(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工多能性幹細胞の製造方法であって、哺乳類動物の体細胞を、miRNAの存在下で核初期化因子により核初期化し、該人工多能性幹細胞を生成する工程を含み、該miRNAが、hsa-miR-372、hsa-miR-373、hsa-miR-302b、hsa-miR-302c、hsa-miR-302a、hsa-miR-302d、hsa-miR-367、hsa-miR-520c、mmu-miR-291a、mmu-miR-294、及びmmu-miR-295からなる群から選ばれる1又は2以上のRNA（ここで、該RNAの記号はmiRBaseデータベースの登録名を示す。）に含まれる1又は2以上のmiRNAであり、該核初期化因子が、Oct3/4、Klfファミリー、及びSoxファミリーからなる3種の遺伝子またはその遺伝子産物を含み、該Klfファミリーが、Klf2またはKlf4であり、該Soxファミリーが、Sox1、Sox2、Sox3、Sox15またはSox17であることを特徴とする前記方法。
【請求項２】
前記miRNAがmiRBaseデータベースの登録名hsa-miR-302b-367で特定されるmiRNAである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記miRNAが配列表の配列番号1〜12から選択される1又は2以上のRNA配列に含まれる1又は2以上のmiRNAである、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
前記体細胞に、前記miRNAの発現を可能にするベクターを導入する工程をさらに含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
前記体細胞に、前記核初期化因子の発現を可能にするベクターを導入する工程をさらに含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
KlfファミリーがKlf4である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
SoxファミリーがSox2である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は分化した体細胞を初期化して効率的に人工多能性幹細胞を製造する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹細胞（ES細胞）はヒトやマウスの初期胚から樹立された幹細胞であり、生体に存在する全ての細胞へと分化できる多能性を維持したまま長期にわたって培養することができるという特徴を有している。この性質を利用してヒトES細胞はパーキンソン病、若年性糖尿病、白血病など多くの疾患に対する細胞移植療法の資源として期待されている。しかしながら、ES細胞の移植は臓器移植と同様に拒絶反応を惹起してしまうという問題がある。また、ヒト胚を破壊して樹立されるES細胞の利用に対しては倫理的見地から反対意見も多い。【０００３】
患者自身の分化体細胞を利用して脱分化を誘導し、ES細胞に近い多能性や増殖能を有する細胞（この細胞を本明細書において「人工多能性幹細胞」又は「iPS細胞」と言うが、この細胞は「誘導多能性幹細胞」、「胚性幹細胞様細胞」又は「ES様細胞」と呼ばれる場合もある）を樹立することができれば、拒絶反応や倫理的問題のない理想的な多能性細胞として利用できるものと期待される。最近、このiPS細胞をマウス及びヒトの分化細胞から製造できることが報告され、極めて大きな反響を呼んでいる(国際公開WO2007/69666; Cell, 126, pp.1-14, 2006; Cell, 131, pp.1-12, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007; Nature, 451, pp.141-146, 2008)。【０００４】
これらの方法では、複数の特定因子(Cell, 126, pp.1-14, 2006ではOct3/4、Sox2、Klf4、及びc-Mycの4因子が用いられている)を体細胞に導入して初期化を行う工程を含んでおり、因子の導入にはレトロウイルス又はレンチウイルスなどのウイルスベクターが用いられている。しかしながら、従来報告されている遺伝子導入による核初期化方法はいずれも効率が低く、人工多能性幹細胞がわずかしか得られないという問題を有している。特に、人工多能性幹細胞から分化した組織や固体において腫瘍化が懸念されるc-Mycを除く3因子(Oct3/4、Sox2、及びKlf4)を体細胞に導入して初期化を行った場合には、人工多能性幹細胞の取得効率が非常に低いという問題がある。【０００５】
一方、細胞にはさまざまなスモールRNA(small RNA)が発現していることが知られている。スモールRNAとしては、例えば二本鎖RNA特異的RNaseであるDicerにより切り出される18〜25塩基程度のRNA分子などを挙げることができるが、このスモールRNAは主としてsiRNA(small interfering RNA)とmiRNA(microRNA、以下、本明細書において「miRNA」と略す)に分類される。スモールRNAはRNA干渉(RNAi)/miRNA分子機構を介して翻訳の抑制、mRNAの分解、又はクロマチンの構造変化などの過程で標的を見つけるためのガイド分子として機能することが知られている。また、スモールRNAが発生過程の制御にも重要な機能を有していることも知られいている（例えば、総説として実験医学, 24, pp.814-819, 2006；microRNA実験プロトコール、pp20-35,2008,羊土社などを参照のこと）。【０００６】
胚性幹細胞(ES細胞)とmiRNAとの関係については、マウスES細胞において数種のmiRNAを含むmicroRNAクラスターがES細胞特異的に発現していることが報告されており(Developmental cell, 5, pp.351-358, 2003)、miRNA-295ががん抑制遺伝子Rbファミリーの一つであるRbl2の発現を抑制し、さらにメチル化酵素の発現を上昇させることによってDNAのメチル化に関連しているとの報告もある(Nature Structural & Molecular Biology, 15, pp.259-267, 2008; Nature Structural & Molecular Biology, 15, pp. pp.268-279, 2008)。しかしながら、スモールRNAが体細胞の核初期化において何らかの機能を有することは従来全く知られていない。
【特許文献１】国際公開WO2007/69666
【非特許文献１】Cell, 126, pp.1-14, 2006
【非特許文献２】Cell, 131, pp.1-12, 2007
【非特許文献３】Science, 318, pp.1917-1920, 2007
【非特許文献４】Nature, 451, pp.141-146, 2008
【非特許文献５】Developmental cell, 5, pp.351-358, 2003
【非特許文献６】Nature Structural & Molecular Biology, 15, pp.259-267, 2008
【非特許文献７】Nature Structural & Molecular Biology, 15, pp. pp.268-279, 2008
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、体細胞を初期化して人工多能性幹細胞を製造するにあたり、効率的に人工多能性幹細胞を製造するための手段を提供することにある。特に、腫瘍化が懸念されるc-Mycを用いることなく効率的な人工多能性幹細胞の製造を可能にする手段を提供することが本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、特定のmiRNAの存在下で核初期化を誘導する遺伝子を体細胞に導入すると効率的に人工多能性幹細胞を製造できることを見出した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。【０００９】
すなわち、本発明により、人工多能性幹細胞の製造方法であって、miRNAの存在下で核初期化因子により核初期化する工程を含み、該miRNAが該miRNAの存在下において該miRNAの非存在下の場合よりも高い核初期化効率を与える性質を有するmiRNAである方法が提供される。
本発明の好ましい態様によれば、該miRNAが、(a)胚性幹細胞において体細胞よりも高度に発現しており、かつ(b)該miRNAの存在下において該miRNAの非存在下の場合よりも高い核初期化効率を与える性質を有するmiRNAである上記の方法が提供される。【００１０】
この発明の好ましい態様によれば、核初期化因子が国際公開WO 2005/80598に記載された核初期化因子のスクリーニング方法により陽性を示す単一の物質又は複数の物質の組合わせである上記の方法；核初期化因子が国際公開WO 2005/80598に記載された核初期化因子のスクリーニング方法により陽性を示す単一の遺伝子の遺伝子産物又は複数の遺伝子の遺伝子産物の組み合わせである上記の方法；核初期化因子による核初期化を体細胞への上記遺伝子の導入により行う上記の方法；体細胞への上記遺伝子の導入を組換えベクターにより行う上記の方法；核初期化因子による核初期化を体細胞への上記遺伝子の遺伝子産物の導入により行う上記の方法が提供される。【００１１】
上記発明のさらに好ましい態様によれば、初期化因子をコードする遺伝子がOctファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、Mycファミリー遺伝子、Linファミリー遺伝子、及びNanog遺伝子からなる群から選ばれる1種以上の遺伝子、好ましくはMycファミリーを除く遺伝子から選ばれる2種の遺伝子の組み合わせ、さらに好ましくは3種の遺伝子の組み合わせ、特に好ましくは4種又は4種以上の遺伝子の組み合わせである上記の方法が提供される。【００１２】
より好ましい組み合わせは、(a)Octファミリー遺伝子及びSoxファミリー遺伝子からなる2種の遺伝子の組み合わせ；(b)Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、及びSoxファミリー遺伝子からなる3種の遺伝子の組み合わせ；(c)Octファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、Linファミリー遺伝子、及びNanog遺伝子からなる4種の遺伝子の組み合わせなどである。さらに、TERT遺伝子及び／又はSV40 Large T antigen遺伝子を組合わせることも好ましい。場合により、Klfファミリー遺伝子を除くことが好ましい場合もある。場合によってはこれらの組合わせにMycファミリー遺伝子を含むこともできるが、本発明においてはMycファミリー遺伝子を含まない組み合わせを好適に用いることができる。【００１３】
これらのうち、特に好ましい組み合わせは、Oct3/4及びSox2からなる2種の遺伝子の組み合わせ；Oct3/4、Klf4、及びSox2からなる3種の遺伝子の組み合わせ；及びOct3/4、Sox2、Lin28、及びNanogからなる4種の遺伝子の組み合わせであり、これらにTERT遺伝子及び／又はSV40 Large T antigen遺伝子を組合わせることも好ましい。場合によりKlf4を除くことが好ましい場合もある。場合によってはこれらの組合わせにc-Mycを組合わせることもできるが、本発明においてはc-Mycを含まない組み合わせを好適に用いることができる。【００１４】
また、別の好ましい態様によれば、体細胞がヒトを含む哺乳類動物の体細胞、好ましくはヒト又はマウスの体細胞、特に好ましくはヒトの体細胞である上記の方法；体細胞がヒト胎児細胞又は成人ヒト由来の体細胞である上記の方法；体細胞が患者から採取した体細胞である上記の方法が提供される。【００１５】
さらに別の好ましい態様によれば、miRNAが表1又は表2に記載されたmiRBaseデータベースの登録名又はアクセッション番号で特定されるRNA配列に含まれる1又は2以上のmiRNAである上記の方法；表1又は表2に記載されたmiRBaseデータベースの登録名（及びアクセッション番号）で特定されるRNA配列がhsa-miR-372 (MI0000780)、hsa-miR-373 (MI0000781)、hsa-miR-302b (MI0000772)、hsa-miR-302c (MI0000773)、hsa-miR-302a (MI0000738)、hsa-miR-302d (MI0000774)、hsa-miR-367 (MI0000775)、hsa-miR-520c (MI0003158)、mmu-miR-291a (MI0000389)、mmu-miR-294 (MI0000392)、及びmmu-miR-295 (MI0000393)からなる群から選ばれる1又は2以上のRNAである上記の方法；miRNAがhsa-miR-302b-367で特定されるRNAに含まれるmiRNAである上記の方法；miRNAが配列表の配列番号1ないし12で示されるRNA配列から選択される1又は2以上のRNA配列に含まれる1又は2以上のmiRNAである上記の方法が提供される。【００１６】
別の観点からは、上記の方法により得られることができる人工多能性幹細胞が本発明により提供される。また、上記の人工多能性幹細胞から分化誘導された体細胞も本発明により提供される。【００１７】
さらに本発明により、幹細胞療法であって、患者から分離採取した体細胞を用いて上記の方法により得られた人工多能性幹細胞を分化誘導して得られる体細胞を該患者に移植する工程を含む療法が提供される。
さらに本発明により、上記の方法により得られた人工多能性幹細胞を分化誘導して得られる各種細胞を用いて、化合物、薬剤、毒物などの生理作用や毒性を評価する方法が提供される。【００１８】
さらに本発明により、胚性幹細胞において体細胞よりも高度に発現しているmiRNAであって、該miRNAの存在下において該miRNAの非存在下の場合よりも高い核初期化効率を与える性質を有するmiRNAを用いる人工多能性幹細胞の製造方法；及び胚性幹細胞において体細胞よりも高度に発現しているmiRNAであって、該miRNAの存在下において該miRNAの非存在下の場合よりも高い核初期化効率を与える性質を有するmiRNAを用いる体細胞の核初期化方法が提供される。【００１９】
さらに本発明により、胚性幹細胞において体細胞よりも高度に発現しているmiRNAであって、該miRNAの存在下において該miRNAの非存在下の場合よりも高い核初期化効率を与える性質を有するmiRNAの人工多能性幹細胞の製造のための使用；並びに胚性幹細胞において体細胞よりも高度に発現しているmiRNAであって、該miRNAの存在下において該miRNAの非存在下の場合よりも高い核初期化効率を与える性質を有するmiRNAの体細胞の核初期化のための使用が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】それぞれ一種類のmiRNAの存在下でOct3/4、Klf4、及びSox2からなる3遺伝子の組み合わせ（この組合わせを「3f」と表記し、「c-Myc(-)」は核初期化効率に優れるOct3/4、Klf4、Sox2、及びc-Mycからなる4遺伝子の組み合わせからc-Mycを除いたことを意味する）によりマウスの胎児腺維芽細胞の核初期化を誘導し、人工多能性幹細胞の生成効率を確認した結果を示す図である。3f+DsRedは対照として上記3遺伝子の組み合わせにDsRed(Discosoma sp. red fluorescent protein)を加えた組み合わせを示す。表は、3f+DsRedで多能性幹細胞誘導を行った場合のコロニー数を100としたとき値である。
【図２】人工多能性幹細胞の生成効率を示した図である。上段はOct3/4、Klf4、及びSox2からなる3遺伝子の組み合わせ（4遺伝子の組み合わせからc-Mycを除いた3遺伝子の組み合わせにDsRedを追加した組み合わせ（対照）の結果を示し、下段はmmu-miR-295の存在下でOct3/4、Klf4、及びSox2からなる3遺伝子の組み合わせによりマウス尻尾線維芽細胞TTF(tail tip fibroblasts)の核初期化を誘導した結果を示す。図中の数字はNanog GFP陽性コロニー数/全コロニー数を示す。
【図３】ヒト成人皮膚細胞を種々のmiRNAの存在下でOct3/4、Klf4、及びSox2からなる3遺伝子の組み合わせ（Oct3/4、Klf4、Sox2、及びc-Mycからなる4遺伝子の組み合わせからc-Mycを除いた3遺伝子の組み合わせ：Myc(-)3f）、並びにOct3/4、Klf4、Sox2、及びc-Mycからなる4遺伝子の組み合わせ(Y4f)により核初期化を誘導し、人工多能性幹細胞の生成効率を確認した結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明の方法は、人工多能性幹細胞の製造方法であって、miRNAの存在下で核初期化因子により核初期化する工程を含み、該miRNAが該miRNAの存在下において該miRNAの非存在下の場合よりも高い核初期化効率を与える性質を有するmiRNAであることを特徴としている。本発明の好ましい態様では、該miRNAが(a)胚性幹細胞において体細胞よりも高度に発現しており、かつ(b)該miRNAの存在下において該miRNAの非存在下の場合よりも高い核初期化効率を与える性質を有するmiRNAであることを特徴としている。【００２２】
miRNAについては、例えば、実験医学, 24, pp.814-819, 2006；microRNA実験プロトコール、pp20-35,2008,羊土社などに分類、生体内での機能などが説明されている。miRNAの塩基数は、例えば18〜25、好ましくは19〜23程度である。現時点で約1,000個程度のmiRNA情報を格納したデータベースを利用することができ（例えばmiRBase、http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/ index.shtml）、当業者はこのデータベースから任意のmiRNA情報を引き出すことができ、胚性幹細胞において体細胞よりも高度に発現しているmiRNAを容易に抽出することが可能である。また、miRNAマイクロアレイやリアルタイムPCRなど当業者に利用可能な手法を用いて胚性幹細胞と体細胞との間でmiRNAの発現の違いを確認することにより、胚性幹細胞において体細胞よりも高度に発現しているmiRNAを容易に特定することが可能である。【００２３】
また、miRNAの存在下及び非存在下における核初期化効率の変化については、本明細書の実施例に具体的に示されたように、ES細胞で特異的に発現しているNanog遺伝子のプロモーター領域の下流にEGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein )とpuromycinの耐性遺伝子をコードする配列をつないだトランスジェニックマウスを作成し、このマウス由来の線維芽細胞に、例えばOct3/4、Sox2、及びKlf4の3種の遺伝子と各種のmiRNAを導入して核初期化を誘導し、人工多能性幹細胞の生成効率を確認すればよい。生成効率は、例えばコロニー数を計測することにより行うことができるが、より具体的には、上記遺伝子及びmiRNA導入後21日目から薬剤選択を開始し、28日目に全体のコロニー数とNanog GFP陽性コロニー数（Nanog遺伝子座によって発現が誘導されるGFPを蛍光顕微鏡で確認することができる）を観察して、コロニー数を比較することができる。もっとも、核初期化効率の確認は上記の方法に限定されることはなく、上記の方法には適宜の修飾や改変が可能であり、当業者が適宜の方法を採用できることは言うまでもない。【００２４】
miRNAとしては、初期化すべき体細胞と同じ動物種由来のmiRNAを用いることが好ましい。miRNAとしては野生型のmiRNAのほか、数個（例えば1〜6個、好ましくは1〜4個、より好ましくは1〜3個、さらに好ましくは1又は2個、特に好ましくは1個）の塩基が置換、挿入、及び／又は欠失したmiRNAであって、生体内で野生型miRNAと同様の機能を発揮可能なmiRNAを用いることもできる。【００２５】
本発明の方法において好ましく用いられるmiRNAとして、例えばmiRBaseに登録された下記のRNA配列：hsa-miR-372 (MI0000780)、hsa-miR-373 (MI0000781)、hsa-miR-302b (MI0000772)、hsa-miR-302c (MI0000773)、hsa-miR-302a (MI0000738)、hsa-miR-302d (MI0000774)、hsa-miR-367 (MI0000775)、hsa-miR-520c (MI0003158)、mmu-miR-291a (MI0000389)、mmu-miR-294 (MI0000392)、及びmmu-miR-295 (MI0000393)（カッコ内はそれぞれmiRBaseのアクセッション番号を示し、hsa-miR-はヒトmiRNA、mmu-miR-はマウスmiRNAを示す）に含まれる1又は2以上のmiRNAを挙げることができるが、これらに限定されることはない。【００２６】
本発明の方法においては、このようにして核初期化効率を高めることが確認されたmiRNAを単独で用いてもよいが、2種以上組合わせて用いることもできる。また、クラスターを形成している複数のmiRNAを用いることもでき、例えばmiRNAクラスターを含むRNA配列として入手可能なhsa-miR-302b-367などを利用することもできる。これらのmiRNAを利用するためのRNA配列の例を配列表の配列番号1ないし12に示す。配列番号1: mmu-mir-294 (MI0000392); 配列番号2: mmu-mir-295 (MI0000393); 配列番号3: hsa-mir-372 (MI0000780); 配列番号4: hsa-mir-373 (MI0000781); 配列番号5: hsa-mir-302b (MI0000772); 配列番号6: hsa-mir-302c (MI0000773); 配列番号7: hsa-mir-302a (MI0000738); 配列番号8: hsa-mir-302d (MI0000774); 配列番号9: hsa-mir-367 (MI0000775); 配列番号10: hsa-mir-520c (MI0003158); 及び配列番号11: mmu-mir-291a MI0000389。また、配列番号12で示されるRNAも好ましく用いることができる。これらのRNA配列のなかには1つの配列中に複数のmiRNAを含むRNA配列が含まれており、このようなRNA配列を利用することにより効率的なiPS細胞の製造が可能になる。さらに、1つの配列中に複数のmiRNAを含むRNA配列とその他の1又は2以上のmiRNAを含む1又は2以上のRNA配列とを組み合わせて利用することも可能である。【００２７】
miRNA は、タンパク質に翻訳されない非コードRNAである。miRNAは、対応する遺伝子からpri-miRNA が先ず転写され、次にこのpri-miRNA から特徴的なヘアピン構造を有する約70塩基のpre-miRNA が生成し、さらにこのpre-miRNAがDicerが介在したプロセシングを受けることによって生成する。本発明においては本発明の効果を損なわない限り、成熟型のmiRNAのみならず、pri-miRNA、又はpre-miRNAを用いてもよい。また、本発明で用いるmiRNAは、天然型のRNAのみならず、非天然型のRNAでもよい。【００２８】
本発明で用いるmiRNAの製造方法は特に限定されないが、例えば、化学合成方法、又は遺伝子組換え技術による方法で製造することができる。遺伝子組換え技術による方法で製造する場合には、遺伝子組み換えにより取得したDNAテンプレートとRNAポリメラーゼを用いて転写反応を行うことによって本発明で用いるmiRNAを製造することができる。RNAポリメラーゼとしては、例えば、T7 RNAポリメラーゼ、T3 RNAポリメラーゼ又はSP6 RNAポリメラーゼなどを用いることができる。【００２９】
あるいは、miRNAをコードするDNAを発現調節配列（プロモータ、エンハンサー等）の制御下に置かれるように適当なベクター内に組み込むことによって、miRNAを発現可能な組換えベクターを製造することができる。ここで用いるベクターの種類は特に限定されないが、好ましくはDNAベクターであり、例えば、ウイルスベクター又はプラスミドベクターなどを挙げることができる。ウイルスベクターとしては、特に限定されないが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどを用いることができる。また上記のプラスミドとしては、当業者にはよく知られた哺乳類の発現プラスミドを用いることができる。【００３０】
核初期化工程においてmiRNAを存在させる手段は特に限定されないが、例えば、miRNAを体細胞の直接核内に注入する方法やmiRNAを発現可能な適宜の組換えベクターを体細胞に導入する方法などが挙げられる。もっとも、これらの方法に限定されることはない。
組換えベクターを体細胞に導入する方法も特に限定されず、当業者に公知の方法で行うことができる。一時的トランスフェクション、微細注射、リン酸カルシウム沈澱法、リポソーム媒介トランスフェクション、DEAEデキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、遺伝子銃による方法などを用いることができる。【００３１】
核初期化因子を確認する手段としては、例えば、国際公開WO 2005/80598に記載された核初期化因子のスクリーニング方法を利用することができる。上記刊行物の全ての開示を参照により本明細書の開示に含める。当業者は上記刊行物を参照することにより核初期化因子をスクリーニングし、本発明の方法に利用することができる。また、上記のスクリーニング方法に適宜の修飾ないし改変を加えた方法を用いて核初期化因子を確認することもできる。【００３２】
初期化因子をコードする遺伝子の組み合わせの一例が国際公開WO2007/69666に開示されている。上記刊行物の全ての開示を参照により本明細書の開示に含める。当業者は上記刊行物を参照することにより本発明の方法に好適に使用可能な遺伝子を適宜選択することが可能である。また、初期化因子をコードする遺伝子の組み合わせの別の例がScience, 318, pp.1917-1920, 2007に記載されている。従って、当業者は核初期化因子をコードする遺伝子の組み合わせの多様性を理解することができ、国際公開WO 2005/80598に記載された核初期化因子のスクリーニング方法を利用することにより、国際公開WO2007/69666及びScience, 318, pp.1917-1920, 2007に記載された組み合わせ以外の適宜の遺伝子の組み合わせを本発明の方法において利用できる。【００３３】
本発明の方法において使用可能な初期化因子をコードする遺伝子として、Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、Mycファミリー遺伝子、Linファミリー遺伝子、及びNanog遺伝子からなる群から選ばれる1種以上の遺伝子を挙げることができるが、好ましくはMycファミリー遺伝子を除くOctファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、Linファミリー遺伝子、及びNanog遺伝子からなる群から選ばれる1種以上の遺伝子、より好ましくは2種の遺伝子の組み合わせ、さらに好ましくは3種の遺伝子の組み合わせ、特に好ましくは4種の遺伝子の組み合わせを挙げることができる。【００３４】
Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、Mycファミリー遺伝子については国際公開WO2007/69666にファミリー遺伝子の具体例が示されている。Linファミリー遺伝子についても当業者は同様にファミリー遺伝子を抽出することが可能である。【００３５】
また、Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、Mycファミリー遺伝子、Linファミリー遺伝子、及びNanog遺伝子からなる群から選ばれる1種以上の遺伝子によりコードされる初期化因子を例えばサイトカインなどで置き換えることができる場合があり、あるいは他の1種又は2種以上の低分子化合物で置き換えることができる場合もある。このような低分子化合物としては、例えばOctファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、Mycファミリー遺伝子、Linファミリー遺伝子、及びNanog遺伝子からなる群から選ばれる1種以上の遺伝子の発現を促進する作用を有する低分子化合物を用いることができるが、このような低分子化合物は当業者が容易にスクリーニングすることが可能である。【００３６】
より好ましい遺伝子の組み合わせとしては、
(a)Octファミリー遺伝子及びSoxファミリー遺伝子からなる2種の遺伝子の組み合わせ
(b)Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、及びSoxファミリー遺伝子からなる3種の遺伝子の組み合わせ；
(c)Octファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、Linファミリー遺伝子、及びNanog遺伝子からなる4種の遺伝子の組み合わせ；
などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。【００３７】
これらの遺伝子はいずれもヒトを含む哺乳類動物において共通して存在する遺伝子であり、本発明において上記遺伝子を利用するためには、任意の哺乳類動物由来（例えばヒト、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ウマ、サルなどの哺乳類動物由来）の遺伝子を用いることが可能である。また、野生型の遺伝子産物のほか、数個（例えば1〜10個、好ましくは1〜6個、より好ましくは1〜4個、さらに好ましくは1〜3個、特に好ましくは1又は2個）のアミノ酸が置換、挿入、及び／又は欠失した変異遺伝子産物であって、野生型の遺伝子産物と同様の機能を有する遺伝子産物も利用可能である。例えば、c-Mycの遺伝子産物としては野生型のほか安定型(T58A)などを用いてもよい。他の遺伝子産物についても同様である。【００３８】
また、上記の遺伝子に加えて、細胞の不死化を誘導する因子をコードする遺伝子をさらに組み合わせてもよい。国際公開WO2007/69666に開示されているように、例えば、TERT遺伝子、及び下記の遺伝子：SV40 Large T antigen、HPV16 E6、HPV16 E7、及びBmilからなる群から選ばれる1種以上の遺伝子を単独で、あるいは適宜組み合わせて用いることができる。
好ましい組み合わせとして、例えば、
(e)Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、及びTERT遺伝子からなる4種の遺伝子の組み合わせ；
(f)Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、及びSV40 Large T antigen遺伝子からなる4種の遺伝子の組み合わせ；
(g)Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、TERT遺伝子、及びSV40 Large T antigen遺伝子からなる5種の遺伝子の組み合わせを挙げることができる。
必要に応じて、上記の組み合わせからKlfファミリー遺伝子を除くことができる場合もある。【００３９】
さらに、上記の遺伝子に加えて、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、及びβ-cateninからなる群から選ばれる1種以上の遺伝子を組み合わせてもよく、及び／又はECAT1、Esg1、Dnmt3L、ECAT8、Gdf3、Sox15、ECAT15-1、Fthl17、Sall4、Rex1、UTF1、Stella、Stat3、及びGrb2からなる群から選ばれる1種以上の遺伝子を組み合わせることもできる。これらの組み合わせについては国際公開WO2007/69666に具体的に説明されている。【００４０】
特に好ましい遺伝子の組み合わせは、
(1)Oct3/4及びSox2からなる2種の遺伝子の組み合わせ；
(2)Oct3/4、Klf4、及びSox2からなる3種の遺伝子の組み合わせ；
(3)Oct3/4、Sox2、Lin28、及びNanogからなる4種の遺伝子の組み合わせ;
(4)Oct3/4、Sox2、TERT、及びSV40 Large T antigenからなる4種の遺伝子の組み合わせ；
(5)Oct3/4、Klf4、Sox2、TERT、及びSV40 Large T antigenからなる5種の遺伝子の組み合わせ
などであるが、これらに限定されることはない。【００４１】
上記の遺伝子産物を含む因子は、下記の群：Fbx15、Nanog、ERas、ECAT15-2、Tcl1、及びβ-cateninからなる群から選ばれる遺伝子のうちの1種又は2種以上の遺伝子産物と組み合わせてもよい。さらに、例えば、下記の群：ECAT1、Esg1、Dnmt3L、ECAT8、Gdf3、Sox15、ECAT15-1、Fthl17、Sall4、Rex1、UTF1、Stella、Stat3、及びGrb2からなる群から選ばれる1種以上の遺伝子の遺伝子産物と組合わせることもできる。これらの遺伝子産物については国際公開WO2007/69666に開示されている。もっとも、本発明の核初期化因子に含むことができる遺伝子産物は上記に具体的に説明した遺伝子の遺伝子産物に限定されることはない。本発明の核初期化因子には、核初期化因子として機能することができる他の遺伝子産物のほか、分化、発生、又は増殖などに関係する因子あるいはその他の生理活性を有する因子を1又は2以上含むことができ、そのような態様も本発明の範囲に包含されることは言うまでもない。【００４２】
初期化すべき体細胞においてこれらの遺伝子のうちの1種又は2種以上の遺伝子の遺伝子産物がすでに発現している場合には、そのような遺伝子産物を導入すべき因子から除外することができる。例えば、すでに発現している遺伝子以外の1種又は2種以上の遺伝子を体細胞に適宜の遺伝子導入方法、例えば組換えベクターを用いる方法などで導入することができる。あるいは、これらの遺伝子の遺伝子産物のうちの1種又は2種以上を融合タンパク質や核内へのマイクロインジェクションなどの手法により核内に導入する場合には、残りの1又は2以上の遺伝子を適宜の遺伝子導入方法、例えば組換えベクターを用いる方法などによって導入することができる。【００４３】
また、核初期化因子である遺伝子産物は、例えば上記遺伝子から産生されるタンパク質自体のほか、該タンパク質とその他のタンパク質又はペプチドなどとの融合遺伝子産物の形態であってもよい。例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)との融合タンパク質やヒスチジンタグなどのペプチドとの融合遺伝子産物を用いることもできる。また、HIVウイルスに由来するTATペプチドとの融合タンパク質を調製して用いることにより、細胞膜からの核初期化因子の細胞内取り込みを促進させることができ、遺伝子導入などの煩雑な操作を回避して、融合タンパク質を培地に添加するだけで初期化を誘導することが可能になる。このような融合遺伝子産物の調製方法は当業者によく知られているので、当業者は目的に応じて適宜の融合遺伝子産物を容易に設計して調製することが可能である。【００４４】
本明細書において「人工多能性幹細胞」(iPS細胞)とはES細胞に近い性質を有する細胞のことであり、より具体的には、体細胞より初期化された未分化細胞であって多能性及び増殖能を有する細胞を包含するが、この用語をいかなる意味においても限定的に解釈してはならず、最も広義に解釈する必要がある。核初期化因子を用いて人工多能性幹細胞を調製する方法については国際公開WO2005/80598に説明されており（上記公報においてはES様細胞という用語が用いられている）、人工多能性幹細胞の分離手段についても具体的に説明されている。また、国際公開WO2007/69666には初期化因子の具体例及びその初期化因子を用いた体細胞の初期化方法の具体例が開示されている。従って、本発明を実施するにあたり当業者はこれらの刊行物を参照することが望ましい。【００４５】
本発明の方法により体細胞から人工多能性幹細胞を調製する方法は特に限定されず、体細胞及び人工多能性幹細胞が増殖可能な環境においてmiRNAの存在下で核初期化因子により体細胞を核初期化できる方法であれば、いかなる方法を採用してもよい。例えば、核初期化因子を発現可能な遺伝子を含むベクターを用いて該遺伝子を体細胞に導入し、同時に、あるいは時間を変えてmiRNAを発現可能な組換えベクターを体細胞に導入するなどの手段を採用してもよい。このようなベクターを用いる場合には、ベクターに2種以上の遺伝子を組み込んでそれぞれの遺伝子産物を体細胞において同時に発現させてもよい。【００４６】
上記遺伝子を発現可能なベクターを用いて遺伝子及び／又はmiRNAを体細胞に導入する場合には、フィーダー細胞上に培養された体細胞に対して発現ベクターの導入を行ってもよいが、体細胞にのみ発現ベクター導入を行ってもよい。発現ベクターの導入効率を高めるために後者の方法が適している場合がある。フィーダー細胞としては胚性幹細胞の培養に用いられるフィーダー細胞を適宜使用することができるが、例えば、マウス14〜15日胚の線維芽細胞初代培養細胞や線維芽細胞由来細胞株であるSTO細胞等をマイトマイシンCなどの薬剤で処理した細胞や放射線処理した細胞などを用いることができる。【００４７】
核初期化因子を導入した体細胞を適宜の条件下で培養することにより自律的に核初期化が進行し、体細胞から人工多能性幹細胞を製造することができる。核初期化因子をコードする遺伝子及び／又はmiRNAを発現ベクターを用いて体細胞に導入して人工多能性幹細胞を得る工程は、例えばレトロウイルスを用いる方法に準じて行うことができ、例えば、Cell, 126, pp.1-14, 2006; Cell, 131, pp.1-12, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007などの刊行物に記載された方法に準じて行うことができる。ヒト人工多能性幹細胞を製造する場合には、発現ベクター導入後の細胞の培養密度を通常の動物細胞培養の場合よりも低く設定することが望ましい。例えば、細胞培養用ディッシュあたり1〜10万個、好ましくは5万個程度の細胞密度で培養を継続することが好ましい。培養に用いる培地は特に限定されず当業者により適宜選択可能であるが、例えば、ヒト人工多能性幹細胞を製造する場合にはヒトES細胞培養に適した培地を用いることが好ましい場合がある。培地の選択及び培養条件などについても上記刊行物を参照することができる。【００４８】
生成した人工多能性幹細胞は未分化細胞に特有の各種マーカーで確認することができるが、その手段についても上記の各刊行物に具体的かつ詳細に説明されている。ES細胞の未分化性及び多能性を維持可能な培地又はその性質を維持することができない培地は当業界で種々知られており、適宜の培地を組み合わせて用いることにより、人工多能性幹細胞を効率よく分離することができる。分離された人工多能性幹細胞の分化能及び増殖能はES細胞について汎用されている確認手段を利用することにより当業者が容易に確認可能である。また、生成した人工多能性幹細胞を適宜の条件下で増殖させると人工多能性幹細胞のコロニーが得られるが、コロニーの形状から人工多能性幹細胞の存在を特定することが可能である。例えば、マウス人工多能性幹細胞は盛り上がったコロニーを形成するのに対して、ヒト人工多能性幹細胞は扁平なコロニーを形成することが知られており、これらのコロニー形状はそれぞれマウスES細胞及びヒトES細胞のコロニーと極めて類似しているので、当業者はコロニー形状から生成した人工多能性幹細胞を特定することが可能になる。【００４９】
本発明の方法により初期化すべき体細胞の種類は特に限定されず、任意の体細胞を利用することができる。例えば、任意の哺乳類動物由来（例えばヒト、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ウマ、サルなどの哺乳類動物由来）の体細胞を用いることができ、胎児期の体細胞のほか、新生児の体細胞、成熟した体細胞及び組織幹細胞を用いてもよい。また、皮膚細胞、肝臓細胞、胃粘膜細胞など、多様な体細胞を初期化することが可能である。人工多能性幹細胞を疾病の治療に用いる場合には、患者から分離した体細胞を用いることが望ましく、例えば、疾病に関与する体細胞や疾病治療に関与する体細胞などを用いることができる。【００５０】
本発明の方法により製造される人工多能性幹細胞の用途は特に限定されず、ES細胞を利用して行われているあらゆる試験・研究やES細胞を用いた疾病の治療などに使用することができる。例えば、本発明の方法により得られた人工多能性幹細胞をレチノイン酸、EGFなどの増殖因子、又はグルココルチコイドなどで処理することにより、所望の分化細胞（例えば神経細胞、心筋細胞、血球細胞など）を誘導することができ、適宜の組織を形成させることができる。このようにして得られた分化細胞や組織を患者に戻すことにより自家細胞移植による幹細胞療法を達成することができる。もっとも、本発明の人工多能性幹細胞の用途は上記の特定の態様に限定されることはない。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１：マウス胎児線維芽細胞の核初期化による人工多能性幹細胞の調製
マウス由来Oct3/4、Sox2、及びKlf4の3種の遺伝子、コントロール用のDsRed、及び18種類のmiRNAのそれぞれをコードするpMXs-ベースのレトロウイルスベクターをPLAT-E細胞にFugene6 (Roche)を用いてトランスフェクトした。翌日、Nanog遺伝子のプロモーター領域の下流にEGFPとpuromycinの耐性遺伝子をコードした配列をつないだトランスジェニックマウス由来の胎児線維芽細胞(Nanog GFP MEF、WO2007/69666)を6 well plateに1×105個ずつまいた。翌日、この細胞にOct3/4、Sox2、及びKlf4、並びに18種類のmiRNAから選ばれる各1種類のmiRNAを発現するレトロウイルスを3因子の発現ウイルスの混合液1 ml＋miRNA発現ウイルス液1 mlの割合で感染させ核初期化により人工多能性幹細胞の調製を行った。【００５２】
【表１】
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【００５３】
感染後3日目からLIFを含むES細胞用培地で培養し、感染後4日目に細胞をはがし、フィーダー細胞上へ全量まきなおした。その後1日おきにLIFを含むES細胞用培地を交換し、感染後21日目から終濃度1.5μg/mlになるようにpuromycinを加えて薬剤選択を開始した。28日目にNanog GFP陽性（Nanog 遺伝子座によって発現が誘導されるGFPが蛍光顕微鏡で観察できる）コロニー数を観察した。コントロールとしてmiRNAの代わりにDsRedを用いた。結果を図１に示す。mmu-miR-294及びmmu-miR-295はそれぞれOct3/4、Sox2、及びKlf4の3つの因子と共にマウス胎児繊維芽細胞に導入した場合に核初期化の効率を高めることができ、効率的な人工多能性幹細胞の調製を可能にすることが分かった。【００５４】
例２：マウス尻尾線維芽細胞の核初期化による人工多能性幹細胞の調製
マウス由来Oct3/4、Sox2、及びKlf4の3種の遺伝子、DsRed（コントロール）、mmu-miR-295のそれぞれをコードするpMXs-ベースのレトロウイルスベクターをPLAT-E細胞にFugene6 (Roche)を用いてトランスフェクトした。翌日、Nanog遺伝子のプロモーター領域の下流にEGFPとpuromycinの耐性遺伝子をコードした配列をつないだトランスジェニックマウス由来の尻尾線維芽細胞(Nanog GFP tailtip fibroblasts)を6 well plateに1×105個ずつまいた。翌日、この細胞にOct3/4、Sox2、及びKlf4の３因子とDsRedあるいはmmu-miR-295を発現するレトロウイルスを(1:1:1:1)の割合で感染させ核初期化により人工多能性幹細胞の調製を行った。【００５５】
感染後3日目からLIFを含むES細胞用培地で培養し、感染後4日目に細胞をはがし、フィーダー細胞上へ全量まきなおした。その後1日おきにLIFを含むES細胞用培地を交換し、感染後7日目、21日目あるいは28日目から終濃度1.5μg/mlになるようにpuromycinを加えて薬剤選択を開始した。39日目に全体のコロニー数とNanog GFP陽性（Nanog 遺伝子座によって発現が誘導されるGFPが蛍光顕微鏡で観察できる）コロニー数を観察した。結果を図２に示す。mmu-miR-295はそれぞれOct3/4、Sox2、及びKlf4の3つの因子と共にマウス尻尾繊維芽細胞に導入した場合に核初期化の効率を高めることができるだけでなく、初期化のスピードを速め、効率的な人工多能性幹細胞の調製を可能にすることが分かった。【００５６】
例３：ヒト成人皮膚細胞の核初期化による人工多能性幹細胞の調製
ヒト由来Oct3/4、Sox2、及びKlf4の3種の遺伝子に加え、コントロール用のDsRedと23種類のmiRNA又はmiRNAクラスターをコードするpMXs-ベースのレトロウイルスベクターをPLAT-E細胞にFugene6 (Roche)を用いてトランスフェクトした。翌日、げっ歯類のみに感染するウイルスのレセプターであるSlc7a1を発現するようにしたヒト成人皮膚細胞（adult human dermal fibroblasts）を6cm dishに3×105個ずつまいた。翌日、この細胞にOct3/4、Sox2、及びKlf4の3種の遺伝子と各種miRNAを発現するレトロウイルスを1:1:1:1の割合で感染させ核初期化による人工多能性幹細胞の生成を試みた。【００５７】
【表２】
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【００５８】
感染後6日目に細胞をはがし、5×105個の細胞をフィーダー細胞上へ全量まきなおした。その後１日おきにbFGFを含むヒトES細胞用培地(リプロセル培地)を交換し、24日目、32日目、及び40日目にに全体のコロニー数とhuman ES細胞様の形をしたコロニー数を観察した。コントロールとしてmiRNAの代わりにDsRedを用いた。結果を図３に示す。  hsa-miR-372、373、302b、302b-367(302b、302c、302a、302d、及び367を含む)、520c、 mmu-miR-291a、294、又は295の存在下で3遺伝子を導入した場合に人工多能性幹細胞のコロニー数がコントロールに比べて2倍以上に増加することが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明により人工多能性幹細胞の効率的な製造方法が提供される。本発明の方法は従来の方法に比べて核初期化効率に優れており、例えばc-Myc又はその遺伝子産物を用いることなく安全な人工多能性幹細胞を効率的に製造することができる。従って、本発明の方法により、例えば患者自身の体細胞から安全性の高い人工多能性幹細胞を効率的に作製することができ、この細胞を分化させることにより得られる細胞（例えば心筋細胞、インスリン産生細胞、又は神経細胞など）を心不全、インスリン依存性糖尿病、パーキンソン病や脊髄損傷など多様な疾患に対する幹細胞移植療法において安全に利用することができる。
【図１】
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【図３】
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【図２】
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【配列表】
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