(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種の微生物, 及び少なくとも１種の被検菌である放線菌又は糸状菌を複合して培養し，培養液中に生産される二次代謝産物を採取することから成る二次代謝産物の製造方法において，
前記微生物は，細胞壁にミコール酸を含有することによって，共存する前記放線菌又は前記糸状菌の二次代謝産物産生を誘導する能力を持ち，ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans) の色素産生を誘導する能力を持っており，
前記細胞壁に前記ミコール酸を含有する前記微生物は，コリネバクテリウム
(Corynebacterium) 属，ロドコッカス(Rhodococcus) 属，ゴルドニア(Gordonia)属，ダイエットジア(Dietzia) 属，ノカルジア(Nocardia)属，スケルマニア(Skermania) 属，ウィラムジア(Williamsia)属，又はマイコバクテリウム(Mycobacterium) 属に属することを特徴とする二次代謝産物の製造方法。
【請求項２】
コリネバクテリウム(Corynebacterium) 属，ロドコッカス(Rhodococcus) 属，又はゴルドニア(Gordonia)属に属する前記微生物は，シーエフィシエンス(C.efficiens），シーグルタミカム(C.glutamicum)，ジールブリペルティンクタ(G.rubripertincta)，アールコプロフィラス(R.coprophilus），アールエリスロポリス(R.erythropolis)，アールウラチスラビエンシス(R.wratislaviensis），又はアールゾプフィイ(R.zopfii)に属することを特徴とする請求項１に記載の二次代謝産物の製造方法。
【請求項３】
前記放線菌は，クリプトバクテリウム(Cryptobacterium) ，ルブロバクター
(Rubrobacter) ，アクチノバチュラム(Actinobaculum) ，アクチノマイセス
(Actinomyces) ，コリネバクテリウム(Corynebacterium) ，ゴルドニア（Gordonia），
マイコバクテリウム(Mycobacterium) ，ノカルディア(Nocardia)，ロドコッカス
(Rhodococcus) ，ミクロスファエラ(Microsphaera)，クリプトスポランギウム
(Cryptosporangium)，ミクロコッカス(Micrococcus) ，アースロバクター
(Arthrobacter)，ブレビバクテリウム(Brevibacterium)，セルロモナス(Cellulomonas)，ミクロバクテリウム(Microbacterium)，アグロマイセス(Agromyces) ，クリオバクテリウム(Cryobacterium) ，ミクロモノスポラ(Micromonospora)，アクチノプラネス
(Actinoplanes)，ダクチロスポランギウム(Dactylosporangium) ，ノカルディオイデス
(Nocardioides)，シュードノカルディア(Pseudonocardia)，アクチノビスポラ
(Actinobispora) ，アミコラトプシス(Amycolatopsis) ，サッカロモノスポラ
(Saccharomonospora) ，アクチノシネマ(Actinosynnema) ，アクチノキネオスポラ
(Actinokineospora)，ストレプトマイセス(Streptomyces)，キタサトスポラ
(Kitasatospora) ，ストレプトスポランギウム(Streptosporangium) ，ミクロビスポラ
(Microbispora)，ミクロテトラスポラ(Microtetraspora) ，ノノムラエ（Nonomuraea），ノカルディオプシス(Nocardiopsis)，アクチノマデュラ(Actinomadura)，キネオコッカス(Kineococcus) ，キネオスポリア(Kineosporia) ，及びサーモビスポラ(Thermobispora）からなる群より選択されるいずれかに属することを特徴とする請求項１又は２に記載の二次代謝産物の製造方法。
【請求項４】
前記糸状菌は，アクレモニウム(Acremonium)，アルテルナリア(Alternaria)，アスペルギルス(Aspergillus) ，ボーベリア(Beauveria) ，ボトリティス(Botorytis) ，カララ
(Chalara) ，セルコスポラ(Cercospora)，セファロスフォリウム(Cephalosporium)，クリソスポリウム(Chrysosporium) ，コクシジオイデス(Coccidioides)，クリプトコッカス
(Cryptococcus)，クルブラリア(Curvularia)，シリンドロカルポン(Cylindrocarpon)，シリンドロクラディウム(Cylindrocladium），カニングハメラ(Cunninghamella)，ドレクスレラ(Drechslera)，エピコッカム(Epicoccum），ユーペニシリウム(Eupenicillium) ，フザリウム(Fusarium)，ジオトリカム(Geotrichum)，グリオクラディウム(Gliocladium），グラフィウム(Graphium)，ヘルミントスポリウム(Helminthosporium)，ヒアロデンドロン(Hyalodendron)，イサリア(Isaria)，メタルヒジウム(Metarhizium），モニリア
(Monilia），モルティレラ(Mortierella），ムコール(Mucor），ノデュリオスポリウム
(Nodulisporium），パエシロマイセス(Paecilomyces)，ペニシリウム(Penicillium），ピリキュラリア(Pyricularia），フィアロマイセス(Phialomyces），リゾクトニア
(Rhizoctonia），スポロスリクス(Sporopthrix），トリコヒートン(Trichophyton)，トリコデルマ(Trichocderma)，及びトリコセシウム(Trichothecium）からなる群より選択されるいずれかに属することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の二次代謝産物の製造方法。
【請求項５】
前記二次代謝産物は，抗菌性抗生物質，制癌性抗生物質，抗寄生虫物質, 又は酵素阻害剤であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の二次代謝産物の製造方法。
【請求項６】
前記細胞壁に前記ミコール酸を含有する前記微生物, 及び前記放線菌又は前記糸状菌がいずれも生菌体として共存した状態で培養することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の二次代謝産物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は，複合培養による二次代謝産物であって，特に，細胞壁にミコール酸を含有する微生物との複合培養を用いる二次代謝産物である抗菌性抗生物質，制癌性抗生物質，抗寄生虫物質，又は酵素阻害剤の二次代謝産物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物培養において，純粋培養は，コッホ以来の基本的概念とされている。抗生物質スクリーニングにおいても，純粋培養された菌株からこれまでに多くの有用物質が発見されている。
【０００３】
自然環境下での微生物は，外部の様々な環境要因の影響を受けて生育するため，純粋培養状態で自然環境下と全く同一の生育を再現することは困難である。医薬品をはじめ，天然物からの抗生物質スクリーニングには，純粋分離された菌株を使用するのが一般的である（例えば，非特許文献１及び２参照）。
【０００４】
現在，ミコール酸を含有する細菌として知られている微生物には，コリネバクテリウム(Corynebacterium) 属，ロドコッカス(Rhodococcus) 属，ゴルドニア(Gordonia)属，ダイエットジア(Dietzia) 属，ノカルジア(Nocardia)属，スケルマニア(Skermania) 属，ウィラムジア(Williamsia)属，マイコバクテリウム(Mycobacterium) 属，及びツカムレラ
(Tsukamurella)属が知られている（例えば，非特許文献３参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Bibb M, The regulation of antibiotic production in Streptomyces coelicolorA3(2).Microbiology. 1996 142:1335-44
【非特許文献２】田中晴雄，土屋友房編，微生物薬品化学改訂第４版，P325-326  南江堂
【非特許文献３】日本放線菌学会編，放線菌の分類と同定，P179-191  日本学会事務センター
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら，自然界においては，様々な環境要因が抗生物質の生産に影響を与えているため，純粋培養ではスクリーニング菌株の抗生物質生産能力を全て引き出すことは難しい。この点から抗生物質生産においても純粋培養が個々の菌株の物質生産能力を完全に引き出しているとは考え難く，培養法の工夫は重要である。
【０００７】
本発明者は，先にスクリーニング菌株の新たな二次代謝産物生産能力を引き出し得る新たな培養方法を用いた二次代謝産物のスクリーニング方法及び製造方法を開発し，先に出願した〔特願２００６−２３８５４７号（特開２００８−５４６３７号公報）参照〕。該二次代謝産物のスクリーニング方法は，１６ＳｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列が配列番号１記載の塩基配列と９５％以上の相同性を示すコリネ型細菌に属する少なくとも1 種の微生物及び少なくとも１種の被検菌を混合して培養し，培養液中に二次代謝産物が含まれているかを確認するものである。また，上記二次代謝産物の製造方法は，コリネ型細菌に属する少なくとも1 種の微生物及び少なくとも１種の放線菌または糸状菌を混合して培養し，培養液中に生産される二次代謝産物を採取するものである。また，培養物は，コリネ型細菌に属する少なくとも1 種の微生物及び少なくとも１種の放線菌または糸状菌を混合して培養し，培養液中に二次代謝産物を蓄積させたものである。
【０００８】
上記特許出願の発明は，ツカムレラ属５種については混合培養活性（ストレプトマイセス・リビダンスに赤色色素を生産誘導させる活性）があることを明らかにしている。本発明者は，更に研究を重ねてツカムレラ属以外のコリネバクテリウム, ロドコッカス，ゴルドニア等の７種の細菌についても混合培養活性があることを新たに確認した。これらはツカムレラ・プルモニスとの間で１６ＳｒＤＮＡ配列において，８８．４〜９５．６％の相同性がある。更に，これらの菌株とツカムレラ・プルモニスに共通している性質として，ミコール酸と呼ばれる物質を細胞壁成分に有していることが確認された。ミコール酸の合成阻害剤であるイソニアジドを添加して混合培養すると，活性は消失することが確認できた。このことからミコール酸の存在が混合培養活性に関係していることが明らかになった。
【０００９】
そこで，本発明者は，ツカムレラ・プルモニス(Tsukamullera pulmonis) と
１６ＳｒＤＮＡ配列が９５％以上ある菌とは別に，ミコール酸を生合成する菌のうちコリネバクテリウム, ロドコッカス，ゴルドニア属についても赤色色素を生産誘導させる活性を持つことを確認した。更に，これらツカムレラ属とは異なる属のミコール酸含有微生物と放線菌とを混合培養すると，ミコール酸含有微生物ごとに異なる二次代謝産物生産を誘導する例が後述の実施例２にも示すように得られた。この結果は，混合培養を行う際に，ツカムレラ・プルモニス以外の菌も合わせて用いることにより，ツカムレラ・プルモニスでは誘導できない二次代謝産物を誘導できることを示している。このような研究成果より，本発明者は，ツカムレラ・プルモニス(Tsukamullera pulmonis) 又はその類縁菌と様々な放線菌との複合培養をすることにより，純粋培養では生産しない新規化合物を生産する現象を解明し，この発明に至ったのである。
【００１０】
この発明の目的は，スクリーニング菌株の新たな二次代謝産物生産能力を引き出し得る，新たな培養方法を用いたものであって，特に，新規な抗菌性抗生物質，制癌性抗生物質，抗寄生虫物質，又は酵素阻害剤等の新規な二次代謝産物の製造，純粋培養では産生量が少ない二次代謝産物の産生量を増大させる二次代謝産物の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
この発明は，少なくとも1 種の微生物, 及び少なくとも１種の被検菌である放線菌又は糸状菌を複合して培養し，培養液中に生産される二次代謝産物を採取することから成る二次代謝産物の製造方法において，
前記微生物は，細胞壁にミコール酸を含有することによって，共存する前記放線菌又は前記糸状菌の二次代謝産物産生を誘導する能力を持ち，ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans) の色素産生を誘導する能力を持っており，
前記細胞壁に前記ミコール酸を含有する前記微生物は，コリネバクテリウム
(Corynebacterium) 属，ロドコッカス(Rhodococcus) 属，ゴルドニア(Gordonia)属，ダイエットジア(Dietzia) 属，ノカルジア(Nocardia)属，スケルマニア(Skermania) 属，ウィラムジア(Williamsia)属，又はマイコバクテリウム(Mycobacterium) 属に属することを特徴とする二次代謝産物の製造方法に関する。
【００１２】
なお，細胞壁にミコール酸を含有する微生物としては，ツカムレラ・プルモニスと１６ＳｒＤＮＡ配列が９５％未満の相同性を示すコリネ型細菌〔コリネバクテリウム(Corynebacterium) 属，ロドコッカス(Rhodococcus) 属，ゴルドニア(Gordonia)属，〕に属するものに，特に有効に適用できるものである。
【００１３】
この二次代謝産物の製造方法において，コリネバクテリウム(Corynebacterium) 属，ロドコッカス(Rhodococcus) 属，又はゴルドニア(Gordonia)属に属する前記微生物は，シーエフィシエンス(C.efficiens），シーグルタミカム(C.glutamicum)，ジールブリペルティンクタ(G.rubripertincta)，アールコプロフィラス(R.coprophilus），アールエリスロポリス(R.erythropolis)，アールウラチスラビエンシス(R.wratislaviensis），又はアールゾプフィイ(R.zopfii)に属するものであることが好ましい。
【００１４】
この二次代謝産物の製造方法において，前記放線菌は，クリプトバクテリウム
（Cryptobacterium ），ルブロバクター（Rubrobacter ），アクチノバチュラム
（Actinobaculum ），アクチノマイセス（Actinomyces ），コリネバクテリウム
（Corynebacterium)，ゴルドニア（Gordonia），マイコバクテリウム（Mycobacterium ），ノカルディア（Nocardia），ロドコッカス（Rhodococcus ），ミクロスファエラ
（Microsphaera），クリプトスポランギウム（Cryptosporangium），ミクロコッカス
(Micrococcus),アースロバクター(Arthrobacter)，ブレビバクテリウム(Brevibacterium)，セルロモナス(Cellulomonas)，ミクロバクテリウム（Microbacterium），アグロマイセス（Agromyces ），クリオバクテリウム（Cryobacterium ），ミクロモノスポラ
（Micromonospora），アクチノプラネス（Actinoplanes），ダクチロスポランギウム
（Dactylosporangium)，ノカルディオイデス（Nocardioides），シュードノカルディア
（Pseudonocardia），アクチノビスポラ（Actinobispora ），アミコラトプシス
（Amycolatopsis ），サッカロモノスポラ（Saccharomonospora ），アクチノシネマ
（Actinosynnema ），アクチノキネオスポラ（Actinokineospora），ストレプトマイセス（Streptomyces），キタサトスポラ（Kitasatospora ），ストレプトスポランギウム
（Streptosporangium ），ミクロビスポラ（Microbispora），ミクロテトラスポラ
（Microtetraspora ），ノノムラエ(Nonomuraea)，ノカルディオプシス(Nocardiopsis)，アクチノマデュラ（Actinomadura），キネオコッカス（Kineococcus ），キネオスポリア（Kineosporia ），及びサーモビスポラ（Thermobispora ）からなる群より選択されるいずれかの属に属する放線菌であるものである。
【００１５】
この二次代謝産物の製造方法において，前記糸状菌は，アクレモニウム(Acremonium)，アルテルナリア(Alternaria)，アスペルギルス(Aspergillus) ，ボーベリア(Beauveria），ボトリティス(Botorytis），カララ(Chalara) ，セルコスポラ(Cercospora)，セファロスフォリウム(Cephalosporium)，クリソスポリウム（Chrysosporium ），コクシジオイデス（Coccidioides），クリプトコッカス（Cryptococcus），クルブラリア（Curvularia），シリンドロカルポン（Cylindrocarpon），シリンドロクラディウム（Cylindrocladium)，カニングハメラ（Cunninghamella），ドレクスレラ（Drechslera），エピコッカム
（Epicoccum ），ユーペニシリウム(Eupenicillium），フザリウム（Fusarium），ジオトリカム(Geotrichum)，グリオクラディウム（Gliocladium ），グラフィウム（Graphium），ヘルミントスポリウム（Helminthosporium），ヒアロデンドロン（Hyalodendron），イサリア（Isaria），メタルヒジウム（Metarhizium ），モニリア（Monilia ），モルティレラ（Mortierella)，ムコール(Mucor），ノデュリオスポリウム(Nodulisporium），パエシロマイセス（Paecilomyces），ペニシリウム（Penicillium ），ピリキュラリア
（Pyricularia ），フィアロマイセス（Phialomyces ），リゾクトニア（Rhizoctonia)，スポロスリクス（Sporopthrix ），トリコヒートン（Trichophyton），トリコデルマ
（Trichocderma），及びトリコセシウム（Trichothecium ）からなる群より選択されるいずれかの属に属するものである。
【００１６】
この二次代謝産物の製造方法において，前記二次代謝産物は，抗菌性抗生物質，制癌性抗生物質，抗寄生虫物質，又は酵素阻害剤である。
【００１７】
また，この二次代謝産物の製造方法において，前記細胞壁に前記ミコール酸を含有する前記微生物及び前記放線菌または前記糸状菌は，いずれも生菌体として共存した状態で培養するものが好ましい。
【発明の効果】
【００１８】
この発明の二次代謝産物の製造方法によれば，純粋培養では産生が確認されなかった，新規な抗生物質等の二次代謝産物をスクリーニングし，又は二次代謝産物を製造することができる。更に，この発明の二次代謝産物の製造方法によれば，純粋培養では産生量が少ない二次代謝産物の産生量を増大することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
−スクリーニング方法−
この発明による二次代謝産物のスクリーニング方法は，ミコール酸を細胞壁に含有する微生物及び少なくとも１種の被検菌を複合して培養し，培養液中に二次代謝産物が含まれているかを確認することに特徴を有している。
【００２０】
この二次代謝産物のスクリーニング方法では，細胞壁にミコール酸を含有する微生物を用いるものであり，ミコール酸を含有する微生物であれば，アールエリスロポリス
（R. erythropolis)PR4 と同等の効果が得られることは実施例において具体的に示す通りである。
【００２１】
この二次代謝産物のスクリーニング方法に用いられるミコール酸を細胞壁に含有する微生物は，共存する微生物の二次代謝産物産生を誘導する能力を持つ微生物である。
【００２２】
さらに，本発明のスクリーニング方法に用いられるミコール酸を細胞壁に含有する微生物は，ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans) の色素産生を誘導する能力を持つ微生物であることができる。ストレプトマイセス・リビダンスは，純粋培養では赤色色素であるアクチノロージン及びウンデシルプロディギオシンの産生を行わないことが知られている。これは、ストレプトマイセス・リビダンスは，赤色色素の生合成遺伝子を有しているが，通常の純粋培養時には，これら生合成遺伝子の転写が行われていないからである。本願発明に述べる複合培養法においては，ミコール酸を含有する微生物がストレプトマイセス・リビダンスに培養液中で刺激を与えることにより，ストレプトマイセス・リビダンスの色素生合成遺伝子の転写スイッチが入り，赤色色素産生が認められるようになったと結論できる。そこで，本願発明に適する微生物であるかどうかの判定は，ストレプトマイセス・リビダンスの色素産生能力を誘導するかどうかで判定することができる。
【００２３】
実施例において詳述するように，アールエリスロポリス（R. erythropolis)PR4 もしくはシーグルタミカム(C.glutamicum)はストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces 
lividans) の赤色色素生産を誘導する菌株として発見された。ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans) と様々な属の菌との複合液体培養を行ったところ，顕著な赤色色素生産を誘導する組み合わせは，検討した範囲では，シーエフィシエンス
（C.efficiens ），シーグルタミカム（C.glutamicum），ジールブリペルティンクタ
（G.rubripertincta），アールコプロフィラス（R.coprophilus ），アールエリスロポリス（R.erythropolis），アールウラチスラビエンシス（R.wratislaviensis ），又はアールゾプフィイ（R.zopfii）に属する微生物だけであり，本菌株に特異的な性質であることが明らかになった。そこで，シーグルタミカム（C.glutamicum) ，又はアールエリスロポリス(R.erythropolis)と１３９株の放線菌との複合培養を行い，培養抽出物の抗菌アッセイを行ったところ，放線菌単独培養では検出できない抗菌物質を生産する例が３９例，単独培養よりも抗菌物質生産が増大する例が５６例見出された。従って，本発明に用いられるミコール酸を含有する微生物は，ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces 
lividans) の色素産生を誘導する能力をもつ微生物であることができる。
【００２４】
細胞壁にミコール酸を含有する微生物は，マイコバクテリウム(Mycobacterium) 属をはじめとする抗酸性細菌とその近縁細菌に限られ，それらの細胞表層の疎水性や抗酸性に関与していると考えられている。現在，ミコール酸を含有する細菌として知られている微生物には，コリネバクテリウム(Corynebacterium) 属，ロドコッカス(Rhodococcus) 属，ゴルドニア(Gordonia)属，ダイエットジア(Dietzia) 属，ノカルジア(Nocardia)属，スケルマニア(Skermania) 属，ウィラムジア(Williamsia)属，マイコバクテリウム
(Mycobacterium) 属，及びツカムレラ(Tsukamurella)属が知られている。本発明で用いられるミコール酸を含有する微生物は，好ましくはコリネバクテリウム(Corynebacterium) 属又はロドコッカス(Rhodococcus) 属に属する微生物，例えば，アールエリスロポリス
（R. erythropolis)PR4 ，又はシーグルタミカム(C. glutamicum) に属する微生物であることができる。しかし，アールエリスロポリス（R. erythropolis)PR4 或いはシーグルタミカム(C. glutamicum) に属する微生物以外のロドコッカス(Rhodococcus) 属，コリネバクテリウム(Corynebacterium) 属に属する微生物や，ロドコッカス(Rhodococcus) 属，又はコリネバクテリウム(Corynebacterium) 属以外に属する微生物であっても，ミコール酸を含有する微生物であれば使用できる。
【００２５】
ミコール酸を細胞壁に含有する微生物が複合培養活性を有する根拠は，（１）実施例に詳細を示した通り，ミコール酸生合成阻害剤であるイソニアジドを添加した状態でアールエリスロポリス（R. erythropolis)PR4 ，又はシーグルタミカム( C. glutamicum)とストレプトマイセス・リビダンスを複合培養しても，赤色色素生産誘導が行われないこと，（２）調べた限りミコール酸を含有する微生物以外に複合培養活性を有する微生物が見いだせないことが挙げられる。
【００２６】
ミコール酸を細胞壁に含有する微生物と複合培養される被検菌は，二次代謝産物を産生することが期待される菌であれば，特に限定されるものではない。被検菌としては，例えば，放線菌及び糸状菌を挙げることができる。
【００２７】
放線菌としては，例えば，クリプトバクテリウム（Cryptobacterium ），ルブロバクター（Rubrobacter ），アクチノバチュラム（Actinobaculum ），アクチノマイセス
(Actinomyces），コリネバクテリウム（Corynebacterium ），ゴルドニア（Gordonia），マイコバクテリウム（Mycobacterium ），ノカルディア（Nocardia），ロドコッカス
（Rhodococcus ），ミクロスファエラ（Microsphaera），クリプトスポランギウム
(Cryptosporangium)，ミクロコッカス(Micrococcus），アースロバクター(Arthrobacter)，ブレビバクテリウム（Brevibacterium），セルロモナス（Cellulomonas），ミクロバクテリウム（Microbacterium），アグロマイセス（Agromyces ），クリオバクテリウム
(Cryobacterium),ミクロモノスポラ(Micromonospora)，アクチノプラネス(Actinoplanes)，ダクチロスポランギウム（Dactylosporangium)，ノカルディオイデス（Nocardioides），シュードノカルディア（Pseudonocardia），アクチノビスポラ（Actinobispora ），アミコラトプシス（Amycolatopsis ），サッカロモノスポラ（Saccharomonospora ），アクチノシネマ（Actinosynnema ），アクチノキネオスポラ（Actinokineospora），ストレプトマイセス（Streptomyces），キタサトスポラ（Kitasatospora ），ストレプトスポランギウム（Streptosporangium ），ミクロビスポラ（Microbispora），ミクロテトラスポラ（Microtetraspora ），ノノムラエ（Nonomuraea),ノカルディオプシス（Nocardiopsis），アクチノマデュラ（Actinomadura），キネオコッカス（Kineococcus ），キネオスポリア（Kineosporia)，及びサーモビスポラ（Thermobispora ）からなる群より選択されるいずれかの属に属するものを挙げることができる。
【００２８】
糸状菌としては，例えば，アクレモニウム（Acremonium），アルテルナリア
（Alternaria），アスペルギルス（Aspergillus ），ボーベリア（Beauveria ），ボトリティス（Botorytis ）カララ（Chalara ），セルコスポラ（Cercospora），セファロスフォリウム（Cephalosporium），クリソスポリウム（Chrysosporium ），コクシジオイデス（Coccidioides），クリプトコッカス（Cryptococcus），クルブラリア（Curvularia），シリンドロカルポン（Cylindrocarpon），シリンドロクラディウム（Cylindrocladium ），カニングハメラ（Cunninghamella），ドレクスレラ（Drechslera），エピコッカム
（Epicoccum ），ユーペニシリウム（Eupenicillium ），フザリウム（Fusarium），ジオトリカム(Geotrichum)，グリオクラディウム（Gliocladium)，グラフィウム（Graphium），ヘルミントスポリウム（Helminthosporium），ヒアロデンドロン（Hyalodendron），イサリア（Isaria），メタルヒジウム（Metarhizium ），モニリア（Monilia ），モルティレラ（Mortierella ），ムコール（Mucor ），ノデュリオスポリウム（Nodulisporium ），パエシロマイセス（Paecilomyces），ペニシリウム（Penicillium ），ピリキュラリア（Pyricularia ），フィアロマイセス（Phialomyces ），リゾクトニア（Rhizoctonia ），スポロスリクス（Sporopthrix ），トリコヒートン（Trichophyton），トリコデルマ
（Trichocderma）, 及びトリコセシウム（Trichothecium ）からなる群より選択されるいずれかの属に属するものを挙げることができる。
【００２９】
二次代謝産物は，例えば，抗菌性抗生物質，制癌性抗生物質，抗寄生虫物質，又は酵素阻害剤であることができる。
【００３０】
複合培養は，細胞壁にミコール酸を含有する微生物と被検菌を複合して行う。ミコール酸を細胞壁に含有する微生物及び被検菌は，いずれも単独であっても，或いは，２種以上であってもよい。複合培養の方法や条件は，ミコール酸を含有する微生物及び被検菌の性質を考慮して適宜決定できる。温度，ｐＨ，培地栄養源，培養時間は，単独に被検菌を培養した場合と同様の条件で行うことができる。ミコール酸を含有する微生物と被検菌との複合割合については，同量ずつであることが好ましいが，被検菌の生産能力を誘導する点を考慮すると被検菌の菌数を多くしてもよい。
【００３１】
ミコール酸を細胞壁に含有する微生物及び被検菌株は，いずれも生菌体として共存した状態で培養することが好ましい。いずれも生菌体として共存した状態で培養することで，被検菌による二次代謝産物の産生を容易に行わせることができる。いずれも生菌体として共存した状態で培養することをここでは複合培養と定義する。実施例に示した産生方法はいずれの場合もミコール酸を細胞壁に含有する微生物を生菌の状態で複合培養している。死菌体や菌体抽出物の添加など，生菌体ではない状態での接触や，透析膜などによって両生菌体の接触を物理的に制限すると，被検菌は二次代謝産物の産生を行わない場合があるため，生菌体同士を複合培養することが好ましい。尚，生菌体とは，培養終了後の複合培養液より菌株が平板分離できる菌体を意味する。
【００３２】
培養液中に二次代謝産物が含まれているかの確認は，二次代謝産物の種類に応じて，公知の方法を用いて行うことができる。
【００３３】
−製造方法−
本発明の二次代謝産物の製造方法は，ミコール酸を細胞壁に含有する微生物及び少なくとも１種の被検菌である放線菌又は糸状菌を複合して培養し，培養液中に産生される二次代謝産物を採取することを特徴とする。
【００３４】
ここで使用されるミコール酸を細胞壁に含有する微生物，及び放線菌又は糸状菌は，上記スクリーニング方法で説明したものと同様である。但し，被検菌である放線菌又は糸状菌は，上記スクリーニング方法で二次代謝産物を生産することが確認された菌であることが適当である。
【００３５】
培養方法及び条件も，上記スクリーニング方法で説明したものと同様であるが，所望の二次代謝産物の産生量が多くなるように最適化して行われることが好ましい。培養は，所定量の二次代謝産物が産生され，培養液に蓄積された時点で終了し，培養液から二次代謝産物を採取する。二次代謝産物の採取方法は，二次代謝産物の種類に応じて，公知の方法から適宜選択することができる。
【００３６】
上記培養においては，ミコール酸を細胞壁に含有する微生物，及び被検菌である放線菌又は糸状菌は，いずれも生菌体として共存した状態で培養することが好ましい。いずれも生菌体として共存した状態で培養することで，ミコール酸を細胞壁に含有する微生物が放線菌，又は糸状菌を刺激し，放線菌，又は糸状菌の二次代謝生産が開始される。ミコール酸を細胞壁に含有する微生物が生菌体でなければ，放線菌，又は糸状菌の二次代謝生産誘導を示さない場合がある。なお，生菌体の定義は，前述の通りである。
【００３７】
−培養物−
本発明は，ミコール酸を細胞壁に含有する微生物に属する少なくとも１種の微生物，及び少なくとも１種の放線菌または糸状菌を複合して培養し，培養液中に二次代謝産物を蓄積させた培養物も包含する。本発明で得られる培養物は，本発明の製造方法において，所定量の二次代謝産物が産生され，培養液に蓄積された時点で培養を終了して得られる培養液であることができる。又は，この培養液をさらに処理や加工したものであることもできる。この培養物は，二次代謝産物を含有しており，そのまま，又は更に処理や加工を施して，二次代謝産物含有物として利用することができる。
【００３８】
次に，本発明を，実施例により更に詳細に説明する。
複合培養活性を有する微生物の分離と同定
ニュートリエントブロース軟寒天にストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces 
lividans) TK23株の胞子約１００万個を混ぜ，ベネットグルコース培地上に重層する。さらにその軟寒天の上に被検菌をエーゼで接種し，３０℃で培養する。２〜３日後にストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans) が一面に生育した際，被検菌を中心として，赤色色素が誘導されている菌株を得る。赤色色素を誘導したシーエフィシエンス(C.efficiens) NBRC100395株，シーグルタミカム(C.glutamicum)ATCC13869 株，ジールブリペルティンクタ(G.rubripertincta)JCM3204 株，アールコプロフィラス(R.coprophilus）JCM320株，アールエリスロポリス（R.erythropolis）NBRC100887株，アールウラチスラビエンシス（R.wratislaviensis)JCM9689 株，又はアールゾプフィイ(R.zopfii)JCM9919 株を得た。
【００３９】
図１には，上記で得られた赤色色素を誘導したシーグルタミカム(C.glutamicum)
ATCC13869 を用いた場合と，用いなかった場合の培養物の写真を，図１に示す。
図１には，ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans ）とコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）の液体培養を示す。ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans) (図１の左側Ｌ) ，及びコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum） (図１の中央Ｃ) のそれぞれの純粋培養では赤色色素生産は見られないが，両者を複合培養すると赤色色素生産が見られ，培養液が赤くなる（図１の右側Ｒ) 。即ち，図１の左側Ｌの培養液は，日本の伝統色でいうと，紅檜皮色であり，黄みの暗い赤色であった。図１の中央Ｃの培養液は，日本の伝統色でいうと，桜鼠色であり，紫みの明るい灰赤色であった。図１の右側Ｒの培養液は，日本の伝統色でいうと，桑染色であり，赤みの暗い赤紫色であった（上申書に添付の写真参照）。
【００４０】
〔ニュートリエントブロース軟寒天〕
０．８％  Nutrient Broth(Difco) ，０．５％  寒天末
〔ベネットグルコース培地〕
０．１％酵母抽出物，０．１％肉エキス（エルリッヒ) ，０．２％ＮＺ  Ａｍｉｎｅ
Ｔｙｐｅ  Ａ，１％グルコース，２％寒天，ｐＨ７．２
【００４１】
−実施例１−
ミコール酸生合成阻害剤であるイソニアジドを用いた複合培養方法
ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans) をＶ−２２液体培地で３０℃３日間振とう培養した。一方，シーエフィシエンス(C.efficiens) ，シーグルタミカム
(C.glutamicum)，アールエリスロポリス（R.erythropolis），アールウラチスラビエンシス（R.wratislaviensis)，アールコプロフィラス(R.coprophilus）を培養した場合はV-22液体培地で３０℃１日間，アールゾプフィイ(R.zopfii)，ジールブリペルティンクタ
(G.rubripertincta)は２日間振とう培養した。イソニアジドをアールウラチスラビエンシス（R.wratislaviensis)には０．０１ｍｇ／ｍｌ，他は１ｍｇ／ｍｌの濃度で添加したＡ−３Ｍ培地にストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans) は３％，そして，シーエフィシエンス(C.efficiens) ，シーグルタミカム(C.glutamicum)，アールエリスロポリス（R.erythropolis）NBRC100887株，アールウラチスラビエンシス
（R.wratislaviensis), アールコプロフィラス(R.coprophilus）, アールゾプフィイ
(R.zopfii)，ジールブリペルティンクタ(G.rubripertincta)は，それぞれ１％植菌し７日間３０℃で振とう培養した。また，イソニアジドを添加しないＡ−３Ｍ培地でも同様に行った。
【００４２】
ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans) による赤色色素生産は目視にて判定した。被検菌全てにおいて，赤色色素生産は見られず色素生産誘導はされなかった。イソニアジドを添加した場合と添加していない場合の写真を，図２に示す。イソニアジドを添加した場合は赤色色素生産が誘導されない。これは，ミコール酸が生合成されなくなったために，誘導活性が消失したことを意味している。本実験結果，及び赤色色素誘導活性を有する微生物が全てミコール酸を含有する微生物であることから，細胞壁にミコール酸を含有する微生物においてのみが赤色色素生産誘導活性を有すると結論した。
図２には，ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans ）とコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）の液体培養を示す。イソニアジドを添加しない複合培養では赤色色素生産が誘導され，培養液が赤くなる（図２の左側Ｌ）が，イソニアジドを添加した複合培養では色素生産が見られないため，培養液の色は培地由来の黄土色のままである（図２の右側Ｒ）。即ち，図２の左側Ｌの培養液は，日本の伝統色でいうと，韓紅花色であり，紫みのさえた赤色であった。図２の右側Ｒの培養液は，日本の伝統色でいうと，琥珀色であり，黄みの深い黄赤色であった（上申書に添付の写真参照）。
【００４３】
〔Ｖ−２２液体培地〕
０．１％澱粉，０．５％グルコース，０．３％ＮＺ−ｃａｓｅ，０．２％酵母抽出物，０．５％トリペプトン，０．１％Ｋ2 ＨＰＯ4 ，０．５％ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ，
０．３％ＣａＣＯ3 ，ｐＨ７．０
〔Ａ−３Ｍ培地〕
０．５％グルコース，２．０％グリセロール，２．０％澱粉，１．５％ファーマメディア(Pharmamedia），０．３％酵母抽出物，１．０％ＨＰ−２０ (脱気した後，ｐＨ調整後に複合した) ，ｐＨ７．０
【００４４】
−実施例２−                                                                    複合培養を用いた抗生物質スクリーニング方法
自然環境から分離した放線菌，１３９株をＶ−２２液体培地で３０℃，３日間培養した。
一方，アールエリスロポリス（R.erythropolis）PR4 株, 或いはシーグルタミカム
(C.glutamicum)をＶ−２２液体培地で３０℃，１日間培養した。培養液をそれぞれ３％，１％ずつＡ−３Ｍ培地に植菌し，３０℃で５〜１０日間培養した。培養液を等量のブタノールで抽出し，抗菌アッセイ用サンプルとした。
【００４５】
抗菌アッセイは被検菌として大腸菌(Escherichia coli)，スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus) ，バチルス・スブチリス(Bacillus subtilis) ，ミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)，サッカロミセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)，カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)の６菌株を用い，１０ｍｍのペーパーディスクにサンプルを染みこませ，培地上に静置し，抗菌阻止円の大きさで抗菌活性を判定した。その結果も一部を表１に示す。
【００４６】
【表１】
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【００４７】
表１には，１３９株の放線菌との複合培養結果のうちＫＫ００１，ＫＫ０１６，ＫＫ０１７，ＫＫ０２０，ＫＫ０５２，ＫＫ０５９，ＫＫ０７６株についての結果を示す。数字は抗菌阻止円の直径をｍｍ単位で表したものである。数字の大きい方が多量の抗菌物質を産生していることを意味する。表１において，「−」は単独培養であり，「Ｃｇ，Ｒｅ」は，アールエリスロポリス（R.erythropolis）PR4 株，或いはシーグルタミカム(C.glutamicum)との複合培養を意味する。表１に示す結果から，単独培養では抗菌成分を産生しない菌体であっても，シーグルタミカム(C.glutamicum)又はアールエリスロポリス（R.erythropolis）PR4 株と複合培養することで，抗菌成分を産生したり増加したりすることが明らかである。純粋培養に比べて，抗菌成分に新たに産生したり，生産量を増加させたりする放線菌は７２株，逆に複合培養をすることで抗菌活性が減少したり消失したりする放線菌は７８株であった。表１において，単独培養時よりも活性が上がった組み合わせ及び新しく活性が検出された組み合わせの数値に○印を付して表示している。
【００４８】
また，純粋培養，及び複合培養における抗菌活性の状況を表２に示す。表２において，純粋培養でのみ抗菌活性を有するものは，２．９％であった。複合培養で新たに抗菌活性を生じるものは，２８．１％であった。複合培養すると抗菌活性が増加するものは，
４０．３％であった。複合培養すると抗菌活性が消失するものは，３９．６％であった。複合培養すると抗菌活性が減少するものは，４３．２％であった。
【００４９】
【表２】
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【００５０】
次に，抗菌アッセイを行った放線菌１３９株のうち，純粋培養で抗菌活性が見られた放線菌８６株について，ＨＰＬＣによってブタノール抽出物の分析を行った。その結果を表３に示し，クロマトグラムを図３に示す。
【００５１】
【表３】
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【００５２】
二次代謝産物の生産パターンが純粋培養時と複合培養時で変化している例が多数見られた。ＨＰＬＣの結果より純粋培養に比べ二次代謝産物の生産量が増大する放線菌がＣｇとの複合培養で２７株であり，Ｒｅとの複合培養で４１株であり，複合培養すると新たに生産物を生産する放線菌はＣｇとの複合培養で１８株であり，Ｒｅとの複合培養で１９株であった。
【００５３】
図３には，複合培養による二次代謝パターンの変化をＨＰＬＣで測定したクロマトグラムを示している。二種類の放線菌Ａと放線菌Ｂを純粋培養及び複合培養した際の培養液を回収し，それをブタノールで抽出したサンプルをＨＰＬＣで解析したものである。縦軸は二次代謝産物のパターンを２５４ｎｍの紫外線の吸光度ピークで示しており，横軸は経過時間（ｍｉｎ）を示している。上段より放線菌Ａ又は放線菌Ｂの純粋培養を示し，中段がアールエリスロポリス（R.erythropolis）（図３では，Ｒｅで示す）と放線菌Ａ又は放線菌Ｂの複合培養を示し, 下段がシーグルタミカム(C.glutamicum)（図３では，Ｃｇで示す）と放線菌Ａ又は放線菌Ｂの複合培養を示している。図中，矢印は複合培養によって新たに生産が確認できた二次代謝産物のピーク, 若しくは複合培養によって生産量が増大したピークを示している。
【００５４】
−実施例３−
複合培養を用いた抗生物質スクリーニング方法（糸状菌）
自然分離糸状菌をＦ１液体培地で，２５℃の条件で３日間培養した。一方，アールエリスロポリス（R.erythropolis）PR4 株，又はシーグルタミカム(C.glutamicum)をＬＢ培地で３０℃の条件で１日間培養した。糸状菌を３％，アールエリスロポリス（R.erythropolis）PR4 株，又はシーグルタミカム(C.glutamicum)を１％ずつ，Ｆ１液体培地にそれぞれ植菌し，３０℃で７日間培養した。培養液を等量のブタノールで抽出し，抗菌アッセイ用サンプルとした。
Ｆ１液体培地は次のとおりである。                                                  １％グルコース，２％澱粉，２％ソイプロ，０．１％ＫＨ2 ＰＯ4 ，
０．０５％ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ，ｐＨ無調整。
【００５５】
抗菌アッセイは，被検菌としてバチルス・サブチリス（Bacilus subtilis) を用い，
１０ｍｍのペーパーディスクにサンプルを染み込ませ，培地上に静置し，抗菌阻止円の大きさで抗菌活性を判定した。その結果を表４に示す。
【００５６】
【表４】
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【００５７】
表４において，数字は抗菌阻止円の直径をｍｍ単位で表わした。「−」は単独培養であり，Ｃｇ，Ｒｅは，シーグルタミカム(C.glutamicum)との複合培養，又はアールエリスロポリス（R.erythropolis）PR4 株との複合培養を示している。表４に示す結果から，単独培養では抗菌成分を産生しない菌体であっても，シーグルタミカム(C.glutamicum)との複合培養，又はアールエリスロポリス（R.erythropolis）PR4 株との複合培養することで抗菌成分を新たに生産するようになったことが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
この発明は，抗生物質等の生理活性物質のスクリーニング，及びその製造方法に用いて有用であり，また，それらで得られる培養物を有効に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】赤色色素を誘導した微生物とシーグルタミカム(C.glutamicum)ATCC13869 株を用いた場合と用いなかった場合の培養物の写真を示す。
【図２】実施例１でイソニアジドを添加した場合と添加しなかった場合のストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans) とシーグルタミカム(C.glutamicum)ATCC13869 株の複合培養物の写真を示す。
【図３】実施例２で得られた培養物の高速液体クロマトグラムを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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