(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
緩衝剤、キレート剤及び界面活性剤を含み、
尿１００質量部に対して５〜１００質量部を混合して前処理された尿中で２００ｍＭ以上となるように前記緩衝剤を含むことを特徴とする、ポドカリキシン及びメガリンからなる群から選択される少なくとも１種類の尿中タンパク質定量用の尿前処理剤。
【請求項２】
前記緩衝剤はグッドの緩衝剤であることを特徴とする請求項１に記載の尿中タンパク質定量用の尿前処理剤。
【請求項３】
酢酸、リン酸、クエン酸、ホウ酸及び酒石酸からなる群より選択される少なくとも１種類の酸を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の尿中タンパク質定量用の尿前処理剤。
【請求項４】
前記界面活性剤はポリアルキレンオキサイド誘導体であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１つに記載の尿中タンパク質定量用の尿前処理剤。
【請求項５】
前記界面活性剤のＨＬＢ値は１０〜１８であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１つに記載の尿中タンパク質定量用の尿前処理剤。
【請求項６】
尿１００質量部に対して請求項１乃至５のいずれか１つに記載の尿前処理剤５〜１００質量部を混合することを特徴とする尿前処理方法。
【請求項７】
尿１００質量部に対して請求項１乃至５のいずれか１つに記載の尿前処理剤５〜１００質量部を混合した後、タンパク質濃度を測定することを特徴とする尿中タンパク質定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は尿中タンパク質定量用の尿前処理剤、尿前処理方法、及び尿中タンパク質定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
尿中のタンパク質の測定は、腎臓や泌尿器系だけでなく、循環器系その他全身のさまざまな疾患及び病状の診断に有用である。しかし、尿中のタンパク質の測定は、ｐＨ、無機塩その他の尿中の低分子成分の変動によって影響を受けることが知られている。そして、ｐＨ、無機塩その他の尿中の低分子成分は病状を反映して変動する。従来は、尿の組成の影響を低減するために原尿を緩衝液で高度に希釈して尿中のタンパク質の測定に供していた。ところが最近注目を集める尿中のタンパク質のなかには、尿中の濃度が低いために従来のように高度に希釈したのでは検出が困難なものがある。【０００３】
糸球体上皮細胞に発現する機能分子であるポドカリキシンは糸球体の機能・形態の保持において重要な役割を演じている。特許文献１は、固相に結合した第１の抗ヒトポドカリキシン抗体と検体とを反応させた後、第１の抗ヒトポドカリキシン抗体とは対応エピトープが異なる第２の抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体を反応させ、次いで固相に結合した第２の抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体を測定することからなる検体中のヒトポドカリキシンの測定方法を開示する。この技術には、尿原液に近い状態で定量系に供することができないために極微量の尿中ポドカリキシンの定量ができない、キレート剤添加による尿前処理を行っていないために尿検体中の無機塩析出沈降物の定量系への沈着もしくは堆積によって精密な定量分析ができない、界面活性剤での可溶化を行わないために尿中の全ポドカリキシンを定量できない、という問題点がある。
【特許文献１】特開平６−０１１５０７号公報
【０００４】
特許文献２は、尿中のαＧＳＴを安定化する量の非−酵素蛋白質、キレート剤ならびに緩衝剤を含有し、その結果、保存液のｐＨが７．０〜７．５であり、αＧＳＴの免疫学的活性の損失を防止するのに有効である尿中αＧＳＴのための安定化保存液を開示する。この技術には、尿ｐＨの補正・均一化が完全には行われていないために精密な定量分析ができない、尿検体中の無機塩析出沈降物の解消が完全には行われていないために精密な定量分析ができない、尿中に膜成分を含んだ形で存在する膜タンパク質の定量ができない、という問題点がある。
【特許文献２】特表平１０−５０７２６９号公報
【０００５】
特許文献３は、尿検体中へアルカリ金属アジ化物、金属キレート剤、アルブミン及びサッカロースからなる群から選ばれる化合物を添加することを特徴とする尿中ミオグロビンの安定化方法と、該方法に用いる保存剤とを開示する。この技術には、尿ｐＨの補正・均一化が完全には行われていないために精密な定量分析ができない、尿検体中の無機塩析出沈降物の解消が完全には行われていないために精密な定量分析ができない、尿中に膜成分を含んだ形で存在する膜タンパク質の定量ができない、という問題点がある。
【特許文献３】特開平１０−２８２０９５号公報
【０００６】
特許文献４は、尿検体に還元性酸素酸塩及び／又はイソチアゾロン系化合物を添加し、さらに緩衝剤又はアルカリ剤を含有し、尿検体のｐＨを６から９の範囲に調整し、さらにキレート剤を含有することを特徴とする尿検体中のアナライトの安定化方法と、該方法を用いる尿検体の保存剤とを記載する。この技術には、尿ｐＨの補正・均一化が完全には行われていないために精密な定量分析ができない、尿検体中の無機塩析出沈降物の解消が完全には行われていないために精密な定量分析ができない、尿中に膜成分を含んだ形で存在する膜タンパク質の定量ができない、という問題点がある。
【特許文献４】特開２０００−３５２５６５号公報
【０００７】
特許文献５は、ｐＨを５．０〜９．０に保つための緩衝剤及びキレート剤を含有する尿中有形成分分析用試薬を開示する。この技術には、尿中有形成分分析用試薬であるため、尿上清中あるいは全尿中の成分の定量はできない、原尿に近い状態での尿検体の処理ができない、という問題点がある。
【特許文献５】特開平８−１７０９６０号公報
【０００８】
特許文献６には、尿中のポドカリキシンの定量において、尿検体を界面活性剤で処理することが記載されている。この技術では、尿ｐＨの補正・均一化が完全には行われていないために精密な定量分析ができない、尿検体中の無機塩析出沈降物の解消が完全には行われていないために精密な定量分析ができない、という問題点がある。
【特許文献６】国際公開ＷＯ２００２／０３７０９９号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、原尿を高度に希釈することなく原尿に近い状態で尿中タンパク質の安定な免疫学的検出を行なうために、尿のｐＨの変動の影響を低減又は解消し、尿中の無機塩が析出した沈降物の影響を解消し、膜タンパク質の可溶化ができる尿前処理剤、尿前処理方法、及び尿中タンパク質定量方法の開発を行なう必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は緩衝剤、キレート剤及び界面活性剤を含むことを特徴とする尿中タンパク質定量用の尿前処理剤を提供する。【００１１】
本発明の尿中タンパク質定量用の尿前処理剤において、前記緩衝剤はグッドの緩衝剤の場合がある。【００１２】
本発明の尿中タンパク質定量用の尿前処理剤は、酢酸、リン酸、クエン酸、ホウ酸、酒石酸からなる群より選択される少なくとも１種類の酸を含む場合がある。【００１３】
本発明の尿中タンパク質定量用の尿前処理剤において、前記界面活性剤はポリアルキレンオキサイド誘導体の場合がある。【００１４】
前記界面活性剤のＨＬＢ値は１０〜１８の場合がある。【００１５】
本発明は、尿１００質量部に対して本発明の尿前処理剤１０〜１０００質量部を混合することを特徴とする尿前処理方法を提供する。【００１６】
本発明は、尿１００質量部に対して本発明の尿前処理剤１０〜１０００質量部を混合した後、タンパク質濃度を測定することを特徴とする尿中タンパク質定量方法を提供する。【００１７】
本発明の尿中タンパク質定量方法は、尿中ポドカリキシン定量方法の場合がある。【００１８】
本発明の尿中タンパク質定量方法は、尿中メガリン定量方法の場合がある。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の尿中タンパク質定量用の尿前処理剤、尿前処理方法、及び尿中タンパク質定量方法は、尿検体のｐＨがサンプル間でばらつくのを抑制でき、尿中無機塩析出沈降物の解消し、膜タンパク質の可溶化することができて、原尿に近い状態での微量成分の定量分析ができるという利点がある。【００２０】
本明細書において緩衝剤とは、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン等のアミノ酸と、カルボン酸塩と、リン酸塩と、炭酸塩とグッドの緩衝剤とを含むが、これらに限定されない。【００２１】
本明細書におけるグッドの緩衝剤は、Ｎ−（２−アセタミド）−２−アミノエタンスルホン酸、Ｎ−（２−アセタミド）イミノジ酢酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸、３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸、２−ヒドロキシ−３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸、２−モルホリノエタンスルホン酸、３−モルホリノプロパンスルホン酸、２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロパンスルホン酸、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル−３−アミノプロパンスルホン酸、２−ヒドロキシ−Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン、２−アミノ−２−ヒドロキシメチルプロパン−１，３−ジオール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｎ−（２−Ａｃｅｔａｍｉｄｏ）−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、Ｎ−（２−Ａｃｅｔａｍｉｄｏ）ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ、Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｉｍｉｎｏｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈａｎｅ、Ｎ−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、Ｎ−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、３−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、２−Ｈｙｄｒｏｘｙ−３−［４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、３−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、２−Ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１，４−ｂｉｓ（２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１，４−ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、２−Ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｎ−ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅ��ｈｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、Ｎ−［Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］ｇｌｙｃｉｎｅ、２−ａｍｉｎｏ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐａｎｅ−１，３−ｄｉｏｌ、Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ）を含むが、これらに限定されない。本発明の尿前処理剤の緩衝剤がグッドの緩衝剤の場合には、緩衝能が大きく効率的な尿ｐＨ補正・均一化が可能となり、より好ましい。【００２２】
本発明の尿前処理剤に、酢酸、リン酸、クエン酸、ホウ酸及び酒石酸からなる群から選択される弱酸を添加すると、幅広い緩衝範囲を有するため好ましい。上記の弱酸の添加量は特に限定されないが、尿前処理剤１００質量部中９０質量部以下、好ましくは１０〜９０質量部とすることが好ましい。上記の弱酸の添加量が上記範囲内であれば、適正なｐＨ値としやすく好ましい。【００２３】
本明細書におけるキレート剤は、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノフェニル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン、トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、ジエチル  エネトリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−五酢酸、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジプロピオン酸、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸、イミノ二酢酸、ニトリロ三酢酸、ニトリロトリス（メチルホスホン酸）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス（２−ピリジルメチル）エチレンジアミン、トリエチレンテトラアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’，Ｎ’’’−六酢酸、ヘパリン、クエン酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、クエン酸デキストロース及びアデノシン三リン酸（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ、Ｏ，Ｏ’−Ｂｉｓ（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ、Ｏ，Ｏ’−Ｂｉｓ（２−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ、Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｇｌｙｃｉｎｅ、ｔｒａｎｓ−１，２−Ｄｉａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ、Ｄｉｅｔｈｙｌ  ｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ、Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ’−ｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、Ｎ−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ、Ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ、Ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ、Ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉｓ（ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−Ｔｅｔｒａｋｉｓ（２−ｐｙｒｉｄｙｌｍｅｔｈｙｌ）ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ、Ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’，Ｎ’’’−ｈｅｘａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ、Ｈｅｐａｒｉｎ、Ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ、Ｓｏｄｉｕｍ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ、ａｃｉｄ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｄｅｘｔｒｏｓｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を含むがこれらに限定されない。エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸が尿中カルシウム及び尿中マグネシウムの高マスキング効果の理由から好ましい。【００２４】
本明細書における界面活性剤は、アニオン系、カチオン系及びノニオン系を含むがこれらに限定されない。ノニオン系界面活性剤の中でもポリアルキレンオキサイド誘導体のポリエチレングリコール系、特にポリエチレンオキサイドモノ（ｐ−イソオクチルフェニルエーテル）が好適に用いられる。【００２５】
本発明の界面活性剤のＨＬＢ値（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ−Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ  Ｂａｌａｎｃｅ値）は特に限定されないが、１０〜１８とすることが好ましく、１１〜１５であることがより好ましい。ＨＬＢ値が上記範囲内であれば、尿検体が水相と油相の２相分離せず正確な定量値が得られる。【００２６】
本発明の尿前処理剤及び尿前処理液の配合は特に限定されないが、尿と混合した時点で下記式（１）〜（６）の関係を満たすように調合することが好ましい。【００２７】
尿と尿前処理剤の混合液中の尿の割合をＸ（％）とし、尿と尿前処理剤の混合液中に含まれる緩衝剤の終濃度をＡ（ｍＭ）、尿前処理剤原液中の緩衝剤の濃度をＢ（ｍＭ）とすると、
Ａ≧（２０／９）×Ｘ・・・・・・・・・・・・・・・（１）
Ｂ≧２０００×Ｘ／９×（１００−Ｘ）・・・・・・・（２）
の関係が成り立つことが好ましい。この範囲内なら、尿前処理剤による尿ｐＨの補正・均一化が可能となる。【００２８】
尿と尿前処理剤の混合液中の尿の割合をＸ（％）とし、尿と尿前処理剤の混合液中に含まれるキレート剤の終濃度をＣ（ｍＭ）、尿前処理剤原液中のキレート剤の濃度をＤ（ｍＭ）とすると、
Ｃ≧（２／９）×Ｘ・・・・・・・・・・・・・・・（３）
Ｄ≧２００×Ｘ／９×（１００−Ｘ）・・・・・・・（４）
の関係が成り立つことが好ましい。この範囲内なら、尿前処理剤による尿中無機塩析出沈降物の解消が可能となる。【００２９】
尿と尿前処理剤の混合液中の尿の割合をＸ（％）とし、尿と尿前処理剤の混合液中に含まれる界面活性剤の終濃度をＥ（％）、尿前処理剤原液中の界面活性剤の濃度をＦ（％）とすると、
Ｅ≧０．２・・・・・・・・・・・・・・・・・・・（５）
Ｆ≧２０／（１００−Ｘ）・・・・・・・・・・・・（６）
の関係が成り立つことが好ましい。この範囲内なら、尿前処理剤によって尿中に膜成分を含んだ形で存在する膜タンパク質の可溶化及び、タンパク質系ブロッキング剤なしでの該界面活性剤のみのブロッキング効果が可能となる。【００３０】
前記式（１）〜（６）の関係を全て包含する配合の尿前処理剤が好ましく、この範囲内なら、該尿前処理剤を用いて、極微量の尿中アナライトの精密な定量分析も可能である。【００３１】
本発明の尿前処理剤は、保存剤、防腐剤等の添加剤を含む場合がある。防腐剤は、アジ化ナトリウムのほか、５−クロロ−２メチル−４−イソチアゾリン−３オンや２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン等のイソチアゾロン系の防腐剤を含むがこれに限られない。【００３２】
本発明の尿前処理剤は、阻害剤を含む場合がある。阻害剤は、プロテインキナーゼ阻害剤、Ｇタンパク質シグナル・セカンドメッセンジャー関連阻害剤、カルモジュリンキナーゼ関連阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ関連阻害剤、ＭＡＰキナーゼシグナル関連阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、Ｗｎｔシグナル関連阻害剤、Ａｋｔキナーゼシグナル関連阻害剤、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤、プロテインホスファターゼ阻害剤、サイトカインシグナル阻害剤、ホルモン関連阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ＮＦκＢ転写因子阻害剤、タンパク質・ＲＮＡの核−細胞質間輸送阻害剤、カルシウムシグナル・チャネル阻害剤、神経系関連阻害剤、カスパーゼ・プロテアソーム・グランザイムＢ等の阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、ＣＯＸ・酸化ストレス・ＮＯ関連阻害剤、アポトーシス誘導剤及び阻害剤、血管新生阻害剤、細胞骨格・細胞分裂阻害剤、テロメラーゼ阻害剤、糖プロセシング阻害剤、制癌剤、ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、タンパク質合成阻害剤、ＤＮＡ分解酵素阻害剤及びＲＮＡ分解酵素阻害剤等を含むがこれらに限られない。【００３３】
本発明の尿前処理剤は、水や有機溶剤を添加して希釈される場合がある。本発明の尿前処理液の配合は、水１００質量部に対して尿前処理剤を固形分換算で１０〜１０００質量部程度とすることが好ましい。【００３４】
本発明の尿中のタンパク質定量方法は特に限定されず、例えば、尿前処理剤を水等で希釈してなる尿前処理液を作製し、尿に尿前処理液を添加してからタンパク質を定量する場合がある。尿と尿前処理剤の割合は特に限定されないが、尿１００質量部に対して尿前処理剤５〜１００質量部添加することが好ましい。尿と尿前処理剤の割合が上記範囲内であれば尿前処理剤が溶解しやすい。【００３５】
ポドカリキシンの定量にはＥＬＩＳＡ法、ＬＡ（Ｌａｔｅｘ  Ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ−Ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）法等の方法が適用できる。メガリンの定量にはＣＬＥＩＡ（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）法、ＭＥＩＡ（Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）法等の方法が適用できる。これらの方法では、遠心工程を省略しても清透化を可能することができるので、ブロッキング剤の使用量を削減したり省略することができる。【００３６】
尿は生体内での恒常性維持の終末として、生理的変動の影響の大きい検体種である。そのため、尿中ポドカリキシン定量には尿検体の採尿時の個人差変動や日差変動、日内変動が要因となって、検査値に誤差を生じやすいが、緩衝剤、キレート剤、及び界面活性剤の添加量を調整することにより、誤差の発生要因である沈殿や相分離を解消することができるので、安定した検査値が得られる。【００３７】
ポドカリキシンの定量に用いる尿検体のｐＨは特に限定されないが、尿検体のｐＨ値を５．５〜７．０に調整することが好ましい。ｐＨがこの範囲外だと検査値に誤差が生じる原因となる場合がある。【００３８】
メガリンの定量に用いる尿検体のｐＨ値は特に限定されないが、尿検体のｐＨ値を７．０〜９．０のアルカリ性とすることが好ましい。ｐＨが酸性だと検査値に誤差が生じる原因となる場合があり、ｐＨ１０を超える検体は皆無である。【００３９】
本発明の尿検体前処理方法は、尿中のタンパク質定量、例えばポドカリキシン又はメガリンの定量に好適に用いられる。タンパク質定量には免疫測定方法や非免疫学的に物質の結合を定量する測定方法が挙げられる。【００４０】
免疫測定方法としては、例えばＥＬＩＳＡ法、ＣＬＥＩＡ（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）法、ＣＬＩＡ（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）法、ＥＣＬＩＡ（Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）法、ＥＩＡ法、ＦＥＩＡ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）法、ＩＥＰ（Ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）法、ＩＲＭＡ（Ｉｍｍｕｎｏｒａｄｉｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙ）法、ＬＡ（Ｌａｔｅｘ  Ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ−Ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）法、ＬＩＦＡ（Ｌｉｇａｎｄ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ａｓｓａｙ）法、ＬＰＩＡ（Ｌａｔｅｘ  Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）法、ＭＥＩＡ（Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）法、ＰＡ（Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔ）法、ＰＩＡ（Ｐｕｌｓｅ  Ｉｍｍｕｎｏ  ａｓｓａｙ）法、ＲＩＡ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）法、ＲＰＬＡ（Ｒｅｖｅｒｓｅｄ  Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌａｔｅｘ  Ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔ）法、ＳＲＩＤ（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｒａｄｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）法、ＴＩＡ（Ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）法、免疫クロマトグラフィー法、免疫ブロッティング法、ウェスタンブロッティング法、金コロイド免疫アッセイ法、比濁分析法（Ｎｅｐｈｅｒｏｍｅｔｒｙ）等を含むがこれらに限定されない。【００４１】
非免疫学的に物質の結合を定量する測定方法としては、例えばＳＢＰＡ（Ｓａｎｄｗｉｃｈ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ）法、ＲＲＡ（Ｒａｄｉｏ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｓｓａｙ）法、ＣＰＢＡ（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｓｓａｙ）法等を含むがこれらに限定されない。
これらの定量方法の中でもＥＬＩＳＡ法やＩｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ法に好適に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】本発明の尿前処理剤を用いて尿ｐＨを補正した際の、緩衝剤の濃度依存効果を示すグラフ。
【図２】本発明の尿前処理剤を用いた際の、尿中ポドカリキシン測定系の測定精度の改善効果を示すグラフ。
【図３】尿中ポドカリキシン測定系のｐＨ依存性を示すグラフ。
【図４】本発明の尿前処理剤を用いた際の、尿中メガリン測定系の測定精度の改善効果を示すグラフ。
【図５】尿中メガリン測定系のｐＨ依存性を示すグラフ。
【図６】本発明の尿前処理剤に添加する界面活性剤のブロッキング効果を示すグラフ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
以下に実施例を示すが、これらは実施態様の例示を意図しており本発明の範囲を限定することは意図しない。【００４４】
以下の実施例で用いる試薬、材料及び器具は以下のとおりである。
・アジュバント：Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ａｊｕｖａｎｔ及びＦｒｅｕｎｄ’ｓ  Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ａｊｕｖａｎｔ（ＤＩＦＣＯ社製）。
・ＴＥＳ：Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ緩衝剤（同仁化学研究所製）。
・ＥＤＴＡ：Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄキレート剤（同仁化学研究所製）。
・Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００：Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  Ｍｏｎｏ−ｐ−ｉｓｏｏｃｔｙｌｐｈｅｎｙｌ  Ｅｔｈｅｒを主体とする界面活性剤、ＨＬＢ値１２（ナカライテスク社製）。
・ヒトポドカリキシン：ヒト腎臓から単離した糸球体から抽出（自家調製品）。
・ヒトポドカリキシン水溶液：ヒトポドカリシン５ｍｇ／Ｌ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４及び１．８ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．３）の水溶液。
・ヒトメガリン：ヒト腎臓腎皮質から抽出（自家調製品）。
・ヒトメガリン水溶液：ヒトポドカリシン５ｍｇ／Ｌ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４及び１．８ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．３）の水溶液。
・ＰＢＳ−Ｔ溶液：１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、３．６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．４ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４及び０．０５％（ｖ．／ｖ．）  Ｔｗｅｅｎ２０。
・抗原固相プレート用ブロッキング液：１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、７．２ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２．８ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１％（ｗｔ．／ｖ．）ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）及び５％（ｗｔ．／ｖ．）乳糖。
・ＴＭＢ溶液：ＴＭＢ（３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）を含む水溶液、３００ｍＭ、ＴＭＢ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＤＡＫＯ社製）。
・酵素標識抗体希釈液：１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、３．６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．４ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％（ｖ．／ｖ．）Ｔｗｅｅｎ２０及び０．５％（ｗｔ．／ｖ．）ＢＳＡ。
・リン酸ナトリウム緩衝液：２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）水溶液（市販品）。
１ｍＭ酢酸緩衝液：１ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）水溶液、市販品。
・０．５Ｍ炭酸緩衝液：１２０ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３及び３８０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．６）溶液、市販品。
・１０ｍＭ  炭酸緩衝液：２．４ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３及び７．６ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．６）水溶液、市販品。
・１Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液：Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）水溶液、市販品。
・標識抗体浮遊液：１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１４５ｍＭ  ＮａＣｌ及び１％（ｖ．／ｖ．）ＢＳＡ溶液（ｐＨ７．６）、市販品。
・標識抗体保存液：２．８ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、７．２ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、１％（ｗｔ．／ｖ．）ＢＳＡ、０．０２％（ｖ．／ｖ．）フェノール及び４０％（ｗｔ．／ｖ．）Ｄ−ソルビトール溶液、市販品。
・ＨＲＰ：西洋ワサビペロキシダーゼ、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ＴｙｐｅＶＩ（Ｓｉｇｍａ社製）。
・抗体固相プレート用ブロッキング液：８６ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．５％（ｗｔ．／ｖ．）ＢＳＡ及び０．０５％（ｖ．／ｖ．）Ｔｗｅｅｎ２０水溶液、市販品。
・抗原固相プレート用ブロッキング液：１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、７．２ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２．８ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１％（ｗｔ．／ｖ．）ＢＳＡ及び５％（ｗｔ．／ｖ．）乳糖。
・反応停止液：３１３ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４溶液。
・マイクロタイタープレート：Ｎｕｎｃ−ＩｍｍｕｎｏＴＭ  Ｍｏｄｕｌｅ  Ｆ８  ＭａｘｉｓｏｒｐＴＭ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｔｅ（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）。
・プロテインＧ  カラム：ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ＨＰ、５ｍＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社製）。【００４５】
（検体）
尿検体として、健康診断で採取した任意の尿検体８０例を使用した。内訳は男性４０検体、女性４０検体であった。【００４６】
（緩衝剤）
緩衝剤は、下記の試薬を使用した。
ＡＤＡ−ＮａＯＨ
ＢＥＳ−ＮａＯＨ
ＢＥＳ−ＮａＯＨ
ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ
ＭＥＳ−ＮａＯＨ
ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ
ＴＥＳ−ＮａＯＨ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
上記の緩衝剤の化合物名は以下のとおりである。
・ＡＤＡ：Ｎ−（２−Ａｃｅｔａｍｉｄｏ）ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ
・ＢＥＳ：Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ
・ＨＥＰＥＳ：２−［４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ
・ＭＥＳ：２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ，ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ
・ＭＯＰＳ：３−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ
・ＴＥＳ：Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ
・Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ：Ｂｉｓ−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｉｍｉｎｏｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈａｎｅ
・Ｔｒｉｓ：Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ
【実施例１】
【００４７】
（評価方法）
（１）尿前処理剤及び尿前処理剤の調製
キレート剤（ＥＤＴＡ）７．４ｇと、界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）１０．７ｇと、表１に示した緩衝剤とを混合して尿前処理剤とし、該尿前処理剤を水と混合して１００ｍＬの尿前処理液とした。【００４８】
（２）尿検体の前処理
各尿検体９０質量部と、表１の処方に基づき製造した尿前処理液１０質量部とを混合した後、ｐＨメーターで各検体のｐＨ値を測定した。尿ｐＨは株式会社堀場製作所製のコンパクトｐＨメーター（Ｔｗｉｎ  ｐＨ）を使用した。【００４９】
（結果）
上記の方法により測定した８０検体分のｐＨ値の最大、最小、平均、及び標準偏差を表１に、緩衝剤量に対する８０検体の標準偏差をプロットしたグラフを図１に示す。【００５０】
【表１】
0005515740.tif 000002
【００５１】
表１及び図１から、緩衝剤の配合量は前処理後の尿検体中２００ｍＭ以上でｐＨ調整効果が顕著となることがわかった。
【実施例２】
【００５２】
実施例２の目的は、尿検体前処理液組成物及びそれを用いた尿検体前処理方法をＥＬＩＳＡ法を用いた尿中ヒトポドカリキシン検出系に適応させることである。【００５３】
（方法）
（１）抗ヒトポドカリキシン・マウスモノクローナル抗体の作製
ヒトポドカリキシン５０μｇをマウス腹腔にアジュバントとともに数回免疫し、その血清力価が上昇したことを確認した。静脈内に追加免疫後３日目に脾臓を取り出し、得られた脾細胞とマウスミエローマ細胞とを細胞数で１０：１の割合でポリエチレングリコール３５００の存在下で融合させ、ハイブリドーマ細胞を作製した。【００５４】
ハイブリドーマ細胞を５％ＣＯ２雰囲気下、３７°Ｃで１週間培養し、培養上清中の抗ヒトポドカリキシン抗体の有無を調べた。抗体産生を認めたハイブリドーマ細胞の陽性ウェル中の細胞を限界希釈法により希釈し２週間培養し、同様に培養上清の抗ヒトポドカリキシン抗体の有無をヒトポドカリキシン固相化マイクロタイタープレートを用いたＥＩＡ法で調べた。陽性ウェル中の細胞を再度限界希釈し、同様の培養を行った。この段階で抗ヒトポドカリキシン抗体を産生している細胞をフラスコにて培養し、その一部を１０％  ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むウシ胎児血清（ＦＣＳ）に懸濁し（５×１０６個／ｍＬ）、液体窒素中で保存した。【００５５】
次に各ウェルの上清を用い、ヒトポドカリキシンに対する培養上清中の産生抗体の反応性を調べた。まずマイクロタイタープレートのウェルに、１００μＬ／ウェルの前記ヒトポドカリキシン水溶液を添加し、５００ｎｇ／ウェル、４°Ｃ、１２時間ヒトポドカリキシンをマイクロタイタープレート上に吸着させて抗原を固相化した。１２時間後、ウェル中の前記ヒトポドカリキシン水溶液をデカンテーションにより除去し、該ウェルに２００μＬ／ウェルのＰＢＳ−Ｔ溶液を添加してデカンテーションで除去することによって、ウェルに吸着及び固相化しなかった過剰なヒトポドカリキシンを洗浄除去した。この洗浄工程を計２回行った。【００５６】
その後、２００μＬ／ウェルの抗原固相プレート用ブロッキング液を添加し、ヒトポドカリキシン固相化マイクロタイタープレートのウェル内のブロッキングを４°Ｃ、１２時間行った。１２時間経過後、ブロッキングを完了したヒトポドカリキシン固相化マイクロタイタープレートは４°Ｃのままで保存された。ブロッキングを完了したヒトポドカリキシン固相化マイクロタイタープレートを培養上清中の抗体の反応性を確認するために用いた。前記ヒトポドカリキシン固相化マイクロタイタープレートの各ウェルに１００μＬ／ウェルのハイブリドーマ培養上清を加え、３７°Ｃ、１時間加温した。その後、前記ウェル中の培養上清をデカンテーションにより除去し、前記ウェルへ２００μＬ／ウェルのＰＢＳ−Ｔを添加し、デカンテーションによってＰＢＳ−Ｔの除去を行い、前記ウェルを洗浄した。この洗浄工程を計３回行った。【００５７】
その後、前記ウェルに１００μＬ／ウェル（２０００倍希釈：０．５５μｇ／ｍＬ）のペロキシダーゼ結合ヤギ抗マウス免疫グロブリン（ＤＡＫＯ社製）を添加し、３７°Ｃ、１時間加温した。この酵素標識抗体の希釈には酵素標識抗体希釈液を用いた。その後、前記ウェル中の酵素標識抗体をデカンテーションにより除去し、２００μＬ／ウェルのＰＢＳ−Ｔを添加し、デカンテーションにより除去して洗浄した。この洗浄工程を計３回行った。その後、前記ウェルの１００μＬ／ウェルのＴＭＢ溶液をペロキシダーゼ反応基質溶液として添加し、２５°Ｃ、３０分静置した。その後直ちに、前記ウェル内の基質反応液に１００μＬ／ウェルの反応停止液（３１３ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４溶液）を添加し、前記ウェル内での酵素反応を停止した。その後、前記ウェルの吸光度を測定し、４５０ｎｍの吸光度から６３０ｎｍの吸光度を差し引いた数値を反応性評価の指標とした。【００５８】
その結果、固相化したヒトポドカリキシンに強い反応性を示す培養上清を産生するハイブリドーマ細胞を選択した。本培養上清中の免疫グロブリンの抗体クラス及びサブクラスを免疫グロブリン  Ｔｙｐｉｎｇ  Ｋｉｔ、Ｍｏｕｓｅ（和光純薬工業社製）を用いて、前記ハイブリドーマ細胞のクローン毎に確認した。その結果を基に、得られた単クローン細胞ライブラリーの中から、ＩｇＧクラスを産生するクローンの細胞を２５ｍＬフラスコで増殖させ、さらに７５ｍＬフラスコに移して増殖させた。この細胞をプリスタン処理マウス腹腔中に注射し、腹水を採取した。【００５９】
（２）抗ヒトポドカリキシン・マウスモノクローナル抗体ＩｇＧの精製
マウス腹水（１０ｍＬ）と混濁血清処理剤（ＦＲＩＧＥＮ（登録商標）ＩＩ、協和純薬工業社製）とを、腹水１．５容に対してＦＲＩＧＥＮ（登録商標）ＩＩを１容の比率で混和し、１〜２分攪拌振とうし、腹水を脱脂した。遠心分離機で１９３０×ｇ、１０分間の遠心分離を行い、清澄化された腹水遠心上清（１０ｍＬ）を分取した。【００６０】
前記腹水遠心上清（１０ｍＬ）について氷浴中、１時間、硫安分画操作（終濃度５０％飽和硫安）を行い、沈降した免疫グロブリン画分をＰＢＳに懸濁溶解させた。前記硫安分画操作を計２回行い、腹水からのＩｇＧ粗画分を得た。【００６１】
得られた免疫グロブリン粗画分（１０ｍＬ）に対して等体積のリン酸ナトリウム緩衝液を混合し、プロテインＧカラムを用いてアフィニティ精製を行った。サンプルをプロテインＧカラムに吸着後、リン酸ナトリウム緩衝液をプロテインＧカラム内に通し、サンプル中のＩｇＧ以外の夾雑物を洗浄除去した。その後、プロテインＧカラムに吸着したＩｇＧは、０．１Ｍ  グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．７）水溶液で溶出した。ＩｇＧを含む溶出液は１Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液で中和し、アフィニティ精製の溶出液の体積に対して５００倍の体積のＰＢＳで、４°Ｃ、６時間の透析を２回行って精製した。透析には透析用セルロースチューブ（Ｖｉｓｋａｓｅ  Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ社製）を用いた。透析されたＩｇＧ溶出画分を、抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体の精製物とした。抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体は４°Ｃで保存した。【００６２】
なお、上記ＩｇＧの精製にはＢｉｏＬｏｇｉｃ  ＬＰシステム（Ｂｉｏ  Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を使い、前記プロテインＧカラムを接続し、流速は１ｍＬ／分となるよう制御した。【００６３】
（３）抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体固相化マイクロタイタープレートの作成
精製抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体を、最終濃度７μｇ／ｍＬとなるようにｐＨ７．３のＰＢＳに溶解した。マイクロタイタープレートのウェルに、１００μＬ／ウェルの前記精製抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体／ＰＢＳ溶液を添加し、４°Ｃ、１２時間、抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体をマイクロタイタープレート上に固相化した。１２時間後、前記ウェル中の抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体／ＰＢＳ溶液をデカンテーションにより除去し、該ウェルに２００μＬ／ウェルのＰＢＳ−Ｔを添加し、デカンテーションにより除去して、ウェルに吸着及び固相化されなかった過剰分の抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体を洗浄した。この洗浄工程を計２回行った。その後、２００μＬ／ウェルの抗体固相プレート用ブロッキング液を添加し、４°Ｃ、１２時間抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体を固定したマイクロタイタープレートのウェル内のブロッキングを行い、１２時間経過後、４°Ｃで保存した。【００６４】
（４）ＨＲＰ標識化抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体の作成
西洋ワサビペロキシダーゼ（ＨＲＰ）を純水に４ｍｇ／ｍＬの濃度で溶かし、ＨＲＰ水溶液とした。このＨＲＰ溶液５００μＬ（２ｍｇ）に１００μＬの１００ｍＭ  メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液を加えて、２０分間、室温で攪拌した。ＨＲＰ溶液に対して５００倍容の１ｍＭ酢酸緩衝液で４°Ｃ、６時間の透析を２回行った。この透析操作には透析用セルロースチューブ（Ｖｉｓｋａｓｅ  Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ社製）を使用した。次に、抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体を、１０ｍＭ  炭酸緩衝液に８ｍｇ／ｍＬの濃度で溶かした。前記ＨＲＰ溶液５００μＬ（２ｍｇ）に、ＨＲＰ溶液に対して１／３倍容の０．５Ｍ  炭酸緩衝液を加え、さらに、５００μＬ（４ｍｇ）の前記抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体／１０ｍＭ  炭酸緩衝液を混合し、室温で２時間攪拌した。その後、４ｍｇ／ｍＬの水素化ホウ素ナトリウム溶液（５０μＬ）を加え、氷水浴中で２時間攪拌した。この溶液に、硫安分画操作（終濃度５０％飽和硫安）を氷浴中で１時間行い、沈降した画分を標識抗体浮遊液１ｍＬに懸濁溶解させた。この硫安分画操作を計２回行い、前記標識抗体浮遊液の総体積に対して３／４倍容の標識抗体保存液を加え、ＨＲＰ標識化抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体原液を得た。【００６５】
（５）尿中ヒトポドカリキシンの定量
前記抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体を固相化したマイクロタイタープレートと、前記ＨＲＰ標識化抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体とを用いて、尿中のヒトポドカリキシンを定量した。まず、尿サンプル９０μＬと、２Ｍ  ＴＥＳ、０．２Ｍ  ＥＤＴＡ及び２％（ｖ．／ｖ．）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む水溶液（ｐＨ７．０）１０μＬとを混合し、この混合液１００μＬを抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体を固定したマイクロタイタープレートの１個のウェルに添加した。これを３７°Ｃ、１時間静置し、前記ウェル中の尿サンプル溶液をデカンテーションにより除去し、該ウェルに２００μＬ／ウェルのＰＢＳ−Ｔを添加し、デカンテーションによって除去して、洗浄を行った。この洗浄工程を計３回行った。【００６６】
その後、前記実施例２の（４）節で調製した原液を標識抗体希釈液で１０，０００倍希釈したＨＲＰ標識化抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体溶液を１００μＬ／ウェル添加した。３７°Ｃで１時間静置し、その後、前記ＨＲＰ標識化抗体溶液をデカンテーションにより除去し、前記ウェルに、２００μＬ／ウェルのＰＢＳ−Ｔを添加し、デカンテーションによって除去を行い、洗浄を行った。この洗浄工程を計３回行った。次に、前記ウェルにペロキシダーゼ酵素反応基質溶液として、１００μＬ／ウェルのＴＭＢ溶液を添加し、２５°Ｃ、３０分静置した。その後直ちに、前記ウェル内の基質反応液に１００μＬ／ウェルの反応停止液を添加し、前記ウェル内での酵素反応を停止させ、吸光度測定試料を作製した。吸光度測定試料の４５０ｎｍ及び６３０ｎｍにおける吸光度を測定し、４５０ｎｍの吸光度から６３０ｎｍの吸光度を差し引いた数値を尿中ヒトポドカリキシン定量の指標とした。検量線の標準品としては、抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体作出時に免疫用抗原として用いたヒトポドカリキシンを使用した。その検量線から実際の尿中ポドカリキシン濃度を算出した。【００６７】
なお、本発明の尿検体前処理液組成及びそれを用いた尿検体前処理方法を尿中ヒトポドカリキシン定量に適応することによって、初めて、尿中ヒトポドカリキシンの精密定量検出が可能となった。本発明の効果を検証するにあたっては、尿中にポドカリキシン排泄が無いことを確認することができた健常人尿を用い、標準品のポドカリキシン抗原を添加して、尿検体間でのポドカリキシン測定誤差の確認と本発明の効果の確認を行った。その効果を表２及び図２に記載した。【００６８】
【表２】
0005515740.tif 000003
【実施例３】
【００６９】
実施例３の目的は、ＥＬＩＳＡ法を用いた尿中ヒトポドカリキシン検出系へのｐＨ依存的反応性を評価することである。【００７０】
実施例２で構築した尿中ポドカリキシン測定系におけるｐＨ依存的反応性を評価した。ｐＨ依存性を評価するため、尿検体の代わりに、５０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５又はｐＨ７．０）か、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０又は８．５）かを含む６種類のｐＨの異なる緩衝液と、０．２％（ｖ．／ｖ．）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び２０ｍＭ  ＥＤＴＡとを含むｐＨ反応性評価液を用意した。ヒトポドカリキシン抗原をスパイク添加したｐＨ反応性評価液を尿検体の代わりに尿中メガリン測定系に供し、ｐＨ依存性を評価した。【００７１】
【表３】
0005515740.tif 000004
【００７２】
その結果、表３及び図３に示すとおり、高ｐＨでは反応性が低く、ｐＨの低下に伴って尿中ポドカリキシン測定系の反応性が向上する結果が得られた。本発明の目的は、尿検体前処理液組成物及びそれを用いた尿検体前処理方法を使用することにより、尿を検査対象物とした尿検査測定技術・測定方法において、検査値に誤差を生じる要因の検査測定系への影響性を消失させ、尿原液に近い状態で、尿測定サンプルを検査測定系へ供することができることであるが、上述の結果は、簡便で所要時間が短く、且つ、臨床検査における尿検体を用いた精密な定量を可能としており、本発明の効果を大きく支持するものである。
【実施例４】
【００７３】
実施例４の目的は、尿検体前処理液組成物及びそれを用いた尿検体前処理方法をＥＬＩＳＡ法を用いた尿中ヒトメガリン検出系に適応させることである。【００７４】
（方法）
（１）抗ヒトメガリン・マウスモノクローナル抗体の作製
ヒトメガリン５０μｇをマウス腹腔にアジュバントとともに数回免疫し、その血清力価が上昇したことを確認した。静脈内に追加免疫後３日目に脾臓を取り出し、得られた脾細胞とマウスミエローマ細胞を細胞数で１０：１の割合でポリエチレングリコール３５００の存在下で融合させ、ハイブリドーマ細胞を作製した。該ハイブリドーマ細胞を５％ＣＯ２雰囲気下、３７°Ｃで１週間培養し、培養上清中の抗ヒトメガリン抗体の有無を調べた。抗体産生を認めたハイブリドーマ細胞の陽性ウェル中の細胞を限界希釈法により希釈し２週間培養し、同様に培養上清中の抗ヒトメガリン抗体の有無をヒトメガリン固相化マイクロタイタープレートを用いたＥＩＡ法で調べた。さらにその後、抗体産生を認めた陽性ウェル中の細胞を再度限界希釈し、同様の培養を行った。この段階で抗ヒトメガリン抗体を産生している細胞を、フラスコにて培養し、その一部を１０％  ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むウシ胎児血清（ＦＣＳ）に懸濁し（５×１０６個／ｍＬ）、液体窒素中で保存した。【００７５】
次に各ウェルの上清を用い、ヒトメガリンに対する培養上清中の産生抗体の反応性を調べた。ヒトメガリン０．０５ｍｇを、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４及び１．８ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４溶液（ｐＨ７．３、以下、「ＰＢＳ，ｐＨ７．３」と略す。）１０ｍＬに溶解した。マイクロタイタープレートのウェルに、１００μＬ／ウェルの前記ヒトメガリン／ＰＢＳ，ｐＨ７．３水溶液を加え、ヒトメガリンを３ｐｍｏｌ／ウェル、４°Ｃ、１２時間マイクロタイタープレート上に固相化した。１２時間後、ウェル中の前記ヒトメガリン／ＰＢＳ，ｐＨ７．３溶液をデカンテーションにより除去し、該ウェルに２００μＬ／ウェルのＰＢＳ−Ｔ溶液を添加してデカンテーションにより除去することによって、ウェルに吸着及び固相化しなかった過剰なヒトメガリンを洗浄した。この洗浄工程を計２回行った。その後、２００μＬ／ウェルの抗原固相プレート用ブロッキング液を各ウェルに添加し、４°Ｃ、１２時間ヒトメガリン固相化マイクロタイタープレートのウェルのブロッキングを行った。１２時間経過後、ブロッキングを完了したヒトメガリン固相化マイクロタイタープレートは４°Ｃのままで保存された。【００７６】
培養上清中の抗体の反応性を確認するために、このブロッキング完了後のヒトメガリン固相化マイクロタイタープレートを用いた。上記ヒトメガリン固相化マイクロタイタープレートのウェルへ、ハイブリドーマ培養上清を１００μＬ／ウェルで加え、３７°Ｃ、１時間加温した。その後、ウェルに加えておいた培養上清をデカンテーションにより除去し、そのマイクロタイタープレートのウェルへＰＢＳ−Ｔを２００μＬ／ウェルで添加し、デカンテーションによるＰＢＳ−Ｔの除去を行い、ウェル内の洗浄をした。この洗浄工程を計３回行った。【００７７】
その後、ウェルに１００μＬ／ウェル（２０００倍希釈：０．５５μｇ／ｍＬ）のペロキシダーゼ結合ヤギ抗マウス免疫グロブリン（ＤＡＫＯ社製）を添加し、３７°Ｃで１時間加温した。この酵素標識抗体の希釈には、酵素標識抗体希釈液を用いた。その後、前記ウェル中の酵素標識抗体をデカンテーションにより除去し、該ウェルに２００μＬ／ウェルのＰＢＳ−Ｔを添加し、デカンテーションにより除去を行い、前記ウェルを洗浄した。この洗浄工程を３回行った。その後、前記ウェルに１００μＬ／ウェルのＴＭＢ溶液をペロキシダーゼ酵素反応基質溶液として添加し、２５°Ｃ、３０分静置した。その後直ちに、前記ウェル内の基質反応液に１００μＬ／ウェルの反応停止液を添加し、前記ウェル内での酵素反応を停止した。その後、前記ウェルの吸光度を測定し、４５０ｎｍの吸光度から６３０ｎｍの吸光度を差し引いた数値を反応性評価の指標とした。【００７８】
その結果、固相化したヒトメガリンに強い反応性を示す培養上清を産生するハイブリドーマ細胞を選択し、本培養上清中の免疫グロブリンの抗体クラス及びサブクラスを免疫グロブリン  Ｔｙｐｉｎｇ  Ｋｉｔ、Ｍｏｕｓｅ（和光純薬工業社製）を用いて、前記ハイブリドーマ細胞のクローン毎に確認した。その結果を基に、得られた単クローン細胞ライブラリーの中から、ＩｇＧクラスを産生するクローンの細胞を２５ｍＬフラスコで増殖させ、さらに７５ｍＬフラスコに移して増殖させた。この細胞をプリスタン処理マウス腹腔中に注射し、腹水を採取した。【００７９】
（２）抗ヒトメガリン・マウスモノクローナル（ＩｇＧ）抗体の精製
得られた腹水（１０ｍＬ）と混濁血清処理剤（ＦＲＩＧＥＮ（登録商標）ＩＩ、協和純薬工業社製）とを、腹水１．５容に対してＦＲＩＧＥＮ（登録商標）ＩＩを１容の比率で混和し、１〜２分攪拌振とうすることで、腹水を脱脂した。遠心機で１９３０×ｇ、１０分間の遠心分離を行い、清澄化された腹水遠心上清（１０ｍＬ）を分取した。前記腹水遠心上清（１０ｍＬ）について氷浴中、１時間、硫安分画操作（終濃度５０％飽和硫安）を行い、沈降した免疫グロブリン画分をＰＢＳに懸濁溶解させた。前記硫安分画操作を計２回行い、腹水からのＩｇＧ粗画分を得た。得られた免疫グロブリン粗画分（１０ｍＬ）に対して等質量のリン酸ナトリウム緩衝液を混合し、プロテインＧカラム（ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ＨＰ、５ｍＬ：Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いてアフィニティ精製を行った。サンプルをプロテインＧカラムに吸着後、５０ｍＬの２０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）をプロテインＧカラム内に通し、サンプル中のＩｇＧ以外の夾雑物を洗浄除去した。その後、プロテインＧカラムにアフィニティ吸着したＩｇＧは、０．１Ｍ  グリシン−ＨＣｌ，ｐＨ２．７水溶液で溶出させ、カラムからの溶出直後の溶出画分を１Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液で中和し回収した。中和後、アフィニティ精製物に対して５００倍容のＰＢＳで４°Ｃ、６時間の透析を２回行った。本透析操作に用いた透析膜は透析用セルロースチューブ（Ｖｉｓｋａｓｅ  Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ社製）で行った。得られたＩｇＧ溶出画分を、抗ヒトメガリンモノクローナル抗体の精製物とした。抗ヒトメガリンモノクローナル抗体は４°Ｃで保存した。なお、本精製には、ＢｉｏＬｏｇｉｃ  ＬＰシステム（Ｂｉｏ  Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）に上述のプロテインＧカラムを接続し、流速は１ｍＬ／分で一貫して行った。【００８０】
（３）抗ヒトメガリンモノクローナル抗体固相化マイクロタイタープレートの作成
精製抗ヒトメガリンモノクローナル抗体をＰＢＳ，ｐＨ７．３水溶液に溶解し、終濃度７μｇ／ｍＬとした。マイクロタイタープレートのウェルに、１００μＬ／ウェルの抗ヒトメガリンモノクローナル抗体／ＰＢＳ，ｐＨ７．３水溶液を加え、４°Ｃ、１２時間、抗ヒトメガリンモノクローナル抗体をマイクロタイタープレート上に固相化した。１２時間後、前記ウェル中の抗ヒトメガリンモノクローナル抗体／ＰＢＳ，ｐＨ７．３水溶液をデカンテーションにより除去し、該ウェルに２００μＬ／ウェルのＰＢＳ−Ｔを添加し、デカンテーションにより除去して、ウェルに吸着及び固相化されなかった過剰分の抗ヒトメガリンモノクローナル抗体を洗浄した。この洗浄工程を２回行った。その後、２００μＬ／ウェルの抗体固相プレート用ブロッキング液を添加し、４°Ｃ、１２時間ヒトメガリンを固相化したマイクロタイタープレートのウェル内のブロッキングを行い、１２時間経過後、４°Ｃで保存した。【００８１】
（４）ペルオキシダーゼ標識化抗ヒトメガリンモノクローナル抗体の作成
西洋ワサビペロキシダーゼ（以下、ＨＲＰと略す）（Ｐｅｒｏｘｙｄａｓｅ  ｆｒｏｍ
ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ＴｙｐｅＶＩ：Ｓｉｇｍａ社製）を純水に４ｍｇ／ｍＬの濃度で溶かしてＨＲＰ溶液とした。このＨＲＰ溶液５００μＬ（２ｍｇ）に１００μＬの１００ｍＭ  メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液を加えて、２０分間、室温で攪拌した。ＨＲＰ溶液に対して５００倍容の１ｍＭ酢酸緩衝液で４°Ｃ、６時間の透析を２回行った。透析には透析用セルロースチューブ（Ｖｉｓｋａｓｅ  Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ社製）を用いた。透析後、抗ヒトメガリンモノクローナル抗体を、１０ｍＭ  炭酸緩衝液に８ｍｇ／ｍＬの濃度で溶かした。前記ＨＲＰ溶液５００μＬ（２ｍｇ）に、ＨＲＰ溶液に対して１／３倍容の０．５Ｍ  炭酸緩衝液を加え、さらに、５００μＬ（４ｍｇ）の前記抗ヒトメガリンモノクローナル抗体／１０ｍＭ  炭酸緩衝液を混合し、室温で２時間攪拌した。さらに４ｍｇ／ｍＬの水素化ホウ素ナトリウム溶液（５０μＬ）を加え、氷水浴中で２時間攪拌した。この溶液に、硫安分画操作（終濃度５０％飽和硫安）を氷浴中で１時間行い、沈降した画分を標識抗体浮遊液１ｍＬに懸濁溶解させた。この硫安分画操作を計２回行い、前記標識抗体浮遊液の総体積に対して３／４倍容の標識抗体保存液を加え、ＨＲＰ標識化抗ヒトメガリンモノクローナル抗体原液を得た。【００８２】
（５）尿中メガリンの定量
ＨＲＰ標識化抗ヒトメガリンモノクローナル抗体を固相化したマイクロタイタープレートと、ＨＲＰ標識化抗ヒトメガリンモノクローナル抗体を用いて、尿中のメガリン（以下、ヒトメガリンともいう）を定量した。ヒトメガリンの定量は、尿サンプル９０μＬと、２Ｍ  ＴＥＳ、０．２Ｍ  ＥＤＴＡ及び２％（ｖ．／ｖ．）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む水溶液（ｐＨ７．０）１０μＬとを混合し、この混合液１００μＬを抗ヒトメガリンモノクローナル抗体を固相化したマイクロタイタープレートの１個のウェルに添加した。前記マイクロタイタープレートを３７°Ｃで１時間静置し、前記ウェル中の尿サンプル溶液をデカンテーションにより除去し、該ウェルに２００μＬ／ウェルのＰＢＳ−Ｔを添加し、デカンテーションによって除去して、洗浄を行った。この洗浄工程を計３回行った。その後、実施例４の（４）節で調製した原液を標識抗体希釈液で１０，０００倍希釈したＨＲＰ標識化抗ヒトメガリンモノクローナル抗体溶液を１００μＬ／ウェル添加した。３７°Ｃで１時間静置し、その後、前記ＨＲＰ標識化抗体溶液をデカンテーションにより除去し、前記ウェルに、２００μＬ／ウェルのＰＢＳ−Ｔを添加し、デカンテーションによって除去を行い、洗浄を行った。この洗浄工程を３回行った。次に、前記ウェルにペロキシダーゼ酵素反応基質溶液として、１００μＬ／ウェルのＴＭＢ溶液を添加し、２５°Ｃ、３０分静置した。前記ウェル内の基質反応液に１００μＬ／ウェルの反応停止液を添加し、前記ウェル内での酵素反応を停止させ、吸光度測定試料を作製した。その後、前記ウェルの吸光度を測定し、４５０ｎｍの吸光度から６３０ｎｍの吸光度を差し引いた数値を尿中ヒトメガリン定量の指標とした。【００８３】
検量線の標準品としては、抗ヒトメガリンモノクローナル抗体作出時に免疫用抗原として用いたヒトメガリンを使用した。尿中にメガリン排泄が無いことを確認することができた健常人尿を用い、標準品のメガリン抗原を添加して、尿検体間でのメガリン定量誤差の確認と本発明の効果の確認を行った。尿検体前処理を行わない場合は、同一標準抗原量添加においても、尿検体（人差、日内差）によって、測定値に大きな乖離が生じてしまい、定量評価ができなかった。【００８４】
この要因としては、検体間での尿ｐＨ差や、尿中マグネシウム、カルシウムでのカオトロピック効果、尿中無機塩析出沈降物による測定系への沈着もしくは堆積による負の要因が大きい。本発明の尿検体前処理液組成物と、該組成物を用いた尿検体前処理方法とを尿中ヒトメガリン定量へ適応することによって、初めて尿中ヒトメガリンを精密に定量検出することができた。本発明の効果を検証するに当たっては、尿中にメガリン排泄が無いことを確認することができた健常人尿を用い、標準品のメガリン抗原を添加して、尿検体間でのメガリン測定誤差の確認と本発明の効果の確認とを行った。その効果を表４及び図４に記載した。【００８５】
【表４】
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【００８６】
本発明の尿検体前処理液組成物及びそれを用いた尿検体前処理方法を使用することにより、尿を検査対象物とした尿検査測定技術・測定方法において、検査値に誤差を生じる要因の検査測定系への影響性を消失させ、尿原液に近い状態で、尿測定サンプルを検査測定系へ供することができる。本発明の方法を採用することにより、簡便で所要時間が短く、且つ、臨床検査における尿検体を用いた精密な測定が可能となった。
【実施例５】
【００８７】
実施例５の目的は、ＥＬＩＳＡ法を用いた尿中ヒトメガリン検出系へのｐＨ依存的反応性を評価することである。【００８８】
実施例４で示した尿中メガリン測定系へのｐＨ依存的反応性を評価した。操作は実施例４に記載の内容と同様である。ｐＨ依存性を評価するため、尿検体の代わりに、ＭＥＳ及びＴｒｉｓの２種類の緩衝液を用いた。５０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５又はｐＨ７．０）か、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０又は８．５）かを含む６種類のｐＨの異なる緩衝液と、１％（ｖ．／ｖ．）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び２０ｍＭ  ＥＤＴＡとを含むｐＨ反応性評価液を用意した。ヒトメガリン抗原をスパイク添加したｐＨ反応性評価液を尿検体の代わりに尿中メガリン測定系に供し、ｐＨ依存性を評価した。その結果、表５及び図５に示すとおり、低ｐＨでは反応性が低く、ｐＨの上昇に伴って尿中メガリン測定系の反応性が向上する結果が得られた。【００８９】
【表５】
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【００９０】
一方、メガリンは生体内においてスカベンジャー受容体として多様なリガンドと結合している。このメガリンとリガンドの結合は、カルシウムイオン依存的に結合し、カルシウムキレート剤の添加とｐＨのアルカリ環境化によって、リガンドをメガリンは切り離し、メガリンに特徴的な構造領域であるリガンド結合領域を分子表面に露呈させる。今回得られた尿中メガリン測定系のｐＨ依存性の結果は、まさに、このメガリンの分子特性による影響である。ｐＨの上昇によって、メガリン分子のエピトープの露呈、若しくは、メガリン分子と抗メガリン抗体の立体障害の緩和等により、尿中メガリン測定系の反応性がｐＨ依存的に向上したものと考えられる。この特性を活かして、尿中メガリン測定用前処理用液を用いることによって、通常は認識できないメガリン特有のエピトープを免疫学的測定法により検出・定量可能とし、本発明の尿前処理液組成及びこれらを用いた前処理方法の効果を大きく支持するものである。
【実施例６】
【００９１】
実施例６では尿中メガリン定量系への界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）の添加効果を評価した。操作は界面活性剤の配合量を変えた点以外は実施例４と同様とした。結果を表６及び図６に示す。【００９２】
【表６】
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【００９３】
表６及び図６に示すとおり、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００未添加の場合は、メガリン抗原濃度が希薄になるに従って、測定時に使用する容器へのメガリン抗原の非特異的吸着による損失が生じ、その結果、正確な測定が行われない結果となった。これに対しＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００添加の場合は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００のブロッキング効果によって、メガリン抗原の非特異的吸着による損失が防止され、正確な測定が維持されることがわかった。さらに、界面活性剤でブロッキング効果を奏する尿前処理液組成物及びこれらを用いた前処理方法を提供することが可能となった。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明の尿中タンパク質定量用の尿前処理剤、尿前処理方法、及び尿中タンパク質定量方法は、尿検体のｐＨがサンプル間でばらつくのを抑制でき、尿中無機塩析出沈降物の解消し、膜タンパク質の可溶化することができるという効果を奏するので、尿中のポドカリキシンやメガリンの定量に好適に用いられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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