(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の１つ以上の不純物から標的分子を分離する方法であって、
（ａ）標的分子及び１つ以上の不純物を含んでいるサンプルを用意するステップ；
（ｂ）ベンジル修飾ポリアリルアミン、ジフェニル修飾ポリアリルアミン、ジクロロベンジル修飾ポリアリルアミン、クロロベンジル修飾ポリアリルアミン、ヘキサン酸およびｔｅｒｔ−ブチル修飾ポリアリルアミン、フェニルベンジル修飾ポリアリルアミン、ベンジル修飾ポリエチレンイミンおよびベンジル修飾ポリビニルアミンからなる群より選択される可溶性刺激応答性ポリマーであって、リン酸塩またはクエン酸塩から選択される多価イオン刺激を加えるとサンプル中の対象生体分子に結合し、沈殿させることができる可溶性刺激応答性ポリマーとサンプルを接触させてポリマーと１つ以上の不純物の複合体を形成するステップ；及び
（ｃ）サンプルにリン酸塩またはクエン酸塩から選択される多価イオン刺激を加えて溶液から複合体を沈殿させるステップ；
を含み、これにより１つ以上の不純物から標的分子を分離する、
前記方法。
【請求項２】
１つ以上の濾過ステップを更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１つ以上のクロマトグラフィーステップを更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ポリマーが少なくとも２つの同一タイプのモノマー単位を含み、前記単位の少なくとも５０％が電荷を含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ベンジル修飾ポリアリルアミン、ジフェニル修飾ポリアリルアミン、ジクロロベンジル修飾ポリアリルアミン、クロロベンジル修飾ポリアリルアミン、ヘキサン酸およびｔｅｒｔ−ブチル修飾ポリアリルアミン、フェニルベンジル修飾ポリアリルアミン、ベンジル修飾ポリエチレンイミンおよびベンジル修飾ポリビニルアミンからなる群より選択される可溶性刺激応答性ポリマーであって、リン酸塩またはクエン酸塩から選択される多価イオン刺激を加えるとサンプル中の対象生体分子に結合し、沈殿させることができる可溶性刺激応答性ポリマーを用いて、当該刺激応答性ポリマーの残留量を最小限にしながら、サンプル中の１つ以上の不純物から抗体を分離する方法であって、
（ａ）抗体及び１つ以上の不純物を含んでいるサンプルを用意するステップ；
（ｂ）前記ポリマーが１つ以上の不純物と結合するのに適した第１組の条件下において、サンプルを前記ポリマーと接触させ、それにより前記ポリマーと１つ以上の不純物の第１複合体を形成し、前記第１組の条件が、前記ポリマーの添加前、添加中または添加後に、サンプルのｐＨまたは塩濃度を調節することを含むステップ；
（ｃ）第２組の条件下でサンプルから第１複合体を沈殿させるステップ；
（ｄ）サンプルをリン酸塩またはクエン酸塩から選択される多価イオン刺激と接触させて、残留ポリマーと多価イオンの第２複合体を形成するステップ；
（ｅ）第２複合体を沈殿させるステップ；
を含み、それによりサンプル中の残留ポリマーの量を減少させながら、サンプル中の１つ以上の不純物から抗体を分離する、前記方法。
【請求項６】
抗体がモノクローナル抗体である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
１つ以上の不純物が宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルス、抗体凝集物及び細胞培養添加物からなる群から選択される請求項５に記載の方法。
【請求項８】
サンプルが供給材料を含む請求項５に記載の方法。
【請求項９】
サンプルが、抗体が分泌される細胞培養培地を含む請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
１つ以上のクロマトグラフィーステップを更に含む請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
１つ以上の濾過ステップを更に含む請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
ベンジル修飾ポリアリルアミン、ジフェニル修飾ポリアリルアミン、ジクロロベンジル修飾ポリアリルアミン、クロロベンジル修飾ポリアリルアミン、ヘキサン酸およびｔｅｒｔ−ブチル修飾ポリアリルアミン、フェニルベンジル修飾ポリアリルアミン、ベンジル修飾ポリエチレンイミンおよびベンジル修飾ポリビニルアミンからなる群より選択される可溶性刺激応答性ポリマーであって、リン酸塩またはクエン酸塩から選択される多価イオン刺激を加えるとサンプル中の対象生体分子に結合し、沈殿させることができる可溶性刺激応答性ポリマーを用いて、当該刺激応答性ポリマーの残留量を最小限にしながら、サンプル中の１つ以上の不純物から抗体を分離する方法であって、
（ａ）抗体及び１つ以上の不純物を含んでいるサンプルを用意するステップ；
（ｂ）前記ポリマーが１つ以上の不純物と結合するのに適した第１組の条件下において、サンプルを前記刺激応答性ポリマーと接触させ、それにより前記ポリマーと１つ以上の不純物の第１複合体を形成し、前記第１組の条件が、前記ポリマーの添加前、添加中または添加後に、サンプルのｐＨまたは塩濃度を調節することを含むステップ；
（ｃ）第１組の条件下でサンプルから第１複合体を凝集させるステップ；
（ｄ）凝集させた固体を除去するステップ；
（ｅ）サンプルをリン酸塩またはクエン酸塩から選択される多価イオンと接触させて、残留ポリマーと多価イオンの第２複合体を形成するステップ；及び
（ｆ）第２複合体を沈殿させるステップ；
を含み、それによりサンプル中の残留ポリマーの量を減少させながら、サンプル中の１つ以上の不純物から抗体を分離させる、前記方法。
【請求項１３】
サンプル中の１つ以上の不純物から標的分子を分離する方法であって、
（ａ）標的分子及び１つ以上の不純物を含んでいるサンプルを用意するステップ；
（ｂ）ベンジル修飾ポリアリルアミン、ジフェニル修飾ポリアリルアミン、ジクロロベンジル修飾ポリアリルアミン、クロロベンジル修飾ポリアリルアミン、ヘキサン酸およびｔｅｒｔ−ブチル修飾ポリアリルアミン、フェニルベンジル修飾ポリアリルアミン、ベンジル修飾ポリエチレンイミンおよびベンジル修飾ポリビニルアミンからなる群より選択される可溶性刺激応答性ポリマーであって、リン酸塩またはクエン酸塩から選択される多価イオン刺激を加えるとサンプル中の対象生体分子に結合し、沈殿させることができる可溶性刺激応答性ポリマーとサンプルを接触させ、前記ポリマーの添加前、添加中または添加後にリン酸塩またはクエン酸塩から選択される多価イオンを添加して、前記ポリマーと１つ以上の不純物の複合体を形成するステップ；
（ｃ）溶液から複合体を沈殿させるステップ；
を含み、それにより１つ以上の不純物から標的分子を分離させる、前記方法。
【請求項１４】
ステップ（ｃ）の後に、多価イオンで修飾させた膜または樹脂を使用することを含む残留量のポリマーを除去するステップを更に含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
多価イオンがリン酸塩である請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質精製のために有用なポリマーに関する。特に、本発明は、少なくとも部分的には、標的分子及び１つ以上の不純物を含有しているサンプルから標的分子を精製するために有用な刺激応答性ポリマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体分子、例えば抗体を含めた治療用タンパク質の効率的且つ経済的な大規模精製はバイオテクノロジー及び製薬業界にとってますます重要な検討対象である。通常、精製プロセスはかなり複雑で費用がかかり、多くの種々のステップを含む。例えば、典型的にはタンパク質の場合、例えばそのタンパク質をエンコードする遺伝子を含む組換えプラスミドを挿入することにより、当該タンパク質を産生するように工学操作された哺乳動物または細菌細胞株を用いる細胞培養方法を用いてタンパク質を産生させる。通常、標的タンパク質を発現させた後、１つ以上の例えば宿主細胞タンパク質、培地副産物及びＤＮＡを含めた望ましくない成分から分離することは、非常な難題となる。このような分離は、治療用タンパク質がヒトを対象とした使用目的であり、食品医薬品局（ＦＤＡ）の認可を必要とする場合には、特に重要である。
【０００３】
通常、タンパク質のために現在使用されている分離及び／または精製プロセスは、少なくとも以下のステップ、すなわち細胞内タンパク質を回収するために細胞溶解するステップまたは分泌タンパク質の場合にはタンパク質を培地から回収するステップ；細胞及び細胞破片を分画遠心または濾過を用いて除去して、当該タンパク質を含有する清澄化サンプルを得るステップ；及び多重ステッププロセスにおいて各種クロマトグラフィー媒体を用いてサンプル中の各種不純物から当該タンパク質を分離するステップを含む。
【０００４】
高分子電解質を含めた各種タイプのポリマーが、生体分子、特にタンパク質を精製するために１つ以上のステップで使用されている。例えば、タンパク質を精製するための凝集における高分子電解質の使用は、十分確立されている（例えば、国際ＰＣＴ特許出願Ｎｏ．ＷＯ  ２００８／０９１７４０を参照されたい）。これは広範囲のポリマーを用いて実施され得、唯一の必要な一般的特性はポリマーが当該種（例えば、標的分子または不純物）と若干レベルの相互作用を有していなければならないことである。最も一般的な方法はイオン種含有ポリマー（例えば、高分子電解質）の使用である。通常、高分子電解質をタンパク質混合物に添加し、精製は、混合物の１つ以上の成分の選択的凝集によりなされる。このアプローチの重大な欠点は、残留ポリマー汚染（例えば、ポリマーレベルが余りに高いとき）または非効率的凝集（例えば、ポリマーレベルが余りに低いとき）を避けるためには、注意深くコントロールされたレベルの高分子電解質を添加しなければならないことである。タンパク質の精製においては、イオン交換及び他の荷電クロマトグラフィー媒体が一般に使用されているため、残留高分子電解質が潜在的に下流精製ステップにおいて使用される媒体に結合して、プロセスを汚し、複雑にする恐れがある。
【０００５】
最近、生体分子の精製のためのポリマーの使用に関連する難題の幾つかを解決するテクノロジーが開発された（例えば、国際ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ  ２００８／０７９３０２  Ａ２を参照されたい）。例えば、可溶性成分（例えば、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、細胞培養添加物）及び不溶性成分（例えば、細胞及び細胞破片）の両方に結合し得る刺激応答性、すなわち「スマート」ポリマーが開発された（例えば、米国公開Ｎｏｓ．２００８０２５５０２７及び２００９００３６６５１を参照されたい）。刺激応答性ポリマーは通常、大いに有望であるが、前記ポリマーの広範囲の使用に直面する重大な難題は、実験室規模から大規模生産までの各種規模で実行し得る簡単な刺激の存在である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００８／０９１７４０号
【特許文献２】国際公開第２００８／０７９３０２号
【特許文献３】米国特許出願公開第２００８／０２５５０２７号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００９／００３６６５１号明細書
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、容易にスケーラブルであり、広範囲のｐＨ及び伝導率で操作し、よって例えば治療用タンパク質を含めた一連の生体分子を精製する際に使用することができる新規な高分子電解質を主成分とする刺激応答性ポリマーを提供する。
【０００８】
本発明に従う幾つかの実施形態では、１つ以上の疎水基を含む高分子電解質骨格を含む刺激応答性ポリマーを提供し、このポリマーは、刺激を加えた後サンプル中の対象生体分子に結合し、沈殿させることができる。
【０００９】
幾つかの実施形態では、本発明に従うポリマーの高分子電解質骨格は、少なくとも２つのモノマー単位または少なくとも３つのモノマー単位を含む。幾つかの実施形態では、モノマー単位の少なくとも５０％は電荷を含む。他の実施形態では、高分子電解質骨格の各モノマー単位は電荷を含む。
【００１０】
幾つかの実施形態では、本発明に従う刺激応答性ポリマーはポリアミン骨格を含む。幾つかの実施形態では、１つ以上の疎水基がフェニル基である。
【００１１】
本発明に従う刺激応答性ポリマーは、所望の標的分子を精製するために有用であり、所望の標的分子と一緒にサンプル中に存在する１つ以上の望ましくない実在物から所望の標的分子を分離することにより精製する。
【００１２】
従って、幾つかの実施形態では、本発明に従う刺激応答性ポリマーは、それ自体刺激応答性ポリマーにより結合し、沈殿する所望の標的分子である対象生体分子に結合し、沈殿させる。他の実施形態では、刺激応答性ポリマーは、所望の標的分子と一緒にサンプル中に存在する望ましくない実在物である対象生体分子に結合し、沈殿させる。
【００１３】
幾つかの実施形態では、対象生体分子は、治療用ポリペプチド（すなわち、所望の標的分子）である。幾つかの実施形態では、治療用ポリペプチドは抗体（例えば、モノクローナル抗体）である。
【００１４】
他の実施形態では、対象生体分子は、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、ウイルス、エンドトキシン、細胞培養添加物、全細胞及び細胞破片からなる群から選択される。
【００１５】
幾つかの実施形態では、本発明に従うポリマーは、複合体形成塩である刺激に対して応答性である。
【００１６】
本明細書中に記載されているポリマーの使用方法も本発明に包含される。刺激応答性ポリマーは、精製プロセスにおける１つ以上のステップ時に取って代わりまたは改善し、これにより１つ以上の望ましくない実在物から精製または分離させたい所望の標的分子の全純度を実質的に向上させる点で、従来技術に記載されているポリマーに比して独自であり、創意に富んでいる。
【００１７】
従って、幾つかの実施形態では、（ａ）標的分子及び１つ以上の不純物を含んでいるサンプルを用意するステップ；（ｂ）高分子電解質骨格に結合させた１つ以上の疎水基を含む高分子電解質骨格を含む刺激応答性ポリマーが溶液中の標的分子に結合してポリマーと標的分子の複合体を形成するのに適した第１組の条件下で、サンプルを刺激応答性ポリマーと接触させるステップ；及び（ｃ）溶液から複合体を沈殿させるのに適した第２組の条件下でサンプルに刺激を加えるステップ；を含み、複合体を沈殿させると１つ以上の不純物から標的分子が分離し、これにより標的分子の純度を向上させる方法を提供する。
【００１８】
本発明の方法に従う幾つかの実施形態では、方法は更に複合体から標的分子を回収するステップを含む。
【００１９】
別の実施形態では、本発明に従う刺激応答性ポリマーは、標的分子ではなく１つ以上の不純物に結合し、沈殿させ、ポリマーと１つ以上の不純物の複合体を沈殿させると１つ以上の不純物から標的分子が分離し、これにより標的分子の純度を向上させる。従って、前記方法は、
（ａ）標的分子及び１つ以上の不純物を含んでいるサンプルを用意するステップ；（ｂ）高分子電解質骨格に結合させた１つ以上の疎水基を含む高分子電解質骨格を含む刺激応答性ポリマーが、１つ以上の不純物に結合してポリマーと１つ以上の不純物の複合体を形成するのに適した第１組の条件下で、サンプルを刺激応答性ポリマーと接触させるステップ；及び（ｃ）複合体を沈殿させるのに適した第２組の条件下でサンプルに刺激を加えるステップ；を含み、複合体を沈殿させると１つ以上の不純物から標的分子が分離し、これにより標的分子の純度を向上させる。
【００２０】
幾つかの実施形態では、本発明に従う刺激応答性ポリマーは、以下の構造：
【００２１】
【化１】
0005612761.tif 000002
（式中、ｘ及びｙはポリマーのモノマー単位を表し；Ｒ１及びＲ２は高分子電解質骨格（Ｂ）の一部を形成する荷電基であり；Ｒ３は骨格中の荷電基に結合している疎水基である）
を含む。モノマー単位の総数（すなわち、ｘ及びｙモノマー単位の合計）に対するｙモノマー単位（すなわち、骨格に結合している疎水基を有する）の比がポリマーの「疎水性修飾の％」に相当する。
【００２２】
幾つかの実施形態では、本発明に従う刺激応答性ポリマーは、以下の構造：
【００２３】
【化２】
0005612761.tif 000003
（式中、ｘ、ｙ及びｚはポリマー中のモノマー単位を表し；Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は高分子電解質骨格（Ｂ）の一部を形成する荷電基であり；Ｒ４は骨格中の荷電基に結合している疎水基であり；Ｒ５は骨格中の荷電基に結合している官能基である）
を含む。ポリマー中のモノマー単位の総数（すなわち、ｘ、ｙ及びｚモノマー単位の合計）に対するｙモノマー単位（すなわち、骨格に結合している疎水基を有する）の比がポリマーの「疎水性修飾の％」に相当する。更に、モノマー単位の総数（すなわち、ｘ、ｙ及びｚモノマー単位の合計）に対するｚモノマー単位（すなわち、骨格上の荷電基に結合している官能基を有する）の比はポリマーの「官能基修飾の％」に相当する。
【００２４】
通常、本発明に包含されるポリマーは、ｎ（ここで、ｎは２以上である）個の本明細書中に記載されているモノマー単位ｘ、ｙまたはｚを有し得る。
【００２５】
もっと他の実施形態では、本発明に従う刺激応答性ポリマーは、以下の構造：
【００２６】
【化３】
0005612761.tif 000004
（式中、ｘ及びｙはポリマーのモノマー単位を表し；Ｒ１、Ｒ２は高分子電解質の炭素含有骨格の一部を形成する脂肪族アミン基（例えば、第１級または第２級及び／または芳香族アミン）であり；Ｒ３はアミン基Ｒ２に結合している疎水基であり、４個以上の炭素原子を含有している（例えば、アルキル基、アルケニル基、アルアルケニル基またはフルオロカーボン基））
を含む。幾つかの実施形態では、ｘ（すなわち、高分子電解質骨格中の非修飾荷電基）に対するｙ（すなわち、高分子電解質骨格中の荷電基に結合している疎水基を有するモノマー単位）の比は０．０１〜０．７５または０．０５〜０．７５である。従って、疎水基修飾％は全高分子電解質モノマー単位（すなわち、ｘ＋ｙ）の１％〜７５％または５％〜７５％である。
【００２７】
更に他の実施形態では、本発明に従う刺激応答性ポリマーは、以下の構造：
【００２８】
【化４】
0005612761.tif 000005
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は炭素含有高分子電解質骨格の一部を形成する脂肪族アミン基（例えば、第１級または第２級アミン及び／または芳香族アミン）であり；Ｒ４は４個以上の炭素原子を含有し、アルケニル、アルアルキル及びアルアルケニル基から選択される疎水基であり；Ｒ５は４個以上の炭素原子を含有し、アルキルまたはフルオロカーボン基から選択される疎水基である）
を含む。高分子電解質モノマー単位の総数に対するｙモノマー単位の比は０．０１〜０．７５である。高分子電解質モノマー単位の総数に対するｚモノマー単位の比は０．０５〜０．５または０．０１〜０．５である。従って、疎水基修飾％は１％〜７５％または５％〜７５％であり、官能基修飾％は１％〜５０％または５％〜５０％である。
【００２９】
本発明に従う刺激応答性ポリマーを用いる追加方法には、サンプル中の残留ポリマーの量を減少させながら当該標的分子または産物（例えば、抗体）を精製することができる方法が含まれる。
【００３０】
幾つかの実施形態では、刺激応答性ポリマーの残留量を最小限にしながら、本発明に従う刺激応答性ポリマーを用いて１つ以上の不純物から標的分子（例えば、抗体）を分離する方法を提供し、その方法は、（ａ）標的分子及び１つ以上の不純物を含んでいるサンプルを用意するステップ；（ｂ）刺激応答性ポリマーの添加前、添加中または添加後にサンプルのｐＨまたは塩濃度を調節することを含むポリマーが１つ以上の不純物に結合してポリマーと１つ以上の不純物の第１複合体を形成するのに適した第１組の条件下で、サンプルを刺激応答性ポリマーと接触させるステップ；（ｃ）第２組の条件下でサンプルから第１複合体を沈殿させるステップ；（ｄ）サンプルを多価イオンと接触させて、残留ポリマーと多価イオンの第２複合体を形成するステップ；（ｅ）第２複合体を沈殿させるステップ；及び（ｆ）サンプルから標的分子を回収するステップ；を含み、これによりサンプル中の残留ポリマーの量を減少させながら、サンプル中の１つ以上の不純物から標的分子が分離する。
【００３１】
幾つかの実施形態では、標的分子は抗体である。特定実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。
【００３２】
特定実施形態では、本発明に従う各種方法中の標的分子の回収はクロマトグラフィーステップを含む。別の実施形態では、標的分子の回収は濾過ステップを含む。
【００３３】
幾つかの実施形態では、本発明に従う方法は、本発明に従う刺激応答性ポリマーを使用する２つ以上のステップを含み得る。例えば、刺激応答性ポリマーは、精製プロセスの１つのステップにおいて１つ以上の不純物を沈殿させるために使用され得、同一または異なるポリマーがプロセスの異なるステップにおいて標的分子または所望の産物を沈殿させるために使用され得る。
【００３４】
幾つかの実施形態では、１つ以上の不純物は宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗体凝集物、ウイルス、エンドトキシン、全細胞、細胞破片及び細胞培養添加物からなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ポリアリルアミンポリマーのベンジルクロリドとの反応を示す図である。
【図２】ヘキサン酸及びｔｅｒｔ−ブチル修飾ポリアリルアミン（ＨＣ−ｔ−ＢｕＭＰＡＡ）についての反応スキームを示す。
【図３】ヘキサン酸及びｔｅｒｔ−ブチル修飾ポリアリルアミン（ＨＣ−ｔ−ＢｕＭＰＡＡ）の多価イオン刺激及びｐＨ応答性に対する塩化ナトリウムの影響を示すグラフである。Ｘ軸はｐＨを表し、Ｙ軸は遠心分離液（すなわち、遠心機の出力）の濁度を表す。
【図４】実施例２９に記載されているポリビニルアミンの合成を示す。
【図５】重合後のポリアミンの脱保護反応を示す。
【図６】ポリビニルアミンのベンジルクロリドとの反応を示す。
【図７】多価イオン刺激応答性コポリマーを形成するための重合及び反応スキームを示す。
【図８】実施例３５からの修飾ポリビニルアミン（ＰＶＡ）のＮＭＲスペクトルを示す。１Ｈ  ＮＭＲの積分は約１８％のベンジル修飾レベルを示す。
【図９】実施例３６からの修飾ポリアリルアミンのＮＭＲスペクトルを示す。１Ｈ  ＮＭＲの積分は約３３％のベンジル修飾レベルを示す。
【図１０】非刺激応答性ポリマー（例えば、キトサン）及び刺激応答性ポリマー（例えば、ベンジル修飾ポリアリルアミン）についてのポリマー添加の遠心分離液濁度に対する影響を示すグラフを示す。実施例３７に記載されているように、Ｘ軸はポリマー添加量（ｗｔ％）であり、Ｙ軸は遠心分離液濁度（ＮＴＵ）である。
【図１１】ベンジルポリアリルアミン刺激応答性ポリマーについての刺激の存在及び非存在下でのポリマー添加量の影響を示すグラフを示す。実施例３８に記載されているように、Ｘ軸はポリマー添加量（ｗｔ％）であり、Ｙ軸は遠心分離液濁度（ＮＴＵ）である。
【図１２】生体分子の精製のために使用される典型的スキームを示す。
【図１３】細胞培養物の清澄化を改善するために使用される刺激応答性ポリマーを含めた精製スキームを示す。刺激応答性ポリマーは、１つ以上の不純物を除去するが、ポリマーは、所望の標的分子に結合しない。
【図１４】細胞培養物の清澄化を改善するために使用される刺激応答性ポリマーを含めた精製スキームを表す。刺激応答性ポリマーは、凝集により１つ以上の不純物を除去するが、ポリマーは、所望の標的分子に結合せず、残留ポリマーは、清澄化後刺激を加えることにより除去される。
【図１５】細胞培養物の清澄化を改善するために使用される刺激応答性ポリマーを含めた精製スキームを表す。刺激応答性ポリマーは、凝集により１つ以上の不純物を除去するが、ポリマーは、所望の標的分子に結合せず、残留ポリマーは、清澄化後の追加の吸着濾過ステップにより除去される。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明は、少なくとも部分的に、１つ以上の疎水基で修飾させた高分子電解質骨格を含む新規で改善された刺激応答性ポリマーを提供し、刺激を加えることによりポリマー溶解度を変化させ得る。
【００３７】
本明細書中に記載されている刺激応答性ポリマー及び前記ポリマーの使用方法は、例えばタンパク質を含めた所望の標的分子を精製するため及び不純物（例えば、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、エンドトキシン、細胞培養添加物、細胞及び細胞破片）のような望ましくない実在物を除去するための改善されたｐＨ範囲を与える点で従来技術に記載されているものよりもより効率的である。幾つかの実施形態では、本明細書中に記載されているポリマーは、低濃度の単一多価塩に対して応答性であり、これにより既存の塩応答性ポリマーに比して改善されたスケーラビリティー及び低い導電性が得られる。各種実施形態では、本発明に従うポリマーは、細胞培養培地から全細胞、細胞破片及び他の可溶性不純物を効果的に除去し得る。ポリマーは、当該タンパク質及び１つ以上の不純物を含有しているタンパク質混合物から不純物をも効果的に除去できる。更に、本明細書中に記載されている各種ポリマーは、サンプル中の標的分子及び当該タンパク質／産物を効果的に捕捉することができ、これによりこれらをサンプル中に存在している１つ以上の不純物から分離し、標的分子の純度を向上させることができる。
【００３８】
広範囲の条件を用いて標的分子（例えば、治療用タンパク質）を精製するための本明細書中に記載されているポリマーの使用方法も本発明に包含される。
【００３９】
理論に拘束されることを望むものではないが、本明細書中に記載されている刺激応答性ポリマーは、所望の標的分子（例えば、治療用タンパク質）または望ましい産物、或いは所望しない実在物（例えば、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、エンドトキシン、細胞培養添加物、全細胞及び細胞破片を含めた１つ以上の不純物）のいずれかに結合し、沈殿させるために使用され得ると考えられる。通常、所望の標的分子または所望しない実在物であれ、本発明に従うポリマーにより結合される分子を対象生体分子と称する。
【００４０】
本明細書中に記載されている、使用する特定の刺激応答性ポリマーの選択は、ポリマーを何と結合させるかによって決定される。例えば、そのｐＩよりも高いｐＨで正味負電荷を持っている対象生体分子（例えば、全細胞、細胞破片、ＤＮＡ、エンドトキシン及びタンパク質）の場合には、カチオン性である（すなわち、正に荷電している）高分子電解質骨格を含む刺激応答性ポリマーを使用することが望ましい。一方、そのｐＩよりも低いｐＨで正味正電荷を持っている対象生体分子（例えば、タンパク質）の場合には、アニオン性である（すなわち、負に荷電している）高分子電解質骨格を含む刺激応答性ポリマーを使用することが望ましい。
【００４１】
正電荷は、精製プロセス中に使用する条件下でポリマーに固有であり得、または正電荷は、刺激応答性ポリマーを帯電させるｐＨの変化に応じて生じ得る。
【００４２】
生体分子の全回収に影響を与える重要なパラメーターは、高分子電解質骨格中の疎水性修飾基の別の非修飾荷電基に対する比である。例えば、疎水基％が上昇すると、非特異的相互作用による生体分子のロスが生ずる。従って、所与の生体分子の場合、生体分子回収を最大とするために荷電基の疎水基に対する特定比が使用され得る。加えて、疎水基の高い％はポリマー溶解度及び高分子電解質骨格上の荷電基の有効性を限定し得る。
【００４３】
更に、高分子電解質ポリアリルアミンの骨格中の荷電アミン基をベンジルクロリドで修飾すると、第２級アミンが生じ、この基は広範囲のｐＨ条件下で帯電される。しかしながら、ベンジル修飾は電荷−電荷相互作用に影響を及ぼし得るアミン基に立体的かさ高さを付加する。加えて、高分子電解質骨格中の荷電基を疎水基で修飾すると、荷電基の数を減少させ得る。例えば、ポリアリルアミンのアミン基をベンジルクロリドで修飾すると、荷電基でないアミド結合が形成され、これにより骨格中の荷電基の数が減少する。従って、荷電基の数の減少は、ポリマーの溶解度及びポリマーの電荷−電荷相互作用を介して結合する能力にも影響を及ぼし得る。
【００４４】
本発明に従うあるポリマーは、カチオン性、他はアニオン性であるが、カチオン性であり、１つ以上の疎水基及で修飾させた高分子電解質骨格及びアニオン性基を含むハイブリッドポリマーも合成され得る。前記ハイブリッドポリマーの場合、カチオン性高分子電解質上の非修飾基は、複合体形成塩に対して応答性であり、骨格上のアニオン性修飾基は、正味正電荷を持つ対象生体分子に結合し得る。従って、高分子電解質骨格内の非修飾カチオン基のアニオン性疎水基に対する比は、ポリマーが対象生体分子と複合体を形成し、捕捉するために必要な溶解度及び刺激を決定するために重要である。例えば、高分子電解質骨格中の非修飾カチオン基が余りに少ないと、刺激に対する応答が制限されるかまたはなくなり得る。一方、アニオン基が余りに少ないと、対象生体分子を捕捉する能力が制限され得る。
【００４５】
疎水基による高分子電解質骨格の修飾の必要レベル、並びに使用される刺激のタイプ及び量は、ポリマーを用いて精製しようとする対象生体分子及び使用する条件、並びにポリマー骨格の固有の溶解度及び分子量に基づいて決定され得る。例えば、使用する刺激（例えば、多価塩）の量を最小とするためには、高分子電解質骨格に結合させる疎水基をより多くすることが望ましい。或いは、多価イオン刺激の量を多くすると、疎水性修飾の程度または必要な疎水性修飾％が低下する。幾つかの場合には、例えば多価イオン刺激が非常に高濃度であるならば、疎水性修飾の必要性を完全に排除することができる。或いは、ポリマー分子量を高くすると、高分子電解質骨格の固有溶解度が低下し、高分子電解質骨格疎水性修飾を低下（５％以下）またはゼロにすることができる。しかしながら、疎水性修飾を排除すると、高いポリマー添加量でより低い分子量またはより可溶性のポリマー骨格の場合残留ポリマー量が増加する恐れがある。
【００４６】
各種実施形態では、高分子電解質骨格上の疎水性修飾の程度は、１％〜８５％または５％〜０％の範囲である。従って、刺激応答性ポリマーにより結合させようとする対象生体分子に応じて、疎水性修飾の％は、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％または８５％である。
【００４７】
幾つかの実施形態では、複合体形成塩を刺激として使用する。各種実施形態では、複合体形成塩の濃度は、２ｍＭ〜５００ｍＭまたは２５ｍＭ〜１００ｍＭの範囲である。複合体形成塩の例には、多価イオン（例えば、クエン酸塩、リン酸塩、硫酸塩及びＥＤＴＡ）及びイオン会合塩（例えば、過塩素酸塩、ドデシル硫酸ナトリウム塩、ドデシルベンゼン硫酸塩、Ｆｅ（ＩＩ）−４−クロロ−２−ニトロフェノールアニオン、テトラフェニルホウ酸ナトリウム塩及びヘキサニトロジフェノールアミン）が含まれるが、これらに限定されない（例えば、ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，ＤＥＣＥＭＢＥＲ  １９８７，ＶＯＬ．３，ｐ．４７９を参照されたい）。通常、当業者は、当業界で公知の、本明細書中に記載されているポリマーに対して刺激として使用され得る各種複合体形成塩を熟知している。
【００４８】
沈殿を誘発するために必要な複合体形成塩の量は、複数の因子、例えばｐＨ、ポリマー濃度及びサンプル中の対象生体分子の濃度に依存する。例えば、ポリアリルアミンのような幾つかの高分子電解質はｐＨ（アミンプロトン化のレベル）によって変化する電荷密度を有している。ｐＨが上昇すると、電荷密度のレベルが低下するため、沈殿を誘発するために必要な刺激の程度は、ｐＨがより低い場合や電荷密度状態がより高い場合とは異なる。
【００４９】
通常、本発明に従う刺激応答性ポリマーは標的分子を含有している供給材料または標的分子を含有しているサンプルに固体または液体形態で添加され得る。最終ポリマー濃度は通常０．０１％〜２％である。本明細書中に記載されている幾つかの方法では、ポリマー及び対象生体分子の混合物を形成した後、刺激、例えば複合体形成塩（例えば、多価アニオン）を加える。刺激の量は、ポリマー濃度に依存し得る。例えば、２％のポリマー濃度はポリマー沈殿を誘発させるのに必要な刺激をより多く必要とする。刺激応答によりポリマーを完全に沈殿させるためには、刺激を正しい量または僅かに過剰の量適用することが重要である。これは、過剰添加により問題となる残留ポリマーが発生するポリマー凝集と対照的である。
【００５０】
本発明は各種精製スキームにおいて使用され得る。刺激応答性ポリマーはプロセスの任意のステップにおいて有用であり得るが、プロセスの始めに標的分子の清澄化または捕捉中に使用することが好ましい。１つの刺激応答性ポリマーまたはポリマー混合物を１つ以上のステップで添加し、その後１つ以上の刺激を用いて沈殿させることができる。ポリマーが対象生体分子（すなわち、１つ以上の不純物または所望の標的分子）と会合させる前、その間またはその後に刺激を加えてもよい。また、通常固体形態である沈殿を除去する前、その間またはその後に刺激を加えてもよい。沈殿はその後、同時、並行または一連の分離スキームにおいて当業界で公知の１つ以上の技術及び／または本明細書中に記載されている技術、例えば濾過、沈降、遠心または他の固体／液体分離方法、或いは方法の組合せを用いて除去され得る。
【００５１】
刺激応答性ポリマーの添加は、幾つかの方法でなし得る。刺激応答性ポリマーを添加する前に細胞培養培地は所望の条件に調節し得、例えばｐＨ及び／または導電性を調節（例えば、低下）し得る。次いで、刺激応答性ポリマーを細胞培養培地に添加し、混合し得る。刺激応答性ポリマーは、液体または固体フォーマットで添加され得る。ポリマー含有溶液それ自体は、まさに細胞培養培地のｐＨを所望の条件に調節するように調製され得る。例えば、刺激応答性ポリマーを濃酢酸溶液中に溶解させ得る。この酢酸溶液の濃度は、刺激応答性ポリマーの添加時に必要なｐＨ調節を与え、これにより所望のポリマー濃度及び溶液ｐＨが生ずるように容量、発酵溶液条件及びタンパク質濃度に基づいて変更し得る。溶液が曇り始め、沈殿を形成し始めるように、刺激応答性ポリマーは、タイプ及び固体％に応じて自然な凝集が起こる濃度で、典型的には０．０１〜０．１％ｗｔポリマーまたは０．０１〜０．５％ｗｔポリマーの範囲で添加され得る。或いは、刺激応答性ポリマーは、自然な凝集は起こらないが、ポリマー−生体分子会合が起こる濃度で、例えば典型的には０．５％〜２％ｗｔポリマーの範囲で添加され得、溶液は元の溶液よりも透明であるか、やや曇っているかまたはより濁っていてもよい。また、刺激応答性ポリマーを自然凝集及びポリマー−生体分子会合の両方が起こる濃度で添加してもよい。
【００５２】
例えば凝集プロセスの場合などのポリマーの過剰添加に関連する諸問題を緩和することから、精製スキームにおいて刺激を使用することがより望ましいが、本明細書中に記載されているポリマーを凝集剤として使用することも考えられる。
【００５３】
例示的精製スキームでは、本発明に従う刺激応答性ポリマーは、発酵が完了した後に細胞培養物に添加され、ポリマーは所望の標的分子でない対象生体分子に結合するように調製される。この方法では、刺激応答性ポリマーを第１組の条件下で、例えば対象生体分子を結合するポリマーの添加前、添加中または添加後に調節され得る条件下で、細胞培養物に添加する。刺激応答性ポリマーを第１組の条件下で添加した後、刺激を第２組の条件下で添加し、これにより対象生体分子（例えば、細胞、細胞破片、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、エンドトキシン及びウイルスのような１つ以上の不純物）を含む沈殿が生ずる。その後固体沈殿を遠心及び／または濾過により除去すると清澄化した細胞培養液が生ずる。その後、生じた清澄化した細胞培養液を所望の標的分子に結合させるためにクロマトグラフィー媒体を用いる捕捉ステップにかけ得る。その後、標的分子は捕捉ステップから溶離され得る。従って、幾つかの場合には、清澄化ステップで１つ以上の不純物を除去することができる本発明に従う刺激応答性ポリマーを用いることにより、追加ステップの数を減少、削除または変更し得る。
【００５４】
幾つかの実施形態では、刺激応答性ポリマーが標的分子ではない対象生体分子に結合する条件下で刺激応答性ポリマーを細胞培養物に添加する。刺激応答性ポリマーを所望の溶液条件下で十分混合した後、対象生体分子を含む凝集物を形成する。対象生体分子を含有する固体を一次清澄化により除去する。生じた細胞培養液を収集し、刺激を加えて残留ポリマーを沈殿させる。その後、沈殿した残留ポリマーを二次清澄化により除去する。生じた清澄化した細胞培養溶液を標的分子に結合させるためにクロマトグラフィー媒体を用いる捕捉ステップにかける。一次清澄化後の精製ステップで刺激を加えることにより残留ポリマーを除去することもできる。また、任意のステップで残留ポリマーを除去するために刺激を加えても、プロセスを通して１つ以上の刺激を複数回加えてもよい。
【００５５】
別の精製スキームでは、刺激応答性ポリマーを、発酵が完了した後の細胞培養液にポリマーが標的分子を結合しないように、ポリマーが１つ以上の不純物に結合するのに適した条件下で添加する。刺激応答性ポリマーを所望の溶液条件下で十分に混合した後、１つ以上の不純物と固体沈殿を形成する刺激を加える。固体沈殿を遠心及び／または濾過により除去する。生じた清澄化した細胞培養溶液を、刺激応答性ポリマーを結合させることができるフィルター中を通過させる。当業者は、刺激応答性ポリマーを結合させることができるフィルターを容易に選択／同定することができる。例えば、ポリマーにより結合させようとする対象生体分子と類似の特性を有しているフィルターを用意し得る。或いは、対象生体分子と同一の電荷を有する荷電基及び刺激応答性ポリマーの電荷と反対の電荷を有するフィルターを使用してもよい。
【００５６】
ポリマーを溶液から除去するために、膜、充填床またはフィルターも使用し得る。例えば、ポリアミン刺激応答性ポリマーを除去するために、スルホン酸基を含有するアニオン性膜を使用し得る。また、ポリマーを沈殿させるために使用される刺激に、類似の結合特性を有するフィルターも使用され得る。刺激が多価アニオンであるならば、多価アニオンを含有している表面を有するフィルターを用意すると、溶液からポリマーを除去することができる。例えば、ポリビニルリン酸塩で修飾させた膜は、リン酸塩イオンがポリアミンと複合体を形成し、それにより、沈殿を誘発させる殆ど同一の方法でポリアミンに結合し得る。また、ポリビニルリン酸塩で修飾させたビーズ（例えば、ポリメタクリレート）を使用してもよい。幾つかの実施形態では、刺激応答性ポリマーを除去することができるフィルターを用いて溶液を濾過した後、生じた溶液を標的生体分子を結合させるためにクロマトグラフィー媒体を用いる捕捉ステップにかける。クロマトグラフィー媒体、デプスフィルター、または刺激応答性ポリマーを結合することができる他の多孔性材料を用いてポリマーを除去することができる。また、単一のステップまたは２つ以上の複数ステップでポリマーを吸着手段を用いて除去することもできる。更に、混合物にポリマーを添加した後の任意のステップで、ポリマーを吸着手段を用いて除去することができる。
【００５７】
本発明は、本明細書中に記載されている精製スキームの多くの改変において使用し得ると考えられる。刺激応答性ポリマーは、清澄化及び捕捉ステップの両方を置換または強化するために使用され得る。例えば、１つ以上の不純物に結合するが、標的分子に結合しない第１のポリマー、標的分子に結合する第２のポリマーという２つの別々の刺激応答性ポリマーを使用し得る。これらの２つのポリマーは、別々のステップまたは単一ステップで適用され得る。同様に、標的分子に結合し得る官能基及び１つ以上の不純物に結合し得る高分子電解質骨格を有する単一ポリマーを使用し得る。単一ポリマーは、単一ステップまたは複数のステップで標的分子及び１つ以上の不純物に結合できる。幾つかの異なる沈殿／刺激添加または洗浄ステップ後、標的分子のポリマーからの溶離をその後行ってもよい。捕捉ステップ後のウイルス不活化または他のステップより生ずる懸濁状固体または不純物を清澄化するために、刺激応答性ポリマーを捕捉ステップ後に添加し、使用してもよい。研磨ステップに代えて、または研磨ステップを強化するために、刺激応答性ポリマーを使用してもよい。
【００５８】
幾つかの実施形態では、ウイルス不活化ステップ（すなわち、溶液を低ｐＨ、界面活性剤または熱に曝す）を含める。溶液条件を調節し、サンプルを一連の研磨ステップ（すなわち、１つ以上のイオン交換、疎水性相互作用、混合モード及びその他）にかけてもよい。次いで、溶液をウイルス濾過及び限外濾過、またはダイアフィルトレーションを含めた一連の濾過ステップにかけてもよい。
【００５９】
本発明の開示内容がより容易に理解され得るように、幾つかの用語をまず定義する。追加の定義は詳細説明を通して記載する。
【００６０】
Ｉ．定義
本明細書中で互換可能に使用されている用語「刺激」は、本発明に従う刺激応答性ポリマーによる応答をもたらす環境における物理的または化学的変化を指すことを意味する。従って、本発明は、刺激に対して応答性であり、刺激によりポリマーの溶解度の変化をもたらす新規ポリマーを提供する。本明細書中に記載されている１つ以上のポリマーが応答性である刺激の例には、例えば温度の変化、導電性の変化及び／またはｐＨの変化が含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、刺激は、サンプルへの複合体化剤または複合体形成塩の添加を含む。各種実施形態では、刺激は、通常、サンプルにポリマーを添加した後に加える。しかしながら、サンプルへのポリマーの添加中またはその前に刺激を加えてもよい。
【００６１】
本明細書中で使用されている用語「ポリマー」は、２つ以上のモノマー単位の共有結合により形成される分子を指す。モノマー単位は合成のものであっても、天然のものであってもよい。反復単位により形成されるポリマーは、線状でも、分枝状でもよい。ポリマーの例には、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレン、ポリアリルアミン、ポリビニルアルコール、ポリスチレン及びコポリマー（例えば、ポリスチレン−コ−ポリピリジン、ポリアクリル酸−コ−メチルメタクリレート、プルロニック、ＰＦ６８等）が含まれるが、これらに限定されない。本発明に従う幾つかの実施形態では、ポリマーは、ポリ高分子電解質骨格を含む。本明細書には、本発明に従う方法において使用され得る刺激に対して応答性であるコポリマーも記載されている。通常、ポリマーの場合モノマー単位は、同一タイプのものであるが、コポリマーは、通常、異なるタイプのモノマー単位を有すると理解される。
【００６２】
本明細書中で使用されている用語「刺激応答性ポリマー」は、刺激を加えた後物理的及び／または化学的特性の変化を示すポリマーまたはコポリマーである。典型的な刺激応答は、ポリマーの溶解度の変化である。例えば、ポリマーポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）は、約３５℃を下回る温度で水に可溶性であるが、約３５℃の温度で水に不溶性となる。特定実施形態では、刺激応答性ポリマーは、多価イオン刺激（例えば、リン酸塩刺激）に対して応答性であるポリアリルアミンまたはポリビニルアミンポリマーである。
【００６３】
本明細書中で使用されている用語「高分子電解質骨格」は、２つ以上のモノマー単位を含む炭素含有ポリマーを指し、単位の少なくとも５０％、単位の少なくとも５５％、単位の少なくとも６０％、単位の少なくとも６５％、単位の少なくとも７０％、単位の少なくとも７５％、単位の少なくとも８０％、単位の少なくとも８５％、単位の少なくとも９０％、または単位の少なくとも９５％が荷電官能基を含有している。換言すると、モノマー単位の少なくとも５０％は、単位の一部を形成する荷電基を含む。幾つかの実施形態では、本明細書中に記載されている高分子電解質骨格は、少なくとも２つ以上のモノマー単位を含有し、前記単位の各々が荷電官能基を含有している。モノマー単位の各々が荷電官能基を含有しているポリマーの高分子電解質骨格の場合、このポリマーは「連続高分子電解質」と称して言及され得る。高分子電解質の例には、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリアクリル酸、ポリエチレンイミン、キトサン及びポリビニルリン酸が含まれるが、これらに限定されない。モノマー単位とは異なる１つ以上の実在物が高分子電解質骨格に結合していてもよいとも考えられる。
【００６４】
本明細書中で使用されている用語「疎水基」は、水に対する親和性がないかまたは殆どない非極性の実在物または化学基を指す。疎水基の例には、フェニル基、第３級ブチル基、環状炭化水素、多環式脂肪族炭化水素、多環式芳香族炭化水素、及び短鎖炭化水素（例えば、ヘキシル及びオクチル基）が含まれるが、これらに限定されない。特定実施形態では、疎水基はフェニル基である。疎水基は、非炭化水素であっても、ヘテロ原子（例えば、窒素、酸素、硫黄、リン等）を含有していてもよい。本発明に従う各種実施形態では、骨格中の荷電基に結合している１つ以上の疎水基を有する高分子電解質骨格を含む刺激応答性ポリマーが提供される。理論に拘束されることを望むものではないが、高分子電解質骨格に結合している疎水基の数はポリマー溶解度を変化させて、ポリマーの刺激応答性を改善するために重要であると理解される。しかしながら、刺激なしでポリマーを水不溶性とする疎水基の数を有することが望ましいことがある。
【００６５】
疎水基で修飾させた高分子電解質骨格中の荷電基の％は、通常、ポリマーの「疎水性修飾％」と称される。従って、各種実施形態では、疎水性修飾％が重要であり、１％〜８５％または５％〜５％の範囲である。従って、疎水性修飾％は少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも８５％であり得る。
【００６６】
本明細書中で使用されている用語「疎水性修飾％」は、通常、高分子電解質ポリマー骨格中の全高分子電解質モノマー単位の％としての疎水基修飾させた高分子電解質荷電基に対する非修飾高分子電解質荷電基の比を指す。
【００６７】
幾つかの実施形態では、高分子電解質骨格に結合している疎水基は、更に骨格中の荷電基とは区別される実在物である疎水基に結合している荷電基を有している。
【００６８】
本明細書中で使用されている用語「アルキル」は、通常、直鎖または分枝状炭化水素鎖を指す。直鎖または分枝鎖炭化水素鎖は、例えばアルカン、アルケン及びアルキンを含めた置換または未置換の非環式炭素含有化合物を指す。アルキル基の例には、低級アルキル、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチルまたはイソヘキシル；高級アルキル、例えばｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、イソオクチル、ノニル、デシル等；低級アルキレン、例えばエチレン、プロピレン、プロピリン、ブチレン、ブタジエン、ペンテン、ｎ−ヘキセンまたはイソヘキセン；並びに高級アルキレン、例えばｎ−ヘプテン、ｎ−オクテン、イソオクテン、ノネン、デセン等が含まれる。当業者は、本発明に包含される多数の直鎖（すなわち、線状）及び分枝状アルキル基を熟知している。
【００６９】
加えて、上記アルキル基は、１個以上の水素原子が官能基で置換されている各種置換基をも含有し得る。官能基の例には、カルボン酸、スルホン酸、ホスホン酸基等が含まれるが、これらに限定されない。本明細書中で使用されている用語「アルケニル」は、炭素−炭素結合の少なくとも１つが炭素−炭素二重結合である直鎖または分枝状炭化水素鎖を指す。
【００７０】
本明細書中で使用されている用語「アルアルキル」は、末端が少なくとも１個のアリール基で置換されているアルキル基を指す。
【００７１】
本明細書中で使用されている用語「アルアルケニル」は、末端が少なくとも１個のアリール基で置換されているアルケニル基を指す。
【００７２】
本明細書中で使用されている用語「アリール」は、多くの場合、少なくとも６個のｎ（π）電子を含む共役二重結合系を有する炭化水素環を指す。アリール基の例には、フェニル、ナフチル、アニシル、トルイル及びキシレニルが含まれるが、これらに限定されない。
【００７３】
本明細書中で使用されている用語「フルオロカーボン」は、１個以上の水素原子がフッ素基で置換されている直鎖または分枝状炭素鎖を指す。直鎖または分枝鎖フルオロカーボン鎖は、通常例えばアルカン、アルケン及びアルキンを含めた置換または未置換の非環式炭素含有化合物を指す。アルキル基の例には、低級アルキル、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチルまたはイソヘキシル；高級アルキル、例えばｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、イソオクチル、ノニル、デシル等；低級アルキレン、例えばエチレン、プロピレン、プロピリン、ブチレン、ブタジエン、ペンテン、ｎ−ヘキセンまたはイソヘキセン；並びに高級アルキレン、例えばｎ−ヘプテン、ｎ−オクテン、イソオクテン、ノネン、デセン等が含まれる。通常、当業者は、本発明の範囲内である多数の直鎖（すなわち、線状）及び分枝状アルキル基を熟知している。加えて、アルキル基は１個以上の水素または１個以上のフッ素原子が官能基で置換されている各種置換基をも含有し得る。官能基の例には、カルボン酸、スルホン酸、ホスホン酸基等が含まれるが、これらに限定されない。
【００７４】
本明細書中で使用されている用語「官能基」は、本明細書中に記載されているポリマーに追加の官能性を付与する基である。換言すると、官能基は疎水基とは異なり、高分子電解質骨格、例えば骨格中の荷電基に結合している基である。例えば、幾つかの実施形態では、官能基はポリマーの結合特性を変化させるためのリガンド、例えばカルボン酸、スルホン酸、スルフェート、第１級アミン、第４級アミン及びジエチルアミノ基であり得る。官能基は特性を変化させたり、またはポリマーに対して追加の所望特性を与え得、例えば刺激応答を変化させたり、ポリマーを第２の刺激に対して応答性とし得る。刺激応答挙動を変化させるための官能基の例には、カルボン酸基（ｐＨ応答性）、ピリジン基（ｐＨ応答性）及びＮ−イソプロピルアクリルアミド基（温度応答）が、これらに限定されない。
【００７５】
本明細書中で使用されている用語「リガンド」は、通常、別の実在物に対する特異的結合能力を与える実在物を指す。「リガンド」の例には、イオン交換基、生物親和性または生物特異的基、疎水基、チオフィリック相互作用基、キレートまたはキレート化基、所謂標的化合物とのπ−π相互作用を有する基、水素結合基及び親水性基が含まれるが、これらに限定されない。
【００７６】
本明細書中で使用されている用語「凝集」は、１つ以上の懸濁状の不溶性または可溶性不純物を除去するための凝集剤（例えば、本明細書中に記載されているポリマー）の溶液への添加を指す。ポリマーは、典型的な固体−液体分離方法により溶液から除去され得る不溶性凝集物を自然に形成し得る濃度で溶液に添加されなければならない。
【００７７】
本明細書中で使用されている用語「組成物」、「溶液」または「サンプル」は、本明細書中に記載されている１つ以上の刺激応答性ポリマーを用いて精製しようとする標的分子または所望産物と１つ以上の望ましくない実在物または不純物の混合物を指す。幾つかの実施形態では、サンプルは標的分子または所望産物が分泌される供給材料または細胞培養培地を含む。幾つかの実施形態では、サンプルは１つ以上の不純物（例えば、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、細胞培養添加物、細胞または細胞破片）と一緒に標的分子（例えば、治療用タンパク質または抗体）を含む。幾つかの実施形態では、サンプルは細胞培養培地に分泌される当該標的分子を含む。幾つかの実施形態では、標的分子を本明細書中に記載されている１つ以上の刺激応答性ポリマーを用いて精製しようとするサンプルを、該サンプルを刺激応答性ポリマーと接触させる前に「部分的に精製」する。部分的精製は、例えばサンプルを１つ以上の精製ステップ、例えば１つ以上の非アフィニティークロマトグラフィーステップにかけることにより達成され得る。標的分子は、１つ以上の不純物を沈殿させるかまたは標的分子を沈殿させることにより１つ以上の望ましくない実在物または不純物から分離され得る。
【００７８】
幾つかの実施形態では、本発明に従う刺激応答性ポリマーは、第１組の条件下でそれ自体標的分子または産物（例えば、標的タンパク質またはポリペプチド）である対象生体分子に結合し、第２組の条件下で、例えばサンプルに刺激を加えて標的分子を沈殿させる。他の実施形態では、対象生体分子は標的分子以外の分子である。換言すると、本明細書中に記載されている刺激応答性ポリマーにより結合される対象生体分子は、サンプル中の標的分子と結合させたくない分子であり得る。理論に拘束されることを望むものではないが、幾つかの実施形態では、本発明に従う刺激応答性ポリマーは、刺激を加えると１つ以上の宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、全細胞、細胞破片、ウイルス、エンドトキシン及び／または細胞培養添加物に結合し、沈殿させると考えられる。従って、標的分子（例えば、標的タンパク質またはポリペプチド）は、本明細書中に記載されているポリマーを用いて所望の標的分子を沈殿させるかまたは所望の標的分子を含有しているサンプル中に存在しているかもしれない１つ以上の望ましくない実在物（例えば、１つ以上の不純物）を沈殿させることにより精製され得る。
【００７９】
本明細書中で使用されている用語「沈殿させる」、「沈殿する」または「沈殿」は、結合（例えば、対象生体分子との複合体の形態）または非結合ポリマーの水性及び／または可溶性状態から非水性及び／または不溶性状態への変化を指す。
【００８０】
本明細書中で使用されている用語「対象生体分子」は、本明細書中に記載されている刺激応答性ポリマーにより結合し、沈殿する分子を指す。例えば、対象生体分子は所望の標的分子、例えば当該の所望産物またはポリペプチド（例えば、抗体）であり得、または所望の標的分子を含有しているサンプルから除去されなければならない望ましくない実在物であり得る。望ましくない実在物には、例えば宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質凝集物、細胞培養添加物、ウイルス、エンドトキシン、全細胞及び細胞破片から選択される１つ以上の不純物が含まれるが、これらに限定されない。
【００８１】
本明細書中で互換可能に使用されている用語「標的分子」、「標的生体分子」、「所望の標的分子」及び「所望の標的生体分子」は、通常、当該ポリペプチドまたは産物を含有しているサンプル中に存在しているかもしれない１つ以上の望ましくない実在物（例えば、１つ以上の不純物）から精製または分離したい当該ポリペプチドまたは産物を指す。本明細書中で互換可能に使用されている用語「当該タンパク質」、「標的ポリペプチド」、「当該ポリペプチド」及び「標的タンパク質」は通常、治療用タンパク質またはポリペプチドを指し、これらには本発明に従う刺激応答性ポリマーを用いて精製しようとする抗体が含まれるが、これに限定されない。
【００８２】
本明細書中で互換可能に使用されている用語「ポリペプチド」または「タンパク質」は、通常、約１０個以上のアミノ酸を有するペプチド及びタンパク質を指す。幾つかの実施形態では、本明細書中に記載されている刺激応答性ポリマーは、タンパク質またはポリペプチドと一緒にサンプル中に存在している１つ以上の望ましくない実在物からタンパク質またはポリペプチドを分離するために使用される。幾つかの実施形態では、１つ以上の実在物は、精製しようするタンパク質またはポリペプチドと一緒にサンプル中に存在しているかもしれない１つ以上の不純物である。先に検討したように、幾つかの実施形態では、本明細書中に記載されている刺激応答性ポリマーは、サンプルに刺激を加えると当該タンパク質またはポリペプチドに特異的に結合し、沈殿させる。他の実施形態では、本明細書中に記載されている刺激応答性ポリマーは、サンプルに刺激を加えると当該タンパク質またはポリペプチド以外の実在物、例えば宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、ウイルス、全細胞、細胞破片及び細胞培養添加物に結合し、沈殿させる。
【００８３】
幾つかの実施形態では、本明細書中に記載されている刺激応答性ポリマーを用いて精製しようとするタンパク質またはポリペプチドは哺乳動物タンパク質、例えば治療用タンパク質または治療において使用され得るタンパク質である。タンパク質の例には、例えばレニン；ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンを含めた成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α−１−アンチトリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；凝固因子、例えば因子ＶＩＩＩＣ、因子ＩＸ、組織因子及びフォン・ウィルブラント因子；抗凝血因子、例えばタンパク質Ｃ；心房性ナトリウム利尿ペプチド因子；肺サーファクタント；プラスミノーゲンアクチベーター、例えばウロキナーゼまたはヒト尿または組織タイププラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン；造血性成長因子；腫瘍壊死因子−α及び−β；エンケファリナーゼ；ランテス（正常Ｔ細胞の発現および分泌の活性制御物質）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−α）；血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン；ミュラー管抑制因子；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；微生物タンパク質、例えばβ−ラクタマーゼ；Ｄｎアーゼ；ＩｇＥ；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）、例えばＣＴＬＡ−４；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは成長因子に対する受容体；タンパク質ＡまたはＤ；リウマチ因子；神経栄養因子、例えば骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５または−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５またはＮＴ−６）、或いは神経成長因子、例えばＮＧＦ−β；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞増殖因子、例えばα−ＦＧＦ及びβ−ＦＧＦ；上皮増殖因子（ＥＧＦ）；トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦ−α及びＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦβ４またはＴＧＦ−β５を含めたＴＧＦ−β；インスリン様成長因子Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−Π）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）；ＣＤタンパク質、例えばＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４及びＣＤ４０；エリスロポエチン；骨形成誘導因子；イムノトキシン；骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン、例えばインターフェロン−α、−β及び−γ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ−１〜ＩＬ−１０；スーパーオキシドジムスターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス抗原、例えばＡＩＤＳエンベロープの一部；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；インテグリン、例えばＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４及びＶＣＡＭ；腫瘍関連抗原、例えばＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４受容体；上にリストしたポリペプチドの断片及び／または変異���が含まれるが、これらに限定されない。
【００８４】
更に、幾つかの実施形態では、本発明に従うスマートポリマーを用いて精製されるタンパク質またはポリペプチドは、抗体、その機能性断片または変異体である。幾つかの実施形態では、当該タンパク質は免疫グロブリンのＦｃ領域を含有する組換えタンパク質である。
【００８５】
（本明細書中で互換可能に使用されている）用語「免疫グロブリン」、「Ｉｇ」または「抗体」は、抗原に特異的に結合する能力を有している２本の重鎖及び２本の軽鎖から構成される基本的４ポリペプチド鎖構造を有するタンパク質を指し、前記鎖は、例えば鎖間ジスルフィド結合により安定化されている。（本明細書中で互換可能に使用されている）用語「一本鎖免疫グロブリン」または「一本鎖抗体」は、抗原に特異的に結合する能力を有している重鎖及び軽鎖から構成される２ポリペプチド鎖構造を有するタンパク質を指し、前記鎖は例えば鎖間ペプチドリンカーにより安定化されている。用語「ドメイン」は、例えばβプリーツシート及び／または鎖間ジスルフィド結合により安定化されているペプチドループを含む（例えば、３〜４ペプチドループを含む）重鎖または軽鎖ポリペプチドの球状領域を指す。ドメインは、更に本明細書中で、「定常」ドメインの場合には各種クラスメンバーのドメイン内の配列変動の相対欠乏に基づいて、また「可変」ドメインの場合には各種クラスメンバーのドメイン内の大きな変動に基づいて、「定常」または「可変」と称されている。抗体またはポリペプチド「ドメイン」はしばしば当業界で抗体またはポリペプチド「領域」と互換可能に称されている。抗体軽鎖の「定常」ドメインは「軽鎖定常領域」、「軽鎖定常ドメイン」、「ＣＬ」領域または「ＣＬ」ドメインと互換可能に称されている。抗体重鎖の「定常」ドメインは「重鎖定常領域」、「重鎖定常ドメイン」、「ＣＨ」領域または「ＣＨ」ドメインと互換可能に称されている。抗体軽鎖の「可変」ドメインは「軽鎖可変領域」、「軽鎖可変ドメイン」、「ＶＬ」領域または「ＶＬ」ドメインと互換可能に称されている。抗体重鎖の「可変」ドメインは「重鎖可変領域」、「重鎖可変ドメイン」、「ＶＨ」領域または「ＶＨ」ドメインと互換可能に称されている。
【００８６】
免疫グロブリンまたは抗体はモノクローナルでもポリクローナルでもよく、モノマーまたはポリマー形態で存在し得る。例えば、ＩｇＭ抗体はペンタマー形態で存在し、及び／またはＩｇＡ抗体は、モノマー、ダイマーまたはマルチマー形態で存在する。リガンド特異的結合ドメインを保持しているかまたはリガンド特異的結合ドメインを含むように修飾されている限り、免疫グロブリンまたは抗体には多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）及び抗体断片も含まれ得る。用語「断片」は、インタクト、すなわち完全抗体、または抗体鎖より少数のアミノ酸残基を含む抗体または抗体鎖の一部または部分を指す。断片はインタクト、すなわち完全抗体、または抗体鎖を化学的または酵素的に処理することにより得ることができる。断片は組換え手段によっても得ることができる。組換え産生したとき、断片は、単独で、または融合タンパク質と呼ばれる大きなタンパク質の一部として発現され得る。断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ及び／またはＦｖ断片が含まれる。融合タンパク質の例には、Ｆｃ融合タンパク質が含まれる。
【００８７】
通常、免疫グロブリンまたは抗体は、当該「抗原」に向いている。好ましくは、抗原は生物学的に重要なポリペプチドであり、抗体を疾患または障害を患っている哺乳動物に対して投与するとその哺乳動物において治療効果が生じ得る。しかしながら、非ポリペプチド（例えば、腫瘍関連糖脂質抗原；米国特許Ｎｏ．５，０９１，１７８を参照されたい）に対する抗体も考えられる。抗原がポリペプチドの場合には、膜貫通分子（例えば、受容体）またはリガンド（例えば、増殖因子）であり得る。
【００８８】
本明細書中で使用されている用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち集団を構成する個々の抗体は、微量で存在するかもしれない考えられる天然に存在する変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一抗原部位に向いている。更に、典型的には、各種決定基（エピトープ）に対して異なる抗体を含んでいる一般的な（ポリクローナル）抗体製剤とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一決定基に向いている。修飾語「モノクローナル」は、抗体の特性を抗体の実質的な均質な集団から得られるものとして示すが、特別の方法により抗体を産生しなければならないとは見なされない。例えば、本発明に従って使用しようとするモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）が最初に記載したハイブリドーマ方法により作成され得、または組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許Ｎｏ．４，８１６，５６７を参照されたい）により作成され得る。「モノクローナル抗体」は、例えばＣｌａｃｋｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載されている技術を用いてファージ抗体ライブラリーからも単離され得る。
【００８９】
モノクローナル抗体は、更に、所望の生物学的活性を示す限り、重鎖及び／または軽鎖の一部が特定種に由来するか或いは特定抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同であり、鎖の残りが別の種に由来するか或いは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、並びに前記抗体の断片が含まれる（米国特許Ｎｏ．４，８１６，５６７；及びＭｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））。
【００９０】
本明細書中で使用されているとき、用語「超可変領域」は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメイン中の残基２４−３４（ＬＩ）、５０−５６（Ｌ２）及び８９−９７（Ｌ３）、及び重鎖可変ドメイン中の残基３１−３５（ＨＩ）、５０−６５（Ｈ２）及び９５−１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））、及び／または「超可変ループ」由来のアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメイン中の残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）及び９１−９６（Ｌ３）、及び重鎖可変ドメイン中の残基２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）及び９６−１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７（１９８７））を含む。「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書中に定義されている超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００９１】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むキメラ抗体である。多くの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域残基が所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット、家兔または非ヒト霊長類のような非ヒト種（ドナー抗体）由来の超可変領域残基で置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。幾つかの場合では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が対応する非ヒト残基で置換されている。更に、ヒト化抗体はレシピエント抗体またはドナー抗体中に存在しない残基を含んでいてもよい。これらの修飾により抗体性能が更に純化される。通常、ヒト化抗体は、超可変ループのすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のものである少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含む。ヒト化抗体は場合により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部をも含む。更なる詳細については、Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。
【００９２】
幾つかの実施形態では、本発明に従う刺激応答性ポリマーを用いて分離または精製される抗体は、治療用抗体である。治療用抗体の例には、例えばトラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（商標）；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｔｅｒら（１９９２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５−４２８９；米国特許Ｎｏ．５，７２５，８５６）；抗ＣＤ２０抗体、例えばキメラ抗ＣＤ２０“Ｃ２Ｂ８”；米国特許Ｎｏ．５，７３６，１３７）；リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（商標））、オクレリズマブ、２Ｈ７抗体のキメラまたはヒト化変異体（米国特許Ｎｏ．５，７２１，１０８；ＷＯ  ０４／０５６３１２）またはトシツモマブ（ＢＥＸＸＡＲ（商標））；抗ＩＬ−８（ＳｔＪｏｈｎら（１９９３），Ｃｈｅｓｔ，１０３：９３２及びＷＯ  ９５／２３８６５）；ヒト化及び／またはアフィニティー成熟した抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ヒト化抗ＶＥＧＦ抗体ｈｕＡ４．６．１ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（商標），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．；Ｋｉｍら（１９９２），Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，７：５３−６４；ＷＯ  ９６／３００４６；ＷＯ  ９８／４５３３１））を含めた抗ＶＥＧＦ抗体；抗ＰＳＣＡ抗体（ＷＯ  ０１／４０３０９）；Ｓ２Ｃ６及びそのヒト化変異体を含めた抗ＣＤ４０抗体（ＷＯ  ００／７５３４８）；抗ＣＤ１１ａ（米国特許Ｎｏ．５，６２２，７００；ＷＯ  ９８／２３７６１；Ｓｔｅｐｐｅら（１９９１），Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｉｎｔｌ．，４：３−７；Ｈｏｕｒｍａｎｔら（１９９４），Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，５８：３７７−３８０）；抗ＩｇＥ（Ｐｒｅｓｔａら（１９９３），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３−２６３２；ＷＯ  ９５／１９１８１）；抗ＣＤ１８（米国特許Ｎｏ．５，６２２，７００；ＷＯ  ９７／２６９１２）；Ｅ２５、Ｅ２６及びＥ２７を含めた抗ＩｇＥ（米国特許Ｎｏ．５，７１４，３３８；米国特許Ｎｏ．５，０９１，３１３；ＷＯ  ９３／０４１７３；米国特許Ｎｏ．５，７１４，３３８）；抗Ａｐｏ−２受容体抗体（ＷＯ  ９８／５１７９３）；ｃＡ２（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（商標））、ＣＤＰ５７１及びＭＡＫ−１９５を含めた抗ＴＮＦ−α抗体（米国特許Ｎｏ．５，６７２，３４７；Ｌｏｒｅｎｚら（１９９６），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５６（４）：１６４６−１６５３；Ｄｈａｉｎａｕｔら（１９９５），Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．，２３（９）：１４６１−１４６９）；抗組織因子（ＴＦ）（ＥＰ  ０  ４２０  ９３７  Ｂ１）；抗ヒトα４β７インテグリン（ＷＯ  ９８／０６２４８）；抗ＥＧＦＲキメラ化またはヒト化２２５抗体（ＷＯ  ９６／４０２１０）；抗ＣＤ３抗体、例えばＯＫＴ３（米国特許Ｎｏ．４，５１５，８９３）；抗ＣＤ２５または抗ｔａｃ抗体、例えばＣＨＩ−６２１  ＳＩＭＵＬＥＣＴ（商標）及びＺＥＮＡＰＡＸ（商標）（米国特許Ｎｏ．５，６９３，７６２）；抗ＣＤ４抗体、例えばｃＭ−７４１２抗体（Ｃｈｏｙら（１９９６），Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．，３９（１）：５２−５６）；抗ＣＤ５２抗体、例えばＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８），Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３３７）；抗Ｆｃ受容体抗体、例え���ＦｃγＲＩに対するＭ２２抗体（Ｇｒａｚｉａｎｏら（１９９５），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５（１０）：４９９６−５００２）；抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）抗体、例えばｈＭＮ−１４（Ｓｈａｒｋｅｙら（１９９５），Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５５（２３Ｓｕｐｐｌ）：５９３５ｓ−５９４５ｓ；ｈｕＢｒＥ−３、ｈｕ−Ｍｃ  ３及びＣＨＬ６を含めた乳房上皮細胞に対する抗体（Ｃｅｒｉａｎｉら（１９９５），Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５５（２３）：５８５２ｓ−５８５６ｓ；及びＲｉｃｈｍａｎら（１９９５），Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５５（２３Ｓｕｐｐ）：５９１６ｓ−５９２０ｓ）；結腸癌細胞に結合する抗体、例えばＣ２４２（Ｌｉｔｔｏｎら（１９９６），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２６（１）：１−９）；抗ＣＤ３８抗体、例えばＡＴ  １３／５（Ｅｌｌｉｓら（１９９５），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５（２）：９２５−９３７）；抗ＣＤ３３抗体、例えばＨｕ  Ｍ１９５（Ｊｕｒｃｉｅら（１９９５），Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５５（２３Ｓｕｐｐｌ）：５９０８ｓ−５９１０ｓ、及びＣＭＡ−６７６またはＣＤＰ７７１；抗ＣＤ２２抗体、例えばＬＬ２またはリンホシド（Ｊｕｗｅｉｄら（１９９５），Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５５（２３Ｓｕｐｐｌ）：５８９９ｓ−５９０７ｓ）；抗ＥｐＣＡＭ抗体、例えば１７−１Ａ（ＰＡＮＯＲＥＸ（商標））；抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体、例えばアブシキマブまたはｃ７Ｅ３  Ｆａｂ（ＲＥＯＰＲＯ（商標））；抗ＲＳＶ抗体、例えばＭＥＤＩ−４９３（ＳＹＮＡＧＩＳ（商標））；抗ＣＭＶ抗体、例えばＰＲＯＴＯＶＩＲ（商標））；抗ＨＩＶ抗体、例えばＰＲＯ５４２；抗肝炎抗体、例えば抗Ｈｅｐ  Ｂ抗体ＯＳＴＡＶＩＲ（商標））；抗ＣＡ  １２５抗体ＯｖａＲｅｘ；抗イディオタイプＧＤ３エピトープ抗体ＢＥＣ２；抗αｖβ３抗体ＶＩＴＡＸＩＮ（商標）；抗ヒト腎細胞癌抗体、例えばｃｈ−Ｇ２５０；ＩＮＧ−１；抗ヒト１７−１Ａ抗体（３６２２Ｗ９４）；抗ヒト直腸結腸腫瘍抗体（Ａ３３）；ＧＤ３ガングリオシドに対する抗ヒトメラノーマ抗体Ｒ２４；抗ヒト扁平上皮癌（ＳＦ−２５）；並びに抗ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）抗体、例えばＳｍａｒｔ  ＩＤ１０及び抗ＨＬＡ  ＤＲ抗体Ｏｎｃｏｌｙｍ（Ｌｙｍ−１）が含まれる。
【００９３】
本明細書中で互換可能に使用されている用語「汚染物質」、「不純物」及び「破片」は、本発明に従う刺激応答性ポリマーを用いて１つ以上の異物または不適切な物質から分離しようとする当該タンパク質またはポリペプチド（例えば、抗体）を含有しているサンプル中に存在するかもしれない生物学的マクロ分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、１つ以上の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰまたはＣＨＯＰ）、エンドトキシン、ウイルス、脂質及び１つ以上の添加物）を含めた異物または不適切な物質を指す。幾つかの実施形態では、本明細書中に記載されている刺激応答性ポリマーは、当該タンパク質またはポリペプチド及び１つ以上の不純物を含有しているサンプルから当該タンパク質またはポリペプチドに結合し、沈殿させる。他の実施形態では、本明細書中に記載されている刺激応答性ポリマーは、１つ以上の不純物に結合し、沈殿させ、これにより１つ以上の不純物から当該ポリペプチドまたはタンパク質を分離する。
【００９４】
本明細書中で互換可能に使用されている用語「チャイニーズハムスター卵巣細胞タンパク質」及び「ＣＨＯＰ」は、チャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞培養物由来の宿主細胞タンパク質（「ＨＣＰ」）の混合物を指す。ＨＣＰまたはＣＨＯＰは通常、細胞培養培地またはライゼート（例えば、当該タンパク質またはポリペプチド（例えば、ＣＨＯＰ細胞中で発現する抗体またはイムノアドヘシン）を含有している収集した細胞培養液）中に不純物として存在している。通常、当該タンパク質を含む混合物中に存在するＣＨＯＰの量は当該タンパク質の純度の目安を与える。典型的には、タンパク質混合物中のＣＨＯＰの量は混合物中の当該タンパク質の量に対して百万分率で表示される。
【００９５】
宿主細胞が別の哺乳動物細胞型、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞または植物細胞の場合、ＨＣＰは宿主細胞のライゼート中に存在する標的タンパク質以外のタンパク質を指すと理解されたい。
【００９６】
本明細書中で使用されている用語「細胞培養添加物」は、細胞培養または発酵プロセスを促進または改善するために細胞培養プロセスに添加される分子（例えば、非タンパク質添加物）を指す。本発明に従う幾つかの実施形態では、本明細書中に記載されている刺激応答性ポリマーは、１つ以上の細胞培養添加物に結合し、沈殿させる。細胞培養添加物の例には、消泡剤、抗生物質、染料及び栄養素が含まれる。
【００９７】
本明細書中で互換可能に使用されている用語「百万分率」または「ｐｐｍ」は、本明細書中に記載されている刺激応答性ポリマーを用いて精製した所望の標的分子（例えば、標的タンパク質または抗体）の純度の目安を指す。従って、この目安は、精製プロセス後に存在する標的分子の量を評価するかまたは所望しない実在物の量を評価するために使用され得る。幾つかの実施形態では、単位「ｐｐｍ」は、ミリグラム／ミリリッター単位での当該タンパク質のナノグラム／ミリリッター単位での溶液中の不純物（例えば、ＨＣＰまたはＣＨＯＰ）（すなわち、ＣＨＯＰ  ｐｐｍ＝（ＣＨＯＰ  ｎｇ／ｍｌ）／（当該タンパク質  ｍｇ／ｍｌ）の量を指す。タンパク質が（例えば、凍結乾燥により）乾燥されている場合には、ｐｐｍは（ＣＨＯＰ  ｎｇ）／（当該タンパク質  ｍｇ）を指す。
【００９８】
用語「単離する」、「精製する」及び「分離する」は、本明細書中に記載されている刺激応答性ポリマーを用いて標的分子及び１つ以上の不純物を含有している組成物またはサンプルから標的分子（例えば、当該ポリペプチドまたはタンパク質）を精製する状況で本明細書中で互換可能に使用されている。幾つかの実施形態では、サンプル中の標的分子の純度は、本明細書中に記載されているように刺激応答性ポリマーを用いることによりサンプルから１つ以上の不純物を（完全にまたは部分的に）除去することにより上昇する。別の実施形態では、サンプル中の標的分子の純度はサンプル中の１つ以上の不純物から標的分子を沈殿除去することにより上昇する。
【００９９】
幾つかの実施形態では、精製プロセスは、更に１つ以上の「クロマトグラフィーステップ」を使用する。典型的には、これらのステップは、本発明に従う刺激応答性ポリマーを用いて１つ以上の所望しない実在物から標的分子を分離した後所要により実施され得る。
【０１００】
幾つかの実施形態では、本明細書中に記載されている刺激応答性ポリマーを用いて当該ポリペプチドまたはタンパク質を単離、分離または精製するための「精製ステップ」は、「均質な」または「純粋な」組成物またはサンプルを生ずる全精製プロセスの一部であり得る。この用語は、当該タンパク質を含んでいる組成物中に１００ｐｐｍ未満のＨＣＰ、或いは９０ｐｐｍ未満、８０ｐｐｍ未満、７０ｐｐｍ未満、６０ｐｐｍ未満、５０ｐｐｍ未満、４０ｐｐｍ未満、３０ｐｐｍ未満、２０ｐｐｍ未満、１０ｐｐｍ未満、５ｐｐｍ未満または３ｐｐｍ未満しかＨＣＰを含んでいない組成物またはサンプルを指すために使用される。
【０１０１】
本明細書中で使用されている用語「清澄化」ステップは、通常、生体分子の精製における１つ以上の初期ステップを指す。清澄化ステップは、通常、例えば遠心及びデブス濾過、沈殿、凝集及び沈降の１つまたはその各種組合せを含めた１つ以上のステップを用いる細胞及び／または細胞破片の除去を含む。清澄化ステップは通常、１つ以上の望ましくない実在物の除去を含み、典型的には所望の標的分子の捕捉を含むステップの前に実施される。清澄化の別の重要な態様は、後に精製プロセスにおいて無菌フィルターを汚す恐れがあるサンプル中の可溶性及び不溶性成分を除去し、これにより全精製プロセスをより経済的とすることである。幾つかの実施形態では、本明細書中の実施例に記載されているより低い濁度／不純物及び下流フィルターのより多い処理量により立証されるように、本発明は、各種精製スキームにおいて一般に使用されている慣用の清澄化ステップ以上の改善を提供する。
【０１０２】
本明細書中で使用されている用語「クロマトグラフィー」は、当該アナライト（例えば、標的分子）を混合物中に存在する他の分子から分離する任意の種類の技術を指す。通常、当該アナライトは、混合物の個々の分子が移動相の影響下で固定媒体を介して移動する速度、または結合及び溶離プロセスの差の結果として他の分子から分離される。
【０１０３】
用語「クロマトグラフィー樹脂」または「クロマトグラフィー媒体」は本明細書中で互換可能に使用されており、当該アナライト（例えば、標的分子）を混合物中に存在している他の分子から分離する任意の種類の相（例えば、固体相）を指す。通常、当該アナライトは、混合物の個々の分子が移動相の影響下で固定固体相を介して移動する速度、または結合及び溶離プロセスの差の結果として他の分子から分離される。各種タイプのクロマトグラフィー媒体の例には、例えばカチオン交換樹脂、アフィニティー樹脂、アニオン交換樹脂、アニオン交換膜、疎水性相互作用樹脂及びイオン交換モノリスが含まれる。
【０１０４】
本明細書中で使用されている用語「捕捉ステップ」は、通常、標的分子を刺激応答性ポリマーまたはクロマトグラフィー樹脂と結合させて、標的分子及びポリマーまたは樹脂の沈殿を含有する固体相を生じさせるために使用される方法を指す。典型的には、標的分子はその後標的分子を固体相から除去して標的分子を１つ以上の不純物から分離させる溶離ステップを用いて回収される。各種実施形態では、捕捉ステップはクロマトグラフィー媒体（例えば、樹脂、膜またはモノリス）またはポリマー（刺激応答性ポリマー、高分子電解質、または標的分子を結合するポリマー）を用いて実施され得る。
【０１０５】
本明細書中で使用されている用語「塩」は、酸及び塩基の相互作用により形成される化合物を指す。本明細書中に記載されている方法において使用される各種バッファー中で使用され得る各種塩には、酢酸塩（例えば、酢酸ナトリウム）、クエン酸塩（例えば、クエン酸ナトリウム塩）、塩化物（例えば、塩化ナトリウム）、硫酸塩（例えば、硫酸ナトリウム）またはカリウム塩が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０６】
本明細書中で互換可能に使用されている用語「多価塩」または「多価イオン」は、２つ以上の電荷または電荷含有基を含有している化合物を指す。幾つかの実施形態では、多価塩は刺激として使用され、その結果塩刺激に対して応答性のポリマーの溶解度が変化し、通常、ポリマーが溶液から沈殿する。使用され得る多価塩の例には、例えばリン酸塩及び硫酸塩が含まれる。例えばクエン酸塩のような使用され得る対イオンも本発明に包含される。本明細書中に記載されている刺激として使用するとき、多価塩は刺激応答性ポリマーと共に対象生体分子を含有しているサンプルに対して独立型試薬として添加され得る。或いは、塩を基質、例えば膜に付着させてもよい。特定実施形態では、膜を多価塩含有ポリマーコーティングであるポリビニルリン酸塩で修飾させる。本明細書中に記載されているように刺激として使用される多価イオンは他の刺激（例えば、温度及びｐＨ）に比べてタンパク質構造及び安定性を余り害さないと考えられる。
【０１０７】
幾つかの実施形態では、多価塩は１つ以上の実在物と相互作用して、会合種または複合体を形成することができる。従って、前記塩は「複合体形成塩」とも称され得る。複合体形成塩及びそれより生ずる複合体の非限定例は、多価カチオン（例えば、Ｃｕ２＋及びＣａ２＋）及びエチレンジアミンテトラ酢酸塩中に存在するカルボン酸基とのその複合体；多価アニオン（例えば、リン酸塩（ＰＯ４３−）及びクエン酸塩）及びポリアリルアミン中に存在する第１級アミンとのその複合体；並びにイオン会合性塩（例えば、過塩素酸塩、ドデシル硫酸塩及びドデシルベンゼンスルホン酸塩）及びポリアリルアミン中に存在する第１級アミンとのその複合体である。
【０１０８】
「イオン会合性塩」は、一価（カチオンまたはアニオン）のかさ高の電荷分散塩である。幾つかの実施形態では、イオン会合性塩は刺激として使用され、その結果塩刺激に対して応答性のポリマーの溶解度が変化して、ポリマーが溶液から沈殿する。使用され得イオン会合性塩の例には、例えば過塩素酸塩、ドデシル硫酸塩、ドデシルベンゼンスルホン酸塩、テトラフェニルホウ酸塩及びヘキサニトロジフェノールアミンが含まれる。
【０１０９】
本明細書中で使用されている用語「溶媒」は、通常、１つ以上の他の物質を溶解または分散させて、溶液を得ることができる液体物質を指す。溶媒には水性及び有機溶媒が含まれ、有用な有機溶媒には、非極性溶媒、エタノール、メタノール、イソプロパノール、アセトニトリル、ヘキシレングリコール、プロピレングリコール及び２，２−チオジグリコールが含まれる。
【０１１０】
本明細書中で互換可能に使用されている用語ポリペプチドの「ｐＩ」または「等電点」は、ポリペプチドの正電荷がその負電荷と釣り合うｐＨを指す。ｐＩは、ポリペプチドの結合炭水化物のアミノ酸残基またはシアル酸残基の正味電荷から計算され得、または等電点電気泳動により測定され得る。
【０１１１】
限定的と解釈されるべきでない以下の実施例により本発明を更に説明する。本明細書を通して引用されているすべての文献、特許及び公開特許出願の内容及び図面は、参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１１２】
［実施例１］
清澄化されていない非発現細胞培養液（ＣＣＦ）の作成
代表的実験において、非発現チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株由来の細胞を１０Ｌのバイオリアクター（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において１０×１０６細胞／ｍＬの密度まで増殖させ、６４％  生存度で収集した。ＩｇＧを１．３ｇ／Ｌの濃度までスパイクした。宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）のレベルは、ＥＬＩＳＡ（Ｃｙｇｎｕｓ  ＃ＣＭ０１５）を用いて８３００ｎｇ／ｍｌであると判明した。清澄化されていない細胞培養物のｐＨは７．２であった。
【０１１３】
［実施例２］
疎水基で修飾させた高分子電解質骨格を含む刺激応答性ポリマーの合成
代表的実験において、疎水基で修飾させたポリアリルアミン（ＢｚＭＰＡＡ）骨格を含む刺激応答性ポリマーを合成した。疎水基で修飾させたカチオン性高分子電解質骨格を含むポリマーを４０％ｗｔ  線状ポリアリルアミン（ＮＩＴＴＯＢＯ，１５０ｋＤ）（１０．３ｇ）、水酸化リチウム（２ｇ）及び５０％  水／メタノール（２０ｍｌ）の混合物を用いて合成し、十分に混合されるまで攪拌した。ベンジルクロリド（２．１ｍｌ）をメタノール（１５ｍｌ）中に含む溶液をポリマー溶液に添加した。生じた混合物を６０℃で１４時間加熱した。溶媒との熱力学的非相容性の結果として、ベンジル修飾ポリアリルアミンは反応期間の終わりに沈殿した。沈殿をアセトン（３０ｍＬ）で洗浄し、１Ｍ  酢酸（４００ｍＬ）中に再溶解した。ポリマーをｐＨ７の５０ｍＭ  リン酸ナトリウムで沈殿させることにより更に精製した。図１は、ポリアリルアミン高分子電解質ポリマーの疎水基、すなわちベンジルクロリドとの反応の概略を示す。
【０１１４】
［実施例３］
ベンジル修飾ポリアリルアミン（ＢｚＭＰＡＡ）の溶液の製造
室温で１６時間連続攪拌しながら実施例２からのポリマー（１０ｇ）を１Ｍ  酢酸（９０ｇ）中に溶解させることにより１０％  ＢｚＭＰＡＡ溶液を製造した。生じた粘性溶液はわずかに曇っていた。
【０１１５】
［実施例４］
非発現細胞培養液（ＣＣＦ）の清澄化における異なる濃度のベンジル修飾ポリアリルアミン（ＢｚＭＰＡＡ）の使用
実施例１からの清澄化されていない細胞培養液（ＣＣＦ）の５ｍＬ  サンプルに０．２ｇ，０．３ｇ，０．４ｇ及び０．５ｇの量の実施例３からのＢｚＭＰＡＡを添加した。サンプルを室温で２分間混合した。ポリマー添加によりｐＨがｐＨ４．５〜５．５の範囲に低下したので、混合物のｐＨを２Ｍ  トリス塩基を用いてｐＨ７に調節した。ポリマー−標的分子、細胞及び細胞破片複合体を沈殿させるために、生じた溶液にリン酸水素二カリウム（０．０４３ｇ）を添加した。分散状の固体懸濁液形態の沈殿を５分間連続的に混合した。次いで、沈殿を遠心（４０００ｒｐｍで１分間）により収集した。各サンプルからの上清を０．２ｕｍ  Ｄｕｒａｐｏｒｅ（登録商標）フィルターを介して濾過した。生じた精製を下表１に詳記する。
【０１１６】
［実施例５］
ＢｚＭＰＡＡを用いる非発現ＣＣＦの清澄化における異なるｐＨ値の使用
実施例１からの清澄化されていない細胞培養液（５ｍＬ）を含有している４つのサンプルに実施例３からのＢｚＭＰＡＡ（各０．４ｇ）を添加した。サンプルを室温で２分間混合した。ポリマー添加によりｐＨがｐＨ４．５〜５．５の範囲に低下したので、混合物のｐＨを２Ｍ  トリス塩基を用いてそれぞれｐＨ５．５、６．５、７．５及び８．５に調節した。ポリマー−標的分子、細胞及び細胞破片複合体を沈殿させるために、生じた溶液にリン酸水素二カリウム（０．０４３ｇ）を添加した。分散状の固体懸濁液の形態の沈殿を５分間連続的に混合した。次いで、沈殿を遠心（４０００ｒｐｍで１分間）により収集した。次いで、各サンプルからの上清を０．２ｕｍ  Ｄｕｒａｐｏｒｅ（登録商標）フィルターを介して濾過した。生じた精製を下表１に詳記する。この表にはスパイクした非発現ＣＨＯＣＣＦのＢｚＭＰＡＡ精製が記載されている。
【０１１７】
【表１】
0005612761.tif 000006
【０１１８】
［実施例６］
ＣＣＦの清澄化におけるＢｚＭＰＡＡの使用により生ずる純度レベルについてのアッセイ
実施例４及び実施例５からのサンプルをアフィニティープロティンＡ分析用ＨＰＬＣアッセイを用いてＩｇＧ回収についてアッセイした。或いは、溶液中のＩｇＧのレベルを分析用プロティンＡカラムを用いて測定した。具体的には、Ｐｏｒｏｓ  Ａ／２０プロティンＡカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をＰＢＳで平衡化し、０．１Ｍ  リシン（ｐＨ２）で溶離し、６Ｍ  グアニジンＨＣｌで洗浄した。注入容量の異なる一連のポリクローナルＩｇＧ（Ｓｅｒａｃａｒｅ）を用いてＩｇＧ標準曲線を作成した。サンプルを注入し、ＩｇＧ濃度を標準曲線から求めた。
【０１１９】
実施例４及び実施例５からのサンプルを市販の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キット（Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，ノースカロライナ州サウスポート，Ｃｙｇｎｕｓ  ＃ＣＭ０１５）を用いて宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）についてアッセイした。実施例４及び実施例５からのサンプルを標準ピコグリーンアッセイ及び標準としてのニシン精液ＤＮＡを用いてＤＮＡについてもアッセイした。
【０１２０】
［実施例７］
清澄化されていない細胞培養液（ＣＣＦ）の作成
発現チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ−ＤＧ４４）細胞株由来の細胞を１０Ｌのバイオリアクター（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において１０×１０６細胞／ｍｌの密度まで増殖させ、３０％  生存度で収集した。モノクローナル抗体（ＭＡｂ）価は０．８ｇ／Ｌであると測定された。宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）のレベルはＥＬＩＳＡアッセイ（Ｃｙｇｎｕｓ  ＃３Ｇ  ＥＬＩＳＡ）を用いて２００，０００ｎｇ／ｍｌであると判明した。清澄化されていない細胞培養物のｐＨはｐＨ６．９であった。
【０１２１】
［実施例８］
２０％  ベンジル修飾ポリアリルアミン（ＢｚＭＰＡＡ）の合成
ポリアリルアミン（ＰＡＡ）（Ｎｉｔｔｏｂｏ，１５０ｋＤ；４０％ｗｔ．／ｗｔ．）（１０ｇ）を１００ｍｌの丸底フラスコに入れ、水酸化ナトリウム（３．３４ｇ）（１．２当量／モノマー）をＨ２Ｏ（２５ｍＬ）中に含む溶液を室温で磁気撹拌しながら少しずつ添加した。次いで、ベンジルクロリド（１．３８ｇ，１．２５ｍＬ）を一度に添加し、室温で数分間攪拌した後、一晩１７時間６０℃に加熱した。次いで、反応物を室温まで冷却し、溶媒を除去すると、ポリマーが沈殿した。沈殿したポリマーを水で洗浄した後、完全に溶解するまで１Ｍ  水性ＡｃＯＨ溶液（４０ｍＬ）中で攪拌した。次いで、溶液をＨ２Ｏで４００ｍＬ（１％  ポリマー溶液）の最終容量まで希釈し、リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）（３．４８ｇ）を撹拌しながら添加し、溶液のｐＨを約６．８に調節して、修飾ポリマーを沈殿させた。ポリマーをガラス濾過器を用いて濾過することにより収集し、最後に真空オーブン中５０〜６０℃で一晩乾燥した。
【０１２２】
［実施例９］
４０％  ベンジル修飾ポリアリルアミン（ＢｚＭＰＡＡ）の合成
ポリアリルアミン（ＰＡＡ）（Ｎｉｔｔｏｂｏ，１５０ｋＤ；４０％ｗｔ／ｗｔ．）（１０ｇ）を１００ｍｌの丸底フラスコに入れ、水酸化ナトリウム（３．３４ｇ）（１．２当量／モノマー）をＨ２Ｏ（２５ｍＬ）中に含む溶液を室温で磁気撹拌しながら少しずつ添加した。次いで、ベンジルクロリド（２．３０ｇ，２．０９ｍＬ）を添加し、室温で数分間攪拌した後、一晩１７時間６０℃に加熱した。次いで、反応物を室温まで冷却し、溶媒を除去すると、ポリマーが沈殿した。沈殿したポリマーを水で洗浄し、完全に溶解するまで１Ｍ  水性ＡｃＯＨ溶液（４０ｍＬ）中で撹拌した。次いで、溶液をＨ２Ｏで４００ｍＬ（１％  ポリマー溶液）の最終容量まで希釈し、リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）（３．４８ｇ）を撹拌しながら添加し、溶液のｐＨをｐＨ６．８に調節して、修飾ポリマーを沈殿させた。ポリマーをガラス濾過器を用いて濾過することにより収集し、最後に真空オーブン中５０〜６０℃で一晩乾燥した。
【０１２３】
［実施例１０］
６０％  ベンジル修飾ポリアリルアミン（ＢｚＭＰＡＡ）の合成
ポリアリルアミン（ＰＡＡ）（ＮＩＴＴＯＢＯ，１５０ｋＤ；４０％ｗｔ／ｗｔ．）（１０ｇ）を１００ｍｌの丸底フラスコに入れ、水酸化ナトリウム（３．３４ｇ）（１．２当量／モノマー）をＨ２Ｏ（２５ｍＬ）中に含む溶液を室温で磁気撹拌しながら少しずつ添加した。次いで、ベンジルクロリド（３．２３ｇ，２．９４ｍＬ）を添加し、室温で数分間攪拌した後、一晩１７時間６０℃に加熱した。次いで、反応物を室温まで冷却し、溶媒を除去した。沈殿したポリマーを水で洗浄した後、完全に溶解するまで１Ｍ  水性ＡｃＯＨ溶液（４０ｍＬ）中で撹拌した。次いで、溶液をＨ２Ｏで４００ｍＬ（１％  ポリマー溶液）の最終容量まで希釈し、リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）（３．４８ｇ）を撹拌しながら添加し、溶液のｐＨをｐＨ６．８に調節して、修飾ポリマーを沈殿させた。ポリマーをガラス濾過器を用いて濾過することにより収集し、最後に真空オーブン中５０〜６０℃で一晩乾燥した。
【０１２４】
［実施例１１］
ジフェニル修飾ポリアリルアミン（ＤＰｈＭＰＡＡ）の合成
例示的実験において、高分子電解質ポリマー骨格のポリアリルアミンをジフェニル基で修飾させた。簡単に説明すると、ポリアリルアミン（ＰＡＡ）（Ｎｉｔｔｏｂｏ，１５０ｋＤ；４０％ｗｔ／ｗｔ．）（１０ｇ）を１００ｍｌの丸底フラスコに入れ、水酸化ナトリウム（３．３４ｇ）（１．２当量／モノマー）をＨ２Ｏ（２５ｍＬ）中に含む溶液を室温で磁気撹拌しながら少しずつ添加した。次いで、クロロジフェニルメタン（３．６８ｇ，３．２３ｍＬ）を添加し、室温で数分間攪拌した後、一晩１７時間６０℃に加熱した。次いで、反応物を室温まで冷却し、溶媒を除去した。沈殿したポリマーを水で洗浄し、１Ｍ  水性ＡｃＯＨ溶液（４０ｍＬ）中で撹拌した。ジフェニルクロロメタンの加水分解により生じた残りの白色固体を濾別した。次いで、溶液をＨ２Ｏで４００ｍＬ（１％  ポリマー溶液）の最終容量まで希釈し、リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）（３．４８ｇ）を撹拌しながら添加し、溶液のｐＨをｐＨ６．８に調節して、修飾ポリマーを沈殿させた。ポリマーをガラス濾過器を用いて濾過することにより収集し、最後に真空オーブン中５０〜６０℃で一晩乾燥した。
【０１２５】
［実施例１２］
６％  ジクロロベンジル修飾ポリアリルアミン（ＤＣｌＢｚＭＰＡＡの合成）
別の実験において、ポリアリルアミン（ＰＡＡ）（ＮＩＴＴＯＢＯ，１５０ｋＤ；４０％ｗｔ／ｗｔ．）（１０ｇ）を１００ｍｌの丸底フラスコに入れ、水酸化ナトリウム（３．３４ｇ）（１．２当量／モノマー）をＨ２Ｏ（２５ｍＬ）中に含む溶液を室温で磁気撹拌しながら少しずつ添加した。次いで、３，４−ジクロロベンジルクロリド（１．７１ｇ，１．２１ｍＬ）を添加し、混合物を室温で一晩１７時間撹拌した。次いで、反応混合物をＨ２Ｏ（１００ｍｌ）で希釈した後、ｐＨをリン酸で中性（ｐＨ７．０）に調節した。沈殿したポリマーを濾別し、Ｈ２Ｏで洗浄し、真空オーブン中６０℃で一晩乾燥した。ポリマーをガラス濾過器を用いて濾過することにより収集し、最後に真空オーブン中５０〜６０℃で一晩乾燥した。
【０１２６】
［実施例１３］
１０％  ジクロロベンジル修飾ポリアリルアミン（ＤＣｌＢｚＭＰＡＡ）の合成
別の代表的実験において、１０％  ジクロロベンジル修飾ポリアリルアミンを次のように合成した。ポリアリルアミン（ＰＡＡ）（ＮＩＴＴＯＢＯ，１５０ｋＤ；４０％ｗｔ／ｗｔ．）（５ｇ）を１００ｍｌの丸底フラスコに入れ、水酸化ナトリウム（１．６８ｇ）（１．２当量／モノマー）を５０／５０  Ｈ２Ｏ／１，２−ジメトキシエタン（ＤＭＥ）（４０ｍＬ）中に含む溶液を室温で磁気撹拌しながら少しずつ添加した。次いで、３，４−ジクロロベンジルクロリド（０．５７ｇ，０．４０ｍＬ）を添加し、室温で数分間攪拌した後、６０℃に一晩２１時間加熱した。次いで、反応物を室温まで冷却し、ＤＭＥを真空下６０〜７０℃で除去した後、残りの溶媒を除去した。沈殿したポリマーを水で洗浄した後、完全に溶解するまで１Ｍ  水性ＡｃＯＨ溶液（２０ｍＬ）中で撹拌した。次いで、溶液をＨ２Ｏで２００ｍＬ（１％  ポリマー溶液）の最終容量まで希釈し、リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）（１．７４ｇ）を撹拌しながら添加し、溶液のｐＨをｐＨ６．８に調節して、修飾ポリマーを沈殿させた。ポリマーをガラス濾過器を用いて濾過することにより収集し、最後に真空オーブン中５０〜６０℃で一晩乾燥した。
【０１２７】
［実施例１４］
３３％  クロロベンジル修飾ポリアリルアミン（ＤＣｌＢｚＭＰＡＡ）の合成
別の代表的実験において、３３％  クロロベンジル修飾ポリアリルアミンを次のように合成した。ポリアリルアミン（ＰＡＡ）（ＮＩＴＴＯＢＯ，１５０ｋＤ；４０％ｗｔ／ｗｔ．）（５ｇ）を１００ｍｌの丸底フラスコに入れ、水酸化ナトリウム（３．３４ｇ）（１．２当量／モノマー）を５０／５０  Ｈ２Ｏ／１，２−ジメトキシエタン（ＤＭＥ）（４０ｍＬ）中に含む溶液を室温で磁気撹拌しながら少しずつ添加した。次いで、４−クロロベンジルクロリド（１．４８ｇ）を添加し、室温で数分間攪拌した後、６０℃に一晩２１時間加熱した。翌日、ＤＭＥを真空下６０〜７０℃で蒸発させ、残りの溶媒を沈殿したポリマーから分離した。後者を水で洗浄した後、完全に溶解するまで１Ｍ  水性ＡｃＯＨ溶液（２０ｍＬ）中で撹拌した。次いで、溶液をＨ２Ｏで２００ｍＬ（１％  ポリマー溶液）の最終容量まで希釈し、リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）（１．７４ｇ）を撹拌しながら添加し、溶液のｐＨをｐＨ７に調節して、精製ポリマーを沈殿させた。ポリマーをガラス濾過器を用いて濾過することにより収集し、最後に真空中５０〜６０℃で一晩乾燥した。
【０１２８】
［実施例１５］
１３％  フェニルベンジル修飾ポリアリルアミン（ＤＣｌＢｚＭＰＡＡ）の合成
別の実験において、１３％  フェニルベンジル修飾ポリアリルアミンを次のように合成した。ポリアリルアミン（ＰＡＡ）（Ｎｉｔｔｏｂｏ，１５０ｋＤ；４０％ｗｔ／ｗｔ．）（４．７ｇ）を１００ｍｌの丸底フラスコに入れ、水酸化ナトリウム（３．３４ｇ）（１．２当量／モノマー）を５０／５０  Ｈ２Ｏ／１，２−ジメトキシエタン（ＤＭＥ）（４０ｍＬ）中に含む溶液を室温で磁気撹拌しながら少しずつ添加した。次いで、４−フェニルベンジルクロリド（１ｇ）を添加し、混合物を５５℃で一晩２０時間加熱した。次いで、反応物を室温まで冷却し、ＤＭＥを真空下６０〜７０℃で除去し、残りの溶媒を沈殿したポリマーから分離した。後者を水で洗浄した後、完全に溶解するまで１Ｍ  水性ＡｃＯＨ溶液（４０ｍＬ）中で撹拌した。次いで、溶液をＨ２Ｏで２００ｍＬ（１％  ポリマー溶液）の最終容量まで希釈し、リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）（１．７４ｇ）を撹拌しながら添加し、溶液のｐＨをｐＨ７．０に調節して、精製ポリマーを沈殿させた。ポリマーをガラス濾過器を用いて濾過することにより収集し、最後に真空中５０〜６０℃で一晩乾燥した。
【０１２９】
［実施例１６］
２７％  フェニルベンジル修飾ポリアリルアミン（ＤＣｌＢｚＭＰＡＡ）の合成
別の実験において、２７％  フェニルベンジル修飾ポリアリルアミンを次のように合成した。ポリアリルアミン（ＰＡＡ）（Ｎｉｔｔｏｂｏ，１５０ｋＤ；４０％ｗｔ／ｗｔ．）（２．８ｇ）を１００ｍｌの丸底フラスコに入れ、水酸化ナトリウム（３．３４ｇ）（１．２当量／モノマー）を５０／５０  Ｈ２Ｏ／１，２−ジメトキシエタン（ＤＭＥ）（４０ｍＬ）中に含む溶液を室温で磁気撹拌しながら少しずつ添加した。次いで、４−フェニルベンジルクロリド（１ｇ）を添加し、混合物を５５℃で一晩２０時間加熱した。次いで、反応物を室温まで冷却し、ＤＭＥを真空下６０〜７０℃で除去し、残りの溶媒を沈殿したポリマーから分離した。後者を水で洗浄した後、１Ｍ  水性ＡｃＯＨ溶液（３２ｍＬ）中で撹拌し、完全に溶解するまで一晩撹拌した。次いで、溶液をＨ２Ｏで２００ｍＬ（１％  ポリマー溶液）の最終容量まで希釈し、リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）（１．７４ｇ）を撹拌しながら添加し、溶液のｐＨをｐＨ７．０に調節して、精製ポリマーを沈殿させた。ポリマーをガラス濾過器を用いて濾過することにより収集し、最後に真空中５０〜６０℃で一晩乾燥した。
【０１３０】
［実施例１７］
異なるポリマー濃度でのＣＣＦの清澄化
例示的実験において、実施例８〜１６に上記されている刺激応答性ポリマーをＣＣＦの清澄化について評価した。ＣＣＦの作成は実施例７に上記されている。清澄化されていない細胞培養液の５ｍＬ  サンプルに０．２ｇ，０．３ｇ，０．４ｇ及び０．５ｇの量の実施例８〜１６からのポリマー溶液を添加した。サンプルを室温で２分間混合した。ポリマー添加によりｐＨがｐＨ４．５〜５．５の範囲に低下したので、混合物のｐＨを２Ｍ  トリス塩基を用いてｐＨ７に調節した。ポリマー−標的分子、細胞及び細胞破片複合体を沈殿させるために、生じた溶液にリン酸水素二カリウム塩（０．０４３ｇ）を添加した。分散状の固体懸濁液の形態の沈殿を５分間連続的に混合した。次いで、沈殿を遠心（４０００ｒｐｍで１分間）により収集した。その後、各サンプルからの上清を０．２μｍ  Ｄｕｒａｐｏｒｅ（登録商標）フィルターを介して濾過した。生じた精製を表２に詳記する。
【０１３１】
［実施例１８］
異なるｐＨでのポリマーを用いるＣＣＦの清澄化
別の実験において、実施例７に記載されている清澄化されていない細胞培養液（５ｍＬ）を含有している４つのサンプルに実施例８〜１６からのポリマー溶液（各０．４ｇ）を添加した。サンプルを室温で２分間混合した。ポリマー添加によりｐＨがｐＨ４．５〜５．５の範囲に低下したので、混合物のｐＨを２Ｍ  トリス塩基を用いてそれぞれｐＨ５．５、６．５、７．５及び８．５に調節した。ポリマー−標的分子、細胞及び細胞破片複合体を沈殿させるために、生じた溶液にリン酸水素二カリウム塩（０．０４３ｇ）を添加した。分散状の固体懸濁液の形態の沈殿を５分間連続的に混合した。次いで、沈殿を遠心（４０００ｒｐｍで１分間）により収集した。その後、各サンプルからの上清を０．２μｍ  Ｄｕｒａｐｏｒｅ（登録商標）フィルターを介して濾過した。生じた精製を表２に記載する。
【０１３２】
［実施例１９］
異なるレベルの多価イオン刺激に対して応答性のポリマーを用いるＣＣＦの清澄化
別の実験において、実施例８〜１５に記載されているポリマーを異なる量の多価イオン刺激を用いてＣＣＦの清澄化について評価した。具体的には、実施例７に記載されている清澄化されていない細胞培養液（５ｍＬ）を含有している４つのサンプルに実施例８〜１５からのポリマー溶液（各０．４ｇ）を添加した。サンプルを室温で２分間混合した。ポリマー添加によりｐＨがｐＨ４．５〜５．５の範囲に低下したので、混合物のｐＨを２Ｍ  トリス塩基を用いてそれぞれｐＨ５．５、６．５、７．５及び８．５に調節した。ポリマー−標的分子、細胞及び細胞破片複合体を沈殿させるために、生じた溶液に０．０３１〜０．０４３ｇ（５０〜７０ｍＭの最終リン酸塩濃度）の範囲のリン酸水素二カリウム塩を添加した。分散状の固体懸濁液の形態の沈殿を５分間連続的に混合した。次いで、沈殿を遠心（４０００ｒｐｍで１分間）により収集した。その後、各サンプルからの上清を０．２μｍ  Ｄｕｒａｐｏｒｅ（登録商標）フィルターを介して濾過した。生じた精製を表２に記載する。
【０１３３】
［実施例２０］
慣用されている凝集剤を用いるＣＣＦの清澄化
別の実験において、比較データを得る試みにおいて慣用されている凝集剤のキトサンをＣＣＦの清澄化のために使用した。ポリマー溶液（２ｗｔ％）はＲｉｓｋｅ，Ｆ．ら；Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２８（２００７），８１３−８２３に記載されている手順に従って作成した。ポリマー溶液を量及びｐＨ条件を変えて実施例７からのＣＣＦに添加した。このポリマーの場合刺激は使用しなかった。生じた精製を表２に記載する。
【０１３４】
［実施例２１］
ＣＣＦを刺激応答性ポリマーを用いて沈殿させた後の純度レベルの評価
代表的実験において、実施例８〜１６に記載されているポリマーをアフィニティープロティンＡ分析用ＨＰＬＣアッセイを用いてＩｇＧ回収についてアッセイした。或いは、溶液中のＩｇＧレベルを分析用プロティンＡカラムを用いて調べた。Ｐｏｒｏｓ  Ａ／２０プロティンＡカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をＰＢＳで平衡化し、０．１Ｍ  リシン（ｐＨ２）で溶離し、６Ｍ  グアニジンＨＣｌで洗浄した。注入容量の異なる一連のポリクローナルＩｇＧ（Ｓｅｒａｃａｒｅ）を用いてＩｇＧ標準曲線を作成した。サンプルを注入し、ＩｇＧ濃度を標準曲線から求めた。実施例８〜１６からのサンプルを市販の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キット（Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，ノースカロライナ州サウスポート，Ｃｙｇｎｕｓ  ＃ＣＭ０１５）を用いて宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）についてアッセイした。実施例８〜１６からのサンプルを標準ピコグリーンアッセイ及び標準としてのニシン精液ＤＮＡを用いてＤＮＡについてもアッセイした。細胞及び細胞破片の減少を評価するために、４０００ｒｐｍで１分間遠心した後濁度を調べた。
【０１３５】
【表２】
0005612761.tif 000007
0005612761.tif 000008
0005612761.tif 000009
【０１３６】
［実施例２２］
ベンジル修飾ポリエチレンイミン（ＢｚＭＰＥＩ）の合成
別の実験において、ベンジル修飾ポリエチレンイミン刺激応答性ポリマーを次のように合成した。ＰＥＩ（Ａｌｄｒｉｃｈ，７５０ｋＤ；５０％ｗｔ．／ｗｔ．）（１０ｇ）を１００ｍｌの丸底フラスコに入れ、水酸化ナトリウム（１．２当量／モノマー）（〜３．３４ｇ）をＨ２Ｏ（２５ｍＬ）中に含む溶液を室温で磁気撹拌しながら少しずつ添加する。次いで、ベンジルクロリド（２．３０ｇ，２．０９ｍＬ）を添加し、室温で数分間攪拌した後、６０℃で一晩１７時間加熱する。次いで、反応物を室温まで冷却し、溶媒を除去する。沈殿したポリマーを水で洗浄した後、完全に溶解するまで１Ｍ  水性ＡｃＯＨ溶液（２０ｍＬ）中で撹拌する。次いで、溶液をＨ２Ｏで４００ｍＬ（１％  ポリマー溶液）の最終容量まで希釈し、リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）（３．４８ｇ）を撹拌しながら添加し、溶液のｐＨをｐＨ６．８に調節して、修飾ポリマーを沈殿させる。ポリマーをガラス濾過器を用いて濾過することにより収集し、最後に真空オーブン中５０〜６０℃で一晩乾燥する。
【０１３７】
［実施例２３］
ベンジル修飾ポリビニルアミン（ＢｚＭＰＶＡ）の合成
代表実施例において、ベンジル修飾ポリビニルアミンを次のように合成した。ポリ（ビニルアミン）（ＰＶＡ）塩酸塩（ＭＷ＝８３，５００，Ａｉｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）（３２ｇ）をガラス容器に秤量して入れた。Ｈ２Ｏ（２００ｍＬ）を添加し、５０％  ＮａＯＨ（２６ｇ）を添加し、十分混合されるまで撹拌する。ベンジルクロリド（２３．５ｇ）を添加し、７０℃で１６時間混合する。反応が進行するにつれて、固体白色塊が上清から分離する。固体を沈降させ、デカントにより上清を捨てる。固体を３％  酢酸（３５０ｍＬ）中に一晩溶解する。Ｈ２Ｏ（３６０ｍＬ）を添加し、溶液が均質になるまで１６時間混合する。全容量を脱イオン（ＤＩ）Ｈ２Ｏで３．２Ｌにすることにより１％ｗ／ｖ溶液まで希釈する。ポリマーの沈殿を開始するためにリン酸ナトリウムを５０ｍＭの濃度まで添加する。ｐＨ６．８に達するまで１Ｍ  ＮａＯＨを添加して、追加的にポリマーを沈殿させる。乾燥ケーキを濾過し、上清を捨てる。固体を７０℃で一晩乾燥する。５％ｗ／ｖ溶液を製造するために均質溶液が生ずるまで３％  酢酸中に溶解する。
【０１３８】
［実施例２４］
刺激の存在下での清澄化における修飾及び非修飾ポリマーの比較
それぞれ０．２％ｗｔ及び０．４％の最終ポリマー濃度とするように水性溶液にポリアリルアミン（ＰＡＡ，Ｎｉｔｔｏｂｏ，１５０ｋＤ；４０％ｗｔ．／ｗｔ．）及び実施例１０からのポリマー（Ｂｚ−ＭＰＡＡ）を添加した。リン酸水素カリウム塩を刺激として使用し、ＰＡＡ及び実施例１０のポリマー溶液に異なる量で添加し、濁度及び形成された凝集物の種類を記録した。結果を下表３に示す。
【０１３９】
【表３】
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【０１４０】
［実施例２５］
刺激の存在下での清澄化における修飾及び非修飾ポリマーの比較
それぞれ０．２重量％及び０．４重量％の最終ポリマー濃度とするように水性溶液に非修飾ポリマーポリアリルアミン（ＰＡＡ，Ｎｉｔｔｏｂｏ，１５０ｋＤ；４０％ｗｔ／ｗｔ．）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ，Ａｌｄｒｉｃｈ，７５０ｋＤ；５０％ｗｔ／ｗｔ．）、ポリビニルアミン（ポリ（ビニルアミン）（ＰＶＡ）塩酸塩，ＭＷ＝８３，５００，Ａｉｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）、並びに実施例１０からの修飾ポリマー（Ｂｚ−ＭＰＡＡ）、実施例２２からの修飾ポリマー（ＢｚＭＰＥＩ）及び実施例２３からの修飾ポリマー（ＢｚＭＰＶＡ）を添加した。リン酸水素カリウム（１５０ｍＭ）を刺激として使用し、０．４％  ポリマー溶液の各々に添加し、濁度及び形成された凝集物の種類を記録した。結果を下表４に示す。
【０１４１】
【表４】
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【０１４２】
［実施例２６］
ヘキサン酸及びｔｅｒｔ−ブチル修飾ポリアリルアミン（ＨＣ−ｔ−ＢｕＭＰＡＡ）の合成
４０ｗｔ％  線状ポリマーポリ（アリルアミン）（１５０ｋＤａ，ＮＩＴＴＯＢＯ）（１０ｍｌ）及び水酸化ナトリウム（１Ｍ）（３０ｍｌ）を含む溶液中に６−ブロモヘキサン酸（３．４９ｇ）を溶解した。混合物をＴ＝５０℃で１８時間反応させ、生成物を水和ゲルとして沈殿させた。沈殿を１００ｍｇ／ｍｌ  水酸化リチウム溶液中に溶解し、ｔｅｒｔ−ブチルグリシジルエーテル（２．５ｍｌ）を含有するメタノール（１０ｍｌ）と混合した。次いで、混合物をＴ＝５０℃で１８時間反応させた。ポリマー溶液を３．５ｋｄａ分子量カットオフ透析チューブを用いて脱イオン（ＤＩ）水に対する示量透析（３日間）により精製した。ポリマー溶液の最終濃度は７．２ｗｔ％であった。合成反応の概略を図２に示す。
【０１４３】
［実施例２７］
トリス緩衝液中に溶解したときのヘキサン酸及びｔｅｒｔ−ブチル修飾ポリアリルアミン（ＨＣ−ｔ−ＢｕＭＰＡＡ）の多価刺激に対する塩化ナトリウムの影響
０、０．１５または０．５Ｍ  塩化ナトリウムを含有する２５ｍＭ  リン酸ナトリウム（１０ｍｌ）に実施例２６からのＨＣ−ｔ−ＢｕＭＰＡＡ（６００μｌ）を添加した。溶液の最終ｐＨは１１．６であった。溶液を３Ｍ  酢酸を用いて滴定し、各添加後に溶液の濁度を記録した。図３に示すように、リン酸ナトリウムに加えて塩化ナトリウムを添加することにより、相転移が生ずるｐＨ応答性の変化が観察された。
【０１４４】
［実施例２８］
異なるポリマー濃度でのポリマーＨＣ−ｔ−ＢｕＭＰＡＡを用いるＣＣＦの清澄化
代表的実験において、清澄化されていないＣＣＦを本発明に従うポリマーを用いて次のように清澄化した。２５ｍＭ  リン酸ナトリウムを含有している実施例１からの清澄化されていない細胞培養液（５ｍｌ）に実施例２６からのＨＣ−ｔ−ＢｕＭＰＡＡ（１７８、３５６または５３４μｌ）を添加し、３Ｍ  酢酸（２５μｌ）を用いてｐＨ８．７に調節した。ポリマーを添加した後、溶液の最終ｐＨを３Ｍ  酢酸を用いて７．２に調節すると、ポリマー−細胞複合体が沈殿した。
【０１４５】
分散状の固体懸濁液の形態の沈殿を更に５分間連続的に混合した。次いで、沈殿を遠心（４０００ｒｐｍで１分間）により収集し、上清を０．２μｍ  Ｄｕｒａｐｏｒｅ（登録商標）フィルターを介して濾過した。使用したポリマーの濃度に関係なく、プロセスによりＭａｂが１００％  回収された。
【０１４６】
［実施例２９］
モノマーからのポリビニルアミン（ＰＶＡ）刺激応答性ポリマーの合成
第１級アミンを含有する反復単位を含む刺激応答性ポリマーをモノマーから次のように合成した。脱イオン水（１６５ｇ）及びＮ−ビニルホルムアミド（ＮＶＦ）（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ，９８％）（２２．５ｇ）を２５０ｍｌの丸底フラスコに入れた。フラスコに磁気攪拌機及びＮ２ディップスティックを備えた。Ｎ２をパージしながら溶液を０．５時間攪拌した後、連続的にパージしながら更に０．５時間かけて４５℃に加熱した。２，２’−アゾビス（２−アミドプロパン）二塩酸塩（ＡＢＡＰ）（Ａｌｄｒｉｃｈ）（０．２８８ｇ）を脱イオン水（１０ｍｌ）に添加することにより開始剤溶液を製造し、溶解した。２５０ｍｌの丸底フラスコに開始剤溶液をＮ２雰囲気下で添加した。窒素下激しく攪拌しながら、溶液を５５℃に１時間加熱した後、６５℃で２時間加熱し、更に７５℃で１時間加熱した。粘性の均質溶液が得られ、室温まで冷却した。粘度をブルックフィールド粘度ＤＶ−ＩＩ＋  Ｐｒｏ粘度計（設定１００ＲＰＭ，４５％  トルク，スピンドル＃３４）により測定した。生じた溶液の粘度は２７８〜３５０センチポイズ（ｃＰ）であった。溶液を５００ｍｌのフラスコに移し、Ｈ２Ｏ（３３０ｍｌ）で希釈し、５０％  ＮａＯＨ（４０ｇ）を攪拌しながら添加した。溶液を８５℃で８時間加熱した。
【０１４７】
加水分解したポリマーに２モル  リン酸ナトリウムを１滴ずつ添加し、リン酸塩イオンを添加したときの溶液からの白色固体の沈殿を観察することにより、小サンプルのリン酸塩刺激に対する感受性を試験した。ｐＨが約２に達するまで加水分解したポリマー溶液に２５％  ＨＣｌを１滴ずつ添加した。溶液を一晩激しく攪拌し、均質な黄色溶液を得た。この溶液に攪拌しながら４モル  ＮａＯＨ（１００ｍｌ）をイソプロピルアルコール（５００ｍｌ）と一緒に添加した。２モル  リン酸ナトリウム（１００ｍｌ）を添加することによりポリマーを単離し、固体を真空濾過し、脱イオン水で洗浄した。固体ポリマーを真空オーブン中６５℃で一晩乾燥した。部分的に乾燥したポリマーを液体窒素を用いて凍結し、微粉末まで粉砕し、更に真空オーブン中６５℃２４時間乾燥した。最後に、４０．７ｇの乾燥粉末を回収し、１モル  酢酸中に５％ｗ／ｗの最終濃度まで溶解した。
【０１４８】
ポリビニルアミン合成プロセスの概略を図４に示す。
【０１４９】
［実施例３０］
一連の疎水性修飾させたポリビニルアミン（ＰＶＡ）刺激応答性ポリマーの合成
実施例２９から合成したＰＶＡを用いて、３つの別々の疎水性修飾させた刺激応答性ポリマーを次のように製造した。実施例２９からの５％  ＰＶＡ溶液（１００ｍｌ）を３つの５００ｍｌのガラスジャーの各々に入れ、ジャー１、２及び３のラベルを付けた。３つのジャーの各々に、４モル  ＮａＯＨ（１００ｇ）を攪拌しながら添加した。次いで、各ジャーに１−プロパノール（５０ｇ）を補助溶媒として添加し、溶液を攪拌した後、ジャー１、２及び３にそれぞれ０．７４ｇ、１．４７ｇ及び２．９４ｇのベンジルクロリドを添加した。３つのジャーを６０℃で１６時間加熱した。反応溶液の容量を脱イオン水で５００ｍｌとし、２５％  ＨＣｌを用いてｐＨを８に調節し、２モル  リン酸ナトリウム（１００ｇ）を添加することにより、生じたポリマーの各々を個々の反応溶液から単離した。リン酸塩イオンを添加したら、固体沈殿を真空濾過により収集した。各反応からの固体を個別に脱イオン水で洗浄し、１モル  酢酸（３００ｍｌ）中に溶解した。個々の溶液をｐＨ７．４に調節し、２モル  リン酸ナトリウムを１滴ずつ添加してポリマーを沈殿し、生じた固体を濾過し、固体を水及びイソプロピルアルコールで順次洗浄した後、真空オーブン中６５℃で２日間乾燥することにより、ポリマーを更に精製した。乾燥ポリマーの各サンプルを液体窒素を用いて凍結し、微粉末に粉砕した。回収した乾燥ポリマーの塊はジャー１、２及び３のそれぞれにつき１．４４、２．１２及び２．４７ｇであった。個々のポリマーの各々を１モル  酢酸中に溶解して２％溶液とした。
【０１５０】
［実施例３１］
ポリビニルアミン（ＰＶＡ）刺激応答性ポリマーを製造するための超高分子量ポリ（Ｎ−ビニルアセトアミド）の加水分解によるアミンの脱保護
別の例示的実験例では、超高分子量刺激応答性ポリマーを次のように製造した。超高分子量ポリマーは通常、１０００ＫＤａ以上の分子量を有するポリマーを指す。
【０１５１】
第１級アミンを含有する反復単位から構成される刺激応答性ポリマーを次のように製造した。２Ｌのガラスジャーにおいて、４，０６０ｋＤａの平均分子量を有するポリ（Ｎ−ビニルアセトアミド）線状ホモポリマー（ＰＯＬＹＳＣＩＥＮＣＥＳ，ＩＮＣ．）（４０ｇ）を１６時間激しく撹拌しながら脱イオン水（０．８Ｌ）中に溶解した。この溶液に濃ＨＣｌ（１４０ｇ）を連続撹拌しながら１時間かけて添加した。ジャーに軽く蓋を被せ、溶液を混合するために断続的に回転させながら溶液を９９℃に５日間加熱した。５日間加熱した後、溶液を室温まで冷却し、全容量を脱イオン水で４リッターに調節した。溶液を激しく攪拌しながら８モル  ＮａＯＨを用いてｐＨ７に調節した。更なる沈殿が観察されないまで、加水分解された生成物を２モル  リン酸ナトリウムを１滴ずつ添加して沈殿させた。白色沈殿を脱イオン水で洗浄し、余分の水を除去するためにプレスした。回収したポリマーを真空オーブン中６５℃で２日間乾燥させた。乾燥させたポリマーを液体窒素を用いて凍結し、微粉末まで粉砕した。回収した乾燥した塊は４２．５ｇであった。乾燥粉末を１モル  酢酸及び０．０８％  ＨＣｌ中に溶解させることにより２％溶液を製造した。生じた溶液をリン酸塩またはクエン酸塩刺激に対する応答について出発物質（ポリ（Ｎ−ビニルアセトアミド）線状ホモポリマー）の２％溶液と比較した。これは、出発物質及び生じた加水分解ポリマーの５０ｍｌ  サンプルに２モル  リン酸ナトリウムまたは０．２モル  クエン酸ナトリウム塩を１滴ずつ添加することにより実施した。
【０１５２】
生じた加水分解ポリマーはリン酸塩またはクエン酸塩イオンの添加により白色塊に沈殿したのに対して、出発物質の溶液はリン酸塩またはクエン酸塩イオンを１滴ずつ添加しても沈殿を有しなかった。これにより、出発物質は刺激（例えば、リン酸塩またはクエン酸塩のような多価アニオン）に対して非応答性であるが、本実施例に記載されているように合成した超高分子量ポリマーは刺激（例えば、リン酸塩またはクエン酸塩のような多価アニオン）に対して応答性であることを示している。
【０１５３】
図５は、ポリアミンポリマーを脱保護して、刺激応答性ポリビニルアミン（ＰＶＡ）を形成するための方法を示す。
【０１５４】
［実施例３２］
脱保護したポリ（Ｎ−ビニルアセトアミド）を主成分とする疎水性修飾ポリビニルアミン（ＰＶＡ）刺激応答性ポリマーの合成
実施例３１からの脱保護した４，０６０ｋＤａ  ポリ（Ｎ−ビニルアセトアミド）線状ホモポリマーから得たＰＶＡを用いて、超高分子量の疎水性修飾した刺激応答性ポリマーを次のように製造した。
【０１５５】
脱保護した４，０６０ｋＤａ  ポリ（Ｎ−ビニルアセトアミド）の２％溶液（１００ｇ）をガラスジャーに入れた。このガラスジャーにｐＨを約１３に調節するために４モル  ＮａＯＨ（１００ｇ）を添加した。次いで、ジャーに１−プロパノール（２０ｇ）を補助溶媒として添加した。最後に、ベンジルクロリド（０．５８ｇ）を添加し、ジャーに蓋をかぶせた。反応物を激しく撹拌しながら６０℃で３時間加熱した。３時間後、反応混合物を室温まで冷却し、生成物をアセトンで沈殿させた後、収集した。生じた固体を脱イオン水、イソプロピルアルコールで順次洗浄し、真空オーブン中６５℃で２日間乾燥した。乾燥した固体を微粉末まで粉砕し、収集したポリマーの最終乾燥した塊は１．４４ｇであった。乾燥粉末を１モル  酢酸及び０．０８％  ＨＣｌ中に溶解させることにより２％溶液を製造した。０．５％  ポリマー溶液の５ｍＬ  サンプルに２モル  リン酸ナトリウムまたは０．２モル  クエン酸ナトリウム塩を１滴ずつ添加することにより生じた溶液の多価イオン刺激に対する感受性について試験した。リン酸塩またはクエン酸塩イオンを添加すると白色沈殿が観察された。これにより、ポリマーが多価アニオン刺激に対して応答性であったことが示される。
【０１５６】
図６は本実施例に記載されている合成方法の概略を示す。
【０１５７】
［実施例３３］
刺激応答性ビニルアミン／ビニルブチルエーテルコポリマー（ＶＡ−コ−ＶＢＥ）の合成
別の実験では、モノマー単位の１つが疎水基を含んでいる刺激応答性コポリマーを製造した。
【０１５８】
第１級アミン及びブチルエーテルを含有している反復単位から構成される刺激応答性ポリマーをモノマーから次のように合成した。オクタン（９０ｇ）、Ｓｐａｎ−８５（ＳＩＧＭＡ）（２．５ｇ）、Ｎ−ビニルホルムアミド（ＮＶＦ）（ＡＬＤＲＩＣＨ，９８％）（１６ｇ）、Ｎ−ブチルビニルエーテル（ＳＩＧＭＡ）（５ｇ）及び脱イオン水（３０ｇ）を２５０ｍｌの丸底フラスコに入れた。フラスコに磁気攪拌機及びＮ２ディップスティックを備えた。溶液を攪拌し、温度が５５℃に上昇するのでＮ２を１時間パージした。
【０１５９】
脱イオン水（１０ｍｌ）中に２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩（ＡＢＡＰ）（ＡＬＤＲＩＣＨ）（０．１０ｇ）を添加することにより開始剤溶液を製造し、溶解した。開始剤溶液を窒素をパージした雰囲気下で反応溶液を収容している２５０ｍｌの丸底フラスコに充填した。激しく攪拌し且つ連続的に窒素をパージしながら、溶液を５５℃に１時間加熱し、次いで６０℃で１時間加熱し、次いで７０℃で１時間加熱した後、８０℃で１時間加熱した。こうすると、底に粘性ゲル層を有する２相溶液が生じた。上層をデカントし、捨てた。下層に脱イオン水（２００ｍｌ）を添加し、激しく攪拌しながら５０％  ＮａＯＨ（２０ｇ）を添加した。溶液を８０℃で６時間加熱した。６時間後、溶液を熱から外し、室温まで冷却した。容量を脱イオン水を用いて２Ｌまで増加させた。２モル  リン酸ナトリウムを１滴ずつ添加することにより生成物を単離すると、大きな白い沈殿が生じた。上清をデカントすることにより沈殿を収集し、沈殿を脱イオン水で洗浄した。単離したポリマーを脱イオン水（５００ｍｌ）、酢酸（１０ｇ）及び濃ＨＣｌ（２ｇ）中に溶解した。０．５％  ポリマー溶液の５ｍＬ  サンプルに２モル  リン酸ナトリウムまたは０．２モル  クエン酸ナトリウム塩を１滴ずつ添加することにより、生じた溶液の多価イオン刺激に対する感受性について試験した。リン酸塩またはクエン酸塩イオンを添加すると、白色沈殿が観察された。これにより、ポリマーが多価アニオン刺激に対して応答性であったことが示される。
【０１６０】
図７は本実施例に記載されている反応の概略を示す。本実施例は、疎水性モノマーと共重合したアミンまたは荷電官能基を含有するコポリマーが多価イオン刺激に対して応答性であることを示している。
【０１６１】
［実施例３４］
逆乳化重合によるＮＶＦモノマーからの超高分子量ポリビニルアミン（ＰＶＡ）刺激応答性ポリマーの合成
第１級アミンを含有する反復単位から構成される刺激応答性ポリマーをモノマーから次のように合成した。オクタン（９０ｇ）、Ｓｐａｎ−８５（ＳＩＧＭＡ）（２．５ｇ）、Ｎ−ビニルホルムアミド（ＮＶＦ）（ＡＬＤＲＩＣＨ，９８％）（１６ｇ）及び脱イオン水（３０ｇ）を２５０ｍｌの丸底フラスコに入れた。フラスコに磁気攪拌機及びＮ２ディップスティックを備えた。溶液を攪拌し、温度が５５℃に上昇したのでＮ２を１時間パージした。脱イオン水（２０ｍｌ）中に２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩（ＡＢＡＰ）（ＡＬＤＲＩＣＨ）（０．２０ｇ）を添加し、溶解することにより開始剤溶液を製造した。開始剤溶液を窒素をパージした雰囲気下で反応溶液を収容している２５０ｍｌの丸底フラスコに充填した。激しく撹拌し且つ窒素を連続パージしながら、溶液を６０℃に２時間加熱した後、７５℃に１時間加熱した。底に粘性ゲル層を有する２相溶液が生じた。上層をデカントし、捨てた。下層に脱イオン水（５００ｍｌ）を添加し、激しく攪拌しながら５０％  ＮａＯＨ（４８ｇ）を添加した。溶液を８０℃に１６時間加熱した。１６時間後、溶液を熱から外し、室温まで冷却した。容量を脱イオン水を用いて１Ｌまで増加させた。２モル  リン酸ナトリウムを１滴ずつ添加することにより生成物を単離すると、大きな白い沈殿が生じた。上清をデカントすることにより沈殿を収集し、沈殿を脱イオン水で洗浄し、イソプロピルアルコール中に２時間浸漬し、最後に脱イオン水で再び洗浄した。生じた固体の塊を真空オーブン中６５℃で３日間乾燥した。乾燥させたポリマーを液体窒素を用いて凍結し、微粉末まで粉砕し、更に１日乾燥した。生じた乾燥粉末の塊は２１．５ｇであった。乾燥粉末を１モル  酢酸及び０．０８％  ＨＣｌ中に溶解することにより２％溶液を製造した。１％  ポリマー溶液の５０ｍＬ  サンプルに２モル  リン酸ナトリウムまたは０．２モル  クエン酸ナトリウムを１滴ずつ添加することにより、生じた溶液の多価イオン刺激に対する感受性について試験した。リン酸塩またはクエン酸塩イオンを添加すると、白色沈殿が観察された。
【０１６２】
［実施例３５］
高分子量の疎水性修飾ポリビニルアミン（ＰＶＡ）刺激応答性ポリマーの合成
ＢＡＳＦから入手したＬｕｐａｍｉｎ  ９０９５（線状ポリビニルアミン，平均ＭＷ＝３４０ｋＤａ，２０％  固体，ｐＨ７〜９）の溶液を用いて、疎水性修飾させた刺激応答性ポリマーを次のように製造した。Ｌｕｐａｍｉｎ  ９０９５（約６０ｇのポリビニルアミン）（３００ｇ）を２Ｌのガラスジャーに添加した。次いで、ＮａＯＨペレット（４０ｇ）及び脱イオン水（５００ｍｌ）を溶解し、ジャーに添加した。この後、１，２−ジメトキシエタン（ＳＩＧＭＡ）（５００ｍｌ）を補助溶媒として添加し、均質になるまで溶液を激しく攪拌した。次いで、反応ジャーにベンジルクロリド（ＡＣＲＯＳ  ＯＲＧＡＮＩＣＳ，９９％）（１７．６６ｇ）を攪拌しながら添加した。溶液を磁気撹拌しながら６０℃に１６時間加熱した。次いで、溶液を室温まで冷却し、５Ｌのビーカーに移した。次いで、脱イオン水（１５００ｍｌ）を攪拌しながら添加した。氷酢酸を用いてｐＨを５に調節した。２モル  リン酸ナトリウム（２５０ｍｌ）をゆっくり添加することにより生成物が沈殿し、固体を収集し、脱イオン水で洗浄した。
【０１６３】
ポリマーを以下の方法により更に精製した。固体を攪拌しながら１モル  酢酸（２Ｌ）中に溶解した。全容量を脱イオン水で１０Ｌとし、５０％  ＮａＯＨを１滴ずつ添加することによりｐＨを７に調節した。２モル  リン酸ナトリウム（６００ｇ）を添加して生成物を沈殿させた。固体を真空濾過により単離し、脱イオン水で洗浄した。生じた固体の塊を真空オーブン中６５℃で３日間乾燥した。乾燥ポリマーを液体窒素で凍結し、微粉末まで粉砕し、更に１日乾燥した。生じた乾燥粉末の塊は４６ｇであった。小サンプルを１モル  ＣＤ３ＣＯＯＤ／Ｄ２Ｏ酸中に溶解し、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを得た。このスペクトルを図８に示す。１Ｈ−ＮＭＲピークを積分し、ベンジル修飾の量は１８％であると判明した。
【０１６４】
［実施例３６］
疎水性修飾ポリアリルアミンを主成分とする刺激応答性ポリマーの２００ｇ規模の合成
本明細書中に記載されている例示的実験で、本明細書中に記載されているポリマーが大規模で製造され得ることが立証された。
【０１６５】
ポリアリルアミンの溶液（ＰＡＡ，ＮＩＴＴＯＢＯ，１５０ｋＤ；４０％ｗｔ／ｗｔ．）を用いて、疎水性修飾させた刺激応答性ポリマーを次のように製造した。ポリアリルアミン（ＰＡＡ，ＮＩＴＴＯＢＯ，１５０ｋＤ；４０％ｗｔ．／ｗｔ．）（５００ｇ）（約２００ｇのポリアリルアミン）を４Ｌのガラスジャーに添加した。次いで、ＮａＯＨペレット（８０ｇ）及び脱イオン水（１０００ｍｌ）を溶解し、ジャーに添加した。この後、１，２−ジメトキシエタン（ＳＩＧＭＡ）（１０００ｍｌ）を補助溶媒として添加し、均質になるまで溶液を激しく攪拌した。次いで、反応ジャーにベンジルクロリド（ＡＣＲＯＳ  ＯＲＧＡＮＩＣＳ，９９％）（１１４ｇ）を添加した。溶液を磁気撹拌しながら６０℃で１６時間加熱した。次いで、溶液を室温まで冷却し、１０Ｌのビーカーに移した。
【０１６６】
次いで、脱イオン水（１０００ｍｌ）を攪拌しながら添加し、粘性の固体塊を溶液から沈殿させた。２モル  リン酸ナトリウム（２００ｍｌ）をゆっくり添加することにより生成物を更に沈殿させ、固体を収集し、脱イオン水で洗浄した。ポリマーを以下の方法により更に精製した。固体を攪拌しながら１モル  酢酸（３Ｌ）中に溶解した。全容量を脱イオン水で１０Ｌとし、５０％  ＮａＯＨを１滴ずつ添加することによりｐＨを７に調節した。２モル  リン酸ナトリウム（８００ｇ）を添加して生成物を沈殿させ、固体を収集し、脱イオン水で洗浄した。ポリマーを以下の方法により更に精製した。固体を撹拌しながら１モル  酢酸（３Ｌ）中に溶解した。全容量を脱イオン水で１０Ｌとし、５０％  ＮａＯＨを１滴ずつ添加することによりｐＨを７に調節した。２モル  リン酸ナトリウム（８００ｇ）を添加して生成物を沈殿させ、固体を収集し、脱イオン水で洗浄した。生じた固体の塊を真空オーブン中６５℃で３日間乾燥した。乾燥したポリマーを液体窒素で凍結し、微粉末まで粉砕し、更に１日乾燥した。生じた乾燥粉末の塊は２５０ｇであった。小サンプルを１モル  ＣＤ３ＣＯＯＤ／Ｄ２Ｏ酸中に溶解し、図９に示す。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを得た。１Ｈ−ＮＭＲピークを積分し、ベンジル修飾の量は３３％であると判明した。
【０１６７】
［実施例３７］
ＣＨＯ細胞培養物における刺激応答性ポリマー対カチオン性高分子電解質の添加量増加に対する凝集性能及び上清品質の測定
本明細書中に記載されている例示的実験では、本発明に従う刺激応答性ポリマーを幾つかの所望の特性について公知のポリマー、すなわちキトサンと比較した。
【０１６８】
ＣＨＯ細胞培養物を実施例１に記載されている方法を用いて作成した。中間分子量キトサン（ＭＭＷキトサン）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の２％ｗ／ｗの溶液の溶液を１モル  酢酸中で製造した。疎水性修飾ポリアリルアミンを主成分とする刺激応答性（３３％−ＢｎＰＡＡ）ポリマーの２％ｗ／ｗ溶液を実施例３６に従って製造した。ＣＨＯ細胞培養物（１０ｍｌ）を１５ｍｌのコニカルチューブ中に分配した。ＬＭＷキトサン及び３３％−ＢｎＰＡＡ毎に、ＣＨＯ細胞培養物を収容している各コニカルチューブに０．０、０．１、０．２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．１４、０．１８、０．２２及び０．４％ｗ／ｖの添加量のポリマーを添加した。３３％−ＢｎＰＡＡを収容しているコニカルチューブの場合のみ、ｐＨを７．２に調節し、１５０ｍＭ  リン酸ナトリウムの刺激を加えた。すべてのコニカルチューブを３０００ＲＰＭで２分間遠心し、上清をデカントし、濁度を測定した。
【０１６９】
下表５及び図１０に代表的実験の結果を要約し、非刺激応答性ポリマー（例えば、キトサン）は効率的凝集のために添加量を最適化することが必要であるが、本発明に従う刺激応答性ポリマーは添加量最適化を必要としないようであることを明示している。換言すると、キトサンのような非刺激応答性ポリマーの場合、効率的凝集のために最適添加量のポリマーを一旦添加し、最適添加量を超えると濁度が増加し、これは望ましくない。一方、本明細書中に記載されているような刺激応答性ポリマーの場合、刺激応答性ポリマーは添加量の増加に関係なく有効な凝集剤／沈殿剤であり続ける。
【０１７０】
【表５】
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【０１７１】
［実施例３８］
ＣＨＯ細胞培養物における多価アニオン刺激の存在下対刺激なしでの刺激応答性ポリマーの添加量の増加を伴う凝集性能及び上清品質の測定
ＣＨＯ細胞培養物を実施例１に記載されている方法を用いて作成した。疎水性修飾ポリアリルアミンを主成分とする刺激応答性（３３％−ＢｎＰＡＡ）ポリマーの２％ｗ／ｗ溶液を実施例３６に従って製造した。３３％−ＢｎＰＡＡポリマーの場合、ＣＨＯ細胞培養物を収容している各コニカルチューブに０．０、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．１４、０．１８、０．２２及び０．４％ｗ／ｖの添加量の個々のポリマーを３通りに（１つはリン酸塩、１つはクエン酸塩、１つは刺激なし）添加した。ｐＨを７．２に調節し、１５０ｍＭ  リン酸ナトリウムまたは１５０ｍＭ  クエン酸ナトリウム塩の刺激を加え、または刺激を加えなかった。すべてのコニカルチューブを３０００ＲＰＭで２分間遠心し、上清をデカントし、遠心分離液濁度を測定した。本実施例に記載されている実験の結果を表６及び図１１に示す。
【０１７２】
表６及び図１１に代表的実験の結果を要約し、刺激応答性ポリマー（例えば、実施例３６に記載されている）は、刺激なしでポリマー添加量を最適化することにより、非刺激応答性凝集剤（実施例３７におけるキトサンデータと同様に）として作用し得ることを明示している。しかしながら、リン酸塩またはクエン酸塩のような多価イオン刺激を加えると、刺激応答性ポリマーは、ポリマー添加量を増加させても遠心分離液濁度が影響されないので添加量最適化を必要としない。
【０１７３】
【表６】
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【０１７４】
［実施例３９］
ＣＨＯ細胞培養物における非修飾刺激応答性ポリマーの添加量の増加に伴う凝集性能及び上清品質の測定
別の実験において、ＣＨＯ細胞培養物中の非修飾刺激応答性ポリマーでの凝集能力及び上清品質を本明細書中に記載されているように測定した。
【０１７５】
ＣＨＯ細胞培養物を実施例１に記載されている方法を用いて作成した。ポリアリルアミン（ＰＡＡ，ＮＩＴＴＯＢＯ，１５０ｋＤ；４０％ｗｔ．／ｗｔ．）を１モル  酢酸中に溶解させることにより非修飾ポリアリルアミンを主成分とする刺激応答性ポリマーの２％ｗ／ｗ溶液を製造した。ＣＨＯ細胞培養物（１０ｍｌ）を１５ｍｌのコニカルチューブに分配する。ＣＨＯ細胞培養物を収容している各コニカルチューブに０．０、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．１４、０．１８、０．２２及び０．４％ｗ／ｗの添加量のポリマーを添加した。ｐＨを７．２に調節し、１５０ｍＭ  リン酸ナトリウムの刺激を加えた。すべてのコニカルチューブを３０００ＲＰＭで２分間遠心し、上清をデカントし、濁度を測定した。本実施例に記載されている実験の結果を表７に示す。
【０１７６】
【表７】
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【０１７７】
［実施例４０］
ＣＨＯ細胞培養物における刺激応答性ポリマーの凝集性能、沈降時間及び上清品質の測定
ＣＨＯ細胞培養物を実施例１に記載されている方法を用いて作成した。疎水性修飾ポリアリルアミンを主成分とする刺激応答性（３３％−ＢｎＰＡＡ）ポリマーの１０％ｗ／ｗ溶液を実施例３６と同様に製造した。ＣＨＯ細胞培養物（５０ｍｌ）を１００ｍｌのガラスメスシリンダーに２通りで入れた。シリンダーの１つには、刺激応答性ポリマーを０．５％の添加量で添加し、２モル  トリス塩基を１滴ずつ添加してｐＨを７に調節し、２モル  リン酸ナトリウム溶液を添加することによりリン酸ナトリウム濃度を５０ｍＭに調節し、溶液を２分間撹拌した。刺激応答性ポリマー及び細胞、細胞破片、不純物、残留ポリマーの複合体を沈殿させ、固体を凝集し、粒子サイズを大きくするために、リン酸ナトリウム及びｐＨ調節を実施した。リン酸ナトリウムを添加し、ｐＨを調節した後、大きな凝集粒子が刺激応答性ポリマーで処理した供給材料で観察された。他のメスシリンダーを２分間攪拌し、何も添加しなかった。いずれのシリンダーも１時間放置した。１時間後、上清を吸引し、濁度を記録した。
【０１７８】
スマートポリマーを有するシリンダー中の固相は明確な沈降前線を有し、不明確な沈降前線を与える未処理シリンダー中の固相に比してより速く沈降する（鋭い固体から液相への転移）ことが観察された。
【０１７９】
上記実験の１つの結果を表８に要約する。未処理シリンダーの場合、沈降前線が大きく散在しており、不明確であったために、沈降前線に関する測定は大まかな推定であった。
【０１８０】
【表８】
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【０１８１】
［実施例４１］
異なる分子量を有するポリアミンを用いる清澄化性能の比較
異なる分子量を有する一連のポリマーを入手し、修飾し、細胞培養物を凝集、沈殿及び精製するために使用した。分子量が１５ｋＤ、８５ｋＤ、１５０ｋＤ、３５０ｋＤ、６００〜９５０ｋＤ及び２０００〜４０００ｋＤの第１級アミン反復単位を有するポリマーを以下の方法により入手し及び／または修飾した。
【０１８２】
１５ｋＤ  ポリアリルアミンポリマーはＮＩＴＴＯＢＯから入手し、実施例３６と同様の方法を用いてベンジル化した（ベンジル基を共有結合し、精製した）。８５ｋＤ  ベンジル化ポリビニルアミンポリマーは実施例２３により製造した。１５０ｋＤ  ベンジル化ポリアリルアミンは実施例３６に従って製造した。３５０ｋＤ  ベンジル化ポリビニルアミンポリマーは実施例３５により製造した。９５０ｋＤ  ポリビニルアミンポリマー骨格は、ポリミンＶＺ（ＢＡＳＦ）を２当量の塩基を用いて８０℃で８時間加水分解することにより製造した。非修飾２０００〜４０００ｋＤ  ＰＶＡは実施例３１に従って製造した。ベンジル化２０００〜４０００ｋＤポリマーは実施例３２に従って製造した。ポリマーは、約１２×１０６細胞／ｍＬのＣＨＯ  ＤＧ４４細胞培養物を凝集、沈殿及び精製するために使用し、＜５０％の細胞生存度で収集した。凝集は０．２％及び０．４％ｗ／ｗのポリマー添加量で実施した。５０ｍＭ  リン酸ナトリウムの溶液刺激及び２モル  トリス塩基を用いる７へのｐＨ調節を適用した。
【０１８３】
フロックサイズについての観察を記録し、＋を小さいフロック、＋＋＋＋＋を非常に大きな凝集物として示した。＋＋＋＋＋と示されたバイアルは、凝集物の懸濁液よりもむしろ完全ゾーン分離であった。鋭い固体液体界面を持つ大きな凝集物／粒子はより速く沈降することも注目される。結果を表９に示す。この表には、異なる分子量のポリアミンを用いた凝集の結果が明示されている。
【０１８４】
【表９】
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【０１８５】
［実施例４２］
異なる疎水性修飾のポリアミンを用いる清澄化性能の比較
ＣＨＯ細胞培養物を実施例１に記載されている方法を用いて作成した。実施例３１、３２、３３及び３５に記載されているポリマーのサンプルを実施例３８に記載されている細胞培養物に添加した。ただし、ポリマー添加量は表１０に記載されているように０．１ｗｔ％〜０．６ｗｔ％であった。初期細胞培養濁度は〜９００ＮＴＵであり、ポリマー処理なしの遠心分離液の濁度は２１２ＮＴＵであった。ｐＨを７．２に調節し、５０ｍＭ  リン酸ナトリウムの刺激を加えた。すべてのコニカルチューブを３０００ＲＰＭで２分間遠心し、上清をデカントし、遠心分離液濁度を測定した。本実施例に記載されている実験の結果を表１０に示す。この表には、異なるポリマー添加量での各種疎水性修飾の性能が明示されている。
【０１８６】
表１０は、疎水基の種類及び／またはポリマー分子量を変化させることにより、刺激に対する応答及び生じる遠心分離液濁度を変化させ得ることを明示している。
【０１８７】
【表１０】
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【０１８８】
［実施例４３］
刺激応答性ポリマーを用いて得た低い濁度の下流濾過に対する影響
刺激応答性ポリマーのその後の遠心及びデプス濾過ステップに対する影響を評価するために、次の手順を実施した。ＰＴＧ１抗体を発現するＤＧ４４チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株を１０Ｌのバイオリアクター（ＮＥＷ  ＢＲＵＮＳＷＩＣＫ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）において約１５×１０６細胞／ｍＬの密度まで増殖させ、＜５０％  生存度で収集した。疎水性修飾ポリアリルアミンを主成分とする刺激応答性（３３％−ＢｎＰＡＡ）ポリマーの１０％ｗ／ｗ溶液を実施例３６と同様に製造する。
【０１８９】
ＤＧ４４  ＣＨＯ細胞培養物の１画分を０．２％の刺激応答性ポリマー３３％−ＢｎＰＡＡで処理し、ＤＧ４４  ＣＨＯ細胞培養物の別の画分は処理しない。刺激応答性ポリマーで処理した細胞培養物に対して２モル  リン酸ナトリウムを１滴ずつ添加することによりリン酸ナトリウム濃度を５０ｍＭとし、２モル  トリス塩基を１滴ずつ添加することによりｐＨを７．２に調節する。リン酸ナトリウム及びｐＨ調節は、刺激応答性ポリマー及び細胞、細胞破片、不純物、残留ポリマーの複合体を沈殿させ、固体を凝集させ、粒度を大きくするために実施する。リン酸ナトリウム添加及びｐＨ調節の後に、刺激応答性ポリマーで処理した供給材料中に大きなフロック状粒子が観察される。両画分を３０００ＲＰＭで５分間遠心し、上清をデカントし、濁度を測定した。３３％−ＢｎＰＡＡポリマーで処理した供給材料についての遠心分離液濁度は１０ＮＴＵであると測定され、未処理供給材料についての遠心分離液濁度は６０ＮＴＵであると測定された。
【０１９０】
各供給材料に対するデプスフィルター処理量を以下の方法により測定した。供給材料毎に、２３ｃｍ２の表面積を有するＸ０ＨＣ  Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）Ｐｏｄ使い捨てデプスフィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を使用した。デプスフィルターにはぜん動ポンプ及びインライン圧力センサーを備えた。フィルターに説明書に従って脱イオン水を流し、供給材料を１００ＬＭＨで圧送し、濾液をプールした。３３％−ＢｎＰＡＡポリマーで処理した供給材料についてのプールした濁度は６ＮＴＵであり、未処理供給材料の濾液についてのプールした濁度は９ＮＴＵであった。３３％−ＢｎＰＡＡポリマーで処理した供給材料に対するフィルター処理量は１０ｐｓｉで１３０４Ｌ／ｍ２であり、この時点で供給限界のために実験を停止した。未処理供給材料に対するフィルター処理量は２０ｐｓｉで２０６Ｌ／ｍ２であり、この時点で圧力限界のために実験を停止した。
【０１９１】
［実施例４４］
モデルタンパク質流の刺激応答性ポリマーを用いる精製及びその後のアフィニティー樹脂を用いる捕捉
刺激応答性ポリマーのその後の精製ステップに対する影響をよりうまく評価するために、モデル供給材料を作成し、次の手順を実施する。ＣＨＯ細胞培養物を実施例１に同様の方法を用いて作成する。初期供給材料ＨＣＰレベルは〜２１０，０００ｐｐｍであった。疎水性修飾ポリアリルアミンを主成分とする刺激応答性（３３％−ＢｎＰＡＡ）ポリマーの１０％ｗ／ｗ溶液を実施例３６と同様に製造する。ＣＨＯ細胞培養物の１つの画分を０．１％の刺激応答性ポリマー３３％−ＢｎＰＡＡで処理し、ＣＨＯ細胞培養物の別の画分を０．４％の刺激応答性ポリマー３３％−ＢｎＰＡＡで処理し、ＣＨＯ細胞培養物の第３の画分は処理しない。刺激応答性ポリマーで処理した細胞培養物に対して２モル  リン酸ナトリウムを１滴ずつ添加することによりリン酸ナトリウム濃度を５０ｍＭとし、２モル  トリス塩基を１滴ずつ添加することによりｐＨを７．２に調節する。リン酸ナトリウム及びｐＨ調節は、刺激応答性ポリマー及び細胞、細胞破片、不純物、残留ポリマーの複合体を沈殿させ、固体を凝集させ、粒度を大きくするために実施する。リン酸ナトリウム添加及びｐＨ調節の後に、刺激応答性ポリマーで処理した供給材料中に大きなフロック状粒子が観察される。細胞培養物の各画分を実験室規模のバケット遠心分離機を用いて３０００ＲＰＭで５分間遠心する。各遠心分離液の濁度を記録し、表１１に報告する。遠心分離液を０．２μｍ  Ｄｕｒａｐｏｒｅ（登録商標）フィルターを介して濾過する。
【０１９２】
濾液プールを、プロティンＡアフィニティークロマトグラフィー（ＰｒｏＳｅｐ  Ｕｌｔｒａ  Ｐｌｕｓ（登録商標））、結合−溶離カチオン交換クロマトグラフィー（ＰｒｏＲｅｓ  Ｓ（登録商標））、及び通過モードでの膜吸着材アニオン交換クロマトグラフィー（ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（登録商標））から構成される３ステップクロマトグラフィーに基づく精製により精製した。精製は表１２の方法に従ってクロマトグラフィーワークステーションで実施した。ステップ毎のプールを、宿主細胞タンパク質（ＣＨＯＰ）についてはＥＬＩＳＡにより、浸出したプロティンＡ（Ｌ  ＰｒｏＡ）についてはＥＬＩＳＡにより、残留ＤＮＡについてはＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）アッセイにより、濁度、凝集タンパク質（ＡＧＧ）％についてはサイズ排除ＨＰＬＣにより、タンパク質濃度についてはＵＶ吸収により分析した。
【０１９３】
【表１１】
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【０１９４】
【表１２】
0005612761.tif 000019
【０１９５】
［実施例４５］
モデルタンパク質流の刺激応答性ポリマーを用いる精製及びその後のカチオン交換樹脂を用いる捕捉
刺激応答性ポリマーのその後の精製ステップに対する影響をよりうまく評価するために、次の手順を実施した。ＰＴＧ１抗体を発現するＤＧ４４チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株を１０Ｌのバイオリアクター（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において約１５×１０６細胞／ｍＬの密度まで増殖させ、〜１４２０００ｐｐｍのＨＣＰレベルで＜５０％  生存度で収集した。
【０１９６】
疎水性修飾ポリアリルアミンを主成分とする刺激応答性（３３％−ＢｎＰＡＡ）ポリマーの１０％ｗ／ｗ溶液を実施例３６と同様に製造した。ＣＨＯ細胞培養物の１つの画分を０．１％の刺激応答性ポリマー３３％−ＢｎＰＡＡで処理し、ＣＨＯ細胞培養物の別の画分を０．４％の刺激応答性ポリマー３３％−ＢｎＰＡＡで処理し、ＣＨＯ細胞培養物の第３画分は処理しなかった。刺激応答性ポリマーで処理した細胞培養物に対して２モル  リン酸ナトリウムを１滴ずつ添加することによりリン酸ナトリウム濃度を５０ｍＭとし、２モル  トリス塩基を１滴ずつ添加することによりｐＨを７．２に調節した。リン酸ナトリウム及びｐＨ調節は、刺激応答性ポリマー及び細胞、細胞破片、不純物、残留ポリマーの複合体を沈殿させ、固体を凝集し、粒度を大きくするために実施した。リン酸ナトリウム添加及びｐＨ調節後、刺激応答性ポリマーで処理した供給材料中に大きな凝集粒子が観察された。細胞培養物の各画分を実験室規模のバケット遠心分離機において３０００ＲＰＭで５分間遠心する。各遠心分離液の濁度を記録し、表１３に報告する。遠心分離液を０．２／μｍ  Ｄｕｒａｐｏｒｅ（登録商標）フィルターを介して濾過した。
【０１９７】
濾液プールを、結合−溶離カチオン交換クロマトグラフィー（ＰｒｏＲｅｓ  Ｓ（登録商標））、及び通過モードでの膜吸着材アニオン交換クロマトグラフィー（ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（登録商標））から構成される２ステップクロマトグラフィーに基づく精製により精製した。精製は表１２の方法に従ってクロマトグラフィーワークステーションで実施した。ステップ毎のプールを、宿主細胞タンパク質（ＣＨＯＰ）についてはＥＬＩＳＡにより、浸出したプロティンＡ（Ｌ  ＰｒｏＡ）についてはＥＬＩＳＡにより、残留ＤＮＡについてはＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）アッセイにより、濁度、凝集タンパク質（ＡＧＧ）％についてはサイズ排除ＨＰＬＣにより、タンパク質濃度についてはＵＶ吸収により分析した。
【０１９８】
【表１３】
0005612761.tif 000020
【０１９９】
［実施例４６］
リン酸２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＰＡＨＥＭＡ）で修飾させたポリエチレン膜表面
別の実験において、膜を多価イオン刺激を取り込むように修飾した。この膜は残留刺激応答性ポリマーを除去するために使用され得る
ＰＡＨＥＭＡの１６％  水性混合物を、ＰＡＨＥＭＡ（Ａｌｄｒｉｃｈ  ＃６９５８９０，７５％  ＰＡＨＥＭＡ及び２５％  ＢｉｓＨＥＭＰＡ）（１６ｇ）、イルガキュア２９５９（０．２ｇ）及び水（９３．８ｇ）を用いて製造した。ポリエチレン膜（０．６５ｕｍ，ＵＰＤＰ  ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を予めメタノールで湿らし、水と交換し、ＰＡＨＥＭＡ調製物で処理した。サンプルをＵＶ光に曝し、メタノール及び水で洗浄し、乾燥した。この表面修飾により膜に付加された重量は４．４％であった。膜の赤外スペクトルは強いメタクリレートカルボニル吸収を示した。膜をメチレンブルー（正に荷電した染料）で染色すると、１．４３のシアン光学密度の深青色が生じた。
【０２００】
［実施例４７］
リン酸２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＰＡＨＥＭＡ）で修飾させた親水性ポリエチレン膜表面
ＰＡＨＥＭＡの１６％  水性混合物を、ＰＡＨＥＭＡ（Ａｌｄｒｉｃｈ  ＃６９５８９０，７５％  ＰＡＨＥＭＡ及び２５％  ＢｉｓＨＥＭＰＡ）（１６ｇ）、イルガキュア２９５９（０．２ｇ）及び水（９３．８ｇ）を用いて製造した。親水性膜（０．６５ｕｍ，ＭＰＬＣ  ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を直接ＰＡＨＥＭＡ溶液と接触させた。上記のようにＵＶ光に曝し、洗浄すると、膜に７．６％が付加された。膜の赤外スペクトルは強いメタクリレートカルボニル吸収を示した。膜をメチレンブルー（正に荷電した染料）で染色すると、１．４５のシアン光学密度の深青色が生じた。
【０２０１】
［実施例４８］
リン酸ヒドロキシエチルメタクリレート（ＰＡＨＥＭＡ）で修飾させた親水性ポリメタクリレート樹脂
別の実験では、樹脂を刺激を含むように修飾した。この修飾された樹脂はその後残留ポリマーを除去するために使用され得る。
【０２０２】
アリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）（６０ｍｌ）、４Ｍ  ＮａＯＨ（１１０ｇ）、硫酸ナトリウム（１２ｇ）の組成を有する溶液を製造する。この溶液にＴｏｙｏＰｅａｒｌ６５Ｃ媒体（６０ｍｌ）を添加し、混合物を回転式ハイブリダイサー中に５０℃で１６時間置く。媒体を標準手順により分離し、洗浄する。ＰＡＨＥＭＡ（１．０ｇ）、過硫酸アンモニウム（０．０６ｇ）、水（９．０ｇ）のＰＡＨＥＭＡグラフト化溶液を製造する。この溶液にＡＧＥ修飾させたＴｏｙｏＰｅａｒｌ媒体（５ｍｌ）を添加する。混合物をハイブリダイザー中に８０℃で１６時間置く。標準手順により分離し、洗浄すると、ＰＡＨＥＭＡ修飾樹脂が得られる。この生成物を正に荷電した染料であるメチレンブルーの０．０１％  水溶液で処理すると、暗青色で染色される。
【０２０３】
［実施例４９］
リン酸２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＰＡＨＥＭＡ）で修飾させた親水性ポリエチレン膜表面との刺激応答性ポリマーの結合
ＰＡＨＥＭＡ修飾ＭＰＬＣ膜（実施例４７）を使用して、以下の実験手順を用いてそれぞれ１００、１０及び１ｐｐｍ  ＰＡＡを含有している３つの溶液からポリアリルアミン（ＰＡＡ）ポリマーを捕捉した。膜ディスク２０ｍｍ直径を１５ｃｃセルホルダーにおいて加工した。ＰＡＡ溶液を１．５ｃｃ／秒で加工した。膜をＰＢＳ緩衝液（１００ｍＬ）を用いてセルホルダーの内外を洗浄した。加工した膜をＰｏｎｃｅａｕ  Ｓで染色した。
【０２０４】
Ｐｏｎｃｅａｕ  Ｓは、正に荷電している表面に強く吸着する負に荷電している染料である。ＰＡＡがＰＡＨＥＭＡ修飾膜に吸着されると、表面は負電荷から正電荷に変化した。この変化は、加工溶液をＰｏｎｃｅａｕ  Ｓで染色することにより容易に観察される。Ｐｏｎｃｅａｕ  Ｓでの染色度の良好な目安はマクベス濃度計を用いて測定されるマゼンタ光学密度である。膜の上流側及び下流側の両方の（すなわち、ＰＡＡを充填した）各種加工膜についてのマゼンタ光学密度の値を表１４に示す。
【０２０５】
１ｐｐｍの場合で見られるように、ＰＡＡのすべてが膜の上流側で捕捉される。１５ｍＬの加工溶液の場合、これは４．８μｇのＰＡＡ／ｃｍ２−膜表面に相当する。
【表１４】
0005612761.tif 000021
【０２０６】
従って、本実施例の結果に基づいて、本明細書中に記載されている修飾した膜及び樹脂は残留ポリマーのレベルを低下させるために、または残留ポリマーを完全に除去するために使用され得ると結論づけることができる。
【０２０７】
明細書は、参照により本明細書に組み入れる本明細書中に引用されている文献の教示内容に照らして最も十分に理解される。明細書中の実施形態は本発明の実施形態の説明を与え、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきでない。当業者は、多くの他の実施形態が本発明に包含されることを容易に認識している。すべての刊行物及び特許文献が全文参照により組み入れられる。参照により組み入れられる材料が本明細書を否定したり矛盾している限り、本明細書は上記材料に取って代わる。本明細書中の文献の引用は、これらの文献が本発明に対する先行技術であるという容認ではない。
【０２０８】
別段の指示がない限り、特許請求の範囲を含めた明細書中で使用されている成分、細胞培養物、処理条件等の量を表すすべての数字はいずれも用語「約」により修飾されると理解されるべきである。従って、反対の指示がない限り、数値パラメーターはおおよそであり、本発明により得るべく求めている所望特性に応じて異なり得る。別段の指示がない限り、一連の要素の前の用語「少なくとも」は一連の中のあらゆる要素を指すと理解すべきである。当業者は、本明細書中に記載されている発明の具体的実施形態に対する多くの均等物を認識しており、またルーチンの実験を用いるだけで確認することができる。これらの均等物は、以下の特許請求の範囲により包含されると意図される。
【０２０９】
当業者には自明のように、本発明の多くの修飾及び改変がその趣旨及び範囲を逸脱することなく加え得る。本明細書中に記載されている具体的実施形態は単なる例として提示されており、決して限定することを意味しない。明細書及び実施例は例としてのみ見なされ、本発明の真の範囲及び趣旨は以下の特許請求の範囲により示されていると意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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