(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポ蛋白を含む試料をイオン交換クロマトグラフに供してリポ蛋白を分離し、分離したリポ蛋白を有機溶媒及び界面活性剤を含む前処理液と反応させてビタミンＥ類を遊離させ、次いで遊離したビタミンＥ類を逆相クロマトグラフに供することを特徴とするリポ蛋白中のビタミンＥ類の分析方法。
【請求項２】
前記前処理液は、イオン交換クロマトグラフで分離したリポ蛋白と反応させる段階で１０から５０％となる有機溶媒と０．２から６．０％となる界面活性剤を含むものであることを特徴とする請求項１の分析方法。
【請求項３】
前記前処理液は、更にイオン交換クロマトグラフで分離したリポ蛋白と反応させる段階で５０から１５０ｍｍｏｌ／Ｌとなるカオトロピックイオンを含むものであることを特徴とする請求項１又は２の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に含まれるリポ蛋白（高比重リポ蛋白／ＨＤＬ、低比重リポ蛋白／ＬＤＬ、中間型リポ蛋白／ＩＤＬ、超低比重リポ蛋白／ＶＬＤＬ、カイロマイクロン／ＣＭなど）の中に含まれるαトコフェロールやγトコフェロール等のビタミンＥ類の分析方法と、かかる分析に使用することのできる分析装置に関するものである。さらに本発明は、リポ蛋白中のビタミンＥ類を指標とする糖尿病の病態、冠動脈疾患のリスク、心筋梗塞の病態といった各種病態の判定方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
動脈硬化の危険因子として、酸化したリポ蛋白が注目を浴び、多くの研究がなされているが、リポ蛋白に含まれる主要な抗酸化物質は、ビタミンＥ類（主としてαトコフェノールとγトコフェノール）である。従って、血液中にある各リポ蛋白中のビタミンＥ類の量を分析することは、動脈硬化のメカニズムを理解するうえで重要であると考えられる。特に血清リポ蛋白中に多量に含まれるビタミンＥ類の一つ、αトコフェロールについては、多くの学術研究において、下記の結果が報告されている。
【０００３】
(1)Ｈａｉｄａｒｉ  Ｍら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、４７、ｐ１２３４（２００１）（非特許文献１）；健常人に比べ冠動脈疾患患者は、ＬＤＬ中のαトコフェロール／コレステロールが低値となる。
(2)Ｆｅｋｉ  Ｍら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、４６、ｐ１４０１（２０００）（非特許文献２）；健常人に比べ冠動脈疾患患者は、ＬＤＬ中のαトコフェロール／コレステロールが低値となる。
【０００４】
また、糖尿病患者の血液中では、活性酸素（ラジカル）が多く発生し、酸化ストレスが上昇し、細胞を攻撃することにより種々の合併症が発生すると考えられている（Ｂｅｉｓｓｗｅｎｇｅｒ  ＰＪら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、５４、ｐ３２７４（２００５）（非特許文献３））。この酸化ストレスは血管の炎症の原因の１つであり、動脈硬化進展のメカニズムの１つでもある（Ｒｅｎａｒｄ  Ｃら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｔａｂ、３２、ｐ１５（２００５）（非特許文献４））。ビタミンＥ（γおよびαトコフェロール）は、細胞膜の持つ抗酸化物質の１つであり、体内にリポ蛋白を介して輸送される。また、ビタミンＥ（γおよびαトコフェロール）は、リポ蛋白の持つ重要な抗酸化物質でもある。
【０００５】
血液中の各リポ蛋白に含まれるビタミンＥと疾患に関する知見は少ないが、上記以外にも下記の結果が報告されている。
【０００６】
(3)Ｙｏｌａｎｄａ  Ｂら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ、１７、ｐ１２７（１９９７）（非特許文献５）；健常人に比べ高脂血症患者は、ＬＤＬ中のαトコフェロール／コレステロールが高値となる。
【０００７】
また、血液中のビタミンＥと糖尿病や冠動脈疾患などとに関する知見も多くはないが、下記の結果が報告されている。
(4)Ｓａｌｏｎｅｎ ＪＴら、ＢＭＪ、３１１、ｐ１１２４（１９９５）（非特許文献６）；健常人に比べ糖尿病患者は、αトコフェロール／コレステロールが低値となる。
(5)Ｒｅｕｎａｎｅｎ  Ａら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ、５２（２）、ｐ８９（１９９８）（非特許文献７）；αトコフェロールが低下すると、糖尿病を発症するリスクが高くなる。
(6)Ｓｏｂｃｚａｋ  Ａら、Ｊ  ｃｈｒｏｍａｒｏｇｒ、７３０、ｐ２６５（１９９９）（非特許文献８）；健常人に比べ糖尿病患者は、αおよびγトコフェロールが高くなる。
(7)Ｍａｙｅｒ−Ｄａｖｉｓ  ＥＪら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ、２５、ｐ２１７２（２００２）（非特許文献９）；糖尿病患者は糖尿病を呈しない患者に比べ、αトコフェロールが低値となる。
(8)Ｏｈｒｖａｌｌ  Ｍら、Ｊ  Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｍｅｄ、２３９、ｐ１１１（１９９６）（非特許文献１０）；健常人に比べ冠動脈疾患患者は、γトコフェロールが低値となるが、αトコフェロールに有意な変化はない。また、αトコフェロール／γトコフェロール比が高値となる。
【０００８】
これ以外のリポ蛋白中のビタミンＥ類についての報告はまだないが、他のリポ蛋白にもビタミンＥ類は含まれていることから、各リポ蛋白のビタミンＥ類の量を総合的に検討することによって、動脈硬化や糖尿病の原因や対処に関する研究が進展する可能性がある。
【０００９】
リポ蛋白中のビタミンＥ類の従来の分析は、各リポ蛋白を分離後、ビタミンＥ類をヘキサンで抽出し、抽出溶液を乾固して濃縮し、メタノール等により再溶解して逆相クロマトグラフに供する方法が知られている（Ｈａｉｄａｒｉ  Ｍら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、４７、ｐ１２３４（２００１）（非特許文献１）；Ｆｅｋｉ  Ｍら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、４６、ｐ１４０１（２０００）（非特許文献２）；Ｙｏｌａｎｄａ  Ｂら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７、ｐ１２７（１９９７）（非特許文献５）；Ｔｅｉｓｓｉｅｒ  Ｅら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２、ｐ４３０（１９９６）（非特許文献１１））。各リポ蛋白の分離については、超遠心分離による方法（Ｈａｉｄａｒｉ  Ｍら（２００１）前掲；Ｆｅｋｉ  Ｍら（２０００）前掲；Ｙｏｌａｎｄａ  Ｂら（１９９７）前掲；Ｔｅｉｓｓｉｅｒ  Ｅら（１９９６）前掲））、アクリルアミド電気泳動による方法、ゲルろ過クロマトグラフによる方法、イオン交換クロマトグラフによる方法（Ｈｉｒｏｗａｔａｒｉ  Ｙら，  Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４４，ｐ１４０４（２００３）（非特許文献１２）；Ｈｉｒｏｗａｔａｒｉ  Ｙら，  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３０８，ｐ３３６（２００２）（非特許文献１３））が知られている。
【００１０】
各リポ蛋白の分離については、溶離液の組成や分離条件を変えることで電荷の僅かな差を利用して各リポ蛋白を良好に分離可能なイオン交換クロマトグラフが提案されている（Ｈｉｒｏｗａｔａｒｉ  Ｙら（２００３）前掲）。しかしながら、各リポ蛋白中のビタミンＥ類の分析は、前述のように、各リポ蛋白を分離した後、ビタミンＥ類を抽出し、乾固濃縮し、再溶解し、そして逆相クロマトグラフに供するという複雑な工程を要しており、誤差を生じやすいうえにその実施は労力と時間を要するものであった。また、酸化ストレスとその病態とが密接に関連する糖尿病、冠動脈疾患などの動脈硬化性疾患では、各リポ蛋白中および血液中のビタミンＥの変動を測定し、それらの病態の判定方法の１つとして用いることが重要であるものの、各リポ蛋白中のビタミンＥの測定は超遠心分離法を用いる方法しかなく、高価な装置が必要で操作が煩雑で研究が進んでいない。さらに、血液中全体のビタミンＥについても、有機溶媒による抽出が必要で、操作が煩雑であり、糖尿病患者の評価結果が研究者によって異なっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｈａｉｄａｒｉ  Ｍら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、４７、ｐ１２３４（２００１）
【非特許文献２】Ｆｅｋｉ  Ｍら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、４６、ｐ１４０１（２０００）
【非特許文献３】Ｂｅｉｓｓｗｅｎｇｅｒ  ＰＪら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、５４、ｐ３２７４（２００５）
【非特許文献４】Ｒｅｎａｒｄ  Ｃら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｔａｂ、３２、ｐ１５（２００５）
【非特許文献５】Ｙｏｌａｎｄａ  Ｂら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ、１７、ｐ１２７（１９９７）
【非特許文献６】Ｓａｌｏｎｅｎ ＪＴら、ＢＭＪ、３１１、ｐ１１２４（１９９５）
【非特許文献７】Ｒｅｕｎａｎｅｎ  Ａら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ、５２（２）、ｐ８９（１９９８）
【非特許文献８】Ｓｏｂｃｚａｋ  Ａら、Ｊ  ｃｈｒｏｍａｒｏｇｒ、７３０、ｐ２６５（１９９９）
【非特許文献９】Ｍａｙｅｒ−Ｄａｖｉｓ  ＥＪら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ、２５、ｐ２１７２（２００２）
【非特許文献１０】Ｏｈｒｖａｌｌ  Ｍら、Ｊ  Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｍｅｄ、２３９、ｐ１１１（１９９６）
【非特許文献１１】Ｔｅｉｓｓｉｅｒ  Ｅら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２、ｐ４３０（１９９６）
【非特許文献１２】Ｈｉｒｏｗａｔａｒｉ  Ｙら，  Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４４，ｐ１４０４（２００３）
【非特許文献１３】Ｈｉｒｏｗａｔａｒｉ  Ｙら，  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３０８，ｐ３３６（２００２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
そこで本発明は、自動分析化が可能な程度にまで簡素化した工程によってビタミンＥ類を定性し定量できる、リポ蛋白中のビタミンＥ類の分析方法を提供するとともに、その分析方法を自動的に実施し得る分析装置を提供することを第一の目的とするものである。さらにはそのような分析方法や分析装置を利用した結果、本発明者はリポ蛋白中のビタミンＥ類を指標とすることで、糖尿病の病態、冠動脈疾患のリスク、心筋梗塞の病態といった各種病態を判定できることを見出すに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記第一の目的のためになされた本発明は、以下のとおりである：
（１）リポ蛋白を含む試料をイオン交換クロマトグラフに供してリポ蛋白を分離し、分離したリポ蛋白を有機溶媒及び界面活性剤を含む前処理液と反応させてビタミンＥ類を遊離させ、次いで遊離したビタミンＥ類を逆相クロマトグラフに供することを特徴とするリポ蛋白中のビタミンＥ類の分析方法。
（２）前記前処理液は、イオン交換クロマトグラフで分離したリポ蛋白と反応させる段階で１０から５０％となる有機溶媒と０．２から６．０％となる界面活性剤を含むものであることを特徴とする（１）の分析方法。
（３）前記前処理液は、更にイオン交換クロマトグラフで分離したリポ蛋白と反応させる段階で５０から１５０ｍｍｏｌ／Ｌとなるカオトロピックイオンを含むものであることを特徴とする（１）又は（２）の分析方法。
（４）一定量の試料を採取する試料導入部、イオン交換カラムを備えるイオン交換クロマトグラフ部、イオン交換クロマトグラフ部からの溶出液の一部又は全部を試薬と混合する試薬混合部、逆相カラムを備える逆相クロマトグラフ部、逆相クロマトグラフ部からの溶出液について検出を行う検出部、及び、試料導入部で採取した試料及びイオン交換クロマトグラフ用の溶離液を送液する送液部、試薬を送液する送液部、イオン交換クロマトグラフ部からの溶出液と試薬とが混合された液を送液する送液部、及び、逆相クロマトグラフ用の溶離液を送液する送液部を備える分析装置。
【００１４】
また我々は、上記分析方法や分析装置を利用し、酸化ストレスとの関連性が高い疾患である糖尿病２０例および心筋梗塞１７例、対象として健常人２０例の血清を測定した結果、以下のとおりのαトコフェロール／コレステロールを指標とする糖尿病の病態、冠動脈疾患のリスク、心筋梗塞の病態といった各種病態を判定する方法を見出すに至った。
【００１５】
（５）超低比重型リポ蛋白（ＶＬＤＬ）中のγトコフェロール／コレステロール値を用いる糖尿病の病態の判定方法。
（６）超低比重型リポ蛋白（ＶＬＤＬ）中のγトコフェロール／コレステロール値が、健常人の平均値に比べ低い場合は糖尿病の病態を有すると判定し、健常人の平均値に比べ低くない場合は糖尿病の病態を有しないと判定する、（５）の方法。
【００１６】
（７）超低比重型リポ蛋白（ＶＬＤＬ）中のγトコフェロール／コレステロール値を用いる冠動脈疾患のリスクの判定方法。
（８）超低比重型リポ蛋白（ＶＬＤＬ）コレステロール値が健常人の平均値に比べ低い場合において、超低比重型リポ蛋白（ＶＬＤＬ）中のγトコフェロール／コレステロール値が、健常人の平均値に比べ低い場合は冠動脈疾患のリスクを有すると判定し、健常人の平均値に比べ低くない場合は冠動脈疾患のリスクを有しないと判定する、（７）の方法。
【００１７】
（９）低比重型リポ蛋白（ＬＤＬ）中のαトコフェロール／コレステロール値を用いる糖尿病の病態の判定方法。
（１０）低比重型リポ蛋白（ＬＤＬ）中のαトコフェロール／コレステロール値が、健常人の平均値に比べ高い場合は糖尿病の病態を有すると判定し、健常人の平均値に比べ高くない場合は糖尿病の病態を有しないと判定する、（９）の方法。
【００１８】
（１１）低比重型リポ蛋白（ＬＤＬ）中のαトコフェロール／コレステロール値を用いる心筋梗塞の病態の判定方法。
（１２）低比重型リポ蛋白（ＬＤＬ）中のαトコフェロール／コレステロール値が、健常人の平均値に比べ高い場合は心筋梗塞の病態を有すると判定し、健常人の平均値に比べ高くない場合は心筋梗塞の病態を有しないと判定する、（１１）の方法。
【００１９】
（１３）超低比重型リポ蛋白（ＶＬＤＬ）中のαトコフェロール／コレステロール値を用いる糖尿病の病態の判定方法。
（１４）超低比重型リポ蛋白（ＶＬＤＬ）中のαトコフェロール／コレステロール値が、健常人の平均値に比べ低い場合は糖尿病の病態を有すると判定し、健常人の平均値に比べ低くない場合は糖尿病の病態を有しないと判定する、（１３）の方法。
【００２０】
（１５）超低比重型リポ蛋白（ＶＬＤＬ）中のαトコフェロール／コレステロール値を用いる冠動脈疾患のリスクの判定方法。
（１６）超低比重型リポ蛋白（ＶＬＤＬ）コレステロール値が健常人の平均値に比べ低い場合において、超低比重型リポ蛋白（ＶＬＤＬ）中のαトコフェロール／コレステロール値が、健常人の平均値に比べ低い場合は冠動脈疾患のリスクを有すると判定し、健常人の平均値に比べ低くない場合は冠動脈疾患のリスクを有しないと判定する、（１５）の方法。
【００２１】
（１７）血液中のγトコフェロール／αトコフェロール比を用いる糖尿病の病態の判定方法。
（１８）血液中のγトコフェロール／αトコフェロール比の値が、健常人の平均値に比べ低い場合は糖尿病の病態を有すると判定し、健常人の平均値に比べ低くない場合は糖尿病の病態を有しないと判定する、（１７）の方法。
【００２２】
好ましくは、上記（５）〜（１８）の方法は、上記（１）〜（３）のいずれかの方法又は上記（４）の装置を用い、行われる。
【００２３】
ここでいう、「健常人の平均値に比べ低い」とは、例えば測定したαトコフェロール／コレステロール値が健常人の平均値に比べ、１０％低い、好ましくは２０％低い、より好ましくは３０％低い、尚より好ましくは５０％低いことを意味する。
【００２４】
また、ここでいう、「健常人の平均値に比べ高い」とは、例えば測定したαトコフェロール／コレステロール値が健常人の平均値に比べ、１０％高い、好ましくは２０％高い、より好ましくは３０％高い、尚より好ましくは５０％高いことを意味する。
【００２５】
なお、各リポ蛋白中のビタミンＥ濃度（γおよびαトコフェノール）およびすべてのリポ蛋白中の総ビタミンＥ濃度は、そのリポ蛋白の抗酸化能力を見ることが主たる目的であるので、リポ蛋白の粒子当りのビタミンＥの量を見る必要がある。我々は、リポ蛋白における比較的量の多い含有成分であるコレステロール値により割ることで、リポ蛋白当りのビタミンＥ量を換算することにした。なお、コレステロールにより割る補正方法は、一般的に用いられている（Ｈａｉｄａｒｉ  Ｍら（２００１）前掲；Ｆｅｋｉ  Ｍら（２０００）前掲；Ｙｏｌａｎｄａ  Ｂら（１９９７）前掲）。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明の分析装置の第一の例を示す。
【図２】本発明の分析装置の第二の例を示す。
【図３】本発明の分析装置の第三の例を示す。
【図４】実施例１のイオン交換クロマトグラフの分析装置の構成を示す図。
【図５】イオン交換クロマトグラフによる血清試料の分析結果を示す。
【図６】イオン交換クロマトグラフによるＨＤＬ試料の分析結果を示す。
【図７】イオン交換クロマトグラフによるＬＤＬ試料の分析結果を示す。
【図８】イオン交換クロマトグラフによるＩＤＬ試料の分析結果を示す。
【図９】イオン交換クロマトグラフによるＶＬＤＬ試料の分析結果を示す。
【図１０】イオン交換クロマトグラフによるＣＭ試料の分析結果を示す。
【図１１】実施例２の逆相クロマトグラフの分析装置の構成を示す図。
【図１２】逆相クロマトグラフおよび電気化学検出によるビタミンＥ標準試料の分析結果を示す。
【図１３】逆相クロマトグラフおよび蛍光検出によるビタミンＥ標準試料の分析結果を示す。
【図１４】逆相クロマトグラフおよび電気化学検出によるＨＤＬ試料の分析結果を示す。
【図１５】逆相クロマトグラフおよび蛍光検出によるＨＤＬ試料の分析結果を示す。
【図１６】逆相クロマトグラフおよび電気化学検出によるＬＤＬ試料の分析結果を示す。
【図１７】逆相クロマトグラフおよび蛍光検出によるＬＤＬ試料の分析結果を示す。
【図１８】逆相クロマトグラフおよび電気化学検出によるＩＤＬ試料の分析結果を示す。
【図１９】逆相クロマトグラフおよび蛍光検出によるＩＤＬ試料の分析結果を示す。
【図２０】逆相クロマトグラフおよび電気化学検出によるＶＬＤＬ試料の分析結果を示す。
【図２１】逆相クロマトグラフおよび蛍光検出によるＶＬＤＬ試料の分析結果を示す。
【図２２】逆相クロマトグラフおよび電気化学検出によるＣＭ試料の分析結果を示す。
【図２３】逆相クロマトグラフおよび蛍光検出によるＣＭ試料の分析結果を示す。
【図２４】電気化学検出によるＨＤＬの中のビタミンＥの分析結果を示す。
【図２５】蛍光検出によるＨＤＬの中のビタミンＥの分析結果を示す。
【図２６】電気化学検出によるＬＤＬの中のビタミンＥの分析結果を示す。
【図２７】蛍光検出によるＬＤＬの中のビタミンＥの分析結果を示す。
【図２８】電気化学検出によるＩＤＬの中のビタミンＥの分析結果を示す。
【図２９】蛍光検出によるＩＤＬの中のビタミンＥの分析結果を示す。
【図３０】電気化学検出によるＶＬＤＬの中のビタミンＥの分析結果を示す。
【図３１】蛍光検出によるＶＬＤＬの中のビタミンＥの分析結果を示す。
【図３２】電気化学検出によるＣＭの中のビタミンＥの分析結果を示す。
【図３３】蛍光検出によるＣＭの中のビタミンＥの分析結果を示す。
【図３４】電気化学検出によるＨＤＬの中のビタミンＥの分析結果を示す。
【図３５】蛍光検出によるＨＤＬの中のビタミンＥの分析結果を示す。
【図３６】電気化学検出によるＬＤＬの中のビタミンＥの分析結果を示す。
【図３７】蛍光検出によるＬＤＬの中のビタミンＥの分析結果を示す。
【図３８】電気化学検出によるＩＤＬの中のビタミンＥの分析結果を示す。
【図３９】蛍光検出によるＩＤＬの中のビタミンＥの分析結果を示す。
【図４０】電気化学検出によるＶＬＤＬの中のビタミンＥの分析結果を示す。
【図４１】蛍光検出によるＶＬＤＬの中のビタミンＥの分析結果を示す。
【図４２】電気化学検出によるＣＭの中のビタミンＥの分析結果を示す。
【図４３】蛍光検出によるＣＭの中のビタミンＥの分析結果を示す。
【図４４】ＨＤＬ中のγトコフェロール／コレステロール値を示す。
【図４５】ＬＤＬ中のγトコフェロール／コレステロール値を示す。
【図４６】ＩＤＬ中のγトコフェロール／コレステロール値を示す。
【図４７】ＶＬＤＬ中のγトコフェロール／コレステロール値を示す。
【図４８】ＶＬＤＬ中のγトコフェロール／コレステロール値とＶＬＤＬコレステロールとの関連性を示す。
【図４９】ＶＬＤＬコレステロールとＶＬＤＬ中のγトコフェロール値とが関連性を有しないことを示す。
【図５０】ＣＭ中のγトコフェロール／コレステロール値を示す。
【図５１】血液中のγトコフェロール／コレステロール値を示す。
【図５２】ＨＤＬ中のαトコフェロール／コレステロール値を示す。
【図５３】ＬＤＬ中のαトコフェロール／コレステロール値を示す。
【図５４】ＩＤＬ中のαトコフェロール／コレステロール値を示す。
【図５５】ＶＬＤＬ中のαトコフェロール／コレステロール値を示す。
【図５６】ＶＬＤＬ中のαトコフェロール／コレステロール値とＶＬＤＬコレステロールとの関連性を示す。
【図５７】ＶＬＤＬコレステロールとＶＬＤＬ中のαトコフェロール値とが関連性を有しないことを示す。
【図５８】ＣＭ中のαトコフェロール／コレステロール値を示す。
【図５９】血液中のαトコフェロール／コレステロール値を示す。
【図６０】血液中のγトコフェロール値の比較を示す。
【図６１】血液中のαトコフェロール値の比較を示す。
【図６２】血液中のγトコフェロール／αトコフェロール値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
リポ蛋白は血中（血清中）に含まれる。本発明は、血液試料について適用される分析方法であるが、狭義の血液を試料とすることに限定されず、例えば血清、血漿、血液や血清から取得したリポ蛋白画分又は該画分を例えば濃縮等した後に適当な溶液に懸濁した懸濁溶液など、リポ蛋白を含む試料に対して適用することができる。本発明で分析対象となるビタミンＥ類は、主としてαトコフェロールとγトコフェロールである。
【００２８】
本発明における２つのクロマトグラフ工程は、いずれも、各クロマトグラフで使用する分離剤をカラムに充填して実施することが好ましい。本発明では、試料をまずイオン交換クロマトグラフに供し、各リポ蛋白を分離する。イオン交換クロマトグラフは、分離能が高く、種々のリポ蛋白を精密に分離できるものであるが、そこで使用する分離剤（イオン交換体）は、リポ蛋白の分離能が陽イオン交換体に勝る陰イオン用の分離剤（陰イオン交換体）が特に好適である。イオン交換クロマトグラフにおける、使用する分離剤の量（イオン交換容量）、溶離液の組成、溶離液の流速等の諸条件は、分析に供する試料の種類、量に応じ、後述する実施例で採用した条件や種々の予備検討を実施して、各リポ蛋白を分離し異なる画分として回収できるように適宜決定する。
【００２９】
イオン交換クロマトグラフにおいて使用する溶離液には、実施例にも示したように、カオトロピックイオンを加えることが好ましい。カオトロピックイオンの蛋白変性作用により、リポ蛋白粒子表面にあるアポ蛋白の高次構造を緩ませ、後述する前処理液との反応の際に、界面活性剤によるリポ蛋白粒子の破壊とビタミンＥ類の遊離の効率を高めることができるからである。カオトロピックイオンとしては、過塩素酸イオン、尿素、グアニジン、チオシアン酸イオン、ヨウ素イオンなどを例示することができる。添加濃度は各イオンのカオトロピック作用の強弱により異なるが、過塩素酸イオンやチオシアン酸イオンでは、試料と混合された場合に５０〜１５０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは５０ｍｍｏｌ／Ｌとなる濃度である。
【００３０】
なお、高濃度のカオトロピックイオン（過塩素酸イオンやチオシアン酸イオンであれば３００ｍｍｏｌ／Ｌ以上）が溶離液に添加されていると、アポ蛋白の高次構造が完全に破壊されてしまい、結果的にリポ蛋白の構造も壊れるために、イオン交換クロマトグラフによる各リポ蛋白の分離に支障をきたすおそれが生じる。そこで、高濃度のカオトロピックイオンを使用する場合には、イオン交換クロマトグラフによって各リポ蛋白を分離した後、各画分に対して高濃度のカオトロピックイオンを添加して反応させるか、イオン交換クロマトグラフにおける溶離液には低濃度のカオトロピックイオンを添加しておき、前記画分に対して追加的にカオトロピックイオンを添加することが好ましい。
【００３１】
イオン交換クロマトグラフでは、試料中のリポ蛋白を分離剤にいったん吸着させた後、塩濃度の異なる溶離液をステップ又はグラジエントで供することにより、電荷の差に基づいて各リポ蛋白をステップ溶出又はグラジエント溶出させ、ステップ溶出の場合には、溶出液を例えばステップごとに画分を回収し、グラジエント溶出の場合には、例えば溶出液を一定容量毎に画分を回収する。続いて回収した全画分に対して前処理液一定の容量比で加えるか、又は回収した画分からリポ蛋白を含む画分を選択後、選択された画分に対して前処理液を一定の容量比で加え、リポ蛋白質と反応させる。リポ蛋白と前処理液の反応は、単に両者を混合して放置するのみで良い。
【００３２】
前処理液は、ビタミンＥ類を溶解するための有機溶媒と、リポ蛋白粒子を壊してビタミンＥ類を遊離させるための界面活性剤を含むが、それ以外にも、ビタミンＥ類の酸化を防止するためアスコルビン酸等の還元剤や、特にイオン交換クロマトグラフにおける溶離液にカオトロピックイオンが添加されていない場合には、前処理液にカオトロピックイオンを含むことが好ましい。カオトロピックイオンは、界面活性剤とともに、その蛋白変性作用によりリポ蛋白粒子表面にあるアポ蛋白の高次構造を変性させて、リポ蛋白粒子が壊される効率を高めるともに、リポ蛋白画分に含まれる種々のタンパク質が有機溶媒と接触して不溶化するのを防止して、後述する逆相クロマトグラフに供する前に遠心分離操作や微細なフィルターでろ過して蛋白質に起因する不溶化物を除去する操作を省くためである。むろん、イオン交換クロマトグラフにおける溶離液にカオトロピックイオンが添加されている場合であっても、前処理液へのカオトロピックイオンの添加が妨げられることはない。リポ蛋白を含む画分に対する前処理液の混合量は、イオン交換カラムから溶出するリポ蛋白画分が希釈されすぎると後の逆相クロマトグラフにおける検出感度が低下するおそれがあり、また、前処理液に含まれる界面活性剤の濃度によっては、混合量を多くすると気泡が生じるおそれがあることから、画分の量に対して１／５〜５倍量とすることが好ましく、より好ましくは１／２〜２倍量とする。
【００３３】
カオトロピックイオンとしては、過塩素酸イオン、尿素、グアニジン、チオシアン酸イオン、ヨウ素イオンなどを例示することができる。その濃度はイオンのカオトロピック作用の強弱により異なるが、過塩素酸イオンやチオシアン酸イオンでは、リポ蛋白と反応させる段階、即ちリポ蛋白を含む画分と混合した場合に５０〜１５０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは５０ｍｍｏｌ／Ｌとなる濃度である。有機溶媒は、ビタミンＥ類を溶解し得るものであれば特に制限はないが、エタノール、アセトニトリル、メタノール、イソプロパノール又はアセトンから選ばれる１種以上を例示することができる。その濃度は有機溶媒の種類により異なるが、エタノールではリポ蛋白を含む画分と混合した場合に１０〜５０％、より好ましくは２５％となる濃度である。界面活性剤は、単独で又はカオトロピックイオンとともにリポ蛋白を壊し、ビタミンＥ類を遊離させ得るものであれば特に制限はないが、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、Ｐｏｌｙ（Ｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ）ｓｏｒｂｉｔａｎ  ｍｏｎｏｌａｕｌａｔｅ（Ｔｗｅｅｎ  ２０）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｂｒｉｊ  ３５又はデオキシコール酸から選ばれる１種以上を例示することができる。その濃度は界面活性剤の種類によって異なるが、本発明者の検討によれば、ＳＤＳでは、リポ蛋白を含む画分と混合した場合に６．９〜２０８ｍｍｏｌ／Ｌ（重量％では、０．２〜６．０％）、好ましくは１００ｍｍｏｌ／Ｌ（重量％では２．９％）となる濃度である。前処理液中の有機溶媒、界面活性剤、そして好ましく含まれるカオトロピックイオンの濃度に関する上記開示は参考のためのものであり、実際に選択した有機溶媒、界面活性剤そしてカオトロピックイオンの種類により変更が必要な場合があり得る。従って、本発明に基づくビタミンＥ類の分析に際しては、前処理液に含まれる各成分の濃度について最適範囲を予備的に検討しておくことが好ましい。
【００３４】
前処理液との反応によってリポ蛋白から遊離したビタミンＥ類を、リポ蛋白を含む画分と前処理液の混合液として逆相クロマトグラフに供する。ビタミンＥ類の分析自体はガスクロマトグラフ、薄層クロマトグラフ、ＮＭＲ等により実施可能であるが、イオン交換クロマトグラフにより各リポ蛋白画分を分離して溶出させる際、塩を含む溶離液を使用することから、本発明は、塩類を含む被分析物を精度良く分析できる逆相クロマトグラフを採用するものである。前記の前処理液と混合した試料を有機溶媒が含まれる溶離液を用いて逆相クロマトグラフに供することにより、ビタミンＥ類を分離して溶出させ、溶出液を検出器で検出して各ビタミンＥ類を分析する。逆相クロマトグラフにおける、使用する分離剤の量、溶離液の組成、溶離液の流速等の諸条件は、分析に供する試料の種類、量に応じ、後述する実施例で採用した条件や種々の予備検討を実施して適宜決定する。なお、イオン交換クロマトグラフの実施後、逆相クロマトグラフの実施前までに、試料にインターナルコントロールとしてビタミンＥ類の一つであるδトコフェロールを加えることにより、分析精度を向上することができる。δトコフェロールは、ビタミンＥ類の一つであるが、リポ蛋白中の存在量はαトコフェノールの１００分の１程度と非常に少ないため、インターナルコントロールとして使用することができるものである。
【００３５】
ビタミンＥ類の検出には紫外吸収検出器、質量検出器、蛍光検出器、アンペロメトリック電気化学検出器又はクーロメトリック電気化学検出器等を用いることができるが、十分な検出感度を有し、メンテナンス等の維持作業の容易さから、蛍光検出器、アンペロメトリック電気化学検出器又はクーロメトリック電気化学検出器が好適である。
【００３６】
次に、本発明の分析装置について、図１から図３に基づいて詳細に説明する。図１の装置では、試料導入部はオートサンプラー２と配管から構成され、イオン交換クロマトグラフ部はイオン交換カラム１と配管から構成され、イオン交換クロマトグラフ部からの溶出液を試薬と混合する試薬混合部は混合器１０とその直前（上流側）に接続された分岐配管２２から構成され、逆相クロマトグラフ部は逆相カラム１３と配管から構成され、逆相クロマトグラフ部からの溶出液について検出を行う検出部は蛍光検出器１４及びアンペロメトリック検出器１５と配管から構成され、試料及びイオン交換クロマトグラフ用の溶離液を送液する送液部は溶離液の混合装置３、送液用ポンプ４と５及び配管から構成され、試薬を送液する送液部は送液ポンプ８で構成され、逆相クロマトグラフ用の溶離液を送液する送液部はポンプ１６と１７及び配管で構成されている。なおこの例では、イオン交換クロマトグラフ部からの溶出液と試薬とが混合された液の送液は、専用の送液ポンプを使用するのではなく、六方切り替えバルブ１１を利用することにより逆相クロマトグラフ用溶離液の送液ポンプ１６及び／又は１７で兼用している（図２の例では、２個の三方切り替えバルブ２０及び２１を利用することにより、試薬送液用の送液ポンプ８並びに逆相クロマトグラフ用溶離液の送液ポンプ１６及び／又は１７、そして図３の例では、六方切り替えバルブ１１を利用することにより試薬送液用の送液ポンプ８並びに逆相クロマトグラフ用溶離液の送液ポンプ１６及び／又は１７と兼用）。
【００３７】
試料は別途試料容器に保持された状態で試料導入部に搬入される。一方、イオン交換クロマトグラフ用の溶離液は別途溶離液容器６及び７に保持された状態で配管によりポンプ４又は５と接続され、イオン交換クロマトグラフ部からの溶出液と混合される試薬は試薬容器９に保持された状態でポンプ８と接続され、逆相クロマトグラフ用の溶離液は別途溶離液１８及び１９に保持された状態で配管によりポンプ１６又は１７と接続される。イオン交換クロマトグラフ部からの溶出液のうち、逆相クロマトグラフ部に供されたもの以外、及び、検出部での検出を終えた溶出液は、廃液として適当な廃液容器に廃棄される。
【００３８】
試料導入部は、試料導入部の所定場所に搬入された試料容器等から自動的に一定量の試料を採取し得るものであれば特に制限はなく、例えば、ＡＳ−８０２０（商品名、東ソー(株)製）など、通常使用されているオートサンプラーを使用することができる。また試料導入部には、試料容器を前記所定場所に自動的に搬入する装置を付加しても良い。
【００３９】
イオン交換クロマトグラフ部が備えるイオン交換カラム１は、各リポ蛋白質を分離できるものであれば制限はなく、例えばＤＥＡＥ−ＮＰＲ、ＤＥＡＥ−５ＰＷ、ＳＰ−ＮＰＲ（いずれも商品名、東ソー(株)製）などを使用することができる。上述したように、特に陰イオン交換カラム（例えばＤＥＡＥ−ＮＰＲ（商品名、東ソー(株)製））を使用することが好ましい。一方、逆相クロマトグラフ部が備える逆相カラム１３は、ビタミンＥ類を分離できるものであれば制限はなく、例えばＯＤＳ−８０Ｔｓ（商品名、東ソー(株)製）などを使用することができる。
【００４０】
逆相クロマトグラフによる一回の分析には、一定の時間が必要である。後の実施例に示したように、一回の分析に４０分程度を要する場合には、イオン交換クロマトグラフによって溶出した任意のリポ蛋白溶出画分について逆相カラムでの分析が完了する前に、イオン交換クロマトグラフから他のリポ蛋白が溶出することになる。従って、逆相カラムとしては、マイクロカラムのような、分析に要する時間を短縮できるカラムを使用し、イオン交換クロマトグラフから溶出する各リポ蛋白画分を、順次逆相クロマトグラフに供するようにすることが好ましい。もっとも、実施例に示したように、あるリポ蛋白の溶出画分についての逆相カラムでの分析完了をまって、同一試料を再度イオン交換クロマトグラフに供し、他のリポ蛋白溶出画分を取得して逆相カラムに供する、というシークエンスを繰り返すことにより、各リポ蛋白中のビタミンＥ類を分析することが可能である。
【００４１】
試薬混合部は、イオン交換クロマトグラフ部からの溶出液の一部又は全部を試薬と混合できるように構成すれば良い。本例では、イオン交換クロマトグラフ部からの溶出液の全部に対して試薬を混合し、その一部のみを切り替えバルブ１１で採取して逆相クロマトグラフ部に送液するように操作することもできるが、試薬消費量を節約するために、その一部に対して試薬を混合するように構成している。即ち、イオン交換カラムからの各リポ蛋白の溶出時間は、クロマトグラフ条件が一定であれば予想し得るものであるから、その予想時間に合わせてポンプ８による試薬の送液を行い、それ以外の時間には送液を停止するようにしている。試薬の混合は、例えば、試薬が送液される配管をイオン交換クロマトグラフ部からの溶出液が送液される配管と単に合流させるのみでも良いが、本例のように、合流後に例えばスタティックミキサーＢ（商品名、東ソー(株)製）のような混合装置を用いて混合したり、また例えば、合流後に配管内径が太い配管を通過させ、ここで流速を低下させて両者の混合が図れるようにしたり、また例えば、内壁に凹凸を形成した配管や内径が変化する配管を使用する等しても良い。
【００４２】
検出部は、ビタミンＥ類の検出が可能な検出器を使用すれば制限はなく、例えば紫外吸収検出器、質量検出器、蛍光検出器、アンペロメトリック電気化学検出器又はクーロメトリック電気化学検出器等を例示することができるが、十分な検出感度を有し、メンテナンス等の維持作業の容易さから、上記例でも使用した蛍光検出器やアンペロメトリック電気化学検出器、そしてクーロメトリック電気化学検出器が好適である。
【００４３】
試料及びイオン交換クロマトグラフ用の溶離液を送液する送液部は、塩濃度の異なる溶離液６及び７を使用し、送液ポンプ４及び５の駆動をコンピューター等で制御してその送液量を制御すれば、イオン交換カラム１に異なる組成（塩濃度）の溶離液をステップ又はグラジエントのいずれのモードでも供することが可能である。なお混合装置３は、溶離液６及び７を混合するためのものである。送液ポンプ４及び５は例えばＤＰ−８０２０（商品名、東ソー(株)製）等を使用することができ、混合装置３は例えばスタティックミキサーＣ（商品名、東ソー(株)製）を使用することができる。
【００４４】
試薬を送液する送液部や逆相クロマトグラフ用の溶離液を送液する送液部は、例えばＤＰ−８０２０（商品名、東ソー(株)製）のようなポンプを使用することができる。なお本例では、六方切り替えバルブ１１を使用することにより、イオン交換クロマトグラフ部からの溶出液と試薬とが混合された液と逆相クロマトグラフ用溶離液の送液のための送液部を簡略化したが、例えば図２に示したように、三方切り替えバルブ２０及び２１を使用することも例示できる。
【００４５】
図１の装置によるビタミンＥ類の分析では、まず、オートサンプラー２で採取された一定量の試料をイオン交換クロマトグラフ用の溶離液とともにポンプ４及び／又は５で送液してイオン交換カラム１に供し、試料中のリポ蛋白をカラムに保持させる。引き続き、同一の溶離液を任意量送液した後、ポンプ４及び５の送液量を制御してカラムに供する溶離液の塩濃度を高くし、カラムに保持された各リポ蛋白を分離して溶出させる。溶出した各リポ蛋白の画分に対しては、ポンプ８により試薬（前処理液）９を送液して混合する。前処理液９の送液量は、イオン交換カラムから溶出するリポ蛋白画分が希釈されすぎると後の逆相クロマトグラフにおける検出感度が低下するおそれがあり、また、前処理液に含まれる界面活性剤の濃度によっては、送液量を多くすると気泡が生じて送液不良となるおそれがあることから、イオン交換カラムに対する溶離液の送液量に対して１／５〜５倍量、特に１／２〜２倍量とすると良い。
【００４６】
前処理液との混合によりリポ蛋白から遊離したビタミンＥ類を、続いて逆相カラム１３に供する。六方流路切り替えバルブ１１を操作して流路を切り替えることで、送液ポンプ８により前処理液と混合されたリポ蛋白画分をサンプルループ１２に導入し、更に六方切り替えバルブ１１を操作して流路を切り替えることにより、送液ポンプ１６及び／又は１７により混合液を逆相カラムに供する。なおサンプルループ１２は、逆相カラムに導入すべき混合液の容量とする。ビタミンＥ類を逆相カラム１３に供するにあたり、図２に示したように、２つの三方の切り替えバルブ２０及び２１を組み合わせて使用する場合には、イオン交換カラムからのリポ蛋白画分の溶出開始から終了までの間、三方切り替えバルブ２０を操作して流路を切り替えることにより混合液を逆相カラム１３に導入し、三方切り替えバルブ２１を操作して流路を切り替えることにより溶離液１８及び／又は１９を廃棄（Ｗａｓｔｅ）するように制御すれば良い。図３のように、サンプルループを備えない六方切り替えバルブを使用する場合には、イオン交換カラムからのリポ蛋白画分の溶出開始から終了までの間、六方切り替えバルブ１１を切り替えることにより混合液が逆相カラム１３に導入されるように制御すれば良い。逆相カラムから溶出するビタミンＥ類は、それぞれ蛍光検出器１４及びアンペロメトリック検出器１５により検出される。
【００４７】
以上に説明したように、ビタミンＥ類の分析装置として構成した図１乃至３の分析装置は、試料導入部に試料容器を所定場所に自動的に搬入する装置と、各部を制御するコンピューター等を付加すれば、試料を容器に入れて搬入装置に載置等するのみで、自動的にリポ蛋白中のビタミンＥ類を分析することが可能である。
【００４８】
そして、以下の実施例により示すとおり、上記分析方法や分析装置を利用した結果、αトコフェロール／コレステロールを指標とすることで、糖尿病の病態、冠動脈疾患のリスク、心筋梗塞の病態といった各種病態を判定することが可能となった。
【実施例】
【００４９】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、実施例は本発明の一形態を示すものであり、本発明を限定するものではない。
【００５０】
実施例１
以下の構成の分析装置（図４）を作製した。
イオン交換クロマトグラフ用カラム１；ＤＥＡＥ−ＮＰＲ（商品名、東ソー(株)製）、４．６ｍｍＩＤ×３５ｍｍを２本直列に連結
試料導入部２；ＡＳ−８０２０（商品名、東ソー(株)製）
混合装置３；スタティックミキサーＣ（商品名、東ソー(株)製）
送液ポンプ４及び５；ＤＰ−８０２０（商品名、東ソー(株)製）
溶離液Ａ６；５０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス＋１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ２Ｎａ、ｐＨ７．５
溶離液Ｂ７；５０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス＋１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ２Ｎａ＋過塩素酸ナトリウム  ３００ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．５
イオン交換クロマトグラフの流速；０．５ｍｌ／ｍｉｎ
イオン交換クロマトグラフの溶出条件
；０分から０．０５分は溶離液Ｂ１０％、溶離液Ａ９０％
；０．０５分から５分は溶離液Ｂ３８％、溶離液Ａ６２％
；５分から１１分は溶離液Ｂ４４％、溶離液Ａ５６％
；１１分から１６分は溶離液Ｂ４９％、溶離液Ａ５１％
；１６分から２１分は溶離液Ｂ５６％、溶離液Ａ４４％
；２１分から２９分は溶離液Ｂ１００％、溶離液Ａ０％
；２９分から４０分は溶離液Ｂ１０％、溶離液Ａ９０％
分離に要した時間；４５分／検体
【００５１】
上記装置によるリポ蛋白質の分離を試験した。高脂血症を呈した者から、インフォームドコンセントを得て採取した血清（総コレステロール値１５９ｍｇ／ｄＬ、中性脂肪４９２ｍｇ／ｄＬ）をイオン交換クロマトグラフに供して分離した画分と、別途同一血清を超遠心分離法によりＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭに分離したリポ蛋白画分に対して、９０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス＋８０ｍｍｏｌ／Ｌ  ホウ酸＋３ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ２Ｎａ、ｐＨ９．６の緩衝液にＰａｒｉｎａｒｉｃ  ａｃｉｄ（疎水的な物に吸着し蛍光を発する試薬）を１．４ｎｇ／ｍＬ濃度となるように添加したラベル試薬を流速０．１５ｍＬ／ｍｉｎで混合してからＦＳ−８０２０（商品名、東ソー(株)製蛍光検出器、３２４ｎｍ、蛍光波長４１３ｎｍ）で検出した。
【００５２】
血清試料を上記装置で分離したものについての結果を図５に、血清試料から超遠心分離法により調製したものについての結果を図６〜１０に示す。ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭが良好に分離されたこと、及び、精製品の分析結果（結果は示していない）との比較からアルブミンや遊離脂肪酸（ｆｒｅｅ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ）はＨＤＬと同じ位置に溶出していることが確認できた。
【００５３】
実施例２
以下の構成の分析装置（図１１）を作製し、前処理液の有機溶媒、界面活性剤、カオトロピックイオンについて試験を行った。
【００５４】
逆相クロマトグラフ用カラム１３；ＯＤＳ−８０Ｔｓ（商品名、東ソー(株)製）、４．６ｍｍＩＤｘ１５０ｍｍ
試料導入部２；ＡＳ−８０２０（商品名、東ソー(株)製）
検出器１４；ＦＳ−８０２０（商品名、東ソー(株)製蛍光検出器）、励起波長２９８ｎｍ、蛍光波長３２５ｎｍ
送液ポンプ１６及び１７；ＤＰ−８０２０（商品名、東ソー(株)製）
溶離液Ｃ１８；３０％  エタノール＋２５ｍｍｏｌ／Ｌ  硝酸アンモニウム
溶離液Ｄ１９；８５％  エタノール＋２５ｍｍｏｌ／ｌ  硝酸アンモニウム
流速；１．０ｍｌ／ｍｉｎ
溶出条件；０分から５分は溶離液Ｃ０％、溶離液Ｄ１００％
；５分から１０分は溶離液Ｃ０％、溶離液Ｄ１００％から溶離液Ｃ１００％、
溶離液Ｄ０％にリニアグラディエント
；１０分から３３分は溶離液Ｃ１００％、溶離液Ｄ０％
；３３分から３５分は溶離液Ｃ１００％、溶離液Ｄ０％から溶離液Ｃ０％、溶離液Ｄ１００％にリニアグラディエント
；３５から４５分は溶離液Ｃ０％、溶離液Ｄ１００％
分離に要した時間；４５分／検体
【００５５】
健常人からインフォームドコンセントを得て採取した血清（総コレステロール値２１５ｍｇ／ｄＬ、中性脂肪９７ｍｇ／ｄＬ）の２０μＬを実施例１の装置に供し、０分から８分までの分画をＨＤＬ画分として、８から１３分までの分画をＬＤＬ画分として取得した。この溶出画分を用いて、界面活性剤としてＳＤＳ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ  ２０を、有機溶媒としてエタノール、アセトニトリル、メタノールを用いて検討した。
【００５６】
まず、ＨＤＬ画分試料を用いて検討した（表１〜３）。取得した溶出画分５００μＬに対して前処理液５００μＬを加え、室温下で３秒間混合後、その５００μＬを上記装置に供した。ＳＤＳを混合後の濃度（以下、終濃度とする）が１２．５〜１００ｍｍｏｌ／Ｌとなるように加え、その他にリポ蛋白の安定化を目的としてアスコルビン酸を１０ｍｍｏｌ／Ｌとリン酸を１％加えた前処理液をＨＤＬ画分に加え、装置に供して分析したところ、表１に示したように、ＳＤＳが２５ｍｍｏｌ／Ｌのときに、γトコフェロールとαトコフェロールのどちらも最大のピーク高さが得られた。これにより、この条件により、効率よく逆相クロマトグラフ用カラムの表面に、ビタミンＥ類が回収されたことが分かる。
【００５７】
ＳＤＳが終濃度２５ｍｍｏｌ／Ｌの条件下で、エタノールを終濃度として１２．５〜３５％、アセトニトリルを２５％、メタノールを２５％となるようにして、その他に試料の安定化を目的としてアスコルビン酸を１０ｍｍｏｌ／Ｌとリン酸を１％加えた前処理液をＨＤＬ画分に加え、装置に供して分析したところ、表２に示したように、γトコフェロールはアセトニトリルが２５％の条件が、αトコフェロールはメタノール  ２５％の条件において最大のピーク高さが得られた。このことから、ＳＤＳを使用する場合には、有機溶媒として、γトコフェロールにはアセトニトリル  ２５％が、αトコフェロールにはメタノール  ２５％が最適であることが分かった。
【００５８】
【表１】
0005522237.tif 000002
【００５９】
【表２】
0005522237.tif 000003
【００６０】
界面活性剤をＳＤＳの代わりにＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはＴｗｅｅｎ  ２０とし、終濃度として０．５％となるようにして、エタノールが終濃度として０％又は２５％となるようにした場合は、表２に示したように、γトコフェノールにはエタノールの効果は確認されなかったが、αトコフェロールについては、どちらもエタノールを加えた場合の方が強いピーク高さが得られた。これらのことから、ＳＤＳを使用する場合には、有機溶媒としてアセトニトリル又はメタノールが、αトコフェロールについて分析する場合に、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００やＴｗｅｅｎ  ２０を使用する場合には、エタノールが効果的であることが分かった。
【００６１】
エタノールを終濃度として２５％として、ＳＤＳを終濃度として０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌになるようにして、その他に試料の安定化を目的としてアスコルビン酸を１０ｍｍｏｌ／Ｌとリン酸を１％加えた前処理液をＨＤＬ画分に加え装置に供して分析したところ、表３に示したように、γトコフェロール、αトコフェロールどちらもＳＤＳが５０ｍｍｏｌ／Ｌの条件において最大のピーク高さが得られた。また、ＳＤＳ  ５０ｍｍｏｌ／Ｌでエタノールが０％と２５％の場合を比べて見ると、γトコフェロールとαトコフェロールのどちらもエタノールがある方が強いピーク高さが得られ、ＳＤＳ  ５０ｍｍｏｌ／Ｌの場合のエタノール添加の効果が確認された。
【００６２】
【表３】
0005522237.tif 000004
【００６３】
次に血清を用いて、前処理液中に含まれる過塩素酸ナトリウムの効果を検討した（表４）。ＨＤＬ画分には、イオン交換クロマトグラフで用いた溶離液に由来する過塩素酸ナトリウムが１１４ｍｍｏｌ／Ｌ含まれていることから、過塩素酸ナトリウムの効果を確認した。上記の健常人血清を、実施例１の装置におけるイオン交換クロマトグラフに用いた溶離液Ａ又はＢで希釈し、エタノールの終濃度が２５％又は０％のそれぞれにおいて、ＳＤＳの終濃度が１２５ｍｍｏｌ／Ｌ、エタノールとＳＤＳの終濃度がそれぞれ２５％、ＳＤＳ  ２５ｍｍｏｌ／Ｌとなるように前処理液を加え、装置に供して分析した。なお、試料の安定化を目的としてアスコルビン酸を終濃度として５ｍｍｏｌ／Ｌ加えた。その結果、表４に示したように、すべての条件について、過塩素酸ナトリウムが含まれた場合の方が含まれない場合に比較して強いピーク高さが得られ、更には、エタノール、ＳＤＳ、過塩素酸ナトリウムのすべてが含まれている場合、最大のピーク高さとなった。
【００６４】
【表４】
0005522237.tif 000005
【００６５】
次に、ＬＤＬ画分試料を用いて検討した（表５）。エタノールが終濃度２５％の条件下で、ＳＤＳが終濃度として０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌとなるようにして、ＳＤＳが終濃度として２５ｍｍｏｌ／Ｌの条件下で、アセトニトリルまたはメタノールが終濃度２５％となるようにして、その他に試料の安定化を目的としてアスコルビン酸を１０ｍｍｏｌ／Ｌとリン酸を１％加えた前処理液をＬＤＬ画分に加え、装置に供して分析した（ＬＤＬ試料には、イオン交換クロマトグラフに用いている溶離液由来の過塩素酸ナトリウムが１３２ｍｍｏｌ／Ｌ含まれている）。この結果、ＨＤＬ画分を用いたときの検討結果と同様、表５に示したように、γトコフェロールとαトコフェロールどちらも、ＳＤＳの濃度が高くなるとともにピーク高さが向上し、そして、アセトニトリルが終濃度２５％、ＳＤＳが２５ｍｍｏｌ／Ｌの条件において最大のピーク高さが得られた。
【００６６】
【表５】
0005522237.tif 000006
【００６７】
以上の通り、逆相クロマトグラフに供するリポ蛋白画分を有機溶媒、界面活性剤、カオトロピックイオンを含む前処理液と混合することにより、各画分中のビタミンＥ類を精度よく安定的に分析可能であり、また、前処理液をリポ蛋白画分とともに逆相クロマトグラフに供しても、その分析に影響を与えないことが分かる。
【００６８】
実施例３
高脂血症を呈した者から、インフォームドコンセントを得て採取した血清（総コレステロール値２４２ｍｇ／ｄＬ、中性脂肪４２１ｍｇ／ｄＬ）の２０μＬを実施例１の装置に供し、下記のとおり各リポ蛋白の溶出画分を取得してリポ蛋白質の分離を試験した。
【００６９】
ＨＤＬ画分；０〜８分のフラクション
ＬＤＬ画分；８〜１３分のフラクション
ＩＤＬ画分；１３〜１９分のフラクション
ＶＬＤＬ画分；１９〜２４分のフラクション
Ｃｈｙｌｏｍｉｃｒｏｎ（以下、ＣＭと記す。）画分；２４〜３０分のフラクション
【００７０】
各リポ蛋白溶出画分の５００μＬに、前処理液（エタノール５０％、ＳＤＳ２５０ｍｍｏｌ／Ｌ、アスコルビン酸１０ｍｍｏｌ／Ｌ、リン酸１％、δトコフェロール０．０４μｇ／ｍＬ）５００μＬを加えて混合し、実施例２の装置に供してγトコフェロールとαトコフェロールを分析した。ただし、実施例２の装置における蛍光検出器１４のあとに、アンペロメトリック電気化学検出器（印加電圧６００ｍＶ）をつなぎ、両方の検出器でクロマトグラムを得た。結果を図１２〜２３（奇数番号は蛍光検出のクロマトグラムを、偶数番号は電気化学検出のクロマトグラム）に示す。図１２と１３は前処理液を純水で２倍希釈した溶液を用いて作成した標準試料（δトコフェロール  ０．０２μｇ／ｍＬ、γトコフェロール  ０．１μｇ／ｍＬ、αトコフェロール  ０．１μｇ／ｍＬ）のクロマトグラムであるが、これらから明らかなように、δトコフェロール、γトコフェロール、αトコフェロールの順に溶出し、良好な分析結果が得られた。図１４及び１５はＨＤＬ画分、図１６及び１７はＬＤＬ画分、図１８及び１９はＩＤＬ画分、図２０及び２１にＶＬＤＬ画分、図２２及び２３はＣＭ画分のクロマトグラムを示す。ＣＭ画分では、インターナルコントロールであるδトコフェロールとαトコフェロールの２つのピークが検出され、γトコフェロールが検出されていないが、その他の画分では、δトコフェロール、γトコフェロール、αトコフェロールのすべてのピークが検出された。蛍光検出器のピーク高さから、血清中の各リポ蛋白中のγトコフェロール、αトコフェロールの濃度を算出した結果を表６に示す。算出に当たっては、前処理液に加えたδトコフェロールをインターナルコントロールとして各分析における回収率を算出し、分析結果を補正し、画分の分離及び前処理液による希釈を考慮してある。なお、血清中のγトコフェロール、αトコフェロールの濃度は各リポ蛋白画分の濃度を合計したものである。
【００７１】
【表６】
0005522237.tif 000007
【００７２】
実施例４
高脂血症を呈した者から、インフォームドコンセントを得て採取した血清（総コレステロール値２０３ｍｇ／ｄＬ、中性脂肪２１５ｍｇ／ｄＬ）の２０μＬを下記の装置（図４に示した実施例１の装置構成と同じとし、溶離液組成および溶出条件を変更した）に供し、試料導入時から３４分まで２分間ごとに１７本の溶出画分を取得し、実施例３の装置及び方法により各リポ蛋白中のγトコフェロール、αトコフェロールを分析した。また、それぞれのフラクションのコレステロール濃度をコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを含んだ酵素液（コレステロールＥテスト、商品名、和光純薬(株)製）で測定した。
【００７３】
イオン交換クロマトグラフ用カラム１；ＤＥＡＥ−ＮＰＲ（商品名、東ソー(株)製）、４．６ｍｍＩＤ×３５ｍｍを２本直列に連結
試料導入部２；ＡＳ−８０２０（商品名、東ソー(株)製）
混合装置３；スタティックミキサーＣ（商品名、東ソー(株)製）
送液ポンプ４及び５；ＤＰ−８０２０（商品名、東ソー(株)製）
溶離液Ａ；５０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス＋１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ２Ｎａ＋１００ｍｍｏｌ／Ｌ  チオシアン酸ナトリウム、ｐＨ７．５
溶離液Ｂ；５０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス＋１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ２Ｎａ＋１００ｍｍｏｌ／Ｌ  チオシアン酸ナトリウム＋５００ｍｍｏｌ／Ｌ  硝酸ナトリウム、ｐＨ７．５
イオン交換クロマトグラフの流速；０．５ｍｌ／ｍｉｎ
イオン交換クロマトグラフの溶出条件
；０分から２４分は溶離液Ｂ１０％、溶離液Ａ９０％から溶離液Ｂ５０％、溶離液Ａ５０％へのリニアグラディエント
；２０分から２５分は溶離液Ｂ５０％、溶離液Ａ５０％
；２５分から３０分は溶離液Ｂ１００％、溶離液Ａ０％
；３０分から４０分は溶離液Ｂ１０％、溶離液Ａ９０％
【００７４】
各溶出画分中のγトコフェロール、αトコフェロール、コレステロールの濃度を表７に示す。フラクション６及び７がＨＤＬに、フラクション８及び９がＬＤＬに、フラクション１０及び１１がＩＤＬに、フラクション１２及び１３がＶＬＤＬに、フラクション１３及び１４がＣＭに相当する。このように、イオン交換クロマトグラフでリポ蛋白をリニアグラディエント溶出した場合でも、良好なリポ蛋白中ビタミンＥ類の分析を行うことが可能であった。
【００７５】
【表７】
0005522237.tif 000008
【００７６】
実施例５
図１に示した本発明の分析装置として、具体的に以下の装置を作製した。高脂血症を呈した者からインフォームドコンセントを得て採取した血清（総コレステロール値２０３ｍｇ／ｄＬ、中性脂肪２１５ｍｇ／ｄＬ）の２０μＬをこの装置に供し、ビタミンＥ類を分析した。なお、本例では一回の試料導入により各リポ蛋白中のビタミンＥ類を測定するのではなく、合計５回の試料導入を行うことにより、各一つのリポ蛋白中のビタミンＥ類を分析したものである。
【００７７】
イオン交換クロマトグラフ用カラム１；ＤＥＡＥ−ＮＰＲ（商品名、東ソー(株)製）、４．６ｍｍＩＤ×３５ｍｍを２本直列に連結
試料導入部２；ＡＳ−８０２０（商品名、東ソー(株)製）
混合装置３；スタティックミキサーＣ（商品名、東ソー(株)製）
送液ポンプ４及び５；ＤＰ−８０２０（商品名、東ソー(株)製）
溶離液Ａ６；５０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス＋１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ２Ｎａ、ｐＨ７．５
溶離液Ｂ７；５０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス＋１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ２Ｎａ＋過塩素酸ナトリウム  ３００ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．５
イオン交換クロマトグラフの流速；０．５ｍｌ／ｍｉｎ
イオン交換クロマトグラフの溶出条件
；０分から０．０５分は溶離液Ｂ１０％、溶離液Ａ９０％
；０．０５分から５分は溶離液Ｂ３８％、溶離液Ａ６２％
；５分から１１分は溶離液Ｂ４４％、溶離液Ａ５６％
；１１分から１６分は溶離液Ｂ４９％、溶離液Ａ５１％
；１６分から２１分は溶離液Ｂ５６％、溶離液Ａ４４％
；２１分から２９分は溶離液Ｂ１００％、溶離液Ａ０％
；２９分から４０分は溶離液Ｂ１０％、溶離液Ａ９０％
送液ポンプ８；ＤＰ−８０２０（商品名、東ソー(株)製）
前処理液９；１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＳＤＳ＋５０％  エタノール
混合装置１０；スタティックミキサーＢ（商品名、東ソー(株)製）
前処理液の流速；０．２５ｍｌ／ｍｉｎ
六方切り替えバルブ１１；６方電磁弁
切り替えのタイミング（ＯＦＦからＯＮへの流路の切り替え）
；ＨＤＬ溶出画分については７分から２分間
；ＬＤＬ溶出画分については１１分から２分間
；ＩＤＬ溶出画分については１７分から２分間
；ＶＬＤＬ溶出画分については２２分から２分間
；ＣＭ溶出画分については２７分から２分間
サンプルループ１２の容量；１．５ｍｌ容量
逆相クロマトグラフ用カラム１３；ＯＤＳ−８０Ｔｓ（商品名、東ソー(株)製）、４．６ｍｍＩＤｘ１５０ｍｍ
検出器１４；ＦＳ−８０２０（商品名、東ソー(株)製蛍光検出器）、励起波長２９８ｎｍ、蛍光波長３２５ｎｍ
検出器１５；ＥＣ−８０２０（商品名、東ソー(株)製アンペロメトリック電気化学検出器、印加電圧６００ｍＶ）
送液ポンプ１６及び１７；ＤＰ−８０２０（商品名、東ソー(株)製）
溶離液Ｃ１８；３０％  エタノール＋２５ｍｍｏｌ／Ｌ  硝酸アンモニウム
溶離液Ｄ１９；８５％  エタノール＋２５ｍｍｏｌ／ｌ  硝酸アンモニウム
逆相クロマトグラフの流速；１．０ｍｌ／ｍｉｎ
逆相クロマトグラフの溶出条件
；当初は溶離液Ｃ１００％、Ｄ０％
；切り替えバルブ１１がＯＮになってから５分後に溶離液Ｃ１００％、Ｄ０％に変更
；切り替えバルブ１１がＯＮになってから３４分後に溶離液Ｃ０％、Ｄ１００％に変更
分析時間；４６分／検体
【００７８】
ＨＤＬ溶出画分の分析結果を図２４及び２５に、ＬＤＬ溶出画分の分析結果を図２６及び２７に、ＩＤＬ溶出画分の分析結果を図２８及び２９に、ＶＬＤＬ溶出画分の分析結果を図３０及び３１に、そしてＣＭ溶出画分の分析結果を図３２及び３３に示す。なお、各図は、偶数番号が電気化学検出のクロマトグラム、奇数番号が蛍光検出のクロマトグラムを示す。各図から明らかなように、各リポ蛋白の画分でγトコフェロールとαトコフェロールが良好に検出された。
【００７９】
実施例６
前処理液の組成を５０ｍｍｏｌ／Ｌ  過塩素酸ナトリウム＋１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００＋７５％  エタノールとした以外は、実施例５と同一の装置及び方法にて分析を行った。ＨＤＬ溶出画分の分析結果を図３４及び３５に、ＬＤＬ溶出画分の分析結果を図３６及び３７に、ＩＤＬ溶出画分の分析結果を図３８及び３９に、ＶＬＤＬ溶出画分の分析結果を図４０及び４１に、そしてＣＭ溶出画分の分析結果を図４２及び４３に示す。なお、各図は、偶数番号が電気化学検出のクロマトグラム、奇数番号が蛍光検出のクロマトグラムを示す。各図から明らかなように、各リポ蛋白の画分でγトコフェロールとαトコフェロールが良好に検出された。
【００８０】
動脈硬化の危険因子として、酸化したリポ蛋白が注目を浴びている。リポ蛋白に含まれる主要な抗酸化物質は、ビタミンＥ類（主としてαトコフェノールとγトコフェノール）であるが、本発明のリポ蛋白中のビタミンＥ類の分析方法によれば、血液中にある各リポ蛋白中のビタミンＥ類の量を分析することができるから、動脈硬化のメカニズムを理解するうえで重要な知見を得ることが可能になる。動脈硬化とリポ蛋白中のビタミンＥ類の関係が明らかになれば、本発明の分析方法は、動脈硬化の診断や治療効果のモニターにも好適なものである。
【００８１】
また本発明の分析装置は、ビタミンＥ類の分析等を、自動的に、従って短時間に行い得るものであり、しかも自動的な分析であるために誤差を生じる可能性が少ないものである。
【００８２】
イオン交換クロマトグラフを使用してリポ蛋白を分離した後、分離したリポ蛋白を有機溶媒及び界面活性剤を含む前処理液と反応させてビタミンＥ類を遊離させ、次いで遊離したビタミンＥ類を逆相クロマトグラフに供するという構成は、従来技術における、各リポ蛋白を分離した後、ビタミンＥ類を抽出し、乾固濃縮し、再溶解し、そして逆相クロマトグラフに供するという構成と比較して、構成自体簡便であり、しかも誤差を生じる可能性が少ないという特徴を有するものである。詳しくは、従来技術では分離した各リポ蛋白画分のそれぞれについて、手作業でビタミンＥ類を抽出し、乾固濃縮し、そして再溶解する、という、複雑で誤差を生じやすい手作業の工程が必須であったが、本発明ではこの工程を、事前に調製された前処理液を添加・混合して反応させるという、単純な工程で置き換えているからである。
【００８３】
従来の技術では、ビタミンＥ類の抽出、乾固濃縮そして再溶解という工程が複雑でしかも手作業で実施せざるを得ないものであったため、操作を自動化することは困難であった。しかし本発明の分析方法では、イオン交換クロマトグラフ及び逆相クロマトグラフで使用する分離剤をカラムに充填して実施することが可能で、かつ、ビタミンＥ類の抽出、乾固濃縮及び再溶解の工程に代わる、イオン交換クロマトグラフにおける溶出液に対して前処理液を混合するという工程を、イオン交換クロマトグラフの溶出液を逆相クロマトグラフに供する過程で自動的に実施することも可能である。この結果、本発明の分析方法は、一定量の試料を採取する試料導入部、イオン交換カラムを備えるイオン交換クロマトグラフ部、イオン交換クロマトグラフ部からの溶出液の一部又は全部を試薬と混合する試薬混合部、逆相カラムを備える逆相クロマトグラフ部、逆相クロマトグラフ部からの溶出液について検出を行う検出部、及び、試料導入部で採取した試料及びイオン交換クロマトグラフ用の溶離液を送液する送液部、試薬を送液する送液部、イオン交換クロマトグラフ部からの溶出液と試薬とが混合された液を送液する送液部、及び、逆相クロマトグラフ用の溶離液を送液する送液部を備える分析装置により、容易に自動化し、分析に要する時間や労力を短縮等することができる。
【００８４】
実施例７
１７例の健常人（Ｈｅａｌｔｈｙ）、２０例の糖尿病患者（Ｄｉａｂｅｔｅｓ）、１７例の心筋梗塞患者（ＡＭＩ）の血清中のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、Ｃｈｙｌｏｍｉｃｒｏｎ中のαおよびγトコフェロールを実施例３に記載した方法で測定した。また、イオン交換クロマトグラフィー法（Ｈｉｒｏｗａｔａｒｉ  Ｙら、Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ、４４、ｐ１４０４（２００３）（非特許文献１２））により、別に各リポ蛋白のコレステロールを測定し、コレステロール当りのαおよびγトコフェロールを算出した。
【００８５】
また、すべてのリポ蛋白中のαおよびγトコフェロールを加算することにより、血液中のすべてのリポ蛋白中の総ビタミンＥ濃度（αおよびγトコフェロール濃度）を算出した。そして、別に各リポ蛋白のコレステロールを測定し、合計して血液中のコレステロールを算出し、コレステロール当りのαおよびγトコフェロールを算出した。結果を図と表に示す。なお、図中のバーおよび四角はノンパラメトリック統計による中心値（５０パーセントタイル値）および２５〜７５パーセンタイル値（ＩＱＲ）を示す。
【００８６】
ＨＤＬ中のγトコフェロール／コレステロール値（コレステロール当たりのγトコフェロール値）を図４４と表８に示した。
【００８７】
【表８】
0005522237.tif 000009
【００８８】
糖尿病（平均値１．２３ｍｍｏｌ／ｍｏｌ）、心筋梗塞（平均値１．００ｍｍｏｌ／ｍｏｌ）、健常人（平均値１．２０ｍｍｏｌ／ｍｏｌ）と、同等の値を示したが、心筋梗塞において、０．５ｍｍｏｌ／ｍｏｌ以下と健常人より明らかに低値の患者が見られた。心筋梗塞において、健常人に比べ低値の患者が見られたのは、酸化ストレスによりＨＤＬ中のγトコフェロールが分解されたことを示しているのであろう。
【００８９】
ＬＤＬ中のγトコフェロール／コレステロール値を図４５と表８に示した。糖尿病（平均値０．４０ｍｍｏｌ／ｍｏｌ）、心筋梗塞（平均値０．３７ｍｍｏｌ／ｍｏｌ）、健常人（平均値０．３４ｍｍｏｌ／ｍｏｌ）と、同等の値を示した。
【００９０】
ＩＤＬ中のγトコフェロール／コレステロール値を図４６と表８に示した。糖尿病（平均値３．１７ｍｍｏｌ／ｍｏｌ）は健常人（平均値６．２５ｍｍｏｌ／ｍｏｌ）より有意（ｐ＝０．００７）に低く、糖尿病が有する病態である酸化ストレスによりＩＤＬ中のγトコフェロールが分解されたことを示している。また、心筋梗塞についても、有意差（ｐ＝０．２１８）はないが、平均値４．８２ｍｍｏｌ／ｍｏｌと健常人より低い値を示し、これも、原因は酸化ストレスによるものである。なお、有意差の有無の判断基準は、健常人の数値と、各患者の数値とで、ウェルチのｔ検定（非等分散の２標本を対象とするｔ検定）を行い、ｐ値が０．０５未満であれば有意差ありとし、それ以上であれば有意差なしと判定した（以下、同様）。
【００９１】
ＶＬＤＬ中のγトコフェロール／コレステロール値を図４７と表８に示した。糖尿病（平均値２．３９ｍｍｏｌ／ｍｏｌ）は健常人（平均値５．０５ｍｍｏｌ／ｍｏｌ）より有意（ｐ＝０．０１８）に低く、糖尿病が有する病態である酸化ストレスによりＶＬＤＬ中のγトコフェロールが分解されたことを示している。このことから、ＶＬＤＬ中のγトコフェロール／コレステロール値を見ることにより糖尿病の酸化ストレスに関した病態を判定することが出来ると言える。
【００９２】
また、ＶＬＤＬコレステロールとの関係を図４８に示した。冠動脈疾患である心筋梗塞患者においては、全体としては健常人に比べ低下傾向ではないものの、その分布は健常人より幅が広く健常人の２５パーセンタイル値（１．９１ｍｍｏｌ／ｍｏｌ）より心筋梗塞患者の２５パーセンタイル値（１．３１ｍｍｏｌ／ｍｏｌ）は低値となった。ところで、ＶＬＤＬコレステロール（Ｈｕｂｅｒｔ  ＨＢら、Ａｍ  Ｊ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ、１２５、ｐ８１２（１９８７））は冠動脈疾患のリスクファクターとして明らかになっているが、このＶＬＤＬコレステロールとＶＬＤＬ中のγトコフェロール／コレステロール値との関係を調べた。ＶＬＤＬコレステロールが高値傾向になるとともに、心筋梗塞患者だけでなく、糖尿病患者も健常人についても、急激にＶＬＤＬ中のγトコフェロール／コレステロール値が低下していることがわかる。なお、ＶＬＤＬコレステロールとＶＬＤＬ中のγトコフェロール値に関連性はなかった（図４９）。そして、健常人のＶＬＤＬ中のγトコフェロール／コレステロール値が３ｍｍｏｌ／ｍｏｌ以下に該当するものは、ＶＬＤＬコレステロール値が９ｍｇ／ｄＬ以上と高値であり、心筋梗塞のリスクの高い人であった。この結果から考えるに健常人の中にも心筋梗塞もリスクの高い人が存在しているのであると推測される。これらのことから、ＶＬＤＬ中のγトコフェロール／コレステロール値は、ＶＬＤＬコレステロールの比較的低いレベルの時の冠動脈疾患のリスクを正確に判断できるものだと言える。冠動脈疾患などの動脈硬化性疾患の高いリスクとなることが知られている病態である糖尿病での測定値が健常者より低値であったことも合わせて考えるに、ＶＬＤＬ中のγトコフェロール／コレステロール値により、冠動脈疾患のリスクを判定することができると言える。
【００９３】
ＣＭ中のγトコフェロール／コレステロール値を図５０と表８に示した。糖尿病（平均値１１．０４ｍｍｏｌ／ｍｏｌ）は健常人（平均値１７．４２ｍｍｏｌ／ｍｏｌ）より有意（ｐ＝０．０４７）に低く、糖尿病が有する病態である酸化ストレスによりＣＭ中のγトコフェロールが分解されたことを示している。心筋梗塞についても、有意差（ｐ＝０．６３７）は見られなかったものの、平均値１５．７１ｍｍｏｌ／ｍｏｌと健常人に比べ低く、これも酸化ストレスによる分解が原因であろう。
【００９４】
血液中のγトコフェロール／コレステロール値を図５１と表８に示した。糖尿病（平均値０．９０ｍｍｏｌ／ｍｏｌ）および心筋梗塞（平均値０．９７ｍｍｏｌ／ｍｏｌ）と有意差（ｐ＝０．１９９およびｐ＝０．５８４）はないものの、健常人（平均値１．０３ｍｍｏｌ／ｍｏｌ）より低値を示した。また、図５１を見ると、その患者数は多くはないものの、明らかに健常人より値が低値の糖尿病患者および心筋梗塞患者が確認できる。これは、糖尿病および心筋梗塞が有する病態である酸化ストレスにより血液中のγトコフェロールが分解されたことを示している。
【００９５】
ＨＤＬ中のαトコフェロール／コレステロール値（コレステロール当たりのαトコフェロール値）を図５２と表９に示した。
【００９６】
【表９】
0005522237.tif 000010
【００９７】
糖尿病（平均値７．５８ｍｍｏｌ／ｍｏｌ）および心筋梗塞（平均値９．３０ｍｍｏｌ／ｍｏｌ）と健常人（平均値６．０９ｍｍｏｌ／ｍｏｌ）を比較した場合に、有意差（ｐ＝０．０７２およびｐ＝０．０９５）は見られなかったが高値傾向を示し、これは、ＨＤＬは脂質代謝の中心的な役割を担う重要なリポ蛋白であるので、糖尿病および心筋梗塞が有する病態である酸化ストレスによるダメージの防御として、ＨＤＬ中のαトコフェロールの含量を増加させたのではないかと考えられる。
【００９８】
ＬＤＬ中のαトコフェロール／コレステロール値を図５３と表９に示した。糖尿病（平均値３．３３ｍｍｏｌ／ｍｏｌ）は健常人（平均値２．０１ｍｍｏｌ／ｍｏｌ）より有意（ｐ＝０．０１６）に高く、これは、ＬＤＬは脂質代謝の中心的な役割を担う重要なリポ蛋白であるので、糖尿病が有する病態である酸化ストレスによるダメージの防御として、ＬＤＬ中のαトコフェロールの含量を増加させたのではないかと考えられる。このように、ＬＤＬ中のαトコフェロール／コレステロール値を見ることにより糖尿病の酸化ストレスに関した病態を判定することが出来ると言える。
【００９９】
心筋梗塞（平均値３．９４ｍｍｏｌ／ｍｏｌ）の場合も健常人（平均値２．０１ｍｍｏｌ／ｍｏｌ）より有意（ｐ＝０．０００１）に高く、これは、ＬＤＬは脂質代謝の中心的な役割を担う重要なリポ蛋白であるので、心筋梗塞が有する病態である酸化ストレスによるダメージの防御として、ＬＤＬ中のαトコフェロールの含量を増加させたのではないかと考えられる。このように、ＬＤＬ中のαトコフェロール／コレステロール値を見ることにより心筋梗塞の酸化ストレスに関した病態を判定することが出来ると言える。
【０１００】
ＩＤＬ中のαトコフェロール／コレステロール値を図５４と表９に示した。有意差（ｐ＝０．１０６）は低いものの、糖尿病（平均値１５．３３ｍｍｏｌ／ｍｏｌ）は健常人（平均値２０．１４ｍｍｏｌ／ｍｏｌ）に比べ明らかに低いことがわかる。これは、糖尿病が有する病態である酸化ストレスによりＩＤＬ中のαトコフェロールが分解されたことを示している。心筋梗塞（平均値２４．３９ｍｍｏｌ／ｍｏｌ）は健常人（平均値２０．１４ｍｍｏｌ／ｍｏｌ）に比べ高かったが、心筋梗塞患者の測定値では健常人に比べ、高い患者と低い患者のばらつきが大きかった。実際に、心筋梗塞患者の２５パーセンタイル値１３．７ｍｍｏｌ／ｍｏｌは健常人の２５パーセンタイル値１５．７ｍｍｏｌ／ｍｏｌより低値となった。健常人の中にも酸化ストレスによりＩＤＬ中のαトコフェロールが分解している人もいる可能性を考えると、健常人の２５パーセンタイル値１５．７ｍｍｏｌ／ｍｏｌより低値の心筋梗塞患者は酸化ストレスによるＩＤＬ中のαトコフェロールの分解が進んでいるのであろう。
【０１０１】
ＶＬＤＬ中のαトコフェロール／コレステロール値を図５５と表９に示した。有意差（ｐ＝０．３７３）はないものの、糖尿病（平均値１３．４６ｍｍｏｌ／ｍｏｌ）は健常人（平均値１７．５１ｍｍｏｌ／ｍｏｌ）より明らかに低く、糖尿病が有する病態である酸化ストレスによりＶＬＤＬ中のαトコフェロールが分解されたことを示している。このことから、ＶＬＤＬ中のαトコフェロール／コレステロール値を見ることにより糖尿病の酸化ストレスに関した病態を判定することが出来ると言える。
【０１０２】
また、ＶＬＤＬコレステロールとの関係を図５６に示した。冠動脈疾患である心筋梗塞患者においては、全体としては健常人に比べ低下傾向ではなかった。しかしながら、健常人の中にも心筋梗塞もリスクの高い人が存在しているのであろうと推測されているので、このような結果になった可能性がある。次に、ＶＬＤＬコレステロール（Ｈｕｂｅｒｔ  ＨＢら（１９８７）前掲）は冠動脈疾患のリスクファクターとして明らかになっているが、このＶＬＤＬコレステロールとＶＬＤＬ中のαトコフェロール／コレステロール値との関係を調べた。ＶＬＤＬコレステロールが高値傾向になるとともに、心筋梗塞患者だけでなく、糖尿病患者も健常人についても、急激にＶＬＤＬ中のαトコフェロール／コレステロール値が低下していることがわかる。なお、ＶＬＤＬコレステロールとＶＬＤＬ中のαトコフェロール値に関連性はなかった（図５７）。そして、健常人のＶＬＤＬ中のαトコフェロール／コレステロール値が７ｍｍｏｌ／ｍｏｌ以下に該当する人は、ＶＬＤＬコレステロール値が１５ｍｇ／ｄＬ以上と高値であり、心筋梗塞のリスクの高い人であることが明らかとなった。このことから、ＶＬＤＬ中のαトコフェロール／コレステロール値は、ＶＬＤＬコレステロールの低いレベルの場合の冠動脈疾患のリスクを正確に判断できるものだと言える。冠動脈疾患などの動脈硬化性疾患の高いリスクとなることが知られている病態である糖尿病での測定値が健常者より低値であったことも合わせて考えるに、ＶＬＤＬ中のαトコフェロール／コレステロール値により、冠動脈疾患のリスクを判定することができると言える。
【０１０３】
ＣＭ中のαトコフェロール／コレステロール値を図５８と表９に示した。有意差（ｐ＝０．１９０）はないものの、糖尿病（平均値４５．３７ｍｍｏｌ／ｍｏｌ）は健常人（平均値６４．７３ｍｍｏｌ／ｍｏｌ）より低値傾向を示し、糖尿病が有する病態である酸化ストレスによりＣＭ中のαトコフェロールが分解されたことを示している。心筋梗塞については、有意差ｐ＝０．５５１と糖尿病より更に低かったが、その平均値は５５．３９ｍｍｏｌ／ｍｏｌと健常人の平均値より低く、これも酸化ストレスによる分解が原因であろう。
【０１０４】
血液中のαトコフェロール／コレステロール値を図５９と表９に示した。有意差はｐ＝０．００５と、心筋梗塞（平均値６．８３ｍｍｏｌ／ｍｏｌ）は健常人（平均値４．７１ｍｍｏｌ／ｍｏｌ）に比べ明らかに高く、これは、血液中の主要なリポ蛋白であるＬＤＬやＨＤＬが、糖尿病が有する病態である酸化ストレスによるダメージの防御として、αトコフェロールの含量を増加させたのではないかと考えられる。また、糖尿病については、有意差（ｐ＝０．１３６）はないものの、やはり健常人（平均値４．７１ｍｍｏｌ／ｍｏｌ）に比べて高く、これも、血液中の主要なリポ蛋白であるＬＤＬやＨＤＬが、糖尿病が有する病態である酸化ストレスによるダメージの防御として、αトコフェロールの含量を増加させたのではないかと考えられる。
【０１０５】
健常人と糖尿病について、血液中のαトコフェロール値とγトコフェロール値の比較を行った（図６０、６１）。αトコフェロール値は健常人（平均値１０．７０μｇ／ｍｌ）に比べ糖尿病患者（平均値１３．６３μｇ／ｍｌ）が明らかに高値を示し、γトコフェロールの平均値は健常人（平均値２．２３μｇ／ｍｌ）に比べ糖尿病患者（平均値２．１５μｇ／ｍｌ）はやや低いが、全体の分布を見ると健常人に比べ糖尿病患者で高値の人が見られ、中心値はやや高値を示している（健常人；中心値２．０７μｇ／ｍｌ、糖尿病患者；中心値２．２６μｇ／ｍｌ）。これらビタミンＥ（αおよびγトコフェロール）が高値となった現象は、糖尿病患者の体内で発生している酸化ストレスに対する防御機構の１つだと考えている。
【０１０６】
また、αトコフェロールに比べて、γトコフェロールは酸化ストレスにより発生するラジカルにより分解を受けやすいという現象がある。また、αおよびγトコフェロールは小腸から同様に吸収され肝臓また一部分は抹消細胞にカイロマイクロンを介して輸送され、肝臓内ではビタミンＥ輸送タンパク質により、ある一定の量のαおよびγトコフェロールをＶＬＤＬ粒子内に含有させて血中に放出することにより体内の抹消細胞に輸送されることが知られている。同様のメカニズムにより小腸で吸収され肝臓から放出されるαおよびγトコフェロールの血液中での比率はほぼ一定であると推定される。これら現象から、γトコフェロールをαトコフェロールの比として算出すれば、糖尿病の酸化ストレスに関する病態を反映する優れた指標と考え検討した。結果を図６２と表１０に示す。血液中のγトコフェロール／αトコフェロール比は予想通り、健常人（平均値０．２２）に比べ、糖尿病（平均値０．１７）と有意（ｐ＝０．０１３）と低く、糖尿病の酸化ストレスに関する病態を判定することが出来ると言える。
【０１０７】
【表１０】
0005522237.tif 000011
【０１０８】
また、冠動脈疾患において、健常人と比べた場合にαトコフェロールは有意（ｐ＝０．０６１）ではないがやや高値であり、γトコフェロールは有意（ｐ＝０．０２３）に低く、γトコフェロール／αトコフェロール比は有意（ｐ＝０．００５）に低いという結果は、Ｏｈｒｖａｌｌ  Ｍら（１９９６）前掲の内容とほぼ一致した。
【図１】
0005522237.tif 000012
【図２】
0005522237.tif 000013
【図３】
0005522237.tif 000014
【図４】
0005522237.tif 000015
【図５】
0005522237.tif 000016
【図６】
0005522237.tif 000017
【図７】
0005522237.tif 000018
【図８】
0005522237.tif 000019
【図９】
0005522237.tif 000020
【図１０】
0005522237.tif 000021
【図１１】
0005522237.tif 000022
【図１２】
0005522237.tif 000023
【図１３】
0005522237.tif 000024
【図１４】
0005522237.tif 000025
【図１５】
0005522237.tif 000026
【図１６】
0005522237.tif 000027
【図１７】
0005522237.tif 000028
【図１８】
0005522237.tif 000029
【図１９】
0005522237.tif 000030
【図２０】
0005522237.tif 000031
【図２１】
0005522237.tif 000032
【図２２】
0005522237.tif 000033
【図２３】
0005522237.tif 000034
【図２４】
0005522237.tif 000035
【図２５】
0005522237.tif 000036
【図２６】
0005522237.tif 000037
【図２７】
0005522237.tif 000038
【図２８】
0005522237.tif 000039
【図２９】
0005522237.tif 000040
【図３０】
0005522237.tif 000041
【図３１】
0005522237.tif 000042
【図３２】
0005522237.tif 000043
【図３３】
0005522237.tif 000044
【図３４】
0005522237.tif 000045
【図３５】
0005522237.tif 000046
【図３６】
0005522237.tif 000047
【図３７】
0005522237.tif 000048
【図３８】
0005522237.tif 000049
【図３９】
0005522237.tif 000050
【図４０】
0005522237.tif 000051
【図４１】
0005522237.tif 000052
【図４２】
0005522237.tif 000053
【図４３】
0005522237.tif 000054
【図４４】
0005522237.tif 000055
【図４５】
0005522237.tif 000056
【図４６】
0005522237.tif 000057
【図４７】
0005522237.tif 000058
【図４８】
0005522237.tif 000059
【図４９】
0005522237.tif 000060
【図５０】
0005522237.tif 000061
【図５１】
0005522237.tif 000062
【図５２】
0005522237.tif 000063
【図５３】
0005522237.tif 000064
【図５４】
0005522237.tif 000065
【図５５】
0005522237.tif 000066
【図５６】
0005522237.tif 000067
【図５７】
0005522237.tif 000068
【図５８】
0005522237.tif 000069
【図５９】
0005522237.tif 000070
【図６０】
0005522237.tif 000071
【図６１】
0005522237.tif 000072
【図６２】
0005522237.tif 000073