(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ライノウイルスにより引き起こされる疾患の治療および／または予防用の、過酸化水素産生酵素および酵素基質を含む医薬であって、該疾患が普通感冒であり、鼻腔用スプレーまたは点鼻薬として処方された、医薬。
【請求項２】
過酸化水素産生酵素が、グルコースオキシダーゼ、キシリトールオキシダーゼ、マンニトールオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグリセロールオキシダーゼからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１記載の医薬。
【請求項３】
過酸化水素産生酵素が、グルコースオキシダーゼである、請求項１または２記載の医薬。
【請求項４】
アミログルコシダーゼをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の医薬。
【請求項５】
過酸化水素産生酵素がリンゲル液に処方されることを特徴とする、請求項１〜４いずれか１項記載の医薬。
【請求項６】
水溶性であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項記載の医薬。
【請求項７】
請求項１〜６いずれか１項記載の医薬の製造のための、過酸化水素産生酵素の使用。
【請求項８】
過酸化水素産生酵素が、グルコースオキシダーゼ、キシリトールオキシダーゼ、マンニトールオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグリセロールオキシダーゼからなる群から選択される請求項７記載の使用。
【請求項９】
過酸化水素産生酵素が、アミログルコシダーゼと併用されるグルコースオキシダーゼである、請求項７記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ライノウイルス類により引き起こされる疾患の治療および／または予防方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
上気道における正常細菌叢は、病原性細菌の異常繁殖およびその後の感染の予防に非常に重要であることがよく知られている。細菌叢の細菌の多くは、α溶血連鎖球菌（ＡＨＳ）からなる。鼻副鼻腔炎および中耳炎病原体の増殖を阻害するために、ＡＨＳによる最も重要なメカニズムの一つが、大量の過酸化水素、Ｈ２Ｏ２の産生であることが示されている［１］。
【０００３】
過酸化水素はまた、鼻咽頭粘膜の非特異的防御システムの１つである、ラクトペルオキシダーゼ（ＬＰＯ）の基質として寄与する。ラクトペルオキシダーゼは、強力な抗菌物質である次亜チオシアン酸、ＯＳＣＮ−の産生を、過酸化水素に依存している。ＡＨＳを含む正常鼻細菌叢およびヒト粘膜は、過酸化水素および次亜チオシアン酸の両方に対して本来の抵抗力を有する［２］。
【０００４】
ブドウ球菌感染症の治療用の皮膚および鼻開口部に適用する軟膏における過酸化水素産生酵素の使用は以前に開示されているが、これは、皮膚の細菌叢の細菌に関する治療であり、過酸化水素含有軟膏（ＭｉｃｒｏｃｉｄＴＭ）に対応する。
【０００５】
ＥＰ１４９００９６は、特に子供における中耳炎の治療用の鼻腔用スプレーの製造における過酸化水素の使用を開示する。しかしながら、中耳炎の治療を目的とするいくつかの抗生物質は存在するが、ライノウイルスにより引き起こされる普通感冒に対する積極的治療は証明されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明において、意外にも、過酸化水素産生酵素を用いて、普通感冒を引き起こすライノウイルスを不活性化することができることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一の具体例は、ライノウイルスにより引き起こされる疾患の治療および／または予防方法であって、該治療および／または予防を必要とする患者を、過酸化水素産生酵素を含む医薬で治療する方法に関する。
【０００８】
本発明のさらなる具体例において、過酸化水素産生酵素は、グルコースオキシダーゼ、キシリトールオキシダーゼ、マンニトールオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグリセロールオキシダーゼからなる群から選択される。
本発明の他の具体例において、過酸化水素産生酵素は、アミログルコシダーゼと併用されるグルコースオキシダーゼである。
【０００９】
本発明の一の具体例において、疾患は普通感冒である。
本発明のさらなる具体例において、過酸化水素産生酵素は、リンゲル液に処方される。
【００１０】
本発明の別の具体例において、医薬は水溶性である。
本発明の一の具体例において、医薬は、鼻腔用スプレーとして処方される。
本発明のさらなる具体例において、医薬は点鼻薬として処方される。
本発明の別の具体例において、酵素基質が医薬に加えられる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
ライノウイルス類（ＲＶ）は、普通感冒を引き起こす最も一般的なものである［３］。さらに、子供の中耳炎も、しばしば普通感冒に先だって生じる。ＲＶは全身性感染症ではないが、鼻腔および鼻咽頭に局在する［４］。過酸化水素がＲＶを不活性化することが知られているが［５］、以下のいくつかの理由のために、ＲＶ感染を不活性化するための過酸化水素を含有する鼻腔用スプレーは製造できなかった：
ａ．スプレーの鼻腔分散は、ウイルス粒子の多くが存在する鼻腔の後部にまで及ばない［６］；
ｂ．粘膜細胞に豊富な酵素カタラーゼが、鼻の後部に届く前に過酸化水素を水と酸素に分解する；
ｃ．過酸化水素の初期濃度が十分高くなければならず、したがって、鼻粘膜に大きな刺激を与える［７］。
【００１２】
現在まで、症状の軽減、例えば鼻水の症状の軽減以外に普通感冒の症状に対する効果が実証された薬剤はない。
【００１３】
本発明において、意外にも、過酸化水素産生酵素を用いて、ライノウイルス類を恒久的に不活性化することができることが見出された。ヒト気道細胞に接種した多くの量のライノウイルス（＞１００  ＴＣＩＤ５０）を不活性化するのに、わずか３０分のインキュベートで十分であることが示された（ＴＣＩＤ５０は、接種瓶の少なくとも５０％に、細胞変性効果（＝感染）が見られるのに必要なウイルスの濃度を意味すると定義される）。このことは、ライノウイルス感染が鼻腔後部で生じる普通感冒の治療が可能であることを意味する。したがって、過酸化水素産生酵素、例えばＧＯが以下の特徴を有することを予測することはできなかった：
１．３０以内でライノウイルス類を恒久的に不活性化する；
２．ＧＯの添加を、初期接種後２日以上後に行った場合でさえも、細胞のさらなる感染を防止する：このことは、普通感冒の防止だけでなく、症状の開始後の感染を治療できることを意味する；
３．粘膜のすべてのウイルスを不活性化するために、鼻咽頭において長時間十分な過酸化水素濃度を維持することができる：これにより初めて、普通感冒の症状が喪失するだろう。
【００１４】
意外にも、実験にて示されるように、ＧＯおよびグルコースを含有する鼻腔用スプレーは上記の基準を満す。
【００１５】
グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）は過酸化水素産生酵素であり、ヒトで使用することができる。これは、蜂蜜の天然成分であり［８］、抗菌性保存剤として長年用いられている。ＧＯの過酸化水素産生効果はまた、口腔内洗浄液（Ｏｒａｌ  ＢａｌａｎｃｅＴＭ）および歯磨き粉（ＺｅｎｄｉｕｍＴＭ）において抗菌性添加剤として用いられている。
【００１６】
アミログルコシダーゼ（ＡＧＯ）は、デンプンからグルコースを産生する酵素であり、約５０−６０℃で最適効果を発揮する。ＧＯおよびＡＧＯは、より低い温度でＧＯの活性化を防止するために、しばしば組み合わされる。溶液が体温となった場合に、ＡＧＯはグルコースの放出を開始し、ＧＯは過酸化水素を産生するだろう。そうでなければ、酵素（ＧＯ）および基質（グルコース）の混合を避けるために、２区画のシステムを用いることが必要になるだろう。
【００１７】
鼻への使用に適した基質は、例えば：キシリトール（それ自体抗菌効果を有する）、マンニトール（ある種の中耳炎病原体に対して接着効果を有する）、ラクテート（先天性物質）、ガラクトース、グリセロール（鼻粘膜に効果的）およびグルコースであるだろう。これは、以下の過酸化水素産生酵素が、ライノウイルス類に対する鼻腔用スプレーにおける医薬として適合することを意味する：グルコースオキシダーゼ、キシリトールオキシダーゼ、マンニトールオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグリセロールオキシダーゼ。本願発明者の研究によると、ガラクトースオキシダーゼおよびグリセロールオキシダーゼは両方とも、ヒト肺繊維芽細胞（ＷＩ３８）に対して非常に寛容である。
【００１８】
他の具体例において、過酸化水素産生酵素は、アミログルコシダーゼと併用されるグルコースオキシダーゼである。
【００１９】
臨床研究では、リンゲル液が、生理食塩水よりも、鼻粘膜の粘膜繊毛に、より有益な効果をもたらすことが報告された［９］。このことは、リンゲル液が、鼻腔用の医薬製剤において好ましい担体溶液であることを示している。
【００２０】
本発明は、実験項でより詳細に記載する。
以下の記載の目的は、酵素により産生される阻害物質である過酸化水素が、普通感冒を引き起こすライノウイルス類を不活性化できることを示すことである。ライノウイルス類（ライノウイルス属に属するウイルス）は、普通感冒の原因物質である。
【００２１】
以前の研究により、良好な阻害活性を有するＡＨＳは、約１０ｍＭ（＝０．０３％）の過酸化水素濃度に対応するレベルの過酸化水素を産生できることが示されている。かくして、約０．０５％の濃度の過酸化水素を産生するグルコースオキシダーゼ濃度は、非常に良好な阻害活性を有する正常細菌叢のインビボでの効果を模倣するのに足りると考えられる。下記実験により、２０Ｕ／ｍｌ未満のＧＯ濃度が、１０ｍＭを超える過酸化水素濃度に相当する、ライノウイルス感染症に対する効果を有することを示す。
【００２２】
実施例１および２に記載する実験により、２０Ｕ／ｍｌの濃度のグルコースオキシダーゼが、ライノウイルスのＷＩ３８細胞に対する細胞変性効果を不可逆的に不活性化するのに十分であることが明らかとなった。この不活性化は３０分未満のインキュベーションの間に完了し、これは、グルコースオキシダーゼが飲み込まれる前に鼻および鼻咽頭を通り抜ける間にライノウイルスを不活性化するのに十分である［１０］。第２の実施例においては、グルコースオキシダーゼを、最初のインキュベーションの２日後になって加えた場合でさえも、ライノウイルスによる細胞のさらなる感染を防止でき、これは、グルコースオキシダーゼの鼻腔用スプレーが、症状が現れた後でさえも、普通感冒に治療効果があることを示唆している。
【００２３】
第３の実施例は、普通感冒のサインの有意な減少が、治療１２時間後にすでに達成されることを示している。本発明者は、３年間普通感冒の発症時に鼻腔用スプレーを用いており、そのパターンはほとんどが同じであった：ＧＯの鼻腔用スプレーの頻繁な使用後（最初の１２時間は２時間毎、その後は頻度を少なくする（続く２〜３日の間１日２〜４回））、普通感冒の症状が、治療開始後１２〜２４時間以内に消失する。また、他のボランティアも、スプレーに関して同様の効果を報告している。これらの予備研究は、鼻および鼻咽頭に存在するＲＶを不活性化するのに十分な期間、ＧＯが有意なレベルで存在することを示している。
【００２４】
カタラーゼは速やかに過酸化水素を酸素と水に変換し、そして、特にライノウイルスは鼻咽頭のアデノイドに存在するので、過酸化水素含有鼻腔用スプレーと機能しそうにない［５］。カタラーゼは、Ｈ２Ｏ２のＯ２およびＨ２Ｏへの変換を触媒する特異的酵素である。この反応は急速に進む。ヒト赤血球から精製したカタラーゼ（＞３００００Ｕ／ｍｇ）を実験に用いた。
【００２５】
普通感冒をシミュレートするウイルスアッセイにおいて、ＡＴＣＣからの２つの標準分離株、すなわち、ＡＴＣＣ１１１７（＝ライノウイルス７）およびＡＴＣＣ１１１８（＝ライノウイルス８）を用いた。
【００２６】
ライノウイルス類での実験に用いた細胞培養物は、ライノウイルスと一緒にインキュベートする場合に明らかな細胞変性効果（ＣＰＥ）を示す、推奨されたヒト胎児肺繊維芽細胞由来のＷＩ３８細胞株である。
【００２７】
グルコースオキシダーゼを含有する鼻腔用スプレーでの臨床研究において、ＧＯは、リンゲル溶液中１００Ｕ／ｍｌの濃度で、等張液中５％ベータ−Ｄグルコースを含有するグルコーススプレーと一緒に用いた。スプレーの１回の噴霧で０．１ｍｌが投与され、実験においては、１回投与あたり、各々のボトル（１つはＧＯのボトル、もう一つはグルコースのボトル）から２回噴霧した。
【００２８】
臨床予備試験では、５％グルコース溶液を含有する鼻腔用スプレーと一緒に用いる１００Ｕグルコースオキシダーゼ／ｍｌを含有する鼻腔用スプレーが、耐用性良好であり、普通感冒の発症期間を短くするだろうことが示唆された。
【００２９】
ＧＯの鼻腔用スプレーの結果は、現在のところ、非常に有望であり、本発明者は、倫理委員会（Ｅｔｈｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）およびスウェーデン医薬品局（Ｓｗｅｄｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ａｇｅｎｃｙ）から、鼻腔用スプレーによる普通感冒の発症期間の短縮の可能性を評価するための、無作為プラセボ−コントロール二重盲検試験の開始の許可を得た。
【実施例】
【００３０】
実施例１
以下の実施例の目的は、普通感冒の原因であるライノウイルス類に対する、過酸化水素産生酵素であるグルコースオキシダーゼの効果を示すことである。
【００３１】
実験１．
ウイルス：ライノウイルス７（ＡＴＣＣから購入（ＶＲ−１１１７））を、ライノウイルス群の代表例として用いた。アッセイにおいて、１０−２および１０−３希釈を用いた。これらの濃度は、１００ＴＣＩＤ５０と関連付けられ、ＷＩ３８と一緒にアッセイした場合に、前述の希釈系列において明確かつ大きな細胞変性効果（ＣＰＥ）を生じる。各々０．３ｍｌの希釈液を容器に加えた。
【００３２】
細胞培養：ヒト肺細胞繊維芽細胞（ＷＩ３８、ＡＴＣＣ−ＣＣＬ−７５）を、細胞変性効果検出用に用いた。１０−倍連続希釈を、濃縮ウイルス懸濁液から行った。０．１ｍｌの１０−４〜１０−５の希釈液は、２ｍｌウェルにおいて５日以内に、目に見える細胞変性効果を生じさせるのに十分であった。１０−３またはそれ以上の希釈液は、植菌の５日後の多くの細胞を破壊するほどだった。細胞は、最初に、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ中で、ウェルの底に滑らかな相が見られるまで培養した。ついで、培地を２％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩに交換し、アッセイの間保存した。細胞を、ＣＯ２豊富エアー中３７℃で培養した。実験の間、１７〜１８代継代の細胞培養を用いた。
【００３３】
カタラーゼ：Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＴＭから入手。１０００００Ｕ／ｍｌの溶液を、１０６Ｕ／ｍｌの原液から調製した。０．０１ｍｌを容器に加え、容器中に１０００Ｕ／ｍｌとした。
Ｈ２Ｏ２：２０％溶液を、リン酸緩衝セイライン（ＰＢＳ）で、０．５％および０．０５％溶液に希釈した。０．１ｍｌを容器に加え、容器中に０．０５％または０．００５％とした。
２．５％グルコース含有Ｒｅｈｙｄｒｅｘ：０．６ｍｌを、グルコースオキシダーゼの基質として各々の容器に用いた。
グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）：Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＴＭから入手。２００Ｕ／ｍｌおよび６００Ｕ／ｍｌの溶液を、６０００Ｕ／ｍｌの原液から調製した。各々０．１ｍｌの希釈液を容器に加え、容器中に２０Ｕ／ｍｌまたは６０Ｕ／ｍｌのグルコースオキシダーゼとした。
【００３４】
過酸化水素の効果が、ウイルスそれ自体または細胞保護効果に直接影響するかを評価するために、細胞を含むウェルに移す前に、ウイルスを過酸化水素とプレインキュベートした。ＷＩ３８細胞もまた、過酸化水素に感受性であり、したがって、植菌前にウェルにカタラーゼを加える必要があった。さらに、カタラーゼ添加によるＲＶ７の不活性化により、この不活性化の速度を証明した。この設計はまた、阻害効果が静ウイルス性であるか、または、不可逆的にウイルスを損傷することができるかを明らかにするだろう。
【００３５】
表１において、各々１０個の容器（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）の内容を示す。容器を３７℃に安定に保持するヒーター中でインキュベートした。１０００Ｕのカタラーゼを、インキュベーションの１５、３０および６０分後に加えた。各々の容器から２×５０μｌを、二重に細胞ウェル（９６−ウェルプレート）に移した。細胞ウェルにおける対照として、以下のものを用いた（二重に）：細胞＋ＲＰＭＩ、細胞＋カタラーゼ、細胞＋グルコースオキシダーゼ、細胞＋０．０５％Ｈ２Ｏ２、細胞＋ｒｅｈｙｄｒｅｘ、カタラーゼ＋ＲＶ７。細胞を、インキュベーションの５日間毎日、および最終的には７日まで試験した。
【００３６】
【表１】
0005558458.tif 000002
【００３７】
ＷＩ３８細胞は、０．０５％Ｈ２Ｏ２の強い毒性効果およびグルコースオキシダーゼ酵素（ＧＯ）の非常に弱い毒性効果に感受性であった。しかしながら、グルコースオキシダーゼの非常に弱い毒性効果は、ＲＶ７の細胞変性効果に関する細胞の試験の実現を妨害しなかった。
【００３８】
インキュベーションの５日後、グルコースオキシダーゼをＲＶ７とインキュベートしたウェルにおいて、細胞変性効果は見られなかった。より高い濃度のＲＶ７と１５分間インキュベーションした後でさえもウェルにおいて見られなかった。２０Ｕ／ｍｌのグルコースオキシダーゼ濃度は、ＲＶ７の完全な不活性化を達成するのに十分であると思われる。表２。
【００３９】
【表２】
0005558458.tif 000003
【００４０】
過酸化水素に関して、低濃度（０．００５％、２ｍＭ）では、高濃度のＲＶ７を不活性化することができなかった。しかしながら、６０分のインキュベーション後には、０．００５％過酸化水素溶液は、１０−３希釈のＲＶ７を不活性化することができた。０．０５％（２０ｍＭ）の濃度の溶液では、すべての濃度で、かつ、１５分のインキュベーションでＲＶ７を不活性化することができた。かくして、２０Ｕ／ｍｌのグルコースオキシダーゼにより産生されるＨ２Ｏ２の量は、０．００５％を超えるＨ２Ｏ２濃度と等価である。上記結果は、インキュベーション７日後のものである。
【００４１】
７日間のインキュベーションにおいて、グルコースオキシダーゼまたは０．０５％過酸化水素溶液をアッセイしているウェルにおいて、不活性化ＲＶ７の回復のサインは見られなかった。これは、ＲＶ７の不活性化は不可逆であったが、静ウイルス性ではいことを示している。
【００４２】
実験２
ＷＩ３８細胞およびグルコースオキシダーゼ（ＧＯ）を用いるライノウイルス７および８の実験
グルコースオキシダーゼ：６０００Ｕ／ｍｌ＝＞０．０７ｍｌ〜２ｍｌ  ＰＢＳ＝２００Ｕ／ｍｌ
カタラーゼ：百万Ｕ／ｍｌ＝＞０．０１ｍｌ〜１ｍｌ  ＰＢＳ＝１０ｋＵ／ｍｌ
過酸化水素：１０％溶液＝＞０．０２ｍｌ〜２ｍｌ  ＰＢＳ＝０．１％溶液
細胞：ＲＰＭＩ中ＷＩ３８＋２％ウシ胎児血清
ライノウイルス：ＡＴＣＣ１１１７（＝Ｒｖ  ｎｒ  ７）およびＡＴＣＣ１１１８（＝Ｒｖ８）
ウイルス希釈液：ＡＴＣＣからの０．１ｍｌ非希釈ウイルス溶液を０．７ｍｌ  ＰＢＳに希釈＝希釈液１
ｄｉｌ１（希釈液１）０．１ｍｌを０．９ｍｌＰＢＳに希釈＝希釈液２等、希釈液５まで。
【００４３】
インキュベーション：
０．７ｍｌ  ５％グルコース溶液＋０．１ｍｌ  ＲＶ７（＝ａ７）またはＲＶ８（＝ａ８）のｄｉｌ１＋０．２ｍｌの上記したグルコースオキシダーゼ溶液（容器中の最終濃度４０Ｕ／ｍｌ）。ウイルス濃度＝ｄｉｌ２。３７℃に保持したヒーターで３０分間インキュベーション。３０分後、過酸化水素の影響を、０．１ｍｌカタラーゼ溶液を容器に添加して停止させる（＝１ｋＵ／ｍｌ）。
０．７ｍｌ  ５％グルコース溶液＋０．１ｍｌのＲＶ７（＝ａ７）またはＲＶ８（＝ａ８）のｄｉｌ１＋０．１ｍｌの過酸化水素溶液（＝容器中の最終濃度＝０．０１％）。インキュベーションおよび過酸化水素の影響の停止は上記ａと同様である）。
全部で４つの容器（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｆ）：ａ７、ａ８、ｂ７およびｂ８。
【００４４】
カタラーゼ添加後、試料を、表３に従って平底の９６−ウェルプレートに移す。３７℃でＣＯ２とインキュベーションの２日後、１０Ｕのグルコースオキシダーゼを、８つのウェル＋０．１ｍｌ  ５％グルコース溶液に加えた。グルコースオキシダーゼを添加したウェルを表４に示す。ＲＶ８はＲＶ７よりも効果的な病原体であったが、４０Ｕ／ｍｌの濃度のグルコースオキシダーゼは、高レベルの初期植菌にもかかわらず、ＲＶ７およびＲＶ８の両方を不活性化することができた。インキュベーション２日後のウェルへのグルコースオキシダーゼの添加は、すでに罹患した細胞以外へのウイルス感染の蔓延を防止することができると考えられる。
【００４５】
【表３】
0005558458.tif 000004
【００４６】
【表４】
0005558458.tif 000005
【００４７】
実施例３
以下の実施例の目的は、普通感冒の治療のパイロット臨床試験において、グルコースオキシダーゼ含有鼻腔用スプレーの最適濃度および投与量を評価することである。
【００４８】
実験３
試験者Ｋ．Ｔ．は、５％のグルコースを含有する鼻腔用スプレーと組み合わせた、１００Ｕ／ｍｌグルコースオキシダーゼを含有する鼻腔用スプレーが、普通感冒の症状を回復できるかどうかを評価することを目的とする。
スプレーは予防として用いる予定ではなく、鼻詰まりおよび／またはくしゃみを伴う鼻炎としての症状後に用いる。症状は０〜５の点数で評価し、該症状を１日の終わりに同じスケールで再評価した。プロトコールの詳細については、表５を参照。
【００４９】
鼻腔用スプレーを、治療の初日は２時間毎に用いた場合、鼻炎、鼻詰まりおよびくしゃみの症状を１日のうちに改善するのに十分であった。疾患の再発を防止するためには、翌日に少なくとも１日２〜３回治療を続けることが必要であると思われる。鼻の乾燥感以外の副作用は観察されず、これも治療の終了時には消失した。
【００５０】
【表５】
0005558458.tif 000006
【００５１】
参考文献
［１］Ｔａｎｏ  Ｋ，Ｇｒａｈｎ  Ｈａｋａｎｓｓｏｎ  Ｅ，Ｗａｌｌｂｒａｎｄｔ  Ｐ，Ｒｏｎｎｑｖｉｓｔ  Ｄ，Ｈｏｌｍ  ＳＥ，Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  Ｓ．Ｉｓ  Ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｌｐｈａ−ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ  ｓａｍｐｌｅｄ  ｆｒｏｍｎａｓｏｐｈａｒｙｎｘ？  Ａｃｔａ  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ  ２００３；１２３：７２４−７２９．
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［７］Ｇｒｅｉｆｆ  Ｌ，Ｅｊｅｒｆａｌｔ  Ｉ，Ｅｊｅｒｆａｌｔ  ＪＳ，Ｗｏｌｌｍｅｒ  Ｐ，Ｐｅｒｓｓｏｎ  ＣＧＡ．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｇｕｉｎｅａ−ｐｉｇ  ｔｒａｃｈｅｏｂｒｏｎｃｈｉａｌ  ｍｕｃｏｓａ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｓｃａｎｄ  １９９９；１６５：４１５−４２０．
［８］Ｂａｎｇ  ＬＭ，Ｂｕｎｔｔｉｎｇ  Ｃ，Ｍｏｌａｎ  Ｐ．Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｒａｙｅ  ｏｆ  Ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｏｎｅｙ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ．Ｊ  ｏｆ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００３；９：２６７−２７３．
［９］Ｕｎａｌ  Ｍ，Ｇｏｒｕｒ  Ｋ，Ｏｚｃａｎ  Ｃ；Ｒｉｎｇｅｒ−Ｌａｃｔａｔｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｖｅｒｓｕｓ  Ｉｓｏｔｏｎｉｃ  Ｓａｌｉｎｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｍｕｃｏｃｉｌｉａｒｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｎａｓａｌ  ｓｅｐｔａｌ  ｓｕｒｇｅｒｙ．Ｊ  Ｌａｒｙｎｇｏｌ  Ｏｔｏｌ  ２００１；１１５：７９６−７．
［１０］Ｎｅｗｍａｎ  ＳＰ，Ｍｏｒｅｎ  Ｆ，Ｃｌａｒｋｅ  ＳＷ．Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｆｒｏｍ  ａ  ｎａｓａｌ  ｐｕｍｐ  ｓｐｒａｙ．Ｒｈｉｎｏｌｏｇｙ  １９８７；２５：７７−８２．