(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を増幅する方法であって，前記方法は，
修飾オリゴヌクレオチドプライマーを用いて核酸を増幅することを含み，
ここで，前記修飾オリゴヌクレオチドプライマーは，１またはそれ以上のヌクレオチド間結合において修飾基を含み；
前記修飾基は，不可逆的に熱解離させることができ；および
前記修飾オリゴヌクレオチドプライマーは，下記の構造Ｉ：
【化２７】
0005558811.tif 000029
［式中，
Ｎｕｃはプライマー配列中のヌクレオシドであり；
ＵおよびＺは，独立して，Ｏ，Ｓ，Ｓｅ，ＮＲ9，またはＣＲ9Ｒ10であり；
Ｒ9およびＲ10は，それぞれ独立して，水素または１−２０個の炭素原子を有する任意に置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のヒドロカルビルであり，ここで，それぞれは，独立して，ハロ，オキソ，ヒドロキシル，アルコキシ，アリールオキシ，アミノ，アミドまたは検出可能な標識から選択される少なくとも１つの置換基を含んでいてもよく；
Ｙは，Ｏ，ＳまたはＳｅであり；
Ｗは，Ｏ，Ｓ，Ｓ（Ｏ），Ｓ（Ｏ）2，Ｓｅ，Ｃ（Ｏ），Ｃ（Ｓ），Ｃ（Ｏ）ＮＨ，ＮＨまたはＮＲ9であり；および
Ｑは，１またはそれ以上の熱切断性基を含む修飾基である］
を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記修飾基Ｑは，
【化２８】
0005558811.tif 000030
（式Ｉ）
［式中，
Ｌは，１−１０個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖のヒドロカルビレン基であり；
Ｘは，Ｏ，Ｓ，Ｓ（Ｏ），Ｓ（Ｏ）2，Ｃ（Ｏ），Ｃ（Ｓ）またはＣ（Ｏ）ＮＨであり；および
Ｒ1は，水素または１−２０個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖のヒドロカルビレン基であり，これは任意に，ハロ，オキソ，ヒドロキシル，アルコキシ，アミノ，アミド，シクロアルキル，ヘテロシクロアルキル，アリール，アリールオキシ，およびヘテロアリールからなる群より選択される少なくとも１つの置換基を含んでいてもよい］；
【化２９】
0005558811.tif 000031
（式Ｉａ）
［式中，
Ｌは，１−１０個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖のヒドロカルビレン基であり；および
Ｒ1は，水素または１−２０個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖のヒドロカルビレン基であり，これは任意に，ハロ，オキソ，ヒドロキシル，アルコキシ，アミノ，アミド，シクロアルキル，ヘテロシクロアルキル，アリール，アリールオキシおよびヘテロアリールからなる群より選択される少なくとも１つの置換基を含んでいてもよい］；
【化３０】
0005558811.tif 000032
（式Ｉｂ）
［式中，
ｋは，０−２の整数であり；
Ｌは，１−１０個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖のヒドロカルビレン基であり；および
Ｒ1は，水素または１−２０個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖のヒドロカルビレン基であり，これは任意に，ハロ，オキソ，ヒドロキシル，アルコキシ，アミノ，アミド，シクロアルキル，ヘテロシクロアルキル，アリール，アリールオキシ，およびヘテロアリールからなる群より選択される少なくとも１つの置換基を含んでいてもよい］；
【化３１】
0005558811.tif 000033
（式Ｉｃ）
［式中，
Ｌは，１−１０個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖のヒドロカルビレン基であり；および
各Ｒ1は，独立して，水素または１−２０個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖のヒドロカルビレン基であり，これは任意に，ハロ，オキソ，ヒドロキシル，アルコキシ，アミノ，アミド，シクロアルキル，ヘテロシクロアルキル，アリール，アリールオキシ，およびヘテロアリールからなる群より選択される少なくとも１つの置換基を含んでいてもよい］；
【化３２】
0005558811.tif 000034
（式Ｉｄ）
［式中，
Ｌは，１−１０個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖のヒドロカルビレン基であり；および
Ｒ1は，水素または１−２０個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖のヒドロカルビレン基であり，これは任意に，ハロ，オキソ，ヒドロキシル，アルコキシ，アミノ，アミド，シクロアルキル，ヘテロシクロアルキル，アリール，アリールオキシ，およびヘテロアリールからなる群より選択される少なくとも１つの置換基を含んでいてもよい］；
【化３３】
0005558811.tif 000035
（式ＩＩ）
［式中，
Ｌは，１−１０個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖のヒドロカルビレン基であり；および
Ｒ2は，水素，シアノ，または５−１０個の原子を有する任意に置換されていてもよい炭素環，複素環，アリールまたはヘテロアリールである］；
【化３４】
0005558811.tif 000036
（式ＩＩＩ）
［式中，
ＬaおよびＬbは，それぞれ独立して，単結合，または１−８個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖のヒドロカルビレン基から選択され；
Ａは，Ｏ，Ｓ，Ｓ（Ｏ），Ｓ（Ｏ）2，Ｓｅ，ＣＲ3Ｒ4，ＮＲ3，Ｃ（Ｏ），Ｃ（Ｓ）またはＣＮＲ3であり；
Ｂは，Ｃ（Ｏ）Ｒ3，Ｃ（Ｓ）Ｒ3，Ｃ（Ｏ）ＮＲ3Ｒ4，ＯＲ3またはＳＲ3であり；および
Ｒ3およびＲ4は，それぞれ独立して，水素または１−２０個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖のヒドロカルビレン基であり，これは任意に，ハロ，オキソ，ヒドロキシル，アルコキシ，アミノ，アミド，シクロアルキル，ヘテロシクロアルキル，アリール，アリールオキシ，およびヘテロアリールからなる群より選択される少なくとも１つの置換基を含んでいてもよい］；および
【化３５】
0005558811.tif 000037
（式ＩＶ）
［式中，
Ｌa，ＬbおよびＬcは，それぞれ独立して，単結合，または１−８個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖のヒドロカルビレン基から選択され；
Ｄは，Ｏ，Ｓ，Ｓ（Ｏ），Ｓ（Ｏ）2，ＣＲ5Ｒ6，またはＮＲ5であり；
Ｅは，Ｏ，Ｓ，Ｓ（Ｏ），Ｓ（Ｏ）2，ＣＲ5Ｒ6，またはＮＲ6であり；
Ｆは，水素，Ｃ（Ｏ）Ｒ7，Ｃ（Ｓ）Ｒ7，Ｃ（Ｏ）ＮＲ7Ｒ8，ＯＲ7またはＳＲ7であり；
Ｒ5およびＲ6は，それぞれ独立して，水素，アリール，アルキル，ハロ，オキソ，ヒドロキシル，アルコキシ，アリールオキシまたはアミノであってもよく，またはＲ5およびＲ6は，一緒になって，５−１０個の原子からなり，Ｄ，Ｒ5，Ｒ6，ＥおよびＬbを含む単環または二環を形成してもよく，ただし，Ｒ5およびＲ6が一緒になって環を形成する場合には，ｎは０−２であり；および
Ｒ7およびＲ8は，それぞれ独立して，アリール，アルキル，ハロ，オキソ，ヒドロキシル，アルコキシ，アリールオキシ，アミノ，アミド，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアリールオキシ，および任意に置換されていてもよいヘテロアリールからなる群より選択される］
からなる群より選択される１またはそれ以上の修飾基を含む，請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記修飾基Ｑは，
【化３６】
0005558811.tif 000038
（式Ｉ）
［式中，
Ｌは，１−１０個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖のヒドロカルビレン基であり；
Ｘは，Ｏ，Ｓ，Ｓ（Ｏ），Ｓ（Ｏ）2，Ｃ（Ｏ），Ｃ（Ｓ）またはＣ（Ｏ）ＮＨであり；および
Ｒ1は，水素または１−２０個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖のヒドロカルビレン基であり，これは任意に，ハロ，オキソ，ヒドロキシル，アルコキシ，アミノ，アミド，シクロアルキル，ヘテロシクロアルキル，アリール，アリールオキシ，およびヘテロアリールからなる群より選択される少なくとも１つの置換基を含んでいてもよい］
を含む，請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記修飾基Ｑは，
【化３７】
0005558811.tif 000039
（式Ｉａ）
［式中，
Ｌは，１−１０個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖のヒドロカルビレン基であり；
および
Ｒ1は，水素または１−２０個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖のヒドロカルビレン基であり，これは任意に，ハロ，オキソ，ヒドロキシル，アルコキシ，アミノ，アミド，シクロアルキル，ヘテロシクロアルキル，アリール，アリールオキシ，およびヘテロアリールからなる群より選択される少なくとも１つの置換基を含んでいてもよい］
を含む，請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記修飾基Ｑは，
【化３８】
0005558811.tif 000040
（式Ｉｂ）
［式中，
ｋは，０−２の整数であり；
Ｌは，１−１０個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖のヒドロカルビレン基であり；および
Ｒ1は，水素または１−２０個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖のヒドロカルビレン基であり，これは任意に，ハロ，オキソ，ヒドロキシル，アルコキシ，アミノ，アミド，シクロアルキル，ヘテロシクロアルキル，アリール，アリールオキシ，およびヘテロアリールからなる群より選択される少なくとも１つの置換基を含んでいてもよい］
を含む，請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記修飾基Ｑは，
【化３９】
0005558811.tif 000041
（式Ｉｃ）
［式中，
Ｌは，１−１０個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖のヒドロカルビレン基であり；および
各Ｒ1は，独立して，水素または１−２０個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖のヒドロカルビレン基であり，これは任意に，ハロ，オキソ，ヒドロキシル，アルコキシ，アミノ，アミド，シクロアルキル，ヘテロシクロアルキル，アリール，アリールオキシ，およびヘテロアリールからなる群より選択される少なくとも１つの置換基を含んでいてもよい］
を含む，請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記修飾基Ｑは，
【化４０】
0005558811.tif 000042
（式Ｉｄ）
［式中，
Ｌは，１−１０個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖のヒドロカルビレン基であり；
および
Ｒ1は，水素または１−２０個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖のヒドロカルビレン基であり，これは任意に，ハロ，オキソ，ヒドロキシル，アルコキシ，アミノ，アミド，シクロアルキル，ヘテロシクロアルキル，アリール，アリールオキシ，およびヘテロアリールからなる群より選択される少なくとも１つの置換基を含んでいてもよい］
を含む，請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記修飾基Ｑは，
【化４１】
0005558811.tif 000043
（式ＩＩ）
［式中，
Ｌは，１−１０個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖のヒドロカルビレン基であり；および
Ｒ2は，水素，シアノ，または５−１０個の原子を有する任意に置換されていてもよい炭素環，複素環，アリールまたはヘテロアリールである］
を含む，請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記修飾基Ｑは，
【化４２】
0005558811.tif 000044
（式ＩＩＩ）
［式中，
ＬaおよびＬbは，それぞれ独立して，単結合，または１−８個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖のヒドロカルビレン基であり；
Ａは，Ｏ，Ｓ，Ｓ（Ｏ），Ｓ（Ｏ）2，Ｓｅ，ＣＲ3Ｒ4，ＮＲ3，Ｃ（Ｏ），Ｃ（Ｓ）またはＣＮＲ3であり；
Ｂは，Ｃ（Ｏ）Ｒ3，Ｃ（Ｓ）Ｒ3，Ｃ（Ｏ）ＮＲ3Ｒ4，ＯＲ3またはＳＲ3であり；および
Ｒ3およびＲ4は，それぞれ独立して，１−２０個の炭素原子を有する水素または直鎖または分枝鎖のヒドロカルビレン基であり，これは任意に，水素，アリール，アルキル，ハロ，オキソ，ヒドロキシル，アルコキシ，アミノ，アミド，シクロアルキル，ヘテロシクロアルキル，アリール，アリールオキシ，およびヘテロアリールからなる群より選択される少なくとも１つの置換基を含んでいてもよい］
を含む，請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記修飾基Ｑは，
【化４３】
0005558811.tif 000045
（式ＩＶ）
［式中，
Ｌa，ＬbおよびＬcは，それぞれ独立して，単結合，または１−８個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖のヒドロカルビレン基から選択され；
Ｄは，Ｏ，Ｓ，Ｓ（Ｏ），Ｓ（Ｏ）2，ＣＲ5Ｒ6，またはＮＲ5であり；
Ｅは，Ｏ，Ｓ，Ｓ（Ｏ），Ｓ（Ｏ）2，ＣＲ5Ｒ6，またはＮＲ6であり；
Ｆは，水素，Ｃ（Ｏ）Ｒ7，Ｃ（Ｓ）Ｒ7，Ｃ（Ｏ）ＮＲ7Ｒ8，ＯＲ7またはＳＲ7であり；
Ｒ5およびＲ6は，それぞれ独立して，水素，アルキル，アリール，ハロ，オキソ，ヒドロキシル，アルコキシ，アリールオキシまたはアミノであってもよく，またはＲ5およびＲ6は，一緒になって，５−１０個の原子からなり，Ｄ，Ｒ5，Ｒ6，ＥおよびＬbを含む単環または二環を形成してもよく，ただし，Ｒ5およびＲ6が一緒になって環を形成する場合にはｎは０−２であり；および
Ｒ7およびＲ8は，それぞれ独立して，水素，アルキル，アリール，ハロ，オキソ，ヒドロキシル，アルコキシ，アリールオキシ，アミノ，アミド，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアリールオキシ，および任意に置換されていてもよいヘテロアリールからなる群より選択される］
を含む，請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記修飾基Ｑは，４−オキソ−１−ヘキシル，４−オキソ−１−ペンチル，５−オキソ−１−ヘキシル，６−オキソ−１−ヘプチル，１−メチル−４−オキソ−ペンチル，４−メチルチオ−１−ブチル，５−メチル−４−オキソ−ヘキシル，１−エチル−４−オキソ−ペンチル，Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）フタルイミド，２−（Ｎ−アセチル−Ｎ−メチル）アミノエチル，２−（Ｎ−ホルミル−Ｎ−メチル）アミノエチル，２−メチル−５−オキソ−ヘキシル，１，１−ジメチル−４−オキソ−ペンチル，４−オキソ−１−オクチル，４−オキソ−１−テトラデシル，４−オキソ−１−エイコサミル，および３−（Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルカルボキサミド）−１−プロピルからなる群より選択される１またはそれ以上の化学成分を含む，請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記修飾基は前記増幅の最初の変性工程の間に解離する，請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記修飾基は３７℃−９５℃の温度で部分的にまたは完全に解離する，請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記修飾オリゴヌクレオチドプライマーはホスホトリエステルヌクレオチド間結合を含む，請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記修飾基はオリゴヌクレオチドプライマーの核酸配列へのハイブリダイゼーションを低下させる，請求項１記載の方法。
【請求項１６】
前記修飾基は前記修飾オリゴヌクレオチドプライマーのポリメラーゼ伸長を低下させる，請求項１記載の方法。
【請求項１７】
前記修飾オリゴヌクレオチドプライマーは，ｎ，ｎ−１，ｎ−２，ｎ−３，ｎ−４，ｎ−５またはｎ−６位において２またはそれ以上の修飾基を含み，ここで，ｎは３’末端ヌクレオチド間結合である，請求項１記載の方法。
【請求項１８】
前記修飾オリゴヌクレオチドプライマーは２またはそれ以上の修飾基を含む，請求項１記載の方法。
【請求項１９】
前記修飾基の解離のｔ1/2は９５℃で０．１−１２０分間である，請求項１記載の方法。
【請求項２０】
修飾基は５０−９５℃で解離する，請求項１記載の方法。
【請求項２１】
前記核酸増幅はホットスタートポリメラーゼを含む，請求項１記載の方法。
【請求項２２】
前記修飾オリゴヌクレオチドプライマーは少なくとも９０％キラル的に純粋である，請求項１記載の方法。
【請求項２３】
前記オリゴヌクレオチドプライマーは検出可能な標識を含む，請求項１記載の方法。
【請求項２４】
前記増幅はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む，請求項１記載の方法。
【請求項２５】
前記ＰＣＲはマルチプレックスＰＣＲを含む，請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
第１の標的は未修飾プライマーを用いて増幅され，および第２の標的は修飾プライマーを用いて増幅される，請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
第１の標的は第１の修飾基を有する１またはそれ以上のプライマーを用いて増幅され，および第２の標的は第２の修飾基を有する１またはそれ以上の修飾プライマーを用いて増幅され，ここで，前記第１の修飾基と第２の修飾基とは異なる，請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
前記増幅はリバーストランスクリプターゼ（ＲＴ）を含む，請求項１記載の方法。
【請求項２９】
前記修飾基は３７−７０℃で解離する，請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記修飾基は４２℃で解離する，請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
前記増幅は，単一のチューブにおけるその後の酵素反応を含む，請求項１記載の方法。
【請求項３２】
前記その後の酵素反応は，第１の酵素反応としてリバーストランスクリプターゼ（ＲＴ）を，および第２の酵素反応としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む，請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記ＲＴ反応は１またはそれ以上の未修飾プライマーを用いて増幅することを含み，および前記ＰＣＲ反応は１またはそれ以上の修飾プライマーを用いて増幅することを含む，請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記ＲＴ反応は第１の修飾プライマーの１またはそれ以上を用いて増幅することを含み，および前記ＰＣＲ反応は第２の修飾プライマーの１またはそれ以上を用いて増幅することを含む，請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
第１の修飾プライマーの前記１またはそれ以上は４２℃で解離する修飾基を含み，および第２の修飾プライマーの前記１またはそれ以上は９５℃で解離する修飾基を含む，請求項３４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願のクロスレファレンス
本出願は，米国特許仮出願６０／８１０，６６５（表題"Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｉｍｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ"；２００６年６月１日出願；参照として本明細書に取り込まれる）に基づく優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は，核酸を増幅するための方法おｙび組成物に関する。特定の観点においては，本発明は，ホットスタート核酸増幅の方法および組成物を提供する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
以下の説明は読者の理解を助けるために提供される。提供される情報または参考文献のいずれも，本発明に対する従来技術であると認めるものではない。
【０００４】
ＰＣＲは，最新の分子生物学およびバイオテクノロジーにおいて最も広く用いられている方法であり，遺伝子試験，診断，法医学および生物兵器防衛に急速に応用されつつある（Ｋｏｌｍｏｄｉｎ，Ｌ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，５６９−５８０（２０００）；Ｂｕｄｏｗｌｅ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，３０１  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８５２−５３（２００３）；Ｙ．Ｓａｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，５（Ｓｕｐｐｌ．１）Ｌｅｇａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓ１９１−Ｓ１９３（２００３）；Ｓａｌｄａｎｈａ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，４３  Ｊ．Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｖｉｒｏｌ．，７２−７６（１９９４）；Ｄａｈｉｙａ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，４４  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，４０７−１５（１９９８）；およびＥｌｎｉｆｒｏ，Ｅ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，１３  Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，５５９−７０（２０００））。ＰＣＲは，米国特許４，６８３，１９５および４，６８３，２０２に記載されている。ＰＣＲ増幅プロセスの各サイクルには，典型的にはいくつかの工程がある。まず二本鎖ＤＮＡ標的配列を高温（約９５℃）で熱変性させる。変性が最初に生ずることを，本明細書においては"最初の変性工程"と称する。次に，低温（約６０℃）で合成オリゴヌクレオチドプライマーを各鎖にアニーリングさせる。次に，これらのフォワードおよびリバース方向のオリゴヌクレオチドプライマーは，５’−デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）を取り込みピロリン酸（ＰＰｉ）を生ずる熱安定性のマグネシウムイオン依存性ＤＮＡポリメラーゼにより，高温（約７０℃）でそれぞれその３’末端から伸長する。これは，図１上に，フォワードオリゴヌクレオチドプライマーについて示される。
【０００５】
ＰＣＲの有用性は約１０6倍の標的増幅を迅速に与えるその能力，ならびに高い特異性により推進され，これは部分的にはオリゴヌクレオチドプライマーハイブリダイゼーションの特異性に依存する。したがって，オリゴヌクレオチドプライマーの配列および長さは，アニーリングに用いられる温度で目的とする標的配列にのみハイブリダイズするよう設計される。しかし，ＰＣＲ増幅反応は，典型的には，オリゴヌクレオチドプライマーハイブリダイゼーションの特異性を確実にするのに必要な温度範囲よりかなり低い周囲温度で，数分間または数時間の時間にわたって準備される。そのようなストリンジェンシーの低いサンプル調製条件においては，オリゴヌクレオチドプライマーは実質的に非相補的な他の配列に非特異的に結合して，標的配列とともに増幅されうる望ましくない伸長産物の合成を開始させる可能性がある。Ｃｈｏｕ，Ｑらにより議論されているように，この"ミスプライミング"による非特異的配列の増幅は，所望の標的配列の増幅と競合する可能性があり，したがって，所望の配列，特に低コピー数の標的の増幅の効率を著しく低下させる可能性がある（Ｃｈｏｕ，Ｑ．，ｅｔ  ａｌ．，２０  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１７１７−２３（１９９２））。
【０００６】
"プライマーダイマー"の形成は，非特異的ハイブリダイゼーションの別の問題点である。これは，Ｃｈｏｕ，Ｑらによれば，２つのオリゴヌクレオチドプライマーが有意な介在配列なしに互いの配列に交叉して増幅される伸長から生ずる。これらの研究はさらに，ＰＣＲの間にプライマーダイマーが増幅されたオリゴマー化を起こして，オリゴヌクレオチドプライマーのアルチファクトの複雑な混合物を生成し，その質は通常は低コピー数の増幅における特異的ＰＣＲ産物の収率と反比例して変わることを示した。ミスプライミングおよびプライマーダイマー形成に起因する上述の問題点はＰＣＲのすべての用途において見られるが，これらの点は，高感度の分析用ＰＣＲスキーム，例えば，血液感染性の感染因子（Ｓａｌｄａｎｈａ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．およびＥｌｎｉｆｒｏ，Ｅ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．），生体有害微生物（Ｂｕｄｏｗｌｅ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．），障害性または癌性遺伝子（Ｄａｈｉｙａ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ）の検出，および科学捜査（Ｂｕｄｏｗｌｅ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．およびＹ．Ｓａｔｏ，ｅｔ  ａｌ．）に用いられるものについて，特に困難な問題である。さらに，マルチプレックスＰＣＲにおいては疑似増幅産物の形成の確率がはるかに高い（Ｍａｒｋｏｕｌａｔｏｓ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，１６  Ｊ．ｏｆ  Ｃｌｉｎ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，４７−５１（２００２））。リバーストランスクリプターゼＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）においては，標的ＲＮＡ配列を検出するための最も感度の高い手段は，ＲＴ工程において遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いることである（Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，３３７  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２３１−４１（１９９９）；Ｌｅｋａｎｎｅ  Ｄｅｐｒｅｚ，Ｒ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，３０７  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６３−６９（２００２）；およびＢｕｓｔｉｎ，Ｓ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，１５  Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１５５−６６（２００４））。"偽陰性"および"偽陽性"の重大かつ有害な結果を回避するために高い特異性を必要とするこれらの高感度用途の重要性に鑑みて，ミスプライミングおよびプライマーダイマー形成に起因するアルチファクトを機能的に含まないアッセイを与える試薬およびプロトコルを有することが重要である。
【０００７】
室温でサンプル調製の間の低ストリンジェンシー条件下で生ずるミスプライミングおよびオリゴヌクレオチドプライマーダイマーの形成による望ましくない増幅を低下させる目的で，いわゆる"ホットスタート"プロセスに基づいて非特異的ＰＣＲ増幅を低下させる多数の一般的戦略が研究されている。続くＰＣＲ増幅は，増幅反応混合物が高ストリンジェンシーの"ホット"の温度に達したときに開始されて，標的配列にのみハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプライマーのポリメラーゼ媒介性伸長を"スタート"させる。すなわち，プライマー／標的ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーが特異性に最適となる高温においてのみオリゴヌクレオチドプライマーの酵素的伸長の引き金をひくために温度が用いられる。
【０００８】
"ホットスタート"のこれらの一般的戦略としては，（１）ワックス等の温度感受性材料を障壁ないし封鎖剤として使用して，試薬の混合を調節する（Ｑ．Ｃｈｏｕ，ｅｔ  ａｌ，およびＴａｎｚｅｒ，Ｌ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，２７３  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３０７−３１０（１９９９））；（２）ＤＮＡポリメラーゼの機能を阻害するオリゴヌクレオチドアプタマー（Ｄａｎｇ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，２６４  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６８−７８（１９９６））または抗体（Ｅａｓｔｌｕｎｄ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，２  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ，２−５（２００１）およびＭｉｚｕｇｕｃｈｉ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，１２６  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ），７６２−６８（１９９９））を使用する；（３）第２の熱安定性酵素，例えばピロホスファターゼ（Ｃｌａｒｋ，Ｄ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，国際公開ＷＯ２００２／０８８３８７）を使用して，添加されたピロリン酸（ＰＰｉ）による抑制を除去する；（４）加水分解的に可逆的な試薬で化学的に修飾したポリメラーゼ，例えばＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（Ｍｏｒｅｔｔｉ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，２５  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，７１６−７２２（１９９８）およびＳａｌｄａｎｈａ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．）中のシトラコン酸修飾リジン（Ｂｉｒｃｈ，Ｄ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，米国特許５，７７３，２５８）を使用する；および（５）低温ミスプライミングを嫌うオリゴヌクレオチドプライマー配列コンストラクト，例えば競合配列（Ｐｕｓｋａｓ，Ｌ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ，５  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３０９−３１１（１９９５）または"タッチアップおよびループ組み込みオリゴヌクレオチドプライマー"（ＴＵＬＩＰＳ−ＰＣＲ）（Ａｉｌｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，２９（５）Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１０１８−２３（２０００））を使用することが挙げられる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
本発明は，核酸増幅のための方法および組成物を提供する。これらの方法は，温度依存性核酸増幅反応においてオリゴヌクレオチドプライマーおよびヌクレオシドを使用することを含む。ある観点においては，本発明の方法は，ある種の修飾オリゴヌクレオチドプライマーを用いることにより達成され，これは核酸増幅に有用性を与える。好ましい態様においては，オリゴヌクレオチドプライマーを，特定の化学基，例えばエステルで修飾する。
【００１０】
１つの観点においては，本発明は，核酸を増幅する方法を提供し，この方法は，修飾オリゴヌクレオチドプライマーを用いて核酸を増幅することを含み，ここで，修飾オリゴヌクレオチドプライマーは，１またはそれ以上の修飾基を含む。修飾基は増幅の最初の変性工程の間に解離する。１つの態様においては，修飾基は式Ｉ，式Ｉａ，式Ｉｂ，式Ｉｃ，式Ｉｄ，式ＩＩ，式ＩＩＩおよび／または式ＩＶの化学基の１またはそれ以上を含み，これは本明細書においてさらに説明する。
【００１１】
特定の態様においては，修飾基を結合させて，ホスホトリエステル（ＰＴＥ）ヌクレオチド間結合を形成する。修飾は，ＰＣＲ等の増幅における最初の高温でのインキュベーション期間前の，ＤＮＡポリメラーゼ媒介性オリゴヌクレオチドプライマー伸長を低下させる。本発明のヌクレオチドおよびヌクレオシドから作成されるオリゴヌクレオチドプライマーは，２つの状態を有する。第１に，オリゴヌクレオチドプライマーは，修飾基の存在のため，最初の変性温度，多くの場合９５℃に達するまでは不活性状態にある。最初の変性温度に到達すると，オリゴヌクレオチドプライマーは，熱的に誘導される分子内フラグメント化により活性となり，オリゴヌクレオチドは第２の状態に変換される。オリゴヌクレオチドプライマーのこの第２の状態は，活性状態のホスホジエステル結合を有し，ポリメラーゼによる伸長の可能な，対応する未修飾オリゴヌクレオチドプライマーである。修飾基の部分的または完全な解離は，好ましくは，およそ９５℃で約２−１０分間インキュベーションした後に生ずる。ある態様においては，修飾基のオリゴヌクレオチドプライマーからの解離は温度に応じて生じ，酵素，化学物質，またはｐＨ等の増幅反応条件を必要としない。ホスホトリエステル結合，はＭｉｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，９３（２４）  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，６６５７−６５（１９７１）；Ｚｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，６（２）  ＰｒｏｔｅｉｎＪ．，１３１−４５（１９８７）；およびＫｏｚｉｏｌｋｉｅｗｉｃｚ，Ｍ．ａｎｄ  Ｗｉｌｋ，Ａ．，Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ（１９９３）に記載されている。
【００１２】
好ましい態様においては，増幅反応において，各プライマー対の少なくとも１つのプライマーは検出可能な標識で標識される。すなわち，増幅後，標的セグメントは，サイズ，アフィニティー捕捉，または色で識別することができる。検出可能な標識は，好ましくは蛍光染料である。ある態様においては，マルチプレックスＰＣＲにおける異なるプライマー対は，異なる区別可能な検出可能な標識で標識することができる。別の態様においては，フォワードプライマーを１つの検出可能な標識で標識し，リバースプライマーを異なる検出可能な標識で標識する。異なる検出可能な標識の使用は，同じ長さまたは非常に似た長さの増幅産物の間を弁別するのに有用である。すなわち，好ましい態様においては，少なくとも２つの異なる蛍光色素を用いて，単一の増幅において用いられる異なるプライマーを標識する。
【００１３】
１つの態様においては，本発明にしたがう修飾基は，式Ｉ：
【化１】
0005558811.tif 000002
［式中，
Ｌは，１−１０個の炭素原子，好ましくは２−５個の炭素原子，より好ましくは３−４個の炭素原子，さらにより好ましくは４個の炭素原子を有する，直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビレン基であり；
Ｘは，Ｏ，Ｓ，Ｓ（Ｏ），Ｓ（Ｏ）2，Ｃ（Ｏ），Ｃ（Ｓ）またはＣ（Ｏ）ＮＨであり；および
Ｒ1は，水素または１−２０個の炭素原子，好ましくは１−１０個の炭素原子，より好ましくは１−６個の炭素原子を有する，直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビル基であり；好ましくは，ヒドロカルビルは，アルキル，アルケニルまたはアルキニルであり，これは任意に，ハロ，オキソ，ヒドロキシル，アルコキシ，アミノ，アミド，シクロアルキル，ヘテロシクロアルキル，アリール，アリールオキシ，およびヘテロアリールからなる群より選択される少なくとも１つの置換基を含んでいてもよい］
の化合物を含む。
【００１４】
１つの態様においては，本発明にしたがう修飾基は，式Ｉａ：
【化２】
0005558811.tif 000003
［式中，
Ｌは，１−１０個の炭素原子，好ましくは２−５個の炭素原子，より好ましくは３−４個の炭素原子，さらにより好ましくは４個の炭素原子を有する，直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビレン基であり；および
Ｒ1は水素または１−２０個の炭素原子，好ましくは１−１０個の炭素原子，より好ましくは１−６個の炭素原子を有する，直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビル基であり；好ましくは，ヒドロカルビルは，アルキル，アルケニルまたはアルキニルであり，これは任意に，ハロ，オキソ，ヒドロキシル，アルコキシ，アミノ，アミド，シクロアルキル，ヘテロシクロアルキル，アリール，アリールオキシ，およびヘテロアリールからなる群より選択される少なくとも１つの置換基を含んでいてもよい］
の化合物を提供する。
【００１５】
式Ｉａの修飾基の好ましい態様は以下のとおりである：
【化３】
0005558811.tif 000004
４−オキソ−１−ペンチル，
【化４】
0005558811.tif 000005
５−オキソ−１−ヘキシル，
【化５】
0005558811.tif 000006
６−オキソ−１−ヘプチル，
【化６】
0005558811.tif 000007
４−オキソ−１−ヘキシル，
【化７】
0005558811.tif 000008
５−メチル−４−オキソ−１−ヘキシル，
【化８】
0005558811.tif 000009
２−メチル−５−オキソ−ヘキシル，
【化９】
0005558811.tif 000010
１−エチル−４−オキソ−ペンチル，
【化１０】
0005558811.tif 000011
１−メチル−４−オキソ−ペンチル，
【化１１】
0005558811.tif 000012
１，１−ジメチル−４−オキソ−ペンチル，
【化１２】
0005558811.tif 000013
４−オキソ−１−オクチル
【化１３】
0005558811.tif 000014
４−オキソ−１−テトラデシル，および
【化１４】
0005558811.tif 000015
４−オキソ−１−エイコサミル。
【００１６】
１つの態様においては，本発明にしたがう修飾基は式Ｉｂ：
【化１５】
0005558811.tif 000016
［式中，
ｋは０−２の整数であり；
Ｌは，１−１０個の炭素原子，好ましくは２−５個の炭素原子，より好ましくは３−４個の炭素原子，さらにより好ましくは４個の炭素原子を有する，直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビレン基であり；および
Ｒ1は，水素または１−２０個の炭素原子，好ましくは１−１０個の炭素原子，より好ましくは１−６個の炭素原子を有する，直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビル基であり；好ましくは，ヒドロカルビルは，アルキル，アルケニルまたはアルキニルであり，これは任意に，ハロ，オキソ，ヒドロキシル，アルコキシ，アミノ，アミド，シクロアルキル，ヘテロシクロアルキル，アリール，アリールオキシ，およびヘテロアリール．からなる群より選択される少なくとも１つの置換基を含んでいてもよい］
の化合物を提供する。
【００１７】
好ましい態様においては，式Ｉｂの修飾基は下記に示す４−メチルチオ−１−ブチルである：
【化１６】
0005558811.tif 000017
【００１８】
１つの態様においては，本発明にしたがう修飾基は式Ｉｃ：
【化１７】
0005558811.tif 000018
［式中，
Ｌは，１−１０個の炭素原子，好ましくは２−５個の炭素原子，より好ましくは３−４個の炭素原子，さらにより好ましくは４個の炭素原子を有する，直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビレン基であり；および
Ｒ1は，水素または１−２０個の炭素原子，好ましくは１−１０個の炭素原子，より好ましくは１−６個の炭素原子を有する，直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビル基であり；好ましくは，ヒドロカルビルは，アルキル，アルケニルまたはアルキニルであり，これは任意に，ハロ，オキソ，ヒドロキシル，アルコキシ，アミノ，アミド，シクロアルキル，ヘテロシクロアルキル，アリール，アリールオキシ，およびヘテロアリールからなる群より選択される少なくとも１つの置換基を含んでいてもよい］
の化合物を提供する。
【００１９】
好ましい態様においては，式Ｉｃの修飾基は下記に示す３−（Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルカルボキサミド）−１−プロピルである：
【化１８】
0005558811.tif 000019
【００２０】
１つの態様においては，本発明にしたがう修飾基は式Ｉｄ：
【化１９】
0005558811.tif 000020
［式中，
Ｌは，１−１０個の炭素原子，好ましくは２−５個の炭素原子，より好ましくは３−４個の炭素原子，さらにより好ましくは４個の炭素原子を有する，直鎖または分枝鎖のヒドロカルビレン基であり；および
各Ｒ1は，独立して，水素または１−２０個の炭素原子，好ましくは１−１０個の炭素原子，より好ましくは１−６個の炭素原子を有する，直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビル基であり；好ましくは，ヒドロカルビルは，アルキル，アルケニルまたはアルキニルであり，これは任意に，ハロ，オキソ，ヒドロキシル，アルコキシ，アミノ，アミド，シクロアルキル，ヘテロシクロアルキル，アリール，アリールオキシ，およびヘテロアリールからなる群より選択される少なくとも１つの置換基を含んでいてもよい］
の化合物を提供する。
【００２１】
修飾基式Ｉｄの好ましい態様としては，２−（Ｎ−ホルミル−Ｎ−メチル）アミノエチルまたは２−（Ｎ−アセチル−Ｎ−メチル）アミノエチルが挙げられる（下記に示す）：
【化２０】
0005558811.tif 000021
２−（Ｎ−アセチル−Ｎ−メチル）アミノエチル
【００２２】
別の態様においては，本発明にしたがう修飾基は式ＩＩ：
【化２１】
0005558811.tif 000022
［式中，
Ｌは，１−１０個の炭素原子，好ましくは２−５個の炭素原子，より好ましくは３−４個の炭素原子，さらにより好ましくは４個の炭素原子を有する，直鎖または分枝鎖のヒドロカルビレン基であり；および
Ｒ2は，水素，シアノ，または５−１０個の原子を有する任意に置換されていてもよい炭素環，複素環，アリールまたはヘテロアリールである］
の化合物を提供する。
【００２３】
好ましい態様においては，式ＩＩの修飾基は下記に示すＮ−（２−ヒドロキシエチル）−フタルイミドである：
【化２２】
0005558811.tif 000023
Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−フタルイミド
【００２４】
別の態様においては，本発明にしたがう修飾基は式ＩＩＩ：
【化２３】
0005558811.tif 000024
［式中，
ＬaおよびＬbは，それぞれ独立して，単結合，または１−８個の炭素原子，好ましくは２−５個の炭素原子，より好ましくは３−４個の炭素原子を有する，直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビレン基から選択され；
Ａは，Ｏ，Ｓ，Ｓ（Ｏ），Ｓ（Ｏ）2，Ｓｅ，ＣＲ3Ｒ4，ＮＲ3，Ｃ（Ｏ），Ｃ（Ｓ）またはＣＮＲ3であり；
Ｂは，Ｃ（Ｏ）Ｒ3，Ｃ（Ｓ）Ｒ3，Ｃ（Ｏ）ＮＲ3Ｒ4，ＯＲ3またはＳＲ3であり；および
Ｒ3およびＲ4は，それぞれ独立して，水素または１−２０個の炭素原子，好ましくは１−１０個の炭素原子，好ましくは１−６個の炭素原子を有する，直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビル基であり；好ましくは，ヒドロカルビルは，アルキル，アルケニルまたはアルキニルであり，これは任意に，ハロ，オキソ，ヒドロキシル，アルコキシ，アミノ，アミド，シクロアルキル，ヘテロシクロアルキル，アリール，アリールオキシ，およびヘテロアリールからなる群より選択される少なくとも１つの置換基を含んでいてもよい］
の化合物を提供する。
【００２５】
別の態様においては，本発明にしたがう修飾基は，式ＩＶ：
【化２４】
0005558811.tif 000025
［式中，
Ｌa，ＬbおよびＬcは，それぞれ独立して，単結合，または１−８個の炭素原子，好ましくは２−５個の炭素原子，より好ましくは３−４個の炭素原子を有する，直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビレン基から選択され；
Ｄは，Ｏ，Ｓ，Ｓ（Ｏ），Ｓ（Ｏ）2，ＣＲ5Ｒ6，またはＮＲ5であり；
Ｅは，Ｏ，Ｓ，Ｓ（Ｏ），Ｓ（Ｏ）2，ＣＲ5Ｒ6，またはＮＲ6であり；
Ｆは，水素，Ｃ（Ｏ）Ｒ7，Ｃ（Ｓ）Ｒ7，Ｃ（Ｏ）ＮＲ7Ｒ8，ＯＲ7またはＳＲ7であり；
Ｒ5およびＲ6は，それぞれ独立して，水素，アリール，アルキル，ハロ，オキソ，ヒドロキシル，アルコキシ，アリールオキシ，またはアミノであってもよく，またはＲ5およびＲ6は，一緒になって，５−１０個の原子からなり，Ｄ，Ｒ5，Ｒ6，ＥおよびＬbを含む単環または二環を形成してもよく，ただし，Ｒ5およびＲ6が一緒になって環を形成する場合，ｎは０−２であり；および
Ｒ7およびＲ8は，それぞれ独立して，アリール，アルキル，ハロ，オキソ，ヒドロキシル，アルコキシ，アリールオキシ，アミノ，アミド，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアリールオキシ，または任意に置換されていてもよいヘテロアリールから選択される］
の化合物を提供する。
【００２６】
Ｒ5およびＲ6が一緒になって環を形成する式ＩＶの化合物の１つの態様においては，修飾基は下記に示すメトキシメチル−シクロヘキシ−１，３−イル−エチルである：
【化２５】
0005558811.tif 000026
メトキシメチル−シクロヘキシ−１，３−イル−エチル
【００２７】
１つの態様においては，オリゴヌクレオチドプライマーは，構造Ｉ：
【化２６】
0005558811.tif 000027
［式中，
Ｎｕｃはプライマー配列中のヌクレオシドであり；
ＵおよびＺは，独立して，Ｏ，Ｓ，Ｓｅ，ＮＲ9，またはＣＲ9Ｒ10であり；
Ｒ9およびＲ10は，それぞれ独立して，水素，または１−１０個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビルであり；好ましくは，ヒドロカルビルは，アルキル，アルケニルまたはアルキニルであり，それぞれは独立して，ハロ，オキソ，ヒドロキシル，アルコキシ，アリールオキシ，アミノ，アミドまたは検出可能な標識から選択される少なくとも１つの置換基を含んでいてもよく；
Ｙは，Ｏ，ＳまたはＳｅであり；
Ｗは，Ｑが熱的に切断されることを可能とする任意の化学成分，例えばＯ，Ｓ，Ｓ（Ｏ），Ｓ（Ｏ）2，Ｓｅ，Ｃ（Ｏ），Ｃ（Ｓ），Ｃ（Ｏ）ＮＨ，Ｃ（Ｎ）Ｈ，ＮＨ，−Ｃ（＝ＮＲ11）−またはＮＲ9であり；
Ｒ11は，水素または１−１０個の炭素原子，好ましくは１−６個の炭素原子を有する任意に置換されていてもよいヒドロカルビルであり；好ましくは，Ｒ11は，Ｈ，アルキルまたは低級アルキルであり；および
Ｑは１またはそれ以上の熱切断性基を含む修飾基である］
の修飾骨格を有する。
【００２８】
１つの態様においては，修飾基Ｑは，本明細書に定義される式Ｉ，Ｉａ，Ｉｂ，Ｉｃ，Ｉｄ，ＩＩ，ＩＩＩまたはＩＶから選択される１またはそれ以上の熱切断性基を含む。
【００２９】
別の観点においては，本発明は，核酸配列を含む核酸増幅用のオリゴヌクレオチドプライマーを提供し，ここで，核酸配列は，１またはそれ以上の修飾基を含む。修飾基は，以下の式Ｉ，式Ｉａ，式Ｉｂ，式Ｉｃ，式Ｉｄ，式ＩＩ，式ＩＩＩおよび／または式ＩＶの化学基の１またはそれ以上を含み，これは本明細書においてさらに説明する。
【００３０】
さらに別の観点においては，本発明は，修飾オリゴヌクレオチドプライマーおよび核酸用の修飾ヌクレオチドを製造する方法を提供し，この方法は，修飾ホスホルアミダイトを用いてオリゴヌクレオチド合成を実施することを含み，ここで，修飾ホスホルアミダイトは，以下の式Ｉ，式Ｉａ，式Ｉｂ，式Ｉｃ，式Ｉｄ，式ＩＩ，式ＩＩＩおよび／または式ＩＶの修飾基の１またはそれ以上を含み，これは本明細書においてさらに説明する。
【００３１】
本明細書に記載される増幅を実施するための修飾オリゴヌクレオチドを含むキットも提供される。キットは，核酸増幅と記された容器，核酸増幅を実施するための指針，および／または，ｄＮＴＰｓ，核酸ポリメラーゼ，マグネシウム，および反応バッファからなる群より選択される１またはそれ以上の試薬を含むことができる。
【００３２】
本発明の核酸増幅用の方法および組成物は，合成オリゴヌクレオチドプライマーおよび核酸のポリメラーゼ伸長を用いる用途に有用である。本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは，単一の修飾部位を有していてもよく，複数の修飾部位を有していてもよい。
【００３３】
本発明にしたがえば，本発明の修飾オリゴヌクレオチドは顕著な利点を有することが見いだされた。例えば，エンドユーザは，未修飾オリゴヌクレオチドプライマーについて既に用いているものと同じ増幅プロトコルおよび方法を用いることができる。本発明の修飾オリゴヌクレオチドプライマーは，現存する増幅系および試薬（例えばホットスタートＰＣＲ）と適合性であり，追加の酵素または試薬は必要なく，現存するオリゴヌクレオチドプライマー合成方法を用いて本発明の修飾オリゴヌクレオチドプライマーを合成することができる。本発明の別の観点は，この技術のための市販製品を含み，例としては，ＰＴＥ修飾ホスホルアミダイト，オリゴヌクレオチド合成用のＰＴＥ修飾固体支持体，通常増幅される標的用のオリゴヌクレオチドプライマーセット，および注文合成オリゴヌクレオチドプライマー配列が挙げられる。忠実性を必要とするオリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ系増幅用途を，本発明の修飾オリゴヌクレオチドプライマーとともに用いることができる。増幅用途としては，限定されないが，ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ），ホットスタートＰＣＲ，逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ），マルチプレックスＰＣＲ，定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ），配列決定，または当該技術分野において知られる他の核酸増幅方法が挙げられる。
【００３４】
本明細書に提供される方法および組成物のある態様においては，増幅はリバーストランスクリプターゼ（ＲＴ）により行う。当業者は，ＲＴを実施するのに必要な条件を熟知している。変性および伸長温度は様々であることができ，使用されるリバーストランスクリプターゼ酵素により異なる。例えば，リバーストランスクリプターゼによる変性および伸長は約３７−７０℃で生ずる。本明細書に提供される修飾基は，所望の解離条件，例えば，特定の温度，または特定の時間と組み合わせた特定の温度にしたがって使用するよう選択することができる。例えば，修飾基は，この基が３７−７０℃；好ましくは３７−６０℃；好ましくは約５０℃；好ましくは約４２℃，好ましくは約３７℃で解離するように，ＲＴについて用いることができる。別の態様においては，修飾基は，所望の温度で，０．１−６０分間；好ましくは１−３０分間；好ましくは１−１５分間；好ましくは１−１０分間；好ましくは０．１−５分間で解離する。
【００３５】
本明細書に提供される方法および組成物の別の態様においては，増幅は，単一の反応混合物における１または２以上の増幅反応，例えばリバーストランスクリプターゼポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）または他の例，例えば米国特許６，３９９，３０４に開示される反応により行うことができる。ある態様においては，２以上の酵素反応に必要な試薬を加えて，１つの反応容器で実施することができる。そのような反応においては，修飾および／または未修飾オリゴヌクレオチドの様々な組み合わせを用いることができる。例えば，修飾オリゴヌクレオチドは，１つの，１またはそれ以上の，２またはそれ以上の，３またはそれ以上の，５またはそれ以上の，１０またはそれ以上の反応において用いることができる。一例においては，ＲＴに理想的な温度，例えば４２℃で解離する修飾基を有するオリゴヌクレオチドを，リバーストランスクリプターゼ用に用いることができ，ＰＣＲに理想的な温度，例えば９５℃で解離する異なる修飾基を有する別のオリゴヌクレオチドを，ＰＣＲ用に用いることができる。そのような組み合わせを提供することにより，ＰＣＲプライマーはＲＴ反応を妨害せず，または実質的に妨害しない。あるいは，ＲＴプライマーは未修飾プライマーであってもよく，ＰＣＲプライマーはＰＣＲに理想的な温度，例えば９５℃で解離する基で修飾してもよい。さらに別の態様においては，続くＰＣＲとしては，マルチプレックスＰＣＲ，リアルタイムＰＣＲ，または定量的ＰＣＲが挙げられる。
【００３６】
本明細書において提供される方法および組成物の別の態様においては，増幅は，単一の反応混合物における１または２以上の増幅反応，例えばマルチプレックスＰＣＲを含む。異なる標的領域を増幅するために用いられるプライマーを同じ反応中に含めることができる。そのような反応においては，各標的領域について修飾および／または未修飾プライマーの異なる組み合わせを用いることができる。未修飾および／または修飾プライマーの異なる組み合わせを用いる場合，異なる修飾基を用いることにより増幅の相対的効率を調節することができる。例えば，第１の標的核酸領域用のプライマーは修飾基を有さないが，第２の標的領域用のプライマーは修飾基を有しており，ここで，同じ条件下で第１の標的領域は第２の標的領域より低い効率で増幅する。あるいは，第１の標的領域用のプライマーはある修飾基を有することができ，第２の標的領域用のプライマーは別の修飾基を有することができ，ここで，修飾基は異なる解離速度を有する。別の代替法においては，増幅の効率を調節するために，修飾プライマーとその未修飾同等物との混合集団を用いることができる。さらに別の好ましい態様においては，マルチプレックスＰＣＲ反応は２またはそれ以上，３またはそれ以上，４またはそれ以上，５またはそれ以上，１０またはそれ以上，２０またはそれ以上の異なる標的領域を増幅する。各標的領域，好ましくは１，２，２またはそれ以上，３またはそれ以上，５またはそれ以上，１０またはそれ以上，または２０またはそれ以上の異なる標的領域について，未修飾プライマーと修飾プライマーとの任意の組み合わせを用いることができる。例えば，３つの標的領域を増幅する場合，第１の標的領域には未修飾プライマーを用い，第２および第３の標的領域には修飾プライマーを用いることができ，ここで，第２および第３の標的領域用のプライマーは，同じ修飾基を用いても異なる修飾基を用いてもよく，１つのヌクレオチド配列のプライマー（すなわち第１の標的領域用のフォワードプライマー）は，修飾プライマーと未修飾プライマー同等物との混合物であってもよい。当業者は，修飾基の解離効率，増幅効率および標的領域の数等にしたがって，プライマーと修飾基のどのような組み合わせが適当であるかを決定することができる。
【００３７】
本明細書において用いる場合，"増幅"または"増幅する"との用語は，標的核酸をコピーし，このことにより選択された核酸配列のコピー数を増加させるための当該技術分野において知られる１またはそれ以上の方法を表す。本発明の増幅は，合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて，核酸ポリメラーゼ伸長，例えばリバーストランスクリプターゼ（ＲＴ）により行う。増幅は指数的であっても直線的であってもよい。標的核酸は，ＤＮＡ，ＲＮＡ，ｃＤＮＡまたは修飾核酸テンプレートであることができる。以下に例示される方法はポリメラーゼ連鎖反応（"ＰＣＲ"）を用いる増幅に関連するが，当該技術分野においては核酸を増幅するための他の多くの方法が知られている。例えば，このような方法としては，等温法，ローリングサークル法，リアルタイムＰＣＲ，定量的ＰＣＲ，マルチプレックスＰＣＲ，ＤＮＡシークエンシングおよび他の核酸伸長反応が挙げられる。当業者は，ＰＣＲ法の代わりに，またはこれと一緒に他の方法を用いることができることを理解するであろう。例えば，Ｓａｉｋｉ，"Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ"，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１３−２０（１９９０）；Ｗｈａｒａｍ，ｅｔ  ａｌ．，２９（１１）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，Ｅ５４−Ｅ５４（２００１）；Ｈａｆｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，３０（４）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，８５２−６，８５８，８６０  ｐａｓｓｉｍ（２００１）；およびＺｈｏｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，３０（４）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，８５２−５６，８５８，８６０ｐ  ａｓｓｉｍ（２００１）を参照。
【００３８】
本明細書において用いる場合，"核酸"，"ヌクレオチド配列"，または"核酸配列"とは，ヌクレオチド，オリゴヌクレオチド，ポリヌクレオチド，またはこれらの任意のフラグメントを表し，天然に生ずるまたは合成の分子を表す。これらの節はまた，ゲノム由来または合成由来のＤＮＡまたはＲＮＡを表し，これは一本鎖であっても二本鎖であってもよく，センス鎖を表してもアンチセンス鎖を表してもよく，または任意のＤＮＡ様またはＲＮＡ様物質を表してもよい。ＤＮＡ配列に関して，"ＲＮＡ同等物"は，参照ＤＮＡ配列と同じヌクレオチドの直線配列から構成されるが，ただし窒素性塩基であるチミンはすべてウラシルに変換されており，糖骨格はデオキシリボースの代わりにリボースから構成される。本発明に適した別の核酸骨格としては，限定されないが，ホスホロチオエート，ホスホロセレノエート，アルキルホスホネート，アリールホスホネート，ロック核酸（ＬＮＡ），およびペプチド核酸（ＰＮＡ）およびボロネートが挙げられる。ＲＮＡは，本明細書に記載される方法において用いることができ，および／または本明細書に記載される方法において用いるために逆転写によりｃＤＮＡに変換してもよい。
【００３９】
本明細書において用いる場合，"修飾オリゴヌクレオチド"との用語は，少なくとも１つの修飾基を有するオリゴヌクレオチドプライマーを表す。修飾オリゴヌクレオチドとしては，例えば，修飾ヌクレオシドを含有するオリゴヌクレオチド，修飾ヌクレオチド間結合を含有するオリゴヌクレオチド，または修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを有するオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド鎖中に天然のヌクレオシドが存在している場合であっても）が挙げられる。そのヌクレオシドが修飾ヌクレオチド間結合を介して連結されているオリゴヌクレオチドは，例えば，Ｗａｌｄｎｅｒら（６Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，２３６３−６６（１９９６））に見いだすことができ，これは，種々のアミドヌクレオチド間結合を含むオリゴヌクレオチドの合成を記載している。
【００４０】
本明細書において用いる場合，"オリゴヌクレオチド"，"プライマー"または"オリゴヌクレオチドプライマー"との用語は，通常は一本鎖であるポリヌクレオチドを表し，これは天然に生ずるものであっても合成のものであってもよく，通常は約５−約５０ヌクレオチド，より好ましくは約１０−約３０ヌクレオチド，またはより好ましくは約１５−約２５ヌクレオチドの配列から構成される。オリゴヌクレオチドにはＤＮＡまたはＲＮＡが含まれる。当業者は，標的配列を増幅するのに適当なプライマーを設計し製造することができる。本発明において用いるための増幅プライマーのプライマーハイブリダイゼーション配列の長さは，ヌクレオチド配列の種類，相補性およびこれらの核酸がハイブリダイズするかまたはインビトロ核酸増幅において用いられる温度等のいくつかの因子によって異なる。特定の配列の増幅プライマーのプライマーハイブリダイゼーション配列について好ましい長さを決定するのに必要な考慮事項は，当業者によく知られている。例えば，短い核酸またはオリゴヌクレオチドの長さは，そのハイブリダイゼーションの特異性または選択性に関連しうる。
【００４１】
本明細書において用いる場合，"修飾基"との用語は，オリゴヌクレオチドプライマーに結合している化学成分を表す。ある態様においては，化学成分はエステルである。本発明の１またはそれ以上の修飾基を含むオリゴヌクレオチドプライマーは，核酸伸長の効率が低下している。好ましくは，修飾オリゴヌクレオチドプライマーの不活性状態が，増幅反応をプライミングする効率がその対応する活性状態のオリゴヌクレオチドより少なくとも５０％低い場合，好ましくは効率が少なくとも６０％低い，好ましくは効率が７０％低い，より好ましくは少なくとも８０％低い，より好ましくは効率が９０％未満低い，さらにより好ましくは増幅反応をプライミングする効率が対応する活性状態のオリゴヌクレオチドプライマーより９５％低い場合，伸長が低下している。当業者は，活性および効力のレベルを容易に測定することができる。当業者にはプライミング能力を試験する多くの方法が知られている。プライミング効率を判定する１つの方法は，実施例４に例示されている（Ｒａｎｄａｌｌ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，２６２  Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６８６４−７０（１９８７））。好ましくは，修飾基は熱感受性であって，増幅反応媒体の温度が上昇するにつれてより速い速度で修飾オリゴヌクレオチドから解離する。修飾基は２つの隣接するヌクレオチドの間に存在していてもよい。
【００４２】
本明細書において用いる場合，オリゴヌクレオチドに関して"末端"との用語は，オリゴヌクレオチドの３’または５’末端またはその近傍に存在するヌクレオチドを表す。好ましくはヌクレオチドの末端は，末端６ヌクレオチド，より好ましくは末端５ヌクレオチド，より好ましくは末端４ヌクレオチド，より好ましくは末端３ヌクレオチド，より好ましくは末端２ヌクレオチド，またはより好ましくは末端ヌクレオチドを含む。
【００４３】
本明細書において用いる場合，"解離する"または"解離"との用語は，オリゴヌクレオチドからの修飾基の分離を表す。解離は部分的であっても完全であってもよい。
【００４４】
本明細書において用いる場合，"ヌクレオチド間結合"との用語は，オリゴヌクレオチドプライマーの２つのヌクレオチド間の結合を表す。
【００４５】
本明細書において用いる場合，"標的核酸配列"または"核酸標的"との用語は，同定すべきヌクレオチドの配列を表す。
【００４６】
本明細書において用いる場合，"標識"または"検出可能な標識"とは，検出可能な標識を検出することにより間接的にその分子を検出することができるように，分子に結合するかまたは何らかの形で結びつけることができる任意の分子（または分子の組み合わせ）を表す。検出可能な標識は，放射性同位体（例えば，ヨウ素，インジウム，イオウ，水素等），染料または蛍光団（例えば，シアニン，フルオレセイン，ローダミン），蛋白質（例えば，アビジン，抗体），酵素（ペルオキシダーゼ，ホスファターゼ等），ハプテン（例えばビオチン），または直接的にまたは間接的に検出することができる他の任意の試薬であることができる。酵素は，間接的な方法により検出される検出可能な標識の一例である。この場合，酵素を標的核酸に結合させ，酵素が作用したときに基質の色が変化するかまたは元の基質とは異なる色を与える切断産物が放出されるような適当な基質を加えることにより，酵素の存在を検出する。
【００４７】
本明細書において用いる場合，"熱誘導"との用語は，熱を適用することによりオリゴヌクレオチドプライマー修飾がオリゴヌクレオチドプライマーから除去されて，活性状態のオリゴヌクレオチドプライマーを生じてポリメラーゼにより伸長可能とするプロセスを表す。
【００４８】
本明細書において用いる場合，"ホットスタート"との用語は，反応が酵素の伸長温度より高い初期温度に達するまで，ポリメラーゼにより誘導される核酸増幅が機能しな，核酸増幅反応を表す。ホットスタートＰＣＲ用途においては，初期温度が約８０−１０５℃に達し；または増幅反応が少なくとも約８０℃の初期温度に達するまで，または増幅反応が少なくとも約８５℃の初期温度に達するまで，または増幅反応が少なくとも約９０℃の初期温度に達するまで，または増幅反応が少なくとも約９５℃の初期温度に達するまで，増幅が低下している。"ホットスタート"との用語は，当該技術分野においてよく知られており，増幅を低下させることが知られている多数の方法，例えば，修飾ポリメラーゼ，ハイブリダイゼーションを低下させる二次構造を有するオリゴヌクレオチド，およびワックス等の温度感受性バリア中に含まれる試薬がある。好ましい態様においては，ホットスタート増幅は，オリゴヌクレオチド修飾基を熱誘導性除去することにより引き起こされる。
【００４９】
本明細書において用いる場合，"分子内フラグメント化"との用語は，修飾基が修飾オリゴヌクレオチドプライマーから解離するプロセスを表す。好ましくは，得られるオリゴヌクレオチドは活性状態である。
【００５０】
本明細書において用いる場合，"ミスプライミング"との用語は，非特異的オリゴヌクレオチドプライマー結合を表す。特に，実質的な非相補性を有し，標的配列とともに増幅されることができる望ましくない伸長産物の合成を開始しうる可能性のある配列を表す。
【００５１】
本明細書において用いる場合，オリゴヌクレオチドプライマーの文脈において，"不活性状態"または"不活性な"との用語は，修飾基を有するオリゴヌクレオチドプライマーを表す。１つの態様においては，修飾基は，オリゴヌクレオチドプライマーの標的配列へのハイブリダイゼーションを低下させる。別の態様においては，修飾基は，オリゴヌクレオチドプライマーが別の配列にハイブリダイズしたときに，ポリメラーゼ伸長を低下させる。
【００５２】
本明細書において用いる場合，オリゴヌクレオチドプライマーの文脈において，"活性状態"または"活性な"との用語は，修飾基を有しないオリゴヌクレオチドプライマーを表す。好ましくは，活性なオリゴヌクレオチドプライマーは，１）未修飾ホスホジエステル結合，および２）未修飾塩基成分を含み，増幅反応において用いるための鎖伸長が可能である。活性状態のオリゴヌクレオチドプライマーは，修飾基を有したことがないオリゴヌクレオチドプライマーであってもよく，そこから修飾基が除去されているオリゴヌクレオチドプライマーであってもよい。
【００５３】
本明細書において用いる場合，"プライマーダイマー"との用語は，２つのオリゴヌクレオチドプライマーが有意な介在配列なしで互いの配列に交叉して増幅される伸長により生ずる非特異的オリゴヌクレオチドプライマーハイブリダイゼーションを表す。
【００５４】
本明細書において用いる場合，"ハイブリダイズする"または"特異的にハイブリダイズする"との用語は，相補的な核酸鎖が適切にストリンジェントな条件下で互いにアニーリングするプロセスを表す。標的核酸へのハイブリダイゼーションは，典型的にかつ好ましくは，プローブの長さ，好ましくは２０−１００ヌクレオチドの長さの核酸分子を用いて行う。核酸ハイブリダイゼーション手法は当該技術分野においてよく知られている。例えば，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｓｅｃａｕｃｕｓ，Ｎ．Ｊ．（１９９４）を参照。
【００５５】
本明細書において用いる場合，"ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件"との用語は，完全に相補的ではない２つの核酸のハイブリダイゼーションを許容しないハイブリダイゼーション条件を表す。
【００５６】
本明細書において用いる場合，"サンプル"または"試験サンプル"との用語は，目的とする核酸を含むと考えられる任意の液体または固体の材料を表す。試験サンプルは，任意の生物学的起源（例えば生物サンプル），例えば，培養した細胞または組織サンプルまたは合成的に製造した，例えば化学的に合成したテンプレート等から得ることができる。
【００５７】
本明細書において用いる場合，"相補性"，"相補的な"，または"相補性"との用語は，ポリヌクレオチド（すなわち，ヌクレオチドの配列，例えばオリゴヌクレオチドまたは標的核酸）に関して標準的なワトソン／クリック塩基対規則にしたがって用いられる。相補的な配列はまた，ＤＮＡ配列に相補的なＲＮＡの配列またはその相補配列であってもよく，ｃＤＮＡであってもよい。例えば，配列"５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−３’"は配列"３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−５’"に相補的である。天然の核酸には一般に見いだされないある種のヌクレオチドも本明細書に記載される核酸中に含まれ，例えば，修飾ヌクレオシド，ヌクレオチド，および核酸，例えば，イノシン，７−デアザグアニン，ロック核酸（ＬＮＡ），およびペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。相補性は必ずしも完全でなくてもよい。安定なデュープレックスは，ミスマッチの塩基対，縮重またはマッチしない塩基を含んでいてもよい。核酸技術の当業者は，多数の変数，例えば，オリゴヌクレオチドの長さ，オリゴヌクレオチドの塩基組成および配列，イオン強度およびミスマッチ塩基対の出現率を考慮して，経験的にデュープレックスの安定性を決定することができる。
【００５８】
相補性は，"部分的"，すなわち，２つの核酸鎖のヌクレオチド塩基の一部のみが塩基対形成規則にしたがってマッチしていてもよい。相補性は，２つの核酸鎖のヌクレオチド塩基のすべてが塩基対形成規則にしたがってマッチしている場合，"完全"または"全面的"である。２つの核酸鎖のヌクレオチド塩基がいずれも塩基対形成規則にしたがってマッチしていない場合，相補性はない。核酸鎖間の相補性の程度は，核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に著しく影響する。このことは，増幅反応，ならびに核酸間の結合に依存する検出方法において特に重要である。いずれの用語も，特にポリヌクレオチドの文脈で個々のヌクレオチドに関しても用いられる。例えば，オリゴヌクレオチド中の特定のヌクレオチドは，オリゴヌクレオチドの残部と核酸鎖との間の相補性と対比または比較して，別の核酸鎖中のヌクレオチドに対して相補性があるまたは相補性がないと記述することができる。
【００５９】
本明細書において用いる場合，"実質的に相補的な"との用語は，ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする２つの配列を表す。当業者は，実質的に相補的な配列はその長さ全体にわたってハイブリダイズする必要がないことを理解するであろう。特に，実質的に相補的な配列は，ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズする塩基の連続する配列の３’または５’側に位置する，標的配列にハイブリダイズしない塩基の連続する配列を含んでいてもよい。
【００６０】
本明細書において用いる場合，"フォワードプライマー"との用語は，一本鎖ＲＮＡ，一本鎖ＤＮＡ，または二本鎖ＤＮＡのアンチセンス鎖にアニーリングするオリゴヌクレオチドプライマーを表す。"リバースプライマー"は一本鎖ＲＮＡ，一本鎖ＤＮＡ，または二本鎖ＤＮＡのセンス鎖にアニーリングする。
【００６１】
本明細書において用いる場合，オリゴヌクレオチドプライマーと核酸とをアラインメントさせたときに，オリゴヌクレオチドプライマーのオリゴヌクレオチドプライマーハイブリダイゼーション配列が核酸の一部と少なくとも５０％の配列同一性を有するとき，オリゴヌクレオチドプライマーは，核酸に対して"特異的"である。核酸に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーとは，適当なハイブリダイゼーションまたは洗浄条件下において，目的とする標的とハイブリダイズすることができ，目的としない核酸には実質的にハイブリダイズしないプライマーである。高レベルの配列同一性が好ましく，これは，少なくとも７５％，少なくとも８０％，少なくとも８５％，少なくとも９０％，少なくとも９５％，より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を含む。
【００６２】
本明細書において用いる場合，"ヌクレオシド"との用語は，すべての修飾したおよび天然に生ずるヌクレオシドを含み，例えば，核酸中に見いだされるすべての形のフラノシドが含まれる。天然に生ずるヌクレオシドとしては，例えば，アデノシン，グアノシン，シチジン，チミジン，およびウリジンが挙げられる。
【００６３】
本明細書において用いる場合，"ヌクレオシド類似体"，"修飾ヌクレオシド"，または"ヌクレオシド誘導体"との用語は，本明細書に記載される合成のヌクレオシドを含む。ヌクレオシド誘導体はまた，修飾された塩基成分を有するヌクレオシドを含み，保護基を有していても有していなくてもよい。そのような類似体としては，例えば，デオキシイノシン，２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシド，５−メチル−２’−デオキシシチジン等が挙げられる。天然に生ずるヌクレオシドに最も一般的に見いだされる塩基環はプリンおよびピリミジン環である。天然に生ずるプリン環としては，例えば，アデニン，グアニン，およびＮ6−メチルアデニンが挙げられる。天然に生ずるプリン環としては，例えば，シトシン，チミン，および５−メチルシトシンが挙げられる。本発明の化合物および方法には，そのような塩基環およびそれらの合成の類似体，ならびに非天然複素環で置換された基部糖，さらには非環状置換基部糖も含まれる。さらに，ヌクレオシド誘導体には，他のプリンおよびピリミジン誘導体，例えば，ハロゲン置換プリン（例えば，６−フルオロプリン），ハロゲン置換ピリミジン，Ｎ6−エチルアデニン，Ｎ6−（アルキル）−シトシン，５−エチルシトシン等が含まれる。ヌクレオシド誘導体および類似体には，広範な範囲の修飾，例えば，米国特許６，７６２，２９８に記載されるものが包含される。
【００６４】
本明細書において用いる場合，"アシル"との用語は，基−Ｃ（Ｏ）Ｒa（Ｒaは，本明細書で定義される水素，低級アルキル，置換低級アルキル，アリール，置換アリール等である）を表す。
【００６５】
本明細書において用いる場合，"置換アシル"との用語は，基−Ｃ（Ｏ）Ｒa'（Ｒa'は，置換低級アルキル，置換アリール，置換ヘテロアリール等である）を表す。
【００６６】
本明細書において用いる場合，"アシルオキシ"との用語は，基−ＯＣ（Ｏ）Ｒb（Ｒbは，水素，低級アルキル，置換低級アルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，ヘテロシクリル，置換ヘテロシクリル，アリール，置換アリール，ヘテロアリール，置換ヘテロアリール等である）を表す。
【００６７】
本明細書において用いる場合，"アルケニル"との用語は，１またはそれ以上の二重結合を有し，および特に記載しない限り約２−約２０個の炭素原子，好ましくは約２−約１０個の炭素原子，より好ましくは約２−約８個の炭素原子，最も好ましくは約２−約６個の炭素原子を含む直鎖または分枝鎖のヒドロカルビルを意味する。アルケニルラジカルの例としては，ビニル，アリル，１，４−ブタジエニル，イソプロペニル等が挙げられる。
【００６８】
本明細書において用いる場合，"アルケニルアリール"との用語は，アルケニル−置換アリール基を表し，"置換アルケニルアリール"とは，さらに本明細書に記載される１またはそれ以上の置換基を有するアルケニルアリール基を表す。
【００６９】
本明細書において用いる場合，"アルケニレン"との用語は，少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有し，および典型的には２−２０個の炭素原子，好ましくは２−１２個の炭素原子，好ましくは２−８個の炭素原子を含む二価直鎖または分枝鎖のヒドロカルビル基を表し，"置換アルケニレン"とは，さらに本明細書に記載される１またはそれ以上の置換基を有するアルケニレン基を表す。
【００７０】
本明細書において用いる場合，"アルキル"との用語は，通常は１−２０個の炭素原子，好ましくは１−８個の炭素原子の単結合炭素の鎖を表し，例としては，メチル，エチル，プロピル，イソプロピル等が挙げられる。そのようなアルキルラジカルの例としては，メチル，エチル，プロピル，イソプロピル，ｎ−ブチル，ｓｅｃ−ブチル，イソブチル，ｔｅｒｔ−ブチル，ペンチル，イソアミル，ヘキシル，オクチル，ドデカニル等が挙げられる。
【００７１】
本明細書において用いる場合，"低級アルキル"との用語は，通常は１−６個の炭素原子，好ましくは２−５個の炭素原子の炭素の直鎖または分枝鎖を表す。例としては，エチル，プロピル，イソプロピル等が挙げられる。
【００７２】
本明細書において用いる場合，"アルキレン"との用語は，１−２０個，好ましくは１−１５個の炭素原子を含む直鎖または分枝鎖の二価のヒドロカルビルを表し，その同じ炭素原子または異なる炭素原子から２つの水素原子が除かれている。アルキレンの例としては，限定されないが，メチレン（−ＣＨ2−），エチレン（−ＣＨ2ＣＨ2−）等が挙げられる。
【００７３】
本明細書において用いる場合，"アルキニル"との用語は，１またはそれ以上の三重結合を有し，約２−２０個の炭素原子，好ましくは約２−１０個の炭素原子，より好ましくは約２−８個の炭素原子，最も好ましくは約２−６個の炭素原子を含む直鎖または分枝鎖のヒドロカルビルを意味する。アルキニルラジカルの例としては，エチニル，プロピニル（プロパルギル），ブチニル等が挙げられる。
【００７４】
本明細書において用いる場合，"アルキニルアリール"との用語は，アルキニル−置換アリール基を表し，"置換アルキニルアリール"とは，さらに本明細書に記載される１またはそれ以上の置換基を有するアルキニルアリール基を表す。
【００７５】
本明細書において用いる場合，"アルコキシ"との用語は，基−ＯＲc（Ｒcは，本明細書で定義される低級アルキル，置換低級アルキル，アシル，アリール，置換アリール，アラルキル，置換アラルキル，ヘテロアルキル，ヘテロアリールアルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，シクロヘテロアルキルまたは置換シクロヘテロアルキルである）を表す。
【００７６】
本明細書において用いる場合，"低級アルコキシ"との用語は，基−ＯＲd（Ｒdは低級アルキルである）を表す。
【００７７】
本明細書において用いる場合，"アルキルアリール"との用語は，アルキル−置換アリール基を表し，"置換アルキルアリール"とは，さらに本明細書に記載される１またはそれ以上の置換基を有するアルキルアリール基を表す。
【００７８】
本明細書において用いる場合，"アルキルカルボニルアミノ"との用語は，基−ＮＲeＣ（Ｏ）Ｒf（Ｒeは任意に置換されていてもよいアルキルであり，Ｒfは水素または低級アルキルである）を表す。
【００７９】
本明細書において用いる場合，"アルキルスルフィニル"との用語は，基−Ｓ（Ｏ）Ｒg（Ｒgは任意に置換されていてもよいアルキルである）を表す。
【００８０】
本明細書において用いる場合，"アルキルスルホニル"との用語は，基−Ｓ（Ｏ）2Ｒg（Ｒgは任意に置換されていてもよいアルキルである）を表す。
【００８１】
本明細書において用いる場合，"アルキルスルホニルアミノ"との用語は，基−ＮＲeＳ（Ｏ）2Ｒf（Ｒeは任意に置換されていてもよいアルキルであり，Ｒfは水素または低級アルキルである）を表す。
【００８２】
本明細書において用いる場合，"アルキルチオ"との用語は，基−Ｓ−Ｒh（Ｒhは低級アルキルまたはアルコキシである）を表す。
【００８３】
本明細書において用いる場合，"置換アルキルチオ"との用語は，基−Ｓ−Ｒi（Ｒiは置換低級アルキルまたはアルコキシである）を表す。
【００８４】
本明細書において用いる場合，"アルキニレン"との用語は，少なくとも１つの炭素−炭素三重結合，および典型的には約２−１２個の炭素原子，好ましくは２−８個の炭素原子を有する二価の直鎖または分枝鎖のヒドロカルビル基を表し，"置換アルキニレン"とは，さらに本明細書に記載される１またはそれ以上の置換基を有するアルキニレン基を表す。
【００８５】
本明細書において用いる場合，"アミド"との用語は，基−Ｃ（Ｏ）ＮＲjＲj'（ＲjおよびＲj'は，独立して，本明細書で定義される水素，低級アルキル，置換低級アルキル，アリール，置換アリール，ヘテロアリール，置換ヘテロアリールであることができる）を表す。
【００８６】
本明細書において用いる場合，"置換アミド"との用語は，基−Ｃ（Ｏ）ＮＲkＲk'（ＲkおよびＲk'は，独立して，水素，低級アルキル，置換低級アルキル，アリール，置換アリール，ヘテロアリール，または置換ヘテロアリールを表すが，ただし，ＲkおよびＲk'の少なくとも１つは水素ではなく，ＲkＲk'は窒素と一緒になって任意に置換されていてもよい複素環またはヘテロアリール環を形成してもよい）を表す。
【００８７】
本明細書において用いる場合，"アミジノ"との用語は，基−Ｃ（＝ＮＲm）ＮＲm'Ｒm"（Ｒm，Ｒm'，およびＲm"は，独立して，水素または任意に置換されていてもよい低級アルキルである）を表す。
【００８８】
本明細書において用いる場合，"アミノ"または置換アミンとの用語は，基−ＮＲnＲn'（ＲnおよびＲn'は，独立して，本明細書で定義される水素，低級アルキル，置換低級アルキル，アリール，置換アリール，ヘテロアリール，または置換ヘテロアリール，あるいは，アシルまたはスルホニルであることができる）を表す。"二価アミン"とは基−ＮＨ−を表す。"置換二価アミン"とは，基−ＮＲ−（Ｒは低級アルキル，置換低級アルキル，アリール，置換アリール，ヘテロアリール，置換ヘテロアリール，アシル，置換アシル，スルホニルまたは置換スルホニルである）を表す。
【００８９】
本明細書において用いる場合，"置換アミノ"または"置換アミン"との用語は，基−ＮＲpＲp'（ＲpおよびＲp'は，独立して，水素，低級アルキル，置換低級アルキル，アリール，置換アリール，ヘテロアリール，置換ヘテロアリール，アシル，置換アシル，スルホニルまたは置換スルホニルであるが，ただし，ＲpおよびＲp'の少なくとも１つは水素ではなく，ＲpＲp'は，窒素と一緒になって，任意に置換されていてもよい複素環またはヘテロアリール環を形成してもよい）を表す。
【００９０】
本明細書において用いる場合，"アリールアルキニル"との用語は，アリール−置換アルキニル基を表し，"置換アリールアルキニル"とは，さらに本明細書に記載される１またはそれ以上の置換基を有するアリールアルキニル基を表す。
【００９１】
本明細書において用いる場合，"アラルキル"との用語は，アルキルの水素原子が本明細書に定義されるアリールで置き換えられている，本明細書に定義されるアルキルを意味する。アラルキルラジカルの例としては，ベンジル，フェネチル，１−フェニルプロピル，２−フェニルプロピル，３−フェニルプロピル，１−ナフチルプロピル，２−ナフチルプロピル，３−ナフチルプロピル，３−ナフチルブチル等が挙げられる。
【００９２】
本明細書において用いる場合，"アロイル"との用語は，ベンゾイル等のアリール−カルボニル種を表し，"置換アロイル"とは，さらに本明細書に記載される１またはそれ以上の置換基を有するアロイル基を表す。
【００９３】
本明細書において用いる場合，"アリールアルキル"との用語は，アリール−置換アルキル基を表し，"置換アリールアルキル"とは，さらに本明細書に記載される１またはそれ以上の置換基を有するアリールアルキルを表す。
【００９４】
本明細書において用いる場合，単独でまたは組み合わせて，"アリール"との用語は，フェニルまたはナフチルを意味し，好ましくは５−７員，より好ましくは５−６員のシクロアルキルと縮合している炭素環であってもよく，および／または，任意にハロ，ヒドロキシ，アルコキシ，アルキルチオ，アルキルスルフィニル，アルキルスルホニル，アシルオキシ，アリールオキシ，ヘテロアリールオキシ，アルキル，アリールまたはヘテロアリール基で任意にモノ−またはジ−置換されていてもよいアミノ，アミジノ；アルキル，アリール，ヘテロアリールまたはヘテロシクリル基で任意に置換されていてもよいウレア；アルキル，アリールまたはヘテロアリール基で任意に置換されていてもよいＮ−モノ−またはＮ，Ｎ−ジ−置換アミノスルホニル，アルキルスルホニルアミノ，アリールスルホニルアミノ，ヘテロアリールスルホニルアミノ，アルキルカルボニルアミノ，アリールカルボニルアミノ，ヘテロアリールカルボニルアミノ等の１−３個の基または置換基で置換されていてもよい。
【００９５】
本明細書において用いる場合，"アリールカルボニルアミノ"との用語は，基−ＮＲqＣ（Ｏ）Ｒr（Ｒqは水素または低級アルキルであり，Ｒrは任意に置換されていてもよいアリールである）を表す。
【００９６】
本明細書において用いる場合，"アリーレン"との用語は，典型的には６から１４個の炭素原子を有する二価の芳香族基を表し，"置換アリーレン"とは，さらに本明細書に記載される１またはそれ以上の置換基を有するアリーレンを表す。
【００９７】
本明細書において用いる場合，"アリールオキシ"との用語は，基−ＯＡｒ（Ａｒはアリールまたは置換アリール基である）を表す。
【００９８】
本明細書において用いる場合，"アリールスルホニルアミノ"との用語は，基−ＮＲqＳ（Ｏ）2Ｒr（Ｒqは水素または低級アルキルであり，Ｒrｈは任意に置換されていてもよいアリールである）を表す。
【００９９】
本明細書において用いる場合，"カルバメート基"は，構造−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ2（各Ｒは，独立して，本明細書に記載されるＨ，アルキル，置換アルキル，アリールまたは置換アリールである）の置換基を包含する。
【０１００】
本明細書において用いる場合，"ジチオカルバメート基"は，構造−Ｓ−Ｃ（Ｓ）−ＮＲ2（各Ｒは，独立して，本明細書に記載されるＨ，アルキル，置換アルキル，アリールまたは置換アリールである）の置換基を包含する。
【０１０１】
本明細書において用いる場合，"炭素環"との用語は，連結された炭素原子から構成される１つの環または複数の縮合環を有する，飽和，不飽和，または芳香族基を意味する。環は，任意に，例えば，ハロゲン，低級アルキル，アルコキシ，アルキルチオ，アセチレン，アミノ，アミド，カルボキシル，ヒドロキシル，アリール，アリールオキシ，複素環，ヘタリール，置換ヘタリール，ニトロ，シアノ，チオール，スルファミド等で置換されていてもよく，未置換であってもよい。
【０１０２】
本明細書において用いる場合，"シクロアルケニル"との用語は３から２０個の範囲の炭素原子を含み，少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する環含有基を表し，"置換シクロアルケニル"とは，さらに本明細書に記載される１またはそれ以上の置換基を有するシクロアルケニル基を表す。
【０１０３】
本明細書において用いる場合，"シクロアルキル"との用語は，３−１５個の炭素原子を含む単環または多数の環のアルキル基を表し，"置換シクロアルキル"とは，さらに本明細書に記載される１またはそれ以上の置換基を有するシクロアルキル基を表す。
【０１０４】
本明細書において用いる場合，"シクロアルキレン"との用語は，約３から約１２個の範囲の炭素原子を含む二価の環含有基を表し，"置換シクロアルキレン"とは，さらに本明細書に記載される１またはそれ以上の置換基を有するシクロアルキレン基を表す。
【０１０５】
本明細書において用いる場合，"グアニジル"との用語は，構造−Ｎ＝Ｃ（ＮＨ2）2を表し，"置換グアニジル"とは，構造−Ｎ＝Ｃ（ＮＲ2）2（各Ｒは，独立して，本明細書に記載されるＨ，アルキル，置換アルキル，アリールまたは置換アリールである）を表す。
【０１０６】
本明細書において用いる場合，"ハロ"または"ハロゲン"との用語は，単独でまたは組み合わせて，すべてのハロゲン，すなわち，クロロ（Ｃｌ），フルオロ（Ｆ），ブロモ（Ｂｒ），ヨード（Ｉ）を意味する。
【０１０７】
本明細書において用いる場合，"ヘテロアリール"との用語は，単独でまたは組み合わせて，８−１０個の原子を有し，独立してＯ，Ｓ，およびＮから選択される１またはそれ以上の，好ましくは１−４個の，より好ましくは１−３個の，さらにより好ましくは１−２個の複素原子を含む，５または６個の環原子を含む単環の芳香族環構造または二環の芳香族基を表し，これは，任意にハロ，ヒドロキシ，アルコキシ，アルキルチオ，アルキルスルフィニル，アルキルスルホニル，アシルオキシ，アリールオキシ，ヘテロアリールオキシ；任意にアルキル，アリールまたはヘテロアリール基でモノ−またはジ−置換されていてもよいアミノ；アミジノ；任意にアルキル，アリール，ヘテロアリールまたはヘテロシクリル基で置換されていてもよいウレア；アルキル，アリールまたはヘテロアリール基で任意にＮ−モノ−またはＮ，Ｎ−ジ−置換されていてもよいアミノスルホニル；アルキルスルホニルアミノ，アリールスルホニルアミノ，ヘテロアリールスルホニルアミノ，アルキルカルボニルアミノ，アリールカルボニルアミノ，ヘテロアリールカルボニルアミノ等の１−３個の基または置換基で置換されていてもよい。ヘテロアリールはまた，酸化されたＳまたはＮ，例えばスルフィニル，スルホニルおよび３級環窒素のＮ−オキシドを含むことが意図される。安定な芳香族環が維持されるような炭素または窒素原子が，ヘテロアリール環構造の結合点である。ヘテロアリール基の例としては，フタルイミド，ピリジニル，ピリダジニル，ピラジニル，キナゾリニル，プリニル，インドリル，キノリニル，ピリミジニル，ピロリル，オキサゾリル，チアゾリル，チエニル，イソオキサゾリル，オキサチアジアゾリル，イソチアゾリル，テトラゾリル，イミダゾリル，トリアジニル，フラニル，ベンゾフリル，インドリル等が挙げられる。置換ヘテロアリールは，利用可能な炭素または窒素で結合して安定な化合物を与える置換基を含む。
【０１０８】
本明細書において用いる場合，"置換ヘテロアリール"との用語は，任意に，１またはそれ以上の官能基，例えば，ハロゲン，低級アルキル，低級アルコキシ，アルキルチオ，アセチレン，アミノ，アミド，カルボキシル，ヒドロキシル，アリール，アリールオキシ，複素環，置換複素環，ヘタリール，置換ヘタリール，ニトロ，シアノ，チオール，スルファミド等でモノ置換またはポリ置換されていてもよい複素環を表す。
【０１０９】
本明細書において用いる場合，"ヘテロアリールカルボニルアミノ"との用語は，基−ＮＲqＣ（Ｏ）Ｒr（Ｒqは水素または低級アルキルであり，Ｒrは任意に置換されていてもよいアリールである）を表す。
【０１１０】
本明細書において用いる場合，"ヘテロアリールオキシ"との用語は，基−ＯＨｅｔ（Ｈｅｔは任意に置換されていてもよいヘテロアリール基である）を表す。
【０１１１】
本明細書において用いる場合，"ヘテロアリールスルホニルアミノ"との用語は，基−ＮＲqＳ（Ｏ）2Ｒs（Ｒqは水素または低級アルキルであり，Ｒsは任意に置換されていてもよいヘテロアリールである）を表す。
【０１１２】
本明細書において用いる場合，"複素環"との用語は，１つの環（例えば，モルホリノ，ピリジルまたはフリル）または複数の縮合環（例えば，ナフトピリジル，キノキサリル，キノリニル，インドリジニルまたはベンゾ［ｂ］チエニル）を有し，環中に炭素原子および少なくとも１つの複素原子，例えばＮ，ＯまたはＳを有する，飽和，不飽和，または芳香族の基を表し，これは任意に，例えば，ハロゲン，低級アルキル，低級アルコキシ，アルキルチオ，アセチレン，アミノ，アミド，カルボキシル，ヒドロキシル，アリール，アリールオキシ，複素環，ヘタリール，置換ヘタリール，ニトロ，シアノ，チオール，スルファミド等で置換されていても未置換であってもよい。
【０１１３】
本明細書において用いる場合，"置換複素環"との用語は，任意に置換されていてもよいアルキル，任意に置換されていてもよいアルケニル，任意に置換されていてもよいアルキニル，ハロ，ヒドロキシ，アルコキシ，アルキルチオ，アルキルスルフィニル，アルキルスルホニル，アシルオキシ，アリール，置換アリール，アリールオキシ，ヘテロアリールオキシ，アミノ，アミド，アミジノ；アルキル，アリール，ヘテロアリールまたはヘテロシクリル基で任意に置換されていてもよいウレア；アルキル，アリールまたはヘテロアリール基で任意にＮ−モノ−またはＮ，Ｎ−ジ−置換されていてもよいアミノスルホニル；アルキルスルホニルアミノ，アリールスルホニルアミノ，ヘテロアリールスルホニルアミノ，アルキルカルボニルアミノ，アリールカルボニルアミノ，ヘテロアリールカルボニルアミノ，アシル，カルボキシル，複素環，置換複素環，ヘタリール，置換ヘタリール，ニトロ，シアノ，チオール，スルホンアミド，およびオキソ，からなる群より選択される，任意の利用可能な点で結合して安定な化合物を与える，１またはそれ以上，例えば，１，２，または３個の置換基で，置換されている複素環である。
【０１１４】
本明細書において用いる場合，"ヒドロカルビル"との用語は，その骨格が炭素および水素のみを含む任意の有機ラジカルを含む。すなわち，ヒドロカルビルは，アルキル，シクロアルキル，アルケニル，シクロアルケニル，アルキニル，アリール，アルキルアリール，アリールアルキル，アリールアルケニル，アルケニルアリール，アリールアルキニル，アルキニルアリール等を包含する。
【０１１５】
本明細書において用いる場合，"置換ヒドロカルビル"との用語は，ヒドロキシ，ヒドロカルビルオキシ，置換ヒドロカルビルオキシ，アルキルチオ，置換アルキルチオ，アリールチオ，置換アリールチオ，アミノ，アルキルアミノ，置換アルキルアミノ，カルボキシ，−Ｃ（Ｓ）ＳＲ，−Ｃ（Ｏ）ＳＲ，−Ｃ（Ｓ）ＮＲ2（各Ｒは，独立して，水素，アルキルまたは置換アルキル，ニトロ，シアノ，ハロ，−ＳＯ3Ｍまたは，−ＯＳＯ3Ｍ（Ｍは，Ｈ，Ｎａ，Ｋ，ＺｎＣａ，又はメグルミンである），グアニジニル，置換グアニジニル，ヒドロカルビル，置換ヒドロカルビル，ヒドロカルビルカルボニル，置換ヒドロカルビルカルボニル，ヒドロカルビルオキシカルボニル，置換ヒドロカルビルオキシカルボニル，ヒドロカルビルカルボニルオキシ，置換ヒドロカルビルカルボニルオキシ，アシル，アシルオキシ，複素環，置換複素環，ヘテロアリール，置換ヘテロアリール，ヘテロアリールカルボニル，置換ヘテロアリールカルボニル，カルバモイル，モノアルキルカルバモイル，ジアルキルカルバモイル，アリールカルバモイル，カルバメート基，ジチオカルバメート基，アロイル，置換アロイル，オルガノスルホニル，置換オルガノスルホニル，オルガノスルフィニル，置換アルキルスルフィニル，アルキルスルホニルアミノ，置換アルキルスルホニルアミノ，アリールスルホニルアミノ，置換アリールスルホニルアミノ，スルホンアミド基，スルフリル等から選択される１またはそれ以上の置換基をさらに有する上述のヒドロカルビル基のいずれかを含み，−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＲ−（Ｒは，水素，アルキルまたは置換アルキルである），−Ｃ（Ｏ）−，−Ｃ（Ｓ）−，−Ｃ（＝ＮＲ’）−，−Ｃ（＝ＣＲ’2）−（Ｒ’は，アルキルまたは置換アルキルである），−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−，−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−，−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ−（または−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−），−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）−，−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ−，−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−，−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−，−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ−，−Ｏ−Ｓ（Ｏ）2−，−Ｏ−Ｓ（Ｏ）2−Ｏ−，−Ｏ−Ｓ（Ｏ）2−ＮＲ−，−Ｏ−Ｓ（Ｏ）−，−Ｏ−Ｓ（Ｏ）−Ｏ−，−Ｏ−Ｓ（Ｏ）−ＮＲ−，−Ｏ−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）−，−Ｏ−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−，−Ｏ−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ−，−ＮＲ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−，−ＮＲ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−，−ＮＲ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ−，−Ｏ−ＮＲ−Ｃ（Ｓ）−，−Ｏ−ＮＲ−Ｃ（Ｓ）−Ｏ−，−Ｏ−ＮＲ−Ｃ（Ｓ）−ＮＲ−，−ＮＲ−Ｏ−Ｃ（Ｓ）−，−ＮＲ−Ｏ−Ｃ（Ｓ）−Ｏ−，−ＮＲ−Ｏ−Ｃ（Ｓ）−ＮＲ−，−Ｏ−Ｃ（Ｓ）−，−Ｏ−Ｃ（Ｓ）−Ｏ−，−Ｏ−Ｃ（Ｓ）−ＮＲ−（または−ＮＲ−Ｃ（Ｓ）−Ｏ−），−ＮＲ−Ｃ（Ｓ）−，−ＮＲ−Ｃ（Ｓ）−ＮＲ−，−Ｓ−Ｓ（Ｏ）2−，−Ｓ−Ｓ（Ｏ）2−Ｏ−，−Ｓ−Ｓ（Ｏ）2−ＮＲ−，−ＮＲ−Ｏ−Ｓ（Ｏ）−，−ＮＲ−Ｏ−Ｓ（Ｏ）−Ｏ−，−ＮＲ−Ｏ−Ｓ（Ｏ）−ＮＲ−，−ＮＲ−Ｏ−Ｓ（Ｏ）2−，−ＮＲ−Ｏ−Ｓ（Ｏ）2−Ｏ−，−ＮＲ−Ｏ−Ｓ（Ｏ）2−ＮＲ−，−Ｏ−ＮＲ−Ｓ（Ｏ）−，−Ｏ−ＮＲ−Ｓ（Ｏ）−Ｏ−，−Ｏ−ＮＲ−Ｓ（Ｏ）−ＮＲ−，−Ｏ−ＮＲ−Ｓ（Ｏ）2−Ｏ−，−Ｏ−ＮＲ−Ｓ（Ｏ）2−ＮＲ−，−Ｏ−ＮＲ−Ｓ（Ｏ）2−，−Ｏ−Ｐ（Ｏ）Ｒ2−，−Ｓ��Ｐ（Ｏ）Ｒ2−，−ＮＲ−Ｐ（Ｏ）Ｒ2−（各Ｒは，独立して，水素，アルキルまたは置換アルキル等である）等のリンカー／スペーサー成分により前記ヒドロカルビル成分に結合した上述の基の２またはそれ以上を含む。
【０１１６】
本明細書において用いる場合，"ヒドロカルビルオキシ"とは，２−２０個の炭素原子を含む−Ｏ−ヒドロカルビル基を表し，"置換ヒドロカルビルオキシ"とは，さらに本明細書に記載される１またはそれ以上の置換基を有するヒドロカルビルオキシ基を表す。
【０１１７】
本明細書において用いる場合，"ヒドロカルビルカルボニル"とは，２−２０個の炭素原子を含む−Ｃ（Ｏ）−ヒドロカルビル基を表し，"置換ヒドロカルビルカルボニル"とは，さらに本明細書に記載される１またはそれ以上の置換基を有するヒドロカルビルカルボニル基を表す。
【０１１８】
本明細書において用いる場合，"ヒドロカルビルオキシカルボニル"とは，２−２０個の炭素原子を含む−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ヒドロカルビルを表し，"置換ヒドロカルビルオキシカルボニル"とは，さらに本明細書に記載される１またはそれ以上の置換基を有するヒドロカルビルオキシカルボニルを表す。
【０１１９】
本明細書において用いる場合，"ヒドロカルビルカルボニルオキシ"とは，２−２０個の炭素原子を含む−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ヒドロカルビル基を表し，"置換ヒドロカルビルカルボニルオキシ"とは，さらに本明細書に記載される１またはそれ以上の置換基を有するヒドロカルビルカルボニルオキシ基を表す。
【０１２０】
本明細書において用いる場合，"ヒドロカルビレン"とは，その骨格が炭素および水素のみを含む任意の二価有機ラジカルを含む。すなわち，ヒドロカルビレンは，アルキレン，シクロアルキレン，アルケニレン，シクロアルケニレン，アルキニレン，アリーレン，アルキルアリーレン，アリールアルキレン，アリールアルケニレン，アルケニルアリーレン，アリールアルキニレン，アルキニルアリーレン等を包含し，"置換ヒドロカルビレン"とは，さらに本明細書に記載される１またはそれ以上の置換基を含む，上述のヒドロカルビレン基の任意のものを表す。
【０１２１】
本明細書において用いる場合，"ヒドロキシル"および"ヒドロキシ"との用語は基−ＯＨを表す。
【０１２２】
本明細書において用いる場合，"オルガノスルフィニル"との用語は，構造−Ｓ（Ｏ）−オルガノを有する置換基を表し，ここで，オルガノは，アルキル−，アルコキシ−，アルキルアミノ−，およびアリール成分，ならびに置換アルキル−，アルコキシ−，アルキルアミノ−，およびアリール成分を包含する。
【０１２３】
本明細書において用いる場合，"オルガノスルホニル"との用語は，構造−Ｓ（Ｏ）2−オルガノを有する置換基を表し，ここで，オルガノはアルキル−，アルコキシ−およびアルキルアミノ−成分，ならびに置換アルキル−，アルコキシ−またはアルキルアミノ−成分を包含する。
【０１２４】
本明細書において用いる場合，"オキソ"との用語は，結合している炭素に二重結合している酸素置換基を表す。
【０１２５】
本明細書において用いる場合，"スルフィニル"との用語は，基−Ｓ（Ｏ）−を表す。
【０１２６】
本明細書において用いる場合，"置換スルフィニル"との用語は，基−Ｓ（Ｏ）Ｒt（Ｒtは，低級アルキル，置換低級アルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，シクロアルキルアルキル，置換シクロアルキルアルキル，ヘテロシクリル，置換ヘテロシクリル，ヘテロシクリルアルキル，置換ヘテロシクリルアルキル，アリール，置換アリール，ヘテロアリール，置換ヘテロアリール，ヘテロアラルキル，置換ヘテロアラルキル，アラルキルまたは置換アラルキルである）を表す。
【０１２７】
本明細書において用いる場合，"スルホニル"との用語は，基−Ｓ（Ｏ）2−を表す。
【０１２８】
本明細書において用いる場合，"置換スルホニル"との用語は，基−Ｓ（Ｏ）2Ｒt（Ｒtは，低級アルキル，置換低級アルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，シクロアルキルアルキル，置換シクロアルキルアルキル，ヘテロシクリル，置換ヘテロシクリル，ヘテロシクリルアルキル，置換ヘテロシクリルアルキル，アリール，置換アリール，ヘテロアリール，置換ヘテロアリール，ヘテロアラルキル，置換ヘテロアラルキル，アラルキルまたは置換アラルキルである）を表す。
【０１２９】
本明細書において用いる場合，"スルホニルアミノ"との用語は，基−ＮＲqＳ（Ｏ）2−（Ｒqは水素または低級アルキルである）を表す。
【０１３０】
本明細書において用いる場合，"置換スルホニルアミノ"との用語は，基−ＮＲqＳ（Ｏ）2Ｒu（Ｒqは水素または低級アルキルであり，Ｒuは，低級アルキル，置換低級アルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，ヘテロシクリル，置換ヘテロシクリル，アリール，置換アリール，ヘテロアリール，置換ヘテロアリール，ヘテロアラルキル，置換ヘテロアラルキル，アラルキルまたは置換アラルキルである）を表す。
【０１３１】
本明細書において用いる場合，"スルフリル"との用語は，構造＝Ｓ（Ｏ）2の置換基を表す。
【０１３２】
本明細書において数値に関して用いる場合，"およそ"および"約"との用語は，示される値の±１０％を意味する。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１】図１は，"ホットスタート"活性化の前にＤＮＡポリメラーゼ媒介性オリゴヌクレオチドプライマー伸長を低下させる化学的修飾（Ｑ）の概略図である。
【図２】図２は，ホスホトリエステル結合が３’末端でポリメラーゼにより伸長されうる未修飾の活性状態のホスホジエステル結合に変換される，熱誘導された分子内フラグメント化の考えられるメカニズムの概略図である。
【図３】図３は，オリゴヌクレオチドプライマーをホスホルアミダイト誘導体で修飾するための一般的合成スキームである。
【発明を実施するための形態】
【０１３４】
発明の詳細な説明
ＰＣＲ等の核酸増幅反応は，オリゴヌクレオチドプライマーの標的核酸へのハイブリダイゼーションを含み，このことによりデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）がポリメラーゼにより取り込まれて，標的配列の多数のコピーが形成される。しかし，増幅反応はしばしばミスプライミングおよびプライマーダイマー形成のために望ましくない生成物を生じ，これはこの方法の効率および正確性に影響を及ぼす。多くの望ましくない生成物は増幅反応の最初の温度上昇の間に生成する。
【０１３５】
本発明は，核酸増幅のための改良された方法および組成物を提供する。特定の観点においては，本発明は，温度依存性核酸増幅反応において増幅オリゴヌクレオチドプライマーを使用することに関する。ある観点においては，増幅オリゴヌクレオチドプライマーは，望ましくない増幅産物の形成を低下させる熱除去可能な修飾基を，好ましくは３’末端に用いることができる。
【０１３６】
化学的に修飾したオリゴヌクレオチドプライマーの使用に基づく戦略はいくつかある。Ｗｉｌｌら（米国特許６，００１，６１１）は，プライマー中の塩基修飾を使用してプライマー−ダイマー形成およびミスプライミングを最小とすることを記載する。Ａｎｋｅｎｂａｕｅｒら（米国特許出願２００３０１１９１５０，ＥＰ１２７５７３５およびＪＰ２００３０３８１８０としても公開）は，熱安定性３’−５’エキソヌクレアーゼにより除去されるリン酸基で３’末端でブロックされているオリゴヌクレオチドプライマーを記載する。Ｕｌｌｍａｎら（米国特許６，４８２，５９０）は，３’末端で修飾されているオリゴヌクレオチドプライマーを開示し，これもエキソヌクレアーゼにより除去される。Ｂｏｎｎｅｒら（米国特許出願２００３０１６２１９９）は，グアニンヌクレオチドにおいてグリオキシルで修飾したオリゴヌクレオチドプライマーを特許請求しており，これは，標的鎖とのハイブリダイゼーションを破壊する熱可逆性共有結合である。
【０１３７】
熱不安定性基は，オリゴヌクレオチドプライマー合成のプロセスにおいて用いられ，文献に記載されている。Ｇｒａｊｋｏｗｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，３  Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，１２８７−９０（２００１）；Ｗｉｌｋ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，４２  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，５６３５−３９（２００１）；Ｗｉｌｋ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，６７  Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６４３０−３８（２００２）；Ｃｉｅｓｌａｋ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，６８  Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１０１２３−２９（２００３）；Ｃｉｅｓｌａｋ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，６９  Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２５０９−１５（２００４）；およびＢｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許６，７６２，２９８を参照。
【０１３８】
１つの観点においては，本発明は核酸を増幅する方法を提供し，この方法は，修飾オリゴヌクレオチドプライマーを用いて核酸を増幅することを含み，ここで，修飾オリゴヌクレオチドプライマーは３’末端に１またはそれ以上の修飾基を含む。修飾基は，増幅の最初の変性工程の間に解離する。１つの態様においては，修飾基としては，式Ｉ，式Ｉａ，式Ｉｂ，式Ｉｃ，式Ｉｄ，式ＩＩ，式ＩＩＩおよび／または式ＩＶの化学基の１またはそれ以上が含まれ，これは本明細書でさらに説明する。
【０１３９】
好ましい態様においては，本発明は，活性状態を有するかまたはその３’−末端に未修飾ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドプライマーと対比して，その３’末端に修飾基を有する少なくとも１つのヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドプライマーである，修飾オリゴヌクレオチドプライマーを提供する。修飾ヌクレオチドの位置を定義する目的では，３’−末端は，オリゴヌクレオチドプライマーの３’−末端の最後の６個のヌクレオチドのいずれか，好ましくは最後の３個のヌクレオチドのいずれかを含む。修飾ヌクレオチドは，これがハイブリダイズしたポリヌクレオチドに沿って鎖を伸長することができず，すなわち，酵素の阻害により，または標的核酸へのハイブリダイゼーションの低下により，伸長可能ではない。したがって，鎖伸長は，修飾または修飾されたヌクレオチドが除去されないかぎり，そして除去されるまで，実質的な程度では生じない。修飾は，ＰＣＲ等の増幅における高温での最初のインキュベーション期間の前に，ＤＮＡポリメラーゼ媒介性オリゴヌクレオチドプライマー伸長を低下させる。本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは，２つの状態を有する。まず，オリゴヌクレオチドプライマーの集団は，最初の変性温度に到達するまで，不活性状態にある。この温度は，通常は９５℃であるが，約８０−１０５℃であってもよく，より好ましくは約８５−１００℃であり，より好ましくは約９０−９６℃である。最初の変性温度に到達すると，オリゴヌクレオチドプライマーは熱的に誘導される分子内フラグメント化により活性となり，修飾オリゴヌクレオチドプライマーは対応する未修飾オリゴヌクレオチドプライマーに変換される。オリゴヌクレオチドプライマーのこの第２の状態は，活性状態のホスホジエステル結合を有し，ポリメラーゼによる伸長が可能である。修飾基の部分的または完全な解離は，好ましくは約９５℃で，約０．１−１２０分間のｔ1/2のインキュベーション後に生ずるが，約１−１２０分間，２−９０分間，好ましくは約２−６０分間，好ましくは約２−４０分間，好ましくは約２−３０分間，好ましくは約２−５分間，好ましくは約４分間，より好ましくは約３分間，さらにより好ましくは約２分間以内に生じてもよい。ある態様においては，解離は温度に関して生じ，酵素，化学物質，またはｐＨ等の増幅反応条件を必要としない。
【０１４０】
本発明の修飾オリゴヌクレオチドプライマーは，２つの状態を有する。修飾オリゴヌクレオチドプライマーの第１の状態は，修飾基の存在のため，最初の変性温度，好ましくは８０℃，または好ましくは８５℃，または好ましくは９０℃，または好ましくは９５℃に到達するまで，不活性状態である。最初の変性温度に到達すると，オリゴヌクレオチドプライマーは熱的に誘導される分子内フラグメント化により活性となり，オリゴヌクレオチドは第２の状態に変換される。オリゴヌクレオチドプライマーのこの第２の状態は，活性状態のホスホジエステル結合を有し，ポリメラーゼによる伸長が可能な，対応する未修飾オリゴヌクレオチドプライマーである。修飾基の解離は，好ましくは，およそ９５℃で，約０．１−１２０分間，または約１−１２０分間，または約２−９０分間，または約２−６０分間，または約２−４０分間，または約２−３０分間，２−１０分間，または約２−８分間，または約２−５分間；または２分間，または５分間または１０分間で生ずる。ある態様においては，解離は温度に関して生じ，酵素，化学物質，またはｐＨ等の増幅反応条件を必要としない。別の態様においては，修飾基は，約８０℃未満，または約８５℃未満，または約９０℃未満では修飾オリゴヌクレオチドから解離しない。
【０１４１】
別の観点においては，本発明は核酸増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーを提供し，ここで，核酸配列は１またはそれ以上の修飾基を含む。好ましくは，修飾基は，式Ｉ，式Ｉａ，式Ｉｂ，式Ｉｃ，式Ｉｄ，式ＩＩ，式ＩＩＩおよび式ＩＶの化学基の１またはそれ以上を含む。好ましい態様においては，修飾オリゴヌクレオチドは約６−７０ヌクレオチドの長さ，好ましくは１０−４５ヌクレオチドの長さ，好ましくは１５−３０，より好ましくは１９−２９の長さである。
【０１４２】
修飾オリゴヌクレオチドプライマーは少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合を有する。別の態様においては，オリゴヌクレオチドプライマーは，オリゴヌクレオチドプライマーの３’−末端で終わる２，３，４，５または６個の修飾ヌクレオチド間結合の連続する配列を含むことができる。さらに別の態様においては，オリゴヌクレオチドプライマーは，複数の非連続的３’修飾ヌクレオチド間結合を含んでいてもよい。修飾オリゴヌクレオチドプライマーの５’−末端も，修飾ヌクレオチド間結合を含むヌクレオチドの配列を有していてもよい。さらに別の態様においては，オリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオチド間結合が修飾されていてもよい。
【０１４３】
別の好ましい態様においては，修飾オリゴヌクレオチドプライマーはオリゴヌクレオチドプライマーの３’ｎヌクレオチド間結合に修飾基を含み，ここでｎは３’末端のヌクレオチド間結合である。さらに別の態様においては，修飾基は，オリゴヌクレオチドの３’ｎ−１，ｎ−２，ｎ−３またはｎ−４ヌクレオチド間結合に存在する。さらに別の態様においては，オリゴヌクレオチドは，ｎ，ｎ−１，ｎ−２，ｎ−３，ｎ−４，ｎ−５またはｎ−６位の２またはそれ以上；好ましくはｎ，ｎ−１，ｎ−２，ｎ−３，ｎ−４，ｎ−５またはｎ−６位の２またはそれ以上；好ましくはｎ，ｎ−１，ｎ−２，ｎ−３，ｎ−４，ｎ−５またはｎ−６位の３またはそれ以上；好ましくはｎ，ｎ−１，ｎ−２，ｎ−３，ｎ−４，ｎ−５またはｎ−６位の４またはそれ以上；好ましくはｎ，ｎ−１，ｎ−２，ｎ−３，ｎ−４，ｎ−５またはｎ−６位の５またはそれ以上，または好ましくはｎ，ｎ−１，ｎ−２，ｎ−３，ｎ−４，ｎ−５またはｎ−６位の６またはそれ以上に修飾基を有する。
【０１４４】
修飾基は，現存の自動化合成および精製方法を用いてオリゴヌクレオチド中に組み込むことができる。本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは，当該技術分野においてよく知られる任意の方法，例えば，シアノエチルホスホルアミダイト前駆体を用いる自動化固相化学合成により合成することができる（Ｂａｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１２  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４０５１（１９８４）），Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｃｈ．１１（２ｎｄ  ｅｄ．１９８９）。他の方法としては，ホスホトリエステルおよびホスホジエステル合成方法を用いることができる（Ｎａｒａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８−９０（１９７９））。修飾および未修飾オリゴヌクレオチドの合成の種々の方法の包括的概観は，Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００６）に見いだすことができる。修飾オリゴヌクレオチドプライマーの合成および精製の後，いくつかの異なる方法を利用して，オリゴヌクレオチドプライマーサイズおよび純度などの許容性を判定することができる。そのような方法の１つはポリアクリルアミドゲル電気泳動である。そのような方法の別のものは高速液体クロマトグラフィー（"ＨＰＬＣ"）である。これらの方法は，当業者にはよく知られている。当該技術分野において現在精製および分離に用いられている方法は，本発明の修飾オリゴヌクレオチドプライマーにも適用可能である。
【０１４５】
本発明の目的を達成する任意の修飾基を利用することができる。修飾基は，修飾オリゴヌクレオチドプライマーを用いる増幅反応の条件下で解離するかまたは除去可能でなければならない。一方，修飾は，本発明の有益性を達成するのに必要な解離の制御を得ることができないほど速く解離してはならないため，修飾オリゴヌクレオチドプライマーの３’−末端の修飾の種類および程度は，一般に，修飾オリゴヌクレオチドプライマーの３’−末端の解離を制御するための上述のパラメータを達成することを目的として経験的に決定される。
【０１４６】
増幅反応中のすべてのオリゴヌクレオチドプライマーが最初に不活性状態である必要はないことが理解されるが，好ましくはオリゴヌクレオチドプライマー状態の混合物は，修飾オリゴヌクレオチドを全く用いない場合と比較して，混合集団において特異性を改良する。好ましくは修飾オリゴヌクレオチドは，全オリゴヌクレオチドの少なくとも３０％，好ましくは全オリゴヌクレオチドの少なくとも７０％，好ましくは全オリゴヌクレオチドの少なくとも８０％，より好ましくは全オリゴヌクレオチドの少なくとも９０％を占める。別の態様においては，フォワードオリゴヌクレオチドのみ，または逆転写オリゴヌクレオチドのみが修飾オリゴヌクレオチドであってもよい。一方向のみの修飾オリゴヌクレオチド，例えばフォワードオリゴヌクレオチドを用いる反応においては，修飾オリゴヌクレオチドは，全フォワードオリゴヌクレオチドの少なくとも５０％，または全フォワードオリゴヌクレオチドの少なくとも６０％，または全フォワードオリゴヌクレオチドの少なくとも７０％，または全フォワードオリゴヌクレオチドの少なくとも８０％，または全フォワードヌクレオチドの少なくとも約９０％を占める。
【０１４７】
１つの観点においては，本発明は，対応するオリゴヌクレオチドが形成されるときに熱により除去可能な修飾基で化学的に修飾したホスホルアミダイトを提供する。各ホスホルアミダイトは，熱不安定性基で修飾することができ，次にこれを，現在の合成方法に適合したオリゴヌクレオチドプライマー合成において用いることができる。修飾ホスホルアミダイトは，オリゴヌクレオチドプライマーの任意の位置に加えることができる。これに対し，グリオキシル修飾はグアニン（ｄＧ）にのみ加えることができる。したがって，修飾の位置は，オリゴヌクレオチドプライマーの配列によって異なる。本発明のオリゴヌクレオチドは，任意の所望の位置に特異的に加えられた修飾基を有することができる。
【０１４８】
さらに別の観点においては，本発明は，本明細書に記載されるヌクレオシド類似体を含有するプライマーを提供する。
【０１４９】
熱安定性ポリメラーゼであるＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ，ならびに他のＤＮＡポリメラーゼは，３’末端に１またはそれ以上のメチルホスホネート修飾ヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドプライマーを容易には伸長しない（Ｓａｕｅｒ，ｅｔ  ａｌ．３０  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，ｅ２２（２００２））。ヌクレオチド間のメチルホスホネート結合（図１）は中性の水性媒体中では活性状態のホスホジエステル結合への熱誘導性変換を生じないと予測されるが，立体的および電子的因子に基づいて，それが生ずるように本発明におけるような代替の修飾を設計することができる。
【０１５０】
本発明の１つの観点は，現在用いられている増幅法に適合した温度で加熱することにより除去可能な保護基で化学的に修飾したオリゴヌクレオチドプライマーを提供する。修飾基は，標的配列との塩基対形成を低下させることができるか，またはポリメラーゼ伸長を阻害する。オリゴヌクレオチドプライマーは，増幅反応が最適温度に到達するまでポリメラーゼにより伸長されることができず，このことはＰＣＲの最初の変性工程と適合し，望ましくない増幅産物を顕著に低下させる。
【０１５１】
修飾基は，室温で安定であることに加えて，オリゴヌクレオチドプライマー合成，クロマトグラフィー等の分離プロセス，アルコール沈殿等の精製プロセス，長期保存および増幅反応調製の条件において安定である。修飾オリゴヌクレオチドは，好ましくは固体としてまたはＤＭＳＯ溶液中で，−８０℃，−２０℃，４℃または室温で保存する。
【０１５２】
別の態様においては，修飾基を有する本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは，実質的にキラル的に純粋である（ＲｐまたはＳｐ）。分離手法は記載されている（Ｓｔｅｃ，ｅｔ  ａｌ．，２６  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，２１９１−２１９４（１９８５），Ｇａｌｌｏ，ｅｔ  ａｌ．，１４  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，７４０５−７４２０（１９８６），Ｋｏｚｉｏｌｋｉｅｗｉｃｚ，ｅｔ  ａｌ．，２６  Ｃｈｅｍ．Ｓｃｒｉｐｔａ，２５１−６０（１９８６）およびＬａＰｌａｎｃｈｅ，ｅｔ  ａｌ．，１４  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，９０８１−９３（１９８６））。
【０１５３】
別の態様においては，修飾基を有するかまたは有しない本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは，目的とする標的核酸に相補的である。好ましくは，オリゴヌクレオチドプライマーは，標的核酸に対して少なくとも７５％，少なくとも８５％，少なくとも８５％，少なくとも９０％，少なくとも９５％，より好ましくは少なくとも９８％相補的である。
【０１５４】
本発明はまた，修飾オリゴヌクレオチドプライマーを含むキットを提供する。例えば，キットは，ＰＣＲ試薬ならびにハウスキーピング遺伝子等の一般的な増幅標的のための修飾オリゴヌクレオチドプライマーを含む。キットは，反応バッファ，ｄＮＴＰｓ，マグネシウム，ポリメラーゼおよび修飾オリゴヌクレオチドプライマーからなる群より選択される１またはそれ以上の核酸増幅試薬を含んでいてもよい。好ましくは，キットは，２またはそれ以上，好ましくは３またはそれ以上，より好ましくは４またはそれ以上の核酸増幅試薬を含む。
【０１５５】
本発明はまた，固相プライマー合成のための修飾ホスホルアミダイト試薬を提供する。これらの試薬は個別に販売してもセットで販売してもよい。これらの試薬は，本明細書に記載される修飾基の１つで修飾した４種の天然のデオキシヌクレオチド（ｄＡ，ｄＣ，ｄＧ，およびｄＴ）のホスホルアミダイトを含むことができる。試薬はまた，本明細書で定義されるヌクレオシド類似体のホスホルアミダイトを含んでいてもよい。
【０１５６】
本発明はまた，固相プライマー合成において用いるための固体支持体試薬を提供する。これらの固体支持体は，式Ｉ，Ｉａ，Ｉｂ，Ｉｃ，Ｉｄ，ＩＩ，ＩＩＩまたはＩＶのヌクレオチド間修飾基をオリゴヌクレオチド中のすべての可能な位置に有する少なくとも２つの結合したヌクレオチドを含む。
【実施例】
【０１５７】
以下の非限定的例を参照して本発明をより詳細に説明する。
【０１５８】
実施例１
ヌクレオシドホスホルアミダイトの合成
修飾ヌクレオシドホスホルアミダイトを合成する第１工程は，ビス（ジイソプロピルアミノ）クロロホスフィンを所望の修飾基のアルコール前駆体と反応させることである。得られるモノエステル化生成物を，触媒としてのジイソプロピルアンモニウムテトラゾリドの存在下で，適当に保護されたヌクレオシドと反応させて，修飾ヌクレオシドホスホルアミダイトを得る。Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）フタルイミド，４−オキソ−１−ペンタノール，および４−メチルチオ−１−ブタノールのアルコール類は市販されているが，３−（Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルカルボキサミド）−１−プロパノールはＷｉｌｋ，Ａ．ら（６７Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６４３０−３８（２００２）により公表されている方法にしたがって製造することができる。合成オリゴヌクレオチドプライマー中のホスホトリエステルフラグメントの安定性が低いことを予想して，ヌクレオシド塩基を超穏和保護基または伝統的な保護基で保護した。ここで，超穏和塩基保護基としては，アデニンおよびシトシン用にはフェノキシアセチル，グアニン用にはイソプロピル−フェノキシアセチルが挙げられる。
【０１５９】
２’−デオキシアデノシンデオキシアデノシン，２’−デオキシシトシン，２’−デオキシグアノシン，および２’−デオキシチミジンについて修飾ホスホルアミダイトを製造した後，１個の３’−ヌクレオチド間ＰＴＥ基を含むモデルテトラヌクレオチド配列を合成した。修飾ホスホルアミダイトとＣＰＧ支持体に結合した５’−ＯＨヌクレオシドとのカップリングは，手動でまたは自動合成装置で行うことができる。今回は，８９０９  Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを，製造元により示唆されるプロトコルにしたがって用いた。
【０１６０】
テトラヌクレオチド３’−ホスホトリエステル誘導体は，メタノール中５０ｍＭ炭酸カリウムで数時間処理することにより脱保護しＣＰＧ支持体から切断した。逆相ＨＰＬＣ精製（酢酸トリエチルアンモニウムバッファ（ｐＨ７．２）中のアセトニトリルの勾配）を用いて，４−メチルチオ−１−ブタノール（ＭＴＢ），４−オキソ−１−ペンタノール（ＯＸＰ），および３−（Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルカルボキサミド）−１−プロパノール（ＴＢＣＡ）基を含有する３’−ホスホトリエステルテトラヌクレオチドを単離した。ほとんどの場合，合成，脱保護および支持体からの切断の間に用いられた条件により，ＰＴＥ機能が部分的に失われた（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）フタルイミドＰＴＥ基（ＥＰＨ）については，これらの工程の間に完全な脱保護が生じた）。さらに最適化することにより，ＰＴＥ官能基の分解の程度を相当低下させることができる。単離されたそれぞれの３’−ホスホトリエステルテトラヌクレオチドは，−７０℃で凍結溶液中に保存した場合，数か月間安定であることが示された。テトラヌクレオチド配列の他に，ＰＣＲに適したより長いＰＴＥ保護オリゴヌクレオチド配列も調製した。下記の表１にその例を示す。
【０１６１】
【表１】
0005558811.tif 000028
【０１６２】
実施例２
ＰＴＥ修飾オリゴヌクレオチドの対応するＰＤＥ配列への速度論的変換
３’−ホスホトリエステル（ＰＴＥ）修飾テトラヌクレオチド配列の対応するホスホジエステル（ＰＤＥ）配列への脱保護の速度論を，"中性"ｐＨ（アセトニトリル酢酸トリエチルアンモニウムの混合物中，ｐＨ７．２）またはＰＣＲバッファ（２５℃でｐＨ８．４）において，２０℃，５０℃，および９５℃で調べた。いずれのバッファにおいても，ＰＴＥ含有オリゴヌクレオチドプライマーについて同様の脱保護速度論が示された。
【０１６３】
ＰＴＥ−修飾オリゴヌクレオチドプライマーの対応するＰＤＥ配列への変換のｔ1/2は，ＯＸＰ，ＭＴＢ，およびＴＢＣＡテトラヌクレオチド３’−ホスホトリエステル誘導体について，９５℃で＞１分間から１０分間の範囲であると測定された。より低い温度（５０℃）では，脱保護の速度がより遅く，ｔ1/2は１０から１０５分間の範囲であった。室温（２０℃）では，ｔ1/2は３から＞１００時間であった。ホットスタートＰＣＲ技術における適切な応用のためには，ＰＴＥ基は，最適には合成および脱保護条件（２０℃）の間安定であり，かつ高温（９５℃）で容易に除去可能であるべきである。
【０１６４】
実施例３
ホスホルアミダイトの大量合成
ｄＡ，ｄＧ，ｄＣおよびｄＴの保護された３’−ホスホルアミダイトのスケールアップ合成および数グラム量の製造（出発スケール５ｇ）のためには，図３に示される２工程−１ポット法を用いた。上述と同様に，ヌクレオシド塩基の環外アミノ基について超穏和保護基を用いた。５’−ＤＭＴ保護ヌクレオシド３’−ホスホルアミダイトは，シリカゲルクロマトグラフィーで５０−７０％の総収率で単離し，固体は室温で少なくとも２週間安定であることが示された。ヌクレオシド３’−ホスホルアミダイトは少なくとも１年間の低温保存（約−７０℃から−１００℃）で安定であるはずであると見込まれる。
【０１６５】
実施例４
ＰＴＥおよびＰＤＥのＤＮＡポリメラーゼ伸長の比較
ＨＩＶ−１（Ｑ．Ｃｈｏｕ，ｅｔ  ａｌ．）およびラムダＤＮＡ標的について，ＰＴＥ修飾を含む一連のフォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマーを製造した。各標的について，一方の組は３’−ヌクレオチド間結合にホスホトリエステル基を含み，他方の組は活性状態のホスホジエステル結合を対応する位置に含むものであった。これらのオリゴヌクレオチドプライマーを選択したのは，未修飾のＰＤＥオリゴヌクレオチドプライマーがＰＣＲの間にプライマー−ダイマーを形成することが示されたためである。修飾ホスホルアミダイトとＣＰＧ−固体支持体に結合した５’−ＯＨヌクレオシドとの最初のカップリングは手動で行ったが，合成の残部は８９０９  Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒで製造元の示唆するプロトコルを用いて行った（１μモルスケール）。メタノール中５０ｍＭ炭酸カリウムを用いて，オリゴヌクレオチドプライマーを脱保護し，ポリマー支持体から切断した。逆相ＨＰＬＣ精製（トリエチルアンモニウムアセテートバッファ（ｐＨ７．２）中のアセトニトリルの勾配を用いる）により，３’−ホスホトリエステル修飾オリゴヌクレオチドプライマーを精製および単離することができた。単離したＰＴＥオリゴヌクレオチドプライマーは，凍結溶液中で−２０℃で保存した場合，数か月間安定であることが示された。
【０１６６】
単離したＰＤＥおよびＰＴＥプライマーを相補的テンプレートにアニーリングさせ，ＤＮＡポリメラーゼ伸長実験に供した。これらの実験の対照として，ＰＤＥおよびＰＴＥプライマーのアリコートを，９５℃でＰＴＥ基が除去されるのに必要な時間加熱し，プライマー伸長実験に含めた。プライマー伸長実験は，ＰＴＥ官能基の大きな喪失を回避するために，フラグメントＤＮＡポリメラーゼＩおよびＴａｑＤＮＡポリメラーゼの両方について室温で行った。プライマー伸長の速度をモニターするために，２−８０分間の期間にわたって特定の時間間隔でアリコートを採取し，ドライアイス上でＥＤＴＡを加えてクエンチした。伸長の進行は，変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により評価した。興味深いことに，非加熱のＰＴＥ−修飾プライマーは，ゲル電気泳動で，対応するＰＤＥオリゴヌクレオチドプライマー（加熱および非加熱）および加熱したＰＴＥオリゴヌクレオチドプライマーよりゆっくり移動することが認められた。
【０１６７】
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメントが，３’−ＰＴＥ修飾オリゴヌクレオチドプライマー（および未修飾ＰＤＥ対照オリゴヌクレオチドプライマー）のテンプレート依存性伸長を行う能力を調べた。増幅反応条件下で，標準的ＰＤＥプライマーは伸長されて全長伸長産物を生ずることができるが，ＰＴＥオリゴヌクレオチドプライマーはクレノーフラグメントＤＮＡポリメラーゼＩによってほとんど伸長されないことがわかった。プライマー伸長反応の間，ＰＴＥオリゴヌクレオチドプライマーを含む反応についてトランケート型の伸長産物がわずかに蓄積した。これは，伸長反応の間にＰＴＥオリゴヌクレオチドプライマーが部分的に脱保護されたか，または１つのＰＴＥ立体異性体の優先的伸長が生じたためであろう。ＰＤＥおよびＰＴＥオリゴヌクレオチドプライマーを９５℃で前加熱すると，オリゴヌクレオチドプライマーの伸長はもはや障害されず，ＰＤＥオリゴヌクレオチドプライマーと一致した。最も詳細な伸長実験はＤＮＡポリメラーゼＩの中温性のクレノーフラグメントを用いて行ったが，ＰＣＲに適したＤＮＡポリメラーゼである高温性ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いた場合にも同様の結果が得られた。総合して，ＰＴＥ含有オリゴヌクレオチドプライマーの伸長能力は，対応する活性状態のＰＤＥオリゴヌクレオチドプライマーと比較して有意に低下した。これは本発明の"ホットスタート"ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーの必須の判定基準である。
【０１６８】
実施例５
テンプレート非依存性ＰＣＲにおけるＰＴＥオリゴヌクレオチドプライマーの性能
オリゴヌクレオチドプライマー伸長実験（実施例４）においてＰＴＥオリゴヌクレオチドプライマーの伸長能力が低かったため，ＰＴＥオリゴヌクレオチドプライマーは，ＤＮＡポリメラーゼの伸長能力を制限することにより，サンプル調製およびＰＣＲの最初の加熱工程の間に形成されるプライマー−ダイマーの量を著しく減少させるはずであると結論づけられた。ＰＴＥ修飾基がプライマー−ダイマー形成に及ぼす影響をさらに研究するために，テンプレートの非存在下でプライマーダイマーを高収率で生成するＰＣＲ条件を調べた。すなわち，ｔａｔＨＩＶ−１遺伝子を標的とするＰＴＥ−修飾オリゴヌクレオチドプライマーを，ＴａｑＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲ増幅の前に，ＰＣＲバッファ（２５℃でｐＨ８．４）中で９５℃で増加する時間で前加熱した。ＰＴＥプライマーを段階的に増加する時間で前加熱することにより，プライマーダイマー形成に及ぼすＰＴＥ修飾の影響を評価することができる。プライマーダイマーは，アガロースゲル電気泳動で５０−８０塩基対フラグメントとして流れ，これを検出した。
【０１６９】
ＨＩＶ−１オリゴヌクレオチドプライマー対については，プライマー−ダイマーを形成するオリゴヌクレオチドプライマーの濃度は４．５μＭであり，一般に推奨されるより約５倍高く，ＰＣＲサイクルパラメータは以下のとおりであった：９５℃で２分間；［９５℃で４０秒間；５６℃で３０秒間；７２℃で２分間］を３０サイクル；７２℃で７分間．ＰＣＲの前の対応するＰＴＥオリゴヌクレオチドプライマーの前ＰＣＲ加熱処理の間では，生成したＰＤＥオリゴヌクレオチドプライマーの量はＰＴＥオリゴヌクレオチドプライマーを前加熱した時間に比例するはずである。形成されたＰＤＥオリゴヌクレオチドプライマーの割合が増加すればするほど，ＰＣＲの間にプライマー−ダイマーが形成される確率が増加することが見いだされた。０−４０分間の前インキュベーション時間については，形成されるプライマーダイマーの量は前ＰＣＲ加熱の時間に比例し，比率は９５℃においてＰＴＥオリゴヌクレオチドプライマーがＰＤＥオリゴヌクレオチドプライマーに変換される速度と正に相関する。しかし，ＰＴＥオリゴヌクレオチドプライマーを長い時間前加熱処理すると（８０および１５０分間），プライマーダイマー形成の量は低下し，これはおそらく脱プリン反応によるオリゴヌクレオチドプライマーの分解のためである。全体として，ＰＣＲにおけるオリゴヌクレオチドプライマーダイマー形成のレベルはＰＴＥ−オリゴヌクレオチドプライマーを使用することにより有意に低下した。
【０１７０】
実施例６
ＰＣＲにおけるＰＴＥオリゴヌクレオチドプライマーの性能
ラムダＤＮＡおよびＨＩＶ−１ＤＮＡプライマーについて，テンプレートの存在下で未修飾のＰＤＥオリゴヌクレオチドプライマーを用いて，プライマー−ダイマーを効率的に形成するＰＣＲ条件を確認した。ＨＩＶおよびラムダＤＮＡテンプレートを標的とするオリゴヌクレオチドプライマーを用いた場合，テンプレートの存在下でプライマーダイマーを効率よく形成する最適条件は，フォワードおよびフォワードオリゴヌクレオチドプライマーの両方の濃度１−２μＭ，５−４０，０００コピーのテンプレート，１．５−２．０ｍＭのＭｇＣｌ2を用いるものであった。
【０１７１】
用いたＰＣＲサイクルパラメータは次のとおりである：９５℃で２分間；９５℃で４０秒間；５６℃で３０秒間；７２℃で２分間を４０サイクル；７２℃で７分間。反応の進行は，サイクル３０，３５，および４０の後にアリコートを採取し，アガロースゲル電気泳動で分析することによりモニターした。
【０１７２】
ラムダおよびＨＩＶ−１ＤＮＡ標的の両方について，非加熱ＰＴＥ修飾オリゴヌクレオチドプライマー（ＰＴＥ０℃）は，未加熱の未修飾ＰＤＥオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＤＥ０℃）と比較して，ＰＣＲの結果を大きく改善することが判明した。それぞれの場合において，加熱していないＰＴＥオリゴヌクレオチドプライマーはプライマー−ダイマー形成の量の顕著な低下，および対応してアンプリコン形成の増加を示した。
【０１７３】
ＰＣＲにおけるＰＴＥオリゴヌクレオチドプライマーの改善された結果が，ＰＤＥおよびＰＴＥオリゴヌクレオチドプライマーの調製および取り扱いの相違に起因するものではないことを確認するために，ＰＴＥオリゴヌクレオチドプライマーを対応するＰＤＥオリゴヌクレオチドプライマーに変換するためにＰＣＲバッファ中で前加熱した。次に，加熱したＰＴＥオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＴＥ９５℃）および加熱したＰＤＥオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＤＥ９５℃）を用いてＰＣＲを行ったところ，未加熱ＰＤＥオリゴヌクレオチドプライマーより高い程度ではないにしても同様に，プライマーダイマーが形成されたことが見いだされた。ラムダＤＮＡおよびＨＩＶ系（サイクル３５について）について，アンプリコンとプライマーダイマーのバンドを統合すると，未加熱ＰＴＥオリゴヌクレオチドプライマーについて，ＰＤＥオリゴヌクレオチドプライマーまたは加熱したＰＴＥオリゴヌクレオチドプライマーのいずれかを用いて行ったＰＣＲ増幅と比較して，アンプリコン対プライマーダイマーの比がはるかに高いことがわかった。すべての増幅反応について，アンプリコン対プライマーダイマーの比率を未加熱ＰＴＥオリゴヌクレオチドプライマーについての比率に対して正規化したところ，ラムダＤＮＡおよびＨＩＶ−１ＤＮＡ系のいずれについても，アンプリコン形成についてのＰＣＲの特異性の顕著な改善が見られた。ＰＴＥオリゴヌクレオチドプライマーは，ＰＣＲの性能の２．６〜１５倍の改良を引き起こした。総合的に，ＰＤＥオリゴヌクレオチドプライマーと比較して，ＰＣＲにおける本発明のホットスタートＰＴＥオリゴヌクレオチドプライマーの有用性が明らかとなった。プライマーダイマーの量は顕著に減少し，同時にアンプリコンの生成は増加した。
【０１７４】
実施例７
リバーストランスクリプターゼＰＣＲにおけるＰＴＥオリゴヌクレオチドプライマーの性能
Ｋｉｅｌａｒ，Ｄ．ら（４７  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０８９−２０９７（２００１））に記載されるようにして，ハウスキーピング遺伝子であるポルホビリノゲン・デアミナーゼ（ＰＢＧＤ）の検出に用いられる２工程ＲＴ−ＰＣＲ系用にＰＴＥ−修飾プライマーを用意した。配列番号１６のフォワードプライマー（５’−ＧＡＧＴＧＡＴＴＣＧＣＧＴＧＧＧＴＡＣＣ）および配列番号１７のリバースプライマー（５’−ＧＧＣＴＣＣＧＡＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣ）を，各プライマーについて３’末端の位置に２つのＰＴＥ修飾を含むよう作成した。２６４ｂｐのアンプリコン生成物の検出を用いて２工程プロトコル系を確認した。
【０１７５】
２工程プロトコルは逆転写および続くＰＣＲ増幅を含む。用いた逆転写条件は，２０μＬの反応液中，０．４μＭのオリゴ（ｄＴ）プライマー，０または１μｇのヒト肝臓総ＲＮＡ，および１５ＵのクローニングしたＡＭＶリバーストランスクリプターゼであった。反応液を以下のリバーストランスクリプターゼ熱サイクルプロトコルに供した：２５℃で１０分間；４２℃で６０分間；９５℃で５分間。完了後，逆転写産物を１：１０に希釈し，一連のＰＣＲ反応のテンプレートとして用いた。２組のＰＣＲ反応を用意した。第１の組は，未修飾ＰＤＥプライマーを０．５μＭで含み，第２の組はＰＴＥ修飾プライマーを０．５μＭで含んでいた。各組の反応は，３回の反応を含み，それぞれ異なるテンプレートを用いるものである：反応ａ）水，反応ｂ）０μｇのヒト肝臓総ＲＮＡ逆転写産物，および反応ｃ）１μｇのヒト肝臓総ＲＮＡ逆転写産物。すべてのＰＣＲ反応は，１．２５ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含み，容量は５０μＬであった。混合物を以下の熱サイクルプロトコルに供した：９４℃で１０分間；［９４℃で３０秒間，６０℃で３０秒間，７２℃で３０秒間］を４０サイクル。次に反応生成物をアガロースゲル分析により分析した。両方の組からの反応ａ）およびｂ）は陰性対照として機能した。陰性対照については，未修飾のＰＤＥプライマーは相当量のプライマーダイマーを形成したが，修飾したＰＴＥプライマーは検出可能なプライマーダイマー形成を示さなかった。ＰＤＥおよびＰＴＥプライマーの両方について，反応ｃ）は所望の２６４ｂｐの生成物を形成した。しかし，陰性対照について明らかであったように，ＰＤＥプライマー反応は相当量のプライマーダイマー形成を含むのに対し，ＰＴＥプライマー反応はそうではなかった。総合して，２工程ＲＴ−ＰＣＲにおけるＰＴＥ−修飾プライマーの利点は明らかであり，修飾プライマーは望ましくないプライマーダイマーの形成を抑制した。
【０１７６】
また，同じプライマー対を１工程ＲＴ−ＰＣＲプロトコルにおいて用いた。２工程プロトコルと同様に，２組の反応を用意した。第１の組は未修飾ＰＤＥプライマーを０．５μＭで含み，第２の組はＰＴＥ修飾プライマーを０．５μＭで含む。各組は３回の反応を含み，反応ｂ）およびｃ）は陰性対照である。反応ａ）は０．２５μｇのヒト肝臓総ＲＮＡおよび２５ＵのＭＭＬＶリバーストランスクリプターゼから構成され，反応ｂ）は０．２５μｇのヒト肝臓総ＲＮＡおよび０ＵのＭＭＬＶリバーストランスクリプターゼから構成され，反応ｃ）は０μｇのヒト肝臓総ＲＮＡおよび２５ＵのＭＭＬＶリバーストランスクリプターゼから構成された。反応はすべてオリゴ（ｄＴ）プライマーを５μＭで，および０．３ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含み，容量は２５μＬであった。反応液は次のとおりインキュベートした：４２℃で６０分間；９４℃で５分間；［９４℃で３０秒間，６０℃で３０秒間，７２℃で５分間］を３０回；および７２℃で５分間。反応生成物はアガロースゲル電気泳動により分析した。両方のプライマー対について，ＲＴなしの対照であるｂ）は同じに現れ，ゲルにわずかのにじみが現れた。これはおそらくサンプル中における総ＲＮＡの存在のためであろう。ＲＮＡなしの対照であるｃ）については，ＰＤＥプライマーは低分子量のプライマーダイマーのバンドを示したが，ＰＴＥプライマーは検出可能な増幅産物を示さなかった。低分子量のプライマーダイマーのバンドはおそらくリバーストランスクリプターゼにより媒介されるＰＤＥ  ＰＣＲプライマーの伸長によるものであり，これは先に議論されている（Ｐｅｔｅｒｓ，Ｉ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，２８６  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０３−２１７（２００４））。反応ａ）については，両方のプライマー対は所望の２６４ｂｐの生成物を形成した。しかし，ＰＤＥプライマーの反応生成物は，反応ｂ）において見られたプライマーダイマーのバンド等のいくつかの増幅産物を含んでいたが，ＰＴＥプライマーは追加の増幅産物なしで所望の反応生成物を形成した。逐次酵素反応，例えば１工程ＲＴ−ＰＣＲにおいてＰＴＥ−修飾プライマーを用いることにより，低温逆転写反応の間に遺伝子特異的プライマーの伸長を部分的または完全にブロックすることが可能となる。
【０１７７】
特にそうではないと定義しない限り，本明細書において使用されるすべての技術的および科学的用語は本発明が属する分野における通常の技術者が共通して理解するのと同じ意味を有する。
【０１７８】
本発明について本明細書に例証的に記載したが，任意の要素（単数または複数），制限（単数または複数）を除いて好適に実施してもよく，それらについては本明細書に特に開示しない。従って，例えば"を有する"，"を含む"，"を含有する"などの用語は，制限なしに広範に読み取ってもよい。更に，本明細書で使用する用語および表現は用語の説明として用いるものであって，制限するものではない。それらの用語および表現の使用においては，明示または記載する特性の等価物またはその一部のいずれをも除外することを意図せず，認識されるように，本発明の特許請求の範囲内で種々の改変を行うことができる。
【０１７９】
従って，好ましい態様および任意の特徴によって本発明を具体的に開示したが，当業者は本明細書において具体化される本発明の改変，改良，および変更の手段をとってもよく，それらの改変，改良，および変更は本発明の範囲内に含まれるとみなされることが理解されるべきである。本明細書に記載する物質，方法，および実施例は好ましい態様を表すものであり，例証であって，本発明の範囲を制限することを意図しない。
【０１８０】
本発明について，本明細書において広範かつ一般的に記載した。包括的な開示の中に含まれるより狭い分類および亜群もそれぞれ本発明の一部を成す。これには，その属から対象物を除外する条件または負の限定付きの本発明の包括的な説明が含まれ，除外されたものが本明細書に具体的に記載されているか否かは関係がない。
【０１８１】
更に，本発明の特徴または観点がマーカッシュグループで記載される場合，当業者に認識されるように，本発明はマーカッシュグループの任意の個別メンバーまたはメンバーのサブグループについて記述される。
【０１８２】
本明細書に記載される全ての刊行物，特許出願，特許，および他の文献は，そのそれぞれが個別で参照により組み込まれるのと同じ程度に，参照によりその全体が明確に本明細書に組み込まれる。不一致がある場合は，本明細書（定義を含む）が優先する。
【０１８３】
他の態様は添付の特許請求の範囲に記載される。
【図１】
0005558811.tif 000046
【図２】
0005558811.tif 000047
【図３】
0005558811.tif 000048
【配列表】
0005558811000001.xml