(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ９５活性を中和する薬剤を含む、高グレードの神経膠腫を有する個体を治療するための医薬品組成物であって、
該高グレードの神経膠腫がＷＨＯグレードＩＶの神経膠腫であり、かつ
該薬剤が
（ａ）阻害性抗−ＣＤ９５Ｌ−抗体および
（ｂ）細胞外ＣＤ９５ドメイン及びヒトＩｇＧ１−Ｆｃドメインを含有する阻害性融合タンパク質
からなる群から選択されるＣＤ９５Ｌに結合する化合物であり、その際、該阻害性融合タンパク質が配列番号１のアミノ酸配列１７−１７２からなる細胞外ＣＤ９５ドメインおよび配列番号１のアミノ酸配列１７３〜４００からなるヒトＩｇＧ１−Ｆｃドメインを含有するＡＰＧ１０１である、
前記医薬品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビボで、ＣＤ９５とそのリガンド、ＣＤ９５Ｌとの結合を妨げる又は妨害することによって、高グレードの多型性神経膠芽腫を有する個体を治療する方法に関し、その際、ＣＤ９５活性の中和は、対側半球を侵す細胞の遊走を劇的に低減する。
【０００２】
背景技術
分離腫瘍細胞による周囲脳組織の侵襲は、多型性神経膠芽腫（ＧＢＭ）の有効治療に対する主要な障害の１つを示す。神経膠腫は、中枢神経系（ＣＮＳ）において生じる多数の腫瘍を含む。成人において、最も一般の腫瘍は、星状膠細胞又は乏突起膠細胞に由来する高グレードの新生物である。世界保健機関は、これらの悪性腫瘍をそれらの退形成の程度によって、グレードＩＩ（び漫性星状細胞腫）、グレードＩＩＩ（退形成性星状細胞腫）、及びグレードＩＶ（ＧＢＭ）に分類している1。
【０００３】
神経膠腫は、全ての脳腫瘍の５０％より多くを占めており、かつ成人において、群を抜いて一般の原発脳腫瘍である。新しい診断技術の開発にもかかわらず、生存率は極めて低い。３％のみが、診断の５年後にまだ生存している。悪性神経膠腫の臨床結果は、正常脳組織における分離腫瘍細胞の侵襲に依存する。遊走細胞は、腫瘍の外科的切除を逃れることができ、かつ従って、手術後の放射線治療及びアジュバント化学療法の主な標的である。化学療法剤及び放射線照射は、主にアポトーシスを誘発することによって作用する。しばしば、このアポトーシスの誘発は、ＣＤ９５（Ａｐｏ−１／Ｆａｓ）死レセプター／リガンド系の活性化を含む。それにもかかわらず、最も悪性の神経膠腫細胞は、ＣＤ９５で誘発されるアポトーシスに耐性がある。本明細書では、ＣＤ９５のトリガーが、アポトーシス耐性のヒトの長期及び原発性神経膠腫培養物における遊走／侵襲を増加する。すなわち、トリガーＣＤ９５は、ＣＤ９５又は組換えＣＤ９５Ｌに対するアゴニスト抗体を使用することによるＣＤ９５活性の開始を必要としてよい。
【０００４】
アポトーシスに関する遊走の原発性神経膠腫腫瘍の傾向は、悪性疾患の程度で増加する。ＣＤ９５は、カスパーゼ非依存法におけるＰＩ３Ｋ／ＩＬＫ／ＧＳＫ３−ベータ；／ＭＭＰ経路によって遊走を媒介する。さらに、ＣＤ９５の下流のリンカー分子を解決しようとした。可能な候補は、糖尿病において多く見られるリンタンパク質／星状細胞において多く見られるリンタンパク質−１５ｋＤ（ＰＥＤ／ＰＥＡ−１５）であった。ノックダウン実験は、ＣＤ９５／ＣＤ９５Ｌ−系を介して媒介させた遊走のシグナル経路におけるリンカー分子としてＰＥＤ／ＰＥＡ−１５を排除した。最も重要なのは、ガンマ−放射線照射も、ＣＤ９５で誘発された死に対して耐性のある細胞の遊走を増加した。放射線照射媒介性遊走は、ＣＤ９５Ｌの中和によって阻害されることができた。従って、ＣＤ９５刺激に対する腫瘍の反応は、その後の治療選択を必然的に決めるべきである。Ｋｌｅｂｅｒ，Ｓ．、"Ｇａｍｍａ ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ ｌｅａｄｓ ｔｏ ＣＤ９５ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｉｎ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ"、Ｐｈ．Ｄ． 命題、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｓ Ｋｒｅｂｓｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｚｅｎｔｒｕｍ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、２００６年１月３日（ｕｒｎ：ｎｂｎ：ｄｅ：ｂｓｚ：１６−ｏｐｕｓ−５９９２６，ａｖａｉｌａｂｌｅ ａｔ ｗｗｗ．ｕｂ．ｕｎｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／ａｒｃｈｉｖ／５９９２／）を参照し、参照をもって本明細書に全て組み込まれたものとする。
【０００５】
主要なタイプの神経膠腫は、上衣細胞腫、星状細胞腫、及び乏突起細胞腫であるが、それらは、神経膠腫細胞状態の混合細胞形、例えば乏突起星状細胞腫も存在する。
【０００６】
細胞の特徴に加えて、神経膠腫腫瘍は、典型的に、当該技術分野によって"グレーディング（ｇｒａｄｉｎｇ）"分類系と認識される、病理学及び細胞浸潤の深刻さによっても特徴付けられる。
【０００７】
最も一般的に使用されるグレーディング系は、星状細胞腫のための世界保健機関（ＷＨＯ）グレーディング系である。ＷＨＯの系は、星状細胞腫のＩ〜ＩＶのグレードを割り当て、その際、Ｉは、最も攻撃性が少なく、かつＩＶは、最も攻撃性がある。従って、毛様細胞性星状細胞腫はＷＨＯグレードＩの神経膠腫の例であり、び漫性星状細胞腫はＷＨＯグレードＩＩの例であり、退形成性（悪性）星状細胞腫はＷＨＯグレードＩＩＩの例であり、かつ多型性神経膠芽腫はＷＨＯグレードＩＶの例である。後半は、成人における最も一般の神経膠腫であり、かつ苦しめられた患者に残念ながら最も悪い予後を有する。
【０００８】
一般的に、"低グレード"の神経膠腫は、典型的に、優れて分化され、ゆっくりと成長し、生物学的に小さい侵略性であり、及び患者のためのより良好な予後の前兆であるが、"高グレード"の神経膠腫は、未分化又は退形成であり、早く成長し、そして隣接する組織を侵略することができ、かつ悪い予後をもたらす。高グレードの神経膠腫は、より高度な血管腫瘍であり、かつ組織を浸潤し、壊死及び低酸素を生じ、かつ腫瘍が位置する血管脳関門を破壊する傾向を有する。
【０００９】
主に子供において生じるテント下神経膠腫、及び成人においてテント上神経膠腫もある。テント下神経膠腫は、側頭葉及び後頭葉の底面より下の全ての内側の大脳領域に位置し、上部頸髄に伸長しており、かつ小脳を含む。テント上部領域は、小脳テントの上方に位置し、かつ前脳を含む。
【００１０】
腫瘍グレードは、重要な予後因子である。グレードＩＩＩの星状細胞腫に関する生存中央値は、３〜４年であり、かつグレードＩＶの星状細胞腫に関しては、１０〜１２ヶ月である。最も頻繁な神経膠腫（６５％）は、ＧＢＭである1。多発性のアポトーシス促進性刺激、及び正常な周囲脳組織中への遊走腫瘍細胞の侵襲に対する細胞の耐性は、有効治療に対する主な障害である。
【００１１】
悪性神経膠腫（グレードＩＩＩ及びＩＶ）の現在の治療は、外科手術、続いて放射線照射、及び化学療法を含む。化学療法剤及びγ−放射線照射は、主にアポトーシスを誘発することによって作用する。しばしば、アポトーシスの誘発は、ＣＤ９５／ＣＤ９５−リガンド（ＣＤ９５Ｌ；Ａｐｏ１Ｌ／ＦａｓＬ）死系の活性化を含む2,3。ＣＤ９５レセプターによる三量体化ＣＤ９５Ｌの結合は、死誘発シグナル複合体（ＤＩＳＣ）5中へ、アダプタータンパク質ＦＡＤＤ（Ｆａｓ関連デスドメイン、ＭＯＲＴ１）4、並びにカスパーゼ−８及び−１０の漸増を導く。ＦＡＤＤは、デスドメイン（ＤＤ）及びデス−エフェクタードメイン（ＤＥＤ）を含む。そのＤＤによって、ＦＡＤＤは、ＣＤ９５のＤＤに結合する6。ＤＥＤは、ＤＥＤ含有プロカスパーゼ−８をＤＩＳＣ中へ補充する7。ＤＩＳＣにあるプロカスパーゼ−８は、自己開裂によって活性化され、かつ下流のエフェクターカスパーゼの活性化によって細胞をアポトーシスする8。
【００１２】
ＣＤ９５／ＣＤ９５Ｌ系は、悪性神経膠腫細胞によって、それらの侵襲応力を増加するために使用される。ＣＤ９５は、ＰＩ３Ｋ／ＩＬＫ／ＧＳＫ３β経路によって細胞侵襲を、続いてメタロプロテイナーゼの発現を誘発する。増加されたＣＤ９５Ｌ発現は、外科的手術を逃れた放射線照射された神経膠腫細胞によって示される。放射線照射で誘発されたＣＤ９５活性は、神経膠腫細胞の遊走を増加した。頭蓋内ＧＢＭのネズミ同系モデルにおいて、ＣＤ９５／ＣＤ９５Ｌ発現は、周囲脳間質との相互作用に対して著しく上方制御させた。
【００１３】
ＣＤ９５及びＣＤ９５Ｌ発現の程度は、明確に、腫瘍グレードと相互に関連する。本明細書では、ＣＤ９５のトリガーが、より少ない悪性腫瘍（ＷＨＯＩ〜ＩＩ）におけるアポトーシスを引き起こした一方で、グレードＩＶの腫瘍は、ＣＤ９５で誘発されたアポトーシスに耐性があることを示す。それらのより高い悪性細胞において、ＣＤ９５は、遊走／侵襲を媒介する。ＣＤ９５ＬによるＣＤ９５の結合は、ＰＩ３Ｋ及びＩＬＫを活性化し、その結果、ＧＳＫ３βの阻害、及びメタロプロテイナーゼの誘発を導く。アポトーシスに耐性がある細胞の放射線照射は、ＣＤ９５及びＣＤ９５Ｌの発現を増加し、その結果としてメタロプロテイナーゼ発現、及び続く遊走／侵襲を増加した。頭蓋内神経膠腫の同系マウスモデルにおいて、ＣＤ９５及びＣＤ９５Ｌ発現は、周囲間質との相互作用に対して上方制御された。ＣＤ９５活性の中和は、劇的に、対側半球を侵す細胞数を低減した。
【００１４】
発明の要約
本発明は、ＣＤ９５活性を高グレードの神経膠腫を有する個体に対して中和する薬剤を投与することを含む、高グレードの神経膠腫を有する個体を治療する方法に関する。
【００１５】
一実施態様において、ＣＤ９５活性を中和する薬剤は、ＣＤ９５をＣＤ９５Ｌとの結合から妨げ、又はＣＤ９５／ＣＤ９５Ｌ複合体を妨害する化合物である。
【００１６】
一実施態様に置いて、該化合物は、ＣＤ９５に結合し、又はＣＤ９５Ｌに結合し、又はＣＤ９５／ＣＤ９５Ｌ複合体に結合する。
【００１７】
他の実施態様において、該化合物は、ＣＤ９５に結合する抗体である。他の実施態様において、該化合物は、ＣＤ９５Ｌに結合する抗体である。本発明による抗体は、モノクローナル、ポリクローナル、又はキメラであってよい。しかしながら、シグナル鎖抗体又は機能抗体の断片も、使用されてよい。一実施態様において、ＣＤ９５に結合する抗体は、Ｎｏｋ１である。従って、本発明は、ＣＤ９５もしくはＣＤ９５ＬもしくはＣＤ９５Ｒ（ＣＤ９５レセプター）活性のあらゆる中和剤又は"阻害剤"を検討する。
【００１８】
本発明による抗体の製造のために、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト等を含む種々の宿主が、免疫原性を有する、タンパク質もしくはあらゆる断片、又はそれらのオリゴペプチドでの注入によって免疫化されてよい。宿主種に依存して、種々のアジュバントを使用して、免疫反応を増強してよい。抗体をタンパク質に誘導するために使用されるペプチド、断片、又はオリゴペプチドは、少なくとも５個のアミノ酸、及びより有利には少なくとも１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有することが好ましい。タンパク質に対するモノクローナル抗体は、培養物中の連続継代性細胞系によって抗体分子の製造を提供するあらゆる技術を使用して製造されてよい。これらは、制限されない限り、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を含む。さらに、‘キメラ抗体’の製造のために開発された技術、適切な抗原特異性及び生物学的活性を有する分子を得るためにマウス抗体遺伝子とヒト抗体遺伝子とをスプライシングすることが、使用されうる。抗体は、修飾して、又は修飾無しに使用されてよく、かつそれらを、共有又は非共有的に、例えばレポーター分子と連結することによって標識されてよい。
【００１９】
種々のイムノアッセイは、スクリーニングを使用して、所望の特異性を有する抗体を識別させてよい。確立された特異性を有するポリクローナル又はモノクローナル抗体を使用する競合結合及びイムノラジオメトリックアッセイのための多数のプロトコルは、当業者によく知られている。典型的に、かかるイムノアッセイは、タンパク質と、すなわちＣＤ９５と、その特異性抗体との複合体形成の測定を含む。２つの部位、２つの非妨害タンパク質エピトープに対するモノクローナル抗体反応を使用するモノクローナルを基礎とするイムノアッセイが好ましいが、しかし競合結合アッセイも、使用されてよい。
【００２０】
１つの阻害剤は、ＣＤ９５−リガンド（Ｆａｓリガンド；ＡＰＯ１リガンド）阻害剤であってよい。例えば、ＣＤ９５−リガンド阻害剤は、（ａ）阻害性抗−ＣＤ９５リガンド−抗体又はそれらの断片、（ｂ）可溶性ＣＤ９５レセプター分子又はそれらのＣＤ９５リガンド結合タンパク質、及び（ｃ）ＦＬＩＮＴ、ＤｃＲ３又はそれらの断片から選択されたＦａｓリガンド阻害剤から選択されてよい。
【００２１】
阻害性抗−ＣＤ９５Ｌ−抗体及びそれらの抗原結合断片、並びに可溶性ＣＤ９５Ｒ分子又はそれらのＣＤ９５Ｌ結合部分も検討される。好適な阻害性抗−ＣＤ９５Ｌ抗体の例は、ＥＰ−Ａ−０ ８４２ ９４８号、ＷＯ ９６／２９３５０号、及びＷＯ ９５／１３２９３号、並びにそれらから得られたキメラ又はヒト化抗体（例えばＷＯ ９８／１００７０号を参照）において開示されており、参照をもって本明細書に組み込まれたものとする。さらに、可溶性ＣＤ９５レセプター分子、例えばＥＰ−Ａ−０ ５９５ ６５９号及びＥＰ−Ａ−０ ９６５ ６３７号において記載されているような膜内外ドメインを有さない可溶性ＣＤ９５レセプター分子、又はＷＯ ９９／６５９３５号において記載されているようなＣＤ９５Ｒペプチドが好ましく、参照をもって本明細書に組み込まれたものとする。
【００２２】
一実施態様において、ＣＤ９５Ｒ分子の細胞外ドメイン、例えばＵＳ特許番号第５，８９１，４３４号（参照をもって本明細書に組み込まれたものとする）による成熟ＣＤ９５配列のアミノ酸１〜１７２（ＭＬＧ．．．ＳＲＳ）を含有するＣＤ９５Ｌ阻害剤は、異種ポリペプチドドメイン、特に、例えばヒトＩｇＧ１分子からのヒンジ領域を含有するＦｃ免疫グロブリン分子に融合されてよい。１つの融合タンパク質は、細胞外ＣＤ９５ドメインを含有し、ヒトＦｃドメインは、ＷＯ ９５／２７７３５号において記載されており、参照をもって本明細書に組み込まれたものとする。従って、好ましい一実施態様によって、ＣＤ９５Ｌに結合した薬剤は、細胞外ＣＤ９５ドメイン及びヒトＦｃドメインを含有する融合タンパク質である。特に好ましい一実施態様によって、ＣＤ９５Ｌに結合する薬剤は、ＡＧＰ１０１（ＣＤ９５−ＦＣ、配列表番号１）である。ＡＧＰ１０１は、ドメインＣＤ９５Ｒ−ＥＣＤ（アミノ酸１７〜１７２；ＥＣＤ細胞外ドメイン）及びＩｇＧ１−Ｆｃ（アミノ酸１７３〜４００）を含有する。
【００２３】
ＡＧＰ１０１及びそれらの誘導体は、ＷＯ ９５／２７７３５号及びＷＯ ２００４／０８５４７８号において記載されており、参照をもって本明細書に組み込まれたものとする。
【００２４】
Ｆａｓリガンド阻害剤ＦＬＩＮＴもしくはＤｃＲ３、又はそれらの断片、例えば可溶性断片、例えば、場合により異種ポリペプチドに融合させた細胞外ドメイン、特にＦｃ免疫グロブリン分子は、ＷＯ ９９／１４３３０号又はＷＯ ９９／５０４１３号において記載されており、参照をもって本明細書に組み込まれたものとする。ＦＬＩＮＴ及びＤｃＲ３は、ＣＤ９５リガンドに結合することができるタンパク質である。
【００２５】
本発明の他の一実施態様において、阻害剤は、（ａ）阻害性抗ＣＤ９５レセプター抗体又はそれらの断片、（ｂ）阻害性ＣＤ９５リガンド断片から選択されてよいＣＤ９５Ｒ阻害剤である。有利には、本発明による阻害性抗ＣＤ９５レセプター抗体の断片は、対応する抗体が行うような同一のエピトープ結合部位を示す。本発明の他の実施態様において、阻害性抗ＣＤ９５レセプター抗体の断片は、実質的に、対応する抗体のような同一のＣＤ９５Ｒ阻害活性を有する。有利には、阻害性ＣＤ９５リガンド断片は、実質的に、対応する阻害性ＣＤ９５リガンド断片が行うような同一の阻害活性を示す。
【００２６】
好適な阻害性抗ＣＤ９５Ｒ抗体及び阻害性ＣＤ９５Ｌ断片の例は、ＥＰ−Ａ−０ ８４２ ９４８号及びＥＰ−Ａ−０ ８６２ ９１９号において記載されており、参照をもって本明細書に組み込まれたものとする。
【００２７】
本発明のさらに他の一実施態様において、該阻害剤は、核酸エフェクター分子である。該核酸エフェクター分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡ−ハイブリッドであってよい。該分子は、一本鎖又は二本鎖であってよい。レトロウィルス、アデノウィルス、ヘルペスもしくはワクチンウィルス、又は種々の細菌性プラスミド由来の発現ベクターは、ヌクレオチド配列の標的器官、組織又は細胞集団への送達のために使用されてよい。かかる構成体は、翻訳できないセンス配列又はアンセンス配列を細胞へ導入するために使用されてよい。さらにＤＮＡ中への統合欠如において、かかるベクターは、ＲＮＡ分子を、内在性ヌクレアーゼによって不能にするまで、転写し続けてよい。一過性の発現は、非複製ベクターで１ヶ月以上の間続いてよく、及び適切な複製要素がベクター系の一部である場合でさえより長い。
【００２８】
前記核酸エフェクター分子は、特に、ＣＤ９５Ｒ及び／又はＣＤ９５Ｌ遺伝子の発現を阻害することができる、アンチセンス分子、ＲＮＡｉ分子、及びリボザイムから選択されてよい。例えば、ＵＳ ２００６０２３４９６８号を参照し、参照をもって本明細書に組み込まれたものとする。他の実施態様において、高グレード神経膠腫は、ＷＨＯグレードＩＩＩ又はＩＶの神経膠腫である。好ましい一実施態様において、高グレード神経膠腫は、ＷＨＯグレードＩＶの神経膠腫である。
【００２９】
本発明の特に好ましい実施態様によって、ＣＤ９５活性を中和する薬剤は、ＣＤ９５とＰＩ３Ｋのタンパク質ｐ８５との相互作用を阻害する。
【００３０】
本発明によって、ＣＤ９５活性は、例えば実施例２５又は実施例２６において略述されたあらゆる種類の好適なアッセイによる当業者によって決定されうる。
【００３１】
本発明は、高グレード神経膠腫を有する個体に対してＣＤ９５活性を中和する少なくとも１つの薬剤を含有する、医薬品組成物も提供する。一実施態様において、該薬剤は、Ｎｏｋ１又はＣＤ９５−ＦＣ（ＡＧＰ１０１）である。ＣＤ９５−ＦＣは、ＣＤ９５Ｌに結合し、かつ従ってＣＤ９５ＬのＣＤ９５への結合を阻害する。
【００３２】
他の実施態様において、医薬品組成物は、ＣＤ９５を結合する少なくとも１つの薬剤、及びＣＤ９５Ｌに結合する少なくとも１つの他の薬剤を含有する。本発明は、本明細書において検討された医薬品組成物の１つを投与することによって、神経膠腫を有する患者を治療する方法も提供する。一実施態様において、神経膠腫は、グレードＩＩＩもしくはグレードＩＶのＷＨＯで分類された神経膠腫、又は"高グレード"神経膠腫である。
【００３３】
他の実施態様において、前記医薬品組成物は、さらに、癌の治療のための、特に高グレード神経膠腫の治療のための活性剤を含有してよい。
【００３４】
該医薬品組成物は、単独で、又は、制限されることなく、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、及び水を含む、あらゆる滅菌の生体適合性医薬品キャリヤーにおいて投与されてよい、少なくとも１つの薬剤、例えば安定化化合物との組合せで投与されてよい。該組成物は、単独で、又は他の薬剤、薬物又はホルモンとの組合せで、患者に投与されてよい。本発明において使用される医薬品組成物は、制限されることなく、口内、血管内、筋内、動脈内、髄内、髄腔内、脳室内、経皮的、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所的、舌下、又は直腸の方法を含むあらゆる数の経路によって投与されてよい。
【００３５】
活性成分に加えて、それらの医薬品組成物は、活性化合物の製剤学的に使用されうる配合物への加工を容易にする賦形剤及び助剤を含む、好適な製剤学的に認容性のキャリヤーを含んでよい。調合物及び投与のための技術に対する詳細は、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．）の最新版において見出されてよい。
【００３６】
本発明における使用に好適な医薬品組成物は、活性成分を、使用目的を達成するための有効量で含有する組成物を含む。有効な投与量の投与は、十分に当業者の能力の範囲内である。あらゆる化合物のために、製剤学的に有効な投与量は、例えば前駆脂肪細胞系の細胞培養アッセイにおいて、又は動物モデル、大抵マウス、ウサギ、イヌ、もしくはブタにおいて、初めに確立されうる。該動物モデルは、適切な濃度範囲及び投与経路を決定するためにも使用されてよい。さらに、かかる情報は、ヒトにおける投与のための有用な投与量及び経路を決定するために使用されうる。治療的に有効な投与量は、特定の状態を治療するために十分な、活性成分、例えば核酸又は本発明のタンパク質又は抗体の量に関する。治療的有効性及び毒性は、細胞培養物又は実験動物における標準的な医薬品処置、例えばＥＤ５０（集団の５０％における治療学的に有効な投与量）及びＬＤ５０（集団の５０％までの致命的な投与量）によって決定されてよい。治療効果と毒性効果との投与比は、治療指数であり、かつそれを、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。大きい治療指数を呈する医薬品組成物が好ましい。細胞培養アッセイ及び動物研究から得たデータは、ヒト使用のための投与量の範囲を考案するために使用される。かかる組成物において含有される投与量は、有利には、殆ど又は全く毒性を有さないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。該投与量は、使用される投与量、患者の感受性、及び投与の経路に依存する範囲内で変動する。正確な投与量は、治療を必要とする被験者に関連する因子を考慮して、開業医によって決定される。投与量及び投与は、活性成分の十分なレベルを提供するために、又は所望の効果を維持するために調整される。考慮に入れられてよい因子は、病気状態の重さ、被験者の一般健康、被験者の年齢、体重、及び性別、食事、投与時間及び頻度、薬の組合せ、反応感受性、並びに治療に対する許容度／応答を含む。長時間作用の医薬品組成物は、特定の調合物の半減期及びクリアランス率に依存して、３〜４日毎に、１週間毎に、又は２週間毎に一度、投与されてよい。通常の投与量は、投与の経路に依存して、０．１〜１０００００マイクログラム、約１ｇの総投与量まで変動してよい。特定の投与量及び送達方法に関する誘導は、文献において提供され、かつ一般に当業者に入手できる。当業者は、タンパク質又はそれらの阻害剤よりもヌクレオチドのための種々の調合物を使用する。同様に、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの送達は、特定の細胞、条件、位置等に固有である。
【００３７】
本発明の他の概要は、
（ａ）（ｉ）ＣＤ９５又はそれらの機能的断片、
（ｉｉ）候補薬剤
を含有する混合物を、ＣＤ９５又はそれらの機能的断片が対照活性を有する条件下でインキュベートする工程、
（ｂ）ＣＤ９５又はそれらの機能的断片の活性を検出して、前記薬剤の存在下で活性を決定する工程、
（ｃ）前記薬剤の存在下での活性と対照活性との相違を決定する工程
を含む、ＣＤ９５の活性を調整する／ＣＤ９５の活性に作用する、有利には中和する薬剤のためのスクリーニング法に関する。
【００３８】
かかるアッセイの好ましい一実施態様によって、遮蔽される薬剤は、ＣＤ９５とＰＩ３Ｋ、有利にはＣＤ９５とＰＩ３Ｋのｐ８５サブユニットとの相互作用を妨害する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】ＣＤ９５で誘発される死に対する感受性及びＣＤ９５の発現を示す図。
【図２】ＣＤ９５で誘発される死に体性のある細胞が、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９を上方制御することを示す図。
【図３】ＣＤ９５で誘発される遊走が、ＩＬＫ／ＡＫＴの活性化及びＧＳＫ３βの阻害によって媒介されることを示す図。
【図４】原発神経膠芽腫におけるＣＤ９５／ＣＤ９５Ｌ系の発現を示す図。
【図５】アポトーシス耐性原発神経膠芽腫におけるＣＤ９５／ＣＤ９５Ｌ系の機能を示す図。
【図６】Ｔ９８Ｇ及び原発神経膠芽腫細胞におけるγ−放射線照射で誘発された遊走を示す図。
【図７】ＣＤ９５及びＣＤ９５Ｌが、インビボでネズミの神経膠腫細胞に対して上方制御され、遊走を誘発することを示す図。
【図８】ＧＳＫ３βの阻害が、カスパーゼに依存しないことを示す図。
【図９】原発神経膠芽腫におけるＣＤ９５／ＣＤ９５Ｌ系の発現及び機能を示す図。
【図１０】原発神経膠芽腫の遊走に対する放射線照射の影響を示す図。
【図１１】ＭＭＰによるアポトーシス耐性細胞のＣＤ９５トリガー誘発を示す図。
【図１２】ＭＭＰによる原発アポトーシス耐性神経膠腫細胞のＣＤ９５トリガー誘発を示す図。
【図１３】ＣＤ９５が、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ＧＳＫ３β経路によって遊走を誘発することを示す図。
【図１４】Ｓｒｃ及びｐ８５が、ＡＫＴを活性化するためのＣＤ９５に関連することを示す図。
【図１５】適切な耐神経膠腫細胞における非効率的なＤＩＳＣ形成を示す図。
【図１６】神経膠芽腫における侵襲のＣＤ９５シグナルのための模型図を示す図。
【図１７】ＧＢＭの臨床試料におけるＣＤ９５Ｌ、Ｙｅｓ及びＰｈｏｓｐｈｏ−Ｓｒｃの発現を示す図。
【図１８】ＣＤ９５及びＣＤ９５Ｌが、インビボでネズミの神経膠腫細胞に対して上方制御され、遊走を誘発することを示す図。
【図１９】ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４の発生を示す図。
【図２０】原発神経膠芽腫における、ＣＤ９５／ＣＤ９５Ｌ系及びアポトーシスに対する感受性を示す図。
【図２１】ＣＤ９５で媒介されたＰＩ３Ｋ活性化の修飾物質を示す図。
【図２２】腫瘍患者からの臨床データの要約を示す図。
【００４０】
図１：ＣＤ９５で誘発される死に対する感受性及びＣＤ９５の発現
（ａ）神経膠芽腫細胞系Ａ１７２、Ｔ９８Ｇ及びＬＮ１８を、ＬＺ−ＣＤ９５Ｌ（ｎｇ／ｍｌ）、スタウロスポリン（１μＭ）、又は未処理のまま（Ｃｏ）の指示投与量でインキュベートした。２４時間及び４８時間後にＤＮＡの断片化を、ＦＡＣＳによって分析した。（ｂ）Ａ１７２、Ｔ９８Ｇ及びＬＮ１８におけるＣＤ９５表面発現のＦＡＣＳ分析。（ｃ）スフェロイド培養を、コラーゲンマトリックス中へ包埋し、そしてＬＺ−ＣＤ９５Ｌ（５ｎｇ／ｍｌ）で処理した。該マトリックス中への単細胞の侵襲を、２４時間にわたって微速度顕微鏡で観察した。スフェロイドの境界への侵略細胞（スフェロイド毎にｎ＝１０、治療毎に３スフェロイド）の距離を、平均±標準誤差、*Ｐ＜０．０５のグラフで示した。（ｄ）治療の０時間及び２４時間後でのＴ９８Ｇ及びＬＮ１８スフェロイドの代表的な位相図。結果は、３つの独立した実験を示す。
【００４１】
図２：ＣＤ９５で誘発される死に耐性のある細胞は、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９を上方制御する
（ａ）Ｔ９８Ｇ及びＬＮ１８細胞を、指示時間、α−Ａｐｏ−１（１μｇ／ｍｌ）で処理した。ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の発現を、定量リアルタイムＰＣＲによって測定した。データは、平均±標準誤差、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１として、５回の独立した実験から得られる。
【００４２】
図３：ＣＤ９５で誘発される遊走は、ＩＬＫ／ＡＫＴの活性化及びＧＳＫ３βの阻害によって媒介される
（ａ）ＧＳＫ３βを、リン酸化し、それによって、Ｔ８９Ｇ及びＬＮ１８細胞中で、α−Ａｐｏ−１（１μｇ／ｍｌ）での治療に対して阻害した。（ｂ）Ｔ８９Ｇ細胞を、空のレンチウィルスベクター（Ｃｏ）又は構成的に活性ＧＳＫ３β突然変異体（ＧＳＫ Ｓ９Ａ）で感染させた。Ｔ９８Ｇ細胞を感染させたＧＳＫ Ｓ９Ａは、３６時間、α−Ａｐｏ−１（２μｇ／ｍｌ）又はＬＺ−ＣＤ９５Ｌ（ＣＤ９５Ｌ、５ｎｇ／ｍｌ）での処理に対して、それらの空のベクターの対応品よりも極めて低く遊走した。ＣＤ９５Ｌ（Ｎｏｋ１ １０μｇ）に対する中和抗体は、ベクター及びＧＳＫ Ｓ９Ａで感染された細胞のＣＤ９５Ｌで誘発された遊走を阻害した。（ｃ）Ｔ９８Ｇ細胞を感染させたＧＳＫ Ｓ９Ａ及びそれぞれのコントロールを、ＬＺ−ＣＤ９５Ｌ（ｎｇ／ｍｌ）の指示投与量で４８時間刺激し、そしてＤＮＡの断片化をＦＡＣＳによって分析した。（ｄ）ＴＧ９８Ｇ Ｃｏ及びＧＳＫ Ｓ９Ａの成長曲線を示す。（ｅ）ＩＬＫ阻害剤（ＫＰ−ＳＤ１、１０μＭ）は、α−Ａｐｏ−１（２μｇ／ｍｌ）及びＬＺ−ＣＤ９５Ｌで誘発された（５ｎｇ／ｍｌ）Ｔ９８Ｇ細胞の遊走を阻害した。（ｆ）ＰＩＬ３Ｋ阻害剤（ＬＹ ２９００５９、２５μＭ）は、α−Ａｐｏ−１で誘発されたＡＫＴの活性化、及びＴ９８Ｇ細胞におけるＧＳＫ３βの阻害を阻害する。（ｇ）活性β−カテニン（緑）を、α−Ａｐｏ−１（１μｇ／ｍｌ）での刺激に対して核に転位し、ホスホ−ＧＳＫ３β（赤）は、ＣＤ９５刺激に対して変化しなかった。ＤＡＰＩ（青）を、Ｔ９８Ｇ細胞における核を視覚化するために使用した。（ｈ）Ｔ９８Ｇ、ＬＮ１８及びＪｕｒｋａｔ１６（Ｊ１６）におけるカスパーゼ−８の開裂を、ウェスタンブロット法によるＣＤ９５刺激に対して検出した。（ｉ）ＥＲＫ阻害剤（ＰＤ ９８０５９、２５μＭ）は、ＣＤ９５で誘発された遊走を妨害しなかった。結果は、平均±標準誤差、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１として示され、かつ２つの独立した実験を示す。Ｐ：リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）、Ｔ：合計（ｔｏｔａｌ）。
【００４３】
図４：原発神経膠芽腫におけるＣＤ９５／ＣＤ９５Ｌ系の発現
原発星状細胞腫、乏突起細胞腫及び神経膠芽腫の細胞系におけるＣＤ９５表面発現のＦＡＣＳ分析は、低い継代（≦４）を有する。ＤＮＡの断片化のために、細胞を、ＬＺ−ＣＤ９５Ｌ（ＣＤ９５Ｌ）の指示投与量で、２４時間及び４８時間処理し、そしてＦＡＣＳによって分析した。
【００４４】
図５：アポトーシス耐性原発神経膠芽腫におけるＣＤ９５／ＣＤ９５Ｌ系の機能
（ａ）原発ＮＣＨ（８９、１２５及び２７０）神経膠芽腫の細胞系におけるＣＤ９５表面発現のＦＡＣＳ分析は、より高く継代した（≧５０）。ＤＮＡの断片化のために、細胞を、ＬＺ−ＣＤ９５Ｌ（ｎｇ／ｍｌ）の指示投与量で、２４時間及び４８時間処理し、そしてＦＡＣＳによって分析した。結果を、平均±標準誤差として示し、そして３つの独立した実験を示す。（ｂ）ＮＣＨ８９、１２５及び２７０細胞は、定量リアルタイムＰＣＲによって検出されたようなα−Ａｐｏ−１（１μｇ／ｍｌ）処理の４０時間後のＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９のｍＲＮＡレベルの上方制御を示した。結果は、平均±標準誤差、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００５として示され、かつ３つの独立した実験を示す。（ｃ）ＮＣＨ８９、１２５及び２７０細胞のための遊走アッセイは、α−Ａｐｏ−１（０．１μｇ／ｍｌ＋タンパク質Ａ）で処理した。結果は、平均±標準誤差、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１として示され、かつ２つの独立した実験を示す。
【００４５】
図６：Ｔ９８Ｇ及び原発神経膠芽腫細胞におけるγ−放射線照射で誘発された遊走
（ａ＋ｂ）Ｔ９８Ｇ細胞を、指示投与量でγ−放射線照射し、そしてＣＤ９５及びＣＤ９５Ｌ（ａ）、並びにＭＭＰ−２及び−９（ｂ）のｍＲＮＡレベルを、４０時間後に定量リアルタイムＰＣＲによって測定した。結果を、平均±標準誤差、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１として示し、かつ３つの独立した実験を示す。（ｃ＋ｄ）γ−放射線照射に対するＴ９８Ｇ（ｃ）及び原発ＮＣＨ細胞（ＮＣＨ１２５、２７０及び８９）（ｄ）における遊走の誘発。ＣＤ９５Ｌに対する中和抗体（Ｎｏｋ１、１０μｇ）は、γ−放射線照射で誘発される遊走を阻害した。結果は、平均±標準誤差、*Ｐ＜０．０５として示され、かつ２つの独立した実験を示す。（ｅ）放射線治療後の９つの異なる再発性神経膠腫のＣＤ９５Ｌスコアリング。腫瘍に毎に３つの領域を分析し、そしてＣＤ９５Ｌ陽性細胞を数え、そしてスコアは、陽性細胞数によって割り当てた。分析された再発性腫瘍は、ＮＣＨ ９０７、２０２、９１０、８６０、６５５、４０８、３０、３８８及び７１５であった。（ｆ）染色を、ＣＤ９５Ｌ、ＣＤ９５及びＭＭＰ９に関する続発の再発性腫瘍組織切片に対して、並びにＧＦＡＰ（緑）及びＣＤ９５Ｌ（赤）に関して二重染色を実施した。
【００４６】
図７：ＣＤ９５及びＣＤ９５Ｌは、インビボでネズミの神経膠腫細胞に対して上方制御され、遊走を誘発する
（ａ）原発ＧＢＭのＣＤ９５Ｌに関する免疫組織化学上の染色をした。（ｂ−ｃ）ネズミの神経膠腫細胞系ＳＭＡ−５６０に対するＣＤ９５及びＣＤ９５Ｌの表面発現を、通常の細胞培養条件下で、スフェロイドの形成後又は頭蓋内移植後に、測定した。前記の条件下でのＣＤ９５（ｂ）及びＣＤ９５Ｌ（ｃ）（ＢＤ ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ ＰｒｏからのＧｅｏＭｅａｎ）の変化を、細胞培養条件下での発現レベルまで正常化させた。結果は、３つの独立した実験を示し、平均±標準誤差、*Ｐ＜０．０５として示される。（ｄ）スフェロイド培養物を、コラーゲンマトリックス中で包埋し、そしてＣＤ９５（Ｊｏ２）に対する抗体、ＣＤ９５Ｌ（ＭＦＬ３）に対する中和抗体、又は適切なアイソタイプコントロール抗体で、指示濃度で処理した。細胞の遊走を、４８時間にわたって観察し、そしてスフェロイドの境界までの細胞の距離を、示した（ｎ＝１０（細胞）、治療毎に３スフェロイド）。（ｅ）実験の構成。ＭＦＬ３又は適切なアイソタイプコントロールで処理後のコラーゲン中への腫瘍外植体の遊走は、前記で記述されたように示される（ｎ＝１０（細胞）、治療毎に３スフェロイド）。（ｆ）ＭＦＬ３又はアイソタイプコントロール抗体で処理されたＶｍ／Ｄｋマウスの対側半球におけるＳＭＡ−５６０細胞数を、計数し、そして腫瘍表面に対して中和した。示される結果は、２つの独立した実験を示し、平均±標準誤差、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．００１として示される。
【００４７】
図８：ＧＳＫ３βの阻害は、カスパーゼに依存しない
（ａ）ＧＳＫ３βを、リン酸化し、そしてそれによって、Ｔ９８Ｇ及びＬＮ１８細胞中でＬＺ−ＣＤ９５Ｌ（５ｎｇ／ｍｌ）での処理に対して阻害する。（ｂ）カスパーゼ阻害剤ｚＶＡＤ−ｆｍｋ（４０μｇ）でのプレインキュベーションは、α−Ａｐｏ−１（２μｇ／ｍｌ）で誘発されたＧＳＫ３βの阻害を妨害しなかった。（ｃ）ｓｉＲＮＡでのＰＥＤノックダウンは、ＥＲＫの活性を阻害するが、しかしα−Ａｐｏ−１で誘発されたＧＳＫ３βの阻害を変化しなかった。結果は、２つの独立した実験を示す。
【００４８】
図９：原発神経膠芽腫におけるＣＤ９５／ＣＤ９５Ｌ系の発現及び機能
（ａ−ｂ）高い継代（≧５０）を有する原発神経膠芽腫の細胞系（ＮＣＨ８２、３７、１２５、１４９、８９、１５６、２７０及び１９９）におけるＣＤ９５表面発現をＦＡＣＳ分析した。ＤＮＡの断片化のために、細胞を、ＬＺ−ＣＤ９５Ｌ（ｎｇ／ｍｌ）の指示投与量で、２４時間及び４８時間処理し、そしてＦＡＣＳによって分析した。結果は、平均±標準誤差として示され、かつ２つの独立した実験を示す。（ｃ）ヒトの腫瘍組織におけるＣＤ９５及びＣＤ９５ＬのｍＲＡＮレベルは、定量リアルタイムＰＣＲによって決定した。結果は、２つの独立した実験を示す。
【００４９】
図１０：原発神経膠芽腫の遊走に対する放射線照射の影響
原発神経膠芽腫の細胞系（ＮＣＨ３４２、３５４、３５７、３７８、４１７、４１９及び２４２１）におけるＣＤ９５表面発現のＦＡＣＳを分析した。ＣＤ９５Ｌに対する中和抗体（Ｎｏｋ１、１０μｇ）によって阻害されうる、γ−放射線照射に対する、それら原発ＮＣＨ細胞において、遊走を誘発した。結果は、平均±標準誤差、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００５として示され、かつ２つの独立した実験を示す。
【００５０】
図１１：ＭＭＰによるアポトーシス耐性細胞のＣＤ９５トリガー侵襲
（Ａ）神経膠芽腫の細胞系Ｔ９８Ｇ及びＬＮ１８を、ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４、スタウロスポリン（Ｓｔ．、１μＭ）又は未処理のまま（Ｃｏ）の指示濃度でインキュベートした。２４時間後に、ＤＮＡの断片化を、ＦＡＣＳによって分析した（上のパネル）。Ｔ９８Ｇ及びＬＮ１８におけるＣＤ９５表面発現をＦＡＣＳ分析した（下のパネル）。（Ｂ）Ｔ９８Ｇ及びＬＮ１８細胞を、ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４で処理し、又は未処理のままで、８μｍの孔サイズを有するボイデンチャンバーによって、単細胞の遊走を検出した。（Ｃ）Ｔ９８Ｇ細胞を、ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４で、２４時間処理し、又は未処理のままにした。その後、ＭＭＰ−９活性を、ゲルザイモグラフィーによって評価した。（Ｄ及びＥ）Ｔ９８Ｇ及びＬＮ１８を、α−Ａｐｏ−１で４８時間処理し、又は未処理のままにした。ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の発現を、定量リアルタイムＰＣＲによって測定した。データは、平均±標準誤差、*Ｐ＜０．０５として、５回の独立した実験から得られる。（Ｆ）Ｔ９８Ｇ細胞を、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９に対してｓｉＲＮＡプール（ｓｈＭＭＰ）で、又はリポフェクタミンのみ（Ｌｉｐｏ）で、形質移入した。形質移入の４８時間後に、細胞を、ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４で処理し、その後４８時間、遊走を、二次元遊走アッセイ中で測定した。（Ｇ）定量−ＲＴ−ＰＣＲによって測定されたＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の発現。結果は、平均±標準誤差、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．００１、***Ｐ＜０．０００１として示され、かつ少なくとも２つの独立した実験を示す。
【００５１】
図１２：ＭＭＰによる原発アポトーシス耐性神経膠腫細胞のＣＤ９５トリガー侵襲
（Ａ）短期間培養した細胞系ＮＣＨ８９、１２５及び２７０を、ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４、スタウロスポリン（Ｓｔ．、１μＭ）又は未処理のまま（Ｃｏ）の指示濃度でインキュベートした。２４時間後に、ＤＮＡの断片化を、ＦＡＣＳによって分析した（上のパネル）。ＮＣＨ８９、１２５及び２７０におけるＣＤ９５表面発現のＦＡＣＳ分析（下のパネル）。（Ｂ）ＮＣＨ細胞を、α−Ａｐｏ−１で４８時間処理し、又は未処理のままで、８μｍの孔サイズを有するボイデンチャンバーによって、単細胞の遊走を検出した。結果は、平均±標準誤差、*Ｐ＜０．０１として示され、かつ３つの独立した実験を示す。（Ｃ及びＤ）ＮＣＨ８９、１２５及び２７０細胞を、α−Ａｐｏ−１で、４８時間処理した。ＭＭＰ−２（Ｃ）及びＭＭＰ−９（Ｄ）の発現を、定量リアルタイムＰＣＲによって測定した。（Ｅ）ＮＣＨ１２５細胞を、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９に対してｓｉＲＮＡプール（ｓｈＭＭＰ）で、又はリポフェクタミンのみ（Ｌｉｐｏ）で、形質移入した。形質移入の４８時間後に、細胞を、ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４で処理し、遊走を、４８時間後に二次元遊走アッセイ中で測定した。（Ｆ）定量−ＲＴ−ＰＣＲによって測定されたＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の発現。結果は、平均±標準誤差、*Ｐ＜０．００５、**Ｐ＜０．００１、***Ｐ＜０．０００１として示され、かつ少なくとも２つの独立した実験を示す。
【００５２】
図１３：ＣＤ９５は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ＧＳＫ３β経路によって遊走を誘発する
（Ａ）ＡＫＴ及びＥＲＫのリン酸化を、ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４で指示時点での処理に対してＴ９８Ｇ及びＬＮ１８細胞において示す。（Ｂ）ＮＣＨ８９中ではなく、Ｔ９８Ｇ、ＬＮ１８、並びにＮＣＨ１２５及び２７０細胞中で、ＡＫＴのリン酸化は、それぞれ、ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４での刺激後に、濃度依存の鐘形を呈した。（Ｃ）Ｔ９８Ｇ細胞において、ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４（１０ｎｇ／ｍｌ）及びα−Ａｐｏ−１（１μｇ／ｍｌ）での処理は、ＧＳＫ３βのリン酸化を誘発した。ＧＳＫ３β阻害の速度論は、鐘形曲線を呈した。（Ｄ）Ｔ９８Ｇ細胞を、空のレンチウィルスベクター（Ｃｏ）又は構成的に活性ＧＳＫ３β突然変異体（ＧＳＫ Ｓ９Ａ）で感染させた。３６時間で、Ｔ９８Ｇ細胞を感染させたＧＳＫ Ｓ９Ａは、α−Ａｐｏ−１又はＣＤ９５Ｌでの処理に対して、それらの空のベクターの対応品よりも極めて低く遊走した。ＣＤ９５Ｌに対する中和抗体（Ｎｏｋ１）は、ベクター及びＧＳＫ Ｓ９Ａで感染された細胞のＣＤ９５Ｌで誘発された遊走を阻害する。（Ｅ）ｂ−カテニンは、ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４（１０ｎｇ／ｍｌ）での処理の３０分後に、Ｔ９８Ｇ細胞の細胞質ゾル中で蓄積した。（Ｆ）活性ｂ−カテニン（緑）は、α−Ａｐｏ−１での刺激に対して、核中へ転位する。ＤＡＰＩ（青）及びＰ−ＧＳＫ３β（赤）を、核及び細胞質ゾルを視覚化するために、それぞれＴ９８Ｇ細胞中で使用した。（Ｇ及びＨ）ｂ−カテニン／ＴＣＦ転写レポーター（ＴＯＰ−ＦＬＡＳＨ；Ｇ）を有するＴ９８Ｇの一時的なトランスフェクションの２４時間後に、コントロールプラスミド（ＦＯＰ−ＦＬＡＳＨ；Ｇ）、又はＮＦｋＢ−レセプター構成体（ＮＦｋＢ−Ｌｕｃ；Ｈ）細胞を、ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４（Ｇ及びＨ）、ＬｉＣｌ（Ｇ）で処理し、又は未処理のままにした（Ｇ及びＨ）。ルシフェラーゼ活性を、１２時間（Ｇ）又は８時間（Ｈ）後にアッセイし、そしてウミシイタケルシフェラーゼ発現に対して中和した。結果は、平均±標準誤差、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．００１、***Ｐ＜０．０００１として示され、かつ２つの独立した実験を示す。Ｐ：リン酸化、Ｔ：合計。
【００５３】
図１４：Ｓｒｃ及びｐ８５はＡＫＴを活性化するためのＣＤ９５に関連する
（Ａ及びＢ）ＬＮ１８及びＴ９８Ｇ細胞を、指示時点及び濃度に関してＣＤ９５Ｌ−Ｔ４で刺激した。左のパネルに関して、ＣＤ９５を免疫沈降し、その免疫沈降物を、抗ｐ８５、抗ＣＤ９５、及び抗Ｓｒｃ抗体でイムノブロットした。中央のパネルに関して、ｐ８５を免疫沈降し、そして、その免疫沈降物を、抗ｐ８５及び抗ＣＤ９５抗体で調べた。タンパク質Ａビーズを、ネガティブコントロールとして含む。抗ｐ８５、抗ＣＤ９５及び抗Ｓｒｃで調べられた全ての細胞溶解産物（ＷＣＬ）を、右のパネルで示す。（Ｃ）Ｔ９８Ｇ細胞を、指示時間及び濃度で、ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４で処理した。ＣＤ９５を免疫沈降し、そして免疫沈降物を、抗Ｙｅｓ抗体でイムノブロットした。（Ｄ）Ｔ９８Ｇ及びＮＣＨ１２５細胞を、ＹｅｓもしくはＦｙｎに対してｓｉＲＮＡで、又はリポ−フェクタミンのみ（Ｌｉｐｏ）で形質移入した。形質移入の２４時間後に、細胞を、ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４で処理し、その後７２時間、遊走を、二次元遊走アッセイ中で測定した。（Ｅ）定量リアルタイムＰＣＲによって測定されたようなＹｅｓ−ｍＲＮＡの発現、及びＦＡＣＳ分析によって評価されたようなＹｅｓタンパク質レベルを示す。（Ｆ）Ｔ９８Ｇ及びＮＣＨ１２５細胞を、Ｙｅｓ、Ｙｅｓ過剰発現プラスミド（ｐＣＭＶ−Ｙｅｓ）又は双方に対してｓｉＲＮＡで形質移入した。形質移入の７２時間後に、細胞を、ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４で処理し、その後２４時間、遊走を、二次元遊走アッセイ中で測定した。（Ｇ）Ｙｅｓ ｓｉＲＮＡ及びＰＩ３Ｋ阻害剤（ＬＹ ２９００５９）は、ＣＤ９５で誘発されたＡＫＴのリン酸化を阻害した。Ｐ：リン酸化、Ｔ：合計、*：特異的バンド、ｎ．ｓ．：非特異的バンド。
【００５４】
図１５：適切な耐神経膠腫細胞における非効率的なＤＩＳＣ形成
（Ａ）ＨＡＰＴＥＮ（ＰＴＥＮ）又は空のベクター（Ｍｏｃｋ）でのＴ９８Ｇ及びＮＣＨ１２５の一時的な形質移入の４８時間後に、細胞をＣＤ９５Ｌ−Ｔ４（５００ｎｇ／ｍｌ）で処理した。ＰＴＥＮ−過剰発現細胞における細胞死の検出のために、ＨＡタグに対して細胞内ＦＡＣＳ染色を実施した。その後、前方側面散乱分析を、ＨＡ正細胞中で実施した。結果は、平均±標準誤差として示され、かつ２つの独立した実験を示す。（Ｂ）Ｔ９８Ｇ細胞を、１時間、α−Ａｐｏ−１、ｚＶＡＤ−ｆｍｋ、ｚＶＡＤ−ｆｍｋとα−Ａｐｏ−１との組合せで処理し、又は未処理のまま（Ｃｏ）にした。ＧＳＫ３βのリン酸化を、ウェスタンブロットで分析した。（Ｃ）Ｔ９８Ｇ、ＬＮ１８及びＪｕｒｋａｔ１６（Ｊ１６）におけるカスパーゼ−８の開裂を、ＣＤ９５刺激の５分後に、ウェスタンブロット分析によって検出した。（Ｄ）ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４で５分間処理したＴ９８Ｇ及びＬＮ１８細胞において、ＣＤ９５（上のパネル）又はカスパーゼ−８（下のパネル）を、免疫沈降した。その免疫沈降物を、抗ＦＡＤＤ抗体と抗ＣＤ９５（上のパネル）とで、及び抗ＣＤ９５と抗カスパーゼ−８（下のパネル）とでイムノブロットした。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ポジティブコントロールとして含んだ。（Ｅ）Ｔ９８Ｇ細胞を、Ｙｅｓ ｓｈＲＮＡ、又はネガティブコントロールとして非標的ｓｈＲＮＡで形質移入した。７２時間後に、細胞をＣＤ９５Ｌ−Ｔ４で処理し、又は未処理のままにし、そしてＣＤ９５の免疫沈降を実施し、そしてその免疫沈降物を、抗ＦＡＤＤ抗体でイムノブロットし、ＩｇＧ重鎖を、ローディングコントロールとして提供した。右に関しては、定量ＲＴＰＣＲによって分析されたノックダウンの効率を示す。（Ｆ）Ｔ９８Ｇ及びＬＮ１８細胞におけるＦＡＤＤ、Ｙｅｓ及びＦｙｎの量的発現を、ＦＡＣＳ分析によって測定した。結果は、平均±標準誤差、*Ｐ＜０．０５として示され、かつ３つの独立した実験を示す。ＭＦＩ：平均蛍光強度（ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）、Ｐ：リン酸化、Ｔ：合計。
【００５５】
図１６：神経膠芽腫における侵襲のＣＤ９５シグナルのための模型図
ＣＤ９５Ｌは、ＳｒｃファミリーメンバーのＹｅｓ、及びＰＩ３Ｋのｐ８５サブユニット（その２つのサブユニットｐ８５及びｐ１１０によって本明細書に示される）の漸増を、ＣＤ９５に誘発し、それによってＡＫＴを活性化する。活性化ＡＫＴは、ＧＳＫ３βをリン酸化及び不活性化し、核中へβ−カテニンの転位を可能にし、その際、それはＭＭＰの転写を誘発する。このシグナル経路を、Ｙｅｓに対してｓｉＲＮＡ、もしくはＭＭＰ−２及び−９、ＰＩ３Ｋ特異性阻害剤（Ｌｙ２９００５９）によって、又はＧＳＫ３βの優性活性変異体（Ｓ９Ａ）でのレンチウィルス感染によって阻害することができた。
【００５６】
図１７：ＧＢＭの臨床試料におけるＣＤ９５Ｌ、Ｙｅｓ及びＰｈｏｓｐｈｏ−Ｓｒｃの発現
（Ａ）原発ヒトＧＢＭにおけるＣＤ９５Ｌ（赤）の典型的な免疫組織化学的染色。より充実性の腫瘍領域（Ａ．ａ*）又は脳実質（Ａ．ｃ）と比較して、腫瘍／宿主の境界面（Ａ．ｂ）でＣＤ９５Ｌの増加された発現に注目する。（Ｂ）リン酸化Ｓｃｒファミリー酵素（ｐ−Ｓｒｃ；Ｂ．ａ、ｅ、ｆ）及びＹｅｓ（Ｂ．ｂ、ｄ、ｇ、ｈ）の免疫組織化学的染色。Ｂ．ａ−ｄは、腫瘍浸潤領域の概要であり、Ｓｒｃの激しいリン酸化、並びに腫瘍／宿主境界（左）、及び充実性腫瘍領域において低減された又は全くないｐ−Ｓｒｃ（右*）の領域におけるＹｅｓの発現を示す。Ｙｅｓ発現は、腫瘍／宿主の境界面（Ｂ．ｂ、ｄ及びｇ）で、及び散乱充実性腫瘍領域（Ｂ．ｈ）において見出された。充実性腫瘍領域（Ｂ．ｆ）及び浸潤領域（Ｂ．ｅ）における腫瘍細胞におけるＳｒｃの強リン酸化。
【００５７】
図１８：ＣＤ９５及びＣＤ９５Ｌは、インビボでネズミの神経膠腫細胞に対して上方制御され、遊走を誘発する
（Ａ及びＢ）ネズミの神経膠腫細胞系ＳＭＡ−５６０に対するＣＤ９５及びＣＤ９５Ｌの表面発現を、通常の細胞培養条件下で、スフェロイドの形成後又は頭蓋内移植後に、測定した。変化を、細胞培養条件のレベルまで中和した。結果は、３つの独立した実験を示し、平均±標準誤差、*Ｐ＜０．０５として示される。（Ｃ）スフェロイド培養物を、コラーゲンマトリックス中で包埋し、そしてＣＤ９５に対する抗体（Ｊｏ２）、ＣＤ９５Ｌに対する中和抗体（ＭＦＬ３）、又は適切なアイソタイプコントロール抗体で、指示濃度で処理した。細胞の遊走を、４８時間にわたって観察し、そしてスフェロイドの境界までの細胞の距離を、示した（ｎ＝１０（細胞）、治療毎に３スフェロイド）。（Ｄ）実験の構成。ＭＦＬ３又は適切なアイソタイプコントロールで処理後のコラーゲン中への腫瘍外植の遊走を、前記で記載したように示す（ｎ＝１０、治療毎に３スフェロイド）。（Ｅ）ＧＦＰ−免疫染色されたアイソタイプ−又はＭＦＬ３−で処理されたＳＭＡ腫瘍の典型的な図。腫瘍支持面（同側）及び対側半球を示す。ＭＦＬ３又はイソタイプコントロール抗体で処理されたＶｍ／Ｄｋマウスの対側半球におけるＳＭＡ−５６０細胞（ＧＦＰポジティブ）数を、計数し、そして腫瘍領域に対して中和した。示される結果は、２つの独立した実験を示し、平均±標準誤差、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．００１として示される。尺度バー：１００μｍ。
【００５８】
図１９：ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４の発生
逆平行β−ストランドを形成する、ＴＲＡＩＬ−ＲＢＤ内でのＮ−及びＣ−末端のアミノ酸の局在化。（Ａ）ＴＲＡＩＬ−ＲＢＤ−構造（Ｎ末端：緑、Ｃ末端：赤）の腫脹。（Ｂ）ＴＲＡＩＬ−ＲＢＤの構造内でのＮ−及びＣ−末端の位置。上の列：ＴＲＡＩＬ−ＲＢＤの重心軸の側面図。下の列：ＴＲＡＩＬ−ＲＢＤの重心軸の上面図。左から右：一量体、二量体及び三量体。（Ｃ）ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４のアミノ酸配列。シグナルペプチドは、下線（Ｍｅｔ１〜Ｇｌｙ２０）である。ＣＤ９５Ｌ−ＲＢＤのＮ末端（緑の矢印）及びＣ末端のアミノ酸（赤の矢印）が、逆平行β−ストランドを形成することを提案される。Ｔ４フォルドン（Ｆｏｌｄｏｎ）配列を、青で印字する（イタリック体）。（Ｄ）ＴＲＡＩＬ−Ｔ４−ＤＲ５複合体の模型。上の列：ＴＲＡＩＬ−ＲＢＤ（濃青）の上方に配置させたＴ４−フォルドン（淡青）を有するＴＲＡＩＬ−ＤＲ５共複合体の側面図。そのＤＲ５鎖を、濃赤で色付けする。ＴＲＡＩＬ−ＲＢＤのＮ末端及びＴ４−フォルドンのアミノ酸を、緑で色付けし、Ｃ末端のアミノ酸を、赤で色付けする。上の列：ＴＲＡＩＬ−ＲＢＤの重心軸の側面図。下の列：ＴＲＡＩＬ−ＲＢＤの重心軸の上面図。左：リボン模型。右：表面模型。（Ｅ）ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４のアフィニティー精製。ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４を含有する一時的に形質移入させたＨｅｋ２９３Ｔ細胞からの上清を、ストレプタクチン セファロースを使用して、アフィニティー精製した。その後、特にデスチオビオチンによって溶出されたタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色によって分析した。ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４の位置を、矢印によって示す。ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４は、約３０ｋＤａの見かけの分子量を示す。２３ｋＤａの理論上の分子量に対する差は、おそらくグリコシル化による。（Ｆ）サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による精製されたＣＤ９５Ｌ−Ｔ４の分析。天然の見かけの分子量の決定のために、ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４を、ＳＥＣによって、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムを使用して分離した。そのグラフは、ストレプタクチン精製されたＣＤ９５Ｌ−Ｔ４の溶出分布（ＯＤ２８０ｎｍ）を示す。ＳＥＣ（Ｂを参照）から採取された画分Ｂ３〜Ｃ２を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色によって分析した。（Ｇ）見かけの分子量の決定。指示タンパク質の保持用量に基づく、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムの較正曲線。ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４の見かけの天然の分子量は、９０．３ｋＤａであり、安定な三量体タンパク質を示す。ＡＰＧ１０１は、Ｊｕｒｋａｔ細胞においてＣＤ９５Ｌ−Ｔ４の活性を誘発するアポトーシスを弱める。（Ｈ）ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４は、カスパーゼ３／７活性における増加によって示されるような、投与量依存の方法で、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるアポトーシスを誘発する。ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４三量体を架橋する抗体の抗ＳｔｒｅｐＭＡＢ１０μｇ／ｍｌの添加は、アポトーシスの程度を増大する。（Ｉ）Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＣＤ９５Ｌ−Ｔ４の２５０ｎｇ／ｍｌの活性を誘発するアポトーシスを、投与量依存方法でＡＰＧ１０１によって弱める。
【００５９】
図２０：ＣＤ９５／ＣＤ９５Ｌ系及び原発神経膠芽腫におけるアポトーシスに対する感受性
（Ａ及びＢ）高い継代（≧５０）を有する原発神経膠芽腫の細胞系（ＮＣＨ８２、３７、１２５、１４９、８９、１５６、２７０及び１９９）におけるＣＤ９５表面発現のＦＡＣＳ分析。ＤＮＡの断片化のために、細胞を、ＣＤ９５Ｌ（ｎｇ／ｍｌ）の指示投与量で、２４時間及び４８時間処理し、そしてＦＡＣＳによって分析した。結果は、平均±標準偏差として示され、かつ２つの独立した実験を示す。（Ｃ）定量リアルタイムＰＣＲによって決定された、ヒト腫瘍組織におけるＣＤ９５及びＣＤ９５ＬのｍＲＮＡレベル。結果は、２つの独立した実験を示す。
【００６０】
図２１：ＣＤ９５で媒介されたＰＩ３Ｋ活性の修飾物質
（Ａ）ＬＮ１８細胞を、ＣＤ９５Ｌに対する中和抗体（Ｎｏｋ１）を有する、又は有さない、ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４、α−Ａｐｏ−１、スタウロスポリン（Ｓｔ．、１μＭ）、又は未処理のまま（Ｃｏ）の指示濃度でインキュベートした。２４時間及び４８時間後に、ＤＮＡの断片化を、ＦＡＣＳによって分析した。（Ｂ）Ｔ９８Ｇ及び短期間で培養された細胞系、ＮＣＨ８９及び１２５を、α−Ａｐｏ−１、スタウロスポリン（Ｓｔ．、１μＭ）、又は未処理のまま（Ｃｏ）の指示濃度でインキュベートした。２４時間及び４８時間後に、ＤＮＡの断片化を、ＦＡＣＳによって分析した。（Ｃ）ＮＣＨ１２５及びＮＣＨ２７０細胞を、４８時間ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４で処理し、又は未処理のままで、８μｍの孔サイズを有するボイデンチャンバーによって、単細胞の遊走を検出した。（Ｄ）Ｔ９８Ｇ細胞におけるＧＳＫのリン酸化は、細胞内ＦＡＣＳ染色によって測定した。（Ｅ）ＧＳＫ Ｓ９Ａで感染させたＴ９８Ｇ細胞及びそれぞれのコントロールを、ＣＤ９５Ｌ（ｎｇ／ｍｌ）の指示投与量で４８時間刺激し、そしてＤＮＡの断片化を、ＦＡＣＳによって分析した。Ｔ９８Ｇ Ｃｏ及びＧＳＫ Ｓ９Ａの成長曲線を示す。（Ｆ）Ｔ９８Ｇ及びＮＣＨ１２５細胞を、ＹｅｓもしくはＦｙｎに対してｓｉＲＮＡで、又はリポ−フェクタミンのみ（Ｌｉｐｏ）で形質移入した。定量−ＲＴ−ＰＣＲによって測定されたＦｙｎの発現を示す。結果を、平均±標準偏差、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．００１、***Ｐ＜０．０００１として示す。
【００６１】
図２２：表１
【００６２】
詳細な説明
ＣＤ９５／ＣＤ９５Ｌ複合体が、アポトーシスを誘発することが、一般的に評価されている18。しかしながら、ＣＤ９５が、アポトーシス非依存法、例えば増殖、血管形成、線維化、及び炎症を媒介することができることが、成長の証拠である19,20。ルイス肺癌腫細胞におけるＣＤ９５の過剰発現は、インビボでの腫瘍細胞の生存の利点をもたらす21。同様の点で、ＣＤ９５のトリガーは、神経膠腫細胞における細胞循環のプログレッションを動因することが報告されている22。悪性星状細胞腫において、ＣＤ９５結紮は、炎症促進性ケモカインの発現及び血管形成を促進した23-25。本明細書で、神経膠芽腫におけるＣＤ９５のトリガーが、最終的に侵襲性を増加することを導くシグナル伝達現象のカスケードを誘導することを報告している。ＣＤ９５で誘発される遊走を、培養された尿細管細胞中で最初に観察し26、そして卵巣、乳房、肺及び腎臓の腫瘍細胞に関して最近報告している13。後者の研究において、血清勾配を、細胞遊走を起こしかつ方向付けるために、ＣＤ９５刺激に加えた13。一方、神経膠芽腫細胞は、それらの侵襲する傾向のある表現型によって特徴付けられ、かつ付加刺激の不在下で遊走する。
【００６３】
従って、本発明は、インビトロ、エクスビボ及びインビボで、ＣＤ９５活性の独占的な中和によるより高い侵襲性神経膠芽腫の挙動を阻害する方法に関する。本発明は、例えば、ＣＤ９５に結合する抗体を使用することによって、又はＣＤ９５遺伝子発現もしくはＣＤ９５ｍＲＮＡ転写翻訳を低下調節することもしくは阻害することによって、ＣＤ９５活性を中和する、又はそうではなく阻害するための、あらゆる方法又は機構を熟考する。
【００６４】
周囲正常脳中へ侵略する及び広がるために、腫瘍細胞は、フィブロネクチン、ラミニン、及びＩＶ型コラーゲンを含む細胞外マトリックスの消化構成成分を要求する。ＥＣＭ劣化酵素の最も特徴付けられたファミリーは、ＭＭＰファミリーである。ＭＭＰ９不足の神経膠芽腫は、インビトロ及びインビボでより低い侵襲性である27。神経膠芽腫は、低グレード神経膠腫及び正常脳組織よりも、極めて高いレベルのＭＭＰ９をもたらす27。ＭＭＰ９のレベルは、ヌードマウスにおいて頭蓋内に移植させた神経膠芽腫細胞の成長中に増加した28。それらのプロテアーゼは、腫瘍細胞の生存を促進する微小環境を確立し維持する役割も有する。従って、ＭＭＰは、腫瘍血管形成、及び内胚葉細胞と神経膠腫細胞との混合培養物における毛細管様構造を低減させたＭＭＰ９の阻害を調整する27。同様の特徴は、ＣＤ９５Ｌ発現に適用する：（ｉ）レベルが悪性度の程度に正に関連する23,29,30、（ｉｉ）レベルが頭蓋内接種後に増加する、（ｉｉｉ）ＧＢＭのヒト献体において、その選択的局在化の１つは腫瘍血管である。
【００６５】
本明細書で、本発明は、ＣＤ９５のトリガーが、確立された神経膠芽腫細胞系及び原発性培養物におけるＭＭＰ９及びＭＭＰ２のｍＲＮＡ発現並びにＭＭＰ２のノックダウンを増加し、かつＭＭＰ２は、ＣＤ９５で誘発される遊走を阻害することを論証する。
【００６６】
ＭＭＰ９のプロモーター領域は、ＡＰ−１、ＮＦκＢ、Ｓｐ１及びＡＰ−２のための推定結合部位を含有する31。ＡＰ−１転写複合体は、ＭＭＰ９の刺激転写の本質的な役割を果たす31,32。神経膠芽腫細胞においてＭＭＰ９の転写をもたらすＡＰ−１は、ＰＩ３Ｋ／ＩＬＫ／ＧＳＫ経路の下流であり9,10、又は代わりにＥＲＫ及びＪＮＫ活性を要求してよい33ことを以前に報告している。
【００６７】
ＡＰ−１転写複合体の推定構成要素のｃ−Ｊｕｎは、最も高く誘発されるＴＣＦ／β−カテニンの標的遺伝子の１つとして識別されている36,37。本明細書で報告されているようなＧＳＫ３βの阻害は、非リン酸化β−カテニンを核中へ蓄積及び転位することを可能にし、その際それは、ＴＣＦ／Ｌｅｆファミリーの転写因子のためのコファクターとして機能する35。加えて、ＮＦκＢの活性を、附随して観察した。ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４がＥＲＫ活性を低下するために、Ｔ９８Ｇ細胞において、ＡＫＴが、ＩＫＫキナーゼのリン酸化／活性化によってＮＦκＢ活性を調整し、その結果ＩκＢをリン酸化し、かつ活性化されたＮＦκＢの放出を可能にすると考えられている。代わりにＩκＢは、ｐ６５サブユニットをトランス活性化することができる64。対照的に、内胚葉又は中胚葉起源の腫瘍細胞系の以前に報告されている運動性及び侵襲性の誘発は、ＥＲＫ、ＮＦκＢ及びカスパーゼ−８活性を含む。
【００６８】
対照的に、神経膠芽腫細胞のＣＤ９５Ｌでの処理は、ＥＲＫ活性もカスパーゼ−８開裂もトリガーしない。ＣＤ９５で媒介された神経膠芽腫細胞の侵襲は、ＥＲＫ又は一般のカスパーゼ阻害によって阻害されることができなかった。代わりに、神経外胚葉起源からのそれらの細胞において、侵襲性を、ＰＩ３Ｋ−、ＩＬＫ−阻害剤によって、及びＧＳＫ３βの優性活性型によって阻害されることができるように、ＰＩ３Ｋ／ＩＬＫ／ＧＳＫ経路によって調整した。ＰＩ３Ｋ活性は、ＥＲＫによってＭＭＰ９の発現をさらに増加する上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）の会合のためにも要求される34。従って、ＣＤ９５で媒介されたＰＩ３Ｋの活性は、ＥＧＦＲによってＭＭＰ９活性における付加増加を促進する。従って、ＣＤ９５の活性化は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ＧＳＫ３β／β−カテニン／ＭＭＰ及び／又はＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ＮＦκＢ／ＭＭＰ経路による遊走／侵襲を誘発する。
【００６９】
ＧＳＫ３βは、腺腫性結腸ポリープ症（ＡＰＣ）腫瘍抑制タンパク質、アキシン（ａｘｉｎ）、及びβ−カテニンとの多タンパク質複合体において見出される。非刺激細胞において、ＧＳＫ３βは、β−カテニンをリン酸化し、ユビキチン化及び続く分解を行う35。ＧＳＫ３βの阻害は、この分解複合体を不安定にして、非リン酸化β−カテニンを、核に蓄積及び転位することを可能にし、その際、それは、Ｔ細胞因子／リンパ様増強性因子（ＴＣＦ／ＬＥＦ）ファミリーの転写因子のためのコファクターとして機能する35。ＡＰ−１転写複合体の推定構成要素のＣ−Ｊｕｎは、最も高く誘発されたＴＣＦ／β−カテニン標的遺伝子の１つとして識別されている36,37。
【００７０】
リン酸化ｃ−Ｊｕｎは、ＴＣＦ４と相互作用し、従って、ＪＮＫ及びＧＳＫ経路を統合することによって、腸管の腫瘍形成を調整することが最近見出されている。高い基礎的なＥＲＫ及びＪＮＫ活性と共にＧＳＫ３β阻害は、ＣＤ９５の腫瘍形成活性を決定することを仮定する。この点で、本発明は、リン酸化ＧＳＫ３βの高い基礎的なレベルが、ＣＤ９５の能力と正の相関関係があり、遊走を増加し（データは示されていない）、一方で、ＣＤ９５表面発現のレベルは、あらゆる影響を受けないことを見出した。従って、悪性神経膠腫は、より少ない悪性神経膠腫よりも、優れた非リン酸化β−カテニンの貯留を有さないことを示す（未出版データ）。
【００７１】
過去に、いくつかの報告が、ＣＤ９５で誘発されるシグナルにおけるチロシンリン酸化のための重要な役割を指摘している56,59。しかしながら、それらの予備報告は、ＣＤ９５で誘発されるチロシンリン酸化が、ＣＤ９５で媒介されるアポトーシスの前提条件であることが示唆された56,60,69。この点で、ホスファターゼＳＨＰ−１、ＳＨＰ−２及びＳＨＩＰは、ＣＤ９５と関連し、生存因子で開始される経路を打ち消すことが見出された54。ごく最近に、Ｓｒｃで誘発されるカスパーゼ−８のチロシンリン酸化は、ＣＤ９５で誘発されるアポトーシスを減退することが見出された53。現在、ＳｒｃファミリーメンバーＹｅｓ及びｐ８５とＣＤ９５との新しい会合を記載している。他のＴＮＦファミリーメンバーのＴＲＡＮＣＥは、ＰＩ３Ｋを、ｃ−Ｓｒｃ及びＴＲＡＦ６を含むシグナル複合体によって活性化する71。他のＳｒｃファミリーメンバーのＦｙｎの阻害は、ＣＤ９５で誘発された神経膠芽腫細胞の遊走を低減したが、重要ではない。これは、Ｆｙｎが、神経細胞におけるＥＧＦＲで媒介されたシグナル中で含まれ、かつＥＧＦＲが、ＣＤ９５との会合において見出されている神経膠腫の侵襲のための非常に重要なレセプターである事実によって説明されることができる。従って、ＣＤ９５で媒介されるシグナルの阻害は、ＥＧＦＲで媒介されるシグナルに、及びその逆に影響してよい。他のアダプター分子が、ＣＤ９５のＰＩ３Ｋ活性化複合体（ＰＡＣ）においてまだ失われていないかどうかは、今後の研究の問題のままである。代わりに、Ｙｅｓ及びｐ５８は、以前に認識された、ＣＤ９５のＤＤにおけるモチーフを含有するホスホチロシンによって、ＣＤ９５と直接相互作用してよい54。従って、Ｔ９８Ｇ細胞において、Ｙｅｓのノックダウンは、Ｙｅｓ及びＦＡＤＤがＣＤ９５に結合するために競争してよいことを示している、ＣＤ９５に対するＣＤ９５Ｌ−Ｔ４で誘発されるＦＡＤＤの漸増を可能にする。この点で、Ｙｅｓ発現レベルの分析は、ＬＮ１８細胞中よりも、Ｔ９８Ｇ中での非常に高い発現を示した。最も重要なことに、Ｙｅｓの発現及びＳｒｃファミリーキナーゼのリン酸化は、腫瘍侵襲におけるその介入を示す、ＧＢＭ臨床試料における腫瘍／宿主相互作用の部位で一貫して見出された。
【００７２】
Ｂａｒｎｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．（２００４）13は、外因性ＣＤ９５Ｌが、インビボで内胚葉起源からの腫瘍細胞の遊走を誘発することを以前に示した。これらの細胞において、ＣＤ９５Ｌは、カスパーゼ−８及びＥＲＫによって遊走を誘発する13。これらの著者は、ＣＤ９５Ｌが、化学療法及び放射線療法に対する腫瘍の回避を含んでよいことを推測している。それというのも、双方の治療は、ＣＤ９５Ｌの発現を増加するからである。我々の研究において、ＣＤ９５Ｌは、ＧＢＭ細胞の遊走も誘発することが見出された。これ以外に、本研究は、腫瘍生物学の分野において著しい概念的向上を示す。それというのも、以下のことを初めて示すからである：（ｉ）腫瘍細胞と周囲柔組織との独占的な相互作用が、腫瘍におけるＣＤ９５Ｌ、及び宿主細胞の発現を誘発し、（ｉｉ）ＧＢＭ細胞において、ＣＤ９５Ｌシグナルが、内胚葉起源の腫瘍細胞における場合に、Ｙｅｓ／ＰＩ３Ｋ／ＭＭＰによって侵襲し、及びカスパーゼ−８／ＥＲＫによって侵襲せず、（ｉｉｉ）ＣＤ９５活性の中和が、臨床環境を擬似したＧＢＭのマウス同系モデルにおいて、インビボでＧＢＭ細胞の基礎的な遊走を阻害する。さらに、この研究は、ＰＩ３Ｋシグナル構成要素の分子化学量論が、ＣＤ９５に対する細胞の応答を決定するようにみえることを示す。
【００７３】
以上をまとめると、本発明のデータは、ＷＨＯグレードＩＶの腫瘍が、ＣＤ９５で誘発されるアポトーシスに耐性があるが、しかしＣＤ９５の刺激に対してそれらの侵襲能力を増加することを示す。
【００７４】
ＧＢＭの放射線照射に対する公知の臨床耐性にもかかわらず、ＧＢＭのための最近の治療は、手術、続く放射線照射及びアジュバント化学療法を含む。標準放射線照射養生は、約６週間、附随する焦点的に指示された放射線治療で、１．８〜２Ｇｙの一日の割合で大抵与えられる６０Ｇｙの最適投与量を使用する。標的領域は、典型的にさらに２〜３ｃｍ端でＭＲＩ上で見られる増大された領域である38。この養生は、悪性神経膠腫における主な治療の失敗が、原腫瘍部位の２ｃｍ以内の約８０％〜９０％の場合で生じる腫瘍の再発である知識を基に発展してきている38。放射線は、細胞標的との直接相互作用によって、又は直接、細胞内の他の原子又は分子（例えば水）との相互作用による損傷を誘発し、間接的に危険な構造に影響する遊離基をもたらす。さらに、放射線照射は、ある場合においてアポトーシスによって細胞を殺す、死レセプター及び死リガンドの発現を増加することを示している3。本発明は、神経膠芽腫細胞の放射線照射が、ＣＤ９５及びＣＤ９５Ｌのレベルを大いに増加することを証明している。それにもかかわらず、細胞は、放射線で誘発された損傷に対して耐性があるままである。その代わり、放射線照射された細胞は、より高いＣＤ９５Ｌ依存の遊走能力を呈することを示している。ＣＤ９５の独占的な刺激後にますます遊走しない細胞でさえもが、放射線照射後に遊走する。従って、追加の放射線照射で媒介されたＣＤ９５レベルの増加、又は全てのキナーゼ活性における可能な変化は、ＣＤ９５で誘発された遊走に対する細胞の感受性を与えてよい。この点で、治療のＸ−線照射は、しばしば治療後１０年以内での、神経膠腫を含む脳腫瘍のより高い危険度と決定的に関連した、ただ１つの環境因子である。最も重要なことに、ＣＤ９５及びＣＤ９５Ｌが、腫瘍内でほとんど発現されない原腫瘍と対照的に、ＣＤ９５及びＣＤ９５Ｌの再発性のＧＢＭ発現においては、劇的に増加した。インビボでのデータと一致して、ＣＤ９５Ｌポジティブ細胞の近くのアポトーシス細胞を検出しなかったが、しかし代わりにＭＭＰ９の増大された発現を検出した。
【００７５】
神経膠芽腫の侵襲を阻害するための現在の実験方法は、中和阻害剤ＴＩＭＰ２及びＴＩＭＰ４の発現によるＭＭＰ活性の阻害に焦点を合わせ、又は、アンチセンス方法によるＭＭＰ ｍＲＮＡの直接の遺伝子標的に依存する。しかしながら、ＴＩＭＰ２が、血管形成及び侵襲を低減する場合に、アポトーシスから腫瘍細胞も保護する40。ＭＭＰ製造を阻害するための他の方法は、腫瘍侵襲の誘発だけでなく、基本的な神経機能を同様に含む、それらの発現を導くシグナル形質導入経路を標的とすることを使用し、従って、臨床適用のためのそれらの方法をより魅力的でなくする。
【００７６】
対比によって、ＣＤ９５活性が、初期の脳発達中の神経突起リモデリング41のために、及び罹患した脳における損傷を受けた脳細胞の除去のために要求される場合に、ＣＤ９５活性は、成人の健康な脳において全く検出されない。従って、標的ＣＤ９５は、通常、正常な脳機能を含む、他の遊走誘発因子よりも、より少ない副作用を有するべきである。
【００７７】
従って、ＣＤ９５は、ヒト神経膠芽腫の最前線治療のための非常に効力があり、かつ魅力的な標的として明白である。
【００７８】
実施例
実施例１−試薬及び一般的な方法
次の抗体、抗ヒトＣＤ９５Ｌ Ｇ２４７−４（１：２００）、ＣＤ９５Ｌに対する中和抗体（Ｎｏｋ１）、抗ネズミＣＤ９５（Ｊｏ２）、抗ネズミＣＤ９５Ｌ（ＭＦＬ３）を使用し、そして適切なアイソタイプコントロールのハムスターＩｇＧ１、λ１を、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから得た。ＣＤ９５（α−Ａｐｏ−１）に対する抗体を、以前に記載されているように生成し46、リン酸化ＧＳＫ３β（Ｐ−Ｓｅｒ９−ＧＳＫ３β、１：１０００）、リン酸化ＡＫＴ（Ｐ−Ｓｅｒ４７３−ＫＴ、１：１０００）、合計ＡＫＴ（Ｔ−ＡＫＴ、１：１０００）、Ｓｒｃファミリーキナーゼ（Ｓｒｃ、１：１０００）、リン酸化Ｓｒｃ（Ｐ−Ｔｙｒ４１６、１：５０）及び合計β−カテニン（１：１０００）を、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社から得た。ＣＤ９５（ＣＤ９５、１：１０００）、合計ＧＳＫ３β（Ｔ−ＧＳＫ３β、１：１０００）、リン酸化ＥＲＫ１／２（Ｐ−ＥＲＫ、１：１０００）、合計Ｙｅｓ（Ｙｅｓ、１：１０００又は１：２００）、合計Ｆｙｎ（１：２００）、及び合計ＥＲＫ（Ｔ−ＥＲＫ、１：１０００）に対する抗体を、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社から得た。抗ＧＦＡＰ（１：２００）を、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社から得て、抗ＰＩ３Ｋ（ｐ８５ Ｎ−ＳＨ２ドメイン、１：１０００）、抗ＦＡＤＤ（ＦＡＤＤ、１：１０００）及び活性−β−カテニン（Ｐ−Ｓｅｒ３７又はＰ−Ｔｈｒ４１、１：８００）を、Ｕｐｓｔａｔｅ社から得て、抗ＭＭＰ９ ＧＥ−２１３（１：１００）をＯｎｃｏｇｅｎｅ社から得て、抗ＧＦＰ（１：４００）を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社から得て、抗ＧＡＤＰＨを、Ａｂｅａｍ社から得て、かつ抗−カスパーゼ−８抗体（１：１０）を、ハイブリドーマの上清から研究所で製造した47。抗ＰＥＤ抗体（１：２０００）は、Ｄｒ．Ｈｅｒｖｅ Ｃｈｎｅｉｗｅｉｓｓによって、寄贈された。組織学的染色に対する特異的抗体の視覚化のために、Ｄａｋｏ社から得られたストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ／ＦａｓｔＲｅｄの双方を、使用した。免疫蛍光法の研究のために、モノクローナル抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（１：５００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）及び抗ローダミン（１：２００、Ｄｉａｎｏｖａ社）を、使用した。
【００７９】
ＭＡＰＫ阻害剤のＰＤ９８０５９（２５μＭ）、ＰＩ３Ｋ阻害剤Ｌｙ２９００５９（２５μＭ）、及びパンカスパーゼ阻害剤ｚＶＡＤ−ｆｍｋ（４０μＭ）を、Ｃａｌｂｉｏ−ｃｈｅｍ社から得た。ＩＬＫ阻害剤（２０μＭ）は、Ｓ．Ｄｅｄｈａｒから寄贈された。細胞を、阻害剤（ＬＹ２９００５９及びｚＶＡＤ−ｆｍｋ）と、ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４又はα−Ａｐｏ−１での処理の３０分前に、プレインキュベートした。ロイシンジッパーＣＤ９５Ｌ（ＬＺ−ＣＤ９５Ｌ）の発生を、以前に記載されているように実施した41。遮断剤（ｚＶＡＤ−ｆｍｋ、ＰＤ９８０５９、ＬＹ２９００５９及びＫＰ−ＳＤ１）を、ＬＺ−ＣＤ９５Ｌ又はα−Ａｐｏ−１での処理の３０分前に与えた。細胞を、さらなる生化学分析のために溶解した。タンパク質抽出及びイムノブロットを、以前に記載されているように実施した41。
【００８０】
実施例２−原発試料
ＮＣＨ腫瘍の組織検体を、患者のインフォームドコンセント及び地域の倫理委員会の承認後に手術中に得た。新鮮な組織を、原発腫瘍培養を確立するための１部分と、ＲＮＡ抽出のための他部分の２つの部分に分けた。腫瘍分類、手術時の年齢、及び性別についてのそれぞれの患者の臨床データを、表１（図２２）で要約する。
【００８１】
実施例３−動物実験
動物実験は、Ｇｅｒｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒの動物管理使用委員会（ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ ａｎｉｍａｌ ｃａｒｅ ａｎｄ ｕｓｅ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）及びＲｅｇｉｅｒｕｎｇｓｐｒａｅｓｉｄｉｕｍ Ｋａｒｌｓｒｕｈｅによって承認された。頭蓋内投与のために、８〜１２週齢の近交系Ｖｍ／Ｄｋマウスを使用した。５０００個のＳＭＡ−５６０細胞を、トリプシン処理によって回収し、１μｌダルベッコ変法イーグル培地（１０％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＰＳ）、及び１％Ｌ−グルタミン２００ｍＭで補足したＤＭＥＭ）中で再懸濁し、そして１０μｌをＦｌｅｘｉｌｆｉｌシリンジ（ＷＰＩ社、ドイツベルリン）中に置いた。穿頭を、ブレグマに対する外側２．７５ｍｍで孔あけし、そして針を、３ｍｍの深さまで挿入した。マウスを、投与の７日、１４日又は１８日後に屠殺した。
【００８２】
実施例４−腫瘍外植
腫瘍接種の１４日後に、マウスを屠殺し、そして腫瘍を抽出した。そして腫瘍外植を、１時間、培地、培地とアイソタイプコントロール抗体（１０μｇ／ｍｌ）、又はＭＦＬ３（１０μｇ／ｍｌ）を有する培地中でインキュベートした。コラーゲン中へ外植の包埋後に、細胞侵襲を、７２時間にわたって、微速度顕微鏡（オリンパス、ドイツ）で記録した。
【００８３】
実施例５−細胞及びスフェロイド培養
確立された神経膠芽腫細胞系Ａ１７２、Ｔ９８Ｇ及びＬＮ１８、並びに原発神経膠芽腫細胞（ＮＣＨｓ）を、ＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ及び１％ＰＳで補充）中で、ＣＯ2インキュベーターで、３６．５℃及び湿度９０％で培養した。ＮＣＨ細胞系は、記載されているように、Ｃ．Ｈｅｒｏｌｄ−Ｍｅｎｄｅの研究所で確立されている48。生化学及び分子分析のために、１×１０6個の細胞を、培地中で１０ｃｍの培養皿上で培養し、そして前記に記載されているようにインキュベートした。スフェロイドを、以前に記載されているように製造した49。簡単に言えば、Ｔ９８Ｇ及びＬＮ１８細胞（２−３×１０4）を、ＤＭＥＭ１０ｍｌを含有する１０ｃｍの培養皿の蓋の上に懸滴（２０μｌ）で培養した。４８時間後に、細胞凝集物を回収し、そして培地で満たした基剤で被覆された２％寒天皿上に転位した。さらに４８時間後に、スフェロイドを、３次元コラーゲンゲル中で侵襲分析のために包埋した。
【００８４】
実施例６−コラーゲン侵襲アッセイ
調査侵襲のための生理学的モデルは、３次元コラーゲンゲルアッセイである。スフェロイドを、コラーゲンゲル溶液（Ｖｉｔｒｏｇｅｎ３ｍｇ／ｍｌ（原液溶液）、最終濃度２．４ｍｇ／ｍｌ）中へ包埋する１時間前に、α−Ａｐｏ−１（２μｇ／ｍｌ）、ＬＺ−ＣＤ９５Ｌ（５ｎｇ／ｍｌ）又はＮｏｋ１（５０ｎｇ）／ＬＺ−ＣＤ９５Ｌ（５ｎｇ／ｍｌ）で処理した。コラーゲンゲルの重合（３７℃で３０６０分）後に、ＤＭＥＭを、ゲルの上層においた。コラーゲンマトリックス中への細胞の侵襲を、微速度顕微鏡（オリンパス、ドイツ）で記録した。スフェロイド境界までのシグナル侵襲細胞の距離（スフェロイド毎にｎ＝１０、処理毎に３スフェロイド）を、Ｉｍａｇｅ Ｊ１．３４ソフトウェア（ＮＩＨ Ｉｍａｇｅに基づく）で決定した。
【００８５】
実施例７−組織の均一化
ＦＡＣＳ分析のために、腫瘍を、指示時点で取り除き、３７℃で２０分間トリプシン処理し、ＰＢＳ／１０％ＦＣＳ中で３回洗浄し、ガラスパスツールピペットで粉砕し、１００μｍナイロンメッシュ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社）を通して濾過し、そして蛍光標示式細胞分取器（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ（ＦＡＣＳ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社））分析のためにＰＢＳ／１０％ ＦＣＳで再懸濁した。
【００８６】
実施例８−遊走アッセイ
インビボで神経膠腫細胞の遊走を、コラーゲンＩで被覆された（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｉｎｓｅｒｔｓ（Ｆａｌｃｏｎ社）による遊走によって測定した。５×１０4個の細胞を、孔サイズ８μｍを有するコラーゲンで被覆された（５０μｇ／ｍｌ）ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｉｎｓｅｒｔｓ上で培地２００μｌ中で培養した。細胞を、培養前にγ−放射線照射し、又は培養後に、α−Ａｐｏ−１（２μｇ／ｍｌ又は０．１μｇ／ｍｌ＋架橋のためのタンパク質Ａ）、ＬＺ−ＣＤ９５Ｌ（５ｎｇ／ｍｌ）、Ｎｏｋ１（５０ｎｇ）／ＬＺ−ＣＤ９５Ｌ（５ｎｇ／ｍｌ）、Ｎｏｋ１（５０ｎｇ）ＬＺ−上清（ＳＮ、５ｎｇ／ｍｌ）、ＣＤ９５Ｌ（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＣＤ９５Ｌ−Ｔ３４で処理した。有利には、培養２４時間後に、細胞を、基礎的なＤＭＥＭで、それらが処理されるさらに２４時間前に、殺す。完全に郵送された細胞の数を、処理後１２時間、２４時間、及び３６時間で計測した。全ての実験において、三回、それぞれの処理に関して測定した。
【００８７】
実施例９−腫瘍のスコアリング及び分析
本来の及び再発性神経膠腫におけるＣＤ９５Ｌのスコアリングを、それぞれのＣＤ９５Ｌで染色された腫瘍から３つの領域の分析（２５０倍の倍率）によって実施した。ポジティブ細胞を、二重盲検法で、及びポジティブ細胞の数によって指定されたスコアで計測した。
【００８８】
インビボでのＣＤ９５で誘発された遊走の分析のために、５０００個のＳＭＡ−５６０細胞と３μｇのＭＦＬ３又は適切なアイソタイプ抗体との懸濁液を、Ｖｍ／Ｄｋマウスの左の線条中へ注入した。１週間後に、マウスを殺し、そして脳を抽出した。免疫組織学的染色に続いて、試料毎に３つの代表的な領域の対側半球におけるＧＦＰポジティブ細胞を測定し、そしてＣｅｌｌ＾Ｒソフトウェア（オリンパス、ドイツ）によって評価されたように腫瘍の表面に対して中和した。
【００８９】
実施例１１−γ−放射線照射
２．５×１０5個の細胞を、放射線照射の１２時間前に、６ｃｍの培養皿上で培養した。細胞を、１、３、１０及び５０Ｇｙで、室温で、137Ｃｓ源（ガンマ細胞１０００、Ａｔｏｍｉｃ Ｅｎｅｒｇｙ ｏｆ Ｃａｎａｄａ，Ｌｔｄ．、ＯＮ）を使用して、１０．２３Ｇｙ／分で放射線照射した。細胞を、放射線照射後すぐに、Ｎｏｋ１（１０μｇ／ｍｌ）で処理し、又は未処理のままにした。その後、細胞を、遊走アッセイ、ＲＮＡ抽出、又はＮｉｃｏｌｅｔｔｉアッセイのために使用した。
【００９０】
実施例１２−統計的分析
遊走及びｍＲＮＡ発現データの統計的分析を、ノンパラメトリックＳｔｕｄｅｎｔ ｔ検定を使用して実施し、処理群とコントロールとの差異を比較した。信頼区間を、９５％で決定し、*Ｐ値＜０．０５、**Ｐ値＜０．０１、***Ｐ値＜０．００５を、統計上有意であるとみなした。
【００９１】
実施例１３−免疫沈降
２×１０7個の細胞を、１０、５００及び５μｇ／ｍｌのＣＤ９５Ｌ−Ｔ４で、１及び５分間（特に指示されない限り）３７℃でそれぞれ処理し、又は処理せず、ＰＢＳ＋リン酸塩阻害剤（ＮａＦ、ＮａＮ３、ｐＮＰＰ、ＮａＰＰｉ、β−グリセリンリン酸のそれぞれ１０ｍＭ及びオルトバナジン酸塩２ｍＭ）中で２回洗浄し、続いて緩衝液Ａ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、プロテアーゼ阻害剤カクテル［Ｒｏｃｈｅ社］、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００［Ｓｅｒｖａ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ］、１０％グリセロール、並びにリン酸阻害剤［ＮａＦ、ＮａＮ３、ｐＮＰＰ、ＮａＰＰｉ、β−グリセリンリン酸のそれぞれ１０ｍＭ、及びオルトバナジン酸塩２ｍＭ］）中で溶解し（刺激条件）、又は処理せずに溶解した（未刺激条件）。タンパク質濃度を、ＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ社）を使用して決定した。タンパク質１ｍｇを、前記に記載されたような抗カスパーゼ−８58、５μｇのα−Ａｐｏ−１、又は２．５μｇの抗ｐ５８、及び３０μｌのタンパク質Ａセファロースで、一昼夜免疫沈降した。ビーズを、５回、溶解緩衝液の２０容量で洗浄した。その免疫沈降物を、それぞれ１５％又は７．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析した。続いて、ゲルを、Ｈｙｂｏｎｄニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、ドイツ）に転写し、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０）中で２％ＢＳＡで１時間阻害し、そして一次抗体で、２％ＢＳＡ ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ中で、４℃で、一昼夜インキュベートした。ブロットを、製造者のプロトコル（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｒｏｄｇａｎ、ドイツ）に従って、化学発光法で顕色した。
【００９２】
実施例１４−フローサイトメトリーによる細胞分析
細胞外染色：
シグナル細胞の表面上でＣＤ９５の発現を、ＦＡＣＳによって分析した。１０％胎児ウシ血清を含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ １０％ＦＣＳ）中で１×１０6細胞／ｍｌを、α−Ａｐｏ−１（０．０１μｇ／μｌ）で、２０分間氷上でインキュベートし、続いて二次抗体（１：３０ヤギ抗マウスフィコエリトリン共役；Ｄｉａｎｏｖａ社）で、３０分間インキュベートした。フローサイトメトリー分析を、Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用してＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）で実施した。試料毎に最低１００００個の細胞を分析した。
【００９３】
細胞内ＦＡＣＳ染色：
ＰＴＥＮの過剰発現効率、Ｙｅｓのノックダウン効率、又はＦＡＤＤ、Ｆｙｎ及びＹｅｓの基礎的なレベルをそれぞれ測定するために、細胞内ＦＡＣＳ染色を実施した。細胞をトリプシン処理し、上清を捨て、そしてペレットをＰＢ緩衝液中で４％パラホルムアルデヒド中で、１５分間氷上で再懸濁した。インキュベーション後に、固定された細胞を遠心分離し（３０００ｒｐｍ、４℃、５分）、上清を捨て、そしてペレットを、２回ＰＢＳ／０．１％サポニン及び１０％ＦＣＳで洗浄した。試料を、一次抗体（α−ＨＡ１：１０００ Ｒｏｃｈｅ社、α−Ｙｅｓ１：２００又はα−Ｆｙｎ１：２００ Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社）で３０分間氷上でインキュベートし、２回のＰＢＳ／０．１％サポニン及び１０％ＦＣＳでの洗浄工程に続いて、二次抗体（α−マウス−ＰＥ１：３３ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、又はα−ウサギ−Ａｌｅｘａ４８８（登録商標）１：２５０ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）の添加前に、さらに２０分間インキュベートした。染色された細胞を、２回、ＰＢＳ／０．１％サポニン及び１０％ＦＣＳで洗浄し、そしてそのペレットを、同様の緩衝液で再懸濁した。そして細胞を、ＦＡＣＳによって分析した。値を、特異性抗原に関して正規化平均蛍光強度（ＭＦＩ）として示した。
【００９４】
実施例１５−アポトーシスの検出（Ｎｉｃｏｌｅｔｔｉアッセイ）
ＤＮＡ断片化を量化するために、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ社）で分離された細胞を、２００×ｇで遠心分離し、そして７０％エタノールで、−２０℃で、１時間固定した。固定した細胞を、ヨウ化プロピジウム溶液（５０μｇ／ｍｌ、０．００２５％クエン酸ナトリウム及び０．００２５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００）で１時間又は一昼夜４℃で染色し、そしてＦＡＣＳによって分析した。
【００９５】
実施例１６−ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９のためのゼラチンザイモグラフィー
未処理又は処理（１０ｎｇ／ｍｌ及び２０ｎｇ／ｍｌのＣＤ９５Ｌ−Ｔ４）したＴ９８Ｇ細胞の調整培地を、非還元条件下で、ゼラチン１ｍｇ／ｍＬを含有する１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上に置いた。電気泳動及びＴｒｉｔｏｎＸ−１００（２．５％（ｖ／ｖ）、３０分２回）でのゲル洗浄後に、そのゲルを、ＭＭＰ反応緩衝液［Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＮａＣｌ２００ｍｍｏｌ／Ｌ、ＣａＣｌ2５ｍｍｏｌ／Ｌ］中で、３７℃で１６時間インキュベートした。ゼラチン分解活性を、クーマシーブリリアントブルーＧ−２５０溶液での染色、及び脱色溶液（１０％酢酸、２０％エタノール）中でのインキュベーションをして、透明なバンドとして検出した。
【００９６】
実施例１７−免疫組織化学
Ｔ９８Ｇ細胞を、４％ＰＦＡで、３７℃で１５分間固定し、５０ｍＭ塩化アンモニウムでインキュベートし、そしてＰＢＳ中で０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で５分間浸透処理した。遮断後に、細胞を、それぞれの一次抗体でインキュベートし、そして免疫反応を、ローダミン又はフルオレセインイソシアネート（ＦＩＴＣ）に結合させたモノクローナル又はポリクローナル抗体で視覚化した。
【００９７】
ＧＢＭ ＷＨＯ ＩＶからの臨床試料を、４％ＰＦＡで固定し、そしてパラフィン包埋した。厚さ５μｍの連続断片を、ＣＤ９５Ｌ、Ｙｅｓ及びホスホ−Ｓｒｃ（Ｔｙｒ４１６）に対するマウス抗体で免疫染色した。抗ＣＤ９５Ｌ及び抗ＣＤ９５抗体の検証のために、ヒト扁桃腺を使用した。ビオチン結合二次抗体でのインキュベーション後、続いてストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（Ｄａｋｏ社）でインキュベーションし、断片を、ＦａｓｔＲｅｄ（Ｄａｋｏ社）で顕色し、そしてグリセルゲル（Ｄａｋｏ社）で包埋した。
【００９８】
ネズミの腫瘍を、４％ＰＦＡで固定した。パラフィン包埋後に、厚さ５μｍの連続した切片を、ウサギ抗ＧＦＰで免疫染色した。
【００９９】
実施例１８−レンチウィルス感染
Ｔ９８Ｇ及びＬＮ１８細胞を、レンチウィルスベクターｐＥＩＧＷ及びｐＥＩＧＷ−ＧＳＫ３βＳ９Ａで、５の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。そのプラスミドを、ＥＦ１ａプロモーターと、ｐＩＲＥＳ２−ｅＧＦＰからのＩＲＥＳ−ｅＧＦＰカセット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、ドイツ）を有するｐＷＰＴＳｅＧＦＰ（ジュネーブのＤ．Ｔｒｏｎｏによって寄贈された）におけるＷＰＲＥ要素との間のｅＧＦＰ配列をスプライシングすることによって構築した。組換えレンチウィルスベクターｐＥＩＧＷ−ＧＳＫ３βＳ９Ａを、ｐｃＤＮＡ３ ＨＡ−ＧＳＫ３βＳ９Ａ（Ｔｒｅｖｏｒ Ｃ．Ｄａｌｅによって寄贈された）を使用して構築した。このベクターは、残基９で、セリンからアラニンの置換を含む構成的な活性ＧＳＫ３β突然変異体（ＧＳＫ３βＳ９Ａ）をコード化する。全てのレンチウィルスを、前記に記載されている方法41を使用して増殖した。全ての導入遺伝子の発現を、感染させた細胞中で、ＧＦＰ発現のＦＡＣＳ分析によって検証した。感染細胞のパーセンテージは、８０〜９０％であった。
【０１００】
実施例１９−リアルタイムＰＣＲ
α−Ａｐｏ−１（１μｇ／ｍｌ）で処理された、又は未処理のままの細胞からのＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキットを使用して、特に規定されていない限り４８時間で抽出した。逆転写後に、標的ｍＲＮＡを、ＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲによって、次の遺伝子特異的プライマーで検出した：ＣＤ９５−ｆｏｒｗ．５’−ＡＣＴ ＧＴＧ ＡＣＣ ＣＴＴ ＧＣＡ ＣＣＡ ＡＡＴ−３’；ＣＤ９５−ｒｅｖ．５’−ＧＣＣ ＡＣＣ ＣＣＡ ＡＧＴ ＴＡＧ ＡＴＣ ＴＧＧ−３’；ＣＤ９５−プローブ５’−ＡＡＴ ＣＡＴ ＣＡＡ ＧＧＡ ＡＴＧ ＣＡＣ ＡＣＴ ＣＡＣ ＣＡＧ ＣＡ−３’；ＣＤ９５Ｌ−ｆｏｒｗ．５’−ＡＡＡ ＧＴＧ ＧＣＣ ＣＡＴ ＴＴＡ ＡＣＡ ＧＧＣ−３’；ＣＤ９５Ｌ−ｒｅｖ．５’−ＡＡＡ ＧＣＡ ＧＧＡ ＣＡＡ ＴＴＣ ＣＡＴ ＡＧＧ ＴＧ−３’；ＣＤ９５Ｌ−プローブ５’−ＴＣＣ ＡＡＣ ＴＣＡ ＡＧＧ ＴＣＣ ＡＴＧ ＣＣＴ ＣＴＧ Ｇ−３’；ＭＭＰ−９−ｆｏｒｗ．５’−ＧＡＴ ＣＣＡ ＡＡＡ ＣＴＡ ＣＴＣ ＧＧＡ ＡＧＡ ＣＴＴ Ｇ−３’；ＭＭＰ−９−ｒｅｖ．５’−ＧＡＡ ＧＧＣ ＧＣＧ ＧＧＣ ＡＡＡ−３’；ＭＭＰ−９−プローブ５’−ＣＧＣ ＧＧＧ ＣＧＧ ＴＧＡ ＴＴＧ ＡＣＧ ＡＣ−３’；ＭＭＰ−２−ｆｏｒｗ．５’−ＧＧＡ ＣＡＣ ＡＣＴ ＡＡＡ ＧＡＡ ＧＡＴ ＧＣＡ ＧＡＡ ＧＴ−３’；ＭＭＰ−２−ｒｅｖ．５’−ＣＧＣ ＡＴＧ ＧＴＣ ＴＣＧ ＡＴＧ ＧＴＡ ＴＴＣ−３’；ＭＭＰ−２−プローブ５’−ＡＧＴ ＧＣＣ ＣＣＡ ＧＣＡ ＡＧＧ ＴＧＡ ＴＣＴ ＴＧＡ ＣＣ−３’；ｂ−アクチン−ｆｏｒｗ．５’−ＡＣＣ ＣＡＣ ＡＣＴ ＧＴＧ ＣＣＣ ＡＴＣ ＴＡＣ ＧＡ−３’；ｂ−アクチン−ｒｅｖ．５’−ＣＡＧ ＣＧＧ ＡＡＣ ＣＧＣ ＴＣＡ ＴＴＧ ＣＣＡ ＡＴＧ Ｇ−３’；ｂ−アクチンプローブ５’−ＡＴＧ ＣＣＣ ＴＣＣ ＣＣＣ ＡＴＧ ＣＣＡ ＴＣＣ ＴＧＣ ＧＴ−３’。Ｙｅｓのノックダウンを証明するために、標的ｍＲＮＡを、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎリアルタイムＰＣＲによって、次のＳｒｃキナーゼファミリーのプライマーの使用で検出した：Ｙｅｓ−ｆｏｒｗ．５’−ＴＡＴ ＧＧＣ ＴＧＣ ＣＡＧ ＡＴＴ ＧＣＴ Ｇ−３’；Ｙｅｓｒｅｖ．５’−ＺＺＣ ＡＧＧ ＡＧＣ ＴＧＴ ＣＣＡ ＴＴＴ ＧＡ−３’；Ｆｙｎ−ｆｏｒｗ．５’−ＴＧＡ ＡＣＡ ＧＣＴ ＣＧＧ ＡＡＧ ＧＡＧ ＡＴ−３’；Ｆｙｎ−ｒｅｖ．５’−ＧＧＴ ＴＴＶ ＡＣＴ ＣＴＣ ＣＧＣ ＧＡＴ ＡＡ−３’。ハウスキーピング遺伝子として、Ｇａｐｄｈは、次の配列を使用した：Ｇａｐｄｈ−ｆｏｒｗ．５’−ＧＧＴ ＣＧＧ ＡＧＴ ＣＡＡ ＣＧＧ ＡＴＴ ＴＧＧ ＴＣＧ−３’；Ｇａｐｄｈ−ｒｅｖ．５’−ＣＣＴ ＣＣＧ ＡＣＧ ＣＣＴ ＧＣＴ ＴＣＡ ＣＣＡ Ｃ−３’。そのリアルタイムＰＣＲを、ＡＢＩＰＲＩＳＭ−７３００ｉ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、ＵＳＡ）で測定した。
【０１０１】
実施例２０−ＰＴＥＮ過剰発現
ＰＴＥＮ（ｐＢＰ−ＰＴＥＮ−ＨＡ）に関する過剰発現プラスミド及び空のベクター（ｐＢＰ）は、Ｆｒａｎｋ Ｆｕｒｎａｒｉ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＵＳＡ）59によって寄贈された。Ｔ９８Ｇ細胞を、ＪｅｔＰｅｉを使用して、ｐＢＰ−ＰＴＥＮ−ＨＡ及びｐＢＰ（６μｇ）で形質移入した。形質移入した細胞を、処理後さらに４８〜７２時間、培養した。
【０１０２】
実施例２１−ノックダウン実験
ノックダウン実験を、取扱説明書に従ってリポフェクタミン２０００（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で一時的に形質移入することによって実施した。遊走実験を、Ｙｅｓ、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９のための有効ｓｈＲＮＡｍｉｒ−ｐＧＩＰＺベクターのネガティブコントロール又はプール、並びにネガティブコントロールとしての非標的ｓｈＲＮＡｍｉｒ−ｐＧＩＺベクター（それぞれ、ＲＨＳ ４４３０−９８８４３９５５、−９８８２０６５４、−９９１６１５１６、−９８５１４２３５、−９８７０９３６１ 、−９９１３７４１９、−９９２９１７５１ 、−９９２９８７１２、−９９１３８４１８及びＲＨＳ４３４６−ＯＢ、Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｒｎｓ社、ＵＳＡ）を使用して、Ｙｅｓに対する有効ｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ社 ＳＩ００３０２２１８）、及びＳｒｃファミリーキナーゼＦｙｎの種々のメンバーを標的とする第二のｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ社 ＳＩ００６０５４５１）を使用して実施した。種々のｓｉＲＮＡｓ細胞での一時的な形質移入を、ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４（１０ｎｇ／ｍｌ及び２０ｎｇ／ｍｌ）での処理の７２時間前に培養した後に、遊走を、２次元遊走アッセイでの処理の２４時間後に分析した。そのノックダウンを、定量リアルタイムＰＣＲ及びＦＡＣＳによって制御した。Ｙｅｓ−ｓｉＲＮＡの適切でない効果を除くために、細胞を、Ｙｅｓ、Ｙｅｓ過剰発現プラスミド（ｐ−ＣＭＶ−Ｙｅｓ）、又は双方に対するｓｉＲＮＡで形質移入し、そして遊走プレートに形質移入する４８時間前に培養した。さらに４８時間後に、細胞を、ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４（１０ｎｇ／ｍｌ及び２０ｎｇ／ｍｌ）で処理した。遊走を、２次元遊走アッセイで、処理の２４時間後に測定した。
【０１０３】
免疫沈降の研究のために、形質移入した細胞を、処理の７２時間前に培養した。
【０１０４】
実施例２２−ルシフェラーゼレセプター遺伝子アッセイ
ルシフェラーゼレセプターベクターは、次の源から寄贈された：ｐＴＯＰＦＬＡＳＨ及びｐＦＯＰＦＬＡＳＨ（Ｒａｎｄａｌｌ Ｔ．Ｍｏｏｎ、Ｈｏｗａｒｄ Ｈｕｇｈｅｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ；ＵＳＡ）並びに６個のＮＦκＢ−結合部位を有するＮＦκＢプラスミド（Ｍｉｎ Ｌｉ−Ｗｅｂｅｒ、Ｇｅｒｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）。形質移入実験を、製造業者の指示書によって、リポフェクタミン２０００（登録商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用して実施した。細胞を、形質移入する２４時間前に、ウェル毎に５×１０4個の細胞の密度で２４−ウェルプレートに播いた。ホタルルシフェラーゼ構成体を、ＣＭＶウミシイタケルシフェラーゼプラスミド（１０ｎｇ）で同時形質移入して、ルシフェラーゼ値を標準化した。ルシフェラーゼ活性を、構造に依存する形質移入の２４時間後に、Ｐｒｏｍｅｇａ （Ｍａｄｉｓｏｎ社、ＷＩ、ＵＳＡ）から市販されているキットを使用することによって、測定した。発光を、Ａｓｃｉｅｎｔ９６ウェルマイクロプレート照度計を使用して定量化した。全ての形質移入を、少なくとも２つの独立した場合に４回実施し、かつ誤差バーは、標準誤差を示した。
【０１０５】
実施例２３−ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４の発生
ヒトＣＤ９５−リガンド−４（ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４）の遺伝子操作
ＴＲＡＩＬ／ＤＲ５複合体及びＴＮＦ−α構造を、ヒトＣＤ９５Ｌ−レセプター結合ドメイン（ＣＤ９５Ｌ−ＲＢＤ）のための発現戦略の開発のためのモデルとして使用した。三量体ヒトＣＤ９５Ｌ−ＲＢＤの構造が、原則としてＴＮＦ−α−又はＴＲＡＩＬ−ＲＢＤ−構造（ＰＤＢエントリー：それぞれ１ＴＮＦ及び１Ｄ０Ｇ／１ＤＵ３51,55,62）に類似していることを前提として、次の観測を、考慮に入れた：
１．ＴＲＡＩＬ及びＴＮＦ−αからのＲＢＤのＮ−及びＣ−末端のアミノ酸が、逆平行β−ストランドを形成する。
２．このβ−ストランドの末端アミノ酸が、ＴＲＡＩＬ−ＲＢＤ三量体の重心軸に近い分子の同一部位で隣接して配置される（図１９を参照）。
これは、位置的理由のために、タンパク質ドメインの融合のため（例えば、安定化モチーフ又はタグの付加のため）の同一分子におけるＮ−及びＣ−末端使用が、互いに排反であることを意味する。理想的な安定化モチーフは、リガンド／レセプター相互作用部位との干渉のその危険度を最小化するために安定化モチーフの反対の部位でＣＤ９５Ｌ三量体のＮ−及びＣ−末端を有するＣＤ９５Ｌ三量体の重心軸の近くに配置された、小さく、十分に定義された三量体であるべきである。これらの基準を満たす適切な三量体タンパク質ドメインは、バクテリオファージＴ４のフィブリチンからのＴ４フォルドンモチーフである61,65。前記の考慮によって、Ｔ４フォルドンを、ヒトＣＤ９５Ｌ−ＲＢＤ（ＣＤ９５ＬのＧｌｕ１４２−Ｌｅｕ２８１）に対してＣ末端に融合した。ＣＤ９５Ｌ−ＲＢＤとＴ４フォルドンとの間で、可撓性リンカー要素（ＧＳＳＧＳＳＧＳＳＧＳ）を配置し、そしてヘキサヒスチジンタグ及びｓｔｒｅｐタグ−ＩＩ（ＨＨＨＨＨ−ＨＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ）を、Ｃ末端に付加した。このアフィニティタグを、可撓性リンカー要素（ＳＧＰＳＳＳＳＳ）によってＴ４フォルドンに結合した。分泌を基礎とする発現を可能にするために、ヒトＩｇκからのシグナルペプチドを、Ｎ末端（ＧＩｕ１４２）に融合した。ＩｇκリーダーとＣＤ９５ＬＲＢＤとの融合によって形成された提案されたシグナルペプチド開裂部位は、ヒトＣＤ９５ＬのＧｌｕ１４２に対応するＮ末端に位置するグルタミンを有する最終生成物を放出することを予想された。図１９Ｃで示されるＣＤ９５Ｌ−Ｔ４構成体のアミノ酸配列を、逆翻訳し、そしてそのコドン使用法を、哺乳動物細胞を基礎とする発現のために最適化した。遺伝子合成を、ＥＮＴＥＬＥＣＨＯＮ ＧｍｂＨ （Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、ドイツ）によって行った。最終発現カセットを、プラスミドの特有のＨｉｎｄ−ＩＩＩ−及びＮｏｔ−Ｉ−部位を使用して、ｐＣＤＮＡ４−ＨｉｓＭａｘ主鎖中へサブクローンした。全ての前記に記載された特徴を含む図の要約を、ＴＲＡＩＬ−Ｔ４−ＤＲ５−複合体（図１９Ｄ）のために例示的に示す。
【０１０６】
ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４の発現及び精製
１０％ＦＢＳ、ペニシリン１００ｕｎｉｔ／ｍｌ及びストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌで補足したＤＭＥＭ＋ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＧｉｂＣｏ社）中で成長させたＨｅｋ ２９３Ｔ細胞を、ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４をコード化するプラスミドで一時的に形質移入した。組換えＣＤ９５Ｌ−Ｔ４を含む細胞培養物の上清を、形質移入後３日間培養し、そして３００ｇで遠心分離し、続いて０．２２μｍ滅菌フィルターを介して濾過することによって透明にした。アフィニティ精製のために、ストレプタクチンセファロース１ｍｌ（ＩＢＡ ＧｍｂＨ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、ドイツ）をカラムに詰め、そして緩衝液Ｗ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）１５ｍｌで平衡化した。その細胞培養物の上清を、流量４ｍｌ／分でカラムに適用した。続いて、そのカラムを、緩衝液Ｗで洗浄し、そして結合ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４を、７×１ｍｌ緩衝液Ｅ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭデスチオビオチン、ｐＨ８．０）の添加によって段階的に溶出した。溶出画分のタンパク質含有量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色によって分析した（図１９Ｅ）。続いて、画分Ｅ２〜Ｅ５を、限界濾過によって濃縮し、そしてさらにサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分析した。ＳＥＣを、Ａｅｋｔａクロマトグラフィーシステム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用してＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム上で実施した。そのカラムを、リン酸緩衝食塩水で平衡し、そして濃縮させた、ストレプタクチンで精製したＣＤ９５Ｌ−Ｔ４（Ｅ２〜Ｅ５）を、ＳＥＣカラム上に、流量０．５ｍｌ／分で置いた。ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４の溶出を、２８０ｎｍでの吸光度で監視した。精製されたＣＤ９５Ｌ−Ｔ４の見かけの分子量を、ゲル濾過標準タンパク質（図１９Ｆ及びＧ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＧｍｂＨ、Ｍｕｅｎｃｈｅｎ、ドイツ）で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムの検量線を基に決定した。
【０１０７】
アポトーシスアッセイ
Ｊｕｒｋａｔ Ａ３永久ヒトＴ−細胞系（ｃａｔ．番号ＣＲＬ２５７０、ＡＴＣＣ）での細胞アッセイを使用して、ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４の活性を誘発するアポトーシスを定量した。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ社）、ペニシリン１００ｕｎｉｔ／ｍｌ及びストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ（ＧｉｂＣｏ社）で補足したＲＰＭＩ １６４０−培地＋ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＧｉｂＣｏ社）を有するフラスコ中で成長した。アッセイ前に、１０００００個の細胞を、９６ウェルマイクロタイタープレート中へウェル毎に播いた。ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４の種々の濃度のウェルへの添加（最終容量２００μｌ）を、３７℃で３時間のインキュベーションによって実施した。細胞を、溶解緩衝液（２５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、１００ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＡＥＢＳＦ、ｐＨ７．５）２０μｌを加えることによって溶解し、そしてプレートを、３０分間氷上に置いた。アポトーシスを、カスパーゼ−３及びカスパーゼ−７の増強させた活性によって平行する。従って、特異的カスパーゼ−３／−７基質Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣ（Ｂｉｏｍｏｌ社）の開裂を使用して、アポトーシスの限界を決定した。実際に、カスパーゼ活性は、ヨウ化プロピジウム及びＨｏｅｃｈｓｔ−３３３４２で細胞を染色した後に、形態学的に決定されたアポトーシス細胞のパーセンテージと関係がある（データは示されていない）。カスパーゼ活性アッセイのために、細胞溶解物２０μｌを、黒い９６ウェルマイクロタイタープレートに移した。５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１％スクロース、０．１％ＣＨＡＰＳ、５０μＭ Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣ及び２５ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．５を含有する緩衝液８０μｌの添加後に、そのプレートを、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ５００マイクロタイタープレートリーダーに移し、そして蛍光強度における増加を、監視した（励起波長４００ｎｍ、放出波長５０５ｎｍ）（図１９Ｈ）。
【０１０８】
このアポトーシスアッセイを、生物薬剤ＡＰＧ１０１の生物学的活性の決定のためにも使用した。ヒトＦｃを有するヒトＣＤ９５レセプター（ＣＤ９５リガンドのインビボでの結合相手）の細胞外ドメインの融合タンパク質であるＡＰＧ１０１は、ＣＤ９５Ｌの効果を含むアポトーシスを拮抗する。ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４のＪｕｒｋａｔ細胞への添加の前に、定常濃度でのＣＤ９５Ｌ−Ｔ４を、３０分間３７℃で、ＡＰＧ１０１の種々の濃度でインキュベートした（図１９Ｉ）。
【０１０９】
実施例２４−アポトーシスに耐性がある神経膠芽腫細胞のＣＤ９５媒介浸潤
長期のヒト悪性神経膠腫細胞系において、最初に、ＣＤ９５のトリガーに対するアポトーシスの誘発を検査した。ロイシンジッパー（ＬＺ）−ＣＤ９５Ｌでの処理は、種々の神経膠腫細胞系における変化しやすい効果を誘発した。ＬＺ−ＣＤ９５Ｌは、Ａ１７２細胞中でアポトーシスを誘発せず、Ｔ９８Ｇ細胞における高い投与量でのみアポトーシスを生じ、又はＬＮ１８細胞において低い投与量ですぐにアポトーシスを媒介した（図１ａ）。ＬＺ−ＣＤ９５Ｌで誘発される死の特異性を、ＣＤ９５Ｌに対する抗体（Ｎｏｋ１：データは示されていない）によるアポトーシスの中和によって証明した。ＣＤ９５で誘発されるアポトーシスに対するＡ１７２の耐性を、ＣＤ９５表面発現の低いレベルに帰することができた（図１ｂ）。しかしながら、ＬＮ１８及びＴ９８Ｇ細胞系は、同等に高レベルのＣＤ９５表面発現を示す間に、アポトーシスに対する種々の感受性を呈した（図１ｂ）。
【０１１０】
活性化ＣＤ９５に対する能力は、ＣＤ９５Ｌのオリゴマー化の程度に比例して関係する。使用可能なＣＤ９５Ｌが、凝集物を形成する傾向があるために、安定な三量体成形能を有するヒトＣＤ９５Ｌ、ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４を設計した（図１９）。種々の神経膠腫細胞系は、ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４での処理に対する種々の感受性を呈した。アポトーシスは、ＬＮ１８細胞において低い濃度で既に含まれたが、しかしＴ９８Ｇ細胞においては含まれなかった（図１１Ａ）。ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４で誘発される死の特異性を、ＣＤ９５Ｌに対する抗体（Ｎｏｋ１、図２１）によるアポトーシスの中和によって試験した。しかしながら、ＬＮ１８及びＴ９８Ｇ細胞系の双方は、ＣＤ９５表面発現の同等に高いレベルを呈した（図１１Ａ）。それらの細胞系は、ＣＤ９５で媒介されるアポトーシスのために必要な他の分子、例えばＦＡＤＤ、カスパーゼ−８又はカスパーゼ−３も発現した（図１５Ｃ及びＤ）63,72。
【０１１１】
悪性神経膠腫細胞は、それらの複製能力、血管形成の誘発、遊走／侵襲及びアポトーシスの回避によって特徴付けられる。ＣＤ９５の刺激は、Ｔ９８Ｇ細胞の増殖率を改変しなかった（データは示されていない）。侵襲行動を試験するために、Ｔ９８Ｇ及びＬＮ１８細胞のスフェロイド培養を製造し、そしてコラーゲンマトリックス内でそれらを培養した。ＬＺ−ＣＤ９５Ｌでの処理は、ＬＮ１８細胞中よりも、Ｔ９８Ｇ中でより高い程度まで周囲マトリックス中への遊走細胞の侵襲を増加した（図１ｃ、図１１Ｂ）。これは、細胞が、コラーゲンで被覆された膜で分離された２つの室の上部の室中で培養される場合でもある。より高いアポトーシス感受性ＬＮ１８細胞は、遊走の増加でＣＤ９５活性化に対して反応しなかった。反対に、Ｔ９８Ｇ細胞は、ＬＺ−ＣＤ９５Ｌ又はＣＤ９５（α−Ａｐｏ−１）に対する刺激抗体での処理に対してそれらの遊走能力を増加した（図３ｂ）。
【０１１２】
神経膠腫細胞の遊走は、ＭＭＰによる細胞外マトリックス構成成分の開裂を要求する。Ｔ９８Ｇ細胞において、ＭＭＰ−９活性は、ゲルザイモグラフィーによって評価されたように、ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４での処理に対して増加した（図１１Ｃ）。従って、ＣＤ９５の刺激は、遊走の傾向があるＴ９８ＧにおけるＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９のｍＲＮＡレベルの発現を増加したが、アポトーシス感受性ＬＮ１８細胞においては増加しなかった（図１１Ｄ及びＥ）。最も重要なことに、ＣＤ９５で誘発されるＴ９８Ｇ細胞の遊走を、それらのＭＭＰが、ＣＤ９５で誘発された遊走を要求することを指示する、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９に対するｓｉＲＮＡプールで阻害することができた（図１Ｆ及びＧ）。
【０１１３】
他の系列の実験において、患者の腫瘍由来の短時間の神経膠腫培養物を使用した。それらの細胞は、配列−ＣＧＨ分析（Ｂｅｒｎｈａｒｄ Ｒａｄｌｗｉｍｍｅｒ、ｐｅｒｓｏｎａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）によって評価されたように、ＰＴＥＮ及びＣＤＫＮ２ａ座のシグナル複製損失、並びにＥＧＦＲ座のシグナル複製増加を含む典型的なＧＢＭの遺伝的異常を呈した。本明細書で試験されたどの原発ＧＢＭ由来の培養物も、侵襲の傾向があるＴ９８Ｇ細胞系における観察と比較して、高いＣＤ９５表面発現（ｎ＝１８）、及び同様の又はより高いレベルのＣＤ９５で誘発されたアポトーシスに対する耐性（ｎ＝８）を呈した（図１２Ａ、図２０及びデータは示されていない）。ＣＤ９５表面発現のレベルとＣＤ９５で媒介されたアポトーシスに対する耐性との双方は、培養物における継代数によって影響されなかった（データは示されていない）。さらに、ＧＢＭ由来の培養物ＮＣＨ８９、ＮＣＨ１２５及びＮＣＨ２７０においてＣＤ９５で誘発された侵襲を試験した。ＮＣＨ１２５及びＮＣＨ２７０におけるＣＤ９５のトリガーは、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の発現を増加し、続いて遊走を誘発した（図１２Ｂ〜Ｄ）。ＮＣＨ８９細胞におけるＣＤ９５の刺激は、ＭＭＰ−９の遊走又は発現を増加しなかった（図１２Ｂ〜Ｄ）。従って、ＣＤ９５投与に対する遊走反応は、厳密に言えば、アポトーシスに対する耐性の程度と関連しない。同様の点で、ＣＤ９５及びＣＤ９５ＬのｍＲＮＡの発現は、より高い侵襲性の試験された原発ＧＢＭ腫瘍の間で異なった（図２０）。ＭＭＰは、遊走を著しく阻害されたＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９に対するｓｉＲＮＡプールのように、ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４で誘発されたＮＣＨ１２５の遊走を要求した（図１２Ｅ）。
【０１１４】
実施例２５−ＰＩ３Ｋ／ＩＬＫ／ＧＳＫ／ＭＭＰ経路を介する、カスパーゼ依存法でのＣＤ９５媒介侵襲
神経膠腫細胞の侵襲は、既に概説されているように、マトリックス金属タンパク質分解酵素（ＭＭＰ）によって細胞外マトリックス構成成分の開裂を要求する。従って、ＭＭＰ９及びＭＭＰ−２のｍＲＮＡレベルは、遊走の傾向があるＴ９８ＧにおけるＣＤ９５トリガーに対して大いに増加したが、アポトーシス耐性ＬＮ１８細胞においては増加しなかった（図２）。インテグリン結合キナーゼ（ＩＬＫ）は、グリコーゲン合成キナーゼ−３β（ＧＳＫ３β）の阻害によるＭＭＰ９発現を媒介することが最近報告されている9,10。ＧＳＫ３βの、そのセリン−９（ホスホ−ｓｅｒ９）残基でのリン酸化による阻害は、ＬＺ−ＣＤ９５Ｌ又はα−Ａｐｏ−１抗体での処理に対するＴ９８Ｇ細胞において観察された（図３ａ及び図８）。ＧＳＫ３βのリン酸化は、ＬＮ１８細胞においても見出されるが、異なる反応速度を有する（図３ａ及び図８）。遊走の傾向があるＴ９８Ｇ細胞は、ＣＤ９５のトリガーに対して、より高い基礎的なホスホ−ｓｅｒ９−ＧＳＫ３βレベル、及び徐々に増加する長期にわたるＧＳＫ３βのリン酸化を呈した（図３ａ及び図８）。アポトーシスの傾向があるＬＮ１８細胞は、ＣＤ９５のトリガーに対して一時的な（５〜１０分）ＧＳＫ３βのリン酸化を示した（図３ａ）。構造的に活性のあるＧＳＫ３β突然変異体（ＧＳＫ Ｓ９Ａ）の過剰発現は、Ｔ９８Ｇ細胞のＣＤ９５で誘発された遊走を阻害した（図３ｂ）。ＧＳＫ Ｓ９Ａ発現Ｔ９８Ｇ細胞及びそれらの野生の相当物は、ＣＤ９５で誘発されたアポトーシスに対する感受性の及び成長速度の比較できるレベルを呈した（図３ｃ〜ｄ）。従って、Ｔ９８Ｇ細胞における構造的に活性のあるＧＳＫ３βによる遊走の阻害は、種々の増殖速度に寄与されなかった。結果として、ＩＬＫ阻害剤ＫＰ−ＳＯ−１での前処理は、Ｔ９８Ｇ細胞のＣＤ９５で媒介された遊走を、基礎的な遊走を影響することなく阻害した（図３ｅ）。ＩＬＫは、タンパク質キナーゼＢ（ＰＫＢ／ＡＫＴ）を活性化し、かつホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）依存法におけるＧＳＫ３β活性を阻害する11。従って、細胞外レセプターキナーゼ（ＥＲＫ）のリン酸化状態を変化することなく、ＬＹ２９４００２によるＰＩ３Ｋの阻害は、ＣＤ９５で誘発されたＡＫＴ活性及びＴ９８Ｇ細胞におけるＧＳＫ３βのｓｅｒ９リン酸化を阻害した（図３ｆ）。
【０１１５】
β−カテニンは、活性ＧＳＫ３β、腺腫様多発結腸ポリープ（ＡＰＣ）及びアキシンタンパク質と共に複合体−分解複合体を形成する。β−カテニンのＧＳＫ３βによるリン酸化は、プロテアソームの分解のための標的にされる。ＧＳＫ３β阻害の結果として、β−カテニンは、β−カテニンが、ＭＭＰを含有する種々の標的遺伝子の発現を含むＴＣＦ／Ｌｅｆファミリー12のＤＮＡ結合タンパク質のＮ末端を連結する場合に、蓄積し、そして核中へ転位する。Ｔ９８Ｇ細胞において、ＣＤ９５のトリガーは、ＧＳＫ標的セリン３７又はトレオニン４１においてリン酸化されてない、活性β−カテニンの核転位を誘発した（図３ｇ）。まとめると、ＣＤ９５の活性化は、ＰＩ３Ｋ／ＩＬＫ／ＧＳＫ３β／β−カテニン／ＭＭＰ経路によって遊走／侵襲を誘発する。
【０１１６】
ＣＤ９５は、カスパーゼの活性によってアポトーシスシグナルを変換する。最近、ＣＤ９５が、ＣＤ９５で誘発されるアポトーシスに対して耐性のある間葉性腫瘍細胞系においてカスパーゼ−８、ＮＦκＢ及びＥＲＫの活性によって、遊走を媒介することが報告されている13。ＬＮ１８細胞と対照的に、Ｔ９８Ｇ細胞のＣＤ９５刺激は、カスパーゼ−８の開裂を誘発しなかった（図３ｈ）。従って、広域スペクトルのカスパーゼ阻害剤、ベンゾイル−ＶＡＤ．フルオロメチルケトン（ｚＶＡＤ．ｆｍｋ）でのＴ９８Ｇ細胞の前処理は、Ｔ９８Ｇ細胞におけるＧＳＫ３βのｓｅｒ９リン酸化を阻害しなかった（図８）。ＭＥＫ阻害剤ＰＤ９８０５９でのＴ９８Ｇ細胞の前処理も、ＣＤ９５で誘発された遊走に妨害されなかった（図３ｉ）。
【０１１７】
カスパーゼに加えて、糖尿病において多く見られるリンタンパク質／星状細胞において多く見られるリンタンパク質−１５ｋＤ（ＰＥＤ／ＰＥＡ−１５）は、ＤＥＤを有し、従ってＤＩＳＣで他の分子と相互に作用することができる。ＰＥＤの過剰発現は、ＥＲＫの刺激活性及びＪｕｎ Ｎ末端キナーゼ（ＪＵＫ）の阻害によって、ＣＤ９５及びＴＮＦＲ−１で誘発されたアポトーシスを阻害することが報告されている14,15。ＰＥＤの抗アポトーシス活性は、ＡＫＴによってリン酸化された場合に増加する16。Ｔ９８Ｇ細胞において、コントロールｓｉＲＮＡではなく、ＰＥＤに対する短干渉（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：ｓｉ）ＲＮＡは、ＰＥＤレベルを増加し、かつＣＤ９５で媒介されたＧＳＫ３βの相互作用ではなく、ＥＲＫの活性化を報告した（図８）。ＦＬＩＰＬのレベルに加えて、ＤＩＳＣに補充され、そしてアポトーシスを阻害することができる他の分子は、ＬＺＣＤ９５Ｌでの処理に対して影響されないままであった（データは示されていない）。
【０１１８】
ＧＢＭ侵襲の最も記述されている誘発物質の１つは、ＥＧＦである。ＥＧＦＲへのＥＧＦの結合は、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ及びＰＩ３Ｋ経路の活性化によってＭＭＰ−９発現を促進する27。ＰＩ３Ｋは、同様にその不活性化を導くＧＳＫ３βをリン酸化することができる、ＡＫＴ／ＰＫＢを活性化する。ＰＩ３Ｋ又はＭＡＰＫシグナルが観察された侵襲の原因でありうる場合に試験するために、ＥＲＫ及びＡＫＴのリン酸化を定量した。ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４でのＴ９８Ｇ及びＬＮ１８細胞の刺激は、ＡＫＴを活性化するが、ＥＲＫを活性化しない（図１３Ａ）。おもしろいことに、ＥＲＫ活性は、刺激に従った増加時間でさえ阻害された（図１３Ａ）。誘発する傾向のあるＴ９８Ｇ、ＮＣＨ１２５及びＮＣＨ２７０細胞において、ＡＫＴのリン酸化は、濃度依存鐘型曲線を示した（図１３Ｂ）。対照的に、増加された誘発を有するＣＤ９５に反応しないＮＣＨ８９細胞において、ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４は、基礎的なレベルより上でＡＫＴを活性化しなかった（図１３Ｂ）。リン酸化によるＧＳＫ３βの、そのセリン−９（ホスホ−ｓｅｒ９）の阻害を、Ｔ９８Ｇ細胞において、ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４又はα−Ａｐｏ−１抗体での処理に対して、ウェスタンブロット及びＦＡＣＳ染色によって観察した（図１３Ｃ及び図２１）。
【０１１９】
レンチウィルス感染による構造的に活性のあるＧＳＫ３β突然変異体（ＧＳＫ Ｓ９Ａ）の過剰発現は、Ｔ９８Ｇ細胞のＣＤ９５で誘発された遊走を阻害した（図１３Ｄ）。ＧＳＫ Ｓ９Ａを発現するＴ９８Ｇ細胞及びそれらの野生型の相当物は、ＣＤ９５で誘発されたアポトーシスに対する比較できる成長速度及び感受性のレベルを呈した（図２１）。従って、Ｔ９８Ｇ細胞における構造的に活性のあるＧＳＫ３βによる遊走の阻害は、種々の増殖速度に寄与されなかった。活性ＧＳＫ３βは、β−カテニン、腺腫様多発結腸ポリープ（ＡＰＣ）及びアキシンタンパク質と共に複合体−分解複合体を形成する。β−カテニンのＧＳＫ３βによるリン酸化は、プロテアソームの分解のために標的にされる。ＧＳＫ３β阻害の結果として、β−カテニンは蓄積して、核中へ転位し、その際、それは、ＭＭＰ−９の発現のための本質的な転写因子のｃ−Ｊｕｎを含む種々の標的遺伝子の発現を誘発する31,32、ＴＣＦ（Ｔ細胞因子）／Ｌｅｆ（リンパ様増強性因子）ファミリー12のＤＮＡ結合タンパク質のＮ末端を連結する。代わりに、ＧＳＫ３β活性の阻害は、ＡＰ−１発現を直接増加することができる10。ＣＤ９５の刺激が、β−カテニンの転写活性をトリガーするかどうかを研究するために、細胞質及び核のβ−カテニンの発現並びにβ−カテニンの転写レセプター活性を試験した。ＬｉＣｌ、公知のＧＳＫ３βの阻害剤及びβ−カテニンの転写活性の誘発物質を、ポジティブコントロールとして使用した。Ｔ９８Ｇ細胞において、ＣＤ９５のトリガーは、ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４での刺激の３０分後に、β−カテニンの細胞質の蓄積を誘発した（図１３Ｅ）。さらに、活性β−カテニンの核転位、Ｓｅｒ３７又はＴｈｒ４１を標的とするＧＳＫに対する非リン酸化を、観察した（図１３Ｆ）。ＴＣＦ／Ｌｅｆ−レポーター活性（ＴＯＰ−ＦＬＡＳＨ）も、ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４に対して著しく誘発した（図１３Ｇ）。ＴＣＦ／Ｌｅｆ結合ドメインの突然変異体は、ルシフェラーゼ活性のＣＤ９５Ｌ−Ｔ４誘発を破壊した（ＦＯＰ−ＦＬＡＳＨ；図１３Ｇ）。さらに、ＮＦκＢの活性は、１０ｎｇ／ｍｌではなく２０ｎｇ／ｍｌのＣＤ９５Ｌ−Ｔ４での刺激の８時間後に著しく増加した（図１３Ｈ）。まとめると、ＣＤ９５の活性化は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ＧＳＫ３β／β−カテニン／ＭＭＰ、及び可能であればＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ＮＦκＢ／ＭＭＰ経路による遊走／侵襲を誘発する。
【０１２０】
実施例２６−ＣＤ９５で誘発された遊走を、アポトーシスに対して耐性のある原発神経膠腫培養物においても検出する
他の系列の実験において、患者の腫瘍由来の短時間の神経膠腫培養物を使用した。び漫性星状細胞腫（ＷＨＯ ＩＩＩ）からの細胞は、高いＣＤ９５表面発現を呈し、そして相対的にＣＤ９５で媒介されるアポトーシスに対して感受性があった（図４）。対照的に、乏突起細胞腫（ＷＨＯ ＩＩＩ）又は神経膠芽腫（ＷＨＯ ＩＶ）から生じる細胞は、高いＣＤ９５表面発現にもかかわらず、ＣＤ９５で媒介されるアポトーシスに対してより高い耐性がある（図４及び図９）。本明細書で試験されたどの原発ＧＢＭ由来の培養物も、侵襲の傾向があるＴ９８Ｇ細胞系における観察と比較して、高いＣＤ９５表面発現（ｎ＝１８）、及び同様の又はより高いレベルのＣＤ９５で誘発されたアポトーシスに対する耐性（ｎ＝８）を呈した（図９）。ＣＤ９５表面発現のレベルとＣＤ９５で媒介されたアポトーシスに対する耐性との双方は、培養物における継代数によって影響されなかった（データは示されていない）。さらに、ＣＤ９５で誘発されるアポトーシスに対して相対的に（ＮＣＨ１２５）又はより高い（ＮＣＨ８９及びＮＣＨ２７０）耐性がある、３つのＧＢＭ由来の培養物を試験した。ＮＣＨ１２５及びＮＣＨ２７０におけるＣＤ９５のトリガーは、ＭＭＰ９及びＭＭＰ−２の発現、及び続く遊走を増加した（図５ａ〜ｃ）。ＮＣＨ８９細胞におけるＣＤ９５の刺激は、ＭＭＰ９及びＭＭＰ−２の遊走又は発現を増加しなかった（図５ｂ〜ｃ）。従って、ＣＤ９５投与に対する遊走反応は、厳密に言えば、アポトーシスに対する耐性の程度と関連しない。同様の点で、ＣＤ９５及びＣＤ９５ＬのｍＲＮＡの発現は、より高い侵襲性の試験された原発ＧＢＭ腫瘍の間で非常に異なった（図９）。
【０１２１】
実施例２７−放射線照射は、ＣＤ９５／ＣＤ９５Ｌ系によって侵襲性を増加する
臨床の場において、手術を回避する侵襲細胞は、放射線療法及びアジュバント化学療法の標的である。γ−放射線照射は、ＣＤ９５及びＣＤ９５Ｌの発現を増加し、そしてそれによってアポトーシスを誘発することが報告されている3。現在のデータを考慮すると、放射線照射で誘発されたＣＤ９５及びＣＤ９５Ｌが、神経膠腫細胞の侵襲性も増加することができるかどうかを対処することを必要とする。最初に、Ｔ９８Ｇ細胞の放射線照射が、ＣＤ９５及びＣＤ９５ＬのｍＲＮＡの発現を増加することを示した（図６ａ）。最も高いＣＤ９５及びＣＤ９５ＬのｍＲＮＡの発現は、３グレイ（Ｇｙ）の投与量で見出された。同様の投与量で、ＭＭＰ−２のｍＲＮＡは、著しく誘発された（図６ｂ）。ＭＭＰ９のｍＲＮＡは、３及び１０Ｇｙで、しかし低い程度まで、著しく上方制御された（図６ｂ）。最も重要なことに、ＭＭＰ発現を、ＣＤ９５Ｌの中和によって回復することができる、放射線照射させた細胞のより高い遊走率によって再現した（図６ｃ）。原発ＧＢＭ培養物は、放射線照射後に、より侵襲性の表現型も呈した（図６ｄ及び図１０）。放射線照射で誘発される遊走は、完全にＣＤ９５Ｌに依存した（図６ｄ）。興味深いことに、ＣＤ９５の直接的なトリガー後に、侵襲性の表現型を呈さないＮＣＨ８９培養物においてさえ、１０Ｇｙの放射線照射は、ＣＤ９５Ｌによる細胞の遊走数を増加した（図６ｄ）。放射線照射は、本明細書で試験されたＧＢＭ由来の原発培養物を十中八九、ＣＤ９５依存法において遊走を著しく誘発した（図６ｄ及び図１０）。ＣＤ９５刺激に対して著しく遊走する傾向を呈することに失敗した培養物のみが、より低いＣＤ９５表面発現レベルを有した（ＮＣＨ４１７、図１０）。さらに、原腫瘍の手術及び放射線照射後に生じる、再発性腫瘍におけるそれらの分子の発現を試験した。腫瘍内でのＣＤ９５Ｌの発現レベルは、０〜４と評価された（図６ｅ）。最初に検出された神経膠腫におけるレベルが決して０ではない（領域毎に１〜２４個のＣＤ９５Ｌポジティブ細胞）場合に、放射線治療後のＣＤ９５Ｌ発現の劇的な増加を、研究された９つの再発性腫瘍のうち８つにおいて検出した（図６ｅ）。ＣＤ９５Ｌを、ＧＦＡＰポジティブ腫瘍細胞において検出した（図６ｆ）。ＣＤ９５及びＭＭＰ９の付加発現を、連続した切片における同様の領域で検出した（図６ｆ）。重要なことに、アポトーシス細胞は、ＣＤ９５Ｌを発現する細胞の近くで観察されなかった（データは示されていない）。
【０１２２】
実施例２８−ＰＩ３Ｋを、ＣＤ９５に対するＳｒｃの漸増によって活性化する
Ｓｒｃは、共免疫沈降実験によって示されたように、ＣＤ９５をＰＩ３Ｋ活性に関連させる（図１４Ａ〜Ｃ）。むしろ、Ｔ９８Ｇ及びＬＮ１８細胞の、ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４での処理は、Ｓｒｃ、及びＣＤ９５に対するＰＩ３Ｋのｐ８５サブユニットの漸増を誘発した。ｐ８５とＣＤ９５との会合は、ＣＤ９５又はｐ８５を免疫沈降することによって試験した。ｐ８５とＣＤ９５との会合の程度は、Ｔ９８Ｇ細胞におけるＣＤ９５−Ｔ４の濃度と、反比例して関連した（図１４Ｂ）。しかしながら、ＬＮ１８細胞において、ＣＤ９５に対するｐ８５の漸増を、高濃度のＣＤ９５Ｌ−Ｔ４でのみ検出した（図１４Ａ）。ＣＤ９５の免疫沈降は、低濃度のＣＤ９５Ｌ−Ｔ４での処理後５分でＳｒｃファミリーメンバーの検出を可能にした（図１４Ａ及びＢ）。Ｓｒｃの会合は、より高い濃度で減少した（図１４Ａ及びＢ）。従って、低濃度のＣＤ９５Ｌ−Ｔ４で、Ｓｒｃとｐ８５との双方は、Ｔ９８Ｇ細胞においてＣＤ９５で検出できるレベルで会合するが、しかしＬＮ１８細胞においては、Ｓｒｃのみが検出された。さらに、いくつかのＳＦＫ、例えばＦｙｎ、Ｌｙｎ、ｐｐ６０及びＹｅｓに対する抗体でのスクリーニング後に、ＣＤ９５をＰＩ３Ｋに連結するＳｒｃファミリーメンバーとしてＹｅｓを識別した（図１４Ｃ）。神経膠腫細胞の遊走におけるＹｅｓの役割を検証するために、ノックダウン実験を実施した。Ｙｅｓ ｓｉＲＮＡで形質移入された細胞において、ＦＡＣＳ及びｑＲＴ−ＰＣＲによって評価されたようなＹｅｓの発現を、Ｆｙｎ発現、他のＳｒｃファミリーメンバーが、影響されないままである場合に低減した（図１４Ｅ）。ＦｙｎではなくＹｅｓに対するｓｉＲＮＡは、Ｔ９８Ｇの、及びＮＣＨ１２５細胞のＣＤ９５Ｌ−Ｔ４で誘発された遊走を著しく破壊した（図１４Ｄ）。この遊走の阻害を、Ｔ９８Ｇ及びＬＮ１８細胞におけるＹｅｓの過剰発現によって低減した（図１４Ｆ）。ＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９００５９のように、Ｙｅｓに対するｓｉＲＮＡは、ＡＫＴのＣＤ９５で誘発されたリン酸化も阻害した（図１４Ｇ）。
【０１２３】
実施例２９−アポトーシス耐性の神経膠腫細胞における非効率的なＤＩＳＣ形成
ＰＩ３Ｋ経路リプレッサーＰＴＥＮ（ＭＭＡＣ１、ＴＥＰ１）の役割を試験した。アポトーシスの傾向があるＬＮ１８細胞が、完全なＰＴＥＮを有する場合に、Ｔ９８Ｇ細胞は、１つの対立遺伝子、及びＰＴＥＮの第二の対立遺伝子の欠如における点突然変異（コドン４２ＣＴＴ〜ＣＧＴ；グリシン〜グルタミン）、並びにある染色体１０の全損失を媒介する57,59。しかしながら、ＰＴＥＮ過剰発現は、ＣＤ９５で媒介されたアポトーシスに対してＴ９８Ｇ又はＮＣＨ１２５細胞を感作しなかった（図１５Ａ）。
【０１２４】
さらに、カスパーゼが、ＣＤ９５で誘発されたＰＩ３Ｋの活性化を含むかどうかを探求した。一般的なカスパーゼ阻害剤ｚＶＡＤ−ｆｍｋによるカスパーゼの阻害は、ＧＳＫ３βのリン酸化を妨がなかった（図１５Ｂ）。同様に、ＣＤ９５で誘発されるカスパーゼ−８の開裂を、Ｔ９８Ｇ細胞においてではなく、ＬＮ１８細胞において検出することのみができた（図１５Ｃ）。ＤＩＳＣ構成成分が、それらの細胞において効率的に漸増するかどうかを調査するために、ＣＤ９５免疫沈降物においてＦＡＤＤの漸増を分析した。ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４での刺激に対して、ＣＤ９５に対するＦＡＤＤの漸増がＬＮ１８細胞において増加したが、一方で、Ｔ９８Ｇ細胞においては全く増加が検出されなかった（図１５Ｄ）。従って、ＣＤ９５に対するカスパーゼ−８の漸増は、Ｔ９８Ｇ細胞においてではなくＬＮ１８及びＪ１６細胞におけるＣＤ９５Ｌ−Ｔ４での刺激に対して増加した（図１５Ｄ）。最も重要なことに、Ｔ９８Ｇ細胞において、ＹｅｓのｓｉＲＮＡノックダウンは、ＣＤ９５に対するＦＡＤＤの漸増のＣＤ９５Ｌ−Ｔ４での誘発を可能にした（図１５Ｅ）。この点で、ＦＡＤＤの発現レベルが、ＬＮ１８及びＴ９８Ｇ細胞において同様である場合に、Ｙｅｓのレベルが、Ｔ９８Ｇ細胞において極めて高くなった（図１５Ｆ）。Ｙｅｓとは対照的に、Ｆｙｎ発現は、ＬＮ１８細胞において極めて高くなった（図１５Ｆ）。
【０１２５】
実施例３０−ＣＤ９５／ＣＤ９５Ｌ系は、インビボでの神経膠腫の誘発の重要な媒介物である
多形性神経膠芽腫に苦しむ患者におけるＣＤ９５Ｌの発現は、試験された全ての腫瘍においてＣＤ９５Ｌの三角様分布を示した（図７ａ、１７Ａ）。腫瘍の内部で、少量のＣＤ９５Ｌのみが発現した（図７ａ．１、１７Ａ．ａ）。腫瘍柔組織境界面で増加された発現（図７ａ．２）は、腫瘍に隣接する脳柔組織においてピークに達し（図７ａ．３、１７Ａ．ｂ）、かつ神経膠腫との距離が増加するにつれて再び減少した（図７ａ．４、１７Ａ．ｃ）。ＣＤ９５Ｌを、神経膠腫細胞、ニューロン及びマクロファージにおいて検出した（データは示されていない）。腫瘍内でのＣＤ９５Ｌの付加発現を、腫瘍血管を囲む神経膠腫細胞において観察した。同様に、Ｓｒｃファミリーキナーゼのリン酸化（ｐＳｃｒ）及びＹｅｓの発現を、腫瘍の侵襲における役割を示唆する、全ての試験された試料における腫瘍宿主の感染で一貫して見出した（図１７Ｂ）。充実性腫瘍領域内で、Ｙｅｓの発現は、腫瘍試料間で、散乱腫瘍細胞において非常に高い発現からわずかな発現まで、大いに様々であった。このより高いＹｅｓ発現領域において、Ｓｒｃのリン酸化は、検出されず、むしろ制限された（図１７Ｂ）。
【０１２６】
より生理学的なインビボ環境への結果の変換のために、多型性神経膠芽腫のマウスモデルにおけるＣＤ９５／ＣＤ９５Ｌ系の役割を試験した。これらの研究のために、確立されたネズミの神経膠腫細胞系ＳＭＡ−５６０を、記載されているような同系のＶｍ／Ｄｋ宿主中へ頭蓋内に注入した。同系腫瘍モデルの使用は、周囲脳組織におけるＣＤ９５Ｌ発現の腫瘍の誘発を可能にするために重要であった。
【０１２７】
ＳＭＡ−５６０細胞は、それらの表面上でＣＤ９５レセプターの低いレベルのみを発現し（図７ｂ、１８Ａ）、及び細胞培養条件下で保たれる場合に全くＣＤ９５Ｌがなかった（図７ｃ、１８Ｂ）。他による報告17として、ＳＭＡ−５６０細胞が、ＣＤ９５で誘発されるアポトーシスに対して耐性があることを見出した（データは示されていない）。スフェロイドの形成に続いて、ＣＤ９５のレベルは、わずかに増加した（図７ｂ、１８Ａ）のに対して、ＦＡＣＳ分析は、細胞表面でＣＤ９５Ｌを認識できなかった（図７ｃ、１８Ｂ）。比較的低い量のＣＤ９５表面レベルにもかかわらず、これらの細胞から形成されたスフェロイドは、投与量依存法におけるＣＤ９５刺激後に、コラーゲン侵襲アッセイにおける増加された遊走を示す（図７ｄ、１８Ｃ）。スフェロイドがＣＤ９５Ｌを発現しない（図７ｃ、１８Ｂ）ことを見出したことに従って、ＣＤ９５Ｌ中和抗体ＭＦＬ３を使用するＣＤ９５Ｌの遮断は、侵襲を改変しなかった（図７ｄ、１８Ｃ）。
【０１２８】
興味深いことに、ＣＤ９５及びＣＤ９５Ｌの表面レベルのＦＡＣＳ分析は、充実性腫瘍から分離された細胞を、接種の１４及び１８日後に分析した場合に、双方の分子の著しい増加を示した（図７ｂ及び７ｃ、１８Ａ及び１８Ｂ）。これは、腫瘍宿主相互作用及び、従ってネズミのＧＢＭの場合において示されたような宿主因子と腫瘍細胞との間のクロストークの要求を示す。
【０１２９】
この増加の機能的意義のより詳細な分析のために、細胞の頭蓋内注入の１４日後に、充実性腫瘍から断片を取り出し、そして培地のみ、ＭＦＬ３を有する培地、又は適切なアイソタイプ抗体で、それぞれ１時間それらをプレインキュベートした。コラーゲンゲル中への包埋後に、遊走を、７２時間監視した（図７ｅ、１８Ｄ）。著しく、アイソタイプ又は培地のみではなく、ＣＤ９５Ｌの中和抗体ＭＦＬ３でのプレインキュベーションは、約５０％だけ、細胞の腫瘍の中心からの遊走を低減した（図７ｅ、１８Ｄ）。
【０１３０】
インビボでのそれらの結果を検証するために、ＧＦＰポジティブＳＭＡ−５６０細胞及びＭＦＬ３又は適切なアイソタイプ抗体を、Ｖｍ／Ｄｋの左の線条中へ注入した。ＭＦＬ３でのマウスの処理は、対側半球中への腫瘍細胞の遊走を著しく低減した（図７ｆ、１８Ｅ）。ＣＤ９５／ＣＤ９５Ｌ系が、インビボで周囲脳中への悪性神経膠腫の侵襲の主な媒介物であることを、これらのデータから結論を出した。
【０１３１】
参考文献
本明細書に挙げられた全ての文献は、参照をもって本明細書中に取り込まれたものとする。
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２２】
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【配列表】
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