(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）第１の蛍光タンパク質コード配列と、
ｂ）前記第１の蛍光タンパク質と異なる蛍光タンパク質をコードする第２の蛍光タンパク質コード配列と、
ｃ）前記第１および第２の蛍光タンパク質コード配列の間に挿入されるリンカー配列と、
ｄ）前記第１および第２の蛍光タンパク質コード配列の間に挿入されるリコーディングシグナル配列であって、配列番号８で表される配列を含むリコーディングシグナル配列と、
を含み、ここで前記第１の蛍光タンパク質コード配列および前記第２の蛍光タンパク質コード配列は、相互にフレーム外であるが、リコーディングされると単一の融合ポリペプチドとして共発現され、前記リンカー配列は、前記共発現された蛍光タンパク質を物理的に分離可能なポリペプチドをコードし、その結果各タンパク質からの蛍光出力が増加する、翻訳リコーディングレポーター構築物を含む哺乳類細胞。
【請求項２】
前記コードされたリンカーが、前記共発現された蛍光タンパク質間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を低下させる、請求項１に記載の哺乳類細胞。
【請求項３】
前記リンカーが、モチーフＡ（ＥＡＡＡＫ）ｎＡ（式中、ｎは１〜１０の数である）を含むポリペプチドをコードする、請求項１または２に記載の哺乳類細胞。
【請求項４】
ｎ＝２である、請求項３に記載の哺乳類細胞。
【請求項５】
前記リンカーが配列番号１に記載の配列をコードする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の哺乳類細胞。
【請求項６】
前記リンカーが、クローニングを容易にするための追加のヌクレオチドを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の哺乳類細胞。
【請求項７】
前記リンカーが配列番号２に記載の配列を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の哺乳類細胞。
【請求項８】
前記蛍光タンパク質が赤色蛍光タンパク質および緑色蛍光タンパク質である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の哺乳類細胞。
【請求項９】
前記赤色蛍光タンパク質コード配列が、前記緑色蛍光タンパク質コード配列の下流にある、請求項８に記載の哺乳類細胞。
【請求項１０】
前記構築物で安定的に形質転換された請求項１〜９のいずれか１項に記載の哺乳類細胞。
【請求項１１】
翻訳リコーディングを調節する条件を哺乳類細胞でアッセイする方法であって、
ａ）請求項１〜９のいずれか一項に記載の哺乳類細胞を提供する工程と、
ｂ）試験条件下で少なくとも１つの哺乳類細胞をインキュベートし、
ｉ）前記構築物を転写し、前記第１および第２の蛍光タンパク質に対応する転写産物を生成する工程と、
ｉｉ）ｉ）の前記転写産物を翻訳し、前記第１の蛍光タンパク質ならびに前記第１および第２の蛍光タンパク質を含む融合タンパク質を生成する工程と、
ｉｉｉ）前記蛍光タンパク質の各々からの蛍光シグナルを測定する工程と、
ｃ）対照条件下で少なくとも１つの哺乳類細胞をインキュベートし、
ｉ）前記構築物を転写し、前記第１および第２の蛍光タンパク質に対応する転写産物を生成する工程と、
ｉｉ）ｉ）の前記転写産物を翻訳し、前記第１の蛍光タンパク質ならびに前記第１および第２の蛍光タンパク質を含む融合タンパク質を生成する工程と、
ｉｉｉ）前記蛍光タンパク質の各々からの蛍光シグナルを測定する工程と、
ｄ）ｂ）における前記蛍光タンパク質の各々からの蛍光シグナルの比を、ｃ）における前記蛍光タンパク質の各々からの蛍光シグナルの比と比較する工程と、
を含み、ここで前記比の差異は前記試験条件がリコーディングを調節することを示す、方法。
【請求項１２】
ｂ）における前記「試験条件」下では、試験組成物を、該組成物がリコーディングを調節するか否かを評価するために前記構築物を含む哺乳類細胞と接触させ、かつ、ｃ）における前記「対照条件」下では、前記試験組成物を前記構築物を含む前記哺乳類細胞と接触させない、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ｃ）における前記対照条件下では、適切な対照組成物が、前記構築物を含む前記哺乳類細胞と接触させられる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
哺乳類細胞でリコーディングの調節因子を同定するための方法であって、
ａ）請求項１〜９のいずれか一項に記載の哺乳類細胞を提供する工程と、
ｂ）スクリーニング対象の化合物の存在下で少なくとも１つの哺乳類細胞をインキュベートする工程と、
ｉ）前記構築物を転写して、前記第１および第２の蛍光タンパク質に対応する転写産物を生成し、
ｉｉ）ｉ）の前記転写産物を翻訳して、前記第１の蛍光タンパク質ならびに前記第１および第２の蛍光タンパク質を含む融合タンパク質を生成し、
ｉｉｉ）前記蛍光タンパク質の各々からの蛍光シグナルを測定し、
ｃ）対照条件下で少なくとも１つの哺乳類細胞をインキュベートし、
ｉ）前記構築物を転写し、前記第１および第２の蛍光タンパク質に対応する転写産物を生成する工程と、
ｉｉ）ｉ）の前記転写産物を翻訳し、前記第１の蛍光タンパク質ならびに前記第１および第２の蛍光タンパク質を含む融合タンパク質を生成する工程と、
ｉｉｉ）前記蛍光タンパク質の各々からの蛍光シグナルを測定する工程と、
ｄ）ｂ）における前記蛍光タンパク質の各々からの蛍光シグナルの比をｃ）における前記蛍光タンパク質の各々からの蛍光シグナルの比と比較する工程と、
を含み、ここで前記比の変化は化合物がリコーディングの調節因子であることを示す、方法。
【請求項１５】
前記哺乳類細胞が、ＣＯＳ−７細胞、ジャーカット細胞、ヒト血液から単離されたＴリンパ球細胞、２９３Ｔ細胞、及びＨＥＫ細胞を含む群から選択される、請求項１１から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記哺乳類細胞がＣＯＳ−７細胞である、請求項１１から１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記哺乳類細胞が部位特異的な形質転換によって形質転換可能であるように適応される、請求項１１から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の哺乳類細胞中の構築物に類似するが、前記第１および第２の蛍光タンパク質が常にインフレームであり、かつリコーディングの必要なく融合タンパク質として共発現されるように構成される対照構築物を含む哺乳類細胞が、試験条件と対照条件の双方に供される、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明はバイオアッセイの分野に含まれ、二重レポーターリコーディングの構築物および方法に関する。かかる構築物および方法は、リコーディングの調節を介して作用する薬剤に対するスクリーニングに有用である。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
単一のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が「リコーディング」として知られるプロセスを通して２種以上のタンパク質に翻訳されることがある。「リコーディング」は、翻訳デコーディングにおける規則がｍＲＮＡ配列内に構築される特定の部位およびシグナルによって一時的に改変される現象である。リコーディングのいくつかのケースでは、特別のシグナルがメッセージ上の遠隔の３’にあるが、リコーディングとして最もよく知られたケースでは、シグナルはリコーディング部位の近傍にある。哺乳類細胞においては、３種のリコーディングについての記載がなされている。
【０００３】
第１に、停止コドンをセンスコドンに再定義することにより、セレノシステインを含有するタンパク質の合成、およびモロネイ（Ｍｏｌｏｎｅｙ）ネズミ白血病ウイルスなどの多数のＲＮＡウイルス内での伸長されたタンパク質の合成が可能になる（Ｙｏｓｈｉｎａｋａら、１９８５年、ＰＮＡＳ、８２、１６１８−２２頁）。
【０００４】
第２に、＋１フレームシフトにより、オルニチンデカルボキシラーゼアンチザイムの発現が調節される。同系は自動調節的であり、ポリアミンの濃度に依存する（Ｈａｙａｓｈｉら、１９９６年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ、２７−３０頁）。
【０００５】
第３に、−１フレームシフトを用い、リーディングフレームが異なるｇａｇ（ｐｒｏ）遺伝子及びｐｏｌ遺伝子を有するレトロウイルスにおいて、ＧａｇＰｏｌ前駆体ポリタンパク質が合成される。例として、ヒト免疫不全ウイルスタイプ１（ＨＩＶ−１）ｇａｇ−ｐｏｌフレームシフトが挙げられる（Ｐａｒｋｉｎら、１９９２年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６、５１４７−５１５１頁）。
【０００６】
シグナルリコーディングを行うメッセンジャーＲＮＡ内の因子に関する研究を促進するため、いくつかのレポーター系が開発されている。一部の系では、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上での電気泳動により分離される、ｓｕｐ．３５  Ｓ−ｍｅｔで標識された翻訳産物の分析により、リコーディングが評価される。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）またはホタルルシフェラーゼを用いるｉｎ  ｖｉｖｏでの研究のために、いくつかの酵素レポーターアッセイが開発されている。これまでフレームシフトアッセイの大部分では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、または酵母もしくは細菌細胞のいずれかにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで用いられる二重ルシフェラーゼレポーターが用いられている。ルシフェラーゼは良好な感度をもたらすが、かかる系には高価な緩衝液を要するという欠点がある。
【０００７】
レポーターとして緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰｓ）などの蛍光タンパク質を使用すると、高価な緩衝液が全く不要となり、さらに、より迅速なアッセイのセットアップと読取時間により、時間の節約が可能であるという点で潜在的な優位性がもたらされる。しかし、蛍光タンパク質のレポーターとしての使用は、一般的に出力シグナルの増幅が全くなく、その結果、ルシフェラーゼなどの酵素ベースのレポーターの場合よりも感度が低下するという点でかなり不利である。
【０００８】
細菌細胞内でのアッセイにおいては蛍光タンパク質が用いられているが、出願人が知る限りにおいて、哺乳類細胞内でうまく使用される、蛍光タンパク質をレポーターとして用いる二重レポーターフレームシフト構築物またはアッセイは、全く開発されていない。
【０００９】
リコーディングアッセイは、ライフサイクルにおいてかかるフレームシフトシステムに依存する生物が関与するヒトの障害の治療に有用な化合物を同定するための薬剤スクリーニングにも適用される。したがって、哺乳類細胞において、酵母または細菌細胞に対してかかるアッセイを実施することは有益であろう。
【００１０】
ヒトリボソームは、ＨＩＶ−１  ＲＮＡをデコードする際に後方に滑り、それによりその３文字のリーディングフレームをシフトさせるが、これは、ヒトリボソームが滑り部位に遭遇するときの約５〜１０％で生じる。この割合はウイルスの生存に必須であり、当該割合によってその構造タンパク質と酵素タンパク質の正確な比が保証されるだけでなく、ウイルス粒子の正確な構築が保証される。滑りは−１フレームシフトの一例である。２つの要素、すなわちＨＩＶ−１  ＲＮＡ内での滑りやすいヘプタマー配列Ｕ  ＵＵＵ  ＵＵＡと隣接する二次構造要素が重要である。試験化合物がフレームシフトの効率にいかに作用するかを測定するアッセイは、これを有望な抗ウイルス標的として活用するために重要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
哺乳類細胞内で使用可能な蛍光タンパク質ベースの翻訳リコーディングレポーター構築物およびアッセイを提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の概要
第１の態様では、本発明は、
ａ）第１の蛍光タンパク質コード配列と、
ｂ）第１の蛍光タンパク質と異なる蛍光タンパク質をコードする第２の蛍光タンパク質コード配列と、
ｃ）第１および第２の蛍光タンパク質コード配列の間に挿入されるリンカー配列と、
を含む翻訳リコーディングレポーター構築物を提供し、ここで第１の蛍光タンパク質コード配列および第２の蛍光タンパク質コード配列は、相互にフレーム外（ｏｕｔ−ｏｆ−ｆｒａｍｅ）であるが、リコーディング時に単一の融合ポリペプチドとして共発現される。
【００１３】
好ましい実施形態では、リンカー配列が共発現された蛍光タンパク質を物理的に分離可能なポリペプチドをコードする結果、各タンパク質からの蛍光出力が増加する。好ましくは、コードされたリンカーは共発現した蛍光タンパク質間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を低減させる。
【００１４】
好ましくは、リンカーは、アミノ酸長が２〜１００個、より好ましくは３〜７５個、より好ましくは４〜６０個、より好ましくは７〜５２個および最も好ましくは１０〜２０個の配列を含むポリペプチドをコードする。
【００１５】
好ましくは、リンカーは、モチーフＡ（ＥＡＡＡＫ）ｎＡ（式中、ｎは１〜１０の数である）を含むポリペプチドをコードする。より好ましくはｎ＝２である。最も好ましくは、リンカーは配列番号１に記載の配列をコードする。リンカーは、クローニングしやすくするための追加のヌクレオチドを含んでいてもよい。好ましくは、リンカーは配列番号２に記載の配列を含む。
【００１６】
さらなる実施形態では、蛍光タンパク質は赤色蛍光タンパク質および緑色蛍光タンパク質である。好ましくは、赤色蛍光タンパク質コード配列は緑色蛍光タンパク質コード配列の下流である。適切な赤色蛍光タンパク質は、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から市販されているＤｓＲｅｄを含む。適切な緑色蛍光タンパク質は、同じくクロンテックから市販されている増強（Ｅｎｈａｎｃｅｄ）緑色蛍光タンパク質を含む。
【００１７】
さらなる実施形態では、レポーター構築物は、第１の蛍光タンパク質コード配列と第２の蛍光タンパク質コード配列との間に挿入されたリコーディングシグナル配列を含む。
【００１８】
好ましくは、リコーディングシグナル配列はフレームシフトシグナル配列である。
【００１９】
好ましくは、フレームシフトシグナル配列は第１の蛍光タンパク質コード配列とリンカー配列との間に挿入される。
【００２０】
好ましくは、フレームシフトシグナル配列シグナルは−１フレームシフトシグナル配列である。
【００２１】
好ましくは、−１フレームシフトシグナル配列シグナルはＨＩＶ−１  ｇａｇ／ｐｏｌフレームシフトシグナル配列である。
【００２２】
好ましくは、フレームシフトシグナル配列は配列番号８に記載の配列を含む。
【００２３】
さらなる態様では、本発明は、本発明の翻訳リコーディングレポーター構築物を含むベクターを提供する。
【００２４】
さらなる態様では、本発明は、本発明の翻訳リコーディングレポーター構築物を含む宿主細胞を提供する。
【００２５】
さらなる態様では、本発明は、本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００２６】
宿主細胞は、本発明の構築物によって一過性にまたは安定的に形質転換されうる。
【００２７】
好ましい実施形態では、宿主細胞は本発明の構築物によって安定的に形質転換される。
【００２８】
さらなる態様では、本発明は、翻訳リコーディングを調節する条件をアッセイする方法であって、
ａ）リコーディング配列を含む本発明の翻訳リコーディングレポーター構築物を提供する工程と、
ｂ）試験条件下で、
ｉ）構築物を転写し、第１および第２の蛍光タンパク質に対応する転写産物を生成する工程と、
ｉｉ）ｉ）の転写産物を翻訳し、第１の蛍光タンパク質と、第１および第２の蛍光タンパク質を含む融合タンパク質とを生成する工程と、
ｉｉｉ）蛍光タンパク質の各々に由来しかつｉｉ）において生成された蛍光シグナルを測定する工程と、
ｃ）対照条件下で、
ｉ）構築物を転写し、第１および第２の蛍光タンパク質に対応する転写産物を生成する工程と、
ｉｉ）ｉ）からの転写産物を翻訳し、第１の蛍光タンパク質ならびに第１および第２の蛍光タンパク質を含む融合タンパク質を生成する工程と、
ｉｉｉ）蛍光タンパク質の各々に由来しかつｉｉ）において生成された蛍光シグナルを測定する工程と、
ｄ）ｂ）における蛍光タンパク質の各々からの蛍光シグナルの比と、ｃ）における蛍光タンパク質の各々からの蛍光シグナルの比とを比較する工程と、
を含み、ここで上記比の差異は試験条件がリコーディングを調節することを示す、方法を提供する。
【００２９】
本方法の好ましい実施形態では、試験組成物を、試験条件下で組成物がリコーディングを調節するか否かを評価するため、本発明の構築物と接触させる。試験組成物は、対応する対照条件下では、本発明の構築物と接触させない。対象条件下では、試験組成物は適切な対照組成物と置換可能である。
【００３０】
さらなる態様では、本発明は、翻訳リコーディングをｉｎ  ｖｉｖｏで調節する条件をアッセイする方法であって、
ａ）リコーディング配列を含む本発明の翻訳リコーディングレポーター構築物を含む宿主細胞を提供する工程と、
ｂ）試験条件下で少なくとも１つの宿主細胞をインキュベートし、
ｉ）構築物を転写し、第１および第２の蛍光タンパク質に対応する転写産物を生成する工程と、
ｉｉ）ｉ）の転写産物を翻訳し、第１の蛍光タンパク質と、第１および第２の蛍光タンパク質を含む融合タンパク質とを生成する工程と、
ｉｉｉ）蛍光タンパク質の各々からの蛍光シグナルを測定する工程と、
ｃ）対照条件下で少なくとも１つの宿主細胞をインキュベートし、
ｉ）構築物を転写し、第１および第２の蛍光タンパク質に対応する転写産物を生成する工程と、
ｉｉ）ｉ）の転写産物を翻訳し、第１の蛍光タンパク質と、第１および第２の蛍光タンパク質を含む融合タンパク質とを生成する工程と、
ｉｉｉ）蛍光タンパク質の各々からの蛍光シグナルを測定する工程と、
ｄ）ｂ）における蛍光タンパク質の各々からの蛍光シグナルの比とｃ）における蛍光タンパク質の各々からの蛍光シグナルの比とを比較する工程と、
を含み、ここで上記比の差異は試験条件がリコーディングを調節することを示す、方法を提供する。
【００３１】
本方法の好ましい実施形態では、試験条件下において、試験組成物を、該組成物がリコーディングを調節するか否か評価するため、本発明の構築物を含む宿主細胞と接触させる。対応する対照条件下では、試験組成物は本発明の構築物と接触させない。対象条件下では、試験組成物は適切な対照組成物と置換可能である。
【００３２】
さらなる態様では、本発明は、リコーディングの調節因子を同定するための方法であって、
ａ）リコーディングシグナルを含む本発明の翻訳リコーディングレポーター構築物を含む宿主細胞を提供する工程と、
ｂ）スクリーニング対象の化合物の存在下で少なくとも１つの宿主細胞をインキュベートし、
ｉ）前記構築物を転写し、第１および第２の蛍光タンパク質に対応する転写産物を生成する工程と、
ｉｉ）ｉ）の転写産物を翻訳し、第１の蛍光タンパク質と、第１および第２の蛍光タンパク質を含む融合タンパク質とを生成する工程と、
ｉｉｉ）蛍光タンパク質の各々からの蛍光シグナルを測定する工程と、
ｃ）対照条件下で少なくとも１つの宿主細胞をインキュベートし、
ｉ）構築物を転写し、第１および第２の蛍光タンパク質に対応する転写産物を生成する工程と、
ｉｉ）ｉ）の転写産物を翻訳し、第１の蛍光タンパク質と、第１および第２の蛍光タンパク質とを含む融合タンパク質を生成する工程と、
ｉｉｉ）蛍光タンパク質の各々からの蛍光シグナルを測定する工程と、
ｄ）ｂ）における蛍光タンパク質の各々からの蛍光シグナルの比を、ｃ）における蛍光タンパク質の各々からの蛍光シグナルの比と比較する工程と、
を含み、ここで比の変化は化合物がリコーディングの調節因子であることを示す、方法を提供する。
【００３３】
さらなる態様では、本発明は本発明の方法によって同定されるリコーディングの調節因子を提供する。
【００３４】
本発明の宿主細胞は、または本発明の方法における使用のためには、任意のタイプの細胞でありうる。好ましくは、宿主細胞は真核細胞である。より好ましくは、宿主細胞は哺乳類細胞である。好ましい哺乳類細胞種は、ＣＯＳ−７細胞、ジャーカット細胞、ヒト血液から単離されるＴリンパ球細胞、２９３Ｔ細胞およびＨＥＫ細胞を含むがこれらに限定されない。
【００３５】
特に好ましい細胞はＣＯＳ−７である。部位特異的な形質転換により形質転換されるように適応された細胞も好ましい。かかる細胞は、インヴィトロジェン・ライフ・テクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から市販されているＦｌｐ−Ｉｎ  ＣＶ１細胞を含む。
【００３６】
好ましい実施形態では、本方法は、対照構築物内で第１および第２の蛍光タンパク質が、リコーディングの必要なく、第１および第２のタンパク質が融合タンパク質として常に共発現されるように常にフレーム内であるように構成されることを除き、本発明の構築物の使用に類似した対照構築物の使用をさらに含む。本方法のこの実施形態では、本発明の翻訳レポーター構築物と対照構築物の双方は試験条件と対照条件の双方に供される。次いで、式：
（（試験条件下でのリコーディング構築物からの第２の蛍光タンパク質シグナル／試験条件下でのリコーディング構築物からの第１の蛍光タンパク質シグナル））／（（試験条件下での対照構築物からの第２の蛍光タンパク質シグナル／試験条件下での対照構築物からの第１の蛍光タンパク質シグナル））＊１００
を用いてリコーディングが評価される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
発明の詳細な説明
本明細書において、特許明細書、他の外部文書または他の情報源が参照されている場合、これは一般に本発明の特徴を考察するためのコンテキストを与えることを目的とする。他に特に言及されない限り、かかる外部文書の参照は、いかなる管轄においても、かかる文書またはかかる情報源が先行技術若しくは当該技術分野で一般常識の一部を形成するものであることを認めるものと解釈されるべきではない。
【００３８】
含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）という用語およびその文法的等価物は、「少なくとも部分的に．．．からなる」を意味することが意図されている。
【００３９】
本明細書で用いられる用語「ポリヌクレオチド」は、一本鎖または二本鎖のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを意味し、非限定的な例として、遺伝子のコーディング配列および非コーディング配列、センスおよびアンチセンス配列、エクソン、イントロン、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、プレ−ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リボザイム、組換えポリヌクレオチド、単離されかつ精製された天然のＤＮＡまたはＲＮＡ配列、合成ＲＮＡおよびＤＮＡ配列、核酸プローブ、プライマー、断片、遺伝子構築物、ベクターおよび修飾ポリヌクレオチドを含む。
【００４０】
用語「プライマー」は、通常は遊離３’ＯＨ基を有する短いポリヌクレオチドを示し、それは鋳型とハイブリダイズされ、標的に相補的なポリヌクレオチドの重合を開始するために用いられる。
【００４１】
本明細書で用いられる用語「ポリペプチド」は、完全長タンパク質を含む、任意の長さのアミノ酸鎖を包含し、ここではアミノ酸残基が共有ペプチド結合によって連結される。本発明のポリペプチドは、精製された天然産物であるか、あるいは部分的または全体的に組換えまたは合成技術を用いて生成されうる。同用語は、ポリペプチド、二量体または他の多量体などのポリペプチドの凝集体、融合ポリペプチド、ポリペプチド断片、ポリペプチド変異体、またはそれらの誘導体を示す場合がある。
【００４２】
「翻訳リコーディングレポーター構築物」は、ポリヌクレオチド分子、通常は二本鎖ＤＮＡを示し、典型的には５’から３’方向に
１）プロモーター、
２）第１の蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチド、
３）リコーディングシグナル配列、
４）発現された蛍光タンパク質を物理的に分離可能なポリペプチド配列をコードするリンカー配列、
５）第２の蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
６）場合により終結シグナル
を含む。
【００４３】
したがって、「翻訳リコーディングレポーター構築物」は、第１の蛍光タンパク質のみの転写および翻訳における、またはコードされたリンカーポリペプチド配列によって分離される第１の蛍光タンパク質および第２の蛍光タンパク質を含む融合タンパク質のリコーディング、転写および翻訳時における必要な要素を有する。
【００４４】
かかる構築物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで転写および翻訳される場合がある。転写／翻訳要素の選択は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの転写および翻訳が望ましいか否かに依存することになる。
【００４５】
本発明の翻訳レポーター構築物が転写／翻訳されるべきである場合、好ましい宿主細胞内で発現を駆動可能なｉｎ  ｖｉｖｏのプロモーターが選択されるべきである。同様に、好ましい宿主細胞内で機能的なターミネーターが場合により含められうる。
【００４６】
本発明のリコーディング構築物における使用のために記載された特定の蛍光タンパク質を、他の蛍光タンパク質配列と置換することで、リコーディング配列の評価に適する別の構築物の提供が可能であることも当業者によって理解されるであろう。かかる別の構築物もまた本発明に包含される。他の蛍光タンパク質配列が当該技術分野で既知である。例えば参照により本明細書中に援用されるＴｓｉｅｎ  Ｒ．（Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９８年；６７：５０９−４４頁）を参照のこと。本発明のリコーディング構築物における使用のために記載された特定のリコーディング配列を、他のリコーディング配列と置換することで、他のかかるリコーディング配列の調節に関連した条件の評価またはアッセイに適する別の構築物の提供も可能であることが当業者によって理解されるであろう。かかる別の構築物もまた本発明に包含される。他のリコーディング配列は当該技術分野で既知であり、参照により本明細書中に援用されるＦａｒａｂａｕｇｈら（Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ、１９９６年、第３０巻、５０７−５２８頁）においてレビューされている。
【００４７】
他のリンカー配列を用い、リコーディング配列の評価に適する本発明の別の構築物を提供することも可能である。かかる別の構築物もまた本発明に包含される。他のリンカー配列は当該技術分野で既知である。例えば参照により本明細書中に援用される、ＭａｒｑｕｓｅｅおよびＢａｌｄｗｉｎ（ＰＮＡＳ、１９８７年、８４、８８９８−８９０２頁）ならびにＰｒｅｓｃｏｔら（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９９年、２７３、３０５−３０７頁）を参照のこと。
【００４８】
転写レポーター構築物は、ベクターに挿入されるかまたはそれに連結されうる。
【００４９】
用語「ベクター」は、ポリヌクレオチド分子、通常は二本鎖ＤＮＡを示し、本発明の翻訳リコーディングレポーター構築物などの構築物を宿主細胞内に輸送するのに用いられる。ベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）など、少なくとも１つの追加の宿主系内で複製能を有しうる。ベクターはまた、かかる追加の宿主系内でベクターの選択を可能にするための配列を含みうる。
【００５０】
用語「組成物」は、複数の独立した成分、複数の化合物の組合せ、及び数種類の成分から構成されうる天然生物の抽出物を含む。
【００５１】
出願人らは、二重蛍光タンパク質レポーターベースの構築物およびリコーディングを改変する条件の評価に有用なアッセイを開発してきた。出願人らは、特定の化学式のリンカー配列の挿入により、構築物によってコードされる２種の蛍光タンパク質から取得可能な出力シグナルが有意に改善されることを見出した。これにより、本発明の構築物を含む宿主細胞内でのアッセイのｉｎ  ｖｉｖｏでの実施が可能になる。
【００５２】
本発明は、翻訳リコーディング構築物およびベクターを提供する。構築物およびベクターの構築をもたらすための方法は当該技術分野で周知であり、一般にＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７年；ＡｕｓｕｂｅｌらのＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、１９８７年に記載されている。
【００５３】
本発明は、本発明の構築物およびベクターを含む宿主細胞も提供する。構築物およびベクターを宿主細胞に導入するための方法は当業者にとって周知である。Ｆｅｌｇｎｅｒ  Ｊ．ら（Ｊ．Ｔｉｓｓ．Ｃｕｌｔ．Ｍｅｔｈ．１５：６３頁（１９９３年）。
【００５４】
宿主細胞は、構築物またはベクターで一過性に形質転換可能である。あるいは、本発明の構築物で安定的に形質転換された宿主細胞系を開発してもよい。形質転換を一過性にまたは安定的に行うためのかかる方法は当業者にとって周知である。
【００５５】
好ましくは、本発明の宿主細胞は、本発明の構築物で安定的に形質転換される。好ましくは、本発明の宿主細胞は哺乳類細胞である。安定的に形質転換された哺乳類細胞の生成にとって特に好ましい系は、構築物が宿主細胞ゲノム内の特定の部位に挿入されうる系である。これは、挿入部位の違いに起因する、試験および対照の宿主細胞における任意の違いを最小にするための機会を提供する。かかる系の１つは、インヴィトロジェン・ライフ・テクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から市販されているＦｌｐ−Ｉｎ系である。
【００５６】
本発明は、リコーディングの調節をもたらす条件を評価するためのアッセイを提供する。
【００５７】
かかるアッセイを、本発明の構築物内の相補的転写／翻訳因子と併用した適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系の適用を通してｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施してもよい。
【００５８】
本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏでリコーディングの調節をもたらす条件を評価するための方法を提供する。かかるアッセイは、典型的には本発明の構築物を含む本発明の宿主細胞の使用を含む。
【００５９】
かかるアッセイでは、任意の目的の条件を比較することが可能である。特に好ましい条件は、リコーディングの調節に対する効果について様々な化合物が試験されうる条件である。
【００６０】
本発明は、リコーディングをｉｎ  ｖｉｖｏで調節するためのスクリーニングの方法を提供する。調節因子はアゴニストまたはアンタゴニストでありうる。また、同方法は、アゴニストまたはアンタゴニストの同定を促進するように適応されうる。
【００６１】
スクリーニングの方法は、高スループット技術を含みうる。本発明の方法は、好ましくはマルチウェルプレート内で実施される。好ましくは、少なくとも２４ウェル、より好ましくは少なくとも４８ウェル、最も好ましくは少なくとも９６ウェルを有するプレートが用いられる。
【００６２】
好ましくは、本発明の方法においては蛍光プレートリーダーが用いられる。好ましくは、プレートを読み取る場合に蛍光強度が用いられる。より好ましくは、プレートを読み取る場合に蛍光分極が用いられる。
【００６３】
あるいは、本発明の方法においてリコーディングを評価するため、フローサイトメトリー法が用いられる場合がある。
【００６４】
有望なアンタゴニストおよびアンタゴニストには、任意の生物、特に植物に由来する小有機分子、ペプチド、ポリペプチド、抗体および天然抽出物が含まれるがこれらに限定されない。本発明の方法における化合物またはペプチドライブラリーのスクリーニングも意図される。
【００６５】
本発明は、添付の図面を参照することでよりよく理解されるであろう。
【実施例】
【００６６】
実施例
ここで、本発明は、以下の非限定的な実施例を参照して説明される。
【００６７】
実施例１．本発明のリコーディング構築物の生成
プラスミド骨格
翻訳リコーディングレポーター構築物を生成するために、プラスミドｐＤｓＲｅｄ．Ｔ４−Ｎ１を骨格として用いた。ｐＤｓＲｅｄ．Ｔ４−Ｎ１はｐＤｓＲｅｄ１−Ｎ１（クロンテック）に由来するものであるが、コードされたＤｓＲｅｄ．Ｔ４−Ｎ１の凝集を集合的に低減し、成熟を促進する１０コドンの変化を有する。ベクターは、Ａｍｐ耐性のマーカーよりは、Ｋａｎ耐性のマーカーを有する。ベクター骨格には、開始コドンのすぐ上流のＡｇｅＩ部位をＳｐｅＩ部位に変化させることを除いて変化を加えない。ＤｓＲｅｄ．Ｔ４−Ｎ１遺伝子の５’末端近傍にもいくつかの変化が存在する（Ｂｅｖｉｓ  Ｂ．およびＧｌｉｃｋ  Ｂ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００２年、２０、８３−９０頁）。
【００６８】
緑色蛍光タンパク質の挿入
増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）のコード配列を、５’末端にＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位を付加し、かつ３’末端の停止コドンを除去すると同時にＥｃｏ  ＲＩ部位を導入するように設計されたプライマーを用い、ＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミド（クロンテック）からＰＣＲにより増幅した。ＥＧＦＰを増幅するために用いたプライマーは以下の通りであった。
リンカーを伴わないＥＧＦＰフォワードプライマー
【化１】
0005415072.tif 000002
【００６９】
ＥＧＦＰリバースプライマー
【化２】
0005415072.tif 000003
【００７０】
増幅されたＥＧＦＰ配列を、ｐＤｓＲｅｄ．Ｔ４−Ｎ１におけるＤｓＲｅｄ．Ｔ４−Ｎ１の上流に、標準的な技術によってクローニングした。
【００７１】
ＤｓＲｅｄ．Ｔ４からのＡＴＧ開始コドンの除去
ＡＴＧ開始コドンをＤｓＲｅｄ．Ｔ４から除去しかつ当該開始コドンをＢａｍ  ＨＩ部位に置換するため、ＤｓＲｅｄ．Ｔ４配列を、以下のプライマーを用いてｐＤｓＲｅｄ．Ｔ４−Ｎ１プラスミドから増幅した。
ＤｓＲｅｄ．Ｔ４フォワードプライマー（Ｂａｍ  ＨＩ部位ＧＧＡＴＧＣを有する）：
【化３】
0005415072.tif 000004
【００７２】
ＤｓＲｅｄ．Ｔ４リバースプライマー（Ｎｏｔ  Ｉ部位ＧＣＧＧＣＣＧＣを有する）：
【化４】
0005415072.tif 000005
【００７３】
ｐＤｓＲｅｄ．Ｔ４−Ｎ１配列内のＤｓＲｅｄ．Ｔ４配列を除去し、標準のクローニング技術により、修飾された（開始コドンのない）配列と置換した。
【００７４】
リコーディング配列の構築
２つのオリゴヌクレオチドを用いてＨＩＶ−１ステムループ／シュードノット配列を作製し、それをＥＧＦＰおよびＤｓＲｅｄ遺伝子の間にリコーディング配列として挿入した。以下のオリゴヌクレオチドを用いた。
シュードノットを有するＨＩＶフォワードオリゴヌクレオチド：
【化５】
0005415072.tif 000006
【００７５】
シュードノットを有するＨＩＶリバースオリゴヌクレオチド
【化６】
0005415072.tif 000007
【００７６】
これらのオリゴヌクレオチドをアニールし、得られた二本鎖配列を、いずれも標準の分子技術を用い、ベクターのＥｃｏＲＩ部位とＳａｃＩＩ部位との間にクローニングした。
【００７７】
ＨＩＶ−１挿入物の特徴を図１に示す。
【００７８】
ＨＩＶ−１リコーディング配列挿入物を、ＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩＩ部位の間、ＥＧＦＰ−Ｎ１の３’末端とＤｓＲｅｄ．Ｔ４−Ｎ１の５’末端の間の翻訳リコーディングレポーター構築物にクローニングした。
【００７９】
ＤｓＲｅｄの開始にＳａｃＩＩ部位およびＢａｍＨ１を有することにより、リンカーまたは他の配列を後に必要に応じて挿入することが可能になった。強力なコンテクスト（ＴＡＡＡ）を有するフレーム内の停止コドンは、それがフレームシフト事象によりバイパスされない限り、ＨＩＶ−１配列後のあらゆる配列の翻訳を停止させるものである。正確なリーディングフレーム内にＤｓＲｅｄレポーターを配置するために、停止コドンＴＡＡＡには２つの塩基ＣＧが後続する。
【００８０】
対照構築物
フレームシフトを伴わない対照構築物もまたリコーディング構築物とほぼ同様に生成し、それはＮｕｌｌ０と称した。Ｎｕｌｌ０構築物では、滑り配列（ｓｌｉｐｐｅｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が変更されるので同配列はリボソーム上で滑ることがなく、かつＡをＧＧＧの前に付加することでフレームシフトが常に０フレームとなるようにした。
【００８１】
滑り配列のＵＵＵ  ＵＵＡは、Ｎｕｌｌ０構築物ではＵＵＣ  ＣＵＡに変更された。いずれの構築物においても配列はフェニルアラニン、ロイシンをコードするので、取り込まれるアミノ酸に変化は全くない。
【００８２】
２つのオリゴヌクレオチドを用い、ＥＧＦＰとＤｓＲｅｄ遺伝子の間に挿入されるべきＮｕｌｌ０フレーム配列を有するＨＩＶ−１ステムループ／シュードノットを作製した。
Ｎｕｌｌ０フォワード：
【化７】
0005415072.tif 000008
【００８３】
Ｎｕｌｌ０リバース：
【化８】
0005415072.tif 000009
【００８４】
これらのオリゴヌクレオチドをアニールし、得られた二本鎖配列を、いずれも標準の分子技術を用い、ベクターのＥｃｏＲＩ部位とＳａｃＩＩ部位との間にクローニングした。
【００８５】
リンカー配列の挿入
二重ＧＦＰ系のシグナル強度を改善し、かつ、リコーディング構築物の有用性を改善するため、出願人は２つの蛍光タンパク質間に配置されたリンカー配列が有益でありうると仮定した。出願人は、かかるリンカーが蛍光タンパク質を空間的に分離し、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を低減する可能性があることについて検討した。
【００８６】
リンカーは、アライら（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  第１４巻、第８号、５２９−５３２頁（２００１年））に基づいて設計し、５’末端にＳａｃＩＩ制限部位および３’末端にＢａｍＨ１を設けてクローニングを容易にした。以下のオリゴヌクレオチドを用い、リンカー挿入物を生成した。
リンカーフォワード：
【化９】
0005415072.tif 000010
【００８７】
リンカーリバース：
【化１０】
0005415072.tif 000011
【００８８】
これらのオリゴヌクレオチドをアニールし、得られた二本鎖配列をＳａｃＩＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間のリコーディングベクターにクローニングした。リンカー配列内のＳａｃＩＩのすぐ５’側に追加のＫｐｎＩ部位を配置し、ＫｐｎＩ部位とＢａｍＨＩ部位の間に後でリンカーを挿入できるようにした。
【００８９】
実施例２．本発明のリコーディング構築物で安定的に形質転換された細胞系の生成
上記の翻訳リコーディング構築物は、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＮｏｔ  Ｉ制限部位を介して切断し、Ｆｌｐ−Ｉｎ  ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ発現ベクターにライゲートした後、製造業者の使用説明書に従って、Ｆｌｐ−Ｉｎ  ＣＶ１細胞（インヴィトロジェン・ライフ・テクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を安定的に形質転換した。
【００９０】
実施例３：シクロヘキシミドを５０ｎＭで用いる二重蛍光レポーターのリコーディングアッセイ
哺乳類ＣＯＳ−７細胞を、いずれも標準条件下で成長させ、採取し、トリプシン処理し、洗浄し、１×１０５細胞／ｍｌに希釈した。
【００９１】
次いで、希釈細胞を２等分した。一方をリコーディング構築物で一過性に、もう一方をＮｕｌｌ０フレーム対照構築物で形質移入した。一過性の形質移入は、製造業者の使用説明書に従って、細胞１ｍＬあたり２μＬのＦｕｇｅｎｅ６（商標）（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））および５００ｎｇのＤＮＡを用いて行った。
【００９２】
形質移入された細胞を標準条件下で２４ウェルプレート内に播種した。５０ｎＭのシクロヘキシミドをトリプリケートで添加し、次いでプレートを３７℃で４８時間インキュベートした。
【００９３】
細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄して培地のあらゆる痕跡を除去した。Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ緩衝液（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））１００μｌを添加した。細胞を凍結させた。次いで、凍結した細胞を解凍し、９６ウェルプレートに移し、ＢＭＧ  ＰｏｌａｒＳｔａｒプレートリーダーで蛍光強度を読み取った。
【００９４】
プレートリーダーの設定は以下の通りであった。
ＥＧＦＰの読み取り：
フィルタ  ４８５励起、５２０−Ｐエミッション
ＤｓＲｅｄの読み取り：
フィルタ  ５４４励起、５９０エミッション
【００９５】
結果：
５４４励起、５９０エミッションでのＤｓＲｅｄシグナル
ＨＩＶ−１フレームシフト構築物、相対蛍光単位（ＲＦＵ）：
１４４０、１４６５、１４３６（平均＝１４４７）−対照＝１３４２
Ｎｕｌｌ０フレームシフト構築物、ＲＦＵ：
４２２９６、４４６１０、４３８８３（平均＝４３５９６）−対照＝４３４９１
薬剤なしの対照ＨＩＶ−１フレームシフト構築物のＲＦＵ：
１６３３、１７１２、１７８３（平均＝１７０９）−対照＝１６０４
薬剤なしの対照Ｎｕｌｌ０フレームシフト構築物のＲＦＵ：４７０１８、４５４８８、４７６４５（平均＝４６７１７）−対照＝４６６１２
対照細胞：９４、１０１、１２０（平均＝ｌ０５）
４８５励起、５２０−ＰエミッションでのＥＧＦＰシグナル
ＨＩＶ−１フレームシフト構築物、ＲＦＵ：
２４０８１、２５２２４、２３５００（平均＝２４２６８）−対照＝２３８５８
Ｎｕｌｌ０フレームシフト構築物のＲＦＵ：
４０７５１、４２９６０、４２４５２（平均＝４２０５４）−対照＝４１６４４
薬剤なしの対照ＨＩＶ−１フレームシフト構築物のＲＦＵ：
２６２８２、２７４７５、２９７９０（平均＝２７８４９）−対照＝２７４３９
薬剤なしの対照Ｎｕｌｌ０フレームシフト構築物のＲＦＵ：
４６２６４、４３８５２、４６７４７（平均＝４５６２１）−対照＝４５２１１
対照細胞：３７４、３９５、４６２（平均＝４１０）
フレームシフトの計算：
［［ＤｓＲｅｄシグナル：ＨＩＶ−１フレームシフト構築物］／［ＥＧＦＰシグナル：ＨＩＶ−１フレームシフト構築物］］／［［ＤｓＲｅｄシグナル：Ｎｕｌｌ０フレームシフト構築物］／［ＥＧＦＰシグナル：Ｎｕｌｌ０フレームシフト構築物］］
シクロヘキシミド：（（１３４２／２３８５８））／（（４３４９１／４１６４４））＊１００＝５．３８％フレームシフト
薬剤なしの対照：（（１６０４／２７４３９））／（（４６６１２／４５２１１））＊１００＝５．６７％フレームシフト
【００９６】
結果は、フレームシフトが５．６７％から５．３８％に低下したことを示す。これは、当初の５．６７％から、フレームシフト効率が０．２９％絶対的に変化したこと、または５％低下したことを意味し、リコーディング変化の検出における本発明のリコーディング構築物および方法の有用性を示している。
【００９７】
実施例４：５０ｎＭのアニソマイシンを用いる二重蛍光レポーターのリコーディングアッセイ
哺乳類ＣＯＳ−７細胞を、いずれも標準条件下で成長させ、採取し、トリプシン処理し、洗浄し、１×１０５細胞／ｍｌに希釈した。
【００９８】
次いで、希釈細胞を２等分した。一方は実施例３に記載のようにリコーディング構築物で、もう一方はＮｕｌｌ０フレーム対照構築物で形質移入された。
【００９９】
次いで、細胞を標準条件下で２４ウェルプレート内に播種した。５０ｎＭのアニソマイシンをトリプリケートで添加し、次いでプレートを３７℃で４８時間インキュベートした。
【０１００】
細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄して培地のあらゆる痕跡を除去した。Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ緩衝液（プロメガ）１００μｌを添加した。細胞を凍結させた。次いで、凍結した細胞を解凍し、９６ウェルプレートに移し、ＢＭＧ  ＰｏｌａｒＳｔａｒプレートリーダーで蛍光強度を読み取った。
【０１０１】
プレートリーダーの設定は以下の通りであった。
ＥＧＦＰの読み取り：
フィルタ  ４８５励起、５２０−Ｐエミッション
ＤｓＲｅｄの読み取り：
フィルタ  ５４４励起、５９０エミッション
【０１０２】
結果：
５４４励起、５９０エミッションでのＤｓＲｅｄシグナル
ＨＩＶ−１フレームシフト構築物、相対蛍光単位（ＲＦＵ）：
１９９９、１９９２、１９３６（平均＝１９７５）−対照＝１８９１
Ｎｕｌｌ０フレームシフト構築物のＲＦＵ：
５８８７５、５９００５、５７０００（平均＝５８２９３）−対照＝５８２０９
薬剤なしの対照ＨＩＶ−１フレームシフト構築物のＲＦＵ：
１９１１、１８４９、２１１０（平均＝１９５６）−対照＝１８７２
薬剤なしの対照Ｎｕｌｌ０フレームシフト構築物のＲＦＵ：
５１１１７、５４５７７、５２７０８（平均＝５２８００）−対照＝５２７１６
対照細胞：８６、７８、８８（平均＝８４）
４８５励起、５２０−ＰエミッションでのＥＧＦＰシグナル
ＨＩＶ−１フレームシフト構築物のＲＦＵ：
３３６２２、３１８６６、３２５１２（平均＝３２６６６）−対照＝３２３３６
Ｎｕｌｌ０フレームシフト構築物のＲＦＵ：
５７５２７、５７１６５、５４７８３（平均＝５６４９１）−対照＝５６１６１
薬剤なしの対照ＨＩＶ−１フレームシフト構築物のＲＦＵ：
２９８４９、３０９２７、３３４１６（平均＝３１３９７）−対照＝３１０６７
薬剤なしの対照Ｎｕｌｌ０フレームシフト構築物のＲＦＵ：５０５９６、５４２７４、５２６０５（平均＝５２４９１）−対照＝５２１６１
対照細胞：３３１、３３２、３２８（平均＝３３０）
【０１０３】
フレームシフトの計算：
［［ＤｓＲｅｄシグナル：ＨＩＶ−１フレームシフト構築物］／［ＥＧＦＰシグナル：ＨＩＶ−１フレームシフト構築物］］／［［ＤｓＲｅｄシグナル：Ｎｕｌｌ０フレームシフト構築物］／［ＥＧＦＰシグナル：Ｎｕｌｌ０フレームシフト構築物］］
アニソマイシン：（（１８９１／３２３３６））／（（５８２０９／５６１６１））＊１００＝５．６４％フレームシフト
薬剤なしの対照：（（１８７２／３１０６７））／（（５２７１６／５２１６１））＊１００＝５．９６％フレームシフト
【０１０４】
フレームシフトの５．９６％から５．６４％への低下。これは、フレームシフト効率が当初の５．９６％から０．３２％絶対的に変化したということ、または５．３％低下したということであり、また変化の検出における本発明のリコーディング構築物および方法の有用性を示している。
【０１０５】
実施例５：様々なシクロヘキシミド濃度を用いる二重蛍光レポーターのリコーディングアッセイ
実施例３および４に記載したように細胞を調製した。シクロヘキシミドは、２４ウェルプレート内に播種された細胞に添加し、最終濃度が０ｎＭ（薬剤なし）、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭおよび５００ｎＭとなるようにした。
【０１０６】
プレートリーダーの設定は以下の通りであった。
フィルタが実施例３、４と異なるため、わずかに異なるフレームシフト効率を与えることに留意すること。
５２５励起、６００ＬＰエミッションでのＤｓＲｅｄシグナル
４８５励起、５２０−ＰエミッションでのＥＧＦＰシグナル
結果を下記の表１〜５に示す。
【０１０７】
【表１】
0005415072.tif 000012
【０１０８】
【表２】
0005415072.tif 000013
【０１０９】
【表３】
0005415072.tif 000014
【０１１０】
【表４】
0005415072.tif 000015
【０１１１】
【表５】
0005415072.tif 000016
【０１１２】
表５に示されるフレームシフト値は、表１、２、３および４のデータを用い、実施例３に示される式を用いて算出した。
【０１１３】
５２５励起および６００ＬＰエミッションのフィルタセットを用いるフレームシフトは、ＥＧＦＰからの約２％のブリードスルー（ｂｌｅｅｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）のために、５４４励起／５９０エミッションのフィルタセットよりも高いフレームシフト数となる。
【０１１４】
結果は、１００ｎＭのシクロヘキシミドで、フレームシフトが８．４８％から８．２５％に低下したことを示す。これは、フレームシフト効率が、当初の８．４８％から０．２３％の絶対的に変化したこと、または２．７％の低下したことを意味する。１００ｎＭ〜５００ｎＭの濃度のシクロヘキシミドによるフレームシフトのパーセンテージの低下は表５に見ることができる。データは、様々な濃度にわたって、リコーディング変化の検出における本発明のリコーディング構築物および方法の有用性を示している。
【０１１５】
表１〜４に示されるＺ因子は、アッセイの信頼性を示すものであり、Ｚｈａｎｇら（Ｄｕｐｏｎｔ：Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  第４巻、第２号、１９９９年）にて言及されている。Ｚ因子は式：
Ｚ＝１−（試料の３ＳＤ＋対照の３ＳＤ）／（試料の平均−対照の平均）
によって計算される。
【０１１６】
０．５と１．０（理論上の最大値）の間のＺ因子は堅牢なアッセイを示す。シクロヘキシミドとアニソマイシンの双方が−１フレームシフトに対するアンタゴニストであることから、Ｚ因子はこのアッセイにおいて低下する（表１〜４を参照）。Ｚ’因子は、いずれの試験化合物も添加しない対照データを用いて算出することができる。同じアッセイ条件下でのＺ’因子とＺ因子を比較することにより、アッセイに対する化合物の効果が明らかになる。−１フレームシフトの構築物のシグナル／数がＣＶ１対照細胞の値に接近していることからＺスコアが０未満に低下することや１．０を超えることがある。ＣＶ１対照細胞は、レポーター遺伝子が全く有しない、真のバックグラウンドをもたらす細胞である。
【０１１７】
実施例６：様々なアニソマイシン濃度での二重蛍光レポーターのリコーディングアッセイ
形質移入された細胞を実施例５に記載したように調製し、０ｎＭ（薬剤なし）、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭおよび５００ｎＭの濃度のアニソマイシンで処理した。
【０１１８】
インキュベーション、プレートリーダーの設定および読み取りは実施例５に記載の通りであった。結果を下記の表６〜１０に示す。
【０１１９】
【表６】
0005415072.tif 000017
【０１２０】
【表７】
0005415072.tif 000018
【０１２１】
【表８】
0005415072.tif 000019
【０１２２】
【表９】
0005415072.tif 000020
【０１２３】
【表１０】
0005415072.tif 000021
【０１２４】
アニソマイシン滴定においては、表１０に示されるフレームシフト値を、表６、７、８および９のデータを用い、実施例３に示される式を用いて計算した。
【０１２５】
５２５励起および６００ＬＰエミッションのフィルタセットを用いるフレームシフトは、ＥＧＦＰからの約２％のブリードスルーにより、５４４励起／５９０エミッションのフィルタセットよりも高いフレームシフト数となる。
【０１２６】
結果は、１００ｎＭのアニソマイシンでフレームシフトが７．９９％から７．８８％に低下したことを示す。これは、当初の７．９９％から、フレームシフト効率が０．１１％絶対的に変化したこと、または１．４％低下したことを意味する。１００ｎＭ〜５００ｎＭの濃度のアニソマイシンでのフレームシフトの百分率の低下は表１０に見ることができる。データは、様々な濃度にわたってリコーディング変化の検出における本発明のリコーディング構築物および方法の有用性を示している。
【０１２７】
実施例７：シクロヘキシミドおよびアニソマイシンの様々な濃度での安定的に形質移入された二重蛍光レポーターのリコーディングアッセイ
実施例２に記載のように−１フレーム構築物で形質移入されたＦｌｐ−Ｉｎ  ＣＶ１細胞（ＣＶ１細胞）および形質移入されていないＣＶ１細胞を、いずれも標準条件下で成長させ、採取し、トリプシン処理し、洗浄し、１×１０５細胞／ｍｌに希釈した。
【０１２８】
次いで、細胞を標準条件下で９６ウェルプレート内に播種した。試験化合物は、表１１、１２、１４および１５に示されるように５０ｎＭ〜２０００ｎＭの濃度で、トリプリケートで添加した。次いで、プレートを３７℃で１２０時間インキュベートした。
【０１２９】
細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄して培地のあらゆる痕跡を除去した。Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ緩衝液（プロメガ）１００μｌを添加した。細胞を凍結させた。次いで、凍結した細胞を解凍し、Ｔｅｃａｎ  Ｇｅｎｉｏｓ  Ｐｒｏプレートリーダーで蛍光強度を読み取った。
【０１３０】
プレートリーダーの設定は以下の通りであった。
ＥＧＦＰ読み取り：
フィルタ  ４８５励起、５１５エミッション
ＤｓＲｅｄの読み取り値：
フィルタ  ５３５励起、５９０エミッション
【０１３１】
結果を、シクロヘキサミドについては表１１〜１３、アニソマイシンについては表１４〜１６に示す。
【０１３２】
安定なＦｌｐ−Ｉｎ  ＣＶ１細胞におけるシクロヘキシミドの結果：
【０１３３】
【表１１】
0005415072.tif 000022
【０１３４】
【表１２】
0005415072.tif 000023
【０１３５】
【表１３】
0005415072.tif 000024
【０１３６】
安定的に形質転換されたＦｌｐ−Ｉｎ細胞におけるアニソマイシンの結果：
【０１３７】
【表１４】
0005415072.tif 000025
【０１３８】
【表１５】
0005415072.tif 000026
【０１３９】
【表１６】
0005415072.tif 000027
【０１４０】
Ｎｕｌｌ０フレームシフト構築物をこの実験で用いなかったことから、ＤｓＲｅｄ対ＥＧＦＰシグナルの比を計算し、薬剤濃度の増加に伴うＥＧＦＰシグナルにおける低下を考慮した。
【０１４１】
計算は実施例３の場合と同様に、平均した計数値を用いて、ＤｓＲｅｄシグナルのＥＧＦＰシグナルに対する比を計算する前に対照細胞の計数値を除外した。Ｎｕｌｌ０フレーム構築物を用いてノーマライゼーションを行うことができず、以下の結果は百分率で表される。計算は以下の通りであった。
［［ＤｓＲｅｄシグナル：ＨＩＶ−１フレームシフト構築物］／［ＥＧＦＰシグナル：ＨＩＶ−１フレームシフト構築物］］
【０１４２】
表１３に示される各シクロヘキサミド濃度についての「比の低下（％）」のデータは、シクロヘキサミドの５０ｎＭ〜２０００ｎＭの範囲での用量反応効果を示す。このデータは、様々な濃度にわたって、リコーディング変化の検出における本発明のリコーディング構築物および方法の有用性を示している。
【０１４３】
表１６に示される各アニソマイシン濃度についての「比の低下（％）」のデータは、アニソマイシンの５０ｎＭ〜２０００ｎＭの範囲での用量反応効果を示す。このデータは、様々な濃度にわたって、リコーディング変化の検出における本発明のリコーディング構築物および方法の有用性をさらに示している。
【０１４４】
Ｚ因子の使用により、任意の化合物／薬剤試験の定量的解釈が可能になる。Ｚ因子の０への低下はＹｅｓ／Ｎｏアッセイを示し、０未満の数はスクリーニングが本質的に不可能であることを意味する。アッセイで試験された化合物は、薬剤／化合物濃度の増加につれてＺ因子を確かに低下させ、安定的に形質移入された細胞を用いる１２０時間のアッセイにおいては、５００ｎＭを超える化合物濃度の場合、Ｚ因子に対して強力な効果を有した。
【０１４５】
上記の実施例は本発明の実施について例示するものである。極めて多数の変形および改良が本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされる場合があることが当業者によって理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】本発明のリコーディング構築物の図示したものである。
【図２】本発明の翻訳リコーディングレポーター構築物内で用いられるＨＩＶ−１  ｇａｇ  ｐｏｌリコーディング配列の特徴を示す。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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