(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の標的に対する複数の異なる生体分子リガンドを同時に合成する方法であって、前記方法が：
結合メンバーと非結合メンバーとを含む生体分子のライブラリーを複数の標的に同時に接触させるステップと；
前記生体分子のライブラリーを前記複数の標的に同時に接触させた後、前記複数の標的に結合しない前記生体分子のライブラリーのメンバーを洗浄によって分離するステップと；
前記複数の標的に結合しない前記生体分子のライブラリーのメンバーを分離した後、複数の標的に結合する生体分子のライブラリーのメンバーを各々特定の標的を示す識別子でマーク付けするステップと；
複数の標的に結合する生体分子のライブラリーのメンバーにマーク付けされた前記識別子により、前記生体分子のライブラリーの結合メンバーを同定し、前記識別子を介して前記メンバーと標的とを相関させるステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記複数の標的分子が、単一反応容量内の基質上に配置される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記識別子を前記生体分子へ付着させるステップ、ライゲーションするステップ、光ライゲーションするステップ、または共有結合させるステップをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記基質上の複数の標的を接触させる前または後に、複数の標的に対する生体分子の前記ライブラリーに関して少なくとも１ラウンドのＳＥＬＥＸ処理を行うステップをさらに含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
複数の標的に対する生体分子リガンドを同時に合成するシステムであって、前記システムが：
核酸生体分子のライブラリーと；
基質上の所定の空間的配置内に配置された複数の標的と；
複数のオリゴヌクレオチド識別子のそれぞれの配列は前記基質上の前記空間的配置の特定位置に対応する、該複数のオリゴヌクレオチド識別子と；
を含み、前記複数のオリゴヌクレオチド識別子が基質へ適用されて前記標的に結合した前記ライブラリーの核酸生体分子をタグ付けするものであり、該タグ付けは前記オリゴヌクレオチド識別子の配列を介して前記生体分子が結合する前記標的を同定するシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００９年３月２３日に出願された「機能的リガンドの同時合成方法」と題する米国仮特許出願番号第６１／１６２，３９４号、及び、２００８年６月６日に出願された「分子検出方法」と題する米国仮特許出願番号を第６１／０５９，４３５号を基礎とする２００９年６月６日に出願された「分子検出方法」と題する米国特許出願番号第１２／４７９，８０６号から優先権の利益を主張する。上記出願全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（配列表）
デオキシリボ核酸配列は、２０１０年１月６日に作成されたサイズ９．１１キロバイトの「Ｐ１０１１ＵＳ０１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と題するＡＳＣＩＩテキストファイルを参照することにより、本明細書に組み込まれる。
【０００３】
（発明の属する技術分野）
本発明は、機能的生体分子を合成する方法に関し、特に、複数の異なる標的分子に対して複数の機能的核酸を同時に合成する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
分子標的に結合可能な核酸リガンドであるアプタマーは、生物学、生命工学の多領域におけるその潜在的用途に関して、近年ますます注目を集めている。かかるアプタマーは、センサや治療手段として、細胞プロセスを調節するためならびに特定の細胞内標的（単数・複数）に薬剤を導入するために使用され得る。
実際の遺伝物質とは異なり、その特異性及び特徴は、一次配列によって直接的に決定されるのではなく、三次構造によって決定される。近年、アプタマーは、マイクロアレイフォーマットの固定捕捉エレメントとして研究されてきた。あるいは、近年、アプタマーは全細胞及び複合的な生物学的混合物に対峙するものとして選択されてきた。
【０００５】
一般的に、アプタマーは、ときに指数関数的な増幅によるリガンドの系統的進化法、すなわち「ＳＥＬＥＸ」と呼ばれるインビトロでの選択方法によって同定される。ＳＥＬＥＸは、典型的には、ランダムに選ばれたポリヌクレオチドの極めて大きなプールから開始して、その後通常、１の分子標的に対して１のアプタマーリガンドとなるよう絞り込まれる。複数ラウンド（典型的には１０〜１５）のＳＥＬＥＸが終了すると、核酸配列が、従来的なクローニングとシークエンシングによって同定される。アプタマーは、その親和性と特異性に関して、抗生物質と競合する重要なタンパク質に対するリガンドとして開発されてきたことが最も有名であり、アプタマーベースの初の治療薬も登場している。しかし、より最近では、アプタマーは、小さな有機分子や細胞毒素、ウイルス、及び重金属イオンなどの小さな標的に対しても結合するよう、開発されてもいる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、例えば複数の異なる機能的分子を同時に合成する方法に関し、特に、複数の標的分子に対する複数の異なる機能的核酸を同時に合成する方法に関する。さらに、本発明は、例えば機能的分子を合成する方法に関し、特に機能的活性を伴って、例えば受容体分子など、他の生体分子に結合する機能的核酸を合成する方法に関する。本明細書で使用される１を超える、すなわち複数の標的は、通常、異種の標的を含み得て、及び／または、例えば温度、ｐＨ、化学環境、及び／またはその他適切な条件などの異なる条件下の単
一種の標的を複数含み得る。
【０００７】
一般的に、機能的生体分子を合成する方法は、例えば多様な、またはランダムに選ばれた生体分子のライブラリーを得るステップを含む。生体分子は、一般的には核酸、特に、一本鎖核酸、ペプチド、その他の生体高分子及び／またはこれらの組み合わせもしくは修飾を含み得る。生体分子のライブラリーは、例えばリボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、人工的に修飾された核酸及び／またはこれらの組み合わせなどの核酸配列を含み得る。機能的生体分子を合成する方法は、生体分子のライブラリーと、例えば分子標的、分子材料及び／または分子性物質などの１を超える標的とを接触させるステップをさらに含む。通常、その親和性では複数の標的と結合しないライブラリーのメンバーは、ライブラリーの残りのメンバーから洗浄されるか、そうでなくても分離される結果、１を超える標的に対する所定レベルの結合親和性が確保される。かかるプロセスが反復されて、ライブラリーのなかで最強のメンバーが分離され得る。後続の反復及び前記プロセスの最終生成物の単離及び／または精製用にライブラリーの結合メンバー数を増加させるために生体分子の増幅も利用され得る。ＳＥＬＥＸ法による実施形態は、一般的に所定レベルの結合親和性を有する機能的生体分子の合成を達成するために利用され得て、かかる生体分子は一般的にアプタマーまたはリガンドと呼ばれる。
【０００８】
本発明の説明的な一態様において、機能的生体分子の合成は、例えば単一反応容量における機能的核酸リガンドの合成など、単一システム中、１を超えるすなわち複数の標的に対して同時に行われ得る。一般的に１を超える、すなわち複数の標的は、単一反応容量内に配置され、核酸ライブラリーなどの生体分子のライブラリーが前記反応容量へ適用され得る。所定の条件で複数の標的のいずれにも結合しないライブラリーのメンバーは、ここで洗浄などによって分離される。例えば、標的に対して所定の親和性を有するライブラリーの残りのメンバーを得るために、ライブラリーのメンバーを結合し、分離する１つまたは複数のラウンドが行われ得る。その結果、ライブラリーの複数の標的に結合する残りのメンバーは、例えば前記ライブリーのメンバー（単数・複数）が結合すべき特定の１つまたは複数の標的を同定するためにマーク付け及び／またはタグ付けされ得る。こうして、ライブラリーのメンバーは、単離されて、マーク付けまたはタグ付けによって特定の１つまたは複数の標的に適合され得る。大容量、多重化同定手段を用いたこのプロセスは、単一標的同定プロセスに比べて時間、費用、物理的空間の節約が可能であるため、望ましい。また、かかる方法は、複数の標的に結合するか、または結合する傾向にある生体分子を同定し、及び／または除去するために利用され得るため、望ましい。
【０００９】
説明的な一態様において、複数の標的分子は、単一反応容量中、標的をアレイの基質に付着させることなどによって取り付けられる。一般的には、単一反応容量とは、離散的または準離散的液滴のような複数反応サブ容量を指し、またはこれを含むと認識されている。一般的に、標的は、各標的が基質上の特定スポットに位置することから同定可能となる状態で所定のアレイが基質上に秩序だった配置を有するように、各標的の複数の複製と１塊になって、または「スポット状に」に配置される。その結果、核酸のライブラリーは、アレイと接触し、またはアレイへ適用されて、ライブラリーの非結合メンバーがアレイから分離され、または洗浄され得る。結合と洗浄のステップは、反復され得て、さらに、ライブラリーの残りの結合メンバーの追加的複製を行うために増幅ステップの利用ができる。その結果、前記アレイは、例えば、ワトソン・クリック相互作用によって、広く核酸ライブラリーのメンバーに結合する複数のオリゴヌクレオチドなどの複数の識別子によってマーク付けされ、またはタグ付けされ得る。かかるマーク付けまたはタグ付けは、例えば、ピペット操作作業や、ミクロ接触ピンの使用、識別子の皮膜／膜への使用、インクジェット印刷などの印刷、及び／または識別子を含んだ溶液をタグ付けする方法など、その他類似の手作業でアレイに取り付けるタグ付け作業によって行われ得る。識別子は、スポットしたがってアレイの標的に対応するために利用され得るユニークまたはセミユニーク識
別子配列をさらに含むことができる。例えば各特定の標的スポットなど、アレイ上の各空間的位置を識別する、ユニーク識別子またはセミユニーク識別子が利用され得る。かかる識別子は、その結果、特定の標的スポットに結合する核酸メンバーに結び付けられ及び／または付着される。このようにして、例えば特定の標的スポットに結合した核酸は、結合された識別子配列によって同定され得る。いくつかの実施形態においては、さらに、かかる識別子はプライマーであってよく、また、結合された核酸の複製を追加的に合成するために、アレイ上で核酸増幅反応とともに利用されてもよい。また、ユニーク識別子またはセミユニーク識別子は、増幅されたライブラリーのメンバーに組み込まれてもよい。これは、メンバーの特定配列を位置的同定配列として維持することがライブラリーメンバーの配列に追加されつつ、所定のメンバーと単数または複数の標的とを結合するうえで、望ましいであろう。これは、複数のバインダーを単数標的または複数の標的に結合するメンバーに分解させるために、特に望ましいであろう。
【００１０】
一般的に、例えば核酸などの生体分子の開始ライブラリーは、前述のＳＥＬＥＸの手続きを少なくとも１ラウンド行って得られる生成物とすることができる。例えば、ＳＥＬＥＸの少なくとも１ラウンドが、例えば溶液中の複数の標的に対する生体分子のライブラリーについて行われ得る。溶液中の標的は、アレイ上に配置された標的と実質的に同一である。これは、選択の複数ラウンドが、マーク付け／タグ付けのために残りのメンバーをアレイへ適用前に、ライブラリーに対して行われ得るため、望ましいであろう。一般的に、複合標的アレイは、標的分子の溶液よりも作製または利用に際して高コスト及び／または困難を伴うため、アレイ上で最終的な結合及びマーク付け／タグ付け手続きのみを行うことが望ましいであろう。
【００１１】
その他の実施形態において、識別子は、アレイ基質上で、前記識別子が、例えば標的スポットに結合された核酸に結合できるように、スポットに対して実質的に近位置に予め配置され得る。例えば、識別子は、基質に共有結合され得る。いくつかの実施形態において、かかる結合は、識別子がスポット上で結合された核酸に、より容易に結合できるよう、前記識別子が基質から切り離されるべく、制御可能に壊れやすい、または開裂可能とすることができる。  
【００１２】
さらなる実施形態において、識別子は、アレイ上の原位置で、例えば原位置の核酸合成光によって合成され得る。適切に配列された識別子は、その結果、新たに合成された識別子が標的スポットに結合された核酸に結合し得るように特定のスポットに近接して合成され得る。
【００１３】
さらに他の実施形態において、識別子は、アレイ上のスポットの空間的配置と実質的に適合する空間的配置の皮膜などの別個の基質上に配置され、及び／または合成され得る。すなわち、前記識別子は、アレイ上の標的スポットに容易に重なるよう配置され得る。その結果、識別子基質は、スポットと識別子との位置が適合するアレイと接触し得る。識別子は、こうして標的スポットに結合された核酸に結合し得る。結合を容易にするために適切な任意の方法が利用され得るが、かかる方法は例えば、毛細現象、電気泳動法、圧力、重力沈降など、識別子をアレイへ移動させる作用及び／またはその他適切な方法またはそれらの組み合わせがある。また、個別の基質は、識別子に対して溶解性、侵食性、実質的に透過性であってよく、及び／または、上記以外でも、識別子のアレイへの移動を容易にするためにその他の適応がなされてもよい。
【００１４】
さらにその他の実施形態において、アレイ基質は、例えばスポットに結合された核酸を個別に回収するために物理的に分割及び／または分離されてもよい。かかるスポットは、それらが個別に回収され、仕分けされるよう、例えば制御可能に基質から除去され得る。
【００１５】
さらにその他の実施形態において、識別子は、アレイ上のスポットの空間的配置と実質的に適合する空間的配置において、皮膜などの個別の基質上に配置され及び／または合成され得る。すなわち、識別子は、アレイ上の標的スポットに容易に重なるように配置され得る。スポットに結合された核酸を個別に回収するために、アレイ基質が物理的に分割され、及び／または分離される一方で、別個の基質が個別に保持され得る。このようにして、位置付けに価値がある場合に、異なる核酸の位置付けが、アレイ基質が損傷を受ないときでも維持され得る。識別子は、アレイ上、選択的に特定の位置へと適用されることもでき、及び／または特定の順番またはグループにも適用され得る。
【００１６】
いくつかの実施形態において、識別子は、結合された核酸を有するスポットにのみ適用され得る。前記結合された核酸を有するスポットは、例えばＳＹＢＲ染料、エチジウムブロマイド及び／またはその他適切な染料などの核酸結合染料を使用することによって、核酸の存在を検出することで検出され得る。核酸ライブラリーのメンバーは、例えば蛍光部、放射性タグ及び／またはその他の適切な検出可能部など、検出可能な部分を含むこともできる。
【００１７】
いくつかの実施形態において、識別子は、例えば核酸増幅反応成分、核酸ライゲーション反応成分、フォトリンカー、及び／または識別子を結合された核酸に付着させ、または結合することを容易にするその他の適切な材料などのその他材料とともに、結合された核酸に適用され得る。
【００１８】
さらにその他の実施形態において、識別子は、例えば結合された核酸へライゲーションが可能である。例えば、核酸リガーゼは、識別子配列と結合された核酸とを共有結合するために利用され得る。さらに核酸フラグメントは、リガーゼ作用を容易にするために利用され得る。かかる核酸フラグメントには、例えば、リガーゼと実質的に互換性を有する二本鎖核酸複合体の形成を助けるうえで適切な相補フラグメントがある。その他の例としては、識別子と、例えば結合された核酸とを結合するために、光ライゲーションが使用され得る。光ライゲーションは、例えばマクロ多孔性材料など、特定の基質が使用されるときに、特に有用である。
【００１９】
一般的に、識別子と、例えばスポットに結合された核酸との結合またはその他の相互作用を容易にする方法が適用され得る。例えば、核酸をスポットから分離するために温度を上昇させることができる。その後、温度を下げて例えば塩基対合が核酸と識別子との間で起き得るようにすることもできる。さらに、一般的には、識別子の拡散／移動によるクロスマークが最小限となるように、個別の標的スポットを物理的に分離／単離するように識別子を適用するのが望ましいであろう。例えば、識別子は、個別の液滴中、識別子を含む個別の流体間で流体の継続的接触がないように適用され得る。さらに、例えば、アレイの基質は、識別子が基質材料に吸収されるように吸収性及び／または多孔性とすることもできる。前記基質材料は、例えば他の標的スポットへの拡散など基質表面への拡散を最小限に抑えつつ、識別子が基質に適用され吸収されるように、鉛直拡散を可能としつつも側方拡散を阻止するようにしてもよい。
【００２０】
さらなる実施形態において、機能的生体分子を合成する方法は、ペプチド配列のライブラリーを得るステップと、前記ライブラリーを複数の標的に接触させるステップとを含む。いくつかの説明的な実施形態において、ペプチド配列は、核酸配列にタグ付けされ、結び付けられ、マーク付けされ、及び／またはそれ以外にも結合され得る。前記核酸配列は、例えば、ペプチドの配列の代表的なものであってよい。例えば、核酸は、ペプチド配列を実質的にコードし得る。また、例えば、核酸は、ユニークまたはセミユニーク識別子配列であってよい。その結果、上記のように、核酸配列は、標的と結合されたペプチドがどの標的と結合すべきかタグ付けされマーク付けされるように、その他の識別子と結合する
ために利用され得る。
【００２１】
説明的な実施形態において、そのタンパク膜に、件のペプチド配列を含むバクテリオファージ（ファージ）が合成され得る。かかるファージは、ファージの核酸内のペプチド配列の代表たり得る核酸配列をさらに含み得る。その結果、前記ファージは、上記のように複数の標的と接触し得る。これは通常、ファージディスプレイと呼ばれる。上記のように結合ファージが識別子でタグ付けされ、またはマーク付けされる一方、非結合ファージは洗浄により除去され、及び／または分離され得る。通常、ファージ核酸は、ファージのタンパク膜内に含まれるため、核酸は通常、識別子と結合して曝され得る。例えば、ファージは、核酸が曝されるようにタンパク膜が変性し、及び／または分解するよう、加熱され得る。また、識別子は、電気穿孔法、電気泳動法、及び／またはその他適切な方法によってファージに導入されることもできる。
【００２２】
ペプチド選択のその他の方法は、ｍＲＮＡディスプレイ、リボソームディスプレイ、及び／またはその他適切なペプチドディスプレイ方法またはこれらの組み合わせを含むことができるが、これらに限定されない。
【００２３】
本発明のその他の態様において、多重化結合プロセスの結果生成した配列を取り扱い、仕分けする方法が提供される。いくつかの実施形態において、前記配列は、識別子配列によって仕分けされ、配列がどの１つまたは複数の標的に結合されるべきかを決定する。かかる配列は、さらに、比較され、並べられ、及び／またはそれ以外にも処理されて、特徴、特性及び／またはその他有用な性質、互いの関係性、及び／または標的の特性が同定されるようにすることができる。
【００２４】
本発明のさらなる態様において、生体分子のライブラリーの多様性を観測し、及び／または制御する方法が利用され得る。例えば、選択ラウンド数が少なすぎると、生体分子のプールには、弱い結合メンバーが多くなりすぎることになり、一方、選択ラウンド数が多すぎると、現存する標的全てに対応するメンバーではなく、ごく僅かの結合メンバーにしか対応できない結合メンバーが少数存在することとなる。一実施形態において、Ｃｏｔ解析が、選択の複数ラウンドを通して生体分子のライブラリーの多様性を測定し、及び／または観測するために採用され得る。Ｃｏｔ、すなわち濃度（Ｃ）×時間（ｔ）による解析法は、生体分子のライブラリーのメンバーなど、その他の核酸とともに溶液中にある特定のオリゴヌクレオチドのアニール時間を測定する。一般的に、アニール時間は、ライブラリーの多様性が低いほど速くなる。
【００２５】
本発明は、上記の及びその他の有利な点とともに、図面に示した以下の発明の実施形態の詳細な説明によって、最もよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、複数の標的アレイの実施形態を示す。
【図２】図２は、生体分子のライブラリーの標的アレイへの適用を示す。
【図２ａ】図２ａは、生体分子のライブラリーのメンバーの標的スポットへの結合を示す。
【図３】図３は、生体分子のライブラリーメンバーの実施形態を示す。
【図３ａ】図３ａは、生体分子のライブラリーメンバーの実施形態を示す。
【図３ｂ】図３ｂは、識別子の実施形態を示す。
【図４】図４は、識別子を用いた標的に結合するライブラリーメンバーのタグ付けを示す。
【図４ａ】図４ａは、タグ付けされたライブラリーメンバーの生成物を示す。
【図５】図５は、基質上のその近傍に識別子がある標的スポットを示す。
【図５ａ】図５ａは、識別子シートの標的アレイへの適用を示す。
【図６】図６は、識別子の実施形態と識別子のライブラリーメンバーへのライゲーションを示す。
【図６ａ】図６ａは、識別子の実施形態と識別子のライブラリーメンバーへのライゲーションを示す。
【図６ｂ】図６ｂは、識別子の実施形態と識別子のライブラリーメンバーへのライゲーションを示す。
【図６ｃ】図６ｃは、識別子の実施形態と識別子のライブラリーメンバーへのライゲーションを示す。
【図７】図７は、標的用のファージディスプレイを示す。
【図７ａ】図７ａは、標的用のファージディスプレイを示す。
【図７ｂ】図７ｂは、ｍＲＮＡディスプレイ融合生成物を示す。
【図７ｃ】図７ｃは、リボソームディスプレイ融合生成物を示す。
【図８】図８は、組織切片標的の一例を示す。
【００２７】
以下に記載する詳細な説明は、本発明の態様にしたがって提供される、現在例示される方法、装置、及び構成の説明として意図されるものであり、本発明が実施され、または利用され得る形態のみを表すことが意図されるものではない。しかしながら、同一、または均等の機能及び構成要素が、本発明の精神及び範囲内に包含されると意図される限りは、異なる実施形態によっても達成されることができる旨、理解されるべきである。
【００２８】
特に、異なる定義がされない限り、本明細書で使用される全ての技術用語ならびに科学用語は、本発明の属する分野の通常の知識を有する者に共通に理解される用語と同義である。本明細書に記載された内容と類似のまたは均等の任意の方法、装置及び材料が本発明の実施または試行に際して使用され得るが、ここでは例示の方法、装置及び材料を記載する。
【００２９】
本発明は、異なる機能的生体分子を同時に合成する方法に関し、特に、複数の標的分子に対する複数の機能的核酸を同時に合成する方法に関する。さらに、本発明は、異なる機能的生体分子を同時に合成する方法に関し、特に機能的活性を伴って、例えば受容体分子など、他の生体分子に結合する機能的核酸を合成する方法に関する。
【００３０】
一般的に、機能的生体分子を合成する方法は、生体分子の多様な、または、ランダムに選ばれたライブラリーなどのライブラリーを得るステップを含む。生体分子は、一般的に核酸、特に一本鎖核酸、ペプチド、その他の生体高分子及び／またはそれらの組み合わせもしくはそれらの修飾を含み得る。生体分子のライブラリーは、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、人工的に修飾された核酸及び／またはこれらの組み合わせなどの核酸配列を含み得る。一般的に、修飾核酸塩基が利用され得て、かかる修飾核酸塩基は、２’−デオキシ−Ｐ−ヌクレオシド−５’−三リン酸、２’−デオキシイノシン−５’−三リン酸、２’−デオキシプソイドウリジン−５’−三リン酸、２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸、２’−デオキシゼブラリン−５’−三リン酸、２−アミノ−２’−デオキシアデノシン−５’−三リン酸、２−アミノ−６−クロロプリン−２’−デオキシリボシド−５’−三リン酸、２−アミノプリン−２’−デオキシリボース−５’−三リン酸、２−チオ−２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸、２−チオチミジン−５’−三リン酸、２’−デオキシ−Ｌ−アデノシン−５’−三リン酸、２’−デオキシ−Ｌ−シチジン−５’−三リン酸、２’−デオキシ−Ｌ−グアノシン−５’−三リン酸、２’−デオキシ−Ｌ−チミジン−５’−三リン酸、４−チオチミジン−５’−三リン酸、５−アミノアリル−２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸、５−アミノアリル−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸、５−ブロモ−２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸、５−フルオロ−２’−デオキシ
ウリジン−５’−三リン酸及び／またはその他の適切な修飾された核酸塩基を含み得るが、これらに限定されない。一般的には、上記掲載したヌクレオシドトリホスフェート（ＮＴＰｓ）は通常、例えば、追加的に塩基の一リン酸塩（ＮＭＰｓ）または二リン酸塩（ＮＤＰｓ）などの修飾塩基の任意の適切なリン酸塩を指す旨、理解され得る。機能的生体分子を合成する方法は、生体分子のライブラリーと、例えば分子標的、分子材料及び／または分子性物質などの少なくとも１つの標的とを接触させるステップをさらに含む。通常、その親和性では標的と結合しないライブラリーのメンバーは、ライブラリーの残りのメンバーから洗浄により除去されるか、そうでなくても分離される結果、標的に対する所定レベルの結合親和性が確保される。かかるプロセスが反復されて、ライブラリーのなかで最強の結合メンバーが分離される。後続の反復及び前記プロセスの最終生成物の単離及び／または精製のために、生体分子の増幅もライブラリーの結合メンバー数を増加させるために利用され得る。ＳＥＬＥＸ法による実施形態が、所定レベルの結合親和性を有する機能的生体分子を合成する目的を達成するために一般的に利用される。基本的なＳＥＬＥＸ法の手順は、「核酸リガンドを同定する方法」という表題の米国特許番号第５，２７０，１６３号に記載されており、その全体の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００３１】
本発明の説明的な一態様において、機能的生体分子の合成は、例えば単一反応容量における機能的核酸リガンドの合成など、単一系において複数の標的に対して同時に行われ得る。一般に、複数の標的は、単一反応容量中に配置され、核酸ライブラリーなどの生体分子のライブラリーが前記反応容量へ適用され得る。標的は、例えば、タンパク質、細胞、小分子、生体分子、及び／またはそれらの組み合わせもしくは部分であってよい。所定の条件で、複数の標的のいずれにも結合しないライブラリーのメンバーは、ここで洗浄などによって分離される。その後、ライブラリーの複数の標的に結合する残りのメンバーは、例えば前記ライブリーのメンバーが結合すべき特定の１つまたは複数の標的を同定するためにマーク付け及び／またはタグ付けされる。ライブラリーの結合メンバーはその後単離され、マーク付けまたはタグ付けによって、特定の１つまたは複数の標的に適合され得る。大容量、多重化同定手段を用いたこの手段は、単一標的同定プロセスに比べて時間、費用、物理的空間の節約が可能であるため、望ましいであろう。また、かかる方法は、複数の標的に結合するか、または結合する傾向にある生体分子を同定し、及び／または除去するために利用され得るため、望ましいであろう。  
【００３２】
本発明の説明的な一態様において、複数の標的分子は、単一反応容量中、標的をアレイの基質に添付することなどによって取り付けられる。図１に例示するように、標的は、所定のアレイ１００の基質１０２上で標的が秩序だって配置され、各標的が前記基質１０２上の特定のスポット１１０に位置していることから同定可能となるよう、各標的の複製と１塊となって、または「スポット」１１０になって、配置され得る。各スポット１１０は、ユニーク標的であってよく、または、所定のアレイ１００の上で少なくとも１つの標的の複数スポット１１０であってもよい。一般的に、高含量タンパク質または抗生物質アレイなどの高含量標的アレイが利用され得る。例えば、核酸２０２のライブラリー２００は、図２に示すようにアレイ１００へ適用される（Ａ）。こうしてライブラリー２００の特定のメンバー２０４が、例えば図２ａに示すように標的スポット１１０へ結合する。ライブラリー２００の非結合メンバー２０６は、アレイ１００から分離され、または洗浄され得る。結合及び洗浄ステップは、反復され得て、前記ステップは、ライブラリー２００の残りの結合メンバー２０４の追加的な複製を行うために増幅ステップを利用し得る。こうして、前記アレイ１００は、例えば、ワトソン・クリック相互作用によって、広く核酸などのライブラリーのメンバーに結合する複数のオリゴヌクレオチドなどの複数の識別子によってマーク付けされ、またはタグ付けされることができる。一実施形態において、ライブラリー２００の各メンバー２０２は、潜在的な結合配列２０２ａ及び、図３に示すように識別子オリゴヌクレオチドを結合し得る少なくとも１つの保存領域２０２ｂを含み得る。また、図３ａで示すように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの増幅反応のプライ
ミングを容易にするために、さらなる保存領域２０２ｃも含み得る。一般的に、前記保存領域２０２ｂ、２０２ｃは、例えば、増幅のためのプライミングを容易にするために、潜在的な結合配列２０２ａの側面に位置し得る。識別子３０２は、図３ｂに示すように、ユニーク配列またはセミユニーク配列３０２ａを含み得て、これは、スポット１１０、したがって、基質１０２上のスポット１１０の位置によってアレイ１００の標的に対応するために利用され得る。識別子３０２は、さらに、ワトソン・クリック塩基対合によってライブラリーメンバー２０２の保存領域２０２ｂに結合し得る保存領域３０２ｂを含むことができる。識別子３０２は、さらに、増幅のためのプライミングを容易にし得るための保存領域３０２ｃを含むこともできる。前記識別子３０２は、例えばインクジェット印刷などの印刷によって、ミクロ接触ピンの使用によって、及び／またはその他、例えばスポット１１０へピペット操作するなど、識別子３０２を含む溶液をアレイ１００の基質１０２に適用することなどで適用され得る。その結果、標的スポット１１０に結合したライブラリーメンバー２０２は、図４に示すように領域２０２ｂ、３０２ｂにて、塩基対合（Ｂ）を介して識別子３０２によってタグ付けされる。したがって、特定の標的スポット１１０に結合した核酸２０２は、識別子３０２の配列３０２ａによって同定されることができる。説明的な一形態において、ＰＣＲのような核酸の増幅が、図４ａに示すように識別子配列３０２ａ（またはその相補配列）を生成物２０３に組み入れつつ、スポット１１０に結合したメンバー２０２の複製を合成するために利用され得る。これは、メンバー２０２の特定配列を維持しながら、所定のメンバー２０２と、１つまたは複数の標的１１０とを結びつけるうえで望ましいであろう。また、これは、複数のバインダーを単数標的または複数の標的に結合するライブラリーのメンバーに分解させるうえで特に望ましいであろう。後続の増幅において、配列２０２ａと３０２ａの両方を含む生成物２０３のみが増幅され得るように、配列２０２ｃ、３０２ｃのプライマーを利用することができる。上記のような核酸配列への参照は、一般的に特定の配列か、対応する相補的核酸配列を指すと理解され得る。一般的には、誤ったタグ付けの可能性が減るように、単一液滴及び／または、それ以外でも、アレイ１００上の各スポット１１０に関して識別子３０２を含む溶液の個別容積が望ましいであろう。
【００３３】
一態様において、識別子は、全標的上に印刷され得る。その他の態様において、かかる識別子は、生体分子に結合する標的上にのみ印刷されることもできる。
【００３４】
その他の実施形態において、図８に示す組織スライド１００”の基質１０２”上の切片１１０”などの組織切片が、標的セットとして利用され得る。かかる切片１１０”は、例えば、組織の切片、細胞集団、及び／または通常組織的に重要な特性を有する任意のその他適切な生体サンプルとすることができる。アレイ１００と同様に、切片１１０”上の特定位置に結合し得る核酸などの生体分子のライブラリーが適用され得るが、かかる位置上には、親和結合核酸を合成するために、例えば、別個の標的が載せられる。こうして識別子が、上記のように、または以下の実施形態のようにスライド１００”上に配置されて、識別子が切片１１０”の特性に対応するために利用され得るようにする。
【００３５】
その他の実施形態において、識別子は、標的スポットに結合される核酸に結合するように、図５における基質１０２上でスポット１１０の近位置に配置される識別子３０２で示すようなスポットの実質的な近位置のアレイ基質上に予め配置されることができる。識別子は、例えば基質に共有結合することができる。いくつかの実施形態においては、かかる結合は、識別子が、例えばスポット上の結合された核酸により容易に結合できるように基質から解放されるよう、制御可能に壊れやすいまたは開裂可能とすることができる。
【００３６】
さらにその他の実施形態において、識別子は、原位置の核酸合成光などによってアレイ上で原位置にて合成される。適切に配列された識別子は、新たに合成された識別子が、スポットに結合された核酸に結合するよう、特定のスポットの近位置で合成され得る。
【００３７】
さらにその他の実施形態において、識別子は、空間的配置においてアレイ上のスポットと適合する皮膜のように、別個の基質上に配置され、及び／または合成され得る。図５ａは、アレイ１００の標的スポット１１０に実質的に対応し得る識別子スポット１１０’を含み得る皮膜１０２’を有する識別子シート１００’の一例を示す。識別子シート１００’は、標的スポット１１０と識別子スポット１１０’との位置の適合を伴ってアレイ１００と接触し得る（Ｃ）。こうして、識別子は、標的スポットに結合された核酸に結合することができる。かかる結合を容易にする任意の適切な方法が利用され得て、かかる方法には、例えば、毛細現象、電気泳動法、圧力、重力沈降、及び／またはその他適切な方法またはそれらの組み合わせなど、識別子をアレイへ移動させる作用がある。
【００３８】
いくつかの実施形態において、皮膜は、溶解性、及び／または実質的に侵食性であってよい。例えば、前記皮膜は膜形成及び／または溶解性材料を含み得る。膜が所望の物質を含有して形成されるように、識別子及び／または核酸増幅成分やライゲーション反応成分などのその他材料を含めることができる。こうして皮膜が基質に適用されて、水やエタノールなどの好適な溶媒が、膜を溶解し、及び／または侵食して、識別子などの含有物質が基質へと解放されるために利用され得る。膜として好適な材料は、カラギーナン、コンドロイチン硫酸、グルコサミン、プルランなどの多糖類を含む親水性材料、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ポリアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、エチレンオキシド−プロピレンオキシド共重合体、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリホスファゼン、ポリ酢酸ビニル、ポリイソブチレンなどの水溶性セルロース誘導体などを含むことができる。
【００３９】
皮膜は、所望の侵食速度及び／または溶解速度を有するように、さらに調整され得る。かかる速度は疎水性の、及び／またはより溶解しにくい添加剤を含めることで変更され得る。好適な材料として、第４級アンモニウムアクリレート／メタクリレート共重合体の族（Ｅｕｄｒａｇｉｔ  ＲＳ）、ブチルセルロース、ヒドロキシブチルセルロース及びエチルヒドロキシエチルセルロースなどのセルロース及びより低溶解性の誘導体、高分子量ＰＥＧまたはＰＥＯもしくはこれらの組み合わせを含めることができるが、これらに限定されない。
【００４０】
さらにその他の実施形態において、アレイ基質は、例えばスポットに結合された核酸を個別に回収するために物理的に分割及び／または分離されていてもよい。かかるスポットは、それらが個別に回収され仕分けされるよう、例えば制御可能に基質から除去可能であってよい。アレイそのものは、穿孔した、及び／または、そうでなければ、容易に及び／または利便性をもって分離可能とすることもできる。
【００４１】
さらに他の実施形態において、識別子は、結合された核酸にライゲーションすることができる。例えば、識別子配列を結合された核酸へ共有結合するために、核酸リガーゼが利用され得る。一般的に、核酸リガーゼは、核酸のリン酸骨格の両末端でリン酸ジエステル結合の形成を触媒することによって２つの核酸を共有結合する酵素である。適切な核酸リガーゼの例として、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ、鎖切断ＤＮＡ修復酵素、及び／またはその他の適切なリガーゼ、修飾酵素、ならびに／若しくはそれらの組み合わせを含むことができるが、これらに限定されない。一般的に、利用されるリガーゼは、平滑末端ライゲーション、互換性のあるオーバーハング（「粘着」）末端ライゲーション、一本鎖ＤＮＡライゲーション、一本鎖ＲＮＡライゲーション及び／またはその他のライゲーションの形態など、行われるライゲーションの形態に基づいて選択され得る。さらに、一般的に、２つの核酸をライゲーションするステップは、室温で、または室温に近い温度で行われ得る１つのステップからなるプロセスであ
る。さらに、リガーゼと互換性のある実質的に二本鎖核酸の形成を補助し得る適切な相補フラグメントなどの核酸フラグメントが、リガーゼ作用を容易にするために利用され得る。一般的に二本鎖ライゲーションが採用され得て、かかるライゲーションを容易にするために、実質的に互換性のあるオーバーハングフラグメントを利用し得る。また、核酸末端またはリン酸化された末端を有し、一方ではライゲーション用の非リン酸化末端も有する平滑末端ライゲーションも利用され得る。一本鎖ライゲーションも採用され得る。
【００４２】
光ライゲーションも、採用され得る。例えば、かかる光ライゲーションは、隣接する核酸を紫外線または可視光線などの電磁エネルギーの使用によって共有結合することを含み得る。共有結合の形成を容易にするために、結合剤が使用されることもできる。
【００４３】
いくつかの実施形態において、染料を識別子に含めることができる。一態様において、識別子に染料を塗布してもよい。その他の態様では、識別子の溶液を染料と混合してもよい。一実施形態によれば、染料は感光性かつ蛍光性とすることができる。別の実施態様によれば、前記染料は感光性かつリン光性とすることができる。
【００４４】
使用される基質は、その表面が基質と標的との接着を促進する限り、ガラス、セラミック、または高分子であってよい。高分子は、合成高分子ならびに精製生体高分子を含むことができる。基質は無孔性または多孔性の任意の膜とすることもできる。
【００４５】
基質は、一般的には平面で、例えば、長方形、正方形、円形、楕円形、三角形、その他多角形、不規則な及び／またはその他適切な形状などの任意の適切な形状とすることができる。前記基質は、例えば、円筒形、球形、不規則な及び／またはその他適切な形状などのその他の形状とすることもできる。
【００４６】
適切なセラミックは、例えば、ヒドロキシアパタイト、アルミナ、グラファイト及び熱分解カーボンを含むことができる。
【００４７】
適切な合成材料は、ポリアミド（例えば、ナイロン）、ポリエステル、ポリスチレン、ポリアクリル酸塩、ビニルポリマー（例えば、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン及び塩化ポリビニル）、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリジメチルシロキサン、酢酸セルロース、ポリメチルメタクリレート、エチレン酢酸ビニル、ポリスルホン、ニトロセルロース及び類似の共重合体などの高分子を含むことができる。これらの合成高分子は、メッシュ状に織り込まれ、または、編み込まれて、マトリックスか、これに類似した構造を形成し得る。あるいは、前記合成ポリマー材料は、適切な形状へと成形または成型される。
【００４８】
生体高分子は、自然発生、もしくは発酵など、または遺伝子組み換えによってインビトロで作製されたものを含み得る。実質的に任意のポリペプチド配列を操作し、その後増幅して細菌性細胞か哺乳類細胞のいずれかにて発現させるために、組み換えＤＮＡ技術が使用され得る。精製生体高分子は、織り込み、編み込み、成型、成形、押し出し成形、細胞整列及び磁気整列などの技術によって適切に基質へと形成されることができる。好適な生体高分子は、限定されないが、コラーゲン、エラスチン、絹、ケラチン、ゼラチン、ポリアミノ酸、多糖類（例えばセルロースや、デンプン）及びこれらの共重合体を含む。
【００４９】
任意の好適な基質は、標的によって接着、付着、または吸着を起こしやすいものであってよい。かかる影響の受けやすさは、固有のものでも修正されたものでもよい。一実施例において、基質表面は、タンパク質への接着、付着、または吸着を起こしやすいものでよい。その他の例において、基質表面は、タンパク質への接着、付着、または吸着を起こしやすいが、核酸に対してはかかる性質を有しないものでよい。
【００５０】
一つの説明的実施形態において、ガラス基質は、標的材料を結合するために、タンパク質などの標的、すなわちプラスに帯電する材料など帯電可能な材料との接着を促進する、材料を覆う層または被覆コートを有することができる。帯電材料の例は、例えばニトロセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロース系材料；エポキシ、ＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）；部分的にまたは完全加水分解されたポリ（ビニルアルコール）；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリ（エチレンオキシド）−コポリ（プロピレンオキシド）ブロック共重合体；ポリアミン；ポリアクリルアミド；ヒドロキシプロピルメタクリル酸塩；ポリスクロース；ヒアルロン酸；アルギン酸塩；キトサン；デキストラン；ゼラチン及びこれらの混合物ならびに共重合体を含む。
【００５１】
その他の説明的な実施形態において、基質が帯電材料によって接着を起こしやすくない場合、または、誤って帯電された材料に対してのみ接着を起こしやすい場合、基質のいくつかの領域は接着剤、結合剤、または、基質の表面にこれに類似する接着、吸着、または被覆がなされてもよい。接着剤の例として、帯電材料を結合する任意の好適な接着剤を含み得る。
【００５２】
標的は、基質上に別々に、または塊で存在することができる。別々の標的間の距離は、近くても、遠くに離れていてもよく、標的ごとに異なっていてもよい。前記の塊は単一標的の複数スポットに使用され得る。
【００５３】
一実施形態において、基質は多孔性であってもよい。多孔性基質は、例えば異なる標的が非常に近位置にある場合に望ましい。標的同士が近い場合、異なる標的間の距離が不十分であり、生体分子がどちらの標的に結合し得るか見分けることができないおそれがある。密に詰まった標的は、生体分子の合成効率を高め得る。多孔性基質は、かかる効率と距離間隔との均衡をとるうえで好適な可能性がある。多孔性基質に対しては、孔が十分大きく孔の中で結合プロセスがなされ得るなら、密に詰まった標的であっても、これらを隔てる孔の壁があれば十分であろう。
【００５４】
また、多孔性基質に対しては、標的材料が孔に進入し、または一部進入して固定するように、孔はその平均直径を標的材料の平均大きさより大きくすることができる。ヒドロゲルも、標的を孔に結合し、または固定するうえで有用である。前記ヒドロゲルは、また、流体にて孔を満たすことができ、流体が孔を通過して流れる状態を維持しつつ、同時に流体フローのための平滑な表面を提供し得る。
【００５５】
複数の標的は、例えば、円形スポットや楕円形スポット、正方形または長方形スポット、縞模様、同心円及び／またはその他の任意の適切な配置にて、任意の適切な方法で被検体上に配置され得る。
【００５６】
一の説明的な実施形態によれば、基質は終始大気温度とすることができる。
【００５７】
その他の説明的な実施形態によれば、基質は、一般的に基質表面上及び隣接する流体に対して少なくとも１つの所望の温度を作り出す、温度に影響を与えるシステムを含み得る。前記所望の温度は、生体分子を合成するプロセスを容易化できる。
【００５８】
さらなる説明的な実施形態によれば、基質は、基質表面上及び隣接する流体に対して所望の温度範囲を作り出す、温度に影響を与えるシステムを含み得る。前記システムは、例えば、重要範囲のＴｍｓすなわち融解温度を有する標的セットを採用する際に特に有用で
ある。一実施形態において、前記のシステムは、基質に熱を伝達する、温度に影響を与える複数の装置を含むことができる。前記複数の装置は、一般的に、かかる装置が基質表面上の所定の場所で各々所望の温度を作り出せるように配置され得る。標的セットは、標的の場所における温度が実質的に標的の融解温度となるように、基質表面上に分散され得る。
【００５９】
温度に影響を与える装置は、基質上に所望の温度を実質的に作り出す任意の適切な装置でよい。かかる装置は、ペルチェ接合装置、半導体加熱装置、抵抗加熱装置、誘導加熱装置、加熱／冷却ポンプなどの熱電装置、電磁放射線源、及び／またはその他の適切な装置を含み得るが、これらに限定されない。温度は、例えば、液体フロー、気体フロー、及び／またはその他の適切な流体フローなどを含むがこれらに限定されない流体フローなどのその他のシステムによっても影響を受け得る。
【００６０】
説明的な一実施形態において、基質表面上の場所で所望の温度を作り出すために、複数のペルチェ接合装置が利用され得る。かかるペルチェ接合装置は、電流を用いて加熱、冷却ともに可能なため、特に有用である。このため、ペルチェ接合装置は、システムの大気温度より高温も低温も作り出せる。かかる装置は、必要に応じてシステムから加熱し、冷却することにより、定常状態で所定の温度条件を維持するうえで有用でもある。
【００６１】
一般的に、温度に影響を与える装置の配置は、基質表面上とチャンバー内の隣接する流体の温度プロファイルを決定し得る。したがって、かかる温度に影響を与える装置は、所定の温度が作り出され、かつ、これが基質上の既知の位置で維持される、適切な位置に配置され得る。
【００６２】
一般的に、基質は、少なくとも１つの温度に影響を与える装置の使用により、基質の表面上に温度勾配を実質的に生じせしめるように、所定の熱伝導性を有し得る。一般的に、基質表面上の温度は、少なくとも１つの温度に影響を与える装置の位置からの距離の作用として変化し得る。一般的に、比較的低い熱伝導性を有する基質材料は、温度に影響を与える装置の周囲に高度に局所的な温度変化を生じさせ得る。一般的に、比較的高い熱伝導性を有する基質材料は、温度に影響を与える装置からの所定の距離にわたり、より穏やかな温度変化を作り出し得る。定常状態では、基質の熱伝導性の効果はシステムの温度プロファイルに寄与し得ない旨、理解されるであろう。
【００６３】
いくつかの実施形態においては、少なくとも１つの温度に影響を与える装置は、基質表面上に特定の温度勾配プロファイルを作り出すために利用され得る。一般的に、温度勾配は、システムの大気温度と異なる温度を作り出す、少なくとも１つの温度に影響を与える装置を利用することによって、生じ得る。システムの大気温度に依存することなく温度勾配を生じさせるためには、少なくとも２つの異なる温度を生じさせる複数の温度に影響を与える装置が利用され得る。
【００６４】
複数の温度に影響を与える装置の位置及び温度は、標準熱伝導方程式を用いて、結果生じた基質表面上の温度勾配プロファイルを計算するために利用され得る。その際、アルゴリズムが利用され得て、複数の温度に影響を与える装置が基質表面上に所望の温度勾配プロファイルを作り出すための最適位置及び／または温度が計算される。かかるアルゴリズムは、例えばコンピュータやその他の計算装置などのコンピュータによるアシストシステムを用いて応用され得る。これは、温度勾配プロファイルを、既知の及び／または計算された融解温度を有する標的の既知の配置を有する特定の基質に合わせて調整することによって行われる。同様に、温度勾配プロファイルに基づいて既知の及び／または計算された融解温度を有する標的セットが基質上に配置されることができる。これは、温度勾配プロファイルを基質上の標的の既存の場所に合わせて調整する場合と比較して、基質上の所定
の位置に標的を配置することがより容易に達成され得るため、望ましいであろう。一般的に標的は、温度プロファイル内の温度アドレスの基質上に配置され得る。前記温度アドレスは、例えば、分子のハイブリダイゼーションシステム動作中は、実質的に標的の融解温度及び／またはその他適切な温度たり得る。
【００６５】
その他の態様において、分子のハイブリダイゼーションシステムは、温度プロファイルを作り出すための調整可能なシステムを含む。前記の調整可能なシステムは、一般的に、基質の特定の場所で温度にそれぞれ影響する、複数の温度に影響を与える装置を含む。
【００６６】
温度に影響を与えるシステムの詳細は、例えば２００８年１０月１０日に出願された「分子集合と画像化のための方法ならびに装置」と題する米国特許出願番号第１２／２４９，５２５号に見出すことができ、その全体の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００６７】
図６は、識別子配列３０２及び相補識別子配列４０２の一例を示す。前記相補配列４０２は、塩基対合が可能なように識別子領域３０２ａに対して実質的に相補的な相補識別子領域４０２ａを含むことができる。相補配列４０２は、識別子３０２のプライマー領域３０２ｃに対しても相補的であるプライマー領域４０２ｃをさらに含み得る。さらに、相補配列４０２は、別の核酸の末端に対するライゲーションと互換性を有する互換性末端４０２ｂを含むことができる。図６ａに示すように、核酸ライブラリーメンバー２０２は、スポット１１０に結合され得る。その結果、識別子３０２及び相補配列４０２は、識別子３０２が領域２０２ｂ、３０２ｂでメンバー２０２と結合するようにメンバー２０２に適用され得る。相補配列４０２は、識別子３０２に対して領域３０２ａ／４０２ａ、３０２ｃ／４０２ｃにて結合し得る。その後、互換性末端４０２ｂは、適切なリガーゼ及び／またはその他の適切な方法でメンバー２０２の末端Ｄへライゲーションされ得る。図６ｂに示すように、生成物２０３’が、プライマー領域２０２ｃ、結合配列２０２ａ、領域２０２ｂ、相補識別子領域４０２ａ、及び相補プライマー領域４０２ｃを含んで合成され得る。その後、生成物２０３’は、例えば図４ａにて上記議論した生成物２０３とともに増幅され得る。生成物２０３’は、メンバー２０２と相補配列４０２の一本鎖ライゲーションによっても合成され得るが、その場合、一般的に、末端同士のライゲーションにつき、前記メンバー２０２または相補配列４０２の一方がリン酸化された末端を有し、他方が非リン酸化された末端を有し得る。
【００６８】
その他の実施例において、図６ｃに示すように、核酸ライブラリーメンバー２０２の相補領域２０２ｄに塩基対合し得る、さらなる相補フラグメント５０２が含まれていてもよい。核酸リガーゼには、一般的に二本鎖核酸に結合するものがあるため、かかる態様は望ましいであろう。相補フラグメント５０２を追加すると、例えば、領域３０２ｃから相補フラグメント５０２の末端にわたって例示されているように、通常、実質的に二本鎖核酸が合成され得る。ポイントＤ及びＥにおいては、さらに二本鎖の「切断」があり得る。一般的にフラグメントの大きさ形成は、リガーゼ作用に鑑み、二本鎖核酸の好適な長さ範囲が生じるように調整され得る。一般的に、相補領域２０２ｄは、例えば利便性、費用及び／または使用容易性のため、同じ相補フラグメント５０２が利用され得るよう、ライブラリー２００の全メンバー２０２と同じ大きさとすることができる。  
【００６９】
一般的には、識別子と、スポットに結合された核酸との結合またはその他の相互作用を容易にする方法が適用され得る。例えば、核酸をスポットから分離させるために温度を上昇させ得る。前記温度は、例えば核酸と識別子の間で塩基対合が起きるように、その後低下させることができる。温度変化は、例えば、核酸が標的に対して結合しない、及び／または低い親和性でしか標的に結合しないようにするなど、標的を変性させるものであってもよい。これは、核酸が識別子と結合するうえで助けとなり得るため、望ましいであろう。
【００７０】
本発明のさらなる態様において、生体分子のライブラリーの多様性を観測し、及び／または制御する方法が利用され得る。例えば、選択のラウンド数が少なすぎると、生体分子のプールに、弱い結合メンバーが多く集まりすぎ、一方、選択のラウンド数が多すぎると、結合メンバーは、存在する全標的に応答せずに、僅かな標的にしか応答しない少数のメンバーしか存在し得ない。一実施形態において、Ｃｏｔ解析が、選択の複数ラウンドを通して生体分子のライブラリーの多様性を測定し、及び／または観測するために採用され得る。Ｃｏｔ、すなわち濃度（Ｃ）×時間（ｔ）による解析法は、生体分子のライブラリーのメンバーなど、その他の核酸とともに溶液中に存在する特定のオリゴヌクレオチドのアニール時間を測定する。一般的に、アニール時間は、ライブラリーの多様性が低いほど速くなる。
【００７１】
一実施態様において、多重化ＳＥＬＥＸのプロセス中の任意の時点でアプタマーライブラリーの配列多様性を測定するためのＣｏｔ−標準曲線が利用され得る。例えば、初期ＳＥＬＥＸライブラリーと同一の、〜２０塩基の５’−、３’−定常領域を有するＤＮＡオリゴヌクレオチドのグループが利用され得る。オリゴは、標準的な方法でｄｓＤＮＡに変換される。要するに、プライマーをアニールしてオリゴとした後は、ｄｓＤＮＡまたはその混合物作製用にｓｓＤＮＡを満たすため、エキソ−マイナスクレノウＴａｑポリメラーゼ（ウィスコンシン州、マジソン、エピセンター）がｄＮＴＰｓと併用され得る。標準的定量ＰＣＲ熱循環装置を用いて、各ＤＮＡ混合物を融解し、制御アニールする温度プロファイルがプログラミングされ得る。再度アニールされたｄｓＤＮＡ量を報告するために、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に対して特異的な標準ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉが利用され得る。一つの極端な例として、単一配列のアニール時間が測定されるであろう。別の極端な例として、例えば約１ｎｍｏｌの配列多様性を含む初期ＳＥＬＥＸプールのアニール時間が測定され得る。ＳＥＬＥＸライブラリーに極めて特異的なＣｏｔ標準曲線を決定するために、中間多様性のアニール時間も測定され得る。かかる標準曲線を用いて、ＳＥＬＥＸ実施中の任意の時点において、アプタマーの進化するライブラリーの配列多様性が前記曲線との比較によって決定され得る。  
【００７２】
さらなる実施形態において、機能的生体分子を合成する方法は、ペプチド配列のライブラリーを得るステップと、前記ライブラリーを複数の標的に接触させるステップとを含む。いくつかの実施形態において、前記ペプチド配列は、核酸配列にタグ付けされ、結び付けられ、マーク付けされ、及び／または、それ以外でも結合され得る。核酸配列は、例えば、ペプチドの配列を代表するものでよい。例えば、核酸は、ペプチド配列を実質的にコードし得る。また、例えば、核酸は、ユニーク識別子配列またはセミユニーク識別子配列たり得る。こうして、上記のように、核酸配列は、標的と結合されたペプチドが、どの標的と結合すべきかタグ付けされ、マーク付けされるよう、その他の識別子と結合するために利用され得る。
【００７３】
説明的な一実施形態において、そのタンパク膜に関連するペプチド配列を含むバクテリオファージ（ファージ）が合成され得る。ファージは、ファージの核酸内のペプチド配列の代表となり得る核酸配列をさらに含むことができる。その結果、前記ファージは、上記のように複数の標的と接触し得る。これは通常、ファージディスプレイと呼ばれる。採用されるファージは、Ｍ１３ファージ、ｆｄ糸状ファージ、Ｔ４ファージ、Ｔ７ファージ、λファージ、及び／またはその他任意の適切なファージを含むことができるが、これらに限定されない。結合ファージが上記のように識別子によってタグ付けまたはマーク付けされる一方で、非結合ファージは洗浄され、及び／または分離され得る。通常、ファージ核酸は、ファージのタンパク膜内に含まれているため、核酸は通常、結合のため識別子に曝され得る。例えば、ファージは、核酸が曝されるように、タンパク膜が変性し、及び／または分解するよう、加熱され得る。また、識別子は、電気穿孔法、電気泳動法、及び／ま
たはその他の適切な方法によってファージに導入されることもできる。
【００７４】
図７において、ファージ６００の例は、通常、なかんずくタンパク膜核６０２をコードし、前記タンパク膜によって封入される、標的１１０の結合領域を含み得る核酸６１０を含むことができる。前記核酸６１０は、さらにファージを同定し、及び／または標的の結合領域をコードする領域６１２を含むことができる。結合されたファージ６００は、図７及び図７ａに示すように、識別子３０２が領域６１２と接触（Ｆ）するようにその後加熱され、破断され、及び／または処理され得る。例えば、識別子３０２が進入できるようにタンパク膜６０２が破断され、及び／または分離され得る。一般的に、上記議論した増幅反応及び／またはその他の方法は、識別子情報を領域６１２の配列へとタグ付けし、マーク付けし、及び／または導入するために利用され得る。さらに、通常、識別子３０２及び領域６１２は、核酸ライブラリーメンバー、識別子、及び／またはその他の核酸フラグメントに関して上記議論したエレメントの任意のもの、全て、またはそれらの組み合わせを組み入れることができる。また上記議論したように、ファージ６００は、ファージ６００が結合した標的１１０の同定を維持できるよう、物理的に除去され、及び／または分離され得る。
【００７５】
その他の実施形態において、核酸をペプチドへ組み入れ、及び／または結び付けるその他の方法、例えば、ｍＲＮＡディスプレイ、リボソームディスプレイ、及び／またはその他の適切な方法が利用され得る。通常、ｍＲＮＡディスプレイにおいては、図７ｂに示すように、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）６１０’の融合生成物６００’は、例えば、通常リボソーム内でｍＲＮＡ６１０’が新生ペプチド６０２’との融合を生ずるピューロマイシンを末端にもつｍＲＮＡ６１２’によってｍＲＮＡ６１０’がコードするペプチド６０２’に結び付くことができ、これがファージディスプレイを有する、上記議論した標的と接触し得る。また、通常、リボソームディスプレイにおいては、図７ｃに示すように、ペプチド６０２”をコードするがストップコドンを欠く修飾ｍＲＮＡ６１０”の融合生成物６００”が利用され得て、翻訳時にリボソーム６２０”のチャネルを占めることができ、前記リボソーム６２０”に集合したペプチド６０２”を折りたたみ、その結果ペプチド６０２”がリボソーム６２０”に結合するとともにｍＲＮＡ６１０”にも結合するスペーサ配列６１２”を組み込むこともできる。この生成物６００”は、その後ファージディスプレイを有する上記の標的と接触し得る。その他の方法には、酵母ディスプレイ、細菌性ディスプレイ、及び／又はその他任意の適切な方法を含み得るが、これらに限定されない。
【００７６】
本発明のその他の態様においては、多重化結合プロセスの結果生成した配列を取り扱い、及び仕分けする方法が提供される。いくつかの実施形態において、前記配列は、識別子配列によって仕分けされ、配列がどの１つまたは複数の標的に結合されるべきかを決定する。かかる配列は、さらに、比較され、並べられ、及び／またはそれ以外にも処理されて、特徴、特性及び／またはその他有用な性質、互いの関係性、及び／または標的の特性が同定されるようにすることができる。例えば、単一標的に結合した複数のアプタマー配列は、配列モチーフ及び／または配列仕分け及び／または比較によって少なくとも部分的に解明されたと考えられるその他共通の特徴を潜在的に共有すると思われる。結果生じた配列の具体的な結合親和性も、親和性分析によって決定され得る。いくつかの実施形態において、表面プラズモン共鳴が、アプタマーの標的への結合力を測定するために利用され得る。例えば、標的に結合した、表面屈折率を測定するセンサが利用され得る。かかる表面屈折率は、アプタマーが標的に結合した結果、変化し得るからである。通常、標準配列方法以外では、例えば４５４クローンシーケンシング（コネチカット州、ブランフォード、ロシュ）などの超並列配列、ソレクサシーケンシング（カリフォルニア州、サンディエゴ、イルミナ）などの超並列クローンアレイ配列などの並列配列方法及び／またはその他任意の適切な配列方法が採用され得る。
【００７７】
（多重化ＳＥＬＥＸ処理の実施例）
複数の標的に対するアプタマーの並行、デノボ選択を示すものとして、各２０ｎｔの２つの保存プライマー結合部が横に配置されている、ランダムに選ばれた４０ｎｔｓのコア配列を含む組み合わせＤＮＡライブラリーが、アプタマープールの開始点として使用される。Ｖｅｔｏｒ  ＮＴＩ（インビトロゲン）のオリゴ分析モジュールを使用して、プライマー配列が設計され最適化される。典型的には、かかるライブラリーはおよそ１０１５のユニーク配列を含むと考えられる。ＳＥＬＥＸプロセス中にコア配列を増幅するためにプライマー結合部が使用される。結合緩衝液中に溶解された一本鎖ＤＮＡプールが９５℃にて５分間の加熱により変性され、その後１０分間氷上で冷却され、ニトロセルロースで被覆したガラススライド（例えばワットマン）上に固定した複数のタンパク質標的に曝される。
【００７８】
（ＤＮＡライブラリーＳＥＬＥＸの実施例）
一実施例としてのＤＮＡライブラリーは、以下の配列を有する、保存プライマーが横に配置された４０のヌクレオチドがランダムに配置された配列から構成される：（順シーケンス）：５’−ＡＴＡＣＣＡＧＣＴＴＡＴＴＣＡＡＴＴ−３’及び逆方向プライマー（ＲＰ）：５’−ＡＧＡＴＴＧＣＡＣＴＴＡＣＴＡＴＣＴ−３’。ＳＥＬＥＸの第一ラウンドにおいて、ｓｓＤＮＡプール５００ｐｍｏｌが結合緩衝液（０．１ｍｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ及び１ｍｇ／ｍｌＢＳＡのＰＢＳ）中の各スライドとともに３７℃にて３０分間インキュベートされる。前記スライドは、その後、結合緩衝液１ｍｌで１分間洗浄される。特定標的に結合したアプタマーを溶出するため、スライドが結合緩衝液内で９５℃まで加熱される。その後、高塩濃度溶液及びエタノールを用いて溶出したｓｓＤＮＡを沈殿させる。沈殿後、アプタマーペレットが水中に再懸濁され、３’−ビオチン標識プライマー及び５’−フルオレセイン（ＦＩＴＣ）標識プライマーを有するＰＣＲで増幅される（９５℃にて３０秒間、５２℃にて３０秒間、７２℃にて３０秒間を２０サイクル、その後７２℃にて１０分間延長）。次のラウンドで使用するストレプトアビジン被覆のセファロースビーズ（ウィスコンシン州、マジソン、プロメガ）によって、選択されたＦＩＴＣ標識のついたセンスｓｓＤＮＡがビオチン化アンチセンスｓｓＤＮＡから分離される。ＳＥＬＥＸ手順におけるＰＣＲ生成物の意図する鎖を過剰合成するために、上記方法の代わりに「非対称ＰＣＲ」を利用してもよい。あるいは、さらに代替的なものとして、例えば、リン酸化ＰＣＲプライマーが採用される際に、望ましくない鎖はλ−エクソヌクレアーゼに消化されてもよい。
【００７９】
個々のアプタマーをフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識すると、ＳＥＬＥＸ手順の観測が容易になる。また、ＦＩＴＣは、標準的なマイクロアレイスキャナのグリーン（ｃｙ３）チャネルでの走査と互換性を有する。選択の各ラウンド後のｓｓＤＮＡアプタマーを増幅するために使用されるセンスプライマーは、蛍光標識され、その結果、蛍光標識アプタマーとなる。タンパク質のスポットがついたニトロセルロース被覆のスライドがマイクロアレイスキャナで走査される。あるいは、タンパク質は、エポキシ被覆のガラススライド上にスポットが付けられてもよい。エポキシスライドは、３Ｄのニトロセルロースパッドよりもタンパク質結合能力が低いが、核酸アプタマープールのスライドのバックグラウンドへの非特定的結合が（ブロックの有無を問わず）少ない旨が、認められている。バックグラウンド蛍光を減らすためにブロックが採用されてもよい。
【００８０】
ＳＥＬＥＸプロセスの各ラウンドにおいて、アプタマーを標的に結合させるため、スライドが３７℃で３０分間インキュベートされる。その後、７Ｍ尿素で９５℃にて加熱することにより特異的に結合するＤＮＡを溶解する前に、スライドは結合緩衝液で洗浄される。溶出液からの核酸は、フェノール−クロロホルムで精製され沈殿した核酸であり、濃縮された一本鎖ＤＮＡ分子がＰＣＲにより増幅されることとなる。ＳＥＬＥＸプロセスを通
して一貫して厳密性を高めるために、洗浄液の容積を（およそ１〜１０ｍｌ）徐々に増やす。例えば選択の最終ラウンド後など、選択が所定の地点に到達後、アプタマーはタグ付け、マーク付け、及び／または分離される。
【００８１】
（識別子の原位置ハイブリダイゼーションの実施例）
短いｓｓＤＮＡ配列タグを用いて識別子のタンパク質標的に結合したアプタマーの３’末端へ、アプタマーへの原位置ハイブリダイゼーションの実施例を行った。これらの合成ｓｓＤＮＡタグ・オリゴヌクレオチドは、識別子３０２を伴う図３ｂに示した３つの領域から構成される。すなわち、（ｉ）オリゴヌクレオチドの３’末端での識別子３０２の領域３０２ｃであるＣ２領域は、使用した全アプタマー上の対応領域に相補的な１７〜２０のヌクレオチド配列から構成され、（ｉｉ）オリゴヌクレオチド３０２の５’末端での領域３０２ｂであるＣ１領域は、１７〜２０ｎｔのプライマー結合部を含み、配列前にタグの増幅、アプタマーハイブリッド中に使用され、（ｉｉｉ）ガラススライド表面上で各遺伝子座のユニーク識別子としての役割を果たすタグ・オリゴヌクレオチド（ｖ）の中心に存在する可変領域３０２ａ。８のヌクレオチドの可変配列により、市場における多くの複合タンパク質アレイ（８０００サンプル）に対して十分な４８（６５，５３６）のユニーク配列が合成される。
【００８２】
以上、概要を記載したように、ＳＥＬＥＸ手順の最終ラウンド（典型的にはラウンド１０）後、特定のアプタマーが、ガラススライドに固定されたタンパク質標的と結合する。各アプタマーの４０ｎｔコア配列はユニーク配列であるが、その末端配列は前記ＳＥＬＥＸ中いかなる種類の選択の影響も受けていなかった。そのタンパク質標的に結合する各ラウンド終了後、その遠位末端（Ｐ１、Ｐ２）での対応領域の維持を要件として保存プライマーを用いてアプタマーを増幅した。したがって、例えば、各アプタマーの３’−領域は、（標準的なハイブリダイゼーションを介して）提供されたタグ・オリゴヌクレオチドのＣ２領域の結合部としての役割を果たし得る。各タグ・オリゴヌクレオチドのユニーク可変配列（Ｖ）を所与として、各アプタマーはガラススライド上のアプタマーの位置まで、遡及可能な配列にてタグ付けされ、したがって、かかる位置にタンパク質のスポットが付く。
【００８３】
（１６プレックスのＳＥＬＥＸ手順の実施例）
１６プレックス（１６標的）のＳＥＬＥＸ手順の実施例が１６のユニーク標的を使用して行われた。すなわち、（１）フィブリノゲン、（２）コラーゲン、（３）フィブロネクチン、（４）アセチルウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、（５）ヘパラン硫酸、（６）プロラクチン抑制因子（ＰＩＦ）、（７）リボヌクレアーゼＡ（ＲＮａｓｅ  Ａ）、（８）ラミニン、（９）インターロイキン−７  ｃａｔ  ２００−７（ＩＬ−７  ｃａｔ  ２００−７）、（１０）ＩＬ−１５  ｃａｔ  ２００−１５、（１１）ＩＬ−２１  ｃａｔ  ２００−２１、（１２）ＩＬ−７Ｒ  ｃａｔ  ３０６−ＩＲ、（１３）ＩＬ−１５Ｒ、（１４）ＩＬ−２１Ｒ、（１５）ＩｇＧ  ｃａｔ  ２ａ（抗ＣＤ１９）及び（１６）抗ＣＤ２０である。かかる１６標的は、ブロックされたニトロセルローススライド上にスポットが付いたアレイとして配置された。上記議論したＤＮＡアプタマーライブラリーがスライドに適用された。ライブラリーの非結合メンバーが洗浄され、上記のように、１標的スポットにつき１標識にて、スライドが１６のユニーク識別子核酸配列によって標識された。前記識別子は６０℃にて短時間インキュベートされて、前記スポット上でアプタマーと３７℃で３０分間ハイブリダイズされるようにした。エキソ−クレノウＴａｑポリメラーゼとｄＮＴＰが追加され、３７℃で１時間、識別子の拡張が行われた。前記Ｔａｑは、６０℃で１０分間かけて不活性化された。ｄｓＤＮＡは、沸点に近い温度にて、７Ｍ尿素で溶出され、その後ｐＨ５．０の３Ｍ酢酸ナトリウムと氷のように冷たいエタノールとで沈殿させた。回収されたｄｓＤＮＡは標準的方法によって配列決定がなされた。
【００８４】
配列決定がなされたＤＮＡ中の識別子配列が、アプタマー配列の標的を同定するために利用された。標的に対して以下のアプタマー配列が同定された（識別子配列とプライミング配列を除く）：
【００８５】
標的１：
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【００８６】
標的２：
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【００８７】
標的３：
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【００８８】
標的４：
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【００８９】
標的５：
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【００９０】
標的６：
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【００９１】
標的７：
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【００９２】
標的８：
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【００９３】
標的９：
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【００９４】
標的１０：
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【００９５】
標的１１：
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【００９６】
標的１３：
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【００９７】
標的１４：
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【００９８】
標的１５：
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【００９９】
標的１６：
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【０１００】
標的１２（ＩＬ−７Ｒ  ｃａｔ  ３０６−ＩＲ）に対するアプタマーは回収されなかった。
【０１０１】
本発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態でも行われ得る旨、本発明の属する分野の通常の知識を有する者に認識されるであろう。したがって、本明細書の記載事項は、全ての点において例示であって、限定的なものと考えてはならない。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲に示されており、当該範囲内の意味内容及び均等の範囲内にある全ての変更が、ここに包含されることが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図２ａ】
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【図３】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図４ａ】
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【図５】
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【図５ａ】
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【図６】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図７】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図８】
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【配列表】
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