(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）（式中、Ｒは低級アルキル基を表し、Ｘはハロゲン原子を表し、ＹはＣＨ２又はＣＯを表す。）
で示される化合物。
【化１】
0005515113.tif 000012
【請求項２】
試料中エストロン類のＬＣ−ＭＳによる測定法であって、
１）試料からステロイドを抽出する工程、
２）上記１）で得られた抽出物に対して下記式（２）
【化２】
0005515113.tif 000013
（式中、Ｘはハロゲン原子を表し、ＹはＣＨ２又はＣＯを表し、Ｌは脱離基を表す。）
で示されるペンタハロゲン化ベンジル化合物又はペンタハロゲン化ベンゾイル化合物をアルカリ条件下で反応させる工程、
３）上記２）で得られた反応物に含まれるエストロン類のペンタハロゲン化ベンジル誘導体又はペンタハロゲン化ベンゾイル誘導体にヒドラジノ−１−低級アルキルピリジンを酸性条件下で反応させる工程、及び
４）上記３）で得られた反応物に含まれるエストロン類のペンタハロゲン化ベンジル−又はペンタハロゲン化ベンゾイル−１−低級アルキルピリジニウムヒドラゾンをＬＣ−ＭＳで測定する工程、
を含むことを特徴とする、測定方法。
【請求項３】
以下の工程：
１）ペンタハロゲン化ベンジル化合物又はペンタハロゲン化ベンゾイル化合物をアルカリ条件下で反応させた後、順相カラムを用いてエストラジオール類のペンタハロゲン化ベンジル又はペンタハロゲン化ベンゾイル誘導体とエストロン類のペンタハロゲン化ベンジル又はペンタハロゲン化ベンゾイル誘導体を分離する工程、
２）上記１）で得られたエストラジオール類のペンタハロゲン化ベンジル又はペンタハロゲン化ベンゾイル誘導体にハロゲノ−１−低級アルキルピリジンを反応させる工程、及び
３）エストロン類のペンタハロゲン化ベンジル−又はペンタハロゲン化ベンゾイル−１−低級アルキルピリジニウムヒドラゾンをＬＣ−ＭＳで測定する際に、上記２）で得られたエストラジオール類のペンタハロゲン化ベンジル−又はペンタハロゲン化ベンゾイル−１−低級アルキルピリジニウム誘導体を合わせて同時に測定する工程、
を更に含む、請求項２に記載の測定方法。
【請求項４】
固相抽出カラムを用いて試料から中性ステロイドを除去する工程を更に含む、請求項２又は３に記載の測定方法。
【請求項５】
ヒドラジノ−１−低級アルキルピリジンが２−ヒドラジノ−１−低級アルキルピリジンである、請求項２〜４のいずれかに記載の測定方法。
【請求項６】
ＬＣ−ＭＳ測定において、イオン化が正イオン検出エレクトロスプレーイオン化で行われる請求項２〜５のいずれかに記載の測定方法。
【請求項７】
試料が、ヒトを含む動物の血液、唾液、尿、組織及び生体細胞又は廃水、河川水又は医薬品からなる群より選択される、請求項２〜６のいずれかに記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に含まれる３−ヒドロキシエストラ−１，３，５（１０）−トリエン−１７−オン（エストロン） 類を液体クロマトグラフィー質量分析 （ＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｍａｓｓ Ｓｐｅｔｒｏｍｅｔｒｙ ：ＬＣ−ＭＳ） を用いて高感度に測定するための化合物及びその化合物を使用した測定方法に関する。より詳細には、試料中のエストロンのフェノール性水酸基にペンタハロゲン化ベンジル基又はペンタハロゲン化ベンゾイル基を導入した後、１７位カルボニル基に１−低級アルキルヒドラジノピリジニウム塩（以下、ヒドラジノ−１−低級アルキルピリジン） を反応させ、その誘導体をＬＣ−ＭＳで測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エストロゲンは、アンドロゲンからアロマターゼによって産生される。エストロゲンは、乳癌、消化器癌、心血管障害、性ホルモン代謝の先天性疾患、思春期早発、骨粗しょう症等といった、さまざまな疾患との関連が深いとされ、その量をモニターすることは疾患の解明や、薬理効果の判定等に有用である。作用の最も強いエストラ−１，３，５（１０）−トリエン−３，１７β−ジオール（エストラジオール） は、１７β−水酸化ステロイド脱水素酵素２型 （１７β−ＨＳＤ２）によって作用の弱いエストロンへと変換され、エストロンは１７β−水酸化ステロイド脱水素酵素１型（１７β−ＨＳＤ１） によってエストラジオールへと再活性化される。成人で妊娠していない閉経前女性の循環血中エストラジオール濃度は、エストロンの１．５〜 ４倍ほど高い。それにひきかえ、男性や閉経後女性において、エストラジオールは１／１０程度に低下し、エストラジオール／エストロン比が逆転する。よって、思春期前の女児、閉経後女性及び男性については、作用の強いエストラジオールだけでなく主要なエストロゲンであるエストロンをモニターすることにより、代謝や疾患の状態をより正確に把握することができる。
【０００３】
多嚢胞性卵巣症候群 （ＰｏｌｙｃｙｓｔｉｃＯｖａｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ： ＰＣＯＳ）は、卵胞が嚢胞化し排卵が起こりにくくなる疾患であるが、さまざまな内分泌の不調和によるものと考えられている。この診断法の一つとして、血中のエストロンとエストラジオール比が有用であり、ＰＣＯＳの検査法に掲げられている。
乳癌でもエストロゲンがその増殖・抑制に大きく関わっていることが知られており、閉経後女性のように血中のエストロゲンの濃度が低いものでも、卵巣以外の臓器で副腎性アンドロゲンや硫酸抱合型エストロンのように比較的量の多いステロイドホルモンから組織中のアロマターゼや１７β−ＨＳＤによって局所的にエストラジオールやエストロンが産生され、それらが乳癌の発症及び増殖に大きく関与している可能性が示唆されている。（非特許文献１）
また、子宮体癌においては、癌組織中でエストロン量が増え、他の組織と比べてエストロンとエストラジオールの比率が異なるという報告がなされている。（非特許文献２）
【０００４】
いずれの場合においても、アロマターゼと病態の因果関係を解析していくことが診断及び病因の解明をする上で肝要であるが、アロマターゼの全体像を把握するには、生理作用の強いエストラジオールのみでなく、エストロンの量も考慮していくことが重要である。しかし、小動物や小児から得られる血液、針生検で採取した組織及び唾液といった検体の中には、エストロゲンがわずかな量しか含まれておらず、これらの測定には高感度が要求される。
【０００５】
通常の臨床検査においては、試料中のエストロンは、３Ｈ−エストロンをリガンドとしたラジオイムノアッセイ、酵素免疫反応などの免疫法により定量されているが、免疫法の一般的な定量限界が１０ｐｇ／ｍＬであることに加えて、血液中にはエストロンの構造類似化合物や性ホルモン結合グロブリンが共存しているので、使用する定量法やキット間差により定量値が大きく変動し易く、結果が臨床症状と乖離する場合もある。最近になって、検出感度が４．８ｐｇ／ｍＬと高感度のエストロンＥＩＡ測定キットが発売されているが、低濃度での測定値のばらつきが大きい。
【０００６】
他方、ガスクロマトグラフィ−質量分析 （ＧａｓＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ −Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＧＣ−ＭＳ）で測定する方法も提案されている。ＧＣ−ＭＳにおいては、一般に、試料中エストロゲンを揮発性試薬のトリフルオロ酢酸無水物、ヘプタフルオロ酪酸無水物等のアシル化剤や、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド等のシリル化剤と反応させ、その誘導体をＧＣ−ＭＳで測定する。（非特許文献３、４）しかし、これらの誘導体は、いずれも不安定なため誘導体としての精製が困難であり、測定の際に試料中の不純物及び試薬の干渉を受け易い。また、ＧＣ−ＭＳによる測定において、試料の注入量が全試料の５〜 １０％以下と少なくなりロスが多くなるために十分に感度が得られない上に、分析に長時間を要すること等も大きな欠点である。さらに、ＧＣ−ＭＳはＬＣ−ＭＳと比べてダイナミックレンジが狭いという欠点がある。このように、ＧＣ−ＭＳを用いた測定には制限が多く、それゆえ、閉経後女性や小動物から得られる生体試料の測定をＧＣ−ＭＳにより行うのは困難である。
【０００７】
ＬＣ−ＭＳについては、大気圧光イオン化法 （ＡｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃＰｒｅｓｓｕｒｅ Ｐｈｏｔｏ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ： ＡＰＰＩ） による直接定量法が報告されている。しかし、ＡＰＰＩは、溶離液にアセトニトリルを用いるとイオン化が阻害され易いこと、ドーパント送液の脈流によってベースラインが乱れ易い等といった欠点も多く、エレクトロスプレーイオン化法（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ：ＥＳＩ） と比べて、ＬＣ−ＭＳ用検出器として普遍的とはいえない。（非特許文献５、６）
【０００８】
エストロゲンを種々誘導体化し、それをＬＣ−ＭＳで測定する試みも行われている。例えば、エストロゲンのフェノール性水酸基をダンシル化（５−ジメチルアミノナフタレン−１−イルスルホン化） し、正イオン検出ＥＳＩを用いて二次元クロマトグラフィーで測定する方法が報告されている。（非特許文献７） しかし、この方法には、化合物由来のプロダクトイオンが得られず特異性に欠けるという欠点がある。
【０００９】
また、サンガー試薬がアルカリ存在下でフェノール性水酸基と容易に反応することから、サンガー試薬のピペラジン誘導体をエストロゲンと反応させて、ＬＣ−ＭＳで測定する方法が報告されている。（非特許文献８） この方法では、比較的高濃度である妊婦血中エストロゲンの測定は可能であったが、男性の血中エストロゲンは検出できていない。
【００１０】
エストロンのカルボニル基をｐ−トルエンスルホニルヒドラジドで誘導体化して測定する方法も報告されている。 （非特許文献９） この方法では、エストロンを１０ｐｇ （ｏｎｃｏｌｕｍｎ） から測定可能であるが、小児及び更年期の血中エストロンの定量には感度が不十分である。
【００１１】
発明者らは、これまでに生体内エストラジオール類のフェノール性水酸基をペンタハロゲン化ベンジル又はペンタハロゲン化ベンゾイル化した後、１７位の水酸基をハロゲノ−１−低級アルキルピリジニウム塩（以下、ハロゲノ−１−低級アルキルピリジン） で誘導体化して測定する方法を開発した。（特許文献１） しかし、この方法では、エストロンのようにアルコール性水酸基を有していないエストロゲンを測定するのには適用できない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２００６−１３８７８６号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】日本臨床６５巻 増刊号 ６ （通巻第９１７号） １０６ − １１０
【非特許文献２】Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ． Ｒｅｓ． １５ （２００９） ６０３８ − ６０３４
【非特許文献３】Ｓｔｅｒｏｉｄｓ ５７（１９９２） ３１９− ３２４
【非特許文献４】Ｅｎｄｏｃｒ． Ｊ． ５０ （２００３） ７８３ − ７９２
【非特許文献５】Ｃｌｉｎ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ ４０９ （２００９） ７８ − ８４
【非特許文献６】ぶんせき （２００９） ２７８ − ２８４
【非特許文献７】Ａｍ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐａｔｈｏｌ． １２９ （２００９） ５３０ − ５３９
【非特許文献８】Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ａｎａｌ． ４４ （２００７） ７８６ − ７９５
【非特許文献９】Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ７６ （２００４） ５８２９ − ５８３６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、試料中に含まれるエストロン類をＬＣ−ＭＳを用いて高感度に測定するための化合物及びその化合物を使用した測定方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、エストロンのようなカルボニル基を有するエストロゲンを微量測定するため、まず、アルカリ条件下でフェノール性水酸基を選択的にペンタハロゲン化ベンジルエーテル化又はペンタハロゲン化ベンゾイルエステル化した後、１７位カルボニル基を種々誘導体化して、その誘導体の測定感度を精査した。その結果、１７位カルボニル基を１−低級アルキルピリジニウムヒドラゾン化することにより、カルボニル基を有するエストロゲンをＬＣ−ＭＳにより良好な感度で測定できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１６】
すなわち、本発明は、試料中エストロン類をＬＣ−ＭＳで測定するための化合物として、下記式（１）
【化１】
0005515113.tif 000002
（式中、Ｒは低級アルキル基を表し、Ｘはハロゲン原子を表し、ＹはＣＨ２又はＣＯを表す）
で示される化合物を提供するものである。
【００１７】
さらに、本発明は、試料中エストロン類のＬＣ−ＭＳによる測定方法であって、
１） 試料からステロイドを抽出する工程、
２） 上記１）で得られた抽出物に対して下記式（２）
【化２】
0005515113.tif 000003
（式中、Ｘはハロゲン原子を表し、ＹはＣＨ２又はＣＯを表し、Ｌは脱離基を表す）
で示されるペンタハロゲン化ベンジル化合物又はペンタハロゲン化ベンゾイル化合物をアルカリ条件化で反応させる工程、
３） 上記２）で得られた反応物に含まれるエストロン類のペンタハロゲン化ベンジル誘導体又はペンタハロゲン化ベンゾイル誘導体にヒドラジノ−１−低級アルキルピリジンを酸性下で反応させる工程、及び
４） 上記３）で得られた反応物に含まれるエストロン類のペンタハロゲン化ベンジル−又はペンタハロゲン化ベンゾイル−１−低級アルキルピリジニウムヒドラゾンをＬＣ−ＭＳで測定する工程、
を含むことを特徴とする、試料中エストロン類の測定方法を提案するものである。
【００１８】
また、本発明は、以下の工程：
１） ペンタハロゲン化ベンジル化合物又はペンタハロゲン化ベンゾイル化合物をアルカリ条件下で反応させた後、順相カラムを用いてエストラジオール類のペンタハロゲン化ベンジル又はペンタハロゲン化ベンゾイル誘導体とエストロン類のペンタハロゲン化ベンジル又はペンタハロゲン化ベンゾイル誘導体を分離する工程、
２） 上記１）で得られたエストラジオール類のペンタハロゲン化ベンジル又はペンタハロゲン化ベンゾイル誘導体にハロゲノ−１−低級アルキルピリジンを反応させる工程、及び
３） エストロン類のペンタハロゲン化ベンジル−又はペンタハロゲン化ベンゾイル−１−低級アルキルピリジニウムヒドラゾンをＬＣ−ＭＳで測定する際に、上記２）で得られたエストラジオール類のペンタハロゲン化ベンジル−又はペンタハロゲン化ベンゾイル−１−低級アルキルピリジニウム誘導体を合わせて同時に測定する工程、
を更に含む、上記記載の試料中エストロン類の測定方法を提案するものである。
【００１９】
また、本発明は、固相抽出カラムを用いて試料から中性ステロイドを除去する工程を更に含む、上記記載の試料中エストロン類の測定方法を提案するものである。
【発明の効果】
【００２０】
本願発明の化合物及び測定法を用いることにより、試料中に微量に存在するエストロン類を０．２５ ｐｇ／ｔｕｂｅ （０．０５ ｐｇ／ｏｎ ｃｏｌｕｍｎ） のレベルで測定することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明において、「エストロン類」には、例えば、エストロン、２−ヒドロキシエストロン、４−ヒドロキシエストロン、２−ヒドロキシエストロン３−メチルエーテル、４−ヒドロキシエストロン ３−メチルエーテル、２−メトキシエストロン、４−メトキシエストロン、１６α−ヒドロキシエストロン、１６オキソエストラジオール等の生体内又は自然界中に存在するエストロゲンを挙げることができる。
【００２２】
本明細書において、「固相抽出カラム」とは、一般的なカートリッジカラムを表し、本発明においては、市販されているものを用いることができる。充填剤の分離モードには吸着、分配、イオン交換、分子ふるい、アフィニティー等が挙げられるが、中でも吸着、分配が好適である。また、移動相と固定相の極性の関係から、逆相、順相に大別されるが、中でも、逆相、順相又はイオン交換が好適である。また、本明細書における「順相カラム」とは、上記「固相抽出カラム」のうち、充填剤の分離モードが吸着であるものを表す。
【００２３】
本明細書において、「ＬＣ−ＭＳ」とは、液体クロマトグラフと質量分析計とを組み合わせた装置を用いて行う分析方法を表すが、その中でも、質量分析部が複数結合したタンデム型の質量分析（Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｔａｎｄｅｍ ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ： ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ） を用いることが好ましい。ＬＣ−ＭＳにおけるイオン化は、例えば、大気圧化学イオン化法 （Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ ＰｒｅｓｓｕｒｅＣｈｅｍｉｃａｌ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ） 、ＥＳＩ、ＡＰＰＩ等が挙げられるが、中でも、正イオン検出ＥＳＩを用いることが望ましい。
【００２４】
また、質量分析部には、例えば、磁場型、四重極型、飛行時間型等が挙げられるが、本発明では、定量性が良く、ダイナミックレンジも広く直線性も良好な四重極型を使用することが好ましい。
【００２５】
さらに、定量におけるイオンの検出としては、目的とするイオンのみを選択的に検出する、選択イオンモニタリング （Ｓｅｌｅｃｔｅｄ ＩｏｎＭｏｎｉｔｏｒｉｎｇ） や、１つ目の質量分析部で精製したイオン種のうち１つを前駆イオンとして選択し、２つ目の質量分析部で、その前駆イオンの開裂によって生じるプロダクトイオンを検出する、選択反応モニタリング（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ： ＳＲＭ）等が挙げられる。本発明では、選択性が増し、ノイズが減ることによってシグナル／ノイズ比が向上するＳＲＭによる測定が好ましい。
【００２６】
さらに、本明細書において、「試料」とは、特に限定はなく、生物、環境又は工業製品いずれの由来のものであってもよい。生物由来の試料としては、例えば、ヒトを含む動物の血液、唾液、涙液、汗、尿、糞、胆汁、組織、生体細胞、組織又は細胞培養液又は臓器から得られる調製物、あるいは植物からの抽出物等を挙げることができる。また、環境由来の試料としては、例えば、土壌、汚水、廃水、河川水、海水等が挙げられる。さらに、工業製品由来の試料としては、食料品、医薬品等が挙げられる。中でも、生体由来試料として、ヒトを含む動物の血液、唾液、尿、組織及び生体細胞等が、環境由来試料としては、廃水、河川水等が、工業製品由来試料としては、医薬品等が好ましい。
【００２７】
本発明において、使用することのできる下記式（２）
【化３】
0005515113.tif 000004
で示されるペンタハロゲン化ベンジル化合物において、Ｘは、具体的には、フッ素原子、臭素原子、塩素原子、ヨウ素原子を表す。また、脱離基Ｌとしては、ハロゲン原子： トシルオキシ、メシルオキシ、又はトリフルオロメタンスルホニルオキシ基等の脱離基を挙げることができ、好適には、ハロゲン原子を挙げることができる。上記ペンタハロゲン化ベンジル化合物の具体例としては、例えば、ペンタフルオロベンジルクロライド、ペンタフルオロベンジルブロマイド、ペンタブロモベンジルクロライド、ペンタブロモベンジルブロマイド等を挙げることができ、中でも、ペンタフルオロベンジルブロマイドが好適である。
【００２８】
これらのペンタハロゲン化ベンジル化合物及びペンタハロゲン化ベンゾイル化合物は、公知化合物であるか、又は公知化合物から公知の方法で合成することができる。
【００２９】
本明細書において、「低級アルキル」は、炭素数１〜６、好ましくは炭素数１〜３の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基を意味する。このような低級アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル等を挙げることができ、好適には、メチル、エチル、ｎ−プロピルを挙げることができる。また、本発明において使用することのできる「ヒドラジノ−１−低級アルキルピリジン」としては、例えば、ジラード試薬Ｐ及び２−ヒドラジノ−１−メチルピリジン等が挙げられ、この中でも反応性が良く、感度が優れている、 ２−ヒドラジノ−１−メチルピリジンを用いた誘導体化が好ましい。このヒドラジノ−１−低級アルキルピリジンも、公知化合物であるか、公知化合物から公知の方法で合成することができる。
【００３０】
本発明について、以下に具体的に説明する。
【００３１】
１．ヒドラジノ−１−低級アルキルピリジンの調製
ヒドラジノ−１−低級アルキルピリジンの調製方法については、後記実施例にて詳述するが、ヒドラジンと２−ハロゲノ−１−低級アルキルピリジニウムｐ−トルエンスルホン酸塩等の一般的な市販合成原料をアセトニトリル等の不活性化溶媒に溶解して反応させることにより得ることができる。この反応は、−１０℃乃至５０℃の範囲で行うことができるが、反応開始から５〜 １５分の間は−５℃乃至５℃の範囲内の温度で行うことが望ましい。その後は、１０℃乃至４０℃の範囲内が適している。また、反応溶媒としては、一般的な不活性有機溶媒、例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、アセトニトリル、酢酸エチル、テトラヒドロフラン等を使用することができる。
【００３２】
２．試料の調製
血清試料からのエストロゲンの調製方法については、後記実施例において詳述するが、有機溶媒による抽出や固相抽出による簡易カラムクロマトグラフィーにより分離精製する一般的調製方法を適宜選択して用いることができる。また、唾液、尿、糞、培養細胞、臓器及び汚水から得られる調製物等の試料の調製方法も、血清の場合とほぼ同様な手法を用いることができる。また、一般に市販されている固相抽出カラム、例えば、ウォーターズ社製のＯａｓｉｓ（登録商標） ＭＡＸや、ジーエルサイエンス社製のＩｎｅｒｔＳｅｐ（登録商標） ＭＡ−１を用いて、フェノール性ステロイドのみを選択的に分取することも必要に応じて行うことができる。
【００３３】
３．ペンタハロゲン化ベンジル誘導体又はペンタハロゲン化ベンゾイル誘導体の調製
上記で調製した試料をアセトニトリル等の不活性溶媒に溶解し、アルカリ条件下でペンタハロゲン化ベンジル化合物又はペンタハロゲン化ベンゾイル化合物を反応させることにより、上記で調製したエストロゲンをペンタハロゲン化ベンジル誘導体又はペンタハロゲン化ベンゾイル誘導体に変換する。この反応は、−１０℃乃至６０℃の範囲内の温度で行うことができ、好ましくは５℃乃至６０℃の範囲内の温度が適している。また、ペンタハロゲン化ベンジル化合物又はペンタハロゲン化ベンゾイル化合物の使用割合は、特に制限されるものではないが、一般に、試料１ｎｇに対して１ ｍｇ乃至１００ｍｇとすることができ、好ましくは２ ｍｇ乃至５ ｍｇが適している。さらに、上記反応において、反応液のｐＨを８〜 １４、好ましくは、１１〜 １３の範囲とすることができ、その際、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、炭酸カリウム等の塩基の中から、反応液を上記ｐＨの範囲にするのに十分な種類及び量の塩基を適宜選択して用いることができる。ここで、本反応はアルカリ条件下で行うことによって、エストロゲンにおける水酸基のうち、フェノール性水酸基が選択的にペンタハロゲン化ベンジルエーテル化又はペンタハロゲン化ベンゾイルエステル化される。
【００３４】
上記３の方法により調製されるエストロゲンのペンタハロゲン化ベンジル誘導体又はペンタハロゲン化ベンゾイル誘導体としては、例えば、次のものを挙げることができる。
エストロン ３−ペンタフルオロベンジルエーテル、
エストロン ３−ペンタフルオロベンゾイルエステル、
２−メトキシエストロン ３−ペンタフルオロベンジルエーテル、
４−メトキシエストロン ３−ペンタフルオロベンジルエーテル、
２−ヒドロキシエストロン ２，３−ジペンタフルオロベンジルエーテル、
４−ヒドロキシエストロン ３，４−ジペンタフルオロベンジルエーテル
１６α−ハイドロキシエストロン３−ペンタフルオロベンジルエーテル、
エストラジオール ３−ペンタフルオロベンジルエーテル、
エストラジオール ３−ペンタフルオロベンゾイルエステル、
２−メトキシエストラジオール３−ペンタフルオロベンジルエーテル、
４−メトキシエストラジオール３−ペンタフルオロベンジルエーテル等。
【００３５】
以上のように、エストロゲンをペンタハロゲン化ベンジル誘導体又はペンタハロゲン化ベンゾイル誘導体化した後、一般的な順相カラム、例えば、ジーエルサイセンス社製ＩｎｅｒｔＳｅｐＳＩ （登録商標）、ウォーターズ社製Ｓｅｐ−Ｐａｋ （登録商標） シリカカートリッジ等を用いて、エストラジオール類の該誘導体とエストロン類の該誘導体を分離することも必要に応じて行うことができる。
【００３６】
４．１−低級アルキルピリジニウムヒドラゾンの調製
上記の方法により調製したエストロン類のペンタハロゲン化ベンジル誘導体又はペンタハロゲン化ベンゾイル誘導体は、アセトニトリル等の不活性溶媒に溶解した後、トリフルオロ酢酸等の酸性下で、１−低級アルキルピリジニウムヒドラゾンへと変換することができる。
【００３７】
この反応は、−１０℃乃至６０℃の範囲内の温度で行うことができ、好ましくは１５℃乃至４０℃の範囲内の温度が適している。また、反応溶媒としては、一般的な不活性有機溶媒、例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、アセトニトリル、酢酸エチル、テトラヒドロフラン等を使用することができる。
【００３８】
また、エストロン類のペンタハロゲン化ベンジル誘導体又はペンタハロゲン化ベンゾイル誘導体に対するヒドラジノ−１−低級アルキルピリジンの使用割合は、特に制限されるものではないが、一般に、試料１ｎｇに対して０．１ μｇ乃至５００ μｇとすることができ、好ましくは、１μｇ乃至５０ μｇが適している。
【００３９】
上記４．の方法により調製される１−低級アルキルピリジニウムヒドラゾンとしては、例えば、次のものを挙げることができる。
３−ペンタフルオロベンジルオキシエストラ−１，３，５（１０）−トリエン−１７−オン１７−（１’−メチルピリジニウム−２’）−ヒドラゾン、
３−ペンタフルオロベンゾイルオキシエストラ−１，３，５（１０）−トリエン−１７−オン１７−（１’−メチルピリジニウム−２’）−ヒドラゾン、
１６α−ヒドロキシ−３−ペンタフルオロベンジルオキシエストラ−１，３，５（１０）−トリエン−１７−オン１７−（１’−メチルピリジニウム−２’）−ヒドラゾン、
１６α−ヒドロキシ−３−ペンタフルオロエンゾイルオキシエストラ−１，３，５（１０）−トリエン−１７−オン１７−（１’−メチルピリジニウム−２’）−ヒドラゾン、
２−メトキシ−３−ペンタフルオロベンジルオキシエストラ−１，３，５（１０）−トリエン−１７−オン１７−（１’−メチルピリジニウム−２’）−ヒドラゾン、
４−メトキシ−３−ペンタフルオロベンジルオキシエストラ−１，３，５（１０）−トリエン−１７−オン１７−（１’−メチルピリジニウム−２’）−ヒドラゾン、
２，３−ジペンタフルオロベンジルオキシエストラ−１，３，５（１０）−トリエン−１７−オン１７−（１’−メチルピリジニウム−２’）−ヒドラゾン、
３，４−ジペンタフルオロベンジルオキシエストラ−１，３，５（１０）−トリエン−１７−オン１７−（１’−メチルピリジニウム−２’）−ヒドラゾン等。
【００４０】
上記反応及びその他の本発明における反応後の夾雑物や試薬等との分離、精製には、一般的な固相抽出カラム、例えば、ＩｎｅｒｔＳｅｐ（登録商標） Ｐｈａｒｍａ（ジーエルサイエンス）、Ｂｏｎｄ Ｅｌｕｔ （登録商標） Ｃ１８ （バリアン） 等を用いることができる。
【００４１】
なお、本発明の測定方法におけるＬＣ−ＭＳ測定は、当業者に一般的な方法により行うことができる。
【００４２】
以下の実施例は、本発明をより詳細に説明するものであるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例１】
【００４３】
３−ペンタフルオロベンジルオキシエストラ−１，３，５（１０）−トリエン−１７−オン１７−（１’−メチルピリジニウム−２’）−ヒドラゾンの合成
１−１．２−ヒドラジノ−１−メチルピリジンの調製
８０％ヒドラジン水和物溶液１３２ μＬを加えたアセトニトリル３０ｍＬと、２−フルオロ−１−メチルピリジニウム ｐ−トルエンスルホン酸塩３００ ｍｇを加えたアセトニトリル６ｍＬを０℃で混合し、１０分間撹拌した後、室温で２０分間窒素下に置いた。その反応液を濃縮し、残渣をアセトニトリル２ｍＬで再溶解し、濾過した。濾液より得られる粗生成物をアセトニトリル−酢酸エチル（５：１）で二回再結晶し、２−ヒドラジノ−１−メチルピリジンを得た。
【００４４】
１−２．エストロン ３−ペンタフルオロベンジルエーテルの合成
エストロン２７６ ｍｇをアセトニトリル１５ｍＬに溶解し、ペンタフルオロベンジルブロマイドを３６１ ｍｇ、無水炭酸カリウム０．６ ｇを添加し、５３℃で１時間撹拌した。反応後、濾紙で濾過し、濾液を濃縮し、残渣をクロロホルム６０ｍＬに注ぎ、水洗した。有機層を分取して溶媒を留去後、メタノールから再結晶し、エストロン３−ペンタフルオロベンジルエーテル１８５ ｍｇを得た。
【００４５】
１−３．３−ペンタフルオロベンジルオキシエストラ−１，３，５（１０）−トリエン−１７−オン１７−（１’−メチルピリジニウム−２’）−ヒドラゾンの合成
上記１−２で得られたエストロン ３−ペンタフルオロベンジルエーテル５０ｍｇ及び２−ヒドラジノ−１−メチルピリジン３０ ｍｇをトルエン１．５ ｍＬに加えた後、１％トリフルオロ酢酸を１３μＬ加え、６０℃で２時間撹拌した。反応後、溶媒を減圧下で留去し、油状物をプレパラティブ薄層クロマトグラフィーにより、クロロホルム−メタノール−トリエチルアミン（２０：１：０．０５）で分離、酢酸エチル−メタノール （２：１） 混液で溶出した。溶媒を除去後、メタノールから再結晶し、３−ペンタフルオロベンジルオキシエストラ−１，３，５（１０）−トリエン−１７−オン１７−（１’−メチルピリジニウム−２’）−ヒドラゾン（Ｅ１−ＰＦＢＺＨＭＰ）を、２７ ｍｇ得た。
得られたＥ１−ＰＦＢＺＨＭＰの高分解能質量分析（Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎＭａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ： ＨＲ−ＭＳ）、融点及び核磁気共鳴（ＮｕｃｌｅａｒＭａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ：ＮＭＲ）データを下記表１に示す。
【表１】
0005515113.tif 000005
表１． Ｅ１−ＰＦＢＺＨＭＰのＨＲ−ＭＳ、融点及びＮＭＲデータ
【実施例２】
【００４６】
エストロン及びエストラジオールの同時定量の再現性
２−１．検量線作成及びＱＣ試料の作製
検量線試料として、エストロン及びエストラジオールのメタノール溶液 （それぞれ、０．２５、０．５、１、１０、１００、５００ ｐｇ／５０μＬ、０．１、０．２５、１、１０、１００、５００ ｐｇ／５０ μＬ） を５０ μＬ添加し、精製水で１ ｍＬにした。ＱＣ （ＱｕａｌｉｔｙＣｏｎｔｒｏｌ） 試料として、活性炭処理血清０．２５ ｍLにエストロン及びエストラジオールのメタノール溶液（それぞれ、０．２５、０．５、１０、５００ ｐｇ／５０ μL、０．１ 、０．２５、１０、５００ ｐｇ／５０μL） を５０ μＬ添加し、精製水で１ｍＬにした。次いで、内標準 （エストロン−１３Ｃ４及びエストラジオール−１３Ｃ４各１００ ｐｇ／５０μＬ） 、ジエチルエーテル５ｍＬを加え、１０分間振とう後、水層を凍結分離し、得られた溶媒を留去した。
【００４７】
２−２．エストロン ３−ペンタフルオロベンジルエーテル及びエストラジオール ３−ペンタフルオロベンジルエーテルの調製
前項２−１で得た残留物に２．５％ペンタフルオロベンジルブロマイドのアセトニトリル溶液を１００ μＬ及び０．８％水酸化カリウム／エタノール溶液５０ μＬを加えて、５３℃で１時間加温した。反応後、反応試薬を加温しながら窒素ガスで留去した後、精製水０．７５ｍＬを加え、ジエチルエーテル４ ｍＬで抽出し、溶媒を留去した。
【００４８】
２−３．エストロン ３−ペンタフルオロベンジルエーテル及びエストラジオール ３−ペンタフルオロベンジルエーテルの分離
前項２−２で得られた残留物に酢酸エチル０．１ ｍＬ及びヘキサン１ｍＬを加えて溶解し、あらかじめ酢酸エチル３ ｍＬとヘキサン３ ｍＬでコンディショニングしたＩｎｅｒｔＳｅｐＳＩカートリッジへ負荷した。カラムをヘキサン１ ｍＬ、酢酸エチル−ヘキサン （３：１７）１ ｍＬで順次洗浄した後、酢酸エチル−ヘキサン（３：１７） ３．５ｍＬでエストロン ３−ペンタフルオロベンジルエーテルを溶出した。次いで、酢酸エチル−ヘキサン （１：１） ３ ｍＬでエストラジオール ３−ペンタフルオロベンジルエーテルを溶出した。それぞれの溶媒を減圧下で留去した。
【００４９】
２−４．１７β−（１’−メチルピリジニウム−２’）−オキシ−３−ペンタフルオロベンジルオキシエストラ−１，３，５（１０） −トリエンの調製
前項２−３で得たエストラジオール ３−ペンタフルオロベンジルエーテルを含む残留物に、２％２−フルオロ−１−メチルピリジニウム ｐ−トルエンスルホナート／ジクロロメタン溶液を２００ μＬ、次いで、トリエチルアミン−ジクロロメタン（１：９） を３０μＬ加え、室温で１．５時間放置した。反応後、溶媒を窒素下で留去した後、メタノール０．５ｍＬで残留物を溶解し、精製水０．５ ｍＬで希釈した後、あらかじめメタノール６ ｍＬ、精製水６ｍＬでコンディショニングしたＢｏｎｄ Ｅｌｕｔ Ｃ１８カートリッジへ負荷した。カラムを精製水１ｍＬ、０．３％アンモニア４ ｍＬ、メタノール３ ｍＬ、０．１％ギ酸−メタノール（１：１） ３ｍＬで洗浄した後、１０％ギ酸−アセトニトリル （１：９） ３ ｍＬで１７β−（１’−メチルピリジニウム−２’）−オキシ−３−ペンタフルオロベンジルオキシエストラ−１，３，５（１０）−トリエン（Ｅ２−ＰＦＢＺＰＹ）を溶出した。次いで溶媒を減圧下で留去した。
【００５０】
２−５．Ｅ１−ＰＦＢＺＨＭＰの調製
前項２−３で得られたエストロン ３−ペンタフルオロベンジルエーテルを含む残留物に上記１−１で得た、２−ヒドラジノ−１−メチルピリジン１ｍｇを１％トリフルオロ酢酸−アセトニトリル （１：１４００）で溶解したものを１４０ μＬ加え、室温で１時間放置した。反応後、反応液にアセトンを５０μＬ加え、溶媒を減圧下で留去した。その残留物をメタノール０．５ｍＬで溶解した後、精製水０．５ ｍＬで希釈し、あらかじめ酢酸エチル３ ｍＬ、メタノール６ｍＬ、精製水６ ｍＬでコンディショニングしたＩｎｅｒｔＳｅｐＰｈａｒｍａへ負荷した。次いで、精製水１ ｍＬ、０．３％アンモニア２ ｍＬ、アセトニトリル−精製水（２：３） ３ｍＬで洗浄した後、Ｅ１−ＰＦＢＺＨＭＰを酢酸エチル−アセトニトリル−０．０５％ギ酸（４０：９：１） ３ ｍＬで溶出した。溶媒を減圧下で留去した後、その残留物に０．３％アンモニア０．５ｍＬを加え、酢酸エチル３ ｍＬで抽出し、減圧下で溶媒を留去した。前項１−４で得られた、Ｅ２−ＰＦＢＺＰＹをアセトニトリル−メタノール−０．１％ギ酸（７：７：６） １１５μＬに溶解し、さらに、その溶液でＥ１−ＰＦＢＺＨＭＰを溶解した。
【００５１】
２−６．ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる測定
前項２−５で得られた溶液のうち、２０ μＬを測定に使用した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳは、液体クロマトグラフ（島津製作所、Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ） に接続した質料分析計 （ＡＢＳｃｉｅｘ、ＡＰＩ ５０００） を用い、正イオン検出ＥＳＩで測定した。測定条件を下記表２に示す。
【表２】
0005515113.tif 000006
エストロンの検量線は、０．２５〜 ５００ｐｇの範囲において、エストラジオールの検量線は、０．１ 〜 ５００ ｐｇの範囲において、各々相関係数０．９９９以上と良好な直線性を示した。また、再現性試験結果を下記表３及び表４に示す。
【表３】
0005515113.tif 000007
【表４】
0005515113.tif 000008
エストロン及びエストラジオールのいずれも、同時並びに日差再現性ともに真度が８０〜 １２０％並びに精度が２０％以内と良好な再現性が得られた。
【実施例３】
【００５２】
ヒト血清中のエストロン及びエストラジオールの同時定量
３−１．ヒト血清試料の調製
ヒト血液から得た血清試料０．２５ ｍＬに内標準（エストロン−１３Ｃ４及びエストラジオール−１３Ｃ４各１００ ｐｇ／５０μＬ） を加え、精製水で１ｍＬにした後にジエチルエーテル５ ｍＬを加え、１０分間振とう後、水層を凍結分離し、得られた溶媒を留去した。以下、検量線は上記２−１と同様にして作成し、その他は上記２−２〜 ２−６と同様に操作してＥ１−ＰＦＢＺＨＭＰとＥ２−ＰＦＢＺＰＹを定量した。結果を下記表５に示す。
【表５】
0005515113.tif 000009
【実施例４】
【００５３】
ヒト組織中エストロン及びエストラジオール濃度の同時定量
４−１．ヒト組織試料の調製
重量測定した組織を液体窒素中で粉砕した後、精製水１ ｍＬを加えてウルトラターラックスでホモジネートした。内標準（エストロン−１３Ｃ４及びエストラジオール−１３Ｃ４各１００ ｐｇ／５０μＬ） 及び３倍量のエタノールを個別のホモジネートした組織へ加えて、５０℃で２時間振とうした。その後、冷所で２時間放置した後、４℃、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した。得られた上清の溶媒を減圧下で留去した。残渣をメタノール０．２５ｍＬで溶解後、精製水１ ｍＬで希釈し、あらかじめメタノール６ ｍＬ、精製水６ｍＬでコンディショニングしたＢｏｎｄ Ｅｌｕｔ Ｃ１８カートリッジカラムへ負荷した。精製水１ ｍＬ、アセトニトリル−精製水 （３：７）で順次洗浄後、アセトニトリル−精製水 （４：１） でエストロン及びエストラジオールを溶出し、溶媒を減圧下で留去した。得られた残渣をメタノール−精製水（１：４） １ｍＬで溶解し、あらかじめ、メタノール６ ｍＬ、精製水３ ｍＬ、０．１ M水酸化ナトリウム溶液２ ｍＬ、精製水４ ｍＬでコンディショニングしたＯａｓｉｓＭＡＸ カートリッジカラムへ負荷した。メタノール−精製水（１：１） ３ｍＬ、メタノール ３ ｍＬで洗浄後、アセトニトリル−精製水（４：１） でエストロゲンを溶出し、溶媒を減圧下で留去した。その後、検量線は上記２−１と同様にして作成し、その他は上記２−２〜 ２−６と同様に操作してＥ１−ＰＦＢＺＨＭＰとＥ２−ＰＦＢＺＰＹを定量した。下記表６に結果を示す。
【表６】
0005515113.tif 000010
【実施例５】
【００５４】
ヒト唾液中エストロン及びエストラジオールの同時定量
５−１．ヒト唾液試料の調製
ヒトから採取した唾液試料２ ｍＬに内標準（エストロン−１３Ｃ４及びエストラジオール−１３Ｃ４各１００ ｐｇ／５０μＬ） を加え、ジエチルエーテル５ｍＬを加え、１０分間振とう後、４℃、３０００ ｒｐｍ、５分間遠心分離した。水層を凍結分離し、得られた溶媒を留去した。その後、検量線は上記２−１と同様にして作成し、その他は上記２−２〜 ２−６と同様に操作してＥ１−ＰＦＢＺＨＭＰとＥ２−ＰＦＢＺＰＹを定量した。その結果を下記表７に示す。
【表７】
0005515113.tif 000011
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明の測定方法によれば、試料中のエストロゲン、特にエストロン類の有無の検出、及びその量の微量測定ができる。本発明は、例えば、医学、薬学、生化学、公衆衛生、食品検査等の分野で利用できる。