(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞、多能性幹細胞由来の心筋細胞以外の細胞、及び多能性幹細胞由来心筋細胞を含む細胞集団を、糖類、グリコサミノグリカン類、アミノグリコシド類、糖アルコール類、およびベタイン類から選択される糖質（炭水化物）を添加することにより調製された370 mOsm/kg以上の浸透圧を有する高張液で培養することにより、多能性幹細胞及び多能性幹細胞由来の心筋細胞以外の細胞を細胞死に導く方法。
【請求項２】
糖質が、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、グリセロール、スクロース、グルコース及びトリメチルグリシンからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
高張液での培養を2時間以上行う、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
370 mOsm/kg以上の浸透圧を有する高張液が、0.1〜1 Mの糖質を含有するものである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
370 mOsm/kg以上の浸透圧を有する高張液が、0.1〜0.6 Mのグリセロールを含有するものである、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
培養を10時間以上行う、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
細胞集団を高張液で培養した後、200〜300 mOsm/kgの通常浸透圧を有する培養液に戻して更に培養する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胚性幹細胞や誘導性多能性幹細胞等の多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する際の心筋細胞の精製に関する手段として、多能性幹細胞及び多能性幹細胞由来の心筋細胞以外の分化細胞に細胞死を誘導する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
成体における心筋細胞は増殖活性を喪失しており、重症な心筋梗塞、心筋症などの疾患を治療するためには、心臓移植に頼らざるを得ない。しかし、現状では心臓のドナー不足の問題を克服するには至っておらず、心臓移植以外の治療方法を見出すことが急務である。これに対して、心筋細胞を体外で作製・精製し、疾患治療の際の心筋細胞の補充に充てることは、心臓移植に頼らなくてはならない心臓疾患の患者を救済するための最も有望な方法と予想されている。【０００３】
心筋細胞を得るための方法としては、幹細胞（例えば、胚性幹細胞や種々の成体幹細胞）を分化させて用いる方法、胎児から取得する方法などが知られている。例えば、マウスの多能性幹細胞を使用する場合には分化を抑制する因子（フィーダー細胞、白血病抑制因子（ＬＩＦ）など）を、ヒトの多能性幹細胞の場合には分化を抑制する因子（フィーダー細胞、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）など）を培養液から除き、それによって細胞塊（胚様体）を形成させることによって、積極的に心筋細胞への分化を惹起することが出来ることが、幹細胞を分化させる方法として知られている。【０００４】
体外における幹細胞から心筋細胞への分化の様式は、生体内での生理的な発生段階を一部踏襲しており、特に発生初期のイベントに関して、受精卵細胞で生じる生理的発生とｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化の様式との間には共通点が多い。体外での心筋細胞への分化の系譜は、生理的発生と同じく、先ず幹細胞が未分化な中胚葉細胞へと分化し、その一部が予定心筋細胞（前心臓中胚葉）へと分化した後、心筋細胞へと分化する。【０００５】
多能性幹細胞は臓器を構成する全ての細胞に分化する能力を有する細胞であるため、心筋細胞のみに分化させることは技術的に困難である。一方で、全ての多能性幹細胞を一斉に分化段階に誘導することも非常に困難であるため、胚様体の中には、未分化な幹細胞が残存することが非常に多い。【０００６】
このように、体外において幹細胞から心筋細胞への分化を誘導する場合、全ての幹細胞の場合において、心筋細胞以外の細胞を副産物として産生してしまうことや未分化な細胞を残存させるという臨床応用に対して有害な性質が残ってしまう。特に、残存してしまう未分化な細胞は、増殖活性を有しかつ多種類の細胞に分化できることから、治療に際して生体に移植された細胞の中に未分化な細胞が残存すれば、この未分化な細胞から奇形腫が形成される危険性がきわめて高い。このような理由から、多能性幹細胞に分化誘導を行って作製された心筋細胞を含有する細胞集団を、そのまま生体に移植し治療に用いることは困難である。従って、多能性幹細胞由来の心筋細胞を用いた治療を安全に実行し、理想的な治療効効果を得るために、未分化の多能性幹細胞を完全に排除し、かつ高度に心筋細胞を精製する方法（即ち、心筋細胞以外の細胞を除去する方法）を見出すことが必要である。【０００７】
現在、心筋細胞を精製することは、あらかじめ幹細胞の遺伝子（ゲノム）に何らかのマーカー遺伝子（例えばＧＦＰ）の導入を行う方法が知られている（非特許文献１）。しかしながら、この様な方法ではゲノムを改変することが必要になり、それ自体に倫理的な問題を持つ上、細胞ガン化率の変化等、安全性に関して予測不可能な重大リスクを伴う（非特許文献２）。未分化な多能性幹細胞を積極的に除去する方法としても、遺伝子改変を用いる方法が報告されている（非特許文献３）。これに対して、細胞死誘導作用を持つことが知られているセラミド類を用いて、胚性幹細胞に比較的特異的に細胞死を誘導する方法が報告されている（非特許文献４）。しかしながら、この方法ではセラミド類で処理後、培養を行った細胞群における多能性幹細胞（ＯＣＴ陽性細胞）が未処理（コントロール）の場合の１／３にも相当する多能性幹細胞が残ってしまい、十分な除去方法ではない。また、ヒト胚性幹細胞の除去についてもアポトーシスを起こした細胞が見出されるとの記載があるだけで十分な除去が行なわれたとの記載はない。また、細胞毒性のある抗体を用いた方法が報告されているが（非特許文献５）、当該方法では、抗体処理後でも２０％前後の胚性幹細胞が残存することが記載されている。更に抗体の治療的な処理に関しては抗原性の回避など、当該方法の利用に際して制約がある。よって、細胞死を誘導する公知の方法では、心筋疾患の治療に用いうる心筋細胞の精製方法としては改善されるべき余地があり、更に効率の良い新たな細胞死誘導法が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｍｕｌｌｅｒ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２０００；１４：２５４０−２５４８
【非特許文献２】Ｓｃｈｒｏｄｅｒ  ＡＲ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２００２；１１０：５２１−５２９
【非特許文献３】Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００３；２１，２５７−２６５
【非特許文献４】Ｂｉｅｂｅｒｉｃｈ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００４；１６７：７２３−７３４
【非特許文献５】ＣＨＯＯ  ＡＢ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００８；２６：１４５４−１４６３．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、遺伝子改変を行うことなく、胚性幹細胞や誘導性多能性幹細胞等の多能性幹細胞、及び多能性幹細胞由来の心筋細胞以外の分化細胞には細胞死を誘導するが、心筋細胞に対しては細胞死を誘導しない方法を開発することを課題とする。本発明はまた、このような方法により、奇形腫の危険性の無い安全で高純度な心筋細胞を多能性幹細胞から作製する方法を開発することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、鋭意研究を行った結果、物質的な毒性や細胞死誘導作用が認められていない物質を多能性幹細胞や非心筋細胞の培養条件に対して添加することにより、短時間で、かつ非常に効率的に心筋細胞以外の分化細胞に対して細胞死を誘導する方法を構築することにより、遺伝子改変によることなく、上記の課題を解決することができることを明らかにした。この方法は、心筋細胞に対しては細胞死を誘導しないことから、効率的な心筋細胞精製方法でもある。【００１１】
具体的には、本発明は、多能性幹細胞、多能性幹細胞由来の心筋細胞以外の分化細胞、及び多能性幹細胞由来心筋細胞を含む細胞集団を、３７０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上の浸透圧を有する高張液で培養することにより、多能性幹細胞及び多能性幹細胞由来の心筋細胞以外の分化細胞を細胞死に導く方法を提供することにより、上述した課題を解決することができることを明らかにした。即ち、本願発明は具体的には以下の事項に関する。
（１）多能性幹細胞、多能性幹細胞由来の心筋細胞以外の細胞、及び多能性幹細胞由来心筋細胞を含む細胞集団を、３７０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上の浸透圧を有する高張液で培養することにより、多能性幹細胞及び多能性幹細胞由来の心筋細胞以外の細胞を細胞死に導く方法。
（２）高張液での培養を２時間以上行う、上記（１）に記載の方法。
（３）３７０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上の浸透圧を有する高張液が、培養液に対して糖質（炭水化物）を添加することにより調製されたものである、上記（１）又は（２）に記載の方法。
（４）３７０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上の浸透圧を有する高張液が、０．１〜１Ｍの糖質を含有するものである、上記（３）に記載の方法。
（５）糖質が、糖アルコール類、糖類、又はベタイン類である、上記（３）又は（４）に記載の方法。
（６）糖アルコール類、糖類、又はベタイン類が、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、グリセロール、スクロース、グルコース及びトリメチルグリシンからなる群から選択される、上記（５）に記載の方法。
（７）３７０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上の浸透圧を有する高張液が、０．１〜０．６Ｍのグリセロールを含有するものである、上記（４）に記載の方法。
（８）培養を１０時間以上行う、上記（７）に記載の方法。
（９）細胞集団を高張液で培養した後、２００〜３００ｍＯｓｍ／ｋｇの通常浸透圧を有する培養液に戻して更に培養する、上記（１）〜（８）のいずれか１項に記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法により多能性幹細胞、多能性幹細胞由来の心筋細胞以外の分化細胞、及び多能性幹細胞由来心筋細胞を含む細胞集団を処理することにより、細胞集団中の未分化の多能性幹細胞及び非心筋細胞を効率的に除去することができると同時に、心筋細胞のみが生存することができることから心筋細胞を効率的に濃縮・精製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
図１は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）由来心筋細胞と残存する未分化胚性幹細胞の免疫染色を示す。
図２は、胚性幹細胞由来心筋細胞と、残存する胚性幹細胞が混入した培養系におけるマンニトール処理を示す。
図３は、マンニトール処理後の細胞におけるＮｋｘ２．５及びＯｃｔ−３／４に対する免疫染色を示す。
図４は、マウス胚性幹細胞に対する、マンニトール０．４５Ｍの細胞死誘導作用を示す。
図５は、マーモセット胚性幹細胞に対するマンニトールの作用を示す。ミトコンドリア膜電位感受性色素ＴＭＲＭを用いて生死判定を行った。
図６は、マーモセット胚性幹細胞に対するマンニトールの効果を示す。
図７は、ヒト胚性幹細胞に対するマンニトールの作用（ＦＡＣＳ解析）を示す。
図８は、ヒト胚性幹細胞に対するマンニトールの効果（直後）を示す。
図９は、ヒト胚性幹細胞に対するマンニトールの効果（５時間後）を示す。
図１０は、は、ヒト胚性幹細胞胚様体のマンニトール処理を示す。
図１１は、ヒト胚性幹細胞細胞胚様体のマンニトール処理による、Ｏｃｔ−３／４陽性細胞の死滅を示す。
図１２は、ヒト誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）に対するマンニトールの作用（ＦＡＣＳ解析）を示す。
図１３は、マンニトール以外の種々の糖質における、ヒト胚性幹細胞に対する細胞死誘導作用を示す。
図１４は、ヒト胚性幹細胞由来心筋・非心筋細胞に対するグリセロールの作用を示す。
図１５は、０．２Ｍマンニトールを含有する培養液で、４８時間または７２時間処理した細胞の状態を示す。下段にそれぞれのコロニーの拡大像を示し、代表的な細胞形態を図示した。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明者らは、胚性幹細胞や心筋細胞、非心筋細胞を含む混合細胞系に対して、高濃度のマンニトールを溶解した高張液を用いたところ、高張液に曝露することで胚性幹細胞及び非心筋細胞が細胞死を起こしやすいという事実を見出した。この知見に関して、更に詳細にマンニトール濃度やマンニトールへの曝露時間と胚性幹細胞及び非心筋細胞の細胞死における関係を検討した結果、低濃度のマンニトールでは長時間の曝露が効果的に胚性幹細胞及び非心筋細胞に細胞死を誘導し、ほぼ飽和濃度である１Ｍでは、短時間に胚性幹細胞の細胞死を誘導することが分かった。
【００１５】
同時に、全ての濃度において、胚性幹細胞及び非心筋細胞が細胞死を起こす濃度・時間でありながら胚性幹細胞から分化した心筋細胞に細胞死を誘導しない条件が存在することが分かった。よって、そのような条件のもとで培養を行う本発明の方法は、効率的な胚性幹細胞及び非心筋細胞の除去方法であると同時に、効率的な心筋細胞の濃縮精製方法である。
【００１６】
従って、本発明は一態様において、未分化の多能性幹細胞、多能性幹細胞由来の心筋細胞以外の分化細胞、及び多能性幹細胞由来心筋細胞を含む細胞集団を、３７０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上の浸透圧を有する高張液で培養することにより、多能性幹細胞及び多能性幹細胞由来の心筋細胞以外の分化細胞を細胞死に導く方法を提供する。
【００１７】
マウス胚性幹細胞に対して、胚様体形成法を用いて分化誘導を行う場合、分化誘導開始後３〜６日の胚様体には中胚葉ないし予定心筋細胞が含まれると言われる。また、心筋細胞が出現するのは、分化開始後７日目（ヒトの胚性幹細胞では、１０日目）である。胚様体には、上記の他に未分化細胞、内皮上皮様細胞、神経細胞などが含まれる。胚様体を構成する細胞をより詳細に検討すると、胚様体を構成する細胞集団の内、７〜８割が心筋細胞以外の分化細胞であり、その中には未分化な胚性幹細胞が含まれることがある。これらの夾雑細胞は盛んに増殖し、時間経過とともにその存在する割合が増加する。本発明者らは、このような細胞構成を有する胚様体を、培養液中で適切な範囲の高浸透圧に曝露することにより、胚様体中に残存する胚性幹細胞や心筋細胞以外の分化細胞が細胞死を起こすことを見出した。本発明者らはまた、この条件下で培養する場合においても、心筋細胞は細胞死を呈することは無く、生理的浸透圧の培養液に置換することで、自律拍動を再開することを見いだした。
【００１８】
本発明の方法において、細胞の供給源としては心筋細胞が含まれる細胞集団であればどのような供給源由来の細胞集団であってもよく、例えば、多能性幹細胞（胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、生体幹細胞、誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などが含まれる）から公知の心筋細胞誘導条件を使用して分化させた心筋細胞を含む細胞集団、胎児組織由来の細胞集団を使用して、本発明の方法を実施することができる。このようにして多能性幹細胞から分化させた心筋細胞を含む細胞集団には、多能性幹細胞由来心筋細胞の他に、多能性幹細胞、多能性幹細胞由来の心筋細胞以外の分化細胞が含まれてもよい。
【００１９】
本発明の方法は、かかる細胞集団を、３７０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上の浸透圧を有する高張液で培養することを特徴とする。本発明の方法において使用する浸透圧は、心筋細胞以外の細胞（多能性幹細胞及び心筋細胞以外の分化細胞）には細胞死を誘導するが、心筋細胞に対しては細胞死を誘導しない浸透圧である。このような浸透圧としては、３７０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上、好ましくは３７０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜１６００ｍＯｓｍ／ｋｇ、より好ましくは３７０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜１０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、更に好ましくは４８０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜１０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、最も好ましくは７００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜１０００ｍＯｓｍ／ｋｇである。通常、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける培養条件下における浸透圧が、２００〜３００ｍＯｓｍ／ｋｇ程度であること（通常の浸透圧または生理学的浸透圧ともいう）と比較すると、これらの値は非常に高い値であり、この条件下で培養する場合に心筋細胞以外の細胞は死滅する。
【００２０】
培養液に対して糖質を添加することにより作製された３７０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上の浸透圧を有する高張液を使用する場合、本発明の方法は、かかる高張液中での培養を２時間以上、好ましくは２〜７２時間、より好ましくは２〜４８時間、更に好ましくは２〜２４時間、最も好ましくは４〜１２時間行うことを特徴とする。
【００２１】
本発明の方法において、ヒトＥＳ細胞やｉＰＳ細胞を含めた未分化な多能性幹細胞、又は心筋細胞以外の分化細胞にのみ細胞死を誘導することができる条件は、高張液の浸透圧の程度と、細胞の高張液への曝露時間との関係によって決定される。即ち、心筋細胞を誘導するために使用される細胞種に関わらず、高張液の浸透圧が高ければ高いほど細胞の高張液への曝露時間は短くてよく、一方、高張液の浸透圧を低く設定すればそれだけ細胞の高張液への曝露時間を長くすることが必要になる。
【００２２】
本発明の方法において高張液中に細胞集団を曝露すると、心筋細胞以外の細胞（未分化の多能性幹細胞又は非心筋細胞）を細胞死に導く（即ち、細胞死を誘導するか、細胞死のシグナルを与える）ことができる。このように細胞死に導かれた細胞は、高張液中で細胞死を起こすか、あるいは高張液から通常の培養液に戻された後に細胞死を起こす。
【００２３】
本発明の方法における細胞死は、生理学的なストレスを細胞に対して曝露することにより誘導されるものであることから、生き残った細胞には遺伝的な損傷を与えることなく、目的とする細胞以外の細胞にのみ細胞死を誘導できる点で、直接遺伝子に損傷を与える物理的な条件（放射線ストレスや酸化ストレスなど）や化学的な条件（化合物ストレス）により細胞死を誘導するよりも非常に好ましい。というのも、生理学的なストレスに耐えて生き残った細胞は、その細胞死を誘導するための生理学的なストレスを除去した培養条件に戻すことにより、再びもともとの細胞の機能を回復し、正常な機能を発揮することができる。この特徴は、ｅｘ  ｖｉｖｏで調製された組織又は組織を構成する細胞を体内に移植することにより行う再生医療の現場においては、非常に利用しやすい特徴である。
【００２４】
本発明において３７０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上の浸透圧を有する高張液という場合、細胞の代謝に対して影響を及ぼすことなく、浸透圧のみを３７０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上とした高張液を意味しており、例えば、培養液に対して糖質（炭水化物）を添加することにより調製されたものを例として挙げることができる。本願発明に用いることができる糖質の例としては、細胞の代謝に影響を及ぼすことなく培養液の浸透圧を上げることができる糖質、即ち、本発明の培養液中に添加することができる糖質の例としては、例えば糖類（単糖類、少糖類、多糖類）、グリコサミノグリカン類、アミノグリコシド類、糖アルコール類又はベタイン類を挙げることができるが、これらには限定されない。より具体的には表１に記載された物質を挙げることができる。
【００２５】
【表１】
0005620905.tif 000002
【００２６】
更に、ソルビトール（糖アルコール類）やトリメチルグリシン（ベタイン類）等の生理的に成体内の浸透圧調節に関わる物質を用いた場合にも、本願発明に係る効果が認められているので、有機浸透圧調節物質（ｏｒｇａｎｉｃ  ｏｓｍｏｌｙｔｅｓ）としてベタイン、タウリン、イノシトール、グリセロフォスフォコリン（ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）等を使用することができる。
【００２７】
培養液に対して糖質を添加することにより３７０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上の浸透圧を有する高張液を作製する場合、高張液が０．１〜１Ｍ（ｍｏｌ／Ｌ）の糖質を、好ましくは、０．１〜０．６Ｍの糖質を、含有するものであることを特徴とする。糖質濃度（ｍｏｌ／Ｌ）と浸透圧（ｍＯｓｍ／ｋｇ）との関係は、ほぼ直線的な関係として近似することができ、０．１Ｍの糖質を含有する高張液は、約３７０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する高張液に相当し、１Ｍの糖質を含有する高張液は約１３００〜１６００ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する高張液に相当する。
【００２８】
但し、糖質がグリセロールの場合は、高張液が０．１〜０．６Ｍのグリセロールを、好ましくは０．１〜０．５Ｍのグリセロールを、含有するものであることを特徴とし、かかる高張液中で培養を１０時間以上、例えば１０〜２４時間、好ましくは１０〜１８時間行うことを特徴とする。
【００２９】
各糖質を用いて高張液を作製した場合の糖質濃度と浸透圧との関係のうち代表的な糖質に関するものを、以下の表に示した。
【００３０】
【表２】
0005620905.tif 000003
【００３１】
本発明の方法においては、細胞集団を３７０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上の浸透圧を有する高張液で培養して、多能性幹細胞や非心筋細胞に対して細胞死を誘導した後、通常の浸透圧（即ち、２００〜３００ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧）を有する培養液に戻して更に培養することが好ましい。本発明の方法において使用する高張液中で培養を行うと、心筋細胞は細胞死を起こさないものの、一過的に拍動を停止する場合がある。しかし、かかる場合であっても、通常の浸透圧の培養液中に戻すことにより、再び拍動を開始し、心筋細胞として機能することができる。また、高張液中で細胞死のシグナルを受けたが外見上は依然として生存しているように見える細胞も存在する。そのような細胞を培養中から除去するためにも、通常の浸透圧を有する培養液に戻して更に培養することは好ましい。
【００３２】
本発明の方法は、実施例において調べた全ての細胞（即ち、マウス由来胚性幹細胞、マーモセット由来の胚性幹細胞、ヒト由来の胚性幹細胞、ヒト由来のｉＰＳ細胞）において、同様の結果を示すことができた。本発明の方法が動物種に依存しなかったことから、本発明の方法はマウスからヒトまで全ての哺乳動物由来の細胞について適用することができることが示された。更に、胚性幹細胞においても誘導性多能性幹細胞においても本発明の方法を利用して目的を達成することができたことから、多能性幹細胞が遺伝子操作を行っていない幹細胞（例えば胚性幹細胞）であるか遺伝子操作を行った幹細胞（例えばｉＰＳ細胞）であるかにかかわらず適用することができることも示された。
【００３３】
例えば、本発明の方法を、胚性幹細胞又はｉＰＳ細胞から分化した心筋細胞を含む細胞集団に対して行う方法を具体的に説明する。まず、胚性幹細胞又はｉＰＳ細胞を分化用の培養液（例えば、α−ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）（ＳＩＧＭＡ）、１０％ＦＢＳ（ＥＱＵＩＴＥＣ  ＢＩＯ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  ペニシリン、５０μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）からなる培養液）中でハンギングドロップ法等により浮遊培養して適切な心筋分化誘導を行い、心筋細胞を含む胚様体を形成する。心筋細胞を分化させた後更に２日間以上の成熟期間を経てから、次いで胚様体を培養するための培養液を、マンニトール、ソルビトール、グルコース、スクロース又はキシリトール０．１〜１Ｍを含有する血清不含α−ＭＥＭ培養液もしくは血清不含Ｄ−ＭＥＭ培養液（即ち、高張液）に交換し、更に所定の時間、高張液である培養液に曝露する。このようにして高張液に曝露すると、心筋細胞以外の細胞（未分化の多能性幹細胞又は非心筋細胞）に対して細胞死を誘導し、もしくは細胞死のシグナルを与えることができる。
【００３４】
高張液への曝露を行う培養が終了した後、処理後の細胞を通常の浸透圧の培養液に交換して更に培養を継続することにより、心筋細胞のみが選択的に培養条件中で生存することができる。必要に応じて、酵素処理による細胞の分散化、培養液の交換や遠心分離などの手法のいずれか又は組み合わせを利用して細胞を洗浄することにより、細胞死を起こした非心筋細胞を積極的に除去することもできる。
【００３５】
本発明の方法により心筋細胞と未分化細胞を含む心筋細胞以外の細胞との両方を含む細胞集団に対して高張液への曝露を行った場合、細胞集団に含まれる心筋細胞以外の細胞のうちの９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、最も好ましくは１００％の細胞に、細胞死を誘導することができる。
【実施例】
【００３６】
本発明を以下の実施例により更に詳細に説明する。しかしながら、以下の実施例は、本発明の例示であって、本発明を限定することを意図するものではない。【００３７】
実施例１：胚性幹細胞由来心筋細胞と残存する未分化胚性幹細胞の免疫染色
本実施例においては、幹細胞から心筋細胞を含む細胞塊（胚様体）を形成した場合の、細胞塊（胚様体）中の心筋細胞と未分化細胞との混在状態を確認することを目的とした。【００３８】
マウス胚性幹細胞（細胞株名  ＥＢ３、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２０００；２４：３７２−３７６）は、独立行政法人・理化学研究所の丹羽仁史博士より恵与していただいた。このマウス胚性幹細胞を既存の方法（Ｂａｄｅｒ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ２００１，６８，ｐ３１−４３）（即ち、培養液［α−ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）（ＳＩＧＭＡ）、１０％ＦＢＳ（ＥＱＵＩＴＥＣ  ＢＩＯ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  ペニシリン、５０μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）］を用いて、ＥＢあたり７５個の胚性幹細胞をハンギングドロップ法により細胞塊として合計７日間培養する方法）にて、心筋細胞を含む細胞塊へと分化させた後、胚様体を上記培養皿に接着させて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて３〜５日間培養した。【００３９】
得られた胚様体を４％パラホルムアルデヒドにて固定化し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００で細胞膜を半可溶化した。４％ＢＳＡ溶液によってブロッキングを行い、最も発生初期の予定心筋細胞において発現すると言われるＮｋｘ２．５に対する抗体（ヤギ抗Ｎｋｘ２．５抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ社Ｎｏ．Ｎ−１９））、及びマウス胚性幹細胞の未分化能維持に重要な働きをしていることが知られている転写因子Ｏｃｔ−３／４に対する抗体（マウス抗Ｏｃｔ−３／４モノクローナル抗体、ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社Ｎｏ．０８４７２０）をそれぞれを１次抗体として、ブロッキング液にて１００倍希釈した後、４℃にて１２時間浸透させた。４回の洗浄後、それぞれの抗体に対する２次抗体として、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｗ４８８でラベルしたロバ抗ヤギ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社）と、ＴＲＩＴＣラベルしたウサギ抗マウス抗体（ＤＡＫＯ社）を共に１／２００希釈した後、室温にて１時間浸透させた。洗浄後、核ＤＮＡ染色試薬であるＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅ社）を含有する溶液を用いて、室温にて５分間核染色を行い、洗浄後、蛍光顕微鏡下で観察を行った。結果を図１に示す。図１においては、２つの胚様体（（ａ）及び（ｂ））に関して、左上：Ｏｃｔ−３（赤色）、右下：Ｎｋｘ２．５（緑色）、右上：Ｏｃｔ−３（赤色）とＮｋｘ２．５（緑色）の重ね合わせ像にＤＡＰＩ染色（青色）を更に重ね合わせたもの、そして左下：位相差像、をそれぞれ示す。【００４０】
図１に示すように、胚様体（ａ）及び（ｂ）の両方共において、一つの胚様体内部に、Ｏｃｔ−３／４陽性の未分化細胞とＮｋｘ２．５陽性である心筋細胞が共存していることが判明した。【００４１】
実施例２：胚性幹細胞由来心筋細胞と残存する胚性幹細胞が混入した培養系における糖質（糖アルコール類）処理
本実施例においては、胚性幹細胞から形成された心筋細胞を含む細胞塊（胚様体）に対して糖質（糖アルコール類）処理を行った後の、心筋細胞の培養状態とそれ以外の細胞の培養状態とを確認することを目的とした。【００４２】
マウス由来胚性幹細胞を実施例１に記載した方法にて胚様体を形成して、予定心筋細胞（前心臓中胚葉）を含む段階へと分化させた。得られた胚様体を、細胞障害を与えないように注意深く消化酵素処理（トリプシン、コラゲナーゼ）することによって部分的に分散させたものを、再接着培養した。５日間培養を継続したところ、図２に示すように自律拍動を行う心筋細胞の集団（赤線で囲った細胞集団）と、胚性幹細胞様の細胞形質を有する細胞集団（黄線で囲った細胞集団）と、そしてその他の細胞集団とが混在した状態となった（図２（ａ）を参照）。【００４３】
次に、この混合培養の培養液を、０．４５Ｍ（約７２０ｍＯｓｍ／ｋｇに相当）のマンニトールとＩＴＳ｛インスリン（１０ｍｇ／Ｌ）、トランスフェリン（５．５ｍｇ／Ｌ）、亜セレン酸ナトリウム（６．７ｍｇ／Ｌ）｝（ＧＩＢＣＯ社）を含む無血清のα−ＭＥＭ培養液に置換し、３６時間培養を行った。その結果、この段階で、既に大多数の細胞が典型的な細胞死を呈していた。その後、培養液を２０％ウシ胎仔血清を含むα−ＭＥＭ培養液へと交換し、培養を継続したところ、１〜２日後には心筋細胞の自律拍動が回復した。一方、培養ディッシュに単層を形成するように広がって存在していた未分化細胞（胚性幹細胞）（図２（ａ）右下を参照）を含め、心筋細胞以外の細胞の殆ど全てが死滅していた（図２（ｂ）を参照）。【００４４】
この図２に示した培養に対して、実施例１と同様の方法によりＮｋｘ２．５とＯｃｔ−３／４に対する免疫染色を行った結果を図３として示した。図３においては、左上に示す位相差像の四角で囲われた部分の細胞に関して、左下：Ｎｋｘ２．５抗体染色（緑色）、そして右上：ＤＡＰＩ染色（青色）、そして右下：Ｎｋｘ２．５抗体染色（緑色）とＤＡＰＩ染色（青色）との重ね合わせ像、をそれぞれ示す。この結果、得られた細胞のうち９８％以上がＮｋｘ２．５陽性の心筋細胞であり（図３左下及び右下を参照）、Ｏｃｔ−３／４陽性の未分化細胞は存在しないことが明らかになった。【００４５】
実施例３：マウス胚性幹細胞に対する糖質（糖アルコール類）の細胞死誘導作用
本実施例においては、マウス胚性幹細胞を糖質（糖アルコール類）にて処理した後の幹細胞の生存状態を確認することを目的とした。【００４６】
ミトコンドリア膜電位は、死細胞では失われるために、生存の指標である膜電位を検出して蛍光を発するミトコンドリア膜電位感受性試薬、ＴＭＲＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）により染色を行った場合、この試薬由来の蛍光シグナルは、生細胞では高く、死細胞では低くなる。【００４７】
この特性を利用して、実施例１に記載した方法により培養した胚性幹細胞を、マンニトール０．４５Ｍ（約７２０ｍＯｓｍ／ｋｇに相当）と１μＭ  ＴＭＲＭを含むα−ＭＥＭ培養液中で、０ｈ（Ｐｒｅ）、３ｈ、６ｈ、２０ｈのあいだ培養したのち、採取した胚性幹細胞を洗浄後ＦＡＣＳ解析を行い、ミトコンドリア膜電位感受性試薬ＴＭＲＭの蛍光強度に基づいて、幹細胞の生存状態を確認し、図４に示した。図４において、０ｈ（Ｐｒｅ）、３ｈ、６ｈ、２０ｈのそれぞれのＦＡＣＳ解析結果に関して、ドットプロットに記した境界線よりも上部に存在する細胞は生細胞であり、ドットプロットに記した境界線よりも下部の細胞は死細胞を示す。【００４８】
図４に示すように、処理前（Ｐｒｅ）はほぼ全てが生細胞であるが、３時間マンニトール処理した後には約９０％の細胞が死に、６時間の処理後には９８％、２０時間の処理後では、すべての細胞が死滅した（図４）。【００４９】
実施例４：マーモセット胚性幹細胞に対する糖質（糖アルコール類）の細胞死誘導作用
本実施例においては、マーモセット胚性幹細胞を糖質（糖アルコール類）にて処理した後の幹細胞の生存状態を確認することを目的とした。【００５０】
マーモセット胚性幹細胞は、財団法人実験動物中央研究所から入手した（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２００５  Ｏｃｔ；２３（９）：１３０４−１３）。基本的な培養方法も本文献に従った。即ち、マーモセット胚性幹細胞の末分化維持培養を、マイトマイシンＣ処理により増殖不活性化したマウス胚性線維芽細胞（ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ；ＭＥＦ）を用いて行った。培養液としては、ＫＯ−ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）、２０％ＫＯ−ＳＥＲＵＭ（ＧＩＢＣＯ）、１．６ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ  非必須アミノ酸（ＭＥＭ）、０．２ｍＭβ−メルカプトエタノール（２−ＭＥ；Ｓｉｇｍａ）、１００ＩＵ／ｍｌ  ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ  硫酸ストレプトマイシン、及び８ｎｇ／ｍｌ  組換えヒト白血病阻止因子（ＬＩＦ；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、組換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を用いた。継代に際しては、０．１％ＩＩＩ型コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｉｎｇｔｏｎ）を用いて、３７℃１０分処理することによりＥＳコロニーを分離した。【００５１】
継代後、ＴＥ（０．２５％トリプシン（ＧＩＢＣＯ）と１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を用いて細胞をバラバラに分散した後、文献（Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００７，２５：６８１−６８６，Ｅｐｕｂ  ２００７  Ｍａｙ  ２７）に従い選択的Ｒｈｏ−関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤（Ｙ２７６３２）を１０μＭ加え、細胞死を抑制した。同時に５０ｎＭ  ＴＭＲＭを用いて生細胞のミトコンドリアを染色した。【００５２】
この染色細胞をマンニトール０．４５Ｍ（約７２０ｍＯｓｍ／ｋｇに相当）を含むα−ＭＥＭ培養液中で２時間処理した細胞のサンプルを作製し、マンニトールを含まないα−ＭＥＭ培養液中で２時間処理した細胞のサンプルをコントロールとして作製した。ＦＡＣＳ解析に先立って、コントロールでは、細胞どうしが接着し、細胞塊を形成していたので、再びＴＥ処理を行って、バラバラな細胞とした。その後、マンニトールで２時間処理した細胞及びコントロールの細胞をそれぞれ、ＴＭＲＭの蛍光強度に基づいてＦＡＣＳにてミトコンドリア膜電位の有無について解析を行い、幹細胞の生存状態を確認し、図５に示した。この結果、コントロール（図５（ａ））と比較して、マンニトールを用いて２時間処理することによって、殆どすべての細胞が膜電位を消失したことが分かった（図５（ｂ））。【００５３】
更に同時に、マンニトールで２時間処理した細胞及びコントロールの細胞について、染色された細胞の写真を撮影した（図６（ａ））。次いで、これらの細胞をそれぞれ５日間、培養液〔ＫＯ−ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）、２０％ＫＯ−ＳＥＲＵＭ（ＧＩＢＣＯ）、１．６ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ  非必須アミノ酸（ＭＥＭ）、０．２ｍＭβ−メルカプトエタノール（２−ＭＥ；Ｓｉｇｍａ）、１００ＩＵ／ｍｌ  ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ  硫酸ストレプトマイシン、及び８ｎｇ／ｍｌ  組換えヒト白血病阻止因子（ＬＩＦ；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）〕を用いて接着培養したところ、コントロール細胞（即ちマンニトール未処理細胞）では、生存する細胞を多数見出した（図６（ｂ）下段）。しかし、マンニトールに曝露された細胞では生存する細胞は全く見られなかった（図６（ｂ）上段）。【００５４】
実施例５：ヒト胚性幹細胞に対する糖質（糖アルコール類）の細胞死誘導作用
本実施例においては、ヒト胚性幹細胞を糖質（糖アルコール類）にて処理した後の幹細胞の生存状態を確認することを目的とした。【００５５】
ヒト胚性幹細胞京都大学再生医科学研究所附属幹細胞医学研究センター（ナショナルバイオリソースプロジェクトによるＥＳ細胞センター）から入手した（文献：Ｓｕｅｍｏｒｉ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．３４５，２００６，ｐ．９２６−９３２）。基本的な培養方法も上記文献に従った。即ち、ヒト胚性幹細胞を、マイトマイシンＣ処理により増殖不活性化したマウス胚性線維芽細胞（ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ；ＭＥＦ）を用いて未分化維持培養を行った。培養液としては、Ｆ１２／ＤＭＥＭ（１：１）（ＳＩＧＭＡ、製品番号Ｄ６４２１）、２０％ＫＯ−ＳＥＲＵＭ（ＧＩＢＣＯ）、１．６ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ  非必須アミノ酸（ＭＥＭ）、０．１ｍＭβ−メルカプトエタノール（２−ＭＥ；Ｓｉｇｍａ）、１００ＩＵ／ｍｌ  ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ  硫酸ストレプトマイシン、及び組換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を用いた。継代に際しては、０．１％ＩＩＩ型コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｉｎｇｔｏｎ）を用いて、３７℃１０分処理することにより胚性幹細胞コロニーを分離した。【００５６】
継代後、ＴＥ（０．２５％トリプシン（ＧＩＢＣＯ）と１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を用いて細胞をバラバラに分散した後、文献（Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００７，２５：６８１−６８６，Ｅｐｕｂ  ２００７  Ｍａｙ  ２７）に従いＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ２７６３２）を１０μＭ加え細胞死を抑制した。同時に５０ｎＭ  ＴＭＲＭを用いて生細胞のミトコンドリアを染色した。【００５７】
この染色細胞を、マンニトール０．４５Ｍ（約７２０ｍＯｓｍ／ｋｇに相当）を含むα−ＭＥＭ培養液中で２、３又は４時間処理した細胞のサンプルを作製し、マンニトールを含まないα−ＭＥＭ培養液中で２時間処理した細胞のサンプルをコントロールとして作製した。ＦＡＣＳ解析に先立って、コントロールで細胞どうしが接着し、細胞塊を形成していたので、再び両者に対し同様のトリプシンとＥＤＴＡ処理を行い細胞を分散させた。マンニトールで２、３、又は４時間処理した細胞及びコントロールの細胞をそれぞれ、ＴＭＲＭの蛍光強度に基づいてＦＡＣＳにてミトコンドリア膜電位の有無について解析を行い、幹細胞の生存状態を確認し、図７に示した。この結果、コントロール（図７（ａ））と比較して、マンニトールを用いて２時間処理することによって、殆どすべての細胞が膜電位を消失したことが分かった（図７（ｂ））。【００５８】
更にマンニトールで２時間処理した細胞及びコントロールの細胞について、ＴＭＲＭ染色された細胞の写真を撮影した（図８）。マンニトール未処理の細胞（図８上段）は、細胞間接着により自己集塊を形成していたが、マンニトールで処理した細胞（図８下段）は、分散したままの状態であった（図８）。【００５９】
次いで、これらの細胞をそれぞれ５日間、培養液［Ｆ１２／ＤＭＥＭ（１：１）（ＳＩＧＭＡ、製品番号Ｄ６４２１）、２０％ＫＯ−ＳＥＲＵＭ（ＧＩＢＣＯ）、１．６ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ  非必須アミノ酸（ＭＥＭ）、０．１ｍＭβ−メルカプトエタノール（２−ＭＥ；Ｓｉｇｍａ）、１００ＩＵ／ｍｌ  ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ  硫酸ストレプトマイシン、及び組換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）］を用いて接着培養したところ、コントロール細胞（即ちマンニトール未処理細胞）では、生存する細胞を多数見出した（図９上段）。しかし、マンニトールに曝露された細胞では生存する細胞は全く見られなかった（図９下段）。【００６０】
実施例６：ヒト胚性幹細胞由来胚様体において残存する幹細胞に対する糖質（糖アルコール類）の細胞死誘導作用と心筋細胞の濃縮
本実施例においては、ヒト胚性幹細胞から形成された心筋細胞を含む細胞塊（胚様体）に対して糖質（糖アルコール類）処理を行った後の、心筋細胞の培養状態とそれ以外の細胞の培養状態とを確認することを目的とした。【００６１】
ヒト胚性幹細胞を継代操作の後、培養液［α−ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）（ＳＩＧＭＡ）、１０％ＦＢＳ（ＥＱＵＩＴＥＣ  ＢＩＯ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  ペニシリン、５０μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）］中で浮遊培養することにより、胚様体を誘導した。分化開始（浮遊培養開始）から１４日目〜１８日目にかけて、自律拍動能を有する細胞が分化し、これは別途心筋細胞であることを確認した。【００６２】
分化開始後３ヶ月を経た胚様体は、依然として自律拍動能を維持していた。これらを０．１％コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｉｎｇｔｏｎ社）及び０．１％トリプシン（ＤＩＦＣＯ社）により部分的に酵素処理し、細かな細胞塊とした。これを２つに分割し、一方に対し、マンニトール０．４５Ｍ（約７２０ｍＯｓｍ／ｋｇに相当）を添加して２時間処理し、もう一方に対照（コントロール）群として、マンニトール処理した場合と同一量の生理的浸透圧溶液Ａｄｓ  ｂｕｆｆｅｒ（１１６．４ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、５．６ｍＭ  デキストロース、１０．９ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、４０５．７μＭ  ＭｇＳＯ４、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．３）のみを加え２時間処理した。処理後、両細胞群ともに、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ溶液で３日間接着培養した。【００６３】
３日後にこれらを顕微鏡下で観察したところ、コントロール群の細胞を培養するディッシュでは、細胞質に対して核の占有面積が大きい未分化細胞と思われる細胞集団からなるコロニーが多数見出された。しかし、マンニトール処理を施した細胞を培養するディッシュにおいては、これらの細胞集団は全く見出されなかった。【００６４】
マンニトール処理を施した細胞を培養するディッシュにおいては、代わりに自律拍動を行う細胞集団や自律拍動を行う単細胞が接着し、又は浮遊していた。これらの細胞を、胚性幹細胞のマーカーであり核内転写因子であるＯｃｔ−３／４タンパク質及び、心筋細胞マーカーであり核内転写因子であるＮｋｘ２．５タンパク質の発現について、それぞれに対して特異的な２種類の抗体（マウス抗Ｏｃｔ−３／４モノクローナル抗体、ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社Ｎｏ．０８４７２０、及び、ヤギ抗Ｎｋｘ２．５抗体、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ社Ｎｏ．Ｎ−１９）を一次抗体として用いて、実施例１と同様の実験手順に従って解析した。上述した２つに分割したサンプルのうちコントロール群についての結果を図１０に、マンニトール処理を２時間行った実験群についての結果を図１１に、それぞれ示した。図１０の上段は心筋細胞を示し、下段は胚性幹細胞を示す。【００６５】
この結果、コントロールで多数見出された胚性幹細胞様コロニーは、Ｏｃｔ−３／４陽性であり、胚性幹細胞と考えられた（図１０下段）。また、０．４５Ｍ（約７２０ｍＯｓｍ／ｋｇに相当）マンニトール処理で見出された自律拍動細胞は、Ｎｋｘ２．５陽性であり、心筋細胞と同定された（図１１（ａ））。これらの結果からマンニトール処理は、未分化幹細胞に対しては細胞死を誘導し、心筋細胞に対しては、顕著な毒性を示さないことが強く示唆された（図１０、図１１）。【００６６】
よって本処理方法は、ヒト胚性幹細胞においても、幹細胞に対し効率的に細胞死を誘導する方法であることが示された。一方で、心筋細胞に対しては細胞死を誘導しないことも示されたことから、心筋細胞を濃縮する方法としても利用できる方法であることが示された。マンニトール処理後１週間において免疫組織化学的手法を用いて生存細胞の種類及び数を検討したところ、コントロールの細胞（非処理群）とは対照的に、生存細胞の大半がＮｋｘ２．５陽性心筋細胞であり、Ｏｃｔ−３／４陰性の細胞が殆ど見出されなかった（図１１（ｂ））。【００６７】
実施例７：ヒト誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）に対する糖質（糖アルコール類）の細胞死誘導作用
本実施例においては、ヒト誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を糖質（糖アルコール類）にて処理した後のｉＰＳ細胞の生存状態を確認することを目的とした。【００６８】
ヒトｉＰＳ細胞は京都大学再生医科学研究所附属幹細胞医学研究センター（ナショナルバイオリソースプロジェクトによるＥＳ細胞センター）から入手した。基本的な培養方法はヒト胚性幹細胞と同じであり、実施例５に記載した方法と同様の方法により培養を行った。継代後、ＴＥ（０．２５％トリプシン（ＧＩＢＣＯ）と１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を用いて細胞をバラバラに分散した、文献（Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００７，２５：６８１−６８６，Ｅｐｕｂ  ２００７  Ｍａｙ  ２７）に従いＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ２７６３２）を１０μＭ加え細胞死を抑制した。同時に５０ｎＭ  ＴＭＲＭを用いて生細胞のミトコンドリアを染色した。【００６９】
この染色細胞を、マンニトール０．４５Ｍ（約７２０ｍＯｓｍ／ｋｇに相当）を含むα−ＭＥＭ培養液中で２時間処理した細胞のサンプルを作製し、マンニトールを含まないα−ＭＥＭ培養液中で２時間処理した細胞のサンプルをコントロールとして作製した。ＦＡＣＳ解析に先立って、コントロールサンプルで細胞同志が接着し、細胞塊を形成していたので、再び両者に対し同様のトリプシンとＥＤＴＡ処理を行い細胞を分散させた後、ＴＭＲＭの蛍光強度に基づいてＦＡＣＳにてミトコンドリア膜電位の有無について解析を行い、幹細胞の生存状態を確認し、図１２に示した。この結果、コントロール（図１２（ａ））と比較して、マンニトールを用いて２時間処理することによって、殆どすべての細胞が膜電位を消失したことが分かった（図１２（ｂ））。これらの細胞は、ヒト胚性幹細胞の場合と同様、死滅したと考えられた。【００７０】
実施例８：ヒト胚性幹細胞に対する種々の糖質（糖アルコール類、糖類、ベタイン類）の細胞死誘導作用
本実施例においては、ヒト胚性幹細胞をマンニトール以外の糖質（糖アルコール類、糖類、ベタイン類）にて処理した後の幹細胞の生存状態を確認することを目的とした。【００７１】
ヒト胚性幹細胞に対して、マンニトールの代わりに種々の糖質（糖アルコール類：ソルビトール、キシリトール、糖類：スクロース、グルコース、ベタイン類：トリメチルグリシン）０．４５Ｍ（約７５０〜７８０ｍＯｓｍ／ｋｇに相当）を２時間添加すること以外は実施例５と同様の実験手法を使用して、ミトコンドリア膜電位の変化を観察した。この結果、コントロール（図１３（ａ））と比較して、２時間の処理によって、全ての細胞が膜電位を消失したことが分かった（図１３（ｂ）〜（ｆ））。【００７２】
実施例９：ヒト胚性幹細胞由来胚様体において残存する幹細胞に対する種々の糖質（糖アルコール類、糖類、ベタイン類）の細胞死誘導作用と心筋細胞の濃縮
本実施例においては、ヒト胚性幹細胞から形成された心筋細胞を含む細胞塊（胚様体）に対してマンニトール以外の糖質（糖アルコール類、糖類、ベタイン類）にて処理を行った後の、心筋細胞の培養状態とそれ以外の細胞の培養状態とを確認することを目的とした。【００７３】
ヒト胚性幹細胞を継代操作の後、培養液［α−ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）（ＳＩＧＭＡ）、１０％ＦＢＳ（ＥＱＵＩＴＥＣ  ＢＩＯ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  ペニシリン、５０μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）］中で浮遊培養することにより、胚様体を誘導した。分化開始（浮遊培養開始）から１４日目〜１８日目にかけて、自律拍動能を有する細胞が分化し、これは別途心筋細胞であることを確認した。【００７４】
分化開始後３ヶ月を経た胚様体は、依然として自律拍動能を維持していた。これらを０．１％コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｉｎｇｔｏｎ社）及び０．１％トリプシン（ＤＩＦＣＯ社）により部分的に酵素処理し、細かな細胞塊とした。これを２つに分割し、一方に対し、０．４５Ｍ（約７００〜７８０ｍＯｓｍ／ｋｇに相当）及び０．６Ｍ（約８５０〜１０００ｍＯｓｍ／ｋｇに相当）の糖質（糖アルコール類：ソルビトール、キシリトール、グリセロール、糖類：スクロース、グルコース、ベタイン類：トリメチルグリシン）を添加して１２時間処理し、もう一方に対照（コントロール）群として、糖質処理した場合と同一量の生理的浸透圧溶液Ａｄｓ  ｂｕｆｆｅｒ（１１６．４ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、５．６ｍＭ  デキストロース、１０．９ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、４０５．７μＭ  ＭｇＳＯ４、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．３）のみを加え２時間処理した。処理後、両細胞群ともに、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ溶液で１２時間培養した。【００７５】
１２時間後にこれらを顕微鏡下で観察したところ、コントロール群の細胞を培養するディッシュでは、細胞質に対して核の占有面積が大きい未分化細胞と思われる細胞集団からなるコロニーが多数見出された。しかし、糖質処理を施した細胞を培養するディッシュにおいては、これらの細胞集団は全く見出されなかった。糖質処理を施した細胞を培養するディッシュにおいては、代わりに自律拍動を行う細胞集団や自律拍動を行う単細胞が接着し、又は、浮遊していた。【００７６】
実施例１０：ヒト胚性幹細胞由来胚様体において残存する幹細胞に対する糖質（糖アルコール類）の細胞死誘導作用の組織学的解析
本実施例においては、ヒト胚性幹細胞から形成された心筋細胞を含む細胞塊（胚様体）に対して糖質（糖アルコール類）にて処理を行った後の、心筋細胞の培養条件下での細胞の形態を確認することを目的とした。【００７７】
グリセロール０．４５Ｍ（約７１０ｍＯｓｍ／ｋｇに相当）及び０．６Ｍ（約８７０ｍＯｓｍ／ｋｇに相当）で１０時間処理したヒト胚性幹細胞由来の分化細胞サンプルについて、培養条件下での形態について検討した。その結果、心筋細胞以外の分化細胞の殆どが死滅していることが示された。この細胞死誘導効果は、グリセロールに１０時間以上曝露した場合に顕著であった（図１４）。【００７８】
上記の結果から、グリセロールは、長時間処理した場合に、効果的に多能性幹細胞（胚性幹細胞／ｉＰＳ細胞）及び心筋細胞以外の分化細胞に細胞死を誘導することが判明した。【００７９】
実施例１１：マウス胚性幹細胞に対する低濃度糖質（マンニトール）の細胞死誘導作用
本実施例においては、マウス胚性幹細胞を低濃度のマンニトールにて処理した後の幹細胞の生存状態を確認することを目的とした。【００８０】
実施例１に記載した方法により培養した胚性幹細胞を、マンニトール０．２Ｍ（約４８０ｍＯｓｍ／ｋｇに相当）を含むα−ＭＥＭ培養液中で、４８時間、７２時間培養したのち、細胞の接着、非接着及び形態観察によって、幹細胞の生存状態を確認し、図１５に示した。【００８１】
図１５に示すように、４８時間処理後は、既に殆ど全てのコロニーは、培養皿から脱離し、細胞死に特有の形態を示した。７２時間後では更にこの状況は顕著であり、完全に細胞は死滅した。４８時間処理した場合の写真（４８ｈ）７２時間処理した場合の写真（７２ｈ）に示すようなバラバラの点が一つの細胞である。塊として見えるものは、ＥＳ細胞のコロニーに由来する死細胞塊である。下に典型的な拡大像を示す。【００８２】
更に、実施例１に記載の方法と同様に、培養液［α−ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）（ＳＩＧＭＡ）、１０％ＦＢＳ（ＥＱＵＩＴＥＣ  ＢＩＯ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  ペニシリン、５０μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）］を用いて、ＥＢ当り７５個のマウス胚性幹細胞をハンギングドロップ法により細胞塊として合計７日間培養することにより、心筋細胞を含む細胞塊へと分化させた後、胚様体を上記培養皿に接着させて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて３〜５日間培養した。当該培養により、分化誘導し、接着培養した心筋細胞を含むマウス胚様体に対して、マンニトール０．２Ｍを最長７２時間処理すると、７２時間後には、心筋細胞以外の細胞の殆ど全てが死滅して心筋細胞が選択的に生存しており、心筋細胞以外の分化細胞に細胞死が誘導されたことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明の方法により多能性幹細胞、多能性幹細胞由来の心筋細胞以外の細胞、及び多能性幹細胞由来心筋細胞を含む細胞集団を処理することにより、細胞集団中の胚性幹細胞及び非心筋細胞を効率的に除去することができると同時に、心筋細胞のみが生存することができることから心筋細胞を効率的に濃縮・精製することができる。
【図４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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