒａｓｖ１２Ｇ×Ａｐｃ１６３８Ｎトランスジェニックマウスにおいて誘導した消化器腫瘍の治療の化学増感
内因性マウス腫瘍モデルを選択し、抗ガン化学療法を増感させるＤｂａｉｔ分子の能力を評価した。このために、Ｋ−Ｒａｓｖ１２ＧおよびＡｐｃ１６３８Ｎ突然変異を有するトランスジェニックマウスを使用した。２つのトランスジェニックマウスを交配させることによってそれらを得た：一方は、マウスビリンプロモーターの制御下でＫ−Ｒａｓｖ１２Ｇ突然変異体を有し（ｐＶｉｌｌ／Ｋ−Ｒａｓｖ１２Ｇ）（Ｊａｎｓｓｅｎら，２００２）、他方は、１アレル中にＡｐｃ１６３８Ｎ突然変異を含む（Ｆｏｄｄｅら，１９９４）。ｐＶｉｌｌ／Ｋ−Ｒａｓｖ１２Ｇ×Ａｐｃ１６３８Ｎ突然変異を有するトランスジェニックマウスは、約５月齢で消化管に自然発生腫瘍を発現し、そして急に死んだ。
【０１５６】
図５．１パネルＡに示すプロトコルに従って、化学療法（５ＦＵ＋ＣＰＴ１１）およびＤｂａｉｔ３２Ｈの併用によって、これに対して化学療法のみによって、平均週齢１２週でそれらを治療した。プロトコルは３治療サイクルを含む。
【０１５７】
各サイクルは、経口投与による０．１ｍｇ  Ｄｂａｉｔ３２Ｈと共の、０．６ｍｇ  ５ＦＵおよび０．６ｍｇ  ＣＰＴ１１の腹腔内注射、１週間に３回、続いて１週休息からなる。
【０１５８】
５ＦＵ（５フルオロウラシル，Ｔｅｖａ）を５０ｍｇ／ｍｌの濃度で０．９％ＮａＣｌ溶液中に調製した。ＣＰＴ１１／ｌｒｉｎｏｔｅｃａｎ（Ｃａｍｐｔｏ，Ａｖｅｎｔｉｓ）を２０ｍｇ／ｍｌの濃度で０．９％ＮａＣｌ溶液中に調製した。マウスの健康状態および生存を、死亡するまでモニタリングした。Ｄｂａｉｔ分子に起因するさらなる毒性効果の臨床的兆候は観察されなかった。
【０１５９】
結果を図５．１に示す。パネルＡ：平均週齢１２週のＫ−Ｒａｓｖ１２Ｇ×Ａｐｃ１６３８Ｎトランスジェニックマウスの３つの群／アームについての治療プロトコル：コントロール群（未治療）、５ＦＵ＋ＣＰＴ１１によって治療した群、５ＦＵ＋ＣＰＴ１１およびＤｂａｉｔ３２Ｈによって治療した群。それを３サイクルの治療によって行った。各サイクルは、経口投与による０．１ｍｇ  Ｄｂａｉｔ３２Ｈと共の、０．６ｍｇ  ５ＦＵおよび０．６ｍｇ  ＣＰＴ１１の腹腔内注射、１週間に３回、続いて１週休息からなる。各群に含まれるマウスの数を括弧内に示す。終点は生存期間である；パネルＢ：３つの群の生存曲線のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロット；パネルＣ：パネルＢに示される３つの群の中央値生存期間。
【０１６０】
減少されたコホートにもかかわらず、生存期間の改善が、化学療法のみ（１７３日）およびコントロールアーム（１７５日）のそれと比べて、化学療法（５ＦＵ＋１１ＣＰＴ）およびＤｂａｉｔ３２Ｈの組み合わせを受容したアーム（中央値生存＝２２６日、ｐ値＝０．２）において観察された（パネルＢおよびＣ）。
【０１６１】
統計的有意性を高めるために、５ＦＵ＋ＣＰＴ１１＋Ｄｂａｉｔ３２Ｈおよび５ＦＵ＋ＣＰＴ１１アームのコホートを増加するさらなるアッセイが、現在進行中である。
【０１６２】
動物１匹当たりの腫瘍の平均数を評価するために、一連のマウスを治療の終了の２週後に犠牲にした（平均週齢１８週）。腸を肉眼検査および組織学検査によって検査した（ヘマトキシリン−エオシン−サフランによって標準染色）。
【０１６３】
結果を図５．２に与える。各群における動物数を括弧内に示した。全てのマウスを、図５．１パネルＡに示すプロトコルの２週間後（第１８週）に犠牲にした。コントロールアーム（未治療群、ｎ＝１０１）の平均数は、３０．８／動物である。
【０１６４】
検査は両方とも、化学療法のみを受容したアーム（ｎ＝７）と比較して、５ＦＵ＋ＣＰＴ１１およびＤｂａｉｔ３２Ｈの組み合わせを受容したアーム（ｎ＝８）において腫瘍数の顕著な減少（＞３０％）を一貫して示した（図５．２）。コントロールアーム（未治療群、ｎ＝１０１）の平均数が３０．８／動物であることは、注目するに値する。
【０１６５】
フルオレセインによってタグされたＤｂａｉｔ分子（Ｄｂａｉｔ３２Ｈ−ＦＩＴＣ）ならびに５ＦＵ＋ＣＰＴ１１で治療した腫瘍サンプルを、免疫蛍光染色法を使用して分析した。インビトロ知見（実施例３．３および４を参照のこと）を回顧して、γ−Ｈ２ＡＸ標識されたフォーカスを蛍光性Ｄｂａｉｔ分子で共染色した。図５．３はさらなるアッセイを示しており、ここで、パネルＡに示されるように、１８週齢Ｋ−Ｒａｓｖ１２Ｇ×Ａｐｃ１６３８Ｎトランスジェニックマウスを、３日間、化学療法（５ＦＵ＋ＣＰＴ１１）およびＤｂａｉｔ３２Ｈ−ＦＩＴＣによって連続して治療し、そして最後の治療の２時間後に犠牲にした。腸を取り出し、そしてＰＢＳによって洗浄した。次いで、腫瘍組織をサンプル化し、そして−８０℃で凍結させた。分析のために、５μｍ組織学的サンプルを、クライオスタットによって凍結腫瘍組織から作製した。ＤＮＡ複製フォーカスを、ＰＢＳ中に１／５００希釈したポリクローナルウサギ抗γ−Ｈ２ＡＸ抗体（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）、次いでＰＢＳ中に１／２００希釈したシアニン３タグされたヤギ抗ウサギ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）での免疫蛍光検査によって検出した。サンプルをさらにＤＡＰＩによって対比染色した。サンプルを落射蛍光顕微鏡検査によって視覚化した。Ｄｂａｉｔ３２Ｈ−ＦＩＴＣの蛍光が、腫瘍組織中に不均一に広められ（腺構造体間の支質および上皮）、優先的な核局在化を有したことがわかった（図５．３、パネルＢ、左）。同様のパターンが、γ−Ｈ２ＡＸ部位について見られた（図５．３、パネルＢ、右）。共局在化されたＤｂａｉｔ３２Ｈ−ＦＩＴＣおよびγ−Ｈ２ＡＸシグナルがほとんど観察された。
【０１６６】
結論として、生存の改善および動物１匹当たりの腫瘍数の減少は、Ｄｂａｉｔ分子（Ｄｂａｉｔ３２Ｈ）による、Ｋ−Ｒａｓｖ１２Ｇ×Ａｐｃ１６３８Ｎ突然変異を有するトランスジェニックマウス中における消化器腫瘍の治療の化学増感の証拠を一貫して示している。治療した動物中における腫瘍組織の徹底的な分析は、Ｄｂａｉｔ分子はＤＮＡ修復プロセスを妨げるという証拠を提供する。
【０１６７】
Ｄｂａｉｔ３２Ｈ分子の経口投与はこの研究においてトランスフェクション剤を含まなかったことが、指摘されるべきである。
【０１６８】
要約すると、生化学およびインビトロデータは、直接的または間接的なＤＮＡ損傷（電離放射線または化学療法剤）によって引き起こされる修復シグナル伝達経路およびＮＨＥＪ経路によるＤＳＢ修復を妨げることによるＤｂａｉｔ分子の作用機構と明らかに一致している。配列非依存性、ＮＨＥＪ経路（Ｊａｃｋｓｏｎ，２００２；Ｂａｒｎｅｓ，２００１、ＤｏｗｎｓおよびＪａｃｋｏｎ，２００４）の性質に起因して、最小の長さ（約３２ｂｐ）を超えるＤｂａｉｔ分子の長さおよび配列について制限はない。インビトロ研究によって、Ｄｂａｉｔ分子によるマウス中の腫瘍の効果的な放射線および化学増感が確認された。総合すると、全てのデータが、Ｄｂａｉｔ分子の分子特徴を特徴とする、ＤＮＡベイトアプローチの概念実証を一貫して提供した。 
【０１６９】
【表７】
0005415952.tif 000008
0005415952.tif 000009
0005415952.tif 000010
0005415952.tif 000011
【図１．４】
0005415952.tif 000012
【図２．１Ａ】
0005415952.tif 000013
【図２．１Ｂ】
0005415952.tif 000014
【図２．２】
0005415952.tif 000015
【図２．３】
0005415952.tif 000016
【図２．４】
0005415952.tif 000017
【図２．５】
0005415952.tif 000018
【図２．６】
0005415952.tif 000019
【図４．１Ａ】
0005415952.tif 000020
【図４．１Ｂ】
0005415952.tif 000021
【図４．１Ｃ】
0005415952.tif 000022
【図４．１Ｄ】
0005415952.tif 000023
【図４．５Ｂ】
0005415952.tif 000024
【図５．１Ａ】
0005415952.tif 000025
【図５．１Ｂ】
0005415952.tif 000026
【図５．１Ｃ】
0005415952.tif 000027
【図５．３Ａ】
0005415952.tif 000028
【図５．３Ｂ】
0005415952.tif 000029
【図１．１】
0005415952.tif 000030
【図１．２】
0005415952.tif 000031
【図１．３】
0005415952.tif 000032
【図３．１】
0005415952.tif 000033
【図３．２】
0005415952.tif 000034
【図３．３】
0005415952.tif 000035
【図３．４】
0005415952.tif 000036
【図４．２】
0005415952.tif 000037
【図４．３】
0005415952.tif 000038
【図４．４】
0005415952.tif 000039
【図４．５Ａ】
0005415952.tif 000040
【図４．６】
0005415952.tif 000041
【図４．７】
0005415952.tif 000042
【図５．２】
0005415952.tif 000043
【配列表】
0005415952000001.app