(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水及び親水性有機溶媒のうちの少なくとも一種を主成分とする抽出溶媒を用いてグァバから抽出されるグァバ抽出物を、特定の条件で高速液体クロマトグラフィによる分画に供したときに得られる成分を含有する抗鳥インフルエンザウイルス剤であって、前記特定の条件は、内径２０ｍｍで長さ２５０ｍｍのＯＤＳカラムを使用すること、ＯＤＳカラムへのグァバ抽出物の投入後１５分までの間はメタノール濃度が２０％の水−メタノール混合物、その後の１５〜３０分の間はメタノール濃度が４０％の水−メタノール混合物を移動相として使用すること、及び移動相の流速が１０ｍＬ／分であることを含み、ＯＤＳカラムへのグァバ抽出物の投入後２０分までの間にカラムから溶出する成分であって、ポリビニルポリピロリドンに吸着しない成分を有効成分として含有することを特徴とする抗鳥インフルエンザウイルス剤。
【請求項２】
抗鳥インフルエンザウイルス剤中に含まれる、ＯＤＳカラムへのグァバ抽出物の投入後２０分までの間にカラムから溶出する成分は、ポリビニルポリピロリドンによる処理がされている、請求項１に記載の抗鳥インフルエンザウイルス剤。
【請求項３】
水及び親水性有機溶媒のうちの少なくとも一種を主成分とする抽出溶媒を用いてグァバから抽出されるグァバ抽出物を、特定の条件で高速液体クロマトグラフィによる分画に供したときに得られる成分を含有する抗鳥インフルエンザウイルス剤であって、前記特定の条件は、内径２０ｍｍで長さ２５０ｍｍのＯＤＳカラムを使用すること、ＯＤＳカラムへのグァバ抽出物の投入後１５分までの間はメタノール濃度が２０％の水−メタノール混合物、その後の１５〜３０分の間はメタノール濃度が４０％の水−メタノール混合物、その後の３０〜４５分の間はメタノール濃度が６０％の水−メタノール混合物を移動相として使用すること、及び移動相の流速が１０ｍＬ／分であることを含み、ＯＤＳカラムへのグァバ抽出物の投入後２０〜３５分の間にカラムから溶出する成分であって、ポリビニルポリピロリドンに吸着しない成分を有効成分として含有することを特徴とする抗鳥インフルエンザウイルス剤。
【請求項４】
抗鳥インフルエンザウイルス剤中に含まれる、ＯＤＳカラムへのグァバ抽出物の投入後２０〜３５分の間にカラムから溶出する成分は、ポリビニルポリピロリドンによる処理がされている、請求項３に記載の抗鳥インフルエンザウイルス剤。
【請求項５】
鳥インフルエンザに対する予防剤又は治療剤として使用される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗鳥インフルエンザウイルス剤。
【請求項６】
前記鳥インフルエンザはＨ５Ｎ３型又はＨ５Ｎ１型である請求項５に記載の抗鳥インフルエンザウイルス剤。
【請求項７】
鳥インフルエンザに対する予防剤又は治療剤を製造するための請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗鳥インフルエンザウイルス剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗鳥インフルエンザウイルス剤及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
鳥インフルエンザウイルスは、主として鳥類に感染するＡ型インフルエンザウイルスの総称であり、野生の水禽類を自然宿主とする。鳥インフルエンザウイルスの中には、ニワトリ、ウズラ、七面鳥等の家禽に感染して高病原性の感染症を引き起こすものがあり、このような高病原性の鳥インフルエンザウイルスは世界的に養鶏産業の脅威となっている。【０００３】
現在、鳥インフルエンザウイルス感染を予防するワクチンの開発研究が行なわれているが（例えば、特許文献１）、いまだ鳥インフルエンザウイルス感染を完全に予防するワクチンはない。そのため、鳥インフルエンザウイルス感染が発生したときの実際の対応は、発生地点から半径数ｋｍの範囲内の家禽を直ちに殺処分することである。また、鳥インフルエンザウイルスの亜型の一つであるＨ５Ｎ１亜型ウイルスのヒトへの感染が、当該ウイルスへの大量接触や宿主の体質によって起こるケースも報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００８−５１５９０６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、本発明者らによる鋭意研究の結果、グァバ抽出物由来の成分が抗鳥インフルエンザウイルス作用を有するのを見出したことに基づくものであり、その目的は、優れた抗鳥インフルエンザウイルス作用を有する抗鳥インフルエンザウイルス剤及びその使用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の目的を達成するために、本発明の一態様では、水及び親水性有機溶媒のうちの少なくとも一種を主成分とする抽出溶媒を用いてグァバから抽出されるグァバ抽出物を、特定の条件で高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）による分画に供したときに得られる成分を含有する抗鳥インフルエンザウイルス剤が提供される。前記特定の条件は、内径２０ｍｍで長さ２５０ｍｍのＯＤＳカラムを使用すること、ＯＤＳカラムへのグァバ抽出物の投入後１５分までの間はメタノール濃度が２０％の水−メタノール混合物、その後の１５〜３０分の間はメタノール濃度が４０％の水−メタノール混合物を移動相として使用すること、及び移動相の流速が１０ｍＬ／分であることを含む。抗鳥インフルエンザウイルス剤は、ＯＤＳカラムへのグァバ抽出物の投入後２０分までの間にカラムから溶出する成分であって、ポリビニルポリピロリドンに吸着しない成分を有効成分として含有する。
【０００７】
本発明の別の態様では、前記特定の条件は、ＯＤＳカラムへのグァバ抽出物の投入後３０〜４５分の間はメタノール濃度が６０％の水−メタノール混合物を移動相として使用することをさらに含み、ＯＤＳカラムへのグァバ抽出物の投入後２０〜３５分の間にカラムから溶出する成分であって、ポリビニルポリピロリドンに吸着しない成分を有効成分として含有する抗鳥インフルエンザウイルス剤が提供される。
【０００８】
本発明のさらに別の態様では、鳥インフルエンザに対する予防剤又は治療剤を製造するための上記いずれかに記載の抗鳥インフルエンザウイルス剤の使用が提供される。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、優れた抗鳥インフルエンザウイルス作用を有する抗鳥インフルエンザウイルス剤及びその使用が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１（ａ）は、グァバ抽出物の高速液体クロマトグラフィ分画で使用される移動相のグラジエント曲線を示すグラフ、図１（ｂ）は、グァバ抽出物の高速液体クロマトグラフィ分画で得られるＨＰＬＣチャートを示す図。
【図２】図２（ａ）は、サンプルＡ〜Ｆ及びサンプルＭｘの高速液体クロマトグラフィ分析で使用される移動相のグラジエント曲線を示すグラフ、図２（ｂ）は、サンプルＭｘの高速液体クロマトグラフィ分析で得られるＨＰＬＣチャート、図２（ｃ）はサンプルＡの高速液体クロマトグラフィ分析で得られるＨＰＬＣチャート、図２（ｄ）はサンプルＢの高速液体クロマトグラフィ分析で得られるＨＰＬＣチャート。
【図３】図３（ａ）は、サンプルＣの高速液体クロマトグラフィ分析で得られるＨＰＬＣチャート、図３（ｂ）は、サンプルＤの高速液体クロマトグラフィ分析で得られるＨＰＬＣチャート、図３（ｃ）はサンプルＥの高速液体クロマトグラフィ分析で得られるＨＰＬＣチャート、図３（ｄ）はサンプルＦの高速液体クロマトグラフィ分析で得られるＨＰＬＣチャート。
【図４】図４（ａ）及び図４（ｂ）は、ウイルス検体混合液中のグァバ抽出物由来の成分の濃度と測定される蛍光強度の関係を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の一実施形態を詳細に説明する。
本実施形態に係る抗鳥インフルエンザウイルス剤は、特定の抽出溶媒を用いてグァバ（Psidium Guajava Linn）から抽出されるグァバ抽出物を特定の条件で高速液体クロマトグラフィによる分画に供したときに特定の溶出時間の間に得られる成分を有効成分として含有する。
【００１２】
グァバは、日本においてバンジロウ又はバンザクロとも呼ばれ、フトモモ科バンジロウ属に属する熱帯地方原産の常緑小高木である。グァバは、例えば、カリブ海沿岸、中央アメリカ、南アメリカ北部、東南アジアに自生し、日本においては沖縄等の暖地で栽培されている。
【００１３】
グァバ抽出物の抽出に使用される抽出原料として、グァバのあらゆる器官又は各器官の構成要素を用いることができる。抽出原料には、グァバの単独の器官又はその構成要素が用いられてもよいし、グァバの二種以上の器官又はその構成要素が混合して用いられてもよい。ただし、抗鳥インフルエンザウイルス作用に優れたグァバ抽出物を得るためには、抽出原料は少なくともグァバの葉又は茎を含むことが好ましい。
【００１４】
抽出原料は、採取したままの状態で、又は採取後に破砕、粉砕若しくはすり潰した状態で、又は採取後に乾燥させた状態で、又は採取及び乾燥後に破砕、粉砕若しくはすり潰した状態で、又は採取後に破砕、粉砕若しくはすり潰して乾燥させた状態で、抽出操作に供される。抽出を効率的に行うためには、抽出原料は破砕されていることが好ましい。また、抗鳥インフルエンザウイルス作用に優れたグァバ抽出物を得るためには、抽出原料は生葉であることが好ましい。
【００１５】
抽出原料からグァバ抽出物を抽出するに際して使用される抽出溶媒は、水及び親水性有機溶媒のうちの少なくとも一種を主成分とする。つまり、水及び親水性有機溶媒のうちの少なくとも一種は、抽出溶媒中で存在割合（容量％）が最も高い。抽出溶媒中の水又は親水性有機溶媒の含有量は５０容量％以上であることが好ましく、より好ましくは７０容量％以上である。抽出溶媒が水と親水性有機溶媒の両方を含有する場合には、水の含有量と親水性有機溶媒の含有量の合計は５０容量％以上であることが好ましく、より好ましくは７０容量％以上である。
【００１６】
抽出溶媒中に含まれる親水性有機溶媒の例としては、メタノール、エタノール等の低級アルコール、アセトン、酢酸エチルが挙げられる。抽出溶媒は、一種類の親水性有機溶媒を単独で含有してもよいし、複数種類の親水性有機溶媒を含有していてもよい。また、抽出溶媒には、水及び親水性有機溶媒以外の溶媒が少量含有されていてもよいし、例えば、有機塩、無機塩、緩衝剤、乳化剤が溶解されていてもよい。
【００１７】
グァバ抽出物の抽出は、抽出溶媒中に抽出原料を所定時間浸漬させることにより行なわれる。その際、必要に応じて、抽出溶媒は攪拌、加温又は加圧されてもよい。一般に抽出温度を高くすると、抽出に要する時間は短くなる。例えば、１〜２気圧の圧力の下、常温であれば１０日かかる抽出も、５０〜１３０℃の温度であれば０．０５〜２時間、あるいは０．１〜０．３時間で済む。抽出条件は、抽出原料の状態や抽出溶媒の種類に応じて適宜に変更が可能である。
【００１８】
抽出原料から抽出されたグァバ抽出物は、抽出原料の残渣を分離除去するべく、固液分離に供される。固液分離は、例えば、ろ過や遠心分離のような公知の方法で行われる。
固液分離により固形分が除去された後のグァバ抽出物は続いて、特定の条件で高速液体クロマトグラフィによる分画に供される。この高速液体クロマトグラフィによる分画では内径２０ｍｍで長さ２５０ｍｍのＯＤＳカラムが使用される。ＯＤＳカラムには、炭素数が１８のオクタデシルシリル基で表面修飾された化学結合型の多孔性球状シリカゲルが固定相として充填されている。このＯＤＳカラムは、例えば、ＹＭＣ社製のＳＨ−３４３−５（シリカゲルの粒子径５μｍ及び細孔径１２ｎｍ）であってもよい。移動相には水とメタノールの混合溶液が用いられる。この混合溶液のメタノール濃度は、ＯＤＳカラムへのグァバ抽出物の投入後、図１（ａ）のグラフ中に示すグラジエント曲線に従って所定時間の経過ごとに段階的に変化させられる。具体的には、混合溶液のメタノール濃度は、ＯＤＳカラムへのグァバ抽出物の投入後１５分まで（０〜１５分）の間は２０％、その後の１５〜３０分の間は４０％、その後の３０〜４５分の間は６０％である。移動相の流速は１０ｍＬ／分に設定される。カラム温度は室温（２５℃）であることが好ましい。
【００１９】
本実施形態の抗鳥インフルエンザウイルス剤は、ＯＤＳカラムへのグァバ抽出物の投入後２０分まで（０〜２０分）の第１の期間にカラムから溶出する成分又はその後の２０〜３５分の第２の期間にカラムから溶出する成分を有効成分として含有する。抗鳥インフルエンザウイルス剤は、第１の期間又は第２の期間にカラムから溶出する溶出液そのものであってもよいし、その溶出液を凍結乾燥等の公知の乾燥処理により粉末化したものであってもよい。なお、第１の期間に得られる溶出液を粉末化したものは茶褐色でややべとつきがある一方、第２の期間に得られる溶出液を粉末化したものは茶褐色でさらさらとしている。
【００２０】
抗鳥インフルエンザウイルス剤は、抗鳥インフルエンザウイルス作用の発揮を目的とする製品に適用して使用することができる。こうした抗鳥インフルエンザウイルス剤含有製品としては、例えば、医療用剤（薬剤を含む）、洗浄剤、化粧品、医療用機器、衛生材料、衛生用の製品及び飲食品が挙げられる。上記医療用剤としては、例えば、医薬品が挙げられる。上記洗浄剤としては、例えば、洗濯用柔軟剤、洗濯用漂白剤、石鹸、入浴剤、洗剤、シャンプー、歯磨き粉が挙げられる。上記化粧品としては、例えば、洗顔石鹸、ハンドソープ、ハンドクリーム、香水、化粧水、乳液、美容液、美容クリーム、口紅、リップクリーム、おしろいが挙げられる。上記医療用機器としては、例えば、マスク、包帯、ガーゼ、手袋、絆創膏、綿球、診断用機械器具、手術用機械器具、治療用機械器具、病院用機械器具、歯科用機械器具、医療用の補助器具、矯正器具が挙げられる。上記衛生材料としては、例えば、ガーゼ、脱脂綿、不織布、綿棒が挙げられる。上記衛生用の製品としては、例えば、加湿器、エアコン、空気清浄機が挙げられる。上記飲食品としては、例えば、健康飲料、健康食品が挙げられる。また、上記医療用剤及び上記化粧品には、うがい薬やのど飴、のどスプレー、薬用石鹸、消毒液等の医薬部外品も含まれる。
【００２１】
抗鳥インフルエンザウイルス剤を含有した医薬品又は医薬部外品の投与法は、経口投与、血管内投与、経皮投与等のあらゆる方法が可能である。医薬品及び医薬部外品の剤形は、特に限定されるものでなく、例えば、散剤、粉剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、坐剤、液剤、注射剤、塗布剤であってもよい。また、医薬品及び医薬部外品には、本発明の目的を損なわない範囲において、賦形剤、基剤、乳化剤、溶剤、安定剤等の添加剤が配合されてもよい。
【００２２】
抗鳥インフルエンザウイルス剤を含有した飲食品は、任意の食品素材又は飲料品素材に抗鳥インフルエンザウイルス剤を添加することによって製造される。飲食品は、例えば、粉末状、錠剤状、顆粒状、液状（ドリンク剤等）、カプセル状、シロップ、キャンディーの形態に加工されて健康食品製剤や栄養補助食品として使用することができる。飲食品の具体例としては、スポーツドリンク、茶葉やハーブなどから抽出した茶類飲料、牛乳やヨーグルト等の乳製品、ペクチンやカラギーナン等のゲル化剤を含有した食品、ハードキャンディやソフトキャンディ、グミ等のキャンディー、チューイングガム、グルコースやショ糖、果糖、乳糖、デキストリン等の糖類、香料、ステビアやアスパルテーム、糖アルコール等の甘味料、植物性油脂及び動物性油脂等の油脂を含有する飲料品や食料品が挙げられる。飲食品には、本発明の目的を損なわない範囲において、基材、賦形剤、添加剤、副素材、増量剤等の添加剤が配合されてもよい。
【００２３】
鳥インフルエンザウイルスには、ヘマグルチニン（hemagglutinin）及びノイラミニダーゼ（neuraminidase）の種類によってＨ５Ｎ３、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ７、Ｈ５Ｎ２、Ｈ７Ｎ３などの複数の亜型が存在するが、本実施形態の抗鳥インフルエンザウイルス剤は、いずれの種類の鳥インフルエンザウイルスに対しても使用することができる。
【００２４】
本実施形態によれば、次の効果が得られる。
本実施形態の抗鳥インフルエンザウイルス剤は、優れた抗鳥インフルエンザウイルス作用を有している。そのため、抗鳥インフルエンザウイルス剤は、鳥インフルエンザウイルスに感染した家禽を含む家畜又はヒトの治療、及び健常な家禽を含む家畜又はヒトのための鳥インフルエンザウイルス感染の予防に利用することができる。すなわち、抗鳥インフルエンザウイルス剤は、鳥インフルエンザに対する予防剤又は治療剤として有用である。
【００２５】
本実施形態の抗鳥インフルエンザウイルス剤は、天然の植物であるグァバ由来の抽出物であるために安全性が高い。
前記実施形態は、次のように変更されてもよい。
【００２６】
抗鳥インフルエンザウイルス剤は、第１の期間（ＯＤＳカラムへのグァバ抽出物の投入後２０分まで）又は第２の期間（その後の２０〜３５分）にカラムから溶出する溶出液をポリビニルポリピロリドン（ＰＶＰＰ）で処理したものであってもよい。この場合、ポリビニルポリピロリドンに吸着する成分の除去が可能である。
【００２７】
次に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。
＜抗鳥インフルエンザウイルス剤の調製＞
グァバの生葉１ｋｇを約１ｃｍ角の大きさに裁断し、エタノールと水を３対７の割合で含有するエタノール水溶液１０Ｌ中に室温下で１０日間浸漬した。その後、これを濾過して得られる濾液を濃縮及び乾固して粉末状のグァバ抽出物６５．１ｇを得た。このグァバ抽出物のうち６．５ｇを、メタノールと水を２対１の割合で含有するメタノール水溶液５０ｍＬ中に溶解した。得られた溶液を３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。その後、上澄みを、Advantec社製の孔径０．８０μｍのCellulose Acetateフィルター（DISMIC-25CS080AN）で濾過し、濾液を分取用サンプルとして回収した。その後、分取用サンプルを以下の条件で高速液体クロマトグラフィによる分画に供した。
【００２８】
（高速液体クロマトグラフィによる分画の条件）
カラム：ＹＭＣ社製のＳＨ−３４３−５（カラムの内径２０ｍｍ及び長さ２５０ｍｍ、シリカゲルの粒子径５μｍ及び細孔径１２ｎｍ）、
移動相：カラムへの分取用サンプル投入後１５分まで（０〜１５分）の間はメタノール濃度が２０％の水−メタノール混合物、その後の１５〜３０分の間はメタノール濃度が４０％の水−メタノール混合物、その後の３０〜４５分の間はメタノール濃度が６０％の水−メタノール混合物、その後の４５〜５０分の間は１００％メタノール（図１（ａ）参照）、
移動相の流速：１０ｍＬ／分、
カラム温度：室温（２５℃）、
検出波長：２５５ｎｍ。
【００２９】
このときに得られたＨＰＬＣチャートを図１（ｂ）に示す。分取用サンプルをカラムに投入してからの時間、すなわち溶出時間が異なる６つの画分を得た。より具体的には、カラムへの分取用サンプル投入後２０分まで（０〜２０分）の間、その後の２０〜３５分の間、その後の３５〜３９分の間、その後の３９〜４１分の間、その後の４１〜４３分の間、その後の４３〜５０分の間にそれぞれカラムから溶出した溶出液を別々に回収し、得られた６つの画分をそれぞれ濃縮及び乾固して表１に示す６つの粉末Ａ〜Ｆを得た。
【００３０】
【表１】
0005558360.tif 000002
粉末Ａ〜Ｆをそれぞれ０．５％ｗ／ｖの濃度でエタノール水溶液（１０〜９０％）に溶解させてサンプルＡ〜Ｆを調製した。また、先に得られた粉末状のグァバ抽出物についても同様に、０．５％ｗ／ｖの濃度でエタノール水溶液（１０〜９０％）に溶解させてサンプルＭｘを調製した。サンプルＡ〜Ｆ及びサンプルＭｘについて、以下の条件で高速液体クロマトグラフィによる分析に供した。
【００３１】
（高速液体クロマトグラフィによる分析の条件）
カラム：Ｉｍｔａｋｔ社製のCadenza CD-C18（ＣＤ００６：内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ、粒子径３μｍ）、
移動相：カラムへのサンプル投入後１０分まで（０〜１０分）の間はメタノール濃度が１０％でかつ酢酸濃度が５％の水−酢酸−メタノール混合物、その後の１０〜２０分の間は水−酢酸−メタノール混合物のメタノール濃度が１０％から３５％まで直線的に徐々に増大、その後の２０〜４０分の間はメタノール濃度が３５％でかつ酢酸濃度が５％の水−酢酸−メタノール混合物、その後の４０〜５０分の間は水−酢酸−メタノール混合物のメタノール濃度が３５％から１００％まで直線的に徐々に増大、その後の５０〜６０分の間は１００％メタノール（図２（ａ）参照）、
移動相の流速：０．６ｍＬ／分、
カラム温度：４０℃、
検出波長：ＭａｘＰｌｏｔ（１９０−８００ｎｍ）、２５０ｎｍ、２８０ｎｍ。
【００３２】
このときに得られたＨＰＬＣチャートを図２（ｂ）〜図２（ｄ）及び図３（ａ）〜図３（ｄ）に示す。より具体的には、図２（ｂ）はサンプルＭｘの、図２（ｃ）はサンプルＡの、図２（ｄ）はサンプルＢの、図３（ａ）はサンプルＣの、図３（ｂ）はサンプルＤの、図３（ｃ）はサンプルＥの、図３（ｄ）はサンプルＦのそれぞれＨＰＬＣチャートを示す。
【００３３】
＜抗鳥インフルエンザウイルス作用に関する試験＞
上記のサンプルＡ〜Ｆ及びサンプルＭｘの抗鳥インフルエンザウイルス作用の評価を以下の手順で行った。
【００３４】
まず、９６穴培養プレートにて、ＭＥＭ７％ＦＢＳ培地を用いてＭＤＣＫ細胞（イヌ腎臓上皮由来細胞）を３７℃のＣＯ２インキュベータで２日間培養し、ＭＤＣＫ細胞を単層形成させた。また、鳥インフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ３：A/Duck/313/4/78 virus）のストック原液を無血清培地（ＳＦ−ＭＥＭ）で希釈して０．７ＨＡＵのウイルス液を作成した。そして、ウイルス液を、サンプルＡ〜Ｆ及びサンプルＭｘのそれぞれを無血清培地（ＳＦ−ＭＥＭ）で２５倍、１００倍、４００倍、１６００倍、６４００倍、２５６００倍（接種時の２倍の濃度）に希釈して得られる同量の希釈液とそれぞれ混合し、４℃で１時間置いてウイルス検体混合液を作成した。各ウイルス検体混合液１００μＬを、９６穴培養プレートに単層形成させたＭＤＣＫ細胞に接種し、３４℃のＣＯ２インキュベータ内で感染処理を行なった。１時間後にウイルス検体混合液を取り除くとともに無血清培地（ＳＦ−ＭＥＭ）で培養プレート上の培養細胞を洗浄した。
【００３５】
その後、サンプルＡ〜Ｆ及びサンプルＭｘのそれぞれを、２．５μＬのアセチルトリプシンを含む無血清培地（ＳＦ−ＭＥＭ）で５０倍、２００倍、８００倍、３２００倍、１２８００倍、５１２００倍に希釈した。得られた希釈液１００μＬのそれぞれを、先に同じ濃度でグァバ抽出物由来の成分を含有するウイルス検体混合液を接種したＭＤＣＫ細胞のセルに加え、培養プレートを３４℃のＣＯ２インキュベータ内に入れた。１８時間後、各セルにメタノール５０μＬを加え、室温で１分間置いてＭＤＣＫ細胞を固定化した。その後、各セルを無血清培地（ＳＦ−ＭＥＭ）で洗浄した。次に、各セルに抗ヌクレオプロテイン−モノクローナル抗体（４Ｅ６）を加えて室温で４５分間置いた後、各セルを無血清培地（ＳＦ−ＭＥＭ）で洗浄した。その後、抗マウスＩｇＧラベルβ−ガラクトシダーゼ（0.1% block-ace）を各セルに加え、室温で４５分間置いた。
【００３６】
次に、４０μＭのＭＵ（4-methylumbelliferone）−Ｇａｌ（５０μＭのＭｇＣｌ２を含有）を各セルに加え、３７℃に４５分間保持した。このとき、抗マウスＩｇＧラベルβ−ガラクトシダーゼは、ＭＵ−Ｇａｌを基質として蛍光性のＭＵ（4-methylumbelliferone）を産生する。その後、１００ｍＭの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．６）を各セルに加えて反応を停止させた後、ＭＵの産生量を測定することにより、細胞に感染したウイルス量の度合いを間接的に測定した。ＭＵの産生量の測定は、蛍光検出器を用いて、励起波長３５５ｎｍ、蛍光波長（検出波長）４６０ｎｍで測定した。この測定の結果に基づいて得られた、ウイルス検体混合液中のグァバ抽出物由来の成分の濃度と測定される蛍光強度の関係を示すグラフを図４（ａ）及び図４（ｂ）に示す。また、各サンプルの５０％効果濃度（ＥＣ５０）を算出した結果を表２に示す。
【００３７】
【表２】
0005558360.tif 000003
表２に示すように、グァバ抽出物を含むサンプルＭｘは高い抗インフルエンザウイルス作用を有していることが確認された。また、サンプルＡ〜ＦのなかでもサンプルＡ及びサンプルＢが特に高い抗インフルエンザウイルス作用を示すことから、グァバ抽出物が有する抗インフルエンザウイルス作用の主体は粉末Ａ及び粉末Ｂであることが確認された。
【００３８】
＜ポリビニルポリピロリドンによる処理に関する試験＞
サンプルＡ及びサンプルＢについて、ポリビニルポリピロリドン（ＰＶＰＰ）による処理による抗インフルエンザウイルス作用の変化を検証した。ＰＶＰＰは、例えばタンニンのような重合したポリフェノールを吸着する作用を有し、ＰＶＰＰによる処理を行なうことによってサンプルＡ及びサンプルＢに含まれるポリフェノールの大部分は除去される。
【００３９】
まず、１ｍＬのサンプルＡ及びサンプルＢのそれぞれに５．０ｇ／ＬのＰＶＰＰを添加して攪拌した。１００００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、その上澄みをAdvantec社製の孔径０．８０μｍのCellulose Acetateフィルター（DISMIC-25CS080AN）で濾過し、濾液を回収した。こうして得られたＰＶＰＰによる処理済みのサンプルＡ及びサンプルＢと、ＰＶＰによる処理をしていないサンプルＡ及びサンプルＢについて、以下の方法で抗インフルエンザウイルス作用を評価した。
【００４０】
まず、２４穴培養プレートにて、ＭＥＭ７％ＦＢＳ培地を用いてＭＤＣＫ細胞（イヌ腎臓上皮由来細胞）を３７℃のＣＯ２インキュベータで２日間培養し、ＭＤＣＫ細胞を単層形成させた。また、鳥インフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ３：A/Duck/313/4/78 virus）のストック原液を無血清培地（ＳＦ−ＭＥＭ）で希釈して０．７ＨＡＵのウイルス液を作成した。そして、ＰＶＰＰによる処理済みのサンプルＡ及びサンプルＢとＰＶＰによる処理をしていないサンプルＡ及びサンプルＢをそれぞれ無血清培地（ＳＦ−ＭＥＭ）で２００倍に希釈し、得られた希釈サンプルのそれぞれを無血清培地（ＳＦ−ＭＥＭ）で２５倍、１００倍、４００倍、１６００倍、６４００倍、２５６００倍（接種時の２倍の濃度）にさらに希釈し、同量のウイルス液と混合した。得られたウイルス検体混合液を氷上で１時間置いた。その後、各ウイルス検体混合液２００μＬを、２４穴培養プレートに単層形成させたＭＤＣＫ細胞に接種し、３４℃のＣＯ２インキュベータ内で感染処理を行なった。
【００４１】
１時間後にウイルス検体混合液を取り除くとともに無血清培地（ＳＦ−ＭＥＭ）で培養プレート上の培養細胞を洗浄した。その後、各セルに０．７５％アガロース含有ＭＥＭ培地を重層し、３４℃のＣＯ２インキュベータ内で３日間培養した。そして、エタノールと酢酸を５対１の割合で含有するエタノール−酢酸溶液を各セルに加えて一晩静置し、感染を停止してＭＤＣＫ細胞を固定化した。その後、重層した培地を取り除き、純水及び０．１％トリトンＰＢＳ溶液で各セルを洗浄してから、１次抗体及び２次抗体を反応させた。そして、染色液（ＤＥＰＤＡ、４ＣＮ  クエン酸緩衝液、Ｈ２Ｏ２）で各セルを処理し、青色に発色したプラーク数をカウントして鳥インフルエンザウイルス感染の抑制率を評価した。その結果を表３に示す。
【００４２】
【表３】
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表３に示すように、ＰＶＰＰによる処理によってサンプルＡ及びサンプルＢのウイルス抑制率に低下が起こることはなかった。この結果から、サンプルＡ及びサンプルＢに含まれる抗鳥インフルエンザウイルス作用を示す成分はタンニンのような重合したポリフェノールでない可能性が示唆される。したがって、ＰＶＰＰによる処理は、抗鳥インフルエンザウイルス作用を示す成分以外の成分を除去して抗鳥インフルエンザウイルス作用を示す成分の含有率を高めるうえで有効である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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