(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＤＦ−８に特異的に結合し、かつ中和する単離されたヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
配列番号３又は配列番号７のアミノ酸配列で規定される重鎖可変（ＶＨ）領域に由来の第１、第２、および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、抗体のＶＨ領域、及び
配列番号５又は配列番号９のアミノ酸配列で規定される軽鎖可変（ＶＬ）領域に由来の第１、第２、および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、抗体のＶＬ領域
を含む、前記抗体又はフラグメント。
【請求項２】
ＶＨ ＣＤＲ１が配列番号１０又は配列番号２０を含み、ＶＨ ＣＤＲ２が配列番号１１又は配列番号２１を含み、ＶＨ ＣＤＲ３が配列番号１２を含み、ＶＬ ＣＤＲ１が配列番号１３を含み、ＶＬ ＣＤＲ２が配列番号１４を含み、かつＶＬ ＣＤＲ３が配列番号１５を含む、請求項１に記載の抗体又はフラグメント。
【請求項３】
前記ＶＨ領域が配列番号３又は配列番号７のアミノ酸配列を含み、かつ、前記ＶＬ領域が配列番号５又は配列番号９のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体又はフラグメント。
【請求項４】
前記ＶＨ領域が、配列番号７のアミノ酸配列を含み、かつ、前記ＶＬ領域が配列番号９のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗体又はフラグメント。
【請求項５】
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥおよびＩｇＭからなる群より選択されるヒト免疫グロブリンサブタイプに由来する重鎖の定常ドメインをさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体又はフラグメント。
【請求項６】
抗体の重鎖の定常ドメインがヒトＩｇＧ１に由来するものである、請求項５に記載の抗体又はフラグメント。
【請求項７】
重鎖の定常ドメインが、定常ドメインのエフェクター機能を変えるように変更されたものである、請求項５又は６に記載の抗体又はフラグメント。
【請求項８】
ヒト抗体のκまたはλ軽鎖定常ドメインをさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体又はフラグメント。
【請求項９】
ＧＤＦ−８に特異的に結合する単離インタクト抗体であって、
配列番号７のアミノ酸配列で規定されるＶＨドメイン及びヒトＩｇＧ１に由来する重鎖定常ドメインをそれぞれ含む、二つの抗体重鎖、並びに、
配列番号９のアミノ酸配列で規定されるＶＬドメイン及び配列番号１７のアミノ酸配列で規定される軽鎖定常ドメインをそれぞれ含む、二つの抗体軽鎖
を含む、前記抗体。
【請求項１０】
重鎖定常ドメインが配列番号１９のアミノ酸配列を有する、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
配列番号１９のアミノ酸配列が、Ｆｃ領域のエフェクター機能を変える１又はそれ以上のアミノ酸残基において変更されたものである、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
配列番号１９のアミノ酸配列の少なくともアミノ酸残基１１７又は１２０が変更されたものである、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１３】
前記抗体が１０ｎＭ又はそれ以上の親和性でＧＤＦ−８と結合する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体又はフラグメント。
【請求項１４】
Ｆｄフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、ｓｃＦＶフラグメント、およびＦｖフラグメントからなる群より選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体フラグメント。
【請求項１５】
ＧＤＦ−８に特異的に結合し、かつ中和する単離抗体又はその抗原結合フラグメントであって、前記抗体又はフラグメントに認識されるエピトープが、配列番号１のアミノ酸３０〜４０又は８４〜９７のアミノ酸配列である、前記抗体又はフラグメント。
【請求項１６】
請求項１〜１２に記載の抗体又はフラグメントのポリペプチド鎖をコードする核酸配列又はその相補配列を含む、単離ポリヌクレオチド。
【請求項１７】
配列番号２、配列番号４、配列番号６及び配列番号８からなる群より選択される核酸配列を含む、請求項１６に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項１６又は１７に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１９】
調節配列と作動可能に連結されている請求項１６又は１７に記載のポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
【請求項２０】
ＧＤＦ−８に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを産生する方法であって、請求項１９に記載の宿主細胞を培養する段階と、前記宿主細胞によって産生された前記抗体又はフラグメントを回収する段階とを含む、前記方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法により産生した抗体又はフラグメント。
【請求項２２】
請求項１〜１２又は２１に記載の抗体又はフラグメント及び製薬上許容される担体を含む組成物。
【請求項２３】
哺乳類の筋障害を処置するための医薬組成物であって、前記筋障害の処置に有効な量の請求項２２に記載の組成物を含む、前記医薬組成物。
【請求項２４】
前記筋障害が、筋ジストロフィー、筋萎縮、サルコペニア、悪液質及び筋肉消耗症候群からなる群より選択される、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
筋ジストロフィーがデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
哺乳類の神経筋障害を処置するための医薬組成物であって、前記神経筋障害の処置に有効な量の請求項２２に記載の組成物を含む、前記医薬組成物。
【請求項２７】
神経筋障害が、運動ニューロンの損失及びＡＬＳからなる群より選択される、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
哺乳類の骨障害を処置するための医薬組成物であって、前記骨障害の処置に有効な量の請求項２２に記載の組成物を含む、前記医薬組成物。
【請求項２９】
骨障害が、骨粗鬆症、骨粗鬆症に関連する骨折、骨関節炎、骨減少症及び低骨量からなる群より選択される、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
哺乳類の代謝障害を処置するための医薬組成物であって、前記代謝障害の処置に有効な量の請求項２２に記載の組成物を含む、前記医薬組成物。
【請求項３１】
代謝障害が、耐糖能異常、インスリン抵抗性、２型糖尿病、肥満及びメタボリック症候群からなる群より選択される、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
哺乳類の筋肉量又は強度を増加するための医薬組成物であって、その筋肉量又は強度の増加に有効な量の請求項２２に記載の組成物を含む、前記医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００５年８月１９日出願の米国特許仮出願第６０／７０９，７０４号の優先権の利益を主張し、その内容は本明細書においてその全文が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府資金による受託研究に関する記載
本発明は、米国国立衛生研究所からの助成金の下で米国政府の支援によりなされた（Ｒ０１  ＧＭ−４８６６１およびＲ０１  ＧＭ−５６７０７）。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本発明の属する技術分野は、増殖分化因子−８（ＧＤＦ−８）アンタゴニスト、具体的には、ＧＤＦ−８に対する抗体、例えば、マウス、ヒトおよびヒト化抗体、ならびにそれらのフラグメント、特にインビトロおよび／またはインビボでＧＤＦ−８活性を阻害するものに関する。当分野は、さらにＧＤＦ−８関連障害、例えば、筋障害、神経筋障害、骨変性疾患、代謝性または誘発性骨疾患、脂肪疾患、グルコース代謝障害またはインスリン関連障害、特に筋萎縮性側索硬化症（「ＡＬＳ」）を処置、寛解、予防、予知、またはモニターすることに関する。
【背景技術】
【０００４】
増殖分化因子−８（ＧＤＦ−８）は、ミオスタチンとしても公知であり、分泌タンパク質で、構造的に関連する増殖因子のトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーのメンバーである。このスーパーファミリーメンバーは増殖調節特性および形態形成特性を有する(Kingsley et al. (1994) Genes Dev. 8:133-46; Hoodless et al. (1998) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 228:235-72)。ヒトＧＤＦ−８は、ホモ二量体複合体を形成する３７５アミノ酸前駆体タンパク質として合成される。プロセシングの間、「潜在関連ペプチド（ＬＡＰ）」として公知のアミノ末端プロペプチドは切断され、ホモ二量体と非共有結合したまま残り、「小型潜在型複合体」と名付けられる不活性複合体を形成し得る(Miyazono et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:6407-15; Wakefield et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:7646-54; Brown et al. (1999) Growth Factors 3:35-43; Thies et al. (2001) Growth Factors 18:251-59; Gentry et al. (1990) Biochemistry 29:6851-57; Derynck et al. (1995) Nature 316:701-05; Massague (1990) Ann. Rev. Cell Biol. 12:597-641)。フォリスタチンおよびその類縁などのタンパク質も成熟ＧＤＦ−８ホモ二量体と結合し、ＧＤＦ−８生物活性を阻害する(Gamer et al. (1999) Dev. Biol. 208:222-32)。
【０００５】
様々な種由来の推定ＧＤＦ−８アミノ酸配列のアラインメントは、ＧＤＦ−８が高度に保存されていることを証明する(McPherron et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:12457-61)。ヒト、マウス、ラット、ブタ、およびニワトリＧＤＦ−８の配列は、Ｃ末端領域が１００％同一であるが、ヒヒ、ウシ、およびヒツジＧＤＦ−８はＣ末端でわずか３アミノ酸が異なる。種を超えてＧＤＦ−８が高度に保存されることは、ＧＤＦ−８が必要不可欠な生理学的機能を有することを示唆する。
【０００６】
ＧＤＦ−８は、筋芽細胞および衛星細胞の増殖と分化の双方を阻害することにより筋肉発生の調節およびホメオスタシスに重要な役割を果たすことが示されている(Lee and McPherron (1999) Curr. Opin. Genet. Dev. 9:604-07; McCroskery et al. (2003) J. Cell. Biol. 162:1135-47)。それは骨格筋の発生の初期段階で発現し、成体骨格筋において、優先的には速筋線維の種類に発現し続ける。さらに、成体マウスで過剰発現したＧＤＦ−８は、顕著な筋肉損失をもたらす(Zimmers et al. (2002) Science 296:1486-88)。また、ＧＤＦ−８遺伝子を不活性にする自然変異が、動物およびヒトの双方において肥大および過形成の双方をもたらすことが示されている(Lee and McPherron (1997) 前掲)。例えば、ＧＤＦ−８ノックアウトトランスジェニックマウスは、骨格筋の顕著な肥大および過形成ならびに皮質骨構造の変化を特徴とする(McPherron et al. (1997) Nature 387:83-90; Hamrick et al. (2000) Bone 27:343-49)。ウシにおけるＧＤＦ−８自然変異では同様の骨格筋量の増加が明らかである(Ashmore et al. (1974) Growth 38:501-07; Swatland et al. (1994) J. Anim. Sci. 38:752-57; McPherron et al.、前掲; Kambadur et al. (1997) Genome Res. 7:910-15)。その上、様々な研究から、ＧＤＦ−８発現の増加がＨＩＶ誘発性筋消耗に関連していることが示される(Gonzalez-Cadavid et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:14938-43)。ＧＤＦ−８はまた、筋肉特異的酵素（例えば、クレアチンキナーゼ）の産生および筋芽細胞増殖にも関与している（ＷＯ００／４３７８１号）。
【０００７】
その増殖調節および形態形成特性に加えて、ＧＤＦ−８は多数のその他の生理学的プロセスにかかわっていると考えられ、それには、２型糖尿病発生の間のグルコースホメオスタシス、耐糖能異常、メタボリック症候群（すなわち、２型糖尿病および／または心疾患についての高いリスクをもたらす、一群の健康状態の同時発生を伴う症候群（例えばシンドロームＸ）、この一群の健康状態には、インスリン抵抗性、腹部肥満、異脂肪血症、高血圧症、慢性炎症、血栓形成前の状態、その他が含まれ得る）、インスリン抵抗性（例えば、熱傷または窒素不均衡などの外傷性傷害により誘発される抵抗性）、および脂肪組織障害（例えば、肥満症、異脂肪血症、非アルコール性脂肪肝疾患、その他）が含まれる(Kim et al. (2000) Biochem. Biophys. Res. Comm. 281:902-06)。
【０００８】
多数のヒトおよび動物の疾患は機能的に障害のある筋肉組織に関連し、その例は、筋萎縮性側索硬化症（「ＡＬＳ」）、筋ジストロフィー（「ＭＤ」；デュシェンヌ型筋ジストロフィーを含む）、筋萎縮、器官萎縮、虚弱、うっ血性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、サルコペニア、悪液質、およびその他の疾患および状態に起因する筋肉消耗症候群である。現在、これらの障害を処置するために存在する、信頼できるかまたは効果的な治療法は少数である。これらの疾患の病態は、これらの疾患の処置における標的としてのＧＤＦ−８シグナル伝達の潜在的役割を示している。
【０００９】
ＡＬＳは、中枢神経系の変性および筋萎縮を特徴とする遅発型かつ致死性の神経変性疾患である。ＡＬＳは、一般に歩行異常および器用さの喪失に始まり、その後手足および横隔膜の麻痺へと進行する。ＡＬＳの大部分の症例は孤発性であって病因不明であるが、５〜１０％の症例は、家族性の優性遺伝（ＦＡＬＳ）に起因することが示されている。約１０〜２０％のＦＡＬＳ症例の原因は、Ｃｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）遺伝子の変異である（Bruijn et al. (2004) Ann. Rev. Neurosci. 27:723-49に概説されている）。ＳＯＤ１は、スーパーオキシドの過酸化水素と二原子酸素への反応を触媒するヘテロ二量体の金属タンパク質であり、ＳＯＤ１の損失は運動ニューロン疾患を引き起こさないため（Reaume et al. (1996) Nat. Genet. 13:43-47）、機能の毒性獲得により疾患が誘発されると考えられる（Bruijn et al.、前掲に概説されている）。ＳＯＤ１に誘発されるニューロン細胞死の具体的な機構は不明であり、軸索輸送、ミスフォールドしたタンパク質への細胞応答、ミトコンドリア機能障害、および興奮毒性の変化を伴い得る（Bruijn et al.、前掲）。
【００１０】
ＡＬＳに観察される運動ニューロンの変性は、運動ニューロンによる栄養因子の取り込みまたは輸送の中断を含む、複数の機構によって起こり得る（Holzbaur (2004) Trends Cell Biol. 14:233-40に概説されている）。したがって、ＡＬＳは最適な生存環境をもたらすことにより変性ニューロンを活性化させる治療法で処置され得る。神経の環境には、グリアおよび運動ニューロンにより神経支配される筋肉細胞などの非ニューロン細胞が含まれる。この環境が、ニューロンにより取り込まれ、逆行性の軸索輸送を経て細胞体へ輸送される栄養因子および増殖因子をもたらす（Chao (2003) Neuron 39:1-2; Holzbaur、前掲）。
【００１１】
ＦＡＬＳは、変異ＳＯＤ１の過剰発現によりマウスおよびラットの双方でモデル化されている（Howland et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:1604-09）。変異ＳＯＤ１のＧ９３Ａ型を過剰発現しているトランスジェニックマウスは９０〜１００日齢で筋力低下および萎縮を示し、一般に１３０日齢前後で死ぬ（Gurney et al. (1994) Science 264:1772-75）。しかし、その根底にある、ＳＯＤＧ９３Ａに誘発される病態（握力低下および神経筋接合部の損失を含む）は、５０日齢程度で著しい（Frey et al. (2000) J. Neurosci. 20:2534-42; Fisher et al. (2004) Exp. Neuro. 185:232-40; Ligon et al. (2005) NeuroReport 16:533-36; Wooley et al. (2005) Muscle Nerve 32:43-50）。ＳＯＤＧ９３Ａ変異を発現しているトランスジェニックラットは、同様の変性の経時的変化をたどる（Howland et al.、前掲）。最近の研究から、病態の発症が細胞自律的でないことが示唆され、ＡＬＳに観察される運動ニューロンの変性が、運動ニューロンによる栄養因子の取り込みまたは輸送の中断を含む、複数の機構によって起こり得るという仮説（上記参照）に一致している。クレメントと共同研究者らは、キメラマウスを用いて野生型非ニューロン細胞が変異ＳＯＤ１を発現している運動ニューロンの生存を延長することができることを示した（Clement et al. (2003) Science 302:113-17）。これらの知見は、生存に最適な微小環境を提供することによりニューロン変性を遅くできる可能性のある治療法の検討につながった。例えば、ウイルスにより発現した増殖因子（ＩＧＦ−１、ＧＤＮＦおよびＶＥＧＦを含む）の直接筋肉注射によるＳＯＤＧ９３Ａマウスの処置は動物の生存を延長させる（Kaspar et al. (2003) Science 301:839-42; Azzouz et al. (2004) Nature 429:413-17; Wang et al. (2002) J. Neurosci. 22:6920-28）。その上、ＳＯＤＧ９３Ａトランスジェニックマウスモデルにおいて、局所のＩＧＦ−１特異的イソ型（ｍＩＧＦ−１）の筋肉特異的発現は、神経筋接合部を安定化させ、運動ニューロンの生存を促進し、疾患の発病および進行を遅延させ、トランスジェニックＳＯＤ１動物において筋肉への直接的な効果が疾患の発病および進行に影響を与え得ることを示している（Dobrowolny et al. (2005) J. Cell Biol. 168:193-99）。筋肉の代謝亢進と運動ニューロンの脆弱性との関連もＡＬＳマウスにおいて報告されており、筋肉の欠損が病気の原因となり得るという仮説を裏付ける（Dupois et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 :11159-64）。したがって、筋肉の成長を促進することは運動ニューロンの局所支持の改善をもたらすはずであり、その結果、治療的利益がもたらされる。
【００１２】
ミオスタチン発現の阻害は、筋肉肥大および過形成の双方を引き起こす（Lee and McPherron、前掲; McPherron et al.、前掲）。ミオスタチンは損傷後の筋肉再生を負に調節し、ＧＤＦ−８ヌルマウスにおいてミオスタチンを欠くと筋肉の再生が加速される（McCroskery et al., (2005) J. Cell. Sci. 118:3531-41）。ミオスタチン中和抗体は、野生型マウス（Whittemore et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 300:965-71）および筋ジストロフィーのモデルであるｍｄｘマウス（Bogdanovich et al. (2002) Nature 420:418-21; Wagner et al. (2002) Ann. Neurol. 52:832-36）の体重、骨格筋量、ならびに骨格筋の筋肉サイズおよび強度を増加させる。さらに、これらのマウスにおいてミオスタチン抗体は、これもＡＬＳの発病の間に標的化される筋肉である横隔膜への損傷を低下させる。増殖因子、例えばＨＧＦの筋肉への作用はミオスタチン発現の阻害に起因し得ると仮定されており（McCroskery et al. (2005)、前掲）、それによって再生と変性の間の「押し引き」、すなわちバランスを正の方向へ移動させることに役立つ。したがって、ＧＤＦ−８阻害は、ＡＬＳ、筋ジストロフィー（ＭＤ）、およびその他のＧＤＦ−８関連障害、例えば、筋肉量、強度、サイズなどを増加させることが望ましい神経筋障害の処置のための潜在的な薬理学的標的として存在する。ＡＬＳの利用可能な動物モデル（マウスおよびラット）を用いて、２つの異なる種において治療法を試験することが可能であり、したがってインビボでのヒトにおける治療効果の信頼性が増大する。
【００１３】
ヒトにおける神経筋障害に加えて、骨の減少に関係する増殖因子関連状態、例えば骨粗鬆症および骨関節炎もあり、これらは主に高齢者および／または閉経後の女性に発症する。その上、代謝性骨疾患および障害には、慢性グルココルチコイド療法に起因する低骨量、早発性性腺機能不全、アンドロゲン抑制、ビタミンＤ欠乏症、二次性副甲状腺機能亢進症、栄養障害、および神経性食欲不振症が含まれる。これらの状態のための多くの現在の治療法は骨吸収を阻害することにより機能するが、骨形成を促進する治療法が有用な代替療法となる。ＧＤＦ−８は骨の発達ならびに筋肉の発達に役割を果たすので、ＧＤＦ−８の調節も骨変性疾患の処置のための優れた薬理学的標的である。
【００１４】
したがって、特にヒトにおいて、さらに特にＡＬＳおよびその他の筋消耗性疾患ならびに骨変性疾患を患っているヒトにおいて、筋肉量および／または強度および／または骨密度、その他の全体的な増加に寄与する化合物および治療方法を開発する必要性が存在する。ＧＤＦ−８に対する親和性の向上した中和抗体およびその他の小分子を作出することは、これらの疾患を処置するための優れた薬理学的アプローチである。
【発明の開示】
【００１５】
本発明のＧＤＦ−８アンタゴニストは、抗体（例えば、インタクト抗体およびその抗原結合フラグメント）に関し、それらは本明細書において「抗ＧＤＦ−８抗体」または「ＧＤＦ−８抗体」と呼ばれる。一実施形態では、抗ＧＤＦ−８抗体は、少なくとも１つのＧＤＦ−８関連活性（すなわち「ＧＤＦ−８活性」）を低下させ、中和し、および／またはアンタゴナイズする。本発明は、したがって、これらの抗ＧＤＦ−８抗体を用いてＧＤＦ−８活性に関連する様々な骨、筋肉、グルコースおよび脂肪の疾患を処置する方法を提供する。本発明は、ＧＤＦ−８アンタゴニスト、例えば、ＧＤＦ−８抗体が、ＡＬＳを患っている動物の処置に用いられる場合に、非常に効果的な治療法であること、およびこのような抗体の投与がＡＬＳ病態の間の標的化される筋肉、例えば、横隔膜、腓腹筋、その他の消耗を低下させることを開示する。その上、本発明は、これらのアンタゴニストがＡＬＳを患う動物において筋肉量および握力を増加させるのに非常に効果的であることを開示する。結果として、本発明は、抗ＧＤＦ−８抗体が、ＧＤＦ−８関連障害、例えば、ＡＬＳ、筋肉消耗性疾患またはＧＤＦ−８調節不全に起因するその他の疾患を処置するために効果的な組成物であることを教示する。
【００１６】
一態様では、本発明は、被験体においてＧＤＦ−８関連障害を処置する（例えば、治癒させる、抑制する）、寛解する、または予防する（例えば、該疾患の発病、再発(recurrence)または再発(relapse)を遅延または予防する）方法を特色とする。前記方法は、被験体へＧＤＦ−８アンタゴニスト、例えば、抗ＧＤＦ−８抗体を、ＧＤＦ−８関連障害を処置または予防するために十分な量で投与する段階を含む。ＧＤＦ−８アンタゴニスト、例えば、抗ＧＤＦ−８抗体は、被験体へ単独でまたは本明細書に記載されるその他の治療法と組み合わせて投与することができる。ＧＤＦ−８抗体は、治療のため、予防のため、または両方のために投与することができる。一実施形態では、被験体は、例えば、骨障害および筋障害を含むＧＤＦ−８関連障害を患っている哺乳類、例えば、ヒトである。好ましくは、被験体はヒトである。より好ましくは、被験体は、本明細書に記載されるＧＤＦ−８関連障害を患っているヒトである。
【００１７】
一実施形態では、本発明は、ＧＤＦ−８関連障害、例えば、筋障害、神経筋障害、骨変性疾患、代謝性または誘発性骨疾患、脂肪疾患、グルコース代謝障害、またはインスリン関連障害を診断、予知、モニター、スクリーニング、処置、寛解、および／または予防するための安全かつ効果的な治療方法を提供し、インスリン関連障害としては、限定されるものではないが、グルコースホメオスタシス、２型糖尿病、耐糖能異常、メタボリック症候群（すなわち、２型糖尿病および／または心疾患についての高いリスクをもたらす一群の健康状態の同時発生を伴う症候群、この一群の健康状態には、インスリン抵抗性、腹部肥満、異脂肪血症、高血圧症、慢性炎症、血栓形成前の状態、その他が含まれ得る）、インスリン抵抗性（例えば、熱傷または窒素不均衡などの外傷性傷害により誘発される抵抗性）、脂肪組織障害（例えば、肥満症、異脂肪血症、非アルコール性脂肪肝疾患、その他）、ＨＩＶ誘発性筋消耗、筋ジストロフィー（デュシェンヌ型筋ジストロフィーを含む）、筋萎縮性側索硬化症（「ＡＬＳ」）、筋萎縮、器官萎縮、虚弱、うっ血性閉塞性肺疾患、サルコペニア、悪液質、筋肉消耗症候群、骨粗鬆症、骨関節炎、代謝性骨疾患、および代謝性骨障害（慢性グルココルチコイド療法に起因する低骨量、早発性性腺機能不全、アンドロゲン抑制、ビタミンＤ欠乏症、二次性副甲状腺機能亢進症、栄養障害、および神経性食欲不振症を含む）が挙げられる。限定されない、好ましい実施形態では、本発明は、脊椎動物、特に哺乳類、およびさらに特にヒトにおけるＧＤＦ−８関連障害（例えば、筋疾患）の診断、予知、モニター、スクリーニング、処置、寛解、および／または予防するための安全かつ効果的な治療方法を提供する。本発明の最も好ましい実施形態では、診断、予知、モニター、スクリーニング、処置、寛解、および／または予防されるＧＤＦ−８関連障害（例えば、筋障害）はＡＬＳである。
【００１８】
もう一つの実施形態では、本発明は、インビボまたはインビトロでＧＤＦ−８機能を阻害する方法を提供する。これらの方法は、ＧＤＦ−８関連障害、例えば、筋肉変性疾患および骨変性疾患、特にＡＬＳなどの筋障害を処置するため、ならびに筋肉量および／または骨強度および／または骨密度を増加させるために有用である。本方法は、限定されるものではないが、ヒトをはじめとする正常な動物において筋肉量および骨密度を増加させるためにも有用である。本方法は、インビトロ（例えば、無細胞系、培養、その他で）、エクスビボ、またはインビボで用いることができる。例えば、ＧＤＦ−８受容体を発現している細胞をインビトロにて培地中で培養し、例えば、１またはそれ以上の抗ＧＤＦ−８抗体（例えば、本明細書に記載されるようなもの）と接触させてよい。あるいは、本方法を被験体の体内に存在する細胞で、例えば、インビボ（例えば、治療用または予防用）プロトコールの一部として実行してよい。
【００１９】
従って、一態様では、本発明は、ＧＤＦ−８アンタゴニスト、例えば、ＧＤＦ−８と相互作用し（例えば、結合し）、中和し、かつ／または阻害する単離抗体を特色とする。具体的には、ＧＤＦ−８抗体の結合するＧＤＦ−８タンパク質は、哺乳類、例えば、ヒト、ヒツジ、非ヒト霊長類のＧＤＦ−８である。もう一つの実施形態では、本発明は、高い親和性（例えば、Ｋｄが少なくとも１０-7Ｍ、好ましくは、１０-8、１０-9、１０-10、より好ましくは、１０-11Ｍまたはそれ以上）で、ＧＤＦ−８と結合する抗体を提供する。抗ＧＤＦ−８抗体の親和性および結合速度は、いくつかの周知の方法、例えば、バイオセンサー技術（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて試験することができる。
【００２０】
一実施形態では、抗ＧＤＦ−８抗体（例えば、インタクト抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、または一本鎖Ｆｖフラグメント））は、モノクローナル抗体である。抗体は、ヒト、ヒト化、キメラ、またはインビトロで作製された抗体であってよい。限定されない、好ましい実施形態では、本発明の抗ＧＤＦ−８抗体は、ヒト化抗体である。
【００２１】
これらの抗ＧＤＦ−８抗体は、筋肉、骨、脂肪およびグルコース代謝関連障害を診断、予知、モニター、スクリーニング、処置、寛解、および／または予防するために用いることができる。抗ＧＤＦ−８抗体の限定されない例は、本明細書において「ＲＫ３５」と称され、マウスおよび改変抗体の双方、例えば、キメラまたはヒト化形態を含む。マウスＲＫ３５の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、本明細書においてそれぞれ配列番号２および配列番号３として示される。ヒト化ＲＫ３５の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、本明細書においてそれぞれ配列番号６および配列番号７として示される。マウスＲＫ３５の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、本明細書においてそれぞれ配列番号４および配列番号５として示される。ヒト化ＲＫ３５の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、本明細書においてそれぞれ配列番号８および配列番号９として示される。
【００２２】
本発明の限定されない、好ましい実施形態では、抗体は、ＧＤＦ−８に対するマウスまたはヒト化抗体である。本発明のより好ましい実施形態では、抗体は、配列番号３に示されるＶＨ（重鎖可変）ドメインと配列番号５に示されるＶＬ（軽鎖可変）ドメインを含む。本発明のもう一つの好ましい実施形態では、抗体は、配列番号７に示されるＶＨドメインと配列番号９に示されるＶＬドメインを含む。本発明のさらなる実施形態は、表１に記載される１またはそれ以上のＶＨまたはＶＬドメインを含む。
【００２３】
本発明の他の実施形態は、ＲＫ３５のＨ３断片、すなわち配列番号１２として示される配列を含む。さらに別の実施形態では、ＧＤＦ−８アンタゴニストは、本明細書に開示される配列番号１０〜１２および２０〜２２から選択される配列を有する抗体の重鎖可変領域に由来の１、２、または３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。さらに別の実施形態では、本発明のアンタゴニストは、本明細書に開示される配列番号１３〜１５および２３〜２５から選択される配列を有する抗体の軽鎖可変領域に由来する１、２、または３つのＣＤＲを含む。さらに別の実施形態では、抗体は、配列番号１０〜１５および２０〜２５から選択される配列を有する１、２、３、４、５、または６つのＣＤＲを含む。
【００２４】
本発明の抗ＧＤＦ−８抗体の重鎖および軽鎖は、全長（例えば、抗体が少なくとも１つ、および好ましくは２つの完全な重鎖と、少なくとも１つ、および好ましくは２つの完全な軽鎖を含み得る）であってもよいし、または抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、または一本鎖Ｆｖフラグメント（「ｓｃＦｖ」））を含んでもよい。他の実施形態では、抗体重鎖定常領域は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、およびＩｇＥから選択され、特に、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４、より特に、ＩｇＧ１（例えば、ヒトＩｇＧ１）から選択される。もう一つの実施形態では、抗体軽鎖定常領域は、例えば、κまたはλ、特にκ（例えば、ヒトκ）から選択される。一実施形態では、抗体の特性を改変する（例えば、１またはそれ以上のＦｃ受容体結合、抗体グリコシル化、システイン残基の数、エフェクター細胞機能、または補体機能を増加または低下させる）ために定常領域が変更される（例えば、変異導入される）。例えば、ヒトＩｇＧ１定常領域は、１またはそれ以上の残基で、例えば、配列番号１９の残基１１７および１２０の１以上で変異導入され得る。一実施形態では、抗ＧＤＦ−８抗体は、配列番号１９に示されるヒトＩｇＧ１定常領域を含む。もう一つの実施形態では、抗ＧＤＦ−８抗体は、ヒトκ配列、例えば、配列番号１７として示される配列を含む。
【００２５】
もう一つの実施形態では、本発明は、ＧＤＦ−８抗体を、ＧＤＦ−８と結合し、ＧＤＦ−８活性を中和または低下させる能力を保持する新規な抗体フラグメントとして提供する。本発明の限定されない、好ましい実施形態では、抗体フラグメントは、ｄＡｂフラグメント、二重特異性抗体、Ｆｄフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、およびＦｖフラグメントからなる群より選択される。本発明のより好ましい実施形態では、抗体フラグメントは、配列番号２、４、６または８から選択されるポリヌクレオチドにコードされる。本発明のもう一つの好ましい実施形態では、抗体フラグメントは、配列番号１０〜１５および２０〜２５に示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む。もう一つの好ましい実施形態では、本発明は、表１に記載される配列とは配列が異なるが（例えば、遺伝子コードの冗長性による）、ＧＤＦ−８と結合し、ＧＤＦ−８活性を中和または低下させる能力を保持する新規な抗体フラグメントを提供する。
【００２６】
もう一つの実施形態では、抗ＧＤＦ−８抗体は、表１に記載されるアミノ酸配列（ＶＨに関して配列番号３または７、および／またはＶＬに関して配列番号５または９）、あるいはそれと実質的に同一の配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％、またはそれ以上同一である配列、あるいは配列番号３、５、７、または９からわずか１、２、５、１０、または１５アミノ酸残基が異なる配列）を有する、少なくとも１、２、３、または４つの抗原結合領域、例えば、可変領域を含む。もう一つの実施形態では、抗体は、表１に記載される核酸配列（ＶＨに関して配列番号２または６、および／またはＶＬに関して配列番号４または８）、あるいはそれと実質的に同一の配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％、またはそれ以上同一である配列、あるいは配列番号２、４、６、または８からわずか３、６、１５、３０、または４５ヌクレオチドが異なる配列）を有する核酸にコードされるＶＨおよび／またはＶＬドメインを含む。さらに別の実施形態では、抗体は、表１に記載されるアミノ酸配列（配列番号１０〜１２および２０〜２２）、あるいはそれと実質的に相同な配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％、またはそれ以上同一であり、かつ／または１またはそれ以上の置換、例えば、保存置換を有する配列）を有する重鎖可変領域に由来の１、２、または３つのＣＤＲを含む。さらに別の実施形態では、抗体は、表１に記載されるアミノ酸配列（配列番号１３〜１５および２３〜２５）、あるいはそれと実質的に相同な配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％、またはそれ以上同一であり、かつ／または１またはそれ以上の置換、例えば、保存置換を有する配列）を有する軽鎖可変領域に由来の少なくとも１、２、または３つのＣＤＲを含む。さらに別の実施形態では、抗体は、表１に記載されるアミノ酸配列（ＶＨ  ＣＤＲに関して配列番号１０〜１２および２０〜２２；ＶＬ  ＣＤＲに関して配列番号１３〜１５および２３〜２５）、あるいはそれと実質的に相同な配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％、またはそれ以上同一であり、かつ／または１またはそれ以上の置換、例えば、保存置換を有する配列ある配列）を有する重鎖および軽鎖可変領域に由来の１、２、３、４、５、または６つのＣＤＲを含む。
【００２７】
もう一つの実施形態では、抗ＧＤＦ−８抗体は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列あるいはそれと実質的に相同な配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上同一である配列、または配列番号１９からわずか１、２、５、１０、５０、または１００アミノ酸残基が異なる配列）を有するヒトＩｇＧ１定常領域を含む。もう一つの実施形態では、抗ＧＤＦ−８抗体は、ヒトκ定常鎖、例えば、配列番号１７に示されるアミノ酸配列あるいはそれと実質的に相同な配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上同一である配列、あるいは配列番号１７からわずか１、２、５、１０、２０、または５０アミノ酸残基が異なる配列）を有するヒトκ定常鎖を含む。さらに別の実施形態では、抗体は、本明細書に記載されるヒトＩｇＧ１定常領域およびヒトκ定常鎖を含む。
【００２８】
限定されない、好ましい実施形態では、本発明は、配列番号２、４、６、または８に示されるポリヌクレオチドにコードされる抗体を提供する。もう一つの好ましい実施形態では、本発明は、ストリンジェント条件下で配列番号２、４、６、または８に示されるポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド配列にコードされる抗体を提供する。もう一つの好ましい実施形態では、本発明は、配列番号２、４、６、または８に示される配列とは異なるが、遺伝子コードの縮重により、配列番号３、５、７、９、または１０〜１５に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドにコードされる抗体を提供する。
【００２９】
ＧＤＦ−８アンタゴニスト、例えば、抗ＧＤＦ−８抗体は、誘導体化するか、または別の機能分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質（例えば、Ｆａｂフラグメント）と結合することができる。例えば、融合タンパク質もしくは抗体、または抗原結合部分は、１またはそれ以上のその他の分子実体、例えば特に抗体（例えば、二重特異性もしくは多重特異性抗体）、毒素、放射性同位元素、細胞傷害性の薬剤もしくは細胞増殖抑制剤などと機能的に結合する（例えば、化学結合、遺伝子融合、非共有結合性会合またはそれ以外のものによって）ことができる。
【００３０】
本発明のさらなる態様は、ＧＤＦ−８アンタゴニストとして、本発明のＧＤＦ−８アンタゴニスト、例えば、抗ＧＤＦ−８抗体をコードする精製および単離された核酸を提供する。一実施形態では、本発明は、表１に記載されるＶＨ（配列番号３または配列番号７）、ＶＬ（配列番号５または配列番号９）、および／またはＣＤＲ（配列番号１０〜１５および２０〜２５）をコードする配列を含むポリヌクレオチドを提供する。もう一つの実施形態では、本発明は、ストリンジェント条件下で表１に記載されるＶＨ、ＶＬ、またはＣＤＲ（配列番号３、５、７、９、１０〜１５、または２０〜２５）をコードする核酸とハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。もう一つの実施形態では、本発明は、配列番号２、４、６、もしくは８、または配列番号２、４、６、もしくは８のフラグメントを含む核酸を提供する。なおさらなる実施形態では、本発明は、ストリンジェント条件下で配列番号２、４、６または８とハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。本発明の別の態様は、本発明のポリヌクレオチドをＧＤＦ−８アンタゴニストとして含む宿主細胞およびベクターを提供する。
【００３１】
本発明の抗体は多数の有用な特性を有する。第１に、抗体は、成熟したＧＤＦ−８と高い親和性で結合する能力がある。第２に、開示される抗体は、インビトロおよびインビボでＧＤＦ−８活性を阻害する。第３に、開示される抗体は、骨格筋量および骨密度の負の調節に関連するＧＤＦ−８活性を阻害する。第４に、開示される抗体は、筋疾患、特にＡＬＳに効果的な処置である。これらの抗体には多くのさらなる用途があり、それにはＧＤＦ−８関連障害、例えば、筋肉および／または骨関連障害を診断、予知、モニター、スクリーニング、処置、寛解、および／または予防することが含まれる。
【００３２】
本発明のその他の態様は、本発明のＧＤＦ−８アンタゴニスト、例えば、本発明の抗ＧＤＦ−８抗体を含む組成物、ならびに、動物において、特にＡＬＳなどの筋疾患をもつヒトまたはその他の動物においてＧＤＦ−８を阻害するかまたは中和させる際のこのような組成物の使用を提供する。本発明の抗体はＧＤＦ−８関連障害、例えば、筋肉組織または骨密度を増加させることが望ましい障害にも用いることができる。例えば、抗ＧＤＦ−８抗体は、損傷した筋肉、例えば、心筋、横隔膜、その他を修復するための治療法および組成物に用いることができる。開示される方法および組成物により処置されるＧＤＦ−８関連障害および疾患の例としては、筋肉および神経筋障害、例えば筋ジストロフィー（デュシェンヌ型筋ジストロフィーを含む）；筋萎縮性側索硬化症；筋萎縮；器官萎縮；虚弱；トンネル症候群；うっ血性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；サルコペニア、悪液質、およびその他の筋肉消耗症候群；脂肪組織障害（例えば、肥満症）；２型糖尿病；耐糖能異常；メタボリック症候群（例えば、シンドロームＸ）；インスリン抵抗性（例えば、熱傷または窒素不均衡などの外傷性傷害により誘発される抵抗性を含む）、および骨変性疾患（例えば、骨関節炎および骨粗鬆症）が挙げられる。本発明の限定されない、好ましい実施形態では、抗ＧＤＦ−８抗体を含有する組成物は、ＡＬＳを処置、緩和、または寛解する方法に用いられる。
【００３３】
別の態様では、本発明は、組成物、例えば、製薬上許容される担体と少なくとも１つのＧＤＦ−８アンタゴニスト、例えば、本明細書に記載される抗ＧＤＦ−８抗体とを含む医薬組成物を提供する。一実施形態では、組成物、例えば、医薬組成物は、２またはそれ以上の前記ＧＤＦ−８アンタゴニスト、例えば、抗ＧＤＦ−８抗体またはその断片の組合せを含む。本発明の範囲内にはまた、ＧＤＦ−８アンタゴニスト、例えば、抗ＧＤＦ−８抗体と、治療薬、例えば、増殖因子阻害剤、免疫抑制剤、抗炎症剤（例えば、全身性抗炎症剤）、代謝阻害剤、酵素阻害剤、および／または細胞傷害性の薬剤もしくは細胞増殖抑制剤との組合せがある。
【００３４】
さらに別の実施形態では、ＧＤＦ−８アンタゴニスト、例えば、抗ＧＤＦ−８抗体、またはその医薬組成物は、単独でまたは併用療法において、すなわち他の薬剤、例えば、ＧＤＦ−８関連障害を処置するために有用な治療薬と組み合わせて投与される。
【００３５】
様々な疾患または障害の処置における使用に加えて、抗ＧＤＦ−８抗体を生物学的サンプル中のＧＤＦ−８タンパク質またはタンパク質断片を定量的または定性的に検出する診断ツールとして用いてよい。検出されるＧＤＦ−８タンパク質の存在または量は、本明細書に列挙される１またはそれ以上の病状と関連付けることができる。したがって、一実施形態では、本発明は、ＧＤＦ−８関連障害を診断、予知、モニター、および／またはスクリーニングする方法を提供する。
【００３６】
別の態様では、本発明は、インビトロでサンプル中（例えば、生物学的サンプル、例えば血清、血漿、組織、生検など）のＧＤＦ−８の存在を検出する方法を提供する。本方法は、ＧＤＦ−８関連障害、例えば、骨、筋肉、脂肪またはグルコース代謝関連障害を診断するために用いることができる。本方法には、（ｉ）サンプルまたは対照サンプルと本明細書に記載される抗ＧＤＦ−８抗体を接触させる段階；および（ｉｉ）抗ＧＤＦ−８抗体とサンプルまたは対照サンプルとの間の複合体の形成を検出する段階が含まれ、この際、対照サンプルと比較してサンプル中での複合体の形成に実質的に有意な変化があれば、そのサンプル中にＧＤＦ−８が存在することを示す。
【００３７】
さらにもう１つの態様では、本発明は、被験体においてインビボでＧＤＦ−８の存在を検出する方法（例えば、被験体におけるインビボ撮像）を提供する。本方法は、ＧＤＦ−８関連障害、例えば、ＡＬＳを診断するために用いることができる。本方法には、（ｉ）抗体とＧＤＦ−８の結合を可能にする条件下で、本明細書に記載される抗ＧＤＦ−８抗体を被験体または対照被験体に投与する段階；および（ｉｉ）抗体とＧＤＦ−８との間の複合体の形成を検出する段階が含まれ、この際、対照被験体と比較して被験体中で複合体の形成に実質的に有意な差異があれば、ＧＤＦ−８の存在に関連する徴候が得られる。
【００３８】
本発明の他の実施形態は、患者がＧＤＦ−８関連障害（例えば、筋障害、神経筋障害、骨変性疾患、代謝性または誘発性骨疾患、脂肪障害、グルコース代謝障害、またはインスリン関連障害）を患っているかどうかを診断または検知する方法を提供し、その方法は、（ａ）関心対象の患者からサンプルを得る段階；（ｂ）サンプルと本明細書に記載される抗ＧＤＦ−８抗体を接触させる段階；（ｃ）患者サンプル中に存在するＧＤＦ−８のレベルを測定する段階；および（ｄ）患者サンプル中のＧＤＦ−８のレベルを対照サンプル中のＧＤＦ−８のレベルと比較する段階を含み、この際、対照サンプル中のＧＤＦ−８のレベルと比較した患者サンプル中のＧＤＦ−８のレベルの実質的な増加、低下、または類似が、患者がＧＤＦ−８関連障害を患っているかどうかを示す。
【００３９】
患者が本明細書に記載されるＧＤＦ−８関連障害を患っているかどうかを診断または検出する方法の別のさらなる実施形態は、（ａ）関心対象の患者から採取した第１のサンプルを得る段階；（ｂ）第１のサンプルと本明細書に記載される抗ＧＤＦ−８抗体を接触させる段階；（ｃ）第１のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルを測定する段階；（ｄ）ＧＤＦ−８関連障害に罹患していない個体から第２のサンプルを得る段階；（ｅ）第２のサンプルと本明細書に記載される抗ＧＤＦ−８抗体を接触させる段階；（ｆ）第２のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルを測定する段階；および（ｇ）第１および第２のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルを比較する段階を含み、この際、第２のサンプルと比較した第１のサンプルのレベルの実質的な増加、低下、または類似が、患者がＧＤＦ−８の過剰発現に（一部または完全に）起因するＧＤＦ−８関連障害を患っているかどうかを示す。例えば、第２のサンプルと比較した第１のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルの増加は、患者がＧＤＦ−８関連障害を患っていることを示し得る。それに対して、第２のサンプルと比較した第１のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルの低下または類似は、患者がＧＤＦ−８関連障害を患っていないことを示し得る。
【００４０】
本発明の抗体は、患者がＧＤＦ−８関連障害、例えば、筋障害、神経筋障害、骨変性疾患、代謝性または誘発性骨疾患、脂肪障害、グルコース代謝障害、またはインスリン関連障害を発症する可能性を予知する方法においても有用である。限定されない、好ましい実施形態では、本方法は、（ａ）関心対象の患者から第１のサンプルを得る段階；（ｂ）第１のサンプルと本明細書に記載される抗ＧＤＦ−８抗体を接触させる段階；（ｃ）第１のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルを測定する段階；（ｄ）ＧＤＦ−８関連障害に罹患していない個体から第２のサンプルを得る段階；（ｅ）第２のサンプルと本明細書に記載される抗ＧＤＦ−８抗体を接触させる段階；（ｆ）第２のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルを測定する段階；および（ｇ）第１および第２のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルを比較する段階を含み、この際、第２のサンプルと比較した第１のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルの増加、低下、または類似が、患者がＧＤＦ−８関連障害を発症する可能性を示す。例えば、ＧＤＦ−８の過剰発現に（一部または完全に）起因するＧＤＦ−８関連障害に関して、もし第１のサンプルが第２のサンプルと比較して高いレベルのＧＤＦ−８を有するならば、患者はＧＤＦ−８関連障害を発症する可能性がある。それに対して、ＧＤＦ−８の過剰発現に（一部または完全に）起因するＧＤＦ−８関連障害に関して、もし第１のサンプルが第２のサンプルと比較して類似または低いレベルのＧＤＦ−８を有するならば、患者がＧＤＦ−８関連障害を発症する見込みは低い。
【００４１】
本発明の抗体は、ＧＤＦ−８関連障害、例えば、筋障害、神経筋障害、骨変性疾患、代謝性または誘発性骨疾患、脂肪障害、グルコース代謝障害、またはインスリン関連障害の重篤度をモニターする方法においても有用である。限定されない、好ましい実施形態では、本方法は、（ａ）第１の時点で関心対象の患者から採取した第１のサンプルを得る段階；（ｂ）第１のサンプルと本明細書に記載される抗ＧＤＦ−８抗体を接触させる段階；（ｃ）第１のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルを測定する段階；（ｄ）第２の時点で患者から採取した第２のサンプルを得る段階；（ｅ）第２のサンプルと本明細書に記載される抗ＧＤＦ−８抗体を接触させる段階；（ｆ）第２のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルを測定する段階；および（ｇ）第１および第２のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルを比較する段階を含み、この際、第２のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルの増加、低下、または類似が、ＧＤＦ−８関連障害の重篤度が変化したかどうかを示す。一実施形態では、本発明のモニターする方法はＡＬＳをモニターするために用いられ、第２のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルの低下はＡＬＳの重篤度が低下したことを示す。
【００４２】
本明細書に記載される疾患をモニターするさらなる方法は、（ａ）関心対象の患者から第１のサンプルを得る段階；（ｂ）第１のサンプルと本明細書に記載される抗ＧＤＦ−８抗体を接触させる段階；（ｃ）第１のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルを測定する段階；（ｄ）第２のサンプルを、筋障害、神経筋障害、骨変性疾患、代謝性または誘発性骨疾患、脂肪障害、グルコース代謝障害、またはインスリン関連障害に罹患していない個体から得る段階；（ｅ）第２のサンプルと本明細書に記載される抗ＧＤＦ−８抗体を接触させる段階；（ｆ）第２のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルを測定する段階；および（ｇ）第１および第２のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルを比較する段階を含み、この際、第２のサンプルと比較した第１のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルの増加、低下、または類似が、その時点でのＧＤＦ−８障害の重篤度を示す。一実施形態では、本発明のモニターする方法はＡＬＳをモニターするために用いられ、第２のサンプルと比較した第１のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルの低下または類似は、ＡＬＳの重篤度が低いことを示す。
【００４３】
好ましくは、抗体を検出可能な物質で直接または間接的に標識して結合抗体または非結合抗体の検出を促進する。適した検出可能な物質としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、および放射性物質が挙げられる。
【００４４】
本発明のアンタゴニスト、例えば抗体を、インビボにおいてＧＤＦ−８発現細胞へ送達する、または標的指向化する方法も、本明細書に開示され、本発明の範囲内にある。
【００４５】
ＧＤＦ−８アンタゴニスト、例えば、本発明の抗ＧＤＦ−８抗体を含む治療および診断用途のためのキットも、本発明の範囲内にある。
【００４６】
本発明のさらなる目的を以下の説明に示す。本発明の様々な目的、態様、および利点は、特に請求項において指摘される要素および組合せによって実現および達成される。
【００４７】
前述の概要および以下の詳細な説明の双方は例示および説明のためだけのものであり、特許請求される本発明を制限するものではないことは当然理解される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
Ｉ．定義
本明細書において「抗体」とは、免疫グロブリンまたはその一部を指し、供給源、起源種、製造方法、および特徴にかかわらず抗原結合部位を含む任意のポリペプチドを包含する。本発明の目的において、特に明記されない限り、抗体には、抗体フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、二重特異性抗体、および抗原結合機能を保持するその他の抗体フラグメントも含まれる。抗体は、例えば、伝統的なハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、またはファージディスプレイ技術により、抗体ライブラリーを用いて作製することができる。様々なその他の抗体製造技法については、Antibodies: A Laboratory Manual, eds. Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 1988を参照のこと。
【００４９】
用語「抗原結合ドメイン」とは、抗原の一部または全てと特異的に結合しているか、または抗原の一部または全てと相補的な領域を含む抗体分子の部分を指す。抗原が大きい場合、抗体は抗原の特定の部分にのみ結合することがある。「エピトープ」または「抗原決定基」は、抗体の抗原結合ドメインとの相互作用に関与する抗原分子の一部分である。抗原結合ドメインは、１またはそれ以上の抗体可変ドメインによりもたらされ得る（例えば、ＶＨドメインからなるいわゆるＦｄ抗体フラグメント）。抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含み得る。
【００５０】
用語「ＧＤＦ−８」とは、特異的増殖分化因子−８を指すが、構造的または機能的にＧＤＦ−８に関連しているその他の因子、例えば、ＢＭＰ−１１、およびＴＧＦ−βスーパーファミリーに属するその他の因子は指さない。この用語は、ＧＤＦ−８のプロセシングされていない全長前駆体形態ならびに翻訳後切断から生じる成熟形態およびプロペプチド形態を指す。この用語はまた、本明細書において考察される成熟ＧＤＦ−８に関連する少なくともいくつかの生物学的活性を維持するＧＤＦ−８の任意の断片および変異体を指し、それには改変された配列が含まれる。成熟ヒトＧＤＦ−８のアミノ酸配列は配列番号１に提供される。本発明は、限定されるものではないが、ヒト、ウシ、ニワトリ、マウス、ラット、ブタ、ヒツジ、シチメンチョウ、ヒヒ、および魚をはじめとする、あらゆる脊椎動物種に由来するＧＤＦ−８に関する（配列情報に関しては、例えば、McPherron et al.、前掲を参照）。
【００５１】
用語「ＧＤＦ−８活性」とは、活性ＧＤＦ−８タンパク質に関連する１またはそれ以上の生理学的な増殖調節活性または形態形成活性を指す。例えば、活性ＧＤＦ−８は骨格筋量の負の調節因子である。活性ＧＤＦ−８はまた、筋肉特異的酵素（例えば、クレアチンキナーゼ）の産生を調節し、筋芽細胞増殖を刺激し、プレ脂肪細胞から脂肪細胞への分化を調節することができる。インビボおよびインビトロでＧＤＦ−８活性を測定するための例示的手順は実施例に示される。
【００５２】
用語「ＧＤＦ−８アンタゴニスト」または「ＧＤＦ−８阻害剤」には、ＧＤＦ−８の活性、発現、プロセシング、または分泌を阻害することのできる任意の薬剤が含まれる。このような阻害剤としては、ＧＤＦ−８を阻害する、高分子および小分子、例えば、タンパク質、抗体、ペプチド、ペプチドミメティクス、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡ、およびその他の小分子が挙げられる。ＧＤＦ−８アンタゴニストには、本明細書において提供される抗体に加えて、ＧＤＦ−８を効率的に阻害する任意の抗体が含まれ、それには、ＧＤＦ−８との結合に高特異性の抗体（例えば、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのその他のメンバー（例えば、ＢＭＰ−１１）に対して低親和性の抗体）が含まれる。これらの抗体の変異体（ヒト化変異体を含む）は、本発明の診断、予知、モニター、処置、寛解、および予防方法において企図される。このような阻害剤は、ＧＤＦ−８の生物活性を「阻害する」、「低下させる（decrease）」または「低下させる（reduce）」と考えられている。
【００５３】
用語「中和する」、「中和」およびそれらの同族語は、同じ阻害剤の不在下でのＧＤＦ−８の活性と比較したときの、ＧＤＦ−８活性の劇的な低下または抑止を指す。例えば、活性の７５〜１００％の低下は、ＧＤＦ−８活性を「中和する」と言ってよい。
【００５４】
用語「処置」は、本明細書において用語「治療方法」と同義的に用いられ、治療的処置および予防(prophylactic/ preventative)手段の双方を指す。処置を必要とする人々には、特定の医学的障害を既に有する個体ならびにその障害を最終的に獲得する人々（すなわち、予防的手段を必要とする人々）が含まれ得る。
【００５５】
用語「単離」とは、その自然環境から実質的に分離されている分子を指す。例えば、単離タンパク質は、それが由来する細胞または組織源から実質的に分離されている分子である。
【００５６】
用語「精製された」とは、その自然環境においてその分子に関連するその他の物質を実質的に含まない分子を指す。例えば、精製されたタンパク質は、それが由来する細胞または組織からの細胞物質またはその他のタンパク質を実質的に含まない。この用語は、単離タンパク質が治療用組成物として投与されるために十分に純粋であるか、または少なくとも７０％〜８０％（ｗ／ｗ）純粋である、より好ましくは、少なくとも８０％〜９０％（ｗ／ｗ）純粋である、さらにより好ましくは、９０〜９５％純粋である；さらに、最も好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（ｗ／ｗ）純粋である場合の調製物を指す。
【００５７】
用語「有効量」「治療上有効量」「効果的な量」または同種のものは、患者の症状の寛解または所望の生物学的成果（例えば、骨格筋量および／または骨密度の増加）がもたらされる化合物の量を指す。このような量は、骨格筋量および骨密度の負の調節に関連するか、またはグルコースホメオスタシスおよび脂肪代謝に関連する、ＧＤＦ−８の活性を低下させるのに十分であるべきである。効果的な量は、本明細書に記載されるように決定することができる。
【００５８】
「ＧＤＦ−８活性に関連する障害」「ＧＤＦ−８に関連する障害」「ＧＤＦ−８関連障害」または同種のものは、ＧＤＦ−８（および／またはＧＤＦ−８活性）の調節不全（例えば、異常な増加または低下）に完全にまたは一部分起因し得る障害、ならびに／あるいは、ＧＤＦ−８（および／またはＧＤＦ−８活性）を調節および／またはモニターすることにより処置、寛解、予防、診断、予知、またはモニターされ得る障害を指す。ＧＤＦ−８関連障害としては、筋障害、神経筋障害、骨変性疾患、代謝性または誘発性骨疾患、脂肪疾患、グルコース代謝障害 またはインスリン関連障害が挙げられる。本発明の好ましいＧＤＦ−８関連障害は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である。
【００５９】
用語「小分子」とは、高分子でない化合物を指す（例えば、Karp (2000) Bioinformatics Ontology 16：269-85; Verkman (2004) AJP-Cell Physiol. 286:465-74参照）。したがって、小分子は、１０００ダルトン未満の化合物と考えられる場合が多い（例えば、Voet and Voet, Biochemistry, 2nd ed., ed. N. Rose, Wiley and Sons, New York, 14 (1995)）。例えば、Davisら（(2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102：5981-86）は、葉酸類、メトトレキサート、およびニューロペプチド類を示すために小分子というフレーズを用いたが、HalpinおよびHarbury（(2004) PLos Biology 2：1022-30）は、小分子遺伝子産物、例えば、ＤＮＡ類、ＲＮＡ類、およびペプチド類を示すためにこのフレーズを使っている。天然小分子の例としては、限定されるものではないが、コレステロール類、神経伝達物質類、およびｓｉＲＮＡ類が挙げられる；合成小分子としては、限定されるものではないが、多数の商用の小分子データベース、例えば、ＦＣＤ（ファインケミカルデータベース）、ＳＭＩＤ（小分子相互作用データベース）、ＣｈＥＢＩ（ケミカル・エンティティーズ・オブ・バイオロジカル・インタレスト(Chemical Entities of Biological Interest)）、およびＣＳＤ（ケンブリッジ結晶構造データベース）にリストされる様々な化学物質が挙げられる（例えば、Alfarano et al. (2005) Nuc. Acids Res. Database Issue 33:D416-24参照）。
【００６０】
ＩＩ．ＧＤＦ−８に対する抗体および抗体フラグメント
Ａ．マウスおよびヒト化抗体ＲＫ３５
本開示は、効率的にＧＤＦ−８を結合する新規な抗体（例えば、インタクト抗体および抗体フラグメント）を提供する。そのような抗体の限定されない例示的な実施形態をＲＫ３５と呼ぶ。この例となる実施形態は、マウスおよびヒト化抗体、ならびにその抗体フラグメントの形態で提供される。
【００６１】
本明細書において「ＲＫ３５」と称される、本発明の例となる抗体は、特有かつ有益な特性を有する。第１に、この抗体および抗体フラグメントは、高い親和性で成熟ＧＤＦ−８と結合する能力がある。第２に、本発明の抗体および抗体フラグメントは、例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ結合の阻害およびレポーター遺伝子アッセイにより証明されるように、インビトロおよびインビボでＧＤＦ−８活性を阻害する。第３に、開示される抗体および抗体フラグメントは、例えば、処置した変異ＳＯＤマウスにおける筋肉量の増加により証明されるように、ＧＤＦ−８関連障害、例えば、筋障害、特にＡＬＳに関連する症状を処置するために有用である。
【００６２】
例となる実施形態では、ＧＤＦ−８アンタゴニストは、ＧＤＦ−８と効率的に結合し、１またはそれ以上のＧＤＦ−８関連活性を阻害する抗体である。当業者であれば、本発明の抗体を用いて様々な種、例えば、本明細書に記載されている種に由来するＧＤＦタンパク質を検出、測定、および阻害することができることを理解する。同一性パーセントは、標準的なアラインメントアルゴリズム、例えば、Altschul et al. (1990) J. Mol Biol. 215:403-10に記載のベーシック・ローカル・アラインメント・ツール（ＢＬＡＳＴ）、Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:444-53のアルゴリズム、またはMeyers et al. (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17のアルゴリズムなどにより決定される。概して、実質的なＧＤＦ−８生物活性を保持し、配列番号１に示されるＧＤＦ−８の成熟形態の少なくとも１００、８０、６０、４０、２０、または１５の隣接アミノ酸の配列のいずれかと少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上同一のアミノ酸配列を含む任意のタンパク質とともに、本発明の抗体および抗体フラグメントを用いることができる。
【００６３】
Ｂ．抗体可変ドメイン
インタクト抗体は、免疫グロブリンとしても知られ、一般に、各約２５ｋＤａの２本の軽（Ｌ）鎖と、各約５０ｋＤａの２本の重（Ｈ）鎖からなる、四量体のグリコシル化タンパク質である。λおよびκと称される２種類の軽鎖が、抗体に存在する。重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは５つの主なクラス：Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、およびＭに割り当てられ、これらのうちのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4、ＩｇＡ1、およびＩｇＡ2に分割され得る。各軽鎖は、Ｎ末端可変（Ｖ）ドメイン（ＶＬ）および定常（Ｃ）ドメイン（ＣＬ）からなる。各重鎖は、Ｎ末端Ｖドメイン（ＶＨ）、３〜４個のＣドメイン（ＣＨ）、およびヒンジ領域からなる。ＶＨに最も近接するＣＨドメインをＣＨ１とする。ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、フレームワーク領域と名付けられる比較的保存された配列の４つの領域からなり（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）、それらは超可変配列の３つの領域（相補性決定領域、ＣＤＲ）についてスキャフォールドを形成する。ＣＤＲは抗体と抗原の相互作用に関与する大部分の残基を含む。ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と称される。従って、重鎖上のＣＤＲ成分は、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３と称され、一方、軽鎖上のＣＤＲ成分はＬ１、Ｌ２、およびＬ３と称される。ＣＤＲ３は、抗体結合部位内での分子多様性の最大の供給源である。例えば、Ｈ３は、２アミノ酸残基程度の短さであっても、２６アミノ酸を超える大きさであってもよい。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および３次元配置は、当分野で周知である。抗体構造の概説には、Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow et al., 1988を参照のこと。当業者であれば、各サブユニット構造、例えば、ＣＨ、ＶＨ、ＣＬ、ＶＬ、ＣＤＲ、および／またはＦＲ構造が、活性フラグメントを含むことを認識する。例えば、活性フラグメントは、抗原と結合するＶＨ、ＶＬ、またはＣＤＲサブユニットの部分、すなわち抗原結合フラグメント、あるいはＦｃ受容体および／または補体と結合し、かつ／または活性化させるＣＨサブユニットの部分からなってよい。
【００６４】
本明細書において用いられる用語「抗体フラグメント」に包含される結合フラグメントの限定されない例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価のフラグメントであるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合されている２つのＦａｂフラグメントを含む２価のフラグメントであるＦ（ａｂ’）2フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の１本のアームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント；ならびに（ｖｉ）単離ＣＤＲが挙げられる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によってコードされているが、それらは組換え技術によって合成リンカーで結合され、ＶＬとＶＨ領域が一組となって一価の分子を形成する単一のタンパク質鎖を作製することができる（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知）。最もよく用いられるリンカーは１５残基（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3ペプチドであるが、その他のリンカーも当分野で公知である。一本鎖抗体も用語「抗体」または抗体の「抗原結合フラグメント」に包含されるものとする。これらの抗体は当業者に公知の従来技法を用いて得られ、フラグメントはインタクト抗体と同じ方法で有用性についてスクリーニングされる。
【００６５】
抗体多様性は、可変領域をコードする複数の生殖細胞系列遺伝子および様々な体細胞事象により作り出される。体細胞事象には、完全なＶＨ領域を作製するための多様性（Ｄ）をもつ可変遺伝子セグメントおよび結合（Ｊ）遺伝子セグメントの組換え、ならびに完全なＶＬ領域を作製するための可変遺伝子セグメントおよび結合遺伝子セグメントの組換えが含まれる。組換えプロセス自体は不正確であり、Ｖ（Ｄ）Ｊ接合部でのアミノ酸の欠失または付加が生じる。これらの多様性の機構は、抗原暴露より前にＢ細胞発生の際に生じる。抗原刺激後、Ｂ細胞で発現した抗体遺伝子は体細胞変異を起こす。生殖細胞系列遺伝子セグメント、これらのセグメントのランダム組換え、およびランダムなＶＨ-ＶＬの対合の推定数に基づいて、最大１.６×１０7の異なる抗体が産生され得る（Fundamental Immunology, 3rd ed. (1993), ed. Paul, Raven Press, New York, NY）。抗体多様性（体細胞変異など）に寄与するその他のプロセスを考慮に入れた場合、１×１０10以上の異なる抗体を産生することができると考えられる（Immunoglobulin Genes, 2nd ed. (1995), eds. Jonio et al., Academic Press, San Diego, CA）。抗体多様性が生み出される際に多くのプロセスが関与していることから、独立して生成された、同じ抗原特異性をもつモノクローナル抗体が同一のアミノ酸配列を有する可能性は低い。
【００６６】
したがって、本発明は、ＧＤＦ−８と結合する新規な抗体を提供する。本発明の抗体フラグメント（例えば、ＣＤＲを含有する構造）は、一般に、抗体の重鎖または軽鎖配列、またはその活性フラグメントであり、その中でＣＤＲは天然に存在するＶＨおよびＶＬのＣＤＲに対応する位置に置かれている。免疫グロブリン可変ドメイン、例えば、ＣＤＲの構造および位置は、周知のナンバリングスキーム、例えば、Ｋａｂａｔナンバリングスキーム、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキーム、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの組合せ（ＡｂＭ）、その他を用いて定義してよい（例えば、Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services (1991), eds. Kabat et al.; Al-Lazikani et al. (1997) J. Mol. Biol. 273:927-48参照）。
【００６７】
したがって、本発明は、さらに新規なＣＤＲを提供する。本発明のＣＤＲを有するための構造は、一般に、ＣＤＲが、天然に存在するＶＨおよびＶＬ領域のＣＤＲに対応する場所に位置するポリペプチド、例えば、抗体重鎖または軽鎖配列またはその実質的な部分である。免疫グロブリン可変ドメインの構造および位置は、例えば、前掲のＫａｂａｔらおよび前掲Ａｌ-Ｌａｚｉｋａｎｉらに記載されるように決定することができる。
【００６８】
本発明の抗体分子（抗体フラグメントを含む）、すなわちＧＤＦ−８に拮抗する抗体分子としては、限定されるものではないが、マウスモノクローナル抗体ＲＫ３５およびその変異体、特に、ヒト化変異体が挙げられる。本発明のＧＤＦ−８アンタゴニストとしては、ＲＫ３５に加えて、ＧＤＦ−８と効率的に結合するその他の抗体が挙げられ、それには、ＧＤＦ−８との結合に高い特異性をもつ抗体（例えば、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのその他のメンバーに対して低親和性の抗体（例えば、ＢＭＰ−１１））が含まれる。ヒト化変異体を含む、これらの抗体の変異体は、本発明の診断、予知、モニター、処置、寛解、および予防方法に企図される。これらの抗体分子は、ＧＤＦ−８関連障害、例えば、骨、筋肉、脂肪、およびグルコース代謝に関連する病態の予防または処置に有用であり得る。マウスおよびヒト化ＲＫ３５の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５および９に示される。マウスおよびヒト化ＲＫ３５の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３および７に示される。マウスおよびヒト化ＲＫ３５の可変軽鎖の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列は、配列番号１３、１４、１５、２３、２４、および２５に示される。マウスおよびヒト化ＲＫ３５の可変重鎖の３つのＣＤＲのアミノ酸配列は、配列番号１０、１１、１２、２０、２１、および２２に示される。
【００６９】
上記のように、ＣＤＲは抗原との相互作用に関与する残基の大部分を含み、ＶＨおよびＶＬドメインの中、すなわち重鎖可変領域および軽鎖可変領域の中にそれぞれ含まれる。したがって、抗体が、配列番号１０〜１５および２０〜２５に示されるアミノ酸配列、またはその活性抗体フラグメントから選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＣＤＲを含む場合、それは本発明の抗体、すなわちＧＤＦ−８と結合し、ＧＤＦ−８シグナル伝達を干渉する抗体である。従って、本発明の実施形態には、ポリペプチド、例えば、配列番号１０〜１５および２０〜２５に示されるアミノ酸配列、またはその活性フラグメントから選択されるアミノ酸配列を含む、１またはそれ以上のＣＤＲを含む抗体が含まれる。したがって、当業者であれば、本発明の抗体には、ＶＬ鎖のＣＤＲが配列番号１３〜１５および２３〜２５に示される抗体、またはＶＨ鎖のＣＤＲが配列番号１０〜１２および２０〜２２に示される抗体が含まれることを認識する。
【００７０】
抗原結合フラグメントは、ＶＨおよびＶＬドメインからなるＦｖフラグメントであってよい。したがって、ＲＫ３５のＦｖフラグメントは、それがＧＤＦ−８と結合し、ＧＤＦ−８シグナル伝達を干渉する場合、本発明の抗体を構成し得る。当業者であれば、例えば、ＲＫ３５のＦｖフラグメントを含む任意の抗体フラグメントもまた、本発明の抗体であり得ることを認識する。さらに、配列番号１０〜１５および２０〜２５に示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する１またはそれ以上のＣＤＲを含む、任意のＦｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、またはＦ（ａｂ’）2フラグメントも本発明の抗体であり得る。
【００７１】
このような抗体分子は、当業者に周知の方法により産生してよい。例えば、モノクローナル抗体は、公知の方法に従ってハイブリドーマを生成することにより産生してよい。このようにして生成されたハイブリドーマを、次に標準的な方法、例えば酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）およびＢｉａｃｏｒｅ分析を用いてスクリーニングし、ＧＤＦ−８と結合し、ＧＤＦ−８シグナル伝達を干渉し、１またはそれ以上のＧＤＦ−８関連活性を中和または阻害する抗体を産生する１またはそれ以上のハイブリドーマを同定する。組換え型ＧＤＦ−８、天然に存在するＧＤＦ−８、その任意の変異体、およびＧＤＦ−８の抗原ペプチド断片を免疫原として用いてよい。ＧＤＦ−８の抗原ペプチド断片は、少なくとも７つの連続アミノ酸残基を含み、該ペプチドに対して作製された抗体がＧＤＦ−８と免疫複合体を形成するようなエピトープを包含する。抗原ペプチドは、好ましくは少なくとも１０個のアミノ酸残基、より好ましくは、少なくとも１５個のアミノ酸残基、さらにより好ましくは、少なくとも２０個のアミノ酸残基、さらに最も好ましくは、少なくとも３０個のアミノ酸残基を含む。さらに、ＧＤＦ−８の抗原ペプチド断片がＧＤＦ−８受容体結合部位を含むことが好ましい。
【００７２】
本発明のポリクローナル血清および抗体は、適した被験体をＧＤＦ−８、その変異体、および／またはその一部分で免疫化することにより作製し得る。免疫化した被験体における抗体力価は、標準的な技法、例えばＥＬＩＳＡにより、または固定化したＧＤＦ−８またはその他のマーカータンパク質（例えば、ＦＬＡＧ）を用いることにより経持的にモニターすることができる。必要であれば、本発明の抗体分子を、被験体または培地から単離し、周知の技法、例えばプロテインＡクロマトグラフィーによりさらに精製して、ＩｇＧ画分を得てもよい。
【００７３】
本発明の特定の実施形態は、ＲＫ３５のＦｖフラグメントのＶＨおよび／またはＶＬドメインを含む。本発明の抗体のフラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｄ、およびｄＡｂフラグメントは、当分野で周知の方法に従って、抗体を切断することにより産生することができる。例えば、免疫学的に活性なＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2フラグメントは、抗体をパパインおよびペプシンなどの酵素で処理することにより生成され得る。
【００７４】
さらなる実施形態は、配列番号１０〜１５および２０〜２５に示される、これらのＶＨおよびＶＬドメインのいずれかの１またはそれ以上のＣＤＲを含む。一実施形態は、配列番号１２に示されるＲＫ３５のＶＨドメインのＨ３フラグメントを含む。
【００７５】
本開示抗体のＶＨおよびＶＬドメインのＤＮＡおよびアミノ酸（ＡＡ）配列、およびＣＤＲを表１に記載されるように列挙する。便宜上、ＶＨおよびＶＬドメインの中の各ＣＤＲのおおよその位置を表２に記載する。
【表１】
0005415071.tif 000002
【表２】
0005415071.tif 000003
【００７６】
抗ＧＤＦ−８抗体は、抗体定常領域またはその部分をさらに含み得る。例えば、本発明のＶＬドメインは、そのＣ末端で抗体軽鎖定常ドメイン、例えば、ヒトＣκまたはＣλ鎖、好ましくは、Ｃλ鎖と結合し得る。同様に、ＶＨドメインに基づく抗原結合フラグメントは、そのＣ末端で任意の抗体アイソタイプ、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＭ、ならびに任意のアイソタイプサブクラス、特にＩｇＧ1およびＩｇＧ4に由来する免疫グロブリン重鎖の全部または一部と結合し得る。例となる実施形態では、抗体は、ヒトＩｇＧ1λの重鎖および軽鎖のＣ末端フラグメントを含む。軽（λ）鎖のＣ末端定常フラグメントに好ましいＤＮＡおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１６および配列番号１７に示される。ＩｇＧ1重鎖のＣ末端定常フラグメントに好ましいＤＮＡおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１８および配列番号１９に示される。遺伝子コードの縮重により、表１に記載されるＤＮＡ配列は、単に関心対象のアミノ酸配列、ペプチド、および抗体をコードする核酸の代表であって、制限するものと解釈されないことは当然理解される。
【００７７】
本発明の特定の実施形態は、ＲＫ３５のＦｖフラグメントのＶＨおよび／またはＶＬドメインを含む。さらなる実施形態は、これらのＶＨおよびＶＬドメインのいずれかの１またはそれ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。一実施形態はＲＫ３５のＶＨドメインのＨ３フラグメントを含む。本発明のＶＨおよびＶＬドメインは、特定の実施形態において、生殖細胞系列化されている(germlined)、すなわち、これらのドメインのフレームワーク領域（ＦＲ）は、ヒト生殖細胞系列遺伝子産物のコンセンサスアミノ酸配列に合わせるように従来の分子生物学技術を用いて変更している。これは、ヒト化または生殖細胞系列化抗体としても知られている。他の実施形態では、フレームワーク配列は生殖細胞系列とは異なったままである。ヒト化抗体は、内因性免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を発現不能であるがヒト重鎖および軽鎖遺伝子を発現する能力のあるトランスジェニックマウスを用いて産生することができる。
【００７８】
Ｃ．改変抗体およびそれらのフラグメント
本発明のさらなる態様は、ＧＤＦ−８に対する抗体抗原結合ドメインを取得する方法を提供する。当業者であれば、本発明の抗体が、表１に記載されるＶＨおよびＶＬの特定の配列に限定されるのではなく、抗原結合能を保持するこれらの配列の変異体も含むことを理解する。このような変異体は、当分野で公知の技術を用いて、与えられた配列から得ることができる。アミノ酸置換、欠失、または付加は、ＦＲ中でなされても、ＣＤＲ中でなされてもよい。フレームワーク領域中の変化が、通常、抗体の安定性を向上させ、抗体の免疫原性を低下させるようにデザインされるのに対して、ＣＤＲ中の変化は、通常、その標的に対する抗体の親和性を高めるようにデザインされる。このような親和性を向上させる変化は、一般にＣＤＲを改変し、抗体を試験することにより、経験的に決定される。このような改変は、例えば、Antibody Engineering, 2nd. ed., Borrebaeck, ed., Oxford University Press, 1995に記載の方法に従ってなされ得る。
【００７９】
したがって、本発明の抗体には、ＧＤＦ−８と結合し、ＧＤＦ−８シグナル伝達を干渉し、重鎖および軽鎖の定常領域に変異を有する抗体も含まれる。定常領域の特定の断片に変異導入し不活性化させることも時には望ましい。例えば、重鎖定常領域における変異は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）および／または補体との結合の低下した抗体を産生するために時には望ましい。このような変異は当分野で周知である。また、当業者であれば、ＣＬおよびＣＨサブユニットのどの活性フラグメントが必要であるかの決定が、本発明の抗体の適用される用途に応じて異なることを理解する。例えば、それらの相互の共有結合に関与するＣＬおよびＣＨサブユニットの活性フラグメントは、インタクト抗体の生成において重要である。
【００８０】
本明細書に提示されるＶＨドメインのアミノ酸配列変異体であるＶＨドメインを作製する方法は、本開示のＶＨドメインのアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸を付加、欠失、置換または挿入する段階、所望により、このようにして得られたＶＨドメインと１またはそれ以上のＶＬドメインを組み合わせる段階、およびＶＨドメインまたはＶＨ／ＶＬの１もしくは複数の組合せをＧＤＦ−８との結合について試験する段階、および（好ましくは）このような抗原結合ドメインの、１またはそれ以上のＧＤＦ−８関連活性を調節する能力を試験する段階を含む。ＶＬドメインは、実質的に本明細書に提示されるようなアミノ酸配列を有し得る。本明細書に開示されるＶＬドメインの１またはそれ以上の配列変異体を１またはそれ以上のＶＨドメインと組み合わせる、類似の方法を用いてよい。
【００８１】
本発明のさらなる態様は、ＧＤＦ−８と相互作用する抗原結合フラグメントを調製する方法を提供する。その方法は、
（ａ）置換されるＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ３）を含むＶＨドメインか、またはＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ３）コード領域を欠くＶＨドメインをコードする核酸の出発レパートリーを準備する段階；
（ｂ）レパートリーと、配列番号２または６の活性フラグメントを含むドナーＣＤＲをコードするドナー核酸、例えば、配列番号３または７に示されるアミノ酸配列をコードするドナー核酸とを、ＶＨドメインをコードする核酸の生成物レパートリーを得るために、ドナー核酸をレパートリーのＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ３）領域に挿入するように組み合わせる段階；
（ｃ）生成物レパートリーの核酸を発現させる段階；
（ｄ）ＧＤＦ−８と相互作用する抗原結合フラグメントを選択する段階；および
（ｅ）選択された抗原結合フラグメントまたはそれをコードする核酸を回収する段階
を含む。
【００８２】
さらに、本発明のＶＬ  ＣＤＲ（例えば、Ｌ３）を、置換されるＣＤＲを含むか、またはＣＤＲコード領域を欠くかのいずれかのＶＬドメインをコードする核酸のレパートリーと組み合わせる、類似の方法を用いることができる。
【００８３】
本発明のＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ３）のコード配列は、組換えＤＮＡ技術を用いて、ＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ３）を欠く可変ドメインのレパートリーに導入することができる。例えば、Ｍａｒｋｓら(1992) Bio/Technology 10:779-83、は、抗体可変ドメインのレパートリーを作成する方法を記載し、その方法においては、可変ドメイン領域の５’末端に指向する（direct）か、または近接するコンセンサスプライマーを、ヒトＶＨ遺伝子の第３フレームワーク領域に対するコンセンサスプライマーとともに用いて、ＣＤＲ３を欠くＶＨ可変ドメインのレパートリーがもたらされる。このレパートリーは、特定の抗体のＣＤＲ３と組み合わせてよい。類似の技術を用いて、本発明のＣＤＲ３由来配列をＣＤＲ３を欠くＶＨまたはＶＬドメインのレパートリーとシャッフルし、シャッフルされた完全なＶＨまたはＶＬドメインを同族のＶＬまたはＶＨドメインと組み合わせて本発明の抗原結合フラグメントを得てもよい。次に、適した抗原結合フラグメントを選択することができるように、例えば、ＷＯ９２／０１０４７号のファージディスプレイ系などの適した宿主系においてレパートリーを提示することができる。
【００８４】
類似のシャッフル技術またはコンビナトリアル技術も、Stemmer (1994) Nature 370:389-91に開示されている。それにはβ−ラクタマーゼ遺伝子に関連した技術が説明されているが、そのアプローチは抗体の生成のために用いられ得ることが考察されている。
【００８５】
さらなる代替法は、全可変ドメインの中で変異を生じるために、１またはそれ以上の選択されたＶＨおよび／またはＶＬ遺伝子のランダム変異誘発を用いて、本発明のＣＤＲ由来配列を有する新規なＶＨまたはＶＬ領域を生成することである。そのような技術は、エラープローンＰＣＲを用いるGram et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:3576-80に記載されている。
【００８６】
新規な抗体またはそのフラグメントを生成するために用いられ得る別の方法は、ＶＨまたはＶＬ遺伝子のＣＤＲに対して変異誘発を導くことである。そのような技術は、 Barbas et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:3809-13 およびSchier et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:551-67に開示されている。
【００８７】
同様に、１、２、または３つすべてのＣＤＲを、ＶＨまたはＶＬドメインのレパートリーにグラフトすることができ、次にそれらのドメインをＧＤＦ−８に対する結合パートナーまたは結合フラグメントについてスクリーニングする。
【００８８】
免疫グロブリン可変ドメインの実質的な部分は、少なくともＣＤＲと、所望により、本明細書に提示される抗体フラグメントに由来の、それらの間に介在するフレームワーク領域を含む。この部分はまた、少なくとも約５０％の、ＦＲ１およびＦＲ４のいずれかまたは両方を含み、この５０％はＦＲ１のＣ末端５０％とＦＲ４のＮ末端５０％である。可変ドメインの実質的部分のＮ末端またはＣ末端のさらなる残基は、天然に存在する可変ドメイン領域と通常会合しない残基であってよい。例えば、組換えＤＮＡ技術により作製された本発明の抗体フラグメントの構築の結果、導入されたリンカーにコードされるＮまたはＣ末端残基が導入されてクローニングまたはその他の操作段階が促進され得る。その他の操作段階としては、免疫グロブリン重鎖、その他の可変ドメイン（例えば、ダイアボディ産生時）または下記において詳細に考察されるタンパク質標識を含む、さらなるタンパク質配列と、本発明の可変ドメインを結合するためのリンカーの導入が挙げられる。
【００８９】
実施例に例証される実施形態はＶＨおよびＶＬドメインの「マッチング」対を含むが、本発明は、単一の可変ドメインを含有する結合フラグメント、例えば、ＶＨまたはＶＬドメイン配列のいずれか、特にＶＨドメインに由来するｄＡｂフラグメントも包含する。いずれかの一本鎖結合ドメインの場合、これらのドメインを用いて、ＧＤＦ−８と結合可能な２ドメインの抗原結合ドメインを形成可能な相補的ドメインについてスクリーニングすることができる。これは、例えば、ＷＯ９２／０１０４７号に開示されるようないわゆる階層的二重コンビナトリアルアプローチを用いるファージディスプレイスクリーニング法により達成され得る。この技術では、Ｈ鎖クローンまたはＬ鎖クローンのいずれかを含有する個々のコロニーを用いてその他の鎖（ＬまたはＨ）をコードするクローンの完全なライブラリーを感染させ、得られる２本鎖抗原結合ドメインを、その参照文献中に記載されるものなどのファージディスプレイ技術に従って選択する。この技術はまた、Ｍａｒｋｓら（前掲）にも開示されている。
【００９０】
抗体は、化学的方法により、放射性核種、薬剤、高分子、またはその他の物質と複合体化することができ、本発明の１またはそれ以上のＣＤＲを含む融合タンパク質として作製され得る。
【００９１】
抗体融合タンパク質は、これらの鎖（通常ＶＨ）のうちの１つおよび別のタンパク質が単一のポリペプチド鎖として合成されるＶＨ−ＶＬ対を含む。これらの種類の生成物は、それらが一般にさらなる機能的要素−小分子の活性部分、または複合体化または融合した高分子の基本的な分子構造上の特徴−を有するという点で抗体とは異なる。
【００９２】
上に概説したアミノ酸配列の変化に加えて、抗体をグリコシル化、ペグ化、またはアルブミンもしくは非タンパク性ポリマーと結合させることができる。例えば、抗ＧＤＦ−８抗体を、様々な非タンパク性ポリマーのうちの１つ、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレン類と結合させてよい。抗体は、例えば、それらの循環半減期を増加させるために、ポリマーとの共有結合的な複合体化によって化学的に修飾され得る。例となるポリマー、およびそれらをペプチドと結合させる方法は当分野で公知である。
【００９３】
他の実施形態では、抗体は修飾されて、改変されたグリコシル化パターン（すなわち、元のまたは天然のグリコシル化パターンと比較して）を有し得る。本明細書において、「改変された」とは、１またはそれ以上の炭水化物部分が欠失されていること、および／あるいは、１またはそれ以上のグリコシル化部位が元の抗体に付加されていることを意味する。抗ＧＤＦ−８抗体へのグリコシル化部位の付加は、グリコシル化部位コンセンサス配列を含むようアミノ酸配列を改変する周知の方法により達成される。抗体上の炭水化物部分の数を増加させる別の方法は、抗体のアミノ酸残基とのグリコシドの化学的または酵素によるカップリングによるものである。抗体に存在する任意の炭水化物部分の除去は、当分野で公知のように、化学的または酵素的に達成され得る。
【００９４】
本発明の抗体はまた、131Ｉまたは99Ｔｃなどの検出可能なまたは機能的標識でタグをつけることができ、その標識は当分野で公知の従来の化学を用いて本発明の抗体に付けることができる。標識には、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼなどの酵素標識も含まれる。標識は、特異的な同族検出可能部分、例えば、標識アビジンとの結合によって検出され得るビオチンなどの化学的部分をさらに含む。
【００９５】
ＣＤＲ配列が表１に記載されるものと非実質的にのみ異なる抗体は、本発明の範囲内に包含される。非実質的相違には、少数のアミノ酸変化、例えば、ＣＤＲの配列中の任意の５アミノ酸のうち１または２の置換が含まれる。一般に、アミノ酸は、類似の電荷、疎水性、または立体化学的特徴を有する近縁アミノ酸で置換される。このような置換は、当業者の技術の範囲内である。構造フレームワーク領域（ＦＲ）は、抗体の結合特性に悪影響を及ぼすことなくＣＤＲよりもさらに実質的に修飾することができる。ＦＲに対する変更としては、限定されるものではないが、非ヒト由来フレームワークのヒト化、または抗原接触または結合部位の安定化に重要な特定のフレームワーク残基の操作、例えば、定常領域のクラスまたはサブクラスの変更、Ｆｃ受容体結合などのエフェクター機能を変え得る特定のアミノ酸残基の変更（例えば、Lund et al. (1991) J. Immunol. 147:2657-62; Morgan et al. (1995) Immunology 86:319-24）、あるいは定常領域の由来する種の変更が挙げられる。抗体は、重鎖のＣＨ２領域にエフェクター機能（例えば、Ｆｃ受容体結合および補体活性化）を低下または改変する変異を有し得る。例えば、抗体は、米国特許第５,６２４,８２１号および同第５,６４８,２６０号に記載されるものなどの変異を有し得る。例えば、ＩｇＧ1またはＩｇＧ2重鎖では、このような変異は、ＩｇＧ1のＦｃ部分を表す配列番号１９のアミノ酸残基１１７および１２０で起こり得る（これらの残基はＩｇＧ1またはＩｇＧ2の全長配列のアミノ酸２３４および２３７に相当する）。抗体はまた、例えば、Angal et al. (1993) Mol. Immunol. 30:105-08に開示されるＩｇＧ4のヒンジ領域中の変異などの、免疫グロブリンの２本の重鎖間のジスルフィド結合を安定化させる変異を有し得る。
【００９６】
本発明のポリペプチドおよび抗体はまた、開示されるポリペプチドおよび抗体とは構造的に異なる、例えば、改変された配列を有するが、開示されるポリペプチドおよび抗体と実質的に同じ生化学特性を有する、例えば、機能上非必須のアミノ酸のみを変更するタンパク質を包含する。このような分子には、天然に存在する対立遺伝子変異体、および改変、置換(substitutions)、置換(replacements)、挿入、または欠失を含有する意図的に操作された変異体が含まれる。このような改変、置換(substitutions)、置換(replacements)、挿入、または欠失のための技術は当業者に周知である。
【００９７】
本発明の抗体は、さらに、動物の内因性抗体よりもむしろ完全なヒト抗体を作製するように改変されたトランスジェニック非ヒト動物を用いて、抗原への暴露に応答して産生され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９４/０２６０２号を参照のこと。非ヒト宿主において免疫グロブリン重鎖および軽鎖をコードする内因性遺伝子は無能力化しておき、ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖をコードする活性のある遺伝子座を宿主のゲノムに挿入する。ヒト遺伝子は、例えば、必須のヒトＤＮＡセグメントを含有する酵母人工染色体を用いて組み込まれる。次に、改変の完全な補完よりも少数を含む中間トランスジェニック動物を異種交配することによって、所望の改変すべてを備える動物を後代として得る。そのような非ヒト動物の一実施形態はマウスであり、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／３３７３５号およびＷＯ９６／３４０９６号に開示されるようにゼノマウス（ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ）（商標）と名付けられている。この動物は、完全なヒト免疫グロブリンを分泌するＢ細胞を産生する。抗体は、関心対象の免疫原で免疫化後の動物から、例えば、ポリクローナル抗体の調製物として、またあるいはその動物由来の不死化Ｂ細胞、例えばモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから、直接得ることができる。さらに、ヒト可変領域をもつ免疫グロブリンをコードする遺伝子を回収し発現させて直接抗体を得るか、またはさらに修飾して抗体の類似体、例えば、一本鎖Ｆｖ分子などを得ることができる。
【００９８】
したがって、本明細書において抗体という用語には、インタクト抗体、抗体のフラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｄ、ｄＡｂ、およびｓｃＦｖフラグメント、ならびに、その定常および／または可変領域のいずれかで変異導入されたインタクト抗体およびフラグメント（例えば、キメラ抗体、一部分ヒト化抗体、または完全なヒト化抗体を産生するため、ならびに所望の形質、例えば、強化されたＧＤＦ−８結合および／または低下したＦｃＲ結合をもつ抗体を産生するためのの変異）が含まれる。そのようなものとして、抗体がＧＤＦ−８特異的に結合し、ＧＤＦ−８シグナル伝達を干渉し、および／または１またはそれ以上のＧＤＦ−８関連活性を中和または阻害するならば、これらの抗体は本発明の範囲に含まれる。
【００９９】
その他のタンパク質結合分子もＧＤＦ−８の活性を調節するために用いることができる。このようなタンパク質結合分子には、小型モジュール免疫医薬品(small modular immunopharmaceutical)（ＳＭＩＰ（商標））の薬物（Ｔｒｕｂｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）が挙げられる。ＳＭＩＰは、抗原、対抗受容体または同種類のもの、システイン残基を１個有するかまたは有さないヒンジ領域ポリペプチド、および免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３ドメインなどの同族の構造に対する結合ドメインからなる一本鎖ポリペプチドである（ HYPERLINK "http://www.trubion.com" www.trubion.comも参照）。ＳＭＩＰおよびそれらの用途および適用は、例えば、米国特許出願公開第２００３／０１１８５９２号、同第同第２００３／０１３３９３９号、同第２００４／００５８４４５号、同第２００５／０１３６０４９号、同第２００５／０１７５６１４号、同第２００５／０１８０９７０号、同第２００５／０１８６２１６号、同第２００５／０２０２０１２号、同第２００５／０２０２０２３号、同第２００５／０２０２０２８号、同第２００５／０２０２５３４号、および同第２００５／０２３８６４６号、ならびにその関連パテントファミリーメンバーに開示され、その全ては本明細書においてその全文が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１００】
本発明の抗体の結合能は、以下の方法：Ｂｉａｃｏｒｅ分析、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、Ｘ線結晶学、下記実施例の配列解析および走査変異誘発、および当分野で周知のその他の方法で測定することができる。本発明の抗体が１またはそれ以上のＧＤＦ−８関連活性を中和および／または阻害する能力は、以下の限定されない方法リスト：ＧＤＦ−８依存性細胞株の増殖を測定するためのアッセイ；ＧＤＦ−８に媒介されるポリペプチドの発現を測定するためのアッセイ；下流シグナル制御分子の活性を測定するためのアッセイ；関連動物モデルにおいて筋障害を予防するための本発明の抗体の効果を試験するアッセイ；下の実施例に記載されるアッセイ；およびその他の当分野で周知のアッセイによって測定され得る。
【０１０１】
本発明のさらなる態様は、ＧＤＦ−８と結合可能な抗体を選択し、１またはそれ以上のＧＤＦ−８関連活性を中和および／または阻害する方法を提供する。この方法は、
ａ）複数の抗体とＧＤＦ−８を接触させること；
ｂ）ＧＤＦ−８と結合する抗体を選択すること；
ｃ）選択された抗体が、ＧＤＦ−８がＧＤＦ−８受容体と結合するのを防ぐ能力を試験すること；および
ｄ）ＧＤＦ−８がその受容体と結合するのを防ぐことのできる抗体を選択することを含む。
【０１０２】
本発明の抗ＧＤＦ−８抗体はまた、上清中、細胞溶解物中、または細胞表面上のＧＤＦ−８を単離、精製および／または検出するために有用である。本発明において開示される抗体は、診断的に用いてＧＤＦ−８タンパク質レベルを臨床試験手順の一部としてモニターすることができる。さらに、本発明の抗体は、１またはそれ以上のＧＤＦ−８関連活性の中和および／または阻害を必要とする処置、例えば、ＡＬＳおよびその他の筋肉関連の病態の処置に用いることができる。本発明はまた、ヒトＧＤＦ−８に対して作られた新規な抗体に関連する、単離および精製された新規なポリヌクレオチドおよびポリペプチドを提供する。本発明の遺伝子、ポリヌクレオチド、タンパク質、およびポリペプチドとしては、限定されるものではないが、ＧＤＦ−８に対するマウスおよびヒト化抗体（例えば、ＲＫ３５）およびその変異体が挙げられる。
【０１０３】
Ｄ．核酸、クローニング、および発現系
本発明は、さらに、本発明の抗体をコードする単離および精製された核酸を提供する。本発明に従う核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含んでよく、完全にまたは部分的に合成されていてよい。本明細書に提示される核酸配列への言及は、指定された配列またはゲノム同等物を含むＤＮＡ分子、ならびに、前後関係で別に求められなければＵがＴに置換される、指定された配列を含むＲＮＡ分子を包含する。
【０１０４】
例えば、本発明は、１またはそれ以上のＧＤＦ−８関連活性を調節する（例えば、ＧＤＦ−８生物活性を中和する）ＧＤＦ−８に対するマウス抗体（ＲＫ３５）、およびＲＫ３５のヒト化版の可変領域をコードする精製および単離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明の好ましいＤＮＡ配列には、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、および化学的に合成されたＤＮＡ配列が含まれる。
【０１０５】
本発明の核酸配列には、配列番号４に示されるマウスＲＫ３５の軽鎖可変領域をコードする配列が含まれ、それには、軽鎖可変領域配列に先行するリーダー配列をコードする核酸、例えば、配列番号３０に示される核酸配列が含まれる（ヌクレオチド１〜６０がリーダー配列に相当し、ヌクレオチド６１〜３８１が配列番号４に相当する）。本発明の核酸配列には、配列番号２に示されるＲＫ３５の重鎖可変領域をコードする配列も含まれ、それには、重鎖可変領域に先行するリーダー配列をコードする核酸、例えば、配列番号２８に示される核酸配列が含まれる（ヌクレオチド１〜５７がリーダー配列に相当し、ヌクレオチド５８〜４０５が配列番号２に相当する）。本発明の核酸配列には重鎖および軽鎖可変領域のヒト化配列、例えば、それぞれ配列番号６および８に示されるものなども含まれる。本発明のポリヌクレオチドはまた、ストリンジェント条件下で配列番号２、４、６、および８に示される核酸配列、ならびにその補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドを含み、かつ／または可変領域において実質的な生物活性（すなわち、活性フラグメント）を保持するポリペプチドをコードする。本発明のポリヌクレオチドはまた、少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む、配列番号２、４、６、および８に示される配列の連続する部分を含む。
【０１０６】
マウスＲＫ３５の可変軽鎖のアミノ酸配列は配列番号５に示される。リーダー配列に先行されるマウスＲＫ３５の可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列の例は配列番号３１として示される。マウスＲＫ３５の可変重鎖のアミノ酸配列は配列番号３として示される。リーダー配列に先行されるマウスＲＫ３５の可変重鎖ドメインのアミノ酸配列の例は、配列番号２９として示される。ヒト化可変重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号７および９に提示される。マウスＲＫ３５の重鎖の中に含まれるＣＤＲのアミノ酸配列は、配列番号１０〜１２および２０〜２２に示される。マウスＲＫ３５の軽鎖の中に含まれるＣＤＲのアミノ酸配列は、配列番号１３〜１５および２３〜２５に示される。本発明のポリペプチドはまた、少なくとも５連続アミノ酸を含む、配列番号３、５、７、９、１０〜１５、および２０〜２５に実質的に示される配列の任意の連続する部分を含む。本発明の好ましいポリペプチドは、本発明の抗体の実質的な生物活性を保持する、配列番号３、５、７、９、および１０〜１５に実質的に示される任意の配列の任意の連続する部分を含む。上記のそれらのポリヌクレオチドに加えて、本発明はまた、配列番号３、５、７、９、および１０〜１５またはその連続する部分に実質的に示され、上記のポリヌクレオチドとは周知の遺伝子コードの縮重によってのみ異なる、アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１０７】
本発明の単離ポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションプローブおよびプライマーとして用いて、本開示のポリヌクレオチドをコードする配列と同一または類似の配列を有する核酸を同定および単離することができる。この方法で単離されたポリヌクレオチドは、例えば、ＧＤＦ−８に対する抗体またはその他のＴＧＦ−βファミリーメンバーを産生するため、あるいはこのような抗体を発現している細胞を同定するために用いられ得る。核酸を同定および単離するためのハイブリダイゼーション法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、サザンハイブリダイゼーション、インサイチューハイブリダイゼーションおよびノーザンハイブリダイゼーションが挙げられ、当業者に周知である。
【０１０８】
ハイブリダイゼーション反応は、異なるストリンジェンシー条件下で行ってよい。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーには、任意の２つの核酸分子が互いにハイブリダイズする困難さが含まれる。好ましくは、各ハイブリダイズするポリヌクレオチドは、低ストリンジェンシー条件、より好ましくは、ストリンジェント条件、さらに最も好ましくは、高度にストリンジェントな条件下でその対応するポリヌクレオチドとハイブリダイズする。ストリンジェンシー条件の例を下の表３に示す。高度にストリンジェントな条件は、少なくとも、例えば、条件Ａ〜Ｆ程度にストリンジェントな条件である；ストリンジェント条件は、少なくとも、例えば、条件Ｇ〜Ｌ程度にストリンジェントである；さらに低ストリンジェンシー条件は、少なくとも、例えば、条件Ｍ〜Ｒ程度にストリンジェントである。
【表３】
0005415071.tif 000004
1ハイブリッド長は、ハイブリダイズするポリヌクレオチドのハイブリダイズされる領域（１または複数領域）に対して予想される長さである。ポリヌクレオチドと未知配列の標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズする場合、ハイブリッド長はハイブリダイズするポリヌクレオチドの長さと仮定される。公知配列のポリヌクレオチドをハイブリダイズする場合、ハイブリッド長は、ポリヌクレオチド配列をアラインし、最適な配列相補性をもつ１または複数の領域を同定することにより決定される。
2ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０.１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、および１.２５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７.４である）は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄緩衝液中のＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０.１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）に対して置換され得る；洗浄は、ハイブリダイゼーションが完了した後１５分間行われる。ＴB*〜ＴR*：長さ５０塩基対未満であると予想されるハイブリッドのためのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔm）よりも５〜１０℃低くあるべきであり、その場合、Ｔmは以下の方程式に従って決定される。長さ１８塩基対未満のハイブリッドに関して、Ｔm（℃）＝２（Ａ＋Ｔの塩基数）＋４（Ｇ＋Ｃの塩基数）。長さ１８〜４９塩基対のハイブリッドに関して、Ｔm（℃）＝８１.５＋１６.６（ｌｏｇ10Ｎａ+）＋０.４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）、式中、Ｎはハイブリッド中の塩基の数であり、Ｎａ+はハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である（１×ＳＳＣのＮａ+＝０.１６５ Ｍ）。
ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションのためのストリンジェンシー条件のさらなる例は、参照により本明細書に援用される、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Chs. 9 & 11, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)、およびAusubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Sects. 2.10 & 6.3-6.4, John Wiley & Sons, Inc. (1995)に記載されている。
【０１０９】
本発明の単離ポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションプローブおよびプライマーとして用いて、本開示のポリヌクレオチドの対立遺伝子変異体をコードする配列を有するＤＮＡを同定および単離してよい。対立遺伝子変異体は、本開示のポリヌクレオチドの天然に存在する代替形態であり、本開示のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと同一であるかまたは有意な類似性を有するポリペプチドをコードする。好ましくは、対立遺伝子変異体は、本開示のポリヌクレオチドと少なくとも９０％の配列同一性（より好ましくは、少なくとも９５％の同一性；最も好ましくは、少なくとも９９％の同一性）を有する。
【０１１０】
また、本発明の単離ポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションプローブおよびプライマーとして用いて、本開示のポリヌクレオチドと相同なポリペプチドをコードする配列を有するＤＮＡを同定および単離してよい。これらの相同体は、本開示のポリペプチドおよびポリヌクレオチドの種とは異なる種から、または同じ種の中から単離された、本開示のポリヌクレオチドおよびポリペプチドと有意な配列類似性をもつ、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドである。ポリヌクレオチド相同体は、本開示のポリヌクレオチドと少なくとも５０％の配列同一性（より好ましくは、少なくとも７５％の同一性；最も好ましくは、少なくとも９０％の同一性）を有することが好ましく、それに対してポリペプチド相同体は、開示される抗体／ポリペプチドと少なくとも３０％の配列同一性（より好ましくは、少なくとも４５％の同一性；最も好ましくは、少なくとも６０％の同一性）を有することが好ましい。本開示のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの相同体は、哺乳類種から単離されたものが好ましい。
【０１１１】
また、本発明の単離ポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションプローブおよびプライマーとして用いて、本発明の抗体を発現する細胞および組織、ならびにそれらが発現される条件を同定してよい。
【０１１２】
さらに、本発明の単離ポリヌクレオチドを用いて、細胞または生物において本発明のポリヌクレオチドに対応する遺伝子の発現を改変（すなわち、増強、減少、または修飾）してよい。これらの「対応する遺伝子」は、転写されて本発明のポリヌクレオチドの由来するｍＲＮＡを作成する、本発明のゲノムＤＮＡ配列である。
【０１１３】
本発明はまた、少なくとも１つの上記の本発明の核酸を含む、プラスミド、ベクター、転写または発現カセットの形態の構築物を提供する。
【０１１４】
本発明の単離ポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの組換え産生のための発現制御配列と作動可能なように連結されていてよい。さらに、当業者であれば、本発明のポリヌクレオチドが、様々な抗体アイソタイプの定常領域をコードする周知の核酸配列と作動可能なように連結され得ることを認識する。例えば、本発明の軽鎖可変領域（１または複数）をコードする本発明のポリヌクレオチド（例えば、配列番号４または８に示される配列）は、κ軽鎖またはλ軽鎖のいずれかの定常領域（またはその誘導体）をコードする核酸配列と作動可能なように（連結されたヌクレオチドが発現すると、ＧＤＦ−８と特異的に連結し、中和する可変領域を含む完全なκまたはλ軽鎖がもたらされるように）連結されている。同様に、本発明の重鎖可変領域をコードする本発明のポリヌクレオチド（例えば、配列番号２または６に示される配列）は、重鎖アイソタイプ（またはその誘導体）の定常領域をコードする核酸配列、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＡなどと作動可能なように連結され得る。組換え型タンパク質を発現する一般的な方法は当分野で周知である。このような組換え型タンパク質は、ＧＤＦ−８活性に関連する障害、例えば、筋肉変性疾患および骨変性疾患の処置に用いるための可溶形態で発現され得る。
【０１１５】
本発明の組換え発現ベクターは、さらなる配列、例えば宿主細胞においてベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）、ヒスチジンなどのタグ配列、および選択マーカー遺伝子を有してよい。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を促進する。例えば、一般に、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞で薬剤に対する耐性を付与する（Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなど）。好ましい選択マーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅ｄｈｆｒ-宿主細胞で用いるため）およびneo遺伝子（Ｇ４１８選択のため）が挙げられる。
【０１１６】
プロモーター配列、転写終結配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および必要に応じたその他の配列をはじめとする、適切な調節配列を含有する適したベクターは、選択されたものであっても構築されたものであってもよい。ベクターは、プラスミドであっても、ウイルス性、例えば、必要に応じてファージ、またはファージミドであってもよい。さらなる詳細は、例えば、Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd ed., Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989を参照のこと。例えば、核酸構築物の調製、変異誘発、配列決定、ＤＮＡの細胞への導入および遺伝子発現、ならびにタンパク質の分析における、核酸の操作のための多くの公知技術およびプロトコールは、Current Protocols in Molecular Biology, 2nd ed., Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992に詳細に記載されている。
【０１１７】
本発明はまた、上記のように１またはそれ以上の構築物を含む宿主細胞を提供する。本明細書に規定されるＣＤＲ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２、もしくはＬ３）、ＶＨもしくはＶＬドメイン、または抗原結合フラグメントをコードする核酸は、本発明の一態様を成す。
【０１１８】
本発明はまた、宿主細胞においてコード核酸からタンパク質を発現させることによりペプチドを生成する方法を含む。発現は、適切な条件下で、核酸を含有する組換え宿主細胞を培養することにより達成され得る。
【０１１９】
本発明に従う特異的抗体フラグメント、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン、ならびにコード核酸分子およびベクターは、例えば、それらの自然環境から、実質的に純粋または同種の形態で単離および精製されて提供されるか、あるいは、核酸の場合、必要な機能をもつポリペプチドをコードする配列以外の起源の核酸または遺伝子を含まないか、または実質的に含まずに提供され得る。
【０１２０】
多数の細胞株が、本発明のポリペプチドおよび抗体の組換え発現に適した宿主細胞である。哺乳類の宿主細胞株には、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、２９３Ｔ細胞、Ａ４３１細胞、３Ｔ３細胞、ＣＶ−１細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｌ細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＨＬ−６０細胞、Ｕ９３７細胞、ＨａＫ細胞、ジャーカット細胞、ならびに一次組織のインビトロ培養に由来する細胞株および一次外植片が含まれる。また、このような宿主細胞は、ゲノムＤＮＡからなる本発明のポリヌクレオチドのスプライシングを可能にする。
【０１２１】
あるいは、酵母などの下等真核生物または原核生物において本発明のポリペプチドおよび抗体を組換えによって産生することも可能であり得る。適する可能性のある酵母株としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）株、およびカンジダ（Candida）株が挙げられる。適する可能性のある細菌株としては、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、およびネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）が挙げられる。本発明のポリペプチドが酵母または細菌において作成される場合、機能タンパク質を得るために、例えば、適切な部位のリン酸化またはグリコシル化によりそれらを修飾することが必要であり得る。このような共有結合は、周知の化学的または酵素的手法を用いて達成してよい。
【０１２２】
本発明のポリペプチドおよび抗体はまた、１またはそれ以上の昆虫発現ベクター（バキュロウイルスベクターなど）において本発明の単離ポリヌクレオチドと適した対照配列を作動可能なように結合させ、昆虫細胞発現系を用いることにより、組換え技術によって作成することができる。バキュロウイルス／Ｓｆ９発現系のための材料および方法は、キットの形態で市販されている（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ製、ＭＡＸＢＡＣ（登録商標）キット）。
【０１２３】
適切な宿主細胞における組換え発現の後、本発明のポリペプチドおよび抗体は、公知の精製工程、例えばゲルろ過およびイオン交換クロマトグラフィーを用いて培地または細胞抽出物から精製してよい。精製には、本発明のポリペプチドおよび抗体と結合することが分かっている薬剤を用いるアフィニティークロマトグラフィーも含まれる。これらの精製工程を用いて自然源からの本発明のポリペプチドおよび抗体を精製してもよい。
【０１２４】
あるいは、本発明のポリペプチドおよび抗体は、組換えによって精製を促進する形態に発現されてよい。例えば、ポリペプチドは、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、またはチオレドキシン（ＴＲＸ）などのタンパク質との融合体として発現し得る。このような融合タンパク質の発現および精製のためのキットは、それぞれ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から市販されている。本発明のポリペプチドおよび抗体はまた、小型のエピトープでタグを付け、その後、エピトープに対する特異的抗体を用いて同定または精製することもできる。好ましいエピトープは、ＦＬＡＧエピトープであり、Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ（Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）社から市販されている。
【０１２５】
本発明のポリペプチドおよび抗体はまた、公知の従来の化学合成によって作製され得る。本発明のポリペプチドおよび抗体を化学的に合成する方法は当業者に周知である。このような化学合成ポリペプチドおよび抗体は、精製された天然ポリペプチドおよび抗体と共通する生物学的特性を有してよく、したがって、天然ポリペプチドおよび抗体の生物学的活性代替物または免疫学的代替物として用いることができる。
【０１２６】
本発明のさらなる態様は、本明細書に開示される、核酸、ポリペプチド、ベクター、または抗体、およびそのフラグメントを含む宿主細胞を提供する。一層さらなる態様は、本発明の核酸を宿主細胞に導入する段階を含む方法を提供する。導入には任意の利用可能な技術を用いてよい。真核細胞に適した技術としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム介在トランスフェクション、およびレトロウイルスまたは別のウイルス（例えば、ワクシニアまたは、昆虫細胞には、バキュロウイルス）を用いる形質導入が挙げられる。細菌細胞に適した技術としては、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーションおよびバクテリオファージを用いる感染が挙げられる。
【０１２７】
核酸の導入を受けて、例えば、遺伝子発現に適した条件下で宿主細胞を培養することにより、核酸からのタンパク質産生が引き起こされるか、または可能となり得る。このような条件は当分野で周知である。
【０１２８】
ＩＩＩ．骨、脂肪、グルコース代謝、インスリンおよび筋肉の障害の進行を処置、寛解、予防、および阻害する方法
ＧＤＦ−８がＡＬＳに関与していること、および本発明の新規な抗体が見出されたことにより、ＧＤＦ−８関連障害、例えば、筋障害、神経筋障害、骨変性疾患、代謝性または誘発性骨疾患、グルコース代謝障害、脂肪疾患、およびインスリン関連障害を処置、緩和、および寛解する方法が可能になる。その上、抗体は、生物学的サンプルにおいてＧＤＦ−８のレベルを測定することにより、骨、筋肉、脂肪またはインスリンの障害の進行を診断、予知およびモニターすることを可能にする。特に、本発明の抗体は、ＡＬＳまたはその他の筋障害をもつ個体を処置するために用いるか、または患者がＡＬＳまたは別の筋障害を患っているかどうかを識別する方法に用いることができる。
【０１２９】
本発明の抗体およびその他の分子は、ヒトまたは動物における様々な医学的障害を予防、診断、または処置するために有用である。抗体を用いてＧＤＦ−８に関連する１またはそれ以上の活性を阻害または低減することができる。最も好ましくは、抗体は、非結合ＧＤＦ−８活性と比較して、１またはそれ以上のＧＤＦ−８の活性を阻害または低減する。特定の実施形態では、１またはそれ以上の抗ＧＤＦ−８抗体と結合した場合のＧＤＦ−８の活性は、１またはそれ以上の抗ＧＤＦ−８抗体と結合していない成熟ＧＤＦ−８タンパク質と比較して、少なくとも５０％、好ましくは、少なくとも６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７２、７６、７８、８０、８２、８４、８６、または８８％、より好ましくは、少なくとも９０、９１、９２、９３、または９４％、さらにより好ましくは、少なくとも９５％〜１００％阻害される。ＧＤＦ−８活性の阻害または中和は、例えば、Ｔｈｉｅｓら、前掲、に記載されるｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）12レポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）および実施例に例示されるＡｃｔＲＩＩＢ受容体アッセイにおいて測定することができる。
【０１３０】
ＧＤＦ−８抗体により診断、予知、モニター、処置、寛解または予防される医学的障害は、ＧＤＦ−８関連障害、例えば、筋肉障害または神経筋障害であり、それには、例えば、筋ジストロフィー（ＭＤ；デュシェンヌ型筋ジストロフィーを含む）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、筋萎縮、器官萎縮、虚弱、手根管症候群、うっ血性閉塞性肺疾患、サルコペニア、悪液質、およびその他の筋肉消耗症候群（例えば、その他の疾患および状態に起因）が含まれる。その上、ＧＤＦ−８抗体により診断、予知、モニター、処置、寛解または予防され得るその他の医学的障害は、脂肪組織障害、例えば肥満症、２型糖尿病、耐糖能異常、メタボリック症候群（例えば、シンドロームＸ）、外傷性傷害（熱傷または窒素不均衡など）により誘発されるインスリン抵抗性、または骨変性性疾患（例えば、骨関節炎、骨粗鬆症、その他）などである。好ましい実施形態では、ＧＤＦ−８抗体により診断、予知、モニター、処置、寛解または予防される障害は、筋肉障害または神経筋障害である。より好ましい実施形態では、抗ＧＤＦ−８抗体により診断、予知、モニター、処置、寛解または予防される筋肉または神経筋障害は、ＭＤまたはＡＬＳのいずれかである。本発明の最も好ましい実施形態では、本発明のＧＤＦ−８アンタゴニスト、例えば、ＧＤＦ−８活性を阻害する抗体により診断、予知、モニター、処置、寛解または予防される筋肉または神経筋障害は、ＡＬＳである。
【０１３１】
ＧＤＦ−８アンタゴニストにより診断、予知、モニター、処置、寛解または予防され得るその他の医学的障害は、骨の減少に関する障害であり、それには、特に高齢者および／または閉経後の女性における骨粗鬆症、グルココルチコイド誘発性骨粗鬆症、骨減少症、骨関節炎、ならびに骨粗鬆症に関連する骨折が含まれる。その他の標的代謝性骨疾患および障害には、慢性グルココルチコイド療法に起因する低骨量、早発性性腺機能不全、アンドロゲン抑制、ビタミンＤ欠乏症、二次性副甲状腺機能亢進症、栄養障害、および神経性食欲不振症が含まれる。抗体は、哺乳類、特にヒトにおけるこのような障害を診断、予知、モニター、処置、寛解または予防するために用いることが好ましい。
【０１３２】
本発明の抗体は、治療上有効量で投与される。一般に、治療上有効量は、被験体の年齢、状態、および性別、ならびに被験体における医学的状態の重篤度によって変化し得る。投薬量は、医師により決定され、必要に応じて観察される治療効果に合うように調節され得る。このような化合物の毒性および治療効力は、例えば、ＬＤ50（集団の５０％に致死性である用量）およびＥＤ50（集団の５０％に治療効果のある用量）を測定するための、標準的な薬学的手順により、細胞培養または実験動物において判定することができる。毒性と治療効果の間の用量比、すなわち、ＬＤ50／ＥＤ50が治療係数であり、大きな治療係数を示す抗体が好ましい。
【０１３３】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトに用いる用量の範囲を処方する際に用いることができる。このような化合物の投薬量は、毒性がほとんどないかまたは全くないＥＤ50を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投薬量は、投与形態および投与経路に応じてこの範囲内で変化し得る。本発明で用いられる任意の抗体に関して、治療上有効量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。用量を動物モデルにおいて処方して、細胞培養で測定されるＩＣ50（例えば、症状の最大半量の阻害または生物活性の阻害の最大半量の阻害を達成する試験抗体の濃度）を含む循環血漿中濃度範囲を得ることができる。血漿のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。任意の特定投薬量の効果は、適したバイオアッセイによりモニターされ得る。適したバイオアッセイの例としては、限定されるものではないが、ＤＮＡ複製アッセイ、転写に基づくアッセイ、ＧＤＦ−８タンパク質／受容体結合アッセイ、クレアチンキナーゼアッセイ、前脂肪細胞の分化に基づくアッセイ、脂肪細胞におけるグルコース取り込みに基づくアッセイ、および免疫学的アッセイが挙げられる。
【０１３４】
一般に、組成物は、抗体またはそれらの結合フラグメントが、１μｇ／ｋｇ〜１５０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ、１００μｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、および５００μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇの用量で与えられるように投与される。抗体は、投与後の時間の長さを最大にするために、抗体の循環レベルを最大化するボーラス投与で与えられることが好ましい。また、持続注入をボーラス投与の前、後、またはその代わりに用いてもよい。
【０１３５】
ＩＶ．治療薬を同定する方法
本発明のさらに別の態様は、筋肉、例えば、グルコース代謝、脂肪、および骨障害の処置に有用な治療薬を同定する方法を提供する。適切なスクリーニングアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡに基づくアッセイは、当分野で公知である。そのようなスクリーニングアッセイでは、第１の結合混合物が本発明の抗体とそのリガンドであるＧＤＦ−８を合わせることにより形成され、第１の結合混合物（Ｍ0）中のリガンドと抗体の間の結合の量が測定される。第２の結合混合物も、抗体、リガンド、およびスクリーニングされる化合物もしくは薬剤を合わせることにより形成され、第２の結合混合物（Ｍ1）中のリガンドと抗体の間の結合の量が測定される。次に、第１および第２の結合混合物中の結合の量を、例えば、Ｍ1／Ｍ0比を計算することにより比較する。化合物もしくは薬剤は、第１の結合混合物と比較して第２の結合混合物中の結合の低下が観察される場合（すなわちＭ1／Ｍ0＜１）、ＧＤＦ−８活性を阻害することができると考えられる。結合混合物の処方および最適化は、当分野の技術レベルの範囲内である；このような結合混合物はまた、結合を増強するかまたは最適化するために必要な緩衝液および塩を含んでもよく、さらなる対照アッセイを本発明のスクリーニングに含めてもよい。
【０１３６】
抗体−リガンド結合を少なくとも約１０％（すなわち、Ｍ1／Ｍ0＜０.９）、好ましくは、約３０％を上回って低下させることが見出された化合物は、このようにして同定することができ、さらに次に、必要であれば、その他のアッセイ、例えばＡｃｔＲＩＩＢ結合実験、または実施例に記載されるかまたは当分野で周知であるその他の細胞に基づくアッセイおよびインビボアッセイなどにおいてＧＤＦ−８活性を阻害する能力について二次スクリーニングすることができる。
【０１３７】
Ｖ．小分子
ＧＤＦ−８関連障害に罹患している（またはそのリスクの高い）生物（または被験体）において、あるいは、このような障害に関与するそのような生物からの細胞において、ＧＤＦ−８活性を阻害することも、ＧＤＦ−８の活性を拮抗、すなわち阻害するアンタゴニスト小分子（通常、有機小分子）の使用によって達成され得る。新規なアンタゴニスト小分子は、上記のスクリーニング法により同定することができ、本明細書に記載される本発明の治療法で用いることができる。
【０１３８】
逆に、ＧＤＦ−８発現および／または活性の低下に関連する障害、あるいはＧＤＦ−８レベルの低下に関連する障害に罹患している（またはそのリスクの高い）生物（または被験体）におけるＧＤＦ−８活性の増加も、ＧＤＦ−８の活性を作動、すなわち増強させる小分子（通常、有機小分子）の使用によって達成され得る。新規なアゴニスト小分子は、上記のスクリーニング法により同定することができ、本明細書に記載される本発明の治療法で用いることができる。
【０１３９】
ＶＩ．骨、脂肪、グルコース代謝、および筋肉の障害の進行を診断、予知、およびモニターする方法
例えば、筋肉、骨、グルコース代謝、および脂肪疾患を、処置することに加えて、本発明は、生物学的サンプル、例えば、血清、血漿、気管支肺胞洗浄液、痰、（例えば、筋肉の）生検、その他においてＧＤＦ−８の低下または増加を検出することにより、このような障害を診断する方法を提供する。「診断の」または「診断」とは、病的状態の存在または不在を同定することを意味する。診断方法には、例えば、被験体（ヒトまたは非ヒト哺乳類）由来の生物学的サンプルにおいてＧＤＦ−８ポリペプチドの試験量を測定することによりＧＤＦ−８の存在を検出すること、および、ＧＤＦ−８ポリペプチドについて試験量を正常な量または範囲（例えば、そのような障害を患っていないことが分かっている（１または複数の）個体の量または範囲）と比較することが含まれる。特定の診断方法からＡＬＳまたはその他のＧＤＦ−８関連障害の確定診断がもたされるのではないが、この方法が診断に役立つ決定的な指標を提供するのであれば十分である。
【０１４０】
本発明はまた、ＧＤＦ−８の上向き調節を検出することにより、ＡＬＳまたはその他の筋障害、または例えば、骨、グルコース代謝、および脂肪の疾患を予知する方法を提供する。「予知の」または「予知」とは、起こり得る病的状態の発生および／または重篤度を予測することを意味する。予知の方法には、被験体由来の生物学的サンプル中のＧＤＦ−８の試験量を測定すること、および、ＧＤＦ−８について試験量を予知量または範囲（例えば、例えばＡＬＳの様々な重篤度の個体からの量または範囲）と比較することが含まれる。試験サンプル中の様々な量のＧＤＦ−８は、ＡＬＳまたはその他のＧＤＦ−８関連障害の特定の予知と一致する。特定の予知レベルでＧＤＦ−８量を検出することにより、被験体の予知がもたらされる。
【０１４１】
本発明はまた、ＧＤＦ−８のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを検出することによりＡＬＳまたはその他のＧＤＦ−８関連障害の経過をモニターする方法を提供する。モニターする方法には、第１および第２の時点で被験体から採取した生物学的サンプル中のＧＤＦ−８の試験量を測定すること、およびその量を比較することが含まれる。第１および第２の時点間のＧＤＦ−８の量の変化は、例えば、ＡＬＳまたはその他のＧＤＦ−８関連障害の重篤度の経過における変化を示す。当業者であれば、ＡＬＳに類似するＧＤＦ−８関連障害において、例えば、筋肉量の増加が望ましい場合、第１および第２の時点間のＧＤＦ−８および／またはＧＤＦ−８活性の量の低下は障害の緩解を示し、量の増加は障害の進行を示すことが分かる。このようなモニターアッセイは、ＡＬＳまたはその他のＧＤＦ−８関連障害の処置を受けている患者において特定の治療的介入の効力（例えば、疾患の減弱および／または逆転）を評価するためにも有用である。
【０１４２】
本発明の抗体は、インビボまたはインビトロでＧＤＦ−８の存在を検出することによる診断、予知またはモニタリングに用いられ得る。このような検出方法は当分野で周知であり、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、イムノブロット、ウエスタンブロット、免疫蛍光、免疫沈降、およびその他の同等技術が含まれる。抗体は、ＧＤＦ−８を検出するための１またはそれ以上のこれらの技術を組み込んだ診断キットの状態でさらに提供され得る。そのようなキットは、タンパク質の検出およびキットの使用を助けるその他の成分、包装、使用説明書、またはその他の材料を含んでよい。
【０１４３】
抗体が、診断、予知、またはモニター目的を対象とする場合、例えば、リガンド群（ビオチンなど）または検出可能なマーカー群（蛍光基、放射性同位元素、または酵素）でそれらを修飾することが望ましい。必要であれば、従来技術を用いて抗体（ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれか）を標識してよい。適した標識としては、フルオロフォア、発色団、放射性原子、電子密度の高い試薬、酵素、および特異的結合パートナーを有するリガンドが挙げられる。酵素は一般にそれらの活性により検出される。例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼは、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を、分光光度計で定量化できる青色の色素に変換するその能力により検出することができる。その他の適した標識としては、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、ＩｇＧおよびプロテインＡ、ならびに当分野で公知の多数の受容体−リガンド対が挙げられ得る。その他の順列および可能性は、当業者に容易に理解され、本発明の範囲内の同等物と見なされる。
【０１４４】
ＶＩＩ．医薬組成物および投与方法
本発明は、本発明のＧＤＦ−８アンタゴニスト、すなわち ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、抗体、抗体フラグメント、および小分子を含む組成物を提供する。このような組成物は、製薬用途および患者への投与に適し得る。組成物は、一般に、本発明の１またはそれ以上の分子、好ましくは、抗体、および製薬上許容される賦形剤を含む。本発明の抗ＧＤＦ−８抗体は、インビトロ、エクスビボで用いてよく、または製薬上許容される担体と組み合わされる場合には医薬組成物に組み込んでよい。本明細書において、「製薬上許容される賦形剤」との語句には、薬剤投与に適合する、任意のあらゆる溶媒、溶液、緩衝液、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤、および同種類のものが含まれる。そのような組成物は、本発明の抗体および担体に加えて、様々な希釈剤、増量剤、塩、緩衝液、安定剤、可溶化剤、および当分野で周知のその他の材料を含み得る。用語「製薬上許容される」とは、有効成分（１または複数）の生物活性の有効性を妨げない無毒材料を意味する。担体の特徴は投与経路に依存する。薬剤活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は当分野で周知である。組成物はまた、追加の治療機能、さらなる治療機能、または向上した治療機能をもたらすその他の活性化合物を含んでよい。医薬組成物はまた、投与のための使用説明書とともに、容器、パック、またはディスペンサーの中に含めてもよい。
【０１４５】
本発明の医薬組成物は、本発明の抗体が、その他の製薬上許容される担体に加えて、ミセル等の凝集形態に存在する脂質、不溶性の単分子層、液晶、または水溶液中ではあるがラメラ層などの両親媒性物質と結合しているリポソームの形態であってよい。リポソーム処方物に適した脂質としては、限定されないが、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸、および同種類のものが挙げられる。このようなリポソーム処方物の調製は、当業者の技術のレベルの範囲内にある。
【０１４６】
本明細書において、用語「治療上有効量」とは、有意義な患者の利益、例えば、このような状態の症状の寛解、回復、または回復速度の増加を示すために十分な、医薬組成物または方法の各活性成分の総量を意味する。単独に投与される、個々の有効成分に用いられる場合、この用語はその成分単独を指す。組合せに用いられる場合、この用語は、連続的に組み合わせて投与されようと同時に組み合わせて投与されようと、治療効果をもたらす有効成分を合わせた量を指す。
【０１４７】
本発明の処置または使用方法を実践する際、例えば、ＧＤＦ−８と結合し、ＧＤＦ−８シグナル伝達を干渉する抗体の治療上有効量は、被験体、例えば、哺乳類（例えば、ヒト）に投与される。本発明の抗体は、単独で、または抗炎症薬などのその他の治療と組み合わせて、本発明の方法に従って投与され得る。１またはそれ以上の薬剤と同時投与される場合、本発明の抗体は、第２の薬剤と同時に投与されるか、または順次に投与されてよい。順次に投与される場合、主治医が他の薬剤と組み合わせた本発明の抗体の投与の適切な順序を決定する。
【０１４８】
一実施形態では、本発明の抗体（例えば、その医薬組成物）は、併用療法で、すなわち、他の薬剤（例えば、病状または障害、例えば筋障害、神経筋障害、骨変性疾患、代謝性または誘発性骨疾患、脂肪疾患、グルコース代謝障害、またはインスリン関連障害、例えば、ならびにアレルギー性および炎症性疾患の処置に有用な治療薬）と組み合わせて投与される。この文脈において用語「組合せて」とは、薬剤が実質的に同時期に、同時にまたは順次に投与されることを意味する。順次に投与される場合、第２の化合物の投与開始時に、２種類の化合物の第１の化合物は、処置部位または被験体においてまだなお効果的な濃度で検出可能であることが好ましい。
【０１４９】
本発明の医薬組成物は、その意図される投与経路に適合するように処方される。投与を達成する方法は当業者に公知である。局所または経口に投与され得るか、あるいは粘膜を越えて送達可能であり得る組成物を得ることも可能である。本発明の方法を実践するための、医薬組成物に用いられる本発明の抗体の投与は、様々な従来の方法、例えば経口摂取、吸入、皮膚、皮下、もしくは静脈の注射で行われ得る。
【０１５０】
皮内もしくは皮下適用に用いられる溶液または懸濁液は、一般に、１またはそれ以上の次の成分：滅菌希釈剤、例えば、注射水、生理食塩水溶液、硬化油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、またはその他の合成溶剤など；抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベンなど；酸化防止剤、例えばアスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなど；キレート化剤、例えばエチレンジアミン四酢酸など；緩衝液、例えば酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩など；ならびに張力の調節のための薬剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロースなどを含む。ｐＨは、酸または塩基、例えば塩酸または水酸化ナトリウムで調節することができる。このような製剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または複数回投与用バイアルに封入され得る。
【０１５１】
注射に適した医薬組成物には、滅菌注射用溶液または分散液の即時調製用の滅菌水溶液または分散液および滅菌粉末が含まれる。静脈内投与のためには、適した担体としては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（商標）ＥＬ（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。いかなる場合でも、組成物は滅菌されていなくてはならず、容易な注入性(syringability)が存在する程度まで流体であるべきである。それは製造および保存の条件下で安定性でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、ならびに適したその混合物を含有する溶媒または分散媒であってよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを用いることにより、分散液の場合には必要とされる粒径を維持することにより、さらに界面活性剤を用いることにより、維持することができる。微生物による作用の保護は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール、および同種類のものにより達成することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖類、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール類、および塩化ナトリウムを組成物中に含めることが好ましい。注射可能組成物の長期吸収は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによりもたらされ得る。
【０１５２】
治療上有効量の本発明の抗体が、例えば、静脈内、皮膚または皮下注射により投与される場合、結合剤は、発熱物質を含まない、非経口的に許容される水溶液の形態となる。ｐＨ、等張性、安定性などを考慮する(due regard to)、このような非経口的に許容されるタンパク質溶液の調製は、当分野の技術の範囲内である。静脈内、皮膚、または皮下注射に好ましい医薬組成物は、結合剤に加えて、等張性媒体、例えば塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、デキストロース注射液、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射液、乳酸化リンゲル注射液、または当分野で公知のその他の媒体を含むべきである。本発明の医薬組成物（１または複数）はまた、安定剤、防腐剤、緩衝液、酸化防止剤、または当業者に公知のその他の添加剤を含んでよい。
【０１５３】
本発明の医薬組成物中の本発明の抗体（または本発明のその他のアンタゴニスト）の量は、処置される状態の性質および重篤度、および患者の受けた前処置の性質によって決まる。最終的に、主治医が各個別の患者を処置するための抗体の量を決定する。最初に、主治医は低用量の抗体を投与して患者の応答を観察する。それより多い用量の抗体が、患者に対して最適な治療効果が得られる時点まで投与され、その時点の投薬量は一般にそれ以上増加されない。本発明の方法を実践するために用いられる様々な医薬組成物は、体重１ｋｇあたり約０．１μｇ〜５０ｍｇの抗体を含むべきであると考えられる。
【０１５４】
本発明の医薬組成物を用いる治療法の継続期間は、処置される疾患の重篤度および各個別の患者の状態および潜在的な特異体質応答によって変動する。抗体の各適用の持続期間は、例えば、皮下経路により、例えば、週に１回の範囲であることが考えられる。最終的に主治医は本発明の医薬組成物を用いる治療法の適切な持続期間を決定する。
【０１５５】
経口組成物には、一般に、不活性な希釈剤または食用の担体が含まれる。それらはゼラチンカプセル剤中に封入されてもよいし、または錠剤に圧縮されてもよい。経口治療用投与のためには、ＧＤＦ−８アンタゴニスト（例えば、抗体、小分子、その他）を賦形剤とともに組み込んで錠剤またはカプセル剤の形態で用いてよい。製薬上相容な結合剤、および／またはアジュバント材料を組成物の一部として含めてもよい。錠剤、丸剤、カプセル剤、および同種類のものは、任意の以下の成分；微晶質セルロース、トラガカントガムまたはゼラチンなどの結合剤；デンプンまたはラクトースなどの賦形剤；アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ（商標）、またはコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓ（商標）などの滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素などの磨砕剤；スクロースまたはサッカリンなどの甘味剤；あるいはペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ香味料などの香味剤、または類似の性質をもつ化合物を含んでよい。
【０１５６】
本発明の医薬組成物、例えば、ＧＤＦ−８と結合し、ＧＤＦ−８シグナル伝達を干渉する抗体の治療上有効量が、経口投与される場合、結合剤は錠剤、カプセル剤、粉剤、溶液またはエリキシル剤の形態である。錠剤の形態で投与される場合、本発明の医薬組成物は、ゼラチンなどの固体担体またはアジュバントをさらに含んでよい。錠剤、カプセル剤、および粉剤は、約５〜９５％の結合剤、好ましくは、約２５〜９０％の結合剤を含む。液体形態で投与される場合、液体担体、例えば、水、石油、動物もしくは植物起源の油（ピーナッツ油、鉱油、ダイズ油、もしくはゴマ油など）、または合成油を（個々の患者および／または巨大な個体集団のこのような液体担体に対するアレルギーを考慮に入れた後に）添加してもよい。医薬組成物の液体形態は、生理食塩水溶液、デキストロースまたはその他の糖類溶液、あるいはエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコール類をさらに含んでよい。液体形態で投与される場合、医薬組成物は約０.５〜９０重量％の結合剤、好ましくは、約１〜５０％の結合剤を含む。
【０１５７】
吸入による投与のためには、ＧＤＦ−８アンタゴニストは、適した噴射剤、例えば、二酸化炭素などのガスを含む圧縮容器もしくはディスペンサー、または噴霧器から、エアロゾールスプレーの形態で送達される。従って、本明細書に記載される化合物は、肺組織への吸入により投与され得る。本明細書において用語「肺組織」とは、別に示されている場合を除いて、気道の任意の組織を指し、上気道と下気道の両方を含む。１またはそれ以上のＧＤＦ−８抗体は、１またはそれ以上の、肺疾患を処置するための既存のモダリティと組み合わせて投与され得る。
【０１５８】
一例では、化合物を噴霧器用に処方する。一実施形態では、化合物を凍結乾燥形態で（例えば、室温にて）保存し、吸入前に溶液中で再構成することができる。
【０１５９】
また、医療用具、例えば、吸入器を用いて吸入用の化合物を処方することも可能である（例えば、米国特許第６，１０２，０３５号（粉末吸入器）および同第６，０１２，４５４号（乾燥粉末吸入器）を参照のこと）。吸入器は、別個の、保存に適したｐＨの活性化合物用の区画と中和緩衝液用の別の区画、ならびに霧化の直前に化合物と中和緩衝液を合わせるための機構を含み得る。一実施形態では、吸入器は、計量式吸入器である。
【０１６０】
必要ではないが、界面活性剤などの送達エンハンサーを用いて肺への送達をさらに増強することができる。本明細書において「界面活性剤」とは、２つの不混和相間の界面で相互作用することにより薬物の吸収を促進する親水性部分と親油性部分を有する化合物を指す。界面活性剤は、いくつかの理由（例えば、粒子の集塊の低下、マクロファージ食作用の低下、その他）で乾燥粒子に有用である。界面活性剤、例えばＤＰＰＣなどは、化合物の拡散を大いに促進するので、化合物は、肺表面活性剤と結合した場合、より効率的な吸収を達成することができる。界面活性剤は当分野で周知であり、限定されるものではないが、ホスホグリセリド類、例えば、ホスファチジルコリン類、Ｌ−α−ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）およびジホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）；ヘキサデカノール；脂肪酸；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；ポリオキシエチレン−９−；アウリルエーテル(auryl ether)；パルミチン酸；オレイン酸；ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ  ８５）；グリココール酸；サーファクチン；ポロキソマー(poloxomer)；ソルビタン脂肪酸エステル；ソルビタントリオレエート；チロキサポール；およびリン脂質が挙げられる。
【０１６１】
全身投与も経粘膜または経皮手段により可能である。例えば、Ｆｃ部分を含む抗体の場合、組成物は、ＦｃＲｎ受容体媒介経路によって粘膜（例えば、腸、口、または肺）を横切る伝達が可能であり得る（例えば、米国特許第６，０３０，６１３号）。概して、経粘膜投与は、例えば、トローチ剤、鼻腔スプレー、吸入器、または坐剤を用いることにより達成することができる。経皮投与においては、活性化合物は、一般に当分野で公知の軟膏、膏薬、ゲル、パッチまたはクリームとして処方される。経粘膜または経皮投与には、浸透させるバリアに適切な浸透剤が処方物に用いられる。このような浸透剤は、一般に当分野で公知であり、例えば、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。
【０１６２】
医薬組成物はまた、遺伝子療法に適した組成物、すなわち本明細書に開示されるポリヌクレオチドで構成される組成物からなってよい。遺伝子療法の場合、製薬上許容される担体には、例えば、脂質、コラーゲン球、陽イオンエマルジョン系、水、生理食塩水緩衝液、ウイルスベクター、カイロミクロンレムナント、ポリマーナノ粒子（例えば、ゼラチン−ＤＮＡまたはキトサン−ＤＮＡ）、金粒子、高分子複合体、リポプレックス、ポリプレックス、その他が含まれ得る（例えば、Gardlik et al. (2005) Med. Sci. Monit. 11(4):RA110-21を参照のこと）。
【０１６３】
安定化および保持
一実施形態では、ＧＤＦ−８抗体は、循環中で、例えば、血液、血清、リンパ、気管支肺もしくは気管支肺胞洗浄、またはその他の組織において、その安定化および／または保持を、例えば少なくとも１．５、２、５、１０、または５０倍改善する部分と物理的に会合している。
【０１６４】
本発明のアンタゴニストは、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤など、身体からの迅速な排出から保護する担体とともに調製され得る。生分解性の、生体適合性ポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステル、およびポリ乳酸を用いてよい。このような製剤の調製方法は当業者には明らかである。ＧＤＦ−８アンタゴニスト、例えば、１またはそれ以上の抗ＧＤＦ−８抗体を含有するリポソーム懸濁液も、製薬上許容される担体として用いることができる。これらは当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【０１６５】
例えば、ＧＤＦ−８抗体はポリマー、例えば、実質的に非抗原性ポリマー、例えばポリアルキレンオキシドまたはポリエチレンオキシドと会合することができる。適したポリマーは、実質的に重量により変動する。数平均分子量が約２００〜約３５，０００（または約１，０００〜約１５，０００、または約２，０００〜約１２，５００）の範囲のポリマーを用いてよい。
【０１６６】
例えば、ＧＤＦ−８抗体を共役させて水溶性ポリマー、例えば、親水性ポリビニルポリマー類、例えば、ポリビニルアルコールおよびポリビニルピロリドンとしてよい。このようなポリマーの限定されないリストとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール類などのポリアルキレンオキシドホモポリマー類、ポリオキシエチレン化ポリオール類、その共重合体およびそのブロック共重合体（ブロック共重合体の水溶性が維持されるという条件で）が挙げられる。さらなる有用なポリマーとしては、ポリオキシアルキレン類、例えばポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、およびポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンのブロック共重合体（プルロニック）；ポリメタクリレート類；カルボマー類；サッカリド単量体であるＤ−マンノース、Ｄ−およびＬ−ガラクトース、フコース、フルクトース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−グルクロン酸、シアル酸、Ｄ−ガラクツロン酸、Ｄ−マンヌロン酸（例えば、ポリマンヌロン酸、またはアルギン酸）、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−グルコースおよびノイラミン酸からなる、ラクトース、アミロペクチン、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、アミロース、硫酸デキストラン、デキストラン、デキストリン類、グリコーゲン、または酸性ムコ多糖類の多糖サブユニット（例えば、ヒアルロン酸）などのホモ多糖類およびヘテロ多糖類を含む、分枝または非分枝多糖類；ポリソルビトールおよびポリマンニトールなどの糖アルコール類のポリマー；ヘパリン、その他が挙げられる。
【０１６７】
その他の化合物、例えば、細胞毒素、標識、または別の標的指向化薬剤、例えば、別のＧＤＦ−８抗体または関係のないリガンドも同じポリマーに結合させることができる。モノ活性化された、アルコキシ基末端ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、例えば、モノメトキシ基末端ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）、Ｃ1-4アルキル基末端ポリマー、およびビス活性化ポリエチレンオキシド（グリコール）を架橋に用いることができる（例えば、米国特許第５，９５１，９７４号を参照のこと）。
【０１６８】
一実施形態では、リガンドと架橋する前のポリマーは、必要ではないが、水溶性であることが好ましい。一般に、架橋後、生成物は水溶性であり、例えば、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは、少なくとも約０．１ｍｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは、少なくとも約１ｍｇ／ｍｌの水溶性を示す。その上、ポリマーは、複合体形態で高度に免疫原性であるべきではなく、静脈内注入、エアロゾル化、または注射と適合しない粘度を有するべきでもない（もし複合体がこのような経路による投与を意図する場合）。
【０１６９】
一実施形態では、ポリマーは、反応性のひとつの基のみを含む。これは、リガンド分子が相互に架橋することを回避するために役立つ。しかし、反応条件を最大化してリガンド分子間の架橋を減少させるか、あるいは反応生成物をゲルろ過またはイオン交換クロマトグラフィーによって精製して実質的に均質な誘導体を回収することは本明細書の範囲内にある。他の実施形態では、ポリマーは、複数のリガンドとポリマー主鎖とが結合するために、２またはそれ以上の反応性基を含む。この場合もやはり、ゲルろ過またはイオン交換クロマトグラフィーを用いて所望の誘導体を実質的に均質な形態で得ることができる。
【０１７０】
ポリマーの分子量の範囲は、最大約５００，０００Ｄであり、好ましくは、少なくとも約２０，０００Ｄ、または少なくとも約３０，０００Ｄ、または少なくとも約４０，０００Ｄである。選択される分子量は、達成されるべき複合体の効果的なサイズ、ポリマーの性質（例えば、直鎖状もしくは分枝状などの構造）、および誘導体化の程度に依存し得る。
【０１７１】
共有結合を用いてＧＤＦ−８抗体とポリマーを結合することができる（例えば、リガンドのＮ末端アミノ基と、リガンドのリジン残基に見出されるεアミノ基、ならびにその他のアミノ、イミノ、カルボキシル、スルフヒドリル、ヒドロキシル、またはその他の親水基との架橋結合）。ポリマーは、多官能性（通常は二官能性）架橋剤を用いずに、直接ＧＤＦ−８抗体と共有結合することができる。アミノ基との共有結合は、塩化シアヌル、カルボニルジイミダゾール、アルデヒド反応性基（ＰＥＧアルコキシド＋ブロモアセトアルデヒドのジエチルアセチル；ＰＥＧ＋ＤＭＳＯおよび無水酢酸、またはＰＥＧクロリド＋４−ヒドロキシベンズアルデヒドのフェノキシド、スクシンイミジル活性エステル類、活性化ジチオカーボネートＰＥＧ、２，４，５−トリクロロフェニルクロロホルメートまたはＰ−ニトロフェニルクロロホメート活性化ＰＥＧ）に基づく公知の化学によって達成される。カルボキシル基は、カルボジイミドを用いるＰＥＧ−アミンの結合により誘導体化することができる。スルフヒドリル基は、マレイミド−置換ＰＥＧ（例えば、アルコキシ−ＰＥＧアミン＋スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸塩）（ＷＯ９７／１０８４７号参照）またはＰＥＧ−マレイミドと結合させることにより誘導体化することができる。あるいは、リガンド上の遊離アミノ基（例えば、リジン残基上のεアミノ基）を２−イミノ−チオラン（トラウト試薬）でチオール化し、次に、例えば、Pedley et al. (1994) Br. J. Cancer 70：1126-30に記載されるように、ＰＥＧのマレイミド含有誘導体と結合させることができる。
【０１７２】
ＧＤＦ−８抗体と結合することのできる官能化されたＰＥＧポリマーは、例えば、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）から市販されている。このような市販のＰＥＧ誘導体としては、例えば、アミノ−ＰＥＧ、ＰＥＧアミノ酸エステル、ＰＥＧ−ヒドラジド、ＰＥＧ−チオール、ＰＥＧ−コハク酸塩、カルボキシメチル化ＰＥＧ、ＰＥＧ−プロピオン酸、ＰＥＧアミノ酸、ＰＥＧコハク酸スクシンイミジル、ＰＥＧプロピオン酸スクシンイミジル、カルボキシメチル化ＰＥＧのスクシンイミジルエステル、ＰＥＧの炭酸スクシンイミジル、アミノ酸ＰＥＧのスクシンイミジルエステル、ＰＥＧ−オキシカルボニルイミダゾール、ＰＥＧ−ニトロフェニルカ−ボネート、ＰＥＧトレシレート(tresylate)、ＰＥＧ−グリシジルエーテル、ＰＥＧ−アルデヒド、ＰＥＧビニルスルホン、ＰＥＧ−マレイミド、ＰＥＧ−オルトピリジルジスルフィド、ヘテロ官能性ＰＥＧ、ＰＥＧビニル誘導体、ＰＥＧシラン、およびＰＥＧホスホリド(phospholides)が挙げられる。これらのＰＥＧ誘導体を結合するための反応条件は、ＧＤＦ−８抗体、所望のペグ化の程度、および利用するＰＥＧ誘導体によって変動し得る。ＰＥＧ誘導体の選択に関与する一部の要因としては、所望の結合点（リジンまたはシステインＲ−基など）、誘導体の加水分解安定性および反応性、安定性、結合の毒性および抗原性、分析の適合性、その他が挙げられる。任意の特定の誘導体の使用に関する具体的な指示は、製造業者から入手できる。
【０１７３】
ＧＤＦ−８抗体とポリマーの複合体は、未反応出発物質から、例えば、ゲルろ過またはイオン交換クロマトグラフィー、またはクロマトグラフィーのその他の形態、例えば、ＨＰＬＣにより分離することができる。複合体の異種は、同じ方法でお互いから精製される。異なる種（例えば、１または２つのＰＥＧ残基を含有する）の分解も、未反応アミノ酸のイオン特性の差異によって可能である（例えば、ＷＯ９６／３４０１５号を参照のこと）。
【０１７４】
本発明のポリヌクレオチドおよびタンパク質は、本明細書において同定される使用または生物活性を１またはそれ以上示すことが予期される（下に引用されるアッセイに関連するものも含む）。本発明のタンパク質に関して記載される使用または活性は、このようなタンパク質の投与または使用によるか、あるいはこのようなタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療またはＤＮＡの導入に適したベクター中など）の投与または使用によってもたらされ得る。
【０１７５】
経口もしくは非経口組成物を、投与の簡便さおよび投薬量の画一性のために、投薬単位形態で処方することは有利であり得る。本明細書において投薬単位形態とは、処置されるべき被験体に対する単位投薬量として適した、物理的に別個の単位を指し、各単位は必要とされる製薬担体に関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含有する。本発明の投薬単位形態の明細は、活性化合物の特有の特性、達成されるべき特定の治療効果、および個体の処置のためのこのような活性化合物の処方に固有の当分野の制限の影響を受け、直接的にそれらに依存する。
【０１７６】
従って、本発明のもう一つの態様は、例えば、その他の治療用化合物とともに、またはその他の治療用化合物を含まずに、本発明のＧＤＦ−８抗体の投与を実行するための、あるいは、抗ＧＤＦ−８抗体を、生物学的サンプルにおいてＧＤＦ−８の存在および／またはレベルを決定するための研究用または治療用ツールとして用いるためのキット、例えばＥＬＩＳＡキットに関する。一実施形態では、キットは、製薬担体中に処方された１またはそれ以上の抗ＧＤＦ−８抗体および少なくとも１種類の薬剤、例えば、必要に応じて処方される治療用薬剤を１またはそれ以上の別個の医薬品中に含む。
【０１７７】
以下の実施例は、本発明の理解を助けるために示されるが、いかなる点においても本発明の範囲を制限するものではなく、解釈されるべきでもない。実施例には、従来法、例えばハイブリドーマ形成、ＥＬＩＳＡ、増殖アッセイ、フローサイトメトリー分析および組換えＤＮＡ技術などの詳細な記述が含まれていない。このような方法は当業者に周知である。
【０１７８】
本出願を通じて引用されるすべての参照文献、特許、特許出願公開、およびその他の特許文献の全内容は、参照により本明細書に援用される。
【実施例】
【０１７９】
実施例１
抗ＧＤＦ−８抗体ＲＫ３５の作製および同定
ヒトＧＤＦ−８タンパク質（成熟ＧＤＦ−８およびＧＤＦ−８プロペプチド）およびＢＭＰ−１１タンパク質を、米国特許出願公開第２００４／０１４２３８２号に記載されるように単離し、特性決定した。
【０１８０】
６頭の雌ミオスタチンノックアウトＢＡＬＢ／ｃマウス（８週齢；ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、前掲）を、フロイント完全アジュバント中２０μｇの組換え型ＧＤＦ−８二量体を用いる皮下注射により免疫化した。
【０１８１】
フロイント不完全アジュバント中同量の抗原の数回の追加免疫注射を２週間隔で行い、最終のＰＢＳ中２μｇの静脈内注射（尾静脈）を融合前に行った。最大の抗体力価を示すこの２頭のマウス由来の脾細胞を、標準的な技法（Oi and Herzenberger (1980) In: Mishell, B.B., Shiigi, S.M., Henry, C, Mishell, R.I. (Eds.), Selected Methods in Cellular immunology W.H. Freemen, San Francisco, pp. 351-72）を用いてマウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ受託番号Ｐ３Ｘ６３．Ａｇ８．６５３）と融合させた。１０〜１４日後、上清を回収し、抗ＧＤＦ−８抗体産生について固相および液相ＥＬＩＳＡ（Whittemore et al.、前掲）によりスクリーニングした。標準的なＥＬＩＳＡ技術およびｐＧＬ３−（ＣＡＧＡ）12レポーターアッセイ（Theis et al (2001) Growth Factors 18：251-59）を用い、ヒトＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ受容体の細胞外ドメインをヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域と融合させることにより生じたキメラＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃを用いて、ミオスタチンとその受容体ＡｃｔＲＩＩＢの結合の阻害についてのＩＣ50を測定した。さらなる研究のために選択されたハイブリドーマを、単クローン性を確実にするための反復限界希釈法によりモノクローナルとした。モノクローナル抗体ＲＫ３５をさらなる研究用に選択した。
【０１８２】
実施例２
ＲＫ３５モノクローナル抗体はＧＤＦ−８に対して高い親和性を有し、中和活性を示す
実施例２．１：試験手順
ＥＬＩＳＡのため、ビオチン化ＧＤＦ−８を、９６ウェルストレプトアビジンマイクロタイタープレート（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）上、１μｇ／ｍｌで４℃にて一晩コートした。コーティング後、溶液をウェルから取り除き、プレートをＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）中で室温にて１時間ブロッキングした。プレートをＰＢＳですすぎ、１００μｌのＲＫ３５抗体を様々な濃度でウェルに添加した。プレートを室温にて１時間インキュベートした後、ＰＢＳで洗浄した。各ウェルに、抗ｈｕＩｇＧ−ＨＲＰ複合体の１:５０００希釈１００μｌ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）を添加し、プレートを室温にて１時間インキュベートした。各プレートをＰＢＳで３回洗浄した。ＴＭＢ基質（１００μｌ）を各ウェルに添加し、顕色するまでインキュベートした。１００μｌの０．１８Ｍ Ｈ2ＳＯ4を添加して反応を停止させた。マイクロタイタープレートリーダーを用いて、４５０ｎｍで吸光度を読み取ることにより生じたシグナルを測定した。ヒトアイソタイプ対照抗体を用いてＧＤＦ−８との結合を確認した。
【０１８３】
組換えＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，カタログ番号３３９−ＲＢ／ＣＦ）を９６ウェル平底アッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ，ＮＹ，カタログ番号３５９０）上、０．２Ｍ 炭酸ナトリウム緩衝液中１μｇ／ｍｌで４℃にて一晩コートした。次に、プレートを１ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミンでブロッキングし、標準的なＥＬＩＳＡプロトコールに従って洗浄した。ビオチン化ＧＤＦ−８またはＢＭＰ−１１のアリコート（１００μｌ）をブロックしたＥＬＩＳＡプレートに様々な濃度で添加し、１時間インキュベートし、洗浄し、結合したＧＤＦ−８またはＢＭＰ−１１の量をストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ、ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，カタログ番号１３０４７Ｅ）により検出した後、ＴＭＢを添加した（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，カタログ番号５０−７６−０４）。比色測定を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製マイクロプレートリーダーにおいて４５０ｎｍで行った。阻害活性を分析するため、ＲＫ３５を２０ｎｇ／ｍｌ ＧＤＦ−８または２０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ−１１とのプレインキュベーションにより様々な濃度で試験した。室温にて１時間のインキュベーションの後、１００μｌのＲＫ３５およびＧＤＦ−８またはＢＭＰ−１１混合物をプレートに添加した。結合した因子の検出および定量化は、Whittemore et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 300：965-71に記載されている。
【０１８４】
ＧＤＦ−８の活性を実証するため、ＴＧＦ−β誘導プロモーターの制御下、ルシフェラーゼを発現しているレポーターベクターｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）12を用いてレポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）を展開した。ＣＡＧＡは、ＴＧＦ−β−誘導遺伝子ＰＡＩ−１のプロモーター内のＴＧＦ−β−応答配列である（Denner et al. (1998) EMBO J. 17:3091-3100）。１２のＣＡＧＡボックスを含むレポーターベクターを、基本的なルシフェラーゼレポータープラスミドｐＧＬ３（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて作製した。アデノウイルス主要後期プロモーターからのＴＡＴＡボックスおよび転写開始部位（−３５／＋１０）を、ＢｇｌＩＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入した。１２反復のＣＡＧＡボックス、すなわちＡＧＣＣＡＧＡＣＡを含むオリゴヌクレオチドをアニールし、ＸｈｏＩ部位にクローニングした。ヒト横紋筋肉腫細胞株Ａ２０４（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−８２）を、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）12で一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの後、細胞を、２ｍＭ グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ ストレプトマイシン、１００μｇ／ｍｌ ペニシリンおよび１０％ ウシ胎児血清を補充したマッコイ５Ａ培地中で９６ウェルプレートにて１６時間培養した。次に、細胞を、１０ｎｇ／ｍｌ ＧＤＦ−８を含むまたは含まない、グルタミン、ストレプトマイシン、ペニシリン、および１ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミンを含有するマッコイ５Ａ培地中、３７℃にて６時間処理した。ルシフェラーゼをＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて処理細胞中で定量した。ＲＫ３５の阻害活性を試験するため、ＧＤＦ−８を抗体と室温にて１時間プレインキュベートした。次に、この混合物をトランスフェクト細胞に添加し、細胞を３７℃にて６時間インキュベートした。ルシフェラーゼをＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて定量した。
【０１８５】
実施例２．２：結果
ミオスタチンに対する高親和性マウスモノクローナル抗体を、成熟マウスミオスタチンとアミノ酸配列が同一の、精製組換えヒトＧＤＦ−８でＧＤＦ−８ノックアウトマウスを免疫化することにより生成させた（McPherron et al., 1997）。ＲＫ３５抗体は、直接ＥＬＩＳＡにより試験したように高い親和性でＧＤＦ−８と結合した（４ｎＭ；図１Ａ）。競合ＥＬＩＳＡを用いて、ＲＫ３５がＧＤＦ−８とその高親和性受容体、ＡｃｔＲＩＩＢの結合を阻害する能力を評価した。ＲＫ３５は、ビオチン化ＧＤＦ−８と固定化ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃの結合をＩＣ50  約２．５ｎＭで阻害した（図１Ｂ）。可溶性ＡｃｔＲＩＩＢはまた、ＧＤＦ−８と固定化ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃの結合を阻害したが、対照抗体は結合を阻害しなかった。ＲＫ３５の中和活性もｐＧＬ３−（ＣＡＧＡ）12細胞系レポーターアッセイを用いて測定した。このアッセイでは、ルシフェラーゼ遺伝子をＧＤＦ−８／ＴＧＦ−β応答性プロモーターの制御下でクローン化し、ヒトＡ２０４横紋筋肉腫細胞をレポータープラスミドで一過性にトランスフェクトした。ＧＤＦ−８に誘導される、Ａ２０４細胞におけるルシフェラーゼ活性の増加は、用量依存的な方法でＲＫ３５により阻害された（図１Ｃ）。ＲＫ３５は、ＧＤＦ−８シグナル伝達活性を０．２ｎＭのＩＣ50で低下させた。従って、ＲＫ３５は、ＧＤＦ−８に対して標的指向された新規な極めて強力なマウスモノクローナル中和抗体である。
【０１８６】
実施例３
野生型およびＡＬＳげっ歯類モデルにおけるＲＫ３５のインビボ活性
実施例３．１：試験手順
実施例３．１．１：動物および薬物処置
動物の使用を伴う全ての手順は、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ大学またはＷｙｅｔｈ社のいずれかのＩＡＣＵＣに認可された。Ｂ６ＳＪＬハイブリッドバックグラウンド（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の、ヒトＳＯＤＧ９３Ａを発現しているトランスジェニックマウス（Gurney et al.、前掲）をＢ６ＳＪＬＦ１雌ブリーダーマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と室内で交配させた。後代をＰＣＲでスクリーニングし；導入遺伝子に対して陰性のマウスを年齢の一致した同腹仔野生型対照として用いた。マウスを４つの群：抗ミオスタチン抗体ＲＫ３５で処置したＳＯＤＧ９３Ａマウス２９頭、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（媒体）で処置したＳＯＤＧ９３Ａマウス２８頭、ＲＫ３５で処置した野生型マウス２３頭、およびＰＢＳで処置した野生型マウス２３頭に分割した。生後２８日目に開始して、マウスに、抗ＧＤＦ−８モノクローナル抗体ＲＫ３５か同等量のＰＢＳのいずれかを週１回ベースで腹膜内に注射した。第１の用量は４０ｍｇ／ｋｇであった；その後の用量は、抗ミオスタチン抗体ＪＡ１６について記載されるプロトコールに従って２０ｍｇ／ｋｇ／週であった（Whittemore, et al.、前掲）。各群から９〜１２頭のマウスを８４〜９０日齢（１２週）の間に（平均８８日）屠殺して湿った（wet）筋肉量および組織を評価し、残りのマウスを、左右両側の横臥位から３０秒以内に体を起こすことができないことと定義される、疾患末期に達するまで（約１３４日）モニターした。
【０１８７】
並行して、雄および雌の同数が混合されている、ヒトＳＯＤＧ９３Ａ発現トランスジェニックラット（５８）（Howland et al.、前掲）にＰＢＳ（媒体）かまたはＲＫ３５のいずれかを投与した。各群１０頭のラットを９５日齢で安楽死させて、湿った筋肉量へのＲＫ３５の効果を測定した。各群の残りの１９頭のラットは疾患末期まで継続した。雌トランスジェニックラットおよび野生型同腹仔対照ラットを用いる第２の研究を用いて、体重の増加ならびに握力の変化を処置群および遺伝子型にわたって比較した。各研究において、４０ｍｇ／ｋｇのＲＫ３５をラットに腹膜注射し（６週齢（約４２日））、その後、９５日目に筋肉量の分析のために屠殺するか、または立ち直り反射不全(right reflex failure)で測定される末期段階まで、２０ｍｇ／ｋｇ／週または媒体の注射を継続した。
【０１８８】
実施例３．１．２：体重および筋肉量測定
初期体重を用いて、研究の開始時の平均体重が確実に同等となるようにコホート間に動物を均一に分配した。体重減少の開始を、体重減少の３回連続測定の１回目を観察した時点の日齢として記録した。湿った筋肉量を、腓腹筋、前脛骨筋(cranial tibialis)、四頭筋、および横隔膜にて、早期疾患（マウスは８８日、ラットは９５日）および末期段階（マウスは約１３４日、ラットは約１２８日）に一致する時点で測定した。動物を安楽死させ、各肢の筋肉を定量的に解剖し、計量した；右肢と左肢の値を平均した。
【０１８９】
実施例３．１．３：筋肉組織病態学および運動ニューロンカウント
腓腹筋および横隔膜を固定し、Ｈ＆Ｅ染色のために切片化した（Howland et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:1604-29）。萎縮および肥大についてのスコア付けは、２つの独立した病態について、サンプルの身元を見せずに行った。線維径を、形態計測（Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎ  ４．３，Ｚｅｉｓｓ，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）により、８８日目および末期段階の腓腹筋（ＰＢＳ処置およびＲＫ３５処置ＳＯＤＧ９３ＡマウスならびにＰＢＳ処置野生型マウス）について、ならびに末期段階の横隔膜筋（ＰＢＳ処置およびＲＫ３５処置ＳＯＤＧ９３ＡならびにＰＢＳ処置野生型マウス）について測定した。１群あたり３つの筋肉をドライアイス冷イソペンタン中で瞬間冷凍し、厚さ８μｍの凍結切片化し、抗ラミニン抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；カタログ番号Ｌ９３９３）を用いて免疫染色した。少なくとも２００の線維の短径の最大直径の直線的測定を、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎソフトウェアを用いて行った。線維径を２０μｍ間隔の値域ごとにまとめ、各筋肉群について頻度ヒストグラムを生成した。
【０１９０】
運動ニューロンカウントを、各群（野生型、ＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａ、およびＲＫ３５処置ＳＯＤＧ９３Ａ）からの初期段階および疾患末期の双方の３頭のマウスにて行った（合計１８マウスを分析した）。断頭したマウスから取り出した脊柱を４％パラホルムアルデヒド中で後固定（post-fixed）し、次に索（cord）を解剖し、さらに４％パラホルムアルデヒド中で２４時間後固定した。ＭｕｌｔｉＢｒａｉｎ（商標）技術（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ，ＴＮ）を用いて、１８の腰髄を、単一のブロック上で一緒に包埋し、腰膨大のセグメント全体（約６ｍｍ）に沿って前頭面を５０ｕｍで横に切断した。６つの切片（３００μｍ）ごとにチオニンニッスルで染色して細胞体を露呈させた（Bjugn (1993) Brain Res. 627:25-33; Kieran et al. (2004) Nat. Med. 10:402-05）。２つの独立したアプローチを用いてカウントを行った。第１に、１８頭のマウスの各々についてＬ３〜５を包含する１０の脊髄切片を、観察者にサンプルの身元を知らせずに、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｏｐｌａｎ２を２０倍および４０倍で用いて分析した。各切片の両前角を計数し、既に記載されているように（Kieran et al.、前掲）目に見える核小体の存在により大型の健康な運動ニューロンを同定した。得られるデータは、前角あたりの大型の運動ニューロンの平均数として表された。第２に、Ｌ３〜Ｌ５領域由来の切片を、記載されるように、電動の試料ステージ、電子マイクロカトール(microcator)、および立体解析学ソフトウェア（Ｓｔｅｒｅｏ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ（ＭＢＦ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｉｌｌｉｓｔｏｎ，ＶＴ））を備えたＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｋｏｐ２を用いて立体解析学的に分析し（West et al. (1991) Anat. Rec. 231:482-97; Schmitz and Hof (2000) J. Chem. Neuroanat. 20:93-114; Schmitz and Hof (2005) Neuroscience 130:813-31）;α−運動ニューロンを、３００μｍ2を越える最大投射野をもつニューロンとしてスコア付けした。
【０１９１】
実施例３．１．４：表現型分析
握力測定（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨ）を、記載されるように、処置および対照マウスの前肢および後肢の両方において生後２８日に開始して隔週行った（ｎ＝８〜２４）（LaMonte et al. (2002) Neuron 34:715-24）。早期疾患相の（生後９５〜１１０日；ｎ＝１０）トランスジェニックおよび野生型ラットを、Ｄｕｎｎｅｔｔラット握力計（ＭＪＳ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｅｖｅｎａｇｅ，Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いて、前肢握力について週２回試験した。ラットはロトロッドによっても分析され（Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｅ，Ｃｏｍｅｒｉｏ，Ｉｔａｌｙ）、ならびに、歩行異常および四肢の運動性の程度についてモニターされた（データは示さず）。
【０１９２】
実施例３．１．５：電気生理学
筋電図検査（ＥＭＧ）記録およびデータ分析を、遺伝子型および処置群を知らせずに行った。体温３５〜３７℃で維持したネンブタール麻酔下のラットを、同心単極針電極（９０１３Ｒ００１１，Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ，ＭＮ，ＵＳＡ）を、ＥＭＧ妨害パターンのバーストが各吸気とともに表れるまで、外科的に露出した横隔膜筋に挿入することにより、針筋電図に供した。電気シグナルを、ＭＰ１５０  Ｄａｔａ  Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  Ｕｎｉｔ、ＵＩＭ１００Ｃ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｍｏｄｕｌｅ、ＥＭＧ１００Ｃ  筋電図検査モジュール、およびＡｃｋｎｏｗｌｅｄｇｅソフトウェア（ＢＩＯＰＡＣ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ，Ｇｏｌｅｔａ，ＣＡ）で構成されるＢＩＯＰＡＣ装置で２０ＫＨｚにて獲得した。シグナルを最初に分析して６０Ｈｚアーチファクトを取り除き、５００〜１０００Ｈｚの間で帯域通過フィルタ処理して、呼吸に起因する動きアーチファクト、さらに運動単位放電を強調することに起因する動きアーチファクトを取り除いた。ＥＭＧバーストを、シグナルを整流すること、１０Ｈｚで低域フィルタリングすること、その後、得られるエンベロープがその平均値よりも大きくなる時点を検出することにより同定した。１００ｍｓ未満続いたバーストはカウントせず、１００ｍｓ未満続いた非バースト時間を周囲(surrounding)バーストの一部としてカウントした。最後に、非バースト時間中のシグナル振幅の標準偏差の３倍に等しく設定されたピーク検出閾値を用いて非整流シグナル中のスパイクを検出した。スパイクバースト分析をＫ．Ｃ．ＭｃＧｉｌｌ（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＣＡ）によるカスタムソフトウェアで行い、各動物に対するバーストスパイク比（Ｈｚ）を、平均バースト持続期間で割った、バーストあたりの平均スパイク数として計算した。
【０１９３】
実施例３．１．６：データ分析および統計
２要因反復測定ＡＮＯＶＡモデルを、ＳＡＳ混合手順を用いて体重データならびに握力データに適用した。２要因ＡＮＯＶＡ線形モデルを、ＳＡＳ  ＧＬＭ手順を用いて筋肉量データに適用した。電気生理学データを２サンプルｔ検定により分析した。運動ニューロンカウントデータには、ポアソン分布を仮定している一般化線形モデル（ＧＬＭ）を用いた。筋線維データは、ＡＮＯＶＡの後、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定により分析した。比較は、ｐ値が０．０５未満である場合に統計上有意であると考えられ；０．０５＜ｐ＜０．１５での比較は傾向として記される。
【０１９４】
実施例３．２：結果
実施例３．２．１：ＲＫ３５処置はＳＯＤＧ９３Ａげっ歯類の体重を増加させたが、生存は延長しなかった。
ＳＯＤＧ９３Ａマウスを抗ミオスタチン抗体ＲＫ３５で処置し、それを生後２８日から開始して疾患末期（生後約１３４日）まで継続した。ＲＫ３５処置の結果、ＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスと比較して、生後４０〜１２０日まで体重が有意に増加した。ＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスは７０日で２７．７８±０．４６ｇの最大体重に達したのに対し、ＲＫ３５処置マウスは３２．１３±０．４８ｇの最大値に達し、相対的な増加は１６％であった（図２Ａ）。野生型マウスは研究を通じて体重増加が続いたが、ＰＢＳ処置およびＲＫ３５処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスの双方は、疾患の進行に起因して生後約９８日に有意な体重減少の徴候を示し始めた。
【０１９５】
トランスジェニックＳＯＤＧ９３ＡラットをＲＫ３５抗体でも処置し、それを生後４２日から開始して疾患末期（約１２８日齢）まで継続した。抗ミオスタチンＲＫ３５での処置により、ＰＢＳ処置ラットと比較してＳＯＤＧ９３Ａラットに体重の増加がもたらされた（図２Ｂ）。ＲＫ３５を受けるトランスジェニックラットは、早くも投薬開始後３週に対応する生後６０日に、ＰＢＳ処置トランスジェニックラットよりも有意に体重が重かった（ｐ＜０．０５）。ＲＫ３５で処置した雄ラットは９６日で４５８．８±６．５ｇの最大値に達し、４１９.１±１０．７ｇのＰＢＳ処置雄ラットよりも１０％の増加であった。ＲＫ３５処置雌は２８９．７±９．３ｇの最大値に達し、２５２.８±６.０ｇのＰＢＳで処置した雌よりも１５％の増加であった。ＰＢＳかＲＫ３５のいずれかで処置したＳＯＤＧ９３Ａラットは、約１１２日後に疾患の進行に起因する有意な体重減少を示し始めた；ＲＫ３５処置は体重減少の開始を遅らせなかった。
【０１９６】
ＲＫ３５処置は有意な体重増加をもたらしたが、発明者らはＲＫ３５処置が生存に効果がないことを見出した。３０秒以内に体を起こすことができないと定義されたエンドポイントを用いて判定される末期段階までの時間は、ＲＫ３５処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスに対して１３２±８日であったが（ｎ＝１６）、ＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスは１３４±７日で末期段階に達した（ｎ＝１７）。ＲＫ３５で処置したＳＯＤＧ９３Ａラットは、ＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａラットの１２８±６日と比較して、１２５±８日で末期段階に達した。これらの差異はいずれも統計上有意でなく、ミオスタチンの阻害がマウスまたはラットのいずれのＡＬＳモデルにおいても疾患末期までの時間を遅らせないことが示される。
【０１９７】
実施例３．２．２：筋肉量および強度へのミオスタチン阻害の効果
ミオスタチン阻害が筋消耗を遅くするかどうかを判定するために、ＳＯＤＧ９３Ａトランスジェニックマウスおよび野生型マウスを各群から、ＲＫ３５処置により誘導される体重の増加が最大に近い時点である、生後８８日目に屠殺した。この時点で、ＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスは、疾患の初期段階に一致する野生型対照マウスと比較して、腓腹筋、前脛骨筋、および四頭筋の筋肉量の有意な低下を示す（図２Ｃ）。対照的に、ＲＫ３５処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスは、８８日目の時点で日齢の合致するＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスと比較して、試験した全ての筋肉において筋肉量の統計上有意な改善を提示し、その範囲は約１９％〜３２％（腓腹筋、＋２６％；前脛骨筋、＋１９％；四頭筋、＋３２％）であった。疾患の初期段階中にＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａマウス由来の横隔膜には筋肉量の有意な低下は見出されなかったが、ＲＫ３５処置はなおこの筋肉の質量の有意な増加を誘導した（＋２１％）。
【０１９８】
各コホートの残りのマウスを、立ち直り反射試験(right reflex test)で定義される末期段階までモニターした。末期段階で、ＲＫ３５処置およびＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスの双方に脚筋消耗が観察された（図２Ｅ）。８８日目のマウス由来組織での知見と対照的に、疾患末期のＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスは、野生型動物と比較して横隔膜筋量の有意な低下を示した（図２Ｅ）。しかし、処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスに観察される、ＲＫ３５に誘導される横隔膜質量の増加は末期段階で有意なままであり、ミオスタチン阻害がＳＯＤＧ９３Ａマウスにおいて横隔膜の萎縮を遅らせることが示される。
【０１９９】
抗ミオスタチン抗体の筋肉量への効果もＳＯＤＧ９３Ａラットにおいて調査した。マウスにおいてなされた知見に類似して、ＲＫ３５で処置した約９５日齢のＳＯＤＧ９３Ａラットは、ＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａラットよりも腓腹筋（＋１７％）、前脛骨筋（＋３０％）、四頭筋（＋３０％）および横隔膜筋（＋１７％）において質量が有意に増加したを示した（図２Ｄ）。疾患末期までに、ＰＢＳ処置およびＲＫ３５処置ＳＯＤＧ９３Ａラットの双方において脚筋萎縮は明白であった（図２Ｆ）。ＳＯＤＧ９３ＡラットにおけるＲＫ３５処置の結果としての、脚筋肉量の増加に対する傾向は末期段階まで続いたが、これらの効果は有意には達しなかった。しかし、ＰＢＳ処置対照（約３５％）に対する、ＲＫ３５処置ＳＯＤＧ９３Ａラット由来の横隔膜質量の堅調かつ有意な３５％の増加は疾患の末期になお明白であり（図２Ｆ）、ＳＯＤＧ９３Ａマウスに関して見られる知見に一致している（図２Ｅ）。
【０２００】
ミオスタチン阻害の筋肉機能への効果を試験するため、ＲＫ３５処置およびＰＢＳ処置マウスに定量的握力アッセイを行った。ＲＫ３５処置およびＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスの双方が、生後２８〜５６日の間の後肢握力において発展的な増加を示した。生後５６日まで、ＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスは、日齢の合致する対照マウスよりも有意に弱くなる（図３Ａ）（ｐ＜０．０００１）。ＲＫ３５処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスにおいて生後６３日まで握力の低下も明白であったが、ＲＫ３５処置マウスは生後４９〜８８日までＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスよりも有意に強いままであった（または強い傾向があった）（ｐ＜０．０５）。前肢握力の分析は、類似のパターンを示した（図３Ｂ）。ＰＢＳ処置およびＲＫ３５処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスの双方においてピーク前肢強度がそれぞれ生後約４９日および５６日までに観察された。ＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスは野生型動物よりも生後５６日までに有意に弱くなり（ｐ＜０．０５）、その後も低下が続いた。ＲＫ３５処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスは、５６〜８８日齢のＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスよりも強かった（５６日；ｐ＝０．０８；６３日：ｐ＝０．０６；７０〜８８日；ｐ＜０．００１）。これらのデータは、ミオスタチン阻害がＳＯＤＧ９３Ａマウスの疾患の初期段階を通じて筋肉機能の低下を遅らせることを示す。しかし、約１００日後、握力の低下は処置および未処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスの双方において同様であった。
【０２０１】
ＲＫ３５処置がＳＯＤＧ９３Ａラットに類似の変化を誘導するかどうかを判定するため、疾患の初期段階の間のＲＫ３５およびＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａラットならびに日齢の合致する野生型同腹仔において前肢握力も分析した（図３Ｃ）。ＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａラットは野生型対照よりも有意に弱く、ＳＯＤＧ９３Ａラットもマウスと同様に明白な運動障害および体重減少に先行する早期疾患段階を示すことが確認された。ＲＫ３５処置ＳＯＤＧ９３Ａラットの握力測定値は一般にＰＢＳで処置した野生型ラットの値よりも低かったが、群に有意な差はなかった。ＳＯＤＧ９３Ａラットにおけるミオスタチン阻害は、この日齢間隔でのＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａラットと比較した場合、握力を有意に改善する。
【０２０２】
実施例３．２．３：ミオスタチン阻害はＳＯＤＧ９３Ａマウスおよびラットにおける脚筋肉および横隔膜の変性を遅くした
ＲＫ３５処置の筋肉形態への効果も調査した。８８日（疾患の初期段階）および約１３４日（疾患末期）ＳＯＤＧ９３Ａマウス由来の横隔膜および内側腓腹筋について、ＲＫ３５処置の効果をＰＢＳと比較し、並行して日齢の合致する野生型対照由来組織と比較して検討した。各組織における萎縮および肥大の程度を、表４に示されるように盲分析でスコア付けした（０、無し；１、僅か；２、軽度；３、中度；４、顕著；５、重篤）。ＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスは、疾患の初期段階に腓腹筋の有意な萎縮を示した（平均スコア２.０；および図４Ｂ）。観察された筋線維の縮み、中央に置かれた核およびクロマチン濃縮した核は、活発な脱神経を受けた筋肉と一致し、野生型マウスと比較して炎症の痕跡もあった（図４ＡおよびＢ）。それに対して、ＲＫ３５で処置した初期段階ＳＯＤＧ９３Ａマウス由来の腓腹筋（図４Ｃ）の萎縮は少量からゼロを示した（表４；平均スコア０．３）。これらの結果は、ＳＯＤＧ９３Ａマウスの疾患初期段階（生後８８日）における脚骨格筋の萎縮がミオスタチン阻害により有意に減少することを示す筋肉量データを裏付ける。
【０２０３】
末期段階のＳＯＤＧ９３Ａマウス由来の腓腹筋の調査により、中程度の筋萎縮がＰＢＳ（表４；平均スコア３.０）およびＲＫ３５処置（表４；平均スコア３.３）（図４ＥおよびＦ）群の双方において確認され、野生型筋肉では変性の徴候は見られなかった（図４Ｄ）。これらの結果は筋肉量データに一致し、早期疾患におけるミオスタチン阻害の保護的効果がＳＯＤＧ９３Ａマウスにおいて疾患末期まで続かないことが示される。
【０２０４】
ＰＢＳ処置またはＲＫ３５処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスのいずれかに由来する横隔膜の萎縮は、８８日目の野生型マウスと比較して少量からゼロを示した（表４；平均スコア０．６）。しかし、末期段階までに、ＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａマウス由来の横隔膜において軽度から中程度の萎縮が観察された（図４Ｈ；表４；平均スコア２．３）。それに対して、疾患末期に分析された、ＲＫ３５処置ＳＯＤＧ９３Ａマウス由来の横隔膜は、ＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａ動物と比較して有意な萎縮の徴候を示さず（表４；図４Ｈおよび４Ｉを比較）、日齢の合致する野生型マウス由来の横隔膜と類似した（図４Ｇ）。総合して、筋肉量および組織学的評価は、疾患の末期段階を通じてＲＫ３５によるミオスタチン阻害が横隔膜を保護するが、脚骨格筋の統合性は保護しないことを示す。
【表４】
0005415071.tif 000005
【０２０５】
腓腹筋および横隔膜筋における筋線維サイズの分析は同様のパターンを示した。８８日の腓腹筋由来線維径測定の頻度分布は、野生型対照マウス（図５Ｃ）と比較してＳＯＤＧ９３Ａマウスにおいてより小さい線維へのシフトを示す（図５Ａ）。ＲＫ３５処置ＳＯＤＧ９３Ａマウス由来線維径の分布（図５Ｂ）は、疾患の初期段階中の未処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスと野生型マウスとの間の中間である。しかし、末期段階までに、ＲＫ３５処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスの腓腹筋の平均線維径はＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスと有意な差はなかった（データは示さず）。ＲＫ３５処置およびＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスの双方由来腓腹筋の平均線維径は、末期段階の野生型とは有意に異なり、組織診断により見出された顕著な筋萎縮に一致する。野生型とＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスとの間の線維サイズの有意差も末期段階の横隔膜筋において明白であった。ＲＫ３５処置ＳＯＤＧ９３Ａマウス由来横隔膜筋線維サイズは平均線維径の有意なシフトを示し、野生型とＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスとの間の中間のサイズ分布をもたらした（図５Ｄ）。
【０２０６】
次に、ＳＯＤＧ９３Ａ発現の横隔膜筋の電気的活性への効果（図４Ｊおよび４Ｋ）を、臨床上の発病に対応する時点のラットモデルを用いて調査した（約１１２日；Howland et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:1604-09）。ＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａラット群に対して示されたＥＭＧは、低密度のスパイク活性ならびに何らかの異常な自発活性の存在を示す（図４Ｊ）。ＲＫ３５で処置したＳＯＤＧ９３Ａラットのスパイク活性は、野生型ラットに見出されるものに類似し、異常な自発活性の形跡はなかった。図４Ｋに示されるように、トランスジェニックＳＯＤＧ９３Ａラット由来の横隔膜筋は、機能障害を示すＥＭＧバーストスパイク比の統計上有意な低下を示した。それに対して、ＲＫ３５で処置したＳＯＤＧ９３Ａラットは、ＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａラットよりも有意に高く、日齢の合致する野生型対照と有意差のないバーストスパイク比を示した。従って、ＲＫ３５によるミオスタチン阻害は、横隔膜構造および横隔膜機能の双方を保護する際に効果的であった。
【０２０７】
実施例３．２．４：ミオスタチン阻害は前角の運動ニューロンの損失を遅らせる。
ＲＫ３５が脊髄の大型の運動ニューロンの損失を遅らせるかどうかを判定するため、ＲＫ３５またはＰＢＳで処置したＳＯＤＧ９３ＡマウスおよびＰＢＳで処置した野生型マウスからのＬ３〜５マウス腰髄の大型の運動ニューロンをカウントした。カウントは、ＲＫ３５処置の結果、ＳＯＤＧ９３Ａマウスにおいて筋肉量の増加、体重増加、握力増加および筋肉組織病理の弱毒化がもたらされる時点である、１２週（８４〜９０日齢；平均８８日）の脊髄で行った。この時点で、ＳＯＤＧ９３Ａマウスにおいて大型の運動ニューロンの有意な損失があった（２５〜４０％）（Guo et al. (2003) Hum. Mol. Genet. 12:2519-32; Sharp (2005) Neuroscience 130:897-910; Schutz et al. (2005) J. Neurosci. 25:7805-12）。
【０２０８】
ＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａマウス（図６Ｆ）における腰部の大型の運動ニューロンのカウント（図６Ａ〜Ｄ）は、同腹仔野生型対照（図６Ｅ）と比較して有意に減少した。ＲＫ３５処置は、疾患の初期段階（図６Ｇ）の運動ニューロンの損失をＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスと野生型マウスの中間のレベルまで低下させた。
【０２０９】
疾患末期までに、腰部前角の大型の運動ニューロンの有意な損失ならびにグリオーシスの増加は、ＳＯＤＧ９３Ａマウスにおいて処置にかかわらず明らかであり（図６ＩおよびＪ）、野生型マウス（図６Ｈ）には対応する変化は示されなかった。
【０２１０】
大型の運動ニューロンの全集団（３００μｍ2を超える面積）の立体解析学的カウントにより、野生型対照と比較したＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスにおいて２５％の運動ニューロン損失の傾向が明らかとなった。ＲＫ３５で処置したマウスでは、運動ニューロン損失を減速する傾向が観察された（ｐ＝０．０８）（図６Ａ）。変性の徴候（すなわち、不規則な膜および空砲の存在）を示す運動ニューロンをカウントすることを避けるため、目に見える核小体をもつ大型の運動ニューロンにカウントを制限すると、野生型対照マウス（図６Ｂ）と比較して、ＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスにおける切片あたりの大型の運動ニューロンの平均数は４０％減少し、ならびにＲＫ３５処置およびＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスの間の統計上の有意差がある（図６Ｂ）。しかし、総合して、図６ＡおよびＢに示される複合データは、１２週（８８日）齢間隔の、大型の運動ニューロンの損失およびＲＫ３５処置のこの損失への効果の双方が比較的軽微であることを示す。
【０２１１】
末期段階までに、ＲＫ３５処置およびＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスの双方における運動ニューロンカウントは、両方の分析方法で、野生型対照マウスと有意差があった（図６ＣおよびＤ）。これらのデータは、疾患の初期段階に観察されたＲＫ３５に媒介される改善点が末期段階で維持されない、上に示した骨格筋構造および機能に関するデータに一致する。
【０２１２】
実施例４
考察
ＡＬＳは、脊髄および脳幹の運動ニューロンが変性し、その後筋萎縮する、致死的かつ進行性の疾患である。運動ニューロン細胞死に関与する機構には相当な関心が向けられてきた。近年のいくつかの研究から、複数の細胞種が、神経筋接合部の細胞外微小環境において鍵となる因子の産生を制御することにより疾患の病因に関与し得ることが示唆されてきた（Bruijn et al. (2004) Annu. Rev. Neurosci. 27:723-49）。キメラマウスを用いる研究は、野生型非ニューロン細胞の存在が、変異ＳＯＤ１を発現している運動ニューロンの生存を延長し得ることを示している（Clement et al. (2003) Science 302:113-17）。これらの知見によって、生存に最適な微小環境を提供することによりニューロン変性を遅くし得る治療法の調査を行うこととした。例えば、ＩＧＦ−１、ＧＤＮＦおよびＶＥＧＦを含む、ウイルスにより発現された増殖因子の筋肉内への投与は全て、ＳＯＤＧ９３Ａマウスモデルの生存を延長することが示されている（Kaspar et al. (2003) Science 301:839-42; Azzouz et al. (2004) Nature 429:413-17; Wang et al (2002) J. Neurosci. 22:6920-28）。さらに、ＳＯＤＧ９３Ａトランスジェニックマウスモデルにおいて、ＩＧＦ−１の筋肉特異的発現が、神経筋接合部を安定化し、運動ニューロンの生存を増強し、疾患の発病および進行を遅延させることが示されており、筋肉への直接的な効果が疾病の発病および進行に影響を与え得ることが示される（Dobrowolny et al. (2005) J. Cell. Biol. 168:193-99）。筋肉代謝および運動ニューロンの脆弱性の変化はまた、ＡＬＳマウスにおいても報告されており、筋肉が疾患病態の能動的なドライバー(acrive driver)であり得るという仮説がさらに支持される（Dupois et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:11159-64）。
【０２１３】
ミオスタチン、すなわちＧＤＦ−８は、筋肉成長の内因性の阻害剤であり、その生物学的機能を、ＡｃｔｉｖｉｎＩＩｂ受容体（ＡｃｔＲＩＩｂ）の活性化により少なくとも一部分誘発し、結果として筋芽細胞の増殖および分化を抑圧する(Langley et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:49831-40; Thomas et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:40235-43）。抗ＧＤＦ−８中和抗体を用いるＧＤＦ−８機能の阻害は、健常成体マウスにおいて筋肉量および強度を増強すること、ならびに筋ジストロフィーのｍｄｘマウスモデルにおいて機能的改善をもたらすことが示されている（Whittemore et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 300:965-71; Bogdanovich et al. (2002) Nature 420:418-21）。運動ニューロン疾患の進行における筋肉の役割をより理解するために、ＧＤＦ−８に対する新規な中和抗体であり、既に記載された試薬よりも高い親和性で結合するＲＫ３５（ＪＡ１６のＩＣ50が＞１００ ｎＭであるのに対して、ＲＫ３５のＩＣ50は３ ｎＭ；Whittemore et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 300:965-71; Bogdanovich et al. (2002) Nature 420:418-21）を用い、その結果ＲＫ３５で処置した野生型マウスにおいて筋肉量のより大きな増加がもたらされた（データは示さず）。
【０２１４】
家族性ＡＬＳのＳＯＤＧ９３Ａマウスおよびラットモデルにおいて、ＲＫ３５での処置の結果、運動ニューロン疾患初期の間に体重増加ならびに筋肉量および強度の増加がもたらされた。この疾患の初期とは、ＳＯＤＧ９３Ａマウスが握力評価により測定される有意な筋肉強度の損失（Ligon et al. (2005) Neuroreport 16:533-36）および歩行異常（Wooley et al. (2005) Muscle Nerve 32:43-50）を示す日齢（生後５６〜８８日）と定義され、歩行異常は神経筋接合部の脱神経と同時に起こる（Frey et al. (2000) J. Neurosci. 20:2534-42; Fischer et al (2004) Experimental Neurology 185:232-40）。ＲＫ３５によるＧＤＦ−８阻害の結果起こる筋肉量増加は、試験した双方のげっ歯類モデルにおいて、四頭筋筋肉において最も明白であったが、腓腹筋、前脛骨筋および横隔膜においても顕著であった。後肢および前肢強度が対照と比較してＲＫ３５で処置したマウスにおいてよりゆっくりと減少したように、これらの増加は、強度の増加と十分に相関した。ＲＫ３５抗ＧＤＦ−８抗体での処置により誘導される筋肉量増加の程度は、ＧＤＦ−８遺伝子の破壊のためのヘテロ接合マウスにおいて観察される筋肉量の２５％増加と規模において同様であった（ＧＤＦ−８に関してヌルの同形接合体であるマウスからの筋肉量は野生型マウスの筋肉量の約２倍である）（McPherron (1997) Nature 387:83-90）。
【０２１５】
ＳＯＤＧ９３Ａマウスにおいて生後約８４〜８８日で、ＳＯＤＧ９３Ａラットについて約１１０日で、体重減少、歩行異常および麻痺をはじめとする、疾患の明白な徴候が明白となった。ＲＫ３５処置は、ＳＯＤＧ９３Ａマウスもラットのいずれにおいても生存を延長させなかった。疾患の初期に抗ＧＤＦ−８処置に誘導されて増加した筋肉量および強度は、ＳＯＤＧ９３Ａマウスおよびラットの双方において歩行異常および四肢の麻痺の出現を遅らせず（データは示さず）、脚筋肉量の増加も維持されなかった。
【０２１６】
しかし、疾患の初期および末期双方の、媒体で処置したＳＯＤＧ９３Ａ対照と比較して、ＲＫ３５処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスおよびラットにおける横隔膜質量の有意な増加が見出された。末期段階のＲＫ３５処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスの横隔膜筋は、質量および組織学的評価の双方で日齢の合致する野生型対照のものに相当した。ＲＫ３５処置ＳＯＤＧ９３Ａラットはまた、末期段階の横隔膜筋量の有意な増加を維持した。これらの形態学的変化に一致して、未処置ＳＯＤＧ９３Ａラット由来の横隔膜の電気生理学的分析は、変異ＳＯＤ１の発現により筋肉機能の有意な阻害がもたらされること、およびＲＫ３５での処置が横隔膜の筋肉機能を効果的に保護したことを示す。
【０２１７】
この研究では、定義されたエンドポイント（有意な四肢の麻痺を示す、立ち直り反射試験の不全）を、「末期段階」および安楽死の判定基準として用いた。従って、ＲＫ３５処置により誘導された、増強された横隔膜筋質量、減少した萎縮、および改善された電気生理学的機能が、栄養強化を施したげっ歯類に長期の寿命をもたらすかどうかは明確ではない。しかし、呼吸器機能不全がＡＬＳの患者の死亡の主な原因であるという事実を踏まえると、これらの知見は重要である可能性がある（Lechtzin et al. (2002) Amyotroph. Lateral Scler. Other Motor Neuron Disord. 3:5-13）。横隔膜機能を増強するようにデザインされたＲＫ３５などの処置は、ＡＬＳ患者において機械に補助される呼吸の必要を遅延させる可能性を有し得る。
【０２１８】
ＲＫ３５によるＧＤＦ−８阻害は、疾患早期の腰髄において運動ニューロン損失に影響を及ぼし得るが、多くの治療上の利益は見たところ疾患末期までに失われるようである。これらのデータは、筋肉に直接作用する治療法は、おそらく栄養微小環境を調節することにより筋肉に神経を分布する、運動ニューロンに利益を有し得ることを示すが、このアプローチは疾患を遅延させるためには明らかに不十分である。これらの知見は、従って、ＩＧＦの筋肉特異的イソ型の発現の結果、ＳＯＤＧ９３Ａマウスモデルにおいて運動ニューロンの損失を遅らせた、Ｄｏｂｒｏｗｏｌｎｙらの結果（(2005) J Cell. Biol. 168:193-99）、およびＩＧＦ１の筋肉へのウイルス送達が疾患の初期段階の運動ニューロン損失の低下をもたらしたＫａｓｐａｒらの結果（(2003) Science 301 : 839-42）に一致する。Ｋａｓｐａｒら（（2003）、前掲）の知見に類似して、処置の運動ニューロン生存への有益な効果は疾患末期を通じて維持されなかった。筋肉からの改善された栄養素補給は、従って、ＳＯＤＧ９３Ａモデルにおける運動ニューロン損失を保護するためには不十分である可能性がある。
【０２１９】
要約すると、家族性ＡＬＳのマウスおよびラット双方のモデルにおいて、ミオスタチンの阻害により筋肉量および強度の増強がもたらされ、それは疾患の初期を通じて維持されるが末期段階までに失われる。ミオスタチン阻害は疾患の初期段階の骨格筋における変性変化を遅くするが、麻痺の発病を遅延させず、立ち直り反射の不全で定義されるように生存を延長させず、そしてまたミオスタチン阻害は有意に運動ニューロン損失を遅らせなかった。しかし、未処置対照と比較して、抗ミオスタチン抗体で処置した動物の横隔膜筋において、形態学的および機能的差異の双方が疾患後期を通じて観察された。全体的に、本明細書に提供されるデータは、ＲＫ３５での処置による筋肉の構築の有益な効果の可能性を支持し、それは疾患過程の早期における増強された「患者の生活の質」に寄与し得る。抗ＧＤＦ−８抗体が現在臨床開発中であることを考えると、このような臨床試薬を四肢および横隔膜筋量の維持のためにＡＬＳに使用することは、さらなる調査をＡＬＳの処置のための多面的アプローチの要素として保証する。抗ＧＤＦ−８治療法とグルタミン酸アンタゴニストリルゾールなどの既存薬物、または臨床開発に入っている最新の薬剤の組合せは、筋肉量の維持を助けることによる有効性のレベルを向上させるだけでなく、全体的な患者の生活の質に有意な影響を与え得る。
【０２２０】
実施例５
ＲＫ３５に対するエピトープのマッピング
ＧＤＦ−８に対する正確な抗体エピトープを位置づけるため、配列番号１に示される成熟ＧＤＦ−８の全配列を表す４８種類の重複する１３残基のペプチドを、スポット合成技術を用いてセルロース紙上で直接合成した（例えば、Molina et al. (1996) Peptide Res. 9:151-55; Frank et al. (1992) Tetrahedron 48:9217-32）。ペプチドの重複は１１アミノ酸であった。このアレイで、システインに起因する化学的混乱を減らすため、システイン残基をセリンに置換した。ポリエチレングリコールおよびＦｍｏｃ保護アミノ酸で修飾されたセルロース膜をＡｂｉｍｅｄ社（Ｌａｇｅｎｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）より購入した。β−アラニンスペーサーを結合することによりアレイを膜上に規定し、既に記載されるように（Molina et al.、前掲；Frank et al.、前掲）、標準的なＤＩＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）／ＨＯＢｔ（ヒドロキシベンゾトリアゾール）結合化学を用いて、ペプチドを合成した。
【０２２１】
Ａｂｉｍｅｄ  ＡＳＰ  ２２２ロボットを用いて活性化アミノ酸をスポットした。洗浄および脱保護段階を手動で行い、最終の合成サイクルの後、ペプチドをＮ末端アセチル化した。ペプチド合成の後、メタノール中で１０分間、およびブロッカー（ＴＢＳＴ（０．１％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ（商標）２０）および１％（ｗ／ｖ） カゼインを含むＴｒｉｓ−緩衝生理食塩水）中で１０分間、膜を洗浄した。次に、ブロッカー中、２.５μｇ／ｍｌの抗ＧＤＦ−８抗体で１時間、穏やかに振盪しながら膜をインキュベートした。ブロッカー中で１０分間３回洗浄した後、膜をＨＲＰ−標識二次抗体（ブロッカー中０．２５μｇ／ｍｌ）で３０分間インキュベートした。次に、ブロッカーで各々３回１０分間、およびＴＢＳＴで各々２回１０分間、膜を洗浄した。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）およびデジタルカメラ（Ａｌｐｈａｎａｎｏｔｅｃｈ  Ｆｌｕｏｒｏｍａｇｅｒ）を用いて結合抗体を可視化した。図７に示されるように、ＲＫ３５エピトープはアミノ酸３０〜４０と８４〜９７との間のＧＤＦ−８の領域に位置し、特性決定されたドメインをもつＴＧＦ−βファミリー受容体の同族体とのＧＤＦ−８受容体配列の比較により予測されるように、ＧＤＦ−８  ２型受容体と相互作用することが推定される。
【０２２２】
実施例６
ＲＫ３５抗体の特性決定
ＲＫ３５をコードする重鎖可変（ＶＨ）および軽鎖可変（ＶＬ）遺伝子を、抗体産生ハイブリドーマ細胞からクローン化し、アミノ酸配列を決定した。ＲＫ３５抗体の配列データを用いて重鎖および軽鎖に最も近い生殖細胞系列配列を同定した。ＲＫ３５の軽鎖および重鎖可変領域と、最も近いヒト生殖細胞系列配列との比較を図８に示す。適切な変異は、適切な変異プライマーを用いる標準的な部位特異的変異誘発技術を用いてなされ得る。次に、抗体の変異を配列解析により確認する。ヒト化ＲＫ３５の例となるアミノ酸配列は、配列番号７（ＶＨ）および９（ＶＬ）に示され、双方とも当業者により容易に決定される核酸配列、例えば、配列番号６（ＶＨ）および８（ＶＬ）として示される核酸配列によってコードされ得る。当業者であれば、ヒト化抗体のフレームワーク中の任意かつ／または全てのアミノ酸が、例えば、抗原結合フラグメントの立体構造を維持するために元のマウスアミノ酸に変異し戻されることを理解する。抗体のＧＤＦ−８に対する親和性を維持するために役立ち得る何らかの復帰変異を含む配列番号７（ＶＨ）および配列番号９（ＶＬ）の限定されない例は、それぞれ配列番号２６および配列番号２７に示される。
【０２２３】
キメラ抗体を作製するため、ＶＨ配列を、ヒトＦｃ受容体および補体成分との結合を減少させる２つの点変異（Ｌ２３４ＡおよびＧ２３７Ａ）を含むヒトＩｇＧ１をコードする、ｐＥＤ６  ｈｕＩｇＧ１  ｍｕｔ発現ベクターにサブクローニングする（Morgan et al. (1995) immunology 86:319-24; Shields et al (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-604）。ＲＫ３５のＶＬ配列は、ｐＥＤ６  κ発現ベクターにサブクローニングされ得る。ＲＫ３５ＶＨおよびＶＬ配列を含む発現ベクターを、次にＣＯＳ−１細胞に共導入し、キメラＲＫ３５抗体を馴化培地から精製する。
【０２２４】
実施例７
筋障害の処置
ＧＤＦ−８の阻害剤、すなわちＧＤＦ−８アンタゴニスト、例えば、阻害抗体などは、２型糖尿病、耐糖能異常、メタボリック症候群（例えば、シンドロームＸ）、インスリン抵抗性（例えば、熱傷または窒素不均衡などの外傷性傷害により誘発される抵抗性）、および脂肪組織障害（例えば、肥満症）などのＧＤＦ−８に関連する代謝障害の処置に有用である。ＧＤＦ−８の阻害剤はまた、ＧＤＦ−８に関連する骨障害および筋障害、例えば、ＡＬＳ、筋ジストロフィーおよび骨関節炎の処置に有用である。抗ＧＤＦ−８抗体および本発明の抗体フラグメントは、被験体、例えば、ヒト被験体、好ましくは、ＡＬＳを患っている被験体（疾患発病時）、または確立された代謝疾患または骨／筋障害を有する被験体を処置するために用いることができる。ＧＤＦ−８に対する阻害抗体はまた、疾患の重篤度および／または症状を予防および／または低下させるために用いることができる。抗ＧＤＦ−８抗体および抗体フラグメントは、例えば、皮下に、頻繁には１日１回、低い頻度では月１回投与されると予想される。処置持続期間は、約１月（またはそれ未満）から数年の範囲である。
【０２２５】
ヒトにおいて抗ＧＤＦ−８の臨床上の有効性を試験するため、ＡＬＳを患っているかそのリスクのある被験体を同定し、無作為に処置群に割り当てる。処置群には、プラセボ群および抗体を（２またはそれ以上の群がある場合は異なる用量で）投与される１〜３またはそれ以上の群が含まれる。個体は、体重、筋肉量、および握力の変化を評価するため、将来的に、例えば、１月〜３年間経過観察される。処置を受ける個体は改善を示すことが予想される。
【０２２６】
好ましくは、１または複数の抗体の形態のＧＤＦ−８アンタゴニストは、唯一の活性化合物として、または別の化合物もしくは組成物と組み合わせて投与される。唯一の活性化合物として、または別の化合物もしくは組成物と組み合わせて投与される場合、投薬量は、好ましくは、症状の重篤度および／または疾患の進行に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである。適切な有効量は、処置を行う医師により以下の限定されない範囲のリスト：１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１００μｇ/ｋｇ、１００μｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、および５００μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇから選択され得る。例となる限定されない治療計画および起こり得る結果を表５に要約する。
【表５】
0005415071.tif 000006
【０２２７】
本明細書は、本明細書中に引用される参照文献の教示に照らして、最も完全に理解され、それらの参照文献は全て、本明細書においてその全文が参照により本明細書に組み込まれる。明細書の中の実施形態は、本発明の実例を提供するものであり、本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。当業者は、多くのその他の実施形態が特許請求される本発明により包含されること、ならびに明細書および実施例が単なる例とみなされることを理解する。
【図面の簡単な説明】
【０２２８】
【図１】ＲＫ３５抗ＧＤＦ−８抗体の特性決定を示すグラフである。Ａ．ビオチン化ＧＤＦ−８を用いるＥＬＩＳＡアッセイで測定した、ＲＫ３５抗体とＧＤＦ−８の直接結合。ＧＤＦ−８に対するＲＫ３５抗体の結合親和性（円）は４ｎＭと測定された。対照ＩｇＧは感知できる結合を示さず（正方形）。Ｂ．ＧＤＦ−８の高親和性受容体への結合に対するＲＫ３５抗体の効果。高親和性ＧＤＦ−８受容体を用いる競合ＥＬＩＳＡにおいて、ＡｃｔＲＩＩＢを用いてＲＫ３５のＧＤＦ−８阻害活性を測定した。ヒトＩｇＧ定常領域（Ｆｃ）と融合した固定化ヒトキメラタンパク質ＡｃｔＲＩＩＢとビオチン化ＧＤＦ−８の結合を、様々な濃度のＲＫ３５ｍＡｂ、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢまたは対照ＩｇＧの不在下（ひし形）または存在下で評価した。可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ受容体（正方形）および無関係なマウスＩｇＧ（三角形）をそれぞれ陽性および陰性対照として用いた。ＲＫ３５（円）は、ビオチン化ＧＤＦ−８と固定化ＡｃｔＲＩＩＢの結合をＩＣ50  約２．５ｎＭで阻害した。Ｃ．ＧＤＦ−８に誘導されるシグナル伝達の阻害。ＴＧＦ−βプロモーター−ルシフェラーゼ融合遺伝子を発現している横紋筋肉腫細胞を、様々な濃度のＲＫ３５抗体の不在下（正方形）または存在下（円）、１０ｎｇ／ｍｌのＧＤＦ−８で処理した。ＲＫ３５は、ＧＤＦ−８によるルシフェラーゼ活性の誘導を用量反応的に低下させ、ＩＣ50は０．２ｎＭであった。バックグラウンド（ひし形）シグナルは、ＧＤＦ−８を加えずに測定した。
【図２Ａ】ミオスタチンの阻害により、ＳＯＤＧ９３Ａマウスおよびラットの双方において体重の増加および筋肉量の増加がもたらされることを示すグラフである。ＲＫ３５処置（正方形）（ｎ＝１１）およびＰＢＳ処置（ひし形）（ｎ＝１１）トランスジェニックＳＯＤＧ９３ＡマウスならびにＰＢＳ処置同腹仔対照（野生型）マウス（三角形）（ｎ＝９）の体重。
【図２Ｂ】ミオスタチンの阻害により、ＳＯＤＧ９３Ａマウスおよびラットの双方において体重の増加および筋肉量の増加がもたらされることを示すグラフである。ＲＫ３５で処置した雄（円）および雌（三角形）ならびにＰＢＳ処置雄（正方形）および雌（ひし形）トランスジェニックＳＯＤＧ９３Ａラット（１群あたりｎ＝１０）の体重。
【図２Ｃ】ミオスタチンの阻害により、ＳＯＤＧ９３Ａマウスおよびラットの双方において体重の増加および筋肉量の増加がもたらされることを示すグラフである。ＲＫ３５およびＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３ＡならびにＰＢＳ処置同腹仔対照マウス（ｎ＝９〜１２）の疾患の初期段階の間の筋肉量。ＰＢＳで処置した８８日齢野生型マウス（黒色の棒）、ＰＢＳで処置したＳＯＤＧ９３Ａマウス（白色の棒）、およびＲＫ３５で処置したＳＯＤＧ９３Ａマウス（灰色の棒）の腓腹筋、前脛骨筋、四頭筋および横隔膜筋について湿重量を測定した。
【図２Ｄ】ミオスタチンの阻害により、ＳＯＤＧ９３Ａマウスおよびラットの双方において体重の増加および筋肉量の増加がもたらされることを示すグラフである。疾患の初期段階（約９５日）にＰＢＳ（白色の棒）またはＲＫ３５で処置した（灰色の棒）、ＳＯＤＧ９３Ａラットの筋肉量（１群あたりｎ＝７）。
【図２Ｅ】ミオスタチンの阻害により、ＳＯＤＧ９３Ａマウスおよびラットの双方において体重の増加および筋肉量の増加がもたらされることを示すグラフである。疾患の末期段階に（約１３４日）ＰＢＳで処置した野生型マウス（黒色の棒）、ＰＢＳで処置したＳＯＤＧ９３Ａマウス（白色の棒）、およびＲＫ３５で処置したＳＯＤＧ９３Ａマウス（灰色の棒）の筋肉量。
【図２Ｆ】ミオスタチンの阻害により、ＳＯＤＧ９３Ａマウスおよびラットの双方において体重の増加および筋肉量の増加がもたらされることを示すグラフである。疾患の末期段階に（約１２８日）ＰＢＳ（白色の棒）またはＲＫ３５（灰色の棒）で処置したＳＯＤＧ９３Ａラットの筋肉量。アスタリスク（＊）は、示された群間の統計上の（ｐ＜０．０５）差を表す。
【図３】ミオスタチン阻害がＳＯＤＧ９３Ａマウスおよびラットにおいて筋肉強度を高めることを示すグラフである。Ａ．ＰＢＳ処置野生型マウス（三角形）、およびＰＢＳ（ひし形）またはＲＫ３５（正方形）のいずれかで処置したＳＯＤＧ９３Ａマウスにおける、年齢を関数とする後肢握力。後肢握力はキログラム（ｋｇ）で表す圧迫として表される。Ｂ．ＰＢＳ処置野生型マウス（三角形）、およびＰＢＳ（ひし形）またはＲＫ３５（正方形）のいずれかで処置したＳＯＤＧ９３Ａマウスにおける、年齢を関数とする前肢握力。Ｃ．ＰＢＳで処置した野生型ラット（ＷＴ＋ＰＢＳ）、またはＰＢＳ（ＳＯＤ＋ＰＢＳ）もしくはＲＫ３５で処置した（ＳＯＤ＋ＲＫ３５）ＳＯＤＧ９３Ａラットにおける前肢握力。ラットに関して、測定は９５〜１１０日齢の間の、疾患の初期段階に対応する４週の間隔の間に行われた。前肢握力は、キログラム（ｋｇ）で表す張力として表される。アスタリスク（＊）は、示された群間の統計上の有意差を表す（ｐ＜０．０００１）。
【図４−１】ＳＯＤＧ９３Ａげっ歯類における筋肉構造および機能へのミオスタチン阻害の効果を示す。８８日目のマウスの内側腓腹筋のヘマトキシリンおよびエオシン染色は、（Ａ）野生型または（Ｃ）ＲＫ３５処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスのいずれかと比較しても（Ｂ）ＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスにおいて有意な萎縮を示す。末期段階の（Ｅ）ＰＢＳ処置および（Ｆ）ＲＫ３５処置ＳＯＤＧ９３Ａマウス双方の内側腓腹筋のヘマトキシリンおよびエオシン染色は、（Ｄ）野生型マウス腓腹筋と比較して、双方とも有意な筋萎縮および中央に位置する核（矢印）を示す。それぞれ末期段階の（Ｇ）ＰＢＳ処置野生型マウスおよび（Ｈ）ＰＢＳまたは（Ｉ）ＲＫ３５処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスの横隔膜のヘマトキシリンおよびエオシン染色。萎縮性筋線維の例に（「ａ」）で印をつける。パネルＨ中のアスタリスクは線維の分裂を表す。図示される棒は、パネルＡ〜Ｆでの５０μｍおよびパネルＧ〜Ｉでの２５μｍのスケールを表す。
【図４−２】パネルＪ：ＰＢＳで処置した野生型ラット（ＷＴ＋ＰＢＳ）またはＰＢＳ（ＳＯＤ＋ＰＢＳ）もしくはＲＫ３５（ＳＯＤ＋ＲＫ３５）で処置したＳＯＤＧ９３Ａラットの横隔膜筋から記録した、吸気バーストを示すＥＭＧの干渉パターン。パネルＫ：野生型ラットの横隔膜筋（ｎ＝４）、および媒体（ＰＢＳ、ｎ＝９）もしくはＲＫ３５（ｎ＝８）のいずれかで処置したＳＯＤＧ９３ＡラットのＥＭＧのバーストスパイク比（Ｈｚ）。アスタリスク（＊）は示された群間の統計上の有意差を表す（ｐ＜０．０５）。
【図５】ＲＫ３５処置による、ＳＯＤＧ９３Ａマウスにおける疾患の初期段階を通した腓腹筋の、さらに疾患末期を通した横隔膜の筋線維の直径の減少を示す。線維径を、８８日目のＰＢＳ処置（Ａ）およびＲＫ３５処置（Ｂ）ＳＯＤＧ９３ＡマウスならびにＰＢＳ処置野生型マウス（Ｃ）の腓腹筋での形態計測により測定した。ＡＮＯＶＡによる平均値は有意差があった（ｐ＜０．０００１）；Ｔｕｋｅｙの多重比較事後検定による対比較も有意であった（ｐ＜０．００１）。末期段階までに、ＰＢＳ処置およびＲＫ３５処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスの腓腹筋において線維分布に有意差は観察されなかった（データは示さず）。Ｄ．日齢の合致する野生型対照マウスと比較した、末期段階のＰＢＳ処置およびＲＫ３５処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスの横隔膜筋の線維の直径の分析。ＲＫ３５処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスの横隔膜筋は、末期段階のＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスと野生型対照マウスとの間の線維径分布の中間を示す。ＡＮＯＶＡによる平均値は有意差があった（ｐ＜０．０００１）；Ｔｕｋｅｙの多重比較事後検定による対比較も有意であった（ｐ＜０．００１）。１群につき３つの筋肉を分析した；Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎソフトウェアを用いて、少なくとも２００の線維の短径（minor axis）の最大直径の直線的測定を行った。線維径を２０μｍ間隔の値域ごとにまとめ、各筋肉群について頻度ヒストグラムを作成した。
【図６−１】脊髄の前角の運動ニューロン減少における抗ミオスタチン処置の効果を示す。日齢の合致する野生型マウス（ＷＴ＋ＰＢＳ）と比較した、ＰＢＳ（ＳＯＤ＋ＰＢＳ）またはＲＫ３５（ＳＯＤ＋ＲＫ３５）のいずれかで処置した疾患の初期段階（Ａ）および末期段階（Ｃ）のＳＯＤＧ９３Ａマウスの前角のＬ３〜５領域由来の大型の運動ニューロン（３００μｍ2より大きな領域）の立体解析学的解析が示される。ＲＫ３５処置は、疾患の初期段階（Ａ）における運動ニューロン減少の逆転傾向を示した（ｐ＝０．０８）。目に見える核小体をもつ大型の健常な運動ニューロンの個別計数を、日齢の合致する野生型マウスと比較した、ＰＢＳまたはＲＫ３５のいずれかで処置した、疾患の（Ｂ）初期段階および（Ｄ）末期段階のＳＯＤＧ９３Ａマウスからのニッスル染色切片Ｌ３〜５で行った。各切片に対して、双方の前角を計数し（１動物あたり合計２０前角）、データを前角あたりの大型運動ニューロンの平均数で表す。アスタリスク（＊）は、示された群間の統計上の有意差を表す（Ｐ＜０．００１）。
【図６−２】脊髄の前角の運動ニューロン減少における抗ミオスタチン処置の効果を示す。ニッスル染色前角切片の代表的な画像（拡大率２０倍）を、疾患初期（８８日）（Ｅ〜Ｇ）および末期段階（１３４日；Ｈ〜Ｊ）に解析した、ＰＢＳで処置した野生型マウス（ＥおよびＨ）、ＰＢＳで処置したＳＯＤＧ９３Ａマウス（ＦおよびＩ）、およびＲＫ３５で処理したＳＯＤＧ９３Ａマウス（ＧおよびＪ）について示す。棒は２００μｍのスケールを表す。
【図７】ＲＫ３５抗体に関するＧＤＦ−８のエピトープマッピングを示す。ＲＫ３５のＧＤＦ−８上の結合部位を、ヒトＧＤＦ−８の重複する１３アミノ酸ペプチドを用いて同定した。ＧＤＦ−８とのＲＫ３５接触部位を太字で示す。
【図８】ＲＫ３５の軽鎖および重鎖可変領域（それぞれ、ＶＬおよびＶＨ）の、ヒト生殖細胞系列フレームワークＤＰＫ９およびＤＰ−４７それぞれとのアラインメント。ヒト化ＲＫ３５（ＨｕＲＫ３５）領域で変化しているマウスＲＫ３５のアミノ酸（ＭＲＫ３５）可変鎖はアスタリスク（＊）で示され、太字で表されている；ＲＫ３５の相補性決定領域は線で囲まれ、下線が引かれている。
【図１】
0005415071.tif 000007
【図２Ａ】
0005415071.tif 000008
【図２Ｂ】
0005415071.tif 000009
【図２Ｃ】
0005415071.tif 000010
【図２Ｄ】
0005415071.tif 000011
【図２Ｅ】
0005415071.tif 000012
【図２Ｆ】
0005415071.tif 000013
【図３】
0005415071.tif 000014
【図４−１】
0005415071.tif 000015
【図４−２】
0005415071.tif 000016
【図５】
0005415071.tif 000017
【図６−１】
0005415071.tif 000018
【図６−２】
0005415071.tif 000019
【図７】
0005415071.tif 000020
【図８】
0005415071.tif 000021
【配列表】
0005415071000001.xml