(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫拡散アッセイを実行するための方法であって、該方法は、（ａ）目的のインフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）抗原を含む開始組成物を取得する工程であって、該ＨＡ抗原はアルミニウム塩を含むアジュバントに吸着されている、工程；（ｂ）該開始組成物を処理して、該ＨＡ抗原を該アジュバントから脱離させる工程；ならびに（ｃ）該脱離させた組成物またはそのサンプルを、該目的のＨＡ抗原に特異的な抗体を含むゲルに拡散させる工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記開始組成物またはそのサンプルと塩を含む脱離試薬とを混合することによって、抗原を工程（ｂ）で脱離させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記塩がリン酸塩である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記塩が、リン酸アンモニウム、リン酸カリウムまたはリン酸ナトリウム、リン酸水素二ナトリウムである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記塩がオルトリン酸水素二カリウムである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記開始組成物またはそのサンプルと界面活性剤を含む脱離試薬とを混合することによって、抗原を工程（ｂ）で脱離させる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記脱離試薬が双性イオン性界面活性剤を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記界面活性剤がｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
オルトリン酸水素二カリウムおよびｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートを含む脱離試薬を使用して、抗原を工程（ｂ）で脱離させる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記脱離試薬が、３００〜３５０ｍＭ  オルトリン酸水素二カリウムおよび０．５％  ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートを有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｃ）が、ゲル中のウェルからの拡散を含み、そして、工程（ｂ）と（ｃ）との間に、前記方法が、脱離させた組成物またはそのサンプルを該ウェルに導入する工程を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｃ）で使用されるゲルが、寒天ゲルまたはアガロースゲルである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ゲル中の沈殿ハローの寸法を決定する、さらなる工程（ｄ）を包含する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｄ）で測定された寸法を標準的な寸法と比較し、その比較の結果を使用して、工程（ｃ）で添加された材料中の前記抗原の濃度を計算する、さらなる工程（ｅ）を包含する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記開始組成物が不活性化されたインフルエンザワクチンである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ワクチンがウイルス粒子全体を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ワクチンが分割ウイルス粒子を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ワクチンがビロソームを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記ワクチンが精製された表面抗原を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記アジュバントがリン酸アルミニウムを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記アジュバントが水酸化アルミニウムを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記アジュバントが水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムの混合物を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
インフルエンザ抗原に対してアッセイを実行するための方法であって、該方法は、（ａ）インフルエンザ抗原を含む開始組成物を取得する工程であって、該抗原は、アジュバントに吸着されている、工程；（ｂ）該開始組成物を処理して、該抗原を該アジュバントから脱離させる工程；および（ｃ）アッセイ技術を該脱離させた組成物またはそのサンプルに適用する工程、を包含する、方法。
【請求項２４】
ワクチンを産生するための方法であって、該方法は：（ｉ）バルクの目的の抗原を調製する工程；（ｉｉ）請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法を使用して該バルクの抗原のサンプルを分析する工程；および、工程（ｉｉ）の結果に基づいて、（ｉｉｉ）該バルクの抗原を所望の最終濃度に希釈する工程；必要に応じて（ｉｖ）該希釈されたバルクの抗原と１つ以上の薬学的に受容可能な成分とを合わせる工程；および（ｖ）流通のために該希釈されたバルクの抗原を包装する工程、を包含する、方法。
【請求項２５】
目的のインフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）抗原の抗原量を標準化するための方法であって、該方法は、アジュバントに吸着した抗原のためのＳＲＩＤアッセイを実行する工程を包含し、ここで、該抗原の放射状拡散が生じる前に、該抗原を脱離させる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インフルエンザワクチン、および特に抗原がアルミニウム塩に吸着しているワクチンに対して行われるアッセイの分野にある。
【背景技術】
【０００２】
様々な形態のインフルエンザウイルスワクチンが、現在利用可能である（例えば、参考文献１の第１７および１８章を参照のこと）。ワクチンは一般的に、生きたウイルスまたは不活性化ウイルスのいずれかに基づく。不活性化ワクチンは、ウイルス粒子全体、「分割」ウイルス粒子、または精製表面抗原に基づき得る。
【０００３】
現在のインフルエンザワクチンは、水中油型エマルションを含むＮｏｖａｒｔｉｓ  ＶａｃｃｉｎｅｓのＦＬＵＡＤＴＭ製品以外は、アジュバントを含まない。しかし、アジュバントは実験的ワクチンと共に使用されており、いくつかの場合において、特に汎流行性株に対するワクチンに関して、アルミニウム塩が使用された。参考文献２から６（特許文献１、特許文献２、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）は、水酸化アルミニウムアジュバントを使用する。参考文献７（特許文献３）は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムの混合物を使用した。参考文献８（非特許文献４）も、アルミニウム塩アジュバントの使用を記載した。
【０００４】
インフルエンザワクチンの抗原含有量を標準化するための通常のアッセイは、一元放射免疫拡散（「ＳＲＩＤ」）アッセイであり［９、１０］、それは赤血球の凝集に基づく試験に代わって、１９７８年にＷＨＯによって推奨された。そのアッセイは、インフルエンザ抗原の、特異的抗赤血球凝集素（抗ＨＡ）血清を含むアガロースゲルへの拡散に基づく。抗原が外側へ拡散するにつれて、ゲル中で同族抗体に遭遇し、そして最初にウェル周囲のハローとして目に見える沈殿を形成する。拡散が続くにつれて、その濃度は物質の過剰へとシフトし、そして沈殿は溶解する。再び沈殿を可能にするよう物質の濃度が低下するまで、拡散はさらに続く。さらなる拡散は、物質が低すぎて沈殿の縁を再溶解できなくなるまで、沈殿、再溶解および再沈殿を可能にする。次いでハローは、直径の増加を止める。最終的なハローの直径は、調製物中のＨＡ抗原の量と直接比例する。未知の調製物によって産生されたハローを、公知のＨＡ含有量を有する参照のものと比較することによって、抗原量を未知のものに割り当て得る。
【０００５】
参考文献５（非特許文献２）におけるアジュバント添加された（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）ワクチンを、使用の直前に抗原およびアジュバントを即時に混合することによって調製した。従って、抗原含有量は、アジュバントを導入する前に標準化された。しかし、もし抗原およびアジュバントを、バルクワクチン製造の段階で混合するなら、ＳＲＩＤアッセイを吸着した抗原に対して行わなければならない。本発明者らは、インフルエンザＨＡはアルミニウム塩アジュバントに非常に強く結合するので、ＳＲＩＤゲル中をよく拡散せず、そして従って標準的な手順によって直接容易にはアッセイできないことを発見した。従って、事前に吸着されたワクチンで使用することを可能にする、ＳＲＩＤアッセイへの改良を提供する必要性が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第６，３７２，２２３号明細書
【特許文献２】国際公開第００／１５２５１号
【特許文献３】国際公開第０１／２２９９２号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｇｏｖｏｒｋｏｖａら、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．（２００６）１９４（２）：１５９〜６７
【非特許文献２】Ｂｒｅｓｓｏｎら、Ｌａｎｃｅｔ（２００６）３６７：１６５７〜６４
【非特許文献３】Ｌｉｎら、Ｌａｎｃｅｔ（２００６）３６８：９９１〜７
【非特許文献４】Ｈｅｈｍｅら、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．（２００４）１０３（１−２）：１６３〜７１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の開示
本発明は、抗原を拡散の前に脱離する工程を含むことによって、吸着した抗原のためのインフルエンザＳＲＩＤアッセイプロトコールを修飾する。従って本発明は、以下の工程を含む、ＳＲＩＤアッセイを行うための方法を提供する：
（ａ）目的の抗原を含む開始組成物を得る工程であって、ここでその抗原はアジュバントに吸着している、工程；
（ｂ）アジュバントから抗原を脱離するために開始組成物を処理する工程；および
（ｃ）脱離した組成物、またはそのサンプルを、目的の抗原に特異的な抗体を含むゲル中へ拡散させる工程。
【０００９】
本発明はまた、アジュバント吸着抗原のためのＳＲＩＤアッセイにおいて、抗原の放射拡散が起こる前に抗原を脱離することから成る改良を提供する。
【００１０】
より一般的には、脱離工程を、吸着が干渉するあらゆるインフルエンザワクチン分析工程、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、イムノブロッティングまたはウェスタンブロッティング、イムノアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）、ＢＣＡタンパク質アッセイ等を含むアッセイ技術の前に使用し得る。従って、本発明は、以下の工程を含む、インフルエンザ抗原に対してアッセイを行うための方法を提供する：
（ａ）インフルエンザ抗原を含む開始組成物を得る工程であって、ここでその抗原はアジュバントに吸着している、工程；
（ｂ）アジュバントから抗原を脱離するために開始組成物を処理する工程；および
（ｃ）脱離した組成物、またはそのサンプルに、アッセイ技術を適用する工程。
【００１１】
本発明はまた、アジュバント吸着インフルエンザ抗原のためのアッセイにおいて、抗原のアッセイを行う前に、抗原を脱離することから成る改良を提供する。
【００１２】
本発明はまた、本発明の方法によってアッセイした抗原組成物を提供する。本発明はまた、本発明の方法によってアッセイした抗原を含むワクチンを提供する。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
免疫拡散アッセイを実行するための方法であって、該方法は、（ａ）目的の抗原を含む開始組成物を取得する工程であって、該抗原はアジュバントに吸着されている、工程；（ｂ）該開始組成物を処理して、該抗原を該アジュバントから脱離させる工程；ならびに（ｃ）該脱離させた組成物またはそのサンプルを、該目的の抗原に特異的な抗体を含むゲルに拡散させる工程を包含する、方法。
（項目２）
上記目的の抗原は、インフルエンザウイルスの赤血球凝集素（ＨＡ）である、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記開始組成物またはそのサンプルと塩を含む脱離試薬とを混合することによって、抗原を工程（ｂ）で脱離させる、項目１〜２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４）
上記塩がリン酸塩である、項目３に記載の方法。
（項目５）
上記塩が、リン酸アンモニウム、リン酸カリウムまたはリン酸ナトリウム、リン酸水素二ナトリウムである、項目４に記載の方法。
（項目６）
上記塩がオルトリン酸水素二カリウムである、項目５に記載の方法。
（項目７）
上記開始組成物またはそのサンプルと界面活性剤を含む脱離試薬とを混合することによって、抗原を工程（ｂ）で脱離させる、項目１〜６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
上記脱離試薬が双性イオン性界面活性剤を含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
上記界面活性剤がｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートである、項目８に記載の方法。
（項目１０）
オルトリン酸水素二カリウムおよびｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートを含む脱離試薬を使用して、抗原を工程（ｂ）で脱離させる、項目１〜９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
上記脱離試薬が、３００〜３５０ｍＭ  オルトリン酸水素二カリウムおよび０．５％  ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートを有する、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
工程（ｃ）が、ゲル中のウェルからの拡散を含み、そして、工程（ｂ）と（ｃ）との間に、上記方法が、脱離させた組成物またはそのサンプルを該ウェルに導入する工程を含む、項目１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
工程（ｃ）で使用されるゲルが、寒天ゲルまたはアガロースゲルである、項目１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
上記ゲル中の沈殿ハローの寸法を決定する、さらなる工程（ｄ）を包含する、項目１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
工程（ｄ）で測定された寸法を標準的な寸法と比較し、その比較の結果を使用して、工程（ｃ）で添加された材料中の上記抗原の濃度を計算する、さらなる工程（ｅ）を包含する、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
上記開始組成物が不活性化されたインフルエンザワクチンである、項目１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
上記ワクチンがウイルス粒子全体を含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
上記ワクチンが分割ウイルス粒子を含む、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
上記ワクチンがビロソームを含む、項目１６に記載の方法。
（項目２０）
上記ワクチンが精製された表面抗原を含む、項目１６に記載の方法。
（項目２１）
上記アジュバントが不溶性の金属塩を含む、項目１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
上記アジュバントがカルシウム塩を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
上記アジュバントがリン酸カルシウムを含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
上記アジュバントがアルミニウム塩を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２５）
上記アジュバントがリン酸アルミニウムを含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
上記アジュバントが水酸化アルミニウムを含む、項目２４に記載の方法。
（項目２７）
上記アジュバントが水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムの混合物を含む、項目２４に記載の方法。
（項目２８）
インフルエンザ抗原に対してアッセイを実行するための方法であって、該方法は、（ａ）インフルエンザ抗原を含む開始組成物を取得する工程であって、該抗原は、アジュバントに吸着されている、工程；（ｂ）該開始組成物を処理して、該抗原を該アジュバントから脱離させる工程；および（ｃ）アッセイ技術を該脱離させた組成物またはそのサンプルに適用する工程、を包含する、方法。
（項目２９）
ワクチンを産生するための方法であって、該方法は：（ｉ）バルクの目的の抗原を調製する工程；（ｉｉ）項目１〜２８のいずれか一項に記載の方法を使用して該バルクの抗原のサンプルを分析する工程；および、工程（ｉｉ）の結果に基づいて、（ｉｉｉ）該バルクの抗原を所望の最終濃度に希釈する工程；必要に応じて（ｉｖ）該希釈されたバルクの抗原と１つ以上の薬学的に受容可能な成分とを合わせる工程；および（ｖ）流通のために該希釈されたバルクの抗原を包装する工程、を包含する、方法。
（項目３０）
アジュバントに吸着した抗原のためのＳＲＩＤアッセイにおける、抗原の放射状拡散が生じる前の、該抗原を脱離させることからなる改善。
（項目３１）
項目１〜２７のいずれか一項に記載の方法によってアッセイされた、抗原組成物。
（項目３２）
項目１〜２７のいずれか一項に記載の方法によってアッセイされた、抗原を含むワクチン。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
ＳＲＩＤアッセイ
本発明のＳＲＩＤアッセイは、上記で記載したように、３つの工程（ａ）から（ｃ）を含む。
【００１４】
ＳＲＩＤアッセイによって分析する開始組成物は、アジュバントに吸着した抗原を含む。その抗原は、下記でより詳細に記載するように、典型的にはインフルエンザウイルス抗原であるが、ＳＲＩＤアッセイはまた、不活性化ポリオおよび狂犬病ワクチンを含む、他のワクチンの効力を決定するために使用することが公知である［９、１０］。ゲルに含まれる抗体は、アッセイする抗原によって選択される。
【００１５】
抗原が吸着するアジュバントは、下記でより詳細に記載するように、典型的には不溶性の金属塩である。
【００１６】
ＳＲＩＤアッセイは、通常分析されるべき組成物をゲル中のウェルに導入することを含む。そのウェルは通常円形であり、そして従って工程（ｃ）における拡散は、実質的に放射状である。本発明のアッセイにおいて、吸着した抗原をアジュバントから脱離して、それがゲル中に拡散させる。脱離のさらなる詳細を下記で提供する。
【００１７】
脱離は、ゲルのウェルの内側で起こり得るが、通常抗原組成物をウェルに加える前に起こる。従って、工程（ｂ）および（ｃ）の間に、本発明の方法は、脱離した組成物、またはそのサンプルを、目的の抗原に特異的な抗体を含むゲルに導入する工程を含み得る。
【００１８】
典型的なＳＲＩＤアッセイにおいて使用するゲルは、サンプルを受け入れる複数のウェルを含み、同時分析を可能にする。単一のアッセイにおいて、同じ材料の複数のサンプルを、通常異なるサンプル希釈物で試験することは普通である。本発明の方法は、単一のサンプル由来の抗原を脱離し、そして次いで免疫拡散の前にそのサンプルを分割し得、その場合工程（ｂ）の脱離材料は、工程（ｃ）の前に多くのサンプルに分割される。
【００１９】
ＳＲＩＤアッセイにおいて使用するゲルは、目的の抗原に特異的な抗体を、標的抗原濃度に関して、拡散の中心から適当な距離で、免疫複合体の形成を可能にする濃度で含む。その抗体は、実質的に均一な濃度で存在し、それは既知であっても既知でなくてもいい。そのようなゲルの調製は、多くの異なる抗原に関して、当該分野で周知である。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得るが、ポリクローナル抗体を含む抗血清を使用することが典型的である。好ましいゲルは従って、ポリクローナル抗ＨＡ抗体で含浸される。ヤギ、またはより好ましくはヒツジ抗血清を使用し得る。
【００２０】
ＳＲＩＤアッセイのゲルは、好ましくは寒天またはアガロースゲルであるが、他の適当な材料が利用可能であり、そして抗原の放射状拡散を支持するその能力に、および抗原／抗体複合体の沈殿を支持するその能力に基づいて、当業者によって選択し得る。
【００２１】
工程（ｃ）における拡散のための温度およびタイミングは、当該分野において周知である。
【００２２】
本発明の方法は、（ｄ）ゲルにおいて沈殿ハローの寸法を決定する、さらなる工程を含み得る。次いで（ｅ）工程（ｄ）で測定した寸法を、標準的な寸法と比較し、そしてその比較の結果を用いて工程（ｃ）において添加された材料の抗原濃度を計算する、さらなる工程を含み得る。測定工程を、手動で、自動で［１１］、または半自動的に行い得る。その標準的な寸法を、通常目的の抗原を標的濃度で含むサンプルから測定する。そのような濃度を、下記でより詳細に記載する。
【００２３】
開始組成物
ＳＲＩＤによって分析する開始組成物は、アジュバントに吸着した抗原を含み、そしてこの抗原は典型的にはインフルエンザウイルス抗原である。
【００２４】
様々な形態のインフルエンザウイルスワクチンが現在利用可能であり、そして一般的に生きたウイルスまたは不活性化ウイルスのいずれかに基づく。本発明は、不活性化ワクチンを分析するために使用し得、それはウイルス粒子全体、「分割」ウイルス粒子、または精製表面抗原（赤血球凝集素を含み、そして通常ノイラミニダーゼも含む）に基づき得る。分析のためのインフルエンザ抗原はまた、ビロソームの形態で提示し得る。
【００２５】
ウイルスを不活性化するための化学的手段は、有効な量の、１つまたはそれ以上の以下の薬剤による処理を含む：界面活性剤、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、メチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレン（Ｃ６０）、バイナリーエチルアミン、アセチルエチレンイミン、またはその組み合わせ。例えばＵＶ光またはガンマ線照射のような、ウイルス不活性化の非化学的方法は、当該分野で公知である。
【００２６】
ウイルス粒子を、様々な方法によって、ウイルスを含む液体から回収し得る。例えば、精製過程は、ウイルス粒子を破壊するために界面活性剤を含む、線形ショ糖勾配溶液を用いた、ゾーン遠心分離を含み得る。次いで抗原を、任意の希釈後、ダイアフィルトレーションによって精製し得る。
【００２７】
分割ウイルス粒子を、「Ｔｗｅｅｎ−エーテル」分割過程を含む、精製ウイルス粒子を界面活性剤および／または溶媒で処理して、サブウイルス粒子調製物を産生することによって得る。インフルエンザウイルスを分割する方法は、当該分野で周知であり、例えば参考文献１２−１７等を参照のこと。ウイルスの分割を、分割剤（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）の破壊濃度で感染性または非感染性に関わらず、典型的にはウイルス全体を破壊または断片化することによって行う。その破壊は、ウイルスタンパク質の完全なまたは部分的な可溶化をもたらし、ウイルスの完全性を変化させる。好ましい分割剤は、非イオン性およびイオン性（例えば陽イオン性）界面活性剤である。適当な分割剤は、エチルエーテル、ポリソルベート８０、デオキシコール酸、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、アルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル糖、スルホベタイン、ベタイン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−グルカミド、Ｈｅｃａｍｅｇ、アルキルフェノキシ−ポリエトキシエタノール、四級アンモニウム化合物、サルコシル、ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウム臭化物）、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、セタブロン、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン、リポフェクタミン、およびＤＯＴ−ＭＡ、オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えばＴｒｉｔｏｎＸ−１００またはＴｒｉｔｏｎＮ１０１のような、Ｔｒｉｔｏｎ界面活性剤）、ノノキシノール９（ＮＰ９）、Ｓｙｍｐａｔｅｎｓ−ＮＰ／０９０、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエステル等を含むがこれに限らない。１つの有用な分割手順は、デオキシコール酸ナトリウムおよびホルムアルデヒドの連続した効果を用い、そして分割は最初のウイルス粒子精製の間に起こり得る（例えばショ糖密度勾配溶液において）。従って、分割過程は、ウイルス粒子を含む材料の浄化（非ウイルス粒子材料を除去するため）、回収したウイルス粒子の濃縮（例えばＣａＨＰＯ４吸着のような吸着法を用いて）、非ウイルス粒子材料からのウイルス粒子全体の分離、密度勾配遠心工程における分割剤を用いたウイルス粒子の分割（例えばデオキシコール酸ナトリウムのような分割剤を含むショ糖勾配を用いて）、そして次いで望ましくない材料を除去するためのろ過（例えば限外ろ過）を含み得る。分割したウイルス粒子を、リン酸ナトリウム緩衝化等張塩化ナトリウム溶液中に有用に再懸濁し得る。ＢＥＧＲＩＶＡＣＴＭ、ＦＬＵＡＲＩＸＴＭ、ＦＬＵＺＯＮＥＴＭ、およびＦＬＵＳＨＩＥＬＤＴＭ製品は、分割ワクチンである。
【００２８】
精製表面抗原ワクチンは、インフルエンザ表面抗原赤血球凝集素、および典型的にはノイラミニダーゼも含む。これらのタンパク質を精製した形態で調製するための過程は、当該分野で周知である。ＦＬＵＶＩＲＩＮＴＭ、ＡＧＲＩＰＰＡＬＴＭ、およびＩＮＦＬＵＶＡＣＴＭ製品は、サブユニットワクチンである。
【００２９】
不活性化インフルエンザ抗原の別の形態は、ビロソームである［１８］（核酸を含まないウイルス様リポソーム粒子）。ビロソームを、界面活性剤によるインフルエンザウイルスの可溶化、続くヌクレオカプシドの除去およびウイルス糖タンパク質を含む膜の再構成によって調製し得る。ビロソームを調製するための代替方法は、ウイルス膜糖タンパク質を、過剰量のリン脂質に加え、その膜にウイルスタンパク質を有するリポソームを生じることを含む。本発明を、ＩＮＦＬＥＸＡＬ  ＶＴＭおよびＩＮＶＡＶＡＣＴＭ製品におけるように、バルクビロソームを保存するために使用し得る。
【００３０】
インフルエンザウイルスを弱毒化し得る。そのインフルエンザウイルスは、温度感受性であり得る。そのインフルエンザウイルスは、低温適応であり得る。ワクチン抗原として生きたウイルスを用いる場合には、これらの３つの特徴は特に有用である。
【００３１】
ＨＡは、現在の不活性化インフルエンザワクチンの主な免疫原であり、そしてワクチン用量を、典型的にはＳＲＩＤによって測定されるＨＡレベルに関して標準化する。既存のワクチンは、典型的には株あたり約１５μｇのＨＡを含むが、より低い用量を、例えば小児のために、または世界的流行の状況において、またはアジュバントを使用する場合に使用し得る。より高い用量（例えば３×または９×用量［１９、２０］）と同様、１／２（すなわち株あたり７．５μｇのＨＡ）、１／４および１／８のような分数の用量を使用した［７、８］。従って、本発明によって分析したワクチンは、インフルエンザ株あたり０．１および１５０μｇの間、好ましくは０．１および５０μｇの間、例えば０．１−２０μｇ、０．１−１５μｇ、０．１−１０μｇ、０．１−７．５μｇ、０．５−５μｇ等のＨＡを含み得る。特定の用量は、例えば株あたり約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約１．９、約１．５μｇ等を含む。
【００３２】
本発明で使用する株は、野生型ウイルスで見出されるような天然ＨＡ、または修飾ＨＡを有し得る。例えば、鳥類の種において、ウイルスを高度に病原性にする決定基（例えばＨＡ１／ＨＡ２切断部位周辺の高度塩基性領域）を除去するためにＨＡを修飾することが公知である。
【００３３】
ワクチンにおいて使用するインフルエンザウイルス株は、シーズン毎に変化する。現在の世界的流行の間の時期において、３価のワクチンは２つのインフルエンザＡ株（Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）および１つのインフルエンザＢ株を含む。本発明を、インフルエンザＡおよびインフルエンザＢウイルスの両方を分析するために使用し得る。本発明を、１価の抗原バルク、すなわち単一のインフルエンザウイルス株のみに由来する抗原を含む組成物を分析するために使用し得る。一旦分析したら、これらの吸着した１価のバルクを次いで組み合わせて多価のワクチンを形成し得る。本発明をまた、組み合わせたバルクおよび組み合わせた最終ワクチンを分析するために使用し得る。
【００３４】
インフルエンザＡウイルスは現在、１６個のＨＡサブタイプ：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５およびＨ１６を示す。これらのサブタイプをいずれも、本発明によって分析し得る。そのウイルスは、ＮＡサブタイプＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、またはＮ９のいずれかを有し得る。
【００３５】
本発明を、汎流行性インフルエンザＡウイルス株に使用し得る。汎流行性株の特徴は：（ａ）現在流布しているヒト株における赤血球凝集素と比較して、新しい赤血球凝集素、すなわち、１０年より長くヒト集団において明らかでなかったもの（例えばＨ２）、またはヒト集団において以前に全く見られなかったもの（例えば一般的に鳥集団においてのみ見出されたＨ５、Ｈ６、またはＨ９）を含み、ワクチンのレシピエントおよび一般的なヒト集団は、その株の赤血球凝集素に対して免疫学的にナイーブである；（ｂ）ヒト集団内で水平に伝染し得る；および（ｃ）ヒトに対して病原性である。汎流行性株Ｈ２、Ｈ５、Ｈ７またはＨ９サブタイプ株、例えばＨ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ３、Ｈ９Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ１およびＨ７Ｎ７株。Ｈ５サブタイプ中で、ウイルスは多くのクレイド、例えばクレイド１またはクレイド２に分類され得る。クレイド２の６個のサブクレイドが同定され、サブクレイド１、２、および３は明確な地理的分布を有し、そしてそのヒト感染における関与のために特に関連がある。
【００３６】
インフルエンザＢウイルスは、現在異なるＨＡサブタイプを示さないが、インフルエンザＢウイルス株は、２つの明確な系統に分類される。これらの系統は、１９８０年代後半に出現し、そしてお互いに抗原的および／または遺伝的に区別し得るＨＡを有する［２１］。
【００３７】
本発明によって分析されるインフルエンザウイルス抗原は、卵または細胞培養において増殖し得る。インフルエンザウイルス増殖のための現在標準的な方法は、特定の病原体を含まない（ＳＰＦ）有胚ニワトリ卵を使用し、卵尿膜腔液からウイルスを精製する。もし抗原を卵で増殖させたなら、分析する材料は卵タンパク質（卵白アルブミンおよびオボムコイドのような）を含み得る。
【００３８】
その抗原を、インフルエンザウイルス複製を支持する細胞株において増殖させ得る。その細胞株は、典型的には哺乳類起源である。適当な起源の哺乳類細胞は、ハムスター、ウシ、霊長類（ヒトおよびサルを含む）、およびイヌ細胞を含むがこれに限らないが、霊長類細胞の使用は好ましくない。腎臓細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肺細胞等のような、様々な細胞型を使用し得る。適当なハムスター細胞の例は、ＢＨＫ２１またはＨＫＣＣという名前を有する細胞株である。適当なサル細胞は、例えばベロ細胞株におけるような腎臓細胞のような、アフリカミドリザル細胞である。適当なイヌ細胞は、例えばＣＬＤＫおよびＭＤＣＫ細胞株におけるような、腎臓細胞である。
【００３９】
従って、適当な細胞株は、ＭＤＣＫ；ＣＨＯ；ＣＬＤＫ；ＨＫＣＣ；２９３Ｔ；ＢＨＫ；Ｖｅｒｏ；ＭＲＣ−５；ＰＥＲ．Ｃ６；ＦＲｈＬ２；ＷＩ−３８等を含むがこれに限らない。適当な細胞株は、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ）コレクション［２２］、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ［２３］、またはＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）から、広く入手可能である。例えば、ＡＴＣＣは、カタログ番号ＣＣＬ−８１、ＣＣＬ−８１．２、ＣＲＬ−１５８６およびＣＲＬ−１５８７で様々な異なるベロ細胞を供給し、そしてそれはカタログ番号ＣＣＬ−３４でＭＤＣＫ細胞を供給する。ＰＥＲ．Ｃ６は、寄託番号９６０２２９４０でＥＣＡＣＣから入手可能である。
【００４０】
最も好ましい細胞株は、哺乳類型の糖鎖付加を有するものである。哺乳類細胞株のより好ましくない代替として、ウイルスを、アヒル由来（例えばアヒル網膜）またはニワトリ由来の細胞株、例えばニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）等を含む、鳥類細胞株で増殖し得る［例えば参考文献２４−２６］。
【００４１】
インフルエンザウイルスを増殖させるために最も好ましい細胞株は、Ｍａｄｉｎ  Ｄａｒｂｙイヌ腎臓由来のＭＤＣＫ細胞株である［２７−３０］。もともとのＭＤＣＫ細胞株は、ＣＣＬ−３４としてＡＴＣＣから入手可能であるが、この細胞株の誘導体も使用し得る。例えば、参考文献２７は、懸濁培養で増殖させるために適応したＭＤＣＫ細胞株を開示する（ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９として寄託された「ＭＤＣＫ３３０１６」）。同様に、参考文献３１は、血清を含まない培養中で、懸濁物中で増殖する、ＭＤＣＫ由来細胞株を開示する（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４４９として寄託された「Ｂ−７０２」）。参考文献３２は、「ＭＤＣＫ−Ｓ」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５００）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０１」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５０１）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０２」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５０２）、および「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０３」（ＰＴＡ−６５０３）を含む、非腫瘍形成性のＭＤＣＫ細胞を開示する。参考文献３３は、「ＭＤＣＫ．５Ｆ１」細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２０４２）を含む、感染に対して高い感受性を有するＭＤＣＫ細胞株を開示する。これらのＭＤＣＫ細胞株のいずれかで増殖したウイルス由来の抗原を含む組成物を分析し得る。
【００４２】
ウイルスを、接着培養または懸濁物中の細胞において増殖させ得る。マイクロキャリア培養も使用し得る。いくつかの実施態様において、その細胞は従って、懸濁物中の増殖のために適応し得る。
【００４３】
細胞株を、好ましくは血清を含まない培地および／またはタンパク質を含まない培地で増殖させる。培地は、本発明の文脈において、血清を含まない培地として言及され、ここでヒトまたは動物由来の血清からの添加物を含まない。そのような培養物中で増殖する細胞は、当然それら自身のタンパク質を含むが、タンパク質を含まない培地は、細胞の増殖が、タンパク質、増殖因子、他のタンパク質添加物、および非血清タンパク質を除いて起こるが、任意でウイルス増殖に必要であり得る、トリプシンまたは他のプロテアーゼのようなタンパク質を含み得るものを意味することが理解される。
【００４４】
抗原およびアジュバントに加えて、分析されるべき組成物は、他の医薬品成分を含み得る。そのような成分の詳細な議論は、参考文献３４において入手可能である。
【００４５】
その組成物は、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールのような保存剤を含み得る。しかし、その組成物は実質的に水銀物質を含まない（すなわち５μｇ／ｍｌ未満）、例えばチオメルサールを含むべきではないことが好ましい［１６、３５］。水銀を含まないワクチンがより好ましい。保存剤を含まないワクチンが特に好ましい。コハク酸α−トコフェロールを、水銀化合物の代わりとして含み得る［１６］。
【００４６】
その組成物は、ナトリウム塩のような、生理学的な塩を含み得る。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、それは１および２０ｍｇ／ｍｌの間で存在し得る。存在し得る他の塩は、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、無水リン酸水素二ナトリウム（ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）、リン酸二水素ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｈｉｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、リン酸水素二カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム等を含む。
【００４７】
組成物は、２００ｍＯｓｍ／ｋｇおよび４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、好ましくは２４０−３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの間の重量オスモル濃度を有し得、そしてより好ましくは２９０−３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲に入る。
【００４８】
組成物は、１つまたはそれ以上の緩衝剤を含み得る。典型的な緩衝剤は、リン酸塩緩衝剤；Ｔｒｉｓ緩衝剤、ホウ酸塩緩衝剤；コハク酸塩緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤（特に水酸化アルミニウムアジュバントと共に）；またはクエン酸緩衝剤を含む。緩衝剤は、典型的には５−２０ｍＭの範囲で含まれる。
【００４９】
組成物のｐＨは、一般的に５．０および８．１の間、そしてより典型的には６．０および８．０の間、例えば６．５および７．５の間、または６．５および８．０の間、または７．０および７．８の間である。本発明の過程は従って、包装の前にバルクワクチンのｐＨを調整する工程を含み得る。
【００５０】
その組成物は、好ましくは滅菌である。その組成物は、好ましくは非発熱性である、例えば用量あたり＜１ＥＵ（エンドトキシンユニット、標準的な尺度）、そして好ましくは用量あたり＜０．１ＥＵを含む。その組成物は、好ましくはグルテンを含まない。
【００５１】
本発明の組成物は、特に分割または表面抗原ワクチンのために、界面活性剤、例えばポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（「Ｔｗｅｅｎ」として知られる）、オクトキシノール（オクトキシノール−９（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、ノノキシノール（ＮＰ９）、セチルトリメチルアンモニウム臭化物（「ＣＴＡＢ」）、またはデオキシコール酸ナトリウムを含み得る。その界面活性剤は、ほんの痕跡量で存在し得る。従って、そのワクチンは１ｍｇ／ｍｌ未満の各オクトキシノール−１０およびポリソルベート８０を含み得る。痕跡量の他の残りの成分は、抗生物質であり得る（例えばネオマイシン、カナマイシン、ポリミキシンＢ）。
【００５２】
アジュバント
分析されるべきサンプル中の抗原を、アジュバントに吸着させる。微粒子および不溶性の金属塩、例えばアルミニウムまたはカルシウム塩を含む、様々なアジュバントが抗原を吸着し得る。吸着は部分的または完全であり得る。例えば、組成物中少なくとも５０％（例えば≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９９％等）の抗原を吸着し得る。吸着の程度を、単純に、例えば組成物を遠心し、そしてどれだけの物質が溶液中に残るか（すなわち吸着されなかった）を決定することによって決定し得る。例えば、参考文献３６において、リン酸カルシウムアジュバントの吸着能力を、この方法によって測定した。
【００５３】
本発明の方法を用いる最も典型的な吸着剤は、アルミニウム塩である。
【００５４】
アルミニウム塩
抗原を吸着するための適当なアルミニウム塩は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムとして公知であるアジュバントを含む。これらの名前は従来のものであるが、どちらも存在する実際の化合物の正確な説明ではないので、簡便さのためにのみ使用する［例えば参考文献３７の第９章を参照のこと］。本発明は、アジュバントとして一般的に使用される「水酸化物」または「リン酸塩」アジュバントのいずれも使用し得る。
【００５５】
「水酸化アルミニウム」として公知のアジュバントは、典型的にはオキシ水酸化アルミニウム（ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｏｘｙｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）塩であり、それは通常少なくとも部分的に結晶性である。式ＡｌＯ（ＯＨ）によって示し得るオキシ水酸化アルミニウムは、赤外（ＩＲ）分光法によって、特に１０７０ｃｍ−１における吸着バンドの存在および３０９０−３１００ｃｍ−１における強いショルダーによって、水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）３のような、他のアルミニウム化合物から区別され得る［参考文献３７の第９章］。水酸化アルミニウムアジュバントの結晶性の程度は、半分の高さにおける回折バンドの幅（ＷＨＨ）によって反映され、結晶性の低い粒子は、より小さい晶子サイズのために、より大きい線の広がりを示す。ＷＨＨが増加するにつれて表面積が増加し、そしてより高いＷＨＨ値を有するアジュバントが、より高い抗原吸着能力を有するようであった。線維状の形態（例えば透過型電子顕微鏡において見られるような）は、水酸化アルミニウムアジュバントに典型的である。水酸化アルミニウムアジュバントのｐＩは、典型的には約１１である、すなわち生理学的なｐＨにおいて、アジュバント自身が正の表面電荷を有する。ｐＨ７．４におけるＡｌ＋＋＋１ｍｇあたり１．８−２．６ｍｇの間のタンパク質の吸着能力が、水酸化アルミニウムアジュバントに関して報告された。
【００５６】
「リン酸アルミニウム」として公知のアジュバントは、典型的にはヒドロキシリン酸アルミニウムであり、多くの場合少量の硫酸塩（すなわち、ヒドロキシリン酸アルミニウム硫酸塩）も含む。それらを沈殿によって得ることができ、そして沈殿の間の反応条件および濃度が、塩におけるヒドロキシルのホスフェートによる置換の程度に影響する。ヒドロキシリン酸塩は、一般的に０．３および１．２の間のＰＯ４／Ａｌモル比を有する。ヒドロキシリン酸塩を、ヒドロキシル基の存在によって、厳密なＡｌＰＯ４から区別し得る。例えば、３１６４ｃｍ−１におけるＩＲスペクトルのバンド（例えば２００℃に加熱した場合）は、構造的なヒドロキシルの存在を示す［参考文献３７の第９章］。
【００５７】
リン酸アルミニウムアジュバントのＰＯ４／Ａｌ３＋モル比は、一般的に０．３および１．２の間、好ましくは０．８および１．２の間、そしてより好ましくは０．９５±０．１である。リン酸アルミニウムは、特にヒドロキシリン酸塩に関しては、一般的に無定形である。典型的なアジュバントは、０．６ｍｇＡｌ３＋／ｍｌで含まれる、０．８４および０．９２の間のＰＯ４／Ａｌモル比を有する、無定形ヒドロキシリン酸アルミニウムである。リン酸アルミニウムは、一般的には粒子性である（例えば、透過型電子顕微鏡写真で見られるようなプレート様形態）。粒子の典型的な直径は、あらゆる抗原吸着の後、０．５−２０μｍの範囲（例えば約５−１０μｍ）である。ｐＨ７．４におけるＡｌ＋＋＋１ｍｇあたり０．７−１．５ｍｇの間のタンパク質の吸着能力が、リン酸アルミニウムアジュバントに関して報告された。
【００５８】
リン酸アルミニウムの電荷ゼロ点（ＰＺＣ）は、ヒドロキシルのホスフェートによる置換の程度と逆に関連しており、そしてこの置換の程度は、沈殿による塩の調製に使用された反応条件および反応物の濃度に依存して変動し得る。ＰＺＣはまた、溶液中の遊離ホスフェートイオンの濃度を変化させることによって（より多いホスフェート＝より酸性のＰＺＣ）、またはヒスチジン緩衝剤のような緩衝剤を加えることによって（ＰＺＣをより塩基性にする）も変化する。本発明によって使用されるリン酸アルミニウムは、一般的に４．０および７．０の間、より好ましくは５．０および６．５の間、例えば約５．７のＰＺＣを有する。
【００５９】
本発明で使用するアルミニウム塩の懸濁物は、緩衝剤（例えばリン酸塩またはヒスチジンまたはＴｒｉｓ緩衝剤）を含み得るが、これは常に必要ではない。その懸濁物は、好ましくは滅菌および発熱物質を含まない。懸濁物は、遊離の水性ホスフェートイオンを含み得、例えば１．０および２０ｍＭの間、好ましくは５および１５ｍＭの間、そしてより好ましくは約１０ｍＭの濃度で存在する。その懸濁物はまた、塩化ナトリウムを含み得る。
【００６０】
そのアジュバントは、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム両方の混合物を含む［７］。この場合、例えば少なくとも２：１、例えば≧５：１、≧６：１、≧７：１、≧８：１、≧９：１等の重量比で、水酸化物よりも多くのリン酸アルミニウムが存在し得る。
【００６１】
分析のための組成物におけるＡｌ＋＋＋の濃度は、通常＜１０ｍｇ／ｍｌ、例えば≦５ｍｇ／ｍｌ、≦４ｍｇ／ｍｌ、≦３ｍｇ／ｍｌ、≦２ｍｇ／ｍｌ、≦１ｍｇ／ｍｌ等である。好ましい範囲は、０．３および１ｍｇ／ｍｌの間である。
【００６２】
１つまたはそれ以上のアルミニウム塩アジュバントを含むのと同様に、そのアジュバント成分は、１つまたはそれ以上のさらなるアジュバントまたは免疫刺激剤を含み得る。そのようなさらなる成分は：３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバント（「３ｄ−ＭＰＬ」）；および／または水中油型エマルションを含むがこれに限らない。３ｄ−ＭＰＬは、以前にリン酸アルミニウム［３８］および水酸化アルミニウム［３９］アジュバントの両方と組み合わされた。
【００６３】
カルシウム塩
様々なカルシウム塩のうち、一般的にリン酸カルシウムのみをアジュバントとして使用する。リン酸カルシウムの様々なアジュバント形態が報告され、そしてこれらのいずれも本発明の方法によって分析し得る。
【００６４】
水和リン酸カルシウムゲルアジュバントが、Ｓｕｐｅｒｆｏｓ（Ｖｅｄｂａｅｋ、Ｄｅｎｍａｒｋ）から入手可能である。
【００６５】
１９９５年に、参考文献３７の第８章がリン酸カルシウムアジュバントを概説した。抗原の存在下で塩のその場での（ｉｎ  ｓｉｔｕ）沈殿によって、または前もって形成した塩に対する吸着によって、抗原をリン酸カルシウムに吸着し得る。前もって形成したリン酸カルシウムゲルの市販の供給源に言及する。吸着能力を含む、アジュバントの物理化学的な特徴に対する沈殿条件の影響について、詳細を提供する。
【００６６】
参考文献４０は、様々なリン酸カルシウムアジュバントの構造および吸着性質について報告する。厳密なＣａ３（ＰＯ４）２であるよりも、そのアジュバントは、式Ｃａ１０−ｘ（ＨＰＯ４）６−ｘ（ＯＨ）２−ｘの非化学量論的なヒドロキシアパタイトであり、そして５．５の電荷ゼロ点（ＰＺＣ）を有するｐＨ依存性表面電荷であることが報告された。そのアジュバントは、約１０ｎｍ×１５０ｎｍの寸法を有する針様の粒子、および約２０−３０ｎｍの直径を有する不規則な形のプレートを形成し得る。
【００６７】
参考文献４１は、反応性の空の部位を含む反応性無定形リン酸カルシウムを開示し、この反応性部位は、プレ成分のガス性または蒸気様（ｖａｐｏｒｏｕｓ）副産物への熱分解による、炭酸無定形リン酸カルシウムの炭酸プレ成分の除去によって得られた。
【００６８】
参考文献４２および４３は、粒子性のリン酸カルシウムアジュバント（「ＣＡＰ」）を開示し、ここでその粒子は、３００−４０００ｎｍ（ナノ粒子）の範囲の直径を有し、そして球形およびなめらかな表面を有する。参考文献４４は、これらの粒子を粘膜免疫に使用し得ることを開示する。
【００６９】
参考文献４５は、上皮を通る輸送のために適当なサイズの、粒子性ヒドロキシル化リン酸カルシウムを使用した。
【００７０】
参考文献４６は、インビボで可溶性であり、そして約１．０から２．０のＣａ／Ｐ比でその表面を覆ったリン酸カルシウム化合物を有するポリマー性物質の粒子を含む、複合粒子を開示した。
【００７１】
参考文献４７は、ワクチンを吸着するための、リン酸カルシウムの注射用水性ゲルを開示し、ここでカルシウムおよびホスフェートイオンを、重量比Ｃａ／Ｐが１．６２から１．８５であるような、そして１リットルあたり０．０７原子のＣａを含む場合、ゲルの沈降時間（ｓｅｔｔｌｉｎｇ  ｔｉｍｅ）が２０℃で１０分において１−２０ｍｍの間であるような比率で組み合わせる。
【００７２】
リン酸カルシウムアジュバントのＣａ対Ｐモル比は、例えば１．３５および１．８３の間で変動し得る［参考文献３７の第８章を参照のこと］。アジュバントの吸着性質は、沈殿の間に使用した条件に依存して変動することが見出された、例えばゆっくりとした混合は、速い混合によって形成されたアジュバントよりも低い吸着能力を有するアジュバントを生じた。
【００７３】
Ｃａ＋＋として測定された、本発明のワクチンにおけるリン酸カルシウムの量は、０．１および１０ｍｇ／ｍｌの間、例えば０．５−５ｍｇ／ｍｌの間、好ましくは０．７５−３ｍｇ／ｍｌ、０．９−１．５ｍｇ／ｍｌ、または約１ｍｇ／ｍｌであり得る。
【００７４】
脱離
本発明の方法は、吸着抗原の脱離を含む。脱離のために、様々な方法を使用し得る。インフルエンザウイルス抗原に関して、本発明者らは、表面糖タンパク質およびアルミニウム塩（特に水酸化アルミニウムアジュバント）の間の相互作用の性質が、多くの利用可能な脱離方法がおだやか過ぎる（それは、タンパク質の一部分は結合したままであり、抗原含有量の過小評価を引き起こすことを意味する）または厳し過ぎる（ＨＡ抗原が変性または切断され、再び抗原含有量の過小評価を引き起こすことを意味する）ことを意味することを見出した。従って、本発明者らは、ＳＲＩＤによってアッセイ可能であることを保証しながらも、インフルエンザタンパク質の実質的に完全な脱離を可能にする脱離処理を考案した。
【００７５】
脱離は通常、分析されるべき組成物と１つまたはそれ以上の脱離試薬を混合することを含む。適当な脱離試薬は、塩および／または界面活性剤を含む。その脱離試薬を、様々なｐＨ値で使用し得るが、好ましくは６および９．５の間である。脱離は、冷蔵温度（例えば２−８℃の間）で、またはより温かい温度（例えば１８−２５℃の間）で起こり得る。
【００７６】
脱離試薬として使用するために適当な塩は、リン酸塩、例えばリン酸アンモニウム、リン酸三カリウム、リン酸二カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム等を含む。これらの塩を、様々な濃度で、例えば１０−１０００ｍＭの間、５０−５００ｍＭの間で使用し得る。＞２５０ｍＭの濃度（例えば≧３５０ｍＭ、≧４００ｍＭ、≧４５０ｍＭ、≧５００ｍＭ等）（例えば３００−５００ｍＭの間、または約３３２．５ｍＭ）は、よい結果を生じることが見出された。従って、脱離塩は、この濃度で可溶性のままでなければならない。他の適当な塩は、クエン酸塩、炭酸塩等を含み得る。
【００７７】
オルトリン酸水素二カリウムが、好ましい脱離試薬である。
【００７８】
脱離試薬として使用するために適当な界面活性剤は、双性イオンを含む、イオン性または非イオン性であり得る。非イオン性界面活性剤が特に有用であり、そして双性イオン性界面活性剤が好ましい。「Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４」ＴＭ（ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート；ＣＡＳ１４９３３−０９−６；「ＴＤＡＰＳ」）を含む、両性「Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ」界面活性剤を試験した。Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４ＴＭは、他の両性界面活性剤と異なり、広いｐＨ範囲でその双性イオン性の特徴を保持する、合成水溶性双性イオン性界面活性剤である。この性質は、強力な塩基性四級アンモニウムイオンおよび同じ強さの酸性スルホナートイオンの両方の存在に起因する。従って、好ましい界面活性剤は、四級アンモニウムイオンおよび／または酸性スルホナートイオンを含む。界面活性剤を、様々な濃度で、例えば０．１−１５％、１−１０％等で使用し得る。Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４ＴＭは、０．１％から２％の間の範囲、例えば０．２５％から１％、または約０．５％の濃度で有用である。
【００７９】
好ましい脱離は、塩および界面活性剤の混合物を使用する。
【００８０】
さらなる方法
本発明は、以下の工程を含む、ワクチンを産生するための方法を提供する：
（ｉ）目的のバルク抗原を調製する工程：
（ｉｉ）本発明の方法を用いて、バルク抗原のサンプルを分析する工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の結果に基づいて、バルク抗原を望ましい最終濃度へ希釈する工程；
（ｉｖ）任意で、希釈したバルク抗原を、１つまたはそれ以上の薬剤学的に許容可能な成分と組み合わせる工程；そして
（ｖ）流通のために希釈したバルク抗原を包装する工程。
【００８１】
工程（ｉ）のバルク抗原は、一価または多価であり得る。工程（ｉｖ）における成分は、担体、賦形剤、さらなる抗原等を含み得る。
【００８２】
本発明はまた、以下の工程を含む、ＳＲＩＤアッセイによって分析するためのサンプルを調製するための方法を提供する：（ａ）目的の抗原を含む開始組成物を得る工程であって、ここでその抗原はアジュバントに吸着している、工程；および（ｂ）開始組成物を処理して、アジュバントから抗原を脱離する。工程（ｂ）の産物を、次いでＳＲＩＤアッセイによって分析し得る。調製方法および実際のＳＲＩＤアッセイを、同じ人または異なる人が行い得る、そして同じ地理的位置で、または異なる地理的位置で、例えば異なる国で行い得る。
【００８３】
一般
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「から成る」を含む、例えばＸを「含む」組成物は、独占的にＸから成り得る、またはさらに何かを、例えばＸ＋Ｙを含み得る。
【００８４】
「実質的に」という言葉は、「完全に」を除外しない、例えば「実質的にＹを含まない」組成物は、完全にＹを含まなくあり得る。必要な場合には、「実質的に」という言葉を、本発明の定義から省略し得る。
【００８５】
数値ｘに関連して「約」という用語は、例えばｘ±１０％を意味する。
【００８６】
他に具体的に述べなければ、２つまたはそれ以上の成分を混合する工程を含む過程は、いかなる特定の混合の順番も必要としない。従って、成分を、あらゆる順番で混合し得る。３つの成分がある場合、２つの成分をお互いに組み合わせ得、そして次いでその組み合わせを３番目の成分と組み合わせ得る等である。
【実施例】
【００８７】
本発明を行うための様式
様々な塩の評価
バルクの一価表面糖タンパク質を、卵増殖Ａ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（Ｈ３Ｎ２）インフルエンザウイルスから調製した。抗原（５０μｇ／ｍｌ）を、水酸化アルミニウムアジュバントに完全に吸着し（１ｍｇ／ｍｌ  ＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌＴＭ）、その後それはもはやＳＲＩＤによって確実には分析できなかった。従って、様々な脱離試薬を試験した（最終的な濃度を下記の表で示す）：
緩衝塩：リン酸アンモニウム
リン酸カリウム（三塩基性）
オルトリン酸水素二カリウム
リン酸二水素ナトリウム
オルトリン酸水素二ナトリウム
界面活性剤  Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４ＴＭ  。
【００８８】
Ａ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｈ３Ｎ２インフルエンザ表面糖タンパク質および水酸化アルミニウムアジュバントを、ボルテックスすることによって完全に混合し、そして周囲温度で１８時間（＋／−３時間）インキュベートした。次いでその処方物を１６，２５０ｇで４分間遠心して、吸着した抗原と共に水酸化アルミニウムをペレットにした。ペレットにした吸着抗原を、これらの成分で作られた、様々な脱離溶液中に再懸濁し、そして次いで周囲温度で少なくとも１８時間（＋／−３時間）インキュベートした。その処方物を次いで１６，２５０ｇで４分間遠心して、水酸化アルミニウムをペレットにした。上清中の脱離した抗原を、タンパク質アッセイによって測定し、そして結果を存在する全タンパク質の％として表した。実験誤差および使用した手順の精度における変動のために、０％未満または１００％超の回収率が可能であった。
【００８９】
結果は以下のようであり、２つの列は脱離タンパク質の回収％（左）および溶液中の最終的なリン酸塩濃度（ｍＭ）（右）であった：
【００９０】
【表１】
0005415449.tif 000002
リン酸アンモニウムは、ＢＣＡタンパク質アッセイと適合性でなく、そして低いタンパク質回収を生じるので、さらに試験しなかった。
【００９１】
従って、完全な抗原回収は、界面活性剤およびリン酸塩の混合物を用いて容易に達成し得た。高い塩濃度（≧３５０ｍＭ）が、最もよい結果を生じる傾向があった。最もよい結果は、オルトリン酸水素二カリウムで達成された。この塩は、タンパク質のもともとのコンフォメーションを維持するｐＨ（９．５未満）で、一致したＨＡ脱離を達成しながら、高い濃度（例えば０．５Ｍ）で容易に溶解し得た。
【００９２】
塩および界面活性剤の濃度範囲
一価表面糖タンパク質を、卵増殖Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）リアソータントから調製した。表面抗原（ＨＡ濃度９０μｇ／ｍｌ）は、水酸化アルミニウム１ｍｇあたり６０μｇの赤血球凝集素の比で、水酸化アルミニウムに完全に吸着した。その処方物を完全にボルテックスし、そして使用するまで４℃で保存した。
【００９３】
ある範囲のリン酸カリウムおよびＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４ＴＭ濃度における脱離を評価するために、その処方物のアリコートをボルテックスし、そして次いで１３，０００ｒｐｍで５分間遠心して、吸着した抗原と共に水酸化アルミニウムをペレットにした。ある範囲の代替脱離溶液を評価した：
（１）３００ｍＭのリン酸水素二カリウムプラス０．５％（ｗ／ｖ）のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４ＴＭ
（２）３５０ｍＭのリン酸水素二カリウムプラス０．５％（ｗ／ｖ）のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４ＴＭ
（３）４００ｍＭのリン酸水素二カリウムプラス０．５％（ｗ／ｖ）のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４ＴＭ
（４）３００ｍＭのリン酸水素二カリウムプラス１．０％（ｗ／ｖ）のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４ＴＭ
（５）３５０ｍＭのリン酸水素二カリウムプラス１．０％（ｗ／ｖ）のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４ＴＭ
（６）４００ｍＭのリン酸水素二カリウムプラス１．０％（ｗ／ｖ）のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４ＴＭ
（７）３００ｍＭのリン酸水素二カリウムプラス２．０％（ｗ／ｖ）のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４ＴＭ
（８）３５０ｍＭのリン酸水素二カリウムプラス２．０％（ｗ／ｖ）のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４ＴＭ
（９）４００ｍＭのリン酸水素二カリウムプラス２．０％（ｗ／ｖ）のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４ＴＭ  。
【００９４】
脱離緩衝液をペレットに加え、ボルテックスして再懸濁し、そして４℃で一晩インキュベートした。次いで各サンプルを１３，０００ｒｐｍで５分間遠心し、そして上清をタンパク質含有量に関してアッセイした。
【００９５】
上清において脱離およびアッセイしたタンパク質の量は、以下のようであった（μｇ／ｍｌ）：
【００９６】
【表２】
0005415449.tif 000003
従って、９０μｇの抗原用量およびこの水酸化アルミニウムアジュバントを用いて、脱離は０．５−１．０％（ｗ／ｖ）の間のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４ＴＭ濃度と組み合わせた、３５０−４５０ｍＭのリン酸水素二カリウム濃度で最適である。
【００９７】
代替赤血球凝集素濃度の評価（パート１）
Ａ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（Ｈ３Ｎ２）の結果に基づいて、汎流行性株Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）由来の抗原を調製し、そして上記で記載したように水酸化アルミニウムに吸着した。９０、６０、３０、１５、および７．５μｇ／ｍｌのＨＡ濃度を用いた。ＨＡ対水酸化アルミニウムの比を、１ｍｇの水酸化アルミニウムに対して３０μｇのＨＡに維持した。Ｋ２ＰＯ４・３Ｈ２Ｏ（３５０、５００および７５０ｍＭ）およびＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４ＴＭ（０．５％、２％、または４％）の混合物を、脱離のために使用した。Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ追加後の最終的な緩衝剤濃度は以下のようであった：
【００９８】
【表３】
0005415449.tif 000004
脱離工程のインキュベーション温度が２−８℃であった以外は、上記で記載した条件によって脱離を行った。
【００９９】
ＳＲＩＤ赤血球凝集素の回収は以下のようであった：
【０１００】
【表４】
0005415449.tif 000005
この研究は、この抗原およびアジュバントに関して最適なＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４ＴＭの組み合わせは、３３２．５ｍＭ（最終的な濃度）のリン酸水素二カリウムと共に、０．５％であることを示す。
【０１０１】
代替赤血球凝集素濃度の評価（パート２）
汎流行性株Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）由来の抗原を調製し、そして上記で記載したように水酸化アルミニウムに吸着した。９０、６０、３０、１５、および７．５μｇ／ｍｌのＨＡ濃度を用いた。ＨＡ対水酸化アルミニウムの比を、１ｍｇの水酸化アルミニウムに対して３０μｇのＨＡに維持した。Ｋ２ＨＰＯ４．３Ｈ２Ｏ（３５０ｍＭ）およびＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４ＴＭ（０．５％、２％、または４％）の混合物を、脱離のために使用した。Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ追加後の最終的な緩衝剤濃度は：０．５％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ＝３３２．５ｍＭ、２％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ＝２８０ｍＭ、および４％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ＝２１０ｍＭであった。脱離工程のインキュベーション温度が２−８℃であった以外は、上記で記載した条件によって脱離を行った。
【０１０２】
結果は以下のようであった（ＡＭＴ＝相加平均力価）：
【０１０３】
【表５】
0005415449.tif 000006
この抗原およびアジュバントに関する最適な脱離は、０．５％のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４ＴＭ濃度で観察された（３３２．５ｍＭの最終的なリン酸水素二カリウムの濃度）。Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔのより高い濃度は、赤血球凝集素の明らかに低い回収を生じた。前の調査の結果と合わせると、これはおそらく、より高い界面活性剤濃度で使用された、低いリン酸水素二カリウムの濃度のためである。従って、３３２．５ｍＭのリン酸水素二カリウムと組み合わせた０．５％のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４は、ある範囲の赤血球凝集素濃度の、水酸化アルミニウムアジュバントからの脱離を保証するために好ましい組み合わせである。
【０１０４】
手順の頑健性の確認
アッセイの頑健性を評価するために、同等のサンプルを用いて並行して行うために第二の操作者を用いた。
【０１０５】
Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４精製表面糖タンパク質を、３ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウムと共に、３０、１５、および７．５μｇＨＡ／ｍｌに処方した。２−８℃で一晩インキュベートした後、処方した材料を１６，２５０ｇで５分間遠心し、アジュバントをペレットにし、そしておよそ９００μｌの上清を、ペレットを乱さないように注意深く除去した。これらの上清を、ＳＲＩＤによって赤血球凝集素に関して、そしてＰｉｅｒｃｅＢＣＡタンパク質アッセイを用いて全タンパク質に関して分析して、全てのタンパク質がアジュバントに結合し、そして溶液中に残っていないことを証明した。
【０１０６】
５０μｌの１０％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４（ｗ／ｖ）溶液を、９５０μｌの３５０ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４脱離緩衝液と共にペレットに加え、０．５％のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４ＴＭおよび３３２．５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、ｐＨ９．４の最終濃度にした。
【０１０７】
その溶液を最低１０分間完全にボルテックスしてペレットを再可溶化し、そして４−８℃で１８±３時間インキュベートした。
【０１０８】
インキュベーション後、その溶液を最低１０秒間ボルテックスし、そして次いで１６，２５０ｇで５分間遠心して、アジュバントをペレットにした。その上清を注意深く除去し、そしてＳＲＩＤによって赤血球凝集素に関して分析した。
【０１０９】
下記の表で示したデータは、並行して行ったアッセイからのＳＲＩＤアッセイデータである。
【０１１０】
【表６】
0005415449.tif 000007
これらの結果は、両方の操作者の間に、よい中間の精度があったことを示す。
【０１１１】
本発明は、例によってのみ記載され、そして本発明の範囲および意図内に留まりながら、修飾を行い得ることが理解される。
【０１１２】
【化１】
0005415449.tif 000008