(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミエロペルオキシダーゼ、過酸化物生成オキシダーゼ、および該ミエロペルオキシダーゼの殺菌活性を増強するように相乗作用的組合せで作用するグリシンと、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−チロシン、β−アラニン、Ｄ−バリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｄ−アラニンメチルエステル、Ｌ−ロイシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−リシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−セリンおよびＬ−プロリンからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸とを含む、標的微生物の増殖を阻害するための組成物であって、該ミエロペルオキシダーゼは、該標的微生物を選択的に結合し、殺滅するか、または、該標的微生物の増殖を阻害する、組成物。
【請求項２】
過酸化水素をさらに含む、請求項１に記載の組成物であって、該過酸化水素が、過酸化物生成オキシダーゼに対する基質の存在下において該過酸化物生成オキシダーゼによって生成される、組成物。
【請求項３】
過酸化物生成オキシダーゼを含み、該オキシダーゼが、該オキシダーゼに対する基質の存在下にある場合、毎分ｍｌ当たり１００ｐモル〜５０μモルの過酸化物を生成するのに有効である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
１〜５０，０００μｇ／ｍｌのミエロペルオキシダーゼを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
０．１〜５００ｍＭのグリシンおよび前記少なくとも１つのアミノ酸の各々を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
１０〜５，０００μｇ／ｍｌのミエロペルオキシダーゼ、０．３〜５０ｍＭのグリシン、０．３〜５０ｍＭのＬ−アラニン、０．３〜５０ｍＭのＬ−プロリン、および１〜５００Ｕ／ｍｌのグルコースオキシダーゼを含む、標的微生物の増殖を阻害するための組成物であって、該ミエロペルオキシダーゼは、該標的微生物を選択的に結合し、殺滅するか、または、該標的微生物の増殖を阻害する、組成物。
【請求項７】
治療を必要とするヒト対象または動物対象における微生物感染を治療するための組成物であって、該組成物は、ミエロペルオキシダーゼ、ならびに、過酸化水素および塩化物または臭化物の存在下において、該ミエロペルオキシダーゼの殺菌活性を増強するように相乗作用的組合せで作用するグリシンと、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−チロシン、β−アラニン、Ｄ−バリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｄ−アラニンメチルエステル、Ｌ−ロイシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−リシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−セリンおよびＬ−プロリンからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸とを含み、そして、該対象における感染部位に投与されることを特徴とし、該ミエロペルオキシダーゼは、該ヒトまたは動物に感染する標的微生物を選択的に結合し、殺滅するか、または、該標的微生物の増殖を阻害する、組成物。
【請求項８】
前記組成物が、過酸化水素をさらに含み、該過酸化水素が、過酸化物生成オキシダーゼに対する基質の存在下において該過酸化物生成オキシダーゼによって生成される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が過酸化物生成オキシダーゼを含み、該オキシダーゼが、該オキシダーゼに対する基質の存在下にある場合、毎分ｍｌ当たり１００ｐモル〜５０μモルの過酸化物を生成するのに有効である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、１〜５０，０００μｇ／ｍｌのミエロペルオキシダーゼを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、０．１〜５００ｍＭのグリシンおよび前記少なくとも１つのアミノ酸の各々を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、１０〜５，０００μｇ／ｍｌのミエロペルオキシダーゼ、０．３〜５０ｍＭのグリシン、０．３〜５０ｍＭのＬ−アラニン、０．３〜５０ｍＭのＬ−プロリン、および１〜５００Ｕ／ｍｌのグルコースオキシダーゼを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ヒト対象または動物対象が、歯茎、眼、耳、皮膚、軟組織、創傷、膣領域、鼠径部領域、褥瘡、または火傷領域の微生物感染に罹患している、請求項７に記載の組成物。
【請求項１４】
前記感染が多菌感染である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
標的微生物を殺滅するかまたはそれらの増殖を阻害するための組成物であって、ミエロペルオキシダーゼ、過酸化物生成オキシダーゼ、および該ミエロペルオキシダーゼの殺菌活性を増強するように相乗作用的組合せで作用するグリシンと、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−チロシン、β−アラニン、Ｄ−バリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｄ−アラニンメチルエステル、Ｌ−ロイシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−リシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−セリンおよびＬ−プロリンからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸を含み、該ミエロペルオキシダーゼは、該標的微生物を選択的に結合し、殺滅するか、または、該標的微生物の増殖を阻害する、組成物。
【請求項１６】
ヒト対象または動物対象における微生物感染を治療するための薬剤の製造における、ミエロペルオキシダーゼ、過酸化物生成オキシダーゼ、グリシン、および、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−チロシン、β−アラニン、Ｄ−バリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｄ−アラニンメチルエステル、Ｌ−ロイシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−リシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−セリンおよびＬ−プロリンからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸を含む組成物の使用であって、該アミノ酸が、過酸化水素および塩化物または臭化物の存在下において、該ミエロペルオキシダーゼの殺菌活性を増強するように相乗作用的組合せで作用し、該ミエロペルオキシダーゼは、該ヒトまたは動物に感染する標的微生物を選択的に結合し、殺滅するか、または、該標的微生物の増殖を阻害する使用。
【請求項１７】
前記組成物が、過酸化水素をさらに含み、該過酸化水素が、過酸化物生成オキシダーゼに対する基質の存在下において該過酸化物生成オキシダーゼによって生成される、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記組成物が過酸化物生成オキシダーゼを含み、該オキシダーゼが、該オキシダーゼに対する基質の存在下にある場合、毎分ｍｌ当たり１００ｐモル〜５０μモルの過酸化物を生成するのに有効である、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記組成物が、１〜５０，０００μｇ／ｍｌのミエロペルオキシダーゼを含む、請求項１６に記載の使用。
【請求項２０】
前記組成物が、０．１〜５００ｍＭのグリシンおよび前記少なくとも１つのアミノ酸の各々を含む、請求項１６に記載の使用。
【請求項２１】
前記組成物が、１０〜５，０００μｇ／ｍｌのミエロペルオキシダーゼ、０．３〜５０ｍＭのグリシン、０．３〜５０ｍＭのＬ−アラニン、０．３〜５０ｍＭのＬ−プロリン、および１〜５００Ｕ／ｍｌのグルコースオキシダーゼを含む、請求項１６に記載の使用。
【請求項２２】
前記ヒト対象または動物対象が、歯茎、眼、耳、皮膚、軟組織、創傷、膣領域、鼠径部領域、褥瘡、または火傷領域の微生物感染に罹患している、請求項１６に記載の使用。
【請求項２３】
前記微生物感染が多菌感染である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
標的微生物を殺滅するかまたはそれらの増殖を阻害するための薬剤の製造における、ミエロペルオキシダーゼ、過酸化物生成オキシダーゼ、グリシン、および、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−チロシン、β−アラニン、Ｄ−バリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｄ−アラニンメチルエステル、Ｌ−ロイシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−リシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−セリンおよびＬ−プロリンからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸を含む組成物の使用であって、該アミノ酸が、該ミエロペルオキシダーゼの殺菌活性を増強するように相乗作用的組合せで作用し、該ミエロペルオキシダーゼは、該標的微生物を選択的に結合し、殺滅するか、または、該標的微生物の増殖を阻害する使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物感染の阻害または治療のための方法および組成物に関する。より具体的に述べると、本発明は、系の殺菌特性を増強する、アミノ酸およびミエロペルオキシダーゼの組合せを用いる方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１および特許文献２で開示される通り、ミエロペルオキシダーゼは、標的微生物に選択的に結合し、過酸化物およびハロゲン化物の存在下において、望ましい微生物を除去したり、標的の微生物環境内にある宿主細胞および正常な微生物叢など、生息環境の他の構成要素を著明に損なったりすることなく、標的微生物の増殖を阻害するのに用いることができる。ミエロペルオキシダーゼは、既に、基質としての適切なハロゲン化物補因子（Ｘ−）および過酸化水素と共に存在すると、天然の系において微生物殺滅活性を示すことが公知である（非特許文献１）。しかし、ミエロペルオキシダーゼ結合の選択的な性質、ならびに治療的適用、研究的適用、および産業的適用に対するこれらの系の有用性が認識されるようになったのは、ごく近年のことである。新たに発見された、ミエロペルオキシダーゼの選択的結合特性によれば、病原性微生物などの標的微生物が、ミエロペルオキシダーゼに対して、正常な微生物叢のメンバーなど、望ましい微生物の場合よりも大きな結合能を有する場合、その標的微生物はミエロペルオキシダーゼに選択的に結合し、望ましい微生物によるミエロペルオキシダーゼに対する結合はほとんどまたは全く生じない。過酸化物およびハロゲン化物の存在下において、標的に結合したミエロペルオキシダーゼは、標的微生物の表面において、ハロゲン化物の酸化を触媒し、過酸化物が一重項酸素分子（１Ｏ２）へと不均化することを促進し、その結果、望ましい微生物または生理学的生息環境に対する付随的な損傷を最小限としながら、標的微生物の選択的な殺滅をもたらす。したがって、特許文献１および特許文献２で開示される通り、ミエロペルオキシダーゼは、ヒト対象または動物対象の治療的処置または予防的処置において、宿主細胞および該宿主の正常な微生物叢に対する付随的な損傷を最小限としながら、病原性微生物に選択的に結合してこれらを殺滅する消毒剤として用いることができる。
【０００３】
該システムはまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、特に、包帯、手術用具、縫合デバイス、カテーテル、歯科適用、コンタクトレンズなどの生物医学的デバイスを殺菌処理して、該生物医学的デバイスをその後ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて用いる際に、対象の宿主細胞を損傷することなく標的微生物の増殖を阻害する適用において、標的微生物の増殖を阻害するための消毒製剤または滅菌製剤としても用いることができる。
【０００４】
特許文献３および特許文献４で開示される通り、特許文献１および特許文献２で開示されるミエロペルオキシダーゼ殺菌系が病原性微生物の処理において高度に有効であることは判明しているが、酵母および芽胞形成微生物の有効な殺滅には、抗微生物活性増強剤が必要とされる場合がある。微生物生活周期の芽胞期は、代謝休眠、およびその栄養期において該微生物を破壊する環境因子に対する耐性を特徴とする。芽胞の発芽最初期は、膨満、および休眠から活性な代謝への移行を特徴とする。栄養増殖、例えば、出芽、また最終的には生殖が後続する。
【０００５】
細菌内生胞子および真菌胞子の発芽は、代謝の上昇、ならびに熱および化学反応物質に対する耐性の低下と関連する。発芽が生じるために、胞子は、環境が発育および生殖を支持するのに十分であることを感知しなければならない。アミノ酸であるＬ−アラニンが、細菌芽胞の発芽を刺激することが報告されている（非特許文献２および非特許文献３）。Ｌ−アラニンおよびＬ−プロリンはまた、真菌胞子の発芽を開始させることも報告されている（非特許文献４）。
【０００６】
グリシンおよびＬ−アラニンなどの単純なα−アミノ酸は、代謝における中心的な位置を占める。α−アミノ酸のアミノ基転移または脱アミノ化により、代謝および増殖に必要とされる糖原性炭水化物またはケト原性炭水化物および窒素がもたらされる。例えば、Ｌ−アラニンのアミノ基転移または脱アミノ化により、解糖代謝（エンブデン−マイアーホーフ−パルナス経路）の最終生成物であるピルベートがもたらされる。ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体によるピルベートの酸化により、アセチル−ＣｏＡ、ＮＡＤＨ、Ｈ＋、およびＣＯ２がもたらされる。アセチル−ＣｏＡは、トリカルボン酸回路（クレブス回路）の開始基質であり、このクレブス回路により、ミトコンドリア電子伝達鎖が始動する。アセチル−ＣｏＡはまた、脂肪酸合成のほか、ステロール合成のための最終的な炭素供給源でもある。単純なα−アミノ酸により、後続する発芽および代謝活性に必要とされる窒素、ＣＯ２、糖原性等価物、および／またはケト原性等価物が供給されうる。
【０００７】
したがって、特許文献３および特許文献４は、酵母の出芽、芽胞形成微生物の発芽、またおそらくは栄養期にある微生物の代謝の加速に対して刺激効果をもたらす特定のα−アミノ酸と組み合わせたミエロペルオキシダーゼにより微生物を処理することにより、酵母および微生物の芽胞形態に対するミエロペルオキシダーゼの殺菌作用が増強されうることを開示する。この目的で開示される代表的なα−アミノ酸には、グリシン、およびアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、リシン、フェニルアラニン、チロシンのＬ−光学異性体またはＤ−光学異性体、ならびにこれらのアルキルエステルが含まれる。特許文献３および特許文献４は、酵母および微生物の芽胞形態に対するミエロペルオキシダーゼの殺菌活性のα−アミノ酸による増強を開示するが、これらの特許は、ミエロペルオキシダーゼおよび本明細書で開示される少なくとも２つのアミノ酸の使用による、非芽胞細菌に対するミエロペルオキシダーゼ殺菌系の増強、または抗菌活性のさらなる増強については開示していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５，８８８，５０５号明細書
【特許文献２】米国特許第６，２９４，１６８号明細書
【特許文献３】米国特許第５，３８９，３６９号明細書
【特許文献４】米国特許第５，４５１，４０２号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ，  Ｊ．、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９６８年、第９５巻、２１３１〜２１３８頁
【非特許文献２】Ｈｉｌｌｓ，  Ｊ．、Ｇｅｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９５０年、第４巻、３８頁
【非特許文献３】ＨａｌｖｏｒｓｏｎおよびＣｈｕｒｃｈ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  Ｒｅｖ．、１９５７年、第２１巻、１１２頁
【非特許文献４】Ｙａｎａｇｉｔａ、Ａｒｃｈ．  Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌ．、１９５７年、第２６巻、３２９頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
この概要は、後出の「発明を実施するための形態」においてさらに説明される概念を精選し、これを簡潔な形で導入する目的で記載される。この概要は、主張される対象物質の重要な特徴を同定することを意図するものではなく、主張される対象物質の範囲を決定する際の補助として用いられることを意図するものでもない。
【００１１】
本発明は、細菌感染など、微生物感染に対して、該感染部位を、ミエロペルオキシダーゼ、および該ミエロペルオキシダーゼの殺菌活性を増強するように組合せで作用する少なくとも２つのアミノ酸を含む組成物と接触させることにより、これを殺滅または阻害するための組成物および方法を対象とする。本発明を実施する場合、感受性微生物を、ある量のミエロペルオキシダーゼ、ならびに過酸化物および臭化物または塩化物の存在下において該微生物の増殖を阻害するかまたはこれらを殺滅するのに有効な少なくとも２つのアミノ酸と接触させることにより、該微生物を殺滅または阻害する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
したがって、一実施形態において、本発明は、ミエロペルオキシダーゼ、および該ミエロペルオキシダーゼの殺菌活性を増強するように組合せで作用する少なくとも２つのアミノ酸を含む、感受性微生物の増殖を阻害するための組成物を提供する。一部の実施形態において、該少なくとも２つのアミノ酸は、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｌ−アラニン無水物、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン無水物、馬尿酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、タウリン、Ｌ−トレオニン、Ｄ−トレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｄ−バリン；ベータアラニン、Ｌ−ベータ−ホモロイシン、Ｄ−ベータホモロイシン、３−アミノ酪酸、Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、Ｄ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、Ｌ−３−アミノイソ酪酸、Ｄ−３−アミノイソ酪酸、３−アミノ酪酸エチルなどのベータアミノ酸；サルコシンメチルエステル塩酸塩、およびニペコチン酸、またはこれらのアルキルエステルもしくは薬学的に許容される塩からなる群から選択される。他の実施形態において、該少なくとも２つのアミノ酸は、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｌ−アラニン無水物、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン無水物、馬尿酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、タウリン、Ｌ−トレオニン、Ｄ−トレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、およびＤ−バリン、またはこれらのアルキルエステルもしくは薬学的に許容される塩からなる群から選択される。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
ミエロペルオキシダーゼ、および該ミエロペルオキシダーゼの殺菌活性を増強するように組合せで作用する少なくとも２つのアミノ酸を含む、感受性微生物の増殖を阻害するための組成物。
（項目２）
前記少なくとも２つのアミノ酸が、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｌ−アラニン無水物、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン無水物、馬尿酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、タウリン、Ｌ−トレオニン、Ｄ−トレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｄ−バリン；ベータアラニン、Ｌ−ベータ−ホモロイシン、Ｄ−ベータ−ホモロイシン、３−アミノ酪酸、Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、Ｄ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、Ｌ−３−アミノイソ酪酸、Ｄ−３−アミノイソ酪酸などのベータアミノ酸；３−アミノ酪酸エチル、サルコシンメチルエステル塩酸塩、およびニペコチン酸、またはこれらのアルキルエステルもしくは薬学的に許容される塩からなる群から選択される、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記少なくとも２つのアミノ酸が、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｌ−アラニン無水物、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン無水物、馬尿酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、タウリン、Ｌ−トレオニン、Ｄ−トレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、およびＤ−バリン、またはこれらのアルキルエステルもしくは薬学的に許容される塩からなる群から選択される、項目２に記載の組成物。
（項目４）
少なくとも３つのアミノ酸を含み、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｌ−アラニン無水物、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン無水物、馬尿酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、タウリン、Ｌ−トレオニン、Ｄ−トレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｄ−バリン；ベータアラニン、Ｌ−ベータ−ホモロイシン、Ｄ−ベータ−ホモロイシン、３−アミノ酪酸、Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、Ｄ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、Ｌ−３−アミノイソ酪酸、Ｄ−３−アミノイソ酪酸、３−アミノ酪酸エチルなどのベータアミノ酸；サルコシンメチルエステル塩酸塩、およびニペコチン酸、またはこれらのアルキルエステルもしくは薬学的に許容される塩からなる群から選択される、項目１に記載の組成物。
（項目５）
前記少なくとも３つのアミノ酸が、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｌ−アラニン無水物、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン無水物、馬尿酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、タウリン、Ｌ−トレオニン、Ｄ−トレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、およびＤ−バリン、またはこれらのアルキルエステルもしくは薬学的に許容される塩からなる群から選択される、項目４に記載の組成物。
（項目６）
過酸化水素または過酸化水素の供給源をさらに含む、項目１に記載の組成物。
（項目７）
前記過酸化水素の供給源が、過酸化物生成オキシダーゼであり、該オキシダーゼ対する基質の存在下において過酸化水素を生成する、項目６に記載の組成物。
（項目８）
過酸化物生成オキシダーゼを含み、該オキシダーゼが、該オキシダーゼに対する基質の存在下にある場合、毎分ｍｌ当たり１００ｐモル〜５０μモルの過酸化物を生成するのに有効である、項目７に記載の組成物。
（項目９）
１〜５０，０００μｇ／ｍｌのミエロペルオキシダーゼを含む、項目１に記載の組成物。
（項目１０）
０．１〜約５００ｍＭの前記少なくとも２つのアミノ酸の各々を含む、項目１に記載の組成物。
（項目１１）
１０〜５，０００μｇ／ｍｌのミエロペルオキシダーゼ、０．３〜５０ｍＭのグリシン、０．３〜５０ｍＭのＬ−アラニン、０．３〜５０ｍＭのＬ−プロリン、および１〜５００Ｕ／ｍｌのグルコースオキシダーゼを含む組成物。
（項目１２）
治療を必要とするヒト対象または動物対象を治療する方法であって、該対象における感染部位に、ミエロペルオキシダーゼ、ならびに、過酸化水素および塩化物または臭化物の存在下において、該ミエロペルオキシダーゼの殺菌活性を増強するように組合せで作用する少なくとも２つのアミノ酸を含む組成物を投与するステップを含む方法。
（項目１３）
前記少なくとも２つのアミノ酸が、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｌ−アラニン無水物、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン無水物、馬尿酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、タウリン、Ｌ−トレオニン、Ｄ−トレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｄ−バリン；ベータアラニン、Ｌ−ベータ−ホモロイシン、Ｄ−ベータ−ホモロイシン、３−アミノ酪酸、Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、Ｄ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、Ｌ−３−アミノイソ酪酸、Ｄ−３−アミノイソ酪酸、３−アミノ酪酸エチルなどのベータアミノ酸；サルコシンメチルエステル塩酸塩、およびニペコチン酸、またはこれらのアルキルエステルもしくは薬学的に許容される塩からなる群から選択される、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記少なくとも２つのアミノ酸が、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｌ−アラニン無水物、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン無水物、馬尿酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、タウリン、Ｌ−トレオニン、Ｄ−トレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、およびＤ−バリン、またはこれらのアルキルエステルもしくは薬学的に許容される塩からなる群から選択される、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記組成物が、少なくとも３つのアミノ酸を含み、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｌ−アラニン無水物、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン無水物、馬尿酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、タウリン、Ｌ−トレオニン、Ｄ−トレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｄ−バリン；ベータアラニン、Ｌ−ベータ−ホモロイシン、Ｄ−ベータ−ホモロイシン、３−アミノ酪酸、Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、Ｄ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、Ｌ−３−アミノイソ酪酸、Ｄ−３−アミノイソ酪酸、３−アミノ酪酸エチルなどのベータアミノ酸；サルコシンメチルエステル塩酸塩、およびニペコチン酸、またはこれらのアルキルエステルもしくは薬学的に許容される塩からなる群から選択される、項目１２に記載の方法。
（項目１６）
前記少なくとも３つのアミノ酸が、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｌ−アラニン無水物、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン無水物、馬尿酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、タウリン、Ｌ−トレオニン、Ｄ−トレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、およびＤ−バリン、またはこれらのアルキルエステルもしくは薬学的に許容される塩からなる群から選択される、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記組成物が、過酸化水素または過酸化水素の供給源をさらに含む、項目１２に記載の方法。
（項目１８）
前記過酸化水素の供給源が過酸化物生成オキシダーゼであり、該オキシダーゼが、該オキシダーゼに対する基質の存在下において過酸化水素を生成する、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記組成物が過酸化物生成オキシダーゼを含み、該オキシダーゼが、該オキシダーゼに対する基質の存在下にある場合、毎分ｍｌ当たり１００ｐモル〜５０μモルの過酸化物を生成するのに有効である、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記組成物が、１〜５０，０００μｇ／ｍｌのミエロペルオキシダーゼを含む、項目１２に記載の方法。
（項目２１）
前記組成物が、０．１〜約５００ｍＭの前記少なくとも２つのアミノ酸の各々を含む、項目１２に記載の方法。
（項目２２）
前記組成物が、１０〜５，０００μｇ／ｍｌのミエロペルオキシダーゼ、０．３〜５０ｍＭのグリシン、０．３〜５０ｍＭのＬ−アラニン、０．３〜５０ｍＭのＬ−プロリン、および１〜５００Ｕ／ｍｌのグルコースオキシダーゼを含む、項目１２に記載の方法。
（項目２３）
前記ヒト対象または動物対象が、歯茎、眼、耳、皮膚、軟組織、創傷、膣領域、鼠径部領域、褥瘡、または火傷領域の微生物感染に罹患している、項目１２に記載の方法。
（項目２４）
前記感染が多菌感染である、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
感受性微生物を殺滅するかまたはそれらの増殖を阻害するための方法であって、該微生物を、過酸化水素および塩化物または臭化物の存在下において、ミエロペルオキシダーゼ、および該ミエロペルオキシダーゼの殺菌活性を増強するように組合せで作用する少なくとも２つのアミノ酸を含む組成物と接触させるステップを含む方法。
（項目２６）
ヒト対象または動物対象における感染を治療するための薬剤の製造における、ミエロペルオキシダーゼおよび少なくとも２つのアミノ酸を含む組成物の使用であって、該アミノ酸が、過酸化水素および塩化物または臭化物の存在下において、該ミエロペルオキシダーゼの殺菌活性を増強するように組合せで作用する使用。
（項目２７）
前記少なくとも２つのアミノ酸が、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｌ−アラニン無水物、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン無水物、馬尿酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、タウリン、Ｌ−トレオニン、Ｄ−トレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｄ−バリン；ベータアラニン、Ｌ−ベータ−ホモロイシン、Ｄ−ベータ−ホモロイシン３−アミノ酪酸、Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、Ｄ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、Ｌ−３−アミノイソ酪酸、Ｄ−３−アミノイソ酪酸、３−アミノ酪酸エチルなどのベータアミノ酸；サルコシンメチルエステル塩酸塩、およびニペコチン酸、またはこれらのアルキルエステルもしくは薬学的に許容される塩からなる群から選択される、項目２６に記載の使用。
（項目２８）
前記少なくとも２つのアミノ酸が、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｌ−アラニン無水物、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン無水物、馬尿酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、タウリン、Ｌ−トレオニン、Ｄ−トレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、およびＤ−バリン、またはこれらのアルキルエステルもしくは薬学的に許容される塩からなる群から選択される、項目２６または２７に記載の使用。
（項目２９）
前記組成物が、少なくとも３つのアミノ酸を含み、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｌ−アラニン無水物、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン無水物、馬尿酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、タウリン、Ｌ−トレオニン、Ｄ−トレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｄ−バリン；ベータアラニン、Ｌ−ベータ−ホモロイシン、Ｄ−ベータ−ホモロイシン、３−アミノ酪酸、Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、Ｄ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、Ｌ−３−アミノイソ酪酸、Ｄ−３−アミノイソ酪酸、３−アミノ酪酸エチルなどのベータアミノ酸；サルコシンメチルエステル塩酸塩、およびニペコチン酸、またはこれらのアルキルエステルもしくは薬学的に許容される塩からなる群から選択される、項目２６に記載の使用。
（項目３０）
前記少なくとも３つのアミノ酸が、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｌ−アラニン無水物、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン無水物、馬尿酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、タウリン、Ｌ−トレオニン、Ｄ−トレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、およびＤ−バリン、またはこれらのアルキルエステルもしくは薬学的に許容される塩からなる群から選択される、項目２９に記載の使用。
（項目３１）
前記組成物が、過酸化水素または過酸化水素の供給源をさらに含む、項目２６に記載の使用。
（項目３２）
前記過酸化水素の供給源が過酸化物生成オキシダーゼを含み、該オキシダーゼが、前記オキシダーゼに対する基質の存在下において過酸化水素を生成する、項目３１に記載の使用。
（項目３３）
前記組成物が過酸化物生成オキシダーゼを含み、該オキシダーゼが、該オキシダーゼに対する基質の存在下にある場合、毎分ｍｌ当たり１００ｐモル〜５０μモルの過酸化物を生成するのに有効である、項目３２に記載の使用。
（項目３４）
前記組成物が、１〜５０，０００μｇ／ｍｌのミエロペルオキシダーゼを含む、項目２６に記載の方法。
（項目３５）
前記組成物が、０．１〜約５００ｍＭの該少なくとも２つのアミノ酸の各々を含む、項目２６に記載の方法。
（項目３６）
前記組成物が、１０〜５，０００μｇ／ｍｌのミエロペルオキシダーゼ、０．３〜５０ｍＭのグリシン、０．３〜５０ｍＭのＬ−アラニン、０．３〜５０ｍＭのＬ−プロリン、および１〜５００Ｕ／ｍｌのグルコースオキシダーゼを含む、項目２６に記載の使用。
（項目３７）
前記ヒト対象または動物対象が、歯茎、眼、耳、皮膚、軟組織、創傷、膣領域、鼠径部領域、褥瘡、または火傷領域の微生物感染に罹患している、項目２６に記載の使用。
（項目３８）
前記感染が多菌感染である、項目３７に記載の使用。
（項目３９）
感受性微生物を殺滅するかまたはそれらの増殖を阻害するための薬剤の製造における、ミエロペルオキシダーゼおよび少なくとも２つのアミノ酸を含む組成物の使用であって、該アミノ酸が、該ミエロペルオキシダーゼの殺菌活性を増強するように組合せで作用する使用。
【００１３】
他の実施形態において、本発明は、ミエロペルオキシダーゼ、およびグリシン、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｌ−アラニン無水物、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン無水物、馬尿酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、タウリン、Ｌ−トレオニン、Ｄ−トレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｄ−バリン；ベータアラニン、Ｌ−ベータ−ホモロイシン、Ｄ−ベータホモロイシン、３−アミノ酪酸、Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、Ｄ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、Ｌ−３−アミノイソ酪酸、Ｄ−３−アミノイソ酪酸、３−アミノ酪酸エチルなどのベータアミノ酸；サルコシンメチルエステル塩酸塩、およびニペコチン酸、またはこれらのアルキルエステルもしくは薬学的に許容される塩からなる群から選択される少なくとも３つのアミノ酸を含む、感受性微生物の増殖を阻害するための組成物を提供する。他の実施形態において、該少なくとも３つのアミノ酸は、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｌ−アラニン無水物、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン無水物、馬尿酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、タウリン、Ｌ−トレオニン、Ｄ−トレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｄ−バリン、またはこれらのアルキルエステルもしくは薬学的に許容される塩からなる群から選択される。
【００１４】
一部の実施形態において、本発明の組成物は、過酸化水素または過酸化水素の供給源もさらに含む。本発明のこの態様において、組成物は、それに対する基質の存在下において過酸化水素を生成する、過酸化物生成オキシダーゼを含みうる。一部の実施形態において、組成物は、それに対する基質の存在下にあると毎分ｍｌ当たり１００ｐモル〜５０μモルの過酸化物を生成するのに有効な、過酸化物生成オキシダーゼを含む。
【００１５】
一実施形態において、本発明の組成物は、１〜５０，０００μｇ／ｍｌのミエロペルオキシダーゼを含む。他の実施形態において、本発明の組成物は、少なくとも２つのアミノ酸の各々を０．１〜約５００ｍＭずつ含む。代表的な一実施形態において、本発明の組成物は、１０〜５，０００μｇ／ｍｌのミエロペルオキシダーゼ、０．３〜５０ｍＭのグリシン、０．３〜５０ｍＭのＬ−アラニン、０．３〜５０ｍＭのＬ−プロリン、および１〜５００Ｕ／ｍｌのグルコースオキシダーゼを含む。
【００１６】
他の態様において、本発明は、このような治療を必要とするヒト対象または動物対象を治療する方法であって、該対象における感染部位に、ミエロペルオキシダーゼ、ならびに、過酸化水素および塩化物または臭化物の存在下において、該ミエロペルオキシダーゼの殺菌活性を増強するように組合せで作用する少なくとも２つのアミノ酸を含む組成物を投与するステップを含む方法を提供する。本発明のこの態様の一部の実施形態において、該少なくとも２つのアミノ酸は、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｌ−アラニン無水物、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン無水物、馬尿酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、タウリン、Ｌ−トレオニン、Ｄ−トレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｄ−バリン；ベータアラニン、Ｌ−ベータ−ホモロイシン、Ｄ−ベータホモロイシン、３−アミノ酪酸、Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、Ｄ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、Ｌ−３−アミノイソ酪酸、Ｄ−３−アミノイソ酪酸、３−アミノ酪酸エチルなどのベータアミノ酸；サルコシンメチルエステル塩酸塩、およびニペコチン酸、またはこれらのアルキルエステルもしくは薬学的に許容される塩からなる群から選択される。本発明のこの態様の他の実施形態において、該少なくとも２つのアミノ酸は、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｌ−アラニン無水物、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン無水物、馬尿酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、タウリン、Ｌ−トレオニン、Ｄ−トレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、およびＤ−バリン、またはこれらのアルキルエステルもしくは薬学的に許容される塩からなる群から選択される。
【００１７】
他の実施形態において、本発明は、このような治療を必要とするヒト対象または動物対象を治療する方法であって、該対象における感染部位に、ミエロペルオキシダーゼ、ならびに、過酸化水素および塩化物または臭化物の存在下において、該ミエロペルオキシダーゼの殺菌活性を増強するように組合せで作用する少なくとも３つのアミノ酸を含む組成物を投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態において、該少なくとも３つのアミノ酸は、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｌ−アラニン無水物、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン無水物、馬尿酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、タウリン、Ｌ−トレオニン、Ｄ−トレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｄ−バリン；ベータアラニン、Ｌ−ベータ−ホモロイシン、Ｄ−ベータホモロイシン、３−アミノ酪酸、Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、Ｄ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、Ｌ−３−アミノイソ酪酸、Ｄ−３−アミノイソ酪酸、３−アミノ酪酸エチルなどのベータアミノ酸；サルコシンメチルエステル塩酸塩、およびニペコチン酸、またはこれらのアルキルエステルもしくは薬学的に許容される塩からなる群から選択される。他の実施形態において、該少なくとも３つのアミノ酸は、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｌ−アラニン無水物、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン無水物、馬尿酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、タウリン、Ｌ−トレオニン、Ｄ−トレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、およびＤ−バリン、またはこれらのアルキルエステルもしくは薬学的に許容される塩からなる群から選択される。
【００１８】
他の実施形態において、ヒト対象または動物対象に投与される組成物は、過酸化水素または過酸化水素の供給源もさらに含みうる。一部の実施形態において、該過酸化水素の供給源は、過酸化物生成オキシダーゼを含み、該オキシダーゼが、該オキシダーゼに対する基質の存在下において過酸化水素を生成する。例えば、ヒト対象または動物対象に投与される組成物は、過酸化物生成オキシダーゼを含み、該オキシダーゼが、該オキシダーゼに対する基質の存在下にあると毎分ｍｌ当たり１００ｐモル〜５０μモルの過酸化物を生成するのに有効である。
【００１９】
一部の実施形態において、ヒト対象または動物対象に投与される組成物は、１〜５０，０００μｇ／ｍｌのミエロペルオキシダーゼを含みうる。他の実施形態において、ヒト対象または動物対象に投与される組成物は、少なくとも２つのアミノ酸の各々を０．１〜約５００ｍＭずつ含みうる。代表的な一実施形態において、ヒト対象または動物対象に投与される組成物は、１０〜５，０００μｇ／ｍｌのミエロペルオキシダーゼ、０．３〜５０ｍＭのグリシン、０．３〜５０ｍＭのＬ−アラニン、０．３〜５０ｍＭのＬ−プロリン、および１〜５００Ｕ／ｍｌのグルコースオキシダーゼ、および１〜５００ｍＭのグルコースを含む。
【００２０】
本発明の一部の態様において、治療されるヒト対象または動物対象は、歯茎、眼、耳、皮膚、軟組織、創傷、膣領域、鼠径部領域、褥瘡、または火傷領域の微生物感染に罹患している。一部の実施形態において、感染は、多菌感染である。他の実施形態において、感染は、少なくとも部分的に、多剤耐性微生物により引き起こされる。
【００２１】
他の態様において、本発明は、感受性微生物を殺滅するかまたはそれらの増殖を阻害するための方法であって、該微生物を、過酸化水素および塩化物または臭化物の存在下において、ミエロペルオキシダーゼ、および該ミエロペルオキシダーゼの殺菌活性を増強するように組合せで作用する少なくとも２つのアミノ酸を含む組成物と接触させるステップを含む方法を提供する。
【００２２】
本発明の前述の態様および多くの付随する利点は、以下の詳細な説明を参照することでより十分に理解されるので、これらが、添付の図面と併せて理解される場合に、より容易に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、実施例１１で説明される通り、９（□）、６（◇）、３（△）、１（○）、０．３  （＊）、および０．１（＋）μｇ  ＭＰＯ／ｍｌを含有する増強ＭＰＯ溶液により治療されたＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ６５３８（図１Ａ）およびＥ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ  ２５９２２（図１Ｂ）についての時間−殺滅解析を示す図である。懸濁液中和法を用いて、迅速な殺菌活性（初期接種材料からの＞３ｌｏｇの低減）が裏付けられた。増強ＭＰＯ溶液のＭＰＯ濃度が上昇すると殺滅速度が増大し、曝露時間が長くなると殺滅規模が増大した。３μｇ  ＭＰＯ／ｍｌ以上の濃度で検出可能な生存が観察されなくなるのは、曝露の５分以内であった。
【図２】図２は、実施例１１で説明される通り、２００（□）、１００（◇）、および５０（△）μｇ  ＭＰＯ／ｍｌを含有する増強ＭＰＯ溶液により治療されたＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ６５３８（図２Ａ）およびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡＴＣＣ  ２７３１７（図２Ｂ）についての時間−殺滅解析を示す図である。懸濁液中和法により、３％のヒト全血液の存在下において単離株を調べた。増強ＭＰＯ溶液の抗微生物活性に対する血液の干渉効果は、ＭＰＯ濃度を上昇させることにより克服された。
【図３−１】図３は、実施例１１で説明される通り、２５６（□）、６４（◇）、１６（△）、４（×）、１（＊）、０．０２５（○）、および０．０６（＋）μｇ  ＭＰＯ／ｍｌを含有する増強ＭＰＯ溶液により治療されたＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ２９２１３（図３Ａ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ  ２５９２２（図３Ｂ）、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ２９２１２（図３Ｃ）、およびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡＴＣＣ  ２７８５３（図３Ｄ）についての時間−殺滅解析を示す図である。ＣＬＳＩ培養液マイクロ希釈変法を用いて、殺菌活性（初期接種材料からの＞３ｌｏｇの低減）が裏付けられた。すべての生物について同等な殺滅パターンが観察され、増強ＭＰＯ溶液のＭＰＯ濃度が上昇すると殺滅速度が増大し、曝露時間が長くなると殺滅規模が増大した。すべての被験生物について、２５６および１６μｇ  ＭＰＯ／ｍｌの濃度で検出可能な生存が観察されなくなるのは、それぞれ、３０分および４時間以内であった。
【図３−２】図３は、実施例１１で説明される通り、２５６（□）、６４（◇）、１６（△）、４（×）、１（＊）、０．０２５（○）、および０．０６（＋）μｇ  ＭＰＯ／ｍｌを含有する増強ＭＰＯ溶液により治療されたＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ２９２１３（図３Ａ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ  ２５９２２（図３Ｂ）、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ２９２１２（図３Ｃ）、およびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡＴＣＣ  ２７８５３（図３Ｄ）についての時間−殺滅解析を示す図である。ＣＬＳＩ培養液マイクロ希釈変法を用いて、殺菌活性（初期接種材料からの＞３ｌｏｇの低減）が裏付けられた。すべての生物について同等な殺滅パターンが観察され、増強ＭＰＯ溶液のＭＰＯ濃度が上昇すると殺滅速度が増大し、曝露時間が長くなると殺滅規模が増大した。すべての被験生物について、２５６および１６μｇ  ＭＰＯ／ｍｌの濃度で検出可能な生存が観察されなくなるのは、それぞれ、３０分および４時間以内であった。
【図４】図４は、実施例１２で説明される通り、１８．７５（◆）、７５ＧＵ／ｍｌ（■）、および１５０（●）ＧＵ／ｍｌを含有する増強ＭＰＯ溶液により治療されたラットの全層創傷モデルにおけるＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ６５３８についての時間−殺滅解析を示す図である。６０分後における非治療創傷からの生物の回収（○）。このグラフは、治療時間が５、１５、３０、および６０分である各治療群から単離された、ｌｏｇ１０ＣＦＵによる平均生存菌数を示す。各治療群について、各データ点の９５％信頼区間を示す。
【図５】図５は、実施例１２で説明される通り、ラットの部分層創傷モデルにおける、メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）およびメチシリン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＳＳＡ）に対する増強ＭＰＯ溶液の殺菌活性の比較を示す図である。このグラフは、治療の１５分後において単離された、ｌｏｇ１０ＣＦＵによる平均生存菌数を示す。
【図６】図６は、実施例１２で説明される通り、１８．７５（◆）、７５ＧＵ／ｍｌ（■）、および１５０（●）ＧＵ／ｍｌを含有する増強ＭＰＯ溶液により治療されたラットの全層創傷モデルにおけるＥ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ  ２５９２２についての時間−殺滅解析を示す図である。６０分後における非治療創傷からの生物の回収（○）。このグラフは、治療時間が５、１５、３０、および６０分である各治療群から単離された、ｌｏｇ１０ＣＦＵによる平均生存菌数を示す。各治療群について、各データ点の９５％信頼区間を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、ミエロペルオキシダーゼ、および該ミエロペルオキシダーゼの殺菌活性を増強するように組合せで作用する少なくとも２つのアミノ酸を用いて、細菌感染を殺滅または阻害するための組成物および方法を対象とする。本発明を実施する場合、感受性微生物を、ある量のミエロペルオキシダーゼ、ならびに過酸化物および臭化物または塩化物の存在下において該微生物の増殖を阻害するかまたはこれらを殺滅するのに有効な少なくとも２つのアミノ酸と接触させることにより、該微生物を殺滅または阻害する。
【００２５】
特に好ましい一実施形態において、本発明の組成物および方法は、細菌および真菌を含めた、広範囲の病原性微生物に対するミエロペルオキシダーゼの抗微生物活性を増強する消毒剤として用いられる。一態様において、本発明の組成物および方法は、本発明の組成物を、例えば、皮膚、眼、耳、口、鼻腔および副鼻腔、外傷性傷害部位、手術部位などの感染など、微生物感染と直接的に接触させることが可能な部位において、ヒト対象または非ヒト哺乳動物対象の感受性感染を局所治療するのに高度に適する。宿主組織と接触させて用いる場合、該消毒系は、病原性微生物に対する選択的な親和性を示す、二酸素化ミエロペルオキシダーゼの使用に基づく。高効力の殺菌作用は、宿主組織を破壊することも、正常な微生物叢を破壊することもなく、標的微生物を指向する、すなわち、該殺菌作用は選択的であり、標的微生物に限定される。
【００２６】
したがって、一実施形態において、本発明は、ミエロペルオキシダーゼ、ならびに、過酸化水素および塩化物または臭化物の存在下において、該ミエロペルオキシダーゼの殺菌活性を増強するように組合せで作用する少なくとも２つのアミノ酸を含む、感受性微生物の増殖を阻害するための組成物を提供する。組成物は、その使用部位において、それ以外の形では十分な量で供給されない場合、過酸化水素または過酸化水素の供給源および塩化物または臭化物もさらに含みうる。関連する実施形態において、本発明は、このような治療を必要とするヒト対象または動物対象を治療する方法であって、該対象における感染部位に、ミエロペルオキシダーゼ、および該ミエロペルオキシダーゼの殺菌活性を増強するように組合せで作用する少なくとも２つのアミノ酸を含む組成物を投与するステップを含む方法を提供する。また、組成物は、感染部位における天然量を補完する過酸化水素または過酸化水素の供給源および塩化物または臭化物もさらに含みうる。
【００２７】
他の実施形態において、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、特に、包帯、手術用具、縫合デバイス、カテーテル、歯科適用、コンタクトレンズなどの生物医学的デバイスが消毒または滅菌を必要とし、該デバイスがその後宿主組織と接触する場合に、感受性微生物の増殖を阻害するための組成物および方法を提供する。したがって、本発明の高効力のミエロペルオキシダーゼ製剤は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける消毒用調製物または滅菌用調製物として用いることができる。過酸化水素の供給時間を制限することにより、ミエロペルオキシダーゼ増強製剤が、材料またはデバイスの消毒、さらにまた滅菌を確保するのに十分なだけ強力となりうるときを、宿主組織との接触前とすることができる。過酸化物が枯渇すれば、これらの高効力製剤の使用と関連する、正常な微生物叢および宿主組織に対する任意の潜在的な毒性は消失し、製剤により処理された材料またはデバイスをさらに洗浄または解毒することなく、宿主組織と接触させることができる。
【００２８】
したがって、一実施形態において、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて感受性微生物を殺滅するかまたはそれらの増殖を阻害するための方法であって、該微生物を、過酸化水素および塩化物または臭化物の存在下において、ミエロペルオキシダーゼ、および該ミエロペルオキシダーゼの殺菌活性を増強するように組合せで作用する少なくとも２つのアミノ酸を含む組成物と接触させるステップを含む方法を提供する。
【００２９】
さらに他の態様において、本発明は、ヒト対象または動物対象における感染を治療するための薬剤の製造における、ミエロペルオキシダーゼおよび少なくとも２つのアミノ酸を含む組成物の使用であって、該アミノ酸が、過酸化水素および塩化物または臭化物の存在下において、該ミエロペルオキシダーゼの殺菌活性を増強するように組合せで作用する使用を提供する。一部の実施形態において、本発明は、感受性微生物を殺滅するかまたはそれらの増殖を阻害するための薬剤の製造における、ミエロペルオキシダーゼおよび少なくとも２つのアミノ酸を含む組成物の使用であって、該アミノ酸が、該ミエロペルオキシダーゼの殺菌活性を増強するように組合せで作用する使用を提供する。
【００３０】
本発明の代表的な組成物は、（１）ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）と、（２）少なくとも２つの活性増強用アミノ酸と、場合によって、（３）過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）またはＨ２Ｏ２の供給源と、（４）塩化物または臭化物とを含む。
【００３１】
本発明において有用なミエロペルオキシダーゼは、ハロゲン化物、すなわち、塩化物または臭化物が電子供与体または還元剤であり、過酸化物が電子受容体または酸化剤である、ハロゲン化物：過酸化水素に対する酸化還元酵素（例えば、国際生化学連合によるＥＣ第１．１１．１．７号およびＥＣ第１．１１．１．１０号）である。ミエロペルオキシダーゼ溶液の酵素活性は、リン酸ナトリウム緩衝液中の過酸化水素存在下におけるグアイアコールとの反応により決定することができる。該反応は、４７０ｎｍにおいて強い吸光度を示す生成物を生成する。該活性は、基準の標準物質と比較した、吸光度上昇の反応速度から決定される。ミエロペルオキシダーゼ活性は一般に、グアイアコール単位／ｍＬ（ＧＵ／ｍＬ）で表されるが、また、ミリリットル当たりのＭＰＯマイクログラム（μｇ／ｍＬ）としても表される。ＭＰＯのμｇからＧＵへの変換は、ＭＰＯμｇ当たりの０．３７５ＧＵに基づく。比活性はその活性および総タンパク質濃度から計算され、ＧＵ／タンパク質ｍｇで表される。本発明の組成物で用いられるミエロペルオキシダーゼの有用量は、該組成物が用いられる条件、使用環境、および所望の結果に応じて多様に変化する。大半の目的の場合、本発明の組成物は一般に、少なくとも約０．０５μｇ／ｍｌ（０．０１８７５ＧＵ／ｍｌ）のミエロペルオキシダーゼを含む。一部の実施形態において、本発明の組成物は、約１〜約５０，０００μｇ／ｍｌ（すなわち約０．３７５〜約１８，７５０ＧＵ／ｍｌ）のミエロペルオキシダーゼ、より好ましくは、約５〜約１０，０００μｇ／ｍｌ（すなわち約１．８７５〜約３，７５０ＧＵ／ｍｌ）のミエロペルオキシダーゼ、またさらにより好ましくは約１０〜約５，０００μｇ／ｍｌ（すなわち約３．７５〜約１，８７５ＧＵ／ｍｌ）のミエロペルオキシダーゼを含む。
【００３２】
本明細書において詳細に説明される、少なくとも２つの活性増強用アミノ酸の組入れにより、感受性微生物に対するオキシダーゼ−ミエロペルオキシダーゼ系の殺菌能は大幅に上昇する。本発明の実施において有用なアミノ酸は、組合せで、また、過酸化物および塩化物または臭化物の存在下において用いられると、感受性微生物に対するミエロペルオキシダーゼ殺菌系の抗微生物活性を増強するアミノ酸である。少なくとも２つのアミノ酸が、該系のミエロペルオキシダーゼ活性に対する有害効果、または該組成物および方法の使用環境において望ましくない効果をもたらさない濃度で用いられる。
【００３３】
一部の実施形態において、本発明の組成物は、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｌ−アラニン無水物、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン無水物、馬尿酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、タウリン、Ｌ−トレオニン、Ｄ−トレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｄ−バリン；ベータアラニン、Ｌ−ベータ−ホモロイシン、Ｄ−ベータ−ホモロイシン、３−アミノ酪酸、Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、Ｄ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、Ｌ−３−アミノイソ酪酸、Ｄ−３−アミノイソ酪酸、３−アミノ酪酸エチルなどのベータアミノ酸のほか、例えば、Ｌ−アラニンメチルエステル、Ｄ−アラニンメチルエステル、Ｌ−リシンメチルエステル二塩酸塩、グリシンメチルエステル塩酸塩、Ｌ−プロリンメチルエステル塩酸塩、Ｌ−バリンエチルエステル塩酸塩、およびエチル２−アミノプロパノエートなど、これらのアルキルエステルもしくは薬学的に許容される塩；ならびにサルコシンメチルエステル塩酸塩、およびニペコチン酸など、Ｎ−置換アミノ酸からなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸を含む。
【００３４】
他の実施形態において、本発明の組成物は、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｌ−アラニン無水物、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン無水物、馬尿酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、タウリン、Ｌ−トレオニン、Ｄ−トレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、およびＤ−バリンのほか、これらのアルキルエステルおよび薬学的に許容される塩からなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸を含む。
【００３５】
一部の実施形態において、本発明の組成物は、ミエロペルオキシダーゼ、および該ミエロペルオキシダーゼの殺菌活性を増強するように組合せで作用する少なくとも３つのアミノ酸を含む。したがって、一部の実施形態において、本発明の組成物は、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｌ−アラニン無水物、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン無水物、馬尿酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、タウリン、Ｌ−トレオニン、Ｄ−トレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｄ−バリン；ベータアラニン、Ｌ−ベータ−ホモロイシン、Ｄ−ベータ−ホモロイシン、３−アミノ酪酸、Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、Ｄ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、Ｌ−３−アミノイソ酪酸、Ｄ−３−アミノイソ酪酸、および３−アミノ酪酸エチルなどのベータアミノ酸のほか、例えば、Ｌ−アラニンメチルエステル、Ｄ−アラニンメチルエステル、Ｌ−リシンメチルエステル二塩酸塩、グリシンメチルエステル塩酸塩、Ｌ−プロリンメチルエステル塩酸塩、Ｌ−バリンエチルエステル塩酸塩、およびエチル２−アミノプロパノエートなど、これらのエステルおよび薬学的に許容される塩、ならびにサルコシンメチルエステル塩酸塩、およびニペコチン酸など、Ｎ−置換アミノ酸からなる群から選択される少なくとも３つのアミノ酸を含む。
【００３６】
さらに他の実施形態において、本発明の組成物は、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｌ−アラニン無水物、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン無水物、馬尿酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、タウリン、Ｌ−トレオニン、Ｄ−トレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｄ−バリンのほか、これらのエステルおよび薬学的に許容される塩からなる群から選択される少なくとも３つのアミノ酸を含む。本明細書において好ましい、本発明のこの態様の代表例において、本発明の組成物は、ミエロペルオキシダーゼ、および該ミエロペルオキシダーゼの抗微生物活性を増強するのに有効な量におけるアミノ酸である、グリシン、Ｌ−アラニン、およびＬ−プロリンを含む。
【００３７】
本発明の組成物で用いられるアミノ酸の有用量は、該組成物中におけるミエロペルオキシダーゼ量、および使用環境において存在する条件に応じて変化する。大半の目的の場合、本発明の組成物は一般に、本発明のアミノ酸の各々を、約０．１〜約５００ｍＭずつ、より好ましくは約０．２〜約１００ｍＭずつ、またさらにより好ましくは約０．３〜約５０ｍＭずつ含む。例えば、代表的な一実施形態において、本発明の組成物は、１０〜５，０００μｇ／ｍｌのミエロペルオキシダーゼ、０．３〜５０ｍＭのグリシン、０．３〜５０ｍＭのＬ−アラニン、０．３〜５０ｍＭのＬ−プロリン、および１〜５００Ｕ／ｍｌのグルコースオキシダーゼを含む。
【００３８】
本発明のミエロペルオキシダーゼ組成物の殺菌活性は、過酸化物および塩化物または臭化物から次亜ハロゲン酸塩を形成する反応、ならびに過酸化物および次亜ハロゲン酸塩から一重項酸素分子を形成する反応を伴い、本発明の組成物の活性は、抗微生物活性部位における、適切な過酸化物およびハロゲン化物の存在に依存する。一部の状況では、例えば、天然の微生物叢の活性により、過酸化物（例えば、過酸化水素）が、抗微生物活性部位において存在する場合があり、また、該転換反応において補因子として作用するのに十分な量の塩化物が、生理学的環境において存在する場合がある。これらの状況では、さらなる過酸化物またはハロゲン化物を投与することも、これらを本発明の組成物中に組み入れることも必要でない。他の状況では、微生物治療部位において過酸化水素および／またはハロゲン化物をさらに供給することが必要であるかまたは望ましい場合がある。したがって、本発明の組成物は、所望の場合、過酸化物またはｉｎ  ｖｉｖｏもしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて過酸化物を生成することが可能な作用物質、および塩化物または臭化物もさらに含みうる。
【００３９】
本発明の組成物および方法において有用な過酸化物には、過酸化水素、式：
Ｒ−ＯＯＨ
［式中、Ｒは、水素、または１〜３個の炭素原子を有する短鎖のアルキル基、また、ボロペルオキシドまたは過酸化尿素などの無機過酸化物である］の過酸化アルキルが含まれる。有機過酸化物の酸化活性は一般に、以下：
Ｒ＝Ｈ＞＞ＣＨ３＞ＣＨ３ＣＨ２＞ＣＨ３（ＣＨ２）２
の通り、Ｒ鎖長が長くなると低下する。
【００４０】
本発明の組成物において用いられる、本明細書において好ましい過酸化物は、過酸化水素である。また、ｉｎ  ｖｉｖｏもしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて過酸化水素を生成することが可能な作用物質を組成物中に組み入れることによって、過酸化水素が殺菌活性部位において供給されるようにすることもできる。この目的で特に有用な作用物質には、例えば、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、およびガラクトースオキシダーゼなどのオキシダーゼが含まれる。
【００４１】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて適用される本発明の組成物中に過酸化水素を直接に組み入れる場合、用いられる量は、最大の消毒活性を提供するように設計することが好ましい。宿主細胞および組織、ならびに正常な微生物叢に対する損傷は、高度のＨ２Ｏ２曝露時間における直接的な接触を回避することにより回避される。したがって、本発明の組成物は、組成物ｍｌ当たり約１ｎモル〜約１０μモルの過酸化水素、より好ましくは、組成物ｍｌ当たり約５ｎモル〜約５μモルの過酸化水素、またより好ましくは、組成物ｍｌ当たり約１０ｎモル〜約１μモルの過酸化水素を含みうる。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて過酸化水素物を生成することが可能な作用物質、例えば、過酸化物生成オキシダーゼは、抗微生物活性部位において存在する過酸化水素量の動的な制御に特に有用である。このような作用物質は、安定的で低レベルのＨ２Ｏ２濃度を供給および維持することにより、組成物の抗微生物活性を最大化する。したがって、このような作用物質が用いられる量は、該作用物質の性質および所望の効果に高度に依存するが、抗微生物活性部位において供給されるハロゲン化物の種類および濃度に応じて、毎分液体ｍｌ当たり約１ｐモル〜約１μモルの安定状態レベルの過酸化水素を生成可能であることが好ましい。製剤を消毒−滅菌液として用いる場合は、オキシダーゼおよびその基質を、必要とされる滅菌時間にわたり存続する、比較的高い安定状態濃度のＨ２Ｏ２を供給するように調整することができる。消毒−滅菌活性は、オキシダーゼ基質の枯渇により、またはオキシダーゼ分解速度との関係で終結する。代表例として述べると、オキシダーゼがグルコースオキシダーゼであり、その基質がグルコース（またはデキストロース）である場合、本発明の組成物は、約０．０５〜約３，０００Ｕ／ｍｌ、より好ましくは、約０．１〜約１，０００Ｕ／ｍｌ、またさらにより好ましくは、約１〜約５００Ｕ／ｍｌのグルコースオキシダーゼと、約０．１〜約１，０００ｍＭ、より好ましくは、約０．５〜約８００ｍＭ、またさらにより好ましくは、約１〜約５００ｍＭのグルコースとを含みうる。
【００４２】
臭化物または塩化物を本発明の組成物中に組み入れる場合、具体的な適用において用いられる臭化物または塩化物の使用、選択、および量は、所望の治療効果、過酸化物の供給可能性、および他の因子など、各種の因子に依存する。塩化物は、大半の生理学的生息環境において、ハロゲン化物補因子として無際限な程度に十分なレベルで存在するので、塩化物の外部供給源は一般に必要とされない。塩化物の外部供給源が望ましい場合、用いられる塩化物量は、生理学的条件を近似する、溶液ｍｌ当たり約１０μモル塩化物〜約１５０μモル塩化物の範囲内に収まることが好ましい。組み入れる場合、本発明の組成物は、液体組成物ｍｌ中約１ｎモル臭化物〜約２０μモル臭化物、より好ましくは、液体組成物ｍｌ中約１０ｎモル臭化物〜約１０μモル臭化物、また最も好ましくは、液体組成物ｍｌ中約１００ｎモル臭化物〜約１μモル臭化物を含みうる。
【００４３】
過酸化物に対するハロゲン化物の比は、有効な殺菌環境の処方において重要な考慮点である。したがって、上記で説明した通り、微生物攻撃部位において有効レベルのハロゲン化物および過酸化物を確保することに加え、最適の殺菌活性を提供するハロゲン化物：過酸化物比において、本発明の方法を実施することが好ましい。例えば、ハロゲン化物がＣｌ−である場合、過酸化物に対するＣｌ−の比は、殺菌活性環境において、好ましくは、約１〜約４０，０００の範囲内、より好ましくは、約５０〜約４０，０００、また最も好ましくは、約２００〜約４０，０００の範囲内に維持される。ハロゲン化物がＢｒ−である場合、過酸化物に対するＢｒ−の比は、殺菌活性環境において、好ましくは、約０．１〜約４，０００の範囲内、より好ましくは、約０．５〜約２，０００、また最も好ましくは、約１〜約１，０００の範囲内に維持される。
【００４４】
本発明の組成物および方法は、好ましくは、正常な微生物叢に対する損傷を最小限としながら、広域スペクトルにわたる病理学的微生物の増殖を阻害するのに用いることができる。実施例において示される通り、本発明の組成物は、例えば、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  Ｃ群、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  Ｆ群、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  Ｇ群、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ａｃｉｎｔｏｂａｃｔｅｒ属種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉａ、およびＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａなど、グラム陽性菌およびグラム陰性菌の両方に対する阻害において高度に効果的である。加えて、本発明の組成物は、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属種およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属種などの細菌、またＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属種、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属種、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ属種などの真菌など、芽胞形成微生物の阻害においても有用である。それらの広域スペクトルにわたる活性のために、一部の実施形態において、本発明の組成物は、多菌感染の治療において用いると有利でありうる。多菌性疾患は複数の感染作用物質を伴い、複合体、複合、混合、二重、二次的、相乗作用的、合併、多菌性、または共感染であると称する。多菌性疾患には、例えば、膿瘍と関連する感染、ＡＩＤＳ関連の日和見感染、結膜炎、胃腸炎、肝炎、多発性硬化症、中耳炎、歯周病、呼吸器疾患、および性器感染が含まれる。加えて、本発明の組成物は、従来の抗生剤療法に関与する作用機構とは全く異なる作用機構により作用するので、一部の実施形態において、本発明の組成物はまた、ＭＲＳＡ（メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、ＶＲＳＡ（バンコマイシン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、ＶＲＥ（バンコマイシン耐性Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ペニシリン耐性Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、ＰＲＳＰ（ペニシリン耐性Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、イソニアジド／リファンピン耐性Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、ならびにＥ．ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉの他の抗生剤耐性菌株などの多剤耐性病原体により少なくとも部分的には引き起こされる感染の治療においても高度に有用である。本明細書では、このような細菌に、「抗生剤耐性」菌もしくは「薬剤耐性」菌もしくは「多剤耐性」菌として、または当技術分野において十分に理解されている他の類似の用語により言及する。
【００４５】
本明細書で用いられる「正常な微生物叢」という用語は、健康な宿主の体表面の内部またはその上において、共生レベルで正常に生息する細菌を意味する。正常な微生物叢には、例えば、ヒト対象の口腔内、腸内、または膣内における細菌の乳酸ファミリー、例えば、口腔内におけるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｉｒｉｄａｎｓ）、および母乳哺育された乳児の腸内、外性器、前部尿道、および膣内におけるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属種（例えば、ティシエ桿菌およびデーデルライン（Ｄｏｄｅｒｌｅｉｎ）桿菌）が含まれる。宿主の正常な微生物叢を構成する微生物は、周知である（例えば、「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ」、前出、ニューヨーク、３４〜３６および１６１頁を参照されたい）。本発明のミエロペルオキシダーゼは、正常な微生物叢に優先して、多くの病原性細菌および病原性真菌に選択的に結合することが見出されている。ｉｎ  ｖｉｖｏの適用では、宿主から正常な微生物叢を除去するには無効な量のミエロペルオキシダーゼにより宿主を治療することが好ましい。消毒−滅菌のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける適用では、すべての栄養形態および酵母形態の完全な殺滅を確保するのに十分に高濃度のミエロペルオキシダーゼを用いることができる。このような条件下では、宿主組織との接触前にＨ２Ｏ２またはＨ２Ｏ２生成系を消尽させることにより、宿主組織および正常な微生物叢に対する損傷が回避される。
【００４６】
本発明の組成物は一般に、ある量のミエロペルオキシダーゼ、ならびに、過酸化物およびハロゲン化物の存在下において、感受性微生物を殺滅するかまたはそれらの増殖を阻害するのに有効な少なくとも２つのアミノ酸を含む。組成物は、薬学的に許容される担体もさらに含みうる。一部の実施形態において、組成物は、液体の担体中において供給されると好都合な場合がある。それがミエロペルオキシダーゼの選択的結合能または酵素活性に著明に干渉するのでない限りにおいて、任意の液体担体を一般にこの目的に用いることができる。代替的に、組成物は、液体中における可溶化時に活性化する固体形態で提供することもできる。
【００４７】
上記の通り、本発明の組成物は、過酸化物、または、上記において詳述したオキシダーゼなど、過酸化物を生成することが可能な作用物質もさらに含みうる。オキシダーゼ−ミエロペルオキシダーゼ系は、活性作用物質による組成物が、使用時において圧密である２つの個別部分において製剤化される、二元製剤としての構築に役立つ。例えば、二元製剤の１つの部分は、オキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、および少なくとも２つのアミノ酸、例えば、グリシン、Ｌ−アラニン、およびＬ−プロリンを含有する溶液を含みうる。二元剤の第２の部分は、オキシダーゼの基質、例えば、グルコースオキシダーゼの場合におけるグルコースもしくはデキストロース、または酸素分子Ｏ２を含みうる。該基質は、例えば、固体ウェハーの形態で提供することができる。医用品、例えば、手術用具またはコンタクトレンズを滅菌する場合、該基質ウェハーは、滅菌される品目と共に滅菌チャンバー内に入れることができる。ミエロペルオキシダーゼ、活性増強用アミノ酸、およびオキシダーゼを添加して滅菌を開始する。一部の実施形態において、オキシダーゼ基質の可溶化およびオキシダーゼによる利用を促進するため、ミエロペルオキシダーゼ組成物は、アルコールもさらに含みうる。この系は、反応を駆動するのに十分な基質が存在する限りにおいて、持続的な殺菌作用をもたらす。
【００４８】
本発明の組成物は、単独で、または１つもしくは複数の他の治療剤と組み合わせて投与することができる。本発明の組成物と組み合わせて用いうる、さらなる代表的な治療剤は、例えば、抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、および／もしくは抗寄生虫剤などの抗生剤または消毒剤を包含する。一部の実施形態において、さらなる治療剤は、１つまたは複数のペニシリン、セファロスポリン、カルバセフェム、セファマイシン、カルバペネム、モノバクタム、アミノグリコシド、グリコペプチド、キノロン、テトラサイクリン、マクロリド、および／またはフルオロキノロンでありうる。一部の実施形態において、さらなる治療剤は、ヨウ素、銀、銅、クロルヘキシジン、ポリヘキサニド、ビグアニド、キトサン、および／または酢酸でありうる。本発明の１つまたは複数のさらなる治療剤は、同じ組成物の一部として組み込むこともでき、個別に投与することもできる。
【００４９】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける適用の場合、消毒用組成物は、ヒト対象および動物対象を含めた温血動物に対して、任意の有効な、薬学的に許容される形態、例えば、局所剤、口内剤、鼻腔用スプレー、吸入用エアゾール、または微生物感染部位へと活性ミエロペルオキシダーゼを送達するのに有効な他の任意の形など、局所用剤形、洗浄用剤形、経口用剤形、膣内用剤形、または坐剤用剤形において投与することができる。投与経路は、感染微生物との消毒用組成物の直接的な接触が得られるように設計することが好ましい。本発明の一態様において、本発明の組成物は、例えば、歯茎、眼、耳、皮膚、創傷、膣領域、鼠径部領域、褥瘡、火傷；医用包帯材、おむつ、または水分を帯びる可能性が高い他の被覆下にある領域など、感染を受けやすい、ヒト対象または動物対象の領域へと局所的に送達または投与される。
【００５０】
局所適用の場合、薬学的に許容される担体は、液体、クリーム、発泡体、ローション、軟膏、懸濁液、坐剤、またはゲルの形態をとることが可能であり、水溶性溶媒または有機溶媒、緩衝剤、乳化剤、ゲル化剤、保湿剤（ｍｏｉｓｔｕｒｉｚｅｒｓ）、安定化剤、界面活性剤、湿潤剤、防腐剤、遅延放出剤、および少量の保湿剤（ｈｕｍｅｃｔａｎｔｓ）、封鎖剤、色素、芳香剤、ならびに局所投与用の医薬製剤において一般に用いられる他の成分もさらに含みうる。加えて、本発明の組成物は、対象に適用される包帯材または被覆内に含浸させることもできる。
【００５１】
本発明の別の実施形態において、本発明の組成物は、特に、医療デバイスまたはコンタクトレンズが、患者または装着者と接触して用いられることが意図される場合、該デバイスまたはレンズの消毒または滅菌など、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける適用のために特別に設計することができる。この種類の適用の場合、組成物は、液体、クリーム、発泡体、ローション、またはゲルの形態で提供すると好都合な場合があり、乳化剤、界面活性剤、緩衝剤、保湿剤、防腐剤、およびこの種類の組成物中において一般に見出される他の成分と共に提供することができる。本発明の組成物を微生物感染防止部位へと送達するために、縫合糸、包帯、およびガーゼなどの吸収性材料内に該組成物を含浸させることもでき、ステープル、ジッパー、およびカテーテルなど、固相材料の表面上において該組成物をコーティングすることもできる。この種類の他の送達系は、当業者には容易に明らかとなろう。
【００５２】
上記において詳細に説明した通り、過酸化物生成用のオキシダーゼ、該オキシダーゼの基質、およびハロゲン化物など、他の成分も、所望に応じて組み入れることができる。加えて、該成分は、単一の製剤中において製剤化することもでき、特定の適用に望ましい場合の通り、その後の使用時において混合される二元製剤へと個別化することもできる。単一製剤の場合、ハロゲン化物、オキシダーゼ、オキシダーゼ用の補欠分子族、オキシダーゼ用の還元基質、または酸素分子など、適用部位において用いられる必須の系成分の１つを製剤から除外し、尚早の反応および系成分の枯渇を回避することが好ましい。
【００５３】
例示的な例として述べると、抗微生物（または抗感染）液として用いるのに適する組成物は、約１〜５０，０００μｇ／ｍｌ（すなわち、約０．３７５〜約１８，７５０ＧＵ／ｍｌ）のミエロペルオキシダーゼ、０．１〜５００μモル／ｍＬ（すなわち、０．１〜５００ｍＭ）のグリシン、０．１〜５００μモル／ｍＬ（すなわち、０．１〜５００ｍＭ）のＬ−プロリン、０〜１００μモル／ｍＬ（すなわち、０〜１００ｍＭ）のＬ−アラニン、ｍｌ当たり０．０１〜５００単位のグルコースオキシダーゼ、および１０〜１５０μモル／ｍＬの塩化物を含みうる。上記の組成物を１〜５００μモル／ｍＬ（すなわち１〜５００ｍＭ）のグルコースまたはデキストロースと組み合わせ、消毒液または滅菌液として用いる。
【００５４】
上記は、以下の代表的な実施例との関連でより十分に理解することができるが、これらは例示を目的として示されるものであり、限定を目的として示されるものではない。
【実施例】
【００５５】
（実施例１）
血液の存在下におけるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対するミエロペルオキシダーゼ系の抗微生物活性に対するＬ−リシンの効果
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対するミエロペルオキシダーゼ系の活性に対するＬ−リシンの効果は、以下の通りに裏付けられた。
【００５６】
材料
早期の定常相増殖に対する後期の対数増殖を達成するため、振とうフラスコ法により細菌懸濁液、この実施例では具体的にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓを調製した。細菌は、トリプチカーゼダイズ培養液（ＴＳＢ）中３５℃で２４時間にわたり増殖させた。４，０００ｒｐｍで１０分間にわたり培養物を遠心分離し、上清を除去した。ペレットを回収し、無菌の０．９％生理食塩液（ＮＳ）により２回にわたり洗浄した。洗浄された微生物を懸濁させ、生理食塩液により、３マクファーランド濁度の標準液、すなわちｍＬ当たりの細菌約１０９コロニー形成単位（ＣＦＵ）へと希釈した。実際のコロニーカウントは、ＴＳＡ上に播種され、３５℃で一晩インキュベートされた希釈系列（１０−１〜１０−５または１０−６）により確認する。約１０７ＣＦＵ／ｍＬの最終的な作業用標的接種材料を得るため、最終反応混合物ｍＬ当たり１５マイクロリットルの微生物を用いる。
【００５７】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  Ｎｉｇｅｒに由来するグルコースオキシダーゼ（ＧＯ）は、英国、Ｂｉｏｚｙｍｅ社から購入した（型番ＧＯ３Ａ；２７０Ｕ／ｍｇ）。ブタミエロペルオキシダーゼ（ｐ−ＭＰＯ）（米国、アーカンソー州、リトルロック、Ｅｘｏｘｅｍｉｓ社製；３７５Ｕ／ｍｇ）。Ｄ−グルコースおよび塩化ナトリウムの無菌原液を調製し、各々、１５０ｍＭの最終濃度で用いた。Ｌ−リシンヒドロクロリド（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製；型番Ｌ１１４２）は、１００ｍＭの原液として調製した。カタラーゼ（Ｓｉｇｍａ社製；型番Ｃ−４０）は、０．９％の生理食塩液中に１％の原液として調製した。静脈穿刺により血液を採取し、同日中に全血液として用いた。
【００５８】
方法
滅菌法を用いて、０．０２％のＴｗｅｅｎ−８０、１５０ｍＥｑ／Ｌの塩化物、および０、１．２５、５、または２０μモル／ｍＬのＬ−リシンを含有するｐＨ６．５の２０ｍＭリン酸緩衝液により、表１において示される濃度で、ｐ−ＭＰＯおよびグルコースオキシダーゼ溶液を調製した。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓを用いて、ｍＬ当たり２〜３×１０７ＣＦＵ（７．４ｌｏｇ１０）の最終標的濃度をもたらし、静脈全血を用いて、３％の最終濃度をもたらした。反応混合物にグルコースを添加して、最終濃度を１５０ｍＭとし、これにより殺菌反応を開始した。反応混合物の最終容量は１ｍＬであった。反応は、乾燥槽内において、室温または３７℃で、必要に応じて３０分間〜２時間にわたり実行した。特定の時点において、最小１００単位／μＬを含有する１００マイクロリットルのカタラーゼ溶液により反応混合物を処理して残りの過酸化物を消尽し、酸化的殺滅を終結させた。無菌の生理食塩液中における各バイアルの内容物から希釈系列によるプレートカウントを実施し、トリプチカーゼダイズ寒天（ＴＳＡ）上に接種して、定量的培養を行った。次いで、３７℃でプレートをインキュベートし、２４時間後においてカウントを行った。インキュベーション後、生物の生存率測定値としてコロニー形成単位（ＣＦＵ）をカウントし、結果を接種材料対照と比較した。２連の平均としての結果を、表１に示す。
【００５９】
表１
血液の存在下におけるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対するミエロペルオキシダーゼ系の殺菌活性に対するＬ−リシンの効果
【００６０】
【表１】
0005643189.tif 000002
１対照は、血液、アミノ酸、グルコース、ＭＰＯ、およびグルコースオキシダーゼの不在下において実施された。
【００６１】
表１に示される通り、ＭＰＯにグルコースオキシダーゼを加えると、アミノ酸（ＡＡ）であるＬ−リシンの存在下において強力な殺菌活性が示される。この組み合わせにより、３％血液の存在下において、１０７個のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓが死滅したのに対し、Ｌ−リシンを有さない同じ組み合わせでは、死滅が著明に低度であった。
【００６２】
（実施例２）
血液の存在下におけるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対するミエロペルオキシダーゼ系の抗微生物活性の潜在的増強剤としてのアミノ酸の効果
各被験アミノ酸に単一濃度のｐ−ＭＰＯ（７１４ｐモル／ｍＬ；これは１００μｇ／ｍＬまたは３８Ｕ／ｍＬと等量である）および単一濃度のグルコースオキシダーゼ（３３．３Ｕ／ｍＬ）を用いたことを除き、実施例１の一般的な手順に従うことによって、血液の存在下におけるＭＰＯ殺菌活性の潜在的増強剤としての各種アミノ酸およびアミノ酸相同体の効果が裏付けられた。以下の表２〜６に示される個々のアミノ酸を５μモル／ｍＬの単一濃度で調べ、アミノ酸を伴わないＭＰＯ系と比較した。それらの殺菌活性を除外するため、ＭＰＯの不在下における単独のアミノ酸を調べた。２連の平均としての結果を、表２〜６に示す。
【００６３】
表２
アミノ酸の種類：血液の存在下におけるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対するミエロペルオキシダーゼ系の殺菌活性に対する効果
【００６４】
【表２】
0005643189.tif 000003
１対照は、血液、アミノ酸、グルコース、ＭＰＯ、およびグルコースオキシダーゼの不在下において実施された。
【００６５】
表３
アミノ酸の種類：血液の存在下におけるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対するミエロペルオキシダーゼ系の殺菌活性に対する効果
【００６６】
【表３】
0005643189.tif 000004
１対照は、血液、アミノ酸、グルコース、ＭＰＯ、およびグルコースオキシダーゼの不在下において実施された。
【００６７】
表４
アミノ酸の種類：血液の存在下におけるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対するミエロペルオキシダーゼ系の殺菌活性に対する効果
【００６８】
【表４】
0005643189.tif 000005
１対照は、血液、アミノ酸、グルコース、ＭＰＯ、およびグルコースオキシダーゼの不在下において実施された。
【００６９】
表５
アミノ酸の種類：血液の存在下におけるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対するミエロペルオキシダーゼ系の殺菌活性に対する効果
【００７０】
【表５】
0005643189.tif 000006
アミノ酸単独の殺菌活性を決定するための対照として、グルコース、ＭＰＯ、およびグルコースオキシダーゼの不在下にあることを除き、反復なしで実施例２の手順に従った。結果を表６に示す
表６
アミノ酸の種類：血液の存在下におけるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対するアミノ酸単独の殺菌活性
【００７１】
【表６−１】
0005643189.tif 000007
【００７２】
【表６−２】
0005643189.tif 000008
表２〜５は、アミノ酸の添加を伴う場合および伴わない場合におけるＭＰＯ系の効能を示す。表６は、アミノ酸もそれらの相同体も、ＭＰＯの不在下におけるそれ自体では、殺菌性でないことを示す。
【００７３】
アミノ酸を介する改良の大きさは、用いられるアミノ酸に依存し、試験条件下において、ゼロｌｏｇ〜少なくとも６ｌｏｇの改良の範囲にある。
【００７４】
表２において、代表的なＬ−アミノ酸による試験は、アミノ酸と共に用いると、ＭＰＯ系の活性が増大することを裏付ける。顕著な例外は、ＭＰＯ系により生成される酸化中間体と化学反応し、不活性化合物を生成すると予測されるアミノ酸である、システイン、メチオニン、およびトリプトファンである。ヒスチジンによる活性増強の限定も、それが一重項酸素に対して高度に反応性であると予測され、ＭＰＯ系の生成物により消尽されるという事実によれば説明できるであろう。
【００７５】
表３および４ではＬ−アミノ酸が追加され、これらにより、アミノ酸のエステルおよび他の密接な相同体もまた、裏付け可能な活性を有することが示される。
【００７６】
表３、４、および５では、多数のＤ−アミノ酸について調べたところ、Ｌ−アミノ酸の場合と同様に、多くのＤ−アミノ酸により、製剤の殺菌活性に対して著明な向上をもたらすことができる。表５に示されるＤ−アルギニンが、表２に示される、本質的に不活性のＬ−アルギニンとは対照的に、高度に活性であることに注目されたい。
【００７７】
一般に、脂肪族アミノ酸、とりわけ、分枝鎖を含有する脂肪族アミノ酸は、高度に活性である。
【００７８】
表６では、それらの殺菌活性を除外するため、すべてのアミノ酸を、ＭＰＯの不在下において単独で調べた。
【００７９】
（実施例３）
血液の存在下におけるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対するミエロペルオキシダーゼ系の抗微生物活性の潜在的増強剤としてのアミノ酸類似体の効果
実施例２の一般的な手順に従うことによって、血液の存在下におけるｐ−ＭＰＯ殺菌活性の潜在的増強剤としての各種ベータアミノ酸、エステル誘導体、およびＮ−置換アミノ酸の効果が裏付けられた。それらの殺菌活性を除外するため、ＭＰＯの不在下における単独のアミノ酸類似体を調べた。
【００８０】
結果を以下の表７および表８に示す。
【００８１】
表７
アミノ酸類似体の種類：血液の存在下におけるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対するミエロペルオキシダーゼ系の殺菌活性に対する効果
【００８２】
【表７】
0005643189.tif 000009
１対照は、血液、アミノ酸、グルコース、ＭＰＯ、およびグルコースオキシダーゼの不在下において実施された。
【００８３】
アミノ酸単独の殺菌活性を決定するための対照として、グルコース、ＭＰＯ、およびグルコースオキシダーゼの不在下にあることを除き、反復なしで上述の手順に従った。結果を表８に示す。
【００８４】
表８
アミノ酸類似体の種類：血液の存在下におけるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対するアミノ酸類似体単独の殺菌活性
【００８５】
【表８】
0005643189.tif 000010
表７および表８に示される通り、大半の被験アミノ酸相同体の存在下において、ＭＰＯ系は、強力な殺菌活性を示す。表２〜表５に示される通り、ベータアミノ酸、エステルアミノ酸、およびＮ−置換されたアミノ酸相同体を代表するものとして選択された化合物の大半が、３％血液の存在下において、１０７ＣＦＵのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ殺滅を達成したのに対し、アミノ酸を伴わない同一の試験条件でもたらされる低減は、１．５ｌｏｇ未満であった。表８に示される通り、アミノ酸単独では、殺菌活性が示されなかった。
【００８６】
（実施例４）
カタラーゼによる反応停止前の３０分間または６０分間にわたって、２５または１００μｇ／ｍＬの濃度におけるＭＰＯ、および１．２５、５、または２０μモル／ｍＬ（ｍＭ）の濃度におけるアミノ酸を用い、各種のアミノ酸について、実施例２の一般的手順に従った。アミノ酸および条件の各々に対する生存生物数のｌｏｇ１０（ＣＦＵ＋１）を、試験条件ごとの平均結果を有効性の降順にランク付けした以下の表９に示す。
【００８７】
表９
濃度条件および時間条件を変化させる場合におけるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対するミエロペルオキシダーゼ系の殺菌活性に対するアミノ酸の効果
【００８８】
【表９】
0005643189.tif 000011
（実施例５）
血液の存在下におけるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対するミエロペルオキシダーゼ系の抗微生物活性に対するアミノ酸の二元的組合せの効果
以下の表９〜１３に示される通り、各試験が、単一低濃度のＭＰＯ（１２．５μｇ／ｍＬまたは４．７Ｕ／ｍＬ）およびグルコースオキシダーゼ（４．２Ｕ／ｍＬ）および２つのアミノ酸による活性化剤を含有し、各々が、１．２５μモル／ｍＬの最終濃度で混合物に添加されることを除き、実施例２の一般的な手順に従うことによって、血液の存在下におけるｐ−ＭＰＯ殺菌活性の潜在的増強剤としてのアミノ酸の二元的組合せの効果が裏付けられた。比較のためにアミノ酸による増強剤を個別に調べる場合、それらは、２．５μモル／ｍＬの最終濃度で混合物に添加される。
【００８９】
結果を以下に示す。
【００９０】
表１０
血液の存在下におけるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対するミエロペルオキシダーゼ系の殺菌活性に対するアミノ酸の二元的組合せの効果
【００９１】
【表１０−１】
0005643189.tif 000012
【００９２】
【表１０−２】
0005643189.tif 000013
１対照は、血液、アミノ酸、グルコース、ＭＰＯ、およびグルコースオキシダーゼの不在下において実施された。
【００９３】
表１１
血液の存在下におけるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対するミエロペルオキシダーゼ系の抗微生物活性に対するアミノ酸の二元的組合せの効果
【００９４】
【表１１】
0005643189.tif 000014
（実施例６）
血液の存在下におけるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対するミエロペルオキシダーゼ系の抗微生物活性に対する、グリシンを含有するアミノ酸の二元的組合せの効果
２つのアミノ酸のうちの１つをグリシンとして、実施例５の一般的手順を用いたところ、表１２および１３に示される結果がもたらされた。
【００９５】
表１２
血液の存在下におけるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対するミエロペルオキシダーゼ系の殺菌活性に対する、グリシンを伴うアミノ酸の二元的組合せの効果
【００９６】
【表１２】
0005643189.tif 000015
表１３
血液の存在下におけるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対するミエロペルオキシダーゼ系の殺菌活性に対する、グリシンを伴うアミノ酸の二元的組合せの効果
【００９７】
【表１３】
0005643189.tif 000016
（実施例７）
血液の存在下におけるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対するミエロペルオキシダーゼ系の抗微生物活性に対する、Ｌ−イソロイシンを含有するアミノ酸の二元的組合せの効果
実施例２において、アミノ酸であるＬ−イソロイシンは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対するＭＰＯ系の強力な活性増強剤として同定された。したがって、実施例５の手順に従うことにより、血液の存在下におけるＭＰＯ殺菌活性の潜在的増強剤としてのＬ−イソロイシンとの個々のアミノ酸の二元的組合せ効果が検討された。結果を、以下の下記表１４に示す。
【００９８】
表１４
血液の存在下におけるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対するミエロペルオキシダーゼ系の殺菌活性に対する、Ｌ−イソロイシンを伴うアミノ酸の二元的組合せの効果
【００９９】
【表１４】
0005643189.tif 000017
効能に対する、２つの組み合わされたアミノ酸によるすべての製剤の効果を、各単一のアミノ酸の効果と比較する、表１０〜表１４に含有されるデータの解析を実施し、可能な相乗作用またはアンタゴニズムを同定した。
【０１００】
３７のアミノ酸またはそれらの誘導体を単独で検討した。上記で説明した標準的な条件下において、７４対のアミノ酸を調べた。
【０１０１】
相乗作用の判定法
相乗作用またはアンタゴニズムの計算は、以下の通りに行った。
【０１０２】
被験アミノ酸対の各々について、標準的な条件下において単独で作用する個別のアミノ酸の２つの結果について見出されるＣＦＵによる生存菌数の平均として、予測ＣＦＵを計算した。例えば、表１１に示される、Ｄ−イソロイシンおよびグリシンによる第１の相乗作用的組合せについて考えてみよう。上記の表１１に由来する、個別に作用する各アミノ酸についてのＣＦＵは、それぞれ、１９６０００および９３００である。これら２つの数の平均は１０２６５０であり、下記の表１６の第１行において、ＣＦＵによる予測生存菌数として示される。次いで、該対について観察される実際のＣＦＵを、予測ＣＦＵにより除し、これに１００を乗じて、予測値に対する％を計算する。次いで、この値を、次節において論じる閾値と比較して、該対が相乗的であるか、アンタゴニスト的であるか、または相加的であるかを判定する。
【０１０３】
閾値の計算
相乗作用およびアンタゴニズムの判定に適切な閾値の計算は、ＣＦＵによる生存菌数を反復して測定した場合のばらつきに基づいた。大半の測定は、２連で行った。すべての２連データについての平方数の和を統合し、ｌｏｇ１０（ＣＦＵ＋１）変換の後、自由度の数で除すると、対数変換されたデータの誤差分散が得られる。これにより、変動係数（ＣＶ）を計算し、これを表１５に示す。
【０１０４】
表１５
ＣＦＵ変動係数の統合推定値の計算
【０１０５】
【表１５】
0005643189.tif 000018
このＣＶは、ＣＦＵ応答の全範囲にわたり計算される。したがって、この応答の場合、正常変動は、標準偏差の２倍以内、または約５０％〜２００％にある。ここで、さらに２倍の控えめな倍数を用い、実際の相乗作用およびアンタゴニズムが同定されることを確認した。したがって、カットオフは、相乗作用の場合が２５％、また、アンタゴニズムの場合が４００％に設定された。上記の例にこの閾値を適用すると、Ｄ−イソロイシンおよびグリシンによる対についての実際のＣＦＵは０ＣＦＵまたは予測値の０％であるので、この対には相乗作用が存在するという明らかな結論が得られる。
【０１０６】
結果の表
被験対象である各組合せの結果を３つの表に分類する：表１６は、応答が予測値の２５％未満である相乗作用的組合せを示し、表１７は、応答が予測値の４００％を超えるアンタゴニスト的組合せを示し、表１８は、応答が予測値の２５％〜４００％である相加的組合せを示す。
【０１０７】
表１６
相乗作用的な組合せ
【０１０８】
【表１６】
0005643189.tif 000019
表１７
アンタゴニスト的な組合せ
【０１０９】
【表１７】
0005643189.tif 000020
表１８
相加的な組合せ
【０１１０】
【表１８】
0005643189.tif 000021
ラセミアミノ酸の組合せ
ラセミアミノ酸とは、Ｄ−異性体およびＬ−異性体の１：１の混合物として考えることができる。そこで、個々のＤ−光学異性体およびＬ−光学異性体の効能に基づいて、いくつかのラセミ混合物を組合せとして調べ、アンタゴニスト的混合物であるか、相加的混合物であるか、または相乗作用的混合物であるかを同定した。４つのアミノ酸のＤ−形態、Ｌ−形態、およびラセミ形態についての結果を、表１９に示す。
【０１１１】
表１９
ラセミ混合物
【０１１２】
【表１９】
0005643189.tif 000022
以下の表中における予測値に基づくと、相乗作用的であると考えられるｒ−フェニルアラニンの場合を除き、ラセミ混合物は相加的であると考えられる。
【０１１３】
表２０
ラセミ混合物の結果
【０１１４】
【表２０】
0005643189.tif 000023
（実施例８）
血液の存在下におけるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ芽胞に対するミエロペルオキシダーゼ系の抗微生物活性に対するベータアラニンおよびＬ−アラニンの組合せの効果
実施例２の手順に従い、血液の存在下におけるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ芽胞に対するＭＰＯ殺菌活性の潜在的増強剤としてのベータアラニンおよびＬ−アラニンの二元的組合せの効果が判定された。しかし、この場合、各試験は、単一低濃度のＭＰＯ（２５μｇ／ｍＬまたは９．４Ｕ／ｍＬ）およびグルコースオキシダーゼ（８．３Ｕ／ｍＬ）を含有した。顕微鏡により確認される、１００％の芽胞を含有するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓの懸濁液は、５０％のエタノールで洗浄してＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓの栄養形態を除去することにより得た。比較のため、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ芽胞に対するミエロペルオキシダーゼの抗微生物活性に対するＬ−アラニン単独およびベータアラニン単独の両方の効果を調べた。結果を、以下の下記表２１に示す。
【０１１５】
表２１
血液の存在下におけるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ芽胞に対するミエロペルオキシダーゼ系の抗微生物活性に対するベータアラニンおよびＬ−アラニンの組合せの効果
【０１１６】
【表２１】
0005643189.tif 000024
表２１に示される通り、アミノ酸であるベータアラニンおよびＬ−アラニンの二元的相互作用により、Ｌ−アラニンを単独で伴うか、またはアミノ酸の不在下におけるＭＰＯ系の効能と比較して、ミエロペルオキシダーゼによるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ芽胞の殺滅が著明に増強された。２時間後において、ベータアラニン／Ｌ−アラニンを含有する製剤が２．４ｌｏｇの低減を示したのに対し、Ｌ−アラニンだけの製剤は１．５ｌｏｇの低減をもたらした。
【０１１７】
上記で説明した相乗作用決定法に従い、ベータアラニンおよびＬ−アラニンの間における関係の性質を検討した。２時間後において、単独でのベータアラニンは３１０００００ＣＦＵの生存菌数を示すが、単独で作用するＬ−アラニンは５２００００ＣＦＵを示す。これらの数の平均は１８１００００ＣＦＵであり、これは、２つのアミノ酸の組合せについての予測値である。ベータアラニン／Ｌ−アラニン対について観察される実際のＣＦＵは７００００ＣＦＵであり、これは、予測値の３．９％を占めるにすぎず、これにより、相乗作用的組合せが示される。
【０１１８】
（実施例９）
血液の存在下におけるグラム陰性菌、グラム陽性菌、および酵母菌に対するミエロペルオキシダーゼ系の抗微生物活性に対する二元的組合せおよび個々のアミノ酸の効果
実施例２の手順に従い、血液の存在下におけるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、およびＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓに対するＭＰＯ殺菌活性の潜在的増強剤としてのアミノ酸であるグリシンおよびバリンの二元的組合せ効果、ならびにベータアラニンの個別効果が判定された。単一低濃度のＭＰＯ（２５μｇ／ｍＬまたは９．４Ｕ／ｍＬ）およびグルコースオキシダーゼ（８．３Ｕ／ｍＬ）に対して各生物を調べた。２つのアミノ酸による活性化剤は、各々２．５μモル／ｍＬの最終濃度で添加し、個別のアミノ酸であるベータアラニンは、５μモル／ｍＬの単一濃度で調べた。比較のために、これらの生物に対するミエロペルオキシダーゼの抗微生物活性に対する、アミノ酸を含有しない製剤の効果を調べた。結果を、以下の表２２に示す。
【０１１９】
表２２
血液の存在下におけるグラム陰性菌、グラム陽性菌、および酵母菌に対するミエロペルオキシダーゼ系の抗微生物活性に対する二元的組合せおよび個々のアミノ酸の効果
【０１２０】
【表２２】
0005643189.tif 000025
表２２に示される通り、Ｌ−バリンおよびグリシンの二元的組合せならびに個別のアミノ酸であるベータアラニンのいずれによっても、アミノ酸の不在下におけるＭＰＯ系の効能と比較して、すべての被験生物に対するＭＰＯ系の殺菌活性が、血液存在下において著明に増強された。Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの場合、Ｌ−バリン／グリシンの組合せによる増強効果は、６０分以内において２．１ｌｏｇであり、ＭＰＯ系に対する５ｍＭベータアラニン単独の添加では、６０分間後において、４．６ｌｏｇだけ抗微生物活性が増大した。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに対しては、Ｌ−バリン／グリシンによりもたらされる殺菌活性の向上が１．２ｌｏｇであり、ベータアラニンの場合が１．９ｌｏｇであった。最も顕著な向上は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対して、ＭＰＯ系に対するベータアラニンの効果により見ることができ、３０分以内に６．８ｌｏｇの効能の増大であった。加えて、表２１で見ることができる通り、アミノ酸およびＭＰＯのいずれもが低濃度の場合において、単一のアミノ酸であるベータアラニンならびにＬ−バリンおよびグリシンの２つのアミノ酸の組合せは、６０分以内にＳ．ａｕｒｅｕｓの完全な殺滅をもたらした。
【０１２１】
（実施例１０）
アミノ酸および添加剤の各種の組合せを含有するＭＰＯ製剤についてのｉｎ  ｖｉｖｏにおける試験データ
以下の通り、ｉｎ  ｖｉｖｏモデルを用いて、ＭＰＯ抗微生物系の有効性の増強における、アミノ酸の各種の組合せの有効性を調べた。
【０１２２】
すべての試験において、成体雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを用いた。ラットに麻酔をかけ、電動式バリカンにより各動物の背部における体毛を除去し、皮膚を準備した。各ラットの背部において、２カ所ずつの創傷部位を準備した。電動式バリカンにより各動物の背部における体毛を除去し、動物に麻酔をかけ、皮膚を準備した。弛緩性皮膚をつまみ上げ、滅菌法を用いてハサミにより楕円形領域を切除し、筋膜を露出させることにより全層皮膚創傷を作製した。
【０１２３】
ＱｕｉｃｋＴｉｔｅ（登録商標）（Ｌｏｃｔｉｔｅ社製）セメントにより、開放端のポリスチレン製円筒（直径２．５ｃｍ）を各治療部位へと接着した。各円筒は液密性の試験チャンバーを形成し、その底部は創傷であった。次いで、露出した筋膜に、約１０７ＣＦＵのＳ．ａｕｒｅｕｓを含有する２００μｌを接種した。１５分後において、接種された筋膜を治療した。生物学的接種の増量が所望される場合は、この時点において、３０μｌの新鮮なラットの全血液を添加した。次に、８００μｌの試験製剤を該部位に添加した結果、試験部位当たり１．０ｍＬの総容量がもたらされた。試験製剤は、以下の表に記載の量で、ミエロペルオキシダーゼ、各種のアミノ酸、グルコースオキシダーゼ、およびグルコースを含有した。対照部位にはｐ−ＭＰＯを投与せず、８００μｌの０．９％生理食塩液または同緩衝液により治療した。単一のラットにおけるいずれの部位も、同じ治療を受けた。
【０１２４】
ｐ−ＭＰＯ製剤による所定の治療時間後において、各治療部位に過大量のカタラーゼを添加し、さらなる殺菌活性を停止させた。これにより、製剤による、残存する、かつ／またはその後生成する過酸化水素が破壊された。
【０１２５】
円筒内に残存する流体を個別に回収し、基底部にある筋膜を無菌的に切除し、秤量し、ホモジナイズした。定量的培養により、液体試料および切除された組織の生存細菌カウントを評価した。結果は、初期接種量からの対数による低減として報告される。
【０１２６】
前述の手順を用いて、アミノ酸であるＬ−アラニン、Ｌ−プロリン、およびグリシンを含む本発明の増強ミエロペルオキシダーゼ試験製剤に対する５分間にわたる曝露による、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（２×１０７ＣＦＵのＳ．ａｕｒｅｕｓを含有する接種材料）に対する、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける阻害の有効性を、３％の血液存在下において、また血液を伴わない場合において、８連の平均として決定した。結果を以下の下記表２３に示す。
【０１２７】
表２３
【０１２８】
【表２３】
0005643189.tif 000026
表２３において示される通り、アミノ酸により、曝露５分後における添加血液の存在を伴う場合および伴わない場合において、同様の形で試験製剤の効能が増強された。
【０１２９】
６連の平均として以下の表２４に示される通り、前述の手順を用いて、多様な濃度のＬ−アラニン、Ｌ−プロリン、およびグリシンを含有する試験製剤に対する、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるグルコース濃度の効果を、２×１０７ＣＦＵのＳ．ａｕｒｅｕｓを含有する接種材料により決定した。
【０１３０】
表２４
【０１３１】
【表２４】
0005643189.tif 000027
示される通り、効能の平均間において観察される差は、被験対象である条件についての統計学的な差ではない。
【０１３２】
前述の手順に従い、６％の血液の存在下において、または血液を伴わない場合において、２００または４００μｇ／ｍｌでミエロペルオキシダーゼを含有する試験製剤の殺菌活性に対して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＬ−アラニン、Ｌ−プロリン、およびグリシンの濃度を変化させる場合の効果を決定した。結果を表２５に示す。
【０１３３】
表２５
【０１３４】
【表２５】
0005643189.tif 000028
前述の手順に従い、２００または４００μｇ／ｍｌでミエロペルオキシダーゼを含有する試験製剤の殺菌活性に対して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＬ−アラニン、Ｌ−プロリン、およびグリシンの濃度を変化させる場合の効果を、これらを変化させない場合と対比して決定した。この関連において、変化とは、ＭＰＯ濃度に合わせて該アミノ酸の濃度を比例的に変化させることを指す。結果を表２６に示す。
【０１３５】
表２６
【０１３６】
【表２６】
0005643189.tif 000029
表２６に示される通り、最低の総アミノ酸濃度（４ｍＭのＬ−アラニン、４ｍＭのＬ−プロリン、および５ｍＭのグリシン）を含有する製剤が、２００および４００μｇ／ｍｌのいずれのミエロペルオキシダーゼ濃度においても、最高の効能を示した。
【０１３７】
表２７において示される通り、前述の手順に従い、Ｌ−プロリン、Ｌ−リシン、およびグリシン、またはＬ−プロリンおよびグリシンを含有する試験製剤のｉｎ  ｖｉｖｏにおける効果が決定され、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの阻害において高度に有効であることが判明した。
【０１３８】
表２７
【０１３９】
【表２７】
0005643189.tif 000030
表２７に示される通り、Ｌ−プロリン、Ｌ−リシン、およびグリシンを含有する試験製剤、またはＬ−プロリンおよびグリシンを含有する試験製剤は、ミエロペルオキシダーゼ抗微生物系の効能を増強する。ＭＰＯが２００μｇ／ｍｌであり、ＭＰＯ：ＧＯ比が１５：１であるこれら２つの製剤は、３０分以内に完全な殺滅をもたらした。これらは、その場合において最良の効能を示す添加剤である２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−２００の存在下において、２倍のＭＰＯおよび２０倍のＧＯを有する製剤の効能を上回った。以下の表２８を参照されたい。
【０１４０】
前述の手順に従い、ＭＰＯ：ＧＯ比が１．５：１で、単一のアミノ酸であるＬ−アラニンおよび２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−２００を含有する試験製剤のｉｎ  ｖｉｖｏにおける効果を決定した。結果を表２８に示す。
【０１４１】
表２８
【０１４２】
【表２８】
0005643189.tif 000031
上記に示される通り、２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−２００を含有するこの製剤は、３％の血液を添加する場合および添加しない場合において同等の効能を示すが、単一のアミノ酸であるＬ−アラニンを伴うこの試験製剤は、２つ以上のアミノ酸を含有する製剤よりも、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する阻害の有効性が著明に低下した。この結果は、以下の表２８および２９において確認される。
【０１４３】
前述の手順に従い、単一のアミノ酸であるＬ−アラニン、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−２００、３：１のＭＰＯ：ＧＯ比、および９０ｍＭのグルコース濃度を含有する試験製剤のｉｎ  ｖｉｖｏにおける効果を決定した。６連の平均として示される結果を、表２９に示す。
【０１４４】
表２９
【０１４５】
【表２９】
0005643189.tif 000032
前述の手順に従い、ＭＰＯ：ＧＯ比が３：１で、単一のアミノ酸であるＬ−アラニンを含有する試験製剤のｉｎ  ｖｉｖｏにおける効果を、ＭＰＯの３つの濃度について決定した。４連の平均として示される結果を、表３０に示す。
【０１４６】
表３０
【０１４７】
【表３０】
0005643189.tif 000033
この製剤は、４００μｇ／ｍｌで３０分後において、最大値である３．８ｌｏｇの低減をもたらした。添加剤を伴わない場合、単一のアミノ酸であるＬ−アラニンを含有するこの試験製剤の効能は、生物学的干渉の存在下において、明らかに限定されている。
【０１４８】
ＭＰＯ：ＧＯ比が１５：１で、Ｌ−プロリン、グリシン、およびＬ−アラニンを含有する試験製剤のｉｎ  ｖｉｖｏにおける経時的な効果を、ＭＰＯの３つの濃度について決定した。この時間−殺滅試験の結果を、図４に示す。データは、表示される時点におけるＣＦＵ／ｍｌ単位のｌｏｇ１０による低減として提示される。増強ＭＰＯ溶液は、すべての被験濃度において、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する殺菌活性を示した。この試験では、接種材料を、１０７ＣＦＵまで増加させた。６連の平均として示される結果を、表３１に示す。
【０１４９】
表３１
【０１５０】
【表３１】
0005643189.tif 000034
表３１において示される通り、アミノ酸による増強製剤は、表３０に示される、４００μｇ／ｍｌでＬ−アラニンを含有する単一のアミノ酸による製剤の８分の１のＭＰＯ（５０μｇ／ｍｌ）を用いて、５分以内に３．１ｌｏｇの低減を結果としてもたらした。アミノ酸による増強製剤は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、より迅速でより大きな殺菌活性をもたらす。
【０１５１】
（実施例１１）
各種のアミノ酸の組合せおよび添加剤を含有するＭＰＯ製剤のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける試験データ
細菌株
ＭＩＣ試験およびＭＢＣ試験のための、活性が増強された、本発明の組成物の例示的な実施形態（「増強ＭＰＯ溶液」）の活性のスペクトルを決定するのに選択された生物（５３０菌株）には、１４０菌株のｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ（そのうち、７０菌株がオキサシリン耐性、５菌種がバンコマイシン低感受性／耐性、４菌株がパントンバレンチンロイコシジン［ＰＶＬ］陽性）、９５菌株のβ型溶血連鎖球菌株、５５菌株の腸球菌（３３菌株がバンコマイシン感受性、２２菌株がバンコマイシン耐性）、１４８菌株のＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ菌株（そのうち、５１菌株がセフタジジム耐性）、および９２菌株の非Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ種（そのうち、５４菌株がセフタジジム耐性）が含まれた。すべての臨床的単離株は、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｍｅｄｉｎｅｔ社Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（米国、バージニア州、ハーンドン）の培養物コレクションから入手されたものであり、多様な地理的領域を代表する。これらは元来、臨床標本に由来し、標準的な微生物学的方法（詳細については、以下の表３３を参照されたい）を用いて同定された。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ  ２５９２２、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ２５９２３、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ２９２１３、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡＴＣＣ  ２７８５３、およびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ２９２１２は、増強ＭＰＯ溶液の品質管理菌株、および臨床検査標準協会（ＣＬＳＩ；旧ＮＣＣＬＳ）による培養液マイクロ希釈変法を検証するための対照作用物質として用いられた。
【０１５２】
抗微生物剤
増強ＭＰＯ溶液は、濃縮液および希釈液と称する、異なるバイアル内にパッケージングされた２つの個別の水溶液として提供される。濃縮液は、注射用水によるリン酸ナトリウム緩衝液中の、塩化ナトリウム、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ−８０）からなる水性製剤媒体中において、ｐ−ＭＰＯ、グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）、およびアミノ酸を含有する。希釈液は、濃縮液と同じ水性製剤媒体中において、デキストロース（グルコース）を含有する。濃縮液および希釈液を共に混合し、薬剤産物である増強ＭＰＯ溶液を生成する。
【０１５３】
増強ＭＰＯ溶液の定量的組成物を、３つのＭＰＯ濃度で表３２に示す。この表において見ることができる通り、グルコースオキシダーゼ活性およびアミノ酸濃度は、ＭＰＯ濃度に直接に比例する。デキストロース濃度は、２８０〜３３６ｍＭに維持される。残りの成分は、一定濃度に保たれる。
【０１５４】
表３２
３つの濃度における増強ＭＰＯ溶液の定量的組成物
【０１５５】
【表３２】
0005643189.tif 000035
注：  ＭＰＯの濃度は、ｍＬ当たりのグアイアコール単位（ＧＵ）として表される。
【０１５６】
増強ＭＰＯ溶液は、使用前に混合される、濃縮液および希釈液と称する２つの水溶液を含む。濃縮液は、水性の製剤媒体中において、ＭＰＯ、ＧＯ、塩化ナトリウム、および特定の抗微生物活性増強剤を含有する。希釈液は、濃縮液と同じ水性製剤媒体中において、グルコース（デキストロース）を含有する。濃縮液および希釈液を、使用の直前に多様な比率で共に混合し、薬剤産物である増強ＭＰＯ溶液を所望の濃度で生成する。増強ＭＰＯ溶液の濃度は、ミリリットル当たりのＭＰＯマイクログラム（μｇ／ｍｌ）として表されるが、また、ミリリットル当たりにおけるＭＰＯ活性のグアイアコール単位（ＧＵ／ｍｌ）としても表される。ＭＰＯのμｇからＧＵへの変換は、０．３７５ＧＵ／μｇ  ＭＰＯに基づく。品質管理の作用物質には、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（米国、ミズーリ州、セントルイス）製のセファゾリンおよびゲンタマイシンが含まれ、選択されて用いられる対照薬は、ゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）およびＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ社（米国、ペンシルベニア州、フィラデルフィア）製のムピロシンリチウムであった。すべての原液は、試験直前に調製された。濃度は、増強ＭＰＯ溶液が０．００４〜８μｇ／ｍｌであり、セファゾリンが０．０６〜６４μｇ／ｍｌであり、ゲンタマイシンが０．２５〜１６μｇ／ｍｌであり、ムピロシンが０．１２〜１６μｇ／ｍｌであった。薬剤相互作用試験に用いられる抗微生物剤は、以下：セファゾリン、セフトリアキソン、セフタジジム、シプロフロキサシン、ドキシサイクリン、ゲンタマイシン、イミペネム、およびＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ社（米国、ペンシルベニア州、フィラデルフィア）製のバンコマイシンであった。
【０１５７】
抗微生物剤の感受性試験
培養液のマイクロ希釈および殺菌活性の決定法は、ＣＬＳＩにより推奨される手順（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ；  Ａｐｐｒｏｖｅｄ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ」、ＣＬＳＩ文書第Ｍ２６−Ａ号、米国、ペンシルベニア州、ウェイン、ＣＬＳＩ、１９９９年９月；Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｔｅｓｔｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ｔｈａｔ  Ｇｒｏｗ  Ａｅｒｏｂｉｃａｌｌｙ；  Ａｐｐｒｏｖｅｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ」、第７版、ＣＬＳＩ文書第Ｍ７−Ａ７号、米国、ペンシルベニア州、ウェイン、ＣＬＳＩ、２００６年１月）を用いて実施された。以下において説明される増強ＭＰＯ溶液の急速なｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性に適合させるため、標準的な培養液マイクロ希釈法に対して改変を行った。各抗微生物剤および濃縮液は、２倍濃度の陽イオン調整型ミュラー−ヒントン培養液（ＣＡＭＨＢ）中において希釈し、マイクロ希釈トレー内において分注した。５％に溶解したウマ血液を補充した、２倍濃度のＣＡＭＨＢ中において、すべてのβ型溶血連鎖球菌を調べた。５％のヒツジ血液を伴うトリプチカーゼダイズ寒天（ＴＳＡ）上における一晩にわたる培養物に由来する複数のコロニー（４〜６個）を無菌の生理食塩液中へと懸濁させることにより単離株を調製し、密度を０．５マクファーランド濁度の標準液（約１０８ＣＦＵ／ｍｌ）へと調整した。約５×１０５ＣＦＵ／ｍｌが薬剤の希釈系列と混合されるように、標準化された細菌懸濁液を、２倍濃度の希釈液中においてさらに希釈した。濃縮液への希釈液の添加により酵素系が活性化し、これにより、その急速な作用方式が作用する。マイクロ希釈トレーは、周囲大気内３５℃で１８〜２４時間にわたりインキュベートした。生物の増殖を完全に阻害する抗微生物剤の最低濃度を観察することにより、ＭＩＣを決定した。
【０１５８】
増強ＭＰＯ溶液のＭＩＣについて、上記で説明した培養液マイクロ希釈変法をまず実施することにより、最小殺菌濃度（ＭＢＣ）を決定した。マイクロ希釈トレーからは、可視的な増殖を伴う、薬剤を含有する最後のウェル、およびそれ以降の透明な各ウェルをサンプリングした。ウェル当たり１０μｌの試料を、５％のヒツジ血液と共にＴＳＡ上へと播種し、周囲大気中において２４時間にわたりインキュベートし、増殖およびコロニーカウントについて検討した。出発接種サイズと比べ、コロニー形成単位で≧９９．９％の低減を示した最低抗微生物濃度として、ＭＢＣを決定した。
【０１５９】
品質管理パラメータ
１ロットの増強ＭＰＯ溶液を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ２９２１３およびＥ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ  ２５９２２に対して２０連にわたって調べることにより、増強ＭＰＯ溶液のＭＩＣ範囲を確立した。次いで、増強ＭＰＯ溶液の最終製剤を調製するのに用いた濃縮液の３つのロットを調べることにより、増強ＭＰＯ溶液についての品質管理パラメータを決定した。試験は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ２９２１３およびＥ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ  ２５９２２に対して２連で実施した。公知の品質管理限界によりＣＬＳＩ培養液マイクロ希釈法を検証するための抗生剤により、標準的な培養液マイクロ希釈試験の改変効果もまた評価した。
【０１６０】
結果を以下の表３３に示すが、ここでは、増強ＭＰＯ溶液製剤を、「Ｅ−ＭＰＯ」と称する。
【０１６１】
表３３
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、および非Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ種の５３０菌種からなる臨床単離株パネルに対する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける増強ＭＰＯ溶液および他の抗微生物剤対照薬の活性
【０１６２】
【表３３】
0005643189.tif 000036
ａ  すべての被験菌株に対するＭＩＣ値の範囲
ｂ  ｎ／ａ：該当なし（単離株の総数が１０未満である）
増強ＭＰＯ溶液を調べるためにＣＬＳＩ培養液マイクロ希釈法を改変することにより、産物を特徴づけ、活性スペクトルを決定するための効果的な手順がもたらされる。表３３に示される５３０種の細菌の臨床単離株に対する増強ＭＰＯ溶液および選択された局所用対照薬を調べた結果、増強ＭＰＯ溶液が、被験対象のグラム陽性菌種およびグラム陰性菌種のいずれに対しても、強力で広域スペクトルの活性を示すことが裏付けられる。腸球菌中、単離株の５０％および９０％が阻害されたときの増強ＭＰＯ溶液のＭＩＣ（ＭＩＣ５０値およびＭＩＣ９０値）は、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓが０．５μｇ／ｍｌであり、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍが０．１２μｇ／ｍｌであった。バンコマイシン感受性腸球菌またはバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）に対する増強ＭＰＯ溶液の活性には、差が認められなかった。ＭＩＣ９０に基づくと、増強ＭＰＯ溶液は、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓに対して、ムピロシンよりも６４倍活性であった。グラム陽性球菌中、増強ＭＰＯ溶液が最も活性であったのは、ブドウ球菌に対してであった。ＭＲＳＡおよびＭＲＳＥを含めたＳ．ａｕｒｅｕｓおよびＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓに対するすべてのＭＩＣが≦０．０６μｇ／ｍｌであり、ＭＩＣ９０は０．０μｇ／ｍｌであった。増強ＭＰＯ溶液の効力は、オキサシリン耐性菌株およびオキサシリン感受性菌株のいずれに対しても同等であった。増強ＭＰＯ溶液がＰＶＬ陽性菌株およびＶＩＳＡ／ＶＲＳＡ菌株に対して高度に活性であったことは、野生型と比較して同等の活性を裏付ける。ＰＶＬ陽性単離株に対するＭＩＣ値は、すべての被験Ｓ．ａｕｒｅｕｓ菌株の範囲内にあった。ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉの場合、増強ＭＰＯ溶液は、５％に溶解したウマ血液を補充したＣＡＭＨＢの存在下においても高度に活性であった。Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅおよびＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに対するＭＩＣ９０は、いずれも０．５μｇ／ｍｌであった。ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉのＣ、Ｆ、およびＧ群の場合、ＭＩＣは≦１μｇ／ｍｌであり、ＭＩＣの範囲は０．２５〜１μｇ／ｍｌであった。Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅおよびＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓを例外として、増強ＭＰＯ溶液は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＭＩＣ９０でムピロシンよりも大きな効力を示した。Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、およびＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓに対するムピロシンのＭＩＣの範囲は、＞３２μｇ／ｍｌにまで拡大された。
【０１６３】
総じて、増強ＭＰＯ溶液は、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ属種に対して高度に活性であり（表３３）、ＭＩＣ９０は０．２５μｇ／ｍｌであり、ＭＩＣの範囲は０．０３〜０．２５μｇ／ｍｌであった。非発酵性のグラム陰性菌中において、ＭＩＣは≦０．１２μｇ／ｍｌであり、狭い活性範囲（≦０．００４〜０．１２μｇ／ｍｌ）を示した。増強ＭＰＯ溶液は、治療が困難なことが多い生物である、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＭＩＣ９０：０．０６μｇ／ｍｌ）およびＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属種（ＭＩＣ９０：０．１２μｇ／ｍｌ）に対して優れた活性を示した。セフタジジム感受性菌株およびセフタジジム耐性菌株に対する増強ＭＰＯ溶液の活性には差が認められなかった。ＭＩＣ９０に基づくと、増強ＭＰＯ溶液は、すべての被験グラム陰性菌に対して、ゲンタマイシンよりも３２〜＞２５６倍活性であった。
【０１６４】
皮膚感染および皮膚構造感染と一般的に関連する病原体の臨床単離株に対するＭＩＣ試験およびＭＢＣ試験の結果を、表３４にまとめる。
【０１６５】
表３４
皮膚感染および皮膚構造感染と関連する臨床単離株に対する増強ＭＰＯ溶液の最小阻害濃度および最小殺菌濃度
【０１６６】
【表３４】
0005643189.tif 000037
ａ  すべての被験菌株に対するＭＩＣ値の範囲
ｂ  ｎ／ａ：該当なし（単離株の総数が１０未満である）
増強ＭＰＯ溶液の強力な殺菌活性は、ＭＢＣの範囲（０．０１５〜２μｇ／ｍｌ）により確認された。増強ＭＰＯ溶液は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのすべての単離株に対して極めて活性であり、ＭＩＣ値およびＭＢＣ値が同一であった（ＭＩＣ５０およびＭＢＣ５０＝０．０１５μｇ／ｍｌ；ＭＩＣ９０およびＭＢＣ９０＝０．０３μｇ／ｍｌ）。
【０１６７】
寒天ベースの方法は、該培地の潜在的な干渉特性のために、比較には用いられなかった。しかし、セファゾリン、ゲンタマイシン、およびムピロシンのＭＩＣに対する、標準化された培養液感受性試験の条件を変更することの効果については、該結果をＣＬＳＩ培養液マイクロ希釈基準法の結果と比較することにより評価および検証した。ＭＩＣ変法およびＭＩＣ基準法共に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける試験パラメータは、培地（ＣＡＭＨＢ）、ｐＨ（７．２）、最終接種材料（５×１０５ＣＦＵ／ｍｌ）、およびインキュベーション環境（３５℃、周囲大気）に関して同様であった。希釈液中における接種材料調製物へと変化させたところ、対照薬である抗生剤について予測されるＭＩＣ結果に対する著明な効果を示さなかった（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、「Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｅｓｔｉｎｇ；  ｓｅｖｅｎｔｅｅｎｔｈ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ」、ＣＬＳＩ文書第Ｍ１００−Ｓ１７号、米国、ペンシルベニア州、ウェイン、２００７年１月）。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ２９２１３に対するセファゾリンおよびムピロシンのＭＩＣ、ならびにＥ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ  ２５９２２に対するセファゾリンおよびゲンタマイシンのＭＩＣは、既に公表された品質管理の範囲（ＣＬＳＩ文書第Ｍ１００−Ｓ１７、前出）内にあった。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ２９２１２およびＥ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ  ２５９２２の場合に増強ＭＰＯ溶液について決定された品質管理の範囲は、それぞれ、０．０１０〜０．０３μｇ／ｍｌおよび０．１５〜０．５μｇ／ｍｌであった。これらの生物については２０連を超えて実施され、結果はすべて確立された品質管理の範囲内にあった。濃縮液の３つのロットを２連で調べた結果は、すべてのＭＩＣ値が、確立された品質管理の範囲内にあることを裏付けた。
【０１６８】
上記で示された通り、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける増強ＭＰＯ溶液についての比較活性は、グラム陽性菌に対して、ムピロシンの活性と同等であるかこれよりも大きく、グラム陰性菌の場合、ゲンタマイシンの活性よりも数倍大きかった。被験対象の耐性菌株および感受性菌株中において、増強ＭＰＯ溶液に対する感受性の差は観察されなかった。ＭＢＣ試験により、増強ＭＰＯ溶液が、重篤な皮膚感染症と関連する最も一般的な２つの病原体であるＳ．ａｕｒｅｕｓおよびＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに対する殺菌活性を呈することが示されたことは重要である。
【０１６９】
時間−殺滅試験
２つの方法：懸濁液中和法（Ｔｏｒｔｏｒａｎｏ，  Ａ．Ｍ．らおよびＥＢＧＡ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ２００５、「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ｆｕｎｇｉｃｉｄａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｂｉｏｃｉｄｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ」、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第５４巻、９５５〜９５７頁）およびＣＬＳＩマイクロ希釈時間−殺滅アッセイ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｇｅｎｔｓ；  ａｐｐｒｏｖｅｄ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ」、ＣＬＳＩ文書第Ｍ２６−Ａ号、米国、ペンシルベニア州、ウェイン、ＣＬＳＩ、１９９９年９月）を適用することにより、増強ＭＰＯ溶液の殺菌効果を評価した。懸濁液中和法は、増強ＭＰＯ溶液の急速な殺菌活性速度、および干渉物質の例としての血液によるその生物学的活性に対する効果を評価するのに用いられた。標準化された試験を適用することにより、増強ＭＰＯ溶液の殺菌活性を評価するため、ＣＬＳＩ法もまた用いられた。
【０１７０】
懸濁液中和による時間−殺滅試験に用いられる被験生物は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ６５３８およびＥ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ  ２５９２２であった。振とうフラスコ法により細菌懸濁液を調製し、早期の定常相増殖に対する後期の対数増殖を達成した。無菌の生理食塩液中において１．０ｍｌ容量の培養物をペレット化して再懸濁させ、約１０９ＣＦＵ／ｍｌとした。２０ｍｌのガラス製シンチレーションバイアル内において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを実施した。適量である１．０ｍｌの希釈液に加えて１５ｍｌの接種材料を含有するように時間−殺滅反応バイアルを調製した後で、濃縮液を添加した。最終懸濁液は約１０７ＣＦＵ／ｍｌを含有し、希釈系列により実際のコロニーカウントを確認した。低濃度の増強ＭＰＯ溶液に生物懸濁液を加え、０．１、０．３、１、３、６、および９μｇ／ｍｌの最終濃度で調べた（図１Ａおよび１Ｂを参照されたい）。処理バイアルは室温でインキュベートした。次いで、１、２、５、１５、３０、６０、および１２０分後において、無菌の１％カタラーゼ溶液１００μｌを添加することにより、細菌の定量直前に酵素反応を停止させた。濃縮液を添加しない対照培養物を室温で３０分間にわたりインキュベートし、定量的培養を実施した。指定された各時点において各反応バイアルから１００μｌの試料を採取し、無菌の生理食塩液中において希釈系列を調製した。１００μｌの各希釈液を適用して、５％ヒツジ血液を伴うＴＳＡプレートを複製し、無菌の接種ループにより表面上に拡散させた。３５℃で一晩にわたるインキュベーション後、コロニーをカウントし、生存カウントを計算した。増強ＭＰＯ溶液の殺菌効果は、増殖対照と比べた、９９．９％または３ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍｌを超える生存カウントの低減として定義された。
【０１７１】
増強ＭＰＯ溶液の活性に対する、干渉物質の潜在力を評価するため、既に説明した懸濁液中和法を用いて、実験日において、ヘパリン処理した試験管内に新鮮な状態で回収されたヒト全血液およびラット全血液の存在下において、時間−殺滅試験を実施した。３％のヒト血液の存在下において、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ６５３８およびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡＴＣＣ  ２７３１７の約１０７ＣＦＵ／ｍｌの接種材料に対して、５０、１００、および２００μｇ／ｍｌで増強ＭＰＯ溶液を調べ、５、１５、３０、および６０分後において殺菌活性を停止させた（図２Ａおよび２Ｂを参照されたい）。上記で説明した通り、６、１２、および２４％のラット血液の存在下において、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ６５３８の約１０７ＣＦＵ／ｍｌの接種材料に対して、４００、８００、および１，６００μｇ／ｍｌの増強ＭＰＯ溶液もまた調べ、２、５、および１５分後において殺菌活性を停止させた。各試験条件について、２連または３連が得られた。
【０１７２】
ＣＬＳＩ変法による時間−殺滅試験に用いられる被験生物には、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ２９２１３、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ２９２１２、Ｅ．ｃｏｉｌ  ＡＴＣＣ  ２５９２２、およびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡＴＣＣ  ２７８５３が含まれた。５％ヒツジ血液を伴うＴＳＡ上で増殖した複数のコロニー（４〜６個）を、３ｍｌの脱イオン化水中に懸濁させ、懸濁液を、０．５マクファーランド濁度の標準液（約１×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）へと調整した。次いで、この懸濁液を、あらかじめ加熱したＣＡＭＨＢ中において１：１０に希釈し、３７℃の振とう式インキュベーター内で１〜４時間にわたりインキュベートした。培養物がその対数増殖相に達し、濁度が０．５マクファーランド濁度の標準液の濁度に近づいたら、１００μｌを採取して１０ｍｌの希釈液へと添加し、結果として約５×１０６ＣＦＵ／ｍｌの濃度を得た。この懸濁液が、時間−殺滅試験用の接種材料を構成した。時間−殺滅反応ウェルは、ＣＡＭＨＢおよび接種材料中において調製された１００μｌの濃縮液（５０μｌの濃縮液および希釈液中で調製された５０μｌの接種材料）を含有するように調製した。濃縮液中におけるＭＰＯの最終濃度は、最高濃度の４倍希釈：０、０．０６、０．２５、１、４、１６、６４、および２５６μｇ／ｍｌであった。培養液および接種材料は含有するが濃縮液は含有しない、同一の反応ウェルが培養物の増殖対照を構成した。細菌細胞の最終濃度は、約５×１０５ＣＦＵ／ｍｌであった。マイクロ希釈トレーは、周囲大気中３５℃でインキュベートし、０、２、５、１５、３０、および６０分後、ならびに４および２４時間後において各時間−殺滅ウェルに１０μｌの１％カタラーゼ溶液を添加して、増強ＭＰＯ溶液の抗微生物作用を停止させた。定量化のために系列試料を得た。各時点において各ウェルから１００μｌずつの試料を採取し、無菌の生理食塩液中において希釈系列を調製した。容量１００μｌの各希釈液を適用して、５％ヒツジ血液を伴うＴＳＡプレートを複製し、無菌の接種ループにより表面上に拡散させた。時点ゼロにおけるプレートは、純度プレートとして機能した。３５℃で一晩にわたるインキュベーション後、手作業でコロニーをカウントし、生存カウントを計算した。殺菌活性は、初期接種材料からの、９９．９％または３ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍｌのコロニーカウントの低減として定義された。
【０１７３】
懸濁液中和法による時間−殺滅試験の結果を、図１に示す。データは、被験増強ＭＰＯ溶液の濃度を上昇させた場合の所定の時点における、初期接種材料と比べたＣＦＵ単位のｌｏｇ１０による低減として提示される。増強ＭＰＯ溶液は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＥ．ｃｏｌｉのいずれに対しても極めて迅速な殺菌活性を示した。増強ＭＰＯ溶液の濃度が上昇すると殺滅速度が増大し、曝露時間が長くなると殺滅規模が増大した。Ｓ．ａｕｒｅｕｓの場合、増強ＭＰＯ溶液は、６〜９μｇ／ｍｌに対する２分間の曝露後において、初期接種材料の３ｌｏｇ１０を超える（７．２ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍｌ）の低減をもたらし、殺菌性であった。３、６、および９μｇ／ｍｌに対する曝露で検出可能な増殖が観察されなくなるのは５分以内であり、１μｇ／ｍｌでも、３ｌｏｇ１０を超える低減が５分以内に達成され、１５分間の曝露では検出可能な増殖が生じなかった。０．３および０．１μｇ／ｍｌの増強ＭＰＯ溶液に対する、それぞれ３０分間および１２０分間の曝露後においても検出可能な増殖は観察されなかった。増強ＭＰＯ溶液は、Ｅ．ｃｏｌｉに対しても同様の時間−殺滅パターンを示した。３μｇ／ｍｌ以上の増強ＭＰＯ溶液濃度に対する曝露で検出可能な増殖が観察されなくなるのは２分以内であった。１μｇ／ｍｌの増強ＭＰＯ溶液に対する２分間の曝露後においては、初期接種材料の３ｌｏｇ１０を超える（６．８ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍｌ）の低減が達成された。１．０μｇ／ｍｌの処理で検出可能な増殖が観察されなくなるのは５分以内であった。増強ＭＰＯ溶液が０．３および０．１μｇ／ｍｌの低濃度の場合も、それぞれ１５分間および６０分間の曝露後において、検出可能な増殖が観察されなかった。
【０１７４】
増強ＭＰＯ溶液の殺菌活性の時間依存性および濃度依存性は、３％のヒト全血液または同ラット全血液の存在下においても依然として存在した。いずれの血液供給源間においても、著明な差は認められなかった。３％のヒト血液存在下において調べた最高のＭＰＯ濃度である２００μｇ／ｍｌでの増強ＭＰＯ溶液が、初期接種材料が７．１５ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍｌであるＳ．ａｕｒｅｕｓおよびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの検出可能な生存菌数をもたらさなくなるのは５分未満であった。濃度１００μｇ／ｍｌの増強ＭＰＯ溶液は、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＳ．ａｕｒｅｕｓに対して、それぞれ、４ｌｏｇ１０を超える低減および５ｌｏｇ１０を超える低減を５分以内に達成した。最低の被験ＭＰＯ溶液濃度である５０μｇ／ｍｌでも、いずれの生物の場合共に、すべての時点において殺菌活性が観察された（図２）。
【０１７５】
増強ＭＰＯ溶液の抗微生物活性に対する血液の干渉作用は、ＭＰＯ濃度を上昇させることにより克服された。増強ＭＰＯ溶液の濃度が４００および８００μｇ／ｍｌの場合、６および１２％のラット血液の存在下において、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する７．１０ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍｌの低減が、検出可能な増殖なしに２分以内に達成された。２４％ラット血液の存在下においても、増強ＭＰＯ溶液は、４００および８００μｇ／ｍｌで４ｌｏｇ１０の低減を２分以内にもたらし、１，６００μｇ／ｍｌで検出可能な生存菌数をもたらさなくなるのが２分以内であった。
【０１７６】
ＣＬＳＩ培養液マイクロ希釈変法による時間−殺滅試験の結果を、図３Ａ〜３Ｄに示す。データは、指定される時点における、ｌｏｇ１０によるＣＦＵ／ｍｌの低減として提示される。増強ＭＰＯ溶液は、すべての被験濃度において、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する殺菌活性を示した。Ｅ．ｃｏｌｉに対して、増強ＭＰＯ溶液は、そのＭＩＣの４分の１である０．０６μｇ／ｍｌを除き、すべての被験濃度で殺菌性であった。Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓおよびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの場合も同様に、増強ＭＰＯ溶液は、ＭＩＣを上回る濃度で調べると殺菌性であった。Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓおよびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに対するＭＩＣは、それぞれ、０．５および０．０６μｇ／ｍｌであった。４つの生物すべてについて同等の殺菌活性パターンが観察され、増強ＭＰＯ溶液の濃度が上昇すると殺滅速度が増大し、曝露時間が長くなると殺滅規模が増大した。増強ＭＰＯ溶液の濃度が２５６および１６μｇ／ｍｌの場合、すべての生物について検出可能な増殖が観察されなくなるのは、それぞれ、３０分および４時間以内であった。増強ＭＰＯ溶液に対する４時間の曝露後において、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓの場合は１６μｇ／ｍｌ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの場合は４．０μｇ／ｍｌ、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの場合は１．０μｇ／ｍｌで３ｌｏｇ１０を超える低減が達成された。懸濁液中和法を用いてより迅速な殺菌活性が観察されたことは、ＣＬＳＩ培養液マイクロ希釈法で用いられた培地の効果による可能性がある。
【０１７７】
懸濁液中和法により実施された時間−殺滅試験は、増強ＭＰＯ溶液の殺菌活性の速度および規模を示した。濃度に依存して、殺滅活性は迅速であり、Ｓ．ａｕｒｅｕｓまたはＥ．ｃｏｌｉに対する６〜７ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍｌの低減が１分以内に結果としてもたらされた。一重項酸素の生成を示す化学発光試験（データは示さない）と併せた迅速な殺菌活性により、一重項酸素が主要な殺滅作用物質である、提起される作用方式が支持される。一重項酸素の高度に求電子的な性質により、標的の生物学的分子における高電子密度領域を酸化し、この結果、膜の完全性の破壊、および／または代謝機能に必要とされる酵素に対する酸化的阻害をもたらすことが可能となる。従来の抗体とは異なり、増強ＭＰＯ溶液は、微生物の細胞内代謝に依存して細胞増殖の阻害または細胞死をもたらすとは考えられない。
【０１７８】
増強ＭＰＯ溶液の時間−殺滅試験のための標準化された方法が存在しなかったので、懸濁液中和法およびＣＬＳＩ培養液マイクロ希釈法の両方を用いて、被験生物に関わらず、増強ＭＰＯ溶液の殺菌活性が時間および濃度に依存的であることを確認した。また、原型的な製剤による、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属またはこれらのメンバーに対する、懸濁液中和法による時間−殺滅試験は、時間が経過すると検出可能な生存が観察されなくなる、時間および濃度に依存する殺菌活性も裏付けた。
【０１７９】
抗微生物的な相互作用
９６ウェルマイクロ希釈トレーを用いるチェッカーボード滴定法により、３つの多剤耐性臨床菌株を用いて、増強ＭＰＯ溶液および抗生剤の組合せを調べた（Ｍｏｏｄｙ，  Ｊ．、「Ｓｙｎｅｒｇｉｓｍ  Ｔｅｓｔｉｎｇ：  Ｂｒｏｔｈ  Ｍｉｃｒｏｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ｃｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ  ａｎｄ  Ｂｒｏｔｈ  Ｍａｃｒｏｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」、５．１２．１〜５．１２．２３頁、Ｈ．Ｄ．  Ｉｓｅｎｂｅｒｇ（編）、「Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、第２版、２００４年、米国、ワシントンＤＣ．、ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ社）。被験生物には、バンコマイシン低感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｍｕ５０菌株（ＮＲＳ１におけるＮＡＲＳＡによる単離株）（Ｈｉｒａｍａｔｓｕ，  Ｋ．Ｈ．ら、「Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｔｒａｉｎ  Ｗｉｔｈ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ」、Ｊ．  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、第４０巻、１３５〜１３６頁、１９９７年）、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  １０７５７０１）、およびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  １４４５５３６）が含まれた。濃縮液および選択された抗生剤を、ＣＡＭＨＢを伴う培養液マイクロ希釈法により調べ、単独および組合せで系列希釈（２倍）した。チェッカーボード内の各ウェルは、２つの薬剤の濃度による固有の組合せを含有し、２つの行は１つの薬剤だけを含有した。増強ＭＰＯ溶液の薬剤濃度範囲は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対して０．０００５〜０．５μｇ／ｍｌ、Ｅ．ｃｏｌｉに対して０．００８〜８μｇ／ｍｌ、またＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに対して０．００１〜１．０μｇ／ｍｌであった。抗生剤の濃度範囲は、被験単離株に対するそれらの各ＭＩＣの４分の１以下〜２倍であった。上記で説明した通り、接種材料は希釈液中で調製し、マイクロ希釈トレーの各ウェルに添加し、周囲大気中３５℃でインキュベートした。単独または組合せでの各抗微生物剤のＭＩＣは、１８〜２４時間後において目視により検出可能な増殖が生じない（１つまたは複数の）最低濃度であるように決定された。ＦＩＣ指標（ｆｒａｃｔｉｏｎａｒｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘｅｓ；ＦＩＣＩ）は、以下の通り：≦０．５：相乗作用；＞０．５〜４．０：相互作用なし；＞４．０：アンタゴニズム（Ｏｄｄｓ，  Ｆ．Ｃ．、「Ｓｙｎｅｒｇｙ，  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ，  ａｎｄ  Ｗｈａｔ  ｔｈｅ  Ｃｈｅｑｕｅｒｂｏａｒｄ  Ｐｕｔｓ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｔｈｅｍ」、Ｊ．  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、第５２巻、１頁、２００３年）に解釈された。
【０１８０】
培養液マイクロ希釈法による耐性発生試験において、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、およびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに対するＭＩＣ結果は、阻害濃度未満の増強ＭＰＯ溶液中における継代後においても、２１日間にわたり変化なしの状態を保った。Ｅ．ｃｏｌｉの３つの臨床菌株に対するＭＩＣは、第１日〜第２日における１回だけの継代後において倍化希釈液の≧４倍の上昇を示し、該ＭＩＣは２１日間にわたって高値を保った。試験期間にわたるＭＩＣの変化は、各菌株それぞれに対して０．１２〜８μｇ／ｍｌ、０．２５〜８μｇ／ｍｌ、０．５〜８μｇ／ｍｌであった。薬剤を含まない寒天プレート上においてこれらの菌株各々を３回にわたって継代したところ、再試験時のＭＩＣは安定的でなく、倍化希釈液の≦２倍の初期ベースラインＭＩＣへと低下した。
【０１８１】
耐性の発生
２つのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法により、多段階の突然変異速度を決定した。阻害濃度未満の原型製剤中で毎日継代された菌株を、懸濁液中和法により調べ（Ｍｉｌｌｉｃｈａｐ，  Ｊ．ら、「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ  Ｓｔｒａｉｎｓ  Ｗｉｔｈ  Ｓｔａｂｌｅ  ａｎｄ  Ｕｎｓｔａｂｌｅ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｓｔｒｅｐｔｏｇｒａｍｉｎ  ＲＰ  ５９５００  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｔｅｐｗｉｓｅ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｅｘｐｏｓｕｒｅ」、Ｄｉａｇｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．、第２５巻、１５〜２０頁、１９９６年；Ｔｏｒｔｏｒａｎｏ，  Ａ．Ｍ．ら、「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｆｕｎｇｉｃｉｄａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｉｄｅｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ」、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第５４巻、９５５〜９５７頁、２００５年）、培養液マイクロ希釈パネル内において増強ＭＰＯ溶液を調べた（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，  Ｊ．  Ａ．ら、「Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｗｉｔｈ  Ｄａｐｔｏｍｙｃｉｎ」、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、第４５巻、１７９９〜１８０２頁、２００１年）。懸濁液中和法により用いられる３つの被験菌株には、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ６５３８、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡＴＣＣ  １５４４２、およびバンコマイシン耐性であるＥ．ｆａｅｃｉｕｍの臨床菌株が含まれた。既に説明した通りに生物懸濁液を調製し、１０７ＣＦＵ／ｍｌの最終標的濃度とした。初期処理として、０．１または０．３μｇ／ｍｌで容量１．０ｍｌの増強ＭＰＯ溶液に生物懸濁液を加えて、各処理バイアルへと添加した。乾燥槽内３７℃でバイアルをインキュベートした。次いで、６０分後、１００μｌのカタラーゼを各バイアルに添加して反応を停止させ、各バイアルの全内容物を単離培地上において培養した。安定的な耐性を誘導しようとする試みでは、４８時間のインキュベーション後において、最高度の増強ＭＰＯ溶液で処理した単離プレートからの生存菌を用いて、次の継代のための接種材料を調製した。各連続実験は、増殖を許容する、前実験における増強ＭＰＯ溶液の最高濃度、およびその濃度の約２倍の濃度で実施された。継代は、３つの菌株すべてを用いて、連続する２５〜３０日間にわたり継続した。
【０１８２】
阻害濃度未満の増強ＭＰＯ溶液に対する生物の反復曝露の結果、耐性が急速に発生するかどうかを判定するため、マイクロ希釈トレーにおいて連続継代法を用いた（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，  Ｊ．  Ａ．ら、「Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｗｉｔｈ  Ｄａｐｔｏｍｙｃｉｎ」、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、第４５巻、１７９９〜１８０２頁、２００１年）。１０の菌株には、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ  ２９２１３、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  １２８８１９９）、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ（ＡＴＣＣ  ２９２１２、ＡＴＣＣ  ５１２９９）、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ  ２５９２２、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  １０７５７０１、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  １３３７４５１、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  １３３７０１９）、およびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＡＴＣＣ  ２７８５３、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  １０７７５６１）が含まれた。上記で説明した通りに、増強ＭＰＯ溶液に対するベースラインのＭＩＣを決定した。増殖を許容した最高濃度の増強ＭＰＯ溶液を含有するウェルから、後続のＭＩＣ試験のための接種材料を調製した。ＣＡＭＨＢ内において系列希釈された濃縮液を含有する新鮮なパネルに、希釈液中において調製された新規の懸濁液を再接種した。２１日間にわたり継代を継続し、各連続継代後において、増強ＭＰＯ溶液のＭＩＣを決定した。その後、ＭＩＣが上昇を示した場合は、薬剤を含まない寒天（ＴＳＡ）プレート上における３回の連続継代により安定性試験を実施し、この間におけるＭＩＣを再決定した。
【０１８３】
培養液マイクロ希釈法による耐性発生試験において、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、およびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに対するＭＩＣ結果は、増強ＭＰＯ溶液の阻害濃度未満における継代後においても、２１日間にわたり変化なしの状態を保った。Ｅ．ｃｏｌｉの３つの臨床菌株に対するＭＩＣは、第１日〜第２日における１回だけの継代後において倍化希釈液の≧４倍の上昇を示し、該ＭＩＣは２１日間にわたって高値を保った。試験期間にわたるＭＩＣの変化は、各菌株それぞれに対して０．１２〜８μｇ／ｍｌ、０．２５〜８μｇ／ｍｌ、および０．５〜８μｇ／ｍｌであった。薬剤を含まない寒天プレート上においてこれらの菌株各々を３回にわたって継代したところ、再試験時のＭＩＣは安定的でなく、倍化希釈液の≦２倍の初期ベースラインＭＩＣへと低下した。
【０１８４】
耐性発生試験は、増強ＭＰＯ溶液および類似の原型製剤が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属種、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、およびＥ．ｃｏｌｉにおける耐性に選ばれないことを示した。Ｅ．ｃｏｌｉの３つの臨床菌株は、増強ＭＰＯ溶液に対する曝露時においてＭＩＣの上昇を示したが、ＭＩＣの上昇は安定的でなく、抗生剤を含まない培地上における後続の継代時に失われた。増強ＭＰＯ溶液による迅速な殺滅速度および作用方式と共に、これらの知見は、該薬剤産物に対する曝露が耐性の発生に対して有する可能性が極めて低いことを示唆する。
【０１８５】
薬剤相互作用試験は、被験対象である従来の抗生剤の活性に対するアンタゴニズムを示さなかった。これは、従来の抗生剤療法と併せて増強ＭＰＯ溶液を用いうる適用にとって重要である。増強ＭＰＯ溶液はまた、手術による創傷および外傷による創傷の治療における不可欠の属性である、全血液の存在下においても、その強力な殺菌活性を及ぼす。
【０１８６】
上記で示された通り、本発明の増強ミエロペルオキシダーゼ組成物は、薬剤感受性菌株、薬剤耐性菌株、および多剤耐性菌株を含めた、臨床生物および基準生物に対して強力で、広域スペクトルで、迅速な殺菌活性を提供する。それらが耐性に選ばれる傾向が小さく、薬剤間相互作用を欠くことから、本発明の増強組成物は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける多種多様な適用における、感染を治療および予防するための局所／外用の抗感染使用に理想的である。
【０１８７】
（実施例１２）
増強ＭＰＯ製剤についてのｉｎ  ｖｉｖｏ試験
ｉｎ  ｖｉｖｏ状況における実施例１１の増強ＭＰＯ溶液を評価するため、３つの異なる創傷モデルを用いた。これらのモデルには、全層切除創傷、部分層創傷、および大腿深部切開創傷が含まれた。
【０１８８】
抗微生物剤
増強ＭＰＯ溶液は、使用前に混合される、濃縮液および希釈液と称する２つの水溶液を含む。濃縮液は、水性の製剤媒体中において、ＭＰＯ、ＧＯ、塩化ナトリウム、および特定の抗微生物活性増強剤を含有する。希釈液は、濃縮液と同じ水性製剤媒体中において、グルコース（デキストロース）を含有する。濃縮液および希釈液を、使用の直前に多様な比率で共に混合し、薬剤産物である増強ＭＰＯ溶液を所望の濃度で生成する。増強ＭＰＯ溶液の濃度は、ミリリットル当たりのＭＰＯグアイアコール単位（ＧＵ／ｍｌ）として表されるが、また、ミリリットル当たりのＭＰＯマイクログラムとしても表される。ＭＰＯのＧＵからμｇへの変換は、０．３７５ＧＵ／μｇ  ＭＰＯに基づく。
【０１８９】
細菌株
ＭＲＳＡの臨床菌株であるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（登録商標）１３６、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ６５３８、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ  ２５９２２、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡＴＣＣ  ２７３１７は、Ｒｉｃｅｒｃａ  ＬＬＣ社（米国、オハイオ州、コンコード）、またはＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から購入した。
【０１９０】
実験動物創傷モデル
米国、ミシガン州、ポーテッジ、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から購入した成体雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（約２５０グラム）を、各創傷モデルにおいて用いた。動物は各ケージ内で飼育し、試験全体にわたり不断に餌および水を与えた。すべての創傷モデルについて、各ラットにおいて２カ所ずつの創傷部位を作製した。創傷形成前に、電気バリカンで対象部位の体毛を剃毛した。イソフルランを用いて動物に麻酔をかけた（顔面マスクを介してＯ２中１〜５％）。試験時間（５時間を超える）にわたり動物が麻酔下に保たれない場合は、１２時間ごとに術後疼痛用にブプレノフィンを投与した（腹腔内で０．０５〜０．２５ｍｇ／ｋｇ）。すべての実験動物手順は、Ｒｉｃｅｒｃａ  ＬＬＣ社内の実験動物管理使用委員会によるガイドラインに従い実施した。
【０１９１】
（ｉ）全層切除創傷モデル
Ｓａｙｍｅｎ，  Ｇ．Ｄ．ら、「Ｉｎｆｅｃｔｅｄ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｗｏｕｎｄ：  Ａｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｏｄｅｌ  ａｎｄ  ａ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔｅｄ  Ｔｉｓｓｕｅｓ」、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２３巻、第３号、５０９〜５１４頁、１９７２年により報告される方法の改変により実験創傷を誘導した。メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（登録商標）１３６、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ６５３８、またはＥ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ  ２５９２２を接種生物として用いた。生物は、トリプチカーゼダイズ培養液中で増殖した後期対数増殖懸濁液として調製した。振とうフラスコから細胞を回収し、遠心分離し、緩衝生理食塩液中において再懸濁させ、９ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍｌの懸濁液をもたらした。次いで、この原液を緩衝液中において希釈して約７．５ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍｌの作業懸濁液をもたらし、接種材料として用いた。弛緩性皮膚をつまみ上げ、滅菌法を用いてハサミにより楕円形の皮膚領域を切除し、約１〜２ｃｍ２の筋膜を露出させることにより、各ラットにおいて２カ所ずつの創傷部位を作製した。すべての治療群では、各々２カ所ずつの創傷を有する３匹ずつのラットを用いた。Ｂｒｅｕｉｎｇら（Ｂｒｅｕｉｎｇ，  Ｋ．、「Ｗｏｕｎｄ  Ｆｌｕｉｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｌｅｖｅｌｓ  Ｅｘｃｅｅｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｃｏｕｎｔｓ  ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｐａｒｔｉａｌ−Ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ  Ｂｕｒｎ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ」、Ｐｌａｓｔ．  Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．  Ｓｕｎｇ．、第１１１巻、７８１〜７８８頁、２００３年）により報告される手順と同様、Ｑｕｉｃｋ  Ｔｉｔｅ（登録商標）（Ｌｏｃｔｉｔｅ社製）セメントにより、直径２．５ｃｍで開放端のポリスチレン製円筒を各切除部位周囲の皮膚へと接着した。各円筒は液密性の試験チャンバーを形成し、その底部は露出した筋膜であった。１０７ＣＦＵの細菌懸濁物を含有する２００μＬを筋膜上において直接に貯留させることにより、露出した創傷に接種した。露出した筋膜を完全に覆うには、この容量の接種材料で十分であった。適用後、治療前の１５分間にわたり、接種材料を筋膜上において静置した。容量８００μＬの増強ＭＰＯ溶液を該部位に添加した結果、試験部位当たり１ｍｌの総容量がもたらされた。無菌の０．９％生理食塩液８００μＬまたは同緩衝液が添加された対照部位には、増強ＭＰＯ溶液を投与しなかった。単一のラットにおけるいずれの創傷部位も、同じ治療を受けた。増強ＭＰＯ溶液による５、１５、３０、または６０分間の治療時間後において、各部位に過大量のカタラーゼ溶液を添加し、残存する酵素および／またはその後生成する過酸化水素を破壊し、これにより、さらなる殺菌活性を阻害した。円筒内の液体を回収し、基底部にある筋膜を無菌的に切除し、秤量し、ホモジナイズした。トリプチカーゼダイズ寒天（ＴＳＡ）上に播種され、３７℃で一晩にわたりインキュベートされた、１０倍の希釈系列を用いる定量的培養により、各部位について回収された液体試料および組織ホモジネート中における生存細菌カウントを個別に評価した。治療の効能は、各創傷について回収された液体および組織ホモジネートに由来するカウントの合計として計算され、各治療群内のすべての試料の平均として報告される。
【０１９２】
全層創傷モデルについて、生データからｌｏｇ１０（ＣＦＵ＋１）による平均生存菌数を計算した。該平均の標準誤差および適切な自由度数を反映するｔ値から、該平均についての９５％信頼区間を計算した。増強ＭＰＯ溶液の活性は、全層切除モデルの３つの異なるｐ−ＭＰＯ濃度である１８．７５、７５、および１５０ＧＵ  ＭＰＯ／ｍｌにおいて、時間依存性および濃度依存性を示した。図４に示される通り、７５ＧＵ  ＭＰＯ／ｍｌおよび１５０ＧＵ  ＭＰＯ／ｍｌを含有する増強ＭＰＯ溶液により、７ｌｏｇ１０を超えるＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ６５３８の接種材料のほぼ完全な殺滅が１５分以内にもたらされた。いずれの濃度の増強ＭＰＯ溶液による治療も、４ｌｏｇ１０ＣＦＵを超える低減を５分以内に結果としてもたらした。該濃度を１８．７５ＧＵ  ＭＰＯ／ｍｌへと低下させても、約３ｌｏｇ１０ＣＦＵの低減がやはり５分以内に達成された。増強ＭＰＯ溶液で治療した創傷から回収された、創傷当たりの対数によるＣＦＵ数は、すべての被験濃度および被験時点について、接種材料（７．３ｌｏｇ１０）および非治療の感染対照（７．２５ｌｏｇ１０）のいずれとも統計学的に異なっていた（ｐ＜０．０５）。
【０１９３】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ  ２５９２２を接種した創傷に対する増強ＭＰＯ溶液の効果を図６に示す。Ｓ．ａｕｒｅｕｓについて観察される通り、細菌カウントは、増強ＭＰＯ溶液による治療後５分以内に迅速に減少した。１５０ＧＵ  ＭＰＯ／ｍｌを含有する増強ＭＰＯ溶液により治療した創傷では、適用された接種材料（７．２ｌｏｇ１０）のほぼ完全な殺滅が５分以内に観察された。
【０１９４】
これらの結果により、組織および創傷滲出物を含む環境における、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＥ．ｃｏｌｉに対する増強ＭＰＯ溶液の迅速で時間依存的かつ濃度依存的な活性が確認された。
【０１９５】
治療の１５分後において、創傷内のＭＲＳＡに対する増強ＭＰＯ溶液の殺菌活性と、同ＭＳＳＡに対する同殺菌活性との間には、著明な差が見られなかった（図５）。いずれの場合においても、治療群からの生存生物の回収により、接種材料対照からの、ＣＦＵ単位で約５ｌｏｇ１０の低減が示された。かつての結果では、創傷部位に対する細菌接種後最長１時間にわたり、細菌生存率にはさほどの増減が示されなかったので、治療に対する曝露の１５分後における殺滅の程度を該接種材料と比較した（図５および図６）。これらの知見は、メチシリン耐性生物およびメチシリン感受性生物に対する、実施例１１に記載される、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける増強ＭＰＯ溶液の活性を裏付ける（ＭＩＣ９０：０．０３μｇ  ＭＰＯ／ｍｌ）。
【０１９６】
（ｉｉ）部分層創傷モデル
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ６５３８を接種生物として用いた。全層切除創傷について上記で説明した通りに、接種材料を調製した。実験創傷は、各ラットの背部正中線上における２つの１０ｍｍ×７ｍｍ部位からなり、１つの部位は前方肩付近であり、もう１つの部位は尾側であった。創傷は、皮膚の制御された剥離により達成された。手指を用いて皮膚をつまんで襞を形成し、力を入れておろし金を１０回通過させることによりこれをこすり取った。これにより、若干落ちくぼみ（すなわち、該皮膚の約１／３〜１／２の厚さ）、若干出血した（ぬぐい取って乾燥させた）創傷がもたらされた。試験は、実験当たり４〜５つずつの治療群へと編成し、３匹ずつのラットに各治療を投与した。各ラットは２カ所ずつの創傷を有し、これにより、実験群当たり６カ所ずつの創傷部位が得られた。露出した創傷の中央部に１０６ＣＦＵ／ｍｌの接種材料２５マイクロリットルを分注し、無菌のポリプロピレン製スパチュラを用いて全創傷領域上において１０秒間にわたってすり込んだ。接種材料の適用２０分後、創傷部位上において、３０秒間にわたり、綿棒により１ｍｌの増強ＭＰＯ溶液またはプラセボをスワッビングした。次いで、３ｍｌの増強ＭＰＯ溶液またはプラセボを含有する含浸ガーゼを各創傷へと適用し、該創傷をＴｅｇａｄｅｒｍにより被覆した。接種の３または２４時間後においてすべての治療部位を回収し、生存生物について培養した。Ｔｅｇａｄｅｒｍおよびガーゼを除去し、創傷全体を筋膜まで切除し、風袋計量済みの無菌試験管内に入れ、秤量し、各試験管に０．９％の無菌低温生理食塩液１ｍｌを添加した。次いで、組織をホモジナイズし、ＴＳＡ上に播種され、３７℃で一晩にわたりインキュベートされた、１０倍の希釈系列を用いる定量的培養により、各部位について回収された組織ホモジネート中における生存細菌カウントを評価した。治療の効能は、各治療群について回収された組織試料に由来するカウントの平均として報告される。
【０１９７】
生データからｌｏｇ１０（ＣＦＵ＋１）による平均生存菌数を計算した。該平均の標準誤差および適切な自由度数を反映するｔ値から、該平均についての９５％信頼区間を計算した。以下の表３５に示される通り、部分層創傷モデルにおける治療の３および２４時間後、７５、１５０、または３００ＧＵ  ＭＰＯ／ｍｌにおける増強ＭＰＯ溶液（Ｅ−ＭＰＯ）の活性度を評価した。この表は、各治療の３および２４時間後に単離された、ｌｏｇ１０ＣＦＵによる平均生存菌数を示す。各治療群について、各々の９５％信頼区間が示される。組織試料から回収された生存Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＣＦＵ数に関して、プラセボ対照治療群と増強ＭＰＯ溶液治療群との間では、有意差が観察された。
【０１９８】
表３５
部分層切除モデル−Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ６５３８に対する、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける増強ＭＰＯ溶液の殺菌活性
【０１９９】
【表３５】
0005643189.tif 000038
＊は、プラゼボ対照または感染対照に対して統計学的な差を示す治療群を表す。
【０２００】
１５０ＧＵ／ｍｌにおける増強ＭＰＯ溶液の単回の適用後において、創傷から単離された生物の平均数は、３時間後において約０．８ｌｏｇ１０ＣＦＵ（約６ＣＦＵ）であった。これは、感染対照と比較して、３ｌｏｇ１０を超える低減を表した。
【０２０１】
２４時間後において、ＭＰＯを７５、１５０、および３００ＧＵ／ｍｌで含有する増強ＭＰＯ溶液の単回適用を検討して用量反応を決定し、プラセボ対照と比較した。７５ＧＵ／ｍｌの増強ＭＰＯ溶液を用いる治療により、回収される生物数が５．３ｌｏｇ１０ＣＦＵまで低減された。しかし、この低減は、６．２ｌｏｇ１０ＣＦＵの回収を伴うプラセボ治療群と比較して統計学的に有意ではなかった（ｐ＝０．１５）。増強ＭＰＯ溶液を１５０ＧＵ／ｍｌで単回適用した後において、創傷から回収される生物数は、プラセボ対照よりも約１．１ｌｏｇ１０ＣＦＵ少なかった（ｐ＜０．０１）。３００ＧＵ／ｍｌの増強ＭＰＯ溶液で治療した創傷は、プラセボ治療対照群から回収された６．２ｌｏｇ１０ＣＦＵと比較して、約４．４ｌｏｇ１０ＣＦＵを含有した（ｐ＝０．０１）。これらの知見は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する増強ＭＰＯ溶液については２４時間後において用量反応が存在し、単回治療後における創傷の汚染レベルの低下に持続的な効果が存在することを示す。
【０２０２】
（ｉｉｉ）大腿深部切開創傷モデル
メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（登録商標）１３６またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを接種生物として用い、上記で説明した通りに接種材料を調製した。創傷は、ＭＲＳＡを用いる場合、各ラットの両方の大腿部における１カ所ずつの切開部からなり、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの場合、１つの大腿部だけにおける１つの切開部からなった。各脚部について、脊柱、大転子、および膝に印をつけ、膝から大転子を経て脊柱へと至る線を描いた。大転子を中心として該描線に沿って約３ｃｍにわたりハサミを用いて皮膚を切開し、約１ｃｍ幅で皮膚を剥離させた。下方は大腿骨のレベルまで、上方は殿筋内へと深部切開を作製した。ピンセットを用いて大腿骨骨幹軸に触れることにより、創傷の深さを確認した。Ｓ．ａｕｒｅｕｓによる試験は、実験当たり３つずつの治療群へと編成した（増強ＭＰＯ溶液群、生理食塩液治療群、および非治療対照群）。一方の足には増強ＭＰＯ溶液を施し、他の足は生理食塩液で治療する１０匹のラットを用いて、増強ＭＰＯ溶液を生理食塩液と比較した。加えて、５匹の動物には左足において増強ＭＰＯ溶液を施し、５匹の動物には右足において同溶液を施した。２匹のラットは、接種は受けるが治療は受けず、その結果、非治療対照には４カ所の創傷がもたらされた。
【０２０３】
Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａによる試験もまた、実験当たり３つずつの治療群へと編成し、増強ＭＰＯ溶液群、生理食塩液治療群、および非治療対照群に、それぞれ４匹ずつのラットを用いた。ラットの各々は１カ所ずつの創傷を施され、これにより、実験群当たり４カ所ずつの創傷がもたらされた。無菌のピペットを用いて、１０９ＣＦＵ／ｍｌの生物懸濁液による接種材料１００μＬを創傷の深部に分注した。Ｓ．ａｕｒｅｕｓを接種した６０分後において、７５ＧＵ／ｍｌの増強ＭＰＯ溶液２．５ｍｌにより１回、または３００ＧＵ／ｍｌの増強ＭＰＯ溶液１０ｍｌずつにより、１５分おいて２回にわたり創傷を治療した（表３６を参照されたい）。Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを接種した６０分後において、３００ＧＵ／ｍｌの増強ＭＰＯ溶液５ｍｌずつにより、１５分おいて２回にわたり創傷を治療した（表３７を参照されたい）。すべての増強ＭＰＯ溶液治療および生理食塩液治療は、経管栄養投与用注射針を伴うシリンジを用いて適用した。治療された創傷が、２回目の治療直後に皮膚用クリップを用いて閉鎖されたのに対し、非治療対照創傷は、細菌接種直後に閉鎖された。第４日において、創傷評価を実施した。各創傷の評価を実施し、感染性スコアを割り当てた。感染の２つの主要な尺度、とりわけ、硬結面積および化膿の存在または不在を用いて、感染性スコアを決定した。硬結面積は、カリパーを用いて平方ｍｍ単位で測定し、化膿の存在は、各創傷を手術して切開することにより決定した。感染性スコアには硬結面積の値を割り当て、化膿が存在する場合は、感染性スコアを２５％割増した。化膿が不在であっても、感染性スコアは割り引かなかった。
【０２０４】
平均感染性スコアは、創傷がラット内に埋め込まれ、ラットが実験内に組み込まれたモデルを用いて、ＰＲＯＣ  ＭＩＸＥＤ（米国、ノースカロライナ州、ケアリー、ＳＡＳ社、ＳＡＳ研究所）により、複数の実験からプールされたデータをもとに決定された。このモデルにおいては、ラットおよび実験のいずれもが、無作為変数として考えられる。ｔ検定を用いて、平均値に対する対応のある比較を行った。Ｓ．ａｕｒｅｕｓまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのメチシリン耐性菌株による感染の進行に対する増強ＭＰＯ溶液の効果は、大腿深部切開創傷モデルにおいて、接種の４日後に決定された。以下の表３６において示される通り、増強ＭＰＯ溶液（Ｅ−ＭＰＯ）により治療された群のいずれもが、互いに対して統計学的な差を示さなかった。＊はプラセボに対して統計学的な差を示す治療群を表し、＃は感染対照に対して統計学的な差を示す治療群を表す。
【０２０５】
以下の表３６および３７に示される通り、治療の４日後における増強ＭＰＯ溶液による治療群に対する感染性スコアを、同生理食塩液群および非治療群の感染性比率と比較した。
【０２０６】
表３６
大腿深部切開創傷モデル−Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける増強ＭＰＯ溶液の殺菌活性
【０２０７】
【表３６】
0005643189.tif 000039
Ｎは、治療群当たりの足の本数である。
＊は、プラゼボに対して統計学的な差を示す治療群を表す。
＃は、感染対照に対して統計学的な差を示す治療群を表す。
【０２０８】
表３７
大腿深部切開創傷モデル：Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに対する、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける増強ＭＰＯ溶液の殺菌活性
【０２０９】
【表３７】
0005643189.tif 000040
Ｎは、治療群当たりの足の本数である。
＊は、プラゼボに対して統計学的な差を示す治療群を表す。
＃は、感染対照に対して統計学的な差を示す治療群を表す。
【０２１０】
ＭＲＳＡを接種された動物は、３００ＧＵ／ｍｌの増強ＭＰＯ溶液１０ｍｌずつにより２回にわたり、または７５ＧＵ／ｍｌの増強ＭＰＯ溶液２．５ｍｌにより１回治療された。治療の４日後における創傷の検査により、生理食塩液で治療された創傷（２５％）および増強ＭＰＯ溶液による治療群（３００ＧＵ／ｍｌおよび７５ＧＵ／ｍＬのいずれにおいても１０％）と比較して、すべての非治療創傷（５９％）についてより高度の発生率により化膿の存在が示された。
【０２１１】
３００ＧＵ／ｍｌの増強ＭＰＯ溶液１０ｍＬずつにより２回にわたり治療された動物についての平均感染性スコア１１０は、それぞれ２１６、１９５、および３０３の感染性スコアを有する２回にわたる生理食塩液治療および非治療群の場合に対して統計学的な差を示した（ｐ値＜０．０５）（表３６）。増強ＭＰＯ溶液の高濃度／高容量および低濃度／低容量の間では、統計学的な差が示されなかった（ｐ＞０．０５）。
【０２１２】
表３６に示される通り、３００ＧＵ／ｍｌで２回にわたり適用される１０ｍｌから、７５ＧＵ／ｍｌで１回適用される２．５ｍｌへと、増強ＭＰＯ溶液の濃度および容量を同時に低減した結果、１回適用される２．５ｍＬの生理食塩液により治療される動物、２回にわたり適用される１０ｍＬの生理食塩液により治療される動物、および非治療動物について得られた、それぞれ２１６、１９５、および３０３の感染性スコアに対して統計学的な差を示す（ｐ値＜０．０５）、８４の感染性スコアがもたらされた。増強ＭＰＯ溶液の高濃度／高容量および低濃度／低容量の間では、統計学的な差が示されなかった（ｐ＞０．０５）。
【０２１３】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓからＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａへと生物を変化させると、両足に接種した場合に、モデルの重症度が増大し、致死率も上昇した（データは示さない）ので、動物にＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを接種する場合は、動物１匹につき片足だけを用いた。加えて、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａは局所投与後において全身性となりうるため、２本の足を異なる治療に用いることは推奨されず、不明確な転帰をもたらす可能性が高かった。図３７に示される通り、３００ＧＵ／ｍｌの増強ＭＰＯ溶液５ｍＬずつにより２回にわたり治療された動物についての８６の平均感染性スコアは、生理食塩液治療群（ＩＳ＝７０５）および非治療群（１０３２）のいずれに対しても統計学的な差を示した（ｐ値＜０．０５）。第４日における観察により、生理食塩液により治療された創傷（２５％）および増強ＭＰＯ溶液治療群（０％）と比較して、すべての非治療創傷（５０％）について、より高い化膿発生率がもたらされた。
【０２１４】
具体的に述べると、これらの結果は、全層創傷感染モデルにおいて、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＥ．ｃｏｌｉに対する増強ＭＰＯ溶液の用量依存的で時間依存的な殺滅活性を裏付ける。増強ＭＰＯ溶液は、単回適用後、創傷滲出物の存在下において細菌負荷を低減するのに有効であり、また従来用いられた抗生剤を添加せずに有効であったことが重要である。この殺滅効果は迅速であり、増強ＭＰＯ溶液による治療の２４時間後であっても、プラセボ対照または非治療対照と比較した細菌回収量を低減する。
【０２１５】
まとめると、これらの殺菌結果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験において見られる広域スペクトルの迅速な殺菌活性、耐性に選ばれる傾向の低さ、および薬剤間相互作用の欠如と結び付き、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて感染を治療、予防、および軽減するための、本発明の組成物の使用を強力に支持する。
【０２１６】
例示的な実施形態について例示および説明してきたが、本発明の精神および範囲から逸脱しない限り、本発明において各種の変化を行いうることが理解されるであろう。
【０２１７】
その中での独占的な所有権または特権が主張される本発明の実施形態は、添付の特許請求の範囲に規定される。
【図１】
0005643189.tif 000041
【図２】
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【図３−１】
0005643189.tif 000043
【図３−２】
0005643189.tif 000044
【図４】
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【図５】
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【図６】
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