(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物におけるＩｇＡ腎症のインビトロ検出方法であって、前記ＩｇＡ腎症の検出が、
前記哺乳動物からの細胞外液の試料中におけるＹＢ−１タンパク質および／またはこのフラグメントの少なくとも１つの存在について調べる前記試料の検査；および
ＹＢ−１タンパク質および／またはこのフラグメントの少なくとも１つが前記試料中に存在する場合、前記試料中における前記ＹＢ−１タンパク質およびこのフラグメントの分泌パターンの決定
を含み、
前記フラグメントは、８ｋＤａ、１６ｋＤａ、２３ｋＤａ、２８ｋＤａ、３０ｋＤａ、３２ｋＤａ、３５ｋＤａ、および前記サイズのいずれかの±５ｋＤａの群から選択されるサイズを有する少なくとも１つのフラグメントであり、
ＹＢ−１およびこのフラグメントの少なくとも１つの存在は、前記哺乳動物がＩｇＡ腎症を有することを示す、
前記検出方法。
【請求項２】
分泌パターンの決定が、ＨＰＬＣを用いたフラグメント定量により、またはウェスタンブロッティングを用いたバンド分析により行われる、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
ＩｇＡ腎症についての一連の検定から確立された分泌パターンと決定された分泌パターンとを相関させることをさらに含む、請求項１に記載の検出方法。
【請求項４】
前記試料が、抗体を用いてＹＢ−１タンパク質および／またはこのフラグメントの少なくとも１つの存在を調べるために検査される、請求項１に記載の検出方法。
【請求項５】
ポリクローナル抗体が前記抗体として使用される、請求項４に記載の検出方法。
【請求項６】
モノクローナル抗体が前記抗体として使用される、請求項４に記載の検出方法。
【請求項７】
ヒトが前記哺乳動物として選択される、請求項１に記載の検出方法。
【請求項８】
前記細胞外液が、血液、尿、血漿、および血清からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の検出方法。
【請求項９】
前記細胞外液が尿である、請求項８に記載の検出方法。
【請求項１０】
哺乳動物における悪性腫瘍のインビトロ検出方法であって、前記悪性腫瘍の検出が、
前記哺乳動物からの細胞外液の試料中におけるＹＢ−１タンパク質および／またはこのフラグメントの少なくとも１つの存在について調べる前記試料の検査；および
ＹＢ−１タンパク質および／またはこのフラグメントの少なくとも１つが前記試料中に存在する場合、前記試料中における前記ＹＢ−１タンパク質およびこのフラグメントの分泌パターンの決定
を含み、
前記フラグメントは、８ｋＤａ、１６ｋＤａ、２３ｋＤａ、２８ｋＤａ、３０ｋＤａ、３２ｋＤａ、３５ｋＤａ、および前記サイズのいずれかの±５ｋＤａの群から選択されるサイズを有する少なくとも１つのフラグメントであり、
前記悪性腫瘍は、膵癌、直腸癌、胃癌、結腸癌、乳癌、悪性黒色腫、腎細胞癌、喉頭癌、卵巣癌、前立腺癌、気管支癌などの固形腫瘍からなる群より選択され、
ＹＢ−１およびこのフラグメントの少なくとも１つの存在は、前記哺乳動物が前記悪性腫瘍を有することを示す、
前記検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物における炎症過程および腫瘍疾患の検出のための、細胞によって分泌されるＹボックスタンパク質ＹＢ−１およびこのフラグメントの存在を調べるための細胞外体液の検査方法に関する。本発明はさらに、マーカーとしてのＹＢ−１の使用、ならびにＹＢ−１、ＹＢ−１のポリペプチドフラグメント、およびこれらの組み合わせの検出のためのキットを含む。加えて、本発明は、炎症性プロセスおよび悪性疾患を治療するためであり、ＹＢ−１タンパク質、ＹＢ−１タンパク質のフラグメント、ＹＢ−１タンパク質に対する抗体および／またはＹＢ−１タンパク質のフラグメントに対する抗体を含む医薬組成物を含む。
【背景技術】
【０００２】
先行技術の説明
炎症は、哺乳動物の結合組織および血管によって生じる外部または内因性の炎症刺激に対する生物の反応であり、この目的は、このような刺激を取り除きまたは不活性化すること、および一般的には創傷治癒とも呼ばれる刺激に起因する組織への損傷を修復することである。このような炎症のトリガーは、機械的刺激、例えば、圧力、または異物、他の物理的要因、例えば、電離放射線、ＵＶ光、温度の影響であるが、化学物質、例えば、酸、苛性アルカリ溶液、細菌毒素、アレルゲン、ならびに病原体、例えば、微生物、虫（ｗｏｒｍ）、および昆虫もまたトリガーである。それは、炎症過程および関連する疾患を制御するための適切な治療を可能にするための、このような炎症過程およびこれらの原因の正確の診断を必要とする生物における、このような炎症刺激の変動性のみならず、関連する炎症過程の変動性でもある。
【０００３】
広範な種々の手段が、それぞれの炎症過程に属する疾患を診断するために使用される。例えば、大部分は外部から観察可能である炎症性徴候、例えば、明白な、目に見える、またはさもなければ外部から識別可能な皮膚の発赤、熱、痛み、および膨張の発生に加えて、体液、例えば、血液および尿における種々のマーカーの検査の結果もまた、診断のために使用される。このようなマーカーには、例えば、低分子量無機または有機物質、タンパク質または細胞が含まれてもよい。このような検査の間、血液または尿の中に含まれるマーカー物質は、例えば、血液または尿の中のこれらの正常な分布と比較した不規則性について調べられる。これらの結果は、疾患の種類および原因に関する結論を出すことが可能であり得る。血液写真によって認識することができる疾患の例として、白血病またはプファイファー病、ウイルス感染に言及してもよい。
【０００４】
しかし、外的に認識可能な炎症性徴候および／または血液写真または尿の状態の測定を用いる診断が、疾患の種類または原因に関する正確な診断を確立するために十分ではない炎症性疾患もまた存在する。１つの例としては、炎症性メサンギウム増殖性糸球体腎炎の型であるＩｇＡ腎症に言及してもよい（ＩｇＡＮはＩｇＡ腎炎とも呼ばれる）。この疾患は、患者にとって定期的な透析を必要とする腎不全の最も頻度の高い原因である。明白な診断のために必要とされる指標となる臨床的徴候は、この疾患においては非常に異なっている可能性がある。例えば、指標となる臨床的徴候として働く可能性がある徴候は、持続する顕微鏡的な血尿または肉眼的な血尿の発生である。加えて、血尿にはしばしば、タンパク尿、すなわち、アルブミン、α１グロブリン、およびβグロブリンなどのタンパク質の実質的な量の排出が付随する。指標となる臨床的徴候は、このようなＩｇＡ腎炎の存在を非常に可能性が高いものとするが、診断の最終的な確認は腎生検を必要とし、ここでは、腎臓の組織試料が実験室での検査のために取り出される。このかなり複雑な過程はまた、疾患のさらなる経過に関する情報を提供する可能性があり、および医師が適切な治療についての基礎を作ることを補助する予後パラメーターの決定のために働く（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ  Ｔｈａｉｓｓ  ａｎｄ  Ｒｏｌｆ  Ａ．Ｋ．Ｓｔａｈｌ，Ｄｅｕｔｓｃｈｅｓ  Ａｅｒｚｔｅｂｌａｔｔ，Ｖｏｌｕｍｅ  １９９７，Ｉｓｓｕｅ  ４１，ｐ．Ａ２７０８−Ａ２７１１，Ｏｃｔｏｂｅｒ  １３，２０００）。組織生検を必要とする他の炎症性疾患には、例えば、狼瘡様腎炎、脈管炎、または膜性糸球体腎炎が含まれる。したがって、侵襲的方法、例えば、生検の使用を不必要にする炎症過程または炎症性疾患の経過のより良好な診断および評価のための方法についての強い必要性がなお存在する。
【０００５】
同様の試みが、腫瘍疾患のためになされている。この場合においてもまた、腫瘍負荷の程度および腫瘍の転移の挙動について、部分的にマーカーに基づく検出方法が確立されており、これは、肝細胞癌についてのαフェトプロテイン、または気管支癌についての癌胎児性抗原（ＣＥＡ）およびニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）を検出する。腫瘍の再発は、部分的には、腫瘍マーカーの増加から早期に確立し、その後に腫瘍の程度およびこの局在に関する診断的検査を実施することができる。
【０００６】
したがって、先行技術において、集中的な研究は、上記に述べたような疾患の迅速および明白な診断を可能にする細胞外と細胞内の両方のマーカーについて実行される。例えば、ＤＥ  １００  ３１  １２２  Ａ１は、悪性疾患の診断のために、細胞中における腫瘍の進行のために重要であるタンパク質ＹＢ−１の使用を記載している。本発明は、特に、タンパク質ＹＢ−１が核の中でのみこの機能を発揮することができるという認識をもとにしている。
【０００７】
ＹＢ−１は、このメンバーが、Ｙ−ボックスとも呼ばれる特定の一本鎖または二本鎖核酸セグメントに結合するタンパク質のファミリーに属する。このタンパク質ファミリーのメンバーは、原核生物と真核生物の両方において存在する。これらのタンパク質は、低温ショックに応答して誘導されることが原核生物に対する最初の試験において確立されたので（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，１９９０，Ｖｏｌ．８７，ｐ．２８３−２８７）、これらは「低温ショックタンパク質」と名付けられた。真核生物ＹＢタンパク質は、平均で３５ｋＤａの計算分子量を有し、アルギニンおよびアラニンが豊富な可変性のＮ末端、約７０アミノ酸の高度に保存性のドメイン、ならびにＣ末端領域においてそれぞれ塩基性／芳香族性アミノ酸および酸性アミノ酸を各々有する４個のクラスターの交互の配置からなる。これらのより少ない３５ｋＤａの計算平均分子量にも関わらず、これらのタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいては５０，０００から６０，０００の分子量（ＭＷ）で存在する。Ｃ末端クラスターにおけるこの高度な電荷の違いは、おそらく、ＳＤＳ  ＰＡＧＥにおける異常な泳動の挙動の理由である（Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｋａｒｓｔｅｎ  Ｊｕｅｒｃｈｏｔｔ  Ｈｕｍｂｏｌｄｔ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ  ｚｕ  Ｂｅｒｌｉｎ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １９９９，表題：「Ｕｎｔｅｒｓｕｃｈｕｎｇｅｎ  ｚｕｒ  ｓｕｂｚｅｌｌｕｌａｅｒｅｎ  Ｌｏｋａｌｉｓａｔｉｏｎ  ｕｎｄ  ｚｕ  ｄｅｎ  Ｆｕｎｋｔｉｏｎｅｎ  ｖｏｎ  ＹＢ−１，ｅｉｎｅｍ  Ｙ−Ｂｏｘ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  Ｓａｅｕｇｅｒｚｅｌｌｅｎ」）。すべてのＹＢタンパク質に特徴的である高度に保存性のドメインは、「低温ショックドメイン」ＣＳＤの命名を得たＤＮＡ結合ドメインである。ＹＢ−１タンパク質のアミノ酸配列および核酸配列は、例えば、Ｄｉｄｉｅｒらによる論文（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８８，Ｖｏｌ．８５，ｐ．７３２２−７３２６）の中に記載されている。
【０００８】
ＹＢ−１タンパク質のクラスは、これらのタンパク質のどれが関係のある標的であるかに起因して、種々の機能を発揮する。Ｓ．Ｋ．Ｓｗａｍｙｎａｔｈａｎらによる概説（Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｍａｙ  １９９８，Ｖｏｌ．１２，ｐ．５１５−５２２）において、今日までに知られているこれらのタンパク質の細胞内での種々の機能が記載されている。従って、多くの細胞型において、ＹＢタンパク質は、転写の調節において、クロマチンの修飾において、翻訳の間のＲＮＡのマスキングにおいて、真核生物の酸化還元シグナル経路において、細胞のストレス応答の調節において、および種々の遺伝子の活性化において役割を果たしている。しかし、細胞外プロセスにおけるＹＢ−１タンパク質の関与、または細胞外でのＹＢ−１タンパク質の存在は今日まで知られていなかった。
【０００９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、炎症過程および悪性疾患の細胞において、今日まで細胞内因子としてのみ知られていたタンパク質ＹＢ−１が発現されるのみならず、細胞によって分泌される、すなわち、細胞によって生物の細胞外液に分泌されるという本発明者らの驚くべき結果に基づく。このことは、炎症過程および悪性疾患の診断のためのマーカーとしてこのタンパク質を使用することの可能性を提供する。
【００１０】
したがって、本発明は、哺乳動物における炎症過程または悪性疾患の決定のためのインビトロ処理方法を含み、ここで、この炎症過程または悪性疾患の決定は、哺乳動物からの細胞外液のサンプル中におけるＹＢ−１タンパク質および／またはこの少なくとも１つのフラグメントの存在を調べるための、このサンプルの試験を含む。
【００１１】
炎症過程または悪性疾患の「決定」という用語は、炎症過程または悪性疾患が生物に存在するか否かを確立する操作を含む。炎症過程に関しては、この用語は、特に、何らかの外部または内因性の炎症刺激に対する生物の応答が存在するか否かを確立することである。加えて、炎症性疾患については、この定義はまた、対応する細胞によって体液にそれぞれ分泌されたＹＢ−１全長タンパク質、ＹＢ−１タンパク質のフラグメント、または両方の検出からの炎症過程の種類の決定を含む。さらに、本発明に従う処理方法はまた、この哺乳動物の身体がある炎症の段階を決定するために使用されてもよい。中でも、悪性疾患に関して、転移している腫瘍が存在するか否かを予測することができる。潜在的な腫瘍組織から組織試料を取り出すことの代わりに、本発明に従うインビトロ処理方法は、悪性の転移している腫瘍の疑いを有する患者における迅速および単純な診断を可能にする。
【００１２】
本発明の処理方法は、哺乳動物における炎症過程および悪性疾患の決定のために特に適している。このことは、すべての哺乳動物の身体細胞が、炎症過程または転移している腫瘍疾患においてＹＢ−１およびＹＢ−１のフラグメントを分泌することを意味する。ヒトは、この細胞が炎症過程または悪性疾患においてＹＢ−１およびＹＢ−１のフラグメントを分泌している哺乳動物の例である。このことは、単離された原発性マクロファージによるＹＢ−１タンパク質の分泌について、実施例６において図示的に実証される。ＹＢ−１を分泌する他の細胞型には、メサンギウム細胞、ＢおよびＴリンパ球、腫瘍細胞、例えば、ＨｅｐＧ２細胞、または急性骨髄症におけるＭｏｎｏＭａｃ−６細胞が含まれる。
【００１３】
本発明において説明されるＹＢ−１タンパク質およびＹＢ−１タンパク質のフラグメントは細胞によって分泌され、従って、分泌型ＹＢ−１として存在しているという事実に起因して、細胞外体液中でのＹＢ−１、ＹＢ−１のタンパク質フラグメント、またはこの組み合わせの検出は可能である。体液の取り出しは、例えば、ＩｇＡ腎炎における診断を最終的に確認するために必要とされる、例えば、組織試料の取り出しよりもより簡単である。同時に、本発明のプロセスは、組織試料を取り出すことなく、および事前の腫瘍疾患の位置診断の必要性なしで、疾患の早期診断を可能にする。
【００１４】
本発明に従う「細胞外体液」とは、血液、尿、リンパ液、血漿、血清、汗、鼻分泌物、膣分泌物、創傷滲出物、唾液、膿、精液、糞便、または脳脊髄液をいう。これらの中で、尿、汗、鼻分泌物、膣分泌物、創傷滲出物、唾液、膿、精液、および糞便が単に身体からの分泌の間に収集することができ、またはスメアを調製することによって得ることができる。血液、血漿、血清、リンパ液、および脳脊髄液は、針吸引によって被験体の血管系から得ることができ、ここで、血液は、血液小体を含まない血漿を得るために、取り出し後に遠心分離されなくてはならない。ユーザーのために、尿からのＹＢ−１タンパク質、ＹＢ−１タンパク質のフラグメント、またはこの組み合わせの検出は、炎症過程または悪性疾患を決定するための最も単純および最も迅速な可能性である。次いで、尿は、ＹＢ−１タンパク質、ＹＢ−１タンパク質のタンパク質フラグメント、またはこの組み合わせについて、継続して試験することができる。
【００１５】
図３（実施例２）から見ることができるように、細胞外ＹＢ−１（図３の「ＬＰＳ／上清」列）は、ポリアクリルアミドゲル中でのこのわずかに高い移動度により、核ＹＢ−１（図３の「ＮＥ」列）と区別される（ＹＢ−１の異なるエピトープに対して指向される異なる抗ＹＢ−１抗体を用いる）。この違いは、タンパク質は修飾され、ここで、代替的な分泌経路が検出され、すなわち、ＹＢ−１は細胞のＥＲまたはゴルジ装置によって修飾されないという事実から生じる。加えて、疾患の活性に依存して変化するタンパク質のフラグメントが検出され、これは例えば、活動的なメサンギウム増殖性ＩｇＡ腎炎における２８ｋＤａ、２３ｋＤａ、１６ｋＤａ、および８ｋＤａのフラグメントの検出（図６を参照のこと）、ならびに腫瘍疾患における血清中でのおよそ１６ｋＤａフラグメントの検出の増強を伴う（図１１を参照のこと）。
【００１６】
細胞によって分泌されるＹＢ−１タンパク質が検出される場合、本発明は、細胞からのこの分泌の後またはこの間に、ＹＢ−１タンパク質がより小さなフラグメントに切断されるという事実を利用する。ＩｇＡ腎炎などの炎症性腎疾患において、または腎臓移植拒絶において、より小さなフラグメントが比較的特異的な方法で形成されるので、疾患の活動性は、尿などの体液中でのフラグメントの特異的検出から結論付けることができる。
【００１７】
「分泌パターン」は、ＹＢ−１、このフラグメントおよびこれらの組み合わせの異なる存在から生じる。ウェスタンブロットにおいて５２ｋＤａに存在する全長ＹＢ−１に加えて、８ｋＤａ、１６ｋＤａ、２３ｋＤａ、２８ｋＤａ、３０ｋＤａ、３２ｋＤａ、および３５ｋＤａのサイズを有するより小さなフラグメントが存在する。炎症過程または悪性疾患の経過に依存して、存在するフラグメントの分布および量は変化する可能性がある。さらに、まだ完全には試験されていない炎症または悪性疾患において存在する可能性がある他のＹＢ−１フラグメントを確立することができる。フラグメントのサイズは、利用される検出方法がどのように実施されるかに依存して、上方または下方にわずかに逸脱することがあり得る。したがって、本発明はまた、本発明の実施例において決定されたような分子量から±５ｋＤａまで逸脱する分子量を有するフラグメントを含む。ＹＢ−１およびＹＢ−１のフラグメントは、特に、表１に言及される抗体を用いて検出することができる。
【００１８】
実施例１に記載されるようなウェスタンブロットを用いる全長ＹＢ−１およびＹＢ−１のフラグメントの検出の代替として、分泌パターンの決定もまた、ＨＰＬＣによって行われてもよい。ウェスタンブロッティングに対して比較した場合、ＨＰＬＣは、検出されたフラグメントのより良好な定量を可能にする。ＨＰＬＣおよび他のタンパク質分析の方法に関する詳細は、Ｆ．ＬｏｔｔｓｐｅｉｃｈおよびＨ．Ｚｏｒｂａｓによる書籍「Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋ」（Ｓｐｅｋｔｒｕｍ  Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｍａｙ  １９９８，１ｓｔ    Ｅｄｉｔｉｏｎ．ＩＳＢＮ  ３−８２７４−００４１−４）において見い出すことができる。タンパク質分析において使用される他の方法は当業者に公知である。例えば、ビウレットアッセイ、ローリーアッセイ、ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡアッセイ）、ブラッドフォードアッセイなどの染色試験；ＵＶおよび蛍光測定に加えて、放射活性標識、タンパク質のヨウ素化および質量分析を含む分光法；酵素試験；および免疫学的検出技術；クロマトグラフィー分離法；電気泳動法；キャピラリー電気泳動；配列分析；ならびにＸ線構造分析にを挙げることができる。
【００１９】
例えば、今日までに尿中での８ｋＤａ、１６ｋＤａ、および２３ｋＤａのサイズのフラグメントの存在を伴うＹＢ−１分泌パターンは、腎小体におけるメサンギウム細胞の炎症に付随する疾患において独占的に観察されてきた。腎臓移植の範囲内では、単球およびリンパ球の特徴的な細胞浸潤物が顕著な量のＹＢ−１を発現することが、免疫組織学によって検出されてきた。尿における分泌パターンおよびＡＴＰおよびＬＰＳ刺激の際のＭＭ−６細胞を用いる結果に起因して、炎症性細胞は、拒絶反応の間にＹＢ−１およびこのフラグメントを分泌し、したがって、これらは尿中で検出可能であることを、考慮することができる。
【００２０】
全長ＹＢ−１および３０ｋＤａ  ＹＢ−１フラグメントは、健常な被験体の血清中で顕著な量で検出することができる。異なる転移している腫瘍疾患を有する患者の血清は、全長ＹＢ−１タンパク質に対して指向されるポリクローナル抗体を用いて、およびモノクローナル抗体を用いてウェスタンブロットによって検査される場合、１６ｋＤａのＹＢ−１フラグメントのバンドが、試験されるすべての腫瘍患者においてさらに検出可能である（ｎ＝１５；図１１）。この１６ｋＤａフラグメントは、試験された３名の健常被験体および敗血症患者Ｓ２においては検出することができなかった。同様の結果は、全長ＹＢ−１に対する異なるポリクローナル抗体を用いても得られた。
【００２１】
したがって、本発明の処理方法は、サンプル中のＹＢ−１タンパク質およびこのフラグメントの分泌パターンを決定するために上記の検査において得られる検査結果の評価を含む。炎症過程の型およびこのような炎症過程が存在する段階に依存して、切断によって得られた細胞外ＹＢ−１の個々のタンパク質フラグメントの量およびサイズは、他の炎症過程において形成されるＹＢ−１の個々のタンパク質フラグメントのサイズ分布と明確に区別される。従って、図９（実施例５）において見ることができるように、腎臓移植の際の拒絶反応におけるＹＢ−１およびこのタンパク質フラグメントの「分泌パターン」は、図６および７（実施例４）に表されるようなＩｇＡ腎炎におけるＹＢ−１分泌パターンと明確に区別される。このことは、本発明に従うプロセスのユーザーが、ＹＢ−１およびＹＢ−１タンパク質フラグメントの分布から、炎症性疾患の種類、この原因、およびこの段階を決定可能であることを意味する。したがって、本発明のプロセスは、炎症過程についての一連の検定から確立された分泌パターンと、以前に決定された分泌パターンを比較する工程をさらに含む。これによって決定された分泌パターンは、常に、全長ＹＢ−１タンパク質それ自体を含む。一連の検定は、実施例４、５および７において例示的な様式で例示されるように、異なる患者に対する複数の測定から確立することができる。
【００２２】
図８において、ＩｇＡ腎炎を有する患者において、ＹＢ−１尿診断から、低分子量バンドの消失後の期間にわたって、腎機能が正常に戻ることを見ることができる。例えば、低分子量バンドの検出に基づいて、免疫抑制についての処理の決定を導き出すことができる。加えて、血清中の１６ｋＤａフラグメントの検出は、腫瘍疾患の経過の診断または評価を可能にする（図１１、実施例７）。
【００２３】
図６および７に示される結果は、分泌パターンが異なる患者においてほぼ同一に見られることを明確にする。図６は、２名の患者の検査の結果を示し、この両方がＩｇＡ腎炎の進行する経過を示す。これらの患者についてのＹＢ−１分泌パターンはまた、５２ｋＤａの全長ＹＢ−１に加えて、ゲル中で２８ｋＤａ、２３ｋＤａ、１６ｋＤａ、および８ｋＤａのフラグメントによって特徴付けられる。本発明の説明の範囲内で述べられるｋＤａ値は、ゲル中のバンドの位置に合致することが言及されてもよい。図７において、生検で確認されたＩｇＡ腎症を有する１２名の患者からの自然発生的な尿を用いたＹＢ−１についての尿検査の結果を示した。患者のデータは、ゲルに適用されるときの血清クレアチンのレベルによって分類し、２年後のクレアチン濃度の経過を提示する。２３ｋＤａ、１６ｋＤａ、および８ｋＤａのサイズを有するより小さなフラグメントが全長ＹＢ−１タンパク質および２８ｋＤａフラグメント（レーン１０および１１）に加えて存在する分泌パターンは、義務的な透析を伴う末期腎不全までの疾患の進行に付随する。したがって、疾患の既知の経過を有する患者に対するこのような測定によって確立されたＹＢ−１についての分泌パターンは、他の患者におけるこのような炎症過程の決定のための一連の検定として使用することができる。
【００２４】
図９（実施例６）における結果からさらに見ることができるように、炎症過程、本実施例においては臓器拒絶の検出のためのマーカー物質としてのＹＢ−１タンパク質およびこのフラグメントの検出は、おそらく、従来的に使用されているマーカーを用いる検出よりも明らかにより初期の症状に適用可能である。図９から見ることができるように、２６ｋＤａにおけるより小さなＹＢ−１タンパク質フラグメントは、拒絶反応の初期のマーカーとして利用されているグランザイムＢまたはＭＩＧの濃度の上昇の前に、すでに患者Ａにおいて見ることができる。ここで使用したモノクローナル抗体（ＡＢ  ４）は言及したフラグメントを認識する。
【００２５】
実施した実験の結果はまた、ＩｇＡ腎炎におけるような、腎臓における炎症過程における本発明の方法の適用が、炎症過程のより正確な診断のために、腎臓疾患において通常再発されるタンパク尿の程度とは独立しているという結論を可能にする。従って、本発明は、哺乳動物生物における炎症過程および悪性疾患の診断のために有効な早期警戒システムを表す。
【００２６】
細胞外に存在するＹＢ−１タンパク質、ＹＢ−１タンパク質の少なくとも１つのフラグメント、またはこの組み合わせの検出は、当分野において公知の方法によってもたらされる。これらには、例えば、染色試験、酵素活性試験、免疫学的方法および分光法を用いるタンパク質検出が含まれる。これらの技術の概観は、例えば、Ｆ．ＬｏｔｔｓｐｅｉｃｈおよびＨ．Ｚｏｒｂａｓによる書籍「Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋ」（Ｓｐｅｋｔｒｕｍ  Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｍａｙ  １９９８，１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＩＳＢＮ  ３−８２７４−００４１−４）において見い出される。例えば、抗体を用いる免疫学的検出は、ＹＢタンパク質を検出するために適切である。含まれるタンパク質のウェスタンブロッティングによる分離後、例えば、尿中で、全長ＹＢ−１タンパク質の異なるセグメントに対して指向されるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が使用され、したがってこれはまた、ＹＢ−１のタンパク質フラグメントの検出のために使用されてもよい。抗体を用いるＹＢ−１およびこのフラグメントの検出は、この免疫学的検出が非常に特異的および非常に高感度であるため有利である。先行技術においては、例えば、ＤＥ  １００  ３１  １２２  Ａ１においては、細胞内ＹＢ−１タンパク質に対して指向される抗体が記載され、これは、組織試料からの細胞の溶解後においてのみ、免疫学的検査に利用可能になる。
【００２７】
本発明の処理方法は、特に、哺乳動物生物における炎症過程の決定のために適している。このような炎症過程は、移植または炎症性疾患の後の拒絶反応であり得る。炎症性疾患は、腎臓疾患、喘息、慢性閉塞性肺疾患、関節リウマチ、脈管炎、糖尿病、癌、白血病、敗血症、膵炎、多発性硬化症、乾癬、および皮膚炎からなる群より選択される。この段階に依存して、各々の疾患は、ＹＢ−１、ＹＢ−１タンパク質フラグメントまたはこの組み合わせについての特異的分泌パターンに起因する。このプロセスは、特に、腎臓疾患の決定のために適切である。
【００２８】
腎臓疾患は、糸球体腎炎、特に、ＩｇＡ腎炎、間質性腎炎、腎盂腎炎、狼瘡様腎炎、放射能による腎炎、血管性腎症、および嚢胞腎からなる群より選択される。以下の実施例において例示的な様式で議論されるはずである、異なる疾患（例えば、ＩｇＡ腎炎および臓器拒絶）、ＩｇＡ腎炎などの疾患の異なる段階における異なる分泌パターンの例は、実施例から明らかになる。
【００２９】
実施例に示されるように、本発明の処理方法はまた、悪性疾患の決定のために適切である。このような悪性疾患には、膵癌、直腸癌、胃癌、結腸癌、乳癌、悪性黒色腫、腎細胞癌、喉頭癌、卵巣癌、前立腺癌、気管支癌などの固形腫瘍からなる群より選択される腫瘍、ならびに急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、および慢性リンパ性白血病などの白血病が含まれる。
【００３０】
本発明はさらに、哺乳動物における炎症過程を決定するためのＹＢ−１または少なくとも１つのこのフラグメントまたはこの組み合わせの使用を含む。ＹＢ−１の分泌がすべての種類の炎症過程および悪性疾患において観察することができるという事実に起因して、ＹＢ−１または少なくとも１つのこのフラグメントまたはこの組み合わせは、哺乳動物の身体中における炎症および悪性疾患のためのマーカーとして特に適切である。特に、特異的抗体／抗原結合を利用する免疫学的技術が、ＹＢ−１タンパク質または少なくとも１つのこのフラグメントまたはこの組み合わせの検出のために適切である。
【００３１】
ＹＢ−１タンパク質、少なくとも１つのこのフラグメントまたはこの組み合わせの検出のために、本発明はまた、哺乳動物における炎症過程の決定のために働く検出キットを提供する。この検出キットは、ＹＢ−１タンパク質および／またはこの少なくとも１つのフラグメントの検出のために適切な少なくとも１種の抗体を含む。この検出キットを用いて、ＹＢ−１の分泌パターンが確立され、炎症過程または悪性疾患についてに既存の一連の検定と比較される。この炎症過程または悪性疾患の早期診断および決定は、患者のための適切な治療が早期に開発されることを可能にする。
【００３２】
タンパク質ＹＢ−１の検出のための手段は抗体を含み、ここで、この抗体は、ＹＢ−１タンパク質またはこのフラグメントの少なくとも１つの抗原決定基に特異的に結合することができるモノクローナル抗体とポリクローナル抗体の両方であり得る。本発明のプロセスのために適切な抗体は表１に示される。これらの抗体には、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、およびＩｇＤ抗体が含まれるがこれらに限定されない。このようなキットは、これらの抗体の保存のための緩衝剤およびタンパク質分解性分解から抗体を保護する試薬両方を含んでもよい。
【００３３】
ＹＢ−１タンパク質およびＹＢ−１タンパク質のフラグメントが細胞によって分泌されるという驚くべき結果に起因して、他の細胞因子または受容体との、分泌型のＹＢ−１タンパク質またはこのフラグメントの相互作用に基づく、可能性のある医学的応用が生じる。したがって、本発明はさらに、ＹＢ−１タンパク質、ＹＢ−１タンパク質のフラグメント、ＹＢ−１タンパク質に対する抗体、および／またはＹＢ−１タンパク質のフラグメントに対する抗体を含む群から選択される薬剤を含む、炎症過程または悪性疾患の治療のための医薬組成物を含む。
【００３４】
本発明者らは、分泌型ＹＢ−１が、パラクリン効果およびオートクリン効果によって炎症過程および細胞増殖に影響を与えることを見い出した。従って、本発明者らは、いくつかの実験において、ＹＢ−１がＮＯＴＣＨファミリーの受容体に結合することを示すことができた。ＮＯＴＣＨ受容体は、細胞中の多くの分化プロセス、例えば、筋発生または造血の間の幹細胞集団の分化などの調節に関与する膜貫通受容体のファミリーである。加えて、Ｔ細胞中のＮＯＴＣＨ−１受容体の活性化ヒトバリアントの抗アポトーシス効果が知られており、これによって、特定の細胞集団の発生が調節される。炎症誘発性刺激（ＴＮＦ−α／細菌リポポリサッカリド）の影響下での免疫担当細胞の活性化におけるＮＯＴＣＨ依存性シグナル経路とＮＦ−κＢ依存性シグナル経路の間のいくつかの関連性が確立された。組換えＹＢ−１を適用することによって、ＹＢ−１の活性は増強することができ、例えば、神経皮膚炎（ｎｅｕｒｏｄｅｒｍｉｔｉｓ）などの増殖性疾患において重要である細胞分化を開始することができる。細胞の増殖およびこれによって達成される分化を阻害することができる。対照的に、分泌型ＹＢ−１を結合する抗体の適用は、炎症性細胞の補充（単球／マクロファージの移動）を阻害することができる。このことは、例えば、移植における拒絶反応を回避するために、しかしまた、冠状動脈介入およびステント挿入の際に、アテローム性動脈硬化症または内膜過形成の予防において所望される。他の応用は、細胞の分化が増殖の阻害をもたらす腫瘍疾患の治療に関連する。
【００３５】
従って、本発明者らは、ケラチノサイト培養を用いる実験において、ＹＢ−１およびＹＢ−１に対する抗体が細胞の分化に影響を与えることを示すことができた（実施例８）。さらに、ＹＢ−１がＴＧＦ−β結合タンパク質（ＬＴＢＰ）に結合し、これによって、ＴＧＦ−βなどのさらなる炎症性メディエーターの放出を引き起こすことを示すことができた。
【００３６】
したがって、本発明はまた、好ましくはモノクローナル抗体を含む医薬組成物に関し、モノクローナル抗体がキメラ化またはヒト化される場合に、医学的応用のために特に利点がある。ヒト化抗体は、対応する非ヒト化抗体よりも低い免疫原性効果を有する。ヒト化において、抗原結合部位を伴う可変ドメインのみまたは超可変ドメインのみのいずれかが非ヒト起源であり、他のヒト抗体骨格に導入される。キメラ化抗体またはヒト化抗体の調製のための広範な種々の実験が先行技術において公知である（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８５，Ｖｏｌ．８１，ｐ．６８５１；Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８５，Ｖｏｌ．３１４，ｐ．４５２；Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，８１６，５６７；Ｔｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８３，Ｖｏｌ．８０，ｐ．７３０８−７３１２；Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，１９８３，Ｖｏｌ．４，ｐ．７２７９；Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．Ｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９９，Ｖｏｌ．２３１  （１−２）  ，ｐ．１１−２３）。
【００３７】
本発明において使用されるモノクローナル抗体は、表１に表されるハイブリドーマ細胞株から調製されるモノクローナル抗体の群から選択される。受入番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２７０３を有するハイブリドーマ細胞株のモノクローナル抗体が好ましい。
【００３８】
医薬組成物の特に好ましい実施形態において、抗体、ＹＢ−１タンパク質、ＹＢ−１タンパク質のフラグメント、またはこの組み合わせは、生物学的に適合可能な移植物上に固定化される。例えば、腸吻合またはヘルニア修復による創傷治癒は、可能な限り高いコラーゲン発現が付随する。移動細胞、例えば、マクロファージの分化、および常在のおよび移動している線維芽細胞とのこの相互作用は、細胞の表現型およびコラーゲンの発現パターンに影響を与える。本発明の抗体または組換えＹＢ−１で生物学的に適合可能な材料をコーティングすることによって、創傷治癒は、直接的に影響を受けることができる。このような生物学的に適合可能な移植物は、ほんの少し例を挙げるだけでも、プラスチックネット、創傷プラスター、ヒドロキシアパタイトまたはポリカプロラクトンの骨格を含む群から選択することができる。
【００３９】
本発明の医薬組成物は、炎症過程および悪性疾患の治療のために特に適切であり、ここで、この炎症過程は、移植または炎症性疾患の際の哺乳動物の拒絶反応であり得る。
【００４０】
この炎症性疾患は、腎臓疾患、喘息、慢性閉塞性肺疾患、内膜過形成、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、脈管炎、糖尿病、敗血症、膵炎、多発性硬化症、乾癬、大腸炎、および皮膚炎であり得る。
【００４１】
この悪性疾患は、膵癌、直腸癌、胃癌、結腸癌、乳癌、悪性黒色腫、腎細胞癌、喉頭癌、卵巣癌、前立腺癌、気管支癌などの固形腫瘍、ならびに急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、および慢性リンパ性白血病などの白血病であり得る。
【００４２】
この腎臓疾患は、糸球体腎炎、特にＩｇＡ腎炎、間質性腎炎、腎盂腎炎、狼瘡様腎炎、放射能による腎炎、血管性腎症、および嚢胞腎であり得る。
【００４３】
本発明の医薬組成物は、経口使用のために適切な型、例えば、錠剤、カプセル、水性もしくは油性溶液、懸濁液、またはエマルジョンで投与されてもよく；経粘膜的および経皮的使用を含む局所的使用のために、これは、例えば、クリーム、軟膏、ゲル、水性もしくは油性溶液または懸濁液、軟膏、またはプラスターの型で投与されてもよい。これはまた、吸入によって、例えば、エアロゾルとして投与されてもよい。これは、同様に、非経口的使用（静脈内、皮下、筋肉内、血管内、または注入を含む）のために、例えば、水性もしくは油性溶液または懸濁液として適切である。炎症過程または悪性疾患の部位が正確に位置決めできる場合、投与の適切な方法は、この部位におけるこの医薬組成物を含む溶液の直接的注射であり得る。
【００４４】
一般的に、本発明の医薬組成物は、当業者に公知の標準的な技術を使用して通常の賦形剤（媒体）を用いて慣用的に製剤化される。
【００４５】
本発明の医薬組成物の経口投与のために、これは、錠剤、カプセルの型で、または水性溶液または懸濁液として提供される。
【００４６】
経口使用のための錠剤は、医薬的に許容される賦形剤、例えば、不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、充填剤、流動促進剤、甘味料、香料、着色料、および保存剤とともに混合された活性成分を含んでもよい。適切な不活性希釈剤には、炭酸ナトリウムまたは炭酸カルシウム、リン酸ナトリウムまたはリン酸カルシウム、およびラクトースが含まれる。適切な崩壊剤には、例えば、デンプンおよびアルギン酸が含まれる。結合剤には、例えば、デンプンおよびゼラチンが含まれ、一方流動促進剤には、存在する場合、ステアリン酸マグネシウム、セバシン酸、または獣脂が含まれる。所望される場合、錠剤は、例えば、胃腸管における吸収を遅らせるために、モノステアリンまたはグリセロール１，３−ジステアリン酸のような物質でコーティングされてもよい。経口使用のためのカプセルには、活性薬学的成分が固体希釈剤と混合される固形ゼラチンカプセル、および本発明の薬学的成分が水または油、例えば、ピーナッツオイル、流動パラフィン、またはオリーブ油と混合されるソフトゼラチンカプセルが含まれる。本発明の医薬組成物の筋肉内、腹腔内、皮下、または静脈内使用のために、これは、適切なｐＨおよび等張性に調整された滅菌水溶液または懸濁液として一般的に提供される。適切な水溶性キャリアには、リンガー液および等張性塩化ナトリウムなどのアジュバントが含まれる。水性懸濁液には、セルロース誘導体、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン−２−オンおよびトラガカントなどの懸濁剤、ならびにレシチンなどの湿潤剤が含まれてもよい。適切な保存剤には、例えば、エチルおよびｎ−プロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸が含まれる。
【００４７】
（実施例）
下記において、実施例で使用される抗体を表に要約する。特に、抗体が、全長ＹＢ−１タンパク質のどの部分に対して作用するか、またはＹＢ−１タンパク質のどのフラグメントに対して作用するかが示される。
【００４８】
【表１】
0005466822.tif 000002
【実施例１】
【００４９】
リポポリサッカリド（ＬＰＳ）を用いる単球細胞株ＭＭ−６の刺激の際の分泌型ＹＢ−１およびこのフラグメントの検出
ＭＭ−６単球細胞からの微小胞の回収およびＹＢ−１の検出
ＭＭ−６単球細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンおよび１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリン−Ｇを含有するＲＰＭＩ  １６４０培地中の懸濁培養として増殖させる。リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中での洗浄操作後、細胞を、リプミン（Ｌｉｐｕｍｉｎｅ）（商標）（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＧｍｂＨ，Ｐａｓｃｈｉｎｇ，Ａｕｓｔｒｉａ）を含有し、ＦＣＳ添加なしのＲＰＭＩ培地中に取り、および計数する。エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）容器中で、２×１０６  ＭＭ−６細胞を、ＬＰＳおよびアデノシン三リン酸（１ｍＭ）（両方ともＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡより）とともに、図１および２に述べた濃度にて、３７℃で４時間インキュベートする。続いて、細胞を含む培地を、細胞を沈殿させるために３３０×ｇで１０分間遠心分離し、次いで、上清を２２００×ｇで１５分間再度遠心分離する。２回目の遠心分離後の上清を、タンパク質（微小胞を含む）の沈殿のために氷冷トリクロロ酢酸と混合し、−２０℃で一晩保存し、続いて３３，０００×ｇで３０分間の遠心分離および上清の廃棄を行う。ペレットを氷冷非変性エタノール（７０％）で１回洗浄し、真空遠心分離で乾燥させる。
【００５０】
続いて、乾燥した沈殿物を２５μｌの蒸留水中に取る。２５μｌの変性緩衝液の添加後、これをＳＤＳポリアクリルアミド（ＳＤＳ−ＰＡ）ゲル（１２．５％）中の電気泳動によって分離し、ＹＢ−１およびＹＢ−１のフラグメントを、「抗体検出」の項目（Ｍｅｒｔｅｎｓ  Ｐ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ，１９９９，Ｖｏｌ．１０，ｐ．２４８０−２４８７）において以下に言及される抗体を用いて、ウェスタンブロッティングにおいて検出する（以下を参照のこと）。全長ＹＢ−１（５２ｋＤａ）に加えて、３５ｋＤａ、３２ｋＤａ、２８ｋＤａ、および１６ｋＤａのサイズを有するＹＢ−１のフラグメントもまた検出した。
【００５１】
ウェスタンブロット分析
利用した溶液：
下部（分離）ゲル緩衝液（４×）：１．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．８
アクリル／ビスアクリル（３０％）：２９．２ｇ  アクリルアミド、０．８ｇ  ビスアクリルアミド、７０ｍｌ  Ｈ２Ｏ
上部（濃縮）ゲル緩衝液（４×）：０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ６．８
ＳＰＳ（１０％）：９０ｍｌのＨ２Ｏ中１０ｇのＳＤＳ
ＡＰＳ（１０％）：９ｍｌのＨ２Ｏ中１ｇのペルオキソ二硫酸アンモニウム
電気泳動緩衝液（１０×）：３０ｇのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１４４ｇのグリシン、１０ｇのＳＤＳを、Ｈ２Ｏで１０００ｍｌにし、全体をｐＨ  ８．３に調整
サンプル緩衝液（４×）：２．４ｍｌのＨ２Ｏ、２．４ｍｌの下部ゲル緩衝液、２．０ｍｌのグリセロール、２．０ｍｌのＳＤＳ（１０％）、２００μｌのブロモフェノールブルー溶液（１％）、４０μｌのＥＤＴＡ溶液（０．５Ｍ）、１ｍｌのβ−メルカプトエタノール
転写緩衝液：３．０３ｇのトリズマベース、１４．４ｇのグリシン、２００ｍｌのメタノールを、Ｈ２Ｏで２０００ｍｌにする
ＴＴＢＳ溶液：１９１６ｍｌのＨ２Ｏ、６０ｍｌのＮａＣｌ溶液（５Ｍ）、２０ｍｌのＴｒｉｓ溶液（１Ｍ、ｐＨ  ８）、４ｍｌのＴｗｅｅｎ−２０溶液（２５％）。
【００５２】
タンパク質を電気泳動によって分離し、ニトロセルロース膜に転写し、および以下のように抗ＹＢ−１抗体を用いて検出する（「抗体検出」の項目において以下に列挙されるリストを参照のこと）。最初に、１２．５％  ＳＤＳ  ＰＡゲルを、ＢｉｏＲａｄミニゲルシステム（Ｍｉｎｉｇｅｌ  Ｓｙｓｔｅｍ）で成型した。４枚の下部ゲル（約２５ｍｌに対応）について、以下の溶液を連続的に混合した。Ｈ２Ｏ  ８ｍｌ、下部ゲル緩衝液（４×）６．２５ｍｌ、アクリル／ビスアクリル（３０％）１０．４ｍｌ、ＳＤＳ（１０％）２５０μｌ、ＴＥＭＥＤ  １２．５μｌ、ＡＰＳ（１０％）１２５μｌ。
【００５３】
続いて、まだ液体である下部ゲルを、液体のレベルがガラスプレートの上端よりも１ｃｍ下まで、ミニゲルシステムのガラスプレート間に直にピペッティングした。残りの空間は水で満たし、重合を室温で４５分間行った。
【００５４】
４枚の下部ゲルについて、以下の溶液を連続的に混合した。Ｈ２Ｏ  ６．１ｍｌ、下部ゲル緩衝液（４×）２．５ｍｌ、アクリル／ビスアクリル（３０％）１．３ｍｌ、ＳＤＳ（１０％）１００μｌ、ＴＥＭＥＤ  １０μｌ、ＡＰＳ（１０％）５０μｌ。
【００５５】
ガラスプレート間の余分の水をデカントし、ガラスの間隙を液体下部ゲルで満たした。すぐにコームを挿入し、下部ゲルを室温で４５分間重合した。この間に、細胞抽出液から、または上清の遠心分離後のサンプルを調製する。１０μｌのサンプルを１０μｌの変性サンプル緩衝液（Ｌａｅｍｍｌｅ）と混合し、ウォーターバス中で９５℃にて３から５分間インキュベートした。コームを重合ゲルから取り出し、チャンバーを電気泳動緩衝液（１×濃度）で満たした。続いて、各サンプルを手短に遠心分離し、サンプルウェルをピペットで前洗浄し、各サンプルをサンプルウェルに適用して、１５０ボルトで約１時間の電気泳動によって分離する。
【００５６】
電気泳動の間、転写のための調製物を作製する。従って、転写緩衝液を調製し、４℃にあらかじめ冷却した。各ゲルについて、ニトロセルロース膜および倍の数のＷｈａｔｍａｎ濾紙を適切なサイズに切断する。電気泳動後、ゲルをチャンバーから取り出し、ニトロセルロース膜およびＷｈａｔｍａｎ濾紙を転写緩衝液で濡らし、以下の順番で、泡が入らないように重ねた。Ｗｈａｔｍａｎ濾紙、ニトロセルロース膜、ゲル、Ｗｈａｔｍａｎ濾紙。転写のために、ニトロセルロース膜は転写チャンバーの陽極に向け、チャンバーは転写緩衝液で満たし、氷の塊を冷却のために挿入し、およびブロッティングを１００ボルトで１時間実施する。
抗体検出
転写後、膜をＴＴＢＳ溶液で３×１０分間洗浄し、２％  ＢＳＡ溶液（ＴＴＢＳＡに溶解）で室温で２時間ブロックし、および再度ＴＴＢＳ中で３×１０分間洗浄する。続いて、膜を１：２０００の希釈にて４℃で一晩、一次抗体とともにインキュベートする。異なる抗ＹＢ−１抗体を利用する（以下のリストを参照のこと）。さらなる洗浄操作後、膜を二次抗体とともにインキュベートする（以下のリストを参照のこと）。
【００５７】
以下の抗体の組み合わせ（［一次抗体］：［二次抗体］）を、ＹＢ−１およびＹＢ−１のフラグメントを検出するために利用する。
【００５８】
ＹＢ−１  Ｃ末端に対するポリクローナルウサギ抗体（ＡＢ１）（Ｍｅｒｔｅｎｓ  Ｐ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ，１９９９，Ｖｏｌ．１０，ｐ．２４８０−２４８７）：ロバからの抗ウサギＨＲＰ−結合体化Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ＡＢ２）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＫ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）、１：５，０００の希釈にて室温で２時間インキュベートする。
【００５９】
全長ＹＢ−１タンパク質に対するポリクローナルウサギ抗体（ＡＢ３）（Ｍｅｒｔｅｎｓ  Ｐ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９７，Ｖｏｌ．２７２，Ｎｏ．３６，ｐ．２２９０５−２２９１２）：ロバからの抗ウサギＨＲＰ−結合体化Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ＡＢ２）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＫ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）、１：５，０００の希釈にて室温で２時間インキュベートする。
【００６０】
モノクローナル抗ＹＢ−１抗体（ＡＢ４およびＡＢ８）：ロバからの抗マウス抗体（ＡＢ５）（ＰＩ−２０００，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＫ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）、１：２０，０００の希釈にて室温で２時間インキュベートする。細菌中で組換え的に調製した全長ＹＢ−１タンパク質に対するモノクローナル抗体「Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ」（ＡＢ４）および「Ｉｔａｌｉｅｎ」（ＡＢ５）は、マウスを免疫すること、および以下のプロトコールに従って組換えタンパク質の２回のブースター注射後に脾臓リンパ球を単離すること、およびこれらをハイブリドーマ細胞と融合させることによって生成された。
【００６１】
モノクローナル抗体の調製
免疫：８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを、精製した抗原（ｒＹＢ−１タンパク質、Ｍｅｒｔｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９７，Ｖｏｌ．２７２，Ｎｏ．３６，ｐ．２２９０５−２２９１２を参照のこと）で免疫した。投薬量は１５０μｇ／マウスである。初回免疫のために、抗原を完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ；Ｓｉｇｍａ）（油中水エマルジョン、Ｈｕｒｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｎｔｌｅｒ，１９８０）中で乳化し、３００μｌの量でマウスに皮下注射する。免疫前に、血液をマウスの尾静脈から取り出す（免疫前血清）。初回免疫の４週間後、血液をマウスから取り出す（免疫血清）。これらの血清中の抗体力価を、半定量的エンザイムイムノアッセイ（スロットブロット）で決定する。高い抗体力価を有するマウスを、初回免疫の６から８週間後免疫し、および２週間後に再度免疫する（ブースター免疫）。このようにして、ＰＢＳ中の１００μｇのｒＹＢ−１を、動物に静脈内注射する。最終免疫の３から５日後に、融合がもたらされる。
【００６２】
脾細胞を得るための脾細胞懸濁液の調製：頚部転置後、滅菌条件下でマウスから脾臓を取り出し、ＨＢＳＳ（ハンクス緩衝化塩溶液）中でペトリ皿中で２対のピンセットを用いて注意深く引っ張って分ける。細胞塊および残りの結合組織は、微細なワイヤメッシュを通す濾過によって除去する。続いて、細胞をＨＢＳＳで３回洗浄する（室温にて２００×ｇ、１０分間の遠心分離）。ハイブリドーマのクローニングのために、組換えＩＬ−６（１００Ｕ／ｍｌ，Ｒｏｃｈｅ）を利用する。
【００６３】
細胞融合：細胞融合のために、ＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｋｏｅｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９２；Ｖｏｌ．２４，ｐ．５２４−５２６）によってもともと記載された方法の改変プロトコールを使用する。免疫したマウスからの１０８個の洗浄した脾細胞および２から５×１０７個の８−アザグアニン耐性ミエローマ細胞（Ｘ６３−Ａｇ８／６５３）を、５０ｍｌの遠心分離チューブ中で混合する。このミエローマ細胞を１０日間増殖させ、大きな細胞培養フラスコ（２２５ｃｍ２）に移す。続いて、これらの細胞数をＮｅｕｂａｕｅｒ計数チャンバー中で測定する。チューブをＧＫＮ培地（８ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、０．４ｇ／ｌ  ＫＣｌ、１．７７ｇ／ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．６９ｇ／ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４、２ｇ／ｌ  グルコース）で満たし、室温にて、２００×ｇで１０分間遠心分離する。上清を吸引する。１分間の時間にわたって、０．５ｍｌの５０％  ＰＥＧ溶液（Ｓｉｇｍａ）を滴下して加える。ペレットを、注意深く、軽く叩くことによって再懸濁する。ＰＥＧを希釈するために、９０秒後、５ｍｌのＧＫＮ培地を、５分間の時間にわたって加える。１０分間の休止期の後、大きな塊を、１０ｍｌピペットを用いて注意深くピペッティングすることによって溶解する。細胞懸濁液は、引き続いて、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、および細胞ハイブリッドの培養のためのチミジン、ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５×１０−５Ｍ  β−メルカプトエタノール、２％（ｖ／ｖ）５０×ＨＡＴ、１％（ｖ／ｖ）非必須アミノ酸、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン、および１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリンを有する培地）中で希釈し、６枚のマイクロタイタープレート（９６ウェル）に分配する。細胞密度は、１００μｌの体積でウェルあたり約１×１０５である。１週間の間隔で、ハイブリドーマは、ＨＡＴ培地を供給する。約２週間後、ハイブリドーマの大部分は増大し、約５×１０３から１０４の細胞数を含む。この時点で、上清を、ドット−ブロットエンザイムイムノアッセイを用いて、特異的抗体のこれらの含量について試験する。この目的のために、各々の上清の１００μｌ／ウェルをマイクロタイタープレートから取り出し、利用する。試験でポジティブであったハイブリドーマを増殖させる。
【００６４】
限界希釈の原理に従うクローニング：抗体産生クローンの単クローン性を保証するために、Ｃｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｅｒによって記載された限界希釈法（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１９８３；Ｖｏｌ．２，ｐ．９１−９６）を用いる。Ｎｅｕｂａｕｅｒ細胞チャンバーを用いて、クローンの細胞数を決定し、細胞培養物を培地で希釈し、その結果、統計学的には１つのみの細胞が９６ウェルプレートの１つおきのウェルに分配される。培養は再度拡大され、約２週間後、これらの培養物からの上清は、特異的抗体の産生についてエンザイムイムノアッセイ（ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ）において再度試験される。陽性クローンを拡大し、より詳細に特徴付けし、および保存のために液体窒素中で凍結する。凍結のために、ハイブリドーマ細胞は、収集され、遠心分離され、氷冷凍結媒体中に１×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で再懸濁し（１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ、２０％から３０％ウシ胎仔血清を有するＤＭＥＭ）、および窒素中に保存する。
【００６５】
「Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ」抗体（ＡＢ４）のアイソタイプ決定により、これがＩｇＧ２ｂサブクラスに属するという結果が出た。「Ｉｔａｌｉｅｎ」（ＡＢ８）および「Ｇｒｏｓｓｂｒｉｔａｎｎｉｅｎ」（ＡＢ９）という表示の抗体は同様の様式で調製した。
【００６６】
検出は、「増強化学発光（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｉｓｃｅｎｃｅ）」反応（ＥＣＬ（商標）、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＫ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）、その後Ｘ線フィルム曝露を用いて行った。
【００６７】
結果：
図１Ａにおいて、全長ＹＢ−１（５２ｋＤａ）の分泌の誘導は、１ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳを加えたときに明確になる（レーン４）。より低い濃度（１０−２から１０−１ｎｇ／ｍｌ）およびより高い濃度（１０から１０４ｎｇ／ｍｌ）は、例えば、１０４ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ濃度において見ることができるように（レーン８）、分泌なしまたは低い分泌のみをもたらす。
【００６８】
０．１から１０ｎｇ／ｍｌのより限定された濃度範囲におけるさらなる試験列（図１Ｂ）は、全長ＹＢ−１が１．０から７．５ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ濃度においてＭＭ６細胞によって分泌されることを示す。ウェスタンブロッティングからの膜がより長く抗体とインキュベートされる場合、全長ＹＢ−１の構成的発現もまた、低いＬＰＳ濃度（０．２５から０．７５ｎｇ／ｍｌ）で見ることができる（図２）。加えて、ＹＢ−１切断産物の分泌は、１．０ｎｇ／ｍｌから７．５ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ濃度において明確になる。ＹＢ−１の切断産物は、３５ｋＤａ、３２ｋＤａ、２８ｋＤａ、および１６ｋＤａのサイズを有する。
【００６９】
図１において、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）およびアクチンが、１ｎｇ／ｍｌ（図１Ａ）および１から７．５ｎｇ／ｍｌ（図１Ｂ）のＬＰＳ濃度においてそれぞれ存在することもまた示される。このことは、分泌メカニズムの特異性、および検出されたＹＢ−１が溶解した細胞に由来するのではないという事実を実証する。
【実施例２】
【００７０】
細胞内発現されたＹＢ−１と分泌型ＹＢ−１の分子量（ＭＷ）の比較
本実験において、Ｅ．ｃｏｌｉ中で組換え的に調製したＹＢ−１（ｒＹＢ−１）、核ＹＢ−１（ＮＥ）、およびＭＭ−６細胞のＬＰＳ刺激に際して分泌されたＹＢ−１（ＬＰＳ／上清）の間の分子量の違いを調べる。
【００７１】
ＭＭ−６細胞のＬＰＳ刺激および分泌型ＹＢ−１の測定についての実験設定の説明は実施例１に見い出される。組換えＹＢ−１の調製および核ＹＢ−１の単離は、Ｍｅｒｔｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，Ｖｏｌ．２７２，ｐ．２２９０５−２２９１２；Ｍｅｒｔｅｎｓ  Ｐ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，Ｖｏｌ．２７３，ｐ．３２９５７−３２９６５による論文に記載されているような方法によって行う。核ＹＢ−１、組換えＹＢ−１、およびＬＰＳ刺激に際して分泌されたＹＢ−１のサンプルを用いて引き続いて実施するウェスタンブロッティングは、実施例１の説明に従って実施する。一方、ウェスタンブロッティングにおいて使用される抗体は、以下に対して指向される。
【００７２】
Ｃ末端（抗Ｃ（ＡＢ１）；上記を参照のこと、Ｍｅｒｔｅｎｓ  Ｐ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ，１９９９，Ｖｏｌ．１０，ｐ．２４８０−２４８７）；
Ｎ末端（抗Ｎ（ＡＢ７）、１：２０００の希釈で利用されるＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚからの抗ＹＢ−１抗体）；および
全長ＹＢ−１タンパク質（抗ｗ（ＡＢ３；上記を参照のこと、Ｍｅｒｔｅｎｓ  Ｐ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９７，Ｖｏｌ．２７２，Ｎｒ．３６，ｐ．２２９０５−２２９１２）（さらなる詳細については、実施例１を参照のこと）。核細胞抽出物の回収は、以下においてより詳細に記載される。
【００７３】
核細胞抽出物（ＮＥ）の回収：
利用される溶液：
低張性緩衝液：１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ  ７．９、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＫＣｌ、０．２ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  オルトバナジン酸ナトリウム。
【００７４】
低塩濃度を有する緩衝液：２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ  ７．９、２５％（ｖ／ｖ）グリセロール、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  ＫＣｌ、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  オルトバナジン酸ナトリウム。
【００７５】
高塩濃度を有する緩衝液：２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ  ７．９、２５％（ｖ／ｖ）グリセロール、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．０Ｍ  ＫＣｌ、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  オルトバナジン酸ナトリウム。
【００７６】
透析緩衝液：２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．５ｍＭ  ＤＴＴ。
【００７７】
核抽出物の回収は、Ｄｉｇｎａｍ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９８３；Ｖｏｌ．１０１，ｐ．５８２−５９８）によって記載される方法から適合される。細胞は、２５０ｍｌ細胞培養フラスコに播種され、１０％ＦＣＳを有する完全ＲＰＭＩ培地中で、８０％のコンフルエンシーまで培養する。培地をデカントし、細胞を氷冷ＰＢＳで１回洗浄し、続いて１０ｍｌの氷冷ＰＢＳ中で細胞スクレーパーを用いて注意深く脱離させる。以下の工程は常に氷上または４℃で行う。１分間あたり３，０００回転（ｒｐｍ）で１０分間の細胞懸濁液の遠心分離、上清のデカント、および５ペレット体積の低張性緩衝液（上記を参照のこと）中への細胞ペレットの取り込み。この懸濁液を、再度３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。ペレットを、低張性緩衝液（３ペレット体積）に再度取り込み、１０分間氷上でインキュベートし、および４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離する。上清を遠心分離後に廃棄し、沈殿物を低塩濃度を有する緩衝液（１／２ペレット体積）中に取り込み、高塩濃度を有する緩衝液（総体積の１／３）を、ピペッティングによって注意深く加える。その後、抽出物を各々３０分間振盪し、１４，０００ｒｐｍで遠心分離する。この間に、透析チューブを０．０５Ｍ  ＥＤＴＡ中で煮沸し、水中に浸漬する。遠心分離後、上清をこの透析チューブにピペットで移し、２リットルのあらかじめ冷却した透析緩衝液中で、定常的に攪拌しながら４℃で一晩透析する。翌朝、透析緩衝液を交換し、さらに２時間透析を行う。引き続いて、サンプルをアリコートとし、液体窒素で瞬間的に凍結し、および−８０℃で保存する。
【００７８】
結果：
図３において示されるウェスタンブロットのゲル中の最初の列は陰性対照として働く（すなわち、一次抗体を使用しなかった）。分泌型ＹＢ−１のより低い移動度（レーン１、５、および８）が、核起源のＹＢ−１（レーン３、６、および９）と比較して見い出される。原核細胞によって調製されたＹＢ−１（ｒＹＢ−１）は、この４６ｋＤａの分子量によってのみならず、これがより高分子量のバンド（８８ｋＤａ）として検出することができるという事実によってもまた、真核生物によって調製されたＹＢ−１（ＬＰＳ／上清；５２ｋＤａ）から区別され（レーン４、７、および１０）、これは、最も可能性が高いこととしては、ホモマルチマー化によってである。加えて、３８ｋＤａ、３６ｋＤａ、３５ｋＤａ、３３ｋＤａ、および２２ｋＤａのサイズを有するフラグメントを検出することができる。加えて、全長ＹＢ−１タンパク質に対して調製した抗体を用いて、２５ｋＤａフラグメントが組換えＹＢ−１を用いて検出することができる（レーン７）。
【００７９】
分泌型ＹＢ−１と細胞内ＹＢ−１の間の違いに関して、本発明者らは、現在のところ、分泌型ＹＢ−１が、古典的な経路の分泌産物について説明されるようなグリコシル化型ではないことのみを知っている。ＹＢ−１の分泌経路に対して何らかのさらなる光を照らすデータが存在している（示さず）。現在の知見によると、分泌は、非常に可能性が高いこととして、代替的な分泌経路に寄与する可能性がある、ＡＢＣトランスポーターを通して活動的に行われる。加えて、図３が分析されるときに、分泌型ＹＢ−１が核ＹＢ−１（約５７ｋＤａ）よりも約５ｋＤａ大きく、全長タンパク質として存在するのみならず、フラグメントとしてもまた存在することが注目される。図３から見ることができるように、細胞内ＹＢ−１は、５０ｋＤａおよび５２ｋＤａの二重バンドとして存在する（例えば、レーン９を参照のこと）。
【実施例３】
【００８０】
血小板由来増殖因子ＰＤＧＦ−Ｂを用いる、条件的にＨＡ−ＹＢ−１を発現するメサンギウム細胞株の刺激後の、微小胞中に分泌されるＹＢ−１およびＹＢ−１のフラグメントの検出
以下の実施例は、条件的にＨＡ−ＹＢ−１を発現するメサンギウム細胞株の細胞が、ＰＤＧＦ−Ｂを用いる刺激に際して、ＹＢ−１およびＹＢ−１のフラグメントを分泌することを示す。この実験は、分泌型のＹＢ−１タンパク質が、ＹＢ−１が属する低温ショックタンパク質のファミリーの異なるメンバーではないことをさらに実証する。
【００８１】
この目的のために、本実施例は、ラットからの原発性メサンギウム細胞を使用する（Ｍｅｒｔｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，１９９８，Ｖｏｌ．３２，ｐ．９４５−９５２）。これらは、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭ  ピルビン酸Ｎａ、非必須アミノ酸、５ｍｇ／ｌ  インスリン、３．４μｇ／ｌ亜セレン酸ナトリウム、２．８ｍｇ／ｌ  トランスフェリン、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン、および１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリンを加えたＲＰＭＩ  １６４０培地中で、５％ＣＯ２を含有するＨ２Ｏ飽和大気下で、３７℃で増殖される。
【００８２】
細胞にＹＢ−１の分泌を誘導させるために、細胞を、７５ｃｍ２培養皿中で、ハイグロマイシン（２００μｇ／ｍｌ）およびジェネティシン（４００μｇ／ｍｌ）の存在下で、８０％コンフルエンシーまで増殖させる。ＰＤＧＦ−Ｂを用いる刺激の前に、増殖を中断するために、細胞をＭＣＤＢ培地（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）で２４時間処理する。ＰＤＧＦ−Ｂを、ＲＭＰＩ培地に、５０ｎｇ／ｍｌの最終濃度まで加える。培養後、細胞を、カルシウムおよびマグネシウム／ＥＤＴＡ（１ｍＭ）を含まないＰＢＳを用いて、細胞培養フラスコの底から脱離させ、滅菌した５０ｍｌファルコンチューブに移し、次に１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清を除去する。細胞ペレットを５ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、細胞数をＮｅｕｂａｕｅｒチャンバー中で計数し、細胞を再度１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。細胞ペレットを、血清を加えていないＲＰＭＩ培地中に取り出し、その結果、細胞数は５×１０５細胞／１００μｌ培地である。２００μｌをエッペンドルフ容器にピペットで移し、サーモブロックシェーカー中で、３７℃にてＰＤＧＦ−Ｂ（２０ｎｇ／ｍｌ  ＰＤＧＦ−Ｂ）とともにインキュベートする。
【００８３】
４時間のインキュベート時間後、エッペンドルフ容器を４℃にて３３０×ｇで１５分間遠心分離して、細胞を沈殿させる。５０μｌの上清（Ｓ１）をＬＤＨ測定のために保存する。残りの上清は０．２μｍフィルター（Ｑｕａｌｉｌａｂ，Ｍｅｒｃｋ，Ｂｒｕｃｈｓａｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を通し、１００，０００×ｇで２１０分間遠心分離する。上清（Ｓ２）および沈殿（Ｐ２）を、別々に変性Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液に取り、すべてのサンプルを１０％  ＳＤＳ−ＰＡゲル中で分離する（図５を参照のこと）。分泌された微小胞は沈殿Ｐ２に含有される。培地中の微小胞の回収に導く上記に言及した工程の模式図は図４に示される。引き続くウェスタンブロッティングにおけるＹＢ−１タンパク質の免疫学的検出は（ウェスタンブロッティングの詳細については、実施例１を参照のこと）、抗ＨＡ抗体（ＡＢ６）を用いてもたらされる。
【実施例４】
【００８４】
進行性のＩｇＡ腎炎を有する患者の尿中でのＹＢ−１およびこの切断産物の検出
実施例４から５および７から８は、試験した患者の臨床的画像を用いて細胞によるＹＢ−１タンパク質およびＹＢ−１タンパク質のフラグメントの分泌の補正を例証する。これらの実施例は、患者における炎症過程に対する明瞭な指摘について、細胞によるＹＢ−１およびこのフラグメントの分泌のパターンを利用することの可能性を示す。従って、患者における炎症性疾患の起源および経過を、より良好に決定することができる。
【００８５】
本実施例において、進行性のＩｇＡ腎炎におけるＹＢ−１およびＹＢ−１のフラグメントの分泌パターンを２例の患者について示す（図６）。ウェスタンブロット（ウェスタンブロットのさらなる詳細は実施例１に見い出される）におけるＹＢ−１およびこのタンパク質分解フラグメントの検出は、完全なＹＢ−１タンパク質に対して調製されたポリクローナル抗体（ＡＢ３）を用いてもたらされる（Ｍｅｒｔｅｎｓ  Ｐ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９７，Ｖｏｌ．２７２，Ｎｏ．３６，ｐ．２２９０５−２２９１２）。
【００８６】
すべての腎臓疾患に付随する効果である、１．５ｇ／ｄよりも上のタンパク尿を有する２例の選択された患者において（図６においてＡおよびＢで示される）、ＹＢ−１についての特徴的な分泌パターンは、これらの免疫学的検査において見い出される。ポリクローナル抗体およびこのタンパク質分解フラグメントで標識されたＹＢ−１タンパク質は、ゲル中で類似の特徴的なバンドパターンで、両方の患者において存在し、ここで、タンパク質バンドは、５２ｋＤａ、２８ｋＤａ、２３ｋＤａ、２６ｋＤａ、および８ｋＤａの分子量で観察することができる（図６、レーン１および４）。５２ｋＤａにおけるバンドは全長タンパク質ＹＢ−１を表す。ＹＢ−１自体および他のより小さなＹＢ−１のフラグメントとのＹＢ−１のマルチマー化によって、５２ｋＤａよりも大きな分子量を有するバンドもまた存在する。
【００８７】
疾患の経過は患者においては同じままであったが、これらの結果は、さらなる自然発生的な尿サンプルを検査することによって、約３ヶ月の間隔で連続的に確認した（図６、患者Ａについてレーン２および３、ならびに患者Ｂについてレーン５および６）。すべての場合において、ほぼ常に、同じバンドパターンがゲル中に存在し、これは、ＹＢ−１およびこのタンパク質分解フラグメントの定常的な分泌を示す。
【００８８】
図７は、ＩｇＡ腎炎に罹患している患者から得られた１２個の尿サンプルのゲルを示す。ゲルの個々のレーンの下に血清クレアチニンについての言及された濃度は現在の腎機能を示すのに対して、血清中のΔクレアチニン値は、いかにして腎機能が発生しているかを示す。クレアチニン濃度の濃度変化の経過は、患者において２年間にわたって観察し、患者についてのゲル上のサンプルの配置は、クレアチニン濃度の増加の範囲であった。全長ＹＢ−１タンパク質に対して指向される抗体（ＡＢ−３）を用いる免疫学的検出において（Ｍｅｒｔｅｎｓ  Ｐ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２７２，Ｎｏ．３６，ｐ．２２９０５−２２９１２）、５２ｋＤａの全長ＹＢ−１タンパク質に加えて、２８ｋＤａ、２３ｋＤａ、１６ｋＤａ、および８ｋＤａの分子量を有するフラグメントもまた検出できることが注目される。サンプルの保存後、患者は彼らの臨床的経過に関して評価され、血清クレアチニンの上昇が言及された。腎機能は大部分の患者において安定しているが、末期腎不全に向けた進行および義務的な透析が、２３ｋＤａ、１６ｋＤａ、および８ｋＤａのＹＢ−１フラグメントが検出された２例の患者において存在した。加えて、ゲルの画像の下のタンパク尿に関する比較データから見ることができるように、ＹＢ−１の検出はタンパク尿の程度とは独立して得られることが注目された。対照として、進行性の腎不全を有する２例のうちの１例の患者の尿サンプルは（レーン１０）、レーン１３における二次抗体とともに独占的にインキュベートする。この場合、低分子量バンドは観察できない。
【００８９】
図８は、尿中のＹＢ−１パターンが数週間にわたって変化した、ＩｇＡ腎炎が生検によって確認された患者における経過を例示的な様式で示す。低分子量バンドは消失し、腎機能の回復が起こることが注目される。急性腎不全の時点で（時間０）、患者は免疫抑制を用いて治療された。
【実施例５】
【００９０】
急性腎臓移植拒絶の指標としてのＹＢ−１タンパク質およびこのタンパク質フラグメントの検出
モノクローナル抗体「Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ」（ＡＢ４）を、ウェスタンブロッティングにおいてＹＢ−１を検出するために使用した。このモノクローナル抗体は、８ｋＤａ、１６ｋＤａ、および２３ｋＤａのより小さなフラグメントは認識しない。腎臓移植が行われた後で、尿サンプルを、検査した６例の患者（Ａ−Ｆ）において連続的に収集する。患者ＡおよびＢにおいては、図９のＡＲとして示されるように、生検によって確認された移植拒絶（ＡＲ）が存在する。患者ＣおよびＤにおいては、拒絶反応も、いかなる他の合併症も存在しない（ＡＲなし）。患者ＥおよびＦにおいては、拒絶反応は存在しなかったが、他の合併症（合併症、φＡＲ）、例えば、腹膜炎およびカテーテル関連敗血症が存在した。ＹＢ−１およびこのフラグメントの存在の決定と並行して、サイトカインおよび拒絶反応についての他のマーカータンパク質もまた決定した。
【００９１】
図９における結果は、移植後の身体の反応が、ＹＢ−１およびこのタンパク質フラグメントの分泌プロフィールに明確に反映されることを示す。図９の患者Ａにおいて見ることができるように、より小さなフラグメント（約２７ｋＤａのＭＷ）は、拒絶反応の初期のマーカーとして評価されてきたグランザイムＡが有意に上昇する前に、すでに検出可能である。この結果は、ＹＢ−１およびこのフラグメントの検出がタンパク尿の程度とは独立していることをさらに示す。
【００９２】
先の実施例は、ＹＢ−１分泌パターンの分析が、担当の医師に、炎症過程およびこのような炎症過程の原因を迅速に決定する可能性を提供することを示す。
【実施例６】
【００９３】
ＬＰＳを用いる刺激の際の単球細胞およびマクロファージによるＹＢ−１の分泌
図１０Ａから見ることができるように、標準的なプロトコールに従ってバフィーコートを用いて健常なドナーの血液から得られた原発性ヒト単球およびマクロファージもまた、ＬＰＳとのインキュベーションに際してＹＢ−１を分泌し始める。このブロットにおいて、完全なＹＢ−１タンパク質に対して調製されたポリクローナル抗体（ＡＢ３）を検出のために利用した。
【実施例７】
【００９４】
悪性疾患と関連するＹＢ−１およびＹＢ−１のフラグメントの検出
図１１は、健常被験体（レーン１から３）、劇症性敗血症を有する２例の患者について（レーン４および５）、ならびに異なる組織系および組織学の転移している腫瘍疾患を有する８例の患者について（レーン６から１３）の血清中でのＹＢ−１の免疫学的検出を示す。診断には、膵臓癌（Ｐａ．−ＣＡ）、非小細胞気管支癌（ＮＳＣ−ＢＣ）、直腸癌（Ｒｅ．−ＣＡ）、乳癌（Ｍａ．−ＣＡ）、喉頭癌（Ｌａ．−ＣＡ）、および原発性腫瘍の検出を伴わない腺癌（Ａｄ．−ＣＡ）が含まれる。レーン１４および１５において、膵臓癌を有する腫瘍患者からのサンプルを再度適用する。レーン１４において、インキュベーションはＹＢ−１に対する一次抗体を用いて行い、レーン１５において、インキュベーションは、二次抗体に起因する非特異的バンドを検出するために二次抗体を用いて独占的に行った。５０ｋＤａおよび２６ｋＤａにおける２つの弱い非特異的バンドが見い出される。全長ＹＢ−１タンパク質に対して指向されるポリクローナル抗体（ＡＢ３）を使用することによって、全長ＹＢ−１（５２ｋＤａ）および２８ｋＤａにおけるＹＢ−１フラグメントの第２の主要なバンドを検出できる。すべてのサンプル中で見られるこれらのＹＢ−１フラグメントに加えて、約１４ｋＤａのサイズを有する小さなＹＢ−１フラグメントがすべての腫瘍患者において検出できるが、劇症性敗血症を有する患者においてはそれほど明確には検出されない（レーン４）。従って、より高い濃度でのこのフラグメントの検出は、腫瘍疾患の存在を結論付けることを可能にする。
【実施例８】
【００９５】
ケラチノサイトの移動に対する、ＹＢ−１およびＹＢ−１に対する抗体の影響
ヒトケラチノサイトは、ペニシリンおよびアムホテリシンＢが加えられたＰＢＳ溶液で皮膚サンプルを３回洗浄することによって成体ドナーの皮膚生検から得られる。サンプルを７０％エタノールで洗浄し、１ｃｍ２の小片に切断する。表皮をカゼイン分解性ディスパーゼ（ｄｉｓｐａｓｅ）（５０Ｕ／ｍｌ、Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）との３７℃で２時間のインキュベーションによって分離する。０．２５ｍｇ／ｍｌトリプシン／ＥＤＴＡ  （Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）中での３７℃、３０分間のインキュベーション後、ケラチノサイトは、注意深いピペッティングによって、単細胞懸濁物として遊離する。トリプシン中和溶液（ＴＮＳ，Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）でトリプシンを中和した後、細胞をＫＧＭ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）に取り、細胞培養フラスコに播種し、およびこの中で培養する。
【００９６】
細胞のコンフルエンシー後、「スクラッチ」を実施する。すなわち、細胞ローンに傷（ｄｅｆｅｃｔ）を作製する（Ｄｒａｐｅｒ  Ｂ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００３，Ｖｏｌ．８９，ｐ．１１２６−３７）。細胞をＫＧＭ培地で洗浄した後、組換えＹＢ−１または抗体を言及した濃度で加える。
【００９７】
結果：
実験の結果を図１３に示す。通常の血清を含まない培地を加えるときには、ケラチノサイトは作製された創傷に移動するのに対して（行：培地）、組換えＹＢ−１で処理した細胞においては細胞の有意な移動は存在しない（行：ｒＹＢ−１（５０ｎｇ））。細菌中で発現されたＹＢ−１サンプルが１０分間にわたり９５℃に加熱され、続いてケラチノサイト培養に加えられる場合、細胞の移動は観察することができ、このことは、阻害効果がリポポリサッカリドによって引き起こされることを意味しない（行：不活性化ＲＹＢ−１（１００ｎｇ））。
【００９８】
抗ＹＢ−１（行：抗ＹＢ−１  ＡＢ４（「Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ」）（２）（１μｇ）および抗ＹＢ−１（３）（５μｇ））の添加は、ケラチノサイトの移動に対して同様の効果を有するのに対して、対照ＩｇＧ抗体は、移動に影響を与えない（行：ＩｇＧ１（１）（１μｇ）およびＩｇＧ１（２）（５μｇ））。このことは、利用したモノクローナル抗体がＹＢ−１効果に対して中和効果を有さないが、むしろこれを増強することを示す。
【実施例９】
【００９９】
モノクローナル抗体を用いるＹＢ−１フラグメントの検出
本実験において、「特異的」ＹＢ−１フラグメントは、モノクローナル抗体を用いて、腫瘍患者の血清およびＩｇＡ腎炎を有する患者の尿において検出した（図１０Ｂ）。生成したモノクローナル抗体「Ｉｔａｌｉｅｎ」（ＡＢ８、表１を参照のこと）を用いて、転移している腎臓癌を有する腫瘍患者の血清（ＴＭ２０）および進行性ＩｇＡ腎炎を有する患者からの尿（Ｋ）を検査した。２００ｋＤａ周辺の高分子量バンドに加えて、５２ｋＤａおよび２８ｋＤａの相対分子量を有するバンドもまた、非変性サンプル緩衝液（メルカプトエタノールおよびＥＤＴＡを含まない）中で観察される。変性条件下では（メルカプトエタノールおよびＥＤＴＡを含む）、異なるポリクローナル抗ＹＢ−１抗体を用いて以前に観察され、１６ｋＤａの相対サイズを有するバンドが腫瘍疾患についての血清中で、または２３ｋＤａの相対サイズを有するバンドが進行性のＩｇＡ腎炎についての尿中で検出できる。特異的ＹＢ−１結合を有さない対照抗体を用いると（「Ｇｒｏｓｓｂｒｉｔａｎｎｉｅｎ」、ＡＢ９、上記の表を参照のこと）、および抗マウス二次抗体（ＡＢ５）単独を用いると、１６ｋＤａおよび２３ｋＤａのバンドは検出不可能である。
【実施例１０】
【０１００】
ＨＡ−タグ化ＮＯＴＣＨとのＧＦＰ−ＹＢ−１の直接的相互作用の検出
ヘマグルチニン（ＨＡ）で標識したＮＯＴＣＨ３（ＥＧＦ）（すなわち、ＮＯＴＣＨ−３受容体の細胞外ＥＧＦ−含有ドメイン）およびＧＦＰまたはＹＢ−１−ＧＦＰを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で同時発現させる。細胞溶解物を、抗ＨＡ−抗体を用いる免疫沈殿に供し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、および抗ＨＡ抗体を用いて検出する（レーン１から３）。発現したタンパク質Ｎ３（ＥＧＦ）は、このようにして検出することができる（レーン２および３）。さらに、細胞溶解物は、抗ＧＦＰまたは抗ＨＡ抗体を用いる免疫沈殿にそれぞれ供し、続いて、抗ＧＦＰ抗体を用いて検出する。レーン９において、同時免疫沈殿したＹＢ−１−ＧＦＰを見ることができる。２つのタンパク質の内の１つのみがそれぞれ発現された、対応する対照実験は陰性である（レーン５および７）。「Ｉ．Ｐ．」は、免疫沈殿を表し、「ブロット」はタンパク質の分離後のウェスタンブロッティングによる検出を意味する。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１Ａ】異なる濃度のリポポリサッカリド（ＬＰＳ）溶液を用いる単球ＭＭ−６細胞の誘導に際しての、タンパク質のＣ末端に対して指向されるポリクローナル抗体（Ｍｅｒｔｅｎｓ  Ｐ．Ｒ．，Ａｌｆｏｎｓｏ−Ｊａｕｍｅ  Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ，１９９９，Ｖｏｌ．１０，ｐ．２４８０−２４８７）を用いるＹＢ−１およびこのフラグメントの検出を示す。図１Ｂにおいて、０．２５から１０ｎｇ／ｍｌの間のＬＰＳ濃度範囲をＭＭ−６細胞を用いて試験した。ＹＢ−１が１．０から７．５ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ濃度において分泌され、タンパク質のＣ末端に対して生成されたポリクローナルペプチド抗体を用いて検出できることが見い出される。
【図１Ｂ】異なる濃度のリポポリサッカリド（ＬＰＳ）溶液を用いる単球ＭＭ−６細胞の誘導に際しての、タンパク質のＣ末端に対して指向されるポリクローナル抗体（Ｍｅｒｔｅｎｓ  Ｐ．Ｒ．，Ａｌｆｏｎｓｏ−Ｊａｕｍｅ  Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ，１９９９，Ｖｏｌ．１０，ｐ．２４８０−２４８７）を用いるＹＢ−１およびこのフラグメントの検出を示す。図１Ｂにおいて、０．２５から１０ｎｇ／ｍｌの間のＬＰＳ濃度範囲をＭＭ−６細胞を用いて試験した。ＹＢ−１が１．０から７．５ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ濃度において分泌され、タンパク質のＣ末端に対して生成されたポリクローナルペプチド抗体を用いて検出できることが見い出される。
【図２】図１と同様に、延長した抗体曝露を用いるウェスタンブロッティングの結果を示す。従って、ＹＢ−１の構成的分泌は、より低いＬＰＳ濃度（０．２５から０．７５ｎｇ／ｍｌ）においてさえ検出することができる。加えて、１から７．５ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ濃度において、３５ｋＤａ、３２ｋＤａ、２８ｋＤａ、および１６ｋＤａの分子量を有するＹＢ−１切断産物の分泌が観察される。
【図３】Ｅ．ｃｏｌｉ中で組換え的に調製したＹＢ−１（ｒＹＢ−１）、核ＹＢ−１（ＮＥ）、およびＭＭ−６細胞のＬＰＳ刺激に際して分泌されたＹＢ−１（ＬＰＳ／上清）の間の分子量の違いをウェスタンブロットにおいて示す。一方、利用する抗体は、Ｃ末端（抗Ｃ）、Ｎ末端（抗Ｎ）、および全長ＹＢ−１タンパク質（抗ｗ）に対して作用する。ゲルにおける最初の列は陰性対照として働く（すなわち、一次抗体を使用していない）。この実験に関するさらなる詳細は実施例２に見い出すことができる。核起源のＹＢ−１（レーン３、６、および９）と比較して、分泌型のＹＢ−１（レーン１、５、および８）のより低い移動度が見い出される。原核生物によって調製されたＹＢ−１（ｒＹＢ−１）は、この４６ｋＤａの分子量によってのみならず、これがより高分子量のバンド（８８ｋＤａ）として検出することができるという事実によってもまた、真核生物によって調製されたＹＢ−１（ＬＰＳ／上清）から区別される。このより高分子量のバンドは、最も可能性が高いこととして、ホモマルチマー化によって説明できる。加えて、３８ｋＤａ、３６ｋＤａ、３５ｋＤａ、３３ｋＤａ、および２２ｋＤａのサイズを有するフラグメントを検出することができる。加えて、全長ＹＢ−１タンパク質に対して調製した抗体を用いて、２５ｋＤａフラグメントが組換えＹＢ−１を用いて検出することができる（レーン７）。
【図４】ＹＢ−１を含有し、およびＰＤＧＦ−Ｂによって誘導されたメサンギウム細胞によって分泌された微小胞からのＹＢ−１およびこのフラグメントの単離のためのプロセスの模式図を示す。実験に関するさらなる詳細は実施例３において見い出すことができる。Ｐ１は沈殿物１を表し、これは、サイトカインインキュベーションの１時間から４時間後の細胞上清の最初の遠心分離後に得られ、主として細胞、高分子量成分、および細胞断片を含有する。Ｓ１は、最初の遠心分離後に残っている細胞上清を表し、これは、引き続いて、微小胞を得るために遠心分離される。Ｓ２はこれによって得られる上清を表し、Ｐ２は第２の沈殿物を表し、これは、微小胞中にＹＢ−１タンパク質およびこのフラグメントを含む。
【図５】メサンギウム細胞によって分泌されたＹＢ−１の免疫学的検出の結果をウェスタンブロットにおいて表す。略号Ｓ１、Ｓ２、およびＰ２の意味は、図４に関連する説明の中に見い出される。文字「Ａ」によって印が付けられたドメインは、分泌されたＹＢ−１のＮ末端ドメインである。「Ｂ」はアルギニンおよびアラニンが多く存在する分泌型ＹＢ−１のドメインを表す。「Ｃ」は分泌型ＹＢ−１の低温ショックドメイン（ＣＳＤ）を表し、および「Ｄ」は、分泌型ＹＢ−１のＣ末端における交互に正電荷および負電荷を有するセグメントを表す。この実験において、ラットメサンギウム細胞によって発現されたヘマグルチニンタグを伴って提供されたＹＢ−１タンパク質は、抗ＨＡ抗体を用いてウェスタンブロットにおいて検出される。このアプローチは、分泌型タンパク質が、ＹＢ−１が属する低温ショックタンパク質のファミリーの異なるメンバーであることを除外する。実験に関するさらなる詳細については、実施例３を参照のこと。
【図６】患者の尿から回収し、完全なＹＢ−１タンパク質に対して作用するポリクローナル抗体を用いてもたらされる、タンパク質ＹＢ−１（５２ｋＤａのバンド）ならびに２８ｋＤａ、２３ｋＤａ、１６ｋＤａ、および８ｋＤａのサイズを有するこのタンパク質分解フラグメントの免疫学的検出を示す。図６において、ＩｇＡ腎炎に罹患しており、１．５ｇ／ｄより上のタンパク尿として数週間の間隔で回復した２例の患者（ＡおよびＢ）からの３つの試料を適用する。これらはすべて、ＹＢ−１およびＹＢ−１のタンパク質分解フラグメントのほぼ同一の分泌パターンを示す。結果に関するさらなる詳細は、実施例４において見い出される。
【図７】ＩｇＡ腎炎に罹患している患者から得られ、クレアチニン値の増加順に分類した１２個の尿サンプルを用いるゲルを示す。全長ＹＢ−１タンパク質に対して作用する抗体を用いる免疫学的検出において、注目すべきは、５２ｋＤａの全長ＹＢ−１タンパク質に加えて、２８ｋＤａ、２３ｋＤａ、１６ｋＤａ、および８ｋＤａの分子量を有するフラグメントもまた検出できることである。サンプルの保存後、患者は彼らの臨床的経過に関して評価され、血清クレアチニンレベルの上昇が言及された。腎機能は大部分の患者において安定していたが、末期腎不全に向けた進行および義務的な透析が、２３ｋＤａ、１６ｋＤａ、および８ｋＤａのＹＢ−１フラグメントが検出された２例の患者において存在した。加えて、ＹＢ−１の検出は、タンパク尿の程度とは独立して得られることが注目された。
【図８】尿中のＹＢ−１分泌パターンが数週間の経過で変化した、生検によって確認されたＩｇＡ腎炎の患者における経過を例示的な様式で示す。低分子量バンドは消失し、腎機能の回復が起こることが注目された。急性腎不全の時点で（時間０）、患者は免疫抑制を用いて治療された。
【図９】ＹＢ−１に対して作用するモノクローナル抗体を用いる、６例の患者の尿からの急性腎臓移植拒絶反応における分泌型ＹＢ−１およびこのタンパク質フラグメントの免疫学的検出を示す。腎臓移植が実施された後、尿サンプルは検査された６例の患者（Ａ−Ｆ）において連続的に収集された。患者ＡおよびＢにおいて、図９においてＡＲとして示されるように、生検によって確認された移植拒絶（ＡＲ）が存在する。患者ＣおよびＤにおいて、拒絶反応も、いかなる他の合併症も存在しない（ＡＲなし）。患者ＥおよびＦにおいて、拒絶反応は存在しなかったが、他の合併症、すなわち、感染性のものが存在した（合併症、φＡＲ）。ＹＢ−１およびこのフラグメントの存在の決定と並行して、サイトカイン、および拒絶反応についての他のマーカータンパク質もまた決定した（ＭＩＧ  ｐｇ／ｍｌ；ＩＰ−１０  ｐｇ／ｍｌ；ＭＣＰ−Ｉ  ｐｇ／ｍｌ；ＩＬ−１８  ｐｇ／ｍｌ；グランザイム  Ｂ  ｐｇ／ｍｌ；タンパク尿  ｇ／ｌ）。
【図１０Ａ】原発性ヒト単球およびマクロファージが健常被験体の血液から単離され、ＬＰＳとともにインキュベートされる実験の結果を示す。５ｎｇ／ｍｌの濃度のＬＰＳを用いる刺激後、全長ＹＢ−１ならびに１６ｋＤａフラグメントは、血清を含まない上清中で検出することができた。
【図１０Ｂ】モノクローナル抗体を使用する、腫瘍患者の血清およびＩｇＡ腎炎の尿における「特異的」ＹＢ−１フラグメントの検出を示す。さらなる詳細については、実施例９を参照のこと。生成したモノクローナル抗体「Ｉｔａｌｉｅｎ」（ＡＢ８、表１を参照のこと）を使用して、転移している腎臓癌を有する腫瘍患者の血清（ＴＭ２０）ならびに進行性ＩｇＡ腎炎を有する患者からの尿（Ｋ）を検査した。２００ｋＤａ周辺の高分子量バンドに加えて、５２ｋＤａおよび２８ｋＤａの相対分子量を有するバンドもまた、非変性サンプル緩衝液（メルカプトエタノールおよびＥＤＴＡを含まない）中で観察される。変性条件下では（メルカプトエタノールおよびＥＤＴＡを含む）、異なるポリクローナル抗ＹＢ−１抗体を用いて以前に観察され、１６ｋＤａの相対サイズを有するバンドが腫瘍疾患についての血清中で、または２３ｋＤａの相対サイズを有するバンドが進行性のＩｇＡ腎炎についての尿中で検出できる。特異的ＹＢ−１結合を有さない対照抗体を用いると（「Ｇｒｏｓｓｂｒｉｔａｎｎｉｅｎ」、ＡＢ９、以下の表を参照のこと）、および抗マウス二次抗体単独を用いると、１６ｋＤａおよび２３ｋＤａのバンドは検出不可能である。
【図１１】健常被験体について（レーン１から３）、劇症性敗血症を有する２例の患者について（レーン４および５）、および異なる組織系および組織学の転移している腫瘍疾患を有する８例の患者について（レーン６から１３）、血清中でのＹＢ−１の免疫学的検出を示す。レーン１４において、一次抗体単独を用いる対照反応は、非特異的バンドを検出するために適用する。レーン１５において、二次抗体単独を用いる対照反応は、二次抗体に起因して存在する非特異的バンドを検出するために適用する。全長ＹＢ−１タンパク質に対して指向されるポリクローナル抗体を使用することによって、全長ＹＢ−１（５２ｋＤａ）および２８ｋＤａにおけるＹＢ−１フラグメントの第２の主要なバンドを検出できる。すべてのサンプル中で見られるこれらのＹＢ−１フラグメントに加えて、約１４ｋＤａのサイズを有する小さなＹＢ−１フラグメントがすべての腫瘍患者において検出できるが、劇症性敗血症を有する患者においてはそれほど明確には検出されない（レーン４）。従って、より高い濃度でのこのフラグメントの検出は、この結果を腫瘍疾患の生成に起因することが可能であることを伴うことなく、腫瘍疾患の存在を結論付けることを可能にする。
【図１２】免疫沈殿におけるＨＡ−タグ化ＮＯＴＣＨとのＧＦＰ−ＹＢ−１の直接的相互作用の検出を示す。さらなる詳細については、実施例１０を参照のこと。
【図１３】スクラッチ実験後の、組換えＹＢ−１ならびに抗ＹＢ−１抗体とのケラチノサイトのインキュベーションの結果を示す。「培地」の表示を伴うライン１は、培地あり、およびＹＢ−１または抗ＹＢ−１抗体なしのケラチノサイトのローン（ｌａｗｎ）の対照インキュベーションを示す。ライン２は、組換えＹＢ−１（ｒＹＢ−１（５０ｎｇ））との細胞ローンのインキュベーションを示し、ライン３は、熱により不活性化した組換えＹＢ−１（ｒＹＢ−１（１００ｎｇ））とのインキュベーションを示し、ライン４および５は、対照ＩｇＧ抗体（ＩｇＧ１（１）（１μｇ）およびＩｇＧ１（２）（５μｇ））とのインキュベーションを示し、ならびにライン６および７は、抗ＹＢ−１抗体（抗ＹＢ−１（２）（１μｇ）および抗ＹＢ−１（３）（５μｇ））とのインキュベーションを示す。さらなる詳細については、実施例８を参照のこと。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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