(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ディスプレイ分子部およびコード部を含む二官能性複合体のライブラリーを生成するスプリット・アンド・ミックス法であって、
各々化学反応部位およびオリゴヌクレオチドタグの酵素的付加のための促進部位を含む発生期二官能性複合体を別々の画分にて供給する工程と、
化学反応部位と一つまたはそれ以上の反応体との間の各々の画分の反応をあらゆる順序で行い、一つまたはそれ以上の酵素を用いて一つまたはそれ以上の反応体を促進部位において識別する一つまたはそれ以上の各々のオリゴヌクレオチドタグを付加する工程と、
二つまたはそれより多くの画分の内容物を一緒にプールし、その後新しい周期の反応のための画分のアレーにプールされた前記内容物をスプリットする工程と、
新しい周期の反応を実行する工程であって、先行する反応周期の最終生成物は、二官能性複合体のライブラリーを得るために発生期二官能性複合体として用いられ、そのライブラリーの各要素は試薬特異的反応生成物および反応生成物の形成に関与する各々の反応体の識別部をコードする各々のタグを含む、工程と、
を含み、
前記酵素がポリメラーゼまたはリガーゼまたはそれらの組み合わせである、方法。
【請求項２】
前記化学反応部位と一つまたはそれ以上の前記反応体との反応において、前記オリゴヌクレオチドタグが二本鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
二つまたはそれより多くのオリゴヌクレオチドタグがＤＮＡ骨格構造からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＤＮＡ骨格構造からなるオリゴヌクレオチドタグが、ＤＮＡリガーゼによって前記促進部位に付加される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドタグのライゲーションが、二本鎖の状態において行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記酵素がＴ４  ＤＮＡリガーゼ又はＴａｑ  ＤＮＡリガーゼである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記二官能性複合体の前記コード部が二本鎖ＤＮＡからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
全てのオリゴヌクレオチドタグを含む前記コード部が、プライマーがオリゴヌクレオチドの３’末端にアニーリングし、ポリメラーゼを用いて伸長するところの伸長方法によって、二本鎖の形に変形する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記伸長方法がリガーゼとポリメラーゼとの組合せによって行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ライブラリーが１０３〜１０６の二官能性複合体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ライブラリーが１０３〜１０１０の二官能性複合体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
異なる二官能性複合体のライブラリーに分配する工程を更に含み、
標的分子を標的にする工程及び二官能性複合体のライブラリーから前記標的分子に対する親和性を有する複合体を選択する工程を更に含む、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記選択する工程を１又は複数回、追加で繰り返す、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記標的分子が固定化されている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
分配するステップにおいて、サイズ排除クロマトグラフィーが用いられる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
選択された二官能性複合体のオリゴヌクレオチド識別部を増幅する工程を更に含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
オリゴヌクレオチド識別部を配列決定する工程を更に含む、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、米国仮出願番号６０／４２２，１６７（２００２年１０月３０日付け出願）；米国仮出願番号６０／４３４，４２５（２００２年１２月１９日付け出願）；および米国仮出願番号６０／４８６，１９９（２００３年７月１１日付け出願）；の利益を請求するものであり、これによって出典明示により当該明細書の一部とする。これらの特許出願または本願明細書において引用した、全ての特許および非特許参考文献を、出典明示により当該明細書の一部とする。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、ディスプレイ分子部（display  molecule  part）およびコード部（coding  part）を含む二官能性複合体を得る方法に関する。本発明はまた二官能性複合体のライブラリーを生成する方法、予め選ばれた特性を有するディスプレイ分子部およびコード部を識別する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
ポリペプチドおよび他の生化学的ポリマーを人工的にコードすることを可能にする方法が開発された。この方法の一例は米国第５７２３５９８号に開示されており、それは二官能性複合体のライブラリー生成に関係がある。二官能性複合体の一方の部位はポリペプチドであり、他方の部位はポリペプチド形成に関わるアミノ酸をコード化および識別する一連のヌクレオチドを含む識別オリゴヌクレオチドである。二官能性分子のライブラリーの生成に続いて、標的に対する親和性に関する部分を誘導し、二官能性分子の識別オリゴヌクレオチド部分をＰＣＲによって増幅する。最終的には、ＰＣＲ増幅物の配列を決定し、標的に対する親和性を有するポリペプチドの同定のために解読する。二官能性複合体のライブラリーを、一般にスプリット・アンド・ミックスとして知られる方法によって生成する。その方法は、リンカー分子を空間的に離れた分画に分配し、各分画のある末端で特定のアミノ酸前駆物質と反応させ、直交化学反応によって他の末端でこの特定のアミノ酸前駆物質をコードする核酸のタグを付加することを含む。その後、様々な分画の内容物を収集（混合）し、アミノ酸前駆物質およびヌクレオチドタグとの交互の反応の新しい周期のために、いくつかの分画に再び分割する。スプリット・アンド・ミックス法は、ポリペプチドが望ましい長さに到達するまで継続する。
【０００４】
この先行技術の方法は、化学単位の付加についての二つの交互の合成操作の間には、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの付加と比較して共通する化学特性があるに違いないので、その用途において規制されている。先行技術によれば、交互にポリマーを合成する際に融和性の保護基を正しく選択し、他のポリマーの伸長が抑制されている間に伸長させるポリマーから選択的に保護基を除去するための方法を正しく選択することによって、合成の融和性の問題は解決される。
【０００５】
ハルピンおよびハーブリーは、ＷＯ００／２３４５８において他の方法を示唆し、その中で形成された分子は核酸のタグによって識別されるだけでなく方向付けられるとした。その方法はまた、スプリット・アンド・ミックス法に基づいて、二つまたはそれより多くの合成工程を用いたコンビナトリアルライブラリーを得るものである。多数の核酸の鋳型が用いられ、それぞれがその鎖を通して複数のコドン領域を分散させ、当該コドン領域が各々順次別のコドンを特定する。鋳型をコドンのハイブリダイゼーションによって固定されたプローブに分別し、続いてそれぞれの鎖を化学反応部位で特異的に選択した試薬と反応させる。その後、全ての鎖を収集し、第二コドン領域における二次分配に付す。スプリット・アンド・ミックス法を適当な回数行い、典型的には１０３から１０６の間の異なる化合物のライブラリーを生成する。当該方法には、大量の核酸の鋳型を供給しなければならないという欠点がある。最終的に１０６の異なる化合物のライブラリーを必要とする場合には、全部で１０６核酸の鋳型を合成しなければならない。その合成は、核酸の鋳型はコドン領域およびプローブの間の十分なハイブリダイゼーションを保証するのに相当な長さでなければならないので、一般に煩わしく高価である。
【０００６】
ＷＯ０２／０７４９２９において、化合物の合成のための方法を開示する。化合物は、アンチコドンを含む転移単位および反応単位を、アンチコドンの鋳型に対するハイブリダイゼーションおよびその後の反応単位の反応を可能にするような条件下で、それと関連する反応単位を有する鋳型と最初に接触させることによって合成される。この方法はまた、大量の核酸の鋳型を最初に供給しなければならないという欠点がある。
鋳型を用いた先行技術の方法は、コード化がアンチコドンおよび鋳型の間の識別に依存するという欠点がある。二つのオリゴヌクレオチドの間のハイブリダイゼーションは、これらの間に十分な相補性が存在する場合に起こりえる。時折、ハイブリダイゼーションは、たとえオリゴヌクレオチド間に完全な適合がみられなくても起こりえる。その効果は、多数の転移単位が存在していて、そのとき時に鋳型のコドン配列が実際に反応する反応単位に一致していない場合である。この望ましくない効果は、多量の鋳型および合成ブロック（building  block）が反応媒質において互いを識別するのを支えるので、ライブラリーの形成を行う際によりいっそう強調される。ハイブリダイゼーションの工程が完全に正確でない場合、鋳型上の不正確なコドンによってコード化される分子が生成するであろう。このことは、ライブラリー上で行われる選別工程に二つの主要な効果をもたらす。第一に、結合するリガンドをコード化するコドンの組み合わせをもつ鋳型が、選別工程において失われるであろう。第二に、そしてより重要なことかもしれないが、非結合性のリガンドをコード化する鋳型とコドンの組み合わせが豊富になるであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の態様においては、コード化分子を得る鋳型非依存性の方法を提供することを目的とし、コード化分子およびオリゴヌクレオチドタグを交互に形成する際に適合可能な直交保護基の適用を回避することができるので、多様な化学的性質をコード化分子の形成に用いることができる。本発明は、その好ましい態様において、コドン識別工程において以前示唆されたエラーを起こしやすいハイブリダイゼーション法を改良することを目的としている。その上、非特異的反応生成物の形成を減少させることが本発明の目的である。従って、本発明の態様において、本発明の方法は、表現型が遺伝子型によって正確にコード化されることを保証する固有の修正手段を有する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
ディスプレイ分子部とコード部を含む二官能性複合体を得る方法であって、化学反応部位およびタグの酵素的付加用の促進部位を含む発生期二官能性複合体が、その化学反応部位で一つまたはそれ以上の反応体と反応し、その促進部位で一つまたはそれ以上の酵素を用いて反応体を識別する各々のタグが供給されるところの、方法。
（項目２）
項目１において得られた二官能性複合体が、さらに１回またはそれ以上の回数、反応体と反応し、各々の識別タグが供給され、二官能性複合体の一部としての反応生成物、および反応生成物の形成に関与する反応体の識別部をコードするタグを含むコード部を生成するところの、項目１記載の方法。
（項目３）
タグが核酸の配列であるところの、項目１、２または３記載の方法。
（項目４）
一つまたはそれ以上のタグが、酵素的伸長反応を利用して、発生期二官能性複合体の促進部位で供給されるところの、項目１ないし３記載の方法。
（項目５）
結合部分が化学反応部位と促進部位とを結合しているところの、項目１ないし４記載の方法。
（項目６）
結合部分が相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに適した長さの核酸配列であるところの、項目５記載の方法。
（項目７）
結合部分が、選択的に切断可能なリンカーを含むスペーサーを介して化学反応部位に結合しているところの、項目５または６記載の方法。
（項目８）
化学反応部位が、一つまたはそれ以上の反応基またはそのような反応基の前駆体を有する化学構造を含む化学的骨格であるところの、項目１または２記載の方法。
（項目９）
二つまたはそれより多くの反応体が、反応体を識別する各々のタグを供給する反応に先立ってまたはその後に、化学反応部位および促進部位との反応に関与するところの、項目１ないし８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
促進部位が、ヌクレオチドの３’−ＯＨまたは５’−リン酸基あるいはそれらの機能的誘導体を含むところの、項目１ないし９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
タグの付加が、ポリメラーゼ、リガーゼ、キナーゼ、リコンビナーゼまたはそれらの組み合わせから選ばれる酵素によって行われるところの、項目１ないし１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
タグの付加が、反応体の化学反応部位との反応に先立って行われるところの、項目１記載の方法。
（項目１３）
反応体が化学反応部位と反応する際に、二官能性複合体の核酸部分が二本鎖であるところの、項目１ないし１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
反応体が遊離反応体であるところの、項目１ないし１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
反応体が核酸配列および化学反応部位と反応する能力を有する機能エンティティを含むところの、項目１ないし１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
反応体が、ハイブリダイゼーションを可能にする結合部分に十分相補的なオリゴヌクレオチド、輸送可能な機能エンティティ、および機能エンティティを識別するアンチコドンを含む合成ブロックであるところの、項目１５記載の方法。
（項目１７）
タグが反応体を識別するコドンを含み、アンチタグが該コドンに相補的な核酸配列（アンチコドン）を含むところの、項目１ないし１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
タグが関連する反応体の反応した合成歴の時点でのフレーム配列情報をさらに含むところの、項目１７記載の方法。
（項目１９）
タグが、３、５、８、１１、１５、２０、３０またはそれより多くのヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを含むところの、項目１記載の方法。
（項目２０）
二官能性複合体が長さの異なるコドンを含むところの、項目１ないし１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
タグのオリゴヌクレオチドに相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドが固定されているところの、項目１ないし２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
タグの酵素的付加を用いる代わりに、タグが、タグの末端に相補的なガイドオリゴヌクレオチドを利用する促進部位に化学的に結合しているか、両末端が互いに隣接しているような促進部位を含む二官能性複合体の一部に結合しているところの、項目１記載の方法。
（項目２３）
ディスプレイ分子部およびコード部を含む二官能性複合体を得る方法であって、
ａ）反応基およびオリゴヌクレオチド識別領域を含む発生期二官能性複合体を提供する工程；
ｂ）ハイブリダイゼーションを可能とする識別領域に対して十分に相補的なオリゴヌクレオチド、輸送可能な機能エンティティ、および該機能エンティティを識別するアンチコドンを含む合成ブロックを提供する工程；
ｃ）その発生期二官能性複合体および合成ブロックをハイブリダイゼーション条件下で混合してハイブリダイゼーション生成物を形成する工程；
ｄ）合成ブロックの機能エンティティを、発生期二官能性複合体の反応基の関わる反応を通して、発生期二官能性複合体に移す工程；および
ｅ）オリゴヌクレオチド識別領域を酵素的に伸長して、機能エンティティを受け取った二官能性複合体に結合したコドンを得る工程
を含む、方法。
（項目２４）
工程ｆ）ハイブリダイゼーション生成物の成分を分離し、複合体を回収することをさらに含む、項目２３記載の方法。
（項目２５）
工程ｃ）ないしｆ）を適宜繰り返すところの、ディスプレイ分子部が最初の複合体の反応基および機能エンティティの反応生成物を含む、項目２３または２４記載の方法。
（項目２６）
発生期二官能性複合体の反応基が化学的骨格の一部であるところの、項目２３ないし２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
コドンを生成するための酵素がポリメラーゼであるところの、項目２３ないし２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
アンチコドンが独特であるところの、項目２３ないし２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
アンチコドンのヌクレオチドの類似した組み合わせが、他の機能エンティティを担持する他の合成ブロック上にみられないところの、項目２３ないし２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
二官能性複合体のライブラリーを生成する方法であって、
ａ）反応基およびオリゴヌクレオチド識別領域を含む、一つまたはそれ以上の異なる発生期二官能性複合体を供給し；
ｂ）複数の異なる合成ブロックであって、その各々にてハイブリダイゼーションを可能とする識別領域に対して十分に相補的なオリゴヌクレオチド、輸送可能な機能エンティティ、および該機能エンティティを識別するアンチコドンを含む合成ブロックを供給し；
ｃ）発生期二官能性複合体および複数の合成ブロックを、ハイブリダイゼーション条件下で混合して、ハイブリダイゼーション生成物を形成し；
ｄ）合成ブロックの機能エンティティを、発生期二官能性複合体の反応基の関与する反応を通して、該発生期二官能性複合体に輸送し；
ｅ）化学エンティティを受け取った二官能性複合体に結合したコドンを得るために、オリゴヌクレオチド識別領域を酵素的に伸長させ；
ｆ）ハイブリダイゼーション生成物の成分を分離して複合体を回収し；
ｇ）工程ｃ）からｆ）を適宜一回またはそれ以上繰り返す；
工程を含む、方法。
（項目３１）
アンチコドンが独特であるところの、項目３０記載の方法。
（項目３２）
アンチコドンのヌクレオチドの類似した組み合わせが、他の機能エンティティを担持する他の合成ブロック上にみられないところの、項目３０または３１記載の方法。
（項目３３）
ディスプレイ分子部およびコード部を含む二官能性複合体のライブラリーを生成する方法であり、各々化学反応部位およびタグの酵素的付加のための促進部位を含む発生期二官能性複合体を別々の画分にて供給し、化学反応部位と一つまたはそれ以上の反応体との間の各々の画分の反応をあらゆる順序で行い、一つまたはそれ以上の酵素を用いて一つまたはそれ以上の反応体を促進部位において識別する一つまたはそれ以上の各々のタグを付加する工程を含む方法。
（項目３４）
二つまたはそれ以上の画分の内容物を一緒に貯蔵するところの、項目３３記載の方法。
（項目３５）
発生期二官能性複合体として二官能性複合体を用い、その二官能性複合体を項目３３または３４の一回またはそれ以上のさらなる周期の方法に付し、二官能性複合体のライブラリーを得て、そのライブラリーの要素が、試薬特異的反応生成物、および反応生成物の形成に関与した各々の反応体の識別部をコードする各々のタグを含むところの、項目３３または３４記載の方法。
（項目３６）
各々の要素が、化学反応部位と二つまたはそれ以上の反応体の関わる反応によって形成されるディスプレイ分子部、および二つまたはそれ以上の反応体の識別部をコードする各々のコドンを含むコード部を含み、項目３０−３２または３３−３５記載の方法を選択する工程、ならびに項目３０−３２の方法および項目３３−３５の方法から選択される方法にて異なる発生期二官能性複合体のプールとして得られる二官能性複合体の成熟前のライブラリーを用いる工程を含むところの、二官能性複合体のライブラリーを生成する項目１ないし３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
予め選択された特性を有するディスプレイ分子を識別する方法であって、
ｉ）項目３０ないし３６のいずれかに従って形成されたライブラリーを、所定の特性を有するディスプレイ分子またはディスプレイ分子の部分集合をライブラリーの残りから分割するところの条件に付し、
ｉｉ）複合体のコード化部を解読することによって、予め選択された特性を有するディスプレイ分子を識別する
工程を含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、識別部および合成ブロックの成分を示す。
【図２】図２は、伸長によるコード化の原理を示す。
【図３】図３は、合成ブロックの伸長領域を示す。
【図４】図４は、識別部および合成ブロックの成分を、内部のコドンと共に示す。
【図５】図５は、特異的アニーリングを用いた伸長によるコード化の原理を示す。
【図６】図６は、骨格およびポリマー分子のコード化を示す。
【図７】図７は、三本鎖集合の原理を用いた伸長によるコード化を示す。
【図８】図８は、特異的アニーリングによる三本鎖集合の原理を用いた伸長によるコード化を示す。
【図９】図９は、固体相の方法を用いた三本鎖識別部−ディスプレイした分子の合成を示す。
【図１０】図１０は、プラットホーム集合を用いた連続した反応／伸長を示す。
【図１１】図１１は、コンビナトリアルライブラリーの交互パラレル合成についての一般的なスキームを開示する。
【図１２】図１２は、ライゲーションコード化および遊離反応体を用いたコード化法を開示する。
【図１３】図１３は、続く反応がコード化工程であるところの、ライブラリー生成法を開示する。
【図１４】図１４は、ポリメラーゼコード化を用いたライブラリー生成法を開示する。
【図１５】図１５は、単一のコード化法についての様々な具体例を開示する。
【図１６】図１６は、二重のコード化法を開示する。
【図１７】図１７は、様々な二重のコード化法を開示する。
【図１８】図１８は、環状の合成ブロックを用いたコード化を開示する。
【図１９】図１９は、可変性リンカーが合成ブロック中で用いられる方法を開示する。
【図２０】図２０は、実施例６に従ったゲル表示の実験結果を開示する。
【図２１】図２１は、三重コード化法を開示する。
【図２２】図２２は、実施例９に用いられる計画を示す。
【図２３】図２３は、実施例９に用いられるスプリット・アンド・ミックスの構造を示す。
【図２４】図２４は、ライブラリー濃縮、増幅および識別の具体例を開示する。
【図２５】図２５は、識別配列にハイブリダイゼーションしていないアンチタグ配列が二本鎖をなし、それによって不活化する具体例を示す。
【図２６】図２６は、濃縮工程が精製工程の前であるところの、具体例を示す。
【図２７】図２７は、ライブラリー濃縮、増幅および識別の一般的原理を示す。
【図２８】図２８は、連続する濃縮手順の間の中間の増幅工程を省略した、ライブラリー濃縮、増幅および識別の一般的原理を示す。
【図２９】図２９は、最初の一本鎖ライブラリーを、濃縮に先立って二本鎖にするところの、ライブラリー濃縮、増幅および識別の一般的原理を示す。
【図３０】図３０は、アンチタグが一回またはそれより多くの濃縮過程の後まで形成されないところの、ライブラリー濃縮の一般的原理を示す。
【図３１】図３１は、実施例１３において報告している二つのゲルを示す。
【図３２】図３２は、実施例１４において報告している実験結果を示す。
【図３３】図３３は、実施例１４において報告している実験結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（発明の開示）
本発明はディスプレイ分子部およびコード部を含む二官能性複合体を得る方法に関するものであり、該方法においては化学反応部位およびタグの酵素付加の促進部位を含む発生期の二官能性複合体を、一つまたはそれ以上の反応体と化学反応部位で反応させ、一つまたはそれ以上の酵素を用いて促進部位で反応体を識別する各々のタグを提供する。
酵素は一般に基質特異性であり、タグの促進部位への酵素的付加は、ディスプレイ分子が形成されることの妨げとなりにくいようである。従って、発生期のディスプレイ分子と同様にコード部位に保護基を適用することによって、この理由については回避できる。しかしながら、ディスプレイ分子の成長を保護するのは他の理由で望ましいかもしれない。酵素は、水性および有機媒質において活性を有して利用できる。しかしながら、非常に多数の酵素は、有機媒質と比べて水性媒質においてより高い活性を有する。それゆえに、タグの供給に先立ってあるいはその後に、化学反応部位における反応体の反応に適した条件を得るために、媒質を交換することが望ましいかもしれない。
一般に、ディスプレイ分子部は、一つまたはそれ以上の反応体および化学反応部位の間の一回以上の反応によって形成される。本発明のある態様としては、一つまたはそれ以上の反応体と反応し、各々のタグを与えた発生期の二官能性複合体を、さらに一回またはそれより多くの回数一つまたはそれ以上の反応体と反応させ、各々の識別タグを与えて反応生成物を二官能性複合体の一部分、および反応生成物の形成に関わる反応体の識別をコードするタグを含む識別部位として生成する。
本発明のある態様として、一回または一周期の反応は、一つの反応体は化学反応部位において反応し、反応体を識別する各々のタグを酵素付加の促進部位に与えることを含んでいる。本発明の他の態様として、一回の反応は、多数の反応体は化学反応部位で反応し、一つまたはそれ以上の、しかし必ずしも全てではない反応体を識別するタグを酵素付加の促進部位に与えることを含んでいる。化学反応部位における反応およびタグの付加はあらゆる順序で起こってよい、すなわち、反応はタグ付加の後で、タグ付加と同時に、またはタグ付加に先立って起こってよい。順序の選択は数ある中で特に酵素のタイプ、反応条件、反応体のタイプに左右される。
【００１１】
発生期の二官能性複合体は、化学反応部位およびタグの酵素付加の促進部位を含む。所望により、発生期の二官能性複合体はまた、化学反応部位を促進部位と結合する連結部分を含んでいてもよい。連結部分は、促進部分と化学反応部位が互いに十分に距離を離し、酵素がタグ付加を行い、ハイブリダイゼーション領域を提供するなどの、種々の目的に供することができる。本発明の態様として、連結部分は核酸配列である。オリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは相補的オリゴヌクレオチドをもつハイブリダイゼーションに適する、すなわち、連結部分中のヌクレオチドの数は８またはそれ以上が適している。ある具体例としては、連結部分は、選択的に切断可能なリンカーを含むスペーサーを介して化学反応部位と結合し、最終的な二官能性複合体の形成後の工程の際に、ディスプレイ分子部をコード部から分離することを可能にする。発生期の二官能性複合体はまた成長複合体と称され、出発複合体または中間複合体を本発明の方法に従って処理すると定めている。中間複合体とは、一回またはそれより多くの反応体反応およびタグ付加に付された出発複合体を指す。
【００１２】
化学反応部位は、一つまたはそれ以上の反応体と反応できる一つまたは多数の反応基を含んでいてよい。ある態様としては、化学反応部位は一つまたはそれ以上の反応基が結合している骨格を含んでいてよい。適当な反応基の例としては、アミン、カルボン酸、チオ、アルデヒド、およびヒドロキシル基を含める。骨格の例としては、ベンゾジアゼピン、ステロイド、ヒダントイン、ピペラジン、ジケトピペラジン、モルホリン、トロパン、クマリン、キノリン、インドール、フラン、ピロール、オキサゾール、アミノ酸前駆体、およびチアゾールを含める。その上、化学反応部位の反応基は、反応体が起こし得る反応の前に活性化される必要のある前駆体中に存在していてよい。一例として、反応基は適当な基で保護されていてよく、それは反応体との反応が進行しうる前に除去される必要がある。特許請求の範囲とともに当該明細書中のディスプレイ分子は、一つまたはそれ以上の反応体と反応した化学反応部位を指す。
【００１３】
本発明の反応体として、遊離反応体ならびに機能エンティティおよび核酸配列を含む反応体が挙げられる。遊離反応体は化学反応部位における反応に関与しており、最終ディスプレイ分子の化学構造を生じさせてよい。核酸に結合した機能エンティティは当該明細書において合成ブロックと称され、機能エンティティが化学反応部位で反応能を有する化学エンティティを特定する。本発明のある態様において、機能エンティティを核酸部から分離し、化学反応部位に移す。合成ブロックのオリゴヌクレオチドは、機能エンティティの識別性に関する情報を含んでいても、含んでいなくてもよい。本発明の具体例としては、反応体は、ハイブリダイゼーション、輸送可能な機能エンティティ、およびアンチコドンが機能エンティティを識別するのを可能にする、連結部分に十分相補的なオリゴヌクレオチドを含む合成ブロックである。遊離反応体は、核酸成分が最終ディスプレイ分子に用いられない限りは、一般に核酸と結合していない。遊離反応体は、あらゆる化学構造を有してよく、好ましくは反応基または前駆体を含み、それゆえに化学反応部位における反応を可能にするであろう。反応基の例としては、ヒドロキシル基、カルボン酸基、チオール、イソシアン酸塩、アミン、エステル、およびチオエステルを含める。所望により、さらなる反応体が生じて遊離反応体および化学反応部位の間の結合を媒介する。合成ブロックの機能エンティティは、化学反応部位が関連する反応に必要であるという点に限っては、遊離反応体に似ている。しかしながら、それに加えて、反応の後で機能エンティティおよび核酸の間の結合を切断することが、もっとも必要な段階である。所望により、反応および切断は単一の段階で起こってもよい。様々なタイプの合成ブロックを以下に詳細に開示している。本発明のある態様として、遊離反応体または機能エンティティはヌクレオチドを含まなくてもよい。
【００１４】
発生期の二官能性複合体のコード部を、少なくとも一つのタグを、一つまたはそれ以上の酵素を用いて促進部位に付加することによって形成する。直鎖または分枝した識別部を生成するために先のタグにさらなるタグを結合してよい。識別部の少なくとも一つのタグが酵素触媒反応によって結合する限りは、さらなるタグを実験者の思うままに化学的方法または酵素的方法を用いて与えてよい。本発明のある具体例においては、全てのタグを酵素触媒反応を用いて得る。タグは、適当には、認識単位、すなわち認識基によって認識される可能性のある単位を含む。様々な異なる種類の認識が天然において存在する。一例が、エピトープを認識する抗体、他のタンパク質を認識するタンパク質、タンパク質を認識するｍＲＮＡ、相補的なオリゴヌクレオチド配列を認識するオリゴヌクレオチドである。一般に、タグはヌクレオチドの配列であることが好ましい。
【００１５】
二官能性複合体のコード部は、増幅を可能にする発明の好ましい態様である。増幅が可能になることによって、選別工程の間の二官能性複合体の使用を少量にすることが可能になる。タグがタンパク質である場合、そのタンパク質はそれの合成をコード化したｍＲＮＡを結合し、ｃＤＮＡをｍＲＮＡから生成し、ｍＲＮＡを翻訳系に付すことによって増幅されてよい。そのような系はＷＯ９８／３１７００に開示されており、その内容を出典明示により当該明細書の一部とする。タンパク質のタグを増幅するためのもう一つの方法は、ファージの提示したタンパク質を用いることである。しかしながら、一般にタグはヌクレオチドの配列であり、ＰＣＲのような標準的な技術を用いて増幅してよい。二つまたはそれより多くのタグが直鎖の識別オリゴヌクレオチドに存在する場合、酵素がオリゴヌクレオチドを基質として識別できるようにするために、オリゴヌクレオチドは一般にある種の主鎖の構造からなる。一例として、主鎖の構造はＤＮＡまたはＲＮＡであってよい。
【００１６】
発生期の二官能性複合体の促進部位はタグの受容能を有する。促進部位の化学的性質は、数ある中で特にタグのタイプおよび用いられた特定の酵素に左右される。タグがポリヌクレオチドである場合、促進部位は一般に、ヌクレオチドを受け取る基である３’―ＯＨまたは５’―リン酸塩、またはそのような基の機能的誘導体を含む。促進部位に対するタグの酵素付加に用いる酵素は、ポリメラーゼ、リガーゼ、およびリコンビナーゼから選ばれる酵素、およびこれらの酵素の組み合わせを含む。
【００１７】
化学反応部位および一つまたはそれ以上の反応体の間の反応は、その反応に好都合な適当な条件下で起こってよい。本発明のいくつかの態様として、反応はハイブリダイゼーション条件下で行われる、すなわち二つの相補的なオリゴヌクレオチド間のアニーリングは反応条件の間存続する。本発明の他の態様として、反応は、反応が起こるのに適した条件を可能にする、変性条件下で行われる。その場合、伸長する複合体のコード部はオリゴヌクレオチドを含み；本発明の態様として、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの成分および反応体の間の副反応の可能性を低下させる反応の間、二重鎖の形で存在する。
【００１８】
反応体を識別するタグはいずれか適当な酵素を用いて促進部位に加えることができる。ある具体例において、酵素的伸長反応を利用して、タグを発生期の二官能性複合体の促進部位に与える。伸長反応は、ポリメラーゼまたはリガーゼまたはそれらの組み合わせによって、行われてよい。ポリメラーゼを用いた伸長は、アンチタグオリゴヌクレオチドを鋳型として用いて適当に行われている。アンチタグオリゴヌクレオチドを、反応体を識別するアンチコドンを含む一本鎖の突出部をもつ、発生期の二官能性複合体のオリゴヌクレオチド部位の３’末端でアニーリングする。アンチタグのアンチコドンは、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの混合物を用いて識別部位に転写し得る。あるいは、リガーゼは、一つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドを基質として用いて、タグの付加に用いられる。ライゲーションは、一本鎖または二本鎖の状態で、用いた酵素に依存して行われ得る。一般に、二本鎖の状態でライゲーションすることが好ましい、すなわち、ともにライゲーションされるオリゴヌクレオチドを、二つのオリゴヌクレオチドの末端を補完する相補的オリゴヌクレオチドによってまとめておく。
【００１９】
適当な酵素の例として、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ＤＮＡリガーゼ、ＲＮＡリガーゼ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、ＨＩＶ−１逆転写酵素、クレノウ断片、あるいはモノ、ジ、またはポリヌクレオチドのような相補的要素の結合を触媒するあらゆる他の酵素が挙げられる。不適当な組み合わせの伸長を可能にする他のタイプのポリメラーゼはまた、例えばＤＮＡポリメラーゼη（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎら、（２００１）ＪＢＣ２７６：２２６３−２２６６）、ＤＮＡポリメラーゼι（Ｖａｉｓｍａｎら、（２００１）ＪＢＣ２７６：３０６１５−３０６２２）、または不適当な組み合わせのアニーリングした塩基対の伸長を可能にするあらゆる他の酵素として用いられる。他の態様において、リガーゼを用いる場合、適当な例として、ＴａｑＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ、Ｔ７ＤＮＡリガーゼ、およびイー・コリＤＮＡリガーゼが挙げられる。リガーゼの選択は、結合する末端の構造にある程度左右される。従って、もし末端が平滑であれば、Ｔ４ＲＮＡリガーゼが好ましいかもしれないし、一方粘着末端のライゲーション、すなわちそれぞれの末端の突出部が互いを補完しあうライゲーションについては、ＴａｑＤＮＡリガーゼが好ましいかもしれない。
【００２０】
発生期の二官能性複合体の促進部位に加えたタグは、反応体に関する情報を保持している。本発明において、反応体に関する情報をコドンと称する。反応体識別部をコードするヌクレオチドの組み合わせを除いて、タグはさらなるヌクレオチドを含んでいてよい。本発明のある態様として、タグはフレーム配列を含む。フレーム配列は、アンチタグの領域のアニーリングおよび／または関連反応体が反応した合成歴の時点の配列情報のような、様々な目的に供することができる。
【００２１】
コドンと反応体の識別部の間の関係は、望ましい生成物に依存して変化してもよい。ある具体例として、コドンはいくつかの異なる反応体をコードするのに用いられる。その後の識別工程において、ディスプレイ分子の構造は、異なる結合性、立体障害、直交保護基の脱保護その他についての知識を利用して推論し得る。他の具体例としては、親油性、分子量、一定の結合性その他の共通の性質を有する反応体の群について、同一のコドンが用いられる。しかしながら、好ましい具体例としては、コドンは独特であり、すなわち、類似した組み合わせのヌクレオチドは他の反応体を識別しない。実際の方法として、特定の反応体については、単一の組み合わせのヌクレオチドのみが用いられる。本発明のある態様として、同一の反応体に対していくつかの異なるコドンを利用することが有利である。同一の反応体を識別する二つまたはそれより多くのコドンは、異なる反応条件に関係するさらなる情報を保有していてもよい。本発明の他の態様として、単一のコドンは二つまたはそれより多くの反応体を特定する。
【００２２】
本発明の一の態様において、各々の二官能性複合体を、同時にまたは連続的に以下のスキームに図示するようにタグの付加および反応体の反応を行うことによって調製する：
【化１】
0005643398.tif 000002
大文字は反応体または化学反応部位を表す。小文字はタグを表す。
骨格「Ｘ」はタグ「ｘ」と結合している。反応体は「Ｘ」例えば「Ａ」と結合しており
、タグも断片、例えば「ａ」と結合している。適当なことには、タグは独特である。
【００２３】
結果として形成された二官能性複合体のコード部は、全てのコドンを含むであろう。各コドンの配列は、ディスプレイ分子、すなわち反応生成物の形成に関わった反応体の構造を解読するのに用いられる。コドンの順序はまた、反応体の結合の順序を決定するために用いられる。ポリマーの正確な配列をコード化した配列を解読することによって決定され得るので、直鎖のポリマーが形成される時に、このことは特に重要となる。通常、解読工程を促進するために、定常領域または結合領域をコドンとともに二官能性複合体に輸送する。定常領域はディスプレイ分子の合成経路中の関連する反応体の位置についての情報を含んでいてよい。
【００２４】
本発明はまた、上記した方法により生成されたライブラリーを一の条件に付し、その中で所定の特性を有するディスプレイ分子またはディスプレイ分子の部分集合がライブラリーの残りから区分化され、予め選択された機能を有するディスプレイ分子を複合体のコード部を解読することによって識別する工程を含む、予め選択された特性を有するディスプレイ分子を識別する方法に関する。
【００２５】
上記の方法は、一般に選別と呼ばれ、条件に対する反応性を有するディスプレイ分子を選別するために、ライブラリーをある条件に付すことを伴う。本条件はライブラリーを標的に曝露することを伴ってよい。この標的に対する親和性を有する二官能性複合体は、結合していない複合体を除去し、その後標的に結合した複合体よりストリンジェントな条件下で溶出することによって、ライブラリーの残りと分割してよい。あるいは、二官能性複合体のコード部は、結合していない複合体を除去した後、ディスプレイ分子から切断でき、ディスプレイ分子を識別するためにコード部を回収し、解読してよい。
【００２６】
特定の標的に対する選別を、その後の選別した変異体の増幅とともに、一回または数回実行することは可能である。これらの得られた変異体は、それから適当なアッセイにおいて別々に検査する。選別条件は、一回の選別において結合した分子を得るために、厳密であり、特異的であってよい。潜在的な結合物が消失する可能性のあるさらなる選別を用いた手順と比較して、潜在的な結合物の数が多く、多様性に富む一回の選別を用いた方法を実行するのが好都合である可能性がある。他の具体例として、選別手順は、より厳密性を高めた条件を用いた数回の選別を伴う。各選別の間、選別した複合体を増幅することが望ましい可能性がある。
【００２７】
コード部は、二つの独特の断端を生成するプライマーを使ったＰＣＲを用いて、増幅し得る。これらの断端は、配列決定に適当なベクターにクローニングすることによって、コード領域の多量体形成に用いられ得る。この方法によって、同時に多くのコード化領域の配列決定が可能になるであろう。あるいは、ＰＣＲ産物を、例えばＴＡクローニングを用いて適当なベクターに直接クローニングする。さらに他の方法として、ディスプレイ分子の識別は、ＰＣＲ産物に適当なマイクロアレーを適用することによって、確立される。
【００２８】
オリゴヌクレオチドの望ましい構造を構成することは当業者が実施できる範囲である。特異的なアニーリング温度が望ましい場合に、核酸モノマーの適切な組成およびその長さを示唆することが標準的操作である。適切な構造の構成は、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ｓｕｉｔｅまたはインターネットアドレスがｈｔｔｐ：//ｗｗｗ．ｎｗｆｓｃ．ｎｏａａ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／ｏｌｉｇｏＴＭｃａｌｃ．ｈｔｍｌ．である公共のデーターベースのようなソフトウェアによって、補助してもよい。二つのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にする条件は、温度、塩濃度、緩衝液のタイプ、および酸性度を含めたいくつかの要因に影響される。二つのオリゴヌクレオチドの結合がハイブリダイゼーション条件で行われることを確証する適切な条件を選ぶことは当業者が実施できる範囲である。二つの一本鎖オリゴヌクレオチドが二本鎖を形成する温度は、アニーリング温度または融解温度と称される。融解曲線は、通常急勾配ではなく、アニーリングがある温度範囲にわたって起こることを示す。
【００２９】
本発明は、二つの基本的な方法で行ってよい。一番目の方法は、コドンまたはアンチコドンが、それが識別する機能エンティティに共有結合している反応体を用いる。二番目の方法はコドンまたはアンチコドンに共有結合していない反応体を用いる。タグは、エンティティを反応体から分離することによって、二官能性複合体の促進部位に与えられる。一回り以上実行すると、一番目および二番目の方法はあらゆる順序で結合し得る。異なる二官能性複合体のライブラリーを生成したい場合は、二つの方法は二つの異なる方法に従って行われる。一番目の方法を用いて生成したライブラリーは、単一の容器で行い得て、それは当該明細書ではワン−ポット合成と呼ばれているが、一方二番目の方法に従って生成したライブラリーは、スプリット・アンド・ミックス合成を必要とする、すなわち反応およびタグ付加は各々の複合体の分離した区画で行わなければならない。本発明のある具体例として、二つまたはそれより多くの反応体をコードする一つまたはそれ以上のタグを、それぞれ、二つまたはそれより多くの反応体および化学反応部位が関わる反応に先立ってまたは反応の後で与える。
【００３０】
様式１
本発明は、第一の様式において、二官能性複合体に移される化学エンティティの識別性をコード化する方法であって、
ａ）反応基およびオリゴヌクレオチド識別領域を含む発生期の二官能性複合体を提供し、
ｂ）ハイブリダイゼーションを可能とする識別領域に対して十分に相補的なオリゴヌクレオチド、輸送可能な機能エンティティ、および該機能エンティティを識別するアンチコドンを含む合成ブロックを提供し、
ｃ）発生期の二官能性複合体および合成ブロックをハイブリダイゼーション条件下で混合してハイブリダイゼーション生成物を形成し、
ｄ）合成ブロックの機能エンティティを、発生期の二官能性複合体の反応基の関わる反応を通して、発生期の二官能性複合体に移し、
ｅ）化学エンティティを受け取った二官能性複合体に結合したコドンを得るために、オリゴヌクレオチド識別領域を酵素的に伸長する
工程を含む、方法に関する。
【００３１】
本発明の方法は、機能エンティティを複合体に輸送するためのコドンの結合を含む。コドンの結合は、適当な酵素、すなわち核酸上で活性を持つ酵素を用いて、合成ブロックのアンチコドンにまで伸長することによって行われる。コード化領域の解読は、ポリメラーゼまたはリガーゼのような酵素によってなされ得る。一般に、できるだけアンチコドンを正確に解読するために、基質および最終生成物に対して特異的な酵素を用いることが好ましい。非特異的活性は生きている細胞の生存能力を壊しかねないので、高度な特異性は、一般に核酸活性酵素として利用される。本発明に従った特に好ましい酵素は、正確にコード化するが上流の核酸塩基を保護する、校正活性を有するポリメラーゼである。
【００３２】
酵素的伸長は、機能エンティティの輸送の後にまたは同時に、あるいは輸送に先立って起こりうる。しかしながら、酵素および機能エンティティの間のあらゆる可能性のある相互作用を防止するために、輸送工程の後に伸長工程を行うことが好ましい。
識別領域および相補的識別領域が互いにハイブリダイゼーションして二重らせんを形成した場合のみ、酵素は伸長を行うので、複合体がコドンで与えられる場合には、機能エンティティおよび反応基は極めて近密であることが保証される。従来示唆されてきたハイブリダイゼーション法と比較して、本発明は、非直接的反応を通して機能エンティティを与えられた複合体はコドンを与えられないであろうという利点がある。従って、偽陽性の分子は、コドンがないために容易に見抜くことができる可能性がある。
【００３３】
本発明はまたディスプレイ分子部およびコード部からなる二官能性複合体を得る方法であって、
ｆ）ハイブリダイゼーション生成物および回収複合体の構成成分を分離する
工程をさらに含む、二官能性複合体に輸送される化学エンティティの識別をコード化する方法に関する。
本発明は、単一の機能エンティティおよび対応するコドンのみを発生期の二官能性複合体に移すことによって、行うこともできる。一般に、二つまたはそれより多くの機能エンティティからなる、ディスプレイ分子を合成することが好ましい。従って、本発明の好ましい態様として、方法は、ディスプレイ分子部およびコード部からなる二官能性複合体を得るために考案され、ディスプレイ分子部は機能エンティティの反応生成物および出発複合体の反応基であり、工程ｃ）からｆ）は適切に反復される。二官能性複合体の調製の最後の周期においては、二本鎖核酸は通常対応する一本鎖オリゴヌクレオチドと比較してより安定であるので、著しく二本鎖識別オリゴヌクレオチドが得られる場合には、工程ｆ）は省略してもよい。識別オリゴヌクレオチドはまた、プライマーをオリゴヌクレオチドの３’末端にアニーリングし、適当なポリメラーゼを用いて伸長する伸長工程によって二本鎖になる可能性がある。一本鎖の核酸は、アプタマーと類似した方法で生物学的標的との相互作用をする可能性があるので、二本鎖であることはその後の選別工程の間好都合である。周期を反復する場合、前の周期において生成した二官能性複合体、すなわち機能エンティティおよびコドンを受け取った発生期の二官能性複合体は、機能エンティティ輸送およびコドン結合の次の周期で発生期の二官能性複合体として用いられる。
【００３４】
当該方法に従って用いられるオリゴヌクレオチドは妥当な大きさである。従って、先行技術（ＷＯ００／２３４５８において、少なくとも２２０の、好ましくは４２０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを用いることが示唆されている）において示唆された予め製造された長鎖鋳型は一般に回避される。
【００３５】
本発明はまた、二官能性複合体のライブラリーを生成する方法であって、
ａ）反応基およびオリゴヌクレオチド識別領域を含む、一つまたはそれ以上の異なる発生期の二官能性複合体を提供し、
ｂ）複数の異なる合成ブロックであって、その各々にてハイブリダイゼーションを可能とする識別領域に対して十分に相補的なオリゴヌクレオチド、輸送可能な機能エンティティ、および該機能エンティティを識別するアンチコドンを含む合成ブロックを提供し、
ｃ）発生期の二官能性複合体および複数の合成ブロックを、ハイブリダイゼーション条件下で混合して、ハイブリダイゼーション生成物を形成し、
ｄ）合成ブロックの機能エンティティを、発生期の二官能性複合体の反応基の関わる反応を通して、発生期の二官能性複合体に輸送し、
ｅ）化学エンティティを受け取った二官能性複合体に結合したコドンを得るために、オリゴヌクレオチド識別領域を酵素的に伸長し、
ｆ）ハイブリダイゼーション生成物を分離し、複合体を回収し、
ｇ）工程ｃ）からｆ）を適宜一回またはそれ以上反復する
工程を含む、方法に関する。
【００３６】
先行技術において示唆されたハイブリダイゼーション技術に関連した不都合な点は、ライブラリーの形成を考慮する場合に明白になる。たとえ二本鎖のオリゴヌクレオチドが同数のヌクレオチドを有していたとしても、それらは決して同じ融解温度を有している保証はない。これは、少なくともある程度、異なる塩基対について異なる水素結合数が関わっている（Ｃ−Ｇの組には三つの水素結合が関わり、Ａ−Ｔ塩基対には二つの水素結合が関わる）事実によるものである。従って、様々な合成ブロックを鋳型にアニーリングする温度を確立することは、不適当な組み合わせを防止することと、十分なアニーリングを保証することの間での妥協案であろう。本発明は、その好ましい具体例において、すべての合成ブロックに対して同様の親和性を有する識別領域を提供することでこの欠点を回避することを目的とする。
【００３７】
結局、一つより多くの識別配列が用いられ、例えば一つより多くの種類の反応基または骨格が存在する場合、時折合成ブロックがそれらに誤ってアニーリングする可能性がある。しかしながら、輸送された機能エンティティは、伸長工程を通して、実際に正確に複合体上でコード化されるであろう。この方法は、ＤＮＡレベルにおける塩基の不適当な結合が（合成ブロックの不適当な組み合わせのアニーリングと比較して）多様性を得ることを可能にするが、（複合体上の正確なコドンの伸長と比較して）正確な表現型のコードを要求するという、Ｎａｔｕｒｅが用いている配列に似ている。
識別部および合成ブロックの間のアニーリングは、無作為の工程であるか、または識別領域および相補的識別領域中の配列によって導かれ得る。無作為の工程は、あらゆる識別領域および相補的識別領域中の同一の配列を用いることによって、達成され得る。従って、識別部および合成ブロックの混合によって、無作為にまたは準無作為にアニーリングして、機能エンティティの独特の組み合わせを創造するだろう。あるいは、無作為または準無作為の工程は、特定の骨格または反応基の識別をコードする識別部の核酸塩基と向かい合う合成ブロックの位置にユニバーサル塩基を用いることによってなされ得る。識別オリゴヌクレオチドおよび合成ブロックのオリゴヌクレオチドの配列は最大限に利用してよく、アニーリング工程に関わるライブラリー中の配列は、合成ブロックに結合している機能エンティティに関わらず、同程度のアニーリングで集合すると確信できるものである。従って、異なるアニーリングの性質による、特定の合成ブロックを選別する手順におけるバイアスは無いかまたは小さいであろう。加えて、各アニーリング工程およびライブラリー中のハイブリダイゼーションにおけるアニーリングの手順の類似点は、機能エンティティを反応基／骨格に対して等しく与えることを確実にするということである。このことは輸送工程に最適な条件を与えるであろう。
【００３８】
発生期の二官能性複合体は、オリゴヌクレオチド識別領域および反応基を含む。反応基は、最終反応生成物をオリゴヌクレオチドから分離することを可能にする切断できるリンカーを通して、オリゴヌクレオチドと結合してよい。単一の反応基が存在してよく、または多数の反応基が骨格の一部として存在してよい。骨格は、その後反応した骨格を分離することを可能にする切断できるリンカーを通して、オリゴヌクレオチドと結合してよい。反応基は、機能エンティティを受け取ることのできるあらゆる基から選択し得る。適当な反応基の例としては、アミン、カルボキシ、チオ、ヒドロキシル基を含む。その上、発生期の二官能性複合体の反応基は、本発明の方法を開始する前に活性化される必要のある前駆体に存在してよい。
発生期の二官能性複合体はまた成長複合体と称され、出発複合体または中間複合体を本発明の方法に従って処理すると定めている。
【００３９】
識別分子の識別領域中のヌクレオチドの数は、識別部および合成ブロックの間でアニーリングがどれだけ強く特異的であるかによって、決定される。より強力で特異的なアニーリングの手順は、一般に長いヌクレオチド配列によって得られる。通常は１０から２０のヌクレオチドが、特異的で効率的なアニーリングを達成するのに十分である。しかしながら、本発明のある態様として、その範囲は２から１０００、もっとも好ましくは１５から３０の間のヌクレオチドであってよい。
【００４０】
識別領域は、ある具体例として、発生期の二官能性複合体の反応基または骨格の識別についての情報を含む可能性がある。そのような骨格のコドンは、一般に骨格から離れた位置にあり、輸送されるべき機能エンティティおよび骨格を含む部分において、安定な二重らせんの形成を可能にする。骨格のコドンは、あらゆる長さを有してよいが、一般に機能エンティティを指定するコドンと同じ長さで選択される。識別領域の後部は、一般に定常配列または結合配列を与えられる。合成ブロックの適当な部位にアニーリングした場合、結合配列は、伸長を起こす酵素の基質を供給する。
【００４１】
合成ブロックは、少なくともハイブリダイゼーションを可能にする識別領域の一部分に十分相補的なオリゴヌクレオチドを含む。合成ブロックのオリゴヌクレオチドは、識別部と完全に相補的でなくてもよく、すなわち、一つまたはそれ以上の不適当な組み合わせは許容されるが、合成ブロックが識別領域にアニーリングできるということが保証されなければならない。単純にするために、オリゴヌクレオチドが識別部にアニーリングできる合成ブロックの部分は、相補的識別領域と呼ばれるであろう。特許請求の範囲とともに当該明細書において、ハイブリダイゼーションという用語は、二つの一本鎖オリゴヌクレオチドを互いに結合させ、その結果ハイブリダイゼーション生成物を形成することとして理解すべきである。
【００４２】
合成ブロックはまた、オリゴヌクレオチドで作られたアンチコドン領域を含む。アンチコドンは、合成ブロックの機能エンティティの識別部を識別する。ある具体例として、同一のアンチコドンが、いくつかの異なる機能エンティティをコードするために用いられる。その後の識別工程において、ディスプレイ分子の構造は、異なる結合性、立体障害、直交保護基の脱保護その他についての知識を利用して推論し得る。他の具体例として、親油性、一定の結合性その他のような共通の性質を有する機能エンティティの群について、同一のコドンが用いられる。しかしながら、好ましい具体例としては、コドンは独特であり、すなわち、類似した組み合わせのヌクレオチドは他の機能エンティティを輸送する他の合成ブロック上に現れない。実践的な方法として、特定の機能エンティティについては、単一のヌクレオチドの組み合わせのみが用いられる。本発明のある態様としては、同一の機能エンティティに対して、Ｎａｔｕｒｅが単独のアミノ酸に対して六つ以下の異なるアンチコドンを用いたのと同様に、いくつかのアンチコドンを用いることは好都合である可能性がある。同一の機能エンティティを識別する二つまたはそれより多くのアンチコドンは、異なる反応条件に関連するさらなる情報を運んでいる可能性がある。
【００４３】
個別のアンチコドンは、単一のヌクレオチドのみによって、ライブラリー中の他のアンチコドンから区別してよい。しかしながら、その後の解読工程を容易にするために、一般に、様々な合成ブロック上にみられる特定のアンチコドンおよび他のあらゆるアンチコドンの間に、二つまたはそれより多くの不適当な組み合わせを有することが望ましい。例として、５個のヌクレオチドの長さのコドン／アンチコドンが選ぶと、二つまたはそれより多くの不適当な組み合わせがみられるものとして、１００より多くのヌクレオチドの組み合わせが存在する。コドン中のあるいくつかのヌクレオチドについて、ライブラリーにみられる他のあらゆるコドン／アンチコドンと比較して、特定のコドン／アンチコドンの間のいくつかの不適当な組み合わせを最適にすることが、一般に望ましい。
【００４４】
機能エンティティの相補的識別領域に対する結合は、適当な結合反応でなされる。当該分野において知られたあらゆるカップリング反応またはそのような反応の組み合わせは、当業者によって容易に理解される程度に用いることができる。相補的識別領域と結合している機能エンティティは分子であり、好ましくは識別部の反応基との結合を可能にする、少なくとも一つの反応基を含む。
【００４５】
アンチコドンの配列は、同一の合成ブロック中に結合した機能エンティティを識別する。このアンチコドン配列は、合成ブロック配列に直接含まれるか、または例えばポリメラーゼまたはリガーゼを用いて前から存在している合成ブロックに結合している。ある具体例としては、実施例７に詳細に開示されているように、実施例でキャリアオリゴと称される相補的識別領域は、様々な機能エンティティを最初に負荷している。各々の負荷したキャリアオリゴを、その後、スプリントオリゴを用いてアンチコドンオリゴにライゲーションして、二つのオリゴヌクレオチドを集合させる。ライゲーション反応は、輸送することのできる機能エンティティをその機能エンティティの構造を特定するアンチコドンと結合させるのに役立つ。アンチコドンオリゴは、様々な方法で構築してよい。通常は、スプリントのアニーリングを可能にする領域は、その構造の中に含まれる。しかしながら、Ｔ４ＲＮＡリガーゼのようなある種のリガーゼは一定の範囲の二重鎖ＤＮＡを必要としない。それゆえに、スプリントおよびそのスプリントにアニーリングするアンチコドンオリゴの部分は、いくつかの具体例を省略し得る。識別領域が骨格の識別部をコードするためのコドンを含む場合、アンチコドンオリゴは、イノシンのような一定の範囲のユニバーサル塩基を含む。ユニバーサル塩基は、もし識別領域上の結合領域と相補的な領域が下流に含まれる場合は、省略し得る。後者の具体例は、通常は、識別部の一部が環状になる必要があるであろう。ポリメラーゼが発生期の二官能性複合体の結合領域をもつ形成された二重らせんを、基質として識別することができるような相補的な結合領域が、通常は選ばれる。アンチコドンは相補的な結合領域の５’側に適切に位置しているので、伸長反応によって発生期の複合体に輸送され得る。適切に、相補的結合領域は、最後の二官能性複合体上にみられる、コドンの配列中の位置を識別することが可能であるように構築される。
【００４６】
アンチコドン配列は、伸長工程を介して識別部に転写され、そのコドンを識別分子上に形成する。これは、ポリメラーゼ伸長反応を含むがそれに限定されない、最先端のいずれの方法によっても行うことができる。ポリメラーゼ伸長反応は、通常、適切な緩衝液中にそれぞれの四つの天然のヌクレオチド三リン酸（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、およびＴＴＰ）とともに、ポリメラーゼ活性が十分存在することが必要となる。従って、特定のアンチコドンの配列は、合成ブロックおよび識別分子をアニーリングし、機能エンティティおよび受容側の反応基の間の反応が起こるようにする場合、コドンとして識別部に輸送されるのみである。
【００４７】
四つの天然のヌクレオチドは、Ｎがコドンの長さであるところの、４Ｎ個の多型をコード化し得る。例えば、独特のコドンが５個のヌクレオチドの長さである場合、可能な異なる機能エンティティのコード化数は１０２４である。コドンはまた、各位置において四つの天然のヌクレオチドの部分集合を用いて、構築し得る。このことは共通の核酸塩基の利用とともに有用である。各々の合成ブロック中のアンチコドンは、同一の合成ブロック中の機能エンティティをコードしている。この配列は、本発明の態様として、ＰＣＲによって相補的識別領域を機能エンティティプライマーおよびアンチコドンプライマーと結合してよい。
【００４８】
合成ブロックの機能エンティティは、結局ディスプレイ分子に結合した構造エンティティの前駆体である機能を果たす。それゆえに、特許請求の範囲とともに本願明細書において機能エンティティが発生期の二官能性複合体に輸送されることを述べる場合、必ずしも全ての最初の機能エンティティの原子が結果的に形成されたディスプレイ分子にみられる必要はないということを理解すべきである。また、結合を伴う反応の結果として、機能エンティティの構造は、発生期のディスプレイ分子上に見られるときに変化し得る。特に、機能エンティティの放出をもたらす切断は、その後の工程において発生期のディスプレイ分子および機能エンティティの間の結合の形成に関与しうる反応基を生成してよい。
【００４９】
合成ブロックの機能エンティティは、好ましくは、合成ブロックの機能エンティティと反応基を有する識別部の間にて結合を形成させる反応に関与しうる反応基を少なくとも一つ含む。機能エンティティ上に見られる反応基の数は、適当なのは１から１０である。一つの反応基のみを特徴づける機能エンティティは、特に、ポリマーまたは骨格の末端の位置において用いられ、一方二つの反応基を有する機能エンティティはさらに反応可能なポリマーまたは骨格の中心部分の形成に適している。結合の形成を意図する二つまたはそれより多くの反応基は、典型的には骨格上に存在する。骨格は中心の構造であり、多数の変異体を作る基礎を形成する。骨格の変異体は、典型的には、骨格の反応基と他の機能エンティティの反応基との反応によって形成され、所望によりフィル−イン基または触媒によって媒介されてもよい。骨格に結合する機能エンティティは、結合を形成できる一つ、二つ、またはいくつかの反応基を含んでいてよい。骨格の例としては、ステロイド、ヒダントイン、ベンゾジアゼピンその他を含む。
【００５０】
合成ブロックの反応基は、識別部の反応基と直接結合を形成することができてもよく、または合成ブロックの反応基は、フィル−イン基を架橋することによって識別部の反応基と結合を形成することができる。反応基の全ての原子が必ずしも形成された結合中で維持されていないということを理解するべきである。むしろ、反応基は結合の構造の前駆体と見なすべきである。
【００５１】
結合の形成後または結合と同時に、機能エンティティを識別部に輸送するために、切断が行われる。切断はあらゆる適当な方法で行われ得る。本発明の態様として、切断には試薬または酵素の使用が伴う。切断することによって、機能エンティティを発生期の二官能性複合体に輸送するか、または複合体を合成ブロックの機能エンティティに輸送することになる。ある場合には、新しい化学基をリンカー切断の結果として導入することは、好都合である可能性がある。新しい化学基は、直接的にあるいは活性化された後に、その後の周期におけるさらなる反応のために用いてよい。他の場合において、切断後には何のリンカーの痕跡も残っていないことが望ましい。
【００５２】
他の態様として、結合および切断は、同時の反応として行われる、すなわち、合成ブロックまたは発生期の二官能性複合体のいずれかの機能エンティティは、反応の遊離基である。本発明のある態様として、工程の数を減少させ、複雑さを軽減できるので、結合および切断が同時に起こるような体系を構築することが望ましい。同時の結合および切断はまた、上記のような、何のリンカーの痕跡も残らないか、またはさらなる反応を誘導されるための新しい化学基として構築し得る。本発明の他の態様にて、段階的方法は下位工程を各々マスターすることが可能であり、非特異的輸送の可能性を減少させることができるので、別々に架橋工程および切断工程を行うことが好ましい。
【００５３】
好ましくは、切断工程後にも少なくとも一つのリンカーがそのままで残っている。少なくとも一つのリンカーは、発生期のディスプレイ分子をコード化領域に結合させるであろう。もし方法が本質的に機能エンティティを骨格または伸長中のポリマーに輸送することを伴う場合は、結局骨格の分子またはポリマーは、選択的に切断可能なリンカーと結合してよい。選択的に切断可能なリンカーは、機能エンティティを発生期の鋳型に向かう分子に輸送させる条件下では、切断しないように設計される。
【００５４】
切断可能なリンカーは、非常に多くの化学構造から選択してよい。リンカーの例としては、酵素的切断部位を有するリンカー、化学的に分解性の成分を含むリンカー、および電磁放射によって切断可能なリンカーを含むが、それだけに限定されない。特に興味深い切断可能なリンカーは、現在のところは、光によって切断し得るリンカーである。適当な例としては、ディスプレイ分子および識別領域の間に位置するところのｏ−ニトロベンジル基を含む。
【００５５】
本発明に従った方法において用いられる合成ブロックは、合成ブロックに含まれる特定のエンティティに従って構築してよい。一例として、アンチコドンは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーによって、相補的識別領域に結合してよく、機能エンティティは、直接相補的識別領域に結合してよい。他の好ましい例としては、アンチコドン、相補的識別領域および機能エンティティは、連続的な鎖状のオリゴヌクレオチドである。本発明のある具体例として、合成ブロックは識別部の一部が環状になるように設計される。識別部を環状にすることは、通常、合成ブロックオリゴは識別部の全長にアニーリングしないために起こる。通常、合成ブロックは、少なくとも二官能性複合体の識別領域に、および識別部の後部の結合領域にアニーリングできるように設計される。相補的識別領域およびアンチコドンは、単結合によって直接結合してもよく、適当な長さのＰＥＧリンカーを介して結合してもよく、または識別部上の様々なコドンおよび結合領域に相補的な核酸塩基を含んでいても含まなくてもよい核酸塩基の配列であってよい。本発明のある具体例として、合成ブロックは、通常ディスプレイ分子と結合した末端と向かい合う識別部位の末端に存在する、結合領域にのみアニーリングするように構築される。本発明のある態様として、合成ブロックおよび／または発生期の識別部は、二つまたはそれより多くのヌクレオチドからなり、互いにハイブリダイゼーションしてハイブリダイゼーション複合体を形成できる。オリゴヌクレオチド間の間隙は、ポリメラーゼおよびリガーゼのような適当な酵素活性を利用して、適当なヌクレオチドで埋めて、コヒーレント識別部およびまたは合成ブロックを生成する。
【００５６】
機能エンティティの相補的識別領域に対する結合は、通常リンカーを介して行われる。好ましくは、リンカーは、末端のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドよりヌクレオチド一つまたは二つ分下流のヌクレオチドにおいて、機能エンティティを相補的識別領域に結合する。機能エンティティの結合は、結合可能なあらゆるエンティティであってよく、すなわち、機能エンティティは核酸塩基または主鎖のヌクレオチドに結合し得る。一般に、ヌクレオシド連結間の燐光部にあるいは核酸塩基に、機能エンティティを結合させることが好ましい。
【００５７】
本発明のある態様として、機能エンティティの反応基は、リンカーのオリゴヌクレオチドと結合する。反応基は、好ましくは、各々の反応基間の直接結合または適当なフィル−イン基を用いてのいずれかによって、発生期のディスプレイ分子に結合を形成できるタイプである。リンカーによって機能エンティティと結合した反応基は、好ましくは、結合の確立と同時に切断される。機能エンティティは、いくつかの場合は、その後の周期における結合の形成に関与することができる第二反応基を含んでいてよい。第二反応基は、結合の形成に関与することができるようになる前に活性化を必要とするタイプであってよい。
【００５８】
二つまたはそれより多くの機能エンティティが複合体に輸送される場合は、コドンは定常領域または結合領域によって隔てられていてよい。結合領域の一つの機能は、ポリメラーゼが結合できるプラットホームを確立することである可能性がある。コード化分子の形成次第であるが、識別部は、３、４、５、またはそれより多くのコドンといったように、さらなるコドンを含む。さらなるコドンのそれぞれは、適当な結合領域で隔てられている。好ましくは、識別部のコドンの全てまたは少なくとも大多数は、結合配列によって隣接するコドンから隔てられている。結合領域は、例えば１から２０のような、あらゆる適切な数のヌクレオチドを有してよい。
【００５９】
結合領域は、もし存在する場合は、酵素に対する基質を提供するほかに、様々な目的にかなう可能性がある。本発明の機構において、結合領域はコドンの位置を識別する。通常、コドンの上流または下流のいずれかの結合領域が、コドンの位置の決定を可能にする情報を含む。他の機構として、結合領域は、ライブラリーの形成に際して合成ブロックを二つのプールから追加することを可能にする、代わりの配列を有する。その上、結合領域は、アニーリング温度を望ましい程度に調節する可能性がある。
【００６０】
高い親和性を有する結合領域は、三つの水素結合を形成する一つまたはそれ以上の核酸塩基を同系の核酸塩基に組み込むことによって得ることができる。この特性を有する核酸塩基の例としては、グアニンおよびシトシンがある。あるいは、またはそれに加えて、結合領域は主鎖の修飾を受けていてよい。いくつかの主鎖の修飾は、リボースの一部分の２’−Ｏ−メチル置換、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、およびＬＮＡとも呼ばれる（閉鎖核酸）リボースの一部分の２’−４’Ｏ−メチレン環状化のような高い親和性を与える。
識別部はコドンの周りにフランキング領域を含んでいてよい。フランキング領域は、複合体の存在または不在の検出を可能にする蛍光物質または放射活性基のようなシグナル基を取り囲むことができ、またはフランキング領域は、ビオチンのような検出し得る標識を含んでいてよい。識別部がビオチンの部分を含む場合、識別部は容易に回収できる可能性がある。
フランキング領域はまた、ＰＣＲのような増幅反応のための促進部位を供給し得る。通常、二官能性複合体の形成の最後の周期には、促進部位の結合を含む。二官能性複合体の識別部位は、通常他の促進部位のために用いられ、それによって二官能性複合体のコード領域のＰＣＲ増幅が可能となる。
【００６１】
当該明細書および特許請求の範囲において識別部という用語が用いられる場合には、識別部はセンス型またはアンチセンス型である、すなわち、識別部は実際に分子をコードするかまたはそれに相補的な配列であるところのコドンの配列を含みうる。その上、識別部は、適当なように一本鎖または二本鎖であってよい。
一般に活性化アンチコドンに先立って一つまたはそれ以上のアンチコドンを含む、相補的識別領域または合成ブロックのオリゴヌクレオチド部分の設計は、無作為または準無作為であり、識別領域についての一つまたはそれ以上の不適当な組み合わせを許容しうる。しかしながら、特にライブラリーについて熟慮した場合、一つまたはそれ以上の非特異的な塩基対をもつ核酸塩基を前述のコドンを補完する領域に含むことは好都合である。非特異的な塩基対をもつ核酸塩基は、主鎖に結合した場合天然に発生する核酸塩基（Ｃ、Ｔ、Ｇ、Ａ、およびＵ）のうち少なくとも二つと対になることのできる塩基である。好ましくは、二つまたはそれより多くの天然の核酸塩基の間の塩基対および非特異的な塩基対の核酸塩基は、本質的に同じエネルギーで生じる、すなわち形成された結合は同等の力を有する。「非特異的な塩基対の核酸塩基」という用語は、当該明細書で「ユニバーサル塩基」という用語とともに互変的に用いられている。
【００６２】
天然のｔＲＮＡとして、核酸塩基イノシンが発見されている。イノシンは三つの核酸塩基、すなわちシトシン、チミンおよびアデニンと非特異的にハイブリダイゼーションする能力を有する。イノシンおよび天然の核酸塩基と非特異的に塩基の組をつくる同じ能力を有する他の合成化合物の例を、以下に描写する。
【００６３】
【化２】
0005643398.tif 000003
【００６４】
当該方法におけるユニバーサル塩基の利用は、前に輸送されたコドンの核酸塩基は合成ブロックの相補的な領域上のユニバーサル塩基と適合し得るので、ライブラリーの生成において好都合である。使用後のコドンをユニバーサル塩基の配列で補完することは、同じ合成ブロックを様々な伸長中の二官能性複合体に対して利用することを可能にする。
【００６５】
伸長原理によるコード化はまた三本鎖操作を使って用いられ得る。それぞれの工程は、機能エンティティキャリアにハイブリダイゼーションしたアセンブリープラットホームのライブラリーを含む（図７）。アセンブリープラットホームは、識別領域を介して識別分子の全てまたは部分集合に略等しく結合する固定した配列（識別領域に相補的）を含む。あるいは、相補的な識別配列はまた、異なる骨格分子の利用を可能にするので、ライブラリーの多様性を高めるために無作為または準無作為であってよい。アセンブリープラットホームはまた、特定の配列を持つ独特なアンチコドン領域を含む。この特定の配列は、キャリア中の独特なコドン領域にアニーリングし、形成している機能エンティティを輸送できる合成ブロックは、ハイブリダイゼーションによって独特なアンチコドンに結合している。独特のアンチコドンの配列および独特のアンチコドン領域を連結しており、これら二つの配列の間の直接結合を可能にする。この結合は例えばアセンブリープラットホームが合成されるときに得られる。
【００６６】
独特のアンチコドンは、独特のアンチコドン領域と同一であるか、より短いまたはより長い配列のいずれかであってよい。しかしながら必要条件として、これら二つの配列（独特のアンチコドンおよび独特のアンチコドン領域）は、例えば相補的識別領域および所望により連結領域によって、互いに結合している。連結領域は、所望により、機能エンティティおよび結合エンティティの間の最大限の反応性を得るために、変化し得る配列である。もしポリマーがこの体系を用いて作られれば、連結領域は集合周期を通じて伸長し得る。
【００６７】
識別部−ディスプレイ分子を三本鎖アセンブリー原理によって形成することは連続工程においてなされる。各々の個別の工程は、キャリアおよび識別分子をアセンブリープラットホームにアニーリングすることを伴う。アニーリング工程の後、二つの重要な出来事が起こる：１）機能エンティティを識別分子への輸送を達成するための結合エンティティおよび機能エンティティの間の反応、および２）アセンブリープラットホーム上の独特のアンチコドン配列を解読配列として用いた、独特のコドン配列の識別分子への伸長。
【００６８】
本発明の二官能性複合体のライブラリーの形成は、図９および１０に示されるように、プラットホーム分子用の固体支持体を用いて行うことができる。このことは、特定の工程に依存して異なる非コード領域および相補的結合領域を加えた、アセンブリープラットホーム分子の各ライブラリーの、別個のバイアル中の固定されている場所への連続した輸送を可能にし、識別部および合成ブロック分子のライブラリーが供給される。アニーリング反応／輸送伸長工程の後、ライブラリーを除去し（例えば温度上昇によって）、アセンブリープラットホームライブラリーを固定した他のバイアルに輸送し（非コード領域および相補的結合領域を追加）、当該方法における次の工程が可能となる。
【００６９】
様式２
本発明は、その第二の様式において、ディスプレイ分子部およびコード部を含む複合体を生成する方法であって、化学反応部位およびタグの酵素付加の促進部位を含む発生期の二官能性複合体が、一つまたはそれ以上の反応体とその化学反応部位で反応し、一つまたはそれ以上の酵素を用いて促進部位で一つまたはそれ以上の反応体を識別する各々のタグを提供する、方法に関する。
【００７０】
合成ブロックの反応部とコード部の間に共有結合が無いことは、ライブラリーがスプリット・アンド・ミックス法によって生成されるべきであることを示すものである。最初の工程において、発生期の二官能性複合体を、一つまたはそれ以上の隔離した分画に分配し、その後各分画中の反応体に曝露し、それを促進部位において反応体を識別するタグを与える試薬と化学反応部位で反応させる。タグを与える試薬には、それゆえに酵素および基質を含む。本発明のある具体例として、タグは、ポリメラーゼを用いてアンチコドン上に伸長することによって与えられる。本発明の他の具体例として、タグはコドンオリゴヌクレオチドのライゲーションによって促進部位で与えられ、反応体の識別についての情報を保持する。
【００７１】
酵素がポリメラーゼである場合、基質は通常ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｒＡＴＰ、ｒＧＴＰ、ｒＴＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＵＴＰを含む群から選ばれるヌクレオチド三リン酸の混合物である。リガーゼの基質は、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド、すなわち二つまたはそれより多くのヌクレオチドを含む核酸である。酵素的ライゲーションは、一本鎖または二本鎖の形で行ってよい。一本鎖のライゲーションを行う場合、一つ目の核酸の３’ＯＨ基は二つ目の核酸の５’リン酸基にライゲートされる。二本鎖のライゲーションは一つ目および二つ目の核酸の３’末端および５’末端の部分に相補的な三番目のオリゴヌクレオチドを用いてライゲーションを助ける。一般に二本鎖ライゲーションを行うことが好ましい。
【００７２】
本発明のある具体例として、ポリメラーゼ転写およびライゲーション結合の組み合わせが用いられる。例として、他の二本鎖の核酸中の間隙は、ポリメラーゼによって補充され、リガーゼは伸長生成物を上流のオリゴヌクレオチドにライゲーションし、完全な二本鎖の核酸を生成し得る。
【００７３】
様式２は、上記したように、各反応について隔離した分画中で行われる。従って、タグの付加は、核酸の競争なしに起こり、交差コード化の可能性は相当減少する。タグの酵素的付加は、反応の前に、後に、または同時に起こる可能性がある。本発明のある態様として、酵素によって用いられる条件とは異なる反応条件を適用することが好ましい可能性があるので、反応に先立って発生期の二官能性複合体にタグを付加することが好ましい。一般に、酵素反応は水性の媒質中で行われ、一方反応体およびある反応に対する化学反応部位の間の反応は、有機溶媒が好都合である。両反応について適当な条件を得るための適切な方法は、水性の媒質中で酵素反応を行い、凍結乾燥し、その後化学反応部位で起こるべき反応に適当な媒質中に溶解または分散させることである。もう一つの方法として、適切な反応条件は溶媒を水性媒質に加えることによって得られるので、凍結乾燥の工程は省略してもよい。溶媒は水性媒質と混和可能で均質な反応媒質を生成してもよく、または非混和性で二相性の媒質を生成してもよい。
【００７４】
第二の様式に従った反応体は、遊離反応体またはジッパー合成ブロックであってよい。遊離反応体は反応体の他の部位を識別するコードに結合しない。多くの場合において、遊離反応体は、一つ、二つまたはそれより多くの反応基を含む化学構造を含み、化学反応部位と反応できる。ジッパー合成ブロックは、化学反応部位の近傍に結合する化学エンティティと結合している機能エンティティである。結合している化学エンティティは、発生期の二官能性複合体の連結部分に、反応に先立ってハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドであってよい。ハイブリダイゼーションの結果、機能エンティティおよび化学反応部位の間は近接さを増し、それによって副反応の可能性が低下し、局所的に高濃度であることから反応が促進される。
【００７５】
発生期の二官能性複合体はコード化法を考慮して構築される。従って、もしポリメラーゼがコード化のために用いられれば、ハイブリダイゼーション領域は、通常、リンカー部分にて提供される。ハイブリダイゼーション領域は、アンチコドンを含む相補的なオリゴヌクレオチドの結合領域が発生期の二官能性複合体にハイブリダイズすることを可能にする。結合領域はポリメラーゼに対する結合部位として供給され、それからアンチコドンオリゴヌクレオチドを鋳型として用いて、伸長生成物を生成してよい。リガーゼがコード化のために用いられる場合、発生期の二官能性複合体の促進部位は、リガーゼが基質とみなす可能性のある一つまたはそれ以上のヌクレオチドを含む。一本鎖のライゲーションにおいて、媒質中に存在するオリゴヌクレオチドおよび反応基の識別について持つ情報を、発生期の二官能性分子にライゲートするであろう。二本鎖のライゲーションは、ライゲーションに先立って相補的なオリゴヌクレオチドにライゲートできるようにするために、発生期の二官能性複合体の促進部位を必要とする。適当に、促進部位は、相補的オリゴヌクレオチドがハイブリダイズしうる一つ、二つ、またはそれより多くのヌクレオチドを含む。相補的なオリゴヌクレオチドは、他方の末端で特定の反応体の情報を保持するコドンオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。
【００７６】
発生期の二官能性複合体のリンカー部分は、化学反応部位の識別に関連する情報を含んでいてよい。適用できる方法において、リンカー部分は、化学反応部位の識別についての情報を提供するコドンを含む。
適切な反応体上の情報を有するオリゴヌクレオチドは、反応体を識別するヌクレオチドの組み合わせは別として、フランキング領域を含んでいてよい。フランキング領域は、発生期の二官能性複合体にハイブリダイズできる結合領域を提供する可能性がある。結合領域は、一つ以上の発生期の二官能性複合体に無差別にハイブリダイズするために、構築されてよい。あるいは、コードオリゴヌクレオチド上の結合領域は、スプリントのオリゴヌクレオチドを調節因子として用いて、発生期の二官能性複合体を結合領域にライゲートさせることができる。
【００７７】
本発明は、単一の反応体を発生期の二官能性複合体と反応させることによって行い、対応するタグを加えてよい。しかしながら、一般に、二つまたはそれより多くの反応体についての反応生成物を含むディスプレイ分子を構築することが望ましい。従って、本発明のある態様として、方法は、ディスプレイ分子部およびコード部を含む二官能性複合体を得るために考案され、ディスプレイ分子は反応体の反応生成物であり、出発複合体の化学反応部位である。本発明の態様として、二つの交互のパラレル合成は、化学反応部位および反応体の間の反応と並行して、タグを酵素的に発生期の二官能性複合体に連結するために行われる。各周期において、タグの付加は、反応体および化学反応部位の間の反応が続くか、またはそれによって起こる。パラレル合成の後の各周期において、先の反応の反応生成物は、化学反応部位を供給し、最後に結合したタグはタグの酵素的付加を可能にする促進部位を与える。本発明の他の態様として、二つまたはそれより多くのタグを、各々の反応体との反応に先立って、またはその後に与える。
全てのタグを含むコード部は、プライマーがオリゴヌクレオチドの３’末端にアニーリングし、適当なポリメラーゼを用いて伸長するところの伸長工程によって、二本鎖の形に変形し得る。二本鎖であることは、一本鎖の核酸は、アプタマーと類似した方法で生物学的標的との相互作用をする可能性があるので、その後の選別工程の間好都合である。
【００７８】
様式２のある態様として、方法は、ディスプレイ分子部およびコード部を含む二官能性複合体のライブラリーを生成するために考案される。当該方法は、分離した画分中で発生期の二官能性複合体を供給する工程を含み、各々の複合体は化学反応部位およびタグの酵素的付加の促進部位を含み、各画分で化学反応部位および一つまたはそれ以上の反応体の間であらゆる順序で反応が起こり、一つまたはそれ以上の酵素を用いて促進部位において一つまたはそれ以上の反応体を識別する一つまたはそれ以上の各々のタグを付加する。
【００７９】
各画分中の発生期の二官能性複合体は、同一であるか、または異なっていてよい。発生期の二官能性複合体が化学反応部位において異なる場合は、適当な発生期の二官能性複合体は化学反応部位の構造を識別するコドンを含む。同様に、各画分において適用する反応体は、場合に応じて同一であるかまたは異なっていてよい。また、各画分における反応条件は、同一であるかまたは異なっていてよい。
【００８０】
通常、複合体を一つ以上の反応体と反応させることが望ましい。本発明のある態様として、二つまたはそれより多くの画分の内容物を一緒にプールし、その後新しい周期の反応のための画分の配列にスプリットする。従って、最初の周期の後に続く全ての周期において、先行する反応周期の最終生成物は、二官能性複合体のライブラリーを得るために発生期の二官能性複合体として用いられ、そのライブラリーの各要素は試薬特異的反応生成物および反応生成物の形成に関与する各々の反応体の識別部をコードする各々のタグを含む。本発明の態様として、反応の各周期の間に、画分の内容物は、混合して再び画分にスプリットされる。本発明の他の態様として、画分の内容物は、コドンを受け取った後で反応が起こる前に、さらなる画分に分けられ、その中でさらなるコドンを受け取ってコード化された二つの反応体との反応が起こる。本発明の他の態様として、化学反応部位および反応体の間の反応が起こるのが可能になる前に、二つより多くのコドンがコード化される。あるいは、二つまたはそれより多くの反応が、各々のタグを用いたコード化が開始される前に、起こることが可能となる。
【００８１】
個別のコドンは、単一のヌクレオチドのみによって、他のコドンと区別される。しかしながら、後の解読工程を容易にするために、一般に特定のコドンおよび他のあらゆるコドンの間には二つまたはそれより多くの違いがあることが望ましい。例として、５個のヌクレオチドの長さのコドン／アンチコドンが選ぶと、二つまたはそれより多くの違いが見られるものとして１００以上のヌクレオチドの組み合わせが存在する。コドン中のある数のヌクレオチドについて、特定のコドン／アンチコドンの間の違いの数をライブラリー中にみられる他のすべてのコドン／アンチコドンと比較して最適にすることが望ましい。オリゴヌクレオチドコドンは、２から１００まで、３から５０まで、４から２０までまたは５から１５までのヌクレオチドのような、あらゆる適当な数のヌクレオチドを含んでいてよい。
【００８２】
反応体は、遊離反応体またはジッパー合成ブロックであってよい。反応体は、結果としてディスプレイ分子部に結合する構造エンティティの前駆体としての機能を与える。これらの反応体の構造は、次の周期において化学反応部位との反応後に変化してよい。反応体がジッパー合成ブロックである場合、機能エンティティおよびオリゴヌクレオチドの間の結合の切断は、通常反応後に行われる。例外は最後の周期であり、切断は省略され得る。切断は化学反応部位との反応の後に、または同時に起こりえる。切断は、その後の工程において発生期のディスプレイ分子および反応体の間の結合の形成に与りえる反応基を生成してよい。
【００８３】
遊離反応体またはジッパー合成ブロックの機能エンティティは、好ましくは、発生期の二官能性複合体の化学反応部位に対する結合を起こす反応に関与することのできる、少なくとも一つの反応基を含む。遊離反応体および機能エンティティ上に見られる反応基の数は、適当なものとして１から１０である。特に、ポリマーおよび骨格の末端の、一つの反応基のみを特徴づけた遊離反応体または機能エンティティが用いられ、一方二つの反応基を有する機能エンティティは、さらに反応できるポリマーまたは骨格の主要部の形成に適している。結合を形成するための二つまたはそれより多くの反応基は、典型的には骨格上に存在する。骨格は中心の構造であり、多数の変異体を作る基礎を形成する。骨格の変異体は、典型的には、骨格の反応基の他の反応体の反応基との反応によって形成され、所望によりフィル−イン基または酵素によって修飾される。骨格に結合する機能エンティティまたは遊離反応体は、結合を形成できる一つ、二つ、またはいくつかの反応基を含んでいてよい。骨格の例としては、ステロイド、ヒダントイン、ベンゾジアゼピンその他を含む。
【００８４】
ジッパー領域を含む、核酸に結合している遊離反応体または機能エンティティの反応基、すなわち、発生期の二官能性複合体の結合部分に無作為に結合する領域は、化学反応部位の反応基に直接結合を形成できてもよく、または反応体は架橋フィル−イン基によって化学反応部位の反応基に結合を形成できてもよい。反応基の全ての原子が必ずしも形成された結合中で維持されていないということを理解すべきである。むしろ反応基は結合の構造の前駆体とみなすべきである。
【００８５】
ジッパー合成ブロックを用いる場合、切断は、化学反応部位および機能エンティティの間の結合の形成の後に、または形成と同時に行ってよい。切断はあらゆる適切な方法で行われ得る。本発明の態様として、切断は試薬または酵素の使用を伴う。切断によって機能エンティティが発生期の二官能性複合体に輸送され、または複合体がジッパー合成ブロックの機能エンティティに輸送される。ある場合においては、切断の結果として新しい化学基を導入することは、好都合である。新しい化学基は、直接または活性化された後に、その後の周期におけるさらなる反応に用いてよい。他の場合においては、切断後には何のリンカーの痕跡も残っていないことが望ましい。本発明のある態様として、一つまたはそれ以上の化学結合を切断することは望ましくない可能性がある。例として、ジッパードメインおよび最後の周期の機能エンティティの間の結合を維持することが望ましい可能性がある。
【００８６】
本発明のある態様として、結合および切断は同時の反応によって行われる、すなわち、ジッパー合成ブロックの機能エンティティまたは発生期の二官能性複合体の化学反応部位のいずれかが、反応の遊離基である。本発明のある態様として、工程の数を減少させ、複雑さを軽減できるので、切断が同時に起こるような体系を構築することが好ましい。同時の結合および切断はまた、上記のように、何のリンカーの痕跡も残らないか、またはさらなる反応を誘導されるための新しい化学基として構築し得る。本発明の他の態様として、段階的な方法では、副反応を抑制し、非特異的輸送の可能性を低下させられるので、別々に架橋結合および切断を行うことが好ましい。
【００８７】
ジッパードメインを含むオリゴヌクレオチドに対して機能エンティティを結合することは、通常、リンカーを介して行われる。好ましくは、リンカーは、末端のヌクレオチドで、またはオリゴヌクレオチドより一つまたは二つのヌクレオチド分下流のヌクレオチドにおいて、機能エンティティをオリゴヌクレオチドに連結する。機能エンティティの結合は、結合のために利用可能なあらゆるエンティティにおいて起こりえる、すなわち、機能エンティティが核酸塩基または主鎖にあるオリゴヌクレオチドのヌクレオチドに結合し得る。一般に、ヌクレオシド連結間の燐光部にあるいは核酸塩基に、機能エンティティを結合させることが好ましい。
【００８８】
本発明のある態様として、機能エンティティの反応基は、オリゴヌクレオチドと結合しており、所望により適当なスペーサーを用いてよい。反応基は、好ましくは、各々の反応基の間の直接反応によって、または適当なフィル−イン基を用いることによって、発生期のディスプレイ分子の結合を作ることのできるタイプである。機能エンティティをオリゴヌクレオチドに結合する反応基は、好ましくは、結合の確立と同時に切断される。機能エンティティは、ある場合においては、その後の周期における結合の形成に関与することのできる第二反応基を含んでいてよい。第二反応基は、結合の形成に関与することができるようになる前に、活性化される必要のあるタイプであってよい。
【００８９】
好ましくは、切断工程後にも少なくとも一つのリンカーがそのままで残っている。少なくとも一つのリンカーは、ディスプレイ分子をコード部、すなわちディスプレイ分子の形成に与った様々な反応体を識別する一つまたはそれ以上のタグを含む部分に結合させるであろう。選択的に切断できるリンカーを含む空間によって、ディスプレイ分子部を二官能性複合体のコード部に結合することが望ましい可能性がある。選択的に切断可能なリンカーは、機能エンティティを化学反応部位に輸送させる条件下では、切断しないように設計される。
【００９０】
切断可能なリンカーは多数の化学構造から選択することができる。リンカーの例としては、酵素的切断部位を有するリンカー、化学的に分解性の成分を含むリンカー、および電磁放射によって切断可能なリンカーを含むが、それに限定されない。特に興味深い切断可能なリンカーは、現在のところは、光によって切断し得るリンカーである。適当な例としては、ディスプレイ分子および二官能性複合体のコード部の間に位置するところのｏ−ニトロベンジル基を含む。
【００９１】
二つまたはそれより多くの反応体が化学反応部位と反応する場合、コード部のコドンは、定常領域または結合領域によって隔てられていてもよい。結合領域の一の機能は、ポリメラーゼまたはリガーゼのような酵素が基質として認識できるプラットホームを確立することでありうる。形成されたコード化分子次第であるが、識別部は、３、４、５、またはそれより多くのコドンなどのさらなるコドンを含んでいてもよい。各々のさらなるコドンは、適当な結合領域によって隔てられてよい。好ましくは、識別部の全てまたは少なくとも大部分のコドンは、結合配列によって、隣接するコドンから隔てられる。結合領域は、例えば１から２０のような、あらゆる適当な数のヌクレオチドを有してよい。
【００９２】
結合領域は、もし存在すれば、酵素に対する基質を与えるほかに、様々な目的に供することもできる。本発明の一つの機構として、結合領域はコドンの位置を識別する。通常、コドンの上流または下流のいずれかの結合領域が、コドンの位置を決定できるようにする情報を含んでいる。他の機構として、結合領域は、ライブラリーの形成に際して合成ブロックを二つのプールから追加することを可能にする、交替の配列を有する。その上、結合領域はアニーリング温度を望ましいレベルに調節することもできる。
【００９３】
高い親和性を有する結合領域は、三つの水素結合を形成する一つまたはそれ以上の核酸塩基の同族の核酸塩基に対する結合によって、与えられ得る。この特性を有する核酸塩基の例としては、グアニンおよびシトシンがある。あるいは、またはそれに加えて、結合領域は主鎖の修飾を受けていてよい。いくつかの主鎖の修飾は、リボースの一部分の２’−Ｏ−メチル置換、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、およびＬＮＡとも呼ばれる（閉鎖核酸）リボースの一部分の２’−４’Ｏ−メチレン環状化のような高い親和性を与える。
【００９４】
識別部はコドンの周りにフランキング領域を含んでいてよい。フランキング領域は、複合体の存在または不在の検出を可能にする蛍光物質または放射活性基のようなシグナル基を取り囲むことができ、またはフランキング領域は、ビオチンのような検出し得る標識を含んでいてよい。識別部がビオチンの部分を含む場合、識別部は容易に回収されうる。
フランキング領域はまた、ＰＣＲのような増幅反応のための促進部位として供することもできる。通常、二官能性複合体の形成における最後の周期は促進部位の組み込みを含む。ディスプレイ分子および骨格分子をコードするコドンの間の核酸配列のような、ディスプレイ分子の近傍の二官能性複合体の領域は、通常他の促進部位のために用いられ、それによって二官能性複合体のコード領域のＰＣＲ増幅が可能となる。
【００９５】
様式１および様式２の組み合わせ
本発明のある態様において、上記した様式１および様式２を組み合わせる、すなわち、異なった反応体を異なった周期にて用いる。また、様式１および様式２の範囲で、異なった合成ブロックを異なった周期に用いてよい。
ライブラリーの形成において、各々の様式１および様式２はその価値があるので、ワン−ポット法（様式１）およびスプリット・アンド・ミックス法（様式２）を組み合わせて用いることは、好都合である可能性がある。ワン−ポット法は、反応に先立って極めて近傍に反応基を有する可能性があるので、したがって高い局所濃度および単一の容器という簡便性が得られる。スプリット・アンド・ミックス法は、遊離反応体および非ハイブリダイゼーション反応条件を有する可能性があるので、多目的の反応が与えられる。様々な単一のコード化の酵素的方法を示した図１５を参照することが適切である可能性がある。スプリット・アンド・ミックス合成法は、一般に反応体／機能エンティティおよびコドン／アンチコドンの間に共有結合を持たない反応体、すなわち、遊離反応体およびジッパー合成ブロックに対して用いられる。ワン−ポット法は、一般に機能エンティティおよび機能エンティティを識別するコドン／アンチコドンの間に共有結合が存在する反応体、すなわち、Ｅ２合成ブロック、環状合成ブロックおよびＮ合成ブロックに対して用いられる。
【００９６】
本発明のある具体例として、二官能性複合体の中間生成物のライブラリーは、ワン−ポット（one-pot）法を用いて生成する。この中間生成物のライブラリーは、その後スプリット・アンド・ミックス合成による最終生成物のライブラリーの生成に用いられる。中間生成物のライブラリーは、一周期のまたは多周期のワン−ポット法を用いて生成してよく、最終生成物のライブラリーは、一周期のまたは多周期のスプリット・アンド・ミックス法を適用することによって生成してよい。ライブラリーの生成の最後の周期にスプリット・アンド・ミックス合成を用いることによって、ハイブリダイゼーションの維持と両立しない反応媒質、例えば高イオン濃度の溶媒または有機溶媒を、最終反応体に対して用いる可能性がある。
【００９７】
他の具体例として、中間生成物のライブラリーは、スプリット・アンド・ミックス合成法を用いて生成する。間生成物のライブラリーは、ワン−ポット法を用いた最終生成物のライブラリーの生成に用いられる。中間生成物のライブラリーは、一周期のまたは多周期のスプリット・アンド・ミックス合成を用いて生成してよく、最終生成物のライブラリーは、一周期のまたはそれより多くのワン−ポット法を適用して製造してよい。最後の周期のワン−ポット法は、伸長するコード化分子および機能エンティティの間を非常に近接にする。非常に近接となることによって、高い局所濃度が得られ、比較的低い反応性を有する反応体に対してさえ反応を促進する。
【００９８】
多重コード化
多重コード化は、二つまたはそれより多くのコドンが、化学反応部位および二つまたはそれより多くの反応体の間の反応に先立ってまたはその後に、識別部に提供されることを意味する。多重コード化には、様々な利点があり、最初の反応体および化学反応部位の間の中間生成物は安定でないので、三つ（またはそれ以上）の成分の反応によってのみ合成され得る多くの化合物のような、広範な反応を可能にする。他の利点は、ある具体例として、有機溶媒の利用および二つまたはそれより多くの遊離反応体が利用できるようになることに関する。
従って、本発明のある態様として、ディスプレイ分子部およびコード部を含む二官能性複合体を得る方法に関し、ディスプレイ分子は、二つまたはそれより多くの反応体および反応体を識別するタグを含むコード部との化学反応部位の反応によって得られる。
【００９９】
本発明のある態様として、最初の反応体は化学反応部位との反応で中間生成物を形成し、第二の反応体は中間生成物と反応してディスプレイ分子およびその前駆体を得る。本発明の他の態様において、二つまたはそれより多くの反応体は、互いに反応して中間生成物を形成し、化学反応部位は中間生成物と反応してディスプレイ分子およびその前駆体を得る。中間生成物は、二つまたはそれより多くの反応体を別々に反応させることによって得られ、その後の工程において、中間生成物を化学反応部位と反応させる。反応体を別個の工程において反応させることはタグが耐えられないであろう条件を用いる可能性を提供するものである。従って、コード部が核酸を含む場合は、反応体間の反応は核酸を分解するであろう別の条件で行ってよい。
【０１００】
反応は以下に示すスキームに従って実行してよい。スキームは、二つの反応体および化学反応部位（骨格）を識別する、化学反応部位に結合しているタグは、分離した画分に与えられる。画分は、マイクロタイタープレートのような、異なるアシル化試薬および異なるアルキル化試薬のあらゆる組み合わせを可能にするアレーに配列する。
【０１０１】
開始条件: 
【表１】
0005643398.tif 000004
Ｘは骨格のような化学反応部位を意味する。
【０１０２】
二つの反応体は、別々にあらゆる組み合わせで互いに反応するか、またはその後コード部のタグに応じて各々の画分に加え、または反応体は直接反応を可能にするように各々の画分にあらゆる順序で加えてよい。以下のスキームは反応の結果を示す。
【０１０３】
生成物のプレート
【表２】
0005643398.tif 000005
例として、ＸＡ２は、最後の状態、すなわち断片Ｘ、Ａ、および２から完全に集められた状態におけるディスプレイ分子ＸＡ２を意味する。
【０１０４】
反応体を識別する二つまたはそれより多くのタグを含むコード部は、反応の前または後のいずれかに、あらゆる適当な方法で調製してよい。本発明のある態様として、各々のコード部を、標準的なホスホロアミダイトの性質によって合成する。他の態様においては、タグを予め調製し、化学的または酵素的ライゲーションによって最後のコード部に集合させる。
【０１０５】
化学的ライゲーションについて様々な可能性が存在する。適当な例として、
ａ）最初のオリゴヌクレオチド末端は３’−ＯＨ基を含み、第二のオリゴヌクレオチド末端は５’−リン酸−２−イミダゾール基を含む。反応すると、ホスホジエステルヌクレオシド間結合が形成され、
ｂ）３’末端にホスホイミダゾライド基、および５’末端にホスホイミダゾライド基を含む最初のオリゴヌクレオチド末端。ともに反応すると、ホスホジエステルヌクレオシド間結合が形成され、
ｃ）３’チオリン酸基を含む最初のオリゴヌクレオチド末端、および５’ヨウ素を含む第二のオリゴヌクレオチド。二つの基が反応すると、３’−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−５’ヌクレオシド間結合が形成され、および
ｄ）３’チオリン酸基を含む最初のオリゴヌクレオチド末端、および５’トシル基を含む第二のオリゴヌクレオチド。反応すると、３’−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−５’ヌクレオシド間結合が形成される
ことが挙げられる。
【０１０６】
適当には、タグは作動可能に結合し、核酸活性酵素がライゲーション領域を基質として識別できるようにする。特に、好ましい具体例において、ライゲーションは、ポリメラーゼがライゲートされた鎖を鋳型として識別することができるように行われる。従って、好ましい態様において、結合工程についての化学反応方法は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合の形成を含む。この態様に従うと、上記の方法ａ）およびｂ）が好ましい。
【０１０７】
他の態様として、リガーゼがライゲーションのために用いられる場合、適当な例としては、ＴａｑＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ＤＮＡリガーゼおよびイー・コリＤＮＡリガーゼを含む。リガーゼの選択は、結合している末端の構造にある程度左右される。従って、もし末端が平滑であれば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼが好ましく、一方粘着末端のライゲーション、すなわちそれぞれの末端の突出部が互いを補完しあうライゲーションについては、ＴａｑＤＮＡリガーゼが好ましい。
【０１０８】
本発明のある態様において、酵素の提供する特異性のため、酵素的コード化が好ましい。図１７は、二官能性分子のコード部において、二つまたはそれより多くの反応体を酵素的にコード化するための様々な方法を開示する。コード化方法の選択は、遊離反応体の必要、近接さの必要、利便性の必要性のような様々な要因に左右される。図１７に示す酵素的二重コード化法は、容易に三重、四重その他のコード化に拡張できる。
【０１０９】
特定の具体例によれば、機能エンティティは、識別タグと結合しており、それぞれの機能エンティティは一つまたはそれ以上の反応基を輸送する。すべての機能エンティティは互いに反応し、機能エンティティと同じだけ多くのタグを含む最終生成物を生成する。タグは、以下に示すように、通常オリゴヌクレオチドを分子間反応または集合によって単一のコード部に結合してよく、続いて二つのリンカーを切断させる。
【０１１０】
【化３】
0005643398.tif 000006
太い線はタグを表す。細い線はリンカーまたは結合を表す。黒星は促進部位を意味する。本発明のある態様として、Ｘは化学反応部位とみなす。
【０１１１】
上の具体例のある態様として、タグはオリゴヌクレオチドのタグであり、化学ライゲーションまたは酵素触媒ライゲーションによって結合する。
あるいは、タグは、機能エンティティの反応に先立って、結合している。その過程において、機能エンティティはタグから切断されるか、またはその後に切断される。例えば、
【０１１２】
【化４】
0005643398.tif 000007
上のスキームの具体例は、タグがヌクレオチドである場合、化学ライゲーションまたは酵素触媒ライゲーションによってタグを組み合わせることを含む。
【０１１３】
実施例９は、三重コード化が用いられる多成分の反応を図示している。従って、化学反応部位における三つの遊離反応体の反応後、コード部は酵素的ライゲーションによって三つの識別タグを与える。
【０１１４】
機能エンティティの輸送能を有する合成ブロック
次の項では、二官能性複合体の反応基に機能エンティティを輸送できる、具体例としての合成ブロックの形成および利用を述べる。太い線は、オリゴヌクレオチドを意味する。
【０１１５】
Ａ．アシル化反応
アシル化合成ブロックの形成の一般的な経路およびこれらの利用：
【化５】
0005643398.tif 000008
【０１１６】
Ｎ−ヒドロキシマレイミドは、（１）例えば塩化アセチルのような塩化アシルの使用によって活性化されてもよく、または例えばＴＨＦ中でジクロロヘキシルカルボジイミドまたはジイソプロピルカルボジイミド、および例えば酢酸のような酸の使用によって活性化されてもよい。中間生成物は過剰の１，３−プロパンジチオールの使用によってマイケル付加に付し、続いて４，４’−ジピリジル二硫化物または２，２’−ジピリジル二硫化物のいずれかと反応してよい。この中間生成物（３）をついでチオールハンドルを有するオリゴヌクレオチドに負荷して合成ブロック（４）を生成してよい。明らかに、中間生成物（２）は、ジスルフィド結合の他の結合、例えばアミド結合のような結合を用いてオリゴヌクレオチドに結合してよく、Ｎ−ヒドロキシマレイミドは、様々なスペーサーを用いてオリゴヌクレオチドから隔てることができる。
【０１１７】
合成ブロック（４）は、レシピエントのアミン基を含む識別オリゴヌクレオチドと、例えば次の手順によって反応させてもよい：合成ブロック（４）（１ｎｍｏｌ）を、ヘペス緩衝剤（１００ｍＭのヘペス２０μｌおよび１Ｍの塩化ナトリウム溶液、ｐＨ＝７．５）および水（３９μｌ）中で、アミノ−オリゴヌクレオチド（１ｎｍｏｌ）と混合する。オリゴヌクレオチドは、５０℃まで加熱して３０℃まで冷却する（毎秒２℃）ことによって共にアニーリングする。ついで、混合物を温度を変動させて一晩放置し（１０℃一秒間、その後３５℃一秒間）、生成物（５）を得る。
【０１１８】
より一般的な用語では、以下に示す合成ブロックは、レシピエントの求核基、典型的にはアミン基に化学エンティティ（ＣＥ）を輸送できる。太い下の水平な線は合成ブロックは図示しており、垂直な線はスペーサーを図示している。５員環の置換されたＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）環は、活性化物質として役立ち、すなわち、不安定な結合が、ＮＨＳ環および機能エンティティに結合している酸素原子の間に形成される。不安定な結合は、例えば骨格に位置するような、求核基によって切断してよい。
【化６】
0005643398.tif 000009
【０１１９】
アミド結合を形成してよい他の合成ブロックは、
【化７】
0005643398.tif 000010
である。
【０１２０】
Ｒは欠けているか、またはＮＯ２、ＣＦ３、ハロゲン、好ましくはＣｌ、ＢｒまたはＩであってよく、ＺはＳまたはＯである。このタイプの合成ブロックは、デンマーク特許出願番号ＰＡ  ２００２  ０９５１、および「機能エンティティをレシピエントの求核基に輸送可能な合成ブロック」という表題で２００２年１２月２０日に提出された米国仮特許出願に開示されている。両特許出願の内容は、出典明示により当該明細書の一部とする。
求核基は、Ｚおよびカルボニル基の間の結合を切断し、それによって化学エンティティ−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＥ’を求核基に輸送することができる。
【０１２１】
Ｂ．アルキル化
アルキル化／ビニル化合成ブロックの形成の一般的経路およびこれらの利用：
アルキル化合成ブロックは、次のような一般的構造を有する：
【化８】
0005643398.tif 000011
【０１２２】
Ｒ１およびＲ２は、硫酸塩の反応性を調節するために用いてよく、適切な反応性を可能にする。塩素置換および窒素置換は、反応性を高めるであろう。アルキル基は反応性を低下させるであろう。硫酸塩に対するオルト置換は、立体的配置の理由によって、入ってくる求核基がＲ基を選択的に攻撃するようにし、硫黄に対する攻撃を防止するであろう。
【０１２３】
アルキル化合成ブロックの形成および機能エンティティの輸送の例を以下に示す。
【化９】
0005643398.tif 000012
【０１２４】
３−アミノフェノール（６）は、無水マレイン酸で処理され、続いて例えばＨ２ＳＯ４またはＰ２Ｏ５で処理され、加熱してマレイミド（７）を得る。マレイミドについての閉環はまた、酸に安定なＯ−保護基がＡｃ２Ｏによる処理によって、加熱をしてまたは加熱なしに用いられ、続いてＯ−脱保護することによって達成される可能性がある。あるいは、Ａｃ２Ｏ中で還流し、続いて熱水／ジオクサン中でＯ−脱アセチル化に付して（７）を得る。さらに、トリエチルアミンまたはジクロロメタンもしくは高沸点溶媒中炭酸カリウムと共にまたはなしで、（７）をＳＯ２Ｃｌ２により処理し、中間生成物（８）を得、それを単離するかまたは適当なアルコール、この場合はメタノールで急冷することによって直接アリールアルキル硫酸塩にさらに変形し、それによって（９）が形成するであろう。
【０１２５】
有機部分（９）は次のようにオリゴヌクレオチドに結合させることができる：緩衝剤５０ｍＭＭＯＰＳまたはヘペスまたはリン酸塩ｐＨ７．５中でオリゴヌクレオチド担持のチオールを、ＤＭＳＯ／ＤＭＦ濃度が５−５０％、好ましくは１０％であるようなＤＭＳＯあるいはまたＤＭＦ中の、有機合成ブロック（９）の、１−１００ｍＭの、好ましくは７．５ｍＭの溶液で処理する。混合物は、１−１６時間、好ましくは２−４時間２５℃で放置し、アルキル化試薬、この場合はメチル化合成ブロック（１０）を得る。
メチル化合成ブロック（１０）と発生期の二官能性複合体を担持するアミンとの反応は、次のように行ってよい：二官能性複合体（１ｎｍｏｌ）は、ヘペス緩衝剤（１００ｍＭのヘペス２０μｌおよび１Ｍの塩化ナトリウム溶液、ｐＨ＝７．５）および水（３９μｌ）中で、合成ブロック（１０）（１ｎｍｏｌ）と混合する。オリゴヌクレオチドを、５０℃まで加熱して３０℃まで冷却する（毎秒２℃）ことによって互いにアニーリングする。混合物は、その後温度を変動させて放置し（１０℃一秒間、その後３５℃一秒間）、メチルアミン反応生成物（１１）を得る。
【０１２６】
より一般的な用語では、化学エンティティを、単結合を形成する受け取る側の反応基に輸送することができる合成ブロックは、
【化１０】
0005643398.tif 000013
である。
受け取る基は、ヘテロ原子を含む基のように求核性であり、それによって化学エンティティおよびヘテロ原子の間に単結合を形成してよく、または受け取る基は、負に帯電した炭素原子であり、それによって化学エンティティおよび骨格の間にＣ−Ｃ結合を形成してよい。
【０１２７】
Ｃ．ビニル化反応
アルキル化合成ブロックについて上記したのと同様に、ビニル化合成ブロックを調製し、使用してよい。クロロスルホン酸（上の８）をアルコールと反応させないで、中間生成物のクロロスルホン酸を単離し、フッ化物存在下でまたはその存在なしに、エノラートまたはＯ−トリアルキルシリルエノラートで処理する。例えば、
【化１１】
0005643398.tif 000014
である。
【０１２８】
具体例としてのビニル化合成ブロック（１３）の形成：
緩衝剤５０ｍＭＭＯＰＳまたはヘペスまたはリン酸ｐＨ７．５中のオリゴヌクレオチドを担持するチオールを、ＤＭＳＯ／ＤＭＦ濃度が５−５０％、好ましくは１０％であるようなＤＭＳＯまたはあるいはＤＭＦ中の、有機部分（１２）の、１−１００ｍＭの、および好ましくは７．５ｍＭの溶液で処理される。混合物は１−１６時間、好ましくは２−４時間２５℃で放置し、ビニル化合成ブロック（１３）を得る。
【０１２９】
スルホニルエノラート（１３）を用い、骨格を担持するアミンと反応させてエナミン（１４ａおよび／または１４ｂ）を得てもよく、または例えばカルボアニオンと反応させて（１５ａおよび／または１５ｂ）を得てもよい。例えば、
【化１２】
0005643398.tif 000015
である。
【０１３０】
ビニル化合成ブロック（１３）および識別部を担持するアミンまたはニトロアルキルの反応は、次のように行ってよい：
アミノオリゴヌクレオチド（１ｎｍｏｌ）またはニトロオリゴヌクレオチド（１ｎｍｏｌ）の識別部を、０．１ＭのＴＡＰＳ、リン酸塩またはヘペス緩衝剤、および３００ｍＭ塩化ナトリウム溶液、ｐＨ＝７．５−８．５好ましくはｐＨ＝８．５中で、合成ブロック（１ｎｍｏｌ）（１３）と混合する。オリゴヌクレオチドは、５０℃まで加熱して３０℃まで冷却する（毎秒２℃）ことによって鋳型にアニーリングする。混合物は、その後温度を変動させて放置し（１０℃一秒間、その後３５℃一秒間）、反応生成物（１４ａ／ｂまたは１５ａ／ｂ）を得る。上記したスルホン酸アルキルおよびスルホン酸ビニルの代わりに、例えば以下に述べる（３１）のようなスルホン酸塩（しかしながらアルキルまたはビニルの代わりにＲ”を持つ）は、同じ程度に有効である可能性があり、（２８、アルキル基によって置換されたフェニル基）および（２９）から調製される可能性があり、アルキル化試薬およびビニル化試薬として用いてよい。
【０１３１】
化学エンティティをレシピエントのアルデヒド基に輸送することによって、二重結合を形成することのできる他の合成ブロックを、以下に示す。アルデヒドの炭素および化学エンティティの間の二重結合は、反応によって形成される。
【化１３】
0005643398.tif 000016
【０１３２】
上記の合成ブロックは、デンマーク特許出願番号ＤＫＰＡ  ２００２  ０１９５２、および「機能エンティティを、Ｃ＝Ｃ二重結合を形成するレシピエントの反応基に輸送可能な合成ブロック」という表題で２００２年１２月２０日に提出された米国仮特許出願に含まれている。両特許出願の内容は、出典明示により当該明細書の一部とする。
【０１３３】
Ｄ．アルケニル化反応
ヴィティヒおよびＨＷＥ合成ブロックの形成の一般的な経路およびこれらの利用：
市販で入手できる化合物（１６）は、標準的な方法、すなわちＤＣＣまたはＤＩＣ結合によって、ＮＨＳエステル（１７）に変形してよい。緩衝剤５０ｍＭＭＯＰＳまたはヘペスまたはリン酸ｐＨ７．５中のオリゴヌクレオチドを担持するアミンを、ＤＭＳＯ／ＤＭＦ濃度が５−５０％、好ましくは１０％であるようなＤＭＳＯまたはあるいはＤＭＦ中の、有機化合物の、１−１００ｍＭの、および好ましくは７．５ｍＭの溶液で処理される。混合物は、１−１６時間、好ましくは２−４時間２５℃で放置し、ホスフィン結合前駆体の合成ブロック（１８）を得る。この前駆体の合成ブロックを、適切なハロゲン化アルキル、例えばＮ，Ｎ−ジメチル−２−ヨードアセトアミドを、ＤＭＳＯ／ＤＭＦ濃度が５−５０％、好ましくは１０％であるようなＤＭＳＯまたはＤＭＦ中の、１−１００ｍＭの、および好ましくは７．５ｍＭの溶液として付加することによって、さらに変形される。混合物は、１−１６時間、好ましくは２−４時間２５℃で放置し、合成ブロック（１９）を得る。これの代わりとして、有機化合物（１７）は、ハロゲン化アルキルによってＰ−アルキル化し、その後オリゴヌクレオチドを担持するアミンとカップリングさせて（１９）を得る。
【０１３４】
識別部（２０）を担持するアルデヒドは、上記した条件と類似した条件を用いて、４−ホルミル安息香酸のＮＨＳエステルと、オリゴヌクレオチドを担持するアミンとの間の反応によって形成してよい。識別部（２０）は弱アルカリ性の条件下で（１９）と反応してアルケン（２１）を生成する。
【０１３５】
【化１４】
0005643398.tif 000017
【０１３６】
単量体の合成ブロック（１９）および識別部（２０）の反応は、次のように行ってよい。：識別部（２０）（１ｎｍｏｌ）は、０．１ＭのＴＡＰＳ、リン酸塩またはヘペス緩衝剤、および１Ｍ塩化ナトリウム溶液、ｐＨ＝７．５−８．５、好ましくはｐＨ＝８．０中で、合成ブロック（１９）（１ｎｍｏｌ）と混合する。反応混合物は、３５−６５℃で、好ましくは５８℃で一晩中放置して、反応生成物（２１）を得る。
【０１３７】
（１７）の代わりとして、ホスホン酸塩（２４）を用いてよい。それらは、ジエチルクロロ亜リン酸塩（２２）とアルコールを担持する適切なカルボキシとの間の反応によって、調製してよい。カルボン酸は、その後ＮＨＳエステル（２４）に変形し、上記した工程および代案を適用してよい。単純なＰ−アルキル化の代わりに、亜リン酸塩はアルブゾフ反応を受けてホスホン酸塩を生成してよい。合成ブロック（２５）はその対応するホスホニウム（１９）よりも反応性であるということで有益である。
【０１３８】
【化１５】
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【０１３９】
Ｅ．遷移金属の触媒するアリール化、ヘテロアリール化およびビニル化反応
アリール、ヘテロアリールまたはビニル官能基を輸送できる求電子性の合成ブロック（３１）は、マレイミド誘導体をＳＨ−運搬オリゴヌクレオチドに結合する手順を利用することによって、有機化合物（２８）および（２９）から調製してよい。マレイミドの代わりに、ＮＨＳエステル誘導体を、例えばカルボキシベンゼンスルホン酸誘導体から調製してよく、オリゴヌクレオチドを担持するアミンにこれらを結合することによって用いてよい。（２８）および（２９）のＲ基は、スルホン酸塩の反応性を調節するために用いて、適切な反応性をもたらす。
遷移金属が触媒する架橋結合は、次のように行ってよい：前もって水中に１．４ｍＭのＮａ２ＰｄＣｌ４および２．８ｍＭのＰ（ｐ−ＳＯ３Ｃ６Ｈ４）３を混合して１５分間放置したものを、ｐＨ＝５の０．５ＭのＮａＯＡｃ緩衝剤および７５ｍＭのＮａＣｌ（最終パラジウム濃度が０．３ｍＭ）中で、識別部（３０）および合成ブロック（３１）（共に１ｎｍｏｌ）の混合物に加えた。混合物は、その後３５−６５℃で、好ましくは５８℃で放置し、反応生成物（３２）を得る。
【０１４０】
【化１６】
0005643398.tif 000019
Ｒ”＝アリール、ヘテロアリールまたはビニル
【０１４１】
アリール、ヘテロアリールまたはビニル官能基を輸送できる対応する求核性単量体合成ブロックは、タイプ（３５）の有機化合物から調製してよい。
これは、例えば（３３）のようなジオールによって、ホウ酸をエステル化し、続いてＮＨＳエステル誘導体に変形することによって利用できる。ＮＨＳエステル誘導体は、その後ＮＨＳエステル誘導体を上記したオリゴヌクレオチドを担持するアミンに結合させる手順を用いることによって、オリゴヌクレオチドに結合し、タイプ（３７）の合成ブロックを生成する可能性がある。あるいは、マレイミド誘導体は、上記したように調製して、ＳＨ−運搬オリゴヌクレオチドに負荷してもよい。
【０１４２】
遷移金属が触媒する架橋結合は、次のように行ってよい：前もって水中に１．４ｍＭのＮａ２ＰｄＣｌ４および２．８ｍＭのＰ（ｐ−ＳＯ３Ｃ６Ｈ４）３を混合して１５分間放置したものを、ｐＨ＝５の０．５ＭのＮａＯＡｃ緩衝剤および７５ｍＭのＮａＣｌ（最終パラジウム濃度が０．３ｍＭ）中で、識別部（３６）および合成ブロック（３７）（共に１ｎｍｏｌ）の混合物に加えた。混合物は、その後３５−６５℃で、好ましくは５８℃で放置し、鋳型に結合した反応生成物（３８）を得る。
【０１４３】
【化１７】
0005643398.tif 000020
Ｒ＝アリール、ヘテロアリールまたはビニル
【０１４４】
Ｆ．エナミンおよびエノールエーテル単量体合成ブロック
エナミンおよびエノールエーテルを負荷した合成ブロックは、次のように調製してよい：Ｚ＝ＮＨＲ（Ｒ＝Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール）については、２−メルカプトエチルアミンはジピリジル二硫化物と反応させ、活性化された二硫化物（４０）を生成してよく、その後脱水条件下でケトンまたはアルデヒドに縮合させてエナミン（４１）を産出してよい。Ｚ＝ＯＨについて、２−メルカプトエタノールはジピリジル二硫化物と反応し、続いてＯ−トシル化（Ｚ＝ＯＴｓ）する。トシラート（４０）は、その後エノラートと直接反応してよく、またはフッ化物存在下でＯ−トリアルキルシリルエノラートと反応して、エノラート（４１）を生成してよい。エナミンまたはエノラート（４１）は、その後上記したようにＳＨを担持するオリゴヌクレオチドに結合して、合成ブロック（４２）を与えてよい。
【０１４５】
【化１８】
0005643398.tif 000021
【０１４６】
合成ブロック（４２）は、次のように、（４４）のような識別オリゴヌクレオチドを担持するカルボニル、または代わりに（４３）のようなオリゴヌクレオチドを担持するハロゲン化アルキルと反応してよい：合成ブロック（４２）（１ｎｍｏｌ）は、５０ｍＭのＭＯＰＳ、リン酸塩またはヘペス緩衝剤、および２５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液、ｐＨ＝７．５−８．５好ましくはｐＨ＝７．５中で、識別部（４３）（１ｎｍｏｌ）と混合する。反応混合物は、３５−６５℃で、好ましくは５８℃で一晩中放置して、あるいは温度を変動させて放置し（１０℃一秒間、その後３５℃一秒間）、Ｚ＝ＯまたはＮＲであるところの反応生成物（４６）を得る。Ｚ＝ＮＲであるところの化合物について、わずかに酸性の条件を適用して、Ｚ＝Ｏの生成物（４６）を得ることができる。
【０１４７】
合成ブロック（４２）（１ｎｍｏｌ）は、０．１ＭのＴＡＰＳ、リン酸塩またはヘペス緩衝剤、および３００ｍＭ塩化ナトリウム溶液、ｐＨ＝７．５−８．５好ましくはｐＨ＝８．０中で、識別部（４４）（１ｎｍｏｌ）と混合する。反応混合物は、３５−６５℃で、好ましくは５８℃で一晩中放置して、あるいは温度を変動させて放置し（１０℃一秒間、その後３５℃一秒間）、Ｚ＝ＯまたはＮＲであるところの反応生成物（４５）を得る。Ｚ＝ＮＲであるところの化合物について、わずかに酸性の条件を適用して、Ｚ＝Ｏの生成物（４５）を得てもよい。
【０１４８】
【化１９】
0005643398.tif 000022
【０１４９】
エノールエーテル型（１３）は、触媒を用いてまたは用いずに、付加環化を受けてよい。同様に、ジエノールエーテルは、例えば（８）の、α、β−不飽和ケトンまたはアルデヒドのエノラートまたはトリアルキルシリルエノラート（フッ化物の存在下で）との、（４７）を生成する反応によって、調製または用いてよく、ＳＨを担持するオリゴヌクレオチドに負荷して、単量体合成ブロック（４８）を得てもよい。
【０１５０】
【化２０】
0005643398.tif 000023
【０１５１】
ジエン（４９）、エン（５０）および１，３−双極分子（５１）は、オリゴヌクレオチドを担持するアミノおよび対応する有機化合物のＮＨＳエステルの間の単純な反応によって、形成してよい。（１３）または代わりに（３１、Ｒ”＝ビニル）の、例えば（４９）のようなジエンとの（５２）を産出する反応、または例えば１，３−双極分子（５１）との（５３）を産出する反応、および（４８）または（３１，Ｒ”＝ジエニル）の、例えば（５０）のようなエンとの（５４）を得る反応は、次のように行ってよい：
合成ブロック（１３）または（４８）（１ｎｍｏｌ）は、５０ｍＭのＭＯＰＳ、リン酸塩またはヘペス緩衝剤、および２．８Ｍ塩化ナトリウム溶液、ｐＨ＝７．５−８．５好ましくはｐＨ＝７．５中で、識別部（４９）または（５０）または（５１）（１ｎｍｏｌ）と混合する。反応混合物は、３５−６５℃で、好ましくは５８℃で一晩中放置して、あるいは温度を変動させて放置し（１０℃一秒間、その後３５℃一秒間）、それぞれ鋳型に結合した（５２）、（５３）または（５４）を得る。
【０１５２】
【化２１】
0005643398.tif 000024
【０１５３】
架橋結合切断合成ブロック
化学エンティティのレシピエントの反応基への輸送を、二つの別々の工程、すなわち架橋工程および切断工程に分割することは、各々の工程を最適化することができるので、遊離でありうる。これら二つの工程の方法についての適当な合成ブロックを、以下に図示する：
【化２２】
0005643398.tif 000025
【０１５４】
最初に、機能エンティティ前駆体（短縮したＦＥＰ）にみられる反応基は、例えば骨格にみられる反応基のようなレシピエントの反応基と反応し、それによって架橋結合を形成する。その後、通常Ｉ２、Ｂｒ２、Ｃｌ２、Ｈ＋、またはルイス酸のような水性の酸化剤を付加することによって、切断が行われる。切断によって、骨格のようなレシピエントの部分にＨＺ−ＦＥＰ基を輸送することになる。
【０１５５】
上の構造式において
ＺはＯ、Ｓ、ＮＲ４であり、
ＱはＮ、ＣＲ１であり、
Ｐは、原子価結合、Ｏ、Ｓ、ＮＲ４、または所望により０−３Ｒ４、０−３Ｒ５および０−３Ｒ９で置換されるＣ５−７アリーレン基、Ｃ１−６アルキレン、Ｃ１−６Ｏ−アルキレン、Ｃ１−６Ｓ−アルキレン、ＮＲ１−アルキレン、Ｃ１−６アルキレン−Ｏ、Ｃ１−６アルキレン−Ｓ、または、０−３Ｒ９で置換されるＣ１−Ｃ３アルキレン−ＮＲ４２、Ｃ１−Ｃ３アルキレン−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）Ｒ８、Ｃ１−Ｃ３アルキレン−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）ＯＲ８、Ｃ１−Ｃ２アルキレン−Ｏ−ＮＲ４２、Ｃ１−Ｃ２アルキレン−Ｏ−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）Ｒ８、Ｃ１−Ｃ２アルキレン−Ｏ−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）ＯＲ８であり、
Ｂは、Ｄ−Ｅ−Ｆを含む基であり、その中で
Ｄは、原子価結合、またはＣ１−６アルキレン、Ｃ１−６アルケニレン、Ｃ１−６アルキニレン、Ｃ５−７アリーレン、またはＣ５−７ヘテロアリーレンであり、それらの基は所望により１ないし４のＲ１１基で置換されていてよく、
Ｅは、存在する場合は、原子価結合、Ｏ、Ｓ、ＮＲ４、またはＣ１−６アルキレン、Ｃ１−６アルケニレン、Ｃ１−６アルキニレン、Ｃ５−７アリーレン、またはＣ５−７ヘテロアリーレンであり、それらの基は所望により１ないし４のＲ１１基で置換されていてよく、
Ｆは、存在する場合は、原子価結合、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ４であり、
Ａは、化学構造を核酸であってよい相補的要素から隔てるスペース基であり、
【０１５６】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ４−Ｃ８アルカジエニル、Ｃ３−Ｃ７シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ７シクロヘテロアルキル、アリール、およびヘテロアリール、０−３Ｒ４、０−３Ｒ５、および０−３Ｒ９で置換されたそれらの基、または０−３のＲ９で置換されたＣ１−Ｃ３アルキレン−ＮＲ４２、Ｃ１−Ｃ３アルキレン−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）Ｒ８、Ｃ１−Ｃ３アルキレン−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）ＯＲ８、Ｃ１−Ｃ２アルキレン−Ｏ−ＮＲ４２、Ｃ１−Ｃ２アルキレン−Ｏ−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）Ｒ８、Ｃ１−Ｃ２アルキレン−Ｏ−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）ＯＲ８からなる群から互いに独立して選ばれ、
ＦＥＰは、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ４−Ｃ８アルカジエニル、Ｃ３−Ｃ７シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ７シクロヘテロアルキル、アリール、およびヘテロアリール、０−３Ｒ４、０−３Ｒ５、および０−３Ｒ９で置換されたそれらの基、または０−３のＲ９で置換されたＣ１−Ｃ３アルキレン−ＮＲ４２、Ｃ１−Ｃ３アルキレン−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）Ｒ８、Ｃ１−Ｃ３アルキレン−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）ＯＲ８、Ｃ１−Ｃ２アルキレン−Ｏ−ＮＲ４２、Ｃ１−Ｃ２アルキレン−Ｏ−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）Ｒ８、Ｃ１−Ｃ２アルキレン−Ｏ−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）ＯＲ８からなる群から選ばれ、
そのＲ４は、Ｈであるか、またはＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ３−Ｃ７シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ７シクロヘテロアルキル、アリール、ヘテロアリール、０−３Ｒ９で置換されたそれらの基からなる群から独立して選ばれ、
【０１５７】
Ｒ５は、−Ｎ３、−ＣＮＯ、−Ｃ（ＮＯＨ）ＮＨ２、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＮＨＲ６、−Ｃ（Ｏ）Ｒ６、−ＳｎＲ６３、−Ｂ（ＯＲ６）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ６）２、または０−２のＲ７で置換されたＣ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ４−Ｃ８アルカジエニルからなる群から、独立に選ばれ、
そのＲ６は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ７シクロアルキル、アリール、または−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、および−Ｉから選ばれる０−５のハロゲン原子で置換されたＣ１−Ｃ６アルキレン−アリールから独立に選ばれ；およびＲ７は、−ＮＯ２、−ＣＯＯＲ６、−ＣＯＲ６、−ＣＮ、−ＯＳｉＲ６３、−ＯＲ６、および−ＮＲ６２から独立に選ばれ、
Ｒ８は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ３−Ｃ７シクロアルキル、アリール、または−Ｆ、−Ｃｌ、−ＮＯ２、−Ｒ３、−ＯＲ３、−ＯＳｉＲ３３から独立に選ばれる０−３の置換基によって置換されるＣ１−Ｃ６アルキレン−アリールであり、
Ｒ９は、＝Ｏ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ６、−ＮＲ６２、−ＮＲ６−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＮＲ６−Ｃ（Ｏ）ＯＲ８、−ＳＲ６、−ＳＯＲ６、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ６、−ＣＯＯＲ６、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６２および−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ６２である。
好ましい具体例として、ＺはＯまたはＳであり、Ｐは原子価結合であり、ＱはＣＨであり、ＢはＣＨ２であり、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はＨである。カルボニル基およびＺの間の結合は、水性のＩ２によって切断できる。
【０１５８】
切断可能なリンカー
切断可能なリンカーは、標的および固体支持体の間に、または潜在的な薬物候補および識別領域に、または結合に成功した複合体由来のコドンを含む核酸配列の、非特異的に結合した複合体から分離を確実にする他のあらゆる位置に、位置付けることができる。切断可能なリンカーは、選択的に切断可能であってよい、すなわち特定のリンカーのみを切断する条件が選択される。
切断可能なリンカーは、非常に多くの化学構造から選択してよい。リンカーの例としては、酵素的に切断可能な部位を有するリンカー、化学分解成分を含むリンカー、電磁放射によって切断可能なリンカーを含むが、それだけに限定されない。
【０１５９】
電磁放射（光）によって切断可能なリンカーの例
【化２３】
0005643398.tif 000026
エキソ位でのｏ−ニトロベンジル
【０１６０】
【化２４】
0005643398.tif 000027
より詳細については、Ｈｏｌｍｅｓ  ＣＰ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９７，６２，２３７０−２３８０を参照
【０１６１】
【化２５】
0005643398.tif 000028
より詳細については、Ｒａｊａｓｅｋｈａｒａｎ  Ｐｉｌｌａｉ，Ｖ．Ｎ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．１９８０，１−２６を参照
【０１６２】
【化２６】
0005643398.tif 000029
ダンシル誘導体
より詳細については、Ｒａｊａｓｅｋｈａｒａｎ  Ｐｉｌｌａｉ，Ｖ．Ｎ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．１９８０，１−２６を参照
【０１６３】
クマリン誘導体
【化２７】
0005643398.tif 000030
より詳細については、Ｒ．Ｏ．Ｓｃｈｏｅｎｌｅｂｅｒ，Ｂ．Ｇｉｅｓｅ．Ｓｙｎｌｅｔｔ  ２００３，５０１−５０４を参照
【０１６４】
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ、潜在的な薬物候補および識別領域のいずれかであってよい。あるいは、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ、標的および固体支持体のいずれかであってよい。
Ｒ３＝ＨまたはＯＣＨ３
ＸがＯならば、生成物はカルボン酸であるであろう。
ＸがＮＨならば、生成物はカルボキシアミドであるであろう。
【０１６５】
一つに特定の例としては、合成の間オリゴヌクレオチド中に導入でき、３０秒間から１分間水中の試料を紫外線放射（約３００−３５０ｎｍ）に付すことによって切断できるＰＣスペーサーホスホルアミダイト（Ｇｌｅｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈカタログ番号１０−４９１３−９０）がある。
【０１６６】
【化２８】
0005643398.tif 000031
ＤＭＴ＝４，４’−ジメトキシトリチル
ｉＰｒ＝イソプロピル
ＣＮＥｔ＝シアノエチル
【０１６７】
上のＰＣスペーサーホスホルアミダイトは、識別領域および潜在的な薬物候補の間の位置の複合体のライブラリーに結合して安定である。スペーサーは次の反応に従って切断してよい。
【化２９】
0005643398.tif 000032
【０１６８】
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ、コード化分子および識別分子のいずれかであってよい。好ましい態様として、Ｒ２はオリゴヌクレオチド識別部であり、Ｒ１は潜在的な薬物候補である。リンカーが切断されるときに、リン酸基が生成し、さらなる生物学的反応を可能にする。例として、リン酸基は酵素的ライゲーションが起こるのを可能にするオリゴヌクレオチドの５’末端に位置してよい。
【０１６９】
化学的試薬によって切断可能なリンカーの例
エステルリンカーは、例えば水酸化物イオンを用いた求核性の作用によって切断できる。実際に、これは標的リガンド複合体を短期間塩基に付すことによって達成し得る。
【化３０】
0005643398.tif 000033
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ、潜在的な薬物候補または識別領域のいずれかであってよい。Ｒ４−６は、次のいずれでもよい：Ｈ、ＣＮ、Ｆ、ＮＯ２、ＳＯ２ＮＲ２。
【０１７０】
ジスルフィドリンカーは、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）によって、効果的に切断／還元し得る。ＴＣＥＰは、もっとも安定な水溶性のアルキルジスルフィドでさえ、広いｐＨの範囲で選択的にかつ完全に還元する。これらの還元は、しばしば室温で５分未満を必要とする。ＴＣＥＰは、不揮発性で無臭の還元剤であり、ほとんどの他の還元試薬と異なり、空気酸化に抵抗性である。ＴＣＥＰのようなトリアルキルホスフィンは、水溶液中で安定であり、選択的にジスルフィド結合を還元し、一般にタンパク質中にみられる他の官能基に対しては選択的に不活性である。
【０１７１】
【化３１】
0005643398.tif 000034
【０１７２】
ジスルフィド結合の還元についてのより詳細は、Ｋｉｒｌｅｙ，Ｔ．Ｌ．（１９８９），後の構造分析のためのシスチン（システイン）を含むタンパク質の還元および蛍光標識、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８０，２３１、およびＬｅｖｉｓｏｎ  Ｍ．Ｅ．ら（１９６９），水溶性ホスフィンによる生物学的基質の還元：ガンマグロブリン．Ｅｘｐｅｒｅｎｔｉａ２５，１２６−１２７にみられる。
【０１７３】
酵素により切断可能なリンカー
潜在的な薬物候補を識別部と、または固体支持体および標的を結合しているリンカーは、プロテアーゼを用いた特異的切断を可能にするペプチド領域を含み得る。このことは、分子生物学においてよく知られた方法である。部位特異的プロテアーゼおよび同系統の標的アミノ酸配列は、融合タンパクの発現、溶解度、分泌、または精製の向上を容易にする融合タンパク質タグを除去するのにしばしば用いられる。
様々なプロテアーゼが、特異的切断を達成するために用いられ得る。特異性は、切断部位が例えば融合タンパクのような他の配列と共に呈示される場合に、特に重要である。切断効率を高め、特異性を制御するために、様々な条件が最大限に利用されてきた。これらの条件は、当該分野において利用され、知られている。
エンテロキナーゼは、特異的アミノ酸配列を切断する酵素セリンプロテアーゼの一例である。エンテロキナーゼ識別部位は、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（ＤＤＤＤＫ）であり、Ｃ末端のリシンを切断する。精製した組み換えエンテロキナーゼは、市販で入手でき、広い範囲のｐＨ（ｐＨ４．５−９．５）および温度（４−４５℃）において高い活性を持つ。
【０１７４】
タバコエッチウィルス（ＴＥＶ）由来の核内プロテアーゼは、特異的なアミノ酸配列での切断に用いられ得る他の市販で入手できる非常に特徴的なプロテアーゼである。ＴＥＶプロテアーゼは、Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ／Ｓｅｒ（ＥＮＬＹＦＱＧ／Ｓ）を、Ｇｌｎ−ＧｌｙまたはＧｌｎ−Ｓｅｒの間で高い特異性で切断する。
他のよく知られたプロテアーゼは、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ＬＶＰＡＧＳ）配列をＡｒｇ−Ｇｌｙの間で特異的に切断するトロンビンである。トロンビンはまた、組み換え融合タンパク質の切断に用いられてきた。他の配列はまた、トロンビンの切断に用いられ可能性があり、これらの配列は、トロンビンによる切断よりもより特異的であるかまたは特異的でなく、より効率的であるかまたは効率的でない。トロンビンは、高い活性のプロテアーゼであり、様々な反応条件が業界では知られている。
【０１７５】
活性化された凝固因子ＦＸ（ＦＸａ）はまた、特異的かつ有用なプロテアーゼとして知られている。この酵素は、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＩＥＧＲ）配列のＣ末端のＡｒｇを切断する。ＦＸａは、組み換え技術によってタンパク質を生成する場合に、融合タンパク質の間を切断するためにしばしば用いられる。他の識別配列はまた、ＦＸａに対して用いられ得る。
他のタイプの特異的アミノ酸配列を識別するタンパク質酵素もまた、用いられ得る。加えて、非特異的方法でアミノ酸配列を切断するタンパク質分解酵素はまた、リンカーが複
合体分子中でアミノ酸配列を含みさえすれば用いられ得る。
【０１７６】
リボザイム、触媒活性のある抗体、またはリパーゼのような他のタイプの分子もまた用いられ得る。唯一の先行条件は、酵素活性分子は、コード化領域およびディスプレイ分子、または代わりに固体支持体および標的を結合しているリンカーまたはリンカーの一部として用いられる、特異的な構造を切断できる。
ヌクレオチドの特異的な配列を有する二本鎖の核酸を識別して切断する、様々なエンドヌクレアーゼが利用できる。エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩは、配列がヌクレオチド配列の長さに近い場合、ＧＡＡＴＴＣ配列を含むヌクレオチド配列リンカーを効果的に切断するヌクレアーゼの一例である。精製した組み換えＥｃｏＲＩは、市販で入手でき、ある範囲の緩衝剤条件において高い活性をもつ。例として、ＥｃｏＲＩは、以下に示す様々なプロトコール（ＮＥ緩衝剤はＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓで入手できる）で作用する：
ＮＥ緩衝剤１：１０ｍＭビストリスプロパン−ＨＣｌ、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭジチオトレイトール（ｐＨ７．０、２５℃）
ＮＥ緩衝剤２：５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭジチオトレイトール（ｐＨ７．９、２５℃）
ＮＥ緩衝剤３：１００ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭジチオトレイトール（ｐＨ７．９、２５℃）
ＮＥ緩衝剤４：５０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭトリス酢酸塩、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭジチオトレイトール（ｐＨ７．９、２５℃）
展開緩衝剤：ｍＭ塩化カリウム、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８、２５℃）、１０ｍＭ硫酸アンモニウム、２ｍＭ硫酸マグネシウム、および０．１％トライトンＸ−１００、および２００μＭｄＮＴＰ
【０１７７】
ヌクレオチド
本発明で用いられるヌクレオチドは、ヌクレオチド、すなわちオリゴヌクレオチドの配列に結合してよい。各々のヌクレオチド単量体は、通常二つの部分、すなわち核酸塩基部分および主鎖からなる。主鎖は、ある場合においては、糖の部分およびヌクレオシド間のリンカーに再分してよい。
核酸塩基部分は、自然には生じない核酸塩基と同様に自然に生じる核酸塩基から選んでよい。従って、「核酸塩基」は既知のプリンおよびピリミジンヘテロ環だけでなく、ヘテロ環類似物およびそれらの互変異性体も含む。核酸塩基の実例は、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシル、プリン、キサンチン、ジアミノプリン、８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニン、７−デアザキサンチン、７−デアザグアニン、Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン、Ｎ６，Ｎ６−エタノ−２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン、５−（Ｃ３−Ｃ６）−アルキニルシトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、シュードイソシトシン、２−ヒドロキシ−５−メチル−４−トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシンおよびＢｅｎｎｅｒら、米国特許第５４３２２７２号に記述されている「自然には生じない核酸塩基」である。「核酸塩基」という用語は、これらの例に加えて類似物およびそれらの互変異性体も包含することを意図している。特に興味深い核酸塩基は、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、およびウラシルであり、自然に生じる核酸塩基と考えられている。
【０１７８】
適当な核酸塩基対の例を以下に示す；
【化３２】
0005643398.tif 000035
【０１７９】
主鎖の単位の適当な例を以下に示す（Ｂは核酸塩基を意味する）：
【化３３】
0005643398.tif 000036
【０１８０】
主鎖の糖部分は、適当なものとしてはペントースであるが、ＰＮＡまたは六員環の一部であってよい。可能なペントースの適当な例としては、リボース、２’−デオキシリボース、２’−Ｏ−メチルリボース、２’−フルオロ−リボース、および２’−４’−Ｏ−メチレンリボース（ＬＮＡ）を含む。適当なものとしては、核酸塩基はペントースエンティティの１’位に結合している。
【０１８１】
ヌクレオシド間のリンカーは、主鎖の糖部分がリボースまたは２−デオキシリボースのようなペントースである場合、前の単量体の３’末端を次の単量体の５’末端に結合する。ヌクレオシド間のリンカーは、自然に生じるホスホジエステル結合またはその誘導体であってよい。そのような誘導体には、モノチオリン酸塩、メチルホスホン酸塩、ホスホルアミダイト、ホスホトリエステル、およびホスホジチオエートを含む。その上、ヌクレオシド間のリンカーは、当該分野において知られたリンを含まないいくつかのリンカーのいずれであってもよい。
好ましい核酸の単量体には、ホスホジエステル結合を介して結合する、ＲＮＡファミリーと同様にＤＮＡの一部を形成する自然に生じるヌクレオシドを含む。ＤＮＡファミリーを構成するものには、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンおよびデオキシシチジンを含む。ＲＮＡファミリーを構成するものには、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジンおよびイノシンを含む。
【０１８２】
選別
ライブラリーが当該明細書で開示された方法に従って形成されるとすぐに、前もって決定された望ましい特性を有する化学的化合物についてのライブラリーを選別しなければならない。前もって決定された望ましい特性には、標的への結合、標的の触媒的変化、標的または標的の機能的活性を変化／修飾する方法での標的との化学反応、自殺阻害剤中のような標的に対する共有結合を含め得る。当該明細書の上で開示したように生成したライブラリーに加えて、以下の方法ＡおよびＢに従って調製したライブラリーは、本発明に従って選別してよい。
【０１８３】
Ａ．ディスプレイ分子は、個別に別々にタグを付けた最終的な「状態」において単一の化合物であってよい。例えば、単一の化合物は、個別に独特のタグを結合してよい。各々の独特のタグは、例えば構造、分子量その他のような特定の化合物上で情報を保持する。
Ｂ．ディスプレイ分子は、化合物の混合物であってよく、最終的な「状態」であるとみなしてよい。これらのディスプレイ分子は、通常個別に別々にタグを付けられる、すなわち化合物の混合物中の各々の単一の化合物は同一のタグを結合してよい。他のタグは、他の化合物の混合物に対して用いてよい。各々の独特のタグは、例えば鋳型上の空間の位置のように、特定の混合物上で情報を保持する。
【０１８４】
標的は目的とするいずれの化合物であってよい。標的は、タンパク質、ペプチド、炭水化物、多糖類、糖タンパク、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウィルス、基質、代謝産物、遷移状態の類似物、補因子、阻害剤、薬物、色素、栄養素、成長因子、細胞、組織その他であってよく、制限はない。特に好ましい標的は、アンギオテンシン変換酵素、レニン、シクロオキシゲナーゼ、５−リポキシゲナーゼ、ＩＩＬ−１０変換酵素、サイトカイン受容体、ＰＤＧＦ受容体、タイプＩＩイノシンモノリン酸脱水素酵素、βラクタマーゼ、および菌類のシトクロムＰ−４５０を含めるが、それだけに限定されない。標的は、ブラジキニン、好中球エラスターゼ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｇａｇ、ｉｎｔ、ＲＴ、ヌクレオカプシドその他を含めたＨＩＶタンパク質、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＧＦβ、ＫＧＦ、ＰＤＧＦ、トロンビン、テオフィリン、カフェイン、サブスタンスＰ、ＩｇＥ、ｓＰＬＡ２、赤血球、神経膠芽腫、フィブリン血塊、ＰＢＭＣｓ、ｈＣＧ、レクチン、セレクチン、サイトカイン、ＩＣＰ４、相補的タンパク質等を含み得る。
【０１８５】
ストリンジェントな条件の強度についての上限は、ディスプレイ分子およびコード化領域を含む複合体の分解である。選別条件は当業者によく知られている。
所定の望ましい特性を有する複合体は、当業者によく知られている様々な方法によって、核酸識別タグに依然として結合している間、ライブラリーの残りから分離し得る。本発明のある具体例として、識別核酸が増幅可能であるような結合した核酸の化学的分解をせずに、望ましい生成物を全ライブラリーから分離する。コドンを含む識別部の部分を増幅し、望ましい化学的化合物に依然として結合しているか、またはその後望ましい化学的化合物から分離してよい。
【０１８６】
ある具体例として、望ましいディスプレイ分子は、望ましいディスプレイ化合物および標的に結合しているコード配列の間に何の相互作用もなしに、標的に作用する。ある具体例として、望ましいディスプレイ分子は、標的に結合し、続いていくつかの方法によって複合体を非結合生成物から分離する。その方法は、プラスチック結合、ニトロセルロースフィルター結合、カラムクロマトグラフィー、濾過、親和性クロマトグラフィー、遠心分離および標的を固定する他のよく知られた方法を含む。
【０１８７】
簡潔に言うと、ライブラリーを分配工程に付し、その工程はライブラリーおよび標的が結合したカラムの間の接触を含んでよい。標的に対する活性を有する反応生成物をコード化しない全ての識別配列は、カラムを通過するであろう。追加の望ましくない化学エンティティ（例えば、他の標的と架橋反応するエンティティ）は、計数選別法によって除去してよい。望ましい複合体は、カラムに結合しており、カラムの条件（塩その他）を変化させることによって溶出でき、または望ましい化学的化合物と関連する識別配列は直接切断し、溶出し得る。
【０１８８】
ある具体例として、基本的工程は、複合体のライブラリーを固定された目的とする標的と混合することを含む。標的は、直接固定または抗体結合または高親和性相互作用によって、カラムのマトリックスまたはマイクロタイターウェルに結合し得る。他の具体例として、標的およびディスプレイした分子は、標的の固定なしに相互作用する。標的と結合するディスプレイした分子は、この表面に保持されるであろうが、一方結合していないディスプレイした分子は単一または一連の洗浄工程の間に除去されるであろう。標的に結合する複合体の識別部は、合成分子の物理的結合を切断することによって分離し得る。洗浄工程後またはその代わりに、クロマトグラフィー工程を行うことは、好都合であるとみなしてよい。合成分子および識別部の間の物理的結合を切断した後、識別部は媒質から回収してよく、所望により解読工程の前に増幅してよい。
【０１８９】
伝統的な溶出プロトコールにおいて、最適に及ばない結合および洗浄工程条件による偽陽性は回避しがたく、実験条件の入念な調節を要求される可能性がある。しかしながら、１００ないし１０００以上の濃縮は滅多に得られない。当該明細書の実施例７において用いられる選別工程は、非特異的複合体は大部分は反応容器内に残存しているので、得られた偽陽性に関する問題を緩和する。当該明細書に報告している実施例は、１０７以上の濃縮がえられることを示唆している。
加えて、標的と反応する化合物は、標的と反応しない生成物と分離し得る。一例として、自殺阻害剤のような標的に共有結合する化合物は、非常にストリンジェントな条件下で洗浄し得る。生じた複合体を、プロテアーゼ、ＤＮＡアーゼまたは他の適当な試薬で処理され、リンカーを切断して望ましい化合物と結合している核酸を遊離し得る。
【０１９０】
他の例として、望ましい生成物の前もって決定された望ましい特性は、生成物が（アシル輸送のような）化学基を標的に輸送し、それによって標的を不活化できることである。全ての生成物がチオエステル化学基または類似した活性化した化学基を有するところの、生成物ライブラリーを得ることができた。標的と接触すると、望ましい生成物は化学基を標的に輸送し、それに伴って、望ましい生成物はチオエステルからチオールに変わるであろう。それゆえに、（チオエステルというよりはむしろ）現在チオールである生成物を識別する分離方法は、望ましい生成物の選別およびそれらに関連する核酸の増幅を可能にする。
【０１９１】
当業者にはよく知られている、本発明と矛盾しない他の分離工程および選別工程が存在する。一つの具体例として、生成物をいくつかの一般的な方法によって細分し、その後各画分の活性をアッセイし得る。細分方法は、大きさ、ｐＨ、疎水性その他を含み得る。
本発明に固有のことは、望ましい機能を基本とした化学エンティティの選別であり、これは望ましい機能および特異性をもつ小さな分子の選別に拡張し得る。特異性は、望ましくない「標的」と相互作用し得る化合物の識別部配列を最初に抽出し（ネガティブセレクション、またはカウンターセレクション）、続いてポジティブセレクションによって望ましい標的を抽出することによる、選別工程の間に必要となり得る。例として、菌類のシトクロムＰ４５０の阻害剤が、ある程度哺乳類のシトクロムＰ４５０と交差反応する（重大な副作用を引き起こす）ということが知られている。菌類のシトクロムの高い特異性をもつ阻害剤は、哺乳類のシトクロムと相互作用し得る生成物を除去し、続いて菌類のシトクロムと相互作用し得る生成物を保持することによって、ライブラリーから選択し得る。
【０１９２】
濃縮
本発明はまた、各工程：
ｉ）独特の識別タグを化学エンティティに付加することによって、タグを付加した化学エンティティのライブラリーを生成し、
ｉｉ）予め選択された特性を持つ化学エンティティまたは化学エンティティの部分集合がライブラリーの残りから分離するところの、条件にライブラリーを付し、
ｉｉｉ）分離したライブラリーからアンチタグを回収し、そのアンチタグが特異的に独特の識別タグと相互作用でき、
ｉｖ）アンチタグを解読することによって、予め選択された機能を有する化学エンティティを識別する
ことを含む、予め選択された特性を有する化学エンティティの識別部を決定する方法に関する。
【０１９３】
タグに適当な方法によって化学エンティティを付加する。特に、選別の項の方法ＡおよびＢのような、各化学エンティティに、化学エンティティの反応基およびタグの反応基の間の化学反応を含む反応によって、タグを付加する。化学エンティティの結合は、直接または架橋分子部を介してよい。分子部は、化学エンティティをタグに結合できるあらゆる適当な化学構造であってよい。
【０１９４】
アンチタグは、独特の識別タグと特異的に相互作用できる。アンチタグの化学構造は、大部分は独特のタグの選択に左右される。例として、独特のタグに抗体を選んだ場合、アンチタグはその抗体に結合できるエピトープが選ばれる。一般に、独特の識別タグに相補的なヌクレオチドの配列を含むアンチタグを用いることが好ましい。
当該方法は、ある具体例として、増幅なしに行ってよい。しかしながら、より大きなライブラリーを目的とした場合、一般に増幅可能なアンチタグを用いることが好ましい。ヌクレオチドの配列を含むアンチタグは、ＰＣＲのような標準的技術を用いて増幅してよい。アンチタグがタンパク質の場合、タンパク質は、その合成をコード化したｍＲＮＡを結合し、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを生成し、ｍＲＮＡを翻訳系に付すことによって増幅してよい。そのような系は、出典明示によりその内容を当該明細書の一部とするところのＷＯ９８／３１７００に記述されている。タンパク質のタグを増幅する代わりの方法は、ファージの発現するタンパク質を用いることである。
【０１９５】
タグがアンチタグと同様に核酸の配列である場合、タグ：アンチタグのハイブリッドは、ライブラリーを分離条件に付すことに先立って、または分離工程の後に形成してよい。本発明のある具体例として、あるヌクレオチド配列が標的に結合し得るまたは化学反応を触媒し得るような系と比較して、付加した核酸配列を不活性にするために、分離工程に先立って、タグ：アンチタグのハイブリッドを形成することが好ましい。
オリゴヌクレオチドのアンチタグは、様々な方法で形成してよい。本発明のある具体例として、アンチタグは酵素的伸長反応のときに形成する。伸長は、最初にプライマーを独特の識別タグにアニーリングし、その後プライマーをポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いて伸長することを含む。他のタイプの伸長反応もまた考えられている。例として、リガーゼはジまたはトリヌクレオチド基質から出発してプライマーを作るために用いてよく、伸長は適当なポリメラーゼを用いて行ってよい。
【０１９６】
アンチタグを当該方法の間の種々の工程にて回収することが望ましい。この目的のために、本発明のある態様において、適当なアフィニティーパートナーと結合できるハンドルを備えたプライマーを提供することが好ましい。異なるハンドルおよびアフィニティーパートナーも当業者は利用できる。最も広く用いられているハンドルはビオチンであり、一般にまた本発明に従うことが好ましい。ビオチンはアフィニティーパートナーであるストレプトアビジンまたはアビジンと結合する。研究室での標準的技術は、ストレプトアビジンで被覆された固体相を用いてビオチンの結合した生化学的エンティティを回収することである。適当には、固体相は、結合作用の後で、回転により、あるいは固体ビーズが磁性粒子を含む場合に磁場によって、液体から分離できるビーズである。
【０１９７】
本発明の他の態様として、アンチタグは分離したオリゴヌクレオチドとして与えられる。分離したオリゴヌクレオチドは標準的アミダイト合成方法を用いて生成してよく、または他の有用な方法を用いて生成してよい。ビオチンアミダイトは発生期のオリゴヌクレオチド鎖に容易に組み込まれるので、一般に、少なくとも一部は合成によってオリゴヌクレオチドを供給することが好ましい。オリゴヌクレオチドのアンチタグを、相補的なオリゴヌクレオチドタグによってタグ付加された化学エンティティを含む液体に付加するのに続いて、二本鎖のライブラリーを、独特の識別タグおよびアンチタグオリゴヌクレオチドの間のハイブリダイゼーション生成物として形成する。
上記したように、アンチタグオリゴヌクレオチドに、ストレプトアビジンまたはアビジンのようなアフィニティーパートナーと結合できる、ビオチンのようなハンドルを提供してもよい。
【０１９８】
アンチタグオリゴヌクレオチドをタグ付加した化学エンティティに付加した後、媒質中に存在するオリゴヌクレオチドのいくつかは、パートナーを見つけられない。本発明のある態様においては、オリゴヌクレオチドを同系統の独特の識別部にハイブリダイズし、および／またはアンチタグを二重らせんに変形することが好ましい。本発明の他の態様として、一本鎖のオリゴヌクレオチドは、意図していない干渉を避けるために、工程ｉｉ）に先立って分解される。
ハンドルは、分離工程に先立ってまたはその後に、ライブラリーを精製するために利用し得る。本発明のある具体例として、系の乱れを減少させるために、分離工程に先立って精製工程が行われる。他の態様として、ハンドルは、増幅してよい二本鎖の生成物を回収するために、工程ｉｉ）の後に分離したライブラリーを精製するために用いられる。
ライブラリーを、条件に敏感な特性を有する化学エンティティを選別するために、ある条件に付す。その条件は、標的に対するライブラリーの曝露、および標的に対する親和性を有する化学エンティティの分離を伴ってよい。他の条件は、ライブラリーを基質に付し、この基質に関する触媒活性を有する化学エンティティを分離することであってよい。
【０１９９】
アンチタグは、分離工程の後に形成してよい。本発明のある態様として、タグを与える一本鎖のヌクレオチドは、化学エンティティを親和性分離の標的に結合している間に二本鎖にされる。所望により、反復する温度の周期において、多量のアンチタグは、タグを鋳型として用いた伸長生成物として形成してよい。本発明の他の態様として、一本鎖オリゴヌクレオチドを持つ化学エンティティを、標的から分離し、相補的なタグをその後調製する。
アンチタグがハンドルを含む場合は、ハンドルは分離したライブラリーを精製するために用いられ得る。アンチタグの回収は、その後、分離した二本鎖のライブラリーからアンチタグを溶出することによって行われる。所望により、アンチタグの量を、ＰＣＲのような従来の増幅技術によって増幅してよい。
【０２００】
本発明に従った方法は、単一の分離工程を用いて行われ得る。しかしながら、通常、大きなライブラリーから望ましい特性を有する候補を選別するために、一回以上の分離工程を用いることが好ましい。従って、回収したアンチタグは、最初のライブラリーまたはそれらの部分集合と混合してよく、分離（工程ｉｉ））および回収の工程（工程ｉｉｉ））８は、望ましい回数繰り返される。所望により、混合物中の一本鎖の部分は、上記したように分解、または除去、または不活化されてよい。
【０２０１】
一般に、工程ｉｉ）において得られた分離ライブラリーを、ストリンジェンシーを強化した条件を用いた接触工程に、さらに一回またはそれ以上付される。温度、塩濃度、酸性度、アルカリ度などを向上することによって、ストリンジェントな条件を向上させてもよい。
本発明の一つの具体例として、分離したライブラリーを、反復する接触工程に先立った中間過程の工程に付さない。特に、分離したライブラリーを、アンチタグの中間の増幅には付さない。この具体例は、比較的小さなライブラリーを用いる場合に好都合でありうる。
【０２０２】
本発明の方法は解読工程で終結し、その工程はアンチタグの分析によって化学エンティティまたは化学エンティティ群の識別部を解読する工程である。アンチタグがオリゴヌクレオチドである場合、解読工程ｉｖ）は、アンチタグの核酸の配列決定をすることによって行ってよい。クローニングの利用およびマイクロアレーへの曝露を含めて、配列決定のための様々な方法が、当業者にとっては明白である。タグは、例えば特に核酸配列、エピトープのような認識基を含む。タグは、例えばエンティティ構造、質量、空間的位置（プレート情報）その他のような、それに結合したエンティティの情報を担持する。タグは、モノクローナル抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ、天然のペプチド、天然に存在しないペプチド、多重合体または低重合体のヒドラジノアリールおよびアルキルカルボン酸、多重合体または低重合体のアミノキシアリールおよびアルキルカルボン酸、ペプチド、他の天然の多重合体または低重合体、天然に存在しない多重合体（分子量が１０００Ｄａより大きい）または低重合体（分子量が１０００Ｄａより小さい）、小さな非多重合体分子（分子量が１０００Ｄａより小さい）または大きな非多重合体分子（分子量が１０００Ｄａより大きい）からなっていてよい。
【０２０３】
ある好ましい具体例として、エンティティは小さな非多重合体分子（分子量が１０００Ｄａより小さい）からなる。小さな分子は、一般に、経口薬剤の候補を求める上で目的とする化合物である。特に、天然に生じない小さな分子は、薬剤発見過程において重要であり、本発明のある態様として当該方法は経口薬剤の候補を選別するために構築される。様々な薬剤候補のライブラリーは、市場において入手できる。ライブラリーの薬剤候補は、通常、反応基または反応基に変えることのできる基を含む。本発明のある好ましい態様として、薬剤候補のライブラリーの各要素に、ライブラリーの要素の反応基および核酸上の反応基を介して、核酸タグを付加する。好ましくは、核酸はオリゴヌクレオチドである。
本発明の他の態様として、エンティティは大きな非多重合体分子（分子量が１０００Ｄａより大きい）からなる。さらに他の具体例として、エンティティは多重合体分子からなる。
【０２０４】
タグおよびアンチタグは、モノクローナル抗体、タンパク質、ＬＮＡ、ＰＮＡ、天然のポリペプチド、天然に存在しないポリペプチド、多重合体または低重合体のヒドラジノアリールまたはアルキルカルボン酸、多重合体または低重合体のアミノキシアリールまたはアルキルカルボン酸、他の天然の多重合体または低重合体、天然に存在しない多重合体（分子量が１０００Ｄａより大きい）または低重合体（分子量が１０００Ｄａより小さい）、小さな非多重合体分子（分子量が１０００Ｄａより小さい）または大きな非多重合体分子（分子量が１０００Ｄａより大きい）に結合したＲＮＡからなっていてよい。
【０２０５】
あるいは、アンチタグは、モノクローナル抗体、タンパク質、ＬＮＡ、ＰＮＡ、天然のポリペプチド、天然に存在しないポリペプチド、多重合体または低重合体のヒドラジノアリールまたはアルキルカルボン酸、多重合体または低重合体のアミノキシアリールまたはアルキルカルボン酸、他の天然の多重合体または低重合体、天然に存在しない多重合体（分子量が１０００Ｄａより大きい）または低重合体（分子量が１０００Ｄａより小さい）、小さな非多重合体分子（分子量が１０００Ｄａより小さい）または大きな非多重合体分子（分子量が１０００Ｄａより大きい）に結合したＤＮＡからなっていてよい。あるいは、アンチタグは、まさにオリゴヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡからなっている。好ましい具体例として、アンチタグは、ＤＮＡからなっている。他の好ましい具体例として、アンチタグは、ＲＮＡからなっている。
ＤＮＡまたはＲＮＡに結合しているアンチタグはまた、それらに結合しているＤＮＡ／ＲＮＡ、例えばファージが提示したまたはポリソームが提示した抗体、ペプチドまたはタンパク質によって、および合成の間ＤＮＡに結合している、アンチタグ合成をＤＮＡがコード化するところの、ＤＮＡを鋳型としたアンチタグの合成を介してコード化されている。
【０２０６】
各々の化合物または化合物の基は、共有結合または非共有結合の形成を介して、タグと結合してよい。共有結合の形成について、タグ付加は、付加環化生成物、アルキル化生成物、アリール化生成物、アシル化生成物、アミド結合、カルボキシエステル結合、スルホンアミド結合、Ｓ−アルキル結合、ＮＲ−アルキル結合、Ｏ−アルキル結合、アリールビニル結合、アルキンビニル結合、オキシム結合、イミン結合、二環生成物、トリゾール、ヘキセン、７−オキサ−ビシクロ［２，２，１］ヘプト−２−エン誘導体、７−アザ−ビシクロ［２，２，１］ヘプト−２−エン誘導体、または７−メチル−７−アザ−ビシクロ［２，２，１］ヘプト−２−エンを含んでよいが、それだけに限定されない。非共有結合は、例えば水素結合、ファンデルワールス相互作用、πスタッキングを介して、またはハイブリダイゼーションを通して結合することを含んでよいが、それだけに限定されない。ハイブリダイゼーションは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡまたはＬＮＡ、またはそれらの混合物に相補的な鎖の間であってよい。そのような場合において、タグおよび化合物の両方が、そのような互いに相補的な鎖を担持する。タグ付加されたエンティティ、化合物または化合物の混合物は、例えばエンティティの変形によって、またはタグの変形によって、新しいタグ付加されたエンティティに変形してよい。変形は、例えば試薬の付加（例えば、特に酸化剤または還元剤、ｐＨ調整剤）または紫外線照射または熱に付すような、化学的または物理的変形のいずれかによって、引き起こしてよい。
【０２０７】
タグおよびアンチタグの間の複合体を、タグ付加後すぐに、個別にタグ付加したエンティティ上で形成してよい。あるいは、タグ付加したエンティティを個別に混合した後、ライブラリー精製を所望により利用する前またはその後、または特定の特性についてライブラリーを濃縮する前またはその後形成してよい。タグおよびアンチタグがヌクレオチドからなる場合、複合体は、例えば二本鎖ＤＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡのハイブリッドのような、二本鎖のヌクレオチドからなる。
【０２０８】
精製ハンドル（「＠」で表される）は、アンチタグに結合してよい。精製ハンドルは、例えば、特にヌクレオチド配列、エピトープ、反応基、高親和性リガンドのような認識基を含む。精製ハンドルは、モノクローナル抗体、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ、天然のペプチド、天然に存在しないペプチド、多重合体または低重合体のヒドラジンアリールおよびアルキルカルボン酸、多重合体または低重合体のアミノキシアリールおよびアルキルカルボン酸、他の天然の多重合体または低重合体、天然に存在しない多重合体（分子量が１０００Ｄａより大きい）または低重合体（分子量が１０００Ｄａより小さい）、小さな非多重合体分子（分子量が１０００Ｄａより小さい）または大きな非多重合体分子（分子量が１０００Ｄａより大きい）からなっていてよい。精製ハンドルは、例えば、ヌクレオチド配列、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジン、「ヒスタグ」、メルカプト基またはジスルフィド／活性化したジスルフィド基であってよい。精製ハンドルは、例えばアンチタグがヌクレオチド塩基、または例えば抗体の一部が他の抗体（例えば精製フィルターを与える固定された抗体）についてのエピトープを与えるところの抗体である場合、アンチタグの一部であってよい。
【０２０９】
精製フィルターは、精製ハンドルと結合、相互作用または反応して複合体が形成されるところの、成分を含む。この複合体は、複合体になっていないタグ付加したエンティティおよび複合体になったタグ付加したエンティティの分離を可能にする。精製フィルターは、例えば特に、ヌクレオチド配列、エピトープ、反応基、高親和性リガンドのような認識基を含む。精製フィルターは、モノクローナル抗体、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ、天然のペプチド、天然に存在しないペプチド、多重合体または低重合体のヒドラジノアリールおよびアルキルカルボン酸、多重合体または低重合体のアミノキシアリールおよびアルキルカルボン酸、他の天然の多重合体または低重合体、天然に存在しない多重合体（分子量が１０００Ｄａより大きい）または低重合体（分子量が１０００Ｄａより小さい）、小さな非多重合体分子（分子量が１０００Ｄａより小さい）または大きな非多重合体分子（分子量が１０００Ｄａより大きい）からなっていてよい。精製フィルターは、例えば、ヌクレオチド配列、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジン、「ヒス−タグ」、メルカプト基またはジスルフィド／活性化したジスルフィド基であってよい。
【０２１０】
ライブラリーは、特性について調査し、濃縮される。特性は、親和性、触媒活性または特に細胞膜透過能であってよい。
増幅は、ＰＣＲまたはＲＴＰＣＲ技術を用いてよい。アンチタグは、本発明のある態様として、増幅可能である。アンチタグは、例えば、紫外線照射、熱、ｐＨ調整剤、特に塩溶液の利用のような、物理的または化学的方法を用いることによって、タグから分離してよい。
単離したタグ付加したエンティティは、そのタグまたはアンチタグのいずれかを介して、識別されてよい。識別は、アンチタグのクローニングおよびそのＤＮＡ／ＲＮＡの配列決定によって、またはタグ付加したエンティティまたはアンチタグまたはアンチタグ／タグ付加したエンティティの複合体を介して、達成してよい。
タグ付加したエンティティのライブラリーは、１０−１０２０または１０−１０１４または１０−１０２または１０−１０３または１０２−１０３または１０２−１０４または１０３−１０６または１０３−１０８または１０３−１０１０または１０３−１０１４または１０５−１０６または１０５−１０８または１０５−１０１０または１０５−１０１４または１０８−１０１４または１０１４−１０２０のエンティティを含んでいてよい。
【０２１１】
タグ付加したエンティティおよびアンチタグの複合体のライブラリーは、精製ハンドルおよび精製フィルターを利用することによる精製に先立って、または精製後に、特性について濃縮してよい。
ヌクレオチド配列と共に用いられた場合、独特という用語は、少なくとも核酸塩基および／または配列の主鎖エンティティの一つが、異なる化学エンティティと共にはみられないことを意味する。好ましくは、特定の配列は、他の化学エンティティが核酸塩基の同じ配列と結合していないという事実によって、独特である。
一度ライブラリーが形成されると、前もって決定された望ましい特性を有する化合物についてのライブラリーを選別しなければならない。前もって決定された望ましい特性には、標的に対する結合、標的の触媒的変化、標的または標的の機能的活性を変化／修飾する方法での標的との化学反応、または自殺阻害剤中のような標的に対する共有結合を含め得る。
【０２１２】
標的は目的とするあらゆる化合物であってよい。標的は、タンパク質、ペプチド、炭水化物、ポリサッカライド、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウィルス、基質、代謝産物、遷移状態の類似物、補因子、阻害剤、薬物、色素、栄養素、成長因子、細胞、組織その他であってよく、制限はない。特に好ましい標的には、アンギオテンシン変換酵素、レニン、シクロオキシゲナーゼ、５−リポキシゲナーゼ、ＩＩＬ−１０変換酵素、サイトカイン受容体、ＰＤＧＦ受容体、タイプＩＩイノシンモノリン酸脱水素酵素、βラクタマーゼ、および菌類のシトクロムＰ−４５０を含めるが、それだけに限定されない。標的は、ブラジキニン、好中球エラスターゼ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｇａｇ、ｉｎｔ、ＲＴ、ヌクレオカプシドその他を含めたＨＩＶタンパク質、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＧＦβ、ＫＧＦ、ＰＤＧＦ、トロンビン、テオフィリン、カフェイン、サブスタンスＰ、ＩｇＥ、ｓＰＬＡ２、赤血球、神経膠芽腫、フィブリン血塊、ＰＢＭＣｓ、ｈＣＧ、レクチン、セレクチン、サイトカイン、ＩＣＰ４、相補的タンパク質その他を含み得る。
【０２１３】
ライブラリーを選別するストリンジェントな条件は、通常、識別タグおよびアンチタグの間のハイブリダイゼーションを維持するような条件に限定される。しかしながら、高い厳密性の条件を、新しくした合成またはアンチタグの結合に続いて、適用してよい。選別条件は、当業者に知られている。
前もって決定された望ましい特性を有する化合物は、当業者に知られた様々な方法によってライブラリーの残りから分離し、一方核酸識別タグには依然として結合したままにできる。本発明のある具体例として、望ましい生成物を、識別部の核酸が増幅可能であるような結合した核酸の化学分解をせずに、全体のライブラリーから分離される。識別タグはその後、望ましい化合物に依然として結合しているか、または望ましい化合物から分離した後、増幅してよい。
【０２１４】
もっとも好ましい具体例として、望ましい化合物は、望ましい化合物に結合したタグおよび標的の間の相互作用なしに、標的に対して作用する。一つの具体例として、望ましい化合物は標的に結合し、結合したタグ−望ましい化合物−標的の複合体は、いくつかの方法によって非結合生成物から分離し得る。その方法は、ニトロセルロースフィルター結合、カラムクロマトグラフィー、濾過、親和性クロマトグラフィー、遠心分離および他のよく知られた方法を含む。
【０２１５】
簡潔に言うと、ライブラリーを、ライブラリーおよび標的に結合しているカラムの間の接触を含む、分離工程に付す。化学エンティティ−タグ凝集体とハイブリダイゼーション生成物を形成しない全てのタグ、または望ましい化学エンティティと結合したタグは、カラムを通過するであろう。追加の望ましくない化学エンティティ（例えば、他の標的と交差反応するエンティティ）は、カウンターセレクション法によって除去してよい。望ましい複合体はカラムに結合しており、カラムの条件（例えば塩その他）を変化させることによって溶出でき、または望ましい化合物と結合したタグは切断でき、直接溶出できる。
【０２１６】
加えて、標的と反応する化合物は、標的と反応しない生成物から分離し得る。一例として、（自殺阻害剤のような）標的に対して共有結合した化合物は、非常にストリンジェントな条件下で洗浄し得る。生じた複合体は、その後プロテアーゼ、ＤＮＡアーゼまたは他の適当な試薬によって処理され、リンカーを切断し、望ましい化合物と結合している核酸を遊離し得る。遊離した核酸は増幅可能である。
【０２１７】
他の例として、望ましい生成物の前もって決定された望ましい特性は、生成物が（アシル輸送のような）化学基を標的に輸送し、それによって標的を不活化できることである。全ての生成物がチオエステル化学基を有するところの生成物ライブラリーを有してよい。標的と接触すると、望ましい生成物は化学基を標的に輸送し、それに伴って、望ましい生成物はチオエステルからチオールに変わるであろう。それゆえに、（チオエステルというよりはむしろ）現在チオールである生成物を識別する分離方法は、望ましい生成物の選別およびそれらに関連する核酸の増幅を可能にする。
【０２１８】
当業者にはよく知られている、本発明と矛盾しない他の分離工程および選別工程が存在する。一つの具体例として、生成物をいくつかの一般的な方法によって細分し、その後各画分の活性をアッセイし得る。細分方法は、大きさ、ｐＨ、疎水性その他を含み得る。
本発明に固有のことは、望ましい機能を基本とした化学エンティティの選別であり、これは望ましい機能および特異性をもつ小さな分子の選別に拡張し得る。特異性は、望ましくない「標的」と相互作用し得る化合物の識別部配列を最初に抽出し（ネガティブセレクション、またはカウンターセレクション）、続いてポジティブセレクションによって望ましい標的を抽出することによる、選別工程の間に必要となり得る。例として、菌類のシトクロムＰ４５０の阻害剤が、ある程度哺乳類のシトクロムＰ４５０と交差反応する（重大な副作用を引き起こす）ということが知られている。菌類のシトクロムの高い特異性をもつ阻害剤は、哺乳類のシトクロムと相互作用し得る生成物を除去し、続いて菌類のシトクロムと相互作用し得る生成物を保持することによって、ライブラリーから選択し得る。
【０２１９】
選別手順に続いて、アンチタグを回収する。回収は、選別された複合体を、識別タグからアンチタグを分離するストリンジェントな条件に付すことによって、行ってよい。タグおよびアンチタグが核酸である場合は、ストリンジェントな条件は、二重らせんの二本鎖が切断するまで温度を徐々に上昇させることによって向上してよい。アンチタグ配列のさらなるコピーを、適当なプライマーおよびポリメラーゼを用いた識別配列の伸長によって、供給してよい。あるいは、回収したアンチタグ配列および／または識別配列タグをＰＣＲに付し、二本鎖の生成物を形成してよい。独特の識別配列の少なくとも一部を補完する配列を含む鎖は、その後単離される。
【０２２０】
選別された化学エンティティは、伸長または増幅の間に標的に結合してよく、または標的から分離してよい。本発明のある態様として、標的は固定され、化合物が伸長または増幅の間に標的に結合し続けており、単純な溶出によって伸長または増幅生成物の回収が容易にできることが好ましい。他の態様として、選別された化学エンティティは、濃縮配列の回収に先立って、それと同時に、またはその後に、独特な識別配列から分離される。
【０２２１】
望ましいアンチタグ配列を回収するために、存在すれば、増幅したものと共に天然に存在する分子親和性の組の一部をもつアンチタグを与えることが適切である。分子親和性の組の一部はまた、当該明細書においてハンドルと呼ばれている。アンチタグはその後、単離可能である固体相に結合した分子親和性の組の他の一部を用いることによって、回収してよい。分子親和性の組の不可欠な特性は、分子親和性の組を集合するために、二つの組が相互作用できることである。生物工学の分野において、分子親和性の組として用いられる、様々な相互作用する分子部が、知られている。例としては、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−ポリサッカライド相互作用、ＲＮＡ−タンパク質相互作用、ＤＮＡ−ＤＮＡ相互作用、ＤＮＡ−ＲＮＡ相互作用、ＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用、酵素−リガンド相互作用、抗体−リガンド相互作用、タンパク質−リガンド相互作用その他を含むが、それだけに限定されない。
【０２２２】
適当な分子親和性の組は、ビオチン−ストレプトアビジンである。アンチタグ配列は、例えば増幅または伸長工程においてビオチン部分に結合したプライマーを用いることによって、またはビオチンタグを付加したアンチタグ配列をビーズで被覆したストレプトアビジンと接触させることによって、ビオチンと共に供給され得る。
アンチタグ配列の回収後、これらは最初のライブラリーまたはその画分と接触し、濃縮したライブラリーは、アンチタグ配列を同系統の独特の識別タグの配列にハイブリダイゼーションさせることによって、形成することが可能になる。
【０２２３】
本発明に従った方法は、一回またはそれ以上反復してよい。当該方法の二回目の周期において、アンチタグ配列によって識別されない一本鎖のライブラリーの一部は、反応媒質から除去してよく、または一本鎖のライブラリーの残りの部分は濃縮したライブラリーとの混合物中に残存していてよい。予め選択された機能についての条件は、通常最初の周期よりも厳しく、それゆえに一本鎖のライブラリーの要素は恐らく標的に結合しないので、一般に、濃縮した二本鎖ライブラリーを標的との二回目の接触に付す前に、一本鎖のライブラリーの残りの部分を媒質から分離する必要はない。しかしながら、系の乱れを減少させるために、ある場合においては、アンチタグ配列と対をなさない一本鎖の最初のライブラリーの要素を媒質から回収することが有用である。アンチタグ配列がビオチンのような分子親和性の組の一部と共に供給される場合、目的とする化合物は、例えばビーズで被覆したストレプトアビジンのような固定されたストレプトアビジンで処理することによって、媒質から抽出できる。
上記したように、二回目またはさらなる選別工程を実行するための条件は、一般に、最初のまたは先行する工程よりも厳密である。連続した選別周期における条件の厳密さの向上によって、数量に関しては制限されるが望ましい特性に関しては濃縮されるところの化合物の副集団が形成される。
【０２２４】
特許請求の範囲と共に当該明細書において、核酸、オリゴヌクレオチド、オリゴ、およびヌクレオチドという用語がしばしば用いられる。ヌクレオチド、ヌクレオチドモノマー、またはモノヌクレオチドは、通常二つの部分、すなわち核酸塩基および主鎖からなる化合物を示すために用いられる。主鎖は、ある場合においては、糖部分およびヌクレオシド間リンカーに細分される。モノヌクレオチドは、互いに結合してオリゴヌクレオチドを形成してよい。通常、モノヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合を介して結合している。核酸という用語は、オリゴヌクレオチドと同様にモノヌクレオチドを包含する。しかしながら、通常、その用語は、ヌクレオシド間結合を介して結合している２から３０までのモノヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを意味する。
【０２２５】
二官能性複合体のコード部の決定
単離した二官能性分子または分離した識別オリゴヌクレオチドに存在する識別配列のコード部は、ディスプレイ分子の形成に与った化学エンティティを識別するために決定される。ディスプレイ分子の合成方法は、機能エンティティ上の情報と共にそれらがディスプレイ分子中に組み込まれる時点が、識別オリゴヌクレオチドから推論される場合、確立してよい。形成の間の構造的制約によって全分子を推論することは、ディスプレイ分子に関係する様々な化学エンティティの化学構造上の情報を得るのには十分である。例として、結合性の異なる種類を用いることは、合成ブロック上の化学エンティティが、骨格上の単一の位置のみに輸送され得ることを保証する可能性がある。他の種類の化学的制限は、骨格分子または輸送される機能エンティティ上の立体障害のために、存在している可能性がある。しかしながら、一般に、情報は、化学エンティティが（発生期の）ディスプレイ分子中に組み込まれていた合成歴における時点と共に、コード化分子の形成に与った各々の化学エンティティの識別を可能にする識別配列から推論し得ることが好ましい。
【０２２６】
伝統的なＤＮＡ配列決定法は、容易に利用でき、この決定に有用であるけれども、単離した二官能性分子の量および質は、配列決定反応に先立って追加の操作を必要とする可能性がある。
量が少ない場合には、識別配列に存在するプライマー結合部位に対するＰＣＲプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、識別配列の量を増加させることは好ましい。
それに加えて、単離した二官能性分子の質は、多様な種類の二官能性分子が、二官能性分子標的に対する結合について類似した能力を持つ長所によって共に単離されるようなものであってよい。一つ以上の種類の二官能性分子が単離される場合は、異なる単離された種類は、識別オリゴヌクレオチドの配列決定に先立って分離しなければならない。
【０２２７】
従って、一つの具体例として、単離した二官能性複合体の異なる識別配列は、ＤＮＡ配列決定法によってその配列を決定するのに先立って、別々の配列決定ベクターにクローニングされる。このことは、典型的には、当該明細書で述べたようにＰＣＲによって全ての異なる識別配列を増幅し、その後増幅した断片を配列決定ベクターに選択的にクローニングするために、増幅生成物上の独特の制限エンドヌクレアーゼ部位を用いることによって達成される。増幅した断片のクローニングおよび配列決定は、その後当該分野で知られたいくつかの分子生物学的方法のいずれによっても実行し得る日常的な手順である。
あるいは、二官能性複合体またはＰＣＲで増幅した識別配列は、マイクロアレーにおいて分析し得る、アレーは、識別配列中の単一のコドンまたは複数のコドンの存在を分析するために、設計してよい。
【０２２８】
核酸の合成
オリゴヌクレオチドは、よく知られている様々な性質によって、合成し得る。３’から５’の方向で基質上にてオリゴヌクレオチドを合成する場合、遊離ヒドロキシ末端は必要に応じて都合よくは遮断したり脱遮断したりされ得ることが必要となる。好ましいヒドロキシ末端遮断基は、ジメキソチルトリチルエーテル（ＤＭＴ）である。ＤＭＴで遮断された末端は、オリゴヌクレオチド合成として知られているジクロロメタン（ＤＣＭ）中の３％ジクロロ酢酸処理によって最初に脱遮断され、遊離ヒドロキシ末端を形成する。
【０２２９】
３’から５’の方向で遊離ヒドロキシ末端に付加するための前駆体のヌクレオチドは、ヌクレオチドの３’末端にアミノジイソプロピル側鎖を有するホスホルアミデート部分を必要とする。それに加えて、ホスホルアミデートの遊離ヒドロキシは、シアノエチルエステル（ＯＣＮＥＴ）で遮断し、５’末端はＤＭＴエーテルで遮断する。５’ＤＭＴ−、３’ＯＣＮＥＴ−で遮断したホスホルアミデートヌクレオチドを遊離ヒドロキシに付加するには、オリゴヌクレオチド合成として知られているように、アセトニトリル中のテトラゾール、続いてヨウ素酸化、未反応のヒドロキシル基を無水酢酸でキャップすることが必要である。生じた生成物は、付加したＤＭＴで５’末端を遮断したヌクレオチド残基を含み、脱遮断し、以前のようにその後遮断したヌクレオチドを付加できるようになる。
【０２３０】
５’から３’の方向でのオリゴヌクレオチドの合成について、リンカー上の遊離ヒドロキシ末端は、以前のように必要となる。しかしながら、付加された遮断したヌクレオチドは、反対方向の付加を容易にするために、５’および３’末端上で逆転した遮断性を有する。遊離３’ヒドロキシおよび５’ＤＭＴエーテルを有するヌクレオチドは、イミダゾール中のＴＢＳ−Ｃｌとの反応によって、３’ヒドロキシ末端で最初に遮断し、３’末端でＴＢＳエステルを形成する。その後ＤＭＴで遮断した５’末端は、以前のようにＤＣＭ中のＤＣＡによって脱遮断し、遊離５’ヒドロキシ末端を形成する。アミノジイソプロピル基を有する試薬（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）（シアノエチル）ホスホンアミド塩化物、およびＯＣＮＥＴエステルは、テトロヒドロフラン（ＴＨＦ）中で５’脱遮断したヌクレオチドと反応して、５’末端にアミノジイソプロピル、ＯＣＮＥＴで遮断したホスホンアミデート基を形成する。その後３’ＴＢＳエステルはＤＣＭ中のテトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）によって除去され、ホスホンアミデート遮断５’末端および遊離３’ヒドロキシ末端を有するヌクレオチドを形成する。ＤＭＴ−Ｃｌを含む塩基中での反応は、ＤＭＴエーテル遮断基を３’ヒドロキシ末端に付加する。
【０２３１】
３’ＤＭＴ−、５’ＯＣＮＥＴ−遮断したホスホンアミデートヌクレオチドを、遊離ヒドロキシ末端を有するリンカー基質に対する付加は、その後先行するテトラゾール反応を用いて起こり、オリゴヌクレオチド重合として知られている。生じた生成物は、付加したＤＭＴで遮断した３’末端を有するヌクレオチド残基を含み、ＤＣＭ中のＤＣＡによって脱遮断し、以前のようにその後遮断したヌクレオチドを付加できるようになる。
【０２３２】
（図面の簡単な説明）
図１は、識別部および合成ブロックの成分を示す。
図２は、伸長によるコード化の原理を示す。
図３は、合成ブロックの伸長領域を示す。
図４は、識別部および合成ブロックの成分を、内部のコドンと共に示す。
図５は、特異的アニーリングを用いた伸長によるコード化の原理を示す。
図６は、骨格およびポリマー分子のコード化を示す。
図７は、三本鎖集合の原理を用いた伸長によるコード化を示す。
図８は、特異的アニーリングによる三本鎖集合の原理を用いた伸長によるコード化を示す。
図９は、固体相の方法を用いた三本鎖識別部−ディスプレイした分子の合成を示す。
図１０は、プラットホーム集合を用いた連続した反応／伸長を示す。
【０２３３】
図１１は、コンビナトリアルライブラリーの交互パラレル合成についての一般的なスキームを開示する。
図１２は、ライゲーションコード化および遊離反応体を用いたコード化法を開示する。
図１３は、続く反応がコード化工程であるところの、ライブラリー生成法を開示する。
図１４は、ポリメラーゼコード化を用いたライブラリー生成法を開示する。
図１５は、単一のコード化法についての様々な具体例を開示する。
図１６は、二重のコード化法を開示する。
図１７は、様々な二重のコード化法を開示する。
図１８は、環状の合成ブロックを用いたコード化を開示する。
図１９は、可変性リンカーが合成ブロック中で用いられる方法を開示する。
図２０は、実施例６に従ったゲル表示の実験結果を開示する。
【０２３４】
図２１は、三重コード化法を開示する。
図２２は、実施例９に用いられる計画を示す。
図２３は、実施例９に用いられるスプリット・アンド・ミックスの構造を示す。
図２４は、ライブラリー濃縮、増幅および識別の具体例を開示する。
図２５は、識別配列にハイブリダイゼーションしていないアンチタグ配列が二本鎖をなし、それによって不活化する具体例を示す。
図２６は、濃縮工程が精製工程の前であるところの、具体例を示す。
図２７は、ライブラリー濃縮、増幅および識別の一般的原理を示す。
図２８は、連続する濃縮手順の間の中間の増幅工程を省略した、ライブラリー濃縮、増幅および識別の一般的原理を示す。
図２９は、最初の一本鎖ライブラリーを、濃縮に先立って二本鎖にするところの、ライブラリー濃縮、増幅および識別の一般的原理を示す。
図３０は、アンチタグが一回またはそれより多くの濃縮過程の後まで形成されないところの、ライブラリー濃縮の一般的原理を示す。
図３１は、実施例１３において報告している二つのゲルを示す。
図３２は、実施例１４において報告している実験結果を示す。
図３３は、実施例１４において報告している実験結果を示す。
【０２３５】
（図面の詳細な記載）
図１は、パネルＡにおいて、発生期の二官能性複合体および合成ブロックの間のハイブリダイゼーション生成物を開示する。発生期の二官能性複合体は、短い識別部について、結合部分によってオリゴヌクレオチド識別領域に結合した結合エンティティを含む。結合エンティティは、機能エンティティを受け取るように適応させた単一のレシピエント反応基であってよく、または一つまたはそれ以上のレシピエント反応基を含む骨格構造であってよい。パネルＡにおいて、結合エンティティは、機能エンティティを受け取ることのできる四つの反応基を有する骨格を示している。
合成ブロックは、ハイブリダイゼーション生成物の形成を可能にする識別領域に十分相補的であるところの、オリゴヌクレオチドに結合した機能エンティティを含む。機能エンティティは、化学反応によって、結合エンティティに輸送され得る。相補的識別領域は、さらにその３’または５’末端に独特のコドンを含む。独特のコドンは、明確に機能エンティティを識別する。
【０２３６】
識別部および合成ブロックの間のハイブリダイゼーション生成物の形成に続いて、機能エンティティおよび独特のアンチコドンを識別部に輸送する。本発明の態様として、機能エンティティおよび相補的識別領域を結合するリンカーは、結合エンティティとの、機能エンティティを結合エンティティに輸送することになる反応と同時に切断される。輸送に先立って、同時にまたはその後に、コドンの転写が起こる。転写は、鋳型のオリゴヌクレオチドを用いて、オリゴヌクレオチドの重合または低重合体化し、相補的な鎖を形成することが可能である酵素によって行われる。通常Ｐｆｕポリメラーゼのようなポリメラーゼは、適当なｄＮＴＰ、すなわちＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＴＴＰと共に用いられ、合成ブロックの独特のアンチコドンを鋳型として用いた識別鎖の伸長として、独特なコドンを形成する
【０２３７】
図１パネルＢは、機能エンティティの二次輸送についての典型的な計画を図示している。識別部は最初の機能エンティティを供給され、コドンによって伸長される。その上、コドンはまた、コドンの伸長として結合領域を含む。結合領域は通常、最初の合成ブロックによって最初の輸送周期において識別部に輸送される定常領域である。識別部は、二番目の合成ブロックとハイブリダイゼーション生成物を形成する。二番目の合成ブロックは、ハイブリダイゼーションを可能にする識別部の識別領域に十分相補的なオリゴヌクレオチドに結合した、二番目の機能エンティティを含む。相補的識別領域の一部は、非コード領域および相補的結合領域を含む。非結合領域は、最初の周期で輸送されるコドンと向かい合っており、相補的結合領域は、結合領域に相補的であり、酵素がらせんに結合するのに十分強力なハイブリダイゼーションを可能にする。二番目の独特なアンチコドンは、相補的結合領域に結合しており、二番目の機能エンティティを識別する。二番目のコドンは、最初のコドンについて上記したのと同様に、鋳型として二番目のアンチコドンを用いて、識別部に輸送される。
【０２３８】
図２は、機能エンティティおよびコドンの輸送の四つの周期を図示している。最初の周期において、ハイブリダイゼーション生成物が、識別部および合成ブロックの間で形成される。ハイブリダイゼーション生成物は、機能エンティティおよび骨格が空間的に近接したところに運ばれ、反応が起こる可能性が上昇することを保証する。二つのオリゴヌクレオチドの間の二本鎖の形成はまた、ポリメラーゼの結合領域を与える。ポリメラーゼの存在下で、ｄＮＴＰ、および２０ｍＭのヘペス−水酸化カリウム、４０ｍＭの塩化カリウムおよび８ｍＭの塩化マグネシウムを含む水溶液のような適当な緩衝剤、およびｐＨを７．４に調節した独特のアンチコドン（ＵＡ１）の混合物は、コドンとして識別部に輸送される。
【０２３９】
機能エンティティおよびコドンの輸送後、それぞれ、使用後の合成ブロックは、厳密性を高めることによって、識別部から分離される。通常、厳密性は、温度の上昇、ｐＨの変化によって、またはイオン強度の上昇によって、高められる。二重らせん構造の開裂後、識別部は回収される。本発明のある態様として、識別部は使用後の合成ブロックからの分離を容易にするために固定される。他の態様として、使用後の合成ブロックは、化学的または酵素的に分解される。識別部の回収に続いて、新しい周期は、識別部をさらに合成ブロックと接触することによって、開始され得る。
【０２４０】
輸送の四つの周期後の最終生成物は二官能性複合体であり、一方の末端に反応生成物、他方にコード化領域を含む。反応生成物は、輸送された機能エンティティおよび最初の骨格由来の成分を含む。コード化領域は、あらゆる順序で輸送されたあらゆるエンティティについての遺伝子コードを含む。従って、合成歴は、コード化領域から解読してよい。
【０２４１】
図３は、コード領域の構築の例を示す。パネルＡは、図１、パネルＢに従った計画の例の詳細な概観を描写している。最初の周期において輸送される独特のコドンは、一部ミスマッチ領域の近くに向かい合っている。親和性の低下を代償するために、結合領域はコドンの後に続く。結合領域は、合成ブロックの適合した相補的結合領域の近くに向かい合っている。
図３において、最初の周期において組み込まれるパネルＢの独特のコドンは、相補的結合領域中に中性の結合領域を組み込まれた二番目の合成ブロックの近くに向かい合っている。中性の結合領域は、様々な独特のコドンの間の同定ができないが、各々のコドンに対するある種の親和性を示すことができる。通常、中性の結合領域は、一つまたはそれ以上のユニバーサル塩基を含み、より好ましい中性の結合領域は、識別部上のコドン領域の少なくとも一部に向かい合っているユニバーサル塩基の配列を含む。
【０２４２】
図４は、識別部が内部のコドンを有し、合成ブロックが対応するアンチコドンを有するところの、識別部および合成ブロックの間のハイブリダイゼーション生成物を示す。識別領域および相補的識別領域はまた、特定の独特のコドンおよびアンチコドンをそれぞれ含み得る。
数回の選別周期が予期される場合、特にコード化分子が先行する周期のＰＣＲ生成物から形成する場合、内部のコドンの利用は、特に重要である。合成ブロック中の内部のアンチコドンは、完全にまたは一部識別配列に適合する可能性があり、または親和性を与えるが特異性は与えない、一つまたはそれ以上のユニバーサル塩基を含んでよい。内部の独特のコドンの役割は、識別分子および合成ブロックの分子の間でのアニーリングを導くことのみである。正確なコード化は、伸長過程中で作られる独特のコドンによって導かれる。これらの独特のコドンは、次の分子の生成にまわされ、ディスプレイした分子の合成歴を解読するために用いられる。この系は、正確な遺伝子型を識別分子の次の生成に伝えるために、内部の独特のコドンによる正確なコード化機能に完全には依存していないであろう。
【０２４３】
パネルＡにおいて、ハイブリダイゼーション生成物は、機能エンティティおよび結合エンティティの間に、空間的近密さを与え、それによって反応が起こる可能性を高めている。独特のコドンは、酵素的伸長反応によって識別配列上のコドンを鋳型としている。パネルＢにおいて、結合領域は、たとえ一つまたはそれ以上のミスマッチ塩基がコドン：前に使用されたコドンの非コードドメインに現れたとしても、二本鎖の互いの親和性を与えるために、各々の独特のコード配列の間に導入される。
【０２４４】
図５は、増幅工程が選別の間に含まれる場合に有用な具体例を示す。最初に、複合体のライブラリーを、図２に描写されるようにして生成する。複合体のライブラリーは、選別過程に付してよい。選別過程は、複合体上のディスプレイ分子を標的に呈示し、その後標的との望ましい相互作用を示すディスプレイ分子を選別することを含んでよい。副ライブラリーを得るために、選別過程の間、比較的緩やかな条件を用いることは好都合である。副ライブラリーは、全副ライブラリーについての合成歴上の情報を得るために解読してよい。しかしながら、通常、解読が行われる前に副ライブラリーをさらに減少させることが好ましい。
【０２４５】
副ライブラリーは、標的に再び付すこと、およびよりストリンジェントな条件を用いることによって減少させてよい。しかしながら、二番目の選別の前に多数の各々の副ライブラリーの成分を得るために、一般に、複合体を増幅することが好ましい。従って、骨格に負荷されるプライマーは、最初にコード化領域の一方の末端でプライマー部位にアニーリングされる。その後転写物が形成される。好ましくは、それに結合している骨格を有する二本鎖ＰＣＲ生成物を得るために、リバースプライマーが、存在している。
【０２４６】
このＰＣＲは、副ライブラリーの増幅の生成についての基礎である。識別配列は、図面中でＩＵＣと短縮された、いくつかの内部の独特のコドンに分離される。ＩＵＣの数は、ディスプレイ分子の形成に与った機能エンティティの数に相当する。ＩＵＣの配列は、個別の機能エンティティの識別部を表し、ＩＵＣの順序は機能エンティティの反応の順序を示す。好ましくは、プライマー領域は、ＩＵＣ配列に近接して与えられ、核酸配列を後で増幅することを可能にする。
【０２４７】
副ライブラリーは、輸送可能な機能エンティティおよびＩＵＣの少なくとも一つに相補的な内部の独特のアンチコドン（ＩＵＡ）を含む、多量の合成ブロックと接触する。相補的識別領域は、オリゴヌクレオチド識別領域とのハイブリダイゼーションを与えるのに十分な相補性を与えられる。好ましい具体例として、輸送される機能エンティティを識別しないＩＵＣは、中性の結合領域を有する相補的識別領域の反対側にある。上記したように、中性の結合領域は、ユニバーサル塩基、すなわち二つまたはそれより多くの天然に生じる核酸塩基と組になることのできる塩基を含む。特異的塩基対の配列および非特異的塩基対の配列を含む領域、すなわち相補的識別領域に近接して、独特のアンチコドン（ＵＡ）が存在する。ＵＡは、相補的識別領域のＩＵＡと同様の情報を含み、典型的には、ＵＡおよびＩＵＡはヌクレオチド中に同じ配列を有する。
【０２４８】
輸送工程および反応工程は、上記したように数周期行われ、二官能性複合体を形成する。図５においては４周期が行われるが、しかしながら、３または２周期のようなそれ未満の周期も、それぞれ３または２つの機能エンティティ由来の構造を含む反応生成物を生成するために行われ得ることが認められるであろう。また５ないし２０のような、４周期より多くの周期も、より多様なディスプレイ分子のライブラリーを形成するために行ってよい。各周期で生じる複合体は、機能エンティティおよび骨格の間の反応生成物、およびオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、誘導領域、すなわち個別の合成ブロックのアニーリングを導く領域、および合成ブロックから識別部に輸送された独特のコドンを含むコード化領域に分割され得る。
【０２４９】
上のコード化法を用いると、解読を可能にするのに十分量の材料を得るための、ますます重点的な副ライブラリーの増幅が可能になる。
図６に示すコード化法は、モノマーおよびポリマーコード化分子の両方を作ることができる。パネルＡ：複合体反応生成物は、多数の機能エンティティと反応した結合エンティティを用いて作ることができる。パネルＢ：ポリマーは、一つの結合エンティティを一つの反応基と共に用いて作ることができ、少なくとも二つの反応基を有する機能エンティティとの結合を可能にする。
【０２５０】
図７は、伸長の原理によるコード化についての三本鎖集合の手順を図示する。Ａ：識別部および合成ブロックは、アセンブリープラットホーム上で集合し得る。このアセンブリープラットホームは、独特のアンチコドン領域および独特のアンチコドンを含み、二つの分子がその配列を介して直接結合する。独特のアンチコドン領域を相補的識別領域と結合する結合領域が存在してもよい。Ｂ：識別部がまた独特のコドンおよび結合領域を含み、アセンブリープラットホームがまた非結合領域および相補的結合領域を含むところの、連続した反応に用いられる合成ブロックおよびアセンブリープラットホームは、識別部の全ての成分を表す。
【０２５１】
図８において、内部のコドンはまた、三本鎖のアセンブリー原理に対して用いられ得ることが示されている。このことは、選別が中間の増幅工程を含む多数の周期で行われる場合に、有用であるであろう。
【０２５２】
図９は、固体相の三本鎖のディスプレイした分子の合成を示す。アセンブリープラットホーム分子は、合成ブロックを結合エンティティに連続して結合することができるようにするために、固体支持体に結合している。アセンブリープラットホーム分子の異なるライブラリーは、適当な非結合領域および相補的結合領域によって伸長され、別々の瓶中の各々の工程において用いられ得る。このことによって、各々の工程において同一の合成ブロックおよび識別分子を用いることが可能となる。
【０２５３】
図１０は、アセンブリープラットホームの原理を利用した連続した輸送／伸長を示す。各々のウェルは、プラットホーム分子のライブラリーを含む。プラットホーム分子は、その後のウェルにおいて独特のアンチコドンによって伸長される。識別部および合成ブロック分子のライブラリーは、最初のウェルに加えられ、特異的アニーリングおよび機能エンティティの輸送を可能にする。反応混合物は、次のウェルに輸送され、最終的に識別部−ディスプレイしたライブラリーを生成する。
【０２５４】
図１１は、コンビナトリアルライブラリーの交互パラレル合成についての一般的スキームを開示する。最初の工程において、発生期の二官能性分子が与えられる。発生期の二官能性分子は、分子の一部として、化学的骨格上に見られる可能性があり、時に当該明細書において化学反応部位と呼んでいる反応基を含む。二官能性分子の他の部分は、タグ付加についての促進部位を含む。促進部位は、タグがヌクレオチドである場合、ヌクレオチドの３’−ＯＨ基または５’−リン酸基であってよい。化学反応部位および促進部位は、所望により、結合基によって隔てられてよい。結合基が存在する場合、ヌクレオチドまたはヌクレオチドの配列であってよい。スペーシングエンティティは、化学反応部位をヌクレオチドから間隔をおくために、ポリエチレンまたはポリプロピレンのような、親水性のリンカーをさらに含んでいてよい。また結合部分に含まれるのは、実験者がディスプレイ分子をコード部から分離できるような選択的に切断可能なリンカーであってよい。
【０２５５】
発生期の二官能性分子は、多数の画分、通常多数の空間的に分離した容器の扱いを容易にすることのできる、マイクロタイタープレートまたは同様の器具のウェルに分配される。各々の画分は、または当該明細書において反応体と呼ばれる、特異的な小さな分子の断片と反応する。従って、最初の画分において、発生期の二官能性分子は、最初の小さな分子の断片（Ｆ１）と反応し、二番目の画分において；発生期の二官能性分子は、二番目の小さな分子の断片（Ｆ２）その他と反応する。画分の数は原則として不定であってよいが、しかしながら、実用的な理由から、その数は、通常１０および５００のような、５および５０００の間である。各々の画分において、小さな分子の断片は、場合によって同一であるか、または異なっていてよい。各々の画分において、一つ、二つまたはそれより多くの反応体が、反応に関わってよい。薬剤断片および発生期の二官能性分子の間の反応が各々の画分で起こった後、タグを付加し、そのタグは小さな分子の断片を識別する。本発明のある態様として、タグは核酸である。従って、最初の画分において、最初の核酸タグ（Ｔ１）を、反応生成物の促進部位に付加し、二番目の画分において、二番目の核酸タグ（Ｔ２）を、二次反応生成物その他の促進部位に付加する。酵素的コード化についての様々な方法が、当該明細書において熟考され、議論される。各々の画分における酵素的タグ付加に続いて、画分の内容物を収集する。
【０２５６】
二番目の周期において、二官能性分子の混合物は、再び画分に分割される。二番目の周期における画分の数は、最初の周期における画分の数と同じである必要はない。各々の画分において、前の周期の生成物は発生期の二官能性分子として働く。従って、骨格および最初の周期の小さな分子の断片の間の反応生成物上にみられる反応基は、一つまたはそれ以上の二番目の周期の小さな分子の断片と反応する。従って、最初の画分において、最初の周期の混合した反応生成物は、最初の小さな分子の断片（Ｆ１）と反応し、二番目の画分において、最初の周期の混合した反応生成物は、二番目の小さな分子の断片（Ｆ２）その他と反応する。二番目の周期の小さな分子の断片Ｆ１、Ｆ２．．．Ｆｘは、最初の周期に用いられた小さな分子の断片と同一であってもよく、または異なっていてもよい。
【０２５７】
反応が起こるようになった後、小さな分子の断片を特定するタグを加える。最初の周期において加えるタグは、通常、タグを含む直線の識別部を生成するために、二番目の周期においてタグの付加のために用いられ得る促進部位を含む。最初の画分において、反応生成物は、発生期の二官能性分子の反応性の反応部位と反応した二番目の周期の反応体を識別する付加した最初のタグであり；二番目の画分において、二番目の周期の二番目の小さな分子の断片と反応した生成物は、その反応体その他を識別する付加したタグである。各々の画分におけるタグの付加に続いて、画分の内容物を共通のプール中で混合する。分割反応−結合周期は、ディスプレイ分子部およびコード部を含む二官能性分子のライブラリーを得るために、適切な回数繰り返し得る。ライブラリーは、当該明細書の他の場所で開示された選別過程において用いてよい。
上で、スプリット・アンド・ミックスについての一般的原理は開示しており、その中で小さな分子の断片および化学反応部位の反応がコード化工程に先立って起こる。明らかに、反応は逆の順序でまたは同時に起こり得る。
【０２５８】
図１２は、左側に９６のウェルマイクロタイタープレートを、スキームとして示す。各々のウェルまたは選別したいくつかのウェルにおいて、右の過程が起こる。最初に、二官能性分子を与える。二官能性分子は、リンカー（線）を介してコドン（長方形）に結合した化学反応部位（楕円）を含む。コドンの左側に、結合領域を与える。次に、コドンオリゴヌクレオチドおよびスプリントオリゴヌクレオチドを加える。コドンオリゴヌクレオチドは、コドンと共に与えられ、態様に結合領域が位置する。スプリントは、ハイブリダイゼーション条件下で末端が互いに隣接するような、発生期の二官能性分子の結合領域、およびコドンオリゴヌクレオチドの結合領域に相補的な配列を用いて設計される。発生期の二官能性複合体、スプリントおよびコドンオリゴヌクレオチドは、適切な条件下でハイブリダイゼーション生成物を形成する。リガーゼは、コドンオリゴを発生期の二官能性複合体に結合するために加えられる。二番目の工程において、薬剤の断片、すなわち反応体を加え、化学反応部位との反応を提供する条件を設ける。
その後、各々のウェルの内容物を結合し、所望により、反応およびコード化の二番目の周期のために再びある範囲のウェルに分割する。最終工程において、結合したウェルの内容物は、当該明細書において開示されているように、選別または分離工程において用いられる。
【０２５９】
図１３は、図１２に示される具体例と比較して、逆転したコード化および反応工程の具体例の概略を述べる。様々なウェルにおいて、オリゴヌクレオチドに結合した反応基（Ｒｘ）を有する発生期の二官能性複合体を分配する。最初の工程において、各々の画分における反応基は反応体と反応し、二番目の工程において、コドンオリゴヌクレオチドおよびスプリントをリガーゼと共に加え、コドンオリゴヌクレオチドを反応した発生期の二官能性複合体と共有結合させ、三番目の工程においてライゲーション生成物を回収する。ウェルの内容物はその後結合してよく、二官能性複合体のライブラリーとして用いられてよく、または他の周期の反応およびタグの付加のために再利用してよい。
【０２６０】
図１４は、図１３に従って生成したライブラリー、またはさらなる周期における、コード部およびディスプレイ分子部を有するあらゆる他のライブラリー利用を開示する。最初に、図１３の具体例のウェルの結合した内容物は、別々のウェルに分配する。その後、発生期の二官能性分子の結合領域に相補的な、結合領域を有するアンチコドンオリゴヌクレオチドを、ハイブリダイゼーション条件下、すなわち発生期の二官能性複合体およびアンチコドンオリゴヌクレオチドの間のハイブリダイゼーション生成物の集合に好都合な条件下で加える。アンチコドンオリゴヌクレオチドの付加の後、またはそれと同時に、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ（通常、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）の集合、および適切な塩および緩衝剤を、伸長が起こるようにするために加える。伸長（点線の矢印）はアンチコドンを識別部に転写し、化学反応部位でその後反応する反応体の識別部をコードするタグを結合する。アンチコドンオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの除去を可能にするために、ビオチン（Ｂ）に結合する。
【０２６１】
図１５は、反応体の集合と組み合わせた様々なコード化法のスキームを開示する。全ての組み合わせは本発明に従う。
遊離反応体／ポリメラーゼコード化：発生期の二官能性複合体は、反応基を含む骨格（＝化学反応部位）、および骨格を識別するコドンを含むオリゴヌクレオチド部分を含む。コドンは、アンチコドンオリゴヌクレオチドの相補的結合領域とハイブリダイゼーションを形成できるオリゴヌクレオチド結合領域と結合している。ハイブリダイゼーション生成物を伸長反応に付し、その反応で骨格のオリゴヌクレオチドはアンチコドンに及び、それによってコドンを有する骨格のオリゴヌクレオチドが得られる。伸長反応の後に、それと同時にまたはそれに先だって、アンチコドンによってコードされた遊離反応体は、骨格と反応する。
【０２６２】
ジッパー合成ブロック／ポリメラーゼ：発生期の二官能性複合体は、反応基を含む骨格（＝化学反応部位）、および骨格を識別するコドンを含むオリゴヌクレオチド部分を含む。コドンは、アンチコドンオリゴヌクレオチドの相補的結合領域、および反応体の相補的結合領域とハイブリダイゼーションを形成できる二つのオリゴヌクレオチド結合領域と結合している。ハイブリダイゼーション生成物を伸長反応に付し、その反応で骨格のオリゴヌクレオチドはアンチコドンに及び、それによってコドンを有する骨格のオリゴヌクレオチドを与える。伸長反応の後に、それと同時にまたはそれに先だって、アンチコドンによってコードされた機能エンティティは、骨格と反応する。ポリメラーゼの選別は反応の順序を決定する可能性があり、シークエナーゼのようなある種のポリメラーゼは機能エンティティと結合した結合領域を置換し、一方Ｔａｑポリメラーゼのような他のポリメラーゼは結合領域の置換を起こさないようにコード化する。ジッパー合成ブロックが用いられる場合、骨格および機能エンティティの間の非常な近接さが得られ、それによって反応が起こるのが促進される。
【０２６３】
Ｅ２合成ブロック／ポリメラーゼコード化：発生期の二官能性複合体は、化学的骨格、および骨格を識別するコドンを含むオリゴヌクレオチド部分を含む。オリゴヌクレオチド部は、コドンの各々の側に、二つの結合領域を含む。Ｅ２合成ブロックは、機能エンティティは骨格に関して近傍にあり、二重鎖がアンチコドンの直前に形成されるような、骨格オリゴヌクレオチドにアニーリングし、ポリメラーゼが二重鎖を結合領域として識別できるようになる。適切な条件および基質を適用することによって、識別オリゴヌクレオチドがアンチコドンに及び、それによって機能エンティティの遺伝情報を識別部に転写する。骨格のコドンに向かい合うのは、一続きのイノシンのような共通結合ヌクレオチドである。Ｅ２合成ブロックの利用によって、ライブラリーのワン−ポット合成を可能にする。
【０２６４】
環状の合成ブロック／ポリメラーゼコード化：発生期の二官能性複合体は、化学的骨格、および骨格を識別するコドンを含むオリゴヌクレオチド部分を含む。オリゴヌクレオチド部は、コドンの各々の側に、二つの結合領域を含む。環状の合成ブロックは、機能エンティティは骨格に関して近傍にあり、二重鎖がアンチコドンの直前に形成されるような、骨格オリゴヌクレオチドにアニーリングし、ポリメラーゼが二重鎖を結合領域として識別できるようになる。適切な条件および基質を適用することによって、識別オリゴヌクレオチドがアンチコドンに及び、それによって機能エンティティの遺伝情報を識別部に転写する。合成ブロックのどの配列も骨格のコドン配列に相補的でないので、このコドン配列はループアウトする。環状の合成ブロックの利用によって、ライブラリーのワン−ポット合成を可能にする。
【０２６５】
Ｎ合成ブロック／ポリメラーゼコード化：発生期の二官能性複合体は、リンカーを介して骨格のコドンに結合した化学的骨格を含む。コドンの片側または各々の側に、結合領域は存在する。Ｎ合成ブロックは、骨格の結合領域に相補的な結合領域およびアンチコドンを含む。機能エンティティは、コドンまたは結合領域に結合している。ハイブリダイゼーション条件下で、相補的結合領域はハイブリダイゼーションし、ポリメラーゼは両方向に伸長し、それによってアンチコドンの遺伝情報を、骨格に共有結合したオリゴヌクレオチドに輸送する。伸長反応の前に、その後にまたはそれと同時に、機能エンティティおよび骨格の間の反応が起こる可能性がある。通常、機能エンティティは、機能エンティティを骨格構造への輸送を可能にするために、切断可能なリンカーを介してアンチコドンオリゴヌクレオチドに結合している。
【０２６６】
遊離反応体／リガーゼ：骨格のエンティティは、コドンを含むオリゴヌクレオチドに結合している。骨格のオリゴヌクレオチドは、コドンのオリゴヌクレオチドがライゲーションしている促進部位を、さらに含む。ライゲーションは、リガーゼによって行われる。ライゲーションは、一本鎖または二本鎖の形で起こり得る。一本鎖の形において、骨格のオリゴヌクレオチドの３’ＯＨ（または５’リン酸）は、コドンのオリゴヌクレオチドの５’リン酸（または３’ＯＨ）にライゲーションされる。二本鎖の形において、骨格の末端およびコドンのオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドは、それぞれ用いられ、末端は互いに隣接しているように構築される。所望により、ライゲーションは、二つの二本鎖オリゴヌクレオチドの間に起こる、すなわち突出部（「接着末端」）を有する二本鎖の骨格のオリゴヌクレオチドは、相補的な突出部を与えた二本鎖のコドンのオリゴヌクレオチドにライゲーションされる。ライゲーションのタイプは、選択された酵素に左右される。通常、反応が末端に相補的なオリゴヌクレオチドの誘導効果のために速いので、二本鎖のライゲーションが好ましい。相補的オリゴヌクレオチドはまた、当該明細書においてスプリントのオリゴヌクレオチドとも呼んでいる。コドンのオリゴヌクレオチドを骨格のオリゴヌクレオチドにライゲーションするのに続いて、それに先行して、またはそれと同時に、遊離反応体および骨格の間の反応が起こる。
【０２６７】
ジッパー合成ブロック／リガーゼ：骨格のエンティティは、コドン、および骨格およびコドンの間の結合領域を含むオリゴヌクレオチドに結合している。骨格のオリゴヌクレオチドは、コドンのオリゴヌクレオチドがライゲーションしている促進部位を、さらに含む。ライゲーションは、リガーゼによって行われる。ライゲーションは、一本鎖または二本鎖の形で起こり得る。一本鎖の形において、骨格のオリゴヌクレオチドの３’ＯＨ（または５’リン酸）は、コドンのオリゴヌクレオチドの５’リン酸（または３’ＯＨ）にライゲーションされる。二本鎖の形において、骨格の末端およびコドンのオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドは、それぞれ用いられ、末端は互いに隣接しているように構築される。所望により、ライゲーションは、二つの二本鎖オリゴヌクレオチドの間に起こる、すなわち突出部（「接着末端」）を有する二本鎖の骨格のオリゴヌクレオチドは、相補的な突出部を与えた二本鎖のコドンのオリゴヌクレオチドにライゲーションされる。ライゲーションのタイプは、選択された酵素に左右される。通常、反応が末端に相補的なオリゴヌクレオチドの誘導効果のために速いので二本鎖のライゲーションが好ましい。相補的オリゴヌクレオチドはまた、当該明細書においてスプリントのオリゴヌクレオチドとも呼んでいる。ジッパー合成ブロックは、結合オリゴヌクレオチドと結合した機能エンティティである。結合オリゴヌクレオチドは、骨格のオリゴヌクレオチドの相補的結合領域であり、それによってハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイゼーション生成物を形成する。コドンのオリゴヌクレオチドを骨格のオリゴヌクレオチドにライゲーションするのに続いて、それに先行して、またはそれと同時に、機能エンティティおよび骨格の間の反応が起こる。反応体上の結合領域を利用することによって、機能エンティティおよび骨格の間の近接さが保証される。
【０２６８】
Ｅ２合成ブロック／ライゲーションコード化：最初に、コドン、および骨格のコドンの間の結合領域、および骨格のコドンを含むところの、オリゴヌクレオチドに結合した骨格を含む発生期の二官能性複合体を与える。骨格のオリゴヌクレオチドはまた、コドンのオリゴヌクレオチドがライゲーションし得る促進部位を含む。骨格のオリゴヌクレオチドは、二本鎖部分を担持するＥ２合成ブロックに、ハイブリダイゼーションする。アンチコドンに相補的なオリゴヌクレオチドは、鋳型としてＥ２合成ブロックを用いて、骨格のオリゴヌクレオチドにライゲーションする。ライゲーションの前に、その後に、またはそれと同時に、機能エンティティおよび骨格の間の反応が起こる。
【０２６９】
環状の合成ブロック／ライゲーションコード化：オリゴヌクレオチドに結合した骨格を含み、その骨格のオリゴヌクレオチドが二つの結合領域に態様を接したコドンを含むところの、二官能性複合体を与える。骨格のオリゴヌクレオチドの結合領域に相補的な結合領域を有する、環状の合成ブロックを与える。ハイブリダイゼーションにおいて、骨格のオリゴヌクレオチドのコード部をループアウトする。環状の合成ブロックはまた、二本鎖のコード部を含む。環状の合成ブロックのアンチコドン部分に相補的なオリゴヌクレオチドを、骨格のオリゴヌクレオチドの遊離結合領域にライゲーションする。ライゲーションの前に、その後に、またはそれと同時に、機能エンティティおよび骨格の間の反応が起こる。
【０２７０】
Ｎ合成ブロック／ライゲーションコード化：最初に、骨格が適当なリンカーを介してその骨格を識別するコドンに結合しているか、またはコドンと結合した結合領域に結合している、発生期の二官能性複合体を与える。コドンと結合した機能エンティティを有する合成ブロックは、骨格のオリゴヌクレオチドを機能エンティティのオリゴヌクレオチドに結合するために、骨格のオリゴヌクレオチドにライゲーションする。ライゲーションは、一本鎖または二本鎖の状態において行ってよく、ライゲーションのために選択された特定の酵素に左右される。その後、機能エンティティを骨格と反応させる。あるいは、機能エンティティおよび骨格は、各々のオリゴヌクレオチドのライゲーションに先立って反応する。
【０２７１】
周期、すなわち発生期の二官能性複合体との反応およびタグ付加が、上のコード化法の全てに従って完遂される場合、恐らく新しい周期は上の反応／コード化法の全てに従って最初の状態に戻される。従って、最初の周期におけるコード化および反応は、その後の二番目またはさらなる周期と同一であっても、または異なっていてもよい。単一の二官能性複合体または複合体のライブラリーを生成してよい。ライブラリーを考えた場合、機能エンティティおよびコドン／アンチコドンの間の共有結合を用いるところのワン−ポット合成が、合成ブロック、すなわちＥ２合成ブロック、環状の合成ブロックおよびＮ合成ブロック／を用いて行われ得る。スプリット・アンド・ミックス合成法は、機能エンティティ／反応体およびコドン／アンチコドンの間に共有結合が存在しない場合、すなわち遊離反応体およびジッパー合成ブロックを示すカラム中で、行い得る。
【０２７２】
図１６は、二重のコード化法、すなわち方法が進行する間に二つまたはそれより多くの反応体をコード化する方法を示す。ある具体例として、多重コード化は、反応体および骨格の間の多数の反応を可能にする。最初に、ハイブリダイゼーション領域、骨格コドンおよび結合領域を含むオリゴヌクレオチドと結合した骨格を、Ｅ２合成ブロックにアニーリングする。その後、伸長は、合成ブロックのアンチコドンが識別部に輸送されるように行われる。いくつかのポリメラーゼは、一つまたはそれ以上の一本鎖ヌクレオチドの突出部を形成する。この突出部は、本発明において、アンチコドンオリゴを結合し、ポリメラーゼが識別オリゴヌクレオチドをアンチコドンオリゴヌクレオチドのアンチコドン領域に向かってさらに伸長することができるようにするために用いられる。アンチコドンオリゴヌクレオチドの情報を輸送することによって、三番目の遊離反応体Ｃのコード化が可能になる。Ａを担持するオリゴヌクレオチドおよびＢを担持するオリゴヌクレオチドの間のアニーリングによって、ＡおよびＢの間が近くなり、それによって高い局所濃度が得られる。従って、遊離反応体Ｃを加えると、三つの成分の間の反応が促進される。二重のコード化の一つの利点として、反応が、伸長が起こるのと同じ溶媒において必ずしも起こる必要のないような、溶媒と交換可能である。
【０２７３】
右側には、１００の異なる骨格オリゴヌクレオチドおよび１００の合成ブロックに上の方法を適用する例を図示している。骨格オリゴヌクレオチドおよび合成ブロックのオリゴヌクレオチドの間のハイブリダイゼーション生成物を、１００の異なるウェルに分配する。各々のウェルにおいて、伸長、アンチコドンオリゴヌクレオチドの付加、および特異的な遊離反応体との反応が可能である。総計で１０６の異なる二官能性分子が生成する。
【０２７４】
図１７は、二重のコード化を行うための様々な方法を開示する。全ての例において、コード化は反応に先立って起こることを示しているが、反応を最初に行ってその後コード化を行うことも、当業者の認識の範囲内であろう。ライブラリーを考えた場合、Ｎ合成ブロックをあらゆるコード化法と組み合わせて用いて、反応を単一の容器内で行う（ワン−ポット合成）ことが可能である。残っている反応体については、一回またはそれより多くのスプリット・アンド・ミックス工程を行う必要がある。ジッパー合成ブロック、Ｅ２合成ブロック、および環状の合成ブロックのあらゆるコード化法との組み合わせにおいて、一回のスプリット・アンド・ミックス工程が必要であり、遊離反応体のあらゆるコード化法との組み合わせについては、二回のスプリット・アンド・ミックス工程が必要である。スキームによって、当業者が特異的な反応に有用な反応／コード化法を選択することを可能にしている。もし三重の、四重のまたは多重のコード化を考えた場合、二重のコード化スキームの具体例を図１５の単一のコード化スキームの具体例と組み合わせて用いたコード化を一回またはそれ以上行い、特異的化学反応の必要性に適したコード化／反応法にたどり着くことが可能である。
【０２７５】
図２１は、三重のコード化法を開示する。最初に、骨格のオリゴヌクレオチドに結合した骨格を与え、骨格のオリゴヌクレオチドはさらにコドンを与えられる。Ｅ２タイプの二つの合成ブロックは、骨格のオリゴヌクレオチドにアニーリングし、それによって機能エンティティのＢＢ１およびＢＢ２を骨格の近傍に運ぶ。合成ブロックを付加するのと同時に、それに先だってまたはその後、最初の合成ブロックのヌクレオチド配列に相補的な、三番目の反応体（ＢＢ３）をコードするコドンオリゴヌクレオチドが与えられる。その系の構成成分は、互いにハイブリダイゼーション可能であり、ポリメラーゼおよびリガーゼを与える。ポリメラーゼは、可能な場所の伸長を行い、リガーゼは、二本鎖の生成物を形成するために伸長したオリゴヌクレオチド同士を結合する。コード化過程に続いて、三番目の反応体を加え、骨格および反応体の間の反応を促進する条件を与える。最後に、選別は、標的に対してある機能を果たす反応生成物を選別するために用いられる。選別した二官能性複合体の識別オリゴヌクレオチドを、ＰＣＲによって増幅し、識別する。
【０２７６】
右側に、本発明を実施した特定の具体例を示す。それに従うと、各々のコドンは、長さが５つのヌクレオチドであり、骨格の態様に位置する結合領域はそれぞれ２０個のヌクレオチドである。骨格の結合領域にハイブリダイゼーションするように設計された合成ブロックは、２０個のヌクレオチド相補的配列を、５つのヌクレオチドコドンと共に含む。
【０２７７】
本発明の濃縮法の具体例を図２４に示す。最初に、ライブラリーにおける各々の化学エンティティ（文字Ａ，Ｂ，Ｃ・・・によって表す）は、独特の識別タグ（ａ，ｂ，ｃ・・・で表す）と結合している。識別タグは、特定の化合物または化合物の群についての情報、例えば構造、質量、組成、空間的位置その他に関する情報を含む。二番目の工程において、タグ付加した化合物を、一組のアンチタグ配列（ａ’，ｂ’，ｃ’・・・で表す）と結合する。各々のアンチタグ配列は、精製目的のために、ビオチンのようなハンドルを担持する。アンチタグ配列は、識別配列の配列に相補的なセグメントを含む。アンチタグ配列および識別配列の組み合わせによって、ハイブリダイゼーション生成物の形成が可能になる。所望により、アンチタグによって識別されなかった、タグ付加した化学エンティティが存在してよい。三番目の工程において、ハンドルを担持する配列は除去される、すなわちタグ付加した化合物が媒質中に残され、一方ハンドルを含む成分は二次媒質に輸送される。ハンドルがビオチンである場合、固定したストレプトアビジンを用いて二次媒質に輸送してよい。
【０２７８】
精製した成分は、同系統の配列にハイブリダイゼーションしていないアンチタグ配列を含んでいてよい。これらのアンチタグ配列が選別されるべき化合物と結合していないので、濃縮した配列は媒質中に残っていてよい。しかしながら、いくつかの適用においては、二重らせんは通常選別の手続きと比較して不活性なので、好ましくは、図２５に図示するように過剰のアンチタグ配列を二重鎖にする。過剰のアンチタグ配列は、プライマーを適当なポリメラーゼおよびヌクレオチド三リン酸塩とともに用いて、二重らせん状態に変形してよい。
【０２７９】
精製した画分は、工程４において、選別過程に付す。選別は、例えば特定のタンパク質に対する親和性であるが、それだけに限定しない一組の特性についてのプローブを含む。そのような場合、特定のタンパク質に結合しないエンティティは除去されるであろう。特定のタンパク質に結合するエンティティと複合体を作るアンチタグは、例えば精製ハンドルの利用を介して、回収／単離してよい。
【０２８０】
工程５において、単離したアンチタグは、所望により、ＰＣＲまたはＲＴＰＣＲの利用を介して増幅してよい。
工程６において、工程１において生成したタグ付加した最初のライブラリーは、複合体化および選別のさらなる周期に付してよい、すなわち工程５由来のアンチタグを、工程１のタグ付加したエンティティのライブラリーに加え、その後工程３、工程４および工程５に付してよい。工程６は反復してよい。
工程７において、工程５の単離したアンチタグをクローニングし、その識別部を露出してよい。例えば、ＤＮＡの場合は、配列決定を適用してよく、それによってタグ付加したエンティティのライブラリー中で選別した特性を有する特定のエンティティの識別部が露呈されるであろう。
【０２８１】
図２６に示す具体例は、複合体を形成していない成分が不活性化されることを除いて、図２４の具体例に似ていて、例えばタグおよび／またはアンチタグが一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡからなる場合、二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡまたはそれらのハイブリッドに変形してよい。これは、プライマー、ヌクレオチド三リン酸塩およびポリメラーゼまたは転写酵素を用いることによって達成してよい。その上、（アンチタグ上の精製ハンドルを用いることによる）精製の配列および特性についてのプロービングは、図２４の方法と比較して変更されている。
【０２８２】
図２７、工程１において、いくつかのエンティティ（文字Ａ，Ｂ，Ｃ・・・によって表す）は、混合物または単一の化合物であり、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列またはそれらの誘導体をより特異的に識別タグに結合しており、例えば構造、質量、組成、空間的情報その他のような化合物または混合物上の情報を含む。
工程２において、タグ付加したエンティティの全てのタグは、（所望により、例えばビオチンのような＠−ハンドルを担持する）プライマー、ヌクレオチド三リン酸塩およびポリメラーゼまたは転写酵素を用いることによって二本鎖にされる。残存している一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡは、所望により、ヌクレアーゼを用いることによって消化してよい。
【０２８３】
混合物は、例えば特定のタンパク質に対する親和性であるが、それだけに限定しない、工程３の一組の特性についてプロービングされる。そのような場合、特定のタンパク質に結合しないエンティティは除去されるであろう。特定のタンパク質に結合するエンティティと複合体を作るアンチタグは、例えば＠−ハンドルの利用を介して、回収／単離してよい。
単離したアンチタグは、所望により、ＰＣＲまたはＲＴＰＣＲの利用を介して、工程４において増幅してよい。
工程５において、工程１のタグ付加したライブラリーは、単離した、および所望により増幅した工程３および４のアンチタグと複合体を形成してよい。
【０２８４】
単一の一本鎖の成分は、例えばヌクレアーゼを用いることによって、工程６において消化される。残存した二本鎖のライブラリーの部分集合は、所望により新しくした工程３ないし６に従ったライブラリーの濃縮に付す。工程３ないし６は、望ましい特性を有する適切な化学エンティティを得るために十分な回数反復してよい。
工程７において、工程４の単離したアンチタグはクローニングすることができ、その識別部を露出してよく、例えば、ＤＮＡの場合は、配列決定を適用してよく、それによってタグ付加したエンティティのライブラリー中で特定のエンティティの識別部が露呈される。
【０２８５】
図２８は、一本鎖のオリゴヌクレオチドの消化を含む方法に関する。最初の工程において、いくつかのエンティティ（文字Ａ，Ｂ，Ｃ・・・によって表す）は、混合物または単一の化合物であり、識別タグに結合しており、例えば構造、質量、組成、空間的情報その他のような化合物または混合物上の情報を含む。
工程２において、タグ付加したエンティティの混合物は、一組の相補的なアンチタグと結合している。アンチタグは、ヌクレオチドの誘導体であってよいが、それだけに限定されない。アンチタグは、所望により、＠−ハンドルを担持してもよい。タグおよびアンチタグは、複合体の形成が可能である。複合体形成は、ハイブリダイゼーションであってよいが、それだけに限定されない。いくつかのアンチタグは、タグ付加したエンティティと複合体を形成しないであろうし、いくつかのタグ付加したエンティティは、アンチタグと複合体を形成しないであろう。
【０２８６】
複合体を形成していない成分は、タグおよび／またはアンチタグがＤＮＡまたはＲＮＡまたはそれらのハイブリッドからなる場合、例えばヌクレアーゼを用いて、工程３において消化される。
工程３の混合物は、例えば特定のタンパク質に対する親和性であるが、それだけに限定しない、工程４の一組の特性についてプロービングされる。そのような場合、特定のタンパク質に結合しないエンティティは除去されるであろう。特定のタンパク質に結合するエンティティと複合体を作るアンチタグは、例えば＠−ハンドルの利用を介して、回収／単離してよい。工程４は一回またはそれ以上反復してよい。
【０２８７】
単離したアンチタグは、所望により、ＰＣＲまたはＲＴＰＣＲの利用を介して、工程５において図示されるように増幅してよい。アンチタグはまた、その後図２４ないし２７に示されるように用いてよい。
単離したアンチタグはクローニングし、その識別部を工程６において露呈してよく、例えば、ＤＮＡの場合は、配列決定を適用してよく、それによってタグ付加したエンティティのライブラリー中で特定のエンティティの識別部を露呈するであろう。
【０２８８】
図２９、工程１に従って、いくつかのエンティティ（文字Ａ，Ｂ，Ｃ・・・によって表す）は、混合物または単一の化合物であり、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列またはそれらの誘導体をより特異的に識別タグに結合しており、例えば構造、質量、組成、空間的情報その他のような化合物または混合物上の情報を含む。
工程２において、タグ付加したエンティティの全てのタグは、（所望により、例えばビオチンのような＠−ハンドルを担持する）プライマー、ヌクレオチド三リン酸塩およびポリメラーゼまたは転写酵素を用いることによって二本鎖にされる。残存している一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡは、所望により、例えばヌクレアーゼを用いることによって消化してよい。
【０２８９】
工程３において、混合物は、例えば特定のタンパク質に対する親和性であるが、それだけに限定しない、一組の特性についてプロービングされる。そのような場合、特定のタンパク質に結合しないエンティティは除去されるであろう。特定のタンパク質に結合するエンティティを付加したタグと複合体を作るアンチタグは、例えば＠−ハンドルの利用を介して、回収／単離してよい。工程３は一回またはそれ以上反復してよい。
【０２９０】
工程４に従って、単離したアンチタグは、所望により、ＰＣＲまたはＲＴＰＣＲの利用を介して増幅してよい。アンチタグはまた、その後図２４ないし２７に示されるように用いてよい。
単離したアンチタグは、工程５においてクローニングしてよく、その識別部を露呈してよく、例えば、ＤＮＡの場合は、配列決定を適用してよい。それによってタグ付加したエンティティのライブラリー中で特定のエンティティの識別部を露呈するであろう。
【０２９１】
図３０、工程１は、いくつかのエンティティ（文字Ａ，Ｂ，Ｃ・・・によって表す）を生成し、それは混合物または単一の化合物であり、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列またはそれらの誘導体をより特異的に識別タグに結合しており、例えば構造、質量、組成、空間的情報その他のような化合物または混合物上の情報を含む。
工程２において、混合物は、例えば特定のタンパク質に対する親和性であるが、それだけに限定しない、一組の特性についてプロービングされる。そのような場合、特定のタンパク質に結合しないエンティティは除去されるであろう。工程２は反復してよい。
【０２９２】
タグ付加したエンティティの全てのタグは、（所望により、例えばビオチンのような＠−ハンドルを担持する）プライマー、ヌクレオチド三リン酸塩およびポリメラーゼまたは転写酵素を用いることによって、工程３において二本鎖にされる。残存している一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡは、所望により、例えばヌクレアーゼを用いることによって消化してよい。
特定のタンパク質に結合するエンティティのタグと複合体を作るアンチタグは、例えば＠−ハンドルの利用を介して、工程４において回収／単離してよい。アンチタグは、所望により、ＰＣＲまたはＲＴＰＣＲの利用を介して増幅してよい。アンチタグはまた、その後図２４ないし２７に示されるように用いてよい。
単離したアンチタグは、工程５においてクローニングしてよく、その識別部を露呈してよく、例えば、ＤＮＡの場合は、配列決定を適用してよく、それによってタグ付加したエンティティのライブラリー中で特定のエンティティの識別部を露呈する。
【実施例】
【０２９３】
実施例
実施例１：骨格の識別分子上への負荷
アミノ修飾因子Ｃ６５’−で標的した識別オリゴ（５’−Ｘ−ＴＣＧＴＡＡＣＧＡＣＴＧＡＡＴＧＡＣＧＴ−３’式中Ｘはグレンリサーチ、カタログ１０−１０３９−９０号から得てよい）に、ペプチド骨格（Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ，ＣＦＦＫＫＫ）をＳＰＤＰ活性化（以下参照）を用いて負荷した。アミノオリゴのＳＰＤＰ活性化は、１００ｍＭヘペス−水酸化カリウム、ｐＨ＝７．５中の１０ナノモルのオリゴ１６０μｌ、および４０μｌの２０ｍＭＳＰＤＰを用いて行い、３０℃で２時間インキュベートした。活性化したアミノオリゴを、５００μｌの酢酸エチルで三回抽出し、スピードバック（speed-vac）中で１０分間乾燥し、１００ｍＭのヘペス−水酸化カリウムと平衡にしたマイクロバイオスピンカラムを用いて精製した。骨格の負荷は、その後、１００ｍＭの結合エンティティを１０μｌ付加し、３０℃で一晩中インキュベートすることによって行った。
【０２９４】
負荷した識別オリゴを、２Ｍの酢酸アンモニウムおよび２倍容量の９６％エタノールを用いて８０℃で１５分間沈殿させ、その後１５分間４℃で１５０００ｇで遠心分離した。ペリットを水中に再懸濁し、沈殿を反復した。オリゴ−ペリットの洗浄は、７０％エタノールを１００μｌ加え、その後短時間遠心分離することによって行った。オリゴは、５０μｌの水に再び溶解し、ＭＳによって分析した。ＭＳ分析は、１０μｌの水中の１００ピコモルのオリゴを、１０μｌのイオン交換樹脂で処理し、振盪器上で２５℃で最低２時間インキュベートした。インキュベーションの後、樹脂を遠心分離によって除去し、１５μｌの上澄みを７μｌの水、２μｌのピペリジンおよびイミダゾール（それぞれ６２５ｍＭ）および２４μｌのアセトニトリルと混合した。試料を、質量分光器（Ｂｌｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  Ｅｓｑｕｉｒｅ  ３０００ｐｌｕｓ）を用いて分析した。観察された質量は、以下にみられるように、７２４４．９３Ｄａであり、これは算出された質量の７２４４．００Ｄａと一致していた、この実験データは、識別オリゴヌクレオチド上への骨格の負荷の可能性を例示している。この負荷した識別分子は、合成ブロックから機能エンティティを受け取るために用いられ得る。この特定の骨格は、三つの同一の反応基、すなわちリシンの側鎖のアミン基を内部に持っており、それゆえに一つ、二つまたは三つのアミン基と反応できる機能エンティティと共に輸送され得る。
【０２９５】
【化３４】
0005643398.tif 000037
【０２９６】
【化３５】
0005643398.tif 000038
【０２９７】
実施例２：合成ブロック上への機能エンティティの負荷
合成ブロック上への機能エンティティの負荷は、チオールオリゴ（以下参照）を用いて行い得る。ビオチンで５’標識し、チオ修飾因子Ｃ６Ｓ−Ｓ（グレンリサーチ、カタログ，１０−１９３６−９０から得られる）で３’標識した合成ブロックオリゴ（５’−ＢＴＧＣＡＧＡＣＧＴＣＡＴＴＣＡＧＴＣＧＴＴＡＣＧＡ−３’）を、ＮＨＭを用いてＮＨＳオリゴに変換した。
１０ｎｍｏｌのオリゴをスピードバック中で乾燥し、５０μｌの１００ｍＭＤＴＴ、１００ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ８．０中に再び溶解し、３７℃で１時間インキュベートした。チオオリゴは、その後１００ｍＭのヘペス−水酸化カリウムｐＨ７．５によって平衡に達したマイクロバイオスピンカラムを用いて精製した。チオオリゴを、１００ｍＭのヘペス−水酸化カリウムｐＨ７．５中の１００ｍＭＮＨＭを加えることによって、ＮＨＳオリゴに変換した。試料を２５℃で一晩中インキュベートした。ＮＨＳオリゴを、その後にＭＳ等級の水によって平衡に達したマイクロバイオスピンカラムを用いて精製した。
【０２９８】
【化３６】
0005643398.tif 000039
ＭＳ分析を、１０μｌの水中１００ピコモルのオリゴが１０μｌのイオン交換樹脂で処理し、振盪器上で２５℃で最低２時間インキュベートした。インキュベーションの後、樹脂を遠心分離によって除去し、１５μｌの上澄みを７μｌの水、２μｌのピペリジンおよびイミダゾール（それぞれ６２５ｍＭ）および２４μｌのアセトニトリルと混合した。試料を、質量分光器（Ｂｌｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  Ｅｓｑｕｉｒｅ  ３０００ｐｌｕｓ）を用いて分析した。観察された質量は、以下にみられるように、８３６９．３２であり、これは算出された質量の８３７２．１と一致していた、この実験データは、合成ブロックのオリゴヌクレオチド上への結合エンティティの可能性を例示している。この生成物は、その後、輸送可能な機能エンティティを結合するために用いられ得る。
【０２９９】
【化３７】
0005643398.tif 000040
【０３００】
ＮＨＳオリゴを、その後機能エンティティを負荷するために用いた。機能エンティティ（４−ペンチン酸）のＥＤＣ活性化を、ＤＭＦ中の２００ｍＭの機能エンティティ５０μｌをＤＭＦ中の２００ｍＭのＥＤＣ５０μｌと混合し、振盪器上で２５℃で３０分間インキュベーションして行った。負荷は、その後スピードバック中で凍結乾燥した１ナノモルのＮＨＳオリゴ、および活性化した合成ブロック１０μｌを用いて行った（以下参照）。これを２５℃で５分間インキュベーションし、その後１００ｍＭＭＥＳｐＨ＝６．０の３０μｌと混合した。負荷したＮＨＳオリゴを、１００ｍＭＭＥＳｐＨ＝６．０によって平衡に達したバイオスピンカラムを用いて精製した。負荷した合成ブロックオリゴを、その後すぐに何らかのＭＳ分析を伴わない輸送反応のために用いられる。これは、ＭＳ測定に用いる条件の間、機能エンティティが不適当な構造であるためである。
【０３０１】
【化３８】
0005643398.tif 000041
【０３０２】
この実験は、完全な識別分子にアニーリングした場合に、レシピエントの反応基に輸送できる合成ブロック分子上への機能エンティティの完全な負荷を例示している。
上記したように合成ブロック分子上へ負荷し得る機能エンティティの他の例は、以下に示す５−ヘキシン酸である。さらに、ＭＳ測定に用いる条件において、機能エンティティが不適当な構造であるため、ＭＳ分析をこの化合物上で行わない。
【０３０３】
【化３９】
0005643398.tif 000042
【０３０４】
実施例３：合成ブロック由来の機能エンティティの識別分子への輸送
次の実験における結合エンティティ（ＡＥ）は、例えばペプチドＣＦＦＫＫＫのような、実施例１において調製した識別部上に負荷した骨格、または実施例１において出発物質として用いられるアミノ修飾オリゴヌクレオチドによって例示されるレシピエントの反応基のいずれかである。これらの結合エンティティは、それぞれ三つまたは一つの機能エンティティの輸送を可能にする。
この実験において用いられる識別部は、実施例１において述べたＣＦＦＫＫＫを負荷した識別オリゴヌクレオチドである。この実験における機能エンティティ（ＦＥ）は、４−ペンチン酸であり、その負荷は実施例２において述べた。骨格を負荷した識別分子を、結合エンティティおよび機能エンティティを近接にするために、負荷した合成ブロック分子にアニーリングされる。アニーリングは、識別分子中の識別領域および合成ブロック分子中の相補的配列に対するものである。
【０３０５】
【化４０】
0005643398.tif 000043
【０３０６】
識別部および合成ブロック分子の間のアニーリング工程後、機能エンティティが識別分子に輸送されるところの、輸送反応が起こる。
アニーリングは、０．１ＭのＭＥＳ緩衝剤中で２５℃で振盪器中で２時間、合成ブロック６００ピコモルおよび識別分子４００ピコモルを用いて行われた。合成ブロックの反応部（機能エンティティ）を、アニーリングの間、識別分子の結合エンティティのアミノ基の一つに輸送した（以下参照）。アニーリングの後、試料をマイクロスピンゲル濾過によって精製し、ＭＳによって分析した。試料は、同量の試料（約１００ピコモル）およびイオン交換樹脂を用いてＭＳ分析のために準備し、最低２時間２５℃で振盪器中でインキュベートした。インキュベーション後、樹脂を遠心分離し、上澄み１５μｌに水７μｌ、ピペリジンおよびイミダゾールを２μｌ（それぞれ６２５ｍＭ）およびアセトニトリル２４μｌを加えた。試料を、質量分光器（Ｂｌｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  Ｅｓｑｕｉｒｅ  ３０００ｐｌｕｓ）を用いて分析した。観察された質量（以下参照）は、７３２３．４５Ｄａであり、これは算出された質量の７３２４．００Ｄａとよく一致していた。従って、輸送反応後の識別分子のＭＳスペクトルは、識別分子上に機能エンティティを輸送したものに一致した質量を示す。
【０３０７】
【化４１】
0005643398.tif 000044
【化４２】
0005643398.tif 000045
【０３０８】
アミノオリゴを識別分子上のＡＥとして直接用いた、機能エンティティの輸送の他の例を以下に示す。この実験において用いられた合成ブロック分子上の機能エンティティは、実施例２において開示したように、４−ペンチン酸であった。
アニーリングは、０．１ＭのＭＥＳ緩衝剤中で、合成ブロックおよび識別分子５００ピコモルを用いて、２５℃で振盪器中で２時間混合物をインキュベーションして行われた。合成ブロックの反応部（機能エンティティ）を、アニーリングの間、識別分子の結合エンティティのアミノ基に輸送した（以下参照）。アニーリングおよび輸送の後、試料をマイクロスピンゲル濾過によって精製し、ＭＳによって分析した。試料は、同量の試料（約１００ピコモル）およびイオン交換樹脂を用いてＭＳ分析のために調製し、最低２時間２５℃で振盪器中でインキュベートした。インキュベーション後、樹脂を遠心分離によって除去し、上澄み１５μｌに水７μｌ、ピペリジンおよびイミダゾールを２μｌ（それぞれ６２５ｍＭ）およびアセトニトリル２４μｌを加えた。
【０３０９】
【化４３】
0005643398.tif 000046
【０３１０】
試料を、質量分光器（Ｂｌｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  Ｅｓｑｕｉｒｅ  ３０００ｐｌｕｓ）を用いて分析した。観察された質量は、６３９８．０４Ｄａであり、これは算出された質量の６４００．００Ｄａとよく一致していた。従って、機能エンティティの輸送後の識別分子のＭＳスペクトルは、識別分子上に機能エンティティを輸送したものに一致した質量を示す。この例は、機能エンティティが合成ブロック分子および識別分子の機構を用いて輸送し得ることを示している。
【０３１１】
【化４４】
0005643398.tif 000047
【０３１２】
アミノオリゴを直接識別分子として用いた、機能エンティティの輸送の他の例を以下に示す。この実施例において用いられる機能エンティティは、５−ヘキシン酸であり、実施例２において調製した。
アニーリングは、２５℃で振盪器中で２時間インキュベートした０．１ＭのＭＥＳ緩衝剤中で、合成ブロック５００ピコモルおよび識別分子５００ピコモルを用いて、行われた。合成ブロックの反応部（機能エンティティ）を、識別分子の結合エンティティのアミノ基に輸送した（以下参照）。アニーリングおよび輸送の後、試料をマイクロスピンゲル濾過によって精製し、ＭＳによって分析した。試料は、同量の試料（約１００ピコモル）およびイオン交換樹脂を用いてＭＳ分析のために調製し、最低２時間２５℃で振盪器中でインキュベートした。インキュベーション後、樹脂を遠心分離によって除去し、上澄み１５μｌに水７μｌ、ピペリジンおよびイミダゾールを２μｌ（それぞれ６２５ｍＭ）およびアセトニトリル２４μｌを加えた。
【０３１３】
【化４５】
0005643398.tif 000048
【０３１４】
試料を、質量分光器（Ｂｌｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  Ｅｓｑｕｉｒｅ  ３０００ｐｌｕｓ）を用いて分析した。観察された質量は、６４１１．９６Ｄａであり、これは算出された質量の６４１４Ｄａとよく一致していた。従って、機能エンティティの輸送後の識別分子のＭＳスペクトルは、識別分子上に機能エンティティを輸送したものに一致した質量を示す。この例は、機能エンティティが合成ブロック分子および識別分子の機構を用いて輸送し得ることを示している。
【０３１５】
【化４６】
0005643398.tif 000049
【０３１６】
実施例４：独特のコドンを輸送する識別分子の伸長
機能エンティティ（ＦＥ）を識別分子上の結合エンティティ（ＡＥ）を輸送した後、輸送した機能エンティティを識別する独特のコドンを識別分子に輸送するために、識別分子を伸長する。これは、適当なポリメラーゼおよび野生型のヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）を含むポリメラーゼ緩衝剤を付加することによって達成される。これは３’末端において識別分子を、合成ブロック分子の５’末端に向かって伸長するであろう。独特のアンチコドンを輸送する識別分子の伸長は、好ましくは、以下に示すようなＦＥの輸送後に行われる。
【０３１７】
【化４７】
0005643398.tif 000050
【０３１８】
伸長緩衝剤（２０ｍＭヘペス−水酸化カリウム、４０ｍＭ塩化カリウム、８ｍＭ塩化マグネシウム、ｐＨ＝７．４）中の各々のヌクレオチド０．４ｍＭを含む緩衝剤中で１５単位のＴａｑポリメラーゼを用いて行った。伸長反応の後、試料をＭＳを用いて分析した。ＭＳ分析は、半分の体積のイオン交換樹脂中の約１００ピコモル精製した伸長混合物を用いて行い、最低２時間２５℃で振盪器中でインキュベートした。インキュベーション後、樹脂を遠心分離によって除去し、上澄み１５μｌに、水７μｌ、ピペリジンおよびイミダゾールを２μｌ（それぞれ６２５ｍＭ）およびアセトニトリル２４μｌを混合した。試料を、質量分光器（Ｂｌｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  Ｅｓｑｕｉｒｅ  ３０００ｐｌｕｓ）上で分析した。
輸送した４−ペンチン酸による識別分子上の伸長についてのＭＳデータを以下に示す。
【０３１９】
【化４８】
0005643398.tif 000051
【０３２０】
観察された質量は、７９２２．５３Ｄａであり、これは算出された質量の７９２４．００Ｄａとよく一致していた。機能エンティティの輸送反応およびコード化領域（独特のコドン）の伸長反応の後の識別分子のＭＳスペクトルは、輸送した機能エンティティおよび識別分子上の伸長に一致した質量を示す。この例は、機能エンティティが識別分子より長い合成ブロック分子による機構を用いて輸送でき、識別分子が輸送過程の後ポリメラーゼを用いて伸長し得ることを示している。このことは、同一の合成ブロック由来の機能エンティティおよび独特のコドンの両方が、識別分子に輸送できる可能性を示している。
【０３２１】
輸送および伸長を示している他の例は、機能エンティティの５−ヘキシン酸を有する合成ブロックについてである。輸送された５−ヘキシン酸を有する識別分子上の伸長のＭＳデータを以下に示す。
【０３２２】
【化４９】
0005643398.tif 000052
【０３２３】
観察された質量は、７９３６．９９Ｄａであり、これは算出された質量の７９３８．００Ｄａとよく一致していた。機能エンティティの輸送反応およびコード化領域（独特のコドン）の伸長反応の後の識別分子のＭＳスペクトルは、輸送した機能エンティティおよび識別分子上の伸長に一致した質量を示す。この例はまた、機能エンティティが識別分子より長い合成ブロック分子を用いて輸送でき、識別分子が輸送過程の後ポリメラーゼを用いて伸長し得ることを示している。このことは、一つの合成ブロック由来の機能エンティティおよび独特のコドンの両方が、一つの識別分子に輸送できる可能性を例示している。
【０３２４】
実施例５：ライブラリーの構築
識別分子は、様々な条件下で最適に作用するように構築され得る。しかしながら、それは、その機能にとって不可欠な少しの要素を含んでいるべきである。識別分子は、合成ブロックにアニーリングし得る配列、および様々な機能エンティティを結合し得る結合エンティティを含むべきである。以下は、識別分子が伸長領域においていかにして構築され得るかの例である。各々の輸送およびコード化の工程の間伸長される領域は、様々な方法を用いて構築し得る。重要なこととして、ポリメラーゼを用いた効率的な伸長を可能にするために、合成ブロックおよび識別部の間の塩基対が適合していなければならない。このことは、図３（Ａ）に記述されるような定常の結合領域である領域、または図３（Ｂ）に示される何らかの配列に結合することを可能にする領域のいずれかを用いて達成し得る、これらの組み合わせがまた方法に対して用いられ得る。
【０３２５】
伸長過程の最初の工程は、識別部および合成ブロック分子の間の適合のために特別な結合領域を必要としない（以下に示す工程１）。しかしながら、その後の工程は、酵素、好ましくはポリメラーゼは二重鎖に結合し、伸長を行うことができなければならないので、ハイブリダイゼーションを可能にする識別分子に十分相補的な結合領域を必要とする。以下の例は、コード化手続きにおける四つの工程を示す。この伸長の過程は、適当な数の合成ブロックの輸送を得るために継続し得る。この例における結合領域は、６つのヌクレオチドを含むが、これは合成ブロックの構築に依存して変化し得る。
【０３２６】
前のアンチコドンにおいて起こり得る不適合を適合させる可能性があるのは、共通の核酸塩基、すなわち一つよりも多くの天然に存在する核酸塩基と塩基対をつくることのできる核酸塩基を用いることである。可能性のある塩基は、シトシン、チミジンおよびアデノシン（しかし、イノシン：アデノシンの組は恐らく二本鎖ＤＮＡにおいてはあまり正確に適合しておらず、らせんがプリン：プリンの組で膨隆している場合に、払うべきエネルギー的不利益が存在する可能性がある）と塩基対を形成し得るイノシンである。原則として、独特のコドンの伸長を可能にする何らかの設計が用いられる可能性がある。
【０３２７】
【化５０】
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【化５１】
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【化５２】
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【０３２８】
伸長を、６０ピコモルのプライマー、および伸長緩衝剤（２０ｍＭのヘペス−水酸化カリウム、４０ｍＭの塩化カリウム、８ｍＭの塩化マグネシウム、ｐＨ＝７．４）および１０ｍＭのＤＴＴを用いて行った。この実験における伸長について、２０ＵＡＭＶ−ＲＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍ５１０Ｂ）を用いた。
ＭＳ分析を、半分の体積のイオン交換樹脂において約１００ピコモルの伸長反応を用いて行い、最低２時間２５℃で振盪器中でインキュベートした。インキュベーションの後、樹脂を遠心分離によって除去し、１５μｌの上澄みを７μｌの水、２μｌのピペリジンおよびイミダゾール（それぞれ６２５ｍＭ）および２４μｌのアセトニトリルと混合した。試料を、質量分光器（Ｂｌｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  Ｅｓｑｕｉｒｅ  ３０００ｐｌｕｓ）を用いて分析した。
【０３２９】
上の例において示すような工程３におけるプライマー／鋳型の組み合わせの伸長を、以下のＭＳグラフのデータで示す。分析は、鋳型の質量、１５４５２．１４Ｄａ（１５４５３．８６Ｄａと予期される）および伸長したプライマーの質量、１５３２８，９２（１５３３１．９０Ｄａと予期される）を共に示す。非伸長の（または一部伸長した）プライマーについての質量がないことは、プライマーの完全な伸長を示すと識別された。この実験は、アンチコドンが他のアンチコドンに先行される場合でさえ、コドンを識別分子に輸送する可能性があることを例示している。
【０３３０】
【化５３】
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【０３３１】
別々の実験において、上記したような工程７におけるプライマー／鋳型の組み合わせの伸長を、調べた。ＭＳデータを以下のグラフに示す。データは伸長したプライマーの質量、２８０５８．１４Ｄａ（２８０５２．３０Ｄａと予期される）を示している。また、非伸長の（または一部伸長した）プライマーについての質量がないことは、プライマーの完全な伸長を示すと識別された。この実験は、アンチコドンが多数のアンチコドンに先行される場合でさえ、コドンを識別分子に輸送する可能性があることを例示している。従って、独特のコドンを含むコード化領域を作る完全な過程は、ライブラリーに適している。
【０３３２】
【化５４】
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【０３３３】
結論として、これらの実験は、近接したコドンをイノシンを含むらせんと共に用いる場合、ポリメラーゼが独特のアンチコドン配列を伸長し得ることを示す。このことは、機能エンティティの輸送の各々の工程において、独特のアンチコドンの識別分子への輸送を可能にするであろう。この実験は、コード化過程において伸長されるアンチコドンに先行するアンチコドン領域の後に結合領域を用いる可能性があることを示す。同じ方法が、結合エンティティの結合した多数の機能エンティティを含む分子のコード化を可能にする連続した工程において用いられ得る。
【０３３４】
ライブラリーが生成し、最初の選別周期が行われた後、選別した識別分子は、ライブラリーの次の周期の供給源として用いられ得る。選別した識別分子は、例えば以下に示すようなＰＣＲ増幅および制限酵素消化を用いたその後の選別周期に用いられ得る。
【化５５】
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【０３３５】
この新しい識別分子は、前の選別周期において選別したディスプレイした分子をコード化する独特のコドンを含むであろう。識別分子は、好ましい機能エンティティを有するライブラリーを得るために、新しいライブラリーの集合を誘導するであろう。しかしながら、正確なコード化は、伸長過程によって依然として決定されるであろう。
【０３３６】
実施例６：伸長過程によるコード化における可変性リンカーおよびループアウト構造
コード化過程は、識別分子におけるループアウト領域の形成を可能にするように構築し得る。コード化過程はまた、相補的識別領域および相補的結合領域の間の可変性リンカーを用いて行われ得る。
ループアウト法は、識別領域が相補的識別領域にアニーリングし、結合領域が相補的結合領域にアニーリングするところの、図１８に示す。これは、アニーリング過程に直接的には関わらない一続きの一本鎖ヌクレオチドを形成するであろう。このアニーリングは、アンチコドン領域、および好ましくは次の伸長周期に用いられ得る他の結合領域の伸長による輸送を可能にする。結合領域は正確なアニーリングおよび生産的な伸長を保証するのに十分長いべきである。伸長は、もし結合領域が短ければ、不完全であるであろう。それは、結合領域の長さを決定する単純な試行錯誤の実験によって、当業者の知り得るところである。通常５ないし７のヌクレオチドが、結合領域として十分である。
【０３３７】
他の例は、相補的識別領域および相補的結合領域の間の可変性リンカーを用いることである。これは図１９に示されている。識別領域は、合成ブロックの識別部に対する十分なアニーリングを保証するであろう。可変性リンカーは、その後相補的結合領域が伸長を可能にするために結合領域にアニーリングすることを確実にするであろう。リンカーは、相補的結合領域および相補的結合領域の間の空間を与え得るあらゆるタイプの化学構造、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリアミン、ポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ）およびポリ炭水化物である可能性がある。リンカーの長さは変化し得るが、識別領域および結合領域の間の同時のアニーリングが可能でなければならない。
【０３３８】
可変性リンカーを用いた機構を、異なるＰＥＧリンカーおよび異なる長さの相補的結合領域を用いて調べた。この例に用いられるＰＥＧリンカー（スペースホスホルアミダイト９および１８）は、グレンリサーチ（それぞれ、カタログ１０−１９０９および１０−１９１８）から得られた。
伸長した識別分子の配列を以下に示した。識別領域および相補的識別領域の間の２１ヌクレオチドの長さのアニーリングが存在する。その後、前のコード化周期において伸長したコドンを表す４２ヌクレオチド領域が存在する。伸長を促進する相補的結合領域は９ヌクレオチドであり、５および１４ヌクレオチド領域はまた、伸長について検査した。最後に、伸長を可能にする１４ヌクレオチド領域が存在する。
【０３３９】
【化５６】
0005643398.tif 000059
【０３４０】
可変性リンカーを有する合成ブロックオリゴは、標準的プロトコール（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ４１０３）を用いてＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いた３２Ｐによって５’標識した。この識別分子は、２分間８０℃まで加熱し、その後ゆっくり約２０℃まで冷却することにより、伸長緩衝剤（２０ｍＭヘペス−水酸化カリウム、４０ｍＭ塩化カリウム、８ｍＭ塩化マグネシウム、ｐＨ＝７．４、１０ｍＭＤＴＴ）中で合成ブロックとアニーリングした。伸長は、３０℃で１時間、約２０単位のシークエナーゼ（ＵＳＢ）を用いて行った。オリゴヌクレオチド複合体を、その後マイクロスピンゲル濾過（ＢｉｏＲａｄ）によって精製した。１０％尿素ポリアシルアミドゲル上に負荷する前に、ホルムアミド色素を試料に加えた。ゲルをオートラジオグラフ（Ｋｏｄａｋ、Ｂｉｏｍａｘ  ｆｉｌｍ）を用いて現像した。この実験の結果は図２０に示されている。
【０３４１】
ゲルは：レーン１、５、９または１４ヌクレオチドを結合領域に有する三つの５’標識（３２Ｐ）した合成ブロックオリゴの混合物；レーン２、９スペースリンカーおよび１８ヌクレオチド結合領域を有する合成ブロックオリゴを用いた伸長；レーン３、９スペースリンカーおよび９ヌクレオチド結合領域を有する合成ブロックオリゴを用いた伸長；レーン４、リンカーを有さず、９ヌクレオチド結合領域を有する合成ブロックオリゴを用いた伸長；レーン５、９スペースリンカーおよび１４ヌクレオチド結合領域を有する合成ブロックオリゴを用いた伸長；レーン６、１８スペースリンカーおよび１４ヌクレオチド結合領域を有する合成ブロックオリゴを用いた伸長；レーン７、リンカーを有さず、１４ヌクレオチド結合領域を有する合成ブロックオリゴを用いた伸長；レーン８、リンカーを有さず、５ヌクレオチド結合領域を有する合成ブロックオリゴを用いた伸長を示す。
【０３４２】
結果は、効率的な伸長は結合領域と共に可変性リンカーを用いて達成し得ることを示している。結果はまた、伸長が可変性リンカーなしで、小さな（５ヌクレオチド）結合領域だけでも可能であることを示している。最後の結果は、この実施例の始めに記述されたループアウト機構の例であり、そのループアウト領域は上の配列中に述べた４２ヌクレオチドである。
【０３４３】
実施例７：ケメティックス（商標）によってコード化した、４８４の要素からなる小さな分子のライブラリーインテグリンαＶβ３リガンドの選別
手順の概観
【化５７】
0005643398.tif 000060
ＤＦ：薬剤断片／機能エンティティ
Ｂ：ビオチン
ＳＡ：ストレプトアビジン
【０３４４】
二官能性複合体のライブラリーの生成法は、ライブラリーの各々の要素が、合成分子、および解読して合成分子の合成歴を確立してよい識別部を含み、以下で例示したいくつかの工程を含む。最初の工程（一般的手順１）において、四つの異なる識別オリゴヌクレオチドに、骨格分子または薬剤断片を負荷している。この実施例において、負荷は、薬剤断片／骨格分子の結合点として識別オリゴ上のアミノ基を用いて行われる。識別部は、発生期の二官能性複合体とみなしてよい。
合成ブロックオリゴを調製するために、同一のキャリアオリゴに、一般的な手順２を用いて最初に１１の異なる薬剤断片を負荷している。１１の負荷したキャリアオリゴは、その後、一般的な手順３を用いて、最初または二番目の周期のアンチコドンオリゴにライゲーションされ、それによって最初の周期の１１の合成ブロックおよび二番目の周期の１１の合成ブロックを得る。
【０３４５】
ライブラリー形成は、一般的な手順４において詳細に記述され、四つの異なる識別オリゴの最初の周期の１１の異なる合成ブロックとの混合物を含む。ライブラリーにバイアスをかけるために、識別部の一つおよび最初の周期の合成ブロックの一つを、他の成分の量の１００少ない量で加えた。識別部および合成ブロックの間のアニーリングを与える条件において、識別オリゴの骨格および薬剤断片の間の架橋結合がもたらされた。識別オリゴを、その後ポリメラーゼを用いて、合成ブロックのアンチコドンを識別部として用いて伸長した。伸長後、薬剤断片を、薬剤断片およびオリゴの間の結合を切断することによって、合成ブロックから解放される。使用後の合成ブロックオリゴをストレプトアビジンビーズによって除去される。
【０３４６】
二番目の周期は、最初の周期において得られた発生期の識別部−合成分子複合体に合成ブロックを付加することを含む。ライブラリーにバイアスをかけるために、１１の二番目の周期の合成ブロックの一つを、１０の他の合成ブロックのために用いた量の１００倍少ない量加えた。二番目の周期は、最初の周期について上記したのと同じスキームに従う。形成されたライブラリーは、４*１１*１１＝４８４の要素である。標的に対するリガンドと知られている要素の一つは、３*１０８の二官能性複合体の中から一つのライブラリーの濃度中にのみみられる。
【０３４７】
一般的な手順５において開示されるように、ライブラリーをその後選別過程に付す。選別は、ライブラリーを、固定した標的で被覆したウェルに付加することを伴う。ライブラリーを標的と共にインキュベートした後、ライブラリーの非結合要素を、洗浄によって除去し、合成分子および識別部の間の結合を切断する。切断された識別部は、ＰＣＲによって収集および増幅される。増幅した識別部は一般的な手順６を用いて解読した。
【０３４８】
一般的な手順１：識別オリゴの負荷
１０μＬのトリエタノラミン（ＴＥＡ）（ＤＭＦ中０．１Ｍ）を、アミン保護基としてペント−４−エナールを有する１０μＬの合成ブロック（ＢＢ）（ＤＭＳＯ中０．１Ｍ）と混合した。この混合物６．７μＬを取り出し、３．３μＬのＥＤＣ［１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩］（ＤＭＦ中０．１Ｍ）と混合し、３０分間２５℃でインキュベートした。１０μＬの合成ブロック−ＥＤＣ−ＴＥＡ混合物を、０．１Ｍのヘペス緩衝剤（（４−（２−ヒドロキシル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸、ＳＩＧＭＡ）、ｐＨ７．５中で、１０μＬのアミノオリゴに加え、オリゴと共に３０分間インキュベートした。
【０３４９】
半時間の間、他の６．７μＬのＢＢ−ＴＥＡ混合物を、３．３μＬのＥＤＣ（ＤＭＦ中０．１Ｍ）と混合し、３０分間２５℃でインキュベートした。１０μＬのこの二番目のＢＢ−ＥＤＣ−ＴＥＡ混合物を、その後アミノオリゴ混合物に１０μＬの０．１Ｍヘペス緩衝剤と共に加え、ＤＭＳＯ／ＤＭＦ：Ｈ２Ｏの１：１の比率を維持した。その後混合物を３０分間インキュベートした。
半時間の間、他の６．７μＬのＢＢ−ＴＥＡ混合物を、３．３μＬのＥＤＣ（ＤＭＦ中０．１Ｍ）と混合し、３０分間２５℃でインキュベートした。１０μＬのこの三番目のＢＢ−ＥＤＣ−ＴＥＡ混合物を、その後アミノオリゴ混合物に１０μＬの０．１Ｍヘペス緩衝剤と共に加え、ＤＭＳＯ／ＤＭＦ：Ｈ２Ｏの１：１の比率を維持した。その後混合物を３０分間インキュベートした。
【０３５０】
負荷したオリゴは、その後水によって平衡に達したカラム（バイオスピンＰ−６、ＢｉｏＲａｄ）を用いたゲル濾過によって精製した。ペント−４−エナールアミン保護基を、０．２５体積２５ｍＭＩ２を１：１＝水：テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中に付加し、３７℃で２時間インキュベートすることによって除去した。
混合物を、その後水によって平衡に達したスピンカラム（バイオスピンＰ−６、ＢｉｏＲａｄ）を用いたゲル濾過によって精製した。負荷した識別オリゴをＥＳ−ＭＳによって分析した。
【０３５１】
実施例７．１．１
【化５８】
0005643398.tif 000061
N : ５'−アミノ修飾因子５（グレンリサーチ  カタログ番号１０−１９０５−９０)
S : スペーサーＣ３ＣＰＧ（グレンリサーチ  カタログ番号２０−２９１３−０１)
P : ＰＣスペーサーホスホルアミダイト（グレンリサーチ  カタログ番号１０−４９１
３−９０)
【０３５２】
【化５９】
0005643398.tif 000062
ＥＳ−ＭＳによって分析した負荷した識別オリゴ１．１
予期された質量：１１７０９Ｄａ
観察された質量：１１７０８Ｄａ
【０３５３】
実施例７．１．２
識別オリゴ１．２:5'- NSPACCTCAGCTGTGTATCGAGCGGCAGCAGTGCCGTCG-3'
N : ５'−アミノ修飾因子５（グレンリサーチ  カタログ番号１０−１９０５−９０)
S : スペーサーＣ３ＣＰＧ（グレンリサーチ  カタログ番号２０−２９１３−０１)
P : ＰＣスペーサーホスホルアミダイト（グレンリサーチ  カタログ番号１０−４９１
３−９０)
【０３５４】
【化６０】
0005643398.tif 000063
ＥＳ−ＭＳによって分析した負荷した識別オリゴ１．２
予期された質量：１１６４７Ｄａ
観察された質量：１１６４１Ｄａ
【０３５５】
実施例７．１．３
識別オリゴ１．３:5'- NSPACCTCAGCTGTGTATCGAGCGGCAGCGCACACGTCG-3' 
N : ５'−アミノ修飾因子５（グレンリサーチ  カタログ番号１０−１９０５−９０)
S : スペーサーＣ３ＣＰＧ（グレンリサーチ  カタログ番号２０−２９１３−０１)
P : ＰＣスペーサーホスホルアミダイト（グレンリサーチ  カタログ番号１０−４９１３−９０)
【０３５６】
【化６１】
0005643398.tif 000064
ＥＳ−ＭＳによって分析した負荷した識別オリゴ１．３
予期された質量：１１７６１Ｄａ
観察された質量：１１７５９Ｄａ
【０３５７】
実施例７．１．４
識別オリゴ１．４:5'- NSPACCTCAGCTGTGTATCGAGCGGCAGCGGATACGTCG-3' 
N : ５'−アミノ修飾因子５（グレンリサーチ  カタログ番号１０−１９０５−９０)
S : スペーサーＣ３ＣＰＧ（グレンリサーチ  カタログ番号２０−２９１３−０１)
P : ＰＣスペーサーホスホルアミダイト（グレンリサーチ  カタログ番号１０−４９１３−９０)
【０３５８】
負荷される識別オリゴ：
【化６２】
0005643398.tif 000065
予期された質量：１１７７５Ｄａ
観察された質量：１１７７５Ｄａ
【０３５９】
一般的な手順２：キャリアオリゴの負荷
１０−１５ナノモルのキャリアオリゴ２を凍結乾燥し、２７．５μｌの水中に再び溶解した。これに、７．５μｌの１ＭヘペスｐＨ７．５、１０μＬの２−アミノペント４エナール保護（アリルグリシン）した合成ブロック（ジメチルスルホキシド中０．１Ｍ）、および５μｌのＤＭＴ−ＭＭ［４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−チアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウム塩化物］（水中０．５Ｍ）を加えた。混合物を、４−１６時間２５−３０℃でインキュベートした。オリゴをゲル濾過（バイオスピンＰ−６、ＢｉｏＲａｄ）によって精製した。合成ブロックのメチルエステル部分をカルボン酸に変換するために、５μｌの０．４Ｍ水酸化ナトリウムを加え、その混合物を２０分間８０℃でインキュベートした。混合物を、その後１０μｌの０．５ＭヘペスｐＨ７．５および５μｌの０．４Ｍ塩酸を付加することによって、中和した。負荷した合成ブロックオリゴを、ゲル濾過（バイオスピンＰ−６、ＢｉｏＲａｄ）によって精製し、ＥＳ−ＭＳによって分析した。
キャリアオリゴ２： 3'-2GGAGTCGACACATAGCTCGCp-5'
２：カルボキシｄＴ（グレンリサーチ  カタログ番号１０−１０３５−９０)
ｐ：５'リン酸塩
【０３６０】
実施例７．２．１
【化６３】
0005643398.tif 000066
ＥＳ−ＭＳによって分析した負荷したキャリアオリゴ２．１
予期された質量：６８５６Ｄａ
観察された質量：６８５７Ｄａ
【０３６１】
実施例７．２．２
【化６４】
0005643398.tif 000067
ＥＳ−ＭＳによって分析した負荷したキャリアオリゴ２．２
予期された質量：６９４４Ｄａ
観察された質量：６９４５Ｄａ
【０３６２】
実施例７．２．３
【化６５】
0005643398.tif 000068
ＥＳ−ＭＳによって分析した負荷したキャリアオリゴ２．３
予期された質量：６７９８Ｄａ
観察された質量：６８００Ｄａ
【０３６３】
実施例７．２．４
【化６６】
0005643398.tif 000069
ＥＳ−ＭＳによって分析した負荷したキャリアオリゴ２．４
予期された質量：６９１７Ｄａ
観察された質量：６９１９Ｄａ
【０３６４】
【化６７】
0005643398.tif 000070
【化６８】
0005643398.tif 000071
【０３６５】
一般的な手順３：アンチコドンの負荷したキャリアオリゴとのライゲーション
５００ピコモルの負荷したキャリアオリゴを、７５０ピコモルのアンチコドンオリゴおよび７５０ピコモルのスプリントオリゴと混合した。混合物を凍結乾燥し、１５μｌの水中に再び溶解した、オリゴを、加熱してゆっくり２０℃まで冷却することによって、アニーリングした。１５μｌのＴａＫａＲａリガーゼ混合物（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ  ｉｎｃ）を付加し、反応系を２０℃で１時間インキュベートした。混合物を、ゲル濾過（バイオスピンＰ−６、ＢｉｏＲａｄ）によって精製し、ライゲーションの効率を、一部をＮｏｖｅｘＴＢＥ−ＵＲＥＡゲル（インビトロジェン）上に流すことによって調べた。
【０３６６】
コード化の最初の周期についての合成ブロックオリゴの例
実施例７．３．１．１
【化６９】
0005643398.tif 000072
２：カルボキシｄＴ（グレンリサーチ  カタログ番号１０−１０３５−９０)
Ｐ：５'リン酸塩
Ｘ：５'ビオチン
ライゲーションの効率：＞９５％
【０３６７】
実施例７．３．１．２
【化７０】
0005643398.tif 000073
ライゲーションの効率：＞９５％
実施例７．３．１．３
【化７１】
0005643398.tif 000074
ライゲーションの効率：＞９５％
【０３６８】
【化７２】
0005643398.tif 000075
【化７３】
0005643398.tif 000076
【０３６９】
コード化の二番目の周期についての合成ブロックオリゴの例
実施例７．３．２．１
合成ブロックオリゴ３．２．１：
【化７４】
0005643398.tif 000077
ライゲーションの効率：＞９５％
【０３７０】
実施例７．３．２．２
【化７５】
0005643398.tif 000078
ライゲーションの効率：＞９５％
【０３７１】
実施例７．３．２．３
【化７６】
0005643398.tif 000079
ライゲーションの効率：＞９５％
【０３７２】
【化７７】
0005643398.tif 000080
【化７８】
0005643398.tif 000081
【０３７３】
一般的な手順４：ケメティックス（商標）による小さな分子のライブラリーのコード化
実施例７．４．１：ケメティックス（商標）による４８４の要素の小さな分子のライブラリーのコード化
実施例７．４．１．１最初のコード化周期
２ピコモルの負荷した識別オリゴ１．１を、２００ピコモルの各々の識別オリゴ１．２、１．３および１．４（総計で６０２ピコモルの負荷した識別オリゴ）と結合した。これらは、０．７ピコモルの合成ブロックオリゴ３．１．３．、および７２．７ピコモルの各々の１０の異なる他の最初の周期の合成ブロックオリゴ（例えば、３．１．１および３．１．２；総計で７２７ピコモルの負荷した合成ブロックオリゴ）と混合した。オリゴを凍結乾燥し、５０μｌの伸長緩衝剤（ＥＸ）［２０ｍＭのヘペス、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、８ｍＭの塩化マグネシウム］に再び溶解した。混合物を８０℃まで加熱し、２０℃までゆっくりと冷却し、識別部および合成ブロックオリゴの効率的なアニーリングを可能にした。５μｌの水中０．５ＭのＤＭＴ−ＭＭを加え、混合物を３７℃で４時間インキュベートした。
【０３７４】
合成ブロックオリゴ識別部上の識別オリゴの伸長を、３μｌの１０ｍＭの各々のデオキシヌクレオチド三リン酸［ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ］の混合物、および３μｌの１３単位／μｌのシークエナーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を付加することによって行った。混合物を、その後３０℃で一晩中インキュベートした。その後３μｌの２Ｍの水酸化ナトリウムを付加し、混合物を８０℃で１０分間インキュベーションし、続いて３μｌの２Ｍの塩酸を付加することによって中和した。混合物を、その後ゲル濾過カラム（バイオスピンＰ−６、ＢｉｏＲａｄ）を通過させて精製した。０．２５体積の１：１のＴＨＦ：水中２５ｍＭのＩ２を付加し、混合して３７℃で２時間インキュベートした。６０μｌの結合緩衝剤（ＢＦ）［１００ｍＭのヘペス、１５０ｍＭの塩化ナトリウム］および水３００μｌを付加した。
【０３７５】
混合物を、ＢＦ緩衝剤中で３回予め洗浄したストレプトアビジン−セファロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に付加し、室温で１０分間インキュベーションし、続いて氷上で１０分間緩やかに攪拌しながらインキュベートした。ビーズを、その後３回水で洗浄した。伸長した識別オリゴを、１００μｌの水中１：１のＮＨ３を利用することによって、ストレプトアビジン−セファロースビーズに結合した合成ブロックオリゴから剥離し、室温で５分間インキュベートした。
【０３７６】
７．４．１．２二番目のコード化周期
溶出液に、０．３６ピコモルの二番目の周期の負荷した合成ブロックオリゴ３．２．２、および３６．４ピコモルの各々の１０の異なる他の二番目の周期の合成ブロックオリゴ（例えば、３．２．１および３．２．３；総計で３６４ピコモルの負荷した二番目の周期の合成ブロックオリゴ）を付加し、混合物を凍結乾燥し、５０μｌのＥＸ緩衝剤中に再び溶解した。コード化は、本質的に７．１．１以降に述べたように行った。
【０３７７】
７．４．１．３最後の伸長
溶出した識別オリゴを凍結乾燥し、５０μｌのＥＸ緩衝剤中に溶解した。その後、２００ピコモルのプライマーＥ３８［５'−ＸＴＴＴＴＡＧＡＴＧＧＣＡＧＡＴ−３'、Ｘ＝ＣＸＳビオチン］を加えた。アニーリングを、混合物を８０℃まで加熱し、ゆっくりと２０℃まで冷却することによって行った。識別オリゴの伸長は、各々のデオキシヌクレオチド三リン酸［ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ］の１０ｍＭの混合物３μｌ、および１３単位／μｌのシークエナーゼ３μｌを付加することによって行った。その後、混合物を３０℃で２時間インキュベートした。混合物を、その後ゲル濾過カラム（バイオスピンＰ−６、Ｂｉｏｒａｄ）を通過させることによって精製した。この溶出液を選別のために用いた。一部（試料７．１．３）を、選別手順における投与量の分析のために除去した。
【０３７８】
一般的手順５：選別
マキシソープＥＬＩＳＡのウェル（ＮＵＮＣ  Ａ／Ｓ、デンマーク）を、ＰＢＳ緩衝剤［２．８ｍＭのリン酸二水素ナトリウム、７．２ｍＭのリン酸水素二ナトリウム、０．１５Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ７．２］中の２μｇ／ｍＬのインテグリンαＶβ３（Ｂａｃｈｅｍ）各々１００μｌで、一晩中４℃で被覆した。その後インテグリン溶液を、２００μｌの遮断緩衝剤［ＴＢＳ、０．０５％ツゥイーン２０（ＳｉｇｍａＰ−９４１６）、１％牛血清アルブミン（ＳｉｇｍａＡ−７０３０）、１ｍＭ塩化マグネシウム］と置換し、それを３時間室温で放置した。その後ウェルを遮断緩衝剤を用いて１０回洗浄し、それを遮断緩衝剤を用いて１００回希釈した後、コード化したライブラリーをウェルに付加した。室温で２時間インキュベートした後、ウェルを遮断緩衝剤を用いて１０回洗浄した。最後の洗浄の後、ウェルから洗浄に用いた緩衝剤を除去し、その後転化して、３００−３５０ｎｍの紫外線光に３０秒間曝露した。その後ツゥイーン２０を含まない遮断緩衝剤１００μｌを直ちに各々のウェルに付加し、ウェルを３０秒間震とうし、溶出した識別部を含む溶液をＰＣＲ分析のために除去した（試料５．１）。
【０３７９】
一般的手順６：選別の投与量および産出量の分析
ＰＣＲを、（試料７．３．１）のための選別の投与量および（試料５．１）の選別の産出量で、識別オリゴの５'末端に対応するプライマーおよびＥ３８プライマーを用いて行った。ＰＣＲを、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ（ＲＴＧ）ＰＣＲビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および１０ピコモルの各々のプライマーを２５μｌの反応体積で用いて行った。ＰＣＲ反応は、最初の９４℃で２分間の変性工程、続いて３０−４５周期の、９４℃で３０秒間の変性工程、５８℃で１分間のアニーリングおよび７２℃で１分間の伸長からなった。最後に７２℃で２分間の伸長工程を含めた。ＰＣＲ生成物を、アガロースゲル電気泳動によって再び溶解し、予期されたサイズに一致するバンドをゲルから切り出して、ＱＩＡ迅速ゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。
【０３８０】
個別のＰＣＲ断片を配列決定するために、精製したＰＣＲ生成物を、業者の指示に従って、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン）にクローニングした。生じた混合物を、標準的手順を用いた、ＴＯＰ１０イー・コリ細胞（インビトロジェン）の形質転換のために用いた。細胞を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む成長培地上に散布し、３７℃で１２−１６時間放置した。
個別にイー・コリクローンを選び出し、５０μｌの水を含むＰＣＲウェルに移した。これらのウェルをその後５分間煮沸し、各々のウェルから２０μｌの混合物を、業者の指示に従った、ＲＴＧＰＣＲビーズおよび各々５ピコモルのＭ１３のフォワードおよびリバースプライマーを用いたＰＣＲ反応に用いた。各々のＰＣＲ生成物の試料を、その後分解した一本鎖のＤＮＡおよびｄＮＴＰを除去するためにエキソヌクレアーゼＩ（ＵＳＢ）およびエビアルカリホスファターゼ（ＵＳＢ）で処理し、業者の指示に従ってＤＹＥｎａｍｉｃＥＴ周期配列決定キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて配列決定し、反応をＭｅｇａｂａｃｅ４０００細孔配列決定機（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。配列の産出量を、ＣｏｎｔｉｇＥｘｐｒｅｓｓソフトウェア（Ｉｎｆｏｒｍａｘ社）によって分析した。
【０３８１】
ライブラリー中の薬剤断片の概観：
【化７９】
0005643398.tif 000082
【化８０】
0005643398.tif 000083
ライブラリーは、３*１０８の識別部のうちの一つから、インテグリンαＶβ３リガンドＡ（ＦｅｕｓｔｏｎＢ．Ｐら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００２年、４５、５６４０−５６４８中の分子７）をコード化できる可能性があった。
【０３８２】
【化８１】
0005643398.tif 000084
上の表から分かるように、ライブラリーは、３*１０８の識別部の全て（１×１×１＝全ての３０１×１００１×１００１〜３*１０８のうち一つ）から、リガンドＡをコード化できる可能性があった。
【０３８３】
実施例７．６．１：選別工程のための投与量および選別工程のための産出量の配列決定分析の結果
リガンドＡのコード化に適合したコドンの組み合わせは、予期された低量のコドンの組み合わせ（３*１０８のうちの１）に従った選別の前にコード化したライブラリー由来の２８配列にはみられなかった。
リガンドＡのコード化に適合したコドンの組み合わせは、インテグリンαＶβ３ウェル中の選別後にコード化したライブラリー由来の１９配列のうち５つにみられた。
これらの数は、（３*１０８／（１９／７））＝８*１０７の濃縮因子に一致する。
【０３８４】
実施例８：サイズ排除カラムを用いたコード化分子の選別
この例は、様々な標的に対する複合体の選別を行うために、カラム選別を用いる可能性を例示する。この例において、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）が用いられるが、標的結合複合体が非結合複合体から分離される他のタイプのクロマトグラフィーも用いられ得る。
複合体を、前もって決定された配列を有するオリゴヌクレオチド配列と結合したビオチン分子によって、この実施例において例示している。従って、識別部のヌクレオチド配列は、合成分子の識別部をビオチンとして指定する。コード化した配列はあらゆる長さを有してよく、当該明細書の他の部分で述べたように、様々な合成ブロックをコード化するための不連続の領域に分割し得る。また、ディスプレイした分子は、鎖状または骨格の構造をもつことができる。
ビオチン−ＡＡＴＴＣＣＧＧＡＡＣＡＴＡＣＴＡＧＴＣＡＡＣＡＴＧＡ
ビオチンはストレプトアビジンと結合することが知られている。ビオチンのストレプトアビジンとの結合は、識別部を標的分子に連結し、それゆえに識別部を、例えばみかけの分子量のような物理的および化学的特性を変化させるであろう。この変化は、例えばサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、検出できる可能性がある。
【０３８５】
７８ピコモルの複合体分子を、スーパーデックス２００、ＰＣ３．２／３０カラム（AＫＴＡ−ＦＰＬＣ、ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）上に負荷し、流速０．０５０ｍｌ／分でＰＢＳ緩衝剤中で分析した。以下から分かるように、複合体分子の反応時間は、およそ３５分であった。標的（８３ピコモルストレプトアビジン）を同一の条件下で分析した場合、反応時間はほぼ同じであった。標的分子の吸着率が低いのは、測定に用いられる波長（２６０ｎｍ）のためである。この波長において、吸光係数は複合体中のヌクレオチドについては高いが、タンパク質の標的については低い。
【０３８６】
【化８２】
0005643398.tif 000085
【０３８７】
しかしながら、結合を可能にしてその後同一の条件下で分析するために、複合体分子が標的分子と前もって混合されていた場合（７８ピコモルの複合体および８３ピコモルの標的を、ＰＢＳ緩衝剤中で１時間インキュベートした場合）、反応時間は有意に変化する（２８分）。その変化は、複合体が標的に結合することによる分子量（または流体力学的体積）の増加のためである。このことによって、標的結合複合体を非結合複合体から分離することが可能となる。複合体および標的分子を含む断片を貯蔵し、適切なプライマーを用いて増幅する。増幅した識別部を、その後濃縮したディスプレイした分子の構造を解読するために用いられ得る。
二官能性複合体のライブラリーのカラム選別を行う方法には、二つの主要な利点がある。第一に、濃縮した（標的と結合した）複合体を、非結合複合体の前に溶出し、非結合複合体由来のバックグラウンドを劇的に減少させるであろう。第二に、カラムでの濃縮は、基質中の孔における全ての分離工程のために徹底したものになるであろう。
【０３８８】
この方法を用いた標的結合複合体の分離は、複合体の分子量にも左右されるであろうが、主として標的の分子量に左右されるであろう。標的の分子量は、標的をみかけの分子量を増加させる土台と結合させることによって、調節し得る。分子量の増加によりカラムの反応時間が減少することによって、分離が促進されるであろう。これは、例えば融合タンパク、抗体、ビーズ、または多量体として標的に架橋結合することを用いて行い得る。従って、標的タンパク質は融合タンパク質として発現され得るか、または特定の抗体は分子量を増加させるために用いられ得る。標的は分離が可能な小さなビーズ上に固定することができ、標的は、多量体を形成するかまたは例えば他のタンパク質のようなキャリア分子に対する架橋結合を形成するために、標準的試薬を用いて架橋結合させることができる。好ましくは、分子量カラムの真空体積中で標的分子が溶出するように、分子量を増加させる。
用いられ得る他のタイプのカラム分離の例は、親和性クロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、およびイオン交換クロマトグラフィーである。サイズ排除クロマトグラフィーで用いられ得るカラムの媒質の例は、スーパーデックスの他に、セファクリル、セファロースまたはセファデックスである。
【０３８９】
実施例９：スプリット・アンド・ミックス法による２５要素のライブラリーの形成およびリガンドの選別
ヒトインテグリン受容体αＶ／βＩＩＩは、細胞の移行および播種性転移とともに、炎症反応および血栓形成のような多くの生物学的機能に影響を与える。αＶ／βＩＩＩに対する天然のリガンドは、受容体の結合ポケットと相互作用するＲＧＤトリペプチドコンセンサスモチーフを含む。結果として、多くの医学研究は、αＶ／βＩＩＩ受容体に対する親和性を高めた小分子のＲＧＤ擬似物の合成および識別に、焦点を当ててきた。ある擬似物、Ｆｅｕｓｔｏｎ５（Ｆｅｕｓｔｏｎら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００２年１２月１９日；４５（２６）：５６４０−８）はＧＤジペプチドに結合したアルギニン生物等配電子体を含み、ＲＧＤトリペプチドと比較して、αＶ／βＩＩＩに対して１０倍高くなった親和性（ＫＤ＝１１１ｎＭ）を示す。
【０３９０】
【化８３】
0005643398.tif 000086
ここに、Ｆｅｕｓｔｏｎ５リガンドおよび２４の追加の小分子のスプリット・アンド・ミックス手順を含む、２５要素の小分子のライブラリーを合成した。ライブラリーを受容体との相互作用について選別し、ＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、配列決定して、対応する小分子のリガンドを識別した。
【０３９１】
プロトコール
ライブラリーの生成
図２２および図２３は、ライブラリー合成についての一般的スキームを示す。最初に、スペーサーＰＥＧ１８（グレンリサーチ、カタログ番号１０−１９１８−９０）および光で切断可能な（グレンリサーチ、カタログ番号１０−４９１３）スペーサーによって結合した、５'末端のアミノ基（グレンリサーチ、カタログ番号１０−１９０５−９０）を含む正味３６のオリゴヌクレオチド（ＩＤ）
５'−ＸＡＣＣＴＣＡＧＣＴＧＴＧＴＡＴＣＧＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＣＴＣＧＴＣＧを、標準的ホスホルアミダイト反応によって合成した（ＤＮＡテクノロジー  Ａ／Ｓ  デンマークから購入できる）１ナノモルのＩＤオリゴヌクレオチドを、次の骨格負荷プロトコールＡを用いて、ペンテネオイル−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＯＨを負荷した。
【０３９２】
１ナノモルのＩＤオリゴヌクレオチドを凍結乾燥し、その後９０ｍＭスルホ−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ｓＮＨＳ、Ｍｅｒｃｋ）と共に、１００ｍＭのホウ酸ナトリウム緩衝剤ｐＨ８．０  ２０μｌ中に溶解した。先だった骨格の活性化：ＤＭＳＯ中１００ｍＭのペンテネオイル−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＯＨ  １５μｌを、ＤＭＦ中１００ｍＭの１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、Ｍｅｒｃｋ）１５μｌと共にインキュベーションし、ＩＤ溶液を付加する前に３０分間３０℃でインキュベートした。４５分間３０℃でインキュベートした後、追加の前もって活性化した骨格３０μｌを付加し、その溶液をさらに４５分間３０℃でインキュベートした。過剰の骨格、活性化試薬、溶媒および塩を、Ｂｉｏｒａｄマイクロスピンカラム６を用いた二重のゲル濾過によって除去し、ＭＳ等級の水に溶出した。負荷は、エレクトロスプレーＭＳ（Ｂｒｕｋｅｒ社）分析によって検証した。その後、アミノ保護基を、ＴＨＦ／水（１：１）の混合物中の０．２体積の２５ｍＭのヨウ素を付加することによって除去し、３７℃で２時間インキュベートした。過剰のヨウ素を、Ｂｉｏｒａｄ６マイクロスピンカラムを用いたゲル濾過精製の前に、２０ｍＭの２−メルカプトエタノールの付加を利用して排除した。ＭＳ分析から、負荷し、脱保護したＩＤオリゴヌクレオチドを、＞７５％の純度になると推定した（データは示していない）。
【０３９３】
５００ピコモルのＤ負荷したＩＤオリゴを、２分間８０℃で変性させて続いてゆっくりと環境温度に冷却することによって、配列
５'−ＴＧＴＧＣＧＡＣＧＡＧＧＣＣＧＣＴＧＣ
を有する５００ピコモルの相補的オリゴにアニーリングした。（効率的なアニーリングおよびライゲーションのために）正味４の突出部を有する二重鎖のオリゴの組（ＩＤ−ｄｓ）を、次の手順を用いて、以下に概略的に示したスプリット・アンド・ミックス反応プロトコールに用いられた。
【０３９４】
二番目の位置のコドンおよび遊離反応体の付加：５００ピコモルのＩＤ−ｄｓを５つのウェル（ここではエッペンドルフチューブ）に分割した。配列
【化８４】
0005643398.tif 000087
の特定の二番目の位置のコドンオリゴヌクレオチド１００ピコモルを、各々のウェルに付加し、オリゴをライゲーション緩衝剤［３０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．９）、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＡＴＰ］および１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて、２０μｌの体積で環境温度で１時間ライゲーションした。
【０３９５】
その後、５ライゲーション生成物を、業者の指示に従って、Ｂｉｏｒａｄマイクロスピンカラム６を用いて個別に精製し、凍結乾燥した。次に、特定の反応体を、上記した負荷プロトコールＡを用いた図２２に示されるスキームに従って、骨格と反応させた。過剰の反応体、試薬および緩衝剤を、ゲル濾過によって除去した。溶出液を貯蔵し、凍結乾燥して、脱保護のために２５ｍＭのヨウ素（ＴＨＦ／水中、比率１：１）１０μｌを付加する前に、４０μｌの水中に再び懸濁した。
【０３９６】
【化８５】
0005643398.tif 000088
Ｎ−ペンテネオイルの反応は、ＩＤオリゴを用いてグリシン反応体を保護し、その後ヨウ素を用いて脱保護した。反応系を、３７℃で２時間インキュベートした。過剰のヨウ素を、１Ｍの２−メルカプトエタノール１μｌの付加によって排除し、スピン−ゲル濾過（Ｂｉｏｒａｄ６）を用いて試料を精製する前に、環境温度で５分間放置した。
【０３９７】
コドンオリゴヌクレオチド：
【化８６】
0005643398.tif 000089
ｐ＝５’リン酸塩
を用いて、三番目の位置のコドンを付加するために、試料を５つのウェルに分割し、次の例外を持つが、２番目の位置について述べ、図２２において示されるように遊離反応体と反応させた：Ｆ３反応体は、Ｆ３の有機溶媒に対する溶解度が乏しいために、プロトコールＡを用いても効果的には反応しなかった。結果として、Ｆ３は、次の手順（プロトコールＢ）を用いて反応させた。ライゲーションし、凍結乾燥した試料を、１００ｍＭの水中のＦ３反応体１０μｌ、および５００ｍＭの４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４メチルモルホリニウム塩化物（ＤＭＴ−ＭＭ、カルボン酸賦活剤）５μｌを付加する前に、１００ｍＭのホウ酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ８．０）３５μｌに溶解し、２５℃で２時間インキュベートした。結合反応に続いて、過剰の反応体、試薬および塩を、プロトコールＡにおいて述べたように、ゲル濾過によって除去した。残りの工程は、二番目の位置について述べたように行った。
【０３９８】
選別工程を行うに先立って、不適合なアニーリングをしたオリゴが集合しないことを保証するために、鎖交換反応を行った。鎖交換を、２０単位のシークエナーゼを付加する前に、デオキシリボヌクレアーゼ（ｄＮＴＰ）を総体積８０μｌで含む２００μＭシークエナーゼ緩衝剤中の、２００ピコモルのＡＨ３６１オリゴ（５'−ＣＧＧＡＧＡＣＧＴＧＧＴＧＧＡＧＧＡＡＣ−３'）をアニーリングし、３０℃で１時間インキュベートすることによって行われた。伸長に続いて、反応混合物を、さらなる精製をせずに、選別工程に用いられた。
【０３９９】
選別
マキシソープＥＬＩＳＡウェル（ＮＵＮＣ  Ａ／Ｓ、デンマーク）を、ＰＢＳ緩衝剤［２．８ｍＭのリン酸二水素ナトリウム、７．２ｍＭのリン酸水素二ナトリウム、０．１５Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ７．２］中の２μｇ／ｍＬのインテグリンαＶβ３（Ｂａｃｈｅｍ）各々１００μｌで、一晩中４℃で被覆した。その後インテグリン溶液を、２００μｌの遮断緩衝剤［ＴＢＳ、０．０５％ツゥイーン２０（ＳｉｇｍａＰ−９４１６）、１％牛血清アルブミン（ＳｉｇｍａＡ−７０３０）、１ｍＭ塩化マグネシウム］と置換し、それを１時間室温で放置した。その後ウェルを２５０μｌの遮断緩衝剤を用いて２回洗浄し、それを遮断緩衝剤を用いて２０回希釈した後、コード化したライブラリー５μｌをウェルに付加した。室温で２時間インキュベートした後、ウェルを２０×２５０μｌの遮断緩衝剤を用いて洗浄した。
【０４００】
溶出
最後の洗浄の後、ウェルから洗浄に用いた緩衝剤を除去し、その後転化して、トランスイルミネーターセットを７０％の出力で用いて、３００−３５０ｎｍの紫外線光に３０秒間曝露した。
ツゥイーン２０を含まない遮断緩衝剤１００μｌを直ちに各々のウェルに付加し、ウェルを３０秒間震とうし、溶出した鋳型を含む溶液をＰＣＲ分析のために除去した。
【０４０１】
ＰＣＲ増幅
投与量および産出量に基づくＰＣＲは、Ｆｒｗ２７オリゴ（ＡＣＣＴＣＡＧＣＴＧＴＧＴＡＴＣＧＡＧ）の５'末端に対応するプライマー、およびＡＨ３６１プライマーを用いる。溶出したＤＮＡ５μｌをエッペンドルフホットマスターミックス２．５ｘ１０μｌおよび各々１０ピコモルのＡＨ３６１およびＦｒｗ２７を用いて、２５μｌの反応においてＰＣＲのために用いた。ＰＣＲを行った：（ＥＮＲＩＣＨ３０）：９４℃で２分、その後［９４℃で３０秒、５８℃で１分、７２℃で１分］を３０周期、その後７２℃で１０分。
【０４０２】
クローニングおよび配列決定
ＴＯＰＯ−ＴＡ（インビトロジェン、カタログ番号Ｋ４５７５−Ｊ１０）ライゲーションを、ＰＣＲ生成物４μｌ、塩溶液１μｌ、ベクター１μｌと反応させた。反応系を室温で３０分間インキュベートした。ヒートショック成分ＴＯＰ１０イー・コリ細胞を解凍し、氷上に置いた。５μｌの反応系を加えた。氷上に３０分置いた後、細胞を４２℃の水で３０秒間ヒートショックを与え、その後氷上に置いた。２５０μｌのＳＯＣを付加し、ＬＢアンピシリンプレート上に散布して続いて３７℃でＯＮインキュベートする前に、細胞を１時間３７℃でインキュベートした。
【０４０３】
個別のイー・コリクローンを選び出し、５０μｌの水を含むＰＣＲウェルに移した。コロニーを９４℃で５分間インキュベーションし、ＰＣＲプログラムＥＫＯ５０：９４℃で２分、その後［９４℃で４秒、５０℃で３０秒、７２℃で１分］を３０周期、その後７２℃で１０分を用いた、各々５ピコモルのＴＯＰＯ  Ｍ１３のフォワードおよびＭ１３のリバースプライマー（ＡＨ３６５／ＡＨ３６６）、およびＲｅａｄｙ−Ｔｏ−ＧｏＰＣＲビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）との２５μｌのＰＣＲ反応に、２０μｌを用いた。
【０４０４】
プライマーおよび遊離反応体を、１μｌのＥＸＯ／ＳＡＰ混合物１：１を２μｌのＰＣＲ生成物に付加することによって分解した。インキュベーションは、３７℃で１５分間、その後８０℃で１５分間であった。５ピコモルのＴ７プライマー（ＡＨ３６８）を付加し、水を１２μｌまで付加した。その後、８μｌのＤＹＥｎａｍｉｃＥＴ周期配列決定ターミネーターミックスを付加し、続いて３０周期の（９５℃で２０秒、５０℃で１５秒、６０℃で１分）を用いたＰＣＲ周期を行った。精製を、ｓｅｑ９６スピンプレート（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて行い、続いてＭｅｇａＢａｃｅ配列決定機上で分析した。
【０４０５】
ライブラリー配列の産出量
１８の成功した配列は、選別工程由来の単離したＤＮＡの情報を与え、以下に示される。
産出量の配列
【化８７】
0005643398.tif 000090
【０４０６】
１番目の位置の強調した５量体の配列はアスパラギン酸に対応しており、２番目の（中央の）位置の強調した２０量体の配列はグリシンに対応しており、強調した２０量体の配列（＋ライゲーション突出部由来の４塩基）はＦ３合成ブロックに対応している。従って、１８配列のうち１６は、インテグリンαＶ／β３受容体に結合する単一の主要な小分子として、正確にＦｅｕｓｔｏｎ５リガンド（Ｆ３−Ｇ−Ｄ）を識別する。Ｆ３ＢＢのみが、３番目の位置においてこのアルギニン生物等配電子体に対する非常に強いバイアスを立証することに注意しなければならない。
【０４０７】
データは、小さな分子のライブラリーの化学的合成、タグ付加、選別および識別手順が、この技術を用いると効率が高く、予期されたように容易に測定可能であり、１０８−１０１０より多くの異なる分子を含むライブラリーに適用可能であることを示している。
図２２は、独特の１番目の位置のＤ（アスパラギン酸塩）を負荷したオリゴ、２番目の位置の５つの異なる反応体／オリゴの組、および３番目の位置の５つの異なる反応体／オリゴの組を用いたライブラリー生成の概観を示す。最終的に、各々対応する独特のＤＮＡコードに結合した、１×５×５＝２５の異なる三量体が集合する。矢印はライゲーション部位を示す。
【０４０８】
実施例９：コード化した多数の成分の反応（ＭＣＲ）生成物
９．１  ４−カルボキシベンズアルデヒドを用いた、骨格オリゴを含むアルデヒドの調製
４−カルボキシベンズアルデヒド（骨格）のＤＭＦ溶液（２５μＬ、１５０ｍＭ）を、１５０ｍＭのＥＤＣのＤＭＦ溶液２５μＬと混合した。混合物を３０分間２５℃で放置した。１００ｍＭのヘペス緩衝剤ｐＨ７．５中のアミノオリゴ（１０ナノモル）５０μＬを付加し、反応混合物を２０分間２５℃で放置した。過剰の骨格を、酢酸エチル（５００μＬ）を用いた抽出によって除去し、残りの酢酸エチルを、真空中でスピードバック中で１０分間回転させることによって除去した。混合物を、その後水によって平衡に達したマイクロバイオスピンカラム（バイオスピンＰ−６、ＢｉｏＲａｄ）を用いたゲル濾過によって精製した。負荷したオリゴをＥＳ−ＭＳによって分析した。
【０４０９】
【化８８】
0005643398.tif 000091
【０４１０】
【化８９】
0005643398.tif 000092
【０４１１】
９．２節に用いられるアミノオリゴＬ１．１：分子量＝７１５４
Ｌ１．１：５’−５ＣＧ  ＡＴＧ  ＧＴＡ  ＣＧＴ  ＣＣＡ  ＧＧＴ  ＣＧＣ  ＡＸ３’Ｘ＝３’ビオチン
５’５＝５’アミノ−Ｃ６（グレンリサーチ、カタログ番号１０−１９０６−９０）
９．３節に用いられるアミノオリゴＬ１．２：分子量＝６５８５
Ｌ１．２：５’−ＧＣＧ  ＡＣＣ  ＴＧＧ  ＡＧＣ  ＡＴＣ  ＣＡＴ  ＣＧＸ
３’Ｘ＝アミノ−Ｃ２−ｄＴ−３’−ＰＯ４（グレンリサーチ、カタログ番号１０−１０３７−９０）
【０４１２】
９．２  多成分反応
ベンズアルデヒドを負荷したＬ１．１オリゴ（２００ピコモル）溶液を凍結乾燥し、１０μｌの水中に再び溶解した。メタノール中の２−メトキシエチルアミン（１０μＬ、４０ｍＭ）、メタノール中の３−フラン−２−イル−アクリル酸（１０μＬ、４０ｍＭ）、およびメタノール中のシクロヘキシルイソシアニド（１０μＬ、４０ｍＭ）を付加し、一晩中３７℃でインキュベートした。反応混合物を４０μＬの水で希釈し、水によって平衡に達したスピンカラム（バイオスピンＰ−６、ＢｉｏＲａｄ）を用いたゲル濾過によって精製した。オリゴ上のＭＣＲ生成物を、ＥＳ−ＭＳによって分析した。出発物質のＬ１オリゴを負荷したベンズアルデヒド（Ａ）は、ＵＧＩ生成物（Ｂ）と共に、ＭＳスペクトルにおいて識別された。
【０４１３】
【化９０】
0005643398.tif 000093
【０４１４】
【化９１】
0005643398.tif 000094
【０４１５】
９．３  多成分反応
ベンズアルデヒドを負荷したＬ１．２オリゴ（３２０ピコモル）溶液を凍結乾燥し、１０μｌの水中に再び溶解した。メタノール中の２−アミノエタノール（１０μＬ、４０ｍＭ）、メタノール中の３−メトキシ−プロピオン酸（１０μＬ、４０ｍＭ）、およびメタノール中のエチルイソシアノ酢酸（１０μＬ、４０ｍＭ）を付加し、一晩中３７℃でインキュベートした。反応混合物を４０μＬの水で希釈し、水によって平衡に達したスピンカラム（バイオスピンＰ−６、ＢｉｏＲａｄ）を用いたゲル濾過によって精製した。オリゴ上のＭＣＲ生成物を、ＥＳ−ＭＳによって分析した。出発物質のＬ１オリゴを負荷したベンズアルデヒド（Ａ）は、三つの生成物、Ｂ  ジケトピペラジン、Ｃ  ＵＧＩ生成物およびＨ  アミン生成物と共に、ＭＳスペクトルにおいて識別された。
【０４１６】
【化９２】
0005643398.tif 000095
【０４１７】
【化９３】
0005643398.tif 000096
【０４１８】
９．４コード化
過剰の反応体、活性化試薬、溶媒および塩を、Ｂｉｏｒａｄマイクロスピンカラム６を用いた二重のゲル濾過によって除去し、ＭＳ等級の水中で溶出し、負荷を、オリゴヌクレオチドＬ１に結合したディスプレイした分子がコード化される前に、エレクトロスプレーＭＳ（Ｂｒｕｋｅｒ社）分析によって検証した。
上記したディスプレイした分子を形成する他の三つの成分と反応した、９．２節中のベンズアルデヒドを負荷したオリゴヌクレオチドＬ１．１を、スプリントオリゴヌクレオチドＳ１、Ｓ２およびＳ３（以下に示した配列）と共に、コドンオリゴヌクレオチドＬ２、Ｌ３およびＬ４と混合し、リガーゼ（Ｔ４ＤＮＡリガーゼ）を用いてライゲーションした。ライゲーションを、次の条件を用いて行った。二本鎖のオリゴヌクレオチドは、コード化する鎖（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４）をスプリントオリゴヌクレオチド（Ｓ１、Ｓ２およびＳ３）と混合することによって達成し、７つのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション生成物を（効率的なアニーリングおよびライゲーションのために）形成した。約５０ピコモルの各々の特定のオリゴヌクレオチドを用い、そのオリゴヌクレオチドを、２０μｌの体積でライゲーション緩衝剤［３０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．９）、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＡＴＰ］および１０単位のＴ４−ＤＮＡリガーゼを用いて、環境温度で１時間ライゲーションした。
【０４１９】
【化９４】
0005643398.tif 000097
【０４２０】
タグを含む識別部を、次の条件を用いてフォワード（ＦＰ）およびリバース（ＲＰ）のプライマーを用いて増幅した：ライゲーションした識別オリゴヌクレオチド５μｌを、２５μｌの体積でエッペンドルフホットマスターミックス２．５ｘ１０μｌおよび各々１０ピコモルのＡＨ３６１およびＦｒｗ−２７を用いて、ＰＣＲのために用いた。ＰＣＲを行った：（ＥＮＲＩＣＨ３０）：９４℃で２分、その後［９４℃で３０秒、５８℃で１分、７２℃で１分］を３０周期、その後７２℃で１０分。
【化９５】
0005643398.tif 000098
【０４２１】
増幅した識別オリゴヌクレオチドを、集合したオリゴヌクレオチドがコドン領域（ＣＧＴＣＣ、ＧＴＡＣＧ、ＡＡＴＧＧおよびＴＣＧＡＴ）を含むことを検証するために、クローニングした。ＴＯＰＯ−ＴＡ（インビトロジェン  カタログ番号Ｋ４５７５−Ｊ１０）ライゲーションを、ＰＣＲ生成物４μｌ、塩溶液１μｌ、ベクター１μｌを反応させた。反応系を室温で３０分間インキュベートした。ヒートショック成分ＴＯＰ１０イー・コリ細胞を解凍して氷上に置いた。５μｌのライゲーション反応系を付加した。氷上に３０分置いた後、細胞を４２℃の水で３０秒間ヒートショックを与え、その後氷上に置いた。２５０μｌのＳＯＣを付加し、ＬＢアンピシリンプレート上に散布して続いて３７℃でＯＮインキュベートする前に、細胞を１時間３７℃でインキュベートした。
【０４２２】
個別のイー・コリクローンを選び出し、５０μｌの水を含むＰＣＲウェルに移した。コロニーを９４℃で５分間インキュベーションし、ＰＣＲプログラム：９４℃で２分、その後［９４℃で４秒、５０℃で３０秒、７２℃で１分］を３０周期、その後７２℃で１０分を用いた、各々５ピコモルのＴＯＰＯ  Ｍ１３のフォワードおよびＭ１３のリバースプライマー（ＡＨ３６５／ＡＨ３６６）、およびＲｅａｄｙ−Ｔｏ−ＧｏＰＣＲビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）との２５μｌのＰＣＲ反応に、２０μｌを用いた。プライマーおよび遊離反応体を、１μｌのＥＸＯ／ＳＡＰ混合物１：１を２μｌのＰＣＲ生成物に付加することによって分解した。インキュベーションは、３７℃で１５分間、その後８０℃で１５分間であった。５ピコモルのＴ７プライマー（ＡＨ３６８）を付加し、水を１２μｌまで付加した。その後、８μｌのＤＹＥｎａｍｉｃＥＴ周期配列決定ターミネーターミックスを付加し、続いて３０周期の（９５℃で２０秒、５０℃で１５秒、６０℃で１分）を用いたＰＣＲ周期を行った。精製を、ｓｅｑ９６スピンプレート（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて行い、続いてＭｅｇａＢａｃｅ配列決定機上で分析した。
【０４２３】
実施例１０：タグ上へのエンティティの負荷
【化９６】
0005643398.tif 000099
【０４２４】
手順：
ＤＭＦ中の１５０ｍＭの合成ブロック溶液２５μｌを、ＤＭＦ中の１５０ｍＭのＥＤＣ溶液２５μｌと混合した。混合物を３０分間２５℃で放置し、１００ｍＭのヘペス緩衝剤ｐＨ７．５中のアミノオリゴ（１０ナノモル）５０μＬを付加し、反応混合物を２０分間２５℃で放置した。過剰の合成ブロックを、酢酸エチル（５００μＬ）を用いた抽出によって除去した。過剰の酢酸エチルを、スピードバック中の低下させた圧力で除去した。合成ブロックを負荷したアミノオリゴを、酢酸アンモニウムを用いて二回エタノールで沈殿させ、エレクトロンスプレー質量分光測定法（ＥＳ−ＭＳ）によって分析した。
【０４２５】
実施例１１
次の例は、エンティティのライブラリーから単離した望ましい特性を含む、エンティティを識別するためのタグ付加の原理の利用を例証している。原理を図１に概略的に示す。
インテグリン受容体αＶ／β３と結合する複合体の識別のためのペプチドのＤＮＡタグ付加
【０４２６】
材料：
・精製したヒトインテグリンαＶ／β３（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）
・ストレプトアビジンセファロース６Ｂ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ）
・Ｎｕｎｃ免疫修飾分子Ｕ８マキシソープ（Ｂｉｏｔｅｃｌｉｎｅ  カタログ番号Ｎｕｎ−４７５０７８）
・長さをそろえて切断したニシンのＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ）
・Ｔａｑ−ポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）および１０ＸＴａｑ−ポリメラーゼ緩衝剤
・結合緩衝剤［１００ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化マグネシウム、５０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ７．５］
・ＵＶトランスイルミネーター
・ＳＰＤＰ［Ｎ−コハク酸イミジル３（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸］（Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ、カタログ：Ｓ−１５３１）
・マイクロＢｉｏ−ｓｐｉｎ６（Ｂｉｏ−Ｒａｄカタログ：７３２−６２２１）
【０４２７】
次の配列を有する６つのタグ付加オリゴヌクレオチド：
【化９７】
0005643398.tif 000100
式中、Ｘ＝、ペプチド、小分子またはポリマーのような機能エンティティの結合に適している５'Ｃ６アミノ修飾因子（グレンリサーチ、カタログ番号１０−１９１６−９０）である。
【０４２８】
・次の配列を有する相補的（鋳型）オリゴヌクレオチド
【化９８】
0005643398.tif 000101
【０４２９】
式中、Ｂ＝５'ビオチン（グレンリサーチ、カタログ番号１０−１９５３−９５）であり、Ｐ＝光で切断可能なリンカー（グレンリサーチ、カタログ番号１０−４９１３−９０）である。
下線を引いた１０のヌクレオチド配列は、各々のタグ付加オリゴヌクレオチドについて独特であり、独特の対の相補的なオリゴヌクレオチドを有する。太線で強調した配列は、クローニングの目的に適している。
【０４３０】
・ＰＣＲ増幅のオリゴヌクレオチド
【化９９】
0005643398.tif 000102
・次の組成物を有する６つのペプチド
P#1:GRGDSPC
P#2:GRADSPC
P#3:GRGESPC
P#4:GDGRSPC
P#5:CKKK
P#6:CFFKKK
Ａ＝アラニン、Ｇ＝グリシン、Ｒ＝アルギニン、Ｄ＝アスパラギン酸、Ｐ＝プロリン、Ｆ＝フェニルアラニン、Ｋ＝リシンおよびＥ＝グルタミン酸。全てのペプチドが、Ｎ−末端カルボキシル化およびＣ−末端アミド化によって、末端をキャップされている。ペプチドは、Ｓｃｈａｆｅｒ−Ｎ  Ａ／Ｓ、ＤＫ−デンマークによって供給された。
【０４３１】
プロトコール
工程１：特定のオリゴヌクレオチド（ＴＯ番号１−６）を有するペプチド番号１−６のタグ付加
各々のＴＯオリゴヌクレオチドは、次の反応においてヘテロ二官能性架橋リンカーＳＰＤＰを用いて、ペプチドのシステインのチオール基に共有結合し得る、単一の５'末端のアミノ求核基（Ｘ）を含む。
【０４３２】
【化１００】
0005643398.tif 000103
【０４３３】
手順：
５ナノモルのアミノオリゴを乾燥させ、１００ｍＭのヘペス−ＯＨ（ｐＨ７．５）１６０μｌ中に再び懸濁する。２０ｍＭのＳＰＤＰ（ＤＭＳＯ中）４０μｌを付加し、２時間３０℃でインキュベートする。試料を３×５００μｌの酢酸エチルによって抽出し、スピードバック中で１０分間乾燥する。試料を、１００ｍＭのヘペス−ＯＨによって平衡に達したマイクロバイオスピン６カラムを用いて精製する。１Ｍのペプチド１０μｌを付加し、２５℃で２時間インキュベートする。２Ｍの酢酸アンモニウム／エタノールによって、２回沈殿させる。５０μｌの水中に再び溶解し、エレクトロスプレー−ＭＳ分析（Ｂｒｕｋｅｒ社）によってタグ付加を検証する。
【０４３４】
工程２：相補的オリゴヌクレオチド（ＣＯ番号１−６）を、工程１由来のＴＯ−ペプチド複合体にアニーリングする
手順：
対応するペプチドを負荷した１０ピコモルのＴＯ番号１−６を、結合緩衝剤［１００ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化マグネシウム、５０ｍＭのヘペス−ＯＨ、ｐＨ７．５］中で、総体積１００μｌで２０ピコモルの各々のＣＯ番号１−６を含む混合物に付加する。試料を２分間８０℃まで加熱し、ゆっくりと室温まで３０分以上冷却する。
【０４３５】
工程３：二本鎖のＤＮＡペプチド複合体を精製する（任意）
アニーリングに続いて、相補的なオリゴヌクレオチド配列とアニーリングした、タグ付加した分子は、機能エンティティおよびビオチンハンドル（図１参照）を共に含むであろう。結果として、選別工程において「ノイズ」を減少させるために、一本鎖のタグ付加した分子を、ビオチンハンドルを用いた前選別工程において、ライブラリーから除去し得る。
手順：
５０μｌのストレプトアビジン−セファロース６Ｂスラリーを、ビーズを１００μｌの結合緩衝剤中に再び懸濁する前に、３×１ｍｌの結合緩衝剤中で洗浄する。ＣＯ／ＴＯ−ペプチドをアニーリングする混合物を、ストレプトアビジンビーズに付加し、攪拌しながら２５℃で３０分間インキュベートする。その後、ストレプトアビジンビーズをペリットにして、上澄みを廃棄し、ビーズを１ｍｌの結合緩衝剤で三回洗浄する。ビーズを１００μｌの結合緩衝剤結合緩衝剤中に再び懸濁し、最後にＣＯ／ＴＯ−ペプチド複合体が光切断を用いて解放される。光切断反応は、Ｖｉｌｂｅｒ−ＬｏｕｒｍａｔＵＶトランスイルミネーターＴＦＸ−２０Ｍ上で、３０秒間７０％の出力で、試料をインキュベートすることによって行う。溶出したＣＯ／ＴＯ−ペプチド複合体を、新しい管に除去する。
【０４３６】
工程４：インテグリンαＶ／β３受容体に結合するリガンドのライブラリーを濃縮する
分子のライブラリーを、プラスチック表面に固定したインテグリンαＶ／β３受容体に対する結合について検査する。
手順：
単一のウェルのＮｕｎｃ８プレートを、標準リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で、１μｇ／ｍｌのインテグリン受容体１００μｌを用いて、一晩中インキュベートする。ウェルをＰＢＳ１００μｌで５回洗浄し、続いて０．５ｍｇ／ｍｌの長さをそろえて切断したニシンのＤＮＡ１００μｌを、ＰＢＳ緩衝剤中で２時間室温で遮断する。
最後に、ウェルをインテグリン結合緩衝剤［トリス塩酸（ｐＨ７．５）、１３７ｍＭの塩化ナトリウム、１ｍＭの塩化カリウム、１ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭの塩化カルシウムおよび１ｍＭの塩化マンガン］１００μｌを用いて、五回洗浄する。
ＣＯ／ＴＯ−ペプチド複合体を、固定したインテグリンに付加し、３７℃で３０分間インキュベートする。上澄みを除去し、固定したインテグリンを、１００μｌのインテグリン結合緩衝剤を用いて、５回洗浄する。ＣＯ／ＴＯ−リガンド複合体を、試料を８０℃まで５分間加熱して溶出する。試料を、室温まで冷却する。試料１μｌを、１０ピコモルの各々のＡＯ番号１および２を外部のプライマーとして用いた、１０ｍＭのトリス塩酸ｐＨ９．０、５０ｍＭの塩化カリウム、１ｍＭの塩化マグネシウム、０．１％トライトンＸ−１００、各々２５０ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを含む反応系における、ＰＣＲ増幅のために用いる。試料を、最初に９４℃で２分間変性させ、３０周期９４℃で３０秒間変性し、４４℃で３０秒間アニーリングして７２℃で１５秒間伸長することによって、精製する。最後に、試料を沈殿させる。
【０４３７】
工程５：一本鎖の鋳型を単離する
その後の選別および増幅周期について、増幅したＰＣＲ生成物の鋳型でない鎖を除去すべきである。この工程は、ビオチニル化した鋳型のオリゴの特異的精製を用いて行う。
手順：
５０μｌのストレプトアビジン−セファロース６Ｂを、結合緩衝剤１ｍｌによって三回洗浄する。洗浄したビーズを、工程４由来のＰＣＲ生成物の２５μｌ（＜１０ピコモル）と共に、１００μｌの結合緩衝剤中で３０分間２５℃でインキュベートした。ビーズを収集するために、試料を軽く回転させる。上澄みを除去し、８００μｌの水を用いて５回洗浄する。ビーズを、２分間室温で１０ｍＭの水酸化ナトリウム５００μｌ中に再び懸濁する。上澄みを除去し、ビーズを１００μｌの水中１００ｍＭのビオチンに、再び懸濁する。溶出のために、試料を攪拌しながら９５℃で１０分間インキュベートする。その後、過剰のビオチンを、マイクロスピンゲル濾過によって除去する。
【０４３８】
工程６：鋳型のオリゴの新しい集団を、工程１由来のタグ付加したペプチドのライブラリーにアニーリングする
インテグリンαＶ／β３受容体に対するリガンドを表す配列を濃縮している、一本鎖の鋳型のオリゴヌクレオチドの新しい集団を、工程２で述べたように工程１由来のタグ付加したペプチドのライブラリーにアニーリングし、さらに他の選別および増幅の周期に付す。
選別および増幅手順（工程２−６）を、５周期反復する。
【０４３９】
工程７：リガンドの識別
リガンドエンティティまたはエンティティに対して特異的な、濃縮した二本鎖ＤＮＡ断片の識別部は、Ｍ１３ｍｐ１８プラスミドベクター中でＤＮＡクローニングし、配列の分析によって個別のクローンを検査することによって、確立される。統計の目的のために、３０より多くのクローンを、配列決定してクローニングした配列のタグのプールの内の主要な配列を識別する。クローニングした主要なＤＮＡ配列はリガンドに対応するので、配列のバイアスは、直接、さらなる実験に適したリガンドの候補を識別する。
【０４４０】
実施例１２
次の例は、配列のライブラリーから単離した小分子を表すＤＮＡ配列を識別するための、タグ付加の原理の利用を例示する。原理を図中に概略的に示す。
ストレプトアビジンと結合する複合体の識別のための、ビオチンおよびグルタチオンのＤＮＡタグ付加
【０４４１】
材料：
・ストレプトアビジンセファロース６Ｂ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ）
・Ｔａｑ−ポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）および１０ＸＴａｑ−ポリメラーゼ緩衝剤
・結合緩衝剤［１００ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化マグネシウム、５０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ７．５］
・ＳＰＤＰ［Ｎ−コハク酸イミジル３（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸］（Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ、カタログ：Ｓ−１５３１）
・Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミジルエステル−ビオチン（Ｆｌｕｋａ番号１４４０５）
・グルタチオン（Ｓｉｇｍａ）
・マイクロバイオスピン６（Ｂｉｏ−Ｒａｄカタログ番号：７３２−６２２１）
・Ｔ７エキソヌクレアーゼ（遺伝子６）および５×緩衝剤
【０４４２】
・次の配列を有するタグ付加オリゴヌクレオチド：
【化１０１】
0005643398.tif 000104
式中、Ｘ＝、ペプチド、小分子またはポリマーのような機能エンティティの結合に適している５'Ｃ６アミノ修飾因子（グレンリサーチ、カタログ番号１０−１０３９−９０）である。ＮはＧ、Ａ、ＴまたはＣである。
【０４４３】
・次の配列を有する相補的（鋳型）オリゴヌクレオチド：
【化１０２】
0005643398.tif 000105
式中、Ｓは、ＤＮＡ主鎖中のモノチオリン酸塩の位置を意味する。下線を引いた１０のヌクレオチド配列は、各々のタグ付加オリゴヌクレオチドまたはタグ付加オリゴヌクレオチドのプールに独特であり、独特の対の相補的なオリゴヌクレオチドを有する。太線で強調した配列は、クローニングの目的に適している。
・ＰＣＲ増幅のためのオリゴヌクレオチド
【化１０３】
0005643398.tif 000106
式中、Ｓは、ＤＮＡ主鎖中のモノチオリン酸塩の位置を意味する。
【０４４４】
プロトコール
工程１：ＴＯ番号１を用いたビオチンのタグ付加、およびＴＯ番号２を用いたグルタチオンのタグ付加
全てのＴＯオリゴヌクレオチドは、小分子の共有結合のために用い得る、単一の５'末端のアミノ求核基（Ｘ）を含む。ビオチンは、次の反応においてＮＨＳ−ビオチン（Ｍｅｒｃｋ）を用いて、ＴＯ番号１のアミノ基と結合する。
【０４４５】
【化１０４】
0005643398.tif 000107
【０４４６】
グルタチオンは、次の反応において、ヘテロ二官能性架橋リンカーＳＰＤＰを用いて、オリゴヌクレオチドのプールに結合する。
【化１０５】
0005643398.tif 000108
【０４４７】
手順：
ＴＯ番号１を用いたビオチンのタグ付加：
５ナノモルのＴＯ番号１のオリゴヌクレオチドを乾燥させ、１００ｍＭのヘペス−ＯＨ緩衝剤（ｐＨ７．５）８０μｌ中に再び懸濁する。５０ｍＭのＮＨＳ−ビオチン（ＤＭＳＯ中）２０μｌをオリゴヌクレオチドに付加し、試料を３０℃で２時間インキュベートする。試料を、マイクロスピン６カラム上での精製の前に、２００μｌの酢酸エチルを用いて２回抽出する。ビオチンのタグ付加を、エレクトロスプレーＭＳを用いて検証する（Ｂｒｕｋｅｒ社）。
ＴＯ番号２を用いたグルタチオン（ＧＳＨ）のタグ付加：
５ナノモルのＴＯ番号２を乾燥させ、１００ｍＭのヘペス−ＯＨ（ｐＨ７．５）１６０μｌ中に再び懸濁する。２０ｍＭのＳＰＤＰ（ＤＭＳＯ中）４０μｌを付加し、試料を３０℃で２時間インキュベートする。試料を３×５００μｌの酢酸エチルを用いて抽出し、スピードバック中で１０分間乾燥させる。試料を、１００ｍＭのヘペス−ＯＨによって平衡に達したマイクロバイオスピン６カラムを用いて精製する。０．１ＭのＧＳＨ１０μｌを付加し、試料を２５℃で２時間インキュベートする。２Ｍの酢酸アンモニウム／エタノールを用いて２回沈殿させる。５０μｌの水中に再び溶解し、エレクトロスプレーＭＳ分析（Ｂｒｕｋｅｒ社）によってタグ付加を検証する。
単一のビオチン配列タグおよび６５５３６の異なるグルタチオン配列タグは、総計６５５３７の異なる配列タグを含む。ライブラリーを、等モル量の各々の配列タグを含むように混合する。結果として、ライブラリーは、タグ付加したビオチンよりも６５５３６倍の過剰の、タグ付加したグルタチオンからなる。
【０４４８】
工程２：相補的なオリゴヌクレオチド（ＣＯ番号１および２）を、工程１由来のＴＯ複合体にアニーリングする
手順：
総計１０ピコモルのタグ付加したライブラリー分子を、総体積１００μｌで、結合緩衝剤［１００ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化マグネシウム、５０ｍＭのヘペス−ＯＨ、ｐＨ７．５］中に、ＣＯ番号１より６５５３６倍過剰のＣＯ番号２を含む２０ピコモルの鋳型分子（ＣＯ番号１および２）を含む混合物に付加する。試料を８０℃まで２分間加熱し、室温まで３０分間以上ゆっくりと冷却する。
【０４４９】
工程３：二本鎖のＤＮＡ複合体を精製する（任意）
アニーリングに続いて、相補的なオリゴヌクレオチド配列にアニーリングしたタグ付加した分子のみが、機能エンティティおよびモノチオリン酸塩主鎖ハンドルを共に含むであろう（図１参照）。結果として、選別工程において「ノイズ」を減少させるために、一本鎖のタグ付加した分子を、モノチオリン酸ハンドルを用いた前選別工程において、ライブラリーから除去し得る。
手順：
５０μｌの活性化したチオプロピルセファローススラリーを、ビーズを１００μｌの結合緩衝剤中に再び懸濁する前に、３×１ｍｌの結合緩衝剤中で洗浄する。ＣＯ／ＴＯアニーリング混合物を、チオプロピルセファロースビーズに付加し、攪拌しながら３０℃で３０分間インキュベートする。その後、ビーズをペリットにして、上澄みを廃棄し、ビーズを１ｍｌの結合緩衝剤で三回洗浄する。ビーズを１００μｌの結合緩衝剤結合緩衝剤中に再び懸濁し、最後にＣＯ／ＴＯ複合体が結合緩衝剤中の５０ｍＭのＤＴＴ１００μｌによるインキュベーションを用いて解放される。溶出したＣＯ／ＴＯ複合体を、新しい管に除去する。
【０４５０】
工程４：ストレプトアビジンに結合するリガンドについてのライブラリーを濃縮する
分子のライブラリーを、ストレプトアビジンセファロース６Ｂに対する結合について検査する。
手順：
５０μｌのストレプトアビジン−セファロース６Ｂスラリーを、結合緩衝剤１ｍｌによって３回洗浄する。工程３で溶出したライブラリー分子１０μｌを、ストレプトアビジンと共に、結合緩衝剤１００μｌ中で、１０分間２５℃で攪拌しながらインキュベートする。その後、試料を結合緩衝剤１ｍｌを用いて５回洗浄する。リガンドＤＮＡを、試料を１００μｌの水中で９５℃で５分間インキュベートすることによって溶出する。試料を、室温まで冷却する。試料１μｌを、１０ピコモルの各々のＡＯ番号１および２を外部のプライマーとして用いた、１０ｍＭのトリス塩酸ｐＨ９．０、５０ｍＭの塩化カリウム、１ｍＭの塩化マグネシウム、０．１％トライトンＸ−１００、各々２５０ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを含む反応系における、ＰＣＲ増幅のために用いる。試料を、最初に９４℃で２分間変性させ、３０周期９４℃で３０秒間変性し、４４℃で３０秒間アニーリングして７２℃で１５秒間伸長することによって、精製する。最後に、試料を沈殿させる。
【０４５１】
工程５：一本鎖の鋳型を単離する
その後の選別および増幅周期のために、増幅したＰＣＲ生成物の鋳型でない鎖を除去すべきである。この工程は、モノチオリン酸主鎖を含む鋳型のオリゴ鎖の特異的精製を用いて行う。
手順：
二本鎖のＰＣＲ生成物を、ファージＴ７（遺伝子６）エキソヌクレアーゼを用いた、エキソヌクレアーゼ消化に付す。この酵素は、ＤＮＡ主鎖中にモノチオリン酸が存在することによって阻害される、二本鎖特異的５'エキソヌクレアーゼである。工程４由来の二本鎖ＰＣＲ生成物２０μｌを、５０単位のＴ７エキソヌクレアーゼ酵素を付加する前に、エキソヌクレアーゼＴ７緩衝剤中でインキュベートする。試料を３０℃で１０分間インキュベートする。試料を、酢酸アンモニウム／エタノールを用いて沈殿させる前に、１００μｌのフェノールを用いて一度抽出する。試料を水中に再び懸濁する。
【０４５２】
工程６：鋳型のオリゴの新しい集団を、工程１由来のタグ付加した分子のライブラリーにアニーリングする
ストレプトアビジンに対するリガンドを表す配列を濃縮している、一本鎖の鋳型のオリゴヌクレオチドの新しい集団を、工程２で述べたように工程１由来のタグ付加した分子のライブラリーにアニーリングし、さらに他の選別および増幅の周期に付す。
選別および増幅手順（工程２−６）を、５周期反復する。
【０４５３】
工程７：リガンドの識別
リガンドエンティティまたはエンティティに対して特異的な、濃縮した二本鎖ＤＮＡ断片の識別部は、Ｍ１３ｍｐ１８プラスミドベクター中でＤＮＡクローニングし、配列の分析によって個別のクローンを検査することによって、確立される。統計の目的のために、３０より多くのクローンを、配列決定してクローニングした配列のタグのプールの内の主要な配列を識別する。クローニングした主要なＤＮＡ配列はリガンドに対応するので、配列のバイアスは、直接、さらなる実験に適したリガンドの候補を識別する。
【０４５４】
実施例１３：分離した画分のコード化手順（様式２）を用いた、プールコード化手順（様式１）から得られた識別部上へのコード化
この例によって、様式１のコード化を用いて得られたコドンを含む識別部の反応体の、様式２のコード化を実行するために用いられる実験条件を述べる。様式１のコード化は、前出の例、特に実施例７において述べたように実行する。本実施例は、コード化様式１および２を組み合わせる一般的原理を例証する。
コード化した識別部の伸長および反応体の輸送を、ジッパー合成ブロックに負荷した機能エンティティをコードする、一つの特定のジッパー合成ブロックおよび一つの特定のアンチコドンオリゴヌクレオチドを混合するところの、別々のウェル中で実行する。この方法はまた、遊離反応体に対して用いられ得る。
【０４５５】
コード化様式２を用いた伸長
この例において、放射線標識した識別オリゴヌクレオチド（Ｅ５７）を、特定のジッパー合成ブロック（Ｅ３２）および以下に示すようなアンチコドン配列（アンチコドン１）を有するアンチコドンオリゴヌクレオチド（ＣＤ−Ｍ−８−０１７２−０００１）を混合する。他の実験において、異なるアンチコドン配列（アンチコドンＸ）を有する異なるアンチコドンオリゴヌクレオチド（Ｅ６０）を、参考試料として用いた。
【０４５６】
【化１０６】
0005643398.tif 000109
【０４５７】
（以下に示すような）オリゴヌクレオチドの組み合わせを、別々の画分において混合し、ジッパー合成ブロックおよびアンチコドンオリゴヌクレオチドの組の特異的アニーリングを可能にする。伸長を、伸長緩衝剤［２０ｍＭのヘペス、８ｍＭの塩化マグネシウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム］中において、１ピコモルの識別オリゴヌクレオチド、２ピコモルのジッパー合成ブロック、２ピコモルのアンチコドンを最終体積１０μｌで用いて行った。オリゴヌクレオチドを加熱し、その後ＰＣＲ機械において８０−２０℃から徐々に再びアニーリングすることが可能となる。アニーリングした後、０．５ｍＭのｄＮＴＰおよび１３Ｕのシークエナーゼの混合物の試料（約２０μｌ）を付加し、伸長を１時間３０℃で行った。試料を、その後図３１Ａで示される１０％尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。
ゲル分析は、識別部が長いアンチコドン１（レーン２）および短いアンチコドンＸ（レーン３）を共に用いて、完全に伸長されることを示している。結果はまた、混合して伸長する前に最初に識別オリゴヌクレオチドにアニーリングできる場合（レーン４）は、アンチコドンオリゴヌクレオチド間に混合がないことを示している。
【０４５８】
架橋結合
様式１でコード化した分子上の試薬の様式２によるコード化は、識別部を三つのコドンおよびディスプレイした分子と共に用いて、検査した。反応体の輸送を、この例ではジッパー合成ブロックの反応体を識別オリゴヌクレオチドのディスプレイした分子に架橋結合することによって、例証している。輸送を、ゲル上での分析を簡単にするために架橋結合によって検査するが、それはこの種の反応に限ったことではない。
以下に示す（化学構造の）ような機能エンティティをオリゴに結合し、相補的領域を介して識別オリゴヌクレオチドにアニーリングするジッパー合成ブロック（ＣＸ−１）を形成する。このジッパー合成ブロックは、以下に示すようなアンチコドン配列（アンチコドン１）を有するアンチコドンオリゴヌクレオチド（ＣＤ−Ｍ−８−０１７２−０００１）と共に用いられた。他の（対照）実験において、異なるジッパー合成ブロック（Ｅ３２）は、異なるアンチコドン配列（アンチコドンＸ）を有する異なるアンチコドンオリゴヌクレオチド（Ｅ６０）と共に用いられた。
【０４５９】
【化１０７】
0005643398.tif 000110
【０４６０】
オリゴヌクレオチドの組み合わせを、別々の画分において混合し、ジッパー合成ブロックおよびアンチコドンオリゴヌクレオチドの組の特異的アニーリングを可能にする。アニーリングは、伸長緩衝剤［２０ｍＭのヘペス、８ｍＭの塩化マグネシウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム］中において、１ピコモルの識別オリゴヌクレオチド、２ピコモルのジッパー合成ブロック、２ピコモルのアンチコドンを最終体積１０μｌで用いて行った。オリゴヌクレオチドを加熱し、その後ＰＣＲ機械において８０−２０℃から徐々に再びアニーリングすることを可能にした。架橋結合は、５ｍＭのＤＭＴ−ＭＭ試薬を付加し、２時間３７℃でインキュベートすることによって行った。試料を、その後図３１Ｂに示すような１０％尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。
【０４６１】
ゲル分析は、ジッパー合成ブロック（ＣＸ−１）上の機能エンティティは、コドン（レーン２）を含む識別オリゴヌクレオチドに架橋結合するが、一方試薬（Ｅ３２）を欠くジッパー合成ブロックは識別オリゴヌクレオチドと反応することができないことを示している。結果はまた、混合して架橋結合する前に最初に識別オリゴヌクレオチドにアニーリングできる場合（レーン４）は、ジッパー合成ブロックオリゴヌクレオチド間に混合がないことを示している。
本発明は特定の方法および具体例に関する参考文献と共に記述しているが、様々な修正および変更を本発明の範疇から外れることなく行ってよいことが、理解されるであろう。
【０４６２】
実施例１４：インテグリン受容体αＶβ３リガンドをディスプレイする二官能性複合体由来のコード部の濃縮
実施例１４．１Ｌ１−ＲＧＤおよびＬ１−ｃＲＧＤの形成
オリゴヌクレオチドＬ１−ＮＨ２を、５００ｍＭのヘペス水酸化カリウム、ｐＨ７．５８０μｌの混合物中の４ナノモルのＬ１−ＮＨ２、およびＤＭＳＯ中２５ｍＭのＢＭＰＳ２０μｌを混合し、その後２時間３０℃でインキュベートすることによって、ｃＲＧＤペプチドおよびＲＧＤペプチドをそれぞれタグ付加するために用いた。ＢＭＰＳで活性化したＬ１−ＮＨ２オリゴヌクレオチドを、酢酸エチルで３回洗浄して結合していないＢＭＰＳを除去し、過剰の酢酸エチルを真空蒸留法によって蒸発させた。１００ｍＭのｃＲＧＤまたはＲＧＤペプチド１０μｌをそれぞれ付加し、反応系を室温で一晩中インキュベートした。インキュベートした後、ｃＲＧＤまたはＲＧＤタグ付加したオリゴヌクレオチドから、ゲル濾過によって過剰の結合していないペプチドを除去した。ペプチドのタグ付加は、質量分光測定分析によって確認され、タグ付加した生成物は、それぞれＬ１−ｃＲＧＤおよびＬ１−ＲＧＤと呼ばれる。
【０４６３】
材料：
Ｌ１−ＮＨ２（６−８−ＣＡＧＣＴＴＧＧＡＣＡＣＣＡＣＧＴＣＡＴＡＣ、６＝ＬＨ１９３、８＝ＰＣスペーサー）は、ＤＮＡ技術、Ａａｒｈｕｓ、デンマークから得られた。ＰＣスペーサーは、光で切断可能なリンカー（グレンリサーチ、生成物カタログ番号１０−４９１３）である。ＢＭＰＳ（Ｎ−［β−マレイミドプロピルオキシ］コハク酸イミドエステル）は、Ｐｉｅｒｃｅ（カタログ番号２２２９８）から得られた。ＬＨ１９３（ジイソプロピル−ホスホルアミド酸２−シアノ−エチルエステル２−［２−（２−｛２−［２−（２−｛［（４−メトキシ−フェニル）−ジフェニル−メチル］−アミノ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エチルエステル）を次の方法に従って合成した：
【０４６４】
【化１０８】
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【０４６５】
市販で入手できるヘキサエチレングリコールを、ＴＢＤＭＳ−Ｃｌ、イミダゾールおよびＤＭＡＰを用いて、５７％の収率で選択的にモノＴＢＤＭＳで保護した。遊離アルコール官能基を、標準的な三つの工程のプロトコールによって、アミン官能基に変換した：ピリジン中のトシルクロリドによって活性化し、続いてＤＭＦ中のアジ化ナトリウムによって求核置換し、その後、三つの工程について全体の９５％を、Ｐｄ／ＣおよびＨ２を用いて反応させた。アミン官能基をその後９９％の収率で４−モノメトキシトリチル（ＭＭＴ）によって保護し、ＴＢＤＭＳ基をＴＢＡＦを用いて除去した。遊離ヒドロキシ官能基を、最後にテトラゾール触媒の下でシアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトライソプロピルホスホルジアミダイトと反応させ、８２％の収率で望ましい化合物を得た。３１Ｐｎｍｒ（ＣＤＣｌ３）＝１４８．５ｐｐｍ
【０４６６】
１４．２Ｌ１−Ｆ５の形成：
１００ｍＭのホウ酸ナトリウムｐＨ８．０の５０μｌ中の、５ナノモルのＬ１−ＮＨ２、５０ｍＭのＤＭＴＭＭおよび１０ｍＭのＦ５の混合物を、一晩中３０℃でインキュベーションし、オリゴヌクレオチドタグ付加したＦ５から、ゲル濾過によって過剰の非結合Ｆ５を除去した。その後、負荷したオリゴを、スピード真空蒸留によって乾燥させ、１００ｍＭの水酸化ナトリウム５０マイクロリットル中に再び懸濁し、Ｆ５の分子を脱保護（エステル切断およびＮ−アセトアミド切断）するために一晩中５０℃で放置した。脱保護した後、懸濁液を塩酸で中和し、Ｆ５の負荷を質量分光測定分析によって確認した。Ｆ５のタグ付加を質量分光測定分析によって確認した。タグ付加した生成物は、Ｌ１−Ｆ５と呼ばれる。
【０４６７】
材料：
ＤＭＴＭＭ（４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウム塩化物）を、Ｋａｍｉｎｓｋｉら（ＪＯＣ（１９９８），６３，４２４８−５５）に従って、市販で入手できるＮ−メチルモルホリンおよび２−クロロ−４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジンから調製した。
Ｆ５（エステルおよびＮ−アセチル誘導体）を次の方法に従って合成した：
【０４６８】
【化１０９】
0005643398.tif 000112
【０４６９】
タグ付加した生成物Ｌ１−Ｆ５は、遊離カルボン酸（ホモグリシン部分）および遊離アミノ基（環状アミノピリジン）を担持する。
市販で入手できるテトラエチレングリコールを、収率６７％で、４−ニトロベンゾイルクロリドを用いて、４−ニトロ安息香酸によって単一保護した。その後、残存した最初のアルコールの対応するカルボン酸への酸化を、ＴＥＭＰＯ、亜塩素酸塩および次亜塩素酸塩の混合物を用いて、８１％の収率で行った。化合物を、２−クロロトリチルクロリド樹脂に結合させ、その後ＭｅＯＨ−ＤＭＦ（１：５）中のシアン化カリウムで処理し、４−ニトロベンゾイルエステルを脱保護した。Ｎ−（２−ニトロフェニルスルホニル）活性化したβアラニンメチルエステルを、ミツノブプロトコールを用いて結合した。４−ニトロフェニルスルホニル基を、過剰のメルカプトエタノール／ＤＢＵによる処理によって除去し、その後形成したアミンを、標準的なＦｍｏｃ作用を用いて、二つの次の合成ブロックによってアシル化した。最終的な分子を、エーテル−ＤＣＭ（１：４）中の０．４Ｍの塩酸による処理によって、樹脂から切断した。［Ｍ＋Ｈ］＋（計算上）＝５９５．３０。［Ｍ＋Ｈ］＋（実測）＝５９５．２８。
【０４７０】
１４．３ライブラリー成分１の形成
二本鎖のタグ付加したＬ１−ｃＲＧＤ（Ｌ１−ｃＲＧＤ−Ｔ１と呼ばれる）の形成：
２００ピコモルのＤＮＡ鋳型、Ｔ１（ＧＣＴＡＧＡＧＡＣＧＴＧＧＴＧＧＡＧＧＡＡＧＴＣＴＴＣＣＴＡＧＡＡＧＣＴＧＧＡＴＡＴＣＡＣＣＡＣＡＴＣＴＣＴＡＧＣＡＧＣＴＡＧＴＡＴＧＡＣＧＴＧＧＴＧＴＣＣＡＡＧＣＴＧ）を、５０ピコモルのＬ１−ｃＲＧＤにアニーリングした。その後、Ｌ１−ｃＲＧＤオリゴを、ＤＮＡポリメラーゼ（シークエナーゼ）によって伸長した。配列は、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手した（カタログ番号７０７７５Ｙ）。
【０４７１】
１４．４ライブラリー成分２の形成
二本鎖のタグ付加したＬ１−ＲＧＤ、Ｌ１−ＲＧＤ−Ｔ２と呼ばれる：
２００ピコモルのＴ２（ＧＣＴＡＧＡＧＡＣＧＴＧＧＴＧＧＡＧＧＡＡＧＴＣＴＴＣＣＴＡＧＡＡＧＣＴＧＧＡＴＡＴＣＡＧＧＴＣＴＴＣＴＧＴＣＴＴＣＴＴＣＣＧＴＡＴＧＡＣＧＴＧＧＴＧＴＣＣＡＡＧＣＴＧ）を、５０ピコモルのＬ１−ＲＧＤにアニーリングした。その後、Ｌ１−ＲＧＤオリゴを、ＤＮＡポリメラーゼ（シークエナーゼ）によって上記したように伸長した。
【０４７２】
１４．５ライブラリー成分３の形成
二本鎖のＬ１−Ｆ５、Ｌ１−Ｆ５−Ｔ３と呼ばれる：
２００ピコモルのＴ３（ＧＣＴＡＧＡＧＡＣＧＴＧＧＴＧＧＡＧＧＡＡＧＴＣＴＴＣＣＴＡＧＡＡＧＣＴＧＧＡＴＡＴＣＴＴＣＡＧＴＴＣＴＣＧＡＣＴＣＣＴＧＡＧＴＡＴＧＡＣＧＴＧＧＴＧＴＣＣＡＡＧＣＴＧ）を、５０ピコモルのＬ１−Ｆ５にアニーリングした。その後、Ｌ１−Ｆ５オリゴを、ＤＮＡポリメラーゼ（シークエナーゼ）によって上記したように伸長した。
【０４７３】
１４．６ライブラリー成分４の形成
二本鎖のＬ１−ＮＨ２、Ｌ１−ＮＨ２−Ｔ４と呼ばれる：
５０ピコモルのＴ４（ＧＣＴＡＧＡＧＡＣＧＴＧＧＴＧＧＡＧＧＡＡＧＴＣＴＴＣＣＴＡＧＡＡＧＣＴＧＧＡＴＡＴＣＴＧＡＣＧＴＧＴＴＧＡＣＧＴＡＣＡＣＡＧＴＡＴＧＡＣＧＴＧＧＴＧＴＣＣＡＡＧＣＴＧ）を、２００ピコモルのＬ１−ＮＨ２にアニーリングした。その後、Ｌ１−ＮＨ２オリゴを、ＤＮＡポリメラーゼ（シークエナーゼ）によって上記したように伸長した。
総計５０ピコモルの、各々のライブラリーの成分、Ｌ１−ｃＲＧＤ−Ｔ１、Ｌ１−ＲＧＤ−Ｔ２、Ｌ１−Ｆ５−Ｔ３およびＬ１−ＮＨ２−Ｔ４を生成した。
【０４７４】
１４．７濃縮
インテグリン結合複合体の濃縮を、０．０４μｇ／ウェルのインテグリン受容体αＶβ３をＮｕｎｃ免疫修飾分子Ｕ８マキシソープ（Ｂｉｏｔｅｃｌｉｎｅ  カタログ番号Ｎｕｎ−４７５０７）中で被覆することによって、行った。
ある実験において（図３２）、Ｌ１−ｃＲＧＤ−Ｔ１、Ｌ１−ＲＧＤ−Ｔ２、Ｌ１−Ｆ５−Ｔ３およびＬ１−ＮＨ２−Ｔ４を、１００μｌの緩衝剤Ａ（トリス緩衝剤で処理した食塩水、０．０５％のツゥイーン、２０．１％の牛血清アルブミン、０．１ｍｇ／ｍＬのニシンの精子のＤＮＡ）中に、Ｌ１−ＮＨ２−Ｔ４複合体１ピコモル、Ｌ１−ｃＲＧＤ−Ｔ１複合体１／１００００００ピコモル、Ｌ１−ＲＧＤ−Ｔ２複合体１／１０００００ピコモルおよびＬ１−Ｆ５−Ｔ３複合体１／１００００ピコモルの比率で混合した。インテグリンで被覆したウェルのインキュベーションを、９０分間２５℃で行った。リガンドが結合した後、全てのウェルを２５０μＬの緩衝剤Ａで１時間２０回洗浄した。その後、１００μＬの緩衝剤Ａを各々のウェルに加え、ＰＣスペーサーを切断し、それによってＤＮＡの鋳型をリガンド分子から切断するために、ウェルを３５０ナノメーターの紫外線光に３０秒間曝露した。紫外線光に曝露した後、溶出液体積を直ちに除去し、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）によって、ＤＮＡ鎖Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３およびＴ４の存在について分析した。
【０４７５】
類似した実験（図３３）において、Ｌ１−ｃＲＧＤ−Ｔ１、Ｌ１−ＲＧＤ−Ｔ２、Ｌ１−Ｆ５−Ｔ３およびＬ１−ＮＨ２−Ｔ４を、１００μｌの緩衝剤Ａ中に、Ｌ１−ＮＨ２−Ｔ４複合体１ピコモル、Ｌ１−ｃＲＧＤ−Ｔ１複合体１／１００００ピコモル、Ｌ１−ＲＧＤ−Ｔ２複合体１／１００００ピコモルおよびＬ１−Ｆ５−Ｔ３複合体１／１００００ピコモルの比率で混合した。その他のアッセイ条件は上記したとおりであった。
【０４７６】
（９６ウェルプレートのために）前もって混合した５ｍＬについて、２．５ｍＬのＴａｑｍａｎユニバーサル塩基ＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、４５０μＬのＲＰｖ２（ＧＴＣＡＧＡＧＡＣＧＴＧＧＴＧＧＡＧＧＡＡ）（１０ピコモル／μｌ）、２５μＬのＴａｑｍａｎプローブ（６−ＦＡＭ−ＴＣＣＡＧＣＴＴＣＴＡＧＧＡＡＧＡＣＭＧＢＮＦＱ；５０μＭ）および１０７５μＬの水と混合した。
前もって混合した４０．５μＬを、各々のウェルに等分し、直接関連する上流のＰＣＲプライマー（ＦＰｖ２（ＣＡＧＣＴＴＧＧＡＣＡＣＣＡＣＧＴＣＡＴＡＣ）（標準曲線について）、または鋳型特異的プライマー、Ｔ１に特異的なＰ１（ＧＴＣＡＴＡＣＴＡＧＣＴＧＣＴＡＧＡＧＡＴＧＴＧＧＴＧＡＴＡ）、Ｔ２に特異的なＰ−２（ＣＡＴＡＣＧＧＡＡＧＡＡＧＡＣＡＧＡＡＧＡＣＣＴＧＡＴＡ）、Ｔ３に特異的なＰ−３（ＴＣＡＴＡＣＴＣＡＧＧＡＧＴＣＧＡＧＡＡＣＴＧＡＡＧＡＴＡ）またはＴ４に特異的なＰ−４（ＣＡＴＡＣＴＧＴＧＴＡＣＧＴＣＡＡＣＡＣＧＴＣＡＧＡＴＡ）のうち一つ；１０ピコモル／μＬ）４．５μＬおよび５μＬの試料（ネガティブコントロールについてはウェル中に水）を加えた。
【０４７７】
標準曲線について試料を、Ｔ４を１０８コピー／５μＬに希釈し、その後この試料を１０倍に連続して希釈を行うことにより調製した。５μＬを各々のＱ−ＰＣＲ反応に用いた。
温度の周期変化／蛍光の測定を、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＡＢＩプリズム７９００ＨＴリアルタイム計器上で、周期変化するパラメーター：９５℃で１０分、９５℃で１５秒と６４℃で１分を４０周期を利用して行った。
【０４７８】
図３２から、二本鎖のＤＮＡ複合体Ｌ１−ｃＲＧＤ−Ｔ１、Ｌ１−ＲＧＤ−Ｔ２、Ｌ１−Ｆ５−Ｔ３は、投与量の比率を濃縮した産出量の比率と比較して考えると、それぞれＬ１−ＮＨ２−Ｔ４よりもおよそ１００万倍、１０００００倍および３００００倍濃縮されている。Ｌ１−ｃＲＧＤ−Ｔ１、Ｌ１−ＲＧＤ−Ｔ２、Ｌ１−Ｆ５−Ｔ３は、ウェルにおけるインキュベーション後、インテグリン受容体なしでは検出し得なかった。
図３３は、Ｌ１−ｃＲＧＤ−Ｔ１、Ｌ１−ＲＧＤ−Ｔ２およびＬ１−Ｆ５−Ｔ３それぞれの濃縮を示す。リガンドＤＮＡ複合体は異なったように濃縮される。これは、三つの分子の電離定数が異なるためにもっとも起こり得ることである。Ｌ１−ｃＲＧＤ−Ｔ１、Ｌ１−ＲＧＤ−Ｔ２およびＬ１−Ｆ５−Ｔ３は、ウェルにおけるインキュベーション後、インテグリン受容体なしでは検出し得なかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【配列表】
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