(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＲＳ活性を有する金属の粒径１００nm以下のナノ粒子（クラスタを含む）として銀イオンを含み、かつ該銀のイオンと金属錯体を形成する配位子を供給する配位化合物を含む銀ナノ粒子（クラスタを含む）１００〜５０００ppm 分散液を、銀の電極電位より卑なる（高い）電極電位を有する銅又は銅合金からなる基板上で電極電位差により凝集させ、上記分散液中のＳＥＲＳ活性を有する金属を表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）活性を有する凝集状態で凝集停止させてなる凝集領域を有することを特徴とする表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）光測定用基板。
【請求項２】
銅又は銅合金からなる基板を用意する一方、ＳＥＲＳ活性を有する金属の粒径１００nm以下のナノ粒子（クラスタを含む）として銀イオンを含み、かつ該銀のイオンと金属錯体を形成する配位子を供給する配位化合物を含む銀ナノ粒子（クラスタを含む）の１００〜５０００ppm 分散液を用意し、該分散液を滴下して銀ナノ粒子を表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）活性を有する状態で凝集を停止させ、請求項１に記載の基板を形成する工程と、該基板の凝集領域に被検出試料を付着させる工程と、金属ナノ粒子表面に吸着させた被検出試料に所定のレーザ光を照射しラマン散乱光を測定する工程を含むことを特徴とする表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）光測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、再現性の高い表面増強ラマン散乱（以下、ＳＥＲＳと略す）活性を有する測定基板及びそれを用いる表面増強ラマン光測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ライフサイエンスを中心とするバイオの分野において、細胞上の単一分子（例えばタンパク質）の計測を行い、病気のメカニズムや生命現象を解明したいという需要が高まってきている。それらの需要を満たすためには、細胞を生きたまま、非標識で観察可能な超高感度分析技術が必要不可欠となっている。【０００３】
現在、バイオの分野の検出法として、表面増強ラマン分光法（Surface Enhanced Raman Spectroscopy）が「ラマン効果による分光法」と「金属表面における光の増強効果」を組み合わせた物質の同定などに用いる超高感度分析方法として注目されている。ラマン効果とは、物質に光が入射したとき、散乱した光の中に入射した光の波長とは異なる波長の光が含まれる現象（非弾性散乱）である。このときの散乱光をラマン散乱光と呼ぶ。ラマン効果により散乱した光と入射光のエネルギーの差は物質内の分子や結晶の振動純位や回転準位、もしくは電子準位のエネルギーに対応しているので、分子や結晶はその構造に応じた特有の振動エネルギーをもつため、単色光であるレーザを入射光として用い、その分子固有のエネルギー状態を反映した光に変調される現象を利用して、スペクトルから化学種を同定し、その散乱光強度から目的物質の定量を行うラマン分光法が知られている。しかしながら、ラマン分光法の感度は本質的に低いため、微少量の試料分析には適していない。【０００４】
他方、金属ナノ粒子においては金属表面に存在する自由電子が集合的に振動する現象であるプラズモンが金属表面に存在し、この表面プラズモンは可視〜近赤外領域の光電場とカップリングさせることによって、金属ナノ粒子表面において著しく電場を増強させる。この表面プラズモン共鳴（Surface ）を利用することによって、金属ナノ粒子表面に吸着させた分子にレーザ光を照射し吸着分子から発生するラマン散乱光を飛躍的に増強させるので、表面増強ラマン分光法が注目されるに至っている。その一つとして金、銀等の貴金属電極やコロイドの表面に物質が吸着させ、分子単独に比べ振動スペクトルが増強されることを利用したＳＥＲＳ測定が行われている（特許文献１）。【０００５】
このＳＥＲＳ測定は、微量物質の構造解析に有用な手法であるが、現在、その手法は、数十〜数百ｎｍ程度の大きさを持った銀や金等の貴金属の微粒子をガラス基板上に蓄積する必要があるといわれ、従来は溶液中で銀あるいは金のコロイド粒子を合成し、リジンやシアンで修飾した基板上に固定する必要がある（非特許文献１、２、３、特許文献２）。特に、特許文献２では、凝集防止をしたコロイドをゲル化し、塗布乾燥して基板とするいわゆるｄｒｏｐ＆ｄｒｙ法が採用され、主流となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平７−１４６２９５号公報
【特許文献２】特開平１１−６１２０９号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓ．Ｎie and Ｓ．Ｒ．Ｅmory，Ｓcience．２７５，１１０２（１９９７）
【非特許文献２】Ｋ．Ｃ．Ｇrabar，Ｐ．Ｃ．Ｓmith，Ｍ．Ｄ．Ｍusick，Ｊ．Ａ．Ｄavis，Ｄ．Ｇ．Ｗalter，Ｍ．Ａ．Ｊackson，Ａ．Ｐ．Ｇuthrie and Ｍ．Ｊ．Ｎatan，Ｊ．Ａm．Ｃhem，Ｓoc．，１１８，１１４８（１９９６）
【非特許文献３】Ｒ．Ｍ．Ｂright，Ｍ．Ｄ．Ｍusick and Ｍ．Ｈ．Ｎatan，Ｌangmuir，１４，５６９５（１９９８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、ｄｒｏｐ＆ｄｒｙ法は測定に時間を要し、被検体を迅速にかつ正確に検出するには、被検体を滴下後即時非乾燥状態（ｄｒｏｐ  ｉｎ  ｓｉｔｕ）で検出することが必要であり、病気の診断等、気相中の極微量の化学種の分析を行うには現在未だ不十分であるといえる。【０００９】
なぜなら、例えば、銀のナノ粒子は溶液中では強い活性を持つが、乾燥させるとナノ粒子の大きさが変化して、活性が下がってしまうためであり、又、金のナノ粒子は、大気中でも安定であるが、銀と比べて元々のＳＥＲＳ活性が低い上に、ナノ粒子分散液ではガラス基板の上に固定できる密度が非常に小さいからである。【００１０】
本発明は、表面プラズモン共鳴による電場増強効果が顕著に発生する場所（ホットサイト）は主に近接した金属ナノ粒子又はクラスタ間やエッジ形状の先端などで顕著に発生していることに鑑み、かかるホットサイトとなる金属ナノ粒子の凝集状態を制御しながら形成し、試料の滴下後即時検出できる測定基板及びそれを用いる測定方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、銀ナノ粒子またはクラスタ分散液が銅又は銅合金基板上で即時凝集を開始し始めて定着し、即時表面増強ラマン散乱光測定可能な状態となることに着目してなされたもので、ＳＥＲＳ活性を有する金属の粒径１００ｎｍ以下のナノ粒子（クラスタを含む）１００〜５０００ｐｐｍを含む分散液をその金属の電極電位より卑なる（高い）電極電位を有する金属基板上で凝集させ、所望の凝集状態で凝集停止させて凝集領域が表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）測定のためのホットサイトを形成していることを特徴とする表面増強ラマン散乱光測定用基板にある。【００１２】
本発明によれば、金属ナノ粒子又はクラスタ分散液からの凝集過程で金属ナノ粒子又はクラスタは金属基板上に定着し付着強度が強固で凝集過程で分散液を拭い去っても、この凝集膜は容易に剥離せず、その時点で凝集はほぼ停止させることができる。したがって、金属ナノ粒子分散液に被検出試料を分散させ、これを金属基板上に滴下凝集させつつレーザ光を照射してもよいが、金属ナノ粒子分散液のみを金属基板上に滴下し適時凝集過程で拭い去って乾燥させ、ラマン散乱光検出に有効な金属ナノ粒子のホットサイトのための凝集域を形成した測定基板を用意することで、これに被検出溶液を滴下することにより最適化されたラマン散乱光の測定が可能となる。【００１３】
金属ナノ粒子又はクラスタが２個以上連鎖し、少なくとも１０ｎｍ以下の粒子間距離に調整されたホットサイトを単位面積当たり複数個有する測定基板であるのが好ましい。ここで、金属ナノ粒子とは粒径が１００ｎｍ以下の金属粒子をいい、物理的に粉砕して製造することができるが、金属イオンを還元又は金属イオンを錯体化してそのまま凝集させても製造することができる。以下、金属ナノ粒子というときは粒径が１００ｎｍ以下の金属粒子またはクラスタをいい、金属イオンを還元して凝集させたものだけでなく、金属イオンを分散剤を介して凝集させたクラスタを含む。金属ナノ粒子の調整法としては金属イオンを還元して、金属原子、金属クラスタを経てナノ粒子に調整する化学的方法（鳥越幹二郎等著、触媒、４１５２１（１９９９））、その他物理的方法（特開３−３４２１１号、特開５−９８１９５号）が知られている。特に数十ナノメータ以下のナノ粒子を物理的に製造するのが難しい。そのため、金属電極を電解してイオンを形成し、これを凝集させてクラスタとして製造されるのが好ましい。特に「ナノクラスタ」とは、数個から数百個の原子・分子が集まってできる集合体で、その大きさは数ナノメータから数十ナノメータに至る。【００１４】
前記金属ナノ粒子又はクラスタはＳＥＲＳ活性を有する金属、金、銀及びその合金からなる群より選ばれ、ホットスポットを形成するには粒子又はクラスタ径が５０〜５ｎｍ、２０〜５ｎｍであるのが好ましい。銀ナノ粒子の２連球では粒子径が大きくなるに従ってピークの位置が高くなる現象も見られるが、単位面積当たりのホットサイト数を粒子間やエッジ形状の先端を形成する意味では粒子径の小さい方が有利であると考えられる。また、ナノ粒子又はクラスタの形状は通常球形状であるが、粒子寸法に応じて結果的に単位面積当たりのホットサイト数を増大させることができるように変形させてもよい。【００１５】
金属イオンの分散液中に、金属イオンと金属錯体を形成する配位子を供給する配位化合物を添加するのがクラスタ凝集サイズを調整しやすいので好ましい。配位化合物種とその濃度の調整によって適切なサイズの金属クラスタを形成して分散液を形成することができる。因みに、配位化合物として銀イオンの場合はアンモニア、脂肪族アミン、アミノ酸等のアミノ基を有する配位化合物が知られている。特に好ましい配位化合物としてアミノ基とカルボキシル基とを有するアミノ酸系界面活性剤を含む両性界面活性剤が挙げられ、その中でもアミノ酸系界面活性剤であるＬ−アラニンは０．００１〜０．００２重量％を添加することにより銀イオン溶液は銀イオンの凝集が５〜２０ｎｍに至るナノクラスタを形成することができる。【００１６】
他方、上記金属基板は金属ナノ粒子の種類によって決定され、それより電極電位が卑なるように金、銀、銅およびその合金から選ばれる。基板全体が全て金属である必要はなく、少なくとも分散液中で電位を示す金属表面を有すればよい。したがって、例えば、図７（ａ）に示すように、ガラス又はプラスチック板１上に円形打ち抜き成形して皿状の０．１ｍｍ程度の薄い金属板２を張りつけて製造することができる。この基板は金属部分２が皿状に形成されるので、上記分散液を滴下すると液滴３となって盛り上がる（図７（ｂ）参照）。その後液滴を窒素ブロー等で吹き飛ばすと、金属ナノ粒子の凝集域４が金属表面上に形成されて測定基板が作成される。金属基板の電位は金合金、銀合金、銅合金など合金化技術を使用し、その組成比を調整することにより調製することもできる。また、適度の電圧を負荷して調整することもできる。なお、凝集の速度は検出のタイミング、凝集の程度は粒子間距離に影響を与えるので重要である。なぜなら、４０ｎｍ径の金粒子の２連球での実験によれば、表面プラズモン同士による共鳴現象が粒子間隔１０ｎｍ以下で起こり、１ｎｍまでの間隔の減少により増大し得るからである。また、銀ナノ粒子の凝集では時間とともに検出感度が増大し、その後減少することから凝集が始まってから完全に凝集し終わるまでの過渡期に表面プラズモン同士による共鳴現象による最適凝集間隔が現れ、検出ピークが現れるからである。なお、本発明で使用する基板は金属表面が酸化されているのが金属ナノ粒子の凝集速度を調整することができるので好ましい場合がある。そこで、金属表面を有する基板上に試料を含む金属ナノ粒子分散液を滴下するにあたり、金属表面に酸化物を形成するのが好ましい場合もある。
上述したように、金属基板は凝集対象の金属ナノ粒子又はクラスタとの関係で電極電位を考慮して選択されるが、銀ナノ粒子またはクラスタを凝集させるには銅板、真鍮板又はリン青銅板等の銅合金板が選択されるのが好ましい。この銀ナノクラスタ分散液を金属基板上で凝集させると、金属基板上にＳＥＲＳ活性を有するクラスタが配位子とともに結晶を形成するものと思われ（図５）、ホットサイトの作成に適する凝集領域となる。【００１７】
前記金属ナノ粒子又はクラスタの含有量は５０００から１００ｐｐｍで、特に３０００から５００ｐｐｍが好ましい。高濃度の場合は粒子間密度が高いのでホットサイトを形成するのが速くなる（分散液中に０．００１〜０．００２重量％のＬ−アラニンを含む場合１０００ｐｐｍで６分、２０００ｐｐｍで３分、３０００ｐｐｍで１分程度の凝集時間が適当であった）ので凝集の停止を早くし、低濃度の場合はホットサイトを形成するのが遅くなるので凝集の停止を遅らせる。したがって、通常凝集開始後適切な時間を設定するが、ホットサイトとなる凝集状態は分散液中の金属ナノ粒子又はクラスタの含有量、分散剤、基板金属との電極電位差等が影響するので最適条件を予め決定しておくことが重要である。【００１８】
本発明は、上記測定基板を使用して各種ラマン散乱光を測定することを特徴とする表面増強ラマン散乱光測定方法を提供するもので、表面増強ラマン活性機能を有する金属の１００ｎｍ以下の粒子径のナノ粒子（クラスタを含む）を含む分散液を表面増強ラマン活性機能を有する金属の金属電極電位より卑なる（高い）電極電位を有する金属表面を有する基板上で凝集開始後適時凝集停止させて最適凝集領域を提供する工程と、該金属凝集域に被検出試料を付着させる工程と、非乾燥状態で金属ナノ粒子表面に吸着させた被検出試料に所定のレーザ光を照射し被検出試料から発生するラマン散乱光を測定する工程を含むことを特徴とする表面増強ラマン散乱光測定方法を提供するものである。【００１９】
各種疾病マーカーや各種ウイルスはタンパク分子であり、最適なホットサイトにタンパク分子を吸着させることが表面プラズモン共鳴（Surface ）を活用できる条件となる。本発明者らは、アミノ酸系界面活性剤を使用して銀ナノ粒子又はクラスタの分散液とすると、アミノ酸を介して銀ナノ粒子が金属基板上に凝集する結果、アミノ酸を等電点以上または以下のｐＨ溶液で処理すると、基板上のアミノ酸がたんぱく分子を吸着しやすい電荷に帯電させることができる。したがって、本発明は、粒径５〜１００ｎｍの金または銀ナノ粒子１００〜５０００ｐｐｍを含むコロイド溶液中に少なくともアミノ基とカルボニル基を有する両性電解質を分散させ、該両性電解質を含むコロイド溶液を金属基板上に滴下し、金属基板とナノ金属との電極電位差で凝集を開始させ、最適凝集状態で凝集を停止させた後両性電解質をその等電点以上または以下のｐＨ溶液で処理してプラスまたはマイナス帯電させることにより、被検出タンパク試料を吸着させ、金または銀ナノ粒子にレーザ光を照射し、吸着した被検出タンパク試料から発生するラマン散乱光を測定することを特徴とする表面増強ラマン散乱光測定方法を提供するものでもある。【００２０】
本発明において、前記電解質はアミノ酸系界面活性剤またはタンパク系界面活性剤であって、特にアミノ酸系電解質、グリシン、Ｌ−アラ二ン、リシンなどのカルボキシル基に対しアミノ基が１以上のアミノ酸系電解質が好ましい。アミノ基が銀ナノ粒子の吸着に有利であるからである。また、アミノ酸は等電点以上のｐＨ溶液の処理によりプラス帯電し、等電点以下のｐＨ溶液でマイナス帯電するので、マイナス或いはプラスに帯電するタンパク分子と選択的に電荷吸着しやすいからである。【００２１】
特に抗原抗体反応を利用する場合、本発明で使用する金属ナノ粒子分散液は界面活性剤としてアミノ酸系両性界面活性剤を含むタンパク系界面活性剤であるのが好ましく、該界面活性剤は凝集した金属ナノ粒子間に介在して抗体成分又は抗原成分を金属ナノ粒子間に誘導する役目を果たすと思われる。抗体成分から選択して単独で添加するかアミノ酸系電解質と抗体成分とを併用して添加するのが好ましい。【００２２】
本発明によれば、分散液中での両性電解質を利用して金属基板上に最適な凝集形態を形成することができるとともに、両性電解質の性質を利用してタンパク吸着に必要な電荷を選択形成することができるので、タンパク吸着を確実に行うことができる。しかも本発明では金属ナノ粒子又はクラスタの間隔の調整が凝集時間でコントロールできるので、最適なホットスポットにタンパク分子を吸着させるようにすることができる。したがって、各種タンパク分子のＳＥＲS検出が再現性よく、検出することができ、各疾病マーカー、各種ウイルスの検出が可能となる。【００２３】
本発明において、前記金属ナノ粒子分散液は通常各種分散剤が利用できるが、被検出試料のノイズを形成しないように選択する必要がある。分散剤濃度等の凝集防止効果はコロイド金属、金属基板の電極電位との関係を考慮して最適検出タイミングを設定することができるように考慮すべきである。したがって、本発明は上記測定方法に用いられる分散液であって、表面増強ラマン活性機能を有する金属イオンの分散液中に金属イオンに配位子を供給する配位化合物を添加して金属錯体クラスタを形成してなる表面増強ラマン活性機能を有する金属ナノ粒子分散液を提供するものでもある。【００２４】
前記配位化合物は、タンパク検出の場合は、アミノ基とカルボキシル基を含む両性界面活性剤であるのが好ましく、抗原抗体反応を利用するときは、抗原抗体反応の抗体成分を単独で又は前記両性界面活性剤とともに添加した分散液とすべきである。前記両性界面活性剤がアミノ酸系界面活性剤を含むタンパク系界面活性剤であると、抗体成分又は抗原成分を金属ナノ粒子又はクラスタ間に誘導する機能を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】凝集時間６分の基板における４，４‘-ビピリジンなしの基板のバックグランドスペクトル図を示す。
【図２】凝集時間７分の基板における４，４‘-ビピリジン１μMのＳＥＲＳスペクトル図を示す。
【図３】凝集時間６分の基板における４，４‘-ビピリジン１ｎMのＳＥＲＳスペクトル図を示す。
【図４】凝集時間７分の基板における４，４‘-ビピリジン１ｎMのＳＥＲＳスペクトル図を示す。
【図５】リン青銅基板上に電解質を含む銀ナノ粒子分散液を凝集させた状態の二万倍ＳＥＭ写真である。
【図６】実施例２で測定されたＣＲＰのＳＥＲSスペクトルである。
【図７】本発明に係る測定基板の製造工程を示す工程図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下図面を参照して、本発明の実施形態を詳細に説明する。
【実施例１】
【００２７】
本実施形態においては、銀イオンを化学的方法で凝集させる方法で作成された平均粒径７〜１０ｎｍの銀ナノクラスタを、Ｌ−アラニンからなるアミノ酸系分散剤を含む水溶液中に分散させ、２０００ｐｐｍ、１０００ｐｐｍ及び１００ｐｐｍの銀ナノクラスタ分散液（無色透明）を作成する。表面清浄な銀基板、銅板および黄銅基板上に、１０００ｐｐｍ１滴（１０μL）ずつ間隔を置いて滴下し、その凝集過程を観察した。銀基板の上ではほぼ凝集に１夜要したのに対し、銅基板上では数分から、黄銅基板上では数十秒から数分で黒い堆積物が形成された。ここでは凝集の停止は滴下後６分と７分に窒素ブローして水滴を飛散乾燥させることにより行われた。このようにして作成した６分凝集と７分凝集の黄銅基板上での堆積域に４，４−ビピリジンを１μM、１００nMに純水で希釈して滴下し、株式会社ラマダビジョン測定器を用い、最大出力で波長８２５ｎｍのレーザを励起光として用いてＳＥＲＳスペクトルを測定した。その結果を図１から図４に示す。図１は６分間凝集の基板上に純水を滴下した場合のスペクトルである。図２は７分間凝集の基板上に４，４‘-ビピリジン１ｍMを滴下したときのＳＥＲＳスペクトル図を示す。図３及び図４は６分凝集と７分間凝集の基板上に４，４‘-ビピリジン１ｎMを滴下したときのＳＥＲＳスペクトル図を示す。【００２８】
図１と図２〜図４のスペクトルを比較すると、１μＭ及び１００ｎＭの濃度の試料の測定が可能であることがわかる。そして、図３と図４の比較から６分凝集が７分凝集より優れ、最適凝集時間が存在することが理解できる。【００２９】
かかる測定基板によれば、レーザ光の焦点合わせを完了させておけば、基板上の凝集域に所定の試料を滴化することにより４，４‘−ビピリジンの１００ｎMＳＥＲＳスペクトルを瞬時に検出できた。
【実施例２】
【００３０】
実施例１で使用した、平均粒径７〜１０ｎｍの銀ナノ粒子又はクラスタを、アミノ酸系界面活性剤（Ｌ−アラ二ン０．００１〜０．００２％）を含む水溶液中に分散させ、２０００ｐｐｍ、１０００ｐｐｍ及び１００ｐｐｍの銀ナノ分散液（無色透明）を作成する。表面清浄な銀基板、銅板および黄銅基板上に、１０００ｐｐｍの分散液１滴（１０μL）ずつ間隔を置いて滴下し、その凝集過程を観察した。銅基板の上ではほぼ凝集に１夜要したのに対し、黄銅基板上では数分から、リン青銅基板上では数分から十数分で黒い堆積物が形成された。ここでは凝集の停止は滴下後窒素ブローして水滴を飛散乾燥させることにより行われた。このようにして作成した６分凝集のリン青銅板（図５に示すＳＥＭ写真）上での堆積域にＣＲＰ（通常濃度の１０００倍）を１０倍、１００倍に純水で希釈して滴下し、株式会社ラムダビジョン測定器を用い、最大出力で８２５ｎｍの波長のレーザを励起光として用いてＳＥＲＳスペクトルを測定した。その結果を図６に示す。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明によれば、被検出試料を滴下後即時ＳＥＲS光を測定できる測定基板を提供できる。そして、かかる測定基板を利用すれば、ホットサイトとなる最適凝集域の荷電状態を調整することができるので、タンパク検出に必要なナノ粒子へのタンパクの吸着が容易となる。また、抗原抗体反応を利用して、癌マーカーおよびウイルスの検出による病気の診断等を行う測定も可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図５】
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