(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における前立腺癌の健康状態若しくは健康状態における変化、又は患者における前立腺癌若しくは前立腺癌のリスクを判定するためにデータを得る方法であって、
ａ）前記患者からの少なくとも１つの血液試料を分析して、１又は２以上の代謝産物マーカーについての定量データを得るステップと、
ｂ）前記１又は２以上の代謝産物マーカーについての定量データと、１又は２以上の標準試料について得られた対応データとを比較して、前記血液試料における前記１又は２以上の代謝産物マーカーのレベルの減少の有無を確認するステップとを含み、
前記１又は２以上の代謝産物マーカーが、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルジメチルエタノールアミン、及びリゾホスファチジルセリンからなる群より選択される、１又は２以上のリゾリン脂質を含み、
前記患者からの血液試料における前記１又は２以上の代謝産物マーカーのレベルの、前記１又は２以上の標準試料について得られた前記対応データに対する減少が、前記患者が前立腺癌を有すること又は前立腺癌のリスクを有することを示す、方法。
【請求項２】
患者における前立腺癌を治療する療法の効力を評価するためにデータを得る方法であって、
ａ）前記患者からの少なくとも１つの血液試料を分析して、１又は２以上の代謝産物マーカーについての定量データを得るステップと、
ｂ）前記１又は２以上の代謝産物マーカーについての定量データと、１又は２以上の標準試料について得られた対応データとを比較して、前記血液試料における前記１又は２以上の代謝産物マーカーのレベルの増加の有無を確認するステップとを含み、
前記１又は２以上の代謝産物マーカーが、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルジメチルエタノールアミン、及びリゾホスファチジルセリンからなる群より選択される、１又は２以上のリゾリン脂質を含み、
前記少なくとも１つの血液試料における前記１又は２以上の代謝産物マーカーのレベルの増加が、前記療法が前記患者の健康状態を改善していることを示す、方法。
【請求項３】
ステップａ）が、液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）によって血液試料を分析することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ハイスループット法であり、ステップａ）が、直接注入又は液体クロマトグラフィー、及び線形イオントラップタンデム質量分析法によって血液試料を分析することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
患者からの少なくとも１つの血液試料を分析して、１又は２以上の内部対照代謝産物についての定量データを得るステップと、
前記１又は２以上の代謝産物マーカーの各々のレベルの、前記１又は２以上の内部対照代謝産物について得られたレベルに対する比率を得るステップとをさらに含み、
ステップ（ｂ）が、各々の比率と、１又は２以上の標準試料について得られた１又は２以上の対応する比率とを比較するステップを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
１又は２以上の標準試料が、対照個体から得られた複数の試料；以前に患者から得られた１又は２以上の基線試料：又はその組合せである、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
リゾリン脂質が、リゾホスファチジルコリン関連化合物である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
リゾリン脂質が、Ｎ、Ｎ−ジメチル−リゾホスホエタノールアミン関連化合物である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
１又は２以上の代謝産物が、
ａ）分子式Ｃ２４Ｈ５１ＮＯ７Ｐ＋において、４９６、４７８、４１９、３１３、２８３、２５８、２３９、１８４、１６６、１０４及び８６から選択される［Ｍ＋Ｈ］＋モードで検出される少なくとも１つのＭＳ／ＭＳ移行；
ｂ）分子式Ｃ２６Ｈ４９ＮＯ７Ｐ＋において、５１８、４５９、４１５、３５９、３４１、２８１、２２１、１０４及び８６から選択される［Ｍ＋Ｈ］＋モードで検出される少なくとも１つのＭＳ／ＭＳ移行；
ｃ）分子式Ｃ２６Ｈ５１ＮＯ７Ｐ＋において、５２０、５０２、４６１、４４５、２８１、２２１、１８４、１６６、１２４及び８６から選択される［Ｍ＋Ｈ］＋モードで検出される少なくとも１つのＭＳ／ＭＳ移行；
ｄ）分子式Ｃ２６Ｈ５３ＮＯ７Ｐ＋において、５２２、５０４、４７８、３５７、２５８、２２１、１８４、１２４、１０４及び８６から選択される［Ｍ＋Ｈ］＋モードで検出される少なくとも１つのＭＳ／ＭＳ移行；
ｅ）分子式Ｃ２６Ｈ５５ＮＯ７Ｐ＋において、５２４、５０６、４９６、４７８、３３１、３１３、２５８、２８５、１８４、１６６、１２４、１０４及び８６から選択される［Ｍ＋Ｈ］＋モードで検出される少なくとも１つのＭＳ／ＭＳ移行；
ｆ）分子式Ｃ２８Ｈ４９ＮＯ７Ｐ＋において、５４２、４８３、２８４、２２５、１８４、１０４及び８６から選択される［Ｍ＋Ｈ］＋モードで検出される少なくとも１つのＭＳ／ＭＳ移行；又は
ｇ）分子式Ｃ２８Ｈ５３ＮＯ７Ｐ＋において、５４６、５２８、５１４、４８７、１０４及び８６から選択される［Ｍ＋Ｈ］＋モードで検出される少なくとも１つのＭＳ／ＭＳ移行；
によって特徴づけれられる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
１又は２以上の代謝産物が、
ｊ）分子式Ｃ２５Ｈ５１ＮＯ９Ｐ−において、５４０、４８０、２５５、２４２、２２４、１６８、１５３及び７９から選択される［Ｍ−Ｈ］−モードで検出される少なくとも１つのＭＳ／ＭＳ移行；
ｌ）分子式Ｃ２７Ｈ５１ＮＯ９Ｐ−において、５６４、５０４、４５４、２７９、２４２、２２４、１６８、１５３及び７９から選択される［Ｍ−Ｈ］−モードで検出される少なくとも１つのＭＳ／ＭＳ移行；
ｍ）分子式Ｃ２７Ｈ５３ＮＯ９Ｐ−において、５６６、５０６、２８１、２４２、２２４、１６８、１５３及び７９から選択される［Ｍ−Ｈ］−モードで検出される少なくとも１つのＭＳ／ＭＳ移行；又は
ｎ）分子式Ｃ２７Ｈ５５ＮＯ９Ｐ−において、５６８、５０８、２８３、２４２、２２４、１６８、１５３及び７９から選択される［Ｍ−Ｈ］−モードで検出される少なくとも１つのＭＳ／ＭＳ移行
によって特徴づけられる、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
１又は２以上の代謝産物が、
a) 
【化１】
0005612303.tif 000049
b)
【化２】
0005612303.tif 000050
c)
【化３】
0005612303.tif 000051
d)
【化４】
0005612303.tif 000052
e)
【化５】
0005612303.tif 000053
f)
【化６】
0005612303.tif 000054
又は
g)
【化７】
0005612303.tif 000055
の構造を有する、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
定量データが、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴、タイムオブフライト、オルビトラップ、四重極若しくは三重四重極質量分析を用いて得られる、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
質量分析計が、クロマトグラフィーシステムを備える、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
クロマトグラフィーシステムが、液体又はガスクロマトグラフィーシステムである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
血液試料が、全血試料、血清試料、又は血漿試料である、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
血液試料について液／液抽出を実施し、これにより無極性代謝産物が有機溶媒に溶解され、極性代謝産物が水性溶媒に溶解される、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
抽出された試料が、正若しくは負のエレクトロスプレーイオン化、正若しくは負の気圧化学イオン化、又はそれらの組合せにより分析される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ｂ）で定義した１又は２以上の標準試料のうち少なくとも１つが、以前に患者から得た治療前の基線試料である、請求項２に記載の方法。
【請求項１９】
患者における前立腺癌を判定するための請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
患者における前立腺癌のリスクを判定するための請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臨床的に前立腺癌陽性と診断された患者と正常患者との間で有意に異なる存在量又は強度（intensity）を有することが見出される小分子又は代謝産物に関する。本発明はまた、前立腺癌又は前立腺癌を発症するリスクを診断するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
前立腺癌は、生涯の間に６人に１人が罹患し、米国のみで１年に２００，０００人以上が診断を受け３０，０００人以上が死亡している（Troyer DA, Mubiru J, Leach RJ, Naylor SL. Promise and challenge: Markers of prostate cancer detection, diagnosis and prognosis. Dis Markers 2004;20(2):117-28）。これは、男性の癌による死亡原因の第２位である。前立腺癌に対する現在のスクリーニング方法には、血液試料中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）のレベルを検出する前立腺特異抗原試験及び直腸指診（ＤＲＥ）などがある。ＰＳＡ試験が採用されて以来、米国で危険状態にある男性の６０〜７０％がこの試験を受けてきたが、前立腺癌の死亡率はわずかしか低下しなかった。これは主に以下の２つの理由による：１）ＰＳＡ試験は、攻撃的な癌のサブセットを同定することができないという事実、及び２）ＰＳＡ試験陽性の男性の約３０％のみが陽性生検を示すという事実。前立腺癌について治療された全ての男性の中で約２５％は疾病再発を示し、さらなる治療を要するが、他の症例では一部の腫瘍は全く進行せず、治療を受けないままで治りうるという事実により診断はさらに複雑である。したがって、今日の前立腺癌診断の重要課題は、この疾病の経過を予測することができないことである。同時に、これらの統計からは、従来の方法での前立腺スクリーニングは意見の分かれるものとなった。したがって、理想的な前立腺癌バイオマーカー（複数可）であれば、早期検出に好適であると共に、疾病の攻撃性を予測することができ、理想的には治療中又は術後の疾病進行をモニターすることができるであろう。
【０００３】
現在、ＰＳＡは、前立腺癌に対する最良の利用可能な血清マーカーとして認められているが、改善の実質的な余地がある。１９９０年代初めに始まる、ＰＳＡ試験の影響は、全体的な死亡率減少と同時に、転移と診断された男性の数の減少にみることができる（Mettlin CJ, Murphy GP, Rosenthal DS, Menck HR. The National Cancer Data Base report on prostate carcinoma after the peak in incidence rates in the U.S. The American College of Surgeons Commission on Cancer and the American Cancer Society. Cancer 1998;83(8):1679-84）。しかし、これは、ＰＳＡスクリーニングが前立腺癌の認識を高め、これがより多くの生検の分析を最終的に促進した事実によると考えられる。発生率の民族性関連差異、及びほとんどの研究において、行われる生検の割合が臨床実務で通常行われるより高いことのために、ＰＳＡ試験の性能特性（感度及び特異性）を推定することは困難である。「前立腺癌予防試験」（Prostate Cancer Prevention Trial)（ＰＣＰＴ）（Thompson IM, Goodman PJ, Tangen CM, et al. The influence of finasteride on the development of prostate cancer. N Engl J Med 2003;349(3):215-24）において、高悪性度の腫瘍についての検出の偽陰性率は少なくとも１５％であり、偽陽性率は７０％である（即ち、高ＰＳＡを有する人の３０％のみが陽性生検を有する）。「医師の健康研究」(the Physician's Health Study)（Gann PH, Hennekens CH, Stampfer MJ. A prospective evaluation of plasma prostate-specific antigen for detection of prostatic cancer. Jama1995;273(4):289-94）という別の研究では、４年の期間を超える攻撃的な癌に対する感度は８７％であったが、非攻撃的な癌に対しては５３％に低下した。ＰＳＡ感度を評価するために他の多くの研究が実施されてきたが、最新の所見は全般的な感度がせいぜい７３％であるとしている（Schroder FH, van der Cruijsen-Koeter I, de Koning HJ, Vis AN,Hoedemaeker RF, Kranse R. Prostate cancer detection at low prostate specific antigen. The Journal of urology 2000;163(3):806-12）。ＰＳＡの閾値を下げるとより多くの癌を検出するが、より多くの偽陽性及びその後のより多くの生検の代償の上である。問題をさらに複雑することに、高齢の男性集団における良性前立腺過形成（ＢＰＨ）の有病率増加のために、４ｎｇ／ｍｌのカットポイントを有するＰＳＡ試験の感度は年齢とともに減少する。
【０００４】
ＰＳＡのみでは前立腺癌を診断できない。診断は複雑な過程であり、これには、身体検査、ＰＳＡ試験、グリーソン等級（生検での腺構造を評価することによる）及び恐らくは他の実験室検査の結果を統合することが含まれる。
【非特許文献１】Troyer DA, MubiruJ, Leach RJ, Naylor SL.Promise and challenge: Markers of prostate cancer detection, diagnosis and prognosis. DisMarkers 2004;20(2):117-28
【非特許文献２】Mettlin CJ, Murphy GP, Rosenthal DS, Menck HR. The National Cancer Data Base report on prostate carcinoma after the peak in incidence rates in the U.S.The American College of Surgeons Commission on Cancer and the American Cancer Society. Cancer 1998;83(8):1679-84
【非特許文献３】Thompson IM, Goodman PJ, Tangen CM, et al. The influence of finasterideon the development of prostate cancer. N Engl J Med 2003;349(3):215-24
【非特許文献４】Gann PH, HennekensCH, Stampfer MJ. A prospective evaluation of plasma prostate-specific antigen for detection of prostaticcancer. Jama 1995;273(4):289-94
【非特許文献５】Schroder FH, van der Cruijsen-KoeterI, de Koning HJ, Vis AN, Hoedemaeker RF, Kranse R. Prostate cancer detection at low prostate specific antigen. The Journal of urology 2000;163(3):806-12
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前立腺癌検出を改善する必要性が存在することは明らかである。前立腺癌のリスク若しくは存在を検出できる、又は高い特異性と感度で攻撃的な疾病を予測できる試験は、極めて有益であり、前立腺癌の死亡率に影響を与えるであろう。請求の範囲に記載された発明は、前立腺癌患者と正常個体との間の存在量の異なったパターンを示す、血清試料に存在する分子の発見について記載する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、臨床的に前立腺癌陽性と診断された患者と正常患者との間で有意に異なる存在量又は強度を有することが見出される小分子又は代謝産物に関する。本発明はまた、前立腺癌又は前立腺癌を発症するリスクを診断する方法に関する。
【０００７】
本発明は、前立腺癌を示す健康状態の診断のために、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）アッセイを確認、実証、及び実施する方法を提供する。特定の実施例において、本方法は、
１．代謝産物の保持時間を分離及び同定する；
２．それぞれの代謝産物に特異的な記述的ＭＳ／ＭＳ断片化パターンを生成する；
３．分子構造の特徴付けをする；及び
４．ハイスループット定量又は半定量ＭＳ／ＭＳ系診断アッセイを開発する
目的のために、正常生物学的試料と前立腺癌陽性生物学的試料との間で異なる全て統計的に有意な代謝産物特徴を同定するために非標的ＦＴＭＳ技術を用いる前立腺癌特異的生物学的試料及び正常生物学的試料の分析、その後に分子の統計及び化学的特性を用いる最適特徴サブセットの選択、並びに、限定されないが、クロマトグラフ分離、質量分析法（ＭＳ／ＭＳ）、及び核磁気共鳴（ＮＭＲ）を含む方法を用いる特徴セットの特徴付けを包含する。
【０００８】
本発明は、試料中に存在する特定の小分子のレベルを測定し、それらを「正常」基準レベルと比較することにより、ヒトにおける前立腺癌又は前立腺癌を発症するリスクを診断するための方法をさらに提供する。この方法は、患者からの試料中の特定の小分子（代謝産物ともいわれる）の強度を測定し、これらの強度を正常個体の集団で観察される強度と比較する。
【０００９】
本発明は、前立腺癌を診断するための１種又は複数の代謝産物マーカーを同定する方法であって、
ａ）１人又は複数の前立腺癌患者からの１種又は複数の試料を高分解能質量分析計に導入するステップであって、前記試料が複数の代謝産物を含むステップと；
ｂ）代謝産物についての定量データを得るステップと；
ｃ）前記定量データのデータベースを作成するステップと；
ｄ）前記試料からの同定及び定量データを１種又は複数の基準試料由来の試料からの対応データと比較するステップと；
ｅ）前記試料と前記１種又は複数の基準試料とで異なる１種又は複数の代謝産物マーカーを同定するステップと
を含む、方法を提供する。
【００１０】
代謝産物マーカーは、表１に記載される代謝産物又はその任意の組合せから選択される。この方法は、最適診断に必要とされる最小数の代謝産物マーカーを選択することをさらに含みうる。高分解能質量分析計は、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計（ＦＴＭＳ）であってもよい。
【００１１】
本発明は、患者における前立腺癌又は前立腺癌のリスクを診断する方法であって、
ａ）前記患者から試料を得るステップと；
ｂ）前記試料を分析して、１種又は複数の代謝産物マーカーについての定量データを得るステップと；
ｃ）前記１種又は複数の代謝産物マーカーについての定量データを１種又は複数の基準試料から得られる対応データと比較するステップと；
ｄ）前記比較を用いて、前立腺癌又は前立腺癌のリスクを示差的に診断するステップとを含む、方法も提供する。
【００１２】
１種又は複数の代謝産物マーカーは、表１に記載される代謝産物又はその任意の組合せから選択される。上記診断方法は、ステップｂ）において液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）によって試料を分析することを含みうる。他に、この方法がハイスループット法である場合、ステップｂ）は、液体クロマトグラフィー又は直接注入のいずれかの後に線形イオントラップタンデム質量分析法によって試料を分析することを含みうる。
【００１３】
上記方法において、１種又は複数の基準試料は、対照個体から得られた複数の試料；以前に患者から得られた１種又は複数の基線試料；又はその組合せであってもよい。
【００１４】
本発明のもう１つの実施形態において、患者における前立腺癌又は前立腺癌のリスクを診断する方法であって、
ａ）前記患者から試料を得るステップと；
ｂ）前記試料を分析して、１種又は複数の代謝産物マーカーについての定量データを得るステップと；
ｃ）前記１種又は複数の代謝産物マーカー対内部対照代謝産物のそれぞれについての比を得るステップと；
ｄ）前記１種又は複数の代謝産物マーカー対内部対照代謝産物のそれぞれについての比を、１種又は複数の基準試料から得られた対応データと比較するステップと；
ｅ）前記比較を用いて、前立腺癌又は前立腺癌のリスクを診断するステップと
を含む方法が、提供される。
【００１５】
上記診断方法は、表１に記載される代謝産物又はその任意の組合せから選択される１種又は複数の代謝産物マーカーを含みうる。上記診断方法は、ステップｂ）において液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）によって試料を分析することを含みうる。他に、この方法が、ハイスループット法である場合、ステップｂ）は、直接注入又は液体クロマトグラフィーのいずれか及び線形イオントラップタンデム質量分析法によって試料を分析することを含みうる。
【００１６】
上記方法において、１種又は複数の基準試料は、対照個体から得られた複数の試料；以前に患者から得られた１種又は複数の基線試料；又はその組合せでありうる。
【００１７】
本発明は、患者における前立腺癌を治療するための治療法の効果を評価する方法であって、
ａ）前記患者から試料を得るステップと；
ｂ）前記試料を分析して、１種又は複数の代謝産物マーカーについての定量データを得るステップと；
ｃ）前記定量データを１種又は複数の基準試料から得られた対応データと比較するステップと；
ｄ）前記比較を用いて、前記治療法が患者の健康状態を改善しているかどうかを判定するステップと
を含む方法を、さらに提供する。
【００１８】
ここで、１種又は複数の代謝産物マーカーは、表１に記載された代謝産物又はその任意の組合せから選択される。上記診断方法は、ステップｂ）において液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）によって試料を分析することを含みうる。他に、この方法が、ハイスループット法である場合、ステップｂ）は、直接注入又は液体クロマトグラフィー、及び線形イオントラップタンデム質量分析法によって試料を分析することを含みうる。
【００１９】
上記方法において、１種又は複数の基準試料は、対照個体から得られた複数の試料；患者から得られた１種又は複数の前治療基線試料；又はその組合せでありうる。
【００２０】
本発明のさらにもう１つの実施形態において、患者における前立腺癌を治療するための治療法の効果を評価する方法であって、
ａ）前記患者から試料を得るステップと；
ｂ）前記試料を分析して、１種又は複数の代謝産物マーカーについての定量データを得るステップと；
ｃ）１種又は複数の代謝産物マーカー対内部対照代謝産物のそれぞれについての比を得るステップと；
ｄ）前記１種又は複数の代謝産物マーカー対内部対照代謝産物のそれぞれについての比を１種又は複数の基準試料から得られた対応データと比較するステップと；
ｅ）前記比較を用いて、前記治療法が患者の健康状態を改善しているかどうかを判定するステップと
を含む方法が提供される。
【００２１】
ここで、１種又は複数の代謝産物マーカーは、表１に記載された代謝産物又はその任意の組合せから選択される。上記診断方法は、ステップｂ）において液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）によって試料を分析することを含みうる。他に、この方法が、ハイスループット法である場合、ステップｂ）は、直接注入又は液体クロマトグラフィー、及び線形イオントラップタンデム質量分析法によって試料を分析することを含みうる。
【００２２】
上記方法において、１種又は複数の基準試料は、対照個体から得られた複数の試料；前記患者から得られた１種又は複数の前治療基線試料；又はその組合せでありうる。
【００２３】
本明細書において記載される上記方法は、前立腺癌をモニターする他の方法、例えば、ＰＳＡ試験と組み合わせてもよい。
【００２４】
上記診断方法及び治療の効果を評価する方法において、１種又は複数の代謝産物マーカーは、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルジメチルエタノールアミン、リゾホスファチジルセリン、リゾスフィンゴシルホスホリルコリン、リゾホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジルイノシトール、血小板活性化因子（ＰＡＦ）、及びその組合せを含むリゾリン脂質からなる群から選択されうる。例えば、１種又は複数の代謝産物マーカーは、ドルトンで測定して、ａ）４９５．３３２８、ｂ）５１７．３１４８、ｃ）５１９．３３２８、ｄ）５２１．３４８０、ｅ）５２３．３６４０、ｆ）５４１．３１４８、ｇ）５４５．３４６０、ｈ）４８１．３１７１、ｉ）５３１．３１２３、ｊ）５４１．３４２２、ｋ）５５５．３１０１、ｌ）５６５．３３９４、ｍ）５６７．３５４６、及びｎ）５６９．３６８７という正確な質量、又はそれに実質的に等しい質量を有する代謝産物を含みうる。１種又は複数の代謝産物についての定量データが比較される方法において、これらの代謝産物は、前立腺癌患者で低下していることが観察される。１種又は複数の代謝産物対内部対照代謝産物についての比が比較される方法において、代謝産物対内部対照代謝産物の比が前立腺癌患者において低下している。
【００２５】
代謝産物ａ）〜ｇ）は、リゾホスファチジルコリン関連化合物であり、代謝産物ｈ）〜ｎ）は、推定上Ｎ，Ｎ−ジメチルリゾホスファチジルエタノールアミン関連化合物である。代謝産物ａ）〜ｎ）は、それぞれａ）図７に示される通り、及び／又は表３に記載される通り；ｂ）図８に示される通り、及び／又は表４に記載される通り；ｃ）図９に示される通り、及び／又は表５に記載される通り；ｄ）図１０に示される通り、及び／又は表６に記載される通り；ｅ）図１１に示される通り、及び／又は表７に記載される通り；ｆ）図１２に示される通り、及び／又は表８に記載される通り；ｇ）図１３に示される通り、及び／又は表９に記載される通り；ｈ）図１４に示される通り、及び／又は表１２に記載される通り；ｉ）図１５に示される通り、及び／又は表１３に記載される通り；ｊ）図１６に示される通り、及び／又は表１４に記載される通り；ｋ）図１７に示される通り、及び／又は表１５に記載される通り；ｌ）図１８に示される通り、及び／又は表１６に記載される通り；ｍ）図１９に示される通り、及び／又は表１７に記載される通り；並びにｎ）図２０に示される通り、及び／又は表１８に記載される通りのＭＳ／ＭＳスペクトルをさらに特徴としうる。
【００２６】
さらに、上記の１種又は複数の代謝産物は、分子式ａ）Ｃ２４Ｈ５０ＮＯ７Ｐ、ｂ）Ｃ２６Ｈ４８ＮＯ７Ｐ、ｃ）Ｃ２６Ｈ５０ＮＯ７Ｐ、ｄ）Ｃ２６Ｈ５２ＮＯ７Ｐ、ｅ）Ｃ２６Ｈ５４ＮＯ７Ｐ、ｆ）Ｃ２８Ｈ４８ＮＯ７Ｐ、ｇ）Ｃ２８Ｈ５２ＮＯ７Ｐ、ｈ）Ｃ２３Ｈ４８ＮＯ７Ｐ、ｉ）Ｃ３０Ｈ４６ＮＯ５Ｐ、ｊ）Ｃ２５Ｈ５２ＮＯ９Ｐ、ｋ）Ｃ２５Ｈ５０ＮＯ１０Ｐ、ｌ）Ｃ２７Ｈ５２ＮＯ９Ｐ、ｍ）Ｃ２７Ｈ５４ＮＯ９Ｐ、及びｎ）Ｃ２７Ｈ５６ＮＯ９Ｐをさらに特徴としうる。１種又は複数の代謝産物の構造は、それぞれ以下：
【００２７】
ａ）  
【化１】
0005612303.tif 000002
ｂ）
【化２】
0005612303.tif 000003
ｃ）
【化３】
0005612303.tif 000004
ｄ）
【化４】
0005612303.tif 000005
ｅ）
【化５】
0005612303.tif 000006
ｆ）
【化６】
0005612303.tif 000007
ｇ）
【化７】
0005612303.tif 000008
ｈ）
【化８】
0005612303.tif 000009
ｊ）
【化９】
0005612303.tif 000010
ｋ）
【化１０】
0005612303.tif 000011
ｌ）
【化１１】
0005612303.tif 000012
ｍ）  
【化１２】
0005612303.tif 000013
及び
ｎ）
【化１３】
0005612303.tif 000014
【００２８】
のように特徴付けすることができる。
【００２９】
本発明は、新規な化合物も提供する。これらの化合物は、ドルトンで測定して、ａ）５３１．３１２３、ｂ）５４１．３４２２、ｃ）５５５．３１０１、ｄ）５６５．３３９４、ｅ）５６７．３５４６、及びｆ）５６９．３６８７という正確な質量、又はそれに実質的に等しい質量を有する代謝産物からなる群から選択される。
【００３０】
上記に記載される化合物は、それぞれ
ａ）図１５に示される通り、及び／又は表１３に記載される通り；
ｂ）図１６に示される通り、及び／又は表１４に記載される通り；
ｃ）図１７に示される通り、及び／又は表１５に記載される通り；
ｄ）図１８に示される通り、及び／又は表１６に記載される通り；
ｅ）図１９に示される通り、及び／又は表１７に記載される通り；並びに
ｆ）図２０に示される通り、及び／又は表１８に記載される通り
のＭＳ／ＭＳスペクトルをさらに特徴としうる。
【００３１】
同様に、上記化合物は、それぞれ表１２から表１８に示される通りのＭＳ／ＭＳスペクトルをさらに特徴としうる。
【００３２】
この化合物は、それぞれ分子式ａ）Ｃ３０Ｈ４６ＮＯ５Ｐ、ｂ）Ｃ２５Ｈ５２ＮＯ９Ｐ、ｃ）Ｃ２５Ｈ５０ＮＯ１０Ｐ、ｄ）Ｃ２７Ｈ５２ＮＯ９Ｐ、ｅ）Ｃ２７Ｈ５４ＮＯ９Ｐ、及びｆ）Ｃ２７Ｈ５６ＮＯ９Ｐもさらに特徴としうる。さらに、上記化合物は、それぞれ推定構造
【００３３】
ｂ）
【化１４】
0005612303.tif 000015
ｃ）
【化１５】
0005612303.tif 000016
ｄ）  
【化１６】
0005612303.tif 000017
ｅ）
【化１７】
0005612303.tif 000018
ｆ）
【化１８】
0005612303.tif 000019
【００３４】
を特徴としうる。
【００３５】
本発明の新規な化合物は、前立腺癌の診断のために、又は患者における前立腺癌の治療の効果を評価するために使用しうる。
【００３６】
本発明は、前立腺癌又は前立腺癌を発症するリスクを検出する能力に有意に影響を与えることができ、人命を救いうる。これらの試料に基づく試験の統計的性能は、試験が前立腺癌についての唯一の他の血清に基づく診断試験であるＰＳＡ試験より優れることを示唆する。他に、本明細書に記載される方法とＰＳＡ試験との組合せは、それぞれの試験の全般的な診断性能を改善しうる。
【００３７】
ＨＴＳアッセイを含む本発明の方法は、以下に用いることができ、ここで、特定の「健康状態」は、限定されないが、前立腺癌をいう：
【００３８】
１．個体から採取された血清試料などの任意の生物学的試料を用いて前立腺癌陽性個体と前立腺癌陰性個体とを区別することができる小分子代謝産物バイオマーカーを同定すること；
【００３９】
２．本明細書に記載される通り、血清、血漿、全血、及び／又はその他の組織生検などの試料において同定された代謝産物を用いて、特に前立腺癌を診断すること；
【００４０】
３．一変量又は多変量統計方法、及び本明細書に記述される分子などの分子についての関連化学情報を用いて、最適診断アッセイ性能統計に必要とされる最小数の代謝産物特徴を選択すること；
【００４１】
４．ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、ＭＳｎ及びＮＭＲを用いる非標的代謝学的分析から選択されたバイオマーカー代謝産物の構造特性を同定すること；
【００４２】
５．試料における選択された代謝産物レベルをアッセイするためのハイスループットトリプル四重極ＭＳ／ＭＳ法を開発すること；
【００４３】
６．限定されないが、質量分析法、ＮＭＲ、ＵＶ検出、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検査法）、化学反応、画像分析、又はその他を含む任意の方法を用いて、患者試料のＦＴＭＳ分析から開示される代謝産物の特徴の任意の組合せのレベルを決定することによって前立腺癌又は前立腺癌を発症するリスクを診断すること；
【００４４】
７．薬剤（化学療法）、放射線療法、外科手術、食事療法、生活様式効果又はその他を含む、前立腺癌の任意の療法治療をモニターすること；並びに／或いは
【００４５】
９．この方法において開示された任意の単一又は組合せの特徴を用いて、前立腺癌について一般集団を長期的にモニターする又はスクリーニングすること。
【００４６】
リスクを評価するために文字通りあらゆる人を生涯にわたって長期的にスクリーニングできるので、前立腺癌の診断への本発明の影響は多大である。本発明の試験の性能特性が一般集団について代表的ということであれば、臨床症状の出現前にこれらの進行を検出する能力を有しうるので、この試験のみで現在利用できる他のどのスクリーニング法よりも優れることがありうる。
【００４７】
本発明のこの要約は、本発明の全ての特徴を必ずしも記載するものではない。
【００４８】
本発明のこれら及び他の特徴は、添付の図面に対して言及がなされる以下の説明からより明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
本発明は、前立腺癌陽性と臨床的に診断された患者と正常患者との間で有意に異なる存在量又は強度を有することが見出される小分子又は代謝産物に関する。本発明はまた、前立腺癌又は前立腺癌を発症するリスクを診断する方法に関する。
【００５０】
本発明は、前立腺癌のための診断方法を発見、実証、及び実施する新規な方法を提供する。本発明の１つの実施形態において、前立腺癌を診断するための特定のバイオマーカーを同定する方法であって、１人又は複数の前立腺癌患者からの１種又は複数の試料を高分解能質量分析計（例えば、限定的であることを望まないが、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計（ＦＴＭＳ））に導入するステップであって、前記試料が複数の代謝産物を含むステップと；代謝産物についてのデータを取得、同定、及び定量するステップと；前記定量データのデータベースを作成するステップと；前記試料からの定量データを対照患者からの１種又は複数の試料から得られた対応データと比較するステップと；異なる１種又は複数の代謝産物を同定するステップとを含む方法が提供される。本発明の方法を用いて同定される代謝産物マーカーには、表１に記載される代謝産物が含まれうる。この方法は、最適診断に必要とされる最小数の代謝産物マーカーを選択するステップをさらに含みうる。
【００５１】
特定の集団における所与の健康状態の生物化学的マーカーを決定するために、健康状態（即ち、特定の疾病）を代表する患者の群及び／又は「正常の」若しくは「対照の」相手方（即ち、特定の健康状態を患わない個体）の群が必要である。次いで、特定の健康状態における患者から取得された生物学的試料は、限定されないがＦＴＭＳ及び／又はＬＣ−ＭＳを含む分析方法を用いて、試料中に存在する生化学物質を分析することによって、正常集団から取得された同じ試料、並びに２つの群間の生化学的差異を同定することを期待して同様の健康状態カテゴリーにある患者から取得された試料と比較することができる。
【００５２】
上記されたような代謝産物マーカーを発見するための方法は、非標的代謝学的戦略又は方法を用いて行うことができる。多数非標的代謝学的戦略は、ＮＭＲ（Reo Nv. NMR-based metabolomics. Drug Chem Toxicol 2002;25(4);375-82）、ＧＣ−ＭＳ（Taylor J, King RD, Altmann T, Fiehn O. Application of metabolomicsto plant genotype discrimination using statistics and machine learning. Bioinformatics 2002;18 Suppl 2:S241-8）、ＬＣ−ＭＳ（Katajamaa M, Oresic M. Processing methods for differential analysis of LC/MS profile data, BMC Bioinformatics 2005;6:179）及びＦＴＭＳ戦略（Aharoni A, Ric de Vos CH, Verhoeven HA, et al. Nontargeted metabolome analysis by use of Fourier Transform Ion Cyclotron Mass Spectrometry. Omics 2002;6(3):217-34、Hirai MY, Klein M, Fujikawa Y, et al. Elucidation of gene-to-gene and metabolite-to-gene networks in arabidopsis by integration of metabolomicsand transcriptomics. The Journal of biological chemistry 2005;280(27):25590-5、Hirai MY, Yano M, Goodenowe DB, et al. Integration of transcriptomicsand metabolomics for understanding of global responses to nutritional stresses in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2004;101(27):10205-10)を含む科学文献に記載されてきた。本発明において示差的に発現される代謝産物の発見に用いられる代謝学的プロファイリング戦略は、現象発見による非標的ＦＴＭＳ戦略であった［非特許文献２１、非特許文献２４〜２７；米国特許公開出願第２００４−００２９１２０Ａ１号公報、カナダ特許出願第２，２９８，１８１号、及び国際公開第０１５７５１８号パンフレットも参照されたい］。非標的分析には、分析前に成分の任意の前もっての知識を有することなく又は成分の選択をすることなく、試料中の可能な限り多くの分子を測定することが含まれる。したがって、新規な代謝産物バイオマーカーを発見するための非標的分析の可能性は、予め決められた一覧の分子を検出する標的方法に対して高い。本発明は、前立腺癌を有する個体と対照個体（即ち、前立腺癌を有しない個体）とで異なる血清試料中の代謝産物成分を同定するために非標的法を用いる。
【００５３】
しかし、当業者であれば、本発明として開示され、示差的に規定される代謝産物の一部又は全てを発見するために他の代謝産物プロファイリング戦略を用いることができること、及び本明細書に記載される代謝産物は、発見又は測定されるが、それらを検出及び測定するのに用いられうる分析技術とは無関係の独特の化学的実体を表すことを認めるであろう。例えば、限定的であることを決して望まないが、代謝産物検出の他の方法、例えば、他のＭＳベースプラットフォーム、ＥＬＩＳＡ、比色法、などを用いることができる。
【００５４】
本発明はまた、患者における前立腺癌又は前立腺癌を発症するリスクを診断する方法であって、
ａ）前記患者から試料を得るステップと；
ｂ）前記試料を分析して、１種又は複数の代謝産物マーカーについての定量データを得るステップと；
ｃ）前記１種又は複数の代謝産物マーカーについての定量データを、１種又は複数の基準試料から得られた対応データと比較するステップと；
ｄ）前記比較を用いて、前立腺癌又は前立腺癌を発症するリスクを診断するステップと
を含む方法を提供する。
【００５５】
試料を分析するステップ（ステップｂ）は、質量分析計（ＭＳ）を用いて試料を分析することを含みうる。例えば、限定的であることを望まないが、このような質量分析計は、ＦＴＭＳ型、オービトラップ型、飛行時間型（ＴＯＦ）又は四重極型のうちであることができる。他に、質量分析計は、付加的な前検出器質量フィルターを備えることができる。例えば、限定的であることを望まないが、このような機器は、通常、四重極−ＦＴＭＳ（Ｑ−ＦＴＭＳ）、四重極−ＴＯＦ（Ｑ−ＴＯＦ）又はトリプル四重極（ＴＱ又はＱＱＱ）といわれる。さらに、質量分析計は、親イオン検出モード（ＭＳ）又はＭＳｎモード（ここで、ｎ＞＝２である）のいずれかで操作することができる。ＭＳｎは、親イオンが衝突誘起解離（ＣＩＤ）又はフラグメントイオンを生成する他の断片化操作によって断片化し、次いで、１種又は複数のフラグメントを質量分析計で検出する状況をいう。次いで、このようなフラグメントは、さらに断片化されて、さらにフラグメントを生成する。他に、試料は、液体若しくはガスクロマトグラフィーシステムを用いて、又は直接注入によって質量分析計に導入することができる。
【００５６】
本発明の方法において、身体内の任意の場所を起源とする任意の種類の生物学的試料、例えば、限定されないが、血液（血清／血漿）、ＣＳＦ、尿、糞便、呼気、唾液、又は、任意の固形組織（腫瘍、隣接正常平滑骨格筋、脂肪組織、肝臓、皮膚、毛、脳、腎臓、膵臓、肺、結腸、胃、又はその他を含む）の生検を用いることができる。特に重要なものは血清である試料である。用語「血清」が本明細書において用いられるが、当業者は、血漿又は全血若しくは全血のサブ画分も用いうることを認めるであろう。
【００５７】
年齢、民族性、体重、職業にわたるとともに、様々な非前立腺癌関連健康状態を示す、個体の多様な集団からの正常群及び前立腺癌陽性群の両方において、生物学的試料は得ることができる。このように対象を選択することは、データセット中に、より変動を導入するが、混同バイアス可能性を減少させ、最終的にバイオマーカーのより強固なセットをもたらす（多くの他の変化する要素が存在する中で疾病を依然として検出できるので）。
【００５８】
非限定的な例において、血液試料を患者から採る場合、試料を処理しうるいくつかの方法がある。処理の範囲は、ほとんど何もないか（即ち、凍結全血）、又は特定の細胞型の分離のように複雑でありうる。最も一般的且つ日常的な手順には、全血から血清又は血漿のいずれかを調製することが含まれる。血液試料を固相支持体、例えば、ろ紙又は他の固定材料にスポットすることを含む血液試料の全ての処理法も、本発明によって企図される。
【００５９】
次いで、限定的であることを決して望まないが、上記処理された血液若しくは血清又は試料は、処理された血清試料又は血液試料内に含まれる代謝産物の検出及び測定に用いられる系統的分析技術と適合させるためにさらに処理することができる。処理の種類は、ほとんどさらなる処理がない処理から微分抽出及び化学的誘導体化のように複雑な処理までの範囲でありうる。抽出法には、一般的な溶媒、例えば、メタノール、エタノール、アルコールと水との混合物、又は有機溶媒、例えば、酢酸エチル若しくはヘキサン中の超音波処理、ソックスレー抽出、マイクロ波補助抽出（ＭＡＥ）、超臨界流体抽出（ＳＦＥ）、促進溶媒抽出（ＡＳＥ）、加圧液体抽出（ＰＬＥ）、加圧熱水抽出（ＰＨＷＥ）及び／又は界面活性剤補助抽出（ＰＨＷＥ）などを挙げることができる。ＦＴＭＳ非標的分析並びにトリプル四重極質量分析計での直接注入のために代謝産物を抽出するのに特に重要な方法は、液体／液体抽出を行うことであり、それにより非極性代謝産物は有機溶媒に溶解し、極性代謝産物は水性溶媒に溶解する。
【００６０】
抽出試料は、当技術分野で知られた任意の好適な方法を用いて分析することができる。例えば、限定的であることを決して望まないが、生物学的試料の抽出物は、直接注入又はその後のクロマトグラフィー分離のいずれによる本質的に任意の質量分析法プラットフォーム上での分析になじみやすい。典型的な質量分析計は、試料内の分子をイオン化する源、及びイオン化された分子又は分子のフラグメントを検出する検出器から構成される。一般的な源の非限定的例には、電子衝撃、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ）、マトリックス補助レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、表面強化レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）、及びその派生物などが挙げられる。一般的な質量分離及び検出系には、四重極型、四重極イオントラップ型、線形イオントラップ型、飛行時間型（ＴＯＦ）、磁場型、イオンサイクロトロン型（ＦＴＭＳ）、オービトラップ型、並びにその派生物及び組合せが含まれうる。ＦＴＭＳが他のＭＳベースプラットフォームに対して有利な点は、低分解能機器によって見逃されるであろう多くの、ドルトンのわずか１００分の１異なる代謝産物の分離を可能にするその高い分解能である。
【００６１】
用語「代謝産物」とは、試料中でそのレベル又は強度が測定され、疾病状態を診断するマーカーとして用いることができる特定の小分子を意味する。これらの小分子は、本明細書において「代謝産物マーカー」、「代謝産物成分」、「バイオマーカー」、「生化学的マーカー」、又は「代謝産物特徴」とも称される。
【００６２】
代謝産物は一般に、上記方法において用いられる質量分析法技術によって測定されるようなそれらの正確な質量を特徴とする。正確な質量は、「正確な中性質量」又は「中性質量」とも称される。代謝産物の正確な質量は、本明細書においてドルトン（Ｄａ）で与えられるか、又は実質的にそれに等しい質量である。「実質的にそれに等しい」とは、当業者によって認められるであろうように、正確な質量における±５ｐｐｍ［part per million（百万分部当たり一部）］の差は、同一の代謝産物を示すことを意味する。質量精度は、理論質量と測定質量との間に観察される差：デルタ質量精度（Δｍ）＝ｍ（真値）−ｍ（測定値）であり、これはしばしば百万分部当たり一部（ｐｐｍ）で表される。ｐｐｍは、１，０００，０００＊Δｍ（精度）／ｍ（測定値）（例えば、理論質量：１０００、測定質量：９９９．９、誤差：１００ｐｐｍ）として定義される。
【００６３】
正確な質量は、中性代謝産物の質量として与えられる。当業者に認められるであろうように、試料の分析中に生じる代謝産物がイオン化すると、代謝産物は１個又は複数の水素原子の喪失又は獲得、及び電子の喪失又は獲得のいずれかを引き起こす。これはその正確な質量を「イオン化質量」に変化させ、これは、イオン化中に喪失され又は獲得された水素及び電子の質量だけ正確な質量から異なる。特記されない限り、正確な中性質量が本明細書において言及される。
【００６４】
同様に、代謝産物がその分子式又は構造によって記載される場合、特記されない限り、中性代謝物質の分子式又は構造が与えられる。当然に、イオン化代謝産物の分子式又は構造は、イオン化中に喪失された又は獲得された水素の数だけ中性分子式又は構造から異なる。
【００６５】
データは分析中に収集され、１種又は複数の代謝産物についての定量データが得られる。「定量データ」は、試料中に存在する特定の代謝産物のレベル又は強度を測定することによって得られる。測定値自体は、相対測定値（例えば、別の試料又は分布に対する強度の比較）、又は定量的測定値（例えば、Ｘｍｇ／ｍｌなどの濃度）でありうる。
【００６６】
定量データは、１種又は複数の基準試料からの対応データと比較される。「基準試料」（本明細書において「対照試料」ともいう）は、特定の疾病状態のための任意の好適な基準試料である。例えば、限定的であることを決して望まないが、本発明において、基準試料は、対照個体、即ち、前立腺癌を患っていない人（本明細書において、「正常の」、「対照の」、又は「基準の」個体又は患者ともいう）からの試料であることができ；基準試料は、前立腺癌患者から得られた試料でもありうる。当業者によって理解されるであろうように、１種又は複数の基準試料は、定量データに対する比較に用いることができる。例えば、限定的であることを望まないが、１種又は複数の基準試料は、対照個体から得られた最初の基準試料でありうる。１種又は複数の基準試料は、先の日付に患者から得られた試料でもあることができ；これは生涯を通しての患者の健康状態の長期的なモニタリングを可能とするであろう。このような試料は、連続的な時間間隔にわたって収集することができる。もう１つの例において、基準試料は、施された治療の効果をモニターするために治療前（即ち、前治療）の前立腺癌患者からも得ることができる。当業者であれば、このような基準試料の組合せを本発明の方法に用いることができることも認めるであろう。
【００６７】
本発明はまた、本発明の方法を用いて同定される新規な化合物を提供する。新規な化合物は、上記の通り、前立腺癌又は前立腺癌を発症するリスクの診断の代謝産物マーカーとして用いることができる。
【００６８】
１つの実施形態において、この化合物は、表１に記載される代謝産物又はその任意の組合せから選択されうる。代謝産物の最適パネルは、表１に示される４９２個の代謝産物の群から選択されうる。例えば、限定的であることを望まないが、代謝産物マーカーの最適パネルは、５１９．３３２８、５４１．３１４８、５４５．３４６０、５５５．３１０１、５４１．３４２２、５６５．３３９４、５２１．３４８０、５１７．３１４８、５６７．３５４６、５２３．３６４０、５３１．３１２３、４８１．３１７１、４９５．３３２８、５６９．３６８７という正確な質量（ドルトンで測定）を有する代謝産物であることができ、ここで、±５ｐｐｍの差は、同一の代謝産物であることを示す。特に、血清又は組織で測定された場合、ちょうど記載された１４個の代謝産物は、対照（疾病を有しない）個体に比べて前立腺癌陽性対象において、より低い濃度を示す。
【００６９】
上記１４個の代謝産物マーカーは、水性抽出物におけるそれらの検出及び陽又は陰のいずれかにイオン化するそれらの特性に基づいて、２群の１つに分類することができる。４９５．３３２８、５１７．３１４８、５１９．３３２８、５２１．３４８０、５２３．３６４０、５４１．３１４８、及び５４５．３４６０という正確な質量（ドルトンで測定）を有する代謝産物（ここで、±５ｐｐｍの差は、同一の代謝産物を示す）は、現に記載される方法を用いて陽イオンとして検出され；４８１．３１７１、５３１．３１２３、５４１．３４２２、５５５．３１０１、５６５．３３９４、５６７．３５４６、及び５６９．３６８７という正確な質量（ドルトンで測定）を有する代謝産物（ここで、±５ｐｐｍの差は、同一の代謝産物を示す）は、現に記載される方法を用いて陰イオンとして検出された。
【００７０】
上記１４個の代謝産物は、リゾリン脂質クラス、例えば、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルジメチルエタノールアミン、リゾホスファチジルセリン、リゾスフィンゴシルホスホリルコリン、リゾホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジルイノシトール、血小板活性化因子（ＰＡＦ）、及びその組合せの代謝産物に関連する。
【００７１】
リゾリン脂質種を含む上記の特定の代謝産物の濃度は、前立腺癌又は前立腺癌のリスクを診断するために検出される。上記代謝産物の任意の組合せは、診断結果に到達するために同時に、連続的に、又は異なる組合せで測定することができる。
【００７２】
上記代謝産物の構造特徴付けは、当業者に周知の方法を用いて行うことができる。代謝産物を特徴付けするのに用いられうる主要な特徴には、限定されないが、正確な質量、分子式、極性、酸／塩基特性、ＮＭＲスペクトル、及びＭＳ／ＭＳ若しくはＭＳｎスペクトルが含まれうる。これらの特性を測定するために用いられる技術には、限定されないが、Ｃ１８カラムを用いる逆相ＬＣ−ＭＳに続けて、ＭＳ、衝突誘起解離（ＣＩＤ）を用いるＭＳ／ＭＳ断片化、ＮＭＲ、及び抽出による分析が含まれる。得られたデータは、特定された実験条件下で特定の代謝産物の指紋又は独特の識別子として用いることができる。本出願によって記載される任意又は全ての代謝産物は、様々な条件下で指紋化でき、代謝産物のさらなる情報、例えば、分子の構造又は性質を与えることができる。
【００７３】
上記代謝産物マーカーの最適パネル内の代謝産物は、衝突誘起解離から生じるＭＳ／ＭＳ断片化パターンによってさらに特徴付けすることができる。特に、以下の正確な質量を有する代謝産物は、以下の通りである。
【００７４】
正確な質量４９５．３３２８を有する代謝産物は、４９６．３４０１（［Ｍ＋Ｈ］＋、Ｃ２４Ｈ５１ＮＯ７Ｐ＋について計算値４９６．３３９８）のイオン化質量を有する。ＭＳ／ＭＳフラグメント（ＭＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ）（相対強度）は、４９６（［Ｍ＋Ｈ］＋、９０％）、４７８（５％）、４１９（１％）、３１３（１％）、２８３（１％）、２５８（１％）、２３９（１％）、１８４（９０％）、１６６（１％）、１０４（１００％）、８６（７０％）である；図７、表３を参照。
【００７５】
正確な質量５１７．３１４８を有する代謝産物は、５１８．３２１９（［Ｍ＋Ｈ］＋、Ｃ２６Ｈ４９ＮＯ７Ｐ＋について計算値５１８．３２４１）のイオン化質量を有する。ＭＳ／ＭＳフラグメント（ＭＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ）（相対強度）は、５１８（［Ｍ＋Ｈ］＋、９０％）、４５９（１０％）、４１５（１％）、３５９（１％）、３４１（１％）、３１３（１％）、２８１（１％）、２２１（１％）、１０４（１００％）、８６（３０％）である；図８、表４を参照。
【００７６】
正確な質量５１９．３３２８を有する代謝産物は、５２０．３４０１（［Ｍ＋Ｈ］＋、Ｃ２６Ｈ５１ＮＯ７Ｐ＋について計算値５２０．３３９８）のイオン化質量を有する。ＭＳ／ＭＳフラグメント（ＭＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ）（相対強度）は、５２０（［Ｍ＋Ｈ］＋、１０％）、５０２（１％）、４６１（５％）、２８１（１％）、２２１（１％）、１８４（１００％）、１６６（５％）、１２４（１％）、８６（３０％）である；図９、表５を参照。
【００７７】
正確な質量５２１．３４８０を有する代謝産物は、５２２．３５５４（［Ｍ＋Ｈ］＋、Ｃ２６Ｈ５３ＮＯ７Ｐ＋について計算値５２２．３５５４）のイオン化質量を有する。ＭＳ／ＭＳフラグメント（ＭＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ）（相対強度）は、５２２（［Ｍ＋Ｈ］＋、１００％）、５０４（７％）、４７８（１％）、３５７（１％）、２５８（１％）、２２１（１％）、１８４（６０％）、１２４（５％）、１０４（８０％）、８６（３０％）である；図１０、表６を参照。
【００７８】
正確な質量５２３．３６４０を有する代謝産物は、５２４．３７１３（［Ｍ＋Ｈ］＋、Ｃ２６Ｈ５５ＮＯ７Ｐ＋について計算値５２４．３７１１）のイオン化質量を有する。ＭＳ／ＭＳフラグメント（ＭＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ）（相対強度）は、５２４（［Ｍ＋Ｈ］＋、１００％）、５０６（５％）、４９６（１％）、４７８（１％）、３３１（１％）、３１３（１％）、２８５（１％）、２５８（１％）、１８４（７０％）、１６６（２％）、１２４（５％）、１０４（７０％）、８６（３０％）である；図１１、表７を参照。
【００７９】
正確な質量５４１．３１４８を有する代謝産物は、５４２．３２１９（［Ｍ＋Ｈ］＋、Ｃ２８Ｈ４９ＮＯ７Ｐ＋について計算値５４２．３２４１）のイオン化質量を有する。ＭＳ／ＭＳフラグメント（ＭＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ）（相対強度）は、５４２（［Ｍ＋Ｈ］＋、８０％）、４８３（２５％）、２８４（１％）、２２５（１％）、１８４（１％）、１０４（１００％）、８６（３０％）である；図１２、表８を参照。
【００８０】
正確な質量５４５．３４６０を有する代謝産物は、５４６．３５３４（［Ｍ＋Ｈ］＋、Ｃ２８Ｈ５３ＮＯ７Ｐ＋について計算値５４６．３５５４）のイオン化質量を有する。ＭＳ／ＭＳフラグメント（ＭＳ／ＭＳ ｍ／ｚ）（相対強度）は、５４６（［Ｍ＋Ｈ］＋、９０％）、５２８（１％）、５１４（１％）、４８７（３０％）、１０４（１００％）、８６（３０％）である；図１３、表９を参照。
【００８１】
正確な質量４８１．３１７１を有する代謝産物は、４８０．３０９１（［Ｍ−Ｈ］−、Ｃ２３Ｈ４７ＮＯ７Ｐ−について計算値４８０．３０８１）のイオン化質量を有する。ＭＳ／ＭＳフラグメント（ＭＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ）（相対強度）は、４８０（［Ｍ−Ｈ］−、１００％）、２５５（１００％）、２４２（１０％）、２２４（１５％）、１６８（１０％）、１５３（１０％）、７９（２５％）である；図１４、表１２を参照。
【００８２】
正確な質量５３１．３１２３を有する代謝産物は、５３０．３０３５（［Ｍ−Ｈ］−、Ｃ３０Ｈ４６ＮＯ５Ｐについて計算値５３１．３１１４）のイオン化質量を有する。ＭＳ／ＭＳフラグメント（ＭＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ）（相対強度）は、（５３０、１００％）、４８０（１００％）、２５５（１００％）、２４２（１０％）、２２４（１５％）、１６８（１０％）、１５３（１０％）、７９（２５％）である；図１５、表１３を参照。
【００８３】
正確な質量５４１．３４２２を有する代謝産物は、５４０．３３３５（［Ｍ−Ｈ］−、Ｃ２５Ｈ５１ＮＯ９Ｐ−について計算値５４０．３２９３）のイオン化質量を有する。ＭＳ／ＭＳフラグメント（ＭＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ）（相対強度）は、５４０（［Ｍ−Ｈ］−、１０％）、４８０（１００％）、２５５（１００％）、２４２（１０％）、２２４（１５％）、１６８（１０％）、１５３（１０％）、７９（２５％）である；図１６、表１４を参照。
【００８４】
正確な質量５５５．３１０１を有する代謝産物は、５５４．３０１３（［Ｍ−Ｈ］−、Ｃ２５Ｈ５０ＮＯ１０Ｐについて計算値５５５．３１７２）のイオン化質量を有する。ＭＳ／ＭＳフラグメント（ＭＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ）（相対強度）は、５５４（［Ｍ−Ｈ］−、１０％）、４９４（１００％）、２６９（１００％）、２４２（１０％）、２２４（１５％）、１６８（１０％）、１５３（１０％）、７９（２５％）である；図１７、表１５を参照。
【００８５】
正確な質量５６５．３３９４を有する代謝産物は、５６４．３３０６（［Ｍ−Ｈ］−、Ｃ２７Ｈ５１ＮＯ９Ｐ−について計算値５６４．３２９３）のイオン化質量を有する。ＭＳ／ＭＳフラグメント（ＭＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ）（相対強度）は、５６４（［Ｍ−Ｈ］−、１００％）、５０４（１００％）、２７９（１００％）、２４２（１０％）、２２４（１５％）、１６８（１０％）、１５３（１０％）、７９（２５％）である；図１８、表１６を参照。
【００８６】
正確な質量５６７．３５４６を有する代謝産物は、５６６．３４５９（［Ｍ−Ｈ］−、Ｃ２７Ｈ５３ＮＯ９Ｐ−について計算値５６６．３４４９）のイオン化質量を有する。ＭＳ／ＭＳフラグメント（ＭＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ）（相対強度）は、５６６（［Ｍ−Ｈ］−、１０％）、５０６（１００％）、２８１（１００％）、２４２（１０％）、２２４（１５％）、１６８（１０％）、１５３（１０％）、７９（２５％）である；図１９、表１７を参照。
【００８７】
正確な質量５６９．３６８７を有する代謝産物は、５６８．３５９８（［Ｍ−Ｈ］−、Ｃ２７Ｈ５５ＮＯ９Ｐ−について計算値５６８．３６０５）のイオン化質量を有する。ＭＳ／ＭＳフラグメント（ＭＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ）（相対強度）は、５６８（ｍ／ｚは［Ｍ＋Ｈ］＋質量を表す、１０％）、５０８（１００％）、２８３（１００％）、２４２（１０％）、２２４（１５％）、１６８（１０％）、１５３（１０％）、７９（２５％）である；図２０、表１８を参照。
【００８８】
前立腺癌の診断のために選択される１４個の代謝産物マーカーの構造の特徴付けに基づいて、代謝産物はリゾリン脂質に関連する分子であることが決定された。特に、これらには、限定されないが、リゾホスファチジルコリン（ｌｙｓｏＰＣ）、リゾホスファチジルエタノールアミン（ｌｙｓｏＰＥ）、リゾホスファチジルジメチルエタノールアミン（ｌｙｓｏＰｄｍＥ）、リゾホスファチジルセリン（ｌｙｓｏＰＳ）、リゾホスファチジルイノシトール（ｌｙｓｏＰＩ）、及びリゾホスファチジルグリセロール（ｌｙｓｏＰＧ）、並びに血小板活性化因子（ＰＡＦ）が含まれ、ここで、グリセロール骨格は、ＳＮ１又はＳＮ２のいずれか、例えば、１６：０、１８：０、１８：１、１８：２、１８：３、２０：３、２０：４、２０：５、２２：６における脂肪酸、セラミド、又はその他に結合しており、ホスフェート含有コリン、エタノールアミン、ジメチルエタノールアミン、セリン、グリセロール、又はイノシトールはＳＮ３に存在する。
【００８９】
ホスファチジルコリン（ＰＣ）及びホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）は、生体膜の２つの主要な脂質成分を表す。ＰＣ及びＰＥは、ＳＮ３位置でエタノールアミン又はコリンに結合したホスフェート基、並びにアシル、エーテル、又はビニル−エーテル結合を介してＳＮ１及びＳＮ２位置に結合した２つの脂肪酸を含むグリセロール骨格を含む。脂肪酸は、飽和（ＳＮ１においてより一般的）、又は不飽和（ＳＮ２においてより一般的）のいずれかでありうる。ＰＣ及びＰＥなどのリン脂質が様々なホスホリパーゼによって加水分解される場合、リゾＰＣなどのリゾリン脂質は遊離の脂肪酸と一緒に生成される。リゾリン脂質は、多くの生物学的経路並びに疾病、例えば、カルシウムシグナル伝達、アテローム性動脈硬化症及び炎症に関与してきた（非特許文献１２）。
【００９０】
米国公開特許出願第２００４／０１３７５４１号公報(Millsら）は、癌の進行における、又は進行中の重要事象としてリゾＰＣの上昇に焦点を当てている。特に、Millsらは、婦人科癌におけるリゾＰＣの上昇について記載している。これは、１４個のバイオマーカー（即ち、正確な質量５１９．３３２８、５４１．３１４８、５４５．３４６０、５５５．３１０１、５４１．３４２２、５６５．３３９４、５２１．３４８０、５１７．３１４８、５６７．３５４６、５２３．３６４０、５３１．３１２３、４８１．３１７１、４９５．３３２８、５６９．３６８７を有する代謝産物）のパネルが、前立腺癌患者の血清において低下していることを示す本発明とは対照的である。
【００９１】
本発明では、前立腺癌の診断のためのハイスループット法も提供される。この方法は、親分子の断片化を含み；非限定的な例において、これはQ-Trap（商標）システムによって達成することができる。代謝産物の検出は、比色化学分析（ＵＶ、又は他の波長）、抗体系酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡｓ）、核酸検出アッセイのためのチップベース及びポリメラーゼ鎖反応、ビーズベース核酸検出法、ディップスティック化学分析又は他の化学反応、画像解析［例えば、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）スキャン、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン］、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、並びに様々な質量分析系システムを含む様々なアッセイプラットフォームの１つを用いて行うことができる。
【００９２】
本発明のさらなる実施形態において、患者における前立腺癌又は前立腺癌のリスクを診断するための方法が提供される。この方法は、
ａ）前記患者から試料を得るステップと；
ｂ）前記試料を分析して、１種又は複数の代謝産物マーカーについての定量データを得るステップと；
ｃ）前記１種又は複数の代謝産物マーカー対内部対照代謝産物のそれぞれについての比を得るステップと；
ｄ）前記１種又は複数の代謝産物マーカー対内部対照代謝産物のそれぞれについての比を１種又は複数の基準試料から得られた対応データと比較するステップと；
ｅ）前記比較を用いて、前立腺癌又は前立腺癌のリスクを診断するステップと
を含む。
【００９３】
試料を分析するステップ（ステップｂ）は、質量分析計（ＭＳ）を用いて試料を分析することを含みうる。例えば、限定的であることを望まないが、このような質量分析計は、ＦＴＭＳ型、オービトラップ型、飛行時間（ＴＯＦ）型又は四重極型のうちのものでありうる。他に、質量分析計は、付加的な前検出器質量フィルターを備えることができる。例えば、限定的であることを望まないが、このような機器は、通常、四重極−ＦＴＭＳ（Ｑ−ＦＴＭＳ）、四重極−ＴＯＦ（Ｑ−ＴＯＦ）又はトリプル四重極（ＴＱ又はＱＱＱ）といわれる。さらに、質量分析計は、親イオン検出モード（ＭＳ）又はＭＳｎモード（ここでｎ＞＝２）のいずれかで操作することができる。ＭＳｎは、親イオンが衝突誘起解離（ＣＩＤ）又は他の断片化手段によって断片化されてフラグメントイオンを生成し、次いで、１種又は複数の該フラグメントが質量分析計によって検出される状況をいう。次いで、このようなフラグメントはさらに断片化されて、さらなるフラグメントを生成することができる。他に、試料は、液体若しくはガスクロマトグラフィーシステムを用いて又は直接注入によって質量分析計に導入することができる。
【００９４】
ちょうど上記されたような方法において、１種又は複数の基準試料は、対照個体から得られた最初の基線基準試料でありうる。
【００９５】
上記されたような方法において、１種又は複数の代謝産物マーカーは、表１に記載されるような代謝産物から選択することができるか、又は代謝産物は、上記１４個の代謝産物でありうる。「内部対照代謝産物」は、患者に自然に存在する内因性代謝物質をいうが、但し、代謝物質は疾病と関連しておらず、疾病状態にわたって変らないという条件であり；他に、「内部対照代謝産物」は、分析前に血清試料中にスパイクされた外部標準もいう。例えば、限定的であることを望まないが、この比は、試験対象について診断スコアを決定するために用いることができる。
【００９６】
代謝産物マーカー対内部対照代謝産物の比の使用は、代謝産物マーカーの絶対レベルの測定値より安定で、再現性がある測定値を与える。内部対照代謝産物は、全ての試料に存在し、疾病状態にわたって変らないので、試料対試料の変動（取り扱い、抽出などによる）は最小化される。
【００９７】
本発明の診断方法において、代謝産物マーカーの測定値は、試験対象において時間経過とともに長期に取得して、代謝産物濃度及び前立腺癌の可能性、又は前立腺癌の発症のリスクにおける変化を決定することができる。試験対象は、開始点において試料を与え、主に基線値を確立し；次いで、試験対象は、開始点試料と比較される試料を時間経過と共に与えることができる。例えば、限定的であることを望まないが、上記１４個の代謝産物の強度の増加は、前立腺癌のリスク減少を示し、一方、強度の低下は、前立腺癌についてのリスク増加を示す。
【００９８】
本発明のさらにもう１つの実施形態において、患者における前立腺癌を治療するための治療法の効果を評価する方法であって、
ａ）前記患者から試料を得るステップと；
ｂ）前記試料を分析して、１種又は複数の代謝産物マーカーについての定量データを得るステップと；
ｃ）前記定量データを１種又は複数の基準試料から得られた対応データと比較するステップと；
ｄ）前記比較を用いて、前記治療法が患者の健康状態を改善しているかどうかを判定するステップと
を含む方法が提供される。
【００９９】
分析するステップ（ステップｂ）後、１種又は複数の代謝産物マーカー対内部対照代謝産物のそれぞれの比を得てもよい。この場合、１種又は複数の基準試料から得られた対応データに対する、１種又は複数の代謝産物マーカー対内部対照代謝産物のそれぞれの比は、治療法の効果を評価するために比較される。
【０１００】
分析するステップ（ステップｂ）は、液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）によって試料を分析することを含んでもよいし、又は他に、この方法がハイスループット法である場合、直接注入又は液体クロマトグラフィー、及び線形イオントラップタンデム質量分析法によって試料を分析することを含んでもよい。
【０１０１】
用語「治療法」又は「治療」とは、評価されている患者の健康状態を改善することを試みうる治療法の任意の好適な過程を意味する。治療法の効果を評価する場合、患者の健康状態を改善する又は悪くさせることにおける特定の治療法の作用が測定される。そのようにすることにおいて、当業者であれば、治療法が前立腺癌を治療するために有効であるかどうかを決定することができるであろう。このような治療には、限定されないが、免疫療法（例えば、カルメットゲラン桿菌注射）、根治的前立腺摘除術、化学療法、放射線療法、ホルモン療法（抗男性ホルモンを含む）、又はその他が含まれうる。
【０１０２】
記載されるような方法において、１種又は複数の基準試料は、任意の好適な基準試料でありうる。例えば、限定的であることを決して望まないが、基準試料は、対照個体から得られた複数の試料、若しくは患者から得られた１種又は複数の前治療基線試料；又はその任意の組合せでありうる。そのとき代謝産物における変動が患者に特有であるので、患者からの前治療基線試料は、特に有用である。
【０１０３】
上記されるような方法において、１種又は複数の代謝産物マーカーは、表１に記載される代謝産物から選択してもよいし、又は代謝産物は、上記１４個の代謝産物であってもよい。
【０１０４】
上記されるような治療法の効果は、代謝産物の測定及び基準試料との比較に基づいて評価され、それにより正常特定範囲に向けた代謝産物の復帰は、陽性治療作用を示すであろう。
【０１０５】
前立腺癌を治療するための治療法の効果を評価する代替方法において、１種又は複数の代謝産物マーカー対内部対照代謝産物のそれぞれについての比は、ステップｂ）において得ることができ；次いで、ステップｃ）において、１種又は複数の代謝産物マーカー対内部対照代謝産物のそれぞれの比は、１種又は複数の基準試料から得られた対応データと比較することができる。
【０１０６】
本発明は、前立腺癌の診断のためのハイスループット法を提供する。この方法は、親分子の断片化を含むことができ；非限定的な例において、これはQ-Trap（商標）システムによって達成しうる。代謝産物の検出は、比色化学分析（ＵＶ、又は他の波長）、抗体系酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡｓ）、核酸検出アッセイのためのチップベース及びポリメラーゼ鎖反応、ビーズベース核酸検出法、ディップスティック化学分析又は他の化学反応、画像解析、例えば、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）スキャン、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンなど、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、並びに様々な質量分析系システムを含む様々なアッセイプラットフォームの１つを用いて行うことができる。
【０１０７】
ＨＴＳ法には、バイオマーカー当たりのそれぞれ選択された娘イオン、並びにそれぞれの試料に添加された１種又は複数の内部標準についての娘イオンの強度、ピーク面積又は積算スキャンの測定が含まれうる。次いで、それぞれのバイオマーカー遷移を内部標準遷移で割ることによって比を生成しうる。内部標準は、機器感度の指標を与え、多数サンプリングの全域でバイオマーカー遷移シグナルの正規化を可能にする。疾病を有しない又は健常集団について生成された比は、「正規」分布についての定義パラメータとなる。次いで、正常及び前立腺陽性を含む試料の実証セットが分析され、正規分布と比較される。これは、本質的に２つの分布を生じ、１つは正常集団のためのものであり、１つは前立腺陽性集団のためのものである。次いで、２つの分布間のカットオフ比が選択され、バイオマーカーアッセイの感度及び特異性を決定する。
【０１０８】
本発明の方法において、本明細書において記載される代謝産物の任意の個体又は組合せは、既存の癌マーカーと組み合わせて、診断／予後の結果に到達することができる。このような既存のマーカーには、限定されないが、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、癌抗原（ＣＡ）１９−９、Ｃ１５−３、又はＣＡ１２５が含まれうる。
【０１０９】
上記方法は、癌が検出される期(stage)に基づいて対象に対する適切な治療計画をより良く決定するための試験を有する医療専門家を提供しうる。診断方法は、比較的に非侵襲性であるので、多数のそうでなければ未診断の症例、特定の介入が医療専門家によって施されうる特に早期症例について同定することができる。本発明の方法は、恐らくは再発の臨床症状前に癌の再発を検出するために用いることもできる。その結果、このような知識は、再発を予防する機会改善を有しうる適切に指示された治療計画に用いることができる。
【０１１０】
文字通り、全ての人を生涯にわたって長期にリスクを評価するためにスクリーニングをすることができるので、前立腺癌の診断への本発明の影響は、極めて大きい。本発明の試験の性能特性が一般集団に対して代表的であるということであれば、臨床症状の出現前に疾病の進行を検出する可能性を有しうるので、唯一この試験は、現在利用できる他のスクリーニング法のいずれよりも優れていることができる。
【０１１１】
本発明は、以下の実施例においてさらに説明される。下記のそれぞれの実施例を含む本発明の概要は、図１に示される。
【実施例１】
【０１１２】
示差的に発現される代謝産物の発見及び同定
示差的に発現された代謝産物は、前立腺癌陽性臨床的に診断された患者及び正常患者において同定される。
【０１１３】
臨床試料
記載される前立腺癌スクリーニングアッセイのために、血清試料を、健常な前立腺癌を有しない個体及び前立腺癌陽性と専門的に診断された患者の代表集団から得た（SeraCareLifeScience社）。下記された前立腺癌の生化学的マーカーは、前立腺癌陽性患者からの２４個の血清試料及び健常対照からの２５個の血清試料の分析から導いた。両群における試料は、年齢、民族性、体重、職業にわたり、様々な非前立腺癌関連健康状態を示す個体の多様な集団からであった。全ての試料は、単一の時点で収集したものであり、前立腺癌試料は、腫瘍の外科的切除の直前又は直後のいずれかで採取した。全ての試料は、化学療法又は放射線療法前に採取した。
【０１１４】
４９個の血清試料内に含まれる代謝産物は、超音波処理及び激しい混合（ボルテックス混合）によって極性及び非極性抽出物に分離した。
【０１１５】
血清抽出物（前立腺癌２４個、正常２５個）の分析は、ＦＴＭＳ中に直接注入、並びに陽性及び陰性の両モードにおいてエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）又は大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）のいずれかによるイオン化によって行った。試料抽出物は、陰性イオン化モードについてメタノール：０．１％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム（５０：５０、ｖ／ｖ）中、又は陽イオン化モードについてメタノール：０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸（５０：５０、ｖ／ｖ）中で３倍又は６倍のいずれかに希釈した。ＡＰＣＩについて、試料抽出物は、希釈することなく直接注入した。７．０Ｔの強力にシールドされた超伝導磁石を備えたBruker Daltonics APEX IIIフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計（Bruker Daltonics、Billerica、MA）で全ての分析を行った。１時間当たり６００μＬの流量でＥＳＩ源及びＡＰＣＩ源を用いて試料を直接注入した。セリン、テトラアラニン、レセルピン、ヒューレットパッカード調節調合物(Hewlett-Packard tuning mix)、及び副腎皮質刺激ホルモンフラグメント４−１０の標準混合を用いてイオン移動／検出パラメータを最適化した。さらに、機器製造メーカーの推奨に従って１００〜１０００ａｍｕの質量範囲にわたってイオン強度及び広帯域集積を最適化するように機器条件を調整した。上記標準の混合物を用いて、１００〜１０００ａｍｕの捕捉範囲にわたって質量精度についてそれぞれの試料スペクトルを内部的に較正した。
【０１１６】
抽出物及びイオン化モードの組合せを含む総計６つの別個の分析において、それぞれの試料について以下を得た：
水性抽出物
１．陽性ＥＳＩ（分析モード１１０１）
２．陰性ＥＳＩ（分析モード１１０２）
有機抽出物
３．陽性ＥＳＩ（分析モード１２０１）
４．陰性ＥＳＩ（分析モード１２０２）
５．陽性ＡＰＣＩ（分析モード１２０３）
６．陰性ＡＰＣＩ（分析モード１２０４）
【０１１７】
質量分析データ処理
線形最小二乗回帰線を用いて、それぞれの内部標準質量ピークがその理論質量と比較して＜１ｐ．ｐ．ｍ．の質量誤差を有するように質量軸値を較正した。Bruker Daltonics社製XMASSソフトウェアを用いて、１メガワードのデータファイルサイズを得て、２メガワードにゼロ詰めした。ｓｉｎｍデータ変換をフーリエ変換及び大きさ（magnitude）の計算前に行った。それぞれの分析からの質量スペクトルを積分し、それぞれのピークの正確な質量及び絶対強度を含んだピークリストを作成した。１００〜２０００ｍ／ｚの範囲の化合物を分析した。異なるイオン化モード及び極性にわたるデータを比較して、まとめるために、全ての検出質量ピークを水素付加体形成を想定するそれらの対応する中性質量に変換した。次いで、DISCOV Ametrics（商標）ソフトウェア（Phenomenome Discoveris社、Saskatoon、SK、Canada)を用いて自然発生二次元（質量対試料強度）配列を作成した。多重ファイルからのデータを積分し、次いで、この結合ファイルを処理して全ての唯一の質量を決定した。それぞれの唯一の質量の平均を決定し、ｙ軸を表した。この値は、等しいと統計的に判定された全ての検出された正確な質量の平均を表す。較正標準に対するこの機器の質量精度が約１ｐｐｍであることを考慮すると、これらの平均質量には、この平均質量の±２ｐｐｍ以内、又はこの平均質量のさらに±５ｐｐｍ以内に入る全ての質量が含まれることは当業者に明らかであろう。分析されるべく最初に選択されたそれぞれのファイルについて列を作成し、ｘ軸を表した。次いで、選択されたそれぞれのファイルに見出だされるそれぞれの質量の強度をその代表ｘ、ｙ座標中に記入した。強度値を有しなかった座標はブランクのままとした。一旦配列後、データをさらに処理、視覚化及び解釈して、推定化学的同一性を割り当てた。次いで、それぞれのスペクトルをピーク取得し、検出された全ての代謝産物の質量及び強度を得た。次いで、全てのモードからのこれらのデータを合体して１試料当たり１個のデータファイルを作成した。次いで、９０個の試料全てからのデータを合体及び調整し、それぞれの試料が列を表し、それぞれの唯一の代謝産物が単一の行を表す二次元の代謝産物配列を作成した。所与の代謝産物試料の組合せに対応するセルにおいて、その試料中の代謝産物の強度を表示した。データをこのフォーマットで表した場合に、試料の群（即ち、正常及び癌）間の差を示す代謝産物を決定した。
【０１１８】
高度データ解釈
スチューデントｔ検定を用いて、正常試料と前立腺癌陽性試料との間で異なる代謝産物について選択した（ｐ＜０．０５）。４９２個の代謝産物はこの基準を満たした（表１に記載される通り）。それぞれのこれらの特徴は、２つの集団間で統計的に相違し、したがって、それぞれは、診断利用性の可能性を有する。特徴をそれらの正確な質量及び分析モードで記述し、これは共に、それぞれの代謝産物の推定分子式及び化学的特性（例えば、極性及び推定官能基）を与えるのに十分である。対照血清及び前立腺癌血清間で区別するべく４９２個の代謝産物の能力は、図２におけるＰＣＡプロットによって示される。対照（灰色）と前立腺癌（黒色）との間の比較的に明らかな区別（点線で示されるような）を引くことができ、これは、４９２個の代謝産物が共に、対照血清に対して前立腺癌陽性血清試料を診断することができることを示す。
【０１１９】
しかし、４９２個のシグナルの商業的に有用なアッセイへの取込み及び開発は、実際的ではなく、したがって、単変量解析と化学的情報の組合せを用いて、さらなる特徴付けのために４９２個から１４個の代謝産物のサブセットをさらに選択した。選択された１４個のサブセットは、以下の２つの異なるモードで検出した：正確な質量（ドルトンで測定）４９５．３３２８、５１７．３１４８、５１９．３３２８、５２１．３４８０、５２３．３６４０、５４１．３１４８、及び５４５．３４６０を有する代謝産物（ここで、±５ｐｐｍの差は同一の代謝産物を示す）は、本出願に記載される方法を用いて陽イオンとして検出し、正確な質量（ドルトンで測定）４８１．３１７１、５３１．３１２３、５４１．３４２２、５５５．３１０１、５６５．３３９４、５６７．３５４６、及び５６９．３６８７を有する代謝産物は、本出願に記載される方法を用いて陰イオンとして検出した。全ての代謝産物質量は、１２Ｃ分子を表す。
【０１２０】
１４個の質量の診断的精度を、図３におけるＰＣＡプロットによって示し、これは、疾病と対照との間の明らかな分離を示す。事実は、点線を用いて前立腺癌から対照を分離することは、感度８４％及び特異性１００％をもたらす。ＦＴＩＣＲ上で検出される１４個の質量の相対強度のグラフを図４に示す（それぞれの質量について０と１との間に縮尺されたデータを用いる）。それぞれのマーカーは、前立腺癌血清対照血清において約５０％（平均で）の減少又は不足を示すと思われる。
【０１２１】
これらの結果に基づいて、前立腺癌陽性患者血清と健常（前立腺癌陰性）個体血清との間の明らかな区別を行うことができる。したがって、前立腺癌陽性血清と前立腺癌陰性血清とを同定及び区別することができるこれらのマーカーは、現に記載されるような前立腺癌診断試験のための基礎を形成することができる。
【実施例２】
【０１２２】
発見された代謝産物の独立した方法確認
代謝産物及び実施例１に記載された臨床的変数とのそれらの関連を、独立した質量分析システムを用いてさらに確認した。それぞれの変数群（１０個の対照及び９個の前立腺癌）からの代表的水性試料抽出物を研究中の臨床的変数間の強度が異なる代謝産物を同定する目的で質量及び強度情報を得るためにHP 1050高性能液体クロマトグラフィーを用いるＬＣ−ＭＳ、又はABI Q-Starにインターフェースで接続された同等のもの、若しくは同等の質量分析計によって再分析した。陽性及び陰性の両方のＥＳＩモードにおいてフル−スキャン検出を用いてデータを得、得られたスペクトルデータをPhenomenoneProfilerソフトウェアを用いて較正及び調整した。特定のクロマトグラフィー条件下で約２８〜３４分の保持時間帯（分子種がＨＰＬＣカラムから流出する時間）を同定した。図５は、対照（Ａ）、前立腺癌（Ｂ）、及び対照と前立腺癌との間の正味差（Ｃ）についてこの保持時間範囲内に抽出された質量スペクトルを示す。ボックス化領域は、前に記載された１４個の質量のサブセットが再検出された質量範囲を示す。前に観察されたように、これらの分子は、対照に比べて前立腺癌血清の強度が有意に低下していた。ＨＰＬＣ連結ＴＯＦ−ＭＳを用いて検出されたそれぞれ１４個の代謝産物についての平均生強度（０と１の間に縮尺）の棒グラフを図６に示す。
【実施例３】
【０１２３】
１４個の代謝産物サブセットのＭＳ／ＭＳ特徴付け
正確な質量及び分子式の決定、極性、酸／塩基特性、ＮＭＲスペクトル、並びにＭＳ／ＭＳ又はＭＳｎスペクトルを含む様々な特性を代謝産物の構造解明のために用いることができる。これらのデータは、特定の代謝産物の指紋として用いることができ、完全な構造が決定されたかどうかに拘わらず特定の代謝産物の固有の識別子である。これらのデータには、以下が含まれる：
【０１２４】
１．ＬＣ保持時間  目的の代謝産物を含む抽出物をＣ１８カラムを用いる逆相ＬＣ−ＭＳにかけ、及び標準化条件下でそれらの保持時間を測定するためにＭＳによる分析を施す。抽出物をＬＣ／ＭＳ分析にかけたとき、１４個の代謝産物全てが２６〜３４分の範囲内で共溶出した。
【０１２５】
２．ＭＳ／ＭＳスペクトル  衝突誘起解離（ＣＩＤ）を用いてＭＳ／ＭＳ断片化を行うことによって目的の１４個の代謝産物をさらに特徴付けした。このＭＳ／ＭＳ分析は、クロマトグラフィー分離処理から集められた画分について実時間（即ち、クロマトグラフィー溶出処理中）又はオフラインで行った。
【０１２６】
９個の前立腺癌試料及び１０個の正常試料の抽出物からの水性画分を窒素ガス下で蒸発乾固し、水：メタノール：ギ酸（９７．９：２：０．１）１００μｌ中で戻した。戻した試料５μｌをフルスキャン及びＭＳ／ＭＳのためにＨＰＬＣ（MetaSil AQ3μｍを備えたAgilent 1100システム、C18、100×2.0mmカラム、Varian社）に用いた。移動相は、溶媒Ａとして水：メタノール：ギ酸（９７．９：２：０．１）、及び溶媒Ｂとしてメタノール中０．１％ギ酸から構成された。流速０．２ｍｌ／分で、溶媒勾配は以下の通りであった：溶媒Ａを最初の１分間に１００％で保持し、次いで、１０分にわたって線形勾配を用いてＡ２０％及びＢ８０％に変え、次いで、９分間Ａ２０％及びＢ８０％に保持した；次いで、この溶媒混合物を、線形勾配を用いて次の１０分間にＢ１００％に変え、Ｂ１００％で１５分間保持した。最後に、２０分の期間にカラムを平衡化させるためにこの溶媒混合物をＡ１００％で保持した（総経過時間６５分）。陽性及び陰性モードにおけるＥＳＩ(TurboIonSpray(商標))源を取り付けたABI QSTAR（登録商標）XL質量分析計を用いてＨＰＬＣからの溶出物を分析した。
【０１２７】
飛行時間型フルスキャンモードについて、「ＴＯＦ−ＭＳ」スキャン型を、集積時間１．０秒、質量スキャン範囲５０から１５００Ｄａ、及び継続時間６０分で用いた。陽性ＥＳＩモードでのソースパラメータは、以下の通りであった：イオン源ガス１（ＧＳ１）５５；イオン源ガス２（ＧＳ２）９０；カーテンガス（ＣＵＲ）４０；噴霧器電流（ＮＣ）３．０；温度４００℃；クラスタ分離電位（ＤＰ）６０；集束電位（ＦＰ）２６５；クラスタ分離電位２（ＤＰ２）１５。陰性ＥＳＩモードでのソースパラメータは以下の通りであった：イオン源ガス１（ＧＳ１）５５；イオン源ガス２（ＧＳ２）７０；カーテンガス（ＣＵＲ）４０；噴霧器電流（ＮＣ）０；温度４００℃；クラスタ分離電位（ＤＰ）−５５；集束電位（ＦＰ）−２６５；クラスタ分離電位２（ＤＰ２）−１５。
【０１２８】
ＭＳ／ＭＳモードにおいて、「Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｉｏｎ」スキャン型を、集積時間１．０秒、スキャン範囲５０から６５０Ｄａ、及び継続時間６０分で用いた。全てのソースパラメータは上記と同じであり、衝突エネルギー（ＣＥ）設定は陽性モードで２０Ｖ、３５Ｖ、５０Ｖ、陰性モードで−２０Ｖ、−３５Ｖ、−５０Ｖであった。衝突ガス（ＣＡＤ、窒素）は５に設定した。
【０１２９】
所与の分子の構造は、規定された条件下で特有の断片化パターンを決定づけ、その分子にとって独特であり（人の指紋と同等）−分子構造に対してわずかな変化でさえも異なる断片化パターンをもたらしうる。分子の同一性の指紋を与えることに加えて、ＣＩＤによって生成されたフラグメントを用いて、代謝産物の構造に関するより確かな知識を得た。
【０１３０】
陽性モードバイオマーカーパネル（即ち、正確な質量４９５．３３２８、５１７．３１４８、５１９．３３２８、５２１．３４８０、５２３．３６４０、５４１．３１４８、及び５４５．３４６０を有する代謝産物）についての可能な分子式を構築した後、７個のバイオマーカー全ては、ＲＮＯ７Ｐの同様な式を保有することが見出され、ここで、Ｒは、リン脂質コリン関連化合物でありうることを示す可変の脂肪酸型である。ＭＳ／ＭＳ解釈に基づいて提案された構造の要約を表２に示す。陽イオン化モードで検出された７個の代謝産物についての断片化スペクトルを図７から図１３（衝突エネルギー２０（Ａ）、３５（Ｂ）及び５０（Ｃ）ボルト）に示し、フラグメントの質量及び分子式帰属を表３から表９に掲載する。それぞれの表は、ＣＩＤから得られる娘イオン、並びにフラグメントイオン及びフラグメント喪失の提案構造を掲載する。
【０１３１】
陽性モードＥＳＩで得られたＭＳ／ＭＳデータは、それぞれ７個の代謝産物がプロトンを引き抜き、それらのＭＳ／ＭＳスペクトルにおいて対応する分子イオン（［Ｍ＋Ｈ］＋）を生じたことを示す。親イオンとして正に荷電した四級アンモニウムイオンを残すリン酸塩基のプロトン化を示唆する。四級アミン基、（ＣＨ３）３ＮＨ＋、を失うことの証拠として、［Ｍ＋Ｈ−６０］＋が全ての代謝産物に観察され、これらの代謝産物におけるコリン頭基の存在を支持した。ホスホコリン（Ｃ５Ｈ１５ＮＯ４Ｐ＋、ｍ／ｚ１８４）及びエタノール−四級アミン（Ｃ５Ｈ１４ＮＯ＋、ｍ／ｚ１０４）によるフラグメントイオンは、ホスホコリン型構造を示唆する他の指標であった。分子イオンからのＨ２Ｏの喪失も観察され、リゾ脂質型構造に固有のｓｎ−２位における遊離のヒドロキシ基の存在を支持した。
【０１３２】
ｓｎ−１脂肪酸側鎖又はその喪失のいずれかについて、弱いが、フラグメントイオンが観察された。例えば、パルミチン酸がｓｎ−１脂肪酸であると考えられた代謝産物４９５．３３２８について、Ｃ１６Ｈ３２Ｏ単位の喪失のためにｍ／ｚ４５８を表すフラグメントイオンをもっともらしいとして帰属させた。強度が低いが、ｍ／ｚ２３９（Ｃ１６Ｈ３１Ｏ＋）における別のフラグメントイオンも存在し、ｓｎ−１脂肪酸それ自体を示す。これらの推論に基づいて、該構造は２−ヒドロキシ−１−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンとして提案した。４９５．３３２８の構造は、それらのＬＣ／ＭＳ及びＭＳ／ＭＳスペクトルデータの比較（フラグメントイオン比較は、表１０に示す）により２−ヒドロキシ−１−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（商業的標準）であることが確認された。
【０１３３】
残りの６個の代謝産物のＭＳ／ＭＳスペクトルデータは、４９５．３３２８のものと非常に類似しており、唯一の相違は、ｓｎ−１脂肪酸側鎖における相違であった。代謝産物５１９．３３２８（５２０Ｍ−Ｈ）、５２１．３４８１（５２２Ｍ−Ｈ）、及び５２３．３６４０（５２４Ｍ−Ｈ）について、それらの親イオンからのＨ２Ｏの喪失は、それぞれフラグメントイオンｍ／ｚ５１８、５２０及び５２２を生じ、それらの脂肪酸側鎖が不飽和度が増加すると共に変化することを示唆した。５２０について、ｓｎ−１側鎖はｍ／ｚ２８１でのフラグメントイオンのためにリノール酸と推定された。５２２及び５２４において、ｍ／ｚ２５８における共通のフラグメントイオンは、それらの親イオンからのオレイル（Ｃ１８Ｈ３３Ｏ）置換基及びステアリル（Ｃ１８Ｈ３５Ｏ）置換基の喪失のためであると考えられ、したがってそれぞれオレイン酸側鎖及びステアリン酸側鎖を支持した。代謝産物５４１．３１４８（５４２Ｍ−Ｈ）について、ｍ／ｚ２２５におけるフラグメントイオンは、エイコサペンタエン酸側鎖の喪失と推定した。上記に検討したＭＳ／ＭＳデータを用いて、表２に示した通りこれら７個の前立腺癌バイオマーカーの構造を提案した。
【０１３４】
陰イオン化モードで検出された７個の代謝産物（即ち、正確な質量４８１．３１７１、５３１．３１２３、５４１．３４２２、５５５．３１０１、５６５．３３９４、５６７．３５４６、及び５６９．３６８７を有する代謝産物）の断片化スペクトルを図１４から図２０に示す（衝突エネルギー２０、３５及び５０ボルト）。７個のバイオマーカーの中から４個（５４１．３４２２、５６５．３３９４、５６７．３５４６、５６９．３６８７）は、同様の式ＲＮＯ９Ｐを保有することが見出され、ここで、Ｒは可変脂肪酸型であり、リン脂質エタノールアミン関連化合物でありうることを分子式は示した。表１１は、分子式及びＭＳ／ＭＳデータに基づく分子の推定構造を要約したものである。表１２から表１８は、フラグメントイオン質量、フラグメント及びフラグメント喪失の推定式、並びにそれぞれのフラグメントについての推定構造を掲載する。
【０１３５】
エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）での陰性モードにおいて、それぞれ７個の分子は、プロトンを失い、それらのＭＳ／ＭＳスペクトル中に対応する分子イオン（［Ｍ−Ｈ＋］−）を生じる。これは、親イオンとして負に荷電したリン酸イオンを残す、リン酸基の脱プロトン化を示唆する。ＭＳ／ＭＳスペクトルにおける卓越したシグナルとしてマーカー４８１．３１６８及び５４１．３４２２（パルミチル、Ｃ１６Ｈ３１Ｏ２、ｍ／ｚ２５５）、５６５．３３９４（リノレイル、Ｃ１８Ｈ３１Ｏ２、ｍ／ｚ２７９）、５６７．３５４６（オレイル、Ｃ１８Ｈ３３Ｏ２、ｍ／ｚ２８１）、並びに５６９．３６８７（ステアリル、Ｃ１８Ｈ３５Ｏ２、ｍ／ｚ２８３）のｓｎ−１脂肪酸側鎖についてフラグメントイオンを観察した。５６９．３６８７のＭＳ／ＭＳスペクトルをその対応するリゾリン脂質エタノールアミン対応物、２−ヒドロキシ−１−ステアリル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（Ｃ２３Ｈ４８ＮＯ７Ｐ、厳密な質量：４８１．３１７）（商業的標準）と比較すると、多くの類似性が観察された（表１９）。５６９．３６８７の親イオン［Ｍ＋Ｈ］−からの初期のフラグメント喪失は、式Ｃ２Ｈ４Ｏ２に関連する６０ドルトン単位の質量喪失に対応していた。このフラグメント喪失は、ｓｎ２−ヒドロキシホスホエタノールアミン型の一般式と類似するＣ２３Ｈ４８ＮＯ７Ｐの式を有する４８１．３１７１を除く上記パネルのマーカー全てに一致した。５６９．３６８７のフラグメントｍ／ｚ５０８をそのリゾホスホエタノールアミン商業的標準（ｍ／ｚ４８０）の親イオンと比較すると、わずか２８ドルトン単位の差が見られ、これはバイオマーカーパネルについてＮ，Ｎ−ジメチルホスホエタノールアミン型の構造の誘導をもたらす。ｓｎ２脂肪酸、ｍ／ｚ２４２、１６８、１５３及び７９の喪失後のフラグメント喪失は、７個のバイオマーカー全てについて常に観察され、分子上の骨格のもっともらしいジメチルエタノールアミン型をさらに支持する。
【０１３６】
報告されたＭＳ／ＭＳデータがリゾリン脂質種の分子と一致する一方、本発明には、官能基又は報告されたフラグメントが現に示されない仕方で結合される構造も含まれる。
【実施例４】
【０１３７】
ハイスループット商業法開発
ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）法を前立腺癌を診断するために開発した。下記方法は、世界的に多くの実験室に配置されている現在の実験室機器及びトリプル四重極質量分析計に適合している（Hopfgartner G, Varesio E, Tschappat V, Grivet C, Bourgogne E, Leuthold LA. Triple quadrupolelinear ion trap mass spectrometer for the analysis of small molecules and macromolecules. J Mass Spectrom 2004;39(8):845-55、Xia YQ, Miller JD, Bakhtiar R, Franklin RB, Liu DQ. Use of a quadrupole linear ion trap mass spectrometer in metabolite identification and bioanalysis. Rapid Commun Mass Spectrom2003;17(11):1137-45）。
【０１３８】
ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）を、Agilent 1100 LCシステムと結合された線形イントラップ質量分析計（Q-trap 4000、Applied Biosystem社）を用いて行った。血清試料を実施例１に記載したように抽出した。水性画分をアクリロニトリルと１：３で混合し、それぞれの試料の分析に使用前にタンパク質を沈殿させた。内部標準（メタノール中レセルピン：陰性ＥＳＩに対して１００μｇ／ｍＬ；陽性ＥＳＩに対して１μｇ／ｍＬ）１５μＬ及び３：１（アクリロニトリル）：（ｄｄＨ２Ｏ中１％ギ酸）１０８μＬを試料アリコートそれぞれ１２μＬに総容量１３５μＬになるように加えた。この試料１００μＬをフロー注入分析（ＦＩＡ）によりABI4000QTRAP中にオートサンプラーで注入した。キャリア溶媒は、６０：４０（メタノール）：（ｄｄＨ２Ｏ中１％ギ酸）であり、APCI源への流速は４５０μＬ／分であった。
【０１３９】
ＭＳ／ＭＳ  ＨＴＳ法（陰性及び陽性ＥＳＩ）を、イオンスプレープローブを有するTurboV（商標）源を備えた四重極線形イオントラップABI 4000QTRAP質量分析計で開発した。ソースガスパラメータは以下の通りであった：陰性ＥＳＩ：（ＣＵＲ：１０．０、ＣＡＤ：６、ＩＳ：−４５００、ＴＥＭ：５００、ＧＳ１：５０、ＧＳ２：６０、インターフェースヒーターオン。「化合物」設定は以下の通りであった：入口電位（ＥＰ）：−１０、及び衝突セル出口電位（ＣＸＰ）：−１０．０）；陽性ＥＳＩ：（ＣＵＲ：１０．０、ＣＡＤ：６、ＩＳ：５５００、ＴＥＭ：５００、ＧＳ１：３０、ＧＳ２：６０、インターフェースヒーター  オン。「化合物」設定は以下の通りであった：入口電位（ＥＰ）：１０、及び衝突セル出口電位（ＣＸＰ）：１５．０）。
【０１４０】
この方法は、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）に基づき、これはそれぞれのバイオマーカーについての２つのＭＲＭ遷移、及びそれぞれの方法について総計１６のＭＲＭに対する内部標準（レセルピンであるが、他の化合物を使用してもよい）についての２つのＭＲＭ遷移からなった。それぞれの遷移を、それぞれ陽性及び陰性ＥＳＩモードについて１００ミリ秒又は７０ミリ秒間モニターした。１試料当たりの総捕捉時間は約１分であった。簡単には、それぞれの方法で、表２０に示されるようにそれぞれ１４個のバイオマーカーＭＲＭ遷移（７個の親由来）及び２個の内部標準（ＩＳ）ＭＲＭ遷移（１個の親由来）の強度を測定した。次いで、１患者当たりの７個の測定されたバイオマーカー遷移：ＩＳ遷移の最小平均正規化ｌｏｇ（２）変換比を決定することによって患者スコアを生成した。次いで、この値を正常個体から生成されたスコアの分布と比較し、それに従って前立腺癌リスク因子を帰属させた。それぞれの方法についてそれぞれ７個のバイオマーカーについてバイオマーカー遷移対内部標準遷移のピーク面積比をプロットすることによって上記方法を用いて、ABI 4000QTRAPはＭＲＭ遷移ピーク面積を正確に測定することができることが確認された。さらに、ＨＴＳ法は、抽出されたヒト基準血清物質の一連の希釈液も取り込み、これは機器の直線性の判定及び保証を可能にする。較正曲線がＲ２値＜０．９８を有する場合、この試料実験は失敗と考えられ、試料は再実験することが必要である。
【０１４１】
上記の通り、前立腺癌ＨＴＳトリプル−四重極法は、分子の半分が陰性モードで検出され、他の半分が陽性モードで検出されるという事実により２つの独立したデータ獲得成分を含む。
【０１４２】
陽性モードで検出された７個のリゾホスファチジルコリン分子（即ち、４９５．３３２８、５１７．３１４８、５１９．３３２８、５２１．３４８０、５２３．３６４０、５４１．３１４８、及び５４５．３４６０という正確な質量を有する代謝産物）について、測定に用いられた遷移は、図２１Ａに示し、それぞれのバイオマーカーについて１分子当たり２個の娘イオン遷移［（ａ及びｂ（５４６．３を除く）、ここで単一遷移を用いた）及び１試料当たり２個の内部標準遷移（１及び２）を含む。したがって、それぞれのバイオマーカー遷移をそれぞれの内部標準遷移で割ると、１バイオマーカー当たり２６の比が得られる。正常基準血清試料も機器の直線性を評価するために種々の希釈で分析し、これについてＲ−二乗係数を計算することができる。それぞれの遷移比の下記に得られるデータについての平均−Ｒ二乗値を図２１Ａに示す。４９６．３／１８４．２ａｌに対する希釈液の平均強度の試料プロットを図２１Ｂに示す。次いで、比のデータを対照集団の平均に対して正規化して、ｌｏｇ（２）変換した。次いで、患者当たりの最小比値を最終結果スコアとして選択した。次いで、これらの患者スコアの分布を視覚化し、最適診断カットオフ点を決定した。
【０１４３】
発見の局面のために用いた同じ２４個の前立腺癌血清試料を、１４７個の男性対照試料の拡大された独立セットとともに本方法を用いて再分析した。対照及び前立腺癌のコホートにおけるそれぞれ２６の遷移についての平均比（ｌｏｇ変換されていない）を図２１Ｃに示す。予期されたように、それぞれの比の強度は、対照に比べて前立腺癌コホートにおいてより低い。
【０１４４】
これらの対象について最終患者スコア（１患者当たり最小検出対数比）を図２２Ａにおける散布図に示す。結果は、２４人の前立腺癌患者（黒色三角）の患者スコアは、大部分の疾病を有しない男性対象（薄灰色四角）より有意に低かったことを明らかに示す。図２２Ｂに示されるように、患者スコアに基づいて対象の分布をプロットすることは以前の所見に酷似しており、前立腺患者の分布（黒色棒）の左へのシフトを示し、対照に対して大多数の前立腺癌患者において全体的により低い患者スコアを示した。カットオフ患者スコアを図２２Ａの点線で示された−１．２５に設定すると、感度約７５％（即ち、癌患者の７５％が−１．２５未満のスコアを有する）、及び特異性約９１％（即ち、対照男性集団の９１％が−１．２５を超えるスコアを有する）を得た。患者スコアを用いてｔ検定から生成されたｐ値は、対照試料と前立腺癌試料との間で１．０９Ｅ−１４であった。
【０１４５】
陰性モードで検出された７個のリゾ脂質種（４８１．３１７１、５３１．３１２３、５４１．３４２２、５５５．３１０１、５６５．３３９４、５６７．３５４６、及び５６９．３６８７）について、ＨＴＳ法についての娘イオン遷移を図２３Ａに示す。この方法は、陽性モードと同様であり、１親イオン当たり生成された４つの比（２つの内部標準測定からの）を有し、患者試料当たり総計２８の比を得た。それぞれの比について多数の希釈血清試料の分析から得られる平均ｒ−二乗値も図２３Ａに示す。例として、第１の遷移比（４８０．３／２５５．４ａｌ）についての標準曲線のプロットを図２３Ｂに示す。予期されたように、図２３Ｃの棒グラフに示されるように、対照に比べてそれぞれの遷移についての比は、前立腺癌コホートでより低かった。
【０１４６】
陰性モードで検出された７個の代謝産物についての最終患者スコア（１患者当たり最小検出対数比）を図２４Ａの散布図に示す。この結果は、２４人の前立腺癌患者（黒色三角）の患者スコアが、大部分の疾病を有しない男性対象（薄灰色四角）より有意に低かったことを明らかに示す。図２４Ｂに示されるように、患者スコアに基づく対象の分布をプロットすることは、以前の所見に酷似しており、前立腺患者（黒色棒）の分布の左へのシフトを示し、対照に比べて大多数の前立腺癌患者の患者スコアが全体的により低いことを示した。カットオフ患者スコアを図２４Ａの点線で示された−１．００に設定すると、感度約７９％（即ち、癌患者の７９％は、−１．００未満のスコアを有する）及び特異性約８１％（即ち、対照男性集団の８１％が−１．２５を超えるスコアを有する）を生じる。患者スコアを用いてｔ検定から生成されたｐ値は、対照試料と前立腺癌試料との間で４．１１Ｅ−１４であった。
【０１４７】
当業者に知られているように、カットオフ値は、それぞれ感度又は特異性のいずれかに有利に働くように上又は下に移動させることができる。この性能は、ＰＳＡ試験で達成できる性能より優れている。この方法は正確で、血清試料に対して迅速に行うことができるので、男性集団をスクリーニングすることは、そうでなければ未検出の事例を同定することが期待され、したがって、前立腺癌死亡率に大きな影響を与えるであろう。
【０１４８】
当業者にまた、知られているように、測定された遷移の様々なサブセット及びそれらの比を用いて診断精度を最適化することができる。同様に、それぞれ陽性及び陰性モードの一連の分析を行い、次いで、その結果を積み重ね又は組み合わせることは、感度及び特異性を改善することもできる。例えば、ただ一つの方法（陽性モード）を用いて間違って診断された患者は、陰性モードで正しく分類することができるし、又は逆の場合も同じである。他に、陽性及び陰性の両モードからのデータを最初に取得し、その後総累積データセットに基づいて１人の患者スコアを生成させることができる。
【０１４９】
全ての引用は参照により本明細書によって組み込まれる。
【０１５０】
本発明を１つ又は複数の実施形態に関して記載してきた。しかし、請求の範囲に規定されるように、本発明の範囲を逸脱することなく、多くの変形及び変更を行うことができることは当業者に明らかである。
【０１５１】
【表１】
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【０１５２】
【表２】
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【０１５３】
【表３】
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【０１５４】
【表４】
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【０１５５】
【表５】
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【０１５６】
【表６】
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【０１５７】
【表７】
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【０１５８】
【表８】
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【０１５９】
【表９】
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【０１６０】
【表１０】
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【０１６１】
【表１１】
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【０１６２】
【表１２】
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【０１６３】
【表１３】
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【０１６４】
【表１４】
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【０１６５】
【表１５】
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【０１６６】
【表１６】
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【０１６７】
【表１７】
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【０１６８】
【表１８】
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【０１６９】
【表１９】
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【０１７０】
【表２０】
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【図面の簡単な説明】
【０１７１】
【図１】前立腺癌の存在に関連するリゾリン脂質種に関する代謝産物を含む代謝産物の発見、同定及び特徴付けに関与するステップの概要を示す図である。
【図２】ｐ値０．０５未満を有する４９２の質量から生成された主要成分分析（ＰＣＡ）プロットを示す図である。プロット上の各点は、１人の患者の試料を表し、点線は、その間で大部分の前立腺癌対象（黒色）と対照（灰色）とを分離できる境界を表す。
【図３】ｐ値＜０．０５を有する４９２から選択された１４個の質量のサブセットから生成されたＰＣＡプロットを示す図である。１４個の質量を用いるだけで、前立腺癌の対象（黒点）と対照対象（灰色点）との間の高度の区別が明らかである。点線は、２つのコホート間の境界を示し、これはカットオフ値として用いる場合、感度８４％（癌の８４％を検出）及び特異性１００％（癌、又は偽陽性として分類される対照はない）を生じる。
【図４】対照（灰色）及び前立腺癌対象（黒色）における１４個の選択された質量の平均相対強度の棒グラフを示す図である。誤差バー＝±１ｓ．ｄ．
【図５】飛行時間（ＴＯＦ）ＭＳを用いて検出された、ＨＰＬＣでのクロマトグラフィー分離の１６分から１８分の間に溶出する代謝産物の一連の抽出質量スペクトルを示す図である。ボックスは、対照血清（Ａ）の約４５０と６００ドルトンとの間で検出された代謝産物質量の領域を示すが、前立腺癌陽性血清（Ｂ）は不在である。下側パネル（Ｃ）は、対照スペクトルと前立腺癌スペクトルとの正味の差を示す。
【図６】ＨＰＬＣに続けてＴＯＦ−ＭＳを用いて検出された１４個の代謝産物のグラフを示す図である。誤差バー＝±１ｓ．ｄ．
【図７】衝突エネルギー電圧がそれぞれ２０（Ａ）、３５（Ｂ）及び５０（Ｃ）ボルトにおける、４９５．３３２８（４９６．３４０１［Ｍ＋Ｈ］）についてのＭＳ／ＭＳ抽出質量スペクトルを示す図である。
【図８】衝突エネルギー電圧がそれぞれ２０（Ａ）、３５（Ｂ）及び５０（Ｃ）ボルトにおける、５１７．３１４８（５１８．３２１９［Ｍ＋Ｈ］）についてのＭＳ／ＭＳ抽出質量スペクトルを示す図である。
【図９】衝突エネルギー電圧がそれぞれ２０（Ａ）、３５（Ｂ）及び５０（Ｃ）ボルトにおける、５１９．３３２８（５２０．３４０１［Ｍ＋Ｈ］）についてのＭＳ／ＭＳ抽出質量スペクトルを示す図である。
【図１０】衝突エネルギー電圧がそれぞれ２０（Ａ）、３５（Ｂ）及び５０（Ｃ）ボルトにおける、５２１．３４８０（５２２．３５５４［Ｍ＋Ｈ］）についてのＭＳ／ＭＳ抽出質量スペクトルを示す図である。
【図１１】衝突エネルギー電圧がそれぞれ２０（Ａ）、３５（Ｂ）及び５０（Ｃ）ボルトにおける、５２３．３６４０（５２４．３７１３［Ｍ＋Ｈ］）についてのＭＳ／ＭＳ抽出質量スペクトルを示す図である。
【図１２】衝突エネルギー電圧がそれぞれ２０（Ａ）、３５（Ｂ）及び５０（Ｃ）ボルトにおける、５４１．３１４８（５４２．３２１９［Ｍ＋Ｈ］）についてのＭＳ／ＭＳ抽出質量スペクトルを示す図である。
【図１３】衝突エネルギー電圧がそれぞれ２０（Ａ）、３５（Ｂ）及び５０（Ｃ）ボルトにおける、５４５．３４６０（５４６．３５３４［Ｍ＋Ｈ］）についてのＭＳ／ＭＳ抽出質量スペクトルを示す図である。
【図１４】衝突エネルギー電圧がそれぞれ２０（Ａ）、３５（Ｂ）及び５０（Ｃ）ボルトにおける、４８１．３１７１（４８０．３０９１［Ｍ−Ｈ］）についてのＭＳ／ＭＳ抽出質量スペクトルを示す図である。
【図１５】衝突エネルギー電圧がそれぞれ２０（Ａ）、３５（Ｂ）及び５０（Ｃ）ボルトにおける、５３１．３１２３（５３０．３０３５［Ｍ−Ｈ］）についてのＭＳ／ＭＳ抽出質量スペクトルを示す図である。
【図１６】衝突エネルギー電圧がそれぞれ２０（Ａ）、３５（Ｂ）及び５０（Ｃ）ボルトにおける、５４１．３４２２（５４０．３３３５［Ｍ−Ｈ］）についてのＭＳ／ＭＳ抽出質量スペクトルを示す図である。
【図１７】衝突エネルギー電圧がそれぞれ２０（Ａ）、３５（Ｂ）及び５０（Ｃ）ボルトにおける、５５５．３１０１（５５４．３０１３［Ｍ−Ｈ］）についてのＭＳ／ＭＳ抽出質量スペクトルを示す図である。
【図１８】衝突エネルギー電圧がそれぞれ２０（Ａ）、３５（Ｂ）及び５０（Ｃ）ボルトにおける、５６５．３３９４（５６４．３３０６［Ｍ−Ｈ］）についてのＭＳ／ＭＳ抽出質量スペクトルを示す図である。
【図１９】衝突エネルギー電圧がそれぞれ２０（Ａ）、３５（Ｂ）及び５０（Ｃ）ボルトにおける、５６７．３５４６（５６６．３４５９［Ｍ−Ｈ］）についてのＭＳ／ＭＳ抽出質量スペクトルを示す図である。
【図２０】衝突エネルギー電圧がそれぞれ２０（Ａ）、３５（Ｂ）及び５０（Ｃ）ボルトにおける、５６９．３６８７（５６８．３５９８［Ｍ−Ｈ］）についてのＭＳ／ＭＳ抽出質量スペクトルを示す図である。
【図２１】Ａ）陽性ＥＳＩトリプル四重極ＨＴＳ法に用いられた親−娘イオン遷移のリスト並びに５個の希釈試料にわたって線形性の計算から得られるＲ−平方相関係数、Ｂ）遷移４９６．３／１８４．２ａｌについての標準曲線、Ｃ）前立腺対象（黒色）及び対照対象（灰色）におけるそれぞれの遷移についての平均比（バイオマーカー：ＩＳピーク面積）を示す図である。
【図２２】Ａ）１４７個の男性対照（灰色四角）及び２４個の前立腺癌患者（黒色三角）についての陽性ＥＳＩ  ＨＴＳ患者スコアの散布図、Ｂ）瓶化患者スコアによる対照集団対象（灰色）及び前立腺癌対象（黒色）の分布を示す頻度ヒストグラムを示す図である。
【図２３】Ａ）陰性ＥＳＩトリプル四重極ＨＴＳ法に用いられる親−娘イオン遷移のリスト並びに５個の希釈試料にわたって線形性の計算から得られるＲ−平方相関係数、Ｂ）遷移４８０．３／２５５．４ａｌについての標準曲線、Ｃ）前立腺対象（黒色）及び対照対象（灰色）におけるそれぞれの遷移についての平均比（バイオマーカー：ＩＳピーク面積）を示す図である。
【図２４】Ａ）１４７個の男性対照（灰色四角）及び２４個の前立腺癌患者（黒色三角）についての陰性ＥＳＩ  ＨＴＳ患者スコアの散布図、Ｂ）瓶化患者スコアによる対照集団対象（灰色）及び前立腺癌対象（黒色）の分布を示す頻度ヒストグラムを示す図である。
【０１７２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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