(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化型グルタチオンを含む培地を用いて、植物のシュートを栽培して発根させる、植物のシュートからの発根を促進する方法。
【請求項２】
前記培地の酸化型グルタチオン濃度は、１ｍｇ／Ｌ〜５０００ｍｇ／Ｌの範囲内である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培地は、酸化型グルタチオン以外の炭素源を含まない、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
酸化型グルタチオンを含む培地を植物のシュートに接触させることによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記培地の酸化型グルタチオン濃度は、１ｍｇ／Ｌ〜５０００ｍｇ／Ｌの範囲内である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記植物が難発根性である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記植物がユーカリ属植物である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
６５０〜６７０ｎｍの波長成分と４５０〜４７０ｎｍの波長成分とを９：１〜７：３の割合で含む光照射下で行われる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
炭酸ガスを供給しながら行われる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記炭酸ガスの供給量は、３００〜２０００ｐｐｍである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
湿度８０％以上の条件下で行われる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
基部に傷をつけられたシュートを用いて行われる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記シュートが、挿し穂、または母本植物から採取した器官を無菌的に培養することにより得た多芽体、もしくは該器官を無菌的に育成して得た茎葉である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
酸化型グルタチオンを含有する、植物のシュートからの発根を促進するための組成物。
【請求項１５】
培地として用いるための、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
１ｍｇ／Ｌ〜５０００ｍｇ／Ｌの範囲内の酸化型グルタチオンを含有する、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
１ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌの範囲内の酸化型グルタチオンを含有する、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
培地または溶液に混合される補助剤として用いるための、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１９】
混合後の培地中または溶液中にて、１ｍｇ／Ｌ〜５０００ｍｇ／Ｌの範囲内の酸化型グルタチオンの最終濃度を提供する、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
混合後の培地中または溶液中にて、１ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌの範囲内の酸化型グルタチオンの最終濃度を提供する、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
錠剤、散剤または顆粒剤の形態である、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
植物の無性繁殖を行うための、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
窒素、リンおよびカリウムを必須元素として含み、かつ、酸化型グルタチオン以外の炭素源を含まない、請求項１４〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クローン苗の生産に関するものであり、詳しくは、植物のシュートを発根させて行うクローン苗の生産方法及び該生産方法に好適に用いられる発根用培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
目的に適った形質を持つ均質な植物体（苗）を大量に生産するステップは、農業生産、植林、育種、その他の目的で植物体を産業的に利用しようとする場合に、必ず要求される。このとき植物体の大量生産手段として有用なのが、伝統的な挿し木法や、近年のバイオテクノロジーの発達により生まれた組織培養法である。これらの方法によれば、単に、苗の大量生産ができるばかりではなく、同一の遺伝的性質を有する植物体、即ちクローン苗を大量かつ迅速に生産することができる。特に、遺伝子組換えを行った優良な樹木の系統を大量増殖する場合には、選定された系統を用いて栄養繁殖による効率的な苗生産を行うことが必須である。【０００３】
挿し木法においては、増殖しようとする植物の個体から枝や茎、場合によっては頂芽、腋芽、葉、子葉又は胚軸等を切取って挿し穂とし、これを挿し床や培地に挿し付けて発根させ植物体を生産する。一方、組織培養法において植物を大量増殖しようとする場合には、増殖しようとする植物の個体から適当な組織を切取って培養し、不定芽、不定胚、苗条原基又はこれらの組織から伸長してくる茎葉（シュート）を採取して発根させる。つまり、いずれの方法を用いてクローン苗を生産するにしても、発根という過程を経ることとなる。【０００４】
従って、植物組織の発根能は、クローン苗の生産性に大きな影響を与える。特に、これらのクローン苗を産業的に利用しようとする場合、発根能が低い植物種では、これは深刻な問題となる。【０００５】
植物組織からの発根に影響する要因として様々な物質が関与することが知られている。例としては、植物組織自身が放出するエチレンの関与が考えられている。そこで、エチレンの発生を抑制するため、前記不定芽等の組織を培養するにあたり、培地中に硝酸銀を添加することが試みられている（特許文献１参照）。しかしながら、この方法では、植物組織の枯死率は、ある程度減少するものの、発根自体は抑制されたり、遅延したりしてしまうため、植物組織からの発根率に対しては、向上効果が小さいか、むしろ阻害的に働くものであった。【０００６】
さらに、銀イオンとしてチオ硫酸銀（ＡｇＳ4Ｏ6、Ｓｉｌｖｅｒ  Ｔｈｉｏｓｕｌｆａｔｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘ、以下ＳＴＳと略記する。）、抗酸化剤としてアスコルビン酸を含有する培地において、特にユーカリの発根率の向上が認められ、さらに光源としては白色光に比較して赤色光がより望ましいとの報告がある（特許文献２参照）。しかしながら、これらの改良によっても、発根率の向上が十分とはいえない植物種や有用形質を持つユーカリの系統があり、発根率が低いために苗の生産効率が低く、大きな問題となっていた。【０００７】
一方、グルタチオンがカルスからの不定胚の分化に関与することが報告されている。例えば、特許文献３において、イネやトルコギキョウのカルスを、グルタチオンを含有する培地で培養すると、再分化が促進されることが開示されている。【０００８】
しかし、特許文献４においては、タバコのカルスからの不定芽形成に対して、グルタチオン１ｍＭの添加はむしろ阻害的に働き、グルタチオン合成阻害剤であるブチオニンスルフォキシミン（ＢＳＯ）の添加によりカルス当たり不定芽分化数が顕著に増加することが開示されている。このことは、グルタチオンのカルスの再分化への影響は、カルスの植物体の種類によって異なるものであることを示している。【０００９】
このように、シュートからクローン苗を実用上十分な程度に得る技術はなく、また、グルタチオンについては、限られた植物種のカルスの不定胚形成に関わることが報告されているに過ぎなかった。以上の背景より、シュートを効率よく発根させクローン苗を得る、産業上有用な技術が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００１−３４６４６４号公報（平成１３年１２月１８日公開）
【特許文献２】特開２００６−１４１２５２号公報（平成１８年６月８日公開）
【特許文献３】特開２００４−３５２６７９号公報（平成１６年１２月１６日公開）
【特許文献４】特開２００８−１２０８１５号公報（平成２０年５月２９日公開）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、植物のシュートからの発根を促進して、その発根率を向上させることにより、挿し木法や組織培養法などによるクローン苗、特に発根能が低い植物種に属するクローン苗の生産性を向上させることを目的する。さらに、クローン苗の大量かつ迅速な生産を可能として、その産業的利用に途を開くことを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明のクローン苗の生産方法は、植物のシュートをグルタチオンの存在下にて栽培する工程を包含することを特徴としている。【００１３】
本発明の生産方法において、上記工程は、グルタチオンを含む培地を用いて行われてもよい。【００１４】
本発明の生産方法において、上記培地のグルタチオン濃度は、１ｍｇ／Ｌ〜５０００ｍｇ／Ｌの範囲内であることが好ましく、１ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌの範囲内であることがより好ましい。【００１５】
本発明の生産方法において、上記培地は、グルタチオン以外の炭素源を含まないことが好ましく、窒素、リンおよびカリウムを必須元素として含むことが好ましい。【００１６】
本発明の生産方法において、上記工程は、グルタチオンを含む溶液を植物のシュートに接触させることによって行われてもよい。【００１７】
本発明の生産方法において、上記溶液のグルタチオン濃度は、１ｍｇ／Ｌ〜５０００ｍｇ／Ｌの範囲内であることが好ましく、１ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌの範囲内であることがより好ましい。【００１８】
本発明の生産方法において、上記グルタチオンは酸化型グルタチオンであることが好ましい。【００１９】
本発明の生産方法において、上記植物は難発根性であってもよく、この場合、ユーカリ属植物、マツ属植物、サクラ属植物、マンゴー属植物およびアボガドからなる群より選択される植物であることが好ましく、ユーカリ属植物であることがより好ましい。【００２０】
本発明の生産方法において、上記工程は、６５０〜６７０ｎｍの波長成分と４５０〜４７０ｎｍの波長成分とを９：１〜７：３の割合で含む光照射下で行われることが好ましい。【００２１】
本発明の生産方法において、上記工程は、炭酸ガスを供給しながら行われることが好ましい。【００２２】
本発明の生産方法において、上記炭酸ガスの供給量は、３００〜２０００ｐｐｍであることが好ましい。【００２３】
本発明の生産方法において、上記工程は、湿度８０％以上の条件下で行われることが好ましい。【００２４】
本発明の生産方法は、基部に傷をつけられたシュートを用いて行われてもよい。【００２５】
本発明の生産方法において、上記シュートは、挿し穂、または、母本植物から採取した器官を無菌的に培養することにより得た多芽体、もしくは該器官を無菌的に育成して得た茎葉であることが好ましい。【００２６】
本発明の組成物は、植物のシュートから発根させるために、グルタチオンを含有することを特徴としている。【００２７】
本発明の組成物は、培地として用いられることが好ましい。【００２８】
本発明の組成物において、グルタチオンの濃度は、１ｍｇ／Ｌ〜５０００ｍｇ／Ｌの範囲内であることが好ましく、１ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌの範囲内であることがより好ましい。【００２９】
本発明の組成物は、培地または溶液に混合される補助剤として用いられてもよく、混合後の培地中または溶液中にて、１ｍｇ／Ｌ〜５０００ｍｇ／Ｌの範囲内のグルタチオンの最終濃度を提供することが好ましく、１ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌの範囲内のグルタチオンの最終濃度を提供することがより好ましい。また、本発明の組成物は、錠剤、散剤または顆粒剤の形態であることが好ましい。【００３０】
本発明の組成物は、植物の無性繁殖を行うために用いられることが好ましく、植物のシュートからクローン苗を調製するために用いられてもよい。【００３１】
本発明の組成物において、上記グルタチオンは酸化型グルタチオンであることが好ましい。【００３２】
本発明の組成物は、グルタチオン以外の炭素源を含まないことが好ましく、窒素、リンおよびカリウムを必須元素として含むことが好ましい。【００３３】
本発明は、植物のシュートから発根させるために、グルタチオンが用いられることを特徴としており、植物のシュートからクローン苗を調製するために、グルタチオンが用いられることがより好ましい。さらに、本発明は、植物のシュートから発根させるための組成物を調製するために、グルタチオンが用いられることを特徴としており、植物のシュートからクローン苗を調製するための組成物を調製するために、グルタチオンが用いられることがより好ましい。
【発明の効果】
【００３４】
本発明によれば、植物のシュートを、グルタチオンの存在下にて栽培することにより、前記シュートからの発根を促進させ、発根率を向上させることができるので、クローン苗の生産性を向上させることができる。しかも、このような効果は、発根能が低い植物種で特に顕著である。従って、本発明は、広く様々な植物種のクローン苗の大量かつ迅速な生産に寄与するものであり、特に、発根能が低い植物種であっても、クローン苗を大量かつ迅速に生産することを可能とし、その産業的利用に途を開くものである。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
［植物の繁殖法］
植物は、種子繁殖（有性生殖）または栄養繁殖（無性生殖）を介して、種の繁栄を維持する。植物の育種において、優良な形質を有する個体を多数得ることが求められている。そのために、遺伝的に異なる多数の個体から、目的に合致する優良な個体を選抜し、選抜された個体が栄養繁殖を用いてクローン増殖され、クローン苗が取得される。栄養繁殖は、同一形質の固体を増殖させることができる技術であり、挿し木、接ぎ木、取り木、株分けなどが含まれる。
【００３６】
挿し木は、目的の植物の一部を採取して、挿し床において不定根、不定芽を発生させて、独立した一個体を形成させる技術であり、最も幅広く利用され得る簡便な技術であるが、発根能が低い植物に適用することは非常に困難である。接ぎ木は、目的の植物の一部を他の植物に接着させて一個体として生育させる技術であり、挿し木や取り木に適用することが困難な植物であっても繁殖させることが可能であるが、技術的に非常に困難である。取り木は、接ぎ木や取り木に適用することが困難な植物に用いられるが、繁殖効率が悪い。
【００３７】
挿し木を試みる場合には、目的の植物の発根能が重要であるので、種々の発根促進剤（例えば、オーキシン）が用いられることが多い。培地中の寒天やショ糖濃度等が根の形態に影響を及ぼすことも知られている。また、ヒノキのように、活性炭による発根促進効果を示すものもある。さらに、有菌状態でシュートを挿しつけることによって発根が促進することがあることも知られている。
【００３８】
このように、植物の栄養繁殖によって種苗を安定的に供給することが求められており、そのために、クローン苗を生産する効率的な手法の開発が望まれている。
【００３９】
本発明は、植物のシュートからのクローン苗の生産に関するものである。すなわち、本発明は、植物のシュートを、グルタチオンの存在下にて栽培し、前記シュートから発根させる技術である。植物のシュートからの発根を促進させて、クローン苗を生産し得る程度にまで発根率を向上させることができる本発明は、クローン苗の生産性を向上させることができる非常に効率的な技術である。
【００４０】
［対象植物］
本発明は、どのような植物に対しても適用することができる。中でも木本植物に適用されることが好ましく、草本植物よりも発根能が劣っている木本植物に適用されることが、本発明の効果を顕著に発揮できる点でより好ましい。木本植物としては例えば、ユーカリ属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）植物、マツ属（Ｐｉｎｕｓ）植物、サクラ属（Ｐｒｕｎｕｓ）植物（サクラ（Ｐｒｕｎｕｓ  ｓｐｐ．）、ウメ（Ｐｒｕｎｕｓ  ｍｕｍｅ）、ユスラウメ（Ｐｒｕｎｕｓ  ｔｏｍｅｎｔｏｓａ）など）、アボカド属（Ａｖｏｃａｄｏ）植物、マンゴー属(Ｍａｎｇｉｆｅｒａ)植物（マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ  ｉｎｄｉｃａ）など）、アカシア属（Ａｃａｃｉａ）植物、ヤマモモ属（Ｍｙｒｉｃａ）植物、クヌギ属（Ｑｕｅｒｃｕｓ）植物（クヌギなど（Ｑｕｅｒｃｕｓ  ａｃｕｔｉｓｓｉｍａ））、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ）属植物、リンゴ（Ｍａｌｕｓ）属植物、バラ属（Ｒｏｓａ）植物、ツバキ属（Ｃａｍｅｌｌｉａ）植物、ジャカランダ属（Ｊａｃａｒａｎｄａ）植物（ジャカランダ（Ｊａｃａｒａｎｄａ  ｍｉｍｏｓｉｆｏｌｉａ）など）、ワニナシ属（Ｐｅｒｓｅａ）植物（アボカド（Ｐｅｒｓｅａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）など）が挙げられる。このうち、ユーカリ、マツ、サクラ、マンゴー、アボカド、アカシア、ヤマモモ、クヌギ、ブドウ、リンゴ、バラ、ツバキ、ウメ、ユスラウメ、ジャカランタ等に適用した場合に、より本発明の効果を発揮しうる。中でもユーカリ属植物、マツ属植物、サクラ属植物、マンゴー属植物が好ましく、特に、難発根性として知られるユーカリ、マツ、サクラ、マンゴー、アボカド等に本発明を適用すれば、大きな効果が得られる。
【００４１】
ユーカリの中でも、ユーカリ・グロビュラス、ユーカリ・スミジアイなどのユーカリ属植物は特に難発根性であるため、本発明を適用すれば、大きな効果が得られうる。なお、ユーカリは発根能が非常に低く、オーキシン存在下であっても、ユーカリ・グロビュラスの精英樹の発根率が、高いものであっても２５％程度であることが知られている（例えば、Sotelo, M. and Monza, J. Agrociencia (2007) Vol XI, No.1, p.81-89参照）。
【００４２】
［シュート］
シュートとは、発根能を有する組織全般をいう。該組織としては、枝、茎、頂芽、腋芽、不定芽、葉、子葉、胚軸、不定胚、苗条原基等が例示される。シュートの由来は特に限定されず、温室や屋外に生育している植物個体から得られたものでもよいし、組織培養法により得られた培養組織であってもよいし、天然の植物体の一部の組織であってもよい。また、クローン苗とは、これらの組織が発根して得られる苗をいう。シュートは、挿し穂の母本植物や、多芽体から効率良く取得することができる。中でも、挿し穂（母本植物から得た挿し穂）、母本植物から採取した器官を無菌的に培養することにより得た多芽体、もしくは前記器官を無菌的に育成して得た茎葉であることが好ましい。
【００４３】
多芽体は、本発明を適用してクローン苗を生産しようとする植物から、頂芽や腋芽等を切取って、これを組織培養して誘導することができる。多芽体を、母本植物から採取した器官を無菌的に培養して得る方法としては、例えば、前記の木本植物から、多芽体を形成させるには、特開平８−２２８６２１号公報に記載の方法、条件に従って行い得る。その方法、条件は概ね次の通りである。まず、材料とする植物から頂芽、腋芽等の組織を採取し、採取した組織について、有効塩素量約０．５％〜約４％の次亜塩素酸ナトリウム水溶液又は有効塩素量約５％〜約１５％の過酸化水素水溶液に約１０分〜約２０分間浸漬して表面殺菌を行う。次いで、これを滅菌水で洗浄し、固体培地に挿し付けて芽を開じょさせ、伸長してきた茎葉を同じ組成の培地で継代培養することにより、多芽体を形成させる。ユーカリ属やアカシア属の組織（例えば腋芽）を用いる場合には、固体培地は、ショ糖１〜５重量％、植物ホルモンとしてベンジルアデニン（以下、ＢＡと略す。）約０．０２ｍｇ／Ｌ〜約１ｍｇ／Ｌ、ゲランガム約０．２重量％〜約０．３重量％若しくは寒天約０．５重量％〜約１重量％を含有するムラシゲスクーグ（以下、ＭＳと略す。）培地又はこのＭＳ培地の硝酸アンモニウム成分と硝酸カリウム成分とを半減させた改変ＭＳ培地を用いるのが好ましい。こうして形成された多芽体からは活発にシュートが伸長してくる。多芽体自体は、適当に分割して多芽体形成に用いた培地と同一組成の培地で培養することにより維持し、増殖させることができる。
【００４４】
［挿し穂］
本発明においては上述したように、植物のシュートを栽培するにあたり、シュートとして挿し穂を用いてもよい。挿し穂としては、緑枝（当年枝）や熟枝（前年以前に伸びた枝）の他、芽や葉も用いることができる。木本植物の場合では緑枝や熟枝を挿し穂として用い、草本植物の場合では葉や芽を挿し穂として用いるのが普通である。
【００４５】
［グルタチオン］
本発明においては、上記シュートを栽培するにあたり、グルタチオンを用いる。グルタチオンは、その製造条件は特に限定されず、人工的に合成されたものでも、天然物由来のものでもよい。また、精製度も特に問わない。市販品を利用することも可能である。グルタチオンとしては、酸化型と還元型とあり、本発明ではいずれも用い得るが、酸化型グルタチオンが好ましい。本発明においてグルタチオンとして酸化型グルタチオンを用いる場合には、植物体に取り込まれた後、植物体内にて、より安定性に優れる還元型グルタチオンに変化するものと推測される。
【００４６】
植物のシュートをグルタチオンの存在下にて栽培する工程は、植物の種類やシュートの状態、栽培方法などから適宜選択でき、グルタチオンを含む発根用培地でシュートを培養する方法；グルタチオンを含む溶液をシュートに接触させる方法、が例示される。シュートとして組織培養法により得られた培養組織を用いる場合には前者が好ましく、シュートとして挿し穂を用いる場合には前者、後者のいずれでもよい。なお、本発明においては上記例示した両方法の併用、すなわち、グルタチオンを含む発根用培地でシュートを培養しつつ、グルタチオンを含む溶液をシュートに接触させる方法を採用することも、もちろん可能である。
【００４７】
グルタチオンを含む発根用培地でシュートを培養する場合、発根用培地中のグルタチオンの濃度は、好ましくは約１ｍｇ／Ｌ〜約５０００ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは約５ｍｇ／Ｌ〜約１０００ｍｇ／Ｌ、とりわけ好ましくは約２５ｍｇ／Ｌ／ｌ〜約５００ｍｇ／Ｌである。
【００４８】
発根用培地での培養の際に、後述のように支持体を用いる場合であって、支持体がオアシス等の活性成分の吸着の少ない支持体のときには、グルタチオンの発根用培地における添加量は、好ましくは約１ｍｇ／Ｌ〜約１００ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは約５ｍｇ／Ｌ〜約７５ｍｇ／Ｌ、とりわけ好ましくは約２５ｍｇ／Ｌ〜約７５ｍｇ／Ｌである。
【００４９】
グルタチオンを含む溶液（グルタチオン溶液）をシュートに接触させる場合、その接触の方法は特に限定されず、植物の種類やシュートの状態、栽培方法などから適宜選択しうる。例えば、シュートへグルタチオン溶液を直接散布する方法、支持体をグルタチオン溶液で浸潤させる方法が挙げられる。
【００５０】
グルタチオン溶液は、グルタチオンを、適当な溶媒（例えば、水など）に溶解させて調製され得る。水としては、脱イオン水、蒸留水、逆浸透水、水道水などが例示され、いずれも利用可能である。グルタチオン溶液におけるグルタチオンの濃度は、約１ｍｇ／Ｌ〜約５０００ｍｇ／Ｌであることが好ましく、約５ｍｇ／Ｌ〜約１０００ｍｇ／Ｌであることがより好ましく、約１０ｍｇ／Ｌ〜約１０００ｍｇ／Ｌであることがさらにより好ましい。
【００５１】
グルタチオン溶液をシュートに直接散布する場合は、グルタチオン溶液を、スプレーなどを用いて霧状に、シュートの一部または全体に散布すればよい。グルタチオン溶液の散布量は、グルタチオン溶液中のグルタチオンの濃度にもより、一概には規定できないが、一般には１つのシュートあたり約０．５ｍｌ〜約５．０ｍｌが好ましく、約１．０ｍｌ〜約３．０ｍｌがより好ましい。散布回数は、１回でも２回以上であってもよいが、少なくとも栽培開始時に散布することが好ましい。さらに栽培条件に応じて、栽培期間中に適宜（例えば数日（２日〜３日）おき）追加で散布を行ってもよい。
【００５２】
支持体をグルタチオン溶液で湿潤させる場合は、グルタチオン溶液を支持体上部から散水する方法、グルタチオン溶液を満たした容器内に支持体を置床し底面から潅水させる方法などが例示される。支持体上部から散水する場合、上部からの散水量としては、１つのシュートあたり約１．０ｍｌ〜約３０ｍｌが好ましく、約５．０ｍｌ〜約１０．０ｍｌがより好ましい。底面から潅水させる場合は、グルタチオン溶液が支持体に、実質的に均一に湿潤されればよい。支持体をグルタチオン溶液で湿潤させる場合、グルタチオン溶液のほかに別途発根用培地を用意し、両者で支持体を湿潤させてもよく、このことは前述したとおりである。
【００５３】
グルタチオンは、グルタチオン含有培地（発根用培地）またはグルタチオン溶液を調製する際に、培地または溶液に添加して混合される補助剤として提供されてもよく、発根用培地またはグルタチオン溶液を首尾よく調製するために、錠剤、散剤または顆粒剤の形態であることが好ましい。調製した発根用培地またはグルタチオン溶液におけるグルタチオンの最終濃度が上述した範囲内になるように、グルタチオンが上記補助剤に含有されている。
【００５４】
なお、グルタチオン含有培地またはグルタチオン溶液は、グルタチオンが上記濃度範囲内に調整された後に植物に供給されることが好ましいが、植物に取り込まれる段階でグルタチオンが培地または溶液と混合されていればよい。よって、グルタチオンを含有しない培地または溶液と上記補助剤とが、同時にまたは連続的に、植物の外表面に直接的に供給されても、植物の近傍（支持体または用土）に供給されてもよい。このような手順をもちいることによって、植物は、補助剤が混合された培地または溶液を取り込むことができる。
【００５５】
［発根用培地］
本発明において発根用培地とは、植物のシュートから発根させるために用いられる培地を意味する。発根用培地は、銀イオン及び／又は抗酸化剤を含有することが好ましく、銀イオン及び抗酸化剤の両方を含有することがより好ましい。銀イオンは、ＳＴＳや硝酸銀等の銀化合物（銀イオン源）として培地中に添加すればよい。中でもＳＴＳは、培地に添加してシュートを培養すると、健全な根の発根・伸長が促進されるので、本発明で用いる銀イオン源として好ましい。これは、このＳＴＳに由来する銀イオンが、培地中で、チオ硫酸銀イオンの形態を取り、マイナスに帯電しているためと考えられる。発根用培地中に添加する銀イオンの濃度は、銀イオン源の種類その他の培養条件などにもよるが、銀イオン源の濃度として約０．５μＭ〜約１０μＭが好ましく、約２μＭ〜約６μＭがより好ましい。
【００５６】
一方、抗酸化剤としては、例えば、アスコルビン酸や亜硫酸塩等、公知のものを用いることができる。中でもアスコルビン酸は、培地への残留性が低いので、本発明で用いる抗酸化剤として好ましい。発根用培地中に添加する抗酸化剤の濃度は、約５ｍｇ／Ｌ〜約２００ｍｇ／Ｌが好ましく、約２０ｍｇ／Ｌ〜約１００ｍｇ／Ｌがより好ましい。
【００５７】
本発明で用いる発根用培地は、上記成分に加え、無機成分、炭素源、ビタミン類、アミノ酸類及び植物ホルモン類等を含み得る。
【００５８】
無機成分としては、窒素、リン、カリウム、硫黄、カルシウム、マグネシウム、鉄、マンガン、亜鉛、ホウ素、モリブデン、塩素、ヨウ素、コバルト等の元素や、これらを含む無機塩が例示される。該無機塩としては例えば、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム、リン酸１水素カリウム、リン酸２水素ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第１鉄、硫酸第２鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸銅、硫酸ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、ホウ酸、三酸化モリブデン、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、塩化コバルト等やこれらの水和物が挙げられる。無機成分として、上記具体例の中から１種を選択して、或いは２種以上を組み合わせて用いうる。本発明で用いられる発根用培地においては、窒素、リン、カリウムが必須元素として含まれることが好ましい。よって、これら無機成分の具体例のうち、窒素、リン、カリウム、窒素を含む無機塩、リンを含む無機塩、及びカリウムを含む無機塩が好ましく、窒素、リン、カリウム、窒素を含む無機塩がより好ましい。無機成分は、発根用培地中の濃度が、１種の場合は約１μＭ〜約１００ｍＭとなるように添加することが好ましく、約０．１μＭ〜約１００ｍＭとなるように添加することがより好ましい。２種以上の組み合わせの場合はそれぞれ約０．１μＭ〜約１００ｍＭとなるよう添加することが好ましく、約１μＭ〜約１００ｍＭとなるように添加することがより好ましい。
【００５９】
炭素源としては、ショ糖等の炭水化物とその誘導体；脂肪酸等の有機酸；エタノール等の１級アルコール、などの化合物を使用することができる。炭素源として、上記具体例の中から１種を選択して、或いは２種以上を組み合わせて用いうる。炭素源は、発根用培地中に約１ｇ／ｌ〜約１００ｇ／ｌとなるよう添加することが好ましく、約１０ｇ／ｌ〜約１００ｇ／ｌとなるように添加することがより好ましい。しかし、培養を炭酸ガスを供給しながら行う場合には、培地は炭素源を含む必要は無く、含まないことが好ましい。ショ糖等の炭素源となりうる有機化合物は微生物の炭素源ともなるので、これらを添加した培地を用いる場合には、無菌環境下で培養を行う必要があるが、グルタチオン以外の炭素源を含まない培地を用いることにより、非無菌環境下での培養が可能となる。
【００６０】
ビタミン類としては、例えば、ビオチン、チアミン（ビタミンＢ１）、ピリドキシン（ビタミンＢ４）、ピリドキサール、ピリドキサミン、パントテン酸カルシウム、イノシトール、ニコチン酸、ニコチン酸アミド及び／又はリボフラビン（ビタミンＢ２）等を使用することができる。ビタミン類として、上記具体例の中から１種を選択して、或いは２種以上を組み合わせて用いうる。ビタミン類は、発根用培地中の濃度が、１種の場合は発根用培地中に約０．０１ｍｇ／Ｌ〜約２００ｍｇ／Ｌとなるように添加することが好ましく、約０．０２ｍｇ／Ｌ〜約１００ｍｇ／Ｌとなるように添加することがより好ましい。２種以上の組み合わせの場合はそれぞれ、発根用培地中に約０．０１ｍｇ／Ｌ〜約１５０ｍｇ／Ｌとなるよう添加することが好ましく、約０．０２ｍｇ／Ｌ〜約１００ｍｇ／Ｌとなるように添加することがより好ましい。
【００６１】
アミノ酸類としては、例えば、グリシン、アラニン、グルタミン酸、システイン、フェニルアラニン及び／又はリジン等を使用することができる。アミノ酸類として、上記具体例の中から１種を選択して、或いは２種以上を組み合わせて用いうる。アミノ酸類は、発根用培地中の濃度が、１種の場合は発根用培地中に約０．１ｍｇ／Ｌ〜約１０００ｍｇ／Ｌとなるように添加することが好ましく、２種以上の組み合わせの場合は、それぞれ発根用培地中に約０．２ｍｇ／Ｌ〜約１０００ｍｇ／Ｌとなるよう添加することが好ましい。
【００６２】
また、植物ホルモン類としては、例えば、オーキシン類及び／又はサイトカイニン類を使用することができる。オーキシン類としては、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、インドール酢酸（ＩＡＡ）、ｐ−クロロフェノキシ酢酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４Ｄ）、インドール酪酸（ＩＢＡ）及びこれらの誘導体等が例示され、これらから選択される１種以上又は２種以上を組み合わせて用い得る。また、サイトカイニン類としてはベンジルアデニン（ＢＡ）、カイネチン、ゼアチン及びこれらの誘導体等が例示され、これらから選択される１種以上又は２種以上を組み合わせて用い得る。植物ホルモン類としては、オーキシン類のみ、サイトカイニン類のみ、或いはオーキシン類とサイトカイニン類の両方を組み合わせて用いうる。植物ホルモン類は、１種を用いる場合には発根用培地中に約０．０１ｍｇ／Ｌ〜約１０ｍｇ／Ｌとなるように添加することが好ましく、約０．０２ｍｇ／Ｌ〜約１０ｍｇ／Ｌとなるように添加することがより好ましい。２種以上の場合にはそれぞれ、発根用培地中に約０．０１ｍｇ／Ｌ〜約１０ｍｇ／Ｌとなるよう添加することが好ましく、約０．０２ｍｇ／Ｌ〜約１０ｍｇ／Ｌとなるように添加することがより好ましい。
【００６３】
なお、本発明においては、植物組織培養用培地として公知の培地に、必要に応じてグルタチオンを添加するほか、さらに銀イオン及び／又は抗酸化剤を添加し、さらにまた、グルタチオン以外の炭素源、植物ホルモン類を適宜添加等して、発根用培地として用いてもよい。かかる植物組織培養用培地としては、例えば、ＭＳ培地、リンスマイヤースクーグ培地、ホワイト培地、ガンボーグのＢ−５培地、ニッチニッチ培地等を挙げることができる。中でも、ＭＳ培地及びガンボーグのＢ−５培地が好ましい。これらの培地は、必要に応じて適宜希釈等して用いることができる。
【００６４】
上記発根用培地は、液体培地、固体培地のいずれであってもよいが、液体培地の方が作業効率および移植時に根を傷つけることが少ない点で好ましい。液体培地の場合には培地組成を混合し調製してそのまま用い得る。また固体培地の場合には液体培地と同様に培地組成を混合し調製すると同時に、或いは調製後に、寒天又はゲランガム等の固化剤で固化させて使用しうる。固化剤の培地への添加量は、固化剤の種類や培地の組成にもっても異なる。固化剤が寒天の場合０．５重量％〜１重量％であることが好ましい。固化剤がゲランガムの場合０．２重量％〜０．３重量％であることが好ましい。
【００６５】
発根用培地へのシュートの挿し付け方法は、培地の種類、培養条件等により適宜選択しうる。発根用培地が固体培地の場合は、発根用培地に直接シュートの基部を挿し付けて培養すればよい。一方発根用培地が液体培地の場合は、例えば、後述の支持体を発根用培地で湿潤させたものにシュートの基部を挿し付けて培養すればよい。なお、発根用培地に挿し付ける時にシュートの基部に傷をつけるといった物理的刺激を加えることも、発根率の向上のために好ましい。シュートの基部とは、シュートの一端であって根が形成される領域（葉の形成される端部に対し反対側）を意味する。シュートとして多芽体を用いる場合の基部は、多芽体を分割する際の切断面を有する領域である。シュートの基部への傷のサイズ（大きさ、形状など）は特に限定されない。例えば、シュートとして多芽体を用いる場合、シュートの基部（上述の切断面）を正面方向から見た際に十字型となるような傷を付けることが好ましい。傷を付ける際には、ハサミやナイフなどを用いることができる。
【００６６】
このように、グルタチオンを、植物のシュートから発根させるための用途に用いることができる。また、グルタチオンを、植物の無性繁殖を行うための用途に用いることができる。
【００６７】
このような用途を実現するためには、化合物としてのグルタチオンが直接用いられても、グルタチオンを含有している組成物が用いられてもよく、また、キットに備えられているグルタチオンまたは組成物が用いられてもよい。本発明の組成物としては、上述したような、発根用培地（グルタチオン含有培地）、グルタチオンを含む溶液（グルタチオン溶液またはグルタチオン含有溶液）および補助剤が挙げられるが、これらに限定されない。一般に、組成物は「二種以上の成分が全体として均質に存在し、一物質として把握されるもの」が意図され、本明細書中で使用される場合、「組成物」は各種成分が一物質中に含有されている形態であることが意図される。また、本明細書中で使用される場合、「キット」は、組成物中に含有されるべき各種成分が別々の容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）に含まれておりかつ容器の全てが全体として1つに梱包されている形態であることが意図され、後述する支持体または培養容器を備えていてもよい。
【００６８】
［支持体］
本発明において支持体とは、植物のシュートを支持するための支持体である。発根用培地（特に固体培地）を用いる場合などには、支持体は不要の場合があるが、それ以外の場合には通常支持体が利用される。
【００６９】
支持体は、栽培の期間中シュートを挿し付けた状態で保持できるものが好ましい。また、本発明において栽培にあたり液状の発根用培地を用いる場合には、通常、支持体に浸潤させて用いられる。よって支持体は液体で浸潤され得るものが好ましく、中でも、グルタチオン溶液、或いはグルタチオンを含む液体培地により実質的に均一に湿潤され得るものが好ましい。発根用培地として、液体培地を用いる場合には、液体培地（グルタチオン溶液を含まない）とグルタチオン溶液とを別個に支持体に添加してもよいし、予め調製したグルタチオンを含む液体培地を支持体に添加してもよい。支持体としては、従来慣用の支持体を用いることができ、特に限定されない。支持体としては例えば、砂、赤玉土等の自然土壌；籾殻燻炭、ココナッツ繊維、バーミキュライト、パーライト、ピートモス、ガラスビーズ等の人工土壌；発泡フェノール樹脂、ロックウール等の多孔性成形品などを挙げることができる。かかる支持体を培養容器内に入れ、グルタチオン溶液、或いはグルタチオンを含む液体培地にて湿潤させることにより発根床が調製され得る。なお、発根用培地が固体培地の場合には、固体培地を直接培養容器に入れることで、発根床が調製され得る。
【００７０】
［培養容器］
本発明においては、発根用培地または支持体を納めるための培養容器を用い得る。培養容器としては、従来慣用の培養容器を用いることができ、特に限定されない。例えば、育苗ポット、プラグトレーなどが例示される。培養容器は密閉型でもよいし開放型でもよいが、密閉型のものが好ましい。密閉型の培養容器を用いることにより、散布されたグルタチオンを保持することができる。また、シュートやこれから形成されるクローン苗を取り巻く環境の湿度維持が容易となる。
【００７１】
シュートとして枝を用いる場合には、培養容器として密閉型の培養容器を用いることが好ましい。これによりシュートを高湿度下に置くことが容易となるので枝についた葉の蒸散作用が抑制され、従来行われていた葉の一部切除処理を省略することができる。
【００７２】
培養容器は、容器内への炭酸ガス供給が可能な容器であることがより好ましい。このような培養容器としては、二酸化炭素透過性の膜で蔽われた開口部を有する容器が例示される。このような容器を用いることにより、培養環境の湿度をも容易に調整しうる。開口部の形状は特に問わない。二酸化炭素透過性の膜の材料は特に限定されず、ポリテトラフルオロエチレンなどが例示される。また、膜の孔径も特に限定されず、約０．１μｍ〜約１μｍのものなどが例示される。
【００７３】
［栽培条件］
シュートを栽培する際の栽培条件としては、シュートから発根させ得る条件である限り特に限定されない。栽培条件は、植物の種類やシュートの状態、発根用培地の種類などにより一概に規定することは難しいが、例えば、温度は、約２３℃〜約２８℃であることがより好ましい。光強度は、光合成有効光量子束密度として表され、約１０μｍｏｌ／ｍ2／ｓ〜約１０００μｍｏｌ／ｍ2／ｓであることが好ましく、約５０μｍｏｌ／ｍ2／ｓ〜約５００μｍｏｌ／ｍ2／ｓであることがより好ましい。いずれの場合でも、通常は約２週間〜約５週間で、シュートからの発根が観察されるようになる。
【００７４】
栽培は、６５０ｎｍ〜６７０ｎｍの波長成分と４５０ｎｍ〜４７０ｎｍの波長成分とを９：１〜７：３の割合で含む光の照射下で行うことが好ましく、これらの波長成分を９：１〜８：２の割合で含む光の照射下で行うことがより好ましい。かかる波長成分を含む光を照射して栽培を行うことで、シュートからの発根がより促進され得る。
【００７５】
さらに、炭酸ガスを栽培環境中に、通常は３００ｐｐｍ〜２０００ｐｐｍ、好ましくは８００ｐｐｍ〜１５００ｐｐｍとなるように供給することが好ましい。炭酸ガスの供給量の制御は、人工気象器等の設備や、二酸化炭素透過性の膜を開口部に有する培養容器などを利用して行われうる。
【００７６】
湿度は８０％以上であることが好ましく、８５％以上であることがより好ましい。この湿度であることにより、シュートの発根を促進することができる。また上限については特に制限はない。
【００７７】
シュートとして挿し穂を用いる場合には、遮光を行うことが好ましい。遮光率は、３０〜７０％が好ましく、４０〜６０％がより好ましい。
【００７８】
以上のようにして、シュートから発根したクローン苗が得られる。得られたシュートは、必要に応じてある程度の期間、そのまま培養を続け、根を充実させてから、これを育苗容器又は苗畑等に移植して育成し、植林等の所定の目的に使用可能な苗とすることができる。この間の用土や、苗を育成する際の温度・光強度等の条件は、その植物に適するように適宜設定すればよい。なお、不定芽や苗条原基等、培養組織由来のシュートを発根させた場合には、通常、育苗容器等への移植の前に、順化の過程を経る必要がある。
【００７９】
［作用］
本発明では、植物のシュートを、グルタチオンの存在下にて栽培することにより、前記シュートから発根させることができる。その理由は、以下のように推察される。
【００８０】
グルタチオンは一般的には抗酸化剤として知られ、細胞中の活性酸素ストレスの低減を行うとされている。しかしながら、植物の発根に酸化還元反応が関係するとの明らかな知見は知られていない。一方、植物の発根において二酸化炭素施肥や光の効果が示されている。このことから、グルタチオンの発根促進作用には、光合成の増強作用が何らかの形で関与している可能性が高い。
【実施例】
【００８１】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。【００８２】
［実施例１］
ユーカリプタス・グロビュラス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｌｏｂｕｌｕｓ、以下、単にＥ．グロビュラスと略記する。）の野生型より誘導した多芽体から、２〜５ｃｍの長さに伸長した茎葉（シュート）を切取った。多芽体の誘導は、特開平８−２２８６２１号公報に示す方法に従った。すなわち、Ｅ．グロビュラス（野生型）から組織（頂芽および腋芽）を採取し、採取した組織について、有効塩素量１％の次亜塩素酸ナトリウム水溶液に２０分間浸漬して表面殺菌を行った。次いで、これを滅菌水で洗浄し、固体培地（ショ糖２０ｇ重量％、ＢＡ０．２ｍｇ／Ｌ、ゲランガム２．５ｇ重量％を含むＭＳ培地）に挿し付けて芽を開じょさせた。培養開始後３〜４週間目に、伸長してきた茎葉を同じ組成の培地で継代培養することにより、多芽体を形成させた。なお、多芽体からの茎葉の育成は、多芽体形成に用いた培地と同一組成の培地を用いて同一条件下で培養を維持して行った。【００８３】
得られたシュートの基部を、酸化型グルタチオン２５ｍｇ／Ｌ、銀イオン源としてＳＴＳ（ＡｇＳ4Ｏ6）５μＭ、抗酸化剤としてアスコルビン酸５０ｍｇ／Ｌ、及び植物ホルモンとしてＩＢＡ２ｍｇ／Ｌを添加した、４倍希釈ＭＳ培地（組成：硝酸アンモニウム  ４１２．５ｍｇ／Ｌ、硝酸カリウム  ４７５ｍｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム  ４２．５２ｍｇ／Ｌ、ヨウ化カリウム  ０．２１ｍｇ／Ｌ、なお、本培地にグルタチオン以外の炭素源は添加されていない。）にて湿潤した発泡フェノール樹脂製多孔性支持体（スミザースオアシス社製、商品名：オアシス）に挿し付け、炭酸ガス濃度１０００ｐｐｍ、温度２５℃、６５０〜６７０ｎｍの波長成分と４５０〜４７０ｎｍの波長成分とを８．２：１．８の割合で含む、光合成有効光量子束密度５１．３μｍｏｌ／ｍ2／Ｓの赤色光照射下で２ヶ月間培養を行った。なお、このとき培養容器としては、最大寸法が縦１０〜１１．５ｃｍ×横１０〜１１．５ｃｍ×高さ１０．０ｃｍ程度の、胴部がやや張出した形状の立方体のものを用いた。この培養容器の頂面には、孔径０．４５μｍのポリテトラフルオロエチレン製膜（ミリポア社製、商品名：ミリシール）を貼り付けた円形開口部１個が設けられている。培養容器内の炭酸ガスの濃度は、培養容器外の炭酸ガスが培養容器の開口部の炭酸ガス透過性の膜より透過するため、培養容器の開口部の膜より透過した濃度（約１０００ｐｐｍ）であった。赤色光照射の培養容器への照射は、光照射装置として商品名：ＣＣＦＬ光源ユニット、メーカー名：日本医化器械製作所を用いて行った。また、培養容器をパラフィルムで封鎖する事により培養容器内の湿度の調整を行った。【００８４】
シュートは、この培養容器１個当たり９本を挿し付けた。シュートの供試数と、２ヶ月間培養後に発根したシュートの数（発根数）から、発根率を算出した。結果を表１に示す。【００８５】
［実施例２］
酸化型グルタチオンの培地への添加量を５０ｍｇ／Ｌとした以外は、実施例１と同様にして培養を行った。結果を表１に示す。【００８６】
［実施例３］
酸化型グルタチオンの培地への添加量を７５ｍｇ／Ｌとした以外は、実施例１と同様にして培養を行った。結果を表１に示す。【００８７】
［比較例１］
酸化型グルタチオンを培地に添加しなかった以外は、実施例１と同様にして培養を行った。結果を表１に示す。【００８８】
【表１】
0005612605.tif 000002
表１より明らかなように、酸化型グルタチオンを２５〜７５ｍｇ／Ｌ添加した発根用培地を用いた実施例１〜３の発根率は５１．９．６〜８５．２％と高いのに対し、発根用培地に酸化型グルタチオンを添加しなかった比較例１は発根率が２２．２％と低かった。【００８９】
［実施例４］
挿し穂の材料として、ユーカリプタス・ユーロフィラとユーカリプタス・グランディスの雑種（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｕｒｏｐｈｙｌｌａ×Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓ、以下、単にＥ．ユーログランディスと略記する。）系統名：Ａを用いた。すなわち採穂母樹から、５〜２０ｃｍの長さ、節が１〜３節、葉が２〜６葉程度に伸長した穂木を切り出し、葉の先端側約半分を切除し、挿し穂を調製した。【００９０】
支持体としては、籾殻燻炭、ココナッツ繊維、バーミキュライトの混合土を、育苗ポット（内径３ｃｍ×高さ１５ｃｍ）に予め詰めたものを用いた。酸化型グルタチオンを濃度が５０ｍｇ／Ｌとなるように水に溶解して、酸化型グルタチオン溶液を作製した。育苗ポット１つあたりの散水量を、酸化型グルタチオン溶液（５０ｍｇ／Ｌ）約８．５ｍｌとして、育苗ポット上部よりジョウロにより散水処理し、支持体に含ませた。その後、挿し穂の基部を、支持体に挿し付けた。挿し付け後は、太陽光を５０％遮光した温室にて３週間育苗を行った。温室内は、ミストを頻繁に噴霧することで高い湿度（８０％以上）を保った。３週間育苗後に発根した挿し穂の数から、発根率を算出した。結果を表２に示す。【００９１】
［実施例５］
酸化型グルタチオン溶液として、酸化型グルタチオンの濃度が２００ｍｇ／Ｌの溶液を用いたこと以外は、実施例４と同様にして育苗を行った。結果を表２に示す。【００９２】
［実施例６］
酸化型グルタチオン溶液として、酸化型グルタチオン濃度が５００ｍｇ／Ｌのものを用いた以外は、実施例４と同様にして育苗を行った。結果を表２に示す。【００９３】
［実施例７］
酸化型グルタチオン溶液として、酸化型グルタチオン濃度が１０００ｍｇ／Ｌのものを用いた以外は、実施例４と同様にして育苗を行った。結果を表２に示す。【００９４】
［比較例２］
酸化型グルタチオン溶液の散水処理をしなかった以外は、実施例４と同様にして育苗を行った。結果を表２に示す。【００９５】
【表２】
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表２より明らかなように、シュートに酸化型グルタチオンを５０〜１０００ｍｇ／Ｌの濃度で含む酸化型グルタチオン溶液を散布した実施例４〜７の発根率は、７２．７％〜８４．１％と高いのに対し、酸化型グルタチオン溶液を散布しなかった比較例２は５６．８％と低かった。【００９６】
［実施例８］
酸化型グルタチオンの付与を挿し穂の葉面へ添加した。すなわち、挿し穂の採穂母樹をＥ．ユーログランディス  系統名：Ｂとしたほかは、実施例５と同様にして挿し穂を調製し、実施例５と同様の支持体に挿し穂の基部を挿し付けた。酸化型グルタチオン溶液を実施例５と同様に調製し、挿し付け直後に、シュートの葉面に向けてスプレーを用いて霧状に散布した。散布量はシュート１つあたり約１．１ｍｌとした。挿し付け後の育苗条件は実施例５と同様とし、同様に発根率を算出した。結果を表３に示す。【００９７】
［実施例９］
酸化型グルタチオン溶液として、酸化型グルタチオン濃度が５００ｍｇ／Ｌの溶液を用いたこと以外は、実施例８と同様にして育苗を行った。結果を表３に示す。【００９８】
［実施例１０］
酸化型グルタチオン溶液として、酸化型グルタチオン濃度が１０００ｍｇ／Ｌの溶液を用いたこと以外は、実施例８と同様にして育苗を行った。結果を表３に示す。【００９９】
［比較例３］
酸化型グルタチオン溶液の葉面への散布をしなかった以外は、実施例８と同様にして育苗を行った。結果を表３に示す。【０１００】
【表３】
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表３より明らかなように、シュートに酸化型グルタチオン溶液２００〜１０００ｍｇ／Ｌを葉面散布した実施例８〜１０の発根率は５４．５％〜６０．２％と高いのに対し、酸化型グルタチオンを葉面散布添加しなかった比較例３は４３．２％と低かった。【０１０１】
［実施例１１］
挿し穂の材料として、マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ  Ｉｎｄｉｃａ  Ｌｉｎｎ．  品種名：アーウィン）を用いた。すなわち、採穂母樹の枝から、１〜３節、１〜５枚の葉を含む穂木を切り出し、葉の一部を切除した。さらに基部にカッターによる傷付けを行い、挿し穂の調製をした。【０１０２】
得られたシュートを、一晩流水処理し、コテツなどの殺虫剤溶液に浸漬した後、酸化型グルタチオン５０ｍｇ／Ｌ、銀イオン源としてＳＴＳ（ＡｇＳ4Ｏ6）５μＭ、抗酸化剤としてアスコルビン酸５０ｍｇ／Ｌ、及び植物ホルモンとしてＩＢＡ１０ｍｇ／Ｌを添加した、４倍希釈ＭＳ培地（組成：硝酸アンモニウム  ４１２．５ｍｇ／Ｌ、硝酸カリウム  ４７５ｍｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム  ４２．５２ｍｇ／Ｌ、ヨウ化カリウム  ０．２１ｍｇ／Ｌなど、なお、本培地にグルタチオン以外の炭素源は添加されていない。）にて湿潤した支持体に挿し付けた。ここで、支持体としては、砂、赤玉土等の自然土壌；バーミキュライト、パーライト、ピートモスなどの混合土を用いた。挿し付け後は炭酸ガス濃度１０００ｐｐｍ、温度２５℃、湿度６０％、６５０〜６７０ｎｍの波長成分と４５０〜４７０ｎｍの波長成分とを８．２：１．８の割合で含む、光合成有効光量子束密度５１．３μｍｏｌ／ｍ2／Ｓの赤色光照射下で１．５ヶ月間培養を行った。【０１０３】
なお、このとき培養容器としては、最大寸法が縦２０〜２２ｃｍ×横３３〜３７ｃｍ×高さ１５〜１７ｃｍ程度の、直方体のものを用いた。この培養容器の頂面には、孔径０．４５μｍのポリテトラフルオロエチレン製膜（ミリポア社製、商品名：ミリシール）を貼り付けた円形開口部１０個が設けられている。培養容器内の炭酸ガスの濃度は、培養容器の開口部の膜により調整して制御した。培養容器内の炭酸ガスの濃度は、培養容器外の炭酸ガスが培養容器の開口部の炭酸ガス透過性の膜より透過するため、培養容器の開口部の膜より透過した濃度（約１０００ｐｐｍ）であった。赤色光照射の培養容器への照射は、光照射装置として商品名：ＣＣＦＬ光源ユニット、メーカー名：日本医化機器製作所を用いて行った。また、培養容器をパラフィルムで封鎖する事により、培養容器内の湿度は約１００％であった。【０１０４】
シュートは、この培養容器１個当たり１０〜２０本を挿し付けた。シュートの供試数と、１．５ヶ月間培養後に発根したシュートの数（発根数）から、発根率を算出した。結果を表４に示す。【０１０５】
［比較例４］
酸化型グルタチオンを添加しなかった以外は、実施例１１と同様にして培養を行った。結果を表４に示す。【０１０６】
【表４】
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表４より明らかなように、培地に酸化型グルタチオンを５０ｍｇ／Ｌ添加した実施例１１では発根率が２６．９％であったのに対し、酸化型グルタチオンを添加しなかった比較例４の発根率は１９．２％と低かった。【０１０７】
［実施例１２］
酸化型グルタチオンの与え方として、１％粒剤を混合土に混ぜ込んで使用した。すなわち、ピートモス、バーミキュライトの混合土５．５Ｌに対し、酸化型グルタチオン１％粒剤を１５ｇ混ぜ込み、それを育苗ポット（内径３ｃｍ×高さ１５ｃｍ×６６穴）に詰め、支持体とした。この育苗ポット上部より、植物ホルモンとして、ＩＢＡ１０ｍｇ／Ｌを添加した４倍希釈ＭＳ培地（組成：硝酸アンモニウム４１２．５ｍｇ／Ｌ、硝酸カリウム  ４７５ｍｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム  ４２．５２ｍｇ／Ｌ、ヨウ化カリウム  ０．２１ｍｇ／Ｌ、なお、本培地に炭素源は添加されていない。）をジョウロにより散水処理し、支持体に含ませた。【０１０８】
挿し穂の材料として、チャを用いた。すわなち、採穂母樹から、５ｃｍ〜２０ｃｍの長さ、節が１〜３節、葉が１〜６枚程度に伸長した穂木を切り出し、葉の先端側半分を切除し、挿し穂を調整調製した。【０１０９】
調整調製した挿し穂の基部を支持体に挿し付けた（育苗ポット１個当たり６６本挿し付けた）。挿し付け後は炭酸ガス濃度１０００ｐｐｍ、温度２５℃、湿度６０％、６５０〜６７０ｎｍの波長成分と４５０〜４７０ｎｍの波長成分とを８．２：１．８の割合で含む、光合成有効光量子束密度５１．３μｍｏｌ／ｍ２／Ｓの赤色光照射下で１．５ヶ月間培養を行った。その後、育苗ポットを温室に移動し、２．５ヶ月育苗した。温室内は、ミストを頻繁に噴霧することで高い湿度（８０％以上）を保った。２．５ヶ月育苗後に発根した挿し穂の数から、発根率を算出した。結果を表５に示す。【０１１０】
［実施例１３］
酸化型グルタチオン１％粒剤の混合土（５．５Ｌ）への添加量を７５ｇとした以外は、実施例１２と同様にして培養を行った。結果を表５に示す。【０１１１】
［比較例５］
酸化型グルタチオン１％粒剤を培地に添加しなかった以外は、実施例１２と同様にして培養を行った。結果を表５に示す。【０１１２】
【表５】
0005612605.tif 000006
表５より明らかなように、シュートに酸化型グルタチオン粒剤を３〜１５ｍｇ／Ｌの濃度で混合土に混ぜ込んだ実施例１１〜１２の発根率は９６．０％〜９９．６％と高いのに対し、酸化型グルタチオン粒剤を混ぜ込まなかった比較例５は６２．１％と低かった。【０１１３】
［実施例１４］
遺伝子組換えＥ．グロビュラス（系統名：Ｃｌｏｎｅ  Ｂ）を用い、さらに、シュート基部にハサミによる傷を付けた以外は、実施例１と同様にして培養を行った。なお、傷付けは、シュートの基部（上述の切断面）を正面方向から見た際に十字型となるよう、直行する２方向にハサミを入れて行った。結果を表６に示す。【０１１４】
［実施例１５］
酸化型グルタチオンの培地への添加量を７５ｍｇ／Ｌとした以外は、実施例１４と同様にして培養を行った。結果を表６に示す。【０１１５】
［比較例６］
酸化型グルタチオンを添加しなかった以外は、実施例１４と同様にして培養を行った。結果を表６に示す。【０１１６】
【表６】
0005612605.tif 000007
表６より明らかなように、培地に酸化型グルタチオンを２５〜７５ｍｇ／Ｌ添加した実施例１４〜１５の発根率は７７．８％〜８８．９％と高いのに対し、酸化型グルタチオンを添加しなかった比較例６の発根率は２２．２％と低かった。【０１１７】
［実施例１６］
遺伝子組換えＥ．グロビュラス（系統名：Ｃｌｏｎｅ  Ｃ）のシュートを用い、酸化型グルタチオンの培地への添加量を５０ｍｇ／Ｌとし、さらに、シュート基部にハサミによる傷を付けた以外は、実施例１と同様にして培養を行った。結果を表７に示す。【０１１８】
［実施例１７］
遺伝子組換えＥ・グロビュラス（系統名：Ｃｌｏｎｅ  Ｄ）のシュートを用いた以外は、実施例１６と同様にして培養を行った。結果を表７に示す。【０１１９】
［実施例１８］
遺伝子組換えＥ・グロビュラス（系統名：Ｃｌｏｎｅ  Ｅ）のシュートを用いた以外は、実施例１６と同様にして培養を行った。結果を表７に示す。【０１２０】
［実施例１９］
Ｅ・グロビュラス（野生型Ｆ）のシュートを用いた以外は、実施例１６と同様にして培養を行った。結果を表７に示す。【０１２１】
［比較例７］
酸化型グルタチオンを添加しなかった以外は、実施例１６と同様にして培養を行った。結果を表７に示す。【０１２２】
［比較例８］
酸化型グルタチオンを添加しなかった以外は、実施例１７と同様にして培養を行った。結果を表７に示す。【０１２３】
［比較例９］
酸化型グルタチオンを添加しなかった以外は、実施例１８と同様にして培養を行った。結果を表７に示す。【０１２４】
［比較例１０］
酸化型グルタチオンを添加しなかった以外は、実施例１９と同様にして培養を行った。結果を表７に示す。【０１２５】
【表７】
0005612605.tif 000008
表７より明らかなように、培地に酸化型グルタチオンを５０ｍｇ／Ｌ添加した実施例１６〜１９の発根率は８８．９〜１００％と高いのに対し、酸化型グルタチオンを添加しなかった比較例７〜１０の発根率は１１．１〜５３．１％と低かった。【０１２６】
［実施例２０］
材料として発根が非常に難しいことが明らかである遺伝子組換えＥ．グロビュラス（系統名：Ｃｌｏｎｅ  Ｇ）を用いた以外は、実施例１６と同様にして培養を行った。結果を表８に示す。【０１２７】
［実施例２１］
材料として発根が非常に難しいことが明らかである遺伝子組換えＥ．グロビュラス（系統名：Ｃｌｏｎｅ  Ｈ）を用いた以外は、実施例１６と同様にして培養を行った。結果を表８に示す。【０１２８】
［実施例２２］
材料として発根が非常に難しいことが明らかである遺伝子組換えＥ．グロビュラス（系統名：Ｃｌｏｎｅ  Ｉ）を用いた以外は、実施例１６と同様にして培養を行った。結果を表８に示す。【０１２９】
［比較例１１］
酸化型グルタチオンを添加せず、シュート基部への傷つけをしなかった以外は、実施例２０と同様にして培養を行った。結果を表８に示す。【０１３０】
［比較例１２］
酸化型グルタチオンを添加せず、シュート基部への傷つけをしなかった以外は、実施例２１と同様にして培養を行った。結果を表８に示す。【０１３１】
［比較例１３］
酸化型グルタチオンを添加せず、シュート基部への傷つけをしなかった以外は、実施例２２と同様にして培養を行った。結果を表８に示す。【０１３２】
【表８】
0005612605.tif 000009
表８より明らかなように、酸化型グルタチオンを添加せず、シュート基部への傷つけをしなかった比較例１１〜１３では全く発根しなかったのに対し、培地に酸化型グルタチオンを５０ｍｇ／Ｌ添加した実施例２０〜２２の発根率は２０．０〜４０．０％と向上した。【０１３３】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１３４】
本発明を用いれば、植物のシュートからクローン苗の大量かつ迅速な生産が可能となり、その産業的利用に道を開くことが期待される。