(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｄ）少なくとも１つの天然ペルオキシソーム形成因子タンパク質の欠損である少なくとも１つの遺伝的変異、および
ｅ）少なくとも１つの制御配列の制御下のマロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、および
ｆ）機能性多価不飽和脂肪酸生合成経路をコードする遺伝子
を含んでなる、トランスジェニックヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種宿主細胞。
【請求項２】
乾燥細胞質量の少なくとも２５％の量の油として蓄積する、請求項１記載の宿主細胞。
【請求項３】
マロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする遺伝子がマルチコピーである、請求項１または２記載の宿主細胞。
【請求項４】
マロニル−ＣｏＡシンセターゼが配列番号２、配列番号４、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２２のアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか1項記載の宿主細胞。
【請求項５】
マロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする遺伝子が配列番号３のヌクレオチド配列を含む、請求項１〜３のいずれか1項記載の宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本明細書は、その開示全体を参照によって本明細書に援用する、２００８年１２月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／１３８９２２号明細書の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は生物工学分野にある。さらに具体的には、本発明は、マロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする遺伝子の発現に基づいて、生物の発酵中に有機酸、特にマロン酸副産物の生成を低下させるのに有用な方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発酵は、生体触媒の使用を通じて１つ以上の基質から１つ以上の生成物を生じる過程であり、生体触媒は微生物全体、単離された酵素、またはあらゆるその組み合わせであり得る。
【０００４】
バッチ発酵では、発酵は、培地に所望の微生物を接種する培養プロセスに始まる。次に成長または代謝活動が起きる。システムの代謝産物および生物体組成物は、培養が終結する時点まで絶えず変化する典型的に微生物細胞の成長速度は、静止遅滞期を経て、高成長対数期（または指数増殖期）、そして最後に成長が減弱しまたは停止する定常期まで進行する。微生物生成物の生成は典型的に高成長対数期の間に起きるが、培養生物の成長の結果として、培地の栄養素が枯渇し、生成物が分泌される場合は生成物が濃縮し、副産物が濃縮するために、この成長期は無期限に継続し得ない。副産物としては、とりわけ多糖類；炭水化物；アミノ酸；タンパク質；塩；および乳酸、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、ピルビン酸、フマル酸、クエン酸、イソクエン酸、グリオキシル酸、コハク酸、α−ケトグルタル酸、およびマロン酸などの様々な有機酸が挙げられる。
【０００５】
発酵は、アミノ酸、エタノール、多価不飽和脂肪酸、および抗生物質をはじめとする多様な微生物生成物を生合成する重要な技術である。いくつかの化学物質の発酵生産および商業化が報告されている（Ｗ．Ｃｒｕｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ａ．Ｃｒｕｅｇｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ．，ｐｐ１２４−１７４（１９９０）；Ｂ．Ａｔｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｆ．Ｍａｖｉｔｕｎａ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，２nd  ｅｄ．；Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ２４３−３６４（１９９１））。
【０００６】
しかし生体触媒によるプロセスは、以下をはじめとするいくつかの良く知られている制限に悩まされることが多い。１）比較的小さな製品系列；２）低い収率、力価、および生産性；３）生成物を水溶液から回収し精製することの困難さ；および４）望まれない副産物の発生。加工限界は、対象の生成物の製造原価を増大させるので、上流代謝エンジニアリング（すなわち生成物の合成）と、下流バイオプロセスエンジニアリング（すなわち生成物の分離および加工デザイン）とを統合することは、工業発酵から大きな価値を得る上で重要である。
【０００７】
様々な生化学的、生理学的および化学／物理的要因が、生体触媒によるプロセスの生産性に影響を及ぼし得るが、重要な要因としては、基質から生成物への転換効率、そして対象の生成物をもたらす生化学経路へのエネルギー／炭素の流れの最適化が挙げられる。これらの要因を鑑みて、望ましい生化学的経路のアップレギュレートを促進し、対象の生合成経路と競合したりまたは特定の最終産物の生成を妨げるような望ましくない生化学的経路のダウンレギュレートを促進する、多様な代謝工学技術が開発されている。
【０００８】
本開示は、生物による生成物の発酵合成中の副産物としてのマロン酸の蓄積に関する。具体的には、マロン酸＋ＡＴＰ＋ＣｏＡ→マロニル−ＣｏＡ＋ＡＭＰ＋ピロリン酸［ＰＰｉ］の反応を可能にする異種性マロニル−ＣｏＡシンセターゼを発現する生物を遺伝子操作することで、高生産性および最小廃棄副産物が達成される。副産物マロン酸からマロニル−ＣｏＡへの転換は生体内での脂肪酸合成を可能にし、それによってそれ以上利用し得ないマロン酸「副産物」の発酵中の蓄積を回避する。これによって生体内の炭素およびエネルギー浪費が回避され、発酵工程中に最適ｐＨ範囲を保つのに要する塩基量が低下し、発酵廃棄蒸気内の中和を要する副産物有機酸の量が低下する。
【０００９】
異種性マロニルＣｏＡシンセターゼは、以前に様々な微生物中で発現されており、様々なポリケチドの生成を改善する。（米国特許第６,９３９,６９１号明細書、米国特許出願公開第２００３／００７３２０５号明細書）。Ｌｏｍｂｏ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，１７（４）：６１２−７（２００１））で概説されるように、天然宿主および異種宿主中でのポリケチド発酵過程の生産性は、マロニル−ＣｏＡおよび（２Ｓ）−メチルマロニル−ＣｏＡなどのα−カルボキシル化ＣｏＡチオエステルから誘導される前駆物質の生体内可用性によって制限されることが多い。マロニル−ＣｏＡシンセターゼの発現はこの制限を軽減して、ポリケチド生成を顕著に増大し得る。以前の開示は、マロン酸生成を低下させ、それによって生物による炭素およびエネルギー浪費を回避する異種性マロニルＣｏＡシンセターゼの発現を考察していない。
【００１０】
出願人らは、生物の発酵中にマロン酸「副産物」を蓄積させて炭素およびエネルギー浪費、対象の生成物の合成低下、および中和を要する廃液流の生成をもたらす（それによって総製造原価を増大させる）既述の問題を解決した。異種性マロニルＣｏＡシンセターゼタンパク質を発現する新しい生物が本明細書に記載される。
【発明の概要】
【００１１】
第１の実施態様では、本発明は、少なくとも１つの制御配列の制御下にある少なくとも１つのマロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする遺伝子を含んでなる、少なくとも１つの生成物の発酵に有用であるトランスジェニック生物であって、前記トランスジェニック生物と（トランスジェニックか非トランスジェニックかにかかわらず）同一の生物が生成するマロン酸量と比較して低下した量のマロン酸を発酵副産物として生成するトランスジェニック生物に関するが、ただし前記同一の生物は、
ａ）マロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする遺伝子を含まない、または
ｂ）発現されないマロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする遺伝子を含んでなる。
【００１２】
好ましくは、生物はその乾燥細胞重量の少なくとも約２５％の量の油を蓄積する。生物は、藻類、真菌、ユーグレナ属、酵母、細菌、およびストラメノパイルからなる群から選択し得る。より好ましくは生物は、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択される油性酵母である。
【００１３】
第２の実施態様では、発明のトランスジェニック生物によって含まれる制御は、強力なプロモーターをさらに含んでなる。
【００１４】
第３の実施態様では、本発明のトランスジェニック生物は、マルチコピーであり得る、マロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする少なくとも１つの遺伝子を含んでなる。
【００１５】
第４の実施態様では、本発明のトランスジェニック生物は、配列番号２、配列番号４、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、マロニル−ＣｏＡシンセターゼポリペプチドをコードする少なくとも１つの配列を含んでなる。
【００１６】
第５の実施態様では、本発明のトランスジェニック生物は、マロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする少なくとも１つの配列を含んでなり、前記配列は配列番号１および配列番号３からなる群から選択される。
【００１７】
第６の実施態様では、本発明のトランスジェニック生物は、前記トランスジェニック生物と（トランスジェニックか非トランスジェニックかにかかわらず）同一の生物によって生成される少なくとも１つの生成物の力価と比較して低下していない、少なくとも１つの生成物の力価を生じるが、ただし前記同一の生物は、
ａ）マロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする遺伝子を含まない、または
ｂ）発現されないマロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする遺伝子を含んでなる。
【００１８】
第７の実施態様では、本発明のトランスジェニック生物は、少なくとも１つの遺伝的変異をさらに含んでなる。この少なくとも１つの遺伝的変異は、少なくとも１つの天然ペルオキシソーム形成因子タンパク質の欠損であり得る。
【００１９】
第８の実施態様では、本発明は、
ａ）適切な制御配列の制御下にある少なくとも１つのマロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする遺伝子を含んでなる、少なくとも１つの生成物の発酵に有用なトランスジェニック生物を提供するステップと、
ｂ）前記トランスジェニック生物と（トランスジェニックか非トランスジェニックかにかかわらず）同一の生物が生成するマロン酸量と比較して低下した量のマロン酸を発酵副産物として生成するように、トランスジェニック生物を成長させてマロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする少なくとも１つの遺伝子を発現させるステップを含んでなる、トランスジェニック生物中のマロン酸含量を操作する方法を含んでなるが、ただし前記同一の生物は、
（ｉ）マロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする遺伝子を含まない、または
（ｉｉ）発現されないマロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする遺伝子を含んでなる。
【００２０】
好ましくは、マロニル−ＣｏＡシンセターゼポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子は、配列番号２、配列番号４、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。さらに少なくとも１つのマロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする遺伝子は、配列番号１および配列番号３からなる群から選択される。
【００２１】
第９の実施態様では、トランスジェニックヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種宿主細胞は、
ａ）少なくとも１つの天然ペルオキシソーム形成因子タンパク質の欠損である少なくとも１つの遺伝的変異、および
ｂ）少なくとも１つの制御配列の制御下のマロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、および
ｃ）機能性多価不飽和脂肪酸生合成経路をコードする遺伝子
を含んでなる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄと合わせて、リゾビウム・レグミノサルムｂｖ．ビシアエ３８４１（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ  ｂｖ．ｖｉｃｉａｅ  ３８４１）マロニル−ＣｏＡシンセターゼ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＹＰ＿７６６６０３；配列番号１）のＤＮＡ配列と、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成遺伝子（配列番号３）との比較を示す。
【図１Ｂ】図１Ａ、図１Ｃ、図１Ｄと合わせて、リゾビウム・レグミノサルムｂｖ．ビシアエ３８４１（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ  ｂｖ．ｖｉｃｉａｅ  ３８４１）マロニル−ＣｏＡシンセターゼ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＹＰ＿７６６６０３；配列番号１）のＤＮＡ配列と、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成遺伝子（配列番号３）との比較を示す。
【図１Ｃ】図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｄと合わせて、リゾビウム・レグミノサルムｂｖ．ビシアエ３８４１（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ  ｂｖ．ｖｉｃｉａｅ  ３８４１）マロニル−ＣｏＡシンセターゼ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＹＰ＿７６６６０３；配列番号１）のＤＮＡ配列と、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成遺伝子（配列番号３）との比較を示す。
【図１Ｄ】図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃと合わせて、リゾビウム・レグミノサルムｂｖ．ビシアエ３８４１（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ  ｂｖ．ｖｉｃｉａｅ  ３８４１）マロニル−ＣｏＡシンセターゼ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＹＰ＿７６６６０３；配列番号１）のＤＮＡ配列と、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成遺伝子（配列番号３）との比較を示す。
【図２】ｐＺＰ２−ＭＣＳのプラスミドマップを提供する。
【図３Ａ】図３Ｂと合わせてω−３／ω−６脂肪酸生合成経路を図示し、この経路の説明を考察する際には図３Ｂと合わせて見るべきである。
【図３Ｂ】図３Ａと合わせてω−３／ω−６脂肪酸生合成経路を図示し、この経路の説明を考察する際には図３Ａと合わせて見るべきである。
【図４】ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４３０５株の開発を図示する。
【００２３】
本発明は、本明細書の一部を形成する以下の詳細な説明および添付の配列説明からより完全に理解され得る。
【００２４】
配列一覧
以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則」）を満たし、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、および実施細則第２０８号および附属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および型式は、３７Ｃ.Ｆ.Ｒ.§１.８２２で述べられる規則に従う。
【００２５】
配列番号１〜２２は、表１に同定される遺伝子またはタンパク質またはプラスミドをコードするＯＲＦである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
表１：核酸およびタンパク質配列番号の概要
【表１】
0005620402.tif 000002
0005620402.tif 000003
【００２７】
本明細書に記載されるのは、発酵中、生成物の生産中に、さらに利用され得ないマロン酸「副産物」の蓄積を避けるための一般的方法である。これらの方法は、宿主中の異種性マロニル−ＣｏＡシンセターゼタンパク質の発現に依存する。これらの方法は、発酵を通じた多様な生成物の生産中に、藻類、真菌、ユーグレナ属、酵母、細菌、およびストラメノパイルをはじめとする多様な生物によるマロン酸副産物生成を低下させるので、幅広い適用性を有する。これらの方法は、油性酵母、具体的にはあらかじめ遺伝子改変されて多価不飽和脂肪酸［「ＰＵＦＡ」］を生成するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で実施された。ＰＵＦＡ生成操作に関わる遺伝的変異は、発酵中にマロン酸副産物の生成増大をもたらすことが分かった（マロン酸は蓄積する総有機酸の約４５％を占めた）。異種性マロニル−ＣｏＡシンセターゼの発現はこの効果を逆転させ、実質的に低下したマロン酸副産物生成をもたらした。
【００２８】
本開示では、以下の略語を使用する。
「読み取り枠」は、「ＯＲＦ」と略記する。
「ポリメラーゼ連鎖反応」は、「ＰＣＲ」と略記する。
「米国微生物系統保存機関」は、「ＡＴＣＣ」と略記する。
「多価不飽和脂肪酸」は、「ＰＵＦＡ」と略記する。
「トリアシルグリセロール」は、は、「ＴＡＧ」と略記する。
「総脂肪酸」は、「ＴＦＡ」と略記する。
「脂肪酸メチルエステル」は、「ＦＡＭＥ」と略記する。
「乾燥細胞重量」は、「ＤＣＷ」と略記する。
「補酵素Ａ」は、「ＣｏＡ」と略記する。
【００２９】
本明細書での用法では、「発明」または「本発明」という用語は制限を意図せず、特許請求の範囲で定義され、または本明細書に記載される本発明のいずれかに一般に適用される。
【００３０】
国際純正応用化学連合［「ＩＵＰＡＣ」］体系的命名法に従ってプロパン二酸とも称される「マロン酸」という用語は、ＣＨ2（ＣＯＯＨ）2で記載される化学構造を有するジカルボン酸を指す。マロン酸またはプロパン二酸イオンは、２個の水素イオンの喪失によってマロン酸から誘導される（すなわちＣＨ2（ＣＯＯ）22-）。マロン酸の塩およびエステルとしては、ジエチルマロン酸［（Ｃ2Ｈ5）2（Ｃ3Ｈ2Ｏ4）］、ジメチルマロン酸［（ＣＨ3）2（Ｃ3Ｈ2Ｏ4）］および二ナトリウムマロン酸［Ｎａ2（Ｃ3Ｈ2Ｏ4）］が挙げられるがこれに限定されるものではない。
【００３１】
本明細書での用法では、「マロン酸」とは、マロン酸のイオン化形態、ならびにそのエステルおよび塩を指す。これらは本明細書では全て集合的に「マロン酸」と称される。
【００３２】
本明細書での用法では、「マロニル−ＣｏＡ」［ＣＡＳ登録番号５２４−１４−１］は、アセチル−ＣｏＡからマロニル−ＣｏＡへのカルボキシル化によって形成され得るアシルチオエステルを指す。代案としては、マロニル−ＣｏＡは、マロニル−ＣｏＡシンセターゼによってマロン酸基質から酵素的に生成される。
【００３３】
本明細書での用法では、「マロニル−ＣｏＡシンセターゼ」［ＥＣ６.２.１.−］は、以下の酵素反応を触媒する。マロン酸＋ＡＴＰ＋ＣｏＡ→マロニル−ＣｏＡ＋ＡＭＰ＋ピロリン酸［「ＰＰｉ」］。酵素は最初マロン酸で成長させた蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）から精製されたが（Ｋｉｍ，Ｙ.Ｓ.およびＳ.Ｋ.Ｂａｎｇ，Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.，２６０：５０９８〜５１０４頁（１９８５年））、その後様々な根粒菌ホモログが、マメ科植物根粒内の根粒菌から単離されている（例えばＫｉｍ，Ｙ．Ｓ．ａｎｄ  Ｈ．Ｚ．Ｃｈａｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２７３：５１１−５１６（１９９１）およびＫｉｍ，Ｙ．Ｓ．ａｎｄ  Ｓ．Ｗ．Ｋａｎｇ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２９７：３２７−３３３（１９９４）を参照されたい）。
【００３４】
「ｒＭＣＳ」という用語は、リゾビウム・レグミノサルムｂｖ．ビシアエ３８４１（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ  ｂｖ．ｖｉｃｉａｅ  ３８４１）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＹＰ_７６６６０３）からのマロニル−ＣｏＡシンセターゼ酵素（配列番号２）をコードする遺伝子（配列番号１）を指す。同様に「ＭＣＳ」という用語は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のために最適化されたリゾビウム・レグミノサルムｂｖ．ビシアエ３８４１（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ  ｂｖ．ｖｉｃｉａｅ  ３８４１）に由来するマロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする合成遺伝子を指す（すなわち配列番号３および４）。
【００３５】
「リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）」という用語は、窒素を固定化する、すなわちジアゾ栄養性の（３０を超える異なる種が含まれる）グラム陰性土壌細菌属を指す。リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）は、エンドウマメ、マメ、クローバー、およびダイズなどのマメ科植物の根と、内共生的窒素固定共生を形成する。細菌は、根粒中の植物細胞にコロニー形成して、大気中の窒素をアンモニアに転換し、次にグルタミンまたはウレイドなどの有機窒素化合物を植物に提供する。植物は、光合成によって生成する有機化合物を細菌に提供する。最近の研究によれば、Ｒ．トリフォリイ（Ｒ．ｔｒｉｆｏｌｉｉ）は、Ｒ．レグミノサルム（Ｒ．ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）の後の異名である（Ｍ．Ｈ．Ｒａｍｉｒｅｚ−Ｂａｈｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５８：２４８４−２４９０（２００８））。
【００３６】
「発酵」とは、生体触媒の使用を通じて基質から生成物を生じる反応を触媒する工程を指す。
【００３７】
「生体触媒」とは、基質と生成物間の化学反応を開始または変更する。生体触媒は、微生物全体、単離酵素、またはあらゆるその組み合わせであり得る。本明細書に記載される目的では、生体触媒は藻類、真菌、ユーグレナ属の、酵母、細菌またはストラメノパイルなどの微生物全体である。
【００３８】
「発酵槽」または「バイオリアクター」とは、発酵工程を収容できる容器を指す。発酵槽は、例えば液体、気体、固体などの２つ以上の相を有する不均一系である。発酵のための最適条件には、効率的な物質移動、熱、および１つの成長期から別の成長期への推進力が必要である。発酵槽は以下を提供する。１）撹拌（細胞と培地を混合するための）；２）Ｏ2供給のための曝気；３）温度、ｐＨ、圧力、曝気、栄養素補給、液体レベルなどの要素の制御；４）滅菌および無菌性の維持；および５）細胞／培地の抜き取り（連続発酵槽の場合）。一般に液飛び、気泡、および曝気を考慮して、発酵槽容量の２０〜２５％は「ヘッドスペース」として培地で満たされない。発酵槽の設計は、それを使用する発酵タイプに応じて多種多様である。近代の発酵槽は、効率的なプロセス監視、データ取得などのために、通常、コンピュータと一体化されている。
【００３９】
「ブロス」または「培地」という用語は、微生物培養のための栄養素を含有する溶液を指し、一般に水、エネルギー源、炭素源、窒素源、および微量栄養素を含んでなる。発酵中および／または発酵終了時に、ブロスはまた、生体触媒；生体触媒によって合成される生成物；代謝中間体；副産物；塩、ビタミン、アミノ酸、補助因子、および抗生物質などのその他の培地構成要素をさらに含有してもよい。
【００４０】
「生成物」とは、発酵から得られる、対象の生体触媒的に生成されるあらゆる一次産物を指す。これは天然で生体触媒によって生成される化合物であってもよく、または非天然遺伝子を発酵中のそれらの機能的発現のために微生物に遺伝子操作で組み込んでもよい。
【００４１】
対照的に「副産物」という用語は、生体触媒による基質から生成物への転換に由来する二次的または偶発的生成物を指す。発酵系から「副産物」を選択的に除去して、フィードバック阻害を排除し、および／または生体触媒活性を最大化することが望ましいことが多い。典型的な発酵副産物としては、例えば多糖類；炭水化物；アミノ酸；タンパク質；塩；および乳酸、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、ピルビン酸、フマル酸、クエン酸、イソクエン酸、グリオキシル酸、コハク酸、α−ケトグルタル酸、およびマロン酸などの様々な有機酸が挙げられる。
【００４２】
「容積生産性」とは、グラム／（リットル時間）（略号ｇ／（Ｌｈｒ））単位で、所定容積中時間当たり、発酵槽内で生じる生成物質量を指す。この量は、生体触媒比活性および生体触媒濃度によって定まる。これは力価、実行時間、および発酵槽の作業容積から計算される。
【００４３】
「力価」とは、グラム／リットル（略号ｇ／Ｌ）単位の生成物濃度を指す。
【００４４】
「保存ドメイン」または「モチーフ」という用語は、進化的に関連したタンパク質の整合配列に沿って、特定位置で保存されているアミノ酸セットを指す。その他の位置のアミノ酸は相同的なタンパク質間で変動し得るが、特定位置で高度に保存されるアミノ酸は、タンパク質の構造、安定性、または活性に必須のアミノ酸を示唆する。それらはタンパク質ホモログファミリーの整合配列中のそれらの高度な保存によって同定されるので、それらは新たに判定された配列のタンパク質が、先に同定されたタンパク質ファミリーに属するかどうかを判定する識別子または「シグネチャー」として使用し得る。
【００４５】
「油性」という用語は、それらのエネルギー源を油の形態で貯蔵する傾向がある生物を指す（Ｗｅｅｔｅ，Ｉｎ：Ｆｕｎｇａｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２nd  Ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ，１９８０）。一般に油性微生物の細胞含油量はＳ字形曲線に従い、脂質濃度は対数後期または初期定常期で最大に達するまで増大し、次に静止期後期および死滅期中に徐々に減少する（Ｙｏｎｇｍａｎｉｔｃｈａｉ  ａｎｄ  Ｗａｒｄ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５７：４１９−２５（１９９１））。油性微生物が、それらの乾燥細胞重量の約２５％超を油として蓄積することは一般的である。
【００４６】
「油性酵母」という用語は、油を生成し得る酵母に分類される微生物を指す。油性酵母の例としては、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）属が挙げられるがこれに限定されるものではない。
【００４７】
「脂質」という用語は、あらゆる脂溶性（すなわち親油性）の天然分子を指す。脂質は、細胞膜構成成分、エネルギー保存源、およびシグナル伝達経路中の中間体などの多数の重要な生物学的機能を有する多様な化合物群である。脂質は、ケトアシルまたはイソプレン基のどちらかに完全にまたは部分的に由来する、疎水性または両親媒性小型分子とおおまかに定義してもよい。国立一般医科学研究所（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）は、Ｌｉｐｉｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ（ＬＩＰＩＤ  ＭＡＰＳ）分類体系に基づく脂質の概説を提供する。
【００４８】
「油」という用語は、２５℃で液体であり、通常は多価不飽和である脂質物質を指す。油性生物中では、油が総脂質の大部分を構成する。「油」は主としてトリアシルグリセロール［「ＴＡＧ」］からなるが、その他の中性脂質、リン脂質、および遊離脂肪酸もまた含有してもよい。油中の脂肪酸組成と総脂質中の脂肪酸組成は一般に類似しており、したがって総脂質中のＰＵＦＡ濃度の増大または減少は、油中のＰＵＦＡ濃度の増大または減少に一致し、逆もまた然りである。
【００４９】
「トリアシルグリセロール」［「ＴＡＧ」］という用語は、グリセロール分子とエステル結合している３つの脂肪酸アシル残基から構成される中性脂質を指す。ＴＡＧは長鎖ＰＵＦＡおよび飽和脂肪酸、ならびにより短い鎖長の飽和および不飽和脂肪酸を含有し得る。
【００５０】
「脂肪酸」という用語は、約Ｃ12〜Ｃ22の異なる鎖長の長鎖脂肪酸（アルカン酸）を指すが、より長い鎖長の脂肪酸とより短い鎖長の脂肪酸の双方が知られている。最多数を占める鎖長は、Ｃ16〜Ｃ22である。脂肪酸の構造は簡易表記体系「Ｘ：Ｙ」によって表され、式中、Ｘは特定の脂肪酸中の炭素［「Ｃ」］原子総数であり、Ｙは二重結合の数である。「飽和脂肪酸」対「不飽和脂肪酸」、「一不飽和脂肪酸」対「多価不飽和脂肪酸」［「ＰＵＦＡ」］、および「ω−６脂肪酸」［「ω−６」または「ｎ−６」］対「ω−３脂肪酸」［「ω−３」または「ｎ−３」］の区別に関する追加的詳細は、参照によって本明細書に援用する米国特許第７,２３８,４８２号明細書に提供される。
【００５１】
本明細書でＰＵＦＡを記載するのに使用される命名法を表２に示す。「略記法」と題された列ではω−基準系を使用して、炭素数、二重結合数、およびこの目的では１と番号付けされるω炭素から数えたω炭素に最も近い二重結合の位置を示す。表の残りの部分は、ω−３およびω−６脂肪酸の一般名とそれらの前駆物質、明細書全体を通じて使用される略語、および各化合物の化学名を要約する。
【００５２】
表２：多価不飽和脂肪酸および前駆物質の命名法
【表２】
0005620402.tif 000004
【００５３】
表２に列挙されるω−３／ω−６ＰＵＦＡが、本明細書に記載される方法を使用して油性酵母の油画分中に蓄積する可能性が最も高いが、一覧は限定的または完全なものとみなすべきではない。
【００５４】
「ＰＵＦＡ生合成経路」という用語は、オレイン酸をＬＡ、ＥＤＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＤＴＡ、およびＤＰＡｎ−６などのω−６脂肪酸に；およびＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡなどのω−３脂肪酸に転換する代謝過程を指す。この過程については文献で十分に記載されている（例えば国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットを参照されたい）。簡単に述べるとこの過程は、小胞体膜内に存在する「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」と称される一連の特有な延長酵素および不飽和化酵素による、炭素原子の付加を通じた炭素鎖の延長、および二重結合の付加を通じた延長分子の不飽和化を伴う。より具体的には「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」とは、ＰＵＦＡの生合成と関連付けられている以下の酵素のいずれか（およびそれらをコードする遺伝子）を指す。Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ９エロンガーゼ、Ｃ14/16エロンガーゼ、Ｃ16/18エロンガーゼ、Ｃ18/20エロンガーゼおよび／またはＣ20/22エロンガーゼ。
【００５５】
「デサチュラーゼ」という用語は、隣接する炭素の１つから水素を取り去り、それによってそれらの間に二重結合を導入することによって脂肪酸中の隣接する炭素を不飽和化し得るポリペプチドを指す。不飽和化からは対象の脂肪酸または前駆物質が生じる。特定の脂肪酸に言及するための明細書全体を通じたオメガ基準系の使用にもかかわらず、デルタ系を使用して基質のカルボキシル末端から数えることによって、デサチュラーゼ活性を示す方がより都合よい。本明細書で特に興味深いのは、Δ８デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ４デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、およびΔ９デサチュラーゼである。当該技術分野では、Δ１５およびΔ１７デサチュラーゼはまた、ω−６脂肪酸をそれらのω−３対応物に転換するそれらの能力に基づいて、（例えばそれぞれＬＡのＡＬＡへの、およびＡＲＡのＥＰＡへの転換）「オメガ−３デサチュラーゼ」、「ｗ−３デサチュラーゼ」、および／または「ω−３デサチュラーゼ」と称されることもある。適切な宿主を脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子で形質転換し、宿主の脂肪酸プロフィールに対するその影響を判定することによって、特定の脂肪酸デサチュラーゼの特異性を経験的に判定することが望ましいかもしれない。
【００５６】
「エロンガーゼ」という用語は、作用する脂肪酸基質の脂肪酸炭素鎖を延長して炭素２個分だけ長い酸を生成し得るポリペプチドを指す。この延長過程は、米国特許出願公開第２００５／０１３２４４２号明細書および国際公開第２００５／０４７４８０号パンフレットに記載されるように、脂肪酸シンターゼと結びついた多段階機序で起きる。エロンガーゼ系によって触媒される反応の例は、ＧＬＡからＤＧＬＡへ、ＳＴＡからＥＴＡへ、およびＥＰＡからＤＰＡへの転換である。一般にエロンガーゼの基質選択性はいくらか広いが、鎖長と不飽和の程度およびタイプとの双方によって区別される。例えばＣ14/16エロンガーゼは例えばミリスチン酸などのＣ14基質を利用し、Ｃ16/18エロンガーゼは例えばパルミチン酸などのＣ16基質を利用し、Ｃ18/20エロンガーゼはＣ18基質（例えばＧＬＡ、ＳＴＡ、ＬＡ、ＡＬＡ）を利用し、Ｃ20/22エロンガーゼ［Δ５エロンガーゼとも称される］はＣ20基質（例えばＡＲＡ、ＥＰＡ）を利用する。本明細書の目的では、２つの異なるタイプのＣ18/20エロンガーゼを定義し得る。Δ６エロンガーゼはそれぞれＧＬＡおよびＳＴＡからＤＧＬＡおよびＥＴＡへの転換を触媒するのに対し、Δ９エロンガーゼはそれぞれＬＡおよびＡＬＡからＥＤＡおよびＥＴｒＡへの転換を触媒できる。
【００５７】
いくつかのエロンガーゼは幅広い特異性を有し、したがって単一酵素がいくつかのエロンガーゼ反応を触媒できるかもしれないことに留意することが重要である。例えば単一酵素が、Ｃ16/18エロンガーゼとＣ18/20エロンガーゼの双方として機能してもよい。適切な宿主を脂肪酸エロンガーゼ遺伝子で形質転換し、宿主の脂肪酸プロフィールに対するその影響を判定することによって、脂肪酸エロンガーゼの特異性を経験的に判定することが望ましいかもしれない。
【００５８】
「転換効率」および「％基質転換」という用語は、それによってデサチュラーゼなどの特定酵素が基質を生成物に転換し得る効率を指す。転換効率は、式、（［生成物／［基質＋生成物］）*１００に従って判定され、式中、「生成物」は、直接生成物およびそれから誘導される経路中の全ての生成物を含む。
【００５９】
「ペルオキシソーム形成因子タンパク質」、「ペルオキシン」、および「Ｐｅｘタンパク質」という用語は同義であり、ペルオキシソーム生合成に関与するタンパク質、および／またはペルオキシソーム膜を通じたＡＴＰ加水分解の手段による細胞タンパク質の輸送過程に関与するタンパク質を指す。これらのタンパク質のいずれかをコードする遺伝子の頭字語は「Ｐｅｘ遺伝子」である。Ｐｅｘ遺伝子の命名システムは、Ｄｉｓｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１３５：１−３（１９９６）に記載される。様々な真核生物中で、これまでに少なくとも３２個の異なるＰｅｘ遺伝子が同定されている。異常なペルオキシソーム機能または構造を示す突然変異体の分析から、多数のＰｅｘ遺伝子が単離されている。１７の異なる真菌種のゲノム配列のコンピュータシミュレーションによる分析が実施されたＫｉｅｌ，Ｊ．Ａ．Ｋ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．（Ｔｒａｆｆｉｃ，７：１２９１−１３０３（２００６））によるレビューに基づいて、以下のＰｅｘタンパク質が同定された。Ｐｅｘ１ｐ、Ｐｅｘ２ｐ、Ｐｅｘ３ｐ、Ｐｅｘ３Ｂｐ、Ｐｅｘ４ｐ、Ｐｅｘ５ｐ、Ｐｅｘ５Ｂｐ、Ｐｅｘ５Ｃｐ、Ｐｅｘ５／２０ｐ、Ｐｅｘ６ｐ、Ｐｅｘ７ｐ、Ｐｅｘ８ｐ、Ｐｅｘ１０ｐ、Ｐｅｘ１２ｐ、Ｐｅｘ１３ｐ、Ｐｅｘ１４ｐ、Ｐｅｘ１５ｐ、Ｐｅｘ１６ｐ、Ｐｅｘ１７ｐ、Ｐｅｘ１４／１７ｐ、Ｐｅｘ１８ｐ、Ｐｅｘ１９ｐ、Ｐｅｘ２０ｐ、Ｐｅｘ２１ｐ、Ｐｅｘ２１Ｂｐ、Ｐｅｘ２２ｐ、Ｐｅｘ２２ｐ−ｌｉｋｅ、およびＰｅｘ２６ｐ。したがってこれらの各タンパク質は、本明細書で「Ｐｅｘタンパク質」、「ペルオキシン」または「ペルオキシソーム形成因子タンパク質」と称され、少なくとも１つの「Ｐｅｘ遺伝子」によってコードされる。
【００６０】
「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」、「核酸断片」、および「単離された核酸断片」という用語は、本明細書で同義的に使用される。これらの用語は、ヌクレオチド配列などを包含する。ポリヌクレオチドは、合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基が含有されていてもよい、一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーであってもよい。ＤＮＡポリマーの形態のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはそれらの混合物の１つ以上のセグメントを含んでなってもよい。ヌクレオチド（通常それらの５’一リン酸の形態で見られる）は、次のような一文字名によって言及される。「Ａ」はアデニル酸またはデオキシアデニル酸（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡ）、「Ｃ」はシチジル酸またはデオキシシチジル酸、「Ｇ」はグアニル酸またはデオキシグアニル酸、「Ｕ」はウリジル酸、「Ｔ」はデオキシチミジル酸、「Ｒ」はプリン（ＡまたはＧ）、「Ｙ」はピリミジン（ＣまたはＴ）、「Ｋ」はＧまたはＴ、「Ｈ」はＡまたはＣまたはＴ、「Ｉ」はイノシン、および「Ｎ」はあらゆるヌクレオチドである。
【００６１】
核酸断片は、適切な温度および溶液イオン強度条件下で、核酸断片の一本鎖形態が別の核酸断片とアニールし得る場合、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡなどの別の核酸断片と「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件については良く知られており、参照によって本明細書に援用する、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２nd  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）の特に第１１章および表１１．１で例示される。温度およびイオン強度条件が、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を定める。ストリンジェントな条件は、（遠縁の生物からの相同的配列などの）中程度に類似の断片をスクリーニングするため、そして（近縁の生物からの機能性酵素を複製する遺伝子などの）高度に類似した断片をスクリーニングするために調節し得る。ハイブリダイゼーション後の洗浄が、ストリンジェントな条件を決定する。１つの好ましい条件のセットは、室温において６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで１５分間に始まり、次に４５℃において２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで３０分間を反復し、次に５０℃において０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを３０分間を２回反復する、一連の洗浄を使用する。より好ましいストリンジェントな条件のセットはより高い温度を使用し、そこでは洗浄は、最後の０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中での２回の３０分間の洗浄の温度を６０℃に増大させること以外は上述したのと同一である。別の好ましい高度にストリンジェントな条件のセットは、６５℃において０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での２回の最終洗浄を使用する。さらに別のストリンジェントな条件のセットは、例えば０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃でのハイブリダイゼーション、および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む。
【００６２】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー次第で塩基間のミスマッチは可能であるが、ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的配列を含有することを要とする。核酸がハイブリダイゼーションする適切なストリンジェンシーは、技術分野で良く知られた変数である、核酸の長さおよび相補性の程度に左右される。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が高い程、これらの配列を有する核酸ハイブリッドの熱融点［「Ｔm」または「Ｔｍ」］値は大きくなる。より高いＴｍに対応する核酸ハイブリダイゼーションの相対安定性は、次の順に低下する。ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さがヌクレオチド１００個を超えるハイブリッドでは、Ｔｍを計算する式が導かれている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、前出９．５０〜９．５１参照）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーションのためにはミスマッチの配置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、前出１１．７〜１１．８参照）。一実施態様では、ハイブリダイゼーション可能な核酸の長さは少なくともヌクレオチド約１０個である。ハイブリダイゼーション可能な核酸の好ましい最小の長さは少なくともヌクレオチド約１５個、より好ましくは少なくともヌクレオチド約２０個、そして最も好ましくは長さが少なくともヌクレオチド約３０個である。さらに当業者は、プローブの長さなどの要因次第で、温度および洗浄液の塩濃度を必要に応じて調節してもよいことを認識する。
【００６３】
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「実質的部分」とは、当業者による配列の手動評価によって、または基本的局所アラインメント検索ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍａｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）［「ＢＬＡＳＴ」］（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９３））などのアルゴリズムを使用したコンピュータ自動化配列比較および同定によって、遺伝子またはポリペプチドの推定上の同定を得るのに十分なポリペプチドまたは遺伝子のヌクレオチド配列のアミノ酸配列を含んでなる部分である。一般に推定的にポリペプチドまたは核酸配列が、既知のタンパク質または遺伝子に相同的であると同定するためには、１０個以上の隣接するアミノ酸または３０個以上のヌクレオチド配列が必要である。さらにヌクレオチド配列に関して、微生物コロニーまたはバクテリオファージプラークの原位置ハイブリダイゼーションなどの配列依存遺伝子同定（例えばサザンハイブリダイゼーション）および単離において、２０〜３０個の隣接するヌクレオチドを含んでなる遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを使用しても良い。さらにプライマーを含んでなる特定の核酸断片を得るために、塩基１２〜１５個の短いオリゴヌクレオチドを増幅プライマーとしてＰＣＲで使用しても良い。したがってヌクレオチド配列の「実質的部分」は、配列を含んでなる核酸断片を特異的に同定、および／または単離できるようにする十分な配列を含んでなる。当業者は本願明細書に報告される配列の恩恵を受けて、本願明細書に記載される方法に基づいて、当業者に既知の目的のために、今や開示された配列の全てまたは実質的部分を使用してもよい。
【００６４】
「相補的」という用語は、互いにハイブリダイゼーションできるヌクレオチド塩基間の関係について述べるために使用される。例えばＤＮＡについて、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって本発明は添付の配列表で報告される完全な配列、ならびに実質的に類似した核酸配列に相補的な単離された核酸断片も含む。
【００６５】
「相同性」および「相同的」」という用語は、区別なく使用される。これらは、その中において１つ以上のヌクレオチド塩基の変化が、遺伝子発現を仲介するまたは特定の表現型を生成する核酸断片の能力に影響を及ぼさない核酸断片を指す。これらの用語はまた、最初の未変性断片と比べて、得られる核酸断片の機能特性を実質的に変化させない、１つ以上のヌクレオチドの欠失または挿入などの核酸断片の修飾も指す。
【００６６】
さらに、当業者は、相同的な核酸配列がまた、０.５×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで６０℃などの中程度にストリンジェントな条件下で、本明細書で例証される配列と、または本明細書で開示されるヌクレオチド配列と機能的に同等であるそのあらゆる部分とハイブリダイズするそれらの能力によって、定義されることを認識する。ストリンジェンシー条件は、中程度に類似した断片をスクリーニングするように調節し得る。
【００６７】
「選択的にハイブリダイズする」という用語は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、その非標的核酸配列へのハイブリダイゼーションよりも検出可能な程度に大きい（例えば少なくともバックグラウンドの２倍の）規定核酸標的配列への核酸配列のハイブリダイゼーション、および非標的核酸の実質的排除を指す。選択的にハイブリダイズする配列は、典型的に互いに少なくとも約８０％の配列同一性、または９０％の配列同一性、１００％までの配列同一性（すなわち完全に相補的）を有する。
【００６８】
「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、その下でプローブがその標的配列に選択的にハイブリダイズする条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、異なる状況では異なる。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件のストリンジェンシーを制御することで、プローブに１００％相補的な標的配列を同定し得る（相同的プロービング）。代案としては、より低い類似性が検出されるようにストリンジェンシー条件を調節して、配列中のいくつかのミスマッチを許し得る（異種性プロービング）。一般にプローブは、約１０００ヌクレオチド未満の長さであり、５００ヌクレオチド未満の長さであってもよい。
【００６９】
典型的にストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３において、塩濃度が約１．５ＭのＮａイオン未満、典型的に約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン（またはその他の塩）濃度であり、温度は短いプローブ（例えば１０〜５０ヌクレオチド）で少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば５０ヌクレオチドを超える）で少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成されてもよい。例示的な低ストリンジェンシー条件としては、３７℃で３０〜３５％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝液溶液でのハイブリダイゼーション、および５０〜５５℃での１〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０ＭのＮａＣｌ／０．３Ｍのクエン酸三ナトリウム）中での洗浄が挙げられる。例示的な中度のストリンジェンシー条件としては、３７℃で４０〜４５％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、および５５〜６０℃での０．５〜１×ＳＳＣ中での洗浄が挙げられる。例示的な高ストリンジェンシー条件としては、３７℃で５０％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、および６０〜６５℃での０．１×ＳＳＣ中での洗浄が挙げられる。追加的なストリンジェントな条件の組としては、例えば０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃でのハイブリダイゼーション、および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが挙げられる。
【００７０】
特異性は、典型的にハイブリダイゼーション後洗浄の関数であり、重要な要因は最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドでは、熱融点［「Ｔm」］は、Ｍｅｉｎｋｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３８：２６７−２８４（１９８４）の式、Ｔm＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ  Ｍ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌから近似し得て、式中、Ｍは一価のカチオンのモル濃度であり、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシンおよびトシシンヌクレオチドの百分率であり、％ｆｏｒｍはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの百分率であり、Ｌは塩基対中のハイブリッドの長さである。Ｔmは、相補的標的配列の５０％が、完全にマッチするプローブにハイブリダイズする（規定のイオン強度およびｐＨ下における）温度である。Ｔmは、１％のミスマッチあたり約１℃低下するので、Ｔm、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件を調節して、所望の同一性がある配列にハイブリダイズさせ得る。例えば≧９０％同一の配列を求める場合、Ｔmを１０℃低下させ得る。一般にストリンジェントな条件は、規定のイオン強度とｐＨにおいて、特定の配列およびその相補体のＴmよりも約５℃低くなるように選択される。しかし厳しくストリンジェントな条件は、Ｔmよりも１、２、３または４℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得て、中度にストリンジェントな条件は、Ｔmよりも６、７、８、９または１０℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得て、低ストリンジェンシー条件は、Ｔmよりも１１、１２、１３、１４、１５または２０℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得る。数式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成物、および所望のＴmを使用して、当業者は、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄溶液のストリンジェンシーのバリエーションが、本質的に記載されることを理解するであろう。所望のミスマッチ程度が、４５℃未満（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）のＴmをもたらす場合、より高い温度を使用し得るようにＳＳＣ濃度を増大させることが好ましい。核酸ハイブリダイゼーションに関する広範な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ，  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９５）にある。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件は、少なくとも１０、３０、６０、９０、１２０または２４０分間にわたり���用し得る。
【００７１】
「％同一性」と言う用語は、配列を比較して判定される２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列の関係を指す。「％同一性」は、場合によっては、比較される配列間の整合百分率によって判定される、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。「％同一性」および「％類似性」は、１）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮＹ（１９８８）；２）Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ：ＮＹ（１９９３）；３）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎｉａ：ＮＪ（１９９４）；４）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ（１９８７）；および５）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，Ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：ＮＹ（１９９１）に記載されるものをはじめとするが、これに限定されるものではない既知の方法によって容易に計算し得る。
【００７２】
％同一性を判定する好ましい方法は、試験される配列間に最良の整合を与えるようにデザインされる。％同一性および％類似性を判定する方法は、一般に入手できるコンピュータプログラムで体系化されている。配列アラインメントおよび％同一性の計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎTMプログラムを使用して実施してもよい。配列の多重アラインメントは、「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｖ法」および「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法」をはじめとするアルゴリズムのいくつかのバリエーションを包含する「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ法」を使用して実施される（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ，５：１５１−１５３（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，８：１８９−１９１（１９９２）により記載され、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎTM（バージョン８．０．２）プログラムにある）。どちらかのＣｌｕｓｔａｌプログラムを使用した配列のアラインメント後、プログラムの「配列距離」表を見ることで「％同一性」を得ることが可能である。
【００７３】
アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｖ法を使用した多重アラインメントでは、デフォルト値はＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に相当する。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖ法を使用したタンパク質配列のペアワイズ配列比較および％同一性計算のデフォルトパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸ではこれらのパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝４である。アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法を使用した多重アラインメントのデフォルトパラメーターは、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、Ｄｅｌａｙ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  Ｓｅｑｓ（％）＝３０、ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ  Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢに相当する。
【００７４】
「配列比較のＢＬＡＳＴＮ法」が、デフォルトパラメーターを使用してヌクレオチド配列を比較する、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ［「ＮＣＢＩ」］が提供するアルゴリズムであるのに対し、「ＢＬＡＳＴＰアラインメント法」は、デフォルトパラメーターを使用してタンパク質配列を比較する、ＮＣＢＩによって提供されるアルゴリズムである。
【００７５】
その他の種から同一または同様の機能または活性を有するポリペプチドを同定する上で、多くのレベルの配列同一性が有用であることを当業者はよく理解している。適切な核酸断片、すなわち本明細書に記載される方法および宿主細胞中でポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドは、本明細書で報告されるアミノ酸配列と少なくとも約７０〜８５％同一のポリペプチドをコードする一方、より好ましい核酸断片は少なくとも約８５〜９５％同一のアミノ酸配列をコードする。好ましい範囲は上述のようであるが、％同一性の有用な例としては、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％などの５０％〜１００％のあらゆる整数百分率が挙げられる。またこの単離されたヌクレオチド断片のあらゆる全長または部分的補体も興味深い。
【００７６】
適切な核酸断片は上の相同性を有するだけでなく、典型的に少なくとも５０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１５０個のアミノ酸、なおもより好ましくは少なくとも２００個のアミノ酸、最も好ましくは少なくとも２５０個のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする。
【００７７】
「コドン縮重」という用語は、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼさないヌクレオチド配列の変動を可能にする遺伝子コードの性質を指す。当業者は、特定のアミノ酸を特定化するヌクレオチドコドンの使用における、特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」についてよく知っている。したがって宿主細胞中の改善された発現のために遺伝子を合成する場合、そのコドン使用頻度が、宿主細胞の好むコドン使用頻度に近くなるように遺伝子をデザインすることが望ましい。
【００７８】
「合成遺伝子」は、当業者に知られる手順を使用して、化学的に合成されるオリゴヌクレオチド構成単位から構築し得る。これらのオリゴヌクレオチド構成単位をアニールし、次にライゲーションして遺伝子断片を形成し、次にそれを酵素的に構築して所望の遺伝子全体を構成する。したがって遺伝子をヌクレオチド配列の最適化に基づいて、最適な遺伝子発現のために調整し、宿主細胞のコドンバイアスを反映させ得る。当業者は、コドン利用が宿主によって好まれるコドンに偏っている場合の遺伝子発現成功の見込みを理解する。好ましいコドンの判定は、配列情報が利用できる宿主細胞から誘導される遺伝子の調査に基づき得る。例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のコドン使用頻度プロフィールは、米国特許第７,１２５,６７２号明細書で提供される。
【００７９】
「遺伝子」とは特定のタンパク質を発現する核酸断片を指し、それはコード領域のみを指してもよく、またはコード配列に先行する（５’非コード配列）およびそれに続く（３’非コード配列）制御配列を含んでもよい。「天然遺伝子」とは、自然界にそれ自体の制御配列と一緒に見られる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」とは、自然界に一緒に見られない制御およびコード配列を含んでなる天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は、異なる供給源から誘導される制御配列およびコード配列、あるいは同一供給源から誘導されるが、自然界に見られるのとは異なるやり方で配列される制御配列およびコード配列を含んでなってもよい。「内在性遺伝子」とは、生物体ゲノムにおいてその天然位置にある天然遺伝子を指す。「外来性」遺伝子とは、遺伝子移入によって宿主生物体に導入された遺伝子を指す。外来性遺伝子は、非天然生物体中に挿入された天然遺伝子、天然宿主内の新しい位置に導入された天然遺伝子、あるいはキメラ遺伝子を含んでなり得る。「導入遺伝子」とは、形質転換によってゲノム中に導入される遺伝子である。「コドン最適化遺伝子」とは、そのコドン使用頻度が宿主細胞の好むコドン使用頻度を模倣するようにデザインされる遺伝子である。
【００８０】
「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適切な制御配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、その中、または下流（３’非コード配列）に位置して、関連コード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。制御配列としては、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、（例えば転写開始部位と翻訳開始コドン間の）５’非翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセッシング部位、エフェクター結合部位、およびステムループ構造が挙げられる。
【００８１】
「プロモーター」とは、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ配列を指す。一般にコード配列は、プロモーター配列に対して３’に位置する。プロモーターは、その全体を天然遺伝子から誘導され、または自然界に見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素から構成され、または合成ＤＮＡセグメントを含んでなってさえもよい。”当業者は、異なる組織または細胞型中で、または異なる成長段階で、または異なる環境的または生理学的条件に応じて、異なるプロモーターが遺伝子発現を誘導してもよいことを理解する。ほとんどの細胞型でほとんどの場合に遺伝子発現を引き起こすプロモーターは、「構成的プロモーター」と一般に称される。ほとんどの場合において、制御配列の正確な境界は完全に画定されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有してもよいことがさらに認識される。
【００８２】
「３’非翻訳配列」および「転写ターミネーター」という用語は、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指す。これには、ｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼせる調節シグナルをコードするポリアデニル化認識配列およびその他の配列が含まれる。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆物質の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響を及ぼすことで特徴付けられる。３’領域は、転写、ＲＮＡプロセッシングまたは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を及ぼし得る。
【００８３】
「ＲＮＡ転写物」とは、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼが触媒する転写から得られる生成物を指す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、それは一次転写物と称され、あるいはそれは一次転写物の転写後プロセッシングから誘導されるＲＮＡ配列であるかもしれず、成熟ＲＮＡと称される。「メッセンジャーＲＮＡ」または「ｍＲＮＡ」はイントロンがなく、細胞によってタンパク質に翻訳され得るＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡに対して相補的であり、それから誘導される二重鎖ＤＮＡを指す。「センスＲＮＡ」は、ｍＲＮＡを含み、細胞によってタンパク質に翻訳され得るＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的一次転写物またはｍＲＮＡの全部または一部に相補的であり、標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写物を指す（米国特許第５，１７０，０６５号明細書、国際公開第９９／２８５０８号パンフレット）。
【００８４】
「作動可能に連結する」という用語は、１つの機能が他方の機能によって影響される、単一核酸断片上の核酸配列のつながりを指す。例えばプロモーターがコード配列の発現に影響を及ぼせる場合、それはそのコード配列と作動可能に連結する。すなわちコード配列は、プロモーターの転写調節下にある。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で制御配列に作動可能に連結し得る。
【００８５】
「組み換え」という用語は、例えば化学合成による、または遺伝子操作技術による核酸の単離されたセグメントの操作による、２つのさもなければ分離した配列のセグメントの人為的組み合わせを指す。
【００８６】
「発現」という用語は、本明細書での用法では、核酸断片から誘導されるセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指しても良い。したがって「発現」という用語は、本明細書での用法ではまた、機能性最終産物（例えばｍＲＮＡまたはタンパク質［前駆型または成熟型のどちらか］）の生成をも指す。
【００８７】
「形質転換」とは、遺伝的に安定した遺伝形質をもたらす、宿主生物体または宿主生物体中への核酸分子の転移を指す。核酸分子は、例えば自律的に複製するプラスミドであってもよく、またはそれは宿主生物体のゲノムに組み込まれてもよい。形質転換核酸断片を含有する宿主生物は、「トランスジェニック」、「組み換え」、「形質転換」または「形質転換体」生物と称される。
【００８８】
「プラスミド」および「ベクター」という用語は、多くの場合遺伝子を運ぶ、細胞の中心的代謝の一部でない染色体外要素を指し、それは通常、環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態である。このような要素は、あらゆる起源に由来する、一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの、直鎖または環状の、自己複製配列、ゲノム一体化配列、ファージまたはヌクレオチド配列であってもよく、その中ではいくつかのヌクレオチド配列が、発現カセットを細胞中に導入できる独自の構成に連結または組み換えされている。
【００８９】
「発現カセット」という用語は、外来遺伝子を含有し、外来遺伝子に加えて、異種宿主中での遺伝子の増強された発現ができるようにする要素を有するＤＮＡ断片を指す。一般に発現カセットは、選択された遺伝子のコード配列と、選択された遺伝子産物の発現に必要である、コード配列に先行する（５’非コード配列）およびそれに続く（３’非コード配列）制御配列とを含んでなる。したがって発現カセットは、典型的に１）プロモーター配列；２）コード配列、すなわち読み取り枠［「ＯＲＦ］；および３）３’非翻訳領域、すなわち真核生物では通常はポリアデニル化部位を含有するターミネーターから構成される。発現カセットは通常はベクターに含まれて、クローニングおよび形質転換を容易にする。各宿主に対して妥当な制御配列を使用しさえすれば、異なる発現カセットを細菌、酵母、植物、および哺乳類細胞をはじめとする異なる生物に形質転換し得る。
【００９０】
「組み換え構築物」、「発現構築物」、および「構築物」という用語は、本明細書で同義的に使用される。組み換え構築物は、例えば自然界に一緒には見られない、制御配列およびコード配列などの核酸断片の人為的組み合わせを含んでなる。例えば組み換え構築物は、異なる起源に由来する制御配列およびコード配列、または同一起源に由来する制御配列およびコード配列を含んでなってもよいが、自然界に見られるのとは異なる様式で配列される。このような構築物はそれ自体を使用してもよく、またはベクターと併せて使用してもよい。ベクターを使用する場合、当業者によく知られているように、ベクターの選択は宿主細胞の形質転換に使用する方法に左右される。例えばプラスミドベクターを使用し得る。当業者は、本明細書に記載の単離された核酸断片のいずれかを含んでなる宿主細胞を成功裏に形質転換し、選択し、増殖するためにベクター上に存在しなくてはならない遺伝的要素について十分承知している。当業者はまた、異なる独立した形質転換事象が、異なるレベルおよびパターンの発現をもたらし（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，４：２４１１  ２４１８（１９８５）；Ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２１８：７８−８６（１９８９））、したがって所望の発現レベルおよびパターンを示す系統を得るために多数の事象をスクリーニングしなくてはならないことを認識する。
【００９１】
「配列分析ソフトウェア」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析に有用なあらゆるコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は、市販のものでも、あるいは独立して開発されてもよい。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、１）ＧＣＧパッケージソフトウェア（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；２）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））、および３）ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；４）Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）；および５．）Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを組み入れたＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４），Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ  １９９２，１１１−２０．Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｌｅｎｕｍ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。本明細書の記述では、分析のために配列分析ソフトウェアを使用する場合は常に、分析結果は特に断りのない限り、言及されるプログラムの「デフォルト値」に基づく。本明細書での用法では、「デフォルト値」とは、最初に初期化されるときにソフトウェアに元からロードされる、あらゆる値またはパラメーターの組を意味する。
【００９２】
本明細書で使用される標準リコンビナントＤＮＡおよび分子クローニング技術については技術分野で良く知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２nd  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）（以下「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ  Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）；およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ（１９８７）で述べられている。
【００９３】
マロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする遺伝子は、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ブラディリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、メソリゾビウム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アゾリゾビウム（Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ニトロバクター（Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、オリゴトロファ（Ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈａ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、およびキサントバクター（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）などの多様な生物に見られる。例えば配列番号８〜２２に相当する、実施例１の表３に提供されるものを参照されたい。マロニル−ＣｏＡシンセターゼの主な役割は、マロニル−ＣｏＡを生じる基質マロン酸とＣｏＡの転換であり、それは次に脂肪酸の生成に使用される。
【００９４】
マロニル−ＣｏＡシンセターゼを特性解析するためのいくつかの研究が実施されている。例えばＮＭＲ分光法、部位特異的変異誘発、および比較モデリング法から判定されたリゾビウム・トリフォリイ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｔｒｉｆｏｌｉｉ）マロニル−ＣｏＡシンセターゼの活性部位および基質結合は、折り畳みタンパク質構造に関する詳細を明らかにし、反応中間体マロニル−ＡＭＰを発生させるその役割に基づいて、その中の２０６番目のヒスチジン残基（Ｈｉｓ２０６）が酵素の機能性に重要であるという裏付けを提供する（Ｊｕｎｇ，Ｊ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，９：１２９４−１３０３（２０００））。酵素はＪｕｎｇらの図３Ａで強調表示されるようにいくつかのＡＭＰ結合モチーフを有する。ブラディリゾビウム・ジャポニカム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）ＵＳＤＡ  １１０のマロニル−ＣｏＡシンセターゼに関する同様の分析がＫｏｏ，Ｈ．Ｍ．およびＹ．Ｓ．Ｋｉｍ（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３７８（１）：１６７−７４（２０００））によって実施された。
【００９５】
表３中のマロニル−ＣｏＡシンセターゼ配列、またはその一部を使用し、配列分析ソフトウェアを使用して、同一種または別種においてマロニル−ＣｏＡシンセターゼホモログを検索してもよい。一般にこのようなコンピュータソフトウェアは、様々な置換、欠失、およびその他の修飾に相同性の程度を割り当てることにより、類似した配列をマッチさせる。表３中のあらゆるマロニル−ＣｏＡシンセターゼタンパク質を核酸またはタンパク質配列データベースと比較して、それによって好ましい生物中の類似した既知の配列を同定するために、低複雑配列フィルターおよび以下のパラメーターを用いたＢＬＡＳＴＰアラインメント法などのソフトウェアアルゴリズムの使用が良く知られている。ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ＝１０、ｍａｔｒｉｘ＝Ｂｌｏｓｕｍ  ６２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７））。
【００９６】
既知の配列のデータベースを綿密にチェックするためのソフトウェアアルゴリズムの使用は、表３に記載されるような公的に入手可能なマロニル−ＣｏＡシンセターゼ配列に対して比較的低い％同一性を有するホモログの単離に特に適している。公的に入手可能なマロニル−ＣｏＡシンセターゼ配列と少なくとも約７０％〜８５％の同一性があるマロニル−ＣｏＡシンセターゼホモログは、単離が比較的容易であろうことが予想できる。さらに少なくとも約８５％〜９０％同一の配列は特に単離に適し、少なくとも約９０％〜９５％同一の配列は最も容易に単離されるであろう。
【００９７】
マロニル−ＣｏＡシンセターゼ酵素にユニークなモチーフを使用して、いくつかのマロニル−ＣｏＡシンセターゼホモログが単離されている。例えばマロニル−ＣｏＡシンセターゼは全て、ＡＭＰ結合モチーフを有することが良く知られている。この「保存ドメイン」領域は特定位置で高度に保存されたアミノ酸の組に相当し、タンパク質の構造、安定性または活性に必須であるマロニル−ＣｏＡシンセターゼタンパク質の領域を示す可能性が高い。モチーフは、タンパク質ホモログファミリーの整合配列中におけるそれらの高度な保存によって同定される。それらはユニークな「シグネチャー」として、新たに決定された配列のタンパク質が、以前に同定されたタンパク質ファミリーに属するかどうかを判定し得る。これらのモチーフは、新しいマロニル−ＣｏＡシンセターゼ遺伝子の迅速な同定のための診断用ツールとして有用である。
【００９８】
代案としては、公的に入手可能なマロニル−ＣｏＡシンセターゼ配列またはそれらのモチーフが、ホモログを同定するハイブリダイゼーション試薬であってもよい。核酸ハイブリダイゼーション試験の基本的構成要素には、プローブ、対象の遺伝子または遺伝子断片を含有することが疑われるサンプル、および特定のハイブリダイゼーション法が含まれる。プローブは典型的に、検出される核酸配列に相補的な一本鎖核酸配列である。プローブは検出される核酸配列にハイブリダイズ可能である。プローブ長は５個の塩基から数万個の塩基まで変動するが、典型的に約１５塩基から約３０塩基のプローブ長が適切である。プローブ分子の一部のみが、検出される核酸配列に相補的であればよい。さらにプローブと標的配列間の相補性は、必ずしも完全である必要はない。ハイブリダイゼーションは不完全に相補的な分子間で起き、その結果ハイブリダイズ領域内の塩基の特定画分は、適切な相補的塩基と対合形成しない。
【００９９】
ハイブリダイゼーション法については良く知られている。典型的にプローブおよびサンプルは、核酸ハイブリダイゼーションをできるようにする条件下で混合されなくてはならない。これは、適切な濃度および温度条件下において、無機または有機塩存在下でプローブとサンプルを接触させることを伴う。プローブおよびサンプル核酸は、プローブとサンプル核酸間のあらゆる可能なハイブリダイゼーションが起きるように、十分な時間接触させなくてはならない。混合物中のプローブまたは標的の濃度は、ハイブリダイゼーションが起きるための所用時間を決定する。プローブまたは標的濃度が高いほど、ハイブリダイゼーションインキュベーションの所要時間はより短くなる。塩化グアニジニウム、グアニジウムチオシアネート、チオシアン酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸リチウム、過塩素酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸ルビジウム、ヨウ化カリウムまたはトリフルオロ酢酸セシウムなどのカオトロピック剤が添加されていてもよい。所望ならばホルムアミドを典型的に３０〜５０％（ｖ／ｖ）［「体積基準」］でハイブリダイゼーション混合物に添加し得る。
【０１００】
様々なハイブリダイゼーション溶液を採用し得る。典型的にこれらは、約２０〜６０％体積、好ましくは３０％の極性有機溶剤を含んでなる。一般的なハイブリダイゼーション溶液には、約３０〜５０％ｖ／ｖのホルムアミド、約０.１５〜１Ｍの塩化ナトリウム、約０.０５〜０.１Ｍの緩衝液（例えばクエン酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳ（ｐＨ範囲約６〜９））、約０.０５〜０.２％の洗剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム）、または０.５〜２０ｍＭのＥＤＴＡ、ＦＩＣＯＬＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｉｎｃ.）（約３００〜５００ｋｄａｌ）、ポリビニルピロリドン（約２５０〜５００ｋｄａｌ）、および血清アルブミンが用いられる。典型的なハイブリダイゼーション溶液にはまた、約０.１〜５ｍｇ／ｍＬの未標識キャリア核酸、および仔ウシ胸腺またはサケ精子ＤＮＡまたは酵母ＲＮＡなどの断片化核酸ＤＮＡも含まれ、約０.５〜２％ｗｔ／ｖｏｌ［「体積当たり重量」］のグリシンが含まれていてもよい。極性水溶性または膨潤剤（例えばポリエチレングリコール）、アニオン性ポリマー（例えばポリアクリレートまたはポリメチルアクリレート）、および硫酸デキストランなどのアニオン性糖鎖ポリマーをはじめとする体積排除剤などのその他の添加剤を含めてもよい。
【０１０１】
核酸ハイブリダイゼーションは、多様なアッセイ様式に適応できる。最も適切なものの１つがサンドイッチアッセイ様式である。サンドイッチアッセイは、非変性条件下のハイブリダイゼーションに特に適応できる。サンドイッチタイプアッセイの主要構成要素は固体担体である。固体担体は、未標識であり配列の一部分と相補的である固定化核酸プローブを吸着しており、またはそれと共有結合的に共役している。
【０１０２】
本明細書または公共文献に記載されるマロニル−ＣｏＡシンセターゼ核酸断片のいずれか、またはあらゆる同定されたホモログを使用して、同一種または別種から相同タンパク質をコードする遺伝子を単離してもよい。配列依存プロトコルを使用した相同遺伝子の単離については、当該技術分野で良く知られている。配列依存プロトコルの例としては、以下が挙げられるがこれに限定されるものではない。１）核酸ハイブリダイゼーション法；２）ポリメラーゼ連鎖反応［「ＰＣＲ「］（米国特許第号４,６８３,２０２明細書）；リガーゼ連鎖反応［「ＬＣＲ」］（Ｔａｂｏｒ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２：１０７４（１９８５））；または鎖置換増幅［「ＳＤＡ」］（Ｗａｌｋｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９：３９２（１９９２））などの様々な核酸増幅技術の使用によって例証されるＤＮＡおよびＲＮＡ増幅法；および３）相補性によるライブラリー構築およびスクリーニング法。
【０１０３】
公的に入手可能な核酸断片の全部または一部をＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして使用し、良く知られている方法を使用してあらゆる所望の生物からライブラリーをスクリーニングし、例えば公的に入手可能なマロニル−ＣｏＡシンセターゼ遺伝子と類似したタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子、またはそれらのモチーフを直接単離し得る。公的に入手可能な核酸配列に基づく特定のオリゴヌクレオチドプローブを当該技術分野で知られている方法によりデザインし、合成し得る（Ｍａｎｉａｔｉｓ、前出）。さらにランダムプライマーＤＮＡ標識、ニックトランスレーションまたは末端標識技術、または利用可能な生体外転写系を使用したＲＮＡプローブなどの当業者に知られている方法によって、配列全体を直接使用してＤＮＡプローブを合成し得る。さらに特定のプライマーをデザインして使用し、公的に入手可能な配列またはそれらのモチーフの一部または全長を増幅し得る。得られる増幅産物を増幅反応中に直接標識し、または増幅反応後に標識し、プローブとして使用して、適切なストリンジェンシー条件下で完全長ＤＮＡ断片を単離し得る。
【０１０４】
典型的にＰＣＲタイプの増幅技術では、プライマーは異なる配列を有して互いに相補的でない。所望の試験条件次第で、プライマー配列は、標的核酸の効率的複製かつ忠実な複製の双方を提供するようにデザインすべきである。ＰＣＲプライマーデザインの方法は一般的であり、良く知られている（Ｔｈｅｉｎ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ，”Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ”，ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｋ．Ｅ．Ｄａｖｉｓ  Ｅｄ．，（１９８６）ｐｐ３３−５０，ＩＲＬ：Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ；Ｒｙｃｈｌｉｋ，Ｗ．，Ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｈｉｔｅ，Ｂ．Ａ．Ｅｄ．，（１９９３）Ｖｏｌ．１５，ｐｐ３１−３９，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｈｕｍａｎｉａ：Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）。
【０１０５】
一般に、入手できるマロニル−ＣｏＡシンセターゼ配列の２つの短いセグメントをＰＣＲプロトコルで使用して、相同遺伝子をコードするより長い核酸断片をＤＮＡまたはＲＮＡから増幅してもよい。ＰＣＲはまた、クローンされた核酸断片のライブラリーに対して実施されてもよく、入手できる核酸断片またはそれらのモチーフから１つのプライマーの配列が誘導される。その他のプライマーの配列は、ｍＲＮＡ前駆物質をコードする遺伝子の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの存在を利用する。
【０１０６】
第２のプライマー配列はまた、クローニングベクターから誘導される配列に基づいてもよい。例えば当業者はＰＣＲを使用して転写物中の一点と３’または５’末端の間の領域のコピーを増幅し、ＲＡＣＥプロトコル（Ｆｒｏｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５：８９９８（１９８８））に従って、ｃＤＮＡを作成し得る。３’および５’方向に配向したプライマーは、入手できる配列からデザインし得る。市販される３’ＲＡＣＥまたは５’ＲＡＣＥシステム（例えばＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して、特定の３’または５’ｃＤＮＡ断片を単し得る（Ｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６：５６７３（１９８９）；Ｌｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３：２１７（１９８９））。
【０１０７】
すぐ上で論じた良く知られている方法のいずれかに基づいて、あらゆる好ましい選択された生物中でマロニル−ＣｏＡシンセターゼ遺伝子ホモログを同定および／または単離することが可能であろう。あらゆる推定上のマロニル−ＣｏＡシンセターゼ遺伝子の活性は標準生化学的アッセイによって容易に確認し得る（例えばＫｉｍ，Ｙ．Ｓ．およびＳ．Ｋ．Ｂａｎｇ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７０（１）：４５−９（１９８８）を参照されたい）。
【０１０８】
アセチル−ＣｏＡは脂肪酸の新規生合成の主要構成単位である。効果的に代謝されてアセチル−ＣｏＡを生じ得るあらゆる化合物が、脂肪酸前駆物質の役割を果たし得るが、グルコースが炭素の主要供給源であることが多い。グルコースは解糖を通じてピルビン酸に転換され、それはミトコンドリア内に輸送されて、ピルビン酸デヒドロゲナーゼによってアセチル−ＣｏＡに転換される。アセチル−ＣｏＡはミトコンドリア膜を越えて細胞質内に直接輸送され得ないので、アセチル−ＣｏＡからの２個の炭素がオキサロ酢酸と縮合してクエン酸を生じる（クエン酸シンターゼによって触媒される）。クエン酸は細胞質内に直接輸送され、そこでＡＴＰ−クエン酸リアーゼにより切断されてアセチル−ＣｏＡとオキサロ酢酸が再生する。オキサロ酢酸はリンゴ酸への転換を通じて、トリカルボン酸サイクルに再び入る。
【０１０９】
マロニル−ＣｏＡの合成は、細胞質内で起きる脂肪酸生合成の最初の関与段階である。マロニル−ＣｏＡは、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ［「ＡＣＣ」；ＥＣ６.４.１.２］によるアセチル−ＣｏＡのカルボキシル化を通じて生成する。脂肪酸合成は多酵素脂肪酸合成酵素複合体［「ＦＡＳ」；ＥＣ２.３.１.８５］によって触媒され、８個の二炭素断片（アセチル−ＣｏＡからのアセチル基）の縮合によって起き、Ｃ１６飽和脂肪酸であるパルミチン酸が形成する。より具体的にはＦＡＳは下に要約する７つの一連の反応を触媒する（Ｓｍｉｔｈ，Ｓ.，ＦＡＳＥＢＪ.，８（１５）：１２４８−５９（１９９４））。最初にアセチル−ＣｏＡおよびマロニル−ＣｏＡが、ＦＡＳのアシルキャリアペプチド［「ＡＣＰ」］に転移される。次にアセチル基がマロニル基に転移されて、β−ケトブチリル−ＡＣＰが形成し、ＣＯ2が放出される。次にβ−ケトブチリル−ＡＣＰが還元（β−ケトアシル還元酵素による）および脱水（β−ヒドロキシアシルデヒドラターゼによる）を被り、トランス−単不飽和脂肪アシル基が形成する。二重結合がＮＡＤＰＨによって還元され、最初のものよりも炭素２個分長い飽和脂肪−アシル基が生じる。次に新しいマロニル基と縮合して延長プロセスを繰り返すブチリル基の能力が、再生する。脂肪アシル基が炭素１６個の長さになったら、チオエステラーゼ活性がそれを加水分解して遊離パルミチン酸を放出する。
【０１１０】
脂肪酸合成は、次式によって要約し得る（Ｈ+および水を無視する）：アセチル−ＣｏＡ＋７マロニル−ＣｏＡ＋１４ＮＡＤＰＨ→パルミチン酸＋７ＣＯ2＋１４ＮＡＤＰ+＋８ＣｏＡ。
【０１１１】
パルミチン酸のさらなる延長および酸化は、ミトコンドリアまたは小胞体どちらかの中で起こり得る。パルミチン酸（１６：０）およびＣ２延長された形態のステアリン酸（１８：０）は、それぞれの一不飽和形態、すなわちパルミトレイン酸（１６：１）およびオレイン酸（１８：１）に不飽和化し得る。この過程は小胞体膜で触媒されて、リン脂質生合成のための脂肪酸を提供する。パルミチン酸は、酸化のためにミトコンドリアマトリックスまたはペルオキシソームマトリックスに運び戻されてもよい。
【０１１２】
脂肪酸の主要な貯蔵単位であるトリアシルグリセロール［「ＴＡＧ」］は、以下が関与する一連の反応によって形成される。１）リゾホスファチジン酸を生じる、アシルトランスフェラーゼによるアシル−ＣｏＡの１分子のグリセロール−３−リン酸塩へのエステル化；２）一般にホスファチジン酸として同定される１，２−ジアシルグリセロールリン酸塩を生じる、アシルトランスフェラーゼによるアシル−ＣｏＡの第２の分子のエステル化；３）１，２−ジアシルグリセロール［「ＤＡＧ」］を生じる、ホスファチジン酸ホスファターゼによるホスフェートの除去；および４）ＴＡＧを形成する、アシルトランスフェラーゼの作用による第３の脂肪酸の付加。
【０１１３】
飽和および不飽和脂肪酸および短鎖および長鎖脂肪酸をはじめとする、幅広い脂肪酸をＴＡＧに組み込み得る。アシルトランスフェラーゼによってＴＡＧに組み込み得る脂肪酸の制限を意図しない例のいくつかとしては、カプリン（１０：０）、ラウリン（１２：０）、ミリスチン（１４：０）、パルミチン（１６：０）、パルミトレイン（１６：１）、ステアリン（１８：０）、オレイン（１８：１）、バクセン（１８：１）、リノール（１８：２）、エレオステアリン（１８：３）、γ―リノレン（１８：３）、α−リノレン（１８：３）、ステアリドン（１８：４）、アラキジン（２０：０）、エイコサジエン（２０：２）、ジホモ−γ−リノレン酸（２０：３）、エイコサトリエン（２０：３）、アラキドン（２０：４）、エイコサア−テトラエン（２０：４）、エイコサ−ペンタエン（２０：５）、ベヘン（２２：０）、ドコサ−ペンタエン（２２：５）、ドコサ−ヘキサエン（２２：６）、リグノセリン（２４：０）、ネルボン（２４：１）、セロチン（２６：０）、およびモンタン（２８：０）脂肪酸が挙げられる。
【０１１４】
本明細書に記載されるのはトランスジェニック生物中のマロン酸含量を操作する方法であり、前記マロン酸はイオン化形態のマロン酸、ならびにそのエステルおよび塩を含んでなる。方法は、
ａ）適切な制御配列の制御下にある少なくとも１つのマロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする遺伝子を含んでなる、少なくとも１つの生成物の発酵に有用なトランスジェニック生物を提供するステップと、
ｂ）前記トランスジェニック生物と（トランスジェニックか非トランスジェニックかにかかわらず）同一の生物が生成するマロン酸量と比較して低下した量のマロン酸を発酵副産物として生成するように、トランスジェニック生物を成長させてマロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする少なくとも１つの遺伝子を発現させるステップ
を含んでなるが、ただし前記同一の生物は、
（ｉ）マロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする遺伝子を含まない、または
（ｉｉ）発現されないマロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする遺伝子を含んでなる。
【０１１５】
いくつかの実施態様では、マロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする少なくとも１つの遺伝子は、配列番号２、配列番号４、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２からなる群から選択されるアミノ酸列によってコードされる。例えば配列番号２のマロニル−ＣｏＡシンセターゼは、配列番号１または配列番号３に記載のヌクレオチド配列によってコードされてもよい。
【０１１６】
好ましくは、マロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする少なくとも１つの配列は、少なくとも１つの強力なプロモーターの制御下にあり、当業者は遺伝子発現もまた、マルチコピー中での発現によって増大されてもよいことを理解するであろう。
【０１１７】
また本明細書に記載されるのは、上述の方法によって生成される、少なくとも１つのマロニル−ＣｏＡシンセターゼタンパク質を含んでなるトランスジェニック生物である。さらに具体的には、本明細書は、少なくとも１つの制御配列の制御下にある少なくとも１つのマロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする遺伝子を含んでなる、少なくとも１つの生成物の発酵に有用なトランスジェニック生物であって、前記トランスジェニック生物と（トランスジェニックか非トランスジェニックかにかかわらず）同一の生物が生成するマロン酸量と比較して低下した量のマロン酸を発酵副産物として生成するトランスジェニック生物について記載するが、ただし前記同一の生物は、
ａ）マロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする遺伝子を含まず、または
ｂ）発現されないマロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする遺伝子を含んでなる。
【０１１８】
トランスジェニック生物は、好ましくは藻類、真菌、ユーグレナ属、酵母、細菌、およびストラメノパイルからなる群から選択される。より好ましいのはそれらの乾燥細胞重量の少なくとも約２５％を油として蓄積するような、油性生物に分類される生物である。例えば好ましい油性酵母としては、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）属からのものが挙げられる。
【０１１９】
「少なくとも１つの生成物」とは、発酵によって生じる、あらゆる生体触媒的に生成された対象の一次産物を指す。生成物は天然で生物によって生成される化合物であってもよく、または非天然遺伝子を発酵中のそれらの機能的発現のために生物に遺伝子操作で組み込んで、それによって天然では生物によって生成されない生成物をもたらしてもよい。顕著には異種性マロニル−ＣｏＡシンセターゼの発現は、（トランスジェニックか非トランスジェニックかに関わらず同一生物の生産性と比較して）少なくとも１つの生成物容積生産性または最終力価に対して実質的な悪影響を与えない（が、ただし同一生物は、（ｉ）マロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする遺伝子を含まず、または（ｉｉ）発現されないマロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする遺伝子を含んでなる）。
【０１２０】
いくつかの実施態様では、少なくとも１つのマロニル−ＣｏＡシンセターゼを含んでなるトランスジェニック生物は少なくとも１つの遺伝的変異をさらに含んでなる。例えば出願人らは、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株中の少なくとも１つの天然ペルオキシソーム形成因子タンパク質［「ＰＥＸ」］の欠損が、副産物マロン酸の生成増大と併行して、有利には総脂質画分中および油画分中の多価不飽和脂肪酸［「ＰＵＦＡ」］の生成増大をもたらすことを観察した。ＰＥＸ欠損を含んでなるいくつかのＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株の構築については、米国特許出願第１２／２４４９５０号明細書［Ｅ．Ｉ．ｄｕ  Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ  ＆  Ｃｏ．Ｉｎｃ．代理人整理番号ＣＬ３８４７］に記載され；好ましい欠損は、以下のＰｅｘ遺伝子のいずれかの中にある：ＹｌＰｅｘ１ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ８２１７８）、ＹｌＰｅｘ２ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７７６４７）、ＹｌＰｅｘ３ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７８５６５）、ＹｌＰｅｘ３Ｂｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ８３３５６）、ＹｌＰｅｘ４ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７９１３０）、ＹｌＰｅｘ５ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７８８０３）、ＹｌＰｅｘ６ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ８２３０６）、ＹｌＰｅｘ７ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７８３８９）、ＹｌＰｅｘ８ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ８０４４７）、ＹｌＰｅｘ１２ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ８１５３２）、ＹｌＰｅｘ１３ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ８１７８９）、ＹｌＰｅｘ１４ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７９３２３）、ＹｌＰｅｘ１６ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７９６２２）、ＹｌＰｅｘ１７ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ８４０２５）、ＹｌＰｅｘ１９ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＫ８４８２７）、ＹｌＰｅｘ２０ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７９２２６）、ＹｌＰｅｘ２２ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７７８７６）、およびＹｌＰｅｘ２６ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ_００６０７２、ヌクレオチド１１７２３０〜１１８３８７のアンチセンス翻訳）。実施例に記載されるように、これらのＰｅｘ欠損ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株中の増大するマロン酸副産物生成は、異種性マロニル−ＣｏＡシンセターゼの発現によってＰＵＦＡ生産性に悪影響を与えることなく実質的に低下される。
【０１２１】
したがって本発明の好ましい一実施態様では、トランスジェニックヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種宿主細胞について記載され、
宿主細胞は、
ａ）少なくとも１つの天然ペルオキシソーム形成因子タンパク質の欠損である少なくとも１つの遺伝的変異、および
ｂ）少なくとも１つの制御配列の制御下のマロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、および
ｃ）機能性多価不飽和脂肪酸生合成経路をコードする遺伝子
を含んでなる。
【０１２２】
当業者は、少なくとも１つの生成物の発酵中に許容できない量のマロン酸の生成をもたらす、トランスジェニック生物中のその他の遺伝的変異を同定できるであろう。少なくとも１つの制御配列の制御下にある少なくとも１つのマロニル−ＣｏＡシンセターゼ遺伝子の発現は、前記トランスジェニック生物と（トランスジェニックか非トランスジェニックかにかかわらず）同一の生物が生成するマロン酸量と比較して低下した量のマロン酸を発酵副産物として生成するトランスジェニック生物をもたらすが、ただし前記同一の生物は、（ｉ）マロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする遺伝子を含まない、または（ｉｉ）発現されないマロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする遺伝子を含んでなる。
【０１２３】
マロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする読み取り枠［「ＯＲＦ」］を含んでなる組み換え構築物作り出して、発酵に有用な生物に導入する必要がある。当業者は、１）ＤＮＡ分子、プラスミドなどの巨大分子構築、操作、および単離のための特定条件および処置；２）組み換えＤＮＡ断片および組み換え発現構築物の作成；および３）クローンのスクリーニングおよび単離について記載する、標準的資料について承知している。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２nd  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）；Ｍａｌｉｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９９５）；Ｂｉｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｅｎｅｓ，ｖ．１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９９８）；Ｂｉｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ＤＮＡ，ｖ．２，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ：ＮＹ（１９９８）；Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｌａｒｋ，ｅｄ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ：ＮＹ（１９９７）を参照されたい。
【０１２４】
一般に構築物に含める配列の選択は、所望の発現産物、宿主細胞の性質、および非形質転換細胞から形質転換細胞を分離するのに提案される手段に左右される。当業者は、キメラ遺伝子を含有する宿主細胞を成功裏に形質転換し、選択し、増殖させるのに、プラスミドベクター上に存在しなくてはならない遺伝的要素を承知している。しかし典型的にベクターまたはカセットは、関連遺伝子の転写および翻訳を指示する配列、選択可能なマーカー、および自律複製または染色体の組み込みを可能にする配列を含有する。適切なベクターは、転写開始を制御する遺伝子の領域５’、すなわちプロモーターと、転写終結を制御するＤＮＡ断片の領域３’、すなわちターミネーターとを含んでなる。双方の制御領域が、形質転換宿主細胞からの遺伝子に由来することが最も好ましい。
【０１２５】
所望の宿主細胞中において異種遺伝子またはその部分の発現を促進するのに有用な開始制御領域またはプロモーターは多数あり、良く知られている。これらの制御領域としては、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、イントロン配列、３’ＵＴＲおよび／または５’ＵＴＲ領域、およびタンパク質および／またはＲＮＡ安定化要素が挙げられる。このような要素はそれらの強度および特異性が異なっていてもよい。実質的に、選択された宿主細胞中においてこれらの遺伝子の発現を指示できるあらゆるプロモーター、すなわち天然、合成、またはキメラが適切である。宿主細胞中における発現は、誘導的または構成的に起こり得る。誘導的発現は、対象のマロニル−ＣｏＡシンセターゼ遺伝子と作動的に連結する調節可能なプロモーターの活性を誘導することによって起きる。構成的発現は、対象の遺伝子と作動的に連結する構成的プロモーターを使用することによって起きる。
【０１２６】
宿主細胞が例えば酵母である場合、酵細胞中で機能する転写および翻訳領域は特に宿主種から提供される。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で使用するのに好ましい転写開始調節領域については、国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットを参照されたい。構成的または誘導的転写が所望されるかどうか、対象のＯＲＦを発現するプロモーターの効率、構築の容易さなどに応じて、いくつもの制御配列を使用してもよい。
【０１２７】
転写終結シグナルをコードする３’非コード配列、すなわち「終結領域」が、組み換え構築物中に提供されなくてはならず、開始領域を得た遺伝子からの３’領域、または異なる遺伝子からの３’領域であってもよい。多数の終結領域が知られており、それらが由来するのと同一のおよび異なる属および種のどちらで利用しても、多様な宿主中で満足に機能する。終結領域は特定の特質についてでなく、より便宜的に選択される。終結領域はまた、好ましい宿主に天然の様々な遺伝子に由来してもよい。
【０１２８】
酵母中で使用するのに特に有用な終結領域は、酵母遺伝子、特にサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）またはクリヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）に由来する。哺乳類のγ−インターフェロンおよびα−２インターフェロンをコードする遺伝子３’領域は、酵母中でもまた機能することが知られている。当業者は入手できる情報を利用して、転写ターミネーターとして機能する３’領域配列をデザインおよび合成し得るので、３’領域もまた合成し得る。終結領域は不要かもしれないが、高度に好ましい。
【０１２９】
ベクターは、上述の制御要素に加えて、選択可能なおよび／またはスコア可能なマーカーを含んでなってもよい。好ましくはマーカー遺伝子は抗生物質耐性遺伝子であり、細胞を抗生物質で処理することで、非形質転換細胞の成長阻害または死滅と、形質転換細胞の阻害されない成長がもたらされる。酵母形質転換体の選択のためには、カナマイシン、ハイグロマイシン、およびアミノグリコシドＧ４１８に対する抵抗性がある、酵母中で機能するあらゆるマーカーが有用であり、ウラシル、リジン、ヒスチジンまたはロイシンを欠く培地上の成長能力が特に有用である。
【０１３０】
遺伝子をクローニングベクターに単に挿入することは、所望の速度、濃度、量などでのその発現を保証しない。高発現率に対する必要に応えて、転写、ＲＮＡ安定性、翻訳、タンパク質安定性および位置、酸素制限、および宿主細胞からの分泌を制御する、いくつかの異なる遺伝的要素を操作することにより、多数の特殊発現ベクターが作り出されている。操作される特徴のいくつかとしては、次が挙げられる。関与する転写プロモーターおよびターミネーター配列の性質、クローン遺伝子コピー数、遺伝子がプラスミド由来であるかまたは宿主細胞のゲノム中に組み込まれているかどうか、合成外来性タンパク質の最終的細胞内所在、宿主生物中のタンパク質翻訳および正しい折りたたみの効率、宿主細胞中のクローン遺伝子のｍＲＮＡおよびタンパク質の固有の安定性、およびその使用頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近くなるようなクローン遺伝子中のコドン使用頻度。これらのそれぞれを本明細書に記載される方法および宿主細胞中で使用して、マロニル−ＣｏＡシンセターゼ遺伝子の発現をさらに最適化してもよい。
【０１３１】
プロモーター、マロニル−ＣｏＡシンセターゼＯＲＦ、およびターミネーターを含んでなる、少なくとも１つのキメラ遺伝子を含んでなる組み換え構築物を作り出した後、それを宿主細胞中で自律複製できるプラスミドベクターに入れ、または宿主細胞のゲノムに直接組み込む。発現カセットの組み込みは、宿主ゲノム内で無作為に起こり得て、または宿主遺伝子座との遺伝子組み換えを標的とするのに十分な宿主ゲノムとの相同性領域を含有する構築物の使用を通じて、標的を定め得る。構築物が内在性遺伝子座に標的を定めると、全てのまたは一部の転写および翻訳調節領域を内在性遺伝子座によって提供し得る。
【０１３２】
別々の複製ベクターから２つ以上の遺伝子が発現する場合、各ベクターは異なる選択手段を有してもよく、他の構築物に対する相同性を欠いて、安定した発現を維持し、構築物中の要素の再集合を防止すべきである。調節領域、選択手段、および導入構築物増殖方法の思慮深い選択は、全ての導入された遺伝子が必要なレベルで発現して、所望の生成物の合成を提供するように実験的に判定し得る。
【０１３３】
対象の遺伝子を含んでなる構築物は、あらゆる標準的技術によって宿主細胞に導入してもよい。これらの技術としては、形質転換（例えば酢酸リチウム形質転換（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４：１８６−１８７（１９９１））、プロトプラスト融合、微粒子銃衝撃、電気穿孔、マイクロインジェクション、真空濾過または宿主細胞中に対象の遺伝子を導入するその他のあらゆる方法が挙げられる。
【０１３４】
便宜上、例えば発現カセット内にＤＮＡ配列を取り込むように、あらゆる方法によって操作されている宿主細胞を「形質転換された」または「組み換え」と本願明細書中で称する。形質転換された宿主は、遺伝子がゲノム中に組み込まれるか、増幅されるか、または複数のコピー数を有する染色体外因子上に存在するかどうか次第で、発現構築物の少なくとも１つのコピーを有し、２つ以上を有してもよい。
【０１３５】
形質転換宿主細胞は、導入される構築物上に含有されるマーカーを選択することで同定し得る。代案としては、多数の形質転換技術は多数のＤＮＡ分子を宿主細胞に導入するので、別個のマーカー構築物を所望の構築物と共に同時形質転換してもよい。
【０１３６】
典型的に、形質転換された宿主は、選択培地上で成長するそれらの能力について選択され、選択培地には抗生物質が組み込まれていてもよく、または栄養素または成長因子などの非形質転換宿主の成長に必要な要素が欠如していてもよい。導入されたマーカー遺伝子は、形質転換された宿主中で発現すると抗生物質抵抗性を与えても、または必須成長因子または酵素をコードしてもよく、それによって選択培地上での成長を可能にする。形質転換された宿主の選択はまた、発現したマーカータンパク質を直接または間接に検出し得る場合にも起こり得る。マーカータンパク質は、単独で、または別のタンパク質との融合物として発現されてもよい。マーカータンパク質またはタグを発現する細胞は、例えば視覚的に、または蛍光活性化細胞選別または抗体を使用したパニングなどの技術によって選択し得る。
【０１３７】
異なる独立した形質転換事象は異なるレベルとパターンの発現をもたらすので、選択される宿主または発現構築物に関わらず、複数の形質転換体をスクリーニングして所望の発現レベル、制御、およびパターンを示す株または系統を得なくてはならない（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，４：２４１１−２４１８（１９８５）；Ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２１８：７８−８６（１９８９））。このようなスクリーニングは、ＤＮＡブロットのサザン分析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３（１９７５））、ｍＲＮＡ発現のザン分析（Ｋｒｏｃｚｅｋ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｐｐｌ．，６１８（１−２）：１３３−１４５（１９９３））、タンパク質発現のウェスタンおよび／またはＥｌｉｓａ分析、有機酸レベルのあらゆる変化を検出する、発酵ブロスの表現型分析またはイオンクロマトグラフィー分析によって達成されてもよい。
【０１３８】
本開示の方法で記載されるように、多様な真核生物が、異種性マロニル−ＣｏＡシンセターゼを含んでなるトランスジェニック生物の役割を果たすのに適切である。発酵槽内で成長し得る様々な真菌、藻類、卵菌綱、酵母、ストラメノパイル、細菌および／またはユーグレナ属が有用な宿主かもしれない。
【０１３９】
場合によっては、油性生物が好ましい。油性生物は天然で油を合成および蓄積でき、一般にそれらの乾燥細胞重量の約２５％超を油として累積する。様々な藻類、コケ、真菌、酵母、ストラメノパイル、および植物が天然で油性に分類される。代案の実施態様では、例えばサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のような酵母などの非油性生物を遺伝子改変して油性にし得る。
【０１４０】
より好ましい油性の微生物としては、ω−３／ω−６ＰＵＦＡを自然に生成する藻類、ストラメノパイルおよび真菌生物が挙げられる。例えばＡＲＡ、ＥＰＡおよび／またはＤＨＡが、キクロテラ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）種、ニッチア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）種、クサレカビ（Ｐｙｔｈｉｕｍ）、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種、およびモルティエラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）によって生成される。Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）の形質転換法については、Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６６：４６５５（２０００））に記載される。同様に、ヤブレツボカビ目（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）微生物（例えばスラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ））の形質転換法については、米国特許第７,００１,７７２号明細書で開示される。
【０１４１】
より好ましいのは、ω−３／ω−６ＰＵＦＡを自然に生成するもの、および生成するように遺伝子改変されたものをはじめとする油性酵母である（後述）。油性酵母として典型的に同定された属としては、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）が挙げられるがこれに限定されるものではない。さらに具体的には、例証的な油合成酵母としては、ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、リポマイセス・スターケイ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙｉｉ）、Ｌ．リポフェラス（Ｌ．ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）、カンジダ・レブカウフィ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｅｖｋａｕｆｉ）、Ｃ．プリケリーマ（Ｃ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．ユチリス（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ）、トリコスポロン・プランズ（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌａｎｓ）、Ｔ．クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）、ロドトルラ・グルチヌス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｕｓ）、Ｒ．グラミニス（Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（以前はカンジダ・リポリチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に分類された）が挙げられる。
【０１４２】
最も好ましい油性酵母は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）であり、最も好ましいのはＡＴＣＣ＃７６９８２、ＡＴＣＣ＃２０３６２、ＡＴＣＣ＃８８６２、ＡＴＣＣ＃１８９４４および／またはＬＧＡＭ  Ｓ（７）１と称されるＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株である（Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ  Ｓ．，ａｎｄ  Ａｇｇｅｌｉｓ  Ｇ．，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，８２（１）：４３−９（２００２））。
【０１４３】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換に関する特定の教示としては、米国特許第４,８８０,７４１号明細書および米国特許第５,０７１,７６４号明細書、およびＣｈｅｎ，Ｄ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４８（２）：２３２−２３５（１９９７））が挙げられる一方、適切な選択技術については米国特許第７,２３８,４８２号明細書、米国特許第７,２５９,２５５号明細書、および国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットに記載される。
【０１４４】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で遺伝子を発現する好ましい方法は、宿主のゲノムへの線状ＤＮＡの組み込みによる。Ｕｒａ３遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ３０６４２１）、Ｌｅｕ２遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２６０２３０）、Ｌｙｓ５遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ３４９２９）、Ａｃｏ２遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ００１３００）、Ｐｏｘ３遺伝子座（Ｐｏｘ３：ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ_５０３２４４またはＡｃｏ３：ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ００１３０１）、Δ１２デサチュラーゼ遺伝子座（米国特許第号明細書.７,２１４,４９１）、Ｌｉｐ１遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｚ５００２０）、Ｌｉｐ２遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ０１２６３２）、ＳＣＰ２遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ４３１３６２）、Ｐｅｘ３遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７８５６５）、Ｐｅｘ１６遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７９６２２）および／またはＰｅｘ１０遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ８１６０６）など、ゲノム内の複数の位置への組み込みは、遺伝子の高レベル発現が所望される場合に特に有用であり得る。
【０１４５】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で使用される好ましい選択法としては、カナマイシン、ハイグロマイシン、およびアミノグリコシドＧ４１８抵抗性と、ウラシル、ロイシン、リジン、トリプトファンまたはヒスチジンを欠く培地上で成長する能力とが挙げられる。５−フルオロオロト酸［５−フルオロウラシル−６−カルボン酸一水和物または「５−ＦＯＡ」］もまた、酵母Ｕｒａ-変異体の選択のために使用してもよい。この化合物は、オロチジン５’−一リン酸脱炭酸酵素［ＯＭＰデカルボキシラーゼ］をコードする機能性ＵＲＡ３遺伝子を有する酵母細胞にとって有毒であるので、この毒性に基づいて、５−ＦＯＡはＵｒａ-変異体酵母株の選択および同定に特に有用である（Ｂａｒｔｅｌ，Ｐ．Ｌ．ａｎｄ  Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．，Ｙｅａｓｔ  ２−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｖ．７，ｐｐ１０９−１４７，１９９７；ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中での５−ＦＯＡ使用については、国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットもまた参照されたい）。
【０１４６】
ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）で使用される代案の好ましい選択法は、スルホニル尿素（クロリムロンエチル；Ｅ．Ｉ．ｄｕＰｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ  ＆  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ））抵抗性に基づいた、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のための優性非抗生物質マーカーに依存する。より具体的にはマーカー遺伝子は、スルホニル尿素除草剤抵抗性を与える単一アミノ酸変化、すなわちＷ４９７Ｌを有する天然アセトヒドロキシ酸シンターゼ（「ＡＨＡＳ」またはアセト乳酸シンターゼ、Ｅ．Ｃ．４．１．３．１８）である（国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット）。ＡＨＡＳは、分枝鎖アミノ酸、すなわちバリン、ロイシン、イソロイシンの生合成経路中の最初の共通酵素であり、それはスルホニル尿素およびイミダゾリノン除草剤の標的である。
【０１４７】
トランスジェニック生物は、マロン酸の生成を制御しながら、少なくとも１つの生成物の生成を最適化する条件下で成長させる。これは生物中の炭素およびエネルギー浪費を低下させ、ならびに発酵廃棄蒸気中の最適ｐＨ範囲を保ちながら、発酵中に中和を要する有機酸副産物の量を低下させる。最適には、異種性マロニル−ＣｏＡシンセターゼを含んでなる生物の発酵は、少なくとも１つの生成物の総製造費用を低下させるであろう。
【０１４８】
一般に培地条件は、炭素源のタイプおよび量、窒素源のタイプおよび量、炭素−対−窒素比、異なる無機イオンの量、酸素レベル、成長温度、ｐＨ、バイオマス生成相の長さ、油蓄積相の長さ、および細胞収集時間と方法を修正することで最適化してもよい。例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）などの対象の油性酵母を一般に、酵母抽出物−ペプトン−デキストロースブロス［「ＹＰＤ」］などの天然培地内で、合成最少培地内で、または成長に必要な構成要素を欠いて所望の発現カセットの選択を強制する合成最少培地（例えばＹｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））内で、成長させる。
【０１４９】
本明細書に記載される方法およびトランスジェニック生物のための発酵培地は、米国特許.７,２３８,４８２号明細書で教示されるような適切な炭素源を含有しなくてはならない。適切な炭素源は多種多様な原料を包含し、グルコースや果糖などの糖、グリセロールおよび／または脂肪酸が好ましい。最も好ましいのはグルコースおよび／または１０〜２２個の炭素を含有する脂肪酸である。
【０１５０】
窒素は、無機原料（例えば（ＮＨ4）2ＳＯ4）または有機原料（例えば尿素またはグルタメート）から供給されてもよい。適切な炭素および窒素源に加えて、発酵培地はまた、適切なミネラル、塩、補助因子、緩衝液、ビタミン、および生物の成長と、少なくとも１つの生成物を生じられるようにする酵素的経路の促進とに適することが当業者に知られている、その他の構成要素を含有しなくてはならない。
【０１５１】
少なくとも１つの生成物を生じるために、多様な発酵工程デザイン（例えばバッチ、流加または連続）を応用してもよいことが考察される。バッチ発酵プロセスは閉鎖システムであり、培地組成がプロセス開始時に固定され、プロセス中にｐＨおよび酸素レベル維持のために必要とされるもの以外は、さらなる追加を受けない。したがって培養プロセスの始めに所望の生物体を培地に接種し、培地への追加的原料（すなわち炭素および窒素源）の添加なしに、成長または代謝活動が起きる。バッチプロセスでは、システムの代謝産物およびバイオマスの組成は、培養が終結するまで絶えず変化する。典型的なバッチプロセスでは、細胞は静止遅滞期から高対数増殖期を通過して、最終的に発育速度が低下または停止する定常期に進行する。処置されない場合、定常期の細胞は次第に死滅する。
【０１５２】
標準バッチプロセスのバリエーションが供給バッチプロセスであり、発酵プロセス経過中に炭素源が発酵槽に連続的に添加される。供給バッチプロセスもまた、本明細書では適している。供給バッチプロセスは、分解産物抑制が細胞代謝を阻害する傾向がある場合に、またはあらゆる時点で培地中に限定量の炭素源を有することが望ましい場合に有用である。供給バッチシステム中の炭素源濃度の測定は困難であるので、ｐＨ、溶解酸素、および排ガス（例えばＣＯ2）などの測定可能な要素の変化に基づいて推定してもよい。バッチおよび供給バッチ培養方法は一般的であって技術分野でよく知られており、実例はＴｈｏｍａｓ  Ｄ．  Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２nd  ｅｄ．，（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ；またはＤｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６：２２７（１９９２）にある。
【０１５３】
代案としては、生成物の回収のため等量の培養物を除去するのと同時に、合成培地をバイオリアクター内に連続的に添加すると、連続発酵プロセスが起きる。連続培養は、一般に細胞を一定細胞密度の対数増殖期に保つ。連続または半連続培養法は、細胞の成長または最終生成物濃度に影響する１つの因子、またはあらゆる数の因子の調節を可能にする。例えば１つのアプローチでは炭素源を制限して、あらゆるその他のパラメーターが代謝を調節できるようにしてもよい。別のシステムでは、培地濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、成長に影響するいくつかの因子を連続的に変化させてもよい。連続システムは定常状態の成長を維持することを目指すので、細胞成長率は、培養から培地が抜き取られることによる細胞損失に対してバランスが取れていなくてはならない。連続培養プロセスのために栄養素および成長因子を調節する方法、ならびに生成物形成速度を最大化する技術は工業微生物学の技術分野でよく知られており、多様な方法がＢｒｏｃｋ、前出で詳述される。
【０１５４】
好ましい実施態様の説明
オレイン酸（１８：１）がω−３／ω−６脂肪酸に転換される代謝過程は、炭素原子の付加を通じた炭素鎖の延長、および二重結合の付加を通じた分子の不飽和化を伴う。これは小胞体膜中に存在する一連の特有な延長および不飽和化酵素を必要とする。しかし図３に示されまた下述するように、特定のω−３／ω−６脂肪酸生成のための複数の代案の経路が存在することが多い。
【０１５５】
具体的には、図３は下述の経路を描写する。全ての経路は、オレイン酸がΔ１２デサチュラーゼによって、第１のω−６脂肪酸であるリノール酸［「ＬＡ」］に最初に転換されることを要する。次に「Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路」および基質としてＬＡを使用して、長鎖ω−６脂肪酸が次のように形成される。１）ＬＡがΔ６デサチュラーゼによってγ−リノレン酸［「ＧＬＡ」］に転換され；２）ＧＬＡがＣ18/20エロンガーゼによってジホモ−γ−リノレン酸［「ＤＧＬＡ」］に転換され；３）ＤＧＬＡがΔ５デサチュラーゼによってアラキドン酸［「ＡＲＡ」］に転換され；４）ＡＲＡがＣ20/22エロンガーゼによってドコサテトラエン酸［「ＤＴＡ」］に転換され；５）ＤＴＡがΔ４デサチュラーゼによってドコサペンタエン酸［「ＤＰＡｎ−６」］に転換される。
【０１５６】
代案としては、「Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路」はまた、基質としてα−リノレン酸［「ＡＬＡ」］を使用して長鎖ω−３脂肪酸を次のように生成し得る。１）ＬＡがΔ１５デサチュラーゼによって第１のω−３脂肪酸ＡＬＡに転換され；２）ＡＬＡがΔ６デサチュラーゼによってステアリドン酸［「ＳＴＡ」］に転換され；３）ＳＴＡがＣ18/20エロンガーゼによってエイコサテトラエン酸［「ＥＴＡ」］に転換され；４）ＥＴＡがΔ５デサチュラーゼによってエイコサペンタエン酸［「ＥＰＡ」］に転換され；５）ＥＰＡがＣ20/22エロンガーゼによってドコサペンタエン酸［「ＤＰＡ」］に転換され；６）ＤＰＡがΔ４デサチュラーゼによってドコサヘキサエン酸［「ＤＨＡ」］に転換される。ω−６脂肪酸がω−３脂肪酸に転換されていてもよい。例えばＥＴＡおよびＥＰＡはΔ１７デサチュラーゼ活性によって、それぞれＤＧＬＡおよびＡＲＡから生成される。
【０１５７】
ω−３／ω−６脂肪酸の生合成のための代案の経路は、Δ９エロンガーゼおよびΔ８デサチュラーゼ、すなわち「Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路」を利用する。さらに具体的には、Δ９エロンガーゼによって、ＬＡおよびＡＬＡがそれぞれＥＤＡおよびＥＴｒＡに転換されてもよい。次にΔ８デサチュラーゼは、ＥＤＡをＤＧＬＡにおよび／またはＥＴｒＡをＥＴＡに転換する。引き続いて下流ＰＵＦＡが上述のように形成される。
【０１５８】
本明細書のトランスジェニック生物は、好ましくは天然で、または遺伝子操作技術を通じてのどちらかでＰＵＦＡを生成する能力を有する。多数の微生物が通常の細胞代謝過程において（ω−３／ω−６脂肪酸をはじめとする）ＰＵＦＡを合成し得て、そのいくつかは商業的に培養し得るが、医薬品、食餌代用物、メディカルフード、栄養補給剤、その他の食品、工業油脂化学またはその他の最終用途で使用するのに所望される含油量と組成を有する油を生成する生物は、わずかまたは皆無である。したがって「デザイナー」脂質および油の生成のために微生物を操作する能力がさらに重要視されるようになっており、脂肪酸含量および組成は遺伝子操作によって注意深く規定される。これに基づいて、宿主は機能性ＰＵＦＡ生合成経路をコードする異種遺伝子を含んでなる可能性が高いが、必ずしも必須ではないことが予期される。
【０１５９】
宿主生物が天然では所望のＰＵＦＡを生成しない、または所望の脂質プロフィールを有さない場合、当業者は、選択された宿主生物に、ＰＵＦＡ生合成のための適切な酵素をコードする１つ以上の発現カセットを導入するのに必要な考察事項、および技術に精通している。文献において、このような発現カセットを様々な宿主生物に導入するための多数の教示が、当業者に提供される。宿主生物ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）を使用した、次のようないくつかの参考文献が提供される。米国特許第７,２３８,４８２号明細書、米国特許第７,４６５,５６４号明細書、米国特許第７,５５０,２８６号明細書、米国特許第７,５８８,９３１号明細書、米国特許出願公開第２００６／０１１５８８１−Ａ１号明細書、および米国特許出願公開第２００９−／００９３５４３−Ａ１号明細書。この一覧は網羅的でなく、制限的と見なすべきではない。
【０１６０】
簡単に述べると、宿主細胞中に存在するまたはそれに形質転換される、ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の脂肪酸基質および特定遺伝子次第で、多様なω−３／ω−６ＰＵＦＡ生成物を生じた後に、それらをＴＡＧに転移し得る。したがって所望の脂肪酸生成物の生成は、直接または間接的に起こり得る。直接生成は、脂肪酸基質が、いかなる中間過程も経路中間体もなしに所望の脂肪酸生成物に直接転換される場合に起きる。間接生成は、所望のＰＵＦＡを生成する一連の反応が起きるような組み合わせで、ＰＵＦＡ生合成経路をコードする同義遺伝子が使用されてもよい場合に起きる。具体的にはＥＰＡの過剰生成のために、Δ１２デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Ｃ18/20エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、およびΔ１７デサチュラーゼを含んでなる発現カセットで油性酵母を形質転換することが望ましいかもしれない。米国特許第７，２３８，４８２号明細書および国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットを参照されたい。当業者に良く知られているように、ＰＵＦＡ生合成経路の酵素をコードする遺伝子のその他の様々な組み合わせが、油性生物中での発現に有用かもしれない（図３参照）。特定の発現カセット内に含まれる特定の遺伝子は宿主生物、そのＰＵＦＡプロフィールおよび／またはデサチュラーゼ／エロンガーゼプロフィール、基質可用性、および所望の最終産物に左右される。
【０１６１】
ＧｅｎＢａｎｋ、特許文献、およびＰＵＦＡ生成能力を有する生物の実験解析などの公的に入手可能な文献に従って、所望のデサチュラーゼおよび／またはエロンガーゼ活性を有するいくつかの候補遺伝子が同定し得る。有用なデサチュラーゼおよびエロンガーゼ配列は、例えば細菌、藻類、真菌、卵菌類、酵母、植物、動物などからの天然原料から単離されたあらゆる起源に由来してもよく、半合成経路または新規合成によって生成される。これらの候補遺伝子の同定に続いて、デサチュラーゼまたはエロンガーゼ活性を有する特定のポリペプチドを選択する上での検討事項としては、次が挙げられる。１）ポリペプチドの基質特異性；２）ポリペプチドまたはその構成要素が律速酵素であるかどうか；３）デサチュラーゼまたはエロンガーゼが所望のＰＵＦＡの合成に必須であるかどうか；４）ポリペプチドに必要な補助因子；５）ポリペプチドの生成後に、それがキナーゼまたはプレニル基転移酵素などによって修飾されるかどうか；および／または６）ポリペプチドがその生成に続いて物理的に適切な細胞内の位置にあるかどうか。
【０１６２】
発現されるポリペプチドは、好ましくは宿主細胞中のその位置の生化学的環境に適したパラメーターを有する。米国特許第７，２３８，４８２号明細書を参照されたい。特定の各デサチュラーゼおよび／またはエロンガーゼの転換効率を考慮することもまた、有用かもしれない。より具体的には各酵素は、基質を生成物に転換する際、滅多に１００％の効率では機能しないので、宿主細胞中に生じる未精製油の最終脂質プロフィールは、典型的に所望のω−３／ω−６脂肪酸、ならびに様々な上流中間ＰＵＦＡからなる様々なＰＵＦＡの混合物である。したがって各酵素の転換効率もまた、所望の脂肪酸の生合成を最適化する際に考慮すべき変数である。
【０１６３】
典型的に油性酵母菌細胞中の相当量のＰＵＦＡおよびＴＡＧの蓄積は、代謝状態が成長と脂肪合成／貯蔵との間で「平衡状態」でなくてはならないので、二段階プロセスを必要とする（米国特許第７,２３８,４８２号明細書参照）。このアプローチでは、発酵の第１段階は細胞集団の生成および蓄積のみを行い、迅速な細胞成長および細胞分割によって特徴づけられる。発酵の第２段階では、培養内の窒素欠乏条件を確立して、高レベルの脂質蓄積を促進することが好ましい。炭素／窒素比は約４０を超えることが多く、好ましくは約５０を超え、より好ましくは約６０を超える。この窒素欠乏の効果は、細胞内のＡＭＰの有効濃度を低下させることにより、ミトコンドリアのＮＡＤ−依存イソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性を低下させることである。これが起きるとクエン酸が蓄積するので、細胞質中に豊富なアセチル−ＣｏＡのプールが形成し、脂肪酸合成の下準備をする。したがってこの相は、細胞分割休止と、それに続く脂肪酸合成および油蓄積によって特徴づけられる。
【０１６４】
本明細書に記載される方法および宿主細胞に好ましい増殖培地は、酵母菌窒素ベース（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））などの一般的な市販の調製培地である。その他の合成または人工増殖培地もまた使用してもよく、トランスジェニック生物の成長に適する培地は、微生物学または発酵科学で良く知られている。発酵に適したｐＨ範囲は、典型的に約ｐＨ４．０〜ｐＨ８．０の間であり、ｐＨ５．５〜ｐＨ７．５が初期成長条件の範囲として好ましい。発酵は好気性または好気性条件下で実施されてもよく、微好気条件が好ましい。
【０１６５】
脂質およびＰＵＦＡの合成を促進する、Ｆｅ+2、Ｃｕ+2、Ｍｎ+2、Ｃｏ+2、Ｚｎ+2、Ｍｇ+2などのいくつかの金属イオンが注目されている（Ｎａｋａｈａｒａ，Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｄ．Ａｐｐｌ．Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｏｉｌｓ，Ｄ．Ｊ．Ｋｙｌｅ  ａｎｄ  Ｒ．Ｃｏｌｉｎ，ｅｄｓ．ｐｐ６１−９７（１９９２）。
【実施例】
【０１６６】
本発明が具体的に完成することを例証するが、その可能なバリエーションの全てを完全には定義しない、以下の実施例で本発明をさらに説明する。
【０１６７】
一般方法
実施例で使用される標準組み換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、技術分野でよく知られており、１）Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）（Ｍａｎｉａｔｉｓ）；２）Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｎａｎ，ａｎｄ  Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）；および３）Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ（１９８７）で述べられている。
【０１６８】
微生物培養の維持および成長に適した材料および方法は、技術分野でよく知られている。以下の実施例で使用するのに適した技術は、次で述べられる。Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ，Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ，Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ，Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ  ａｎｄ  Ｇ．  Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｅｄｓ），Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４））；またはＴｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２nd  ｅｄ．，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８９）。微生物細胞の成長および維持のために使用される全ての試薬および材料は、特に断りのない限りＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ），ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ），Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ），ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、またはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得た。特に断りのない限り大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、典型的に３７℃でルリア・ベルターニ（ＬＢ）プレート上で成長させた。
【０１６９】
一般分子クローニングは、標準法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ.、前出）に従って実施した。ＤＮＡ配列は、ベクターと挿入断片特異的プライマーとの組み合わせを使用し、染料ターミネーター技術（米国特許第５,３６６,８６０号明細書；欧州特許第２７２,００７号明細書）を使用してＡＢＩ自動配列決定装置上で作成した。Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ,Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ,ＭＩ）内で配列編集を実施した。全ての配列は、双方向に少なくとも２回のカバレッジを表す。本明細書で特に断りのない限り、遺伝子配列比較はＤＮＡＳＴＡＲソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ.，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して行った。略語の意味は次の通り。「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「μＭ」はマイクロモル濃度を意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌｅ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「Ｕ」は単位を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋＢ」はキロベースを意味する。
【０１７０】
発現カセット命名法：
発現カセットの構造は簡易表記体系「Ｘ：：Ｙ：：Ｚ」によって表され、式中Ｘはプロモーター断片を記載し、Ｙは遺伝子断片を記載し、Ｚはターミネーター断片を記載し、これらは全て互いに作動的に連結する。
【０１７１】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換および培養
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２株は、米国微生物系統保存機関（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ,ＭＤ）から購入した。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株は、下記の配合に従ったいくつかの培地で２８〜３０℃で慣例的に成長させた。
高グルコース培地（ＨＧＭ）（リットル当たり：８０のグルコース、２.５８ｇのＫＨ2ＰＯ4、および５.３６ｇのＫ2ＨＰＯ4、ｐＨ７.５（調節不要）。
発酵培地（ＦＭ）（ｐｅｒ  ｌｉｔｅｒ）：６.７０ｇ／Ｌの酵母窒素ベース、６.００ｇのＫＨ2ＰＯ4、２.００ｇのＫ2ＨＰＯ4、１.５０ｇのＭｇＳＯ4*７Ｈ2Ｏ、２０ｇのグルコース、および５.００ｇの酵母抽出物（ＢＢＬ）。
【０１７２】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換は、参照によって本明細書に援用する米国特許出願公開第２００９／００９３５４３−Ａ１号明細書に記載されるように実施した。
【０１７３】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４３０５Ｕ株の単離
Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路発現を通じて総脂質との比較でＥＰＡを生成するＹ４３０５Ｕ株は、参照によって本明細書に援用する米国特許出願公開第２００８／０２５４１９１号明細書の一般方法に記載されるようにして作成した。簡単に述べると、図４に略図で示すように、Ｙ４３０５Ｕ株は、Ｙ２２２４株（野生型ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２株Ｕｒａ３遺伝子の自律突然変異からのＦＯＡ抵抗性変異体）、Ｙ４００１株（Ｌｅｕ−表現型で１７％ＥＤＡ産生）、Ｙ４００１Ｕ１株（Ｌｅｕ−およびＵｒａ−）、Ｙ４０３６株（Ｌｅｕ−表現型で１８％ＤＧＬＡ産生）、Ｙ４０３６Ｕ株（Ｌｅｕ−およびＵｒａ−）、Ｙ４０７０株（Ｕｒａ−表現型で１２％ＡＲＡの産生）、Ｙ４０８６株（１４％ＥＰＡ産生）、Ｙ４０８６Ｕ１株（Ｕｒａ３−）、Ｙ４１２８株（３７％ＥＰＡ産生；ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８６１４の名称で２００７年８月２３日に米国微生物系統保存機関に寄託）、Ｙ４１２８Ｕ３株（Ｕｒａ−）、Ｙ４２１７株（４２％ＥＰＡ産生）、Ｙ４２１７Ｕ２株（Ｕｒａ−）、Ｙ４２５９株（４６.５％ＥＰＡ産生）、Ｙ４２５９Ｕ２株（Ｕｒａ−）、およびＹ４３０５株（総ＴＦＡに対して５３.２％ＥＰＡ産生）の構築を通じて、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２から誘導される。
【０１７４】
Ｙ４３０５株の完全な脂質プロフィールは、次の通りであった：１６：０（２.８％）、１６：１（０.７％）、１８：０（１.３％）、１８：１（４.９％）、１８：２（１７.６％）、ＡＬＡ（２.３％）、ＥＤＡ（３.４％）、ＤＧＬＡ（２.０％）、ＡＲＡ（０.６％）、ＥＴＡ（１.７％）、およびＥＰＡ（５３.２％）。乾燥細胞総脂質重量％［「ＤＣＷ」］は２７.５であった。
【０１７５】
野性型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２と比較したＹ４３０５株の最終遺伝子型は、次の通りであった。ＳＣＰ２−（ＹＡＬＩ０Ｅ０１２９８ｇ），ＹＡＬＩ０Ｃ１８７１１ｇ−，Ｐｅｘ１０−，ＹＡＬＩ０Ｆ２４１６７ｇ−，ｕｎｋｎｏｗｎ  １−，ｕｎｋｎｏｗｎ  ３−，ｕｎｋｎｏｗｎ  ８−，ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０，ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：ＯＣＴ，ＧＰＭ／ＦＢＡＩＮ：：ＦｍＤ１２Ｓ：：ＯＣＴ，ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ，ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ｌｉｐ２，ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６，ＥＸＰ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０（３ｃｏｐｉｅｓ），ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１，ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２，ＦＢＡ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｐｅｘ２０，ＧＰＤ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２，ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２，ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ：：ＯＣＴ，ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０，ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１（２ｃｏｐｉｅｓ），ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６，ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ，ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５：：Ａｃｏ，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ｐｅｘ２０，ＹＡＴ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ａｃｏ，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：ＡＣＯ，ＹＡＴ１：：ＲＤ５Ｓ：：ＯＣＴ，ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１，ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６，ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ，ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ１：：ＡＣＯ，ＧＰＤ：：ＹｌＣＰＴ１：：ＡＣＯ（ここでＦｍＤ１２はフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼ遺伝子［米国特許第７，５０４，２５９号明細書］；ＦｍＤ１２Ｓはフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）に由来するコドン最適化Δ１２デサチュラーゼ遺伝子［米国特許第７，５０４，２５９号明細書］；ＭＥ３Ｓはモルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）に由来するコドン最適化Ｃ16/18エロンガーゼ遺伝子［米国特許第７，４７０，５３２号明細書］；ＥｇＤ９ｅはミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼ遺伝子［国際公開第２００７／０６１７４２号パンフレット］；ＥｇＤ９ｅＳはミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来するコドン最適化Δ９エロンガーゼ遺伝子［国際公開第２００７／０６１７４２号パンフレット］；Ｅ３８９Ｄ９ｅＳはユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）種ＣＣＭＰ３８９に由来するコドン最適化Δ９エロンガーゼ遺伝子［国際公開第２００７／０６１７４２号パンフレット］；ＥｇＤ８Ｍはミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来する［米国特許第７，２５６，０３３号明細書］合成変異Δ８デサチュラーゼ［国際公開第２００８／０７３２７１号パンフレット］；ＥｇＤ５はミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ５デサチュラーゼ［米国特許出願公開第２００７／０２９２９２４号明細書］；ＥｇＤ５Ｓはミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎ���  ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来するコドン最適化Δ５デサチュラーゼ遺伝子［米国特許出願公開第２００７−／０２９２９２４号明細書］；ＲＤ５Ｓはペリディニウム（Ｐｅｒｉｄｉｎｉｕｍ）種ＣＣＭＰ６２６に由来するコドン最適化Δ５デサチュラーゼ［米国特許出願公開第２００７／０２７１６３２］号明細書；ＰａＤ１７はピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）Δ１７デサチュラーゼ［米国特許第７，５５６，９４９号明細書］；ＰａＤ１７Ｓはピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）に由来するコドン最適化Δ１７デサチュラーゼ［米国特許第７，５５６，９４９号明細書］；およびＹｌＣＰＴ１はヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ジアシルグリセロールコリンリン酸転移酵素遺伝子［国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット］である）。
【０１７６】
引き続いて（米国特許出願公開第２００８／０２５４１９１号明細書の一般方法に記載されるように）Ｕｒａ３変異遺伝子がＹ４３０５株のＵｒａ３遺伝子に組み込まれるように、Ｕｒａ３遺伝子をＹ４３０５株中で破壊した。形質転換体の選択およびＦＡＭＥの分析に続いて、ＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上で成長させると、形質転換体＃１、＃６、および＃７は総脂質の３７.６％、３７.３％、および３６.５％のＥＰＡを生成することが測定された。これらの３つ株をそれぞれＹ４３０５Ｕ１、Ｙ４３０５Ｕ２、およびＹ４３０５Ｕ３株と称し、集合的にＹ４３０５Ｕ株と同定する。
【０１７７】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の脂肪酸分析
脂肪酸分析のために、Ｂｌｉｇｈ，Ｅ．Ｇ．  ＆  Ｄｙｅｒ，Ｗ．Ｊ．（Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３７：９１１−９１７（１９５９））に記載されるようにして、遠心分離によって細胞を収集し脂質を抽出した。ナトリウムメトキシドを用いた脂質抽出物のエステル交換によって、脂肪酸メチルエステル［「ＦＡＭＥ」］を調製し（Ｒｏｕｇｈａｎ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｎｉｓｈｉｄａ  Ｉ．，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２７６（１）：３８−４６（１９９０））、引き続いて３０ｍ×０.２５ｍｍ（内径）ＨＰ−ＩＮＮＯＷＡＸ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）カラムを装着したＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０  ＧＣを用いて分析した。オーブン温度は３.５℃／分で１７０℃（２５分間保持）〜１８５℃であった。
【０１７８】
直接塩基エステル交換のために、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）培養物（３ｍＬ）を収集し、蒸留水で１回洗浄し、Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ内で真空下で５〜１０分間乾燥させた。ナトリウムメトキシド（１００μｌの１％）をサンプルに添加し、次にサンプルをボルテックスして２０分間振盪した。３滴の１Ｍ  ＮａＣｌおよび４００μｌ  ヘキサンを添加した後、サンプルをボルテックスし遠沈した。上層を取り出して、上述のようにＧＣによって分析した。
【０１７９】
実施例１
公的に入手可能なマロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする遺伝子の同定
遺伝子クラスターはリゾビウム・トリフォリイ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｔｒｉｆｏｌｉｉ）中で、マロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ（ＭａｔＡ）、マロニル−ＣｏＡシンセターゼ（ＭａｔＢ）、および推定上のジカルボキシレートキャリアタンパク質（ＭａｔＣ）をコードすると定同された（Ａｎ，Ｊ．Ｈ，  ＆  Ｙ．Ｓ．Ｋｉｍ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５７：３９５−４０２（１９９８））。
【０１８０】
リゾビウム・トリフォリイ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｔｒｉｆｏｌｉｉ）マロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードするタンパク質配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ１１７６９４およびＮｏ.ＡＡＣ８３４５５；配列番号５）を使用して、国立バイオテクノロジー情報センター［「ＮＣＢＩ」］ＢＬＡＳＴＰ  ２.２.１９（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｊ．，２７２：５１０１−５１０９（２００５））検索を実施して、ＢＬＡＳＴ「ｎｒ」データベース（全ての非重複性ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ［「ＰＤＢ」］タンパク質配列データベース、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴタンパク質配列データベース、タンパク質情報資源［「ＰＩＲ」］タンパク質配列データベース、およびタンパク質Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ［「ＰＲＦ」］タンパク質配列データベースを含んでなり、全ゲノムショットガン［「ＷＧＳ」］プロジェクトからの環境サンプルを除外する）中の類似性を有する配列を同定した。
【０１８１】
配列番号５がそれに対して最も類似性の高い配列を要約するＢＬＡＳＴＰ比較の結果は、％同一性、％類似性、および期待値によって報告される。「％同一性」は、２つのタンパク質間で同一のアミノ酸の百分率と定義される。「％類似性」は、２つのタンパク質間で同一のまたは保存されているアミノ酸の百分率と定義される。「期待値」は、絶対的に偶然にこの大きさのデータベース検索で期待される、特定スコアでのマッチ数を特定してマッチの統計学的有意さを推定する。
【０１８２】
多数のタンパク質が、リゾビウム・トリフォリイ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｔｒｉｆｏｌｉｉ）マロニル−ＣｏＡシンセターゼ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＣ８３４５５；配列番号５）との顕著な類似性を有すると同定された。表３は、「０.０」に等しい期待値と、タンパク質を「マロニル−ＣｏＡシンセターゼ」と具体的に同定するアノテーションとを有するヒットの部分的概要を提供するが、これは本明細書の開示を制限するものではない。表３中のタンパク質は、配列番号５と６４％〜９４％の同一性を有する。
【０１８３】
表３：いくつかの公的に入手可能なマロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする遺伝子
【表３】
0005620402.tif 000005
【０１８４】
実施例２
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のためのリゾビウム・レグミノサルムｂｖ．ビシアエ３８４１（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ  ｂｖ．ｖｉｃｉａｅ  ３８４１）のコドン最適化マロニル−ＣｏＡシンセターゼ遺伝子の合成
リゾビウム・レグミノサルムｂｖ．ビシアエ３８４１（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ  ｂｖ．ｖｉｃｉａｅ  ３８４１）のマロニル−ＣｏＡシンセターゼ遺伝子のコドン使用頻度を米国特許第７,１２５,６７２号明細書に記載されるのと同様の方法で、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のために最適化した。具体的には、リゾビウム・レグミノサルムｂｖ．ビシアエ３８４１（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ  ｂｖ．ｖｉｃｉａｅ  ３８４１）（「ｒＭＣＳ」；配列番号１および２、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＹＰ_７６６６０３に相当する）からのマロニル−ＣｏＡシンセターゼ遺伝子のコード配列に基づいて、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）コドン使用頻度パターン（米国特許第７,１２５,６７２号明細書）、「ＡＴＧ」翻訳開始コドン周辺の共通配列、およびＲＮＡ安定性の原則に従って、コドン最適化マロニル−ＣｏＡシンセターゼ遺伝子（「ＭＣＳ」と称する、配列番号３）をデザインした（Ｇｕｈａｎｉｙｏｇｉ，Ｇ．  ａｎｄ  Ｊ．Ｂｒｅｗｅｒ，Ｇｅｎｅ，２６５（１−２）：１１−２３（２００１））。翻訳開始部位の修飾に加えて、１５１５ｂｐのコード領域の内２３３ｂｐ（停止コドンを含む）を修飾し（１５.４％；図１）、２１９コドンを最適化した（４３.４％）。ＧＣ含量を野性型遺伝子（すなわちｒＭＣＳ）中の６１.４％から、合成遺伝子（すなわちＭＣＳ）中の５５.６％に低下させた。ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）は翻訳開始のために「ＧＴＧ」コドンを使用し得ないので、翻訳開始コドン「ＡＴＧ」をｒＭＣＳ遺伝子（配列番号１）の前に付加した。ＮｃｏＩ部位およびＮｏｔＩ部位をそれぞれ翻訳開始コドン周辺と、ＭＣＳの停止コドンの後に組み込んだ。コドン最適化ＭＣＳ遺伝子（配列番号３）は１５１８ｂｐであり、５０５個のアミノ酸のペプチドと停止コドンをコードする（配列番号４）。デザインされたｄＭＣＳ遺伝子はＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって合成され、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｙ１４８３７）にクローンしてｐＭＣＳ（配列番号６）を作成した。
【０１８５】
実施例３
合成マロニル−ＣｏＡシンセターゼを含んでなる構築物ｐＺＰ２−ＭＣＳの作成
プラスミドｐＺＰ２−ＭＣＳ（図２）を構築して、油性酵母ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で、リゾビウム・レグミノサルムｂｖ．ビシアエ３８４１（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ  ｂｖ．ｖｉｃｉａｅ  ３８４１）（実施例２）に由来する合成コドン最適化マロニル−ＣｏＡシンセターゼ遺伝子の発現を可能にした。ｐＺＰ２−ＭＣＳプラスミドは、以下の表４に列挙する構成要素を含有した。
【０１８６】
表４：プラスミドｐＺＰ２−ＭＣＳ(配列番号７)の説明
【表４】
0005620402.tif 000006
【０１８７】
実施例４
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４３０５Ｕ株中のマロン酸に対するマロニル−ＣｏＡシンセターゼ遺伝子発現の効果
プラスミドｐＺＰ２−ＭＣＳをＳｐｈＩおよびＡｓｃＩで消化した。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯＸ２遺伝子の５’および３’領域で挟まれて、ＦＢＡＩＮプロモーター制御下にあるＭＣＳ遺伝子と、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＵＲＡ３遺伝子とを含有する６.４ｋＢの直鎖断片をアガロースゲル電気泳動法によって分離し、Ｑｉａｇｅｎゲル精製キットを用いて製造業者のプロトコルに従って精製した。精製されたＤＮＡ断片を使用して、標準形質転換手順を使用し、Ｙ４３０５、Ｙ４３０５ＵのＵｒａ３−株（一般方法）を形質転換した。
【０１８８】
３個のＵｒａ＋形質転換体を脂質含量、脂肪酸プロフィール、およびマロン酸生成について試験し、また対照としてＹ４３０５株も同様に分析した。簡単に述べると、１２５ｍＬフラスコ内の２５ｍＬのＦＭ培地中で細胞を４８時間成長させた。各培養物（５ｍＬ）を遠心分離して、細胞を収集した。各培養物からの細胞を２５ｍＬのＨＧＭ培地に再懸濁し、さらに５日間３０℃、２５０ｒｐｍで成長させた。脂肪酸プロフィールおよび総脂質含量を一般方法に記載されるように測定した。
【０１８９】
培養物上清中のマロン酸濃度をイオンクロマトグラフィーによって分析するために、サンプルを次のように調製した。１ｍＬの培養液サンプルを１３,０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を収集した。次に上清（０.５ｍＬ）をＰＡＬＬ  ｎａｎｏｓｅｐ  ＭＦ  ０.２μｍ（ＰＡＬＬ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ，ＮＹ；カタログ番号Ｐ／Ｎ  ＯＤＭ０２Ｃ３５）スピンチューブに入れてスピンチューブを微量遠心管に入れ、１３,０００ｒｐｍで１５分間遠沈した。次に濾液をナノ純水で希釈して０.００１ｇ／Ｌ〜０.２５０ｇ／Ｌの濃度を得た。分析で使用した分析バイアルは、ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＰａｌｏＡｌｔｏ,ＣＡ）ねじ蓋バイアル（カタログ番号Ｐ／Ｎ  ５１８２−０７１５）であった。
【０１９０】
マロン酸濃度は、Ｄｉｏｎｅｘ  ＤＸ６００  Ｓｙｓｔｅｍ  およびＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ  ＭＳＱ質量分光計を用いたイオンクロマトグラフィーによって測定した。Ｄｉｏｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ,ＣＡ）によって提供されるシステムの詳細は次の通り。ＩｏｎＰａｃ  ＡＧ１１−ＨＣ  ２×５０ｍｍガードカラム、カタログ番号Ｐ／Ｎ  ０５２９６３；ＩｏｎＰａｃ  ＡＳ１１−ＨＣ  ２×２５０ｍｍ分析カラム、カタログ番号Ｐ／Ｎ  ０５２９６１；ＡＳＲＳ  Ｕｌｔｒａ−ＩＩ  ２ｍｍ自己再生型サプレッサー、カタログ番号Ｐ／Ｎ  ０６１５６２；Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌソフトウェア、バージョン６.８０。方法は対象の化合物の導電率分析および質量分析の双方のために、２つの検出器を逐次使用した。移動相、すなわちＫＯＨの勾配濃度を実行時間全体に適用して、多様な有機酸を分離した。勾配は典型的に６４分間にわたり０.５ｍＭ〜６０ｍＭのＫＯＨで、全ての有機酸および無機アニオンについて良好なピーク分離および分解能が達成された。導電率検出器は、外部標準から作成した標準較正曲線に基づいて化合物を定量的に判定した。質量分析計は、各化合物を検出および同定するために、そして場合によっては共溶出されて導電率では分離し得ない化合物を定量化するために、総イオン電流［「ＴＩＣ」］および選択的イオンモニタリング［「ＳＩＭ」］モードの双方で使用した。
【０１９１】
マロン酸は２８.４９分に溶出した。ピーク面積を既知の量のマロン酸標準のピーク面積と比較することにより定量化を行った（Ｆｌｕｋａ，Ａｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。
【０１９２】
各培養物中のマロン酸濃度に加えて、各株の総脂質（ＴＦＡ％ＤＣＷ）、ＴＦＡの％としてのＥＰＡ、およびＤＣＷの％としてのＥＰＡを下の表５に示す。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４３０５対照株、およびコドン最適化マロニル−ＣｏＡシンセターゼを発現するＹ４３０５Ｕ株の平均脂肪酸組成と平均マロン酸濃度を太字で強調表示する。
【０１９３】
さらに具体的には、「総脂肪酸」［「ＴＦＡ」］という用語は、本明細書では所定のサンプル中において、（当該技術分野で知られているような）塩基エステル交換法によって脂肪酸メチルエステル［「ＦＡＭＥ」］に誘導体化し得る細胞性脂肪酸の総和を指し、それは例えば生物由来資源または油であってもよい。したがって総脂肪酸は、（ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール、およびＴＡＧをはじめとする）中性脂質画分からの脂肪酸と、（ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミン画分をはじめとする）極性脂質画分からの脂肪酸とを含むが、遊離脂肪酸は含まない。
【０１９４】
細胞の「総脂質含量」という用語は乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］の％としてのＴＦＡの測定値であるが、総脂質含量はＤＣＷの％としてのＦＡＭＥ［「ＦＡＭＥ％ＤＣＷ」］の測定値として近似し得る。したがって総脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］は、例えば１００ミリグラムのＤＣＷの中の総脂肪酸のミリグラムに相当する。
【０１９５】
総脂質の脂肪酸濃度は、本明細書では、例えば１００ミリグラムのＴＦＡあたりの所定の脂肪酸のミリグラムなど、ＴＦＡの重量％［「％ＴＦＡ」］として表される。本明細書の開示で特に断りのない限り、総脂質との比較での所定の脂肪酸の％への言及は、％ＴＦＡとしての脂肪酸濃度に相当する（例えば総脂質の％ＥＰＡはＥＰＡ％ＴＦＡに相当する）。
【０１９６】
場合によっては細胞中の所定の脂肪酸の含量は、乾燥細胞重量の重量％［「％ＤＣＷ」］として表すことが有用である。したがって例えばエイコサペンタエン酸％ＤＣＷは、次式に従って判定される：［（エイコサペンタエン酸％ＴＦＡ）*（ＴＦＡ％ＤＣＷ）］／１００。しかし乾燥細胞重量の重量％［「％ＤＣＷ」］としての細胞中の所定の脂肪酸の含量は、次のように近似し得る：［（エイコサペンタエン酸％ＴＦＡ）*（ＦＡＭＥ％ＤＣＷ）］／１００。
【０１９７】
表５：形質転換ヤロウィア・リポリティカ(Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ)Ｙ４３０５Ｕ株中のマロン酸濃度
【表５】
0005620402.tif 000007
【０１９８】
表５に示すように、ｐＺＰ２−ＭＣＳ形質転換体（Ｙ４３０５Ｕ−ＭＣＳ−１、Ｙ４３０５Ｕ−ＭＣＳ−２、およびＹ４３０５Ｕ−ＭＣＳ−３と同定される）は全て、Ｙ４３０５株の複製培養物中のマロン酸レベルとの比較で著しく低レベルのマロン酸を培養物上清中に示した。脂肪酸プロフィールおよび総脂質収率は、対照Ｙ４３０５細胞と同様である。マロニル−ＣｏＡシンセターゼ、すなわち配列番号３の発現は、脂肪酸プロフィールまたは％ＤＣＷとしての総脂質収のどちらにも影響を及ぼすことなくマロン酸総量（ｇ／ｇ  ＤＣＷ）を約９４％低下させた。
以下に本発明の具体的実施態様を列挙する。
（１）少なくとも１つの制御配列の制御下にある少なくとも１つのマロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする遺伝子を含んでなる、少なくとも１つの生成物の発酵に有用なトランスジェニック生物であって、
前記トランスジェニック生物と（トランスジェニックか非トランスジェニックかにかかわらず）同一の生物が生成するマロン酸量と比較して低下した量のマロン酸を発酵副産物として生成するトランスジェニック生物であり、前記同一の生物は
ｃ）マロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする遺伝子を含まない、または
ｄ）発現されないマロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする遺伝子を含んでなる、トランスジェニック生物。
（２）藻類、真菌、ユーグレナ属、酵母、細菌、およびストラメノパイルからなる群から選択される、（１）に記載のトランスジェニック生物。
（３）乾燥細胞重量の少なくとも約２５％の量の油を蓄積する、（２）に記載のトランスジェニック生物。
（４）ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択される油性酵母である、（３）に記載のトランスジェニック生物。
（５）少なくとも１つの制御配列が強力なプロモーターを含んでなる、（１）に記載のトランスジェニック生物。
（６）マロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする少なくとも１つの遺伝子がマルチコピーである、（１）または（５）に記載のトランスジェニック生物。
（７）マロニル−ＣｏＡシンセターゼポリペプチドをコードする少なくとも１つの配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、（１）に記載のトランスジェニック生物。
（８）マロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする少なくとも１つの配列が、配列番号１および配列番号３からなる群から選択される、（７）に記載のトランスジェニック生物。
（９）少なくとも１つの生成物の力価が、（トランスジェニックか非トランスジェニックかにかかわらず）同一生物によって生成される少なくとも１つの生成物の力価と比較して低下していないトランスジェニック生物であり、前記同一生物は
ａ）マロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする遺伝子を含まない、または
ｂ）発現されないマロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする遺伝子を含んでなる、
（１）に記載のトランスジェニック生物。
（１０）少なくとも１つの遺伝的変異をさらに含んでなる、（１）に記載のトランスジェニック生物。
（１１）少なくとも１つの遺伝的変異が、少なくとも１つの天然ペルオキシソーム形成因子タンパク質の欠損である、（１０）に記載のトランスジェニック生物。
（１２）ａ）適切な制御配列の制御下にある少なくとも１つのマロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする遺伝子を含んでなる、少なくとも１つの生成物の発酵に有用なトランスジェニック生物を提供するステップと、
ｂ）前記トランスジェニック生物と（トランスジェニックか非トランスジェニックかにかかわらず）同一の生物が生成するマロン酸量と比較して低下した量のマロン酸を発酵副産物として生成するように、前記トランスジェニック生物を成長させてマロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする少なくとも１つの遺伝子を発現させるステップ
を含んでなるが、ただし前記同一の生物は
（ｉ）マロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする遺伝子を含まない、または
（ｉｉ）発現されないマロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする遺伝子を含んでなる、
トランスジェニック生物中のマロン酸含量を操作する方法。
（１３）マロニル−ＣｏＡシンセターゼポリペプチドをコードする前記少なくとも１つの遺伝子が、配列番号２、配列番号４、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、（１２）に記載の方法。
（１４）少なくとも１つのマロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする遺伝子が、配列番号１および配列番号３からなる群から選択される、（１３）に記載の方法。
（１５）トランスジェニック生物が、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択される、（１３）に記載の方法。
（１６）ｄ）少なくとも１つの天然ペルオキシソーム形成因子タンパク質の欠損である少なくとも１つの遺伝的変異、および
ｅ）少なくとも１つの制御配列の制御下のマロニル−ＣｏＡシンセターゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、および
ｆ）機能性多価不飽和脂肪酸生合成経路をコードする遺伝子
を含んでなる、トランスジェニックヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種宿主細胞。
【図１Ａ】
0005620402.tif 000008
【図１Ｂ】
0005620402.tif 000009
【図１Ｃ】
0005620402.tif 000010
【図１Ｄ】
0005620402.tif 000011
【図２】
0005620402.tif 000012
【図３Ａ】
0005620402.tif 000013
【図３Ｂ】
0005620402.tif 000014
【図４】
0005620402.tif 000015
【配列表】
0005620402000001.app