(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニワトコ抽出物と、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・ブルガリクスまたはストレプトコッカス・サーモフィルスの少なくとも１つの菌株との組合せを含み、キャッツクロー、パウダルコ、スクテラリア・バイカレンシスおよびアルテミシニンの混合物を含まない、食品、栄養補助食品または医薬である、組成物。
【請求項２】
ニワトコ抽出物と、ラクトバチルス・パラカゼイの少なくとも１つの菌株との組合せを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ニワトコ抽出物が、該抽出物の固形分を基準にして０．５重量％と２５重量％との間のアントシアン、および抽出物の固形分を基準にして２重量％と１０重量％との間のタンパク質を含有する、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
１×１０７ＣＦＵ／単位用量と１×１０１１ＣＦＵ／単位用量との間の量のＬ．パラカゼイ、Ｌ．カゼイ、Ｌ．ブルガリクスまたはＳ．サーモフィルスを含有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記食品が、乳製品、発酵乳製品、ヨーグルト、発酵乳、乳幼児用ミルク、散剤、トローチ剤、野菜ジュース、飲料およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記食品が、新鮮な乳製品、果物および／または野菜ジュース、およびフルーツピューレからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
内服用錠剤、チュアブル錠、発泡錠、カプセル剤、トローチ剤、丸薬、散剤、顆粒剤、経口液剤または懸濁剤、ならびに、舌下およびバッカルの投与形態からなる群から選択される生薬の形態である栄養補助食品または医薬である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
単位用量当たり１５０ｍｇと３００ｍｇとの間のニワトコ固形分、および単位用量当たり１×１０７ＣＦＵと１×１０１１ＣＦＵとの間のＬ．パラカゼイ、Ｌ．カゼイ、Ｌ．ブルガリクスまたはＳ．サーモフィルスを含有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
単位用量当たり２００ｍｇと２５０ｍｇとの間のニワトコ固形分、および単位用量当たり１×１０７ＣＦＵと１×１０１１ＣＦＵとの間のＬ．パラカゼイ、Ｌ．カゼイ、Ｌ．ブルガリクスまたはＳ．サーモフィルスを含有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
医薬として用いられる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
免疫を刺激しおよび／または免疫防御を増強しおよび／または抗感染性および／または抗炎症応答を促進するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
インフルエンザウイルスによる感染によって引き起こされるインフルエンザ病態の症状の治療および／または予防に用いられる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニワトコ抽出物とＬ．パラカゼイ（Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ）、Ｌ．カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）、Ｌ．ブルガリクス（Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の少なくとも１つの菌株との組合せを含む、好ましくは、免疫を刺激しおよび／または抗感染性および／若しくは抗炎症応答を促進することを意図した組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニワトコ（ｅｌｄｅｒ）またはセイヨウニワトコ（Ｓａｍｂｕｃｕｓ  ｎｉｇｒａ  Ｌ）は、レンプクソウ科の一部である。
【０００３】
ニワトコ属は、世界中の温帯地域に分布した２５の種を含む。黒ニワトコ、Ｓ．ｎｉｇｒａ  ｓｓｐ．ｎｉｇｒａは、ヨーロッパ（デンマーク、イタリアおよびオーストリア）、北アフリカおよび西アジアに広く生育している。北アメリカの北東を起源とするカナダニワトコ、Ｓ．ｎｉｇｒａ  ｓｓｐ．ｃａｎａｄｅｎｓｉｓは、オレゴン、ペンシルバニアおよびカンザスで生育するが、その選別はカナダで実施される。
【０００４】
以下の種々のニワトコの器官、すなわちコルク組織、茎、花、葉および果実は、医薬、食品産業および道具および玩具の製作を含む種々の分野において伝統的に使用されている。その主要な工業的生産は、現在、栄養補助食品市場および着色剤産業に向けたニワトコ果粒抽出物（ｅｌｄｅｒｂｅｒｒｙ  ｅｘｔｒａｃｔ）の生産に関する。
【０００５】
幾つかの刊行物は、サイトカインの産生に対するニワトコ果粒抽出物の効果を報告している（《Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｓａｍｂｕｃｏｌ，  ａ  ｂｌａｃｋ  ｅｌｄｅｒｂｅｒｒｙ−ｂａｓｅｄ，  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔ，  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：  Ｉ．  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  》  Ｅｕｒ．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ．  ２００１  Ａｐｒｉｌ−Ｊｕｎｅ；  １２（２）：  ２９０−２９６）。特に、インフルエンザウイルス（Ａおよび／またはＢおよび／またはＣ）によるインフルエンザ感染に関する症状の軽減に対するニワトコ果粒抽出物の効果は、１型単純ヘルペスウイルス、ＲＳウイルスおよびパラインフルエンザウイルスに対するその抗ウイルス効果と同様に既に開示されている（《Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  Ｏｒａｌ  Ｅｌｄｅｒｂｅｒｒｙ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ  Ｖｉｒｕｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ》  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｔ．  Ｍｅｄ．  Ｒｅｓ．  ２００４；  ３２：１３２−１４０）。
【０００６】
多くの科学的研究は、発酵食品、特に乳製品中に含まれるある種の微生物の健康に対する有利な効果を示している。これらの微生物は、通常《プロバイオティクス》と称される。広く受け入れられている現行の定義によれば、プロバイオティクスは、《適量で消費されるときに宿主の健康に対して有利な効果を有する、生きている微生物》である（ＦＡＯ／ＷＨＯ  ｒｅｐｏｒｔ  ｏｎ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ  ｉｎ  Ｆｏｏｄ  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  Ｐｏｗｄｅｒ  Ｍｉｌｋ  ｗｉｔｈ  Ｌｉｖｅ  Ｌａｃｔｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａ；  Ｃｏｒｄｏｂａ，  Ａｒｇｅｎｔｉｎａ；  １−４  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２００１を参照されたい）。
【０００７】
プロバイオティクス細菌を含む食品の消費は、特に、腸内菌叢を均衡させ、感染に対する耐性を向上させ、および免疫応答を調節することにより、健康に対する望ましい効果を生じ得ることが、特許出願ＷＯ９６／２０６０７、ＥＰ０７９４７０７、ＥＰ１２８３７１４、およびＦＲ２９１２６５７において示されている。
【０００８】
ヒトの飲食物中で使用されるプロバイオティクス微生物は、一般に乳酸菌であり、主として乳酸桿菌属およびビフィズス菌の菌株、および特にラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）種に属する。
【０００９】
米国特許出願第２００６／０２３３８９５号は、Ｌ−カゼイなどのプロバイオティクスと場合により組み合わせることができるニワトコ抽出物を含む組成物を開示している。しかしながら、この組成物は、キャッツクロー、パウダルコ、スクテラリア・バイカレンシス（Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ  ｂａｉｃａｌｅｎｓｉｓ）およびアルテミシニンの混合物を必然的に含有する。さらに、この組成物は、免疫を刺激することは意図されず、細菌感染により惹起され、したがってインフルエンザ型ウイルス感染とは非常に異なるライム病を治療するためのものである。
【発明の概要】
【００１０】
本発明者らは、ニワトコ抽出物(ｅｌｄｅｒ  ｅｘｔｒａｃｔ)とＬ．パラカゼイ、Ｌ．カゼイ、Ｌ．ブルガリクスまたはＳ．サーモフィルスの少なくとも１つの菌株とを含む組合せの、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）による非特異的な免疫メディエータ（サイトカイン）の産生に対するインビトロ効果を研究してきた。このタイプのインビトロモデルの結果は、インビボで得ることができる効果と高度に関連する（Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２００７；１３（２）：２３６−２４３）。
【００１１】
ＰＢＭＣ細胞モデルは、ヒト免疫系の細胞応答能力を研究するために使用される。この応答はＩＬ−１０、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−６サイトカイン産生により発現する。
【００１２】
炎症性ストレスにおいては、ＩＬ−１０がマクロファージにより産生されて、ＴＮＦ−αなどの炎症誘発性サイトカインの産生を調節する。これは抗原発現の減少を助長し、Ｔ細胞増殖を減少させるが、ＩＬ−２、−４および７の存在下において細胞傷害性Ｔ細胞の分化因子として作用することができる。ＩＬ−１０は抗体産生Ｂ細胞の生存を向上させる。
【００１３】
ＩＦＮ−γ即ちＩＩ型ＩＦＮは若干の抗ウイルス活性を有して、細胞増殖を阻害する。しかしながら、主として抗ウイルス活性を有するＩ型ＩＦＮ（α−およびβ−ＩＦＮ）に対して、ＩＦＮ−γは本質的に免疫調節性である。ＩＦＮ−γはマクロファージおよびＮＫ細胞を活性化し、それ故細胞傷害性機構に影響する。それはＴ細胞増殖および分化を調節し、１型免疫応答を助長して２型を逆に阻害することが知られている。
【００１４】
ＩＬ−６は、抗原特異的免疫応答および炎症性反応に影響する多面発現性サイトカインである。これは急性期反応の主要な生理学的メディエータの１つである。ＩＬ−６はＢ細胞分化因子およびＴ細胞に対する活性化因子である。ＩＬ−２の存在において、ＩＬ−６は、成熟および未成熟Ｔ細胞の細胞傷害性Ｔ細胞への分化を誘発する。ＩＬ−６およびＩＬ−３は、インビトロでの多分化能の造血性前駆細胞の増殖の促進で相乗作用を示す。ＩＬ−６は巨核球の成熟をインビトロで誘発し、インビボで血小板数を増加させる血小板産生因子でもある。
【００１５】
両方の構成要素（ニワトコ抽出物およびＬ．パラカゼイ、Ｌ．カゼイ、Ｌ．ブルガリクスまたはＳ．サーモフィルス菌株）が、ヒト免疫系細胞に作用して免疫応答を増強し、その結果、身体は任意の感染性侵襲または任意の病的炎症性過程に対してよりよく備えられる。得られた結果は、非常に驚くべきことで且つ予想されずに、これらの構成要素は、同じ組成物中にあるとき、非特異的免疫応答に対して相乗的に作用することを示した。
【００１６】
このように、本発明は、ニワトコ抽出物とＬ．パラカゼイ、Ｌ．カゼイ、Ｌ．ブルガリクスまたはＳ．サーモフィルスの少なくとも１つの菌株との組合せを含む組成物に関する。前記組成物は、特に米国特許第２００６／０２３３８９５号に記載されたようなキャッツクローおよび／またはパウダルコおよび／またはスクテラリア・バイカレンシスおよび／またはアルテミシニンを含まないことが好ましい。特に、それはキャッツクロー、パウダルコ、スクテラリア・バイカレンシス、およびアルテミシニンの混合物を含まない。
【００１７】
特定の一態様によれば、本発明による組成物は、ニワトコ抽出物とＬ．パラカゼイの少なくとも１つの菌株との組合せを含む組成物に関する。
【００１８】
特定の一態様によれば、本発明による組成物は、以下のステップ：
ａ）ニワトコ抽出物とＬ．パラカゼイ、Ｌ．カゼイ、Ｌ．ブルガリクスまたはＳ．サーモフィルスの少なくとも１つの菌株との組合せを調製し、
ｂ）本発明による組成物に対する前記組合せを添加すること
を含む方法により調製することができる。
【００１９】
この場合は、この組合せは、それが組成物に添加される前に調製されることになる。しかしながら、組合せの構成要素の各々を別々に組成物に添加することにより、即ち、前以て組合せを調製せずに本発明による組成物を調製することも可能である。
【００２０】
特定の一態様によれば、本発明による組成物は、ニワトコ抽出物とＬ．パラカゼイ、Ｌ．カゼイ、Ｌ．ブルガリクスおよび／またはＳ．サーモフィルスの少なくとも１つの菌株との組合せを含む組成物に関する。
【００２１】
好ましくは、本発明による組成物は経口投与用である。
好ましくは、本発明による組成物は、食品、栄養補助食品、医薬またはＯＴＣ（Ｏｖｅｒ  Ｔｈｅ  Ｃｏｕｎｔｅｒ）製品である。
【００２２】
好ましくは、本発明のニワトコ抽出物は、ニワトコの果粒および／または花から、好ましくはニワトコ果粒（ｅｌｄｅｒｂｅｒｒｙ）から得られる。有利には、本発明のニワトコ抽出物は水溶性抽出物である。
【００２３】
本発明の範囲内で使用されるニワトコ抽出物は、一方でアントシアンおよび他方でタンパク質（特にレクチン）などの高分子の含有率により特徴づけすることができる。
【００２４】
好ましくは、ニワトコ抽出物は、より好ましくはペラルゴニジンおよびシアニジン族に属するアントシアンを、抽出物の固体含有率を基準にして重量で約０．５％と約２５％との間、より好ましくは約３％と約２５％との間、および最も好ましくは約８％と約１６％との間の量で含む。好ましくは、アントシアン含有率は、抽出物の固体含有率を基準にして約１２重量％に等しい。これらの含有率は、Ｊ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．  ２００４，  ５２，  ７８４６−７８５６に記載されたＨＰＬＣ法によりシアニジン−３−グルコシドとして表わされる。
【００２５】
好ましくは、ニワトコ抽出物は、固体を基準にして２重量％と１０重量％との間、好ましくは５重量％と１０重量％との間、およびより好ましくは５重量％と７重量％との間の量でタンパク質を含有する（ケルダール法によりＮ×６．２５：Ｐｒｏｔｅｉｎｅｓ  ｖｅｇｅｔａｌｅｓ，Ｅｄ．Ｂ．Ｇｏｄｏｎ，Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｅｔ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ａｇｒｏ−ａｌｉｍｅｎｔａｉｒｅｓ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｅｔ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｖｏｉｓｉｅｒ，Ｐａｒｉｓ，１９８５）。
【００２６】
本発明の範囲内で、ニワトコ抽出物は市販されているかまたは以下の工程を含む方法により得ることができる：
【００２７】
新鮮または冷凍ニワトコ果粒は、濾過後にジュースを得るために圧縮することができる。それは、濾過前にそれを清澄化するために、酵素による加水分解ステップ（ペクチナーゼまたはペクチンメチルエステラーゼとポリガラクツロナーゼとの混合物）にかけることができる（Ｇｉｒａｒｄ  Ｂ．  ａｎｄ  Ｆｕｋｕｍｏｔｏ  Ｌ．Ｒ．  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｆｒｕｉｔ  ｊｕｉｃｅｓ  ａｎｄ  ｂｅｖｅｒａｇｅｓ：  ａ  ｒｅｖｉｅｗ．  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，  ２０００，  ４０（２）：９１−１５７）。乾燥して粉砕された果粒も水で抽出し、続いて濾過により固体／液体分離をすることができる。
【００２８】
生じた抽出物は、そのまままたは濃縮して、または乾燥し粉末にして使用することができる。
【００２９】
この段階で、アントシアン含有率は、抽出物の固体含有率を基準にして０．５重量％と３重量％の間であり、好ましくは約１％に等しい（ＨＰＬＣアッセイ、シアニジン−３−グルコシドで表される）。
【００３０】
ニワトコ抽出物は、特に、アントシアンおよび／または高分子量の分子（タンパク質、ポリフェノール、多糖類）で補完することができる。
【００３１】
この目的のために、数通りの方法が可能であり、当業者に周知のことである：
限外濾過：予め希釈されたジュースを、続けて有機または無機膜により１ｋＤａと２０ｋＤａとの間の、好ましくは３ｋＤａと１０ｋＤａとの間のカットオフ閾値で一極集中させることに基づく透析濾過ステップ（Ｇｉｒａｒｄ  Ｂ．  ａｎｄ  Ｆｕｋｕｍｏｔｏ  Ｌ．  Ｒ．  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｆｒｕｉｔ  ｊｕｉｃｅｓ  ａｎｄ  ｂｅｖｅｒａｇｅｓ：  ａ  ｒｅｖｉｅｗ．  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，  ２０００，  ４０（２）：９１−１５７）；
Ａｍｂｅｒｌｉｔｅタイプの吸収剤ポリマー性樹脂ＸＡＤのカラムに通す；
水性アルコール（任意の比率の水とＣ１からＣ４までのアルコールとの混合物）または酸性ｐＨ水溶液による抽出（Ｂｒｏｎｎｕｍ−Ｈａｎｓｅｎ  Ｋ．  ａｎｄ  Ｆｌｉｎｋ  Ｊ．Ｍ．  Ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎ  ｃｏｌｏｒａｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ｅｌｄｅｒｂｅｒｒｙ  （Ｓａｍｂｕｃｕｓ  ｎｉｇｒａ  Ｌ．）  ＩＶ．  Ｆｕｒｔｈｅｒ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｑｕｉｄ  ｅｘｔｒａｃｔｓ，  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ  ａｎｄ  ｆｒｅｅｚｅ  ｄｒｉｅｄ  ｐｏｗｄｅｒｓ．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈ  １９８６，  ２１（２）：６０５−６１４；  Ｌｅｅ  Ｊ．  ａｎｄ  Ｗｒｏｌｓｔａｄ  Ｒ．Ｅ．  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｓ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｉｃｓ  ｆｒｏｍ  ｂｌｕｅｂｅｒｒｙ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｗａｓｔｅ．  Ｊ．  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．  ２００４，  ６９（７）：５６４−５７３）。この抽出は、好ましくは、乾燥して粉砕された果粒または新鮮果粒からの裏ごしに直接行うことができる。
【００３２】
生じた抽出物は、ブリックス度を増大させ、微生物汚染に関して安定化するために、（５０℃を超えない温度で真空下に）熱的に濃縮することができる。単独でまたは支持体（例えばマルトデキストリン、ラクトース等）を用いて乾燥することもできる。
【００３３】
得られた補完後のジュースは、好ましくはブリックス度が４０°と６０°との間であり、アントシアンが固体含有率を基準にして３重量％と２５重量％の間、およびタンパク質（ケルダール法、Ｎ×６．２５）は５重量％と１０重量％の間である。
【００３４】
好ましくは、組成物中における単位用量当たりのニワトコ固形分(elder solid)の量は、本発明によれば、約１００ｍｇと約１ｇとの間である。より好ましくは、組成物は、単位用量当たり約１５０ｍｇと約５００ｍｇとの間のニワトコ固形分、より好ましくは、単位用量当たり約１５０ｍｇと３００ｍｇとの間のニワトコ固形分、特に好ましくは単位用量当たり２００ｍｇと２５０ｍｇとの間のニワトコ固形分を含む。
【００３５】
本発明の範囲内で、《単位用量》という用語は１回の用量で投与される本発明による組成物の量を指す。好ましくは、本発明による単位用量は、例えば１００または１２５ｍｌのヨーグルト、１ｇのカプセル、または２ｇの錠剤に相当することができる。したがって、単位用量当たりの組成物の重量に関わらず、ニワトコ固体および／またはＬ．パラカゼイ、Ｌ．カゼイ、Ｌ．ブルガリクスまたはＳ．サーモフィルス菌株の量は一定のままである。好ましくは、投与計画は１日当たり２単位の用量である。
【００３６】
本発明の範囲内で最も適当な１つのＬ．パラカゼイ菌株は、１９９４年１２月３０日に、ＣＮＣＭ（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、２８  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ、Ｐａｒｉｓ）に参照番号Ｉ−１５１８で寄託したＬ．パラカゼイ菌株である。参照番号ＤＮ−１１４  ００１またはＬ．ｃａｓｅｉ  ｄｅｆｅｎｓｉｓ（登録商標）（商品名）としても知られるこの菌株は、特許ＥＰ０７９４７０７の主題でもある。気道病原性微生物（インフルエンザウイルスを含む）に特異的な全身性免疫応答の増強におけるこの菌株の効果は、特許ＥＰ１２８３７１４に記載されており、ワクチン接種後のインフルエンザに対する防護の増強におけるその効果は、特許出願ＦＲ２９１２６５７に記載されている。
【００３７】
ラクトバチルス・カゼイおよびパラカゼイの学名は、これまで、改良に対する要求の主題であって、それは現在も未だ論争されている。文献でＬ．カゼイまたはＬ．パラカゼイ亜種パラカゼイと称される菌株の大部分は、現行の学名に合わせるにはラクトバチルス・パラカゼイ亜種パラカゼイと命名できる、現行では同じ種の構成員である。
【００３８】
これらの細菌の菌株は、他の乳酸菌と組み合わせて、またはヨーグルト発酵物、即ちラクトバチルス・ブルガリクスおよびストレプトコッカス・サーモフィルスと組み合わせて使用することができる。
【００３９】
したがって、Ｌ．パラカゼイがヨーグルト発酵物と組み合わせて使用されるとき、前記組成物は、１ｍｌ当たり少なくとも１０７、および好ましくは５×１０７と２×１０８との間のＳ．サーモフィルス細胞、および１ｍｌ当たり少なくとも５×１０４、および好ましくは１０５と５×１０５との間のＬ．ブルガリクス細胞をさらに含むことができる。
【００４０】
本発明の範囲内で最も適当な１つのＬ．ブルガリクス菌株は、参照番号Ｉ−２７８７でＣＮＣＭに寄託されたＬ．ブルガリクス菌株である。
【００４１】
本発明の範囲内で最も適当な１つのＳ．サーモフィルス菌株は、参照番号Ｉ−２１３０でＣＮＣＭに寄託されたＳ．サーモフィルス菌株である。
【００４２】
これら菌株からの細菌は、生きているまたは生きていない細菌の菌体の形態で、および細菌溶解産物の形態でも、または細菌画分の形態でも使用することができる。
【００４３】
これらの細菌は、それらの生存を向上させるために、特許出願ＷＯ２００５／０７０２２１に記載されたように、植物性脂肪で被覆することもできる。
【００４４】
好ましくは、組成物は、単位用量当たり１×１０７ＣＦＵから１×１０１１ＣＦＵのＬ．パラカゼイ、Ｌ．カゼイ、Ｌ．ブルガリクスまたはＳ．サーモフィルスを含むであろう。
【００４５】
Ｌ．パラカゼイ、Ｌ．カゼイ、Ｌ．ブルガリクスまたはＳ．サーモフィルスの毎日の用量は１０８ＣＦＵと１０１０ＣＦＵとの間が有利である。
好ましくは、毎日の投与計画は１日当たり２単位の用量である。
【００４６】
本発明の特定の一態様によれば、組成物は、単位用量当たり、
１００ｍｇから１ｇ、好ましくは１５０ｍｇから５００ｍｇ、有利には１５０ｍｇから３００ｍｇ、およびより好ましくは２００ｍｇから２５０ｍｇのニワトコ固体；および
１×１０７から１×１０１１のＬ．パラカゼイ、Ｌ．カゼイ、Ｌ．ブルガリクスまたはＳ．サーモフィルス；
を含む。
【００４７】
本発明の特定の一態様によれば、組成物は、単位用量当たり、
３ｍｇから２００ｍｇ、好ましくは１０から１００ｍｇおよびより好ましくは２０ｍｇから５０ｍｇのニワトコアントシアン；
２ｍｇから１００ｍｇ、好ましくは１０ｍｇから２０ｍｇのニワトコタンパク質；および
１×１０７から１×１０１１のＬ．パラカゼイ、Ｌ．カゼイ、Ｌ．ブルガリクスまたはＳ．サーモフィルス；
を含む。
それと共に、有利なことに相乗効果が記録されている。
【００４８】
ニワトコ抽出物とＬ．パラカゼイ、Ｌ．カゼイ、Ｌ．ブルガリクスまたはＳ．サーモフィルスの菌株との本発明による組合せは、非特異的免疫応答を誘発／刺激する優れた能力を示し、したがって食品および／または薬剤分野におけるその利点を示す。
【００４９】
本発明による組成物は、食品および／または薬剤分野において、経口または舌下投与用に普通に使用されるいかなる生薬の形態で好ましく見出され得る。
【００５０】
食品の場合には、これは、特に新鮮な乳製品、発酵乳製品、ヨーグルト、発酵乳、乳幼児用ミルク、粉末、飴、野菜ジュース、飲料、および、好ましくは新鮮な乳製品、フルーツおよび／または野菜ジュース、またはフルーツピューレからなる群から選択されるそれらの混合物であり得る。
【００５１】
フルーツは、リンゴ、オレンジ、レッドベリー、イチゴ、モモ、アンズ、スモモ、ラズベリー、ブラックベリー、アカフサスグリ、レモン、グレープフルーツ、バナナ、パイナップル、キーウィー、セイヨウナシ、サクランボ、ココナツ、パッションフルーツ、マンゴー、イチジク、ルバーブ、メロン、エキゾチックフルーツ、ライチー、ブドウ、ブルーベリー、またはそれらの混合物からなる群から選択するのが有利である。
【００５２】
好ましくは、本発明による食品は新鮮な乳製品である。発酵乳製品であることが有利である。特に有利なのは、新鮮なフルーツに基づく乳製品である。
【００５３】
新鮮なフルーツに基づく乳製品に関して、ニワトコ抽出物は、フルーツ製剤による最終製品に添加されることが好ましい。Ｌ．パラカゼイ、Ｌ．カゼイ、Ｌ．ブルガリクスまたはＳ．サーモフィルス菌株は、発酵物として順に乳製品基剤中に混合される。
【００５４】
「発酵乳製品」により、それはより具体的にヒト消費用に準備された発酵乳製品、即ち、発酵乳製食品と理解されるべきである。本出願において、発酵乳およびヨーグルトはより特定して提供される。前記発酵乳製食品は、あるいは「白チーズ」または「プティ・スイス」であってもよい。
【００５５】
本明細書中で使用される、「発酵乳」および「ヨーグルト」という用語は、乳製品産業の分野におけるそれらの通常の意味、即ちヒト消費用を意図した、乳製基質の酸性乳酸発酵から生じる製品という意味を有する。これらの製品は、果物、植物、糖などの第２の成分を含むことができる。例えば、１９８８年１２月３１日にＪｏｕｒｎａｌ  Ｏｆｆｉｃｉｅｌ  ｄｅ  ｌａ  Ｒｅｐｕｂｌｉｑｕｅ  Ｆｒａｎｃａｉｓｅで公布された発酵乳およびヨーグルトに関する１９８８年１２月３０日のＦｒｅｎｃｈ  Ｏｒｄｅｒ  Ｎｏ．８８−１２０３を参照されたい。「国際食品規格（Ｃｏｄｅｘ  Ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ）」（ＦＡＯおよびＷＨＯの援助の下に国際食品規格委員会（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｏｄｅｘ  Ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ）により作成され、ＦＡＯのＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎによって公開された。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｏｄｅｘａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ．ｎｅｔでオンライン利用が可能）も参照されたい；より具体的には国際食品規格「Ｃｏｄｅｘ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ｆｏｒ  ｍｉｌｋ  ａｎｄ  ｄａｉｒｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ」の１２巻、および規格「ＣＯＤＥＸ  ＳＴＡＮ  Ａ−１１（ａ）−１９７５」を参照されたい）。
【００５６】
したがって、本出願において、「発酵乳」という用語は、低温殺菌と少なくとも同等な工程にかけられて、各製品に特徴的な種に属する微生物を接種された乳製基質で調製された乳製品を示すためにだけ使用される。「発酵乳」は、使用される乳製基質の構成要素を減ずる如何なる工程にもかけられておらず、および特に凝塊の排出にかけられていない。「発酵乳」の凝集は使用される微生物の活性から生じるもの以外の他の手段により得られるべきではない。したがって実際には、「発酵乳」という用語は、一般にヨーグルト以外の他の発酵乳を示すのに使用されて、国により、例えば、「ケフィア」、「クミス」、「ラッシー」、「ダヒ」、「レーベン」、「フィルミョルク」、「ヴィリ（Ｖｉｌｌｉ）」、「アシドフィルスミルク」と称することができる。
【００５７】
「ヨーグルト」という用語に関しては乳部分を基準にして１グラム当たり少なくとも１０００万個の細菌数が完成製品中に生きて残るはずの前記ラクトバチルス・ブルガリクスおよびストレプトコッカス・サーモフィルスに特定される好熱性乳酸菌の開発により、伝統的におよび一貫して得られる発酵乳を指して使用される。幾つかの国においては、ヨーグルトの生産における他の乳酸菌の添加、および特にビフィズス菌および／またはラクトバチルス・アシドフィルス菌株の追加使用が法規で認可されている。これらの追加の乳酸菌株は完成製品に、腸内菌叢の均衡を助長する、または免疫系を制御する性質などの種々の性質を付与することを狙っている。
【００５８】
発酵乳基質中に含有される遊離の乳酸の量は、消費者に販売される時点で１００ｇ当たり０．６ｇ未満であるべきではなく、且つ乳部分に提供されるタンパク質分含有率は通常乳のそれ未満であるべきではない。本出願における「白チーズ」または「プティ・スイス」という名は、熟成させない、無塩の、乳酸菌のみを用いて発酵させた（乳酸発酵に他ならない発酵）チーズだけを指して使用される。白チーズ中の固体含有率は、完全に乾燥させたときに、白チーズ１００ｇ当たり１５ｇ若しくは１０ｇまで、またはその脂肪含有率が２０ｇより２５％高いかどうかにより、最大で丁度２０ｇにまで下げることができる。白チーズの固体含有率は、１３％と２０％との間である。プティ・スイスの固体含有率に関しては、プティ・スイス１００ｇ当たり２３ｇ以上である。一般には２５％と３０％との間である。白チーズおよびプティ・スイスは、通常共通して、本発明の技術分野において伝統的に使用される《コテージチーズ》と称される。
【００５９】
好ましくは、新鮮な乳製品は、攪拌ヨーグルト、飲むヨーグルト、コテージチーズおよび発酵乳を含むヨーグルトから選択される。
【００６０】
本発明の意味の内で、《栄養補助食品》は通常の食事を補完することを意図し、且つ単独若しくは組合せで食餌療法のまたは生理学的効果を有する栄養分または他の物質が濃縮された供給源である食品を指す。
【００６１】
好ましくは、栄養補助食品はビタミンおよび／またはミネラルおよび／または微量元素を含むことができる。
【００６２】
これらのビタミンは、特にビタミンＡ、Ｅ、Ｃ、およびＢ群ビタミン、特にビタミンＢ６を含む。有利には、これらはビタミンＣ、ＥおよびＢ６である。
【００６３】
ビタミンＡ（レチノールまたはカルテノイド）、ビタミンＥおよびビタミンＣは、３種の主要な抗酸化性ビタミンである。実際に、これらの抗酸化性ビタミンは、過剰な産生が多くの病態、特に心血管、免疫、癌、皮膚、加齢の加速、神経変性疾患などの原因となる、酸素代謝から生じるフリーラジカルの産生を制御する能力を有する。
【００６４】
特に、ビタミンＣはよく知られた抗酸化剤であり、水に可溶である。ヒトは必要なビタミンＣ補給を外部供給源に依存している。したがって、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、またはそれらの混合物は、ビタミンＣの供給源である。
【００６５】
ビタミンＥもよく知られた抗酸化剤である。ビタミンＥは、通常の酸化剤に対して生命維持に必要な細胞機能を保護するために、ビタミンＣと相乗的に機能することができる。α−トコフェリルアセテート、トリメチル−トコフェリルアセテートおよび／またはビタミンＥスクシネートはビタミンＥの供給源である。
【００６６】
ビタミンＢは、ビタミンＢ１またはチアミン、ビタミンＢ２またはリボフラビン、ビタミンＢ３（ＰＰ）またはニコチンアミド、ビタミンＢ５またはパントテン酸、ビタミンＢ６またはピリドキシン、ビタミンＢ８（Ｈ）またはビオチン、ビタミンＢ９または葉酸、ビタミンＢ１２またはシアノコバラミンを含む水溶性ビタミン群を形成する。
【００６７】
好ましくは、ミネラルは、鉄、亜鉛、セレン、クロム、銅およびそれらの混合物から選択される。
【００６８】
亜鉛は、酸化剤に対する防御に直接関与するこれらの酵素の補助因子として抗酸化作用を有する。酸化亜鉛、グルコン酸亜鉛、クエン酸亜鉛、酢酸亜鉛、塩化亜鉛、乳酸亜鉛または硫酸亜鉛は、本発明による組成物に、単独でまたは混合物として使用することができる。グルコン酸亜鉛が好ましい。
【００６９】
セレンも、酸化剤に対する防御に直接関与するこれらの酵素（グルタチオンペルオキシダーゼなど）の補助因子として抗酸化作用を有する。
【００７０】
栄養補助食品または医薬の場合に、以下の生薬形態（ｇａｌｅｎｉｃ  ｆｏｒｍ）を考えることができる。すなわち、内服用錠剤、チュアブル錠、発泡錠、カプセル剤、トローチ剤、丸薬、散剤、顆粒剤、経口液剤または懸濁剤および舌下およびバッカルの投与形態である。好ましい生薬の形態は錠剤またはカプセル剤である。
【００７１】
固体組成物が錠剤の形態で調製されるとき、主要な有効成分は、ゼラチン、デンプン、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはアラビアゴムなどの薬剤担体と混合することができる。錠剤は、スクロース若しくは他の適当な材料で被覆することができ、または持続する若しくは遅延する作用を有するように加工して、所定量の有効成分を連続的に放出することができる。
【００７２】
カプセル製剤は、有効成分を希釈剤と混合して、生じた混合物を軟質または硬質のカプセル中に充填することにより調製される。
【００７３】
シロップ剤またはエリキシル剤の形態の製剤は、有効成分を、甘味剤、防腐剤、並びに着香剤および適当な着色剤と一緒に含むことができる。
【００７４】
水分散性散剤または顆粒剤は、有効成分を、分散剤または湿潤剤、または懸濁剤、並びに味覚矯正剤または甘味剤との混合物として含むことができる。
【００７５】
本発明の他の目的は、医薬として用いられる本発明による組成物である。
【００７６】
本発明の他の目的は、免疫を刺激しおよび／または免疫防御を増強し、および／または抗感染性および／または抗炎症応答を促進するための本発明による組成物である。
【００７７】
本発明の他の目的は、呼吸器および／または腸感染の治療および／または予防に用いられる組成物である。
【００７８】
本発明の他の目的は、特に１型単純ヘルペスウイルス、ＲＳウイルス、およびインフルエンザ（Ａおよび／またはＢおよび／またはＣ）およびパラインフルエンザウイルスによる感染により引き起こされる症状、好ましくは、特にインフルエンザ（Ａおよび／またはＢおよび／またはＣ）ウイルスにより引き起こされるインフルエンザ病態の症状の治療および／または予防に用いられる組成物である。
【００７９】
本発明による組成物は、インフルエンザウイルス（オルトミクソウイルス、インフルエンザＡ、ＢまたはＣ）による感染により引き起こされるインフルエンザ病態の症状の治療および／または予防に特に適する。これらの症状には、感冒、鼻炎、咳、鼻粘膜の炎症（鼻漏、鼻腔閉塞、くしゃみ）、咽喉炎（種々の発現：痛み、嚥下困難）、発熱、頭痛、筋痛、疲労が含まれる。
これらの《冬の病気》は、我々の免疫防御の弱体化に関連する。
【００８０】
本発明の他の目的は、食品、栄養補助食品または医薬を製造するための組成物の使用である。
【００８１】
本発明の他の目的は、呼吸器および／または腸感染の治療および／または予防を意図する医薬を製造するための組成物の使用である。
【００８２】
本発明の他の目的は、１型単純ヘルペスウイルス、ＲＳウイルスおよびインフルエンザ（Ａおよび／またはＢおよび／またはＣ）ウイルスおよびパラインフルエンザウイルスによる感染の症状、好ましくは特にインフルエンザ（Ａおよび／またはＢおよび／またはＣ）ウイルスにより引き起こされるインフルエンザ病態の症状の治療および／または予防を意図する医薬を製造するための組成物の使用である。
【００８３】
本発明の他の目的は、免疫の刺激および／または抗感染性および／または抗炎症応答の助長に用いられる医薬を製造するための組成物の使用である。
【００８４】
さらに、本発明の他の目的は、ニワトコ抽出物とＬ．パラカゼイ、Ｌ．カゼイ、Ｌ．ブルガリクスまたはＳ．サーモフィルスの少なくとも１つの菌株との組合せに基づく、経口投与を含む免疫防御を増強するための方法を提供することである。
添付図を参照して説明する：
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】ニワトコ抽出物単独により、またはＬ．パラカゼイ：ＰＢＭＣの比が４．５：１のＬ．パラカゼイとの組合せにより誘発されたＩＬ−１０の産生を示す。      図１の凡例  ／  黒丸（●）−  ニワトコ抽出物  ／  白丸（○）−  ニワトコ＋Ｌ．パラカゼイＣＮＣＭ  Ｉ−１５１８）、理論値  ／  黒菱形（◆）−  ニワトコ＋Ｌ．パラカゼイＣＮＣＭ  Ｉ−１５１８）、実験値
【図２】Ｌ．パラカゼイ単独によりまたは１０μｇ／ｍｌのニワトコ抽出物との組合せにより誘発されたＩＦＮ−γの産生を示す。                                  図２の凡例  ／  黒丸（●）−Ｌ．パラカゼイＣＮＣＭ  Ｉ−１５１８／  白丸（○）−（Ｌ．パラカゼイＣＮＣＭ  Ｉ−１５１８＋ニワトコ）、理論値  ／  黒菱形（◆）−（Ｌ．パラカゼイＣＮＣＭ  Ｉ−１５１８＋ニワトコ）、実験値
【図３】Ｌ．パラカゼイ単独によりまたは１０μｇ／ｍｌのニワトコ抽出物との組合せにより誘発されたＩＬ−６の産生を示す。                                    図３の凡例  ／  黒丸（●）−Ｌ．パラカゼイＣＮＣＭ  Ｉ−１５１８  ／  白丸（○）−（Ｌ．パラカゼイＣＮＣＭ  Ｉ−１５１８＋ニワトコ）、理論値  ／  黒菱形（◆）−（Ｌ．パラカゼイＣＮＣＭ  Ｉ−１５１８＋ニワトコ）、実験値
【図４】Ｌ．カゼイ菌株単独によりまたは１０μｇ／ｍｌのニワトコ抽出物との組合せにより誘発されたＩＬ−６の産生を示す。                                    図４の凡例  ／  黒丸（●）−  Ｌ．カゼイ／  白丸（○）−（Ｌ．カゼイ＋ニワトコ）、理論値／  黒菱形（◆）−（Ｌ．カゼイ＋ニワトコ）、実験値
【図５】Ｌ．ブルガリクス単独によりまたは１０μｇ／ｍｌのニワトコ抽出物との組合せにより誘発されたＩＬ−６の産生を示す。                                  図５の凡例  ／  黒丸（●）−Ｌ．ブルガリクスＣＮＣＭ  Ｉ−２７８７  ／  白丸（○）−（Ｌ．ブルガリクスＣＮＣＭ  Ｉ−２７８７＋ニワトコ）、理論値  ／  黒菱形（◆）−Ｌ．ブルガリクスＣＮＣＭ  Ｉ−２７８７＋ニワトコ）、実験値
【図６】Ｓ．サーモフィルス単独によりまたは１０μｇ／ｍｌのニワトコ抽出物との組合せにより誘発されたＩＬ−６の産生を示す。                                図６の凡例  ／  黒丸（●）−Ｓ．サーモフィルスＣＮＣＭ  Ｉ−２１３０  ／  白丸（○）−（Ｓ．サーモフィルスＣＮＣＭ  Ｉ−２１３０＋ニワトコ）、理論値  ／  黒菱形（◆）−（Ｓ．サーモフィルスＣＮＣＭ  Ｉ−２１３０＋ニワトコ）、実験値
【図７】Ｌ．ブレビス菌株単独によりまたは１０μｇ／ｍｌのニワトコ抽出物との組合せにより誘発されたＩＬ−６の産生を示す。                                  図７の凡例  ／  黒丸（●）−Ｌ．ブレビス  ／  白丸（○）−（Ｌ．ブレビス＋ニワトコ）、理論値  ／  黒菱形（◆）−（Ｌ．ブレビス＋ニワトコ）、実験値
【図８】担体（緑）、完全剤形（１５００ｍｇ／ｋｇ；赤）、Ｌ．パラカゼイＤＮ−１１４  ００１＋乳製品ミックス（３９３ｍｇ／ｋｇ；青）、ニワトコ果粒抽出物（２９６ｍｇ／ｋｇ；紫）またはビタミン＋ミネラル（２８２ｍｇ／ｋｇ；灰色）を投与されたマウスからのＮＫ細胞の細胞傷害活性を現す。Ｐ値：担体と完全剤形の比較。                                                                          図８の凡例  ／  黒四角−完全剤形  ／  黒三角（▲）−ビタミン＋ミネラル  ／  黒菱形（◆）−ニワトコ果粒抽出物  ／  点線（…）−  担体  ／  黒丸（●）−Ｌ．パラカゼイ＋乳製ミックス
【００８６】
本発明は、本発明による組成物の特定の実施形態である、非限的的な以下の実施例を参照することにより、よりよく理解されるであろう。
【実施例】
【００８７】
実施例１：本発明の範囲内で使用されるニワトコ抽出物の調製
ニワトコ抽出物は、アントシアンを富化したニワトコ果粒ジュースから得て、マルトデキストリンに加えて乾燥する。富化は下記の方法による膜濾過工程を使用して実施した：２６リットルの清澄化されたニワトコジュースを２８４リットルの水（１容量のジュース当たり１１容量の水）で希釈する。生じた３１０リットルを攪拌して４５℃に加熱し、次にジュース１容量当たり７容量の水（即ち１８１Ｌ）を添加しながら第１の５ｋＤａ膜で透析濾過する。続いて透析透過液を限外濾過により５ｋＤａ膜（５．８ｍ２の単位表面積を有する５／１０ｋＤのパイロット膜）で濃縮する。限外濾過濃縮水を真空下に５０℃を超えない温度で加熱濃縮し、次にマルトデキストリン支持体にマルトデキストリンの量が３０％（ｗ／ｗ）以下になるように加えて微細化する。生じる抽出物の特性は：
アントシアン含有率：抽出物の固体含有率を基準にして１０〜１４重量％（Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ  ２００４、５２、７８４６−７８５６）に記載されたＨＰＬＣ法によりシアニジン−３−グルコシドとして表される）
タンパク質含有率：抽出物の固体含有率を基準にして５〜７重量％（ケルダール法によるＮ×６．２５）。
【００８８】
実施例２：末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるニワトコ抽出物と組み合わせたＬ．パラカゼイ菌株ＣＮＣＭ  Ｉ−１５１８の免疫調節剤効果のインビトロの検討
【００８９】
材料および方法
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、健常被験者から単離して再懸濁し、２４ウェルのプレート中に０．５×ｌ０６細胞／ウェルで分配する。これらのＰＢＭＣを、種々の濃度のニワトコ抽出物（３、１０、３０、１００μｇ／ｍｌのＰＢＭＣ細胞培養上清）と共に、ある量のＬ．パラカゼイ（ＰＢＭＣ１細胞当たり４．５細胞のＬ．パラカゼイ）を存在させ若しくは存在させずに、またはこれとは別に異なるＬ．パラカゼイ：ＰＢＭＣ比（０．５：１、１：１、２：１、４．５：１）でニワトコ抽出物を１０μｇ／ｍｌ（ＰＢＭＣ細胞培養上清）で存在させ若しくは存在させずにのいずれかで、終夜３７℃でインキュベートする。
【００９０】
使用されるニワトコ抽出物は実施例１により調製した。
【００９１】
培養上清はサイトカイン（ＩＬ−１０およびＩＦＮ−γ）をフローサイトメトリーにより測定するために回収した。
【００９２】
この組合せにおいて、組み合わされたニワトコとＬ．パラカゼイとは同じ測定単位を有さず、即ちそれぞれμｇ／ｍｌでの濃度および細菌：ＰＢＭＣの数の比である。
【００９３】
ニワトコ抽出物＋Ｌ．パラカゼイの組合せが相乗効果を生じるかを決定するために、本発明者らは、Ｅｔｉｅｖａｎｔ  Ｃ、Ｋｒｕｃｚｙｎｓｋｉ  Ａ、Ｂａｒｒｅｔ  Ｊ  Ｍらの報告《Ｆ  １１７８２，  ａ  ｄｕａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｏｒｉｇｉｎａｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ，  ａｎｄ  ｍａｒｋｅｄｌｙ  ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｔｉｔｕｍｏｕｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｔｏ  ｔｈｒｅｅ  ｏｔｈｅｒ  ｄｕａｌ  ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，  ｉｎｔｏｐｌｉｃｉｎ，  ａｃｌａｒｕｂｉｃｉｎ  ａｎｄ  ＴＡＳ−１０３》Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０００；４６：１０１−１１３に記載された方法を使用した。
【００９４】
この報告は、理論曲線のプロットと比較して実験結果の比較および解釈を教示する。
【００９５】
解釈は１つの化合物についての可変実験データ（例えば、増大するニワトコ抽出物濃度）および第２の化合物についての固定した実験データ（例えば細菌：ＰＢＭＣ数の固定した比）に基づく。
【００９６】
図１中の理論曲線は、比を４．５：１に固定したＬ．パラカゼイ：ＰＢＭＣと組み合わせたある範囲のニワトコ抽出物用量により誘発されたＩＬ−１０の産生を示し、ニワトコ単独に対する曲線の各実験の点（●）に、比が４．５：１のＬ．パラカゼイ：ＰＢＭＣの寄与を加えることによりプロットされた。実験的に決定されたこの寄与は、２．４ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１０である。
【００９７】
図１についてのデータの表
【表１】
0005558475.tif 000002
【００９８】
図２中の理論曲線は、１０μｇ／ｍｌに固定された濃度のニワトコ抽出物と組み合わされたある範囲のＬ．パラカゼイ用量により誘発されたＩＦＮ−γの産生を示し、Ｌ．パラカゼイ単独に対する曲線の各実験点（●）に、１０μｇ／ｍｌのニワトコ抽出物の寄与を加えることによりプロットされた。実験的に決定されたこの寄与は、５ｐｇ／ｍｌのＩＦＮ−γである。
【００９９】
図２についてのデータの表
【表２】
0005558475.tif 000003
【０１００】
結果
図１および２は得られた結果を示す：
−  図１は、単独のまたは４．５：１の比のＬ．パラカゼイ：ＰＢＭＣと組み合わせたニワトコ抽出物により誘発されたＩＬ−１０産生を示す。
−  図２は、単独のまたは１０μｇ／ｍｌのニワトコ抽出物と組み合わせたＬ．パラカゼイより誘発されたＩＦＮ−γ産生を示す。
【０１０１】
単独のまたは特定の比（４．５：１）のＬ．パラカゼイ：ＰＢＭＣと組み合わせたニワトコ抽出物により誘発された非特異的免疫応答に対する効果を検討した。
【０１０２】
４．５：１の比のＬ．パラカゼイ：ＰＢＭＣで得られたサイトカイン濃度は２．４ｐｇ／ｍｌである。
【０１０３】
実験的に得られた結果と理論曲線値との比較は、Ｌ．パラカゼイがニワトコ抽出物単独の効果を増強することを示す。すなわちこの組合せは、２つの効果（一方はニワトコ抽出物および他方はＬ．パラカゼイ）の合計よりもはるかに高いＩＬ−１０産生を生じる。
【０１０４】
本発明者らは、種々の比のＬ．パラカゼイ：ＰＢＭＣのγ−インターフェロン産生に対する効果も、単独でまたは固定された濃度（１０μｇ／ｍｌ）のニワトコ抽出物との組合せで検討した。
【０１０５】
１０μｇ／ｍｌの濃度のニワトコ抽出物で得られたサイトカイン濃度は５ｐｇ／ｍｌである。
【０１０６】
得られた種々の曲線の比較はニワトコ抽出物がＬ．パラカゼイの効果を増強することを示す。すなわち、この組合せは、２つの効果（一方はニワトコ抽出物および他方はＬ．パラカゼイ）の合計よりもはるかに高いＩＦＮ−γ産生を生じる。
【０１０７】
結論：
ニワトコ抽出物とＬ．パラカゼイＣＮＣＭ  Ｉ−１５１８（ＤＮ−１１４  ００１）とは非特異的免疫応答に対して相乗的に作用し、したがってヒト免疫系細胞を感染性侵襲または病的炎症性過程に対して、より反応しやすくする。
【０１０８】
実施例３：菌株特異性のインビトロの検討
材料および方法
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は健常被験者から単離し、再懸濁して２４ウェルプレート中に０．５×ｌ０６細胞／ウェルで分配した。これらのＰＢＭＣを、異なった菌株：ＰＢＭＣ比（０．５：１、１：１、２：１、４．５：１）で、ニワトコ抽出物を１０μｇ／ｍｌ（ＰＢＭＣ細胞培養上清）で存在させまたは存在させずに、終夜３７℃でインキュベートする。
【０１０９】
使用したニワトコ抽出物は実施例１により調製した。５つの菌株をこのインビトロの検討のために試験した：即ちラクトバチルス・パラカゼイ（ＣＮＣＭ  Ｉ−１５１８）菌株、ラクトバチルス・カゼイ菌株、ラクトバチルス・ブルガリクス（ＣＮＣＭ  Ｉ−２７８７）菌株、ストレプトコッカス・サーモフィルス（ＣＮＣＭ  Ｉ−２１３０）菌株およびラクトバチルス・ブレビス菌株である。
【０１１０】
培養上清を、ＥＬＩＳＡによりサイトカインＩＬ−６を測定するために回収した。
ニワトコ抽出物／菌株の組合せが相乗効果を生じるかを決定するために、Ｅｔｉｅｖａｎｔ  Ｃ．らの報告（上記を参照されたい）に記載された方法を使用した。この報告は、理論曲線のプロットと比較して実験結果の比較および解釈を教示する。
【０１１１】
解釈は、増加する数の細菌：ＰＢＭＣ比についての可変実験データとニワトコ抽出物濃度について固定された実験データとに基づく。
【０１１２】
図３〜７中の理論曲線は、１０μｇ／ｍｌに固定された濃度のニワトコ抽出物との組合せで、ある範囲の菌株用量により誘発されたＩＬ−６の産生を示し、菌株単独についての曲線の各実験の点（●）に１０μｇ／ｍｌのニワトコ抽出物の寄与を加えることによりプロットされた。この寄与は各実験について実験的に決定した。
【０１１３】
結果
図３から７は得られた結果を示す：
−  図３は、Ｌ．パラカゼイ単独または１０μｇ／ｍｌのニワトコ抽出物との組合せにより誘発されたＩＬ−６の産生（１０μｇ／ｍｌの濃度のニワトコ抽出物で得られたサイトカイン濃度は７．７ｎｇ／ｍｌである）を表し；
−  図４は、Ｌ．カゼイ単独または１０μｇ／ｍｌのニワトコ抽出物との組合せにより誘発されたＩＬ−６の産生（１０μｇ／ｍｌの濃度のニワトコ抽出物で得られたサイトカイン濃度は２．２ｎｇ／ｍｌである）を表し；
−  図５は、Ｌ．ブルガリクス単独または１０μｇ／ｍｌのニワトコ抽出物との組合せにより誘発されたＩＬ−６の産生（１０μｇ／ｍｌの濃度のニワトコ抽出物で得られたサイトカイン濃度は２．０ｎｇ／ｍｌである）を表し；
−  図６は、Ｓ．サーモフィルス単独または１０μｇ／ｍｌのニワトコ抽出物との組合せにより誘発されたＩＬ−６の産生（１０μｇ／ｍｌの濃度のニワトコ抽出物で得られたサイトカイン濃度は２．４ｎｇ／ｍｌである）を表し；
−  図７は、Ｌ．ブレビス単独または１０μｇ／ｍｌのニワトコ抽出物との組合せにより誘発されたＩＬ−６の産生（１０μｇ／ｍｌの濃度のニワトコ抽出物で得られたサイトカイン濃度は６．０ｎｇ／ｍｌである）を表す。
【０１１４】
固定されたニワトコ抽出物濃度（１０μｇ／ｍｌ）と組み合わせないかまたは組み合わせた、種々の菌株：ＰＢＭＣ比のＩＬ−６産生に対する効果を、５種の異なった菌株について検討した。
【０１１５】
Ｌ．パラカゼイを用いて実施した実験（図３）は、ニワトコ抽出物がＬ．パラカゼイの効果を増強することを確証する。すなわち、この組合せは２つの効果（一方はＬ．パラカゼイおよび他方はニワトコ抽出物）の合計よりもはるかに高いＩＬ−６産生を生じる。
【０１１６】
このタイプの相乗効果は、Ｌ．カゼイ、Ｌ．ブルガリクス、またはＳ．サーモフィルスについても観察されたが、Ｌ．ブレビスについては観察されず、相乗的効果は菌株特異的であることを示した。
【０１１７】
結論：
ニワトコ抽出物とＬ．パラカゼイとは非特異的免疫応答に対して相乗的に作用し、したがってヒト免疫系細胞を感染性侵襲または病的炎症性過程に対して、より反応しやすくすることが確認された。
【０１１８】
さらに相乗的効果は菌株特異的であることが観察された。ニワトコ抽出物とＬ．カゼイ、Ｌ．ブルガリクスまたはＳ．サーモフィルスとは、非特異的免疫応答に対して相乗的に作用する。
【０１１９】
反対に、ニワトコ抽出物とＬ．ブレビスとの関係について相乗効果は観察されなかった。したがって、この菌株は他の研究のために陰性対照として役立ち得る。
【０１２０】
実施例４：完全剤形を投与されるマウスの脾細胞の細胞傷害活性のインビボにおける検討
序
実施例２および３で示したように、ニワトコ果粒抽出物およびＬ．パラカゼイＤＮ−１１４  ００１などのプロバイオティクスはインビトロにおいて、増大したサイトカイン産生を生じるように相乗的に作用する。この検討の目的は免疫機能に対する完全剤形のインビボでの効果を評価して、その活性を各成分群：
− Ｌ．パラカゼイ＋乳製ミックス；
− ニワトコ果粒抽出物；
− ビタミンおよび無機塩のミックス＝ビタミン＋ミネラル；
と比較することであった。
【０１２１】
使用したニワトコ抽出物は実施例１により調製した。
完全剤形は以下の成分の組合せ、すなわちＬ．パラカゼイ＋乳製品ミックス、ニワトコ果粒抽出物、ビタミンと無機塩と賦形剤とのミックスである。成分の３群の各成分についての投与量は、完全剤形中に存在する成分の対応する量に等しい。
【０１２２】
この目的のために、本発明者らはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の機能をモニターすることを選定する。実際に、ＮＫ細胞を含む生来の免疫応答は、呼吸器ウイルスに対する宿主の防御にとって決定的に重要である。ＮＫ細胞は、細胞傷害性機能を示すことにより、ある種のウイルス、寄生虫、および微生物病原体に対する免疫応答の初期相において重要な役割を演ずる（３）、他と全く別なリンパ球亜集団を現す。その上、適応性の免疫応答の性質に影響することにおいてＮＫ細胞が重要な機能を有するという証拠が増加している（１；２）。
【０１２３】
材料および方法
動物および処置
７週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスを、５群の１群に無作為に割り当てた：
第１群→担体（滅菌水）
第２群→完全剤形（１５００ｍｇ／ｋｇ）
第３群→Ｌ．パラカゼイＤＮ−１１４  ００１＋乳製品ミックス（３９３ｍｇ／ｋｇ）
第４群→ニワトコ果粒抽出物（２９６ｍｇ／ｋｇ）
第５群→ビタミン＋ミネラル（２８２ｍｇ／ｋｇ）
【０１２４】
第０日、第１日および第２日に、１０ｍｌ／ｋｇの試験製品を経口的に処置した。第９日に、マウスを屠殺して脾臓を取り出した。
【０１２５】
細胞傷害性アッセイ
標的に対する細胞溶解活性はＣｙｔｏＴｏｘ  ９６非放射性細胞傷害性アッセイを使用して決定した。脾細胞をマウスから捕集して、ＹＡＣ−１細胞（マウスＴリンパ腫細胞ライン）を標的細胞として、適当なエフェクター対標的細胞の計数比で、９６ウェルＶ底プレート中で共培養した。３７℃で４時間インキュベートした後、放出された乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の量を上清中で測定した。放出されたＬＤＨ量はＬＤＨ基質を使用して測定し、４９０ｎｍで評価した。各マウスについて、３通りのエフェクター／標的比（１００：１、５０：１、および２５：１）における平均のＮＫの細胞傷害性（％）を以下の式を使用して決定した：
［Ａ４９０実験放出−（Ａ４９０エフェクター細胞自発放出＋Ａ４９０標的細胞自発放出）×１００］／（Ａ４９０標的細胞最大放出−Ａ４９０標的細胞自発放出）。
【０１２６】
統計分析
統計分析はＷｉｎｄｏｗｓ用のＳｉｇｍａＳｔａｔ３．５パッケージを使用して実施した。結果は一元配置分散分析を用いて、続いてＨｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法を使用する多重比較群（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｇｒｏｕｐ）により評価した。前例において、Ｐ＜０．０５で統計的に有意と見なした。
【０１２７】
結果
完全剤形または各成分を投与されたマウスの脾細胞の細胞傷害活性を研究した。完全剤形で免役されたマウスの脾細胞は、担体（水）を投与されたマウスに比較して、ＹＡＣ−１標的細胞に対して有意に増大した細胞傷害活性を発揮した（図８）。対照的に、個々の成分で免役されたマウスは、ＹＡＣ−１標的細胞に対する細胞傷害活性を増大することはなかった。
【０１２８】
結論
これらのデータは、ＮＫ細胞の活性化に対して個々では効率の悪い成分の組合せが、適当な量で組み合わされると十分有効になることを明確に示す。
【０１２９】
参考文献
１．Ｄｉ  Ｓａｎｔｏ，  Ｊ．Ｐ．  Ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｐａｔｈｗａｙｓ：  ａ  ｑｕｅｓｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｌａｎｃｅ．  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２４，  ２５７−２８６  （２００６）
２．Ｖｉｖｉｅｒ，  Ｅ．，  Ｔｏｍａｓｅｌｌｏ，  Ｅ．，  Ｂａｒａｔｉｎ，  Ｍ．，  Ｗａｌｚｅｒ，  Ｔ．  ＆  Ｕｇｏｌｉｎｉ，  Ｓ．  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ９，  ５０３−５１０  （２００８）
３．Ｌｏｄｏｅｎ，  Ｍ．  Ｂ．  ＆  Ｌａｎｉｅｒ，  Ｌ．Ｌ．  Ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ａｎ  ｉｎｉｔｉａｌ  ｄｅｆｅｎｓｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ．  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １８，  ３９１−３９８  （２００６）
【０１３０】
実施例５：栄養補助食品
如何なるタイプの栄養補助食品も考慮に入れることができた。例として、単位用量は１ｇのカプセルまたは２ｇの錠剤にすることができた。一般的組成物は以下の通りである：
ニワトコ固体（実施例１による）                                ３０％
Ｌ．パラカゼイＤＮ−１１４  ００１を含む発酵乳粉末            ４０％
ビタミンミックス（ビタミンＣ、ＥおよびＢ６）            ２４〜２７％
グルコン酸亜鉛（亜鉛）                                      ２〜５％
セレン酸ナトリウム（セレン）                        ０．１〜０．５％
それ故、調製工程の終了時の錠剤またはカプセルのＬ．パラカゼイＤＮ−１１４  ００１の個体数は、２×１０１０ＣＦＵである。
【０１３１】
この栄養補助食品は、当業者によく知られた方法により作製される。例として錠剤またはカプセルを得るために、特に、Ｌ．パラカゼイ菌株とニワトコ抽出物とは、互いに独立に組成物に添加される。
【０１３２】
実施例６：発酵乳製品
単位用量は１００ｍｌの発酵乳製品に相当する。しかしながら、例えば、１００ｇのＡｃｔｉｍｅｌ（登録商標）は、考慮されるレシピが低カロリーかまたは標準かに依存して９４〜９７ｍｌの製品に相当することは注意すべきである。
【０１３３】
発酵乳製品は（重量％で）：
−  Ｌ．パラカゼイＤＮ−１１４  ００１菌株（ＣＮＣＭ  Ｉ−１５１８）（Ａｃｔｉｍｅｌ（登録商標）タイプの製品）により、およびラクトバチルス・ブルガリクスおよびストレプトコッカス・サーモフィルスの市販の菌株により発酵した９５％の乳製品；
−  実施例１に記載したような濃縮されたニワトコ抽出物ジュースを５％含有する、５％の伝統的な赤色フルーツ製剤；
を含有する。
【０１３４】
発酵乳製品の固体含有率は、乾燥前で約１７％である。
【０１３５】
発酵乳製品の組成（標準成分、重量％）：
−  標準的スキムミルク７７％（乳タンパク質３．６４％）
−  低温殺菌されたクリーム９．６％
−  濃縮されたスキムミルク５．７％ 
−  スキムミルクタンパク質０．６％
−  スクロース６．６％
−  デキストロ−ス（Ｃａｒｇｉｌｌ）０．５％
−  ＤＮ−１１４  ００１（ＣＮＣＭ  Ｉ−１５１８）発酵物：１０８〜１０９ＣＦＵ／ｍｌ
−  全体的に１０７ＣＦＵ／ｍｌから１０８ＣＦＵ／ｍｌの個体数のＬ．ブルガリクスおよびＳ．サーモフィルスの数種の市販の菌株からなる発酵物。
【０１３６】
ニワトコ抽出物の濃縮ジュースで補完された伝統的なフルーツ製剤は、熱処理後に発酵乳製品に添加される。
【０１３７】
完成製品の特性：
この製品１００ｇ当たり２５０ｍｇのニワトコ固体、即ち単位用量に対して、単位用量の固体重量を基準にして１．４７重量％のニワトコ固体である。
【０１３８】
アントシアン含有率：２５ｍｇ／１００ｇ、即ち単位用量に対して、単位用量の固体重量を基準にして０．１４７重量％のアントシアンである。
Ｌ．パラカゼイ個体数：１００ｍｌの発酵製品に対して１０８ＣＦＵ／ｍｌである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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