(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺疾患、障害もしくは傷害、およびそれにより生じた損傷を治療するための薬剤において、
臍帯組織由来細胞、
を含み、
前記臍帯組織由来細胞は、血液のないヒト臍帯組織由来であり、培養中に自己再生および増殖することができ、少なくとも肺組織の細胞に分化する能力を有し、ＣＤ１１７に対して陰性である、薬剤。
【請求項２】
請求項１に記載の薬剤において、
前記肺疾患、障害もしくは傷害は、閉塞性の疾患もしくは障害、拘束性の疾患もしくは障害、または直接的もしくは間接的な傷害であるか、あるいはそれらにより生じる、薬剤。
【請求項３】
肺疾患を治療するための薬剤において、
臍帯組織由来細胞、
を含み
前記細胞は、血液のないヒト臍帯組織由来であり、培養中に自己再生および増殖することができ、ＣＤ１１７およびＣＤ４５に対して陰性であり、テロメラーゼまたはｈＴＥＲＴを発現しない、薬剤。
【請求項４】
請求項１または３に記載の薬剤において、
前記臍帯組織由来細胞は、ｈＴＥＲＴまたはテロメラーゼを発現しない、薬剤。
【請求項５】
請求項１または３に記載の薬剤において、
前記細胞は、肺組織に分化するようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導される、薬剤。
【請求項６】
請求項１または３に記載の薬剤において、
少なくとも１つの他の細胞型、
をさらに含む、薬剤。
【請求項７】
請求項６に記載の薬剤において、
前記他の細胞型は、肺前駆細胞、血管平滑筋細胞、血管平滑筋前駆細胞、周皮細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞および、他の多分化能もしくは多能性幹細胞からなる群から選択される、肺組織細胞である、薬剤。
【請求項８】
請求項１または３に記載の薬剤において、
前記細胞は、少なくとも１つの他の薬剤と共に投与される、薬剤。
【請求項９】
請求項８に記載の薬剤において、
前記少なくとも１つの他の薬剤は、抗血栓薬、抗炎症薬、免疫抑制剤、免疫調節剤、血管新生促進剤、および抗アポトーシス薬からなる群から選択されるである、薬剤。
【請求項１０】
請求項２に記載の薬剤において、
前記細胞は、前記肺疾患、障害もしくは傷害の部位で投与される、薬剤。
【請求項１１】
請求項１または３に記載の薬剤において、
前記臍帯組織由来細胞は、注入、注射、患者に植え込まれた装置によって、または前記細胞を含有するマトリックスもしくは足場の植え込みによって、投与される、薬剤。
【請求項１２】
請求項１または３に記載の薬剤において、
前記細胞は、患者の前記肺組織に栄養作用を及ぼす、薬剤。
【請求項１３】
請求項１または３に記載の薬剤において、
前記細胞は、患者の血管平滑筋または血管内皮に栄養作用を及ぼす、薬剤。
【請求項１４】
請求項１３に記載の薬剤において、
前記血管平滑筋に対する前記栄養作用は、血管平滑筋細胞の増殖である、薬剤。
【請求項１５】
請求項１３に記載の薬剤において、
前記血管内皮に対する前記栄養作用は、血管内皮細胞の増殖である、薬剤。
【請求項１６】
請求項１または３に記載の薬剤において、
前記細胞は、前記肺疾患、障害もしくは傷害の部位への、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、血管平滑筋細胞、血管平滑筋前駆細胞および周皮細胞からなる群から選ばれた１つまたは複数の遊走を誘発する、薬剤。
【請求項１７】
肺疾患、障害もしくは傷害を有する患者を治療するための医薬組成物において、
医薬的に許容可能な担体および、前記肺疾患、障害もしくは傷害を治療するのに有効な量の臍帯組織由来細胞、
を含み、
前記臍帯組織由来細胞は、血液のないヒト臍帯組織由来であり、培養中に自己再生および増殖することができ、少なくとも肺組織の細胞に分化する能力を有し、ＣＤ１１７に対して陰性である、医薬組成物。
【請求項１８】
肺疾患、障害もしくは傷害を有する患者を治療するためのキットにおいて、
医薬的に許容可能な担体と、
臍帯組織由来細胞集団と、
前記患者を治療する方法において前記キットを使用するための説明書と、
を含み、
前記臍帯組織由来細胞は、血液のないヒト臍帯組織由来であり、培養中に自己再生および増殖することができ、少なくとも肺組織の細胞に分化する能力を有し、ＣＤ１１７に対して陰性である、キット。
【請求項１９】
肺疾患、障害もしくは傷害を有する患者を治療するための医薬組成物において、
医薬的に許容可能な担体と、
臍帯組織由来細胞から作られた製剤と、
を含み、
前記臍帯組織由来細胞は、血液のないヒト臍帯組織由来であり、培養中に自己再生および増殖することができ、少なくとも肺組織の細胞に分化する能力を有し、ＣＤ１１７に対して陰性である、医薬組成物。
【請求項２０】
肺疾患、障害もしくは傷害を有する患者を治療するためのキットにおいて、
請求項１９に記載の医薬組成物、
を含む、キット。
【請求項２１】
請求項１７または１９に記載の医薬組成物において、
前記臍帯組織由来細胞は、ｈＴＥＲＴまたはテロメラーゼを発現しない、医薬組成物。
【請求項２２】
請求項１８に記載のキットにおいて、
前記臍帯組織由来細胞は、ｈＴＥＲＴまたはテロメラーゼを発現しない、キット。
【発明の詳細な説明】
【開示の内容】
【０００１】
〔関連出願への相互参照〕
本出願は、２００８年１２月１９日出願の米国仮特許出願第６１／１３９，４２５号の利益を主張するものであり、この仮特許出願の内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【０００２】
〔発明の分野〕
本発明は、肺の障害、疾患、および傷害の、細胞に基づいた療法または再生療法の分野に関する。
【０００３】
〔発明の背景〕
特許、公開済み出願、および技術論文を含む、さまざまな文献を、本明細書全体にわたって挙げる。挙げられたそれらの文献はそれぞれ、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【０００４】
肺疾患は、慢性および急性のいずれであっても、世界中で、罹患率および死亡率の大きな原因のままである。慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、世界で死因の第４位であり（Ｓｐｕｒｚｅｍ  ａｎｄ  Ｒｅｎｎａｒｄ，  Ｓｅｍｉｎ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ，２００５；２６：１４２−１５３）、これは、気道が解剖学的に狭まるか、または正常な呼吸を妨げる粘液で気道が遮られることによって、生じ得る。さらに、肺線維症としても知られる間質性肺疾患は、さまざまな慢性肺障害を含む制限的疾患として分類される。慢性肺疾患の管理には、薬物療法、酸素療法、手術、および肺のリハビリテーションが含まれる。
【０００５】
ＣＯＰＤ患者の９０％が喫煙家であるが、喫煙家のうちわずか１０％がこの疾患を発病し、このことは、遺伝的素因が重要な予後因子であることを示唆している（Ｓｉａｆａｋａｓ  ａｎｄ  Ｔｚｏｒｔｚａｋｉ，  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｍｅｄ，  ２００２  Ａｕｇ．；９６（８）：６１５−２４）。喫煙家の肺疾患は、慢性活動性炎症、気道粘液分泌過多、および気腫により特徴付けられ（ＭａｃＮｅｅ，  Ｐｒｏｃ  Ａｍ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｏｃ．，２００５；２（４）：２５８−６６；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  ２９０−１）、禁煙した場合、部分的に元に戻せるにすぎない（Ｓｐｕｒｚｅｍ  ａｎｄ  Ｒｅｎｎａｒｄ，  Ｓｅｍｉｎ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ，２００５；２６：１４２−１５３）。気道および肺実質の炎症は、慢性閉塞性肺疾患の病変形成に、主要な役割を果たす。タバコの煙は、タバコの煙への暴露がやめられていたとしても、肺の炎症を誘発し、最終的にはＣＯＰＤを引き起こすことが分かっている。
【０００６】
気腫は、慢性閉塞性肺疾患における罹患率および死亡率を決定する主要な要因の１つである。この疾患は、例えば、肺胞などの肺組織を支持する構造体の破壊、および肺胞への送り込みをする（ｆｅｅｄｉｎｇ）毛細血管の破壊による、肺組織の弾性損失によって、特徴付けられる。この破壊は、炎症性酵素、例えばエラスチンによって生じ得る。気腫は、肺（呼吸細気管支および肺胞を含む）における末梢気腔の拡張として定義され、これは肺胞壁構造の破壊を伴うものである。気腫を有する患者の出現頻度は、環境汚染物質、喫煙、および他の、有害物質への暴露の増加の結果として、過去数十年で増加している。現在の標準治療は、今日、肺移植のみが重篤な気腫の治療を提供できることを明示している。エラスターゼ誘発気腫などの気腫を有する患者において、肺の損傷を治療し、修復し、かつ／または改善する、適切かつ有用なアプローチに対する必要性が残っている。
【０００７】
タバコの煙にさらされた動物モデルが、病態、およびさまざまな治療的介入の有効性を調べるために、研究された。残念ながら、これらの研究は、限られた成功しか証明できなかった。問題の一部は、一般的に使用されるラットおよびマウス株が、タバコの煙に対して、軽度の炎症および粘液分泌を示したに過ぎないことであり（Ｇｕｅｒａｓｓｉｍｏｖ，  Ａ，  ｅｔ  ａｌ，  Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｍｅｄ，  ２００４  Ｎｏｖ．１；１７０（９）：９７４−８０．  Ｅｐｕｂ  ２００４  ＪｕＩ．２８）、対応する傷害は、迅速に元に戻すことができる。したがって、実験室の健康なげっ歯類は、傷害後に肺機能を補い再生する、並外れた能力を有することができ、これは、ＣＯＰＤの発症に対するげっ歯類の相対抵抗の基礎となることができるものである。遺伝的に罹患しやすい自発性過敏症のラット（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｅｄ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  （ＳＨ）  ｒａｔｓ）が、ＣＯＰＤの患者でも見られる表現型（例えば、全身炎症、凝固亢進、酸化的ストレス、および抑制された免疫機能）を示すことが、最近分かった（Ｙｕ，  Ｂ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｈａｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ，  ２００８  Ｍａｙ；２０（７）：６２３−３３）。したがって、ＳＨラットモデルは、実験的ＣＯＰＤのより関連的なモデルとなり得る。
【０００８】
制限的肺疾患は、罹患率および死亡率の最も一般的な原因の１つであり、３つの一次病因、すなわち、肺がん、肺炎、および肺線維症を有する。突発性肺線維症（ＩＰＦ）は、進行性の呼吸困難により特徴付けられる有害な疾患であり、高い死亡率、進行性固定組織線維症、構築的歪み、および機能喪失を伴う（Ｏｒｔｉｚ，  ＬＡ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．，２００３  ＪｕＩ．８，２００３；１００（１４）：８４０７−１１．Ｅｐｕｂ  ２００３  Ｊｕｎ．１８）。過度の線維化促進サイトカイン（ｐｒｏｆｉｂｒｏｔｉｃ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）、または抗線維化サイトカインの欠乏が、病理過程に関わっている。米国では、突発性肺線維症の有病率評価は、１０万人当たり３〜６件とさまざまである。現在、疾患の経過を逆行させるかまたは遅らせる、有効な療法はない。副腎皮質ステロイド、免疫抑制剤、免疫調節剤、または抗線維化薬などの大部分の治療薬が、炎症を抑制しようとするが、ＩＰＦ疾患の進行を変えるものは何も証明されていない。したがって、線維症を遅らせるかもしくは停止させると共に、内在性の肺修復および再生を促進することを目的とした、新規な療法の開発に対するかなりの必要性がある。
【０００９】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、ブレオマイシン（ＢＬＭ）で損傷されたマウスの損傷した肺において肺胞上皮細胞に分化することができ、ＭＳＣの生着により、損傷した肺組織における炎症およびコラーゲン沈着を抑制することができることが示されている（Ｚｈａｏ，  Ｆ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，２００８  Ｊｕｎ．；４０（５）：１７００−１７０５；Ｏｒｔｉｚ，  ＬＡ，  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．，２００３  Ｊｕｌ．８，２００３；１００（１４）：８４０７−１１，  Ｅｐｕｂ  ２００３  Ｊｕｎ．１８；Ｒｏｊａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２００５；３３：１４５）。ＢＬＭは、抗腫瘍活性のある細胞増殖抑制性抗生物質であり、動物モデルにおいて肺線維症を研究するための、よく認識された化合物である。ＢＬＭは、肺胞上皮細胞傷害および炎症を肺において誘発し、肺線維症を引き起こす。
【００１０】
急性肺傷害（ＡＬＩ）および急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）も、引き続き、集中治療環境において罹患率および死亡率の大きな原因である。ＡＬＩおよびＡＲＤＳは、直接的な傷害（例えば、溺水、肺炎、有毒ガス吸い込み、および肺挫傷）または間接的な傷害（例えば、重篤な敗血症、輸血、ショック、および膵炎）に反応して、びまん性肺水腫を伴う低酸素血症が突然発症することにより特徴付けられる、重い疾患である。ＡＬＩおよびＡＲＤＳは、現在、機械的換気、および支持的ケアによって治療される。
【００１１】
細胞療法は、探索医療の最も面白い分野の１つであり、広範囲の臨床的障害を治療する新しい治療プラットフォームに発展している。過去５年間にわたり、肺疾患における細胞療法の分野は、急速に発展し続けた。いくつかの研究が、肺疾患を治療するため細胞療法を採用する可能性を証明している。例えば、循環血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）は、罹患した肺血管系の再生に貢献でき、また、肺高血圧症を持つ患者において調べられている（Ｄｉｌｌｅｒ，  Ｇ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２００８  Ｊｕｎ  １０，１１７（２３）：３０２０−３０，ＥＰｕｂ  ２００８  Ｊｕｎ  ２）。さらに、最近の出版物では、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）も、炎症および免疫介在性の肺疾患のいくつかのマウスモデルにおいて肺傷害および炎症を抑制することが証明されている（Ｗｅｉｓｓ，  Ｄ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ  Ａｍ  Ｔｈｏｒａｃ．  Ｓｏｃ．，２００８  ＪｕＬ  １５；５（５）：６３７−６７）。これらの見込みある発見にもかかわらず、ＡＬＩの細胞療法の発展に関して、ほとんど注意が払われていない。
【００１２】
現在、分裂および分化できる幹細胞、または、平滑筋細胞および骨格筋細胞を含む、他の供給源からの筋細胞のいずれかを使用して、肺の疾患、障害、または傷害による肺損傷などの組織損傷の修復または回復を助けることへの関心がある。幹細胞の移植を、臨床ツールとして用いて、標的組織を再構成し、それにより、生理学的および解剖学的な機能性を回復することができる。幹細胞テクノロジーの適用は、組織工学、遺伝子療法送達（ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）、および細胞治療学、すなわち、生物学的薬物（ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ）を、それらの薬物を産生もしくは含有する外因的に供給された生細胞または細胞成分を介して標的場所に送達すること、を含めて、広範囲にわたる。幹細胞の識別により、再生医療のため特定の細胞型を選択的に生成することを目的とした調査が振興された。
【００１３】
血管構造を含め、多くの肺組織に分化する能力を有するそのような細胞の実質的に同種の集団の、確実でよく特徴付けられたたくさんの供給は、肺の修復、再生、保護および改善のため、また、肺疾患、障害、および／または傷害による肺損傷前、その最中、またはその後の、血流ならびに酸素／ＣＯ２交換の改善のため、さまざまな診断および治療の適用において有利であろう。
【００１４】
〔発明の概要〕
本発明の一態様は、肺の疾患、障害、および／または傷害を有する患者を治療する方法を特徴とする。そのような疾患、障害、および／または傷害には、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺線維症、急性肺傷害（ＡＬＩ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、およびそれに関連する損傷が含まれるがこれらに限定されない。
【００１５】
本発明の一態様は、肺疾患、障害および／または傷害を有する患者を治療する方法を特徴とし、この方法は、肺疾患、障害および／または傷害、ならびにそれに伴う損傷を治療するのに有効な量の臍帯組織由来細胞を患者に投与することを含む。
【００１６】
特定の実施形態では、肺疾患、障害、および／または傷害は、閉塞性であり、拘束性であり、かつ／または、ＡＬＩおよび／もしくはＡＲＤＳと関連するかまたはそれらを引き起こすような傷害から生じる。ある実施形態では、細胞は、投与前に肺組織細胞、例えば、血管平滑筋、周皮細胞、または血管内皮系細胞に分化するように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘発される。他の実施形態では、細胞は、遺伝子操作されて、肺疾患、障害、および／または傷害の治療を促進する遺伝子産物を産生する。
【００１７】
この方法のいくつかの実施形態では、細胞は、少なくとも１つの他の細胞型と共に投与され、これには、肺組織細胞、例えば、肺前駆細胞、血管平滑筋細胞、血管平滑筋前駆細胞、周皮細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、または他の多分化能もしくは多能性幹細胞が含まれ得る。その他の細胞型は、臍帯組織由来細胞と同時に、その前に、またはその後で、投与されてもよい。
【００１８】
他の実施形態では、細胞は、少なくとも１つの他の薬剤と共に投与され、これは、例えば、抗血栓薬、抗炎症薬、免疫抑制薬、免疫調節薬、血管新生促進薬、または抗アポトーシス薬であってよい。その他の薬剤は、臍帯組織由来細胞と同時に、その前、またはその後に、投与されることができる。
【００１９】
細胞は、肺疾患、障害、および／または傷害の部位で、またはその近位で投与されるのが好ましいが、そのような部位の遠位の場所で投与されてもよい。細胞は、注射、注入、患者に植え込まれる装置によって、またはそれらの細胞を含有するマトリックスもしくは足場の植え込みによって、投与されることができる。細胞は、患者の肺組織に対し、増殖などの栄養作用を及ぼすことができる。細胞は、肺疾患、障害、および／または傷害の部位への、肺組織細胞、例えば、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞、肺前駆細胞、周皮細胞、血管平滑筋前駆細胞、または血管内皮前駆細胞の遊走を誘発し得る。
【００２０】
本発明の別の態様は、肺疾患、障害、および／または傷害を有する患者を治療するための、医薬組成物およびキットを特徴とし、これは、医薬的に許容可能な担体、希釈剤および／または緩衝液、ならびに臍帯組織由来細胞またはそのような臍帯組織由来細胞から作られた製剤を含む。いくつかの好適な実施形態では、この製剤は、ＦＧＦおよびＨＧＦを含む。医薬組成物およびキットは、前記に概説したような本発明の方法を実行するために設計および／または処方される。
【００２１】
本発明の別の態様によると、前述した方法は、臍帯組織由来細胞から作られた製剤を用いて実行されてよく、製剤は、臍帯組織由来細胞の細胞可溶化液、臍帯組織由来細胞の細胞外マトリックス、もしくは臍帯組織由来細胞が中で成長する馴化培地を含む。このような製剤はＦＧＦおよびＨＧＦを含むのが好ましい。本発明の別の態様は、臍帯組織由来細胞の産物、例えば、栄養因子で本発明を実施することを含む。
【００２２】
本発明の他の態様は、臍帯組織由来細胞の細胞可溶化液、細胞外マトリックス、または馴化培地を含む製剤を含有する、医薬組成物およびキットを特徴とする。組成物はまた、当技術分野で既知のような、医薬的に許容可能な担体、希釈剤および／または緩衝液を含むこともできる。本発明の他の態様は、臍帯組織由来細胞の産物を含む医薬組成物およびキットでの治療を特徴とする。
【００２３】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および実施例を参照することにより、理解されるであろう。
【００２４】
〔詳細な説明〕
以下の、例示的な実施形態の詳細な説明では、この一部を形成する添付図面について参照を行う。これらの実施形態は、当業者が本発明を実施できるよう十分詳細に説明してあり、他の実施形態を使用してよいこと、ならびに、本発明の主旨または範囲から逸脱せずに、論理的、構造的、機械的、電気的および化学的変更がなされてよいこと、が理解される。本明細書に記載する実施形態を当業者が実施できるようにするのに必要ない詳細を回避するために、この説明は、当業者に既知の、ある情報を省略する場合がある。したがって、以下の詳細な説明は、限定的な意味で理解されるものではない。
【００２５】
明細書および請求項を通じて、さまざまな用語が使用される。そのような用語は、特に指定のない限り、当技術分野の通常の意味が与えられている。特に定義された他の用語は、本明細書で提供される定義と一致するように解釈されるものである。
【００２６】
「肺組織」には、全ての肺組織構造体および関連組織（静脈、動脈、血管、毛細血管、およびそのような構造体の一部であるかもしくはそれと関連する種類の細胞を含むがそれらに限定されない）；肺および胸膜組織（ｐｌｅａｕｒａｌ  ｔｉｓｓｕｅ）；および血管平滑筋、周皮細胞、ならびに血管内皮系列および／または表現型が含まれ得るがこれらに限定されない。
【００２７】
本明細書で使用される「呼吸器または肺疾患、障害、および傷害」には、閉塞性肺疾患、拘束性肺疾患、気道感染症（上下）、呼吸器の腫瘍、胸膜腔の疾患、および肺血管疾患が含まれるがこれらに限定されない。このような疾患、障害、および／または傷害により生じる、肺組織への損傷は、本発明の範囲内の肺損傷として特徴付けられ得る。さらに、本発明に包含される損傷肺組織には、全ての肺組織構造体および関連組織（静脈、動脈、血管、毛細血管、およびそのような構造体の一部であるかもしくはそれと関連する種類の細胞を含むがそれらに限定されない）が含まれる。「閉塞性肺疾患」には、ＣＯＰＤ、嚢胞性線維症、気管支拡張症、細気管支炎、気腫、およびアレルギー性気管支肺アスペルギルス症が含まれ得る。ＣＯＰＤは、例えば、肺で異常な炎症反応を誘発する、（最も一般的には喫煙による）有害な粒子またはガスにより、生じる。大きな気道での炎症反応は、慢性気管支炎として知られ、これは、人が定期的に咳をして痰を吐き出す場合に臨床的に診断される。肺胞では、炎症反応により、肺組織の破壊が生じ、これは気腫として知られるプロセスである。これらの問題は、本発明に関連するので、ＣＯＰＤに付随するものであることが、認識されるべきである。ＣＯＰＤの病因には、喫煙、職業的に職場のほこりにさらされること（例えば、採炭、金採掘、木綿工業、および化学工業）、大気汚染、ならびに遺伝学が含まれるが、これらに限定されない。
【００２８】
本明細書で使用される「拘束性肺疾患」は、間質性肺疾患（ＩＬＤ）としても知られる。これらの多くは、突発性である。その例には、突発性肺線維症、突発性間質性肺炎（数種類）、サルコイドーシス、好酸球性肺炎、リンパ脈管筋腫症、肺のランゲルハンス細胞の組織球症、および、肺の肺胞タンパク質症が含まれる。ＩＬＤは肺の間質：すなわち、肺胞上皮、肺の毛細血管内皮、基底膜、血管周囲組織および外リンパ組織に影響を及ぼす。ＩＬＤのほとんどの種類が線維症を含む。
【００２９】
呼吸器腫瘍には、悪性腫瘍および良性腫瘍の双方が含まれる。悪性腫瘍には、例えば、小細胞肺がん、非小細胞肺がん（腺がん、扁平上皮がん、および大細胞未分化がん）、リンパ腫、ならびに他のがんが含まれる。良性腫瘍は稀であるが、例えば肺の過誤腫および先天奇形が含まれ得る。
【００３０】
本明細書で使用される、「急性肺障害」（ＡＬＩ）は、低酸素血症、非心原性肺水腫、低い肺コンプライアンス、および広範囲に及ぶ毛細血管の漏れにより特徴付けられる、びまん性異種性肺傷害である。ＡＬＩは、局所または全身の炎症の任意の刺激により生じる。急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）は、ＡＬＩよりさらに重篤である。本明細書で使用される、ＡＬＩおよびＡＲＤＳは、直接的傷害または間接的傷害に応答して、びまん性肺水腫のある低酸素血症が突然発症することにより特徴付けられ得る。本明細書で使用される、「直接的傷害」には、溺水エピソード（ｄｒｏｗｎｉｎｇ  ｅｐｉｓｏｄｅｓ）、肺炎、有毒ガスの吸い込み、および肺挫傷から生じる肺傷害が含まれるがこれらに限定されない。本明細書で使用される「間接的傷害」は、例えば重篤な敗血症、輸血、ショック、および膵炎によるものであり得る。ＡＬＩおよびＡＲＤＳを引き起こすこれらの傷害は、肺胞−毛細血管のインターフェースの崩壊、タンパク質を豊富に含む流体の、間質および肺胞空間への漏れ、サイトカインの広範な放出、ならびに、好中球の遊走を結果として生じる。
【００３１】
本発明の方法により包含される肺疾患、障害、および傷害は、当技術分野で既知である。関連する合併症、病因、および治療を含むそれぞれの特徴は、当業者によって知られている。これには、本明細書で特に説明しない肺疾患、障害、および傷害が含まれるが、これは閉塞性および拘束性肺疾患、障害、および傷害に当てはまるためである。
【００３２】
本発明で使用される細胞は、概して、分娩後細胞または分娩後由来細胞（ＰＰＤＣ）と呼ばれる。これらの細胞は、より具体的には「臍由来細胞」または「臍帯由来細胞」（ＵＤＣ）、または「臍帯組織由来細胞」（ＵＴＣ）である。さらに、この細胞は、幹細胞または前駆細胞として記載されていてよく、前駆細胞という用語は、広い意味で使用されている。「由来（ｄｅｒｉｖｅｄ）」という用語は、細胞がそれらの生物学的起源から入手され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで成長するかまたは別様に処置された（例えば、成長培地で培養されて集団を増殖させ、かつ／もしくは細胞株を産生した）ことを示すために使用される。本発明の、臍幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ処置および臍由来細胞の独自の特徴を以下で詳細に説明する。
【００３３】
幹細胞は、自己再生前駆体、非再生前駆体、および最終分化細胞を含む子孫細胞を産生するため自己再生および分化する、単一の細胞の能力により定められる未分化細胞である。幹細胞はまた、複数の胚葉（内胚葉、中胚葉および外胚葉）からさまざまな細胞系統の機能細胞へｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化し、かつ移植後、複数の胚葉の組織を生じさせ、また、胚盤胞への注射後、全部ではなくても大部分の組織に実質的に貢献する、それら幹細胞の能力により特徴付けられる。
【００３４】
幹細胞は、それらの発生能に従って、（１）全能性；（２）多能性；（３）多分化能性；（４）寡能性（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ）；および（５）単能性と分類される。全能性細胞は、全ての胚細胞型および胚体外細胞型を生じることができる。多能性細胞は、全ての胚細胞型を生じさせることができる。多分化能細胞は、細胞系統のサブセットではあるが、全てが特定の組織、臓器、もしくは生理系内にあるものを生じさせることができるものを含む。例えば、造血性幹細胞（ＨＳＣ）が、ＨＳＣ（自己再生性）、血液細胞に制限された寡能性前駆体、ならびに、血液の正常な成分である全ての細胞型および要素（例えば、血小板）を含む子孫を産生することができる。寡能性の細胞は、多分化能幹細胞よりも制限された、細胞系統のサブセットを生じさせることができる。単能性の細胞は、単一の細胞系統（例えば、精子形成幹細胞）を生じさせることができる。
【００３５】
幹細胞はまた、幹細胞を入手する供給源に基づいて分類される。成体幹細胞は、概して、複数の分化細胞型を含む組織に見られる、多分化能未分化細胞である。成体幹細胞は、それ自体で再生することができる。通常環境下では、起源を発する組織の特殊化された細胞型、および恐らくは他の組織型を生じるように分化することもできる。胚幹細胞は、胚盤胞期胚の内側細胞集団からの多能性細胞である。胎児幹細胞は、胎児組織または膜から生じるものである。分娩後幹細胞は、出生後利用可能な胚外組織、すなわち臍帯から実質的に生じる多分化能または多能性細胞である。これらの細胞は、急速な増殖、および多くの細胞系統に分化する可能性を含む、多能性幹細胞に特有の特徴を有することが分かっている。分娩後幹細胞は、血液由来（例えば、臍帯血から得られるもの）、または非血液由来（例えば、臍帯および胎盤の非血液組織から得られるもの）であってよい。
【００３６】
培養中の細胞を説明するため、さまざまな用語が使用される。「細胞培養」は、概して、生物から採取され制御条件下で成長した（「培養中」または「培養された」）細胞を指す。「初代細胞培養」は、生物から直接採取された細胞、組織または臓器を、最初の二次培養前に培養することである。細胞は、細胞増殖および／または分裂を促進する条件下で成長培地に入れられると、培養中に「増殖（ｅｘｐａｎｄｅｄ）」し、結果として、大きな細胞集団をもたらす。細胞が培養中に増殖すると、細胞増殖速度は、時には、細胞が２倍の数になるのに必要な時間の長さで測定される。これを、「倍加時間」という。
【００３７】
「細胞株」という用語は、概して、初代細胞培養の１回または複数回の二次培養により形成された細胞集団を指す。二次培養の各ラウンドは、継代と呼ばれる。細胞が二次培養されると、それらは、「継代されて」きたと言われる。特定の細胞集団、または細胞株は、時には、継代されてきた回数で呼ばれるか、またはそれによって特徴付けられる。例えば、１０回継代されてきた培養細胞集団は、Ｐ１０培養物と呼ばれ得る。初代培養物、すなわち、組織から細胞を単離した後の最初の培養物は、Ｐ０と呼ばれる。最初の二次培養の後、細胞は、２度目の培養物（Ｐ１または１代継代）と説明される。２度目の二次培養後、細胞は、第３培養物（Ｐ２または２代継代）になる、等である。継代期間中に多くの集団倍加があり得、そのため、培養物の集団倍加数は、継代数より大きいことが、当業者には理解されるであろう。継代相互間の時間中の細胞増殖（すなわち、集団倍加数）は、播種密度、基質、培地、成長条件、および継代相互間の時間を含むがこれらに限定されない多くの要因に依存している。
【００３８】
「分化」は、分化していない（ｕｎｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ）（「コミットしていない（ｕｎｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）」）かまたはあまり分化していない（ｌｅｓｓ  ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ）細胞が例えば神経細胞もしくは筋細胞などの、分化した細胞の特徴を取得するプロセスである。「分化」細胞は、細胞系統内で、より分化した（「コミットした」）位置についたものである。用語「コミットした（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）」は、分化のプロセスに使用される場合、通常環境下で特定の細胞型または細胞型のサブセットに分化し続け、また、通常環境下で、異なる細胞型に分化したり、あまり分化していない細胞型に戻ったりできない時点まで、分化経路を進んできた細胞を指す。「脱分化」は、細胞が細胞系統内で、あまり分化していない（またはコミットした）位置に戻るプロセスを指す。本明細書で使用される、細胞の「系統」は、細胞の遺伝形質、すなわち、どの細胞から生じたか、また、何の細胞を生じさせることができるのかを定める。細胞系統は、発生および分化の遺伝的スキームの中にその細胞を位置付ける。
【００３９】
広義には、「前駆細胞」は、それ自身よりも分化した子孫を作る能力を有するが、前駆体の集まり（ｐｏｏｌ）を補充する能力を有する、細胞である。その定義により、幹細胞自体は、最終分化細胞に対してより直接的な前駆体であるので、これも前駆細胞である。本発明の細胞について言及する場合、以下でさらに詳細に説明するように、前駆細胞の、この広義の定義を使用することができる。狭義では、前駆細胞は、分化経路における中間体である細胞としばしば定義される。すなわち、前駆細胞は、幹細胞から生じており、成熟細胞型または細胞型のサブセットの産生における中間体である。この型の前駆細胞は、概して、自己再生することができない。したがって、この型の細胞に本明細書中で言及する際、「非自己再生前駆細胞」または「中間前駆細胞」もしくは「中間前駆体細胞」と呼ぶ。
【００４０】
細胞もしくは組織移植、または細胞置換療法に関して、いくつかの用語を本明細書で使用する。用語「自家移転」、「自家移植」、「自家移植片（ａｕｔｏｇｒａｆｔ）」などは、細胞または移植ドナーが細胞または移植レシピエントでもある処理を指す。用語「同種移転」、「同種移植」、「同種移植片」などは、細胞または移植ドナーがレシピエントと同じ種であるが、同じ個体ではない処理を指す。ドナーの細胞がレシピエントと組織適合的に一致している細胞移転は、時には、「同系移転」と呼ばれる。用語「異種移転」、「異種移植」、「異種移植片」などは、細胞または移植ドナーがレシピエントとは異なる種である移植を指す。
【００４１】
用語「医薬的に許容可能な担体」または「薬剤的に許容可能な培地」は、用語「生物学的に適合性の担体」または「生物学的に適合性の培地」と交換して使用されてよく、概して、治療的に投与されるべき細胞および他の薬剤と適合性があるだけでなく、妥当なリスク／ベネフィット比に比例した過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の合併症なしで、ヒトおよび動物の組織と接触して使用されるのに適している、試薬、細胞、化合物、材料、組成物、および／または剤形を指す。本明細書でさらに詳細に説明するように、本発明で使用するのに適した、医薬的に許容可能な担体には、液体、半固体（例えばゲル）、および固体材料（例えば、細胞足場およびマトリックス、チューブ、シート、ならびに、当技術分野で既知であり、本明細書でさらに詳細に説明される、他のそのような材料）が含まれる。これらの半固体および固体材料は、体内での分解に抵抗するよう設計されてよく（非生分解性）、またはそれらは、体内で分解するように設計されてもよい（生分解性、生体侵食性）。生分解性材料は、さらに、生体再吸収性（ｂｉｏｒｅｓｏｒｂａｂｌｅ）または生体吸収性（ｂｉｏａｂｓｏｒｂａｂｌｅ）であってよい。すなわち、生分解性材料は、体液中に溶解および吸収されてよく（水溶性インプラントが１例である）、または他の材料への変換、もしくは天然経路を通じた崩壊および排除によって、分解され、最終的には体から排除される。生分解速度は、いったん体内に植え込まれたら、所望の放出速度によって変わることができる。
【００４２】
「馴化培地」は、特定の細胞または細胞集団が培養され、その後取り除かれる培地である。細胞が培地で培養されると、細胞因子を分泌することができ、この細胞因子は、他の細胞に栄養に関する支援を与えることができる。そのような栄養因子には、ホルモン、サイトカイン、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）、タンパク質、小胞、抗体、および顆粒が含まれるがこれらに限定されない。細胞因子を含む培地は、馴化培地である。
【００４３】
概して、「栄養因子」は、細胞の生存、成長、増殖および／または成熟化を促進するか、または細胞の活性増大を刺激する、物質として定義される。
【００４４】
本明細書で使用される用語「成長培地」は、概して、分娩後由来細胞を培養するのに十分な培地を指す。具体的には、本発明の細胞を培養する、現在好ましい１つの培地は、ダルベッコ変法基本培地（ＤＭＥＭ）を含む。特に好ましいのは、ＤＭＥＭ−低グルコース（ＤＭＥＭ−ＬＧ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）である。ＤＭＥＭ−ＬＧは、好ましくは、血清、最も好ましくはウシ胎仔血清またはヒト血清を補充される。典型的には、１５％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清（例えば、規定のウシ胎仔血清、Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ  Ｕｔａｈ）が、抗生物質／抗真菌薬（好ましくは１００単位／ｍＬペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍＬアンホテリシンＢ；（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．））、ならびに０．００１％（ｖ／ｖ）の２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  Ｍｏ．）と共に加えられる。場合によっては、異なる成長培地を使用するか、または異なる補充物（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ）が提供され、これらは通常、成長培地への補充物として本文中で示される。化学的に定義されたある培地では、細胞は、血清が全く存在しない状態で成長することができる。そのような場合、細胞は、ある成長因子を必要としてよく、この成長因子は、培地に加えられて、細胞を支持および維持することができる。無血清培地で成長するために加えられるべき、現在好ましい因子は、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、およびＰＤＧＦのうち１つまたは複数を含む。さらに好適な実施形態では、これらの因子のうち２つ、３つ、または４つ全てが無血清培地または化学的に定義された培地に加えられる。他の実施形態では、ＬＩＦを無血清培地に加えて、細胞の成長を支持または改善する。
【００４５】
本明細書で使用される用語「標準的な成長条件」は、５％のＣＯ２、および約１００％に維持された相対湿度を含む標準大気において３７℃で細胞を培養することを指す。前述した条件は、培養に有用であるが、そのような条件は、細胞を培養するために当技術分野で利用可能なオプションを認識するであろう当業者によって変えられ得ることが理解される。
【００４６】
用語「有効量」は、特定の生物学的結果を達成するのに有効な、本明細書に記載する化合物、材料、または組成物の濃度または量を指す。そのような結果は、骨格組織の再生、修復、もしくは改善、血流の改善、ならびに／または、本発明の範囲内の疾患、障害、および傷害から肺の損傷を受けた患者における血管新生の刺激および／もしくは支持を含むが、これらに限定されない。そのような効果的な活性は、例えば、本明細書に記載するように、本発明の細胞および／または組成物を、肺に損傷のある患者に投与することによって、達成され得る。ＵＴＣを患者にｉｎ  ｖｉｖｏで投与することに関して、有効量は、わずか数百未満から、数百万以上まで変化してよい。特定の実施形態では、有効量は、約１０３〜約１０１１個の細胞、さらに具体的には少なくとも約１０４個の細胞に及ぶ。投与されるべき細胞数は、医薬生物学者によく知られている要因の中でも、治療される大きさまたは総体積／表面積、治療される領域の場所に対する投与部位の近さを含むがこれらに限定されない、治療されるべき肺疾患、障害または傷害の詳細によって異なることが認識されるであろう。
【００４７】
用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、症状の寛解、緩解、減弱、または傷害、病態もしくは状態が患者にとってより耐えられるものとなること、変性もしくは減退の速度が遅くなること、変性の最終地点があまり衰弱させるものでなくなる（ｌｅｓｓ  ｄｅｂｉｌｉｔａｔｉｎｇ）こと、被験者の身体的もしくは精神的幸福の改善、または生存長さが長くなること、などの客観的または主体的なパラメータを含む、傷害、病態または状態の希薄化または回復の成功または成功の兆しを指す。症状の治療または回復は、身体検査、または神経学的検査の結果を含む、客観的または主観的なパラメータに基づいていてよい。
【００４８】
用語「有効期間（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｐｅｒｉｏｄ）」、「有効時間（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｐｅｒｉｏｄ  ｏｆ  ｔｉｍｅ）」または「有効条件」は、概して、意図する結果を達成するために、薬剤または医薬組成物に必要であるかまたは好ましい、時間、または他の制御可能な条件（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法の温度、湿度）を指す。
【００４９】
用語「個体」、「患者」または「被験者」は、本明細書では交換可能に使用され、これらは、製薬または治療組成物で、または本明細書に記載する方法に従って、治療される、動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトを指す。
【００５０】
本明細書で使用される用語「マトリックス」は、概して、細胞と共に患者に投与される、生分解性および／または生体再吸収性材料を指す。マトリックスは、骨格筋、周皮細胞、血管平滑筋、または血管内皮組織などの新たに成長した細胞により置き換えられるまで、一時的な足場として作用することができる。いくつかの実施形態では、マトリックスは、細胞と関連して使用される栄養因子（ｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｕｒｅｓ）または他の薬剤の徐放をもたらすことができ、また、患者における組織成長を展開する構造体を提供することができる。他の実施形態では、マトリックスは単に、発達している組織の一時的な足場を提供するだけである。マトリックスは、粒子形態（直径が１０μｍ（１０ミクロン）超のマクロ粒子、または直径が１０μｍ（１０ミクロン）未満の微小粒子）であってよく、あるいは、構造的に安定した３次元インプラント（例えば足場）の形態であってもよい。マトリックスは、スラリー、ヒドロゲル、または３次元構造体、例えば、立方体、円筒、チューブ、ブロック、フィルム、シート、もしくは適切な解剖学的な形態、であってよい。
【００５１】
本明細書で使用される用語「足場」は、概して、細胞成長のテンプレートを提供する３次元の多孔性構造体を指す。足場は、体内で時間とともに分解する生分解性および／または生体再吸収性材料で作られる。足場が分解するのにかかる時間の長さは、材料の分子量に依存していてよい。したがって、より高い分子量の材料は、より長い期間にわたって構造的完全性を維持するポリマー足場を生じることができ、一方、より低い分子量のものは、遅い放出、および短い足場寿命を生じる。足場は、当技術分野で既知の任意の手段により作られてよい。足場を形成するのに使用され得るポリマーの例には、天然および合成ポリマーが含まれる。
【００５２】
本明細書で使用される用語「単離する」は、概して、自然環境から分離されている細胞を指す。この用語は、自然環境からの全体的な物理的分離（ｇｒｏｓｓ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）、例えば、ドナー動物からの除去、を含む。好適な実施形態では、単離した細胞は、組織に存在しない、すなわち、その細胞は、通常は接触している隣接細胞から分離または解離する。好ましくは、細胞は、細胞懸濁液として投与される。本明細書で使用される語句「細胞懸濁液」は、培地に接触していて、また、例えば組織片を穏やかな粉砕（ｇｅｎｔｌｅ  ｔｒｉｔｕｒａｔｉｏｎ）にかけることによって、解離されている、細胞を含む。
【００５３】
本明細書に記載されるさまざまな実施形態では、本発明は、分娩後組織、特に臍組織由来の、前駆細胞および細胞集団を使用する、肺疾患、障害および／または傷害治療のための方法および医薬組成物を特徴とする。これらの方法および医薬組成物は、血管新生を刺激および支持し、血流を改善し、肺疾患、障害および／もしくは傷害により損傷を受けた肺組織を再生、修復、および改善し、かつ／または、そのような疾患、障害および／もしくは傷害から肺組織を保護するように設計される。本発明の医薬製剤および方法に使用される、細胞、細胞集団、および細胞可溶化液、馴化培地などを含む製剤は、米国特許出願公開第２００５／００３２２０９号、２００５／００５８６３１号、および２００５／００５４０９８号に、また、本明細書中以下にも、詳細に説明されている。
【００５４】
本明細書に記載の方法によると、哺乳動物の臍帯は、満期妊娠または早産の終了時または終了後すぐに、例えば後産（ａｆｔｅｒ  ｂｉｒｔｈ）の娩出後に、回収される。分娩後組織は、分娩場所から研究室まで、フラスコ、ビーカー、培養皿、または袋などの無菌容器に入れて運ばれてよい。容器は、塩類溶液、例えばダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ダルベッコ最小基本培地としても知られる）もしくはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、または、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ液もしくは全フッ素置換化合物溶液（ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）など、移植に使用される臓器の輸送に使用される任意の溶液を含むがこれらに限定されない、溶液または培地を有してよい。ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン、およびニスタチンなどであるがこれらに限定されない、１つまたは複数の抗生物質および／または抗真菌薬を、培地または緩衝液に加えることができる。分娩後組織を、ヘパリン含有溶液などの抗凝固溶液ですすぐことができる。ＵＴＣの抽出前は、組織を約４〜約１０℃に保つのが好ましい。ＵＴＣの抽出前は、組織を凍らせないことがさらに好ましい。
【００５５】
ＵＴＣの単離は、好ましくは無菌環境で行われる。臍帯は、当技術分野で既知の手段によって、胎盤から分離され得る。血液および残骸は、好ましくは、ＵＴＣの単離前に分娩後組織から除去される。例えば、分娩後組織は、リン酸緩衝生理食塩水を含むがこれに限定されない、緩衝溶液で洗浄されてよい。洗浄用緩衝液はまた、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン、およびニスタチンを含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の抗真菌薬および／または抗生物質を含むこともできる。
【００５６】
臍帯、またはその破片もしくは断片を含む分娩後組織は、好ましくは、機械の力（刻む力または剪断力）によって脱凝集される。現在好適な実施形態では、単離処置はまた、酵素消化プロセスを用いる。多くの酵素が培養中の成長を促進するため複合組織マトリックスからの個々の細胞の単離に有用であることが、当技術分野で既知である。消化酵素は、消化性の弱いもの（例えば、デオキシリボヌクレアーゼおよび中性プロテアーゼ、ディスパーゼ）から、消化性の強いもの（例えば、パパインおよびトリプシン）までさまざまであり、市販されている。そのような酵素の限定的なリストには、粘液溶解酵素活性、メタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ（トリプシン、キモトリプシン、もしくはエラスターゼなど）、およびデオキシリボヌクレアーゼが含まれる。現在好適なのは、メタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、および粘液溶解活性から選択される酵素活性である。例えば、コラゲナーゼは、さまざまな細胞を組織から単離するのに有用であることが知られている。デオキシリボヌクレアーゼは、単鎖ＤＮＡを消化でき、単離中、細胞凝集を最小限に抑えることができる。好適な方法は、コラゲナーゼおよびディスパーゼ、またはコラゲナーゼ、ディスパーゼ、およびヒアルロニダーゼによる酵素処理を含む。当業者は、さまざまな組織源から細胞を単離する、そのような多くの酵素処理が当技術分野で知られていることを認識するであろうし、本発明の細胞単離における有用性について、新しいかまたは追加の酵素または酵素の組み合わせを評価する知識を身につけている。好適な酵素処理は、約０．５〜２時間以上であってよい。他の好適な実施形態では、組織は、解離工程の酵素処理中、約３７℃でインキュベートされる。
【００５７】
単離した細胞は、細胞培養を開始するかまたは播種するために使用されてよい。単離した細胞は、コートされていないか、または細胞外マトリックス、またはラミニン、コラーゲン（天然、変性、もしくは架橋）、ゼラチン、フィブロネクチン、および他の細胞外マトリックスタンパク質などのリガンドでコートされた、無菌組織培養容器に移される。細胞は、ＤＭＥＭ（高または低グルコース）、先端的なＤＭＥＭ（ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ２０１、イーグルの基本培地、ハムＦ１０培地（Ｆ１０）、ハムＦ−１２培地（Ｆ１２）、イスコフ改変ダルベッコ培地、間葉系幹細胞成長培地（ＭＳＣＧＭ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０、およびＣＥＬＬ−ＧＲＯ−ＦＲＥＥ（Ｍｅｄｉａｔｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｎｄｏｎ，Ｖａ．）の商品名で販売される血清／培養液のない培地などであるがこれらに限定されない、細胞の成長を維持できる任意の培養培地で培養される。培養培地は、例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、好ましくは約２〜１５％（ｖ／ｖ）；ウマ血清（ＥＳ）；ヒト血清（ＨＳ）；β−メルカプトエタノール（ＢＭＥもしくは２−ＭＥ）、好ましくは約０．００１％（ｖ／ｖ）；１つもしくは複数の成長因子、例えば、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−Ｉ）、白血球阻害因子（ＬＩＦ）、およびエリスロポエチン（ＥＰＯ）；Ｌ−バリンを含むアミノ酸；ならびにペニシリンＧ、ストレプトマイシン硫酸塩、アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン、およびニスタチンなど、微生物汚染を制御する１つもしくは複数の抗生物質および／または抗真菌薬を含む、１つまたは複数の成分を、単独または組み合わせて、補充されることができる。培養培地は、好ましくは、成長培地（例えば、ＤＭＥＭ低グルコース、血清、ＢＭＥ、および抗生物質）を含む。
【００５８】
細胞は、細胞成長させる密度で培養容器に播種される。好適な実施形態では、細胞は、空気中、約０〜約５容量％のＣＯ２で培養される。いくつかの好適な実施形態では、細胞は、空気中、約２〜約２５％Ｏ２、好ましくは空気中、約５〜約２０％Ｏ２で、培養される。細胞は、好ましくは、約２５〜約４０℃の温度で培養され、さらに好ましくは３７℃で培養される。細胞は、好ましくは、インキュベーター中で培養される。培養容器中の培地は、静止しているか、または例えばバイオリアクターを使用して、攪拌されてもよい。ＵＴＣは、好ましくは、低酸化的ストレスで（例えば、グルタチオン、ビタミンＣ、カタラーゼ、ビタミンＥ、Ｎ−アセチルシステインを加えて）成長する。本明細書で使用される「低酸化的ストレス」は、培養される細胞に対して、フリーラジカルによるダメージが全くないかまたは最小限である状態を指す。
【００５９】
最も適切な培養培地、培地製剤、および細胞培養技術を選択する方法は、当技術分野で周知であり、Ｄｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），１９９５，Ｃｅｌｌ＆Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ；およびＨｏ  ａｎｄ  Ｗａｎｇ（ｅｄｓ．），１９９１，Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｂｏｓｔｏｎ、を含むさまざまな出典に記載されており、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６０】
本発明のいくつかの実施形態では、ＵＴＣは、継代されるか、または最初に使用したものと同じかまたは異なる種類の新鮮培地を含む別個の培養容器へと除去され、ここで細胞集団は、有糸分裂的に増殖し得る。本発明の細胞は、０代継代と老化との間のどの時点でも使用されてよい。細胞は、好ましくは、約３〜約２５回継代され、さらに好ましくは約４〜約１２回継代され、好ましくは、１０または１１回継代される。クローン化および／またはサブクローン化は、細胞のクローン集団が単離したことを確認するために行われてよい。
【００６１】
本発明のいくつかの態様では、分娩後組織に存在する異なる細胞型は、部分集団に分割され、その部分集団からＵＴＣを単離することができる。分割または選択は、分娩後組織をその構成細胞に解離する酵素処理、それに続く特定の細胞型のクローン化および選択（これには、形態学的および／または生化学的マーカーに基づいた選択；所望の細胞の選択的成長（ポジティブ選択）；不必要な細胞の選択的破壊（ネガティブ選択）；例えば大豆アグルチニンによる、混合集団における差次的細胞凝集力に基づいた分離；凍結融解処置；混合集団における細胞の差次的接着特性；ろ過；従来の、およびゾーン遠心分離；遠心性水簸（流動に対抗する遠心分離（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｔｒｅａｍｉｎｇ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ））；単位重力分離；向流分配；電気泳動；および蛍光励起細胞選別（ＦＡＣＳ）が含まれるがこれらに限定されない）を含むがこれらに限定されない、細胞分離の標準技術を用いて達成することができる。
【００６２】
培養培地は、例えば、ピペットで培地を皿から注意深く吸引し、新鮮培地を補充することにより、必要に応じて変えられる。インキュベーションは、十分な数または密度の細胞が皿に蓄積するまで続けられる。その後、存在する任意の元の外植組織断片を除去してよく、残りの細胞は、標準技術を用いたトリプシン処理によって、または細胞スクレーパーを使用することによって、皿から分離される。トリプシン処理後、細胞は、前記のとおり、収集され、新鮮培地へと除去され、インキュベートされる。いくつかの実施形態では、培地は、トリプシン処理後の約２４時間で、少なくとも１回変えられて、浮遊細胞を除去する。培養物に残る細胞は、ＵＴＣであると考えられる。
【００６３】
ＵＴＣは、冷凍保存されてよい。したがって、以下でさらに詳細に説明する好適な実施形態では、自家移転（母もしくは子）のためのＵＴＣは、子供を出産した後の適切な分娩後組織由来であってよく、その後、移植のため後で必要になった場合に利用可能となるよう、冷凍保存され得る。
【００６４】
ＵＴＣは、例えば、成長特性（例えば、集団倍加能力、倍加時間、老化までの継代）、核型分析（例えば、正常な核型；母系性もしくは新生児系列）、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ分析）、免疫組織化学および／または免疫細胞化学（例えば、エピトープ検出のため）、遺伝子発現プロファイリング（例えば、遺伝子チップアレイ；ポリメラーゼ連鎖反応（例えば、逆転写酵素ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、および従来のＰＣＲ））、タンパク質アレイ、タンパク質分泌（例えば、血漿凝固アッセイまたはＰＤＣ−馴化培地の分析による、例えば酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）による）、混合リンパ球反応（例えば、ＰＢＭＣ刺激の指標として）、ならびに／または当技術分野で既知の他の方法によって、特徴付けられ得る。
【００６５】
臍組織由来のＵＴＣの例は、２００４年６月１０日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎが預かっており、以下のとおりＡＴＣＣ受入番号が割り当てられている：（１）菌株表示ＵＭＢ０２２８０３（Ｐ７）は、受入番号ＰＴＡ−６０６７を割り当てられ；（２）菌株表示ＵＭＢ０２２８０３（Ｐ１７）は、受入番号ＰＴＡ−６０６８を割り当てられた。
【００６６】
さまざまな実施形態では、ＵＴＣは、以下の成長特徴のうち１つまたは複数を有する：（１）培養中、成長のためＬ−バリンを必要とする；（２）約５％〜約２０％の酸素を含有する大気中で、成長することができる；（３）老化に達する前に、培養中、少なくとも約４０倍加する可能性を有する；（４）コートされていない組織培養容器、またはゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオルニチン、ビトロネクチンもしくはフィブロネクチンでコートされた組織培養容器に付着し、その容器上で増殖する。
【００６７】
ある実施形態では、ＵＴＣは、細胞が継代するときに維持される正常な核型を有する。核型分析方法が利用可能であり、また、当業者に既知である。
【００６８】
他の実施形態では、ＵＴＣは、（１）組織因子、ビメンチン、およびα−平滑筋アクチンのうち少なくとも１つの産生、ならびに（２）フローサイトメトリーにより検出されたときにおける、ＣＤ１Ｏ、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＰＤ−Ｌ２、およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ細胞表面マーカーのうち少なくとも１つの産生、を含む、あるタンパク質の産生により特徴付けられることができる。他の実施形態では、ＵＴＣは、フローサイトメトリーにより検出されたときに、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ細胞表面マーカーのうち少なくとも１つの産生がないことにより特徴付けられ得る。特に好ましいのは、組織因子；ビメンチン；およびα−平滑筋アクチンのうち少なくとも２つを産生する細胞である。さらに好ましいのは、組織因子；ビメンチン；およびα−平滑筋アクチンの３つ全てのタンパク質を産生する細胞である。
【００６９】
他の実施形態では、ＵＴＣは、遺伝子発現により特徴付けられることができ、遺伝子発現は、線維芽細胞、間葉系幹細胞、もしくは腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞に関し、interleukin 8; reticulon 1; chemokine (C-X-C motif) ligand 1 (melonoma growth stimulating activity, alpha); chemokine (C-X-C motif) ligand 6 (granulocyte chemotactic protein 2); chemokine (C-X-C motif) ligand 3; およびtumor necrosis factor, alpha-induced protein 3のうちの少なくとも１つをコード化する遺伝子について、増加する。
【００７０】
さらに他の実施形態では、ＵＴＣは、遺伝子発現により特徴付けられてよく、遺伝子発現は、線維芽細胞、間葉系幹細胞、または腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞に関し、short stature homeobox 2; heat shock 27 kDa protein 2; chemokine (C-X-C motif) ligand 12 (stromal cell-derived factor 1); elastin (supravalvular aortic stenosis, Williams-Beuren syndrome); Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp586M2022 (from clone DKFZp586M2022); mesenchyme homeo box 2 (growth arrest- specific homeo box); sine oculis homeobox homolog 1 (Drosophila); crystallin, alpha B; disheveled associated activator of morphogenesis 2; DKFZP586B2420 protein; similar to neuralin 1; tetranectin (plasminogen binding protein); src homology three (SH3) and cysteine rich domain; cholesterol 25-hydroxylase; runt-related transcription factor 3; interleukin 11 receptor, alpha; procollagen C-endopeptidase enhancer; frizzled homolog 7 (Drosophila); hypothetical gene BC008967; collagen, type VIII, alpha 1; tenascin C (hexabrachion); iroquois homeobox protein 5; hephaestin; integrin, beta 8; synaptic vesicle glycoprotein 2; neuroblastoma, suppression of tumorigenicity 1; insulin-like growth factor binding protein 2, 36 kDa; Homo sapiens cDNA FLJ12280 fis, clone MAMMA1001744; cytokine receptor-like factor 1; potassium intermediate/small conductance calcium-activated channel, subfamily N, member 4; integrin, beta 7; transcriptional co-activator with PDZ-binding motif (TAZ); sine oculis homeobox homolog 2 (Drosophila); KIAA1034 protein; vesicle-associated membrane protein 5 (myobrevin); EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1; early growth response 3; distal-less homeo box 5; hypothetical protein FLJ20373; aldo-keto reductase family 1, member C3 (3-alpha hydroxysteroid dehydrogenase, type II); biglycan; transcriptional co- activator with PDZ-binding motif (TAZ); fibronectin 1; proenkephalin; integrin, beta-like 1 (with EGF-like repeat domains); Homo sapiens mRNA full length insert cDNA clone EUROIMAGE 1968422; EphA3; KIAA0367 protein; natriuretic peptide receptor C/guanylate cyclase C (atrionatriuretic peptide receptor C); hypothetical protein FLJ14054; Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp564B222 (from clone DKFZp564B222); BCL2/adenovirus ElB 19 kDa interacting protein 3 -like; AE binding protein 1; および cytochrome c oxidase subunit VIIa polypeptide 1 (muscle)のうち少なくとも１つをコード化する遺伝子について、減少する。
【００７１】
他の実施形態では、ＵＴＣは、ＭＣＰ−１；ＩＬ−６；ＩＬ−８；ＧＣＰ−２；ＨＧＦ；ＫＧＦ；ＦＧＦ；ＨＢ−ＥＧＦ；ＢＤＮＦ；ＴＰＯ；ＭＩＰ１ｂ；Ｉ３０９；ＭＤＣ；ＲＡＮＴＥＳ；およびＴＩＭＰ１のうち少なくとも１つの分泌により特徴付けられ得る。いくつかの実施形態では、ＵＴＣは、ＥＬＩＳＡにより検出されたときにＴＧＦ−β２；ＡＮＧ２；ＰＤＧＦｂｂ；ＭＩＰ１ａ；ＶＥＧＦのうち少なくとも１つの分泌がないことにより特徴付けられ得る。
【００７２】
いくつかの好適な実施形態では、ＵＴＣは、血液が実質的にない臍帯組織由来であり、培養中に自己再生および増殖することができ、成長のためＬ−バリンを必要とし、少なくとも約５％の酸素中で成長でき、以下の特徴のうち少なくとも１つを含む。その特徴とは、（１）培養中に少なくとも約４０倍加する能力；（２）コートされていない組織培養容器、またはゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオルニチン、ビトロネクチン、またはフィブロネクチンでコートされた組織培養容器上で付着および増殖する能力；（３）ビメンチンおよびα−平滑筋アクチンの産生；（４）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、およびＣＤ９０の産生；ならびに（５）線維芽細胞、間葉系幹細胞、または腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞に関し、インターロイキン８（interleukin 8）およびレティキュロン１（reticulon 1）をコード化する遺伝子について増加する、遺伝子発現である。いくつかの実施形態では、そのようなＵＴＣは、ＣＤ４５およびＣＤ１１７を産生しない。
【００７３】
前述したＵＴＣは、末梢血管疾患を有する患者を治療する方法で使用することができ、末梢血管疾患を治療する医薬組成物に使用することができ、例えば、そのような組成物は、これらの特徴を有する細胞、および医薬的に許容可能な担体を含む。また、ＵＴＣは、本明細書で説明し例証するそのような方法および医薬組成物を作り、使用し、実行するためのキットに使用することができる。さらに、前述したようなＵＴＣは、馴化細胞培養培地を生成するため、または、本明細書で説明し例証するそのような方法および医薬組成物を作り、使用し、実行するのに使用され得る細胞抽出物および細胞成分分画などの製剤を作るために、使用されることができる。
【００７４】
好適な実施形態では、細胞は、前述した成長、タンパク質／表面マーカー産生、遺伝子発現または物質分泌特徴のうち２つまたは３つ以上を含む。さらに好ましいのは、それらの特徴のうち３つ、４つ、５つ、またはそれ以上を含む細胞である。さらに、より好ましいのは、それらの特徴のうち６つ、７つ、８つ、またはそれ以上を含むＵＴＣである。現在さらにいっそう好ましいのは、前記の特徴を全て含む細胞である。
【００７５】
本発明の態様のうちいくつかにおいて、本発明で使用されるのに現在好ましい細胞の中には、前述した特徴を有するＵＴＣ、さらに具体的には、細胞が正常な核型を有し、継代と共に正常な核型を維持し、さらには、細胞がマーカーＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃのそれぞれを発現し、細胞が、列挙したマーカーに対応する免疫学的に検出可能なタンパク質を産生するものがある。さらにいっそう好ましいのは、前記に加え、フローサイトメトリーにより検出されたときに、マーカーＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、またはＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの任意のものに対応するタンパク質を産生しない細胞である。
【００７６】
さまざまな表現型を生じさせる株（ｌｉｎｅｓ）に沿って分化する能力を有する、ある細胞は、不安定であるので、自発的に分化し得る。本発明で使用されるのに現在好ましいのは、例えば、筋芽細胞、骨格筋、血管平滑筋、周皮細胞、血液脈管新生（ｈｅｍａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ）、血管新生、血管原生、または血管内皮の株に沿って、自発的に分化しない細胞である。好適な細胞は、成長培地で成長すると、例えば、ＧＥＮＥＣＨＩＰ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆ．）の商品名で販売されている医療診断試験を用いて判断したときに、細胞表面で産生された細胞マーカーに対して、また、さまざまな遺伝子の発現パターンに対して、実質的に安定する。細胞は、継代中にわたり、また、複数回の集団倍加にわたって、例えばそれらの表面マーカー特徴においては、実質的に一定のままである。
【００７７】
本発明の別の態様は、前述のＵＴＣ集団の使用を特徴とする。いくつかの実施形態では、細胞集団は、異種性であってよい。本発明の異種性細胞集団は、本発明のＵＴＣを少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％含んでよい。本発明の異種性細胞集団は、幹細胞または他の前駆細胞、例えば、筋芽細胞または他の筋前駆細胞、血管芽細胞、または血管前駆細胞をさらに含んでよく、あるいは、完全に分化した骨格筋細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、または血管内皮細胞をさらに含んでよい。いくつかの実施形態では、集団は、実質的に同種であり、すなわちＵＴＣ（好ましくは、少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上のＵＴＣ）のみを実質的に含む。本発明の同種細胞集団は、臍由来細胞を含んでよい。臍由来細胞の同種集団は、好ましくは、母系性系統の細胞がない。細胞集団の同種性は、当技術分野で既知の任意の方法によって、例えば、細胞選別（例えば、フローサイトメトリー）によって、または既知の方法に従ったクローン増殖によって、達成され得る。よって、好適な同種ＵＴＣ集団は、分娩後由来細胞のクローン細胞株を含むことができる。そのような集団は、非常に望ましい機能性を備えた細胞クローンが単離されたときに、特に有用である。
【００７８】
血管平滑筋、血管内皮、または周皮細胞の経路に沿って幹細胞分化を刺激する、１つまたは複数の因子の存在下または条件下でインキュベートされた細胞集団の使用も本明細書で提供される。そのような因子は、当技術分野で既知であり、当業者は、適切な分化条件の決定が、所定の実験で達成され得ることを認識するであろう。そのような条件の最適化は、統計学的な実験デザインおよび分析により達成することができ、例えば、応答曲面法は、生物学的培養における複数の変数を同時に最適化することができる。現在好適な因子は、例えば、血管新生、血液血管新生、血管原生、骨格筋、血管平滑筋、周皮細胞もしくは血管内皮の経路もしくは系統に沿った幹細胞の分化を刺激することが現在既知であるか、または後に決定される、成長因子または栄養因子、ケモカイン、サイトカイン、細胞産物、脱メチル化薬、および他の刺激物を含むがこれらに限定されない。
【００７９】
ＵＴＣはまた、治療的に有用な遺伝子産物を産生するか、血管新生薬を産生してさらなる血管形成もしくは成長を促進もしくは支援するか、または、血管内皮前駆細胞を肺の損傷エリアまで補給する因子を産生するために、遺伝子操作されてもよい。血管内皮前駆細胞は、虚血性イベントの後で特に、脈管形成および血流を促進する（Ｕｒｂｉｃｈ  Ｃ  ａｎｄ  Ｄｉｍｍｅｌｅｒ  Ｓ，  Ｃｉｒｃ．  Ｒｅｓ．，２００４；９５：３４３−５３）。内皮細胞補充において役割を果たす因子は、ＶＥＧＦ、間質由来因子１（ＳＤＦ−１）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、Ｇ−ＣＳＦ、スタチン、エストロゲン（ｓｔｒｏｇｅｎ）、ＰＰＡＲ−γ、ＣＸＣＲ４、ＦＧＦ、およびＨＧＦを含むがこれらに限定されない。遺伝子操作は、組み込みウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、もしくは、アデノ随伴ウイルスベクター；非組み込み複製ベクター、例えば、パピローマウイルスベクター、ＳＶ４０ベクター、アデノウイルスベクター；もしくは、複製欠陥ウイルスベクターを含むがこれらに限定されない、様々なベクターのいずれかを使用して達成され得る。ＤＮＡを細胞に導入する他の方法は、リポソーム、エレクトロポレーション、パーティクルガンの使用、または直接的なＤＮＡ注入によるものを含む。
【００８０】
宿主細胞は好ましくは、とりわけプロモーターもしくはエンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位などの１つまたは複数の適切な発現制御要素によって制御されるか、またはそれらと操作的に関連するＤＮＡ、および選択可能なマーカーで、形質転換もしくは形質移入される。任意のプロモーターが、挿入遺伝子の発現を駆動するために用いられてよい。例えば、ウイルスプロモーターは、ＣＭＶプロモーター／エンハンサー、ＳＶ４０、パピローマウイルス、エプスタイン・バーウイルス、またはエラスチン遺伝子プロモーターを含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、目的の遺伝子の発現を制御するのに使用される制御要素により、遺伝子の発現を調節することができ、産物は、ｉｎ  ｖｉｖｏで必要とされる場合にのみ合成される。一時的な発現を望むならば、非組み込みベクターおよび／もしくは複製欠陥ベクターに、好ましくは、構成的プロモーターを用いる。あるいは、必要ならば、誘導プロモーターを、挿入遺伝子の発現を駆動するために用いることができる。誘導プロモーターは、メタロチオネイン、もしくは、ヒートショックタンパク質と関連したものを含むがこれらに限定されない。
【００８１】
外来ＤＮＡ導入後、操作された細胞を、強化培地で成長させ、その後、選択培地に切り換えることができる。外来ＤＮＡ中の選択可能なマーカーは、選択物に対する耐性を与え、細胞が（例えば、プラスミド上の）外来ＤＮＡを染色体中に安定的に組み込み、巣（ｆｏｃｉ）を形成するよう成長することを可能にし、この巣は、クローン化し、細胞株中へと増殖することができる。この方法は、遺伝子産物を発現する細胞株を操作するために、有利に用いることができる。
【００８２】
本発明の細胞は、植え込み部位の炎症および拒絶反応を促進する因子の発現を「ノックアウト」もしくは「ノックダウン」するように遺伝子操作されてもよい。標的遺伝子の発現レベルもしくは標的遺伝子産物の活性レベルを低減するための陰性調節技術を、以下で説明する。本明細書で用いられる「陰性調節」は、調節処理の不存在下の標的遺伝子産物のレベルおよび／もしくは活性に対する、標的遺伝子産物のレベルおよび／もしくは活性の低減をいう。骨格筋細胞、血管平滑筋細胞、周皮細胞、血管内皮細胞、またはそれらの前駆細胞に固有の遺伝子の発現は、例えば相同組み換え技術を使用して遺伝子を不活性化させることによる発現抑制を含む、いくつかの技術を用いて、低減するか、またはノックアウトすることができる。典型的には、標的遺伝子からの正常なｍＲＮＡの産生を阻害し、結果的に遺伝子の不活性化を生じる陽性選択可能マーカー、例えばｎｅｏ、によって、タンパク質の重要な領域をコードするエキソン（すなわち、その領域の５’側エキソン）が、割り込まれる。また、遺伝子の一部に欠失を作り出すことで、もしくは、全体の遺伝子を欠失することによって、遺伝子を不活性化してもよい。ゲノム中で、離れた、標的遺伝子と相同な２つの領域を備えた構築物を用いることによって、その２つの領域に介在する配列を欠失することができる（Ｍｏｍｂａｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９１；８８：３０８４−８７）。また、アンチセンス、ＤＮＡザイム、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）（ｓｉＲＮＡ）、および、標的遺伝子の発現を抑制する他のこのような分子を、標的遺伝子活性のレベルを低減するために用いることができる。例えば、主要組織適合性遺伝子複合体（ＨＬＡ）の発現を抑制するアンチセンスＲＮＡ分子は、免疫反応について、最も多用途であることが示されてきた。さらに、三重らせん分子を、標的遺伝子活性のレベルを低減する上で利用することができる。
【００８３】
他の態様では、本発明は、ＵＴＣ、またはＵＴＣを含む異種もしくは同種細胞集団、ならびに、遺伝子操作されるか、もしくは骨格筋、血管平滑筋、周皮細胞、もしくは血管内皮の経路に沿って分化するように刺激されているＵＴＣもしくはその集団から準備された、細胞可溶化液および細胞可溶性分画を利用する。そのような可溶化液およびその分画には多くの実用性がある。ＵＴＣ可溶化液可溶性分画（すなわち、実質的に膜がない）のｉｎ  ｖｉｖｏでの使用は、例えば、拒絶反応もしくは他の逆免疫反応の誘因となる可能性が最も高い細胞表面タンパク質を相当量導入することなしに、患者において、有利な細胞内環境を同種的に用いることを可能にする。細胞を可溶化する方法は、当技術分野では周知であり、機械的破砕、酵素的破砕、化学的破砕、またはそれらの組み合わせといった様々な手段を含む。そのような細胞可溶化液は、それらの成長培地において直接細胞から準備されてよく、したがって、分泌された成長因子などを含んでよく、あるいは、例えばＰＢＳもしくは他の溶液中で、洗浄され培地を含まない細胞から準備されてもよい。洗浄された細胞は、好適な場合、元の集団密度より高い濃度で再懸濁されてもよい。
【００８４】
一実施形態では、例えば細胞分画を後に分離せずに、細胞を破砕することによって、全体的な細胞可溶化液が準備される。別の実施形態では、細胞膜分画は、当技術分野で既知の所定の方法、例えば、遠心分離、ろ過もしくは同様の方法、によって、細胞の可溶性分画から分離される。
【００８５】
分娩後由来細胞集団から準備された細胞可溶化液または細胞可溶性分画は、そのまま使用されるか、例えば限外ろ過もしくは凍結乾燥によってさらに濃縮されるか、あるいは、乾燥して、部分的に精製して、当技術分野において既知の製薬上許容できる担体もしくは希釈剤と組み合わせるか、または、例えば、製薬上有用なタンパク質組成物といった生物製剤のような他の化合物と組み合わせてもよい。細胞可溶化液またはその分画は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、単独で、または、例えば自家もしくは同系の生細胞と共に、使用されることができる。可溶化液は、ｉｎ  ｖｉｖｏで導入される場合、治療部位で局所的に導入してもよいし、あるいは、例えば、患者に必要とされる細胞成長因子を提供するために、遠隔的に導入してもよい。
【００８６】
さらなる実施形態では、ＵＴＣは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養されて、生物学的産物を高い収量で産生することができる。目的の特定の生物学的産物（例えば、栄養因子）を天然で産生するか、または生物学的産物を産生するよう遺伝子操作したＵＴＣは、本明細書で説明する培養技術を用いて、クローン的に増殖することができる。あるいは、細胞を、骨格筋、血管平滑筋、周皮細胞、もしくは、血管内皮系統への分化を誘導する培地中で、増殖させてもよい。いずれの場合も、細胞によって産生され、培地中に分泌された生物学的産物を、標準的分離技術、例えば、数例挙げると、差次的タンパク質沈殿、イオン交換クロマトグラフィ、ゲルろ過クロマトグラフィ、電気泳動、および、ＨＰＬＣを用いて、馴化培地から容易に単離することができる。「バイオリアクター」を、フィーディング（ｆｅｅｄｉｎｇ）のためのフロー法、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの３次元培養、を利用するために用いてもよい。基本的に、新鮮培地が３次元培養を通過するので、生物学的産物が培養物から洗い出され、その後、上記のように流出物から単離されてもよい。
【００８７】
あるいは、目的の生物学的産物は、細胞の中にとどまってもよい。したがって、その収集には、上記で説明したように、細胞を可溶化する必要があるかもしれない。生物学的産物を、その後、前記に列記した技術のうち任意の１つまたは複数を用いて、精製してもよい。
【００８８】
他の実施形態では、本発明は、以下で説明するように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの使用のために培養されたＵＴＣ由来の馴化培地を利用する。ＵＴＣ馴化培地の使用により、拒絶反応もしくは他の逆免疫反応の誘因となりうる無処理細胞を導入することなしに、ＵＴＣによって分泌された有利な栄養因子を、患者において同種的に用いることができる。培養培地中で細胞を培養し、その後、培地から細胞を取り除くことによって、馴化培地を準備する。
【００８９】
臍帯由来細胞集団から準備された馴化培地を、そのまま用いるか、例えば限外ろ過もしくは凍結乾燥によってさらに濃縮するか、あるいは、乾燥して、部分的に精製して、当技術分野において既知の製薬上許容可能な担体もしくは希釈剤と組み合わせるか、または、例えば製薬上有用なタンパク質組成物といった生物製剤のような他の化合物と組み合わせることができる。馴化培地を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏで、単独で使用するか、または、例えば、自家もしくは同系生細胞と組み合わせることができる。馴化培地は、ｉｎ  ｖｉｖｏで導入される場合、治療部位で局所的に導入してもよいし、患者に必要とされる細胞成長もしくは栄養因子を提供するために、遠隔的に導入してもよい。
【００９０】
別の実施形態では、液体、固体、半固体の基質上でＵＴＣを培養することによって産生された細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を、組織修復もしくは置換を必要とする被験者に生細胞を埋め込む代替物として、準備し、収集し、利用する。ＵＴＣは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、本明細書中で別の箇所で説明するような３次元フレームワーク上で、所望の量のＥＣＭをそのフレームワーク上へ分泌するような条件下で、培養される。新組織を含む細胞を取り除き、例えば注入可能な製剤として更に使用するために、ＥＣＭを加工する。これを達成するために、フレームワーク上の細胞を殺し、フレームワークから任意の細胞壊死破片を取り除いた。このプロセスは、いくつかの異なる方法で実行されてもよい。例えば、生組織を低温保存することなしに液体窒素中で急速冷凍することができるか、または、組織を無菌蒸留水に浸すことができ、細胞は浸透圧に反応して破裂する。
【００９１】
一度細胞を殺すと、細胞膜は破砕されて、ＥＤＴＡ、ＣＨＡＰＳ、もしくは、双性イオン洗剤のような中性洗剤によるすすぎ処理をすることによって、細胞壊死破片が取り除かれる。あるいは、細胞膜を破壊し、細胞内容物を除去することのできる試薬によって、組織を酵素的に消化し、かつ／もしくは抽出することができる。このような酵素の例は、ヒアルロニダーゼ、ディスパーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼを含むがこれらに限定されない。洗剤の例は、例えば、アルキルアリルポリエーテルアルコール（トリトン  Ｘ−１００）、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．）、ＢＲＩＪ−３５、ポリエトキシエタノールラウリルエーテル（Ａｔｌａｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ  ２０）、ポリエトキシエタノールソルビタンモノラウレート（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．）、ポリエチレンラウリルエーテル（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．）のような非イオン性洗剤、および、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、硫酸化高級脂肪族アルコール、スルホン酸化アルカン、枝分かれ鎖もしくは非枝分かれ鎖中に７〜２２個の炭素原子を含むスルホン酸化アルキルアーレンのようなイオン性洗剤を含む。
【００９２】
少なくとも部分的に、新しい組織が、生分解性もしくは非生分解性の３次元フレームワーク上で形成されたかどうかに応じて、金属の場合のように、さまざまな方法で、ＥＣＭの収集を達成することができる。例えば、フレームワークが非生分解性の場合、フレームワークを超音波処理、高圧力水噴流、機械的剥離、または、洗剤もしくは酵素での軽い処理、あるいは、上記の任意の組み合わせにかけることによって、ＥＣＭを取り除くことができる。
【００９３】
フレームワークが生分解性である場合、ＥＣＭは、例えば、フレームワークを溶液中に分解もしくは溶解させることによって、収集され得る。あるいは、生分解性フレームワークがＥＣＭとともに注入することが可能な材料から構成される場合、フレームワークおよびＥＣＭは全体として、その後の注入のために加工することができる。あるいは、上記で説明した非生分解性フレームワークからＥＣＭを収集するための方法のいずれかによって、ＥＣＭを生分解性フレームワークから除去することができる。好ましくは、全収集プロセスが、ＥＣＭを変性することがないように設計される。
【００９４】
収集後、ＥＣＭを更に加工してもよい。例えば、超音波処理のような当技術分野で周知の技術を用いて、ＥＣＭを細かい粒子に均質化することができ、外科用針を通過することが可能である。所望の場合、ガンマ線照射によって、ＥＣＭの成分を架橋することもできる。好ましくは、ＥＣＭを滅菌し架橋するために、０．２５〜２メガラドで、ＥＣＭを照射することができる。グルタルアルデヒドのような有毒な薬剤を用いた化学的架橋は可能であるが、概して好適ではない。
【００９５】
本発明の細胞によって産生されたＥＣＭを１つまたは複数の他の細胞型のＥＣＭと混ぜることによって、ＥＣＭ中に存在するさまざまな型のコラーゲンのような、タンパク質の量および／もしくは割合を調整してもよい。その上、タンパク質、成長因子、および／もしくは、薬剤のような生物活性物質を、ＥＣＭ中に取り込むことができる。例示的な生物活性物質は、注入部位での治癒および組織修復を促進する組織成長因子、例えばＴＧＦ−βおよび同様のもの、を含む。このような追加的な薬剤は、本明細書において前記で説明したような実施形態のいずれか、例えば、ＵＴＣによって産生された全細胞可溶化液、可溶性細胞分画、もしくは、さらに精製した成分および産物とともに利用してもよい。
【００９６】
別の態様では、本発明は、末梢虚血発作によって引き起こされた傷害もしくは損傷を治療するための様々な方法で、ＵＴＣ、ＵＴＣ集団、ＵＴＣの成分および産物を利用する医薬組成物を提供する。ある実施形態は、生細胞（ＵＴＣ単独、または他の細胞型と混合されたＵＴＣ）を含む医薬組成物を包含する。他の実施形態は、ＵＴＣ細胞成分（例えば、細胞可溶化液、可溶性細胞分画、馴化培地、ＥＣＭ、もしくは前記のいずれかの成分）、または、産物（例えば、ＵＴＣによって天然に、もしくは、遺伝子操作を通じて産生された栄養因子および他の生物学的因子、ＵＴＣ培養由来の馴化培地）を含む医薬組成物を包含する。本発明に使用され得るＵＴＣ成分および産物は、米国特許出願公開第２００５／００３２２０９号、２００５／００５８６３１号、および２００５／００５４０９８号に説明され、参照により本明細書に組み込まれる。いずれの場合も、医薬組成物は、当技術分野で既知の抗炎症薬、抗アポトーシス薬、抗酸化剤、成長因子、筋栄養因子、または筋再生薬もしくは筋保護薬のような他の活性薬剤をさらに含んでもよい。
【００９７】
ＵＴＣ生細胞を含む医薬組成物は、典型的には、液体、半固体（例えばゲル）または固体（例えば、血管または肺組織の処理に適切な、マトリックス、足場など）として処方される。標的の血管もしくは肺組織への生細胞の送達を達成するため、当技術分野で既知である任意の許容できる経路によって投与するために、液体組成物を処方する。典型的には、これらは、ポンプ装置を備えるかもしくは備えない針および／もしくはカテーテルを有する注射器を経由して、筋内送達、静脈内送達、動脈内送達を含むがこれらに限定されない投与経路によって、拡散性の方法の、または、肺の傷害、損傷、もしくは、苦痛に係る部位を標的とした、注入もしくは注射を含む。
【００９８】
半固体もしくは固体担体中に生細胞を含む医薬組成物は、典型的には、肺の傷害、損傷、もしくは、苦痛に係る部位での外科的な植え込みのために処方される。液体組成物もまた、外科的手法によって投与されてもよいことが、十分に認識されるだろう。特定の実施形態では、半固体もしくは固体の医薬組成物は、非生分解性もしくは生分解性であってもよい半透過性のゲル、格子、細胞足場、および、同様のものを含んでもよい。例えば、ある実施形態では、周囲の肺組織もしくは血管細胞に対して、細胞が生物学的分子（例えば、筋栄養因子、血管栄養因子、内皮前駆細胞補充因子）を分泌し送達することができるが、周囲からは外因性の細胞を隔絶することが望まれるか、または適切であるかもしれない。これらの実施形態では、細胞を、自律性インプラントとして、処方してもよい。そのインプラントは、移植細胞を宿主組織から物理的に分離するような、非分解性の選択透過性障壁によって囲まれた、生きたＵＴＣもしくはＵＴＣを含む細胞集団を含む。生存、または非分解性で選択的に透過性のバリアにより囲まれたを含む細胞集団を含む。このようなインプラントは、薬理学的に誘導された免疫抑制の不存在下で、免疫細胞および巨大分子が移植細胞を殺すことを妨げることができるため、時折「免疫保護性」と呼ばれる。
【００９９】
他の実施形態では、本発明の医薬組成物のために、異なる分解性ゲルおよびネットワークを利用する。例えば、徐放処方に特に適当な分解性材料は、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、メチルセルロース、ヒアルロン酸、コラーゲン、および、同様のもののような生物適合性ポリマーを含む。
【０１００】
他の実施形態では、生分解性、好ましくは、生体再吸収性もしくは生体吸収性の足場もしくはマトリックスの上、もしくは、それらの中で、細胞を送達することが望ましいか、または適切であるかもしれない。このような典型的には３次元の生体材料は、足場に付着するか、足場内に拡散するか、または足場の中にとらえられた細胞外マトリックスに取り込まれる、生細胞を含む。いったん体の標的領域に植え込まれると、これらのインプラントは、宿主組織と統合されるようになり、移植細胞は段階的に定着するようになる（例えば、Ｔｒｅｓｃｏ，  Ｐ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．，２０００；４２：３−２７を参照のこと；Ｈｕｔｍａｃｈｅｒ，  Ｄ  Ｗ，  Ｊ．  Ｂｉｏｍａｔｅｒ．  Ｓｃｉ．  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｅｄｎ．，２００１；１２：１０７−１７４も参照されたい）。
【０１０１】
生物適合性マトリックスは、天然の生分解性ポリマー、修飾された天然の生分解性ポリマー、合成の生分解性ポリマーで構成されてもよい。そのポリマーは、ホモポリマー、コポリマー、ブロックポリマー、ならびに、それらの組み合わせを含む。概して、ポリマーは合成されるモノマーに基づいて命名されることに留意されたい。
【０１０２】
適当な生分解性ポリマーもしくはポリマークラスの例は、フィブリン、コラーゲン、エラスチン、ゼラチン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ラミニン、トロンビン、ポリ（アミノ酸）、酸化セルロース、トロポエラスチン、絹、リボ核酸、デオキシリボ核酸、タンパク質、ポリヌクレオチド、再構成基底膜マトリックス、デンプン、テキストラン、アルギン酸、ヒアルロン、キチン、キトサン、アガロース、多糖類、ヒアルロン酸、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリエチレングリコール、脱細胞化組織、自己集合性ペプチド、ポリペプチド、グリコサミノグリカン、それらの誘導体、および、それらの混合物を含む。グリコール酸、乳酸の双方について、中間環状二量体は、典型的には、重合に先行して準備され、精製される。これらの中間二量体は、それぞれ、グリコリド、ラクチドと呼ばれる。他の有用な生分解性ポリマーもしくはポリマークラスは、限定されないが、脂肪族ポリエステル、ポリ（シュウ酸アルキレン）、チロシン由来ポリカーボネート、ポリイミノカーボネート、ポリオルトエステル、ポリオキサエステル、ポリアミドエステル、アミン基を含むポリオキサエステル、ポリ（フマル酸プロピレン）、ポリジオキサノン、ポリカーボネート、ポリシュウ酸、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（エステル）、ポリウレタン、ポリ（ウレタンエステル）、ポリ（ウレタンエーテル）、ポリ無水物、ポリアセテート、ポリカプロラクトン、ポリ（オルトエステル）、ポリアミノ酸、ポリアミド、ならびに、そのブレンドおよびそのコポリマーを含む。追加的な有用な生分解性ポリマーは、限定されないが、Ｌ−乳酸およびＤ−乳酸のステレオポリマー、ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパンとセバシン酸とのコポリマー、セバシン酸コポリマー、カプロラクトンのコポリマー、ポリ（乳酸）／ポリ（グリコール酸）／ポリエチレングリコールコポリマー、ポリウレタンとポリ（乳酸）とのコポリマー、α−アミノ酸のコポリマー、α−アミノ酸とカプロン酸とのコポリマー、α−ベンジルグルタミン酸塩とポリエチレングリコールとのコポリマー、コハク酸塩とポリ（グリコール）とのコポリマー、ポリフォスファゼン、ポリ（ヒドロキシアルカノアート）、および、それらの混合物を含む。二成分系、三成分系もまた考えられる。
【０１０３】
概して、マトリックスとして用いられる適切な生分解性ポリマーは、（１）意図された適用に適切な機械的な特性を有し、（２）組織が成長し治癒されるまで十分無処理のままであり、（３）炎症反応もしくは有毒反応を引き起こさず、（４）その目的を果たした後に体内で代謝され、（５）形成されるべき望ましい最終産物へと容易に加工され、（６）許容できる品質保持期間を示し、（７）容易に滅菌されるように、望ましく構成される。
【０１０４】
本発明の１つの態様では、マトリックスを形成するために用いられる生物適合性ポリマーは、ヒドロゲルの形態である。概して、ヒドロゲルは、架橋ポリマー材料であり、これは、明らかな３次元構造を維持しながら、その重量の２０％より多く吸水することができるものである。この定義は、水で膨脹した材料と同様に、水を含む環境下で膨脹するであろう乾燥した架橋ポリマーも含む。多くの親水性ポリマーは、ポリマーが生物起源、半合成性、全合成性であっても、ヒドロゲルを産生するために架橋されることが可能である。ヒドロゲルを、合成ポリマー材料から産生してもよい。このような合成ポリマーは、特性の範囲および予想できるロット間の一様性にあわせて調整されることが可能であり、概して免疫原性の心配がないような信頼できる材料源を示すことができる。マトリックスは、米国特許第５，６７０，４８３号および５，９５５，３４３号、米国出願公開第２００２／０１６０４７１号、ＰＣＴ出願ＷＯ０２／０６２９６９号で論じられるように、自己集合性ペプチドから形成されるヒドロゲルを含んでもよい。
【０１０５】
薬剤送達に係る適用において、ヒドロゲルを価値のあるものにする特性は、平衡膨張度、吸着動力学、溶質透過性、ｉｎ  ｖｉｖｏでの実行特性を含む。化合物に対する透過性は、一部には、膨張度もしくは含水量、および生分解速度に依存する。ゲルの機械的強度は膨張度に正比例して減少するため、合成方式が機械的強度を高めるように、ヒドロゲルが基質に付着することが可能なことは、本発明の意図の範囲内である。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは、ヒドロゲルの有用な送達特性と共に、基質の機械的強度を得るために、多孔性基質内に含浸することができる。
【０１０６】
本発明で用いてもよい足場もしくはマトリックス（時折、まとめて「フレームワーク」と呼ばれる）の非限定的例は、織物、編み物、組みひも、メッシュ、不織布、ねじれ編みのような織物構造、多孔性フォーム、半多孔性フォーム、有孔フィルムもしくはシート、微粒子、ビーズ、球、および、上記の構造体の組み合わせである複合構造体を含む。不織性マットを、例えば、商品名ＶＩＣＲＹＬ縫合糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ，  Ｉｎｃ．，  Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，  Ｎ．Ｊ．）で販売されているグリコール酸と乳酸との合成吸収性コポリマー（ＰＧＡ／ＰＬＡ）から構成される繊維を用いて、形成してもよい。例えば、ポリ（ε−カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸）（ＰＣＬ／ＰＧＡ）コポリマーから構成され、フリーズドライすなわち凍結乾燥のようなプロセスによって形成され、米国特許第６，３５５，６９９号で論じられているようなフォームをも利用してよい。自己集合性ペプチド（例えば、ＲＡＤ１６）のようなヒドロゲルをも使用してよい。ｉｎ  ｓｉｔｕ形成性分解ネットワーク（ｉｎ  ｓｉｔｕ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｎｅｔｗｏｒｋ）もまた、本発明での使用に適切である（例えば、Ａｎｓｅｔｈ，  Ｋ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，２００２；７８：１９９−２０９；Ｗａｎｇ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，  ２００３；２４：３９６９−３９８０；米国特許出願公開第２００２／００２２６７６号を参照のこと）。これらのｉｎ  ｓｉｔｕ形成性の材料を、注入に適当な液体として処方し、その後、ｉｎ  ｓｉｔｕもしくはｉｎ  ｖｉｖｏでの温度、ｐＨ、光照射の変化のような様々な手段によってヒドロゲルを形成するよう誘導してもよい。
【０１０７】
別の実施形態では、フレームワークは、生体吸収性材料、例えば、ＰＧＡ、ＰＬＡ、ＰＣＬコポリマーもしくはブレンド、または、ヒアルロン酸、から作られたマルチフィラメント糸から構成されることが可能なフェルトである。糸は、圧着、裁断、梳綿、穿刺から成る標準的な織物加工技術を用いて、フェルトへと製造される。別の実施形態では、複合構造体であってもよいフォーム足場上に、細胞を播種する。
【０１０８】
前記の実施形態の多くでは、フレームワークを、血管のような有用な形状に成型してもよい。さらに、前形成された、非分解性の外科的なもしくは植え込み可能な装置の上で、例えば、線維芽細胞を含むＧＤＣ血管内コイルを準備するために用いられるものに対応するやり方で、ＵＴＣを培養してもよい（Ｍａｒｘ，  ＷＦ，  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｒａｄｉｏｌ．，  ２００１；２２：３２３−３３３）ことが理解されるであろう。
【０１０９】
細胞の植え込みに先立って、マトリックス、足場、もしくは、装置を、細胞付着を高めるために処理してもよい。例えば、植え込みに先立って、ナイロンマトリックスを、ナイロンをコートするために、０．１モル酢酸で処理し、ポリリジン、ＰＢＳ、および／もしくは、コラーゲン中でインキュベートすることができる。ポリスチレンは、硫酸を用いて同様に処理することができる。例えば、フレームワークをプラズマコーティングすることによって、または、１つまたは複数のタンパク質（例えば、コラーゲン、弾性線維、細網線維）、糖タンパク質、グリコサミノグリカン（例えば、硫酸ヘパリン、コンドロイチン−４−硫酸、コンドロイチン−６−硫酸、ダルマタン硫酸、ケラチン硫酸）、サイトカインおよび成長因子といった遺伝的材料、細胞マトリックス、ならびに／または、他の材料（細胞の生存および分化に影響を与える他の因子のうち、ゼラチン、アルギン酸塩、寒天、アガロース、植物ゴム、を含むがこれらに限定されない）を添加することによって、細胞の付着もしくは成長、および、組織の分化を改善するためにフレームワークの外側表面を修飾してもよい。
【０１１０】
ＵＴＣ含有フレームワークを当技術分野で既知の方法に従って準備する。例えば、細胞を、培養容器中でサブコンフルエンスもしくはコンフルエンスまで、自由に成長させ、培養から引き上げ、フレームワーク上に植えつけることができる。成長因子を、所望の場合、分化および組織形成を誘引するよう、細胞の植えつけの前に、その最中に、もしくは、その後、培養培地に加えてもよい。あるいは、フレームワーク自体を、フレームワーク上での細胞成長を高めるか、またはインプラントの拒絶のリスクが減少するように、改変してもよい。したがって、抗炎症化合物、免疫抑制剤、もしくは、成長因子を含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の生物活性化合物を、局所的放出のためにフレームワーク上に加えてもよい。
【０１１１】
特に肺疾患患者において、肺の細胞および組織の修復、再生、改善を補助し、促進するため、血流を改良するため、そして、血管新生を刺激かつ／もしくは補助するため、様々な方法で、ＵＴＣ、ＵＴＣの一部、もしくは、ＵＴＣを含む細胞集団、または、ＵＴＣの成分もしくはＵＴＣによって産生された産物を用いてもよい。このような実用性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法、ｅｘ  ｖｉｖｏ法、およびｉｎ  ｖｉｖｏ法を包含する。
【０１１２】
一実施形態では、上記で説明したように、生物学的産物を産生するために、ＵＴＣをｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することができる。その生物学的産物は、細胞によって天然に産生されるか、肺組織へと分化するように誘導された場合に細胞によって産生されるか、または、遺伝子操作経由の細胞によって産生されるものである。例えば、ＴＩＭＰ１、ＴＰＯ、ＫＧＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＭＩＰ１ｂ、ＭＣＰ１、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、ＴＡＲＣ、ＭＤＣ、ＩＬ−８は、成長培地中で成長した臍由来細胞から分泌されることがわかった（実施例を参照）。さらに、血管内皮前駆細胞を補充するための因子、例えば、ＶＥＧＦ、ＳＤＦ−１、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、スタチン、エストロゲン、ＰＰＡＲγ、ＣＸＣＲ４は、ＵＴＣによって産生されてよく、成長培地中に分泌されてもよい。まだ検出されていないか、もしくは試験されていない、肺組織もしくは血管の修復および再生において使用される他の栄養因子は、ＵＴＣによって産生されると思われ、かつ培地中へ分泌される可能性がある。
【０１１３】
この点において、本発明の別の実施形態は、未分化ＵＴＣ、または、肺組織もしくは血管系統への分化を刺激する条件下でインキュベートしたＵＴＣのいずれかから、馴化培地を産生するために、ＵＴＣを使用することを特色とする。このような馴化培地は、例えば、肺組織前駆細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｅｘ  ｖｉｖｏでの培養のための使用、あるいはＵＴＣの同種集団、またはＵＴＣおよび肺組織もしくは血管前駆体を含む異種集団を含む移植細胞を補助するための、または血管内皮前駆細胞を肺傷害の部位へ補充するための、ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用について、企図される。
【０１１４】
さらに別の実施形態は、様々な目的のために、ＵＴＣ細胞可溶化液、可溶性細胞分画、もしくはそれらの成分、または、ＥＣＭもしくはそれらの成分の使用を含む。前記のように、これらの成分のうちのいくつかを、医薬組成物中で用いてもよい。他の実施形態では、細胞可溶化液もしくはＥＣＭを、外科的に用いる、すなわち、植え込みのため、もしくは、ｅｘ  ｖｉｖｏの目的のための物質もしくは装置をコーティングするかまたは別様に処理するために用いて、そのような処理の過程で接触される細胞もしくは組織の治癒もしくは生存を促進する。いくつかの好適な実施形態では、このようなＵＴＣから作られる製剤は、ＦＧＦおよびＨＧＦを含む。
【０１１５】
別の実施形態では、他の細胞、特に、肺組織細胞、例えば、骨格筋前駆細胞、血管平滑筋細胞、血管平滑筋前駆細胞、周皮細胞、血管内皮細胞もしくは血管内皮前駆細胞に、栄養的補助を提供するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの共培養において、ＵＴＣは有利に用いられる。いくつかの好適な実施形態では、栄養的補助は、細胞の増殖である。共培養については、２つの細胞型が接触している条件下で、ＵＴＣおよび所望の他の細胞が共培養されることが望ましいかもしれない。このことは、例えば、異種性細胞集団としての細胞を、培養培地中に、もしくは、適当な培養基質上に播種することによって達成される。あるいは、ＵＴＣは、まずコンフルエンスまで成長させられてよく、その後、培養中に、２番目の所望の細胞型の基質として役立つ。この後者の実施形態では、共培養期間後、他の細胞型を取り除き、別個に用いることができるように、例えば、膜もしくは同様の装置によって、細胞をさらに物理的に分離してもよい。肺組織もしくは血管細胞型の増殖および分化を推進するための共培養におけるＵＴＣの使用には、研究および臨床上／治療上の分野において、適用性が見出される。例えば、ＵＴＣ共培養を、例えば、基礎研究の目的で、もしくは、薬剤スクリーニング解析で使用する目的で、培養中に、肺組織、例えば、血管平滑筋、周皮細胞、もしくは血管内皮細胞の成長や分化を培養中で促進するために利用してもよい。また、後に治療目的で投与するように、例えば、血管平滑筋、周皮細胞、もしくは血管内皮前駆体をｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させるために、ＵＴＣ共培養を利用してもよい。肺組織、例えば、血管平滑筋、周皮細胞、または血管内皮前駆細胞は、個体から採取され、ｅｘ  ｖｉｖｏでのＵＴＣとの共培養で増殖され、その後、その個体（自家移転）もしくは他の個体（同系もしくは同種移転）に戻されてもよい。これらの実施形態では、ｅｘ  ｖｉｖｏでの増殖後、ＵＴＣ、および、肺組織、例えば血管平滑筋、周皮細胞、もしくは血管内皮前駆体を含む混合細胞集団を、治療が必要な患者に投与することができたことが認識されるであろう。あるいは、自家移転が適切であるかもしくは望ましい状況では、共培養された細胞集団を、患者に投与するために、培養中に物理的に分離してよく、自家の肺組織、例えば、血管平滑筋もしくは血管内皮前駆体、を取り除くことができる。
【０１１６】
米国特許出願公開第２００５／００３２２０９号、２００５／００５８６３１号、２００５／００５４０９８号、および２００５／００５８６３０号に説明されるように、ＵＴＣ、ならびにその成分および産物は、体の中に効果的に移植され、受け入れられた動物モデルにおいて、血流を改善し、組織壊死を低減することが示されてきた。本発明で説明した発見とともに、これらの成果は、本発明の好適な実施態様を援護するものであり、ＵＴＣは、肺損傷患者における肺組織および／もしくは血管組織を修復もしくは再生することによって、あるいは、肺損傷患者における血流を改良するか、または血管新生を刺激および／もしくは補助することによって、肺傷害もしくは損傷を治療するための細胞療法において用いられる。一実施形態では、ＵＴＣを、体の標的位置、特に、肺損傷の位置もしくはその近位に移植し、ＵＴＣは、肺組織表現型、例えば、血管平滑筋、周皮細胞、もしくは血管内皮表現型のうち１つまたは複数に分化でき、ＵＴＣは、肺組織、例えば、血管平滑筋細胞、周皮細胞、もしくは血管内皮細胞前駆体および／または肺組織細胞に栄養的補助を提供することができる。ｉｎ  ｓｉｔｕで、ＵＴＣは、肺傷害の部位へ内皮前駆細胞を補充する因子を産生することができ、あるいは、ＵＴＣは、とりわけ、これらの方法のうち２つまたは３つ以上における有利な効果を及ぼすことができる。ＵＴＣは、ＧＦＧＦｍ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＨＧＦ、ＩＧＦ−１、ＴＰＯおよび同様のものを含むがこれらに限定されない、栄養因子を分泌する。ＵＴＣは、新しい血管形成を刺激するための血管芽細胞のような、血管前駆細胞の補充を助けることができる。
【０１１７】
ＵＴＣは、投与された患者の体に、栄養作用を及ぼすことができる。例えば、ＵＴＣは、肺組織細胞、例えば、それらの血管平滑筋細胞、血管内皮細胞、周皮細胞、もしくは前駆細胞に栄養作用を及ぼすことができる。いくつかの好適な実施形態では、栄養作用は、このような細胞の増殖である。ＵＴＣは、投与された患者の体内で、細胞の遊走を誘導することもできる。このような遊走は、肺の疾患、障害、および／または傷害、例えばＣＯＰＤ、ＡＬＩ、ＡＲＤＳ、および肺線維症、の修復、再生、および治療を促進することができる。例えば、肺損傷の部位もしくはその部位の近くに投与されたＵＴＣは、罹患組織およびその周囲を、修復するか、再生するか、もしくは別様に治療するために、肺損傷の部位への細胞の遊走を誘導することができる。そのように投与されたＵＴＣは、肺組織細胞、例えば、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞、周皮細胞、もしくはその前駆細胞の遊走を誘導することができる。好適な実施形態では、ＵＴＣは、肺損傷の部位、もしくは、少なくともその部位の近くに、血管内皮細胞および／もしくは血管内皮前駆細胞の遊走を誘導する。いくつかの実施形態では、遊走は、ＦＧＦおよび／もしくはＨＧＦによって、好ましくはＵＴＣによって発現されたＦＧＦおよびＨＧＦによって、誘導されるか、もしくは、補助される。細胞可溶化液、細胞内分画、産物、および、同様のものを含む、ＵＴＣから作られた製剤を、肺の疾患、障害および／または傷害を治療するために用いることもできる。そのような製剤を、本明細書で説明され、例示されるような医薬的に許容可能な担体と共に処方することができ、また、肺の疾患、障害および／または傷害を治療するために有効な量で、患者に投与することができる。好適な実施形態では、ＵＴＣから作られた製剤は、ＦＧＦおよびＨＧＦを含む。
【０１１８】
本発明の特定の実施形態は、肺の傷害または損傷の治療のため、血管の直接の修復、再生、もしくは置換、または修復、再生、もしくは置換の補助に関する。
【０１１９】
ＵＴＣを、単独で（例えば、実質的に同種の集団として）投与してもよいし、他の細胞とともに混合剤として投与してもよい。前述のように、ＵＴＣを、マトリックスもしくは足場と共に、または、従来の医薬的に許容可能な担体と共に、医薬製剤の中に処方するように、投与してもよい。ＵＴＣを他の細胞と共に投与した場合、他の細胞と同時に投与してもよいし、他の細胞と連続して投与してもよい（他の細胞の前後どちらでも）。ＵＴＣと関連して投与してもよい細胞は、筋細胞、肺組織細胞、骨格筋前駆細胞、血管平滑筋細胞、血管平滑筋前駆細胞、周皮細胞、血管内皮細胞、もしくは血管内皮前駆細胞、および／または他の多分化能もしくは多能幹細胞を含むが、これらに限定されない。異なる型の細胞を、投与の直前に、すなわち投与のすぐ前に、ＵＴＣと混合してもよいし、投与前、ある期間にわたり、共に共培養してもよい。
【０１２０】
ＵＴＣを、他の有益な薬物もしくは生物学的分子または他の活性薬剤、例えば、当技術分野で既知の抗炎症薬、抗アポトーシス薬、抗酸化剤、成長因子、血管新生因子、または、筋再生薬もしくは筋保護薬、とともに投与してもよい。ＵＴＣを他の薬剤とともに投与する場合、単一の医薬組成物中でともに投与してもよいし、別々の医薬組成物中で、他の薬剤と同時に、もしくは、連続して投与してもよい（他の薬剤の投与の前後どちらでも）。他の薬剤は、当技術分野の内科医が適切であると判断した場合、移植前に始まり回復経過全体にわたり連続する治療措置の一部であってもよいし、移植の時点もしくは移植の後でさえ開始してもよい。
【０１２１】
一実施形態では、ＵＴＣを、未分化細胞、すなわち、成長培地の中で培養した細胞として投与する。あるいは、ＵＴＣを、培養中で、所望の肺組織表現型、例えば、血管平滑筋、周皮細胞、もしくは血管内皮表現型への分化を刺激する条件にさらした後に、投与してもよい。
【０１２２】
本発明の細胞を、外科的に植え込み、注入し、送達し（例えば、カテーテル、注射器、シャント、ステント、マイクロカテーテル、もしくはポンプによって）、または別様に、肺の傷害、損傷、苦痛に係る部位へ直接的に、もしくは、間接的に投与してもよい。本発明の細胞、もしくは、その組成物の投与経路は、静脈内、筋内、皮下、鼻内、髄腔内、大槽内、または、ポンプ装置を備えるかもしくは備えない、針もしくはカテーテルを有する注射器を経由することを含むがこれらに限定されない。
【０１２３】
細胞を半固体もしくは固体装置に投与する場合、体の正確な位置への外科的な植え込みが、典型的には適当な投与手段である。しかしながら、液体または流体医薬組成物を、血液を通じて、もしくは、罹患した肺組織に（例えば、びまん性ＡＬＩもしくはＡＲＤＳの場合などは、びまん性患部全体にわたって）直接投与してもよい。ＵＴＣの遊走は、化学的シグナル、成長因子、もしくは、カルパインによって、導かれる。
【０１２４】
臍帯組織由来細胞もしくは組成物、および／または臍帯組織由来細胞を含むマトリックスを、マイクロカテーテル、カテーテル内方法（ｉｎｔｒａｃａｔｈｅｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ）、ミニポンプを経由して部位に送達してもよい。ビヒクル賦形剤もしくは担体は、患者、特に、細胞分化が誘導されるべき部位に局所的に、投与するために薬剤的に許容できることが既知である任意のものでありうる。例としては、液体培地、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、滅菌生理食塩水、滅菌リン酸緩衝生理食塩水、リーボビッツ培地（Ｌ１５；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）、滅菌ブドウ糖液、および、任意の他の生理学上許容できる液体を含む。
【０１２５】
他の実施形態は、医薬的に許容できる担体およびＵＴＣ細胞成分（例えば、細胞可溶化液もしくはその成分）、もしくは産物（例えば、ＵＴＣによって天然に、もしくは、遺伝子操作を通じて産生された栄養因子および他の生物学的因子、ならびに、ＵＴＣ培養由来の馴化培地）、または、ＵＴＣ成長培地、もしくは、成長培地から精製された産物を含む治療組成物を投与することによって、肺傷害もしくは損傷を治療する方法を包含する。好適な実施形態では、生物学的因子はＦＧＦおよびＨＧＦである。これらの方法は、当技術分野で既知の、成長因子、血管新生因子、筋再生薬、もしくは、筋保護薬のような、他の活性薬剤の投与をさらに含んでもよい。
【０１２６】
ＵＴＣを投与するための剤形および方法、または、本明細書で説明される他の治療組成物もしくは医薬組成物のいずれかは、個々の患者の病状、例えば、肺損傷事象に由来する傷害もしくは損傷の本質および程度、年齢、性別、体重、一般的医療状態、および、開業医に既知である他の因子）を考慮して、正しい医療行為に従って開発される。このように、患者に投与されるべき医薬組成物の有効量は、当技術分野において既知のこれらの考察によって決定される。
【０１２７】
ＵＴＣは混合リンパ球反応における同種のＰＢＭＣを刺激しないことが、示されてきた。したがって、同種、もしくは、異種による、ＵＴＣの移植でさえ、いくつかの例で耐性であるかもしれない。いくつかの実施形態では、ＵＴＣ自体が免疫抑制効果を提供し、それによって、移植されたＵＴＣの宿主拒絶反応を妨げる。このような例では、細胞療法中の薬理学的な免疫抑制は、必ずしも必要でないかもしれない。
【０１２８】
しかしながら、他の例において、細胞療法の開始に先立って、患者を薬理学的に免疫抑制することが望ましいかまたは適切であるかもしれない。このことは、全身性、もしくは、局所性の免疫抑制薬の使用を通じて達成されてもよいし、上記で説明したように、封入された装置中の細胞を送達することで達成されてもよい。移植細胞に対する免疫反応を低減および排除するためのこれらの手段および他の手段は、当技術分野において既知である。代わりに、ＵＴＣを、上記で述べたように、免疫原性を低減するように、遺伝子操作してもよい。
【０１２９】
生きている患者における移植されたＵＴＣの生存を、様々なスキャン技術、例えば、コンピュータ断層撮影（ＣＡＴ、またはＣＴ）スキャン、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）スキャン、を用いて決定することができる。また、移植片生存の決定は、死後に、肺組織もしくは血管組織を取り除き、可視的に、もしくは、顕微鏡下で検査することによって、なされることが可能である。あるいは、肺組織細胞、例えば、血管平滑筋細胞、周皮細胞、もしくは血管内皮細胞に特異的な染色で、細胞を処理することが可能である。また、例えば、ローダミンもしくはフルオレセイン標識したミクロスフィア、ファストブルー（ｆａｓｔ  ｂｌｕｅ）、三価鉄微粒子、ビスベンザミド、または、β−ガラクトシダーゼもしくはβ−グルクロニダーゼのような遺伝的に導入されたレポーター遺伝子産物のような、追跡染料の前もった取り込みによって、移植細胞を同定することができる。
【０１３０】
別の態様では、本発明は、前記のとおり、血管新生を刺激および／もしくは補助するための、血流を改良するための、そして、肺損傷事象によって傷つけられ、損傷された肺組織を再生し、修復し、改善するための様々な方法で、ＵＴＣ、ＵＴＣ集団、ＵＴＣの成分および産物を利用するキットを提供する。肺疾患、障害および／もしくは傷害によって引き起こされた損傷もしくは傷害の治療、または、他の予定された治療のために用いられる場合、キットは、少なくともＵＴＣおよび医薬的に許容可能な担体（液体、半固体、もしくは固体）を含む１つまたは複数の細胞集団を含んでもよい。また、キットは、オプションとして、例えば注入によって、細胞を投与する手段を含んでもよい。キットは、細胞の使用説明書を、さらに含んでもよい。軍用などの野戦病院用に準備されたキットは、組織足場、外科縫合糸、および同様のものを含む完全な手順の供給物を含んでもよく、細胞は、急性傷害の修復と関連付けて用いられるものである。本明細書で説明されたアッセイおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ法のためのキットは、（１）ＵＴＣ、またはＵＴＣの成分もしくは産物、（２）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法を実践するための試薬、（３）適切な、他の細胞もしくは細胞集団、（４）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法を実行するための説明書、のうちの１つまたは複数を含んでもよい。
【０１３１】
以下の実施例は、本発明の実施形態のいくつかの態様を、より詳細に説明する。これらの実施例は、本明細書で説明した発明の態様をさらに例示することを意図している。これらの実施例は、そのように例示された態様を限定するものと解釈されるべきではない。
【０１３２】
実施例１
過酸素症誘導急性肺傷害のマウスモデルにおける肺の保護効果
この実施例は、過酸素症誘導肺傷害のモデルにおいて肺の修復および再生を強化する、ヒトＵＴＣ（ｈＵＴＣ）の有効性を例示する（ｈＵＴＣの単離および特徴づけは、実施例５〜１５で見ることができる）。
【０１３３】
臍細胞培養および単離
臍由来細胞（ＵＤＣ、ｈＵＴＣ）を、米国特許出願公開第２００５／００３２２０９号、２００５／００５８６３１号、および２００５／００５４０９８号に記載のとおり準備した。細胞は、所望の継代まで培養し、その後、低温貯蔵により保存した。
【０１３４】
動物モデル
メスのＣ５７ＢＬ／６マウス（７週齢）をＡｃｅ  Ａｎｉｍａｌｓ（Ｂｏｙｅｒｔｏｗｎ，ＰＡ）から入手した。注入の直前に、ｈＵＴＣを、３７℃で解凍し（水浴）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で２回洗って、１ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁させた。細胞は、血球計数器を用いてカウントした。細胞生存率を、トリパンブルー染料排除により判断した。細胞は、２００μＬのＰＢＳ中で１ｘ１０６個の細胞の濃度で再構成した。
【０１３５】
研究の概略は、以下の表１−１にまとめた。０日目、細胞（２００μＬのＰＢＳ中１ｘ１０６個ｈＵＴＣ）またはＰＢＳビヒクルは、１ｍＬ注射器および２６ゲージ針を用いて、静脈内尾静脈注入によってゆっくりとマウスに投与され、マウスは、その後、室内空気、または９０％のＯ２にさらされた。９０％のＯ２への暴露は、動物をＢｉｏＳｐｈｅｒｉｘチャンバ（ＢｉｏＳｐｈｅｒｉｘ，ＬＴＤ，Ｌａｃｏｎａ，ＮＹ）の中に置くことで達成された。このチャンバは、下準備され、１時間にわたり９０％のＯ２に釣り合わせてあったものである。支持療法（熱による支援およびニュートリカル（ＮｕｔｒｉＣａｌ））をこれらの動物に毎日施した。各タンクについての、動物の観察、死亡率、生存、および酸素濃度パーセントを、１日に２回記録した。処理後４日目、５０ｍｇ／ｍＬのネンブタール（ペントバルビタール）を用いて、動物を安楽死させた。
【表１】
0005518893.tif 000002
【０１３６】
気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）総タンパク質分析
各サンプル中の総タンパク質を決定するため、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、無細胞ＢＡＬＦを分析した。Ｓｏｆｔｍａｘ  ４．０プログラムを使用して分析を完了し、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いてデータをグラフ化した。
【０１３７】
ＢＡＬＦおよび肺ホモジネートサイトカイン／ケモカイン分析
ＢＡＬＦを準備するため、１処理群当たり６匹の動物を安楽死させ、１．０ｍＬの無菌ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で肺を１回洗浄し、湿った氷（ｗｅｔ  ｉｃｅ）上にチューブを置いた。ＢＡＬＦを１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄み液を取り除き、さらなる分析に使用した。
【０１３８】
肺ホモジネートを準備するため、１群当たり６匹の動物を安楽死させ、ＰＢＳによる全身灌流にかけ、左肺を切開し、Ｌｙｓｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｄチューブ内で氷上に置き、その後、ＦａｓｔＰｒｅｐ器具において、４．０の速度で４０秒間、遠心分離した。
【０１３９】
ＢＡＬＦおよび肺ホモジネート双方の上澄み中のサイトカイン／ケモカインレベルを、製造業者のプロトコルに従ってマウス２２−マルチプレックスビーズキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて決定し、ＢｉｏＲａｄ  Ｂｉｏｐｌｅｘ機器を用いて分析した。結果をグラフ化し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて分析した。
【０１４０】
ヒト細胞の検出
Ａｓｕｒａｇｅｎ，  Ｉｎｃ．により、その会社の標準操作手順に従って、全ＲＮＡをマウス組織から単離した。全ＲＮＡサンプルの純度および量が、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００  ＵＶ分光光度計を用いて、２６０および２８０ｎｍで吸収示度により決定された。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて、ＲＮＡの完全性を評価した。
【０１４１】
ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ（Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍｌ＿ＧＡＰＤＨ）のヒト特異性アッセイを使用して、マウスの肺組織内のｈＵＴＣ数を見積もった。単一チューブＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）分析用のサンプルを、Ａｓｕｒａｇｅｎ，  Ｉｎｃ．により、その会社の標準操作手順に従って処理した。製造業者の説明書に従ってＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、希釈物当たり２０μＬの全反応容積で、全ＲＮＡの希釈物を逆転写した。５０ｎｇの入力ｃＤＮＡが次に、ＰＣＲにより分析された。全ての増幅は、有効なＡＢＩ  ７５００リアルタイムサーモサイクラー上で３回（ｉｎ  ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）行われた。９５℃で１０分間のインキュベーション後、サンプルは、９５℃で１５秒間、その後６０℃で１分間の４０サイクルで、増幅された。マウスの肺内のｈＵＴＣ総数は、既知の量の精製ｈＵＴＣ全ＲＮＡを分析することで生成される検量線に基づいて見積もられた。
【０１４２】
ＢＡＬＦ総タンパク質
９０％のＯ２に４日間さらすことで、室内空気の対照動物に比べて、ＢＡＬＦの総タンパク質含量が増加した（ｐ＜０．０１、図１、表１−２）。さらに、９０％のＯ２のＰＢＳ処理群に比べると、９０％のＯ２のｈＵＴＣ処理群においてＢＡＬＦ総タンパク質が、統計的に有意に減少した（ｐ＜０．０５）。
【表２】
0005518893.tif 000003
【０１４３】
ＢＡＬＦおよび肺ホモジネートサイトカイン分析
ＢＡＬＦのケラチノサイト因子（ＫＣ）、γインターフェロン誘導性サイトカイン（ＩＰ−ＩＯ）、インターロイキン１α（ＩＬ−１α）および肺ホモジネート単球走化性因子−１（ＭＣＰ−１）における統計的に有意な減少が、ＰＢＳビヒクルで処理され９０％のＯ２にさらされた動物に比べて、ｈＵＴＣで処理され９０％のＯ２にさらされた動物において観察された（ｐ＜０．０２）（図２ａおよび図２ｂ、図３および図４）。
【０１４４】
ヒト細胞の生着
処理後４日目に、動物を屠殺し、肺を回収し、全ＲＮＡを、ヒト細胞検出のため単離した。結果では、ｈＵＴＣ処理した動物の肺の中にｈＵＴＣが存在するが、ＰＢＳ処理した動物の肺にはないことが示された（表１−３）。
【表３】
0005518893.tif 000004
【０１４５】
マウスにおける過酸素症誘導急性肺傷害発症に対する、ｈＵＴＣの予防的静脈内投与の効果を評価した。９０％のＯ２にさらされたマウスにｈＵＴＣ投与した後、ＢＡＬＦにおける総タンパク質レベルが減少することは、ｈＵＴＣが肺における過酸素症誘導による血管の漏れ／浮腫を減少させることができたことを示唆している。さらに、データは、ｈＵＴＣが、肺における炎症の減少を示唆する、３つの重要なケモカインのレベルを減少させたことを示した。これらのデータは、ｈＵＴＣが肺疾患を治療する重要な治療薬かもしれないという証拠をもたらすものである。
【０１４６】
実施例２
慢性閉塞性肺疾患のげっ歯類モデルにおける治療効果
この実施例は、タバコの煙で誘発された肺傷害のげっ歯類モデルにおいて、肺の修復および再生を高めるｈＵＴＣの有効性を示す。データは、ＣＯＰＤの予防的治療に対するｈＵＴＣの治療価値を表している。
【０１４７】
臍細胞の培養および単離
臍由来細胞（ＵＤＣ、ｈＵＴＣ）を、米国特許出願公開第２００５／００３２２０９号、２００５／００５８６３１号および２００５／００５４０９８号に示されるように準備した。細胞を所望の継代まで培養して、その後、低温貯蔵により保存した。
【０１４８】
動物モデル
健康なオスの１２〜１５週齢のＳＨラットを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣから購入する。各ラット系統は、体重によって３つの群に無作為化される（表２−１）。ＳＤラットはその後、全身をタバコの煙（粒子の総濃度：７５〜８５ｍｇ／ｍ（３））またはろ過した室内空気に、６時間／日、１５日間さらされる（３日／週）。
【０１４９】
用量の準備
１５日目に、煙による処理を終わらせ、ｈＵＴＣまたはＰＢＳビヒクルを投与する。注入の直前に、ｈＵＴＣを３７℃（水浴）で解凍し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で２回洗って、１ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁させる。血球計数器を使用して細胞をカウントする。細胞生存率を、トリパンブルー染料排除によって決定する。細胞は、２ｍＬのＰＢＳ中で１ｅ６個の細胞および３ｅ６個の細胞の適切な濃度で再構築される。細胞は、尾静脈注入によって、２分の間隔にわたりゆっくりと投与される。
【０１５０】
ビヒクルまたはｈＵＴＣ注入後２週間で、動物を屠殺して、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）（８匹の動物／処理群）および肺組織（８匹の動物／処理群）を回収する。
【表４】
0005518893.tif 000005
【０１５１】
ＢＡＬＦの準備
ＢＡＬＦを準備するため、処理群当たり８匹の動物を安楽死させ、肺を、１．０ｍＬの無菌ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１回洗浄し、新鮮なＢＡＬＦを含むチューブを湿った氷の上に置く。ＢＡＬＦを、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄み液を取り除いて、さらなる分析のために使う。
【０１５２】
ＢＡＬＦのサイトカイン分析
ＢＡＬＦのサイトカイン／ケモカインレベルは、製造業者のプロトコルに従ってマウス２２−マルチプレックスビーズキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて決定され、ＢｉｏＲａｄ  Ｂｉｏｐｌｅｘ機器を用いて分析される。結果をグラフ化し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して分析する。
【０１５３】
ＢＡＬＦ総タンパク質分析
各サンプル中の総タンパク質を決定するため、無細胞ＢＡＬＦが、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して分析される。分析は、Ｓｏｆｔｍａｘ  ４．０プログラムを用いて完了され、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いてデータをグラフ化する。
【０１５４】
組織診断
肺を、処理群当たり８匹の動物から回収する。各肺の半分が、１０％のホルムアルデヒド中性緩衝溶液で２４時間固定され、段階的なエタノールシリーズ（ｇｒａｄｅｄ  ｅｔｈａｎｏｌ  ｓｅｒｉｅｓ）中で脱水され、パラフィンに封入され、５μｍにスライスされた。パラフィン切片は、病理組織学的分析のため、ヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）およびマッソン（Ｍａｓｓｏｎ）で染色される。残りの肺半分は、急速に凍結され、ＭＰＯおよびヒト細胞検出のために処理される（以下を参照）。
【０１５５】
ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性
右上葉からの約２００ｍｇの肺組織が、２０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中でホモジネート化され（ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅｄ）、超遠心される。沈殿物が、ＭＰＯ測定のため、ＨＴＡＢと共に−７Ｏ℃で保存される。ＭＰＯ活性をその後決定する。
【０１５６】
ＲＮＡ単離
Ａｓｕｒａｇｅｎ，  Ｉｎｃ．によって、その会社の標準操作手順に従って、急速凍結された肺組織全てから全ＲＮＡを単離する。全ＲＮＡサンプルの純度および量は、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００  ＵＶ分光光度計を用いて、２６０および２８０ｎｍで、吸収示度により決定される。ＲＮＡ完全性が、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて評価される。
【０１５７】
ヒト細胞の検出
ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ（Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍｌ  ＧＡＰＤＨ）のヒト特異的アッセイを使用して、マウスの肺組織内部のｈＵＴＣ数を見積もる。単一チューブＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）分析用のサンプルを、Ａｓｕｒａｇｅｎ，  Ｉｎｃ．によって、その会社の標準操作手順に従って処理する。全ＲＮＡの希釈物は、製造業者の説明書に従ってＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、希釈物当たり２０μＬの全反応容積において、逆転写される。５０ｎｇの入力ｃＤＮＡが次に、ＰＣＲにより分析される。全ての増幅は、有効なＡＢＩ  ７５００リアルタイムサーモサイクラー上で３回行われる。９５℃出１０分間のインキュベーション後、サンプルは、９５℃で１５秒間、その後６０℃で１分間の４０サイクルで増幅される。
【０１５８】
実施例３
肺線維症のげっ歯類モデルにおける肺の保護および抗線維化効果
この実施例は、ブレオマイシン（ＢＬＭ）で誘発された肺線維症のげっ歯類モデルにおいて、線維症を防止し、肺の修復および再生を高めるｈＵＴＣの有効性を示す。
【０１５９】
臍細胞の培養および単離。臍由来細胞（ＵＤＣ、ｈＵＴＣ）が、米国特許出願公開第２００５／００３２２０９号、２００５／００５８６３１号、および２００５／００５４０９８号に記載されるように準備された。細胞を、所望の継代まで培養して、その後、低温貯蔵により保存した。
【０１６０】
動物モデル
６４匹の成体のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（体重２００〜２５０ｇ）を入手し、各群１６匹の４群にランダムに分割する。動物を、５ｍｇ／ｋｇのＢＬＭで気管内灌流する。注入の直前に、ｈＵＴＣを３７℃（水浴）で解凍し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で２回洗って、１ｍＬのＰＢＳ中で再懸濁させる。細胞は、血球計数器を使用してカウントする。細胞生存率を、トリパンブルー染料排除によって決定する。細胞は、２ｍＬのＰＢＳ中で適切な濃度（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｎｇ）で再構築される。細胞は、２分間の間隔にわたり、尾静脈注入によってゆっくり投与される。研究デザインを以下の表３−１にまとめる。
【０１６１】
ｈＵＴＣ処理群では、０．１−ｘ１０６、１ｘ１０６、または３ｘ１０６個のｈＵＴＣが、ＢＬＭ灌流から１２時間後に、尾静脈の中へ注入される。ＰＢＳビヒクルは単独で、ｈＵＴＣ処理群と同じように投与される。ビヒクルまたはｈＵＴＣ注入から２週間後、動物を屠殺して、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）（８匹の動物／処理群）および肺組織（８匹の動物／処理群）を回収する。
【表５】
0005518893.tif 000006
【０１６２】
ＢＡＬＦの準備
ＢＡＬＦを準備するため、処理群当たり８匹の動物を安楽死させ、肺を１．０ｍＬの無菌ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１回洗浄し、新鮮なＢＡＬＦを含むチューブを湿った氷の上に置く。ＢＡＬＦは、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離され、上澄み液を取り除いて、さらなる分析のため使用する。
【０１６３】
ＢＡＬＦのサイトカイン分析
ＢＡＬＦのサイトカイン／ケモカインレベルは、製造業者のプロトコルに従ってマウス２２−マルチプレックスビーズキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて決定され、ＢｉｏＲａｄ  Ｂｉｏｐｌｅｘ機器を用いて分析される。結果は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いてグラフ化され、分析される。
【０１６４】
ＢＡＬＦの総タンパク質分析
各サンプル中の総タンパク質を決定するため、無細胞ＢＡＬＦは、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて分析される。Ｓｏｆｔｍａｘ  ４．０プログラムを用いて分析を完了し、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いてデータをグラフ化する。
【０１６５】
組織診断
処理群当たり８匹の動物から肺を回収する。各肺の半分が、１０％のホルムアルデヒド中性緩衝溶液で２４時間固定され、段階的なエタノールシリーズで脱水され、パラフィンに封入され、５μｍでスライスされる。パラフィン切片が、病理組織学的分析のため、ヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）およびマッソンで染色される。残りの肺半分は、ヒト細胞の検出のため、急速凍結され処理される（以下を参照）。
【０１６６】
ヒト細胞の検出
Ａｓｕｒａｇｅｎ，  Ｉｎｃ．によって、その会社の標準操作手順に従って、全ＲＮＡは、急速凍結された全肺組織から単離される。全ＲＮＡサンプルの純度および量は、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００  ＵＶ分光光度計を使用して、２６０および２８０ｎｍで、吸収示度により決定される。ＲＮＡの完全性は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて評価される。
【０１６７】
ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ（Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍｌ  ＧＡＰＤＨ）のヒト特異的アッセイを使用して、マウス肺組織内部のｈＵＴＣ数を見積もる。単一チューブＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）分析のためのサンプルが、Ａｓｕｒａｇｅｎ，  Ｉｎｃ．によって、その会社の標準操作手順に従って処理される。全ＲＮＡの希釈物は、製造業者の説明書に従ってＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、希釈物当たり２０μＬの全反応容積において、逆転写される。５０ｎｇの入力ｃＤＮＡが、次に、ＰＣＲにより分析される。全ての増幅は、有効なＡＢＩ  ７５００リアルタイムサーモサイクラー上で３回行われる。９５℃で１０分間のインキュベーション後、サンプルは、９５℃で１５秒間、その後６０℃で１分間の４０サイクルで、増幅される。
【０１６８】
実施例４
エラスターゼにより誘発される気腫のげっ歯類モデルにおける肺の保護効果
この研究は、げっ歯類モデルにおいて、エラスターゼにより誘発される気腫を治療し、回復させ、かつ／または防止する上での、静脈内投与されたｈＵＴＣの有効性を示すものである。
【０１６９】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスまたはラットが、エーテル、またはケタミン（９０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注入により麻酔をかけられ、０．３または１．２単位のブタ膵臓エラスターゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ，Ｕ．Ｓ．Ａ）を鼻腔内投与される。対照のマウスは、生理食塩水単独の鼻腔内投与を受ける。
【０１７０】
エラスターゼ処理から２〜２４時間後、濃度が増加したヒト臍組織由来細胞（ｈＵＴＣ）が、尾静脈注入により投与される。表４．１に示すように、ＰＢＳビヒクル中で再構築された、０．１ｘ１０６、１ｘ１０６、または３ｘ１０６個のｈＵＴＣが、総容量２００μＬで投与される。ｈＵＴＣを含まないＰＢＳビヒクルは、ｈＵＴＣ処理群と同じように投与される。ビヒクルまたはｈＵＴＣ注入から２週間後、動物を屠殺して、肺組織サンプルおよび気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を回収し、分析前に−７０℃で保管する。
【表６】
0005518893.tif 000007
【０１７１】
ＢＡＬＦの分析
ＢＡＬＦを準備するため、全ての動物を安楽死させ、肺を１．０ｍＬの無菌ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１回洗浄し、チューブを湿った氷上に置く。ＢＡＬＦを１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄み液を取り除いて、さらなる分析に使用する。
【０１７２】
ＢＡＬＦおよび肺ホモジネート双方の上澄み中のサイトカイン／ケモカインレベルは、製造業者のプロトコルに従ってマウス２２−マルチプレックスビーズキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて決定され、ＢｉｏＲａｄ  Ｂｉｏｐｌｅｘ機器を用いて分析される。結果は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いてグラフ化され、分析される。
【０１７３】
ＢＡＬＦの総タンパク質分析
各サンプル中の総タンパク質を決定するため、無細胞ＢＡＬＦが、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて分析される。分析は、Ｓｏｆｔｍａｘ  ４．０プログラムを用いて完了し、データは、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いてグラフ化される。
【０１７４】
組織診断
肺組織サンプルは、１０％ホルムアルデヒド中性緩衝溶液で２４時間固定され、段階的なエタノールシリーズ中で脱水され、パラフィンに封入され、５μｍでスライスされる。パラフィン切片は、病理組織学的分析のため、ヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）およびマッソンで染色される。
【０１７５】
ヒト細胞の検出
全ＲＮＡは、Ａｓｕｒａｇｅｎ，  Ｉｎｃ．によって、その会社の標準操作手順に従って、マウス組織から単離される。全ＲＮＡサンプルの純度および量は、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００  ＵＶ分光光度計を用いて２６０および２８０ｎｍで吸収示度によって決定される。ＲＮＡ完全性は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて評価される。
【０１７６】
ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ  （Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍｌ  ＧＡＰＤＨ）のヒト特異的アッセイを用いて、マウス肺組織内部のｈＵＴＣ数を見積もる。単一チューブＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）分析用のサンプルが、Ａｓｕｒａｇｅｎ，  Ｉｎｃ．によって、その会社の標準操作手順に従って処理される。全ＲＮＡの希釈物が、製造業者の説明書に従って、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、希釈物当たり２０μＬの全反応容積において、逆転写される。５０ｎｇの入力ｃＤＮＡが次にＰＣＲにより分析される。全ての増幅は、有効なＡＢＩ  ７５００リアルタイムサーモサイクラー上で３回行われる。９５℃で１０分間のインキュベーション後、サンプルは、９５℃で１５秒間、次に６０℃で１分間の４０サイクルで、増幅される。マウスの肺の中のｈＵＴＣの総数は、既知の量の精製されたｈＵＴＣ全ＲＮＡを分析することにより生成される検量線に基づいて見積もられる。
【０１７７】
ＢＡＬＦの総タンパク質
ＢＡＬＦ総タンパク質濃度の統計的に有意な減少が、ビヒクル処理した対照動物と比べて、ｈＵＴＣ処理した動物で観察される。さらに、有意な好中球蓄積がＰＢＳ対照動物で観察されるが、ｈＵＴＣ処理群では減少し得ることが可能である。
【０１７８】
ＢＡＬＦサイトカイン／細胞外マトリックスタンパク質分析
線維化促進性および／または炎症誘発性サイトカインの統計的に有意な減少が、ビヒクル処理した対照動物に比べ、ｈＵＴＣ処理動物で観察される。さらに、エラスターゼが、肺傷害のマーカーであるＥＣＭの含量を気管支肺胞洗浄液中で増加させる。これらの影響は、ｈＵＴＣ処理により減弱される。
【０１７９】
組織学的分析
エラスターゼ処理は、肺実質のかなりの部分を包囲する胸膜下炎症エリアの発生をもたらす。さらに、正常な肺胞および気管支の構造、ならびに脈管構造の損失が観察される。エラスターゼによる攻撃（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）のすぐ後のｈＵＴＣ投与は、正常な肺胞構造を有する大きな非損傷組織エリアにより証明されるように、肺内部の炎症および損傷の程度を減少させる。
【０１８０】
ヒト細胞の生着
ヒト細胞は、ｈＵＴＣ処理したげっ歯類の肺の内部で検出されるが、ＰＢＳビヒクル処理した動物にはない。
【０１８１】
実施例５
細胞の単離
臍細胞単離。臍帯を、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（ＮＤＲＩ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）から入手した。組織は、通常の運送に従って入手した。細胞単離プロトコルが、層流フードにおいて無菌で行われた。血液および残骸を除去するため、臍帯が、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍＬのアンホテリシンＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の存在下で、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で洗浄された。組織は次に、組織が細かな柔らかい塊（ｆｉｎｅ  ｐｕｌｐ）に刻まれるまで、５０ｍＬの培地（ＤＭＥＭ−低グルコースもしくはＤＭＥＭ−高グルコース；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下で、１５０ｃｍ２の組織培養プレートにおいて機械的に解離された。切り刻まれた組織を、５０ｍＬの円錐チューブ（チューブ当たり約５ｇの組織）へ移した。
【０１８２】
組織が、次に、ＤＭＥＭ−低グルコース培地もしくはＤＭＥＭ−高グルコース培地のいずれかで消化された。これらの培地はそれぞれ、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍＬのアンホテリシンＢ、および消化酵素を含有する。いくつかの実験では、コラゲナーゼおよびディスパーゼの酵素混合物を使用した（「Ｃ：Ｄ」）（コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、５００単位／ｍＬ；およびディスパーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５０単位／ｍＬ、ＤＭＥＭ−低グルコース培地中）。他の実験では、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、およびヒアルロニダーゼ（「Ｃ：Ｄ：Ｈ」）の混合物を使用した（Ｃ：Ｄ：Ｈ＝コラゲナーゼ、５００単位／ｍＬ；ディスパーゼ、５０単位／ｍＬ；およびヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）、５単位／ｍＬ、ＤＭＥＭ−低グルコース中）。組織、培地および消化酵素を含む円錐チューブは、オービタルシェーカー（Ｅｎｖｉｒｏｎ，Ｂｒｏｏｋｌｙｎ，ＮＹ）中、３７℃で、２２５ｒｐｍで２時間インキュベートされた。
【０１８３】
消化後、組織を、１５０ｘｇで５分間遠心分離し、上澄みを吸引した。ペレットが、２０ｍＬの成長培地（ＤＭＥＭ：低グルコース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；規定のウシ胎仔血清；ロット番号ＡＮＤ１８４７５；Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍＬのアンホテリシンＢ（それぞれＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡより））中で再懸濁された。細胞懸濁液は、７０μｍ（７０ミクロン）のナイロンＢＤ  ＦＡＬＣＯＮ細胞ろ過器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を通してろ過された。成長培地を含む、５ｍＬの追加のリンス剤を、ろ過器に通した。細胞懸濁液を次に、４０μｍナイロン細胞ろ過器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）に通し、追加の５ｍＬの成長培地のリンス剤がその後に入れられる（ｃｈａｓｅｄ）。
【０１８４】
ろ過液は、成長培地（総容量５０ｍＬ）に再懸濁され、１５０ｘｇで５分間遠心分離される。上澄みを吸引し、細胞を、５０ｍＬの新鮮な成長培地に再懸濁した。このプロセスを、さらに２回繰り返した。
【０１８５】
最終的な遠心分離の後、上澄みを吸引し、細胞ペレットを、５ｍＬの新鮮な成長培地に再懸濁した。トリパンブルー染色を用いて、生存細胞数を決定した。次に、細胞を、標準条件下で培養した。
【０１８６】
臍帯組織から単離された細胞を、成長培地において、５，０００個の細胞／ｃｍ２で、ゼラチンコートＴ−７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）上に播種した。２日後、使用済み培地、および未付着細胞を、フラスコから吸引した。付着細胞を、ＰＢＳで３回洗浄し、残骸および血液由来細胞を除去した。次に、細胞は、成長培地を補充され、コンフルエンスまで成長した（０代継代から１代継代まで約１０日）。次の継代では（１から２代継代まで、など）、細胞は、４〜５日でサブコンフルエンス（７５〜８５％コンフルエンス）に達した。続いて起こるこれらの継代では、細胞を、５，０００個の細胞／ｃｍ２で播種した。細胞は、加湿インキュベーター中、５％の二酸化炭素により、３７℃で成長した。
【０１８７】
いくつかの実験では、ＬＩＢＥＲＡＳＥ（２．５ｍｇ／ｍＬ，Ｂｌｅｎｄｚｙｍｅ  ３；Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）およびヒアルロニダーゼ（５単位／ｍＬ，Ｓｉｇｍａ）による消化の後、細胞は、ＤＭＥＭ−低グルコース培地中で、分娩後組織から単離される。組織の消化、および細胞の単離は、他のプロテアーゼ消化について前述したとおりであるが、ＬＩＢＥＲＡＳＥ／ヒアルロニダーゼ混合物を、Ｃ：ＤもしくはＣ：Ｄ：Ｈ酵素混合物の代わりに使用した。ＬＩＢＥＲＡＳＥによる組織消化は、直ちに増殖した分娩後組織からの細胞集団の単離をもたらした。
【０１８８】
異なる酵素の組み合わせを用いて、臍帯から細胞を単離する処置を比較した。消化について比較された酵素は、ｉ）コラゲナーゼ；ｉｉ）ディスパーゼ；ｉｉｉ）ヒアルロニダーゼ；ｉｖ）コラゲナーゼ：ディスパーゼ混合物（Ｃ：Ｄ）；ｖ）コラゲナーゼ：ヒアルロニダーゼ混合物（Ｃ：Ｈ）；ｖｉ）ディスパーゼ：ヒアルロニダーゼ混合物（Ｄ：Ｈ）；およびｖｉｉ）コラゲナーゼ：ディスパーゼ：ヒアルロニダーゼ混合物（Ｃ：Ｄ：Ｈ）を含んだ。これらの異なる酵素消化条件を使用した細胞単離の差異を観察した（表５−１）。
【０１８９】
異なるアプローチによって臍帯から細胞の集まりを単離する、他の試みを行った。ある場合には、臍帯をスライスし、成長培地で洗浄して、血餅およびゼラチン質の材料を取り除いた。血液、ゼラチン質の材料、および成長培地の混合物を収集し、１５０ｘｇで遠心分離した。ペレットを再懸濁し、成長培地において、ゼラチンコーティングしたフラスコ上に播種した。これらの実験から、容易に増殖した細胞集団を単離した。
【０１９０】
細胞はまた、ＮＤＲＩから入手した臍帯血サンプルからも単離された。使用した単離プロトコルは、Ｈｏ，  ｅｔ  ａｌ．による国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００２／０２９９７１のものである。臍帯血のサンプル（それぞれ５０ｍＬおよび１０．５ｍＬ）（ＮＤＲＩ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ＰＡ）を、溶解緩衝液（ろ過滅菌された（ｆｉｌｔｅｒ−ｓｔｅｒｉｌｉｚｅｄ）１５５ミリモルの塩化アンモニウム、１０ミリモルの炭酸水素カリウム、０．１ミリモルの、ｐＨ７．２に緩衝化されたＥＤＴＡ（全成分はＳｉｇｍａ，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯより））と混合した。細胞は、臍帯血と溶解緩衝液が１：２０の割合で溶解された。結果として得られた細胞懸濁液を５秒間ボルテックスし、周囲温度で２分間インキュベートした。可溶化液を遠心分離した（２００ｘｇで１０分間）。細胞ペレットは、１０％のウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ  ＵＴ）、４ミリモルのグルタミン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）、１００単位／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含有するＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）中で再懸濁された。再懸濁した細胞を遠心分離し（２００ｘｇで１０分間）、上澄みを吸引し、細胞ペレットを完全培地中で洗浄した。細胞を、Ｔ７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）、Ｔ７５ラミニンコートフラスコ、またはＴ１７５フィブロネクチンコートフラスコ（２つともＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）中に直接播種した。
【０１９１】
細胞集団を異なる条件下で単離し、単離直後にさまざまな条件下で増殖できるかどうかを決定するため、０．００１％（ｖ／ｖ）の２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含むかまたは含まない成長培地で、Ｃ：Ｄ：Ｈの酵素組み合わせを用いて、前記の手順に従って細胞を消化した。１００単位／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンの存在下で全ての細胞が成長した。全試験条件下で、細胞は、０代継代と１代継代との間で、十分に付着し増殖した（表５−２）。５〜８および１３〜１６の条件での細胞は、播種後、細胞が低温保存される４回目の継代までは十分増殖したことが示された。
【０１９２】
Ｃ：Ｄ：Ｈの組み合わせは、単離後、最もよい細胞の収量を提供し、他の条件よりも多くの世代にわたって培養中に増殖した細胞を生成した（表５−１）。増殖可能な細胞集団は、コラゲナーゼまたはヒアルロニダーゼ単独を使用した場合では、得られなかった。この結果が試験したコラゲナーゼに特異的なものであるかどうかを判断する試みは行っていない。
【表７】
0005518893.tif 000008
略語：＋＝良い、  ＋＋＝非常に良い、  ＋＋＋＝極めて良い、  Ｘ＝成功せず
【０１９３】
細胞は、酵素消化および成長について試験した全条件下において、０代継代と１代継代との間で十分付着および増殖した（表５−２）。実験条件５〜８および１３〜１６の細胞は、低温保存される４回目の継代までは、播種後十分に増殖した。全ての細胞をさらなる分析のため、低温保存した。
【表８】
0005518893.tif 000009
【０１９４】
有核細胞が、急速に付着および成長した。これらの細胞は、フローサイトメトリーにより分析され、酵素消化により得られた細胞と同様であった。
【０１９５】
製剤は、赤血球および血小板を含有した。最初の３週間は、有核細胞は付着および分裂しなかった。培地は、播種後３週間で変えられ、付着および成長した細胞は観察されなかった。
【０１９６】
細胞集団は、酵素の組み合わせ、すなわち、コラゲナーゼ（メタロプロテアーゼ）、ディスパーゼ（中性プロテアーゼ）およびヒアルロニダーゼ（ヒアルロン酸を分解する粘液溶解酵素）を用いて、効果的に臍組織から単離できた。コラゲナーゼと中性プロテアーゼとのブレンドであるＬＩＢＥＲＡＳＥも使用することができる。コラゲナーゼ（４Ｗｕｎｓｃｈ単位／ｇ）およびサーモリシン（１７１４カゼイン単位／ｇ）である、Ｂｌｅｎｄｚｙｍｅ  ３もヒアルロニダーゼと共に使用されて、細胞を分離した。これらの細胞は、成長増殖培地においてゼラチンコートプラスチック上で培養されると、多くの継代にわたり容易に増殖した。
【０１９７】
細胞は、臍帯中の残りの血液からも単離されたが、臍帯血からは分離されなかった。使用した条件下で付着および成長した、組織から洗浄された血餅中の細胞の存在は、切開プロセス中に放出されている細胞によるものであろう。
【０１９８】
実施例６
細胞の成長特性
臍由来細胞の細胞増殖能力を、他の単離された幹細胞集団と比較した。老化までの細胞増殖プロセスは、ヘイフリックの限界と呼ばれる（Ｈａｙｆｌｉｃｋ，  Ｌ，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｇｅｒｉａｔｒ．  Ｓｏｃ，  １９７４；２２（１）：１−１２；Ｈａｙｆｌｉｃｋ，  Ｌ，  Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｉｓｔ，  １９７４；１４（１）：３７−４５）。
【０１９９】
組織培養プラスチックフラスコは、室温で、２０分間、２０ｍＬの２％（ｗ／ｖ）ゼラチン（タイプＢ：２２５  Ｂｌｏｏｍ；  Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）をＴ７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）に加えることによってコートされた。ゼラチン溶液の除去後、１０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が加えられ、その後吸引された。
【０２００】
成長増殖能力の比較のため、以下の細胞集団を使用した；ｉ）間葉系幹細胞（ＭＳＣ；Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）；ｉｉ）脂肪由来細胞（米国特許第６，５５５，３７４  Ｂｌ；米国特許出願公開ＵＳ２００４００５８４１２）；ｉｉｉ）正常な皮膚線維芽細胞（ｃｃ−２５０９  ロット番号９Ｆ０８４４；Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）；およびｉｖ）臍由来細胞。細胞は、最初に５，０００個の細胞／ｃｍ２で、ゼラチンコートのＴ７５フラスコに成長培地において播種された。その後の継代では、細胞培養を以下のとおり処理した。トリプシン処理後、トリパンブルー染色の後で生存細胞をカウントした。細胞懸濁液（５０μＬ）を、トリパンブルー（５０μＬ，  Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）と混ぜ合わせた。生存細胞数は、血球計数器を用いて見積もった。
【０２０１】
カウントの後、細胞は、５，０００個の細胞／ｃｍ２で、ゼラチンコートＴ７５フラスコに、２５ｍＬの新鮮な成長培地中で播種された。細胞は、３７℃で、標準大気（５％（ｖ／ｖ）二酸化炭素）中で成長した。成長培地は、１週間に２回変えた。細胞が約８５％のコンフルエンスに達すると、細胞を継代した；このプロセスは、細胞が老化に達するまで繰り返された。
【０２０２】
各継代で、細胞をトリプシン処理してカウントした。生存細胞収量、集団倍加［ｌｎ（最終の細胞／最初の細胞）／ｌｎ２］、および倍加時間（培養中の時間／集団倍加）を計算した。最適な細胞増殖を決定する目的で、継代当たりの総細胞収量が、各継代の増殖因子に、前の継代の総収量を掛け合わせることにより、決定された（すなわち、増殖因子＝最終の細胞／最初の細胞）。
【０２０３】
１０代継代で保存された（ｂａｎｋｅｄ）の細胞の増殖能力も試験した。異なる１組の条件を使用した。正常な皮膚の線維芽細胞（ｃｃ−２５０９  ロット番号９Ｆ０８４４；Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）および臍由来細胞を試験した。これらの細胞集団は、その前に１０代継代で保存されており、各継代５，０００個の細胞／ｃｍ２で、その時点まで培養されていた。１０代継代での細胞解凍後の細胞集団に対する細胞密度の影響を決定した。細胞は、標準条件下で解凍され、トリパンブルー染色を用いてカウントされた。解凍した細胞は次に、成長培地中、１，０００個の細胞／ｃｍ２で播種された。細胞は、３７℃で、通常の大気条件下で成長した。成長培地は１週間に２回変えられた。細胞は、約８５％コンフルエンスに達すると、継代された。細胞は、その後、老化まで、すなわち、それ以上増殖できなくなるまで、継代された。細胞は、各継代で、トリプシン処理されカウントされた。細胞収量、集団倍加（ｌｎ（最終の細胞／最初の細胞）／ｌｎ２）、および倍加時間（培養中時間）／集団倍加）を計算した。継代当たりの総細胞収量は、各継代の増殖因子に、その前の継代の総収量を掛け合わせることにより決定された（すなわち、増殖因子＝最終の細胞／最初の細胞）。
【０２０４】
低細胞播種条件下での、新たに単離された臍由来細胞培養物の増殖能力を、別の実験で試験した。臍由来細胞は、先の実施例で述べたように単離された。細胞は、１，０００個の細胞／ｃｍ２で播種され、老化するまで前記のように継代された。細胞は、３７℃で、標準的な大気条件下で成長した。成長培地は、１週間に２回変えられた。細胞は、約８５％コンフルエンスに達すると継代された。各継代では、細胞は、トリプシン処理され、トリパンブルー染色によりカウントされた。細胞収量、集団倍加（ｌｎ（最終の細胞／最初の細胞）／ｌｎ２）、および倍加時間（培養中の時間／集団倍加）を、各継代について計算した。継代当たりの総細胞収量は、各継代の増殖因子と、先の継代の総収量を掛け合わせることにより決定された（すなわち、増殖因子＝最終的な細胞／最初の細胞）。細胞は、ゼラチンコートのフラスコ、および非ゼラチンコートのフラスコで成長した。
【０２０５】
低Ｏ２細胞培養条件が、ある場合には、細胞増殖を改善し得ることが証明されている（例えば、ＵＳ２００４０００５７０４を参照）。臍由来細胞の細胞増殖が、細胞培養条件を変えることにより改善され得るかどうかを決定するため、臍由来細胞の培養物を低酸素条件で成長させた。細胞は、成長培地中で、ゼラチンコートしたフラスコに、５，０００個の細胞／ｃｍ２で播種された。細胞は、最初は、５代継代にわたり標準的な大気条件下で培養され、５代継代の時点で、低酸素（５％  Ｏ２）培養条件に移された。
【０２０６】
他の実験では、細胞は、コーティングなしのプレート、コラーゲンコートされたプレート、フィブロネクチンコートされたプレート、ラミニンコートされたプレート、およびマトリゲルコートされたプレート上で増殖された。培養物は、これらの異なるマトリックス上で十分増殖することが示された。
【０２０７】
臍由来細胞は、４０継代超にわたり増殖し、６０日で＞１Ｅ１７個の細胞の細胞収量を生成した。それとは対照的に、ＭＳＣおよび線維芽細胞は、＜２５日後、および＜６０日後にそれぞれ老化した。脂肪由来細胞および網細胞は双方、ほぼ６０日にわたり増殖したが、これらは、４．５Ｅ１２および４．２４Ｅ１３の総細胞収量をそれぞれ生成した。したがって、使用した実験条件下で、５，０００個細胞／ｃｍ２で播種されると、臍由来細胞は、同じ条件下で成長した他の細胞型よりも、はるかによく増殖した（表６−１）。
【表９】
0005518893.tif 000010
【０２０８】
臍由来細胞および線維芽細胞は、１０継代超にわたり増殖し、６０日で＞ＩＥ１１個の細胞の細胞収量を生成した（表６−２）。これらの条件下では、線維芽細胞および臍由来細胞の集団双方が、８０日後に老化し、それぞれ＞５０集団倍加および＞４０集団倍加を完了した。
【表１０】
0005518893.tif 000011
【０２０９】
細胞は低酸素条件下で十分に増殖するが、低酸素条件下での培養は、分娩後由来細胞の細胞増殖に対してはあまり効果がないようである。これらの結果は、低酸素の影響に関して下されるあらゆる究極的結論は、最初の単離から低酸素中における成長細胞に対する実験から引き出されるのが最も良いという意味では、予備的なものである。標準的大気条件は、十分な数の細胞を成長させるのにうまくいくことが既に証明されており、低酸素培養は、分娩後由来細胞の成長には必要でない。
【０２１０】
標準的な大気中酸素の下、約５，０００個の細胞／ｃｍ２密度で、成長培地中で、ゼラチンコートされるかまたはコートされないフラスコ上で、単離された臍由来細胞を成長させる現在の細胞増殖条件は、多数の細胞を１１代継代で生成するのに十分である。さらに、データは、細胞が低密度培養条件（例えば、１，０００個細胞／ｃｍ２）を用いて容易に増殖し得ることを示唆している。低酸素条件における臍由来細胞増殖も、細胞増殖を促進するが、細胞増殖能力の漸進的改善は、これらの成長条件を使用した場合に、観察されていない。現在、標準的な大気条件下で臍由来細胞を培養することが、細胞の大きな集まりを生成するのに好ましい。しかしながら、培養条件を変えた場合、臍由来細胞増殖は同様に変えられることができる。このストラテジーを用いて、これらの細胞集団の増殖および分化能力を高めることができる。
【０２１１】
利用した条件下で、ＭＳＣおよび脂肪由来細胞の増殖能力は限られているが、臍由来細胞は、容易に多くの数まで増殖した。
【０２１２】
実施例７  Ｄ‐バリン含有培地での細胞成長
通常のＬ−バリンアイソフォームの代わりにＤ−バリンを含有する培地を用いて、培養中の線維芽細胞様細胞の成長を選択的に抑制できることが報告されている（Ｈｏｎｇｐａｉｓａｎ，  Ｊ，  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔ．，  ２０００；２４：１−７；Ｓｏｒｄｉｌｌｏ，  Ｌ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔ  Ｒｅｐ．，１９８８；１２：３５５−６４）。実験を行って、臍由来細胞が、Ｄ−バリンを含有する培地で成長できるかどうか判断した。
【０２１３】
臍由来細胞（Ｐ５）および線維芽細胞（Ｐ９）を、５，０００個細胞／ｃｍ２で、ゼラチンコートＴ７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）において播種した。２４時間後、培地を取り除き、細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ．）で洗浄して、残りの培地を取り除いた。培地は、修飾成長培地（Ｄ−バリンを含むＤＭＥＭ（特注品  Ｇｉｂｃｏ）、１５％（ｖ／ｖ）透析ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、０．００１％（ｖ／ｖ）βメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、５０単位／ｍＬのペニシリン、および５０ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ））と取り替えられた。
【０２１４】
Ｄ−バリン含有培地に播種された臍由来細胞および線維芽細胞は、透析血清を含有する成長培地に播種された細胞と異なり、増殖しなかった。線維芽細胞は形態学的に変化し、サイズが大きくなり、形状が変わった。細胞は全て死滅し、最終的には、４週間後にフラスコ表面から離れた。したがって、臍帯組織由来細胞は、細胞成長のため、および長期間の生存を維持するために、Ｌ−バリンを必要とすると結論付けることができる。Ｌ−バリンは、好ましくは、臍帯組織由来細胞については成長培地から取り除かれない。
【０２１５】
実施例８
細胞の核型分析
細胞療法に使用される細胞株は、好ましくは、同種であり、汚染細胞型を含まない。細胞療法に使用されるヒト細胞は、正常な構造を有する、正常な数（４６個）の染色体を有していなければならない。同種であり、臍組織由来でない細胞を含まない、臍由来細胞株を識別するため、細胞サンプルの核型を分析した。
【０２１６】
オスの新生仔（ｍａｌｅ  ｎｅｏｎａｔｅ）の分娩後組織からのＵＴＣを成長培地で培養した。オスの新生仔からの分娩後組織（Ｘ、Ｙ）は、新生児由来細胞と母系由来細胞（Ｘ、Ｘ）との間で識別を行うように選択された。細胞は、１平方センチ当たり５，０００個の細胞で、Ｔ２５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）中、成長培地において播種され、８０％コンフルエンスまで増殖された。細胞を含有するＴ２５フラスコは、ネック部分まで成長培地を入れられた。サンプルは、臨床組織遺伝学研究所までクーリエにより送達された（研究所間の輸送時間は１時間と予測される）。染色体分析は、ニュージャージー州ニューアークのＮｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＳｃｈｏｏｌにあるＣｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓにより行われた。細胞は、染色体が最もよく見える分裂中期の間に分析された。カウントされた分裂中期の２０個の細胞のうち、５個が、正常な同種核型数（２）について分析された。細胞サンプルは、２つの核型が観察された場合に同種であると特徴付けられた。細胞サンプルは、３つ以上の核型が観察された場合に異種であると特徴付けられた。異種性の核型数（４）が識別されると、追加の分裂中期細胞をカウントし、分析した。
【０２１７】
染色体分析に送られた全細胞サンプルは、細胞遺伝学研究室のスタッフによって、正常外見を呈していると解釈された。分析された１６の細胞株のうち３つが、異種性の表現型（ＸＸおよびＸＹ）を表し、これは、新生児由来および母系由来の双方に由来する細胞が存在することを示している（表８−１）。細胞サンプルはそれぞれ、同種であると特徴付けられた（表８−１）。
【表１１】
0005518893.tif 000012
【０２１８】
染色体分析は、臨床細胞遺伝学研究室により解釈されたように、核型が正常である臍由来ＵＴＣを識別した。核型分析はまた、同種核型により判断される、母系性細胞を含まない細胞株も識別した。
【０２１９】
実施例９
細胞表面マーカーのフローサイトメトリー評価
フローサイトメトリーによる細胞表面タンパク質または「マーカー」の特徴づけを用いて、細胞株の同一性を判断することができる。発現の一貫性は、複数のドナーから、異なる処理および培養条件にさらされた細胞において、判断され得る。臍から単離された分娩後細胞株は、フローサイトメトリーにより特徴付けられ、これらの細胞株の同定のプロファイルを与えた。
【０２２０】
細胞は、プラズマ処理されたＴ７５、Ｔ１５０、およびＴ２２５組織培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）中、成長培地で、コンフルエントまで培養された。フラスコの成長表面は、２％（ｗ／ｖ）ゼラチン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を２０分間室温でインキュベートすることにより、ゼラチンによりコートされた。
【０２２１】
フラスコ中の付着細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）；（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＭＯ）で洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）で分離した。細胞を回収し、遠心分離し、ＰＢＳ中の３％（ｖ／ｖ）ＦＢＳで、１ｘ１０７／ｍＬの細胞濃度で再懸濁した。製造業者の仕様書に従って、目的の細胞表面マーカーに対する抗体（以下参照）が、１００μＬの細胞懸濁液に加えられ、混合物が、３０分間４℃で暗所においてインキュベートされた。インキュベーション後、細胞を、ＰＢＳで洗浄し、遠心分離して、非結合抗体を除去した。細胞を、５００μＬのＰＢＳ中に再懸濁して、フローサイトメトリーにより分析した。フローサイトメトリー分析は、ＦＡＣＳ  ｃａｌｉｂｕｒ器具（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて行った。
【０２２２】
細胞表面マーカーに対する以下の抗体を使用した。
【表１２】
0005518893.tif 000013
【０２２３】
臍由来細胞は、８代継代、１５代継代、および２０代継代で分析された。
【０２２４】
ドナー間の差異を比較するため、異なるドナー由来の臍帯組織由来細胞を互いに比較した。
【０２２５】
ゼラチンコートフラスコで培養された臍由来細胞もまた、非コートフラスコで培養された臍由来細胞と比較された。
【０２２６】
細胞の単離および準備に使用される４つの処理を比較した。１）コラゲナーゼ；２）コラゲナーゼ／ディスパーゼ；３）コラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ；および４）コラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ／ディスパーゼでの処理による、分娩後組織由来の細胞を比較した。
【０２２７】
フローサイトメトリーで分析した、８代継代、１５代継代、および２０代継代における臍帯由来細胞は全て、ＩｇＧ対照に対する蛍光の増大で示される、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−αおよびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃを発現した。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱに対して陰性であり、これは、ＩｇＧ対照と一致する蛍光値により示される。
【０２２８】
フローサイトメトリーにより分析された別個のドナーから単離された臍帯由来細胞はそれぞれ、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの産生に対して陽性を示し、これは、ＩｇＧ対照に対する蛍光値の増大に反映される。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの産生に対して陰性であり、蛍光値はＩｇＧ対照と一致した。
【０２２９】
フローサイトメトリーにより分析された、ゼラチンコートフラスコおよび非コートフラスコで増殖した臍帯由来細胞は全て、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの産生に対して陽性であり、ＩｇＧ対照に対する蛍光値は増大した。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの産生に対しては陰性であり、蛍光値は、ＩｇＧ対照と一致していた。
【０２３０】
フローサイトメトリーによる臍帯由来細胞分析は、これらの細胞株の同一性を証明した。これらの臍帯由来細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃに対して陽性であり、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱに対して陰性である。この同一性は、ドナー、継代、培養容器表面コーティング、消化酵素および胎盤層を含む変数の変動間で一致していた。個々の蛍光値のヒストグラム曲線平均および範囲におけるいくらかの変動が観察されたが、試験した全条件下での全ての正の曲線（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｕｒｖｅｓ）は、正常であり、ＩｇＧ対照より大きな蛍光値を発現したため、細胞は、マーカーの陽性発現を有する同種集団を含むことが、確認される。
【０２３１】
実施例１０
オリゴヌクレオチドアレイによる細胞の分析
オリゴヌクレオチドアレイを使用して、臍由来細胞および胎盤由来細胞の遺伝子発現プロファイルを、線維芽細胞、ヒト間葉系幹細胞、およびヒト骨髄由来の別の細胞株と比較した。この分析により、分娩後由来細胞の特徴付けがもたらされ、これらの細胞に対する独自の分子マーカーが識別された。
【０２３２】
分娩後組織由来細胞。ヒト臍帯および胎盤が、患者の同意を得て、正常満期分娩から、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（ＮＤＲＩ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）によって入手された。組織を受け取り、Ｃ：Ｄ：Ｈ混合物による消化後、実施例５に記載するように細胞を単離した。細胞は、成長培地において、ゼラチンコートプラスチック組織培養フラスコ上で培養された。培養物は、３７℃、５％のＣＯ２でインキュベートされた。
【０２３３】
線維芽細胞。ヒトの皮膚線維芽細胞を、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ；ロット番号９Ｆ０８４４）およびＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５０１（ＣＣＤ３９ＳＫ）から購入した。いずれの株も、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、およびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で培養した。細胞は、標準の組織処理プラスチック上で成長した。
【０２３４】
ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）。ｈＭＳＣｓを、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ；ロット番号２Ｆ１６５５、２Ｆ１６５６および２Ｆ１６５７）から購入し、製造業者の仕様書に従って、ＭＳＣＧＭ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）で培養した。細胞は、標準の組織培養プラスチック上で３７℃、５％ＣＯ２で成長した。
【０２３５】
ヒト腸骨稜骨髄細胞（ＩＣＢＭ）。ヒト腸骨稜骨髄は、患者の同意を得てＮＤＲＩから受け取った。骨髄を、Ｈｏ，  ｅｔ  ａｌ．により概説された方法に従って処理した（ＷＯ０３／０２５１４９）。骨髄は、溶解緩衝液（１５５ｍＭのＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭのＫＨＣＯ３、および０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）と、１部の骨髄：２０部の溶解緩衝液の割合で混合された。細胞懸濁液は、ボルテックスされ、周囲温度で２分間インキュベートされ、５００ｘｇで１０分間遠心分離された。上澄みを廃棄し、細胞ペレットを、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清および４ｍＭのグルタミンを補充された、最小基本培地−α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で再懸濁した。細胞をもう一度遠心分離し、細胞ペレットを、新鮮培地で再懸濁した。生存単核細胞が、トリパンブルー排除（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いてカウントされた。単核細胞は、プラスチック組織培養フラスコ中、５ｘ１０４個の細胞／ｃｍ２で播種された。細胞は、３７℃、５％ＣＯ２で、標準の周囲Ｏ２もしくは５％Ｏ２で、インキュベートされた。細胞は、培地を変えずに５日間培養された。培地および非付着細胞を、培養から５日後に除去した。付着細胞は、培養物中に維持された。
【０２３６】
細胞の、活発に成長する培養物は、冷たいリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、細胞スクレーパーによりフラスコから除去された。細胞を、３００ｘｇで５分間遠心分離した。上澄みを除去し、細胞を新鮮なＰＢＳ中に再懸濁し、再び遠心分離した。上澄みを除去し、細胞ペレットをすぐに冷凍し、−８０℃で保管した。細胞ｍＲＮＡが抽出され、ｃＤＮＡに転写された。ｃＤＮＡは次に、ｃＲＮＡに転写され、ビオチン標識された。ビオチン標識ｃＲＮＡは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧＥＮＥＣＨＩＰ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａ  オリゴヌクレオチドアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）によりハイブリダイズされた。ハイブリダイゼーションおよびデータ収集を、製造業者の仕様書に従って行った。データ分析が、「Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ」（ＳＡＭ）バージョン１．２１コンピューターソフトウェア（Ｔｕｓｈｅｒ，  Ｖ．Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，２００１，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  ＳｃＬ  ＵＳＡ  ９８：５１１６−５１２１）を用いて行われた。分析ソフトウェアのライセンスは、スタンフォード大学のＯｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｉｃｅｎｓｉｎｇを通じて入手でき、さらなる情報は、スタンフォード大学の統計学部のＴｉｂｓｈｉｒａｎｉ教授のウェブサイトで、ワールドワイドウェブ（ｗｗｗ−ｓｔａｔ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／〜ｔｉｂｓ／ＳＡＭ／）で入手することができる。
【０２３７】
１４個の異なる細胞集団を、この研究では分析した。継代情報、培養基質、および培養培地と共に細胞を表１０−１に挙げる。
【表１３】
0005518893.tif 000014
【０２３８】
データは、前記のようにＳＡＭソフトウェアで、主要成分分析によって評価された。分析により、試験した細胞において異なる相対量で発現した２９０個の遺伝子が明らかになった。この分析により、集団間の相対比較がもたらされた。
【０２３９】
表１０−２は、細胞対の比較のために計算されたユークリッド距離を示す。ユークリッド距離は、細胞型間で差次的に発現した２９０個の遺伝子に基づいた細胞の比較に基づいていた。ユークリッド距離は、２９０個の遺伝子の発現間の類似性に反比例している。
【表１４】
0005518893.tif 000015
【０２４０】
表１０−３、１０−４および１０−５は、胎盤由来細胞で増加した遺伝子の発現（表１０−３）、臍帯由来細胞で増加した遺伝子の発現（表１０−４）、ならびに臍帯および胎盤由来細胞で減少した遺伝子の発現（表１０−５）を示す。
【表１５】
0005518893.tif 000016
【表１６】
0005518893.tif 000017
【表１７−１】
0005518893.tif 000018
【表１７−２】
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【０２４１】
表１０−６、１０−７、および１０−８は、ヒト線維芽細胞（表１０−６）、ＩＣＢＭ細胞（表１０−７）、およびＭＳＣ（表１０−８）で増加した遺伝子の発現を示す。
【表１８】
0005518893.tif 000020
【表１９】
0005518893.tif 000021
【表２０】
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【０２４２】
本実施例は、臍帯および胎盤由来の細胞の分子の特徴づけをもたらすために実行された。この分析は、３つの異なる臍帯および３つの異なる胎盤由来の細胞を含んだ。研究はまた、２つの異なる皮膚線維芽細胞株、３つの間葉系幹細胞株、および３つの腸骨稜骨髄細胞株も含んだ。これらの細胞により発現されたｍＲＮＡは、オリゴヌクレオチドプローブを含むＧＥＮＥＣＨＩＰオリゴヌクレオチドアレイにおいて、２２，０００個の遺伝子について分析された。
【０２４３】
分析により、２９０個の遺伝子の転写物が、これらの５つの異なる細胞型に、異なる量で存在したことが明らかになった。これらの遺伝子は、胎盤由来細胞で特に増加した１０個の遺伝子、および臍帯由来細胞で特に増加した７個の遺伝子を含む。５４個の遺伝子が、胎盤由来細胞および臍帯組織由来細胞において特に低い発現レベルを有することが分かった。
【０２４４】
選択された遺伝子の発現は、実施例１１に示すようにＰＣＲで確認された。一般的には、分娩後由来細胞、詳細には臍由来細胞は、例えば、ここで試験した骨髄由来細胞および線維芽細胞などの、他のヒト細胞と比較すると、別個の遺伝子発現プロファイルを有する。
【０２４５】
実施例１１
細胞マーカー
ヒト臍帯由来の細胞の遺伝子発現プロファイルが、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧＥＮＥＣＨＩＰを用いて、他の供給源由来の細胞のものと比較された。６つの「シグネチャー（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）」遺伝子が識別された、すなわち、酸化ＬＤＬレセプター１（oxidized LDL receptor 1）、インターロイキン−８（interleukin-8）（ＩＬ−８）、レニン（renin）、レティキュロン（reticulon）、ケモカインレセプターリガンド３（chemokine receptor ligand 3）（ＣＸＣリガンド３（CXC ligand 3））、および顆粒球走化性タンパク質２（granulocyte chemotactic protein 2）（ＧＣＰ−２）である。これらの「シグネチャー」遺伝子は、臍由来細胞において比較的高いレベルで発現した。
【０２４６】
この実施例で説明される手順は、マイクロアレイデータを確認し、遺伝子およびタンパク質の発現についてデータを比較するため、ならびに、臍由来細胞について独自の識別子を検出する一連の確実なアッセイを確立するために、実行された。
【０２４７】
臍由来細胞（４つの分離物（ｉｓｏｌａｔｅｓ））、および正常なヒトの皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ；新生児および成体）を、ゼラチンコートＴ７５フラスコで、成長培地において成長させた。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が、間葉系幹細胞成長培地Ｂｕｌｌｅｔキット（ＭＳＣＧＭ；Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｗａｌｋｅｒｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で成長した。
【０２４８】
ＩＬ−８実験について、細胞が、液体窒素から解凍され、ゼラチンコートフラスコに、５，０００個の細胞／ｃｍ２で蒔かれ、成長培地で４８時間成長し、１０ｍＬの血清飢餓培地［ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ペニシリン（５０単位／ｍＬ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ）（Ｇｉｂｃｏ）、および０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；  Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）］で８時間さらに成長した。ＲＮＡを次に抽出し、上澄みを、１５０ｘｇで５分間遠心分離して、細胞の残骸を除去した。上澄みを、ＥＬＩＳＡ分析まで−８０℃で凍らせた。
【０２４９】
臍帯組織由来細胞、ならびに、ヒト新生児包皮由来のヒト線維芽細胞を、ゼラチンコートＴ７５フラスコにおいて、成長培地で培養した。細胞は、液体窒素中で、１１代継代において凍らせた。細胞を解凍し、１５ｍＬ遠心分離チューブに移した。１５０ｘｇで５分間の遠心分離の後、上澄みを捨てた。細胞を、４ｍＬの培養培地中に再懸濁し、カウントした。細胞は、１５ｍＬの成長培地を含む７５ｃｍ２フラスコにおいて、３７５，０００個の細胞／フラスコで２４時間、成長した。培地は、８時間かけて血清飢餓培地に変えた。血清飢餓培地は、インキュベーションの最後に収集され、１４，０００ｘｇで５分間遠心分離され、−２０℃で保管された。
【０２５０】
各フラスコ内の細胞数を見積もるため、２ｍＬのトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を各フラスコに加えた。細胞がフラスコから離れた後、トリプシン活性が、８ｍＬの成長培地で中和された。細胞を、１５ｍＬ遠心分離チューブに移し、１５０ｘｇで５分間、遠心分離した。上澄みを除去し、１ｍＬの成長培地を各チューブに加えて、細胞を再懸濁させた。細胞の数は、血球計数器により判断された。
【０２５１】
細胞が血清飢餓培地中に分泌したＩＬ−８の量は、ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を使用して分析された。全てのアッセイは、製造業者が提供する説明書に従って行われた。
【０２５２】
ＲＮＡを、コンフルエントの臍帯由来細胞および線維芽細胞から、またはＩＬ−８発現のため、前記のとおり処理された細胞から、抽出した。細胞は、製造業者の説明書（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）に従って、βメルカプトエタノールを含有する、３５０μＬの緩衝液ＲＬＴ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で溶解した。ＲＮＡは、製造業者の説明書（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）に従って抽出され、デオキシリボヌクレアーゼ処理にかけられた（２．７単位／サンプル）（Ｓｉｇｍａ  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。ＲＮＡは、５０μＬのＤＥＰＣ処理水により溶出し、−８０℃で保管された。ＲＮＡはまた、ヒト臍帯からも抽出された。組織（３０ｍｇ）は、βメルカプトエタノールを含有する７００μＬの緩衝液ＲＬＴ中に懸濁された。製造業者の仕様書に従って、サンプルを機械的に均質化し、ＲＮＡ抽出を進めた。ＲＮＡは、５０μＬのＤＥＰＣ処理水で抽出され、−８０℃で保管された。
【０２５３】
ＲＮＡは、ＴａｑＭａｎ逆転写試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）と共にランダムヘキサマーを使用して、２５℃で１０分間、３７℃で６０分間、９５℃で１０分間、逆転写された。サンプルを−２０℃で保管した。
【０２５４】
ｃＤＮＡマイクロアレイによって臍帯細胞で特異的に調節されたとして識別された遺伝子（シグネチャー遺伝子‐酸化ＬＤＬレセプター、インターロイキン−８、レニン、およびレティキュロンを含む）は、リアルタイムＰＣＲおよび従来のＰＣＲを使用して、さらに調べられた。
【０２５５】
ＰＣＲは、商品名Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）遺伝子発現産物として販売される遺伝子発現産物を用いて、ｃＤＮＡサンプルに対して行われた。酸化ＬＤＬレセプター（Ｈｓ００２３４０２８）；レニン（ＨｓＯＯ１６６９１５）；レティキュロン（Ｈｓ００３８２５１５）；ＣＸＣリガンド３（Ｈｓ００１７１０６１）；ＧＣＰ−２（Ｈｓ００６０５７４２）；ＩＬ−８（Ｈｓ００１７４１０３）；およびＧＡＰＤＨが、７０００配列検出システムをＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７０００  ＳＤＳソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と共に使用して、製造業者の説明書（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従って、ｃＤＮＡおよびＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲマスターミックスと混合された。熱サイクル条件は、最初は、５０℃で２分間、および９５℃で１０分間で、その後、９５℃で１５秒間、および６０℃で１分間の４０サイクルが続いた。ＰＣＲデータは、製造業者の仕様書（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍについてＡｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのＵｓｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ＃２）に従って分析された。
【０２５６】
従来のＰＣＲは、リアルタイムＰＣＲからの結果を確認するため、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いて行われた。ＰＣＲは、２μＬのｃＤＮＡ溶液（１ｘＴａｑポリメラーゼ（商品名：ＡＭＰＬＩＴＡＱ  ＧＯＬＤ）ユニバーサルミックスＰＣＲ反応緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および初期変性を使用して、９４℃で５分間行われた。増幅が、各プライマーセットについて最適化された。ＩＬ−８、ＣＸＣリガンド３、およびレティキュロン（９４℃で１５秒間、５５℃で１５秒間、および７２℃で３０秒を３０サイクル）；レニン（９４℃で１５秒間、５３℃で１５秒間、および７２℃で３０秒間を３８サイクル）；酸化ＬＤＬレセプターおよびＧＡＰＤＨ（９４℃で１５秒間、５５℃で１５秒間、および７２℃で３０秒間を３３サイクル）。増幅に使用したプライマーを表１１−１に挙げる。最終ＰＣＲ反応におけるプライマー濃度は１マイクロモルであったが、これは、０．５マイクロモルであったＧＡＰＤＨを除く。ＧＡＰＤＨプライマーは、製造業者のＴａｑＭａｎプローブが最終ＰＣＲ反応に加えられなかったことを除けば、リアルタイムＰＣＲと同じであった。サンプルは、２％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上で分離され、臭化エチジウム（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で染色された。画像が、単焦点ＰＯＬＡＲＯＩＤカメラ（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ）を使用して、６６７フィルム（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｔｗｉｎｐａｃｋ，  ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ）に取り込まれた。
【表２１】
0005518893.tif 000023
【０２５７】
臍帯由来細胞が、４％（ｗ／ｖ）の冷パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で１０分間、室温にて固定された。０代継代（Ｐ０）（単離直後）および１１代継代（Ｐ１１）における臍帯由来細胞のそれぞれ１つの単離物（臍帯由来細胞の２つの単離物）、ならびに線維芽細胞（Ｐ１１）の単離物を使用した。免疫細胞化学は、以下のエピトープに対する抗体を用いて行った。エピトープは、ビメンチン（１：５００，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、デスミン（１：１５０；Ｓｉｇｍａ  −  ウサギに対して産生；または１：３００；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ−  マウスに対して産生）、α平滑筋アクチン（ＳＭＡ；１：４００；Ｓｉｇｍａ）、サイトケラチン１８（ＣＫ１８；１：４００；Ｓｉｇｍａ）、フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ；１：２００；Ｓｉｇｍａ），およびＣＤ３４（ヒトＣＤ３４クラスＩＩＩ；１：１００；ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）である。さらに、以下のマーカーを、１１代継代臍帯由来細胞に対して試験した：抗−ヒトＧＲＯα−ＰＥ（１：１００；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）、抗−ヒトＧＣＰ−２（１：１００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、抗−ヒト酸化ＬＤＬレセプター１（ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１；１：１００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、および抗−ヒトＮＯＧＡ−Ａ（１：１００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈ）。
【０２５８】
培養物を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）、および０．３％（ｖ／ｖ）トリトン（トリトンＸ−１００；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含むタンパク質遮断溶液に３０分間さらして、細胞内抗原にアクセスした。目的のエピトープ（ＣＤ３４，  ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１）が細胞表面に位置する場合、トリトンＸ−１００は、エピトープ損失を防ぐために手順の全工程で省略した。さらに、一次抗体がヤギに対して産生された場合（ＧＣＰ−２，ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１，ＮＯＧＯ−Ａ）、３％（ｖ／ｖ）のロバ血清をプロセス全体にわたって、ヤギ血清の代わりに使用した。遮断溶液中で希釈された一次抗体を次に、１時間にわたり室温で培養物に加えた。一次抗体溶液を除去し、ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（１：２５０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）および／またはヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  ４８８（１：２５０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）またはロバ抗ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１：１５０，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）と共に遮断溶液（ｂｌｏｃｋ）を含む二次抗体溶液（室温で１時間）を加える前に、培養物をＰＢＳで洗浄した。培養物をその後洗浄し、１０マイクロモルのＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を１０分間適用して、細胞核を可視化する。
【０２５９】
免疫染色後、Ｏｌｙｍｐｕｓ倒立落射蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）上で適切な蛍光フィルターを用いて、蛍光を可視化した。いずれの場合も、一次抗体溶液を適用したことを除いて前記に概説した手順全体に従った場合、ポジティブ染色は対照染色を超えて蛍光信号を表した（１°対照なし）。代表的な画像が、デジタルカラービデオカメラ、およびＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて取り込まれた。三重染色（ｔｒｉｐｌｅ−ｓｔａｉｎｅｄ）サンプルでは、各画像は、１回にただ１つの放出フィルターを使用して撮られた。層をなすモンタージュが、次に、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（Ａｄｏｂｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて準備された。
【０２６０】
フラスコ中の付着細胞が、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で洗浄され、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）により分離された。細胞を回収し、遠心分離し、１ｘ１０７／ｍＬの細胞濃度で、ＰＢＳ中３％（ｖ／ｖ）ＦＢＳで再懸濁させた。１００μＬのアリコートを円錐チューブへ送った。細胞内抗原について染色された細胞は、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で透過処理された。製造業者の仕様書のとおり、抗体を、アリコートに加え、細胞を、暗所で３０分間、４℃でインキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離して、余分な抗体を除去した。二次抗体を必要とする細胞を、１００μＬの３％ＦＢＳで再懸濁した。二次抗体を、製造業者の仕様書に従って加え、細胞を、暗所で３０分間、４℃でインキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離して、余分な二次抗体を除去した。洗浄した細胞を、０．５ｍＬのＰＢＳで再懸濁し、フローサイトメトリーにより分析した。以下の抗体を使用した：酸化ＬＤＬレセプター１（ｓｃ−５８１３；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＧＲＯａ（５５５０４２；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）、マウスＩｇＧ１κ（Ｐ−４６８５およびＭ−５２８４；Ｓｉｇｍａ）、ならびにロバ抗ヤギＩｇＧ（ｓｃ−３７４３；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈ．）。フローサイトメトリー分析が、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）によって行われた。
【０２６１】
ヒト臍帯由来の細胞、成体および新生児線維芽細胞、ならびに間葉系幹細胞（ＭＳＣ）からのｃＤＮＡに対して行われた、選択された「シグネチャー」遺伝子に関するリアルタイムＰＣＲの結果は、レティキュロンおよび酸化ＬＤＬレセプター双方の発現が、臍由来細胞の方が、その他の細胞に比べて高かったことを示している。リアルタイムＰＣＲから得られたデータは、ΔΔＣＴ方法によって分析され、対数尺度で表示された。分娩後細胞と対照との間では、ＣＸＣリガンド３およびＧＣＰ−２の発現レベルに有意な差は見られなかった。リアルタイムＰＣＲの結果が、従来のＰＣＲにより確認された。ＰＣＲ産物の配列決定が、これらの観察をさらに確認した。表１１‐１に挙げた従来のＰＣＲ  ＣＸＣリガンド３プライマーを使用して、分娩後細胞と対照との間で、ＣＸＣリガンド３の発現レベルに有意差は見られなかった。
【０２６２】
臍帯組織由来細胞におけるサイトカイン、ＩＬ−８の発現は、成長培地で培養した臍帯組織由来細胞、および血清が欠乏した臍帯組織由来細胞の双方で、上昇した。リアルタイムＰＣＲデータ全てが、従来のＰＣＲで、またＰＣＲ産物を配列決定することによって、有効であった。
【０２６３】
無血清培地で成長した後、馴化培地が、ＩＬ−８の存在について調べられた。最も多い量のＩＬ−８が、臍細胞が成長した培地で検出された（表１１‐２）。ヒトの皮膚線維芽細胞が成長した培地では、ＩＬ−８が検出されなかった。
【表２２】
0005518893.tif 000024
【０２６４】
０代継代でのヒト臍帯由来の細胞が、免疫細胞化学的分析によって、選択されたタンパク質の産生について調べられた。単離（０代継代）直後、細胞は、４％パラホルムアルデヒドで固定され、６個のタンパク質の抗体に曝露された。それらのタンパク質とは、フォン・ヴィルブランド因子、ＣＤ３４、サイトケラチン１８、デスミン、α−平滑筋アクチン、およびビメンチンである。臍帯由来細胞は、α−平滑筋アクチンおよびビメンチンに対して陽性であり、染色パターンは、１１代継代にわたり一貫していた。
【０２６５】
１１代継代での臍帯由来細胞におけるＧＲＯα、ＧＣＰ−２、酸化ＬＤＬレセプター１およびレティキュロン（ＮＯＧＯ−Ａ）の産生を、免疫細胞化学により調べた。臍帯由来細胞は、ＧＣＰ−２陽性であったが、ＧＲＯαの産生は、この方法では検出されなかった。さらに、細胞は、ＮＯＧＯ−Ａ陽性であった。
【０２６６】
マイクロアレイおよびＰＣＲ（リアルタイムおよび従来のもの）により測定された遺伝子発現レベル間の一致が、４つの遺伝子：酸化ＬＤＬレセプター１、レニン、レティキュロン、およびＩＬ−８について証明された。これらの遺伝子の発現は、臍帯由来細胞において、ｍＲＮＡレベルで差次的に調節され、ＩＬ−８も、タンパク質レベルで差次的に調節された。ＧＣＰ−２およびＣＸＣリガンド３の差次的発現は、ｍＲＮＡレベルでは確認されなかった。この結果は、マイクロアレイ実験からもともと入手されたデータを支持するものではないが、これは、方法の感受性における違いによるものであろう。
【０２６７】
０代継代でのヒト臍帯由来の細胞が、α−平滑筋アクチンおよびビメンチンの発現について調べられ、この双方について陽性であった。染色パターンは、１１代継代にわたり保たれた。
【０２６８】
結論として、完全なｍＲＮＡデータは、マイクロアレイ実験から入手したデータを、少なくとも部分的に検証した。
【０２６９】
実施例１２
細胞表現型の免疫組織化学的特徴付け
ヒト臍帯組織内で発見された細胞の表現型を、免疫組織化学的検査により分析した。
【０２７０】
ヒト臍帯組織を回収し、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドで一晩、４℃で浸漬固定した。免疫組織化学的検査が、以下のエピトープに対する抗体を用いて行われた（表１２−１）。エピトープは、ビメンチン（１：５００；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、デスミン（１：１５０，ウサギに対して産生；Ｓｉｇｍａ；または１：３００，マウスに対して産生；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）、α−平滑筋アクチン（ＳＭＡ；１：４００；Ｓｉｇｍａ）、サイトケラチン１８（ＣＫ１８；１：４００；Ｓｉｇｍａ）、フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ；１：２００；Ｓｉｇｍａ）、およびＣＤ３４（ヒトＣＤ３４クラスＩＩＩ；１：１００；ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，  ＣＡ）である。さらに、以下のマーカーを試験した。そのマーカーは、抗ヒトＧＲＯα−ＰＥ（１：１００；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）、抗ヒトＧＣＰ−２（１：１００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、抗ヒト酸化ＬＤＬレセプター１（ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１；１：１００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、および抗ヒトＮＯＧＯ−Ａ（１：１００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）である。固定された検体は、メスで刈り込まれ、エタノールを含むドライアイス浴上で、ＯＣＴ包埋化合物（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  ＯＣＴ；Ｓａｋｕｒａ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）の中に置かれた。凍結ブロックは、標準のクリオスタット（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて切開され（１０μｍ（１０ミクロン）厚さ）、染色のため、スライドガラスに載せられた。
【０２７１】
免疫組織化学的検査が、先の研究と同様に行われた（例えば、Ｍｅｓｓｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒ．  Ｎｅｕｒｏｌ，  ２００３；１８４：８１６−８２９）。組織切片を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）、および０．３％（ｖ／ｖ）トリトン（トリトンＸ−１００；Ｓｉｇｍａ）を含むタンパク質遮断溶液に１時間さらして、細胞内抗原にアクセスした。目的のエピトープが細胞表面上にある場合（ＣＤ３４，ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１）、トリトンは、エピトープ損失を防ぐために、手順の全工程で省略された。さらに、一次抗体がヤギ（ＧＣＰ−２，ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１，ＮＯＧＯ−Ａ）に対して産生された場合、３％（ｖ／ｖ）ロバ血清が、手順全体にわたってヤギ血清の代わりに使用された。遮断溶液で希釈された一次抗体は、次に、切片に４時間、室温で適用された。一次抗体溶液を除去し、培養物は、ヤギ抗−マウスＩｇＧ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（１：２５０；  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）および／またはヤギ抗−ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  ４８８（１：２５０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）またはロバ抗−ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１：１５０；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）と共に、遮断溶液を含有する二次抗体溶液を適用する（室温で１時間）前に、ＰＢＳで洗浄された。培養物を洗浄し、１０マイクロモルのＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を１０分間適用し、細胞核を可視化した。
【０２７２】
免疫染色後、Ｏｌｙｍｐｕｓ倒立落射蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）上で適切な蛍光フィルターを用いて蛍光を可視化した。ポジティブ染色は、対照染色を上回って、蛍光信号により表された。代表的な画像が、デジタルカラービデオカメラ、およびＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、取り込まれた。三重染色サンプルでは、各画像は、１回にただ１つの放出フィルターのみを使用して撮られた。層をなしたモンタージュが、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（Ａｄｏｂｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて準備された。
【表２３】
0005518893.tif 000025
【０２７３】
ビメンチン、デスミン、ＳＭＡ、ＣＫ１８、ｖＷＦおよびＣＤ３４マーカーが、臍帯内で発見された細胞の部分集団で発現した（データは不図示）。具体的には、ｖＷＦおよびＣＤ３４の発現は、臍帯に含まれる血管に制限された。ＣＤ３４＋細胞は、最も内側の層（管腔側）にあった。ビメンチン発現は、臍帯のマトリックスおよび血管全体で見られた。ＳＭＡは、動脈および静脈のマトリックスおよび外壁に限定されたが、血管自体には含まれなかった。ＣＫ１８およびデスミンは、血管内部のみで観察され、デスミンは、中間および外側の層に限定された。
【０２７４】
これらのマーカーのいずれも臍帯内では観察されなかった（データは不図示）。
【０２７５】
ビメンチン、デスミン、α−平滑筋アクチン、サイトケラチン１８、フォン・ヴィルブランド因子、およびＣＤ３４は、ヒト臍帯内部の細胞で発現した。ビメンチンおよびα−平滑筋アクチンのみが発現したことを示す、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの特徴付けの研究に基づいて、データは、臍帯由来細胞単離の現行のプロセスにより細胞の部分集団が回収されること、または単離細胞が、マーカーの発現を変えて、ビメンチンおよびα−平滑筋アクチンを発現することを示唆している。
【０２７６】
実施例１３
栄養因子の分泌
臍由来細胞からの、選択された栄養因子の分泌を測定した。血管新生活性を有する因子が選択され、それらは、例えば、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）（Ｒｏｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄ．  Ｓｙｍｐ．，１９９７；２１２：２１５−２６）；単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）（Ｓａｌｃｅｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２０００；９６；３４−４０）；インターロイキン−８（ＩＬ−８）（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００３；１７０：３３６９−７６）；ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）；塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）（Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．  Ｔｈｏｒａｃ．  Ｓｕｒｇ．２００４；７７：８１２−８）；組織マトリックスメタロプロテアーゼ阻害物質１（ＴＩＭＰ１）；アンジオポエチン２（ＡＮＧ２）；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦｂｂ）；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ヘパリン結合上皮成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）；間質由来因子１α（ＳＤＦ−１α）、神経栄養／神経保護活性（脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．，２００３；２５８；３１９−３３）；インターロイキン−６（ＩＬ−６）；顆粒球走化性タンパク質−２（ＧＣＰ−２）；形質転換成長因子β２（ＴＧＦβ２））；またはケモカイン活性（マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ１α）；マクロファージ炎症性タンパク質１β（ＭｌＰ１β）；単球走化性因子−１（ＭＣＰ−１）；Ｒａｎｔｅｓ（活性時に調節、発現および分泌された正常なＴ細胞）；Ｉ３０９；胸腺および活性調節ケモカイン（ＴＡＲＣ）；エオタキシン；マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）；ならびに（ＩＬ−８）である。
【０２７７】
臍帯由来の細胞、ならびにヒト新生児の皮膚由来のヒト線維芽細胞が、成長培地中で、ゼラチンコートＴ７５フラスコにおいて培養された。細胞は、１１代継代で冷凍保存され、液体窒素中に保存された。解凍後、成長培地が細胞に加えられ、その後、１５ｍＬ遠心分離チューブに移され、細胞の遠心分離を１５０ｘｇで５分間行った。細胞ペレットが、４ｍＬの成長培地で再懸濁され、細胞をカウントした。細胞を、５，０００個の細胞／ｃｍ２で、１５ｍＬの成長培地をそれぞれ含むＴ７５フラスコに播種し、２４時間培養した。培地を、無血清培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ）、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、ペニシリン（５０単位／ｍＬ）およびストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ，Ｇｉｂｃｏ））に８時間かけて変えた。馴化無血清培地が、１４，０００ｘｇで５分間の遠心分離によるインキュベーションの終わりに収集され、‐２０℃で保管された。
【０２７８】
各フラスコ内の細胞の数を見積るため、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、２ｍＬのトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて分離した。８ｍＬの成長培地を加えることにより、トリプシン活性が抑制された。細胞を１５０ｘｇで５分間、遠心分離した。上澄みを除去し、細胞を、１ｍＬ成長培地で再懸濁した。細胞数は、血球計数器を用いて見積られた。
【０２７９】
細胞は、５％二酸化炭素および大気中酸素中で、３７℃で成長した。各細胞サンプルにより産生されたＭＣＰ−Ｉ、ＩＬ−６、ＶＥＧＦ、ＳＤＦ−Ｉα、ＧＣＰ−２、ＩＬ−８、およびＴＧＦ−β２の量は、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）によって判断された。すべてのアッセイは、製造業者の説明書に従って行われた。示された値は、１００万個の細胞当たりのピコグラム／ｍＬ（ｎ＝２，ｓｅｍ）であった。
【０２８０】
ケモカイン（ＭＩＰ１α、ＭｌＰ１β、ＭＣＰ−１、Ｒａｎｔｅｓ、Ｉ３０９、ＴＡＲＣ、エオタキシン、ＭＤＣ、ＩＬ８）、ＢＤＮＦ、および血管新生因子（ＨＧＦ、ＫＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＩＭＰ１、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、ＴＰＯ、ＨＢ−ＥＧＦが、Ｓｅａｒｃｈｌｉｇｈｔ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ａｒｒａｙｓ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）を用いて測定された。Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ａｒｒａｙｓは、１つのウェル当たり２〜１６個のタンパク質の定量的測定をするための、多重サンドイッチＥＬＩＳＡである。アレイは、２ｘ２、３ｘ３、または４ｘ４パターンの、４〜１６個の異なる捕捉抗体を、９６ウェルプレートの各ウェルにスポッティングすることにより産生される。サンドイッチＥＬＩＳＡ手順の後、プレート全体が画像化され、プレートの各ウェル内部の各スポットで生成された化学発光信号を捕捉する。各スポットで生成された信号は、元の標準またはサンプルにおける標的タンパク質の量に比例する。
【０２８１】
ＭＣＰ−１およびＩＬ−６が、臍由来ＰＰＤＣおよび皮膚線維芽細胞から分泌された（表１３−１）。ＳＤＦ−１αおよびＧＣＰ−２が線維芽細胞により分泌された。ＧＣＰ−２およびＩＬ−８は、臍由来ＰＰＤＣにより分泌された。ＴＧＦ−β２は、ＥＬＩＳＡによってはいずれの細胞型からも検出されなかった。
【表２４】
0005518893.tif 000026
略語：ＮＤ：不検出、＝/−ｓｅｍ
【０２８２】
Ｓｅａｒｃｈｌｉｇｈｔ（商標）多重ＥＬＩＳＡアッセイ。ＴＩＭＰ１、ＴＰＯ、ＫＧＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＭＩＰ１β、ＭＣＰ１、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、ＴＡＲＣ、ＭＤＣ、およびＩＬ−８が臍由来ＰＰＤＣから分泌された（表１３−２および１３−３）。Ａｎｇ２、ＶＥＧＦ、またはＰＤＧＦｂｂは検出されなかった。
【表２５】
0005518893.tif 000027
略語：ｈＦＢ（ヒト線維芽細胞）、Ｕ１（臍由来ＰＰＤＣ（０２２８０３））、Ｕ３（臍由来ＰＰＤＣ（０７１００３））
ＮＤ：不検出
【表２６】
0005518893.tif 000028
略語：ｈＦＢ（ヒト線維芽細胞）、Ｕ１（臍由来ＰＰＤＣ（０２２８０３））、Ｕ３（臍由来ＰＰＤＣ（０７１００３））
ＮＤ：不検出
【０２８３】
臍由来細胞は、いくつかの栄養因子を分泌した。これらの栄養因子の一部、例えばＨＧＦ、ｂＦＧＦ、ＭＣＰ−１およびＩＬ−８、は血管新生において重要な役割を果たす。他の栄養因子、例えば、ＢＤＮＦおよびＩＬ−６は、神経再生または保護に重要な役割を有する。
【０２８４】
実施例１４
Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏでの免疫学
免疫学的反応を予測しようとして、臍帯細胞株が、それらの免疫学的特徴についてｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価され、もしあれば、これらの細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏ移植の際に引き出すであろう。分娩後細胞株は、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＢ７−Ｈ２の発現についてフローサイトメトリーによりアッセイされた。これらのタンパク質は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）により発現され、未処理ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ａｂｂａｓ  ＆  Ｌｉｃｈｔｍａｎ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  Ｅｄ．（２００３）  Ｓａｕｎｄｅｒｓ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ｐ．１７１）の直接刺激のために必要である。細胞株はまた、ＨＬＡ−Ｇ（Ａｂｂａｓ  ＆  Ｌｉｃｈｔｍａｎ，ｓｕｐｒａ）；ＣＤ１７８（Ｃｏｕｍａｎｓ  ｅｔ．ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９９；２２４：１８５−１９６）；、およびＰＤ−Ｌ２（Ａｂｂａｓ  ＆  Ｌｉｃｈｔｍａｎ，  ｓｕｐｒａ；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ．  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００３；１７０：１２５７−１２６６）の発現について、フローサイトメトリーによって分析された。どの程度まで分娩後臍由来細胞株がｉｎ  ｖｉｖｏで免疫反応を引き出すかを予測するため、細胞株は、一方向混合リンパ球反応（ＭＬＲ）で試験された。
【０２８５】
細胞は、コンフルエントまで、２％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）でコーティングされた、Ｔ７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）において、成長培地中で培養された。
【０２８６】
細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＭＯ）で分離した。細胞を回収し、遠心分離し、１ｘ１０７／ｍＬの細胞濃度で、ＰＢＳ中３％（ｖ／ｖ）ＦＢＳにおいて再懸濁した。抗体（表１４−１）が、製造業者の仕様書のとおりに、１００μＬの細胞懸濁液に加えられ、暗所で３０分間、４℃でインキュベートされた。インキュベーション後、細胞は、ＰＢＳで洗浄され、遠心分離されて非結合抗体を除去した。細胞は、５００μＬのＰＢＳ中で再懸濁され、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ器具（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いてフローサイトメトリーによって分析された。
【表２７】
0005518893.tif 000029
【０２８７】
細胞株「Ａ」と標識された、１０代継代の臍由来ＰＰＤＣの冷凍保存バイアルが、ドライアイス上で包装され、ＣＴＢＲ（Ｓｅｎｎｅｖｉｌｌｅ，Ｑｕｅｂｅｃ）に送られて、ＣＴＢＲ  ＳＯＰ  ｎｏ．  ＣＡＣ−０３１を用いて混合リンパ球反応を行った。末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）が、複数の男性および女性のボランティアドナーから収集された。６個のヒトボランティア血液ドナーをスクリーニングし、残りの５個の血液ドナーとの混合リンパ球反応において強い増殖反応を示した単一の同種ドナーを識別した。このドナーは、同種陽性対照ドナーとして選択された。残りの５つの血液ドナーは、レシピエントとして選択された。刺激剤（ドナー）同種ＰＢＭＣ、自家ＰＢＭＣ、および分娩後細胞株が、マイトマイシンＣで処理された。自家およびマイトマイシンＣで処理した刺激細胞が、反応者（レシピエント）ＰＢＭＣに加えられ、４日間培養された。インキュベーション後、［３Ｈ］チミジンが各サンプルに加えられ、１８時間培養された。細胞の回収後、放射標識ＤＮＡが抽出され、［３Ｈ］チミジンの取り込みが、シンチレーションカウンターを用いて測定された。反応は、プレート当たり３つのレシーバーで２細胞培養プレートを用いて３回行われた。
【０２８８】
同種ドナー（ＳＩＡＤ）の刺激指数が、レシーバー＋マイトマイシンＣ処理同種ドナーをレシーバーのベースライン増殖で割ったものの平均増殖として、計算された。分娩後細胞の刺激指数が、レシーバーのベースライン増殖で割った、レシーバー＋マイトマイシンＣ処理分娩後細胞株の平均増殖として計算された。
【０２８９】
６個のヒトボランティア血液ドナーがスクリーニングされて、残りの５つの血液ドナーとの混合リンパ球反応で強い増殖反応を示すであろう単一の同種ドナーを識別した。このドナーは、同種陽性対照ドナーとして選択された。残りの５つの血液ドナーは、レシピエントとして選択された。同種陽性対照ドナーおよび臍帯由来細胞株は、マイトマイシンＣ処理され、５個の個々の同種レシーバーとの混合リンパ球反応において培養された。反応は、プレート当たり３つのレシーバーで２つの細胞培養プレートを用いて３回行われた（表１４−２）。平均刺激指数は、６．５（プレート１）〜９（プレート２）の範囲であり、同種ドナー陽性対照は、４２．７５（プレート１）〜７０（プレート２）の範囲であった（表１４−３）。
【表２８】
0005518893.tif 000030
【表２９】
0005518893.tif 000031
【０２９０】
フローサイトメトリーにより分析された臍帯由来細胞のヒストグラムは、ＩｇＧ対照と一致した蛍光値により示されるように、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＢ７−Ｈ２の陰性発現を示し、このことは、臍帯由来細胞株には、同種ＰＢＭＣを直接刺激するのに必要な細胞表面分子がないこと（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞）を示している。
【０２９１】
フローサイトメトリーにより分析された臍細胞は、ＩｇＧ対照に対する蛍光の増大に反映されるように、ＰＤ−Ｌ２の発現について陽性であった。細胞は、ＩｇＧ対照と一致した蛍光値により示されるように、ＣＤ１７８およびＨＬＡ−Ｇの発現について陰性であった。
【０２９２】
臍細胞株で実施された混合リンパ球反応では、平均刺激指数は、６．５〜９の範囲であり、同種陽性対照では、４２．７５〜７０の範囲であった。臍細胞株は、フローサイトメトリーにより測定された場合に、検出可能な量の刺激タンパク質ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＢ７−Ｈ２を発現しなかった。臍細胞株はまた、免疫調節タンパク質ＨＬＡ−ＧおよびＣＤ１７８を発現しなかったが、ＰＤ−Ｌ２の発現が、フローサイトメトリーにより検出された。同種ドナーＰＢＭＣは、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＱ、ＣＤ８、ＣＤ８６、およびＢ７−Ｈ２を発現する抗原提示細胞を含み、それにより、同種リンパ球の刺激を可能にする。未処理ＣＤ４＋Ｔ細胞の直接刺激に必要な抗原提示細胞表面分子の臍由来細胞がないこと、ならびに免疫調節タンパク質、ＰＤ−Ｌ２の存在は、同種対照と比較した場合に、ＭＬＲ中でこれらの細胞により示される低い刺激指数の説明となる。
【０２９３】
本発明は、前記で説明し例示した実施形態に限定されるものではない。本発明は、請求項の範囲内でバリエーションおよび改変が可能である。
【０２９４】
実施例１５
テロメラーゼ活性のアッセイ
テロメラーゼは、染色体の完全性を保護し、また細胞の複製寿命を延ばすのに役立つ、テロメア繰り返し体を合成するよう機能する（Ｌｉｕ，  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９９９；９６：５１４７−５１５２）。テロメラーゼは、２つの成分、テロメラーゼＲＮＡテンプレート（ｈＴＥＲ）、およびテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）のみからなる。テロメラーゼの調節は、ｈＴＥＲではなく、ｈＴＥＲＴの転写により決定される。ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ゆえに、細胞のテロメラーゼ活性を決定する、認められた方法である。
【０２９５】
細胞単離
リアルタイムＰＣＲ実験が行われ、ヒト臍帯組織由来細胞のテロメラーゼ産生が決定された。ヒト臍帯組織由来細胞が、実施例５〜７、および、米国特許第７，５１０，８７３号として特許となった米国特許出願第１０／８７７，０１２号（’０１２号出願）に記載される実施例に従って、準備された。概して、正常な運搬後にＮａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．）から入手された臍帯が洗浄され、血液および残骸を除去し、機械的に解離される。組織は次に、コラゲナーゼ、ディスパーゼおよびヒアルロニダーゼを含む消化酵素で、培養培地において３７℃でインキュベートされる。ヒト臍帯組織由来細胞は、’０１２号出願の実施例に記載された方法に従って培養された。間葉系幹細胞および正常な皮膚線維芽細胞（ｃｃ−２５０９  ロット番号９Ｆ０８４４）が、Ｃａｍｂｒｅｘ，  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，  Ｍｄ．から入手された。多能性ヒト精巣胎児性癌（テラトーマ）細胞株ｎＴｅｒａ−２細胞（ＮＴＥＲＡ−２  ｃｌ．Ｄｌ）（Ｐｌａｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２００６；２４（３）：５３１−５４６を参照）をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．）から購入し、’０１２号出願に記載した方法に従って培養した。
【０２９６】
全ＲＮＡ単離
ＲＮＡが、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａ．）を用いて細胞から抽出された。ＲＮＡは、５０μＬのＤＥＰＣ処理水で溶出され、−８Ｏ℃で保管された。ＲＮＡは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）逆転写試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａ．）により、２５℃で１０分間、３７℃で６０分間、９５℃で１０分間、ランダムヘキサマーを用いて逆転写された。サンプルは、‐２０℃で保管された。
【０２９７】
リアルタイムＰＣＲ
ＰＣＲが、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ａｓｓａｙｓ−Ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（商標）（ＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイとしても知られる）を用いて、製造業者の仕様書（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従って、ｃＤＮＡサンプルに対して行われた。この市販のキットは、ヒト細胞のテロメラーゼのアッセイに広く使われる。手短に言えば、ｈＴＥＲＴ（ヒトテロメラーゼ遺伝子）（Ｈｓ００１６２６６９）およびヒトＧＡＰＤＨ（内部対照）が、ＡＢＩ  ｐｒｉｓｍ  ７０００  ＳＤＳソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と共に７０００配列検出システムを用いて、ｃＤＮＡおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲマスターミックスと混合された。熱サイクル条件は、最初は、５０℃で２分、９５℃で１０分、その後、９５℃で１５秒および６０℃で１分の４０サイクルであった。ＰＣＲデータは、製造業者の仕様書に従って分析された。
【０２９８】
ヒト臍帯組織由来細胞（ＡＴＣＣ受入番号  ＰＴＡ−６０６７）、線維芽細胞、および間葉系幹細胞は、ｈＴＥＲＴおよび１８Ｓ  ＲＮＡについてアッセイされた。表２２−１に示すように、ｈＴＥＲＴ、したがってテロメラーゼは、ヒト臍帯組織由来細胞では検出されなかった。
【表３０】
0005518893.tif 000032
ＮＤ：不検出；  ＋：信号検出
【０２９９】
ヒト臍帯組織由来細胞（ｉｓｏｌａｔｅ  ０２２８０３，ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−６０６７）およびｎＴｅｒａ−２細胞が、アッセイされ、結果は、ｈＵＴＣの２つのロットではテロメラーゼの発現を示さず、一方、テラトーマ細胞株は、高レベルの発現を表した（表２２−１）。
【０３００】
〔実施の態様〕
（１）  肺疾患、障害もしくは傷害を有する患者を治療する方法において、
前記肺疾患、障害もしくは傷害、およびそれにより生じた損傷を治療するのに有効な量の臍帯組織由来細胞を前記患者に投与すること、
を含み、
前記臍帯組織由来細胞は、実質的に血液のないヒト臍帯組織由来であり、培養中に自己再生および増殖することができ、少なくとも肺組織の細胞に分化する能力を有する、方法。
（２）  実施態様１に記載の方法において、
前記肺疾患、障害もしくは傷害は、閉塞性の疾患もしくは障害、拘束性の疾患もしくは障害、または直接的もしくは間接的な傷害であるか、あるいはそれらにより生じる、方法。
（３）  肺疾患を有する被験者を治療する方法において、
肺疾患を治療するのに有効な量で臍帯組織由来細胞を前記患者に投与すること、
を含み
前記細胞は、実質的に血液のないヒト臍帯組織由来であり、培養中に自己再生および増殖することができる、方法。
（４）  実施態様３に記載の方法において、
前記臍帯組織由来細胞は、ｈＴＥＲＴまたはテロメラーゼを発現しない、方法。
（５）  実施態様３に記載の方法において、
前記臍帯組織由来細胞は、ＣＤ１１７に対して陰性である、方法。
【０３０１】
（６）  実施態様１に記載の方法において、
前記細胞は、肺組織に分化するようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導される、方法。
（７）  実施態様１に記載の方法において、
前記細胞は、少なくとも１つの他の細胞型と共に投与される、方法。
（８）  実施態様７に記載の方法において、
前記他の細胞型は、肺前駆細胞、血管平滑筋細胞、血管平滑筋前駆細胞、周皮細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、または他の多分化能もしくは多能性幹細胞から選択される、肺組織細胞である、方法。
（９）  実施態様１に記載の方法において、
前記細胞は、少なくとも１つの他の薬剤と共に投与される、方法。
（１０）  実施態様９に記載の方法において、
前記薬剤は、抗血栓薬、抗炎症薬、免疫抑制剤、免疫調節剤、血管新生促進剤、または抗アポトーシス薬である、方法。
【０３０２】
（１１）  実施態様２に記載の方法において、
前記細胞は、前記肺疾患、障害もしくは傷害の部位で投与される、方法。
（１２）  実施態様１に記載の方法において、
前記臍帯組織由来細胞は、注入、注射、前記患者に植え込まれた装置によって、または前記細胞を含有するマトリックスもしくは足場の植え込みによって、投与される、方法。
（１３）  実施態様１に記載の方法において、
前記細胞は、前記患者の前記肺組織に栄養作用を及ぼす、方法。
（１４）  実施態様１に記載の方法において、
前記細胞は、前記患者の血管平滑筋に栄養作用を及ぼす、方法。
（１５）  実施態様１４に記載の方法において、
前記栄養作用は、血管平滑筋細胞の増殖である、方法。
【０３０３】
（１６）  実施態様１に記載の方法において、
前記細胞は、前記患者の血管内皮に栄養作用を及ぼす、方法。
（１７）  実施態様１６に記載の方法において、
前記栄養作用は、血管内皮細胞の増殖である、方法。
（１８）  実施態様１に記載の方法において、
前記細胞は、前記肺疾患、障害もしくは傷害の部位への血管内皮細胞の遊走を誘発する、方法。
（１９）  実施態様１に記載の方法において、
前記細胞は、前記肺疾患、障害もしくは傷害の部位への血管内皮前駆細胞の遊走を誘発する、方法。
（２０）  実施態様１に記載の方法において、
前記細胞は、前記肺疾患、障害もしくは傷害の部位への血管平滑筋細胞の遊走を誘発する、方法。
【０３０４】
（２１）  実施態様１に記載の方法において、
前記細胞は、前記肺疾患、障害もしくは傷害の部位への血管平滑筋前駆細胞の遊走を誘発する、方法。
（２２）  実施態様１に記載の方法において、
前記細胞は、前記肺疾患、障害もしくは傷害の部位への周皮細胞の遊走を誘発する、方法。
（２３）  肺疾患、障害もしくは傷害を有する患者を治療するための医薬組成物において、
前記肺疾患、障害もしくは傷害を治療するのに有効な量の、医薬的に許容可能な担体および臍帯組織由来細胞、
を含み、
前記臍帯組織由来細胞は、実質的に血液のないヒト臍帯組織由来であり、培養中に自己再生および増殖することができ、少なくとも肺組織の細胞に分化する能力を有する、医薬組成物。
（２４）  肺疾患、障害もしくは傷害を有する患者を治療するためのキットにおいて、
医薬的に許容可能な担体と、
臍帯組織由来細胞集団と、
前記患者を治療する方法において前記キットを使用するための説明書と、
を含み、
前記臍帯組織由来細胞は、実質的に血液のないヒト臍帯組織由来であり、培養中に自己再生および増殖することができ、少なくとも肺組織の細胞に分化する能力を有する、キット。
（２５）  肺疾患、障害もしくは傷害を有する患者を治療するための医薬組成物において、
医薬的に許容可能な担体と、
臍帯組織由来細胞から作られた製剤と、
を含み、
前記臍帯組織由来細胞は、実質的に血液のないヒト臍帯組織由来であり、培養中に自己再生および増殖することができ、少なくとも肺組織の細胞に分化する能力を有する、医薬組成物。
【０３０５】
（２６）  肺疾患、障害もしくは傷害を有する患者を治療するためのキットにおいて、
実施態様２５に記載の医薬組成物、
を含む、キット。
【図面の簡単な説明】
【０３０６】
【図１】ＢＡＬＦ総タンパク質濃度を示す。総タンパク質は、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  タンパク質アッセイを用いて測定した。各データ点は、１つの動物から得た測定値を表す。水平な線は、全測定値の平均を表す。スチューデントＴ検定分析を行った。データは表形式で示す（表８）。
【図２ａ】肺ホモジネートのサイトカイン／ケモカイン分析を示す。２２個の異なるサイトカイン／ケモカインの濃度が、製造業者のプロトコルに従い、マウス２２−マルチプレックスビーズキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、肺ホモジネートについて決定され、ＢｉｏＲａｄ  Ｂｉｏｐｌｅｘ機器を用いて分析された。データバーは、６個のサンプルの平均を表す。データは、表形式で以下に示す（図３）。
【図２ｂ】ＢＡＬＦのサイトカイン／ケモカイン分析を示す。２２個の異なるサイトカイン／ケモカインの濃度が、製造業者のプロトコルに従い、マウス２２−マルチプレックスビーズキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＢＡＬＦについて決定され、ＢｉｏＲａｄ  Ｂｉｏｐｌｅｘ機器を用いて分析された。データバーは、６個のサンプルの平均を表す。データは、表形式で以下に示す（図４）。
【図３】肺ホモジネートサイトカイン／ケモカイン分析を示す。２２個の異なるサイトカイン／ケモカインの濃度が、製造業者のプロトコルに従い、マウス２２−マルチプレックスビーズキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて肺ホモジネートについて決定され、ＢｉｏＲａｄ  Ｂｉｏｐｌｅｘ機器を用いて分析された。
【図４】ＢＡＬＦサイトカイン／ケモカイン分析を示す。２２個の異なるサイトカイン／ケモカインの濃度が、製造業者のプロトコルに従い、マウス２２−マルチプレックスビーズキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＢＡＬＦについて決定され、ＢｉｏＲａｄ  Ｂｉｏｐｌｅｘ機器を用いて分析された。
【図１】
0005518893.tif 000033
【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
0005518893.tif 000036
【図４】
0005518893.tif 000037
【配列表】
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