(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラットリンパ球由来のものであり、
ＴＥＲＴ遺伝子とＣｙｃｌｉｎＤ１遺伝子が発現しており、且つ
ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／０に対して、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子の発現量が６０％以下である一方で、ｐ１６／ｐ１９遺伝子の発現量が３００％以上であることを特徴とするラットモノクローナル抗体作製用パートナー細胞。
【請求項２】
接着性細胞用培養容器表面に対して接着性を有する請求項１に記載のラットモノクローナル抗体作製用パートナー細胞。
【請求項３】
ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン混合培地に感受性を有する請求項１または２に記載のラットモノクローナル抗体作製用パートナー細胞。
【請求項４】
ＲａＭ  ＃４（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０１５８０）であるラットモノクローナル抗体作製用パートナー細胞。
【請求項５】
１０週齢以上のＷｉｓｔａｒ系ラットを抗原により免疫する工程；
免疫ラットのリンパ節からリンパ球を分取する工程；および、
リンパ球を培養し、増殖してコロニーを形成するものをスクリーニングする工程
を含むことを特徴とするラットモノクローナル抗体作製用パートナー細胞のスクリーニング方法。
【請求項６】
さらに、スクリーニングされた細胞をヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン混合培地で培養し、増殖を停止するか又は死滅する細胞を選択する工程を含む請求項５に記載のラットモノクローナル抗体作製用パートナー細胞のスクリーニング方法。
【請求項７】
抗原としてキャリアタンパク質が結合したものを用い、アジュバントを併用して免疫する請求項５または６に記載のラットモノクローナル抗体作製用パートナー細胞のスクリーニング方法。
【請求項８】
ラットを抗原により免疫する工程；
免疫ラットからリンパ球を分取する工程；
分取したリンパ球と請求項１〜４のいずれかに記載のラットモノクローナル抗体作製用パートナー細胞とを融合してハイブリドーマを得る工程；
ハイブリドーマの中からモノクローナル抗体産生細胞を選択する工程；
モノクローナル抗体産生細胞を培養するか、または、ラットに投与する工程；および、
培養したモノクローナル抗体産生細胞またはラットの腹水からモノクローナル抗体を分離する工程
を含むことを特徴とするモノクローナル抗体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミエローマ細胞ではないにもかかわらず優れた増殖能を有するラットモノクローナル抗体作製用パートナー細胞とその作製方法、および、当該ラットモノクローナル抗体作製用パートナー細胞を用いたモノクローナル抗体の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体は、一般的に、実験動物を所定の抗原で免疫した後にリンパ球を分取し、当該リンパ球とミエローマ細胞を融合してハイブリドーマとし、目的の抗体を産生するハイブリドーマを培養することにより製造される。ここで用いられる実験動物としてヒトを用いるのは勿論倫理的に問題がある。また、ウサギのミエローマ細胞は一般に流通していない。よって、通常、実験動物としてマウスを用い、ミエローマ細胞としてマウス由来のものを用いるケースが最も多いといえる。
【０００３】
しかし、マウスのハイブリドーマでリンパ球由来の免疫グロブリンを産生する割合は６０％に過ぎないのに対して、ラットのハイブリドーマの同割合は９０％に達する（非特許文献１）。また、ラットはマウスに比べて大型であるため、約１０倍量の腹水を得ることができる（非特許文献２）。さらに、ラットを用いた場合、補体を結合できる抗体が産生される頻度が高い。また、異種の抗原を用いた場合には良好な免疫応答が期待できるため、実験で多用されるマウス抗原に対しては、実験動物としてラットを用いることが好ましい。そこで、モノクローナル抗体を製造するに当たり、免疫ラット由来のリンパ球とラットミエローマ細胞を融合することが考えられる。
【０００４】
ラットミエローマ細胞としては、２１０．ＲＣＹ．Ａｇ１．２．３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６３１）（非特許文献２）やＹＢ２／０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６６２）（特許文献１）などが知られている。しかし、これらラットミエローマは不安定であるといえる。
【０００５】
具体的には、２１０．ＲＣＹ．Ａｇ１．２．３はリンパ芽球性のものであり、成熟リンパ球に分化する前の未成熟な前駆細胞であって不安定なものである。また、ＹＢ２／０は、ヒトの補体で免疫したＡＯ系ラットの脾細胞と２１０．ＲＣＹ．Ａｇ１．２．３とを融合して作製したものである。このように、上記ラットミエローマ細胞は、未成熟な前駆細胞や、それをさらに細胞融合したものであるため、継代培養すると形態や性質が変化し、逐一クローニングを繰返して元の性質を維持することが必要となる。そもそも、ミエローマ細胞はがん細胞であるために、染色体の数や構造が不安定であり、細胞の形質転換が起き易いという問題がある。また、これら細胞は接着性を有さず、表面処理された細胞容器にさえ接着することができず培養液中に浮遊することから、そのハイブリドーマもサスペンション培養せざるを得ず、産生された抗体を精製し難いという問題がある。その他のラットミエローマとしてＹＢ２／０の派生株であるＹＯ（ＹＢ２／３．０Ａｇ３０．ＹＯ）も知られているが、モノクローナル抗体の製造には使い難い。
【０００６】
さらに、上記のラットミエローマは、ラット由来のリンパ球との融合効率が決して高くないという欠点があった。よって、一般的に、異種動物間での細胞融合は融合効率が低い上に、ハイブリドーマが得られても不安定なため短期間のうちに抗体を発現しなくなることが知られているが、ラット由来のリンパ球との融合パートナーとしてマウスハイブリドーマが選択される場合もあった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１２−１９１９３６号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Mike Clarkら，Immunology Today，4（4），pp．100-101（1983）
【非特許文献２】Galfre Gら，Nature，277（5692），pp．131-133（1979）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述したように、従来、ラットミエローマ細胞は知られていたが、ラット由来のリンパ球との融合効率が低かったり、不安定なものであるなど、モノクローナル抗体の製造に必ずしも適するものではない。また、ラットのミエローマの発症は比較的まれであり、例えば上記の２１０．ＲＣＹ．Ａｇ１．２．３は、回腸と盲腸の発がん率が高いＬｏｕ／Ｃラットからクローニングを繰返して得られたものである。このように、従来のラットミエローマ細胞の作製は容易なものではない。
【００１０】
そこで本発明は、簡便な方法で容易に製造できるものであり、ラット由来のリンパ球との融合効率が高く、且つがん細胞ではないにもかかわらず活発な増殖能を有し、安定なラットモノクローナル抗体作製用パートナー細胞を提供することを目的とする。また、本発明は、当該ラットモノクローナル抗体作製用パートナー細胞の簡便な作製方法と、当該ラットモノクローナル抗体作製用パートナー細胞を用いたモノクローナル抗体の製造方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、通常の実験用ラットは購入後直ぐや３日間からせいぜい１週間の馴化飼育の後に実験に付されるのに対して、１０週齢以上という実験用ラットとして普通は考えられないほど予備飼育したラットを免疫して分取されたリンパ球は、がん細胞でないにも関わらず不死化しており、モノクローナル抗体作製用パートナー細胞として非常に有用なラット細胞であることを見出して、本発明を完成した。
【００１２】
本発明に係るラットモノクローナル抗体作製用パートナー細胞は、ラットリンパ球由来のものであり、ＴＥＲＴ遺伝子とＣｙｃｌｉｎＤ１遺伝子が発現しており、且つ、ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／０に対して、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子の発現量が６０％以下である一方で、ｐ１６／ｐ１９遺伝子の発現量が３００％以上であることを特徴とする。
【００１３】
本発明に係るラットモノクローナル抗体作製用パートナー細胞は、接着性細胞用培養容器表面に対して接着性を有する。通常のラットミエローマ細胞は接着性を示さず、浮遊状態で培養せざるを得ないため洗浄や培地交換などの操作が煩雑であるのに対して、発明に係るラットモノクローナル抗体作製用パートナー細胞は接着性を示すため、極めて利便性が高い。
【００１４】
本発明に係るラットモノクローナル抗体作製用パートナー細胞としては、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン混合培地に感受性を有するものが好ましい。それにより、脾細胞などとのハイブリドーマの選択が容易になる。
【００１５】
本発明に係るラットモノクローナル抗体作製用パートナー細胞としては、ＲａＭ  ＃４（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０１５８０）を挙げることができる。
【００１６】
本発明に係るラットモノクローナル抗体作製用パートナー細胞の作製方法は、１０週齢以上のＷｉｓｔａｒ系ラットを抗原により免疫する工程；免疫ラットのリンパ節からリンパ球を分取する工程；および、リンパ球を培養し、増殖してコロニーを形成するものをスクリーニングする工程を含むことを特徴とする。
【００１７】
本発明に係るラットモノクローナル抗体作製用パートナー細胞の作製方法では、さらに、スクリーニングされた細胞をヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン混合培地で培養し、増殖を停止するか又は死滅する細胞を選択する工程を行うことが好ましい。かかる工程により、モノクローナル抗体の作製で利便性の高いＨＡＴ感受性細胞を選択することができる。
【００１８】
上記の免疫工程においては、抗原としてキャリアタンパク質が結合したものを用い、アジュバントを併用して免疫することが好ましい。かかる条件により、本発明に係るラットモノクローナル抗体作製用パートナー細胞の発現率を高めることが可能になる。
【００１９】
本発明に係るモノクローナル抗体の製造方法は、ラットを抗原により免疫する工程；免疫ラットからリンパ球を分取する工程；分取したリンパ球と上記の本発明に係るラットモノクローナル抗体作製用パートナー細胞とを融合してハイブリドーマを得る工程；ハイブリドーマの中からモノクローナル抗体産生細胞を選択する工程；モノクローナル抗体産生細胞を培養するか、または、ラットに投与する工程；および、培養したモノクローナル抗体産生細胞またはラットの腹水からモノクローナル抗体を分離する工程を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００２０】
本発明に係るラットモノクローナル抗体作製用パートナー細胞は、ラット由来のリンパ球と高効率で融合させることができる。また、がん細胞でないことから安定性が高いにも関わらず活発な増殖能を示す。よって、モノクローナル抗体の製造に有用である。また、本発明に係るラットモノクローナル抗体作製用パートナー細胞は、簡便な条件で効率的に作製することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、通常のラット由来のリンパ球と、本発明に係るラットモノクローナル抗体作製用パートナー細胞との間で、発現遺伝子の違いを示す電気泳動写真である。
【図２】図２は、ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／０と、本発明に係るラットモノクローナル抗体作製用パートナー細胞との間で、発現遺伝子の違いを示す電気泳動写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明に係るラットモノクローナル抗体作製用パートナー細胞は、ラットリンパ球由来のものであり、ＴＥＲＴ遺伝子とＣｙｃｌｉｎＤ１遺伝子が発現しており、且つ、ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／０に対して、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子の発現量が６０％以下である一方で、ｐ１６／ｐ１９遺伝子の発現量が３００％以上であることを特徴とする。
【００２３】
本発明に係る細胞は、ラットリンパ球由来のものである。よって、本発明細胞と免疫ラット細胞から作製されるハイブリドーマが免疫グロブリンを産生する割合は、マウス由来の細胞を用いた場合に比べて高いといえる。また、モノクローナル抗体作製のための実験動物としてラットが使えるようになるが、ラットから得られる腹水の量はマウスに比べて約１０倍にもなる。その他、実験動物としてラットを用いた場合には補体を結合できる抗体が得られ易く、また、異種抗原であるマウス抗原と組合わせると良好な免疫応答が期待できる。その他、本発明細胞は、抗原を免疫することによって活性化したリンパ球由来のものであるからこそ、がん細胞でないにもかかわらず容易に不死化させることができる可能性がある。また、本発明細胞は、以下のとおり不死化細胞でありながらがん細胞ではないことから、染色体の不安定性を示さず安定であり、また、形質転換され難いといえる。
【００２４】
よって、本発明細胞は、モノクローナル抗体を作製するに当たり脾細胞やリンパ節細胞などと融合してハイブリドーマとするためのパートナー細胞として非常に有用である。
【００２５】
本発明に係る細胞は、ＴＥＲＴ遺伝子とＣｙｃｌｉｎＤ１遺伝子が発現している。ＴＥＲＴはテロメアの伸長に関与する逆転写酵素であり、ＣｙｃｌｉｎＤ１タンパク質は細胞周期をＧ１期からＳ期へ移行させる。通常の分化細胞はほとんど増殖しないことから、これら遺伝子もほとんど発現していない。それに対してがん細胞など活発に増殖する細胞においては、これら遺伝子の発現量は高いといえる。即ち、本発明に係る細胞は、活発な増殖能を有するいわゆる不死化細胞である。
【００２６】
また、本発明におけるｃ−Ｍｙｃ遺伝子の発現量は、ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／０に対して６０％以下である。ｃ−Ｍｙｃ遺伝子は代表的ながん原遺伝子であるので、がん細胞であるラットミエローマ細胞株ＹＢ２／０では当然に発現しているが、がん細胞でなければ発現していないか或いはほとんど発現していない。即ち、かかる要件は、本発明細胞ががん細胞ではないことの指標になる。
【００２７】
さらに、本発明におけるｐ１６／ｐ１９遺伝子の発現量は、ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／０に対して３００％以上である。ｐ１６／ｐ１９遺伝子は代表的ながん抑制遺伝子であるので、がん細胞であるラットミエローマ細胞株ＹＢ２／０では発現していないか或いはほとんど発現していない。即ち、かかる要件も、本発明細胞ががん細胞ではないことの指標になる。
【００２８】
上記遺伝子の発現状況は、常法により測定することができる。例えば、細胞の全ＲＮＡを抽出した上でｃＤＮＡを合成し、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いたり、或いは、上記遺伝子がコードするタンパク質を、電気泳動、呈色分析、発光分析、抗体染色などで検出したり、上記遺伝子がコードするタンパク質の活性を測定すればよい。
【００２９】
また、ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／０に対する上記遺伝子の発現割合も、常法により測定することができる。例えば、本発明細胞とラットミエローマ細胞株ＹＢ２／０の全ＲＮＡから合成されるｃＤＮＡを等量用い、また、測定すべき上記遺伝子に対応するプライマーを用い、同じサイクル数でＲＴ−ＰＣＲを行い、増幅された遺伝子に対応する電気泳動バンドの濃さを画像解析ソフトで定量化し、本発明細胞の定量値をラットミエローマ細胞株ＹＢ２／０を除してパーセンテージを算出すればよい。或いは、上記遺伝子がコードするタンパク質の発現量を発光強度などで直接測定できる場合には、測定値から上記割合を直接算出してもよい。
【００３０】
本発明に係る細胞は、接着性細胞用培養容器表面に対して接着性を示す。細胞用培養容器の中には、接着性細胞をその表面に接着させるために、表面をプラズマ処理したり、表面に親水性基を担持したり、コラーゲン、ポリリジン、ガラスなどでコーティングすることが行われている。細胞が培養容器表面に接着している場合には、洗浄や培地交換を容易に行えることによる。それに対して血球がん細胞であるラットミエローマは浮遊性を示し、培養容器表面に接着させることができないため、洗浄や培地交換などの処理が難しい。それに対して本発明細胞は、接着性細胞用培養容器表面に対して接着性を示すため、洗浄や培地交換などの処理を良好に行いつつ培養が可能である。また、本発明細胞から得られるハイブリドーマも同様に接着性を有することから、培養液中へ産出される抗体を当該ハイブリドーマから分離精製することも容易である。
【００３１】
本発明に係る細胞には、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（以下、「ＨＡＴ」という）混合培地に感受性を有すものと非感受性のものと両方が含まれるものとする。
【００３２】
後述する本発明に係る本発明細胞の作製方法を通常の条件で行えば、ＨＡＴ非感受性の本発明細胞が得られる。しかし、８−アザグアニン（８−ＡＧ）を添加した培養液中で本発明細胞を培養し、ＨＧＰＲＴ（ヒポキサンチン・グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）欠損株を選択すれば、ＨＡＴ感受性の本発明細胞が得られる。ＨＡＴ感受性の細胞はＨＡＴ培地で生存できないのに対して、当該細胞と正常細胞である脾細胞から得られるハイブリドーマはＨＡＴ非感受性であり生存できるため、モノクローナル抗体を製造するに当たりハイブリドーマを選択するに便利である。
【００３３】
本発明に係るラットモノクローナル抗体作製用パートナー細胞としては、ＲａＭ  ＃４（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０１５８０）を挙げることができる。当該細胞は、下記の通り寄託機関に寄託されている。
（ｉ）  寄託機関の名称およびあて名
名称：  独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター
あて名：  日本国  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８
（ｉｉ）  受託日：  ２０１３年３月２６日
（ｉｉｉ）  受託番号：  ＮＩＴＥ  Ｐ−０１５８０
以下、本発明に係るラットモノクローナル抗体作製用パートナー細胞の作製方法を、実施の順番に従って説明する。
【００３４】
（１）  免疫工程
本発明細胞を作製するためには、１０週齢以上のＷｉｓｔａｒ系ラットを抗原により免疫する。
【００３５】
本発明では、１０週齢以上のＷｉｓｔａｒ系ラットを用いる。１０週齢以上のＷｉｓｔａｒ系ラットを用いれば、本発明細胞が得られる確率が高くなる。一方、当該週齢が高過ぎると、本発明細胞が得られる確率がかえって低くなり得るので、当該週齢としては３０週齢以下が好ましい。当該週齢としては１２週齢以上が好ましく、１３週齢以上がより好ましく、１４週齢以上がさらに好ましく、また、２８週齢以下がより好ましく、２５週齢以下がさらに好ましく、２２週齢以下が特に好ましい。
【００３６】
Ｗｉｓｔａｒ系ラットは米国フィラデルフィアのＷｉｓｔａｒ研究所を起源とし、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓに属する中型の非近交系アルビノラットであり、各種要因に対して優れた感受性を示すものであり、研究のために汎用されているものである。本発明では、Ｗｉｓｔａｒ系ラットの形質転換体や、継代飼育したものも用いることができる。なお、がんを有しておりがん原遺伝子が発現しているＷｉｓｔａｒ系ラットや、発がんを促進する外来遺伝子が導入されたＷｉｓｔａｒ系ラットは、それ由来の細胞ががん化する可能性があるため好ましくない。
【００３７】
抗原は特に制限されず、本発明細胞が得られるものを適宜選択すればよい。例えば、Ｐ１９ペプチド（Ａｃ−ＳＷＰＱＫＶＩＷＨＧＳＳＣ）などを用いることができる。
【００３８】
抗原としては、キャリアタンパク質が結合したものを用いることが好ましい。キャリアタンパク質を用いることにより、不完全抗体にも免疫原性を付与することが可能になる。キャリアタンパク質としては、ＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）、ラット血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、オボアルブミンを挙げることができる。
【００３９】
また、本工程においてはアジュバントを用いることが好ましい。アジュバントを用いることにより免疫応答を増強することができる。アジュバントとしては、水酸化ナトリウムやカルボキシビニルポリマーなどの沈降性アジュバントや、流動パラフィン、不完全フロイントアジュバント、コンプリートフロイントアジュバントを挙げることができる。
【００４０】
本工程は、常法により実施することができる。例えば、抗原とアジュバントを含むエマルションを１０週齢以上のラットに麻酔下、後肢肉球部などで皮下注射し、食餌と水を自由摂取させつつ飼育すればよい。抗原投与量は十分な免疫応答が起こる範囲で適宜設定すればよいが、例えば、１回当たり０．０１ｍｇ以上、０．５ｍｇ以下程度とすることができる。また、飼育期間も特に制限されないが、例えば、１０日間以上、３０日間以下程度とすることができる。
【００４１】
（２）  リンパ球の分取工程
次に、上記免疫工程で免疫されたラットのリンパ節からリンパ球を分取する。
【００４２】
免疫後、リンパ球を分取するまでの期間は適宜調整できるが、例えば、１０日以上、３０日以下程度とすることができる。その期間中は、ラットは自由に食餌や水を摂取させつつ通常の条件で飼育すればよい。上記期間としては、１２日以上が好ましく、１５日以上がより好ましく、また、２８日以下が好ましく、２５日以下がより好ましい。
【００４３】
当該工程は常法により実施することができる。例えば、免疫ラットを麻酔し、必要に応じてさらに屠殺した後に開腹し、肥大したリンパ節を取り出し、取り出したリンパ節からリンパ球を分取すればよい。
【００４４】
リンパ節は肥大したものを取り出せばよく、特に制限されないが、抗原注入から細菌が侵入する可能性を考慮して、抗原を注入した箇所からより遠くのリンパ節を取り出すことが好ましい。また、他のリンパ節由来の細胞よりも腸骨リンパ節由来の細胞の方が融合効率が高いとの報告があることから、腸骨由来のリンパ節が好ましい。
【００４５】
（３）  リンパ球の培養工程
次に、分取したリンパ球を培養し、増殖してコロニーを形成するもの、即ち不死化して増殖する本発明細胞をスクリーニングする。
【００４６】
リンパ球の培養工程は特に制限されず、少なくとも通常のリンパ球が死滅しない条件を設定する。例えば、５％ＣＯ2雰囲気下、３０℃以上、４０℃以下程度で、培地を新鮮なものに適時交換しつつ培養すればよい。なお、本発明細胞は接着性細胞用培養容器の表面に対して接着性を示すため、培地交換を容易に行うことができる。
【００４７】
培養期間は特に制限されず、適宜設定すればよい。少なくとも、不死化していない通常のリンパ球細胞と、不死化している本発明細胞との区別が明確になるまでとする。好ましくは、本発明細胞が十分に増殖してコロニーを形成するまでとする。また、増殖した本発明細胞の一部を別途培養し、その量を十分に確保できるようにしてもよい。
【００４８】
本発明に係るラットモノクローナル抗体作製用パートナー細胞は、不死化しているものでありながらがん細胞ではないという特徴を有する。よって、この時点で、増殖したリンパ球細胞でがん原遺伝子が発現していないことやほとんど発現していないこと、また、がん抑制遺伝子が十分に発現していること、即ち、がん細胞ではないことを、常法により確認してもよい。
【００４９】
（４）  ＨＡＴ感受性細胞の選択工程
次に、スクリーニングされた細胞をＨＡＴ培地で培養し、増殖を停止するか又は死滅する細胞を選択する工程を実施する。但し、本工程の実施は任意であり、本発明細胞はＨＡＴ感受性であってもよいし、ＨＡＴ非感受性であってもよい。しかし、本発明細胞はラットモノクローナル抗体作製用のパートナー細胞として用いられるものであるので、ハイブリドーマの選択のためにＨＡＴ感受性であることが好ましいので、好適には本工程を実施する。
【００５０】
当該工程は、常法に従って実施することができる。即ち、上記工程でスクリーニングされた本発明細胞を８−アザグアニン（８−ＡＧ）を含む培地で培養し、当該培地中で増殖できるものを選択する。当該細胞は、ＨＧＰＲＴ（ヒポキサンチン・グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）欠損株であり、アミノプテリン存在下で増殖できない。即ち、ＨＡＴ培地中では増殖できない。確認のため、選択された細胞の一部をＨＡＴ培地中で培養し、増殖できないことを確認してもよい。
【００５１】
上記方法で作製された本発明細胞は、ラットモノクローナル抗体作製用のパートナー細胞として利用することができる。以下、本発明細胞を用いたモノクローナル抗体の製造方法を説明する。
【００５２】
（１’）  免疫工程
先ず、目的のモノクローナル抗体のエピトープを含む抗原でラットを免疫する。ラットとしては、モノクローナル抗体の製造に用いることができるものであれば任意に使用できる。具体的には、抗原として特定のものを用いること以外は、上記の本発明細胞の製造方法の免疫工程（１）や常法に従って実施することができる。
【００５３】
（２’）  リンパ球の分取工程
次に、免疫したラットからリンパ球を分取する。当該工程は、上記の本発明細胞の製造方法の分取工程（２）や常法に従って実施することができる。
【００５４】
（３’）  ハイブリドーマの作製工程
次に、分取したリンパ球と本発明細胞とを融合し、ハイブリドーマを得る。具体的な条件は常法に従えばよい。例えば、分取したリンパ球と本発明細胞とを含む培地にポリエチレングリコールを添加するポリエチレングリコール法や、電気パルスを付与する電気融合法などで細胞を融合させ、ハイブリドーマとする。なお、ハイブリドーマの選択は、上記の本発明細胞の製造方法におけるＨＡＴ感受性細胞の選択工程（４）や常法に従って実施することができる。
【００５５】
（４’）  モノクローナル抗体産生細胞の選択工程
次に、得られたハイブリドーマの中から、所望のモノクローナル抗体を産生する細胞を選択する。当該工程は、例えば、ハイブリドーマの培養液に放出された抗体をＥＬＩＳＡ法により検出することにより行うことができる。
【００５６】
（５’）  モノクローナル抗体産生細胞の培養工程
次に、選択されたモノクローナル抗体産生細胞を十分に培養する。具体的な条件は、モノクローナル抗体産生細胞が良好に増殖できる範囲で適宜設定する。例えば、上記の本発明細胞の製造方法におけるリンパ球の培養工程（３）に従って、モノクローナル抗体産生細胞を培養すればよい。或いは、モノクローナル抗体産生細胞をラットに投与し、飼育してもよい。
【００５７】
（６’）  モノクローナル抗体の分離工程
次に、培養したモノクローナル抗体産生細胞、または、モノクローナル抗体産生細胞を投与されたラットの腹水からモノクローナル抗体を分離する。当該工程は、一般的な免疫グロブリンの分離精製法により行うことができる。例えば、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例えば、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相、タンパク質Ｇなどの活性吸着剤により抗体のみを分離することができる。
【実施例】
【００５８】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【００５９】
実施例１：  ＨＡＴ非感受性の本発明細胞の作製
医療法人創和会  重井医学研究所で継代飼育していた１４週齢のＷｉｓｔａｒ系ラット６匹に、麻酔下で、抗原としてＰ１９ペプチド−ＫＬＨ（Ａｃ−ＳＷＰＱＫＶＩＷＨＧＳＳＣ−ＫＬＨ）とコンプリートアジュバント（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製，製品名「Ｂａｃｔｏ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ」）を含むエマルションを、１匹当たりの抗原投与量が０．１ｍｇとなるよう両後足の肉球部分に皮下注射することにより免疫した。食餌と水を自由摂取させつつ２１日間飼育した。次いで、セボフレンを適量吸入させることにより麻酔した後、頸椎脱臼により屠殺した。開腹して肥大した腸骨リンパ節を取り出し、得られた腸骨リンパ節からメッシュ法によりリンパ球を分取し、ＨＡＴ（Hypoxanthine-Aminopterin-thymidine）培地（基礎培地ＧＩＴ（和光純薬社製）に１０％ＦＢＳ、ＨＡＴ試薬および１０％コンディムド（ロシュ社製）を添加したもの）に分散させ、プラズマ処理により表面接着性が高められた９６ウェルプレート（グライナー社製，製品名「マルチウェルプレート」）に播種した。７日後に培地交換を行いつつ、５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃でインキュベートしたところ、培養開始から約２週間後、免疫したラット６匹のうち２匹から得られたリンパ球が、それぞれ２５／１９２ウェルおよび２／１９２ウェルの割合で増殖してコロニーを形成していた。かかるコロニーの形状は、マウスのミエローマ細胞であるＳＰ２／０やそのハイブリドーマのコロニーとほぼ同じのきれいな円形であるが、ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／０とは異なりプレートへの接着性を有していた。また、当該細胞の一部を別の２４ウェルプレートに移して同様の条件で培養を行ったところ、依然として増殖を継続した。
【００６０】
なお、上記細胞は正常なラットのリンパ球由来のものであるので、ミエローマ（骨髄腫細胞）ではない。また、通常のリンパ球はほとんど増殖しないため、がん細胞でない上記細胞が不死化して増殖を継続するのは驚くべきことである。また、ＥＬＩＳＡ法により、上記細胞が免疫グロブリンの分泌能を有することを確認した。
【００６１】
実施例２：  ＨＡＴ感受性の本発明細胞の作製
ＨＡＴに対して感受性を有さなければ、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製に用いることができないため、上記細胞をＨＡＴ感受性化した。
【００６２】
具体的には、上記実施例１で得られた本発明細胞の中から増殖能が極めて高い細胞を選択し、おおよそ２０％コンフルエントの状態になるまで１０ｃｍディッシュで細胞を培養した後、１０μｇ／ｍＬの８−アザグアニン（８−ＡＧ）を添加した培養液中、３７℃で１週間培養することにより、ＨＧＰＲＴ（ヒポキサンチン・グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）欠損株を選択した。その後、培養された細胞を２つに分割し、一方の細胞をＨＡＴ培地に添加し、増殖が停止することを確認した。なお、核酸塩基の合成経路にはサルベージ経路とデノボ経路とがあり、ＨＧＰＲＴ欠損細胞はサルベージ経路で核酸塩基を合成することができず、また、デノボ経路はアミノプテリンで阻害されるため、ＨＧＰＲＴ欠損細胞はＨＡＴ培地で増殖できなくなる。
【００６３】
また、他方の細胞を９６ウェルプレートに１ウェル当たり１個ずつ播種し、８−ＡＧを添加した培地で引き続き培養した。順調に増殖した細胞を４８クローン選抜し、各ウェルの細胞を２つに分割し、それぞれを２４ウェルプレートで培養し、一方をＨＡＴ培地に添加した場合に死滅するウェルを選択した。その結果、４８クローン中、４６クローンの細胞がＨＡＴ感受性であった。
【００６４】
上記のＨＡＴ感受性細胞の免疫グロブリン産生能をＥＬＩＳＡ法で試験したところ、免疫グロブリンを産生しないことが確認された。
【００６５】
試験例１：  本発明細胞の形質特定試験
上記実施例１および実施例２で得た本発明細胞の形質をＲＴ−ＰＣＴ法を用いて試験した。また、比較のため、上記実施例１において増殖しない通常のリンパ球についても同様に試験した。
【００６６】
具体的には、上記３種の細胞を培養し、ＲＮＡ抽出試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，製品名「ＴＲＩＺＯＬ」）を用いて２×１０7個の細胞から全ＲＮＡを抽出した。続いて、全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、さらにＲＴ−ＰＣＲ法により、発現量に変化のある遺伝子を探索した。結果を図１に示す。なお、図１中、「Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ」は通常のリンパ球の結果を示し、「＃９−４」は上記実施例１の非ＨＡＴ感受性細胞の結果を示し、「ＲａＭ＃４」は上記実施例２のＨＡＴ感受性細胞の結果を示し、「ＤＷ」は蒸留水の測定結果を示す。また、「β−アクチン」のデータは、各細胞から抽出した全ＲＮＡ量に違いが無いことを示している。
【００６７】
図１に示す結果のとおり、通常のリンパ球ではＴＥＲＴ遺伝子とＣｙｃｌｉｎＤ１遺伝子が発現していない一方で、本発明細胞ではこれら遺伝子の発現が亢進していることが明らかとなった。
【００６８】
ＴＥＲＴはテロメラーゼを構成する逆転写酵素であり、テロメア配列の鋳型となるＲＮＡを逆転写し、テロメアを伸長する作用を有する。また、ＣｙｃｌｉｎＤ１タンパク質は、ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ（ＣＤＫ）と複合体を形成し、ＲＢタンパク質をリン酸化して不活性化することにより、細胞周期をＧ１期からＳ期へ移行させる。よって、ＴＥＲＴ遺伝子とＣｙｃｌｉｎＤ１遺伝子が発現しているということは、細胞が活発な増殖能を有することであるといえる。かかる結果は、本発明細胞がいわゆる不死化細胞であることを示している。
【００６９】
試験例２：本発明細胞の形質特定試験
次に、上記実施例１および実施例２で得た本発明細胞の形質を、汎用ラットミエローマ細胞株であるＹＢ２／０と比較する実験を行った。
【００７０】
上記３種の細胞を培養し、ＲＮＡ抽出試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，製品名「ＴＲＩＺＯＬ」）を用いて２×１０7個の細胞から全ＲＮＡを抽出した。続いて、全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ＲＴ−ＰＣＲ法により、代表的ながん原遺伝子であるｃ−Ｍｙｃ遺伝子とがん抑制遺伝子であるｐ１６／ｐ１９遺伝子の発現状況を調べた。結果を図２に示す。
【００７１】
なお、この際、各細胞から得られたｃＤＮＡを等量ずつ使用し、ＲＴ−ＰＣＲにおいてサイクル数をβ−アクチン遺伝子とｃ−Ｍｙｃ遺伝子については３０サイクル、ｐ１６／ｐ１９遺伝子については３５サイクルとした。また、電気泳動後、画像解析ソフトウェア（ＡＴＴＯ社製，製品名「ＣＳ  Ａｎａｌｙｚｅｒ３．０」）を用い、ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／０と実施例２の本発明細胞について得られた電気泳動ゲル画像を解析し、各バンドを定量化した。定量化した値はβ−アクチンの定量値で補正し、ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／０の数値を１００％とし、本発明細胞の相対値を算出した。測定は３回ずつ行い、平均値を算出した。結果を表１に示す。
【００７２】
【表１】
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【００７３】
図２と表１に示す結果のとおり、がん細胞であるラットミエローマ細胞株ＹＢ２／０では、がん原遺伝子であるｃ−Ｍｙｃ遺伝子が明確に発現していたが、がん抑制遺伝子であるｐ１６／ｐ１９遺伝子は発現していなかった。一方、本発明細胞は、不死化しているにもかかわらずｃ−Ｍｙｃ遺伝子の発現が抑制されているのに対して、ｐ１６／ｐ１９遺伝子は明確に発現していた。以上の結果と試験例１の結果をあわせて考慮すると、本発明細胞は不死化細胞ではあるが、がん細胞ではないことが明らかとなった。
【００７４】
実施例３：  モノクローナル抗体産生能試験
８週齢の雌性Ｗｉｓｔａｒラット６匹を任意に３匹ずつに分けた。別途、抗原としてＰ１２ペプチド−ＫＬＨまたはＰ１９ペプチド−ＫＬＨとコンプリートアジュバントとを含むエマルションを調製し、各群に対して、セボフレン麻酔下、抗原投与量が１匹当たり０．１ｍｇとなるよう後肢の肉球部に皮下注射した。食餌と水を自由摂取させつつ１７日間飼育した後、セボフレン麻酔下で開腹して肥大した腸骨リンパ節を摘出し、培養室クリーンベンチ内でメッシュを用いて濾過することにより、リンパ球細胞画分を分取した。各群のリンパ球細胞画分を混合した後に７等分し、上記実施例２で得られたＨＡＴ感受性の本発明細胞のうち増殖能の高いクローン６種、または市販のマウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０を表２の割合で融合パートナーとし、電気融合装置を用いて細胞融合を行った。
【００７５】
【表２】
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【００７６】
なお、本発明細胞Ｎｏ．２，４およびマウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０は高い増殖能を示すことから常法通り１×１０7個の細胞を用い、そのほかの細胞は、使用可能な細胞数に対して１／７ずつのリンパ球と細胞融合させた。
【００７７】
細胞融合後、細胞混合物をプラズマ処理により表面接着性が高められた９６ウェルプレート（グライナー社製，製品名「マルチウェルプレート」）２枚ずつ、計１９２ウェルに播種し、ＨＡＴ培地を用いて、５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃で培養した。培養開始から５日目にＨＡＴ培地を交換し、８日目の観察では、本発明細胞Ｎｏ．２，４の増殖が活発であり、マウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０よりもコロニーの出現率が高かった。また、各増殖細胞は、ウェルプレート表面に対して接着性を示していた。
【００７８】
また、培養開始から８日目に各ペプチド抗原をコートしたＥＬＩＳＡ用プレートを用いて、培養上清中の抗体価をＥＬＩＳＡ法で測定した。結果を表３に示す。なお、表３中の値は、１９２ウェルのうち４９０ｎｍの波長光の吸光度が相対値で０．４以上のウェルの数と割合である。
【００７９】
【表３】
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【００８０】
表３のとおり、何れの抗原を用いた場合でも、特に本発明細胞Ｎｏ．２，４のクローンの抗体産生能陽性率がマウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０よりもかなり高く、また、本発明細胞の陽性率の平均値も、マウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０に比べておよそ２倍かそれ以上であった。さらに本発明細胞は、上記実施例２のとおり免疫グロブリンの産生能を有さないが、ハイブリドーマとした場合にリンパ球由来の免疫グロブリン産生を阻害しないことが示され、また、接着性細胞用９６ウェルプレートに対して接着性を示した。このように、本発明細胞は、従来汎用されているマウスミエローマ細胞に比べ、ラットを用いたモノクローナル抗体の作製に非常に有用であることが実証された。
【００８１】
実施例４：  モノクローナル抗体産生能試験
上記の本発明細胞Ｎｏ．２の細胞と、１０週齢の雌性Ｗｉｓｔａｒ系ラット２匹を用い、抗原ペプチドを組換えタンパク質（Ｎ末端にＨｉｓタグが結合したヒトリンパ管内皮ヒアルロン酸レセプター（ＬＹＶＥ−１））に変更した以外は上記試験例３と同様にして、ＥＬＩＳＡ法による抗体産生能を測定した。使用した２匹のラットから得られたリンパ球ごとの結果を表４に示す。
【００８２】
【表４】
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【００８３】
表４の結果のとおり、本発明細胞を用いた場合には、やはり汎用のマウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０に比べておよそ２倍の抗体産生能陽性率が得られた。
【００８４】
実施例５：  モノクローナル抗体産生能試験
さらに、市販のラットミエローマと比較すべく、ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／０を用い、凍結リンパ節細胞を用いた以外は上記実施例４と同様の条件で実験を行った。結果を表５に示す。
【００８５】
【表５】
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【００８６】
ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／０を用いた場合、上記の条件では細胞融合後にＨＡＴ培地において増殖やコロニー形成が全く認められず、抗体産生能も検出限界以下であった。また、接着性細胞用９６ウェルプレートに接着性を示さなかったため、たとえハイブリドーマが得られていたとしても、モノクローナル抗体を分離する際に不便であるといえる。それに対して本発明細胞を用いた場合には、上記実験例と同様に、汎用のマウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０に比べておよそ２倍かそれ以上の抗体産生能陽性率が得られ、また、接着性細胞用９６ウェルプレートに対して接着性を示したため、モノクローナル抗体の製造に有用であることが示された。なお、上記実施例４に比べて陽性率が低い理由としては、本実施例では凍結細胞を用いたことが考えられる。
【要約】
【課題】本発明は、簡便な方法で容易に製造できるものであり、ラット由来のリンパ球との融合効率が高く、且つがん細胞ではないにもかかわらず活発な増殖能を有し、安定なラットモノクローナル抗体作製用パートナー細胞を提供することを目的とする。また、本発明は、当該ラットモノクローナル抗体作製用パートナー細胞の簡便な作製方法と、当該ラットモノクローナル抗体作製用パートナー細胞を用いたモノクローナル抗体の製造方法を提供することも目的とする。
【解決手段】本発明に係るラットモノクローナル抗体作製用パートナー細胞は、ラットリンパ球由来のものであり、ＴＥＲＴ遺伝子とＣｙｃｌｉｎＤ１遺伝子が発現しており、且つ、ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／０に対して、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子の発現量が６０％以下である一方で、ｐ１６／ｐ１９遺伝子の発現量が３００％以上であることを特徴とする。
【選択図】なし【図１】
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【図２】
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