(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡである５’部分とＤＮＡである３’部分を含む一本鎖のセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ分子に付着したＤＮＡデンドリマーを含む組成物。
【請求項２】
タンパク質、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含む分子、ビオチンもしくはビオチン誘導体、フルオレセインもしくはフルオレセイン誘導体、またはその任意の組合せが、前記ＤＮＡデンドリマーにさらに付着している、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ｓｉＲＮＡ分子と抗体とに付着したＤＮＡデンドリマーを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
ｓｉＲＮＡ分子とビオチンとに付着したＤＮＡデンドリマーを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
ｓｉＲＮＡ分子とフルオレセインまたはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を含む、フルオレセイン誘導体とに付着したＤＮＡデンドリマーを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
ヒトまたは動物の血清、血漿、血液、リンパ液、および任意の数の他の体液をさらに含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物が血清中で少なくとも０．５時間安定である、請求項２に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＲＮＡである５’部分が１〜３０塩基長であり、前記ＤＮＡである３’部分が１〜５０塩基長である、請求項１〜７の何れか１項に記載の組成物。
【請求項９】
ＤＮＡデンドリマーと、ＲＮＡである５’部分とＤＮＡである３’部分を含む一本鎖のセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ分子とを含む組成物を調製する方法であって、（ａ）ジスルフィド架橋結合によって；（ｂ）ＮＨＳエステル依存的縮合反応の使用によって；（ｃ）二官能性架橋反応の使用によって；（ｄ）ｓｉＲＮＡのＤＮＡデンドリマー配列への直接的もしくは間接的ハイブリダイゼーションによって；または（ｅ）電荷−電荷相互作用を介してｓｉＲＮＡ分子を前記ＤＮＡデンドリマーに架橋するポリカチオン性化合物の使用によって、前記ｓｉＲＮＡを前記ＤＮＡデンドリマーに付着させる工程を含む方法。
【請求項１０】
前記ＤＮＡデンドリマーに、タンパク質、フルオレセインもしくはフルオレセイン誘導体、ジゴキシゲニン、コレステロール、１級アミン、３〜１２０炭素長の炭化水素スペーサー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含む分子、ビオチンもしくはビオチン誘導体、またはその任意の組合せを付着させる工程をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
抗体またはその断片をさらに付着させる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ビオチンをさらに付着させる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
フルオレセインまたはフルオレセイン誘導体をさらに付着させる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＲＮＡである５’部分が１〜３０塩基長であり、前記ＤＮＡである３’部分が１〜５０塩基長である、請求項９〜１３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ＲＮＡである５’部分とＤＮＡである３’部分を含む一本鎖のセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ分子を分解から保護する方法であって、（ａ）前記ｓｉＲＮＡ分子と（ｂ）タンパク質、ジゴキシゲニン、コレステロール、１級アミン、３〜１２０炭素長の炭化水素スペーサー、ＰＥＧ分子、ビオチン、ビオチン誘導体、フルオレセインもしくはフルオレセイン誘導体、またはその任意の組合せとをＤＮＡデンドリマーに付着させ、それにより、ｓｉＲＮＡ分子を分解から保護する工程を含む方法。
【請求項１６】
前記分解が体液中で起こる分解である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記体液が血清を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記タンパク質が抗体またはその断片である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記ビオチンを前記ＤＮＡデンドリマーに付着させる工程を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記フルオレセインまたはフルオレセイン誘導体を前記ＤＮＡデンドリマーに付着させる工程を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＲＮＡである５’部分が１〜３０塩基長であり、前記ＤＮＡである３’部分が１〜５０塩基長である、請求項１５〜２０の何れか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ＤＮＡデンドリマーとそれに付着したｓｉＲＮＡ分子とを含む組成物ならびにそれを調製、保護、および送達する方法を提供する。
配列表の相互参照
２０１１年４月２６日に作製された「ＤＳＣ００４１−００ＵＳ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」（４４，５４４バイト）として特定される配列表は、参照として本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
樹状分子は、構造完全性を特徴とする繰り返し枝分かれした種である。これは、対称性と多分散性の両方の評価に基づくものである。樹状分子の分野は、低分子量種と高分子量種に大きく分けることができる。第１のカテゴリーには、デンドリマーとデンドロンが含まれ、第２のカテゴリーには、デンドロン化ポリマー、超分岐ポリマー、およびブラシポリマーが含まれる。
【０００３】
最初のデンドリマーはダイバージェントに合成されたが、１９９０年にコンバージェント合成が導入された。その後、その独特の分子構造ゆえに、デンドリマーにおいて科学的関心が急増した。
【０００４】
ＤＮＡデンドリマーは、相互接続した天然または合成ＤＮＡサブユニットから構築された複雑な高分岐分子である。ＤＮＡデンドリマーは、部分的二本鎖ＤＮＡモノマーから構築され、この部分的二本鎖ＤＮＡモノマーは各々、各鎖の中央部分にある配列相補性領域を共有する２つの一本鎖ＤＮＡ分子から作られる。モノマーは、製造プロセスの間に組み合わされて、様々な大きさや形状のＤＮＡデンドリマーが製造される。ＤＮＡデンドリマーが時間とともに壊れてゆくのを防ぐために、このプロセスの間に、ＵＶ光を用いて、ソラーレン架橋剤の挿入と活性化によって、成長するアセンブリに化学的な「スポット溶接点」を付加する。
【０００５】
ＤＮＡデンドリマーをはじめとする、多分子骨格装置は、細胞トランスフェクション剤、イメージング剤、および薬物送達剤として有用であり得る。具体的には、ＤＮＡデンドリマーは、ターゲッティング装置（例えば、細胞のエンドサイトーシスによる内在化事象を誘発することができる細胞表面特徴に特異的な抗体）と結合しており、ターゲッティングされる細胞上の表面特徴に結合して、積み荷（例えば、薬物）の送達を受容することができる。積み荷は、ターゲッティングされたＤＮＡデンドリマーと受動的に会合して、単にこのデンドリマーとの空間的会合によって細胞に侵入し得るか、または積み荷は、いくつかの付着戦略によってデンドリマーに直接結合させ得る。
【０００６】
ｓｉＲＮＡ分子によって誘発される典型的な応答は、ｍＲＮＡノックダウンまたは定常状態ｍＲＮＡレベルの低下と呼ばれており、ｓｉＲＮＡ分子の配列は、どの遺伝子（単数または複数）がノックダウンの標的とされるかを決定する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一実施形態では、本発明は、ｓｉＲＮＡ分子に付着したＤＮＡデンドリマーを含む組成物を提供する。
【０００８】
本発明の別の実施形態では、本発明は、ＤＮＡデンドリマーとｓｉＲＮＡ分子とを含む組成物を調製する方法であって、（ａ）ジスルフィド架橋結合によって；（ｂ）ＮＨＳエステル依存的縮合反応の使用によって；（ｃ）ヘテロ二官能性架橋反応の使用によって；（ｄ）ｓｉＲＮＡのＤＮＡデンドリマー配列への直接的もしくは間接的ハイブリダイゼーションによって；または（ｅ）電荷−電荷相互作用を介してｓｉＲＮＡ分子をＤＮＡデンドリマーに架橋するポリカチオン性化合物の使用によって、ｓｉＲＮＡをＤＮＡデンドリマーに付着させる工程を含む方法を提供する。
【０００９】
本発明の別の実施形態では、本発明は、ｓｉＲＮＡ分子を分解から保護する方法であって、（ａ）ｓｉＲＮＡ分子と（ｂ）タンパク質、ジゴキシゲニン、コレステロール、１級アミン、３〜１２０炭素長の炭化水素スペーサー、ＰＥＧ分子、ビオチン、ビオチン誘導体、フルオレセインもしくはフルオレセイン誘導体、またはその任意の組合せとをＤＮＡデンドリマーに付着させ、それにより、ｓｉＲＮＡ分子を分解から保護する工程を含む方法を提供する。
【００１０】
本発明の別の実施形態では、本発明は、ＤＮＡデンドリマーを体液中での分解から保護する方法であって、ＤＮＡデンドリマーに、タンパク質、ジゴキシゲニン、コレステロール、１級アミン、３〜１２０炭素長の炭化水素スペーサー、ＰＥＧ部分を含む分子、ビオチンもしくはビオチン誘導体、フルオレセインもしくはフルオレセイン誘導体、またはその任意の組合せを付着させ、それにより、ＤＮＡデンドリマーを体液中でのヌクレアーゼ分解から保護する工程を含む方法を提供する。
【００１１】
本発明の別の実施形態では、本発明は、ＤＮＡデンドリマーを体液中に送達する方法であって、ＤＮＡデンドリマーに、タンパク質、ＰＥＧ部分を含む分子、ビオチンもしくはビオチン誘導体、フルオレセインもしくはフルオレセイン誘導体、またはその任意の組合せを付着させ、それにより、ＤＮＡデンドリマーを体液中に送達する工程を含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】デンドリマー成分の調製に使用されるＤＮＡ鎖とモノマーの図である。
【図２】様々なモノマーを添加したときのＤＮＡデンドリマーの（層としての）連続的な成長を示す、ＤＮＡデンドリマーアセンブリ工程の図である。
【図３】ＤＮＡデンドリマーの精製工程の図である。
【図４】特定のオリゴとシグナル分子の付着を含むＤＮＡデンドリマー（４ａ）；オリゴライゲーションによってデンドリマーに結合した標的特異性の拡大像（４ｂ）；および標識オリゴのデンドリマーアームへの共有結合的付着の拡大像（４ｃ）の図である。
【図５】未修飾の４層ＤＮＡデンドリマー、０〜１２０分（５ａ）；および修飾された４層ＤＮＡデンドリマー  ０〜１２０分（抵抗性）（５ｂ）の分解を示すゲルのマイクロ写真。
【図６】未修飾の４層ＤＮＡデンドリマー  ０〜９６０分（６ａ）；および修飾された４層ＤＮＡデンドリマー  ０〜９６０分（抵抗性）（６ｂ）の分解を示すゲルのマイクロ写真。
【図７】（ＤＮＡオリゴ合成用の）６炭素アミノリンカーアミダイト構造物（７Ａ）；（ＤＮＡオリゴ合成用の）１２炭素アミノリンカーアミダイト構造物（７Ｂ）；（ＤＮＡオリゴ合成用の）７炭素内部アミノリンカーアミダイト構造物（７Ｃ）；（ＤＮＡオリゴ合成用の）ｄＴ内部アミノリンカーアミダイト構造物（７Ｄ）の化学構造。
【図８】ＮＨＳエステルの化学構造；Ｃｙ（商標）３  ＮＨＳエステル（８ａ）  励起極大＝５４８ｎｍ、放出極大＝５６２ｎｍ；Ｃｙ５  ＮＨＳエステル（８ｂ）  励起極大＝６４６ｎｍ、放出極大＝６６４ｎｍ。
【図９】Ｏｙｓｔｅｒ  ５５０−Ｄの化学構造（９ａ）；およびＯｙｓｔｅｒ  ６５０−Ｄの化学構造（９ｂ）。
【図１０】（ＤＮＡオリゴ合成用の）ビオチン−ＢＢ−ＣＰＧアミダイト構造物（１０ａ）；（ＤＮＡオリゴ合成用の）ビオチン−ｄＴアミダイトの構造物（１０ｂ）；（ＤＮＡオリゴ合成用の）ビオチン−ＴＥＧアミダイトＣ９Ｏ４スペーサーの構造物（１０ｃ）；（ＤＮＡオリゴ合成用の）ビオチン−ＴＥＧアミダイトＣ４スペーサーの構造物（１０ｄ）の化学構造。
【図１１】ジゴキシゲニン１１−ＵＴＰとそのレポーターの化学構造。
【図１２】ＤＮＡデンドリマーとともに利用されるｓｉＲＮＡ  ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド構築物：ＳＳＢ  ｓｉＲＮＡ（１２ａ）および陰性対照ｓｉＲＮＡ（１２ｂ）のアンチセンス鎖およびセンス鎖の配列；１６塩基のＤＮＡリンカー配列を有するＳＳＢ（１２ｃ）および１６塩基のリンカー配列を有する陰性対照（ｍＲＮＡ標的なし）（１２ｄ）のアンチセンス鎖およびセンス鎖の配列；２１塩基のＤＮＡリンカーを有するＳＳＢ（１２ｅ）および２１塩基のリンカー配列を有する陰性対照（ｍＲＮＡ標的なし）（１２ｆ）のアンチセンス鎖およびセンス鎖の配列；ならびに；２６塩基のＤＮＡリンカー配列を有するＳＳＢ（１２ｇ）および２６塩基のリンカー配列を有する陰性対照（ｍＲＮＡ標的なし）（１２ｈ）のアンチセンス鎖およびセンス鎖の配列。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の一実施形態では、本発明は、ｓｉＲＮＡ分子に付着したＤＮＡデンドリマーを含む組成物を提供する。本発明の別の実施形態では、組成物は、ＤＮＡデンドリマーにさらに付着したタンパク質、フルオレセインもしくは限定するものではないが、ＦＩＴＣなどのフルオレセイン誘導体、ＰＥＧ分子、ビオチン、ビオチン誘導体、または任意のその組合せをさらに含む。驚くべきことに、タンパク質、ペプチド、アプタマー、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体、蛍光色素、ジゴキシゲニン、コレステロール、１級アミン、３〜１２０炭素長の炭化水素スペーサー、ＦＩＴＣ、ＰＥＧ分子、ビオチン、ビオチン誘導体、または任意のその組合せをＤＮＡデンドリマーに付着させることにより、ＤＮＡデンドリマーが体液分解や血清分解から保護されることが発見された。別の驚くべき観察では、タンパク質、ペプチド、アプタマー、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体、蛍光色素、ジゴキシゲニン、コレステロール、１級アミン、３〜１２０炭素長の炭化水素スペーサー、ＦＩＴＣ、ＰＥＧ分子、ビオチン、ビオチン誘導体、または任意のその組合せをＤＮＡデンドリマーに付着させることにより、ＤＮＡデンドリマーとそれに付着したｓｉＲＮＡ分子を体液分解や血清分解から保護することが発見された。別の驚くべき観察では、タンパク質、ペプチド、アプタマー、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体、蛍光色素、ジゴキシゲニン、コレステロール、１級アミン、３〜１２０炭素長の炭化水素スペーサー、ＦＩＴＣ、ＰＥＧ分子、ビオチン、ビオチン誘導体、フルオレセインもしくはフルオレセイン誘導体、または任意のその組合せをＤＮＡデンドリマーに付着させることにより、ＤＮＡデンドリマーが体液分解や血清分解から保護されることが発見された。別の驚くべき観察では、タンパク質、ペプチド、アプタマー、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体、蛍光色素、ジゴキシゲニン、コレステロール、１級アミン、３〜１２０炭素長の炭化水素スペーサー、ＦＩＴＣ、ＰＥＧ分子、ビオチン、ビオチン誘導体、フルオレセインもしくはフルオレセイン誘導体、または任意のその組合せをＤＮＡデンドリマーに付着させることにより、ＤＮＡデンドリマーとそれに付着したｓｉＲＮＡ分子がヌクレアーゼ依存的分解から保護されることが発見された。
【００１４】
本発明の別の実施形態では、ヌクレアーゼはタンパク質ＤＮアーゼである。本発明の別の実施形態では、ヌクレアーゼは外因性ＤＮアーゼである。本発明の別の実施形態では、ヌクレアーゼは、当業者に公知の任意の様々なタンパク質ＤＮアーゼであってもよい。本発明の別の実施形態では、血清分解は血清ヌクレアーゼ分解である。驚くべきことに、タンパク質、ＦＩＴＣ、ＰＥＧ分子、ビオチン、ビオチン誘導体、フルオレセインもしくはフルオレセイン誘導体、または任意のその組合せをＤＮＡデンドリマーに付着させることにより、ＤＮＡデンドリマーとそれに付着したｓｉＲＮＡ分子が血清分解に対して安定化されることが発見された。
【００１５】
本発明の別の実施形態では、本発明の組成物は、組成物を分解から保護する保護基を含む。本発明の別の実施形態では、本発明の組成物は、組成物を、例えば、血清、血液血漿などの体液中での分解から保護する保護基を含む。本発明の別の実施形態では、本発明の組成物は、組成物をヌクレアーゼ依存的分解から保護する保護基を含む。本発明の別の実施形態では、保護基は、ＤＮＡデンドリマーを安定化する化合物または分子である。本発明の別の実施形態では、保護基は、ＤＮＡデンドリマーを分解から保護する化合物または分子である。本発明の別の実施形態では、保護基は、ＤＮＡデンドリマーを体液中での分解から保護する化合物または分子である。本発明の別の実施形態では、保護基は、ＤＮＡデンドリマーを血清中での分解から保護する化合物または分子である。
【００１６】
本発明の別の実施形態では、本明細書に記載の安定化された組成物は、血清中、血清を含む組成物中、血液中、または任意の他の体液中で、少なくとも０．３時間安定である。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載の安定化された組成物は、血清中、血清を含む組成物中、血液中、または任意の他の体液中で、少なくとも０．５時間安定である。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載の安定化された組成物は、血清中、血清を含む組成物中、血液中、または任意の他の体液中で、少なくとも０．７時間安定である。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載の安定化された組成物は、血清中、血清を含む組成物中、血液中、または任意の他の体液中で、少なくとも１時間安定である。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載の安定化された組成物は、血清中、血清を含む組成物中、血液中、または任意の他の体液中で、少なくとも１．５時間安定である。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載の安定化された組成物は、血清中、血清を含む組成物中、血液中、または任意の他の体液中で、少なくとも２時間安定である。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載の安定化された組成物は、血清中、血清を含む組成物中、血液中、または任意の他の体液中で、少なくとも３時間安定である。別の実施形態では、本明細書に記載の安定化された組成物は、血清中、血清を含む組成物中、血液中、または任意の他の体液中で、少なくとも４時間安定である。別の実施形態では、本明細書に記載の安定化された組成物は、血清中、血清を含む組成物中、血液中、または任意の他の体液中で、少なくとも５時間安定である。別の実施形態では、本明細書に記載の安定化された組成物は、血清中、血清を含む組成物中、血液中、または任意の他の体液中で、少なくとも６時間安定である。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載の安定化された組成物は、血清中、血清を含む組成物中、血液中、または任意の他の体液中で、少なくとも７時間安定である。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載の安定化された組成物は、血清中、血清を含む組成物中、血液中、または任意の他の体液中で、少なくとも８時間安定である。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載の安定化された組成物は、血清中、血清を含む組成物中、血液中、または任意の他の体液中で、少なくとも９時間安定である。別の実施形態では、本明細書に記載の安定化された組成物は、血清中、血清を含む組成物中、血液中、または任意の他の体液中で、少なくとも１０時間安定である。別の実施形態では、本明細書に記載の安定化された組成物は、血清中、血清を含む組成物中、血液中、または任意の他の体液中で、少なくとも１１時間安定である。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載の安定化された組成物は、血清中、血清を含む組成物中、血液中、または任意の他の体液中で、少なくとも１２時間安定である。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載の安定化された組成物は、血清中、血清を含む組成物中、血液中、または任意の他の体液中で、少なくとも２時間安定である。別の実施形態では、本明細書に記載の安定化された組成物は、血清中、血清を含む組成物中、血液中、または任意の他の体液中で、少なくとも１３時間安定である。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載の安定化された組成物は、血清中、血清を含む組成物中、血液中、または任意の他の体液中で、少なくとも１４時間安定である。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載の安定化された組成物は、血清中、血清を含む組成物中、血液中、または任意の他の体液中で、少なくとも１５時間安定である。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載の安定化された組成物は、血清中、血清を含む組成物中、血液中、または任意の他の体液中で、少なくとも１６時間安定である。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載の安定化された組成物は、血清中、血清を含む組成物中、血液中、または任意の他の体液中で、少なくとも２０時間安定である。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載の安定化された組成物は、血清中、血清を含む組成物中、血液中、または任意の他の体液中で、少なくとも２４時間安定である。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載の安定化された組成物は、血清中、血清を含む組成物中、血液中、または任意の他の体液中で、少なくとも３０時間安定である。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載の安定化された組成物は、血清中、血清を含む組成物中、血液中、または任意の他の体液中で、少なくとも３６時間安定である。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載の安定化された組成物は、血清中、血清を含む組成物中、血液中、または任意の他の体液中で、少なくとも４８時間安定である。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載の安定化された組成物は、血清中、血清を含む組成物中、血液中、または任意の他の体液中で、少なくとも６０時間安定である。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載の安定化された組成物は、血清中、血清を含む組成物中、血液中、または任意の他の体液中で、少なくとも７２時間安定である。
【００１７】
本発明の別の実施形態では、本明細書に記載の安定化された組成物は、血清中、血清を含む組成物中、血液中、または任意の他の体液中で１〜２４時間安定である。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載の安定化された組成物は、血清中、血清を含む組成物中、血液中、または任意の他の体液中で１〜２０時間安定である。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載の安定化された組成物は、血清中、血清を含む組成物中、血液中、または任意の他の体液中で５〜１５時間安定である。別の実施形態では、本明細書に記載の安定化された組成物は、血清中、血清を含む組成物中、血液中、または任意の他の体液中で１０〜１６時間安定である。
【００１８】
本発明の別の実施形態では、本発明は、抗体またはその断片とＤＮＡデンドリマーに付着したｓｉＲＮＡ分子とを含む組成物をさらに提供する。本発明の別の実施形態では、抗体は、コンジュゲート抗体である。本発明の別の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。本発明の別の実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体である。本発明の別の実施形態では、抗体は、単鎖Ｆｖ断片（ＳＣＦＶ）抗体である。本発明の別の実施形態では、抗体は、任意の抗体または当業者に公知のコンジュゲート抗体である。
【００１９】
本発明の別の実施形態では、本発明は、色素分子とＤＮＡデンドリマーに付着したｓｉＲＮＡ分子とを含む組成物をさらに提供する。本発明の別の実施形態では、本発明は、リンカーまたはスペーサーに付着した検出可能標識を含む色素分子（図８および図９）とＤＮＡデンドリマーに付着したｓｉＲＮＡ分子とを含む組成物をさらに提供する。本発明の別の実施形態では、本発明は、フルオロフォアとＤＮＡデンドリマーに付着したｓｉＲＮＡ分子とを含む組成物をさらに提供する。本発明の別の実施形態では、本発明は、フルオレセインとＤＮＡデンドリマーに付着したｓｉＲＮＡ分子とを含む組成物をさらに提供する。本発明の別の実施形態では、本発明は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）とＤＮＡデンドリマーに付着したｓｉＲＮＡ分子とを含む組成物をさらに提供する。本発明の別の実施形態では、ＦＩＴＣはフルオレセイン誘導体と呼ばれる。
【００２０】
本発明の別の実施形態では、本発明は、ウレイド（テトラヒドロイミジザロン）環を含む分子とＤＮＡデンドリマーに付着したｓｉＲＮＡ分子とを含む組成物をさらに提供する。本発明の別の実施形態では、本発明は、テトラヒドロチオフェン環を含む分子とＤＮＡデンドリマーに付着したｓｉＲＮＡ分子とを含む組成物をさらに提供する。本発明の別の実施形態では、本発明は、吉草酸置換基を含む分子とＤＮＡデンドリマーに付着したｓｉＲＮＡ分子とを含む組成物をさらに提供する。本発明の別の実施形態では、本発明は、脂肪酸の代謝で補因子として働く分子とＤＮＡデンドリマーに付着したｓｉＲＮＡ分子とを含む組成物をさらに提供する。本発明の別の実施形態では、本発明は、ロイシンの代謝で補因子として働く分子とＤＮＡデンドリマーに付着したｓｉＲＮＡ分子とを含む組成物をさらに提供する。本発明の別の実施形態では、本発明は、ビオチンとＤＮＡデンドリマーに付着したｓｉＲＮＡ分子とを含む組成物をさらに提供する。
【００２１】
本発明の別の実施形態では、「ビオチン」という用語は、既知のビオチン誘導体を含む。本発明の別の実施形態では、ビオチン誘導体はストレプトアビジンに結合する。本発明の別の実施形態では、「フルオレセイン」という用語は、既知のフルオレセイン誘導体を含む。
【００２２】
本発明の別の実施形態では、本発明は、血清をさらに含む、本明細書に記載の組成物をさらに提供する。本発明の別の実施形態では、本発明は、血液をさらに含む、本明細書に記載の組成物をさらに提供する。本発明の別の実施形態では、本発明は、抗体、電解質、および可溶性タンパク質をさらに含む、本明細書に記載の組成物をさらに提供する。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、カチオン性の薬剤をさらに含む。
【００２３】
本発明の別の実施形態では、本発明は、ＤＮＡデンドリマーとｓｉＲＮＡ分子とを含む組成物を調製する方法であって、（ａ）ジスルフィド架橋結合によって；（ｂ）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル依存的縮合反応の使用によって；（ｃ）二官能性架橋反応の使用によって；（ｄ）ｓｉＲＮＡのＤＮＡデンドリマー配列への直接的もしくは間接的ハイブリダイゼーションによって；または（ｅ）電荷−電荷相互作用を介してｓｉＲＮＡ分子をＤＮＡデンドリマーに架橋するポリカチオン性化合物の使用によって、ｓｉＲＮＡをＤＮＡデンドリマーに付着させる工程を含む方法をさらに提供する。本発明の別の実施形態では、本発明は、ＤΝＡデンドリマーに、タンパク質、ペプチド、アプタマー、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体、蛍光色素、ジゴキシゲニン、コレステロール、１級アミン、３〜１２０炭素長の炭化水素スペーサー、ＦＩＴＣ、ＰＥＧ分子、ビオチン、ビオチン誘導体、または任意のその組合せを付着させる工程をさらに含む方法をさらに提供する。
【００２４】
本発明の別の実施形態では、本発明は、ｓｉＲＮＡ分子を分解から保護する方法であって、（ａ）ｓｉＲＮＡ分子と（ｂ）タンパク質、ペプチド、アプタマー、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体、蛍光色素、ジゴキシゲニン、コレステロール、１級アミン、３〜１２０炭素長の炭化水素スペーサー、ＦＩＴＣ、ＰＥＧ分子、ビオチン、ビオチン誘導体、または任意のその組合せとをＤＮＡデンドリマーに付着させ、それにより、ｓｉＲＮＡ分子を分解から保護する工程を含む方法をさらに提供する。本発明の別の実施形態では、タンパク質、ＦＩＴＣ、ＰＥＧ分子、ビオチン、ビオチン誘導体、または任意のその組合せのＤＮＡデンドリマーへの付着により、ＤＮＡデンドリマーとそれに付着したｓｉＲＮＡ分子が安定化された。本発明の別の実施形態では、タンパク質、ＦＩＴＣ、ＰＥＧ分子、ビオチン、ビオチン誘導体、フルオレセイン、または任意のその組合せのＤＮＡデンドリマーへの付着により、ＤＮＡデンドリマーとそれに付着したｓｉＲＮＡ分子が予想外に安定化される。本発明の別の実施形態では、タンパク質、ＦＩＴＣ、ＰＥＧ分子、ビオチン、ビオチン誘導体、フルオレセイン、または任意のその組合せのＤＮＡデンドリマーへの付着により、ＤＮＡデンドリマーとそれに付着したｓｉＲＮＡ分子が血清分解に対して予想外に安定化される。本発明の別の実施形態では、抗体またはその断片のＤＮＡデンドリマーへの付着により、ＤＮＡデンドリマーとそれに付着したｓｉＲＮＡ分子が血清分解に対して予想外に安定化される。本発明の別の実施形態では、ビオチンのＤＮＡデンドリマーへの付着により、ＤＮＡデンドリマーとそれに付着したｓｉＲＮＡ分子が血清分解に対して予想外に安定化される。本発明の別の実施形態では、ＰＥＧのＤＮＡデンドリマーへの付着により、ＤＮＡデンドリマーとそれに付着したｓｉＲＮＡ分子が血清分解に対して予想外に安定化される。本発明の別の実施形態では、ＦＩＴＣのＤＮＡデンドリマーへの付着により、ＤＮＡデンドリマーとそれに付着したｓｉＲＮＡ分子が血清分解に対して予想外に安定化される。本発明の別の実施形態では、フルオレセインのＤＮＡデンドリマーへの付着により、ＤＮＡデンドリマーとそれに付着したｓｉＲＮＡ分子が血清分解に対して予想外に安定化される。
【００２５】
本発明の別の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子を分解から保護する方法であって、ＤＮＡデンドリマーに、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、タンパク質、ペプチド、化学療法剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、静菌剤、向精神剤、スタチン、神経障害因子、ホルモン、ＡＣＥ阻害剤、抗凝固因子、鎮痛剤、抗血管新生剤、血管形成剤、増殖因子、増殖因子阻害剤、または任意のその組合せを含む分子を付着させる工程を含む方法が本明細書で提供される。
【００２６】
本発明の別の実施形態では、ＤＮＡデンドリマーを体液中での分解から保護する方法であって、ＤＮＡデンドリマーに、タンパク質、ペプチド、アプタマー、ＰＥＧ部分を含む分子、ビオチンもしくはビオチン誘導体、フルオレセインもしくはフルオレセイン誘導体、蛍光色素、ジゴキシゲニン、コレステロール、１級アミン、３〜１２０炭素長の炭化水素スペーサー、または任意のその組合せを付着させ、それにより、ＤＮＡデンドリマーを体液中での分解から保護する工程を含む方法が本明細書で提供される。
【００２７】
本発明の別の実施形態では、ＤＮＡデンドリマーと、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、タンパク質、ペプチド、化学療法剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、静菌剤、向精神剤、スタチン、神経障害因子、ホルモン、ＡＣＥ阻害剤、抗凝固因子、鎮痛剤、抗血管新生剤、血管形成剤、増殖因子、増殖因子阻害剤、または任意のその組合せとを含む組成物を調製する方法であって、（ａ）ジスルフィド架橋結合によって；（ｂ）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル依存的縮合反応の使用によって；（ｃ）ヘテロ二官能性架橋反応の使用によって；（ｄ）ｓｉＲＮＡのＤＮＡデンドリマー配列への直接的もしくは間接的ハイブリダイゼーションによって；または（ｅ）電荷−電荷相互作用を介してｓｉＲＮＡをＤＮＡデンドリマーに架橋するポリカチオン性化合物の使用によって、ｓｉＲＮＡをＤＮＡデンドリマーに付着させる工程を含む方法が本明細書で提供される。
【００２８】
低分子量蛍光色素（１０，０００ダルトン未満）のＤＮＡデンドリマーへの付着が、ＤＮＡデンドリマーを含む組成物またはＤＮＡデンドリマーとそれに付着したｓｉＲＮＡ分子とを含む組成物を安定化することが予想外に発見された。リンカーまたはスペーサーに付着した蛍光分子を含む、低分子量蛍光色素（１０，０００ダルトン未満）のＤＮＡデンドリマーへの付着が、ＤＮＡデンドリマーを含む組成物またはＤＮＡデンドリマーとそれに付着したｓｉＲＮＡ分子とを含む組成物を安定化することが予想外に発見された。本発明の別の実施形態では、リンカーまたはスペーサーに付着した蛍光分子を含む低分子量蛍光色素（１０，０００ダルトン未満）のＤＮＡデンドリマーへの付着により、ＤＮＡデンドリマーを含む組成物またはＤＮＡデンドリマーとそれに付着したｓｉＲＮＡ分子とを含む組成物が安定化される。本発明の別の実施形態では、限定するものではないが、Ｃｙ３またはＣｙ５（図８）などのシアニン色素のＤＮＡデンドリマーへの付着により、ＤＮＡデンドリマーを含む組成物またはＤＮＡデンドリマーとそれに付着したｓｉＲＮＡ分子とを含む組成物が予想外に安定化される。本発明の別の実施形態では、限定するものではないが、Ｏｙｓｔｅｒ  ５５０またはＯｙｓｔｅｒ  ６５０（図９）などの、リンカーまたはスペーサーに付着したＯｙｓｔｅｒ色素分子を含むＯｙｓｔｅｒ色素のＤＮＡデンドリマーへの付着により、ＤＮＡデンドリマーを含む組成物またはＤＮＡデンドリマーとそれに付着したｓｉＲＮＡ分子とを含む組成物が予想外に安定化される。本発明の別の実施形態では、限定するものではないが、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、  またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００などの、リンカーまたはスペーサーに付着したＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ分子を含むＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素のＤＮＡデンドリマーへの付着により、ＤＮＡデンドリマーを含む組成物またはＤＮＡデンドリマーとそれに付着したｓｉＲＮＡ分子とを含む組成物が予想外に安定化される。本発明の別の実施形態では、リンカーまたはスペーサーに付着したフルオレセイン分子を含むフルオレセイン、および限定するものではないが、ＦＩＴＣ、５／６−カルボキシフルオレセインスクシニミジルエステル、５／６−ＦＡＭ  ＳＥ、または５（６）フルオレセインイソチオシアネート混合異性体である５／６−ＦＩＴＣなどの誘導体のＤＮＡデンドリマーへの付着により、ＤＮＡデンドリマーを含む組成物またはＤＮＡデンドリマーとそれに付着したｓｉＲＮＡ分子とを含む組成物が予想外に安定化される。本発明の別の実施形態では、リンカーまたはスペーサーに付着したＢＯＤＩＰＹ分子を含むＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０のＤＮＡデンドリマーへの付着により、ＤＮＡデンドリマーを含む組成物またはＤＮＡデンドリマーとそれに付着したｓｉＲＮＡ分子とを含む組成物が���想外に安定化される。
【００２９】
本発明の別の実施形態では、限定するものではないが、ＤＮＡデンドリマー構造物に前もって組み込まれたビオチンに結合した、（ストレプトアビジンにコンジュゲートされた）Ｒ−フィコエリスリン、ＤＮＡデンドリマー構造物に前もって組み込まれたビオチンに結合した、（ストレプトアビジンにコンジュゲートされた）Ｂ−フィコエリスリン、またはＤＮＡデンドリマー構造物に前もって組み込まれたビオチンに結合した、（ストレプトアビジンにコンジュゲートされた）アロフィコシアニン（ＡＰＣ）などの高分子量蛍光色素（５０，０００ダルトン超）のＤＮＡデンドリマーへの付着により、ＤＮＡデンドリマーを含む組成物またはＤＮＡデンドリマーとそれに付着したｓｉＲＮＡ分子とを含む組成物が予想外に安定化される。
【００３０】
本発明の別の実施形態では、限定するものではないが、ビオチンおよび誘導体、（ＤＮＡデンドリマーまたはオリゴヌクレオチド構造物に前もって組み込まれた１級アミンに共有結合させるための）ＮＨＳ−ビオチン、（合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド合成用の）ビオチン−ＢＢ−ＣＰＧアミダイト、（合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド合成用の）ビオチン−ｄＴアミダイトアミダイト、（合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド合成用の）ビオチン−ＢＢ−ＣＰＧアミダイト、またはジゴキシゲニン誘導体などの非蛍光性低分子量化合物のＤＮＡデンドリマーへの付着により、ＤＮＡデンドリマーを含む組成物またはＤＮＡデンドリマーとそれに付着したｓｉＲＮＡ分子とを含む組成物が予想外に安定化される。
【００３１】
本発明の別の実施形態では、コレステロールＴＥＧ  ５’／３’アミダイト、プロピル３’スペーサーアミダイト、１２炭素スペーサーアミダイト、１８炭素スペーサーアミダイト、６炭素アミノリンカーアミダイト、１２炭素アミノリンカーアミダイト、７炭素内部アミノリンカーアミダイト、またはｄＴ内部アミノリンカーアミダイトを含むオリゴヌクレオチドのＤＮＡデンドリマーへの付着により、ＤＮＡデンドリマーを含む組成物またはＤＮＡデンドリマーとそれに付着したｓｉＲＮＡ分子とを含む組成物が予想外に分解から保護される。
【００３２】
本発明の別の実施形態では、シアニン、Ｏｙｓｔｅｒ、およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素は、直接的にＤＮＡデンドリマー構造物の上にあるかまたは後でＤＮＡデンドリマー構造物にハイブリダイズさせられ、架橋される合成オリゴヌクレオチドの上にあるかのいずれかの１級アミンに共有結合したＮＨＳ−エステル色素コンジュゲートとして、ＤＮＡデンドリマー構造物に組み込まれている。本発明の別の実施形態では、合成オリゴヌクレオチドの（標識アミダイトとしての）合成中にあるいは標識ＲＮＡおよび／またはＤＮＡヌクレオチド（リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチド）を取り込むＲＮＡもしくはＤＮＡポリメラーゼの使用によって組み込まれるＤＮＡおよび／およびＲＮＡヌクレオチド。本発明の別の実施形態では、前もってＤＮＡデンドリマー構造物に組み込まれたビオチンに結合するストレプトアビジンコンジュゲート。
【００３３】
本発明の別の実施形態では、本発明は、ＤＮＡデンドリマーを血清分解または体液分解から保護する方法であって、ＤＮＡデンドリマーに、タンパク質、ペプチド、アプタマー、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体、蛍光色素、ジゴキシゲニン、コレステロール、１級アミン、３〜１２０炭素長の炭化水素スペーサー、ＦＩＴＣ、ＰＥＧ分子、ビオチン、ビオチン誘導体、または任意のその組合せを付着させ、それにより、ＤＮＡデンドリマーを血清ヌクレアーゼ分解から保護する工程を含む方法をさらに提供する。本発明の別の実施形態では、本発明は、ＤＮＡデンドリマーを血清分解または体液分解から保護する方法であって、抗体またはその断片をＤＮＡデンドリマーに付着させる工程を含む方法をさらに提供する。本発明の別の実施形態では、本発明は、ＤＮＡデンドリマーを血清分解または体液分解から保護する方法であって、ビオチンまたはビオチン誘導体をＤＮＡデンドリマーに付着させる工程を含む方法をさらに提供する。本発明の別の実施形態では、本発明は、ＤＮＡデンドリマーを血清分解から保護する方法であって、ＦＩＴＣをＤＮＡデンドリマーに付着させる工程を含む方法をさらに提供する。本発明の別の実施形態では、本発明は、ＤＮＡデンドリマーを血清分解または体液分解から保護する方法であって、フルオレセインまたはフルオレセイン誘導体をＤＮＡデンドリマーに付着させる工程を含む方法をさらに提供する。
【００３４】
本発明の別の実施形態では、本発明は、生物活性を含む分子を運ぶＤＮＡデンドリマーを保護する方法であって、ＤＮＡデンドリマーに、タンパク質、ペプチド、アプタマー、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体、蛍光色素、ジゴキシゲニン、コレステロール、１級アミン、３〜１２０炭素長の炭化水素スペーサー、ＦＩＴＣ、ＰＥＧ分子、ビオチン、ビオチン誘導体、または任意のその組合せを付着させ、それにより、生物活性を含む分子を運ぶＤＮＡデンドリマーを血清ヌクレアーゼ分解から保護する工程を含む方法をさらに提供する。本発明の別の実施形態では、生物活性を含む分子は酵素である。本発明の別の実施形態では、生物活性を含む分子は治療剤である。本発明の別の実施形態では、生物活性を含む分子は化学療法剤である。本発明の別の実施形態では、生物活性を含む分子はサイトカインである。本発明の別の実施形態では、生物活性を含む分子はケモカインである。本発明の別の実施形態では、生物活性を含む分子はホルモンである。本発明の別の実施形態では、生物活性を含む分子は神経伝達物質である。本発明の別の実施形態では、生物活性を含む分子は神経伝達物質前駆体である。本発明の別の実施形態では、生物活性を含む分子は神経伝達物質アゴニストである。本発明の別の実施形態では、生物活性を含む分子は神経伝達物質アンタゴニストである。本発明の別の実施形態では、生物活性を含む分子は非ステロイド性抗炎症剤である。本発明の別の実施形態では、生物活性を含む分子はビタミンである。本発明の別の実施形態では、生物活性を含む分子は凝固因子である。本発明の別の実施形態では、生物活性を含む分子はキレート剤である。本発明の別の実施形態では、生物活性を含む分子はペプチドである。本発明の別の実施形態では、生物活性を含む分子はタンパク質である。本発明の別の実施形態では、生物活性を含む分子は酵素である。本発明の別の実施形態では、生物活性を含む分子は脂質である。
【００３５】
本発明の別の実施形態では、本発明は、ＤＮＡデンドリマーを体液中に送達する方法であって、ＤＮＡデンドリマーに、タンパク質、ペプチド、アプタマー、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体、蛍光色素、ジゴキシゲニン、コレステロール、１級アミン、３〜１２０炭素長の炭化水素スペーサー、ＦＩＴＣ、ＰＥＧ分子、ビオチン、ビオチン誘導体、フルオレセイン、または任意の組合せを付着させ、それにより、ＤＮＡデンドリマーを血清中に送達する工程を含む方法をさらに提供する。本発明の別の実施形態では、本発明は、ＤＮＡデンドリマーを体液中に送達する方法であって、ＤＮＡデンドリマーに、タンパク質、ペプチド、アプタマー、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体、蛍光色素、ジゴキシゲニン、コレステロール、１級アミン、３〜１２０炭素長の炭化水素スペーサー、ＦＩＴＣ、ＰＥＧ分子、ビオチン、ビオチン誘導体、フルオレセイン、または任意の組合せを付着させ、それにより、ＤＮＡデンドリマーを、血清を含む組成物か、または体液中に送達する工程を含む方法をさらに提供する。本発明の別の実施形態では、本発明は、ＤＮＡデンドリマーを血清または体液中に送達する方法であって、ＤＮＡデンドリマーに抗体またはその断片を付着させ、それにより、ＤＮＡデンドリマーを、血清を含む組成物か、または体液中に送達する工程を含む方法をさらに提供する。本発明の別の実施形態では、本発明は、ＤＮＡデンドリマーを、血清を含む組成物か、または体液中に送達する方法であって、ＤＮＡデンドリマーにビオチンを付着させ、それにより、ＤＮＡデンドリマーを血清中に送達する工程を含む方法をさらに提供する。本発明の別の実施形態では、本発明は、ＤＮＡデンドリマーを血清または体液中に送達する方法であって、ＤＮＡデンドリマーに色素分子を付着させ、それにより、ＤＮＡデンドリマーを血清を含む組成物か、または体液中に送達する工程を含む方法をさらに提供する。本発明の別の実施形態では、本発明は、ＤＮＡデンドリマーを血清中に送達する方法であって、ＤＮＡデンドリマーにＰＥＧを付着させ、それにより、ＤＮＡデンドリマーを、血清を含む組成物か、または体液中に送達する工程を含む方法をさらに提供する。
【００３６】
本発明の別の実施形態では、本発明は、核酸分子に付着したＤＮＡデンドリマーを血清中に送達する方法であって、ＤＮＡデンドリマーに、タンパク質、ペプチド、アプタマー、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体、蛍光色素、ジゴキシゲニン、コレステロール、１級アミン、３〜１２０炭素長の炭化水素スペーサー、ＦＩＴＣ、ＰＥＧ分子、ビオチン、ビオチン誘導体、または任意のその組合せを付着させる工程を含む方法をさらに提供する。本発明の別の実施形態では、本発明は、ｓｉＲＮＡ分子に付着したＤＮＡデンドリマーを血清中に送達する方法であって、ＤＮＡデンドリマーに、タンパク質、ペプチド、アプタマー、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体、蛍光色素、ジゴキシゲニン、コレステロール、１級アミン、３〜１２０炭素長の炭化水素スペーサー、ＦＩＴＣ、ＰＥＧ分子、ビオチン、ビオチン誘導体、フルオレセインまたは任意のその組合せを付着させる工程を含む方法をさらに提供する。
【００３７】
本発明の別の実施形態では、送達は、インビトロ混合である。本発明の別の実施形態では、送達は、インビボ送達である。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載の組成物または記載されたような付着で修飾されたＤＮＡデンドリマーのインビボ送達は、限定するものではないが、静脈内注射または動脈内注射などの、当業者に公知の方法で行なわれる。
【００３８】
本発明の別の実施形態では、本発明は、細胞にｓｉＲＮＡ分子をトランスフェクトする方法であって、細胞を、ＤＮＡデンドリマーと本明細書に記載のｓｉＲＮＡ分子とを含む組成物と接触させ、それにより、細胞にｓｉＲＮＡ分子をトランスフェクトする工程を含む方法をさらに提供する。本発明の別の実施形態では、本発明は、細胞にｓｉＲＮＡ分子をトランスフェクトする方法であって、細胞を、ＤＮＡデンドリマーと抗体またはその断片と本明細書に記載のｓｉＲＮＡ分子とを含む組成物と接触させ、それにより、細胞にｓｉＲＮＡ分子をトランスフェクトする工程を含む方法をさらに提供する。本発明の別の実施形態では、本発明は、細胞にｓｉＲＮＡ分子をトランスフェクトする方法であって、細胞を、ＤＮＡデンドリマーとビオチンと本明細書に記載のｓｉＲＮＡ分子とを含む組成物と接触させ、それにより、細胞にｓｉＲＮＡ分子をトランスフェクトする工程を含む方法をさらに提供する。本発明の別の実施形態では、本発明は、細胞にｓｉＲＮＡ分子をトランスフェクトする方法であって、細胞を、ＤＮＡデンドリマーと色素分子と本明細書に記載のｓｉＲＮＡ分子とを含む組成物と接触させ、それにより、細胞にｓｉＲＮＡ分子をトランスフェクトする工程を含む方法をさらに提供する。
【００３９】
本発明の別の実施形態では、核酸分子は、非共有結合によってＤＮＡデンドリマーに付着している。本発明の別の実施形態では、核酸分子は、共有結合によってＤＮＡデンドリマーに付着している。本発明の別の実施形態では、核酸分子はｓｉＲＮＡである。本発明の別の実施形態では、核酸分子は、ワトソン−クリック型塩基対合などの水素結合によってＤＮＡデンドリマーに付着している。本発明の別の実施形態では、核酸分子は、ジスルフィド架橋結合によってＤＮＡデンドリマーに付着している。本発明の別の実施形態では、核酸分子は、ＮＨＳエステルとアミンを介してＤＮＡデンドリマーに付着している。本発明の別の実施形態では、核酸分子は、ヘテロ二官能性架橋結合によってＤＮＡデンドリマーに付着している。本発明の別の実施形態では、本明細書で使用される「付着」という用語は、化学的結合を指す。
【００４０】
本発明の別の実施形態では、ＤＮＡ鎖は、デンドリマーの各層において共有結合している。本発明の別の実施形態では、ＤＮＡデンドリマーは、ＤＮＡデンドリマーのアーム内にある少なくとも１つのＣａｐ０３配列を含む。別の実施形態では、Ｃａｐ０３配列は、以下の核酸配列を含む：５’−ＴＣＣＡＣＣＴＴＡｇＡｇＴＡＣＡＡＡＣｇｇＡＡＣＡＣｇＡｇＡＡ−３’（配列番号８）。本発明の別の実施形態では、Ｃａｐ０３配列は、Ｃａｐ０３アンチセンス配列を含む抗体またはその断片などの分子をＤＮＡデンドリマーに結合／付着させるために使用される。別の実施形態では、Ｃａｐ０３アンチセンス配列は、以下の核酸配列を含む：５’−ＴＴＣＴＣｇＴｇＴＴＣＣｇＴＴＴｇＴＡＣＴＣＴＡＡｇｇＴｇｇＡ−３’（配列番号９）。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載の組成物を調製する方法は、Ｃａｐ０３配列に相補的な配列を含むＤＮＡ分子に共有結合的にコンジュゲートしたタンパク質をＤＮＡデンドリマーに非共有結合させる工程を含む。
【００４１】
本発明の別の実施形態では、核酸分子は結合部分を含み、ＤＮＡデンドリマーは結合パートナーを含み、ここで、結合パートナーは結合部分に非共有結合する。
【００４２】
本発明の別の実施形態では、ＤＮＡデンドリマーは共有結合的に架橋されている。本発明の別の実施形態では、ＤＮＡデンドリマーは４層ＤＮＡデンドリマーである。本発明の別の実施形態では、ＤＮＡデンドリマーは２層ＤＮＡデンドリマーである。別の実施形態では、ＤＮＡデンドリマーは、３つ以上の鎖のＤＮＡから調製される任意のデンドリマーである。
【００４３】
本発明の別の実施形態では、ターゲッティング抗体またはその断片とハイブリダイゼーション事象を介して非共有結合したｓｉＲＮＡ分子とを含むＤＮＡデンドリマーの製造方法と使用方法がさらに提供される（実施例１）。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡデンドリマーはＤＮＡモノマーから構築され、ＤＮＡモノマーは各々、各鎖の中央部分にある配列相補性領域を共有する２個のＤＮＡ分子から作られたものである。本発明の別の実施形態では、ＤＮＡデンドリマーは、４つの一本鎖「アーム」に隣接した中央の二本鎖「ウェスト」を有するものとして記載されている構造を含む。本発明の別の実施形態では、ＤＮＡデンドリマーは、基本ＤＮＡモノマーを含むウェスト−プラス−アーム構造を含む。別の実施形態では、５つのモノマータイプの各々の末端にある一本鎖アームは、正確かつ特異的な方法で、互いに相互作用する。本発明の別の実施形態では、塩基対合（水素結合）は、モノマー層の順次付加によるデンドリマーの有向アセンブリを可能にする（図１参照）。
【００４４】
本発明の別の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡデンドリマーは、ＤＮＡ鎖が互いに共有結合し、それにより、ＤＮＡ鎖が互いに共有結合しなければデンドリマー構造の変形を引き起こすことになる変性条件に影響されない完全に共有結合した分子が形成される架橋プロセスによってアセンブルされている（図２参照）。
【００４５】
本発明の別の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡデンドリマーは２層デンドリマーである。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡデンドリマーは、少なくとも６０個のビオチン分子を含む。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡデンドリマーは、少なくとも８０個のビオチン分子を含む。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡデンドリマーは、少なくとも１００個のビオチン分子を含む。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡデンドリマーは、少なくとも１２０個のビオチン分子を含む。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡデンドリマーは、少なくとも１５０個のビオチン分子を含む。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡデンドリマーは、少なくとも１８０個のビオチン分子を含む。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡデンドリマーは、少なくとも２００個のビオチン分子を含む。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡデンドリマーは、少なくとも１〜４００個のビオチン分子を含む。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡデンドリマーは、少なくとも６０〜３６０個のビオチン分子を含む。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡデンドリマーは、少なくとも８０〜３００個のビオチン分子を含む。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡデンドリマーは、少なくとも１００〜２５０個のビオチン分子を含む。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡデンドリマーは、少なくとも１５０〜２５０個のビオチン分子を含む。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡデンドリマーは、約１２０個のビオチン分子を含む。
【００４６】
本発明の別の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡデンドリマーは４層デンドリマーである。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡデンドリマーは、少なくとも５００個のビオチン分子を含む。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡデンドリマーは、少なくとも５５０個のビオチン分子を含む。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡデンドリマーは、少なくとも６００個のビオチン分子を含む。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡデンドリマーは、少なくとも６５０個のビオチン分子を含む。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡデンドリマーは、少なくとも７００個のビオチン分子を含む。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡデンドリマーは、少なくとも５００〜１５００個のビオチン分子を含む。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡデンドリマーは、少なくとも５５０〜１４００個のビオチン分子を含む。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡデンドリマーは、少なくとも６００〜１０００個のビオチン分子を含む。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡデンドリマーは、少なくとも６００〜８００個のビオチン分子を含む。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡデンドリマーは、少なくとも７００〜８００個のビオチン分子を含む。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡデンドリマーは、約７２０個のビオチン分子を含む。
【００４７】
本発明の別の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡデンドリマーは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ依存的ライゲーション反応によって利用可能なアームの５’末端に連結される相補的なキャプチャーオリゴヌクレオチドを含む。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡデンドリマーは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ依存的ライゲーション反応によって利用可能なアームの５’末端に連結される相補的なキャプチャーオリゴヌクレオチド（５〜８０塩基）を含む。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡデンドリマーは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ依存的ライゲーション反応によって利用可能なアームの５’末端に連結される相補的なキャプチャーオリゴヌクレオチド（１０〜６０塩基）を含む。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡデンドリマーは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ依存的ライゲーション反応によって利用可能なアームの５’末端に連結される相補的なキャプチャーオリゴヌクレオチド（２０〜４０塩基）を含む。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡデンドリマーは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ依存的ライゲーション反応によって利用可能なアームの５’末端に連結される相補的なキャプチャーオリゴヌクレオチド（３０〜５０塩基）を含む。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡデンドリマーは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ依存的ライゲーション反応によって利用可能なアームの５’末端に連結される相補的なキャプチャーオリゴヌクレオチド（３０〜４０塩基）を含む。
【００４８】
本発明の別の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡデンドリマーは、まず架橋縮合コンジュゲーション化学反応を用いて（Ｃａｐ０３配列に相補的な）ＤＮＡオリゴヌクレオチドを抗体に共有結合的にコンジュゲートさせ、次いで、この抗体結合オリゴヌクレオチドをデンドリマーのアーム上の相補的配列（Ｃａｐ０３）にハイブリダイズさせることによってＤＮＡデンドリマーに結合した抗体またはその断片を含む。本発明の別の実施形態では、抗体などの分子をＤＮＡデンドリマーに付着させるために、Ｃａｐ０３以外の配列を使用することができる。
【００４９】
本発明の別の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡデンドリマーは、ｓｉＲＮＡ分子を含む。本発明の別の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は化学合成される。本発明の別の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、１０〜２５塩基長の、ＲＮＡリボヌクレオチドとしての５’部分と、通常０〜４０塩基長の、ＤＮＡデオキシリボヌクレオチドとしての３’部分とを含む一本鎖「センス」鎖を含み、これは、ＤＮＡデンドリマーに連結されるキャプチャーオリゴに相補的になるように設計される。本発明の別の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、１〜３０塩基長の、ＲＮＡリボヌクレオチドとしての５’部分と、通常１〜５０塩基長の、ＤＮＡデオキシリボヌクレオチドとしての３’部分とを含む一本鎖「センス」鎖を含み、これは、ＤＮＡデンドリマーに連結されるキャプチャーオリゴに相補的になるように設計される。
【００５０】
本発明の別の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡデンドリマーは、ＲＮＡリボヌクレオチドのみの、５〜４０塩基長の部分と、１〜５個の３’末端デオキシリボヌクレオチドとを含む、「センス」鎖に相補的な一本鎖「アンチセンス」鎖を含む。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡデンドリマーは、ＲＮＡリボヌクレオチドのみの、１０〜２５塩基長の部分と、１〜３個の３’末端デオキシリボヌクレオチドとを含む、「センス」鎖に相補的な一本鎖「アンチセンス」鎖を含む。本発明の別の実施形態では、ｓｉＲＮＡ構築物は、２４〜３５塩基伸長を含む。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡデンドリマーは、「センス」鎖と「アンチセンス」鎖の間に安定なハイブリッドを形成して、「センス」鎖の一本鎖ＤＮＡ部分がＤＮＡデンドリマーのキャプチャーオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに利用できるように、等モル量で組み合わされた２つの鎖を含む。
【００５１】
本発明の別の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡデンドリマーを含む組成物は、インビトロでのトランスフェクションに使用される。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡデンドリマーを含む組成物は、インビボでのトランスフェクションに使用される。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡデンドリマーとｓｉＲＮＡ分子とを含む組成物は、転写された標的遺伝子のデノボでのノックダウンに使用される。本発明の別の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、転写された標的遺伝子（ｍＲＮＡ）を標的とするように設計される。
【００５２】
本発明の別の実施形態では、ターゲッティング抗体またはその断片とｓｉＲＮＡ分子とを含むＤＮＡデンドリマーの製造方法と使用方法が本明細書で提供されており、ここで、このｓｉＲＮＡ分子は、ビオチン化ｓｉＲＮＡ分子のストレプトアビジンへの結合と、その後のＤＮＡデンドリマー上のビオチンへの結合を介して非共有結合されている。本発明の別の実施形態では、ターゲッティング抗体またはその断片とｓｉＲＮＡ分子とを含むＤＮＡデンドリマーの製造方法と使用方法が本明細書で提供されており、ここで、このｓｉＲＮＡ分子は、ビオチン化ｓｉＲＮＡ分子のストレプトアビジンへの結合と、その後のＤＮＡデンドリマー上の複数のビオチンへの結合を介して非共有結合されている。
【００５３】
本発明の別の実施形態では、ターゲッティング抗体もしくはその断片または提供された任意の他の分子と結合したＤＮＡデンドリマーを含む本明細書に記載の組成物は、オリゴの合成中に取り込まれた末端標識ビオチンまたは内部ビオチンを含むＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションや架橋を介してビオチン部分がデンドリマーの「アーム」上に導入されることを除き、上記のように調製される。本発明の別の実施形態では、典型的なデンドリマービオチン標識反応は、抗体またはその断片のデンドリマーへの結合前、かつキャプチャー配列のライゲーション時またはライゲーション後に行なわれる。
【００５４】
本発明の別の実施形態では、本発明のビオチン化「センス」ＲＮＡは、ストレプトアビジン分子上で利用できる４つの利用可能なビオチン結合価のうちの２〜３つと極めて強い非共有結合を形成し、それ以外の形でビオチン部分と結合することができる（平均して）少なくとも１つの遊離ビオチン結合ストレプトアビジン結合価は、「センス」ＲＮＡ分子と会合しないまま残る。
【００５５】
本発明の別の実施形態では、ターゲッティング抗体またはその断片とｓｉＲＮＡ分子とを含むＤＮＡデンドリマーの製造方法が本明細書で提供されており、ここで、このｓｉＲＮＡ分子は、ジスルフィド架橋結合の使用によって共有結合されている。本発明の別の実施形態では、抗体またはその断片を含む４層ＤＮＡデンドリマーまたは２層ＤＮＡデンドリマーは、実施例１または２の記載に従って合成される。本発明の別の実施形態では、細胞内でｓｉＲＮＡとして働くよう設計された分子を化学合成し、これは、１）３’末端上の２〜８０個のＤＮＡヌクレオチドとともに、通常１０〜４０塩基長の全ＲＮＡリボヌクレオチドを含み、かつオリゴヌクレオチド合成時または合成後にこの分子の５’末端に付加されたスルヒドリル（ＳＨ）部分を含む一本鎖「センス」鎖と、２）２個の３’末端デオキシヌクレオチドとともに、ＲＮＡリボヌクレオチドのみの、５〜５０塩基長の部分を含む、「センス」鎖に相補的な一本鎖「アンチセンス」鎖とを含む。本発明の別の実施形態では、これら２つの鎖を等モル量で組み合わせて、「センス」鎖と「アンチセンス」鎖の間に安定なハイブリッドを形成させ、スルフヒドリル部分を、デンドリマーのアームに付加されたキャプチャー配列に相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチド上の（「Ｓ−Ｓ」ジスルフィド結合を形成する）別のスルフヒドリル部分へのコンジュゲーションに利用できるようにする。
【００５６】
本発明の別の実施形態では、ターゲッティング抗体またはその断片とｓｉＲＮＡ分子とを含むＤＮＡデンドリマーの製造方法が本明細書で提供されており、ここで、このｓｉＲＮＡ分子は、ＮＨＳ−エステル依存的縮合化学反応の使用によって共有結合されている。本発明の別の実施形態では、抗体またはその断片を含む４層ＤＮＡデンドリマーまたは２層ＤＮＡデンドリマーは、ビオチンが１級アミンと置き換えられることを除き、実施例２と同様に合成される。本発明の別の実施形態では、細胞内でｓｉＲＮＡとして働くよう設計された分子を化学合成し、これは、１）３’末端上の２〜８０個のＤＮＡヌクレオチドとともに、通常５〜５０塩基長の全ＲＮＡリボヌクレオチドを含み、かつオリゴヌクレオチド合成時または合成後にこの分子の５’末端上に付加されるカルボキシル（ＣＯＯＨ）部分を含む一本鎖「センス」鎖と、２）２個の３’末端デオキシヌクレオチドとともに、ＲＮＡリボヌクレオチドのみの、５〜５０塩基長の部分を含む、「センス」鎖に相補的な一本鎖「アンチセンス」鎖とを含む。本発明の別の実施形態では、カルボキシルがＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルに変換され、次に、このエステルが１級アミンと反応して、ＮＨＳエステルとアミンの間に共有結合を形成するように、カルボキシルを含むＲＮＡ鎖を、市販の試薬を用いて化学修飾する。本発明の別の実施形態では、１級アミンで標識されたデンドリマーは、ｓｉＲＮＡの「センス」鎖と共有結合し、このｓｉＲＮＡの「センス」鎖は、「アンチセンス」ＲＮＡ鎖とハイブリダイズしたとき、機能的なｓｉＲＮＡ二重鎖を形成する。
【００５７】
本発明の別の実施形態では、ターゲッティング抗体またはその断片とｓｉＲＮＡ分子とを含むＤＮＡデンドリマーの製造方法が本明細書で提供されており、ここで、このｓｉＲＮＡ分子は、ヘテロ二官能性化学架橋剤化学反応の使用によって共有結合されている。本発明の別の実施形態では、抗体またはその断片を含む４層ＤＮＡデンドリマーまたは２層ＤＮＡデンドリマーは、ビオチン分子が１級アミンと置き換えられることを除き、実施例２と同様に合成される。本発明の別の実施形態では、細胞内でｓｉＲＮＡとして働くよう設計された分子を化学合成したが、これは、１）３’末端上の２〜８０個のＤＮＡヌクレオチドとともに、通常５〜５０塩基長の全ＲＮＡリボヌクレオチドを含み、かつオリゴヌクレオチド合成時または合成後にこの分子の５’末端上に付加されるカルボキシル（ＣＯＯＨ）部分を含む一本鎖「センス」鎖と、２）２個の３’末端デオキシヌクレオチドとともに、ＲＮＡリボヌクレオチドのみの、５〜５０塩基長の部分を含む、「センス」鎖に相補的な一本鎖「アンチセンス」鎖とを含む。本発明の別の実施形態では、カルボキシルを含むＲＮＡ鎖を、カルボキシル部分とアミン部分の間に共有結合を形成させたヘテロ二官能性架橋試薬であるＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド）の存在下で、アミン修飾デンドリマーと組み合わせる。本発明の別の実施形態では、１級アミンで標識されたデンドリマーは、ｓｉＲＮＡの「センス」鎖と共有結合し、このｓｉＲＮＡの「センス」鎖は、「アンチセンス」ＲＮＡ鎖とハイブリダイズしたとき、機能的なｓｉＲＮＡ二重鎖を形成した。
【００５８】
本発明の別の実施形態では、ターゲッティング抗体またはその断片とｓｉＲＮＡ分子とを含むＤＮＡデンドリマーの製造方法が本明細書で提供されており、ここで、このｓｉＲＮＡ分子は、ホモ二官能性化学架橋剤化学反応の使用によって共有結合されている。本発明の別の実施形態では、抗体またはその断片を含む４層ＤＮＡデンドリマーまたは２層ＤＮＡデンドリマーは、ビオチンが１級アミンと置き換えられることを除き、実施例２と同様に合成される。本発明の別の実施形態では、細胞内でｓｉＲＮＡとして働くよう設計された分子を化学合成し、これは、１）３’末端上の２〜８０個のＤＮＡヌクレオチドとともに、通常５〜４０塩基長の全ＲＮＡリボヌクレオチドを含み、かつオリゴヌクレオチド合成時または合成後にこの分子の５’末端上に付加される１級アミン部分を含む一本鎖「センス」鎖と、２）２個の３’末端デオキシヌクレオチドとともに、ＲＮＡリボヌクレオチドのみの、２〜５０塩基長の部分を含む、「センス」鎖に相補的な一本鎖「アンチセンス」鎖とを含む。本発明の別の実施形態では、アミンを含むＲＮＡ鎖を、アミン部分の間に共有結合を形成させる試薬であるスルホ−ＥＧＳ［エチレン−グリコールビス（スクシニミジルスクシネート）］などの、ホモ二官能性架橋剤の存在下で、アミン修飾デンドリマーと組み合わせる。本発明の別の実施形態では、１級アミンで標識されたＤＮＡデンドリマーは、ｓｉＲＮＡの「センス」鎖と共有結合し、このｓｉＲＮＡの「センス」鎖は、その後、「アンチセンス」ＲＮＡ鎖とハイブリダイズして、機能的なｓｉＲＮＡ二重鎖を形成する。
【００５９】
本発明の別の実施形態では、ターゲッティング抗体またはその断片とｓｉＲＮＡ分子とを含むＤＮＡデンドリマーの製造方法、ならびにデンドリマーの構造物に結合したビオチンおよびトランスフェクションにおける対イオンとして複数の正電荷を有するカチオンの重要性を比較する方法が本明細書で提供される。本発明の別の実施形態では、抗体またはその断片を含む２層ＤＮＡデンドリマーまたは４層ＤＮＡデンドリマーは、デンドリマーの「アーム」を密集させる最大１６０個のビオチンを付けて合成され、デンドリマー上の一定数の遊離「アーム」が、ハイブリダイゼーション結合事象を介するｓｉＲＮＡ二重鎖の結合に利用可能となる（実施例１および２参照）。本発明の別の実施形態では、抗体またはその断片を含む２層ＤＮＡデンドリマーまたは４層ＤＮＳデンドリマーは、デンドリマーの「アーム」を密集させる最大１４０個のビオチンを付けて合成され、デンドリマー上の一定数の遊離「アーム」が、ハイブリダイゼーション結合事象を介するｓｉＲＮＡ二重鎖の結合に利用可能となる（実施例１および２参照）。本発明の別の実施形態では、抗体またはその断片を含む２層ＤＮＡデンドリマーまたは４層ＤＮＳデンドリマーは、デンドリマーの「アーム」を密集させる最大１２０個のビオチンを付けて合成され、デンドリマー上の一定数の遊離「アーム」が、ハイブリダイゼーション結合事象を介するｓｉＲＮＡ二重鎖の結合に利用可能となる（実施例１および２参照）。
【００６０】
本発明の別の実施形態では、本発明の組成物は、ｓｉＲＮＡ二重鎖のセンス鎖の１０〜４０塩基伸長を含むｓｉＲＮＡ構築物と、実施例１および２に記載のものと同様のＩＣＡＭ１を標的とするデンドリマーとを含む。本発明の別の実施形態では、ビオチン化デンドリマー構築物とｓｉＲＮＡ分子とを含む本発明の組成物は、特に血清の存在下で、ビオチンを欠く組成物よりもトランスフェクション効率が高い。本発明の別の実施形態では、カチオンを含む本発明の組成物は、特に血清の存在下で、カチオンを欠く組成物よりもトランスフェクション効率が高い。本発明の別の実施形態では、約２５ｍＭのカチオンを含む本発明の組成物は、特に血清の存在下で、カチオンを欠く組成物よりもトランスフェクション効率が高い。本発明の別の実施形態では、約５〜１０００ｍＭのカチオンを含む本発明の組成物は、特に血清の存在下で、カチオンを欠く組成物よりもトランスフェクション効率が高い。本発明の別の実施形態では、本発明の組成物は、約２５ｍＭのＭｇ、Ｃａ、スペルミン、スペルミジン、またはＭｎをさらに含み、特に血清の存在下で、カチオンを欠く組成物よりもトランスフェクション効率が高い。本発明の別の実施形態では、本発明の組成物は、約５〜１０００ｍＭのＭｇ、Ｃａ、スペルミン、スペルミジン、またはＭｎをさらに含み、特に血清の存在下で、カチオンを欠く組成物よりもトランスフェクション効率が高い。
【００６１】
本発明の別の実施形態では、本明細書に記載の組成物を用いるｍＲＮＡ発現のノックダウン方法が本明細書で提供される。本発明の別の実施形態では、２層バージョンと４層バージョンの両方の上に抗体またはその断片などの保護基を含む本発明の組成物は、２層デンドリマーの「アーム」を密集させる最大１８０個のビオチン、および４層デンドリマーの「アーム」を密集させる最大８００個のビオチンを付けて合成され、両方のタイプのデンドリマーは、ハイブリダイゼーション結合事象を介するｓｉＲＮＡ二重鎖の結合に利用可能な一定数の遊離「アーム」を含む（実施例１および７参照）。
【００６２】
本発明の別の実施形態では、ヒトおよび動物血清中でのタンパク質ヌクレアーゼへの曝露によるＤＮＡデンドリマーのヌクレアーゼ依存的分解から本発明の組成物を保護する方法が本明細書で提供される。本発明の別の実施形態では、タンパク質ＤＮアーゼ分解から本発明の組成物を保護する方法が本明細書で提供される。本発明の別の実施形態では、外因性ＤＮアーゼ分解から本発明の組成物を保護する方法が本明細書で提供される。
【００６３】
本発明の別の実施形態では、ハイブリダイズしたｓｉＲＮＡ分子を有するＤＮＡデンドリマーを含む組成物を市販のリポフェクトアミントランスフェクション試薬と組み合わせる方法が本明細書で提供される。本発明の別の実施形態では、ＤＮＡデンドリマーを含む組成物を、ｓｉＲＮＡを細胞質に送達するためのトランスフェクション試薬と組み合わせる。本発明の別の実施形態では、ＤＮＡデンドリマーと、組成物のノックダウン効率を改善するリポフェクトアミンとを含む組成物が提供される。本発明の別の実施形態では、ＤＮＡデンドリマーと、ｓｉＲＮＡ分子のｍＲＮＡノックダウン効率を改善するリポソーム性トランスフェクション試薬とを含む組成物が提供される。本発明の別の実施形態では、ＤＮＡデンドリマーと、ｓｉＲＮＡ分子のｍＲＮＡノックダウン効率を改善する当業者によく知られた他のトランスフェクション剤とを含む組成物が提供される。
【００６４】
本発明の別の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、個体それ自体に提供される。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、診断法の一部として使用される。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、治療法の一部として使用される。本発明の一実施形態では、本明細書に記載の組成物は、薬学的に許容される担体と混合された場合に、薬学的組成物の一部として個体に提供される。
【００６５】
本発明の一実施形態では、「薬学的組成物」は、生理学的に好適な担体および賦形剤などの他の化学的成分を含む本明細書に記載の１つまたは複数の活性成分の製剤を指す。薬学的組成物の目的は、生物に化合物を投与しやすくすることである。
【００６６】
本発明の一実施形態では、「活性成分」は、生物学的効果について説明可能な、本明細書に記載の組成物を指す。
【００６７】
本発明の一実施形態では、本発明は、組合せ製剤を提供する。本発明の一実施形態では、「組合せ製剤」は、上で定義されたような組合せパートナーを、独立に、または明確な量の組合せパートナーとの様々な固定の組合せの使用により、すなわち、同時に、一斉に、個別に、もしくは連続的に、投与することができるという意味で、特に「パーツからなるキット」を定義するものである。本発明のいくつかの実施形態では、パーツからなるキットのパーツは、次に、例えば、同時に、または時間をずらして、すなわち、パーツからなるキットのどのパーツに対しても、異なる時点で、同じもしくは異なる時間間隔で、投与することができる。いくつかの実施形態では、組合せパートナーの全体量の比率を組合せ製剤において投与することができる。本発明の一実施形態では、組合せ製剤は、例えば、治療される患者亜集団のニーズまたは１人の患者のニーズに対処するために多様であることができ、その異なるニーズは、当業者により容易に理解されるように、特定の疾患、疾患の重症度、年齢、性別、または体重に起因するものであることができる。
【００６８】
本発明の一実施形態では、「生理学的に許容される担体」および「薬学的に許容される担体」という語句は互換的に使用され得るが、これは、生物にそれほど大きな刺激を引き起こさず、投与される化合物の生物活性や特性を無効にしない担体または希釈剤を指す。アジュバントがこれらの語句に含まれる。本発明の一実施形態では、薬学的に許容される担体に含まれる成分の１つは、例えば、有機媒体と水性媒体の両方に対して幅広い溶解度を有する生体適合性ポリマーである、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であることができる（Ｍｕｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９）。
【００６９】
本発明の一実施形態では、「賦形剤」は、活性成分をさらに投与しやすくするために薬学的組成物に添加される不活性物質を指す。本発明の一実施形態では、賦形剤として、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖や様々な種類のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、およびポリエチレングリコールが挙げられる。
【００７０】
薬物を処方および投与するための技術は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，最新版に見出され、これは、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７１】
本発明の一実施形態では、好適な投与経路として、例えば、経口送達、直腸送達、経粘膜送達、経鼻送達、腸送達、または筋肉内注射、皮下注射、および髄内注射、ならびに髄腔内注射、直接脳室内注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻腔内注射、もしくは眼内注射をはじめとする非経口送達が挙げられる。
【００７２】
本発明の一実施形態では、製剤は、例えば、製剤を患者の身体の特定の領域に直接注射することにより、全身にではなく、局所に投与される。
【００７３】
投薬量範囲の様々な実施形態が本発明により企図されている。本発明の一実施形態によれば、本発明の組成物の投薬量は、０．００５〜８０ｍｇ／日の範囲内である。本発明の別の実施形態では、投薬量は、０．０５〜５０ｍｇ／日の範囲内である。本発明の別の実施形態では、投薬量は、０．１〜２０ｍｇ／日の範囲内である。本発明の別の実施形態では、投薬量は、０．１〜１０ｍｇ／日の範囲内である。本発明の別の実施形態では、投薬量は、０．１〜５ｍｇ／日の範囲内である。本発明の別の実施形態では、投薬量は、０．５〜５ｍｇ／日の範囲内である。本発明の別の実施形態では、投薬量は、０．５〜５０ｍｇ／日の範囲内である。本発明の別の実施形態では、投薬量は、５〜８０ｍｇ／日の範囲内である。本発明の別の実施形態では、投薬量は、３５〜６５ｍｇ／日の範囲内である。本発明の別の実施形態では、投薬量は、３５〜６５ｍｇ／日の範囲内である。本発明の別の実施形態では、投薬量は、２０〜６０ｍｇ／日の範囲内である。本発明の別の実施形態では、投薬量は、４０〜６０ｍｇ／日の範囲内である。本発明の別の実施形態では、投薬量は、４５〜６０ｍｇ／日の範囲内である。本発明の別の実施形態では、投薬量は、４０〜６０ｍｇ／日の範囲内である。本発明の別の実施形態では、投薬量は、６０〜１２０ｍｇ／日の範囲内である。本発明の別の実施形態では、投薬量は、１２０〜２４０ｍｇ／日の範囲内である。本発明の別の実施形態では、投薬量は、４０〜６０ｍｇ／日の範囲内である。本発明の別の実施形態では、投薬量は、２４０〜４００ｍｇ／日の範囲内である。本発明の別の実施形態では、投薬量は、４００〜８００ｍｇ／日の範囲内である。本発明の別の実施形態では、投薬量は、８００〜１６００ｍｇ／日の範囲内である。本発明の別の実施形態では、投薬量は、４５〜６０ｍｇ／日の範囲内である。本発明の別の実施形態では、投薬量は、１５〜２５ｍｇ／日の範囲内である。本発明の別の実施形態では、投薬量は、５〜１０ｍｇ／日の範囲内である。本発明の別の実施形態では、投薬量は、５５〜６５ｍｇ／日の範囲内である。
【００７４】
本発明の一実施形態では、投薬量は、２０ｍｇ／日である。本発明の別の実施形態では、投薬量は、３０ｍｇ／日である。本発明の別の実施形態では、投薬量は、４０ｍｇ／日である。本発明の別の実施形態では、投薬量は、５０ｍｇ／日である。本発明の別の実施形態では、投薬量は、６０ｍｇ／日である。本発明の別の実施形態では、投薬量は、７０ｍｇ／日である。本発明の別の実施形態では、投薬量は、８０ｍｇ／日である。本発明の別の実施形態では、投薬量は、９０ｍｇ／日である。本発明の別の実施形態では、投薬量は、１００ｍｇ／日である。
【００７５】
いくつかの実施形態では、経口組成物は、液体溶液、乳濁液、懸濁液などを含む。いくつかの実施形態では、このような組成物の調製に好適な薬学的に許容される担体は、当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、液体経口組成物は、約０．０１２％〜約０．９３３％の所望の化合物（単数または複数）を含み、または本発明の別の実施形態では、約０．０３３％〜約０．７％の所望の化合物（単数または複数）を含む。本発明の一実施形態では、経口投薬形態は、所定の放出プロファイルを含む。
【００７６】
いくつかの実施形態では、本発明の方法で使用される組成物は、溶液または乳濁液を含み、これは、いくつかの実施形態では、安全かつ有効な量の本発明の化合物と、場合により、局所的な鼻腔内投与を対象とした他の化合物とを含む水性溶液または乳濁液である。いくつかの実施形態では、組成物は、鼻腔内経路による化合物の全身送達に使用される、約０．０１％〜約１０．０％ｗ／ｖの対象化合物、より好ましくは約０．１％〜約２．０の対象化合物を含む。
【００７７】
本発明の別の実施形態では、薬学的組成物は、液体製剤の静脈内注射、動脈内注射、または筋肉内注射によって投与される。いくつかの実施形態では、液体処方物として、溶液、懸濁液、分散液、乳濁液、油などが挙げられる。本発明の一実施形態では、薬学的組成物は静脈内投与され、したがって、静脈内投与に好適な形態で処方される。本発明の別の実施形態では、薬学的組成物は動脈内投与され、したがって、動脈内投与に好適な形態で処方される。本発明の別の実施形態では、薬学的組成物は筋肉内投与され、したがって、筋肉内投与に好適な形態で処方される。
【００７８】
さらに、本発明の別の実施形態では、薬学的組成物は体表に局所投与され、したがって、局所投与に好適な形態で処方される。好適な局所処方物としては、ジェル、軟膏、クリーム、ローション、点滴薬などが挙げられる。局所投与のために、本発明の化合物は、追加の適当な治療剤（単数または複数）と組み合わされ、薬学的担体を含むまたは含まない生理学的に許容される希釈液中の溶液、懸濁液、または乳濁液として調製され、適用される。
【００７９】
本発明の一実施形態では、本発明の薬学的組成物は、当該技術分野で周知のプロセスによって、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、封入、または凍結乾燥プロセスによって製造される。
【００８０】
本発明の一実施形態では、本発明に従って使用される薬学的組成物は、薬学的に使用することができる活性成分を製剤へと加工しやすくする、賦形剤や補助薬を含む１つまたは複数の生理学的に許容される担体を用いて、従来の方法で処方される。本発明の一実施形態では、処方物は、選択される投与経路によって決まる。
【００８１】
本発明の一実施形態では、本発明の注射剤は、水性溶液中に処方される。本発明の一実施形態では、本発明の注射剤は、ハンクス溶液、リンガー溶液、または生理学的な塩緩衝液などの生理学的に適合する緩衝液中に処方される。いくつかの実施形態では、経粘膜投与のために、バリアを透過するのに適した浸透剤が処方物中で使用される。このような浸透剤は、当該技術分野で一般に公知である。
【００８２】
本発明の一実施形態では、本明細書に記載の製剤は、例えば、ボーラス注射または持続注入による非経口投与のために処方される。いくつかの実施形態では、注射用処方物は、単位投薬形態で、例えば、任意で追加の防腐剤を含む、アンプル中にまたは複数回投与容器中に提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、または乳濁液であり、懸濁剤、安定剤、および／または分散剤などの処方剤を含む。
【００８３】
いくつかの実施形態では、組成物は、必要に応じて、塩化ベンザルコニウムやチメロサールなどの防腐剤；エデト酸ナトリウムなどのキレート剤；リン酸、クエン酸、および酢酸などの緩衝剤；塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトールなどの等張化剤；アスコルビン酸、アセチルシスチン、メタ重亜硫酸ナトリウムなどの酸化防止剤；芳香剤；セルロースやその誘導体をはじめとするポリマーなどの粘度調整物質；ポリビニルアルコール、ならびにこれらの水性組成物のｐＨを調整するための酸や塩基も含む。いくつかの実施形態では、組成物は、局所麻酔薬または他の活性剤も含む。組成物は、スプレー、ミスト、点滴薬などとして使用することができる。
【００８４】
いくつかの実施形態では、非経口投与用の薬学的組成物は、水溶性形態の活性製剤の水溶液を含む。さらに、いくつかの実施形態では、活性成分の懸濁液は、適当な油性または水性の注射懸濁液として調製される。いくつかの実施形態では、好適な親油性溶媒またはビヒクルとして、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチル、トリグリセリド、もしくはリポソームなどの合成脂肪酸エステルが挙げられる。いくつかの実施形態では、水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの、懸濁液の粘度を高める物質を含む。本発明の別の実施形態では、懸濁液は、活性成分の溶解度を高めて高濃縮溶液の調製を可能にする好適な安定剤または薬剤も含む。
【００８５】
本発明の別の実施形態では、活性化合物は、ビヒクル中で、特に、リポソーム中で送達することができる（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；Ｔｒｅａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｆｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３−３６５（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，同書，ｐｐ．３１７−３２７参照；一般的には同書を参照されたい）。
【００８６】
本発明の別の実施形態では、制御放出系で送達される薬学的組成物は、静脈内注入、埋め込み型浸透圧ポンプ、経皮パッチ、リポソーム、または他の投与様式のために処方される。本発明の一実施形態では、ポンプを使用する（Ｌａｎｇｅｒ，前掲；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）参照）。本発明の別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる。さらに別の実施形態では、制御放出系を、治療標的、すなわち、脳の近くに置くことができ、したがって、全身用量のごく一部だけが必要とされる（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，前掲，第２巻，ｐｐ．１１５−１３８（１９８４）参照）。他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））による総説で論じられている。
【００８７】
いくつかの実施形態では、活性成分は、使用する前に、好適なビヒクル、例えば、滅菌パイロジェンフリー水をベースにした溶液で構成するための粉末形態である。いくつかの実施形態では、組成物は、噴霧や吸入投与のために処方される。本発明の別の実施形態では、組成物は、噴霧手段が取り付けられた容器に収容される。
【００８８】
いくつかの実施形態では、本発明との関連で使用するのに好適な薬学的組成物は、活性成分が意図した目的を達成するのに有効な量で含まれる組成物を含む。いくつかの実施形態では、治療有効量は、疾患を予防するか、緩和するか、もしくは疾患の症状を改善するか、または治療される対象の生存を延長するのに有効な活性成分の量を意味する。
【００８９】
本発明の一実施形態では、治療有効量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。
【００９０】
組成物は、必要に応じて、塩化ベンザルコニウムやチメロサールなどの防腐剤；エデト酸ナトリウムなどのキレート剤；リン酸、クエン酸、および酢酸などの緩衝剤；塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトールなどの等張化剤；アスコルビン酸、アセチルシスチン、メタ重亜硫酸ナトリウムなどの酸化防止剤；芳香剤；セルロースやその誘導体をはじめとするポリマーなどの粘度調整物質；ポリビニルアルコール、ならびにこれらの水性組成物のｐＨを調整するための酸や塩基も含む。組成物は、局所麻酔薬または他の活性剤も含む。組成物は、スプレー、ミスト、点滴薬などとして使用することができる。
【００９１】
薬学的に許容される担体またはその成分としての役割を果たすことができる物質のいくつかの例には、ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの糖類；トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなどのデンプン類；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、およびメチルセルロースなどのセルロースおよびその誘導体；粉末トラガカント；モルト；ゼラチン；タルク；ステアリン酸およびステアリン酸マグネシウムなどの固形潤滑剤；硫酸カルシウム；ピーナッツ油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、およびカカオ脂などの植物油；プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールなどのポリオール類；アルギン酸；Ｔｗｅｅｎ（商標）ブランドの乳化剤などの乳化剤；ラウリル硫酸ナトリウムなどの湿潤剤；着色剤；香味剤；錠剤化剤、安定剤；酸化防止剤；防腐剤；パイロジェンフリー水；等張食塩水；ならびにリン酸緩衝剤溶液がある。化合物とともに使用される薬学的に許容される担体の選択は、基本的には、化合物が投与される方法によって決定される。本発明の一実施形態において、対象化合物が注射される場合、薬学的に許容される担体は、血液適合性の懸濁剤を含む、滅菌生理食塩水であり、そのｐＨは約７．４に調整されている。
【００９２】
さらに、組成物は、結合剤（例えば、アカシア、トウモロコシデンプン、ゼラチン、カルボマー、エチルセルロース、グアーガム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポビドン）、崩壊剤（例えば、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸、二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、グアーガム、グリコール酸デンプンナトリウム）、様々なｐＨおよびイオン強度の緩衝剤（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、表面への吸収を防止するためのアルブミンまたはゼラチンなどの添加物、洗剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｗｅｅｎ  ８０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８、胆汁酸塩）、プロテアーゼ阻害剤、界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）、透過促進剤、可溶化剤（例えば、グリセロール、ポリエチレングリセロール）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、ブチル化ヒドロキシアニソール）、安定剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、粘度増加剤（例えば、カルボマー、コロイド状二酸化ケイ素、エチルセルロース、グアーガム）、甘味料（例えば、アスパルテーム、クエン酸）、防腐剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、流動補助剤（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）、可塑剤（例えば、フタル酸ジエチル、クエン酸トリエチル）、乳化剤（例えば、カルボマー、ヒドロキシプロピルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム）、ポリマーコーティング（例えば、ポロキサマーもしくはポロキサミン）、被覆および被膜形成剤（例えば、エチルセルロース、アクリレート、ポリメトアクリレート）、ならびに／またはアジュバントをさらに含む。
【００９３】
シロップ、エリキシル、乳濁液、および懸濁液用の担体の典型的な成分としては、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、液体スクロース、ソルビトール、および水が挙げられる。懸濁液について、典型的な懸濁剤としては、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、セルロース（例えば、Ａｖｉｃｅｌ（商標）、ＲＣ−５９１）、トラガカント、およびアルギン酸ナトリウムが挙げられ、典型的な湿潤剤としては、レシチンおよびポリエチレンオキシドソルビタン（例えば、ポリソルベート８０）が挙げられる。典型的な防腐剤としては、メチルパラベンおよび安息香酸ナトリウムが挙げられる。本発明の別の実施形態では、経口液体組成物は、上で開示された甘味料、香味剤、および着色料などの１つまたは複数の成分も含む。
【００９４】
組成物は、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ハイドロゲルなどのポリマー化合物の微粒子製剤中もしくはこのような微粒子製剤上への、あるいはリポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、単層小胞もしくは多層小胞、赤血球ゴースト、またはスフェロプラスト上への活性材料の取込みも含む。このような組成物は、物理的状態、溶解度、安定性、インビボでの放出速度、インビボでのクリアランス速度に影響を及ぼす。
【００９５】
ポリマー（例えば、ポロキサマーまたはポロキサミン）でコーティングされた微粒子組成物や、組織特異的な受容体、リガンド、もしくは抗原に対する抗体に結合しているか、または組織特異的な受容体のリガンドに結合している化合物もまた、本発明によって理解される。
【００９６】
いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、またはポリプロリンなどの水溶性ポリマーの共有結合的な付加によって修飾された化合物。本発明の別の実施形態では、修飾された化合物は、対応する未修飾化合物が示すよりも大幅に長い静脈内注射後の血中半減期を示す。本発明の一実施形態では、修飾はまた、水溶液中での化合物の溶解度を高め、凝集を取り除き、化合物の物理化学的安定性を高め、化合物の免疫原性と反応性を大いに低下させる。本発明の別の実施形態では、所望のインビボ生物活性は、このようなポリマー−化合物付加物を未修飾化合物の場合よりも少ない頻度または少ない用量で投与することによって得られる。
【００９７】
いくつかの実施形態では、有効量または有効用量の製剤を、インビトロアッセイから最初に推定することができる。本発明の一実施形態では、用量を動物モデルで策定することができ、このような情報を用いて、ヒトでの有用な用量をより正確に決定することができる。
【００９８】
本発明の一実施形態では、本明細書に記載の活性成分−組成物の毒性および治療効力は、インビトロ、細胞培養、または実験動物での標準的な薬学的手法により決定することができる。本発明の一実施形態では、これらのインビトロアッセイや細胞培養アッセイや動物実験から得られたデータは、ヒトで使用する投薬量範囲の策定に用いることができる。本発明の一実施形態では、投薬量は、利用する投薬形態や使用する投与経路によって変わる。本発明の一実施形態では、個々の医師は、患者の状態を考慮して、正確な処方、投与経路、および投薬量を選択することができる［例えば、Ｆｉｎｇｌ，ｅｔ  ａｌ．，（１９７５）「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，第１章の第１頁を参照されたい］。
【００９９】
本発明の一実施形態では、治療される状態の重症度や応答性によって、投薬を単回投与または複数回投与とし、数日間から数週間、または治癒がもたらされるかもしくは疾患状態の縮小が達成されるまで治療コースを持続させることができる。
【０１００】
本発明の一実施形態では、投与される組成物の量は、当然、治療される対象、苦痛の重症度、投与様式、処方医師の判断などによって決まる。
【０１０１】
本発明の一実施形態では、適合性の薬学的担体中に処方される本発明の製剤を含む組成物も調製し、適当な容器に入れ、かつ適応症の治療について表示する。
【０１０２】
本発明の一実施形態では、本発明の組成物は、活性成分を含む１つまたは複数の単位投薬形態を含む、ＦＤＡが承認したキットなどの、パックまたはディスペンサー装置中に提供される。本発明の一実施形態では、パックは、例えば、ブリスターパックなどの、金属またはプラスチックホイルを含む。本発明の一実施形態では、パックまたはディスペンサー装置に、投与のための取扱説明書が添付されている。本発明の一実施形態では、パックまたはディスペンサー装置に、医薬品の製造、使用、または販売を規制する行政機関が定めた形で容器に関連した注意書きが添付されており、この注意書きは、組成物またはヒトもしくは動物への投与の形態に関して当局に承認されたものを反映している。本発明の一実施形態では、このような注意書きは、処方薬について米国食品医薬品局によって承認された表示であるか、または承認された製品添付文書である。
【０１０３】
本発明の一実施形態では、各薬剤単独での治療と比較して治療効果の改善を達成するために、本発明の組成物を追加の活性剤とともに個体に提供することができることが理解されるであろう。本発明の別の実施形態では、併用療法に伴う有害な副作用に対する対策（例えば、補足的な薬剤の投与と選択）がとられる。
【０１０４】
限定的であることが意図されない、以下の実施例を検討すれば、本発明のさらなる目的、利点、および新規の特徴が当業者に明白になるであろう。さらに、上で説明されたようなおよび以下の特許請求の範囲の節で特許請求されるような本発明の様々な実施形態や態様は各々、以下の実施例に実験的裏付けを見出す。
【実施例】
【０１０５】
一般に、本明細書で使用される命名法および本発明で利用される実験法は、分子的技術、生化学的技術、微生物学的技術、および組換えＤＮＡ技術を含む。このような技術は、文献において十分に説明されている。例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」  第Ｉ〜ＩＩＩ巻  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（編）  「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」，第１〜４巻，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号；同第４，６８３，２０２号；同第４，８０１，５３１号；同第５，１９２，６５９号；および同第５，２７２，０５７号に示されているような方法；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」，第Ｉ〜ＩＩＩ巻  Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編．（１９９４）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙによる「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ  −  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４），第３版；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」  第Ｉ〜ＩＩＩ巻  Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．編．（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（編），「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版），Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ（編），「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；利用可能な免疫アッセイは、特許および科学文献に広く記載されており、例えば、米国特許第３，７９１，９３２号；同第３，８３９，１５３号；同第３，８５０，７５２号；同第３，８５０，５７８号；同第３，８５３，９８７号；同第３，８６７，５１７号；同第３，８７９，２６２号；同第３，９０１，６５４号；同第３，９３５，０７４号；同第３，９８４，５３３号；同第３，９９６，３４５号；同第４，０３４，０７４号；同第４，０９８，８７６号；同第４，８７９，２１９号；同第５，０１１，７７１号；および同第５，２８１，５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」  Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編．（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」  Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編．（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」  Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編．（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編．（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」  Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８４）、および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」第１〜３１７号，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」  ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照されたく、これらは全て、参照により本明細書に組み込まれる。他の一般的な参考文献は、本文書の全体を通して提供される。
【０１０６】
実施例１
ターゲッティング抗体またはその断片と、ハイブリダイゼーション事象によって非共有結合したｓｉＲＮＡ分子とを含むＤＮＡデンドリマーの製造と使用
【０１０７】
材料と方法：
ＤＮＡデンドリマーは、その各々が、各鎖の中央部分にある配列相補性領域を共有する２つのＤＮＡ鎖から作られたＤＮＡモノマーから構築される。２つの鎖がアニールしてモノマーを形成するとき、結果として生じる構造は、４つの一本鎖「アーム」に隣接した中央の二本鎖「ウェスト」を有するものとして記載することができる。このウェスト−プラス−アーム構造は、基本ＤＮＡモノマーを含む。５つのモノマータイプの各々の末端にある一本鎖アームは、正確かつ特異的な方法で、互いに相互作用するように設計される。相補的なモノマーのアーム間の塩基対合（水素結合）は、モノマー層の順次付加によるデンドリマーの有向アセンブリを可能にした（図１）。デンドリマーの各層のアセンブリには、ＤＮＡ鎖が互いに共有結合し、それにより、ＤＮＡ鎖が互いに共有結合しなければデンドリマー構造の変形を引き起こすことになる変性条件に影響されない完全に共有結合した分子が形成される架橋プロセスが含まれた（図２）。さらに、実施例２に記載されているように、この実施例のために調製されたデンドリマーは、その外面に付着した約１２０個のビオチン分子（２層デンドリマー）または約７２０個のビオチン分子（４層デンドリマー）を含んでいた。さらに、キャプチャーオリゴとしての役割を果たす３８塩基のオリゴヌクレオチドを、以下のように、簡単なＴ４  ＤＮＡリガーゼ依存的ライゲーション反応によって、利用可能なデンドリマーアームの５’末端に連結した。
【表１】
0005583667.tif 000002
【０１０８】
最初の４回の反応物を合せて、６５℃に加熱し、室温まで冷却した。次に、５回目と６回目の反応物を添加して、４５分間インキュベートした。２．８ｕＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ溶液を添加して、ライゲーション反応を停止させた。Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ４００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて調製されたサイズ排除スピンカラムを用いて、連結されなかったオリゴヌクレオチドを除去した。
【０１０９】
まず、先に記載した架橋縮合コンジュゲーション化学反応（Ｓｏｌｕｌｉｎｋ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で準備した）を用いて（Ｃａｐ０３配列に相補的な）ＤＮＡオリゴヌクレオチドを抗体に共有結合的にコンジュゲートさせ、次いで、この抗体結合オリゴヌクレオチドをデンドリマーのアーム上の相補的配列（Ｃａｐ０３）にハイブリダイズさせることによって、抗体をＤＮＡデンドリマーに結合させた。このハイブリダイゼーションは３１個の塩基対を含み、生理学的塩溶液中で６５℃よりも大きい融解温度を有し、それにより、生理的温度と条件で抗体と結合したデンドリマーの安定な複合体が得られる。典型的なハイブリダイゼーション処方物には以下のものが含まれる。
【表２】
0005583667.tif 000003
【０１１０】
上記の反応物を組み合わせ、穏やかに混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。この処方物は、４℃で少なくとも６カ月間安定である。
【０１１１】
ｓｉＲＮＡ設計／調製
細胞内でｓｉＲＮＡとして働くよう設計された分子を化学合成したが、これは、１）通常１９塩基長の、ＲＮＡリボヌクレオチドとしての５’部分と、通常０〜３３塩基長の、ＤＮＡデオキシリボヌクレオチドとしての３’部分とを含み、ＤＮＡデンドリマーに連結されたキャプチャーオリゴに相補的であるよう設計された一本鎖「センス」鎖と、２）ＲＮＡリボヌクレオチドのみの、通常１９塩基長の部分と、２個の３’末端デオキシリボヌクレオチドとを含む、「センス」鎖に相補的な一本鎖「アンチセンス」鎖とを含む。これら２つの鎖を等モル量で組み合わせて、「センス」鎖と「アンチセンス」鎖の間に安定なハイブリッドを形成させ、「センス」鎖の一本鎖ＤＮＡ部分をＤＮＡデンドリマーのキャプチャーオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに利用できるようにする。
【０１１２】
この実験では、３個のＤＮＡ分子に付着したときのｓｉＲＮＡの有効性に対する（ｓｉＲＮＡをデンドリマーに連結する）デオキシリボヌクレオチド伸長の長さを研究した。Ｈｅｐａ１−６細胞上のＩＣＡＭ−１をターゲッティングし、このＨｅｐａ１−６細胞を、１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）および１０％ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ中で増殖させ、この細胞に、マウスｓｓｂ（Ｌａ自己抗原）（カタログ番号：Ｓ１０１４３３８３１，Ｑｉａｇｅｎ  ＧＭＢＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）ｍＲＮＡをノックダウンするよう設計されたｓｉＲＮＡと、標的を持たないｓｉＲＮＡ（カタログ番号：Ｓ１０２７３１０，Ｑｉａｇｅｎ  ＧＭＢＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）とを用いた。
【０１１３】
試験したｓｉＲＮＡ：
条件＃１：リンカーなし
ＳＳＢ  ｓｉＲＮＡ：
アンチセンス鎖：
ＲＮＡアンチセンス鎖：５’−ＵＵＡＡＡＧＵＣＵＧＵＵＧＵＣＡＧＣＣ−３’（配列番号１）
ＤＮＡアンチセンス鎖  ５’−ｄＧｄＧ−３’
【０１１４】
完全なアンチセンス鎖は、ＲＮＡアンチセンス鎖の３’末端に結合したＤＮＡアンチセンス鎖から構成されており、したがって、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドアンチセンス鎖：５’−ｒＵｒＵｒＡｒＡｒＡｒＧ  ｒＵｒＣｒＵ  ｒＧｒＵｒＵ  ｒＧｒＵｒＣ  ｒＡｒＧｒＣ  ｒＣ  ｄＧｄＧ−３’（配列番号１０）を形成する。
【０１１５】
ｒはリボヌクレオチドを表し、ｄはデオキシリボヌクレオチドを表し、下線のあるヌクレオチドは、２’−メトキシ（Ｏメチルとも呼ばれる）修飾を有するオリゴヌクレオチド内の位置を示す。
【０１１６】
センス鎖：
ＲＮＡセンス鎖：５’−ＧＧＣＵＧＡＣＡＡＣＡＧＡＣＵＵＵＡＡ−３’（配列番号２）
ＤＮＡセンス鎖：５’−ｄＴｄＴ−３’  
【０１１７】
完全なセンス鎖は、ＲＮＡセンス鎖の３’末端に結合したＤＮＡセンス鎖から構成されており、したがって、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドセンス鎖：
５’−ｒＧｒＧｒＣ  ｒＵｒＧｒＡ  ｒＣｒＡｒＡ  ｒＣｒＡｒＧ  ｒＡｒＣｒＵ  ｒＵｒＵｒＡ  ｒＡ  ｄＴｄＴ−３’（配列番号１１）
を形成する。
【０１１８】
ｒはリボヌクレオチドを表し、ｄはデオキシリボヌクレオチドを表す。
【０１１９】
陰性対照ｓｉＲＮＡ：
アンチセンス鎖：
ＲＮＡアンチセンス鎖：５’−ＡＣＧＵＧＡＣＡＣＧＵＵＣＧＧＡＧＡＡ−３’（配列番号３）
ＤＮＡアンチセンス鎖  ５’−ｄＴｄＴ−３’
【０１２０】
完全なアンチセンス鎖は、ＲＮＡアンチセンス鎖の３’末端に結合したＤＮＡアンチセンス鎖から構成されており、したがって、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドアンチセンス鎖：
５’−ｒＡｒＣｒＧ  ｒＵｒＧｒＡ  ｒＣｒＡｒＣ  ｒＧｒＵｒＵ  ｒＣｒＧｒＧ  ｒＡｒＧｒＡ  ｒＡ  ｄＴｄＴ−３’（配列番号１２）
を形成する。
【０１２１】
ｒはリボヌクレオチドを表し、ｄはデオキシリボヌクレオチドを表し、下線のあるヌクレオチドは、２’−メトキシ（Ｏメチルとも呼ばれる）修飾を有するオリゴヌクレオチド内の位置を示す。
【０１２２】
センス鎖：
ＲＮＡセンス鎖：５’−ＵＵＣ  ＵＣＣＧＡＡＣＧＵＧＵＣＡＣＧＵ−３’（配列番号４）
ＤＮＡセンス鎖：５’−ｄＴｄＴ−３’
【０１２３】
完全なセンス鎖は、ＲＮＡセンス鎖の３’末端に結合したＤＮＡセンス鎖から構成されており、したがって、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドセンス鎖：
５’−ｒＵｒＵｒＣ  ｒＵｒＣｒＣ  ｒＧｒＡｒＡ  ｒＣｒＧｒＵ  ｒＧｒＵｒＣ  ｒＡｒＣｒＧ  ｒＵ  ｄＴｄＴ−３’（配列番号１３）
を形成する。
【０１２４】
ｒはリボヌクレオチドを表し、ｄはデオキシリボヌクレオチドを表す。
【０１２５】
条件＃２：１６塩基のＤＮＡリンカー配列を含むＳＳＢ：
アンチセンス鎖：
ＲＮＡアンチセンス鎖：５’−ＵＵＡＡＡＧＵＣＵＧＵＵＧＵＣＡＧＣＣ−３’（配列番号１）
ＤＮＡアンチセンス鎖  ５’−ｄＧｄＧ−３’（配列番号２）
【０１２６】
完全なアンチセンス鎖は、ＲＮＡアンチセンス鎖の３’末端に結合したＤＮＡアンチセンス鎖から構成されており、したがって、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドアンチセンス鎖：  
５’−ｒＵｒＵｒＡ  ｒＡｒＡｒＧ  ｒＵｒＣｒＵ  ｒＧｒＵｒＵ  ｒＧｒＵｒＣ  ｒＡｒＧｒＣ  ｒＣ  ｄＧｄＧ−３’（配列番号１０）
を形成する。
【０１２７】
ｒはリボヌクレオチドを表し、ｄはデオキシリボヌクレオチドを表し、下線のあるヌクレオチドは、２’−メトキシ（Ｏメチルとも呼ばれる）修飾を有するオリゴヌクレオチド内の位置を示す。
【０１２８】
センス鎖：
ＲＮＡセンス鎖：５’−ＧＧＣＵＧＡＣＡＡＣＡＧＡＣＵＵＵＡＡ−３’（配列番号２）
ＤＮＡセンス鎖：５’−ＴＴＣＣＧＴＴＧＡＣＡＴＣＴＣＧＴＡ−３’（配列番号５）
【０１２９】
完全なセンス鎖は、ＲＮＡセンス鎖の３’末端に結合したＤＮＡセンス鎖から構成されており、したがって、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドセンス鎖：
５’−ｒＧｒＧｒＣ  ｒＵｒＧｒＡ  ｒＣｒＡｒＡ  ｒＣｒＡｒＧ  ｒＡｒＣｒＵ  ｒＵｒＵｒＡ  ｒＡ  ｄＴｄＴ  ｄＣｄＣｄＧｄＴｄＴ  ｄＧｄＡｄＣ  ｄＡｄＴｄＣｄＴｄＣ  ｄＧｄＴｄＡ−３’（配列番号１６）
を形成する。
【０１３０】
ｒはリボヌクレオチドを表し、ｄはデオキシリボヌクレオチドを表す。
【０１３１】
１６塩基のリンカー配列を含む陰性対照（ｍＲＮＡ標的なし）：
アンチセンス鎖：
ＲＮＡアンチセンス鎖：５’−ＡＣＧＵＧＡＣＡＣＧＵＵＣＧＧＡＧＡＡ−３’（配列番号３）
ＤＮＡアンチセンス鎖  ５’−ｄＧｄＧ−３’
【０１３２】
完全なアンチセンス鎖は、ＲＮＡアンチセンス鎖の３’末端に結合したＤＮＡアンチセンス鎖から構成されており、したがって、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドアンチセンス鎖：
５’−ｒＡｒＣｒＧ  ｒＵｒＧｒＡ  ｒＣｒＡｒＣ  ｒＧｒＵｒＵ  ｒＣｒＧｒＧ  ｒＡｒＧｒＡ  ｒＡ  ｄＴｄＴ−３’（配列番号１７）
を形成する。
【０１３３】
ｒはリボヌクレオチドを表し、ｄはデオキシリボヌクレオチドを表し、下線のあるヌクレオチドは、２’−メトキシ（Ｏメチルとも呼ばれる）修飾を有するオリゴヌクレオチド内の位置を示す。
【０１３４】
センス鎖：
ＲＮＡセンス鎖：５’−ＵＵＣＵＣＣＧＡＡＣＧＵＧＵＣＡＣＧＵ−３’（配列番号４）
ＤＮＡセンス鎖：５’−ＴＴＣＣＧＴＴＧＡＣＡＴＣＴＣＧＴＡ−３’（配列番号５）  
【０１３５】
完全なセンス鎖は、ＲＮＡセンス鎖の３’末端に結合したＤＮＡセンス鎖から構成されており、したがって、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドセンス鎖：
５’−ｒＵｒＵｒＣ  ｒＵｒＣｒＣ  ｒＧｒＡｒＡ  ｒＣｒＧｒＵ  ｒＧｒＵｒＣ  ｒＡｒＣｒＧ  ｒＵ  ｄＴｄＴ  ｄＣｄＣｄＧｄＴｄＴ  ｄＧｄＡｄＣ  ｄＡｄＴｄＣｄＴｄＣ  ｄＧｄＴｄＡ−３’（配列番号１８）
を形成する。
【０１３６】
ｒはリボヌクレオチドを表し、ｄはデオキシリボヌクレオチドを表す。
【０１３７】
条件＃３：２１塩基のＤＮＡリンカー配列を含むＳＳＢ：
アンチセンス鎖：
ＲＮＡアンチセンス鎖：５’−ＵＵＡＡＡＧＵＣＵＧＵＵＧＵＣＡＧＣＣ−３’（配列番号１）
ＤＮＡアンチセンス鎖  ５’−ｄＧｄＧ−３’
【０１３８】
完全なアンチセンス鎖は、ＲＮＡアンチセンス鎖の３’末端に結合したＤＮＡアンチセンス鎖から構成されており、したがって、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドアンチセンス鎖：
５’−ｒＵｒＵｒＡ  ｒＡｒＡｒＧ  ｒＵｒＣｒＵ  ｒＧｒＵｒＵ  ｒＧｒＵｒＣ  ｒＡｒＧｒＣ  ｒＣ  ｄＧｄＧ−３’（配列番号１０）
を形成する。
【０１３９】
ｒはリボヌクレオチドを表し、ｄはデオキシリボヌクレオチドを表し、下線のあるヌクレオチドは、２’−メトキシ（Ｏメチルとも呼ばれる）修飾を有するオリゴヌクレオチド内の位置を示す。
【０１４０】
センス鎖：
ＲＮＡセンス鎖：５’−ＧＧＣＵＧＡＣＡＡＣＡＧＡＣＵＵＵＡＡ−３’（配列番号２）
ＤＮＡセンス鎖：５’−ＴＴＣＣＧＴＴＧＡＣＡＴＣＴＣＧＴＡＧＡＴＴＴ−３’（配列番号６）
【０１４１】
完全なセンス鎖は、ＲＮＡセンス鎖の３’末端に結合したＤＮＡセンス鎖から構成されており、したがって、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドセンス鎖：
５’−ｒＵｒＵｒＣ  ｒＵｒＣｒＣ  ｒＧｒＡｒＡ  ｒＣｒＧｒＵ  ｒＧｒＵｒＣ  ｒＡｒＣｒＧ  ｒＵ  ｄＴｄＴ  ｄＣｄＣｄＧｄＴｄＴ  ｄＧｄＡｄＣ  ｄＡｄＴｄＣｄＴｄＣ  ｄＧｄＴｄＡｄＧｄＡｄＴｄＴｄＴ−３’（配列番号１９）
を形成する。
【０１４２】
ｒはリボヌクレオチドを表し、ｄはデオキシリボヌクレオチドを表す。
【０１４３】
２１塩基のリンカー配列を含む陰性対照（ｍＲＮＡ標的なし）：
アンチセンス鎖：
ＲＮＡアンチセンス鎖：５’−ＡＣＧＵＧＡＣＡＣＧＵＵＣＧＧＡＧＡＡ−３’（配列番号３）
ＤＮＡアンチセンス鎖  ５’−ｄＴｄＴ−３’
【０１４４】
完全なアンチセンス鎖は、ＲＮＡアンチセンス鎖の３’末端に結合したＤＮＡアンチセンス鎖から構成されており、したがって、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドアンチセンス鎖：
５’−ｒＡｒＣｒＧ  ｒＵｒＧｒＡ  ｒＣｒＡｒＣ  ｒＧｒＵｒＵ  ｒＣｒＧｒＧ  ｒＡｒＧｒＡ  ｒＡ  ｄＴｄＴ−３’（配列番号１２）
を形成する。
【０１４５】
ｒはリボヌクレオチドを表し、ｄはデオキシリボヌクレオチドを表し、下線のあるヌクレオチドは、２’−メトキシ（Ｏメチルとも呼ばれる）修飾を有するオリゴヌクレオチド内の位置を示す。
【０１４６】
センス鎖：
ＲＮＡセンス鎖：５’−ＵＵＣＵＣＣＧＡＡＣＧＵＧＵＣＡＣＧＵ−３’（配列番号４）
ＤＮＡセンス鎖：５’−ＴＴＣＣＧＴＴＧＡＣＡＴＣＴＣＧＴＡＧＡＴＴＴ−３’（配列番号６）
【０１４７】
完全なセンス鎖は、ＲＮＡセンス鎖の３’末端に結合したＤＮＡセンス鎖から構成されており、したがって、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドセンス鎖：
５’−ｒＵｒＵｒＣ  ｒＵｒＣｒＣ  ｒＧｒＡｒＡ  ｒＣｒＧｒＵ  ｒＧｒＵｒＣ  ｒＡｒＣｒＧ  ｒＵ  ｄＴｄＴ  ｄＣｄＣｄＧｄＴｄＴ  ｄＧｄＡｄＣ  ｄＡｄＴｄＣｄＴｄＣ  ｄＧｄＴｄＡｄＧｄＡｄＴｄＴｄＴ−３’（配列番号１９）
を形成する。
【０１４８】
ｒはリボヌクレオチドを表し、ｄはデオキシリボヌクレオチドを表す。
【０１４９】
条件＃４：２６塩基のＤＮＡリンカー配列を含むＳＳＢ：
アンチセンス鎖：
ＲＮＡアンチセンス鎖：５’−ＵＵＡＡＡＧＵＣＵＧＵＵＧＵＣＡＧＣＣ−３’（配列番号１）
ＤＮＡアンチセンス鎖  ５’−ｄＧｄＧ−３’
【０１５０】
完全なアンチセンス鎖は、ＲＮＡアンチセンス鎖の３’末端に結合したＤＮＡアンチセンス鎖から構成されており、したがって、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドアンチセンス鎖：
５’−ｒＵｒＵｒＡ  ｒＡｒＡｒＧ  ｒＵｒＣｒＵ  ｒＧｒＵｒＵ  ｒＧｒＵｒＣ  ｒＡｒＧｒＣ  ｒＣ  ｄＧｄＧ−３’（配列番号１０）
を形成する。
【０１５１】
ｒはリボヌクレオチドを表し、ｄはデオキシリボヌクレオチドを表し、下線のあるヌクレオチドは、２’−メトキシ（Ｏメチルとも呼ばれる）修飾を有するオリゴヌクレオチド内の位置を示す。
【０１５２】
センス鎖：
ＲＮＡセンス鎖：５’−ＧＧＣＵＧＡＣＡＡＣＡＧＡＣＵＵＵ  ＡＡ−３’（配列番号２）
ＤＮＡセンス鎖：５’−ＴＴＣＣＧＴＴＧＡＣＡＴＣＴＣＧＴＡＧＡＴＴＴＧＡＡＴＴ−３’（配列番号７）  
【０１５３】
完全なセンス鎖は、ＲＮＡセンス鎖の３’末端に結合したＤＮＡセンス鎖から構成されており、したがって、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドセンス鎖：
５’−ｒＧｒＧｒＣ  ｒＵｒＧｒＡ  ｒＣｒＡｒＡ  ｒＣｒＡｒＧ  ｒＡｒＣｒＵ  ｒＵｒＵｒＡ  ｒＡ  ｄＴｄＴ  ｄＣｄＣｄＧｄＴｄＴ  ｄＧｄＡｄＣ  ｄＡｄＴｄＣｄＴｄＣ  ｄＧｄＴｄＡｄＧｄＡｄＴｄＴｄＴｄＧ  ｄＡｄＡｄＴｄＴ−３’（配列番号１４）
を形成する。
【０１５４】
ｒはリボヌクレオチドを表し、ｄはデオキシリボヌクレオチドを表す。
【０１５５】
２６塩基のリンカー配列を含む陰性対照（ｍＲＮＡ標的なし）：
アンチセンス鎖：
ＲＮＡアンチセンス鎖：５’−ＡＣＧＵＧＡＣＡＣＧＵＵＣＧＧＡＧＡＡ−３’（配列番号３）
ＤＮＡアンチセンス鎖  ５’−ｄＴｄＴ−３’
【０１５６】
完全なアンチセンス鎖は、ＲＮＡアンチセンス鎖の３’末端に結合したＤＮＡアンチセンス鎖から構成されており、したがって、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドアンチセンス鎖：
５’−ｒＡｒＣｒＧ  ｒＵｒＧｒＡ  ｒＣｒＡｒＣ  ｒＧｒＵｒＵ  ｒＣｒＧｒＧ  ｒＡｒＧｒＡ  ｒＡ  ｄＴｄＴ−３’（配列番号１２）
を形成する。
【０１５７】
ｒはリボヌクレオチドを表し、ｄはデオキシリボヌクレオチドを表し、下線のあるヌクレオチドは、２’−メトキシ（Ｏメチルとも呼ばれる）修飾を有するオリゴヌクレオチド内の位置を示す。
【０１５８】
センス鎖：
ＲＮＡセンス鎖：５’−ＵＵＣＵＣＣＧＡＡＣＧＵＧＵＣＡＣＧＵ−３’（配列番号４）
ＤＮＡセンス鎖：５’−ＴＴＣＣＧＴＴＧＡＣＡＴＣＴＣＧＴＡＧＡＴＴＴＧＡＡＴＴ−３’（配列番号７）
【０１５９】
完全なセンス鎖は、ＲＮＡセンス鎖の３’末端に結合したＤＮＡセンス鎖から構成されており、したがって、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドセンス鎖：
５’−ｒＵｒＵｒＣ  ｒＵｒＣｒＣ  ｒＧｒＡｒＡ  ｒＣｒＧｒＵ  ｒＧｒＵｒＣ  ｒＡｒＣｒＧ  ｒＵ  ｄＴｄＴ  ｄＣｄＣｄＧｄＴｄＴ  ｄＧｄＡｄＣ  ｄＡｄＴｄＣｄＴｄＣ  ｄＧｄＴｄＡｄＧｄＡｄＴｄＴｄＴｄＧ  ｄＡｄＡｄＴｄＴ−３’（配列番号１５）
を形成する。
【０１６０】
ｒはリボヌクレオチドを表し、ｄはデオキシリボヌクレオチドを表す。
【０１６１】
ｓｉＲＮＡハイブリダイゼーション処方物：
「センス」ＤＮＡ／ＲＮＡ分子（５０μＭ）  ２５μＬ
「アンチセンス」ＲＮＡ分子（５０μＭ）  ２５μＬ
【０１６２】
上記の処方物当たり１本のマイクロチューブ中で、センスｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドとアンチセンスｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを組み合わせた。オリゴ混合物を８０℃で５分間インキュベートした後、３７℃に２０分間移し、ｓｉＲＮＡ二重鎖を形成させた。トランスフェクション混合物を調製する前に、ハイブリダイズしたｓｉＲＮＡを、２μＭの最終濃度になるように無血清培地中で２５倍希釈した。
【０１６３】
トランスフェクション混合物の調製
以下の構成要素をマイクロチューブ中で組み合わせた：
抗体を含む２層ＤＮＡデンドリマー（１０ｎｇ／μＬ）  １２．０μＬ
ｓｉＲＮＡ二重鎖分子（２μＭに希釈）  ３．０μＬ
無血清培地またはＰＢＳ  １０５．０μＬ
【０１６４】
この混合物を３７℃で２０〜３０分間インキュベートした後、使用するまで室温に、または長期保存の場合４℃に置いた。他の薬剤をトランスフェクション混合物に添加する実験については、添加される構成要素の容量を、トランスフェクション混合物で使用される無血清培地の量から差し引いた。例えば、１０５μｌの無血清培地の代わりに７．５μｌの１Ｍ  ＭｇＣｌ２と９７．５μｌの無血清培地を添加して、ＭｇＣｌ２を含むトランスフェクション混合物を調製した。
【０１６５】
トランスフェクション実験：
ターゲッティング抗体とハイブリダイズしたｓｉＲＮＡ二重鎖とを含む、ＤＮＡデンドリマーを、インビトロトランスフェクションの標的として好適な２，０００〜１０，０００個の生きた細胞を含む組織培養プレートのウェルに導入し、１０％血清を含む適切な培地中または無血清培地中で増殖させた。これらの細胞は、１）デンドリマーが結合したターゲッティング抗体の結合標的として好適な表面抗原、２）このデンドリマーに結合したｓｉＲＮＡアンチセンス分子の適切な標的としての役割を果たすメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、３）抗体が媒介する細胞表面結合事象、またはエンドサイトーシス過程を開始させることができる他の事象を介してＤＮＡデンドリマーを内在化させる能力を含むが、これらに限定されない、特定の特徴を含まなければならない。典型的には、上記の処方物を、９６ウェルプレート中の１００μＬの組織培養培地に、ウェルの総容量の１０〜２５％の範囲の容量（１０〜２５μｌ）で添加したが、最良の効果を得るにはより少ないまたはより多い容量が必要となり得る。ｓｉＲＮＡの機能は、標的とされたｍＲＮＡを内部対照ｍＲＮＡ（１８ｓ  ＲＮＡおよびＰＰＩＢ  ｍＲＮＡ）と比べて検出するように設計されたｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを用いて、デンドリマー−ｓｉＲＮＡ複合体の添加後に細胞に残存するインタクトなｍＲＮＡの量を定量することによって直接的に測定したか、またはｓｉＲＮＡのトランスフェクションならびにｍＲＮＡ標的および関連タンパク質の発現のノックダウン後に細胞に残存するタンパク質の量を定量することによって間接的に測定した。
【０１６６】
修飾ｓｉＲＮＡの適切な機能を確認するための対照として、製造元の奨めによる市販のトランスフェクション試薬であるリポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）と、１０ｎＭの最終的なｓｉＲＮＡ濃度とを用いて、各修飾ｓｉＲＮＡについてノックダウン活性を確認した。ノックダウン測定値は全て、同じ構造的修飾を含む陰性対照（ｍＲＮＡ標的なし）ｓｉＲＮＡ二重鎖と比べたものであった。
【０１６７】
ｓｉＲＮＡ修飾のリスト：
１．両方とも対照未修飾非伸長鎖からなる野生型ｓｉＲＮＡ二重鎖
２．１６塩基のデオキシヌクレオチド伸長を有するセンス鎖からなるｓｉＲＮＡ二重鎖
３．２１塩基のデオキシヌクレオチド伸長を有するセンス鎖からなるｓｉＲＮＡ二重鎖
２６塩基のデオキシヌクレオチド伸長を有するセンス鎖からなるｓｉＲＮＡ二重鎖
【０１６８】
結果
まず、適切な陰性対照オリゴと比較した残存するＳＳＢ  ｍＲＮＡの相対量を測定することにより、リポフェクトアミン２０００を用いたＤＮＡデンドリマー送達方法とは独立して、ｓｉＲＮＡ（１０ｎＭ最終濃度）の各々について、ノックダウン効率を測定した。全ての場合において、本発明者らは、７０〜９５％のノックダウン効率を観察した。次に、本発明者らは、１０ｎＭの最終ｓｉＲＮＡ濃度と、０．２ｎｇ／μｌの最終ＤＮＡデンドリマー濃度（配列伸長を介してデンドリマーに結合することができるものについて、デンドリマー結合型ｓｉＲＮＡとして約２．５〜３ｎＭ）とを有するＤＮＡデンドリマーハイブリダイゼーション混合物を調製し、ノックダウン効率を比較した。一般に、おそらくｓｉＲＮＡの分解のために、血清を含む培地と比較して無血清培地においてより顕著なノックダウン効率が観察された。血清含有培地と無血清培地の両方の比較において、最も長い（２６塩基）伸長を含むｓｉＲＮＡ構築物は、２つのより短い３’デオキシヌクレオチド伸長（それぞれ、２１塩基と１６塩基、および伸長なし）と比較して、最も高い能力を発揮し、標的ｍＲＮＡのより多いノックダウンをもたらした。血清含有培地では、本発明者らは、２６塩基の３’伸長を有するｓｉＲＮＡ二重鎖については約４０％のノックダウンで、ｓｉＲＮＡにセンス鎖の３’伸長がない場合は、ほとんどまたは全くノックダウンがないところまで低下することを観察した。無血清培地では、本発明者らは、３’なし、１６塩基伸長、および２１塩基伸長についての、それぞれ０〜５％、１０〜２０％、および３０〜３５％のノックダウンと比較して、２６塩基の３’伸長ｓｉＲＮＡについて約６５〜７０％のノックダウンを観察した。
【０１６９】
血清含有培地を無血清培地と比較したトランスフェクションの結果に基づいて、血清含有培地中でのｓｉＲＮＡの安定性を改善するために、様々な化学的部分で修飾されたｓｉＲＮＡを引き続き研究に含めた。これらの修飾は本明細書において上で記載されている。
【０１７０】
実施例２
ｓｉＲＮＡ分子がビオチン化ｓｉＲＮＡ分子のストレプトアビジンに対する結合を介して非共有結合し、その後ＤＮＡデンドリマー上のビオチンに結合するターゲッティング抗体とｓｉＲＮＡ分子とを含むＤＮＡデンドリマーの製造と使用
オリゴの合成中に取り込まれた末端標識ビオチンを含むＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションと架橋によってビオチン部分がデンドリマーの「アーム」上に導入されていることを除き、ターゲッティング抗体と結合したＤＮＡデンドリマーを上記のように調製した。典型的なデンドリマービオチン標識反応は、抗体のデンドリマーへの結合前、およびキャプチャー配列のライゲーション中またはライゲーション後に、以下のように行なわれた。
【０１７１】
以下の構成要素をマイクロチューブに添加した：
連結されたＣａｐ０３配列を有する４層ＤＮＡデンドリマー（５０ｎｇ／μＬ）  ５０．０μＬ
ｃ（−）ビオチンオリゴ（５００ｎｇ／μＬ）  ２．６μＬ
ａ（−）ビオチンオリゴ（５００ｎｇ／μＬ）  ２．６μＬ
５Ｍ  ＮａＣｌ  ４．０μＬ
エタノール中で飽和した２，４，８トリメチルソラーレン  ７．０μＬ
【０１７２】
上記の反応物を合わせ、よく混合し、６５℃の水の容器に入れ、４２℃までゆっくりと冷却した。３００ｎｍのＵＶ光に１０分間（×２）曝露すると、ビオチン化オリゴをＤＮＡデンドリマーのアームに共有結合させる架橋事象が起こった。サイズ排除スピンカラムの使用により、架橋されていないオリゴヌクレオチドを除去した。
【０１７３】
ビオチン標識オリゴヌクレオチドは、商業的なＤＮＡオリゴヌクレオチド供給メーカーから供給された。Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．およびＴｒｉｌｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．から入手可能なＤＮＡ合成試薬をはじめとする、ビオチン化ＤＮＡオリゴヌクレオチド合成のための種々のビオチン化ホスホロアミダイトを使用したが、これには、ビオチンホスホロアミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  カタログ番号１０−１９５３−９５）、ビオチンＴＥＧホスホロアミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  カタログ番号１０−１９５５−９５）、ビオチン−ｄＴ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  カタログ番号１０−１０３８−９５）、５’−ビオチンホスホロアミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  カタログ番号１０−５９５０−９５）、５’ビオチン（Ｔｒｉｌｉｎｋ）、ビオチンジオールリンカー（５’または内部）（Ｔｒｉｌｉｎｋ）、３’ビオチンＢＢ  ＣＰＧ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）、および５’デュアルビオチン（Ｔｒｉｌｉｎｋ）が含まれる。ＤＮＡポリメラーゼとビオチン化デオキシリボヌクレオチドとを用いたビオチンのＤＮＡへの取込み、ＲＮＡポリメラーゼとビオチン化リボヌクレオチドとを用いたビオチンのＲＮＡへの取込み、およびＫｒｅａｔｅｃｈ，Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏや他の会社から市販されている技術を用いたビオチンの核酸への化学的取込みをはじめとする、酵素合成や化学合成を用いたビオチンの核酸への取込みのための他の方法によって、同じような標識効率が得られる可能性が高い。
【０１７４】
細胞内でｓｉＲＮＡとして働くよう設計された分子を化学合成したが、これは、１）３’末端上の２個以上のＤＮＡヌクレオチドとともに、通常１９〜２３塩基長の全ＲＮＡリボヌクレオチドを含み、かつオリゴヌクレオチド合成時または合成後にこの分子の３’または５’末端に付加されたビオチン部分（またはビオチン類似体）を含む一本鎖「センス」鎖と、２）２個の３’末端デオキシヌクレオチドとともに、ＲＮＡリボヌクレオチドのみの、通常１９塩基長の部分を含む、「センス」鎖に相補的な一本鎖「アンチセンス」鎖とを含んでいた。これら２つの鎖を等モル量で組み合わせて、「センス」鎖と「アンチセンス」鎖の間に安定なハイブリッドを形成させ、ビオチン部分を、アビジンまたはストレプトアビジン分子への結合に利用できるようにした。ビオチン−アビジン結合処方物は、以下のものであった：
ｓｉＲＮＡハイブリダイゼーション処方物：
末端ビオチン標識を有する「センス」ＤＮＡ／ＲＮＡ分子（５０μＭ）  ２５μＬ
「アンチセンス」ＲＮＡ分子（５０μＭ）  ２５μＬ
【０１７５】
上記の処方物当たり１本のマイクロチューブ中で、センスｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドとアンチセンスｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを組み合わせた。オリゴ混合物を８０℃で５分間インキュベートした後、３７℃に２０分間移し、ｓｉＲＮＡ二重鎖を形成させた。
【０１７６】
以下の構成要素をマイクロチューブに添加した：
末端ビオチン標識を有するハイブリダイズした二重鎖ｓｉＲＮＡ（５０ｕＭ）  ５．３μＬ
１×ＰＢＳ  ８６．５μＬ
ストレプトアビジン（１０００ｎｇ／μＬ）  ８．０μＬ
５Ｍ  ＮａＣｌ  ０．２μＬ
【０１７７】
上記の反応物を組み合わせ、穏やかに混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。
【０１７８】
上記の処方物では、ビオチン化「センス」ＲＮＡは、ストレプトアビジン分子上で利用できる４つの利用可能なビオチン結合価のうちの２〜３つと極めて強い非共有結合を形成し、それ以外の形でビオチン部分と結合することができる（平均して）少なくとも１つの遊離ビオチン結合ストレプトアビジン結合価は、「センス」ＲＮＡ分子と会合しないまま残った。
【０１７９】
次に、ストレプトアビジン上の残りのビオチン結合価がＤＮＡデンドリマー上のビオチン標識に結合するように、［ビオチン化ｓｉＲＮＡ−ストレプトアビジン］複合体をビオチン化デンドリマーと混合した。この結合は、以下の反応によって達成された：
抗体を含む４層ビオチン化ＤＮＡデンドリマー（１０ｎｇ／μＬ）  ５０．０μＬ
「ビオチン化ｓｉＲＮＡ−ストレプトアビジン」複合体  ５．３μＬ
１×ＰＢＳ  ３．７μＬ
【０１８０】
上記の反応物を組み合わせ、穏やかに混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。
【０１８１】
ターゲッティング抗体とハイブリダイズしたｓｉＲＮＡ二重鎖とを含む、ＤＮＡデンドリマーを、インビトロトランスフェクションの標的として好適な２，０００〜１０，０００個の生きた細胞を含む組織培養プレートのウェルに導入した。これらの細胞は、１）デンドリマー結合型ターゲッティング抗体の結合標的として好適な表面抗原、２）このデンドリマーに結合したｓｉＲＮＡアンチセンス分子の適切な標的としての役割を果たすメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、３）抗体が媒介する細胞表面結合事象、またはエンドサイトーシスもしくは内在化過程を開始させることができる他の事象を介してＤＮＡデンドリマーを内在化させる能力を含むが、これらに限定されない、特定の特徴を含んでいた。上記の処方物を、９６ウェルプレート中の１００μＬの組織培養培地に、ウェルの総容量の１０〜２５％の範囲の容量（１０〜２５μｌ）で添加したが、最良の効果を得るにはより少ないまたはより多い容量が必要となり得る。上記の処方物を、９６ウェルプレート中の１００μＬの組織培養培地に、ウェルの総容量の１０〜２５％の範囲の容量（１０〜２５μｌ）で添加したが、最良の効果を得るにはより少ないまたはより多い容量が必要となり得る。ｓｉＲＮＡの機能は、デンドリマー−ｓｉＲＮＡ複合体の添加後に細胞に残存するインタクトなｍＲＮＡの量を定量することによって直接的に測定したか、またはｍＲＮＡおよび関連タンパク質の発現の「ノックダウン」により生じた、特定のｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ結合の分解活性の結果として細胞により合成されたタンパク質の量を定量することによって間接的に測定した。
【０１８２】
実施例３
ｓｉＲＮＡ分子がジスルフィド架橋結合の使用によって共有結合されているターゲッティング抗体とｓｉＲＮＡ分子とを含むＤＮＡデンドリマーの製造
抗体を含む４層ＤＮＡデンドリマー（１０ｎｇ／μＬ）を上記の実施例１または２と同様に合成する。細胞内でｓｉＲＮＡとして働くよう設計された分子を化学合成したが、これは、１）３’末端上の２個以上のＤＮＡヌクレオチドとともに、通常１９〜２３塩基長の全ＲＮＡリボヌクレオチドを含み、かつオリゴヌクレオチド合成時または合成後にこの分子の５’末端に付加されたスルヒドリル（ＳＨ）部分を含む一本鎖「センス」鎖と、２）２個の３’末端デオキシヌクレオチドとともに、ＲＮＡリボヌクレオチドのみの、通常１９塩基長の部分を含む、「センス」鎖に相補的な一本鎖「アンチセンス」鎖とを含んでいた。これら２つの鎖を組み合わせて、「センス」鎖と「アンチセンス」鎖の間に安定なハイブリッドを形成させ、スルフヒドリル部分を、デンドリマーのアームに付加されたキャプチャー配列に相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチド上の（「Ｓ−Ｓ」ジスルフィド結合を形成する）別のスルフヒドリル部分へのコンジュゲーションに利用できるようにする。ジスルフィド処方物に対する典型的なスルフヒドリル−スルフヒドリルコンジュゲーションは以下の通りであった。
【０１８３】
以下の構成要素をマイクロチューブに添加した：
末端スルフヒドリルを有する「センス」ｓｉＲＮＡ鎖（５０ｕＭ）  １０．０μＬ
スルフヒドリルを有する、キャプチャー配列に相補的なＤＮＡオリゴ（５０ｕＭ）  ９．０μＬ
２Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）水溶液  ２０．０μＬ
ヌクレアーゼフリー水  １．０μＬ
【０１８４】
上記の反応物を組み合わせ、穏やかに混合し、６５℃で１６時間、またはほとんどもしくは全てのジスルフィド結合が単一のスルフヒドリル部分に還元されるまでインキュベートした。インキュベーション後、混合物を脱塩し、市販の脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ，カタログ番号８９８９１）の使用によって緩衝液を交換し、オリゴヌクレオチド合成後に形成されたジスルフィドの還元により生じたＳ−Ｈスルフヒドリルを両方とも含む、「センス」ＲＮＡ分子とＤＮＡ分子の等モル溶液を得た。穏やかな酸化的条件（大気、酸素、またはオゾンへの曝露）の存在下で、または穏やかな酸化剤（過酸化水素、１〜３％）の添加によって、ＤＮＡオリゴとＲＮＡオリゴの間に安定なジスルフィド結合を形成させた。平均して、ジスルフィド結合のランダムな形成から生じるＤＮＡとＲＮＡのジスルフィド複合体の約５０％が適切なＤＮＡ／ＲＮＡオリゴの組合せとなり、この組合せの２５％がＤＮＡ／ＤＮＡジスルフィド複合体とＲＮＡ／ＲＮＡジスルフィド複合体とを含む。ＤＮＡ／ＤＮＡ複合体やＲＮＡ／ＲＮＡ複合体由来の特有の分子量と全長を含むＤＮＡ／ＲＮＡ複合体をＨＰＬＣでまたはＰＡＧＥ電気泳動過程により精製した。次に、実施例１で論じたように、ＤＮＡオリゴとＲＮＡオリゴの間にジスルフィド結合を含む、得られたＤＮＡ／ＲＮＡ複合体をＤＮＡデンドリマーにハイブリダイズさせた。
【０１８５】
実施例４
ｓｉＲＮＡ分子がＮＨＳ−エステル依存的縮合化学反応の使用によって共有結合されているターゲッティング抗体とｓｉＲＮＡ分子とを含むＤＮＡデンドリマーの製造
抗体を含む４層ＤＮＡデンドリマー（１０ｎｇ／ｕＬ）は、ビオチンが１級アミンと置き換えられたことを除き、上記の実施例２と同様に合成された。細胞内でｓｉＲＮＡとして働くよう設計された分子を化学合成したが、これは、１）３’末端上の２個以上のＤＮＡヌクレオチドとともに、通常１９〜２３塩基長の全ＲＮＡリボヌクレオチドを含み、かつオリゴヌクレオチド合成時または合成後にこの分子の５’末端上に付加されるカルボキシル（ＣＯＯＨ）部分を含む一本鎖「センス」鎖と、２）２個の３’末端デオキシヌクレオチドとともに、ＲＮＡリボヌクレオチドのみの、通常１９塩基長の部分を含む、「センス」鎖に相補的な一本鎖「アンチセンス」鎖とを含んでいた。カルボキシルがＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルに変換され、次に、このエステルが１級アミンと反応して、ＮＨＳエステルとアミンの間に共有結合を形成するように、カルボキシルを含むＲＮＡ鎖を、市販の試薬を用いて化学修飾した。したがって、１級アミンで標識されたデンドリマーは、ｓｉＲＮＡの「センス」鎖と共有結合することができ、このｓｉＲＮＡの「センス」鎖は、「アンチセンス」ＲＮＡ鎖とハイブリダイズしたとき、機能的なｓｉＲＮＡ二重鎖を形成する。
【０１８６】
カルボキシルからＮＨＳへの変換は、以下のように行なわれた。
【０１８７】
以下の構成要素をマイクロチューブに添加した：
超純水中の末端カルボキシルを有する「センス」ｓｉＲＮＡ鎖（５００ｎｇ／μＬ）  １０００μＬ
ＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド）  ０．４ｍｇ
スルホ−ＮＨＳ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ  カタログ番号２４５１０）  １．１ｍｇ
【０１８８】
室温（１５〜３０℃）で１５分間のインキュベーションの後、混合物を脱塩し、市販の脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ，カタログ番号８９８９１）の使用によって緩衝液を交換した。交換緩衝液は、（アミンを含まない）１×ＰＢＳ  ｐＨ  ７．４であった。
【０１８９】
次に、このとき活性化ＮＨＳエステルを含む「センス」ＲＮＡ分子を、（水またはアミンを含まない１×ＰＢＳ中の）１級アミンを含むＤＮＡデンドリマーに添加した。この反応を室温で２時間進行させた。インキュベーション後、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを最終濃度５０ｍＭになるよう添加し、これによってＮＨＳ−エステルの反応が「クエンチ」された。５Ｍ  ＮａＣｌを最終濃度１００ｍＭになるよう添加した。「アンチセンス」ＲＮＡ鎖を過剰に添加し、反応液を３７℃で３０分間加温することによって、デンドリマー結合型「センス」ＲＮＡ鎖とハイブリダイズさせた。先に記載したようなサイズ排除スピンカラムの使用により、未反応のまたは過剰な試薬をデンドリマーから取り除いた。
【０１９０】
実施例５
ｓｉＲＮＡ分子がヘテロ二官能性化学架橋剤化学反応の使用によって共有結合されているターゲッティング抗体とｓｉＲＮＡ分子とを含むＤＮＡデンドリマーの製造
抗体を含む４層ＤＮＡデンドリマー（１０ｎｇ／μＬ）は、ビオチン分子が１級アミンと置き換えられたことを除き、実施例２と同様に合成された。細胞内でｓｉＲＮＡとして働くよう設計された分子を化学合成したが、これは、１）３’末端上の２個以上のＤＮＡヌクレオチドとともに、通常１９〜２３塩基長の全ＲＮＡリボヌクレオチドを含み、かつオリゴヌクレオチド合成時または合成後にこの分子の５’末端上に付加されるカルボキシル（ＣＯＯＨ）部分を含む一本鎖「センス」鎖と、２）２個の３’末端デオキシヌクレオチドとともに、ＲＮＡリボヌクレオチドのみの、通常１９塩基長の部分を含む、「センス」鎖に相補的な一本鎖「アンチセンス」鎖とを含んでいた。カルボキシルを含むＲＮＡ鎖を、カルボキシル部分とアミン部分の間に共有結合を形成させるヘテロ二官能性架橋試薬であるＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド）の存在下で、アミン修飾デンドリマーと組み合わせた。したがって、１級アミンで標識されたＤＮＡデンドリマーは、ｓｉＲＮＡの「センス」鎖と共有結合し、このｓｉＲＮＡの「センス」鎖は、「アンチセンス」ＲＮＡ鎖とハイブリダイズしたときに、機能的なｓｉＲＮＡ二重鎖を形成した。
【０１９１】
カルボキシルを含む「センス」ＲＮＡ鎖とデンドリマーに予め結合した１級アミンとの架橋は、以下のように行なわれた。
【０１９２】
以下の構成要素をマイクロチューブに添加した：
超純水中の末端カルボキシルを有する「センス」ｓｉＲＮＡ鎖（５００ｎｇ／μＬ）  １００．０μＬ
１×ＰＢＳ中の、キャプチャー配列を有する４層アミンデンドリマー（５００ｎｇ／μＬ）  １００．０μＬ
ＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド）  １０ｍｇ
【０１９３】
上記の反応液を室温（１５〜３０℃）で２時間インキュベートした。インキュベーション後、混合物を脱塩し、市販の脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ，カタログ番号８９８９１）の使用によって緩衝液を交換した。交換緩衝液は、（アミンを含まない）１×ＰＢＳ  ｐＨ  ７．４であった。
【０１９４】
「アンチセンス」ＲＮＡ鎖を過剰に添加し、反応液を３７℃で３０分間加温することによって、デンドリマー結合型「センス」ＲＮＡ鎖とハイブリダイズさせた。サイズ排除スピンカラムの使用により、未反応のまたは過剰な試薬をデンドリマーから取り除いた。抗体も、実施例１と２に記載したようなデンドリマーに結合させた。
【０１９５】
実施例６
ｓｉＲＮＡ分子がホモ二官能性化学架橋剤化学反応の使用によって共有結合されているターゲッティング抗体とｓｉＲＮＡ分子とを含むＤＮＡデンドリマーの製造
抗体を含む４層ＤＮＡデンドリマー（１０ｎｇ／μＬ）は、ビオチンが１級アミンと置き換えられたことを除き、実施例２と同様に合成された。細胞内でｓｉＲＮＡとして働くよう設計された分子を化学合成したが、これは、１）３’末端上の２個以上のＤＮＡヌクレオチドとともに、通常１９〜２３塩基長の全ＲＮＡリボヌクレオチドを含み、かつオリゴヌクレオチド合成時または合成後にこの分子の５’末端上に付加される１級アミン部分を含む一本鎖「センス」鎖と、２）２個の３’末端デオキシヌクレオチドとともに、ＲＮＡリボヌクレオチドのみの、通常１９塩基長の部分を含む、「センス」鎖に相補的な一本鎖「アンチセンス」鎖とを含んでいた。アミンを含むＲＮＡ鎖を、アミン部分の間に共有結合を形成させる試薬であるスルホ−ＥＧＳ［エチレングリコールビス（スクシニミジルスクシネート）］（Ｐｉｅｒｃｅ  カタログ番号２１５６６）などのホモ二官能性架橋剤の存在下で、アミン修飾デンドリマーと組み合わせた。したがって、１級アミンで標識されたＤＮＡデンドリマーは、ｓｉＲＮＡの「センス」鎖と共有結合し、このｓｉＲＮＡの「センス」鎖は、その後、「アンチセンス」ＲＮＡ鎖とハイブリダイズして、機能的なｓｉＲＮＡ二重鎖を形成した。
【０１９６】
１級アミンを含む「センス」ＲＮＡ鎖とデンドリマーに予め結合した１級アミンとの架橋は、以下のように行なわれた。
【０１９７】
以下の構成要素をマイクロチューブに添加した：
超純水中の末端アミンを有する「センス」ｓｉＲＮＡ鎖（５００ｎｇ／μＬ）  １００．０μＬ
１×ＰＢＳ中の、キャプチャー配列を有する４層アミンデンドリマー（５００ｎｇ／μＬ）  １００．０μＬ
スルホ−ＥＧＳ［エチレングリコールビス（スクシニミジルスクシネート）］  ２０．０ｍｇ
【０１９８】
上記の反応液を室温（１５〜３０℃）で２時間のインキュベートした。インキュベーション後、混合物を脱塩し、市販の脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ，カタログ番号８９８９１）の使用によって緩衝液を交換した。交換緩衝液は、（アミンを含まない）１×ＰＢＳ  ｐＨ  ７．４であった。
【０１９９】
「アンチセンス」ＲＮＡ鎖を過剰に添加し、反応液を３７℃で３０分間加温することによって、デンドリマー結合型「センス」ＲＮＡ鎖とハイブリダイズさせた。サイズ排除スピンカラムの使用により、未反応のまたは過剰な試薬をデンドリマーから取り除いた。抗体も、実施例１および２に記載したようなデンドリマーに結合させた。
【０２００】
実施例７
ターゲッティング抗体とｓｉＲＮＡ分子とを含むＤＮＡデンドリマーの製造ならびにデンドリマーの構造物に結合したビオチンおよびトランスフェクションにおける対イオンとして複数の正電荷を有するカチオンの重要性の比較
抗体を含む２層ＤＮＡデンドリマーは、デンドリマーの「アーム」を密集させる最大１２０個のビオチンを付けて合成された。このデンドリマー上の一定数の遊離「アーム」は、ハイブリダイゼーション結合事象を介するｓｉＲＮＡ二重鎖の結合に利用可能である（実施例１および２参照）。
【０２０１】
ｓｉＲＮＡ二重鎖のセンス鎖の２６塩基伸長（実施例１での最良の結果）と、実施例１および２に記載のものと同様のＩＣＡＭ１を標的とするデンドリマーとからなるｓｉＲＮＡ構築物を用いて、本発明者らは、デンドリマー送達プラットフォーム上のビオチンの重要性を検討した。この実験のために、本発明者らは、外面にビオチンを付けて調製されたデンドリマーと外面にビオチンを付けないで調製されたデンドリマーを比較した。実施例１に記載されたものと同じデンドリマーとｓｉＲＮＡ分子の調製方法およびこの２つを組み合わせて、トランスフェクションノックダウン研究で使用する方法を用いた。さらに、ｓｉＲＮＡノックダウンアッセイでビオチン化デンドリマー構築物と組み合わせて、本発明者らは、１Ｍの適切なカチオン塩溶液を最終濃度１２５ｍＭになるまで添加し、その後、１００μｌの血清または無血清培地中のプレーティングされた細胞と組み合わせて２５ｕｌのこの混合物を使用することにより、ｓｉＲＮＡデンドリマー構築物の初期のハイブリダイゼーションの一部としてのアッセイにおけるＭｇ２＋、Ｃａ２＋、およびＭｎ２＋を含むときまたは含まないときのターゲッティングされたデンドリマーｓｉＲＮＡのトランスフェクション効率を比較した。
【０２０２】
結果
本発明者らは、（実施例１に記載したように）無血清培地中で試験したとき、外面にビオチンを付けて調製されたデンドリマー構築物が６５〜８０％のノックダウンを示す一方で、ビオチンが付いていないデンドリマーは約３５〜４０％のノックダウンしかもたらさないことを観察した。血清含有培地では、ビオチンを含むデンドリマーとビオチンを含まないデンドリマーの間に同じような割合の性能が観察され、ｓｉＲＮＡノックダウン活性は、そのビオチン化対応物と比較して、ビオチンを含まないデンドリマーについて無血清培地中で観察された活性の約２５〜５０％であった。同様に、本発明者らは、最終濃度２５ｍＭのＭｇ、Ｃａ、およびＭｎにより、カチオンが除かれたトランスフェクションと比較してより再現性が高くかつ効率的なノックダウンが得られることを観察した。本発明者らはまた、このような種類の実験でデンドリマーを使用するとき、スペルミンやスペルミジンなどの他のカチオンが同様の効果を示すであろうと考えている。
【０２０３】
実施例８
ｍＲＮＡ発現のｓｉＲＮＡノックダウンのための２層デンドリマーと４層デンドリマーの使用
２層バージョンと４層バージョンの両方の上に抗体を含むＤＮＡデンドリマーは、２層デンドリマーの「アーム」を密集させる最大１２０個のビオチン、および４層デンドリマーのアームを密集させる最大７２０個のビオチンを付けて合成され、両方のタイプのデンドリマーは、ハイブリダイゼーション結合事象を介するｓｉＲＮＡ二重鎖の結合に利用可能な一定数の遊離「アーム」を含む（実施例１および７参照）。実施例１に記載されたものと同じｓｉＲＮＡ調製、デンドリマーとｓｉＲＮＡとの組み合わせ、およびトランスフェクションノックダウン研究のための方法を用いた。２層デンドリマーと４層デンドリマーの結果を比較した。等しい量のｓｉＲＮＡ分子がデンドリマー分子に結合するのを確実にするために、２層構築物と４層構築物の両方に対して最終的なｓｉＲＮＡとデンドリマーの（質量）濃度を用いた。
【０２０４】
結果
これらの結果から、各２層デンドリマーがデンドリマー１つ当たり１／９の量のｓｉＲＮＡ分子を有するにもかかわらず、等しい入力質量の各デンドリマータイプを同じｓｉＲＮＡ最終濃度で用いたとき、２層デンドリマーが４層デンドリマーよりも１．５〜２倍大きいノックダウンを生じさせることが示される。
【０２０５】
実施例９
ヒトおよび動物血清中でのタンパク質ヌクレアーゼへの曝露によるＤＮＡデンドリマーのヌクレアーゼ依存的分解からの保護
未修飾のＤＮＡデンドリマーは、タンパク質ＤＮアーゼを含む溶液に曝露されたとき、ヌクレアーゼ依存的分解を受ける。それゆえ、未修飾であるかまたは様々なハプテン、蛍光、アミン、もしくは他の標識とターゲッティング抗体とで修飾されているかのいずれかの、ＤＮＡデンドリマーが、動物供給源に由来する体液（例えば、血清）を含むインビトロまたはインビボ環境に導入されたときに、素早く分解すると仮定するのは理に適っていた。歴史的に見て、こうした仮定のために、つい最近になって（先の実施例１〜８によって調製された）ＤＮＡデンドリマーが、少なくとも９６０分（１６時間）、ヌクレアーゼ依存的分解に対して顕著な抵抗性を示すことが予期せず観察されるまで、本発明者らがＤＮＡデンドリマーをインビトロ細胞アッセイや任意のインビボ用途に使用するのは不可能であった。実験を以下のように行なった。
【０２０６】
実験１：未修飾および修飾ＤＮＡデンドリマーと、添加された追加の外因性ＤＮアーゼを含むおよび含まない、０％および７５％ヒト血清とのインキュベーション
条件：
チューブ１〜４は、以下の添加物をとともに、未修飾の４層ＤＮＡデンドリマーを含んでいた。
チューブ１：ＰＢＳのみ。
チューブ２：７５％新鮮ヒト血清。
チューブ３：１Ｕの外因性ＤＮアーゼを含むＰＢＳ。
チューブ４：１Ｕの外因性ＤＮアーゼを含む７５％新鮮ヒト血清。
【０２０７】
チューブ５〜８は、以下の添加物をとともに、デンドリマー１つ当たり（平均して）約９６０個のＦＩＴＣ色素と、（実施例１に記載したように付加された）１５〜２５個の抗ＩＣＡＭ１マウスモノクローナル抗体とを含む、修飾された４層ＤＮＡデンドリマーを含んでいた。
チューブ５：ＰＢＳのみ。
チューブ６：７５％新鮮ヒト血清。
チューブ７：１Ｕの外因性ＤＮアーゼを含むＰＢＳ。
チューブ８：１Ｕの外因性ＤＮアーゼを含む７５％新鮮ヒト血清。
【０２０８】
各チューブを３７℃で０、３０、および１２０分間インキュベートした。各時点で試料を各チューブから取り出し、ヌクレアーゼ活性化に必要とされる重要なカチオンの単純な錯化によってヌクレアーゼ分解を停止させるために、取り出された試料にＥＤＴＡを最終濃度５０ｍＭになるようすぐに添加した。各試料を０．８％アガロースゲルで３時間、７５ボルトで電気泳動した後、デンドリマーの分解を観察した（図５ａおよび５ｂ）。
【０２０９】
ゲルの結果から、以下の結果が明確に示された：
チューブ１：１２０分後に分解は観察されなかった。
チューブ２：１２０分後に分解は観察されなかった。
チューブ３：３０分の時点で明らかな分解が観察された。
チューブ４：３０分の時点で明らかな分解が観察された。
チューブ１：１２０分後に分解は観察されなかった。
チューブ２：１２０分後に分解は観察されなかった。
チューブ３：１２０分後に分解は観察されなかった。
チューブ４：３０分の時点で明らかな分解が観察された。
【０２１０】
結果
未修飾ＤＮＡデンドリマーの分解は、ＰＢＳ条件と７５％血清条件の両方において、１Ｕの外因性ＤＮアーゼの存在下でのみ起こった。修飾ＤＮＡデンドリマーの分解は、７５％血清の条件のみにおいて、１Ｕの外因性ＤＮアーゼの存在下でのみ起こった。
【０２１１】
結論：未修飾ＤＮＡデンドリマーと修飾ＤＮＡデンドリマーは両方とも、ヒト血清中でのヌクレアーゼ分解に対する予期せぬ抵抗性を示したが、修飾ＤＮＡデンドリマーはさらに、ＰＢＳ緩衝液中での外因性ＤＮアーゼに対する抵抗性を示し、しかしヒト血清中での外因性ＤＮアーゼに対する抵抗性は示さなかった。以前の結果では、未修飾ＤＮＡデンドリマーが、動物血清への比較的短い曝露（３０分）の後にひどく分解されることが示されたので、これは予期せぬ結果であった。
【０２１２】
実験２；最大９６０分（１６時間）の、未修飾および修飾ＤＮＡデンドリマーと０％および７５％ヒト血清とのインキュベーション
条件
チューブ１〜４は、以下の添加物をとともに、未修飾の４層ＤＮＡデンドリマーを含んでいた。
チューブ１：ＰＢＳのみ。
チューブ２：７５％新鮮ヒト血清。
【０２１３】
チューブ３〜４は、以下の添加物をとともに、デンドリマー１つ当たり（平均して）約９６０個のＦＩＴＣ色素と、（実施例１に記載したように付加された）１５〜２５個の抗ＩＣＡＭ１マウスモノクローナル抗体とを含む、修飾された４層ＤＮＡデンドリマーを含んでいた。
チューブ３：ＰＢＳのみ。
チューブ４：７５％新鮮ヒト血清。
【０２１４】
各チューブを３７℃で０、６０、および１２０、２４０、４８０、および９６０分間インキュベートした。各時点で試料を各チューブから取り出し、ヌクレアーゼ活性化に必要とされる重要なカチオンの単純な錯化によってヌクレアーゼ分解を停止させるために、取り出された試料に５０ｍＭ  ＥＤＴＡをすぐに添加した。各試料を０．８％アガロースゲルで３時間、７５ボルトで電気泳動した後、デンドリマーの分解を観察した（図６ａおよび６ｂ）。ゲルの結果から、以下の結果が明確に示された：
チューブ１：９６０分後に分解は観察されなかった。
チューブ２：４８０分後に分解は観察されず、９６０分の時点で＞８０％分解が観察された。
チューブ３：９６０分後に分解は観察されなかった。
チューブ４：９６０分後に分解は観察されなかった。
【０２１５】
結果
未修飾ＤＮＡデンドリマーの分解は、４８０分の時点の後しばらくして、７５％ヒト血清の存在下でのみ起こった。修飾ＤＮＡデンドリマーの分解は、ＰＢＳ条件でも７５％血清条件でも、どの時点でも観察されなかった。
【０２１６】
結論：未修飾ＤＮＡデンドリマーと修飾ＤＮＡデンドリマーは両方とも、ヒト血清中でのヌクレアーゼ分解に対する予期せぬ抵抗性を示したが、修飾ＤＮＡデンドリマーはさらに、未修飾ＤＮＡデンドリマーと比較したとき、血清に基づくヌクレアーゼ分解に対する幾分より大きい抵抗性を示した。修飾ＤＮＡデンドリマーが、ヒト血清中、３７℃で１６時間、安定であることが示されたが、これも予期せぬ結果であった。本発明者らは、ＤＮＡデンドリマーにＦＩＴＣと抗体による修飾を付加することにより、そのような修飾を付加しなければ、ヒト血清中のヌクレアーゼに抵抗するよう他の方法で化学修飾（例えば、これらのＤＮＡデンドリマーに使用されていない、ホスホチオレート化学反応修飾）されていないＤＮＡ分子での以前の経験からは予期されない若干の追加レベルの保護がもたらされると考えている。
【０２１７】
実施例１０
ハイブリダイズしたｓｉＲＮＡ分子を有するＤＮＡデンドリマーと市販のリポフェクトアミントランスフェクション試薬との組合せ
この実験の目的は、ターゲッティング抗体から独立しており、かつハイブリダイゼーションによって付着したｓｉＲＮＡ分子を有するＤＮＡデンドリマーを、ｍＲＮＡノックダウンによって測定されるようなｓｉＲＮＡの細胞質送達のための別のトランスフェクション試薬とうまく組み合わせることができるかどうかを明らかにすることであった。
【０２１８】
実施例１で概説され、かつ以前に開示されたように、ＤＮＡデンドリマーを調製した（特許第５，１７５，２７０号、第５，４８４，９０４号、第５，４８７，９７３号、第６，１１０，６８７号、第６，２７４，７２３号を参照されたい）。簡潔に述べると、その各々が、各鎖の中央部分にある配列相補性領域を共有する２つのＤＮＡ鎖から作られた、ＤＮＡモノマーからＤＮＡデンドリマーを構築した。２つの鎖がアニールしてモノマーを形成するとき、結果として生じる構造は、４つの一本鎖「アーム」に隣接した中央の二本鎖「ウェスト」を有するものとして記載することができる。このウェスト−プラス−アーム構造は、基本ＤＮＡモノマーを含む。５つのモノマータイプの各々の末端にある一本鎖アームは、正確かつ特異的な方法で、互いに相互作用するよう設計される。相補的なモノマーのアーム間の塩基対合は、モノマー層の順次付加によるデンドリマーの有向アセンブリを可能にした（図１）。デンドリマーの各層のアセンブリには、ＤＮＡ鎖が互いに共有結合し、それにより、ＤＮＡ鎖が互いに共有結合しなければデンドリマー構造の変形を引き起こすことになる変性条件に影響されない完全に共有結合した分子が形成される架橋プロセスが含まれた（図２）。この実施例のために調製されたデンドリマーは、ビオチンを含まないか、またはその外面に付着した最大約７２０個のビオチン分子（４層デンドリマー）を含むかのいずれかであった。試験されたいくつかの条件については、相補的なキャプチャーオリゴとしての役割を果たす３８塩基のオリゴヌクレオチドをまず付着させることによって、抗体をデンドリマーと組み合わせ、以下のように、簡単なＴ４  ＤＮＡリガーゼ依存的ライゲーション反応によって、利用可能なデンドリマーアームの５’末端に連結した。
【０２１９】
以下の構成要素をマイクロチューブに添加した：
１×ＴＥ緩衝液中の２層ＤＮＡデンドリマー（５００ｎｇ／μＬ）  ５．４μＬ（２６８０ｎｇ）
ａ（−）ＬＩＧ−ＢＲ７架橋オリゴ（１４ｍｅｒ）（５０ｎｇ／μＬ）  ２．７μＬ（１３４ｎｇ）
１０×リガーゼ緩衝液  １０．２μＬ
ヌクレアーゼフリー水  ８１．７μＬ
Ｃａｐ０３キャプチャーオリゴ（３８ｍｅｒ）（５０ｎｇ／μＬ）  ４．０μＬ（２００ｎｇ）
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（１Ｕ／μＬ）  １０．０μＬ（１０ユニット）
【０２２０】
最初の４回の反応物を合せて、６５℃に加熱し、室温まで冷却した。次に、５回目と６回目の反応物を添加して、４５分間インキュベートした。２．８μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ溶液を添加して、ライゲーション反応を停止させた。Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ４００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて調製されたサイズ排除スピンカラムを用いて、連結されなかったオリゴヌクレオチドを除去した。
【０２２１】
まず、先に記載した架橋縮合コンジュゲーション化学反応（Ｓｏｌｕｌｉｎｋ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で準備した）を用いて（Ｃａｐ０３配列に相補的な）ＤＮＡオリゴヌクレオチドを抗体に共有結合的にコンジュゲートさせ、次いで、この抗体結合オリゴヌクレオチドをデンドリマーのアーム上の相補的配列（Ｃａｐ０３）にハイブリダイズさせることによって、抗体をＤＮＡデンドリマーに結合させた。このハイブリダイゼーションは３１塩基対を含み、生理学的塩溶液中で６５℃よりも大きい融解温度を有し、それにより、生理的温度と条件で抗体と結合したデンドリマーの安定な複合体が提供される。
【０２２２】
典型的なハイブリダイゼーション処方物：
連結されたＣａｐ０３配列を含む２層ＤＮＡデンドリマー（５０ｎｇ／μＬ）  ５０．０μＬ
ＰＢＳまたは同等物（例えば、Ｓｕｐｅｒｆｒｅｅｚｅ（Ｐｉｅｒｃｅ））中の５０％エチレングリコール  ２５．０μＬ
１×リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）  ５７．０μＬ
５Ｍ  ＮａＣｌ  ４．３μＬ
オリゴ−抗体コンジュゲート（抗マウスＩＣＡＭ−１抗体）（オリゴとして７．８ｎｇ／μＬ）  １３．７μＬ
【０２２３】
上記の反応物を組み合わせ、穏やかに混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。この処方物は、４℃で少なくとも６カ月間安定である。
【０２２４】
ｓｉＲＮＡ設計／調製
細胞内でｓｉＲＮＡとして働くよう設計された分子を化学合成するが、これは、１）通常１９塩基長の、ＲＮＡリボヌクレオチドとしての５’部分と、通常０〜３３塩基長の、ＤＮＡデオキシリボヌクレオチドとしての３’部分とを含み、ＤＮＡデンドリマーに連結されたキャプチャーオリゴに相補的であるよう設計された、一本鎖「センス」鎖と、２）ＲＮＡリボヌクレオチドのみの、通常１９塩基長の部分と、２個の３’末端デオキシリボヌクレオチドとを含む、「センス」鎖に相補的な一本鎖「アンチセンス」鎖とを含む。これら２つの鎖を等モル量で組み合わせて、「センス」鎖と「アンチセンス」鎖の間に安定なハイブリッドを形成させ、「センス」鎖の一本鎖ＤＮＡ部分をＤＮＡデンドリマーのキャプチャーオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションに利用できるようにする。
【０２２５】
この実験のために、本発明者らは、２６塩基長のリンカー配列のハイブリダイゼーションを介してデンドリマーに直接付着しているか、または付着していないかのいずれかのｓｉＲＮＡ分子を研究した。いくつかの場合では、以下に記載の条件によって概略が示されるように、抗体をデンドリマーに予め付着させた。
【０２２６】
抗体含有デンドリマーのために、本発明者らは抗ＩＣＡＭ−１を付着させたが、それは、この抗体が、１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）および１０％ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ中で増殖したＨｅｐａ１−６細胞上に見られるからである。全ての場合について、本発明者らは、マウスｓｓｂ（Ｌａ自己抗原）ｍＲＮＡをノックダウンするよう設計されたｓｉＲＮＡと、標的を持たないｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ）とを用いた。
【０２２７】
試験されたｓｉＲＮＡ：
デンドリマー付着配列を含まないｓｉＲＮＡ
ＳＳＢ  ｓｉＲＮＡ（ＳＳＢ  ｕｎｍｏｄ）：
アンチセンス鎖：
ＲＮＡアンチセンス鎖：５’−ＵＵＡＡＡＧＵＣＵＧＵＵＧＵＣＡＧＣＣ−３’（配列番号１）
ＤＮＡアンチセンス鎖  ５’−ｄＧｄＧ−３’
【０２２８】
完全なアンチセンス鎖は、ＲＮＡアンチセンス鎖の３’末端に結合したＤＮＡアンチセンス鎖から構成されており、したがって、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドアンチセンス鎖：  
５’−ｒＵｒＵｒＡ  ｒＡｒＡｒＧ  ｒＵｒＣｒＵ  ｒＧｒＵｒＵ  ｒＧｒＵｒＣ  ｒＡｒＧｒＣ  ｒＣ  ｄＧｄＧ−３’（配列番号１０）
を形成する。
【０２２９】
ｒはリボヌクレオチドを表し、ｄはデオキシリボヌクレオチドを表し、下線のあるヌクレオチドは、２’−メトキシ（Ｏメチルとも呼ばれる）修飾を有するオリゴヌクレオチド内の位置を示す。
【０２３０】
センス鎖：
ＲＮＡセンス鎖：５’−ＧＧＣＵＧＡＣＡＡＣＡＧＡＣＵＵＵＡＡ−３’（配列番号２）
ＤＮＡセンス鎖：５’−ｄＴｄＴ−３’
【０２３１】
完全なセンス鎖は、ＲＮＡセンス鎖の３’末端に結合したＤＮＡセンス鎖から構成されており、したがって、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドセンス鎖：  
５’−ｒＧｒＧｒＣ  ｒＵｒＧｒＡ  ｒＣｒＡｒＡ  ｒＣｒＡｒＧ  ｒＡｒＣｒＵ  ｒＵｒＵｒＡ  ｒＡ  ｄＴｄＴ−３’（配列番号１１）
を形成する。
【０２３２】
ｒはリボヌクレオチドを表し、ｄはデオキシリボヌクレオチドを表す。
【０２３３】
陰性対照ｓｉＲＮＡ（Ｎｅｇ  ｕｎｍｏｄ）：
アンチセンス鎖：
ＲＮＡアンチセンス鎖：５’−ＡＣＧＵＧＡＣＡＣＧＵＵＣＧＧＡＧＡＡ−３’（配列番号３）
ＤＮＡアンチセンス鎖  ５’−ｄＴｄＴ−３’  
【０２３４】
完全なアンチセンス鎖は、ＲＮＡアンチセンス鎖の３’末端に結合したＤＮＡアンチセンス鎖から構成されており、したがって、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドアンチセンス鎖：  
５’−ｒＡｒＣｒＧ  ｒＵｒＧｒＡ  ｒＣｒＡｒＣ  ｒＧｒＵｒＵ  ｒＣｒＧｒＧ  ｒＡｒＧｒＡ  ｒＡ  ｄＴｄＴ−３’（配列番号１２）
を形成する。
【０２３５】
ｒはリボヌクレオチドを表し、ｄはデオキシリボヌクレオチドを表し、下線のあるヌクレオチドは、２’−メトキシ（Ｏメチルとも呼ばれる）修飾を有するオリゴヌクレオチド内の位置を示す。
【０２３６】
センス鎖：
ＲＮＡセンス鎖：５’−ＵＵＣＵＣＣＧＡＡＣＧＵＧＵＣＡＣＧＵ−３’（配列番号４）
ＤＮＡセンス鎖：５’−ｄＴｄＴ−３’
【０２３７】
完全なセンス鎖は、ＲＮＡセンス鎖の３’末端に結合したＤＮＡセンス鎖から構成されており、したがって、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドセンス鎖：
５’−ｒＵｒＵｒＣ  ｒＵｒＣｒＣ  ｒＧｒＡｒＡ  ｒＣｒＧｒＵ  ｒＧｒＵｒＣ  ｒＡｒＣｒＧ  ｒＵ  ｄＴｄＴ−３’（配列番号１３）
を形成する。
【０２３８】
ｒはリボヌクレオチドを表し、ｄはデオキシリボヌクレオチドを表す。
【０２３９】
２６塩基のＤＮＡリンカー配列を含むＳＳＢ（ＳＳＢ＋２６）：
アンチセンス鎖：
ＲＮＡアンチセンス鎖：５’−ＵＵＡＡＡＧＵＣＵＧＵＵＧＵＣＡＧＣＣ−３’（配列番号１）
ＤＮＡアンチセンス鎖  ５’−ｄＧｄＧ−３’
【０２４０】
完全なアンチセンス鎖は、ＲＮＡアンチセンス鎖の３’末端に結合したＤＮＡアンチセンス鎖から構成されており、したがって、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドアンチセンス鎖：
５’−ｒＵｒＵｒＡ  ｒＡｒＡｒＧ  ｒＵｒＣｒＵ  ｒＧｒＵｒＵ  ｒＧｒＵｒＣ  ｒＡｒＧｒＣ  ｒＣ  ｄＧｄＧ−３’（配列番号１０）
を形成する。
【０２４１】
ｒはリボヌクレオチドを表し、ｄはデオキシリボヌクレオチドを表し、下線のあるヌクレオチドは、２’−メトキシ（Ｏメチルとも呼ばれる）修飾を有するオリゴヌクレオチド内の位置を示す。
【０２４２】
センス鎖：
ＲＮＡセンス鎖：５’−ＧＧＣＵＧＡＣ  ＡＡＣ  ＡＧＡＣＵＵＵ  ＡＡ−３’（配列番号２）
ＤＮＡセンス鎖：５’−ＴＴＣＣＧＴＴＧＡＣＡＴＣＴＣＧＴＡＧＡＴＴＴＧＡＡＴＴ−３’（配列番号７）
【０２４３】
完全なセンス鎖は、ＲＮＡセンス鎖の３’末端に結合したＤＮＡセンス鎖から構成されており、したがって、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドセンス鎖：  
５’−ｒＧｒＧｒＣ  ｒＵｒＧｒＡ  ｒＣｒＡｒＡ  ｒＣｒＡｒＧ  ｒＡｒＣｒＵ  ｒＵｒＵｒＡ  ｒＡ  ｄＴｄＴ  ｄＣｄＣｄＧｄＴｄＴ  ｄＧｄＡｄＣ  ｄＡｄＴｄＣｄＴｄＣ  ｄＧｄＴｄＡｄＧｄＡｄＴｄＴｄＴｄＧ  ｄＡｄＡｄＴｄＴ−３’（配列番号１４）
を形成する。
【０２４４】
ｒはリボヌクレオチドを表し、ｄはデオキシリボヌクレオチドを表す。
【０２４５】
２６塩基のＤＮＡリンカー配列を含むＳＳＢ陰性対照（ｍＲＮＡ標的なし）：
アンチセンス鎖：
ＲＮＡアンチセンス鎖：５’−ＡＣＧＵＧＡＣＡＣＧＵＵＣＧＧＡＧＡＡ−３’（配列番号３）
ＤＮＡアンチセンス鎖  ５’−ｄＴｄＴ−３’
【０２４６】
完全なアンチセンス鎖は、ＲＮＡアンチセンス鎖の３’末端に結合したＤＮＡアンチセンス鎖から構成されており、したがって、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドアンチセンス鎖：  
５’−ｒＡｒＣｒＧ  ｒＵｒＧｒＡ  ｒＣｒＡｒＣ  ｒＧｒＵｒＵ  ｒＣｒＧｒＧ  ｒＡｒＧｒＡ  ｒＡ  ｄＴｄＴ−３’（配列番号１２）
を形成する。
【０２４７】
ｒはリボヌクレオチドを表し、ｄはデオキシリボヌクレオチドを表し、下線のあるヌクレオチドは、２’−メトキシ（Ｏメチルとも呼ばれる）修飾を有するオリゴヌクレオチド内の位置を示す。
【０２４８】
センス鎖：
ＲＮＡセンス鎖：５’−ＵＵＣＵＣＣＧＡＡＣＧＵＧＵＣＡＣＧＵ−３’（配列番号４）
ＤＮＡセンス鎖：５’−ＴＴＣＣＧＴＴＧＡＣＡＴＣＴＣＧＴＡＧＡＴＴＴＧＡＡＴＴ−３’（配列番号７）
【０２４９】
完全なセンス鎖は、ＲＮＡセンス鎖の３’末端に結合したＤＮＡセンス鎖から構成されており、したがって、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドセンス鎖：
５’−ｒＵｒＵｒＣ  ｒＵｒＣｒＣ  ｒＧｒＡｒＡ  ｒＣｒＧｒＵ  ｒＧｒＵｒＣ  ｒＡｒＣｒＧ  ｒＵ  ｄＴｄＴ  ｄＣｄＣｄＧｄＴｄＴ  ｄＧｄＡｄＣ  ｄＡｄＴｄＣｄＴｄＣ  ｄＧｄＴｄＡｄＧｄＡｄＴｄＴｄＴｄＧ  ｄＡｄＡｄＴｄＴ−３’（配列番号１５）
を形成する。
【０２５０】
ｒはリボヌクレオチドを表し、ｄはデオキシリボヌクレオチドを表す。
【０２５１】
ｓｉＲＮＡハイブリダイゼーション処方物：
「センス」ＤＮＡ／ＲＮＡ分子（５０μＭ）  ２５μＬ
「アンチセンス」ＲＮＡ分子（５０μＭ）  ２５μＬ
【０２５２】
上記の処方物当たり１本のマイクロチューブ中で、センスｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドとアンチセンスｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを組み合わせた。オリゴ混合物を８０℃で５分間インキュベートした後、３７℃に２０分間移し、ｓｉＲＮＡ二重鎖を形成させた。トランスフェクション混合物を調製する前に、ハイブリダイズしたｓｉＲＮＡを、２μＭの最終濃度になるように無血清培地中で２５倍希釈した。
【０２５３】
トランスフェクション混合物の調製
リポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を製造元に従って使用し、２倍濃縮物となるように無血清培地中でまず希釈して、２×リポフェクトアミン溶液を調製した。
【０２５４】
ｓｉＲＮＡのみのリポフェクトアミン複合体：
以下の構成要素をマイクロチューブ中で組み合わせた：
ｓｉＲＮＡ二重鎖分子（２μＭに希釈）  ３．０μＬ
無血清培地またはＰＢＳ  ５１．０μＬ
【０２５５】
使用する５分前に、上記の混合物に、５４μｌの２×リポフェクトアミン溶液を添加した。
【０２５６】
デンドリマー＋ｓｉＲＮＡリポフェクトアミン複合体：
以下の構成要素をマイクロチューブ中で組み合わせた：
抗体を含むまたは含まない４層ＤＮＡデンドリマー（１０ｎｇ／μＬ）  １２．０μＬ
ｓｉＲＮＡ二重鎖分子（２μＭに希釈）  ３．０μＬ
無血清培地またはＰＢＳ  ３９．０μＬ
【０２５７】
この混合物を３７℃で２０〜３０分間インキュベートした後、使用する５分前に、２×リポフェクトアミン溶液と組み合わせるまで、室温に置いた。
【０２５８】
トランスフェクション実験
トランスフェクション混合物を、インビトロトランスフェクションの標的として好適な２，０００〜１０，０００個の生きた細胞を含む組織培養プレートのウェルに導入し、１０％血清を含む適切な培地中または無血清培地中で増殖させた。５μｌの適当な上記の処方物を、プレーティングされた細胞を含む９６ウェルプレート中の１２０ｕＬの組織培養培地に添加した。ｓｉＲＮＡの最終濃度は、２ｎＭであった。ｓｉＲＮＡの機能は、標的とされたｍＲＮＡ（ｓｓｂ）を内部対照ｍＲＮＡ（１８ｓ  ＲＮＡおよびＰＰＩＢ  ｍＲＮＡ）と比べて検出するように設計されたｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを用いて、リポフェクトアミンｓｉＲＮＡまたはリポフェクトアミンデンドリマー−ｓｉＲＮＡ複合体の添加後に細胞に残存するインタクトなｍＲＮＡの量を定量することによって直接的に測定した。
【０２５９】
ノックダウン測定値は全て、同じ構造的修飾を含む陰性対照（ｍＲＮＡ標的なし）ｓｉＲＮＡ二重鎖と比べたものであった。
【０２６０】
試験された実験条件のリスト：
リポフェクトアミン＋「ＳＳＢ  ｕｎｍｏｄ」デンドリマーなし（＃１）、リポフェクトアミン＋「Ｎｅｇ  ｕｎｍｏｄ」デンドリマーなし（＃２）、リポフェクトアミン＋「ＳＳＢ＋２６」デンドリマーなし（＃３）、リポフェクトアミン＋「Ｎｅｇ＋２６」デンドリマーなし（＃４）、リポフェクトアミン＋Ａｂを含まないデンドリマー＋「ＳＳＢ  ｕｎｍｏｄ」（＃５）、リポフェクトアミン＋Ａｂを含まないデンドリマー＋「Ｎｅｇ  ｕｎｍｏｄ」（＃６）、リポフェクトアミン＋Ａｂを含まないデンドリマー＋「ＳＳＢ＋２６」（＃７）、リポフェクトアミン＋Ａｂを含まないデンドリマー＋「Ｎｅｇ＋２６」（＃８）、リポフェクトアミン＋７２０個のビオチンを含み、Ａｂを含まないデンドリマー＋「ＳＳＢ  ｕｎｍｏｄ」（＃９）、リポフェクトアミン＋７２０個のビオチンを含み、Ａｂを含まないデンドリマー＋「Ｎｅｇ  ｕｎｍｏｄ」（＃１０）、リポフェクトアミン＋７２０個のビオチンを含み、Ａｂを含まないデンドリマー＋「ＳＳＢ＋２６」（＃１１）、リポフェクトアミン＋７２０個のビオチンを含み、Ａｂを含まないデンドリマー＋「Ｎｅｇ＋２６」（＃１２）、リポフェクトアミン＋７２０個のビオチンを含み、Ａｂを含むデンドリマー＋「ＳＳＢ  ｕｎｍｏｄ」（＃１３）、リポフェクトアミン＋７２０個のビオチンを含み、Ａｂを含むデンドリマー＋「Ｎｅｇ  ｕｎｍｏｄ」（＃１４）、リポフェクトアミン＋７２０個のビオチンを含み、Ａｂを含むデンドリマー＋「ＳＳＢ＋２６」（＃１５）、リポフェクトアミン＋７２０個のビオチンを含み、Ａｂを含むデンドリマー＋「Ｎｅｇ＋２６」（＃１６）。
【０２６１】
結果
「ＳＳＢ  ｕｎｍｏｄ」のノックダウン効率を「ＳＳＢ＋２６」を比較した全ての場合において、ｓｉＲＮＡがデンドリマーと組み合わされているかどうかにかかわらず、２つのｓｉＲＮＡ構築物の間にはほとんど違いが見られず、２６塩基の伸長が、結果に対して良くも悪くも影響を及ぼさないことが示された。さらに、ｓｉＲＮＡをデンドリマーに付着させたとき、このｓｉＲＮＡはハイブリダイズしていないｓｉＲＮＡと同じくらい良く機能し、ハイブリダイズしたｓｉＲＮＡがデンドリマーｓｉＲＮＡ構築物から効率的に放出されることが示唆された。
【０２６２】
デンドリマーを含まないリポフェクトアミンｓｉＲＮＡ複合体（上記の条件＃１〜＃４）のノックダウン効率をデンドリマーを含むリポフェクトアミンｓｉＲＮＡ複合体（＃５〜＃８、＃９〜＃１２、または＃１３〜＃１６）のノックダウン効率と比較して、本発明者らは、デンドリマーが存在するときのノックダウン効率の顕著な改善を観察した。デンドリマーを含まないリポフェクトアミン複合体は、デンドリマーが存在するときの９０〜９５％超のノックダウンと比較して、約８０％のノックダウンを示した。
【０２６３】
抗体を含むまたは含まないリポフェクトアミンｓｉＲＮＡデンドリマー複合体のノックダウン効率を比較して、違いはほとんどまたは全く観察されなかった。両方とも等しく効率的であった。
【０２６４】
ビオチンを含むデンドリマーは、ビオチンを含まないデンドリマーを用いて調製した同様の複合体と比較して、リポフェクトアミン複合体中のｓｉＲＮＡと組み合わせたときにより良好なノックダウン効率の傾向を示したが、この用量のｓｉＲＮＡではノックダウン効率の統計的な違いは観察されなかった。
【０２６５】
結論：観察された結果に基づいて、リポソーム性のトランスフェクション剤と組み合わせたときのＤＮＡデンドリマーは、ｓｉＲＮＡ分子のｍＲＮＡノックダウン効率を改善すると結論付けられた。使用した組成物に基づいて、本発明者らは、デンドリマーが、細胞内コンパートメント（例えば、エンドソーム）からのｓｉＲＮＡの放出を改善するように作用し得るという理論を立てている。
【０２６６】
上で示したように、前述の考察には、例示的でかつ好ましい本発明の様々な実施形態が開示および記載されている。しかしながら、当業者であれば、このような考察から、ならびに添付の図面、特許請求の範囲、および実施例から、以下の特許請求の範囲で規定されるような本発明の精神および範囲から逸脱することなく、変更、修正、および変化をそれらの中で行なうことができるということを容易に認識するであろう。
【図１】
0005583667.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５ａ】
0005583667.tif 000010
【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
0005583667.tif 000016
【図７ｄ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９ａ】
0005583667.tif 000020
【図９ｂ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１０ｄ】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１２ｄ】
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【図１２ｅ】
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【図１２ｆ】
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【図１２ｇ】
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【図１２ｈ】
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【配列表】
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