(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の構造式（１）で表されるフラボノイド化合物
【化１】
0005620660.tif 000022
を有効成分として含むことを特徴とする脂肪代謝改善剤。
【請求項２】
下記の構造式（１）で表されるフラボノイド化合物。
【化１６】
0005620660.tif 000023
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ツバキ科植物であるチャの花もしくは花蕾（茶花）、その抽出物もしくは抽出エキス、又はこれらから得られる化合物を有効成分として含有する脂肪代謝改善剤、及びその脂肪代謝改善剤を含有する医薬や食品に関する。本発明は、さらに、茶花、その抽出物又は抽出エキスから得られる新規フラボノイド化合物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ツバキ科（Theaceae）植物のツバキ属(Camellia)に属するチャ(Camellia sinensis、別名Thea sinensis)は、本来、熱帯及び亜熱帯性の多年性植物であるが、インド、スリランカ、インドネシア、中国及び日本等アジアにおいて広く自生または栽培されている常緑樹である。特に、緑茶原料としては中国の福建省において大量栽培が行なわれている。
【０００３】
従来、チャの幼葉を摘んで不発酵、半発酵または発酵加工して、緑茶、ウーロン茶または紅茶等に製茶したものは、嗜好飲料として古くから広く日常的に愛飲されている。また、チャの興奮作用及び利尿作用は古くから知られ、中国においては、明時代の「本草綱目」に、そして我が国においては、江戸時代の「本朝食鑑」に記載されているほどである。
【０００４】
さらに近年、チャに関しては、主として、その葉部の成分として含まれるカテキン等のポリフェノール類が、活性酸素の消去等に対して有効であることが報告され、一段と注目されている。また、チャ葉には抗炎症、抗菌作用を有するサポニン化合物が含まれることも報告されている（例えば、非特許文献１及び特許文献１等）。さらにチャの木の花芽が、抗菌作用を有する新規サポニンを含有することも報告されている（例えば、非特許文献２）。
【０００５】
また、最近、本発明者により茶花が、中性脂肪吸収抑制、糖吸収抑制及び胃粘膜保護作用または抗高脂血症作用を有する新規サポニン化合物を含むことが見出されたことも報告されている（例えば、特許文献２、非特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平７-６１９９８号公報
【特許文献２】特開２００６-７００１８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】提坂裕子ら、薬学雑誌、１１６巻、２３８-２４３頁（１９９６）
【非特許文献２】Masayuki Yoshikawaら、Chem. Pharm. Bull., 55(4) pp598-605(2007)
【非特許文献３】Masayuki Yoshikawaら、J. Nat. Prod., 68, pp1360-1365 (2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、茶花の新規用途として、肝細胞内の中性脂肪を低減することにより、種々疾病（肥満、糖尿病、高脂血症等の生活習慣病）の予防、改善に寄与することが期待できる脂肪代謝改善剤を提供することを目的とする。本発明は、又、茶花に含まれる化合物からなる脂肪代謝改善剤であって、茶花そのものから得られるものよりも、さらに優れた作用を有する脂肪代謝改善剤を提供することを課題とする。本発明は、さらに、茶花に含まれる新規化合物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、茶花の成分及びその薬理作用を明らかにすべく研究に着手し、茶花、水、低級脂肪族アルコールもしくは含水低級脂肪族アルコールにより茶花を抽出して得られる抽出液、該抽出液より得られる抽出エキス、及び該抽出エキスより分離、精製して得られる成分（化合物）についてそれらの薬理作用を鋭意研究した。その結果、茶花、前記抽出液及び前記抽出エキスが、脂肪代謝改善作用を有することを見出した。
【００１０】
さらに、本発明者は、前記抽出エキスより特定の分離、精製手段により得られる成分（化合物）の中には、より優れた脂肪代謝改善作用を有する化合物が含まれていることを見出した。さらに、本発明者は、前記の、より優れた脂肪代謝改善作用を有する化合物の中には、新規フラボノイド化合物が含まれていることを見出し、その化学構造の決定を行った。以下に示す本発明は、これらの知見に基づき完成されたものである。
【００１１】
本発明はその第１の態様として茶花、水、低級脂肪族アルコールもしくは低級脂肪族アルコールの含水物により茶花を抽出して得られる抽出液、または前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキス、を有効成分として含むことを特徴とする脂肪代謝改善剤を提供する。ここで茶花とは、チャ(Camellia sinensis)の花部、すなわち花及び花蕾を意味する。
【００１２】
茶花、水、低級脂肪族アルコールもしくは低級脂肪族アルコールの含水物により茶花を抽出して得られる抽出液、または前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキスは、脂肪代謝改善作用を有する。従って、これらを有効成分として利用することにより脂肪代謝改善剤が得られる。
【００１３】
また、第２の態様として、下記の構造式（１）で表されるフラボノイド化合物
【００１４】
【化１】
0005620660.tif 000002
【００１５】
下記の構造式（２）で表されるフラボノイド化合物
【００１６】
【化２】
0005620660.tif 000003
【００１７】
下記の構造式（３）で表されるフラボノイド化合物
【００１８】
【化３】
0005620660.tif 000004
【００１９】
下記の構造式（４）で表されるフラボノイド化合物
【００２０】
【化４】
0005620660.tif 000005
【００２１】
下記の構造式（５）で表されるフラボノイド化合物
【００２２】
【化５】
0005620660.tif 000006
【００２３】
下記の構造式（６）で表されるフラボノイド化合物
【００２４】
【化６】
0005620660.tif 000007
【００２５】
下記の構造式（７）で表されるフラボノイド化合物
【００２６】
【化７】
0005620660.tif 000008
【００２７】
下記の構造式（８）で表されるフラボノイド化合物
【００２８】
【化８】
0005620660.tif 000009
【００２９】
下記の構造式（９）で表されるフラボノイド化合物
【００３０】
【化９】
0005620660.tif 000010
【００３１】
下記の構造式（１０）で表されるフラボノイド化合物
【００３２】
【化１０】
0005620660.tif 000011
【００３３】
下記の構造式（１１）で表されるフラボノイド化合物
【００３４】
【化１１】
0005620660.tif 000012
【００３５】
下記の構造式（１２）で表されるフラボノイド化合物
【００３６】
【化１２】
0005620660.tif 000013
【００３７】
下記の構造式（１３）で表されるカテキン化合物
【００３８】
【化１３】
0005620660.tif 000014
【００３９】
下記の構造式（１４）で表されるカテキン化合物、及び
【００４０】
【化１４】
0005620660.tif 000015
【００４１】
下記の構造式（１５）で表されるカテキン化合物
【００４２】
【化１５】
0005620660.tif 000016
【００４３】
からなる群の中から選ばれる化合物を有効成分として含むことを特徴とする脂肪代謝改善剤を提供する。
【００４４】
本発明者は、前記の抽出液又は抽出エキスを分離、精製して得られた成分（化合物）について、詳細な探索等を行いその構造を決定するとともに、ヒト肝癌細胞ＨｅｐＧ２を使用して、肝細胞内の中性脂肪含量に与える影響を検討した結果、いくつかの化合物が脂肪代謝改善作用を有することを見いだした。そして、この脂肪代謝改善作用を有する化合物は、前記構造式（１）〜（１５）のいずれかで表される構造であることが判明した。本発明の第２の態様は、この脂肪代謝改善作用を有する化合物の中から選ばれた１又は２以上の化合物を有効成分として利用することによる脂肪代謝改善剤である。
【００４５】
本発明の第２の態様は、この脂肪代謝改善作用を有する化合物の中から選ばれた１又は２以上の化合物を有効成分として利用することによる脂肪代謝改善剤である。第２の態様の脂肪代謝改善剤は、第１の態様の脂肪代謝改善剤より、さらに優れた脂肪代謝改善作用を示す。
【００４６】
前記の第１の態様、第２の態様の脂肪代謝改善剤は、肝細胞中の中性脂肪含量を低減させることにより、各種生活習慣病（肥満症、糖尿病、メタボリック症候群、高脂血症等）の改善または予防効果を有する。従って、この脂肪代謝改善剤を医薬や食品に適用することにより、優れた脂肪代謝改善効果を有し、前記の改善または予防効果を奏する医薬や健康食品を製造することができる。
【００４７】
そこで、本発明はその第３の態様として、前記の第１の態様又は第２の態様の脂肪代謝改善剤、すなわち、請求項１又は請求項２に記載の脂肪代謝改善剤を含有することを特徴とするヒト又は動物用の医薬（請求項３）を提供する。又、その第４の態様として、前記の第１の態様又は第２の態様の脂肪代謝改善剤、すなわち、請求項１又は請求項２に記載の脂肪代謝改善剤を含有することを特徴とする食品（請求項４）を提供する。
【００４８】
前記の構造式（１）で表されるフラボノイド化合物、８−メトキシケンフェロール３−Ｏ−α−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→２）［β−Ｄ−グルコピラノシル（１→３）］−β−Ｄ−グルコピラノシド、は、新規な化合物である。そこで、本発明はその第４の態様として、構造式(１)で表されるフラボノイド化合物またはその塩を提供する。
【発明の効果】
【００４９】
本発明の第１の態様及び第２の態様の脂肪代謝改善剤は、ヒト肝細胞由来の細胞であるＨｅｐＧ２細胞において中性脂肪量の低減作用を示し、脂肪代謝改善剤としての優れた生物活性を有する。そこで、この脂肪代謝改善剤を用いることにより、肝細胞中の中性脂肪含量を低減させることができ、中性脂肪含量の低減により、各種生活習慣病の改善または予防効果が期待される。特に、第２の態様の脂肪代謝改善剤はこの効果が大きい。
【００５０】
この脂肪代謝改善剤を含有させた本発明の医薬（第３の態様）や食品（第４の態様）は、優れた脂肪代謝改善作用を示す医薬または食品であり、肝細胞中の中性脂肪含量を低減させる効果を有し、各種生活習慣病の改善または予防効果が期待されるものである。
【００５１】
本発明の第５の態様である構造式（１）で表される新規なフラボノイド化合物は、脂肪代謝改善を有するものであり、それを有効成分として利用することにより、本発明の第２の態様である脂肪代謝改善剤となる。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
次に、本発明を実施するための最良の形態について説明するが、本発明の範囲はこの実施の形態のみに限定されるものではない。
【００５３】
本発明の第１の態様の脂肪代謝改善剤としては、茶花（ツバキ科植物チャの花及び／又は花蕾）そのものを用いたものを例示することができる。茶花そのものを用いる方法としては、未乾燥の茶花をそのまま用いる方法、茶花に粉砕、破砕、切断、すりつぶし等の形状変化を行って用いる方法、又は、茶花に乾燥等の調製を実施したものを用いる方法を例示することができる。
【００５４】
本発明の第１の態様の脂肪代謝改善剤としては、茶花を水、低級脂肪族アルコールもしくは低級脂肪族アルコールの含水物により抽出して得られる抽出液も例示することができる。さらに、前記抽出液を濃縮した抽出エキスも例示することができる。
【００５５】
この抽出液は、茶花をそのまま、水、低級脂肪族アルコール及び低級脂肪族アルコールの含水物より選ばれる抽出溶媒により、抽出して得ることもできるが、茶花を粉砕、破砕、切断またはすりつぶし等による形状変化を行ったものを用いて抽出する方法が、抽出効率の面で望ましい。
【００５６】
抽出溶媒として用いられる低級脂肪族アルコールとしては、炭素数１〜４の低級アルコール類が挙げられ、具体的には、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｔ−ブタノール又はこれらの混液が挙げられる。抽出溶媒としては、好ましくは、これらの低級脂肪族アルコール、又はこれらの低級脂肪族アルコールに３０容量％までの水を含有する含水アルコールが用いられる。前記のアルコールの中でもメタノール又はエタノールが好ましい。これらの抽出溶媒は、抽出材料に対して、１〜５０倍（重量）程度、好ましくは１０〜３０倍程度用いられる。
【００５７】
抽出温度は、室温〜溶媒の沸点の間で任意に設定できるが、例えば５０℃〜抽出溶媒の沸点の温度で、振盪下もしくは非振盪下または還流下に、前記の抽出材料、即ち、茶花そのもの、又は、それを粉砕、破砕、切断、すりつぶし等による形状変化を行ったもの等を、前記の抽出溶媒に浸漬することにより行うのが適当である。
【００５８】
好ましい抽出時間は、抽出温度や抽出の際の振盪の有無等により変動し、特に限定されない。例えば、抽出材料を振盪下に浸漬する場合には、３０分間〜１０時間程度行うのが適当であり、非振盪下に浸漬する場合には、１時間〜２０日間程度行うのが適当である。又、抽出溶媒の還流下に抽出するときは、３０分間〜数時間加熱還流するのが好ましい。なお、５０℃より低い温度で浸漬して抽出することも可能であるが、その場合には、前記の時間よりも長時間浸漬するのが好ましい。抽出操作は、同一材料について１回だけ行ってもよいが、複数回、例えば２〜５回程度繰り返すのが好ましい。
【００５９】
前記の抽出工程により得られた抽出液には茶花の含有成分が溶出されている。本発明の脂肪代謝改善剤には、このようにして得られた抽出液をそのまま加えてもよいが、前記抽出液を濃縮して抽出エキスにして脂肪代謝改善剤としてもよい。濃縮は、低温で減圧下に行うのが好ましい。なお、濃縮する前に濾過して濾液を濃縮してもよい。
【００６０】
抽出エキスは、濃縮したままの状態で脂肪代謝改善剤として用いることができる。また、濃縮は乾固するまで行ってもよく、粉末状又は凍結乾燥品等として用いてもよい。濃縮する方法、粉末状及び凍結乾燥品とする方法は、当該分野での公知の方法を用いることができる。
【００６１】
このようにして得られる抽出液又は抽出エキスを、精製処理に付し、含有される各成分に分離することができる。そして、分離された成分中には、脂肪代謝改善作用を有する化合物、具体的には、構造式（１）〜（１５）のいずれかで表される化合物が含まれており、これらも脂肪代謝改善剤として用いることができ（本発明の第２の態様）、この脂肪代謝改善剤は、前記の第１の態様の脂肪代謝改善剤より、脂肪代謝改善作用が大きいものである。
【００６２】
精製処理は、例えば、クロマトグラフ法、イオン交換樹脂を使用する溶離法、溶媒による分配抽出等を単独又は組み合わせて採用することができる。クロマトグラフ法としては、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、遠心液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等を挙げることができ、これらのいずれか又はそれらを組み合わせで行う方法が挙げられる。この際の担体、溶出溶媒等の精製条件は、各種クロマトグラフィーに対応して適宣選択することができる。
【００６３】
本発明の第１の態様及び第２の態様の脂肪代謝改善剤は、脂肪代謝改善剤としての活性評価の指標として実施した、ヒト肝がん由来細胞であるＨｅｐＧ２細胞を用いた細胞内脂肪代謝促進作用試験において活性が見出された。特に第２の態様の脂肪代謝改善剤は活性が大きかった。
【００６４】
この細胞内脂肪代謝促進作用試験は、ヒト肝がん由来細胞であるＨｅｐＧ２細胞を用い、高濃度グルコースを含む培地にて培養し細胞内に脂肪を蓄積させた後、培地を、低濃度グルコース含有培地へ交換するとともに被検サンプルを添加し、培養後の細胞内トリグリセリド残存量を脂肪代謝の指標として評価するものである。この試験により、肝細胞における脂肪代謝促進作用の高い検体は、肝臓における脂肪代謝を改善すると判断される。
【００６５】
本発明の第１の態様及び第２の態様の脂肪代謝改善剤は、そのままの状態で、又は適当な媒体で希釈して、医薬品等の製造分野における公知の方法により、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤又は液剤等の種々の形態にして、ヒト又は動物用の医薬（本発明の第３の態様）として用いることができる。
【００６６】
種々の形態にする場合においては、適当な媒体を添加してもよい。適当な媒体としては、医薬的に許容される賦形剤、例えば結合剤（例えばシロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガント又はポリビニルピロリドン）、充填剤（例えば乳糖、砂糖、トウモロコシ澱粉、リン酸カルシウム、ソルビトール又はグリシン）、錠剤用滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール又はシリカ）、崩壊剤（例えば馬鈴薯澱粉）又は湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）等が挙げられる。
【００６７】
錠剤とする場合は、通常の製薬における周知の方法でコートしてもよい。液体製剤の場合は、例えば水性又は油性の懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップ又はエリキシルの形態であってもよい。又、使用前に水や他の適切な賦形剤と混合する乾燥製品として提供してもよい。
【００６８】
こうした液体製剤は、通常の添加剤、例えば、ソルビトール、シロップ、メチルセルロース、グルコースシロップ、ゼラチン水添加食用脂等の懸濁化剤、レシチン、ソルビタンモノオレエート、アラビアゴム等の乳化剤（食用脂を含んでもよい）、アーモンド油、画分ココヤシ油又はグリセリン、プロピレングリコールやエチレングリコールのような油性エステル等の非水性賦形剤、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピル又はソルビン酸等の保存剤、を含んでもよく、さらに所望により着色剤又は香料等を含んでもよい。
【００６９】
本発明の第１の態様及び第２の態様の脂肪代謝改善剤を、それぞれ単独で又は混合物として食品に含有させることにより、食品に脂肪代謝改善効果を与えることができる（本発明の第４の態様）。ここで言う食品には健康食品も含まれる。
【００７０】
ここで健康食品とは、通常の食品よりも積極的な意味で、保健、健康維持・増進等を目的とした食品を意味する。食品又は健康食品の形態としては、例えば、液体又は半固形、固形の製品、具体的には散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤又は液剤等のほか、クッキー、せんべい、ゼリー、ようかん、ヨーグルト、まんじゅう等の菓子類、清涼飲料、お茶類、栄養飲料、スープ等の形態が挙げられる。これらの食品の製造工程において、あるいは最終製品に、前記の抽出物、抽出エキス、及び／又は化合物を混合又は塗布、噴霧等により添加して、健康食品とすることができる。
【００７１】
本発明の医薬又は食品における、前記抽出液、抽出エキス、前記構造式（１）から（１５）のいずれかで表される化合物の使用量は、濃縮、精製の程度、活性の強さ等、使用目的、対象疾患や自覚症状の程度、使用者の体重、年齢等によって適宣調整される。例えば、医薬として成人について使用する場合は、１回の投与毎に、抽出液又は抽出エキスでは、１ｍｇ〜２０ｇ程度の範囲で使用し、この範囲内で精製度や水分含量等に応じて調整することが適当な場合が多い。又、前記化合物を使用する場合は、１ｍｇ〜１ｇ程度が適当な場合が多い。
【００７２】
また、食品や健康食品として使用する場合は、食品の味や外観に悪影響を及ぼさない量、例えば、対象となる食品１ｋｇに対して、前記抽出液、抽出エキス、前記構造式（１）から（１５）のいずれかで表される化合物を、１ｍｇ〜２０ｇ程度の範囲で添加することが適当な場合が多い。
【実施例】
【００７３】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものではない。なお、以下の実施例では、特に記載がない限り、以下に示す各種溶媒、濾紙、クロマトグラフィー用担体及びＨＰＬＣカラムを用いた。また、特に明記しない試薬については、和光純薬工業社製試薬（特級）を用いた。
【００７４】
［溶媒］
メタノール：ナカライテスク社製、一級
ＨＰＬＣ用メタノール：関東化学社製、特級
【００７５】
［濾紙］  アドバンテック社製：Ｎｏ．２
【００７６】
［クロマトグラフィー用担体］
順相シリカゲルカラムクロマトグラフ用担体：富士シリシア社製、ＢＷ−２００，１５０〜３００メッシュ
逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフ用担体：富士シリシア社製、Ｃｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ  ＯＤＳ１０２０Ｔ，１００〜２００メッシュ
多孔質ポリマーカラムクロマトグラフ用担体：日本練水社製、ダイアイオンＨＰ−２０
【００７７】
［ＨＰＬＣカラム］  ＹＭＣ社製、ＹＭＣ  Ｐａｃｋ−ＯＤＳ−Ａ、２０ｍｍ（ｉ．ｄ．）×２５０ｍｍ
【００７８】
実施例１  茶花抽出物の調整
福建省産茶花(Camellia sinensis)５．０７ｋｇを、５０（１０倍量）ｋｇのメタノールで３時間還流下抽出し、その後抽出液を濾取し、メタノール抽出液を得た。濾過残渣にメタノールを加え、同様の抽出操作を計３回行い、それぞれメタノール抽出液を得た。得られたメタノール抽出液を合わせた後、減圧下溶媒留去しメタノール抽出エキス（１１７３．７ｇ、植物からの収率２３．１％。）を得た。
【００７９】
実施例２  茶花抽出物の分離及び精製
実施例１で得られたメタノール抽出エキス（１０３２．５ｇ）を、酢酸エチル（ＡｃＯＥｔ）と水で分配抽出した。得られたＡｃＯＥｔ移行部を減圧下溶媒留去し、ＡｃＯＥｔ可溶部（１４９．７ｇ、植物からの収率３．３％）を得た。さらに、水可溶部をＤｉａｉｏｎ  ＨＰ−２０カラムクロマトグラフィーに付し、水及びメタノールで順次、成分を溶出させて水溶出部（４７１．６ｇ、植物からの収率１０．５％）及びメタノール溶出部（３７３．４ｇ、植物からの収率８．３％）を得た。
【００８０】
実施例３  ＡｃＯＥｔ可溶部の精製
ＡｃＯＥｔ可溶部（４０ｇ）を、順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー［２．０ｋｇ、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝（１０：１→５：１→１：１→１：１０）→クロロホルム→クロロホルム：メタノール＝（５：１→１：１）→メタノール］で順次溶出し、溶出画分Ｅ１（７．６ｇ）、Ｅ２（９．５ｇ）、Ｅ３（１．８ｇ）、Ｅ４（２．２ｇ）、Ｅ５（３．９ｇ）、Ｅ６（１７．５ｇ）、Ｅ７（２．９ｇ）、Ｅ８（１７．３ｇ）、Ｅ９（２．５ｇ）及びＥ１０（２．１ｇ）を得た。
【００８１】
実施例４
溶出画分Ｅ５（３．９ｇ）を、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー［１２０ｇ、メタノール：水＝（１０：９０→３０：７０→７０：３０→メタノール）にて画分し、溶出画分Ｅ５−１（３３２．０ｍｇ）、Ｅ５−２（４６．０ｍｇ）、Ｅ５−３（２３４．４ｍｇ）、Ｅ５−４（１４３．０ｍｇ）、Ｅ５−５（３５２．５ｍｇ）、Ｅ５−６（４５７．７ｍｇ）、Ｅ５−７（４０．４ｍｇ）、Ｅ５−８（１４６．２ｍｇ）、Ｅ５−９（１４９．２ｍｇ）、Ｅ５−１０（１０１．１ｍｇ）、Ｅ５−１１（８２．１ｍｇ、０．００３９％（茶花５．０７ｋｇからの化合物の単離収率。以下同様）、化合物（１１）とする。）、Ｅ５−１２（５６．５ｍｇ）、Ｅ５−１３（３１０ｍｇ）及びＥ５−１４（１．７ｇ）を得た。
【００８２】
画分Ｅ５−５（３５２．５ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［移動相  ＭｅＯＨ：水＝３０：７０、１％酢酸］を用いて分離精製し、化合物（１３）（４７．３ｍｇ、００２３％）を単離した。さらに画分Ｅ５−６（４５７．７ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［移動相  ＭｅＯＨ：水＝３０：７０、１％酢酸］を用いて分離精製し化合物（１４）（７７．４ｍｇ、０．００３７％）を単離した。また、画分Ｅ５−１０（１０１．１ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［移動相  ＭｅＯＨ：水＝５０：５０、１％酢酸］を用いて分離精製し化合物（１２）（６６．１ｍｇ、０．００３２％）を得た。
【００８３】
実施例５
溶出画分Ｅ６（１７．５ｇ）を、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー［６００ｇ、メタノール：水＝（２０：８０→４０：６０→５０：５０→７０：３０→メタノール）にて画分し、溶出画分Ｅ６−１（８０４．２ｍｇ）、Ｅ６−２（２４５．３ｍｇ）、Ｅ６−３（２４１．５ｍｇ）、Ｅ６−４（２．６ｇ）、Ｅ６−５（１．８ｇ）、Ｅ６−６（２．２ｇ）、Ｅ６−７（８４３．９ｍｇ）、Ｅ６−８（４８４．２ｍｇ）、Ｅ６−９（６５３．２ｍｇ）、Ｅ６−１０（８０７．６ｍｇ）、Ｅ６−１１（４０１．４ｍｇ）、Ｅ６−１２（３５７．８ｍｇ）、Ｅ６−１３（３７１．５ｍｇ）、Ｅ６−１４（４．５ｇ）を得た。画分Ｅ６−６（５００ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［移動相  ＭｅＯＨ：水＝３０：７０、１％酢酸］を用いて分離精製し、化合物（１５）（２５．０ｍｇ、０．００５３％）を単離した。
【００８４】
実施例６  ＭｅＯＨ溶出部の精製
ＭｅＯＨ溶出部（１６０．２ｇ）を、順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー［３．０ｋｇ、クロロホルム：ＭｅＯＨ：水＝１０：３：１（下層）→６：４：１（下層）→ＭｅＯＨ］で順次溶出させて、溶出画分Ｍ１（１８．７ｇ）、Ｍ２（７．０ｇ）、Ｍ３（２２．７ｇ）、Ｍ４（９７．９ｇ）、Ｍ５（７．５ｇ）を得た。
【００８５】
実施例７
溶出画分Ｍ３（２２．７ｇ）を、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー［７００ｇ、メタノール：水＝（４０：６０→６０：４０→８０：２０→メタノール）にて画分し、溶出画分Ｍ３−１（３．６８ｇ）、Ｍ３−２（０．９１ｇ）、Ｍ３−３（５．１０ｇ）、Ｍ３−４（５．５８ｇ）、Ｍ３−５（２．７８ｇ）を得た。さらに得られた画分Ｍ３−３（５００ｍｇ）を、逆相ＨＰＬＣ［移動相  ＭｅＯＨ：水＝４０：６０、１％酢酸］を用いて分離精製し、化合物（２）（６．０ｍｇ、０．００３２％）、化合物（３）（１１．７ｍｇ、０．００６２％）、化合物（４）（１９．９ｍｇ、０．０１０６％）、化合物Ａ（９４．６ｍｇ、０．０５０４％）、化合物（５）（３９．５ｍｇ、０．０２１１％）を得た。
【００８６】
実施例８
溶出画分Ｍ４（９７．９ｇ）を、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー［３．０ｋｇ、メタノール：水＝（５０：５０→７０：３０→メタノール）にて画分し、溶出画分Ｍ４−１（２６．２ｇ）、Ｍ４−２（４．６０ｇ）、Ｍ４−３（２２．５ｇ）、Ｍ４−４（３９．７ｇ）、Ｍ４−５（８．６０ｇ）を得た。さらに得られた画分Ｍ４−１（５００ｍｇ）を、逆相ＨＰＬＣ［移動相  ＭｅＯＨ：水＝４０：６０、１％酢酸］を用いて分離精製し、化合物（６）（７．６ｍｇ、０．０２１％）、化合物（７）（８．３ｍｇ、０．０２３％）、化合物Ｂ（１５．３ｍｇ、０．０４２％）、化合物（８）（１７．３ｍｇ、０．０４７％）、化合物（９）（１３９．１ｍｇ、０．３８１％）、化合物（１０）（１０．２ｍｇ、０．００２８％）及び化合物（１）（９．８ｍｇ、０．０２７％）を得た。
【００８７】
実施例９
実施例４、５で得られた化合物（１１）〜（１５）、並びに、実施例７、８で得られた化合物（１）〜（１０）及び化合物Ａ、Ｂについて、１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲ等の測定を行った。それらの測定値と、公知文献記載の物理化学的データの数値との比較から、化合物（２）〜（１５）及び化合物Ａ、Ｂは、それぞれ、以下に示す公知化合物であることが確認された。それぞれの構造及び［］内に化合物名を示す。
【００８８】
・化合物（２）：前記の構造式（２）で表される化合物［ケルセチン３−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド］
・化合物（３）：前記の構造式（３）で表される化合物［ケルセチン３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド］
・化合物（４）：前記の構造式（４）で表される化合物［ケンフェロール３−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド］
・化合物（５）：前記の構造式（５）で表される化合物［ケンフェロール３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド］
・化合物（６）：前記の構造式（６）で表される化合物［ルチン］
・化合物（７）：前記の構造式（７）で表される化合物［アピゲニン６Ｃ−β−Ｄ−グルコピラノシル８Ｃ−α−Ｌ−アラビノシド］
【００８９】
・化合物（８）：前記の構造式（８）で表される化合物［ケンフェロール３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→６）−β−Ｄ−グルコピラノシド］
・化合物（９）：前記の構造式（９）で表される化合物［ケンフェロール３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→６）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド］
・化合物（１０）：前記の構造式（１０）で表される化合物［ミリセチン３−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド］
・化合物（１１）：前記の構造式（１１）で表される化合物［ケンフェロール］
・化合物（１２）：前記の構造式（１２）で表される化合物［ケルセチン］
・化合物（１３）：前記の構造式（１３）で表される化合物［（−）−エピカテキン］
・化合物（１４）：前記の構造式（１４）で表される化合物［（−）−エピカテキン３−Ｏ−ガレート］
・化合物（１５）：前記の構造式（１５）で表される化合物［（−）−エピガロカテキン３−Ｏ−ガレート］
【００９０】
・化合物（Ａ）：［ケンフェロール３−Ｏ−ルチノシド］
・化合物（Ｂ）：［ケルセチン３−Ｏ−ネオヘスペリドシド］
【００９１】
化合物（１）についての質量分析、赤外吸収スペクトル、１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲ等の測定結果を以下に示す。これらの測定結果から、化合物（１）は、前記の構造式（１）で表される新規化合物：８−メトキシケンフェロール３−Ｏ−α−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→２）［β−Ｄ−グルコピラノシル（１→３）］−β−Ｄ−グルコピラノシド（８−Ｍｅｔｈｏｘｙｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ  ３−Ｏ−α−Ｌ−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｐｓｙｌ−（１→２）［β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ（１→３）］−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）であることが決定された。
【００９２】
・性状：黄色不定形粉末
・旋光度：［α］Ｄ２６：  −３８．９°（ｃ＝１．３５，ＭｅＯＨ）
・紫外吸収スペクトル［ＭｅＯＨ，ｎｍ，（ｌｏｇ  ε）］：２７２．５（４．１２）
・高分解能質量分析（Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＦＡＢ−ＭＳ）：
理論値  Ｃ３４Ｈ５０Ｏ２１Ｎａ  ［Ｍ＋Ｎａ］＋：  ８０９．２１１６
実測値  ：  ８０９．２１１２
・赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ，ｃｍ−１）：  ３４６９、１６８６、１５４１、１０７６
・Ｐｏｓ．ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ８０９［Ｍ＋Ｎａ］＋
・Ｎｅｇ．ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ７８５［Ｍ−Ｈ］−、６２３［Ｍ−Ｃ６Ｈ１２Ｏ５］−、３１５［Ｍ−Ｃ１８Ｈ３１Ｏ１４］−
【００９３】
・核磁気共鳴スペクトル：化合物（１）の１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ：測定溶媒：ジメチルスルホキシド−ｄ６）及び１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ：測定溶媒：ジメチルスルホキシド−ｄ６）の測定値を以下の表１及び２にそれぞれ示す。なお、以下の１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲによる構造解析に用いたナンバリングは、次式に基づいている。
【００９４】
【化１６】
0005620660.tif 000017
【００９５】
【表１】
0005620660.tif 000018
【００９６】
【表２】
0005620660.tif 000019
【００９７】
実施例１０  ＨｅｐＧ２細胞を用いた脂肪代謝促進作用試験
実施例１、２で得られたメタノール抽出エキス、ＡｃＯＥｔ可溶部、メタノール溶出部及び水溶出部、実施例４、５で得られた化合物（１１）〜（１５）、並びに、実施例７、８で得られた化合物（１）〜（１０）及び化合物Ａ、Ｂについて、脂肪代謝改善作用の指標として、ＨｅｐＧ２細胞を用いた細胞内脂肪代謝促進作用試験を実施した。試験方法を以下に示す。
【００９８】
［細胞内脂肪代謝促進作用試験］
大日本住友製薬より購入したヒト肝がん由来ＨｅｐＧ２細胞を用いた。培地はｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ（ＭＥＭ，シグマ−アルドリッチ社）に、１０％（ｖ／ｖ）ｆａｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ（ＦＣＳ）及び１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン及び０．１ｍＭ非必須アミノ酸（インビトロジェン社）を添加して使用した。細胞の培養は、７５ｃｍ２培養フラスコ（ファルコン社）中で行い、５％ＣＯ２雰囲気下３７℃にて行った。継代操作は，培養した細胞をダルベッコＰＢＳ（−）（日水製薬社）で洗浄した後、０．０２％（ｗ／ｖ）トリプシン（ディフコ社）及び０．０５％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡ・２Ｎａ（同人化学社）を含むＰＢＳ（−）により剥離して、定法に従い行った。
【００９９】
ＨｅｐＧ２細胞を１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（２００μＬ／ｗｅｌｌ）の細胞密度で４８穴培養プレート（住友ベークライト社）に播種して実験を行った。培養１日後、高濃度グルコース（４５００ｍｇ／Ｌ）含有ＤＭＥＭ（ＤＵＬＢＥＣＣＯ’Ｓ  ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＥＡＧＬＥ’Ｓ  ＭＥＤＩＵＭ）（２００μＬ／ｗｅｌｌ）に培地交換して計６日間（２日に１回培地を交換）培養した。高濃度グルコース含有ＤＭＥＭによる培養終了後、被験サンプルを添加した低濃度グルコース（１０００ｍｇ／Ｌ）含有ＤＭＥＭ（２００μＬ／ｗｅｌｌ）に培地交換して、さらに２０時間培養した。
【０１００】
培養期間終了後、培養上清を除去、次いで蒸留水（１００μＬ／ｗｅｌｌ）を加え、超音波破砕機にて細胞を破砕して細胞破砕液を得た。得られた細胞破砕液の中性脂肪濃度及びタンパク質濃度は、それぞれ市販キットであるトリグリセリドＥテストワコー（和光純薬工業社）及びＢＣＡｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ社）を使用して定量した。尚、定量結果については、タンパク質あたりの中性脂肪量（下表のＴＧ／Ｐｒｏｔｅｉｎ）で算出し、対照群に対する相対値（％  ｏｆ  ｃｏｎｔｒｏｌ）として表し、表３及び４に示した。なお、表３及び４中のＴＧ／ｐｒｏｔｅｉｎの値は、平均値±標準誤差（Ｎ＝４（対照群はＮ＝８））で表記し、末尾の符号「＊」及び「＊＊」は、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定で検定した対照との有意差：ｐがそれぞれ０．０５及び０．０１未満であったことを表す。
【０１０１】
【表３】
0005620660.tif 000020
【０１０２】
【表４】
0005620660.tif 000021
【０１０３】
なお、化合物Ａ（ケンフェロール３−Ｏ−ルチノシド）及び化合物Ｂ（ケルセチン３−Ｏ−ネオヘスペリドシド）についても、前記と同様にして細胞内脂肪代謝促進作用試験を行ったが活性は確認されなかった。
【０１０４】
表３及び表４の結果より、茶花から調製されたＡｃＯＥｔ可溶部、水溶出部、及び構造式（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）、（８）、（９）、（１０）、（１１）、（１２）、（１３）、（１４）、及び（１５）で表される化合物は、ＨｅｐＧ２細胞を用いた脂肪代謝促進作用試験において有意な脂肪代謝改善作用あるいは脂肪代謝改善傾向を有することがわかる。従って、これらを有効成分として利用することにより、脂肪代謝改善剤が得られることが示されている。