(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式で表される化合物、並びに、その薬学的に許容される塩および溶媒和物：
【化１】
0005583635.tif 000124
式中のP-C(O)-NH-は、水素をGlnの側鎖における-NH2から除去することによって取得される、成長ホルモン由来のペプチドラジカルを表し；
Dは、結合または酸素を表し；
Rは、リンカーまたは結合を表し；
Eは、リンカーまたは結合を表し；
Aは、オキシム, ヒドラゾン, フェニルヒドラゾン, セミカルバゾン, トリアゾールまたはイソオキサゾリジン成分を表し；および
Zは、PEGまたはmPEGラジカル及びそのアミノ誘導体(直鎖状および分枝状のPEGおよびmPEGラジカルを含む)；直鎖状、分枝状および／または環状のC1-22 アルキル, C2-22 アルケニル, C2-22 アルキニル, C1-22 ヘテロアルキル, C2-22 ヘテロアルケニル, C2-22 ヘテロアルキニル（ここで１以上の単素環式芳香族化合物ビラジカルまたは複素環式化合物ビラジカルが挿入されてもよく、ここで前記C1-C22 または C2-C22 ラジカルはヒドロキシル, ハロゲン, カルボキシル, ヘテロアリールおよびアリールから選択される１以上の置換基で任意に置換されてもよく、ここで前記アリールまたはヘテロアリールはヒドロキシル, ハロゲン, およびカルボキシルから選択される１以上の置換基で任意にさらに置換されてもよい）；ステロイドラジカル; 脂質ラジカル; ポリサッカライドラジカル; デキストラン; ポリアミドラジカル; ポリアミノ酸ラジカル; PVPラジカル; PVAラジカル; ポリ(1-3-ジオキサラン(dioxalane)); ポリ(1,3,6-トリオキサン); エチレン/無水マレイン酸ポリマー; シバクロン染料; またはシバクロンブルー3GA（商標）のなかから選択される。
【請求項２】
前記成長ホルモンが成長ホルモン化合物である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記成長ホルモンがヒト成長ホルモンである、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載の化合物であって、前記化合物がヒト成長ホルモン中のポジション141に対応するポジションで結合される化合物。
【請求項５】
請求項３に記載の化合物であって、前記化合物がヒト成長ホルモン中のポジション141に対応するポジションで結合される化合物。
【請求項６】
Nε141-[2-(4-(4-(mPEG(20k)イルブタノイル)-アミノ-ブチルオキシイミノ)-エチル]hGH, 
Nε141-[2-(1-(ヘキサデカノイル)ピペリジン-4-イル)エチルオキシイミノ)-エチル]hGH,
Nε141(2-(4-(4-(1,3-ビス(mPEG(20k)イルアミノカルボニルオキシ)プロパ-2-イルオキシ)ブチリルアミノ)ブチルオキシイミノ)エチル)hGH,
Nε141(2-(4-(2,6-ビス(mPEG(20k)イルオキシカルボニルアミノ)ヘキサノイルアミノ)ブチルオキシイミノ)エチル)hGH,
Nε141(2-(4-(4-(mPEG(30k)イルオキシ)ブチリルアミノ)ブチルオキシイミノ)エチル)hGH,
Nε141(2-(4-(4-(mPEG(20k)イルオキシ)ブチリルアミノ)ブチルオキシイミノ)エチル)hGH, および
Nε141(2-(4-(3-(mPEG(30k)イルオキシ)プロパノイルアミノ)ブチルオキシイミノ)エチル)hGH；並びに、その薬学的に許容される塩および溶媒和物から選択される請求項１に記載の化合物であって、
上記のmPEG(20k)イルおよびmPEG(30k)イルが、それぞれ1.06未満の多分散性指標を有するmPEG(20k)イルおよびmPEG(30k)イルを指すことを意図する、化合物。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか１項に記載の化合物を含む薬学的組成物。
【請求項８】
治療で使用するための、請求項１〜６の何れか１項に記載の化合物。
【請求項９】
以下の治療で使用するための、請求項１〜６の何れか１項に記載の化合物：
成長ホルモン分泌不全症(GHD); ターナー症候群; プラーダーヴィリ症候群(PWS); ヌーナン症候群; ダウン症候群; 慢性腎臓病、若年性関節リウマチ; 嚢胞性線維症、HAART治療を受けている小児におけるHIV感染症（HIV/HALS小児）; 在胎齢が短く誕生した小さい小児（SGA）; SGAを除く極低出生体重（VLBW）で誕生した小児における低身長; 骨格形成異常; 低軟骨形成症; 軟骨形成不全症; 特発性低身長（ISS）; 成人におけるGHD; 脛骨, 腓骨, 大腿骨, 上腕骨, 橈骨, 尺骨, 鎖骨, 中手骨, 中足骨, および指などの長骨における、又は、それらの骨折; 頭蓋骨, 手の基部, および足の基部などの海綿状骨における、又は、それらの骨折; 手, 膝, または肩部などにおける腱または靭帯の手術後の患者; 伸延骨形成を有している又は経験している患者; 臀部または円板の置換, メニスカスの修復, 脊椎固定または膝, 臀部, 肩部, 肘, 手関節または下顎などのプロテーゼ固定の後の患者; 釘、スクリューおよびプレートなどの骨接合材料が固定された患者; 癒着不能または変形癒合の骨折を有する患者; 脛骨または第一足指からなどのオステアトミア（osteatomia）後の患者; 移植物の移植後の患者; 外傷または関節炎が原因の膝の関節軟骨変性; ターナー症候群の患者のオステオポローシス; 男性のオステオポローシス; 慢性透析の成人患者（APCD）; APCDにおける栄養不良関連性心臓血管疾患; APCDにおけるカヘキシーの反転; APCDにおけるガン; APCDにおける慢性閉塞性（abstractive）肺疾患; APCDにおけるHIV; APCDを伴う高齢者; APCDにおける慢性肝疾患, APCDにおける疲労症候群; クローン病; 肝機能の障害; HIV感染症を伴う男性; 短小腸症候群; 中心性肥満; HIV関連性リポジストロフィ症候群 (HALS); 男性の不妊症; 主要な待機手術後の患者, アルコール/薬の解毒または神経学的な外傷; 加齢; 虚弱な高齢者; 骨関節炎; 外傷性に傷害された軟骨; 勃起不全; 線維筋痛; 記憶障害; うつ病; 外傷性の脳傷害; くも膜下出血; 非常に低い出生時体重; 代謝症候群; 糖質コルチコイドミオパシー;または小児の糖質コルチコイド治療による低身長；筋肉組織, 神経組織または傷のヒーリングの促進のため；損傷を受けた組織の血流の促進または改善のため；或いは損傷を受けた組織における感染率の減少のため。
【請求項１０】
請求項１〜６の何れか１項に記載の化合物の、以下の治療に使用される医薬の製造における使用：
成長ホルモン分泌不全症(GHD); ターナー症候群; プラーダーヴィリ症候群(PWS); ヌーナン症候群; ダウン症候群; 慢性腎臓病、若年性関節リウマチ; 嚢胞性線維症、HAART治療を受けている小児におけるHIV感染症（HIV/HALS小児）; 在胎齢が短く誕生した小さい小児（SGA）; SGAを除く極低出生体重（VLBW）で誕生した小児における低身長; 骨格形成異常; 低軟骨形成症; 軟骨形成不全症; 特発性低身長（ISS）; 成人におけるGHD; 脛骨, 腓骨, 大腿, 上腕骨, 橈骨, 尺骨, 鎖骨, 中手骨, 中足骨, および指などの長骨における、又は、それらの骨折; 頭蓋骨, 手の基部, および足の基部などの海綿状骨における、又は、それらの骨折; 手, 膝, または肩部などにおける腱または靭帯の手術後の患者; 伸延骨形成を有している又は経験している患者; 臀部または円板の置換, メニスカスの修復, 脊椎固定または膝, 臀部, 肩部, 肘, 手関節または下顎などのプロテーゼ固定の後の患者; 釘、スクリューおよびプレートなどの骨接合材料が固定された患者; 癒着不能または変形癒合の骨折を有する患者; 脛骨または第一足指からなどのオステアトミア（osteatomia）後の患者; 移植物の移植後の患者; 外傷または関節炎が原因の膝の関節軟骨変性; ターナー症候群の患者のオステオポローシス; 男性のオステオポローシス; 慢性透析の成人患者（APCD）; APCDにおける栄養不良関連性心臓血管疾患; APCDにおけるカヘキシーの反転; APCDにおけるガン; APCDにおける慢性閉塞性（abstractive）肺疾患; APCDにおけるHIV; APCDを伴う高齢者; APCDにおける慢性肝疾患, APCDにおける疲労症候群; クローン病; 肝機能の障害; HIV感染症を伴う男性; 短小腸症候群; 中心性肥満; HIV関連性リポジストロフィ症候群 (HALS); 男性の不妊症; 主要な待機手術後の患者, アルコール/薬の解毒または神経学的な外傷; 加齢; 虚弱な高齢者; 骨関節炎; 外傷性に傷害された軟骨; 勃起不全; 線維筋痛; 記憶障害; うつ病; 外傷性の脳傷害; くも膜下出血; 非常に低い出生時体重; 代謝症候群; 糖質コルチコイドミオパシー;または小児の糖質コルチコイド治療による低身長；筋肉組織、神経組織または傷のヒーリングの促進のため；損傷を受けた組織の血流の促進または改善のため；或いは損傷を受けた組織における感染率の減少のため。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドの翻訳後結合（post-translational conjugation）のための新規方法に関する。該方法において、トランスグルタミナーゼ（Transglutaminase）を使用して、別の基が選択的に付着しえる前記ペプチド中の付着点（a point of attachment）を導入することができる。前記の結合型ペプチド（conjugated peptides）は、変化した特性を有し、治療上の適用に有用であろう。また、それらは前記ペプチドの分析または単離および精製を容易にしえる。
【発明の背景】
【０００２】
ペプチドの特性および特徴を、基を前記ペプチドに結合させることによって、変化させることが知られており、これによって前記ペプチドの特性が正しく（duly）変化させられる。一般的に、係る結合は、結合基中の別の官能基と反応するために、ペプチド中に幾つかの官能基を要求する。典型的には、アミノ基（例えば、Ｎ末アミノ基又はリジン中のεアミノ基）が、適切なアシル化試薬と組合わせて使用されている。結合反応をコントロールできることがしばしば望まれるか又はむしろ要求される（即ち、結合する化合物が付着するところをコントロールすること及び如何程の結合基が付着するかをコントロールすること）。これは、しばしば特異性（specificity）と称される。
【０００３】
ペプチドを高度の特異性で結合しえる方法を提供することが本発明の課題である。一般論として、前記方法は酵素（例えば、トランスグルタミナーゼ）を利用し、該酵素は適切な官能基を具備する化合物を前記ペプチド中に導入する能力を有するものである（ここで該官能基は、結合させるポイントとして引き続いて使用される）。
【０００４】
一般に、ペプチドの結合は長い間知られており、US 4,179,337はポリエチレンまたはポリ-プロピレングリコールに結合させたペプチドを20年以上前に開示している。
【０００５】
ペプチドと該ペプチドに結合されるべき成分との間に結合を形成するのに効果的な、異なるタイプの化学現象（chemistries）が開示されている。EP605963は、タンパク質上のアルデヒド基とのオキシム連結を形成する、水性ポリマーの移植を開示している。天然のアミノ酸はアルデヒドを具備していないので、ヒドロキシル基は結合プロセスの第一工程として酸化されなければならない。WO96/41813は、結合反応で有用なアミノ-オキシオキシム形成基（an amino-oxy oxime forming group）に機能化（functionalised）させたポリマーを開示している。WO98/05363は、ペプチドおよび水溶性ポリマーを具備している化合物（ここで前記の２つは、Ｎ末のアミノ酸残基でのオキシム結合を介して共有結合されている）を開示している。
【０００６】
さらにまた、ペプチドのさらに特異的な結合を可能にする酵素の使用も知られている。EP243929は、特定の官能基を有する化合物をペプチドのＣ末に導入するためのタンパク分解性酵素（例えば、カルボキシペプチダーゼ）の使用を開示しており、前記官能基は、前記ペプチドの分析を促進するために使用される細胞毒性基（cytotoxic groups）、他のペプチドまたはレポーター基を付着させるポイント（point）として引続いて使用することができる。しかしながら、この技術は、Ｃ末アミノ酸残基へ付着のポイントを限定し、Ｃ末残基が前記ペプチドの活性に必須である場合に重大な制限を構成するものである。
【０００７】
トランスグルタミナーゼは、以前にペプチドの特性を変更させるために使用されている。食物産業において及び特に食産業において、多くの技術が利用可能である〔例えば、トランスグルタミナーゼを用いたクロス結合ペプチド（cross-bind peptides）〕。他の文献は、生理的に活性なペプチドの特性を変更させるための、トランスグルタミナーゼの使用を開示している。EP950665、EP785276およびSato（Adv.Drug Delivery Rev., 54, 487-504, 2002）は、トランスグルタミナーゼの存在下で少なくとも１つのGlnとアミン機能化PEG（amine-functionalised PEG）との間の又は類似するリガンドとの間の直接的な反応を開示している。そして、Wada（Biotech.Lett., 23, 1367-1372, 2001）は、β―ラクトグロブリンと脂肪酸とのトランスグルタミナーゼの手段による直接的な結合を開示している。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は驚くべきことに次の事項を見出した、その事項とは、酵素（例えば、トランスグルタミナーゼ）を使用して、ペプチドに１以上の官能基（これは前記ペプチド中で接触可能ではなく、機能化ペプチドを形成する）を導入しえることと、この機能化ペプチド（functionalised peptide）が、結合成分を具備している別の化合物及び前記ペプチドにこのように導入された官能基または官能基群と反応する能力を有する１以上の官能基と引続き反応するが、しかし、前記ペプチドに存在する別の官能基とは反応しないことである。
【０００９】
係る方法は、次の事項において高度な特異性を提供する；その事項とは、トランスグルタミナーゼが、トランスグルタミナーゼの基質となるアミノ酸残基で化合物の導入のみを触媒することが可能であることと、及び前記官能基が、それらが互いでのみ反応するが、前記ペプチド中で接触可能な他の官能基とは反応しないように選択されることである。この様式で、結合成分は、コントロールされたローカス（locus）またはローサイ（loci）でのみ接着し、そして官能基を選択することによって、幾つかの結合基がコントロールされうる。
【００１０】
従って、一態様において、本発明は、ペプチドを結合するための方法を提供し、該方法は、以下の工程を備える：
i)１以上の工程で、ペプチドを、前記ペプチドを構成しているアミノ酸の何れとも接触可能ではない（not accessible）１以上の官能基または潜在的な官能基（latent functional groups）を具備する第１化合物と、前記第１化合物を前記ペプチドへと導入することを触媒する能力を有するトランスグルタミナーゼの存在下で反応させて、機能化ペプチドを形成する工程と、
ii)任意に、前記潜在的な官能基を活性化させる工程と、
iii)１以上の工程で、前記機能化ペプチドを、前記ペプチドを構成しているアミノ酸残基における接触可能な官能基と反応せず、かつ前記第１化合物中の前記官能基と反応する能力を有する１以上の官能基を具備する第２化合物と反応させて、前記機能化ペプチドと前記第２化合物との間に共有結合を形成する工程。
【００１１】
また、本発明の方法によって結合されたペプチドを提供することも本発明の課題である。
【００１２】
さらなる本発明の課題は、本発明の方法に適切となる様式で修飾されるペプチドを提供することである。
【００１３】
なお更なる本発明の課題は、本発明の方法に使用するために適切な試薬および酵素を提供することである。
【００１４】
なお更なる本発明の課題は、本発明の方法によって結合されたペプチドを具備している薬学的組成物などの組成物を提供することである。
【００１５】
なお更なる本発明の課題は、療法（therapy）に使用するための、本発明の方法により結合されたペプチドを提供することである。
【００１６】
なお更なる本発明の課題は、疾患の治療のための治療方法を提供することであり、該方法は本発明の方法により調製された結合型ペプチドの投与を備える。
【００１７】
なお更なる本発明の課題は、本発明の方法により調製された結合型ペプチドの、医薬の製造における使用を提供することである。
【００１８】
なお更なる本発明の課題は、前記ペプチドの本発明の方法による結合によってペプチドの薬理学的特性を改善する方法を提供することである。
【定義】
【００１９】
本発明において、「アミノ基転移（transamination）」又は類似の用語は、グルタミンの側鎖中の窒素が、別の化合物からの窒素、特に別の窒素含有求核因子（nitrogen containing nucelophile）からの窒素で交換される反応を指摘（indicate）することを意図（intended）している。
【００２０】
本発明において、「接触可能ではない（not accessible）」の用語は、何らかのもの（something）が、それが達することができないという意味において、非存在または事実上非存在（de facto absent）であることを指摘することを意図している。官能基が結合されるペプチドに接触可能ではないことが述べられる場合、該官能基が前記ペプチドから遠ざけられている（absent）か、又はたとえ存在しても何らかの様式で反応に参加することを阻止されることを指摘することを意図している。例示として、前記官能基は、前記ペプチドの構造中に埋め込まれている可能性がある；それゆえ前記官能基は、反応に参加することを妨げられるか又は前記ペプチドの制限された可動性によって官能基が反応に参加することが阻止されるペプチドの領域に配置された可能性がある。特定の官能基は反応条件に応じて接触可能であるかどうかが認識される。変性剤の存在下で又は温度が上昇した際に、前記ペプチドがアンフォールドされて、普段は接触可能ではない官能基を暴露するだろうことを予見（envisaged）しえる。「接触可能ではない」は、「所望の特定の反応に対して選ばれた反応条件で接触可能ではない（not accessible at the reaction condition chosen for the particular reaction of interest）」を意味することが理解されるべきである。
【００２１】
本発明において、「オキシム結合（oxime bond）」の用語は、式-C=N-O-の成分（moiety）を指摘することを意図している。
【００２２】
本発明において、「ヒドラゾン結合（hydrazone bond）」の用語は、式-C=N-N-の成分を指摘することを意図している。
【００２３】
本発明において、「フェニルヒドラゾン結合（phenylhydrazone bond）」の用語は、以下の式の成分を指摘することを意図している、
【化１】
0005583635.tif 000002
【００２４】
本発明において、「セミカルバゾン結合（semicarbazone bond）」の用語は、式-C=N-N-C(O)-N-の成分を指摘することを意図している。
【００２５】
「アルカン」の用語は、飽和の、直鎖状の、分枝状の、および／または環状の炭化水素を指摘することを意図している。別の数の炭素原子で特定しないかぎり、前記用語は、1〜30（双方が含まれる）の炭素原子、例えば1〜20(双方が含まれる)、例えば1〜10（双方が含まれる）、例えば1〜5（双方が含まれる）；または15〜30炭素原子（双方が含まれる）を有する炭化水素を指摘することを意図している。
【００２６】
「アルケン」の用語は、少なくとも１つの炭素-炭素の二重結合を具備している、直鎖状の、分枝状の、および／または環状の炭化水素を指摘することを意図している。別の数の炭素原子で特定しないかぎり、前記用語は、2〜30（双方が含まれる）の炭素原子、例えば2〜20 (双方が含まれる)、例えば2〜10（双方が含まれる）、例えば2〜5（双方が含まれる）；または15〜30炭素原子（双方が含まれる）を有する炭化水素を指摘することを意図している。
【００２７】
「アルキン」の用語は、少なくとも１つの炭素-炭素の三重結合を具備している、直鎖状の、分枝状の、および／または環状の炭化水素を指摘することを意図しており、これは任意で１以上の炭素-炭素の二重結合を具備してもよい。別の数の炭素原子で特定しないかぎり、前記用語は、2〜30（双方が含まれる）の炭素原子、例えば2〜20 (双方が含まれる)、例えば2〜10（双方が含まれる）、例えば2〜5（双方が含まれる）；または15〜30炭素原子（双方が含まれる）を有する炭化水素を指摘することを意図している。
【００２８】
「単素環式芳香族化合物（homocyclic aromatic compound）」の用語は、芳香族炭化水素（例えば、ベンゼンおよびナフタレン）を指摘することを意図している。
【００２９】
「複素環式化合物（heterocyclic compound）」の用語は、5、6または7の環状原子を具備している環状化合物であって、そのうち1、2、3または4つがN、Oおよび／またはSから選択されるヘテロ原子である環式化合物を指摘することを意図している。複素環式芳香族化合物の例には、チオフェン, フラン, ピラン, ピロール, イミダゾール, ピラゾール, イソチアゾール（isothiazole）, イソオキサゾール（isooxazole）, ピリジン, ピラジン, ピリミジン, ピリダジン, 同様に、それらの部分的に又は完全に水素化された均等物、例えば、ピペリジン, ピラゾリジン（pirazolidine）, ピロリジン, ピロリン（pyroline）, イミダゾリジン, イミダゾリン, ピペラジンおよびモルフォリンが含まれる。
【００３０】
「ヘテロアルカン（hetero alkane）」、「ヘテロアルケン（hetero alkene）」、および「ヘテロアルキン（hetero alkyne）」の用語は、上記で規定したアルカン、アルケン、およびアルキンにおいて、１以上のヘテロな原子または基が前記成分の構造に挿入されているものを指摘することを意図している。ヘテロ基の例には、-O-, -S-, -S(O)-, -S(O)2, -C(O)- -C(S)- および -N(R*)-（式中のR*は、水素またはC1-C6-アルキルを表す）が含まれる。ヘテロアルカンの例には、以下のものが含まれる：  
【表１】
0005583635.tif 000003
【００３１】
「ラジカル（radical）」または「ビラジカル（biradical）」の用語は、それぞれ１または２の水素原子が除去された化合物を指摘することを意図している。具体的に述べた場合、ラジカルは、特定の原子のより大きな基（例えば、ヒドロキシル基）の規則的（formal）な除去によって形成される成分を指摘してもよい。
【００３２】
「ハロゲン（halogen）」の用語は、周期表の７群（例えば、F, Cl, BrおよびI）のメンバーを指摘することを意図している。
【００３３】
「PEG」の用語は、約100および約1,000,000 Daの間の分子量のポリエチレングリコールを指摘することを意図している。該用語には、そのアナログも含まれ、例えば、末端のOH-基がアルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基またはプロポキシ基）によって置換される。特に、末端のOH-基がメトキシ基で置換されているPEGは、mPEGと称される。
【００３４】
「mPEG」（より適切には「mPEGイル」）の用語は、以下の構造の多分散性（polydisperse）または単分散性（mono-disperse）のラジカルを意味しており、
【化２】
0005583635.tif 000004
【００３５】
上記の式中のmは、１を超える整数である。従って、ｍが90であるmPEG は、3991 Da（即ち、約4kDa）の分子量を有する。同様に、20 kDaの平均分子量を有するmPEGは、454の平均ｍを有する。mPEGを製造する方法が原因で、これらの分子はしばしば分子量の分布を有している。この分布は、多分散性指標によって記載される。
【００３６】
本明細書中に使用される「多分散性指標（polydispersity index）」の用語は、高分子化学の技術(例えば、“Polymer Synthesis and Characterization”, J.A. Nairn, University of Utah, 2003を参照されたい）において知られるように、重量平均分子量（weight average molecular weight）および数平均分子量（number average molecular weight）の間の比率を意味する。多分散性指標は、１より大きいか又は等しい数であり、それはゲルパーミエーションクロマトグラフィーのデータから推定しえる。多分散性指標が１である場合、産物は単分散性であるので、単一の分子量を有する化合物から構成される。多分散性指標が１より大きい場合、それがそのポリマーの多分散性の基準である（即ち、異なる分子量を有するポリマーの分布がいかに広いか）。
【００３７】
式（formulas）、化合物名、又は分子構造における、例えば「mPEG20000」の使用は、mPEGが多分散性であり、約20 kDaの分子量を有するmPEG残基を指摘する。
【００３８】
多分散性指標は、典型的にはPEGまたはmPEGの分子量と共に増加する。20 kDa PEGおよび特に20 kDa mPEGに関して参照された場合、多分散性指標が1.06未満、例えば1.05未満、例えば1.04未満、例えば1.03未満、例えば1.02および1.03の間である化合物（又は化合物の実際上の混合物）を指摘することを意図している。30 kDa PEGおよび特に30 kDa mPEGに関して参照された場合、多分散性指標が1.06未満、例えば1.05未満、例えば1.04未満、例えば1.03未満、例えば1.02および1.03の間である化合物（又は化合物の実際上の混合物）を指摘することを意図している。40 kDa PEGおよび特に40 kDa mPEGに関して参照された場合、多分散性指標が1.06未満、例えば1.05未満、例えば1.04未満、例えば1.03未満、例えば1.02および1.03の間である化合物（又は化合物の実際上の混合物）を指摘することを意図している。
【００３９】
本発明において「ペプチド」および「タンパク質」の用語は、互換的に使用され、同じことを指摘することを意図している。「ペプチド」の用語は、ペプチド結合で連結された２以上のアミノ酸残基を有する化合物を指摘することを意図している。アミノ酸は、天然（natural）または非天然（unnatural）であってもよい。また、前記用語は、他のペプチド、サッカライド、脂質、または他の有機化合物、同様に、1以上のアミノ酸残基が化学的に修飾された化合物で置換された前記化合物を含むことを意図している。また、前記用語は、補欠分子族（prosthetic groups）が付着されるペプチドを含むことを意図している。特に、前記ペプチドは、生理的な、例えば、治療上の活性を発揮する。
【００４０】
本発明において、「アリール（aryl）」の用語は、単素環式芳香環ラジカルまたは融合した単素環式芳香環系ラジカル（a fused homocyclic ring system radical）を意味する（ここで、少なくとも1つの環は芳香族である）。典型的なアリール基には、フェニル、ビフェニリル、ナフチル、テトラリニル（tetralinyl）などが含まれる。
【００４１】
本明細書中で使用される「ヘテロアリール（heteroaryl）」の用語は、例えば5〜7の環原子（ring atoms）を有する芳香族環ラジカル又は例えば7〜18の環原子を有する融合した芳香環系ラジカルの単独または組合わせを意味し、ここで少なくとも１つの環は、芳香族であり、１以上のヘテロ原子（heteroatoms）を窒素、酸素、またはイオウ  ヘテロ原子から選択される環原子として含有し、ここでN-オキシドおよび一酸化硫黄および二酸化硫黄は、複素環式芳香族置換（heteroaromatic substitutions）を許容する。例には、フラニル（furanyl）, チエニル, チオフェニル, ピロリル（pyrrolyl）, イミダゾリル, ピラゾリル（pyrazolyl）, トリアゾリル（triazolyl）, テトラゾリル（tetrazolyl）, チアゾリル, オキサゾリル（oxazolyl）, イソキサゾリル（isoxazolyl）, オキサジアゾリル（oxadiazolyl）, チアジアゾリル（thiadiazolyl）, イソチアゾリル（isothiazolyl）, ピリジニル（pyridinyl）, ピリダジニル（pyridazinyl）, ピラジニル（pyrazinyl）, ピリミジニル（pyrimidinyl）, キノリニル（quinolinyl）, イソキノリニル（isoquinolinyl）, ベンゾフラニル（benzofuranyl）, ベンゾチオフェニル（ben-zothiophenyl）, インドリル, およびインダゾリル（indazolyl）などが含まれる。
【００４２】
名詞としての「結合体（conjugate）」の用語は、修飾されたペプチド（即ち、ペプチドに結合し、前記ペプチドの特性を修飾する成分を有するペプチド）を指摘することを意図している。動詞として、前記用語は、成分がペプチドに結合して、前記ペプチドの特性を修飾する成分を結合するプロセスを指摘することを意図している。
【００４３】
本明細書中で使用される「プロドラッグ（prodrug）」の用語は、必ずしも治療活性を有さなくてもよいが、投与に際して治療的に活性な化合物へと身体中で発生する反応によって転換する化合物を指摘することを意図している。典型的には、係る反応は、加水分解（例えば、エステラーゼによる）または酸化である。プロドラックの例には、生加水分解性アミド（biohydrolyzable amides）および生加水分解性エステル、また、a)係るプロドラックにおける生加水分解性の機能が本発明による化合物中に包含される化合物、及びb)所与の官能基で生物学的に酸化または還元されて、本発明の薬剤物質を産出しえる化合物が含まれる。これらの官能基の例には、1, 4-ジヒドロピリジン, N-アルキルカルボニル-1, 4-ジヒドロピリジン, 1, 4-シクロヘキサジエン, tert-ブチルなどが含まれる。
【００４４】
本明細書中に使用される「生加水分解性エステル（biohydrolyzable ester）」の用語は、原薬（drug substance）（本発明による化合物の場合における）のエステルであり、これはa)親物質の生物活性を妨害しないが、その物質に、作用の持続時間（duration of action）、作用の発現（onset of action）などのインビボでの優れた特性を与えるか、或いはb)生物学的に不活性であるが、インビボで被験者によって生物学的に活性な素因（principle）へと容易に転換されるかである。利点は、例えば、溶解性の増加又は生加水分解性エステルが経口的に腸から吸収され、本発明による化合物へと血漿中で転換されることである。係るものの多くの例は、当該技術分野において既知のものであり、例として、低級のアルキルエステル(例えば、C1-C4)、より低級のアシルオキシ  アルキルエステル、より低級のアルコキシアシルオキシアルキル  エステル（alkoxyacyloxyalkyl esters）、アルコキシアシルオキシ  エステル、アルキル  アシルアミノ  アルキル  エステル、およびコリンエステルが含まれる。
【００４５】
本明細書中に使用される「生加水分解性アミド（biohydrolyzable amide）」の用語は、原薬（drug substance）（本発明による化合物の場合における）のアミドであり、これはa)親物質の生物活性を妨害しないが、その物質に、作用の持続時間（duration of action）、作用の発現（onset of action）などのインビボでの優れた特性を与えるか、或いはb)生物学的に不活性であるが、インビボで被験者によって生物学的に活性な素因（principle）へと容易に転換されるかである。利点は、例えば、溶解性の増加又は生加水分解性アミドが経口的に腸から吸収され、本発明による化合物へと血漿中で転換されることである。係るものの多くの例は、当該技術分野において既知のものであり、例として、低級アルキルアミド、α-アミノ酸アミド、アルコキシルアシルアミド（alkoxyacyl amides）、およびアルキルアミノアルキルカルボニルアミド（alkylaminoalkylcarbonyl amides）が含まれる。
【００４６】
本発明において、「薬学的に許容される塩（pharmaceutically acceptable salt）」の用語は、患者に有害ではない塩を意味する。係る塩には、薬学的に許容される酸付加塩、薬学的に許容される金属塩、アンモニウムおよびアルキル化アンモニウム塩が含まれる。酸付加塩（Acid addition salts）には、無機酸および有機酸の塩が含まれる。適切な無機酸の代表的な例には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸, リン酸, 硫酸, 硝酸などが含まれる。適切な有機酸の代表的な例には、蟻酸, 酢酸, トリクロロ酢酸, トリフルオロ酢酸, プロピオン酸, 安息香酸, 桂皮酸, クエン酸, フマル酸, グリコール酸, 乳酸, マレイン酸, リンゴ酸, マロン酸, マンデル酸, 蓚酸, ピクリン酸, ピルビン酸, サリチル酸, コハク酸, メタンスルホン酸, エタンスルホン酸, 酒石酸, アスコルビン酸, パモイン酸（pamoic）, ビスメチレンサリチル酸（bismethylene salicylic）, エタンジスルホン酸, グルコン酸, シトラコン酸, アスパラギン酸, ステアリン酸, パルチミン酸, EDTA, グリコール酸, p-アミノ安息香酸, グルタミン酸, ベンゼンスルホン酸, p-トルエンスルフォン酸などが含まれる。薬学的に許容される無機または有機の酸付加塩の更なる例には、文献（J. Pharm. Sci. 1977, 66, 2、該文献は本明細書中に参照によって援用される）にリストされる薬学的に許容される塩が含まれる。金属塩の例には、リチウム, ナトリウム, カリウム, マグネシウム塩などが含まれる。アンモニウムおよびアルキル化アンモニウム塩の例には、アンモニウム, メチルアンモニウム, ジメチルアンモニウム, トリメチルアンモニウム, エチルアンモニウム, ヒドロキシエチルアンモニウム, ジエチルアンモニウム, ブチルアンモニウム, テトラメチルアンモニウム塩などが含まれる。
【００４７】
本明細書中に使用される化合物の「治療的に効果的な量（therapeutically effective amount）」は、特定の疾患及びその合併症の臨床上の症状を、治癒（cure）、軽減（alleviate）、または部分的に抑止（arrest）するために十分な量を意味する。これを達成するのに十分な量は、「治療的に効果的な量」と規定される。それぞれの目的のために有効な量は、疾患または傷害の重症度、並びに被検者の重量および一般的な状態（state）に依存する。適切な用量の決定は、値からマトリックス（a matrix）を構築すること、および前記マトリックスの異なる点を試験することによるルーチン試験を使用して達成し得ることが理解されるだろう；この事項は、全て訓練された医師または獣医の通常の知識の範囲内である。
【００４８】
本明細書中に使用される「治療（treatment）」および「治療すること（treating）」の用語は、コンディション（例えば、疾患または障害）に対処するための、患者の管理（management）と世話（care）とを意味する。前記用語は、患者が罹患する、特定のコンディションに関する全てのスペクトルの治療を含み、例えば、徴候または合併症を軽減するための、疾患、障害、またはコンディションの進行を遅延させるための、徴候および合併症を軽減または解放（relief）するための、および／または、疾患、障害、またはコンディションを治癒または排除（eliminate）するための、同様に、コンディションを予防（prevent）するための活性化合物の投与である。ここで予防は、疾患、コンディション、または障害に対処するための、患者の管理および世話と理解され、そして徴候または合併症の開始を予防するための活性化合物の投与を含む。治療されるべき患者は、好ましくは哺乳類、特にヒトであるが、動物（例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、およびブタ）をも含む。
【発明の説明】
【００４９】
トランスグルタミナーゼ(E.C.2.3.2.13)は、タンパク質-グルタミン-γ-グルタミルトランスフェラーゼとしても知られており、一般的な反応（general reaction）を触媒する。
【化３】
0005583635.tif 000005
【００５０】
一態様において、Q-C(O)-NH2(アミンアクセプター)はグルタミン含有ペプチド（a glutamine containing peptide）を表し、Q’-NH2(アミンドナー)は第１化合物を表す（上記で指摘したとおり）、或いはQ-C(O)-NH2は第１化合物を表し（上記で指摘したとおり）、Q’-NH2はリジン含有ペプチド（a lysine containing peptide）を表す。しかしながら、特定の態様において、Q-C(O)-NH2はグルタミン含有ペプチドを表し、Q’-NH2は第１化合物を表す（上記で指摘したとおり）。
【００５１】
インビボでの共通のアミンドナーはペプチド結合リジン（peptide bound lysine）であり、上記の反応はペプチドの交差結合（cross-bonding）を生じる。凝固因子XIII因子は、トランスグルタミナーゼであり、損傷時の血液の凝固に影響する。異なるトランスグルタミナーゼは、例えば、Glnの周囲のどのアミノ酸残基が基質となるタンパク質に要求されるにおいて互いに異なる、即ち、異なるトランスグルタミナーゼは、どのアミノ酸残基がGln残基と隣接するかに依存して、基質としてのGln-含有ペプチドを有する。修飾されるべきペプチドが１を超えるGln残基を含有する場合、この側面が利用される。ペプチドを存在するGln残基の幾つかのみで選択的に結合されることが所望される場合、この選択性は、関連するGln残基(s)のみを基質として受容するトランスグルタミナーゼを選択することで得ることができる。或いは、Glnに近接する1以上のアミノ酸残基を、例えば、前記Gln残基に対する所与のトランスグルタミナーゼの活性を修飾させるために遺伝子工学の手段によって変更してもよい。
【００５２】
化合物が一般的に所与の酵素（a given enzyme）に対する基質であるかどうかは、時間枠（time frame）などの反応条件に原則的に依存することが認識されている。十分な時間が与えられれば、通常は基質として認識されない多くの化合物は、事実上は基質である。所与のトランスグルタミナーゼに関して、幾つかのGln残基は基質であろうが他はそうではない（others are not）と上記で述べた場合、他は所望の選択性が達成することができる程度までではないことを指摘することを意図している。1以上のGln残基（これは非結合のまま残されることが所望される）が事実上はトランスグルタミナーゼに対する基質である場合（しかしながら、これは延長期間の間をトランスグルタミナーゼと接触したときのみ）、選択性は適切な時間後にトランスグルタミナーゼを除去すること又は不活性化することによって達成されえる。
【００５３】
有用なトランスグルタミナーゼの例には、微生物のトランスグルタミナーゼであって、例えば、Streptomyces mobaraense, Streptomyces cinnamoneum および Streptomyces griseocarneum (全てはUS 5,156,956に開示されており、これは本明細書中に参照によって援用される), および Streptomyces lavendulae (US 5,252,469に開示されており、これは本明細書中に参照によって援用される) および Streptomyces ladakanum (JP2003199569, これは本明細書中に参照によって援用される)からのトランスグルタミナーゼが含まれる。以前の属Streptoverticilliumのメンバーは、現在は属Streptomycesに含まれることに注意すべきである[Kaempfer, J.Gen.Microbiol., 137, 1831-1892, 1991]。他の有用な微生物のトランスグルタミナーゼは、Bacillus subtilis(US 5,731,183に開示されており、これは本明細書中に参照によって援用される)から及び多様な変形菌類（Myxomycetes）から単離されている。有用な微生物のトランスグルタミナーゼの他の例は、WO96/06931 (例えば、Bacilus lydicusからのトランスグルタミナーゼ)およびWO96/22366に開示されたものであり、これら双方の文献は本明細書中に参照によって援用される。有用な非微生物のトランスグルタミナーゼには、モルモット肝臓 トランスグルタミナーゼ、およびカレイ（Pagrus major）などの多様な海洋性生物供給源からのトランスグルタミナーゼ(EP-0555649に開示されており、これは本明細書中に参照によって援用される)、および日本産カキ（Crassostrea gigas）(US5,736,356に開示されており、これは本明細書中に参照によって援用される)が含まれる。
【００５４】
一態様において、Q’-NH2（即ち、上記で指摘した第１化合物）は、窒素含有求核試薬（a nitrogen containing nucleophile）であり、ここで求核試薬は、炭素の核を攻撃する傾向がある、塩基性（basic）で、電子リッチ（electron-rich）な化合物であると理解すべきである。窒素含有求核試薬は、例えば、アミンまたはオキシアミン誘導体（oxy amine derivative）であってもよい。
【００５５】
一態様において、本発明はペプチドを結合する方法であって、以下の式によって表されるGln残基含有ペプチド
【化４】
0005583635.tif 000006
【００５６】
を、１以上の工程において、以下の式で表される窒素含有求核試薬(第１化合物)
【化５】
0005583635.tif 000007
【００５７】
と、トランスグルタミナーゼの存在下で反応させて、以下の式のアミノ基転移ペプチド（transaminated peptide）
【化６】
0005583635.tif 000008
【００５８】
を形成し、
任意に、Xにおける前記潜在的な官能基を次に活性化し、
前記アミノ基転移ペプチドを、以下の式の第２化合物
【化７】
0005583635.tif 000009
【００５９】
と更に反応させて、以下の式の結合型ペプチド
【化８】
0005583635.tif 000010
【００６０】
を形成する方法に関し、
上記式中のDは、結合または酸素を表し；
Rは、リンカーまたは結合を表し；
Xは、ペプチド  P-C(O)-NH2を構成しているアミノ酸残基に接触可能ではない１以上の官能基又は潜在的な官能基を具備しているラジカルを表し；
Yは、Xに存在する官能基と反応し、かつペプチド  P-C(O)-NH2における接触可能な官能基と反応しない１以上の官能基を具備しているラジカルを表し；
Eは、リンカーまたは結合を表し；
Aは、XおよびYに具備された官能基のペア間の反応によって形成される成分（moiety）を表し；並びに
Zは、前記ペプチドに結合される成分（moiety）である。
【００６１】
結合に引続き、結合型ペプチドは、当該技術における周知の方法によって単離および精製されえる。また、結合型ペプチドは、妥当であれば、薬学的に許容される塩またはプロドラッグへと転換されてもよい。
【００６２】
特に、前記方法は、結果的に生じた結合型ペプチドが薬学的組成物として処方される工程をも備えていてもよい。
【００６３】
XおよびYの官能基間の反応で形成される成分Aは、原則的には、どのような特性の最終的な結合型ペプチドが所望されるかに依存して、任意の種類のものでありえる。ある種の状況において、若干後の段階で切断（例えば、ある種の酵素作用によって又は光分解によって）できる不安定な結合を有することが望まれるだろう。他の状況において、安定な結合型ペプチドが得られるような、安定な結合を有することが望まれるだろう。特別の言及（Particular mentioning）は、アミン誘導体およびカルボニル基、例えば、オキシム、ヒドラゾン、フェニルヒドラゾンおよびセミカルバゾン成分の間の反応で形成される成分のタイプに関してなされる。
【００６４】
一態様において、XおよびYの官能基は、カルボニル基から選択され、例えば、ケトおよびアルデヒド基、およびアミノ誘導体、例えば、
ヒドラジン誘導体                  -NH-NH2,
ヒドラジンカルボキシレート誘導体    -O-C(O)-NH-NH2,
セミカルバジド誘導体                -NH-C(O)-NH-NH2,
チオセミカルバジド誘導体            -NH-C(S)-NH-NH2,
炭酸ジヒドラジド誘導体              -NHC(O)-NH-NH-C(O)-NH-NH2,
カルバジド誘導体                    -NH-NH-C(O)-NH-NH2,
チオカルバジド誘導体                -NH-NH-C(S)-NH-NH2,
アリールヒドラジン誘導体            -NH-C(O)-C6H4-NH-NH2,および
ヒドラジド誘導体                    -C(O)-NH-NH2;または
オキシルアミン誘導体（例えば、-O-NH2, -C(O)-O-NH2, -NH-C(O)-O-NH2 および -NH-C(S)-O-NH2）である。
【００６５】
次の事項が理解されるべきである、その事項とは、Xに具備された官能基がカルボニル基である場合、Yに具備された官能基はアミン誘導体であり、逆もまた同様であることである。多くのペプチド中に-NH2基が存在することから、良好な選択性は次の場合に得られること信じられている、その場合とは、Xがケト-又はアルデヒド-官能性（functionality）を具備する場合である。
【００６６】
XおよびYに存在する適切なペアの官能基の別の例は、反応してトリアゾール成分を形成するアジド誘導体(-N3)およびアルキンである。適切なペアのなお別の例は、反応してイソオキサゾリジン成分を形成するアルキンおよびニトリルオキシド（nitril-oxide）である。
【００６７】
次の事項が理解されるべきである、その事項とは、Xに具備された官能基が、それがY-E-Zとの反応の前に活性化されるべきであるとの意味で潜在的（latent）であってもよいことである。例として、Xは、適切な試薬との反応に際して、アルデヒドまたはケトンへと変形（transformed）される成分を具備してもよい。係る成分の例には、以下が含まれる：  
【化９】
0005583635.tif 000011
【００６８】
式中のR9は、H, C1-6アルキル, アリールまたはヘテロアリールを表す。特定の例には、メチル、エチルおよびプロピルが含まれる。前記成分は、アルデヒドまたはケトンへと、適切な薬剤（例えば、過ヨウ素酸塩）での酸化によって、又は任意で触媒（例えば、銅、銀、または水銀の塩）の存在下において水性の酸での加水分解によって、変形されてもよい。
【００６９】
特に、以下の式の化合物（第１化合物）
【化１０】
0005583635.tif 000012
【００７０】
は、4-(アミノメチル)フェニル エタノン, 4-(2-アミノエチル)フェニル エタノン, N-(4-アセチルフェニル) 2-アミノアセトアミド, 1-[4-(2-アミノエトキシ)フェニル]エタノン, 1-[3-(2-アミノエトキシ)フェニル]エタノン, 1,4-ビス(アミノキシ)ブタン, 3-オキサペンタン-1,5-ジオキシアミン, 1,8-ジアミノキシ-3,6-ジオキサオクタン, 1,3-ビス(アミノキシ)プロパン-2-ol, 1,11-ビス(アミノキシ)-3,6,9-トリオキサウンデカン, 1,3-ジアミノ-2-プロパノール, 1,2-ビス(アミノキシ)エタン, および 1,3-ビス(アミノキシ)プロパンのなかから選択されてもよい。
【００７１】
アミノ基転移するための化合物（第１化合物）およびアミノ基転移ペプチドと反応すべき化合物（第２化合物）の両方は、それぞれリンカー、RおよびEを具備する。これらのリンカー（これらは互いに独立である）は、存在しないか又はアルカン、アルケンまたはアルキンジラジカル並びにヘテロアルカン、ヘテロアルケンおよびヘテロアルキンジラジカルから選択されてもよく、ここで１以上の任意に置換された芳香族単素環式ビラジカル又は複素環式化合物のビラジカル（例えば、フェニレン又はピペリジンビラジカル）が既述のビラジカルへと挿入されてもよい。次の事項が理解されるべきである；その事項とは、前記リンカーがヒドロキシル, ハロゲン, ニトロ, シアノ, カルボキシル, アリール, アルキルおよびヘテロアリール（heteroaryl）から選択された基による置換体を具備してもよいことである。
【００７２】
EおよびRの両方は結合またはリンカーを表す。そして、本発明において、「リンカー（linker）」の用語は、それぞれYをZから及びXをNH2-D-から分けるための手段として機能している成分（moiety）を指摘することを意図している。リンカーEおよびRの１つの機能は、ぺプチドと結合成分Zとの間の連結（linkage）に適切な可動性（flexibility）を提供することであってもよい。EおよびRの典型例には、直線の、分枝状および／または環状のC1-10 アルキレン, C2-10 アルケニレン, C2-10 アルキニレン（alkynylene）, C2-10 ヘテロアルキレン, C2-10 ヘテロアルケニレン, C2-10 ヘテロアルキニレンが含まれ、ここに１以上の単素環式芳香族化合物のビラジカルまたは複素環式化合物のビラジカルが挿入されてもよい。EおよびRの特定の例には、以下が含まれる、
【表２】
0005583635.tif 000013
【００７３】
上記の*は、付着するポイントを表示する。
【００７４】
ペプチドを修飾する必要性は、幾つかの理由で生じるであろう。そして、これは本発明の方法によるペプチドに結合されるだろう化合物の種類にも反映される。ペプチドの物理化学的特性を変更させるために、ペプチドを結合させること〔例えば、治療ペプチドのバイオアベイラビリティーを修飾するために溶解性を増加（又は減少）させること〕が所望されるであろう。別の態様において、身体におけるクリアランス比率を次のように修飾することが所望されるであろう。つまり、化合物をペプチドに結合させることによって、血漿タンパク質（例えば、アルブミン）に結合させて又はぺプチドのサイズを増加させて腎臓を介した排出を予防または遅延させて修飾する。また、結合によって、ペプチドの加水分解に対する感受性が変更（特に、減少）されえる。別の態様において、標識を結合させてペプチドの分析を促進することが所望されるであろう。係る標識の例には、放射性同位体、蛍光マーカー、および酵素基質が含まれる。なお別の態様において、化合物をペプチドに結合して、前記ペプチドの単離を促進する。例えば、特定のカラム材料に特異的な親和性を有する化合物を、前記ペプチドに結合させてもよい。ペプチドの免疫原性を次のように修飾することも所望されるであろう。つまり、例えば、ペプチドを、前記ペプチドの１以上の免疫原性エピトープを隠す（hide）、マスクする、又は覆い隠す（eclipse）ように結合して修飾する。
【００７５】
一態様において、本発明は、ペプチドの薬理学的特性を改善する方法を提供する。前記改善は、対応する非結合型ペプチド（un-conjugated peptide）に関連する。係る薬理学的特性の例には、機能的なインビボ半減期、免疫原性、腎臓濾過（renal filtration）、プロテアーゼ防御、およびアルブミン結合が含まれる。
【００７６】
「機能的なインビボ半減期（functional in vivo half-life）」の用語は、その通常の意味で使用される。即ち、前記ペプチドまたは結合型ペプチドの生物活性の50%が身体／標的器官中になおも存在している時間、或いは前記ペプチドまたは結合型ペプチドの前記活性がその初期値の50%である時間である。機能的なインビボ半減期を決定することの代替として、「インビボ血漿半減期（in vivo plasma half-life）」を決定してもよい。即ち、これは前記ペプチドまたはペプチド結合体（peptide conjugate）の50%が、クリアされる前に血漿または血流中で循環している時間である。血漿半減期の決定は、機能的な半減期を決定することよりもしばしば単純である。また、血漿半減期の規模（magnitude）は、通常は機能的なインビボ半減期の規模の良好な指標である。血漿半減期の代替的な用語には、血清半減期、循環半減期（circulating half-life）、循環性半減期（circulatory half-life）、血清クリアランス、血漿クリアランス、およびクリアランス半減期（clearance half-life）が含まれる。
【００７７】
機能的なインビボ半減期または血漿半減期と関連して使用される「増加（increased）」の用語は、次の事項を指摘するために使用される、その事項とは、ペプチド結合体の関連する半減期が、非結合（親）ペプチドのものと比べて、統計学的に有意に増加することである（比較できる条件下で決定される）。一例を挙げると、関連性のある半減期は、少なくとも約 25%、例えば、少なくとも約 50%まで、例えば、少なくとも約 100%, 150%, 200%, 250%, または500%まで増加しえる。一態様において、本発明の化合物は、少なくとも約5 h、好ましくは少なくとも約24 h、より好ましくは少なくとも約 72 h、および最も好ましくは少なくとも約 7 日の、親ペプチドの半減期と比べて増加を呈する。
【００７８】
インビボ血漿半減期の測定は、文献に記載の多くの様式で実施することができる。インビボ血漿半減期における増加は、クリアランス(CL；clearance)における減少として又は平均滞留時間（MRT；mean residence time）における増加として定量化しえる。本発明の結合型ペプチドに関して、CLは、適切なアッセイで決定されたときに親ペプチドのCLの70%未満、例えば50%未満、例えば20%未満、例えば10%未満に減少させられ、これにより増加したインビボ血漿半減期を有すると言われる。本発明の結合型ペプチドに関して、MRTは、適切なアッセイにおいて親ペプチドのMRTの130%以上、例えば150%以上、例えば200%以上、例えば500%以上に増加させられ、これにより増加したインビボ血漿半減期を有すると言われる。クリアランスおよび平均滞留時間は、適切な試験動物を用いた標準の薬物動態学的試験で評価することができる。所与のタンパク質に関して適切な試験動物を選ぶことは、当業者の能力の範囲内である。ヒトにおける試験は、もちろん最大限の試験を示す。典型的には、例として、マウス、ラット、イヌ、サルまたはブタが所望の化合物を注射される。注射される量は、試験動物に依存する。引き続いて、血液サンプルが、CLおよびMRTの評価のために必要に応じて、１から５日の期間で採取される。血液サンプルは、ELISA技術で都合良く分析される。
【００７９】
化合物の「免疫原性（Immunogenicity）」の用語は、ヒトに投与された場合に有害（deleterious）な免疫反応（体液性、細胞性、または両方であろうと）を惹起する化合物の能力を意味する。任意のヒト亜集団において、特定の投与されたタンパク質に感受性を呈する個体が存在しえる。免疫原性は、感受性個体における成長ホルモン抗体および／または成長ホルモン応答性T細胞の存在を、当該技術分野において知られる通常の方法を用いて定量することによって測定されえる。一態様において、本発明の結合型ペプチドは、感受性個体の免疫原性において、その個体に関して親ペプチドの免疫原性と比べて、少なくとも約 10%、好ましくは少なくとも約 25%、より好ましくは少なくとも約 40%および最も好ましくは少なくとも約 50%の減少を呈する。
【００８０】
本明細書中で使用される「プロテアーゼ防御（protease protection）」または「プロテアーゼ防御された（protease protected）」の用語は、本発明の結合型ペプチドが、親ペプチドよりも血漿ペプチダーゼまたはプロテアーゼに対してより耐性であることを指摘することを意図している。血漿に存在するプロテアーゼおよびペプチダーゼ酵素は、循環しているタンパク質のデグラデーションに関与することが知られている。
【００８１】
例えば、ジペプチジルアミノペプチダーゼIV(DPPIV)によるデグラデーションに対するタンパク質の耐性は、以下のデグラデーションアッセイによって決定される：タンパク質 (5 nmol)のアリコット（Aliquots）を、37゜Cで1 μLの精製ジペプチジルアミノペプチダーゼIV（100μLの0.1 Mトリエチルアミン-HCl緩衝剤、pH 7.4中で10〜180分間、5 mUの酵素活性に相当する）とインキュベーションした。酵素反応を5 μLの10%トリフルオロ酢酸を添加することによって終了させ、そしてタンパク質デグラデーション産物をHPLC分析を用いて分離し、定量した。この分析を行うための１つの方法を以下に記す：混合物を、文献（Siegel et al., Regul. Pept. 1999;79:93-102およびMentlein et al. Eur. J. Biochem. 1993;214:829-35）にしたがって、Vydac C18 widepore (30 nm pores, 5 μm particles) 250 x 4.6 mm カラムに適用し、流速1 ml/minで、アセトニトリルを0.1%トリフルオロ酢酸中に含有する溶液(0%アセトニトリルで3 min、0-24%アセトニトリルで17 min、24-48%アセトニトリルで1 min)のリニア  ステップワイズ  グラジエントで溶出した。タンパク質及びそのデグラデーション産物を、220 nm(ペプチド結合)または280 nm(芳香族アミノ酸)での彼らの吸光度によってモニターしてもよい、そして、標準のものと関連する彼らのピーク領域を積分することで定量される。ジペプチジルアミノペプチダーゼIVによるタンパク質の加水分解の速度は、加水分解されるペプチドの10%未満を生じるインキュベーション時間で推定される。一態様において、ペプチド結合体の加水分解の速度は、親ペプチドのものの70%未満、例えば40%未満、例えば10%未満である。
【００８２】
哺乳類種の循環血液中において最も豊富なタンパク質コンポーネントは血清アルブミンであり、これは約 3〜4.5グラム／100ミリリットル全血の濃度で通常存在する。血清アルブミンは約 70,000ダルトンの血液タンパクであり、これは循環系中で幾つかの重要な機能を有している。それは血液で見出される様々な有機分子のトランスポーターとして、脂肪酸およびビリルビンなどの様々な代謝物の血液を介した主なトランスポーターとして、及びその豊富さによって循環血液の浸透圧レギュレーターとして機能する。血清アルブミンは、１週間以上の半減期を有する。そして、タンパク質の血漿半減期を増加させるための１つのアプローチは、前記タンパク質を血清アルブミンに結合する基に結合させることである。アルブミン結合特性は、文献（J.Med.Chem, 43, 2000, 1986-1992, この文献は本明細書中に参照によって援用される）に記載のとおり決定しえる。
【００８３】
Zの具体的な例には、次のものを具備するラジカル、１以上の標識、例えば、蛍光マーカー、例えば、フルオレッセインラジカル、ローダミンラジカル、テキサスレッド(R)ラジカルおよびフィコビリンタンパク質ラジカル;酵素基質、例えば、p-ニトロフェノールアセテートラジカル；および放射性同位体、例えば、Cu-64, Ga67, Ga-68, Zr-89, Ru-97, Tc-99, Rh-105, Pd-109, In-111, I-123, I-125, I-131, Re-186, Re-188, Au-198, Pb-203, At-211, Pb-212 およびBi-212;有機成分（organic moieties）、例えば、PEGまたはmPEGラジカル及びそのアミノ誘導体(直鎖状および分枝状のPEGおよびmPEGラジカルを含む); 直鎖状、分枝状および／または環状のC1-22 アルキル, C2-22 アルケニル, C2-22 アルキニル, C1-22 ヘテロアルキル, C2-22 ヘテロアルケニル, C2-22 ヘテロアルキニルが含まれ、ここで１以上の単素環式芳香族化合物ビラジカルまたは複素環式化合物ビラジカルが挿入されてもよく、ここで前記C1-C22 または C2-C22 ラジカルはヒドロキシル, ハロゲン, カルボキシル, ヘテロアリールおよびアリールから選択される１以上の置換体で任意で置換されてもよく、ここで前記アリールまたはヘテロアリールはヒドロキシル, ハロゲン, およびカルボキシルから選択される１以上の置換基で任意でさらに置換されてもよい；ステロイドラジカル;脂質ラジカル;ポリサッカライドラジカル、例えば、デキストラン;ポリアミドラジカル、例えばポリアミノ酸ラジカル;PVPラジカル;PVAラジカル;ポリ(1-3-ジオキサラン(dioxalane));ポリ(1,3,6-トリオキサン);エチレン/無水マレイン酸ポリマー;シバクロン染料、例えば、シバクロンブルー（Cibacron Blue）3GA;WO 00/12587に開示された特定長のポリアミド鎖（この文献は本明細書中に参照によって援用される）；並びにヒドロキシアルキル澱粉、例えば、ヒドロキシエチル澱粉、例えば、WO 03/074087およびWO 02/80979（これらの文献の双方は本明細書中に参照によって援用される）に開示されたものから選択される１以上の置換体で任意でさらに置換されてもよい。
【００８４】
特別の言及が以下の式のC10-20 アルキル、例えば、C15およびC17, および特に直鎖状C15 およびC17, およびベンゾフェノン誘導体に関してなされる：
【化１１】
0005583635.tif 000014
【００８５】
特別の言及が以下にスケッチされるシバクロニルラジカル（cibacronyl radical）を具備しているZに関してなされる：
【化１２】
0005583635.tif 000015
【００８６】
本発明によるペプチドに結合されるPEGまたはmPEGは、任意の分子量のものであってもよい。特に、分子量は、500および1000,000 Daの間、例えば500および500,000 Daの間、例えば500および100,000 Daの間、例えば500および60,000 Daの間、例えば1000および40,000 Daの間、例えば5000および40,000 Daの間であってもよい。特に、10,000 Daおよび40,000 Daの間、例えば、20,000 Da および40,000 Daの間、例えば、20,000および30,000 Daの間または30,000および40,000 Daの間の分子量を有するPEGが使用されえる。特別の言及は、10,000, 20,000, 30,000又は40,000 Daの分子量を有するPEGまたはmPEGに関してなされる。
【００８７】
Zは、Zが上記で述べた標識またはラジカルの２以上を具備するように分枝してもよい。一例を挙げると、mPEG40Kは、2つのアームの各々にmPEG20kを具備している分枝状mPEGとして典型的には達成される。
【００８８】
一態様において、Zは、血漿タンパク質（例えば、アルブミン）に結合することが知られている１以上の成分を具備する。化合物のアルブミンに結合する能力は、文献（J.Med.Chem, 43, 2000, 1986-1992）に記載のように決定し得る、該文献は参照によって本明細書中に援用される。この関連において、Ru/Daが0.05を超える、例えば0.10を超える、例えば0.12を超える、または0.15以上である場合、化合物はアルブミンへ結合すると規定される。
【００８９】
本発明の別の態様において、アルブミン結合成分は、ペプチド（例えば、40アミノ酸残基未満を具備しているペプチド）である。アルブミン結合成分である幾つかの小さいペプチドは、文献〔J. Biol Chem.277, 38 (2002) 35035-35043, 該文献は本明細書中に参照によって援用される〕に開示されている。
【００９０】
式Y-E-Zの化合物の特定の例には、以下が含まれる：
【化１３】
0005583635.tif 000016
【００９１】
上記のmPEGは20 kDaの分子量を有する、
【化１４】
0005583635.tif 000017
【００９２】
上記のmPEGは20 kDaの分子量を有する、
【化１５】
0005583635.tif 000018
【００９３】
上記のmPEGは20 kDaの分子量を有する、
【化１６】
0005583635.tif 000019
【００９４】
上記のmPEGは20 kDaの分子量を有する、
【化１７】
0005583635.tif 000020
【００９５】
上記のmPEGは20 kDaの分子量を有する、
【化１８】
0005583635.tif 000021
【００９６】
上記のmPEGは20 kDaまたは30 kDaの分子量を有する、
【化１９】
0005583635.tif 000022
【００９７】
上記のmPEGは20 kDaの分子量を有する、
【化２０】
0005583635.tif 000023
【００９８】
上記のmPEGは20 kDaの分子量を有する、
【化２１】
0005583635.tif 000024
【００９９】
上記のmPEGは20 kDaの分子量を有する、
【化２２】
0005583635.tif 000025
【０１００】
上記のmPEGは20 kDaの分子量を有する、
【化２３】
0005583635.tif 000026
【０１０１】
上記のmPEGは20 kDaの分子量を有する、
【化２４】
0005583635.tif 000027
【０１０２】
上記のmPEGは20 kDaの分子量を有する、
【化２５】
0005583635.tif 000028
【０１０３】
上記のmPEGは20 kDaの分子量を有する、
【化２６】
0005583635.tif 000029
【０１０４】
上記のmPEGは20 kDaの分子量を有する、
【化２７】
0005583635.tif 000030
【０１０５】
上記のmPEGは20 kDaの分子量を有する、
【化２８】
0005583635.tif 000031
【０１０６】
上記のmPEGは20 kDaの分子量を有する、
【化２９】
0005583635.tif 000032
【０１０７】
上記のmPEGは20 kDaの分子量を有する、
【化３０】
0005583635.tif 000033
【０１０８】
上記のmPEGは20 kDaの分子量を有する、
【化３１】
0005583635.tif 000034
【０１０９】
上記のmPEGは20 kDaの分子量を有する、
【化３２】
0005583635.tif 000035
【０１１０】
上記のmPEGは20 kDaの分子量を有する、
【化３３】
0005583635.tif 000036
【０１１１】
上記のmPEGは20 kDaの分子量を有する、
【化３４】
0005583635.tif 000037
【０１１２】
上記のmPEGは20 kDaの分子量を有する、
【化３５】
0005583635.tif 000038
【０１１３】
上記のmPEGは20 kDaの分子量を有する、
【化３６】
0005583635.tif 000039
【０１１４】
上記のmPEGは20 kDaの分子量を有する、
【化３７】
0005583635.tif 000040
【０１１５】
上記のmPEGは20 kDaの分子量を有する、
【化３８】
0005583635.tif 000041
【０１１６】
上記のmPEGは20 kDaの分子量を有する、
【化３９】
0005583635.tif 000042
【０１１７】
上記のmPEGは20 kDaの分子量を有する、
【化４０】
0005583635.tif 000043
【０１１８】
上記のmPEGは20 kDaの分子量を有する、
【化４１】
0005583635.tif 000044
【０１１９】
上記のmPEGは20 kDaの分子量を有する、
【化４２】
0005583635.tif 000045
【０１２０】
上記のmPEGは20 kDaの分子量を有する、
【化４３】
0005583635.tif 000046
【０１２１】
上記のmPEGは20 kDaの分子量を有する、
【化４４】
0005583635.tif 000047
【０１２２】
上記のmPEGは10 kDaの分子量を有する、
【化４５】
0005583635.tif 000048
【０１２３】
上記のmPEGは10 kDaの分子量を有する、
【化４６】
0005583635.tif 000049
【０１２４】
上記のmPEGは10 kDaの分子量を有する、
【化４７】
0005583635.tif 000050
【０１２５】
上記のmPEGは10 kDaの分子量を有する、
【化４８】
0005583635.tif 000051
【０１２６】
上記のmPEGは10 kDaの分子量を有する、
【化４９】
0005583635.tif 000052
【０１２７】
上記のmPEGは10 kDaの分子量を有する、
【化５０】
0005583635.tif 000053
【０１２８】
上記のmPEGは10 kDaの分子量を有する、
【化５１】
0005583635.tif 000054
【０１２９】
上記のmPEGは10 kDaの分子量を有する、
【化５２】
0005583635.tif 000055
【０１３０】
上記のmPEGは10 kDaの分子量を有する、
【化５３】
0005583635.tif 000056
【０１３１】
上記のmPEGは10 kDaの分子量を有する、
【化５４】
0005583635.tif 000057
【０１３２】
上記のmPEGは10 kDaの分子量を有する、
【化５５】
0005583635.tif 000058
【０１３３】
上記のmPEGは10 kDaの分子量を有する、
【化５６】
0005583635.tif 000059
【０１３４】
上記のmPEGは10 kDaの分子量を有する、
【化５７】
0005583635.tif 000060
【０１３５】
上記のmPEGは10 kDaの分子量を有する、
【化５８】
0005583635.tif 000061
【０１３６】
上記のmPEGは10 kDaの分子量を有する、
【化５９】
0005583635.tif 000062
【０１３７】
上記のmPEGは10 kDaの分子量を有する、
【化６０】
0005583635.tif 000063
【０１３８】
上記のmPEGは10 kDaの分子量を有する、
【化６１】
0005583635.tif 000064
【０１３９】
上記のmPEGは10 kDaの分子量を有する、
【化６２】
0005583635.tif 000065
【０１４０】
上記のmPEGは10 kDaの分子量を有する、
【化６３】
0005583635.tif 000066
【０１４１】
上記のmPEGは10 kDaの分子量を有する、
【化６４】
0005583635.tif 000067
【０１４２】
上記のmPEGは10 kDaの分子量を有する、
【化６５】
0005583635.tif 000068
【０１４３】
上記のmPEGは10 kDaの分子量を有する、
【化６６】
0005583635.tif 000069
【０１４４】
上記のmPEGは10 kDaの分子量を有する、
【化６７】
0005583635.tif 000070
【０１４５】
上記のmPEGは10 kDaの分子量を有する、
【化６８】
0005583635.tif 000071
【０１４６】
上記のmPEGは10 kDaの分子量を有する、
【化６９】
0005583635.tif 000072
【０１４７】
上記のmPEGは10 kDaの分子量を有する、
【化７０】
0005583635.tif 000073
【０１４８】
上記のmPEGは10 kDaの分子量を有する、
【化７１】
0005583635.tif 000074
【０１４９】
上記のmPEGは10 kDaの分子量を有する、
【化７２】
0005583635.tif 000075
【０１５０】
上記のmPEGは10 kDaの分子量を有する、
【化７３】
0005583635.tif 000076
【０１５１】
上記のmPEGは10 kDaの分子量を有する、
【化７４】
0005583635.tif 000077
【化７５】
0005583635.tif 000078
【化７６】
0005583635.tif 000079
【化７７】
0005583635.tif 000080
【化７８】
0005583635.tif 000081
【化７９】
0005583635.tif 000082
【化８０】
0005583635.tif 000083
【化８１】
0005583635.tif 000084
【化８２】
0005583635.tif 000085
【化８３】
0005583635.tif 000086
【化８４】
0005583635.tif 000087
【化８５】
0005583635.tif 000088
【化８６】
0005583635.tif 000089
【化８７】
0005583635.tif 000090
【化８８】
0005583635.tif 000091
【化８９】
0005583635.tif 000092
【化９０】
0005583635.tif 000093
【化９１】
0005583635.tif 000094
【化９２】
0005583635.tif 000095
【化９３】
0005583635.tif 000096
【化９４】
0005583635.tif 000097
【化９５】
0005583635.tif 000098
【化９６】
0005583635.tif 000099
【化９７】
0005583635.tif 000100
【化９８】
0005583635.tif 000101
【化９９】
0005583635.tif 000102
【化１００】
0005583635.tif 000103
【化１０１】
0005583635.tif 000104
【化１０２】
0005583635.tif 000105
【化１０３】
0005583635.tif 000106
【化１０４】
0005583635.tif 000107
【０１５２】
上記式中の各kは、0〜5、即ち、0, 1, 2, 3, 4 または5の整数を表す。
【０１５３】
「発明の背景」の部分で議論したとおり、例えば、アミン機能化PEGまたは脂肪酸をGln含有ペプチドに直接結合させたことは知られている。しかしながら、例えば、文献（EP 950665, EP 785276, Sato, Adv.Drug Delivery Rev., 54, 459-476, 2002およびWada, Biotech.Lett., 23, 1367-1372, 2001）に開示された例示から、進行させる反応に前記ペプチドに結合させるべき化合物が有意に過剰（100〜1000倍まで）に必要とされることは明らかである。係る過剰性によって、技術上または大規模の反応の利用性に制限がかかる。一例を挙げると、小さい多分散性指標を有するmPEGは、非常に高価であり、大過剰を要求することは実際上は禁止される。そのうえ、大きな成分（例えば、PEG 10 kDaまたはPEG 20k Da）の結合に関して、100〜1000倍のオーダーでの試薬の過剰は、係る化合物の分子量により可能ではない。PEGが大量に存在することによって、ペプチド（即ち、結合されるべきペプチドおよびトランスグルタミナーゼ）を沈殿させるだろうことも周知である。これと対照的に、本２工程法は、次の利点を提供する；その利点とは、酵素工程において大過剰で要求される反応体は、大過剰でも容易に操作できる小分子であることである。第２工程で形成されるべき結合の適切な選択によって、大過剰は要求されない；例えば、オキシム形成は、アミン-およびケト-官能価（functionalities）のほとんど等モル量で生じる。
【０１５４】
更なる利点は、「結合させる準備ができた（ready-to-conjugate）」ペプチドを作出する可能性である。ペプチドは、トランスグルタミナーゼの存在下で適切な求核試薬（H2N-D-R-X）と反応して、機能化ペプチドを産生しえる。係る機能化ペプチドは、次に必要に応じて、１以上の第２化合物（Y-E-Z）と後に反応させて、様々な異なる結合型ペプチドを産生するために保存されてもよい。これによって、使用される１つの機能化ペプチドが、多数の結合型ペプチドを産生することが許容される。この様式で、適切な反応条件を同定するための多くの至適化を、避けることができる。
【０１５５】
ペプチドは、本発明の方法によるトランスグルタミナーゼに対する基質でなければならない。従って、前記ペプチドがGlnまたはLys残基（特にGln 残基）を含有することが要求される。所与のペプチドがトランスグルタミナーゼ基質ではない場合、１以上のGlnまたはLys残基（特に、Gln残基）を、ペプチド配列に挿入して、前記ペプチドをトランスグルタミナーゼに関する基質となすことが可能である。原則的には、係るGlnまたはLys残基は配列の任意のポジションで挿入されてもよい、しかしながら、生理学的、例えば、前記ペプチドの治療上の活性が前記ペプチドがもはや有用ではない（例えば、治療上のインターベンション）程度まで影響されないポジションで挿入されることが好ましい。アミノ酸残基のペプチドへの挿入は、当該技術分野における当業者に知られる標準の技術（例えば、翻訳後化学修飾またはトランスジェネティック技術）によって達成できる。
【０１５６】
トランスグルタミナーゼに対する基質である任意のペプチドは本発明の方法によって結合することができ、例えば、酵素, ペプチドホルモン, 成長因子, 抗体, サイトカイン, レセプター, リンフォカインおよびワクチン抗原, および特別の言及は治療ペプチド, 例えば、インシュリン, グルカゴン様ペプチド１ (GLP-1), グルカゴン様-ペプチド2 (GLP-2), 成長ホルモン, サイトカイン, トレフォイル因子ペプチド（trefoil factor peptides）(TFF), ペプチドメラノコルチン レセプターモディファイヤーおよびVII因子化合物に関してなされる。
【０１５７】
具体的に適用可能なインシュリンは、ヒトインシュリンである。本発明において「ヒトインシュリン」の用語は、天然で産生されたインシュリンまたは組換え技術で産生されたインシュリンを意味する。組換え型のヒトインシュリンは、任意の適切な宿主細胞において産生でき、例えば、前記宿主細胞は細菌性、真菌性 (酵母を含む)、昆虫、動物または植物細胞であってもよい。多くのインシュリン化合物は文献中に開示されており、それらも本発明の方法に特に有用である。「インシュリン化合物」（および関連する表現）は、1以上のアミノ酸が、非コード化可能なアミノ酸（non-codeable amino acids）を含む他のアミノ酸によって削除（deleted）および／または置換されたヒトインシュリン、および／または付加的なアミノ酸（即ち、51アミノ酸を超える）を具備しているヒトインシュリン、および／または少なくとも１つの有機置換基が1以上のアミノ酸に結合されたヒトインシュリンを意味する。
【０１５８】
以下の特許文献は、本発明によって提供される方法に特に適用可能なインシュリン化合物の開示として言及される。
【０１５９】
WO97/31022(Novo Nordisk)（該文献は、本明細書中に参照によって援用される）は遅延性活性プロファイル（a protracted activity profile）を有しているインシュリン化合物を開示しており、該インシュリン化合物はB-鎖のN末端アミノ酸のアミノ基および／またはLysB29のε−アミノ基がカルボン酸含有親油性置換基を有するものである。特別の言及が以下のものに関してなされる：NεB29-(CO-(CH2)14-COOH) ヒトインシュリン; NεB29-(CO-(CH2)16-COOH) ヒトインシュリン; NεB29-(CO-(CH2)18-COOH) ヒトインシュリン; NεB29-(CO-(CH2)20-COOH); NεB29-(CO-(CH2)22-COOH) ヒトインシュリン; NεB29-(CO-(CH2)14-COOH) AspB28 -ヒトインシュリン; NεB29-(CO-(CH2)16-COOH) AspB28 -ヒトインシュリン; NεB29-(CO-(CH2)18-COOH) AspB28 -ヒトインシュリン; NεB29-(CO-(CH2)20-COOH) AspB28 -ヒトインシュリン; NεB29-(CO-(CH2)22-COOH) AspB28 -ヒトインシュリン; NεB30-(CO-(CH2)14-COOH) ThrB29LysB30-ヒトインシュリン; NεB30-(CO-(CH2)16-COOH) ThrB29LysB30-ヒトインシュリン; NεB30-(CO-(CH2)18-COOH) ThrB29LysB30-ヒトインシュリン; NεB30-(CO-(CH2)20-COOH) ThrB29LysB30-ヒトインシュリン; NεB30-(CO-(CH2)22-COOH) ThrB29LysB30-ヒトインシュリン;
NεB28-(CO-(CH2)14-COOH) LysB28ProB29-ヒトインシュリン; NεB28-(CO-(CH2)16-COOH) LysB28ProB29-ヒトインシュリン; NεB28-(CO-(CH2)18-COOH) LysB28ProB29-ヒトインシュリン; NεB28-(CO-(CH2)20-COOH) LysB28ProB29-ヒトインシュリン; NεB28-(CO-(CH2)22-COOH) LysB28ProB29-ヒトインシュリン; NεB29-(CO-(CH2)14-COOH) desB30 ヒトインシュリン; NεB29-(CO-(CH2)16-COOH) desB30 ヒトインシュリン; NεB29-(CO-(CH2)18-COOH) desB30 ヒトインシュリン; NεB29-(CO-(CH2)20-COOH) desB30 ヒトインシュリン; および NεB29-(CO-(CH2)22COOH) desB30 ヒトインシュリン。
【０１６０】
WO96/29344 (Novo Nordisk)（該文献は、本明細書中に参照によって援用される）は、遅延性活性プロファイルを有しているインシュリン化合物を開示しており、該インシュリン化合物はＢ鎖のＮ−末端アミノ酸のアミノ基が付着した12〜40炭素原子を具備している親油性置換基を有するか、或いはＢ鎖のＣ−末端アミノ酸のカルボン酸基が付着した12〜40炭素原子を具備している親油性置換基を有している。
【０１６１】
WO95/07931(Novo Nordisk)（該文献は、本明細書中に参照によって援用される）は、遅延性活性プロファイルを有しているインシュリン化合物を開示しており、該インシュリン化合物はLysB29のε−アミノ基が親油性置換基を有するものである。特別の言及が以下のものに関してなされる：NεB29-トリデカノイル des(B30) ヒトインシュリン, NεB29-テトラデカノイル des(B30) ヒトインシュリン, NεB29-デカノイル des(B30) ヒトインシュリン, NεB29-ドデカノイル des(B30) ヒトインシュリン, NεB29-トリデカノイル GlyA21 des(B30) ヒトインシュリン, NεB29-テトラデカノイル GlyA21 des(B30) ヒトインシュリン, NεB29-デカノイル GlyA21 des(B30) ヒトインシュリン, NεB29-ドデカノイル GlyA21 des(B30) ヒトインシュリン, NεB29-トリデカノイル GlyA21 GlnB3 des(B30) ヒトインシュリン, NεB29-テトラデカノイル GlyA21 GlnB3 des(B30) ヒトインシュリン, NεB29-デカノイル GlyA21 GlnB3 des(B30) ヒトインシュリン, NεB29-ドデカノイル GlyA21 GlnB3 des(B30) ヒトインシュリン, NεB29-トリデカノイル AlaA21 des(B30) ヒトインシュリン, NεB29-テトラデカノイル AlaA21 des(B30) ヒトインシュリン, NεB29-デカノイル AlaA21 des(B30) ヒトインシュリン, NεB29-ドデカノイル AlaA21 des(B30) ヒトインシュリン, NεB29-トリデカノイル AlaA21 GlnB3 des(B30) ヒトインシュリン, NεB29-テトラデカノイル AlaA21 GlnB3 des(B30) ヒトインシュリン, NεB29-デカノイル AlaA21 GlnB3 des(B30) ヒトインシュリン, NεB29-ドデカノイル AlaA21 GlnB3 des(B30) ヒトインシュリン, NεB29-トリデカノイル GlnB3 des(B30) ヒトインシュリン, NεB29-テトラデカノイル GlnB3 des(B30) ヒトインシュリン, NεB29-デカノイル GlnB3 des(B30) ヒトインシュリン, NεB29-ドデカノイル GlnB3 des(B30) ヒトインシュリン, NεB29-トリデカノイル GlyA21 ヒトインシュリン, NεB29-テトラデカノイル GlyA21 ヒトインシュリン, NεB29-デカノイル GlyA21 ヒトインシュリン, NεB29-ドデカノイル GlyA21 ヒトインシュリン, NεB29-トリデカノイル GlyA21 GlnB3 ヒトインシュリン, NεB29-テトラデカノイル GlyA21 GlnB3 ヒトインシュリン, NεB29-デカノイル GlyA21 GlnB3 ヒトインシュリン, NεB29-ドデカノイル GlyA21 GlnB3 ヒトインシュリン, NεB29-トリデカノイル AlaA21 ヒトインシュリン, NεB29-テトラデカノイル AlaA21 ヒトインシュリン, NεB29-デカノイル AlaA21 ヒトインシュリン, NεB29-ドデカノイル AlaA21 ヒトインシュリン, NεB29-トリデカノイル AlaA21 GlnB3 ヒトインシュリン, NεB29-テトラデカノイル AlaA21 GlnB3 ヒトインシュリン, NεB29-デカノイル AlaA21 GlnB3 ヒトインシュリン, NεB29-ドデカノイル AlaA21 GlnB3 ヒトインシュリン, NεB29-トリデカノイル GlnB3 ヒトインシュリン, NεB29-テトラデカノイル GlnB3 ヒトインシュリン, NεB29-デカノイル GlnB3 ヒトインシュリン, NεB29-ドデカノイル GlnB3 ヒトインシュリン, NεB29-トリデカノイル GluB30 ヒトインシュリン, NεB29-テトラデカノイル GluB30 ヒトインシュリン, NεB29-デカノイル GluB30 ヒトインシュリン, NεB29-ドデカノイル GluB30 ヒトインシュリン, NεB29-トリデカノイル GlyA21 GluB30 ヒトインシュリン, NεB29-テトラデカノイル GlyA21 GluB30 ヒトインシュリン, NεB29-デカノイル GlyA21 GluB30 ヒトインシュリン, NεB29-ドデカノイル GlyA21 GluB30 ヒトインシュリン, NεB29-トリデカノイル GlyA21 GlnB3 GluB30 ヒトインシュリン, NεB29-テトラデカノイル GlyA21 GlnB3 GluB30 ヒトインシュリン, NεB29-デカノイル GlyA21 GlnB3 GluB30 ヒトインシュリン, NεB29-ドデカノイル GlyA21 GlnB3 GluB30 ヒトインシュリン, NεB29-トリデカノイル AlaA21 GluB30 ヒトインシュリン, NεB29-テトラデカノイル AlaA21 GluB30 ヒトインシュリン, NεB29-デカノイル AlaA21 GluB30 ヒトインシュリン, NεB29-ドデカノイル AlaA21 GluB30 ヒトインシュリン, NεB29-トリデカノイル AlaA21 GlnB3 GluB30 ヒトインシュリン, NεB29-テトラデカノイル AlaA21 GlnB3 GluB30 ヒトインシュリン, NεB29-デカノイル AlaA21 GlnB3 GluB30 ヒトインシュリン, NεB29-ドデカノイル AlaA21 GlnB3 GluB30 ヒトインシュリン, NεB29-トリデカノイル GlnB3 GluB30 ヒトインシュリン, NεB29-テトラデカノイル GlnB3 GluB30 ヒトインシュリン, NεB29-デカノイル GlnB3 GluB30 ヒトインシュリン およびNεB29-ドデカノイル GlnB3 GluB30 ヒトインシュリン。
【０１６２】
WO97/02043(Novo Nordisk)（該文献は、本明細書中に参照によって援用される）は、インシュリン予防法（insulin prophylaxis）に有用なホルモン的に不活性のインシュリン化合物を開示しており、特にヒトインシュリンの係るアナログは、以下から選択されるものが本発明の方法に適用可能である：desA1 ヒトインシュリン; des(A1-A2) ヒトインシュリン; des(A1-A3) ヒトインシュリン; desA21 ヒトインシュリン; des(B1-B5) ヒトインシュリン; des(B1-B6) ヒトインシュリン; des(B23-B30) ヒトインシュリン; des(B24-B30) ヒトインシュリン; des(B25-B30) ヒトインシュリン; GlyA2 ヒトインシュリン; AlaA2 ヒトインシュリン; NleA2 ヒトインシュリン; ThrA2 ヒトインシュリン; ProA2 ヒトインシュリン; D-アロ IleA2 ヒトインシュリン; NvaA3 ヒトインシュリン; NleA3 ヒトインシュリン; LeuA3 ヒトインシュリン; ValA2,IleA3 ヒトインシュリン; AbuA2,AbuA3 ヒトインシュリン; GlyA2,GlyA3 ヒトインシュリン; D-CysA6 ヒトインシュリン; D-CysA6,D-CysA11 ヒトインシュリン; SerA6,SerA11,des(A8-A10) ヒトインシュリン; D-CysA7 ヒトインシュリン; D-CysA11 ヒトインシュリン; LeuA19 ヒトインシュリン; GlyB6 ヒトインシュリン; GluB12 ヒトインシュリン; AsnB12 ヒトインシュリン; PheB12 ヒトインシュリン; D-AlaB12 ヒトインシュリン; および AspB25 ヒトインシュリン。
【０１６３】
WO92/15611(Novo nordisk)（該文献は、本明細書中に参照によって援用される）は、インシュリンレセプター結合プロセスにおいて速い会合速度定数を有し、チロシンをポジションA13に、および／またはフェニルアラニン、トリプトファンまたはチロシンをポジションB17に具備していることによって特徴づけるヒトインシュリンのアナログを開示している。特に、係るアナログは、TyrA13 ヒトインシュリン, PheB17 ヒトインシュリン, TrpB17 ヒトインシュリン, TyrB17 ヒトインシュリン, TyrA13,PheB17 ヒトインシュリン, TyrA13,TrpB17 ヒトインシュリン, TyrA13,TyrB17 ヒトインシュリン, PheA13,PheB17 ヒトインシュリン, PheA13,TrpB17 ヒトインシュリン, PheA13,TyrB17 ヒトインシュリン, TrpA13,PheB17 ヒトインシュリン, TrpA13,TrpB17 ヒトインシュリン および TrpA13,TyrB17 ヒトインシュリンのなかから選択される。
【０１６４】
WO92/00322 (Novo Nordisk)（該文献は、本明細書中に参照によって援用される）は、ヒトインシュリンのアナログを開示しており、該アナログは特定の組織を標的とする能力を有し、インシュリン分子のA13ポジションに及び／又はB17ポジションにロイシンとは異なる天然のアミノ酸残基を有していること及び／又はインシュリン分子のB18ポジションにバリンとは異なる天然のアミノ酸残基を有していることによって特徴付けられる。特に、係るアナログは、AlaB17 ヒトインシュリン, AlaB18 ヒトインシュリン, AsnA13 ヒトインシュリン, AsnA13,AlaB17ヒトインシュリン, AsnA13,AspB17 ヒトインシュリン, AsnA13,GluB17 ヒトインシュリン, AsnB18 ヒトインシュリン, AspA13 ヒトインシュリン, AspA13,AlaB17 ヒトインシュリン, AspA13,AspB17 ヒトインシュリン, AspA13,GluB17 ヒトインシュリン, AspB18 ヒトインシュリン, GlnA13 ヒトインシュリン, GlnA13,AlaB17 ヒトインシュリン, GlnA13,AspB17 ヒトインシュリン, GlnB18 ヒトインシュリン, GluA13 ヒトインシュリン, GluA13,AlaB17 ヒトインシュリン, GluA13,AspB17 ヒトインシュリン, GluA13,GluB17 ヒトインシュリン, GluB18 ヒトインシュリン, GlyA13 ヒトインシュリン, GlyA13,AlaB17 ヒトインシュリン, GlyA13,AsnB17 ヒトインシュリン, GlyA13,AspB17 ヒトインシュリン, GlyA13,GluB17 ヒトインシュリン, GlyB18 ヒトインシュリン, SerA13 ヒトインシュリン, SerA13,GlnA17,GluB10,GlnB17-des(ThrB30) ヒトインシュリン, SerA13,AlaB17 ヒトインシュリン, SerA13,AsnB17 ヒトインシュリン, SerA13,AspB17 ヒトインシュリン, SerA13,GlnB17 ヒトインシュリン, SerA13,GluB17 ヒトインシュリン, SerA13,ThrB17 ヒトインシュリン, SerB14,AspB17 ヒトインシュリン, SerB18 ヒトインシュリン, ThrA13 ヒトインシュリン or ThrB18 ヒトインシュリンのなかから選択される。
【０１６５】
WO90/01038(Novo Nordisk)（該文献は、本明細書中に参照によって援用される）はヒトインシュリンのアナログを開示しており、該アナログは高い生物活性を有し、HisまたはTyrで置換されたPheB25 を有していること、A4, A8, A17, A21, B9, B10, B12, B13, B21, B26, B27, B28 および B30の1以上のポジションに置換を有していること、およびアミノ酸残基をポジションB30に有していること（任意で非存在）ことによって特徴付けられる。特に、係るアナログは、TyrB25 ヒトインシュリン, TyrB25, AspB28 ヒトインシュリン, HisB25 ヒトインシュリン, HisB25, AspB28 ヒトインシュリン, TyrB25 ヒトインシュリン -B30-アミド および HisB25 ヒトインシュリン-B30-アミドのなかから選択される。
【０１６６】
WO 86/05496 (Nordisk Gentofte)はヒトインシュリンのアナログを開示しており、該アナログは遅延性作用を有し、ブロックされたB30カルボキシル基を有していること、ポジションA4, A17, A21, B13 および B21でのアミノ酸残基に、１〜４のブロックされたカルボキシル基を有していることによって特徴づけられる。特に、係るアナログは、インシュリン-B30-オクチルエステル, インシュリン-B30-ドデシルアミド, インシュリン-B30-ヘキサデシルアミド, インシュリン-(B21,B30)-ジメチルエステル, インシュリン-(B17,B30)-ジメチルエステル, インシュリン-(A4,B30) ジアミド, インシュリン-A17アミド-B30-オクチルエステル, インシュリン-(A4,B13)-ジアミド-B30-ヘキシルアミド, インシュリン-(A4,A17,B21,B30)-テトラアミド, インシュリン-(A17,B30)-ジアミド, A4-Ala-インシュリン-B30-アミドおよび B30-Leu-インシュリン-(A4,B30)-ジアミドのなかから選択される。
【０１６７】
WO86/05497(Nordisk Gentofte)（該文献は、本明細書中に参照によって援用される）は、ポジションA4, A17, B13 および B21における４つのアミノ酸残基の１以上が、無電荷の側鎖を具備しているインシュリン化合物を開示している。特別の言及がヒトインシュリン A17-Gln, ヒトインシュリン A4-Gln, ブタインシュリン B21-Gln, ヒトインシュリン B13-Gln, ヒトインシュリン (A17,B21)-Gln, ヒトインシュリン A4-Ala, ヒトインシュリン B21-Thr, ヒトインシュリン B13-Val, ヒトインシュリン-Thr-A17-Gln, ヒトインシュリン B21-メチルエステル および ヒトインシュリン A17-メチルエステルに関してなされる。
【０１６８】
WO92/00321(Novo Nordisk)（該文献は、本明細書中に参照によって援用される）はインシュリン化合物を開示しており、該インシュリン化合物は、長期活性（prolonged activity）を有し、B-鎖のＮ末端終端に正電荷が導入されている。特別の言及がArgB5,SerA21,ThrB30-NH2 ヒトインシュリン, ArgB5,ProB6,SerA21,ThrB30-NH2 ヒトインシュリン, ArgB5,GlyA21,ThrB30-NH2 ヒトインシュリン, ArgB5,ProB6,GlyA21,ThrB30-NH2 ヒトインシュリン, ArgB2,SerA21,ThrB30-NH2 ヒトインシュリン, ArgB2,ProB3,SerA21,ThrB30-NH2 ヒトインシュリン, ArgB2,GlyA21,ThrB30-NH2 ヒトインシュリン, ArgB2,ProB3,GlyA21,ThrB30-NH2 ヒトインシュリン, ArgB2,ArgB3,SerA21,ThrB30-NH2 ヒトインシュリン, ArgB2,ArgB3,SerA21 ヒトインシュリン, ArgB4,ProB5,SerA21,ThrB30-NH2 ヒトインシュリン, ArgB4,ArgB5,ProB6,GlyA21,ThrB30 ヒトインシュリン, ArgB3,GlyA21,ThrB30-NH2 ヒトインシュリン, ArgB3,SerA21,ThrB30-NH2 ヒトインシュリン, ArgB4,GlyA21,ThrB30-NH2 ヒトインシュリン, ArgB4,SerA21,ThrB30-NH2 ヒトインシュリン および ArgB1,ProB2,GlyA21,ThrB30-NH2 ヒトインシュリンに関してなされる。
【０１６９】
WO90/07522(Novo Nordisk)（該文献は、本明細書中に参照によって援用される）は、陽性に荷電したアミノ酸残基（即ち、LysまたはArgをポジションB28に）が存在する、溶液中で相互作用する低い能力を呈するインシュリン化合物を開示している。特別の言及がdes[PheB25]-ヒトインシュリン, des[TyrB26]-ヒトインシュリン, des[ThrB27]-ヒトインシュリン, des[ProB28]-ヒトインシュリン, des[PheB25]-ブタインシュリン, des[ProB28]-ブタインシュリン, des[ProB28]-ウサギインシュリン, des[PheB25],des[ThrB30]-ヒトインシュリン, des[TyrB26],des[ThrB30]-ヒトインシュリン, [SerA21]-des[ProB28]-ヒトインシュリン, [GlyA21]-des[ProB28]-ヒトインシュリン, [GlyA21]-des[PheB25]-ヒトインシュリン, [AspA21]-des[PheB25]-ヒトインシュリン, [HisB25]-des[TyrB26],des[ThrB30]-ヒトインシュリン, [AsnB25]-des[TyrB26],des[ThrB30]-ヒトインシュリン, [AspA21]-des[PheB25],des[ThrB30]-ヒトインシュリン, [AspB28]-des[PheB25]-ヒトインシュリン, [AspB3]-des[PheB25]-ヒトインシュリン, [LysB28]-ヒトインシュリン, [LysB28,ThrB29]-ヒトインシュリン および [ArgB28]-des[LysB29]-ヒトインシュリンに関してなされる。
【０１７０】
WO90/11290(Novo Nordisk)（該文献は、本明細書中に参照によって援用される）は、長期活性を有するインシュリン化合物を開示している。特別の言及が [ArgA0]-ヒトインシュリン-(B30-アミド), [ArgA0, GlnB13]-ヒトインシュリン-(B30-アミド), [ArgA0, GlnA4, AspA21]-ヒトインシュリン-(B30-アミド), [ArgA0, SerA21]-ヒトインシュリン-(B30-アミド) および [ArgA0, ArgB27]-des[ThrB30]-ヒトインシュリンに関してなされる。
【０１７１】
WO 90/10645 (Novo Nordisk)（該文献は、本明細書中に参照によって援用される）は、グリコシル化インシュリンを開示している。特別の言及がPhe(B1) グルコースヒトインシュリン, Phe(B1) マンノース ヒトインシュリン, Gly(A1) マンノース ヒトインシュリン, Lys(B29) マンノース ヒトインシュリン, Phe(B1) ガラクトース ヒトインシュリン, Gly(A1) ガラクトース ヒトインシュリン, Lys(B29) ガラクトース ヒトインシュリン, Phe(B1) マルトースヒトインシュリン, Phe(B1) ラクトース ヒトインシュリン, Gly(A1) グルコースヒトインシュリン, Gly(A1) マルトースヒトインシュリン, Gly(A1) ラクトース ヒトインシュリン, Lys(B29) グルコースヒトインシュリン, Lys(B29) マルトースヒトインシュリン, Lys(B29) ラクトースヒトインシュリン, Gly(A1),Phe(B1) ジ-グルコースヒトインシュリン, Gly(A1),Lys(B29) ジグルコースヒトインシュリン, Phe(B1),Lys(B29) ジグルコースヒトインシュリン, Phe(B1) イソマルトースヒトインシュリン, Gly(A1) イソマルトースヒトインシュリン, Lys(B29) イソマルトースヒトインシュリン, Phe(B1) マルトトリオースヒトインシュリン, Gly(A1) マルトトリオースヒトインシュリン, Lys(B29) マルトトリオースヒトインシュリン, Gly(A1),Phe(B1) ジマルトースヒトインシュリン, Gly(A1),Lys(B29) ジマルトースヒトインシュリン, Phe(B1),Lys(B29) ジマルトースヒトインシュリン, Gly(A1),Phe(B1) ジラクトースヒトインシュリン, Gly(A1),Lys(B29) ジラクトースヒトインシュリン, Phe(B1),Lys(B29) ジラクトースヒトインシュリン, Gly(A1),Phe(B1) ジマルトトリオースヒトインシュリン, Gly(A1),Lys(B29)ジマルトトリオースヒトインシュリン, Phe(B1),Lys(B29) ジマルトトリオースヒトインシュリン, Phe(B1),Gly(A1) ジマンノースヒトインシュリン,  Phe(B1),Lys(B29) ジマンノースヒトインシュリン, Gly(A1),Lys(B29) ジマンノースヒトインシュリン, Phe(B1),Gly(A1) ジガラクトースヒトインシュリン, Phe(B1),Lys(B29) ジガラクトースヒトインシュリン,
Gly(A1),Lys(B29) ジガラクトースヒトインシュリン, Phe(B1),Gly(A1)ジイソマルトースヒトインシュリン, Phe(B1),Lys(B29) ジイソマルトースヒトインシュリン, Gly(A1),Lys(B29) ジイソマルトースヒトインシュリン, Phe(B1)グルコース[AspB10]ヒトインシュリンおよびGly(A1),Phe(B1)ジグルコース[AspB10]ヒトインシュリンに関してなされる。
【０１７２】
WO88/065999 (Novo Nordisk)（該文献は、本明細書中に参照によって援用される）は、Ans21A が他のアミノ酸残基で置換されている、安定化されたインシュリン化合物を開示している。特別の言及がGlyA21 ヒトインシュリン, AlaA21 ヒトインシュリン, SerA21 ヒトインシュリン, ThrA21 ヒトインシュリンおよびhSerA21 ヒトインシュリンに関してなされる。
【０１７３】
EP254516(Novo Nordisk)（該文献は、本明細書中に参照によって援用される）はインシュリン化合物を開示しており、該インシュリン化合物は、長期作用（prolonged action）を有し、塩基性アミノ酸残基が中性アミノ酸残基で置換されている。特別の言及が以下のものに関してなされる：
GlyA21,LysB27,ThrB30-NH2 ヒトインシュリン, SerA21,LysB27 ,ThrB30-NH2 ヒトインシュリン, 
ThrA21,LysB27,ThrB30-NH2 ヒトインシュリン, AlaB21,LysB27,ThrB30-NH2 ヒトインシュリン, 
HisB30,LysB27,ThrB30-NH2 ヒトインシュリン, AspB21,LysB27,ThrB30-NN2 ヒトインシュリン, 
GlyA21,ArgB21,ThrB30-NH2 ヒトインシュリン, SerA21,ArgB27, ThrB30-NH2 ヒトインシュリン, 
ThrA21,ArgB27,ThrB30-NH2 ヒトインシュリン, AlaB21,ArgB27,ThrB30-NH2 ヒトインシュリン, 
HisA21,ArgB27,ThrB30-NH2 ヒトインシュリン, AspB21,ArgB27,ThrB30-NH2 ヒトインシュリン, 
GlnB13,GlyA21,ArgB27,ThrB30-NH2 ヒトインシュリン, GlnB13,SerA21,ThrB30-NH2 ヒトインシュリン, 
GlnB13,SerA21,ArgB27,ThrB30-NH2 ヒトインシュリン, GlnB13,ThrA21,ArgB27,ThrB30-NH2 ヒトインシュリン, 
GlnB13,AlaA21,ArgB27,ThrB30-NH2 ヒトインシュリン, GlnB13,HisA21,ArgB27,ThrB30-NH2 ヒトインシュリン, 
GlnB13,AspA21,ArgB27,ThrB30-NH2 ヒトインシュリン, GlnB13,GlyA21,LysB27,ThrB30-NH2 ヒトインシュリン, 
GlnB13,SerA21,LysB27,ThrB30-NH2 ヒトインシュリン, GlnB13,ThrA21,LysB27,ThrB30-NH2 ヒトインシュリン, 
GlnB13,AlaA21,LysB27,ThrB30-NH2 ヒトインシュリン, GlnB13,HisA21,LysB27,ThrB30-NH2 ヒトインシュリン, 
GlnB13,AspA21,LysB27,ThrB30-NH2 ヒトインシュリン, AsnA21,LysB27 ヒトインシュリン, SerA21,LysB27 ヒトインシュリン, ThrA21,LysB27 ヒトインシュリン, AlaA21,LysB27 ヒトインシュリン, HisA21,LysB27 ヒトインシュリン, AspA21,LysB27 ヒトインシュリン, GlyA21,LysB27 ヒトインシュリン, AsnA21,ArgB27 ヒトインシュリン, 
SerA21,ArgB27ヒトインシュリン, ThrA21,ArgB27 ヒトインシュリン, AlaA21,ArgB27ヒトインシュリン, 
HisA21,ArgB27 ヒトインシュリン, AspA21,ArgB27ヒトインシュリン, GlyA21,ArgB27 ヒトインシュリン, 
GlnA17,AsnA21,ArgB27ヒトインシュリン, GlnA17,SerA21,ArgB27ヒトインシュリン, GlnA17,ThrA21,ArgB27ヒトインシュリン, GlnA17,AlaA21,ArgB27ヒトインシュリン, GlnA17,HisA21,ArgB27ヒトインシュリン, 
GlnA17,AspA21,ArgB27ヒトインシュリン, GlnA17,GlyA21,ArgB27ヒトインシュリン, 
GlnA17,AsnA21,GlnB13ヒトインシュリン, GlnA17,SerA21,GlnB13ヒトインシュリン, GlnA17,ThrA21,GlnB13ヒトインシュリン, GlnA17,AlaA21,GlnB13ヒトインシュリン, GlnA17,HisA21,GlnB13ヒトインシュリン, 
GlnA17,AspA21,GlnB13ヒトインシュリン, GlnA17,GlyA21,GlnB13ヒトインシュリン, 
ArgA27,AsnA21,GlnB13ヒトインシュリン, ArgA27,SerA21,GlnB13ヒトインシュリン, ArgA27,ThrA21,GlnB13ヒトインシュリン, ArgA27,AlaA21,GlnB13ヒトインシュリン, ArgA27,HisA21,GlnB13ヒトインシュリン, 
ArgA27,AspA21,GlnB13ヒトインシュリン, ArgA27,GlyA21,GlnB13ヒトインシュリン, 
GlnA17,AsnA21,LysB27ヒトインシュリン, GlnA17,SerA21,LysB27ヒトインシュリン, GlnA17,ThrA21,LysB27ヒトインシュリン, GlnA17,AlaA21,LysB27ヒトインシュリン, GlnA17,HisA21,LysB27ヒトインシュリン, 
GlnA17,AspA21,LysB27ヒトインシュリン, GlnA17,GlyA21,LysB27ヒトインシュリン, 
GlnB13,AsnA21,LysB27ヒトインシュリン, GlnB13,SerA21,LysB27ヒトインシュリン, GlnB13,ThrA21,LysB27ヒトインシュリン, GlnB13,AlaA21,LysB27ヒトインシュリン, GlnB13,HisA21,LysB27ヒトインシュリン, 
GlnB13,AspA21,LysB27ヒトインシュリン, およびGlnB13,GlyA21,LysB27ヒトインシュリン。
【０１７４】
EP214826(Novo Nordisk)（該文献は、本明細書中に参照によって援用される）は、迅速に発現するインシュリン化合物（rapid onset insulin compounds）を開示している。
【０１７５】
EP194864(Novo Nordisk)（該文献は、本明細書中に参照によって援用される）はインシュリン化合物を開示しており、該インシュリン化合物は、長期作用を有し、塩基性アミノ酸残基が中性アミノ酸残基で置換されている。特別の言及が、GlnA17,ArgB27,ThrB30-NH2 ヒトインシュリン, GlnA17,GlnB13,ThrB30-NH2 ヒトインシュリン, GlnA17,LysB27,ThrB30-NH2 ヒトインシュリン, GlnA17,LysB27-NH2 ヒトインシュリン, GlnA17, GlnA17,ThrB30-NH2 ヒトインシュリン, GlnB13,ArgB27,ThrB30-NH2 ヒトインシュリン, GlnB13,LysB27,ThrB30-NH2 ヒトインシュリン, GlnB13,LysB30-NH2 ヒトインシュリン, GlnB13,ThrB30-NH2 ヒトインシュリン, ArgB27,ArgB30-NH2 ヒトインシュリン, ArgB27,LysB30-NH2 ヒトインシュリン, ArgB27,ThrB30-NH2 ヒトインシュリン, LysB27,ArgB30-NH2 ヒトインシュリン, LysB27,LysB30-NH2 ヒトインシュリン, LysB27,ThrB30-NH2 ヒトインシュリン, LysB29-NH2,des-(B30)ヒトインシュリン, ThrB30-NH2 ヒトインシュリン, LysB30-NH2 ヒトインシュリン, LysB30(Lau)-NH2 ヒトインシュリン, LysB30,ArgB31-NH2 ヒトインシュリン, LysB30,LysB31-NH2 ヒトインシュリン, ArgB30-NH2 ヒトインシュリン, ArgB30,ArgB31-NH2 ヒトインシュリン, および ArgB30,LysB31-NH2 ヒトインシュリンに関してなされる。
【０１７６】
米国特許第3,528,960(Eli Lilly)（該文献は、本明細書中に参照によって援用される）は、インシュリン分子の１、２または３つの一級アミノ基がカルボキシアロイル基を有するN-カルボキシアロイル（carboxyaroyl）  インシュリン化合物を開示する。
【０１７７】
英国特許第1.492.997 (Nat. Res. Dev. Corp.)（該文献は、本明細書中に参照によって援用される）は、NεB29 にカルバミル置換を有し、低血糖性作用（hypoglycaemic effect）の改善されたプロフィールを有するインシュリン化合物を開示している。
【０１７８】
日本国特許出願公開第1-254699号(Kodama Co., Ltd.)（該文献は、本明細書中に参照によって援用される）は、PheB1のアミノ基またはLysB29のε−アミノ基またはこれらの両方にアルカノイル基が結合したインシュリン化合物を開示している。
【０１７９】
日本国特許出願公開第57−067548号(Shionogi)（該文献は、本明細書中に参照によって援用される）は、ヌクレオチドのトリプレットに必ずしもコードされない少なくとも5つの炭素原子を有するアミノ酸をＢ30位に有するインシュリン化合物を開示している。
【０１８０】
WO03/053339 (Eli Lilly)（該文献は、本明細書中に参照によって援用される）はインシュリン化合物を開示しており、該インシュリン化合物は、A鎖がN末端において２つのアミノ酸残基（A-1およびA0）で拡張（extended）されており、B鎖がN末端において２つのアミノ酸残基（B-1およびB0）で拡張されており、ポジションB28、B29およびB39でのアミノ酸残基は置換されてもよく、ポジションB28またはB29でのLysのε−アミノ基はポジティブに荷電したアミノ酸のα−アミノ基と共有結合して、Lys-Nε-アミノ酸誘導体を形成する。特別の言及が前記アナログに関してなされ、該アナログにおいてA-1およびB-1は双方とも非存在であり、A0はArgを表し、B0はArgを表すか又は非存在である。
【０１８１】
以下からなる群から選択されるインシュリン化合物：
i.  ポジションB28がAsp, Lys, Leu, Val, またはAlaであり、ポジションB29がLysまたはProであるアナログ;および
ii.  des(B28-B30), des(B27)またはdes(B30)ヒトインシュリン、
は、同様に本発明の方法に適用可能であり、特に、ポジションB28がAspまたはLysであり、ポジションB29がLysまたはProであるインシュリン化合物である。
【０１８２】
des(B30)ヒトインシュリンも、本発明の方法に適用可能である。
【０１８３】
他の適用可能なインシュリン化合物は、B29-Nε-ミリストイル-des(B30)ヒトインシュリン, B29-Nε-パルミトイル-des(B30)ヒトインシュリン, B29-Nε-ミリストイルヒトインシュリン, B29-Nε-パルミトイルヒトインシュリン, B28-Nε-ミリストイル LysB28 ProB29 ヒトインシュリン, B28-Nε-パルミトイル LysB28 ProB29 ヒトインシュリン, B30-Nε-ミリストイル-ThrB29LysB30 ヒトインシュリン, B30-Nε-パルミトイル-ThrB29LysB30 ヒトインシュリン, B29-Nε-(N-パルミトイル-γ-グルタミル)-des(B30)ヒトインシュリン, B29-Nε-(N-リトコリル-γ-グルタミル)-des(B30)ヒトインシュリン, B29-Nε-(ω-カルボキシヘプタデカノイル)-des(B30)ヒトインシュリン, B29-Nε-(ω-カルボキシヘプタデカノイル)ヒトインシュリンおよびB29-Nε-ミリストイル-des(B30)ヒトインシュリンからなる群から選択される。
【０１８４】
本発明の方法に適用可能なGLP-1の例には、ヒトGLP-1およびGLP-1化合物が含まれる。ヒトGLP-1は、37アミノ酸残基のペプチドであり、プレプログルカゴン（i.a.  遠位の回腸のＬ細胞、膵臓および脳で合成される）に由来する。GLP-1は、糖代謝と胃腸の分泌および代謝とにおける調節機能を有する重要な胃腸ホルモンである。プレプログルカゴンのプロセッシング〔GLP-1(7-36)アミド、GLP-1(7-37)およびGLP-2を生じる〕は、主にL細胞で生じる。断片  GLP-1(7-36)-アミドおよびGLP-1(7-37)は、双方グルコース依存的なインシュリン分泌性因子である。過去数十年間において、GLP-1の幾つかの構造類似物（structural analogues）が、ヒーラモンスタートカゲ（Gila monster lizards）(Heloderma suspectum および Heloderma horridum)の毒から単離された。Exendin-4は、Heloderma horridumの毒液から単離された39アミノ酸残基のペプチドであり、このペプチドは、GLP-1と52%の相同性を共有している。Exendin-4は、強力なGLP-1レセプターアゴニストであり、イヌに注射されたときに、インシュリン放出を刺激し、血中グルコースレベルの低下を確実（ensuring）にすることが示されている。GLP-1(1-37)およびexendin-4(1-39)および特定の断片、アナログ、及びその誘導体のグループ（本明細書中でGLP-1化合物と指定される）は、強力なインシュリン分泌性因子であり、彼らの全ては本発明の方法に適用可能である。GLP-1(1-37)のインシュリン分泌性断片は、全体配列がGLP-1(1-37)の配列中に見出せ、そこで少なくとも１つの末端アミノ酸が削除されているインシュリン分泌性ペプチドである。GLP-1(1-37)のインシュリン分泌性断片の例は、GLP-1(1-37)のポジション1-6におけるアミノ酸残基が削除されたGLP-1(7-37)およびGLP-1(1-37)のポジション1-6および37におけるアミノ酸残基が削除されたGLP-1(7-36)である。exendin-4(1-39)のインシュリン分泌性断片の例は、exendin-4(1-38)およびexendin-4(1-31)である。化合物のインシュリン分泌性特性は、当該技術分野において周知のインビボまたはインビトロアッセイで決定されえる。一例を挙げると、前記化合物は、動物に投与され、インシュリン濃度の時間経過がモニタされる。GLP-1(1-37)およびexendin-4(1-39)のインシュリン分泌性アナログ（Insulinotropic analogs）はそれぞれの分子を意味し、その分子において１以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で交換（exchanged）されている及び／又はその分子から１以上のアミノ酸残基が削除（deleted）されている及び／又はその分子から１以上のアミノ酸残基が付加（added）されている（但し、前記アナログの何れかは、インシュリン分泌性であるか又はインシュリン分泌性化合物のプロドラックである）。GLP-1(1-37)のインシュリン分泌性アナログの例は、例えば、ポジション8でのアラニンがメチオニンで置換され、ポジション1〜6におけるアミノ酸残基が削除されているMet8-GLP-1(7-37)並びにポジション34でのバリンがアルギニンで置換され、ポジション1〜6におけるアミノ酸残基が削除されているArg34-GLP-1(7-37)である。exendin-4(1-39)のインシュリン分泌性アナログの例は、ポジション2および3におけるアミノ酸残基がそれぞれセリンおよびアスパラギン酸で置換されているSer2Asp3-exendin-4(1-39)である（この特定のアナログは、当該技術分野においてexendin-3としても知られている）。GLP-1(1-37)、exendin-4(1-39)及びそのアナログのインシュリン分泌性誘導体は、当業者がこれらのペプチドの誘導体であると考えるものであり、即ち、親ペプチド分子には存在しないが、但し、前記誘導体の何れかはインシュリン分泌性であるか又はインシュリン分泌性化合物のプロドラックであるものである。置換基の例は、アミド、炭水化物、アルキル基および親油性の置換基である。GLP-1(1-37)、exendin-4(1-39)及びそのアナログのインシュリン分泌性誘導体の例は、GLP-1(7-36)-アミド, Arg34, Lys26 (Nε-(γ-Glu (Nα-ヘキサデカノイル)))-GLP-1(7-37)およびTyr31-exendin-4(1-31)-アミドである。GLP-1(1-37)、exendin-4(1-39)、そのインシュリン分泌性断片、そのインシュリン分泌性アナログ及びそのインシュリン分泌性誘導体は、WO98/08871、WO99/43706、US5424286およびWO00/09666（これらの文献は、本明細書中に参照によって全て包含される）に記載されている。
【０１８５】
GLP-2およびGLP-2化合物も、本発明によって提供される方法によって修飾されえる。本発明において、GLP-2化合物は、GLP-2レセプターと、好ましくは1 μM以下（例えば、100 nM以下）の親和性の定数 (KD)または作用強度(EC50)で結合する。「GLP-2化合物」の用語は、１以上のアミノ酸残基が削除された及び／又は別のアミノ酸残基（天然または非天然）で置換されたヒトGLP-2を、及び／又は付加的なアミノ酸残基を具備しているヒトGLP-2を、及び／又は少なくとも１つの有機置換基が１以上のアミノ酸残基と結合しているヒトGLP-2を指摘することを意図している。特に、次のペプチドが考慮される、それはアミノ酸配列がヒトGLP-2のアミノ酸配列の60%を超える33連続アミノ酸（33 consecutive amino acids）の任意の配列で提示されるものである。また、次のペプチドが考慮される；それはアミノ酸配列が、前記アミノ酸配列から4アミノ酸までが削除された場合、ヒトGLP-2のアミノ酸配列の60%を超える37連続アミノ酸の任意の配列で提示されるものである。また、次のペプチドが考慮される；それはアミノ酸配列が、2アミノ酸までがそれらのアミノ酸に付加された場合、GLP-2のアミノ酸配列の60%を超える31連続アミノ酸の任意の配列で提示されるものである。また、「GLP化合物」の用語には、１つの個体から別の個体へ存在（exist）し、発生（occur）しえる対立遺伝子バリエーション（allelic variations）が含まれる。また、糖鎖形成または他の翻訳後修飾の程度および位置は、選ばれた宿主細胞および宿主細胞環境の性質に依存して変動してもよい。
【０１８６】
本発明にしたがって使用しえる候補GLP-2化合物には、WO 96/32414, WO 97/39031, WO 98/03547, WO 96/29342, WO 97/31943, WO 98/08872（該文献は、全て本明細書中に参照によって援用される）に記載されたGLP-2化合物が含まれる。
【０１８７】
特に、以下のGLP-2化合物が、本発明の方法に適用可能である：A2G-GLP-2(1-33); K30R-GLP-2(1-33); S5K-GLP-2(1-33); S7K-GLP-2(1-33); D8K-GLP-2(1-33); E9K-GLP-2(1-33); M10K-GLP-2(1-33); N11K-GLP-2(1-33); T12K-GLP-2(1-33); I13K-GLP-2(1-33); L14K-GLP-2(1-33); D15K-GLP-2(1-33); N16K-GLP-2(1-33); L17K-GLP-2(1-33); A18K-GLP-2(1-33); D21K-GLP-2(1-33); N24K-GLP-2(1-33); Q28K-GLP-2(1-33); S5K/K30R-GLP-2(1-33); S7K/K30R-GLP-2(1-33); D8K/K30R-GLP-2(1-33); E9K/K30R-GLP-2(1-33); M10K/K30R-GLP-2(1-33); N11K/K30R-GLP-2(1-33); T12K/K30R-GLP-2(1-33); I13K/K30R-GLP-2(1-33); L14K/K30R-GLP-2(1-33); D15K/K30R-GLP-2(1-33); N16K/K30R-GLP-2(1-33); L17K/K30R-GLP-2(1-33); A18K/K30R-GLP-2(1-33); D21K/K30R-GLP-2(1-33); N24K/K30R-GLP-2(1-33); Q28K/K30R-GLP-2(1-33); K30R/D33K-GLP-2(1-33); D3E/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/S5K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/S7K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/D8K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/E9K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/M10K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/N11K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/T12K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/I13K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/L14K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/D15K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/N16K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/L17K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/A18K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/D21K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/N24K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); および D3E/Q28K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)。
【０１８８】
また、GLP-2ペプチドに付着させたただ１つの親油性置換基を有するGLP-2誘導体も、本発明の方法に適用可能である（これは例えば、前記親油性置換基が4〜40炭素原子、例えば、8〜25炭素原子、例えば、12〜20炭素原子を具備するGLP-2誘導体である）。
【０１８９】
前記親油性置換基は、前記親油性置換基のカルボキシル基がアミド結合を前記アミノ酸残基のアミノ基と形成するような様式で、アミノ酸残基に付着されえる。
【０１９０】
例示として、前記親油性置換基は、Lys残基に付着（attached）される。
【０１９１】
前記親油性置換基は、前記親油性置換基のアミノ基がアミド結合を前記アミノ酸残基のカルボキシル基と形成するような様式で、アミノ酸残基に付着されえる。
【０１９２】
また、前記親油性置換基はスペーサーの手段でGLP-2ペプチドに付着されてもよく、前記スペーサーはβ-アラニン, ガンマアミノ酪酸 (GABA), γ-グルタミン酸, Lys, Asp, Glu, Aspを含むジペプチド, Gluを含むジペプチド, またはLysを含むジペプチドのなかから選択されえる。本発明の一態様において、前記スペーサーはβ-アラニンである。また、親GLP-2ペプチドのカルボキシル基はアミド結合をスペーサーのアミノ基と形成し、前記アミノ酸又はジペプチドスペーサーのカルボキシル基はアミド結合を前記親油性置換基のアミノ基と形成してもよい。
【０１９３】
また、親GLP-2ペプチドのアミノ基はアミド結合をスペーサーのカルボキシル基と形成し、前記スペーサーのアミノ基はアミド結合を前記親油性置換基のカルボキシル基と形成してもよい。
【０１９４】
本発明の一態様において、前記親油性置換基は、直線鎖（a straight-chain）または分枝状のアルキル基である。本発明の一態様において、前記親油性置換基は、直線鎖（a straight-chain）のアシル基または分枝状の脂肪酸である。
【０１９５】
本発明の一態様において、前記親油性置換基は、直線鎖のアシル基または分枝状のアルカン  α,ω-ジカルボン酸である。
【０１９６】
本発明の一態様において、前記GLP-2誘導体は１つの親油性置換基を有する。本発明の一態様において、前記GLP-2誘導体は２つの親油性置換基を有する。本発明の一態様において、前記GLP-2誘導体は３つの親油性置換基を有する。本発明の一態様において、前記GLP-2誘導体は４つの親油性置換基を有する。
【０１９７】
以下のリストには、本発明の方法に特に適用可能であるGLP-2化合物が含まれる：
S5K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33); 
S7K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
D8K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
E9K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
M10K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
N11K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
T12K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
I13K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
L14K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
D15K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
N16K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(オクタノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(ノナノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(デカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(ウンデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(ドデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(トリデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(テトラデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(ペンタデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(ヘプタデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(オクタデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(ノナデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(エイコサノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシル-4-(オクタノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシル-4-(ノナノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシル-4-(デカノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシル-4-(ウンデカノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシル-4-(ドデカノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシル-4-(トリデカノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシル-4-(テトラデカノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシル-4-(ペンタデカノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシル-4-(ヘキサデカノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシル-4-(ヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシル-4-(オクタデカノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシル-4-(ノナデカノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシル-4-(エイコサノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(オクタノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(ノナノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(デカノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(ウンデカノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(ドデカノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(トリデカノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(テトラデカノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(ペンタデカノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(ヘキサデカノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(ヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(オクタデカノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(ノナデカノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(エイコサノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
A18K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
D21K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
N24K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
Q28K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
S5K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33); 
S7K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
D8K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
E9K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
M10K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
N11K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
T12K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
I13K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
L14K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
D15K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
N16K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(オクタノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(ノナノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(デカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(ウンデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(ドデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(トリデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(テトラデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(ペンタデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(ヘプタデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(オクタデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(ノナデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(エイコサノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシル-4-(オクタノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシル-4-(ノナノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシル-4-(デカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシル-4-(ウンデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシル-4-(ドデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシル-4-(トリデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシル-4-(テトラデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシル-4-(ペンタデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシル-4-(ヘキサデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシル-4-(ヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシル-4-(オクタデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシル-4-(ノナデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシル-4-(エイコサノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(オクタノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(ノナノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(デカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(ウンデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(ドデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(トリデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(テトラデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(ペンタデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(ヘキサデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(ヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(オクタデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(ノナデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(エイコサノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
A18K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
D21K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
N24K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
Q28K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
D3E/S5K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33); 
D3E/S7K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/D8K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/E9K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/M10K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/N11K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/T12K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/I13K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L14K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/D15K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/N16K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(オクタノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(ノナノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(デカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(ウンデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(ドデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(トリデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(テトラデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(ペンタデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(ヘプタデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(オクタデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(ノナデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(エイコサノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-カルボキシル-4-(オクタノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-カルボキシル-4-(ノナノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-カルボキシル-4-(デカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-カルボキシル-4-(ウンデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-カルボキシル-4-(ドデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-カルボキシル-4-(トリデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-カルボキシル-4-(テトラデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-カルボキシル-4-(ペンタデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-カルボキシル-4-(ヘキサデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-カルボキシル-4-(ヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-カルボキシル-4-(オクタデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-カルボキシル-4-(ノナデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-カルボキシル-4-(エイコサノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(オクタノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(ノナノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(デカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(ウンデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(ドデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(トリデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(テトラデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(ペンタデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(ヘキサデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(ヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(オクタデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(ノナデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(エイコサノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/A18K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/D21K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/N24K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33); および
D3E/Q28K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)。
【０１９８】
本発明の方法に適用可能なVII因子化合物は、野生型VII因子(即ち、米国特許第4,784,950号に開示されたアミノ酸配列を有しているポリペプチド)、同様に、野生型VII因子、VII因子関連ポリペプチド同様にVII因子誘導体およびVII因子結合体（Factor VII conjugates）と比較して、実質的に同じ又は改善された生物活性（substantially the same or improved biological activity）を呈しているVII因子のバリアントを包含する。「VII因子化合物（Factor VII compounds）」の用語は、VII因子ポリペプチドの未切断（酵素前駆体）の形態、並びにタンパク質分解性にプロセスされてこれらのそれぞれの生理活性の形態に産生された、VIIa因子と指定されるものを含むことが意図される。典型的には、VII因子は、残基152および153の間で切断されてVIIa因子を産出する。VII因子の係るバリアントは、ヒトVII因子と比較して、安定度、リン脂質結合、変更された比活性などを含む異なる特性を示してもよい。
【０１９９】
本明細書中に使用される、「VII因子関連ポリペプチド（Factor VII-related polypeptides）」は、野生型VIIa因子と比較して、実質的に修飾または減少されたVIIa因子生物活性を有するバリアントを含む、ポリペプチドを包含する。これらのポリペプチドには、特定のアミノ酸配列の変更が導入されて、ポリペプチドの生理活性を修飾または崩壊（disrupt）された、VII因子またはVIIa因子が限定されることなく含まれる。
【０２００】
本明細書中に使用される「VII因子誘導体（Factor VII derivative）」の用語は、野生型VII因子およびVII因子関連ポリペプチドと比較して、実質的に同じか又は改善された生物活性を呈している野生型VII因子、VII因子のバリアントを指定することを意図しており、ここで親ペプチドの1以上のアミノ酸は、例えば、アルキル化、PEG化（PEGylation）、アシル化、エステル形成またはアミド形成などによって化学的に修飾されている。これにはPEG化ヒトVIIa因子、システイン―PEG化ヒトVIIa因子及びそのバリアントが含まれるが、これらに限定されない。
【０２０１】
「PEG化ヒトVIIa因子（PEGylated human Factor VIIa）」の用語は、ヒトVIIa因子ポリペプチドに結合されたPEG分子を有しているヒトVIIa因子を意味する。前記PEG分子は、VIIa因子ポリペプチドの任意のアミノ酸残基または炭水化物部分を含む、VIIa因子ポリペプチドの任意の部分に付着しえることが理解される。「システイン―PEG化ヒトVIIa因子（cysteine-PEGylated human Factor VIIa）」の用語は、ヒトVIIa因子に導入されたシステインのスルフヒドリル基に結合させたPEG分子を有しているVIIa因子を意味する。
【０２０２】
血液凝固におけるVIIa因子の生物活性は、これが（i）組織因子（TF）に結合する能力、および（ii）IX因子またはX因子のタンパク質分解性の切断を触媒して活性化されたIX因子またはX因子（それぞれIXa因子またはXa因子）を産生する能力に由来する。本発明の目的のために、VIIa因子の生物活性は、たとえば米国特許第5,997,864号に記載されているとおり、VII因子が欠乏した血漿およびトロンボプラスチンを用いて、調製物が血液凝固を促進する能力を測定することによって定量してもよい。このアッセイ法において、生物活性は、コントロールサンプルと比較した凝固時間の減少として表され、１単位／mlのVII因子活性を含むプールされたヒト血清標準と比べることにより「VII因子単位（Factor VII units）」に換算される。代わりに、VIIa因子の生物活性は、(i)脂質膜およびX因子に包埋（embedded）されたTFを含む系において、VIIa因子がXa因子を産生する能力を測定すること(Persson et al., J. Biol. Chem. 272:19919-19924, 1997)；(ii)水性系におけるX因子の加水分解を測定すること；(iii)表面プラスモン共鳴に基づいた機器を使用して、そのTFに対する物理的な結合を測定すること；および(iv)合成基質（synthetic substrate）の加水分解を測定することによって定量してもよい。
【０２０３】
野生型VIIa因子と比較して実質的に同じ又は改善された生物活性を有するVII因子バリアント（Factor VII variants）は、上記の通りに凝固アッセイ法、タンパク質分解アッセイ法、またはTF結合実験の１つまたは複数において試験したときに、同じ細胞タイプにおいて産生されたVIIa因子の比活性（specific activity）の少なくとも約25％、好ましくは少なくとも約50％、より好ましくは少なくとも約75％、および最も好ましくは少なくとも約90％を示すものを包含する。VII因子バリアントは、野生型VIIa因子と比較して実質的に減少した生物活性を有し、上記の通りに凝固アッセイ法、タンパク質分解アッセイ法、またはTF結合実験の１つまたは複数において試験したときに、同じ細胞タイプにおいて産生された野生型VIIa因子の比活性の約25％未満、好ましくは約10％未満、より好ましくは約5％未満、および最も好ましくは約1％未満を示すものである。野生型VII因子と比較して実質的に修飾された生物活性を有するVII因子バリアントは、TF非依存性のX因子タンパク分解活性を示すVII因子バリアント、およびTFに結合するが、X因子を切断しないものを含むが、これらに限定されない。
【０２０４】
VII因子のバリアントは、実質的に野生型VII因子と同じ若しくは優れた生理活性を示すか、または代わりに、野生型VII因子と比較して実質的に修飾され、もしくは減少した生理活性を示すかどうかにかかわらず、１つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失、または置換によって野生型VII因子の配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むが、これらに限定されない。
【０２０５】
本明細書中に使用される、「バリアント（variant）」または「バリアント（variants）」の用語は、野生型VII因子の配列を有しているVII因子であって、親タンパク質（parent protein）の１以上のアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている、および／または親タンパク質の１以上のアミノ酸が欠失している、および／または１以上のアミノ酸がタンパク質中に挿入されている、および／または１以上のアミノ酸が親タンパク質に付加されているものを指定（designate）することを意図している。係る付加は、親タンパク質のN末端終端（N-terminal end）またはC末端終端の何れかで又は両方で生じてもよい。本定義内の「バリアント（variant）」または「バリアント（variants）」は、その活性型においてなおもFVII活性を有する。一態様において、バリアントは、野生型VII因子の配列と70 %同一である。一態様において、バリアントは、野生型VII因子の配列と80 %同一である。別の態様において、バリアントは、野生型VII因子の配列と90 %同一である。更なる一態様において、バリアントは、野生型VII因子の配列と95 %同一である。
【０２０６】
野生型のVII因子と実質的に同じ生物活性を有しているVII因子バリアントの非限定的な例には、次のものが含まれる、即ち、S52A-FVIIa, S60A-FVIIa (Lino et al., Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192, 1998);米国特許第5,580,560号に開示された増加したタンパク分解の安定性を呈しているFVIIaバリアント;残基290及び291の間又は残基315及び316の間がタンパク分解性に切断されているVIIa因子(Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995);VIIa因子の酸化型(Kornfelt et al., Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54, 1999);PCT/DK02/00189に開示されたFVIIバリアント;およびWO 02/38162(Scripps研究所)に開示された増加したタンパク分解の安定性を呈しているFVIIバリアント；WO 99/20767(ミネソタ大学)に開示された修飾型Glaドメインを有している及び増強された膜結合を呈しているFVIIバリアント;およびWO 01/58935(Maxygen ApS)に開示されたFVIIバリアントであり、これらの全てはは本明細書中に参照によって援用される。
【０２０７】
特別の言及が次のものに関してなされる：野生型FVIIaと比較して、増加した生物活性を有しているFVIIバリアント、WO 01/83725, WO 02/22776, WO 02/077218, PCT/DK02/00635, デンマーク国特許出願PA 2002 01423, デンマーク国特許出願PA 2001 01627; WO 02/38162 (Scripps研究所)に開示されたFVIIバリアントを含む；およびJP 2001061479 (Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.)に開示された増強した活性を有するFVIIaバリアント（該文献の全ては本明細書中に参照によって援用される）。
【０２０８】
野生型VII因子と比較して、実質的に減少した又は修飾された生物活性を有するVII因子バリアントの例は、R152E-FVIIa (Wildgoose et al., Biochem 29:3413-3420, 1990)、S344A-FVIIa (Kazama et al., J. Biol. Chem. 270:66-72, 1995)、FFR-FVIIa (Holst et al., Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 15:515-520, 1998)、およびGlaドメインを欠いているVIIa因子(Nicolaisen et al., FEBS Letts. 317:245-249, 1993)を含む（該文献の全ては本明細書中に参照によって援用される）。
【０２０９】
VII因子のバリアント、VII因子又はVII因子関連ポリペプチドの例には、以下のものが含まれる、即ち、野生型VII因子, L305V-FVII, L305V/M306D/D309S-FVII, L305I-FVII, L305T-FVII, F374P-FVII, V158T/M298Q-FVII, V158D/E296V/M298Q-FVII, K337A-FVII, M298Q-FVII, 
V158D/M298Q-FVII, L305V/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII, 
V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, 
E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII, V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII, および S336G-FVII, 
L305V/K337A-FVII, L305V/V158D-FVII, L305V/E296V-FVII, L305V/M298Q-FVII, 
L305V/V158T-FVII, L305V/K337A/V158T-FVII, L305V/K337A/M298Q-FVII, 
L305V/K337A/E296V-FVII, L305V/K337A/V158D-FVII, L305V/V158D/M298Q-FVII, 
L305V/V158D/E296V-FVII, L305V/V158T/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V-FVII, 
L305V/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, 
L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, 
L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, 
L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, 
L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/K316H-FVII, S314E/K316Q-FVII, 
S314E/L305V-FVII, S314E/K337A-FVII, S314E/V158D-FVII, S314E/E296V-FVII, 
S314E/M298Q-FVII, S314E/V158T-FVII, K316H/L305V-FVII, K316H/K337A-FVII, 
K316H/V158D-FVII, K316H/E296V-FVII, K316H/M298Q-FVII, K316H/V158T-FVII, 
K316Q/L305V-FVII, K316Q/K337A-FVII, K316Q/V158D-FVII, K316Q/E296V-FVII, 
K316Q/M298Q-FVII, K316Q/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D-FVII, S314E/L305V/E296V-FVII, S314E/L305V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T-FVII, 
S314E/L305V/K337A/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII, 
S314E/L305V/K337A/E296V-FVII, S314E/L305V/K337A/V158D-FVII, 
S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V-FVII, 
S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V-FVII, 
S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, 
S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, 
S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, 
S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, 
S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/K337A-FVII, 
K316H/L305V/V158D-FVII, K316H/L305V/E296V-FVII, K316H/L305V/M298Q-FVII, 
K316H/L305V/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/K337A/E296V-FVII, K316H/L305V/K337A/V158D-FVII, 
K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V-FVII, 
K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V-FVII, 
K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, 
K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, 
K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, 
K316H/L305V/V158D/E296V/K337A -FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316Q/L305V/K337A-FVII, 
K316Q/L305V/V158D-FVII, K316Q/L305V/E296V-FVII, K316Q/L305V/M298Q-FVII, 
K316Q/L305V/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII, 
K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII, 
K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII, 
K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, 
K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, 
K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, 
K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A -FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/K337A-FVII, F374Y/V158D-FVII, F374Y/E296V-FVII, F374Y/M298Q-FVII, F374Y/V158T-FVII, F374Y/S314E-FVII, 
F374Y/L305V-FVII, F374Y/L305V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D-FVII, 
F374Y/L305V/E296V-FVII, F374Y/L305V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T-FVII, 
F374Y/L305V/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E-FVII, F374Y/K337A/V158T-FVII, 
F374Y/K337A/M298Q-FVII, F374Y/K337A/E296V-FVII, F374Y/K337A/V158D-FVII, 
F374Y/V158D/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q-FVII, F374Y/V158D/E296V-FVII, 
F374Y/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q-FVII, F374Y/V158T/E296V-FVII, 
F374Y/E296V/S314E-FVII, F374Y/S314E/M298Q-FVII, F374Y/E296V/M298Q-FVII, 
F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII, F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII, 
F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII, F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII, 
F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII, 
F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII, 
F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII, 
F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII, F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII, 
F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII, 
F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII, F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII, 
F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII, 
F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII, F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII, 
F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII, F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII, 
F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII, 
F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII, 
F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII, 
F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII, F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII, 
F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII, 
F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII, 
F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, 
F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII, 
F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, 
F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII, 
F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII, 
F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, 
F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII, 
F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII, 
F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII, 
F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII, 
F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, 
F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, 
F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII, 
F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, 
F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, 
F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, S52A-VII因子, S60A-VII因子; 
R152E-VII因子, S344A-VII因子, Glaドメインを欠いているVIIa因子; およびP11Q/K33E-FVII, T106N-FVII, K143N/N145T-FVII, V253N-FVII, R290N/A292T-FVII, G291N-FVII, 
R315N/V317T-FVII, K143N/N145T/R315N/V317T-FVII;およびアミノ酸配列の233Thr〜240Asnに置換、付加、又は欠失を有しているFVII, アミノ酸配列の304Arg 〜 329Cysに置換、付加、又は欠失を有しているFVIIである。
【０２１０】
本発明の方法に適用可能な成長ホルモン(GH)には、その配列および特性が文献（Hormone Drugs, Gueriguian, U.S.P. Covention, Rockvill, 1982）などに記載されたヒト成長ホルモン(hGH)および成長ホルモン化合物が含まれる。「成長ホルモン化合物（growth hormone compound）」の用語は、１以上のアミノ酸残基が削除された及び／又は別のアミノ酸残基（天然または非天然）で置換されたヒト成長ホルモン(hGH)を、及び／又は付加的なアミノ酸残基を具備しているhGHを、及び／又は少なくとも１つの有機置換基が１以上の有機置換基と結合しているhGHを指摘することを意図している。特別の言及が191の本来（native）のアミノ酸配列(ソマトロピン)および192アミノ酸Ｎ末端メチオニン種(ソマトレム)に関してなされる。
【０２１１】
本発明に適用可能な成長ホルモン化合物の他の例には、アミノ酸 No 172, 174, 176 および 178がグループとして、次のグループのアミノ酸(R, S, F, R); (R, A, Y, R), (K, T, Y, K); (R, S, Y, R); (K, A, Y, R); (R, F, F, R); (K, Q, Y, R); (R, T, Y, H); (Q, R, Y, R); (K, K, Y, K); (R, S, F, S) または (K, S, N, R)の１つによって置換されるWO 92/09690 (Genentech)（該文献は本明細書中に参照によって援用される）に記載のものが含まれる。
【０２１２】
本発明に適用可能な成長ホルモン化合物の他の例には、US 6,004931 (Genentech)（該文献は本明細書中に参照によって援用される）に記載された、次の置換 G120R, G120K, G120Y, G120F および G120Eを有するhGHが含まれる。
【０２１３】
本発明に適用可能な成長ホルモン化合物の他の例には、US6,143,523 (Genentech)（該文献は本明細書中に参照によって援用される）に記載された、次のセットの置換 R167N, D171S, E174S, F176Y およびI179T; R176E, D171S, E174S およびF176Y; F10A, M14W, H18D およびH21N; F10A, M14W, H18D, H21N, R167N, D171S, E174S, F176Y, I179T; F10A, M14W, H18D, H21N, R167N, D171A, E174S, F176Y, I179T; F10H, M14G, H18N およびH21N; F10A, M14W, H18D, H21N, R167N, D171A, T175T およびI179T; およびF10I, M14Q, H18E, R167N, D171S およびI179Tを有するhGHが含まれる。
【０２１４】
本発明に適用可能な成長ホルモン化合物の他の例には、US 6,136,536 (Genentech)に記載された（該文献は本明細書中に参照によって援用される）、次の置換 H18A, Q22A, F25A, D26A, Q29A, E65A, K168A, E174A およびG120Kを有するhGHが含まれる。
【０２１５】
本発明に適用可能な成長ホルモン化合物の他の例には、US 6,057,292 (Genentech)に記載された（該文献は本明細書中に参照によって援用される）、次の置換 H18D, H21N, R167N, K168A, D171S, K172R, E174S, I179Tを有し、G120がR, K, W, Y, F またはEの何れかで更に置換されるhGHが含まれる。
【０２１６】
本発明に適用可能な成長ホルモン化合物の他の例には、US 5,849,535 (Genentech)に記載された（該文献は本明細書中に参照によって援用される）、次の置換 H18D, H21N, R167N, K168A, D171S, K172R, E174S およびI179Tを有するhGHが含まれる。
【０２１７】
本発明に適用可能な成長ホルモン化合物の他の例には、WO 97/11178(Genentech)に記載された（該文献は本明細書中に参照によって援用される）、次の置換 H18D, H21D, R167N, K168A, D171S, K172R, E174S およびI179T; 並びにH18A, Q22A, F25A, D26A, Q29A, E65A, K168A およびE174Aを有するhGHが含まれる。
【０２１８】
本発明に適用可能な成長ホルモン化合物の他の例には、WO 90/04788 (Genentech)に記載された（該文献は本明細書中に参照によって援用される）、次の置換 K168A およびE174A; R178N およびI179M; K172A およびF176A; およびH54F, S56E, L58I, E62S, D63N およびQ66Eを有するhGHが含まれる。
【０２１９】
本発明の方法を用いて修飾できるサイトカインの例には、エリスロポエチン (EPO), トロンボポエチン, INF-α, IFN-β, IFN-γ, TNF-α, インターロイキン-1β (IL-1-β), IL-3, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21 IL-24, 顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF), GM-CSF, およびケモカイン、例えば、マクロファージ炎症性タンパク質-1(MIP-1)ガンマインターフェロン誘導性タンパク質およびIFNγ で誘導されるモノカイン(MIG)が含まれる。
【０２２０】
本発明の方法に適用可能なIL-19の具体的な例には、WO 98/08870 (Human Genome Science)（該文献は本明細書中に参照によって援用される）に開示されたものが含まれる。特別の言及がWO 98/08870に配列番号2として開示されたペプチドに関してなされる。
【０２２１】
IL-20に適用可能なIL-19の具体的な例には、WO 99/27103 (Zymogenetics)（該文献は本明細書中に参照によって援用される）に開示されたものが含まれる。本発明において、IL-20は、IL-20それ自身及びその断片、同様に、IL-20又はその断片と少なくとも90%同一であるポリペプチドを指摘することを意図している。本発明の方法に特に適用可能なタンパク質には、WO 99/27103に配列番号1, 配列番号2, 配列番号3, 配列番号4, 配列番号5, 配列番号6, 配列番号7, 配列番号8, 配列番号9, 配列番号10, 配列番号11, 配列番号12, 配列番号13, 配列番号14, 配列番号15, 配列番号16, 配列番号17, 配列番号18, 配列番号19, 配列番号20, 配列番号21, 配列番号22, 配列番号23, 配列番号24, 配列番号25, 配列番号26, 配列番号27, 配列番号28, 配列番号29, 配列番号30, 配列番号31, 配列番号32, 配列番号33, 配列番号34および配列番号35として開示されたものが含まれる。
【０２２２】
本発明に適用可能なIL-21の例には、WO 00/53761 (Zymogenetics)（該文献は本明細書中に参照によって援用される）に開示されたものが含まれ、特別の言及はWO 00/53761に配列番号2として開示されたペプチドに関してなされる。
【０２２３】
TTFは、本発明の方法に適用可能である。TTFペプチドは、胃腸管と主に関連するペプチドのファミリーである。特別の言及は、ヒト, マウス, およびラットから知られている乳癌関連pS2ペプチド(TFF-1)、ヒト, ブタ, ラット, およびマウスから知られている鎮痙ポリペプチド(TFF-2)、並びにヒト, ラット およびマウスから知られている腸トレフォイルファクター(TFF-3)に関してなされる。
【０２２４】
本発明の方法に適用可能なTFFファミリーの他のペプチドには、WO 02/46226 (Novo Nordisk)（該文献は本明細書中に参照によって援用される）に開示されたものが含まれる。特別の言及は、WO 02/46226の配列番号1に開示されたアミノ酸を有し、Cys6-Cys104, Cys8-Cys35, Cys19-Cys34, Cys29-Cys46, Cys58-Cys84, Cys68-Cys83, およびCys78-Cys95の間にジスルフィド結合を具備している、成分Xが独立に糖残基（sugar residues）から選択され、オリゴ糖がAsn15に共有結合性に付着するTFF-2ペプチドに関してなされる。
【０２２５】
TFFファミリーの他のペプチドには、WO 96/06861(Novo Nordisk)（該文献は本明細書中に参照によって援用される）に開示されたTFF-1およびTFF-3ダイマーが含まれる。
【０２２６】
幾つかのメラノコルチンレセプターが知られており、本発明の方法に適用可能なペプチドの特別の言及が、ペプチド性（peptidic）のメラノコルチン-4レセプターアゴニスト（これは食欲抑制性の効果を有することが知れている）に関してなされる。特別の言及が次に記す特許文献に開示されたペプチドまたはタンパク質に関してなされる（該文献は、全て本明細書中に参照によって援用される）：US 6,054,556 (Hruby), WO 00/05263 (William Harvey Research), WO 00/35952 (Melacure), WO 00/35952 (Melacure), WO 00/58361 (Procter & Gamble), WO 01/52880 (Merck), WO 02/26774 (Procter & Gamble), WO 03/06620 (Palatin), WO 98/27113 (Rudolf Magnus Institute) およびWO 99/21571 (Trega)。
【０２２７】
本発明の方法に適用可能な他のクラスのペプチドまたはタンパク質には、酵素が含まれる。多くの酵素は様々な産業目的で使用されており、特別の言及はヒドロラーゼ(プロテアーゼ, リパーゼ, セルラーゼ, エステラーゼ), オキシドレダクターゼ(ラッカーゼ, ペルオキシダーゼ, カタラーゼ, スーパーオキシドジスムターゼ, リポキシゲナーゼ), トランスフェラーゼおよびイソメラーゼに関してなされる。
【０２２８】
本発明の方法に適用可能な他のペプチドまたはタンパク質には、副腎皮質刺激ホルモン, コルチコトロピン-放出因子, アンギオテンシン, カルシトニン, インシュリン及びその断片およびアナログ, グルカゴン, IGF-1, IGF-2, エンテロガストリン（enterogastrin）, ガストリン, テトラガストリン, ペンタガストリン, ウロガストリン（urogastrin）, 上皮成長因子, , セクレチン, 神経成長因子, 甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン, ソマトスタチン, 成長ホルモン放出ホルモン, ソマトメジン, 副甲状腺ホルモン, トロンボポエチン, エリスロポエチン, 視床下部の 放出因子, プロラクチン, 甲状腺刺激ホルモン, エンドルフィン, エンケファリン, バソプレッシン, オキシトシン, オピオイド及びそのアナログ, アスパラギナーゼ, アルギナーゼ, アルギニンデアミナーゼ, アデノシンデアミナーゼおよびリボヌクレアーゼが含まれる。
【０２２９】
本発明の方法にしたがって修飾されるペプチドは、天然の供給源(例えば、植物、動物または微生物、例えば、酵母、細菌、菌類またはウイルス)から単離されたものあってもよい又はそれらは合成されたものであってもよい。天然の供給源からのペプチドには、遺伝的に修飾されて、ペプチドを発現する又は発現が増加する供給源などのトランスジェニック供給源からのペプチドも含まれる；ここで、前記ペプチドは、天然（nature）に存在するという意味で「天然の（natural）」もので又はヒトの介在によってのみ存在するという意味で「非天然の（unnatural）」ものであってもよい。天然の供給源から単離されたペプチドは、本発明の結合の前に合成的な修飾を施されてもよい。
【０２３０】
一態様において、本発明は、取得可能（obtainable）な結合型ペプチドに関し、例えば、本発明の方法により取得される。取得可能な結合型ペプチド（例えば、本発明の方法により取得される）が治療ペプチド（therapeutic peptide）である場合、本発明は係る化合物の療法における使用、および係る化合物を含んでいる薬学的組成物をも提供する。
【０２３１】
一態様において、本発明は、以下の式
【化１０５】
0005583635.tif 000108
【０２３２】
｛式中のP, R, A, D, E および Zは、上記で規定したものであり、式中の基
【化１０６】
0005583635.tif 000109
【０２３３】
は水素をGln残基の側鎖における-NH2 から除去することによって取得されるペプチドラジカルを表す｝の結合型ペプチド、並びにその薬学的に許容される塩、溶媒和物およびプロドラックを提供する。
【０２３４】
特に、以下の式による化合物
【化１０７】
0005583635.tif 000110
【０２３５】
は、ポジション141（特に、この部位で排他的に）に結合を有するヒト成長ホルモンを表す。
【０２３６】
係る化合物の特定の例には、以下のものが含まれる：
Nε141-[2-(4-(4-(mPEG(20k)イルブタノイル)-アミノ-ブチルオキシイミノ)-エチル]hGH, 
Nε141-[2-(1-(ヘキサデカノイル)ピペリジン-4-イル)エチルオキシイミノ)-エチル]hGH,
Nε141(2-(4-(4-(1,3-ビス(mPEG(20k)イルアミノカルボニルオキシ)プロパ-2-イルオキシ)ブチリルアミノ)ブチルオキシイミノ)エチル)hGH,
Nε141(2-(4-(2,6-ビス(mPEG(20k)イルオキシカルボニルアミノ)ヘキサノイルアミノ)ブチルオキシイミノ)エチル)hGH,
Nε141(2-(4-(4-(mPEG(30k)イルオキシ)ブチリルアミノ)ブチルオキシイミノ)エチル)hGH,
Nε141(2-(4-(4-(mPEG(20k)イルオキシ)ブチリルアミノ)ブチルオキシイミノ)エチル)hGH, および
Nε141(2-(4-(3-(mPEG(30k)イルオキシ)プロパノイルアミノ)ブチルオキシイミノ)エチル)hGH；並びに、その薬学的に許容される塩、溶媒和物（solvates）およびプロドラッグ。
【０２３７】
上記で議論したとおり、上記リストで言及されたmPEG(20k)イルは、1.06未満、例えば、1.05未満、例えば、1.04未満、例えば、1.03未満、例えば、1.02 および 1.03の間の多分散性指標を有するmPEG(20k)イルを指摘することを意図している。同様に、mPEG(30k)イルは、1.06未満、例えば、1.05未満、例えば、1.04未満、例えば、1.03未満、例えば、1.02 および 1.03の間の多分散性指標を有するmPEG(30k)イルを指摘することを意図している。
【０２３８】
上記で議論したとおり、ペプチドは、前記ペプチドを結合させることができる１を超えるGln-残基を含んでいてもよい。この場合において、上記の事項は、１を超える部位で結合されているペプチドをも指摘することを意図している。
【０２３９】
非結合型ペプチド(P-C(O)-NH2)が治療ペプチドである範囲で、本発明は、結合型ペプチドI療法の使用に、および前記結合型ペプチドを含んでいる薬学的組成物にも関する。
【０２４０】
インシュリンを使用して、糖尿病が治療または予防される。そして、一態様において、本発明は、１型または２型の糖尿病を治療する方法を提供し、該方法は、必要とする被験者に治療的に効果的な量の本発明によるインシュリンまたはインシュリン化合物結合体を投与することを備える。
【０２４１】
別の態様において、本発明は、本発明によるインシュリンまたはインシュリン化合物結合体の、１型または２型の糖尿病の治療に使用される医薬の製造における使用を提供する。
【０２４２】
GLP-1は、高血糖、２型糖尿病、耐糖能障害（impaired glucose tolerance）、１型糖尿病、肥満、高血圧症、Ｘ症候群、異脂肪血症、β-細胞アポトーシス、β-細胞欠乏、炎症性の腸症候群（inflammatory bowel syndrome）、消化不良、認知障害（cognitive disorders）、例えば、認知増強（cognitive enhancing）、神経保護、アテローム性動脈硬化症、冠性心疾患および他の心臓血管障害の治療に使用しえる。従って、一態様において本発明は、前記疾患を治療する方法を提供し、該方法は、必要とする被験者に治療的に効果的な量の本発明によるGLP-1またはGLP-1化合物結合体を投与することを備える。
【０２４３】
別の態様において、本発明は、本発明によるGLP-1またはGLP-1化合物結合体の、上記で言及した疾患の治療に使用される医薬の製造における使用を提供する。
【０２４４】
GLP-2は、腸における栄養の吸収不良へと至る腸不全（intestinal failure）の治療に使用しえる。また、特にGLP-2は、小腸症候群（small bowel syndrome）, 炎症性腸症候群（Inflammatory bowel syndrome）, クローン病, コラーゲン大腸炎（collagen colitis）を含む大腸炎, 放射線大腸炎, 照射後萎縮症（post radiation atrophy）, 非熱帯性(グルテン不耐性)および熱帯性スプルー, 血管閉塞または外傷の後の組織の傷害, 旅行者の下痢, 脱水, 菌血症, 敗血症, 神経性食欲不振症, 化学療法後の組織傷害, 未熟児, 強皮症（schleroderma）, 萎縮性胃炎を含む胃炎, 幽門洞切除後の萎縮性胃炎（postantrectomy atrophic gastritis）およびピロリ菌胃炎, 潰瘍, 腸炎, 盲腸（cul-de-sac）, リンパ閉塞（lymphatic obstruction）, 血管疾患（vascular disease）および移植片対宿主病, 外科的な処置後のヒーリング（healing）, 放射線照射後の萎縮症および化学療法,および 骨粗鬆症の治療に使用しえる。従って、上記の疾患を治療する方法を提供することが本発明の意図することであり、該方法は、必要とする患者に治療的に効果的な量の本発明によるGLP-2またはGLP-2化合物結合体を投与することを備える。
【０２４５】
別の態様において、本発明は、本発明によるGLP-2またはGLP-2化合物結合体の、上記で言及した疾患の治療に使用される医薬の製造における使用を提供する。
【０２４６】
成長ホルモンは、成長ホルモン分泌不全症(GHD); ターナー症候群; プラーダーヴィリ症候群(PWS); ヌーナン症候群; ダウン症候群; 慢性腎臓病（chronic renal disease）、若年性関節リウマチ; 嚢胞性線維症、HAART治療を受けている小児におけるHIV感染症（HIV/HALS children）; 在胎齢が短く誕生した小さい小児（SGA；short children born short for gestational age）; SGAを除く極低出生体重（VLBW）で誕生した小児における低身長（short stature in children born with very low birth weight）; 骨格形成異常; 低軟骨形成症（hypochondroplasia）; 軟骨形成不全症（achondroplasia）; 特発性低身長（ISS；idiopathic short stature）; 成人におけるGHD; 脛骨, 腓骨, 大腿骨, 上腕骨, 橈骨, 尺骨, 鎖骨, 中手骨, 中足骨, および指（digit）などの長骨（long bones）における、又は、それらの骨折; 頭蓋骨, 手の基部（base of hand）, および足の基部などの海綿状骨（spongious bones）における、又は、それらの骨折; 手, 膝, または肩部などにおける腱または靭帯の手術後の患者; 伸延骨形成（distraction oteogenesis）を有している又は経験している患者; 臀部または円板（discus）の置換（replacement）, メニスカスの修復, 脊椎固定または膝, 臀部, 肩部, 肘, 手関節または下顎などのプロテーゼ固定の後の患者; 釘、スクリューおよびプレートなどの骨接合材料（osteosynthesis material）が固定された患者; 癒着不能（non-union）または変形癒合（mal-union）の骨折を有する患者; 脛骨または第一足指（1st toe）からなどのオステアトミア（osteatomia）後の患者; 移植物の移植後の患者; 外傷（trauma）または関節炎が原因の膝の関節軟骨変性; ターナー症候群の患者のオステオポローシス; 男性のオステオポローシス（osteoporosis in men）; 慢性透析の成人患者（APCD；adult patients in chronic dialysis）; APCDにおける栄養不良関連性心臓血管疾患（malnutritional associated cardiovascular disease）; APCDにおけるカヘキシーの反転（reversal）; APCDにおけるガン; APCDにおける慢性閉塞性肺疾患（chronic abstractive pulmonal disease）; APCDにおけるHIV; APCDを伴う高齢者; APCDにおける慢性肝疾患, APCDにおける疲労症候群（fatigue syndrome）; クローン病; 肝機能の障害; HIV感染症を伴う男性; 短小腸症候群; 中心性肥満; HIV関連性リポジストロフィ症候群 (HALS); 男性の不妊症; 主要な待機手術（major elective surgery）後の患者, アルコール/薬の解毒または神経学的な外傷; 加齢; 虚弱な高齢者; 骨関節炎（osteo-arthritis）; 外傷性に傷害された軟骨（traumatically damaged cartilage）; 勃起不全; 線維筋痛; 記憶障害; うつ病; 外傷性の脳傷害; くも膜下出血; 非常に低い出生時体重; 代謝症候群; 糖質コルチコイドミオパシー;または小児の糖質コルチコイド治療による低身長の治療に使用され得る。また、成長ホルモンは、筋肉組織, 神経組織または傷のヒーリングの促進；損傷を受けた組織の血流の促進または改善；或いは損傷を受けた組織における感染率の減少に使用されており、その方法は必要とする患者に効果的な量の治療的に効果的な量の式Ｉの化合物を投与することを備える。従って、本発明は、これらの疾患または状態を治療するための方法を提供し、該方法は、必要とする患者に治療的に効果的な量の本発明による成長ホルモンまたは成長ホルモン化合物結合体を投与することを備える。
【０２４７】
典型的には、投与される結合型成長ホルモンの量は、10-7 - 10-3 g/kg 体重、例えば、10-6 - 10-4 g/kg 体重、例えば、10-5 - 10-4 g/kg 体重の範囲である。
【０２４８】
別の態様において、本発明は、成長ホルモンまたは成長ホルモン化合物結合体の、上記で言及した疾患または状態の治療に使用される医薬の製造における使用を提供する。
【０２４９】
サイトカインは、免疫系に関与している疾患のホストの病因（etiology）に関係する。特に、IL-20が乾癬（psoriasis）に関与し、その治療にも影響するであろうこと、I-21が癌に関与し、本疾患の治療処置を構成するだろうことが言及される。一態様において、本発明は、乾癬を治療する方法を提供し、該方法は、治療的に効果的な量の本発明によるIL-20結合体を投与することを備える。別の態様において、本発明は、本発明のIL-20結合体の、乾癬の治療に使用される医薬の製造における使用に関する。
【０２５０】
別の態様において、本発明は、癌を治療する方法に関し、該方法は治療的に効果的な量の本発明のIL-21結合体を、それを必要とする被験者に投与することを備える。
【０２５１】
別の態様において、本発明は、本発明のIL-21結合体の、癌の治療に使用される医薬の製造における使用に関する。
【０２５２】
TTFペプチドを使用して、被験者における粘膜層の粘性を増加させること、唾液の分泌（例えば、唾液分泌の増加が放射線療法、抗コリン作用性またはシェーグレン症候群の治療で生じる）を減少させること、アレルギー性鼻炎、外傷に対して二次的なストレス誘発性胃潰瘍、ショック（shock）、大きな手術（large operations）、腎臓または肝臓の疾患、NSAID（例えば、アスピリン）、ステロイドまたはアルコールでの処置を治療することが可能である。また、TTFペプチドを使用して、クローン病、潰瘍性大腸炎、角膜結膜炎、慢性 膀胱感染症、腸管性膀胱炎（intestinal cystitis）、乳頭腫および膀胱癌を治療しえる。従って、一態様において本発明は、上記で言及した疾患または状態を治療する方法に関し、該方法は、必要とする被験患者に治療的に効果的な量の本発明によるTTF結合体を投与することを備える。
【０２５３】
別の態様において、本発明は、本発明のTTF結合体の、上記で言及した疾患または状態の治療に使用される医薬の製造における使用に関する。
【０２５４】
メラノコルチンレセプターモディファイヤー（Melanocortin receptor modifiers）と、特にメラノコルチン4レセプターアゴニストとは、肥満および関連する疾患の治療および予防に関与している。一態様において、本発明は、糖耐性障害(IGT；impaired glucose tolerance)のインシュリン非要求性２型糖尿病への進行を予防する又は遅延させるための、インシュリン非要求性２型糖尿病のインシュリン要求性糖尿病への進行を予防する又は遅延させるための、肥満（obesity）を治療するための、および食欲（appetite）を制御するための方法を提供する。また、メラノコルチン4レセプターアゴニストは、アテローム性動脈硬化症, 高血圧症, 糖尿病, ２型糖尿病, 糖耐性障害(IGT), 異脂肪血症, 冠性心疾患, 胆嚢 疾患, 胆石, 骨関節炎, 癌, 性的不能および早発死のリスク（the risk of premature death）から選択される疾患の治療に関与している。従って、一態様において本発明は、上記の疾患または状態を治療する方法を提供し、該方法は、必要とする被験者に治療的に効果的な量の本発明によるメラノコルチン4レセプターアゴニスト結合体を投与することを備える。
【０２５５】
更に別の態様において、本発明は、本発明のメラノコルチン4レセプターアゴニスト結合体の、上記で言及した疾患または状態の治療に使用される医薬の製造における使用に関する。
【０２５６】
VII因子化合物は、凝固に関連する疾患の治療に関与している。また、生物学的に活性なVII因子化合物は、特に血友病, VIIIおよびIX因子に対するインヒビターを伴う血友病, 血小板減少症を伴う患者, 血小板病（thrombocytopathies）を伴う患者、例えば、グランツマン血小板無力症血小板放出欠陥および貯蔵プール欠陥（Glanzmann’s thrombastenia platelet release defect and strorage pool defects）, フォンウィルブランド病を伴う患者, 肝疾患および外傷または外科に関連する出血問題を伴う患者の治療に関与している。生物学的に不活性なVII因子化合物は、過剰凝固状態（hypercoagluable states）、例えば、敗血症を伴う患者, 深部静脈血栓症（deep-vein thrombosis）, 心筋感染症（myocardial infections）または血栓発作（thrombotic stroke）の危険がある患者, 肺塞栓症, 急性の冠血管症候群を伴う患者, 冠血管心臓疾患（coronary cardiac）を経験している患者, 血管形成術を受けている患者に対する心臓イベント（cardiac events）および再狭窄の予防, 末梢性の脈管性疾患を伴う患者, および急性の呼吸困難症候群（acute respiratory distress syndrome）の治療に関与している。従って、一態様において本発明は、上記で言及した疾患または状態を治療するための方法を提供し、該方法は、必要とする被験者に治療的に効果的な量の本発明によるVII因子化合物結合体を投与することを備える。
【０２５７】
別の態様において、本発明は、本発明によるVII因子化合物結合体の、上記で言及した疾患または状態の治療に使用される医薬の製造における使用を提供する。
【０２５８】
多くの疾患は、治療において１を超える医薬を用いて、同時に投与されるか又は連続的に投与されて治療される。従って、本発明のペプチド結合体を、上記で言及した疾患の１つを治療するための治療方法に、該疾患の治療に通常使用される1以上の他の治療的に活性な化合物と組み合わせて使用することは本発明の範囲内である。同様に、本発明のペプチド結合体を、上記で言及した疾患の１つの治療に通常使用される他の治療的に活性な化合物と組み合わせて、該疾患のための医薬の製造に使用することも本発明の範囲内である。
【０２５９】
上記で議論したとおり、本発明の方法にしたがって結合された治療ペプチドは、療法に使用しえるものであり、本事項もまた本発明の態様である。
【０２６０】
別の態様において、本発明は、本発明の結合型ペプチドの、診断（diagnostics）における使用を提供する。
【薬学的組成物】
【０２６１】
別の課題は、結合型ペプチドを具備している薬学的組成物を提供することであり、これは例えば、本発明の結合型成長ホルモン(GH)であり、10-15 mg/ml〜200 mg/ml（例えば、10-10 mg/ml〜5 mg/ml）の濃度で存在し、前記組成物は2.0〜10.0のpHを有する。前記組成物は、さらに緩衝系、保存剤、張性剤（tonicity agent）、キレート剤、安定化剤（stabilizer）および界面活性剤を具備してもよい。本発明の一態様において、薬学的組成物は水性組成物（即ち、水を含む組成物）である。係る組成物は、典型的には溶液または懸濁物である。本発明の更なる態様において、前記薬学的組成物は、水溶液である。「水性組成物（aqueous composition）」の用語は、少なくとも 50 % w/wの水を具備している組成物と規定される。同様に、「水溶液（aqueous solution）」の用語は、少なくとも 50 %w/wの水を具備している溶液と規定される。また「水性懸濁物（aqueous suspension）」の用語は、少なくとも 50 %w/wの水を具備している懸濁物と規定される。
【０２６２】
別の態様において、前記薬学的組成物は、医師または患者によって使用前に溶媒および／または希釈剤が添加されるフリーズドライ組成物（freeze-dried composition）である。
【０２６３】
別の態様において、前記薬学的組成物は、事前に溶解することなく使える状態の乾燥組成物（例えば、フリーズドライまたはスプレードライ）である。
【０２６４】
更なる側面において、本発明は、ペプチド結合体（例えば、GH結合物）および緩衝剤の水溶液を具備している薬学的組成物に関し、該ペプチド結合体（例えば、GH結合物）は0.1〜100 mg/ml以上の濃度で存在し、該組成物は約 2.0〜約 10.0のpHを有する。
【０２６５】
本発明の別の態様において、前記組成物のpHは、2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, および 10.0からなるリストから選択される。
【０２６６】
本発明の更なる態様において、前記緩衝剤は、酢酸ナトリウム, 炭酸ナトリウム, シトレート, グリシルグリシン, ヒスチジン, グリシン, リジン, アルギニン, リン酸二水素ナトリウム（sodium dihydrogen phosphate）, リン酸水素二ナトリウム（disodium hydrogen phosphate）, リン酸ナトリウム, およびトリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン, ビシン, トリシン, リンゴ酸, スクシナート, マレイン酸, フマル酸, 酒石酸, アスパラギン酸又はその混合物からなる群から選択される。これらの特定の緩衝剤の各々は、本発明の代替的な態様を構成する。
【０２６７】
本発明の更なる態様において、前記組成物は、さらに薬学的に許容される保存剤を含む。本発明の更なる態様において、前記保存剤は、フェノール, o-クレゾール, m-クレゾール, p-クレゾール, メチル p-ヒドロキシルベンゾアート, プロピル p-ヒドロキシルベンゾアート, 2-フェノキシエタノール, ブチル p-ヒドロキシルベンゾアート, 2-フェニルエタノール, ベンジルアルコール, クロロブタノール, およびチメロサール（thiomerosal）, ブロノポール, 安息香酸, イミド尿素（imidurea）, クロロヘキシジン（chlorohexidine）, デヒドロ酢酸ナトリウム, クロロクレゾール, エチル p-ヒドロキシルベンゾアート, 塩化ベンゼトニウム, クロルフェネシン(3p-クロルフェノキシプロパン-1,2-ジオール)又はその混合物からなる群から選択される。本発明の更なる態様において、前記保存剤は、0.1 mg/ml〜20 mg/mlの濃度で存在する。本発明の更なる態様において、前記保存剤は、0.1 mg/ml〜5 mg/mlの濃度で存在する。本発明の更なる態様において、前記保存剤は、5 mg/ml〜10 mg/mlの濃度で存在する。本発明の更なる態様において、前記保存剤は、10 mg/ml〜20 mg/mlの濃度で存在する。これらの特定の保存剤の各々は、本発明の代替的な態様を構成する。薬学的組成物における保存剤の使用は、当業者に周知である。便宜のため、文献（Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, 2000）を参照されたい。
【０２６８】
本発明の更なる態様において、前記組成物は、さらに等張化剤を含む。等張性剤（isotonicity agent）は、塩(例えば、塩化ナトリウム), 糖または糖アルコール, アミノ酸(例えば、L-グリシン, L-ヒスチジン, アルギニン, リジン, イソロイシン, アスパラギン酸, トリプトファン, スレオニン), アルジトール(例えば、グリセロール(グリセリン), 1,2-プロパンジオール(プロピレングリコール), 1,3-プロパンジオール, 1,3-ブタンジオール)ポリエチレングリコール(例えば、PEG400)、又はその混合物からなる群から選択される。任意の糖を使用してもよく、これは例えば次のものである；モノ-、ジ-、またはポリサッカライド、または水溶性のグルカン、例えば次のものが含まれる、果糖、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性のデンプン、ヒドロキシエチルスターチおよびカルボキシメチルセルロース-Na。一態様において、糖添加物は、スクロースである。糖アルコールは、少なくとも1つの-OH基を有しているC4-C8炭化水素と規定され、これには、例えば、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクティトール、ズルシトール（dulcitol）、キシリトール、およびアラビトールが含まれる。一態様において、糖アルコール添加物は、マンニトールである。上記の糖または糖アルコールは、個々に（individually）又は組み合わせて使用してもよい。糖または糖アルコールが液体調製物中で可溶性であり、本発明の方法を用いて得られた安定化効果に不利に影響しないかぎり、使用される量に定められた限度はない。一態様において、糖または糖アルコール濃度は、約 1 mg/mlおよび約 150 mg/mlの間である。本発明の更なる態様において、等張化剤（isotonic agent）は、1 mg/ml〜50 mg/mlの濃度で存在する。本発明の更なる態様において、等張化剤は、1 mg/ml〜7 mg/mlの濃度で存在する。本発明の更なる態様において、等張化剤は、8 mg/ml〜24 mg/mlの濃度で存在する。本発明の更なる態様において、等張化剤は、25 mg/ml〜50 mg/mlの濃度で存在する。これらの特定の等張化剤の各々は、本発明の代替的な態様を構成する。薬学的組成物における等張化剤の使用は、当業者に周知である。便宜のため、文献（Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, 2000）を参照されたい。
【０２６９】
本発明の更なる態様において、前記組成物は、さらにキレート剤を含む。本発明の更なる態様において、前記キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、クエン酸、およびアスパラギン酸の塩、並びにその混合物から選択される。本発明の更なる態様において、前記キレート剤は、0.1mg/ml〜5mg/mlの濃度で存在する。本発明の更なる態様において、前記キレート剤は、0.1mg/ml〜2mg/mlの濃度で存在する。本発明の更なる態様において、前記キレート剤は、2mg/ml〜5mg/mlの濃度で存在する。これらの特定のキレート剤の各々は、本発明の代替的な態様を構成する。薬学的組成物におけるキレート剤の使用は、当業者に周知である。便宜のため、文献（Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, 2000）を参照されたい。
【０２７０】
本発明の更なる態様において、前記組成物は、さらに安定化剤を含む。薬学的組成物における安定化剤の使用は、当業者に周知である。便宜のため、文献（Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, 2000）を参照されたい。
【０２７１】
より具体的には、本発明の組成物は、安定化された液体薬学的組成物（liquid pharmaceutical compositions）であって、治療的に活性な成分が液体薬学的組成物中での貯蔵の間に凝集物形成を呈する可能性のあるタンパク質を含む安定化された液体薬学的組成物である。「凝集物形成（aggregate formation）」は、オリゴマー（可溶性が残存しえる）、または溶液から沈殿した大きな可視の凝集物の形成を生じるタンパク質分子間の物理的な相互作用を意図している。「貯蔵される間（during storage）」は、一度調製された液体薬学的組成物または組成物が被験者に即座に投与されないことを意図している。むしろ、調製に引続いて、それは被験者への投与に適切な、後の液体形態または他の形態への再構成のために、液体形態、凍結状態、又は乾燥形態への何れかでの貯蔵のためにパッケージされる。「乾燥形態（dried form）」は、液体薬学的組成物または組成物が、フリーズドライ（即ち、凍結乾燥;例えば、Williams and Polli (1984) J. Parenteral Sci. Technol. 38:48-59を参照されたい)、スプレードライ（Masters (1991) in Spray-Drying Handbook (5th ed; Longman Scientific and Technical, Essez, U.K.), pp. 491-676; Broadhead et al. (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18:1169-1206; and Mumenthaler et al. (1994) Pharm. Res. 11:12-20を参照されたい）、又は空気乾燥（Carpenter and Crowe (1988) Cryobiology 25:459-470; and Roser (1991) Biopharm. 4:47-53）の何れかにより乾燥されることを意図している。液体薬学的組成物の貯蔵間のタンパク質による凝集物形成は、そのタンパク質の生物活性に不利に影響しえるものであり、前記薬学的組成物の治療上の有効性の欠損を生じる。さらにまた、凝集物形成は、タンパク質含有薬学的組成物が輸液システムを用いて投与されるときのチュービング（tubing）、膜、又はポンプの閉塞（blockage）などの他の問題の原因となりえる。
【０２７２】
本発明の薬学的組成物は、前記組成物の貯蔵間のタンパク質による凝集物形成を減少させるために十分なアミノ酸塩基の量をさらに具備してもよい。「アミノ酸塩基（amino acid base）」は、任意の所与のアミノ酸が、その遊離塩基の形態（its free base form）又はその塩の形態（its salt form）の何れかで存在する、アミノ酸又はアミノ酸の組合わせを意図している。アミノ酸の組合わせが使用される場合、全てのアミノ酸は、それらの遊離塩基の形態で存在してもよい、全てがそれらの塩の形態で存在してもよい、又は幾つかがそれらの遊離塩基の形態で存在し、他方で他はそれらの塩の形態で存在してもよい。一態様において、本発明の組成物を調製することに使用するアミノ酸は、例えば、アルギニン、リジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸などの荷電側鎖を保持しているものである。特定のアミノ酸(メチオニン, ヒスチジン, アルギニン, リジン, イソロイシン, アスパラギン酸, トリプトファン, スレオニン及びその混合物)の任意の立体異性体（即ち、LまたはD異性体、又はその混合物）又はこれらの立体異性体の組合わせ又はグリシン又は有機塩基（例えば、イミダゾールであるが、限定されない）が、特定のアミノ酸または有機塩基がその遊離塩基の形態又はその塩の形態の何れかで存在するかぎり、本発明の薬学的組成物に存在してもよい。一態様において、アミノ酸のL-立体異性体が使用される。一態様において、L-立体異性体が使用される。また、本発明の組成物は、これらのアミノ酸のアナログと処方されてもよい。「アミノ酸アナログ（amino acid analogue）」は、本発明の液体薬学的組成物の貯蔵間のタンパク質による凝集物形成を減少させる所望の効果を生じせしめる天然アミノ酸の誘導体（derivative）を意図している。適切なアルギニンアナログには、例えば、アミノグアニジン（aminoguanidine）、オルニチンおよびN-モノエチルL-アルギニンが含まれる、適切なメチオニンアナログには、エチオニンおよびブチオニン（buthionine）が含まれる、並びに適切なシステインアナログには、S-メチル-Lシステインが含まれる。他のアミノ酸と同様に、アミノ酸アナログは、それらの遊離塩基の形態又はそれらの塩の形態の何れかで前記組成物に導入される。本発明の更なる態様において、前記アミノ酸またはアミノ酸アナログは、前記タンパク質の凝集を阻止する又は遅延（delay）させるのに十分な濃度で使用される。
【０２７３】
本発明の更なる態様において、メチオニン(または他の硫黄性アミノ酸またはアミノ酸アナログ)は、治療薬として作用する前記タンパク質が次の酸化に感受性の少なくとも１つのメチオニン残基を具備しているタンパク質である場合、メチオニン残基のメチオニンスルホキシドへの酸化を阻害するために添加されてもよい。「阻害（inhibit）」は、メチオニン酸化型種の、時間に対する最小の蓄積を意図している。メチオニン酸化を阻害することによって、前記タンパク質を、その適切な分子形態によりよく保持することとなる。メチオニン(LまたはD異性体)の任意の立体異性体又はその任意の組合わせを使用することができる。添加すべき量は、メチオニン残基の酸化を阻害するために十分な量にすべきであり、メチオニンスルホキシドの量が管理機関（regulatory agencies）に認可されるような量にすべきである。典型的には、この事項は、前記組成物が約 10%〜約 30%のメチオニンスルホキシド以下を含有することを意味している。一般に、この事項は、メチオニンのメチオニン残基に添加される比率が約 1:1〜約 1000:1（例えば、10:1〜約 100:1）の範囲であるようにメチオニンを添加することで達成することができる。
【０２７４】
本発明の更なる態様において、前記組成物は、高分子量ポリマーまたは低分子化合物からなる群から選択される安定化剤を更に含む。本発明の更なる態様において、前記安定化剤は、ポリエチレングリコール(例えば、PEG 3350)、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリビニルピロリドン、カルボキシル-/ヒドロキシセルロース（hydroxycellulose）又はその誘導体(例えば、HPC, HPC-SL, HPC-LおよびHPMC)、シクロデキストリン、モノチオグリセロール、チオグリコール酸および2-メチルチオエタノールのようなイオウ含有物質、並びに異なる塩(例えば、塩化ナトリウム)から選択される。これらの特定の安定化剤の各々は、本発明の代替的な態様を構成する。
【０２７５】
また、薬学的組成物は、そのなかの治療的に活性なタンパク質の安定性をさらに増強する付加的な安定化剤を具備する。本発明に特に重要な安定化剤には、メチオニンおよびEDTA（メチオニン酸化に対して前記タンパク質を防御する）、および非イオン性界面活性剤（凍結融解または機械的剪断に関連する凝集に対して前記タンパク質を防御する）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２７６】
本発明の更なる態様において、前記組成物は、さらに界面活性剤を含む。本発明の更なる態様において、前記界面活性剤は、洗剤（detergent）, エトキシル化ヒマシ油（ethoxylated castor oil）, ポリグリコール化グリセリド（polyglycolyzed glycerides）, アセチル化モノグリセリド, ソルビタン脂肪酸エステル, ポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンブロックポリマー(例えば、ポロキサマー、例えば、Pluronic(R) F68, ポロキサマー 188 および407, トリトン X-100), ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル, ポリオキシエチレンおよびポリエチレン誘導体（例えば、アルキル化およびアルコキシル化誘導体(tweens, 例えば、 Tween-20, Tween-40, Tween-80 およびBrij-35), モノグリセリド又はそのエトキシル化誘導体, ジグリセリド又はそのポリオキシエチレン誘導体, アルコール, グリセロール, レクチンおよびリン脂質(例えば、ホスファチジルセリン, ホスファチジルコリン, ホスファチジルエタノールアミン, ホスファチジルイノシトール, ジホスファチジルグリセロールおよびスフィンゴミエリン), リン脂質の誘導体(例えば、ジパルミトイルホスファチジン酸)およびリゾリン脂質の誘導体(例えば、パルミトイルリゾホスファチジル-L-セリンおよびエタノールアミン, コリン, セリンまたはスレオニンの1-アシル-sn-グリセロ-3-リン酸エステル)およびリゾホスファチジルおよびホスファチジルコリンのアルキル, アルコキシル (アルキルエステル), アルコキシ (アルキルエーテル)-誘導体、例えば、リゾホスファチジルコリンのラウロイルおよびミリストイル誘導体, ジパルミトイルホスファチジルコリン, および, 極性の頭部基（head group）の修飾体, 該頭部基はコリン, エタノールアミン, ホスファチジン酸, セリン, スレオニン, グリセロール, イノシトール, および陽性荷電のDODAC, DOTMA, DCP, BISHOP, リゾホスファチジルセリンおよびリゾホスファチジルスレオニン, およびグリセロリン脂質(例えば、セファリン), グリセロ糖脂質 (例えば、ガラクトピラノシド), スフィンゴ糖脂質 (例えば、セラミド, ガングリオシド), ドデシルホスホコリン, ニワトリ卵リゾレシチン, フシジン酸誘導体-(例えば、タウロ-フシジン酸ナトリウムなど), 長鎖脂肪酸及びその塩,  C6-C12 (例えば、オレイン酸およびカプリル酸), アシルカルニチンおよび誘導体, リジン, アルギニンまたはヒスチジンのNα-アシル化誘導体, またはリジンまたはアルギニンの側鎖アシル化誘導体（side-chain acylated derivatives）, リジン, アルギニンまたはヒスチジンおよび中性または酸性アミノ酸の何れかの組合わせを具備しているジペプチドのNα-アシル化誘導体, 中性アミノ酸および２荷電化アミノ酸（two charged amino acids）の何れかの組合わせを具備しているトリペプチドのNα-アシル化誘導体, DSS (ドキュセートナトリウム, CAS登録番号[577-11-7]), ドキュセートカルシウム, CAS登録番号[128-49-4]), ドキュセートカリウム, CAS登録番号[7491-09-0]), SDS (ドデシル硫酸ナトリウムまたはラウリル硫酸ナトリウム), カプリル酸ナトリウム, コール酸又はその誘導体, 胆汁酸及びその塩およびグリシンまたはタウリン結合体, ウルソデオキシコール酸, コール酸ナトリウム, デオキシコール酸ナトリウム, タウロコール酸ナトリウム, グリココール酸ナトリウム, N-ヘキサデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホナート, 陰イオン性(��ルキル-アリール-スルホナート)一価  界面活性剤, 双性イオン性界面活性剤(例えば、N-アルキル-N,N-ジメチルアンモニオ-1-プロパンスルホナート, 3-コラミド（cholamido）-1-プロピルジメチルアンモニオ-1-プロパンスルホナート, 陽イオン性界面活性剤(四級アンモニウム塩基)(例えば、セチル-トリメチルアンモニウム  ブロミド, 塩化セチルピリジニウム), 非イオン性界面活性剤(例えば、ドデシルβ-D-グルコピラノシド), ポロキサミン(例えば、 Tetronic’s), これはプロピレンオキシドおよびエチレンオキシドをエチレンジアミンに順次付加することから派生する四官能性ブロック  コポリマーである, 又はイミダゾリン誘導体, 又はその混合物からなる群から選択されえる界面活性剤、から選択される。これらの特定の界面活性剤の各々は、本発明の代替的な態様を構成する。
【０２７７】
薬学的組成物における界面活性剤の使用は、当業者に周知である。便宜のため、文献（Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, 2000）を参照されたい。
【０２７８】
他の構成成分が本発明の薬学的組成物中に存在することが可能である。係る付加的な構成成分は、湿潤剤, 乳化剤, 抗酸化剤, バルキング剤（bulking agents）, 張性修飾剤（tonicity modifiers）, キレート剤, 金属イオン, 油性ビヒクル（oleaginous vehicles）, タンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン, ゼラチンまたはタンパク質)および双性イオン(例えば、アミノ酸、例えば、ベタイン, タウリン, アルギニン, グリシン, リジン および ヒスチジン)を含んでもよい。係る付加的な構成成分は、もちろん、本発明の薬学的組成物の全体の安定性に不利に影響すべきではない。
【０２７９】
ペプチド結合体（例えば、本発明によるGH結合体）を含有している薬学的組成物は、係る治療を幾つかの部位、例えば、局所的部位（例えば、皮膚および粘膜部位）、吸収をバイパスする部位（例えば、動脈における、静脈における、心臓における投与）、吸収が関与する部位（例えば、皮膚における、皮膚下における、筋肉における又は腹部における投与）で必要としている患者に投与しえる。
【０２８０】
本発明による薬学的組成物の投与は、係る治療を必要とする患者に、舌（lingual）, 舌下（sublingual）, 頬, 口内（in the mouth）, 経口（oral）, 胃および腸中（in the stomach and intestine）, 経鼻（nasal）, 肺（例えば, 細気管支および肺胞又はその組み合わせを介して）, 上皮（epidermal）, 真皮（dermal）, 経皮（transdermal）, 膣（vaginal）, 直腸, 眼球（例えば, 結膜を介して）, 尿管（uretal）, および非経口などの幾つかの投与経路を介するものであってもよい。
【０２８１】
当該発明の組成物は、溶液, 懸濁物, エマルジョン剤, マイクロエマルジョン剤, 複合エマルジョン, 泡剤（foams）, 軟膏剤（salves）, ペースト剤（pastes）, プラスター, 軟膏（ointments）, 錠剤, 被覆錠剤, リンス剤（rinses）, カプセル, 例えば, 硬いゼラチンカプセルおよび柔らかいゼラチンカプセル, 坐剤, 直腸カプセル, ドロップ剤（drops）, ゲル, スプレー, 粉末剤, エアロゾル, 吸入剤（inhalants）, 点眼液, 眼軟膏, 眼のリンス剤（ophthalmic rinses）, 膣のペッサリー, 膣のリング, 膣軟膏, 注射溶液, インサイチュー転換溶液（in situ transforming solutions）、例えば、インサイチューゲル化剤, インサイチュー硬化剤（in situ setting）, インサイチュー沈殿剤, インサイチュー結晶化剤, 輸液溶液, およびインプラントなどの幾つかの剤形で投与しえる。
【０２８２】
本発明の組成物は、例えば、共有結合性、疎水性及び静電気的な相互作用を介して、薬担体、薬物送達システムおよび高度な薬物送達システムに、GH結合体の安定性をさらに増強させる、バイオアベイラビリティーを増加させる、溶解度を増加させる、有害な作用を減少させる、当業者に周知の時間療法（chronotherapy）を達成する、および患者のコンプライアンスを増加させる、又はその任意の組み合わせのために、さらに配合され（compounded）又は付属（attached）されてもよい。担体（carriers）、薬物送達システムおよび高度な薬物送達システムの例には、ポリマー, 例えば、セルロースおよび誘導体, ポリサッカライド, 例えば、デキストランおよび誘導体, デンプンおよび誘導体, ポリ(ビニルアルコール), アクリラートおよびメタクリレートポリマー, ポリ乳酸およびポリグリコール酸及びそのブロックコポリマー, ポリエチレングリコール, 担体タンパク質, 例えば、アルブミン, ゲル, 例えば、サーモジェリング（thermogelling）システム, 例えば、当業者に周知のブロックブロックコポリマーシステム, ミセル, リポソーム, ミクロスフェア, ナノ微粒子（nanoparticulates）, 液体結晶（liquid crystals）及びその分散剤, 脂質-水システムにおける相行動（phase behaviour）の当業者に周知のL2相及びその分散剤, ポリマー性ミセル, 複合エマルジョン剤, 自己乳化（self-emulsifying）, 自己ミクロ乳化, シクロデキストリン及びその誘導体, およびデンドリマー（dendrimers）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２８３】
当該発明の組成物は、定量吸入器（a metered dose inhaler）、乾燥粉末吸入器（dry powder inhaler）およびネブライザー（全て当業者に周知の装置である）などを用いて、ペプチド結合体（例えば、GH結合体）を肺投与するための、固体、半固体（semisolids）、粉末および溶液の組成物に有用である。
【０２８４】
当該発明の組成物は、コントロール性（controlled）、持続性（sustained）、遅延性（protracting）、遅滞性（retarded）、および緩徐性（slow）に放出させる薬物送達系に特に有用である。より具体的には、組成物は、当業者に周知の、非経口のコントロール性放出および持続性放出システム（双方のシステムによって投与数における何倍もの減少に至る）の組成物に有用であるが、これらに限定されない。なおより好ましいものは、皮下に投与されるコントロール性放出および持続性放出システムである。本発明の範囲を限定することなく、有用なコントロール性放出システムおよび組成物の例は、ヒドロゲル、油性の（oleaginous）ゲル、液体結晶（liquid crystals）、重合体ミセル（polymeric micelles）、ミクロスフェア、ナノ粒子（nanoparticles）である。
【０２８５】
当該発明の組成物に有用なコントロール性放出システムを産生する方法には、結晶化, 凝縮, 共結晶化（co-crystallization）, 沈殿, 共沈殿, 乳化, 分散剤, 高圧均質化（high pressure homogenisation）, カプセル化（encapsulation）, スプレードライ, マイクロカプセル化（microencapsulating）, コアセルベーション, 相分離（phase separation）, 溶媒蒸発によるミクロスフェアの産生, 押出し成形（extrusion）および超臨界流体プロセス（supercritical fluid processes）が含まれるが、これらに限定されない。一般的な参照は、文献〔Handbook of Pharmaceutical Controlled Release (Wise, D.L., ed. Marcel Dekker, New York, 2000) およびDrug and the Pharmaceutical Sciences vol. 99: Protein Composition and Delivery (MacNally, E.J., ed. Marcel Dekker, New York, 2000)〕によってなされる。
【０２８６】
非経口投与は、皮下、筋肉内、腹腔内、または静脈内の注射で、注射器（自由選択で、ペン様の注射器）の手段によって実施し得る。或いは、非経口投与は、輸液ポンプの手段で実施することができる。さらなるオプションは、ペプチド結合体（例えば、GH結合体）を、経鼻または肺スプレー（nasal or pulmonal spray）の形態で投与するための溶液剤または懸濁剤である組成物である。なお更なるオプションとして、ペプチド結合体（例えば、本発明のGH結合体）を含有している薬学的組成物は、経皮投与〔例えば、針なし注射（needle-free injection）による又はパッチ、任意でイオントフォレーシス性パッチ（iontophoretic patch）からの〕、又は経粘膜（例えば、頬投与）に適用することもできる。
【０２８７】
「安定化組成物（stabilized composition）」の用語は、増加した物理的な安定性、増加した化学的な安定性または増加した物理的および化学的な安定性を有する組成物を意味する。
【０２８８】
本明細書中に使用されるタンパク質組成物の「物理的な安定性（physical stability）」の用語は、タンパク質の熱機械的ストレス（thermo-mechanical stresses）への暴露の及び／又は不安定な界面（interfaces）および表面（例えば、疎水性の表面および界面）との相互作用の結果として、タンパク質の生物学的に不活性および／または不溶性の凝集物を形成するタンパク質の傾向を意味する。水性のタンパク質組成物の物理的な安定性は、適切なコンテナ(例えば、カートリッジまたはバイアル)に充填した前記組成物を、機械的／物理的なストレス(例えば、撹拌)に異なる温度で様々な時間で暴露した後で、視覚的な点検および／または濁度測定の手段によって評価される。前記組成物の視覚的な点検（Visual inspection）は、暗い背景で焦点を絞った光源（a sharp focused light）において行われる。前記組成物の濁度は、濁度の度合を、例えば、0から3のスケール（濁りを呈していない組成物は視覚スコア0に対応し、昼光中で視覚的な濁りを呈している組成物は視覚スコア3に対応する）で、視覚的にスコアをつけることによって特徴づけられる。組成物が昼光中で視覚的な濁度を呈した場合、タンパク質凝集に関して物理的に不安定であると分類される。或いは、組成物の濁度は、当業者に周知の単純な濁度測定によって評価することができる。また、水性のタンパク質組成物の物理的な安定性は、タンパク質のコンホメーション状態の分光学的な薬剤またはプローブを用いることによって評価することができる。前記プローブは、好ましくは、タンパク質の非天然コンフォーマー（non-native conformer）へと優先的に結合する小分子である。タンパク質構造の小分子の分光学的なプローブの一例は、チオフラビンTである。チオフラビンTは、アミロイドフィブリルの検出に広く使用されている蛍光色素である。フィブリルの存在下（おそらく他のタンパク質配置も同様）で、チオフラビンTは、フィブリルタンパク質形態に結合した場合に、新たな最大励起を約 450 nmで及び増強した発光を約 482 nmで発生する。非結合型のチオフラビンTは、前記波長で基本的に非蛍光性（non-fluorescent）である。
【０２８９】
他の小分子は、タンパク質構造における天然から非天然の状態への変化のプローブとして使用することができる。一例を挙げると、「疎水性パッチ（hydrophobic patch）」プローブは、タンパク質の暴露した疎水性パッチに優先的に結合する。一般的に、疎水性パッチは、天然の状態においてタンパク質の三次構造内で埋没しているが、タンパク質がアンフォールドする又は変性しはじめると暴露される。これらの小分子、分光学的なプローブの例は、芳香族の、疎水性色素、例えば、アントラセン（antrhacene）、アクリジン、フェナントロリンなどである。他の分光学的なプローブは、金属アミノ酸複合体（metal-amino acid complexes）、例えば、疎水性アミノ酸（例えば、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、およびバリンなど）のコバルト金属複合体である。
【０２９０】
本明細書中に使用されるタンパク質組成物の「化学的な安定性（chemical stability）」の用語は、タンパク質構造における化学的な共有結合性の変化であって、天然のタンパク質構造と比較して、潜在的に低い生物学的な作用強度および／または潜在的に増加した免疫原性の特性を有する化学的なデグラデーション産物の形成に至る変化を意味する。様々な化学的なデグラデーション産物は、天然タンパク質のタイプおよび性質に並びに前記タンパク質が暴露される環境に依存して形成されえる。化学的なデグラデーションの除去は、完全に避けることは多分不可能である。そして、化学的なデグラデーション産物の量の増加は、当業者に周知のように、タンパク質組成物の貯蔵および使用の間にしばしば認められる。大抵のタンパク質は、脱アミド（グルタミニルまたはアスパラギニル残基中の側鎖アミド基が加水分解されて、遊離カルボン酸を形成するプロセス）する傾向がある。他のデグラデーション経路には、高分子量転換産物（high molecular weight transformation products）の形成が関与する。ここでは２以上のタンパク質分子がアミド基転移および／またはジスルフィド相互作用を介して互いに共有結合で結合されて、共有結合性のダイマー、オリゴマーおよびポリマーのデグラデーション産物の形成に至る(Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern. T.J. & Manning M.C., Plenum Press, New York 1992)。酸化（一例を挙げると、メチオニン残基の）を、化学的なデグラデーションの別のバリアントとして言及することができる。タンパク質組成物の化学的な安定性は、異なる環境条件(デグラデーション産物の形成は、一例を挙げると、温度を増加させることによってしばしば促進させることができる)に暴露後に、化学的なデグラデーション産物の量を様々な時点で測定することによって評価することができる。各々の個々のデグラデーション産物の量は、分子サイズおよび／または電荷に依存した様々なクロマトグラフィー技術(例えば、SEC-HPLCおよび／またはRP-HPLC)を用いて、デグラデーション産物を分離することによって度々決定される。
【０２９１】
以上、上記で概説したとおり「安定化組成物（stabilized composition）」は、増加した物理的な安定性、増加した化学的な安定性または増加した物理的および化学的な安定性を有する組成物を意味する。一般的に、組成物は、有効期限に達するまでの、使用および貯蔵（推奨される使用および貯蔵条件にしたがって）の間に安定でなければならない。
【０２９２】
本発明の一態様において、GH結合体を含んでいる薬学的組成物は、6週以上の使用の間に及び3年以上の貯蔵の間に安定である。
【０２９３】
本発明の別の態様において、GH結合体を含んでいる薬学的組成物は、4週以上の使用の間に及び3年以上の貯蔵の間に安定である。
【０２９４】
本発明の更なる態様において、GH結合体を含んでいる薬学的組成物は、4週以上の使用の間に及び2年以上の貯蔵の間に安定である。
【０２９５】
本発明のなお更なる態様において、GH結合体を含んでいる薬学的組成物は、2週以上の使用の間に及び2年以上の貯蔵の間に安定である。
【０２９６】
本明細書中に記載される、文献（publications）、特許出願（patent applications）、および特許（patents）を含む全ての文献は、その全体が並びに各文献が参照によって援用されると個別に具体的に指摘され且つその全体が本願発明に記載されているのと同程度にまで（法が許容する最大程度にまで）参照によって援用される。
【０２９７】
全ての見出し（heading）および小見出し（sub-headings）は、便宜上の目的でのみ本明細書中に使用され、これらは本発明を如何なる様式においても限定するように解釈されない。
【０２９８】
本明細書中で記載される、任意の及び全ての例又は例示的な用語（「例えば」など）は、単に本発明をよりよく説明することを意図しており、他で請求しない限り本発明の範囲を限定しない。明細書における用語は、任意の非請求の要素（any non-claimed element）を、本発明の実施に必須のものと指摘していると解釈されるべきではない。
【０２９９】
本明細書での特許文書（patent documents）の引用（citation）および援用（incorporation）は、便宜上の目的でのみなされ、係る特許文書の有効性（validity）、特許可能性（patentability）、および／または権利行使可能性（enforceability）の如何なる見解（view）をも反映するものではない。
【０３００】
本発明は、適用される法律が許可する、本願の特許請求の範囲に記載される対象（subject matter）の全ての修飾物（modifications）および均等物（equivalents）を含む。
【実施例】
【０３０１】
結合されるペプチド（例えば、水などの適切な溶媒に溶解される）を、5〜1000倍過剰の第１化合物（上記で議論したとおり）と混合し、トランスグルタミナーゼが添加される。適切なトランスグルタミナーゼは、例えば、Streptomyces mobaraenese、Streptomyces lyticus又はモルモットの肝臓から単離されたものである。添加すべきトランスグルタミナーゼの量は、反応の所望の速度（rate）に依存する。より多くの酵素を添加すれば、反応はより速く進行する。温度は、周囲温度（ambient）であるか又は約40°Cまで若干上昇してもよい。前記反応が所望のポイント（即ち、結合されるべきペプチドの所望の画分が機能化されるポイント）に達したとき、第２化合物（上記で議論したとおり）が添加されて結合型ペプチドが生じる。結合型ペプチドは、引続いて精製されてもよい（例えば、カラム技術によって）。また、１以上の付加的な精製工程を、反応シークエンスの早期に含ませてもよい（例えば、過剰な第１化合物を除去するため又は前記酵素を除去するため）。第２工程において、温度を、反応速度を増加させるために上昇させてもよい（というのも、この工程は、酵素活性に依存しないからである）。典型的な反応条件は、文献（Biochem., 35, 13072-13080, 1996, Bioconjugate Chem., 11, 502-509, 2000, and Bioconjugate Chem., 12, 701-710, 1991）中に見出すことができる。
【０３０２】
略語
TGase:  US5156956に記載のStreptoverticillium mobaraenaeからの又はWO9606931-A1に記載のStreptomyces Lydicusからの微生物のトランスグルタミナーゼ。
【０３０３】
分析方法：
Maldi-Tof質量分析。
【０３０４】
分子量は、Autoflex Maldi-Tof機器(Bruker)を用いて決定された。サンプルは、サンドイッチ法にしたがって調製された。マトリックス1は、1mlのアセトン中に10 mgのアルファ-シアノ-4-ヒドロキシ-桂皮酸を含有する溶液であった。マトリックス2は、水で希釈した50%アセトニトリル1ml中に10 mgのアルファ-シアノ-4-ヒドロキシ-桂皮酸を含有する溶液であった。サンプルは、ターゲット上で順次、1 μl マトリックス１を適用し、空気乾燥し、1 μl 3%トリフルオロ酢酸を適用し、1 μl サンプルを適用し、1 μl マトリックス２を適用し、空気乾燥し、フラッシング（flushing）することによってターゲットプレートを水で洗浄し、そして最後に空気乾燥することによって調製された。スペクトルは、20%レーザー出力および標準方法を用いて、3-20 kDa範囲に関して取得された（これは機器から供給される）。
【０３０５】
RP-HPLC.
RP-HPLC分析を、Waters996ダイオードアレイ検出器を備えたWaters 2690 Separation Module上で実施した。A Vydac 218TP54 4.6mm x 250mm 5μm C-18 シリカ  カラム(The Separations Group, Hesperia)を使用し、検出をUVで214 nm、254 nm、280 nmおよび301nmで行った。前記カラムを、0.1% トリフルオロ酢酸 / H2Oで平衡化し、0.1% トリフルオロ酢酸 /H2Oに対して0から90%アセトニトリルのグラジエントで、50 min、42゜C、0.5ml/minの流速で溶出した。
【０３０６】
LC-MS
LC-MS分析を、２つのPerkin Elmerシリーズ200マイクロポンプ、Perkin Elmerシリーズ200オートサンプラー、アプライドバイオシステム785A  UV検出器およびSedex 75 蒸発光散乱検出器（Evaporative Light scattering detector）を備えるPE-Sciex API 100質量分析計で実施した。Waters Xterra 3.0 mm x 50 mm 5μ C-18シリカカラムを、1.5 ml/minで室温で溶出した。それを5 % アセトニトリル / 0.1% トリフルオロ酢酸 / H2O で平衡化し、5% アセトニトリル / 0.1% トリフルオロ酢酸 / H2Oで1.0 min、そして90% アセトニトリル / 0.1% トリフルオロ酢酸 / H2Oまでのリニアグラジエントで7 min溶出した。検出を、UV検出器で214nm及び蒸発光散乱で行った。カラム溶出液のフラクションを、PE-Sciex API 100 質量分析計のイオンスプレー  インターフェースに導入した。質量範囲300〜2000 amuを、試験の間2秒毎にスキャンした。
【０３０７】
エドマン  シークエンシング:
アミノ酸配列を、Applied Biosystem モデル494タンパク質シークエンサーを用いた自動化エドマン分解で、基本的に製造者によって記載されたとおりに決定した。通常、50pmolのペプチドを、分析に使用した。PEG化（PEGylated）または脂肪酸誘導体化（fatty-acid derivatized）アミノ酸残基は、ブランクのエドマン  サイクルを提示する。
【０３０８】
タンパク質の定量
タンパク質濃度を、UV分光光度計を用いて280nmでの吸収を測定することで見積もった。16170 M÷1 cm÷1 のモル吸光係数を使用した。量を、ボリューム（volumes）および濃度から計算した。
【０３０９】
誘導体化部位の決定に関する酵素的なペプチドマッピング
ペプチドマッピングを、還元された又はアルキル化されたタンパク質のAsp-N消化を用いて行った。最初に、タンパク質を標準の手順にしたがいDTT(ジチオスレイトール)およびヨードアセトアミドで処理した。アルキル化された産物を、HPLCを用いて精製した。引き続いて、アルキル化された精製産物を、酵素：基質の比率を1:100でエンドプロテアーゼ  Asp-N(Boehringer)で一晩消化した。消化物を、C-18カラムおよび標準のトリフルオロ酢酸/アセトニトリル緩衝系を用いて、HPLC分離した。結果的に生じたペプチドマップを、未誘導体化hGHのものと比較した。そして、異なる保持時間を有するフラクションを、収集し、Maldi-tof 質量分析を用いてさらに分析した。
【０３１０】
SDS  page
SDS  ポリアクリルアミドゲル電気泳動を、NuPAGE  4%-12%Bis-Trisゲル(インビトロゲン  NP0321BOX)を用いて実施した。ゲルを、銀染色(インビトロゲン LC6100)またはクーマシー染色(インビトロゲン  LC6065)した。そして妥当な場合には、M. M. Kurfurst（Anal.Biochem. 200(2):244-248, 1992）による記載のとおりにPEGに関してヨウ化バリウムで染色した。
【０３１１】
hGHのmPEGとの又は親油性成分（lipophilic moiety）との結合に関する図解
【化１０８】
0005583635.tif 000111
【０３１２】
I.  hGH, ヒト成長ホルモン
II.  Nε141-(2-ヒドロキシ-3-アミノ-プロピル)hGH
III.  Nε141-(2-オキソ-エチル)hGH
IV.  Nε141-[2-(4-(4-(mPEGyl)ブタノイル)-アミノ-ブチルオキシイミノ)-エチル]hGH
V.  Nε141-[2-(1-(ヘキサデカノイル)ピペリジン-4-イル)エチルオキシイミノ)-エチル]hGH。
【０３１３】
例１.  hGH のトランス-アミノ化(I.)でのNε141-(2-ヒドロキシ-3-アミノ-プロピル)hGH(II.)の生成
hGH (I.)(200 mg)を、リン酸緩衝液(50 mM, pH 8.0, 14 ml)に溶解した。
【０３１４】
この溶液を、リン酸緩衝液(50 mM, 1 ml, pH 8.0, 1,3-ジアミノ-プロパン-2-オールに溶解後にpHを8.0に希塩酸で調整した）に溶解した1,3-ジアミノ-プロパン-2-オール(378mg)の溶液と混合した。
【０３１５】
最終的に、リン酸緩衝液(50 mM, pH 8.0, 1 ml)に溶解したTGase(18 mg ~ 40 U)の溶液を添加し、上記のボリュームをリン酸緩衝液(50 mM, pH 8)の添加によって10mlへと調整し、これによって1,3-ジアミノ-プロパン-2-オールの濃度0.2 Mを得た。組合わされた混合物を、４時間37゜Cでインキュベーションした。
【０３１６】
温度を室温に下げ、N-エチル-マレイミドを終濃度の1mMまで添加した。
【０３１７】
さらに１時間後、混合物を10ボリュームのトリス緩衝液(50 mM, pH 8.5)で希釈した。
【０３１８】
例２.  Nε141-(2-ヒドロキシ-3-アミノ-プロピル)hGH(II.)のイオン交換クロマトグラフィー
例1で生成した溶液を、緩衝液Ａ(50 mM tris, pH 8.5)で前平衡化したMonoQ 10/100 GLカラム(Amersham Biosciences cat.No.17-5167-01)に適用した。それを次に2 ml/minの流速で緩衝液Ｂ（50 mM tris, 2 M NaCl, pH 8.5）の3%から6%のグラジエントで溶出した。フラクションを280 nmでのUV吸収に基づいて収集した。そして、Maldi-Tof分析を選択したフラクションで行った。Maldi-Tof質量分析法による予想mwを提示している最大ピークに対応するフラクションをプールした。
【０３１９】
例３.  Nε141-(2-ヒドロキシ-3-アミノ-プロピル)hGH (II.)のキャラクタリゼーション
例2で収集されたプールのペプチドマッピングは次の事項を提示した。その事項とは、Asp-N断片AA130-146が、グルタミン残基の側鎖中にアミノアルコールの付加に対応する73 amuの質量増加を提示したことである。これは本来のhGHのものと比較した際に、HPLCマップ中で保持時間が変化した唯一のペプチドであった。この断片は、２つのグルタミン残基を含有する。前記ペプチドをエドマンシークエンシングに供試した。そしてGln-137は予測された産物で発見されたが、Gln-141はブランクのエドマン  サイクルを提示した。誘導体化はGln-141で選択的に発生したと結論された。
【０３２０】
例４.  N-(4-アミノオキシ-ブチル)-4-mPEGyl-ブチルアミド（式中のmPEGylは、多分散性であり、約20 kDaの分子量を有する）の合成
工程１:  2-(4-(tert-ブトキシカルボニルアミノキシ)ブチル)イソインドール-1,3-ジオン
【化１０９】
0005583635.tif 000112
【０３２１】
商業的に利用可能なN-(4-ブロモブチル)フタルイミド(2.82g, 10mmol)およびN-Boc-ヒドロキシルアミン(2.08 g, 15.6mmol)の混合物に、アセトニトリル(2ml)を引続いて1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデ-7-エン(2.25 ml, 15mmol)を添加した。前記反応混合物を、室温で30 min、次に50゜Cで2日間撹拌した。それを水(30 ml)および1N塩酸(20 ml)の混合物で希釈した。それを酢酸エチル(2x100ml)で抽出した。有機物相（organic phase）をブライン（50 ml）で洗浄し、硫酸マグネシウムに対して乾燥させた。粗製品（crude product）を、ヘプタン/酢酸エチル  1:0から0:1のグラジエントを溶出液として用いて、シリカ（60 g）上でクロマトグラフィーで精製し、2.08 gの2-(4-(tert-ブトキシカルボニルアミノキシ)ブチル)イソインドール-1,3-ジオンを生成した。
【０３２２】
工程２：  N-(4-アミノブトキシ)カルバミン酸tert-ブチルエステル
【化１１０】
0005583635.tif 000113
【０３２３】
ヒドラジン水和物(1.0 ml, 20 mmol)を、エタノール(8.0 ml)中の2-(4-(tert-ブトキシカルボニルアミノキシ)ブチル)イソインドール-1,3-ジオン(2.08 g, 6.22 mmol)の溶液に添加した。反応混合物を、80゜Cで65 h撹拌した。溶媒を、減圧下（in vacuo）で除去した。残渣をトルエン(10 ml)に溶解し、溶媒を減圧下で除去した。残渣を、1N塩酸(10 ml)中に懸濁した。沈殿物を、濾過で除去し、水(2 ml)で洗浄した。濾過物および洗浄液体（wash-liquids）を、混合し、炭酸カリウムで塩基性とした。溶液を、ジクロロメタン(4x20ml)で抽出した。有機物層を、硫酸マグネシウムに対して乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、0.39 gのN-(4-アミノブトキシ) カルバミン酸tert-ブチルエステルを生成した。炭酸カリウム(3 g)を水相に添加した、これをジクロロメタン(3 x 20 ml)で抽出した。これらの混合した有機物層を、硫酸マグネシウムに対して乾燥させた。溶媒を減圧下で除去して、別の0.39 gのN-(4-アミノブトキシ)カルバミン酸tert-ブチルエステルを得た。
【０３２４】
工程３：  N-(4-(4-(mPEG20000yl)ブタノリアミド)ブトキシ)カルバミン酸tert-ブチルエステル
【化１１１】
0005583635.tif 000114
【０３２５】
商業的に利用可能なmPEG2000ylブタン酸のN-ヒドロキシ  スクシンイミド  エステル(Nektar “mPEG-SBA”, # 2M450P01, 3 g, 0.15 mmol)を、ジクロロメタン(25ml)に溶解した。N-(4-アミノブトキシ)カルバミン酸 tert-ブチルエステル(0.12 g, 0.59 mmol)を添加した。反応混合物を室温で撹拌した。ジエチルエーテルを、沈殿が得られるまで添加した。沈殿を、濾過で分離した。物質を減圧下で乾燥して、2.39 gのN-(4-(4-(mPEG20000yl)ブタノリアミド（butanolyamino）)ブトキシ)カルバミン酸tert-ブチルエステルを産出した。
【０３２６】
工程４:  N-(4-アミノキシブチル)-4-(mPEG20000yl)ブタノリアミド
【化１１２】
0005583635.tif 000115
【０３２７】
トリフルオロ酢酸(20ml)を、ジクロロメタン(20ml)中のN-(4-(4-(mPEG20000yl)ブタノリアミノ)ブトキシ)カルバミン酸tert-ブチルエステル(2.39 g, 0.12 mmol)の溶液に添加した。反応混合物を、30 min撹拌した。ジエチルエーテル(100 ml)を添加した。形成された沈殿を、濾過で単離した。それをジエチルエーテル(2 x 100 ml)で洗浄し、減圧下で乾燥し、1.96 gのN-(4-アミノキシブチル)-4-(mPEG20000yl)ブタノリアミド（butanolyamide）を得た。
【０３２８】
例５.  Nε141-(2-ヒドロキシ-3-アミノ-プロピル)hGH(II.)の酸化でのNε141-(2-オキソ-エチル)hGH(III.)の生成
48.7mgの(II.)を含有している例2からのプールしたフラクションの緩衝液を、アミコンウルトラ-15限外濾過装置(ミリポア)を用いて、15 mMトリエタノールアミン  pH8.5(1N塩酸で調整した)緩衝液に対して４回交換した。最終的に溶液は、2mlまで濃縮された。これに2 mllの100mMメチオニン溶液（15 mM トリエタノールアミン緩衝液pH 8.5中に存在）が添加された。最終的に、0.4 mlの25 mM過ヨウ素酸ナトリウム（水溶液）を添加し、そして混合物を30 min室温でインキュベーションした。次にそれを氷上で冷却し、1.6 mlの氷冷したN, N-ジメチルホルムアミドを添加した。
【０３２９】
例６.  Nε141-(2-オキソ-エチル)hGH(III.)のN-(4-アミノオキシ-ブチル)-4-mPEGyl-ブチルアミドのオキシム化（Oximation）でのNε141-[2-(4-(4-(mPEGyl)ブタノイル)-アミノ-ブチルオキシイミノ)-エチル]hGH(IV.)（式中のmPEGylは、多分散性であり、約20 kDaの分子量を有する）の生成
380 mgのN-(4-アミノオキシ-ブチル)-4-mPEGyl-ブチルアミド（butyramide）を、4mlの水に溶解し、pHを1N塩酸で6.0に調整した。例5から結果的に生じた混合物を、次に穏やかに撹拌しながらゆっくりと添加し、反応を室温で72h進行させた。
【０３３０】
例７.  Nε141-[2-(4-(4-(mPEGyl)ブタノイル)-アミノ-ブチルオキシイミノ)-エチル]hGH(IV.)のイオン交換クロマトグラフィー（式中のmPEGylは、多分散性であり、約20 kDaの分子量を有する）
例6で結果的に得られた溶液を、緩衝液Ａ(50 mM tris, pH 8.5)で前平衡化したMonoQ 10/100 GL カラム(Amersham Biosciences cat. No. 17-5167-01)に適用した。次にそれを緩衝液Ａにおいて0%から7%の緩衝液Ｂ(50 mM tris, 2 M NaCl, pH 8.5)のグラジエントで流速0.5 ml/minで1120 min以上溶出した。フラクションを280 nmでのUV吸収に基づいて収集し、Maldi-Tof分析を選択したフラクションで行った。Maldi-Tof 質量分析によって予想されたmwを提示している最大ピークに対応するフラクションをプールした。Maldi-Tof分析は、mPEGの多分散特性と一致して43130 Da付近を中心とするブロードなピークを呈した。SDS pageは、60kDaの見かけの分子量を有する単一バンドを示した。前記バンドは銀およびヨウ化バリウムの双方で染色されたので、PEG誘導化タンパク質であることが確認された。これらの分析的結果によって、分離された産物化合物がhGHのモノペグ化誘導体（mono pegylated derivative）であることが確認された。
【０３３１】
例８.  1-[4-(2-(アミノオキシ)エチル)ピペリジン-1-イル]ヘキサデカン-1-オンの合成
【化１１３】
0005583635.tif 000116
【０３３２】
工程１:
4-[2-(トルエン-4-スルホニルオキシ)エチル]ピペリジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル
【化１１４】
0005583635.tif 000117
【０３３３】
トシル  クロライド(4.16 g, 21.8 mmol)を、商業的に利用可能な4-(2-ヒドロキシエチル) ピペリジン-1-カルボサイクリックエステル tert-ブチルエステル(例えば、アルドリッチ 54,724-7, 5.0 g, 21.8 mmol)およびトリエチルアミン(4.25 ml, 30.5 mmol)をジクロロメタン(100 ml)中に含む溶液に添加した。反応混合物を、室温で16h撹拌した。それを酢酸エチル(300 ml)で希釈し、硫化水素（sodium hydrogensulphate）(200 ml)の10%水溶液で洗浄した。水相を、酢酸エチル(150 ml)で抽出した。組合せた有機物層（organic layers）を、炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液(250 ml)で洗浄し、硫酸マグネシウムに対して乾燥させた。溶媒を、減圧下で除去した。粗製品を、酢酸エチル/ヘプタンを最初に1:2を次に1:1を溶出液として用いて、シリカ(80g)上でフラッシュ・クロマトグラフィーで精製し、6.04 gの4-[2-(トルエン-4-スルホニルオキシ) エチル] ピペリジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステルを生成した。
【０３３４】
1H-NMR (CDCl3):δ 1.05 (m, 2 H); 1.45 (s, 9 H); 1.55 (m, 5 H); 2.50 (s, 3 H); 2.65 (t, 2 H); 4.05 (m, 4 H); 7.35 (d, 2 H); 7.80 (d, 2 H)。
【０３３５】
工程２:
4-[2-(1,3-ジオキソ-1,3-ジヒドロイソインドール-2-イルオキシ)エチル]ピペリジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル
【化１１５】
0005583635.tif 000118
【０３３６】
0゜Cで、水素化ナトリウムを鉱物油中に含む60%懸濁物(0.69 g, 17.2 mmol)を、N-ヒドロキシフタルイミド(2.80 g, 17.2 mmol)をN,N-ジメチルホルムアミド(20 ml)中に含む溶液に添加した。反応混合物を、0゜Cで45分間撹拌した。4-[2-(トルエン-4-スルホニルオキシ)エチル]ピペリジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル(5.99 g, 15.6 mmol)をN,N-ジメチルホルムアミド(15 ml)中に含む溶液およびヨウ化  テトラブチルアンモニウム(0.17 g, 0.47 mmol)を、逐次添加した。反応混合物を、60゜Cで2日間処理し、室温に冷却した。水(5 ml)を慎重に添加した。反応混合物を、酢酸エチル(250 ml)で希釈し、硫化水素(200 ml)の10%水溶液で洗浄した。水相を、酢酸エチル(200 ml)で抽出した。組合わせた有機物層（organic layers）を、炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液(150 ml)で洗浄し、硫酸マグネシウムに対して乾燥させた。溶媒を、減圧下で除去した。粗製品を、酢酸エチル/ヘプタン1:1を溶出液として用いて、シリカ(80g)上でフラッシュ・クロマトグラフィーで精製し、4.36 gの4-[2-(1,3-ジオキソ1,3-ジヒドロイソインドール-2-イルオキシ)エチル]ピペリジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステルを生成した。
【０３３７】
1H-NMR (CDCl3):δ 1.15 (m, 2 H); 1.50 (s, 9 H); 1.75 (m, 5 H); 2.75 (m, 2 H); 4.10 (m, 2 H); 4.30 (t, 2 H); 7.80 (m, 4 H)。
【０３３８】
工程３:
2-(2-(ピペリジン-4-イル)エトキシ)イソインドール-1, 3-ジオン
【化１１６】
0005583635.tif 000119
【０３３９】
トリフルオロ酢酸(20ml)を、ジクロロメタン(20ml)中の4-[2-(1,3-ジオキソ-1,3-ジヒドロイソインドール-2-イルオキシ)エチル]ピペリジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル(4.26 g, 11.4 mmol)の溶液に添加した。反応混合物を、室温で50min撹拌した。溶媒を、減圧下で除去した。残渣をジクロロメタン(50 ml)に溶解し、溶媒を減圧下で除去した。後者の手順を２回繰り返して、6.46 gの粗製のトリフルオロ酢酸塩の2-(2-(ピペリジン-4-イル)エトキシ)イソインドール-1, 3-ジオンを生成した。
【０３４０】
MS:m/z = 275 [M+1+]
1H-NMR (DMSO-d6):δ 1.30 (m, 2 H); 1.65 (m, 2 H); 1.90 (m, 3 H); 2.90 (q, 2 H); 3.30 (d, 2 H); 4.20 (t, 2 H); 7.90 (s, 4 H); 8.30 (br, 1 H); 8.65 (br, 1 H)。
【０３４１】
工程４:
2-[2-(1-(ヘキサデカノイル)ピペリジン-4-イル)エトキシ]イソインドール-1, 3-ジオン
【化１１７】
0005583635.tif 000120
【０３４２】
0゜Cで、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド  ハイドロクロライド(1.04 g, 5.44 mmol)を、N,N-ジメチルホルムアミド(20 ml)およびジクロロメタン(20 ml)中のパルミン酸（palmic acid）(1.40 g, 5.44 mmol)および3,4-ジヒドロ-3-ヒドロキシ-4-オキソ-1,2,3-ベンゾトリアゾール(0.89 g, 5.44 mmol)の溶液に添加した。反応混合物を、0゜Cで20min撹拌した。N, N-ジメチルホルムアミド(5 ml)およびエチルジイソプロピルアミン(6.19 ml, 38.1 mmol)中のトリフルオロ酢酸塩の2-(2-(ピペリジン-4-イル)エトキシ)イソインドール-1, 3-ジオン (2.11 g, 5.44 mmol)の溶液を、連続的に添加した。反応混合物を、室温にまで暖めている間に16h撹拌した。それを酢酸エチル(150 ml)で希釈し、硫化水素（sodium hydrogensulphate）の10%水溶液(150 ml)で洗浄した。水相を、酢酸エチルで抽出した。組合わせた有機物層（organic layers）を、水(50 ml)と炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液(50 ml)との混合物で洗浄し、硫酸マグネシウムに対して乾燥させた。粗製品を、酢酸エチル/ヘプタン1:1を溶出液として用いて、シリカ(40 g)上でフラッシュ・クロマトグラフィーで精製し、1.52 gの2-[2-(1-(ヘキサデカノイル)ピペリジン-4-イル)エトキシ]イソインドール-1, 3-ジオンを生成した。
【０３４３】
MS:m/z = 513 [M+1+]
1H-NMR (DMSO-d6):δ 0.90 (t, 3 H); 1.10 (m, 2 H); 1.25 (m, 26 H); 1.45 (m, 2 H); 1.65 (m, 1 H); 1.80 (m, 2 H); 2.30 (t, 2 H); 2.95 (t, 1 H); 3.85 (m, 3 H); 4.20 (t, 2 H); 4.40 (d, 1 H); 7.90 (s, 4 H)。
【０３４４】
工程５:
ヒドラジン水和物(0.14 ml, 20 mmol)を、エタノール(30 ml)中の2-[2-(1-(ヘキサデカノイル)ピペリジン-4-イル)エトキシ]イソインドール-1, 3-ジオン(1.52 g, 2.96 mmol)の溶液に添加した。反応混合物を熱して75 min還流（reflux）し、室温に冷却した。形成された沈殿を、濾過で除去した。濾過物の溶媒を、減圧下で除去した。粗製品を、ジクロロメタン/メタノール/25%アンモニア水(100:10:1)の混合物を溶出液として用いて、シリカ(30 g)上でフラッシュ・クロマトグラフィーで精製し、800 mgの1-[4-(2-(アミノオキシ)エチル)ピペリジン-1-イル]ヘキサデカン-1-オンを生成した。
【０３４５】
MS:m/z = 383 [M+1+]
1H-NMR (CDCl3):δ 0.80 (t, 3 H); 1.25 (m, 2 H); 1.60 (m, 26 H); 1.70 (m, 4 H); 1.65 (m, 3 H); 2.70 8t, 2 H); 2.60 (t, 1 H); 3.05 (t, 1 H); 3.80 (m, 3 H); 4.60 (d, 1 H)。
【０３４６】
例９.  Z-Gln-Glyのアミノ基転移での[4-(3-アミノ-2-ヒドロキシ-プロピルカルバモイル)-2-ベンジルオキシカルボニルアミノ-ブチリルアミノ]-酢酸の生成
【化１１８】
0005583635.tif 000121
【０３４７】
30 mg Z-Gln-Gly (Bachem C1635)を、リン酸緩衝液(50 mM, pH 8.0, 2 ml)に溶解した。
【０３４８】
これに、リン酸緩衝液(50 mM, pH 8.0, 1, 3-ジアミノ-プロパン-2-オール, 0.9 mlに溶解後にpHを8.0に調整した）中の1, 3-ジアミノ-プロパン-2-オール(9 mg)の溶液を添加した。最終的に、リン酸緩衝液 (50 mM, pH 8.0, 0.1 ml)に溶解したTGase(0.9 mg ~ 2U)の溶液を添加し、組合わせた混合物を4 時間、37゜Cでインキュベーションした。温度を室温に下げ、N-エチル-マレイミドを終濃度の1mMまで添加した。更に１時間後、混合物を10ボリュームの水で希釈した。産物を、この溶液から半調製的（semipreparative）なHPLCを7μm C-18 シリカを充填した25 mm x 250 mm カラム上で１回（one run）行って単離した。前記カラムを、0.1% トリフルオロ酢酸 / H2O中に10から30%アセトニトリルを含有する溶液のグラジエントで、10 ml/min、40゜Cの温度で、50minで溶出した。主要なピークに対応するフラクションを含有しているペプチドを、収集し、30 mlに約 3ボリュームのH2Oで希釈し、凍結乾燥した。得られた最終的な産物の特徴を調べたところ、RP-HPLCで産物は12.75 minの保持時間を有しており、LC-MSで1.9 minの保持時間のものが411.5 amuのM + H+に対応する質量ピークを有していた、この結果は予想された構造と一致していた。
【０３４９】
例１０.  [4-(3-アミノ-2-ヒドロキシ-プロピルカルバモイル)-2-ベンジルオキシカルボニルアミノ-ブチリルアミノ]-酢酸の酸化での[2-ベンジルオキシカルボニルアミノ-4-(2-オキソ-エチルカルバモイル)-ブチリルアミノ]-酢酸の生成
【化１１９】
0005583635.tif 000122
【０３５０】
0.8 mgの[4-(3-アミノ-2-ヒドロキシ-プロピルカルバモイル)-2-ベンジルオキシカルボニルアミノ-ブチリルアミノ]-酢酸を、4 mlの15 mMトリエタノールアミン緩衝剤pH8.5(1N塩酸で調整した)に溶解した。これに1 mlの173 mMメチオニン溶液（水に溶解）を添加した。最終的に、0.5 mlの24 mM過ヨウ素酸ナトリウム（水溶液）を添加し、そして混合物を10 min、0゜Cでインキュベーションした。
【０３５１】
例１１.  [2-ベンジルオキシカルボニルアミノ-4-(2-オキソ-エチルカルバモイル)-ブチリルアミノ]-酢酸のオキシム化での(2-ベンジルオキシカルボニルアミノ-4-{2-[2-(1-ヘキサデカノイル-ピペリジン-4-イル)-エトキシイミノ]-エチルカルバモイル}-ブチリルアミノ)-酢酸の生成
【化１２０】
0005583635.tif 000123
【０３５２】
2 mgの1-[4-(2-(アミノオキシ)エチル)ピペリジン-1-イル]ヘキサデカン-1-オンを、3 mlのN, N-ジメチルホルムアミドに溶解し、溶液を氷上で冷却した。0.53 mlの本溶液に、例10からの1.38 mlの反応混合物を添加し、混合物を0゜Cで一晩反応させた。RP-HPLCによって、新しい産物の形成が確認された。それをRP-HPLCにより分析用スケールで単離し、Maldi-TOF質量分析に供し、予測された構造と一致したM+H+:744.7amuに相当するピークが出現した。
【０３５３】
例１２.  Nε141-(2-ヒドロキシ-3-アミノ-プロピル)hGH(II.)の酸化でのNε141-(2-オキソ-エチル)hGH(III.)の生成
5 mgのNε141-(2-ヒドロキシ-3-アミノ-プロピル)hGH(II.)を、0.5 mlの15 mMトリエタノールアミン緩衝剤pH 8.5(1N塩酸で調整した)に溶解した。これに0.13 mlの173 mMメチオニン溶液（水に溶解）を添加した。最終的に、0.06 mlの24 mM過ヨウ素酸ナトリウム（水溶液）を添加し、そして混合物を10 min、0゜Cでインキュベーションした。
【０３５４】
例１３.  Nε141-(2-オキソ-エチル)hGH(III.)の1-[4-(2-(アミノオキシ)エチル)ピペリジン-1-イル]ヘキサデカン-1-オンでのオキシム化によるNε141-[2-(1-(ヘキサデカノイル)ピペリジン-4-イル)エチルオキシイミノ)-エチル]hGH(V.)の生成
2 mgの1-[4-(2-(アミノオキシ)エチル)ピペリジン-1-イル]ヘキサデカン-1-オンを、3 mlのN, N-ジメチルホルムアミドに溶解し、溶液を氷上で冷却した。例12からの0.14 mlの反応混合物を添加し、混合物を0゜Cで一晩反応させた。
【０３５５】
例１４.  Nε141-[2-(1-(ヘキサデカノイル)ピペリジン-4-イル)エチルオキシ-イミノ)-エチル]hGH(V.)のキャラクタリゼーション
例13からの粗製の反応混合物のアリコートを、RP-HPLCにより分析用スケール（analytical scale）で分画し、Maldi-TOF質量分析を前記フラクションで行った。産物の構造から予想される予想分子量を呈している前記フラクションを、ペプチドマッピングに供した。前記マップは次の事項を示した。その事項とは、Asp-N断片AA130-146が、グルタミン残基の側鎖中に2-(1-(ヘキサデカノイル)ピペリジン-4-イル)エチルオキシイミノ)-エチルの付加に対応する407 amuの質量増加を提示したことである。これは本来のhGHのものと比較した際に、HPLCマップ中で保持時間が変化した唯一のペプチドであった。この断片は、２つのグルタミン残基を含有する。前記ペプチドをエドマン  シークエンシングに供試した。そしてGln-137は予測された産物で発見されたが、Gln-141はブランクのエドマン  サイクルを提示した。誘導体化はGln-141で選択的に発生したことが結論づけられた。