(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
デオキシリボヌクレオシドキナーゼ依存性薬に対する細胞株又は患者試料の耐性又は感受性を決定するインビトロの方法であって、
（ｉ）デオキシリボヌクレオシドキナーゼ依存性薬を用いて患者試料若しくは細胞株又はその一部分を処理する工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）由来の患者試料又は細胞株の細胞を溶解する工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）由来の細胞溶解物の一部分と、（Ａ）ヌクレオシド類似体薬に感受性を有し、かつ、デオキシリボヌクレオシドキナーゼをコードする遺伝子を組み込んだ生物発光レポーター細菌、及び（Ｂ）デオキシリボヌクレオシドキナーゼ転写プロモーターとを混合する工程；
（ｉｖ）工程（ｉｉ）由来の細胞溶解物の一部分と、（Ａ）ヌクレオシド類似体薬に感受性を有し、かつ、デオキシリボヌクレオシドキナーゼをコードする遺伝子を組み込んだ生物発光レポーター細菌、（Ｂ）デオキシリボヌクレオシドキナーゼ転写プロモーター、及び（Ｃ）脱リン酸化剤とを混合する工程；及び
（ｖ）工程（ｉｉｉ）及び工程（ｉｖ）由来の混合物の各々の生物発光出力値を測定する工程（ここで、該混合物の各々の生物発光出力値の比較レベルは、前記薬に対する耐性又は感受性の尺度をもたらす。）
を含み、
前記（Ａ）生物発光レポーター細菌、前記（Ｂ）デオキシリボヌクレオシドキナーゼ転写プロモーター、および前記（Ｃ）脱リン酸化剤は、３つの分割された成分である、方法。
【請求項２】
（ａ）工程（ｉ）の処理を施されていない前記患者試料又は前記細胞株由来の細胞を溶解に供する工程；
（ｂ）工程（ａ）由来の細胞溶解物の一部分と、ヌクレオシド類似体薬に感受性を有し、かつ、デオキシリボヌクレオシドキナーゼをコードする遺伝子を組み込んだ前記（Ａ）生物発光レポーター細菌、及び前記（Ｂ）デオキシリボヌクレオシドキナーゼ転写プロモーターとを混合する工程；
（ｃ）工程（ａ）由来の細胞溶解物の一部分と、ヌクレオシド類似体薬に感受性を有し、かつ、デオキシリボヌクレオシドキナーゼをコードする遺伝子を組み込んだ前記（Ａ）生物発光レポーター細菌、及び前記（Ｂ）デオキシリボヌクレオシドキナーゼ転写プロモーター、及び前記（Ｃ）脱リン酸化剤とを混合する工程；及び
（ｄ）工程（ｂ）及び工程（ｃ）由来の混合物の各々の生物発光値を測定し、かつ、それぞれ請求項１の工程（ｖ）において測定された対応する前記生物発光出力値から各々の値を減算する工程（ここで、各々のアッセイに関する、得られた前記生物発光出力値の比較は、前記薬に対する耐性又は感受性の尺度をもたらす。）
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｖｉ）請求項１の前記工程（ｉｉ）由来の細胞溶解物の一部分と、ヌクレオシド類似体薬に感受性を有し、かつ、デオキシリボヌクレオシドキナーゼをコードする遺伝子を組み込んだ前記（Ａ）生物発光レポーター細菌とを混合する工程；及び
（ｖｉｉ）前記工程（ｖｉ）由来の混合物の生物発光出力値を測定する工程（ここで、前記工程（ｉｉｉ）および前記工程（ｉｖ）由来の前記混合物の該生物発光出力値と比較される、該混合物の該生物発光出力値は、前記薬に対する耐性又は感受性の尺度をもたらす。）
をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
（ｄ）前記工程（ａ）由来の細胞溶解物の一部分と、ヌクレオシド類似体薬に感受性を有し、かつ、デオキシリボヌクレオシドキナーゼをコードする遺伝子を組み込んだ前記（Ａ）生物発光レポーター細菌とを混合する工程；
（ｅ）前記工程（ｄ）由来の混合物の前記生物発光出力値を測定し、かつ、請求項３の工程（ｖｉｉ）において測定された対応する前記生物発光出力値から減算する工程（ここで、アッセイに関する、得られた前記生物発光出力値の比較は、前記薬に対する耐性又は感受性の尺度をもたらす。）
をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
請求項３の工程（ｖｉ）を実施し、かつ、以下の一般式：
ＬＩＰ＞ＬＩ及びＬＩＰ＞Ｌ及びＬＩ≒Ｌの前記生物発光出力値の場合、前記細胞は前記薬を取り込みかつ代謝する；
ＬＩＰ＞Ｌ及びＬＩ＞Ｌ及びＬＩＰ≒ＬＩの前記生物発光出力値の場合、前記薬は取り込まれるが代謝されない；
ＬＩＰ＞ＬＩ＞Ｌの前記生物発光出力値の場合、前記薬は取り込まれかつ部分的に代謝される；及び
ＬＩＰ≒ＬＩ≒Ｌの前記生物発光出力値の場合、前記薬は取り込まれない
（ここで、Ｌ＝溶解物のみを含む混合物の生物発光出力値であり、ＬＩ＝溶解物及び転写プロモーターを含む混合物の生物発光出力値であり、ＬＩＰ＝溶解物及び転写プロモーター及びホスファターゼを含む混合物の生物発光出力値である）
を適用することにより、前記細胞株又は前記患者試料の耐性又は感受性を分類する、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記生物発光レポーター細菌が、大腸菌ＭＧ１６５５のデオキシシチジンデアミナーゼ（ｃｄｄ）欠損株である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記生物発光レポーター細菌がｌｕｘＣＤＡＢＥオペロンを発現する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記生物発光レポーター細菌がアクセッション番号ＮＣＴＣ１３４２７として寄託されている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記デオキシリボヌクレオシドキナーゼが、チミジンキナーゼ１、チミジンキナーゼ２、デオキシシチジンキナーゼ又はデオキシグアノシンキナーゼである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記デオキシリボヌクレオシドキナーゼがデオキシシチジンキナーゼである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記デオキシリボヌクレオシドキナーゼ転写プロモーターが誘導性であり、かつ、該デオキシリボヌクレオシドキナーゼ転写プロモーターの誘導因子がＩＰＴＧである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記（Ｃ）脱リン酸化剤がアルカリホスファターゼである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記（Ｃ）脱リン酸化剤が、細菌アルカリホスファターゼ、仔ウシ腸管アルカリホスファターゼ、エビアルカリホスファターゼ又はウシ腸管粘膜アルカリホスファターゼである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記デオキシリボヌクレオシドキナーゼ依存性薬が、抗癌薬又は抗ウイルス薬である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記薬がＡｒａ−Ｃ又はフルダラビンである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞株又は前記患者試料の細胞が癌細胞又はウイルスに感染した細胞である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞が急性骨髄性白血病細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
デオキシリボヌクレオシドキナーゼ依存性薬に対する細胞株又は患者試料の耐性又は感受性を決定するキットであって、
（Ａ）ヌクレオシド類似体薬に感受性を有し、かつ、デオキシリボヌクレオシドキナーゼをコードする遺伝子を組み込んだ生物発光レポーター細菌、（Ｂ）デオキシリボヌクレオシドキナーゼ転写プロモーター、及び（Ｃ）脱リン酸化剤を含み、
前記（Ａ）生物発光レポーター細菌、前記（Ｂ）デオキシリボヌクレオシドキナーゼ転写プロモーター、および前記（Ｃ）脱リン酸化剤は、３つの分割された成分である、キット。
【請求項１９】
前記（Ａ）生物発光レポーター細菌が、大腸菌ＭＧ１６５５のデオキシシチジンデアミナーゼ（ｃｄｄ）欠損株である、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記（Ａ）生物発光レポーター細菌がｌｕｘＣＤＡＢＥオペロンを発現する、請求項１８又は１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記（Ａ）生物発光レポーター細菌がアクセッション番号ＮＣＴＣ１３４２７として寄託されている、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
前記デオキシリボヌクレオシドキナーゼがデオキシシチジンキナーゼである、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２３】
前記（Ｂ）デオキシリボヌクレオシドキナーゼ転写プロモーターが誘導性であり、かつ、前記（Ｃ）脱リン酸化剤が細菌アルカリホスファターゼである、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２４】
前記（Ｂ）デオキシリボヌクレオシドキナーゼ転写プロモーターが誘導性であり、かつ、該（Ｂ）デオキシリボヌクレオシドキナーゼ転写プロモーターの誘導因子がＩＰＴＧである、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２５】
前記デオキシリボヌクレオシドキナーゼ依存性薬が抗癌薬又は抗ウイルス薬である、請求項１８〜２４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２６】
前記デオキシリボヌクレオシドキナーゼ依存性薬がＡｒａ−Ｃ又はフルダラビンである、請求項１８〜２５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２７】
デオキシリボヌクレオシドキナーゼ依存性薬に対する細胞株又は患者試料の耐性又は感受性を決定するための、（Ｃ）脱リン酸化剤、（Ｂ）デオキシリボヌクレオシドキナーゼ転写プロモーター、及び（Ａ）ヌクレオシド類似体薬に感受性を有し、かつ、デオキシリボヌクレオシドキナーゼ遺伝子を組み込んだ生物発光レポーター細菌のエクスビボでの使用であって、
前記（Ａ）生物発光レポーター細菌、前記（Ｂ）デオキシリボヌクレオシドキナーゼ転写プロモーター、および前記（Ｃ）脱リン酸化剤は、３つの分割された成分である、生物発光レポーター細菌のエクスビボでの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヌクレオシド類似体薬に対する細胞の感受性を決定する方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、骨髄性前駆体細胞の悪性転換により引き起こされる血液疾患の異質の群を規定するために使用される用語である。転換により、血液及び骨髄中における未成熟かつ未分化型の細胞の増殖、並びに正常な造血の抑制が引き起こされる。ＡＭＬ患者の効果的な治療は難易度が高く、臨床転帰は期待外れかつ予測不可能であることがある。標準的な治療計画を受け入れた新たに診断された患者の７０％しか、治療に応答しない。さらに、これらの患者の大部分が、長期間の寛解を達成することができず、その後の治療方法に対する耐性を発達させる。
【０００３】
ヌクレオシド類似体（ＮＡ）は、或る特定の型の癌及びウイルス感染症の治療において広範に使用される抗代謝薬の一種である。これらの化合物は、身体の天然ヌクレオシドと構造的に類似しており、新たに合成されたＤＮＡ中へのそれらの組み込みをもたらす同じ生理学的な取り込み及び代謝メカニズムに供される。このＤＮＡ改質は、細胞死をもたらすＤＮＡ合成阻害及び連鎖終結を引き起こす。ＮＡは、活性ヌクレオチドを形成するために三リン酸エステルへのリン酸化を必要とするプロドラッグである。或る特定のＮＡは、ＤＮＡ複製を直接妨害する訳ではない。例えば、抗ヘルペス薬アシクロビルは、細胞による取り込み及びリン酸化の後、ＤＮＡポリメラーゼを阻害することによりＤＮＡ複製を妨害する。
【０００４】
ヌクレオシド類似体Ａｒａ−Ｃは、最も活性の高い単一の抗癌剤の１つであり、３０年を超える期間ＡＭＬの中心的な治療法である。ｉｎ  ｖｉｖｏでＡｒａ−Ｃは、特異的ヌクレオシドトランスポーターｈＥＮＴ１を介して細胞中に輸送され、ｄＣＫにより迅速にリン酸化されてその一リン酸エステル形態となる。Ａｒａ−ＣＭＰは、ヌクレオシドキナーゼによってさらにリン酸化されて、その活性な三リン酸化形態であるＡｒａ−ＣＴＰとなる。Ａｒａ−ＣＴＰの抗増殖効果及び細胞毒性効果は、ＤＮＡポリメラーゼと干渉しかつＤＮＡ鎖中に組み込まれる能力に起因して、連鎖終結及びＤＮＡ合成停止を引き起こす。高用量のＡｒａ−Ｃは、サイトゾル中におけるシトクロムＣの蓄積、ミトコンドリアの膜電位の喪失、及び活性酸素種の増大を引き起こすこともある。
【０００５】
Ａｒａ−Ｃに対する化学療法耐性は、薬の取り込みの低さ、シチジンデアミナーゼによるＡｒａ−Ｕへの変換、又は細胞質ヌクレオチダーゼによる活性代謝産物の脱リン酸化を含む、Ａｒａ−ＣＴＰ形成の速度及びＤＮＡ中への組み込みに影響する多数の因子から生じ得る。
【０００６】
ヌクレオシド類似体薬に対する耐性の主要メカニズムは、不十分なＮＡ三リン酸エステルに起因する。この主要な原因は、リン酸化酵素（例えばｄＣＫ）のレベルの減少、非効率的な細胞取り込み（例えばｈＥＮＴ１のレベルの減少）、ＮＡ分解酵素（とりわけシチジンデアミナーゼ、ｃｄｄ）のレベルの増大、及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）プールの拡大である。デオキシリボヌクレオシドキナーゼ（ｄＮＫ）レベルも、薬耐性において主要な役割を果たすと考えられる。
【０００７】
大腸菌は、ｄＣＫを欠きデオキシシチジンデアミナーゼ（ｃｄｄ）の活性によりＡｒａ−ＣをＡｒａ−ウラシルへと脱アミノ化するため、Ａｒａ−Ｃは大腸菌に対する効果を有しない。非特許文献１は、ヒトｄＣＫ遺伝子の発現によりＡｒａ−Ｃの存在下で低減された相対的な成長を示すｃｄｄ欠損大腸菌突然変異体（Ｓ０５２１８）の構築を記載した。成長に対するＡｒａ−Ｃの効果は、ｄＣＫ誘導性プロモーターであるＩＰＴＧの非存在下でアッセイすると完全に消失し、細菌におけるヒトｄＣＫの発現が細菌ＤＮＡへのＡｒａ−ＣＴＰの組み込みをもたらすことが示された。
【０００８】
Ａｒａ−Ｃの有効性のインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での評価は伝統的に、白血病細胞のＡｒａ−Ｃに対する曝露後におけるａ）細胞死の測定、ｂ）Ｓ期活性の低減の測定、又はｃ）ＡＭＬクローン形成アッセイの使用を伴っている。これらの方法は標準化されておらず、多大な時間を必要とし、費用がかかり、日常的なスクリーニングには好適でない。したがって、患者は、薬に対する感受性と関係なくＡｒａ−Ｃを含む治療計画により治療され、衰弱させる副作用、例えば骨髄機能抑制、嘔気、下痢、嘔吐、及び薬耐性の続発性癌の発症に苦しむことがある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Wang et al., Antimicrob. Agents. Chemother., 1998, 42:2620-2625
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、患者におけるヌクレオシド類似体薬の有効性を決定するための、単純で迅速な予備スクリーニング試験に対する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、デオキシリボヌクレオシドキナーゼ依存性薬に対する細胞の耐性又は感受性を決定する方法及びキットに関する。
【００１２】
本発明の第１の態様によれば、デオキシリボヌクレオシドキナーゼ依存性薬に対する細胞株又は患者試料の耐性又は感受性を決定するインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）の方法は、
（ｉ）デオキシリボヌクレオシドキナーゼ依存性薬を用いて患者試料若しくは細胞株又はその一部分を処理する工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）由来の患者試料又は細胞株の細胞を溶解する工程；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）由来の細胞溶解物（lysate）の一部分と、デオキシリボヌクレオシドキナーゼをコードする遺伝子を組み込んだ生物発光レポーター細菌、及びデオキシリボヌクレオシドキナーゼ転写プロモーターとを混合する工程；
（ｉｖ）工程（ｉｉ）由来の細胞溶解物の一部分と、デオキシリボヌクレオシドキナーゼをコードする遺伝子を組み込んだ生物発光レポーター細菌、デオキシリボヌクレオシドキナーゼ転写プロモーター、及び脱リン酸化剤とを混合する工程；
（ｖ）必要に応じて、工程（ｉｉ）由来の細胞溶解物の一部分と、デオキシリボヌクレオシドキナーゼをコードする遺伝子を組み込んだ生物発光レポーター細菌とを混合する工程；及び
（ｖｉ）工程（ｉｉｉ）、工程（ｉｖ）及び必要に応じて工程（ｖ）由来の混合物の各々の生物発光を測定する工程（ここで、該混合物の各々の生物発光の比較レベルは、前記薬に対する耐性又は感受性の尺度をもたらす。）を含む。
【００１３】
本発明の第２の態様によれば、デオキシリボヌクレオシドキナーゼ依存性薬に対する細胞株又は患者試料の耐性又は感受性を決定するキットは、デオキシリボヌクレオシドキナーゼをコードする遺伝子を組み込んだ生物発光レポーター細菌、デオキシリボヌクレオシドキナーゼ転写プロモーター、及び脱リン酸化剤を含む。
【００１４】
本発明の第３の態様によれば、デオキシリボヌクレオシドキナーゼによるリン酸化を受けることが可能な薬に対する細胞株又は患者試料の耐性又は感受性を決定するための、脱リン酸化剤、デオキシリボヌクレオシドキナーゼ転写プロモーター、及びデオキシリボヌクレオシドキナーゼ遺伝子を組み込んだ生物発光レポーターのエクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）での使用が存在する。
【００１５】
本発明を、以下の添付の図面を参照して説明する：
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】Ａｒａ−Ｃに対する生物発光細菌バイオセンサーの応答を示すグラフである。グラフ（Ａ）はＯＤ６００を使用して測定された成長に対応し、グラフ（Ｂ）は相対光単位（ＲＬＵ）で測定された同じ培養物の発光に対応する。
【図２】低濃度のＡｒａ−Ｃに対する生物発光バイオセンサーの応答を示すグラフである。
【図３】Ａｒａ−ＣＴＰに対するバイオセンサーの応答を示すグラフである。グラフ（Ａ）は、種々の濃度で添加されたＡｒａ−ＣＴＰに対する細菌バイオセンサーの応答に対応する。グラフ（Ｂ）は、開始時にアッセイにＢＡＰを添加し、その後Ａｒａ−ＣＴＰを種々の濃度で添加した場合における細菌バイオセンサーの応答に対応する。
【図４】Ａｒａ−Ｃに対する細胞内応答を示すための、生物発光細菌バイオセンサーを使用する細胞溶解アッセイの模式図である。
【図５】４つの処理応答プロファイルを示す４つのグラフである。
【図６】２５μＭのＡｒａ−Ｃ及び対照に対するＡｒａ−Ｃ感受性ＫＧ１−ａ細胞の応答を示す図である。
【図７】Ａｒａ−Ｃ応答性ＡＭＬ患者由来の末梢血液試料（グラフ（Ｃ））、及びＡｒａ−Ｃ耐性ＡＭＬ患者由来の末梢血液試料（グラフ（Ｄ））に対する２５μＭのＡｒａ−Ｃの効果を示す２つのグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、抗癌薬及び抗ウイルス薬に対する患者細胞試料又は細胞株の耐性又は感受性を迅速に決定する方法を提供する。本方法は、細胞内リン酸化に関してデオキシリボヌクレオシドキナーゼ（ｄＮＫ）に依存するヌクレオシド類似体（ＮＡ）薬に対する感受性を有する生物発光レポーター細菌を使用する。
【００１８】
本発明は、薬活性のレポーターとして生物発光細菌を使用し、ｄＮＫリン酸化依存性ＮＡ薬に対するウイルスに感染した細胞及び癌細胞の感受性のスクリーニングにおいて相当な使用可能性を有する細胞溶解物（lysate）アッセイに関する。このアッセイは、薬治療の開始前の臨床的試料の予備スクリーニングにおける使用、または、用量低減療法の有効性の指標としての使用に好適である。さらに、腫瘍がクローン性進化を受けたか否か、及び薬を使用して完全な第二寛解を達成するために使用できるか否かを決定するために、癌患者における再発時にアッセイを繰り返すことができる。
【００１９】
本発明の一実施形態によれば、薬に対する細胞の感受性を決定するために、生物発光レポーター細菌を、薬で処理された細胞溶解物と混合し、細菌により放出された生物発光を測定する。デオキシシチジンデアミナーゼ（ｃｄｄ）欠損細菌が、ヌクレオシド類似体薬に対して感受性を有し、該類似体薬の存在下で、増大した生物発光を示す。
【００２０】
本明細書で使用する場合、「生物発光」という用語は、酸素分子（Ｏ２）及びエネルギー（ＮＡＤＨ）の存在下において、酵素ルシフェラーゼにより触媒される有機化合物（ルシフェリン）の酸化に起因する、生きている生物における可視光の産生を表す。光を放出する能力は生物の還元力に依存するため、代謝的に活性な細菌のみが光を産生することができる。
【００２１】
生物発光表現型は内在性のものであり得るか、又は代替的には例えば、フォトラブダス・ルミネセンス（Photorhabdus luminescens）から単離されるｌｕｘＣＤＡＢＥオペロンを構成的プロモーターの制御下で導入し発現させることにより、大抵の細菌に付与することができる。生物発光細菌は外来性基質を必要とせず、リアルタイムでの細菌の生理学的状態の直接的な指標として光を放出する。
【００２２】
生物発光細菌からの光の出力の驚くべき増大により、０．０５μＭ未満の細胞内濃度のＮＡ薬を検出することができ、この技術は、８時間以内の臨床的なＮＡ用量範囲に対する応答を定量化するのに好適である。
【００２３】
本発明の細菌は、ＮＡ薬に対して感受性を有し、生物発光表現型を与える内在性又は外来性の遺伝子を発現する任意の細菌であり得る。好ましい一実施形態では、細菌は、シトシンをウラシルへと脱アミノ化することができず、より好ましい一実施形態では、酵素デオキシシチジンデアミナーゼ（ｃｄｄ）を発現しない。細菌は、好ましくは大腸菌、より好ましくは大腸菌ＭＧ１６５５である。ＭＧ１６５５は、野生型大腸菌Ｋ−１２の誘導体である。野生型ＭＧ１６５５は、デオキシシチジンデアミナーゼを発現する。したがって、大腸菌ＭＧ１６５５のデオキシシチジンデアミナーゼ（ｃｄｄ）欠損株であることが本発明の細菌に関しては最も好ましい。この菌株は、アクセッション番号ＮＣＴＣ１３４２７として寄託されている。
【００２４】
本発明の方法は、インビトロで、すなわち患者の体外で実施する。
【００２５】
本明細書で使用する場合の、「患者細胞試料」という用語は、患者から単離された細胞を表す。細胞試料の細胞は、典型的には癌細胞又はウイルスに感染した細胞、例えば急性骨髄性白血病細胞であろう。
【００２６】
「患者」という用語は、非霊長類（例えばウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット及びマウス）及び霊長類（例えばサル及びヒト）を含む哺乳動物、より好ましくはヒトを表す。
【００２７】
好ましい一実施形態では、試料材料は、例えば標準的な静脈切開技法を使用することにより、末梢血液から得られる骨髄又は白血球である。
【００２８】
「細胞株」という用語は、不死化したエクスビボの細胞培養物を表す。細胞株の細胞は典型的には、癌細胞又はウイルスに感染した細胞、例えば急性骨髄性白血病細胞であろう。
【００２９】
「未処理対照細胞」という用語は、デオキシリボヌクレオシドキナーゼ依存性薬を用いた処理が施されていない、患者細胞試料又は細胞株の細胞を表す。
【００３０】
本発明の方法及びキットを使用して、デオキシリボヌクレオシドキナーゼ依存性薬、すなわちデオキシリボヌクレオシドキナーゼ（ｄＮＫ）経路を利用するＮＡ薬に対する耐性又は感受性を決定することができる。表１は、その作用メカニズムがｄＮＫによるリン酸化に依存する抗ウイルス薬及び抗癌薬の例の非網羅的なリストを提供する。
【００３１】
【表１】
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【００３２】
「デオキシリボヌクレオシドキナーゼ依存性薬」という用語は、その作用メカニズムがデオキシリボヌクレオシドキナーゼによる５’位の細胞内リン酸化に依存するヌクレオシド類似体薬を表す。デオキシリボヌクレオシドキナーゼは、チミジンキナーゼ１又はチミジンキナーゼ２（ＴＫ１及びＴＫ２）、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）又はデオキシグアノシンキナーゼ（ｄＧＫ）であり得る。好ましくは、デオキシリボヌクレオシドキナーゼは、デオキシシチジンキナーゼである。
【００３３】
本発明のデオキシリボヌクレオシドキナーゼ依存性薬は、ＤＮＡ破壊薬（DNA-disrupting drug）、すなわち、細胞のＤＮＡへの組み込み若しくは該ＤＮＡの修飾を介した上記ＤＮＡとの直接的な干渉により、又はＤＮＡ複製酵素（例えばＤＮＡポリメラーゼ）への組み込み若しくは該酵素の修飾を介した間接的な干渉によって、細胞のＤＮＡ複製を妨げる薬であり得る。
【００３４】
本発明の好ましい一実施形態では、デオキシリボヌクレオシドキナーゼ依存性薬は、プリン（アデニン及びグアニン）ヌクレオシド群又はピリミジン（シトシン、チミン及びウラシル）ヌクレオシド群を含む、構造種の成員である。好ましくは、薬は抗癌薬又は抗ウイルス薬である。より好ましくは薬は表１の薬のリストから選択され、最も好ましくは薬はＡｒａ−Ｃ又はフルダラビンである。
【００３５】
「薬耐性」という用語は本明細書では、哺乳動物細胞が正常な細胞又は耐性を有しない細胞と同じように薬と相互作用することができず、それにより薬が所望の効果を達成することができないことと規定される。「薬感受性」という用語は、細胞が薬と相互作用する能力（細胞は薬に対して耐性を有しない）ことを表す。
【００３６】
その最も広範な態様では、本発明の方法は、ＮＡ薬に対する細胞試料の耐性又は感受性を決定するために使用される２つ（必要に応じて３つ）の生物発光の読み取り値をもたらす、少なくとも２つ（必要に応じて３つ）のアッセイを実施することを含む。この方法によれば、１つ又は複数の細胞株又は患者細胞試料を単離し、試料の全体又はその一部分のいずれかをデオキシリボヌクレオシドキナーゼ依存性薬で処理する。処理された細胞をその後溶解し、細胞溶解物を２つ（必要に応じて３つ）の試料に分割する。デオキシリボヌクレオシドキナーゼ転写プロモーター（promoter）の存在下で、デオキシリボヌクレオシドキナーゼをコードする遺伝子を組み込んだ生物発光レポーター細菌に第１の試料を添加する。この混合物を「ＬＩ」と称する。デオキシリボヌクレオシドキナーゼ転写プロモーター及びさらに脱リン酸化剤の存在下で、デオキシリボヌクレオシドキナーゼをコードする遺伝子を組み込んだ生物発光レポーター細菌に第２の試料を添加する。この混合物を「ＬＩＰ」と称する。任意の第３の試料を生物発光レポーター細菌に添加する。プロモーター及び脱リン酸化剤は混合物中に存在しない。このアッセイは、薬を代謝しない患者と薬を取り込まない患者との識別を可能とし、「Ｌ」と称する。第３のアッセイによって、薬の部分的な代謝に関する試験が可能となるため、第３のアッセイを用いて本方法を実施することが好ましい。最初の２つのアッセイのみを実施した場合、全体的な又は実質的な耐性に関して試験することになる。
【００３７】
本発明の方法の際立った利点は、脱リン酸化剤を用いたアッセイ、すなわち第２のアッセイ「ＬＩＰ」の使用である。これは、これにより薬に対する患者試料／細胞株の感受性／耐性を測定することができる、内部標準を提供する。
【００３８】
デオキシリボヌクレオシドキナーゼは、デオキシリボヌクレオシドの５’位をリン酸化する。生物発光レポーター細菌中に組み込まれた遺伝子によりコードされるデオキシリボヌクレオシドキナーゼは、チミジンキナーゼ１又はチミジンキナーゼ２（ＴＫ１及びＴＫ２）、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）又はデオキシグアノシンキナーゼ（ｄＧＫ）であってもよく、好ましくは哺乳動物デオキシリボヌクレオシドキナーゼである。より好ましくはデオキシリボヌクレオシドキナーゼはデオキシシチジンキナーゼである。最も好ましくは、デオキシシチジンキナーゼはヒトデオキシシチジンキナーゼである。
【００３９】
本明細書で使用する場合、「デオキシリボヌクレオシドキナーゼ転写プロモーター」という用語は、デオキシリボヌクレオシドキナーゼ遺伝子の発現のプロセスを開始することができる任意の作用因子を表す。プロモーター／作用因子は、遺伝子の調節エレメントに対して作用することにより、キナーゼ遺伝子の発現を誘導することができる。多数のこのような「誘導因子」が当該技術分野で既知である。本発明の好ましい一実施形態では、デオキシリボヌクレオシドキナーゼ転写プロモーターは、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）である。ＩＰＴＧは本明細書で分子式Ｃ９Ｈ１８Ｏ５Ｓ及びＣＡＳ登録番号３６７−９３−１を有する分子として特定される。
【００４０】
本明細書で使用する場合の、「脱リン酸化剤」という用語は、ヌクレオチドからリン酸基を取り除くことができる任意の作用因子を表す。本発明の好ましい一実施形態では、脱リン酸化剤はアルカリホスファターゼ（本明細書でＥＣ３．１．３．１として特定される加水分解（ヒドロリアーゼ（hydrolyase））酵素である）である。好適なアルカリホスファターゼは、細菌アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）、仔ウシ腸管アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）、エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）及びウシ腸管粘膜アルカリホスファターゼ（ＢＩＭＡＰ）を含む。
【００４１】
上記の方法によれば、ヌクレオシド類似体薬に対する細胞の耐性又は感受性を、生物発光レポーター細菌アッセイの各々に由来する細胞溶解混合物の生物発光を測定及び比較することにより決定する。本発明の細菌は、活性化された（三リン酸化された）ヌクレオシド類似体薬に対して感受性を有する。薬は、その不活性な非リン酸化形態でレポーター細菌に進入した後、誘導性転写プロモーターの影響下で細菌により発現されたｄＮＫにより細胞内でリン酸化されて、細菌生物発光の増大をもたらす。
【００４２】
別の実施形態では、本発明の方法は６つのアッセイを含む。第１の３つのアッセイは、上記の薬で処理されたアッセイ試料に対応する。第２の３つのアッセイは、薬を含有しない未処理ブランク対照を含む。これらのアッセイ試料は、患者試料又は細胞株由来の未処理細胞を溶解に供すること、溶解した細胞を３つの試料に分割すること、及びその後、分割した試料をそれぞれ、（ｉ）生物発光レポーター細菌（Ｌ）、（ｉｉ）デオキシリボヌクレオシドキナーゼ転写プロモーターの存在下で、デオキシリボヌクレオシドキナーゼをコードする遺伝子を組み込んだ生物発光レポーター細菌（ＬＩ）及び（ｉｉｉ）デオキシリボヌクレオシドキナーゼ転写プロモーター（promoter）及び脱リン酸化剤の存在下で、デオキシリボヌクレオシドキナーゼをコードする遺伝子を組み込んだ生物発光レポーター細菌（ＬＩＰ）に添加することにより作製される。３つのアッセイの各々の生物発光を測定し、各々の値を、薬で処理された、対応するアッセイに関して測定した生物発光値から減算する。得られた値をその後使用して、薬に対する細胞の耐性又は感受性を決定する。
【００４３】
６アッセイ法は、アッセイ混合物の生物発光測定値からバックグラウンドの発光を減算することを可能とし、それ故に細胞の耐性又は感受性を決定する際に使用するためのより正確な値を提供するため、有益である。生物発光の出力に対するデオキシリボヌクレオシドキナーゼ転写プロモーター（例えばＩＰＴＧ）及び脱リン酸化剤（例えばＢＡＰ）の影響は極めて小さいことがあるが、薬で処理された患者試料又は細胞株のＬＩＰアッセイの生物発光の出力を測定し、未処理患者試料又は未処理細胞株のＬＩＰアッセイと比較することにより、その効果を決定することができる。
【００４４】
この方法は、任意の第３のアッセイ（Ｌ）を実施しない場合、４アッセイ法として実施することもできる。この結果は、薬に対する全体的な又は実質的な耐性を予測する際に有用である。
【００４５】
好ましい一実施形態では、３つのアッセイを全て実施する場合、薬との４つの考え得る相互作用のうちの１つに従って細胞試料を分類する：薬は細胞により取り込まれかつ代謝される；薬は細胞により取り込まれかつ部分的に代謝される；薬は細胞により取り込まれるが代謝されない；薬は細胞により取り込まれない。図４の模式図及び図５のグラフがこの概要を示している。対照（Ｌ）は、完全な薬代謝と部分的な薬代謝とを識別するために、及び耐性の２つの様式（取り込みの欠如、又は細胞内リン酸化の欠如）を識別するために、必要である。
【００４６】
処理された細胞が薬を取り込まない場合、細胞溶解物中には薬は存在しないであろう。生物発光レポーターアッセイの各々に関する測定値は類似し、対応する対照と比較した場合生物発光の顕著な薬誘導性増大は存在せず、細胞が薬に対して耐性を有することが示されよう。
【００４７】
処理された細胞が薬を取り込むが代謝しない場合、薬投与及び細胞溶解（lysation）の後、リン酸化されていない薬のみが存在し、これによりアルカリホスファターゼの有無に関わらず、リン酸化されていない薬を取り込む生物発光レポーター細菌がもたらされる。したがって、ＬＩＰアッセイ及びＬＩアッセイの両方において、光の出力はおよそ等しく、対照アッセイ（Ｌ）に関する出力より顕著に大きい。
【００４８】
処理された細胞が薬を取り込みかつ部分的に代謝する場合、薬投与及び細胞溶解の後、リン酸化された薬及びリン酸化されていない薬が存在する。ＬＩアッセイにおいては、生物発光レポーター細菌は、リン酸化されていない薬のみを取り込むことができ、リン酸化された薬を取り込むことはできず、脱リン酸化剤の存在により全ての薬を取り込むＬＩＰアッセイと比較して光の出力の低減をもたらす。ＬＩアッセイの生物発光の測定値はＬＩＰアッセイの測定値より顕著に小さいが、対照アッセイ（Ｌ）より顕著に大きいだろう。
【００４９】
処理された細胞が薬を取り込みかつ代謝する場合、薬投与及び細胞溶解の後、添加した薬全てがリン酸化されているだろう。ＬＩアッセイにおいては、生物発光レポーター細菌はリン酸化された薬を取り込むことができず、対照アッセイ（Ｌ）と同様であるがＬＩＰアッセイ（全ての薬が取り込まれる）より顕著に低い生物発光の測定値をもたらす。
【００５０】
生物発光は相対光単位（ＲＬＵ）で測定される。これは、マルチモードマイクロプレートリーダー、感光性ＣＣＤカメラ、シングルチューブルミノメーター及び感光紙（写真用フィルムを含む）を含む、当該技術分野で既知の或る範囲の技法を使用して達成することができる。
【００５１】
本発明はＲＬＵデータを得る方法及びキットに関するが、薬と細胞株又は患者細胞試料との間の相互作用の性質を決定するためにＲＬＵデータが計算され得る幾つかの異なる方法が存在する。
【００５２】
以下の一般式を適用して、どの分類が所定の細胞試料に適用されるかを決定することができる：
各々のアッセイ試料に関して測定された生物発光値がＬＩＰ＞ＬＩ及びＬＩＰ＞Ｌ及びＬＩ≒Ｌであるようなものである場合、細胞は感受性を有する、すなわち薬を取り込みかつ代謝すると言う；
各々のアッセイ試料に関して測定された生物発光値がＬＩＰ＞Ｌ及びＬＩ＞Ｌ及びＬＩＰ≒ＬＩであるようなものである場合、薬は取り込まれるが代謝されない；
各々のアッセイ試料に関して測定された生物発光値がＬＩＰ＞ＬＩ＞Ｌであるようなものである場合、薬は取り込まれかつ部分的に代謝される；及び
各々のアッセイ試料に関して測定された生物発光値がＬＩＰ≒ＬＩ≒Ｌであるようなものである場合、薬は取り込まれない
（ここで、Ｌ＝溶解物及び生物発光レポーター細菌であり、ＬＩ＝溶解物、及びデオキシリボヌクレオシドキナーゼをコードする遺伝子を組み込んだ生物発光レポーター細菌、及びキナーゼ転写プロモーターであり、ＬＩＰ＝溶解物、及びデオキシリボヌクレオシドキナーゼをコードする遺伝子を組み込んだ生物発光レポーター細菌、及びキナーゼ転写プロモーター、及びホスファターゼである）。
【００５３】
デオキシリボヌクレオシドキナーゼ転写プロモーターは光の出力に対してわずかな変化をもたらすことがあり、本質的に同等の値が厳密には等しくないことを意味するため、「≒」という記号は値がおよそ等しいことを示す。
【００５４】
本発明のさらなる実施形態では、以下の式を使用して、どの分類が所定の細胞試料に適用されるかを決定する。３アッセイ法を使用する場合、式は以下の通りである：
％Ｉｎｔ＝［Ｔ（ｎ／ｍ）］×１００
［式中、％Ｉｎｔ＝％相互作用、Ｔ＝処理（薬）であり：かつ、
ｎ＝ＬＩＰ及びｍ＝ＬＩである；又は
ｎ＝ＬＩＰ及びｍ＝Ｌである；又は
ｎ＝ＬＩ及びｍ＝Ｌである
（ここで、
ｎ＝ＬＩＰ、ｍ＝ＬＩであるとき％Ｉｎｔ≧１０％であり、ｎ＝ＬＩ、ｍ＝Ｌであるとき％Ｉｎｔ＜１０％である場合、患者試料又は細胞株はデオキシリボヌクレオシドキナーゼ依存性薬を取り込みかつ代謝する；
ｎ＝ＬＩＰ、ｍ＝ＬＩであるとき％Ｉｎｔ≦１０％であり、ｎ＝ＬＩ、ｍ＝Ｌ及びｎ＝ＬＩＰ、ｍ＝Ｌのいずれも％Ｉｎｔ＞１０％である場合、患者試料又は細胞株はデオキシリボヌクレオシドキナーゼ依存性薬を取り込みかつ代謝しない；
ｎ＝ＬＩＰ、ｍ＝ＬＩであるとき％Ｉｎｔ≧１０％であり、ｎ＝ＬＩ、ｍ＝Ｌであるとき％Ｉｎｔ＞１０％である場合、患者試料又は細胞株はデオキシリボヌクレオシドキナーゼ依存性薬を取り込みかつ部分的に代謝する；
ｎ＝ＬＩＰ、ｍ＝ＬＩ及びｎ＝ＬＩ、ｍ＝Ｌ及びｎ＝ＬＩＰ、ｍ＝Ｌであるとき％Ｉｎｔ≦１０％である場合、患者試料又は細胞株はデオキシリボヌクレオシドキナーゼ依存性薬を取り込まない）］。
【００５５】
ブランク対照アッセイを組み込んだ６アッセイ法を使用する場合、式は以下の通りである：
％Ｉｎｔ＝［（Ｔｎ／Ｔｍ）−（Ｃｎ／Ｃｍ）］×１００
［式中、％Ｉｎｔ＝％相互作用、Ｔ＝処理（薬）、Ｃ＝対照（薬なし）であり：かつ、
ｎ＝ＬＩＰ及びｍ＝ＬＩである；又は
ｎ＝ＬＩＰ及びｍ＝Ｌである；又は
ｎ＝ＬＩ及びｍ＝Ｌである
（ここで、
ｎ＝ＬＩＰ、ｍ＝ＬＩであるとき％Ｉｎｔ≧１０％であり、ｎ＝ＬＩ、ｍ＝Ｌであるとき％Ｉｎｔ＜１０％である場合、患者試料又は細胞株はＤＮＡを破壊するデオキシリボヌクレオシドキナーゼ依存性薬を取り込みかつ代謝する；
ｎ＝ＬＩＰ、ｍ＝ＬＩであるとき％Ｉｎｔ≦１０％であり、ｎ＝ＬＩ、ｍ＝Ｌ及びｎ＝ＬＩＰ、ｍ＝Ｌのいずれも％Ｉｎｔ＞１０％である場合、患者試料又は細胞株はＤＮＡを破壊するデオキシリボヌクレオシドキナーゼ依存性薬を取り込みかつ代謝しない；
ｎ＝ＬＩＰ、ｍ＝ＬＩであるとき％Ｉｎｔ≧１０％であり、ｎ＝ＬＩ、ｍ＝Ｌであるとき％Ｉｎｔ＞１０％である場合、患者試料又は細胞株はＤＮＡを破壊するデオキシリボヌクレオシドキナーゼ依存性薬を取り込みかつ部分的に代謝する；
ｎ＝ＬＩＰ、ｍ＝ＬＩ及びｎ＝ＬＩ、ｍ＝Ｌ及びｎ＝ＬＩＰ、ｍ＝Ｌであるとき％Ｉｎｔ≦１０％である場合、患者試料又は細胞株はＤＮＡを破壊するデオキシリボヌクレオシドキナーゼ依存性薬を取り込まない）］。
【００５６】
本発明のさらなる一実施形態では、患者細胞試料又は細胞株における薬感受性の評価のために、上記の式が以下のカットオフ値を有していてもよい：
ｎ＝ＬＩＰ、ｍ＝ＬＩであるとき％Ｉｎｔ≧５％であり、ｎ＝ＬＩ、ｍ＝Ｌであるとき％Ｉｎｔ≦１０％である場合、患者試料又は細胞株はデオキシリボヌクレオシドキナーゼ依存性薬を取り込みかつ代謝する；
ｎ＝ＬＩＰ、ｍ＝ＬＩであるとき％Ｉｎｔ≦１０％であり、ｎ＝ＬＩ、ｍ＝Ｌ及びｎ＝ＬＩＰ、ｍ＝Ｌのいずれも％Ｉｎｔ＞５％である場合、患者試料又は細胞株はデオキシリボヌクレオシドキナーゼ依存性薬を取り込みかつ代謝しない；
ｎ＝ＬＩＰ、ｍ＝ＬＩであるとき％Ｉｎｔ≧５％であり、ｎ＝ＬＩ、ｍ＝Ｌであるとき％Ｉｎｔ＞５％である場合、患者試料又は細胞株はデオキシリボヌクレオシドキナーゼ依存性薬を取り込みかつ部分的に代謝する；
ｎ＝ＬＩＰ、ｍ＝ＬＩ及びｎ＝ＬＩ、ｍ＝Ｌ及びｎ＝ＬＩＰ、ｍ＝Ｌであるとき％Ｉｎｔ≦１０％である場合、患者試料又は細胞株はデオキシリボヌクレオシドキナーゼ依存性薬を取り込まない。
【００５７】
本明細書で使用する場合、「取り込まれる（taken up）」という用語は、細胞により薬が細胞外空間からサイトゾルへと吸収されることを表す。
【００５８】
「代謝する」という用語は、生物による分子の構造的修飾を表す。
【００５９】
本明細書で使用する場合、「代謝される（metabolised）」と言う薬はリン酸化されており、したがってＬＩアッセイ及びＬアッセイの曲線が同等（parity）に近く、ＬＩＰアッセイ曲線より顕著に低い光の出力を有する。
【００６０】
「代謝されない」と言う薬は、実質的に又は完全に構造的に変化がなく、かつリン酸化されておらず、したがって、ＬＩＰアッセイ及びＬＩアッセイの曲線が同等に近く、溶解物処理より顕著に大きい光の出力を有する。
【００６１】
薬は、リン酸化された親薬に対する変化していない親薬の比が、完全に代謝された薬の比と完全に非代謝の薬の比との間の領域にあり、したがってＬＩアッセイの光の出力がＬＩＰアッセイより顕著に小さいがＬアッセイの光の出力より顕著に大きい場合、「部分的に代謝される」と言う。
【００６２】
上で言及したように、本発明の方法は、最初の２つのアッセイのみを行って実施することができる。この場合、値はＬＩ及びＬＩＰであろう（値Ｌは得られない）。細胞株又は患者試料の耐性を以下の通りに分類することができる：
ＬＩＰ≒ＬＩの生物発光の場合、患者試料又は細胞株は薬に対して耐性を有する（全体として又は実質的に耐性を有する）。
【００６３】
耐性を、以下の式を適用することにより分類することができる：
％Ｉｎｔ＝［Ｔ（ｎ／ｍ）］×１００
［式中、ｎ＝ＬＩＰ及びｍ＝ＬＩである
（ここで、％Ｉｎｔ≦１０％である場合、患者試料又は細胞株は薬に対して実質的に耐性を有する）］。
【００６４】
ブランク対照アッセイを組み込んだ４アッセイ法を使用する場合、以下の式により耐性を分類する：
［Ｔ（ｎ）−Ｃ（ｎ）］≒［Ｔ（ｍ）−Ｃ（ｍ）］の生物発光の場合、薬に対する耐性が存在する。
【００６５】
式に関する定義は前述したものと同じである。
【００６６】
式は以下のように表現することもできる：
％Ｉｎｔ＝［Ｔ（ｎ／ｍ）−Ｃ（ｎ／ｍ）］×１００
［式中、ｎ＝ＬＩＰ及びｍ＝ＬＩである
（ここで、
％Ｉｎｔ≦１０％
である場合、実質的な耐性が存在する）］
【００６７】
式に関する定義は前述したものと同じである。
【００６８】
別の実施形態では、本発明は、デオキシリボヌクレオシドキナーゼ依存性薬に対する細胞株又は患者細胞試料の感受性を決定する際の使用に好適なキットを提供する。キットは、デオキシリボヌクレオシドキナーゼをコードする遺伝子を組み込んだ生物発光レポーター細菌、デオキシリボヌクレオシドキナーゼ転写プロモーター、及び脱リン酸化剤を含む。
【００６９】
ここで、以下の非限定的な実施例を参照して本発明を説明する。
【実施例】
【００７０】
［方法］
（細菌株、プラスミド及び成長培地）
大腸菌Ｓ０５２１８は、ＩＰＴＧ誘導性ｐＴｒｃ９９−Ａプラスミド上のヒトｄＣＫ  ｃＤＮＡを発現するｃｄｄ−欠損株である。大腸菌ＭＧ１６５５は、ｐｙｒＥによりコードされるオロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子の最適以下の発現に起因して最少培地におけるピリミジン要求性を有する野生型大腸菌Ｋ−１２の誘導体である。両方の菌株を、ＥｃｏＲＩ  ＰＣＲ断片としてのフォトラブダス・ルミネセンス由来のｌｕｘＣＤＡＢＥカセットを保有する広宿主（broad-host）ベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２で形質転換することにより自己生物発光性とした。Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地を、細菌の日常的な培養のために使用した。抗生物質アンピシリン（ｐＴｒｃ−Ａを維持するための）及びカナマイシン（ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２を維持するための）を、それぞれ１００μｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌで添加した。ＬＢ  ＲＰＭＩ  １６４０中で、又はチアミン及びロイシンを添加し０．２％グルコース、０．２％ビタミンフリーカザミノ酸を加えた最少塩培地（ＡＢ）中で、成長阻害実験を行った。
【００７１】
（細胞株、骨髄及び血液試料）
２ｍＭ  Ｌ−グルタミン及び１０％ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ  １６４０培地中で単球細胞株ＫＧ−１ａ（ＤＳＭＺ、ドイツ）を成長させ、細胞懸濁液として維持した。密度勾配遠心分離（ＳＧ１．００７）を使用して患者末梢血液又は骨髄試料（ｎ＝８）から単核細胞画分を単離し、その後、Ａｒａ−Ｃを用いるインキュベーションの前にＲＰＭＩ  １６４０培地中に再懸濁した。凍結保存した骨髄試料を解凍し、薬への曝露の前にＲＰＭＩ  １６４０培地中に再懸濁した。全ての場合において、白血病試料は、８０％を超える芽球負荷（burden）を有していた。
【００７２】
（大腸菌ＭＧ１６５５のｃｄｄ欠損株の構築）
Ｔｎ１０トランスポゾンを保有するＰ１ファージでの転位突然変異誘発を使用して、大腸菌ＭＧ１６５５株のライブラリを構築した。テトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）寒天プレート上にプレーティングすることによりトランスポゾンを保有する突然変異体を選択し、１０μｇ／ｍｌの類似体５−フルオロ−２’デオキシシチジン（ｃｄｄを発現する大腸菌に対して毒性を有する）を含有するプレート上にプレーティングすることによりｃｄｄ突然変異体を選択した。ｃｄｄ突然変異体の表現型を、シチジンデアミナーゼ活性がないことにより確認した。
【００７３】
（細胞溶解アッセイ）
ＡＭＬの細胞株又は患者由来の試料を、３７℃及び５％ＣＯ２で９０分間２５μＭのＡｒａ−Ｃで処理し、回収し、洗浄し、新たなＲＰＭＩ  １６４０培地中に再懸濁した。ＥＤＴＡ及びサポニンを添加して、最終濃度をそれぞれ１．５ｍＭ及び０．１％とした。その後試料を３０秒間ボルテックス処理し、１０２７ｇで５分間の遠心分離により細胞残屑を除去した。溶解物又は上清由来の試料を、レポーター細菌、１ｍＭのＩＰＴＧ、及び１０単位のアルカリホスファターゼと混合した。マルチモードマイクロプレートリーダーにおいて細菌の生物発光及び成長（ＯＤ６００）をモニタリングした。Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存度アッセイキット（Promega）を使用して、Ａｒａ−Ｃに対するＡＭＬの細胞株又は患者由来の試料の感受性もアッセイした。製造業者の取扱説明書に従ってＡＴＰの細胞内レベルを測定する前に、３７℃及び５％ＣＯ２で７２時間２５μＭ  Ａｒａ−Ｃで試料を処理した。対応のあるｔ検定を使用して、対照アッセイ試料と処理したアッセイ試料との間の生物発光の出力の有意差を解析した。
【００７４】
［結果］
大腸菌は、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）を欠きデオキシシチジンデアミナーゼ（ｃｄｄ）の活性によりＡｒａ−ＣをＡｒａ−ウラシルへと脱アミノ化するため、Ａｒａ−Ｃは大腸菌に対する効果を有しない。ヒトｄＣＫ遺伝子の発現により、塩基性（basic）最少培地中におけるＡｒａ−Ｃの存在下で相対的な成長の低減を示すｃｄｄ欠損大腸菌突然変異体（Ｓ０５２１８）は、細菌ＤＮＡ中へのＡｒａ−ＣＴＰ組み込みと培地中のシトシン三リン酸（ＣＴＰ）の競合により、富化成長培地においてアッセイした場合Ａｒａ−Ｃに応答しなかった（データは示していない）。
【００７５】
高栄養細胞内環境におけるＡｒａ−Ｃ応答を測定するために、トランスポゾン突然変異誘発を使用して生物発光大腸菌ＭＧ１６５５突然変異体の代替的なｃｄｄ欠損株を構築し、ｐＴｒｃ９９−Ａでさらに形質転換して、ｄＣＫのＩＰＴＧ誘導性発現を得た。新たに構築されたレポーター菌株（ＮＣＴＣ１３４２７）は、高栄養培地において、ＩＰＴＧにより誘導すると、Ａｒａ−Ｃの存在下で成長の低減を示した。図１は、同じ細菌培養物由来の成長及び生物発光の出力に対するＡｒａ−Ｃの効果を示す。薬で処理された培養物（図１Ａ）では成長が減少したが、予想に反して、Ａｒａ−Ｃは同じ薬で処理された培養物由来の光の出力の有意な増大をもたらした（ｐ＝０．０００１）（図１Ｂ）。これらの効果はＩＰＴＧの存在下でのみ観察され、ヒトｄＣＫの活性が細菌ＤＮＡ中へのＡｒａ−ＣＴＰの組み込みをもたらすことが示唆された。光の増大に関する１つの考え得る説明は、Ａｒａ−ＣＴＰにより引き起こされるＤＮＡの損傷が、光回復プロセスによるＤＮＡ修復に使用され得る生物発光を誘導するということである。
【００７６】
低濃度のＡｒａ−ＣでのＮＣＴＣ１３４２７（ｌｕｘ＋ｃｄｄ欠損大腸菌ＭＧ１６５５）を用いる実験（図２）により、細菌バイオセンサーが高い感受性を有し、０．０５μＭもの低さのＡｒａ−Ｃ濃度に応答することが示された。
【００７７】
提唱したアッセイの特異性を増大させるために、細菌バイオセンサーに対する活性な細胞内の薬誘導体（Ａｒａ−ＣＴＰ）の直接的効果をモニタリングした（図３Ａ）。結果は、Ａｒａ−ＣＴＰが直接レポーター細菌に進入する訳ではないことを示す。少なくとも１５時間の成長の後に観察された光の出力の増大は、その後レポーター細菌に進入し得るＡｒａ−ＣＴＰを脱リン酸化するアルカリホスファターゼ（大腸菌の定常期に上方調節されることが知られている）の細菌による産生に起因するものであった可能性がある。これを検証するために、開始時にアルカリホスファターゼを添加して、アッセイを繰り返した。これにより、Ａｒａ−Ｃを用いて観察されたものと同様に、３時間〜５時間後に明らかな光の出力の増大がもたらされた（図３Ｂ）。アルカリホスファターゼ存在下及び非存在下（＋／−）における生物発光の増大を測定することにより、白血病細胞内におけるＡｒａ−Ｃからその活性な代謝産物への細胞内変換を定量化することが可能であった。
【００７８】
９０分の溶解プロトコルと並行して＋／−ホスファターゼアッセイを行うことにより、ホスファターゼ−ｖｅアッセイ（変換されていない／不活性なＡｒａ−Ｃを「検出する」）由来の光の出力とホスファターゼ＋ｖｅアッセイ（全ての細胞内Ａｒａ−Ｃを「検出する」）由来の光の出力との比較を介したＡＭＬ細胞内におけるＡｒａ−ＣからＡｒａ−ＣＴＰへの変換の割合の決定が可能となった。このプロトコルの模式図を図４に示す。代謝感受性を有する患者、代謝耐性を有する患者、部分的に代謝耐性を有する患者、及び取り込み耐性を有する患者に関する生物発光アッセイにおける光の出力の代表例を図５に示す。
【００７９】
ＫＧ−１ａ細胞株、及び導入療法において使用されるＡｒａ−Ｃに応答することが分かっている患者由来のＡＭＬ試料を使用して、アッセイを評価した。図６は、高濃度（２５μＭ）のＡｒａ−Ｃで処理されたＡｒａ−Ｃ感受性細胞株ＫＧ−１ａの溶解物由来の光の出力を示す。結果は、ＢＡＰの存在下（ｐ＝０．０００１）及び非存在下（ｐ＝０．０００１）におけるＩＰＴＧ誘導性溶解物由来の光の出力の有意な増大を明らかに示し、白血病細胞内におけるＡｒａ−Ｃ及びＡｒａ−ＣＴＰの存在を示している。３日間の細胞毒性試験により、ＫＧ−１ａ細胞がＡｒａ−Ｃに対して感受性を有することが確認された。
【００８０】
ＡＭＬ患者由来の末梢血液（ｎ＝５）の臨床試料に、細胞溶解アッセイを適用した。Ａｒａ−Ｃ感受性患者及びＡｒａ−Ｃ耐性患者に関する典型的な結果を、図７（Ｃ）及び図７（Ｄ）に示す。細胞毒性（cytotox）アッセイ及び生物発光アッセイを比較する６人の患者由来のデータの要約を表２に示す。７つの臨床試料に対して行われたこれらの予備アッセイは、療法に対する臨床応答との１００％の相関をもたらした。
【００８１】
【表２】
0005449355.tif 000003
【００８２】
表３により、耐性を有する患者及び感受性を有する患者を特定するための、様々な処理由来の光の出力のピークの相対的な百分率の差異を使用する生物発光アッセイの適用が検証される。表３に示すデータは、例としてｃ）を使用すると、式｛［ＲＬＵ（薬で処理した試料）（ＬＩＰ／ＬＩ）−ＲＬＵ（対照）（ＬＩＰ／ＬＩ）］×１００｝に従って計算される。
【００８３】
【表３】
0005449355.tif 000004
【００８４】
表３から明らかなように、患者１及び患者２は薬を取り込みかつ代謝し、ここでＬＩＰはＬＩ及びＬの両方より明らかに大きなＲＬＵ％値を有し、ＬＩ及びＬは類似の値を有する（すなわち図５の左上の図）。反対に、患者３のプロファイルは図５の左下の図により表され、患者が薬を取り込むが代謝しないことを示唆している。患者４は、臨床的には確認されないが、ａ）、ｂ）及びｃ）に関するＲＬＵ％値が類似しているため、薬の取り込みに対して耐性を有すると考えられる（図５の右下の図）。
【００８５】
結論として、薬と、患者試料又は細胞株との相互作用を決定することが可能である。
【００８６】
本明細書で大腸菌ＭＧ１６５５と記載された微生物は、ブダペスト条約の規定の下に健康保護局感染症センターの英国コレクション・オブ・タイプ・カルチャーズ（National Collection of Type Cultures）（61 Colindale Avenue, London NW9 5EQ, United Kingdom）にＮＣＴＣ１３４２７として寄託されている。
【図１】
0005449355.tif 000005
【図２】
0005449355.tif 000006
【図３】
0005449355.tif 000007
【図４】
0005449355.tif 000008
【図５】
0005449355.tif 000009
【図６】
0005449355.tif 000010
【図７】
0005449355.tif 000011