(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の検出を補助する方法であって、
個体から得た試料において、ＦＵＳ／ＴＬＳの核酸またはそのフラグメント中の１または２以上の遺伝子マーカーを検出すること、
を含み、
ここで、前記１または２以上の遺伝子マーカーは、配列番号３と比較して、Ｃ１５５１Ｇ、Ｃ１５６１Ｇ、Ｇ１５４２Ｔ、Ｇ１５４３Ｔ、Ｃ１５６１Ｔ、Ｇ１５６２Ａ、Ａ１５６４ＧまたはＧ１５７２Ｃからなる群より選択され、および
ここで、１または２以上のマーカーの存在は、前記個体がＡＬＳを有するか、またはＡＬＳについての遺伝的素因または易罹患性を有することを示す、
前記方法。
【請求項２】
変異がＦＵＳ／ＴＬＳのエクソン１５中にある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
遺伝子マーカーの１または２以上が、ＦＵＳ／ＴＬＳタンパク質中の（野生型と比較しての）アミノ酸変化をコードする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
アミノ酸変化が、Ｈ５１７Ｑ、Ｒ５２１Ｇ、Ｒ５１４Ｓ、Ｇ５１５Ｃ、Ｒ５２１Ｃ、Ｒ５２１Ｈ、Ｒ５２２ＧまたはＲ５２４Ｓにおけるものである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
８つ全てのマーカーを含むハプロタイプを検出することを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
核酸が、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｈｎＲＮＡまたはｍＲＮＡである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
１または２以上の遺伝子マーカーの検出が、シークエンシング、ハイブリダイゼーション、制限酵素断片分析、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイまたは対立遺伝子特異的ＰＣＲにより達成される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
１または２以上の遺伝子マーカーが、変異体ＦＵＳ／ＴＬＳタンパク質に選択的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを用いて同定される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＦＵＳ／ＴＬＳの核酸またはそのフラグメント中の１または２以上のマーカーであって、該マーカーが、配列番号３と比較して、Ｃ１５５１Ｇ、Ｃ１５６１Ｇ、Ｇ１５４２Ｔ、Ｇ１５４３Ｔ、Ｃ１５６１Ｔ、Ｇ１５６２Ａ、Ａ１５６４ＧまたはＧ１５７２Ｃからなる群より選択される１または２以上の前記マーカーを検出するためのプローブの少なくとも１つの組み合わせを含む、診断用キットおよび／または研究用キット。
【請求項１０】
シークエンシングが、ゲノムＤＮＡのエクソンシークエンシングである、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００８年７月２２日に出願された米国仮出願第61/135,689号の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ）に基づく利益を主張し、該仮出願は、本明細書においてその全体が参照として組み込まれる。
【０００２】
政府の出資
本発明は、国立神経疾患・脳卒中研究所（National Institute of Neurological Disorders and Stroke：NINDS）からの助成金第R01 NS050557-01号に基づく政府の支持によりなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、運動ニューロン疾患、特に筋萎縮性側索硬化症の診断および処置に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、進行性の、致死性の神経変性障害である。その発症率は、0.6〜2.6／100,000であると報告されており（Roman, J Neurol Neurosurg Psychiatry. 1996. 61(2):131-7）、やや男性優位である。疾患の発症率のピークは６０歳代においてであり（Nelson, Clin. Neurosci. 3, 327 (1995)）、生存は典型的には２〜５年である。ＡＬＳは、機械的人工呼吸の不在下において、呼吸麻痺からの死を回避不能にもたらす。家族性の症例がＡＬＳの１０％を占め、細胞質の銅−亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）における変異がこれらの家族性症例の２０〜２５％を占めることが示されている（Rosen, Nature 364, 362 (1993)）。小胞結合膜タンパク質結合タンパク質（ＶＡＰＢ）における変異は、少数のブラジルの家族において古典的ＡＬＳまたは非定型運動ニューロン疾患のいずれかを引き起こすことが示されている。少数の遺伝子が、上位運動ニューロン優性ＡＬＳ２（alsin）、若年性ＡＬＳ（senataxin）および下位運動ニューロン疾患（lower motor neuropathy）（DCTN1）を含む、非定型運動ニューロン疾患に関連付けられている。若年性遺伝性ＡＬＳ（この場合は劣性）の第２の形態は、染色体１５ｑに関連付けられる（Hentati et al., Neurogenetics 2, 55 (1998)）。しかし、家族性の古典的ＡＬＳの症例の大多数においては、原因遺伝子は未知である。染色体１６および１８への連鎖を有する高浸透率の古典的ＡＬＳの系統が報告されているが、一方で、染色体９への連鎖を有する前頭側頭型認知症を伴うかまたは伴わないＡＬＳを有する家系が報告されている。
【発明の概要】
【０００５】
発明の要旨
本発明者らは、ヒトＦＵＳ／ＴＬＳ遺伝子における変異が、ヒト筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）および関連する運動ニューロン疾患に関連することを発見した。ここで、本発明者らは、優性な古典的ＡＬＳと見かけ上劣性で非定型のＡＬＳとの両方に関連する、染色体１６上のＦＵＳ／ＴＬＳ遺伝子における変異を報告する。したがって、本発明は、筋萎縮性側索硬化症および他の運動ニューロン疾患の診断および処置のための方法を提供する。方法は、ＦＵＳ／ＴＬＳ活性の変化および／またはＦＵＳ／ＴＬＳの物理的特性の変化の結果である家族性筋萎縮性側索硬化症および筋萎縮性側索硬化症ならびに他の運動ニューロン疾患を処置するために提供される。さらに、ＦＵＳ／ＴＬＳの生化学的経路の変化により引き起こされる疾患のための治療が提供される。
【０００６】
一側面において、本発明は、対象においてＡＬＳまたは関連する運動ニューロン疾患を診断するための方法を提供し、該方法は、個体から得られた試料において、ＦＵＳ／ＴＬＳの核酸またはそのフラグメントにおける１または２以上の遺伝子マーカーを検出することを含み、ここで、前記１または２以上の遺伝子マーカーは、Ｃ１５５１Ｇ、Ｃ１５６１Ｇ、Ｇ１５４２Ｔ、Ｇ１５４３Ｔ、Ｃ１５６１Ｔ、Ｇ１５６２Ａ、Ａ１５６４ＧまたはＧ１５７２Ｃからなる群より選択され、ここで、前記１または２以上のマーカーの存在は、前記個体がＡＬＳもしくは関連する運動ニューロン疾患を有するか、またはＡＬＳもしくは関連する運動ニューロン疾患に対する遺伝的素因または易罹患性を有することを示す。
【０００７】
一態様において、変異は、ＦＵＳ／ＴＬＳのエクソン１５におけるものである。一態様において、遺伝子マーカーの１または２以上は、（野生型と比較して）ＦＵＳ／ＴＬＳタンパク質中のアミノ酸の変化をコードする。一態様において、アミノ酸の変化は、Ｈ５１７Ｑ、Ｒ５２１Ｇ、Ｒ５１４Ｓ、Ｇ５１５Ｃ、Ｒ５２１Ｃ、Ｒ５２１Ｈ、Ｒ５２２ＧまたはＲ５２４Ｓにおけるものである。一態様において、方法は、全ての８個のマーカーを含むハプロタイプを検出することを含む。一態様において、核酸は、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｈｎＲＮＡまたはｍＲＮＡである。一態様において、検出は、シークエンシング、ハイブリダイゼーション、制限酵素断片分析、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイまたは対立遺伝子特異的ＰＣＲにより達成される。一態様において、１または２以上の遺伝子マーカーは、変異体ＦＵＳ／ＴＬＳタンパク質に選択的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを用いて同定される。
【０００８】
別の側面において、本発明は、本明細書において記載される遺伝子マーカーのうちの少なくとも１つを同定するためのプローブの少なくとも１つの組み合わせを含む、診断用キットおよび／または研究用キットを提供する。
【０００９】
別の側面において、本発明は、ＡＬＳまたは関連する運動ニューロン疾患の処置または予防の方法を提供し、該方法は、上記または本明細書において他に記載される診断方法を実施して、ＡＬＳもしくは関連する運動ニューロン疾患を有するかまたはＡＬＳもしくは関連する運動ニューロン疾患に対する遺伝的素因または易罹患性を有する個体を同定すること、および、該個体に、該個体においてＡＬＳまたは関連する運動ニューロン疾患を遅延させるか、低減するかまたは予防するために好適な組成物の治療有効量を投与すること、および／あるいは、該個体を治療により処置することを含む。
【００１０】
一態様において、組成物は、変異型ＦＵＳ／ＴＬＳの活性のモジュレーターを含む。別の態様において、モジュレーターは、変異型ＦＵＳ／ＴＬＳの発現を減少させるｓｉＲＮＡ分子である。別の態様において、モジュレーターは、野生型ＦＵＳ／ＴＬＳの発現を増大させる発現ベクターである。
【００１１】
別の側面において、本発明は、ＦＵＳ／ＴＬＳ遺伝子においてＣ１５５１Ｇ、Ｃ１５６１Ｇ、Ｇ１５４２Ｔ、Ｇ１５４３Ｔ、Ｃ１５６１Ｔ、Ｇ１５６２Ａ、Ａ１５６４ＧもしくはＧ１５７２Ｃからなる群より選択される１または２以上の遺伝子マーカー、またはＦＵＳ／ＴＬＳタンパク質においてＨ５１７Ｑ、Ｒ５２１Ｇ、Ｒ５１４Ｓ、Ｇ５１５Ｃ、Ｒ５２１Ｃ、Ｒ５２１Ｈ、Ｒ５２２ＧもしくはＲ５２４Ｓからなる群より選択される１または２以上の遺伝子マーカーを含む、遺伝子改変生物を提供する。
【００１２】
一態様において、遺伝子マーカーは、ＦＵＳ／ＴＬＳ中のエクソン１５におけるものである。別の態様において、生物はマウスである。
なお別の側面において、本発明は、変異体ＦＵＳ／ＴＬＳのタンパク質または核酸に選択的に結合する分子についてスクリーニングするための方法を提供し、該方法は、野生型および変異型ＦＵＳ／ＴＬＳの核酸またはタンパク質を候補分子と接触させること、ならびに、候補分子の野生型および変異型ＦＵＳ／ＴＬＳの核酸またはタンパク質への結合を測定することを含み、ここで、変異型ＦＵＳ／ＴＬＳへの結合のレベルが野生型ＦＵＳ／ＴＬＳへの結合のレベルよりも５倍大きいことが、変異型ＦＵＳ／ＴＬＳに選択的に結合する分子の指標である。
【００１３】
本発明は、さらに、患者において細胞死疾患を発症する可能性が高いことを診断する方法を特徴とする。方法は、患者のＤＮＡを分析して該ＤＮＡがＦＵＳ／ＴＬＳコード配列中に変異を含むか否かを決定することを含み、かかる変異は、当該患者が細胞死疾患を発症する可能性が高いことの指標である。方法は、細胞死疾患、特に神経変性疾患、とりわけ筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を診断するために用いることができる。
ＡＬＳは、家族性、孤発性の定型または非定型の性質であってよい。
【００１４】
本明細書において記載される方法はまた、限定されないが、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、ハラーホルデン・スパッツ病、オリーブ橋小脳萎縮症、多系統萎縮症、進行性核上性麻痺、びまん性レビー小体病、皮質歯状核黒質変性症（corticodentatonigral degeneration）、進行性家族性ミオクローヌスてんかん、線条体黒質変性症（strionigral degeneration）、捻転ジストニア、家族性振戦、ジル・ドゥ・ラ・トゥーレット症候群、およびハラーホルデン・スパッツ病などの、別の神経変性状態を発症する可能性を決定するために用いることができる。
【００１５】
方法は、患者のＦＵＳ／ＴＬＳをコードする遺伝子を増幅すること、および増幅された遺伝子を分析することを含む。ＤＮＡを、ヌクレオチドシークエンシング、ＳＳＣＰ分析、ＲＦＭＰ、ヘテロ二本鎖分析またはＲＦＬＰ分析により分析することができる。増幅は、ＰＣＲ反応により、逆転写ＰＣＲにより、または十分な量のＤＮＡを得るために利用可能な任意の他の方法により行うことができる。
【００１６】
本発明の変異核酸によりコードされるタンパク質またはペプチドを認識する（およびしたがって結合する）が野生型（非ＳＮＰ変異含有核酸）によりコードされるタンパク質またはペプチドを認識しない（およびしたがって結合しない）抗体は、家族性ＡＬＳを含む筋萎縮性側索硬化症の診断のために用いることができる。
【００１７】
本発明の別の側面によれば、診断用キットおよび／または研究用キットが提供される。キットは、本明細書において記載される変異の少なくとも１つを検出するためのプローブの少なくとも１つの組み合わせを含む。
【００１８】
本発明はさらに、患者におけるＡＬＳなどの細胞死疾患の診断のためのキットを提供する。キットは、１もしくは２以上のＦＵＳ／ＴＬＳ遺伝子特異的ＰＣＲプライマーまたはＦＵＳ／ＴＬＳ変異タンパク質もしくはペプチドを認識する抗体を含んでもよい。ＰＣＲプライマーは、正常または変異（例えばＦＵＳ／ＴＬＳ配列中のＳＮＰ変異の結果として本発明により提供されるもののような）のいずれであるかに拘わらず、ＦＵＳ特異的核酸配列、ＴＬＳ特異的核酸配列および／またはＦＵＳ／ＴＬＳ特異的核酸配列を含んでもよい。これらのキットを、上述の疾患のいずれを診断するために用いてもよい。
【００１９】
本発明は、本明細書において記載される診断方法を実施してＡＬＳまたは他の関連する運動ニューロン疾患に対する遺伝的素因または易罹患性を有する個体を同定し、該個体に、該個体においてＡＬＳまたは関連する運動ニューロン疾患を遅延させるか、低減するかまたは予防するために好適な組成物の治療有効量を投与し、および／あるいは、該個体を治療により処置するための方法を提供する。
【００２０】
本発明はさらに、変異型ＦＵＳ／ＴＬＳ遺伝子に関連する疾患を有する患者を処置するための方法を提供する。この方法は、第１に、患者のＤＮＡ中の変異型ＦＵＳ／ＴＬＳ遺伝子を同定すること、および第２に、患者にＦＵＳ／ＴＬＳ変異タンパク質をコードする遺伝子のアンチセンスＲＮＡホモログの治療有効量を投与することを含む。
【００２１】
また含まれるのは、変異型ＦＵＳ／ＴＬＳ遺伝子に関連する疾患を有する患者を処置するための方法であって、ここで、ＤＮＡ中の変異型ＦＵＳ／ＴＬＳ遺伝子を患者において同定し、野生型ＦＵＳ／ＴＬＳホモログをコードする導入遺伝子の治療有効量を投与する。
【００２２】
また本発明の一部は、変異体ＦＵＳ／ＴＬＳタンパク質を部分的に不活化するために十分な抗体を患者に投与することにより、ＦＵＳ／ＴＬＳ遺伝子に関連する疾患を有する患者を処置する方法である。
【００２３】
本発明の診断方法はまた、スクリーニングの結果としてＡＬＳまたは他の関連する運動ニューロン疾患を有することが疑われる個体を処置しない場合を決定するためにも用いることができる。
【００２４】
本発明はさらに、本発明のＳＮＰを含むＦＵＳ／ＴＬＳの核酸、かかる核酸によりコードされるタンパク質またはペプチド、該核酸またはタンパク質に特異的に結合する結合パートナー、かかる核酸を含むベクターおよび細胞（例えば細菌のものまたは哺乳動物のもの）、ならびにこれらの使用の方法を提供する。
本発明のこれらのおよび他の側面、ならびにその多様な態様は、本発明の図面および詳細な説明を参照することによりより明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ】図１：ＡおよびＢ。ＦＵＳ／ＴＬＳのＡＬＳのインデックス系統および遺伝子情報。
【図１Ｂ】図１：ＡおよびＢ。ＦＵＳ／ＴＬＳのＡＬＳのインデックス系統および遺伝子情報。
【図１Ｃ】Ｃ：ＦＵＳ／ＴＬＳの進化上保存。ＡＬＳ患者において観察される変異を、赤で、ヒト配列の上に示す。「（ＳＣ）」は、１個体における２つの連続したミスセンス変異（Ｒ５１４ＳおよびＧ５１５Ｃ）を引き起こす２ｐｂの変異（cisにおけるもの）を指す。
【００２６】
【図２Ａ】図２：ＦＵＳ／ＴＬＳの組織および細胞染色ならびにＲＮＡ結合。Ａ．Ｆ５５のＡＬＳ患者対対照の、抗ＮｅｕＮ／ｇｆｐおよび抗リポフスチン／Ｃｙ３抗体により染色された脳（皮質）、マージされた画像（左）、または抗ＦＵＳ／ＴＬＳ抗体＋ＤＡＢ二次抗体により染色された脳（皮質）。
【図２Ｂ】Ｂ．Ｆ５５のＡＬＳ患者対対照の、抗ＮｅｕＮ／Ｃｙ３および抗ＦＵＳ／ＴＬＳ抗体ならびにＤＡＰＩにより染色された脊髄、およびマージされた画像。Ｃ．変異体（Ｒ５２１ＧまたはＨ５１７Ｑ）組み換えＦＵＳ／ＴＬＳおよび２４塩基のＲＮＡオリゴマーを用いたゲルシフトアッセイ。
【００２７】
【図３Ａ】図３：トランスフェクションおよび細胞分画研究。Ａ．野生型または変異型（Ｆ５５＝Ｒ５２１ＧまたはＦ５７７＝Ｈ５１７Ｑ）組み換えＦＵＳ／ＴＬＳ−ｇｆｐ融合タンパク質をトランスフェクトされたＳＫ−ＮＡＳ（上）またはＮ２Ａ（下）細胞、ＤＡＰＩによりカウンター染色されたもの、マージされた画像。有意な核対細胞質のＦＵＳ／ＴＬＳ染色が観察された細胞のパーセンテージを、右に示す。
【図３Ｂ】Ｂ．細胞分画研究。野生型または変異型（Ｆ５５＝Ｒ５２１ＧまたはＦ５７７＝Ｈ５１７Ｑ）組み換えＦＵＳ／ＴＬＳ−ｇｆｐ融合タンパク質をトランスフェクトされたＳＫ−ＮＡＳ細胞を、２４時間後に収集して分画した。ウェスタンブロットに供し、抗ｇｆｐ抗体／ＥＬＣで染色した。ラミンおよびＧＡＰＤＨローディング対照染色を下に、密度測定比を右に示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
発明の詳細な説明
本発明者らは、ヒトＡＬＳ患者（優性および劣性遺伝する家族性ＡＬＳを含む）におけるＦＵＳ／ＴＬＳ遺伝子における変異を同定した。この遺伝子配列中の変異の知識、およびＦＵＳ／ＴＬＳ変異を保有する患者についての臨床情報を用いて、徴候性の個体および危険性がある個体においてＡＬＳを診断および予測することができる。さらに、ＡＬＳおよび運動ニューロンの生物学を研究するために、実験動物および培養細胞においてＦＵＳ／ＴＬＳ遺伝子中に変異を導入することができる。かかる動物および細胞は、ＡＬＳおよび関連疾患を有するヒト患者における使用のために、治療的介入（薬物、ｓｉＲＮＡ、ならびに遺伝子およびタンパク質治療を含む）を開発して試験するために用いることができる。
【００２９】
FUS遺伝子の公式な完全名称は、「fusion (involved in t(12;16) in malignant liposarcoma)」である。この遺伝子はまた、ＦＵＳ、ＴＬＳ；ＦＵＳ／ＴＬＳ；ＣＨＯＰ；ＦＵＳ１；ＦＵＳ−ＣＨＯＰ；ＴＬＳ／ＣＨＯＰ；およびｈｎＲＮＰ−Ｐ２としても知られている。この遺伝子は、１５個のエクソンおよび長さ２，００２ヌクレオチドの転写物を有する。ＦＵＳ／ＴＬＳ遺伝子は、７５ｋＤａのＤＮＡと対形成する核タンパク質をコードし、これは一本鎖および二本鎖ＤＮＡの両方と結合し、相補的な一本鎖ＤＮＡのＡＴＰ非依存的アニーリング、および高次らせん二本鎖ＤＮＡにおけるＤループ形成を促進する。タンパク質の長さは５２６アミノ酸残基である。ＦＵＳ／ＴＬＳ配列は、本明細書において以下のように提供され、本明細書に添付され本明細書において組み込まれる配列表中に含まれる：
配列番号１は遺伝子配列であり；
配列番号２はｃＤＮＡ配列であり；
配列番号３はタンパク質コード配列であり；および
配列番号４は前記タンパク質のアミノ酸配列である。
【００３０】
ＦＵＳ／ＴＬＳは、ハンチントン病のモデルにおいて、主要な核凝集体相互作用タンパク質であることが見出されている。凝集体における貯留（sequestration）によるＦＵＳ／ＴＬＳの枯渇は、ポリグルタミン伸長に媒介される疾患における神経細胞死の原因であり得る。運動ニューロン疾患の劣性症例におけるＦＵＳ／ＴＬＳの機能の喪失は、この病態を模倣する場合がある（注：ＦＵＳ／ＴＬＳの１結合パートナーであるＣＢＰもまた、ポリグルタミン経路を含む）。
【００３１】
予想外に、ＡＬＳ患者（家族性ＡＬＳおよび孤発性ＡＬＳの両方）におけるＦＵＳ／ＴＬＳ遺伝子の配列中に幾つかの変異を発見した。配列の番号付けは、開始コドンのＡを塩基１として始め、イントロンの塩基は、最も近いエクソンに相対的にプラスまたはマイナスとした。
【００３２】
【表１】
0005643200.tif 000002
【００３３】
１家系５７７は、偽優性形質としてＡＬＳを分離する多世代の系統であり、劣性であると考えられる［家系は少なくとも１つの近親ループを含む］；患者における家系固有（identity-by-descent）の最も重要な領域は、染色体１６上にある。患者は、非延髄性（したがって非致死性）の下位〜上位運動ニューロン疾患の形態を有する。
【００３４】
２家系５５は、優性形質としてＡＬＳを分離する多世代の系統である（染色体１６に連鎖する：本発明者らのグループにより報告される）。
一つの家系が、Ｘ連鎖する球脊髄性筋萎縮症およびＦＵＳ／ＴＬＳ媒介性運動ニューロン疾患の両方を分離する場合がある。
【００３５】
用語「対立遺伝子」とは、本明細書において用いられる場合、ヌクレオチド配列のバリアントを指す。二対立遺伝子多型は、２つの形態を有する。代表的には、第１に同定された対立遺伝子がオリジナルの対立遺伝子（original allele）として命名され、一方他の対立遺伝子は代替的な対立遺伝子（alternative allele）として命名される。二倍体生物は、ある対立遺伝子の形態について、ホモ接合またはヘテロ接合である。
【００３６】
用語「遺伝子型」は、本明細書において用いられる場合、個体または試料中に存在する対立遺伝子のアイデンティティーを指す。用語、試料または個体をある対立遺伝子マーカーについて「遺伝子型同定する（genotyping）」ことは、ある対立遺伝子マーカーにおいて、個体により保有される特定の対立遺伝子または特定のヌクレオチドを決定することからなる。
用語「ハプロタイプ」とは、個体または試料中に存在する対立遺伝子の組み合わせを指す。
【００３７】
本明細書において記載される方法は、ＳＮＰマーカーの検出に関する。本明細書において用いられる場合、用語「ＳＮＰ」は、全ての一塩基バリアントを包含し、また、一ヌクレオチド置換（例えばＡ−＞Ｇ）に加えて、一ヌクレオチドの挿入および欠失を包含する。一ヌクレオチド多型は、一ヌクレオチドにより占有される多型部位において発生し、これは対立遺伝子配列間のバリエーションの部位である。ＳＮＰが観察される代表的な頻度は、１０００塩基対毎に約１つである（Li and Sadler, Genetics, 129:513-523, 1991; Wang et al., Science, 280:1077-1082, 1998; Harding et al., Am. J. Human Genet., 60:772-789, 1997; Taillon-Miller et al., Genome Res., 8:748-754, 1998）。
【００３８】
代表的には、異なるゲノムの間で、または異なる個体の間で、多型部位は２つの異なるヌクレオチドにより占有される。ＳＮＰは、ゲノム内の規定の部位において発生し、遺伝子のマッピング、集団の構造の定義づけ、および機能的研究の実施のために用いることができる。ＳＮＰは、マーカーとして有用である。なぜならば、多数の既知の遺伝子疾患が点変異および挿入／欠失により引き起こされるからである。核酸分子の高次構造は、一般的に、ゲル電気泳動により測定される電気泳動移動性、キャピラリー電気泳動および／またはエンドヌクレアーゼ消化に対する感受性などの当該分野において公知の方法を用いて検出可能であり、同定可能であり、および／または区別可能である。
【００３９】
「連鎖」は、遺伝子、対立遺伝子、遺伝子座または遺伝子マーカーが、同一染色体上のそれらの位置の結果として、一緒に遺伝する傾向を表わし、２つの遺伝子、対立遺伝子、遺伝子座または遺伝子マーカーの組み換えのパーセンテージとして測定することができる。互いに５０センチモルガン内に生じる遺伝子座は、連鎖する。幾つかの連鎖したマーカーは、同じ遺伝子または遺伝子クラスター内に生じる。
【００４０】
「連鎖不均衡」または「対立遺伝子相関（allelic association）」とは、特定の対立遺伝子または遺伝子マーカーの、近傍の染色体位置における特定の対立遺伝子または遺伝子マーカーとの、当該集団における任意の特定の対立遺伝子頻度について偶然により予測されるより高い頻度での優先的な相関を意味する。連鎖不均衡は、特定の対立遺伝子の組み合わせの天然の選択の結果として生じるか、または対立遺伝子が最近になって導入されたために連鎖する対立遺伝子との平衡状態に達していないことにより生じ得る。
【００４１】
「遺伝子バリアント」または「バリアント」とは、集団中の少なくとも１の個体における特定の遺伝子座に存在する特定の遺伝子バリアントであって参照配列と異なるものを意味する。
【００４２】
評価されるべき遺伝子材料は、個体からの任意の有核細胞から得ることができる。本発明による方法において用いられる核酸は、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｈｎＲＮＡおよび／またはｍＲＮＡであってよい。ゲノムＤＮＡのアッセイのために、実質的にあらゆる生物学的試料（純粋な赤血球細胞以外のもの）が好適である。例えば、便利な組織試料として、全血、精液、唾液、涙、尿、糞便材料、汗、皮膚および毛髪が挙げられる。ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡのアッセイのために、組織試料は、標的核酸が発現している器官から得なければならない。例えば、中枢神経系または脳からの細胞が、ＦＵＳ／ＴＬＳ遺伝子についてのｃＤＮＡを得るための好適なソースである。
【００４３】
適用可能な診断技術として、限定されないが、ミニシークエンシングを含むＤＮＡシークエンシング、プライマー伸長、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ、対立遺伝子特異的プライマーを用いるＰＣＲ、ドットブロット分析、flapプローブ切断アプローチ、制限酵素断片長多型（restriction fragment length polymorphism）、キネティックＰＣＲ、およびＰＣＲ−ＳＳＣＰ、蛍光in situハイブリダイゼーション、パルスフィールドゲル電気泳動分析、サザンブロット分析、一本鎖高次構造分析、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動、温度勾配ゲル電気泳動、変性ＨＰＬＣ、およびＲＮＡｓｅ保護アッセイが挙げられ、これらの全ては、当業者に現在公知であり、当該分野において慣用的に実施されている。
【００４４】
本明細書において記載される方法の多くは、標的試料からのＤＮＡの増幅を必要とする。これは、例えばＰＣＲにより達成することができる。一般的には、PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification (H. A. Erlich編、Freeman Press, NY, N.Y., 1992)；PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innisら編、Academic Press, San Diego, Calif., 1990)；Mattilaら、Nucleic Acids Res. 19, 4967 (1991); Eckertら、PCR Methods and Applications 1, 17 (1991)；PCR (McPhersonら編、IRL Press, Oxford)；および米国特許第4,683,202号を参照。
【００４５】
他の好適な増幅方法として、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Wu and Wallace, Genomics 4, 560 (1989)、Landegren et al., Science 241, 1077 (1988)を参照）、転写増幅（Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173 (1989)）、および自家持続配列複製（Guatelli et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87, 1874 (1990)）、および核酸ベース配列増幅（nucleic acid based sequence amplification：NASBA）が挙げられる。後の２つの増幅法は、等温転写に基づく等温反応を伴い、これは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）および二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の両方を増幅産物として、それぞれ約３０または１００対１の割合で生成する。
【００４６】
目的の多型部位を占有するヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡのサザン分析；制限酵素消化による直接変異分析；ＲＮＡのノーザン分析；変性高圧液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）；遺伝子の単離およびシークエンシング；対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドの、増幅遺伝子産物とのハイブリダイゼーション；一塩基伸長法（ＳＢＥ）などの多様な方法により同定することができる。好適な手順のサンプリングは、以下に議論される。
【００４７】
多型を分析するための対立遺伝子特異的プローブの設計および使用は、例えば、Saiki et al., Nature 324, 163-166 (1986)；Dattagupta, EP 235,726、Saiki, WO 89/11548において記載される。対立遺伝子特異的プローブは、２個体からのそれぞれのセグメントにおける異なる多型の形態の存在に起因して、１個体からの標的ＤＮＡのセグメントにハイブリダイズするが、別の個体からの対応するセグメントにはハイブリダイズしないように、設計することができる。ハイブリダイゼーション条件は、対立遺伝子間のハイブリダイゼーション強度において有意な差異が存在するように、および好ましくはプローブが対立遺伝子の一方にのみハイブリダイズする本質的にバイナリーな応答が存在するように、十分にストリンジェントであるべきである。ハイブリダイゼーションは、通常、ストリンジェントな条件下において、例えば、１Ｍ以下の塩濃度および少なくとも２５℃の温度で行われる。例えば、５×ＳＳＰＥ（７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）および２５〜５０℃の温度の条件、または相当する条件が、対立遺伝子特異的プローブのハイブリダイゼーションのために好適である。相当する条件は、分野において公知であるように、標的ヌクレオチド配列と用いられるプライマーまたはプローブとの間に同程度の同一性または類似性を維持しつつ、例として示されるパラメーターの１または２以上を変化させることにより決定することができる。
【００４８】
いくつかのプローブは、多型部位がプローブの中心の位置（例えば、１５マーにおいては７の位置；１６マーにおいては８または９のいずれかの位置）とアラインメントするように、標的ＤＮＡのセグメントにハイブリダイズするように設計される。このプローブの設計は、異なる対立遺伝子形態の間のハイブリダイゼーションの良好な区別を達成する。
【００４９】
対立遺伝子特異的プローブは、しばしばペアにおいて用いられ、ペアのうちの１つのメンバーは標的配列の参照形態に対して完全な一致を示し、他方のメンバーはバリアント形態に対して完全な一致を示す。したがって、同じ標的配列中の複数の多型の同時分析のために、いくつかのプローブのペアを同じ支持体上に固定してもよい。
【００５０】
多型はまた、核酸アレイ（例えばマイクロアレイ）に対するハイブリダイゼーションにより同定することができ、そのいくつかの例は、WO 95/11995において記載される。WO 95/11995はまた、予め特徴づけられた多型のバリアント形態の検出のために最適化されたサブアレイを記載する。かかるサブアレイは、第１の参照配列の対立遺伝子のバリアントである第２の参照配列に対して相補的であるように設計されたプローブを含む。プローブの第２群は、当該プローブが第２の参照配列に対する相補性を示すこと以外は同じ原理により設計される。第２群（またはさらなる群）の包含は、プローブの長さに相当する短い距離のうちに複数の変異（例えば９〜２１塩基中に２または３以上の変異）が生じることが予測される第１の参照配列の短い部分配列（subsequence）を分析するために、特に有用であり得る。
【００５１】
対立遺伝子特異的プライマーは、標的ＤＮＡ上の多型と重なる部位にハイブリダイズし、プライマーが完全な相補性を示す対立遺伝子の形態の増幅のみをプライミングする。Gibbs, Nucleic Acid Res. 17, 2427-2448 (1989)を参照。このプライマーは、離れた部位にハイブリダイズする第２のプライマーと組み合わせて用いられる。増幅は、２つのプライマーから進行し、特定の対立遺伝子の形態が存在することを示す検出可能な産物を生じる。対照は、通常、一方が多型部位において一塩基のミスマッチを示し、他方が離れた部位に対して完全な相補性を示す、第２のプライマーのペアを用いて行われる。一塩基のミスマッチは、増幅を妨げ、検出可能な産物は形成されない。この方法は、ミスマッチが、多型とアラインメントするオリゴヌクレオチドの最も３’寄りの位置において含まれる場合に最も良好に機能する。なぜならば、この位置が、プライマーからの伸長に対して最も不安定であるからである（例えばWO 93/22456を参照）。
【００５２】
本発明の多型の配列の直接分析は、ジデオキシ鎖停止法（dideoxy chain termination method）またはマクサム・ギルバート法のいずれかを用いて達成してもよい（Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual（第２版、CSHP、New York、1989）；Zyskindら、Recombinant DNA Laboratory Manual（Acad. Press、1988）を参照）。
【００５３】
ポリメラーゼ連鎖反応を用いて生成された増幅産物は、変性剤勾配ゲル電気泳動の使用により分析することができる。異なる対立遺伝子は、溶液中のＤＮＡの異なる配列依存性融解特性および電気泳動の移動性に基づいて同定することができる。Erlich編、PCR Technology, Principles and Applications for DNA Amplification（W. H. Freeman and Co, New York, 1992）、第７章。
【００５４】
標的配列の対立遺伝子は、Orita et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 86, 2766-2770 (1989)において記載されるような、一本鎖ＰＣＲ産物の電気泳動の移動性における変化により塩基の差異を同定する一本鎖高次構造多型分析を用いて区別することができる。増幅されたＰＣＲ産物は、上記のとおりに生成し、加熱するか、または他の方法により変性させて、一本鎖増幅産物を形成させることができる。一本鎖核酸を、リフォールディングさせるか、または、塩基配列に部分的に依存性である２次構造を形成させてもよい。一本鎖増幅産物の異なる電気泳動移動度は、標的配列の対立遺伝子間の塩基配列の差異に関係する。
【００５５】
多型を同定および分析するための代替的方法は、追加された塩基の標識とプライマーの標識との間の蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）と共役した蛍光標識プライマーの一塩基伸長（ＳＢＥ）に基づく。代表的には、Chenら（本明細書において参考として組み込まれるPNAS 94:10756-61 (1997)）により記載されるもののようなこの方法は、５’末端において５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）で標識された遺伝子座特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いる。この標識プライマーは、その３’末端が目的の多型部位のすぐ隣となるように設計される。標識プライマーは、遺伝子座にハイブリダイズし、該標識プライマーの一塩基伸長は、蛍光標識されたジデオキシリボヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）を用いて、デオキシリボヌクレオチドが存在しないことを除いてはダイターミネーターシークエンシングの様式において行われる。標識プライマーの波長における励起に対する応答における追加されたｄｄＮＴＰの蛍光の増大は、追加されたヌクレオチドのアイデンティティーを推測するために用いられる。
【００５６】
多型は、ＦＵＳ／ＴＬＳ遺伝子中の２または３以上の多型の群のうちの一つ、または、かかる多型との連鎖不均衡にあるものであって、ＡＬＳまたは他の関連する運動ニューロン疾患の存在、不在または重篤度の一因となるハプロタイプを形成するものであってもよい。ＦＵＳ／ＴＬＳ遺伝子中の他の多型、またはかかる多型との連鎖不均衡にある他の多型の評価を行い、これらの多型の患者の表現型に対する別々のおよび組み合わせた効果を評価することができる。
【００５７】
特定の表現型と、特定の対立遺伝子の存在または不在との間の相関分析は、該表現型の存在または不在について既に試験されている個体の集団について行われる。相関分析は、当該分野において公知であるように、および本明細書において記載されるように、標準的な統計学的方法により行うことができ、多型の形態と表現型の特徴との間の統計学的に有意な相関を記録する。
【００５８】
さらに、目的の形質と関連する遺伝子座と、該形質とは関連しないが該形質の原因である遺伝子座と物理的近位にありそれと同時分離する多型マーカーとの間の物理的連鎖を同定することが可能である場合がある。かかる分析は、ある表現型の形質と関連する遺伝子座を染色体位置にマッピングし、およびそれにより該形質の原因である遺伝子をクローニングするために有用である。Lander et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 83, 7353-7357 (1986); Lander et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84, 2363-2367 (1987); Donis-Keller et al., Cell 51, 319-337 (1987); Lander et al., Genetics 121, 185-199 (1989)を参照。連鎖により局在化された遺伝子を、定方向クローニングとして知られているプロセスによりクローニングすることができる。Wainwright, Med. J. Australia 159, 170-174 (1993); Collins, Nature Genetics 1, 3-6 (1992)を参照。
【００５９】
本発明の方法によりＡＬＳまたは他の関連する運動ニューロン疾患を有するかまたは発症する可能性が正常より高いと診断された個体を、また、ＦＵＳ／ＴＬＳの機能または活性を調節する化合物により処置してもよい。モジュレーター処置は、単独で、またはＡＬＳおよび関連する運動ニューロン疾患のための他の公知の処置様式と組み合わせて提供することができる。１つの可能なモジュレーターは、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンス分子などの、変異型ＦＵＳ／ＴＬＳ（すなわち、本発明により提供される変異の１または２以上を含むＦＵＳ／ＴＬＳ）の機能を阻害する、または変異型ＦＵＳ／ＴＬＳ（すなわち、本発明により提供される変異の１または２以上を含むＦＵＳ／ＴＬＳ）の発現を減少させる阻害分子である。１つの特定の態様において、阻害剤は、変異型ＦＵＳ／ＴＬＳ核酸分子に選択的に結合するか、コードされた変異型ＦＵＳ／ＴＬＳ遺伝子産物の細胞内での発現を減少させる、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ分子である。
【００６０】
本明細書において用いられる場合、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または「アンチセンス」は、オリゴリボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチド、修飾オリゴリボヌクレオチドまたは修飾オリゴデオキシリボヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドであって、生理学的条件下において特定の遺伝子を含むＤＮＡまたはその遺伝子のｍＲＮＡ転写物にハイブリダイズし、それによりその遺伝子の転写および／またはそのｍＲＮＡの翻訳を阻害するものを記載する。アンチセンス分子は、標的遺伝子または転写物とのハイブリダイゼーションにより標的遺伝子の転写または翻訳を妨害するように設計される。当業者は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの正確な長さおよびその標的との相補性の程度が、標的の配列およびその配列を構成する特定の塩基を含む、選択される具体的な標的に依存することを理解するであろう。
【００６１】
本明細書において用いられる場合、「ｉＲＮＡ分子」とは、相補的なセンス鎖とアンチセンス鎖とからなる二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）である（Tuschl, T. et al., 1999, Genes & Dev., 13:3191-3197; Elbashir, S.M. et al., 2001, EMBO J., 20:6877-6888）。一態様において、アンチセンス鎖の３’末端の最後のヌクレオチドは、任意のヌクレオチドであってよく、標的遺伝子の領域に対して相補的であることを必要とされない。ｓｉＲＮＡ分子は、一部の態様において、長さ１９〜２３ヌクレオチドであってよい。他の態様において、ｓｉＲＮＡは、より長いが、長さ１９〜２３ヌクレオチドのヘアピン構造を形成する。なお別の態様において、ｓｉＲＮＡは、細胞において、１９〜２３ヌクレオチドより長い二本鎖ＲＮＡ分子の消化により形成される。ｓｉＲＮＡ分子は、好ましくは一方または両方の末端においてオーバーハング、好ましくは３’オーバーハング、より好ましくはセンス鎖において２ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。別の好ましい態様において、２ヌクレオチドのオーバーハングは、チミジン−チミジン（ＴＴ）である。ｓｉＲＮＡ分子は、目的の変異型ＦＵＳ／ＴＬＳ遺伝子の少なくとも一部に対応する。好ましい態様において、ｓｉＲＮＡ分子の第１のヌクレオチドはプリンである。遺伝子発現のＲＮＡｉ阻害のために有用なｓｉＲＮＡおよび他の二本鎖ＲＮＡ分子の多くのバリエーションは、当業者に公知であろう。
【００６２】
ｓｉＲＮＡ分子は、プラスミドベースのものであってよい。好ましい方法において、変異型ＦＵＳ／ＴＬＳ遺伝子のポリペプチドをコードする配列を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの周知の技術を用いて増幅する。ポリペプチドをコードする配列全体の使用は必要ではない。当該分野において周知であるように、ポリペプチドをコードする配列の一部が、ＲＮＡ干渉のために十分である。例えば、当業者に周知の慣用的な技術を用いて、ＰＣＲフラグメントをベクターに挿入することができる。インサートは、ハイブリダイズしてｓｉＲＮＡ分子を形成する２つの相補的なＲＮＡ分子が産生されるように、反対の方向を指向する２つのプロモーター間に配置することができる。あるいは、ｓｉＲＮＡ分子は、自己ハイブリダイズしてｓｉＲＮＡ二本鎖を形成する単一のＲＮＡ分子として合成し、これは、好ましくは、ハイブリダイズする配列との間に「ループ」を形成するハイブリダイズしない配列を有する。好ましくは、ヌクレオチドをコードする配列は、変異型ＦＵＳ／ＴＬＳ遺伝子のコード配列の一部である。ｓｉＲＮＡは、細胞内に導入されたベクターから発現させてもよい。
【００６３】
変異型ＦＵＳ／ＴＬＳ遺伝子配列を含むベクター、好ましくは哺乳動物細胞において活性なプロモーターを含むベクターが、ｓｉＲＮＡの産生のために提供される。ベクターの非限定的な例は、pSUPER RNAiシリーズのベクターである（Brummelkamp, T.R. et al., 2002, Science, 296:550-553；OligoEngine, Inc., Seattle, WAから市販で入手可能）。一態様において、部分的に自己相補的なヌクレオチドコード配列を、制限酵素切断部位を用いて哺乳動物ベクターに挿入し、ステムループ構造を作出することができる。好ましい態様において、哺乳動物ベクターは、ポリメラーゼ−ＩＩＩ  Ｈ１−ＲＮＡ遺伝子プロモーターを含む。ポリメラーゼ−ＩＩＩ  Ｈ１−ＲＮＡプロモーターは、ポリアデノシンテイルを欠失するＲＮＡ転写物を産生し、明確な転写の開始および５個のチミジン（Ｔ５）からなる終止シグナルを一列に有する。終止部位における転写物の切断は、２つ目のウリジンの後で起こり、２つの３’でオーバーハングするＴまたはＵヌクレオチドを含む合成ｓｉＲＮＡの末端に類似する転写物を生じる。ｓｉＲＮＡベクターにおいて有用な他のプロモーターは、当業者に周知であろう。
【００６４】
哺乳動物細胞におけるｓｉＲＮＡの発現のためのベクターシステムとして、上記のpSUPER RNAiシステムが挙げられる。他の例として、限定されないが、pSUPER.neo、pSUPER.neo+gfpおよびpSUPER.puro（OligoEngine、Inc.）；BLOCK-iT T7-TOPOリンカー、pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、pENTR/U6、pLenti6-GW/U6-laminshrnaおよびpLenti6/BLOCK-iT-DEST（Invitrogen）が挙げられる。これらのベクターおよび他のものは、市販されている。
【００６５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ分子が、生理学的条件下において標的と選択的に結合するように、すなわち、標的細胞中で生理学的条件下において、実質的に、任意の他の配列よりも標的配列にハイブリダイズするように、構築され配列されることが好ましい。当業者は、本発明による使用ための多数の好適なアンチセンスまたはｓｉＲＮＡ分子のうちの任意のものを、容易に選択して合成することができる。阻害のために十分に選択的かつ強力であるために、かかるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５の、連続した、標的に対して相補的な塩基を含むべきであるが、特定の場合においては、７塩基の長さしかない修飾オリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして首尾よく用いられている（Wagner et al., Nature Biotechnol. 14:840 844, 1996）。最も好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２０〜３０塩基の相補配列を含む。ｓｉＲＮＡ分子については、分子が２１〜２３ヌクレオチドの長さであって３’に２ヌクレオチドのオーバーハングを有することが好ましいが、より短いおよびより長い、ならびにオーバーハングを有さない分子もまた、本発明により有用であると企図される。
【００６６】
アンチセンスは、好ましくは、ｍＲＮＡの二次構造が予測されない部位（例えばSainio et al., Cell Mol. Neurobiol. 14(5):439-457, 1994を参照）、およびポリペプチドが結合することが予測されない部位に対してターゲティングされる。好ましいｓｉＲＮＡ配列を選択するための他の方法は、当業者に公知である（例えばWhitehead Institute for Biomedical Research （2003）の「siRNA Selection Program」）。
【００６７】
１セットの態様において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ分子は、「天然の」デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたは任意のこれらの組み合わせからなってよい。すなわち、ネイティブなヌクレオチドの５’末端および別のネイティブなヌクレオチドの３’末端が、天然の系において、ホスホジエステルヌクレオシド間結合を介して、共有結合していてもよい。これらのオリゴヌクレオチドは、当該分野において認められたマニュアルでまたは自動合成機により行われる方法により、調製することができる。これらはまた、ベクターにより組み換え的に生成されてもよく、これはin situを含む。
【００６８】
しかし、好ましい態様において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ分子はまた、「修飾された」オリゴヌクレオチドを含んでもよい。すなわち、オリゴヌクレオチドは、それらがそれらの標的とハイブリダイズすることを妨げないが、それらの安定性またはターゲティングを増強するか、またはそれらの治療有効性を増大する、多数の方法において修飾されていてもよい。
【００６９】
用語「修飾オリゴヌクレオチド」とは、本明細書において記載される場合、（１）そのヌクレオチドの少なくとも２つが、合成のヌクレオシド間結合（すなわち、一方のヌクレオチドの５’末端と他方のヌクレオチドの３’末端の間でのホスホジエステル結合以外の結合）により共有結合している、および／または（２）通常は核酸と関連しない化学基がオリゴヌクレオチドに共有結合している、オリゴヌクレオチドを記載する。好ましい合成ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、ホスホロジチオエート、リン酸エステル、アルキルホスホノチオエート、ホスホロアミデート、カルバメート、カーボネート、リン酸トリエステル、アセトアミデート、カルボキシメチルエステルおよびペプチドである。
【００７０】
用語「修飾オリゴヌクレオチド」はまた、共有結合により修飾された塩基および／または糖を有するオリゴヌクレオチドを包含する。例えば、修飾オリゴヌクレオチドとして、３’位においてはヒドロキシル基以外、５’位においてはリン酸基以外の、低分子量の有機基に共有結合した骨格糖を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。したがって、修飾オリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−アルキル化リボース基を含んでもよい。さらに、修飾オリゴヌクレオチドは、リボースの替わりに、アラビノースなどの糖を含んでもよい。本発明は、したがって、変異型ＦＵＳ／ＴＬＳ遺伝子に相補的であって生理学的条件下においてこれにハイブリダイズする修飾アンチセンス分子を、薬学的に受容可能なキャリアと共に含む、医薬製剤を企図する。
【００７１】
別の可能なモジュレーターは、ＦＵＳ／ＴＬＳの活性を増大させる機能的なＦＵＳ／ＴＬＳタンパク質を発現する発現ベクターである。好適な発現ベクター、ならびにタンパク質（この場合はＦＵＳ／ＴＬＳ）を発現するための組み換え発現ベクターを構築し、生成し、投与するための技術は、当該分野において周知である。
【００７２】
本発明はまた、本発明によるＡＬＳおよび他の関連する運動ニューロン疾患のためのマーカーでありこれの指標であるＦＵＳ／ＴＬＳのＳＮＰを検出するための少なくとも１つのプローブを含む、診断用キットおよび/または研究用キットに関する。キットは、本発明の方法を実施するための、酵素、緩衝化剤および／または色素などの他の化合物を含んでもよい。キットはまた、ＳＮＰ分析を実施するための説明書および／または本明細書において記載されるような統計学的分析のためのソフトウェアを含んでもよい。
【００７３】
好ましくは、本発明はさらに、本明細書において記載されるような少なくとも１つの対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを含むキットを提供する。しばしば、キットは、異なる形態の多型にハイブリダイズする対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドの１または２以上のペアを含む。一部のキットにおいて、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、基質に固定されて提供される。例えば、同じ基質が、本明細書において開示される多型の任意の１または２以上を検出するための対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを含んでもよい。キットの随意のさらなる成分として、例えば、制限酵素、逆転写酵素またはポリメラーゼ、基質ヌクレオシド三リン酸（substrate nucleoside triphosphate）、標識のために用いられる手段、および逆転写、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーション反応のための好適な緩衝化剤が挙げられる。通常、キットはまた、方法を実施するための説明書を含む。
【００７４】
本発明はさらに、変異型ＦＵＳ／ＴＬＳの活性を低下させる剤または分子のための薬理作用剤またはリード化合物を同定する効率的な方法を提供する。一般に、スクリーニング方法は、変異型ＦＵＳ／ＴＬＳの活性の量を調節する化合物についてアッセイすることを含む。当業者に理解されるように、スクリーニング方法は、当該分野において周知の方法を用いて、活性の量を直接的に測定してもよい。さらに、変異型ＦＵＳ／ＴＬＳの活性の二次効果を測定するスクリーニング方法を利用してもよい。
【００７５】
標識in vitroタンパク質−タンパク質結合アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ、イムノアッセイ、２−ハイブリッドまたは３−ハイブリッドスクリーニングなどの細胞ベースのアッセイ、発現アッセイなどを含む、薬理作用剤のための多様なアッセイを、本発明のこの側面により用いることができる。アッセイ混合物は、候補の薬理作用剤を含む。代表的には、多様な濃度に対する異なる応答を得るために、複数のアッセイ混合物を、異なる剤の濃度で平行して実施する。代表的には、これらの濃度のうちの一つが、陰性対照として、すなわち、剤のゼロの濃度で、またはアッセイ検出の限界より低い濃度で、役立つ。
【００７６】
本発明により有用な候補の剤は、多数の化合物クラスを包含するが、代表的には、これらは有機化合物である。好ましくは、候補の薬理活性剤は、低分子有機化合物、すなわち、５０より大きいが約２５００未満、好ましくは約１０００未満、およびより好ましくは約５００未満の分子量を有するものである。候補の剤は、タンパク質および／または核酸分子との構造的相互作用に必要な、官能化学基を含み、代表的には少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基を含み、好ましくは官能化学基の少なくとも２つを含み、より好ましくは官能化学基の少なくとも３つを含む。候補の剤は、上で同定された官能基の１または２以上で置換された、環式炭素もしくは複素環式構造および／または芳香族もしくは芳香族多環式構造を含んでもよい。候補の剤はまた、ペプチド、サッカライド、脂肪酸、ステロール、イソプレノイド、プリン、ピリミジンなどの生体分子、上記の物の誘導体もしくは構造アナログ、またはこれらの組み合わせなどであってもよい。剤が核酸分子である場合、剤は、代表的にはＤＮＡまたはＲＮＡ分子であるが、本明細書において規定されるような修飾核酸分子もまた企図される。
【００７７】
本明細書において記載されるような細胞ベースのアッセイを、細胞試料および／または培養細胞を用いて行ってよいことが企図される。生検の細胞および組織、ならびに培養において増殖させた細胞株は、本発明の方法において有用である。
【００７８】
候補の剤は、合成または天然の化合物のライブラリーを含む多様なソースから得られる。例えば、多様な有機化合物および生体分子の無作為なおよび方向づけられた合成のために、無作為なオリゴヌクレオチドの発現、合成有機コンビナトリアルライブラリー、無作為なペプチドのファージディスプレイライブラリーを含む、多様な手段が利用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態における、天然の化合物のライブラリーが利用可能であるかまたは容易に生成される。さらに、天然または合成で生成されたライブラリーおよび化合物を、従来の化学的、物理学的および生化学的手段により、容易に修飾することができる。さらに、既知の生理活性剤を、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などの方向づけされたまたは無作為な化学修飾に供して、剤の構造アナログを生成してもよい。
【００７９】
多様な他の試薬もまた、混合物中に含めることができる。これらは、塩、緩衝化剤、中性タンパク質（例えばアルブミン）、界面活性剤などを含み、至適なタンパク質−タンパク質および／またはタンパク質−核酸結合を促進するために用いることができる。かかる試薬はまた、反応成分の非特異的またはバックグラウンドの相互作用を低減するものであってもよい。プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤などの、アッセイの効率を改善する他の試薬もまた用いることができる。
【００８０】
成分の添加の順番、インキュベーション温度、インキュベーションの時間およびアッセイの他のパラメーターは、容易に決定することができる。かかる実験は、単にアッセイパラメーターの至適化に関するものであり、アッセイの基本的な組成ではない。インキュベーション温度は、代表的には、４℃〜４０℃である。インキュベーション時間は、好ましくは、迅速なハイスループットスクリーニングを容易にするために最短化され、代表的には０．１〜１０時間である。
【００８１】
インキュベーションの後で、変異型ＦＵＳ／ＴＬＳの活性を、ユーザーに利用可能な任意の便利な方法により検出する。細胞フリーの結合型アッセイについては、結合成分を未結合成分と分離するために、分離の工程がしばしば用いられる。分離の工程は、多様な方法において達成することができる。簡便には、成分のうちの少なくとも１つを、未結合成分をそれから容易に分離することができる固体の基質上に固定する。固体の基質は、多様な材料から作ることができ、例えばマイクロタイタープレート、マイクロビーズ、ディップスティック、樹脂粒子などの多様な形状であってよい。基質は、好ましくはシグナル対ノイズ比を最大にするよう、主にバックグラウンド結合を最少化するように、ならびに分離の容易性およびコストのために、選択される。
【００８２】
分離は、例えば、ビーズまたはディップスティックを、リザーバから取り除き、マイクロタイタープレートのウェルなどのリザーバを空にするか希釈して、ビーズ、粒子、クロマトグラフィーのカラムまたはフィルターを洗浄溶液または溶媒でリンスすることにより、達成することができる。分離の工程は、好ましくは、複数回のリンスまたは洗浄を含む。例えば、固体の基質がマイクロタイタープレートである場合、ウェルを、代表的には塩、緩衝化剤、界面活性剤、非特異的タンパク質などの特異的結合に関与しないインキュベーション混合物の成分を含む洗浄溶液で、数回洗浄してもよい。固体の基質が磁性ビーズである場合、ビーズを、洗浄溶液で１回または２回以上洗浄し、磁石を用いて単離する。
【００８３】
検出は、以下の例において記載されるようなレポーター遺伝子の転写などの、２ハイブリッドまたは３ハイブリッドスクリーニングなどの細胞ベースのアッセイのための任意の簡便な方法において達成することができる。細胞フリーの結合アッセイについて、成分のうちの少なくとも１つは、通常、検出可能な標識を含むか、これに共役している。直接的検出（例えば、放射活性、発光、光学密度または電子密度、エネルギー転移など）または間接的検出（例えば、ＦＬＡＧまたはｍｙｃエピトープなどのエピトープタグ、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素タグ）を提供するものなどの、多様な標識を用いることができる。
【００８４】
標識を検出するために、標識および他のアッセイ成分の性質に依存して、多様な方法を用いることができる。例えば、固体の基質に結合した状態で、または固体の基質からのなんらかの分離に続いて、標識を検出してもよい。標識は、光学密度もしくは電子密度、放射活性放出、非放射性エネルギー転移などを介して直接的に検出しても、または抗体抱合体、ストレプトアビジン―ビオチン抱合体などにより間接的に検出してもよい。標識を検出するための多様な方法が、当該分野において周知である。
本発明は、以下の非限定的な例において、より詳細に説明される。
【００８５】
例
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、上位および下位運動ニューロンの致死性の変性障害である。ＡＬＳは、主に孤発性に発生するが、症例の１０％は家族性であり、分離は典型的には常染色体優性であるが、遺伝様式が不明な多くの小さい家族クラスターが観察される。しかし、ほとんどの家族性の症例は、未だ同定されていない遺伝子に関与する。本発明者らは、常染色体優性ＡＬＳと関連するＦＵＳ／ＴＬＳ遺伝子におけるいくつかの異なる変異、ならびに、希少な劣性の非致死性ＡＬＳバリアントと関連するユニークな変異を同定した。同族のタンパク質は広範に発現しており、核と細胞質との両方において見出される。ＦＵＳ／ＴＬＳは、幾つかの細胞プロセス、特にｍＲＮＡのスプライシングおよび輸送に関与している。ＦＵＳ／ＴＬＳの変異形態は、なおＲＮＡに結合するが、in vitroで細胞の細胞質において凝集塊に蓄積する。患者の脳および脊髄は、同様に、細胞質のＦＵＳ／ＴＬＳ貯留、ならびに核のユビキチン染色を示す。これらの結果は、ＡＬＳにおけるＲＮＡのプロセッシングおよび／または輸送の役割を示唆する。
【００８６】
材料および方法
ヘテロ接合性欠損マッピング。ＴＧＥＮゲノミクスコアファシリティー（TGEN genomics core facility）において、ＤＮＡ試料を増幅し、250k (Sty I) SNPマイクロアレイ（Affymetrix）にハイブリダイズさせた。遺伝子型データを、autoSNPaソフトウェアを用いて分析し、ＩＢＤ（identical by descent）モジュールを用いて、20-SNP-runのカットオフを用いて、３個体全てのＦ５７７患者においてホモ接合性な領域を選択し、グラフに可視化した。
【００８７】
ＰＣＲおよびシークエンシング。ヒト（患者、家族のメンバー、および対照）のＦＵＳ／ＴＬＳ配列を、Ｍ１３フォワードおよびリバーステイルドプライマー、エクソヌクレアーゼＩ／エビアルカリホスファターゼ処置を用いたＰＣＲ増幅、および直接シークエンシングにより得た。ＤＮＡ試料を、リンパ芽球様細胞株または全血から抽出し、後者の一部を、Genomiphiキット（GE Healthcare Lifesciences）により増幅した。候補遺伝子エクソンのスクリーニングのために、UCSCゲノムブラウザを用いて、コード配列および６０ｂｐのフランキング配列を標的として、プライマーを設計した。ＰＣＲ増幅に失敗するプライマーペアを、Whitehead Institute Primer3ソフトウェアを用いて再設計した。ＦＵＳ／ＴＬＳ遺伝子のシークエンシングのためのプライマー配列は以下の通りであった：
【００８８】
クローニング。全長ヒトＦＵＳ／ＴＬＳのｃＤＮＡ、MGC-8537（InVitrogen）を得（pOTB7中）、インサートを、エントリーベクターとしてのpDONR221ならびにBPおよびLR Clonaseキット（InVitrogen）を用いて、attサイト組み換え（att site recombination）により、pcDNA3.2V5（Invitrogen）中にクローニングした。Ｆ５５およびＦ５７７患者に対応する変異を、QuikChange II Site-Directed Mutagenesisキット（Stratagene）を用いて導入した。変異を、シークエンシングにより確認した。
【００８９】
外来性pOTB7配列およびｃＤＮＡ  ５’ＵＴＲ配列を、attBサイトテイルドプライマーを用いて、上記のとおりpDONR221を介したpcDEST53およびpcDEST17（InVitrogen）中へ、増幅することにより取り除いた（Ｎ末端タグの後の余分なＮ末端アミノ酸の付加を回避するため）。
スクリーニングにより変異を確認した。さらに、pcDEST53プラスミド配列をその全体についてシークエンシングした。
【００９０】
細胞培養。ヒト神経芽細胞腫ＳＫＮＡＳ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および４ｍＭのＬ−グルタミンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。マウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞を、１０％ＦＢＳ、４ｍＭのＬ−グルタミンおよび１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含む最小必須培地（ＭＥＭ）中で培養した。細胞を、加湿された１０％ＣＯ２チャンバーにおいて３７℃に保持した。全ての組織培養試薬は、Gibco（Invitrogen）から購入した。
【００９１】
ＧＦＰ−ＦＵＳプラスミドによる哺乳動物細胞のトランスフェクション。蛍光顕微鏡法のために、７．５×１０４のＳＫＮＡＳ細胞／ウェルまたは１．０×１０５のＮ２Ａ細胞／ウェルを、２４ウェルディッシュ中に播種し、ポリＬリジンコートされたガラスカバースリップ（BD Biosciences）に約１４時間接着させた。培地を、次いで、製造者（Invitrogen）の説明書に従って、８００ｎｇのプラスミドＤＮＡおよび１．２５μＬのリポフェクタミン２０００試薬を含むＯＰＴＩ−ＭＥＭで交換した。５時間後、培地をそれぞれの血清含有培地で交換した。トランスフェクションを、全２４時間にわたり進行させた。カバースリップ上で増殖した細胞を、次いで、リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）でよくリンスし、３％パラホルムアルデヒドで１５分間固定し、ＤＡＰＩを含むVectashieldハードマウント（Vectorlabs）を用いてスライドガラスに接着させた。細胞内分画実験のためのＳＫＮＡＳ細胞のトランスフェクションを、２．２×１０６個の細胞を１６μｇのプラスミドＤＮＡおよび２５μＬのリポフェクタミン２０００試薬と共に１０ｃｍディッシュ中に播種したこと以外は、上記のとおり行った。
【００９２】
トランスフェクトした細胞における細胞質対核のＧＦＰ−ＦＵＳ／ＴＬＳの定量。ＧＦＰ−ＦＵＳ（ＷＴ）、ＧＦＰ−ＦＵＳ（５５）またはＧＦＰ−ＦＵＳ（５７７）のいずれかによりトランスフェクトしたＳＫＮＡＳおよびＮ２Ａ細胞を、Nikon TE300倒立蛍光顕微鏡で１００×の倍率で可視化した。核コンパートメント境界（ＤＡＰＩ染色により同定される）の外側の緑色蛍光の検出を、細胞質ＧＦＰ−ＦＵＳ発現を示すものとして決定した。少なくとも２回の独立したトランスフェクション実験から調製された３枚のカバースリップ上の最少でも１５０個の細胞を、核にのみ局在するＧＦＰ−ＦＵＳ発現を有するか、または細胞質ＧＦＰ−ＦＵＳ発現を有するものとして分類した（後者の分類は、核および細胞質の両方のＧＦＰ−ＦＵＳ発現を有する細胞を含む）。結果を、計数された全細胞の平均パーセンテージとして示し、Holm試験統計学により分析した。
【００９３】
ＧＦＰ−ＦＵＳ（ＷＴ）、ＧＦＰ−ＦＵＳ（５５）またはＧＦＰ−ＦＵＳ（５７７）のいずれかによりトランスフェクトしたＳＫＮＡＳ細胞を、Qproteome細胞コンパートメントキット（Qiagen）を用いて、製造者の説明書に従って、細胞内分画に供した。不溶性画分を含む各画分からの細胞ペレットを、２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および１％のトリトンＸ−１００を含有するＰＢＳ中に再懸濁し、全ての画分からの全タンパク質濃度を、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ（Pierce）により定量した。細胞質および核の画分からの３μｇの全タンパク質と、１．２５μｇの不溶性画分からの全タンパク質とを、ウェスタンブロット分析に供した。ＧＡＰＤＨ（１：２０００；Abcam）およびラミンＡ／Ｃ（１：３０００；BD Transduction laboratories）は、ローディング標準、ならびにそれぞれ細胞質および核コンパートメントのマーカーとして、用いられた。ＧＦＰ−ＦＵＳタンパク質は、living colors A.v.モノクローナル（抗ＧＦＰ）抗体ＪＬ−８（１：４０００；Clontech）により検出した。細胞質／核および不溶性／核のＦＵＳの比を、３回のウェスタンブロットの密度測定から定量し、Holm試験統計学により分析した。
【００９４】
免疫組織化学。１５マイクロメートルの切片を、前頭皮質から採取し、４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定し、ＰＢＳで３回５分間ずつ洗浄した。切片を、次いで、１時間室温でブロッキングし（２０％正常ヤギ血清／０．１％トリトンＸ／ＰＢＳ）、次いで、一次抗体と共に、一晩４℃でインキュベートした：ウサギポリクローナル抗ユビキチン（１：６００、Abcam）およびマウス抗ＦＵＳ／ＴＬＳ（Santa Cruz Labs、１：５０）またはマウスモノクローナル抗ＮｅｕＮ（１：１０００、Chemicon）およびウサギ抗Ｆｕｓ（Bethyl Labs、１：５００）。切片をＰＢＳで３回５分間ずつ洗浄し、次いで、二次抗体と共に３時間室温でインキュベートした：ヤギ抗ウサギフルオレセインイソチオシアネート（Jackson Immuno、１：２００）およびヤギ抗マウスシアニン３（Jackson Immuno、１：３００）。切片を上記のとおり洗浄し、次いで、７０％エタノール中で５分間インキュベートし、その後、自家蛍光エリミネーター試薬（Chemicon）と共に４分間インキュベートし、７０％エタノール中で１分間洗浄した。切片をカウンター染色し、ＤＡＰＩを含有するVectashieldハードマウントメディウム（Vector Labs）でマウントした。
【００９５】
結果
染色体１６への連鎖を有する常染色体優性の様式においてＡＬＳを分離する２つの大きな家系が、先に報告されている。これらの系統におけるハプロタイプ分析は、この遺伝子座についての４０Ｍｂの候補領域を示した。２つのさらなる家系は、この遺伝子座のテロメアのサブセットを含むより小さな領域への連鎖を示し、本発明者らが、この領域に努力の焦点を当てるよう導いた。徹底的なエクソンのシークエンシングによっても、対照においてもまた観察されない変異は明らかとならなかった。その後、さらなる個体の確認と、これらの２つの家系についてのデータの再分析により、染色体１６への連鎖が除外された。
【００９６】
最近になって、本発明者らは、偽常染色体様式において非定型ＡＬＳの表現型を分離する家系を観察した（図１Ａ）。該表現型は、上肢近位部発生型の脱力と、その後の下肢への拡散からなるが、４人の患者全員において延髄性領域を残す。２人の示した発端者において、上位運動ニューロンの兆候は存在したが、最少であった。筋萎縮症は、全ての症例において存在したが、全不全麻痺に近いと予測されていたよりもはるかに軽かった。これらの発端者の母親は、延髄性の症状を発症することなく（四肢麻痺であったが）、発症から１４年間生存し、心筋梗塞で死亡したと報告されている。発端者の母方の祖父母は、いとこ同士であり、さらに、当該家系はおよそ６０００人の住人の小さな島に起源を有し、発端者の父親および母親もまた親戚であった可能性がある。このことは、遺伝の劣性の様式を可能にする。250k SNPチップおよびautoSNPaソフトウェアを用いたヘテロ接合欠損マッピングにより、先に報告された遺伝子座のサブセットを構成する、染色体１６の動原体周囲領域における主要ＬＯＨクラスター、ならびに他の場所にあるいくつかのより小さい領域を同定した。
【００９７】
最大の連続したＬＯＨクラスターは、約４Ｍｂを含み、３１５のコーディングエクソンを含む５３個の遺伝子を含む。これらのエクソンの約７５％のゲノムのシークエンシングを行い、ニューロンの機能の推定される重要性に従って、優先順位をつけた。両方の系統からの患者において、ＦＵＳ／ＴＬＳ（融合タンパク質／脂肪肉腫において転座している）遺伝子のエクソン１５において、配列バリアントを発見した。家系５５において、利用可能な罹患個体５人全てが、Ｒ５２１Ｇ置換を引き起こすＣ１５６１Ｇ変異についてヘテロ接合性であることが示された（図１Ｂ）が、家系５７７からの利用可能な患者３人全てが、Ｈ５１７Ｑ置換をもたらすＣ１５５１Ｇ変異についてホモ接合性であることが示された（図１Ａ）。１２０のさらなる家族性ＡＬＳ系統からのインデックス症例の、１５個のエクソン全てについてのスクリーニングから、エクソン１５における７個の他のミスセンス変異が明らかとなり、２９３の孤発性ＡＬＳ症例の、エクソン１５についてのスクリーニングは、いかなる変異も明らかにしなかった。１つのサイレントコーディング変異、３つのイントロンのバリアント、および１つの３’ＵＴＲバリアントを含む、重要性が不明なさらなるバリアントが観察された。エクソン１５のバリアントのいずれも、シークエンシングした７９５の対照個体においては観察されなかった。この領域における他の遺伝子における全ての配列バリアントは、オンラインＳＮＰデータベースにおいて先に報告されているか、または複数の対照試料において検出された。
【００９８】
家系５５（Ｆ５５）からの単一の患者からの生検組織が利用可能であった。慣用的な病態試験の知見は、脊髄前角における複数のレベルでの、および舌下核における、運動ニューロンの欠損、前皮質脊髄路におけるミエリンの蒼白化、ならびに運動皮質におけるベッツ細胞を置き換えるマクロファージ凝集塊を含んだ。その後、凍結脳組織を免疫組織化学により試験した。対照および患者の両方の組織が、明確な皮質性のニューロンのＦＵＳ／ＴＬＳ染色を示すが、一方、対照組織においては、主として核の染色が観察され、Ｆ５５患者組織（Ｒ５２１Ｇ変異についてヘテロ接合性）は、顕著な細胞質の染色もまた示した（図２Ａ）。抗ユビキチン抗体によるさらなる染色により、患者の組織において散在性の核染色が明らかとなったが、対照の組織においては見られなかった（図２Ｂ）。患者のニューロンにおいて、対照のニューロンと比較して増大したリポフスチン染色が存在し、これは、ＡＬＳニューロンにおいて細胞デブリの蓄積が増大していることと一致した。
【００９９】
ＦＵＳ／ＴＬＳ野生型、Ｒ５２１ＧおよびＨ５１７ＱのｃＤＮＡ発現コンストラクトを、pcDNA3.2（Invitrogen−タグ化されていない）、pcDEST53（Invitrogen−Ｎ末端ｇｆｐタグ化）およびpcDEST17（Invitrogen−Ｎ末端Ｈｉｓタグ化）において調製した。ＲＮＡ結合実験を、E. Coliにおいて産生されたＨｉｓタグ化された精製タンパク質、およびＧＧＵＧモチーフを含みＦＵＳ／ＴＬＳに結合することが知られているＲＮＡの２４マーのオリゴを用いて行った。ＦＵＳ／ＴＬＳ（劣性Ｈ５１７Ｑおよび優性Ｒ５２１Ｃ）の変異形態はいずれも、ゲルシフトアッセイにおいて、野生型タンパク質と同様の様式において、ＲＮＡオリゴマーに結合した。ＳＫ−ＮＡＳ神経細胞およびＮ２Ａ神経細胞のｇｆｐタグ化ＦＵＳ／ＴＬＳコンストラクトによるトランスフェクションにより、２４時間以内の変異体ＦＵＳ／ＴＬＳタンパク質の細胞質蓄積を明らかにし、これは、５２１ＧについてＨ５１７ＱよりもＲ強かった（およびこれは野生型においては存在しなかった）。このことはまた、抗ＦＵＳ／ＴＬＳ抗体および蛍光二次抗体により可視化された（データは示さず）タグ化されていないタンパク質についても示された。
【０１００】
ＦＵＳ／ＴＬＳの細胞内局在を、野生型、Ｒ５２１ＧまたはＨ５１７ＱのＦＵＳ／ＴＬＳ−ＧＦＰ融合タンパク質をトランスフェクトしたＳＫＮＡＳ細胞のコンパートメント分画により試験した。画分のウェスタンブロットと、その後の抗ＧＦＰ抗体による免疫染色により、実質的により高い細胞質：核のＦＵＳ／ＴＬＳシグナルが、両方の変異について示された（図３Ｂ）。さらに、Ｒ５２１Ｇ変異体について、対照より高い比の不溶性対核のＦＵＳ／ＴＬＳタンパク質が示され、一方、その比は、Ｈ５１７Ｑ変異体ＦＵＳ／ＴＬＳタンパク質については、わずかのみ増大していた。
【０１０１】
考察
ＦＵＳ／ＴＬＳは、脂肪肉腫における体細胞の染色体転座により作られる融合タンパク質のＮ末端の半分に寄与するものとして、もともとは記載された。その後、それがＤＮＡの修復、ＲＮＡのプロセッシングおよび輸送において役割を有することが示された。ＦＵＳ／ＴＬＳノックアウトマウスは、系統のバックグラウンドに依存して、周産期死亡またはオスの不妊のいずれかおよび放射線感受性を伴う多様な表現型を示す。ニューロンの機能不全はまだ記載されていないが、マウスのニューロン機能の長期的研究はなんら公開されていない。最近の報告は、非コードＲＮＡがＦＵＳ／ＴＬＳタンパク質に結合し、それがＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＢＰ）に結合して後者のヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性を阻害し、転写の阻害をもたらすことを可能にすることを示す。ＧＧＵＧ含有ｎｃＲＮＡによるこのＦＵＳ／ＴＬＳ結合の活性化は、ＦＵＳ／ＴＬＳのＮ末端領域とＣ末端領域との結合を防止することにより作用すると考えられる。優性遺伝性ＡＬＳ患者において見られるもののようなＦＵＳ／ＴＬＳのＣ末端領域におけるアルギニン残基の変異が、また、この自家結合を防止して構成的に活性な転写リプレッサーをもたらすと推測することは魅力的である。また、ＦＵＳ／ＴＬＳは、ハンチントン病のモデルにおいて主要な核凝集物相互作用タンパク質であることが見出されている。凝集物中における貯留によるＦＵＳ／ＴＬＳの枯渇が、ポリグルタミン伸長媒介性疾患における神経細胞死に寄与し得、運動ニューロン疾患の劣性の症例におけるＦＵＳ／ＴＬＳの機能の喪失がこの病態を模倣し得ると推測することは魅力的である（注：。ＦＵＳ／ＴＬＳの１つの結合パートナーであるＣＢＰもまた、ポリグルタミン経路を含む）。
【０１０２】
ＦＵＳ／ＴＬＳについてのニューロンの機能は、海馬ニューロンのスライス培養において明らかにされている。タンパク質は、代謝型（ｍＧｌｕＲ１）グルタミン酸作動性刺激に応答して樹状突起の棘突起へ輸送されるＲＮＡ顆粒において見出される。これらの顆粒は、多数のタンパク質（ＴＤＰ−４３を含む）およびｍＲＮＡ種を含み、これはアクチンおよびアクチン安定化タンパク質を含む。実際、ＦＵＳ／ＴＬＳ欠損ニューロンは、棘突起の分枝の減少および異常な形態を示す。
【０１０３】
運動ニューロン疾患と関連する２つの変異（一方は優性、一方は劣性）は、培養中の神経細胞の細胞質におけるＦＵＳ／ＴＬＳの異常な蓄積（優性の変異は、より高い程度まで）を引き起こすと考えられる。かかる貯留は、核内で利用可能なタンパク質の量の減少を介して、または細胞質における機能の有害な増大により、細胞の機能不全をもたらし得る。また、変異型ＦＵＳ／ＴＬＳがＲＮＡ顆粒中に組み込まれても、樹状突起の棘突起へのｍＲＮＡの送達において正しく機能せず、それによりドミナントネガティブ効果を発揮するか、または劣性の変異の場合は機能の部分的喪失を介する可能性もある。２つのＡＬＳ関連タンパク質である同じＲＮＡ顆粒中のＴＤＰ−４３およびＦＵＳ／ＴＬＳの存在は、これらの下流の構造または局在における混乱が、運動ニューロン疾患の病因において、少なくともこれらの２つの遺伝子に関連する症例において、重要であり得ることを示唆する。
【０１０４】
【表２】
0005643200.tif 000003
【０１０５】
均等物
いくつかの発明の態様が本明細書において記載され説明される一方で、当業者は、本明細書において記載される１または２以上の機能を実施するため、および／または結果および／または利点を得るための、多様な他の手段および／または構造を容易に想起することができ、かかるバリエーションおよび／または改変の各々は、本明細書において記載される発明の態様の範囲内であるとみなされる。より一般的には、当業者は、本明細書において記載される全てのパラメーター、寸法、材料および配置が、例示的なものであることを意味しており、実際のパラメーター、寸法、材料および／または配置は、発明の技術が用いられる具体的な適用に依存するであろうことを理解する。当業者は、本明細書において記載される特定の発明の態様に対する多数の均等物を認識するか、または慣用的な実験のみを用いて確認することができる。したがって、前述の態様が例としてのみ提示されること、および、添付の請求の範囲およびその均等物の範囲において、発明の態様は、具体的に記載され請求されたもの以外の方法においても実施することができることが理解されるべきである。本開示の発明の態様は、本明細書において記載される各々の個々の特徴、システム、物品、材料、キットおよび／または方法に関する。さらに、かかる特徴、システム、物品、材料、キットおよび／または方法の２または３以上の任意の組み合わせは、相互に相反するものではなく、本開示の発明の範囲内に含まれる。
【０１０６】
全ての定義は、本明細書において定義され用いられる場合、辞書による定義、参考として組み込まれる文書における定義、および／または定義される用語の通常の意味を超えて支配することが理解されるべきである。
本明細書において開示される全ての参考文献、特許および特許出願は、各々が引用される主題に関して参考として組み込まれ、これは、一部の場合においては当該文書の全体を包含する。
不定冠詞「a」および「an」は、本明細書においておよび請求の範囲において用いられる場合、明確に逆に示されない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
【０１０７】
句「および／または」は、本明細書においておよび請求の範囲において用いられる場合、そのように結合された要素、すなわち、一部の場合においては結合して存在し、他の場合においては結合しないで存在する要素の、「一方または両方」を意味すると理解されるべきである。「および／または」により列記された複数の要素、すなわち、そのように結合された「１または２以上」の要素は、同じ様式において解釈されるべきである。「および／または」の節により具体的に同定された要素以外の他の要素もまた、これらの具体的に同定された要素に関連するか関連しないかに拘わらず、随意に存在してもよい。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」についての言及は、「含む（comprising）」などの制約のない（open-ended）言語により結合されて用いられる場合、一態様においてはＡのみ（随意にＢ以外の要素を含む）を；別の態様においてはＢのみ（随意にＡ以外の要素を含む）を；さらに別の態様においてはＡおよびＢの両方（随意に他の要素を含む）を、指し得る。
【０１０８】
本明細書においておよび請求の範囲において用いられる場合、「または」とは、上で定義された「および／または」と同じ意味を有するものと理解されるべきである。例えば、列記されたものの中の項目を分離する場合、「または」または「および／または」は、包含的なもの、すなわち、多数のまたは列記された要素および随意に列記されていない項目の、少なくとも１つの包含、なおまた１つより多くの包含、として解釈されるべきである。「１つのみ」または「正確に一方」、または請求の範囲において用いられる場合は「からなる（consisting of）」などの、明確に逆に示された用語のみが、多数のまたは列記された要素のうちの正確に１つの要素の包含を指す。一般に、用語「または」とは、本明細書において用いられる場合、「いずれか」、「一方」、「一方のみ」、または「正確に一方」などの排他的な用語により先行される場合のみ、排他的な代替（すなわち、「一方または他方であるが両方ではない」）を示すものとして解釈されるべきである。「本質的になる（consisting essentially of）」とは、請求の範囲において用いられる場合、特許法の分野において用いられるその通常の意味を有する。
【０１０９】
本明細書においておよび請求の範囲において用いられる場合、１または２以上の要素の列記を参照する句「少なくとも１つ」とは、列記された要素のうちの任意の１または２以上の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されるべきであるが、必ずしも、要素の列記の中の具体的に列記された要素の一つ一つのうちの少なくとも１つを含まなくてもよく、要素の列記の中の要素の任意の組み合わせを除外しない。この定義はまた、句「少なくとも１つ」が参照する要素の列記のうちに具体的に同定された要素以外の要素が、これらの具体的に同定された要素に関連しているか関連していないかに拘わらず、随意に存在してもよいことを可能にする。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または、同等に、「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または同等に、「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、一態様においては、少なくとも１つの、随意に１つより多くを含む、Ａであって、Ｂが存在しないもの（および随意にＢ以外の要素を含む）；別の態様においては、少なくとも１つの、随意に１つより多くを含む、Ｂであって、Ａが存在しないもの（および随意にＡ以外の要素を含む）；さらに別の態様においては、少なくとも１つの、随意に１つより多くを含む、Ａ、および少なくとも１つの、随意に１つより多くを含む、Ｂ（および随意に他の要素を含む）などを指すことができる。
【０１１０】
また、逆に明確に示されない限り、本明細書において請求される、１つより多くの工程または行動を有する任意の方法において、方法の工程または行動の順序は、必ずしも、当該方法の工程または行動が列挙された順序に限定されないことが理解されるべきである。
【０１１１】
請求の範囲において、ならびに上記の明細書において、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「保有する（carrying）」、「有する（having）」、「含む（containing）」、「含む（involving）」、「保持する（holding）」、「からなる（composed of）」などの全ての移行句は、制限されない（open-ended）、すなわち、含むがそれに限定されないことを意味すると理解されるべきである。米国特許庁特許審査手続便覧（United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures）のセクション2111.03において記載されるように、移行句「からなる（consisting of）」及び「から本質的になる（consisting essentially of）」のみが、それぞれ、閉鎖型（closed）または半閉鎖型（semi-closed）の移行句であるべきである。
【図１Ａ】
0005643200.tif 000004
【図１Ｂ】
0005643200.tif 000005
【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
0005643200.tif 000008
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【配列表】
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