(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列で表されるペプチド、または、
Ｎ末端に配列番号１のアミノ酸配列を含む、配列番号４のアミノ酸配列で表されるＭＡＲＣＫＳタンパク質由来の連続するアミノ酸配列の部分ペプチドであって、アミノ酸長が５０個以下である、ペプチド
から選択されるペプチドを含む、粘液分泌細胞による粘液分泌を減少するための医薬組成物であって、前記ペプチドが、Ｎ末端がミリストイル化されてなるものであり、
前記ペプチドがＭＡＲＣＫＳタンパク質関連の粘液分泌を阻害し、
前記ペプチドが粘液分泌細胞による粘液分泌を該ペプチドの非存在下で生じるであろう粘液分泌に比べて減少させる、医薬組成物。
【請求項２】
医薬的に許容される担体をさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
気道疾患の治療のための、請求項１または２のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記気道疾患が、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫、慢性気管支炎、嚢胞性線維症、気管支拡張症、肺炎、鼻炎、インフルエンザまたは感冒を含む、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
吸入により投与するための、請求項１〜４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
肺にリポソームまたはエアゾール投与することにより細胞に投与するための、請求項１〜５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項７】
粘液分泌の治療のためまたは予防的治療のための医薬の製造のための、請求項１〜６のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
【請求項８】
粘液分泌及び炎症の治療のためまたは予防的治療のための医薬の製造のための、請求項１〜６のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】［発明の分野］
本発明は、粘液分泌の調節に有用であり、粘液分泌を増加または減少させることが望ましい病状の処置に使用し得る方法および組成物に関する。
【０００２】［発明の背景］
粘液は、ゲルを形成できる生物学的液体である。それは、水および様々な細胞からの分泌産物を含む成分の混合物である。喀痰されたヒト気道粘液は、約９５％の水および５％の固体を含む。固体内容物は、２〜３％のタンパク質および糖タンパク質、１％の脂質、および１％のミネラルを含む。Ｂｏａｔら、粘液の生化学、気道分泌、ＴａｋａｓｈｉｍａおよびＳｈｉｍｕｒａ（編）、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、１９９４参照。ムチンは、粘液糖タンパク質または上皮糖タンパク質とも称されるが、これは、ＮおよびＯ結合によりペプチドコアに連結した数多くのオリゴ糖側鎖を特徴とする複合糖質である。
【０００３】  気道では、ムチンは、表面上皮上の杯細胞から、および、粘膜下腺の粘液細胞から気道表面に放出される。気道中の表面液体（粘液）の総量は、（上皮再吸収、蒸発、シリア線毛輸送、および咳輸送による）粘液のクリアランス速度と粘液分泌速度の結果である。「正常な」条件下では、粘液の分泌速度およびクリアランス速度は、ほんの薄い表面の液層が、気管気管支樹を覆うようにバランスをとっている。粘液過剰分泌（粘液クリアランスの同時増加を伴わない場合）により、気道の粘液が蓄積し、これにより、気道の閉塞および吸入した粒子状物質および微生物の保持増強が起こり得る。気道中の管腔粘液を減少させる既存の戦略は、間接的な薬理作用を使用した粘液過剰分泌阻害、粘液の物理的特徴の変化による線毛機能の増強、および、粘液の咳クリアランスの増強を含む。
【０００４】  粘液の過剰分泌は、ヒトおよび非ヒト動物の両方において、多くの気道炎症疾患において、病理発生の原因となる。粘液分泌増加は、喘息、ＣＯＰＤおよび慢性気管支炎などの慢性疾患状態、嚢胞性線維症などの遺伝病、アレルギー容態（アトピー、アレルギー炎症）、気管支拡張症、および、肺炎、鼻炎、インフルエンザまたは感冒などの多くの急性で感染性の呼吸器の疾病に認められる。従って、粘液分泌を減少または低下できる新規方法および治療化合物が望まれる。
【０００５】  粘液分泌不足も有害な作用を示す。気道粘液は、生物学的に活性な吸入粒子に対する物理的障壁として作用し、気道での細菌によるコロニー形成および白血球から遊離される不活性な細胞毒性産物を防ぐのに役立ち得る。Ｋｉｎｇら、Ｒｅｓｐｉｒ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．６２：４７〜５９（１９８５）；ＶｉｓｈｗａｎａｔｈおよびＲａｍｐｈａｌ、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４５：１９７（１９８４）；Ｃｒｏｓｓら、Ｌａｎｃｅｔ  １：１３２８（１９８４）参照。眼では、粘液は涙液膜を維持し、眼の健康および快適さのために重要である。胃腸管の粘膜分泌物は、細胞保護機能も有する。化学的、生物学的および機械的障壁としての粘液の役割は、粘膜によって粘液分泌が異常に低くなることが好ましくないことを意味する。
【０００６】  前述のことを鑑みて、上皮細胞および粘膜からの粘液分泌を変化（すなわち増加または減少）させる改良された方法および組成物が望まれる。
【０００７】［発明の概要］
本発明の第一の態様は、細胞に、ＭＡＲＣＫＳタンパク質関連粘液分泌を阻害する化合物を、粘液を阻害する量で投与することを含む粘液分泌細胞による粘液分泌を阻害する方法である。
【０００８】  本発明の第二の態様は、細胞に、ＭＡＲＣＫＳ関連粘液分泌のペプチド阻害剤を投与することにより、粘液分泌細胞による粘液分泌を阻害する方法である。
【０００９】  本発明の第三の態様は、被検者の気道に、ＭＡＲＣＫＳに関連するムチンの放出を阻害する化合物を、粘液を阻害する量で投与することにより、かかる処置の必要な被検者の気道の粘液分泌を阻害する方法である。
【００１０】  本発明の第四の態様は、細胞に、ＭＡＲＣＫＳタンパク質の分泌増強断片を、細胞による粘液分泌を増強するのに十分な量で投与することにより、該タンパク質断片の非存在下で生じるであろう粘液分泌に比べて、粘液分泌細胞による粘液分泌を増加させる方法である。
【００１１】  本発明の第五の態様は、細胞に、内因性ＭＡＲＣＫＳタンパク質コード配列に生理的条件下で特異的に結合するアンチセンス構築物を、粘液を阻害する量で投与することを含み、ここで、該細胞による粘液分泌は、かかる投与の非存在下で生じるであろう粘液分泌に比べて阻害される、粘液分泌細胞による粘液分泌を阻害する方法である。
【００１２】  本発明の第六の態様は、ＭＡＲＣＫＳの粘液阻害ペプチド断片および医薬的に許容される担体を含む医薬製剤である。
【００１３】  本発明の第七の態様は、ＭＡＲＣＫＳタンパク質をコードするヌクレオチド分子に生理的条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する約１０個から約５０個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドである。該オリゴヌクレオチドは、内因性ヌクレオチド分子を含む細胞に投与した場合に、ＭＡＲＣＫＳタンパク質の発現を阻害する。
【００１４】  本発明の第八の態様は、粘液分泌細胞による粘液分泌を阻害する方法であって、該細胞に、（ａ）ＭＡＲＣＫＳタンパク質の結合する部位のムチン顆粒膜と、（ｂ）ムチン顆粒結合部位のＭＡＲＣＫＳタンパク質とから選択される標的部位に結合する化合物を、粘液を阻害する量で投与することを含む。細胞により分泌される粘液の量は、該化合物の非存在下で生じるであろう粘液量に比べて減少する。
【００１５】  本発明の第九の態様は、粘液分泌細胞による粘液分泌を増強する方法であって、該細胞に、ＭＡＲＣＫＳタンパク質の内因性阻害剤に結合する化合物の粘液増強量を投与することを含む。
【００１６】  本発明の第十の態様は、ムチン分泌細胞における、（ａ）ＭＡＲＣＫＳタンパク質の結合する部位のムチン顆粒膜と、（ｂ）ムチン顆粒膜結合部位のＭＡＲＣＫＳタンパク質とから選択された部位への結合能について、試験化合物をスクリーニングする方法である。該方法は、該試験化合物を、粘液分泌細胞に投与し、次いで、該試験化合物が、ムチン顆粒膜への内因性ＭＡＲＣＫＳタンパク質の結合を阻害するかどうかを検出することを含む。
【００１７】  本発明の第十一の態様は、粘液分泌細胞による粘液分泌を増強させる方法であって、細胞に、細胞中のＭＡＲＣＫＳタンパク質の量を増加させる化合物を、粘液を増強させる量で投与することを含む。よって、粘液分泌は、該化合物の非存在下で生じるであろう粘液分泌に比べて増強する。
【００１８】  本発明の最後の態様は、タンパク質、ペプチド断片、オリゴヌクレオチド、および非ペプチド化合物を含む粘液分泌を変化させるために使用し得る化合物の、それを必要とする被検者の粘液分泌のための、医薬品の調製における使用である。
【００１９】［好ましい実施形態の詳細な説明］
粘液とは、粘膜の透明で、粘稠な分泌物であり、水、ムチン、脂質、および様々な無機酸を含む。ムチンは、特殊上皮細胞（杯細胞として知られる）、顎下腺、および他の粘液腺細胞により分泌される炭水化物の豊富な糖タンパク質である。杯細胞は、分泌に特化した上皮細胞であり、集積された粘液分泌腺を含む。
【００２０】  粘膜組織（すなわち粘膜）は、哺乳動物および鳥類の生体の様々な解剖学的構造の内部を満たすものであり、眼、気道（肺胞、気管支、口腔、喉頭、鼻腔、咽頭、気管）、胃腸管（食道、胃、小腸および大腸、直腸）、および尿生殖路（尿道、膀胱、子宮および膣）を含む。
【００２１】  粘液分泌量の変化は、粘液分泌細胞から分泌される粘液糖タンパク質の量の変化、粘液分泌細胞の総数の変化、またはそれらの組合せを含む様々な根底の因子に起因し得る。脂質メディエーター、酸素代謝物、および他の細胞特異的産物を含む炎症応答により遊離されるメディエーターは、粘液分泌促進物質として作用することが知られている。Ｌａｒｉｖｅｅら、気道分泌、ＴａｋｉｓｈｉｍａおよびＳｈｉｍｕｒａ（編）、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．１９９４、４６９〜５１１項。
【００２２】  本明細書に使用した、粘液の「過剰分泌」とは、正常または基礎量を超える粘液の産生、または、病的変化または症状に至る量の粘液の産生を意味する。
【００２３】  本明細書に使用した「粘液分泌を阻害」は、粘液分泌を低下または減少させることを意味する。それは、粘液分泌の完全な停止を意味するものではない。粘液分泌を阻害する処置は、かかる処置の非存在下で生じるであろう、または期待される粘液産生と比べて、粘液産生の減少をもたらす。
【００２４】  培養液中の細胞により、またはインビボの組織により分泌される粘液量は、当分野で既知の方法を使用して測定または評価することができる。
【００２５】  本明細書に使用した粘液分泌の「増強」または「刺激」は、粘液分泌の増加を意味する。粘液分泌を増強させる処置は、かかる処置の非存在下で生じるであろう、または期待される粘液産生と比べて、粘液産生の増加をもたらす。
【００２６】  本明細書に使用した「刺激された粘液分泌」は、分泌促進物質に応答して生じる粘液分泌を意味する。これは、普通の生理的条件下で生じる「基礎粘液分泌」と対比される。
【００２７】  本明細書に使用した、ＭＡＲＣＫＳタンパク質媒介ムチン顆粒（すなわち粘液）遊離を阻害する化合物は、粘液分泌をもたらすＭＡＲＣＫＳタンパク質媒介シグナル伝達経路の一つの段階に作用し、粘液分泌の減少を引き起こす化合物を含む。
【００２８】  本明細書に使用した、「内因性」とは、細胞に天然に存在する化合物を意味する。従って、内因性ＭＡＲＣＫＳタンパク質は、細胞に導入される（直接、または遺伝子工学技術により投与される）ＭＡＲＣＫＳタンパク質とは逆に、細胞内にみられるＭＡＲＣＫＳタンパク質を意味する。
【００２９】  本明細書に使用したＭＡＲＣＫＳタンパク質の「活性断片」は、ＵＴＰ（ウリジン５'三リン酸）などの分泌促進物質に応答して生じるＭＡＲＣＫＳタンパク質媒介粘液遊離に影響を及ぼす（阻害または増強する）ものである。ＭＡＲＣＫＳの活性ペプチド断片は、天然ＭＡＲＣＫＳタンパク質に見られるアミノ酸の連続する配列と同一、または実質的に同一なアミノ酸配列を含む。活性ＭＡＲＣＫＳタンパク質断片は、典型的には、約５、１０、１５、２０または２５アミノ酸長であるが、完全ＭＡＲＣＫＳタンパク質よりも短い。活性ＭＡＲＣＫＳタンパク質断片は、好ましくは、約５０、７５、１００または２００以下のアミノ酸を有する。
【００３０】  化合物の「粘液阻害性」または「粘液を阻害する」量とは、化合物の非存在下で生じるであろう量と比べて、粘液分泌を減少または阻害する量である。化合物の「粘液を増強する」量とは、化合物の非存在下で生じるであろう量と比べて、粘液分泌を増強または増加する量である。例えば、本明細書に記載したように、配列番号２のペプチドは、一定の量で供給すると、インビボでの気道上皮の粘液分泌を増加させ、より多い量で供給すると、粘液分泌を阻害することが判明した。特定のペプチドの最も効果的な投与量は、ペプチド、投与経路、および処置する容態に応じて変化する。本明細書に使用した「化合物」なる語は、タンパク質、ペプチド断片、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、および他のタンパク質でない化学物質を含み、広く捉えるべきである。
【００３１】  本明細書に使用したＭＡＲＣＫＳ関連粘液分泌（またはムチン遊離）のペプチド阻害剤は、粘液分泌細胞に提供すると、前記ペプチドの非存在下で生じるであろう粘液分泌と比べて、粘液分泌を阻害または低下させるペプチドである。
【００３２】  本明細書に使用したＭＡＲＣＫＳ関連粘液分泌（またはムチン遊離）のペプチド増強剤は、粘液分泌細胞に提供すると、前記ペプチドの非存在下で生じるであろう粘液分泌と比べて、粘液分泌を増強または増加させるペプチドである。
【００３３】  本明細書に使用した「オリゴヌクレオチド」は、ＤＮＡまたはＲＮＡを意味し、所望の効果に適切なようにセンスまたはアンチセンス鎖あるいはそれらの両方を含み得る。本発明に有用なオリゴヌクレオチドは、プロモーター並びに所望の翻訳産物（例えばペプチド）の発現に必要な他の配列を含む組換え発現ベクターに取込み得る。あるいは、「裸（naked）」のオリゴヌクレオチドは、当分野で公知のように、標的細胞に送達し得る（例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒら、米国特許第５，５８０，８５９号参照）。
【００３４】  本明細書に使用した粘膜（ｍｕｃｏｓａ）または粘膜（ｍｕｃｏｕｓ  ｍｅｍｂｒａｂｎｅ）は、それらが、呼吸器路（鼻、口、気管、気管支）、生殖器路（膣、頸管、肛門、陰茎）、尿路（尿道、膀胱）、および眼を含むがこれらに限定されず、生体のいずれに位置してもよい宿主の粘膜組織を意味する。
【００３５】  本発明は、上皮細胞からの粘液分泌を阻害するに有用な方法および組成物を提供する。本発明者は、上皮細胞のムチン分泌プロセスは、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）基質のＭＡＲＣＫＳタンパク質（ミリストイル化されたアラニンリッチなＣキナーゼ基質タンパク質）が関与することを見出した。分泌上皮細胞のＭＡＲＣＫＳタンパク質の機能または産生あるいはそれらの両方を遮断または阻害することにより、粘液分泌は、そうでなければ生じたであろう（すなわち、かかる処置の非存在下で生じたであろう）ものよりも減少させる。本発明は、上皮細胞からの粘液分泌を増強するために有用な方法および組成物も提供する。分泌上皮細胞のＭＡＲＣＫＳタンパク質の機能または産生あるいはそれらの両方を増強することにより、粘液分泌は、そうでなければ生じたであろう（すなわち、前記遮断の非存在下で生じたであろう）ものよりも減少する。
【００３６】  本発明者は、ＭＡＲＣＫＳタンパク質の断片を使用することは、上皮細胞による粘液分泌を低下させることを示した。さらに、ＭＡＲＣＫＳｍＲＮＡ配列に対するアンチセンス断片を使用することで、上皮細胞の粘液産生を減少させることが示された。
【００３７】  数多くの粘液分泌促進物質が、以前から認識されていたにも関わらず、粘液分泌に関与する一般的なシグナル伝達経路および細胞内分子は以前には解明されていなかった。本発明は、ミリストイル化アラニンリッチＣキナーゼ基質（ＭＡＲＣＫＳ）タンパク質が細胞の分泌プロセスに、特に上皮細胞（例えば杯細胞）からの粘液の分泌に関与しているという予期されなかった発見を活用する。ＭＡＲＣＫＳタンパク質は、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の主要な細胞基質であり、本発明者の研究により、それは、ムチン顆粒の遊離を制御している中心的で収束的な分子であることが示される。本発明のいずれかの１つの理論に固執したくはないが、粘液のＭＡＲＣＫＳ関連分泌は、粘液分泌促進物質と気道上皮（杯）細胞の相互作用および２つの別々のプロテインキナーゼ、ＰＫＣおよびＰＫＧの活性化に関与するようである。活性化されたＰＫＣは、ＭＡＲＣＫＳをリン酸化し、形質膜から細胞質へそれを移行させ、そこで、ＭＡＲＣＫＳ会合タンパク質の助けをかりてムチン顆粒膜に標的化する。一酸化窒素（ＮＯ）−ｃＧＭＰ−ＰＫＧ経路を介して活性化されたＰＫＧは、次に、細胞質タンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）を活性化し、これは、ＭＡＲＣＫＳを脱リン酸化し、よって、顆粒膜へのその付着を安定化させ、ＭＡＲＣＫＳがアクチンフィラメントに架橋することができ、これにより、移動およびエキソサイトーシスのために細胞骨格に頼粒を繋げることができる。この提唱されたシグナル伝達経路は、一般に図４に示すとおりである。
【００３８】  本発明者は、ヒト気管支上皮細胞のＭＡＲＣＫＳｍＲＮＡおよびタンパク質を認識し、インビトロで分泌細胞分化と共に、ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの両方が増加した。これらの細胞のＭＡＲＣＫＳは、ホルボールエステルＰＭＡ（ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート）によりリン酸化されるが、その後のｃＧＭＰアクチベーター（８−ブロモ−ｃＧＭＰ）の添加は、脱リン酸化を引き起こした。病態生理学的に関連する分泌促進物質のウリジン三リン酸（ＵＴＰ）により（またはＰＭＡと８−ブロモ−ｃＧＭＰの組合せにより）誘起された粘液分泌は、ＭＡＲＣＫＳタンパク質のＮ末端領域のミリストイル化ペプチド断片（提唱されている、タンパク質が顆粒膜へ付着する部位）により、用量依存的に阻害された。従って、ＭＡＲＣＫＳタンパク質のＮ末端領域のミリストイル化ペプチド断片、並びに、他の活性ペプチド断片は、粘液分泌の阻害法に有用である。本明細書でさらに記載したように、ＭＡＲＣＫＳタンパク質のある活性断片の投与は、上皮粘膜分泌細胞による粘液分泌を増加および減少の両方ができることが判明した。
【００３９】  本発明者は、ＭＡＲＣＫＳタンパク質に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが、本明細書にさらに記載したように、粘液分泌を遮断または阻害することを発見した。従って、かかるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、粘液分泌の阻害方法に有用性を見出す。
【００４０】  従って、図４に示した粘液分泌シグナル伝達経路の成分のうち、一定の非タンパク質阻害剤は粘液分泌細胞の粘液分泌を阻害し、従って、本発明の方法の実施に有用である。例えば、カルフォスチンＣなどのＰＫＣ阻害剤、Ｒｐ−８−Ｂｒ−ＰＥＴ−ｃＧＭＰなどのサイクリックＧＭＰ阻害剤、Ｒｐ−８−Ｂｒ−ＰＥＴ−ｃＧＭＰなどのＰＫＧ阻害剤、ＬＹ８３５８５などの可溶性グアニリルシクラーゼ阻害剤、およびオカダ酸などのホスファターゼ阻害剤は、各々、上記に列挙した分泌促進物質により刺激された細胞における粘液分泌を阻害する。従って、このような粘液分泌シグナル伝達経路の成分の阻害剤は、粘液分泌の阻害法に有用性を見出す。
【００４１】  本発明の実施に有用性を見出す他の化合物は、粘液分泌細胞でＭＡＲＣＫＳタンパク質の量（すなわち濃度）を増加させる化合物である。前記化合物は、これらの細胞で粘液分泌を増加させることが判明した。これらの化合物が細胞中のＭＡＲＣＫＳタンパク質のレベルまたは量を増加させる機序は不明であるが、可能性ある機序は、（１）これらの化合物による、直接的または間接的な、ＭＡＲＣＫＳｍＲＮＡ産生の転写調節（すなわち、転写因子の結合または変化、または他の転写調節機序を通して）、および（２）これらの化合物による、直接的または間接的な、ＭＡＲＣＫＳタンパク質の発現の翻訳制御または調節（例えば、ＭＡＲＣＫＳｍＲＮＡの上流調節領域に結合し、よって、発現されたＭＡＲＣＫＳタンパク質の量を阻害する二次構造を潜在的に変化させることにより）を含む。本明細書に使用したような、粘液分泌細胞でＭＡＲＣＫＳタンパク質の量を増加させる化合物は、タンパク質、ペプチド、または非タンパク質化合物であり得る。本発明の１つの実施形態において、該化合物は細菌性リポ多糖（ＬＰＳ）である。好ましくは、該化合物はタンパク質またはペプチドである。特に好ましい本発明の実施形態において、該化合物はサイトカインである。より特に好ましい本発明の実施形態において、粘液分泌細胞でＭＡＲＣＫＳタンパク質の量を増加させる化合物は、サイトカインの主要壊死因子α（ＴＮＦ−α）である。
【００４２】  従って、本発明は、粘液分泌の調節（増加または減少）に有用な方法および組成物を提供する。かかる方法および組成物は、粘液過剰分泌が起こる病状の処置に有用であり、特に気道に有用である。本発明の方法および組成物はさらに、粘液分泌の増加が望ましい病状の処置に有用であり得る。
【００４３】  本発明の方法および組成物は、任意の粘液分泌細胞（例えば杯細胞）または組織（例えば気道の粘膜）から生じる粘液分泌を阻害または低下させるために使用し得る。特定の理論に固執したくはないが、本発明者はまた、本発明の化合物および方法は、マクロファージ、好中球および肥満細胞などの細胞からの炎症メディエーターの分泌を遮断するのにも使用し得ると考える。このように、本発明の粘液阻害化合物は、粘液分泌および炎症を減少させる二重の機能を有し得る。
【００４４】  以下に議論したように、本発明はまた、粘液分泌細胞に送達されると二モード効果を示す、ＭＡＲＣＫＳタンパク質の活性ペプチド断片にも関する。ある投与量レベル（粘液増強量）で、かかるペプチドは、粘液分泌を増加または増強させる（かかる処置の非存在下で生じるであろう粘液分泌と比較して）。異なる投与量レベルでは、この増強はもはや観察されない。さらにより極端な投与量により、粘液分泌は阻害または減少する（かかる処置の非存在下で生じるであろう粘液分泌と比較して）。
【００４５】  従って、本発明は、粘液分泌経路でＭＡＲＣＫＳタンパク質の効果を調節することにより、粘液分泌を調節する方法および組成物を提供する。かかる調節は、予め決定した量でのＭＡＲＣＫＳタンパク質の活性断片の投与、粘液分泌阻害量のＭＡＲＣＫＳアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与、または、ＭＡＲＣＫＳ関連分泌経路を増強または阻害するこれらまたは他の化合物（単独でまたは組合せて）の投与により達成できる。かかる化合物は、ムチン遊離をもたらす脱リン酸化ＭＡＲＣＫＳタンパク質結合事象を遮断する化合物を含む。かかる化合物は、内因性ＭＡＲＣＫＳタンパク質の結合する部位に結合して遮断し得るか、または、妥当な部位でＭＡＲＣＫＳタンパク質に結合し得る。本明細書に記載したＭＡＮＳペプチドは、細胞中の妥当な結合部位について内因性ＭＡＲＣＫＳタンパク質と競合し、従って、細胞内のムチンのＭＡＲＣＫＳ媒介遊離を遮断すると考えられている。別に、ＭＡＲＣＫＳタンパク質のＮ末端配列（例えばＭＡＮＳ配列）に指向した抗体が、内因性ＭＡＲＣＫＳタンパク質に結合し、結合を遮断すると予測される。
【００４６】  本発明の基礎をなす１つの理論に固執したくはないが、ＭＡＲＣＫＳ関連粘液分泌を増加させる化合物（例えばＭＡ−ＰＳＤペプチド、配列番号２）は、粘液分泌細胞に投与すると、細胞中の内因性タンパク質に結合しうる。これは、そうでなければＭＡＲＣＫＳタンパク質に結合し、ＭＡＲＣＫＳが粘液分泌経路の１段階を完了するのを阻害すると考えられる。カルモジュリンは、ＭＡＲＣＫＳのかかる内因性阻害剤の１つである。カルモジュリンは、ＭＡＲＣＫＳに結合し、リン酸化を防ぐ。これによって、ＭＡＲＣＫＳタンパク質が、形質膜から遊離されるのを防ぐ。本明細書に使用した「内因性ＭＡＲＣＫＳタンパク質阻害剤」は、ＭＡＲＣＫＳタンパク質に結合し、ＭＡＲＣＫＳ関連粘液分泌経路の一つの段階の完了を防ぐ、細胞中に天然に存在する化合物である。ＭＡＲＣＫＳ阻害剤に結合するペプチドまたは他の化合物は、より多くの内因性ＭＡＲＣＫＳタンパク質が、自由に粘液分泌経路で機能するようにする。従って、粘液分泌を増加させる方法は、粘液分泌細胞に、ＭＡＲＣＫＳタンパク質阻害剤に結合する化合物を投与することである。
【００４７】  多くの治療状況で、粘液の防御作用のために、ある程度の粘液分泌レベル（すなわち基礎または正常レベル）を維持することが望ましい。基礎粘膜分泌維持は、使用する活性化合物の投与量の調節により達成し得る。さらに、本発明の１つの理論に固執したくはないが、本発明者は、いくつかの粘膜では、粘液分泌基礎レベルは、ＭＡＲＣＫＳ関連経路および刺激された粘液分泌とは別の経路により維持され得ると示唆する。
【００４８】  本発明は、炎症、ウイルス、細菌、または遺伝的原因に関連した病理容態を含む多くの病理容態で生じる粘液過剰分泌を、減少または低下させることができる方法および組成物を提供する。特に、本発明の方法および組成物は、粘液分泌が、疾病の非存在下で生じる粘液分泌を超えて増加している（すなわち、基礎レベルを超えて、または正常粘液分泌レベルを超えて増加している）気道疾患を処置する方法を提供する。本発明の方法により処置する被験者は、ヒトおよび非ヒト被験者を含む。非ヒト被験者は、ネコおよびイヌなどのコンパニオンアニマル、並びに、ウシ、ウマ、ヒツジおよびブタなどの家畜を含む。
【００４９】  本発明の方法および組成物は、粘液分泌を低下させるために、または、粘液過剰分泌を阻害するために、気道上皮細胞（例えば、口、鼻、気管支）、眼上皮細胞、胃または腸上皮細胞、および生殖器路（例えば膣、頸管）の内部にある上皮細胞を含むがこれに限定されない、任意の分泌上皮または上皮細胞で使用し得る。当業者には明らかなように、被検者および処置する容態に基づき、粘液の過剰分泌を低下させつつ、基礎レベルの粘液分泌を維持することが望ましい。本明細書に使用したように、粘液分泌を低下または阻害させる処置は、かかる処置の非存在下で被検者に生じるであろう分泌粘液量に比べて、分泌粘液量を減少させる処置を意味する。
【００５０】  本発明はまた、気道上皮細胞、眼上皮細胞（角膜上皮または結膜）、胃または腸上皮細胞、および生殖器路の内部にある上皮細胞を含むがこれに限定されない、上皮細胞による粘液分泌を増加または刺激する方法および組成物を提供する。本明細書に使用したように、粘液分泌を増加、増強または刺激する処置は、かかる処置の非存在下で生じるであろう分泌粘液量と比較して、分泌粘液量を増加させる処置を意味する。特に、本発明の方法および組成物は、眼上皮細胞による（眼球乾燥の容態を処置するために）、および膣上皮細胞による（膣乾燥を処置するために）粘液の分泌を増加させるのに有用である。
【００５１】  本発明のペプチドおよび化合物は、既知のＰＫＣアクチベーターおよびプロテインキナーゼＧ（図１）に、および生理学的に関連した刺激（例えばＵＴＰ）（図２）に応答した粘液分泌を遮断する。
【００５２】  従って、本発明は、細胞または組織により分泌される粘液量を減少させることが望ましい上皮細胞または上皮組織を処置するための方法および組成物を提供する。従って、本発明はまた、細胞または組織により分泌される粘液量を増加させることが望ましい上皮細胞または上皮組織の量を処置するための方法および組成物を提供する。特に、本発明は、気道に存在する粘液量を減少させることが望ましい、または、気道に存在する粘液の量を増加させることが望ましい、呼吸器容態を処置するための方法および組成物を提供する。本発明の方法による処置に適した容態は、ヒトおよび動物炎症、ウイルスまたは細菌気道疾患（例えば喘息、慢性閉塞性肺疾患、感冒、鼻炎、急性または慢性気管支炎、肺炎、およびケンネルコフ）、アレルギー容態（アトピー、アレルギー性炎症）、気管支拡張症、およびある遺伝子容態（例えば嚢胞性線維症）を含む。
【００５３】［気道の粘液分泌］
肺の正常な粘液分泌は、吸入した外来粒子および病原体を気道から排除するのに重要な役割を果たす。粘液は、吸入粒子を捕獲し、次いで、気道から線毛作用によりまたは咳により除去する。気道での正常以上のレベルの粘液分泌（過剰分泌）は、腔内粘液蓄積をもたらし、気道閉塞および感染性因子への感受性増加が生じる。気道の分泌細胞は、粘膜下腺および表在上皮粘液細胞（杯細胞）を含む。
【００５４】  気道粘液分泌は、肺疾患の予後および臨床特徴の重要な決定因子である。気道分泌細胞（気管支腺および上皮杯細胞）の肥大または過形成あるいはそれらの両方が、慢性気道炎症に関連した容態に認められることが多い。慢性気管支炎および気管支喘息の被検者では、杯細胞過形成が観察され、コントロールに比べて、杯細胞の数が２から３倍増加している。Ｃｕｔｚら、Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２：４０７〜４２１（１９７８）、Ｇｌｙｎｎ＆Ｍｉｃｈａｅｌｓ  Ｔｈｏｒａｘ  １５：１４２〜１５３（１９６０）。気道の炎症は、周辺の組織および細胞からの化学物質メディエーターの遊離を含む複数の機序により粘液過剰分泌を誘導し得る。気道粘液過剰分泌は、特に、嚢胞性線維症、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫、および気管支喘息に圧倒的に多い臨床所見である。例えば、気道分泌、ＴａｋｉｓｈｉｍａおよびＳｈｉｍｕｒａ（編）、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．１９９４参照。過剰な気管支粘膜の存在は、呼吸器不全および細菌感染に至り得る。喘息患者の肺は、剖検時に、過剰な気管支粘液および粘液栓の存在を示すことが多い。気道粘液分泌を減少させる方法は、かかる容態の処置、並びに、細菌またはウイルス感染（例えば肺炎、インフルエンザ、および感冒）の処置に有用である。動物では、かかる方法は、ケンネルコフおよびウマＣＯＰＤの処置にさらに有用である。
【００５５】  疾病状態により、必要な場合には、様々な方法が現在、粘液分泌を減少させるために使用されている。いくつかの療法は、粘液分泌をアップレギュレートするシグナルまたは刺激を減少させるように作用する。例えば、炎症メディエーターは、粘液分泌をアップレギュレートし得る。ステロイド処置はしばしば、炎症を減少させ、従って間接的に粘液分泌を減少させる。抗ヒスタミン剤は、アレルギー性喘息発作を引き起こし得るアレルゲンに対する応答を遮断するために使用される。嚢胞性線維症患者に存在する濃化粘液は圧迫療法により除去され、濃化粘液に起因して生じる感染は、抗生物質で処置される。本発明の方法および組成物は、様々な刺激に応答した細胞性粘液分泌が、細胞レベルで直接遮断されるという点で、上記の処置とは異なる。
【００５６】［眼の粘液層］
眼の表面上の粘液層は、涙膜の維持および拡散に重要であり、眼の正常な機能に必要である。眼の表面上皮は、複数のムチン遺伝子を発現することが示されている。Ｇｉｐｓｏｎ、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４３８：２２１（１９９８）。様々な疾病および症候群は、乾性角結膜炎、スティーブンジョンソン症候群、眼の類天疱瘡、および手術または放射線誘発眼球乾燥を含む、病的「眼球乾燥」容態を引き起こす。かかる疾病において眼の表面上皮は、杯細胞減少、ムチン欠乏、および角質化を含み得る変化を受ける。眼上皮の杯細胞密度がより低くなることが、これらの症候群において記録されている。Ｒａｌｐｈ、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１４：２９９（１９７５）。
【００５７】  眼球乾燥により日常生活に不快感を引き起こす被検者に加えて、多くの個体が、被検者がコンタクトレンズを装着しようとする場合のみに困難を示し得る、「辺縁（marginal）」眼球乾燥を有する。コンタクトレンズ不耐性は、頻繁に、涙膜が不十分であることに起因する。Ｊｕｒｋｕｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｏｐｔｏｍ．Ａｓｓｏｃ．６５：７５６（１９９４）；Ｔｏｄａら、Ｂｒ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌ．８０：６０４（１９９６）。眼球乾燥の既存の処置は、トレチノイン（Ｔｓｅｎｇ、Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１５：８６０（１９８６））またはレチノイン酸（Ｄｒｉｏｔ＆Ｂｏｎｎｅ、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．３３：１９０（１９９２））の局所使用を含む。
【００５８】  眼の粘液分泌増加は、眼の粘液の欠失が眼の正常な機能に影響を及ぼす場合に望ましい。さらに、眼の粘液分泌の増加は、コンタクトレンズ装着の補助として望ましい。
【００５９】［投与］
本発明の方法は、粘膜または粘液分泌細胞による粘液分泌の産生を低下（すなわち減少または阻害）または増強（すなわち増加または刺激）するために、任意の理由から前記処置の必要な被検者に使用できる。当分野で公知の投与法を使用して、処置する表面から分泌され、または表面に保持される粘液の量を減少または増加させるために、本発明の療法を、特定の標的臓器（口腔、鼻腔、肺、胃腸管、眼および生殖器路を含むがこれに限定されない）の粘膜または粘液分泌細胞に向けることができる。粘液の変化（減少または増加）は、処置前に存在した（すなわち処置の非存在下での）粘液との、または、被検者の容態を鑑みてかかる処置をしない場合で予期されるであろう粘液との比較により評価する。
【００６０】  本発明の方法は、本発明の化合物を投与する段階前に被検者の気道から保持粘液分泌物を除去する段階を含む、他の療法または化合物と合わせて使用し得る。これにより、投与段階中での、活性物質の気道上皮への適用が容易になる。このような保持粘液分泌物の除去は、当分野で既知の任意の適切な物理的または薬学的手段により実施できる。
【００６１】  ペプチドをベースとした薬物の粘膜への送達は、Ｃｈｉｅｎ、新規薬物送達系、第４章（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、１９９２）に議論され、鼻薬物送達は、Ｃｈｉｅｎ、上記、第５章に議論されている。また、Ｃｈａｎｇら、鼻薬物送達、「制御薬物送達に関する論文」、第９章（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、１９９２）参照。皮膚を通して薬物の吸収を増強することが知られる薬剤は、Ｓｌｏａｎ、第５章、「プロドラッグ、局所および眼薬物送達」（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、１９９２）に記載されている。本発明のペプチドは、標的細胞に直接、例えばリポソームを使用して投与することができる。当業者は、過度の実験をすることなく、本発明の化合物と共に使用するために、かかる技術および他の既知の薬物送達技術を適応し得る。
【００６２】  本発明の処置方法に使用するための医薬組成物は、吸入、経口、直腸、膣、局所（頬側、皮膚および眼を含む）投与に適したものを含む。組成物は、当分野で公知の任意の方法により調製し得る。任意の場合における最も適切な投与経路は、当業者には明らかであるが、処置する組織の位置、処置する容態の性質および重度、および使用する具体的な活性化合物に依存する。気道疾患の処置のための活性化合物の投与量は、処置する容態および被検者の状態に応じて変化する。当業者は、過度の実験をすることなく、当分野で既知の用量反応研究を使用して、適切な具体的化合物の投与量を決定できる。
【００６３】  本明細書に開示した活性化合物は、任意の適切な手段により被検者の気道に投与し得るが、好ましくは、活性化合物からなる呼吸可能な粒子（この粒子を被検者が吸入する）の呼吸可能な粒子からなるエアゾールを作成することにより投与する。呼吸可能な粒子は、液体でも固体でもよい。粒子は所望により、他の治療成分を含み得る（例えば、Ｍｏｌｉｎａｙ  Ｖｅｄｉａらの米国特許第５，８４９，７０６号参照）。
【００６４】  気管支および／または肺胞の処置法で、本発明を実践するための活性化合物からなる粒子は、呼吸可能なサイズの粒子を含む。すなわち、吸入時に口腔および喉頭を通って気管支および肺の肺胞へと入るに十分に小さいサイズの粒子を含む。一般に、約０．５〜１０μｍのサイズの範囲の粒子（より特定すると、約５μｍ以下のサイズ）を使用すれば、呼吸可能である。エアゾールに含まれる呼吸不可能なサイズの粒子は、咽頭に沈着し、嚥下される傾向があり、肺胞および／または気管支の処置を目的としたエアゾール中の呼吸不可能な粒子の量は、好ましくは最小限である。鼻腔投与では、１０〜５００μの範囲の粒子サイズが、鼻腔での保持を確実とするためには好ましい。
【００６５】  エアゾールを製造するための活性化合物の液体医薬組成物は、活性化合物を、発熱物質を含まない水などの適切なビヒクルと配合することにより調製できる。
【００６６】  活性化合物の投与は、治療的または予防的に実施し得る（例えば、上記で議論したように、粘液分泌保持が生じることに起因するかなりの肺遮断が起きる前に、または、かかる分泌保持が少なくとも部分的に除去された時に実施しうる）。
【００６７】  活性化合物を含む液体粒子のエアゾールは、噴霧器を用いるなどの任意の適切な手段により作成し得る。例えば、米国特許第４，５０１，７２９号参照。噴霧器は、狭いベンチュリ開口部を通る圧縮ガス、典型的には空気または酸素の加速により、または超音波撹拌により、活性成分の溶液または懸濁液を、治療エアゾール霧に変換する市販されており、入手可能な装置である。噴霧器に使用するに適切な製剤は、液体担体、典型的には水または希釈水性アルコール溶液中の活性成分からなり、好ましくは体液と等張となっている。
【００６８】  活性化合物を含む固体粒子のエアゾールは、同様に任意の固体粒子医薬エアゾール生成器を用いて製造し得る。１つの例示的種類の固体粒子エアゾール生成器は、吸入器である。
【００６９】  経口投与に適した製剤は、離散的な状態で提示しうる。例えば、カプセル剤、カシェ剤、トローチ剤、または錠剤などの個別の単位で（各々、予め決定した量の活性化合物を含む）、散剤または顆粒剤として、水性または非水性液体中の液剤または懸濁剤として、または、水中油滴型または油中水滴型乳剤として提示し得る。かかる製剤は、活性化合物と適切な担体（これは上記したような１つまたはそれ以上の補助物質を含み得る）と合わせる段階を含む、調剤学の任意の適切な方法により調製し得る。経口投与用の製剤は、所望により、胃中での製剤の分解を防ぎ、小腸での薬物の放出する当分野で既知の腸溶性コーティングを含み得る。
【００７０】  直腸または膣投与に適した製剤は、単位投与坐剤として提示し得る。これらは、活性化合物を、１つまたはそれ以上の慣用的な固体担体、例えばココアバターと混合し、次いで、得られた混合物を成形することにより調製し得る。
【００７１】  眼、口、鼻、または他の表面への局所適用に適した製剤は、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、スプレー、エアゾール、またはオイルの形をとり得る。
【００７２】［ペプチド］
ミリストイル化アラニンリッチＣキナーゼ基質（myristoylated alanine-rich C kinase substrate）（ＭＡＲＣＫＳ）タンパク質は、プロテインキナーゼＣの主要な細胞基質である。ＭＡＲＣＫＳは、細胞、組織および発達段階に特異的な様式で調節され、ＭＡＲＣＫＳの発現は様々なサイトカインにより刺激できる。ＭＡＲＣＫＳは、ヒト、ウシ、げっ歯類および鳥類で同定されている。Ｈａｒｌａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１４３９９（１９９１）；Ｇｒａｆｆら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１４３９０（１９９１）；Ｇｒａｆｆら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．３：１９０３（１９８９）；Ｓｔｕｍｐｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：４０１２〜１６（１９８９年６月）。
【００７３】  ＭＡＲＣＫＳタンパク質に対応するペプチドは、市販のものを入手できる。ＭＡＲＣＫＳ「ｐｓｄペプチド」は、ＢＩＯＭＯＬ（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ、ペンシルバニア）から入手でき、配列ＫＫＫＫＫＲＦＳＦＫ  ＫＳＦＫＬＳＧＦＳＦＫＫＮＫＫ（配列番号２）を有する。Ｐ．Ｂｌａｃｋｓｈｅａｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１５０１（１９９３）参照。
【００７４】  本発明者は、粘液分泌に影響を及ぼすことができるＭＡＲＣＫＳタンパク質の２つの特異的な活性断片を同定した。２４アミノ酸長で、以下の配列、ミリスチン酸−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡＡＶＡ（配列番号１）を有するミリストイル化ポリペプチドを、本明細書ではミリストイル化Ｎ末端配列のＭＡＮＳペプチドと称する。このペプチドは、ヒト気道上皮細胞を含む、粘膜および粘液分泌細胞からの粘液の分泌を阻害する。本発明者のデータにより、このペプチドは、ムチン顆粒へのＭＡＲＣＫＳタンパク質の付着を遮断し、よって、細胞によるムチン顆粒の遊離および粘液分泌を遮断または阻害することが示唆される。
【００７５】  ＭＡＲＣＫＳのＰＳＤ（リン酸化）部位に対応する第二ペプチドも試験した。いくつかの濃度で、このペプチドは粘液分泌を刺激するが、他の（より高い）投与量では刺激分泌に対する効果は全くなく（図３）、さらに高い投与量は、刺激された粘液分泌を減少させることが予測される。ＰＳＤペプチド配列は、ミリスチン酸−ＫＫＫＫＫＲＦＳＦＫＫＳＦＫＬＳＧＦＳＦＫＫＮＫＫ（配列番号２）であり、本明細書ではＭＡ−ＰＳＤペプチドと称する。本発明の基礎をなす１つの理論に固執したくはないが、本発明者は、粘液分泌増加するＭＡＲＣＫＳタンパク質断片（例えばＭＡ−ＰＳＤペプチド、配列番号２）は、ＭＡＲＣＫＳのリン酸化を競合的に阻害する細胞中の内因性タンパク質に結合し、よって、形質膜から細胞内部へのＭＡＲＣＫＳの放出を阻害し得ると考える（図４参照）。１つのこのようなＭＡＲＣＫＳリン酸化阻害剤は、カルモジュリンである。本発明の目的のための他の「ＭＡＲＣＫＳ阻害剤」は、粘液分泌経路中の必要な段階を、ＭＡＲＣＫＳタンパク質が完了するのを防ぐための内因性化合物である。従って、ＭＡＲＣＫＳ阻害剤は、ＭＡＲＣＫＳのリン酸化または脱リン酸化（その各々は本発明の経路に必要である）を阻害するように作用し得るか、またはＭＡＲＣＫＳに結合して、そのムチン顆粒膜への結合を防ぎ得る。粘液の分泌を増加させる本発明の化合物は、かかる内因性阻害剤に結合し、よって、内因性ＭＡＲＣＫＳタンパク質を遊離して、粘液分泌経路を完了することにより作用し得る。
【００７６】  従って、ＭＡＲＣＫＳタンパク質のペプチド断片は、本発明の開示および当分野で既知の方法を使用して、粘液分泌を阻害または増強する能力について設計、試験および選択し得る。
【００７７】  Ｈａｒｌａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１４３９９（１９９１）（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ６８９５６）により報告された、ヒトＭＡＲＣＫＳｃＤＮＡおよびタンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、配列番号３および配列番号４として提供される。Ｓａｋａｉら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １４：１７５（１９９２）により報告された、ヒトＭＡＲＣＫＳｃＤＮＡおよびタンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、配列番号５および配列番号６として提供される。さらなる刊行物（Ｈａｒｌａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（２２）：１４３９９（１９９１）は、Ｓａｋａｉらのヌクレオチド配列とはヌクレオチド６１９番目および７２４番目において異なる、ヒトＭＡＲＣＫＳのヌクレオチド配列を提供する。この配列で、６１９位でＧはＴに置換され、７２４位でＣはＧで置換されている。ヒトおよび他のＭＡＲＣＫＳタンパク質の、さらなる対立遺伝子変異体が期待される。
【００７８】  本発明の基礎をなす単一の理論に固執したくはないが、本発明者は、気道上皮の粘液分泌でのＭＡＲＣＫＳの関与する経路は図４で示されるものであると提唱する。現在、ＭＡＲＣＫＳの活性ペプチド断片は、ＭＡＲＣＫＳと、ムチン顆粒（これは粘液の主要なタンパク質成分を含む）の相互作用のレベルでの粘液分泌に影響を及ぼすと考えられている。図４に示すように、本発明者は、ＭＡＲＣＫＳは、ムチン顆粒に結合するために脱リン酸化されなければならず、これにより、ムチンエキソサイトーシスが引き起こされ、粘液が分泌されると考える。
【００７９】  本発明の方法は、本発明のペプチドをコードする単離されたＤＮＡ分子の使用を含む。かかる単離されたＤＮＡ分子は、治療用のペプチドの産生に有用である。さらに、インビボでのペプチドの発現のための当分野で既知の方法を使用して、遺伝子療法の適切な遺伝子発現ベクターに使用し得る。インビボで治療ペプチドの発現を制御するために、細胞特異的または誘導性プロモーターをさらに使用し得る。治療効果を達成するために所望のペプチドをコードするＤＮＡを送達する方法が、例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒらの米国特許第５，５８０，８５９号および第５，７０３，０５５号に開示されている。
【００８０】  本明細書で開示した治療ペプチドの類似体は、本発明の態様である。本明細書に使用した「類似体」は、第一の化合物（a first compound）に構造が類似し、第一の化合物と類似した生理学的作用を有する、化学的化合物である。特に本発明に言及すると、ＭＡＲＣＫＳペプチド類似体は、天然ＭＡＲＣＫＳ断片の正にそのアミノ酸配列を有してはいないが、天然ＭＡＲＣＫＳ断片と同じ部位に結合できる化合物である。かかる類似体は、以下のさらに詳細に記載したように、核酸類似体を含む、ペプチドまたはペプチド類似体であり得る。
【００８１】  受容体と相互作用するタンパク質分子において、タンパク質と受容体の間の相互作用は、安定な三次元分子の表面に近づくことのできる部位で起こらなければならない。重要な結合部位残基を適切なコンフォメーションに並べることにより、ｐ２０リガンドの必須な表面特徴を模倣したペプチドを、既知の技術に従って設計および合成し得る。
【００８２】  ペプチド三次元構造およびそれに加えて類似体を決定する方法が知られており、時に、「合理的な薬物設計技術」と称する。例えば、Ｇｅｙｓｅｎの米国特許第４，８３３，０９２号、Ｎｅｓｔｏｒの米国特許第４，８５９，７６５号、Ｐａｎｔｏｌｉａｎｏの米国特許第４，８５３，８７１号、Ｂｌａｌｏｃｋの米国特許第４，８６３，８５７号参照、（出願人は、特に、本明細書に引用した全ての米国特許文献を引用することにより本明細書の一部をなすものとする）。また、Ｗａｌｄｒｏｐ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７、２８０２９（１９９０）；Ｒｏｓｓｍａｎｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３３３、３９２〜３９３（１９８８）；Ｗｅｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３３３、４２６〜４３１（１９８８）；Ｊａｍｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６０、１９３７（１９９３）（テトラペプチドリガンドの構造および機能に基づいたベンゾジアゼピンペプチド模倣化合物の開発）参照。
【００８３】  一般に、当業者は、本発明のペプチドのアミノ酸配列に、その活性に過度に有害な影響を及ぼすことなく、小さな欠失または置換を施し得ると理解する。従って、かかる欠失または置換を含むペプチドは、本発明のさらなる態様である。アミノ酸の置換または交換を含むペプチドにおいて、ペプチド配列の１つまたはそれ以上のアミノ酸が、１つまたはそれ以上の他のアミノ酸により交換されうる。ここでの交換はその配列の機能に影響を及ぼさない。かかる変化は、荷電密度、疎水性／親水性、サイズ、および立体配置などの物理的特徴におけるアミノ酸間の既知の類似性により導くことができる。よって、アミノ酸は、実質的に同じ機能的特性を有する他のアミノ酸で置換される。例えば、Ａｌａは、ＶａｌまたはＳｅｒと交換し得る。Ｖａｌは、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ＭｅｔまたはＴｉｅと、好ましくはＡｌａまたはＬｅｕと交換し得る。Ｌｅｕは、Ａｌａ、ＶａｌまたはＩｌｅと、好ましくはＶａｌまたはＩｌｅと交換し得る。Ｇｌｙは、ＰｒｏまたはＣｙｓと、好ましくはＰｒｏと交換し得る。Ｐｒｏは、Ｇｌｙ、ＣｙＳ、ＳｅｒまたはＭｅｔと、好ましくはＧｌｙ、Ｃｙｓ、またはＳｅｒと交換し得る。Ｃｙｓは、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、またはＭｅｔと、好ましくはＰｒｏまたはＭｅｔと交換し得る。Ｍｅｔは、ＰｒｏまたはＣｙｓと、好ましくはＣｙｓと交換し得る。Ｈｉｓは、ＰｈｅまたはＧｌｎと、好ましくはＰｈｅと交換し得る。Ｐｈｅは、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、またはＴｒｐと、好ましくはＨｉｓまたはＴｙｒと交換し得る。Ｔｙｒは、Ｈｉｓ、ＰｈｅまたはＴｒｐと、好ましくはＰｈｅまたはＴｒｐと交換し得る。Ｔｒｐは、ＰｈｅまたはＴｙｒと、好ましくはＴｙｒと交換し得る。Ａｓｎは、ＧｌｎまたはＳｅｒと、好ましくはＧｌｎと交換し得る。Ｇｌｎは、Ｈｉｓ、ＬｙＳ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、またはＳｅｒと、好ましくはＡｓｎまたはＳｅｒと交換し得る。Ｓｅｒは、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、ＣｙｓまたはＡｌａと交換し得る。Ｔｈｒは、ＧｌｎまたはＳｅｒと、好ましくはＳｅｒと交換し得る。Ｌｙｓは、ＧｌｎまたはＡｒｇと交換し得る。Ａｒｇは、Ｌｙｓ、ＡｓｐまたはＧｌｕと、好ましくはＬｙｓまたはＡｓｐと交換し得る。Ａｓｐは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、またはＧｌｕと、好ましくはＡｒｇまたはＧｌｕと交換し得る。そして、Ｇｌｕは、ＡｒｇまたはＡｓｐと、好ましくはＡｓｐと交換し得る。一旦作成すると、変化を、酵素を用いて機能に対するその効果を決定するために慣用的にスクリーニングできる。
【００８４】  本発明のペプチドの非ペプチド模倣体も本発明の態様である。非タンパク質薬物設計を、本明細書に開示した天然ＭＡＲＣＫＳ断片の結合する部位に結合する非ペプチド性有機分子を設計するために、コンピューターグラフィックモデリングを使用して実施し得る。例えば、Ｋｎｉｇｈｔ、ＢＩＯ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８、１０５（１９９０）参照。Ｉｔｚｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３６３、４１８（１９９３）；ＬａｍらＳｃｉｅｎｃｅ、２６３、３８０（１９９４年１月）（ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤として機能する生体利用可能な非ペプチド環式尿素の合理的設計）。類似体はまた、分子ライブラリーを作成し、特定の標的のリガンドとして作用する分子を選択し、そして、選択したリガンドを同定および増幅することにより開発し得る。例えば、Ｋｏｈｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６０、１９３４（１９９３）参照。ある受容体タンパク質に特異的に結合するものを同定するために、オリゴマー生体分子の組合せライブラリーを作成およびスクリーニングする技術は既知である。適切なオリゴマーは、ペプチド、オリゴヌクレオチド、炭水化物、非オリゴヌクレオチド（例えばホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、Ｃｈｅｉｎ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｅｗｓ、２０項、１９９４年２月７日参照）および非ペプチドポリマー（例えば、Ｓｉｍｏｎらの「ペプトイド」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．ＵＳＡ、８９、９３６７（１９９２）参照）を含む。また、Ｓｃｈａｔｚの米国特許第５，２７０，１７０号、ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９、３８６〜３９０（１９９０）、Ｄｅｖｌｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９、４０４〜４０６（１９９０）、Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎ、ＢＩＯ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１、２８５（１９９３）参照。ペプチドライブラリーは、固相支持体上で合成しても、バクテリオファージウイルスの表面上で発現させてもよい（ファージディスプレイライブラリー）。当業者は既知のスクリーニング法を使用して、適切なペプチド類似体を同定するために組合せライブラリーをスクリーニングし得る。所望の活性を有する分子を選択するために合成分子をスクリーニングするための、および、選択した活性分子を同定し得るようにライブラリーメンバーを標識するための技術は既知である。例えば、ＢｒｅｎｎｅｒおよびＬｅｒｎｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９、５３８１（１９９２）、ＢｅｒｇｅｒらのＰＣＴ  Ｕ５９３／０６９４８、Ｓｉｍｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９、９３６７、（１９９２）、Ｆｉｅｌｄｓらの米国特許第５，２８３，１７３号参照。
【００８５】  本明細書に使用した「組合せライブラリー」は、特定の標的のリガンドとして活性について同時にスクリーニングできる、様々な配列の多様なオリゴマー生体分子の集合を意味する。組合せライブラリーはまた、「形状ライブラリー」、すなわちリガンドである可能性がある無作為ポリマーの個体群と称され得る。その分子の形状は、ファンデルワールス力、疎水性、静電力および動力学を含む、それと他の分子との相互作用を支配する分子の特徴を意味する。
【００８６】  核酸分子はまた、受容体タンパク質のリガンドとして作用し得る。例えば、Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎ、ＢＩＯ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１、２８５（１９９３）参照。ＧｏｌｄおよびＴｕｅｒｋの米国特許第５，２７０，１６３号は、無作為な配列を有するＲＮＡ分子ライブラリーから、標的分子に特異的に結合する分子を選択することにより、ある標的分子の核酸リガンドを同定する方法を記載する。特異的ペプチドと免疫的に交差反応するＲＮＡ分子のインビトロでの選択法が、Ｔｓａｉ、ＫｅｎａｎおよびＫｅｅｎｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９、８８６４（１９９２）およびＴｓａｉおよびＫｅｅｎｅ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１５０、１１３７（１９９３）に開示されている。
【００８７】［アンチセンスオリゴヌクレオチド］
本発明者はさらに、ＭＡＲＣＫＳｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ヒト気道上皮細胞の粘液分泌を減少（阻害）させることを実証した。
（実施例６および図５参照）。
【００８８】  特異的なＲＮＡ類に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、タンパク質類として細胞遺伝子の発現を阻害できることが実証された。ＥｒｉｃｋｓｏｎおよびＩｚａｎｔ、遺伝子調節：アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡの生物学、第１巻、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９２参照。例えば、正常な遺伝子と１ヌクレオチド異なるｐ２１遺伝子の選択的阻害が報告されている。Ｃｈａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９１、３０：８２８３〜８２８６。アンチセンスオリゴヌクレオチドが遺伝子発現を阻害する機序を説明するために多くの仮説が提唱されているが、関与する具体的機序は、試験する細胞型、標的化されたＲＮＡ、標的化されたＲＮＡ上の具体的部位、およびオリゴヌクレオチドの化学的性質に依存し得る。Ｃｈｉａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１、２６６：１８１６２〜１８１７１；ＳｔｅｉｎおよびＣｏｈｅｎ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９８８、４８：２６５９〜２６６８。
【００８９】  本発明は、粘液分泌細胞に内因的に生じる、ＭＡＲＣＫＳタンパク質ヌクレオチド配列に実質的に相補的なオリゴヌクレオチドを提供する。かかるオリゴヌクレオチドは、それらが送達される細胞による粘液産生を減少させるのに有用である。「ヌクレオチド配列」とは、一連の連結したヌクレオチド単位から形成されたポリヌクレオチドを意味する。本明細書に使用した「実質的に相補的」なる語は、生理的条件下でのストランド間のハイブリダイゼーションを可能とし、オリゴヌクレオチドがＭＡＲＣＫＳ遺伝子の発現を阻害できる程度の、オリゴヌクレオチドとＭＡＲＣＫＳ遺伝子ヌクレオチド配列の間の相補的な配列の量を意味する。ストランド間ハイブリダイゼーションは、オリゴヌクレオチドとＭＡＲＣＫＳヌクレオチド配列の間の相互作用である。安定なストランド間のハイブリッド形成能は、当業者により、例えば数学的モデリングまたは経験的解析によるハイブリッドの融解温度の決定、または固相支持体核酸ハイブリダイゼーションなどの、当分野で既知の方法を使用して決定できる。（例えば、ＭａｒｍｕｒおよびＤｏｔｙ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６２、５、１１３参照）。
【００９０】  本発明に使用したアンチセンスＤＮＡは、対応するアンチセンスＲＮＡを産生できる。アンチセンスＲＮＡ分子は、発現の逆（reverse）または反対（opposite）の順のヌクレオチド塩基を有する。かかるアンチセンスＲＮＡは当分野で公知であり、例えば、Ｃａｌｇｅｎｅ  Ｉｎｃの米国特許第４，８０１，５４０号参照。
【００９１】  本明細書に使用した「ＭＡＲＣＫＳヌクレオチド配列」なる語は、ＭＡＲＣＫＳタンパク質をコードする遺伝子から得られた任意のヌクレオチド配列を意味し、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列、遺伝子のＤＮＡ配列、任意の転写されたＲＮＡ配列、プレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ転写物のＲＮＡ配列、およびタンパク質に結合したＤＮＡまたはＲＮＡを含む。
【００９２】  ＭＡＲＣＫＳ遺伝子の配列に標的化したオリゴヌクレオチドを使用して、上皮細胞の粘液産生を阻害できる。オリゴヌクレオチドは、生理的条件下で内因性ＭＡＲＣＫＳヌクレオチド配列と安定なハイブリッドを形成できる任意の長さの配列であり得る。オリゴヌクレオチド長は、５〜２００ヌクレオチドであることが好ましい。オリゴヌクレオチドは１０〜５０ヌクレオチド長であることがより好ましい。オリゴヌクレオチドは１５〜２５ヌクレオチド長であることが最も好ましい。
【００９３】  オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、天然および合成部分を含む当分野で既知の任意のものであり得る。本明細書に使用した「オリゴヌクレオチド」なる語は、連結したヌクレオチドから形成されたポリヌクレオチドを意味する。さらに、「オリゴヌクレオチド」なる語は、生物系でより安定となるように、または標的配列により強固に結合するように、オリゴヌクレオチド上に特殊な性質を付与するように設計された、天然サブユニットまたは類似体サブユニットから形成された天然オリゴヌクレオチドまたは合成オリゴヌクレオチドを含む。それはまた、それらのヌクレオチドを、細胞または核および他の細胞区分への送達を増強する他の化合物に化学的に結合するなどのオリゴヌクレオチドの修飾を含む。本発明のオリゴヌクレオチドは、合成化学法を含む、当分野で既知の任意の方法により合成し得る。例えば、ＶｕおよびＨｉｒｓｃｈｂｅｉｎ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９１、３２：３０００５〜３０００８参照。オリゴヌクレオチドは、リポソームへの封入、またはステロイド、抗体、および細胞受容体への化学的結合を含む当業者に既知の化学的な方法によって修飾し得る。
【００９４】  本発明の好ましい実施形態は、処置する細胞に見られる内因性ＭＡＲＣＫＳヌクレオチド配列に相補的であるか、または、オリゴヌクレオチドと内因性ＭＡＲＣＫＳヌクレオチドの間の安定なストランド間のハイブリダイゼーションを可能とするのに十分な相補性を有する、そして、ＭＡＲＣＫＳ遺伝子の発現を阻害するオリゴヌクレオチドである。好ましいオリゴヌクレオチドは、哺乳動物、特にヒトから得られた、または選択された、ＭＡＲＣＫＳヌクレオチド配列に相補的なものである。
【００９５】  本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾されたオリゴデオキシヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオチドを含む、オリゴデオキシリボヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオチドであり得る。さらに、本発明のオリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの組合せを含んでなり得る。さらに、本発明のオリゴヌクレオチドはまた修飾されたサブユニットも含み得る。例えば、本発明は、ホスホロチオエートオリゴデオキシリボヌクレオチドを含み得る。本発明のオリゴヌクレオチドは、安定性を増加させ、細胞内および細胞外分解を防ぐために修飾を施すことが好ましい。本発明のオリゴヌクレオチドは、標的配列へのその親和性、および医薬的に活性な形で哺乳動物に送達される場合の、適切な細胞および細胞区分への輸送を増加させるために修飾することが好ましい。
【００９６】  本発明のオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドであることが好ましい。本発明のオリゴヌクレオチドは、ＭＡＲＣＫＳの非コード部分に標的化されても、遺伝子のコード配列に標的化されてもよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、イントロンエキソン接合部を含み得る（すなわち、イントロンエキソン接合部のいずれかまたは両側に数個のヌクレオチド）。
【００９７】  本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドと処置する被検者の標的組織または細胞の接触をもたらす任意の方法により投与し得る。例えば、経口投与、局所投与、および吸入を含むがこれに限定されない。オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、固体投与形、例えばカプセル剤、錠剤および散剤、または液体投与形、例えばエリキシル剤、シロップ剤、および懸濁剤であり得る。投与する投与量は、薬力学特徴、その投与形態および経路、レシピエントの年齢、健康および体重、症状の性質および程度、併用処置の種類、および処置頻度および所望の効果などの因子に応じて変化する。効果的な投与量は、粘液産生に関連した症状または容態を軽減、減少または消失させるレベルで、気道の粘液産生を阻害できるものである。
【００９８】  オリゴヌクレオチドは、単独で、または本発明の他の化合物、他の医薬化合物、または治療法と組合せて投与し得る。オリゴヌクレオチドは、好ましくは、選択した投与経路および標準的な医薬慣行に基づいて選択した医薬的に許容される担体または希釈剤と共に投与する。
【００９９】  上皮分泌細胞のＭＡＲＣＫＳタンパク質機能阻害による、粘液分泌阻害は、本発明の中心である。この目標を達成するために、本発明は、粘液分泌細胞を、ＭＡＲＣＫＳ遺伝子発現阻害量の内因性ＭＡＲＣＫＳ遺伝子ヌクレオチド配列に実質的に相補的なオリゴヌクレオチドと接触させることを含む、粘液分泌阻害法を提供する。本発明はまた、接触段階が、オリゴヌクレオチドの担体としてのリポフェクチン（lipofectin）を含む方法を含んでなる。本発明のオリゴヌクレオチドは、哺乳動物または鳥類、好ましくはヒトに、標的組織または臓器の粘液産生を阻害または減少するのに効果的な治療に有効な量または濃度で投与する。
【０１００】  本発明のオリゴヌクレオチドは、その細胞内の標的に到達して、そこでＭＡＲＣＫＳタンパク質の発現を阻害または減少させることができる。それ故、本発明は、ＭＡＲＣＫＳ遺伝子発現組織の少なくとも１つのエレメントを、遺伝子発現を阻害する量のオリゴヌクレオチドと接触させることを含む、粘液分泌を阻害する方法を提供する。本発明の目的のために、遺伝子発現組織のエレメントは、ＭＡＲＣＫＳ遺伝子の任意のヌクレオチド配列、遺伝子から転写されたスプライシングされたｍＲＮＡのヌクレオチド配列、遺伝子から転写されたスプライシングされていないＲＮＡおよび部分的にスプライシングされたＲＮＡ、活発に転写している遺伝子などの遺伝子から得られた配列を含むＤＮＡとＲＮＡのハイブリッド、タンパク質に結合した遺伝子から転写されたＲＮＡ、および、遺伝子発現に関与する当分野で既知の任意の分子または構造を含み得る。
【０１０１】  Ｄｅｂｓらの米国特許第５，８５８，７８４号は、噴霧に適したリポソーム−核酸混合物を調製し、混合物を噴霧化し、そして被検者の肺に得られた噴霧化混合物を沈着することにより、被検者の肺細胞に核酸を投与する方法を提供する。核酸配列は、治療効果に直接的にまたは間接的に関与するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、またはアンチセンス配列およびリボザイムなどの活性ヌクレオチド配列を含み得る。核酸構築物は、発現カセットとして被検者の細胞に提供できる。好ましくは、構築物は、宿主細胞ゲノムに取り込まれず、組込まれていない発現ベクターの一部として宿主に導入される（本明細書に引用した全ての米国特許の開示を、本明細書にその全体を取込むものとする）。
【０１０２】  二本鎖ＲＮＡおよびリボザイム
外来性二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の導入は、おそらく転写後の作用により、相同的な配列を含む遺伝子の活性を特異的に破壊し得ることが近年示された。Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１５５０２（１９９８）；Ｎｇｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１４６８７（１９９８）。従って、本発明の方法は、外来性ｄｓＲＮＡを粘液分泌細胞に導入することにより実施しうる。ここで、ｄｓＲＮＡは、内因性ＭＡＲＣＫＳ遺伝子のＲＮＡに十分な配列の類似性を有し、よって細胞中のＭＡＲＣＫＳタンパク質は減少する（外来ｄｓＲＮＡの非存在下で生じるであろうものと比べて）。
【０１０３】  ｄｓＲＮＡの投与は、ペプチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド投与に関して上記で議論した方法を使用して実施し得る。
【０１０４】  本発明の別の実施形態において、酵素ＲＮＡ分子（リボザイム）をコードするＤＮＡを標的細胞に導入し得る。リボザイムは、細胞の内因性ＭＡＲＣＫＳタンパク質のｍＲＮＡ転写物に対するものであり、それを切断する。酵素ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡは、既知の技術に従って産生し得る（例えば、米国特許第４，９８７，０７１号参照）。かかる酵素ＲＮＡ分子の産生およびＭＡＲＣＫＳタンパク質産生崩壊は、アンチセンスＲＮＡ分子の産生と同じ様式で、標的細胞による粘液産生に影響を及ぼす。
【０１０５】［スクリーニング法］
本発明はまた、粘液産生に影響を及ぼす（増強または阻害する）その能力について化合物をスクリーニングする方法を提供する。当分野で既知のコンビナトリアルケミストリーのプロセスを使用して、多くの構造的に多様な化合物を作成することができ、次いでこれをスクリーニングできる。かかるスクリーニング法は、本明細書の実施例１に記載した正常ヒト気管支上皮細胞の培養液などの、粘液分泌細胞培養液を提供することを含む。試験化合物を細胞に投与し、細胞を、粘液産生を刺激することが知られる化合物（例えばＰＭＡ、ＵＴＰ、８−ブロモ−ｃＧＭＰ）に曝露し得る。試験化合物および刺激化合物を、例えば、化合物を含む培地に細胞を曝露することにより、細胞に投与し得る。細胞は、例えば、最初に試験化合物と共にプレインキュベートし、次いで、刺激化合物と試験化合物と共にインキュベートし得る。あるいは、プレインキュベート段階を省略してもよい。試験化合物がムチン顆粒膜（またはムチン顆粒膜関連受容体）、または、ムチン顆粒膜結合部位での内因性ＭＡＲＣＫＳタンパク質に結合する能力を、試験化合物がムチン顆粒への内因性ＭＡＲＣＫＳの結合を阻害するかどうかを検出することにより評価する。かかる検出は、例えば、検出可能な分子で試験化合物を標識することにより、当分野で既知の方法を使用して実施し得る。
【０１０６】  分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的および視覚的手段により検出可能な分子は既知である。眼で検出可能な分子は、蛍光標識（フルオレセイン、テキサスレッド、緑蛍光タンパク質）を含む。生菌細胞を見る方法は既知であり、リアルタイム共焦点レーザー走査顕微鏡および二光子励起レーザー走査顕微鏡を含む。
【０１０７】  細胞により分泌された粘液はまた、例えば当分野で既知のＥＬＩＳＡアッセイを使用して、予め決定した時間の後に測定し得る。試験化合物に曝露された細胞の粘液分泌はまた、試験化合物に曝露されていないコントロール細胞の粘液分泌と比較し得る。コントロール細胞と比べた試験細胞による粘液分泌の減少は、試験化合物が粘液分泌を阻害することを示し、コントロール細胞と比べた試験細胞による粘液分泌の増加は、試験化合物が粘液分泌を増強することを示す。
【０１０８】  以下の実施例は、本発明をより完全に説明するために提供されるものであり、本発明を限定すると捉えるべきではない。
【０１０９】［実施例１］
［インビトロでの粘液分泌の評価］
［細胞培養系：増殖および細胞凍結保存］
一次正常ヒト気管支上皮（ＮＨＢＥ）細胞（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社製、サンディエゴ、ＣＡ）を、２５ｎｇ／ｍｌのヒト組換え上皮増殖因子（ＥＧＦ社製、インターゲン、Ｐｕｒｃｈａｓｅ、ＮＹ）、６５ｎｇ／ｍｌのウシ下垂体抽出物（Ｂｅｒｔｏｌｅｒｏらの方法により調製、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  １５５：６４、１９８４）、５×１０-8Ｍのオールトランスのレチノイン酸、１．５μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ社製、Ｐｕｒｃｈａｓｅ、ＮＹ）、２０ＩＵ／ｍｌのナイスタチン（ギブコ社製、グランドアイランド、ＮＹ）、０．５μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、５μｇ／ｍｌのインシュリン、１０μｇ／ｍｌのトランスフェリン、０．５μｇ／ｍｌのエピネフリン、６．５ｎｇ／ｍｌのトリヨードサイロニン、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、および５０μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社製、サンディエゴ、ＣＡ）を含む、気管支上皮基礎培地（ＢＥＢＭ社製、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ、サンディエゴ、ＣＡ）中の半密閉Ｔ７５組織培養フラスコ（５００細胞／ｃｍ2）に接種した。一旦集密となった後、培養液をトリプシン／ＥＤＴＡで解離し、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社の方法に従って第２継代として凍結した。
【０１１０】［ＮＨＢＥ細胞の空気と液体との界面での培養］
増殖の後に、ＮＨＢＥ細胞を、Ｇｒａｙおよび共同研究者の方法を少し変更した方法に従って、空気／液体界面中で培養した（Ｇｒａｙら、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １４：１０４、１９９６）。空気液体界面培養は、ラット尾コラーゲンＩ型（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ製、ベッドフォード、ＭＡ）で薄く覆膜したトランスウェルクリアカルチャーインサート（２４．５ｍｍ、０．４５μｍの孔サイズ、Ｃｏｓｔａｒ社製、ケンブリッジ、ＭＡ）上にＮＨＢＥ細胞（第２継代、２×１０4細胞／ｃｍ2）を接種することにより開始した。細胞を、ＥＧＦ（０．５ｎｇ／ｍｌ）を除き上記したのと同じ捕捉物を含む気管支上皮細胞増殖培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社製、サンディエゴ、ＣＡ）：高グルコースを含むダルベッコ修飾イーグルス培地（ＢＥＧＭ：ＤＭＥＭ−Ｈ）の１：１混合物に７０％集密度（５〜７日間）となるまで液内培養した。培養物が７０％集密性となると、空気液体界面を、頂端培地を除去することにより創製し、基礎培地（ＢＥＧＭ：ＤＭＥＭ−Ｈ）をその後毎日交換した。次いで、細胞を空気液体界面中でさらに１４日間、培養液中で計２１日間培養した。
【０１１１】［粘液ＥＬＩＳＡ］
アクチベーターによる刺激後にインビトロで気道上皮細胞から分泌された粘液を、ＥＬＩＳＡ（抗体捕捉法）を使用して評価し（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ、Ｄ．Ｌａｎｅ、「抗体：実験マニュアル」ニューヨーク：コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、１９８８）、ここで、集めた粘液は、ＥＬＩＳＡプレートに直接結合している。粘液を、サル気道粘液に対して生じた抗体を使用して検出した（Ｌｉｎら、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １：４１、１９８９）。
【０１１２】［実施例２］
［ヒト気管支上皮細胞のＭＡＲＣＫＳｍＲＮＡ］
ＭＡＲＣＫＳメッセンジャーＲＮＡを、放射標識プローブとしてヒトＭＡＲＣＫＳｃＤＮＡ（約１ｋｂ）を使用して、ノザン解析（Ａｕｓｕｂｅｌら編、「分子生物学の現在のプロトコル」、ニューヨーク：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９２）により空気／液体界面培養液中で増殖したヒト気管支上皮細胞中に検出した。これらの細胞を空気／液体界面培養液中で維持する場合、より分化してくると、ＭＡＲＣＫＳメッセージは増加する。
【０１１３】  これらの細胞中のＭＡＲＣＫＳタンパク質を検出するために、細胞を培地中で１６時間、3Ｈ−ミリスチン酸（ＭＡＲＣＫＳはミリストイル化されている）で標識した。細胞を溶解し、ＭＡＲＣＫＳタンパク質を、Ｓｐｉｚｚ＆Ｂｌａｃｋｓｈｅａｒ（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１：５５３、１９９６）の方法に従って、モノクローナル抗体２Ｆ１２（Ｂｌａｃｋｓｈｅａｒ実験室から贈呈）を使用して免疫沈降した。
【０１１４】  気道上皮細胞内のＭＡＲＣＫＳは、ＰＫＣアクチベーターのＰＭＡ（１００ｎＭ）によりリン酸化されることが判明したが、４α−ＰＭＡ（ＰＫＣを活性化しないホルボールエステルコントロール）は、ＭＡＲＣＫＳをリン酸化しなかった。ＰＭＡによるＭＡＲＣＫＳのリン酸化は、カルフォスチンＣ（５００ｎＭ）により減弱した。ＮＨＢＥ細胞はまた、かなりの量のｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ１α型（ＰＫＧ−１α）活性を含み、これは細胞質画分に局在化していた。細胞は構成性ＰＫＧ活性を示し、これは１００μＭのジブチリルｃＧＭＰとのインキュベートにより増加した。さらに、ＰＭＡにより誘導されたＭＡＲＣＫＳのリン酸化は、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ（１０μＭ）とのインキュベートにより反応が逆転した。オカダ酸（５００ｎＭ）はこの効果を阻害した。これらの結果により、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰは、ＭＡＲＣＫＳを脱リン酸化するホスファターゼ（１または２Ａ型）を阻害することが示される。
【０１１５】［実施例３］
［ペプチドＭＡＮＳによるムチン分泌の遮断］
粘液分泌に対する、ヒトＭＡＲＣＫＳタンパク質の最初の２４アミノ酸を含むミリストイル化ペプチド（ＭＡＮＳとは、ミリストイル化Ｎ末端配列。配列番号１）の効果を試験した。上記の培養正常ヒト気管支上皮細胞を使用した。試験細胞を、１、１０または１００μＭのＭＡＮＳペプチドを含む頂端（apical）および基底側（basolateral）培地中で１５分間共インキュベートし、次いで、ペプチドおよび１００ｎＭのＰＭＡと１μＭの８−Ｂｒ−ｃＧＭＰと共に１５分間共インキュベートした（図１Ａの３〜５列目）。コントロール細胞は、ＭＡＮＳペプチドに曝露されなかったが、培地のみで（図１Ａの１列目）またはＰＭＡおよび８−Ｂｒ−ｃＧＭＰを含む培地中で（図１Ａの２列目）プレインキュベートした。アスタリスク１つ（＊）は、応答が、培地コントロール（１列目）とは統計学的に異なることを示し、アスタリスク２つ（＊＊）は、応答が、ＭＡＮＳペプチドに曝露されていない刺激細胞で観察されたもの（２列目）と統計学的に異なることを示す。
【０１１６】  ＰＭＡおよび８−Ｂｒ−ｃＧＭＰによる刺激は、コントロールレベルに比べ、粘液分泌において少なくとも１００％の増加を引き起こした。しかし、この増加は、ＭＡＮＳペプチドとのプレおよび共インキュベートにより遮断された。１０μＭのペプチドを使用すると、分泌粘液のレベルはコントロール値まで下降し、分泌粘液のレベルは、１００μＭのＭＡＮＳペプチドと共にインキュベートした後にコントロール値よりかなり下であった（図１Ａ）。
【０１１７】  ＭＡＮＳペプチド（１００μＭ）はまた、１時間のインキュベートにより構成性（constitutive）（基礎）粘液分泌を減少させることが判明した。細胞を、ＰＭＡまたは８−Ｂｒ−ｃＧＭＰを使用しないことを除き、上記の通りに処理した。さらに、無作為な順のＭＡＮＳペプチドと同じアミノ酸組成のネガティブコントロールペプチド（ＲＮＳは無作為なＮ末端配列を表す）は、構成性粘液分泌に影響を及ぼさなかった。結果を図１Ｂにグラフで示す。アスタリスク１つ（＊）は、応答が、培地コントロール（１列目）と統計学的に異なることを示す。
【０１１８】［実施例４］
［ＵＴＰ誘導ムチン分泌は、ペプチドＭＡＮＳにより遮断される］
これらの実験は、実施例３に記載したのと同じように実施した。刺激分泌について試験するために、細胞を、培地中０．１ｍＭの濃度で、ウリジン５'−三リン酸（ＵＴＰ）に頂端および基底側に曝露した。細胞を、１５分間、ＭＡＮＳペプチドと共にプレインキュベートし、次いで、試験培養液をＭＡＮＳペプチドおよびＵＴＰと共に４５分間共インキュベートした。
【０１１９】  結果を図２に示す。ここで、１列目は培地／コントロールであり、２列目＝０．１ｍＭのＵＴＰ、３列目＝０．１ｍＭのＵＴＰおよび１μＭのＭＡＮＳペプチド、４列目＝０．１ｍＭのＵＴＰおよび１０μＭのＭＡＮＳペプチド、および５列目＝０．１ｍＭのＵＴＰおよび１００μＭのＭＡＮＳペプチドである。アスタリスク１つ（＊）は、測定した応答が、培地コントロール（１列目）とは統計学的に異なることを示し、アスタリスク２つ（＊＊）は、応答が、ＭＡＮＳペプチドに曝露されていない刺激細胞で観察されたもの（２列目）と統計学的に異なることを示す。１０μＭおよび１００μＭのＭＡＮＳペプチドは、有意にＵＴＰに刺激された粘液分泌を減少させた。
【０１２０】［実施例５］
［ムチン分泌に対するＭＡ−ＰＳＤペプチドの効果］
これらの実験を、上記したようにインビトロで正常ヒト気管支上皮細胞を使用して実施した。ＭＡＲＣＫＳの２５個のアミノ酸リン酸化部位ドメインからなるミリストイル化ペプチド（ＭＡ−ＰＳＤペプチド、配列番号２）を調製した。試験細胞を、１５分間、ＭＡ−ＰＳＤペプチド（１、１０または１００μＭ）を含む頂端および基底側培地中でプレインキュベートし、次いで、ペプチドおよび刺激物質（１００ｎＭのＰＭＡと１μＭの８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ）と共インキュベートした。コントロール細胞を、培地中のみで（図３Ａの１列目）、または１００ｎＭのＰＭＡのみと（２列目）、または、１００ｎＭのＰＭＡおよび１μＭの８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ（３列目）と共にプレインキュベートした。
【０１２１】  ＰＭＡおよび８−Ｂｒ−ｃＧＭＰによる刺激は、コントロールレベルよりも、粘液分泌において約１００％の増加を引き起こした。この増加は、１または１０μＭのＭＡ−ＰＳＤペプチドとのプレおよび共インキュベートにより、用量依存的に増大した。興味深いことに、粘液分泌の刺激レベルは、１００μＭのペプチドの存在により影響を受けなかった。結果を図３Ａにグラフで示す。ＭＡＮＳペプチド（１、１０および１００μＭ）を使用した結果を、比較のために７〜９列目に提供する。アスタリスク１つ（＊）は、測定した応答が、培地コントロール（１列目）とは統計学的に異なることを示し、アスタリスク２つ（＊＊）は、応答が、ペプチドに曝露されなかった刺激細胞で観察されたもの（３列目）と統計学的に異なることを示す。
【０１２２】  基礎ムチン分泌に対するＭＡ−ＰＳＤペプチド（１、１０および１００μＭ）の効果も測定した。上記の細胞を、ＭＡ−ＰＳＤペプチド（ＰＭＡまたは８−Ｂｒ−ｃＧＭＰを含まない）と共に１時間インキュベートした。結果を図３Ｂにグラフで示す。アスタリスク１つ（＊）は、１００μＭのＭＡ−ＰＳＤペプチドに対する応答が、培地コントロール（１列目）とは統計学的に異なることを示し、一方、１または１０μＭのペプチドを使用した場合には（３列目および４列目）統計学的有意差は見られなかった。
【０１２３】［実施例６］
［アンチセンスオリゴヌクレオチドによる粘液分泌阻害］
内因性ヒトＭＡＲＣＫＳ遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、粘液分泌がインビトロでヒト気道上皮細胞において阻害された。実施例１に記載のインビトロアッセイ系を使用して、ＭＡＲＣＫＳｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を試験した。
【０１２４】  アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳａｋａｉらのヒトＭＡＲＣＫＳ遺伝子配列（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １４：１７５（１９９２）；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｄ１０５２２、Ｄ９０４９８）に基づき、業者（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ；Ｂｉｏｇｎｏｓｔｉｋ  ＧｍｂＨ、ゲッティンゲン、ドイツと共に）により作成された。コントロールオリゴヌクレオチドも作成された。
【０１２５】  オリゴヌクレオチドは、３日間、オリゴヌクレオチド（５μＭ）を含む培地中でインキュベートすることにより、分化気道上皮培養液に投与した。オリゴヌクレオチドは、リポフェクチン試薬（２μｇ／ｍｌ、ギブコＢＲＬ社製）を含む０．４ｍｌ培地中の細胞の頂端表面に加えた。細胞を、２４時間、リポフェクチンの存在下で、オリゴヌクレオチドと共にインキュベートした。培地を交換した後、細胞を、オリゴヌクレオチドのみと共に、さらに４８時間インキュベートした。オリゴヌクレオチドが刺激粘膜分泌に影響を及ぼす能力について試験するために、試験細胞を、１５分間、１００ｎＭのＰＭＡおよび１μＭの８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ（それぞれＰＫＣおよびＰＫＧのアクチベーター）で刺激した。
【０１２６】  結果を図５に示す。ここで、１列目＝培地／コントロール、２列目＝ＰＭＡおよび８−Ｂｒ−ｃＧＭＰで刺激した細胞、３列目＝５μＭのコントロールオリゴヌクレオチドに曝露し、ＰＭＡおよび８−Ｂｒ−ｃＧＭＰで刺激した細胞、および４列目＝５μＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドに曝露し、ＰＭＡおよび８−Ｂｒ−ｃＧＭＰで刺激した細胞である。アスタリスク１つ（＊）は、測定した応答が、培地コントロール（１列目）とは統計学的に異なることを示し、アスタリスク２つ（＊＊）は、応答が、オリゴヌクレオチドに曝露されていない刺激細胞で観察されたもの（２列目）と統計学的に異なることを示す。
【０１２７】  ＰＫＣおよびＰＫＧアクチベーターによる刺激後に気道上皮細胞から分泌された粘液を、ＥＬＩＳＡ（抗体捕獲法）を使用して評価した。コントロールオリゴヌクレオチド（３列目）は、刺激された粘液分泌に対する効果は全くなかった。これに対し、アンチセンスオリゴヌクレオチド（４列目）は、刺激レベルに比べて、粘液分泌において統計学的に有意な減少を引き起こした。
【０１２８】  これらの結果により、ＭＡＲＣＫＳアンチセンスオリゴヌクレオチドは、刺激された粘液分泌を阻害するが、粘液分泌基礎レベルは、適切な投与量の選択により維持できることが示される。これに対し、コントロールオリゴヌクレオチドは、刺激分泌に対して効果は全くなかった。
【０１２９】［実施例７］
［ＴＮＦ−αは、ＭＡＲＣＫＳ発現をアップレギュレートし、ムチン過剰分泌を増大させる］
ＮＨＢＥ細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのヒト組換えＴＮＦ−αまたは培地のみと共に、４時間インキュベートし、次いで、ＰＭＡ（１００ｎＭ）＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ（１μＭ）で１５分間、またはＵＴＰ（０．１ｍＭ）で２時間刺激した。分泌されたムチンを集め、ＥＬＩＳＡにより測定した。全ＲＮＡおよびタンパク質を処理した細胞から単離した。ＭＡＲＣＫＳｍＲＮＡを、ノザンハイブリダイゼーションにより、タンパク質をウェスタンブロットにより評価した。結果を図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃに示す。
【０１３０】  図６Ａに示したノザンブロットおよびグラフは、培地のみと共にインキュベートした細胞と比べて（ブロットの１レーン、グラフの１列目）、ＴＮＦ−αと共にインキュベートした細胞における（ブロットの２レーン、グラフの２列目）ＭＡＲＣＫＳｍＲＮＡの増加を示す。図６Ｂに示したウェスタンブロットおよびグラフは、培地のみでインキュベートした細胞と比べて（ブロットの１レーン、グラムの１列目）、ＴＮＦ−αと共にインキュベートした細胞では（ブロットのレーン２、グラフの２列目）、ＭＡＲＣＫＳタンパク質の３〜４倍の増加を示す。図６Ｃのグラフは、ＴＮＦ−αと共にインキュベートした細胞では、ムチン過剰分泌が、培地のみでインキュベートした細胞のムチン分泌と比べて、ＰＭＡ＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰまたはＵＴＰによるその後の刺激に応答して有意に増大した。データは平均±ＳＥＭ（各点でｎ＝６）として提示する。アスタリスク１つ（＊）は、コントロール（培地のみ）サンプルからの統計学的有意差を示す（ｐ＜０．０５）。クロスマーク１つ（†）は、刺激からの統計学的有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
【０１３１】［実施例８］
［オカダ酸は刺激されたムチン過剰分泌を遮断する］
ＮＨＢＥ細胞を、１５分間、３７℃／５％のＣＯ2で、オカダ酸（５００ｎＭ）と共にプレインキュベートし、次いでＰＭＡ（１００ｎＭ）＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ（１μＭ）で１５分間、またはＵＴＰ（０．１ｍＭ）で２時間刺激した。頂端培地中の分泌されたムチンを集め、ＥＬＩＳＡによりアッセイした。結果を図７に示す。
【０１３２】  図７に示したグラフは、ホスファターゼ阻害剤のオカダ酸が、ＰＭＡ＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰまたはＵＴＰにより誘導されたムチン過剰分泌を阻害することを示す。１列目は、培地のみと３０分間インキュベートした結果を示す。２列目は、培地のみと１５分間プレインキュベートし、次いで、ＰＭＡ＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰと共にさらに１５分間インキュベートした結果を示す。３列目は、オカダ酸と共に１５分間プレインキュベートし、次いでＰＭＡ＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰとさらに１５分間共インキュベートした結果を示す。４列目は、培地のみと２時間インキュベートした結果を示す。５列目は、培地のみと１５分間プレインキュベートし、次いでＵＴＰと共にさらに２時間インキュベートした結果を示す。６列目は、オカダ酸と共に１５分間プレインキュベートし、次いで、ＵＴＰとさらに２時間共インキュベートした結果を示す。データは、平均±ＳＥＭ（各点でｎ＝６）として提示する。アスタリスク１つ（＊）は、コントロールからの統計学的有意差を示す（ｐ＜０．０５）。クロスマーク１つ（†）は、刺激からの統計学的有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
【０１３３】［実施例９］
［ＵＴＰにより誘導されるムチン過剰分泌は粘液分泌シグナル伝達経路阻害剤により阻害される］
ＮＨＢＥ細胞を、指定した阻害剤と共に１５分間プレインキュベートし、次いでＵＴＰ（０．１ｍＭ）で２時間刺激した。頂端培地中の分泌されたムチンを集め、ＥＬＩＳＡによりアッセイした。結果を図８に示す。
【０１３４】  図８のグラフは、ＵＴＰにより誘導されたムチン過剰分泌は、ＰＫＣおよびＰＫＧによる活性化に関与することを示す。１列目は、培地のみでインキュベートした結果を示す。２列目は、０．１ｍＭのＵＴＰ中でインキュベートした結果を示す。３列目は、０．１ｍＭのＵＴＰ＋５００ｎＭカルフォスチンＣ（ＰＫＣ阻害剤）中でインキュベートした結果を示す。４列目は、０．１ｍＭのＵＴＰ＋１０μＭのＲｐ−８−ＰＥＴ−ｃＧＭＰ（ＰＫＧ阻害剤）と共にインキュベートした結果を示す。５列目は、０．１ｍＭのＵＴＰ＋５０μＭのＬＹ８３５８３（可溶性グアニリルシクラーゼ阻害剤）とインキュベートした結果を示す。６列目は、０．１ｍＭのＵＴＰ＋５００ｎＭのＫＴ５７２０（ＰＫＡ阻害剤）と共にインキュベートした結果を示す。データは、平均±ＳＥＭ（各点でｎ＝６）として提示する。アスタリスク１つ（＊）は、コントロールからの統計学的有意差を示す（ｐ＜０．０５）。クロスマーク１つ（†）は、ＵＴＰ刺激からの統計学的有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
【０１３５】  これらは、本発明の説明であり、それを限定するものとは捉えない。本発明は、特許請求の範囲により定義され、特許請求の範囲の均等物も本明細書に含まれる。
【０１３６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１Ａは、様々な量のＭＡＮＳペプチド（配列番号１）に応答した、インビトロで、ヒト気管支上皮細胞による刺激されたムチン分泌のグラフである。１列目＝培地／コントロール（ペプチドなし、刺激なし）、２列目＝１００ｎＭのＰＭＡおよび１μＭの８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ（刺激分泌）、３列目＝１μＭのＭＡＮＳペプチド、１００ｎＭのＰＭＡおよび１μＭの８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ、４列目＝１０μＭのＭＡＮＳペプチド、１００ｎＭのＰＭＡおよび１μＭの８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ、および５列目＝１００μＭのＭＡＮＳペプチド、１００ｎＭのＰＭＡおよび１μＭの８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ。アスタリスク１つ（＊）は、測定した応答が、培地コントロール（１列目）とは統計学的に異なることを示し、アスタリスク２つ（＊＊）は、応答が、ＭＡＮＳペプチドに曝露されていない刺激細胞の応答（２列目）とは統計学的に異なることを示す。  図１Ｂは、ＭＡＮＳペプチド（配列番号１）、または、ＭＡＮＳペプチドと同じアミノ酸からなるが、無作為な順番であるネガティブコントロールペプチド（ＲＮＳペプチド、無作為なＮ末端配列）に曝露された、ヒト気管支上皮細胞による基礎ムチン分泌の阻害のグラフを示す。１列目＝培地コントロール、２列目＝１００μＭのＲＮＳと共に１時間インキュベート、３列目＝ＭＡＮＳペプチドと共に１時間インキュベート。アスタリスク１つ（＊）は、３列目の応答が、培地コントロール（１列目）とは統計学的に異なることを示す。
【図２】  図２は、様々な量のＭＡＮＳペプチド（配列番号１）の、インビトロでのヒト気管支上皮細胞によるＵＴＰ誘導ムチン分泌に対する効果のグラフである。１列目は培地／コントロールであり、２列目＝０．１ｍＭのＵＴＰ、３列目＝０．１ｍＭのＵＴＰおよび１μＭのＭＡＮＳペプチド、４列目＝０．１ｍＭのＵＴＰおよび１０μＭのＭＡＮＳペプチド、および５列目＝０．１ｍＭのＵＴＰおよび１００μＭのＭＡＮＳペプチドである。アスタリスク１つ（＊）は、測定した応答が、培地コントロール（１列目）とは統計学的に異なることを示し、そして、アスタリスク２つ（＊＊）は、応答が、ＭＡＮＳペプチドに曝露されていないＵＴＰ刺激細胞の応答とは統計学的に異なることを示す。
【図３】  図３Ａは、ＭＡＮＳペプチド（配列番号１）およびＭＡ−ＰＳＤペプチド（配列番号２）の、インビトロでのヒト気管支上皮細胞による刺激ムチン分泌に対する効果のグラフである。１列目＝培地／コントロール、２列目＝１００ｎＭのＰＭＡ、３列目＝１００ｎＭのＰＭＡおよび１μＭの８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ、４列目＝１００ｎＭのＰＭＡ、１μＭの８−Ｂｒ−ｃＧＭＰおよび１μＭのＭＡ−ＰＳＤペプチド、５列目＝１００ｎＭのＰＭＡ、１μＭの８−Ｂｒ−ｃＧＭＰおよび１０μＭのＭＡ−ＰＳＤペプチド、６列目＝１００ｎＭのＰＭＡ、１μＭの８−Ｂｒ−ｃＧＭＰおよび１００μＭのＭＡ−ＰＳＤペプチド、７列目＝１００ｎＭのＰＭＡ、１μＭの８−Ｂｒ−ｃＧＭＰおよび１μＭのＭＡＮＳペプチド、８列目＝１００ｎＭのＰＭＡ、１μＭの８−Ｂｒ−ｃＧＭＰおよび１０μＭのＭＡＮＳペプチド、および９列目＝１００ｎＭのＰＭＡ、１μＭの８−Ｂｒ−ｃＧＭＰおよび１００μＭのＭＡＮＳペプチド。アスタリスク１つ（＊）は、応答が、培地コントロール（１列目）とは統計学的に異なることを示し、アスタリスク２つ（＊＊）は、応答が、ＭＡＮＳペプチド（３列目）に曝露されていない刺激細胞の応答とは統計学的に異なることを示す。  図３Ｂは、インビトロでのヒト気管支上皮細胞による基礎ムチン分泌に対する、ＭＡ−ＰＳＤペプチド（配列番号２）と共に１時間インキュベートした効果のグラフを示す。１列目＝培地／コントロール、２列目＝１００μＭのＭＡ−ＰＳＤ、３列目＝１０μＭのＭＡ−ＰＳＤ、４列目＝１μＭのＭＡ−ＰＳＤ。アスタリスク１つ（＊）は、３列目の応答が、培地コントロール（１列目）とは統計学的に異なることを示す。
【図４】  図４は、ヒト上皮細胞によるＭＡＲＣＫＳ媒介ムチン分泌の提唱されたシグナル伝達経路の図解である。この図で、ＰＫＣ＝プロテインキナーゼＣ、ＰＫＧ＝ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ、ＧＣ−Ｓ＝可溶性グアニルシクラーゼ；ＰＰ２Ａ＝タンパク質ホスファターゼ２Ａ、ＮＯ＝一酸化窒素、ＧＴＰ＝グアノシン三リン酸、およびｃＧＭＰ＝サイクリックグアノシン一リン酸。この提唱された経路では、ムチン分泌促進物質（図では受容体に結合して示す）は、気道上皮（杯）細胞と相互作用し、２つの別々のプロテインキナーゼ、ＰＫＣおよびＰＫＧを活性化する。活性化されたＰＫＣはＭＡＲＣＫＳをリン酸化し、形質膜から細胞質へそれを移行させ、そこで、ＭＡＲＣＫＳ会合タンパク質の助けをかりてムチン顆粒膜に標的化する。一酸化窒素（ＮＯ）−ｃＧＭＰ−ＰＫＧ経路を介して活性化されたＰＫＧは、次に、細胞質タンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）を活性化し、これは、ＭＡＲＣＫＳを脱リン酸化し、よって、顆粒膜へのその付着を安定化させ、ＭＡＲＣＫＳがアクチンフィラメントに架橋することができる。これにより、顆粒は移動およびエキソサイトーシスのために細胞骨格に繋がる。
【図５】  図５は、ＭＡＲＣＫＳアンチセンスオリゴヌクレオチドの、インビトロでのヒト気管支上皮細胞による刺激ムチン分泌に対する効果のグラフである。１列目＝培地／コントロール、２列目＝１００ｎＭのＰＭＡおよび１μＭの８−Ｂｒ−ｃＧＭＰで刺激した細胞、３列目＝５μＭのコントロールオリゴヌクレオチド、１００ｎＭのＰＭＡおＦよび１μＭの８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ、４列目＝５μＭのアンチセンスオリゴヌクレオチド、１００ｎＭのＰＭＡおよび１μＭの８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ。アスタリスク１つ（＊）は、測定した応答が、培地コントロール（１列目）とは統計学的に異なることを示し、アスタリスク２つ（＊＊）は、応答が、どのオリゴヌクレオチドにも曝露されていない刺激細胞の応答（２列目）とは統計学的に異なることを示す。
【図６】  図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃは、共に、ＴＮＦ−αが、ＭＡＲＣＫＳ発現をアップレギュレートし、ムチン過剰分泌を増大することを示す。ＮＨＢＥ細胞を、１０ｎｇ／ｍｌヒト組換えＴＮＦ−αまたは培地のみと共に４時間インキュベートし、次いで、ＰＭＡ（１００ｎＭ）＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ（１μＭ）で１５分間、またはＵＴＰ（０．１ｍＭ）で２時間刺激した。分泌したムチンを集め、エリザにより測定した。全ＲＮＡおよびタンパク質を処理した細胞から単離した。ＭＡＲＣＫＳｍＲＮＡを、ノザンハイブリダイゼーションにより、ＭＡＲＣＫＳタンパク質をウェスタンブロット技法により評価した。  図６Ａは、培地のみでインキュベートした細胞（プロットのレーン１、グラフの１列目）と比較した、ＴＮＦ−αと共にインキュベートした細胞（ブロットのレーン２、グラフの２列目）中のＭＡＲＣＫＳｍＲＮＡの増加を示す、ノザンブロットおよびグラフである。  図６Ｂは、培地のみと共にインキュベートした細胞（ブロットのレーン１、グラフの１列目）と比較した、ＴＮＦ−αと共にインキュベートした細胞（ブロットのレーン２、グラフの２列目）中のＭＡＲＣＫＳタンパク質の３〜４倍の増加を示すウェスタンブロットおよびグラフである。  図６Ｃは、ＴＮＦ−αと共にインキュベートした細胞のムチン過剰分泌が、培地中のみでインキュベートした細胞のムチン分泌と比較した場合、ＰＭＡ＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰまたはＵＴＰによるその後の刺激に応答して、有意に増大したことを示すグラフである。データは、平均±ＳＥＭ（各点でｎ＝６）として提示する。アスタリスク１つ（＊）は、コントロール（培地のみ）サンプルからの統計学的有意差（ｐ＜０．０５）を示す。クロスマーク１つ（†）は、刺激からの統計学的な有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
【図７】  図７は、ホスファターゼ阻害剤のオカダ酸が、ＰＭＡ＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰまたはＵＴＰにより誘導されたムチン過剰分泌を遮断することを示すグラフである。ＮＨＢＥ細胞を、オカダ酸（５００ｎＭ）と共に１５分間３７℃、５％のＣＯ2でプレインキュベートし、次いで、ＰＭＡ（１００ｎＭ）＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ（１μＭ）で１５分間、またはＵＴＰ（０．１ｍＭ）で２時間刺激した。頂端培地中の分泌ムチンを集め、エリザによりアッセイした。１列目は、培地のみで３０分間インキュベートした結果を示す。２列目は、培地のみで１５分間プレインキュベートし、次いでさらに１５分間ＰＭＡ＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰと共にインキュベートした結果を示す。３列目は、オカダ酸と共に１５分間プレインキュベートし、次いで、さらに１５分間ＰＭＡ＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰと共に共インキュベートした結果を示す。４列目は、培地のみで２時間インキュベートした結果を示す。５列目は、培地のみで１５分間プレインキュベートし、次いで、ＵＴＰと共にさらに２時間インキュベートした結果を示す。６列目は、オカダ酸と共に１５分間プレインキュベートし、次いで、さらに２時間ＵＴＰと共インキュベートした結果を示す。データは平均±ＳＥＭ（各点でｎ＝６）として提示する。アスタリスク１つ（＊）は、コントロールからの統計学的有意差（ｐ＜０．０５）を示す。クロスマーク１つ（†）は、刺激からの統計学的有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
【図８】  図８は、ＵＴＰにより誘導されるムチン過剰分泌が、ＰＫＣおよびＰＫＧの活性化に関与することを示すグラフである。ＮＨＢＥ細胞を、指定した阻害剤（下記）と共に１５分間プレインキュベートし、次いで、ＵＴＰ（０．１ｍＭ）で２時間刺激した。頂端培地中の分泌ムチンを集め、エリザによりアッセイした。１列目は、培地のみと共にインキュベートした結果を示す。２列目は、０．１ｍＭのＵＴＰと共にインキュベートした結果を示す。３列目は、０．１ｍＭのＵＴＰ＋５００ｎＭカルフォスチンＣ（ＰＫＣ阻害剤）と共にインキュベートした結果を示す。４列目は、０．１ｍＭのＵＴＰ＋１０μＭのＲｐ−８−Ｂｒ−ＰＥＴ−ｃＧＭＰ（ＰＫＧ阻害剤）と共にインキュベートした結果を示す。５列目は、０．１ｍＭのＵＴＰ＋５０μＭのＬＹ８３５８３（可溶性グアニリルシクラーゼ阻害剤）と共にインキュベートした結果を示す。６列目は、０．１ｍＭのＵＴＰ＋５００ｎＭのＫＴ５７２０（ＰＫＡ阻害剤）と共にインキュベートした結果を示す。データは平均±ＳＥＭ（各点でｎ＝６）として提示する。アスタリスク１つ（＊）は、コントロールからの統計学的有意差（ｐ＜０．０５）を示す。クロスマーク１つ（†）は、ＵＴＰ刺激からの統計学的な有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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