(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の、トラコーマクラミジア（ＣＴ）および／または性器マイコプラズマ（ＭＧ）および／または淋菌（ＮＧ）の検出方法であって、
前記検出は、
ａ／  ＣＴの検出については：リアルタイムマルチプレックス増幅におけるＣＴの検出に適している、少なくとも２つのＣＴ標的プライマーおよび少なくとも１つのＣＴ特異的プローブ、および／または
ｂ／  ＭＧの検出については：リアルタイムマルチプレックス増幅におけるＭＧの検出に適している、少なくとも２つのＭＧ標的プライマーおよび少なくとも１つのＭＧ特異的プローブ、および／または
ｃ／  ＮＧの検出については：リアルタイムマルチプレックス増幅におけるＮＧの検出に適している、少なくとも２つのＮＧ標的プライマーおよび少なくとも１つのＮＧ特異的プローブ
によるリアルタイムマルチプレックス増幅によって、少なくとも１つのアンプリコンが、前記サンプルまたはその核酸物質から産生されたか否か、または産生されるか否かの判定を含み、
上記のａ／、ｂ／およびｃ／の少なくとも２つが、同一の増幅チューブ内にあり、
ポジティブの判定が、少なくとも１つのＣＴおよび／または少なくとも１つのＭＧおよび／または少なくとも１つのＮＧが前記サンプル中に存在することを示し、
ａ／について、
前記少なくとも２つのＣＴ標的プライマーが、配列番号７および１２のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＣＴ特異的プローブが、配列番号８の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結され、
ｂ／について、
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号１５および１８のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号１６の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号２１および２４のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号２２の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号２７および３０のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号２８の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号３３および３６のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号３４の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号３９および３６のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号４０の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結され、
ｃ／について、
前記少なくとも２つのＮＧ標的プライマーが、配列番号４４および４７のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＮＧ特異的プローブが、配列番号４５の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結される、
方法。
【請求項２】
請求項１に記載の検出方法であって、上記のａ／、ｂ／およびｃ／のそれぞれを同一の増幅チューブ内に含んでなる方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の検出方法であって、前記少なくとも２つのＣＴ標的プライマーは、前記配列番号７のオリゴヌクレオチドおよび前記配列番号１２のオリゴヌクレオチドであり、かつ前記少なくとも１つのＣＴ特異的プローブは、配列番号８もしくは９の配列であるかまたはこの配列番号の配列の全長にわたってこの配列番号の配列に完全に相補的な配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルに任意に連結される、方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の検出方法であって、前記少なくとも１つのＣＴ特異的プローブが、フルオロフォアに連結される、方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の検出方法であって、前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーは、前記配列番号１５のオリゴヌクレオチドおよび前記配列番号１８のオリゴヌクレオチドであり、かつ前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブは、配列番号１６もしくは１７の配列であるかまたはこの配列番号の配列の全長にわたってこの配列番号の配列に完全に相補的な配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルに任意に連結される、方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の検出方法であって、前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーは、前記配列番号２１のオリゴヌクレオチドおよび前記配列番号２４のオリゴヌクレオチドであり、かつ前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブは、配列番号２２もしくは２３の配列であるかまたはこの配列番号の配列の全長にわたってこの配列番号の配列に完全に相補的な配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルに任意に連結される、方法。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の検出方法であって、前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーは、前記配列番号２７のオリゴヌクレオチドおよび前記配列番号３０のオリゴヌクレオチドであり、かつ前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブは、配列番号２８もしくは２９の配列であるかまたはこの配列番号の配列の全長にわたってこの配列番号の配列に完全に相補的な配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルに任意に連結される、方法。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の検出方法であって、前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーは、前記配列番号３３のオリゴヌクレオチドおよび前記配列番号３６のオリゴヌクレオチドであり、かつ前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブは、配列番号３４もしくは３５の配列であるかまたはこの配列番号の配列の全長にわたってこの配列番号の配列に完全に相補的な配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルに任意に連結される、方法。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の検出方法であって、前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーは、前記配列番号３９のオリゴヌクレオチドおよび前記配列番号３６のオリゴヌクレオチドであり、かつ前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブは、配列番号４０もしくは４１の配列であるかまたはこの配列番号の配列の全長にわたってこの配列番号の配列に完全に相補的な配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルに任意に連結される、方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の検出方法であって、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、フルオロフォアに連結される、方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の検出方法であって、前記少なくとも２つのＮＧ標的プライマーは、前記配列番号４４のオリゴヌクレオチドおよび前記配列番号４７のオリゴヌクレオチドであり、かつ前記少なくとも１つのＮＧ特異的プローブは、配列番号４５もしくは４６の配列であるかまたはこの配列番号の配列の全長にわたってこの配列番号の配列に完全に相補的な配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルに任意に連結される、方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の検出方法であって、前記少なくとも１つのＮＧ特異的プローブが、フルオロフォアに連結される、方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の検出方法であって、その配列がＣＴ、ＭＧおよびＮＧと無関係である内部標準が、増幅されたか否か、または増幅されるか否かの判定をさらに含む、方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の検出方法であって、前記内部標準が、増幅されたか否か、または増幅されるか否かの判定が、配列番号４９および５２のプライマーの使用を含む、方法。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載の検出方法であって、前記内部標準が、増幅されたか否か、または増幅されるか否かの判定が、配列番号５０のプローブ配列またはその相補配列の使用を含み、前記プローブ配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結される、方法。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の検出方法であって、前記内部標準が、ａ／、ｂ／およびｃ／の前記少なくとも２つと同一の増幅チューブ内に含有される、方法。
【請求項１７】
前記増幅がPCRである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項１８】
ＣＴからアンプリコンを産生する方法であって、同一の増幅チューブ内でプライマーおよびプローブを用いてリアルタイムマルチプレックス増幅により、ＣＴ含有サンプルまたはその核酸材料から前記アンプリコンを産生することを含み、前記プライマーおよびプローブは、
ａ／  少なくとも２つのＣＴ標的プライマーおよび少なくとも１つのＣＴ特異的プローブ
を含み、前記プライマーおよびプローブは、
ｂ／  少なくとも２つのＭＧ標的プライマーおよび少なくとも１つのＭＧ特異的プローブ、および／または
ｃ／  少なくとも２つのＮＧ標的プライマーおよび少なくとも１つのＮＧ特異的プローブ
を更に含み、
ａ／について：
前記少なくとも２つのＣＴ標的プライマーが、配列番号７および１２のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＣＴ特異的プローブが、配列番号８の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結され、
ｂ／について：
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号１５および１８のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号１６の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号２１および２４のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号２２の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号２７および３０のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号２８の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号３３および３６のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号３４の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号３９および３６のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号４０の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結され、
ｃ／について：
前記少なくとも２つのＮＧ標的プライマーが、配列番号４４および４７のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＮＧ特異的プローブが、配列番号４５の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結される、
方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、前記プライマーおよびプローブが、
ａ／  前記少なくとも２つのＣＴ標的プライマーおよび前記少なくとも１つのＣＴ特異的プローブ、
ｂ／  前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーおよび前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブ、および
ｃ／  前記少なくとも２つのＮＧ標的プライマーおよび前記少なくとも１つのＮＧ特異的プローブ
を含む、方法。
【請求項２０】
請求項１８または１９に記載の方法であって、前記少なくとも１つのＣＴ特異的プローブが、フルオロフォアに連結される、方法。
【請求項２１】
請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法であって、前記サンプルが、ＭＧおよび／またはＮＧを更に含有する、方法。
【請求項２２】
ＭＧからアンプリコンを産生する方法であって、同一の増幅チューブ内でプライマーおよびプローブを用いてリアルタイムマルチプレックス増幅により、ＭＧ含有サンプルまたはその核酸材料から前記アンプリコンを産生することを含み、前記プライマーおよびプローブは、
ａ／  少なくとも２つのＭＧ標的プライマーおよび少なくとも１つのＭＧ特異的プローブ
を含み、前記プライマーおよびプローブは、
ｂ／  少なくとも２つのＣＴ標的プライマーおよび少なくとも１つのＣＴ特異的プローブ、および／または
ｃ／  少なくとも２つのＮＧ標的プライマーおよび少なくとも１つのＮＧ特異的プローブ
を更に含み、
ｂ／について：
前記少なくとも２つのＣＴ標的プライマーが、配列番号７および１２のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＣＴ特異的プローブが、配列番号８の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結され、
ａ／について：
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号１５および１８のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号１６の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号２１および２４のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号２２の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号２７および３０のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号２８の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号３３および３６のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号３４の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号３９および３６のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号４０の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結され、
ｃ／について：
前記少なくとも２つのＮＧ標的プライマーが、配列番号４４および４７のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＮＧ特異的プローブが、配列番号４５の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結される、
方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、前記プライマーおよびプローブが、
ａ／  前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーおよび前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブ、
ｂ／  前記少なくとも２つのＣＴ標的プライマーおよび前記少なくとも１つのＣＴ特異的プローブ、および
ｃ／  前記少なくとも２つのＮＧ標的プライマーおよび前記少なくとも１つのＮＧ特異的プローブ
を含む、方法。
【請求項２４】
請求項２２または２３に記載の方法であって、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、フルオロフォアに連結される、方法。
【請求項２５】
請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の方法であって、前記サンプルが、ＣＴおよび／またはＮＧを更に含有する、方法。
【請求項２６】
ＮＧからアンプリコンを産生する方法であって、同一の増幅チューブ内でプライマーおよびプローブを用いてリアルタイムマルチプレックス増幅により、ＮＧ含有サンプルまたはその核酸材料から前記アンプリコンを産生することを含み、前記プライマーおよびプローブは、
ａ／  少なくとも２つのＮＧ標的プライマーおよび少なくとも１つのＮＧ特異的プローブ
を含み、前記プライマーおよびプローブは、
ｂ／  少なくとも２つのＣＴ標的プライマーおよび少なくとも１つのＣＴ特異的プローブ、および／または
ｃ／  少なくとも２つのＭＧ標的プライマーおよび少なくとも１つのＭＧ特異的プローブ
を更に含み、
ｂ／について：
前記少なくとも２つのＣＴ標的プライマーが、配列番号７および１２のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＣＴ特異的プローブが、配列番号８の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結され、
ｃ／について：
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号１５および１８のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号１６の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号２１および２４のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号２２の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号２７および３０のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号２８の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号３３および３６のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号３４の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号３９および３６のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号４０の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結され、
ａ／について：
前記少なくとも２つのＮＧ標的プライマーが、配列番号４４および４７のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＮＧ特異的プローブが、配列番号４５の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結される、
方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法であって、前記プライマーおよびプローブが、
ａ／  前記少なくとも２つのＮＧ標的プライマーおよび前記少なくとも１つのＮＧ特異的プローブ、
ｂ／  前記少なくとも２つのＣＴ標的プライマーおよび前記少なくとも１つのＣＴ特異的プローブ、および
ｃ／  前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーおよび前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブ
を含む、方法。
【請求項２８】
請求項２６または２７に記載の方法であって、前記少なくとも１つのＮＧ特異的プローブが、フルオロフォアに連結される、方法。
【請求項２９】
請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の方法であって、前記サンプルが、ＣＴおよび／またはＭＧを更に含有する、方法。
【請求項３０】
ａ／  少なくとも２つのＣＴ標的プライマーおよび少なくとも１つのＣＴ特異的プローブ
を含み、
ｂ／  少なくとも２つのＭＧ標的プライマーおよび少なくとも１つのＭＧ特異的プローブ、および／または
ｃ／  少なくとも２つのＮＧ標的プライマーおよび少なくとも１つのＮＧ特異的プローブ
を更に含む、オリゴヌクレオチド組であって、
ａ／について：
前記少なくとも２つのＣＴ標的プライマーが、配列番号７および１２のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＣＴ特異的プローブが、配列番号８の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結され、
ｂ／について：
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号１５および１８のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号１６の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号２１および２４のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号２２の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号２７および３０のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号２８の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号３３および３６のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号３４の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号３９および３６のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号４０の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結され、
ｃ／について：
前記少なくとも２つのＮＧ標的プライマーが、配列番号４４および４７のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＮＧ特異的プローブが、配列番号４５の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結される、
オリゴヌクレオチド組。
【請求項３１】
請求項３０に記載のオリゴヌクレオチド組であって、
ａ／について：
前記少なくとも２つのＣＴ標的プライマーが、配列番号７および１２のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＣＴ特異的プローブが、配列番号８もしくは９の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルに任意に連結され、
ｂ／について：
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号１５および１８のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号１６もしくは１７の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルに任意に連結されるか、または
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号２１および２４のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号２２もしくは２３の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルに任意に連結されるか、または
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号２７および３０のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号２８もしくは２９の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルに任意に連結されるか、または
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号３３および３６のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号３４もしくは３５の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルに任意に連結されるか、または
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号３９および３６のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号４０もしくは４１の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルに任意に連結され、
ｃ／について：
前記少なくとも２つのＮＧ標的プライマーが、配列番号４４および４７のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＮＧ特異的プローブが、配列番号４５もしくは４６の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルに任意に連結される、
オリゴヌクレオチド組。
【請求項３２】
請求項３０または３１に記載のオリゴヌクレオチド組であって、前記少なくとも１つのＣＴ特異的プローブが、フルオロフォアに連結される、オリゴヌクレオチド組。
【請求項３３】
ａ／  少なくとも２つのＭＧ標的プライマーおよび少なくとも１つのＭＧ特異的プローブ
を含み、
ｂ／  少なくとも２つのＣＴ標的プライマーおよび少なくとも１つのＣＴ特異的プローブ、および／または
ｃ／  少なくとも２つのＮＧ標的プライマーおよび少なくとも１つのＮＧ特異的プローブ
を更に含む、オリゴヌクレオチド組であって、
ｂ／について：
前記少なくとも２つのＣＴ標的プライマーが、配列番号７および１２のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＣＴ特異的プローブが、配列番号８の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結され、
ａ／について：
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号１５および１８のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号１６の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号２１および２４のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号２２の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号２７および３０のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号２８の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号３３および３６のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号３４の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号３９および３６のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号４０の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結され、
ｃ／について：
前記少なくとも２つのＮＧ標的プライマーが、配列番号４４および４７のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＮＧ特異的プローブが、配列番号４５の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結される、
オリゴヌクレオチド組。
【請求項３４】
請求項３３に記載のオリゴヌクレオチド組であって、
ｂ／について：
前記少なくとも２つのＣＴ標的プライマーが、配列番号７および１２のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＣＴ特異的プローブが、配列番号８もしくは９の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルに任意に連結され、
ａ／について：
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号１５および１８のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号１６もしくは１７の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルに任意に連結されるか、または
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号２１および２４のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号２２もしくは２３の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルに任意に連結されるか、または
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号２７および３０のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号２８もしくは２９の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルに任意に連結されるか、または
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号３３および３６のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号３４もしくは３５の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルに任意に連結されるか、または
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号３９および３６のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号４０もしくは４１の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルに任意に連結され、
ｃ／について：
前記少なくとも２つのＮＧ標的プライマーが、配列番号４４および４７のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＮＧ特異的プローブが、配列番号４５もしくは４６の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルに任意に連結される、
オリゴヌクレオチド組。
【請求項３５】
請求項３３または３４に記載のオリゴヌクレオチド組であって、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、フルオロフォアに連結される、オリゴヌクレオチド組。
【請求項３６】
ａ／  少なくとも２つのＮＧ標的プライマーおよび少なくとも１つのＮＧ特異的プローブ
を含み、
ｂ／  少なくとも２つのＣＴ標的プライマーおよび少なくとも１つのＣＴ特異的プローブ、および／または
ｃ／  少なくとも２つのＭＧ標的プライマーおよび少なくとも１つのＭＧ特異的プローブ
を更に含む、オリゴヌクレオチド組であって、
ｂ／について：
前記少なくとも２つのＣＴ標的プライマーが、配列番号７および１２のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＣＴ特異的プローブが、配列番号８の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結され、
ｃ／について：
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号１５および１８のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号１６の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号２１および２４のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号２２の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号２７および３０のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号２８の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号３３および３６のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号３４の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号３９および３６のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号４０の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結され、
ａ／について：
前記少なくとも２つのＮＧ標的プライマーが、配列番号４４および４７のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＮＧ特異的プローブが、配列番号４５の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルおよび／または少なくとも１つのビーコンアームに任意に連結される、
オリゴヌクレオチド組。
【請求項３７】
請求項３６に記載のオリゴヌクレオチド組であって、
ｂ／について：
前記少なくとも２つのＣＴ標的プライマーが、配列番号７および１２のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＣＴ特異的プローブが、配列番号８もしくは９の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルに任意に連結され、
ｃ／について：
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号１５および１８のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号１６もしくは１７の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルに任意に連結されるか、または
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号２１および２４のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号２２もしくは２３の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルに任意に連結されるか、または
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号２７および３０のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号２８もしくは２９の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルに任意に連結されるか、または
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号３３および３６のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号３４もしくは３５の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルに任意に連結されるか、または
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーが、配列番号３９および３６のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブが、配列番号４０もしくは４１の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルに任意に連結され、
ａ／について：
前記少なくとも２つのＮＧ標的プライマーが、配列番号４４および４７のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＮＧ特異的プローブが、配列番号４５もしくは４６の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも１つの検出ラベルに任意に連結される、
オリゴヌクレオチド組。
【請求項３８】
請求項３６または３７に記載のオリゴヌクレオチド組であって、前記少なくとも１つのＮＧ特異的プローブが、フルオロフォアに連結される、オリゴヌクレオチド組。
【請求項３９】
医薬組成物または増幅組成物であって、
ＣＴ、ＭＧおよびＮＧ含有サンプルに対して請求項１〜１７のいずれか１項の検出方法を実施することにより得られる少なくとも１つのＣＴおよび／またはＭＧおよび／またはＮＧアンプリコンを含み、前記検出方法のリアルタイムマルチプレックスプライマーおよびプローブを更に含むか、または
請求項１８〜２１のいずれか１項の産生方法により得られるＣＴアンプリコンを含み、前記産生方法のリアルタイムマルチプレックスプライマーおよびプローブを更に含むか、または
請求項２２〜２５のいずれか１項の産生方法により得られるＭＧアンプリコンを含み、前記産生方法のリアルタイムマルチプレックスプライマーおよびプローブを更に含むか、または
請求項２６〜２９のいずれか１項の産生方法により得られるＮＧアンプリコンを含み、前記産生方法のリアルタイムマルチプレックスプライマーおよびプローブを更に含むか、または
同一の増幅チューブ内で請求項３０〜３２のいずれか１項のオリゴヌクレオチド組を用いてＣＴ核酸からリアルタイムマルチプレックス増幅により得られるＣＴアンプリコンを含み、前記オリゴヌクレオチド組を更に含むか、または
同一の増幅チューブ内で請求項３３〜３５のいずれか１項のオリゴヌクレオチド組を用いてＭＧ核酸からリアルタイムマルチプレックス増幅により得られるＭＧアンプリコンを含み、前記オリゴヌクレオチド組を更に含むか、または
同一の増幅チューブ内で請求項３６〜３８のいずれか１項のオリゴヌクレオチド組を用いてＮＧ核酸からリアルタイムマルチプレックス増幅により得られるＮＧアンプリコンを含み、前記オリゴヌクレオチド組を更に含む、
組成物。
【請求項４０】
ＣＴおよび／またはＭＧおよび／またはＮＧによる感染を診断するためのキットであって：
−請求項３０〜３８の何れか１項の少なくとも１つのオリゴヌクレオチド組；
−任意に、その使用および／またはヌクレオチドのための説明書
を含むキット。
【請求項４１】
請求項４０に記載のキットであって、更に、配列番号４８のオリゴヌクレオチド、および／または配列番号４９および５２のプライマー対、および／または配列番号５０のプローブ、および／または配列番号５１のプローブを含んでなるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、性感染病（sexually transmitted disease）の原因である３つの異なる細菌種、すなわち、トラコーマクラミジア（Chlamydia trachomatis）(CT)、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）(NG)、および性器マイコプラズマ（Mycoplasma genitalium）(MG)、の検出に関する。
【０００２】
本発明は、特に、リアルタイムPCR、マルチプレックスPCR、またはリアルタイム マルチプレックスPCRにおける、これら３つの種の検出に関する。
【発明の背景】
【０００３】
トラコーマクラミジア(CT)は、クラミジアの一種、偏性細胞内細菌のグループである。これは、性感染病、例えばクラミジアおよび性病性リンパ肉芽腫、ならびにトラコーマ、失明をしばしば引き起こす眼感染を引き起こす。
【０００４】
淋菌(NG)は、淋病の原因であるグラム陰性細菌の一種である。
【０００５】
CTおよびNGの共感染は、頻繁に起こる。
【０００６】
性器マイコプラズマ(MG)は、霊長類の生殖器官および呼吸器官内に生息している、寄生細菌である。MGは、尿道炎に関係すると考えられている。
【０００７】
CTおよび／またはMGおよび／またはNGの存在についての従来の診断は、患者から回収されたサンプルの培養、例えば、種特異的培地上での尿道部試験片の培養によって行われる。このような培養は、長時間を要しかつ条件選択の困難性を伴う。CT、MGおよびNGの場合において、この傾向は最も顕著になる。なぜなら、CTおよびMGの培養は高レベルの技術を要し、また、NGは温度および湿度の変動に非常に敏感であるためである。
【０００８】
したがって、核酸増幅に基づいた診断方法が開発されてきた。
【０００９】
例えば、Roche Diagnosticから入手可能なFDA認可のAmplicorTMキットは、CTまたはNGの検出を可能にする。しかしながら、これはMGを検知することができない。
【００１０】
Visible Geneticsの名前におけるWO 98/11259には、CT、MGおよびNGの共増幅および検出のための方法が開示されている。この方法は、増幅プライマーによる、CT、MGおよびNGターゲットの増幅によって行われる。前述のプライマーによって生産されたアンプリコン（amplicon）の検出は、プライマーの直接的なラベリングによって、あるいはアガロースゲル技術によって行われる。しかしながら、WO 98/11259の方法は、アンプリコン−アニーリングプローブの使用を伴わない（WO 98/11259の9-10ページ参照）。従って、WO 98/11259の方法は、リアルタイム技術ではない。
【００１１】
本発明は、リアルタイム増幅においてCT、MGおよびNGの検出を可能にし、また、リアルタイム増幅において３つの細菌種を検出するために同一チューブ内においてマルチプレックスにおいて一緒に使用することができる、プライマーおよびプローブ、好ましくは標識プローブを提供する。 
有意な特徴として、本発明は、リアルタイムPCR、マルチプレックスPCR、またはマルチプレックス リアルタイムPCRにおいて導入しうる。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、性感染病（sexually transmitted disease）の原因である３つの異なる細菌種、すなわち、トラコーマクラミジア（Chlamydia trachomatis）(CT)、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）(NG)、および性器マイコプラズマ（Mycoplasma genitalium）(MG)、の検出に関する。
【００１３】
本発明は、特に、リアルタイムPCR、マルチプレックスPCR、およびリアルタイム マルチプレックスPCRにおける、これらの３つの種の検出に関する。
【００１４】
本発明は、リアルタイム マルチプレックス増幅によって、CTおよび／またはMGおよび／またはNG、有意にはCTおよびMGおよびNGを検出するために同一チューブ内において一緒に使用することができる、プライマーおよびプローブの設計に特に適合した、参照鋳型配列（reference template sequence）を提供する。
【００１５】
本発明はまた、これらのプライマーおよびプローブ、ならびに本発明のプライマーおよび／またはプローブのうち少なくとも１つを含む、薬学的組成物、生物学的組成物、検出キットおよび診断キットに関する。
【００１６】
以下の例１の終わりにある表１、配列番号リストに規定される配列は、本発明の参照鋳型ポリヌクレオチド、プライマーおよびプローブの代表例である。
【００１７】
本発明はさらに、本発明の少なくとも１つのプライマー対および／または少なくとも１つのプローブの使用を含む、CT、MGおよびNGの検出のための方法、ならびに本発明のプライマーで入手可能なアンプリコンに関する。
【００１８】
発明者の知りうる限り、本発明は、リアルタイム マルチプレックス増幅におけるCTおよびMGおよびNGの検出を最初に記述したものである。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１−１】図１は、CTのpCHL1プラスミドの配列である、受託番号J03321 (配列番号１)のもとで利用可能な配列を示す。
【図１−２】図１は、CTのpCHL1プラスミドの配列である、受託番号J03321 (配列番号１)のもとで利用可能な配列を示す。
【図１−３】図１は、CTのpCHL1プラスミドの配列である、受託番号J03321 (配列番号１)のもとで利用可能な配列を示す。
【図２】図２は、MGの接着遺伝子の5'部位の配列である、受託番号X91074(配列番号２)のもとで利用可能な配列を示す。
【図３−１】図３は、MGの接着遺伝子の配列である、受託番号M31431(配列番号３)のもとで利用可能な配列を示す。
【図３−２】図３は、MGの接着遺伝子の配列である、受託番号M31431(配列番号３)のもとで利用可能な配列を示す。
【図３−３】図３は、MGの接着遺伝子の配列である、受託番号M31431(配列番号３)のもとで利用可能な配列を示す。
【図４】図４は、NGのpilE遺伝子の配列である、受託番号AF042097(配列番号４)のもとで利用可能な配列を示す。
【詳細な説明】
【００２０】
本発明は、３つの性感染性細菌種、すなわち、トラコーマクラミジア(CT)、性器マイコプラズマ(MG)、および淋菌(NG)の検出に関する。
【００２１】
本発明は、リアルタイム マルチプレックス増幅におけるCTおよび／またはMGおよび／またはNGの検出に適した、プライマーおよびプローブの構築および産生を可能にする、核酸参照鋳型配列を提供する。 
本発明は、従って、リアルタイム マルチプレックス増幅におけるCTおよび／またはMGおよび／またはNGの検出に適した、CTプライマー、CTプライマー対、CTプローブ、MGプライマー、MGプライマー対、MGプローブ、NGプライマー、NGプライマー対およびNGプローブを提供する。
【００２２】
本発明のプライマーは、同一チューブ内においてCTおよびMGおよびNGを増幅するために前記同一チューブ内においてマルチプレックスにおいて一緒に混合することができる。
【００２３】
有意には、本発明は、このようなマルチプレックス操作条件におけるリアルタイム検出に適した、プローブを提供する。
【００２４】
従って、本発明のプライマーおよびプローブは、前記同一チューブ内においてリアルタイムにおいてCTおよびMGおよびNGを増幅および検出するために、前記同一チューブ内においてマルチプレックスにおいて一緒に混合することができる。
【００２５】
従って、本発明は、１回（増幅＋検出）操作ステップにおいてCTおよびMGおよびNGの検出を可能にする。
【００２６】
発明者の知りうる限り、本発明は、３つの細菌種（CT、MG、NG）のリアルタイム マルチプレックス検出を最初に記述したものである。
【００２７】
同一サンプル内の３つの細菌種の検出に加えて、本発明は、内部標準（Internal Control）(IC)の使用によって、Taqポリメラーゼ阻害剤の欠失について検査することを可能にするという優位性をもつ。IC、ならびにICプライマーおよびプローブが、以下により詳細に記述される。
【００２８】
したがって、本発明は、４重増幅（CT、MG、NGおよびIC)を可能にする。
【００２９】
本発明は、あらゆる先行技術と比較して非常に速い、３つの細菌種の検出を提供する。また、本発明は、分析用サンプルまたは培養液が汚染される危険性を大きく減少させるので非常に信頼性が高い。 
本発明の手段は、さらに、高い感度と再現能を有する（以下の例４を参照）。
【００３０】
現時点において、MGの全身性の検出が行われていない一方、MGが非淋菌性の尿道炎の原因になること、そして、しばしば子宮頚管炎および子宮内膜炎に関連することが現在知られている。
【００３１】
本発明は、CTおよびNGの同時検出を可能にする常用試験においてMGの全身性検出を可能にする第１の手段を提供する。
【００３２】
本発明は、それゆえ、医師が不適当な抗生物質の処方を回避することを可能にする。
【００３３】
特に、本発明は、以下のものを提供する：
−CTリアルタイム増幅系であって、各CTリアルタイム増幅系が、本発明の少なくとも２つのCTプライマーおよび本発明の少なくとも１つのCTプローブを含むもの、
−MGリアルタイム増幅系であって、各MGリアルタイム増幅系が、本発明の少なくとも２つのMGプライマーおよび本発明の少なくとも１つのMGプローブを含むもの、および
−NGリアルタイム増幅系であって、各NGリアルタイム増幅系が、少なくとも２つのNGプライマーおよび少なくとも１つのNGプローブを含むもの。
【００３４】
またより具体的には、本発明は、リアルタイム増幅系が行われる細菌種について特異的である、CT、MGおよびNGそれぞれを検出することができる、CTリアルタイム増幅系、MGリアルタイム増幅系、およびNGリアルタイム増幅系を提供する。
【００３５】
有意には、本発明は、特異性におけるあらゆる顕著な喪失を伴わずに、同一チューブ内においてマルチプレックスにおいて一緒に使用することができる、CTリアルタイム増幅系、MGリアルタイム増幅系およびNGリアルタイム増幅系を提供する：同一チューブ内においてマルチプレックスにおいて一緒に使用されるときでさえ、
−本発明のこのようなCTリアルタイム増幅系はまた、特異的にはMGおよびNGのリアルタイム増幅系と、あるいはこれらのMGおよびNG系によって生産されたであろうアンプリコンとのあらゆる顕著な交差反応性を示さずに、CTを検出する。
【００３６】
−本発明のこのようなMGリアルタイム増幅系はまた、CTおよびNGのリアルタイム増幅系と、あるいはこれらのCTおよびNG系によって生産されたであろうアンプリコンとのあらゆる顕著な交差反応性を示さずに、MGを検出する。
【００３７】
−本発明のこのようなMGリアルタイム増幅系はまた、CTおよびMGのリアルタイム増幅系、またはこれらのCTおよびMG系によって生産されたであろうアンプリコンとのあらゆる顕著な交差反応性を示さずに、NGを検出する。
【００３８】
発明者の知りうる限り、本発明のリアルタイム増幅系は、ヒトDNAを検出しない（交差ハイブリダイゼーションを起こさない)。
【００３９】
本出願はまた、薬学的組成物、生物学的組成物、検出キットおよび診断キットに関し、これらは本発明の少なくとも１つのプライマーおよび／またはプローブ、好ましくは本発明の少なくとも２つのプライマーおよび少なくとも１つのプローブ、より好ましくは本発明の少なくとも１つのリアルタイム増幅系、最も好ましくは、本発明の少なくとも１つのＣＴおよび少なくとも１つのＭＧおよび少なくとも１つのＮＧリアルタイム増幅系を含む。
【００４０】
本出願はまた、少なくとも１つのトラコーマクラミジア(CT)および／または少なくとも１つの性器マイコプラズマ(MG)および／または少なくとも１つの淋菌(NG)の検出方法に関する。
【００４１】
前記検出は、通常はサンプル中において行なわれる。
【００４２】
「核酸材料を含むサンプル」とは、少なくとも１つの核酸を含む任意のサンプル、例えば、生体試料（細胞培養、動物またはヒトから回収されたサンプルなど）、好ましくはCTおよび／またはMGおよび／またはNGを含む可能性のある組織または液体から回収されたサンプル、例えば、子宮頚部のサンプル、最も好ましくは、尿サンプル(最初の排尿時の尿サンプルなど)を意味する。
【００４３】
有意には、本発明は、尿サンプルにおいてCTおよび／またはMGおよび／またはNGの信頼しうる検出を可能にする。
【００４４】
前記サンプルは、任意的には、当業者に知られた任意の技術に基づいてさらなる処理および／または精製を行い、増幅効率および／または定性的精度および／または量的精度を向上させてもよい。従って、前記サンプルは、精製、単離、または化学合成によって得られた核酸から、排他的または本質的になる。手段は、核酸、例えば生体試料からのDNAを単離または精製することができる、例えば、頚部切屑からDNAを単離または精製することができる当業者に利用可能である（例えば、QIAamp-DNA Mini-Kit; Qiagen, Hilden, Germany）。
【００４５】
前記検出は、少なくとも１つのアンプリコンが、増幅プライマーによる増幅によって、前記サンプルから、あるいはその核酸物質から産生された、あるいはされるか否かの判定を含み、ここで、陽性判定は、少なくとも１つのCTおよび／または少なくとも１つのMGおよび／または少なくとも１つのNGが、前記サンプル中に存在することを示す。
【００４６】
前記判定は、前記少なくとも１つのアンプリコンにアニールする、少なくとも１つのプローブによって行うことができる。
【００４７】
本発明の検出プロセスは、以下の工程を含むことができる：
−前記プライマーによる少なくとも１つのアンプリコンの産生に適した条件下（すなわち、CTおよび／またはMGおよび／またはNGが前記サンプル中に存在していた場合、検出されるべき前記少なくとも１つのCTおよび／またはMGおよび／またはNGからの少なくとも１つのアンプリコンの、前記プライマーによる産生に適した条件下)、前記サンプルまたはこの核酸物質を少なくとも２つの増幅プライマーと接触させる工程と、
−前記プライマーによって、例えば、前記少なくとも２つのプライマーによって産生されたアンプリコンにアニールする少なくとも１つの検出プローブによって、好ましくは本発明の少なくとも１つのプローブを含むリアルタイム増幅において、少なくとも１つのアンプリコンが産生された、あるいは産生されるか否かについて判定する工程。
【００４８】
本発明のプロセスにおいて、前記増幅プライマーは以下のものを含む：
−ＣＴをターゲットにし、かつリアルタイム マルチプレックス増幅においてＣＴの検出に適した、少なくとも２つのプライマー、および／または
−ＭＧをターゲットにし、かつリアルタイム マルチプレックス増幅においてＭＧの検出に適した、少なくとも２つのプライマー、および／または
−ＮＧをターゲットにし、かつリアルタイム マルチプレックス増幅においてＮＧの検出に適した、少なくとも２つのプライマー。
【００４９】
本発明のプロセスにおいて、前記少なくとも１つのプローブは、好ましくは：
−リアルタイム マルチプレックス増幅においてＣＴの検出に適した、少なくとも１つのＣＴ標的プローブ、および／または
−リアルタイム マルチプレックス増幅においてＭＧの検出に適した、少なくとも１つのＭＧ標的プローブ、および／または
−リアルタイム マルチプレックス増幅においてＮＧの検出に適した、少なくとも１つのＮＧ標的プローブ。
【００５０】
本発明の参照鋳型配列、プライマーおよびプローブは、リアルタイム マルチプレックス増幅においてＣＴ、ＭＧおよびＮＧを検出できるように最適化されるので、これらの単一性を満たす実施形態は当然、本出願によって包含される（例えば、本発明の１つのプライマー対を含む、リアルタイム、または非リアルタイムの単一性の実施形態）。
【００５１】
全く同様に、本発明は、リアルタイムにおいてＣＴ、ＭＧおよびＮＧをマルチプレックスに検出することができる特別な特徴を提供するので、本発明のプローブを含まない、あるいは本発明の少なくとも１つのプローブを含むがリアルタイムにおいてではない本発明のプライマーの実施形態も当然、本出願によって包含される。
【００５２】
また、本発明のプライマーは、プライマー対として設計されているので、各プライマーは、個々に本出願によって包含される。
【００５３】
以下の例１の終わりにある表１には、本発明の参照鋳型ポリヌクレオチド、プライマーおよびプローブの代表である、SEQ ID配列が列挙されている。表１にはその結果、本発明の２つのＣＴリアルタイム増幅系、５つのＭＧリアルタイム増幅系、および１つのリアルタイム増幅系が示されている。これらのシステムは、リアルタイム マルチプレックス増幅においてＣＴおよびＭＧおよびＮＧを検出するための同一のチューブにおいて一緒に使用することができる。
【００５４】
ＣＴをターゲットにし、かつリアルタイム マルチプレックス増幅においてＣＴの検出に適している前記少なくとも２つのプライマーは、オリゴヌクレオチドであり、これらの配列は、少なくとも１つのＣＴ参照鋳型配列の増幅において、フォワードおよびリバースプライマーとしての使用にそれぞれ適している。ここで、前記少なくとも１つのＣＴ参照鋳型配列は、配列番号１（CT pCHL1プラスミド； J03321）のＣＴ配列の位置5571-5760（配列番号５）からなる断片、または適切な参照鋳型配列であるその性質を保持した保存的亜断片である。これらの断片群は、ＣＴ標的プライマーを構築および産生し、ＣＴのリアルタイム マルチプレックス検出を可能にする。ＣＴをターゲットにする前記少なくとも２つのプライマーは、好ましくは14〜30ヌクレオチドからなる（各々互いに独立して）。
【００５５】
前記少なくとも１つのＣＴ参照鋳型配列は、有意には配列番号１のＣＴ配列の位置5580〜5754（配列番号６）からなる断片、または前記断片の全長にわたって前記断片と完全に相補的である配列である。
【００５６】
ＭＧをターゲットにし、かつリアルタイム マルチプレックス増幅においてＭＧの検出に適切である前記少なくとも２つのプライマーは、オリゴヌクレオチドであり、少なくとも１つのＭＧ参照鋳型配列の増幅において、それぞれ、フォワードおよびリバースプライマーとしての使用に適した配列である。ここで、前記少なくとも１つのＭＧ参照鋳型配列は、以下のものからなる断片である：
−配列番号２（ＭＧ接着遺伝子；X91074の5'領域）のＭＧ配列の、あるいは適切な参照鋳型配列になる性質を保持した、その保存的亜断片の位置1-270（配列番号13）。これらはＭＧ標的プライマーを構築および産生し、ＭＧのリアルタイム マルチプレックス検出を可能にする。
【００５７】
−配列番号３（ＭＧ接着遺伝子；Ｍ31431）のＭＧ配列の、あるいは適切な参照鋳型配列になる性質を保持した、その保存的亜断片の位置1140-1290（配列番号１９）。これらはＭＧ標的プライマーを構築および産生し、ＭＧのリアルタイム マルチプレックス検出を可能にする。
【００５８】
−配列番号３のＭＧ配列の、または適切な参照鋳型配列になる性質を保持した、その保存的亜断片の位置1060-1250（配列番号２５）。これらはＭＧ標的プライマーを構築および産生し、ＭＧのリアルタイム マルチプレックス検出を可能にする。
【００５９】
−配列番号３のＭＧ配列の、または適切な参照鋳型配列になる性質を保持した、その保存的亜断片の位置1520-1710（配列番号３１）。これらはＭＧ標的プライマーを構築および産生し、ＭＧのリアルタイム マルチプレックス検出を可能にする。
【００６０】
−配列番号３のＭＧ配列の、または適切な参照鋳型配列になる性質を保持した、その保存的亜断片の位置1500-1710（配列番号３７）。これらはＭＧ標的プライマーを構築および産生し、ＭＧのリアルタイム マルチプレックス検出を可能にする。
【００６１】
ＭＧをターゲットにする、前記少なくとも２つのプライマーは、好ましくは14〜30ヌクレオチドからなる（各々互いに独立して）。
【００６２】
前記少なくとも１つのＭＧ参照鋳型配列は、有意には以下の配列である：
−配列番号２のＭＧ配列の位置2-259（配列番号１４）からなる断片、もしくは前記断片の全長にわたって前記断片に完全に相補的である配列、または
−配列番号３のＭＧ配列の位置1144-1283（配列番号２０）からなる断片、もしくは前記断片の全長にわたって前記断片に完全に相補的である配列、または
−配列番号３のＭＧ配列の位置1064-1249（配列番号２６）からなる断片、もしくは前記断片の全長にわたって前記断片に完全に相補的である配列、または
−配列番号３のＭＧ配列の位置1527-1704（配列番号３２）からなる断片、もしくは前記断片の全長にわたって前記断片に完全に相補的である配列、または
−配列番号３のＭＧ配列の位置1501-1704（配列番号３８）からなる断片、もしくは前記断片の全長にわたって前記断片に完全に相補的である配列。
【００６３】
前記ＭＧ参照鋳型配列は、ＭＧ標的プライマーおよびＭＧ特異的プライマーを構築および産生するための適切な参照である特別な技術的特徴を共有する。これらは、同一チューブ内においてマルチプレックスにおいて一緒に使用することができ、前記同一チューブ中においてリアルタイムにおいて、CTおよび／またはMGおよび／またはNG、有意にはＣＴおよびＭＧおよびＮＧを特異的に検出する。
【００６４】
NGをターゲットにし、かつリアルタイム マルチプレックス増幅におけるNGの検出に適している、前記少なくとも２つのプライマーは、オリゴヌクレオチドであり、その配列は、少なくとも１つのＮＧ参照鋳型配列の増幅において、フォワードおよびリバースプライマーとして、それぞれ使用に適している。前記少なくとも１つのNG参照鋳型配列は、配列番号４のＮＧ配列（NG pilE遺伝子; AF042097）の位置101-380（配列番号４２）、または適切な参照鋳型配列であるという性質を保持し、NGのリアルタイム マルチプレックス検出を可能にするＮＧ標的プライマーを構築および産生する、その保存的サブフラグメントからなる断片である。
【００６５】
NGをターゲットすることを目的とした前記少なくとも２つのプライマーは、好ましくは14〜30ヌクレオチドからなる（各々互いに独立して）。
【００６６】
前記少なくとも１つのNG参照鋳型配列は、有意には配列番号４のNG配列の位置114-365（配列番号43）からなる断片、または前記断片の全長にわたって前記断片に完全に相補的である配列である。
【００６７】
「14〜30ヌクレオチドからなる」とは、「14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30ヌクレオチドからなる」を意味する。
【００６８】
同じことは、本出願において記載された、任意の範囲に準用して適用される。
【００６９】
プライマーのヌクレオチド長は、互いから独立して選択することができる。
【００７０】
参照鋳型配列「増幅中において、それぞれ、フォワードおよびリバースプライマーとして使用に適した」とは、望ましい配列または配列番号「からなり」、これらのフォワードおよびリバース プライマーは、参照鋳型配列に隣接しないが、これらは望ましい参照鋳型配列からなるように増幅された配列を可能にする正確な末端位置においてアニールすることを意味する。
【００７１】
より好ましくは、本発明のプライマーは、14〜30のヌクレオチドからなり、その配列は、その参照鋳型配列またはその保存的サブフラグメントの、あるいは、この参照鋳型配列またはその相補的配列の全長にわたって前記参照鋳型配列またはその保存的サブフラグメントと完全に相補的である配列の、3'末端または5'末端に含まれる同じ長さの配列と、少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、さらにより好ましくは少なくとも92％、またさらにより好ましくは95％、最も好ましくは少なくとも97％の同一性を有する。
【００７２】
例えば、本発明のプライマー対は、各々独立して14〜30ヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよびリバースプライマーであって、前記フォワードプライマーの配列は、前記参照鋳型配列またはその相補的な配列の全長にわたって、前記参照鋳型配列またはその保存的サブフラグメントと完全に相補的である配列の5'末端に含まれる同じ長さの配列と、少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、さらにより好ましくは少なくとも92％、またさらにより好ましくは95％、最も好ましくは少なくとも97％の同一性を有する。
【００７３】
本発明のプライマーは、好ましくは14〜28、より好ましくは15〜28、さらにより好ましくは16〜27、またさらにより好ましくは16〜26、最も好ましくは17〜25ヌクレオチドからなり、例えば、17、18、19、20、21、22、23、24または25ヌクレオチドからなる。
【００７４】
前記少なくとも２つのＣＴ標的プライマーは、好ましくは配列番号７の１つのオリゴヌクレオチド（フォワードプライマー）またはその保存的変異体、および配列番号１２の１つのオリゴヌクレオチド（リバースプライマー）またはその保存的変異体である。
【００７５】
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーは、好ましくは：
−配列番号１５の１つのオリゴヌクレオチド（フォワードプライマー）またはその保存的変異体、および配列番号１８の１つのオリゴヌクレオチド（リバースプライマー）またはその保存的変異体であり、または
−配列番号２１；２７；３３；３９、またはその保存的変異体からなる群から選択された少なくとも１つのオリゴヌクレオチドまたはその保存的変異体、および配列番号２４；３０；３６からなる群から選択された少なくとも１つのオリゴヌクレオチドまたはその保存的変異体である。
【００７６】
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーは、例えば、配列番号２１；２７、またはその保存的変異体からなる群から選択された少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、および配列番号２４；３０；３６、またはその保存的変異体からなる群から選択された少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであってもよい。
【００７７】
前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーは、好ましくは配列番号２１の１つのオリゴヌクレオチドまたはその保存的変異体、および配列番号２４；３６からなる群から選択された少なくとも１つのオリゴヌクレオチドまたはその保存的変異体である。
【００７８】
より好ましくは、前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーは、配列番号２１の１つのオリゴヌクレオチド、またはその保存的変異体、および配列番号２４の１つのオリゴヌクレオチドまたはその保存的変異体である。
【００７９】
より好ましくは、前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーは、配列番号２７の１つのオリゴヌクレオチドまたはその保存的変異体、および配列番号２４；３０；３６からなる群から選択された少なくとも１つのオリゴヌクレオチドまたはその保存的変異体である。最も好ましくは、前記少なくとも２つのMG標的プライマーは、配列番号２７の１つのオリゴヌクレオチドまたはその保存的変異体、および配列番号３０の１つのオリゴヌクレオチドまたはその保存的変異体である。
【００８０】
前記少なくとも２つのMG標的プライマーは、好ましくは配列番号３６の１つのオリゴヌクレオチドまたはその保存的変異体、および配列番号２１；２７；３３および３９からなる群から選択された少なくとも１つのオリゴヌクレオチドまたはその保存的変異体である。
【００８１】
最も好ましくは、前記少なくとも２つのMG標的プライマーは、配列番号３３の１つのオリゴヌクレオチド、配列番号３６の１つのオリゴヌクレオチドであり；あるいは配列番号３９の１つおよび配列番号３６の１つのオリゴヌクレオチドである。
【００８２】
前記少なくとも２つのNG標的プライマーは、好ましくは配列番号４４の１つのオリゴヌクレオチドまたはその保存的変異体、および配列番号４７の１つのオリゴヌクレオチドまたはその保存的変異体である。
【００８３】
このようなプライマーの保存的変異体は、より具体的には、これらの変異体プライマーを含み、この配列は、上述した配列番号プライマー配列の少なくとも１つと、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９２％、またさらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％の同一性を有する。
【００８４】
それぞれ、CTまたはMGまたはNGの検出に適した、前記少なくとも１つのCT-またはMG-またはNG-標的プローブは、リアルタイム マルチプレックス増幅においてオリゴヌクレオチドであり、その配列は、それぞれ、前記少なくとも２つのCT-またはMG-またはNG-標的プライマーによって、CTまたはMGまたはNGから産生された少なくとも１つのアンプリコンの検出のためのプローブとしての使用に適している。
【００８５】
このようなCT-またはMG-またはNG-標的プローブの配列は、それゆえ、CT-またはMG-またはNG-標的プライマーの配列とは必然的に異なる。
【００８６】
有意には、前記少なくとも１つのCT標的プローブは、少なくとも中程度のストリンジェンシーの条件下でNGまたはMGアンプリコンとアニーリングせずに、CTアンプリコンとアニールするCT-特異的プローブである。
【００８７】
有意には、前記少なくとも１つのMG-標的プローブは、少なくとも中程度のストリンジェンシーの条件下でCTまたはNGアンプリコンとアニーリングせずに、MGアンプリコンとアニールするMG-特異的プローブである。
【００８８】
有意には、前記少なくとも１つのNG-標的プローブは、少なくとも中程度のストリンジェンシーの条件下でCTまたはMGアンプリコンとアニーリングせずに、NGアンプリコンとアニールするNG-特異的プローブである。
【００８９】
前記少なくとも１つのCT-特異的プローブは、好ましくは15〜60ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであって、前記CT参照鋳型配列の同じサイズの断片、あるいは前記参照鋳型配列の全長にわたって、前記CT参照鋳型配列と完全に相補的である配列の同じサイズの断片であって、少なくとも中程度のストリンジェンシー条件下において、前記CT参照鋳型配列またはその相補的配列とアニールする断片と十分に相補的であり、かつ、前記MGまたはNG参照鋳型配列の、あるいは前記MGまたはNG参照鋳型配列の全長にわたって、前記MGまたはNG参照鋳型配列と完全に相補的である配列の同じサイズの任意の断片であって、前記と同じストリンジェンシー条件下において、前記MGまたはNG参照鋳型配列またはその相補的配列とアニールする断片と十分に相補的ではない。
【００９０】
前記少なくとも１つのMG-特異的プローブは、好ましくは15〜60ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであって、前記MG参照鋳型配列の同じサイズの断片、あるいは前記参照鋳型配列の全長にわたって、前記MG参照鋳型配列と完全に相補的である配列の同じサイズの断片であって、少なくとも中程度のストリンジェンシー条件下において、前記MG参照鋳型配列またはその相補的配列とアニールする断片と十分に相補的であり、かつ、前記CTまたはNG参照鋳型配列の、あるいは前記CTまたはNG参照鋳型配列の全長にわたって、前記CTまたはNG参照鋳型配列と完全に相補的である配列の同じサイズの任意の断片であって、前記と同じストリンジェンシー条件下において、前記CTまたはNG参照鋳型配列またはその相補的配列とアニールする断片と十分に相補的ではない。
【００９１】
前記少なくとも１つのNG-特異的プローブは、好ましくは15〜60ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであって、前記NG参照鋳型配列の同じサイズの断片、あるいは前記参照鋳型配列の全長にわたって、前記NG参照鋳型配列と完全に相補的である配列の同じサイズの断片であって、少なくとも中程度のストリンジェンシー条件下において、前記NG参照鋳型配列またはその相補的配列とアニールする断片と十分に相補的であり、かつ、前記CTまたはMG参照鋳型配列の、あるいは前記CTまたはMG参照鋳型配列の全長にわたって、前記CTまたはMG参照鋳型配列と完全に相補的である配列の同じサイズの任意の断片であって、前記と同じストリンジェンシー条件下において、前記CTまたはMG参照鋳型配列またはその相補的配列とアニールする断片と十分に相補的ではない。
【００９２】
より好ましくは、前記少なくとも１つのCT-特異的プローブは、前記CT参照鋳型配列の少なくとも１５ヌクレオチドの断片であり、あるいは前記参照鋳型配列の全長にわたって前記CT参照鋳型配列と完全に相補的である配列の断片である。ここで、前記断片は、少なくとも中程度のストリンジェンシーの条件下で前記MGまたはNG参照鋳型配列とアニールしない。
【００９３】
より好ましくは、前記少なくとも１つのMG-特異的プローブは、前記MG参照鋳型配列の少なくとも１５ヌクレオチドの断片であり、あるいは前記参照鋳型配列の全長にわたって前記MG参照鋳型配列と完全に相補的である配列の断片である。ここで、前記断片は、少なくとも中程度のストリンジェンシーの条件下で前記CTまたはNG参照鋳型配列とアニールしない。
【００９４】
より好ましくは、前記少なくとも１つのNG-特異的プローブは、前記NG参照鋳型配列の少なくとも１５ヌクレオチドの断片であり、あるいは前記参照鋳型配列の全長にわたって前記NG参照鋳型配列と完全に相補的である配列の断片である。ここで、前記断片は、少なくとも中程度のストリンジェンシーの条件下で前記CTまたはMG参照鋳型配列とアニールしない。
【００９５】
「少なくとも中程度のストリンジェンシーの条件」とは、中程度の、強度の、非常に強度の、条件を意味する。
【００９６】
用語「中程度の」、「強度の」および「非常に強度の」は、当該技術分野における通常の意味が与えられる。
【００９７】
ストリンジェンシーは、異なる程度の相補性をもつポリヌクレオチド配列の結合を最適化するために選択されたハイブリダイゼーション条件を意味する。ストリンジェンシーは、温度、塩条件、ハイブリダイゼーション混合物中の有機溶媒の存在、およびハイブリダイズする配列の長さおよび塩組成物および塩基ミスマッチングの程度、およびパラメーターの組み合わせは、任意の１つの因子の絶対的測定よりもより重要である。
【００９８】
中程度のストリンジェンシーの例示的条件は、以下のものを含む：
−55〜65℃で8時間にわたって５×ＳＳＣ、２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、100マイクログラム／mL 一本鎖ＤＮＡ中、フィルター結合ＤＮＡとハイブリダイゼーションさせ、0.2×ＳＳＣおよび0.2％ＳＤＳ中50〜55℃で30分間にわたって洗浄する。
【００９９】
強度のストリンジェンシーの例示的条件は、以下のものを含む：
−55〜65℃で8時間にわたって５×ＳＳＣ、２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、100マイクログラム／mL 一本鎖ＤＮＡ中、フィルター結合ＤＮＡとハイブリダイゼーションさせ、0.2×ＳＳＣおよび0.2％ＳＤＳ中60〜65℃で30分間にわたって洗浄する。
【０１００】
非常に強度のストリンジェンシーの例示的条件は、以下のものを含む：
−55〜65℃で8時間にわたって５×ＳＳＣ、２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、100マイクログラム／mL 一本鎖ＤＮＡ中、フィルター結合ＤＮＡとハイブリダイゼーションさせ、0.1×ＳＳＣおよび0.1％ＳＤＳ中60〜65℃で30分間にわたって洗浄する。
【０１０１】
最も好ましくは、リアルタイムマルチプレックス増幅中においてＣＴの検出に適している、前記少なくとも１つのＣＴ-特異的プローブは、好ましくは：
ｉ．前記ＣＴ参照鋳型配列の少なくとも15ヌクレオチドの断片、または前記参照鋳型配列の全長にわたって前記ＣＴ参照鋳型配列と完全に相補的である配列の断片、または
ｉｉ．少なくとも１つのヌクレオチドの欠失および／または置換および／または付加によって、前記ｉの断片から誘導され、かつＣＴ-特異的プローブである能力を保持した、その保存的変異体であって、前記ＮＧまたはＭＧ参照鋳型配列とアニールしない断片、例えば、その配列が前記ｉの断片の全長にわたって前記ｉの断片と少なくとも９０％の同一性を有する、前記ｉの断片の保存的変異体。
【０１０２】
最も好ましくは、リアルタイムマルチプレックス増幅中においてＭＧの検出に適している、前記少なくとも１つのＭＧ-特異的プローブは、好ましくは：
ｉｉｉ．前記ＭＧ参照鋳型配列の少なくとも１５ヌクレオチドの断片、または前記参照鋳型配列の全長にわたって前記ＭＧ参照鋳型配列と完全に相補的である配列の断片、または
ｉｖ．少なくとも１つのヌクレオチドの欠失および／または置換および／または付加によって、前記ｉの断片から誘導され、かつＭＧ-特異的プローブである能力を保持した、その保存的変異体であって、前記ＣＴまたはＮＧ参照鋳型配列とアニールしない断片、例えば、その配列が前記ｉｉｉの断片の全長にわたって前記ｉｉｉの断片と少なくとも９０％の同一性を有する、前記ｉｉｉの断片の保存的変異体。
【０１０３】
最も好ましくは、リアルタイムマルチプレックス増幅中においてＮＧの検出に適している、前記少なくとも１つのＮＧ-特異的プローブは、好ましくは：
ｖ．前記ＮＧ参照鋳型配列の少なくとも１５ヌクレオチドの断片、または前記参照鋳型配列の全長にわたって前記ＮＧ参照鋳型配列と完全に相補的である配列の断片、または
ｖｉ．少なくとも１つのヌクレオチドの欠失および／または置換および／または付加によって、前記ｉの断片から誘導され、かつＮＧ-特異的プローブである能力を保持した、その保存的変異体であって、前記ＣＴまたはＭＧ参照鋳型配列とアニールしない断片、例えば、その配列が前記ｖの断片の全長にわたって前記ｖの断片と少なくとも９０％の同一性を有する、前記ｖの断片の保存的変異体（グローバル アライメント、「ニードル」アライメントとも呼ばれている）。
【０１０４】
前記同一性のパーセンテージは、好ましくは、少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、さらにより好ましくは少なくとも９３％、またさらにより好ましくは少なくとも９４％、最も好ましくは少なくとも９５％、例えば、９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％である。
【０１０５】
本発明のプローブは、少なくとも１５ヌクレオチドを含む。例えば、これは１５〜６０ヌクレオチドからなる。本発明のプローブは、好ましくは１５〜５０、より好ましくは１５〜４０、さらにより好ましくは１５〜３０、またさらにより好ましくは１６〜３０、またさらにより好ましくは１８〜３０、最も好ましくは１９〜３０、さらに最も好ましくは２１〜２９、またさらに最も好ましくは２２〜２７ヌクレオチドからなり、例えば、２２、２３、２４、２５、２６または２７ヌクレオチドである。
【０１０６】
前記少なくとも１つのＣＴ-特異的プローブは、好ましくは、配列番号８または１０（ＣＴプローブＳＣＴ175bおよび175c）であり、あるいはこの配列番号の配列の全長にわたってこの配列番号の配列に完全に相補的である配列である。
【０１０７】
前記少なくとも１つのMG-特異的プローブは、好ましくは、配列番号16；22；28；34および40（ＭＧプローブSF-MG258c、MGBR140c、MGBR186j、MGBR178q、MGBR204u）からなる群から選択されるか、あるいはこれらの配列番号の配列の全長にわたって、これらの配列番号の配列と完全に相補的である配列である。
【０１０８】
前記少なくとも１つのNG-特異的プローブは、配列番号４５（ＮＧプローブpilEc）であるか、あるいはこの配列番号の配列の全長にわたって、この配列番号の配列と完全に相補的である配列である。
【０１０９】
本発明のプローブは、少なくとも１つの検出ラベル、および／またはＣＴ、ＭＧおよびＮＧと関連せず、かつクエンチャーまたはリポーター（例えばフルオロフォア）を担持する、少なくとも１つのヌクレオチドアームに連結させることができる。
【０１１０】
TaqmanTMプローブ（加水分解プローブ）、分子ビーコンTM（ビーコンプローブまたは分子ビーコンプローブ）、およびScorpionTMプローブを含む、プローブの様々なフォーマット（タイプ）が、当業者に知られている。
【０１１１】
これは、例えば、少なくとも１つのビーコンアーム、または少なくとも１つのScorpionTMアーム、好ましくは5'および／または3'におけるこのようなアームの少なくとも１つ、最も好ましくは、それぞれ、5'におけるおよび3'における、２つのこのようなアームに連結されていてもよい。
【０１１２】
好ましいフォーマットの１つは、ビーコンフォーマットである。
【０１１３】
分子ビーコンの構造は、以下のとおりである。標的配列に関連しない短いヌクレオチド配列（いわゆるビーコンアーム）は、プローブの両末端に共有結合する。短い非関連性アームは、プローブの5'において連結され、かつ蛍光基でラベルされる（例えば、蛍光色素または蛍光マーカー）。もう1つの非関連性アームは、プローブの3'末端と連結し、蛍光クエンチング基でラベルされる。したがって、分子ビーコンは、反対側でフルオロフォアおよびクエンチャーを有する。5'の短いアームは、3'におけるものと完全に相補的であり、これらは一緒にアニールすることができ、したがって、溶液中のターゲットにハイブリダイズしなかったとき、ヘアピン構造をとる。このヘアピン構造において、クエンチャーおよび蛍光色素は互いに非常に近く、フルオロフォアを効率的にクエンチングすることができる。しかしながら、プローブがターゲット分子と遭遇したとき、ビーコンアームTmとプローブTmの値が適切に選択されるとき（理論的には：プローブTm＞ビーコンアームＴｍ＞プライマーＴｍ、ここでＴｍは対象の融解温度である）、アニーリングはヘアピン構造について支持される。フルオロフォアおよびクエンチャーは互いに離れ、フルオロフォアはその後、適切な光の励起によって照射されたとき、蛍光を発することができる。ＰＣＲが進行するとき、増幅産物の蓄積、および任意の所与のサイクルでの蛍光の量は、その時間に存在する増幅産物の量に依存する（例えば、Sanjay Tyagi and Fred Russell Kramer, Nature Biotechnology 1996, volume 14, pages 303-308; Nature Biotechnology 1998, volume 16, pages 49-53を参照）。
【０１１４】
（所見：3'末端でフルオロフォアを連結することができる一方、5'末端でクエンチャーを接着することができる）
模式的に、前記プローブは、以下の式（分子ビーコンフォーマット）を有することができる。
【０１１５】
5'フルオロフォア-(arm1)-プローブ-(arm2)-クエンチャー3'
5'クエンチャー-(arm1)-プローブ-(arm2)-フルオロフォア3'
ここで、arm1およびarm2は、適切なストリンジェンシー条件下でヘアピン構造の形成を可能にする、例えば3〜10ヌクレオチド、好ましくは5、6、7ヌクレオチドの範囲内において任意の短いヌクレオチド配列とすることができる。すなわち、arm1およびarm2は、所望のストリンジェンシー条件下でアニールするために完全に相補的である（標準的なPCRストリンジェンシー条件は、例えば、55〜65℃のアニーリング温度および4〜8mMのMg濃度を含む）。しかしながら、arm1およびarm2は、プローブの標的配列と関連性がない、すなわち、arm1とarm2との間のアニーリングから生じるヘアピン構造は、主としてプローブについての唯一の可能な二次構造である。当業者は、所与のプローブについてのこのようなアームを選択する方法を知るであろう。
【０１１６】
例示的ビーコンアームは、以下の例１において与えられる。
【０１１７】
フルオロフォアは、本明細書中、当業者に周知の任意の蛍光マーカー／色素と理解される。このような適切な蛍光マーカーの例には、Fam、Hex、Tet、Joe、Rox、Tamra、Max、Edans、Cy色素、例えばCy5、フルオレセイン（Fluorescein）、クマリン（Coumarin）、エオシン（Eosine）、ローダミン（Rhodamine）、ボディピィ（Bodipy）、アレクサ（Alexa）、カスケードブルー（Cascade Blue）、ヤキマイエロー（Yakima Yellow）、ルシファーイエロー（Lucifer Yellow）およびテキサスレッド（Texas Red）（これらの全ては商標である）、ATTO色素のファミリーが含まれる。
【０１１８】
クエンチャーは、当業者に周知の任意のクエンチャーとして理解される。このようなクエンチャーの例には、Dabcyl、Dark Quencher、Eclipse Dark Quencher、ElleQuencher、Tamra、BHQおよびQSY（これらの全ては商標である）が含まれる。
【０１１９】
当業者であれば、色素／クエンチャーのどの組み合わせがプローブをデザインするときに適切であるか分かるであろう。
【０１２０】
本発明の好ましい実施態様において、前記プローブのスペクトル性質は互いに干渉しないように選択することができる。特に、プローブがマルチプレックスに使用されるとき、各シグナルプローブは、それ自体のフルオロフォアを互いにスペクトル的に顕著に異ならせることができる。すなわち、吸収／発光スペクトルは、基本的にオーバーラップしない。これは優位には全ての単一プローブについて低ノイズのマルチプレックス検出を可能にし、個々のシグナルは検出において互いに干渉しないことが確かめられる。
【０１２１】
マルチプレックスに一緒に使用することができるこれらの色素の例には、FamとTamra、FamとTamraとTexas Redが含まれる。
【０１２２】
一緒に使用する適切な色素の選択はまた、増幅装置に含まれたフィルターに依存してもよい。
【０１２３】
前記少なくとも１つのＣＴ特異的プローブは、最も好ましくは、配列番号９または１１（ビーコンアームを含むＣＴプローブＳＣＴ175bおよび175c）、またはこの配列番号の配列の全長にわたって、この配列番号の配列に完全に相補的である配列である。
【０１２４】
前記少なくとも１つのMＧ特異的プローブは、最も好ましくは、配列番号１７；２３；２９；３５および４１（ビーコンアームを含むMGプローブSF−MG258c、MGBR 140c、MGBR 186j、MGBR 178q、MGBR 204u)からなる群から選択され、あるいはこの配列番号の配列の全長にわたって、この配列番号の配列に完全に相補的な配列である。
【０１２５】
前記少なくとも１つのNG特異的プローブは、最も好ましくは、配列番号４６(ビーコンアームを含むNGプローブpilEc)であり、あるいはこの配列番号の配列の全長にわたって、この配列番号の配列に完全に相補的な配列である。
【０１２６】
前記少なくとも１つのＣＴまたはＭＧ特異的プローブはまた、上述したような、前記プローブの配列番号の保存的変異体であるオリゴヌクレオチド、すなわち、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失および／または置換および／または付加によって前記配列番号の配列から誘導され、かつＣＴまたはＭＧまたはＮＧ特異的プローブである能力を保持したもの、例えば、前記配列番号の配列の保存的変異体であって、その配列が、前記配列番号の配列の全長にわたって、前記配列番号の配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列（グローバル アライメント、「ニードル」アライメントとも呼ばれている）であってもよい。
【０１２７】
前記ＣＴ、ＭＧおよびＮＧ参照鋳型配列によって共有された特異的な技術的特徴の一つは、これらがＣＴ、ＭＧおよびＮＧ標的プライマーならびにＣＴ、ＭＧおよびＮＧ特異的プローブを構築および産生するのに適している、参照鋳型配列であることである。これらは、少なくとも１つのCTおよび／または少なくとも１つのMGおよび／または少なくとも１つのNG（好ましくは、同一のチューブにおいてリアルタイムにおいて、少なくとも１つのCTおよび少なくとも１つのMGおよび少なくとも１つのNG）を特異的に検出するために同一のチューブ内においてマルチプレックスに一緒に使用することができる。
【０１２８】
好ましくは、前記少なくとも２つのＣＴ標的プライマーは、配列番号７の１つのオリゴヌクレオチドおよび配列番号１２の１つのオリゴヌクレオチドであり、かつ前記少なくとも１つのＣＴ特異的プローブは、配列番号８；９；１０；１１からなる群から選択される。
【０１２９】
好ましくは、前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーは、配列番号１５の１つのオリゴヌクレオチドおよび配列番号１８の１つのオリゴヌクレオチドであり、かつ前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブは、配列番号１６または１７の配列、またはこの配列番号の配列の全長にわたって、この配列番号の配列に完全に相補的である配列である。
【０１３０】
好ましくは、前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーは、配列番号２１の１つのオリゴヌクレオチドおよび配列番号２４の１つのオリゴヌクレオチドであり、かつ前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブは、配列番号２２または２３の配列、またはこの配列番号の配列の全長にわたって、この配列番号の配列に完全に相補的である配列である。
【０１３１】
好ましくは、前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーは、配列番号２７の１つのオリゴヌクレオチドおよび配列番号３０の１つのオリゴヌクレオチドであり、かつ前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブは、配列番号２８または２９の配列、またはこの配列番号の配列の全長にわたって、この配列番号の配列に完全に相補的である配列である。
【０１３２】
好ましくは、前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーは、配列番号３３の１つのオリゴヌクレオチドおよび配列番号３６の１つのオリゴヌクレオチドであり、かつ前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブは、配列番号３４または３５の配列、またはこの配列番号の配列の全長にわたって、この配列番号の配列に完全に相補的である配列である。
【０１３３】
好ましくは、前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーは、配列番号３９の１つのオリゴヌクレオチドおよび配列番号３６の１つのオリゴヌクレオチドであり、かつ前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブは、配列番号４０または４１の配列、またはこの配列番号の配列の全長にわたって、この配列番号の配列に完全に相補的である配列である。
【０１３４】
好ましくは、前記少なくとも２つのＮＧ標的プライマーは、配列番号４４の１つのオリゴヌクレオチドおよび配列番号４７の１つのオリゴヌクレオチドであり、かつ前記少なくとも１つのＮＧ特異的プローブは、配列番号４５または４６の配列、またはこの配列番号の配列の全長にわたって、この配列番号の配列に完全に相補的である配列である。
【０１３５】
有利には、本発明に応じて、前記増幅プライマーは、少なくとも２つのＣＴ標的プライマー、および少なくとも２つのＭＧ標的プライマー、および少なくとも２つのＮＧ標的プライマーを含みうる。
【０１３６】
好ましくは：
−前記少なくとも２つのＣＴ標的プライマーは、配列番号７の１つのオリゴヌクレオチドおよび配列番号１２の１つのオリゴヌクレオチドであり、かつ
−前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーは、配列番号１５の１つのオリゴヌクレオチドおよび配列番号１８の１つのオリゴヌクレオチド；または配列番号２１の１つのオリゴヌクレオチドおよび配列番号２４の１つのオリゴヌクレオチド；または配列番号２７の１つのオリゴヌクレオチドおよび配列番号３０の１つのオリゴヌクレオチド；または配列番号３３の１つのオリゴヌクレオチドおよび配列番号３６の１つのオリゴヌクレオチド；または配列番号３９の１つのオリゴヌクレオチドおよび配列番号３６の１つのオリゴヌクレオチドであり、および
−前記少なくとも２つのＮＧ標的プライマーは、配列番号４４の１つのオリゴヌクレオチドおよび配列番号４７の１つのオリゴヌクレオチドである。
【０１３７】
有利には、本発明によれば、前記少なくとも１つのプローブは、少なくとも１つのＣＴ特異的プローブおよび少なくとも１つのＭＧ特異的プローブおよび少なくとも１つのＮＧ特異的プローブを含みうる。
【０１３８】
好ましくは：
−前記少なくとも２つのＣＴ特異的プライマーは、配列番号７の１つのオリゴヌクレオチドおよび配列番号１２の１つのオリゴヌクレオチドであり、かつ前記少なくとも１つのＣＴ特異的プローブは、配列番号８、９、１０または１１の配列、またはこの配列番号の配列の全長にわたって、この配列番号の配列に完全に相補的な配列であり、および
−前記少なくとも２つのＮＧ標的プライマーは、配列番号４４の１つのオリゴヌクレオチドおよび配列番号４７の１つのオリゴヌクレオチドであり、かつ前記少なくとも１つのＮＧ特異的プローブは、配列番号４５または４６の配列、またはこの配列番号の配列の全長にわたって、この配列番号の配列に完全に相補的な配列であり；および
−前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーおよび前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブは、以下のとおりである：
−前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーは、配列番号１５の１つのオリゴヌクレオチドおよび配列番号１８の１つのオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブは、配列番号１６または１７であるか、またはこの配列番号の配列の全長にわたって、この配列番号の配列に完全に相補的な配列であり；または
−前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーは、配列番号２１の１つのオリゴヌクレオチドおよび配列番号２４の１つのオリゴヌクレオチドであり、かつ前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブは、配列番号２２または２３であり、あるいはこの配列番号の配列の全長にわたって、この配列番号の配列に完全に相補的な配列であり；または
−前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーは、配列番号２７の１つのオリゴヌクレオチドおよび配列番号３０の１つのオリゴヌクレオチドであり、かつ前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブは、配列番号２８または２９であり、あるいはこの配列番号の配列の全長にわたって、この配列番号の配列に完全に相補的な配列であり；または
−前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーは、配列番号３３の１つのオリゴヌクレオチドおよび配列番号３６の１つのオリゴヌクレオチドであり、かつ前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブは、配列番号３４または３５であり、あるいはこの配列番号の配列の全長にわたって、この配列番号の配列に完全に相補的な配列であり；または
−前記少なくとも２つのＭＧ標的プライマーは、配列番号３９の１つのオリゴヌクレオチドおよび配列番号３６の１つのオリゴヌクレオチドであり、かつ前記少なくとも１つのＭＧ特異的プローブは、配列番号４０または４１であり、あるいはこの配列番号の配列の全長にわたって、この配列番号の配列に完全に相補的な配列である。
【０１３９】
本発明の有利な実施形態によれば、ＣＴおよび／またはＭＧおよび／またはＮＧの検出が、リアルタイムマルチプレックス増幅において行われうる。
【０１４０】
当然ながら、本発明のプライマーおよびプローブはまた、単一のプロトコル、マルチプレックスなプロトコル、エンドポイントなプロトコル、定性的プロトコル、定量的プロトコル、これらの組み合わせなどを含む、他のプロトコルに適している。
【０１４１】
前記増幅は、当業者によって適切に見出される、任意の核酸増幅、例えば、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）、または等温増幅技術、例えば、TMA（転写媒介増幅）、NASBA（核酸配列に基づいた増幅）、3SR（自立配列複製）または鎖置換増幅とすることができる。
【０１４２】
前記増幅は、好ましくはPCRである。
【０１４３】
好ましい実施態様において、本発明によるプライマーは、20〜2000 nMの最終濃度範囲において使用される。典型的には、前記プライマーは、20〜1300 nM、好ましくは20〜1250 nM、より好ましくは25〜1250 nM、例えば約25、125、250、500、850、1250 nMの最終濃度範囲で使用することができる。
【０１４４】
PCR反応におけるプローブ濃度は、典型的には50 nM〜1000 nMまで最終濃度を変化させることによって最適化することができる。好ましい実施態様において、本発明による各プローブは、75〜300nM、好ましくは75〜250 nM、より好ましくは100〜250 nM、さらにより好ましくは150〜200nM、例えば、約150 nMまたは約200 nMの最終濃度で使用される。
【０１４５】
適切な増幅条件は、当業者に知られている。これらには、温度条件、特に、熱周期条件、例えば、温度、連続数、サイクルの加熱速度が含まれる。好ましい実施態様において、前記温度条件には、PCRに適切な条件が含まれる。他の好ましい実施態様において、前記条件には、Q-PCRに適した条件が含まれる。
【０１４６】
本発明によれば、また、ＣＴおよび／またはＭＧおよび／またはＮＧに関係しない内部標準（IC）、例えば、配列番号４８のICを実行することができる。
【０１４７】
前記ICの増幅に適切なプライマー対には、配列番号４９および５２のプライマー対が含まれる。適切なICプローブには、配列番号５０（ビーコンフォーマット中の配列番号５１）のプローブが含まれる。
【０１４８】
これらのIC、ICプライマーおよびICプローブはまた、本出願によって個々に包含される。
【０１４９】
16S rRNAプライマー対、例えば配列番号５３および５４のプライマー対がまた提供される。この系は、サンプル中の細菌DNAの存在を検出するために使用される。
【０１５０】
本出願はまた、ＣＴおよび／またはＭＧおよび／またはＮＧ含有サンプルでの本発明のプロセスの実行によって得ることができる任意のアンプリコンに関する。
【０１５１】
本出願はまた、本発明のプライマーおよびプローブ、例えば、個々のオリゴヌクレオチド産物に関する。
【０１５２】
本発明によれば、全ての提供されたオリゴヌクレオチドは、別々に保存されたものか、または部分的に混合されたものか、または全体的に混合されたもののいずれであってもよい。
【０１５３】
前記オリゴヌクレオチドは、当業者によって判断され、乾燥状態下で提供してもよいし、あるいは適切な溶媒中において可溶化してもよい。適切な溶媒には、TE、PCRグレード水などが含まれる。
【０１５４】
本出願はまた、本明細書中に記載された全てのもの、より好ましくは、個々のものとして、全ての参照鋳型ポリヌクレオチド、全てのプライマーおよび全てのプローブに関する。
【０１５５】
本出願はまた、本発明の少なくとも２つのもの、好ましくは本発明の少なくとも３つのもの、例えば、本発明の少なくとも２つのプライマーおよび本発明の少なくとも１つのプローブで作ることができる全ての可能な組み合わせに関する。
【０１５６】
本発明は、したがって、リアルタイムマルチプレックス増幅においてCTおよびMGおよびNGの検出のために同一のチューブにおいて使用することができる、プライマーおよびプローブの設計において参照鋳型配列として使用に適しているポリヌクレオチドに関する。ここで、前記ポリヌクレオチドは、以下のものから選択される：
CTプライマーおよびプローブの設計について：配列番号１（CT pCHL1プラスミド；J03321）のCT配列の位置5571〜5760（配列番号５）からなる断片、またはこれらの保存的サブラグメントであって、適切な参照鋳型配列である性質を保持したもの（CT標的プライマーを構築および産生し、CTのリアルタイムマルチプレックス検出を可能にする）、または前記断片またはサブフラグメントの全長にわたって前記断片またはサブフラグメントに完全に相補的である配列。
【０１５７】
MGプライマーおよびプローブの設計について：以下のものからなる断片：
−配列番号２（MG接着遺伝子の5’領域；X91074）のMG配列の位置1〜270（配列番号13）、またはこれらの保存的サブフラグメントであって、適切な参照鋳型配列である性質を保持したもの（MG標的プライマーを構築および産生し、MGのリアルタイムマルチプレックス検出を可能にする）、または前記断片またはサブフラグメントの全長にわたって前記断片またはサブフラグメントに完全に相補的である配列、
−配列番号３（MG接着遺伝子；M31431）のMG配列の位置1140〜1290（配列番号１９）、またはこれらの保存的サブフラグメントであって、適切な参照鋳型配列である性質を保持したもの（MG標的プライマーを構築および産生し、MGのリアルタイムマルチプレックス検出を可能にする）、または前記断片またはサブフラグメントの全長にわたって前記断片またはサブフラグメントに完全に相補的である配列、
−配列番号３のMG配列の位置1060〜1250（配列番号２５）、またはこれらの保存的サブフラグメントであって、適切な参照鋳型配列である性質を保持したもの（MG標的プライマーを構築および産生し、MGのリアルタイムマルチプレックス検出を可能にする）、または前記断片またはサブフラグメントの全長にわたって前記断片またはサブフラグメントに完全に相補的である配列、
−配列番号３のMG配列の位置1520〜1710（配列番号３１）、またはこれらの保存的サブフラグメントであって、適切な参照鋳型配列である性質を保持したもの（MG標的プライマーを構築および産生し、MGのリアルタイムマルチプレックス検出を可能にする）、または前記断片またはサブフラグメントの全長にわたって前記断片またはサブフラグメントに完全に相補的である配列、
−配列番号３のMG配列の位置1500〜1710（配列番号３７）、またはこれらの保存的サブフラグメントであって、適切な参照鋳型配列である性質を保持したもの（MG標的プライマーを構築および産生し、MGのリアルタイムマルチプレックス検出を可能にする）、または前記断片またはサブフラグメントの全長にわたって前記断片またはサブフラグメントに完全に相補的である配列。
【０１５８】
−NGプライマーおよびプローブの設計について：配列番号４のNG配列（NG pilE遺伝子：AF042097）の位置101〜380からなる断片（配列番号４２）、またはこれらの保存的サブフラグメントであって、適切な参照鋳型配列である性質を保持したもの（NG標的プライマーを構築および産生し、NGのリアルタイムマルチプレックス検出を可能にする）、または前記断片またはサブフラグメントの全長にわたって前記断片またはサブフラグメントに完全に相補的である配列。
【０１５９】
好ましくは、前記参照鋳型ポリヌクレオチドは：
CTプライマーおよびプローブの設計について：配列番号１のCT配列の位置5580〜5754からなる断片（配列番号６）、または前記断片の全長にわたって前記断片に完全に相補的である配列、
−MGプライマーおよびプローブの設計について：
−配列番号２のMG配列の位置2〜259からなる断片（配列番号１４）、または前記断片の全長にわたって前期断片またはサブフラグメントに完全に相補的である配列、または
−配列番号３のMG配列の位置1144〜1283からなる断片（配列番号２０）、または前記断片の全長にわたって前記断片またはサブフラグメントに完全に相補的である配列、または
−配列番号３のMG配列の位置1064〜1249からなる断片（配列番号２６）、または前記断片の全長にわたって前記断片またはサブフラグメントに完全に相補的である配列、または
−配列番号３のMG配列の位置1527〜1704からなる断片（配列番号３２）、または前記断片の全長にわたって前記断片またはサブフラグメントに完全に相補的である配列、または
−配列番号３のMG配列の位置1501〜1704からなる断片（配列番号３８）、または前記断片の全長にわたって前記断片またはサブフラグメントに完全に相補的である配列。
【０１６０】
−NGプライマーおよびプローブの設計について：配列番号４のNG配列の位置114〜365からなる断片（配列番号４３）、または前記断片の全長にわたって前記断片またはサブフラグメントに完全に相補的である配列。
【０１６１】
本出願はまた、リアルタイムマルチプレックス増幅においてＣＴおよび／またはＭＧおよび／またはＮＧの検出に特に適合している、プライマーであって、以下のものに関する：
−配列番号７；１２からなる群から選択された、CT標的プライマー、または
−配列番号１５；１８；２１；２４；２７；３０；３３；３６；３９からなる群から選択された、MG標的プライマー、または
−配列番号４４、４７からなる群から選択された、NG標的プライマー、
−本明細書中に定義された、前記プライマーの保存的変異体。
【０１６２】
本出願はまた、リアルタイムマルチプレックス増幅においてＣＴおよび／またはＭＧおよび／またはＮＧの検出に特に適合している、プライマーの系に関する。ここには、少なくとも２つのCT標的プライマーおよび／または少なくとも２つのMG標的プライマーおよび／または少なくとも２つのNG標的プライマーが含まれる。例えば以下のものがある：
−配列番号７および配列番号１２の少なくとも１つのCT標的プライマー対、および／または
−以下の対から選択された少なくとも１つのMG標的プライマー対：配列番号１５および１８；配列番号２１および２４；配列番号２７および３０；配列番号３３および３６；配列番号３９および３６、および／または
−配列番号４４および４７の少なくとも１つのNG標的プライマー対。
【０１６３】
本出願はまた、リアルタイムマルチプレックス増幅においてＣＴおよび／またはＭＧおよび／またはＮＧの検出に特に適合しているプローブであって、以下のものに関する：
−配列番号８または１０のCT特異的プローブ；またはこの配列番号の配列の全長にわたって、この配列番号の配列に完全に相補的である配列からなるもの、または
−配列番号１６；２２；２８；３４または４０のMG特異的プローブ、またはこの配列番号の配列の全長にわたって、この配列番号の配列に完全に相補的である配列からなるもの、または
−配列番号４５のNG特異的プローブ、またはこの配列番号の配列の全長にわたって、この配列番号の配列に完全に相補的である配列からなるもの、または
−本明細書中に定義された、これらのプローブの保存的変異体。
【０１６４】
本出願はまた、リアルタイムマルチプレックス増幅においてＣＴおよび／またはＭＧおよび／またはＮＧの検出に特に適合しているビーコンプローブであって、以下のものに関する。
【０１６５】
−配列番号９または１１のCT特異的プローブ、またはこの配列番号の配列の全長にわたって、この配列番号の配列に完全に相補的である配列からなるもの、または
−配列番号１７；２３；２９；３５または４１のMG特異的プローブ、またはこの配列番号の配列の全長にわたって、この配列番号の配列に完全に相補的である配列からなるもの、または
−配列番号４５または４６のNG特異的プローブ、またはこの配列番号の配列の全長にわたって、この配列番号の配列に完全に相補的である配列からなるもの、または
−これらのプローブの保存的変異体。
【０１６６】
本出願はまた、リアルタイムマルチプレックス増幅においてＣＴおよび／またはＭＧおよび／またはＮＧの検出に特に適合している、プライマーおよびプローブの系に関し、本発明の少なくとも１つのプライマーおよび本発明の少なくとも１つのプローブ、好ましくは本発明の少なくとも１つのプライマー系、および本発明の少なくとも１つのプローブ系が含まれる。
【０１６７】
本出願はまた、本発明の少なくとも１つのプライマーの系によって、ＣＴおよび／またはＭＧおよび／またはＮＧからの少なくとも１つの核酸の増幅によって得られうるアンプリコンに関する。
【０１６８】
本出願はまた、本発明による少なくとも１つのアンプリコンを含む、増幅組成物に関する。
【０１６９】
本出願はまた、ＣＴおよび／またはＭＧおよび／またはＮＧによる感染の診断のためのキットに関し、以下のものを含む：
−本発明の少なくとも１つのプライマーの系、および／または
−本発明の少なくとも１つのプローブ
−任意的には、その使用および／またはヌクレオチドのための説明書。
【０１７０】
本発明によるキットにおいて、オリゴヌクレオチド（プライマー、プローブ）は、別々に保持され、あるいは部分的に混合され、あるいは全体的に混合されうる。
【０１７１】
前記オリゴヌクレオチドは、当業者によって判断され、乾燥状態下で提供してもよいし、あるいは適切な溶媒中において可溶化してもよい。適切な溶媒には、TE、PCRグレード水などが含まれる。
【０１７２】
好ましい実施態様において、本発明によるキットはまた、さらにPCRステップに適した試薬を含むことができる。
【０１７３】
このような試薬は当業者に知られており、水、例えばヌクレアーゼ除去水、RNaseフリー水、DNAseフリー水、RCRグレード水；塩、例えばマグネシウム、カリウム；バッファ、例えばTris；ポリメラーゼ、例えばTaq、Vent、Pfu（これらの全ては商標）、活性可能なポリメラーゼなどを含む酵素；ヌクレオチド、例えばデオキシヌクレオチド、ジデオキシヌクレオチド（dideoxunucleotides）、dNTPs、dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dUTP；他の試薬、例えばDTTおよび／またはRNase阻害剤；およびポリヌクレオチド、例えばpolyT、polydT、および他のオリゴヌクレオチド、例えばプライマーを含む。
【０１７４】
他の好ましい実施態様において、本発明によるキットは、PCRコントロールを含む。このようなコントロールは、当業者に知られており、定性的コントロール、ポジティブコントロール、ネガティブコントロール、内部標準、定量的コントロール、内部定量的コントロール、および較正レンジを含む。前記PCRステップについての内部標準は、PCR工程におけるターゲット鋳型に関係しない鋳型とすることができる。このようなコントロールはまた、コントロールプライマーおよび／またはコントロールプローブを含むことができる。例えば、HPV検出の場合において、内部標準として使用することができる。このポリヌクレオチドは、ヒト体内を起源とするサンプル中に存在しない遺伝子内（例えば、植物遺伝子から）であって、かつそのサイズおよびGC含量が標的配列からのものと等価である遺伝子内で選択される。
【０１７５】
例示的内部標準は、配列番号４８のICを含む。適切なICプライマーは、配列番号４９のプライマーおよび配列番号５０のプライマーを含む。これらは配列番号４８の前記ICを増幅することができるプライマー対を一緒に形成する。適切なICプローブは配列番号５０（またはビーコンプローブ中の、配列番号５１）のプローブを含む。
【０１７６】
好ましい実施態様において、本発明によるキットは、生物学的サンプル、例えば尿から核酸を抽出および／または精製するための手段を含む。このような手段は、当業者にとって周知である。
【０１７７】
好ましい実施態様において、本発明によるキットは、これらの使用のための説明書を含む。前記説明書は、好ましくはリーフレット、カードなどとすることができる。前記説明書はまた、以下の２つの態様：キットおよびその使用についての包括的な情報を含む詳細なもの；およびその使用に必要な情報を含む、例えばカード形状のクイックガイド形状またはメモで存在することができる。
【０１７８】
本発明はまた、本発明の検出プロセスの全ての医学的、生物学的、薬学的適用、および／または本発明のプライマーおよび／またはプローブに関する。
【０１７９】
本発明は、従って、本発明の少なくとも１つのプライマーでＣＴおよび／またはＭＧおよび／またはＮＧを検出することを含む、ＣＴおよび／またはＭＧおよび／またはＮＧ感染の診断または予後のためのプロセスに関する。
【０１８０】
本発明はまた、抗CTおよび／または抗MGおよび／または抗NG治療または薬剤、または抗CTおよび／または抗MGおよび／または抗NG候補の治療または薬剤の効果をモニタリングするためのプロセスであって、前記治療、薬剤、候補治療または候補薬剤が少なくとも１つのCTおよび／またはMGおよび／またはNGの存在下において非再発、非残留、消失、または減少を誘導する、本発明の検出方法によって決定することを含むものに関する。ここで、ポジティブ判定は、前記治療、薬剤、候補治療または候補薬剤が有効であることを示す。
【０１８１】
本発明はまた、抗CTおよび／または抗MGおよび／または抗NG薬剤を産生するための方法に関し、以下の工程を含む：
少なくとも１つの抗CTおよび／または抗MGおよび／または抗NG候補薬剤を提供すること、
前記少なくとも１つの候補抗CTおよび／または抗MGおよび／または抗NG薬剤を、細胞培養液または非ヒト動物（前記細胞培養液または動物は、少なくとも１つのCTおよび／またはMGおよび／またはNGであるまたはを含む）に投与することと、
本発明の検出方法によって決定すること（前記候補抗CTおよび／または抗MGおよび／または抗NG薬剤は、前記少なくとも１つのCTおよび／またはMGおよび／またはNGの緩解または消失を誘導する）（ここで、ポジティブ判定は、前記候補薬剤が有効なCTおよび／またはMGおよび／またはNG薬剤であることを示す）。
【０１８２】
本出願において、全ての記載された範囲の開始および最後の値が、前記範囲内に含まれたときに理解されるべきである。例えば、「配列の位置ＸからＹ」という表現は、位置Ｘにおけるヌクレオチドから位置Ｙにおけるヌクレオチドまで延びる配列であって、位置Ｘにおけるヌクレオチドと位置Ｙにおけるヌクレオチドの両方が前記配列の一部である配列を意味する。
【０１８３】
用語「含む（comprising）」は、「含む（including）」または「含む（containing）」と同義であり、オープンエンドな表現であり、さらなる、列挙されていない要素、成分または方法工程を除外しない。一方、用語「からなる」は、クローズドな用語であり、明示的に列挙されていない任意のさらなる要素、工程または成分を除外する。
【０１８４】
用語「本質的に〜からなる」は、部分的にオープンな用語であり、さらなる、列挙されていない要素、工程、または成分が本発明の基本的かつ新規な性質に実質的に影響を与えない限り、これらのさらなる要素、工程、または成分を除外しない。
【０１８５】
用語「含む」は、従って、用語「からなる」および用語「本質的に〜からなる」を包含する。これに応じて、用語「含む」は、本出願において、より具体的には、用語「からなる」および用語「本質的に〜からなる」を含むことを意味する。
【０１８６】
本出願において、ｎ要素のセットまたは群に関する用語「少なくともｘ」（ｘはゼロではなく、ｎはｘよりも大きい数である）は、明示的に、ｘとｎとの間に含まれる各値を包含する。例えば、６つの要素の群またはセットに関する用語「少なくとも１つの」には、１、２、３、４、５および６の前記要素、ならびに少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの前記要素が明示的に包含される。
【０１８７】
本明細書中に引用された全ての参照文献の各々の関連の開示は、参照によって明確に組み込まれる。以下の例は、例証によって提供されるが、本発明を制限するものではない。
【例】
【０１８８】
例１：プライマーおよびプローブの設計
1.1. トラコーマクラミジア（C. trachomatis (CT)）についてのプライマーおよびプローブの選択
適切なCTターゲットの源として、発明者は陰性プラスミドを選択した。これは全てのC. trachomatis血液型亜型（血清型）の中に存在している。このプラスミドは、１ゲノム当たり7〜10コピーで含まれている。
【０１８９】
このプラスミドの4つの異なる配列は、Genbankから利用可能である：
−血清型D株GO/86（受託番号J03321; 7502 bp）の、プラスミドpCHL1、
−血清型Bの、プラスミドpCTT1（受託番号M 19487; 7496 bp）、
−血清型L1の、プラスミドpLGV440（受託番号X06707; 7501 bp）、
−血清型L2のプラスミドCTPLAS75（受託番号X07547.1; 7499 bp）。
【０１９０】
これらの4つの配列の間に１%未満の変異が存在する（Comanducci, et al., 1990, Plasmid, 23: 149-154）。
【０１９１】
受託番号J03321の下で利用可能である、プラスミドpCHL1の配列は、同封された図１に示されている（配列番号1; 7502nt）。
【０１９２】
選択されたCT標的配列は、pCHL1のORF5内に位置している。配列番号５の部分配列は、pCHL1 ORF5の配列内において発明者によって選択された。
【０１９３】
配列番号１のpCHL1内に選択されたCT部分配列:
【表１−１】
0005518471.tif 000002
【０１９４】
配列番号５のこのCT部分配列内において、CT標的配列が本発明者によって選択された（配列番号６）。フォワードおよびリバースプライマーは、それぞれU-PC 5580およびL-PC 5754と呼ばれる。２つのFAMラベル付き蛍光プローブ（SCT175b、SCT175c）は、アンプリコンをうまく検出することが分かった。これらのCTプライマーおよびプローブの配列は、配列番号５（5'から3'まで）の上記CT部分配列において示される：
−CTフォワードプライマーの配列（U-PC 5580）(下線および太字)、
−２つのCTプローブのそれぞれの配列（括弧間の下線および太字におけるプローブSCT 175b; 括弧間の下線および太字におけるプローブSCT175c)のそれぞれの配列、
−CTリバースプライマーの標的配列（L-PC 5754）(下線および太字)。
【０１９５】
選択されたCT標的配列は、それゆえ以下のものである：
CT標的配列（175nt）：配列番号１の位置5580〜5754
【表１−２】
0005518471.tif 000003
【０１９６】
CTフォワードプライマーU-PC 5580（20nt）：配列番号１の位置5580〜5599
ATT TCT GAA TGA GTA CTG CG            配列番号７
【０１９７】
CTプローブSCT 175b（26nt）：配列番号１の位置5613〜5638
CAT CTG CAT AAT AGA CAC TCC ACC TA            配列番号８
ビーコン（登録商標）アーム：5'中 CGC GC；3'中GC GCG
ビーコン（登録商標）フォーマット中のプローブ：
CGC GCC ATC TGC ATA ATA GAC ACT CCA CCT AGC GCG（配列番号９)
色素／クエンチャー： 5'中のFAM；3'中のDabcyl
【０１９８】
CTプローブSCT 175c(27nt): 配列番号１の位置5635〜5661
CCT AGC CTA GGA GGG TTA ACG AAA GAA          配列番号１０
ビーコン（登録商標）アーム：5'中 ACG CGC；3'中GCG CGT
ビーコン（登録商標）フォーマット中のプローブ：
ACG CGC CCT AGC CTA GGA GGG TTA ACG AAA GAA GCG CGT（配列番号１１)
色素／クエンチャー： 5'中のFAM；3'中のDabcyl
【０１９９】
配列番号１の位置5733〜5754に相補的である、CTリバースプライマー L-PC 5754(22nt)：
CGA ACT TAA GAA TTC ACG TAT C            配列番号１２
【０２００】
1.2.  性器マイコプラズマ(MG)のためのプライマーおよびプローブの選択
MG標的配列は、MgPa接着タンパク質（主要な表面タンパク質）をコードする遺伝子内において選択される。この遺伝子は、接着遺伝子、またはPa遺伝子、またはMgPa遺伝子と呼ばれている。
【０２０１】
これは、細菌ゲノム当たり１コピーで存在し、参照株G-37について完全にシークエンスされている（受託番号M31431）。
【０２０２】
この遺伝子の5'領域はまた、4つの他のMG株についてシークエンスされている；これらの配列は、GenBankから入手可能である：
−受託番号X91074、株M2341；
−受託番号X91073、株M2321；
−受託番号X91071 株2288；
−受託番号X91072、株2300。
【０２０３】
受託番号X91074で入手可能である、株M2341の接着遺伝子の5'領域の配列は、同封された図２（配列番号２）において示される。
【０２０４】
受託番号M31431で入手可能である、株G-37の接着遺伝子の配列は、同封された図３（配列番号３）において示されている。
【０２０５】
1.2.1.  受託番号X91074（配列番号２）を有する、MG接着遺伝子5'-部位の設計： 
選択されたMG標的配列は、次のPa遺伝子の部分配列内に位置する：
【０２０６】
配列番号２のMgPa配列内において選択されたMG部分配列：
【表１−３】
0005518471.tif 000004
【０２０７】
MG標的配列（配列番号１４）は、配列番号１３のこのMG部分配列内において選択された。MGフォワードプライマー（U-MG 1320）の配列、MGプローブ（SF-MG 258c）の配列、およびMGリバースプライマー（L-MG 1578）の標的配列は、配列番号１３（それぞれ、5'から3'まで）の上記MG部分配列内における下線かつ太字の部分において示される。
【０２０８】
選択されたMG標的配列は、それゆえ以下のものである：
MG標的配列（258nt）：配列番号２の位置2〜259：
【表１−４】
0005518471.tif 000005
【０２０９】
MGフォワードプライマー（U-MG 1320; 24nt）： 配列番号２の位置2〜25
GGA TCA TTT GGA TTA GTA AGA AGC            配列番号１５
【０２１０】
MGプローブ（SF-MG 258c; 27nt)： 配列番号２の位置136〜162
CAG AAG GTA TGA TAA CAA CGG TAG AGC      配列番号１６
ビーコン（登録商標）アーム：5'中 TGC GCA；3'中TGC GCA
ビーコン（登録商標）フォーマット中のプローブ：
TGC GCA CAG AAG GTA TGA TAA CAA CGG TAG AGC TGC GCA（配列番号１７）
色素／クエンチャー： 5'中のTamra； 3'中のDabcyl
【０２１１】
配列番号２の位置237〜259に相補的である、MGリバースプライマー（L-MG 1578; 23nt)：
ACC AAA GCC TTT AAA AGG ATC AA                配列番号１８
【０２１２】
1.2.2.  受託番号M31431（配列番号３）を有するMG接着遺伝子の設計：
４つの他のMGターゲットは、発明者によって選択された。これらの４つの他のMGターゲットはまた、MG接着遺伝子内、より具体的には、この遺伝子の5'領域内に位置する。これらは、受託番号M31431（配列番号３、図３に示されたもの）で入手可能である、接着遺伝子配列に関して定義される。
【０２１３】
これらの４つの他のMG標的配列は、次のMG部分配列内に位置する：
−配列番号３の位置1140〜1290（配列番号１９の部分配列）；
−配列番号３の位置1060〜1250（配列番号２５の部分配列）；
−配列番号３の位置1520〜1710（配列番号３１の部分配列）；
−配列番号３の位置1500〜1710（配列番号３７の部分配列）。
【０２１４】
−配列番号３の位置1140〜1290（配列番号１９の部分配列）：
【表１−５】
0005518471.tif 000006
【０２１５】
−配列番号３の位置1060〜1250（配列番号２５の部分配列）：
【表１−６】
0005518471.tif 000007
【０２１６】
−配列番号３の位置1520〜1710（配列番号３１の部分配列）：
【表１−７】
0005518471.tif 000008
【０２１７】
−配列番号３の位置1500〜1710（配列番号３７の部分配列）：
【表１−８】
0005518471.tif 000009
【０２１８】
1.2.2.1.  プライマー対（U-MG 1144/L-MG 1283)、140 bpのアンプリコン：
MG標的配列（140 bp）：配列番号３の位置1144〜1283
【表１−９】
0005518471.tif 000010
【０２１９】
太字かつ下線部において、ＭＧフォワードプライマーの配列（U-MG1144）、MGプローブについてのターゲットの配列（MGBR 140c）、およびMGリバースプライマーについてのターゲットの配列（L-MG1283）が示されている（5'から3'まで）。
【０２２０】
MGフォワード（U-MG 1144, 21 nt）、配列番号３の位置1144〜1164
GGT GTA GGT GGT TAT TTT CTC              配列番号２１
【０２２１】
MGプローブ（MGBR 140c  Tamra/Dabcyl, 25 nt)  配列番号３の位置1208〜1232
ACC AAC CCA AGC AGT TAA GTG TTA A        配列番号２２
ビーコン（登録商標）アーム：5'中 CGCGTT；3'中A ACG CG
ビーコン（登録商標）フォーマット中のプローブ：
CGC GTT AC CAA CCC AAG CAG TTA AGT GTT AA A ACG CG（配列番号２３）
色素／クエンチャー： 5'中のTamra； 3'中のDabcyl
【０２２２】
MGリバースプライマー（L-MG 1283, 22 nt)： 配列番号３の位置1262〜1283に相補的
TTA TTG TTT CAA GTC CAA GGG G                配列番号２４
【０２２３】
1.2.2.2.  プライマー対（U MG 1087／L MG1249）、186 bpのアンプリコン：
MG標的配列（186 bp）：配列番号３の位置1064〜1249
【表１−１０】
0005518471.tif 000011
【０２２４】
太線および下線部において、MGフォワードプライマーの配列（U-MG1087）、MGプローブについてのターゲットの配列（MGBR 186j Tamra/Dabcyl）、MGリバースプライマーについてのターゲットの配列（L-MG1249）が示される（5'から3'まで）。
【０２２５】
MGフォワード（U-MG 1087, 24nt）、配列番号３の位置1064〜1087
GTATGCACCAACCAAAGAAAAGAC                配列番号２７
【０２２６】
MGプローブ(MGBR 186j Tamra/Dabcyl, 28nt)  配列番号３の位置1142〜1168
CAG GTG TAG GTG GTT ATT TTC TCT TTA          配列番号２８
ビーコン（登録商標）アーム：5'中 CGCGTT；3'中AAC GCG
ビーコン（登録商標）フォーマット中のプローブ：
CGC GTT CAG GTG TAG GTG GTT ATT TTC TCT TTA AAC GCG            
配列番号２９
色素／クエンチャー： 5'中のTamra； 3'中のDabcyl
【０２２７】
MGリバースプライマー（L-MG 1249, 24nt）：配列番号３の位置1226〜1249に相補的
CAA CTG CTT GTT GGT GTT TAA CAC                配列番号３０
【０２２８】
1.2.2.3.  プライマー対（U-MG 1527／L-MG 1704)、177 bpのアンプリコン
MG標的配列（178 bp）：配列番号３の位置1527〜1704
【表１−１１】
0005518471.tif 000012
【０２２９】
太字および下線部において、MGフォワードプライマーの配列（U-MG1527）、MGプローブについてのターゲットの配列（MGBR 178q Tamra/Dabcyl）、およびMGリバースプライマーについてのターゲットの配列（L-MG1704）が示されている（5'から3'まで）。 
【０２３０】
ＭＧフォワード（U-MG 1527, 24 nt）、配列番号３の位置1527〜1550
GCA AAG GGG TTT AAA TGG CGA GCC                配列番号３３
【０２３１】
MGプローブ（MGBR 178q Tamra/Dabcyl, 26 nt）配列番号３の位置1607〜1630
ATG AGA TCA AAG GTA AAG TTC CAG TA            配列番号３４
ビーコン（登録商標）アーム：5'中のAGC GTC；3'中のGAC GCT
ビーコン（登録商標）フォーマット中のプローブ：
AGC GTC ATG AGA TCA AAG GTA AAG TTC CAG TA GAC GCT      （配列番号３５）
色素／クエンチャー： 5'中のTamra; 3'中のDabcyl
【０２３２】
MGリバースプライマー（L-MG 1704, 24 nt):  配列番号３の位置1681〜1704に相補的
ATA CTC CAA TAC CAC CTT AGG CAC                    配列番号３６
【０２３３】
1.2.2.4. プライマー対（U MG 1501／LMG 1704)、203 bpのアンプリコン
MG標的配列（203 bp）： 配列番号３の位置1501〜1704
【表１−１２】
0005518471.tif 000013
【０２３４】
太字および下線部において、MGフォワードプライマーの配列（U-MG1501）、MGプローブについてのターゲットの配列（MGBR 178q Tamra/Dabcyl）、およびMGリバースプライマーについてのターゲットの配列（L-MG1704）が示されている（5'から3'まで）。
【０２３５】
MGフォワード（U-MG 1501, 25 nt）、配列番号３の位置1501〜1525
GCA AAA ATG GAA AAC CCC TCA ACG G                  配列番号３９
【０２３６】
MGプローブ（MGBR 204u Tamra/Dabcyl, 27 nt)、配列番号３の位置1600〜1626
GAT TGG AAT GAG ATC AAA GGT AAA GTT            配列番号４０
ビーコン（登録商標）アーム： 5'中のCGC CCT;  3'中のAGG GCG
ビーコン（登録商標）フォーマット中のプローブ：
CGC CCT GAT TGG AAT GAG ATC AAA GGT AAA GTT AGG GCG（配列番号４１)
色素／クエンチャー： 5'中のTamra; 3'中のDabcyl
【０２３７】
MGリバースプライマー（L-MG 1704, 24 nt): 配列番号３の位置1681〜1704に相補的
ATA CTC CAA TAC CAC CTT AGG CAC                  配列番号３６
【０２３８】
1.3.  淋菌（NG）のためのプライマーおよびプローブの選択
適切なヌクレオチド ターゲットの選択は、NGを達成するのが難しい。NGのゲノムは、実際にはM.meningitidisの１つと高い相同性を有し（約98%で）、共生種、例えばN. cinerea, N. lactamica, N. sicca, N. subflava, N. mucosaのゲノムと相同性を有する。
【０２３９】
我々は、NGを検出するpilE遺伝子を選択した。pilE遺伝子はIV型piliをコードする。これは全ての病原性NG内に存在し、かつ非病原性NGには存在しない（NG株は、これらがin vitroで増殖するとき、しばしばこの遺伝子を欠く）。
【０２４０】
pilE遺伝子は、可変のコピー数で存在し、しばしばヌクレオチド変異にさらされる。pilE遺伝子はまた、N. lactamicaおよび N. cinerea中に存在し、また、いくつかの他の細菌種、例えば、他のPseudomonas、Bacteroides、およびBacillus中において存在していてもよい。
【０２４１】
プライマー対（U-pilE 159／L-pilE 406）は選択された。得られたアンプリコン
は252 bpである。蛍光（ATTO 647N/Dabcyl）プローブは、アンプリコンにハイブリダイズするように選択された。
【０２４２】
受託番号AF042097で入手可能である pilE遺伝子の配列は、同封された図４において示される（配列番号４）。
【０２４３】
配列番号４のpilE内で選択されたNG部分配列（位置101〜380）：
【表１−１３】
0005518471.tif 000014
【０２４４】
下線部は、NGフォワードプライマーの配列（U-pilE 159）、NGプローブについてのターゲットの配列（pilEc）、およびNGリバースプライマーについてのターゲットのプローブ（L-pilE 406）を示す。
【０２４５】
NG標的配列（252nt）：配列番号４の位置114〜365
【表１−１４】
0005518471.tif 000015
【０２４６】
NGフォワードプライマー（U-pilE 159; 19nt）：配列番号４の位置114〜132
CGT CAC CGA GTA TTA CCT G                        配列番号４４
【０２４７】
NGプローブ(pilEc; 22nt)：配列番号４の位置285〜306に相補的：
GGC CCA CAG GGA GAG TTT TTT G                配列番号４５
ビーコン（登録商標）アーム：5'中のACT GCG; 3'中のCGC AGT
ビーコン（登録商標）フォーマット中のプローブ： 
ACT GCG GGC CCA CAG GGA GAG TTT TTT G CGC AGT  （配列番号４６）
色素／クエンチャー： 5'中のAtto 647 N; 3'中のDabcyl
【０２４８】
NGリバースプライマー（L-pilE 406; 17nt）：配列番号４の位置349〜365に相補的
TCG TCG GTG CGC GTA AC                        配列番号４７
【０２４９】
1.4. 内部標準（IC）：
内部標準（IC）は、単鎖のランダム配列からなる。
【０２５０】
ICには、CT、MGおよびNGと関係しない配列が含まれ、また、好ましくはヒト核酸と関係しない。ICには、さらに、この非関連配列の5'に位置する配列およびこの非関連配列の3'に位置する配列が含まれる。前記5'および3'に位置する配列の１つは、プライマー対のプライマーの配列を有し、かつ他の前記5'および3'に位置する配列は、同じプライマー対の他のプライマーの相補的配列であり、例えば、前記プライマー対は、このような位置および方向において前記ICとハイブリダイズすることができる。このプライマー対は前記IC上で増幅フォワードおよびリバースプライマー対として機能することができる。例えば、前記5'に位置する配列は、プライマー対のフォワードプライマーと同一であり、前記3'に位置する配列は、前記プライマー対のリバースプライマーと相補的である。
【０２５１】
このプライマー対は、CT、MGまたはNGの検出のために使用されるプライマー対であってもよいし、あるいはマルチプレックスPCRを実行するときにPCR混合物中に添加しなければならない、異なるプライマー対とすることができる。
【０２５２】
本出願の例において、ICは92塩基であり、かつ、CT、MGおよびNGプライマー対とは異なる、プライマー対（プライマー対IS 368およびIS 569）とハイブリダイズする5'および3'に位置した配列を含む。
【０２５３】
内部標準配列（92 nt）：
ATTGGATCCCAGCACGCTAATTACCCAGTATCAGATGACGTGGCAGCCATGAGAGTGGGACAGTCGTCCTTCAAGGAGCACATCAGCGGATC
配列番号４８
下線部は、ICフォワードプライマーの配列（IS 368）、ICプローブのターゲットの配列、およびリバースプライマーのターゲットの配列（IS 569）を示す。
【０２５４】
ICフォワードプライマー（IS 368; 17nt）
CAGCACGCTAATTACCC                          配列番号４９
【０２５５】
ICプローブ（SIMB ATTO 590; 23nt）
CCC ACT CTC ATG GCT GCC ACG TC              配列番号５０
ビーコンアーム：5'中のCAGGCG; 3'中のCGCCTG
ビーコンフォーマット中のプローブ：
CAGGCG CCC ACT CTC ATG GCT GCC ACG TC CGCCTG（配列番号５１）
色素／クエンチャー：5'中のATTO 590; 3'中のDabcyl
【０２５６】
ICリバースプライマー（IS 569; 17nt)
GCTGATGTGCTCCTTGA                              配列番号５２
【０２５７】
1.5.  16S rRNA
すべての微生物中に存在する16S rRNAの断片がまた増幅される。
【０２５８】
以下の16S rRNAプライマーが使用された：
S1-F: AGT TTG ATC ATG GCT CAG                      配列番号５３ 
S1-R: GTA TTA CCG CGG CTG CT                      配列番号５４
【０２５９】
1.6.  配列および配列番号:
【表１】
0005518471.tif 000016
【０２６０】
0005518471.tif 000017
【０２６１】
２．例２：本発明のCT、MGおよびNGリアルタイム増幅系の特異性および感度：
−リアルタイム シンプレックスPCR（real-time simplex PCR）における特異性（細菌株のパネル上でのCTまたはMGまたはNGリアルタイム増幅系）；
−リアルタイム マルチプレックスPCR（所定量のCT、MGおよびNG DNAの混合物での、同じ混合物中における一緒のCT+MG+NG+IC系）におけるこれらの系の感度。
【０２６２】
2.1.  材料および方法：
2.1.1.  抽出方法の説明
溶解は、洗浄剤およびChelexTM X-100ビーズ（すなわち、二価のイオンと結合し、かつカオトロピック剤でもある樹脂）の存在中において行われる。
【０２６３】
溶解バッファの組成：
8％のChelexTM X-100樹脂（Bio-Rad, ref.: 142-1253）；0.5% NP-40（Sigma, ref.: Igepal I-3021）；Tris 10 mMバッファ（Sigma, ref.: T-6791）中の0.5％Tween 20（VWR, ref.: 28829296）；EDTA 1mM（Sigma, ref.: E-1644）pH 8.3。
【０２６４】
方法：
−1 mLのサンプル（尿素の、または輸送培地のサンプル）を回収し、8000 rpmで10分間にわたってこれを遠心分離し、
−遠心ペレット中に400μL溶解バッファを加え、
−10μLの液体内部標準を加え、
−vortex 30''、
−95℃で10分間にわたるインキュベーション、
−8000 rpmで5分間にわたる遠心分離、
−10μLの上清でのPCR。
【０２６５】
内部標準（IC）は、抽出工程で加えられる。
【０２６６】
IC溶液は、10μL当り9.6 104コピーのICであり、抽出後PCR試験当り2.4 103コピーを得る。
【０２６７】
内部標準は、ICが添加される400μLの溶解バッファを回収することによって達成される。
【０２６８】
2.1.2.  PCR条件：
* 反応物：
Hot Start Taq Polymerase Qiagen (5U/μL、ref203205)、PCRバッファを含む
dNTP: Promega ref U151（4×25mM）
MgCl2: Sigma, ref M-2670
PVP10: Sigma, ref PVP-10
Glycerol: VWR, ref 24388295
* Thermocyclor: iQ1 (Bio-Rad)
【０２６９】
2.1.3.  16S rRNAをコードする遺伝子の断片の増幅
16S rRNAプライマー（S1-F, およびS1-R）によって増幅された産物は、7.5％アクリルアミドゲル上での電気泳動後のBet染色後によって可視化される。
【０２７０】
2.1.4.  トラコーマクラミジアのためのリアルタイムシンプレックスPCR
* 混合物の組成
１×PCR混合物中において、以下のものを添加： 0.2μMのSCT 175bプローブ（配列番号９）、0.5μMの各CTプライマー（U-PC 5580  −配列番号７−、et L-PC 5754 −配列番号１２−）、5%グリセロール、0.3% PVP 10、2UのTaqポリメラーゼ、1 mM dNTPおよび6 mM最終のMgCl2。 
10μLのDNAがこの混合物に加えられる。
【０２７１】
* 熱サイクリング：
第１のサイクル：95℃で15"
第２のサイクル：95℃で30"
第３のサイクル：56℃で45"
第４のサイクル：72℃で30"
サイクル２〜サイクル４までを50回繰り返す。
【０２７２】
2.1.5.  性器マイコプラズマのためのリアルタイムシンプレックスPCR
* 混合物の組成：
１×PCR混合物中において、以下のものを添加： 0.2μMのMGプローブ（SF-MG 258c  −配列番号１７−）、0.5μMの各MGプライマー（U-MG 1320  −配列番号１５−、およびL-MG 1578  −配列番号１８−)、5% グリセロール、0.3% PVP 10、2UのTaqポリメラーゼ、1mM dNTPおよび6 mM最終のMgCl2。
【０２７３】
10μLのDNAがこの混合物に加えられる。
【０２７４】
* 熱サイクリング：
第１のサイクル：95℃で15"
第２のサイクル：95℃で30"
第３のサイクル：57℃で45"
第４のサイクル：72℃で30"
サイクル２〜サイクル４までを50回繰り返す。
【０２７５】
2.1.6.  淋菌のためのリアルタイムシンプレックスPCR
* 混合物の組成
１×PCR混合物中において、以下のものを添加： 0.2μMのNGプローブ（pilEc −配列番号：４６−)、0.5μMの各ＮＧプライマー（U pilE 159 −配列番号４４−、et L-pilE 406 −配列番号４７−）、5% グリセロール、0.3% PVP 10、2UのTaqポリメラーゼ、1mM dNTPおよび4mM最終のMgCl2。
【０２７６】
10μLのDNAがこの混合物に加えられる。
【０２７７】
* 熱サイクリング：
第１のサイクル：95℃で15"
第２のサイクル：95℃で30"
第３のサイクル：57℃で45"
第４のサイクル：72℃で30"
サイクル２〜サイクル４までを50回繰り返す。
【０２７８】
2.1.7. リアルタイム マルチプレックスPCR
* 混合物の組成
１×PCR混合物中において、以下のものを添加： 
0.125μMのCTフォワードプライマーU-PC 5580（配列番号７）、
0.5μMのCTリバースプライマー L-PC 5754（配列番号１２)、
0.025μMのMGフォワードプライマーU-MG 1320（配列番号１５）、
1.25μMのMGリバースプライマーL-MG 1578（配列番号１８）、
0.85μMのNGフォワードプライマーU-pilE 159（配列番号４４）、
0.25μMのNGリバースプライマーL-pilE 406（配列番号４７）、
0.5μMのICフォワードプライマーIS 368（配列番号４９）、および
0.5μMのICリバースプライマーIS 569（配列番号５２）。
【０２７９】
プローブは、以下の濃度で使用される：
0.15μMのCTプローブSCT 175b（配列番号９）（フルオロフォアFAM）、
0.2μMのMGプローブSF-MG 258c（配列番号１７）（フルオロフォア TAMRA）、および0.2μMのNGプローブpilEc(配列番号４６)（フルオロフォアATTO 647N）。
【０２８０】
0.15μMのICプローブSIMB（配列番号５１）（フルオロフォアATTO-590）
【０２８１】
以下の反応物がさらに添加される：
5％グリセロール、0.3％PVP 10、2UのTaqポリメラーゼ、1mM dNTPおよび5mM最終のMgCl2。
【０２８２】
10μLのDNAがこの混合物に加えられる。
【０２８３】
* 熱サイクリング：
第１のサイクル：95℃で15"
第２のサイクル：95℃で30"
第３のサイクル：58℃で50"
第４のサイクル：72℃で30"
サイクル２〜サイクル４までを50回繰り返す。
【０２８４】
* 出発物質：
CT DNA: トラコーマクラミジア LGVII株434、ABi、ロット141-115、1.63 1010基本体／ml、50 ng/μLで100μLから入手可能。
【０２８５】
ABiは、Advanced Biotechnologies Inc., RiversPark II, 9108 Guilford Road, Columbia, MD 21046-2701, U.S.A.である。
【０２８６】
MG DNA: ATCC、受託番号33530（培養源＝ATCC 33530D）、ロット2305272、濃度200 ng/μLから入手可能なG-37株。
【０２８７】
ATCCは：American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard Manassas, Virginia 20110-2209, U.S.A.である。
【０２８８】
NG DNA: CNCM
CNCM (Collection de l’Institut Pasteur, BP 52, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris cedex 15, France)からの株107031、抗菌ディスク感受性試験のための参照株（カウントはペトリ皿上で行われた)。
【０２８９】
ICの量：  PCR当り1000コピー
【０２９０】
2.2. 結果：
CTおよびMGのプライマーおよびプローブは、完全な特異性を有する：これらは、それぞれCTまたはMGの核酸以外の全ての核酸と交差反応せず；これらは、他の細菌の核酸またはヒトの核酸とほとんど交差反応しない。
【０２９１】
NGプライマーおよびプローブは、これらが髄膜炎菌（N. meningitidis）と交差反応することを除いて、NGについて特異的である。
【０２９２】
2.2.1. リアルタイムシンプレックスPCRにおけるCT系についての特異性試験：
アンプリコンは175 bpである。
【０２９３】
本発明のCTプライマーおよびプローブは、全てのCT血液型亜型（血清型）を検出する。これらは、特に、以下の血液型亜型（血清型）： A、B、Ba、C、D、E、F、H、I、J、K、L1、L2aおよびL3を検出する。
【０２９４】
本発明のCTプライマーおよびプローブはまた、泌尿生殖器球体に見出される24の異なる細菌株上で試験され、非交差反応性であることが示された。これらの24の他の株について、DNAの存在は、16S rRNAプライマー（S1RおよびS1Fプライマー)を使用するエンドポイント(end-point)PCRによって確認され、その後にゲル上に堆積した。
【０２９５】
特異性の結果は、以下の表１に示す（「シンプレックスCT」の欄）。
【０２９６】
2.2.2. リアルタイムシンプレックスPCRにおけるMG系についての特異性試験：
アンプリコンは、258 bpである。
【０２９７】
本発明のMGプライマーおよびプローブは、試験された９つのMG株を検出する（株G-37、2282、2288、2300、2321、2341、M30、UTMB1およびTW-10-51）。
【０２９８】
本発明のMGプライマーおよびプローブは、試験された全ての29の非MG細菌DNAと交差反応しなかった。
【０２９９】
結果は、表２の「シンプレックスMG」の欄において報告する。
【表２】
0005518471.tif 000018
【０３００】
0005518471.tif 000019
【０３０１】
0005518471.tif 000020
【０３０２】
2.2.3. リアルタイムシンプレックスPCRにおけるNG系についての特異性試験：
アンプリコンは252 bpである。
【０３０３】
本発明のNGプライマーおよびプローブは、55の異なるNG株でリアルタイムPCRにおいて分析した。すべての結果は陽性であった。
【０３０４】
本発明のNGプライマーおよびプローブはまた、NG以外のいくつかのナイセリア（Neisseria）種で試験した。結果を、以下の表３に示す。増幅は以下の種では得られなかった：N. sicca (3株)、N. polysaccharia (1株)、N. subflava (4株)、N. mucosa (3株)、N. cinerea (1株)、およびN. lactamica (2株)。
【０３０５】
試験された16 N. meningitidis株の中で、10はポジティブ反応を与えた（NM交差反応）。
【表３】
0005518471.tif 000021
【０３０６】
本発明のNGプライマーの特異性は、ナイセリア（Neisseria）属に属さない１３の細菌株と共に、エンドポイントPCRにおいて分析し、ゲル上に堆積した。増幅は検出されなかった。結果は、以下の表４に報告した。
【表４】
0005518471.tif 000022
【０３０７】
2.2.4. マルチプレックスPCRの結果:
PCR感度
本発明のCT、MG、NGおよびICプライマーおよびプローブは、CT、MGおよびNG DNAの所定量の混合物で４重にアッセイした（実験は二重に行われた）。
【０３０８】
結果は、以下のとおりである：
【表５】
0005518471.tif 000023
【表６】
0005518471.tif 000024
【表７】
0005518471.tif 000025
【表８】
0005518471.tif 000026
【０３０９】
３．例３：本発明のCT、MGおよびNGリアルタイム増幅系の特異性および感度：
−リアルタイム マルチプレックスPCR（細菌株のパネル上で試験された、同じ混合物中におけるマルチプレックスにおいて一緒の、本発明のCT+MG+NG+ICリアルタイム増幅系）における特異性；
−リアルタイム マルチプレックスPCR（CT、MGおよびNG DNAの所定量の混合物上で試験された、同じ混合物中におけるマルチプレックスにおいて一緒の、CT+MG+NG+IC系）における感度。
【０３１０】
3.1.  材料および方法：
リアルタイム マルチプレックスPCR
* 第１の混合物の組成
1×PCR混合物において、以下のプライマーを加えた：
0.125μMのCTフォワードプライマーU-PC 5580（配列番号７）、
0.5μMのCTリバースプライマーL-PC 5754（配列番号１２）、
0.5μMのMGフォワードプライマーU-MG 1144（配列番号２１）、
0.5μMのMGリバースプライマーL-MG 1283（配列番号２４）、
0.85μMのNGフォワードプライマーU-pilE 159（配列番号４４）、
0.25μMのNGリバースプライマーL-pilE 406（配列番号４７）、
0.5μMのICフォワードプライマーIS 368（配列番号４９）、および
0.5μMのICリバースプライマーIS 569（配列番号５２）。
【０３１１】
プローブは、以下の濃度で使用される：
0.15μM（フルオロフォアFAM）のCTプローブSCT 175b（配列番号９）、
0.2μM（フルオロフォアTAMRA）のMGプローブMGBR 140c（配列番号２３）、
0.2μM（フルオロフォアATTO 647N）のNGプローブpilEc（配列番号４６）および
0.15μM（フルオロフォアATTO-590）のICプローブSIMB（配列番号５１）。
【０３１２】
* 第２の混合物の組成
１×PCR混合物において、以下のプライマーを加えた：
0.125μMのCTフォワードプライマーU-PC 5580（配列番号７）、
0.5μMのCTリバースプライマーL-PC 5754（配列番号１２）、
0.5μMのMGフォワードプライマーU-MG 1087（配列番号２７）、
0.5μMのMGリバースプライマーL-MG 1249（配列番号３０）、
0.85μMのNGフォワードプライマーU-pilE 159（配列番号４４）、
0.25μMのNGリバースプライマーL-pilE 406（配列番号４７）、
0.5μMのICフォワードプライマーIS 368（配列番号４９）、および
0.5μMのICリバースプライマーIS 569（配列番号５２）。
【０３１３】
プローブは、以下の濃度で使用した：
0.15μMのCTプローブSCT 175b（配列番号９）（フルオロフォアFAM)、
0.2μM（フルオロフォアTAMRA）のMGプローブMGBR 186j（配列番号２９）
0.2μM（フルオロフォアATTO 647N）のNGプローブpilEc（配列番号４６）および
0.15μM（フルオロフォアATTO-590）のICプローブSIMB（配列番号５１）。
【０３１４】
* 第３の混合物の組成
1×PCR混合物において、以下のプライマーを加えた：
0.125μMのCTフォワードプライマーU-PC 5580（配列番号７）、
0.5μMのCTリバースプライマーL-PC 5754（配列番号１２）、
0.5μMのMGフォワードプライマーU-MG 1527（配列番号３３）、
0.5μMのMGリバースプライマーL-MG 1704（配列番号３６）、
0.85μMのNGフォワードプライマーU-pilE 159（配列番号４４）、
0.25μMのNGリバースプライマーL-pilE 406（配列番号４７）、
0.5μMのICフォワードプライマーIS 368（配列番号４９）、および
0.5μMのICリバースプライマーIS 569（配列番号５２）。
【０３１５】
プローブは、以下の濃度で使用される：
0.15μMのCTプローブSCT 175b（配列番号９）(フルオロフォアFAM)
0.2μMのMGプローブMGBR 178q（配列番号３５）（フルオロフォアTAMRA）
0.2μM（フルオロフォアATTO 647N）のNGプローブpilEc（配列番号４６）および
0.15μM（フルオロフォアATTO-590）のICプローブSIMB（配列番号５１）。
【０３１６】
* 第４の混合物の組成
１×PCR混合物において、以下のプライマーを加えた：
0.125μMのCTフォワードプライマーU-PC 5580（配列番号７）、
0.5μMのCTリバースプライマーL-PC 5754（配列番号１２)、
0.5μMのMGフォワードプライマーU-MG 1501（配列番号３９）、
0.5μMのMGリバースプライマーL-MG 1704（配列番号３６）、
0.85μMのNGフォワードプライマーU-pilE 159（配列番号４４）、
0.25μMのNGリバースプライマーL-pilE 406（配列番号４７）、
0.5μMのICフォワードプライマーIS 368（配列番号４９）、および
0.5μMのICリバースプライマーIS 569（配列番号５２）。
【０３１７】
プローブは、以下の濃度で使用される：
0.15μMのCTプローブSCT 175b（配列番号９）（フルオロフォアFAM）、
0.2μMのMGプローブMGBR 204u（配列番号４１）（フルオロフォアTAMRA）
0.2μMのNGプローブpilEc（配列番号４６)（フルオロフォアATTO 647N）および
0.15μMのICプローブSIMB（配列番号５１）（フルオロフォアATTO-590）。
【０３１８】
以下の反応物をさらに加える：
5％グリセロール、0.3% PVP 10、2UのTaqポリメラーゼ、1mM dNTPおよび5 mM最終のMgCl2。
【０３１９】
10μLのDNAをこの混合物に加える。
【０３２０】
* 熱サイクリング：
第１のサイクル：95℃で15"
第２のサイクル：95℃で30"
第３のサイクル：58℃で50"
第４のサイクル：72℃で30"
サイクル２からサイクル４を50回繰り返す。
【０３２１】
16S rRNA PCR
1.6.1章参照
【０３２２】
3.2.  結果
3.2.1.  リアルタイム マルチプレックスPCRにおけるMG系についての特異性試験
本発明のMGプライマーおよびプローブは、試験された９つのMG株を検出する（株G-37、2282、2288、2300、2321、2341、M30、UTMB1およびTW-10-51）。
【０３２３】
本発明のMGプライマーおよびプローブはまた、泌尿生殖器球体に見出される27の異なる細菌株上で試験され、非交差反応性であることが示された。これらの27の異なる細菌株について、DNAの存在は、16S rRNAプライマー（S1RおよびS1Fプライマー)を使用するエンドポイントPCRによって確認され、その後にゲル上に堆積した。
【０３２４】
結果を表に報告する。
【表９】
0005518471.tif 000027
【０３２５】
0005518471.tif 000028
【表１０】
0005518471.tif 000029
【０３２６】
0005518471.tif 000030
【表１１】
0005518471.tif 000031
【０３２７】
0005518471.tif 000032
【０３２８】
3.2.2.  四重混合（quadruplex mix）PCRの結果：感度
本発明のCT、MG、NGおよびICプライマーおよびプローブは、所定量のCT、MGおよびNG DNAの混合物上で４重にアッセイした（実験は４重において行なわれた）。４つのマルチプレックスについて試験を行い、１つのMGシンプレックスを含む各マルチプレックスについて記載した。
【０３２９】
結果は以下のとおりである：
【表１２】
0005518471.tif 000033
【表１３】
0005518471.tif 000034
【表１４】
0005518471.tif 000035
【表１５】
0005518471.tif 000036
【０３３０】
４．例４：患者から集めたサンプル（最初のボイド(void)尿試験）
同じ混合物中におけるマルチプレックスにおいて一緒に、CT+MG+NG+ICリアルタイム増幅系；
Roche Amplicor CT試験、ハウスMG PCR試験、およびNG培養試験で比較。
【０３３１】
4.1.  材料および方法：
4.1.1.  サンプル：
サンプルを、ヒトの患者 (Saint Louis Hospital, France) から収集する。最初のボイド(void)尿を使用するまで−20℃で貯蔵する。
【０３３２】
19サンプル（1〜19）をマルチプレックスに試験する。ネガティブコントロール（DNAを含まないサンプル）、ポジティブトラコーマクラミジア（C. trachomatis）コントロール（C. trachomatis DNAのみ）、ポジティブ性器マイコプラズマ（M. genitalium）コントロール（M. genitalium DNAのみ) および 淋菌（N. gonorrhoeae）(N. gonorrhoeae DNAのみ) ポジティブコントロールを、同じランにおいて試験した。
【０３３３】
4.1.2. 抽出方法の説明：
例２を参照
4.1.3.  先行技術CTまたはMGまたはNG検出方法：
CT検出：Roche Diagnostics (Amplicor CT/NG増幅キット  参照：ART：07 59 41 4、およびCobas Amplicor CT検出キット  参照：Art 07 5749 7)から利用可能なCOBAS Amplicor（登録商標）CT試験
MG検出：組織内MG PCR試験： プライマーセット、MgPa-1（5'-AGT TGA TGA AAC CTT AAC CCC TTG G-3';  配列番号５５）およびMgPa-3（5'-CCG TTG AGG GGT TTT CCA TTT TTG C-3';  配列番号５６）を使用して、主要な接着遺伝子の281塩基対の断片を増幅した (Jensen JS, Uldum SA, J Sondergard-Andersen, J Vuust, and K Lind, “Polymerase chain reaction for detection of Mycoplasma genitalium in clinical samples” J. Clin. Microbiol., 1991; 29: 46-50)。281塩基対の増幅した断片の特異性は、ECLオリゴヌクレオチド3-テール ラベリング系（Amersham International, Amersham UK）の使用を含むフルオレセイン11 dUTPでラベルされた、25 mer MgPa 2プローブ (5’- GAC CAT CAA GGT ATT TCT CAA CAG C 3’; 配列番号５７) でのハイブリダイゼーションによって検証した。内部プローブを含むサザンブロットハイブリダイゼーション後に可視できる、281塩基対DNA断片は、検体から得られ、ポジティブとみなされた (Casin I, Vexiau-Robert D, De La Salmoniere P, Eche A, Grandry B, Janier M. “High prevalence of Mycoplasma genitalium in the lower genitourinary tract of women attending a sexually transmitted disease clinic in Paris, France”, Sex Transm Dis., June 2002; 29: 353-359)。
【０３３４】
NG検出：Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) antimicrobial susceptibility testing standards M2-A9 and M7-A7によって編集された、“Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; sixteenth Information Supplement”, January 2006, p130 Table 2Fに記載された、標準NG培養試験。
【０３３５】
4.1.4.  本発明のリアルタイム マルチプレックスPCR: 
例２を参照。
【０３３６】
リアルタイム マルチプレックスPCR
* 混合物の組成
１×PCR混合物において、以下のプライマーを加えた：
0.125μMのCTフォワードプライマーU-PC 5580（配列番号６）、
0.5μMのCTリバースプライマーL-PC 5754（配列番号１２)、
0.025μMのMGフォワードプライマーU-MG 1320（配列番号１５）、
1.25μMのMGリバースプライマーL-MG 1578（配列番号１８)、
0.85μMのNGフォワードプライマーU-pilE 159（配列番号４４）、
0.25μMのNGリバースプライマーL-pilE 406（配列番号４７）、
0.5μMのICフォワードプライマーIS 368（配列番号４９）、および
0.5μMのICリバースプライマーIS 569（配列番号５２）。
【０３３７】
プローブは、次の濃度で使用する：
0.15μM（フルオロフォアFAM）のCTプローブSCT 175b（配列番号９）、
0.2μM（フルオロフォアTAMRA）のMGプローブSFMG 258c（配列番号１７）、および
0.2μM（フルオロフォアATTO 647N）のNGプローブpilEc（配列番号４６）、
0.15μM（フルオロフォアATTO-590）のICプローブSIMB（配列番号５１）。
【０３３８】
次の反応物をさらに加える：
5% グリセロール、0.3% PVP 10、2UのTaqポリメラーゼ、1 mM dNTPおよび5mM最終のMgCl2。
【０３３９】
10μLのDNAをこの混合物に加える。
【０３４０】
*熱サイクリング：
第１のサイクル：95℃で15"
第２のサイクル：95℃で30"
第３のサイクル：58℃で50"
第４のサイクル：72℃で30"
サイクル２からサイクル４を50回繰り返す。
【表１６】
0005518471.tif 000037
【０３４１】
0005518471.tif 000038
【０３４２】
ICは、本発明のリアルタイムマルチプレックス系において完全に検出され、Taqポリメラーゼ阻害剤が存在しないことが確認される。
【０３４３】
本発明のリアルタイム マルチプレックス増幅は良好な再現性を有し、淋菌（N.gonorrhoeae）上の２点を除いて、標準偏差が非常に低い。 
本発明のリアルタイムマルチプレックス系で得られた検出結果は、少なくとも先行技術で得られたものと同様、正確である。
【図１−１】
0005518471.tif 000039
【図１−２】
0005518471.tif 000040
【図１−３】
0005518471.tif 000041
【図２】
0005518471.tif 000042
【図３−１】
0005518471.tif 000043
【図３−２】
0005518471.tif 000044
【図３−３】
0005518471.tif 000045
【図４】
0005518471.tif 000046
【配列表】
0005518471000001.app