(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体に含有されるＤＮＡをＰＣＲ法により解析するために用いられるＤＮＡ解析マイクロ流路チップであって、
シリコンからなる第１層（１０１）および
プラスチックからなる第２層（１０２）
を具備し、ここで、
前記第２層（１０２）が前記検体の種類および解析される対象物に応じて可変的に選択されるように、前記第２層（１０２）は前記第１層（１０１）上に積層され、
前記第１層（１０１）は、
少なくとも４個の開口部（２９１、２９２、２９３、２９４）、
２以上のＰＣＲリアクタ（２０３、２０４、４０３、４０４）、
前記ＰＣＲリアクタの間に設けられた少なくとも１つのフィルタ（２０６）、および
前記開口部、各ＰＣＲリアクタおよび前記少なくとも１つのフィルタの間と連通するマイクロ流路
を具備し、
前記第２層（１０２）は、
前記ＰＣＲ法のために用いられる試薬（１、２）、
ポンプ（３１２）、および
センサ（３１５）
を具備し、
第１層（１０１）の法線方向から見たときに、前記試薬（１、２）は、前記少なくとも４個の開口部に含まれる少なくとも１つの開口部（２９１）に重なり合い、
第１層（１０１）の法線方向から見たときに、前記ポンプ（３１２）は、前記少なくとも４個の開口部に含まれる少なくとも２つの開口部（２９２、２９３）に重なり合い、
前記ポンプにより、前記試薬は、前記マイクロ流路を介して前記ＰＣＲリアクタに供給され、
前記ＰＣＲリアクタには、前記試薬および前記検体の混合物が供給され、
前記混合物は、前記ＰＣＲリアクタから前記少なくとも４個の開口部に含まれる少なくとも１つの開口部（２９４）を介して前記センサに送られ、前記センサを用いて前記検体に含有されるＤＮＡを解析する、ＤＮＡ解析マイクロ流路チップ。
【請求項２】
請求項１記載のＤＮＡ解析マイクロ流路チップにおいて、前記ＰＣＲリアクタの周辺部のうち、マイクロ流路と接続されている付近以外のシリコン領域が掘り抜かれていることを特徴とする、ＤＮＡ解析マイクロ流路チップ。
【請求項３】
請求項１記載のＤＮＡ解析マイクロ流路チップにおいて、前記フィルタは、シリコンのエッチングで形成された円柱形状のピラーにより構成され、前記ピラー間の間隔が１０μｍ以下、１μｍ以上であることを特徴とする、ＤＮＡ解析マイクロ流路チップ。
【請求項４】
請求項１記載のＤＮＡ解析マイクロ流路チップにおいて、前記ポンプにポリマーアクチュエータを用いることを特徴とする、ＤＮＡ解析マイクロ流路チップ。
【請求項５】
検体に含有されるＤＮＡをＰＣＲ法により解析する方法であって、
第１層（１０１）および複数の第２層（１０２）を用意する工程（ａ）、ここで、
前記第１層（１０１）は、シリコンからなり、
前記第１層（１０１）は、
少なくとも４個の開口部（２９１、２９２、２９３、２９４）、
２以上のＰＣＲリアクタ（２０３、２０４、４０３、４０４）、
前記ＰＣＲリアクタの間に設けられた少なくとも１つのフィルタ（２０６）、および
前記開口部、各ＰＣＲリアクタおよび前記少なくとも１つのフィルタの間と連通するマイクロ流路
を具備し、
各第２層（１０２）は、プラスチックからなり、
各第２層（１０２）は、
前記ＰＣＲ法のために用いられる試薬（１、２）、
ポンプ（３１２）、および
センサ（３１５）
を具備し、
前記複数の第２層（１０２）の中から、前記検体の種類および解析される対象物に応じて１つの第２層（１０２）を選択する工程（ｂ）、
工程（ｂ）において選択された第２層を前記第１層（１０１）上に積層し、ＤＮＡ解析マイクロ流路チップを得る工程（ｃ）、ここで、
第１層（１０１）の法線方向から見たときに、前記試薬（１、２）は、前記少なくとも４個の開口部に含まれる少なくとも１つの開口部（２９１）に重なり合い、かつ
第１層（１０１）の法線方向から見たときに、前記ポンプ（３１２）は、前記少なくとも４個の開口部に含まれる少なくとも２つの開口部（２９２、２９３）に重なり合い、
前記ＤＮＡ解析マイクロ流路チップの内部に、前記検体を供給する工程（ｄ）、
前記ポンプにより、前記試薬を、前記マイクロ流路を介して前記ＰＣＲリアクタに供給する工程（ｅ）、
ここで、前記ＰＣＲリアクタには、前記試薬および前記検体の混合物が供給され、
前記ＰＣＲリアクタにおいて、前記ＰＣＲ法を実施し、ＰＣＲ生成物を得る工程（ｆ）、
前記工程（ｆ）において得られたＰＣＲ生成物を、前記ＰＣＲリアクタから前記少なくとも４個の開口部に含まれる少なくとも１つの開口部（２９４）を介して前記センサに送る工程（ｇ）、および
前記センサを用いて前記ＰＣＲ生成物を感知して、前記検体に含有されるＤＮＡを解析する工程（ｈ）
を含む、検体に含有されるＤＮＡをＰＣＲ法により解析する方法。
【請求項６】
検体に含有されるＤＮＡをＰＣＲ法によりＤＮＡ解析マイクロ流路チップを用いて解析する方法であって、
以下を具備するＤＮＡ解析マイクロ流路チップを用意する工程（ａ’）
シリコンからなる第１層（１０１）および
プラスチックからなる第２層（１０２）、ここで、
前記第２層（１０２）は前記第１層（１０１）上に積層され、
前記第１層（１０１）は、
少なくとも４個の開口部（２９１、２９２、２９３、２９４）、
２以上のＰＣＲリアクタ（２０３、２０４、４０３、４０４）、
前記ＰＣＲリアクタの間に設けられた少なくとも１つのフィルタ（２０６）、および
前記開口部、各ＰＣＲリアクタおよび前記少なくとも１つのフィルタの間と連通するマイクロ流路
を具備し、
前記第２層（１０２）は、
前記ＰＣＲ法のために用いられる試薬（１、２）、
ポンプ（３１２）、および
センサ（３１５）
を具備し、
第１層（１０１）の法線方向から見たときに、前記試薬（１、２）は、前記少なくとも４個の開口部に含まれる少なくとも１つの開口部（２９１）に重なり合い、かつ
第１層（１０１）の法線方向から見たときに、前記ポンプ（３１２）は、前記少なくとも４個の開口部に含まれる少なくとも１つの開口部（２９２、２９３）に重なり合い、
前記ＤＮＡ解析マイクロ流路チップの内部に、前記検体を供給する工程（ｄ）、
前記ポンプにより、前記試薬を、前記マイクロ流路を介して前記ＰＣＲリアクタに供給する工程（ｅ）、
ここで、前記ＰＣＲリアクタには、前記試薬および前記検体の混合物が供給され、
前記ＰＣＲリアクタにおいて、前記ＰＣＲ法を実施し、ＰＣＲ生成物を得る工程（ｆ）、
前記工程（ｆ）において得られたＰＣＲ生成物を、前記ＰＣＲリアクタから前記少なくとも４個の開口部に含まれる少なくとも１つの開口部（２９４）を介して前記センサに送る工程（ｇ）、および
前記センサを用いて前記ＰＣＲ生成物を感知して、前記検体に含有されるＤＮＡを解析する工程（ｈ）、
を含む、検体に含有されるＤＮＡをＰＣＲ法によりＤＮＡ解析マイクロ流路チップを用いて解析する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、シリコンならびにプラスチックの積層基板上に形成されたマイクロ流路チップに関する。更に詳細には、本開示は、迅速・簡便に遺伝子を含む検体から所望のＤＮＡを抽出、増幅、またはその配列を検出するための機能を集積したマイクロ流路チップに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ＤＮＡ解析技術の向上により、遺伝子の多様性解析や発現解析の進展が目覚しい。特に医療分野では、遺伝子と疾患の関係が注目されている。例えば、疾患に関連した個々の遺伝子情報（特定のＤＮＡ配列）を解析することで、患者個人毎に適切な治療や投薬を行うこと（テーラーメイド医療）が可能になってきた。テーラーメイド医療では、その場診断が最も望ましく、ＰＯＣＴ（Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ  Ｔｅｓｔｉｎｇ）性が高く、迅速、簡便な手法が求められる。そのため、血液など、採取した検体から解析対象の遺伝子のＤＮＡを抽出、増幅し、その配列の検出を迅速・簡便に行えるデバイスの実現が強く求められている。【０００３】
これらの要求に応える手段の１つとして、近年、マイクロ・トータル・アナリシス・システムズ（μＴＡＳ）（またはラブ・オン・チップ（Ｌａｂ−ｏｎ−Ｃｈｉｐ）と呼ばれる）が注目されている。μＴＡＳやＬａｂ−ｏｎ−ｃｈｉｐは基板内にマイクロメートルオーダーの微細構造で構成されたマイクロ流路やポートを設け、その構造内で物質の混合、抽出、精製、化学反応及び／または分析など各種の操作を行うことができ、一部は実用化されている。各種の操作が微細構造内で行われるため、常用サイズの同種の装置に比べて、（１）サンプルおよび試薬の使用量が著しく少ない、（２）分析時間が短い、（３）感度が高い、（４）現場に携帯し、その場で分析できる、及び（５）使い捨てできるなどの特徴を有する。このような目的のために作製された、基板内にマイクロ流路およびポート等の微細構造を有する構造物は総称してマイクロ流路チップ又はマイクロ流体デバイスと呼ばれる。【０００４】
マイクロ流路チップを用いて短時間で検体中の遺伝子内のＤＮＡを解析するためには、チップ内に抽出・増幅の機能を組み込む必要があり、血球などの不純物を分離する微細なフィルタや高速で昇降温温度可能なＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）の実現が要求される。加えて、使用の簡便性が要求されるため、検体や試薬などをチップ内に安定して保持できることが望ましい。さらに、テーラーメイド医療用途では、血液から処理が可能である構成であることや、検出部でＤＮＡ中の一塩基多系（ＳＮＰ）をセンシングできることが望ましい。すなわち、使用状況に柔軟に対応できる汎用性の高いチップの実現が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】ＢｉｏＭｅｄ  Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅ  （２０１１）  １３：１９−２７
【非特許文献２】Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ４３ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  （ＩＭＡＰＳ２０１０）  ００００３６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、マイクロ流路チップを構成する基板材料の性質の制約から、前述した要求に全て答えられるマイクロ流路デバイスの実現が難しい。その理由を以下に説明する。【０００７】
マイクロ流路チップの基板材料は、プラスチックやシリコンが用いられる。プラスチック基板は、材料代が比較的安価、切削加工しやすい、生体・バイオ材料と比較的親和性が高くて試薬の保持がしやすいなどの特徴を持つ反面、サブマイクロメートルオーダーの微細構造の加工が難しいことや材料の熱伝導性が優れないため、血球などの不純物を分離するための微細なフィルタ構造や、ＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）のように高速の昇降温が要求されるサーマルリアクタの形成に向かないことが課題であった。また、シリコン基板は、半導体リソグラフィ技術により微細構造を容易に形成でき、熱伝導率はプラスチックの２〜３桁高いことから、微細なフィルタ構造やＰＣＲサーマルリアクタの形成に向く反面、材料単価がプラスチックと比較すると高価なことや、シリコンの表面と生体・バイオ材料との親和性が必ずしも高くないため、タンパク質やＤＮＡの非特異吸着が起り、試薬の保存に向かないことが課題であった。このように、プラスチックとシリコンはそれぞれ相反する利点と欠点が存在し、各々の基板のみを用いた構成ではＤＮＡ解析用途のマイクロ流路チップに要求される条件を十分に満たすことができなかった。【０００８】
上記課題を解決する手段として、シリコン基板とプラスチック基板を積層したマイクロ流路チップが提案されている（例えば、非特許文献１、非特許文献２参照。）。
非特許文献１では、プラスチックとシリコンを積層し、マイクロ流路チップと送液部を分けて配置する構造が開示されている。しかしながら、この方法によると、サーマルリアクタがプラスチック材料で構成されている上、そのリアクタがガラス基板を挟んで加熱面であるシリコンから隔離されているため熱接触が非常に取りにくく、熱伝達が悪いため、高速な昇降温には対応できない。また、検体や試薬をチップ外部から供給する構造になっているため、簡便に使用できない。そのため、迅速・簡便な処理に向かないことが問題であった。【０００９】
非特許文献２では、サーマルリアクタをシリコンチップ内に形成し、チップ内部から検体や試薬を供給する構造が開示されている。それゆえ、高速な昇降温、簡便な処理に対応できる。しかしながら、この方法によると、センサはＤＮＡマイクロアレイチップに限定されており、それがサーマルリアクタ（ＰＣＲ）と同一のシリコン基板に形成されている。すなわち、サーマルリアクタとセンサの製造工程は、続いて行われる必要があり、使用目的に応じた設計の変更が柔軟に行えない。さらに、搭載されているサーマルリアクタは１基のみであり、検体は精製されたゲノムしか使えず、血液からの処理ができない構成になっている。血液から解析対象となるゲノム抽出することを目的としたＰＣＲと、その解析対象中のＳＮＰの有無によって選択的にＤＮＡを増幅することを目的したＰＣＲ等、ＰＣＲが２段階必要な用途には対応できない。さらに。その間に生じた血液由来の血球を分離・除去するためのフィルタが存在しない。すなわち、血液からの検出の用途には対応できず、汎用性に乏しいことが問題であった。【００１０】
すなわち、開示されている方法においては、迅速・簡便にＤＮＡ解析を行うために必要な高機能なマイクロ流路チップ構成と、高い汎用性を有するマイクロ流路チップ構成の両立ができないことが非常に大きな課題であった。【００１１】
本開示は、上記課題を解決するためになされたものであり、ＤＮＡ解析マイクロ流路チップにおいて、ＤＮＡの抽出、増幅、またはその配列の検出を迅速・簡便に行うことを実現すると同時に、チップの高い汎用性を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記目的を達成する本開示に係るＤＮＡ解析マイクロ流路チップは、検体に含有されるＤＮＡをＰＣＲ法により解析するために用いられるＤＮＡ解析マイクロ流路チップであって、
シリコンからなる第１層（１０１）および
プラスチックからなる第２層（１０２）
を具備し、ここで、
前記第２層（１０２）が前記検体の種類および解析される対象物に応じて可変的に選択されるように、前記第２層（１０２）は前記第１層（１０１）上に積層され、
前記第１層（１０１）は、
少なくとも４個の開口部（２９１、２９２、２９３、２９４）
２以上のＰＣＲリアクタ（２０３、２０４、４０３、４０４）、および
前記開口部および各ＰＣＲリアクタの間と連通するマイクロ流路
を具備し、
前記第２層（１０２）は、
前記ＰＣＲ法のために用いられる試薬（１、２）、
ポンプ（３１２）、
センサ（３１５）
を具備し、
第１層（１０１）の法線方向から見たときに、前記試薬（１、２）は、前記複数の開口部の少なくとも１つの開口部に重なり合い、
第１層（１０１）の法線方向から見たときに、前記ポンプ（３１２）は、前記複数の開口部の少なくとも２つの開口部に重なり合い、
前記ポンプにより、前記試薬は、前記マイクロ流路を介して前記ＰＣＲリアクタに供給され、
前記ＰＣＲリアクタには、前記試薬および前記検体の混合物が供給され、
前記混合物は、前記ＰＣＲリアクタから前記センサに送られ、前記センサを用いて前記検体に含有されるＤＮＡをＰＣＲ法により解析する。【００１３】
上記構造にすることによって、高速な昇降温が可能なＰＣＲが組み込める、および検体・試薬をチップ内部で操作および保存できるようになるため、迅速・簡便にＤＮＡ解析を行える。それと同時に、この構造にすることによって、ゲノムのみならず血液を対象としたＰＣＲ増幅およびフィルタリングが可能になる。それゆえ、チップＡの構成を変えずに、チップＢの試薬、送液機構およびセンサの構成を変えるだけで、（１）ゲノムからのＤＮＡの抽出・増幅、（２）血液からのＤＮＡ抽出・増幅、（３）ゲノムまたは血液からのアレル特異ＤＮＡの抽出増幅、（４）ゲノムまたは血液からのＳＮＰ検出など複数用途（少なくとも４種類）への対応が可能になる。すなわち、チップに高い汎用性を付加できるようになる。
【発明の効果】
【００１４】
本開示によれば、ＤＮＡ解析マイクロ流路チップにおいて、ＤＮＡの抽出、増幅、またはその配列の検出を迅速・簡便に行えると同時に、チップを多様な用途に用いることが可能になり、汎用性が高まる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本開示のＤＮＡ解析マイクロ流路チップの全般的概念図
【図２】本開示のＤＮＡ解析マイクロ流路チップの構成要素を示す模式図
【図３（ａ）】本開示のＤＮＡ解析マイクロ流路チップの構成要素を示す断面模式図であって、試薬、ポンプ、バルブを含む断面図
【図３（ｂ）】本開示のＤＮＡ解析マイクロ流路チップの構成要素を示す断面模式図であって、センサを含む断面図
【図４】本開示のシリコンチップ内に含まれる構成要素のレイアウト図
【図５】本開示のプラスチックチップ内に含まれる構成要素のレイアウト図
【図６】（ａ）本開示の方法を用いて得られたシリコンチップ、（ｂ）本開示の方法を用いて得られたフィルタのＳＥＭ写真
【図７】本開示の方法を用いて得られたプラスチックチップとそれに接合されたシリコンチップ
【図８】本開示の汎用性を示す実施例の表
【図９】本開示の実施例１で得られた遺伝子型解析の結果を示す。
【図１０】本開示の実施例２で得られた遺伝子型解析の結果を示す。
【図１１】本開示の実施例３で得られた遺伝子型解析の結果を示す。
【図１２】本開示の実施例４で得られた遺伝子型解析の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本開示の第１態様に係るＤＮＡ解析マイクロ流路チップは、検体に含有されるＤＮＡをＰＣＲ法により解析するために用いられるＤＮＡ解析マイクロ流路チップであって、
シリコンからなる第１層（１０１）および
プラスチックからなる第２層（１０２）
を具備し、ここで、
前記第２層（１０２）が前記検体の種類および解析される対象物に応じて可変的に選択されるように、前記第２層（１０２）は前記第１層（１０１）上に積層され、
前記第１層（１０１）は、
少なくとも４個の開口部（２９１、２９２、２９３、２９４）、
２以上のＰＣＲリアクタ（２０３、２０４、４０３、４０４）、
前記ＰＣＲリアクタの間に設けられた少なくとも１つのフィルタ（２０６）、および
前記開口部、各ＰＣＲリアクタおよび前記少なくとも１つのフィルタの間と連通するマイクロ流路
を具備し、
前記第２層（１０２）は、
前記ＰＣＲ法のために用いられる試薬（１、２）、
ポンプ（３１２）、および
センサ（３１５）
を具備し、
第１層（１０１）の法線方向から見たときに、前記試薬（１、２）は、前記少なくとも４個の開口部に含まれる少なくとも１つの開口部（２９１）に重なり合い、
第１層（１０１）の法線方向から見たときに、前記ポンプ（３１２）は、前記少なくとも４個の開口部に含まれる少なくとも２つの開口部（２９２、２９３）に重なり合い、
前記ポンプにより、前記試薬は、前記マイクロ流路を介して前記ＰＣＲリアクタに供給され、
前記ＰＣＲリアクタには、前記試薬および前記検体の混合物が供給され、
前記混合物は、前記ＰＣＲリアクタから前記少なくとも４個の開口部に含まれる少なくとも１つの開口部（２９４）を介して前記センサに送られ、前記センサを用いて前記検体に含有されるＤＮＡを解析する。
【００１７】
第２態様に係るＤＮＡ解析マイクロ流路チップは、上記第１態様において、前記ＰＣＲリアクタの周辺部のうち、マイクロ流路と接続されている付近以外のシリコン領域が掘り抜かれていてもよい。
上記のように、ＰＣＲリアクタの外周部を概ね掘り抜いて、周辺部と熱的に分離された構造とすることによって、リアクタ外周部への放熱、外周部からの吸熱を抑制できるため、より高速な昇降温が可能なＰＣＲができるようになり、より迅速なＤＮＡ解析が行える。
【００１８】
第３態様に係るＤＮＡ解析マイクロ流路チップは、上記第１態様において、前記フィルタは、シリコンのエッチングで形成された円柱形状のピラーにより構成され、前記ピラー間の間隔が１０μｍ以下、１μｍ以上であってもよい。
上記のように、ピラー間の間隔を１０μｍ以下、１μｍ以上とすることによって、検体に血液を用いたとき、ＰＣＲリアクタで破砕された不要な血球成分を、フィルタを目詰まりさせることなく、フィルタで効率的に取り除くことができる。
【００１９】
第４態様に係るＤＮＡ解析マイクロ流路チップは、上記第１態様において、前記送液機構にポリマーアクチュエータを用いてもよい。
上記のように送液機構（例えば、ポンプ）にポリマーアクチュエータを用いることによって、送液を行うことに対して高い発生力が得られるため、フィルタでの検体由来物質の目詰まりを起こしにくい。さらに、送液機構（例えば、バルブ）にポリマーアクチュエータを用いることによって、送液を止めることに対して、高い耐圧性が得られるため、流路へのリークを抑制することができる。これらより、安定したチップ動作が行える。
【００２０】
本開示の第５態様に係る検体に含有されるＤＮＡをＰＣＲ法により解析する方法は、検体に含有されるＤＮＡをＰＣＲ法により解析する方法であって、
第１層（１０１）および複数の第２層（１０２）を用意する工程（ａ）、ここで、
前記第１層（１０１）は、シリコンからなり、
前記第１層（１０１）は、
少なくとも４個の開口部（２９１、２９２、２９３、２９４）、
２以上のＰＣＲリアクタ（２０３、２０４、４０３、４０４）、
前記ＰＣＲリアクタの間に設けられた少なくとも１つのフィルタ（２０６）、および
前記開口部、各ＰＣＲリアクタおよび前記少なくとも１つのフィルタの間と連通するマイクロ流路
を具備し、
各第２層（１０２）は、プラスチックからなり、
各第２層（１０２）は、
前記ＰＣＲ法のために用いられる試薬（１、２）、
ポンプ（３１２）、および
センサ（３１５）
を具備し、
前記複数の第２層（１０２）の中から、前記検体の種類および解析される対象物に応じて１つの第２層（１０２）を選択する工程（ｂ）、
工程（ｂ）において選択された第２層を前記第１層（１０１）上に積層し、ＤＮＡ解析マイクロ流路チップを得る工程（ｃ）、ここで、
第１層（１０１）の法線方向から見たときに、前記試薬（１、２）は、前記少なくとも４個の開口部に含まれる少なくとも１つの開口部（２９１）に重なり合い、かつ
第１層（１０１）の法線方向から見たときに、前記ポンプ（３１２）は、前記少なくとも４個の開口部に含まれる少なくとも２つの開口部（２９２、２９３）に重なり合い、
前記ＤＮＡ解析マイクロ流路チップの内部に、前記検体を供給する工程（ｄ）、
前記ポンプにより、前記試薬を、前記マイクロ流路を介して前記ＰＣＲリアクタに供給する工程（ｅ）、
ここで、前記ＰＣＲリアクタには、前記試薬および前記検体の混合物が供給され、
前記ＰＣＲリアクタにおいて、前記ＰＣＲ法を実施し、ＰＣＲ生成物を得る工程（ｆ）、
前記工程（ｆ）において得られたＰＣＲ生成物を、前記ＰＣＲリアクタから前記少なくとも４個の開口部に含まれる少なくとも１つの開口部（２９４）を介して前記センサに送る工程（ｇ）、および
前記センサを用いて前記ＰＣＲ生成物を感知して、前記検体に含有されるＤＮＡを解析する工程（ｈ）
を含む。
【００２１】
本開示の第６態様に係る検体に含有されるＤＮＡをＰＣＲ法によりＤＮＡ解析マイクロ流路チップを用いて解析する方法は、検体に含有されるＤＮＡをＰＣＲ法によりＤＮＡ解析マイクロ流路チップを用いて解析する方法であって、
以下を具備するＤＮＡ解析マイクロ流路チップを用意する工程（ａ’）
シリコンからなる第１層（１０１）および
プラスチックからなる第２層（１０２）、ここで、
前記第２層（１０２）は前記第１層（１０１）上に積層され、
前記第１層（１０１）は、
少なくとも４個の開口部（２９１、２９２、２９３、２９４）、
２以上のＰＣＲリアクタ（２０３、２０４、４０３、４０４）、
前記ＰＣＲリアクタの間に設けられた少なくとも１つのフィルタ（２０６）、および
前記開口部、各ＰＣＲリアクタおよび前記少なくとも１つのフィルタの間と連通するマイクロ流路
を具備し、
前記第２層（１０２）は、
前記ＰＣＲ法のために用いられる試薬（１、２）、
ポンプ（３１２）、および
センサ（３１５）
を具備し、
第１層（１０１）の法線方向から見たときに、前記試薬（１、２）は、前記少なくとも４個の開口部に含まれる少なくとも１つの開口部（２９１）に重なり合い、かつ
第１層（１０１）の法線方向から見たときに、前記ポンプ（３１２）は、前記少なくとも４個の開口部に含まれる少なくとも１つの開口部（２９２、２９３）に重なり合い、
前記ＤＮＡ解析マイクロ流路チップの内部に、前記検体を供給する工程（ｄ）、
前記ポンプにより、前記試薬を、前記マイクロ流路を介して前記ＰＣＲリアクタに供給する工程（ｅ）、
ここで、前記ＰＣＲリアクタには、前記試薬および前記検体の混合物が供給され、
前記ＰＣＲリアクタにおいて、前記ＰＣＲ法を実施し、ＰＣＲ生成物を得る工程（ｆ）、
前記工程（ｆ）において得られたＰＣＲ生成物を、前記ＰＣＲリアクタから前記少なくとも４個の開口部に含まれる少なくとも１つの開口部（２９４）を介して前記センサに送る工程（ｇ）、および
前記センサを用いて前記ＰＣＲ生成物を感知して、前記検体に含有されるＤＮＡを解析する工程（ｈ）、
を含む。
【００２２】
以下、本開示の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。
【００２３】
（実施の形態１）
図１は、本開示のマイクロ流路チップの全般的概念図である。本開示におけるＤＮＡ解析マイクロ流路チップは、シリコン層１０１（チップＡ）とプラスチック層１０２（チップＢ）が積層された構造を有する。前記チップＡは、マイクロ流路中に少なくとも２つ以上直列に接続されたＰＣＲリアクタと、前記ＰＣＲリアクタ間に複数本のシリコンピラーで構成される少なくとも１つのフィルタを具備し、前記チップＢは、マイクロ流路中に試薬、送液機構およびセンサを具備し、かつ前記試薬、送液機構およびセンサは、検体の種類および検出対象によって可変できることを特徴とする。検体や試薬の投入や各処理は図１の矢印の順番に進む。
【００２４】
図２は、本開示のＤＮＡ解析マイクロ流路チップの構成要素を示す模式図である。チップＡの材質は、シリコンであり、シリコン基板上にフォトリソグラフィとＲＩＥ（リアクティブイオンガスエッチング）により流路および構造体を掘りこみ、ＰＣＲ１：２０３とＰＣＲ２：２０４の他にミキサー２０５およびフィルタ２０６を形成し、図のように接続する。
【００２５】
チップＢの材質は、プラスチックであり、ＰＭＭＡ（ポリメタクリル酸メチル樹脂）やＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキ酸）を用いることが好ましい。また、シリコン層との接続部は、接着層やエラストマーを用いるのが好ましい。試薬は、それぞれのＰＣＲリアクタでの反応に用いるプライマーやポリメラーゼなどの試薬（１）、（２）の他に、センサに用いる試薬（３）がこのチップ内に配置される。検体は、孔２０７、試薬（１）、試薬（２）はそれぞれ孔２０８、孔２０９から注入する。試薬は、フリーズドライ化させておき、使用するときにバッファ液を注ぎ込んで溶かして使ってもよい。また、チップＢには送液機構を有し、ポンプ２１０およびバルブ２１１を配置し、試薬をチップＡ内へ注ぐ機能を備える、その投入量、タイミングを制御する。
【００２６】
図３（ａ）及び図３（ｂ）は、本開示のＤＮＡ解析マイクロ流路チップの構成要素を示す断面模式図である。
図３（ａ）は、試薬、ポンプ、バルブを含む断面図である。ポンプ３１０は、バルブ３１１は、プラスチック部に埋め込まれ、脱着が容易にできるようになっている。ポンプの駆動部のアクチュエータ３１２は、ピエゾ素子やポリマーアクチュエータを用いるとよく、メンブレン３１３を上下できるように配置される。チップが使い捨てで使われることを想定すると、ポリマーアクチュエータを用いることが特に好ましい。図に示す通り、これらは下面のシリコンで形成されたポートと流路に接続され、シリコン層内での送液が行うことができる。シリコン層のマイクロ流路は、下面から、フォトリソグラフィとＲＩＥによってパターニングされる。また、パターニングされた流路を密閉させるために、パイレックスガラス３１４を蓋として用いる。パイレックスガラス３１４は、陽極酸化法でシリコン面に対して接合されている。また、プラスチックとシリコンのマイクロ流路を接続するために、プラスチック層を接合する前に上面から貫通穴を形成している。
【００２７】
図３（ｂ）は、センサを含む箇所の断面図である。センサチップ３１５は検出面３１６が下面を向くように配置される。またセンサチップ３１７は脱着可能な状態にしておくことが好ましい。さらに検出面に試薬（３）をドライケム化してキャビティ３１８に保持しておいてもよい。またセンサチップとシリコンチップとの距離が遠い場合はスペーサ３１９を設けてもよい。センサのキャビティに送液するとき、脱気が必要になるため、空気穴３２０を上面に設けるとよい。
【００２８】
図４は、本開示の実施の形態に用いたシリコンチップ内に含まれる構成要素のレイアウト図を示す。
シリコン基板の厚さは５００〜８００μｍ程度が好ましい。２枚のマスクを用いて上面および下面からそれぞれのパーツがエッチングされる。ＰＣＲ１の４０３、ＰＣＲ２の４０４の周りは概ねＲＩＥにより上面および下面の両面からエッチングされ、完全に掘り抜かれ、熱的に孤立している。一方で、流路およびミキサー４０５、マイクロシーブ４０６は、ＲＩＥによって下面より約３００μｍの深さをエッチングして形成され、パイレックスガラスを陽極酸化接合し、表面がふさがれている。孔４０７，４０８，４０９とプラスチック部との接続部の貫通穴は、ＲＩＥによって上面より約３００μｍの深さをエッチングして形成されている。
【００２９】
また、図５は、本開示のプラスチックチップ内に含まれる構成要素のレイアウト図を示す。符号５１０の箇所にポリマーアクチュエータのポンプ、符号５１１の箇所にはポリマーアクチュエータのバルブが取りつけられる。また、符号５１５にはセンサが接続される。
【００３０】
図６（ａ）は、本実施の形態によって実際に作製されたＤＮＡ解析マイクロ流路チップのシリコンチップ部の写真である。また加工の一例として、図６（ｂ）は、本実施の形態の方法によって実際に作製されたフィルタ部の写真である。
【００３１】
図７は、実施の形態によって実際に作製されたＤＮＡ解析マイクロ流路チップのプラスチックチップとそれに接合されたシリコンチップの写真である。
【実施例】
【００３２】
図８は、実施の形態で説明した本開示のＤＮＡ解析マイクロチップを４種類の目的に対して使用した実施例を表にまとめたものである。以下に、試薬の構成を記載する。
（Ａ）タカラバイオ製のＴａｑ−ポリメラーゼ：０．２・Ｌ、ＰＣＲ  ｍｉｘ：３・Ｌ、水：２μＬ、２ｍＭｄＮＴＰ：１・Ｌ、１０・Ｍ  Ｐｒｉｍｅｒ１：１・Ｌ、１０・Ｍ  Ｐｒｉｍｅｒ２：１・Ｌ（それぞれのＰｒｉｍｅｒ配列は※に記載）
（Ｂ）東洋紡製ＫＯＤ−ＦＸポリメラーゼ：０．２・Ｌ、２×ＫＯＤ−Ｂｕｆｆｅｒ：５・Ｌ、２ｍＭｄＮＴＰ：  １・Ｌ、１０・Ｍ  Ｐｒｉｍｅｒ３：１・Ｌ、１０・Ｍ  Ｐｒｉｍｅｒ４：１・Ｌ  （それぞれのＰｒｉｍｅｒ配列は※に記載）
（Ｃ）タカラバイオ製のＴａｑ−ポリメラーゼ：０．２・Ｌ、ＰＣＲ  ｍｉｘ：３・Ｌ、Ｐｒｉｍｅｒ３‘：２・Ｌ、Ｐｒｉｍｅｒ４：２・Ｌ、蒸留水１０．８・Ｌ  （それぞれのＰｒｉｍｅｒ配列は※に記載）
（Ｄ）  トリシン緩衝液（ｐＨ８．８）      １．８μＬ      ４５ｍＭ
酸化型ニコチンアミドジヌクレオチド  ０．２μＬ      １ｍＭ
塩化マグネシウム                    ０．４μＬ      １．７ｍＭ
フェリシアン化カリウム              ２μＬ          １０ｍＭ
グリセルアルデヒド−３−リン酸      ０．６６μＬ    １０ｍＭ
ジアホラーゼ                        １μＬ          １０Ｕ／ｍＬ
グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ  １μＬ      ３２Ｕ／ｍＬ
ピロホスファターゼ                  ０．５μＬ      ５Ｕ／ｍＬ
※Ｐｒｉｍｅｒ１（５‘−ＡＣＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＡＣＡＣＴ−３‘：配列番号１）、Ｐｒｉｍｅｒ２（５’−ＧＧＣ  ＡＧＧ  ＴＣＣ  ＴＧＡ  ＡＣＣ  ＴＣ−３’：配列番号２）、Ｐｒｉｍｅｒ３（５‘−ＴＡＧＧＡＡＧＧＡＴＧＴＣＣＴＣＧ−３’：配列番号３）、Ｐｒｉｍｅｒ３‘（５’−ＴＡＧＧＡＡＧＧＡＴＧＴＣＣＴＣＧＴＧＡＣＧ−３’：配列番号４）、およびＰｒｉｍｅｒ４（５’−ＴＴＣＴＴＧＡＴＧＧＣＡＡＡＣＡＣＡＧＴＴＡＡＣ−３’：配列番号５）【００３３】
以下、本開示のＤＮＡ解析マイクロ流路チップの汎用性を示す例を具体的に説明する。なお、本開示は以下の実施例によって限定されるものではない。【００３４】
（例１）
本開示の一実施の形態に係るＤＮＡ解析マイクロ流路チップを用いて、ヒトゲノム検体からアセトアルデヒド脱水素酵素２（ＡＬＤＨ２）遺伝子の第１２エクソンの１１４番目の塩基を含む所望のＤＮＡ断片の抽出・増幅を行った。プライマーは、前述したＰｒｉｍｅｒ１およびＰｒｉｍｅｒ２を用い、断片長１４１ｂｐのＤＮＡ断片の抽出・増幅を試みた。【００３５】
試薬１には、（Ａ）を用い、ミキサーで検体と撹拌した後に、ＰＣＲ１リアクタでの反応を９８℃３０秒、６０℃３０秒、６８℃３０秒の条件で３０サイクルＰＣＲを行った。その後、フィルタおよびＰＣＲ２をそのまま通過させ。この３μＬを採取した。その後、アガロースゲルの電気泳動法により、ＤＮＡ増幅の有無を確かめた。図９の第２レーンがサンプルから採取したＤＮＡフラグメントの増幅有無の結果である。図９の第２レーン（Ｌ２）に示すように、所望のＤＮＡ断片（１４１ｂｐ）が増幅されたことが確認された。【００３６】
（例２）
本開示の一実施の形態に係るＤＮＡ解析マイクロ流路チップを用いて、血液検体からＤＮＡ増幅を行った。ＤＮＡ増幅のモデルとして、テンプレートとしてＡＢ型とＯ型それぞれの血液を用いた。ヒト血液のゲノム中の第６エクソンの２６１番目の塩基を含む、ＤＮＡ断片の抽出・増幅行った。プライマーとして、プライマーは前述したＰｒｉｍｅｒ３およびＰｒｉｍｅｒ４を用い、断片長１３４又は１３５ｂｐのＤＮＡ断片の抽出・増幅を試みた。【００３７】
試薬１には、（Ｂ）を用い、ミキサーで検体と撹拌した後に、ＰＣＲ１リアクタでの反応を９８℃３０秒、６０℃３０秒、６８℃３０秒の条件で３５サイクルＰＣＲを行った。その後、フィルタを通過させ、ＰＣＲリアクタで破砕された不要な血球成分を除去した。そのままＰＣＲ２リアクタを通過させ、この試料液のうち３μＬ採取し、電気泳動により、ＤＮＡ増幅の有無を確かめた。図１０の第２レーンがＡＢ型、第３レーンがＯ型のサンプルから採取したＤＮＡフラグメントの増幅有無の結果である。図１０に示すように、ＡＢ（１３５ｂｐ）およびＯ（１３４ｂｐ）ともにＤＮＡ増幅したことが確認された。【００３８】
（例３）
本開示の一実施の形態に係るＤＮＡ解析マイクロ流路チップを用いて、血液検体からアレル特異ＤＮＡ増幅を行った。アレル特異ＤＮＡ増幅のモデルとして、テンプレートとしてＡＢ型とＯ型それぞれの血液を用いた。ヒトゲノムの第六エクソンの２６１番目の塩基（ＳＮＰ部位）を含むＤＮＡ断片を増幅するプライマーとして、前述したＰｒｉｍｅｒ３およびＰｒｉｍｅｒ４を用いた。第六エクソンの２６１番目の塩基（ＳＮＰ部位）の違いを見分けるアレル特異性プライマーとして、Ｐｒｉｍｅｒ３‘、Ｐｒｉｍｅｒ４を用いて測定を行った。このアレル特異性プライマーはＡＢ型の血液に対してのみ特異的に伸長反応を起こす。【００３９】
試薬１には、（Ｂ）を用い、ミキサーで検体と撹拌した後に、ＰＣＲ１リアクタでの反応を９８℃３０秒、６０℃３０秒、６８℃３０秒の条件で３５サイクルＰＣＲを行った。その後、マイクロシーブで不純物を除去した後、試薬２には（Ｃ）を用い、ＰＣＲ２リアクタを９５℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒の条件で３０サイクルＰＣＲを行った。この試料液のうち３μＬ採取し、電気泳動により、アレル特異ＤＮＡ増幅の有無を確かめた。図１１の第２レーンがＡＢ型、第３レーンがＯ型のサンプルから採取したＤＮＡフラグメントの増幅有無の結果である。図１１に示すように、ＡＢのみが特異的にＤＮＡ増幅したことが確認された。【００４０】
（例４）
本開示の一実施の形態に係るＤＮＡ解析マイクロ流路チップを用いて、血液検体からＳＮＰ検出を行った実施例について説明する。
例３と同様、ＳＮＰ検出のモデルとして、テンプレートとしてＡＢ型とＯ型それぞれの血液を用いた。用いたプライマーの種類は例３と同様である。【００４１】
試薬１には、（Ｂ）を用い、ミキサーで検体と撹拌した後に、ＰＣＲ１リアクタでの反応を９８℃３０秒、６０℃３０秒、６８℃３０秒の条件で３５サイクルＰＣＲを行った。その後、フィルタを通過させ、ＰＣＲリアクタで破砕された不要な血球成分を除去した後、ミキサー２で試薬２と混合し、ＰＣＲ２リアクタに導入、試薬２には（Ｃ）を用い、ＰＣＲ２リアクタを９５℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒の条件で３０サイクルＰＣＲを行った。この試料液のうち１μＬだけをピロリン酸センサに送液し、乾燥させた試薬（Ｄ）と混合し、作用極に６００ｍＶの電圧を印可して、電流値の測定を行った。図１２に示すように、アレル特異ＤＮＡ増幅が起こった場合のみピロリン酸が副生成物として発生したことによりＡＢ型とＯ型でそれぞれ顕著な電流の差が確認し、ＳＮＰの検出ができたことを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本開示によれば、ＤＮＡ解析マイクロ流路チップにおいて、ＤＮＡの抽出、増幅、またはその配列の検出を迅速・簡便に行えると同時に、チップを多様な用途に用いることが可能になり、汎用性が高まる。テーラーメイド医療への貢献が期待される。
【符号の説明】
【００４３】
１０１  シリコン基板
１０２  プラスチック基板
２０３  ＰＣＲ１
２０４  ＰＣＲ２
２０５  ミキサー
２０６  フィルタ
２０７  孔（検体）
２０８  孔（試薬１）
２０９  孔（試薬２）
２１０、３１０  ポンプ
２１１、３１１  バルブ
３１２  アクチュエータ
３１３  メンブレン
３１４  パイレックスガラス
３１５  センサチップ
３１６  検出面
３１７  試薬３
３１８  キャビティ
３１９  スペーサ
３２０  空気穴
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３（ａ）】
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【図３（ｂ）】
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【図４】
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【図８】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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