(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のビタミンＤ類似体の存在または不存在を検出する方法であって、
前記サンプルに有効量の多電荷カチオン剤を加えてカチオン処理されたサンプルを形成するステップであって、前記有効量の多電荷カチオン剤は質量分析法によるさらなる分析のときにビタミンＤ類似体からのシグナルを強めるステップ、
前記カチオン処理されたサンプルを、遠心分離して上澄み液を形成させるステップ、
前記上澄み液を、前記ビタミンＤ類似体を他のビタミンＤ以外の組成物から分離するための分離手段上に装填して被分析物質溶液を形成させるステップであって、前記分離手段はタンパク質沈殿を含むステップ、
前記被分析物質溶液を、分析用カラム上に置いて互いにおよびビタミンＤ以外の化合物から分離された前記ビタミンＤ類似体を有する溶離液を形成させるステップ、
前記溶離液を、質量分析計中に置き、質量スペクトルによってサンプル中のビタミンＤ類似体の存在または不存在を検出するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記タンパク質沈殿が、沈殿剤を前記上澄み液と一緒にして混合することおよび前記タンパク質沈殿物を水溶液から分離して被分析物質溶液を形成させることによって行なわれる、請求項１の方法。
【請求項３】
前記タンパク質沈殿物が、遠心分離によって分離される、請求項２の方法。
【請求項４】
前記サンプルが血清である、請求項１の方法。
【請求項５】
前記多電荷カチオン剤が、金属硫酸塩を含む群から選択される、請求項１の方法。
【請求項６】
前記金属硫酸塩が、硫酸亜鉛である、請求項５の方法。
【請求項７】
前記サンプルが、既知量の標識されたビタミンＤ類似体を加えられる、請求項１の方法。
【請求項８】
前記標識されたビタミンＤ類似体が、重水素化された２５（ＯＨ）ビタミンＤ３および重水素化された２５（ＯＨ）ビタミンＤ２を含む群から選択される、請求項７の方法。
【請求項９】
前記被分析物質溶液が、乾燥され、メタノールおよび水中において再構成されて再構成されたサンプルを形成する、請求項１の方法。
【請求項１０】
前記再構成されたサンプルが、分析用カラム上のクロマトグラフィーによって分離されて前記溶離液を形成し、この溶離液は質量分析計に向けられる、請求項９の方法。
【請求項１１】
サンプル中のビタミンＤ類似体の存在または不存在を検出するためのキットであって、
有効量の多電荷カチオン剤、
タンパク質沈殿剤、および
有効量の多電荷カチオン剤が前記サンプルに加えられてカチオン処理されたサンプルを形成し、ここで前記有効量の多電荷カチオン剤は質量分析法によるさらなる分析のときにビタミンＤ類似体からのシグナルを強め、前記処理されたサンプルは遠心分離されて上澄み液を形成し、前記上澄み液中のタンパク質は前記タンパク質沈殿剤によるタンパク質沈殿により前記ビタミンＤ類似体から分離されて被分析物質溶液を形成し、および前記被分析物質溶液は分析カラム上に置かれて互いにおよびビタミンＤ以外の化合物から分離された前記ビタミンＤ類似体を有する溶離液を形成し、前記溶離液を質量分析計に入れて質量スペクトルによってサンプル中のビタミンＤ類似体の存在または不存在を検出する方法におけるその使用のための取扱説明書
を含む、キット。
【請求項１２】
前記タンパク質沈殿が、沈殿剤を前記上澄み液と一緒にして混合することおよび前記タンパク質沈殿物を水溶液から分離して被分析物質溶液を形成させることによって行なわれる、請求項１１のキット。
【請求項１３】
前記タンパク質沈殿物が、遠心分離によって分離される、請求項１２のキット。
【請求項１４】
前記サンプルが、血清である、請求項１１のキット。
【請求項１５】
前記多電荷カチオン剤が、金属硫酸塩を含む群から選択される、請求項１１のキット。
【請求項１６】
前記金属硫酸塩が、硫酸亜鉛である、請求項１５のキット。
【請求項１７】
前記キットが、質量分析法による定量化を容易にするような標識されたビタミンＤ類似体の既知量を含む、請求項１１のキット。
【請求項１８】
前記標識されたビタミンＤ類似体が、重水素化された２５（ＯＨ）ビタミンＤ３および重水素化された２５（ＯＨ）ビタミンＤ２を含む群から選択される、請求項１７のキット。
【請求項１９】
分析用カラムをさらに含む、請求項１１のキット。
【請求項２０】
前記分析用カラムが、架橋されたエチルハイブリッド材料を含むクロマトグラフィー媒体を有する、請求項１９のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本出願は、２００８年２月２５日に出願した米国特許仮出願第６１／０３１，０３３号の優先権を主張するものである。これらの出願の全内容は参照により本明細書に組み込まれている。
【０００２】
（連邦政府財政援助に関する声明）
本明細書において提示される発明は、連邦政府の補助金または資金によって支援されたものではない。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、サンプル中のビタミンＤおよびビタミンＤ類似体の存在および量を検出またはモニターすることが望ましい診断の分野に関する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
ビタミンＤの欠乏は、高齢者にとっておよび重大な肝臓疾患または腎臓疾患を有する個人において問題である。欠乏は日光への露光が少ないまたは栄養不足の個人においても留意されることがある。
【０００５】
ビタミンＤとは密接に関連する化合物群のことであり、そのうちの２つはヒトにおいて最も重要なビタミンＤ２およびビタミンＤ３である。ビタミンＤ２、エルゴカルシフェロールは下の化学式１に示す。
【０００６】
【化１】
0005449202.tif 000002
【０００７】
ビタミンＤ３、コレカルシフェロールは下の化学式２に示す。
【０００８】
【化２】
0005449202.tif 000003
ビタミンＤ３は、皮膚内の光媒介反応において合成され、ヒトにおいて最も活性な形態である。肝臓内で、ビタミンＤ２およびビタミンＤ３は２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３に転化される。腎臓内で、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３は、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２および１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３に転化される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ビタミンＤ欠乏症は通常、ビタミンＤ２を用いて治療される。ビタミン欠乏症および治療を評価するために、生体サンプル中のビタミンＤレベルおよびビタミンＤ２のレベルを検出しモニターするための正確で再現性のある方法を有することが望ましい。本文書は、すべての密接に関連するビタミンＤ化合物ならびにこれらの前駆体および代謝産物をビタミンＤ類似体と呼ぶ。また、より詳細な化学的特定性が必要な場合は、これらの化学種はビタミンＤ２またはビタミンＤ３という用語によって識別される。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明の実施形態は、サンプル中のビタミンＤ類似体の存在または不存在、および存在する場合の量を決定するための方法およびキットを対象とする。サンプル中のビタミンＤ類似体の存在または不存在を検出するための本発明の方法の一実施形態は、有効量の多電荷カチオン剤をサンプルに加えてカチオン処理されたサンプルを形成するステップを含む。有効量の多電荷カチオン剤は、さらに質量分析法による分析のときにビタミンＤ類似体のシグナルを強める。次に、カチオン処理されたサンプルは遠心分離されて上澄み液を形成する。この上澄み液は、ビタミンＤ類似体を他のビタミンＤ以外の組成物のそれぞれから分離するための分離手段に装填されて、被分析物質溶液を形成する。被分析物質溶液は、分析用クロマトグラフィー媒体上に置かれてビタミンＤ類似体が互いからおよびビタミンＤ以外の化合物から分離された溶離液を形成する。サンプル中にビタミンＤ類似体が存在する場合は、溶離液はビタミンＤ類似体を有し、質量分析法によって検出される。本明細書において使用される「サンプル」という用語は、評価することが望ましい任意の材料のことを言うものである。これらの材料は通常、組織または流体の形態の生物起源のものである。ビタミンＤ類似体の血液、血漿、または血清濃度を測定することが特に望ましい。本明細書において使用される「装填される」という用語は、種々の化合物を分離することができる態様で置かれることを意味する。「溶離される」という用語は、取り去ることまたは取り除くことを意味するために使用される。クロマトグラフィー媒体から取り去られたものは「溶離液」として知られている。
【００１１】
本明細書において使用される「分離手段」という用語は、液／液抽出、固相抽出およびタンパク質沈殿を含む群のことを言うものである。固相抽出において、上澄み液は分取クロマトグラフィー媒体上に装填される。ビタミンＤ類似体は、分取クロマトグラフィー媒体から溶離されて被分析物質溶液を形成する。サンプル中にビタミンＤ類似体が存在する場合、ビタミンＤ類似体を有する被分析物質溶液は、分析用クロマトグラフィー媒体を有する分析用カラム上に置くことによって、さらに処理される。
【００１２】
本明細書において使用される「液／液抽出」という用語は、上澄み液を含む水溶液に脂肪族溶媒を加えることによる抽出の方法のことを言うものである。脂肪族溶媒および上澄み液は混合され、分離されて被分析物質溶液を形成する。本明細書において使用される脂肪族溶媒は、１個−１２個の炭素を有する有機分子から成る。
【００１３】
本明細書において使用される「タンパク質沈殿」という用語は、沈殿剤を上澄み液と一緒にし、タンパク質沈殿物を水溶液から分離して、沈降させたときに、またはより一般的には、さらに遠心分離したときに、被分析物質溶液を形成させる方法のことを言うものである。沈殿剤は高濃縮された塩溶液およびメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコールを含む。
【００１４】
本発明の一実施形態は、金属硫酸塩を含む群から選択される多電価カチオン剤を特徴とする。１つの好ましい金属硫酸塩は、硫酸亜鉛である。
【００１５】
好ましい分取クロマトグラフィー媒体は親水性成分および疎水性成分を有するポリマー媒体である。このクロマトグラフィー媒体は、好ましくはカラム、カートリッジまたはマルチウエル抽出デバイスなどの適当な容器中に保持される。９６ウエルプレートなどのマルチウエル抽出デバイスは、オフラインの分取処理のために好ましく、カラムまたはカートリッジはオンラインの分取処理のために好ましい。
【００１６】
好ましくは、サンプルには既知量の標識されたビタミンＤ類似体が加えられる。標識されたビタミンＤ類似体は、所望の被分析物質の質量分析ピークの同定を容易にする。また、標識されたビタミンＤ類似体は、既知量の標識されたビタミンＤ類似体ピーク面積と未知のビタミンＤ類似体のピーク面積の間で比較することを可能にすることによって、定量化を容易にする。好ましい標識されたビタミンＤ類似体は、重水素化ビタミンＤ類似体を含む群から選択される。例えば、ビタミンＤ２類似体またはビタミンＤ３類似体を同定し定量化することが望まれる場合は、重水素化２５（ＯＨ）ビタミンＤ３および重水素化２５（ＯＨ）ビタミンＤ２の組成物が好ましい。
【００１７】
好ましくは、本方法は、分析溶液を乾燥し、かかる固体をメタノールおよび水中において再構成して再構成されたサンプルを形成させるステップをさらに含む。好ましくは、この再構成されたサンプルは、分析用クロマトグラフィー媒体を用いてクロマトグラフ的に分離されて溶離液を形成する。この溶離液は質量分析計へ向けられる。
【００１８】
好ましい分析用クロマトグラフィー媒体は、架橋されたエチルハイブリッド組成物である。この分析用クロマトグラフィー媒体は、好ましくは分析カラム中に保持される。分析用カラムは、１，５００ｐｓｉ−１５，０００ｐｓｉの間の圧力で操作される高性能カラムである。好ましい高性能カラムは６，０００−１５，０００ｐｓｉの圧力で操作される。
【００１９】
本発明のさらなる実施形態は、サンプル中におけるビタミンＤ類似体の存在または不存在を検出するためのキットを特徴とする。キットという用語は、方法を行なうための部品、要素および試薬の集合体を意味するために使用される。このキットは通常、集合体および取扱説明書を保持するためのパッケージングを含む。キットを対象とする本発明の実施形態は、有効量の多電荷カチオン剤、およびビタミンＤ類似体の存在もしくは不存在または量を決定するための方法におけるその使用のための取扱説明書を含む。この方法において、有効量の多電荷カチオン剤がサンプルに加えられて、カチオン処理されたサンプルを形成する。有効量の多電荷カチオン剤は、遠心分離後に、質量分析計のシグナルを強める。処理されたサンプルは遠心分離されて上澄み液を形成する。この上澄み液は、前記ビタミンＤ類似体を他のビタミンＤ以外の組成物のそれぞれから分離して被分析物質溶液を形成するための分離手段に装填される。この被分析物質溶液は、互いにおよびビタミンＤ以外の化合物から分離されたビタミンＤ類似体を有する溶離液を形成させるための分析用クロマトグラフィー媒体上に置かれる。この溶離液は、質量分析計中に入れられて、サンプル中のビタミンＤ類似体の存在もしくは不存在または量が質量分析法によって検出される。
【００２０】
サンプルが血清である場合、キットは好ましくは流体を取り扱うためのピペットを含む。固体組織サンプルの分析に向けられるキットは、好ましくは組織を可溶化するための溶液を含む。
【００２１】
１つの好ましい多電荷カチオン剤は、硫酸亜鉛などの金属硫酸塩を含む群から選択される。
【００２２】
１つの好ましいキットは、分離手段を含む。この分離手段は、液／液抽出、固相抽出およびタンパク質沈殿を含む群から選択された少なくとも１つを含み、かかるキットはかかる分離手段を含む。
【００２３】
例えば、固相抽出が、上澄み液を分取クロマトグラフィー媒体上に装填することおよびビタミンＤ類似体を分取クロマトグラフィー媒体から溶離して被分析物質溶液を形成させることによって行なわれる場合は、キットは分取クロマトグラフィー媒体を収容している。分取クロマトグラフィー媒体は、好ましくはオフライン抽出用の単一ウエルまたはマルチウエルデバイス、およびオンライン作業用のカラムおよびカートリッジなどの固相抽出デバイス内部に収容されている。マルチウエルデバイスは一般的に、９６の倍数のウエル数で販売されている。上澄み液を受け入れるための好ましい分取クロマトグラフィー媒体は、親水性成分および疎水性成分を有するポリマー媒体である。オフライン抽出用の好ましい固相抽出デバイスは、ウエルデバイスまたはマルチウエルデバイスである。
【００２４】
液／液抽出が、脂肪族溶媒を加えること、混合することおよび脂肪族溶媒を水溶液から分離して被分析物質溶液を形成することによって行なわれる場合は、キットはかかる脂肪族溶媒を含む。
【００２５】
タンパク質沈殿が、沈殿剤を入れて上澄み液と一緒に混合することおよび前記タンパク質沈殿物を水溶液から分離して被分析物質溶液を形成させることによって行なわれる場合は、キットはかかる沈殿剤を含む。
【００２６】
好ましくは、キットは、質量分析法による定量化を容易にするために既知量の標識されたビタミンＤ類似体を含む。好ましい標識されたビタミンＤ類似体は、重水素化されたビタミンＤ類似体を含む群から選択される。例えば、被分析物質が２５（ＯＨ）ビタミンＤ３および２５（ＯＨ）ビタミンＤ２である場合は、好ましい標識されたビタミンＤ類似体は重水素化された２５（ＯＨ）ビタミンＤ３および重水素化された２５（ＯＨ）ビタミンＤ２を含む。
【００２７】
好ましくは、キットは、分析用クロマトグラフィー媒体をさらに含む。分析用クロマトグラフィー媒体は、好ましくは分析用カラム中に収容され、分析溶液は乾燥され、再構成されて再構成されたサンプルを形成する。この再構成されたサンプルは、分析用クロマトグラフィー媒体へ向けられて溶離液を形成する。この溶離液は質量分析計によって質量分析される。好ましい第２のクロマトグラフィー媒体は、架橋されたエチルハイブリッド材料である。
【００２８】
本発明のさらなる特徴および利点は、図面を見て、下記の詳細な説明を読むと当業者には認められる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明の特徴を具体化しているキットを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
（発明の詳細な記述）
本発明の実施形態は、サンプル中におけるビタミンＤ類似体の存在または不存在および存在する場合の量を決定するための方法およびキットに関して詳細に記載される。「サンプル」という用語は広い意味で使用されるが、本論は組織または流体の形態の生物起源の材料を想定している。また、特に、本論および実施例は、ある種のステップおよび材料は変更または改変され得るという理解の下で、血清および好ましいステップを対象としている。本発明の実施形態は、ビタミンサプリメントの欠乏または過剰投与を診断する目的のための、ビタミンＤ類似体の臨床的血中濃度を決定するために使用されることができる。
【００３１】
まず方法については、本方法は有効量の多電荷カチオン剤をサンプル、血清、に加えてカチオン処理されたサンプルを形成させるステップを含む。サンプルが全血として提供される場合、当業者は血液細胞をスピンアウトして血漿を形成させ、次いで血液タンパク質を沈殿させて血清を形成させることによって全血サンプルを処理して血清を得ることを知っている。血清サンプルは任意の容積であってよいが、約２００μＬの小容積が普通である。有効量の多電荷カチオン剤は、遠心分離したときにサンプルからのビタミンＤ以外の組成物の除去を排除するまたは容易にする。
【００３２】
好ましい多電荷カチオン剤は、硫酸亜鉛などの金属硫酸塩を含む群から選択される。硫酸亜鉛は、いくつかの販売者から入手可能である。多電荷カチオン剤は、０．０１−１Ｍの間の、より好ましくは０．０５−０．５Ｍの最終濃度となるようにサンプルに加えられる。
【００３３】
好ましくは、サンプルは既知量の標識されたビタミンＤ類似体を受け入れる。標識されたビタミンＤ類似体は、好ましくはサンプルに加えられるが、既知量の標識されたビタミンＤ類似体を有する較正溶液の別個の操作によって質量分析計を較正することが可能である。標識されたビタミンＤ類似体は、所望の被分析物質についての質量スペクトルのピークの同定を容易にする。また、標識されたビタミンＤ類似体は、既知量の標識されたビタミンＤ類似体と未知のビタミンＤ類似体とのピーク面積の間で比較することを可能にすることによって、定量化を容易にする。好ましい標識されたビタミンＤ類似体は、重水素化されたビタミンＤ類似体を含む群から選択される。例えば、ビタミンＤ２類似体またはビタミンＤ３類似体を同定および定量化することが望まれる場合は、重水素化された２５（ＯＨ）ビタミンＤ３および重水素化された２５（ＯＨ）ビタミンＤ２組成物が好ましい。
【００３４】
血清中ビタミンＤ類似体および較正用標識ビタミンＤ類似体のための好ましい溶媒はメタノールである。したがって、血清、水性混合物は、１０ｎｇ／ｍＬのｄ６２５（ＯＨ）ビタミンＤ３を含有しているメタノールの２倍容積と合わせられる。
【００３５】
多電荷カチオン剤は、適当な時間、通常は５−１８０秒間、ボルテックスすることによって完全に混合され、さらに５秒間−１０分間静置されてカチオン処理されたサンプルを形成する。
【００３６】
次に、カチオン処理されたサンプルは、遠心分離されて上澄み液を形成する。本発明者らは如何なる特定の理論にも束縛されたくはないが、多電荷カチオン剤は血清中に残っているビタミンＤ以外の化合物と錯体を形成すると考えられている。これらの錯体はより低い溶解度を有し、遠心分離の間に沈降して、ビタミンＤ化合物の検出を妨害する可能性がある組成物が除去された上澄み液を形成する。代わりにまたは加えて、多電荷カチオン剤は、ビタミンＤ類似体が結合されているタンパク質を、それに結合されているビタミンＤ類似体がタンパク質から外されるように変更する場合がある。上澄み液は、６００−２６，０００ｒｐｍにおいて２−３０分間、より好ましくは６０００−２０，０００ｒｐｍにおいて５−１０分間遠心分離されると生じる。
【００３７】
この上澄み液は分離手段に投入される。例えば、固相抽出を行なうことが望まれる場合は、上澄み液はビタミンＤ類似体を他のビタミンＤ以外の組成物のそれぞれから分離するための分取クロマトグラフィー媒体上に装填される。好ましい分取クロマトグラフィー媒体は、親水性成分および疎水性成分を有するポリマー媒体である。１つの好ましいポリマー媒体は、ＯＡＳＩＳ（登録商標）ＨＬＢ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）の商標で販売されている。
【００３８】
この分取クロマトグラフィー媒体は、好ましくはカラム、カートリッジまたはマルチウエル抽出デバイスなどの適当な容器中に保持されている。９６ウエルプレートなどのマルチウエル抽出デバイスはオフラインの分取処理のために好ましく、カラムまたはカートリッジはオンラインの分取処理のために好ましい。９６ウエルプレートは３０ｍｇの収着剤と一緒にＯＡＳＩＳ（登録商標）ＨＬＢの商標で販売されている。
【００３９】
収着剤は通常、上澄み液を装填する前に、当技術分野において知られている仕方で調整される。調整は、部分的には、収着剤の性質、被分析物質が溶離される仕方およびその中に被分析物質が溶解される溶媒によって決定される。本明細書において記載されている９６マルチウエルデバイス中のポリマー収着剤は、装填の前に、酢酸エチル１ｍＬ、メタノール１ｍＬで調整され、水１ｍＬと平衡状態にされる。
【００４０】
収着剤が調整され、上澄み液が装填された後、収着剤は妨げになる可能性のある化合物を除去するために洗浄される。それ故に、収着剤は２回、まず、５％メタノール／水溶液１ｍＬを用いて、次に８０％メタノール／水溶液１ｍＬを用いて洗浄される。
【００４１】
ビタミンＤ類似体は、分取クロマトグラフィー媒体から溶離されて被分析物質溶液を形成する。サンプル中にビタミンＤ類似体が存在する場合は、被分析物質溶液はビタミンＤ類似体を有する。標識されたビタミンＤ類似体がサンプルに加えられた場合は、標識されたビタミンＤ類似体も存在する。標識されたビタミンＤ類似体および標識されていないビタミンＤ類似体の双方が酢酸エチル５００μＬの２倍容積で溶離される。
【００４２】
好ましくは、被分析物質は乾燥され、再構成されて再構成されたサンプルを形成する。例えば、被分析物質溶液は窒素または何らかの他の不活性ガスの下の高められた温度、例えば５０℃において乾燥される。好ましくは、かかる再構成されたサンプルは、メタノールおよび水の中で形成される。好ましい溶液は、７０／３０のメタノール／水である。通常の容積は２００μＬである。
【００４３】
再構成されたサンプルは、分析用クロマトグラフィー媒体を用いてクロマトグラフィーで分離され、溶離液を形成する。この溶離液は、質量分析計に向けられる。
【００４４】
好ましい分析用クロマトグラフィー媒体は、架橋されたエチルハイブリッド組成物である。この第２のクロマトグラフィー媒体は、好ましくは分析用カラム中に保持されている。分析用カラムは、１，０００−１５，０００ｐｓｉの圧力で操作される高性能カラムである。好ましい高性能カラムは、６，０００−１５，０００ｐｓｉの圧力で操作される。好ましいカラムは、ＡＣＱＵＩＴＹ（登録商標）ＢＥＨ  ２．１×５０ｍｍ、Ｃ８、１．７μ粒子（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）の商標で販売されている。かかるカラムを受け入れるための好ましい計器は、ＡＣＱＵＩＴＹ（登録商標）ＵＰＬＣ（登録商標）クロマトグラフィーシステム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）である。
【００４５】
ビタミンＤ類似体および標識されたビタミンＤ類似体は、２つの溶液から成るグラジエントを用いて溶離される。第１の溶液は２ｍＭの酢酸アンモニウムを有し、０．１％のギ酸を有する水であり、本明細書において「移動相Ａ」と呼ばれることがある。第２の溶液は２ｍＭの酢酸アンモニウムを有し、０．１％のギ酸を有するメタノールであり、本明細書において「移動相Ｂ」と呼ばれることがある。この系に対して、第１の溶液は弱い洗浄溶媒として使用され、第２の溶液は強い洗浄溶媒として使用される。
【００４６】
グラジエントはある時間を掛けて達成される。１つの好ましいグラジエントは約２５％の移動相Ａおよび７５％の移動相Ｂで開始して７５％の移動相Ａおよび２５％の移動相Ｂまで６分間かけて、流量０．３５ｍＬ／分、および注入容積２０μＬ（ＰＬＮＯ、ループ５０μＬ、サンプルシリンジ２５０μＬ。２５（ヒドロキシ）ビタミンＤ２の保持時間は３．４８分であり、２５（ヒドロキシル）ビタミンＤ３は３．３分であり、ｄ６２５（ヒドロキシル）ビタミンＤ３は３．３分である。
【００４７】
ビタミンＤ類似体は、質量分析法によって検出される。質量分析計は、いくつかの販売者から種々の商標で入手可能である。好ましい質量分析計は、ＷＡＴＥＲＳ（登録商標）ＴＱＤ、ＭＡＳＳＬＹＮＸ（登録商標）４．１ソフトウエアを有するタンデム四重極型検出器質量分析計として販売されている。
【００４８】
少しだけ分離手段に戻って、分離手段は、直ぐ前に記載された固相抽出法または液／液抽出またはタンパク質沈殿から選択されるとよい。液／液抽出法が好ましい場合は、分離手段は、上澄み液を含む水溶液に脂肪族溶媒を加えることを含む。脂肪族溶媒および上澄み液は、混合され、分離されて被分析物質溶液を形成する。
【００４９】
本明細書において使用される脂肪族溶媒は、１−１２個の炭素を有する有機分子から成る。好ましい脂肪族溶媒はヘキサンである。混合は一般的に、ボルテックスすることによって行なわれ、分離はさらなる遠心分離によって支援されてもよくまたは単に水性媒体および脂肪族媒体を時間を掛けて分液および沈降させるだけでもよい。水性成分は脂肪族成分から分離されて被分析物質溶液を形成する。
【００５０】
分離手段がタンパク質沈殿である場合、分離手段は沈殿剤を上澄み液に加えることを含む。沈殿剤は、濃縮された塩溶液および／またはメタノール、エタノール、プロパノールおよびブタノールなどのアルコールを含む。沈殿剤は、タンパク質が、沈降またはさらなる遠心分離によって上澄み液を去る原因となって、被分析物質溶液を形成する。
【００５１】
ここで図１を見ると、本発明のさらなる実施形態は、一般的に数字１１によって示されているキットを特徴とする。このキットは、血清を含むサンプル中のビタミンＤ類似体の存在または不存在を検出するためのものである。キット１１は、より詳細に後述される集合体を含む様々な部品を保持するためのパッケージング１５を有する。パッケージング１５は、袋、プラスチック包み、プラスチック型枠または描かれているような箱などの如何なる形態をも含み得る。
【００５２】
有効量の多電荷カチオン剤は、バイアル１７中に保持される。バイアル１７は、多電荷カチオン剤を溶液または再構成のための乾燥状態で収容し得る。１つの好ましい多電荷カチオン剤は、硫酸亜鉛などの金属硫酸塩を含む群から選択される。
【００５３】
キットは、その使用のためのビタミンＤ類似体の存在もしくは不存在または量を決定するための方法を記載している取扱説明書１９をさらに含む。この方法において、有効量の多電荷カチオン剤がサンプルに加えられてカチオン処理されたサンプルを形成する。取扱説明書１９は、好ましくは多電荷カチオン剤を形成させるための仕方を記載している。
【００５４】
サンプルが血清である場合、キットは好ましくは流体を取り扱うためのピペット［示されていない］を含む。固体組織サンプルの分析に向けられるキットは、好ましくは組織を可溶化するための溶液または溶液を作成するための手段を含む。例えば、カオトロピックとして知られているある種の塩は、細胞膜を溶解させる。かかる塩は、溶液中に入れられるために、バイアル［示されていない］中に、多電荷カチオン剤の仕方で、収容されている。
【００５５】
１つの好ましいキット１１は、分取クロマトグラフィー媒体の形態の分離手段、沈殿剤および／または液／液抽出材料および試薬を含む。例えば、抽出デバイス中にマルチウエルプレートまたは分取カラム２１の形態で保持されている分取クロマトグラフィー媒体は、パッケージング１５中に保持されている。分取カラム２１が示されているが、一部の用途のためには９６ウエルプレート［示されていない］が好ましいことがある。沈殿剤ならびに／または液／液抽出材料および試薬は、通常バイアルまたはボトル［示されていない］中に収容されている。
【００５６】
好ましくは、キットは、質量分析法による定量化を容易にするための既知量の標識されたビタミンＤ類似体を含む。好ましい標識されたビタミンＤ類似体は、重水素化されたビタミンＤ類似体を含む群から選択される。例えば、被分析物質が２５（ＯＨ）ビタミンＤ３および２５（ＯＨ）ビタミンＤ２である場合は、好ましい標識されたビタミンＤ類似体は、重水素化された２５（ＯＨ）ビタミンＤ３および重水素化された２５（ＯＨ）ビタミンＤ２を含む。適当な溶媒中に溶解させるためのかかる標識されたビタミンＤ類似体は、バイアル２３中に収容されているものとして示されている。取扱説明書１９は、その再構成の仕方を記載している。
【００５７】
このキットは、分析用カラム２５の形態の分析用クロマトグラフィー媒体をさらに含む。
【００５８】
本発明の実施形態は、２５（ＯＨ）ビタミンＤ２およびＤ３の検出および濃度の決定を強調している次の実施例において、さらに例示される。
【００５９】
（実施例）
実施例１および２は、下記の計器、材料、設定および手順を使用する。
計測器
質量分析計：ＷＡＴＥＲＳ（登録商標）ＴＱＤ  Ｓ／Ｎ  ＱＢＡ０６８
クロマトグラフィーシステム：ＡＣＱＵＩＴＹ（登録商標）ＵＰＬＣ（登録商標）クロマトグラフィーシステムＳＭ：Ｓ／Ｎ  Ｋ０６ＵＰＳ１５Ｍ（ＦＷ  １．２３．１７２）、ＢＳＭ：Ｓ／Ｎ  Ｂ０７ＵＰＢ８０５Ｍ（ＦＷ  １．２３．１２１）
ソフトウエア：ＭａｓｓＬｙｎｘ  ４．１  
材料および方法
標準
２５（ＯＨ）ビタミンＤ３（１ｍｇ）は、Ｆｌｕｋａ（１７９３８）から購入し、エタノール（１ｍＬ）中に溶解させた。２５（ＯＨ）ビタミンＤ２（１ｍｇ）は、Ｆｌｕｋａ（１７９３７）から購入し、エタノール（１ｍＬ）中に溶解させた。ｄ６−２５（ＯＨ）Ｖｉｔ  Ｄ３は、内部標準として使用する。１ｍｇをＥｔＯＨ（１ｍＬ）中に溶解させて１ｍｇ／ｍＬ標準を得た。
１ｍｇ／ｍＬ標準は、必要となるまで−２０において貯蔵した。この標準は必要に応じて適切な溶媒中に希釈した。
【実施例１】
【００６０】
クロマトグラフィー
移動相Ａ：２ｍＭ酢酸アンモニウム＋０．１％ギ酸を有する水
移動相Ｂ：２ｍＭ酢酸アンモニウム＋０．１％ギ酸を有するＭｅＯＨ
弱い洗浄溶媒：移動相Ａ
強い洗浄溶媒：移動相Ｂ
カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ  ＢＥＨ  ２．１×５０ｍｍ  Ｃ８  １．７μｍ
カラム温度：４５℃
注入容積：２０μＬ（ＰＬＮＯ、ループ容積５０μＬ、適合サンプルシリンジ２５０μＬ）
流量：０．３５ｍＬ／ｍｉｎ
グラジエント：
【００６１】
【表１】
0005449202.tif 000004
ランタイム：６．０分
【００６２】
質量分析計（ＭＳ／ＭＳ）
この計器は、ＭＳ１に関する単位分解能（０．７Ｄａ  ＨＨ）およびＭＳ２に関する分解能（０．９Ｄａ  ＨＨ）について調整した。
極性                            ＥＳ＋
キャピラリー（ｋＶ）            ２．００
コーン（Ｖ）                    ２２．００
エクストラクター                ３．００
ＲＦ（Ｖ）                      ０．１
ソース温度（℃）                １２０
脱溶媒和温度（℃）              ３５０
コーンガス流量（Ｌ／Ｈｒ）      ５０
脱溶媒和ガス流量（Ｌ／Ｈｒ）    ９００
衝突ガス流量（ｍＬ／ｍｉｎ）    ０．１５
ＬＭ１分解能                    １４．９
ＨＭ１分解能                    １４．９
イオンエネルギー１              ０．１
ＭＳモード注入口                ５０．００
ＭＳモード衝突エネルギー        ２．００
ＭＳモード出口                  ５０．００
ＭＳＭＳモード注入口            ０．００
ＭＳＭＳモード衝突エネルギー    １２．００
ＭＳＭＳモード出口              ０．５０
ＬＭ２分解能                    １３．５
ＨＭ２分解能                    １３．５
イオンエネルギー２              １．０
ゲイン                          １．０
マルチプライヤー                −６５２．１０
ＭＲＭ遷移
【００６３】
【表２】
0005449202.tif 000005
スキャン間スキャン遅延（ｓｅｃ）：０．０２
スキャン間チャンネル遅延（ｓｅｃ）：０．０１
【００６４】
サンプル抽出
タンパク質沈殿
血清１５０μＬ
ＭｅＯＨ／ＩＰＡ中２５０ｎｇ／ｍＬのｄ６−２５（ＯＨ）ビタミンＤ３ＩＳ１０μＬを加える
５秒間ボルテックスする
０．２Ｍ  ＺｎＳＯ４  １５０μＬを加える
５秒間ボルテックスする
ＭｅＯＨ  ６００μＬを加える
３０秒間ボルテックスする
１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離する
上澄み液２０μＬを注入する
液−液抽出
血清１５０μＬ、
ＭｅＯＨ／ＩＰＡ中２５０ｎｇ／ｍＬ  ｄ６−２５（ＯＨ）ビタミンＤ３ＩＳ１０μＬを加える
０．２Ｍ  ＺｎＳＯ４  １５０μＬを加える
５秒間ボルテックスする
ＭｅＯＨ  ３００μＬを加える
５秒間ボルテックスする
ヘキサン７５０μＬを加える
３０秒間ボルテックスする
１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離する
上の有機層（ヘキサン）を取り除く
窒素下、５０℃で乾燥する
７０／３０のＭｅＯＨ／水７５μＬ中で再構成する
２０μＬを注入する。
固相抽出
Ｏａｓｉｓ  ＨＬＢ  ３０ｍｇ  ９６ウエルプレート
サンプルの前処理：血清２００μＬ＋ＩＳ（８０／２０ＭｅＯＨ／ＩＰＡ中Ｘｎｇ／ｍＬｄ６−２５（ＯＨ）ビタミンＤ３）１０μＬを５秒間ボルテックスする＋０．２Ｍ  ＺｎＳＯ４  ２００μＬを５秒間ボルテックスする。ＭｅＯＨ８００μＬを加え３０秒間ボルテックスする。１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。
条件１：酢酸エチル１ｍＬ
条件２：ＭｅＯＨ  １ｍＬ
平衡：水１ｍＬ
装填：上澄み液
洗浄１：５％ＭｅＯＨ  １ｍＬ
洗浄２：８０％ＭｅＯＨ  １ｍＬ
溶離液：酢酸エチル２×５００μＬ
窒素下、５０℃で乾燥し、７０／３０のＭｅＯＨ／水１００μＬ中で再構成する。
２０μＬをカラムに注入する
【実施例２】
【００６５】
２５（ＯＨ）ビタミンＤ２およびＤ３の分析
ＳＰＥ／ＵＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ条件
クロマトグラフィー
移動相Ａ：酢酸アンモニウム２ｍＭを有する水＋０．１％ギ酸
移動相Ｂ：酢酸アンモニウム２ｍＭを有するＭｅＯＨ＋０．１％ギ酸
弱い洗浄溶媒：移動相Ａ、６００μＬ
強い洗浄溶媒：移動相Ｂ、２００μＬ
シール洗浄：２０％ＭｅＯＨ水溶液
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＢＥＨ  ２．１×５０ｍｍ  Ｐｈｅｎｙｌ  １．７μｍ（製品番号  １８６００２８８４）プレカラムフィルター付き
カラム温度：６０℃
注入容積：２０μＬ（ＰＬＮＯ、ループ５０μＬ、取付けサンプルシリンジ２５０μＬ）オーバーフィル３μＬ（ＳＣＮ  ６２７）、前装填
流量：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
グラジエント：
【００６６】
【表３】
0005449202.tif 000006
ランタイム：４．０分
【００６７】
質量分析
計器は、ＭＳ１に関する単位分解能（０．７Ｄａ  ＦＷＨＭ）およびＭＳ２に関する分解能（０．８−０．９Ｄａ  ＦＷＨＭ）について調整した。
ＭＳ条件
極性                          ＥＳ＋
キャピラリー（ｋＶ）            ２．５
コーン（Ｖ）                  ２４．００  
エクストラクター（Ｖ）          ３．００
ＲＦ（Ｖ）                      ０．１
ソース温度（℃）            １２０
脱溶媒和温度（℃）          ３５０
コーンガス流量（Ｌ／Ｈｒ）    ５０
脱溶媒和ガス流量（Ｌ／Ｈｒ）  ９００
衝突ガス流量（ｍＬ／ｍｉｎ）    ０．１５
ＬＭ１分解能                    １４．９
ＨＭ１分解能                    １４．９
イオンエネルギー１              ０．１
ＭＳＭＳモード注入口            ０．００
ＭＳＭＳモード衝突エネルギー    １２．００
ＭＳＭＳモード出口              ０．５０
ＬＭ２分解能                    １３．５
ＨＭ２分解能                    １３．５
イオンエネルギー２              １．０
ＭＲＭ遷移
【００６８】
【表４】
0005449202.tif 000007
スキャン間スキャン遅延（ｓｅｃ）：０．０２
スキャン間チャンネル遅延（ｓｅｃ）：０．０１
【００６９】
Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＨＬＢ  μＥｌｕｔｉｏｎ  ＳＰＥ抽出
このＳＰＥ抽出ステップは、ＯＡＳＩＳ（登録商標）（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  ＵＳＡ）の商標で販売されている親水性−親油性バランスを有する有機ポリマー収着剤を有する９６ウエルデバイスを特徴とする。
サンプル調製：
血清１５０μＬを２ｍＬディープウエルの９６ウエルプレートに加える
ＩＳ２０μＬを加える：２５０ｎｇ／ｍＬのｄ６−２５（ＯＨ）ビタミンＤ３（６０％ＭｅＯＨ／４０％ＩＰＡ）
１０秒間ボルテックスする
０．２Ｍ  ＺｎＳＯ４水溶液  １５０μＬを加える
１０秒間ボルテックスする
ＭｅＯＨ６００μＬを加える
３０秒間ボルテックスする
プレートを１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離する
上澄み液６００μＬを取り出して装填ステップのために使用する。
ＳＰＥ  Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＨＬＢ  μＥｌｕｔｉｏｎ（製品番号  １８６００１８２８ＢＡ）プロトコール：
調整：メタノール２００ｕｌ
平衡：６０％メタノール（水溶液）２００ｕｌ
サンプル装填：上記サンプル調製からの上澄み液６００ｕｌ
洗浄１：５％メタノール（水溶液）２００ｕｌ
洗浄２：６０％メタノール（水溶液）２００ｕｌ
溶離１：６０／４０  メタノール／ＩＰＡ  ８０ｕｌ
溶離２：Ｗａｔｅｒ（登録商標）４０ｕｌ
（Ｗａｔｅｒｓ（登録商標）１ｍｌ９６ウエルプレート中に溶離する）
プレートウエルを混合する（１８０秒間ボルテックスする）
２０μＬをカラムに注入する。
【００７０】
こうして、本発明の実施形態が、本明細書の教示から逸脱することなく本発明が変更および改変され得るとの理解の下に記載されてきた。したがって、本発明は正確な詳細に限定されてはならず、むしろ続く特許請求の範囲の主題およびその同等物を包含するべきである。
【図１】
0005449202.tif 000008