(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シトクロムＰ４５０−１Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）の発現を阻害する薬剤であって、ビワの葉の1,3-ブチレングリコール水溶液による抽出物を有効成分とすることを特徴とする薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シトクロムＰ４５０−１Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）の発現を阻害する薬剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
シトクロムＰ４５０（以降、ＣＹＰと略）は、アラキドン酸やステロイドホルモン及び脂肪酸を始めとする細胞制御及び細胞伝達機構における内因性化合物及び薬物や毒物等の外来性異物の代謝に重要な役割を担っている。ＣＹＰにはＣＹＰ１、ＣＹＰ２、ＣＹＰ３の３タイプが現在までに報告されており、例えば、ＣＹＰ２に属するＣＹＰ２Ａのファミリーにおいて、特にＣＹＰ２Ａ６はヒトの肝臓における主要ニコチン代謝酵素であることが報告されている他（特許文献１）、更にはＣＹＰ２Ａ６が発癌性物質を活性化することが報告されている。そして、このＣＹＰ２Ａ６の活性を阻害する成分として、大豆サポニン抽出画分並びに甘草抽出物が報告されている（特許文献２）。
【０００３】
また、ＣＹＰの他タイプであるＣＹＰ３は、ヒト肝臓や小腸において発現する薬物代謝酵素であり、生体への効率的な薬物投与を目的として、ＣＹＰ３の活性を阻害する成分であるグレープフルーツジュースに含まれるソラレン骨格を有する化合物や（特許文献３）、スターフルーツの処理物（特許文献４）、イチゴ由来ポリフェノール（特許文献５）、多価不飽和脂肪酸（特許文献６）等が報告されている。
【０００４】
一方、ＣＹＰ１のファミリーに属するシトクロムＰ４５０については、肝臓以外の組織で発現されるＣＹＰ１Ａ１、肝臓で発現されるＣＹＰ１Ａ２、及び腫瘍細胞中で広範囲に発現されているＣＹＰ１Ｂ１が報告されており、特にＣＹＰの代謝基質の１つである抗癌剤の不活化あるいは代謝に係るＣＹＰ１Ｂ１を阻害することで、抗癌剤の有効性を向上させることが検討されてきており、阻害成分としてα−ナフトフラボン、アカカチン、ジオスメチン、ヘスペレチン、ホメリオジクチオール、2-エチニルピレン等が報告されている（特許文献７）。更には、近年において腫瘍細胞以外の、マウスケラチノサイト（ＨａＣａＴ細胞）において、ＵＶＢ照射によりＣＹＰ１Ａ１の発現が誘導されることが確認されている他（非特許文献１）、ヒト表皮皮膚繊線維芽細胞においてタバコの煙抽出物によりＣＹＰ１Ｂ１の発現及びＭＭＰ−１の発現が誘導され、その発現誘導を3-メトキシ-4-ニトロフラボン及びα-ナフトフラバノンが阻害することが報告され（非特許文献２）、またマウス及びヒトのメラノサイトにおいて、ダイオキシンによりＣＹＰ１Ａ１及びＣＹＰ１Ｂ１の発現が誘導されることが報告されている（非特許文献３）。
【０００５】
ここで特に注目すべきＣＹＰは、小腸、腎臓及び肺を始めとする肝臓以外の特異的組織、更には皮膚組織といった広範囲において発現し、腫瘍細胞の主要マーカーでもあるＣＹＰ１のファミリーに属するＣＹＰ１Ｂ１であり、生体内の正常な組織（例えば肝臓や小腸等）や腫瘍細胞への薬物や抗癌剤の効果的な投与、あるいは化粧品分野における皮膚への酵素の阻害剤や活性化剤といった有効成分の効果的な適用を考える上で、薬物あるいは有効成分を使用する際に、投与対象とする組織内において、このＣＹＰ１Ｂ１の発現を如何に抑制するかが重要となってきている。しかしながら、現在までに報告されているＣＹＰ１の発現を阻害する有効成分の種類は稀少であり、具体的にはアカカチン、ジオスメチン、ヘスペレチン、ホメリオジクチオール、2-エチニルピレンや3-メトキシ-4-ニトロフラボン及びα-ナフトフラバノンが挙げられるが、これらの効果はＣＹＰ１の発現阻害を試験する上で陽性対照となる程の強い阻害活性を有するものであるが、反面生体に対し強い毒性を有するものであり、薬剤として服用するにあたっては、その安全性が常に懸念される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開公報ＷＯ９８／０３１７１
【特許文献２】特開２００６−１６９１８６号公報
【特許文献３】特開平１０−２０４０９１号公報
【特許文献４】特開２００６−２２０７１号公報
【特許文献５】特開２００６−１１１５９７号公報
【特許文献６】特開２００６−２７３７９８号公報
【特許文献７】特表２００３−５２２１４３号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ellen Fritsche et al.，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2007，104(21)，8851-8856
【非特許文献２】Y   Ono et al.，Journal of Investigative Dermatology，2008，28，Abstract248
【非特許文献３】I Kurtmann et al.，Journal of Investigative Dermatology，2008，28，Abstract1315
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明の課題は、従来のＣＹＰ１発現阻害成分よりも、生体に対して安全であって、かつ十分なシトクロムＰ４５０−１Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）の発現を阻害する薬剤の開発である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らはビワ抽出物に優れたＣＹＰ１Ｂ１の発現阻害作用があることを見いだした。そしてこの知見より、本発明はビワ抽出物を有効成分とするＣＹＰ１Ｂ１の発現を阻害する薬剤を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の薬剤は優れたＣＹＰ１Ｂ１の発現阻害作用を有する。この薬剤を利用することにより、肝臓や小腸、皮膚といった生体組織、あるいは腫瘍細胞に対して投与する他の薬剤の代謝や不活性化を抑制し、それら薬剤の組織あるいは細胞内における生体利用効率（バイオアベイラビリティー）を向上させることが可能である。また本発明の有効成分として使用されるビワ抽出物は、従来から医薬、食品あるいは化粧品等に配合するものとして汎用されてきたものであり、生体に対するそれらの安全性は非常に高いものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の薬剤に有効成分として用いられるビワ抽出物は、バラ科ビワ属ビワ（Eriobotrya japonica Thunb. Lindl.）の葉を、生あるいは乾燥後、そのまま又は粉砕し、溶媒で抽出したものである。
【００１２】
本発明で用いるビワ抽出物を得るための抽出溶媒としては、水及び1,3-ブチレングリコールによる混合溶媒を用いる。
【００１３】
抽出方法については、その溶媒の温度や原料に対する溶媒の重量比率、又は抽出時間についても、使用原料の部位及び使用する溶媒に対し、それぞれを任意に設定することができる。溶媒の温度としては−４℃から１００℃の範囲で任意に設定できるが、原料中に含まれる成分の安定性の点から、１０〜４０℃付近が好ましい。また、原料に対する溶媒の重量比率も、例えば原料：溶媒が、４：１〜１：１００の範囲内で任意に設定でき、特に１：１〜１：２０の重量比率が好ましい。
【００１４】
本発明で用いるビワ抽出物は、溶媒抽出後、更に適宜精製操作を施したものも、その抽出物の範囲に包含される。精製操作としては、酸（塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、有機酸等）又はアルカリ（水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、アンモニア等）添加による分解、微生物による発酵又は代謝変換、イオン交換樹脂や活性炭、ケイ藻土等による成分吸着、種々の分離モード（イオン交換、親水性吸着、疎水性吸着、サイズ排除、配位子交換、アフィニティー等）を有するクロマトグラフィーを用いた分画、濾紙やメンブランフィルター、限外濾過膜等を用いた濾過、加圧又は減圧、加温又は冷却、乾燥、ｐＨ調整、脱臭、脱色、長時間の静置保管等が例示でき、これらを任意に選択し組み合わせた処理を行うことが可能である。
【００１５】
本発明の薬剤を製造する上で、使用する前記ビワ抽出物の形状としては、液状、固形状、粉末状、ペースト状等いずれの形状でも良く、本発明を実施する上で最適な形状を適宜に選択する。
【００１６】
本発明の薬剤は、その内容成分がビワ抽出物のみで構成されている薬剤の他、薬物製剤を構成する上で許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水、有機溶媒等）を含有するものも、その薬剤の範囲に包含される。薬剤の剤型は、経口的又は非経口的に投与可能であれば特に制限はなく、カプセル状、粉末状、顆粒状、固形状、液状、ゲル状、気泡状、乳液状、クリーム状、軟膏状、シート状、ムース状、粉末分散状、多層状、エアゾール状等から任意の剤型を成す。本発明の薬剤中における前記ビワ抽出物の含有量は、0.01〜100質量％の範囲であり、好ましくは1〜50質量％の範囲である。
【００１７】
本発明の薬剤は、特に非経口投与の剤型の１つである外用製剤であることが好ましい。また本発明の薬剤はそれ自体が外用製剤となり得る他、化粧品類や医薬部外品類の製造における添加成分としても使用される。外用の形態としては、具体的には化粧水（美白用や抗老化用も含む）、乳液（美白用や抗老化用も含む）、クリーム（美白用や抗老化用も含む）、ローション（美白用や抗老化用も含む）、パック（美白用や抗老化用も含む）、石鹸やボディーシャンプー、洗顔料、口紅、ファンデーション等の化粧品類が挙げられる。また軟膏や貼付剤、ローション剤、パップ剤、リニメント剤等の医薬品類並びに医薬部外品類が挙げられる。化粧品類や医薬部外品類における本発明の薬剤の含有量は、0.001〜50質量％の範囲である。
【００１８】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの内容に限定されるものではない。
【実施例１】
【００１９】
（製造例１）ビワ抽出物の製造
ビワ葉を粉砕したもの10ｇに50％1,3-ブチレングリコール水溶液100mLを加え１0日間、室温にて浸漬抽出した後、次いで吸引ろ過して残留物を除去することでビワ抽出物を得た。
【実施例２】
【００２０】
（試験例１）ＣＹＰ１Ｂ１の発現阻害活性の測定
１．ＣＹＰ１Ｂ１発現誘発成分（タバコエキス）の調製
タバコ５本分の主煙をアスピレーターにて吸引し、ヘキサン100mL中にてバブリングさせた。次いでヘキサン抽出物を濃縮乾固した後、各々DMSO5mLに溶解して下記の測定に用いた。
２．ＣＹＰ１Ｂ１の発現阻害活性の測定
非喫煙者の健常人より採取した皮膚線維芽細胞を24穴プレートに播種し、10％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地(シグマ社製)にてサブコンフルエントまで培養した。次いで細胞を血清飢餓とし、培地3mLに対して製造例１のビワ抽出物を10mL添加し、2時間培養した。陰性対照は50％1,3-ブチレングリコール水溶液を用いて同様の処理を施した。次いで上記のタバコエキス20.1μLをこれらの培地に加え、24時間培養後、細胞を回収した。Fast Pure RNA kit(タカラバイオ社製)を用いて全ＲＮＡを抽出した後、ＣＹＰ１Ｂ１の発現量をＲＴ−ＰＣＲ法にて解析した。内部標準としてグリセロールー３−リン酸脱水素酵素（以下以降、Ｇ３ＰＤＨと記す）を調べた。内部標準に対する比を求めた後、陰性対照との比を算出することで、ＣＹＰ１Ｂ１発現活性とした。以下に解析に用いたＣＹＰ１Ｂ１及びＧ３ＰＤＨのプライマーを示した。
GA3PDH sense；CTGGGCTACACTGAGCACCA  
G3APDH antisense；CAGCGTCAAAGGTGGAGGGA  
CYP1B1 sense；CGCAACTTCAGCAACTTCTAGG  
CYP1B1 antisense；CCGCAGAGAGGATAAAGG  
【００２１】
（試験例１の結果）
製造例１のビワ抽出物のＣＹＰ１Ｂ１発現活性を試験した結果、タバコエキス誘発刺激において、ビワ抽出物は陰性対照と比較して７０％のＣＹＰ１Ｂ１発現活性を示した。従って、本発明で有効成分として用いられるビワ抽出物は優れたＣＹＰ１Ｂ１の発現阻害作用を有することが判明した。
【実施例３】
【００２２】
（製造例２）ＣＹＰ１Ｂ１発現阻害剤の製造（経口投与剤）
１．製造例１のビワ抽出物  10g
２．無水カフェイン  0.5g
３．ショ糖  4.0g
４．ソルビトール  7.0g
５．クエン酸  10.0g
６．安息香酸ナトリウム  0.05g
７．ミックスフルーツフレーバー  0.1g
上記１〜７の成分を精製水に溶解した後、ｐＨを4.0に調整し、精製水を加えて全量を100mLとした。この液をろ紙でろ過し、滅菌装置を用いて、ろ液を８０℃で２５分間加熱滅菌することで、経口投与用のＣＹＰ１Ｂ１発現阻害剤を得た。
【実施例４】
【００２３】
（製造例３）ＣＹＰ１Ｂ１発現阻害剤の製造（経皮投与剤）
１．スクワラン  10％
２．ベヘニルアルコール  1.0％
３．セテアリルアルコール  1.5％
４．ジメチコン  2.4％
５．ステアリン酸グリセリル  5.0％
６．ブチルパラベン  0.1％
７．製造例１のビワ抽出物  10.0％
８．グリセリン  5.0％
９．ステアロイルグルタミン酸ナトリウム  0.2％
１０．ＰＥＧ−６０水添ヒマシ油  1.0％
１１．キサンタンガム  0.2％
１２．メチルパラベン  0.2％
１３．精製水  残余
上記１〜６の成分を加熱混合し、次いで７〜１３を混合した水溶液に添加して乳化させることで経皮投与用のＣＹＰ１Ｂ１発現阻害剤を得た。