(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基盤と、基盤の上に形成された溶解性マイクロニードル・アレイとを有する、ワクチン抗原を皮膚へデリバリーするための溶解性マイクロニードル・アレイ・パッチであって、
該溶解性マイクロニードル・アレイが３層構造からなるものであり、
ニードルの最先端部分に相当する第１番目の層には抗原が配置されず、
ニードルの先端から２番目の層にワクチン抗原が配置される溶解性マイクロニードル・アレイ・パッチ。
【請求項２】
前記マイクロニードル・アレイは、ニードルの先端から３番目の層には抗原が配置されない請求項１に記載の溶解性マイクロニードル・アレイ・パッチ。
【請求項３】
前記溶解性マイクロニードル・アレイは、水溶性の洩糸性高分子物質を基剤として用いて形成されるものである請求項１又は２に記載の溶解性マイクロニードル・アレイ・パッチ。
【請求項４】
前記水溶性の曳糸性高分子物質がコンドロイチン硫酸、デキストラン及びヒアルロン酸から成る群から選択される少なくとも一種である請求項１〜３のいずれか一項に記載の溶解性マイクロニードル・アレイ・パッチ。
【請求項５】
ワクチン抗原を皮膚表皮層へデリバリーするための請求項１〜４のいずれか一項に記載の溶解性マイクロニードル・アレイ・パッチ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高い効率で抗体価を得るための溶解性３層マイクロニードル・アレイの構造に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロニードルは、皮膚に刺しても痛みを感じないほどに微細化された針であり、皮膚の最も外側に位置して外界からの細菌やウィルスの進入から体内を防御している角質層を物理的に突破して、従来の技術では経皮的に投与を行っても吸収が望めない薬物、化粧品用化合物あるいは吸収率が極めて低い薬物、化粧品用化合物の吸収率を改善する製剤技術である。マイクロニードルの材質としては、従来の注射針と同じ金属の他、シリカ等も用いられている（特許文献１〜５２）。
【０００３】
マイクロニードル・アレイは、注射針と同様の中空構造を有し、薬液を注入するタイプであったり、ポリ乳酸などの生分解性高分子製のマイクロニードル・アレイであったりする。さらに、水溶性物質を基剤とする溶解型のマイクロニードルも開発されている。すなわち、水溶性物質の基剤に目的物質を保持させておき、皮膚に挿入した後、基剤が皮膚内の水分により溶解することにより、目的物質を経皮的に投与することができる。例えば、麦芽糖を基剤とするマイクロニードルが開示されている（特許文献１〜３、４０〜４３）。また、マイクロニードルを介して薬物を注入する装置、器具、あるいはマイクロニードルの素材、形状、製法などに関する特許も多数公知である（特許文献４、特許文献７〜５０）。
【０００４】
本発明者は上記麦芽糖を基剤とするマイクロニードルの欠点を克服したマイクロニードルとして、水溶性の洩糸性高分子物質を基剤とするマイクロニードルを特許出願した（特許文献５）。当該発明は、遺伝子組み換え蛋白薬、ワクチン、遺伝子ＤＮＡなどの高分子薬、水溶性の難・低経皮吸収性薬物など皮膚透過性が低いために従来の経皮投与では十分な効果が期待できない薬物の皮膚透過性を高めたものである。
【０００５】
さらに本発明者は水溶性の洩糸性高分子物質であるコンドロイチン硫酸、デキストラン、ヒアルロン酸などを基剤とするマイクロニードルの工業的製造法を発明して特許出願を行った（特許文献６）。マイクロニードルデバイスおよびマイクロニードル送達装置に関する特許も考案されている（特許文献９）。さらに本発明者は多層マイクロニードル・アレイを表面に形成したパッチ剤を考案した（特許文献５１）。
【０００６】
また、本発明者は、ワクチン抗原などの高分子、インスリンなどのペプチド・蛋白薬を目的物質とし、コンドロイチン硫酸、デキストラン、ヒアルロン酸、などを基剤に用いて、長さ約５００μｍ、底部直径約３００μｍの溶解性マイクロニードルを例えば１平方センチメートルのパッチ上に１０行１０列で１００本構築したマイクロニードル・アレイの製造法を発明した（特許文献５２）。さらにマイクロニードル・アレイを構築するのに適した多孔性の基盤を発明した（特許文献５３）。また、マイクロニードル・アレイ・パッチを皮膚に対して垂直に挿入するための投与器具と一体化した密封包装投与システムに関する特許も出願した（特許文献５４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００３−２３８３４７号公報
【特許文献２】特開２００５−１５４３２１号公報
【特許文献３】特開２００５−１５２１８０号公報
【特許文献４】特表２００６−５００９７３号広報
【特許文献５】国際公開２００６／０８０５０８号パンフレット
【特許文献６】特願２００７−１５０５７４号公報
【特許文献７】特表２００６−５１３８１１号公報（ＷＯ２００５／０４４３６４号）
【特許文献８】特表２００６−５０２８３１号公報（ＷＯ２００４／０３５１０５号）
【特許文献９】特表２００５−５３３６２５号公報（ＷＯ２００４／００９１７２号）
【特許文献１０】特表２００５−５１４１７９号公報（ＷＯ２００３／０５９４３１号）
【特許文献１１】特表２００５−５０３１９４号公報（ＷＯ２００２／１００４７４号）
【特許文献１２】特表２００５−５０１６１５号公報（ＷＯ２００３／０２０３５９号）
【特許文献１３】特表２００４−５３２６９８号公報（ＷＯ２００２／１００４７６号）
【特許文献１４】特表２００４−５０７３７１号公報（ＷＯ２００２／０１７９８５号）
【特許文献１５】特表２００４−５０４１２０号公報（ＷＯ２００２／００７８１３号）
【特許文献１６】特表２００２−５２６２７３号公報（ＷＯ００／１６８３３号）
【特許文献１７】特開２００８−４６５０７号公報
【特許文献１８】特開２００８−２９７１０号公報
【特許文献１９】特開２００８−２９５５９号公報
【特許文献２０】特開２００８−６１７８号公報
【特許文献２１】特開２００７−１３００３０号公報
【特許文献２２】特開２００６−３３５７５４号公報
【特許文献２３】特開２００５−２４６５９５号公報
【特許文献２４】特表２００７−５２３７７１号公報（ＷＯ２００５／０８２５９６号）
【特許文献２５】特表２００７−５１１３１８号公報（ＷＯ２００５／０４９１０７号）
【特許文献２６】ＷＯ２００７／０３０４７７号公報
【特許文献２７】ＷＯ２００４／０００３８９号公報
【特許文献２８】ＷＯ２００７／０９１６０８号公報
【特許文献２９】ＷＯ２００７／１１６９５９号公報
【特許文献３０】特開２００８−０１１９５９号公報
【特許文献３１】特開２００８−０７４７６３号公報
【特許文献３２】特開２００８−１２５８６４号公報
【特許文献３３】特開２００８−２３７６７５号公報
【特許文献３４】特開２００８−２９６０３７号公報
【特許文献３５】特開２００９−０６１２１２号公報
【特許文献３６】特開２００９−０７２２７０号公報
【特許文献３７】特開２００９−０７８０７４号公報
【特許文献３８】特表２００９−５０１０６６号公報（ＷＯ２００８／０１０６８１号）
【特許文献３９】特表２００９−５０２２６１号公報（ＷＯ２００７／０１２１４４号）
【特許文献４０】特開２００９−２５４７５６号公報
【特許文献４１】特開２００９−２７３８７２号公報
【特許文献４２】特開２００９−２０１９５６号公報
【特許文献４３】特開２００９−２７３７７２号公報
【特許文献４４】特開２００９−２３３１７０号公報
【特許文献４５】特開２００９−２４１３５７号公報
【特許文献４６】特開２００９−２４１３５８号公報
【特許文献４７】特開２００９−２５４８７６号公報
【特許文献４８】特表２００９−５０７５７３号公報（ＷＯ２００７／０３０４７７号）
【特許文献４９】特表２００９−５３３１９７号公報（ＷＯ２００８／００４７８１号）
【特許文献５０】特表２００９−５４０９８４号公報（ＷＯ２００７／１４７６７１号）
【特許文献５１】ＷＯ２００９／０６６７６３号
【特許文献５２】特開２００９−１９５５８３号公報
【特許文献５３】特願２０１０―０３１３１７号
【特許文献５４】特願２０１０―２０１８７５号
【特許文献５５】Ghartey-Tagoe Esi ら、United States Patent Application20090155330
【非特許文献１】J. C. Birchall, Stratum corneum bypassed or removed. In Enhancement inDrug Delivery, ed by E. Touitou and B. W. Barry, CRC Press, 2007, pp.337-351.
【非特許文献２】Sparber,F.他,Immunobiology, 215, 770-779, 2010.
【非特許文献３】Parton,M.他,Vaccine, 28, 6104-6113, 2010.
【非特許文献４】Romani,N.他,Immunol. Cell Biol., 88, 424-430, 2010.
【非特許文献５】Furmanov,K.他,J. Immunol., 184, 4889-4897, 2010.
【非特許文献６】Flacher,V.他,J. Inves. Derm., 130, 755-762, 2010.
【非特許文献７】Rozis,G.他,Eur. J. Immunol., 35, 2617-2626, 2005
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
マイクロニードルの大きさに関しては数多くの研究が行われており、本発明者も水溶性の洩糸性高分子物質であるコンドロイチン硫酸やデキストランを用いて種々の長さの溶解性マイクロニードルを作成してきたが、操作性および皮膚への突刺時における強度の点から鑑みて、実用上、長さ５００μｍ、底部の直径３００μｍのマイクロニードル・アレイがほぼ最適であるとの結論に至った。皮膚の生理学的構造として、ヒトの角質層の厚さは10-20μｍ、表皮層の厚さは50-150μｍであるといわれている（非特許文献１および２）。また、真皮層は皮膚の表面から数mmの深さまで存在する。
【０００９】
実験動物の表皮層の厚さはラットで11.58±1.02μｍ、イヌで22.47±2.40μｍであると報告されている（非特許文献３）。しかし、マイクロニードル・アレイ・パッチを指で加圧して皮膚に刺しても、500μｍのマイクロニードルの全長を皮膚内へ挿入することはできない。ヘアレスラットおよび除毛したラットの皮膚への投与を行った実験では先端から約半分までが皮膚内に挿入された。一方、経皮ワクチンの場合、表皮層に多く分布するLangerhans細胞、さらに真皮層に多く分布するDendritic細胞のいずれの免疫系細胞が経皮的に投与された抗原蛋白を主として認識するのかという問題に関しては、免疫学分野において数多くの研究が行われてきているにもかかわらず、未だに結論に至っていない（非特許文献２から７）。多層マイクロニードル・アレイを利用したワクチンの経皮デリバリーに関する特許も出願されているが（特許文献５５）、第１層であるマイクロニードルの先端部に抗原を高濃度で配置し、第２層を主として基剤で形成するという技術である。なお、当該特許文献においては、第１層と第２層の具体的な長さについては明示していない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ね、本発明を完成した。すなわち、先にも述べたように操作性および強度の観点から実用的なマイクロニードルのサイズとしては、長さが約500μm、底部の直径が約300μmのマイクロニードルに集約される。本発明者が先に特許出願を行った水溶性の洩糸性高分子物質を基剤とする溶解性マイクロニードル・アレイ・パッチの密封包装投与システム（特許文献５４）を用いれば、一定の加圧力でマイクロニードル・アレイ・パッチを皮膚へ投与することができ、再現性良くマイクロニードルの先端から同じ長さの部分を皮膚内へ挿入することができる。そこでマイクロニードル・アレイを３層構造とし、最先端である第１層には抗原を入れず基剤である水溶性の洩糸性高分子物質にて形成し、先端から第２番目の部分にはLangerhans細胞の多く分布する皮膚表皮層へデリバリーするためのワクチン抗原を配置し、３番目に相当する根元部分には基剤を配置することによりより高い効率でワクチンの効果を得ることに成功し、上記の問題を解決した。
【００１１】
より具体的には、本発明のマイクロニードルは、
ワクチン抗原を効率良く皮膚表皮層へデリバリーするための３層構造から成る溶解性マイクロニードル・アレイ・パッチである。
【００１２】
また、前記溶解性３層マイクロニードル・アレイにおいて用いる基剤は水溶性の洩糸性高分子物質である溶解性マイクロニードル・アレイ・パッチである。
【００１３】
また、前記３層マイクロニードル・アレイ・パッチにおいてニードルの最先端部分に相当する第１番目の層は基剤である水溶性の洩糸性高分子物質により形成される溶解性マイクロニードル・アレイ・パッチである。
【００１４】
また、前記３層マイクロニードル・アレイ・パッチにおいて先端から２番目の層にはワクチン抗原が配置されている溶解性マイクロニードル・アレイ・パッチである。
【００１５】
また、前記３層マイクロニードル・アレイ・パッチにおいて先端から３番目の層は基剤である水溶性の洩糸性高分子物質により形成されている溶解性マイクロニードル・アレイ・パッチである。
【００１６】
また、前記の３層マイクロニードル・アレイ・パッチにおいてマイクロニードルのサイズが長さ500μm、底部の直径300μmである場合、最先端である第１番目の層の長さは先端から１６０μｍ、第２番目の層は先端から１６０〜２２０μmの部位、第３番目の層は先端から２２０〜５００μｍの部分に相当する溶解性マイクロニードル・アレイ・パッチである。なお、これらの数値はラットでの検証実験において得た数値であり、人間の場合には若干の変動がある。
【発明の効果】
【００１７】
３層構造を有する溶解性マイクロニードル・アレイを皮膚に突き刺すと、最先端部は溶解しながら皮膚の真皮内に入っていくので、３層構造からなるマイクロニードル・アレイにおいて先端から２番目の部分にワクチン抗原を配置することにより、皮膚表皮層に広範に分布する抗原認識細胞であるLangerhans細胞へのデリバリーを達成することができる。
【００１８】
なお、マイクロニードル・アレイの先端から第３番目の層は皮膚に突き刺さらない部分になるので、抗原を配置する必要はない。
【００１９】
長さが約500μm、底部の直径が約300μmのマイクロニードルの場合、具体的には、先端から１６０μｍまでの第１層については基剤である水溶性の洩糸性高分子物質を用いて形成し、先端からの長さが１６０から２２０μｍに相当する第２番目の層についてはワクチン抗原を配置することにより、皮膚表皮層への効率的な抗原のデリバリーが可能となった。先端からの長さが２２０μｍ以上の第３層であるマイクロニードルの根元部分については第１層と同様に水溶性の洩糸性高分子物質を用いて成形する。このような３層構造を有するマイクロニードル・アレイを構築したパッチとすることにより、上記の問題を解決することができる。なお、上記の長さに関する数値はラットでの検証実験の結果によるものであり、人間の皮膚に適用する場合には若干の変動がある。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下に実施例をあげて具体的な実施形態を説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２１】
（実施例１）
１平方センチメートルあたりに深さ約５００ミクロン、開口部直径約３００ミクロンの逆円錐状細孔を有するシリコン製基盤の上に、375mｇのコンドロイチン硫酸Ｃナトリウム（ナカライテスク）に精製水700μlを加えて作成した粘調液を塗布した。サランラップ（クレハ化学）を被せ、卓上遠心分離器（クボタ4000）を用いて毎分3500回転で樹脂基盤ごと15分間回転させ、遠心力を利用して加重下、充填した。サランラップを取り除き、30分間同条件で回転させ乾燥を行った。次に、モデルワクチン抗原として卵白アルブミン（シグマ社、米国）の20mg、微量のエバンスブルー（ナカライテスク）および35ｍｇのコンドロイチン硫酸Ｃナトリウムに精製水170μlを加えて調製した粘性濃厚液を塗布した。卓上遠心分離器にて毎分3500回転で樹脂基盤ごと20分間回転させ、遠心力を利用して加重下、充填した。サランラップを取り除き、卓上遠心分離器にて同条件で30分間回転させ、乾燥を行った。樹脂基盤上の残留物を除去した後、コンドロイチン硫酸Ｃナトリウムの1ｇに精製水1ｍｌを加えて作成した粘調液を樹脂基盤上の穴に塗布した。樹脂基盤ごと卓上遠心分離器にて3500回転で30分間回転させ、遠心力を利用して加重下、充填した。コンドロイチン硫酸Ｃナトリウムの粘調液を塗布した円形基盤を樹脂基盤の上に被せ、加重下で乾燥を行った。6時間後に円形基盤を引き離すことにより、3層マイクロニードル・アレイ・パッチを得た。調製した３層マイクロニードル・アレイ・パッチの１０個を取り出し、ビデオマイクロスコープ（ＶＨ−Ｚ、キーエンス製）で観察を行い、透明な第１層および青色に着色した第２層の長さを測定したところ次に示す結果を得た。
第１層、１６０．２±７．２μｍ
第２層、  ５８．７±４．２μｍ
【００２２】
（実施例２）
実施例１で用いたのと同様の樹脂基盤の上に、卵白アルブミンの20mg、微量のエバンスブルーおよび35ｍｇのコンドロイチン硫酸Ｃナトリウムに精製水170μlを加えて調製した粘性濃厚液を塗布した。サランラップを被せ、卓上遠心分離器にて毎分3500回転で樹脂基盤ごと45分間回転させ、遠心力を利用して加重下、充填した。サランラップを取り除き、15分間同条件で回転させ乾燥を行った。樹脂基盤上の残留物を除去した後、コンドロイチン硫酸Ｃナトリウムの1ｇに精製水1ｍｌを加えて作成した粘調液を樹脂基盤上の穴に塗布した。シリコン樹脂基盤ごと卓上遠心分離器にて3500回転で30分間回転させ、遠心力を利用して加重下、充填した。コンドロイチン硫酸Ｃナトリウムの粘調液を塗布した円形基盤を樹脂基盤の上に被せ、加重下で乾燥を行った。6時間後に円形基盤を引き離すことにより、２層マイクロニードル・アレイ・パッチを得た。調製した２層マイクロニードル・アレイ・パッチの１０個を取り出し、ビデオマイクロスコープで観察を行い、青色に着色した第１層の長さを測定したところ次に示す結果を得た。
第１層、１５３．７±７．４μｍ
【００２３】
（実施例３）
実施例１および２で作成したマイクロニードル・アレイ・パッチ中の卵白アルブミン含量をLawry法を用いて蛋白量として測定した。その結果、
実施例１の３層マイクロニードル・アレイ・パッチ、 211.2±31.1μg
実施例２の２層マイクロニードル・アレイ・パッチ、 226.9±25.6μg
【００２４】
（実施例４）
体重約３００グラムの雄性ラットにペントバルビタール麻酔をかけ、手術台の上に仰向けに固定した。腹部の体毛を除毛した後、手術台に固定した。頸静脈より約０．２ｍＬ採血した後、実施例１および２で作製したモデル抗原である卵白アルブミンを含有する経皮ワクチンパッチを除毛したラットの腹部に押し当てることにより投与した。ポシティブコントロールとして卵白アルブミンの注射液を作成してラットに1000μgの投与量で皮下注射にて投与を行った。投与2週間後にペントバルビタール麻酔下、ラットより採血を行うとともに２回目の卵白アルブミンを含有する経皮ワクチンパッチおよび卵白アルブミン注射液のブースター投与を行った。１回目および２回目の投与後に回収したマイクロニードル・アレイ・パッチ中における卵白アルブミンの含有量を残存量としてLawry法にて測定したところ以下の結果を得た。
実施例１の３層マイクロニードル・アレイ・パッチ、7.0±2.6μg
実施例２の２層マイクロニードル・アレイ・パッチ、 7.1±2.0μg
従って、経皮的に投与された卵白アルブミン量を算出したところ次のような結果となった。
実施例１の３層マイクロニードル・アレイ・パッチ、 204.2±2.6μg
実施例２の２層マイクロニードル・アレイ・パッチ、 219.8±2.0μg
【００２５】
2週間後および４週間後にラットから採血を行って得た血漿試料を用いてELISA法（Rat
anti-ovalbumin Ig ELISA kit, ALPHA DIAGNOSTICS社）にて血漿中の卵白アルブミン抗体価を測定したところ以下の結果を得た。
２週間後の血漿試料
実施例１の３層マイクロニードル・アレイ・パッチ投与群、54.99±7.08単位/ml
実施例２の２層マイクロニードル・アレイ・パッチ投与群、8.93±2.78単位/ml      
皮下注射による投与群、98.34±3.82  単位/ml
４週間後の血漿試料
実施例１の３層マイクロニードル・アレイ・パッチ投与群、1578.57±182.59単位/ml
実施例２の２層マイクロニードル・アレイ・パッチ投与群、351.27±156.52単位/ml              
皮下注射による投与群、655.70±118.01単位/ml
以上より、先端から２番目の層にモデル抗原蛋白である卵白アルブミンを含有する本発明の３層マイクロニードル・アレイ・パッチは２層マイクロニードル・アレイ・パッチよりも循環血漿中の高い抗体価を誘導し、経皮ワクチンとしての優秀性が示された。
【００２６】
（実施例５）
実施例１および２に示した方法でフルオレッセインイソチオシアネート(FITC)で蛍光標識を行った卵白アルブミンを含有する３層および２層マイクロニードル・アレイ・パッチを作成した。ペントバルビタール麻酔下で雄性ラット腹部の除毛皮膚に投与した後、経時的に切除して得た皮膚切片を用いて、蛍光照射下にてビデオマイクロスコープにて撮影を行った。実施例１で作成した３層マイクロニードル・アレイ・パッチをラットの皮膚に投与した後、３０秒後には皮膚の表面に近い表皮層に強い蛍光が観察された。２分後においても表皮層に強い蛍光発光が観察され、FITC卵白アルブミンの表皮層へのデリバリーが確認された。実施例２で作成した２層マイクロニードル・アレイ・パッチをラットの皮膚に投与した後、３０秒後および２分後において、皮膚表面から離れた真皮層に強い蛍光発光が観察され、卵白アルブミンの真皮層へのデリバリーが示された。  
【産業上の利用可能性】
【００２７】
より高い効率で経皮ワクチンの効果を得るためには、ワクチン抗原のデリバリー部位を免疫系細胞であるLangerhans細胞が主として分布する皮膚表皮層とするかそれともDendritic細胞が主として分布する真皮層とするか、いずれの部位が最適の部位であるかという問題は長年の論争の的となっていた。それゆえ、溶解性マイクロニードル・アレイ・パッチを経皮ワクチンのデリバリーに用いる場合、多層マイクロニードル・アレイ・パッチとし、いずれの層にワクチン抗原を配置するのが最適であるのかという課題を解決する必要があった。本発明により、長さ約500μｍ、底部の直径約300μｍのマイクロニードルの先端から２番目の層に相当する先端から１６０から２２０μｍの部分にワクチン抗原を配置すればワクチン抗原の表皮層へのデリバリーを達成でき、より効果的な薬理効果を引き出すことができることが明らかとなった。