(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号７のアミノ酸配列と９０％以上同一であるアミノ酸配列からなる、β−ガラクトシダーゼ。
【請求項２】
請求項１に記載のβ−ガラクトシダーゼの断片であって、β−ガラクトシダーゼ活性を示し、かつ配列番号８のアミノ酸配列と９０％以上同一であるアミノ酸配列からなる、β−ガラクトシダーゼ。
【請求項３】
以下の(a)〜(e)からなる群より選択されるいずれかのDNAからなるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子：
(a)配列番号６又は７のアミノ酸配列をコードするDNA；
(b)配列番号５の配列を含むDNA；
(c)配列番号５の配列に相補的な配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA；
(d)配列番号５の配列のDNA配列縮重体であるDNA；
(e)配列番号５の配列を基準として１若しくは複数の塩基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含む配列からなり、β−ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
【請求項４】
β−ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質が、配列番号７のアミノ酸配列において10％未満の変化を生じている配列からなる、請求項３に記載のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子。
【請求項５】
前記変化が保存的アミノ酸置換である、請求項４に記載のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子。
【請求項６】
請求項３〜５のいずれか一項に記載のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子がコードするβ−ガラクトシダーゼ。
【請求項７】
請求項３〜５のいずれか一項に記載のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項８】
発現ベクターである、請求項７に記載の組換えベクター。
【請求項９】
請求項３〜５のいずれか一項に記載のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が導入されている形質転換体。
【請求項１０】
請求項７又は８に記載の組換えベクターが導入されている形質転換体。
【請求項１１】
細菌細胞、酵母細胞又は真菌細胞である、請求項９又は１０に記載の形質転換体。
【請求項１２】
以下のステップ(1)及び(2)を含む、β−ガラクトシダーゼの製造法：
(1)請求項９〜１１のいずれか一項に記載の形質転換体を、前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子がコードするタンパク質が産生される条件下で培養するステップ；
(2)産生された前記タンパク質を回収するステップ。
【請求項１３】
請求項１、２及び６のいずれか一項に記載のβ−ガラクトシダーゼを有効成分とする酵素剤。
【請求項１４】
前記有効成分が、配列番号７のアミノ酸配列を含むβ−ガラクトシダーゼ、及び配列番号８のアミノ酸配列を含むβ−ガラクトシダーゼからなる群より選択される一以上のβ−ガラクトシダーゼである、請求項１３に記載の酵素剤。
【請求項１５】
低乳糖牛乳、腸内ビフィズス菌増殖因子であるガラクトオリゴ糖、乳糖不耐症患者のための医薬又はサプリメントからなる群より選択される製品の製造のための、請求項１、２及び６のいずれか一項に記載のβ−ガラクトシダーゼ又は請求項１３若しくは１４に記載の酵素剤の使用。
【請求項１６】
請求項１、２及び６のいずれか一項に記載のβ−ガラクトシダーゼ又は請求項１３若しくは１４に記載の酵素剤を有効成分とする医薬又はサプリメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はβ-ガラクトシダーゼに関する。詳しくは、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）から単離された新規なβ-ガラクトシダーゼ及びその遺伝子並びにその用途等に関する。本発明のβ-ガラクトシダーゼは例えば、低乳糖牛乳の製造や、腸内ビフィズス菌増殖因子であるガラクトオリゴ糖の製造、或いは乳糖不耐症患者のための医薬又はサプリメントの有効成分として利用される。本出願は、２００９年６月５日に出願された日本国特許出願第２００９−１３６７３５号に基づく優先権を主張するものであり、当該特許出願の全内容は参照により援用される。
【背景技術】
【０００２】
β-ガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２３）は、β−Ｄ−ガラクトシド結合を加水分解してＤ−ガラクトースを遊離する酵素であり、一般に微生物および動植物中に広く存在している。β−ガラクトシダーゼは別名ラクターゼとも呼ばれ、乳糖不耐症用の低乳糖牛乳やチーズ製造時に副産する乳清からのホエーシロップの製造用の酵素として、或いは乳糖不耐症患者用の医薬やサプリメントの有効成分として用いられている。また、β−ガラクトシダーゼはガラクトシド結合を転移させる能力をも有しており、この能力を利用してガラクトオリゴ糖（ガラクトース残基を有するオリゴ糖）を製造する方法が知られている。これらの用途に用いられるβ-ガラクトシダーゼとして麹菌アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、酵母クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、クルイベロマイセス・マルキナス（K. marxinus）や細菌バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）などが知られている。【０００３】
この中で、バチルス・サーキュランスのβ-ガラクトシダーゼについては、Mozafferら（非特許文献１）、Vetereら（非特許文献２）、Itoら（非特許文献３、４）によって研究されている。非特許文献１によれば、分子量240 kDaと160 kDaの2種類の酵素の精製が報告されている。そして、前者は分解活性が高く、後者はガラクトース転移活性が高いこと、また前者はラクトースに対する分解活性に比べ合成基質p-ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシド(ONPG)に対する分解活性が高いことが報告されている。一方、非特許文献２によれば分子量212 kDa、145 kDa及び86 kDaの3種類の酵素の精製が報告されている。しかしながら、これら複数の酵素の相互の蛋白質化学的相関や分子生物学的（遺伝子的）特性が明らかではなかった。また、非特許文献３、４においては67 kDaの酵素の遺伝子クローニングと組換え蛋白質の性質が報告されているが、当該酵素は、β-1,3結合に特異的な酵素であり、牛乳中のラクトース中の結合であるβ-1,4結合には作用しない。よって、牛乳や牛乳由来の乳糖の処理に使用される通常のβ-ガラクトシダーゼとは異なるものである。また、ジェンバンク（GenBank）にはバチルス・サーキュランス由来のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子が2種類（ジェンバンク・アセッション・ナンバー（GenBank accession number） L03424及びL03425）登録されているが、これらについては遺伝子配列について報告されているのみで、実際に活性のある蛋白質をコードしているか定かではない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Mozaffar, Z., Nakanishi, K., Matsuno, R., and Kamikubo, T. Agric. Biol. Chem., 48(12), 3053-3061, 1984
【非特許文献２】Vetere, A., and Paoletti, S. Biochem. Biophys. Acta., 1380, 223-231 (1998)
【非特許文献３】Ito. Y., and Sasaki, T. Biosci. Biotech. Biochem., 61(8), 1270-1276 (1997)
【非特許文献４】Fujimoto, H., Miyasato, M., Ito, Y., Sasaki, T., and Ajisaka, K. Glycoconjugate Journal, 15, 1550160 (1998)
【非特許文献５】Saito, and Miura. Biochim. Biophys. Acta, 72, 619-629 (1963)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
この様にバチルス・サーキュランス由来のβ-ガラクトシダーゼとして複数の酵素が報告されているが、これらの相互の蛋白質化学的相関や分子生物学的（遺伝子的）特性が明らかではなかったため、低乳糖牛乳の製造やガラクトオリゴ糖の製造など、産業上のそれぞれの用途にあった酵素剤を製造する上において制限があった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、バチルス・サーキュランス由来の新規なβ-ガラクトシダーゼを提供する。本発明者らは、バチルス・サーキュランスの生産するβ-ガラクトシダーゼを研究する過程において、これまでに報告されていなかった分子量195 kDa（SDS-PAGEによる。質量分析では189.3 kDa）の酵素（本明細書において「β-Gal1」と呼称する）を見出すとともに、当該酵素をコードする遺伝子（以下、「本遺伝子」という）をクローニングすることにも成功した。そして本遺伝子の塩基配列及びそれから推定されるアミノ酸配列は、これまで報告されてきたバチルス・サーキュランス由来の3種のβ-ガラクトシダーゼ（アミノ酸配列について非特許文献３を参照。GenBank accession No. L03424及びL03425）と大きく相違する、新規なものであることが判明した。また本発明者らは、バチルス・サーキュランスが合成基質2-ニトロフェニルβ-D-ガラクトピラノシド（2-nitrophenyl β-D-Galactopyranoside：ONPG）に対する分解活性が低く、即ちガラクトシル転移活性が高い酵素を3種類（本明細書において「β-Gal2」、「β-Gal3」、「β-Gal4」と呼称する）生産することも見出した。さらには、これら3種類のβ-ガラクトシダーゼが本遺伝子（β-Gal1をコードする遺伝子）から派生して生産されることも見出した。加えて、本遺伝子及び本遺伝子の断片を適当な宿主に導入することにより、これらのβ-ガラクトシダーゼ蛋白質群の製造法も確立した。
本発明は以上の成果に基づき完成されたものである。以下に本発明を示す。
［１］分子量が195 kDa（SDS-PAGEによる）である、バチルス・サーキュランス由来のβ−ガラクトシダーゼ。
［２］［１］に記載のβ−ガラクトシダーゼの断片からなる、バチルス・サーキュランス由来のβ−ガラクトシダーゼ。
［３］配列番号７のアミノ酸配列、又はβ−ガラクトシダーゼ活性を示すその断片からなる、β−ガラクトシダーゼ。
［４］前記断片が、配列番号７のアミノ酸配列の内、N末端からWSIGNEIY（配列番号１８）までの領域を含む、［３］に記載のβ−ガラクトシダーゼ。
［５］前記断片が、配列番号８〜１０のいずれかの配列番号のアミノ酸配列を含む、［３］に記載のβ−ガラクトシダーゼ。
［６］配列番号５の配列を含むDNAによってコードされる、［３］に記載のβ−ガラクトシダーゼ。
［７］以下の(a)〜(e)からなる群より選択されるいずれかのDNAからなるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子：
(a)配列番号６又は７のアミノ酸配列をコードするDNA；
(b)配列番号５の配列を含むDNA；
(c)配列番号５の配列に相補的な配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA；
(d)配列番号５の配列のDNA配列縮重体であるDNA；
(e)配列番号５の配列を基準として１若しくは複数の塩基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含む配列からなり、β−ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
［８］β−ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質が、配列番号７のアミノ酸配列において60％未満、好ましくは45％未満、更に好ましくは25％未満の変化を生じている配列又はその断片からなる、［７］に記載のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子。
［９］前記変化が保存的アミノ酸置換である、［８］に記載のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子。
［１０］［７］〜［９］のいずれか一項に記載のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子がコードするβ−ガラクトシダーゼ。
［１１］［７］〜［９］のいずれか一項に記載のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む組換えベクター。
［１２］発現ベクターである、［１１］に記載の組換えベクター。
［１３］［７］〜［９］のいずれか一項に記載のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が導入されている形質転換体。
［１４］［１１］又は［１２］に記載の組換えベクターが導入されている形質転換体。
［１５］細菌細胞、酵母細胞又は真菌細胞である、［１３］又は［１４］に記載の形質転換体。
［１６］以下のステップ(1)及び(2)を含む、β−ガラクトシダーゼの製造法：
(1)［１３］〜［１５］のいずれか一項に記載の形質転換体を、前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子がコードするタンパク質が産生される条件下で培養するステップ；
(2)産生された前記タンパク質を回収するステップ。
［１７］［１］〜［６］及び［１０］のいずれか一項に記載のβ−ガラクトシダーゼを有効成分とする酵素剤。
［１８］前記有効成分が、配列番号７のアミノ酸配列を含むβ−ガラクトシダーゼ、配列番号８のアミノ酸配列を含むβ−ガラクトシダーゼ、配列番号９のアミノ酸配列を含むβ−ガラクトシダーゼ、及び配列番号１０のアミノ酸配列を含むβ−ガラクトシダーゼからなる群より選択される一以上のβ−ガラクトシダーゼである、［１７］に記載の酵素剤。
［１９］低乳糖牛乳、腸内ビフィズス菌増殖因子であるガラクトオリゴ糖、乳糖不耐症患者のための医薬又はサプリメントからなる群より選択される製品の製造のための、［１］〜［６］及び［１０］のいずれか一項に記載のβ−ガラクトシダーゼ又は［１７］若しくは［１８］に記載の酵素剤の使用。
［２０］［１］〜［６］及び［１０］のいずれか一項に記載のβ−ガラクトシダーゼ又は［１７］若しくは［１８］に記載の酵素剤を使用して得られた、低乳糖牛乳、腸内ビフィズス菌増殖因子であるガラクトオリゴ糖、乳糖不耐症患者のための医薬又はサプリメント。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、バチルス・サーキュランス由来のβ−ガラクトシダーゼ粗酵素溶液のハイドロキシアパタイト・クロマトグラフィーの溶出パターンである。280nmの吸光度は蛋白質を、420nmの吸光度はONPG法で測定したβ-ガラクトシダーゼ活性をそれぞれ表す。
【図２】図２は、得られた画分１（図１を参照）のアフィニティー・クロマトグラフィーによる溶出パターンである。280nmの吸光度は蛋白質濃度を、420nmの吸光度はONPG法で測定したβ-ガラクトシダーゼ活性をそれぞれ表す。
【図３】図３は、得られた画分２（図１を参照）のアフィニティー・クロマトグラフィーによる溶出パターンである。280nmの吸光度は蛋白質濃度を、420nmの吸光度はONPG法で測定したβ-ガラクトシダーゼ活性をそれぞれ表す。
【図４】図４は、4種の精製されたβ-ガラクトシダーゼβ-Gal1（レーン３）、β-Gal2（レーン４）、β-Gal3（レーン５）及びβ-Gal4（レーン６）のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果である。レーン２には粗酵素粉末を供した。左端には使用した分子量マーカー（レーン１及び７）の分子量を表す。
【図５】図５は、大腸菌形質転換体の細胞破砕物の遠心上清のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果である。レーン１はβ-Gal1、レーン２はβ-Gal2、レーン３はβ-Gal3、レーン４はβ-Gal4である。レーン５及び６は、大腸菌ベクター形質転換体の細胞破砕物の遠心上清である。矢印は、発現したβ-ガラクトシダーゼ蛋白質を示す。左端には使用した分子量マーカー（レーンM）の分子量を表す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
（用語）
本発明において「アミノ酸配列をコードするDNA」とは、それを発現させた場合に当該アミノ酸配列を有するタンパク質が得られるDNA、即ち、当該アミノ酸配列に対応する塩基配列を有するDNAのことをいう。従ってコドンの縮重も考慮される。
【０００９】
本明細書において用語「単離された」は「精製された」と交換可能に使用される。本発明の酵素（β−ガラクトシダーゼ）に関して使用する場合の「単離された」とは、本発明の酵素が天然材料に由来する場合、当該天然材料の中で当該酵素以外の成分を実質的に含まない（特に夾雑タンパク質を実質的に含まない）状態をいう。具体的には例えば、本発明の単離された酵素では、夾雑タンパク質の含有量は重量換算で全体の約20％未満、好ましくは約10％未満、更に好ましくは約5％未満、より一層好ましくは約1％未満である。一方、本発明の酵素が遺伝子工学的手法によって調製されたものである場合の用語「単離された」とは、使用された宿主細胞に由来する他の成分や培養液等を実質的に含まない状態をいう。具体的には例えば、本発明の単離された酵素では夾雑成分の含有量は重量換算で全体の約20％未満、好ましくは約10％未満、更に好ましくは約5％未満、より一層好ましくは約1％未満である。尚、それと異なる意味を表すことが明らかでない限り、本明細書において単に「β−ガラクトシダーゼ」と記載した場合は「単離された状態のβ−ガラクトシダーゼ」を意味する。β−ガラクトシダーゼの代わりに使用される用語「本酵素」についても同様である。
【００１０】
DNAについて使用する場合の「単離された」とは、もともと天然に存在しているDNAの場合、典型的には、天然状態において共存するその他の核酸から分離された状態であることをいう。但し、天然状態において隣接する核酸配列（例えばプロモーター領域の配列やターミネーター配列など）など一部の他の核酸成分を含んでいてもよい。例えばゲノムDNAの場合の「単離された」状態では、好ましくは、天然状態において共存する他のDNA成分を実質的に含まない。一方、cDNA分子など遺伝子工学的手法によって調製されるDNAの場合の「単離された」状態では、好ましくは、細胞成分や培養液などを実質的に含まない。同様に、化学合成によって調製されるDNAの場合の「単離された」状態では、好ましくは、dNTPなどの前駆体（原材料）や合成過程で使用される化学物質等を実質的に含まない。尚、それと異なる意味を表すことが明らかでない限り、本明細書において単に「DNA」と記載した場合には単離された状態のDNAを意味する。
【００１１】
β−ガラクトシダーゼは一般にラクトース分解活性（β−1,4結合に作用してラクトースを分解する活性）とガラクトシル転移活性（ガラクトースを転移する活性）を示す。そこで、本発明における「β−ガラクトシダーゼ活性」は当該二つの活性を含むものとする。ラクトース分解活性は実施例に示したラクトース法によって測定することができる。他方のガラクトシル転移活性は、実施例に示したONPG法による活性値と同ラクトース法による活性値の比を指標にして、表すことができる。[実施例に示したONPG法による活性値／同ラクトース法による活性値]の値が小さい方が、転移活性が高いことが知られている（非特許文献１）。
【００１２】
本発明における「分子量」とは、特に断りのない場合は、SDS-PAGE（SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）で測定される分子量をいう。
【００１３】
（β−ガラクトシダーゼ）
本発明の第１の局面は本発明者らが単離及び特徴付けに成功した、バチルス・サーキュランス由来のβ−ガラクトシダーゼを提供する。本発明のβ−ガラクトシダーゼは一態様において、その分子量が195 kDa（SDS-PAGEによる）である。本発明者らは、本β-ガラクトシダーゼを単離精製する過程において、他に分子量135 kDaのβ-ガラクトシダーゼ（β-Gal2）、86 kDaのβ-ガラクトシダーゼ（β-Gal3）及び160 kDaのβ-ガラクトシダーゼ（β-Gal4）（いずれもSDS-PAGEによる）が生産されていることを見出すととともに、これら3種類のβ-ガラクトシダーゼがいずれも一つの遺伝子から派生することを見出した。一方で、実際、C末端領域を半分以上欠失させた遺伝子が活性のあるβ-ガラクトシダーゼを発現することを確認した。これらの知見に基づき本発明は他の態様として、上記β−ガラクトシダーゼ（分子量が195 kDaのバチルス・サーキュランス由来のβ−ガラクトシダーゼ）の断片（以下、「本断片」という）からなるβ−ガラクトシダーゼを提供する。β−ガラクトシダーゼ活性を示す限りにおいて、本断片の長さは特に限定されないが、基準となるタンパク質の例えば5〜98％、好ましくは40〜95％、最も好ましくは55〜75％のタンパク質を含む。また、基準となるタンパク質のＮ末端領域を含有することが好ましい。本断片の具体例は、本発明者らが見出した分子量135 kDaのβ-ガラクトシダーゼ（β-Gal2）、86 kDaのβ-ガラクトシダーゼ（β-Gal3）及び160 kDaのβ-ガラクトシダーゼ（β-Gal4）である。
【００１４】
本断片はプロテアーゼ処理によっても得ることが出来る。例えば、精製した上記β−ガラクトシダーゼ（分子量が195 kDaのバチルス・サーキュランス由来のβ−ガラクトシダーゼ）をプロテアーゼ処理に供することによって本断片を得る。或いは、上記β−ガラクトシダーゼを含む、バチルス・サーキュランスの培養液をプロテアーゼで処理することによって本断片を得ることにしてもよい。使用するプロテアーゼに特段の制限はない。例えば、市販のプロテアーゼ剤や、バチルス・サーキュランスの生産する内在性のプロテアーゼを用いることができる。
【００１５】
本発明のβ−ガラクトシダーゼは一態様において配列番号７のアミノ酸配列を含む。当該アミノ酸配列は配列番号６のアミノ酸配列からシグナルペプチド部分を除いたものである。尚、配列番号６のアミノ酸配列は、バチルス・サーキュランスからクローニングして得られた遺伝子の塩基配列（配列番号５）から推定されたアミノ酸配列である。配列番号７のアミノ酸配列を有する本発明のβ-ガラクトシダーゼは、アミノ酸数の相違と相同性の低さ（10〜12％）から、これまで報告されていた3種類のバチルス・サーキュランス由来β−ガラクトシダーゼとは明らかに異なる、新規な酵素である。
【００１６】
本発明の他の一態様は、配列番号７のアミノ酸配列の断片からなるβ−ガラクトシダーゼである。ここで断片は、好ましくは、配列番号７のアミノ酸配列の内、N末端からWSIGNEIY（配列番号１８）までの領域を含む。当該部分配列（WSIGNEIY）は、推定活性領域である。断片の具体例として、配列番号８〜１０のいずれかの配列番号のアミノ酸配列を有するものを挙げることができる。配列番号８のアミノ酸配列はGal2に対応し、配列番号９のアミノ酸配列はGal3に対応し、配列番号１０のアミノ酸配列はGal4に対応する。
【００１７】
一般に、あるタンパク質のアミノ酸配列の一部に改変を施した場合において改変後のタンパク質が改変前のタンパク質と同等の機能を有することがある。即ちアミノ酸配列の改変がタンパク質の機能に対して実質的な影響を与えず、タンパク質の機能が改変前後において維持されることがある。この技術常識を考慮すれば、本発明のβ−ガラクトシダーゼ（配列番号７〜１０のいずれかのアミノ酸配列からなる）と比較した場合に、アミノ酸配列の僅かな相違が認められるものの、β−ガラクトシダーゼとしての機能に実質的な差が認められないものは、上記β−ガラクトシダーゼと実質同一の酵素とみなすことができる。ここでの「アミノ酸配列の僅かな相違」とは、典型的には、アミノ酸配列を構成する１〜数個（上限は例えば３個、５個、７個、１０個）のアミノ酸の欠失、置換、若しくは１〜数個（上限は例えば３個、５個、７個、１０個）のアミノ酸の付加、挿入、又はこれらの組合せによりアミノ酸配列に変異（変化）が生じていることをいう。「実質同一の酵素」のアミノ酸配列と、基準となる上記β−ガラクトシダーゼのアミノ酸配列との同一性（％）は、好ましくは90%以上であり、更に好ましくは95%以上であり、更に更に好ましくは98%以上であり、最も好ましくは99%以上である。尚、アミノ酸配列の相違は複数の位置で生じていてもよい。
【００１８】
「アミノ酸配列の僅かな相違」は、好ましくは保存的アミノ酸置換により生じている。ここでの「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することをいう。アミノ酸残基はその側鎖によって塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のように、いくつかのファミリーに分類されている。保存的アミノ酸置換は好ましくは、同一のファミリー内のアミノ酸残基間の置換である。
【００１９】
ここで、二つのアミノ酸配列の同一性（％）は例えば以下の手順で決定することができる。まず、最適な比較ができるよう二つの配列を並べる（例えば、第一の配列にギャップを導入して第二の配列とのアライメントを最適化してもよい）。第一の配列の特定位置の分子（アミノ酸残基）が、第二の配列における対応する位置の分子と同じであるとき、その位置の分子が同一であるといえる。配列同一性は、その二つの配列に共通する同一位置の数の関数であり（すなわち、同一性（％）＝同一位置の数／位置の総数 × 100）、好ましくは、アライメントの最適化に要したギャップの数およびサイズも考慮に入れる。二つの配列の比較及び同一性の決定は数学的アルゴリズムを用いて実現可能である。配列の比較に利用可能な数学的アルゴリズムの具体例としては、KarlinおよびAltschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68に記載され、KarlinおよびAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77において改変されたアルゴリズムがあるが、これに限定されることはない。このようなアルゴリズムは、Altschulら (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10に記載のNBLASTプログラムおよびXBLASTプログラム（バージョン2.0）に組み込まれている。例えば、XBLASTプログラムでscore = 50、wordlength = 3としてBLASTポリペプチド検索を行えば、同一性の高いアミノ酸配列を得ることが可能である。比較のためのギャップアライメントを得るためには、Altschulら (1997) Amino Acids Research 25(17):3389-3402に記載のGapped BLASTが利用可能である。BLASTおよびGapped BLASTを利用する場合は、対応するプログラム（例えばXBLASTおよびNBLAST）のデフォルトパラメータを使用することができる。詳しくは例えばNCBIのウェブページを参照されたい。配列の比較に利用可能な他の数学的アルゴリズムの例としては、MyersおよびMiller (1988) Comput Appl Biosci. 4:11-17に記載のアルゴリズムがある。このようなアルゴリズムは、例えばGENESTREAMネットワークサーバー（IGH Montpellier、フランス）またはISRECサーバーで利用可能なALIGNプログラムに組み込まれている。アミノ酸配列の比較にALIGNプログラムを利用する場合は例えば、PAM120残基質量表を使用し、ギャップ長ペナルティ＝12、ギャップペナルティ＝4とすることができる。二つのアミノ酸配列の同一性を、GCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムを用いて、Blossom 62マトリックスまたはPAM250マトリックスを使用し、ギャップ加重＝12、10、8、6、又は4、ギャップ長加重＝2、3、又は4として決定することができる。
【００２０】
（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）
本発明の第２の局面はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子に関する。一態様において本発明の遺伝子は、配列番号６又は７のアミノ酸配列をコードするDNAを含む。当該態様の具体例は、配列番号５の塩基配列からなるDNAである。
【００２１】
ところで、一般に、あるタンパク質をコードするDNAの一部に改変を施した場合において、改変後のDNAがコードするタンパク質が、改変前のDNAがコードするタンパク質と同等の機能を有することがある。即ちDNA配列の改変が、コードするタンパク質の機能に実質的に影響を与えず、コードするタンパク質の機能が改変前後において維持されることがある。そこで本発明は他の態様として、配列番号５の塩基配列と等価な塩基配列を有し、β−ガラクトシダーゼ活性をもつタンパク質をコードするDNA（以下、「等価DNA」ともいう）を提供する。ここでの「等価な塩基配列」とは、配列番号５に示す核酸と一部で相違するが、当該相違によってそれがコードするタンパク質の機能（ここではβ−ガラクトシダーゼ活性）が実質的な影響を受けていない塩基配列のことをいう。
【００２２】
等価DNAの具体例は、配列番号５の塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAである。ここでの「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このようなストリンジェントな条件は当業者に公知であって例えばMolecular Cloning（Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)やCurrent protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987）を参照して設定することができる。ストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液（50％ホルムアミド、10×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、5×Denhardt溶液、1％ SDS、10％ デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いて約42℃〜約50℃でインキュベーションし、その後0.1×SSC、0.1％ SDSを用いて約65℃〜約70℃で洗浄する条件を挙げることができる。更に好ましいストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液として50％ホルムアミド、5×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、1×Denhardt溶液、1％SDS、10％デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いる条件を挙げることができる。
【００２３】
等価DNAの他の具体例として、配列番号５に示す塩基配列を基準として１若しくは複数（好ましくは１〜数個）の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含む塩基配列からなり、β−ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAを挙げることができる。塩基の置換や欠失などは複数の部位に生じていてもよい。ここでの「複数」とは、当該DNAがコードするタンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置や種類によっても異なるが例えば２〜４０塩基、好ましくは２〜２０塩基、より好ましくは２〜１０塩基である。以上のような等価DNAは例えば、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやDNAリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法（Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13 ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）やランダム突然変異導入法（Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13 ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）による変異の導入などを利用して、塩基の置換、欠失、挿入、付加、及び／又は逆位を含むように、配列番号５に示す塩基配列を有するDNAを改変することによって得ることができる。また、紫外線照射など他の方法によっても等価DNAを得ることができる。
等価DNAの更に他の例として、SNP（一塩基多型）に代表される多型に起因して上記のごとき塩基の相違が認められるDNAを挙げることができる。
【００２４】
ここで、後述の実施例に示す通り、配列番号７のアミノ酸配列（Gal1）の断片である配列番号８〜１０のアミノ酸配列からなるタンパク質（Gal2、Gal3及びGal4）が高いβ−ガラクトシダーゼ活性を示した。この事実に基づき本発明の一態様は、配列番号７に示すアミノ酸配列において60％未満、好ましくは45％未満、更に好ましくは25％未満の変化を生じている配列又はその断片からなるタンパク質をコードするβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を提供する。
【００２５】
本発明の遺伝子は、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報を参考にし、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法などを用いることによって単離された状態に調製することができる。具体的には、適当なバチルス・サーキュランスのゲノムDNAライブラリー又はcDNAライブラリー、或はバチルス・サーキュランスの菌体内抽出液から、本発明の遺伝子に対して特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドプローブ・プライマーを適宜利用して調製することができる。オリゴヌクレオチドプローブ・プライマーは、市販の自動化DNA合成装置などを用いて容易に合成することができる。尚、本発明の遺伝子を調製するために用いるライブラリーの作製方法については、例えばMolecular Cloning, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照できる。
【００２６】
例えば、配列番号５の塩基配列を有する遺伝子であれば、当該塩基配列又はその相補配列の全体又は一部をプローブとしたハイブリダイゼーション法を利用して単離することができる。また、当該塩基配列の一部に特異的にハイブリダイズするようにデザインされた合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いた核酸増幅反応（例えばPCR）を利用して増幅及び単離することができる。また、配列番号６に示すアミノ酸配列や配列番号５の塩基配列の情報を元にして、化学合成によって目的とする遺伝子を得ることもできる(参考文献：Gene,60(1), 115-127 (1987))。
【００２７】
（組換えベクター）
本発明のさらなる局面は本発明のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する組換えベクターに関する。本明細書において用語「ベクター」は、それに挿入された核酸分子を細胞等のターゲット内へと輸送することができる核酸性分子をいい、その種類、形態は特に限定されるものではない。従って、本発明のベクターはプラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター（アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等）の形態をとり得る。
使用目的（クローニング、タンパク質の発現）に応じて、また宿主細胞の種類を考慮して適当なベクターが選択される。ベクターの具体例を挙げれば、大腸菌を宿主とするベクター（M13ファージ又はその改変体、λファージ又はその改変体、pBR322又はその改変体（pB325、pAT153、pUC8など）など）、酵母を宿主とするベクター（pYepSec1、pMFa、pYES2等、昆虫細胞を宿主とするベクター（pAc、pVLなど）、哺乳類細胞を宿主とするベクター（pCDM8、pMT2PCなど)等である。
【００２８】
本発明の組換えベクターは好ましくは発現ベクターである。「発現ベクター」とは、それに挿入された核酸を目的の細胞（宿主細胞）内に導入することができ、且つ当該細胞内において発現させることが可能なベクターをいう。発現ベクターは通常、挿入された核酸の発現に必要なプロモーター配列や発現を促進させるエンハンサー配列等を含む。選択マーカーを含む発現ベクターを使用することもできる。かかる発現ベクターを用いた場合には選択マーカーを利用して発現ベクターの導入の有無（及びその程度）を確認することができる。
【００２９】
本発明の遺伝子のベクターへの挿入、選択マーカー遺伝子の挿入（必要な場合）、プロモーターの挿入（必要な場合）等は標準的な組換えDNA技術（例えば、Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照することができる、制限酵素及びDNAリガーゼを用いた周知の方法）を用いて行うことができる。
【００３０】
（形質転換体）
本発明は更に、本発明の遺伝子が導入された宿主細胞（形質転換体）に関する。本発明の形質転換体では、本発明の遺伝子が外来性の分子として存在することになる。本発明の形質転換体は、好ましくは、上記本発明のベクターを用いたトランスフェクション乃至はトランスフォーメーションによって調製される。トランスフェクション、トランスフォーメーションはリン酸カルシウム共沈降法、エレクトロポーレーション(Potter, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 7161-7165(1984))、リポフェクション(Felgner, P.L. et al.,  Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84,7413-7417(1984))、マイクロインジェクション(Graessmann, M. & Graessmann,A., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73,366-370(1976))、Hanahanの方法(Hanahan, D., J. Mol. Biol. 166, 557-580(1983))、酢酸リチウム法(Schiestl, R.H. et al., Curr. Genet. 16, 339-346(1989))、プロトプラスト−ポリエチレングリコール法(Yelton, M.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 1470-1474(1984))等によって実施することができる。
【００３１】
宿主細胞は、本発明のβ-ガラクトシダーゼが発現する限りにおいて特に限定されず、例えばBacillus subtillus、Bacillus likemiformis、Bacillus circulansなどのBacillus属細菌、Lactococcus、Lactobacillus、Streptococcus、Leuconostoc、Bifidobacteriumなどの乳酸菌、Escherichia、Streptomycesなどのその他の細菌、Saccharomyces、Kluyveromyces、Candida、Torula、Torulopsis、などの酵母、Aspergillus oryzae、Aspergillus nigerなどのAspergillus属、Penicillium属、Trichoderma属、Fusarium属などの糸状菌（真菌）などより選択される。
【００３２】
（β−ガラクトシダーゼの製造法）
本発明の更なる局面はβ−ガラクトシダーゼの製造法を提供する。本発明の製造法の一態様では上記の形質転換体を用いてβ−ガラクトシダーゼを製造する。この態様の製造法ではまず、それに導入された遺伝子によってコードされるタンパク質が産生される条件下で上記の形質転換体を培養する（ステップ(1)）。様々なベクター宿主系に関して形質転換体の培養条件が公知であり、当業者であれば適切な培養条件を容易に設定することができる。
【００３３】
培養法及び培養条件は、目的のタンパク質であるβ−ガラクトシダーゼが生産されるものである限り特に限定されない。即ち、β−ガラクトシダーゼが生産されることを条件として、使用する微生物の培養に適合した方法や培養条件を適宜設定できる。培養法としては液体培養、固体培養のいずれでも良いが、好ましくは液体培養が利用される。液体培養を例にとり、その培養条件を説明する。
【００３４】
培地としては、使用する形質転換体が生育可能な培地であれば、如何なるものでも良い。例えば、グルコース、シュクロース、ゲンチオビオース、可溶性デンプン、グリセリン、デキストリン、糖蜜、有機酸等の炭素源、更に硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、あるいは、ペプトン、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、ふすま、肉エキス等の窒素源、更にカリウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、鉄塩、亜鉛塩等の無機塩を添加したものを用いることができる。使用する形質転換体の生育を促進するためにビタミン、アミノ酸などを培地に添加してもよい。培地のｐＨは例えば約３〜１０、好ましくは約７〜８程度に調整し、培養温度は通常約１０〜５０℃、好ましくは約２０〜３７℃程度で、１〜７日間、好ましくは３〜４日間程度好気的条件下で培養する。培養法としては例えば振盪培養法、ジャー・ファーメンターによる好気的深部培養法が利用できる。
【００３５】
培養ステップに続き、産生されたタンパク質（β−ガラクトシダーゼ）を回収する（ステップ(2)）。培養液から回収する場合には、例えば培養上清をろ過、遠心処理等することによって不溶物を除去した後、限外ろ過膜による濃縮、硫安沈殿等の塩析、透析、イオン交換樹脂等の各種クロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて分離、精製を行うことにより本酵素を得ることができる。他方、菌体内から回収する場合には、例えば菌体を加圧処理、超音波処理などによって破砕した後、上記と同様に分離、精製を行うことにより目的のタンパク質を得ることができる。尚、ろ過、遠心処理などによって予め培養液から菌体を回収した後、上記一連の工程（菌体の破砕、分離、精製）を行ってもよい。
【００３６】
β−ガラクトシダーゼの精製度は特に限定されない。また、最終的な形態は液体状であっても固体状（粉体状を含む）であってもよい。
【００３７】
（酵素剤）
本発明のβ−ガラクトシダーゼは例えば酵素剤の形態で提供される。酵素剤は、有効成分（本発明のβ−ガラクトシダーゼ）の他、賦形剤、緩衝剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水などを含有していてもよい。賦形剤としては乳糖、ソルビトール、D-マンニトール、白糖等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等と用いることができる。
【００３８】
本発明の酵素剤の一態様では、有効成分として、配列番号７のアミノ酸配列を含むβ−ガラクトシダーゼ、配列番号８のアミノ酸配列を含むβ−ガラクトシダーゼ、配列番号９に示すアミノ酸配列を含むβ−ガラクトシダーゼ、及び配列番号１０に示すアミノ酸配列を含むβ−ガラクトシダーゼからなる群より選択される一以上のβ−ガラクトシダーゼが用いられる。一態様として、これら４種類のβ−ガラクトシダーゼを全て含む酵素剤が提供される。
【００３９】
（β−ガラクトシダーゼの用途）
本発明の更なる局面は本発明のβ−ガラクトシダーゼ又は酵素剤の用途を提供する。用途の例は、低乳糖牛乳の製造、腸内ビフィズス菌増殖因子であるガラクトオリゴ糖の製造、或いは乳糖不耐症患者のための医薬やサプリメントの製造である。本発明のβ−ガラクトシダーゼ又は酵素剤の使用によって原材料中の乳糖を低減することができる。例えば、生乳1mLに対して1Uのβ−ガラクトシダーゼを添加し、10℃の低温下で放置することによって、乳糖が分解され、低乳糖牛乳が得られる。ガラクトオリゴ糖の製造においては、例えば、予め加熱溶解させた40％乳糖液（pH 7.0）に100LUのβ-ガラクトシダーゼを加え、40℃、5時間放置し、ガラクトオリゴ糖を生成させる。尚、ガラクトオリゴ糖はGal-(Gal)n-Glc（nは通常0〜3）で表される（Gal：ガラクトース残基、Glc：グルコース残基）。結合様式にはβ1-6、β1-3、β1-4、β1-2の他、α1-3、α1-6などがある。
【実施例】
【００４０】
１．バチルス・サーキュランス由来のβ-ガラクトシダーゼの精製
(a)β-ガラクトシダーゼ活性測定法
以下の精製においては、β-ガラクトシダーゼ活性測定は2-ニトロフェニルβ-D-ガラクトピラノシド（ONPG）を基質とした方法(i)とラクトースを基質とした方法(ii)の2種類で測定した。いずれも非特許文献１に記載の方法に従って実施した。また蛋白質濃度は280nmの吸光度で表した。【００４１】
i) ONPG法
0.245% ONPGを含む100mMリン酸緩衝液（pH 6.0）1.98 mlを40℃、10分予温した。ここにサンプル20μlを添加し、40℃、10分反応後、10%炭酸ナトリウム溶液2.0 mlを加えて反応を停止した。反応液の420 nmにおける吸光度を測定し、1分間につき1μmolの2-ニトロフェノールを生成する際の活性を1Uとしてβ−ガラクトシダーゼ活性を算出した。【００４２】
ii) ラクトース法
5%ラクトースを含む100 mMリン酸緩衝液（pH 6.0）2 mlを40℃、10分予温した。ここにサンプル50μlを添加し、40℃、15分反応後、沸騰浴中で煮沸して反応を停止した。反応液100μlについてグルコスタット法にてグルコース濃度を測定した。即ち、反応液100μlに0.1 N水酸化ナトリウム溶液100μlを加えて1分間放置し、続いて0.1 N酢酸、3 mlの酢酸緩衝液（pH 5.0）を添加した。この溶液にグルコスタット液（小野薬品工業社）500μlを添加して550 nmにおける吸光度の増加速度を測定し、1分間につき1μmolのグルコースを生成する際の活性を1Uとしてラクトース分解活性を算出した。【００４３】
(b)β−ガラクトシダーゼの粗酵素粉末の調製
バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）ATCC31382を、3.0％大豆ペプトン、2.5％肉エキス、1.0％酵母エキス、0.5％乳糖を含む液体培地に接種し、30℃、3日間振とう培養した。遠心分離により菌体を除いて得られた培養上清を、限外ろ過膜（AIP-1013D、旭化成社製）に供し5倍濃縮した。得られた濃縮液を噴霧乾燥し、β−ガラクトシダーゼの粗酵素粉末を得た。【００４４】
（c）β-ガラクトシダーゼの精製
得られた粗酵素粉末を10 mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.0）中に5.0％の濃度で溶解した溶液50 mlを、同緩衝液で平衡化したヒドロキシアパタイトゲルカラム（CHTTM Ceramic hydroxyapataite、BIO-RAD社製、内径2.5 cm、長さ25 cm）に供し、10 mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.0）を用いて未吸着タンパク質を溶出させた。その後、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を100 mM、150 mM、200 mM、300 mM及び500 mMの順に変化させる段階溶出法で、酵素を溶出させた。本クロマトグラフィーは室温で行った。図１に示すように、リン酸ナトリウム緩衝液濃度が100 mM、150 mM、300-500 mMにおいてβ-ガラクトシダーゼ（ONPG）活性を示す酵素が溶出し、それぞれの画分を順に画分１、２、３とした。画分３に含まれる酵素は、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分子量195 kDaのほぼ単一の蛋白質であり、β-Gal1と呼称した。【００４５】
次に、画分１をアフィニティー・クロマトグラフィーにより分離精製を行った。先ず、画分１を50 mM 酢酸緩衝液（pH 5.8）に対して透析を行った。透析された酵素液を、同緩衝液により平衡化したアフィニティゲルカラム（p-Aminobenzyl-1-thio-β-D-galactopyranoside-agarose、Sigma社製、直径1.6 cm、長さ18 cm）にかけ、同緩衝液で未吸着タンパク質を溶出させた後に、4℃においてpHを5.8から3.5に変化させる直線勾配法（50 mM 酢酸緩衝液（pH 5.8）/50 mM 酢酸緩衝液, （pH 3.5））で溶出させた。画分１に示すように、洗浄画分とpH 4.4前後にそれぞれβ-ガラクトシダーゼ活性を有する酵素が溶出した。これらはSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動でほぼ単一のバンドを示し、分子量はそれぞれ135 kDa、86 kDaであった。前者をβ-Gal2、後者をβ-Gal3と呼称した。【００４６】
一方、画分２を、画分1と同様にアフィニティー・クロマトグラフィーにより分離精製した。画分２を50 mM酢酸緩衝液（pH 5.8）に対して透析を行い、同緩衝液により平衡化した上記アフィニティカラムに供した。図２の場合と同様に、同緩衝液で未吸着タンパク質を溶出させた後に、4℃においてpHを5.8から3.5に変化させる直線勾配法により溶出させた。図３に示すように、洗浄画分とpH 4.4前後にそれぞれβ-ガラクトシダーゼ活性を有する酵素が溶出した。これらはSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動でほぼ単一のバンドを示し、分子量はそれぞれ86 kDa、160 kDaであった。前者はβ-Gal3と同一であり、後者をβ-Gal4と呼称した。図４に、粗酵素標品（レーン2）と精製されたβ-Gal1（レーン3）、β-Gal2（レーン4）、β-Gal3（レーン5）及びβ-Gal4（レーン6）の10% SDS-PAGEの解析結果を示す。【００４７】
２．バチルス・サーキュランス由来の精製β-ガラクトシダーゼの諸性質
精製した4種類のβ-ガラクトシダーゼの主な性質を調べた。
(a）比活性の測定
基質としてONPG（終濃度0.24%）及びラクトース（終濃度4.88%）を用いた場合の活性を、40℃、100 mMリン酸緩衝液pH 6中で測定した。結果を表１に示す。なお、基質としてONPGを用いた場合は、40℃、pH6の条件で、生成物ニトロフェノール1μmolを1分間に生成する酵素量を1Uと定義し、基質としてラクトースを用いた場合は、40℃、pH6の条件で、生成物グルコース1μmolを1分間に生成する酵素量を1Uと定義した。表１に示す通り、ラクトースに対する分解活性に比べONPGに対する分解活性がβ-Gal1は高く、β-Gal２、β-Gal3及びβ-Gal4は低いことが判る。
【表１】
0005643756.tif 000002
【００４８】
(b）分子量の決定
4種類のβ-ガラクトシダーゼの分子量を、Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization, MALDI分析計を用いて求めた。サンプルは0.1μl 10 mg/ml Sinapinic acid/0.1μl 0.7-3mg/ml酵素溶液の混合溶液を用いた。結果、β-Gal1は189.283 kDa、β-Gal2は134.788 kDa、β-Gal3は91.027 kDa、β-Gal4は153.932 kDaであった（表１）。またSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で求めた分子量（図４）を表１のカッコ内に示した。質量分析計による分子量は、いずれの酵素の場合もSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動から求めた分子量に近い結果を示した。【００４９】
(c）N末端アミノ酸配列の決定
プロテインシークエンサーにより、4種類のβ-ガラクトシダーゼのN末端アミノ酸配列の解析を行った。その結果、β-Gal1には２種類の配列、GNSVSYDGERRVNFNEN（配列番号１）及びSVSYDGERRVNFNEN（配列番号１７）が含まれていることが明らかにされた。しかし、この２種類の配列は、N末端にGNが有るか否かの違いであり、基本的には同じ配列であることがわかった。またβ-Gal2、β-Gal3、β-Gal4のN末端アミノ酸配列もβ-Gal1と同様であった。【００５０】
(d）内部アミノ酸配列の決定
次にβ-Gal1、β-Gal2、β-Gal3の精製酵素を1〜2mg/mlに調製し、これにトリプシン（0.5mg/ml）を加えて37℃でインキュベートした。48時間後に8% SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。いずれの酵素からも70 kDaのバンドが検出された。泳動後のゲルをニトロセルロース膜に転写しクマージーブリリアントブルーで染色した。染色されたバンドの中から各酵素由来の70 kDaのバンドを切り出し、プロテインシーケンサーでアミノ酸配列を解析した。結果、各酵素由来の70 kDa蛋白質のN末端5残基の配列が一致した。また、β-Gal3由来の70 kDa蛋白質のN末端15残基のアミノ酸配列はEDRADVNIKTKISND（配列番号２）であった。【００５１】
３．バチルス・サーキュランス由来のβ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子断片の取得
(a)染色体DNAの単離
バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）ATCC31382の菌体から斉藤・三浦の方法（非特許文献５）により染色体DNAを調製した。【００５２】
(b)PCRによるDNAプローブの作製
２．で決定したN末端アミノ酸配列および内部アミノ酸配列をもとに2種のオリゴヌクレオチド（配列番号３、４）を合成し、PCRプライマーとした。これらのプライマーを用い、バチルス・サーキュランスの染色体DNAを鋳型として、以下の条件にてPCR反応を行った。
＜PCR 反応液＞
10×PCR反応緩衝液（TaKaRa社)  5.0μl
dNTP混合液（それぞれ2.5 mM、TaKaRa社）  8.0μl
25mM MgCl2  5.0μl
50μM センス・プライマー  0.5μl
50μM アンチセンス・プライマー  0.5μl
蒸留水  29.5μl
染色体DNA溶液（100μg/ml）  1.0μl
LA Taq DNAポリメラーゼ（TaKaRa社）  0.5μl【００５３】
＜PCR反応条件＞
ステージ1： 変性（95℃、5分）  1サイクル
ステージ2： 変性（95℃、1分）  30サイクル
アニール（52℃、1分）
伸長（72℃、1分）
ステージ3： 伸長（72℃、10分）  1サイクル【００５４】
得られた約0.6 kbのDNA断片をpGEM-Teasy（Promega社）にクローニング後、塩基配列を確認したところ、センス・プライマーの直後とアンチセンス・プライマーの直前に、上記の部分アミノ酸配列をコードする塩基配列が見出された。本DNA断片を全長遺伝子クローニングのためのDNAプローブとした。【００５５】
（c）遺伝子ライブラリーの作製
バチルス・サーキュランスの染色体DNAのサザン・ハイブリダイゼーション解析の結果、SpeI分解物中にプローブDNAとハイブリダイズする約8.2kbのシングルバンドが確認された。この約8.2kbのSpeI DNA断片をクローニングするため、以下の様に遺伝子ライブラリーを作製した。上記(a)で調製した染色体DNAのSpeI処理を行った。染色体DNA50μg、10×M 緩衝液40μl、蒸留水342.0μl、及びSpeIを8.0μl混合し、37℃で15時間処理した。得られた分解物をSpeI処理したpBluescript II KS+ベクター（Stratagene 社）にライゲーションし、遺伝子ライブラリーを得た。【００５６】
（d）遺伝子ライブラリーのスクリーニング
上記（b）で得た0.6 kbのDNA断片をDIG-High Prime（Roche社）を用いてラベルした。これをDNAプローブとして、（c）で得た遺伝子ライブラリーをコロニー・ハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。得られたポジティブコロニーからプラスミドpBlue-Gal1を得た。【００５７】
（e）塩基配列の決定
プラスミドpBlue-Gal1の塩基配列を定法に従って決定した。バチルス・サーキュランス由来β−ガラクトシダーゼをコードする塩基配列（5214 bp）を配列番号５に示す。また、配列番号５によりコードされるアミノ酸配列（1738アミノ酸）を配列番号６に示す。このアミノ酸配列中には、２．で決定したN末端領域アミノ酸配列（配列番号１）及び内部アミノ酸配列（配列番号２）が見出された。興味深いことに、本遺伝子における開始コドンはGTGと考えられた。尚、配列番号６のアミノ酸配列からシグナルペプチドを除いたアミノ酸配列を配列番号７に示す。【００５８】
４．バチルス・サーキュランス由来のβ−ガラクトシダーゼβ-Gal1、β-Gal2、β-Gal4の大腸菌での発現
(a)β−ガラクトシダーゼの大腸菌での発現プラスミドの構築
分子量189.3 kDa、134.8 k Da、153.9 k Da（質量分析の値）のβ-Gal1、β-Gal2、β-Gal4に相当する蛋白質のN末端領域アミノ酸配列が共通であることから、これをコードするDNA配列をもとに、1種のオリゴヌクレオチドF-Gal（配列番号１１）を合成した。また、それぞれ推定されるC末端領域アミノ酸配列をコードするDNA配列をもとに、3種のオリゴヌクレオチドR-Gal1、R-Gal2、R-Gal4（配列番号１２、１３、１４）を合成し、PCRプライマーとした。センス・プライマーF-GalにはSacI制限酵素認識部位を、アンチセンス・プライマーR-Gal1、R-Gal2、R-Gal4にはSalI制限酵素認識部位を付加した。これらのプライマーと、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を有する染色体DNAを鋳型として、以下の条件にてPCR反応を行った。
＜PCR反応液＞
10×PCR反応緩衝液（TOYOBO社）  5.0μl
dNTP混合液（それぞれ2.5 mM、TOYOBO社）  5.0μl
10μM センス・プライマー  1.5μl
10μM アンチセンス・プライマー  1.5μl
25mM MgSO4  2.0μl
蒸留水  33.0μl
染色体DNA溶液（200μg/ml）  1.0μl
KOD -Plus- DNA ポリメラーゼ（TOYOBO社）  1.0μl
＜PCR反応条件＞
ステージ1： 変性（94℃、2分）  1サイクル
ステージ2： 変性（94℃、15秒）  30サイクル
アニール（57℃、30秒）
伸長（68℃、5分）【００５９】
得られたPCR産物を電気泳動にて確認後、エタノール沈殿により脱塩（69μl）した。続いて15μlの10×T緩衝液、10μlの0.1% BSA溶液及びSacI 3μlとSalI 3μlを加え、37℃で15時間酵素処理した。制限酵素処理液を電気泳動にて確認し、NucleoSpin Extract II（日本ジェネティクス社）で精製後、予めSacIとSalIで処理したベクターpCold II DNA（タカラバイオ社）にβ-Gal1、β-Gal2、β-Gal4断片をライゲーションして発現プラスミドpCold-Gal1、Gal2、Gal4を得た。【００６０】
(b)β−ガラクトシダーゼの大腸菌での発現
発現プラスミドpCold-Gal1、Gal2、Gal4を大腸菌BL21 Competent Cells（タカラバイオ社）に導入した。アンピシリン耐性株として得られた形質転換体の中から、コロニーPCRにより目的のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が挿入されたpCold-Gal1、Gal2、Gal4を保有する菌株を選別した。また対照として発現ベクターpCold II DNAを有する大腸菌BL21の形質転換体も得た。これらの形質転換体を100μg/mlのアンピシリンを含有するLB培地1 mlに植菌し、37℃、170rpmでO.D600=0.4-1.0に到達するまで培養した（前培養）。続いて、前培養液300μlを100μg/mlのアンピシリンを含有するLB培地9 mlに植菌し、37℃、170rpmでO.D600=0.4-1.0に到達するまで培養した。15℃、30分放置後、0.1 M IPTGを9μl添加し、15℃、160rpmで24時間培養（本培養）、集菌した。菌体を1.0 mlの100mMリン酸緩衝液（pH 6.0）に懸濁し、φ0.1mmのガラスビーズを0.50g加え、マルチビーズショッカー（安井機械社）にて菌体を破砕した。破砕条件は、ON 120秒、OFF 60秒を 3.75 サイクル繰り返した。得られたCell free-extractを遠心分離に供し、可溶性成分を得た。【００６１】
(c)β−ガラクトシダーゼの発現確認
取得した可溶性成分をSDS-PAGEに供した。電気泳動装置としてPhastSystem（GE Healthcare 社）を、分離ゲルとしてPhastGel Homogeneous 7.5（GE Healthcare 社）を使用した。その結果、図５に示すように、pCold-Gal1では189kDa付近に、pCold-Gal2では135kDa付近に、pCold-Gal4では154kDa付近にそれぞれβ-Gal1、β-Gal2、β-Gal4と考えられる有意なタンパク質の生産が確認された。対照であるpCold II DNAでは同様のタンパク質の生産が確認されなかったため、本タンパク質はそれぞれβ−ガラクトシダーゼ遺伝子β-Gal1、β-Gal2、β-Gal4の導入に因るものと考えられた。【００６２】
また、同じサンプルについてONPG及びラクトースを基質としたβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。活性測定結果を表２に示す。
【表２】
0005643756.tif 000003
【００６３】
いずれにおいても、ONPGを基質とした場合は対照の4倍以上、ラクトースを基質とした場合は対照に比べて明らかなβ−ガラクトシダーゼ活性が検出され、目的のβ−ガラクトシダーゼβ-Gal1、β-Gal2、β-Gal4の発現が確認された。【００６４】
５．バチルス・サーキュランス由来のβ−ガラクトシダーゼβ-Gal3の大腸菌での発現
(a)β−ガラクトシダーゼの大腸菌での発現プラスミドの構築
上記と同様に、β-Gal3の発現プラスミドを構築した。分子量91.0 kDa（質量分析の値）のβ-Gal3に相当する蛋白質のN末端領域アミノ酸配列および推定C末端領域アミノ酸配列をコードするDNA配列をもとに、2種のオリゴヌクレオチド（配列番号１５、１６）を合成し、PCRプライマーとした。センス・プライマーF-Gal3にはNdeI制限酵素認識部位を、アンチセンス・プライマーR-Gal3にはXbaI制限酵素認識部位を付加した。これらのプライマーと、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を有する染色体DNAを鋳型として、以下の条件にてPCR反応を行った。
＜PCR反応液＞
10×PCR反応緩衝液（TOYOBO社）  5.0μl
dNTP混合液（それぞれ2.5 mM、TOYOBO社）  5.0μl
10μM センス・プライマー  1.5μl
10μM アンチセンス・プライマー  1.5μl
25mM MgSO4  2.0μl
蒸留水  33.0μl
染色体DNA溶液（200μg/ml）  1.0μl
KOD-Plus-DNAポリメラーゼ（TOYOBO社）  1.0μl
＜PCR反応条件＞
ステージ1： 変性（94℃、2分）  1サイクル
ステージ2： 変性（94℃、15秒）  30サイクル
アニール（57℃、30秒）
伸長（68℃、3分）【００６５】
得られたPCR産物を電気泳動にて確認後、エタノール沈殿により脱塩（84μl）した。続いて、10μlの適当な緩衝液及びNdeI 3μlとXbaI 3μlとを加え、37℃で15時間酵素処理した。制限酵素処理液を電気泳動にて確認し、NucleoSpin Extract IIで精製後、予めNdeI及びXbaIで処理したベクターpCold III DNAにライゲーションして発現プラスミドpCold-Gal3を得た。【００６６】
(b)β−ガラクトシダーゼの大腸菌での発現
発現プラスミドpCold-Gal3を大腸菌BL21 Competent Cellsに導入した。アンピシリン耐性株として得られた形質転換体の中から、コロニーPCRにより目的のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が挿入されたpCold-Gal3を保持する菌株を選別した。また対照として発現ベクターpCold III DNAを有する大腸菌BL21の形質転換体も得た。これらの形質転換体を100μg/mlのアンピシリンを含有するLB培地1 mlに植菌し、37℃、170rpmでO.D600=0.4-1.0に到達するまで培養した（前培養）。続いて、前培養液300μlを100μg/mlのアンピシリンを含有する LB培地9 mlに植菌し、37℃、170rpmでO.D600=0.4-1.0に到達するまで培養した。15℃、30分処理後、0.1 M IPTGを9μl添加し、15℃、160rpmで24時間培養（本培養）、集菌した。菌体を1.0 mlの100mMリン酸緩衝液（pH 6.0）に懸濁し、φ0.1mmのガラスビーズを0.50g加え、マルチビーズショッカーにて菌体を破砕した。破砕条件は、ON 120秒、OFF 60秒を3.75サイクル繰り返した。得られたCell free-extractを遠心分離に供し、可溶性成分を得た。【００６７】
(c)β−ガラクトシダーゼの発現確認
４．と同様に取得した可溶性成分をSDS-PAGEに供した。電気泳動装置としてPhastSystemを、分離ゲルとしてPhastGel Homogeneous 7.5を使用した。その結果、図５に示すように、pCold-Gal3では91kDa付近にβ-Gal3と考えられる有意なタンパク質の生産が確認された。対照であるpCold III DNAでは同様のタンパク質の生産が確認されなかったため、本タンパク質はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子β-Gal3の導入に因るものと考えられた。
また同じサンプルについてONPG及びラクトースを基質としたβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。活性測定結果を表３に示す。ONPGを基質とした場合は対照の5倍以上、ラクトースを基質とした場合は対照の200倍以上のβ−ガラクトシダーゼ活性が検出され、目的のβ−ガラクトシダーゼβ-Gal3の発現が確認された。
【表３】
0005643756.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明はバチルス・サーキュランス由来の新規なβ−ガラクトシダーゼを提供する。本発明のβ−ガラクトシダーゼは産業上有用であり、例えば、牛乳、乳製品、発酵乳製品、ガラクトオリゴ糖又は食事サプリメントの製造に利用される。【００６９】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【配列表フリーテキスト】
【００７０】
配列番号３、４、１１〜１６：人工配列の説明：プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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