(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中に存在する核酸の量を、当該核酸の事前の精製を行わずに測定する方法であって、
検体に、核酸挿入剤であるフルオロフォアを添加し、
少なくとも２つの励起波長での光刺激に応じてそれぞれ少なくとも２つの発光波長で該
フルオロフォアにより発光された蛍光強度を測定し、
該少なくとも２つの測定された蛍光強度から検体中に存在する核酸の量を導き出すことを特徴とし、
ここで、３つの励起波長λ’1、λ’２、λ’３での光刺激に応じてそれぞれ３つの発光波長λ1、λ２、λ３で該フルオロフォアにより発光された蛍光強度Ｉ1、Ｉ2、Ｉ3を測定し、ただしλ1＜λ２＜λ３であり、λ1、λ２、λ３は予め決定し、前記核酸の量を下記のＦの値から導き出すか、
【数１】
0005484051.tif 000032
又は、
２つの励起波長λ’1およびλ’２での光刺激に応じてそれぞれ２つの発光波長λ1およびλ２で該フルオロフォアにより発光された蛍光強度Ｉ1およびＩ2をそれぞれ測定し、λ’1およびλ’２は予め決定し、該核酸の量を、Ｉ1およびＩ２間の差の絶対値、すなわち、下記のＦの値から導き出し、
【数３】
0005484051.tif 000033
当該検体は、細胞培養物、全血、血清、血漿、血液形成要素、赤血球、尿、糞便、脳脊髄液、精液、穿刺液、痰、唾液、気管支および肺胞（alveolar）液、膿汁、生殖器分泌物、羊水、胃液、胆汁、膵液、組織生検、毛髪、皮膚、歯、およびリンパ液からなる群から選択される、前記方法。
【請求項２】
該核酸がＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該検体が生物学的検体または生物学的検体誘導体である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
該検体が生物学的検体から希釈により誘導されたものである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
該検体が細胞破壊を起こしていた可能性のある生理病理的状態にあった患者を起源とするものである、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
測定された核酸の量を細胞死の特徴づけとの関連で使用する、請求項３〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
該フルオロフォアがピコグリーン（Picogreen（登録商標）、［Ｎ−ビス−（３−ジメチルアミノプロピル）−アミノ］−４−［２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾル−２−イル）−メチリデン］−１−フェニル−キノリニウム］＋）である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
３つの励起波長λ’1、λ’２、λ’３での光刺激に応じてそれぞれ３つの発光波長λ1、λ２、λ３で該フルオロフォアにより発光された蛍光強度Ｉ1、Ｉ2、Ｉ3を測定し、ただしλ1＜λ２＜λ３であり、λ1、λ２、λ３は予め決定し、そして
前記核酸の量を下記のＦの値から導き出す、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【数１】
0005484051.tif 000034
【請求項９】
該フルオロフォアがピコグリーン（登録商標）であり、該波長が下記の通りである請求項８に記載の方法。
【数２】
0005484051.tif 000035
【請求項１０】
２つの励起波長λ’1およびλ’２での光刺激に応じてそれぞれ２つの発光波長λ1およびλ２でフルオロフォアにより発光された蛍光強度Ｉ1およびＩ2をそれぞれ測定し、λ’1およびλ’２は予め決定し、
該核酸の量を、Ｉ1およびＩ２間の差の絶対値、すなわち、下記のＦの値から導き出す、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【数３】
0005484051.tif 000036
【請求項１１】
該フルオロフォアがピコグリーン（登録商標）であり、該波長は下記の通りである、請求項１０に記載の方法。
【数４】
0005484051.tif 000037
【請求項１２】
該検体中の核酸の量を、較正曲線を用いてＦの値から導き出す、請求項８または１０に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法を行う蛍光分析システムであって、蛍光光度計を含み、当該蛍光光度計が以下のものを含む、システム：
２つまたは３つの励起波長λ’1、λ’２および場合によりλ’３で光励起するための１つ以上の手段、
３つの発光波長λ1、λ２および場合によりλ３で発光された蛍光強度Ｉ1、Ｉ2および場合によりＩ3を測定する１つ以上の手段、および
下記の値Ｆを計算する計算機。
【数５】
0005484051.tif 000038
【請求項１４】
該励起および発光波長が下記の通りである、請求項１３に記載のシステム。
【数６】
0005484051.tif 000039
【請求項１５】
該励起および発光波長が下記の通りである、請求項１３に記載のシステム。
【数７】
0005484051.tif 000040
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、２００６年８月１１日に出願された先の米国仮特許出願第６０／８３６，９４９号に基づく利益を主張する。
【０００２】
本発明は、検体中に存在する核酸の量を測定する蛍光分析法に関し、該方法の実施に好適な蛍光光度計および化合物の蛍光分析用トレイに関する。
【背景技術】
【０００３】
血中を循環している遊離核酸の存在は、古くから知られている（Mandel and Metais, 1947およびTan, et al., 1966）。以来、ＲＩＡ（放射免疫測定法）などの方法を用いて、良性腫瘍患者あるいは健常者の循環ＤＮＡ量に比較して、癌患者の循環ＤＮＡ量が上昇していることが見出されている（Leon, et al., 1977およびShapiro, et al., 1983）。
【０００４】
しかし、近年、リアルタイムＰＣＲなどの非常に有効な分子生物学的方法の開発に伴い、臨床生物学的マーカーとして使用するという観点から、循環ＤＮＡフラグメントに対する関心が高まってきている。
【０００５】
癌患者から抽出したＤＮＡは、通常、鎖構造の不安定性、特定の癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、マイクロサテライト変性の存在など、腫瘍ＤＮＡの特徴を有している（Anker P., et al., 1999）。Kokら（De Kok, et al., 1997）は、この循環ＤＮＡは腫瘍細胞由来であると仮定し、特定の変性により特徴づけされる腫瘍由来のＤＮＡが大腸癌患者の血清中に存在する可能性を報告した。この著者らは、原発性腫瘍において既に同定されているある種のＫ−ｒａｓ点変異を血清のＤＮＡ中に検出した。このように、循環ＤＮＡに関する研究の多くが、種々の癌患者の腫瘍（組織）または血清から抽出したＤＮＡにおける突然変異、ヘテロ接合体の消失、マイクロサテライト変性およびメチル化の検出に注目していたのである。血清の遊離ゲノム遺伝子中に検出されるマイクロサテライト変性および不安定性は、高い特異性を有する腫瘍モニタリング用新規マーカーとしての可能性を示唆している。
【０００６】
近年になって、ゲノムまたは非ゲノム循環ＤＮＡの単なる濃度上昇を、初期乳癌および肺癌の診断マーカーまたはマーカーとして、さらに既に化学療法を受けている患者のモニタリングおよび検査に使用する試みについて多数の研究がなされている（Sozzi, et al., 2001）。この方法は、生検などのより侵襲性の高い処置の必要性を排除、あるいは少なくとも低減することができる。さらに、肺癌（Sozzi, et al., 2003）、乳癌（Gal, et al., 2004）または前立腺癌（Boddy, et al., 2005およびJung, et al., 2004）などの初期段階の癌に特異的なスクリーニングとして有用であり得る。また、癌患者、化学療法治療中の患者、あるいは外科手術を受けた患者、外傷（Lam, et al., 2003）、または心筋梗塞（Chang, et al., 2003）患者のモニタリングに通常使用されているマーカーの補助分析としても使用され得る。
【０００７】
血中を循環しているＤＮＡには基本的に次の２つのタイプがある。
・循環有核細胞に関連するＤＮＡ
・血漿中を循環している遊離ＤＮＡ
癌患者または心筋梗塞を起こした患者では、血清中のゲノムＤＮＡがフラグメント化しており、癌の場合には約１００塩基対のフラグメントが存在し（Wu, et al., 2002）、心筋梗塞では約２００塩基対のフラグメントが存在する（Chang, et al., 2003）。これらのフラグメントは、循環ＤＮＡの濃度が非常に低い、病変を有さないコントロールの血中からは検出されない。ＤＮＡが血流中に放出される機構については、今なお、ほとんど分かっていない。Jahrら（Jahr, et al., 2001）は、このＤＮＡは主にアポトーシスおよび壊死細胞に由来する、という仮説を唱えた。
【０００８】
健常者におけるこの循環ＤＮＡの濃度を規定する参照濃度限界は、現在存在しない。この閾値を見積もる多くの研究がなされたが、それらを方法論的に比較することは極めて困難であり、得られた結果は多くの水準で異なっている。さらに、研究毎に使用されている単位が、ｎｇ／ｍｌ、コピー数／ｍｌ、ゲノム当量／ｍｌ（６．６ｐｇ／ｍｌで見積もられた二倍体細胞中に含まれるＤＮＡ量）などのように異なっている。
【０００９】
複数の研究グループが、予後診断の可能性を求めて、特に、従来の診断マーカーとの関連を構築する試みにより、循環ＤＮＡの量を測定してきた。現在まで、全ての研究において、使用された検体が血清、血漿にかかわりなく、癌患者におけるＤＮＡ量の平均値が健常者コントロールにおける値よりも相当高いという点で一致していた。それにもかかわらず、測定された絶対値は、研究ごとに異なっている。この差異は、分析対象である癌の種類、使用された方法に関連している可能性がある。公表されている大量のデータ（Thijssen, et al., 2002）により確認できるように、血漿中のＤＮＡ量は、血清を用いた場合よりも低い値となる。臨床的な意義に関しては、ＤＮＡ量と公知の予後因子との間の相関関係について少なくとも２つの報告がなされている。（小細胞または非小細胞）肺癌では、血漿ＤＮＡ量と血清ＬＤＨ活性およびニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）との間には、各マーカーと患者の生存率との関連性と同様の、高い相関関係が存在する（Fournie, et al., 1995）。同様に、ＤＮＡ量は、乳癌患者のリンパ節転移における臨床病期や腫瘍の大きさに相関していた（Shao, et al., 2001）。最後に、腫瘍を原因とする循環ＤＮＡのフラクションは、患者間で大きく異なるということを念頭に置くことが重要である（Jahr, et al., 2001）。
【００１０】
今日、溶液中の核酸を測定する方法は多数あり、それらの方法によって、臨床医や研究者の様々な要求に対応している。それらの方法には、まず、分光測光法（Greenstock, et al., 1975）がある。この方法は、全ての研究室で行われる非常に一般的な方法であり、安価であるという利点を有するが、臨床業務においては大きな欠点、つまり感度が極めて低いという欠点を有する。したがって、測定対象の患者中の循環ＤＮＡ量を測定することはできない。
【００１１】
その他の高感度の測定法もあるが、それらは全て多かれ少なかれ日常的使用が困難であるという特徴を有する。一つには、測定に先立って生物学的環境からＤＮＡを抽出するという、通常の操作を必要とするからである。すなわち、
・放射免疫測定法（Leon, et al., 1975）は、比較的長時間（分析当たり数時間）かかり、散発的ではなく一連の測定を行わなければならず、中でも、放射性元素を取り扱うための専門的なシステムと認可されたスタッフを必要とする。
・競合ＰＣＲ（Siebert, et al., 1992およびYap, et al., 1992）は、既知の標準に対する相対的なディスプレイに基づくものであり、検出感度および特異性を提供する一連の複数の工程が追加される。これらの工程は、扱いづらいと共に比較的秘密情報とされている。すなわち、医療分析研究所でのその日常的な使用は、将来的にはあり得ない。
・リアルタイム定量ＰＣＲ（Mulder, et al., 1994）は、循環ＤＮＡの測定における問題点に関する様々な報告において好適な方法である。その利点は、２つある。すなわち、ディスプレイされる標的ＤＮＡ（この場合、ヒトＤＮＡ）に特異的であり、また、今日、もはや研究機関だけのものではなく、多数の病院において見られる機器である。にもかかわらず、欠点が無いわけではない。すなわち、抽出操作が必要であり、比較的操作コストが高く、大量の日常的分析には使用できず、感度も不十分な特別な機器を必要とする。
・蛍光定量法（Greenstock, et al., 1975）。この方法では抽出工程が不要なわけではないが、測定対象である溶液中の遊離ＤＮＡを迅速に直接測定することができる。しかし、本法が使用される技術的条件（マイクロプレート、試薬の容量、蛍光の測定）により、必要な感度に到達することが阻まれ、検出されたＤＮＡ（ヒトまたは非ヒト）の由来を同定することができない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Anker P. et al. Detection of Circulating Tumour DNA in the blood (plasma/serum) of Cancer Patients. Cancer Metastasis Rev 1999, 18: 65-73.
【非特許文献２】Boddy J.L. et al. Prospective Study of Quantitation of plasma DNA Levels in Diagnosis of Malignant versus Benign Prostate Disease. Clinical Cancer Res 2005, 11: 1394-1399.
【非特許文献３】Chang C.P. Elevated cell-free serum DNA detected in patients with myocardial infarction. Clin Chim Acta 2003, 327: 95-101.
【非特許文献４】De Kok JB et al. Detection of Tumour DNA in Serum of Colorectal Cancer Patients. Scand J Lab Clin Invest 1997, 57: 601-4.
【非特許文献５】Fournie G.J. et al. Plasma DNA as a Marker of Cancerous Cell Death: Investigation in Patients Suffering from Lung Cancer in Nude Mice Beaming Human Tumours. Cancer Letters 1995, 91: 221-227.
【非特許文献６】Gal S. et al. Quantitation of Circulating DNA in Serum of Breast Cancer Patients by Real Time PCR. British Journal of Cancer 2004, 90: 1211-1215.
【非特許文献７】Greenstock C. L., et al. Interaction of ethidium bromide with DNA as studied by kinetic spectrophotometry. Chem Biol Interact. 1975, 11: 441-7.
【非特許文献８】Jahr S. et al. DNA Fragments in the blood Plasma of Cancer Patients: Quantitation and Evidence for their Origin from Apoptotic and Necrotic Cells. Cancer Res 2001, 61:1659-65.
【非特許文献９】Jung K. et al. Increased Cell Free DNA in Plasma of Patients with Metastasic Spread in Prostate Cancer. Cancer letters 2004, 205: 173-180.
【非特許文献１０】Lam N.Y. et al. Time Course of Early and Late Changes in Plasma DNA in Trauma Patients. Clinical Chemistry 2003, 49: 1286-1291.
【非特許文献１１】Leon SA, et al. Radioimmunoassay for nanogram quantities of DNA. J Immunol Methods 1975 9: 157-64.
【非特許文献１２】Leon S. et al. Free DNA in the Serum of Cancer patients and effects of the Therapy. Cancer Res. 1977, 37: 646-650.
【非特許文献１３】Mandel P. and Metais P. Les acides nucleiques du plasma sanguin chez l'homme. C. R. Soc Biol 1948, 142: 241.
【非特許文献１４】Mulder J. Rapid and simple PCR assay for quantitation of human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma: application to acute retroviral infection. J Clin Microbiol 1994, 32: 292-300.
【非特許文献１５】Shao Z et al. P53 Mutation in Plasma DNA and its Prognostic Value in Breast Cancer Patients. Clinical Cancer Res 2001, 7: 2222-2227.
【非特許文献１６】Shapiro B. et al. Determination of Circulating DNA Levels in the Patients with Benign or malignant Gastrointestinal Disease. Cancer 1983, 51: 2116-2120.
【非特許文献１７】Siebert PD, et al. Competitive PCR. Nature. 1992, 359: 557-8.
【非特許文献１８】Sozzi G. et al. Analysis of Circulating Tumour DNA in Plasma at Diagnosis and Follow-up Lung Cancer Patients. Cancer Res 2001, 61: 4675-4678.
【非特許文献１９】Sozzi G. et al. Quantitation of Free Circulating DNA as a Diagnostic Marker in Lung Cancer. Journal of Clinical Oncology 2003, 21: 3902-3908.
【非特許文献２０】Tan E. M. et al. Deoxyribonucleic acid (DNA) and antibodies to DNA in the serum of patients with systemic lupus erythematosus. J Clin Invest 1966, 45: 1732-40.
【非特許文献２１】Thijssen M. A. et al. Difference between Free Circulating Plasma and Serum DNA in Patients with Colorectal Liver Metastasis. Anticancer Res 2002, 22: 421-425.
【非特許文献２２】Wu T. L. et al. Cell Free DNA: Measurement in Various Carcinomas and Etablishment of normal Reference range. Clinica Chimica Acta 2002, 321: 77-87.
【非特許文献２３】Yap EP, et al. Nonisotopic SSCP and competitive PCR for DNA quantification: p53 in breast cancer cells. Nucleic Acids Res. 1992, 20: 145.
【発明の概要】
【００１３】
したがって、本発明は、既存の方法の欠点を克服した、試料中に存在する核酸の量を測定する方法を提供することを目的とする。
【００１４】
本発明の出発点は、本発明者らが、検体にフルオロフォアを添加し、そして同時分析で、または少なくとも２つ、特に少なくとも３つの対応する波長での励起に応じて少なくとも２つ、特に少なくとも３つの異なる発光波長で発光された蛍光強度を測定することにより、検体中に存在する核酸の量を測定することができることを実証したことにある。
【００１５】
発明の要旨
本発明は、検体中に存在する核酸の量を少なくとも２つ、好ましくは３つの波長の蛍光により測定する方法に関するもので、
検体にフルオロフォアを添加し、
少なくとも２つ、好ましくは３つの励起波長での光刺激に応じてそれぞれ少なくとも２つ、好ましくは３つの発光波長でフルオロフォアにより発光された蛍光強度を測定し、
該少なくとも２つ、好ましくは３つの測定された蛍光強度から検体中に存在する核酸の量を導き出す。
【００１６】
前述の方法の特定の態様においては、３つの励起波長λ’1、λ’２、λ’３での光刺激に応じてそれぞれ３つの発光波長λ1、λ２、λ３でフルオロフォアにより発光された蛍光強度Ｉ1、Ｉ2、Ｉ3を測定する。ここで、λ1＜λ２＜λ３であり、λ1、λ２、λ３は予め決定しておく。
【００１７】
前述の方法の他の特定の態様においては、前記核酸の量は、次式のＦの値から導き出す。
【００１８】
【数１】
0005484051.tif 000002
【００１９】
前述の方法の他の特定の態様においては、該フルオロフォアはピコグリーン（Picogreen登録商標）であり、該波長は下記の通りである。
【００２０】
【数２】
0005484051.tif 000003
【００２１】
さらに、前述の方法の他の特定の態様においては、２つの励起波長λ’1およびλ’２での光刺激に応じてそれぞれ２つの発光波長λ1およびλ２でフルオロフォアにより発光された蛍光強度Ｉ1およびＩ2を測定する。ここで、λ1およびλ２は予め決定しておく。
【００２２】
これに関連して、好ましくは、該核酸の量を、Ｉ1およびＩ２間の差の絶対値、すなわち、下記のＦの値から導き出す。
【００２３】
【数３】
0005484051.tif 000004
【００２４】
さらに、これに関連して、該フルオロフォアがピコグリーン（登録商標）である場合、該波長は下記の通りである。
【００２５】
【数４】
0005484051.tif 000005
【００２６】
さらに具体的には、該検体中の核酸の量は、較正曲線を用いてＦの値から導き出される。
【００２７】
本発明はまた、上述の方法を行うのに適した蛍光光度計に関し、
２つおよび／または３つの励起波長λ’1、λ’２および場合によりλ’３で光励起するための１つ以上の手段、
３つの発光波長λ1、λ２および場合によりλ３で発光された蛍光強度Ｉ1、Ｉ2および場合によりＩ3を測定する１つ以上の手段、および
下記の値Ｆを計算することを可能とする計算機、を含むことを特徴とする。
【００２８】
【数５】
0005484051.tif 000006
【００２９】
前述の蛍光光度計の特定の態様においては、３つの波長に関して、励起および発光波長は下記の通りである。
【００３０】
【数６】
0005484051.tif 000007
【００３１】
前述の蛍光光度計の他の特定の態様においては、２つの波長に関して、励起および発光波長は下記の通りである。
【００３２】
【数７】
0005484051.tif 000008
【００３３】
本発明はまた、化合物の蛍光アッセイ用のトレイに関し、該トレイは、少なくとも蛍光分析に使用される波長の光を透過し得る混合及び測定容器を含む。該容器は、
フルオロフォアを含有し、それ自体、希釈液を含有するリザーバに接続されているフルオロフォアリザーバ、および
分析される化合物を含有する検体の体積を標準化するためのリザーバであって、それ自体、分析される化合物を含有する検体を収集するウェルに接続されている標準化リザーバ、
に接続されている。
【００３４】
前述のトレイの特定の態様においては、逆止弁が、
収集された溶液が標準化リザーバの方向にのみ通過できるように、収集ウェルと標準化リザーバとの間に、
収集された溶液が混合及び測定容器の方向にのみ通過できるように、標準化リザーバと該容器との間に、
希釈液がフルオロフォアリザーバの方向にのみ通過できるように、希釈溶液リザーバとフルオロフォアリザーバとの間に、および
希釈液が混合及び測定容器の方向にのみ通過できるように、フルオロフォアリザーバと該容器との間に、配置されている。
【００３５】
前述のトレイの他の特定の態様においては、標準化リザーバ、混合及び測定容器、フルオロフォアリザーバ、および希釈液リザーバからなる区画が十分な弾力性を有する物質でできており、それら器に入っている液体をそれらの器に圧力を与えることによって移動させることができる。
【００３６】
前述のトレイの他の特定の態様においては、該フルオロフォアはピコグリーン（登録商標）であり、該希釈液がトリス‐ホウ酸‐ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝液である。
【００３７】
前述のトレイの他の特定の態様においては、該標準化リザーバが、該収集された溶液中に含まれ、１０００ヌクレオチド未満の長さを有する核酸分子を選択する手段に連結されている。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
核酸
核酸は、天然または合成由来でよく、それに組み込まれるヌクレオチド、特に、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドは、天然でもよくまたは修飾されていてもよい。好ましくは、核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり、より好ましくは、ＤＮＡである。さらに、核酸鎖の大きさは、好ましくは、５塩基を越える。
【００３９】
望ましくは、検体中の低分子量（例えば、１０００塩基未満の長さ）の鎖を有する核酸を、必要であれば、これらの核酸を適当な処理により選択した後、特異的に定量することにより、細胞、例えば、検体が由来する生物または培養物中の細胞のアポトーシスによる細胞死の定量が可能である。そのように測定された値は、ＤＮＡの総量の値に関連付けることが可能であり、場合により、１０００塩基未満の大きさの核酸鎖を選択するための処理を経ずに測定して、アポトーシスによる細胞死の割合を求めることも可能である。
【００４０】
アポトーシスは、総核酸を測定し、適当な処理により低分子量の核酸を除去した後、高分子量の核酸を測定することにより、定量することも可能である。次いで、低分子量の核酸の量は、高分子量の核酸を差し引くことにより得ることができる。
【００４１】
場合により、低分子量の核酸を特異的に選択して、直接定量することも可能である。その後、残存する高分子量の核酸は、それらを特異的に測定してもよい。したがって、総核酸は、両者の量を合わせることにより得られる。
【００４２】
アポトーシスを定量するためには、ＤＮＡとフルオロフォアの相互作用の後に、蛍光により、低分子量または高分子量の核酸および総核酸の量の特異的定量を行うことができる。核酸は、前もって適当な処理により捕獲および／または濃縮することができる。
【００４３】
本発明の構成におけるアポトーシスの定量は、実験を進行させながら、動的状態において行うことができる。実際、外部媒体（例えば、培養媒体）中に排出された核酸フラグメントを測定するので、測定を行うために、例えば、細胞培養を停止する必要はない。残っている生細胞により、実験を続けることができる。したがって、短時間の後などに測定を必要なだけ頻繁に繰り返すことができる。同様に、ヒトまたは動物に起こるアポトーシスを測定することが可能であり、ここで、測定媒体は、いずれの種類の生物学的検体であってもよい。
【００４４】
そのように、種々の分野、例えば、医療分野、動物実験のプロトコール、細胞培養に応用することを考えることが可能である。核酸フラグメントは、天然または非天然にかかわらず、いずれの種類の流体において測定してもよい。
【００４５】
一つの分野は、特に、動物または細胞培養物における薬理学的研究に関する。注目される分野としては、以下のものが含まれる。
・薬剤の致死性の試験、
・細胞死の誘導形態、例えば、壊死またはアポトーシス、の確立、
・適用されている実験条件において、その他の細胞が生存している状態で、最初の細胞死が起こるまでの、実験の継続が可能である時間の規定。
【００４６】
他の分野は、細胞培養の科学研究に関する。実際には、
・代謝径路の刺激または不活性化、または
・使用される実験条件による、細胞死に及ぼす影響の研究が可能である。
【００４７】
さらに、他の分野は、動物実験のプロトコールであって、
・ランダム細胞死に対する薬剤の、
・誘導細胞死の、または
・実験条件の影響の試験のためのプロトコールに関する。
【００４８】
上述の全てに加えて、細胞死を誘導する病状の患者のモニタリングまたはフォローアップにおけるアポトーシスの定量、それらの病状の診断、または治療効果のフォローアップも興味深い。
【００４９】
さらに、一般的に、細胞死の有無を知る必要のあるもの、細胞死誘導状態、細胞死発現の遅延、および研究対象の効果の持続時間などの分野に応用できる。上記で定義された方法によって測定された核酸の量を、細胞死の特徴づけに好適に使用することができる。
【００５０】
検体
検体は、天然または合成由来、また無機物または有機物であることができる。好ましくは、検体は、生物学的検体または生物学的検体の誘導体である。さらに好ましくは、検体は生物学的検体から希釈により誘導されたものである。生物学的検体は、例えば、動物、特にヒト、または植物由来であってよい。
【００５１】
さらに好ましくは、生物学的検体は、細胞培養物、全血、血清、血漿、血液形成要素、赤血球、尿、糞便、脳脊髄液、精液、穿刺液、痰、唾液、気管支および肺胞（alveolar）液、膿汁、生殖器分泌物、羊水、胃液、胆汁、膵液、組織生検、毛髪、皮膚、歯、およびリンパ液からなる群から選択される。
【００５２】
さらに好ましくは、検体が細胞破壊を起こしていた可能性のある生理病理的状態にあった患者から得られたものである。特に、検体は、癌を患っているかまたは癌が疑われる患者、化学療法治療を受けている患者、外科手術を受けた患者、外傷（traumatised）患者、および心筋梗塞を患った患者からなる群から選択された患者に由来する。
【００５３】
好ましくは、生物学的検体に含有される核酸は、生理的または病理的原因による溶解細胞に由来し、特にアポトーシス細胞に由来する。
【００５４】
検体は、特に好ましくは、２０〜４００倍に希釈された血漿である。
【００５５】
本発明による方法は、核酸の事前の精製を行わずにいずれの所望の検体中の核酸も定量することができ、有利である。
【００５６】
フルオロフォア
用語「フルオロフォア」とは、光励起に応答して発光する傾向のある化合物をいう。
【００５７】
本発明では、フルオロフォアは、好ましくは核酸との間に弱いまたは強い相互作用または化学結合を構築することにより核酸と相互作用しやすいものである。
【００５８】
一般に、その特徴により、核酸と相互作用するフルオロフォアは、次のように区別される。
・臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウム、またはピコグリーン（登録商標）などの挿入剤
・ＤＡＰＩやヘキスト試薬（例えば、ヘキスト３３２５８、ヘキスト３４５８０）などの二重鎖ＤＮＡのマイナーグルーブ（minor groove：副溝）に結合する試薬
・アクリジンオレンジ、７−ＡＡＤ、ＬＤＳ７５１、およびヒドロキシスチルバニジン（hydroxystilbanidine）などの、核酸と相互作用する種々の試薬
他の例としては、ＳＹＢＲ（化学的に反応性）、ＴＯＴＯ（シアニン二量体）、ＴＯ−ＰＲＯ（シアニン単量体）、ＳＹＴＯ（細胞浸透性）、およびＳＹＴＯＸ（細胞非浸透性）ファミリーからのフルオロフォアからなる群から選択されるフルオロフォアを挙げることができる。
【００５９】
好ましくは、フルオロフォアは、核酸挿入剤である。
【００６０】
用語「核酸挿入剤」とは、核酸鎖を形成する塩基の間にはめ込まれ易いフルオロフォアをいう。挿入剤は、当業者において周知である。
【００６１】
本発明者らは、ピコグリーン（登録商標）、臭化エチジウム、試薬ヘキスト３３２５８、アクリジンオレンジ、ＰＯＰＯ（登録商標）、ＴＯＴＯ（登録商標）、およびＳＹＢＲ（登録商標）を用いることによって、本発明の方法により核酸を定量できることを特に示した。
【００６２】
従って、好ましくは、フルオロフォアは、ピコグリーン（登録商標）、臭化エチジウム、試薬ヘキスト３３２５８、アクリジンオレンジ、ＰＯＰＯ（登録商標）、ＴＯＴＯ（登録商標）、およびＳＹＢＲ（登録商標）からなる群から選択される。
【００６３】
さらに好ましくは、フルオロフォアは、ピコグリーン（登録商標）または２−［Ｎ−ビス−（３−ジメチルアミノプロピル）−アミノ］−４−［２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾル−２−イル）−メチリデン］−１−フェニル−キノリニウム］＋）である。
【００６４】
ピコグリーン（登録商標）は、特に、Molecular Probesにより販売されており、特に、米国特許第５８６３７５３号に詳述されている。前述の処理においては、好ましくは、ピコグリーンｄｓＤＮＡ定量キット（Molecular Probes）のピコグリーン（登録商標）を約１／５０００〜約１／８００００、特に約１／２００００に希釈して使用する。
【００６５】
臭化エチジウムを使用する場合には、下記の励起および発光波長を上述の方法および蛍光光度計に使用することができる。
【００６６】
３つの波長の場合には、以下の通りである。
【００６７】
【数８】
0005484051.tif 000009
【００６８】
２つの波長の場合には、以下の通りである。
【００６９】
【数９】
0005484051.tif 000010
【００７０】
ヘキスト３３２５８を使用する場合には、下記の励起および発光波長を上述の方法および蛍光光度計に使用することができる。
【００７１】
３つの波長の場合には、以下の通りである。
【００７２】
【数１０】
0005484051.tif 000011
【００７３】
２つの波長の場合には、以下の通りである。
【００７４】
【数１１】
0005484051.tif 000012
【００７５】
ＳｙＢｒグリーンＩＩを使用する場合には、下記の励起および発光波長を上述の方法および蛍光光度計に使用することができる。
【００７６】
３つの波長の場合には、以下の通りである。
【００７７】
【数１２】
0005484051.tif 000013
【００７８】
２つの波長の場合には、以下の通りである。
【００７９】
【数１３】
0005484051.tif 000014
【００８０】
Ｐｏｐｏ１を使用する場合には、下記の励起および発光波長を上述の方法および蛍光光度計に使用することができる。
【００８１】
３つの波長の場合には、以下の通りである。
【００８２】
【数１４】
0005484051.tif 000015
【００８３】
２つの波長の場合には、以下の通りである。
【００８４】
【数１５】
0005484051.tif 000016
【００８５】
同期蛍光
用語「同期蛍光」とは、その波長が、一定の間隔、例えば、３０ｎｍだけ離れているように設定されている励起光および発光に対応する一組のシグナルを測定するために、発光および励起光を受光する２つのモノクロメータ（monochrometer）が同時に動いて蛍光を測定する、当業者には周知の蛍光測定法をいう。同期蛍光は、特に、Lloyd (1971) "Synchronised excitation of fluorescence emission spectra" Nature physical Science 231: 64-5およびFicheuxら(1991) "La spectrofluorescence synchrone: theorie et applications" Toxicorama 3:1 :8-13によって定義されている。
【００８６】
上記に定義した方法では、２つまたは３つの蛍光強度を同期蛍光により測定することが可能であり、あるいは、一旦励起および発光波長を決定すれば、与えられた励起波長に応じて決定される発光波長で発光された２つまたは３つの光の強度を単に測定することにより測定することが可能である。
【００８７】
したがって、λ1、λ２、および場合によりλ３は、同期スペクトルの傾斜における変化に印付けする点として、特に、同期スペクトルの傾斜における変曲点あるいは不連続点（breaking point）として、同期蛍光により決定することができる。
【００８８】
傾斜不連続点は、先行する値により規定されるバックグラウンドと統計的に異なる新しい傾斜と、ピークに先行する点における平均傾斜値との間の境界を示す点であることが理解される。その際、この平均近辺の点はある程度のばらつきが許されなければならない。
【００８９】
より具体的には、３つの波長を基準とする場合、λ２は蛍光発光強度ピークが観察される発光波長を示し、このピークはλ１およびλ３に対応する２つの変曲または勾配不連続点に囲まれている。
【００９０】
同期蛍光スペクトルから波長λ1、λ２、λ３、λ’1、λ’２、λ’３を決定する方法を、ピコグリーン（登録商標）を使用する特定の場合に関する下記の例により説明する。手短に言えば、λ1、λ２、λ３は、より具体的には、それぞれ以下に対応する。
・島津ＲＦ５３５型蛍光光度計を用いて読み取った場合には、核酸とフルオロフォアの溶液の同期蛍光スペクトルを示す単一曲線の変曲点
・ＳＡＦＡＳ Ｘｅｎｉｕｓ型蛍光光度計を用いて読み取った場合には、核酸とフルオロフォアの溶液の同期蛍光スペクトルを示す単一曲線の勾配の不連続点
本発明による方法は、レイリー干渉現象を限定または防止することができる点で有利である。
【００９１】
あるいは、２つの波長を基準とする場合、λ１およびλ２の一方は蛍光発光強度ピークが観察される発光波長を示し、他方は、該発光強度ピークの直前または直後の傾斜の変曲点または不連続点が観察される発光波長を示す。図１５および１６は、λ1およびλ２の選択を示している。好ましくは、λ１およびλ２の一方は蛍光発光強度ピークが観察される発光波長を示し、他方は、該発光強度ピークの直前の傾斜の変曲点または不連続点が観察される発光波長を示す。
【００９２】
２つの波長を使用する場合は、３つの波長を使用する場合に比較して、正確さに劣るが、その操作が簡単であると同時に、レイリー干渉現象を限定または防止することもできる。
【００９３】
蛍光光度計
本発明による蛍光光度計に関しては、励起光源の出力は、例えば励起波長において、２．５ｎｇ／ｍｌ程度の低濃度のＤＮＡを１０％未満の精度で読み取れることが好ましい。好ましくは、使用するモノクロメータの帯域幅が＋／−５ｎｍを超えない。発光、特に、発光方向に対して９０°で発光された光は、好ましくは、適当なシステムにより捕獲され、測定に特異的な波長を選択するために発光モノクロメータに向けられる。
【００９４】
Ｆの値は、好ましくは、メモリーに記憶されているアルゴリズムを使ってコンピュータにより計算する。さらに、本発明による蛍光光度計は、各測定グループの較正曲線などのデータを記憶できるシステムが装備されていることが好ましい。さらに好ましくは、本発明による蛍光光度計は、計算と記憶されている較正曲線を使った後に、検体中に含有される核酸の量を提供する。
【００９５】
さらに、本発明による蛍光光度計は、好ましくは、結果を表示するシステム、およびデータを作成してプリンター（またはプリンターを連結する設備）などに該データを転送するシステムが装備されている。また、さらに好ましくは、蛍光光度計は、検体と試薬を混合し、測定を行う読み取り容器に搬送することもできる。本発明の蛍光光度計は、好ましくは、例えば含有される核酸の量を計算するための１つ以上の検体を提供する患者の識別子を入力することができる数字入力または英数字入力キーボードを有する。分析の最後に、この識別子はプリンターを使って印刷されるレポートに記入することができる。さらに、蛍光光度計は、分析対象である検体を収容する容器に付されたバーコードを読み取るシステムを備えていても良い。本発明によるトレイなどの、蛍光光度計を使って測定できる容器に検体が収容されている場合には、各容器のバーコードは少なくとも１つの製品バッチ番号を有してよい。この番号も、分析の最後にプリンターを使って印刷されるレポートに記入されて良い。
【００９６】
本発明の蛍光光度計は、好ましくは、コンセントまたは電池（携帯使用の際）による電力を供給する少なくとも１つの手段、およびコンピュータシステムに連結する少なくとも１つの手段を装備している。蛍光光度計が複数の連結手段を装備している場合、これらの連結手段は、好ましくは、いくつかの異なる標準のものである。携帯使用では、蛍光光度計は、好ましくは、使用者が不便なく、例えば研究所の卓上に設置でき、簡単に移動できるよう、できるだけ小型で、例えば、次のような寸法、高さ＜１５ｃｍ、長さ＜２５ｃｍ、幅＜２０ｃｍを有し、できるだけ軽量である。
【００９７】
最後に、蛍光光度計は、好ましくは、試薬の搬送および混合ができるシステムを装備しており、特に、該システムが本発明によるトレイとともに使用されることが好ましい。
【００９８】
トレイ
本発明によるトレイは、本発明による方法に必要な機器および試薬の全て、すなわち、フルオロフォア、必要により希釈剤、測定容器、検体を収集するためのシステム、および測定を有効に行うために必要なものを含む。
【００９９】
本発明によるトレイとして、トレイに入れる種々の試薬（検体、緩衝液、フルオロフォア）の混合物を、例えば、加圧−減圧や機械的圧力により混合することができるように可撓性の材料が有利に使用される。
【０１００】
トレイの種々の区画（ウェル、リザーバ、容器）は、好ましくはキャピラリーにより連結されており、ある区画から他の区画への移動は、好ましくは、例えば、緩衝液リザーバ、フリオロフォアリザーバ、および／または標準化リザーバを押しつぶすことによって行われる。フルオロフォアリザーバを経由して緩衝液を移動すれば、フルオロフォアを希釈することができ、混合物を全体として容器に誘導できる。検体は、あらかじめ希釈されていてもいなくてもよく、蛍光光度計にトレイをセットする前あるいは後にトレイのウェルに添加され得る。好ましくは、正確な検体量をウェルに添加し、最適化された量の検体を、標準化リザーバを経由してフルオロフォアと混合するために容器に移動する。次いで、容器中での混合は、例えば、加圧−減圧や機械的圧力を容器に与えることにより行われる。本発明によるトレイは、濃縮溶液中のフルオロフォアおよび緩衝液のその場での混合により、蛍光発光に最適な最終濃度にすることができるので有利であり、フルオロフォアと検体とを均一化し、さらに適切な場合、検体の適切な希釈と発光された蛍光の測定を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】１／１００に希釈した血漿中に含まれるＤＮＡの同期蛍光スペクトルであり、ｙ軸は蛍光強度（ＵＦ）を、ｘ軸は発光波長（ｎｍ）を示す。
【図２】１／４０００希釈のピコグリーン（登録商標）、ＴＢＥ１倍緩衝液（ｐＨ８．４）、Δλ＝５０ｎｍでの健常者血漿中のＤＮＡの蛍光強度であり、血漿は１／１００に希釈し、ｙ軸は蛍光強度（ＵＦ）を、ｘ軸は発光波長（ｎｍ）を示す。
【図３】１／４０００希釈のピコグリーン（登録商標）、ＴＢＥ１倍緩衝液（ｐＨ８．４）、Δλ＝５０ｎｍでの疾患患者血漿中のＤＮＡの蛍光強度であり、血漿は１／１００に希釈し、ｙ軸は蛍光強度（ＵＦ）を、ｘ軸は発光波長（ｎｍ）を示す。
【図４】１／２００００希釈のピコグリーン（登録商標）、ＴＢＥ１倍緩衝液（ｐＨ８．４）、Δλ＝５０ｎｍでの健常者血漿中のＤＮＡの蛍光強度であり、血漿は１／１００に希釈し、ｙ軸は蛍光強度（ＵＦ）を、ｘ軸は発光波長（ｎｍ）を示す。
【図５】１／２００００希釈のピコグリーン（登録商標）、ＴＢＥ１倍緩衝液（ｐＨ８．４）、Δλ＝５０ｎｍでの疾患患者血漿中のＤＮＡの蛍光強度であり、血漿は１／１００に希釈し、ｙ軸は蛍光強度（ＵＦ）を、ｘ軸は発光波長（ｎｍ）を示す。
【図６】異なる３つのΔλ（５０ｎｍ、３５ｎｍ、および３０ｎｍ）、ＴＢＥ１倍緩衝液（ｐＨ８．４）での血漿中のＤＮＡの蛍光強度であり、ｙ軸は蛍光強度（ＵＦ）を、ｘ軸は発光波長（ｎｍ）を示す。
【図７】ＤＮＡ濃度（ｘ軸、ｎｇ／ｍｌ）の関数としての蛍光強度（ｙ軸、任意の望ましい単位）の直線性を示す。
【図８】前立腺癌患者からキットを使って抽出したＤＮＡを、ＴＢＥ１倍緩衝液（ｐＨ８．４）、１／２００００希釈のピコグリーン（登録商標）で、同期蛍光法（ｙ軸、コピー数／ｍｌ）およびリアルタイムＰＣＲ（ｘ軸、コピー数／ｍｌ）により測定したＤＮＡ濃度の相関を示す。
【図９】図８に示した結果から、リアルタイムＰＣＲにより測定したコピー数とリアルタイムＰＣＲにより得られたコピー数の関数としての同期蛍光法により測定されたコピー数との関連を示す。
【図１０】前立腺癌患者からキットを使って抽出したＤＮＡを、ＴＢＥ１倍緩衝液（ｐＨ８．４）、１／２００００希釈のピコグリーン（登録商標）で、同期蛍光法（ｙ軸、コピー数／ｍｌ）およびリアルタイムＰＣＲ（ｘ軸、コピー数／ｍｌ）により測定したＤＮＡ濃度の相関を示しており、ゲノムコピー数／ｍｌが１００を超える患者から抽出したＤＮＡの濃度のみを図８に示した結果との関連で保存したものである。
【図１１】前立腺癌または大腸癌患者から精製したＤＮＡを、ＴＢＥ１倍緩衝液（ｐＨ８．４）、１／２００００希釈のピコグリーン（登録商標）で、リアルタイムＰＣＲ（ｙ軸、コピー数／ｍｌ）および同期蛍光法（ｘ軸、コピー数／ｍｌ）により測定したＤＮＡ濃度の相関を示す。
【図１２】ゲノムコピー／ｍｌが１００を超える前立腺癌患者から検体を調製せずに得た血漿ＤＮＡを、ＴＢＥ１倍緩衝液（ｐＨ８．４）、１／２００００希釈のピコグリーン（登録商標）で、リアルタイムＰＣＲ（ｙ軸、コピー数／ｍｌ）および同期蛍光法（ｘ軸、コピー数／ｍｌ）により測定したＤＮＡ濃度の相関を示す。
【図１３】前立腺癌患者から検体を調製せずに得た血漿ＤＮＡを、ＴＢＥ１倍緩衝液（ｐＨ８．４）、１／２００００希釈のピコグリーン（登録商標）で、同期蛍光法（ｙ軸、コピー数／ｍｌ）および３波長または微分蛍光器を用いて（ｘ軸、ｎｇ／ｍｌ）測定したＤＮＡ濃度の相関を示す。
【図１４】島津ＲＦ５３５型蛍光光度計（上の曲線）およびＳＡＦＡＳ Ｘｅｎｉｕｓ型蛍光光度計（下の曲線）を用いて測定した、１／２００００希釈のピコグリーン（登録商標）、ＴＢＥ１倍緩衝液（ｐＨ８．４）での血漿中のＤＮＡの同期スペクトルであり、血漿は１／１００に希釈し、ｙ軸は蛍光強度（ＵＦ）を、ｘ軸は発光波長（ｎｍ）を示す。λ1、λ２、λ３をグラフから決定する方法を示している。
【図１５】２つの波長での蛍光強度（Ｉ１、Ｉ２）を用いる本発明による方法による蛍光（Ｆ）測定法の例を示す。
【図１６】２つの波長での蛍光強度（Ｉ１、Ｉ２）を用いる本発明による方法による蛍光（Ｆ）測定法の例を示す。
【実施例】
【０１０２】
本発明を以下の実施例を参照してより詳細に説明するが、該実施例は説明のためだけのものであって、なんら限定をもたらすものではない。
【０１０３】
機器
全血を遠心分離して血漿または血清をヘパリン化ＥＤＴＡ試験管に収集し、デカンテーションする。ＴＢＥ１倍緩衝液（ｐＨ８．５）（９０ｍＭトリス、９０ｎＭホウ酸、２ｍＭＥＤＴＡ）、ポリエチレン溶血試験管、アクリル容器、同期蛍光光度計（島津ＲＦ５３５リーダー、ＤＲ‐３データ分析器）、ピコグリーン（登録商標）（ｄｓＤＮＡ定量キット、Molecular Probes）、標準範囲にある濃度既知の標準ＤＮＡ。
【０１０４】
方法
Ａ．同期蛍光法の原理
ａ）従来の蛍光法における問題点
従来の蛍光検出法においてしばしば問題となる主なものは、励起と発光との波長差が小さいことに起因するレイリー散乱に関連するものである。この効果は、血清などの複雑なタンパク質化合物の媒体の分析の場合、特に大きい。
【０１０５】
従来の蛍光スペクトルを測定する場合には、モノクロメータの一方がスペクトルを掃引し、他方は固定したままにしておく。発光スペクトルを作成するには、励起波長を選択（ピコグリーン（登録商標）に対しては４８０ｎｍ）し、再発光された光を選択するモノクロメータはこの範囲外、例えば、４８０〜６２０ｎｍを掃引する。
【０１０６】
測定の開始時に、２つのモノクロメータを同じ波長にセットすると、発光モノクロメータは、溶液中の化合物分子により散乱された光に対応する非常に強い光信号を、検体が入っている容器から受け取る。散乱の際、僅かに多色性（polychromatic）である光は、少なくとも励起光と同じ波長を有するため、発光された光の強度の測定を干渉する。実際、蛍光の現象では、励起光は単色光ではなく、むしろ励起用モノクロメータによって選択された一組の波長に対応する。読み取り容器は単色光で照射する。溶液中の検体により発光された蛍光は多色性であり、一組の波長に対応する。この散乱光は、発光モノクロメータにより選択され、測定される。２つのモノクロメータ、励起モノクロメータと発光モノクロメータが同じ波長にセットされている場合には、２種類の光、散乱光と発光された光が測定される。発光の強度の測定は不可能である。これがレイリー干渉である。
【０１０７】
この散乱光の強度は、蛍光により発光された光に比較して非常に大きく、それを覆い隠してしまう。したがって、測定が定まらず、さらには不可能になってしまう。この干渉による問題を避けるためには、励起波長から十分に離れた波長の発光の強度を測定する必要がある。したがって、このような条件においては、非常に近い波長に由来するシグナルを正確に測定することは不可能である。
【０１０８】
従来の蛍光分析法に付随的に発生する現象を排除するためには、
・光学スリットの幅を狭くして、その集光範囲を狭くする（これは光線の強度を下げるので、必然的に分析感度が下がるのであるが）、または
・励起波長を置き換える（これは励起された分子の蛍光収率を下げるので、やはり分析感度が下がるのであるが）ことが必要である。
【０１０９】
ｂ）同期蛍光法の貢献
方法の原理
同期スペクトルを生成する際には、蛍光分光計が２つのモノクロメータを同時に動かす。この場合、もはや、励起スペクトルか発光スペクトルを生成するということでなく、一定の間隔（Δλと名づけた。本例では３０ｎｍ）だけ離れてセットされた波長の励起光および発光に対応する一組のシグナルを測定するということである。
【０１１０】
長所
１）レイリー散乱による干渉の排除
２つのモノクロメータが、同じ速度で動きながらスペクトルを掃引し、一定の間隔で相殺する。この場合、それらモノクロメータが同じ波長にないので、レイリー散乱に悩まされることはない。励起および発光光学システムのスリットを部分的に覆うと、残留干渉を起こすことがある。しかし、この干渉の程度は、測定の間ほとんど一定で、スペクトルの線形バックグラウンドとして現れる。それは、接線法により特定のシグナルの高さとして測定する際に容易に取り除くことができる。
【０１１１】
２）帯域幅の縮小
測定に使用される励起および発光波長が、蛍光のピーク収率を与える波長である場合、再発光強度はピークとなる。一方、これらの波長から離れるに従い、吸収された光の強度が励起の際に減少し、蛍光の収率が発光の際に減少するので、再発光された光の強度は弱くなる。同期蛍光の間に、２つの現象は合計され、再発光された光の変動はより大きくなる。これにより、従来のスペクトルにおいて得られるものと比較して、発光帯域の幅がスペクトル全体にわたって狭くなる。
【０１１２】
Ｂ．３波長での特異的蛍光の測定
前述の所見によって、同期蛍光技術から導かれる技術を推定することができる。本発明者らは、種々の異なる疾病患者から採取した数百のＤＮＡの測定により、同期スペクトルに観測される谷が常に存在し、特に、同じ波長では常に最小となる、ということを見出した。
【０１１３】
したがって、図１に示される同期スペクトルでは、３つの重要な点に注意すべきである。５０４ｎｍにおける「Ｉ１」と５７０ｎｍにおける「Ｉ３」の２つの変曲点。蛍光の強度「Ｆ」（単位は任意）は、２つの点Ｉ１とＩ３を結ぶことにより算出され、その蛍光の強度は、５２６ｎｍの発光ピークにおいて直線「Ｉ１Ｉ３」の交差までのピークの単に高さを測定することにより決定される。直線Ｉ１Ｉ３の下方のシグナルの高さはレイリー散乱による干渉シグナルに対応し、それは測定されない。
【０１１４】
接線法として知られているこの技術は、レイリー散乱によるバックグラウンドノイズを排除することができ、非常に優れた蛍光シグナルの近似値を与える。
【０１１５】
したがって、以上のことから、本発明者らは、これら３つの蛍光発光波長で新しい技術を開発することが可能であると結論づけた。
【０１１６】
したがって、次のような測定を行った。
【０１１７】
【数１６】
0005484051.tif 000017
【０１１８】
次に、主読み取り波長（λ２＝５２６ｎｍ）でのレイリー効果による蛍光値「ＩＲ」を推定することが必要である。この蛍光は、測定値Ｉ１およびＩ３に基づいて算出される。蛍光ピークは、完全に左右対称ではないので、蛍光ＩＲは、次の計算式により算出する。
【０１１９】
【数１７】
0005484051.tif 000018
【０１２０】
ＤＮＡに特異的な蛍光「Ｆ」は、次のように主波長でのＩＲ測定値に基づいて算出される。
【０１２１】
【数１８】
0005484051.tif 000019
【０１２２】
図１４は、蛍光を測定するこの方法が使用する分光蛍光計とは無関係に一般化することができることを示している。
【０１２３】
Ｃ．実施のモード
ピコグリーン（登録商標）の調製
エチノール／ＴＢＥの５０％（ｖ／ｖ）混合液で５０倍に希釈したピコグリーン（登録商標）の原液をエッペンドルフ（登録商標）試験管に１２０μｌずつ分取し、−２０℃の冷凍庫に遮光して保存する。
【０１２４】
実験操作
冷凍庫（−２０℃）に保存されていた一定量の血漿を解凍し、実験室の雰囲気温度（１５〜２５℃）に戻した後、ＴＢＥ１倍緩衝液で１０〜３００倍に希釈した（最終容量＝４５０μｌ）。これらの希釈物は、分析まで氷中保存する。
【０１２５】
４０ｍｌのＴＢＥ１倍緩衝液を分取し、１００μｌのピコグリーン（登録商標）を必要に応じて解凍して加え（最終希釈倍率：２００００倍）、遮光して氷中に保存する。
【０１２６】
少なくとも測定開始２０〜３０分前に分光蛍光計のスイッチを入れ、以下のようにプログラミングする。
・励起の間は、モノクロメータが４００ｎｍから６００ｎｍまでスキャンする。
・発光の間は、モノクロメータが４３０ｎｍから６３０ｎｍまでスキャンする。
【０１２７】
測定を行うために、以下の手順を採用する。
・１／２００００に希釈されたピコグリーン（登録商標）１．９ｍｌを取り、作業台上に遮光して載置されている溶血用試験管に移す。
・１００μｌの血漿／血清希釈液を加え（最終容量＝２ｍｌ）、混合物をボルテックスで８〜１２秒間混和した後、２〜３分作業台上に静置した。その後、混合物をポンプでアクリル容器に迅速に送り込み、スペクトルの記録を開始する。
【０１２８】
標準範囲は、常に、ピコグリーン（登録商標）を加えた既知濃度の標準ＤＮＡに基づいて作成され、この範囲は、２．５ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｎｇの点を選択した。
【０１２９】
注意：ＴＢＥ１倍緩衝液は、測定の少なくとも２４時間前に調製し、レイリー散乱現象を極力低減するように作業台の上に放置しておくことが必要である。
【０１３０】
Ｄ．結果
Ａ．実験条件の最適化
１．緩衝液の選択
ピコグリーン（登録商標）は、二重らせんＤＮＡの塩基間に入り込むので、緩衝液の性質は、蛍光シグナルに影響する。したがって、実験室に一般的に見られるさまざまな種類の緩衝液を試験した。
・ＴＢＥ１倍緩衝液（１Ｍトリス（ヒドロキシメチルアミン）アミノメタン、０．１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ＝７．５）：ピコグリーン（登録商標）に使用される従来の緩衝液である。
・１０ｍＭリン酸１カリウム緩衝液、ｐＨ＝７．８：リン酸緩衝液は、標準または血漿中に存在するＤＮＡの濃度を適切な精度で測定することを不可能にするような著しい蛍光を有している。
・ＴＢＥ１倍緩衝液（９０ｍＭトリス（ヒドロキシメチルアミン）アミノメタン、９０ｍＭホウ酸、２ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ＝８．５）：ＴＢＥ１倍緩衝液は、わずかに残存する蛍光を有するが、特に試験波長に蛍光ピークを有さない。したがって、その使用は、本発明による分析に有利である。
【０１３１】
２．ｐＨの選択
上記の緩衝液は、種々のｐＨ、すなわち５、５．５、６、６．５、７、７．５、８および８．５で試験した。
【０１３２】
これらのｐＨ範囲では、蛍光スペクトルに変化はない。
【０１３３】
３．試薬、ピコグリーン（登録商標）、の希釈倍率の選択
レイリー散乱に加えて、従来の緩衝現象、すなわち、自動抑制、消光、フェーディング、および競合を制限するために、蛍光分析は極めて低濃度の媒体中で行う。
【０１３４】
本発明者らは、最高の信号を与える、最低の試薬濃度を決定した。
【０１３５】
次の濃度のピコグリーン（登録商標）を試験した：１／１００、１／２５０、１／５００、１／１０００、１／２０００、１／４０００、１／８０００、１／１２０００および１／２００００。
【０１３６】
希釈度が低いと、信号の強度は弱くなる。過度に希釈程度が高いと、信号はほとんど再現性がなく、試験されたＤＮＡ濃度に比例した増加を示さない。
【０１３７】
シグナルは、１／４０００以上の希釈で検出可能になるが、感度が不足する。この希釈では、コントロール血漿（図２）と疾病患者血漿（図３）を区別することができない。
【０１３８】
ピコグリーン（登録商標）では、１／２００００希釈において最良の結果が得られる。この試薬の希釈濃度で、本技術は、感度と直線性を示し、コントロール血漿（図４）と疾病患者血漿（図５）を区別することができる。
【０１３９】
４．血漿希釈率の選択
生物学的マトリックスに関連する干渉を避けるために、できる限り高希釈度の検体を用いることが重要である。１／２０、１／５０、１／１００、１／１５０、１／２００、１／３００、１／４００に希釈した血漿を使用した。
【０１４０】
１／１００に希釈した血漿において、最良の結果が得られる。
【０１４１】
乳白色または濁った血漿であっても、血漿の濁度に関与するヘイズはなく、溶血、黄疸、高タンパク血症に関与するヘイズも観察されなかった。
【０１４２】
この希釈により、コントロール血漿を適切な精度で測定できる。
【０１４３】
５．励起光と発光との間の波長差の選択
ピコグリーン（登録商標）の製造者が提案するピーク励起波長およびピーク発光波長は、それぞれ４８５ｎｍと５３０ｎｍである。これらの波長の選択およびその波長差４５ｎｍという選択は、分子の特徴によるものであるかもしれないが、読み取り容器内での光の散乱に関与する材料のストレスにもよるものである。４５ｎｍという差の選択は、励起および発光波長が４０ｎｍだけ離れている場合にレイリー干渉を制御することだけができる大多数の蛍光光度計に関与する、技術的ストレスによるかもしれない。
【０１４４】
この場合には、それらはピーク蛍光波長ではなく、最良の感度と最小の干渉との間との間で妥協して波長を決める。
【０１４５】
同期蛍光の使用は、レイリー干渉を大幅に抑えながら、１０ｎｍ未満で分離され得る複数のピーク蛍光波長を有する分子を使用することができる。
【０１４６】
したがって、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０および５５ｎｍの差を試験した。
【０１４７】
励起波長および発光波長の差が３０ｎｍ（図６）であるときに、最良の感度が得られた。
【０１４８】
６．ピコグリーン（登録商標）の経時安定性
測定の繰り返し精度（repeatability）は次の通りである。
【０１４９】
【表１】
0005484051.tif 000020
【０１５０】
再現性（reproducibility）は次の通りである。
【０１５１】
【表２】
0005484051.tif 000021
【０１５２】
本技術の正確度（accuracy）は、臨床生物学における使用に許容できる。
【０１５３】
ｂ．同期蛍光技術の質
１．精度
精度（precision）には繰り返し精度および再現性試験が含まれる。
【０１５４】
繰り返し精度
試験は、さまざまな種類の検体を、同じ試薬を用いて同日に１０回測定することにより行った。
【０１５５】
本発明者らは、異なる濃度の３つの標準と患者血漿２検体（一方は１週間凍結したものであり、他方は新鮮血漿として分析に供した）を使用した。
【０１５６】
ＣＶ％（（標準偏差／平均）＊１００）で表した結果は、下記の表にまとめられている。
【０１５７】
【表３】
0005484051.tif 000022
【０１５８】
再現性
試験は、異なる２０の試験日に２０回、各試験日に再構成した試薬を用いて測定を行った。
【０１５９】
本発明者らは、分取して凍結保存した血漿検体と異なる濃度の３つの標準とを用いた。
【０１６０】
結果は、下記の表にまとめられている。
【０１６１】
【表４】
0005484051.tif 000023
【０１６２】
２．正確度
試験は、次のように行った。２つの精製ＤＮＡ検体を光度測定法（２６０ｎｍ）により分析した（ＲＮＡまたはタンパク質の存在により補正）。これらの測定値は、分析の参照値となる。これらの精製ＤＮＡ検体を同期蛍光法により分析した。
【０１６３】
下記の表では、該方法の正確度を光度測定法と比較して、検出されたＤＮＡの割合として表している。
【０１６４】
【表５】
0005484051.tif 000024
【０１６５】
３．検出閾値
検出閾値は、以下のように算出する。ＴＢＥ１倍緩衝液だけを含有する２０例を測定した。これらの１０回の測定の平均値を算出し、測定値の標準偏差の３倍値を該平均値に加えた。
【０１６６】
この方法により測定された閾値は、３．５ｎｇ／ｍｌである。
【０１６７】
４．感度閾値
２０％の適切な精度をもって検出できる第１のＤＮＡ濃度は、４ｎｇ／ｍｌであり、
比較的満足できるものであることが確認されている。健常者の循環ＤＮＡの血漿濃度は、ほぼ２〜６ｎｇ／ｍｌである。病院では、病的値がこれらの正常値より非常に高い値である。
【０１６８】
５．直線性試験
本技術では、４ｎｇ／ｍｌのＤＮＡ濃度から少なくとも５０００ｎｇ／ｍｌまで直線性を示している（図７）。
ｃ．３つの蛍光点の測定に関与する技術の質
本方法により得られた結果は、全ての点において同期蛍光技術の結果とあらゆる点において一致した（図１３）。
【０１６９】
結論：これらの第１の試験は、同期蛍光法または３つの蛍光点の測定に関与する方法は、臨床生物学に使用できる信頼できる技術であることを示している。
【０１７０】
これらの結果を、以下において定量ＰＣＲの結果と比較する。
ｄ．種々の癌（前立腺、大腸）における循環ＤＮＡの同期蛍光法による測定
第１段階として、同一のＤＮＡ抽出物を用いて、精製抽出物における該方法の有効性を確認し、参照方法、すなわち、定量ＰＣＲとの相対的な関連性を調べた。その後、第２段階として、常に該参照方法と比較しながら、患者血漿を用いて本方法の有効性を直接確認した。
【０１７１】
１．種々の癌からキットを用いて抽出したＤＮＡに対するＰＣＲ対蛍光光度法の相関関係
前立腺癌
相関関係は存在するが、低ＤＮＡ濃度において点の集団のゆがみが見られる（図８）。
【０１７２】
このゆがみを、図９に示す結果間の比のグラフにより分析する。顕著なゆがみが点集団のものであることが観察される。１００ゲノムコピー／ｍｌ未満では、同期蛍光法とは違って、ＰＣＲ技術では感度が不足していることが分かった。
【０１７３】
この１００ゲノムコピー／ｍｌの閾値以上では、優れた相関性が見られる（図１０）。
【０１７４】
異なる病期にある前立腺および大腸癌
前立腺癌または大腸癌の患者から得た検体について、第２の測定を行った。前記の一連の測定と同様に、定量ＰＣＲ技術では、１００ゲノムコピー／ｍｌの閾値が見出される（図１１）。
【０１７５】
２．血漿ＤＮＡに対するＰＣＲ対蛍光光度法の相関関係
調製処理をなされていない生物学的検体に対する有効性も調査した。本発明者らは、前立腺または大腸の癌患者の凍結血漿を用いた。特に、１００コピー／ｍｌ以上のゲノムコピーを有する検体（ｎ＝３２）を使用して、血漿中のＤＮＡを直接定量した（図１２）。
【０１７６】
相関関係に優れ、抽出ＤＮＡで得られる値と同じ値が得られることが観察される。
【０１７７】
ｅ．種々の癌（前立腺、大腸）における循環ＤＮＡの３点蛍光発光法による測定
同期蛍光法による測定と同時に、本発明者らは、３点の蛍光発光法によって、ＤＮＡの前処理を行わずに血漿中の循環ＤＮＡ濃度を分析した（図１３）。
【０１７８】
相関関係に優れ、同期蛍光で得られる値と完全に一致していることが見出される。したがって、循環ＤＮＡを測定する２つの新規技術は、参照技術、すなわち定量ＰＣＲと完全に同等であり、十分に相関性を有する。
【０１７９】
考察
定量ＰＣＲは、循環ＤＮＡの量を測定する方法として、現在最も広く使用されている。しかし、この方法は、比較的高価であり、専門的であり、救急医療センターで使用するにはふさわしくない。
【０１８０】
まさにその原理により、ＰＣＲは、検体中に存在する全てのＤＮＡを増幅してしまう。ＤＮＡ量がわずかに変動している患者の検体もほとんど同一の割合で増幅されるので、それを区別することはかなり難しい。この場合、ＰＣＲ技術は、感度が不足していることになる。患者はＤＮＡ濃度の明確な増加を示さない限り、コントロールから区別または他の検体から区別することができないのである。
【０１８１】
さらに、定量ＰＣＲでは、酵素および巨大分子（プライマー、精製ＤＮＡフラグメント、フルオロフォアなど）に富む複雑な反応媒体中で蛍光を測定するので、重大な干渉を分析に引き起こすリスクがある。媒体が濃縮されると、読み取られる蛍光が低くなることが知られている。これに関連して、干渉の主要なものとして、以下のようなものが考えられる。
・自己阻害：受け取ったエネルギーを消散する分子同士の衝突の回数の増加または非蛍光高分子の形成により、高濃度において蛍光の自己阻害が起こり得る。
・蛍光または消光の阻害：高濃度または不均質複合媒体では、蛍光分子と溶媒またはその他の溶質との間の干渉の結果として、蛍光または消光阻害現象が起こるリスクがある。蛍光の収率および／または蛍光の持続時間が減少する。実用の観点から、これは、阻害物質が存在すると化合物の発する蛍光は弱くなることを意味する。これは、予め精製されていない生物学的媒体の分析における欠点の１つである。さらに、消光が常に均一に起こるわけではない。
・フェーディング（光退色）：これは、反応型にある分子が他の分子と結合することによる、分子の破壊またはその反応性の欠如を引き起こす光の過励起による蛍光色素の蛍光発光の消失である。
・競合：これは、ガラス容器の特定の物質あるいは汚染物質の自己蛍光発光である。
【０１８２】
定量ＰＣＲでは、ＤＮＡを同期蛍光技術とほぼ同じ濃度で分析する場合、フルオロフォアは１０００倍以上の濃度で存在する。さらに、プライマー分子およびポリメラーゼ分子は、発光を干渉する濃度で存在する。
【０１８３】
この媒体中の高濃度の分子は、溶液中の分子による入射光の分散に関連するレイリー効果も促進する。４５ｎｍだけ離れているように、励起波長と発光波長とが近ければ近いだけ、感度が高くなる。これは、ランプ強度の選択や読み出しスロットの選択に重大な技術的制限をもたらす。
【０１８４】
これら全ての要素から、本発明者らは、さらに希釈した媒体中での分析に基づく新規な技術を考え出した。
【０１８５】
従来の蛍光技術を選択すると、分析の感度を大幅に高めるとともに、抽出と増幅工程を回避するので、干渉、技術的変動性、操作エラーといったリスクを引き起こす。
【０１８６】
同期蛍光法を選択すると、分析の特異性に優れ、ピーク励起・発光波長を使用することにより、分析の感度をさらに上げることができる。
【０１８７】
この方法を行うことにより、同期スペクトルに重要な３つの点が存在することを明らかした。全てのデータを分析することにより、本発明者らは、これらの点の安定性についても確信した。これらの点は常に存在し、常に同じ波長である。したがって、新しい測定方法は、３つの蛍光強度のみを測定し、ＤＮＡに特異的な蛍光を正確に測定するための計算式を展開することにより開発された。この新しい技術は、特に感度に関しては、同期蛍光法で開発されたと同等の優れた分析品質を有する。
【０１８８】
ＤＮＡ分析の感度が高いほど、患者の追跡調査において増加を早い段階で検出できる。このことは、年齢とともに正常値が次第に高くなっているように見える（データ非表示）高齢者（６５歳〜）の場合、特に当てはまる。この分析を適用できる分野は広がっていくと思われる。
【０１８９】
開発された技術は、非常に満足できるものである。これらの技術は非常に正確であり、分析範囲は臨床上の要求によく適合している。また、これらの技術は最も普通に使用されている技術、リアルタイム定量ＰＣＲ、と非常によく相関している。さまざまな相関関係は、今回の結果の優れた臨床的適切さを示すものである。１００ゲノムコピー／ｍｌという閾値は、定量ＰＣＲの病理上の判断の現時点での閾値である１５０ゲノムコピー／ｍｌに近いものである。これは、本発明者らの技術の場合のＤＮＡ１５０００ゲノムコピー／ｍｌ、これは文献中にも見出される値である、にほぼ対応する。
【０１９０】
したがって、本発明者らは、ＤＮＡの抽出および増幅工程を省くために２つの新規技術を規定し、これにより、分析時間を数分にまでかなり短くすることができた。
【０１９１】
参考文献
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以下に、出願時の特許請求の範囲の記載を示す。
［請求項１］
検体中に存在する核酸の量を測定する方法であって、
検体にフルオロフォアを添加し、
少なくとも２つの励起波長での光刺激に応じてそれぞれ少なくとも２つの発光波長でフ
ルオロフォアにより発光された蛍光強度を測定し、
該少なくとも２つの測定された蛍光強度から検体中に存在する核酸の量を導き出す、核
酸の量を測定する方法。
［請求項２］
該核酸が天然または合成由来である、請求項１に記載の方法。
［請求項３］
該核酸がＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１または２に記載の方法。
［請求項４］
該検体が天然または合成由来である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
［請求項５］
該検体が生物学的検体または生物学的検体誘導体である、請求項１から４のいずれか１
項に記載の方法。
［請求項６］
該検体が生物学的検体から希釈により誘導されたものである、請求項５に記載の方法。
［請求項７］
該検体が細胞破壊を起こしていた可能性のある生理病理的状態にあった患者を起源とす
るものである、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
［請求項８］
測定された核酸の量を細胞死の特徴づけとの関連で使用する、請求項５から７のいずれ
かに記載の方法。
［請求項９］
該フルオロフォアが核酸挿入剤である、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
［請求項１０］
該フルオロフォアがピコグリーン（Picogreen（登録商標）、［Ｎ−ビス−（３−ジメ
チルアミノプロピル）−アミノ］−４−［２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１
，３−チアゾル−２−イル）−メチリデン］−１−フェニル−キノリニウム］＋）である
、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
［請求項１１］
３つの励起波長λ’1、λ’２、λ’３での光刺激に応じてそれぞれ３つの発光波長λ1
、λ２、λ３で該フルオロフォアにより発光された蛍光強度（Ｉ1、Ｉ2、Ｉ3）を測定し
、ただしλ1＜λ２＜λ３であり、λ1、λ２、λ３は予め決定する、請求項１から１０の
いずれか１項に記載の方法。
［請求項１２］
前記核酸の量を下記のＦの値から導き出す、請求項１１に記載の方法。
【数１】
0005484051.tif 000025
［請求項１３］
該フルオロフォアがピコグリーン（登録商標）であり、該波長が下記の通りである請求
項１１又は１２に記載の方法。
【数２】
0005484051.tif 000026
［請求項１４］
２つの励起波長λ’1およびλ’２での光刺激に応じてそれぞれ２つの発光波長λ1およ
びλ２でフルオロフォアにより発光された蛍光強度Ｉ1およびＩ2をそれぞれ測定し、λ’
1およびλ’２は予め決定する、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
［請求項１５］
該核酸の量を、好ましくは、Ｉ1およびＩ２間の差の絶対値、すなわち、下記のＦの値
から導き出す、請求項１４に記載の方法。
【数３】
0005484051.tif 000027
［請求項１６］
該フルオロフォアがピコグリーン（登録商標）であり、該波長は下記の通りである、請
求項１４または１５に記載の方法。
【数４】
0005484051.tif 000028
［請求項１７］
該検体中の核酸の量を、較正曲線を用いてＦの値から導き出す、請求項１２または１５
に記載の方法。
［請求項１８］
２つおよび／または３つの励起波長λ’1、λ’２および場合によりλ’３で光励起す
るための１つ以上の手段、
３つの発光波長λ1、λ２および場合によりλ３で発光された蛍光強度Ｉ1、Ｉ2および
場合によりＩ3を測定する１つ以上の手段、および
下記の値Ｆを計算することを可能とする計算機、を含んでなることを特徴とする、請求
項１０から１７のいずれか１項に記載の方法を行うのに適した蛍光光度計。
【数５】
0005484051.tif 000029
［請求項１９］
該励起および発光波長が下記の通りである、請求項１８に記載の蛍光光度計。
【数６】
0005484051.tif 000030
［請求項２０］
該励起および発光波長が下記の通りである、請求項１８に記載の蛍光光度計。
【数７】
0005484051.tif 000031
［請求項２１］
その内部と外部の間で光の交換が可能な混合及び測定容器を含む、化合物の蛍光アッセ
イ用のトレイであって、該容器が、
フルオロフォアを含有し、それ自体、希釈液を含有するリザーバに接続されている、フ
ルオロフォアリザーバ、および
分析される化合物を含有する検体の体積を標準化するためのリザーバであって、それ自
体、該分析される化合物を含有する検体を収集するためのウェルに接続されている、標準
化リザーバ、
に接続されている、化合物の蛍光分析用トレイ。
［請求項２２］
収集された溶液が該標準化リザーバの方向にのみ通過できるように、該収集ウェルと該
標準化リザーバとの間に、
該収集された溶液が該混合及び測定容器の方向にのみ通過できるように、該標準化リザ
ーバと該容器との間に、
該希釈液が該フルオロフォアリザーバの方向にのみ通過できるように、該希釈溶液含有
リザーバと該フルオロフォアリザーバとの間に、および
該希釈液が該混合及び測定容器の方向にのみ通過できるように、該フルオロフォアリザ
ーバと該容器との間に、
逆止弁が配置されている、請求項２１に記載のトレイ。
［請求項２３］
該標準化リザーバ、該混合及び測定容器、該フルオロフォアリザーバ、および該希釈液
リザーバからなる区画が十分な弾力性を有する物質でできており、それら器に入っている
液体をそれら器に圧力を与えることによって移動させることができる、請求項２１または
２２に記載のトレイ。
［請求項２４］
該フルオロフォアがピコグリーン（登録商標）であり、該希釈液がトリス‐ホウ酸‐Ｅ
ＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝液である、請求項２１から２３のいずれか１項に記載のトレイ。
［請求項２５］
該標準化リザーバが、該収集された溶液中に含有され、１０００ヌクレオチド未満の長
さを有する核酸分子を選択するための手段に連結されている、請求項２１から２４のいず
れか１項に記載のトレイ。
【図１】
0005484051.tif 000041
【図２】
0005484051.tif 000042
【図３】
0005484051.tif 000043
【図４】
0005484051.tif 000044
【図５】
0005484051.tif 000045
【図６】
0005484051.tif 000046
【図７】
0005484051.tif 000047
【図８】
0005484051.tif 000048
【図９】
0005484051.tif 000049
【図１０】
0005484051.tif 000050
【図１１】
0005484051.tif 000051
【図１２】
0005484051.tif 000052
【図１３】
0005484051.tif 000053
【図１４】
0005484051.tif 000054
【図１５】
0005484051.tif 000055
【図１６】
0005484051.tif 000056