(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フリーラジカルが投与された組織液の抗酸化能を評価する方法であって、
試験管またはビーカのような容器に収容された前記組織液を電子スピン共鳴装置に誘導し、前記組織液に含まれるフリーラジカルを電子スピン共鳴装置を用いて測定する第１の測定ステップと、
前記組織液を再ラジカル化するステップと、
再ラジカル化された前記組織液のフリーラジカルを電子スピン共鳴装置を用いて測定する第２の測定ステップと、
第１の測定ステップの測定結果から第１のフリーラジカル量を算出し、第２の測定ステップの測定結果から第２のフリーラジカル量を算出する算出ステップと、
第１のフリーラジカル量と第２のフリーラジカル量を比較するステップと、
を有する評価方法。
【請求項２】
前記比較するステップは、第２のフリーラジカル量に対する第１のフリーラジカル量の比を算出する、請求項１に記載の評価方法。
【請求項３】
前記第１の測定ステップは、時間的に間隔をもつ複数の回数だけ第１のフリーラジカルを測定し、前記第２の測定ステップは、前記複数の回数だけ第２のフリーラジカルを測定し、前記算出するステップは、前記複数の回数に応じた第１および第２のフリーラジカル量を算出し、前記比較するステップは、前記複数の回数毎の第１および第２のフリーラジカル量の比を比較する、請求項１または２に記載の評価方法。
【請求項４】
前記再ラジカル化するステップは、前記組織液を酸化する、請求項１ないし３いずれか１つに記載の評価方法。
【請求項５】
マイクロダイアリーシス法を用いた人体以外の生体から取り出された組織液の抗酸化能を評価する方法であって、
フリーラジカルを含む試薬が投与された前記生体から回収された潅流液に含まれるフリーラジカルを電子スピン共鳴装置を用いて測定する第１の測定ステップと、
前記潅流液を再ラジカル化するステップと、
再ラジカル化された前記潅流液のフリーラジカルを電子スピン共鳴装置を用いて測定する第２の測定ステップと、
第１の測定ステップの測定結果から第１のフリーラジカル量を算出し、第２の測定ステップの測定結果から第２のフリーラジカル量を算出する算出ステップと、
第１のフリーラジカル量と第２のフリーラジカル量の比を算出するステップと、
を有する評価方法。
【請求項６】
前記試薬は、ニトロキシドラジカルを含む、請求項５に記載の評価方法。
【請求項７】
前記再ラジカル化するステップは、生体から回収された潅流液をフェリシアン化カリウムリンゲル溶解液を用いて反応させ、嫌気化で電子スピン共鳴装置に誘導する、請求項５または６に記載の評価方法。
【請求項８】
前記試薬は、脳血液関門通過性ニトロキシドラジカルを含み、前記第１の測定ステップは、生体の海馬から回収された潅流液を測定する、請求項５ないし７いずれか１つに記載の評価方法。
【請求項９】
第１のフリーラジカル量は、脳内で還元されなかったニトロキシドラジカルの総和を示し、第２のフリーラジカル量は、脳内に移行したニトロキシドラジカルの総和を示す、請求項５ないし８いずれか１つに記載の評価方法。
【請求項１０】
前記比を算出するステップは、ニトロキシドラジカルの投与回数に対応する第１および第２のフリーラジカル量の比の時間的な変化を算出する、請求項５ないし９いずれか１つに記載の評価方法。
【請求項１１】
物質の抗酸化能を評価する評価装置であって、
フリーラジカルが投与された物質からの潅流液に含まれるフリーラジカルを測定し、第１の測定信号を出力する第１の電子スピン共鳴装置と、
前記潅流液を再ラジカル化する再ラジカル化手段と、
再ラジカル化された潅流液に含まれるフリーラジカルを測定し、第２の測定信号を出力する第２の電子スピン共鳴装置と、
第１の測定信号に基づき第１のフリーラジカル量を算出し、かつ第２の測定信号に基づき第２のフリーラジカル量を算出する算出手段と、
第１および第２のフリーラジカル量を比較する比較手段と、
を有する評価装置。
【請求項１２】
前記比較手段は、第２のフリーラジカル量に対する第１のフリーラジカル量の比を算出する、請求項１１に記載の評価装置。
【請求項１３】
前記比較手段は、時間的に間隔をもって複数回の投与が行われたとき、前記算出手段は、複数回の投与に応じた第１および第２のフリーラジカル量を算出し、前記比較手段は、複数回の投与に応じた第１のフリーラジカル量と第２のフリーラジカル量をそれぞれ比較する、請求項１１または１２に記載の評価装置。
【請求項１４】
前記比較手段は、第２のフリーラジカル量に対する第１のフリーラジカル量の比の時間的変化を比較する、請求項１３に記載の評価装置。
【請求項１５】
前記再ラジカル化手段は、生体から回収されたニトロキシドラジカルを含む組織液をフェリシアン化カリウムリンゲル溶解液を用いて反応させ、嫌気化で第２の電子スピン共鳴装置に誘導する、請求項１１ないし１４いずれか１つに記載の評価装置。
【請求項１６】
評価装置はさらに、前記比較手段による比較結果を出力する出力手段を含む、請求項１１ないし１５いずれか１つに記載の評価装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電子スピン共鳴装置を用いた抗酸化能を評価する方法およびその装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内での活性酸素は、反応活性が高いため、生体細胞と反応し、細胞を傷つけたり脂質を酸化させ、これにより、血液疾患や老化などが引き起こされることが知られている。他方、生体内には、活性酸素を消滅または除去する生体内抗酸化物質が存在する。生体内のこうした酸化、還元の動的状態を知ることが重要であり、酸化還元のバランスは、レドックスと呼ばれている。レドックス状態を知るために、電子スピン共鳴を利用した測定装置（以下、電子スピン共鳴装置またはＥＳＲ装置）が利用される。電子スピン共鳴装置は、フリーラジカルを選択的に検出することができるものであり、生体内のフリーラジカルを観察することで、生体のレドックス（酸化還元）状態を知ることができる（特許文献１）。【０００３】
脳組織のレドックス状態を解析するにあたって、いくつかの注意事項がある。脳組織のホモジェネートを試料としてレドックス状態を解析する際、酸素との反応やホモジェネート時間の不均一性などの条件が入るため、組織のレドックス状態が正しく反映されず、比較が困難になる。また、700mHzESRを用いた麻酔下でのレドックス解析も行われているが（非特許文献１を参照）、一般的に麻酔によって抗酸化システムは増強されることや高濃度のニトロキシドラジカルの生体投与を必要とし観察したい病態を修飾することからレドックスを正しく評価できない（非特許文献２を参照）。【０００４】
従来の我々が行ってきたマイクロダイアリーシスを用いたニトロキシドラジカルによるレドックス状態の解析方法について説明する。図６は、雄性Wistar系ラットにマイクロダイアリーシスプローブを脳定位術にて海馬に固定し、電子スピン共鳴装置に組織外液を送っている図である。宮崎大学動物実験委員会の承認を得て、Wistar系雄性ラット（体重２００−２５０ｇ）８匹に対し、ネンブタール麻酔下で、脳定位術を施行し、マイクロダイアリーシス（ＭＤ）プローブをデンタルセメントで固定した。図６に示すデバイスによって、マイクロダイアリーシスによって回収される標的脳組織の細胞外液中のニトロキシドラジカルのＥＳＲシグナル強度を嫌気下で追跡できる。【０００５】
具体的には自由行動条件下、マイクロダイアリーシスプローブを通じてリンゲル液を２μ l/minの速度で潅流し、電子スピン共鳴装置（ＦＲ３０、ＪＥＯＬ）へ直接潅流液を誘導し、１２０分間の定常状態後、次に、脳血液関門通過性ニトロキシドラジカル(3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine-1-oxyl;ＰＣＡＭ)を腹腔内投与し（0.2MのＰＣＡＭ(0.4mmol/kg)）、海馬から回収されるＰＣＡＭのＥＳＲ信号強度を観察することができる（非特許文献３を参照）。【０００６】
図７は、図６に示すニトロキシドラジカルを用いた電子スピン共鳴装置によって検出されたＥＳＲ信号波形を示している。横軸は磁界強度を、縦軸は信号強度を示している。ニトロキシドラジカルの測定では、低磁場から高磁場への挿引により３本のスペクトルをもつＥＳＲ信号波形が生じる。図７のニトロキシドラジカルのＥＳＲシグナル強度の減衰速度から半減期を計算し、生体の抗酸化システムの強弱を推測した。ニトロキシドラジカルは、ａＮ＝１．５ｍＴの超微細分裂を示す信号波形が観察されるが、低磁場のＥＳＲシグナル（333.8+/-0.43mT）強度を、２．６７ｍｉｎ毎に計測することで、３０分を要する磁場挿引計測の時間分解能の向上を図ることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−１３９６６１号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Yokoyama H, Sato T, Oteki T, Ohya H, Akatsuka T. Estimation of the in vivo decay rate of EPR signals for a nitroxide radical in rat brain by a region-selected intensity determination method. Applied Magnetic Resonance. 2005;29:363-73
【非特許文献２】Ueda Y, Doi T, Nagatomo K, Nakajima A. Protective role of pentobarbital pretreatment for NMDA-R activated lipid peroxidation is derived from the synergistic effect on endogenous anti-oxidant in the hippocampus of rats. Neurosci Lett. 2007 Apr 24;417(1):46-9
【非特許文献３】Ueda Y, Doi T, Nagatomo K, Nakajima A. In vivo activation of N-methyl-d-aspartate receptors generates free radicals and reduces antioxidant ability in the rat hippocampus: Experimental protocol of in vivo ESR spectroscopy and microdialysis for redox status evaluation. Brain Res. 2007 Oct 31;1178:20-7
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、従来の生体の抗酸化能を評価する方法には、次のような課題がある。濃度の高いニトロキシドラジカルを生体に投与すると、生体が変化してしまい、生体の抗酸化能を正確に評価することができない。このため、検出限界のニトロキシドラジカル濃度を投与して病態レドックスを描出することが求められる。【００１０】
また、図６に示す従来のニトロキシドラジカル法によるレドックス解析では、ニトロキシドラジカルの減衰が抗酸化物質による還元に起因していることを検証することはできなかった。【００１１】
本発明は、上記従来の課題を解決し、病体や細胞等の生体を損なうことなく、ニトロキシドラジカルのような安定的なラジカルを投与してその消滅を観察することができる、電子スピン共鳴装置を用いた抗酸化能を評価する方法およびその装置に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明に係る物質の抗酸化能を評価する方法は、物質にフリーラジカルを投与するステップと、物質からの潅流液に含まれるフリーラジカルを電子スピン共鳴装置を用いて測定する第１の測定ステップと、物質から回収された潅流液を再ラジカル化するステップと、
再ラジカル化された潅流液のフリーラジカルを電子スピン共鳴装置を用いて測定する第２の測定ステップと、第１の測定ステップの測定結果から第１のフリーラジカル量を算出し、第２の測定ステップの測定結果から第２のフリーラジカル量を算出する算出ステップと、第１のフリーラジカル量と第２のフリーラジカル量を比較するステップとを有する。【００１３】
好ましくは前記比較するステップは、第２のフリーラジカル量に対する第１のフリーラジカル量の比を算出する。好ましくは投与するステップは、フリーラジカルを時間的に間隔をもって複数回物質に投与し、前記第１の測定ステップは、前記投与回数に応じた回数だけ第１のフリーラジカルを測定し、前記第２の測定ステップは、前記投与回数に応じた回数だけ第２のフリーラジカルを測定し、前記算出するステップは、投与回数に応じた第１および第２のフリーラジカル量を算出し、前記比較するステップは、投与回数毎の第１および第２のフリーラジカル量の比を比較する。好ましくは再ラジカル化するステップは、物質からの潅流液を酸化する。【００１４】
本発明に係るマイクロダイアリーシス法を用いた生体の抗酸化能を評価する方法は、生体にフリーラジカルを含む試薬を投与するステップと、生体から回収された潅流液に含まれるフリーラジカルを電子スピン共鳴装置を用いて測定する第1の測定ステップと、生体から回収された潅流液を再ラジカル化するステップと、再ラジカル化された潅流液のフリーラジカルを電子スピン共鳴装置を用いて測定する第２の測定ステップと、第１の測定ステップの測定結果から第１のフリーラジカル量を算出し、第２の測定ステップの測定結果から第２のフリーラジカル量を算出する算出ステップと、第１のフリーラジカル量と第２のフリーラジカル量の比を算出するステップとを有する。【００１５】
好ましくは投与するステップは、ニトロキシドラジカルを投与する。例えば再ラジカル化するステップは、生体から回収された潅流液をフェリシアン化カリウムリンゲル溶解液を用いて反応させ、嫌気化で電子スピン共鳴装置に誘導する。例えば、投与するステップは、脳血液関門通過性ニトロキシドラジカルを生体の腹腔内に投与し、前記第１の測定ステップは、生体の海馬から回収された潅流液を測定する。この場合、第１のフリーラジカル量は、脳内で還元されなかったニトロキシドラジカルの総和を示し、第２のフリーラジカル量は、脳内に移行したニトロキシドラジカルの総和を示す。好ましくは比を算出するステップは、ニトロキシドラジカルの投与回数に対応する第１および第２のフリーラジカル量の比の時間的な変化を算出する。【００１６】
本発明に係る物質の抗酸化能を評価する評価装置は、フリーラジカルが投与された物質からの潅流液に含まれるフリーラジカルを測定し、第１の測定信号を出力する第１の電子スピン共鳴装置と、前記潅流液を再ラジカル化する再ラジカル化手段と、再ラジカル化された潅流液に含まれるフリーラジカルを測定し、第２の測定信号を出力する第２の電子スピン共鳴装置と、第１の測定信号に基づき第１のフリーラジカル量を算出し、かつ第２の測定信号に基づき第２のフリーラジカル量を算出する算出手段と、第１および第２のフリーラジカル量を比較する比較手段とを有する。【００１７】
好ましくは比較手段は、第２のフリーラジカル量に対する第１のフリーラジカル量の比を算出する。好ましくは比較手段は、時間的に間隔をもって複数回の投与が行われたとき、前記算出手段は、複数回の投与に応じた第１および第２のフリーラジカル量を算出し、前記比較手段は、複数回の投与に応じた第１のフリーラジカル量と第２のフリーラジカル量をそれぞれ比較する。好ましくは比較手段は、第２のフリーラジカル量に対する第１のフリーラジカル量の比の時間的変化を比較する。好ましくは再ラジカル化手段は、生体から回収されたニトロキシドラジカルを含む組織液をフェリシアン化カリウムリンゲル溶解液を用いて反応させ、嫌気化で第２の電子スピン共鳴装置に誘導する。好ましくは評価装置はさらに、前記比較手段による比較結果を出力する出力手段を含む。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、第１のフリーラジカル量と第２のフリーラジカル量を比較することで、生体の抗酸化能を検証することができる。好ましくは、複数回の試薬を投与し、第２のフリーラジカル量に対する第１のフリーラジカル量の比の時間的な変化を監視することで、抗酸化物質による生体の抗酸化能を正確に検証することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の実施の形態に係る抗酸化能評価装置の構成を示すブロック図である。
【図２】図１に示す処理装置の機能ブロック図である。
【図３】本発明の実施例の形態に係る抗酸化能評価装置の動作を説明するフローチャートである。
【図４Ａ】本発明の実施例に係る抗酸化能評価装置の構成例を示す図である。
【図４Ｂ】図４ＡのＥＳＲ  ＴＥ１００のＥＳＲシグナル強度の波形図である。
【図５】ＦＲ３０とＴＥ１００で観察されるＥＳＲ信号の強度を縦軸に、ＰＣＡＭ投与後の時間軸を横軸にしてプロットしたものである。
【図６】マイクロダイアリーシスＥＳＲ法を示す図である。
【図７】図６に示すニトロキシドラジカルのＥＳＲシグナル強度の波形図である。
【図８】本発明の試験管等内に収容された物質の抗酸化評価の例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
次に、本発明を実施するための形態について図面を参照して詳細に説明する。本発明の電子スピン共鳴装置を用いた抗酸化能評価方法およびその装置は、生体を含む物質に広く適用することができる。物質は、固体（固相）、液体、ゲル状のいずれであってもよい。また、物質は、生体や生体以外のものも包含する。生体は、例えば、人体、ラットなどの哺乳類、魚類、爬虫類、昆虫などを含み、これらの細胞、組織、臓器（例えば肝臓）、脳、筋肉、血液、組織液などを包む広い概念である。
【００２１】
図１は、本発明の好ましい実施の形態に係る抗酸化能評価装置の構成を示すブロック図である。本実施例の抗酸化能評価装置１０は、第１の電子スピン共鳴装置（ＥＳＲ）２０と、第２の電子スピン共鳴装置３０と、第１および第２の電子スピン共鳴装置２０、３０で測定された生体のフリーラジカルを示すＥＳＲ信号Ｓ１、Ｓ２を受取りこれらのＥＳＲ信号Ｓ１、Ｓ２の信号処理を行う処理装置４０と、処理装置４０による処理結果をディスプレイ等に出力する出力装置５０とを含んで構成される。
【００２２】
電子スピン共鳴装置は、公知のように、試料の形状、固体、液体、気体に影響されることなく、非破壊で物質内のフリーラジカルを選択的に測定することができる装置である。典型的なＥＳＲ装置は、試料を収容する空間を提供するキャビティ、試料に外部磁場を与える磁場発生装置、試料にマイクロ波を与えるマイクロ波発生装置、マイクロ波による共鳴状態を検出する検出装置、検出された信号を増幅する増幅装置などを含んで構成される。
【００２３】
本実施の形態では、２つのＥＳＲ装置を用いて生体の抗酸化能を評価することを主たる特徴とする。生体Ｓに、フリーラジカルＦを含む試薬を投与し、生体Ｓから回収された組織液Ｌ１を嫌気化で第１のＥＳＲ装置２０に誘導する。第１のＥＳＲ装置２０は、組織液Ｌ１のフリーラジカルの消滅状態を測定する。その測定結果は、ＥＳＲ信号Ｓ１として処理装置４０に提供される。
【００２４】
酸化装置５０は、生体から回収された組織液Ｌ２を酸化することで、生体内で抗酸化物質等によって還元されていた試薬を再びフリーラジカル化し、フリーラジカル化された組織液Ｌ２ｓを第２のＥＳＲ装置３０へ嫌気化で誘導する。第２のＥＳＲ装置３０は、酸化された組織液Ｌ２ｓのフリーラジカルを測定し、その測定結果をＥＳＲ信号Ｓ２として処理装置４０へ提供する。
【００２５】
処理装置４０は、ＥＳＲ信号Ｓ１に基づきフリーラジカル量を算出する。好ましくは、ＥＳＲ信号Ｓ１の信号強度を複数サンプリングし、サンプリングされた信号強度を加算することによりフリーラジカル量を算出する。あるいは、サンプリングされた信号強度によって囲まれた面積を近似的に算出するようにしてもよい。処理装置４０は、これと同様の方法を用い、ＥＳＲ信号Ｓ２に基づきフリーラジカル量を算出する。処理装置４０はさらに、ＥＳＲ信号Ｓ１、Ｓ２から算出されたフリーラジカル量の比を算出したり、フリーラジカルの差分を算出することができる。生体Ｓに複数回のフリーラジカルＦの試薬が投与された場合には、処理装置４０は、試薬の投与毎にフリーラジカル量を算出し、投与回数に応じた回数のフリーラジカルの比を算出する。このようなフリーラジカルの比の時間的な変化は、生体の抗酸化能を表す。また、フリーラジカルの比の時間的な変化は、ディスプレイ等の出力装置６０に出力させることができる。
【００２６】
処理装置４０は、コンピュータ、マイクロプロセッサ、マイクロコントローラその他の電子処理装置であることができ、好ましくは、処理プログラムを格納したメモリ、処理プログラムを実行する処理プロセッサを含む。処理装置４０は、第１および／または第２のＥＳＲ装置２０、３０と別体であってもよいし、これらの装置のいずれかに含まれるものであってもよい。出力装置６０もまた第１および／または第２のＥＳＲ装置２０と別体であってもよいし、これらの装置のいずれかに含まれるものであってもよい。
【００２７】
図２は、処理装置４０の機能ブロック図である。処理装置４０は、第１のＥＳＲ装置２０からのＥＳＲ信号Ｓ１に基づき生体内のフリーラジカルの非還元量を算出する第１の算出部７０と、第２のＥＳＲ装置３０からのＥＳＲ信号Ｓ２に基づき酸化されたフリーラジカル量を算出する第２の算出部７２と、第１の算出部７０で算出されたフリーラジカルの非還元量と第２の算出部７２で算出されたフリーラジカル量の比を算出する比算出部７４とを有する。
【００２８】
次に、本実施の形態に係る抗酸化能評価装置の動作について図３のフローを参照して説明する。ここでは、評価対象に生体を用い、生体の測定準備を開始する（ステップＳ１０１）。
【００２９】
次に、安定したフリーラジカルを含む物質を生体に投与する（ステップＳ１０２）。そして、生体から回収された組織液Ｌ１を第１のＥＳＲ装置２０に誘導し、第１のＥＳＲ装置２０においてフリーラジカルを測定する（ステップＳ１０３）。次に、測定結果であるＥＳＲ信号Ｓ１が処理装置４０に供給され、ＥＳＲ信号Ｓ１に基づき生体のフリーラジカルの非還元量が算出される（ステップＳ１０４）。処理装置４０は、ＥＳＲ信号Ｓ１の信号強度の変化を複数サンプリングし、このサンプリングは、一定の期間あるいは信号強度が一定になるまでの間に行われる。
【００３０】
次に、第１のＥＳＲ装置２０で測定が終了した組織液Ｌ２を酸化し（ステップＳ１０５）、酸化された組織液Ｌ２ｓが第２のＥＳＲ装置３０に誘導され、第２のＥＳＲ装置３０においてフリーラジカルが測定される（ステップＳ１０６）。次に、測定結果であるＥＳＲ信号Ｓ２が処理装置４０に供給され、ＥＳＲ信号Ｓ２に基づき生体内のフリーラジカルの総量が算出される（ステップＳ１０７）。処理装置４０は、ＥＳＲ信号Ｓ２の信号強度の変化を複数サンプリングし、このサンプリングは、一定の期間あるいは信号強度が一定になるまでの間に行われる。
【００３１】
次に、処理装置４０は、ＥＳＲ信号Ｓ１から求められたフリーラジカルの非還元量と、ＥＳＲ信号Ｓ２から求められたフリーラジカル量の比を算出する（ステップS１０８）。次に、生体への投与回数が規定の回数に満たない場合には（ステップS１０９）、再び上記のステップＳ１０２からの処理が繰り返され、投与が規定の回数に到達した場合には、終了する。
【００３２】
フリーラジカルの総量に対するフリーラジカルの非還元量の比は、生体内においてフリーラジカルがどれくらい還元されたのかを示する。この比が小さければ、より多くのフリーラジカルが還元されたことを意味する。また、複数回の投与から得られる、この比の時間的な変化は、生体内の抗酸化能を示し、比が漸減すれば、比の抗酸化能が増加していることを示す。これにより、生体の抗酸化能を感度よく測定または評価することができる。
【実施例】
【００３３】
次に、本発明の実施例について説明する。本実施例は、フェリシアン化カリウムによるニトロキシドラジカルの再酸化−Ｄｕａｌ  ＥＳＲ法の構築に関する。【００３４】
図４Ａは、本実施例に係るＤｕａｌ  ＥＳＲ法による生体の抗酸化能評価システムの構成を示す概略図である。同図において、左側に示す測定部分は、図６で示した従来のニトロキシドラジカルによるレドックス解析法と同じであり、マイクロダイアリーシスによって回収される標的組織の細胞外液中のラジカルのＥＳＲシグナル強度を嫌気下で追跡する構成を示している。【００３５】
本実施例では、図６にて回収されるマイクロダイアリーシス組織液を1mMのフェリシアン化カリウムリンゲル溶解液と反応させ、第２のＥＳＲ装置（ＴＥ１００、ＪＥＯＬ）３０に嫌気下で誘導し、ラットの灌流液に含まれる還元されたニトロキシドラジカルを再酸化し、第２のＥＳＲ装置３０でフリーラジカルを測定する。好ましい例として、ＦＲ３０から回収されたラットの組織液は、チューブによって酸化装置５０に搬送され、酸化装置５０は、このチューブ内にフェリシアン化カリウムリンゲル溶解液を供給する。これにより、組織液が連続的に酸化され、酸化された組織液が、FR30に直列に接続された次のＴＥ１００へ誘導される。なお、組織液が第１のＥＳＲ装置２０から第２のＥＳＲ装置３０まで到達する時間は、既知である。【００３６】
本実施例では、第１のＥＳＲ装置であるＦＲ３０よりも感度が高いＴＥ１００（第２のＥＳＲ装置３０）を用いている。ＦＥ３０、ＴＥ１００ともに、試料を収容するためのキャビティ、キャビティ内の試料に磁場を掃引するための磁場生成部、キャビティ内の試料にマイクロ波を照査するマイクロ波ユニット、試料内のフリーラジカルを検出する検出回路等を備えている。さらに、ＦＲ３０、ＴＥ１００は、検出回路から出力されたＥＳＲ信号を処理するためのコンピュータ装置および処理結果を出力するディスプレイを備えている。ＦＲ３０、ＴＥ１００のコンピュータ装置は、電気的に独立し駆動する測定装置で、各装置で得られた測定データが抽出される。但し、ＦＲ３０、ＴＥ１００を、ネットワーク等を介して互いにデータ通信できるように電気的に接続してもよい。【００３７】
第２のＥＳＲ装置であるＴＥ１００で検波されるＥＳＲ信号を図４Ｂに示す。このＥＳＲ信号は、図７に示すＥＳＲ信号と同様のものである。本実施例において、信号強度の測定は、低磁場側のＥＳＲシグナルのみを２．６７ｍｉｎごとに追跡した。【００３８】
（脳内還元物質（能）の推定）
図５は、第１のＥＳＲ装置であるＦＲ３０と第２のＥＳＲ装置であるＴＥ１００で観察されるＥＳＲシグナルの強度を縦軸に、ＰＣＡＭ投与後の時間軸を横軸にしてプロットしたものである。同図において、○は、ＦＲ３０によるＥＳＲ信号強度のプロット（Ａはその強度値）である。●は、ＴＥ１００によって測定されたＥＳＲ信号強度のプロット（Ｂはその強度値）である。横軸の１、２、３は、ニトロキシドラジカルを含む試薬Ｆの投与回数（この例では３回）である。【００３９】
第１回目の試薬の投与に応答して、ＦＲ３０は、２．６７ｍｉｎごとにＥＳＲ信号波形の信号強度をサンプリングする。時間の経過とともに、脳内に移行したニトロキシドラジカルは、脳内での還元や拡散によって信号強度が減衰している（○印）。また、第１回目の投与に応答して、ＴＥ１００は、２．６７ｍｉｎごとにＥＳＲ信号波形の信号強度をサンプリングする。ラットから回収された組織液に含まれるニトロキシドラジカルが時間の経過とともに拡散等によって消滅し、●の信号強度が減衰している。【００４０】
ＦＲ３０は、図５に示すように、サンプリングされた強度値Ａ１の漸減カーブが形成する面積Ｓｑ（Ａ１）を算出する。好ましい１つの算出方法は、各サンプリングされた強度値Ａ１を加算することによって行う。あるいは、各サンプリングされた強度値Ａ１に近似する直線または曲線を求め、面積Ｓｑ（Ａ１）を求めても良い。ＴＥ１００は、サンプリングされた強度値Ｂ１の漸減カーブが形成する面積Ｓｑ（Ｂ１）を算出する。算出方法は、上記と同様の方法により行うことができる。さらに、ＴＥ１００は、面積の比Ｓｑ（Ａ１）／Ｓｑ（Ｂ１）＝Ｒｄ１を求める。このような面積Ｓｑ（Ａ）、Ｓｑ（Ｂ）の算出およびＳｑ（Ａ）／Ｓｑ（Ｂ）の比の算出は、第２回目、および第３回目の試薬の投与についても、ＦＲ３０、ＴＥ１００において行われる。【００４１】
Ｓｑ（Ｂ）は、脳内に移行したニトロキシドラジカルの総和を示し、Ｓｑ（Ａ）は、脳内で還元されなかったニトロキシドラジカルの総和を示す。よって、Ｒｄ値（Ｒｄ１、Ｒｄ２、Ｒｄ３）の時間的な増加は、還元能の低下を示し、Ｒｄ値の低下は、脳内還元能の増加を示す。図５の場合、ＰＣＡＭの腹腔内投与回数を３回繰り返し、Ｒｄ１、Ｒｄ２、Ｒｄ３を求めたところ、Ｒｄ値は漸減していった。【００４２】
ＦＲ３０またはＴＥ１００のディスプレイには、図５に示すようなＲｄ値の変化を表示することができる。ＦＲ３０からＴＥ１００までの測定の時間差は既知であり、これを考慮してＦＲ３０、ＴＥ１００の測定結果が整合するような時間軸での表示が可能になる。【００４３】
なお、図５に示す測定結果の例では、生体の脳内還元能が増加していることを示しているが、病変した生体などによっては、サンプリングされた強度値Ａ、Ｂが漸増することもある。また、上記の例では、面積Ｓｑ（Ａ）とＳｑ（Ｂ）の比Ｒｄを求める例を示したが、面積Ｓ１（Ａ）−Ｓｑ（Ｂ）の差分を求め、当該差分の時間的な変化を観測するようにしてもよい。試薬の投与回数に応じ、当該差分が時間的に減少すれば還元能の低下を示し、反対に増加すれば還元能の増加を示す。【００４４】
このように本実施例によれば、ＦＲ３０およびＴＥ１００の２つのＥＳＲ装置を直列に接続し、生体内におけるニトロキシドラジカルの非還元量と、生体内に供給されたニトロキシドラジカルの総量との比を時間経過的に観測することができるため、生体の抗酸化能をより正確に評価することができる。同時に、抗酸化能の精度の向上は、生体へのニトロキシドラジカルの投与量を、生体が損なわれないまたは変化しない程度であって検出限界まで少なくすることを可能にする。【００４５】
なお、上記実施例では、低磁場側の信号を選択してニトロキシドラジカルの量を算出する例を示したが、どのスペクトルの信号波形を選択するかは任意であって、非低磁場側の信号波形を用いてニトロキシドラジカルの量を算出するようにしてもよい。また上記実施例では、ニトロキシドラジカルの試薬を３回投与したが、この回数は、任意に選択し得るものである。【００４６】
さらに上記実施例では、組織液Ｌ１をチューブにてＥＳＲに誘導する例を示したが、組織液Ｌ１をＥＳＲに誘導できるものであれば、チューブに限らず、他の誘導装置を利用するものであってもよい。例えば、試料を嫌気化で送る装置として、市販されているエイコム（ＥｉＣＯＭ）社製のオートインジェクタＥＡＳ−２０を利用し、マイクロダイアリーシス手法において、灌流液をオートインジェクタのループに連続的にため込み、一定時間毎にＥＳＲの分析系に送るようにしてもよい。【００４７】
さらに上記実施例では、チューブ内にフェリシアン化カリウムを供給することで組織液Ｌ２の酸化（ラジカル化）を行う例を示したが、組織液Ｌ２を酸化できるものであれば、チューブに限らず、他の酸化装置、酸化方法を利用するものであってもよい。また、酸化剤は、フェリシアン化カリウムに限らず、例えば、次亜塩素酸ナトリウム、ヨードベンゼンアセテート、二酸化マンガン、二酸化鉛、過酸化水素などを用いることも可能である。【００４８】
また上記実施例では、感度の異なるＥＳＲ装置を用いたが、これに限らず、同じ感度をもつ同一のＥＳＲ装置を２台用いてもよく、ＥＳＲ装置の組合せは任意である。【００４９】
さらに上記実施例では、ラットの生体の抗酸化能を評価する例を示したが、本発明は、生体の抗酸化能の評価に限定されるものではなく、試験管やビーカなどに収容された物質の抗酸化能を評価するものであってもよい。例えば、図８に示すように、試験管またはビーカのような容器１００内に、ビタミンＣ、Ｅなどの抗酸化剤または還元剤を含む液状の物質１１０を収容し、そこに、ニトロキシドラジカル１２０等の試薬を複数回投与し、その物質１１０を第１のＥＳＲに嫌気下で誘導し、そこでニトロキシドラジカルを測定し、次いで、第１のＥＳＲからの物質１１０を酸化し、酸化された物質１１０を嫌気下で第２のＥＳＲに誘導し、そこでニトロキシドラジカルを測定する。そして、第１のＥＳＲの測定結果から容器１００内で還元されなかったニトロキシドラジカルの総和Ｓｑ（Ａ）を算出し、第２のＥＳＲの測定結果から容器１００に滴下されたニトロキシドラジカルの総和Ｓｑ（Ｂ）を算出し、両者の比または差分を算出することで、物質１１０の抗酸化能を評価することができる。【００５０】
本発明の好ましい実施の形態について詳述したが、本発明は、特定の実施形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された本発明の要旨の範囲内において、種々の変形・変更が可能である。
【符号の説明】
【００５１】
Ｆ：フリーラジカルを含む試薬
Ｓ：生体
Ｌ１、Ｌ２：組織液
Ｌ２ｓ：酸化された組織液
２０、３０：ＥＳＲ装置
４０：処理装置
５０：酸化装置
６０：出力装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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