(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
７または８の核酸でトランスフェクションされた細胞を培養する工程を含んでなる、ヘルパーウイルスを使用せずに複製型インフルエンザウイルス粒子を産生する方法であって、該核酸が各々インフルエンザ遺伝子セグメント及びバクテリオファージポリメラーゼプロモーターを含んでなるか又は該核酸が各々インフルエンザ遺伝子セグメントの相補物及びバクテリオファージポリメラーゼプロモーターを含んでなり、該方法に使用される細胞が更にバクテリオファージポリメラーゼを含んでなる、上記方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法であって、該方法に使用される核酸が、バクテリオファージポリメラーゼターミネーターを含まない、上記方法。
【請求項３】
請求項１〜２のいずれか１項に記載の方法であって、該方法に使用される核酸が、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターの隣に少なくとも１個の更なるグアニン残基を提供された、上記方法。
【請求項４】
請求項３記載の方法であって、該方法に使用される核酸が、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターの隣に２個の更なるグアニン残基を提供された、上記方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、該バクテリオファージポリメラーゼプロモーターが、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターである、上記方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法であって、細胞のトランスフェクションが、インフルエンザ核タンパク質及びポリメラーゼタンパク質ＰＡ、ＰＢ１及びＰＢ２のみならずまた、８種のインフルエンザｖＲＮＡ核酸を発現する１２種の単方向性プラスミドによる、上記方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法であって、該方法に使用される少なくとも１種の核酸が、ワクチンの目的のために世界保健機構により推奨されるインフルエンザウイルスから誘導されたインフルエンザ遺伝子セグメントを含んでなる、上記方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法であって、該方法に使用される少なくとも１種の核酸がインフルエンザＡ遺伝子セグメントを含んでなる、上記方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法であって、該バクテリオファージポリメラーゼが、核局在化シグナルを含んでなる、上記方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法であって、該バクテリオファージポリメラーゼが、Ｔ７ポリメラーゼである、上記方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法であって、該方法に使用される細胞が、霊長類以外の細胞である、上記方法。
【請求項１２】
請求項１１記載の方法であって、該方法に使用される細胞が、ＭＤＣＫ細胞又はＣＥＦ細胞である、上記方法。
【請求項１３】
インフルエンザ遺伝子セグメントまたはその相補物及びＴ７バクテリオファージポリメラーゼプロモーターを含んでなり、かつ、該プロモーターに接して少なくとも一つの追加のグアニン残基を備えた核酸。
【請求項１４】
請求項１３記載の核酸であって、該プロモーターに接して２つの追加のグアニン残基を備えた、上記核酸。
【請求項１５】
ワクチンの目的上ＷＨＯにより推薦されているインフルエンザウイルス由来の遺伝子セグメントを含んでなる請求項１３又は１４記載の核酸。
【請求項１６】
インフルエンザＡの遺伝子セグメントを含んでなる請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１７】
請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の核酸を含んでなる細胞。
【請求項１８】
さらに、Ｔ７バクテリオファージポリメラーゼを含んでなる請求項１７記載の細胞。
【請求項１９】
該ポリメラーゼが核局在化シグナルを含んでなる、請求項１８記載の細胞。
【請求項２０】
請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の非霊長目の動物細胞。
【請求項２１】
ＭＤＣＫ細胞又はＣＥＦ細胞である請求項２０記載の細胞。
【請求項２２】
ヘルパーウイルスを含まない請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２３】
医薬組成物の製造のための、請求項１７に記載の細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はインフルエンザウイルスワクチン産生の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルス（オルトミキソリウイルス（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ））はセグメント化ゲノムを伴う、エンベロープをもつマイナス鎖のＲＮＡウイルスである（特許文献１参照）。それらはそれらの核タンパク質及びマトリックスタンパク質間の著しい抗原の相異に基づいて、２種の分類：１つはインフルエンザＡ及びＢを包含し、他方はインフルエンザＣからなるものに分類される。３種の型のウイルスはまた、病原性及びゲノム組織が異なる。Ａ型は広範な温血動物に認められるがＢ型及びＣ型は主としてヒトの病原体である。インフルエンザＡウイルスは更に血液凝集素（ＨＡ）及び、ビリオン（ｖｉｒｉｏｎ）の表面から突き出すＮＡ表面の糖タンパク質の抗原特性により準分割される。現在１５種のＨＡ及び９種のＮＡサブタイプが存在する。インフルエンザＡウイルスはトリ、ブタ、ウマ、ヒト及び他の哺乳動物を包含する広範な動物に感染する。水鳥はインフルエンザＡのすべての知られたサブタイプの天然のレザボアとしての役目をもち、恐らくヒトの流行性インフルエンザ株の遺伝物質の発生源である。
【０００３】
インフルエンザウイルスは関連するパラミクソ・ウイルスと異なり、セグメント化ＲＮＡゲノムを有する。インフルエンザＡ及びＢウイルスは同様な構造をもち、他方インフルエンザＣはより異なる。Ａ型及びＢ型のウイルスはそれぞれ、それぞれ少なくとも１個のタンパク質をコードする８個の別々の遺伝子セグメントを含有するが、Ｃ型はＡ型及びＢ型のセグメント４及び６を併せて７個の別々のセグメントを含有する。インフルエンザＡ及びＢウイルスは３種のタンパク質：ＨＡ、ＮＡ及びマトリックス２（Ｍ２）の突起物（ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）で覆われている。インフルエンザＣウイルスは唯一の表面糖タンパク質を有する。各インフルエンザＲＮＡセグメントは核タンパク質（ＮＰ）によりキャプシドを包まれて（ｅｎｃａｐｓｉｄａａｔｅｄ）リボヌクレオチド核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する。３種のポリメラーゼタンパク質はＲＮＰ複合体の一方の端と結合されている。ＲＮＰは不可欠な部分としてマトリックスタンパク質（マトリックス１）を含む膜で囲まれている。エンベロープのリン脂質部分は細胞の宿主の膜から誘導される。ウイルス粒子内には非構造的タンパク質２（ＮＳ２）も認められる。
【０００４】
インフルエンザウイルス命名のための世界保健機構（ＷＨＯ）指針は以下である。第１に、ウイルスの型（Ａ、Ｂ又はＣ）を指定し、次に宿主（ヒト以外の場合）、単離場所、単離数及び単離の年（斜線により分割）。インフルエンザＡに対しては、ＨＡ及びＮＡサブタイプが括弧内に記載される。例えば、２０００年〜２００１年のシーズンに対する最近の３価ワクチンに包含された株は：Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９（Ｈ３Ｎｓ）、Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）及びＢ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６／９８である。１９７７年以来、ヒトには２種のインフルエンザＡサブタイプ：Ｈ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２が流行してきた。
【０００５】
インフルエンザウイルスはそれらのＲＮＡポリメラーゼ複合体がプルーフリーディング作用をもたないので、複製中に点突然変異（ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）を蓄積する。表面糖タンパク質の抗原部分のアミノ酸を変化させる突然変異がそれを既存の免疫から巧みに逃げさせることにより、ウイルス株に選択的な利益を与えることができる。ＨＡ分子は特定の宿主細胞上の受容体に結合することにより感染を開始する。ＨＡタンパク質に対する抗体が受容体結合を妨げ、同一株による再感染予防に非常に有効である。ＨＡは、近年流行しているＨＡ遺伝子の突然変異体が抗体結合を破壊する抗原ドリフト又は、ウイルスが新サブタイプのＨＡを獲得する抗原シフトのいずれかにより、以前獲得した免疫を逃れることができる。抗原ドリフトの影響（ｐｒｅｓｓｕｒｅｓ）は、主としてＨＡタンパク質の球状ヘッド上に存在するプラスに選択される変化を伴って、ＨＡ分子全体に不均一である。これらの変化はまた、ＮＡよりＨＡにおいてより激しく蓄積する。他のインフルエンザタンパク質中の変化はより緩徐に起る。同様に、抗原ドリフトの影響もヒトに適応されたインフルエンザ株において最大で、ブタ−及びウマ−に適応された株で中程度、そしてトリ−に適応された株でもっとも弱い。
【０００６】
インフルエンザウイルスはセグメント化ゲノムを有するので、同一宿主における２種の異なる株による同時感染は親遺伝子セグメントの異なる組み合わせを含有する新規の再仕分けされたインフルエンザ株の産生をもたらす可能性がある。野生のトリには１５種のＨＡサブタイプが存在することが知られており、ヒトに対して新規のＨＡ源を提供する。抗原シフトによる新規サブタイプをもつインフルエンザ株のヒトの流行における出現が１９５７年及び１９６８年の最近の２回のインフルエンザ流行の原因であり、おそらく１９１８年のインフルエンザ流行の原因であるらしい。流行するインフルエンザウイルスの出現について知られているすべてと一致するためには、流行株は１つの近年優勢なものと抗原の異なるＨＡをもたなければならない；このＨＡは６０〜７０年間ヒトに流行した可能性がなく；そして該ウイルスはヒトからヒトに感染可能でなければならない。１９５７年及び１９６８年双方において、流行はＨＡのシフトからもたらされ、双方の場合に流行株のＨＡはトリの株に密接に関連していた。流行の絶対条件の１つは、ＨＡが変化しなければならないことであり、残りのウイルスが変化することができる又は変化するにちがいない程度は不明である。１９５７及び１９６８年流行のウイルスのみが直接的研究に利用可能であり、１９１８年流行のインフルエンザウイルスは分子考古学を使用して特徴を研究されている。１９５７年に、３種の遺伝子がトリ−様遺伝子：ＨＡ、ＮＡ及びポリメラーゼ複合体（ＰＢ１）の１サブユニットにより置き換えられた。１９６８年には、ＨＡ及びＰＢ１のみが置き換えられた。
【０００７】
インフルエンザ感染症の特別の診断はウイルス単離、血球凝集抑制（ＨＩ）試験、免疫アッセイによる抗原検出、血清学的試験、分泌物中のＮＡ活性の表示又は分子に基づくアッセイ、により実施することができる。試料は唾液、鼻咽頭塗抹標本又は、バッファー生理食塩水溶液でうがいすることにより得られる鼻咽頭洗浄物として収集することができる。インフルエンザ診断の基準は培養後の免疫学的特徴付けであった。血清学的分析は急性及び回復期の血清双方の収集を必要とするので、インフルエンザ感染症の正確なしかし懐古的診断法を提供する。
【０００８】
インフルエンザウイルスは発育鶏卵又は多数の組織培養系中で増殖させることができる。トリプシン（ＨＡの分割活性化のため）の添加はＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ犬腎（ＭＤＣＫ）細胞及び他の株中でのインフルエンザウイルス増殖を許す。ワクチン産生の主要な方法はいまだに卵中でのインフルエンザウイルスの培養である。ヒトインフルエンザウイルス（Ａ型及びＢ型の双方）の主要な単離のためには細胞株中での培養が一般に使用される。多数のヒトインフルエンザウイルスは発育鶏卵の尿膜腔中で直接培養することができる。幾つかのインフルエンザＡ及びＢウイルスは最初に羊膜腔中で培養し、次に尿膜腔への適用を必要とする。培養物単離後、大部分のインフルエンザ単離物は免疫アッセイ又は免疫蛍光染色法を使用して確実に同定される。インフルエンザウイルスのＨＡ分子はウイルスが侵入するための呼吸器細胞の表面上のシアル酸残基に結合する。
【０００９】
インフルエンザ株はインフルエンザウイルスがインビトロで赤血球を凝集する能力を利用して抗原学的に特徴を示すことができる。抗−ＨＡ抗体は凝集を妨げることができる。従って、血液凝集抑制（ＨＩ）アッセイがインフルエンザ株を特徴付けるために使用される標準法の１つである。ＨＩアッセイは試料の株が最近のワクチン株と免疫学的に関連す
る（すなわち、交差反応性である）かどうかを決定するために使用される。一般にフェレットで生産される分類血清を一連の２倍希釈物でウェルに添加し、実験室作業員は凝結赤血球細胞に対する懸濁赤血球細胞を検出することによりアッセイウェルを評価する。大部分の状況において、ワクチンに対する試料株と対照株を一致させるために血清のパネルを使用し、任意の特定のインフルエンザ流行期間中は、大部分の試料株がＨＩアッセイによりうまく一致される。ＷＨＯは指針を提供し、ＷＨＯ協力センターは個々のウイルス株の抗原特徴の識別に対する指針を提供し、それらを入手希望の人々にこれらの株を提供することができる。試料株はＡ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／９９（Ｈ３Ｎ２）−様ウイルス、Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）−様ウイルス、及びＢ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／１８４／９３−様ウイルスのような免疫学的系図に従って分類される。ＨＩアッセイで特徴を調べることができない試料株に対しては、実験室作業員はそれらをフェレット中に接種して、株特異的抗血清を製造しなければならない。新規抗血清が準備されると、ＨＩアッセイを前記のように再度実施する。新規の血清が交差反応において有意な差異（通常、試料とワクチン株間の４倍の差異と定義される）を示す場合は、定常実験室パネルに取り込まれて、新規の流行株を探索するために使用される。従って、ＨＩアッセイはワクチン株選択のためのインフルエンザウイルス監視努力において極めて重要であり、抗原ドリフトを測定するためのもっとも一般に使用される方法である。
【００１０】
インフルエンザ株は個々の遺伝子セグメントの配列の比較により遺伝子学的に特徴を調べることができ、再度ＷＨＯが指針を与え、そしてＷＨＯ協力センターがインフルエンザゲノムを含んでなるＲＮＡセグメントの個々の物体；核タンパク質（ＮＰ）、塩基性（ｂａｓｉｃ）ポリメラーゼ１（ＰＢ１）、塩基性ポリメラーゼ２（ＰＢ２）、酸ポリメラーゼ（ＰＡ）、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、マトリックスタンパク質（Ｍ１及びＭ２）並びに非構造的タンパク質（ＮＳ１及びＮＳ２）をコードするインフルエンザＡ及びＢウイルスの核酸セグメント並びに核タンパク質（ＮＰ）、塩基性ポリメラーゼ１（ＰＢ１）、塩基性ポリメラーゼ２（ＰＢ２）、血球凝集素−ノイラミニダーゼ様糖タンパク質（ＨＮ）、マトリックスタンパク質（Ｍ１及びＭ２）及び非構造タンパク質（ＮＳ１及びＮＳ２）をコードするインフルエンザＣウイルス核酸セグメント、の識別に対する指針を提供する。
【００１１】
例えば抗原分析のため、核酸配列比較のため、そしてワクチンウイルス同定のための参照株の要請は、ＷＨＯ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｎｇ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ（インフルエンザにおける参照及び研究のためのＷＨＯ協力センター），４５  Ｐｏｐｌａｒ  Ｒｏａｄ，Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ  ３０５２，Ａｕｓｔｒａｌｉａ（ｆａｘ：＋６１
３  ９３８９  １８８１，ｗｅｂ  ｓｉｔｅ：ｈｔｔｐ／／ｗｗｗ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｃｅｎｔｒｅ，ｏｒｇ）、ＷＨＯ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｎ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（国立感染症研究所），Ｇａｋｕｅｎ  ４−７−１，Ｍｕｓａｓｈｉ−Ｍｕｒａｙａｍａ，Ｔｏｋｙｏ  ２０８−００１１，Ｊａｐａｎ（ｆａｘ：＋８１  ４２５６１０８１２又は＋８１  ４２  ５６５２４９８）、ＷＨＯ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｎｇ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ，  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，１６００  Ｃｌｉｆｔｏｎ  Ｒｏａｄ，Ｍａｉｌ  ｓｔｏｐ  Ｇ１６，  Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ  ３０３３３，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ（ｆａｘ：＋１  ４０４  ６３９  ２３  ３４）あるいはＷＨＯ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｎｇ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｔｈｅ  Ｒｉｄｇｅｗａｙ，  Ｍｉｌｌ  Ｈｉｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ  ＮＷ７  １ＡＡ，Ｅｎｇｌａｎｄ（ｆａｘ：＋４４  ２０８  ９０６  ４４７７）宛てに照会することができる。最近の伝染病学的情報はＷＨＯのｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｉｎｆｌｕｅｎｚａのウェブサイト及びｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｆｌｕｎｅｔの地理的情報システム、ＦｌｕＮｅｔ，で利用可能である。
【００１２】
インフルエンザの影響並びにその予防の健康及び経済的利益の認識は増加しつつあり、過去１０年間はワクチン接種の使用及び利益が認められ、多数の抗インフルエンザ薬が著しく増加している。多数の国における、より長い寿命の結果として、新製品の紹介が該疾患の予防及び処置のための選択肢を増加したにもかかわらず、より多数の人々が合併症の危険にさらされ、インフルエンザ流行中の保健システムに対する負担がより広範に認識され、そしてより頻繁な海外旅行がウイルスの散逸の機会を作り出してきた。およそ５０カ国が政府基金の国家インフルエンザ予防接種プログラムを有し、多数の他国においてワクチンが利用可能である。ワクチンの使用に対する特別の推奨事項は変動するが、一般に、既存の慢性の医学的状態のために重篤な疾患の危険の高い高齢者及び６カ月以上の人々に対する毎年の接種を伴う。幾つかの国では、ワクチンは医学的危険の高い人々に対するインフルエンザの蔓延を減少するために使用される。メンバー国はそれらの全公衆の健康優先の観点でインフルエンザ予防活動の利益を考慮する必要がある。
【００１３】
不活性化ワクチンはそれが全ウイルス粒子、一部破壊されたウイルス粒子（分離ワクチン）又は精製エンベロープ抗原（サブユニットワクチン）を含有するかに応じて幾つかのタイプに分類される。幾つかのサブユニットワクチンは補助剤又は送達系と組み合わされてきた。
【００１４】
幾つかの国は特定の標的群に対する生の弱毒化インフルエンザワクチンを許可してきた。ロシア連邦においては１ワクチンの２種の異なる調合物が健康な成人及び幼児に使用されて来、もう１つの生ワクチンが集中して試験されてきたが、まだ許可に至っていない。生の弱毒化ワクチンが更に広範に利用可能になるまで、それらはインフルエンザの予防のためには一般にまだ推奨されない。
【００１５】
２群の抗ウイルス剤がインフルエンザの予防及び処置に開発されてきた。Ｍ２インヒビターのアマンタジン及びリマンタジンはインフルエンザＡウイルスの処置に限定され、感染予防にも有効であることが報告されている。両製品は幾らかの副作用を引き起こすが、アマンタジンにより有意な神経学的副作用がより一般的である。ザナミビル及びオセルタミビルのようなノイラミニダーゼインヒビターが、最近多数の国でＡ型及びＢ型インフルエンザの処置のために許可され、予防に有効であることが報告されている。両群の抗ウイルス剤を摂取している患者に抵抗性突然変異体が検出された。現在のところ、これは重要な公衆保健の問題とは考えられないが、これらの薬剤が非常に大規模に使用される場合は状況は変化するかも知れない。
【００１６】
８２カ国に設置された１１０の国立インフルエンザセンター及び、アトランタ（米国）、ロンドン（英国）、メルボルン（オーストラリア）及び東京（日本）に設置された、４つのインフルエンザ参照及び研究のためのＷＨＯ協力センター、の協力により運営される大掛かりな国際監視プログラムを維持する。これらのセンターは流行の可能性をもつ株の出現に対する早期の警告システムを提供する。インフルエンザワクチンの効果は、それらが現在流行している株を含有しない場合に減少するために、このシステムは重要である。ＷＨＯは、北半球で使用されるワクチンのために２月に、そして南半球で使用されるワクチンのために９月に、世界保健機構により刊行される、Ｗｅｅｋｌｙ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｃｏｒｄ（例えば、第９刊、２００４、７９、ページ８８又はｈｔｔｐ：／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｗｅｒを参照）に認めることができるようなワクチン組成物のための推奨事項を発行している。インフルエンザは赤道下地域では明確な季節パターンをもたないので、赤道下の国における使用のためのワクチンに対してこれらの推奨事項（２月又は９月）のうちで適当な伝染病学的考慮が影響を与えるであろう。
【００１７】
協力センターは国立センターにより提出されるインフルエンザ単離物の抗原及び遺伝学的分析を実施する。抗原の抗原の変異の証明が認められると、伝染病学的データと相関させて、変異体の伝染病学的有意性を算定する。代表的単離物を接種前後に収集されたヒト血清のパネルを使用して現在のワクチン株と比較して、現在のワクチンがこれらのウイルスを防御することが期待できるかどうかを算定する。ＷＨＯの年間ワクチン推奨事項の発行後、高い増殖株を開発して、ワクチン生産のための種ウイルスの生成を補助するための参照ウイルスとして業者に提供される。インフルエンザワクチンの安全性及び効力の試験はウイルス不活性化、微生物の殺菌性（ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ）、ウイルスを崩壊するために使用される化学薬品の測定及び推奨抗原濃度の確認を包含する。ワクチンはＷＨＯ条件を準拠しなければならないが、国家の監督機関が各国で使用される特定のワクチンウイルスを承認しなければならないことが推奨される。国立公衆保健監督局はワクチンの使用に関する推奨事項に責任をもつ。更にＷＨＯはインフルエンザウイルス感染症の予防に関する推奨事項を刊行した（ＷＥＲ  Ｎｏ．３５，２００２，ｐｐ．２８１−２８８を参照）。
【００１８】
インフルエンザワクチンは５０年以上にわたり発育鶏卵で製造されてきたが、近年、ワクチン産生のための細胞培養系を開発する多大の努力がなされてきた。発育鶏卵における従来の標準法は極めて面倒で、幾つかの主要な欠点有する：何百万もの卵が必要であり、米国では、１季節当たり１００百万超の卵を接種し、個別に収穫しなければならず、アレルギーの危険を最少にするために卵タンパク質を確実に除去するために集中的な精製が多数の濾過及び遠心分離工程を要し、時間の浪費及び汚染にさらされることは言わずもがな、自動化が困難で労力を要する多数の生産工程が必要である。
【００１９】
従って、既存のワクチン製造法に置き換えるための、すなわちインフルエンザウイルスの増殖を支持することができる細胞の特別の株を利用して、自動化生物反応容器中、生物担体上又は他の細胞培養システム中で増殖させるようになっている製造プロトコールを開発することにより、近年のワクチン産生法より利点を示すワクチン産生法を開発するための長期にわたる需要が当該産業に存在してきた。
【００２０】
ＶＥＲＯ細胞又は霊長類が発生源の他の細胞のような十分に特徴を知られた連続的細胞株がしばしば、インフルエンザウイルスワクチン産生における使用に示唆されている。しかし、登録当局（ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ａｕｔｈｏｒｉｔｙ）は今日、ヒトにおける使用を意図される霊長類細胞で産生されたワクチンを敬遠する。このような当局はますます、霊長類の細胞から誘導されるすべての生成物（Ｖｅｒｏのような）が残留するインタクト細胞を含まないことを推奨し、これらの細胞中で製造される製品中に霊長類細胞のＤＮＡのような残留物質の濃度について連続した心配を表わしている。世界保健機構（ＷＨＯ）は近年、非経口投与される時のウイルスワクチンに対し、１回１０ｎｇの連続的細胞株からの残留ＤＮＡの限界を許容しているが、登録当局はウイルスワクチンに対する各症例に基づくＤＮＡのような残留霊長類細胞物質によりもたらされる危険の程度を考慮し続けている。
【００２１】
長い間、インフルエンザＡウイルスの基礎研究は有効な逆遺伝学的系の利用可能性欠如により妨げられてきた。マイナス鎖のＲＮＡウイルスに対するもっとも初期の逆遺伝学法は事実、インフルエンザＡウイルスに対し開発されたが、組換えＤＮＡのみからのこのウイルスのレスキューはごく近年に達成された。
【００２２】
組換えインフルエンザウイルスは、それからゲノムのウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）の各セグメントがＲＮＡポリメラーゼ１により転写される、１組の８種のプラスミド並びに核タンパク質（ＮＰ）及びポリメラーゼタンパク質ＰＢ１、ＰＢ２及びＰＡを発現する１組の４種の更なるプラスミドによる真核細胞のトランスフェクション時に産生された。これらの１２−プラスミド系を使用するウイルス産生の報告された有効性は比較的低かった。血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、マトリックスタンパク質１及び２（Ｍ１及びＭ２）並びに非構造タンパク質２（ＮＳ２）をコードする５種の更なるプラスミドの同時発現時に、上澄み液中のウイルス滴定濃度は増加することができた。これらの１２及び１７−プラスミド系の的確な修飾が、トランスフェクションされたプラスミドの数を８に減少するように双方向性ベクトルの実行である。この系により、マイナス鎖ｖＲＮＡ及びプラス鎖ｍＲＮＡを同一プラスミドから合成することができる。
【００２３】
組換えインフルエンザＡウイルスを産生する能力は将来のインフルエンザウイルス研究を容易にはするが、しかし、全部ではないにしろ、ワクチン生産に使用される大部分の細胞系が、逆遺伝学的系に関与するポリメラーゼと、もっとも頻繁に使用される細胞種間の非適合性のために前記の組換えウイルスの複製を許さないか又はほとんど許さないという事実を与えられるので、ワクチン産生において十分に高い滴定濃度まで逆遺伝学的方法により得られる組換えインフルエンザＡウイルスを使用するための実際的解決はまだ見いだされていない。
【００２４】
インフルエンザＡウイルスはマイナス鎖ＲＮＡウイルスである。これは１つの複製周期で３種のＲＮＡ：マイナスのセンスｖＲＮＡ、プラスのセンスｃＲＮＡ及びプラスのセンスｍＲＮＡ、が産生されることを意味する。ウイルスのＲＮＡ（ｖＲＮＡ）と異なり、ｍＲＮＡはキャップをもち、ポリ（Ａ）尾部を有する。ｍＲＮＡのポリ（Ａ）尾部の第１のＡ残基は転写停止／ポリアデニル化シグナルとみなされるゲノム中のＵ残基の短いストレッチと合致する。ポリメラーゼは、それがＵ残基のこのストレッチに到達する時に後方への滑動の反復周期を受け、この方法でｍＲＮＡの全ポリ（Ａ）尾部を形成すると考えられる。
【非特許文献１】Ｔｒａｕｂｅｎｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｌａｙｎｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  Ｖｏｌ．６  Ｎｏ．４  ２００１
【発明の開示】
【００２５】
本発明は異なる種の細胞型に適用することができるインフルエンザウイルスの逆遺伝学的系を提供する。ポリメラーゼＩはリボゾームのＲＮＡを転写する核の酵素であり、増殖している細胞中に豊富に発現される。ｒＲＮＡはｖＲＮＡのようにキャップもポリ（Ａ）尾部ももたず、従ってポリメラーゼＩはｃＤＮＡからのｖＲＮＡの産生のために使用することができる。ポリメラーゼＩによるウイルスのｃＤＮＡの転写は正確な５’及び３’末端を有するＲＮＡのようなウイルスの産生を許す。しかし、ポリメラーゼＩＩの転写機構はしばしば、異なる種からの遺伝子と適合性であるが、ポリメラーゼＩの転写は絶対的ではないが、厳格な種特異性を示す。この種特異性はプロモーターと転写因子の相互作用により、そして程度は少ないが、因子間のタンパク質−タンパク質相互作用において与えられる。１つは、イヌ又はトリのポリメラーゼＩプロモーターのようなヒト以外の細胞種に対するポリメラーゼＩプロモーターがいまだ記載されておらず、そこでは当該産業では、十分に規定されたイヌ（すなわちＭａｄｉｎ  Ｄａｒｂｙ犬の腎臓（ＭＤＣＫ）又はトリ細胞（発育鶏卵繊維芽細胞（ＣＥＦ）がインフルエンザウイルスワクチン産生に頻繁に使用されるために、ポリメラーゼＩに基づく逆遺伝学的系の種特異性は、ワクチン開発に対して主要な欠点である。
【００２６】
本発明はインフルエンザ遺伝子セグメント及びバクアテリオファージポリメラーゼプロモーターを含んでなる核酸又は該核酸の相補鎖を提供する。非セグメント化ウイルスに比較して、Ｔ７ポリメラーゼが作用しないと考えられた明白な例外はインフルエンザウイルスであり、その作製はポリメラーゼ及びクローンしたｃＤＮＡからの核タンパク質に加えて８種のウイルスのＲＮＡの合成の付加的複雑さを伴うことを示すＮｅｕｍａｎｎ及びＫａｗａｏｋａ（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２８７，２４３−２４０，２００１）の所見と反対に、本発明はこのバクアテリオファージ−ポリメラーゼ−に基づく逆遺伝学的方法のためのプラスミドベクトル及びそれらが含有する要素に関して著しい自由度を提供する。例えば、ｖＲＮＡ又はｃＲＮＡ−様ＲＮＡ分子を産生するために我々はバクアテリオファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼを使用したが、バクアテリオファージＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼのような種々の他のＲＮＡポリメラーゼを使用することができる。好ましい態様において、本発明はインフルエンザ遺伝子セグメント及びＴ７プロモーターを含んでなる核酸又は該核酸の相補鎖を提供して、Ｔ７プロモーターの制御下のインフルエンザウイルスの遺伝子セグメントの発現時に本発明の系を基礎にさせる。１つの態様において、ポリメラーゼターミネーターが欠如している。該核酸はプロモーターの隣に１又は２個の更なるグアニン残基を提供されていることが好ましい。ワクチンの目的のためには、ワクチンの目的のためにＷＨＯにより推奨されるインフルエンザウイルスから誘導される遺伝子セグメントを含んでなる本発明に従う核酸が提供される。好ましい態様において、本発明はインフルエンザＡ遺伝子セグメント及びＴ７プロモーターを含んでなる核酸又は該核酸の相補鎖を提供する。双方向性の系においては特に、本発明に従う核酸はＴ７ターミネーターを含まないことが好ましい。ポリメラーゼは好ましくは、ウイルスを発現するプラスミドと一緒にトランスフェクションされる核外遺伝子から発現されるので、本明細書に提供される系は特定の種に限定はされない。Ｔ７ポリメラーゼに基づく逆遺伝学的系は時々、非セグメント化マイナス鎖ウイルスの救済のために使用されるが、バクアテリオファージポリメラーゼ法に基づくセグメント化インフルエンザウイルスに対する逆遺伝学的系はこれまで成功に使用されたことはなかった。ｃＤＮＡを転写するためにＴ７ポリメラーゼを使用する逆遺伝学的系における１つの制約因子は時々、Ｔ７−ポリメラーゼ駆動転写を高めるために転写開始部位にＧ残基を導入することにより克服すること追求されている。このアプローチは例えば、ＲＶ、ＶＳＶ及びＳＶの救済に使用されたが、しかしＺｏｂｅｌ当等（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９４  Ｊｕｌ；２０２（１）：４７７−９；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９３  Ａｕｇ  １１；２１（１６）：３６０７−１４）は、ウイルスポリメラーゼが適当に機能するためには、インフルエンザＡ遺伝学セグメントの５’及び３’の両方が正確に規定される必要があり、従って、転写部位における更なるヌクレオチド付加のための空間を明らかに残さず、転写開始部位にＧ残基の導入を妨げることを教示していることを明記している。
【００２７】
しかし驚くべきことには、本発明の好ましい態様において、Ｔ７プロモーターの隣に少なくとも１個の更なるグアニン残基を提供された本発明に従う核酸が提供され、Ｔ７プロモーターの隣に２個の更なるグアニン残基が提供されることは更に好ましい。更に、本発明はＴ７ポリメラーゼを提供されたＭａｄｉｎ  Ｄａｒｂｙ犬の腎臓（ＭＤＣＫ）又は発育鶏卵繊維芽細胞（ＣＥＦ）を提供する。とりわけ、本発明は本発明に従う少なくとも１種の核酸を提供された細胞を提供する。本発明は１７−プラスミド又は１２−プラスミド又は８−プラスミド系のような多−プラスミド系の使用を容易にし、そして本発明が、更に、好ましくは、本発明に従うインフルエンザ遺伝子セグメントを発現することができる１個又は複数のプラスミドと一緒にトランスフェクションされるプラスミドから発現されるＴ７ポリメラーゼを提供された、本発明に従う核酸をもつ細胞を提供するために、該系は特定の種に限定されない。本明細書には更にＴ７ポリメラーゼが核局在化シグナルを含んでなる、本発明に従う細胞を使用することが提供される。好ましい態様において、本明細書に提供されるような細胞は霊長類以外の細胞であるので、それにより、本発明に従う核酸又は細胞から誘導される細胞物質又はワクチン中への霊長類ＤＮＡの導入を回避する。好ましくは、ＭＤＣＫ細胞又はＣＥＦ細胞が使用される。逆遺伝学的系のためにヘルパーウイルスが不要であり、トランスフェクションにより提供されるすべてのウイルス粒子が所望の核酸を含んでなり、そしてその後のワクチン産生系において面倒なクローン形成法を伴わずに使用することができることが本発明の利点である。本発明はまた、初めて、本発明に従う核酸を含んでなる複製型ウイルス粒子を提供する。米国特許第５，１６６，０５７号明細書においては、複製可能なこのようなウイルス粒子は提供されておらず、セグメント化インフルエンザウイルスにＴ７系を使用する他の試みは本発明まで成功しなかった。本明細書に提供されるような〜１０4のウイルス粒子のウイルス滴定濃度を含む細胞培養物の組成物は、ウイルスが複製を許される時は、＞１０7まで強化することができるトランスフェクション細胞培養物中でウイルス複製せずに容易に得ることができる。本発明に従う粒子の複製はヘルパーウイルスなしに実施されることが特に有用である。本発明に従う細胞から誘導される細胞又は物質あるいは本発明に従うウイルス粒子から誘導されるウイルス又は物質を含んでなる、このような細胞培養物組成物は有利には、インフルエンザウイルスによる被験体の感染に対する免疫学的防御をもたらすことを目的とした製薬学的組成物の生産のために使用することができる。確かに、本明細書に提供されたような細胞は米国特許第５，１６６，０５７号明細書には提供されていなかった。従って本発明はまた、本発明に従う少なくとも１種の核酸を含む細胞を培養する工程を含んでなる、複製型インフルエンザウイルス粒子の産生法を提供する。該方法に使用される少なくとも１種の核酸は少なくとも１種の、しかし好ましくは、７種又は８種のインフルエンザ遺伝子セグメント及びバクアテリオファージポリメラーゼプロモーター又は１種又は複数の該核酸の相補鎖を��んでなることが好ましい。更に、該セグメントはバクアテリオファージポリメラーゼターミネーターを含まず、それにより有利にはこのようなセグメントがプロモーターの隣に少なくとも１個の更なるグアニン残基を提供されているか又はプロモーターの隣に２個の更なるグアニン残基を提供されていることが好ましい。該セグメントは好ましくは、ワクチンの目的のためにＷＨＯにより推奨されるインフルエンザウイルス、例えば、インフルエンザＡ遺伝子セグメントから誘導される。最後に本発明は前記に開示の方法により得ることができる複製型インフルエンザウイルス粒子を提供する。それにより本発明はまた、本明細書に提供されるような組成物をそれを要する被験体に提供する方法を含んでなる、インフルエンザウイルスによる被験体の感染に対する免疫学的遮蔽をもたらすための方法を提供する。このような組成物は好ましくは、ワクチンとして、すなわちウイルス粒子又はこのような粒子から誘導されるウイルスタンパク質（サブユニット−ワクチン）を塩溶液又は補助剤（例えば、アルミニウム塩又は他の一般に使用される補助剤（例えば、ｈｔｔｐ：／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｎｉｐ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｐｉｎｋ／Ａｐｐｅｎｄｉｃｅｓ／Ａ／Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ．ｐｄｆ．参照））のような適当な製薬学的担体と混合することにより調合される。
【実施例１】
【００２８】
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼに基づく逆遺伝学的系を使用する組換えインフルエンザＡウイルスの生成
序文
長い間、インフルエンザＡウイルスの基礎的研究は有効な逆遺伝学的系の利用可能性の欠如により妨げられてきた。マイナス鎖ＲＮＡウイルスのもっとも初期の逆遺伝学法は事実、インフルエンザＡウイルスに対して開発されたが（７、１８）、組換えＤＮＡから独占的のこのウイルスの救済はごく最近達成された（９、２０）。
【００２９】
インフルエンザＡウイルスはマイナス鎖ＲＮＡウイルスである。ウイルス複製周期中に、３種のＲＮＡ：マイナスのセンスゲノムウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）、ゲノムＲＮＡに相補的なプラスのセンスＲＮＡ（ｃＲＮＡ）及び、プラスのセンスメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、が生産される。ｖＲＮＡ及びｃＲＮＡは本質的に非修飾末端を含有するが、ｍＲＮＡはキャップを有し、ポリ（Ａ）尾部を有する（１６）。
【００３０】
ＲＮＡポリメラーゼＩ（ＰｏｌＩ）はリボゾームのＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を転写する核の酵素であり、増殖細胞中で豊富に発現される。ｖＲＮＡのように、ｒＲＮＡはキャップをもたず、ポリ（Ａ）尾部ももたない（２３）。Ｈｏｂｏｍ等（１９、２１、２９）はＰｏｌＩを使用して正確な５’及び３’末端をもつ人工的インフルエンザウイルスｖＲＮＡ−様セグメントを生成するのに成功した。ＰｏｌＩプロモーター−ターミネーターカセットの環境でクローン化されたｃＤＮＡの転写は正確な５’及び３’末端をもつｖＲＮＡ−様分子の生成を可能にした（２９）。ヘルパーインフルエンザウイルスに関与したその後の研究により、これらのゲノムｖＲＮＡ分子を認めることができ、インフルエンザウイルスのポリメラーゼ複合体により複製され、そして子孫のインフルエンザウイルス中にパッケージされることができることが示された。このシステムがウイルス遺伝子セグメント又は更なる遺伝子セグメントの１つに突然変異体を含有するインフルエンザウイルスの生成を許し、従ってウイルス遺伝子及びそれらの製品の研究を可能にした。ヘルパーウイルスの使用の結果として、トランスフェクタントウイルスの選択を必要とし、これがむしろ面倒である。
【００３１】
Ｎｅｕｍａｎｎ等は専らクローン化したｃＤＮＡからのインフルエンザＡウイルスの回収のためのＰｏｌＩ系を考案した。インフルエンザＡウイルスの全長のｖＲＮＡをコードするｃＤＮＡはヒトのＰｏｌＩプロモーターとマウスのＰｏｌＩターミネーター間でクローンされた。原則として、これらの８種のプラスミドの真核細胞へのトランスフェクションは８種すべてのインフルエンザｖＲＮＡの合成をもたらすにちがいない。ヒトの胚腎細胞（２９３Ｔ）をこれらの８種のｖＲＮＡ発現プラスミド及び、ウイルスの核タンパク質を発現するプラスミド及びＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＰｏｌＩＩ）プロモーターからのポリメラーゼタンパク質ＰＢ２、ＰＢ１及びＰＡで同時トランスフェクションした。細胞のＰｏｌＩにより合成されたｖＲＮＡはＲＮＰ中にパッケージされ、上澄み液１ｍｌ当り１×１０３を超える量のプラーク−形成単位の感染性ウイルス（ｐｆｕ／ｍｌ）を回収した。残りのウイルス構築物タンパク質を発現するプラスミドによる同時トランスフェクションがウイルス産生の実質的増加、すなわち３×１０４〜５×１０７ｐｆｕ／ｍｌをもたらした（２０）。Ｆｏｄｏｒ等はインフルエンザＡウイルスの回収のための同様な系を報告した（９）。この系はヒトのＰｏｌＩプロモーターを隣にもつが、ＰｏｌＩターミネーター配列よりむしろ肝炎δウイルスリボザイム（ＨδＶｒｉｂ）配列を含有した、すべての８種のｖＲＮＡのｃＤＮＡをコードする８種のプラスミドに依存した。これらのプラスミドはアデノウイルス２型の主要な最近のプロモーターからＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ及びＮＰタンパク質を発現する４種のプラスミドでＶｅｒｏ細胞中に同時トランスフェクションされた。等量のそれぞれの発現プラスミドを使用して、Ｆｏｄｏｒ等は１０６のトランスフェクション細胞から１〜２個の感染ウイルス粒子の救済率を報告した（９）。我々は組換えインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４を産生するための同様な逆遺伝学的系を考案した。我々は、トランスフェクション細胞培養物中で、ウイルス複製なしに〜１０４のウイルス滴定濃度を得ることができ、それはウイルスが複製を許される時に、＞１０７まで高めることができると結論を出した。これらのＰｏｌＩ駆動系は１２〜１６種のプラスミドの同時トランスフェクションを要したので、高効率でトランスフェクション可能な細胞株の使用が組換えウイルスの効率的な産生のために必要であった。
【００３２】
その後、Ｈｏｆｆｍａｎｎ等は８種のみのプラスミドからのインフルエンザＡウイルスの生成のための双方向性ＰｏｌＩ−ＰｏｌＩＩ転写系を開発した（１２）。この双方向性の系において、ｖＲＮＡのｃＤＮＡをヒトＰｏｌＩプロモーターと最少のマウスＰｏｌＩターミネーター配列間に挿入した。この全カセットをＰｏｌＩＩプロモーターとポリアデニル化サイト間に挿入した。これが単一の構築物からのＰｏｌＩ及びＰｏｌＩＩプロモーターそれぞれからのｖＲＮＡ及びｍＲＮＡの転写を許した。Ｍａｄｉｎ  Ｄａｒｂｙ犬腎（ＭＤＣＫ）細胞とともに同時培養された２９３Ｔ細胞中で、それぞれインフルエンザＡウイルス遺伝子セグメントの１つをコードする８種のＰｏｌＩ−ＰｏｌＩＩプラスミドの同時トランスフェクションが２×１０7ｐｆｕ／上澄み液１ｍｌまでの収率で感染性インフルエンザＡウイルスの回収をもたらした（１２）。ｍＲＮＡ及びｖＲＮＡ双方の合成のための１個の鋳型の使用はウイルス生成に要するプラスミド数を減少させた。この系中のウイルス生成の効率は単方向性（１２〜１６プラスミド）ＰｏｌＩ系のものと同様であることが報告された。
【００３３】
ＰｏｌＩＩプロモーターはしばしば、異種からの転写機構と適合性であるが、ＰｏｌＩプロモーターからの転写は絶対ではなくとも厳格な種特異性を示す。この種特異性はプロモーターとの転写因子の相互作用によりそして、程度は少ないが、これらの因子間のタンパク質−タンパク質相互作用において与えられる（２３）。
【００３４】
ＰｏｌＩ−に基づく逆遺伝学的系の種特異性は主要な欠点を形成する。前記の逆遺伝学的系はヒトＰｏｌＩプロモーターを使用して、組換えウイルスの産生を２９３Ｔ細胞又はＶｅｒｏ細胞のような霊長類発生源の細胞に限定した。ＰｏｌＩプロモーターはヒト、マウス、ラット及びブタを包含する幾つかの種に対して特徴を示されたが（８、１４、１７）、それらは多数の他の動物に対しては未知のままである。イヌ及びトリ細胞はインフルエンザＡウイルスの研究及びワクチン産生に定常的に使用されるが、イヌ及びトリのＰｏｌＩプロモーターはまだ記載されていない。インフルエンザウイルスの逆遺伝学法の自由度を改善するために、我々は普遍的な逆遺伝学的系を開発することを追求した。我々はバクアテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（ｐＴ７）の制御下のインフルエンザＡウイルスの遺伝子セグメントの発現に基づく系を考案することを選択した。バクアテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ｐｏｌ）は転写により、又は安定に修飾された細胞株の使用により細胞に供給することができるために、この系は特定の種からの細胞に限定されない。
【００３５】
Ｔ７ｐｏｌに基づく逆遺伝学的系は非セグメント化のマイナス鎖ウイルスの救済のために使用される。Ｓｃｈｎｅｌｌ等は最初に、クローン化ｃＤＮＡ単独からの非セグメント化のマイナス鎖ウイルスを救済した。ｃＤＮＡクローンは狂犬病ウイルス（ＲＶ）の全長の抗ゲノムＲＮＡをコードすることにより作製された。このｃＤＮＡはＴ７ｐｏｌターミネーター配列（ｔＴ７）の隣にｐＴ７及びＨδＶｒｉｂ配列を有した。Ｔ７ｐｏｌによる転写後、ゲノムの正確な３’末端が３’末端におけるＨδＶｒｉｂ配列の自己消化開裂（ａｕｔｏｌｙｔｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ）により生成される。このプラスミドは、Ｔ７ｐｏｌを発現する細胞に、ｐＴ７の制御下でウイルスのＮタンパク質及びポリメラーゼタンパク質Ｌ及びＰをコードする発現プラスミドで同時トランスフェクションされた。この方法は組換えＲＶの救済をもたらしたが、２×１０7トランスフェクション細胞のうちの約１個からのみであった（２７）。それ以来、非セグメント化ＮＳＶのパラミキソウイルス（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、ラブドウイルス（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）及びフィロウイルス（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）科について同様な系が記載された（１０）。
【００３６】
ｃＤＮＡからの非セグメント化のマイナス鎖ウイルスの有効な回収のためには、マイナスセンスｖＲＮＡでなく、むしろプラスセンス抗ゲノムＲＮＡ（ｃＲＮＡ）が非常にしばしば産生される。裸のマイナスセンスｖＲＮＡ及びウイルスタンパク質をコードするプラスセンスのｍＲＮＡの同時の存在がハイブリッド形成をもたらして、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）へのゲノムの集合を妨げるであろうと考えられる（２７）。マイナス鎖のウイルスは通常、それらが常に、ハイブリッド形成を妨げるＲＮＰ型にそれらのゲノムを維持するためにこの問題に遭遇しない。Ｓｅｎｄａｉウイルス（１５）、ヒトパラインフルエンザウイルス３型（６）及びヒトメタニューモウイルス（１１）の回収がマイナスセンスのゲノムＲＮＡをコードするｃＤＮＡにより報告されているが、効率はプラスセンスＲＮＡによる結果より有意に低かった。この原理はまた、組換えインフルエンザウイルスの救済についても適用された。Ｈｏｆｆｍａｎｎ等（１３）はまた、抗ゲノムのプラスセンスＲＮＡからの組換えインフルエンザウイルス産生の効率を決定した。細胞質中でのみ複製する非セグメント化及びセグメント化のマイナス鎖のウイルスに比較して、インフルエンザＡウイルスは同様な
効率で、ゲノム及び抗ゲノムベクトル双方から救済することができた。
【００３７】
ｐＴ７を使用するウイルス救済系における１つの限定因子は、＋１〜＋３位の残基が転写に影響を与える可能性があることである。ｃＤＮＡの転写がｐＴ７の直接下流の２又は３Ｇ残基の導入により増加させることができることが認められた（２２）。この観察が例えば組換えＲＶ（２７）、水疱性口内炎ウイルス（２８）、呼吸器合胞体ウイルス（３）及びヒトメタニューモウイルス（１１）の救済のために適用されてきた。これらのウイルスに対しては、明らかに、ゲノム末端の一方における更なるＧ残基はウイルス複製に影響を与えなかったが、Ｔ７ｐｏｌ駆動の転写に陽性の効果を有した。
【００３８】
Ｔ７ｐｏｌに基づく系はインフルエンザウイルス逆遺伝学研究（１８）に集中的に使用されてきたが、組換えインフルエンザウイルスのプラスミドに基づく産生は今日まで記載されていない。ここで我々は初めて、組換えインフルエンザウイルスの産生のためのそのようなＴ７ｐｏｌに基づく逆遺伝学的系を記載する。
【００３９】
物質及び方法
細胞及びウイルス
Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ犬腎（ＭＤＣＫ）細胞を１０％ＦＣＳ、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのグルタミン、１．５ｍｇ／ｍｌの重炭酸ナトリウム、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ及び非必須アミノ酸を補給されたＥＭＥＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）中で培養した。２９３Ｔ細胞を１０％ＦＣＳ、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、１０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのグルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム及び非必須アミノ酸を補給されたＤＭＥＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）中で培養した。ＢＳＲ−Ｔ７細胞はＴ７ＲＮＡポリメラーゼを安定に発現する新生児ハムスター腎臓細胞株である。ＢＳＲ−Ｔ７細胞を１０％ＦＣＳ、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのグルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム及び０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｒｅｄａ，オランダ）を補給されたＤＭＥＭ中で増殖させた。発育鶏卵中で複製するようになっており、哺乳動物細胞培養液中では好ましくは、複製することができないインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４を、１０ＩＵ／ｍｌのペニシリン及び１０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補給されたＥｐｉｓｅｒｆ培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）中で増殖されたＭＤＣＫ細胞中で感染の低い多重度において７回通過させた。７回目の通過後、１０８のＴＣＩＤ５０／ｍｌのウイルス滴定濃度を定常的に得た。
【００４０】
２９３Ｔ細胞のトランスフェクション
２９３Ｔ細胞の一過性のリン酸カルシウム−媒介トランスフェクションを本質的に記載の通りに実施した（２４）。５０パーセントの密集単層を得るために、トランスフェクションの前日に、細胞をゼラチン状にした１００ｍｍの直径の培養皿中に入れた。１晩のトランスフェクション後、トランスフェクション培地を、ウイルス産生に対しては２％ＦＣＳ又はすべての他のトランスフェクションに対しては１０％ＦＣＳを補給された新鮮培地で置き換えた。細胞を３０〜７２時間インキュベートし、その後上澄みを回収し、適当な場合には細胞を蛍光染色分析した。プラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，オランダ）をすべての実験において平行にトランスフェクションし、蛍光染色細胞の百分率をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）フロー・サイトメーターで測定して、トランスフェクション効率が９５〜１００パーセントの範囲にあることを確認した。ウイルス含有上澄みを３００×ｇで１０分間の遠心分離により透明にした。上澄み中のウイルス滴定濃度を直接又は１週間未満に対しては４℃で保存時に、又は１週間を超える時は−８０℃で決定した。
【００４１】
ＭＤＣＫ細胞のトランスフェクション
ＭＤＣＫ細胞の一時的トランスフェクションを本質的に前記の通りに実施した（１）。端的には、２４０μｌのＯｐｔｉｍｅｍＩ培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を１０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００に添加し、室温で５分間インキュベートした。この混合物に、Ｏｐｔｉｍｅｍ  Ｉ培地を使用して５０μｌの容量に調整された、意図された量のＤＮＡを添加した。この混合物を室温で２０分間インキュベートした。インキュベート後、ペニシリン及びストレプトマイシンを含まない２００μｌのＭＤＣＫ培養培地（前記参照）を添加し、この混合物を６−ウェルプレート中の懸濁物中の１×１０６ＭＤＣＫ細胞に添加した。５時間のインキュベート後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ペニシリン及びストレプトマイシンを含まない２ｍｌのＭＤＣＫ培養培地中で培養した。１晩のインキュベート後にこの培地を２％ＦＣＳ含有ＭＤＣＫ培養培地と置き換えた。
【００４２】
ＢＳＲ−Ｔ７細胞のトランスフェクション
ＢＳＲ−Ｔ７細胞の一時的トランスフェクションのために、トランスフェクションの前日に６−ウェル培養皿中に４００．０００細胞を入れて、５０〜７０％の密集単層を得た。血清を含まないＤＭＥＭ（２４０μｌ）を１０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００に添加し、室温で４分間インキュベートした。この混合物に血清を含まないＤＭＥＭで５０μｌに調整したＤＮＡを添加し、室温で２０分間インキュベートした。トランスフェクション前に、培地を２ｍｌの血清を含まないＤＭＥＭで置き換えた。インキュベート後、トランスフェクション混合物を細胞に滴下し、３７℃で５時間インキュベートした。トランスフェクション後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ウイルス産生のためには２％ＦＣＳ又はＦＡＣＳ分析のためには１０％ＦＣＳを補給された２ｍｌのＤＭＥＭを添加した。
【００４３】
プラスミド
Ｔ７ｐｏｌをコードする真核細胞発現ベクトル（ｐＡＲ３１２６及びｐＡＲ３１３２）を使用した。プラスミドｐＡＲ３１２６は野生型Ｔ７ｐｏｌをコードするが、プラスミドｐＡＲ３１３２はＴ７ｐｏｌを細胞核に有効に命中にさせる核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含有するＴ７ｐｏｌを発現する。それからインフルエンザＡウイルスのポリメラーゼタンパク質が発現される真核細胞発現プラスミドはマウスのヒドロキシ−メチルグルタリル−補酵素Ａ還元酵素プロモーターのｐＨＭＧ−ＰＢ１、ｐＨＭＧ−ＰＢ２、ｐＨＭＧ−ＰＡ及びｐＨＭＧ−ＮＰを使用する（２５）。
【００４４】
ｐＰｏｌＩ−ＣＡＴ−ＲＴのＨδＶｒｉｂ（２５）はＰＣＲにより増力され（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ）、ｐＳＯ７２のＸｂａｌ−ＢａｍＨＩサイトでクローン化された。ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶにより消化されたｔＴ７配列はｐＳＰ７２−ＨδＶｒｉｂのＢａｍＨＩ−Ｈｐａｌサイトにおいてクローン化されて、ｐＳＰ７２−ＨδＶｒｉｂ−ｔＴ７（ＭＳ２４）をもたらした。ｐＴ７をコードするオリゴヌクレオチドを、導入されたＢｂｓｌサイトに適当な条件でｐＳＰ７２−ＨδＶｒｉｂ−ｔＴ７のＮｄｅｌ−Ｘｂａｌサイトで連結反応させると、ベクトルｐＳＰ７２−ｐＴ７−ＨδＶｒｉｂ−ｔＴ７（ＭＳ２５、図１）をもたらした。インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４のセグメント５からの、ＮＣＲを隣にもつ緑の蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のオープンリーディングフレームを、鋳型としてｐＳＰ−Ｈｕ−ＧＦＰ−Ｍｕ（４）を使用してｐＳＰ７２−ｐＴ７−ＨδＶｒｉｂ−ｔＴ７のＢｂｓｌサイトでクローン化した。このＧＦＰミニゲノムをセンス及びアンチセンス配置双方でクローン化し、ｐＴ７のすぐ下流に０／２／３個のいずれかの更なるＧ残基を含有した（図１）。
【００４５】
ｐＳＰ７２−ｐＴ７−ＨδＶｒｉｂ−ｔＴ７中でインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４の遺伝子セグメントをクローンするためには、ｄｅ  Ｗｉｔ等に記載された（４）双方向性インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４構築物をＰＣＲの鋳型として使用した（第４の３’ヌクレオチドは国立インフルエンザ配列データベースで報告されたインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４配列と対応していた）。Ａａｒｌ制限サイトを含有するプライマーがクローンセグメント１、２、３、４、６、７、８に対して使用され、セグメント５に対しては率直な（ｂｌｕｎｔ）末端連結反応が使用され、遺伝子セグメントは、ｐＴ７後に２個の更なるＧ残基を含有するアンチセンス配置のＢｂｓｌサイトでクローンされた。
【００４６】
双方向性ベクトルｐＳＰ７２−ｐＴ７−ＨδＶｒｉｂ−ｔＴ７−ｐＣＭＶ（ＭＳ６５、図１）はｔＴ７の下流でＣＭＶプロモーター（ｐＣＭＶ）をクローン化して対応する遺伝子セグメントからｍＲＮＡの産生を可能にすることにより産生された。ｐＣＭＶはＡｓｅｌ制限サイトを含有するプライマーを使用してＰＣＲにより増力された。ｐＳＰ７２−ｐＴ７−ＨδＶｒｉｂ−ｔＴ７は一部Ａｓｅｌで消化され、ｐＣＭＶは遺伝子セグメントからのｍＲＮＡの産生のために適当な方向のｔＴ７からの下流で連結反応された。
【００４７】
再度インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４セグメントをクローン化して各双方向性Ｔ７ｐｏｌ駆動インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４構築物を得た。
【００４８】
我々は更に、ｔＴ７がそれから消去された１組の双方向性ベクトルを生成した。これを、知られた酵素による処理のＢａｍＨＩ−ＢｐｅＥＩによるｐＳＰ７２−ｐＴ７−ＨδＶｒｉｂ−ｔＴ７−ｐＣＭＶの消化及び連結反応により実施して、ｐＳＰ７２−ｐＴ７−ＨδＶｒｉｂ−ｐＣＭＶ（ＭＳ９０、図１）を生成した。再度、インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４セグメントをクローン化して各双方向性Ｔ７ｐｏｌ駆動インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４構築物を得た。
【００４９】
すべてのプラスミドを製造会社の指示に従って、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及び３１００Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して配列した。
【００５０】
Ｔ７ｐｏｌに基づく系による組換えウイルスの産生
２９３Ｔ細胞を、前記のように、ＰＲ／８／３４の遺伝子セグメントを含有する単方向性プラスミドそれぞれから５μｇ、それぞれ５μｇの発現プラスミドＨＭＧ−ＰＢ２、ＨＭＧ−ＰＢ１、ＨＭＧ−ＰＡ、ＨＭＧ−ＮＰ及び１５μｇのｐＡＲ３１３２によりトランスフェクションした。あるいはまた、我々はＰＲ／８／３４の遺伝子セグメントを含有する双方向性プラスミドそれぞれから５μｇ及び１５μｇのｐＡＲ３１３２をトランスフェクションした。トランスフェクションの７２時間後に上澄みを回収し、１ｍｌを使用してＭＤＣＫ細胞の密集単層を感染させた。
【００５１】
ウイルス感染及び濃度滴定
播種の前に、ＭＤＣＫ細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１ｍｌの２９３Ｔ上澄みを使用して６−ウェルのプレート中のＭＤＣＫ細胞の密集単層を播種し、感染中に４０μｇのトリプシン（２．５％、Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）を添加した。プレートを３７℃で１時間保存し、ＰＢＳで２回洗浄し、その後、４％ＢＳＡ、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのグルタミン、１．５ｍｇ／ｍｌの重炭酸ナトリウム、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、非必須アミノ酸及び２０μｇ／ｍｌのトリプシン（（感染媒質）を補給された２ｍｌのＥＭＥＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）を添加した。感染３日後に、培養物の上澄みを回収し、細胞の感染の指標としてのＨＡ活性を試験した。前記のようにウイルス滴定を実施した（２６）。端的には、トランスフェクション細胞の上澄みの１０倍連続希釈物を感染媒質中に調製した。播種の前に、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。１００μｌの希釈培養物上澄みを使用して９６ウェルプレート中のＭＤＣＫ細胞の密集単層に播種した。３７℃で１時間後に、細胞を再度ＰＢＳで洗浄し、２００μｌの新鮮な感染媒質を各ウェルに添加した。感染３日後に、培養物の上澄みを個々のウェル中の細胞の感染の指標としてのＨＡ活性を試験した。感染滴定濃度はＳｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒの方法に従って１０回の反復から計算した（２６）。
【００５２】
結果
単方向性のＴ７ｐｏｌに基づく逆遺伝学的系によるＧＦＰミニゲノムアッセイ
ｐＴ７、ＨδＶｒｉｂ及びｔＴ７を含有する単方向性ベクトルを構成した。インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４のセグメント５の非コード領域（ＮＣＲ）を隣にもつＧＦＰオープンリーディングフレームを０、２又は３個の更なるＧ残基をもつセンス（Ｓ）及びアンチセンス（ＡＳ）配置のｐＳＰ７２−ｐＴ７−ＨδＶｒｉｂ−ｔＴ７中でクローンさせた（図１及び別図２及び３）。これらの構築物はそれぞれＳ−０Ｇ、Ｓ−２Ｇ、Ｓ−３Ｇ、ＡＳ−０Ｇ、ＡＳ−２Ｇ及びＡＳ−３Ｇと名付けた。我々はこれらの選択肢のどれが最良の効果をもたらしたかを試験した。
【００５３】
我々はＧＦＰミニゲノム（Ｓ−０Ｇ、Ｓ−２Ｇ、Ｓ−３Ｇ、ＡＳ−０Ｇ、ＡＳ−２Ｇ，ＡＳ−３Ｇ）の１つ、Ｔ７ｐｏｌ発現プラスミド（ｐＡＲ３１３２）及びＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰタンパク質を発現する４種のプラスミド（ｐＨＭＧ−ＰＢ２、ｐＨＭＧ−ＰＢ１、ｐＨＭＧ−ＰＡ、ｐＨＭＧ−ＮＰ）で２９３Ｔ細胞をトランスフェクションした。対照として、我々は、ＧＦＰミニゲノムの複製の欠乏をもたらすにちがいない、ｐＨＭＧ−ＮＰを省いた、同様なトランスフェクションを実施した。トランスフェクションの３０時間後に、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ中の蛍光につき細胞を分析した。結果は図２に示される。左側のパネルから、２個の更なるＧ残基を伴う、アンチセンス配置のＧＦＰミニゲノムのトランスフェクション時に最高の割合のＧＦＰプラス細胞を認めたことを見ることができる。
【００５４】
その他のＧＦＰミニゲノム構築物もまた、ある割合のＧＦＰのプラス細胞をもたらしたが、幾らか少なかった。ＧＦＰプラス細胞の平均蛍光を比較すると（図２、右側パネル）、再度、２個の更なるＧ残基をもつアンチセンス配置のＧＦＰミニゲノムが最大の効力を示した。この実験において、２個の更なるＧ残基をもつセンス配置のＧＦＰミニゲノムがもっとも低い効力を示し、その他の構築物は中間であった。
【００５５】
実験から実験にわたり異なるＧＦＰミニゲノムプラスミド間のＧＦＰ−発現細胞の割合及びＧＦＰ発現のレベルに関しては幾らかの変動を認めたが（データは示されていない）、概括的に、２個の更なるＧ残基を伴うアンチセンス配置のＧＦＰミニゲノムが最大の効力を示したので、この構築物を次の実験のために選択した。
【００５６】
核のＴ７ｐｏｌ発現対細胞質のＴ７ｐｏｌ発現
我々が解決する必要がある可能性がある１つの問題はＴ７ｐｏｌの発現であった。パラミキソウイルスの逆遺伝学に対しては、パラミキソウイルスの複製はまた細胞質内で起るために、望ましい、主として細胞質内で発現されたＴ７ｐｏｌが使用される。インフルエンザウイルスは細胞核内で複製し、従って細胞質内のＴ７ｐｏｌの発現は最良の選択ではないかも知れない。従って我々は、Ｔ７ｐｏｌの細胞質バージョン（プラスミドＡＲ３１２６）又は、核局在化シグナルを含有するＴ７ｐｏｌ（ＮＬＳ、プラスミドｐＡＲ３１３２）のいずれかが使用された時のＧＦＰ発現レベルを比較することを所望した。
【００５７】
この実験の結果は図３に示される。野生型Ｔ７ｐｏｌ発現プラスミドが使用された時は、プラス細胞中の平均ＧＦＰ蛍光は５２１であった。ＧＦＰ発現レベルは核局在化シグナルを含有したＴ７ｐｏｌを使用することにより有意に高めることができた（平均蛍光１１０６）。核局在化シグナルをもつＴ７ｐｏｌ構築物及びそれをもたないＴ７ｐｏｌ構築物双方を合わせると（１：１比、トランスフェクションされたプラスミドの総量を不変に維持）、ＧＦＰ発現の中程度のレベルを認めた（平均蛍光７７５）。広範なＧＦＰミニゲノムプラスミドを使用する多数の独立した実験において、これらの結果は再現可能であり、Ｔ７ｐｏｌの核バージョンを使用すると、ＧＦＰ発現の２〜１０−倍の増加を認めた（データは示されていない）。従って次の実験において、我々は核局在化シグナルを含有するＴ７ｐｏｌを使用した。
【００５８】
一時的Ｔ７ｐｏｌ発現対安定なＴ７ｐｏｌ発現
幾つかのパラミキソウイルスの逆遺伝学的系に対して、Ｔ７ｐｏｌはプラスミドトランスフェクションにより供給されず、Ｔ７ｐｏｌの安定な発現を許す細胞株の使用によって供給された。この目的のために、新生児ハムスターの腎臓細胞（ＢＳＲ−Ｔ７）が利用できる。我々はＢＳＲ−Ｔ７細胞が、次にインフルエンザウイルスポリメラーゼ複合体により複製されて、ＧＦＰ発現をもたらすことができる、インフルエンザウイルスＧＦＰミニゲノムの転写のために使用することができるかを試験した（図４）。
【００５９】
図４から見ることができるように、２９３Ｔ細胞中の高いＧＦＰ蛍光はＴ７ｐｏｌの発現に強度に依存する。ＢＳＲ−Ｔ７細胞において、ｐＨＭＧ−ＮＰプラスミドが省かれたトランスフェクションに比較して、インフルエンザウイルスのポリメラーゼ複合体によるＧＦＰミニゲノムの同時トランスフェクション時には、比較的高いレベルのＧＦＰ発現を認めた。Ｔ７ｐｏｌの核バージョンを発現するプラスミドを添加すると、ＧＦＰ発現は更に高いことを認めた。ＢＳＲ−Ｔ７細胞中のＧＦＰ発現の比較的高いレベルは、Ｔ７ｐｏｌの安定な発現がトランスフェクションによる一時的発現よりもより効果的であることを示唆する。しかし、核のＴ７ｐｏｌがトランスフェクションにより提供される実験は、インフルエンザウイルスの逆遺伝学に対しては野生型Ｔ７ｐｏｌよりむしろ核のＴ７ｐｏｌを発現する安定な細胞株が更により効率的であろうことを示唆する。
【００６０】
単方向性のＴ７ｐｏｌに基づく逆遺伝学的系による組換えウイルスの産生
次にインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４の遺伝子セグメントを組換えインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４の産生のために、ベクトルｐＳＰ７２−ｐＴ７−ＨδＶｒｉｂ−ｔＴ７中でクローン化させた。
【００６１】
インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４の遺伝子セグメントをコードする８種の構築物、ｐＴ７ＰＯＬ（ｐＡＲ３１３２）、ｐＨＭＧ−ＰＢ１、ｐＨＭＧ−ＰＢ２、ｐＨＭＧ−ＰＡ及びｐＨＭＧ−ＮＰで２９３Ｔ細胞をトランスフェクションした。トランスフェクション後、産生ウイルスの複製を許すために、培地にトリプシンを添加した。トランスフェクションの７２時間後、上澄みを回収し、ＭＤＣＫ細胞播種に使用した。播種の３日後、ウイルス複製の指標として、これらのＭＤＣＫ細胞の上澄み上でＨＡ−試験を実施した。ＨＡ−試験は陽性であった。次に２９３Ｔ及びＭＤＣＫ上澄みのウイルス滴定濃度を決定した。２９３Ｔ上澄み中のウイルス滴定濃度は１．６×１０1ＴＣＩＤ50／ｍｌであることが示され、ＭＤＣＫ上澄み中のウイルス滴定は２．０×１０7ＴＣＩＤ50／ｍｌであることが示された。トランスフェクション後に２９３Ｔ細胞にトリプシンを添加しなかった時は、２９３Ｔ細胞及びＭＤＣＫ細胞中に僅かに低いウイルス滴定を得た（データは示されていない）。従って、これは、ＰｏｌＩプロモーターを使用しなかった最初のプラスミドのみの組換えインフルエンザＡウイルスの救済を表わす。
【００６２】
双方向性Ｔ７系
次に我々はｐＴ７の制御下で双方向性逆遺伝学的系を開発することを所望した。ｐＳＰ７２−ｐＴ７−ＨδＶｒｉｂ−ｔＴ７中でｐＣＭＶをクローン化させることによりプラスミドベクトルを産生して、ベクトルｐＳＰ７２−ｐＴ７−ＨδＶｒｉｂ−ｔＴ７−ｐＣＭＶをもたらした（図１）。インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４のセグメント５の非コード領域（ＮＤＲ）を隣にもつＧＦＰオープンリーディングフレームを２個の更なるＧ残基をもつアンチセンス配置におけるｐＳＰ７２−ｐＴ７−ＨδＶｒｉｂ−ｔＴ７−ｐＣＭＶ中でクローン化させた。我々はこのプラスミドがインフルエンザウイルスポリメラーゼ複合体によるミニゲノム複製の必要なしにＧＦＰ発現を引き起こすであろうと期待したので（ｐＣＭＶはミニゲノムに対してセンス配置にある）、我々は更に、ｐＴ７に対してセンス配置にある（従ってｐＣＭＶに対してアンチセンス）ミニゲノム（０のＧ残基）を含有する同様な構築物を作製した。ミニゲノムプラスミドを核Ｔ７ｐｏｌ及びｐＨＭＧ−ＰＢ１、ｐＨＭＧ−ＰＢ２、ｐＨＭＧ−ＰＡ及びｐＨＭＧ−ＮＰを発現するプラスミドと一緒に２９３Ｔ細胞中でトランスフェクションした。３０時間後に細胞をＦＡＣＳにより分析した（図５）。
【００６３】
不完全インフルエンザウイルスポリメラーゼ複合体によるセンスＧＦＰミニゲノム（Ｓ−０Ｇ）のトランスフェクションは非常に低いＧＦＰ発現（図５、右側パネル）を伴い、非常に少ないＧＦＰプラス細胞（図５、左側パネル）をもたらした。完全なインフルエンザウイルスポリメラーゼ複合体の存在下では、〜７％の細胞が〜１２００の平均蛍光を伴い、ＧＦＰプラスであった。アンチセンスＧＦＰミニゲノムプラスミドを使用すると、比較的高い割合の細胞（〜１０％）が完全なインフルエンザウイルスポリメラーゼ複合体の不在下でＧＦＰを発現したが、低いレベルのみであった（平均ＧＦＰ蛍光１８２）。完全なインフルエンザウイルスポリメラーゼ複合体の同時トランスフェクション時には、ＧＦＰを発現する細胞の割合は増加せず、他方細胞１個当りのＧＦＰ発現レベルは有意に増加した（平均ＧＦＰ蛍光１２０５）。従って、この実験から我々は、双方向性発現ベクトルが有用であると結論することができ、ｐＣＭＶからのＧＦＰｍＲＮＡの産生の結果として、インフルエンザウイルスポリメラーゼ複合体の必要なしに、低いレベルのＧＦＰ発現が認められた。注目すべきことには、これは、同様なレベルのＧＦＰ発現をもたらした（〜１９％の細胞が１２８の平均蛍光で発現、データは示されない）、ＡＳ−２Ｇ  ＧＦＰミニゲノムプラスミド単独による２９３Ｔ細胞のトランスフェクションにより確証された。更に、ｐＴ７から転写されたミニゲノムの複製の結果として、インフルエンザウイルスポリメラーゼ複合体の存在下でＧＦＰ発現の増加したレベルが認められた。従って、双方向性ｐＴ７−ｐＣＭＶ発現プラスミドは有用であった。
【００６４】
双方向性のＴ７ｐｏｌに基づく逆遺伝学的系による組換えウイルスの産生
次にインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４の遺伝子セグメントを組換えインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４の作製のためにベクトルｐＳＰ７２−ｐＴ７−ＨδＶｒｉｂ−ｔＴ７−ｐＣＭＶ中でクローン化させた。
【００６５】
インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４の遺伝子セグメントをコードする８種の構築物及びｐＴ７ｐｏｌ（ｐＡＲ３１３２）で２９３Ｔ細胞をトランスフェクションした。トランスフェクション後、産生されたウイルスの複製を許すために培地にトリプシンを添加した。トランスフェクションの７２時間後、上澄みを回収し、ＭＤＣＫ細胞を播種するために使用した。播種の３日後、ウイルス複製の指標としてのＨＡ−試験をこれらのＭＤＣＫ細胞の上澄み上で実施した。ＨＡ−試験は陰性であり、組換えウイルスが回収されなかったことを示した。
【００６６】
ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰ遺伝子を発現するために双方向性ベクトルを使用するミニゲノムリポーターアッセイから、これらのプラスミドからのタンパク質発現は非常に低いという証拠が得られた（データは示されていない）。ｔＴ７配列が転写形態ｐＣＭＶを妨げて、コード遺伝子の低い産生をもたらしたことが仮定された。従って、ｔＴ７配列を省いた新規の双方向性プラスミド（ｐＳＰ７２−ｐＴ７−ＨδＶｒｉｂ−ｐＣＭＶ）が作製された。インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４の遺伝子セグメントを組換えインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４の作製のためにベクトルｐＳＰ７２−ｐＴ７−ＨδＶｒｉｂ−ｐＣＭＶ中でクローン化させた。最初の試みにおいては、再度組換えウイルスは産生されなかった。しかし、トランスフェクションに使用されるプラスミドの量の何かの最適化により、組換えウイルスの産生に成功した。この実験に使用されたプラスミドの量はＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＨＡをコードする構築物それぞれ１０μｇ及びＮＰ、ＮＡ、ＭＡ及びＮＳをコードする構築物、それぞれ５μｇであった。２９３Ｔ細胞中の組換えウイルス滴定濃度は検出不可能であったが、ＭＤＣＫ細胞の次の播種は１．３×１０5ＴＣＩＤ50／ｍｌの初期滴定濃度をもつウイルスをもたらした。
【００６７】
ＭＤＣＫ細胞中のＴ７ｐｏｌ系
Ｔ７ｐｏｌに基づく逆遺伝学的系の普遍的性状の更なる証拠を提供するために、２９３Ｔ細胞でなくＭＤＣＫ細胞中のＧＦＰミニゲノムの複製を試験された。ＢＳＲ−Ｔ７細胞による実験はすでに、Ｔ７ｐｏｌ逆遺伝学的系が霊長類以外の発生源の細胞中で有効であるという証明を提供したが（図４）、ＭＤＣＫはインフルエンザウイルスの研究及びワクチンの生産により広範に利用される。
【００６８】
図６で見られるように、Ｔ７ｐｏｌに基づく逆遺伝学的系はＭＤＣＫ細胞中で有用であることが見いだされた。ＢＳＲ−Ｔ７細胞中での結果（図４）と併せて、これらの実験は、Ｔ７ｐｏｌ逆遺伝学的系が実に、広範な細胞タイプに適用可能な「普遍的」系を表わすことを示す。この実験から、更に、霊長類以外の細胞からの組換えインフルエンザウイルスの産生が今や可能であると結論することができる。
【００６９】
ここで、初めて、我々により２９３Ｔ細胞中にＴ７ｐｏｌに基づく系を使用する組換えインフルエンザＡウイルスＡ／ＰＲ／８／３４（ＭＤＣＫ−適応ＮＩＢＳＣ株）の産生が示された。しかし、これらの方法の使用をインフルエンザＡウイルスＡ／ＰＲ／８／３４に限定する条件はなく、それらは他のセグメント化マイナス鎖ＲＮＡウイルスのみならずまた、Ａ型、Ｂ型及びＣ型すべてのインフルエンザウイルスに適用することができる。これらの方法の使用を２９３Ｔ細胞、ＢＳＲ−Ｔ７細胞及びＭＤＣＫ細胞に限定する条件もなく、Ｔ７ｐｏｌは例えば、組換えウイルスがそのときに産生され得る広範な細胞株のトランスフェクションにより供給することができる。
【００７０】
更に、このＴ７ｐｏｌに基づく逆遺伝学的方法のためのプラスミドベクトル及びそれらが含有する要素に関して著しい自由度が存在する。ここで、ｖＲＮＡ又はｃＲＮＡ−様ＲＮＡ分子を産生するためにバクアテリオファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼが使用されたが、バクアテリオファージＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼのような種々のその他のＲＮＡポリメラーゼも使用することができた。本明細書で示された実験において、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼはＳＶ４０の大型Ｔ抗原の核局在化シグナルを含有するように修飾されたが、ＲＮＡポリメラーゼは種々の他の核ターゲティングシグナル（例えばｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質のもの）を使用して修飾することができる。ここでは、肝炎のデルタウイルスのリボザイム配列が使用されたが、その代わりに他のリボザイム配列を使用することができることが記載されている。最後に本明細書に記載された系はマウスのヒドロキシ−メチルグルタリル−補酵素Ａ還元酵素プロモーター（ｐＨＭＧ構築物）に基づいたインフルエンザウイルスポリメラーゼタンパク質発現ベクトルの使用に依存せず、広範なインフルエンザウイルスからのポリメラーゼタンパク質を使用することができ、広範な発現ベクトルを使用して発現することができた。
【００７１】
引用文献
１．Ｂａｓｉｅｒ，Ｃ．Ｆ．，Ｘ．Ｗａｎｇ，Ｅ．Ｍｕｈｌｂｅｒｇｅｒ，Ｖ．Ｖｏｌｃｈｋｏｖ，Ｊ．Ｐａｒａｇａｓ，Ｈ．Ｄ．Ｋｌｅｎｋ，Ａ．Ｇａｒｃｉａ−Ｓａｓｔｒｅ，ａｎｄ  Ｐ．Ｐａｌｅｓｅ．２０００．Ｔｈｅ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ  ＶＰ３５  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｓ  ａ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ＩＦＮ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ（エボラウイルスＶＰ３５タンパク質はＩ型のＩＦＮアンタゴニストとして機能する）。Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７：１２２８９−９４．
２．Ｂｕｃｈｈｏｌｚ，Ｕ．Ｊ．，Ｓ．Ｆｉｎｋｅ，ａｎｄ  Ｋ．Ｋ．Ｃｏｎｚｅｌｍａ
ｎｎ．１９９９．  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ    ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ（ＢＲＳＶ）  ｆｒｏｍ  ｃＤＮＡ：ＢＲＳＶ  ＮＳ２  ｉｓ  ｎｏｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ，ａｎｄ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＲＳＶ  ｌｅａｄｅｒ  ｒｅｇｉｏｎ  ａｃｔｓ  ａｓ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ＢＲＳＶ  ｇｅｎｏｍｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ｃＤＮＡからのウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）の生成：ＢＲＳＶ  ＮＳ２は組織培養物中のウイルス複製に本質的ではなく、ヒトＲＳＶリーダー領域が機能的ＢＲＳＶゲノムプロモーターとして働く）。Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７３：２５１−９
３．Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｐ．Ｌ．，Ｍ．Ｇ．Ｈｉｌｌ，Ｅ．Ｃａｍａｒｇｏ，Ｈ．Ｇｒｏｓｆｅｌｄ，Ｒ．Ｍ．Ｃｈａｎｏｃｋ，ａｎｄ  Ｂ．Ｒ．Ｍｕｒｐｈｙ．１９９５．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  ｆｒｏｍ  ｃｌｏｎｅｄ  ｃＤＮＡ  ｃｏｎｆｉｒｍｓ  ａｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ５’  ｐｒｏｘｉｍａｌ
ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍ２  ｍＲＮＡ  ｉｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ａ  ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（クローン化ｃＤＮＡからの感染性ヒト呼吸器合胞体ウイルスの産生は遺伝子発現におけるＭ２  ｍＲＮＡの５’近位オープンリーディングフレームからの転写伸長因子に対する本質的な役割を確証し、ワクチン会派圧の可能性を提供する）．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：１１５６３−７．
４．ｄｅ  Ｗｉｔ，Ｅ．，Ｍ．Ｉ．Ｓｐｒｏｎｋｅｎ，Ｔ．Ｍ．Ｂｅｓｔｅｂｒｏｅｒ，Ｇ．Ｆ．Ｒｉｍｍｅｌｚｗａａｎ，Ａ．Ｄ．Ｏｓｔｅｒｈａｕｓ，ａｎｄ  Ｒ．Ａ．Ｆｏｕｃｈｉｅｒ．２００４．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  Ａ／ＰＲ／８／３４  ｆｒｏｍ  ｅｉｇｈｔ  ｃＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（８個のｃＤＮＡフラグメントからのインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４の効率的作製及び増殖）．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ  １０３：１５５−６１．
５．Ｄｕｎｎ，Ｊ．Ｊ．，Ｂ．Ｋｒｉｐｐｌ，Ｋ．Ｅ．Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｈ．Ｗｅｓｔｐｈａｌ，ａｎｄ  Ｆ．Ｗ．Ｓｔｕｄｉｅｒ．１９８８．（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅｕｓ（哺乳動物細胞核にバクアテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼを標的にする方法）．Ｇｅｎｅ  ６８：２５９−２６６
６．Ｄｕｒｂｉｎ，Ａ．Ｐ．，Ｓ．Ｌ．Ｈａｌｌ，Ｊ．Ｗ．Ｓｉｅｗ，Ｓ．Ｓ．Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ，Ｐ．Ｌ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，ａｎｄ  Ｂ．Ｒ．Ｍｕｒｐｈｙ．１９９７．Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ
ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ３  ｆｒｏｍ  ｃＤＮＡ（ｃＤＮＡからの感染性ヒトパラインフルエンザウイルス３型の回収）．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３５：３２３−３２
７．Ｅｎａｍｉ，Ｍ．，Ｗ．Ｌｕｙｔｊｅｓ，Ｍ．Ｋｒｙｓｔａｌ，ａｎｄ  Ｐ．Ｐａｌｅｓｅ．１９９０．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ（インフルエンザウイルスのゲノム中へのサイト特異的突然変異の導入）．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｔ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８７：３８０２−５．
８．Ｆｉｎａｎｃｓｅｋ，Ｉ．，Ｋ．Ｍｉｚｕｍｏｔｏ，Ｙ．Ｍｉｓｈｉｍａ，ａｎｄ  Ｍ．Ｍｕｒａｍａｔｓｕ．１９８２．Ｈｕｍａｎ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ  ｇｅｎｅ：ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｇｅｎｅｓ（ヒトのリボゾームのＲＮＡ遺伝子：転写開始領域のヌクレオチド配列及び３種の哺乳動物の遺伝子の比較）．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  
Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７９：３０９２−６．
９．Ｆｏｄｏｒ，Ｅ．，Ｌ．Ｄｅｖｅｎｉｓｈ，Ｏ．Ｇ．Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ，Ｐ．Ｐａｌｅｓｅ，Ｇ．Ｇ．Ｂｒｏｗｎｌｅｅ，ａｎｄ  Ａ．Ｇａｒｃｉａ−ｓａｓｔｒｅ．１９９９．Ｒｅｓｃｕｅ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ（組換えＤＮＡからのインフルエンザＡウイルスの救済）．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７３：９６７９−９６８２．
１０．Ｇａｒｃｉａ−Ｓａｓｔｒｅ，Ａ．１９９８．Ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｓｔｒａｎｄ  ＲＮＡ  ｖｉｒｕｓｅｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（マイナス−鎖のＲＮＡウイルス：生物工学への適用）．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １６：２３０−５．
１１．Ｈｅｒｆｓｔ，Ｓ．，Ｍ．ｄｅ  Ｇｒａａｆ，Ｊ．Ｈ．Ｓｃｈｉｃｋｌｉ，Ｒ．Ｓ．Ｔａｎｇ，Ｊ．Ｋａｕｒ，Ｃ．Ｆ．Ｙａｎｇ，Ｒ．Ｒ．Ｓｐａｅｔｅ，Ａ．Ａ．Ｈａｌｌｅｒ，Ｂ．Ｇ．ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｏｇｅｎ，Ａ．Ｄ．Ｏｓｔｅｒｈａｕｓ，ａｎｄ  Ｒ．Ａ．Ｆｏｕｃｈｉｅｒ．２００４．Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｌｉｎｅａｇｅｓ  ａ  ａｎｄ  Ｂ  ｆｒｏｍ  ｃｌｏｎｅｄ  ｃＤＮＡ（クローン化したｃＤＮＡからのヒトのメタニューモウイルスの遺伝的系統ａ及びＢの回収）．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７８：８２６４−７０。
１２．Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｅ．，Ｇ．Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｙ．Ｋａｗａｏｋａ，Ｇ．Ｈｏｂｏｍ，ａｎｄ  Ｒ．Ｇ．Ｗｅｂｓｔｅｒ．２０００．Ａ  ＤＮＡ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ  ｆｒｏｍ  ｅｉｇｈｔ  ｐｌａｓｍｉｄｓ（８種のプラスミドからのインフルエンザＡウイルスの作製のためのＤＮＡトランスフェクション系）．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７：６１０８−１３．
１３．Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｅ．，ａｎｄ  Ｒ．Ｇ．Ｗｅｂｓｔｅｒ．２０００．Ｕｎｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｌ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩ  ｔｒａｎｓｃｔｉｐｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ  ｆｒｏｍ  ｅｉｇｈｔ  ｐｌａｓｍｉｄｓ（８種のプラスミドからのインフルエンザＡウイルスの作製のための単方向性ＲＮＡポリメラーゼｌ−ポリメラーゼＩＩ転写系）．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８１：２８４３−７．
１４．Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｙ．，Ｇ．Ｓａｆｒａｎｙ，Ｋ．Ｈｉｓａｔａｋｅ，Ｎ．Ｔａｎａｋａ，Ｙ．Ｍａｅｄａ，Ｈ．Ｋａｔｏ，Ｒ．Ｋｏｍｉｎａｍｉ，ａｎｄ  Ｍ．Ｍｕｒａｍａｔｓｕ．１９９１．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｒｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｍｏｕｓｅ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ  ｇｅｎｅ．Ａ  ｓｙｍｍｅｔｒｙ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ヒト及びマウスのリボゾームのＲＮＡ遺伝子の核プロモーターの構造。種特異的転写の非対称性）．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１８：５５−６７．
１５．Ｋａｔｏ，Ａ．，Ｙ．Ｓａｋａｉ，Ｔ．Ｓｈｉｏｄａ，Ｔ．Ｋｏｎｄｏ，Ｍ．Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，ａｎｄ  Ｙ．Ｎａｇａｉ．１９９６．Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｃＤＮＡ  ｏｒ  ＲＮＡ  ｗｉｔｈ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｏｒ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｓｅｎｓｅ（マイナス又はプラスセンスをもつトランスフェクションされたｃＤＮＡ又はＲＮＡからのＳｅｎｄａｉウイルスの増殖の開始）．Ｇｅｎｅｎ  Ｃｅｌｌｓ  １：５６９−７９．
１６．Ｌａｍｂ，Ｒ．Ａ．，ａｎｄ  Ｒ．Ｍ．Ｋｒｕｇ．１９９６．Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ：ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ（オルソミキソウイルス：ウイルス及びそれらの複製），ｐ．１３５３−１３９５．Ｉｎ  Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ，Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，ａｎｄ  Ｐ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ（ｅｄ．），Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ．
１７．Ｌｉｎｇ，Ｘ．，ａｎｄ  Ｎ．Ａｒｎｈｅｉｍ．１９９４．Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｉｇ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ブタのリボゾーム遺伝子プロモーターのクローン化及び同定）．Ｇｅｎｅ  １５０：３７５−９．
１８．Ｌｕｙｔｊｅｓ，Ｗ．，Ｍ．Ｋｒｙｓｔａｌ，Ｍ．Ｅｎａｍｉ，Ｊ．Ｄ．Ｐａｖｉｎ，ａｎｄ  Ｐ．Ｐａｌｅａｓｅ．１９８９．Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｇｅｎｅ  ｂｙ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ（インフルエンザウイルスによる外来遺伝子の増力、発現及びパッケージング）．Ｃｅｌｌ  ５９：１１０７−１３．
１９．Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｇ，Ｈｏｂｏｍ．１９９５．Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ（インビボのインフルエンザウイルスのプロモーター要素の突然変異分析）．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７６：１７０９−１７．
２０．Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｇ．，Ｔ．Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｈ．Ｉｔｏ，Ｓ．Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｈ．Ｇｏｔｏ，Ｐ．Ｇａｏ，Ｍ．Ｈｕｇｈｅｓ，Ｄ．Ｒ．Ｐｅｒｅｚ，Ｒ．Ｄｏｎｉｓ，Ｅ．Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｇ．Ｈｏｂｏｍ，ａｎｄ  Ｙ．Ｋａｗａｏｋａ．１９９９．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｅｎｔｉｒｅｌｙ  ｆｒｏｍ  ｃｌｏｎｅｄ  ｃＤＮＡｓ（専らクローン化ｃＤＮＡからのインフルエンザＡウイルスの作製）．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６：９３４５−９３５０．
２１．Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｇ．，Ａ．Ｚｏｂｅｌ，ａｎｄ  Ｇ．Ｈｏｂｏｍ．１９９４．ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（インフルエンザウイルスのＲＮＡ分子のＲＮＡポリメラーゼＩ仲介発現）．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０２：４７７−９．
２２．Ｐａｔｔｎａｉｋ，Ａ．Ｋ．，Ｌ．Ａ．Ｂａｌｌ，Ａ．Ｗ．ＬｅＧｒｏｎｅ，ａｎｄ  Ｇ．Ｗ．Ｗｅｒｔｚ．１９９２．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｏｆ  ＶＳＶ  ｆｒｏｍ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ｏｆ  ａ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅ（ｃＤＮＡの転写物からのＶＳＶの感染性欠陥を妨げる粒子）．Ｃｅｌｌ  ６９：１０１１−２０．
２３．Ｐａｕｌｅ，Ｍ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｒ．Ｊ．Ｗｈｉｔｅ．２０００．Ｓｕｒｖｅｒｙ
ａｎｄ  ｓｕｍｍａｒｙ：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｂｙ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩＩ（調査及び要約：ＲＮＡポリメラーゼＩ及びＩＩＩによる転写）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２８：１２８３−９８．
２４．Ｐｅａｒ，Ｗ．Ｓ．，Ｇ．Ｐ．Ｎｏｎａｎ，Ｍ．Ｌ．Ｓｃｏｔｔ，ａｎｄ  Ｄ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ．１９９３．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｔｉｔｒｅ  ｈｅｌｐｅｒ−ｆｒｅｅ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ（一時的トランスフェクションによる高滴定濃度のヘルパーを含まないレトロウイルスの産生）．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：８３９２−６．
２５．Ｐｌｅｓｃｈｋａ，Ｓ．，Ｒ．Ｊａｓｋｕｎａｓ，Ｏ．Ｇ．Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ，Ｔ．Ｚｕｒｃｈｅｒ，Ｐ．Ｐａｌｅｓｅ，ａｎｄ  Ａ．Ｇａｒｃｉａ−Ｓａｓｔｒｅ．１９９６．Ａ  ｐｌａｓｍｉｄ−ｂａｓｅｄ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ（インフルエンザＡウイルスに対するプラスミドに基づく逆遺伝学的系）．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７０：４１８８−９２．
２６．Ｒｉｍｍｅｌｚｗａａｎ，Ｇ．Ｆ．，Ｍ．Ｂａａｒｓ，Ｅ．Ｃ．Ｃｌａａｓ，ａｎｄ  Ａ．Ｄ．Ｏｓｔｅｒｈａｕｓ．１９９８．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ，  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｓ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｉｎｆｌ
ｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（インビトロでインフルエンザウイルス複製をモニターする方法としてのＲＮＡハイブリッド形成、血球凝集アッセイ、感染性ウイルスの滴定及び免疫蛍光測定法の比較）．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７４：５７−６６．
２７．Ｓｃｈｎｅｌｌ，Ｍ．Ｊ．，Ｔ．Ｍｅｂａｔｓｉｏｎ，ａｎｄ  Ｋ．Ｋ．Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ，９９４．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｆｒｏｍ  ｃｌｏｎｅｄ  ｃＤＮＡ（クローンｃＤＮＡからの感染性狂犬病ウイルス）．Ｅｍｂｏ  Ｊ  １３：４１９５−２０３．
２８．Ｗｈｅｌａｎ，Ｓ．Ｐ．，Ｌ．Ａ．Ｂａｌｌ，Ｊ．Ｎ．Ｂａｒｒ，ａｎｄ  Ｇ．Ｔ．Ｗｅｒｔｚ．１９９５．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｅｎｔｉｒｅｌｙ  ｆｒｏｍ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅｓ（独占的にｃＤＮＡクローンからの感染性水泡性口内炎ウイルスの有効な回収）．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：８３８８−９２．
２９．Ｚｏｂｅｌ，Ａ．，Ｇ．Ｎｅｕｍａｎｎ，ａｎｄ  Ｇ．Ｈｏｂｏｍ．１９９３．ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉ  ｃａｔａｌｙｓｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｓｅｒｔ  ｖｉｒａｌ  ｃＤＮＡ（挿入ウイルスｃＤＮＡのＲＮＡポリメラーゼＩ触媒の転写）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２１：３６０７−１４．
【実施例２】
【００７２】
組換えウイルスを関連流行ウイルス（例えばＡ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／９９）のＨＡ及びＮＡ遺伝子を使用して高処理量のウイルス骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）に基づいて（例えば、ワクチン株Ａ／ＰＲ／８／３４から誘導された）前記のように産生した。トランスフェクションによる組換えウイルスの産生後、ウイルスを十分に高い量まで、適当な細胞基質（例えば、卵、ＭＤＣＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞）中で増力する。発育鶏卵中で増殖時には、尿膜腔液を１０００×ｇで１０分間の遠心分離及び０．４５マイクロメーターのフィルターを通る濾過により透明にする。今度はウイルスを４℃で１５０．０００×ｇで１．５時間の遠心分離によりペレットにし、リン酸バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁する。次にウイルスをＰＢＳ中２５％の蔗糖の層上に負荷された２％のデカノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ）で処理し、４℃で２５０．０００×ｇで１．５時間遠心分離する。次にＨＡ及びＮＡタンパク質含有の上部層をＰＢＳに対して透析し、タンパク質調製物の純度及び量をクーマシー（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）ブリリアント・ブルーで染めた１２．５％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを使用して証明した。フェレットを〜１０ミクログラムのＨＡ／ＮＡタンパク質の筋肉内投与により免疫性を与える。所望される場合はワクチン接種はその後の複数回の投与又は補助剤（ＭＦ５９、ＩＳＣＯＭ）を使用して実施することができる。ワクチン接種の前後に収集された血清試料中のＨＡ及びＮＡに対する抗体濃度滴定は赤血球凝集反応抑制アッセイ、ノイルアミニダーゼ抑制アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ウイルス中和アッセイ、等を使用して決定される。ワクチン接種６週間後に、ワクチン投与及び対照動物にインフルエンザウイルスＡ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／９９又は異種のウイルス単離物の１×１０Ｅ５の５０パーセント組織培養物感染量（ＴＣＩＤ−５０）を使用して試験した。投与後、１０日間、毎日、動物から鼻又は咽頭スワブ試料を収集し、感染動物により排泄されたウイルスの量を定量ＰＣＲ分析又はウイルス滴定により決定する。このようにして得られたワクチン誘導免疫を抗体滴定量及び投与ウイルスによる感染に対する予防のレベルを定量することにより確認することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】Ｔ７ｐｏｌ−に基づく逆遺伝学的系に使用される構築物。クローン形成法についての詳細は本文を参照されたい。
【図２】ＧＦＰミニゲノム（０．６μｇ）、Ｔ７ｐｏｌ（０．６μｇ）及びインフルエンザＡウイルスポリメラーゼ遺伝子（各１μｇ）をコードする構築物でトランスフェクションされた２９３Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析。左側パネル：トランスフェクションの３０時間後のＧＦＰプラス細胞の％。右側パネル：ＧＦＰプラス画分中のＧＦＰ発現レベル（平均蛍光）。Ｘ−軸上には記載された数の更なるＧヌクレオチドを含む、センス（Ｓ）又はアンチセンス（ＡＳ）配置いずれかのトランスフェクションされたＧＦＰミニゲノム構築物が示される。黒色棒はインフルエンザＡウイルスポリメラーゼ複合体のすべての４成分（ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰ）同時トランスフェクションを示し、白色棒はｐＨＭＧ−ＮＰ構築物を排除した対照トランスフェクションを示す。
【図３】２個の更なるＧ残基を伴うアンチセンスＧＦＰミニゲノム０．６μｇ、４μｇのインフルエンザＡウイルスポリメラーゼ構築物及び０．６μｇの、野生型Ｔ７ｐｏｌ（Ｃ）、核局在化シグナル（Ｎ）を含有するＴ７ｐｏｌ又は１：１比率（Ｃ／Ｎ）の双方の構築物、のいずれか、でトランスフェクションされた２９３Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析。左側パネル：トランスフェクション３０時間後のＧＦＰプラス細胞の％。右側パネル：ＧＦＰプラス画分のＧＦＰ発現レベル（平均蛍光）。
【図４】２個の更なるＧ残基をもつアンチセンスＧＦＰミニゲノムをコードする構築物０．６μｇ及び４μｇのインフルエンザＡウイルスポリメラーゼ構築物でトランスフェクションされた２９３Ｔ又はＢＳＲ−Ｔ７のＦＡＣＳ分析。細胞のＧＦＰプラス画分中のＧＦＰ発現レベル（平均蛍光）が示される。細胞を核局在化シグナルを含有するＴ７ｐｏｌを発現するプラスミドを伴って又は伴わずに（２９３Ｔ対２９３Ｔ  Ｎ又はＢＳＲ−Ｔ７対ＢＳＲ−Ｔ７  Ｎ）トランスフェクションした。黒色棒はインフルエンザＡウイルスポリメラーゼ複合体の４種すべての成分（ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰ）との同時トランスフェクションを示し、白色棒はｐＨＭＧ−ＮＰ構築物を排除した対照トランスフェクションを示す。
【図５】２個の更なるＧ残基をもつアンチセンスＧＦＰミニゲノム（ＡＳ−２Ｇ）又はセンスＧＦＰミニゲノム（Ｓ−０Ｇ）をコードする０．６μｇの構築物及び０．６μｇの核局在化シグナルによりＴ７ｐｏｌを発現するプラスミド及び４μｇのインフルエンザＡウイルスポリメラーゼ遺伝子を発現するプラスミドでトランスフェクションされた２９３Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析。左側パネル：トランスフェクション３０時間後のＧＦＰプラス細胞の％。右側パネル：ＧＦＰプラス画分中のＧＦＰ発現レベル（平均蛍光）。黒色棒はインフルエンザＡウイルスポリメラーゼ複合体の４種すべての成分（ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰ）との同時トランスフェクションを示し、白色棒はｐＨＭＧ−ＮＰ構築物を排除した対照トランスフェクションを示す。
【図６】２個の更なるＧ残基をもつアンチセンスＧＦＰ３ミニゲノム（ＡＳ−２Ｇ）をコードする０．６μｇの構築物及び０．６μｇの核局在化シグナルによりＴ７ｐｏｌを発現するプラスミド及び４μｇのインフルエンザＡウイルスポリメラーゼ遺伝子を発現するプラスミドでトランスフェクションされた２９３Ｔ細胞及びＭＤＣＫ細胞のＦＡＣＳ分析。左側パネル：トランスフェクション３０時間後のＧＦＰプラス細胞の％。右側パネル：ＧＦＰプラス画分中のＧＦＰ発現レベル（平均蛍光）。黒色棒はインフルエンザＡウイルスポリメラーゼ複合体の４種すべての成分（ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰ）との同時トランスフェクションを示し、白色棒はｐＨＭＧ−ＮＰ構築物を排除した対照トランスフェクションを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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