(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料液を収容する試料容器、
作動液を収容する作動液容器、
希釈液を収容する希釈液容器、
これらの液体または空気を吸引／吐出するためのシリンジポンプおよびニードル、
ならびに試料液と希釈液との混合液を収容する希釈容器を備えた、試料希釈装置を用いて、
［１］前記シリンジポンプを用いて前記ニードルから前記シリンジポンプまでの流路を作動液で満たし、
［２］前記シリンジポンプを用いて（Ａ）少量の空気、（Ｂ）所定量の希釈液、（Ｃ）少量の空気、（Ｄ）所定量の試料液、の順に前記ニードルから吸引し、
［３］前記（Ｂ）から（Ｄ）を前記希釈容器に吐出し、
［４］［３］で吐出した試料液と希釈液との混合液の全量またはその一部を複数回吸引／吐出することで試料液を希釈する方法において、
前記希釈容器に前記［３］で吐出した混合液を収容したときの液面高さが、前記希釈容器の内径の３倍以下であり、
［４］の吸引／吐出量が、［３］で吐出した混合液量の３０％以上、かつ回数を重ねるにつれ減少することを特徴とする、試料液希釈方法。
【請求項２】
試料液を収容する試料容器、
希釈液を収容する希釈液容器、
これらの液体または空気を吸引／吐出するためのシリンジポンプおよびニードル、
ならびに試料液と希釈液との混合液を収容する希釈容器を備えた、試料希釈装置を用いて、
［１］前記シリンジポンプを用いて前記ニードルから前記シリンジポンプまでの流路を希釈液で満たし、
［２］前記シリンジポンプを用いて（Ａ）少量の空気、（Ｂ）所定量の試料液、の順に前記ニードルから吸引し、
［３］前記（Ａ）、（Ｂ）および前記希釈液の一部を前記希釈容器に吐出し、
［４］［３］で吐出した試料液と希釈液との混合液の全量またはその一部を複数回吸引／吐出することで試料液を希釈する方法において、
前記希釈容器に前記［３］で吐出した混合液を収容したときの液面高さが、前記希釈容器の内径の３倍以下であり、
［４］の吸引／吐出量が、［３］で吐出した混合液量の３０％以上、かつ回数を重ねるにつれ減少することを特徴とする、試料液希釈方法。
【請求項３】
溶離液を収容した容器、溶離液を送液するポンプ、分析する試料液の希釈および導入を行なう試料注入装置、分析カラム、および検出器を備えた液体クロマトグラフ装置において、前記試料注入装置が、
試料液を収容した試料容器、作動液を収容した作動液容器、希釈液を収容した希釈容器、これらの液体または空気を吸引／吐出するためのシリンジポンプおよびニードル、ならびに試料液と希釈液との混合液を収容する希釈容器を備えた試料希釈装置と、
前記装置で希釈された試料液をサンプルループに導入し、前記サンプルループに導入した試料液を前記分析カラムに導入可能な試料注入バルブとを備えており、
かつ前記試料希釈装置が請求項１に記載の方法で試料液を希釈することを特徴とする、液体クロマトグラフ装置。
【請求項４】
溶離液を収容した容器、溶離液を送液するポンプ、分析する試料液の希釈および導入を行なう試料注入装置、分析カラム、および検出器を備えた液体クロマトグラフ装置において、前記試料注入装置が、
試料液を収容した試料容器、希釈液を収容した希釈容器、これらの液体または空気を吸引／吐出するためのシリンジポンプおよびニードル、ならびに試料液と希釈液との混合液を収容する希釈容器を備えた試料希釈装置と、
前記装置で希釈された試料液をサンプルループに導入し、前記サンプルループに導入した試料液を前記分析カラムに導入可能な試料注入バルブとを備えており、
かつ前記試料希釈装置が請求項２に記載の方法で試料液を希釈することを特徴とする、液体クロマトグラフ装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体クロマトグラフを用いた分析における試料液の希釈方法、および前記方法を利用した液体クロマトグラフ装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
液体クロマトグラフ装置は、図１に示すように、溶離液を収容した容器（１００）、送液ポンプ（２００）、試料注入装置（３００）、分析カラム（４００）、検出器（５００）から主に構成される。このうち試料注入装置（３００）は少なくとも、
分析する試料液を収容した試料容器（３０１）と、
試料液を収容するサンプルループ（３０２）と、
サンプルループ（３０２）が接続された試料注入バルブ（３０３）と
サンプルループ（３０２）の一部または全部に試料を導入する手段と、
試料注入バルブ（３０３）を切り替える手段（３１３）、から構成される。
【０００３】
試料注入バルブ（３０３）は、通常図１に示す六方バルブが用いられており、バルブを６０度回転させることで、試料容器（３０１）中に収容された試料液をサンプルループ（３０２）へ導入する流路（ロード位置、図１では点線で図示）と、サンプルループ（３０２）に導入された試料液を分析カラム（４００）に導入する流路（導入位置、図１では実線で図示）とに流路を切り替えることができる。
【０００４】
図１に示す試料注入装置（３００）を用いて分析カラム（４００）への試料を導入する際は、まず試料注入バルブ（３０３）をロード位置にして、試料容器（３０１）に収容された試料液をシリンジポンプ（３０４、３１４）を用いてニードル（３０５）から吸引することでサンプルループ（３０２）に導入する。この時点で、サンプルループ（３０２）の一部または全部に試料液が導入された状態となる。なお、ニードル（３０５）から試料注入バルブ（３０３）までの流路はデッドボリュームとなるため、前記流路の容量を小さくするのが好ましい。また、前記流路の容量が無視できない場合は、移動機構（３０８）でニードル（３０５）を試料容器（３０１）の試料液面より上昇させた後、空気を前記流路の途中まで吸引してもよい。サンプルループ（３０２）への試料液の導入終了後、試料注入バルブ（３０３）を導入位置に切り替えて、サンプルループ（３０２）に導入された試料液を、送液ポンプ（２００）で送液された溶離液により分析カラム（４００）へ導入し、前記カラムからの溶出液を検出器（５００）で検出する。
【０００５】
しかしながら通常、分析カラム（４００）の負荷容量、および検出器（５００）で検出可能な濃度には上限があるため、試料液中に含まれる分析対象成分の濃度が濃い場合は、前記カラムおよび検出器の上限に収まるように、前記試料液を分析カラム（４００）に導入する前に希釈する必要がある。
【０００６】
試料液の希釈方法としては、
［１］ホールピペットとメスフラスコを用いて希釈する方法、
［２］吸引／吐出手段で試料液および希釈液をそれぞれ計量し希釈容器に吐出した後、前記手段による吸引／吐出、ヘラや撹拌子による回転、ヘラや超音波またはボルテックスミキサーによる振動、空気の吐出等により撹拌して希釈する方法、が例示できる。
【０００７】
前記［２］の希釈方法のうち、吸引／吐出手段としてディスポーザブルチップを装着したピペッターを用い、前記ピペッターによる吸引／吐出で撹拌して希釈する方法は、自動分析装置（特許文献１）で通常用いられる希釈方法であり、一般的には希釈容器の底に近い位置で吸引後、前記ピペッターを上方に持ち上げて吐出することで撹拌し試料液を希釈する。しかしながら、前記方法を液体クロマトグラフ装置に適用する場合、前記ピペッターにより吸引した希釈試料液を試料注入バルブに直接導入することができない。そのため、別途希釈試料液を吸引し分析カラムに導入するためのニードルおよびシリンジポンプが必要となり、装置が複雑化する問題点があった。また、吸引／吐出で撹拌することで得られた希釈試料液を液体クロマトグラフ装置で分析すると、同一試料を分析した場合の再現性が十分でないという問題点があった。
【０００８】
特許文献２は、試料液を吸引するニードルを試料容器内に収容された試料液に浸し、前記ニードルを振動させることで撹拌後、前記ニードルで試料液を吸引する液体クロマトグラフ装置を開示している。しかしながら、特許文献２による撹拌方法は微小な液滴が発生する問題点があり、装置構成が複雑化する問題点もあった。
【０００９】
特許文献３は、予めニードルからシリンジポンプまでの流路を作動液で満たした後、前記ポンプで［Ａ］少量の空気、［Ｂ］所定量の希釈液、［Ｃ］少量の空気、［Ｄ］所定量の試料液、の順に吸引し、前記ポンプで前記［Ｂ］から［Ｄ］を希釈容器に吐出することによって試料液の希釈を行なう液体クロマトグラフ装置用希釈装置を開示している。しかしながら、特許文献３の装置は希釈試料液を分析カラムへ導入する機構についての開示はなく、別途希釈試料液を吸引し前記カラムに導入するためのニードルおよびシリンジポンプが必要であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開平１０−６２４３２号公報
【特許文献２】特開平１１−３０４７７９号公報
【特許文献３】特公平８−１０２１４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、液体クロマトグラフを用いた分析において、高い再現性を有する試料液希釈方法および前記方法を利用した液体クロマトグラフ装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を鑑みてなされた本発明は、以下の発明を包含する：
第一の発明は、
試料液を収容する試料容器、
作動液を収容する作動液容器、
希釈液を収容する希釈液容器、
これらの液体または空気を吸引／吐出するためのシリンジポンプおよびニードル、
ならびに試料液と希釈液との混合液を収容する希釈容器を備えた、試料希釈装置を用いて、
［１］前記シリンジポンプを用いて前記ニードルから前記シリンジポンプまでの流路を作動液で満たし、
［２］前記シリンジポンプを用いて（Ａ）少量の空気、（Ｂ）所定量の希釈液、（Ｃ）少量の空気、（Ｄ）所定量の試料液、の順に前記ニードルから吸引し、
［３］前記（Ｂ）から（Ｄ）を前記希釈容器に吐出し、
［４］［３］で吐出した試料液と希釈液との混合液の全量またはその一部を吸引／吐出することで試料液を希釈する方法において、
前記希釈容器に前記［３］で吐出した混合液を収容したときの液面高さが、前記希釈容器の内径の３倍以下であることを特徴とする、試料液希釈方法である。
【００１３】
第二の発明は、
試料液を収容する試料容器、
希釈液を収容する希釈液容器、
これらの液体または空気を吸引／吐出するためのシリンジポンプおよびニードル、
ならびに試料液と希釈液との混合液を収容する希釈容器を備えた、試料希釈装置を用いて、
［１］前記シリンジポンプを用いて前記ニードルから前記シリンジポンプまでの流路を希釈液で満たし、
［２］前記シリンジポンプを用いて（Ａ）少量の空気、（Ｂ）所定量の試料液、の順に前記ニードルから吸引し、
［３］前記（Ａ）、（Ｂ）および前記希釈液の一部を前記希釈容器に吐出し、
［４］［３］で吐出した試料液と希釈液との混合液の全量またはその一部を吸引／吐出することで試料液を希釈する方法において、
前記希釈容器に前記［３］で吐出した混合液を収容したときの液面高さが、前記希釈容器の内径の３倍以下であることを特徴とする、試料液希釈方法である。
【００１４】
第三の発明は、
溶離液を収容した容器、溶離液を送液するポンプ、分析する試料液の希釈および導入を行なう試料注入装置、分析カラム、および検出器を備えた液体クロマトグラフ装置において、前記試料注入装置が、
試料液を収容した試料容器、作動液を収容した作動液容器、希釈液を収容した希釈液容器、これらの液体または空気を吸引／吐出するためのシリンジポンプおよびニードル、ならびに試料液と希釈液との混合液を収容する希釈容器を備えた試料希釈装置と、
前記装置で希釈された試料液をサンプルループに導入し、前記サンプルループに導入した試料液を前記分析カラムに導入可能な試料注入バルブとを備えており、
かつ前記試料希釈装置が第一の発明に記載の方法で試料液を希釈することを特徴とする、液体クロマトグラフ装置である。
【００１５】
第四の発明は、
溶離液を収容した容器、溶離液を送液するポンプ、分析する試料液の希釈および導入を行なう試料注入装置、分析カラム、および検出器を備えた液体クロマトグラフ装置において、前記試料注入装置が、
試料液を収容した試料容器、希釈液を収容した希釈容器、これらの液体または空気を吸引／吐出するためのシリンジポンプおよびニードル、ならびに試料液と希釈液との混合液を収容する希釈容器を備えた試料希釈装置と、
前記装置で希釈された試料液をサンプルループに導入し、前記サンプルループに導入した試料液を前記分析カラムに導入可能な試料注入バルブとを備えており、
かつ前記試料希釈装置が第二の発明に記載の方法で試料液を希釈することを特徴とする、液体クロマトグラフ装置である。
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明の試料液希釈方法は、
［１］シリンジポンプを用いてニードルから前記シリンジポンプまでの流路を作動液で満たし、
［２］前記シリンジポンプを用いて（Ａ）少量の空気、（Ｂ）所定量の希釈液、（Ｃ）少量の空気、（Ｄ）所定量の試料液、の順に前記ニードルから吸引し、
［３］前記（Ｂ）から（Ｄ）を希釈容器に吐出し、
［４］［３］で吐出した試料液と希釈液との混合液の全量またはその一部を吸引／吐出することで試料液を希釈する方法において、
前記希釈容器に前記［３］で吐出した混合液を収容したときの液面高さが、前記希釈容器の内径の３倍以下であることを特徴としている。前記希釈方法は、高い精度で試料液を希釈することができるため、液体クロマトグラフを用いた分析における同一希釈試料液のピーク再現性を向上させることができる。
【００１８】
本発明の希釈方法で用いる希釈容器の形状は円筒形であっても角柱形であってもよく、さらにテーパを設置してもよい。なお、角柱形の容器を用いる場合は、前記［３］で吐出した混合液を収容したときの液面高さが、底面を構成する四角形の短辺の長さの３倍以下となればよく、テーパを設置した容器を用いる場合は、前記［３］で吐出した混合液を収容したときの液面高さが、底面の内径の３倍以下となればよい。
【００１９】
本発明の希釈方法で用いる希釈容器の大きさは前記［３］で吐出する混合液量に基づき、前述の条件を満たす範囲で適宜選択すればよい。なお、試料容器に前記［３］で吐出する混合液を収容したときの液面高さが、前記試料容器の内径の３倍以下であるときは、試料容器と希釈容器とで同じ容器を使用することができる。
【００２０】
本発明の希釈方法で用いる希釈容器の好ましい態様は、前記希釈容器に前記［３］で吐出した混合液を収容したときの液面高さが、前記希釈容器の内径の２倍以下となる容器である。前記好ましい希釈容器を用いて試料液を希釈することで、より高い精度で試料液を希釈することができるため、液体クロマトグラフを用いた分析における同一希釈試料液のピーク再現性をより向上させることができる。
【００２１】
本発明の希釈方法で用いる希釈容器の材質は、通常用いられるポリプロピレン等の樹脂やガラスをあげることができるが、試料液および希釈液に対する濡れ性がよい材質（例えばガラス）を希釈容器の材質として用いると同一試料希釈液を液体クロマトグラフ分析したときのピーク再現性がより向上するため好ましい。
【００２２】
本発明の希釈方法における前記［２］で吸引する空気の吸引量は、作動液と希釈液、ならびに希釈液と試料液が互いに混合しない量であればよく、ニードルおよびニードルからシリンジポンプまでの配管の内径を考慮の上、決定すればよい。
【００２３】
本発明の希釈方法において、前記［４］の吐出操作をニードルが希釈容器内の液面から離して行ない、液滴を落下させると、前記［４］の吸引／吐出操作による撹拌を効率的に行なえる点で、好ましい。
【００２４】
本発明の希釈方法で用いる希釈液としては、液体クロマトグラフ装置で通常用いられる純水、緩衝液、有機溶媒をあげることができる。なお、後述の液体クロマトグラフ分析で用いる溶離液と同じ組成の液を希釈液として用いると、クロマトグラムのベースラインの変動が抑えられる点で好ましい。本発明の希釈方法で用いる作動液としては、シリンジポンプの容積変化をニードルへ伝達可能な液体であればよく、純水、緩衝液、有機溶媒をあげることができる。なお、作動液として洗浄液と同じ組成の液を用いると、希釈試料液を後述の分析カラムに導入後、流路中に残存する作動液を吐出することでニードルが洗浄できる点で好ましい。また、作動液として希釈液と同じ組成の液を用いると、作動液容器が希釈液容器としての役割も有するため、希釈液容器を別途設置する必要がなく、装置構成の簡素化／小型化の点で好ましい。作動液と希釈液が同じ組成の場合は、
［１］前記シリンジポンプを用いて前記ニードルから前記シリンジポンプまでの流路を作動液（希釈液）で満たし、
［２］前記シリンジポンプを用いて（Ａ）少量の空気、（Ｂ）所定量の試料液、の順に吸引し、
［３］前記（Ａ）、（Ｂ）および前記作動液（希釈液）の一部を希釈容器に吐出し、
［４］［３］で吐出した試料液と希釈液との混合液の全量またはその一部を吸引／吐出する方法で試料液を希釈してもよい。
【００２５】
高い精度で試料液を希釈する方法の別の態様として、前記［４］の吸引／吐出操作を複数回実施し、前記［４］の吸引／吐出量を、吸引／吐出の回数を重ねるにつれ減少させる希釈方法をあげることができる。前記希釈方法は、前記［４］の吸引／吐出量を常に一定にして希釈する方法と比較し、液体クロマトグラフを用いた分析における同一希釈試料液のピーク再現性が向上する。なお、前記［４］の吸引／吐出量を前記［３］で吐出した混合液量の３０％未満とすると、十分に撹拌されないため、前記［３］で吐出した混合液量の３０％から１００％で行なう必要がある。また、前記［４］の吸引／吐出量を前記［３］で吐出した混合液量の５０％から１００％とするとピーク再現性がさらに向上するため好ましい。
【００２６】
前記希釈方法における、前記［４］の吸引／吐出の回数は複数回つまり２回以上であればよく、希釈工程の処理時間、希釈試料量、希釈容器の形状等を考慮し適宜吸引／吐出の回数を決定すればよい。なお、前記［４］の吸引／吐出操作における吸引／吐出量の、前回の量に対する減少幅が小さいと、常に一定量で吸引／吐出する希釈方法と同様、同一希釈試料液を液体クロマトグラフ分析したときのピーク再現性が低下するため、好ましくは前記［４］の吸引／吐出量の減少幅は１５％以上あるとよい。さらに、前記減少幅が２０％以上あるとピーク再現性向上の点でより好ましい。
【００２７】
本発明の試料液希釈方法を用いた液体クロマトグラフ装置の一態様を図２に示す。図２に示す試料注入装置（３００）において、試料注入バルブ（３０３）は、流路の切り替えにより、サンプルループ（３０２）に導入された希釈試料液を分析カラム（４００）に導入可能なバルブであればよく、図２に示した回転式六方バルブの他にも、２個の回転式四方バルブまたは２個の三方電磁弁等が使用できる。シリンジポンプ（３０４）側の流路と、ニードル（３０５）側の流路または作動液容器（３０６）側の流路とを接続する切り替えバルブ（３０７）としては、三方電磁弁が例示できる。また、希釈試料液がシリンジポンプ（３０４）に入るのを防止するために、試料注入バルブ（３０３）から切り替えバルブ（３０７）までの流路に、希釈溶液を保持するための保持ループ（３０９）が設けられている。ニードル（３０５）から試料注入バルブ（３０３）までの配管、サンプルループ（３０２）、保持ループ（３０９）の材質は液体クロマトグラフで用いる移動相に対して耐性を有していればよいが、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、フッ化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）等が好ましく用いられる。試料液を収容する試料容器（３０１）は、蒸発を防止するための蓋ができる容器であってもよい。希釈液を収容する希釈液容器（３１０）は移動機構（３０８）によりニードル（３０５）が移動できる範囲に設置すればよい。また、複数の希釈液を使用する場合または大量の希釈液を使用する場合は、希釈液容器を複数設置してもよい。
【００２８】
図２に示す試料注入装置（３００）を用いた、試料液の希釈および分析カラムへの導入方法の一例を以下に示す。
［１］切り替えバルブ（３０７）を作動液容器（３０６）側に切り替えて、シリンジポン
プ（３０４、３１４）を用いて作動液を吸引する。なお、試料注入バルブ（３０３）は導入位置（図２では実線で図示）にする。
［２］切り替えバルブ（３０７）をニードル（３０５）側に切り替えて、シリンジポンプ（３０４、３１４）を用いてニードル（３０５）の先端まで作動液で満たす。
［３］シリンジポンプ（３０４、３１４）を用いて少量の空気を吸引する。
［４］移動機構（３０８）によりニードル（３０５）を希釈液容器（３１０）に収容された希釈液と接触する位置まで移動後、シリンジポンプ（３０４、３１４）を用いて前記希釈液を吸引する。
［５］移動機構（３０８）によりニードル（３０５）を上昇させた後、シリンジポンプ（３０４、３１４）を用いて少量の空気を吸引する。
［６］移動機構（３０８）によりニードル（３０５）を試料容器（３０１）に収容された試料液と接触する位置まで移動後、シリンジポンプ（３０４、３１４）を用いて前記試料液を吸引する。
［７］移動機構（３０８）によりニードル（３０５）を希釈容器（３１１）の位置まで移動後、シリンジポンプ（３０４、３１４）を用いて［４］で吸引した希釈液、［５］で吸引した空気および［６］で吸引した試料液を希釈容器（３１１）へ吐出する。
［８］シリンジポンプ（３０４、３１４）を用いて少量の空気を吸引する。
［９］移動機構（３０８）によりニードル（３０５）を希釈容器（３１１）に収容された［７］の吐出液と接触する位置まで移動後、シリンジポンプ（３０４、３１４）を用いて前記吐出液の全量またはその一部を吸引する。
［１０］移動機構（３０８）によりニードル（３０５）を上昇させた後、シリンジポンプ（３０４、３１４）を用いて［９］で吸引した液を吐出することで撹拌する。
［１１］必要に応じて、前記［８］から［１０］の操作を１回以上繰り返す。ただし、繰り返す場合、吸引／吐出量は前回の吸引／吐出より少ない量で行なうのが好ましい。
［１２］移動機構（３０８）によりニードル（３０５）を上昇させた後、シリンジポンプ（３０４、３１４）を用いて少量の空気を吸引する。
［１３］移動機構（３０８）によりニードル（３０５）を希釈容器（３１１）に収容された希釈試料液と接触する位置まで移動し、切り替え装置（３１３）により試料注入バルブ（３０３）をロード位置（図２では点線で図示）に切り替え後、シリンジポンプ（３０４、３１４）を用いて希釈試料液をサンプルループ（３０２）まで吸引する。
［１４］切り替え装置（３１３）により試料注入バルブ（３０３）を導入位置（図２では実線で図示）に切り替えて、サンプルループ（３０２）中に保持された希釈試料を送液ポンプ（２００）で送液された溶離液により分析カラム（４００）へ導入し、検出器（５００）で希釈試料液中の成分を検出する。
【００２９】
本発明の試料液希釈方法を用いた液体クロマトグラフ装置の別の態様を図３に示す。図２の装置との相違点は、希釈液容器（３１０）の設置がなく、作動液が希釈液を兼ねている点である。
【００３０】
図３に示す試料注入装置（３００）を用いた、試料液の希釈および分析カラムへの導入方法の一例を以下に示す。
［１］切り替えバルブ（３０７）を作動液（希釈液）容器（３０６）側に切り替えて、シリンジポンプ（３０４、３１４）を用いて作動液（希釈液）を吸引する。なお、試料注入バルブ（３０３）は導入位置（図３では実線で図示）にする。
［２］切り替えバルブ（３０７）をニードル（３０５）側に切り替えて、シリンジポンプ（３０４、３１４）を用いてニードル（３０５）の先端まで作動液（希釈液）で満たす。
［３］シリンジポンプ（３０４、３１４）を用いて少量の空気を吸引する。
［４］移動機構（３０８）によりニードル（３０５）を試料容器（３０１）に収容された試料液と接触する位置まで移動後、シリンジポンプ（３０４、３１４）を用いて前記試料液を吸引する。
［５］移動機構（３０８）によりニードル（３０５）を希釈容器（３１１）の位置まで移動後、シリンジポンプ（３０４、３１４）を用いて必要量の作動液（希釈液）、［３］で吸引した空気および［４］で吸引した試料を希釈容器（３１１）へ吐出する。
［６］シリンジポンプ（３０４、３１４）を用いて少量の空気を吸引する。
［７］移動機構（３０８）によりニードル（３０５）を希釈容器（３１１）に収容された前記［５］の吐出液と接触する位置まで移動後、シリンジポンプ（３０４、３１４）を用いて前記吐出液の全量またはその一部を吸引する。
［８］移動機構（３０８）によりニードル（３０５）を上昇させた後、シリンジポンプ（３０４、３１４）を用いて［７］で吸引した液を吐出することで撹拌する。
［９］必要に応じて、前記［６］から［８］の操作を１回以上繰り返す。ただし、繰り返す場合、吸引／吐出量は前回の吸引／吐出より少ない量で行なうのが好ましい。
［１０］移動機構（３０８）によりニードル（３０５）を上昇させた後、シリンジポンプ（３０４、３１４）を用いて少量の空気を吸引する。
［１１］移動機構（３０８）によりニードル（３０５）を希釈容器（３１１）に収容された希釈試料液と接触する位置まで移動し、切り替え装置（３１３）により試料注入バルブ（３０３）をロード位置（図３では点線で図示）に切り替え後、シリンジポンプ（３０４、３１４）を用いて希釈試料液をサンプルループ（３０２）まで吸引する。
［１２］切り替え装置（３１３）により試料注入バルブ（３０３）を導入位置（図３では実線で図示）に切り替えて、サンプルループ（３０２）中に保持された希釈試料液を送液ポンプ（２００）で送液された溶離液により分析カラム（４００）へ導入し、検出器（５００）で希釈試料液中の成分を検出する。
【００３１】
前記図２および３の装置において、ニードル（３０５）および保持ループ（３０９）の内径、吸引する速度、吐出する速度が不適切であると、作動液（図３の装置の場合は希釈液）と希釈試料液（試料液と希釈液との混合液）の間に挿入した少量の空気と液体との界面が乱れ、希釈試料液が作動液または希釈液により希釈されるため好ましくない。そのため、希釈試料液と配管を構成する材質との濡れ性により変化するものの、ニードル（３０５）から試料注入バルブ（３０３）までの配管、試料注入バルブ（３０３）および保持ループ（３０９）内の配管はいずれも内径が０．４ｍｍ以上１ｍｍ以下が好ましい。また、吸引／吐出速度は１ｍＬ／分以上１０ｍＬ／分以下が好ましい。
【００３２】
また、前記２および３の装置において、希釈容器（３１１）に収容された試料液と希釈液との混合液を吸引する場合および前記混合液を吐出する場合のニードル（３０５）位置は、各々一定の位置であってもよいし、各操作中に変化させてもよい。前記変化させる例として、希釈容器（３１１）に収容された試料液と希釈液との混合液を吸引する際、ニードル（３０５）先端が常に前記容器（３１１）の底から液面までの高さの１／２の位置となるように、ニードル（３０５）を下げながら液体を吸引する方法があげられる。
【発明の効果】
【００３３】
本発明は、
試料液を収容する試料容器、
作動液を収容する作動液容器、
希釈液を収容する希釈液容器、
これらの液体または空気を吸引／吐出するためのシリンジポンプおよびニードル、
ならびに試料液と希釈液との混合液を収容する希釈容器を備えた、試料希釈装置を用いて、
［１］前記シリンジポンプを用いて前記ニードルから前記シリンジポンプまでの流路を作動液で満たし、
［２］前記シリンジポンプを用いて（Ａ）少量の空気、（Ｂ）所定量の希釈液、（Ｃ）少量の空気、（Ｄ）所定量の試料液、の順に前記ニードルから吸引し、
［３］前記（Ｂ）から（Ｄ）を前記希釈容器に吐出し、
［４］［３］で吐出した試料液と希釈液との混合液の全量またはその一部を吸引／吐出することで試料液を希釈する方法において、
前記希釈容器に前記［３］で吐出した混合液を収容したときの液面高さが、前記希釈容器の内径の３倍以下であることを特徴としている。前記希釈方法により、試料液を高い精度で希釈することができる。また、前記希釈方法を液体クロマトグラフ装置に適用することで、液体クロマトグラフ分析における同一希釈試料液のピーク再現性が向上する。
【００３４】
前記希釈方法において作動液と希釈液は同一の組成であってもよく、その場合は、前記［２］および［３］の操作を
［２］前記シリンジポンプを用いて（Ａ）少量の空気、（Ｂ）所定量の試料液、の順に前記ニードルから吸引し、
［３］前記（Ａ）、（Ｂ）および前記作動液（希釈液）の一部を前記希釈容器に吐出する
操作としても、前記希釈方法と同様の効果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】試料液の希釈を行なわない試料注入装置を備えた液体クロマトグラフ装置を示す図。
【図２】試料液の希釈が可能な試料注入装置を備えた液体クロマトグラフ装置を示す図。
【図３】試料液の希釈が可能な試料注入装置を備えた液体クロマトグラフ装置を示す図。
【図４】比較例１の方法により希釈した試料液の分析結果を示す図。
【図５】実施例１の方法により希釈した試料液の分析結果を示す図。
【図６】実施例２の方法により希釈した試料液の分析結果を示す図。
【図７】実施例３の方法により希釈した試料液の分析結果を示す図。
【図８】実施例４の方法により希釈した試料液の分析結果を示す図。
【図９】比較例２の方法により希釈した試料液の分析結果を示す図。
【図１０】比較例３の方法により希釈した試料液の分析結果を示す図。
【実施例】
【００３６】
以下に本発明を更に詳細に説明するために実施例を示すが、これら実施例は本発明の一例を示すものであり、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００３７】
比較例１
図３に示した装置を用い、同一希釈試料液のピーク再現性を確認した。
【００３８】
分析カラム（４００）にはイオン交換樹脂が充填されたカラムを用いた。作動液容器（３０６）には作動液（希釈液を兼ねる）として純水を収容した。試料容器（３０１）には試料液として１０ｍＭ  ＫＣｌ水溶液を収容した。試料容器（３０１）および希釈容器（３１１）には共に外径寸法φ１１．３ｍｍ×３２ｍｍ（高さ）、内径寸法φ６．０ｍｍ×３１ｍｍ（高さ）からなるポリプロピレン製容器を使用した。なお、前記容器に７００μＬの純水を入れると、液の高さは約２４．８ｍｍになる。ニードル（３０５）は外径２．０ｍｍ、内径０．５ｍｍの硬質樹脂チューブを用いた。ニードル（３０５）から試料注入バルブ（３０３）までの配管はＰＴＦＥチューブを使用した。保持ループ（３０９）は内径０．７５ｍｍ、長さ２ｍのＰＥＥＫチューブを用いた。シリンジポンプ（３０４、３１４）の吸引／吐出速度は３．０ｍＬ／分とした。検出器（５００）には電気伝導度計を用いた。
【００３９】
試料液の希釈および分析カラムへの導入は以下のように実施した。
［１］試料注入バルブ（３０３）を導入位置とし、作動液容器（３０６）からニードル（３０５）先端まで希釈液（純水）で満たされた状態から、ニードル（３０５）先端から空気を３μＬ吸引後、試料液（１０ｍＭ  ＫＣｌ）を７０μＬ吸引した。
［２］前記試料液７０μＬ、前記空気３μＬ、および前記純水６３０μＬ（合計７０３μＬ）を希釈容器（３１１）に吐出した。
［３］ニードル（３０５）先端から空気を２０μＬ吸引後、希釈容器（３１１）の底から約３ｍｍの位置で、純水と試料液との混合液５６０μＬ（［２］で吐出した純水および試料液の８０％量）を吸引した。
［４］移動機構（３０８）で希釈容器（３１１）の底から約３０ｍｍの位置までニードル（３０５）を上昇させ、５６０μＬ吐出した。
［５］［３］および［４］の操作を２回繰り返して、希釈試料液を調製した。
［６］ニードル（３０５）先端から空気を２μＬ吸引後、切り替え装置（３１３）で試料注入バルブ（３０３）をロード位置に切り替え、シリンジポンプ（３０４、３１４）を用いて前記希釈試料液をサンプルループ（３０２）まで吸引した。
［７］試料注入バルブ（３０３）を導入位置に切り替え、サンプルループ（３０２）へ導入された希釈試料液を、分析カラム（４００）に導入し、検出器（５００）で試料のピークを確認した。
［８］［６］および［７］の操作を再度実施した。
［９］［１］から［８］の操作を再度実施した。
【００４０】
分析結果のクロマトグラフを図４に示す。なお以降の図において、Ａ１とＡ２は１回目に調製した希釈試料液の分析結果、Ｂ１とＢ２は２回目に調製した希釈試料液の分析結果をそれぞれ表す。また、Ａ１とＢ１は各希釈試料液の１回目の分析結果、Ａ２とＢ２は各希釈試料液の２回目の分析結果をそれぞれ表す。ピーク面積はほぼ一定であり、良好な再現性を示していたものの、クロマトグラムを拡大して調べると、ピーク高さに測定間差（Ａ１とＡ２、Ｂ１とＢ２）があった。
【００４１】
実施例１
比較例１のうち、希釈容器（３１１）を外径寸法φ１１．８ｍｍ×３２ｍｍ（高さ）、内径寸法φ１０．１ｍｍ×３０．６ｍｍ（高さ）からなるポリプロピレン製容器（当該容器に７００μＬの純水を入れると、液の高さは約８．７４ｍｍになる）に、前記［３］および［４］の吸引／吐出操作を５００μＬで１回に、それぞれ変更した他は、比較例１と同様に実施した。
【００４２】
分析結果のクロマトグラフを図５に示す。測定間（Ａ１とＡ２、Ｂ１とＢ２）におけるピーク高さの変動が比較例１より小さくなった。これより、前記［２］の純水および試料液を希釈容器（３１１）に吐出したときの液面高さが、前記容器の内径の３倍以下となる希釈容器（３１１）に変更することにより、ピーク再現性が向上していることがわかる。
【００４３】
実施例２
比較例１のうち、希釈容器（３１１）を外径寸法φ１０（底部）から１２ｍｍ（上部）×２１ｍｍ（高さ）、内径寸法φ８．０（底部）から１０（上部）ｍｍ×２０ｍｍ（高さ）からなる、底部が細く上部が広いポリプロピレン製容器（当該容器に７００μＬの純水を入れると、液の高さは約１２ｍｍになる）に、前記［３］および［４］の吸引／吐出回数を３回から２回に、それぞれ変更した他は、比較例１と同様に実施した。
【００４４】
分析結果のクロマトグラフを図６に示す。測定間（Ａ１とＡ２、Ｂ１とＢ２）におけるピーク高さの変動が比較例１より小さくなった。これより、前記［２］の純水および試料液を希釈容器（３１１）に吐出したときの液面高さが、前記容器の内径の３倍以下となる希釈容器（３１１）であれば、テーパを設置した容器であっても、実施例１で使用した希釈容器と同様、ピーク再現性が向上していることがわかる。
【００４５】
実施例３
比較例１のうち、希釈容器（３１１）を外径寸法φ１１．３ｍｍ×３２ｍｍ（高さ）、内径寸法φ９．０ｍｍ×３１ｍｍ（高さ）からなるガラス製容器（当該容器に７００μＬの純水を入れると、液の高さは約１１．０ｍｍになる）に、前記［３］および［４］の吸引／吐出回数を３回から２回に、それぞれ変更した他は、比較例１と同様に実施した。
【００４６】
分析結果のクロマトグラフを図７に示す。測定間（Ａ１とＡ２、Ｂ１とＢ２）におけるピーク高さの変動が比較例１より小さくなった。これより、希釈容器（３１１）の材質を純水および試料液（１０ｍＭ  ＫＣｌ水溶液）に対する濡れ性の低い材料（ポリプロピレン）から高い材料（ガラス）に変更することにより、ピーク再現性が向上していることがわかる。
【００４７】
実施例４
比較例１のうち、前記［３］および［４］の吸引／吐出量を１回目７００μＬ（前記［２］で吐出した純水および試料液の１００％量）、２回目５６０μＬ（前記［２］で吐出した純水および試料液の８０％量）、３回目３５０μＬ（前記［２］で吐出した純水および試料液の５０％量）とした他は、比較例１と同様に実施した。
【００４８】
分析結果のクロマトグラフを図８に示す。測定間（Ａ１とＡ２、Ｂ１とＢ２）におけるピーク高さの変動が比較例１より小さくなった。これより、希釈する際の吸引／吐出量を回数を重ねるにつれ減少させることで、ピーク再現性が向上していることがわかる。
【００４９】
比較例２
比較例１のうち、前記［３］および［４］の吸引／吐出量を１回目３５０μＬ（前記［２］で吐出した純水および試料液の５０％量）、２回目５６０μＬ（前記［２］で吐出した純水および試料液の７０％量）、３回目７００μＬ（前記［２］で吐出した純水および試料液の１００％量）とした他は、比較例１と同様に実施した。
【００５０】
分析結果のクロマトグラフを図９に示す。測定間（Ａ１とＡ２、Ｂ１とＢ２）におけるピーク高さの変動が比較例１より大きくなった。これより、前記［２］の純水および試料液を希釈容器（３１１）に吐出したときの液面高さが前記容器の内径の３倍をこえる希釈容器（３１１）を用いた場合、希釈する際の吸引／吐出量を回数を重ねるにつれ増加させると、ピーク再現性は向上しないことがわかる。
【００５１】
比較例３
比較例１のうち、前記［３］および［４］の吸引／吐出量を１回目７００μＬ（前記［２］で吐出した純水および試料液の１００％量）、２回目６３０μＬ（前記［２］で吐出した純水および試料液の９０％量）、３回目２００μＬ（前記［２］で吐出した純水および試料液の２８．６％量）とした他は、比較例１と同様に実施した。
【００５２】
分析結果のクロマトグラフを図１０に示す。測定間（Ａ１とＡ２、Ｂ１とＢ２）におけるピーク高さの変動が比較例１より大きくなった。これより、前記［２］の純水および試料液を希釈容器（３１１）に吐出したときの液面高さが前記容器の内径の３倍をこえる希釈容器（３１１）を用いた場合、希釈する際の吸引／吐出量を回数を重ねるにつれ減少させたとしても、前記［２］で吐出した純水および試料液の３０％量未満で吸引／吐出を行なうと、ピーク再現性は向上しないことがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明の試料液希釈方法および前記方法を利用した液体クロマトグラフ装置は、高濃度の試料液を液体クロマトグラフで分析する時に、高い精度で前記試料液を希釈することができるため、前記試料液に含まれる成分をより高精度に分析することが可能となる。
【符号の説明】
【００５４】
１００：溶離液容器
２００：送液ポンプ
３００：試料注入装置
３０１：試料容器
３０２：サンプルループ
３０３：試料注入バルブ
３０４：シリンジ
３０５：ニードル
３０６：作動液容器
３０７：切り替えバルブ
３０８：ニードル移動機構
３０９：保持ループ
３１０：希釈液容器
３１１：希釈容器
３１２：洗浄ポート
３１３：試料注入バルブ切り替え装置
３１４：吸引／吐出ポンプ
３１５：制御装置
４００：分析カラム
５００：検出器
６００：廃液ビン
【図１】
0005446515.tif 000002
【図２】
0005446515.tif 000003
【図３】
0005446515.tif 000004
【図４】
0005446515.tif 000005
【図５】
0005446515.tif 000006
【図６】
0005446515.tif 000007
【図７】
0005446515.tif 000008
【図８】
0005446515.tif 000009
【図９】
0005446515.tif 000010
【図１０】
0005446515.tif 000011