(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
９− (２−フルオロベンジル) −Ｎ (６) −メチル−２−トリフルオロメチルアデニン、９− (２−メトキシベンジル) −Ｎ (６) −メチル−２−ｎ−プロピルアデニン、９− (２−メトキシベンジル) −Ｎ (６) −メチル−２−トリフルオロメチルアデニン、及び９− (２−メトキシベンジル) −Ｎ (６) −メチル−２−メチルアデニン、又はその薬剤に許容される塩、そのエナンチオマー若しくはジアステレオマー、又はそれらの混合物から選ばれる化合物の、全身性エリテマトーデスの治療用医薬の製造に対する使用。
【請求項２】
該化合物が９− (２−フルオロベンジル) −Ｎ (６) −メチル−２−トリフルオロメチルアデニンであることを特徴とする、請求項１記載の使用。
【請求項３】
非ステロイド系抗炎症薬、合成抗マラリア薬、コルチコステロイド又は免疫抑制剤から選ばれた別の化合物と組合わせた、請求項１または２に記載の化合物の、同時に、別々に、一定時間引き離して、又は交互に投与される、全身性エリテマトーデス（ループス）の治療用医薬の製造に対する使用。
【請求項４】
ループスの治療に有用な前記別の化合物が、アスピリン、イブプロフェン、インドメタシン、ヒドロキシクロロキン、プレドニゾン、シクロホスファミド、又はアザチオプリンから選ばれることを特徴とする、請求項３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアデニンの２位および９位と場合によりＮ(６位)が置換されているアデニン由来化合物の全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ, systemic lupus erythematosus、全身性紅斑性狼瘡、以下、単にループスともいう）の治療用薬剤の製造に対する使用に関する。本化合物は、ＳＬＥの治療に使用される別の（第２の）化合物と組合わせて使用することもできる。
【背景技術】
【０００２】
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）又は播種性エリテマトーデスは、非常に多形の多遺伝子性自己免疫疾患である。それは典型的な非臓器特異性の自己免疫疾患である。罹患するのは平均して年間１０万人当たり１５〜５０人である。フランスでは年間５０,０００〜８０,０００人程度が罹患する。患者は主に女性（１０例中約９例の割合で）であり、一部の人種の人々、特にアフリカ系カリブ人、アフリカ系アメリカ人およびスペイン系アメリカ人の人々がこの病気を発症しやすいようである。
【０００３】
この病気の発症原因はわかっていないが、多因子疾患であることは明らかであり、いろいろな病因因子が同定されてきた。遺伝因子としては、この疾患の罹病性は明らかに多遺伝子的である。とくにＨＬＡ系のＤＲ２およびＤＲ３アレル（対立遺伝子）のようないくつかの遺伝子が遺伝的罹病性にからんでいることが示された。ＨＬＡ系には関係しない別の遺伝子もかかわっている。
【０００４】
さらに、紫外線（狼瘡発疹の光過敏性）および性ホルモン（生殖活性期の女性、妊娠のおよび妊娠への役割）といった環境因子も同定されてきた。
ＳＬＥは高度に多形性の疾患であって、従ってその徴候および臨床症状は非常に多様である。そのため、本疾患はしばしば診断が困難である。診断は詳しい質問と血液検査の後にしか下すことができない。診断を確立させるため、アメリカリウマチ学会（ＡＲＡ）の診断基準が使用される。ループスの診断を確認するには、下記基準のうち４つが存在していなければならない。これらはＳＬＥの９６％に存在する：
１．顔面の蝶型形状の発疹
２．円板状ループス皮疹
３．光過敏症
４．口腔または鼻咽喉の潰瘍
５．非びらん性の多発性関節炎
６．胸膜炎または心膜炎
７．腎障害：タンパク尿（＞０.５ｇ／２４ｈ）または円柱尿
８．痙攣発作または精神病
９．血液異常：溶血性貧血または白血球減少症（＜４０００／ｍｍ3）またはリンパ球減少症（＜１５００／ｍｍ3）または血小板減少症（＜１０００００／ｍｍ3）
１０．免疫異常：ＬＥ細胞（ハーグレーブス細胞）または抗天然（二本鎖）ＤＮＡ抗体または抗Ｓｍ抗体の存在（陽性）、あるいは梅毒反応の偽陽性
１１．抗核抗体陽性。
【０００５】
ループスの臨床症状のうち、ループス腎臓病は発生頻度の高い（通常の生物学的パラメータを用いて３５〜５５％と推定）症状であり、主要な予後因子の１つである。それは、血尿及び／又は円柱形成を伴う白血球尿、高血圧、あるいは最も普通にはタンパク尿について検査することによって検出することができる。腎臓病の検出は、５〜１０年以内に慢性腎不全に進行することがあるので、本疾患の予後に影響するターニングポイントである。慢性腎不全になると、患者の生存は透析または腎臓移植によってのみ維持されうる。
【０００６】
生物学的レベルでは、ＳＬＥの特徴は次の通りである。
・ループス・フレア（憎悪）期間中の、特に多量のＴＮＦ−α分泌を伴う全身の炎症徴候；
・血液学的異常、
・血清学的異常、主に、抗ＤＮＡ、抗ヒストン、抗ヌクレオソーム、抗Ｓｍ、抗ＳＳＡまたは抗ＳＳＢを含む抗核抗体（ＡＮＡ）の存在。患者はまた、血液またはリン脂質の形のある要素に抗する抗体も産生し、それらの自己抗体の一部は血中免疫複合体の生成に関与することがある；および
・免疫複合体による補体の使用に関連する低補体血症（寛解中に改善する重度の腎不全に関係）、ならびに／またはＣ２もしくはＣ４の生来の欠損（ＳＬＥの素因となる）。
【０００７】
この病気の原因がまだわかっていないため、現在のところＳＬＥの固有の治療は存在しない。疾患の重篤度や検出された症状に応じて多様な選択枝から選ばれた治療法が使用される。
【０００８】
静止性ループスについては単に監視するだけでよい。
皮膚および関節を冒す軽症形態の本疾患の治療は非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、例えば、アスピリン（日用量２〜４ｇ）、および合成抗マラリア薬、例えば、ヒドロキシクロロキンもしくはクロロキンの使用に基づく。ＮＳＡＩＤは症状を軽減するが、消化系への危険性（胃潰瘍）、アレルギーの危険性、および腎臓への危険性（腎不全）を伴う。ループスにおける合成抗マラリア薬の作用様式はよくわかっていないが、有効であることが実証されている。ヒドロキシクロロキン（プラケニルTM）は通常４００ｍｇ／ｄで使用される。有効性は３カ月後に判定される。しかし、この種の化合物の主な副作用であって、治療中止の必要がある網膜への毒性の徴候の有無を見つけるために、年１回の検眼（色覚、アムスラースケール）が必要となる。他の副作用（例えば、神経筋障害、無顆粒球症）はまれである。
【０００９】
関節症状が持続する場合、温和なステロイド治療（１０ｍｇ／ｄ未満のプレドニゾン）の適用へと進むことがある。これに対して、抗マラリア薬に耐性の皮膚障害は、ステロイド治療の適応とはならず、他の治療法（抗マラリア薬、サリドマイド等の組合わせ）の使用が正当化される。
【００１０】
内蔵が冒された形態に対してはステロイド療法（corticothery）が使用される。プレドニゾン（例えば、コルタンシルTM）が標準的なコルチコステロイドである。広くいうと、用量は重症形態（びまん性増殖性糸球体腎炎、溶血性貧血）における１〜１.５ｍｇ／ｋｇ／ｄから漿膜炎における０.５ｍｇ／ｋｇ／ｄまでである。しかし、ステロイド療法は著しい副作用を生じ、そのあるものは防止しなければならない。特に、アテローム発生の促進におけるステロイド療法の役割のために、その各種の成分（ＨＢＰ、糖尿病、異脂肪血症＜dyslipidemia＞、喫煙など）を考慮に入れる必要がある。ナトリウムを含まない低糖の食事が推奨され、一般にはそれにカリウムのサプリメントが併用される。胃腸保護剤の予防的使用および抗Ｈ２による治療処置が消化器合併症、特にＮＳＡＩＤとの併用治療から起こるもの、を低減させる。骨に関しては、骨粗鬆症は、二燐酸塩と交互にビタミンＤおよびカルシウムを毎日添加することにより低減するようである。感染の危険性は、高用量のステロイド療法によりかなり増大し、そのため感染の潜伏性病巣の検出と全身治療が正当化される。実際、初位相ステロイド療法は６週間から３カ月間までの期間で指示される。５〜１５日ごとにそれまでの用量より１０％ずつ少なくすることによって用量を徐々に少なくする。投与中止（離脱）を試みる場合には、視床下部−下垂体−副腎系の検査を事前に行わなければならない。高用量のコルチコステロイドは重症の憎悪、特に腎および神経の憎悪を治療するために静脈内ボーラスとして投与される。患者には、３時間で５００ｍｇ〜１ｇのメチルプレドニゾロン（例えば、ソルメドロールTM）が３日間続けて投与され、その後は経口ステロイド療法に切り替わる。従って、最も重症形態のＳＬＥに使用されるステロイド療法は患者の健康および生活の質にマイナスの影響を及ぼすことは明らかである。
【００１１】
場合によっては、免疫抑制化合物が使用される。ループス疾患における免疫抑制治療は慎重な判断を必要とする。これは、危険性（短期的には感染症、不妊症、長期的には発がんの可能性）から免疫抑制剤の使用は重症の内臓またはコルチコステロイド依存性形態に制限されていることを意味するためである。従来の治療計画（プロトコル）では、下記の各種薬剤が６カ月から２年の期間にわたって使用される：２〜３ｍｇ／ｋｇ／日の用量のシクロホスファミド（例えば、エンドキサンTM）、２〜４ｍｇ／ｋｇ／日の用量のアザチオプリン（例えば、イムランTM）。どちらの薬剤にも共通する危険性に加えて、シクロホスファミドは膀胱炎および内臓がんを引き起こす傾向が高い。シクロホスファミドの間欠的静脈内投与（毎月０.５〜１ｇ／ｍ2を６カ月、次いで３カ月に１度を２年間）と中用量のステロイド療法の併用は、ステロイド療法単独より効果が高い。この治療法は近年広く使用されている。
【００１２】
上の説明から、現在の治療は単に症状を治療するにすぎず、患者の生活の質に著しく影響する多くの副作用を伴うことは明白である。即ち、ＳＬＥの満足すべき治療は現在まで利用可能ではない。従って、最も重症の症状、特にループス腎症状の発症を遅らせ、それらが現れてもその重症度を軽減することができ、とりわけ現在の治療のような重度の副作用を引き起こさない新たな治療を見つける必要性がある。
【００１３】
ホスホジエステラーゼ類（ＰＤＥ）は、セカンド細胞内メッセンジャーのｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの加水分解を生ずる酵素で、１１ファミリーからなるスーパーファミリーを構成し、従って、細胞反応の正常および病的コントロールにおいて主要な役割を担っている。細胞内シグナル伝達でのそれらの基本的な役割から、これらの酵素は新たな治療標的とされてきた。これらの新規な標的の発見により創出された意気込みとそれらの組織中を通して変動する分布の面で、ＰＤＥ阻害薬の潜在的な治療用途については多量の文献が作り出されてきた。特に、ＰＤＥの異なるファミリーの阻害薬の治療用途に関する非常に多くの特許出願が出願されている。これらの特許出願のほぼ全てにおいて、ＰＤＥの特定のファミリーの阻害薬に対して想定されている治療用途は極めて広く、血管、神経、血液および炎症障害を含む多くのカテゴリーの疾患を包含し、各カテゴリーにおいて非常に多くの病気が引用されている。特に、これらの特許出願の内容からは、ＳＬＥがいずれか１つのＰＤＥファミリーの阻害薬により等しく十分に治療されうるように見える。次の表１は、ループスの治療に対する各種ＰＤＥファミリーの阻害薬の使用の可能性に関するいくつかの特許出願を示す。
【００１４】
【表１】
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【００１５】
全ＰＤＥファミリーの阻害薬にとって、ＳＬＥのような特異的で多形の疾患の治療に真に有効となることは明らかに不可能である。さらに、ＳＬＥの特異的治療のためにＰＤＥ２阻害薬と場合によりＰＤＥ５阻害薬を使用することを示唆している出願ＷＯ０３／１７９２６を例外として、上の表１に示した出願のどれも、ＰＤＥのそれ以外のファミリーの阻害薬がループス治療に何らかの効果を本当に有すると当業者が考えるように仕向けるような結果を何ら与えていない。
【００１６】
ＰＤＥ阻害薬およびそれらの潜在的治療用途に関して夥しい数の不協和の文献があることを考慮すると、ＰＤＥ２阻害薬はもしかすると例外であるが、ＰＤＥ阻害薬の中からループスの治療用の効果的な新規化合物を見つけるよう当業者が奨励されていないことは明らかである。
【００１７】
さらに、より具体的にＰＤＥ４阻害薬に関して、ＳＬＥについての実験結果を記載した従来技術の文書は全くなく、単にそれらの文書に記載された特定の阻害薬のアレルギーおよび炎症現象を阻害する能力、さらには場合によってＬＰＳ−由来ＴＮＦ−αの産生を阻害するその能力を示す結果しか記載されていないことを強調することは重要である。
【００１８】
例えば、米国特許第６,７１６,９８７号は、実験部分において、特許請求されているＰＤＥ４阻害薬化合物が、ＳＬＥとは完全に異なる、いくつかのアレルギーおよび炎症現象、特にＬＰＳ−由来ＴＮＦ−αの産生に対する阻害効果を有することを示している。ＳＬＥに関する結果は全く記載がない。
【００１９】
同様に、特許出願ＵＳ２００３／０１０４９７４においても、ＰＥＥ４およびＰＤＥ７への二重阻害効果を有する特許請求された化合物のＬＰＳ由来ＴＮＦ−α分泌の阻害能力についてしか実施例が示されていない。
【００２０】
従って、ＰＤＥ４阻害薬に関する従来技術でＳＬＥ治療におけるその使用を特許請求または一般的に示唆しているものは、特許請求された化合物の抗炎症性または抗アレルギー性作用しか実験では示していない。ループス疾患の成分、例えば、タンパク尿または血清中の抗ＤＮＡ抗体の存在に対する効果は、これらが本疾患の基本的成分であるにもかかわらず、記載がない。
【００２１】
ループスの複雑さおよび多形性という性質を承知しているＳＬＥ治療の領域で働いている当業者は、従来技術の文書中に提示されている結果がＰＤＥ４阻害薬をループス治療について試験するよう彼らを仕向けるのに十分であるとは決して考えないであろう。
【００２２】
特許出願ＥＰ１０４３０２１は、アデニン由来化合物とＴＨ２細胞の免疫反応の選択的阻害薬または抗アレルギー薬としてのその使用を記載している。
この特許出願に記載されている治療用途は主にＴＨ２反応誘発アレルギー疾患に関するが、ループスも触れられている。
【００２３】
しかし、実験的な実施例は、特許請求された化合物が感作ＴＨ２細胞によるサイトカイン産生とエオシン好性浸潤への阻害作用、並びに抗アレルギー作用を有することしか示していない
従って、ＳＬＥに特に重要である機序におけるこれらの化合物の何らかの効果を示す実験結果は全く記載されておらず、従って、明細書中におけるループスの単なる言及は、ループス治療の領域で働く当業者がこれらの化合物をＳＬＥ治療に試験するよう励ますことは全くなかった。
【非特許文献１】Bourguignon, J.J. et al., J. Med. Chem. (1997) 40, 1768-1770
【非特許文献２】Raboisson P. et al., Eur. J. Med. Chem. (2003) 38, 199-214
【非特許文献３】"Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 66: 1 (1977)
【非特許文献４】Monneaux F. et al., Eur. J. Immunol. (2003) 33, 287-296
【非特許文献５】Monneaux F. et al., Arthritis Rheum (2004) 50, 3232-3238
【非特許文献６】Lugnier C. et al., Biochem. Pharmacol. (1986) 35, 1743-1751
【非特許文献７】Keravis T. et al., Meth. Mol. Biol. (2005) 307, 63-74
【非特許文献８】Kameni Tcheudji J.F. et al., J. Mol. Biol. (2001) 310, 181-191
【発明の開示】
【００２４】
しかし、予想外にも、本発明者らは、ＰＤＥ４ファミリーの酵素の阻害能力を有する、アデニンの２位と９位および場合によりＮ(６)位が置換されているアデニン由来化合物のＳＬＥ治療における有効性を示すことができた。本発明者らは実際、ＳＬＥのマウスモデルであるＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおける疾患の進行を、特に腎障害の阻止（タンパク尿の低下）、およびＴＮＦ−α産生や本疾患のマーカーである抗ＤＮＡ自己抗体の産生の阻止によって阻害することができ、それによりＭＲＬ／ｌｐｒマウスの生存期間が延長されることを示した。
【００２５】
本発明者らはまた、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおけるループスの各種成分に対するこれらの化合物の効果を、別のアデニン由来ＰＤＥ４阻害薬のデンブフィリン（denbufyline）のそれと比較した。デンブフィリンの化学式を下に示す。
【００２６】
【化３】
0005446271.tif 000003
【００２７】
得られた結果は、in vivoループス治療に対して、本発明に係る化合物はデンブフィリンよりはるかに効果が高いことを示す。デンブフィリンは、ＴＮＦ−α産生の阻害に対しては類似の効果を有するが、この化合物のタンパク尿または抗ＤＮＡ自己抗体発生（ループスの基本成分の２つ）に対する効果は、本発明に係る化合物のそれより著しく低いか、或いは存在すらしない。
【００２８】
従って、本発明者らは、アデニンの２および９位および場合によりＮ(６)位が置換されている種類のアデニン由来化合物を示すと同時に、この高度に多形性の疾患であるＳＬＥの全成分について真のin vivo効果を初めて示すものである。
【００２９】
よって、本発明は、下記一般式(Ｉ)で示される化合物、又はその薬剤に許容される塩、そのエナンチオマー若しくはジアステレオマー、又はそれらの混合物の全身性エリテマトーデスの治療用医薬の製造に対する使用に関する。
【００３０】
【化４】
0005446271.tif 000004
【００３１】
式中、
Ｒ１はＣＦ3，Ｃ1〜Ｃ5アルキル、若しくは(ＣＨ2)nＲ４から選ばれ、ここでｎは０〜４の範囲内であり；
Ｒ２は(ＣＨ2)mＲ４又は(ＣＨ2)mＡｒから選ばれ、ここでｍは０〜５の範囲内であり；
Ｒ３は水素又はメチルから選ばれ；
Ｒ４はフェニル、ＯＨ、Ｃ1〜Ｃ3アルコキシ、Ｃ1〜Ｃ3ジアルキルアミノ、ピペリジノ、又はＮ−メチルピペラジノから選ばれ；
Ａｒは次式で示される基を意味し、
【００３２】
【化５】
0005446271.tif 000005
【００３３】
ここで、ＸはＦ、Ｃｌ、Ｃ1〜Ｃ3アルコキシ、又はＣＦ3から選ばれる。
本出願で用いた「Ｃ1〜Ｃiアルキル」（ｉ≧１）なる用語は、式：ＣjＨ2j+1（１≦ｊ≦ｉ）で示される線状または分岐飽和炭化水素基を意味するものである。特に、Ｃ1〜Ｃ5アルキルは、Ｃ1（メチル）、Ｃ2（エチル）、Ｃ3（ｎ−プロピルもしくはイソプロピル）、Ｃ4（ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）、またはＣ5（例えば、ｎ−ペンチル、ネオペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル）アルキルであることができる。同様に、Ｃ1〜Ｃ3アルキルは、Ｃ1（メチル）、Ｃ2（エチル）、またはＣ3（ｎ−プロピルもしくはイソプロピル）アルキルであることができる。
【００３４】
本書で用いた「Ｃ1〜Ｃ3アルコキシ」なる用語は、式：−Ｏ−(Ｃ1〜Ｃ3アルキル)で示される基を意味し、ここでＣ1〜Ｃ3アルキルは上記と同じ意味である。従って、この用語は、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシおよびイソプロピルオキシ基を包含する。本発明で有利なアルコキシ基は、メトキシおよびｎ−プロピルオキシ、特にメトキシである。
【００３５】
本書で用いた「Ｃ1〜Ｃ3ジアルキルアミノ」なる用語は、式：−Ｎ(Ｃ1〜Ｃ3アルキル)2で示される基を意味し、ここで各Ｃ1〜Ｃ3アルキルは独立して上記と同じである。有利には、両方のＣ1〜Ｃ3アルキルが同一である。有利には、本発明におけるＣ1〜Ｃ3ジアルキルアミノは−Ｎ(ＣＨ3)2、−Ｎ(Ｃ2Ｈ5)2、または−Ｎ(Ｃ3Ｈ7)2から選ばれた式を有する。
【００３６】
エナンチオマーおよびジアステレオマーは、立体異性体である。ここで用いた「立体異性体」とは、異性体、即ち、同じ実験式を有する化合物で、展開式も同じであるが、空間配置が異なる化合物を意味するものである。その上で、「エナンチオマー」とは、平面鏡において互いに鏡像関係にあり、重なり合わない立体異性化合物であり、「ジアステレオマー」とは、エナンチオマーではない立体異性体、即ち、平面鏡において互いに鏡像関係にある立体異性体ではないものである。本発明の範囲は、一般式(Ｉ)で示される種々のエナンチオマーおよびジアステレオマー、並びにこれらの混合物、特に立体異性体のラセミ混合物にも及ぶ。
【００３７】
アデニンのＮ(６)位にメチル基が存在すると、上記化合物のループス治療に対する有効性が高まる。従って、有利な態様においては、Ｒ３はメチルである。
アデニンの９位が場合により置換されているベンジル基が存在する場合も、ループスの治療に対する上記化合物の有効性が改善される。従って、有利な態様においては、Ｒ２は(ＣＨ2)Ａｒであり、ここでＡｒは既に定義した通りである。Ａｒ基のＸ置換基はベンゼン環のどの位置にあってもよい。しかし、Ａｒ基のＸ置換基は有利にはベンゼン環の２位にある。さらに、Ｘは有利にはフッ素原子およびメトキシから選ばれる。
【００３８】
ＳＬＥの治療用医薬の製造に使用するのが容易な具体的化合物が本発明者らにより既に同定されている。具体的には、このような有利な化合物は下の表２に示される化合物を含む。
【００３９】
【表２】
0005446271.tif 000006
【００４０】
特に有利な化合物は、９−(２−フルオロベンジル)−Ｎ(６)−メチル−２−トリフルオロメチルアデニン（ＮＣＳ６１３）である。
【００４１】
ＳＬＥ治療用医薬を製造するために本発明に従って使用される化合物を製造するには、２つの合成経路を使用することができる。
第１の経路は、慣用的で適用範囲が狭い方法であるが、Ｒ2の位置が正確に置換されているクロロプリンを使用し、これをまず種々のハロゲン化アルキル（Ｒ2Ｘ）でアルキル化し、次いでＮ−メチルアミンとの反応によりアミノ化する（下の反応式１を参照）。この方法についてのさらなる詳細はBourguignon, J.J. et al., J. Med. Chem. (1997) 40, 1768-1770に見ることができる。
【００４２】
【化６】
0005446271.tif 000007
【００４３】
第２の合成経路は、アデニンの２位のより体系的な検討を可能にするものであり、対応する２−ヨード化誘導体から出発してパラジウム（０）を用いたアミノ化またはカップリング（Suzuki、Sonogashira、Heck, Buchward）による方法である。出発のヨード化誘導体は２−アミノ誘導体を亜硝酸イソアミル、次にジヨードメタンで処理することにより得られる（下の反応式２を参照）。この合成経路についてのさらなる詳細はRaboisson P. et al., Eur. J. Med. Chem. (2003) 38, 199-214に見ることができる。
【００４４】
【化７】
0005446271.tif 000008
【００４５】
上記化合物はそのまま、または薬剤に許容される塩として使用することができる。本書で用いた「薬剤に許容される塩」とは、塩酸塩、硫酸塩、燐酸塩、二燐酸塩、臭化水素酸塩、および硝酸塩のような無機酸の付加により生ずる塩、並びに酢酸塩、マイレン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、メタンスルホン酸塩、p−トルエンスルホン酸塩、パモ酸塩、シュウ酸塩およびステアリン酸塩などの有機酸の付加により生ずる塩を特に意味するものである。やはり本発明の範囲内に含まれるのは、利用可能であれば、水酸化ナトリウムまたはカリウムのような塩基から生ずる塩である。薬剤に許容される塩の他の例については、"Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 66: 1 (1977)を参照。
【００４６】
上記化合物から製造されたＳＬＥ治療用医薬は、当業者に公知の薬剤に許容される担体をさらに含有しうる。かかる医薬はまた薬剤に許容される任意の種類の賦形剤も含有しうる。これらの賦形剤は特に医薬中に含有される化合物の保存性とその生物学的利用能を改善し、または生体内での有効成分の持続放出を可能にする。
【００４７】
上記化合物から製造されたＳＬＥ治療用医薬は、種々の経路、特に経口、経鼻、直腸、静脈内、筋肉内、皮下および局所経路で投与することができる。特に、ＳＬＥの特徴として、全身性の炎症もしくは免疫複合体の循環といった全身性症状と、特に皮膚および関節での局所症状の両方を含むことがある。本発明に係る医薬は、従って、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、経口、経鼻、もしくは局所経路または関節への浸潤により、侵襲性または非侵襲性の方法で使用することができる。
【００４８】
本発明者らは、上記化合物が特にＳＬＥの治療に有効であることを実証した。これらの化合物は単独で使用することができる。それらはまた、ＳＬＥの治療に有用な別の（第２の）化合物と併用することもできる。ループスの治療に有用なそのような化合物は、好ましくは非ステロイド系抗炎症薬、合成抗マラリア薬、コルチコステロイド類または免疫抑制剤から選ばれる。従って、１態様において、本発明は、上記のような本発明の化合物を、非ステロイド系抗炎症薬、合成抗マラリア薬、コルチコステロイド又は免疫抑制剤から選ばれた別の化合物と組合わせて、同時に、別々に、一定時間引き離して、又は交互に投与される、全身性エリテマトーデスの治療用医薬の製造に使用することにも関する。
【００４９】
非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）は、鎮痛、解熱および抗炎症特性を備えたすぐに作用する症状治療薬であり、それらは、化学的な性質が互いに異質であるにもかかわらず、次のような共通の作用機序を有する：シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）の阻害による組織内でのプロスタグランジン（ＰＧ）およびトロンボキサン（ＴＸ）の産生低下。ＣＯＸには２種類のアイソエンザイム（構成的かつ遍在的なＣＯＸ−１と、マクロファージ単核細胞および多核細胞中で誘導されうるＣＯＸ−２）。ここで用いた「ＮＳＡＩＤ」とは、ＮＳＡＩＤそれ自体とサリチレートの両方を意味するものである。なぜなら、それらはほとんど全く同じ治療効果と同じ副作用を有するからである。本発明に係る医薬において上記のような化合物と組合わせるのに有用なＮＳＡＩＤとしては、ジフルニサール、ベノリレートもしくはアスピリンのようなサリシレート系ＮＳＡＩＤ；アルミノプロフェン、ケトプロフェン、イブプロフェン、ナプロキセン、フルルビプロフェンもしくはチアプロフェン酸のようなプロピオン酸誘導体；インドメタシン、スリンダックもしくはエトドラクのようなインドリン誘導体；フェニルブタゾンのようなピラゾール誘導体；ピクロキシカム、テノキシカムもしくはメロキシカムのようなオキシカム類；ロフェコキシブもしくはセレコキシブのような選択的抗ＣＯＸ２剤；またはジクロフェナック、ニメスリド、ニフルミン酸、メフェナミン酸、もしくはナブメトンのような他のＮＳＡＩＤが挙げられる。好ましくは、上記化合物と併用するＮＳＡＩＤはアスピリン、インドメタシンおよびイブプロフェンから選ばれる。
【００５０】
本発明に係る医薬において上記９−ベンジルアデニン由来化合物と組合わせることができる合成抗マラリア薬は、キニーネおよびメフロキンのような４−メタノールキノリン類；クロロキン、ヒドロキシクロロキンおよびアモジアキンのような４−アミノキノリン類；プリマキンのような８−アミノキノリン類；プログアニルのようなビグアニド類；スルファドキシン／ピリメタミンのようなスルホンアミドとジアミノピリミジンとの組合わせ；アルテミシニンおよび誘導体のようなセスキテルペンラクトン類を包含する。好ましくは、上記化合物と併用する合成抗マラリア薬は、クロロキンおよびヒドロキシクロロキンから選ばれ、好ましくはヒドロキシクロロキンである。
【００５１】
コルチコステロイドとして天然コルチコステロイド（コルチゾンおよびヒドロコルチゾン）並びにそれらの合成誘導体が挙げられる。本発明に係る医薬において上記９−ベンジルアデニン誘導体と併用するのに有用なコルチコステロイドは、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、フッ素化トリアムシノロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、パラメタゾン、トリアムシノロン、コルチバゾール、およびテトラコサクチドを包含する。プレドニゾンはループス治療においていまだ第一級のコルチコステロイドであるので、優先的に使用される。コルチコステロイドを本発明に係る医薬において上記化合物と併用する場合には、食塩を含まない糖尿病型の食事（低糖、低カロリー）とカリウム、カルシウムおよびビタミンＤの補給が重要である。
【００５２】
本発明に係る医薬において上記９−ベンジルアデニン由来化合物と組合わせることができる免疫抑制剤は、シクロスポリン、タクロリムス、アザチオプリンおよびシクロホスファミドを包含する。好ましくは、上記化合物と併用する免疫抑制剤はアザチオプリンおよびシクロホスファミドから選ばれる。
【００５３】
ＳＬＥ治療用医薬を上記化合物とＳＬＥの治療に有用な第２の化合物とから製造する場合、これらの有効化合物は、同時に、別々に、一定時間引き離して、または交互に投与することができる。これは、２種類の化合物の組合わせから得られる医薬が、これを取るたびごとにその２種類の化合物が必ず「同時に」に投与される単一医薬の形態で、或いはそれぞれ一方の化合物を含む２つの別個の医薬の形態で、それらの医薬を「別々に」（同時ではあるが、２つの異なる単位で、場合により２つの異なる経路で）、または「一定時間引き離して」（２つの単位を数時間または数日離れた異なる時点で投与する）投与する形で提供することができることを意味する。これらの異なる可能性によって、その異なる２種類の化合物の具体的な性質を考慮することが可能となる。さらに、この２種類の化合物を「交互に」に投与することもできる。即ち、患者は、まず一方の化合物の処置による治療を受け、次いでもう１つの化合物の処置による治療を受け、これを交互に繰り返すのである。
【実施例】
【００５４】
実施例１：化合物ＮＣＳ６１３の生物学的効果および別のＰＤＥ４阻害薬のデンブフィリンの効果との比較
１．１  材料および方法
１．１．１  動物実験：化合物ＮＣＳ６１３またはデンブフィリンの投与の効果のin vivo試験
投与およびサンプル
５週齢のプレ自己免疫雌性ＭＲＬ／ｌｐｒマウスに、緩衝食塩水（ＰＢＳ；対照群、１匹当たり１００μl）、または化合物ＮＣＳ６１３（１０％エタノールを含有する食塩水中に希釈、１匹当たり３０μｇ／１００μl）、またはデンブフィリン（１０％エタノールを含有する食塩水中に希釈、１匹当たり１００μｇ／１００μl）のいずれかを静脈内経路により投与した。最後の２群はそれぞれ１０匹ずつのマウスから構成された。投与（４回）は５、７、９および１３週齢の時点で行い、マウスを規則的に監視した（観察、アルブティクス試験紙によるタンパク尿検査、血液検査）。
【００５５】
血清中の抗ＤＮＡ抗体の測定
マウス血清中のＤＮＡに抗する抗体の存在を、ＥＬＩＳＡにより異なる週齢で測定した（Monneaux et al., Eur. J. Immunol. (2003) 33, 287-296; Monneaux et al., Arthritis Rheum (2004) 50, 3232-3238）。ウシ胸腺二本鎖ＤＮＡ（Sigma）を９６ウェルのポリ塩化ビニルプレート（Falcon）上で吸着させ（１００ｎｇ／ｍｌ）、３７℃で一晩インキュベーションした。三回の洗浄とウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ−Tween緩衝液中での飽和工程の後、血清（１／５００に希釈）を３７℃で１時間インキュベーションした。血清中に存在する抗体とＤＮＡとの結合を、第二の抗体（ペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ）と共にインキュベーションした後、ペルオキシダーゼ基質および色原体と共にインキュベーションすることにより顕示させた。反応を停止させた後、分光光度法によって４５０ｎｍでの吸光度を測定した。
【００５６】
ＬＰＳ刺激後の治療マウスの血球（血液細胞）によるＴＮＦ−α分泌の測定
ＴＮＦ−α分泌をマウス血球（１群当たり７匹のマウスから集めた血球）の細菌性リポ多糖（ＬＰＳ）刺激後に測定した。２４時間のＬＰＳ細胞刺激はＴＮＦ−α分泌を生ずるので、それを培養液の上清中で測定することができる。３群のマウスの血液から得た細胞（血球）をフィコール比重装置で分離し、次いでＬＰＳで刺激した。２４時間培養した後で上清を集め、上清中のＴＮＦ−αの存在を、二重サンドイッチＥＬＩＳＡ試験（BD Biosciences）により測定した。この実験を異なる週齢（１１および１４週齢、即ち、それぞれ３回目の投与から２週間後と、４回目の投与から１週間後）に行った。
【００５７】
１．１．２  患者試験：化合物ＮＣＳ６１３がＴＮＦ−α産生に及ぼす効果のex vivo試験
ループス、リウマチ様関節炎またはシェーグレン症候群の患者５名の血液をヘパリン加チューブ内に直接集めた。単核血球をフィコール比重装置で遠心（６００ｇで３０分）により分離した。細胞をその後、化合物ＮＣＳ６１３（１０μＭ）の存在下または不存在下で１ウェル当たり２×１０5個の濃度で４５分間増殖させ、その後にＬＰＳで刺激した。２４時間の培養後に上清を回収し、上清中のＴＮＦ−αの濃度を二重サンドイッチＥＬＩＳＡ（BD Biosciences）により測定した。
【００５８】
１．１．３  サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼの試験
ホスホジエステラーゼ活性
サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性を、基質としてトリチウム化サイクリックＡＭＰまたはＧＭＰ（１μＭ）を用いた放射酵素法により測定した（Lugnier C. et al., Biochem. Pharmacol. (1986) 35, 1743-1751；Keravis T. et al., Meth. Mol. Biol. (2005) 307, 63-74）。標識サイクリックヌクレオチドの加水分解により生成させたトリチウム化アデノシンまたはグアノシン一リン酸を、過剰のヌクレオチダーゼと一緒の二次インキュベーションにおいて、トリチウム化アデノシンまたはグアノシンに変換させた。生成したヌクレオシドをヌクレオチドからアニオン交換樹脂クロマトグラフィーにより分離した。分離したヌクレオシドの放射能を液体シンチレーションにより測定した。酵素インキュベーションは基質加水分解が１５％以下である条件下で実施し、各ポイントを反復した。
【００５９】
ＰＤＥ１，ＰＤＥ３，ＰＤＥ４およびＰＤＥ５の単離
ウシ大動脈中膜の３ｇの小片をハサミで切り刻み、多種類のプロテアーゼ阻害薬（20 mM Tris-HCl, 0.25 M サッカロース、 2 mM 酢酸マグネシウム、1 mM ジチオスレイトール、5mM ＥＧＴＡ、 2000 U/ml アプロチニン、10 mg/l ロイペプチンおよび10 mg/l 大豆トリプシン阻害薬）を含有する７体積／重量倍量の緩衝液Ａ中ので、最初にウルトラタラックスを用い、次にガラス／ガラスポッター型を用いてホモジナイズした。ホモジネートを105,000 gで１時間遠心分離した。上清を、緩衝液Ｂ（サッカロース、ＥＧＴＡおよびプロテアーゼ阻害薬を含有しない緩衝液Ａ）で予め平衡化させておいたＤＥＡＥセファセルカラム（15×1.6 cm）に通した。カラムを、280 nmでの吸光が検出できなくなるまで洗浄し、次いで緩衝液Ｂ中の直線ＮａＣｌ傾斜 (0〜0.5 M) で溶離した。3 mlずつの画分を集め、溶離順で、酵素活性をＰＤＥ１，ＰＤＥ５，ＰＤＥ３およびＰＤＥ４について、画分中に含まれる酵素活性のピークを求めるように各種条件下で酵素活性を測定した。各画分は等分して−８０℃で保存した。
【００６０】
ＰＤＥ２の単離
ストラスブールのフランス血液銀行（Etalissement Francais du Sang）から入手した洗浄ずみのヒト血小板を放置した後、沈降細胞を緩衝液Ａ中でホモジナイズし、105,000 gで１時間遠心分離した。上清を大動脈中膜について既に述べた手順に従ってクロマトグラフィー処理した（Ｃ−２）。その後、ＰＤＥ２（活性が5 μM cGMPにより刺激される）に富む画分を、ファルマシアのMono Q H/R 5X5を用いてＨＰＬＣクロマトグラフィーにかけた。ＰＤＥ２を含有する画分を等分し、−８０℃で保存した (Kameni Tcheudji J.F. et al, J. Mol. Biol. (2001) 310, 181-791)。
【００６１】
分子の活性および薬理プロフィール
ＩＣ50の測定
１μＭの基質で酵素活性の５０％阻害を生じる物質の濃度（ＩＣ50）を、分子濃度を１ｎＭから３００μＭまで増大させた間に変動させた化合物濃度に対して得られた結果を利用して非線形回帰（Prism, GraphPad）により算出した。可溶性の問題のために、この試験で用いた最大濃度は３００μＭに制限された。
【００６２】
ＰＤＥ１からＰＤＥ５までの全群についてのＩＣ50の決定により、その標的に対する該分子の特異性の特性決定が可能となった。
１．２  結果
１．２．１  化合物ＮＣＳ６１３のＰＤＥ４ｃ選択的阻害能力
異なるファミリーのＰＤＥ酵素に対する化合物ＮＣＳ６１３およびデンブフィリンの選択性を分析した。下の表３に示す結果は、この化合物がＰＤＥ４ファミリーの酵素に対して選択性であることを示す。
【００６３】
【表３】
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【００６４】
さらに、ＰＤＥ４酵素の４タイプ（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ）に対する化合物ＮＣＳ６１３の選択性も試験した。下の表４に示す結果は、この化合物がＰＤＥ４Ｃサブタイプに対して選択性であることを示す。
【００６５】
【表４】
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【００６６】
１．２．２  プレ自己免疫マウスへの化合物ＮＣＳ６１３又はデンブフィリンの投与の病状発現への効果
化合物ＮＣＳ６１３の生物学的性質のin vivo試験をプレ自己免疫（pre-autoimmune）ＭＲＬ／ｌｐｒマウスで行った。これらのマウスでは、Ｆａｓ遺伝子（アポトーシスに入る細胞に関与する膜受容体）に関係するｌｐｒとして知られる突然変異の存在が自己免疫症状をもたらす。この症状は、発現する臨床及び生物学的徴候に関してはヒトのループスに似ているが、ヒトで見られる症状より重症である。ＭＲＬ／ｌｐｒマウス系の特色は、血管病変を伴うリンパ滲出性症候群、関節炎、およびマウスの死に至る腎炎である。この疾患はＭＲＬ／ｌｐｒマウスでは早くに現れ（２０週齢で死亡率５０％）、最初の臨床徴候（タンパク尿）は１３〜１４週齢から現れる。ヒトのループスと同様に、核複合体（スプライセオソームおよびヌクレオソーム）に抗するように向けられた自己抗体がこれらのＭＲＬ／ｌｐｒマウス中に存在する。従って、ＭＲＬ／ｌｐｒマウス系は全身性エリテマトーデスの非常に良好なマウスモデルとなる。しかし、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスの別の特色は、別のヒトの自己免疫疾患であるリウマチ様関節炎に似たリウマチ様因子を伴う関節炎の発現である。ほぼ３〜４月齢で群れの４５％は関節糜爛を伴う滑膜への浸潤を有する。
【００６７】
ＭＲＬ／ｌｐｒマウスのループスの各種成分に対する化合物ＮＣＳ６１３のin vivo効果を、別のアデニン由来ＰＤＥ４阻害薬であるデンブフィリンの効果とさらに比較した。
タンパク尿への効果
臨床パラメータの観察は、１３週齢までの化合物ＮＣＳ６１３の投与がタンパク尿の出現を遅らせることを示す。１４週齢でタンパク尿が検出されたのは、対照マウスの７０％に対して、化合物ＮＣＳ６１３で治療したマウスではわずか１０％である。さらに、治療の終了後も、化合物ＮＣＳ６１３で治療したマウスではタンパク尿の割合がずっと低くなる。２０週齢でタンパク尿が検出されたのは、化合物ＮＣＳ６１３で治療したマウスでは５０％にすぎないのに対して、未治療の対照マウスで８０％である（図１を参照）。
【００６８】
即ち、化合物ＮＣＳ６１３による治療期間中（１３週齢まで）、治療されたマウスはタンパク尿の発症から保護されるのに対して、一部の未治療の対照マウスでは早くも１０週齢からタンパク尿が検出される。化合物ＮＣＳ６１３により治療の終了後、タンパク尿が検出されるマウスの数は２６週齢（これは治療終了から１３週後である）まではより小さいままである。
【００６９】
従って、長期投与した場合に化合物ＮＣＳ６１３はＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおけるタンパク尿の発症を防止するようである。
これに対して、化学構造が異なる別のアデニン由来ＰＤＥ４阻害薬であるデンブフィリンで得られた結果は、デンブフィリンがタンパク尿の発症を有意に遅らせないことを示す。なぜなら、化合物ＮＣＳ６１３で治療されたマウスとは異なり、デンブフィリンで治療されたマウスは２０週齢で対照マウスと同等のタンパク尿を有するからである。
【００７０】
従って、デンブフィリンとは異なり、別のＰＤＥ４阻害薬である化合物ＮＣＳ６１３は、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスのタンパク尿を有意に低下させる。そして、タンパク尿の発現こそが高度に多形性の疾患であるＳＬＥの進行の主要因子なのである。
【００７１】
平均余命への効果
得られた結果は、化合物ＮＣＳ６１３の投与がＭＲＬ／ｌｐｒマウスの生存率に有益な効果を及ぼすことを示す。
【００７２】
実際、化合物ＮＣＳ６１３は２０週齢でマウスの平均余命を著しく延長し（ｐ＝０.０５８１）、この効果は２６週までは、少なくなるものの継続する（ｐ＝０.０８８１、図２Ａ参照）。２１週齢での死亡率が、未治療の対照群では６０％であるのに比べてわずか３０％であるので、本化合物は自己免疫マウスの半減期を著しく増大させる（図２Ａ照）。
【００７３】
これに対して、デンブフィリンは、１５週齢で死亡が始まり、２６週齢での死亡率は対照マウスのそれとほぼ同じであるので、マウス生存率に対して何の効果も認められない（ｐ＝０.２７、図２Ｂ参照）。
【００７４】
ＴＮＦ−α分泌への効果
ＴＮＦ−α分泌のex vivo阻害を、マウス血球（１群当たり７匹のマウスから集めた血液）の細菌性リポ多糖類（ＬＰＳ）刺激後に測定した。この実験は、異なる週齢のマウス（１１および１４週齢、即ち、それぞれ３回目の投与から２週間後と、４回目の投与から１週間後）に行った。。
【００７５】
結果は、前に化合物ＮＣＳ６１３を投与されたマウスの血球は、未治療の対照群のマウスからの血球よりＬＰＳに応答したＴＮＦ−αの産生量がより少量であったことを示す（図３参照）。ＰＢＳ対照群の血球に比べた化合物ＮＣＳ６１３で治療したマウスの血球中のＴＮＦ−α分泌の阻害率（％）は、１１週齢で４４％、１４週齢では５４％であった（図３を参照）。
【００７６】
デンブフィリンでも同等の結果が得られた（図３を参照）。１４週齢ではデンブフィリンで得られた阻害は化合物ＮＣＳ６１３で得られたものより大きかった。
抗二本鎖ＤＮＡ抗体の産生への効果、ループスのマーカー
結果（図４参照）は、未治療のループスマウス（対照）では血清中の抗ＤＮＡ抗体の存在が１１週齢から明らかとなり、２０週齢では実際に全てで検出可能であった。化合物ＮＣＳ６１３は、これらの抗体の出現を２０週齢まで遅らせ、さらにマウスのより少数（２０％）でしか抗体が出現しなかった。２６週齢、即ち、治療終了から１３週間後に、血清中の抗ＤＮＡ抗体の存在に対して陽性であるのは、対照群では９０％であるのに比べて、化合物ＮＣＳ６１３で治療したマウスでは５０％だけであった。
【００７７】
デンブフィリンも陽性マウスの割合を低減させたが、その効果は化合物ＮＣＳ６１３より著しく目立たなかった。最初の陽性マウスの出現は、化合物ＮＣＳ６１３では２０週齢であったのに対し、１４週齢（即ち、治療停止からわずか１週間後）であった。さらに、２６週齢での陽性マウスの割合は、化合物ＮＣＳ６１３で治療した群ではより小さい値にとどまった。
【００７８】
血清中の抗ＤＮＡ抗体の存在は高度に多形性の疾患であるＳＬＥの重要な発現である。これに関して、得られた結果は、別のアデニン由来ＰＤＥ４阻害薬であるデンブフィリンに比べた化合物ＮＣＳ６１３の優位性を明らかに示している。
【００７９】
結論
以上の全ての結果が、プレ自己免疫ＭＲＬ／ｌｐｒマウスへの化合物ＮＣＳ６１３の投与によって、細菌由来の分裂促進刺激に応答したＴＮＦ−αを分泌する血球の能力が低減し、かつタンパク尿および抗ＤＮＡ抗体の産生の低減により治療マウスにおける疾患の進行が遅くなることを示す。
【００８０】
従って、化合物ＮＣＳ６１３は高度に多形性の疾患であるＳＬＥの全部の成分に対して効果的に作用する。
これに対して、別のアデニン由来ＰＤＥ４阻害薬であるデンブフィリン（１００μｇ）は、ＬＰＳ刺激に応答するＴＮＦ−α分泌の阻害だけは化合物ＮＣＳ６１３（３０μｇ）同等の効果を有するが、タンパク尿や抗ＤＮＡ抗体産生といった本疾患の残りの成分については効果がずっと弱いか、又は存在しない。その結果、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスの生存に対する効果はずっと小さくなる。
【００８１】
総括すると、これらの結果は従って本発明者らが、ＳＬＥの全成分と戦うことから、本疾患のin vivo治療に特に有用な新規種類の化合物を見出したことを示す。
１．２．３  自己免疫患者の単核血球のＬＰＳ刺激後のＴＮＦ−α分泌に及ぼす化合物ＮＣＳ６１３の効果
ループス（ＳＬＥ）、リウマチ様関節炎（ＲＡ）およびシェーグレン症候群（ＳＳ）を含む全身性自己免疫疾患の患者からの単核血球（単核血液細胞）を化合物ＮＣＳ６１３の存在下又は不存在下でインキュベーションした後、ＬＰＳで刺激し、ＴＮＦ−α分泌を測定した。
【００８２】
結果（図５参照）は、１０μＭの濃度で使用した化合物ＮＣＳ６１３が、細菌性リポ多糖類（ＬＰＳ）により刺激された自己免疫患者の血球によるＴＮＦ−α産生を非常に有意に阻害する（約７０〜９８％）ことを示す。特に、ループス（ＳＬＥ）患者の単核血球によるＴＮＦ−α分泌の阻害率は６９％、９１％および９８％（平均８６％）である。
【００８３】
ヒトで得られたこの結果は、ループスのマウスモデルで得られたものと一致し、ループス患者からのＬＰＳ刺激された単核血球がＳＬＥにより起こる炎症症状に固有の炎症性サイトカインのＴＮＦ−αを分泌する能力を阻害することができることを示す。
【００８４】
１．２．４  ループス患者の単核血球による基礎ＴＮＦ−α分泌に及ぼす化合物ＮＣＳ６１３の効果
試験した３名のループス患者のうち、１名はＬＰＳ刺激の不存在下でも基礎ＴＮＦ−α分泌を有していた。そこで、化合物ＮＣＳ６１３が基礎ＴＮＦ−α分泌を阻害する能力を、この患者の血球中で試験した。
【００８５】
図６に示した結果は、化合物ＮＣＳ６１３がループス患者からの血球による自発ＴＮＦ−α分泌を６７％阻害したことを示す。
従って、化合物ＮＣＳ６１３はＳＬＥ患者の単核血球によるＴＮＦ−α分泌を有効に阻害することができる。
【００８６】
１．３  結論
ループスマウスで得られた全ての結果は、化合物ＮＣＳ６１３が、タンパク尿およびマーカーの抗ＤＮＡ抗体産生を遅延又は減少させ、炎症反応を減少させ、かつ治療マウスの生存率を高めることによりループスの発現を防止することを明らかに示している。その有益な効果は治療を停止した後も長く続き、長期治療がより一層効果的であることを示唆している。
【００８７】
これらの結果は化合物ＮＣＳ６１３およびその誘導体に特異的なものである。別のアデニン由来ＰＤＥ４阻害薬であるデンブフィリンの使用は、匹敵しうる結果を生じなかった。デンブフィリンはＬＰＳにより起こるＴＮＦ−α分泌を阻害することができるが、タンパク尿阻害および抗ＤＮＡ抗体の産生については化合物ＮＣＳ６１３に匹敵する効果を示さない。従って、本発明者らは、ＳＬＥのin vivo治療に特に有効な新規種類の化合物を明らかにした。
【００８８】
さらに、ループス患者およびリウマチ様関節炎およびシェーグレン症候群のような全身性自己免疫疾患の患者の炎症反応に及ぼす化合物ＮＣＳ６１３の効果は、化合物ＮＣＳ６１３がループスおよび他の自己免疫疾患を治療することができる可能性を秘めていることを示唆する。
【００８９】
実施例２：腎でのＰＤＥ４活性とＭＲＬ／ｌｐｒマウスのループスの発現との相関
２．１  材料および方法
プレループス（前ループス）マウス（８週齢、ｎ＝３）およびループスマウス（１８週齢、ｎ＝３）を致死後、腎臓を取り出し、液体窒素中で凍結させ、ついで酵素活性測定まで−８０℃で保存した。腎臓を次いで凍結粉砕器を用いて液体窒素中でばらばらに粉砕し、種々のプロテアーゼ阻害薬を含有するｐＨ７.５の緩衝液中でホモジナイズ処理した。各マウス臓器について別々に、タンパク質含有量をローリー法により、ＰＤＥ類の加水分解活性を放射化酵素法を用いて求めた。
【００９０】
このアッセイは、過剰の５’ヌクレオチダーゼの添加後のトリチウム化ｃＡＭＰ又はｃＧＭＰからそれぞれトリチウム化アデノシン又はグアノシンへの変換を測定する。生成したトリチウム化ヌクレオシド類はイオン交換クロマトグラフィーによりサイクリックヌクレオチド類から分離して、液体シンチレーションにより定量した。
【００９１】
ｃＡＭＰの全加水分解活性に対するＰＤＥ４の寄与を、特異的ＰＤＥ４阻害薬であるロリプラム（rolipram）(Keravis anc coll., 2005)１０μＭの存在下および不存在下でアッセイを行うことにより求めた。
【００９２】
２．２  結果
ループスが始まるにつれて、ｃＧＭＰの加水分解活性は全く変化せずにｃＡＭＰの加水分解活性が増大し、ｃＡＭＰを特異的に加水分解する酵素だけがループスにより変性することを示唆している。さらに、この増大は特異的にＰＤＥ４活性の増大を伴い、この活性はｃＡＭＰ加水分解活性に５０％以上も寄与する。
【００９３】
従って、この結果は、腎のＰＤＥ４活性の増大とループス疾患の発現との間の真の相関関係を初めて示す。当業者といえども、この正確な結果を予測できなかった。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】ＭＲＬ／ｌｐｒマウスのタンパク尿に及ぼす化合物ＮＣＳ６１３およびデンブフィリンの影響。１３週齢までマウスは３０μｇの化合物ＮＣＳ６１３または１００μｇのデンブフィリンのいずれかを４回投与された。結果は、使用したマウスの週齢によるタンパク尿が陽性のマウスの割合を示す。
【図２】ＭＲＬ／ｌｐｒループスマウスの生存に及ぼす化合物ＮＣＳ６１３(Ａ)およびデンブフィリン(Den)(Ｂ)の影響。１３週齢までマウスは３０μｇの化合物ＮＣＳ６１３または１００μｇのデンブフィリンのいずれかを４回投与された。結果はマウスの生存率で示す。対照マウスは、有効成分を含まないＰＢＳ（燐酸緩衝食塩水、ｐＨ７.４）のみを投与された。
【図３】ＬＰＳ刺激後の治療マウスの血球によるＴＮＦ−α産生に及ぼす化合物ＮＣＳ６１３およびデンブフィリンの影響。２４時間のex vivoＬＰＳ刺激後に食塩水（ＰＢＳ）、化合物ＮＣＳ６１３またはデンブフィリンを投与されたマウスの血球によるＴＮＦ−α分泌を上清中でＥＬＩＳＡにより測定した。エラー・バー（誤差範囲棒）は、２回の標準偏差を示し、ＰＢＳ群で測定された分泌の関数としてのＴＮＦ−α分泌の阻害率を示す。この図は１１週齢(Ａ)および１４週齢(Ｂ)のマウスで行われた実験を示す。
【図４】抗二本鎖ＤＮＡ抗体に及ぼす化合物ＮＣＳ６１３およびデンブフィリンの影響。マウス血清中の抗ＤＮＡ抗体の存在をＥＬＩＳＡにより異なる週齢で測定した。結果は陽性マウスの割合で示す。ＥＬＩＳＡにより測定された光学密度（ＯＤ）が１より大きい場合にマウスを陽性とする。
【図５】自己免疫疾患患者のＰＢＭＣのＬＰＳ刺激後の化合物ＮＣＳ６１３によるＴＮＦ−α分泌の阻害。ループス（ＳＬＥ）、リウマチ様関節炎（慢性関節リウマチ）（ＲＡ）、およびシェーグレン症候群（ＳＳ）の患者からの血球を、ＮＣＳ６１３（１０μＭ）の存在下または不存在下で４５分間インキュベーションした後、ＬＰＳで刺激した。２４時間の培養後に上清を回収し、上清中のＴＮＦ−α濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。結果は、(Ａ)ＮＣＳ６１３の存在下もしくは不存在下でインキュベーションした後のＴＮＦ−α濃度、または(Ｂ)ＮＣＳ６１３と共にインキュベーションした後のＴＮＦ−α分泌の阻害により示す。エラー・バーは、２回の標準偏差を示す。
【図６】ＮＣＳ６１３と共にインキュベーションした後のループス患者のＰＢＭＣによるＴＮＦ−α分泌の阻害。ループス患者（ＬＥＤ２）の血球をＮＣＳ６１３（１０μＭ）の存在下または不存在下でインキュベーションした。２４時間の培養後に上清を回収し、上清中のＴＮＦ−α濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。結果は、ＮＣＳ６１３の存在下もしくは不存在下でインキュベーションした後のＴＮＦ−α濃度、並びにＮＣＳ６１３の存在下でのインキュベーション後のＴＮＦ−α分泌の阻害率により示す。エラー・バーは、２回の標準偏差を示す。
【図７】ループスが起こる時の腎組織におけるホスホジエステラーゼ活性の変化。ｃＧＭＰ(Ａ)、ｃＡＭＰ(Ｂ)の加水分解活性、並びにＰＤＥ４活性(Ｃ)をプレループスマウス（８週齢、ｎ＝３）とループスマウス（１８週齢、ｎ＝３）とで比較した。結果はpmol.min-1.mg-1で表された３匹のマウスで得られた結果の平均値±標準誤差である。＊Ｐ＜０.０５（プレループス組織に対して）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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