(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イオン化室と、イオン、中性粒子、電子、並びにレーザー光の中から選ばれる一つの一次ビームを測定対象物質に照射する手段と、前記一次ビームで脱離・イオン化された前記測定対象物質の質量情報を得る手段と、を有する質量分析装置であって、
基板上に、少なくとも、下記式（１）で表される官能基を１分子中に２個以上有し、かつ沸点が１５０℃以上であるイオン化剤と、前記測定対象物質とを載置する手段を有しており、
前記基板上に載置される前記イオン化剤は、溶媒と、該イオン化剤とを含む組成物として前記基板上に付与されるものであり、
前記質量分析用イオン化剤と測定対象物質に、前記一次ビームを照射することを特徴とする質量分析装置。
【化１】
0005518152.tif 000017
【請求項２】
前記イオン化室が高真空状態にすることが可能なイオン化室であり、前記溶媒が蒸発するが前記イオン化剤が蒸発しない高真空状態で前記イオン化剤と測定対象物質に、前記一次ビームを照射する請求項１に記載の質量分析装置。
【請求項３】
前記一次ビームを照射する場所を変えることにより、取得した質量情報に基づいて測定対象物質の分布状態に関する情報を得ることを特徴とする請求項１に記載の質量分析装置。
【請求項４】
イオン、中性粒子、電子、並びにレーザー光の中から選ばれる一つの一次ビームを用いて、測定対象物質を脱離・イオン化する工程を含む質量分析に用いる質量分析用組成物であって、前記質量分析用組成物が、溶媒と、イオン化剤とを含み、該イオン化剤が下記式（１）で表される官能基を１分子中に２個以上有し、かつ常圧における沸点が１５０℃以上であることを特徴とする質量分析用組成物。
【化２】
0005518152.tif 000018
【請求項５】
前記イオン化剤が、波長３３０ｎｍ以上３７０ｎｍ以下の紫外線を吸収しないことを特徴とする請求項４に記載の質量分析用組成物。
【請求項６】
前記イオン化剤が下記一般式（２）で表される化合物であることを特徴とする請求項４または５に記載の質量分析用組成物。
【化３】
0005518152.tif 000019
（式中、ｎは２以上７以下の整数を表す。）
【請求項７】
前記溶媒が、極性溶媒を含む請求項４から６のいずれかに記載の質量分析用組成物。
【請求項８】
前記溶媒が、沸点が１５０℃以下の溶媒である請求項４から７のいずれかに記載の質量分析用組成物。
【請求項９】
前記溶媒が、水、エタノール、メタノール、プロピルアルコール、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ＤＭＳＯ、ベンゼン、トルエン、ジクロロメタン、トリクロロメタン、アセトン、メチルエチルケトンから選択される少なくとも一種を含む請求項４から８のいずれかに記載の質量分析用組成物。
【請求項１０】
基板上に、少なくとも、下記式（１）で表される官能基を１分子中に２個以上有し、かつ沸点が１５０℃以上であるイオン化剤と、測定対象物質とを載置する工程、前記イオン化剤と前記測定対象物質に、イオン、中性粒子、電子、並びにレーザー光の中から選ばれる一つの一次ビームを照射する工程を有し、
前記イオン化剤は、溶媒と、該イオン化剤とを含む組成物として前記基板上に付与することを特徴とする質量分析方法。
【化４】
0005518152.tif 000020
【請求項１１】
前記一次ビームの照射位置を変えることにより、取得した質量情報に基づいて測定対象物質の分布状態に関する情報を得ることを特徴とする請求項１０に記載の質量分析方法。
【請求項１２】
前記溶媒が、極性溶媒を含む請求項１０または１１に記載の質量分析方法。
【請求項１３】
前記溶媒が、沸点が１５０℃以下の溶媒である請求項１０から１２のいずれかに記載の質量分析方法。
【請求項１４】
前記溶媒が、水、エタノール、メタノール、プロピルアルコール、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ＤＭＳＯ、ベンゼン、トルエン、ジクロロメタン、トリクロロメタン、アセトン、メチルエチルケトンから選択される少なくとも一種を含む請求項１０から１３のいずれかに記載の質量分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イオン、中性粒子、電子、並びに、レーザー光の中から選ばれる一つの一次ビームを用いて、測定対象物質を脱離・イオン化する工程を含む質量分析に用いる質量分析用組成物、質量分析装置及び質量分析方法に関する。
【０００２】
また、本発明は、イオン、中性粒子、電子、並びに、レーザー光の中から選ばれる一つの一次ビームを用いて、測定対象物質を脱離・イオン化する工程を含む質量分析装置により、測定対象物を構成する構成物、特にタンパク質等の有機物を種類ごとにイメージング検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
質量分析装置は、測定対象物質を何らかの方法でイオン化し、これに電界あるいは磁界を作用させ、質量／電荷数（ｍ／ｚ）に従って分離した後、電気的に検出した質量スペクトルから測定対象物の定性分析、定量分析を行うものである。この場合、イオン化法としては、電子スプレイイオン化（ＥＳＩ）、電子衝撃イオン化（ＥＩ）、化学イオン化（ＣＩ）、高速原子衝撃（ＦＡＢ）、フィールドデソープション（ＦＤ）、レーザー脱離イオン化（ＬＤＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、元素イオン、元素のクラスターイオン、或いは分子イオン等を照射する２次イオン質量分析（ＳＩＭＳ）などの各種方法がある。例えば、レーザイオン化質量分析計では、試料にパルスレーザ光を照射してイオン化し、そのイオンを飛行時間型等の分析部に導くことで質量スペクトルなどを測定することができる。
【０００４】
ここで、測定対象物質の質量が測定可能になる条件としては、まず検体中に含まれる測定対象物質が分子単位に独立した状態が形成されることと、分子単位に独立したものが正または負の電荷を有することとが必要となる。上述の質量分析方法のうち、特にＭＡＬＤＩ方式は、これまで測定が困難であったポリマー材料や蛋白質といった高分子量の分子を測定できるため、近年、様々な分野で盛んに利用されている。これは、ＭＡＬＤＩ方式ではマトリックスを使用するために、測定分子同士の相互作用が弱められ、結果として測定分を分子単位で孤立して取り出す効率が高まったこと、及び、マトリックス自身がレーザー照射による反応によって測定対象分子のイオン化を行える可能性があるため、先に述べた質量分析を可能とする二つの要件を満たす事ができるためと推測されている。
【０００５】
電荷が付与された測定物質としては、測定物質から電子が引き抜かれたラジカルカチオン、測定物質に電子を付与したラジカルアニオン、測定分子にプロトンやアルカリ金属や銀などの陽イオン付加したカチオン、ハロゲンなどの陰イオン付加あるいは脱プロトンによるアニオン等が挙げられる。特に蛋白質などの生体分子では、多くの極性基を有しており、プロトン付加によるカチオン化することで、比較的感度よく質量分析が可能となる。
【０００６】
また、近年、レーザー照射型の質量分析においても、マトリックスを使用する代わりに、多孔質シリコン等を用いることで、比較的感度よく、かつ、マトリックス由来の共雑物のピークが少ない状態での質量分析が可能となっており、注目を集めている。多孔質基板による質量分析の作用効果は不明であるが、平坦な基板に比べ、比表面積が広いために、測定対象分子の吸着点が多く、基板上で測定対象分子が凝集する割合が減ったために、結果として、レーザー照射による１分子単位で脱離する割合が増えたものと考えられる。
【０００７】
一方、近年、質量分析によるイメージング技術に対する注目が集まっている。これは、例えば腫瘍細胞等の生体組織や、半導体ウエハー等の電子材料において、発現している蛋白質や表面に付着している不純物の場所を特定することが強く求められているためである。
【０００８】
質量分析によるイメージング技術においては、測定対象分子の脱離・イオン化を行う工程が、集束したイオンやレーザー光を照射するタイプの装置が適している。特に、ＳＩＭＳでは、表面に付着しているものを、ガリウムイオンや金イオンを照射することにより、非常に効率よく脱離させることができる。また脱離が困難な比較的分子量が大きいものについては、ガリウムイオンや金イオンの照射時に断片化させることが可能なため、部分的ではあるが、測定対象物質に関する情報を得ることができる。
【０００９】
このような、レーザーもしくはガリウムイオンや金イオンを照射する方式の質量分析法においては、測定分子の脱離は必ずしもイオンの状態ではなく、中性分子もしくは中性ラジカルの状態で脱離しているものもある。質量分析装置における検出は、１分子の単位に脱離した測定対象分子の電荷情報をもとにしているため、中性の分子やラジカルでは、脱離した個数が多くても検出することができないという課題があった。
【００１０】
この測定分子のイオン化効率に関する問題は特にマトリックスを使わずに、レーザーやガドリニウムイオンを照射する質量分析方法において、顕著の問題となる。
【００１１】
この点を改良すべく、例えば特許文献１の実施例においては、測定分子によう化ナトリウムを加えて、測定分子はナトリウムイオンの付加体として検出する方法が開示されている。また、特許文献２においては、トリフルオロ酢酸、塩酸、硝酸、フッ酸等の酸を添加する方法によりイオン化効率を上げる方法が開示されている。
【００１２】
しかしながら、アルカリ金属等の金属塩の含有は、測定対象分子のイオン化が効率よく行われる場合もあれば、例えば特許文献３に開示されているようにイオン化を逆に阻害することも知られており、必ずしもイオン化効率を上げるのに有効ではない。また、トリフルオロ酢酸や塩酸のような酸は、プロトン付与能力はあり、また金属塩などのようなイオン化阻害の作用はないために有効な方法では有るが、これらの酸は揮発性が高い。特に質量分析装置の内部は高真空状態であるため、これらの揮発性の酸は測定中に揮発し、そのプロトン付与能力が変化する可能性があり、イメージングのための複数箇所の測定では、測定場所や測定順序による酸の濃度の違いがイオン化効率を変える可能性があった。逆に硫酸は揮発性がない酸として知られているが、測定サンプル中の水等の溶媒が蒸発し、硫酸の濃度が高まると硫酸の強い酸化作用や脱水作用により測定対象分子が変質してしまう恐れがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開２００６−２０１０４２号公報
【特許文献２】特開２００６−１５３４９３号公報
【特許文献３】特開２００６−１７０８５７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
以上述べたように、従来の方法では、イオン、中性粒子、電子、並びに、レーザー光の中から選ばれる一つの一次ビームを用いて、測定対象物質を脱離・イオン化する質量分析においては、測定対象分子を長時間に渡り、あるいは測定場所を一様に、高い効率でイオン化させることが困難であるという問題があった。
【００１５】
本発明は、この様な背景技術に鑑みてなされたものであり、測定対象物質を脱離・イオン化する質量分析において、脱離／イオン化した測定対象物質の検出を高感度に行うことができる質量分析用組成物、質量分析装置及び質量分析方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記の課題を解決する質量分析用組成物は、イオン、中性粒子、電子、並びに、レーザー光の中から選ばれる一つの一次ビームを用いて、測定対象物質を脱離・イオン化する工程を含む質量分析に用いる質量分析用組成物であって、前記質量分析用組成物が、溶媒と、イオン化剤とを含み、該イオン化剤が下記式（１）で表される官能基を１分子中に２個以上有し、かつ常圧における沸点が１５０℃以上であることを特徴とする。
【００１７】
【化１】
0005518152.tif 000002
【００１８】
上記の課題を解決する質量分析方法は、基板上に、少なくとも、下記式（１）で表される官能基を１分子中に２個以上有し、かつ沸点が１５０℃以上であるイオン化剤と、測定対象分子とを載置する工程、前記イオン化剤と測定対象物質に、イオン、中性粒子、電子、並びに、レーザー光の中から選ばれる一つの一次ビームを照射する工程を有し、前記イオン化剤は、溶媒と、該イオン化剤とを含む組成物として前記基板上に付与することを特徴とする。
【００１９】
【化２】
0005518152.tif 000003
【００２０】
また、上記の課題を解決する質量分析装置は、イオン化室と、イオン、中性粒子、電子、並びにレーザー光の中から選ばれる一つの一次ビームを測定対象物質に照射する手段と、前記一次ビームで脱離・イオン化された前記測定対象物質の質量情報を得る手段と、を有する質量分析装置であって、基板上に、少なくとも、下記式（１）で表される官能基を１分子中に２個以上有し、かつ沸点が１５０℃以上であるイオン化剤と、前記測定対象物質とを載置する手段を有しており、前記基板上に載置される前記イオン化剤は、溶媒と、該イオン化剤とを含む組成物として前記基板上に付与されるものであり、前記質量分析用イオン化剤と測定対象物質に、前記一次ビームを照射することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、測定対象物質を脱離・イオン化する質量分析において、脱離／イオン化した測定対象物質の検出を高感度に行うことができる質量分析用基板及び質量分析方法を提供できる。
【００２２】
また、本発明は、レーザー光照射による脱離、イオン化法の質量分析において、脱離／イオン化による高分子量化合物の検出を高感度に行うと共に、実質的に低分子領域の解析に支障がでないようにフラグメンテーションを極力避けることを可能にする質量分析用基板を提供できる。
【００２３】
また、本発明は、該質量分析用基板を用いた質量分析方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明の実施例１、２及び比較例１の質量分析スペクトルを示す図である。
【図２】本発明の実施例３，４及び比較例２の質量分析スペクトルを示す図である。
【図３】本発明の実施例５及び比較例３の質量分析スペクトルを示す図である。
【図４】本発明の実施例７及び比較例５の質量分析スペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２６】
本発明に係る質量分析用基板は、イオン、中性粒子、電子、並びに、レーザー光の中から選ばれる一つの一次ビームを用いて、測定対象物質を脱離・イオン化する工程を含む質量分析に用いる基板であって、前記基板が下記式（１）で表される官能基を１分子中に２個以上有し、かつ常圧における沸点が１５０℃以上であるイオン化剤を有することを特徴とする。
【００２７】
【化３】
0005518152.tif 000004
【００２８】
前記イオン化剤が、波長３３０ｎｍ以上３７０ｎｍ以下の紫外線を吸収しないことが好ましい。
【００２９】
前記イオン化剤が下記一般式（２）で表される化合物であることが好ましい。
【００３０】
【化４】
0005518152.tif 000005
【００３１】
（式中、ｎは２以上７以下の整数を表す。）
【００３２】
前記質量分析基板が、金、プラチナ、ステンレス、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化スズ、ＩＴＯから選ばれる素材で形成されていることが好ましい。
【００３３】
本発明に係る質量分析方法は、基板上に、少なくとも、下記式（１）で表される官能基を１分子中に２個以上有し、かつ沸点が１５０℃以上であるイオン化剤と、測定対象分子とを載置する工程、前記イオン化剤と測定対象分子に、イオン、中性粒子、電子、並びに、レーザー光の中から選ばれる一つの一次ビームを照射する工程を有することを特徴とする。
【００３４】
【化５】
0005518152.tif 000006
【００３５】
前記基板上にイオン化剤を塗布し、前記イオン化剤の上に測定対象分子を含有する溶液を塗布することが好ましい。
【００３６】
前記基板上に、イオン化剤および測定対象分子を含有する溶液を塗布することが好ましい。
【００３７】
前記イオン、中性粒子、電子、並びに、レーザー光の中から選ばれる一つの一次ビームを、該イオン化剤と測定対象分子への照射位置を変えることにより、取得した質量情報に基づいて測定対象物質の分布状態に関する情報を得ることが好ましい。
【００３８】
また、本発明に係る質量分析方法は、イオン、中性粒子、電子、並びに、レーザー光の中から選ばれる一つの一次ビームを、照射する場所を変えることにより、取得した質量情報に基づいて測定対象物質の分布状態に関する情報を得る質量分析方法において、上記の質量分析用基板を用いることを特徴とする。
【００３９】
本発明者らは、鋭意検討を行った結果、下記式（１）で表される官能基を１分子中に２個以上有し、かつ沸点が１５０℃以上であるイオン化剤を有する質量分析用基板を用いると、測定対象分子を効率よく、しかも長時間にわたり一定した効率でプロトン化させることを見出した。
【００４０】
【化６】
0005518152.tif 000007
【００４１】
一般に、蛋白質やペプチド等の生体物質は、複数のアミノ酸がアミド結合により繋がった構造をしており、そのイオン化においてはプロトンが付加される部位が比較的多く存在している。そのため、プロトン化によるイオン化によって、質量分析装置で検出可能となる。しかしながら、そのプロトン化されやすさは、物質ごとに異なり、一定ではない。蛋白質やペプチドの水溶液には等電点という水素イオン濃度が存在し、水溶液において等電点付近では、溶質である蛋白質やペプチドの電荷は０となり、その等電点以下の状態において、溶質はプロトン化されることが可能となる。従って、目的の蛋白質やペプチドのプロトン化には、ある程度プロトン付与性の高い化合物を用いることが好ましい。
【００４２】
質量分析において、プロトン付与性の高い化合物を用いる例としては、例えば上述の特許文献２には、トリフルオロ酢酸、塩酸、硝酸、フッ酸、酢酸及びギ酸などの酸を用いることが開示されおり、ある程度の効果は認められる。しかし、ここに挙げられている酸のうち、トリフルオロ酢酸以外の有機酸は、酸としてそれほど強い酸ではない。酸としての作用する部分は、カルボキシル基であるが、この官能基はアミノ基にも含まれるものであり、特にアスパラギン酸などは、例えペプチド結合により１つのカルボキシル基がアミド結合に使われても、もう一つのカルボキシル基が存在する。従って、等電点としては低くなり、このアスパラギン酸ユニットが多いペプチドや蛋白質のプロトン化には、単なる有機酸添加ではプロトン付与性が十分ではない可能性もある。トリフルオロ酢酸は、カルボキシル基に結合する炭素原子が、電子吸引性の強いフッ素原子を有しているため、酸としての強さは、酢酸や蟻酸より高くなり、プロトン付与性を高めることができる。しかし、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳやＴＯＦ−ＳＩＭＳにおけるイオン化室の気圧は、生成したイオン種が周囲の気体分子との衝突で失活するのを防ぐために、一般的には高真空状態である。このようなイオン化室の高真空環境においては、蟻酸、酢酸、硝酸といった低分子量の有機酸は揮発してしまい、プロトン付与体としての効力が低下するものと予想される。また、塩酸やフッ酸といった無機酸は水溶液状態であるが、水が蒸発した後は同様に、揮発してしまい、プロトン付与体としての効力が低下するものと予想される。硝酸については、水溶液としては共沸混合物形成のため、沸点は１２３℃程度である。しかし、質量分析装置の真空度は高く、気体状態の酸が溶解した酸では、質量分析装置の真空条件下で十分に残留し、測定対象物質をプロトン化させる作用を維持することは困難である。また、硫酸は蒸発しない酸であるが、酸化性が強く、粘性の高い酸である。例え希薄な硫酸溶液を用いても、水分の蒸発と共に、硫酸濃度が上昇することになる。有機物と高濃度の硫酸との接触では、硫酸の脱水作用により、有機分子中の酸素原子と水素原子が奪われ、炭化するといった激しい変性を起こすことも考えられ、高真空条件となる質量分析装置に用いる酸としては、揮発性はないものの、必ずしも適当ではない。また、硝酸についても、有る程度沸点は高いとはいえ、有機物との接触によりニトロ化等の変性反応を起こす懸念があった。
【００４３】
本発明者ら、種々のプロトン化作用を持つ化合物について検討した結果、先ず、プロトン付与性を、通常の有機酸であるカルボキシル基よりも強くするために、カルボキシル基に結合する炭素にフッ素原子が結合した構造をとることが必要であることが見出した。更に、質量分析装置の高い真空条件においても、効力を持続するために、蒸発や揮発しない分子である必要がある点を考慮した。特に、沸点が１５０℃以上の化合物の場合は、質量分析装置の高い真空条件においても直ぐに揮発若しくは蒸発することなく効力を維持することが可能である。
【００４４】
また、一般に蛋白質やペプチドなどの生体試料の分析においては、溶媒として水を用いることが多い。従って、測定対象分子である蛋白質やペプチドと、プロトン付与体とを接触させる場としては水溶液系が適しており、プロトン付与体も水溶性が必要であることがわかった。一般に分子量をあげれば、融点や沸点は上昇し、高真空条件下おける残留性は上がる。しかし、例えば、高いプロトン供与性を維持しながら融点、沸点を上げるために、フッ素原子含有の炭素鎖を上げていくと、融点や沸点は上昇するものの、水に対する溶解性が極端に低下し、蛋白質やペプチドなどのプロトン付与体としては利用できないことが分かった。また、融点や、沸点を上げるために芳香環を含むユニットを導入すると、紫外線に対する吸収が増え、レーザー照射型のイオン化方法においては、プロトン付与剤が照射レーザー光を吸収し、測定対象物質の脱離・イオン化を阻害したり、またマトリックス分子を用いる測定方法においてはマトリックスの結晶性を阻害する弊害が生じた。
【００４５】
本発明者らが、プロトン付与剤に関し鋭意検討を重ねた結果、分子中に、下記式（１）
【００４６】
【化７】
0005518152.tif 000008
【００４７】
で表される官能基を１分子中に２個以上有する化合物は、高い沸点を有しながら、プロトン付与性と水に対する溶解性をも維持することを見出し、質量分析におけるイオン化剤として好適であることを見出した。特に、これらのイオン化剤でも非芳香族系の分子は、実質的に紫外線域に吸収を有さず、レーザー照射型の質量分析においても、イオン化剤が照射エネルギーを吸収することがないため、有効にマトリックスや基板が照射エネルギーに吸収させることが出るため、測定分子の脱離過程を阻害することがない。
【００４８】
本発明におけるイオン化剤の１分子中に存在する上記式（１）で表される官能基は２個以上であればよいが、取り扱いの簡便性から特に２個または３個が好ましい。
【００４９】
また、イオン化剤分子において、上記式（１）で表される部分以外の構造としては、分子としての沸点を１５０℃以上にできるものであれば、特に制限は無いが、波長３３０ｎｍ以上３７０ｎｍ以下の紫外線領域に強い吸収を持たせないために、非芳香族性のユニットであること、分子全体としてプロトン供与能を低下させないユニットが好ましい。特にフッ素原子で置換されたアルキレンユニットは、波長３３０ｎｍ以上３７０ｎｍ以下の紫外線領域における吸収を増加させること無く、またプロトン供与能を維持したまま、沸点を上げることができるため、好適に利用することが可能であり、パーフルオロアルキレン鎖の両末端に上記式（１）で表されるユニットが結合したパーフルオロジカルボン酸は、特に好適に用いることが可能である。この場合、あまりにもパーフルオロアルキレン鎖長が長くなりすぎると沸点やプロトン供与性の効果よりも、水溶性低下が予想されるため、上記式（１）を繋ぐパーフルオロアルキレン鎖の炭素数としては２以上５以下であることが好ましい。
【００５０】
そのために、前記イオン化剤としては、下記一般式（２）で表されるジカルボン酸が好ましい。
【００５１】
【化８】
0005518152.tif 000009
【００５２】
式中、ｎは２以上７以下、好ましくは２以上５以下の整数を表す。
【００５３】
以下に、本発明で用いることができるイオン化剤の具体的構造式を例示するが、本発明はこれらの例示化合物に限定されるものではない。
【００５４】
【化９】
0005518152.tif 000010
【００５５】
本発明においては、イオン化剤の使用方法としては下記の３通りが考えられる。（１）一旦、質量分析用の試料基板上に、イオン化剤を塗布しておき、後に測定対象物質やマトリックス等の質量分析に用いる試薬を塗布する方法、（２）測定対象物質やマトリックスに対し、本発明におけるイオン化剤を同時に混合した溶液を基板上に塗布する方法、（３）基板上に測定対象物質やマトリクッスを塗布した上に、本発明のイオン化剤を塗布する方法である。
【００５６】
本発明は、これらの方法のいずれかに特定されるわけではないが、特に予め基板上にイオン化剤を塗布しておく場合には、蒸発や揮発によるイオン化剤の消失がないのでイオン化剤の効力が最も顕著に現れる。
【００５７】
本発明において、質量分析の試料基板としては金、白金等の貴金属やステンレス、アルミニウム等の金属、シリコンや酸化チタン、酸化亜鉛等の公知の材質を選択することが可能である。特に本発明のイオン化剤を予め塗布しておく基板としては、酸化して表面の電気的特性が変わることを避けるために、白金等の貴金属やステンレス、酸化チタン、酸化亜鉛を好適に用いることが可能である。特に、これらの材質の形状として平坦な材質よりも、最低谷底部から最大山頂部までの高さの差が１０から２００ｎｍ程度の凹凸のある基板を用いると、基板上に有るイオン化剤と測定対象分子との接触頻度が高められることにより好ましい。
【００５８】
また、本発明においては、必要に応じてマトリックス分子を用いることができる。マトリックス分子としては、ニトロアントラセン（９ＮＡ）４４、２，５−ジヒドロキシベンゾイックアシッド（ＤＨＢ）、シナピニックアシッド、α−シアノ−ヒドロキシ−シンナミックアシッド（ＣＨＣＡ）などの従来公知の材料を選択して用いることが可能である。
【００５９】
本発明において、質量分析のために使用する試料調整用の溶媒としては、水、エタノール、メタノール、プロピルアルコール、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ＤＭＳＯ、ベンゼン、トルエン、ジクロロメタン、トリクロロメタン、アセトン、メチルエチルケトン等の従来公知の溶媒を用いることができるが、本発明のイオン化剤のプロトン付与性を考慮すると、水等の極性溶媒が含まれているほうが好ましい。更に、質量分析試料の取り扱い上の問題として、難揮発性の溶媒よりは、沸点が１５０℃以下、より好ましくは１２０℃以下の溶媒を用いることが好ましい。
【００６０】
また、本発明においては、イオン、中性粒子、電子、並びにレーザー光の中から選ばれる一つの一次ビームには、金イオンや金のクラスターイオン、ビスマスイオンやビスマスクラスターイオン、フラーレンイオン、電子、希ガス、紫外線レーザーや赤外線レーザー、可視光レーザーが用いられる。
【００６１】
また、本発明において用いられる測定対象物質は、蛋白質、修飾を受けた蛋白質、ペプチド、修飾を受けたププチド、糖類、脂質類、糖蛋白、糖脂質、ＤＮＡやＲＮＡ、合成高分子、染料、顔料、添加剤等が挙げられる。
【実施例】
【００６２】
以下、実施例を示して本発明を具体的に説明する。
【００６３】
＜質量分析用試料基板例１＞
鏡面加工したステンレス（ＳＵＳ４３０、３０ｍｍ×３０ｍｍ×ｔ０．６ｍｍ）上に反応性スパッタ法により樹枝状構造の白金酸化物層を１０００ｎｍの厚さに形成した。このときのＰｔ担持量は０．２７ｍｇ／ｃｍ２であった。反応性スパッタは、全圧４Ｐａ、酸素流量比（ＱＯ２／（ＱＡｒ＋ＱＯ２））７０％、基板温度８０℃、投入パワー４．９Ｗ／ｃｍ２なる条件にて行った。ここで、ＱＯ２は酸素の流量、ＱＡｒはアルゴンの流量を示す。
【００６４】
次に、この樹枝状構造の白金酸化物を２％Ｈ２／Ｈｅ雰囲気（１ａｔｍ）にて１２０℃、３０分間の還元処理を行い、樹枝状構造の白金ナノ構造体を有する基板を得た。次いで、この基板を、０．６ｍｍだけ切削したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（ブルカー社製）測定用のステンレス製ターゲット基板へ導電性両面テープで接着して固定した。
【００６５】
＜測定対象物質の調整例１＞
質量分析の測定においては、ＲＡＳＧ−１（分子量：Ｍｗ＝１０００．４９）、アンジオテンシンフラグメント（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ｆｒａｇ．）１−７（Ｍｗ＝８９８．４７）、ブラジキニン（ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ）（Ｍｗ＝１０５９．５６）、アンジオテンシン（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ）Ｉ（Ｍｗ＝１２９５．６８）、アンジオテンシン（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ）ＩＩ（Ｍｗ＝１０４５．５３）、レニニンサブストレート（Ｒｅｎｉｎ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）（Ｍｗ＝１７５７．９３）、エノラーゼ（Ｅｎｏｌａｓｅ）Ｔ３５（Ｍｗ＝１８７１．９６）、エノラーゼ（Ｅｎｏｌａｓｅ）Ｔ３７（Ｍｗ＝２８２７．２８）、メリチン（Ｍｅｌｉｔｔｉｎ）（Ｍｗ＝２８４５．７４）の組成からなる９種類のペプチドが混合しているサンプル（ＭａｓｓＰＲＥＰ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｍｉｘｔｕｒｅ、Ｗａｔｅｒｓ社）を用いた。各ペプチドの含有量はおよそ１．０ｎｍｏｌである。
【００６６】
このペプチド混合試料に水を加え各ペプチド濃度が約１０μｍｏｌ／Ｌとなるように調整した。このペプチド溶解液を１μＬ滴下、乾燥させた場合には、測定試料の１スポット当たりに各ペプチドが約１０ｐｍｏｌ含有された状態である。
【００６７】
実施例１
上記基板例１で作成した基板上に、下記構造式を有するパーフルオロジカルボン酸（沸点１５０℃／５ｍｍＨｇ）の１ｗｔ％水溶液：２μＬを滴下、乾燥させた。
【００６８】
【化１０】
0005518152.tif 000011
【００６９】
更に、この基板上に、測定対象物質の調整例１で調整したペプチド溶液を１μＬ滴下、乾燥させた。
【００７０】
次いでこの基板をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ装置（商品名：ＲＥＦＬＥＸ−  ＩＩＩ、ブルカー・ダルトニクス社製）へ装着した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳの測定における照射レーザーは窒素レーザー（波長＝３３７ｎｍ）であり、ポジイオンの反射モード（レフレクターモード）とした。照射レーザー強度は親イオンのピークが出始めた強度よりも２％だけ強い強度で測定し、一箇所において２０パルスぶんのスペクトルを積算し、それを１０箇所に渡り積算し、合計２００パルスぶんのレーザー照射から得られる信号強度を合計したスペクトルを得た。
【００７１】
また、加速電圧２６．５ｋＶに設定し、質量数８００から３０００までのピークを取り込んだ。
【００７２】
実施例２
実施例１においてイオン化剤を下記構造式で表される化合物（沸点１５０℃以上）に変えた以外は同様にして、試料調整及び質量分析測定を行った。
【００７３】
【化１１】
0005518152.tif 000012
【００７４】
比較例１
実施例１においてイオン化剤をトリフルオロ酢酸（沸点：７４℃）に変えた以外は同様にして、試料調整及び質量分析測定を行った。
実施例１、２及び比較例１の質量分析スペクトルを図１に示した。
実施例１、２と比較例１とのスペクトルの比較より、本発明のイオン化剤を基板に塗布した質量分析基板を用いることで、測定対象分子をより高感度に検出することが可能となることが分かる。
【００７５】
実施例３
測定対象物質の調整例１と同様の９種類のペプチドが混合しているサンプル（ＭａｓｓＰＲＥＰ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｍｉｘｔｕｒｅ、Ｗａｔｅｒｓ社）を、下記構造式
【００７６】
【化１２】
0005518152.tif 000013
【００７７】
で表されるパーフルオロジカルボン酸（沸点１５０℃／５ｍｍＨｇ）を１ｗｔ％溶解した水溶液にて溶解し、各ペプチド濃度が約１０μｍｏｌ／Ｌとなるように調整した。このペプチド溶解液を、上記基板例１で作成した基板上に、１μＬ滴下、乾燥させた。
【００７８】
次いで、この基板をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ装置（商品名：ＲＥＦＬＥＸ−  ＩＩＩ、ブルカー・ダルトニクス社製）へ装着した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳの測定における照射レーザーは窒素レーザー（波長＝３３７ｎｍ）であり、ポジイオンの反射モード（レフレクターモード）とした。照射レーザー強度は親イオンのピークが出始めた強度よりも２％だけ強い強度で測定し、一箇所において２０パルスぶんのスペクトルを積算し、それを１０箇所に渡り積算し、合計２００パルスぶんのレーザー照射から得られる信号強度を合計したスペクトルを得た。
【００７９】
また、加速電圧２６．５ｋＶに設定し、質量数７００から３０００までのピークを取り込んだ。
【００８０】
実施例４
実施例３において、イオン化剤を下記構造式
【００８１】
【化１３】
0005518152.tif 000014
【００８２】
で表されるパーフルオロジカルボン酸（沸点１５０℃以上）を用いた以外は、同様にして質量分析の測定を行った。
【００８３】
比較例２
実施例３において、イオン化剤としてトリフルオロ酢酸を用いた以外は、同様にして質量分析を行った。
実施例３，４及び比較例２の質量分析スペクトルを図２に示した。
実施例３，４と比較例２とのスペクトルの比較より、本発明のイオン化剤を測定対象試料に混合させた状態で測定することで、本発明のイオン化剤が特に測定対象分子をより高感度に検出させることが可能であることがわかる。
【００８４】
実施例５
実施例１において、鏡面加工したステンレス（ＳＵＳ４３０、３０ｍｍ×３０ｍｍ×ｔ０．６ｍｍ）を濃塩酸（３７ｗｔ％）に２０分浸漬した後に、純水で２分間すすいで粗面化した基板を用いた以外、同様にして質量分析の測定を行った。
【００８５】
比較例３
実施例５において、イオン化剤を用いなかった以外は、同様にして質量分析の測定を行った。
実施例５及び比較例３の質量分析スペクトルを図３に示した。
実施例５と比較例３のスペクトル比較より、本発明のイオン化剤により、測定対象分子を極めて高感度に検出可能にすることが分かる。
【００８６】
実施例６
実施例５において、質量分析をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳから、ＴＯＦ‐ＳＩＭＳに変更した以外は同様にして検討を行った。ＴＯＦ−ＳＩＭＳは、下記条件件で行った。
ＴＯＦ−ＳＩＭＳ分析では、ＩＯＮ  ＴＯＦ社製、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ  ＩＶ型装置を用い下記測定条件で測定した。
一次イオン：２５ｋＶ  Ｇａ＋、２．４ｐＡ（パルス電流値）、ｓａｗｔｏｏｔｈスキャンモード
一次イオンのパルス周波数：３．３ｋＨｚ（３００μｓ／ｓｈｏｔ）
一次イオンパルス幅：約０．８ｎｓ
一次イオンビーム直径：約３μｍ
測定領域：３００μｍ×３００μｍ
二次イオン像のｐｉｘｅｌ数：１２８×１２８
積算時間：約４００秒
【００８７】
比較例４
比較例３において、質量分析の測定をＴＯＦ−ＳＩＭＳ（測定条件は、実施例６と同じ）で行った以外、同様にして行った。
【００８８】
比較例５
イオン化剤を下記構造式で示されるパーフルオロアルキル鎖のついたモノカルボン酸（沸点：２１８℃）の水溶液の調整を試みたが、溶解させることが困難であった。従って、質量分析を行うことができなかった。
【００８９】
【化１４】
0005518152.tif 000015
【００９０】
実施例６と比較例４とのスペクトルの比較により、本発明のイオン化剤により、測定対象分子の検出感度が上がっていることが分かる。
【００９１】
実施例７
Ｉｎｓｕｌｉｎ（組成式：Ｃ２５４Ｈ３７７Ｎ６５Ｏ７５Ｓ６、分子量：５７７３．４９）及び、Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｃｈａｉｎ  Ｂ  Ｏｘｉｄｉｚｅｄ（組成式：Ｃ１５７Ｈ２３２Ｎ４０Ｏ４７Ｓ２、分子量：３４９５．８９）がそれぞれ２μｇ／Ｌである混合水溶液を調整し、更にイオン化剤として、下記構造式
【００９２】
【化１５】
0005518152.tif 000016
【００９３】
で表されるパーフルオロジカルボン酸（沸点１５０℃以上）を２ｗｔ％となるように添加して、測定試料溶液を調整した。この溶液を金蒸着したシリコンウエハー上に、０．１μｌを滴下し、大気圧下で乾燥後、下記測定装置にて質量分析を行った。
ＴＯＦ−ＳＩＭＳ分析では、ＩＯＮ  ＴＯＦ社製、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ  ５型装置を用い下記測定条件で測定した。
一次イオン：２５ｋＶ  Ｂｉ＋、０．３ｐＡ（パルス電流値）、ｓａｗｔｏｏｔｈスキャンモード
一次イオンのパルス周波数：２．５ｋＨｚ（３００μｓ／ｓｈｏｔ）
一次イオンパルス幅：約０．８ｎｓ
一次イオンビーム直径：約３μｍ
測定領域：３００μｍ×３００μｍ
二次イオン像のｐｉｘｅｌ数：１２８×１２８
積算時間：約４００秒
【００９４】
比較例６
実施例７において、イオン化剤をトリフルオロ酢酸とした以外、同様にして測定を行った。
実施例７及び比較例５のスペクトルを図４に示した。実施例７では、Ｉｎｓｕｌｉｎのモノプロトン付加体、ジプロトン付加体、及びＩｎｓｕｌｉｎ  Ｃｈａｉｎ  Ｂ  Ｏｘｉｄｉｚｅｄのモノカチオンが検出されているが、比較例６では、これらのピークは何れも非常に微弱で、実施例のイオン化剤の効果が確認できた。
【００９５】
以下にイオン化剤の揮発性を確認した参考例を示す。
【００９６】
参考例１
実施例１、２及び比較例１及び５で使用したイオン化剤の水溶液（比較例５のイオン化剤は分散液）：各３μＬを、鏡面加工してあるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳの試料基板（ブルカー・ダルトニクス社製）に滴下、乾燥し、更に質量分析装置（（商品名：ＲＥＦＬＥＸ−ＩＩＩ、ブルカー・ダルトニクス社製）に装着し、３０分間、上記質量分析装置内の高真空状態（２×１０−７ｔｏｒｒ）で放置した後、取り出し、基板表面に残留しているイオン化剤を顕微鏡にて確認した。その結果、実施例１，２及び比較例５のイオン化剤においては、装置層装着後も、イオン化剤が基板上に残留していることが確認できたが、比較例１で用いたイオン化剤は残留している痕跡を確認することはできなかった。
【００９７】
参考例２
実施例１、２及び比較例１及び５で使用したイオン化剤を内径３ｍｍの石英チューブに入れ、１５０℃のオイルバスに３０分浸漬した後に、各イオン化剤の残留量を確認したところ、比較例１のイオン化剤は残留が確認できなかった。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明は、測定対象物質を脱離・イオン化する質量分析において、脱離／イオン化した測定対象物質の検出を高感度に行うことができるので、質量分析におけるイオン化促進剤として利用することができる。
【図１】
0005518152.tif 000021
【図２】
0005518152.tif 000022
【図３】
0005518152.tif 000023
【図４】
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