(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖を含有する単離ｓｉＲＮＡであって、該センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖はＲＮＡ二本鎖を形成し、該センスＲＮＡ鎖は、ヒトＨＩＦ−１アルファｍＲＮＡにおける１９個〜２５個の連続ヌクレオチドの標的配列と同一であるヌクレオチド配列を有するものであり、前記標的配列は、配列ＩＤ番号４０、２０１、２２３、及び２３７から成る群から選択されるものである、単離ｓｉＲＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載のｓｉＲＮＡにおいて、該ヒトＨＩＦ−１アルファｍＲＮＡは配列番号１である、ｓｉＲＮＡ。
【請求項３】
請求項１に記載のｓｉＲＮＡにおいて、該センスＲＮＡ鎖は１ＲＮＡ分子を含有し、アンチセンスＲＮＡ鎖は１ＲＮＡ分子を有するものである、ｓｉＲＮＡ。
【請求項４】
請求項１に記載のｓｉＲＮＡにおいて、ＲＮＡ二本鎖を形成している該センスＲＮＡ鎖及び該アンチセンスＲＮＡ鎖は、一本鎖ヘアピンにより共有結合しているものである、ｓｉＲＮＡ。
【請求項５】
請求項１に記載のｓｉＲＮＡにおいて、該ｓｉＲＮＡは更に、非ヌクレオチド物質を有するものである、ｓｉＲＮＡ。
【請求項６】
請求項１に記載のｓｉＲＮＡにおいて、該センスＲＮＡ鎖及び該アンチセンスＲＮＡ鎖は、ヌクレアーゼ分解に対して安定である、ｓｉＲＮＡ。
【請求項７】
請求項１に記載のｓｉＲＮＡであって、更に３’オーバーハングを有するものである、ｓｉＲＮＡ。
【請求項８】
請求項７に記載のｓｉＲＮＡにおいて、該３’オーバーハングは、１〜６個のヌクレオチドを有するものである、ｓｉＲＮＡ。
【請求項９】
請求項７に記載のｓｉＲＮＡにおいて、該３’オーバーハングは、２個のヌクレオチドを有するものである、ｓｉＲＮＡ。
【請求項１０】
請求項４に記載のｓｉＲＮＡにおいて、該センスＲＮＡ鎖は第１の３’オーバーハングを有し、該アンチセンスＲＮＡ鎖は第２の３’オーバーハングを有するものである、ｓｉＲＮＡ。
【請求項１１】
請求項１０に記載のｓｉＲＮＡにおいて、該第１及び第２の３’オーバーハングはそれぞれ１〜６個のヌクレオチドを有するものである、ｓｉＲＮＡ。
【請求項１２】
請求項１１に記載のｓｉＲＮＡにおいて、該第１の３’オーバーハングはジヌクレオチドを含有し、該第２の３’オーバーハングはジヌクレオチドを有するものである、ｓｉＲＮＡ。
【請求項１３】
請求項１２に記載のｓｉＲＮＡにおいて、該第１及び第２の３’オーバーハングを含有する該ジヌクレオチドは、ジチミジル酸（ＴＴ）又はジウリジル酸（ｕｕ）である、ｓｉＲＮＡ。
【請求項１４】
請求項７に記載のｓｉＲＮＡにおいて、該３’オーバーハングはヌクレアーゼ分解に対して安定である、ｓｉＲＮＡ。
【請求項１５】
請求項１に記載のｓｉＲＮＡを有する網膜色素上皮細胞。
【請求項１６】
センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖を含有するｓｉＲＮＡを発現する核酸配列を含有する組換えプラスミドであって、該センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖は二本鎖ＲＮＡを形成し、該センスＲＮＡ鎖はヒトＨＩＦ−１アルファｍＲＮＡにおける１９個〜２５個の連続ヌクレオチドの標的配列と同一であるヌクレオチド配列を有するものであり、前記標的配列は、配列ＩＤ番号４０、２０１、２２３、及び２３７から成る群から選択されるものである、組換えプラスミド。
【請求項１７】
請求項１６に記載の組換えプラスミドにおいて、ｓｉＲＮＡを発現する該核酸配列は、誘導性プロモータ又は調節性プロモータを有するものである、組換えプラスミド。
【請求項１８】
請求項１６に記載の組換えプラスミドにおいて、ｓｉＲＮＡを発現する該核酸配列は、ヒトＵ６  ＲＮＡプロモータの調節下でポリＴ終止配列と操作可能に連結するセンスＲＮＡ鎖コード配列と、ヒトＵ６  ＲＮＡプロモータの調節下でポリＴ終止配列と操作可能に連結するアンチセンスＲＮＡ鎖コード配列とを有するものである、組換えプラスミド。
【請求項１９】
請求項１８に記載の組換えプラスミドにおいて、該プラスミドはｐＡＡＶｓｉＲＮＡである、組換えプラスミド。
【請求項２０】
センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖を含有するｓｉＲＮＡを発現する核酸配列を有する組換えウイルス性ベクターであって、該センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖はＲＮＡ二本鎖を形成し、該センスＲＮＡ鎖は、ヒトＨＩＦ−１アルファｍＲＮＡにおける１９個〜２５個の連続ヌクレオチドの標的配列と同一であるヌクレオチド配列を有するものであり、前記標的配列は、配列ＩＤ番号４０、２０１、２２３、及び２３７から成る群から選択されるものである、組換えウイルス性ベクター。
【請求項２１】
請求項２０に記載の組換えウイルス性ベクターにおいて、ｓｉＲＮＡを発現する該核酸配列は、誘導性プロモータ又は調節性プロモータを有するものである、組換えウイルス性ベクター。
【請求項２２】
請求項２０に記載の組換えウイルス性ベクターにおいて、ｓｉＲＮＡを発現する該核酸配列は、ヒトＵ６  ＲＮＡプロモータの調節下でポリＴ終止配列と操作可能に連結するセンスＲＮＡ鎖コード配列と、ヒトＵ６  ＲＮＡプロモータの調節下でポリＴ終止配列と操作可能に連結するアンチセンスＲＮＡ鎖コード配列とを有するものである、組換えウイルス性ベクター。
【請求項２３】
請求項２０に記載の組換えウイルス性ベクターにおいて、該組換えウイルス性ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ髄伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、及びヘルペスウイルスベクターからなる群から選択されるものである、組換えウイルス性ベクター。
【請求項２４】
請求項２０に記載の組換えウイルス性ベクターにおいて、該組換えウイルス性ベクターは、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、又はモコラウイルスからの表面タンパク質によって偽型化されるものである、組換えウイルス性ベクター。
【請求項２５】
請求項２３に記載の組換えウイルス性ベクターにおいて、該組換えウイルス性ベクターはアデノ髄伴ウイルスベクターを有するものである、組換えウイルス性ベクター。
【請求項２６】
ｓｉＲＮＡおよび薬学的に許容し得る担体を含有する薬学的組成物であって、該ｓｉＲＮＡはセンスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖を有し、該センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖はＲＮＡ二本鎖を形成し、該センスＲＮＡ鎖は、ヒトＨＩＦ−１アルファｍＲＮＡにおける１９個〜２５個の連続ヌクレオチドの標的配列と同一であるヌクレオチド配列を有するものであり、前記標的配列は、配列ＩＤ番号４０、２０１、２２３、及び２３７から成る群から選択されるものである、薬学的組成物。
【請求項２７】
請求項２６に記載の薬学的組成物であって、更に、リポフェクチン、リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）、セルフェクチン（ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ）、ポリカチオン（ｐｏｌｙｃａｔｉｏｎ）、又はリポソームを含有するものである、薬学的組成物。
【請求項２８】
請求項１６に記載のプラスミド、またはその生理学的に許容し得る塩類、及び薬学的に許容し得る担体を含有する薬学的組成物。
【請求項２９】
請求項２８に記載の薬学的組成物であって、更に、リポフェクチン、リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）、セルフェクチン（ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ）、ポリカチオン（ｐｏｌｙｃａｔｉｏｎ）、又はリポソームを有するものである、薬学的組成物。
【請求項３０】
請求項２０に記載のウイルス性ベクター及び薬学的に許容し得る担体を有する薬学的組成物。
【請求項３１】
請求項１に記載のｓｉＲＮＡにおいて、該ｓｉＲＮＡは更に変性ＲＮＡを有するものであり、前記変性ＲＮＡは修飾され、ヌクレアーゼ消化に対して抵抗性を示すものであり、又は前記ｓｉＲＮＡは置換若しくは修飾され、１若しくはそれ以上のデオキシリボヌクレオチド塩基を含有するものである、ｓｉＲＮＡ。
【請求項３２】
センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖を含有する単離ｓｉＲＮＡであって、該センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖はＲＮＡ二本鎖を形成し、該センスＲＮＡ鎖は、ヒトＨＩＦ−１アルファｍＲＮＡにおける１９個〜２５個の連続ヌクレオチドの標的配列と同一であるヌクレオチド配列を有するものであり、前記標的配列は、配列ＩＤ番号２２３を有するものである、単離ｓｉＲＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００２年１１月１日に出願された米国仮出願第６０／４２３，２６２号明細書の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、転写調節因子ＨＩＦ−１アルファのｓｉＲＮＡ誘導分解による遺伝子発現の調節に関するものである。特にＶＥＧＦ分裂促進性経路における遺伝子を下方制御することができる。
【背景技術】
【０００３】
新しい毛細血管の増殖として定義される、血管新生は、増殖及び発達において基本的な役割を果たす。成熟した人間には、全組織において血管新生反応を開始する能力は存在するが、厳密な調節下にある。血管新生における重要な調節因子は、血管内皮増殖因子（"ＶＥＧＦ"）であり、血管透過性因子（"ＶＰＦ"）とも称される。
【０００４】
ＶＥＧＦは、例えば癌、糖尿病性網膜症、乾癬、加齢性黄斑変性、リウマチ性関節炎及び他の炎症性疾患等、異常血管新生により特徴付けられる疾患の、特定組織において異常な高レベルで発現する。従って、これらの組織におけるＶＥＧＦ値を選択的に減少させる試薬が、癌およびその他の血管新生疾患の治療において使用され得る。
【０００５】
低酸素誘導因子１（ＨＩＦ−１）は、ＨＩＦ−１アルファ及びＨＩＦ−１ベータサブユニットからなる、ヘテロ二量体ベーシック・ヘリックス・ループ・ヘリックス・ＰＡＳ転写因子である。ＨＩＦ−１アルファ発現及びＨＩＦ−１転写活性は、細胞酸素濃度が減少すると指数関数的に増加する。ＨＩＦ−１によりトランス活性化される数ダースの標的遺伝子が同定されており、エリスロポイエチン、グルコース輸送体、解糖酵素、及びＶＥＧＦをコードする遺伝子が含まれる。（非特許文献１を参照。）
【０００６】
腫瘍細胞におけるｐ５３欠失は、ＨＩＦ−１アルファレベルを高め、低酸素に応じたＶＥＧＦのＨＩＦ−１依存性転写活性を増加させる。ｐ５３発現腫瘍細胞におけるＨＩＦ−１アルファの強制発現により、低酸素誘導ＶＥＧＦ発現は高まり、新生血管形成及び腫瘍異種移植片の増殖は増加する。これらの結果は、ｐ５３機能の欠失を介した低酸素に対する正常ＨＩＦ−１依存反応の増幅は、腫瘍形成の間におけるスイッチとなることを示している。（非特許文献２を参照。）
【０００７】
ＲＮＡ干渉（"ＲＮＡｉ"）は、多くの真核細胞生物中に保存された、転写後の遺伝子調節の方法である。ＲＮＡｉは細胞中に存在する低分子（すなわち、<３０ヌクレオチド）二本鎖ＲＮＡ（"ｄｓＲＮＡ"）により誘導される。（非特許文献３を参照。）これらの低分子ｄｓＲＮＡ（「低分子干渉ＲＮＡ」又は「ｓｉＲＮＡ」と称する。）は、１ヌクレオチド分解という精度で、該ｓｉＲＮＡと配列相同性を共有するメッセンジャーＲＮＡｓ（"ｍＲＮＡｓ"）の破壊を引き起こす。（非特許文献４を参照。）ｓｉＲＮＡと標的ｍＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（"ＲＩＳＣ"）に結合し、該ＲＩＳＣは標的ｍＲＮＡを開裂させると考えられている。該ｓｉＲＮＡは明らかにマルチプルターンオーバー酵素のように再利用され、ｓｉＲＮＡ１分子で約１０００分子のｍＲＮＡ開裂を誘導することができる。従って、ｓｉＲＮＡ媒介ＲＮＡｉは、標的遺伝子の発現を阻害するために現在利用可能な他の技術よりもかなり効果的である。
【０００８】
上掲のＥｌｂａｓｈｉｒ  ＳＭら（２００１）は、２１個及び２２個のヌクレオチド長であり、３’オーバーハングを有する合成ｓｉＲＮＡは、キイロショウジョウバエ細胞溶解液における標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉを誘導し得ることを示していた。培養された哺乳類細胞もまた合成ｓｉＲＮＡを用いた場合にＲＮＡｉを示し（非特許文献５を参照。）、合成ｓｉＲＮＡにより誘導されたＲＮＡｉは、近年、生きたマウスにおいても観察された（非特許文献６および７を参照。）ｓｉＲＮＡ媒介ＲＮＡｉの治療学的ポテンシャルは、近年におけるいくつかのｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究により証明されており、それにはＨＩＶ−１感染のｓｉＲＮＡ調節阻害（非特許文献８を参照。）及び神経毒性ポリグルタミン疾患タンパク質発現の減少（非特許文献７を参照。）が含まれている。治療学的ＲＮＡｉはまた、Ａｌａｎ  Ｇｅｗｉｒｔｚによりヒト癌細胞に関して証明され、公開された米国特許出願番号第ＵＳ  ２００２／０１７３４７８号明細書に記載されている。
【０００９】
この度、ＨＩＦ−１アルファのｓｉＲＮＡ誘導ＲＮＡｉが、ＨＩＦ−１アルファｍＲＮＡの分解、ＶＥＧＦ発現の随伴性現象、及び血管新生の阻害を生じることが見出された。
【００１０】
【非特許文献１】Ｓｅｍｅｎｚａ  ＧＬ（１９９９）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１５：５５１〜５７８
【非特許文献２】Ｒａｖｉ  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．（２０００）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１４：３４〜４４
【非特許文献３】Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）、Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８０６〜８１１
【非特許文献４】Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ＳＭ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ，１５：１８８〜２００
【非特許文献５】Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ＳＭ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）、Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４９４〜４９８
【非特許文献６】ＭｃＣａｆｆｒｅｙ  ＡＰ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）、Ｎａｔｕｒｅ，４１８：３８〜３９
【非特許文献７】Ｘｉａ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６〜１０１０
【発明の開示】
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、ヒトＨＩＦ−１アルファ遺伝子からのｍＲＮＡを特異的に標的とし、該ｍＲＮＡのＲＮＡｉ誘導分解分解を引き起こすｓｉＲＮＡに関するものである。本発明に係るｓｉＲＮＡ化合物及び組成物は、癌性腫瘍及び他の血管新生疾患、並びにＶＥＧＦが新生血管形成領域内又はその近傍組織に過剰発現する非病原性症状を治療するために使用される。
【００１２】
従って、本発明により、ＨＩＦ−１アルファｍＲＮＡを標的とし、該標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介分解を誘導するｓｉＲＮＡ、及びその薬学的組成物が提供される。
【００１３】
更に、本発明により、ＨＩＦ−１アルファの発現を阻害する方法であって、ＨＩＦ−１アルファｍＲＮＡを標的とする有効量のｓｉＲＮＡを被験体に投与する工程を含み、その結果、ＨＩＦ−１アルファｍＲＮＡが分解される方法が提供される。
【００１４】
更に、本発明により、血管新生を阻害する方法であって、ＨＩＦ−１アルファｍＲＮＡを標的とする有効量のｓｉＲＮＡを被験体に投与する工程を含み、その結果、ＨＩＦ−１アルファｍＲＮＡが分解され、ＶＥＧＦの発現が阻害される方法が提供される。
【００１５】
更に、本発明により、血管新生疾患の治療方法であって、ＨＩＦ−１アルファｍＲＮＡを標的とする有効量のｓｉＲＮＡを被験体に投与する工程を含み、その結果、ＨＩＦ−１アルファｍＲＮＡが分解され、ＶＥＧＦの発現が阻害される方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
ＨＩＦ−１アルファｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡを含有する組成物及び方法は、血管新生を阻害するため、特には血管新生疾患の治療において有利に使用される。本発明に係るｓｉＲＮＡはＨＩＦ−１アルファｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介破壊を誘導する。ＨＩＦ−１アルファはＶＥＧＦの転写調節因子であり、本発明のｓｉＲＮＡにより引き起こされるＨＩＦ−１アルファｍＲＮＡにおける減少は、ＶＥＧＦ産物における減少と相互関係を有する。ＶＥＧＦは血管新生の開始及び維持に必要とされるため、ＨＩＦ−１アルファのｓｉＲＮＡ媒介破壊は血管新生過程を遅延、停止、または逆反応にする。
【００１７】
ここで、「ＨＩＦ−１アルファｍＲＮＡを標的とする」ｓｉＲＮＡとは、二本鎖の第１鎖がＨＩＦ−１  ｍＲＮＡ配列の一部と同じヌクレオチド配列を有するｓｉＲＮＡを意味する。ｓｉＲＮＡ二本鎖の第２鎖は、ｓｉＲＮＡ二本鎖の第1鎖及びＨＩＦ−１アルファｍＲＮＡの同一部分の双方に相補的であることが理解される。
【００１８】
従って、本発明により、約１７個〜約２９個のヌクレオチド長、好ましくは約１９個〜約２５個のヌクレオチド長を有する低分子二本鎖ＲＮＡを含有し、標的ＲＮＡを標的とする、単離ｓｉＲＮＡが提供される。該ｓｉＲＮＡは、標準ワトソン−クリック（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）塩基対相互作用（以下において「塩基対」という。）により共にアニールされたセンスＲＮＡ鎖及び相補的アンチセンスＲＮＡ鎖を含有する。以下において詳細に述べるとおり、該センス鎖は、標的ｍＲＮＡ内に含まれる標的配列と実質的に同一である核酸配列を含有する。
【００１９】
ここで、標的ｍＲＮＡ内に含まれる標的配列と「実質的に同一」である核酸配列とは、標的配列と同一の核酸配列、あるいは標的配列と１個又は２個以上のヌクレオチドが異なる核酸配列である。標的配列と実質的に同一である核酸配列を含む本発明のセンス鎖は、かかるセンス鎖を含有するｓｉＲＮＡが、標的配列を含むｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介分解を誘導することで特徴付けられる。例えば、本発明に係るｓｉＲＮＡには、標的配列と１個、２個又は３個以上のヌクレオチドが異なる核酸配列が含まれ、ここにおいて標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介分解は該ｓｉＲＮＡにより誘導される。
【００２０】
本発明に係るｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖には、相補的な２個の一本鎖ＲＮＡ分子、または二つの相補的部分が塩基対になり一本鎖「ヘアピン」領域により共有結合している１個の分子が含まれ得る。理論的にどのように結合しているか望むまでもなく、後者タイプのｓｉＲＮＡ分子のヘアピン領域は、"ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）"タンパク質（又はその相当物）により細胞内で開裂し、２個の、各々塩基対になっているＲＮＡ分子のｓｉＲＮＡを形成する（前掲のＴｕｓｃｈｌ，Ｔ．（２００２）を参照）。以下に示すように、ｓｉＲＮＡはまた、１個又はそれ以上のリボヌクレオチド塩基の変質、置換、又は修飾を含み得る。例えば、本ｓｉＲＮＡは変質、置換又は修飾され、１個又はそれ以上のデオキシリボヌクレオチド塩基を含み得る。
【００２１】
ここで用いられる「単離された」とは、人間の介入を通して、天然状態から変化又は取り除かれたことを意味する。例えば、生存する動物中に天然に存在するｓｉＲＮＡは「単離」されていないが、合成ｓｉＲＮＡ、又はその天然状態で共存する物質から部分的に又は完全に分離されたｓｉＲＮＡは「単離」されている。単離されたｓｉＲＮＡは、実質的に精製された形態か、あるいは例えばその中にｓｉＲＮＡが導入された細胞のような、非天然環境に存在し得る。
【００２２】
ここで用いられる「標的ｍＲＮＡ」とは、ヒトＨＩＦ−１アルファｍＲＮＡ、ヒトＨＩＦ−１アルファｍＲＮＡの変異体もしくは選択的スプライシング形態、または同族体ＨＩＦ−１アルファ遺伝子からのｍＲＮＡを意味する。ヒトＨＩＦ−１アルファｍＲＮＡ配列に対応するｃＤＮＡ配列は配列番号１により与えられる。
【００２３】
ＧｅｎＢａｎｋレコードアクッセション番号、ＮＭ＿００１５３０及びＮＭ＿１８１０５４（全開示内容はこの参照により本明細書に組み込まれる。）に記載されているように、ヒトＨＩＦ−１アルファの選択的スプライシング変異体は、ＨＩＦ−１アルファ転写変異体１（配列ＩＤ番号２）及び２（配列ＩＤ番号３）を含み公知である。ヒトＨＩＦ−１アルファ遺伝子から転写されたｍＲＮＡは、当該分野で周知の技術を使用して更に別の選択的スプライシング形態が分析され得る。かかる技術には、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノザンブロット法（ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）及びｉｎ−ｓｉｔｕ（インサイツ）ハイブリッド形成が含まれる。ｍＲＮＡを分析する技術に関しては、例えば、Ｂｕｓｔｉｎｇ  ＳＡ（２０００），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２５：１６９〜１９３（全開示内容はこの参照により本明細書に組み込まれる。）に記載されている。また、選択的スプライシングｍＲＮＡを同定する典型的な技術について以下に記載する。
【００２４】
例えば、選択的スプライシングｍＲＮＡを同定するために、ある疾患遺伝子に関連するヌクレオチド配列を含むデータベースを使用することができる。このようなデータベースとしては、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｅｍｂａｓｅ及びｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｔｏｍｙ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＣＧＡＰ）データベースがある。例えば、ＣＧＡＰデータベースは、様々なタイプのヒト癌由来の発現遺伝子配列断片（ＥＳＴｓ）を含む。ＨＩＦ−１アルファ遺伝子由来のｍＲＮＡ又は遺伝子配列は、かかるデータベースをクエリーし、選択的スプライシングｍＲＮＡを表すＥＳＴｓがこれらの遺伝子に見出されるか否かを決定するために使用することができる。
【００２５】
"ＲＮＡｓｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ法"と呼ばれる技術もまた、選択的スプライシングＨＩＦ−１アルファｍＲＮＡを同定するために使用することができる。ＲＮＡｓｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ法には、遺伝子配列の合成ＲＮＡへの翻訳が含まれ、他の細胞（例えば、新生血管形成領域又はその周囲における組織由来の細胞）から誘導されたＲＮＡにはイブリダイズされる。ハイブリダイズされたＲＮＡは、次いで、ＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドミスマッチを認識する酵素と共に培養される。フラグメントが予想よりも短い場合には、選択的スプライシングｍＲＮＡの存在が示される。推定された選択的スプライシングｍＲＮＡは当業者に周知の方法によりクローニングされ、配列決定され得る。
【００２６】
ＲＴ−ＰＣＲもまた、選択的スプライシングＨＩＦ−１アルファｍＲＮＡを同定するために使用することができる。ＲＴ−ＰＣＲにおいては、当業者に周知の方法を用い、逆転写酵素により組織からｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換する。次いで、ｃＤＮＡの全コード配列が、３'非翻訳領域に位置する順方向プライマー、及び５'非翻訳領域に位置する逆方向プライマーを使用し、ＰＣＲを介して増幅される。増幅産物は、選択的スプライシング形態について分析することができ、例えば、増幅産物のサイズを、選択的スプライシングされた正常にスプライシングされたｍＲＮＡ由来の予想産物のサイズと比較することによって、例えばアガロースゲル電気泳動により分析することができる。増幅産物のサイズにおける全ての相違は、選択的スプライシングであることを示し得る。
【００２７】
変異体ＨＩＦ−１アルファ遺伝子由来のｍＲＮＡ産物はまた、選択的スプライシング形態を同定するための上記技術により容易に同定され得る。ここで用いられる「変異体」ＨＩＦ−１アルファ遺伝子又はｍＲＮＡには、ここで示されるＨＩＦ−１アルファｍＲＮＡと配列が異なるＨＩＦ−１アルファ遺伝子又はｍＲＮＡが含まれる。従って、ＨＩＦ−１アルファ遺伝子の対立遺伝子形態、並びに該遺伝子由来のｍＲＮＡ産物は、本発明の目的とする「変異体」と考えられる。
【００２８】
ここで用いられる、ヒトＨＩＦ−１アルファに対する「同属体」（ｃｏｇｎａｔｅ）である遺伝子又はｍＲＮＡとは、ヒトＨＩＦ−１アルファと相同性を有する他の哺乳動物種由来の遺伝子又はｍＲＮＡをいう。例えば、ラット及びマウス由来同属型ＨＩＦ−１アルファｍＲＮＡについては、各々、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０２４３５９及びＮＭ＿０１０４３１（全開示内容はこの参照により本明細書に組み込まれる。）に記載されている。ラットＨＩＦ−１アルファｍＲＮＡ配列は、配列ＩＤ番号4により与えられ、マウスＨＩＦ−１アルファｍＲＮＡ配列は、配列ＩＤ番号５により与えられる。
【００２９】
ヒトＨＩＦ−１アルファｍＲＮＡには、各々選択的スプライシング形態、同族体又は変異体と共通する標的配列が含まれ得ることが理解される。従って、かかる共通の標的配列を含有する１個のｓｉＲＮＡは、共通の標的配列を含む異なるＲＮＡタイプのＲＮＡ媒介分解を誘発し得る。
【００３０】
本発明のｓｉＲＮＡには、部分的に精製されたＲＮＡ、実質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、並びに１個又はそれ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換及び／又は変性により、天然由来のＲＮＡと異なる変性ＲＮＡなどの組みかえで生産されたＲＮＡが含まれ得る。かかる変性には、例えばｓｉＲＮＡ末端へのもしくはｓｉＲＮＡの１個又はそれ以上の内部ヌクレオチドへの非ヌクレオチド物質の付加、ｓｉＲＮＡに耐ヌクレアーゼ分解性を付与するための修飾、またはデオキシリボヌクレオチドでのｓｉＲＮＡの１個又はそれ以上のヌクレオチドの置換が含まれ得る。
【００３１】
本発明に係るｓｉＲＮＡの１本又は双方の鎖にはまた３’オーバーハングが含有され得る。ここで用いられる、「３’オーバーハング」は、ＲＮＡ二本鎖の３'末端から延長した少なくとも１本の非対ヌクレオチドをいう。
【００３２】
従って、一態様において、本発明に係るｓｉＲＮＡは１個〜約６個のヌクレオチド長（リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドが含まれる。）、好ましくは１個〜約５個、より好ましくは１個〜約４個、特に好ましくは約２個〜約４個のヌクレオチド長を有する少なくとも１つの３’オーバーハングが含有される。
【００３３】
ｓｉＲＮＡ分子の双方の鎖が３’オーバーハングを含有する態様において、突出部の長さは各鎖で同一でも異なっていてもよい。特に好ましい態様は、ｓｉＲＮＡの双方の鎖に３’オーバーハングが存在し、２個のヌクレオチド長を有するものである。例えば、本発明に係るｓｉＲＮＡの各鎖はジチミジル酸（"ＴＴ"）又はジウリジル酸（"ｕｕ"）の３’オーバーハングを含み得る。
【００３４】
本発明に係るｓｉＲＮＡの安定性を高めるために、３’オーバーハングもまた分解に対して安定化され得る。一態様において、オーバーハングがプリンヌクレオチド（例えば、アデノシン又はグアノシンヌクレオチド）を含めることにより安定化される。あるいは、修飾された類似体によるピリミジンヌクレオチドの置換（例えば、３’オーバーハング中のウリジンヌクレオチドの２'−デオキシチミジンでの置換）でもよく、ＲＮＡｉ分解効率に影響を及ぼさない。特に、２'−デオキシチミジンにおける２'ヒドロキシル基の不存在は、組織培地における３’オーバーハングのヌクレアーゼ耐性を有意に増加させる。
【００３５】
特定の態様において、本発明に係るｓｉＲＮＡは、配列ＡＡ（Ｎ１９）ＴＴ又はＮＡ（Ｎ２１）を有し、ここでＮはすべてのヌクレオチドを表す。これらｓｉＲＮＡは、約３０〜７０％のＧ／Ｃを含有し、好ましくは約５０％のＧ／Ｃを含有する。センスｓｉＲＮＡ鎖の配列は、（Ｎ１９）ＴＴ又はＮ２１（すなわち、３位〜２３位）に各々対応する。後者の場合、センスｓｉＲＮＡの３'末端はＴＴに変換される。この配列変換の原理は、センス及びアンチセンス鎖の３’オーバーハングの配列構成に関し、対称な二本鎖を発生させることである。次いで、アンチセンス鎖はセンス鎖の１位〜２１位の相補体として合成される。
【００３６】
これらの態様において２３−ｎｔセンス鎖の１位は、アンチセンス鎖による配列特定作用においては認識されないため、アンチセンス鎖のほとんどの３'ヌクレオチド残基が慎重に選択され得る。しかしながら、アンチセンス鎖の末端から２番目のヌクレオチド（双方の態様において２３−ｎｔセンス鎖の２位に相補的）が通常は標的配列に相補的である。
【００３７】
他の態様において、本発明に係るｓｉＲＮＡは、配列ＮＡＲ（Ｎ１７）ＹＮＮを有し、ここでＲはプリン（例えば、Ａ又はＧ）であり、Ｙはピリミジン（例えば、Ｃ又はＵ／Ｔ）である。従って、本態様の各２１−ｎｔセンス及びアンチセンス鎖は、通常、プリンヌクレオチドで始まる。かかるｓｉＲＮＡは、第１の転写ヌクレオチドがプリンである時、ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターからのＲＮＡの発現のみが有効であるとして、標的部位において変化することなくｐｏｌ  ＩＩＩ発現ベクターから発現され得る。
【００３８】
本発明のｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ配列（「標的配列」）のすべてにおいて、約１９〜２５個の連続ヌクレオチドの全ストレッチに対して標的とすることができる。ｓｉＲＮＡに係わる標的配列を選択する技術は、例えば、Ｔｕｓｃｈｌ  Ｔら、"Ｔｈｅ  ｓｉＲＮＡ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ"、２００２．１０．１１改訂（全開示内容はこの参照により本明細書に組み込まれる。）に示されている。"Ｔｈｅ  ｓｉＲＮＡ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ"は、Ｄｒ．Ｔｈｏｍａｓ  Ｔｕｓｃｈｌ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＡＧ  １０５，  Ｍａｘ−Ｐｌａｎｃｋ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７０７７  Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により維持されているウェブサイトにおけるＷＷＷから入手可能であり、Ｍａｘ  Ｐｌａｎｃｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイトにアクセスし、キーワード"ｓｉＲＮＡ"で検索することにより見出すことができる。従って、本発明に係るｓｉＲＮＡのセンス鎖には、標的ｍＲＮＡにおける約１９個〜約２５個のヌクレオチドの連続ストレッチすべてに対して同一のヌクレオチド配列が含有される。
【００３９】
一般に、標的ｍＲＮＡの標的配列は、標的ｍＲＮＡに対応する所定のｃＤＮＡから選択され得、好ましくは開始コドンから最初の５０〜１００ｎｔ下流（すなわち、３'方向）である。しかしながら、標的配列は、５'もしくは３'非翻訳領域、又は開始コドン近傍領域に位置し得る。ＨＩＦ−１アルファｃＤＮＡ配列における好適な標的配列は、
ＡＡＣＴＧＧＡＣＡＣＡＧＴＧＴＧＴＴＴＧＡ  （配列ＩＤ番号６）
である。
【００４０】
従って、この配列を標的とし、かつ３'ＵＵオーバーハング（オーバーハングを太字で示す。）を有する本発明に係るｓｉＲＮＡは、
【００４１】
【化１】
0005449639.tif 000002
である。
【００４２】
本配列と同一の配列を標的とするが、各鎖に３'ＴＴオーバーハング（オーバーハングを太字で示す。）を有する本発明に係るｓｉＲＮＡは、
【００４３】
【化２】
0005449639.tif 000003
である。
【００４４】
本発明に係るｓｉＲＮＡが誘導され得る典型的なＨＩＦ−１アルファ標的配列には、表１中の配列及び配列ＩＤ番号３９〜２９６として示される配列が含まれる。
【００４５】
【表１】
0005449639.tif 000004
【００４６】
本発明に係るｓｉＲＮＡは、当業者に知られた多くの技術を用いて得ることができる。例えば、当該分野で公知の方法（例えば米国公開公報番号第ＵＳ２００２／００８６３５６号、Ｔｕｓｈｌらによる（全開示内容はこの参照により本明細書に組み込まれる。）に記載されたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏシステム）を用いて化学的に合成することができ、あるいは組換えにより産生することができる。
【００４７】
好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡは、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）及び従来のＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用い化学的に合成される。ｓｉＲＮＡは、２つの分離した相補的ＲＮＡ分子として、あるいは２つの相補的領域を有する単一のＲＮＡとして合成され得る。合成ＲＮＡ分子又は合成試薬の商業的供給業者には、Ｐｒｏｌｉｇｏ（ハンブルグ，ドイツ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ラフィエット，コロラド州，米国）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅの一部，ロックフォード，イリノイ州，米国）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（スターリング，ヴァージニア州，米国）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（アッシュランド，マサチューセッツ州，米国）及びＣｒｕａｃｈｅｍ（グラスゴー，英国）がある。
【００４８】
あるいは、ｓｉＲＮＡは、組換え環状又は線状ＤＮＡプラスミドから好適なプロモーターを使用し発現させることもまたできる。プラスミドから本発明のｓｉＲＮＡを発現させるために好適なプロモーターには、例えば、Ｕ６又はＨ１  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター配列及びサイトメガロウイルスプロモーターが含まれる。他の好適なプロモーターの選択は、公知の当該分野の範囲内である。本発明の組換えプラスミドにはまた、特定組織又は特定細胞内環境でのｓｉＲＮＡの発現に用いられる誘導性又は調節性プロモーターが含まれる。
【００４９】
組換えプラスミド由来のｓｉＲＮＡは、標準的技術により培養細胞発現系から単離されるか、あるいはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて新生血管形成領域或いはその近傍における細胞内で発現し得る。本発明のｓｉＲＮＡをｉｎ  ｖｉｖｏにおいて細胞に輸送するための組換えプラスミドの使用について以下により詳細に説明する。
【００５０】
本発明のｓｉＲＮＡは、２つの分離した相補的ＲＮＡ分子、あるいは２つの相補的領域を有する単一のＲＮＡのいずれかとして組換えプラスミドから発現し得る。
【００５１】
本発明のｓｉＲＮＡを発現するのに好適なプラスミドの選択方法、ｓｉＲＮＡを発現するためのプラスミドへの核酸配列の挿入方法、及び目的細胞への組換えプラスミドの輸送方法は当業者が適宜なし得るものである。例えば、Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．（２００２），Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０：４４６〜４４８；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ＴＲ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：５５０〜５５３；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０：４９７〜５００；Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ＰＪ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６：９４８〜９５８；Ｌｅｅ  ＮＳ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５００〜５０５；Ｐａｕｌ  ＣＰ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０：５０５〜５０８（全開示内容はこの参照により本明細書に組み込まれる。）を参照のこと。
【００５２】
例えば、プラスミドは、ヒトＵ６  ＲＮＡプロモーターの調節下でポリＴ終止配列と操作可能に連結するセンスＲＮＡ鎖コード配列と、ヒトＵ６  ＲＮＡプロモーターの調節下でポリＴ終止配列と操作可能に連結するアンチセンスＲＮＡ鎖コード配列とを含有し得る。
【００５３】
ここで用いられる、「ポリＴ終止配列と操作可能に連結する」とは、センス鎖又はアンチセンス鎖をコードする核酸配列が、５'方向においてポリＴ終止シグナルと直接的に隣接していることを意味する。プラスミドからのセンス又はアンチセンス配列の転写の間に、ポリＴ終止シグナルは転写を終止させるように作用する。
【００５４】
ここで用いられる、プロモーターの「調節下で」とは、センス又はアンチセンス鎖をコードする核酸配列が、プロモーターの３'に位置し、これによりプロモーターがセンス又はアンチセンスコード配列の転写を開始し得ることを意味する。
【００５５】
本発明のｓｉＲＮＡはまた、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて新生血管形成領域或いはその近傍における細胞内で組換えウイルス性ベクターから発現し得る。本発明の組換えウイルス性ベクターは本発明のｓｉＲＮＡをコードする配列、及びｓｉＲＮＡ配列を発現するための好適なプロモーターすべてを含有する。好適なプロモーターには、例えば、Ｕ６又はＨ１  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター配列及びサイトメガロウイルスプロモーターが含まれる。他の好適なプロモーターの選択は、当業者が適宜なし得る。また本発明の組換えウイルス性ベクターには、特定組織又は特定細胞内環境でのｓｉＲＮＡの発現に用いられる誘導性又は調節性プロモーターが含まれる。本発明のｓｉＲＮＡをｉｎ  ｖｉｖｏにおいて細胞に輸送するための組換えウイルス性ベクターの使用方法について以下により詳細に説明する。
【００５６】
本発明のｓｉＲＮＡは、２つの分離した相補的核酸分子として、あるいは２つの相補的領域を有する単一の核酸分子として組換えウイルス性ベクターから発現し得る。
【００５７】
発現するｓｉＲＮＡ分子のコード配列を受容することができるすべてのウイルス性ベクター、例えば、アデノウイルス（ＡＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス）、ヘルペスウイルス、およびその同等物から誘導されるベクターを使用することができる。ウイルス性ベクターの指向性もまた、エンベロープタンパク質又は他のウイルス由来の表面抗原を用いてベクターを偽型化（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅ）することにより修飾され得る。例えば、本発明のＡＡＶベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、又はモコラウイルス等からの表面タンパク質を用いて偽型化（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅ）され得る。
【００５８】
本発明に好適に使用し得る組換えウイルス性ベクターの選択方法、ｓｉＲＮＡを発現するための核酸配列のベクターへの挿入方法、及び目的細胞へのウイルス性ベクターの輸送方法は、当業者が適宜なし得るものである。例えば、Ｄｏｒｎｂｕｒｇ  Ｒ  （１９９５），Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐ．２：３０１〜３１０；Ｅｇｌｉｔｉｓ  ＭＡ（１９８８），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６０８〜６１４；Ｍｉｌｌｅｒ  ＡＤ（１９９０），Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐ．１：５〜１４；Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＷＦ（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：２５〜３０（全開示内容はこの参照により本明細書に組み込まれる。）を参照のこと。
【００５９】
好ましいウイルス性ベクターは、ＡＶ及びＡＡＶ由来のものである。特に好ましい態様において、本発明のｓｉＲＮＡは、２つの分離した相補的一本鎖ＲＮＡ分子として、例えば、Ｕ６又はＨ１  ＲＮＡプロモーターのいずれか、もしくはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含有する組換えＡＡＶベクターから発現される。
【００６０】
本発明のｓｉＲＮＡを発現する好適なＡＶベクター、組換えＡＶベクターの構築方法、標的細胞へのベクターの輸送方法が、Ｘｉａ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６〜１０１０に記載されている。
【００６１】
本発明のｓｉＲＮＡを発現する好適なＡＡＶベクター、組換えＡＡＶベクターの構築方法、標的細胞へのベクターの輸送方法が、Ｓａｍｕｌｓｋｉ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６〜３１０１；Ｆｉｓｈｅｒ  ＫＪ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５２０〜５３２；Ｓａｍｕｌｓｋｉ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２〜３８２６；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，２５２，４７９；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，１３９，９４１；国際特許出願番号第ＷＯ９４／１３７８８号、国際特許出願番号第ＷＯ９３／に４６４１号（全開示内容はこの参照により本明細書に組み込まれる。）に記載されている。
【００６２】
標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介分解を引き起こす所定の標的配列を含むｓｉＲＮＡの性能は、細胞中のＲＮＡレベル又はタンパク質レベルを測定するための標準的技術を用いて評価することができる。例えば、本発明のｓｉＲＮＡは培養細胞に輸送され得、標的ｍＲＮＡのレベルが、ノザンブロット法又はドットブロッティング技術により、もしくは定量ＲＴ−ＰＣＲにより測定され得る。あるいは、培養細胞中のＨＩＦ−１アルファタンパク質のレベルは、ＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロット法により測定され得る。標的ｍＲＮＡにまたはタンパク質レベルに対する本発明ｓｉＲＮＡの効果を測定するための好適な細胞培養系が後掲の実施例１に記載されている。
【００６３】
ＨＩＦ−１アルファｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介分解を標的・招来するｓｉＲＮＡの性能もまた、ＨＩＦ−１アルファ発現における減少がＶＥＧＦ発現も阻害し得るものとして、培養細胞中のＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ又はタンパク質のレベルを測定することにより評価することができる。
【００６４】
例えば、５０％コンフルエントの２９３ヒト腎臓細胞を、ｓｉＲＮＡ（Ｍｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＴＫＯトランスフェクション試薬等のトランスフェクション試薬と任意に合成される）を含む培地を使用し４８時間インキュベートする。次いで、ＨＩＦ−１アルファ又はＶＥＧＦいずれか一方のＥＬＩＳＡ又はｍＲＮＡ定量を行う。ＨＩＦ−１アルファ標的配列に対して相同性を有しなかったｓｉＲＮＡと共にインキュベートされた細胞をコントロールとして用いることができる。
【００６５】
所定の標的配列を含むｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介分解もまた、新生血管形成の動物モデル（例えば、未熟児網膜症（"ＲＯＰ"）又は脈絡膜の新生血管形成（"ＣＮＶ"）マウスモデル等）を用いて評価することができる。例えば、ＲＯＰ又はＣＮＶマウスにおける新生血管形成領域をｓｉＲＮＡの投与前および投与後に測定することができる。これらモデルの、ｓｉＲＮＡ投与時における新生血管形成領域の減少は、標的ｍＲＮＡの下方制御を示している（後掲の実施例２を参照。）。
【００６６】
上記に示したように、本発明のｓｉＲＮＡはＨＩＦ−１アルファｍＲＮＡ、またはその選択的スプライシング形態、変異体もしくは同族体のＲＮＡｉ媒介分解を標的・招来する。本発明のｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡの分解により、ＨＩＦ−１アルファ遺伝子由来の機能性遺伝子産物の産生が減少する。従って、本発明により、被験体におけるHIF-１アルファの発現を阻害する方法であって、本発明のｓｉＲＮＡの有効量を被験体に投与する工程を含み、その結果標的ｍＲＮＡが分解される方法が提供される。本方法の実施において、本発明の１以上のｓｉＲＮＡが被験体に同時に投与され得ることが理解され得る。どのような論理が適用されるかを望むまでもなく、ＨＩＦ−１アルファ遺伝子の産物は、ＶＥＧＦの転写調節に関与していると思われる。ＶＥＧＦは同様に血管新生を開始・維持するのに欠かせない。従って、本発明は、本発明のｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介分解により、被験体における血管新生を阻害する方法もまた提供する。
【００６７】
ここで用いられる、「被験体」には、ヒト又はヒト以外の動物が含まれる。好ましくは、被験体はヒトである。
【００６８】
ここで用いられる、ｓｉＲＮＡの「有効量」は、標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介分解を引き起こすのに充分な量か、あるいは被験体における血管新生を阻害するのに充分な量をいう。
【００６９】
標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介分解は、上記のようにｍＲＮＡ又はタンパク質を単離・定量するための標準技術を使用し、被験体の細胞中の標的ｍＲＮＡ又はタンパク質レベルを測定することにより検知することができる。
【００７０】
血管新生の阻害は、被験体における病原性又は非病原性血管新生の進行を直接的に測定することにより、評価することができる。例えば、本発明のｓｉＲＮＡを用いた治療前後における新生血管形成領域のサイズを観察することにより行うことができる。新生血管形成領域のサイズが同一のまま又は縮小している場合には、血管新生の阻害が示される。被験体における新生血管形成領域のサイズの観察及び測定技術は、当業者が適宜なし得るものであり、例えば、脈絡膜の新生血管形成領域は検眼鏡検査法により観察することができる。
【００７１】
血管新生の阻害はまた、血管新生に関連する病原性症状における変化又は逆転の観察を通して推測され得る。例えば、ＡＲＭＤにおいて、視力低下の遅延、停止又は逆転は、脈絡膜における血管新生の阻害を示す。腫瘍に関しては、腫瘍増殖の遅延、停止又は逆転、あるいは腫瘍転移の遅延又は停止は、腫瘍部位又はその近傍における血管新生阻害を示す。非病原性血管新生の阻害はまた、例えば、本発明のｓｉＲＮＡ投与時における脂肪損失又はコレステロール値の減少から推測することができる。
【００７２】
本発明のｓｉＲＮＡは化学量論に近い量において標的ｍＲＮＡを分解すること（したがって、血管新生を阻害すること）が理解できる。どのような論理が適用されるかを望むまでもなく、本発明のｓｉＲＮＡは、触媒的態様においてＲＩＳＣが標的ｍＲＮＡの分解を誘導すると考えられる。したがって、標準的な抗血管新生治療と比較し、ｓｉＲＮＡは治療額的効果を有するために新生血管形成部位またはその近傍に運ばれる必要が極めて少ない。
【００７３】
当業者であれば、特定の被験体に本発明のｓｉＲＮＡを投与する有効量は、被験体の大きさ及び重さ；新生血管形成の範囲または疾患の洞察；被験体の年齢、健康、及び性別；投与経路；投与が局所的か全身にわたるか、等の要素を考慮することにより、容易に決定し得る。概して、本発明のｓｉＲＮＡの有効量は、新生血管形成領域またはその近傍における細胞内濃度が約１ナノモル（ｎＭ）〜約１００ｎＭ、好ましくは約２ｎＭ〜約５０ｎＭ、より好ましくは約２．５ｎＭ〜約１０ｎＭとなる量が含まれる。より多い、あるいはより少ない量のｓｉＲＮＡが投与され得ることも想定される。
【００７４】
非病原性の血管新生、すなわち、被験体において通常過程に起因する血管新生、を阻害するために本発明の方法が使用され得る。非病原性の血管新生には、子宮内膜の新生血管形成、及び脂肪組織及びコレステロール産物に含有されるプロセスが含まれる。このように、本発明により非病原性の血管新生阻害方法、例えば、体重調節又は脂肪損失促進、コレステロール値の低減のための方法、もしくは流産促進物質に関する方法が提供される。
【００７５】
本方法はまた、脈管形成疾患、すなわち病原性が不適切もしくは調節できない脈管形成に関連する疾患に関わる脈管形成もまた阻害し得る。たとえば、多くの癌性固形腫瘍は、
血管新生を腫瘍部位及びその近傍に誘導することにより、適切な血液供給をそれ自体で発生させる。この腫瘍誘導血管新生は、しばしば腫瘍増殖のために必要とされ、転移性細胞が血流に入り込むことも可能にする。
【００７６】
他の血管新生疾患には、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性（ＡＲＭＤ）、乾癬、リウマチ性関節炎及び他の炎症性疾患が含まれる。これらの疾患は、新生血管形成領域に新たに形成された血管により正常組織が破壊されることを特徴とする。たとえば、ＡＲＭＤでは、毛細管により脈絡膜が侵され破壊される。ＡＲＭＤにおける脈絡膜の血管新生起因の破壊は、最終的には部分的又は全体的な失明をもたらす。
【００７７】
好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡは、癌関連固形腫瘍（たとえば、胸部癌、肺癌、頭部及び頸部癌、脳癌、腹部癌、結腸癌、食道癌、胃腸癌、神経腫瘍、肝臓癌、舌癌、神経芽細胞腫、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫、多発性骨髄腫、皮膚癌（例えば、メラノーマ）、リンパ腫、及び血液癌）の増殖または転移を阻害するために使用される。
【００７８】
より好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡは、加齢性黄斑変性における脈絡膜新生血管形成を阻害するために使用される。
【００７９】
血管新生疾患を処置するために、本発明のｓｉＲＮＡは、本発明のｓｉＲＮＡとは異なる薬学的試薬との組み合わせにおいて被験体に投与され得る。あるいは、本発明のｓｉＲＮＡは、脈管形成疾患を治療するために設計された他の治療学的方法との組み合わせにおいて被験体に投与され得る。例えば、本発明のｓｉＲＮＡは、現在癌を治療している、あるいは腫瘍の転移を阻止している治療方法（例えば、放射線治療、化学療法及び手術）と組み合わせて投与され得る。腫瘍を治療するために、本発明のｓｉＲＮＡは、好ましくは放射線治療と組み合わせて、もしくはシスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、ダウノルビシン、又はタモキシフェン等の化学療法薬と組み合わせて被験体に投与される。
【００８０】
本方法において、本発明のｓｉＲＮＡは、輸送試薬と共にｓｉＲＮＡそのままの形態で、あるいはｓｉＲＮＡを発現する組換えプラスミドもしくはウイルス性ベクターとして被験体に投与され得る。
【００８１】
本発明のｓｉＲＮＡと共に投与される好適な輸送試薬には、Ｍｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＴＫＯ脂肪親和性試薬；リポフェクチン；リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）；セルフェクチン（ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ）；ポリカチオン（例えば、ポリリシン（ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ））、リポソームが含まれる。好ましい輸送試薬はリポソームである。
【００８２】
リポソームは、ｓｉＲＮＡの特定組織（例えば、網膜又は腫瘍組織）への輸送を促進することができ、またｓｉＲＮＡの血液半減期を増加することもできる。本発明における使用に好適なリポソームは、標準的な小疱形成脂質から形成され、一般的に中性又は負の電荷を帯びたリン脂質及びコレステロール等のステロールが含まれる。脂質の選択は、通常、所望とされるリポソームサイズ及び血流中におけるリポソームの半減期等の要因を考慮して決定される。リポソームを調製するための様々な方法が公知であり、例えばＳｚｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ｂｕｉｅｂｇ．９：４６７；及び米国特許番号第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号，第５，０１９，３６９号（全開示内容はこの参照により本明細書に組み込まれる。）に記載されている。
【００８３】
好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡを封入するリポソームは、該リポソームを血管新生部位又はその近傍における特定細胞もしくは組織に向けることができるリガンド分子を含有する。腫瘍又は血管内皮細胞において優勢にレセプターと結合するリガンド（例えば、腫瘍抗原又は内皮細胞表面抗原と結合するモノクロナル抗体）が好ましい。
【００８４】
特に好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡを封入するリポソームは、単核マクロファージ及び細網内皮系によりクリアランスを避けるために修飾される。例えば、構造の表面に結合したオプソニン作用阻害部分を有することによる。１実施形態において、本発明のリポソームは、オプソニン作用−阻害部位とリガンドの両方を有しているものである。
【００８５】
本発明のリポソームの調製において使用するオプソニン作用−阻害部位は、典型的には、リポソーム膜に結合される大分子親水性ポリマーである。ここで用いられる、リポソーム膜に「結合」しているとは、オプソニン作用−阻害部位が、例えば、脂質溶解性アンカーの膜自体への挿入により、あるいは膜脂質の活性基への直接的結合により、化学的又は物理的に膜に付着しているとき、リポソーム膜に「結合」しているという。これらのオプソニン作用−阻害親水性ポリマーは、マクロファージ単核細胞系（"ＭＭＳ"）及び細網内皮系（"ＲＥＳ"）によりリポソームの摂取を有意に減少させる保護表面層を形成するものであり、例えば米国特許番号第４，９２０，０１６号に記載されているようなものである（全開示内容はこの参照により本明細書に組み込まれる。）。このようにオプソニン作用−阻害部位で修飾されたリポソームは、修飾されていないリポソームよりもはるかに長く循環系に留まる。かかる理由により、リポソームは時々「ステルス」リポソームと呼ばれる。
【００８６】
ステルスリポソームは、多孔性又は「漏れ孔のある」微小血管系により供給される組織中に蓄積することが知られている。したがって、かかる微小血管系の欠陥により特徴付けられる標的組織（例えば、固形腫瘍、）は、これらのリポソームを効率的に蓄積し得る（Ｇａｂｉｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８），Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，ＵＳＡ，１８：６９４９〜５３を参照のこと。）。加えて、ＲＥＳによって取り込みが減少したことにより、肝臓及び脾臓におけるかなりの蓄積が阻止され、ステルスリポソームの毒性が低下する。したがって、オプソニン作用−阻害部位で修飾された本発明のリポソームは、腫瘍細胞に本発明のｓｉＲＮＡを輸送し得る。
【００８７】
リポソームの修飾に好適なオプソニン作用阻害部位は、好ましくは数平均分子量約５００〜約４０，０００ダルトンの水溶性ポリマーであり、より好ましくは約２，０００〜約２０，０００ダルトンの水溶性ポリマーである。かかるポリマーには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）誘導体が含まれる、例えば、メトキシＰＥＧ又はＰＰＧ、及びＰＥＧ又はＰＰＧステアレート；ポリアクリルアミド又はポリＮ‐ビニルピロリドン等の合成ポリマー；直線状、分岐状、又は樹枝状（ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｉｃ）ポリアミドアミン；ポリアクリル酸；ポリアルコール（例えば、カルボキシル基又はアミノ基が化学的に連結しているポリビニルアルコール及びポリキシリトール）、並びにガングリオシド（例えば、ＰＥＧのガングリオシドＧＭ１．コポリマー、メトキシＰＥＧ又はメトキシＰＰＧ）、またはその誘導体も好適である。さらに、オプソニン作用阻害ポリマーは、ＰＥＧのブロックコポリマーであってもよいし、ポリアミノ酸、ポリサッカライド、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン、又はポリヌクレオチドであってもよい。オプソニン作用阻害ポリマーはまた、アミノ酸又はカルボン酸を含む天然ポリサッカライド（例えば、ガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラゲーニン）；アミノ化ポリサッカライド、又はオリゴサッカライド（直線状又は分岐状）；カルボキシル化ポリサッカライド又はオリゴサッカライド（例えば、カルボキシル基の合成結合を有するカルボン酸誘導体）であってもよい。
【００８８】
好ましくは、オプソニン作用−阻害部位は、ＰＥＧ、ＰＰＧ又はその誘導体である。ＰＥＧ又はＰＥＧ誘導体により修飾されたリポソームは「ＰＥＧ化リポソーム」（"ＰＥＧｙｌａｔｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ"）と言われることがある。
【００８９】
オプソニン作用−阻害部位は、リポソーム膜と周知技術のいずれかを用いて結合され得る。例えば、ＰＥＧのＮ‐ヒドロキシスクシニミドエステルは、ホスファチジルエタノールアミン脂質可溶性アンカーに結合し、次いで膜に結合し得る。同様に、デキストランポリマーは、Ｎａ（ＣＮ）ＢＨ３及び溶媒混合物（例えば、テトラヒドロフランと水の３０：１２比率の６０℃溶媒混合物）を使用する還元性アミノ化を介してステアリルアミン脂質可溶性アンカーを用い誘導体化され得る。
【００９０】
本発明のｓｉＲＮＡを発現する組換えプラスミドについては上述している。かかる組換えプラスミドはまた、直接的、または好適な輸送試薬と共に被験体に投与することができ、該輸送試薬には、Ｍｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＬＴ１脂肪親和性試薬；リポフェクチン；リポフェクトアミン(ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ)；セルフェクチン(ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ)；ポリカチオン（例えば、ポリリシン（ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ）)、又はリポソームが含まれる。本発明のｓｉＲＮＡを発現する組換えウイルス性ベクターについても上述しており、かかるベクターを被験体の新生血管形成領域に輸送する方法は当業者が適宜なし得るものである。
【００９１】
本発明のｓｉＲＮＡは、新生血管形成領域またはその近傍の組織細胞に本発明のｓｉＲＮＡを輸送する好適ないかなる手段を用いて被験体に投与してもよい。例えば、ｓｉＲＮＡは、遺伝子ガン、エレクトロポレーション、もしくは他の好適な非経口又は経腸的投与経路により投与することができる。
【００９２】
好適な経腸的投与経路には、経口、直腸、又は鼻腔内輸送が含まれる。
【００９３】
好適な非経口的投与経路には、血管内投与（例えば、静脈内ボーラス注射、静脈内注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入、血管系へのカテーテル点滴注入）；組織周囲及び組織内投与（例えば、腫瘍周囲及び腫瘍内注射、網膜内注射又は網膜下注射）；皮下注射又は皮下注入（例えば、浸透ポンプによる）を含む沈着；新生血管形成領域又はその近傍における、例えばカテーテルもしくは他の配置装置（例えば、角膜ペレット剤又は坐剤、点眼剤、もしくは多孔性、非多孔性、又はゼラチン物質を含むインプラント）による直接的（例えば、局所的）適用；及び吸入、が含まれる。好適な配置装置には、米国特許番号第５，９０２，５９８号及び第６，３７５，９７２号（全開示内容はこの参照により本明細書に組み込まれる。）に記載された眼用インプラント、米国特許番号第６，３３１，３１３号（全開示内容はこの参照により本明細書に組み込まれる。）に記載された生分解性の眼用インプラントが含まれる。かかる眼用インプラントは、Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ,Ｉｎｃ．（ウォータータウン、マサチューセッツ州)及びＯｃｕｌｅｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．(サニーベール、カリフォルニア州)から入手可能である。
【００９４】
好ましい態様において、ｓｉＲＮＡの注射又は注入は、新生血管形成部位又はその近傍において施される。例えば、本発明のｓｉＲＮＡは、眼の網膜色素上皮細胞に輸送され得る。好ましくは、ｓｉＲＮＡは、眼に局所的に投与され、例えば、液体又はゲル形態において、下眼瞼又は結膜円蓋に投与される（例えば、Ａｃｈｅａｍｐｏｎｇ ＡＡ  ｅｔ ａｌ．,２００２，Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌ．  ａｎｄ  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ３０：４２１〜４２９（全開示内容はこの参照により本明細書に組み込まれる。）を参照のこと。
【００９５】
典型的には、本発明のｓｉＲＮＡは、約５マイクロリットル〜約７５マイクロリットルの体積において眼に局所的に投与され、例えば約７マイクロリットル〜約５０マイクロリットル、好ましくは約１０マイクロリットル〜約３０マイクロリットルの体積において投与される。本発明のｓｉＲＮＡは、水溶液に非常に可溶性である。７５マイクロリットルを超える体積でのｓｉＲＮＡの局所的点眼は、ｓｉＲＮＡが眼からこぼれて排液となるため損失となることが理解される。したがって、高濃度（例えば、１００〜１０００ｎＭ）のｓｉＲＮＡを、約５マイクロリットル〜約７５マイクロリットルの体積において眼に局所的に投与することが好ましい。
【００９６】
特に好ましい非経口的投与経路は、眼内投与である。本発明のｓｉＲＮＡの眼内投与は、本発明のｓｉＲＮＡが眼に入ることが可能な限り、眼への注射又は直接投与（例えば、局所的投与）により達成されることが理解される。上述した眼への局所的投与経路に加え、好適な眼内投与には、硝子体内、網膜内、網膜下、サブテノン（ｓｕｂｔｅｎｏｎ）、眼窩周囲及び眼窩後方、角膜超（ｔｒａｎｓ−ｃｏｒｎｅａｌ）又は強膜超（ｔｒａｎｓ−ｓｃｌｅｒａｌ）投与が含まれる。かかる眼内投与経路は当該分野で適宜なし得るものであり、例えば、Ａｃｈｅａｍｐｏｎｇ  ＡＡ  ｅｔ  ａｌ．,２００２，ｓｕｐｒａ；Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６），Ｈｕｍ．Ｇｅｎ  Ｔｈｅｒ．７： １７６３〜１７６９；ＡｍｂａｔｉＪ  ｅｔ  ａｌ．,２００２，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｒｅｔｉｎａｌ  ａｎｄ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．２１：１４５〜１５１（全開示内容はこの参照により本明細書に組み込まれる。）を参照のこと。
【００９７】
本発明のｓｉＲＮＡは、１回服用又は複数回服用において投与され得る。本発明のｓｉＲＮＡ投与が注入による場合、注入は、１回の持続性服用であり得、また複数回の注入で輸送されてもよい。組織内への直接的なｓｉＲＮＡの注射は、新生血管形成の部位又はその近傍であることが好ましい。新生血管形成の部位又はその近傍組織へのｓｉＲＮＡの複数回の注射が特に好ましい。
【００９８】
当業者であれば、特定の被験者に本発明のｓｉＲＮＡを投与するための適切な投薬量を容易に決定し得る。例えば、ｓｉＲＮＡは被験者に一回投与され得、例えば一回の注射又は沈着により新生血管形成部位又はその近傍に投与される。あるいは、ｓｉＲＮＡは被験者に１日又は一週間に複数回投与され得る。例えば、約３週間〜約２８週間の間、より好ましくは約７週間〜約１０週間の間、週に１回投与され得る。好ましい投薬計画において、ｓｉＲＮＡは７週間にわたり週１回、新生血管形成の部位又はその近傍（例えば硝子体内）に注射される。慢性の血管新生疾患（例えば、ＡＲＭＤ又は糖尿病性網膜症）に罹患している被験者には、不確定の期間にわたる本発明のｓｉＲＮＡの周期的な投与が必要となり得ることが理解される。
【００９９】
投薬計画に複数回の投与が含まれる場合において、被験者に投与されるｓｉＲＮＡの有効量には、全計画を通して投与されたｓｉＲＮＡの合計量を含み得ることが理解される。
【０１００】
本発明のｓｉＲＮＡは、好ましくは、当該分野で知られた技術に従い、被験者に投与する前に薬学的組成物として調製される。本発明に係る薬学的組成物は、少なくとも無菌かつ発熱物質が含まれないことを特徴とする。ここで用いられる、「薬学的調製物」には、ヒト及び獣医学に使用される調製物が含まれる。本発明の薬学的組成物を調製する方法は、当業者が適宜なし得るものであり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１７ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ（１９８５））（全開示内容はこの参照により本明細書に組み込まれる。）に記載されている。
【０１０１】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体媒体と混合された、本発明のｓｉＲＮＡ（例えば、０．１〜９０重量％）、又はその薬学的に許容される塩類を含有する。好ましい薬学的に許容される担体媒体は、水、緩衝水、塩水溶液（例えば、ハンクス又はアール平衡塩溶液のような規定塩水又は平衡塩水溶液）、０．４％塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸、等である。
【０１０２】
本発明の薬学的組成物はまた、従来の賦形剤及び／又は添加物を含有し得る。好適な薬学的賦形剤には、安定化剤、抗酸化薬、重量オスモル濃度調整薬、バッファー、及びｐＨ調整試薬が含まれる。好適な添加剤には、生理学的に生体適合性を有するバッファー（例えば、トロメタミン塩酸塩）、添加物（ａｄｄｉｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃｈｅｌａｎｔｓ）（例えば、ＤＴＰＡ又はＤＴＰＡ-ビスアミド）又はカルシウムキレート複合体（例えば、カルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ-ビスアミド）、又は任意にカルシウム又はナトリウム塩の添加物（例えば、塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、又は乳酸カルシウム）が含まれる。本発明の薬学的組成物は、液状で使用するために包装され得、あるいは凍結乾燥され得る。
【０１０３】
眼への局所的使用のために、従来の眼内輸送試薬が使用され得る。例えば、局所的眼内輸送に用いられる本発明の薬学的組成物は、上記の塩水溶液、角膜浸透促進剤、不溶性粒子、ワセリン、ゲル軟膏、点眼時における粘性増加に耐えるポリマー、粘膜粘着性ポリマーを含有し得る。好ましくは、眼内輸送試薬は角膜浸透性を増加させ、あるいは粘性効果を通して、もしくは角膜上皮を覆うムチン層を用い物理化学的相互作用を確立することによりｓｉＲＮＡの保持時間を長くする。
【０１０４】
局所的眼内輸送のために好適な不溶性粒子には、Ｂｅｌｌらの米国特許番号第６，３５５，２７１号（全開示内容はこの参照により本明細書に組み込まれる。）に記載されたリン酸カルシウム粒子が含まれる。点眼時における粘性増加に耐える好適なポリマーには、ｐｏｌｏｘａｍｅｒ  ４０７（例えば、２５％の濃度において）、セルロースアセトフタラート（例えば、３０％の濃度において）、又はＧｅｌｒｉｔｅ（登録商標）（ＣＰ  Ｋｅｌｃｏ，ウィルミントン，デラウェア州から入手可能）等の低アセチルゲル化ゴムのようなポリエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマーが含まれる。好適な粘膜粘着性ポリマーには、カルボキシル、ヒドロキシル、アミド及び／又はサルフェート基等の多数の親水性官能基を有するヒドロコロイド；例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリアクリル酸、高分子量グリコール（例えば、>２００，０００数平均分子量）、デキストラン、ヒアルロン酸、ポリガラクツロン酸、及びキシロカン（ｘｙｌｏｃａｎ）が含まれる。好適な角膜浸透促進剤には、シクロデキストリン、塩化ベンザルコニウム、ポリオキシエチレングリコールラウリルエーテル（例えば、Ｂｒｉｊ（登録商標）３５）、ポリオキシエチレングリコールステアリルエーテル（例えば、Ｂｒｉｊ（登録商標）７８）、ポリオキシエチレングリコールオレイルエーテル（例えば、Ｂｒｉｊ（登録商標）９８）エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、ジギトニン、タウロコール酸ナトリウム、サポニン及びポリオキシエチル化ひまし油（Ｃｒｅｍａｐｈｏｒ  ＥＬなど）が含まれる。
【０１０５】
固形組成物に関し、従来の非毒性固形キャリアが使用され得る。例えば、マニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等の薬学的グレードが挙げられる。
【０１０６】
例えば、経口投与に用いられる固形薬学的組成物は、上記担体及び賦形剤のいずれをも含有し得、且つ、１０〜９５％、好ましくは２５％〜７５％の１種又それ以上の本発明のｓｉＲＮＡを含有し得る。エアロゾル（吸入）投与に用いられる薬学的組成物は、噴霧剤（ｐｒｏｐｅｌｌａｎｔ）と、上述したリポソーム中に封入された１種又はそれ以上の本発明のｓｉＲＮＡを０．００１〜２０重量％、好ましくは１重量％〜１０重量％含有し得る。上記のような担体（例えば、鼻腔内輸送のレシチン）もまた、含有され得る。
【０１０７】
以下に本発明を非限定的実施例を用いて詳述する。以下に示す動物実験は、動物のケア及び慣習の研究のためのユニバーシティ・オブ・ペンシルベニア  インスチチューショナル  ガイドラインを使用して行われた。
【実施例】
【０１０８】
実施例１：抗ＨＩＦ−１アルファｓｉＲＮＡを用いた培養ヒト胎児由来腎臓細胞におけるヒトＶＥＧＦ発現の阻害
ヒト胎児由来腎臓２９３（ＨＥＫ−２９３）細胞を、標準成長培地において３７℃、５％ＣＯ２で一晩、２４ウェルプレートにて培養した。次の日、細胞が約５０％コンフルエントになったとき、実験細胞及び対照細胞にトランスフェクションを行った。リン酸カルシウム試薬中に混合された２５ｍＭヒトＨＩＦ−１アルファｓｉＲＮＡを実験細胞にトランスフェクトした。対照細胞はｓｉＲＮＡを欠くトランスフェクション試薬で処理するか、あるいはリン酸カルシウムトランスフェクション試薬中の２５ｍＭ非特異的ｓｉＲＮＡ（ＥＧＦＰ１  ｓｉＲＮＡ）で処理した。実験細胞について、ヒトＨＩＦ−１アルファｍＲＮＡを標的とする２０個の異なるｓｉＲＮＡをテストした。これらの抗ＨＩＦ−１アルファｓｉＲＮＡは、表２に挙げられた標的配列を含み、すべてのｓｉＲＮＡは各鎖に３'ＴＴを含んでいた。表２中、「サンプル番号」は図１及び２に示された実験細胞サンプルに対応する。
【０１０９】
【表２】
0005449639.tif 000005
【０１１０】
トランスフェクション４時間後、最終濃度２００μｍのデスフェリオキサミンを用い
て、対照及び実験ＨＥＫ−２９３細胞を低酸素に導入した。トランスフェクション４８時間後、すべてのウェルから細胞培地を取り除き、ヒトＶＥＧＦ  ＥＬＩＳＡ（Ｒ&Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，ミネアポリス，ミネソタ州）をＱｕａｎｔｉｋｉｎｅヒトＶＥＧＦ  ＥＬＩＳＡプロトコルに記載されている通りに行った。ＥＬＩＳＡの結果はＡＤ３４０プレートリーダー（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で読み出され、その結果を図１に示す。
【０１１１】
図１に示されるように、低酸素のデスフェリオキサミン媒介誘導により、ＨＥＫ−２９３細胞でヒトＶＥＧＦタンパク質が上方制御された。ＶＥＧＦタンパク質の低酸素誘導増加は、ヒト抗ＨＩＦ−１アルファｓｉＲＮＡでトランスフェクションした細胞中で減少した。非特異的ｓｉＲＮＡ（ＥＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ）での低酸素細胞のトランスフェクション、またはｓｉＲＮＡを用いない模擬トランスフェクションは、ＶＥＧＦタンパク質レベルに何らの効果ももたらさなかった。抗ＨＩＦ−１アルファｓｉＲＮＡであるｈＨＩＦ１番号１２、ｈＨＩＦ１番号１３、およびｈＨＩＦ１番号１６は、非低酸素ＨＥＫ−２９３細胞のＶＥＧＦタンパク質発現に近づくレベルにまでＶＥＧＦタンパク質発現が減少した。抗ＨＩＦ−１アルファｓｉＲＮＡであるｈＨＩＦ１番号１１は、非低酸素ＨＥＫ−２９３細胞のＶＥＧＦタンパク質発現を下回るまで減少した。
【０１１２】
対照および実験細胞から細胞培地を除去した後、以下に示す細胞毒性アッセイを行った。１０％ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，カマリロ，カリフォルニア州）を含有する完全成長培地を各ウェルに添加し、細胞を５％ＣＯ２、３７℃で３時間インキュベートした。細胞増殖を、細胞代謝活性に起因するＡｌａｍａｒＢｌｕｅを含む培地の色変化を検知することにより測定した。細胞毒性アッセイの結果はＡＤ３４０プレートリーダー（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で読み出され、その結果を図２に示した。図２に示されるように、試験した２０個の抗ＨＩＦ−１アルファｓｉＲＮＡのいずれにおいてもＨＥＫ−２９３細胞中に有意な細胞毒性は見られなかった。
【０１１３】
細胞毒性アッセイを行った後、各ウェルにおける増殖培地を完全に取り除き、ＨＥＫ−２９３細胞からのＲＮＡ抽出を、ＲＮＡ  ｑｕｅｏｕｓ  ＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ，オースティン，テキサス州）を用いて製品使用説明書に従い行った。細胞中のヒトＨＩＦ−１アルファおよびＶＥＧＦ  ｍＲＮＡのレベルを、定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）により、内標準としてヒトグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡを用い、測定した。
【０１１４】
ＲＴ−ＰＣＲ実験により、非低酸素細胞中のＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ発現と比較してヒトＶＥＧＦのｍＲＮＡレベルが低酸素において増加していることが示された。低酸素細胞中のＶＥＧＦ  ｍＲＮＡレベルは、抗ＨＩＦ−１アルファｓｉＲＮＡでのトランスフェクションにより減少した。非特異的ｓｉＲＮＡ（ＥＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ）を用いた低酸素細胞のトランスフェクション、あるいはｓｉＲＮＡを用いない模擬トランスフェクションにおいては、ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡレベルは減少しなかった。従って、ＨＩＫ−２９３細胞中への抗ＨＩＦ−１アルファｓｉＲＮＡの導入により、非特異的ｓｉＲＮＡを用いて、あるいはｓｉＲＮＡを用いないでトランスフェクトされた細胞と比較して、ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡの分解が誘導された。図１に示されるように、ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡの分解は、ＶＥＧＦタンパク質産物における減少と相互関係を示す抗ＨＩＦ−１アルファｓｉＲＮＡにより、誘導された。
【０１１５】
実施例２：脈絡膜新生血管形成のマウスモデルにおける抗ＨＩＦ−１アルファｓｉＲＮＡを用いた血管新生のｉｎ  ｖｉｖｏ阻害
成体（８〜１５週齢）メスＣ５７Ｂ１／６マウス（ｎ＝７）をアベルチン（２，２，２−トリブロモエタノール）で麻酔し、１％のトロピカミドで瞳孔を拡張した。ダイオードレーザー光凝固装置（ＩＲＩＳ  Ｍｅｄｉｃａｌ，マウンテンビュー，カリフォルニア州）、及びコンタクトレンズとしてカバースリップを備えたスリットランプシステムを使用し、左右相称にレーザー光凝固術を施した。レーザー光凝固術（１４０ｍＷ；７５ミクロンスポットサイズ；０．１秒持続時間）を視神経から２〜３ディスク直径の所で、両眼の９時、１２時、３時の位置に施した。ブルーフ膜の破裂は有意な脈絡膜新生血管形成（ＣＮＶ）を作るために必要であるため、ブルーフ膜の破裂のしるしとしてレーザー光凝固時における気泡形成が用いられた。ブルーフ膜の破裂を誘導しないレーザー噴射は本研究から除外した。
【０１１６】
レーザー処理後直ちに、マウスＨＩＦ‐１アルファｍＲＮＡ標的ｓｉＲＮＡを試験群の各動物の両眼に注射（ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した。対照動物には担体のみを注射（ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した。
【０１１７】
マウス抗ＨＩＦ‐１アルファｍＲＮＡの標的配列は、ＡＡＣＴＡＡＣＴＧＧＡＣＡＣＡＧＴＧＴＧＴ  （配列ＩＤ番号２９７）であり、用いられたｓｉＲＮＡは、
５’−ｃｕａａｃｕｇｇａｃａｃａｇｕｇｕｇｕＴＴ‐３'（配列ＩＤ番号２９８）
３’−ＴＴｇａｕｕｇａｃｃｕｇｕｇｕｃａｃａｃａ‐５'    （配列ＩＤ番号２９９）
レーザー光凝固から１２日後、網膜／脈絡膜血管系を標識するために高分子量のデキストラン−フルオレセイン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，ユージーン，オーランド州）を灌流し、眼を摘出した。各ＣＮＶ領域を脈絡膜フラットマウント調製物において測定した。
【０１１８】
脈絡膜フラットマウントを調製するために、前眼房を除去し、網膜を硝子体で抽出し、アイカップを残した。アイカップ上で切り口を弛緩し、脈絡膜をスライド上に平坦化した。蛍光照明（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）を具備するライカ  ＤＭＲ顕微鏡（Ｗｅｔｚｌａｒ，ドイツ）を使用し、マスクした研究者がデキストラン−フルオレセイン灌流フラットマウント調製物中で、レーザー光にあらかじめ曝された領域に対応する環状蛍光（フルオレセイン陽性）領域として病変を同定した。ＯｐｅｎＬａｂ  ２．２ソフトウェアを具備するアップルマッキントッシュＧ４コンピューター（クパチーノ，カリフォルニア州）に連結したモノクロＨａｍａｍａｔｓｕ  ＣＣＤカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ,ブリッジウォーター，ニュージャージー州）を使用し、病変の画像を取り込んだ。公知サイズのｇｒａｔｉｎｇでスライドからキャリブレーション画像が得られた。レーザー照射領域内の超蛍光性フルオレセイン−デキストラン標識血管がＯｐｅｎｌａｂソフトウェアを使用し「重要領域」（ＲＯＩ）として選択され、このソフトウェアはＲＯＩにおいてホワイトピクセルにより占められる領域（μｍ２）を計算するために使用された。Ｏｐｅｎｌａｂソフトウェアに規定されているように、２０００〜４０９０強度ユニットの範囲におけるレーザー照射部位におけるピクセルを同定するために、Ｏｐｅｎｌａｂ"ｍａｇｉｃ  ｗａｎｄ"ツールを使用することにより、同一統合調節下に画像を収集した後、ＲＯＩを選択した。選択された強度ユニットは通常のフルオレセイン灌流血管系において測定されたレベルを表示した。参考のために、バックグラウンドの強度、非蛍光性領域は<４５０強度ユニットであった。
【０１１９】
通常、ＲＯＩは傾向性を欠く領域により充分に限界が定められている。ＣＮＶ領域を測定した後、Ｏｐｅｎｌａｂソフトウェアの"ａｐｐｌｙ  ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ"機能を使用し、５１５ナノメータにおける強度ランプを適用することによりＯｐｅｎｌａｂにて画像をカラー化した。この強度ランプは画像中全てのピクセルに適用され、もっとも白いピクセルを最も明るいグリーンカラーとする。次いで、画像をプレゼンテーション目的でＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェアにエクスポートした。脈絡膜フラットマウントのブライトフィールド分析後レーザー照射の証拠がない状態が除外された。
【０１２０】
片側分布（ｏｎｅ−ｔａｉｌｅｄ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）、二サンプルの非同等分散スチューデントｔ検定（ｔｗｏ  ｓａｍｐｌｅ  ｕｎｅｑｕａｌ  ｖａｒｉａｎｃｅ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）を使用し、結果の統計分析を行った。抗ＨＩＦ−１アルファｓｉＲＮＡ試験動物と対照レーザー動物との間には統計的にＣＮＶ領域に有意な減少（Ｐ＝０．０００３５４）が見られ、項ＨＩＦ−１アルファｓｉＲＮＡを受容する動物において血管新生に実質的な減少が示された。結果を図３に示す。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】図１は、ＯＤ４５０ナノメーターにおいてＶＥＧＦ  ＥＬＩＳＡにより測定されたＶＥＧＦ濃度のヒストグラムであり、ここにおいて、ｓｉＲＮＡなし（"なし"）で処置された非低酸素（"−"）培養ＨＥＫ−２９３細胞中、ｓｉＲＮＡなし（"なし"）、非特異的ｓｉＲＮＡ（"ＥＧＦＰ"）、又はヒトＨＩＦ−１アルファｍＲＮＡを標的とする２０個の単離ｓｉＲＮＡ（"ｈＨＩＦ１番号１−２０"）で各々処理された低酸素（"＋"）培養ＨＥＫ−２９３細胞中のＶＥＧＦ濃度を示している。
【図２】図２は、細胞毒性を示すヒストグラムであり、ここにおいて、ｓｉＲＮＡなし（"なし"）で処理された非低酸素（"−"）培養ＨＥＫ−２９３細胞中、及びｓｉＲＮＡなし（"なし"）、非特異的ｓｉＲＮＡ（"ＥＧＦＰ"）、又はヒトＨＩＦ−１アルファｍＲＮＡを標的とする２０個の単離ｓｉＲＮＡ（"ｈＨＩＦ１番号１−２０"）で各々処理された低酸素（"＋"）培養ＨＥＫ−２９３細胞中のＶＥＧＦ濃度を示している。
【図３】図３は、ｍｍ２中の脈絡膜新生血管形成領域を示すヒストグラムであり、ここにおいて、対照マウス（"対照"）及び抗ＨＩＦ−１アルファｓｉＲＮＡで処理されたマウス（"ＨＩＦ−１  ｓｉＲＮＡ"）からの眼中における形成領域を示している。
【図１】
0005449639.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【配列表】
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