(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドを細胞内へ透過させる少なくとも１つのアミノ酸配列と、ＥＲＫ型ＭＡＰキナーゼの基質のドッキングドメイン配列であるアミノ酸配列と、を含んでなり、
前記ドッキングドメイン配列は、配列番号：２０に記載される配列を含み、
前記ペプチドを細胞内へ透過させる少なくとも１つのアミノ酸配列は、ＨＩＶ−ＴＡＴ透過ペプチド配列である、ペプチド。
【請求項２】
少なくとも１つのスペーサー配列と、スペーサー配列により挟まれてもよい酵素切断配列をさらに含む請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
フルオロフォア又は酵素と結合しているか、又はビオチン化されている、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項４】
前記フルオロフォアは共有結合されている請求項３記載のペプチド。
【請求項５】
前記酵素はβ−ガラクトシダーゼである請求項３又は４に記載のペプチド。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか１項記載のペプチドをコードする核酸。
【請求項７】
請求項６記載の核酸を含んでなる発現ベクター。
【請求項８】
請求項１から５のいずれか１項記載の少なくとも１つのペプチド及び／又は請求項７記載の少なくとも１つの発現ベクターを含んでなるキット。
【請求項９】
一定の細胞区画中の特定の基質に関する、前記ＥＲＫ型ＭＡＰキナーゼのインビボ又はインビトロにおける活性を阻害するために用いられる請求項１から５のいずれか１項記載のペプチド。
【請求項１０】
請求項１から５のいずれか１項記載の少なくとも１つのペプチドを発現できる非ヒトトランスジェニック哺乳動物。
【請求項１１】
請求項７記載の発現ベクターを使用して遺伝子導入することによって得られる請求項１０記載の非ヒトトランスジェニック哺乳動物。
【請求項１２】
前記非ヒトトランスジェニック哺乳動物はげっ歯類である請求項１０又は１１に記載の非ヒトトランスジェニック哺乳動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の基質に対する、かつ特定の細胞区画における、ＥＲＫタイプＭＡＰキナーゼ経路の選択的阻害に用いるペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＭＡＰキナーゼ（マイトゲン活性化プロテインキナーゼ）は、多様な細胞機能に関わる遍在性の蛋白質である。これらの蛋白質により、細胞の表面から核への細胞内シグナル伝達が確保される。ＭＡＰキナーゼの三種の大きなファミリー（ＥＲＫ、ｐ３８、ＪＮＫ）が同定されており、これらはシグナル伝達経路カスケードに対応する。これらのシグナル伝達経路は、アポトーシスから、増殖、分化、又はさらにはニューロンの可塑性に亘る細胞機能において重要な役割を果たす。これらの機能は先ず、ＭＡＰキナーゼの型に厳密に依存し、そしてＭＡＰキナーゼの各型について、その細胞局在に厳密に依存する。
【０００３】
ＥＲＫシグナル伝達経路によって支配される分子機構を解明し、所定のレベルでシグナル伝達カスケードに干渉できるための、特異的インヒビターが存在すれば有用である。現在入手可能な化合物として、ＰＤ９８０５９（２’−アミノ−３’−メトキシフラボン、窒素含有多環式インヒビター）、及びＵ０１２６（１，４−ジアミノ−２，３−ジシアノ−１，４−ビス（２−アミノフェニルチオ）ブタジエン）は、ＥＲＫの上流のキナーゼであるＭＥＫに対して特異的なインヒビターである。しかし、それらの作用はＥＲＫの上流に向けられるため、これにより下流側の活性化が、それらを任意に識別することも、それらの細胞局在に応じて区別することもなく完全に阻害され、またそれにより下流の基質全てが完全に阻害される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、ＥＲＫに対する選択性が高く、且つ下流で細胞質又は核内の１つ以上の基質に対して特異的に作用するインヒビターを提供し、それに関連する効果、又は場合によっては多面的に表れるいかなる効果を、最低限に、好ましくは完全に回避することが有用と考えられる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、核内又は細胞質内の基質に対して選択性の高い、ＥＲＫ型ＭＡＰキナーゼインヒビターとして有用なペプチドを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明では、「ＥＲＫ型ＭＡＰキナーゼ」又は「ＥＲＫ」の用語は、あらゆるＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼを示す。前記ＥＲＫ型ＭＡＰキナーゼは特に、哺乳類、特にヒト、霊長類、又はマウスのＭＡＰキナーゼが好ましい。あるいは、哺乳動物以外（ヤツメウナギ、ゼブラフィッシュ、線虫、ショウジョウバエ、アフリカツメガエルなど）の由来であってもよい。本発明では、「ＥＲＫインヒビター」又は「ＥＲＫ型ＭＡＰキナーゼインヒビター」の用語は、少なくとも１つの所定の基質に対するＥＲＫのキナーゼ機能を阻害できるあらゆる化合物を示す。
【０００７】
本発明では、「ペプチド」又は「ペプチド鎖」の用語は、アミノ酸のあらゆる鎖を示す。前記アミノ酸の鎖には通常、２〜１００残基、好ましくは５〜７５残基、より好ましくは１０〜５０残基が含まれる（ＩＵＰＡＣ命名法、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ｑｍｕｌ．ａｃ．ｕｋ／ｉｕｐａｃ／ＡｍｉｎｏＡｃｉｄ／Ａ１１１３．ｈｔｍｌ＃ＡＡ１１参照）。
【０００８】
好ましくは、前記の鎖には２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、…、５０、…、１００のアミノ酸残基が含まれる。
【０００９】
本発明では、「アミノ酸」又は「アミノ酸残基」の用語は当業者に公知のあらゆるアミノ酸残基をさす（例えばＮ．Ｓｅｗａｌｄ、Ｈ．−Ｄ．Ｊａｋｕｂｋｅ、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００２、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、ＩＵＰＡＣ命名法ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ｑｍｕｌ．ａｃ．ｕｋ／ｉｕｐａｃ／ＡｍｉｎｏＡｃｉｄ／を参照）。
【００１０】
そこには、天然アミノ酸（例えば、３文字表記でＡｌａ、ｂＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌを含む）や、特殊なアミノ酸及び／又は合成アミノ酸、並びにそれらの誘導体（例えば、Ａａｄ、Ａｂｕ、Ａｃｐ、Ａｈｅ、Ａｉｂ、Ａｐｍ、Ｄｂｕ、Ｄｅｓ、Ｄｐｍ、Ｈｙｌ、ＭｅＬｙｓ、ＭｅＶａｌ、Ｎｖａ、ＨＡＯ、ＮＣａｐ、Ａｂｕ、Ａｉｂ、ＭｅＸａａ等）が含まれる（例えば、Ｊ．Ｓ．Ｎｏｗｉｃｋ，Ｊ．Ｏ．Ｂｒｏｗｅｒ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，１２５，８７６−８７７；Ｒ．Ａｕｒｏｒａ，Ｇ．Ｄ．Ｒｏｓｅ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９８，７，２１−３８；Ｗ．Ｍａｉｓｏｎ，Ｅ．Ａｒｃｅ，Ｐ．Ｒｅｎｏｌｄ，Ｒ．Ｊ．Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｄ．Ｓ．Ｋｅｍｐ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００１，１２３，１０２４５−１０２５４；Ｄ．Ｏｂｒｅｃｈｔ，Ｍ．Ａｌｔｏｒｆｅｒ，Ｊ．Ａ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ａｄｖ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９９，４，１−６８；Ｋ．Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｄ．Ｏｂｒｅｃｈｔ，Ａ．Ｋｎｉｅｒｚｉｎｇｅｒ，Ｃ．Ｓｔａｎｋｏｖｉｃ，Ｃ．Ｓｐｉｅｇｌｅｒ，Ｗ．Ｂａｎｎｗａｒｔｈ，Ａ．Ｔｒｚｅｃｉａｋ，Ｇ．Ｅｎｇｌｅｒｔ，Ａ．Ｍ．Ｌａｂｈａｒｄ，Ｐ．Ｓｃｈｏｅｎｈｏｌｚｅｒ  ｉｎ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（Ｅｄｓ．：Ｂ．Ｔｅｓｔａ，Ｅ．Ｋｙｂｕｒｚ，Ｗ．Ｆｕｈｒｅｒ，Ｒ．Ｇｉｇｅｒ），Ｖｅｒｌａｇ、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，Ｂａｓｅｌ，１９９３，ｐｐ．５１３−５３３；Ｆ．Ｆｏｒｍａｇｇｉｏ，Ａ．Ｂｅｔｔｉｏ，Ｖ．Ｍｏｒｅｔｔｏ，Ｍ．Ｃｒｉｓｍａ，Ｃ．Ｔｏｎｉｏｌｏ，Ｑ．Ｂ．Ｂｒｏｘｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉ．２００３，９，４６１−４６６を参照）。
【００１１】
前記アミノ酸残基又はその誘導体は、そのあらゆる異性体、特にあらゆるキラル異性体であってもよく、例えばＬ−又はＤ−アイソフォーム、並びにこれらの混合物であってもよい。Ｄ−イソフォームの場合、安定性が向上するという利点がある。
【００１２】
本明細書で「アミノ酸誘導体」の用語は、あらゆるアミノ酸誘導体、特に当業者に公知のあらゆる誘導体（例えば、Ｎ．Ｓｅｗａｌｄ，Ｈ．−Ｄ．Ｊａｋｕｂｋｅ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００２，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；ＩＵＰＡＣ命名法、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ｑｍｕｌ．ａｃ．ｕｋ／ｉｕｐａｃ／ＡｍｉｎｏＡｃｉｄ／参照）を指す。
【００１３】
アミノ酸誘導体には、例えばアルキル側鎖などの更なる側鎖、及び／又はヘテロ原子による置換を有する、天然アミノ酸に由来しうるアミノ酸残基が含まれる。
【００１４】
「アミノ酸配列」の概念は当業者に公知である。アミノ酸配列は、少なくとも１つのペプチド結合で共有結合した少なくとも２つの残基を含んでなる。
【００１５】
アミノ酸配列は以下では１文字表記で示す。
【００１６】
前記ペプチドは、当業者に公知の方法で得ることができ、例えば前記ペプチドは、固相合成若しくは溶液中での合成（合成ペプチド）などの合成法、又は分子生物学的方法（組換えペプチド技術）によって得ることができる。
【００１７】
本発明は、ペプチドを細胞内へ透過させる少なくとも１つのアミノ酸配列と、ＮＥＳの中から選択される細胞内ターゲッティングアミノ酸配列と、任意に、ＮＬＳの中から選択される細胞内ターゲッティング配列と、ＥＲＫ型ＭＡＰキナーゼの基質のドッキングドメイン配列に対応するアミノ酸配列と、任意に、少なくとも１つの「スペーサー」配列と、任意に、好適にはスペーサー配列により挟まれる酵素切断配列を含んでなるペプチドに関する。
【００１８】
本発明の「ペプチドを細胞内へ透過させるアミノ酸配列」の用語は、細胞外から細胞内への前記ペプチドの輸送を促進及び／又は媒介するあらゆるアミノ酸配列を指す。このような配列は、当業者に公知である。前記ペプチドを細胞内へ透過させる前記配列は、前記細胞のタイプにより適宜選択し、透過効率を最適化できる。
【００１９】
一実施形態では、前記ペプチドを細胞内へ透過させる前記配列は２〜２０残基長、特に６、７、８、９、…、１７、１８、１９又は２０残基長を有する。
【００２０】
一実施形態では、前記ペプチドを細胞内へ透過させる前記配列は、ＨＩＶ−ＴＡＴ透過ペプチド配列、ペネトラチン（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）、７〜１１個のアルギニン配列、「Ｘ７／１１Ｒ配列」と称される配列から選択される。
【００２１】
一実施形態では、前記ペプチドを細胞内へ透過させる前記配列は、Ｄｅ  Ｃｏｕｐａｄｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（２００５）３９０，４０７−４１８及び国際公開第０１／６４７３８号パンフレットに記載の透過配列などの、Ｖｅｃｔｏｃｅｌｌ（登録商標）ファミリー（すなわちディアトス（ｄｉａｔｏｓ）ペプチドベクター：ＤＰＶ）由来の配列から選択される。
【００２２】
「Ｘ７／１１Ｒ配列」の用語は、７〜１１個のアルギニン残基（７／１１Ｒ）を含む、７〜２５、好ましくは７〜２０アミノ酸で構成されるあらゆるペプチド配列であって、アルギニン残基（Ｒ）が前記配列内で無作為に配置できるものを意味する。例を以下に示すが、当業者であれば他の可能性を想起できる。
【００２３】
一実施形態では、前記ペプチドを細胞内へ透過させる前記配列は以下から選択できる。
【表１】
0005612248.tif 000002
※（＊）Ｄｅ  Ｃｏｕｐａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（２００５）３９０，４０７−４１８及び国際公開第０１／６４７３８号パンフレット。
【００２４】
ＮＬＳ（核局在化シグナル）の概念は当業者に公知である。それは通常、核内移行の現象を介して所定の蛋白質を核内でターゲッティングさせるアミノ酸配列である。
【００２５】
一実施形態では、前記ＮＬＳ配列は塩基性アミノ酸（アルギニン又はリジン）に富む配列である。一実施形態では、前記ＮＬＳ配列は、２〜２０残基、特に６、７、８、９、…、１７、１８、１９又は２０残基長である。
【００２６】
一実施形態では、前記ＮＬＳ配列は以下から選択できる。
【表２】
0005612248.tif 000003
【００２７】
ＮＥＳ（核外移行シグナル）は当業者に公知である。それらは通常、核から細胞質へ特定の蛋白質が移動する核外移行を媒介するアミノ酸配列である。
【００２８】
一実施形態では、前記ＮＥＳ配列は２〜２０残基、特に６、７、８、９、…、１０、１１、１２、…、１７、１８、１９又は２０残基長である。
【００２９】
一実施形態では、前記ＮＥＳ配列は以下から選択される。
【表３】
0005612248.tif 000004
【００３０】
ＥＲＫ型ＭＡＰキナーゼの基質のドッキングドメイン配列に対応する前記アミノ酸配列には、当業者に公知のＥＲＫ基質のドッキングドメインの何れを含めてもよい。
【００３１】
「ドッキングドメイン」は当業者に公知である。それは通常、前記基質と前記ＭＡＰキナーゼとの間で相互作用及び／又は動員を特異的に調節するＭＡＰキナーゼの基質の一部分である。それは、前記ＭＡＰキナーゼに対する前記基質のドッキング部位の全体又は一部である。したがって、前記ドッキングドメインの配列は特定の相互作用に対して特異的且つ選択的である。
【００３２】
よって、本発明では、これらドッキングドメイン配列の各々はＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼ基質の一部分（アミノ酸配列）に対応し、この部分が前記基質と前記ＥＲＫ型ＭＡＰキナーゼとの間で相互作用及び／又は動員を特異的に調整するという利点がある。一実施形態では、ＥＲＫ型ＭＡＰキナーゼの基質のドッキングドメイン配列に対応する前記アミノ酸配列は、ＥＲＫ基質のドッキングドメインの一部のみを含んでもよい。このように、ＥＲＫ型ＭＡＰキナーゼの基質のドッキングドメイン配列に対応する前記アミノ酸配列は、ドッキングドメインの一部分のみを含むため、数種の特定のＥＲＫの基質を阻害できる。
【００３３】
本発明の一実施形態では、ＥＲＫ型ＭＡＰキナーゼの基質のドッキングドメイン配列に対応する前記アミノ酸配列は、１２〜２５残基、好ましくは１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４残基長である。
【００３４】
一実施形態では、前記ドッキングドメイン配列は、ＦＸＦＰ型ドッキングドメイン配列及びＤ型ドッキングドメイン配列から選択される。
【００３５】
一実施形態では、前記ドッキングドメイン配列は、１２〜２５残基、好ましくは１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４残基長である。任意に、一実施形態では、最小のＦＸＦＰ型配列に対応するように前記配列を縮小してもよい。ゆえに、一実施形態では、前記ドッキングドメイン配列は３〜１１残基、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１残基長であってもよい。
【００３６】
本明細書の「Ｄ型ドッキングドメイン」配列の用語は、当業者に公知のいずれのＤ型ドッキングドメイン配列をも意味する。これには、特に疎水性アミノ酸の配列とそれに続く塩基性アミノ酸の一配列、疎水性アミノ酸の複数配列とそれに続く塩基性アミノ酸の一配列及び「ロイシンＸロイシン」（ＬＸＬ）配列、塩基性アミノ酸の配列とそれに続く「ロイシンＸロイシン」配列と更に疎水性アミノ酸の配列が含まれる。
【００３７】
本明細書において「ＦＸＦＰ型ドッキングドメイン配列」の表現は、当業者に公知のＦＸＦＰ型ドッキングドメイン配列を意味する。これには、特に前記基質の「ＦＸＦＰ」ドメインの配列と、対応する隣接のＮｔｅｒ及びＣｔｅｒ配列が含まれる。これにはまた、（Ｆ／Ｙ）Ｘ（Ｆ／Ｙ）Ｐ型、すなわち、
−ＦＸＦＰ、又は
−ＦＸＹＰ、又は
−ＹＸＦＰ、又は
−ＹＸＹＰ
（Ｆはフェニルアラニン（Ｐｈｅ）を表し、Ｘは何れかのアミノ酸（Ｘａａ）を表し、Ｙはチロシンを表し、Ｐはプロリン（Ｐｒｏ）を表す）の型のドッキングドメインも含まれる。一実施形態では、前記ドッキングドメイン配列は、以下のものから選択される。
【表４】
0005612248.tif 000005
【００３８】
単一の基質が、ＥＲＫに対する幾つかのドッキングドメインを有する場合がある。これは、例えば、ＥＲＫに対するＥｌｋ−１及びＭＫＰ−１の場合である。この場合、ＥＲＫ／基質相互作用を阻止するために、１種又は別種のドッキングドメイン配列を本発明に係るペプチドに適用してもよい。あるいは、例えばＦＸＦＰ配列などのドッキングドメイン配列を含む１つのペプチドと、例えばＤ配列などの別のドッキングドメイン配列を含むもう１つのペプチドとの、２つの本発明に係るペプチドを組み合わせて使用することで、閾値下の濃度での阻害能を向上させることができる。
【００３９】
本発明では、前記ペプチドは、細胞との接触後、前記ペプチドを細胞内へ透過させる前記アミノ酸配列を利用して、本発明に係るペプチドを前記細胞に取り込ませるという効果を発揮する。その後、前記細胞内ターゲッティング配列によって、前記ペプチドが核内（ＮＬＳの場合）又は細胞質内（ＮＥＳの場合）のいずれかに局在化する。あるいは、追加的な細胞内ターゲッティング配列がなくとも、透過に関与する前記配列中に塩基性アミノ酸が多く存在すれば、それがまたＮＬＳの役割を果たし、前記ペプチドが核に局在化する。すなわち、本発明に係る前記ペプチド構造によって特異的な細胞内局在化が効率的になされる。前記ドッキングドメイン配列は、次いで阻害的な役割を果たし、効率的にＥＲＫ型ＭＡＰキナーゼに対して前記基質の存在をミミッキングし、それにより特異的な細胞内局在化を伴いながらＥＲＫと前記基質との相互作用の選択的且つ特異的に阻害を引き起こす。場合により、このＥＲＫと前記基質との間の阻害は、核内での相互作用特異的であるときも、又は細胞質内での相互作用特異的であるときもある。よって、本発明では、結果的に行われる阻害が、基質／ＥＲＫの結合（ドッキングドメインによる）において特異的であるのみならず、細胞内局在化（核内相互作用の選択的阻害又は細胞質内相互作用の選択的な阻害：すなわち特異的な差分的阻害）においても特異的である点で有用である。
【００４０】
前記細胞は、真核細胞好ましくは高等真核細胞であり、例えば哺乳動物細胞又はヒト細胞である。それは、有糸分裂中の細胞、又は定常期（有糸分裂後）の細胞、例えばニューロン細胞であってよい。
【００４１】
本発明は、前記任意のスペーサー配列によって、前記ペプチドを細胞内へ透過させる前記配列と前記ドッキングドメイン配列との間で特定の立体構造的柔軟性が確保できるという意味で有用である。例えば、前記スペーサー配列は少なくとも１つ、好ましくは幾つかのプロリン残基（例えば２、３又は４のプロリン残基）を含んでもよい。
【００４２】
さらに、一実施形態では、前記ペプチドは前記ペプチドを細胞内へ透過させる前記アミノ酸配列を、前記ペプチドの残部から分離するための酵素切断部位を含んでもよい。本発明では、前記ペプチドは２つの連続したシステイン残基を含んでもよく、これにより細胞質中のグルタチオンにより細胞内での切断（これら２残基の間に存在するジスルフィド結合が細胞への透過後に切断）がなされるという意味で有用である。他のいずれの酵素切断部位、特に当業者に公知の細胞内プロテアーゼによる切断部位を使用してもよい。本発明の一実施形態では、前記切断部位はカスパーゼ型のシステインプロテアーゼ切断部位、又はＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ）切断部位であってもよい。
【００４３】
一実施形態では、本発明に係るペプチドは少なくとも１つのフルオロフォアと、好ましくは共有結合により結合している。前記フルオロフォアは当業者に公知の何れのフルオロフォアであってもよい。特に、前記フルオロフォアはＦａｍ、Ｈｅｘ、Ｔｅｔ、Ｊｏｅ、Ｒｏｘ、Ｔａｍｒａ、Ｍａｘ、Ｅｄａｎｓ、Ｃｙ５、Ｃｙ２又はＣｙ３などのＣｙ染料、フルオレセイン、クマリン、エオシン、ローダミン、ｂｏｄｉｐｙ、アレクサ、カスケードブルー、Ｙａｋｉｍａイエロー、Ｌｕｃｉｆｅｒイエロー及びＴｅｘａｓレッドＡＭＣＡ（登録商標）から選択できる。あるいは、前記ペプチドをビオチン化し、前記フルオロフォアでラベルしたアビジンで間接的に可視化してもよい。前記ペプチドは、例えばβ−ガラクトシダーゼなどの酵素ラベルと結合させてもよい。本発明は、前記フルオロフォア、ビオチン又は酵素（例えばベータ−ガラクトシダーゼ）が、それをインビボで動物体内全体に、インビトロにおける細胞の調製物上に、さらには固定化細胞の調製物上に配置できるように、前記ペプチドのドッキング部位のＣ−末端又はＮ−末端領域に位置するという意味で有用である。
【００４４】
本発明はまた、前記のペプチドをコードする核酸に関する。当業者であれば、特定のペプチドに関し、どの核酸配列（単数または複数）がこのペプチドをコードしているかを、遺伝暗号、前記暗号の縮重、及び種に応じたコドン使用頻度に基づいて同定できる。
【００４５】
本発明はまた、前記のペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターに関する。
【００４６】
一実施形態では、前記発現ベクターは真核生物の発現ベクターである。
【００４７】
前記発現ベクターは、本発明に係るペプチドの使用目的に応じ、特定の細胞のタイプに適するものが好適である。当業者は以上からこのようなベクターを設計できる。特に、当業者であれば構成的かあるいは組織特異的プロモーターを選択して、前記ベクターから前記ペプチドを発現させることができる。さらに、前記発現プロモーターは構成的プロモーター、誘導型プロモーター及び特異的プロモーター（例えば組織特異的プロモーター）から選択できる。
【００４８】
一実施形態では、前記発現ベクターには発生時において前記ペプチドを初期発現させるネスチン型プロモーターが含まれる。
【００４９】
別の実施形態によれば、前記発現ベクターには、標的組織において前記ペプチドを発現させるための少なくとも１つの組織特異的プロモーターが含まれる。
【００５０】
さらに、特定の組織の場合には、前記ペプチドの発現は前記組織内の特定領域、例えば脳の特定領域に限定されてもよい。
【００５１】
一実施形態では、海馬（空間記憶の部位）において優先的に発現させるため、前記発現ベクター中にＣａＭＫＩＩ型プロモーターを含める。
【００５２】
一実施形態では、前記発現ベクターには脳線条体（中毒症状を起こす部位）特異的に発現させるために、Ｄ１型ドーパミン作動性レセプタープロモーターが含まれる。
【００５３】
一実施形態では、前記発現ベクターには黒質緻密部（パーキンソン病における変性プロセスの部位）での発現のためのチロシンヒドロキシラーゼプロモーターが含まれる。
【００５４】
一実施形態では、前記発現ベクターには誘導型プロモーター（例えばテトラサイクリンによって誘導又は抑制されるプロモーター（ＴｅｔＯｎ、ＴｅｔＯｆｆシステム））を含めてもよい。
【００５５】
前記発現ベクターは、一般にＥ．ｃｏｌｉなどの細菌宿主細胞での複製を可能にする、細菌由来の複製起点を含んでもよい。
【００５６】
一実施形態では、前記発現ベクターは特定組織（例えば脳で）で所望の時期に、その組織内の特定領域で前記ペプチドを発現させるように設計でき、例えばトランスジェニックマウスなどのトランスジェニック動物の作出用に設計できる。
【００５７】
一実施形態では、前記発現ベクターはウイルスベクターである。前記ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、イヌウイルスベクター及びレンチウイルスベクターの群より選択できる。レトロウイルスベクターにより分裂中の細胞が優先的に標的とされ、イヌウイルスベクターによりニューロン型の有糸分裂後細胞が標的とされ、レンチウイルスベクターにより区別なく宿主細胞のゲノム中に取り込まれるなど、前記ウイルスベクターにより組織特異的発現が可能となる。前記ウイルスベクターはまた、遺伝子療法にも使用できる。
【００５８】
本発明はまた、少なくとも１つの前記ペプチド、及び／又は前記ペプチドをコードする少なくとも１つのベクター若しくは核酸を含むキットに関する。更に前記キットには、少なくとも１つの本発明に係るペプチドに関する実験と並行してコントロール実験を行うための、ペプチド形態又はベクター形態のコントロール（陽性又は陰性）を含めてもよい。例えば、陰性コントロールペプチドにはアミノ酸の「スクランブル」配列を含めてもよい。前記キットには更に、使用説明書を含めてもよい。
【００５９】
一実施形態では、前記キットは少なくとも本発明に係る２種の異なるペプチドを含めてもよい。前記ペプチドを用いて、ＥＲＫ型ＭＡＰキナーゼと、少なくとも２種の異なる基質、又は１つの基質のみとの相互作用を阻害させてもよい。実際、一つの基質中には同じＭＡＰキナーゼとの幾つかのドッキングドメインが含まれる場合がある。これは、例えばＥＲＫに対するＥｌｋ１及びＭＫＰ１の場合である。この場合、ＥＲＫ／基質相互作用を阻止するために、１つの又はその他のドッキングドメイン配列を本発明に係るペプチドに使用してもよい。あるいは、１つのドッキングドメイン配列（例えばＦＸＦＰ配列）を含むペプチドと、別のドッキングドメイン配列（例えばＤ配列）を含む他のペプチドとの、２つの本発明に係るペプチドを組み合わせて使用することで、閾値下の濃度での阻害能を高めることもできる。
【００６０】
本発明はまた、前記ペプチドの使用であって、特定の基質に関する、前記ＥＲＫ型ＭＡＰキナーゼ活性のインビトロ又はインビボにおけるインヒビターとしての使用に関する。このタイプの使用は、前記ＥＲＫ型ＭＡＰキナーゼの基質（単数または複数）の性質、使用可能な細胞のタイプ及び使用可能な細胞外刺激のタイプに応じて非常に広い分野に応用できる。
【００６１】
有利には、前記ペプチドは、例えばラベル（例えば、フルオロフォア、ビオチン又はベータ−ガラクトシダーゼ）と結合させ、又はそれらを全身又は組織内に注射した後、インビボでの動物体全体における試験に供してもよい。全身注射後に、ペプチドに結合したラベルを利用し、中枢神経系（前記配列の存在により血液脳関門における透過が可能となる）を含めた様々な組織に、前記ペプチドを分布させてもよい。
【００６２】
よって、本発明に係るペプチドは、様々なタイプの現象、特に神経生物学（発生、ニューロン可塑性、耽溺性プロセスの研究）、及び癌腫学（細胞周期調節）の研究に使用できる。
【表５】
0005612248.tif 000006
【００６３】
最後に、本発明は少なくとも１つの本発明に係るペプチドを発現できる非ヒトトランスジェニック哺乳類、特に齧歯類に関する。特に前記非ヒト哺乳類は、例えば本発明に係るベクターを用いて遺伝子導入により作製できる。当業者は遺伝子導入技術に精通しており、彼等の一般的な知識を用いてこのような哺乳類を得ることができる（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｒｐ．ｆｒ／Ａｃｃｅｓｓ／ｂｉｏｔｉｃ／ｂｉｏｍｏｌ／ｔｒａｎｓｇｅｎ／ａｃｃｕｅｉｌ．ｈｔｍ参照）。
【００６４】
本発明に係るペプチドは、以下の構造を有してもよい。
【表６】
0005612248.tif 000007
0005612248.tif 000008
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【００６５】
表中、
−「透過配列」とは、前記ペプチドを細胞内へ透過させる少なくとも１つのアミノ酸配列であり、
−「Ｓ」は、例えば２つのプロリン、又は１つのγ−アミノ酪酸などのスペーサー型の任意の配列であって、透過配列とドッキングペプチドとの間に可撓性を与える配列を含むか又はそれに対応する配列であり、
−「Ｃ」は、ドッキングペプチド及びその局在化配列を、透過配列からの細胞内への遊離を可能にする酵素切断部位を含むか又はこれに対応する配列であり、この切断部位は、切断部位のＣ−末端、Ｎ−末端又は両端にスペーサー「Ｓ」を配置してもしなくてもよい。すなわち、Ｃはそれ自身でも、２つのＳと隣接するものでも、又はＣ−末端若しくはＮ−末端側でＳに「隣接する」ものであってもよく、
−「ターゲッティング」とは、ＮＥＳ又はＮＬＳ型の細胞内ターゲッティング配列を含むものであり、
−「ドッキングドメイン」とは、ＥＲＫの所定の基質のＦＸＦＰ型又はＤ型ドッキングドメインのアミノ酸配列を含むものである。
【００６６】
本発明では、ペプチドの一端に存在する透過配列を、切断部位によってペプチドの残部から分離するのが望ましい。これは、ターゲッティング配列がＮＥＳである場合に特に有利であり、それによりペプチドは細胞質内における局在に限定される。
【００６７】
本発明に係るペプチドの優位性は、以下の限定的でない実施例を参照することにより更に明瞭に理解できる。
【実施例】
【００６８】
＜実施例１＞本発明に係るペプチド
以下のペプチド（ペプチドＰ１、Ｐ２及びＰ３）を、固相合成法によって合成した。
【００６９】
ペプチドＰ１及びＰ２：Ｅｌｋ−１とＥＲＫとの相互作用の阻害
ペプチドＰ１（配列番号：３９）：ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＣＣＴＬＷＱＦＬＬＨＬＬＬＤＳＰＡＫＬＳＦＱＦＰＳＧＳＡＱＶＨＩ
（配列中、
−透過配列：ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（ＨＩＶ−ＴＡＴ透過ペプチド）（配列番号：１）
−酵素切断部位：ＣＣ
−ターゲッティング配列：ＴＬＷＱＦＬＬＨＬＬＬＤ（ＮｅｔのＮＥＳ）（配列番号：１８）
−ドッキングドメイン配列：ＳＰＡＫＬＳＦＱＦＰＳＧＳＡＱＶＨＩ（配列番号：２０）。）
Ｐ１は細胞内へ透過し、細胞質内で局在化する。
【００７０】
ペプチドＰ２（配列番号：４０）：ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＳＰＡＫＬＳＦＱＦＰＳＧＳＡＱＶＨＩ
（配列中：
−透過配列：ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号：１）
−スペーサー配列：ＰＰ
−ドッキングドメイン配列：ＳＰＡＫＬＳＦＱＦＰＳＧＳＡＱＶＨＩ（配列番号：２０）。）
Ｐ２は細胞内へ透過し、核内で局在化する。
【００７１】
ペプチドＰ３：ＭＫＰ−３とＥＲＫとの相互作用の阻害
ペプチドＰ３（配列番号：４１）：ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＣＣＴＬＷＱＦＬＬＨＬＬＬＤＰＧＩＭＬＲＲＬＱＫＧＮＬＰＶＲＡＬ
（配列中、
−透過配列：ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号：１）
−酵素切断部位：ＣＣ
−ターゲッティング配列：ＴＬＷＱＦＬＬＨＬＬＬＤ（ＮｅｔのＮＥＳ）（配列番号：１８）
−ドッキングドメイン配列：ＰＧＩＭＬＲＲＬＱＫＧＮＬＰＶＲＡＬ（配列番号：３６）。）
Ｐ３は細胞内へ透過し、細胞質内で局在化する。
【００７２】
＜実施例２＞本発明に係るペプチドの細胞透過及び核内局在化の例
本実施例では本発明に係るペプチドＦ２（「ドッキングペプチド」）を用いた。これはペプチドＰ２（実施例１参照）と同じ配列を有し、そのＣ−末端でＦＩＴＣ（フルオロフォア）と結合している。
【００７３】
すなわち以下の構造を有する。［ＨＩＶ−ＴＡＴ透過ペプチド］−［ＰＰ型のスペーサー］−［ＥＲＫ／Ｅｌｋ−１結合のＦＸＦＰ型ドッキングドメイン］−［ＦＩＴＣ］。
【００７４】
ＨＥＫ２９３細胞を、様々な濃度（蒸留水中１ｍＭの原液、次いでＤＭＥＭ培養培地で２５、５０及び１００μＭに希釈）のペプチドＦ２の存在下で、１５、３０又は６０分間インキュベートした。細胞核をＨｏｅｃｈｓｔ染料（左パネル）を用いてラベルし、ペプチドＦ２をＦＩＴＣラベル（中央パネル）によって可視化した。図１では、１００μＭ濃度のペプチドＦ２について得られた結果を、時間の関数として示す。ラベルした細胞核を左パネルに示し、ラベルしたペプチドＦ２を中央パネルに示し、そしてこれら２つのラベルを重ねたものを右パネルに示す（パネル中の融合部にマーキング）。
【００７５】
本発明に係るペプチドＦ２は迅速に細胞内へ透過し、わずか３０分後に核内で局在化した。更なる細胞内ターゲッティング配列がなくとも、ＨＩＶ−ＴＡＴ透過配列の塩基性アミノ酸に富んでいればＮＬＳの役割を果たし、ペプチドＦ２はこれにより核内に好適に局在化する。
【００７６】
ペプチドＦ２は細胞内に迅速に透過し、次いで特異的に核内で局在化した。
【００７７】
＜実施例３＞本発明に係るペプチドの細胞透過及び細胞質局在化の例
本実施例では本発明に係るペプチドＦ１（「ドッキングペプチド」）を用いた。これはペプチドＰ１（実施例１参照）と同じ配列を有し、そのＣ−末端でＦＩＴＣ（フルオロフォア）と結合している。
【００７８】
すなわち以下の構造を有する。［ＨＩＶ−ＴＡＴ透過ペプチド］−［Ｃ−Ｃ切断部位］−［ＥＲＫ／Ｅｌｋ−１の結合のＦＸＦＰ型ドッキングドメイン］−［ＦＩＴＣ］。
【００７９】
ＨＥＫ２９３細胞を、様々な濃度（蒸留水中１ｍＭの原液、次いでＤＭＥＭ培養培地で２５、５０及び１００μＭに希釈）のペプチドＦ１の存在下で、１５、３０又は６０分間インキュベートした。細胞核をＨｏｅｃｈｓｔ染料（左パネル）を用いてラベルし、ペプチドＦ１をＦＩＴＣラベル（中央パネル）によって可視化した。図２では、１００μＭ濃度のペプチドＦ１について得られた結果を、時間の関数として示す。
【００８０】
ラベルした細胞核を左パネルに示し、ペプチドＦ２を中央パネルに示し、そしてこれら２つのラベルを重ねたものを右パネルに示す（パネル中の融合部にマーキング）。
【００８１】
本発明に係るペプチドは迅速に細胞を透過し、細胞質に局在化した。
【００８２】
＜実施例４＞本発明に係るペプチドの阻害効果の生化学的特徴付け（Ｐ２による、有糸分裂細胞中における血清によるＥｌｋ１の活性化阻害）
本実施例では、本発明に係るペプチドＰ２（実施例１参照）を用いた。
【００８３】
実施例２（図１）に示すように、ＨＥＫ細胞をペプチドＰ２（４０分）で処理し、その後血清（１０％）で２０分又は５分間処理した。血清によりＭＡＰキナーゼ／ＥＲＫ経路が活性化された。
【００８４】
ＥＲＫの活性化を、ＥＲＫのリン酸化（活性）型に対する抗Ｐ−ＥＲＫ１／２抗体（抗ウサギホスホＴｈｒ２０２−Ｔｙｒ２０４  ＥＲＫ、細胞シグナル伝達、１／５０００希釈）を用い、ウエスタンブロッティングによって解析した（図３、上パネル）。Ｅｌｋ−１の活性化は、Ｅｌｋ−１のリン酸化型に対する抗Ｐ−Ｅｌｋ−１抗体（抗マウスホスホＳｅｒ３８３  Ｅｌｋ−１、Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ、１／２００希釈）（図３、下パネル）を用いて可視化した。蛋白質は、セイヨウワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートさせた抗ウサギ及び抗マウス二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ、１／５０００希釈）を用いてそれぞれ検出し、化学発光（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＥＬＣキット）により可視化した。効果を発揮させるのに必要なペプチドの最低濃度を求めるために、用量応答曲線を作成した。
【００８５】
本発明では好適にも、Ｐ−Ｅｌｋ−１の血清による誘導が、１０μＭのペプチドＰ２濃度で完全に阻害された。この阻害は１μＭのＰ２では認められなかった（図３、下パネル）。ペプチドＰ２の用量を更に増加させた場合（５０、１００μＭ）もまた、Ｅｌｋ−１の阻害に対して効果的であることが認められた。本発明では好適にも、血清によるＰ−ＥＲＫの誘導は１０μＭのペプチドＰ２によって変化しなかった。
【００８６】
＜実施例５＞本発明に係るペプチドによる阻害特異性（Ｅｌｋ−１のリン酸化は、Ｐ２により阻害されるが、Ｐ１によっては阻害されない）
本実施例では、本発明に係るペプチドＰ１及びＰ２（実施例１参照）を用いた。
【００８７】
ＨＥＫ細胞を、１０μＭの濃度のペプチドＰ２（図４、中央パネル）又はＰ１（図４、右パネル）の存在下で４０分間インキュベートした。未処理細胞（ペプチドなし）をコントロールとして用いた（図４、左パネル）。
【００８８】
その後、胎児ウシ血清（血清）を用いて細胞を２０分間処理し、ＭＡＰキナーゼ／ＥＲＫ経路を活性化した。
【００８９】
抗ホスホＥＲＫ抗体（抗ウサギホスホＴｈｒ２０２−Ｔｙｒ２０４  ＥＲＫ、細胞シグナル伝達、１／５００希釈（希釈度は実際は、ウエスタンブロッティングと比較して本実験では１０倍低い））を用い、免疫検出によってＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼの活性化型の存在を可視化し、Ｃｙ３とコンジュゲートした蛍光標識二次抗体（抗ウサギＣｙ３、Ｓｉｇｍａ、１／２０００）を用いて検出した（図４、第二列目の３つのパネル、Ｐ−ＥＲＫにマーキング）。処理条件に関わらず、Ｐ−ＥＲＫの誘導が明瞭に観察された（図４、一例として、Ｐ−ＥＲＫラベルを白色星印で示し、Ｈｏｅｃｈｓｔラベルに対応する上部パネルでも同じ星印でこの細胞核をマーキング）。
【００９０】
活性化型Ｅｌｋ−１の存在を、Ｅｌｋ−１のホスホ−Ｓｅｒ３８３に対する抗体（抗マウスホスホＳｅｒ３８３  Ｅｌｋ−１、Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ、１／２００希釈）を用いて免疫細胞化学法により可視化し、Ｃｙ３とコンジュゲートさせた抗マウス二次抗体（抗マウスＣｙ３、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、１／６００）（図４、一例として、第四列目の左右のパネルにＰ−Ｅｌｋ−１ラベルを白色星印で示す）を用いて検出した。対応する核を、第三列目のパネルにて同じ星印でマーキングし、Ｈｏｅｃｈｓｔにより可視化した。
【００９１】
Ｐ−Ｅｌｋ−１の誘導は細胞質区画及び核区画において血清に反応する態様で観察され（図４、第四列目の左のパネル）、血清及びペプチドＰ１の存在下でも観察された（図４、第四列目の右のパネル）。Ｐ−Ｅｌｋ−１誘導の阻害は、ペプチドＰ２で前処理した細胞でも観察された（図４、第四列目の中央のパネル）。
【００９２】
＜実施例６＞本発明に係るペプチドの阻害効果の生化学的解析（ニューロンにおける興奮性神経伝達物質、グルタミン酸塩に応答したＥｌｋ−１の活性化をＰ２で阻害）
線条体ニューロン（マウスのＥ１４胚形成期に採取）の初代培養物を、神経細胞用基礎培地にてインビトロで７日間培養し、次いでペプチドＰ２（５μＭ）で１時間処理した（未処理のコントロールも設けた）。次いで培地を交換し、その後ニューロンをペプチドを含まない培地で３０分間インキュベートした。その後、興奮性神経伝達物質、グルタミン酸塩（１００μＭ）をＧｌｕ２０’でマーキングしたインキュベーションウェルに２０分間添加した。ＥＲＫの活性化は、実施例４に示す抗ホスホＥＲＫ抗体（希釈：１／５０００）を用いたウエスタンブロッティング（図５Ａ）により解析した。
【００９３】
同じ膜上でβ−チューブリン（モノクローナル抗体、Ｓｉｇｍａ、１／５０００希釈）を検出し、ローディングコントロールとした（図５Ａ）。２％パラホルムアルデヒドで固定したニューロンについて同じ抗体（１／５００希釈）を用いてＰ−ＥＲＫ免疫蛍光（図５Ｂ）を行い、Ｃｙ３とコンジュゲートした二次抗体で（１／２０００希釈）検出した（図５Ｂ）。ペプチドＰ２はＥＲＫの活性化を阻害せず、ニューロンにおけるグルタミン酸塩により誘発される核内への移行も阻害しなかった。
【００９４】
免疫沈降（図５Ｃ）：未処理の、又はペプチドＰ２で処理したニューロン抽出物を、抗Ｅｌｋ−１抗体（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ、免疫沈降あたり５μｌ）を用いて免疫沈降させた。これらの免疫沈降した抽出物を、抗ＥＲＫ抗体（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ、１／５０００希釈）を用いたウエスタンブロッティングによってＥＲＫ／Ｅｌｋ−１相互作用を検出した（図５Ｃ）。ペプチドＰ２は塩基性条件下、グルタミン酸塩処理でＥＲＫ／Ｅｌｋ−１相互作用を完全に阻害した。
【００９５】
実施例４の抗ホスホ−Ｓｅｒ３８３−Ｅｌｋ−１抗体（１／２００希釈）を用いたウエスタンブロッティングを行い、Ｅｌｋ−１の活性化をウエスタンブロッティング解析により可視化した（図５Ｄ）。抗ホスホ−Ｔｈｒ５８１  ＭＳＫ１抗体（細胞シグナル伝達、１／７５０希釈）を用いた免疫蛍光によりＭＳＫ１の活性化を可視化し、Ｃｙ３とコンジュゲートした二次抗体を用いて検出した（図５Ｅ）。
【００９６】
ペプチドＰ２は、ＭＳＫ１の活性化を阻害することなく、グルタミン酸塩で誘導されるＥｌｋ−１の活性化を阻止した。
【００９７】
＜実施例７＞脳におけるインビボでのペプチドＦ２の透過性
本発明に係るペプチドＦ２（１ｍＭ溶液、０．５μｌ）（実施例１参照）を、マイクロカニューレを用いてマウス線条体内へ脳室注射した。注射後、マイクロカニューレを１時間留置した。マウスをペントバルビタールの致死量注射によって安楽死させ、その後パラホルムアルデヒド（４％）を心臓内に灌流させた。この切片（３０μｍ）をビブラトームを用いて切断した。ＦＩＴＣフィルターを用いてペプチドＦ２を可視化し（左パネル）、核をＨｏｅｃｈｓｔで染色した（中央パネル）。大多数の細胞でのペプチドＦ２の透過性に注目すべきである（図６）。
【００９８】
＜実施例８＞脳におけるインビボでのペプチドＰ２の効果
本発明に係るペプチドＰ２（１ｍＭ溶液、０．５μｌ）（実施例１参照）を、実施例７と同様に線条体内へ注射した。本実施例では一方の半球にペプチドＰ２を投与し、もう一方の半球に食塩溶液を投与した。１時間後にコカイン（２０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。コカイン投与後１０分において、実施例７と同様に安楽死、心臓内灌流、及び脳の切片作製を行った。線条体中でコカインで誘導されたＥＲＫの活性化とＥｌｋ１の活性化を、前記実施例に記載の抗ホスホ−ＥＲＫ抗体（１／４００希釈）及びモノクローナル抗ホスホ−Ｅｌｋ１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、１／１００）を用いて、二重免疫組織蛍光発光により同じ切片で可視化した。ＥＲＫ活性化をＣｙ３とコンジュゲートした抗ウサギ二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ、１／５００）で、Ｅｌｋ１の活性化をＦＩＴＣに接合させた抗マウス二次抗体（Ｓｉｇｍａ、１／１００）で検出した。ペプチド不存在の細胞でＥＲＫ及びＥｌｋ１が活性化され（図７、上パネル、白色星印）、またペプチドＰ２を投与した側ではＥＲＫの活性化のみが検出された（図７、下パネル）ことに注目すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】本発明に係るペプチド（１００μＭ濃度のペプチドＦ２）の細胞透過及び核内局在化を示す。
【図２】本発明に係るペプチド（１００μＭ濃度のペプチドＦ１）の細胞透過及び細胞質局在化を示す。
【図３】Ｐ２による、有糸分裂細胞中における血清によるＥｌｋ１の活性化阻害を示す。
【図４】本発明に係るペプチドによる阻害特異性（Ｅｌｋ−１のリン酸化）を示す。
【図５】本発明に係るペプチドの阻害効果（ニューロンにおける興奮性神経伝達物質、グルタミン酸塩に応答したＥｌｋ−１の活性化）を示す。
【図６】脳におけるインビボでのペプチドＦ２の透過性を示す。
【図７】脳におけるインビボでのペプチドＰ２の効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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