(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
代謝物を含むサンプルの中から、計測対象となる所定の代謝物を予め設定する代謝物設定工程と、
前記予め設定された代謝物の物質量に基づく値の基準値からの乖離度合を、異常度として取得する異常度取得工程と、
を備えた代謝物の異常度の取得方法であって、
前記異常度取得工程は、
代謝物を含むサンプルである対照サンプルについての質量分析を利用して得られる前記代謝物の物質量に関する情報の中から、前記代謝物設定工程により予め設定された代謝物に対応する情報を抽出・参照し、前記参照される情報に基づいて前記代謝物の物質量に基づく値の基準値を取得する第１工程と、
前記計測対象となる代謝物を含むサンプルである供試サンプルについての質量分析を利用して得られる前記代謝物の物質量に関する情報の中から、前記代謝物設定工程により予め設定された代謝物に対応する情報を抽出・参照し、前記参照される情報に基づいて前記代謝物の物質量に基づく値を取得する第２工程と、
前記第１工程にて取得された基準値と、前記第２工程にて取得された物質量に基づく値とに基づいて、前記乖離度合を異常度として取得する第３工程と、
を備え、
前記第１工程は、
前記対照サンプル中の複数の代謝物を化合物毎に分離するとともに、前記分離された代謝物毎の前記質量分析により前記分離された代謝物毎のマススペクトルを取得する工程を複数回実行し、
前記複数回の実行毎に取得されたマススペクトルに基づく濃度の対数値の平均値を、前記基準値として取得するように構成され、
前記第２工程は、
前記供試サンプル中の複数の代謝物を化合物毎に分離するとともに、前記分離された代謝物毎の前記質量分析により前記分離された代謝物毎のマススペクトルを取得し、
前記取得されたマススペクトルに基づいて濃度を取得するように構成され、
前記第３工程は、
前記第１工程にて取得された前記平均値と、前記第２工程にて取得された前記濃度の対数値とに基づいて、前記乖離度合を異常度として取得するように構成された
代謝物の異常度の取得方法。
【請求項２】
請求項１に記載の代謝物の異常度の取得方法において、
前記第１工程は、
前記基準値としての前記平均値に加え、
前記複数回の実行毎に取得された各濃度の対数値の標準偏差をも取得するように構成され、
前記第３工程は、
前記乖離度合として、
前記第１工程にて取得された前記平均値と、前記第２工程にて取得された前記濃度の対数値との偏差を、前記第１工程にて取得された前記標準偏差で除して得られた値を用いるように構成された
代謝物の異常度の取得方法。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載の代謝物の異常度の取得方法において、
前記第１工程、及び前記第２工程は、
前記対照サンプル及び前記供試サンプル中の複数の代謝物を化合物毎に分離するに際し、
クロマトグラフを利用するように構成された
代謝物の異常度の取得方法。
【請求項４】
請求項１乃至請求項３の何れか一項に記載の代謝物の異常度の取得方法において、
前記第１工程、及び前記第２工程は、
前記濃度の取得に際し、
前記代謝物の質量分析により得られる前記代謝物の質量スペクトルであって、ｍ／ｚと検出強度との関係を表す質量スペクトルにおけるピークを選択し、
前記選択されたピークの大きさに基づいて前記代謝物の濃度を取得するように構成された
代謝物の異常度の取得方法。
【請求項５】
請求項４に記載の代謝物の異常度の取得方法において、
前記第２工程は、
前記質量スペクトルのピークの選択に際し、
１種の前記代謝物についての３つの異なる前記ｍ／ｚに対応する３つのピークをそれぞれ選択し、
前記濃度の取得に際し、
前記選択された各ピークの大きさに基づいて１種の前記代謝物についての３つの異なる濃度をそれぞれ取得するように構成され、
前記第３工程は、
前記第１工程にて取得された前記平均値と、前記第２工程にて取得された前記３つの異なる濃度の対数値とに基づいて、１種の前記代謝物についての３つの前記乖離度合を３つの異常度として取得するように構成された
代謝物の異常度の取得方法。
【請求項６】
請求項１乃至請求項５の何れか一項に記載の代謝物の異常度の取得方法、又は、代謝異常の判定方法をコンピュータに実行させる、コンピュータで読み取り可能なプログラム。
【請求項７】
代謝物を含むサンプルの中から、計測対象となる所定の代謝物を予め設定する代謝物設定手段と、
前記予め設定された代謝物の物質量に基づく値の基準値からの乖離度合を、異常度として取得する異常度取得手段と、
を備えた代謝物の異常度の取得装置において、
前記異常度取得手段は、
代謝物を含むサンプルである対照サンプルについての質量分析を利用して得られる前記代謝物の物質量に関する情報の中から、前記代謝物設定工程により予め設定された代謝物に対応する情報を抽出・参照し、前記参照される情報に基づいて前記代謝物の物質量に基づく値の基準値を取得する第１手段と
前記計測対象となる代謝物を含むサンプルである供試サンプルについての質量分析を利用して得られる前記代謝物の物質量に関する情報の中から、前記代謝物設定工程により予め設定された代謝物に対応する情報を抽出・参照し、前記参照される情報に基づいて前記代謝物の物質量に基づく値を取得する第２手段と、
前記第１手段にて取得された基準値と、前記第２手段にて取得された物質量に基づく値とに基づいて、前記乖離度合を異常度として取得する第３手段と、
を備え、
前記第１手段は、
前記対照サンプル中の複数の代謝物を化合物毎に分離するとともに、前記分離された代謝物毎の前記質量分析により前記分離された代謝物毎のマススペクトルを取得する工程を複数回実行し、
前記複数回の実行毎に取得されたマススペクトルに基づく濃度の対数値の平均値を、前記基準値として取得するように構成され、
前記第２手段は、
前記供試サンプル中の複数の代謝物を化合物毎に分離するとともに、前記分離された代謝物毎の前記質量分析により前記分離された代謝物毎のマススペクトルを取得し、
前記取得されたマススペクトルに基づいて濃度を取得するように構成され、
前記第３手段は、
前記第１手段にて取得された前記平均値と、前記第２手段にて取得された前記濃度の対数値とに基づいて、前記乖離度合を異常度として取得するように構成された
代謝物の異常度の取得装置。
【請求項８】
代謝物を含むサンプルの中から、計測対象となる所定の代謝物を予め設定する代謝物設定工程と、
前記予め設定された代謝物の物質量に基づく値の基準値からの乖離度合を、異常度として取得する異常度取得工程と、
を備え、
前記異常度取得工程は、
代謝物を含むサンプルである対照サンプルについての質量分析を利用して得られる前記代謝物の物質量に関する情報の中から、前記代謝物設定工程により予め設定された代謝物に対応する情報を抽出・参照し、前記参照される情報に基づいて前記代謝物の物質量に基づく値の基準値を取得する第１工程と、
前記計測対象となる代謝物を含むサンプルである供試サンプルについての質量分析を利用して得られる前記代謝物の物質量に関する情報の中から、前記代謝物設定工程により予め設定された代謝物に対応する情報を抽出・参照し、前記参照される情報に基づいて前記代謝物の物質量に基づく値を取得する第２工程と、
前記第１工程にて取得された基準値と、前記第２工程にて取得された物質量に基づく値とに基づいて、前記乖離度合を異常度として取得する第３工程と、
を備え、
前記第１工程は、
前記対照サンプル中の複数の代謝物を化合物毎に分離するとともに、前記分離された代謝物毎の前記質量分析により前記分離された代謝物毎のマススペクトルを取得する工程を複数回実行し、
前記複数回の実行毎に取得されたマススペクトルに基づく濃度の対数値の平均値を、前記基準値として取得するように構成され、
前記第２工程は、
前記供試サンプル中の複数の代謝物を化合物毎に分離するとともに、前記分離された代謝物毎の前記質量分析により前記分離された代謝物毎のマススペクトルを取得し、
前記取得されたマススペクトルに基づいて濃度を取得するように構成され、
前記第３工程は、
前記第１工程にて取得された前記平均値と、前記第２工程にて取得された前記濃度の対数値とに基づいて、前記乖離度合を異常度として取得するように構成され、
前記第３工程にて取得された前記異常度と、
前記異常度と代謝異常の有無との関係、及び／又は、前記異常度と代謝異常発生の可能性の有無との関係を規定するデータと、
に基づいて前記代謝異常の有無、及び／又は、前記代謝異常発生の可能性の有無を判定する第４工程と、
前記第４工程の判定結果に基づいて診断を行う第５工程と、
をコンピュータに実行させる、コンピュータで読み取り可能なプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、代謝全体像（以下、「メタボローム」と称呼する。）から得られる情報の解析（以下、「メタボローム解析」と称呼する。）や、有機酸を含む化合物群からの情報の取得等において、代謝物の濃度変動を異常度として取得する方法、その異常度に基づく代謝異常の判定方法、並びにそれらを実現するためのプログラム及び装置に関する。また、上記代謝異常の判定に基づく診断プログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、メタボローム解析によれば、代謝経路から生成される代謝物が解析されることによって、代謝経路の探索、生態の生理的変化を指標する化合物を見出すこと等が可能となってきている。このようなメタボロームの網羅的な解析であるメタボロミクスは、ゲノミクス、プロテオミクスと同様、診断や創薬に有効であると考えられている。
【０００３】
しかしながら、メタボロミクスは、その対象となる化合物が非常に多岐に亘るため、実用化が困難な状況にある。例えば、ゲノミクスの対象である遺伝子は、高分子であるものの、それを構成する核酸塩基の種類はたった４種類である。また、プロテオミクスの対象である蛋白質も、高分子であるものの、それを構成するアミノ酸の種類は２０種類である。
【０００４】
このように、遺伝子・蛋白質は、多種多様な情報・機能を有するもののその組成につき大きな単純性を有している。一方、メタボロミクスの対象である代謝物は、その種類が数千種類である。このことは、メタボロミクスにおけるダイナミックレンジが、ゲノミクスにおけるものに比して１０６程度となることを意味している。即ち、メタボロミクスにおいては、信頼できる情報の取得が困難である。このため、メタボロミクスは、生命科学のツールの観点から、包括的で迅速、安価、実用性が高いというポテンシャルを有しているにもかかわらず、有用な生命情報を高精度、迅速、安価に提供することが困難であるという問題があった。
【０００５】
上記を鑑み、問題解決への種々のアプローチがなされている。例えば、下記特許文献に示すように、メタボローム解析においては、分離技術と質量分析（ＭＳ）を組み合わせた計測手法が提案されている。分離技術としては、例えば、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、キャピラリ・電気泳動（ＣＥ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等が挙げられる。以下、分離技術毎における特徴について説明する。
【０００６】
ＣＥ／ＭＳ、及びＨＰＬＣ／ＭＳは、ＧＣ／ＭＳに比して、同定精度と検出感度の点で劣る。ＣＥ／ＭＳ及びＨＰＬＣ／ＭＳの両者で得られる物質の構造情報量が、ＧＣ／ＭＳで得られるものに比して少なく、同両者での物質量を示すシグナル強度も、ＧＣ／ＭＳによるものに比して小さいからである。同定精度の向上に際し、更にＭＳを追加する手法も考えられるが、現状では装置コストとデータ解析時間が増大するという課題がある。
【０００７】
加えて、ＣＥ／ＭＳ、及びＨＰＬＣ／ＭＳにおける計測値は、一般的に互換性が小さく固有の装置に頼ることが多い。これは、クロマト保持時間の変動が比較的大きく、変動補正が困難であることに起因している。これに対し、ＧＣ／ＭＳでの計測は互換性が大きい。これによれば、異なるメーカーの装置で取得したデータのやりとり等が可能である。例えば、海外でＧＣ／ＭＳにて計測し、その計測データを国内に転送する。転送されたデータが国内にて処理されて、国内データと比較される、といったことも可能である。また、ＧＣ／ＭＳ装置の価格やその維持費も、ＣＥ／ＭＳ、及びＨＰＬＣ／ＭＳに比して１/３程度である。
【０００８】
一方、ＣＥ／ＭＳ、及びＨＰＬＣ／ＭＳにて計測できる代謝物のうち、ＧＣ／ＭＳでは計測できないものがある。即ち、ＧＣ／ＭＳは、上述したようにデータ解析時間や互換性等の点で優位であるが、代謝物の種類によっては計測ができないというデメリットも有する。
【０００９】
他方、分析・計測に要する時間に関しても、分離技術毎に特徴がある。ＧＣ／ＭＳでは、１０００種を超える成分について、１種類のカラムを用いて分析・測定ができる。その所要時間は、０．５〜１時間程度である。これに対し、ＬＣ／ＭＳでは、１０００種を超える成分については、数種類のカラムを要し、分析・測定の所要時間は数時間となる。ＣＥ／ＭＳでは、網羅的な分析のため、陽イオンと陰イオンの分析毎にそれぞれ対応するモードを変更して計測がなされ、中性分子についてはＬＣ／ＭＳが用いられて計測がなされる。即ち、計３回の計測がなされ、その所要時間は２時間以上となる。以上がメタボロミクスにおける分離技術の特徴である。
【００１０】
このように、メタボロミクスでは分析の網羅性が強調されるため、しばしば網羅性の高い機器が評価される傾向にある。おもうに、各機器の優位性を生かしつつ、必要があれば他の機器により補完する手法が望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００９−５０３４８０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ところで、メタボロームは化合物の集合であって、それらの濃度の相違が大きい。一般に、数百種をこえる、濃度の相違が大きい化合物の同定は困難である。従って、現行のメタボローム解析では、ノンターゲット手法での多変量解析が用いられる場合が多い。多変量解析のうち最も一般的に用いられるＰＣＡ解析では、多数の変量（ここでは代謝物）を含むサンプル間の相関性を判断するために、変量の数だけ存在する次元を、人が視覚的に理解できる２次元にまで圧縮する。この際、サンプル間の分散を最大に保つように２次元にまで圧縮するが、サンプルの持つ全ての情報を２次元上に投影することは不可能である。また、解析の性格上、変動の大きな変量に結果が左右されやすく、細かな変動を検出するのは難しい。
【００１３】
このような解析過程をもつ多変量解析では、機器分析データが通常に有するような計測誤差でも解析結果に大きな影響を与える。従って、解析前に実施する計測誤差の補正等に多大な時間を要する。他方、その補正等を省略すると誤った結果が生じる可能性が大きい。このようなことから、多変量解析は、解析者のスキルによって結果が左右される場合が多く、多量のサンプルを安定的に解析するような場合には不向きと言える。更に、バイオマーカー検索に成功しても、その成分の同定ができず実用性に欠ける場合もある。このため、メタボローム解析を用いた安定的な診断支援に際し、上記解析の結果は、診断の根拠となり得るほどの信頼性を有していない場合が多い。
【００１４】
メタボロミクスの実用性担保の観点から、同定及び定量に加え、供試サンプル中の各代謝物の対照サンプルに対する量的な異常の度合い（以下、「異常度」と称呼する。）をも取得することが望まれている。また、上記異常度の取得にあたり、ハイスループットな取得方法が望まれる。
【００１５】
以上を鑑み、本発明の目的は、代謝物を含むサンプルの計測で得られた保持時間情報、ｍ／ｚ、及び検出強度からなる情報取得に続いて、評価の代謝物を含むサンプルの計測にあたり計測対象となる代謝物の異常度を取得する方法であって、ハイスループットな取得方法となり得る方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明にかかる代謝物の異常度の取得方法の特徴は、代謝物を含むサンプルの中から、計測対象（即ち、評価対象と等価）となる所定の代謝物（ａｎａｌｙｔｅ）を予め設定する代謝物設定工程と、予め設定された代謝物の物質量に基づく値の基準値からの乖離度合を、異常度として取得する異常度取得工程と、を備えたことにある。
【００１７】
ここにおいて、「物質量に基づく値」とは、例えば、物質量そのものであってもよいし、物質量に対応する質量分析のアウトプット（例えば、検出強度等）であってもよい。また、「物質量に基づく値」とは、濃度（例えば、サンプル中全物質量に対する対象の物質量の割合等）そのものであってもよいし、濃度の対数値であってもよく、これらに限定されない。例えば、サンプルが尿である場合には、濃度は、同一尿のクレアチニン濃度、あるいはクレアチニンとクレアチンの濃度の和で補正した値（除した値）、あるいはさらに、試料に添加した内標準物質（ＩＳ）の強度に対する相対値をさらにクレアチニン、あるいはクレアチニンとクレアチンの和で除した値、あるいは安定同位体希釈法などで得た定量値をクレアチニン、あるいはクレアチニンとクレアチンの値の和で除した値、あるいは血漿や血清では試料に添加した内標準物質の強度に対する相対値を単位容積（例えば１ｍｌ等）あたりで示したもの、あるいはその試料に含まれる蛋白量で補正したものなどである。また、「基準値からの乖離度合」とは、例えば、基準値と物質量そのものとの偏差であってもよいし、基準値と物質量に対応する質量分析のアウトプットとの比較であってもよい。また、「基準値からの乖離度合」とは、濃度そのものの偏差であってもよいし、基準値と濃度の対数値の偏差であってもよく、これらに限定されない。
【００１８】
上記構成によれば、例えば、予想される症状や、予想される代謝の態様、予想される代謝経路、予想される酵素反応等に応じて分析・評価すべき代謝物を予め設定することができる。即ち、代謝物（化合物）が予めターゲットとして登録され、この登録されたもののみが限定して定量・検索され得る。また、同定できる最大種類のａｎａｌｙｔｅを登録し、包括的な代謝異常の一斉スクリーニング、或いは見逃しのない化学診断を実行できる。他方、未知物質も定義のうえ登録して、未知のバイオマーカーの高感度探索、或いは新しい代謝疾患の発見にも活用できる。
【００１９】
また、例えば、基準値を正常なサンプルにおける濃度等に設定しておくことで、異常度が異常度合を表す指標となり得る。このため、容易に異常判定がなされ得る。以上により、ハイスループットな異常度の取得がなされ得る。
【００２０】
上記本発明にかかる代謝物の異常度の取得方法においては、異常度取得工程は、代謝物を含むサンプルである対照サンプルについての質量分析を利用して得られる代謝物の物質量に関する情報の中から、代謝物設定工程により予め設定された代謝物に対応する情報を抽出・参照し、参照される情報に基づいて代謝物の物質量に基づく値の基準値を取得する第１工程と、計測対象となる代謝物を含むサンプルである供試サンプルについての質量分析を利用して得られる代謝物の物質量に関する情報の中から、代謝物設定工程により予め設定された代謝物に対応する情報を抽出・参照し、参照される情報に基づいて代謝物の物質量に基づく値を取得する第２工程と、第１工程にて取得された基準値と、第２工程にて取得された物質量に基づく値とに基づいて、乖離度合を異常度として取得する第３工程と、を備えると好適である。
【００２１】
ここにおいて、質量分析を利用した計測と代謝物の評価とは、例えば、代謝物（１〜１５００種類）が計測されている生データベース（計測データ）を用い、代謝物を評価すべきターゲットとして量的乖離度を取得するものである。ここで、ターゲットの代謝物の種類は１、１００、５００、或いは１０００種類であってもよい。また、量的乖離度は、健常、対照集団、或いは対照からの量的乖離度である。これらの評価値の集合、或いは評価値の全体から、被検サンプルの特徴、ひいてはそこにおいて障害されている反応を特定できる。
【００２２】
上記構成によれば、代謝物を含むサンプルの質量分析によって、化合物が定性的かつ定量的に分析され得る。このため、物質量に基づく値が容易かつ精度良く取得され得る。また、この物質量に基づく値に基づいて異常度が取得されるので、異常度も容易かつ精度良く取得され得る。
【００２３】
上記本発明にかかる代謝物の異常度の取得方法においては、第１工程が、対照サンプル中の複数の代謝物を化合物毎に分離するとともに、分離された代謝物毎の質量分析により分離された代謝物毎のマススペクトルを取得する工程を複数回実行し、複数回の実行毎に取得されたマススペクトルに基づく濃度の対数値の平均値を、基準値として取得するように構成され、第２工程が、供試サンプル中の複数の代謝物を化合物毎に分離するとともに、分離された代謝物毎の質量分析により分離された代謝物毎のマススペクトルを取得し、取得されたマススペクトルに基づいて濃度を取得するように構成され、第３工程が、第１工程にて取得された平均値と、第２工程にて取得された濃度の対数値とに基づいて、乖離度合を異常度として取得するように構成されると好適である。
【００２４】
また、第１工程、及び第２工程においては、サンプル中の複数の代謝物を化合物毎に分離するに際し、クロマトグラフが利用されてもよい。クロマトグラフィーとしては、例えば、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が用いられてもよい。また、分離に際して、キャピラリ・電気泳動（ＣＥ）が利用されてもよい。
【００２５】
上記構成によれば、分離操作により、サンプル中の化合物毎に質量分析がなされ得る。このためサンプル中に複数の化合物が含有されている場合であっても、より精度良く濃度が取得され得る。また、基準値として濃度の対数値の平均値が用いられるため、基準値が容易な計算で一意に決定され得る。
【００２６】
ここにおいて、「乖離度合」としては、平均値と濃度の対数値とに基づく値であればよく、例えば、平均値と濃度の対数値との偏差等であり、これに限定されない。
【００２７】
上記本発明にかかる代謝物の異常度の取得方法においては、第１工程が、基準値としての平均値に加え、複数回の実行毎に取得された各濃度の対数値の標準偏差をも取得するように構成され、第３工程が、乖離度合として、第１工程にて取得された平均値と、第２工程にて取得された濃度の対数値との偏差を、第１工程にて取得された標準偏差で除して得られた値を用いるように構成されると好適である。
【００２８】
上記構成により取得される異常度は、平均値からの濃度の乖離が大きいほど大きい値となる。即ち、異常度（の絶対値）が大きいほど、代謝異常の度合いが大きいと判定することができる。ここで、取得される異常度は、標準偏差にも基づいているため、統計学的に信頼性の高い値となり得る。以上のことから、上記構成によれば、異常度の大きさを、信頼性の高い判定指標とすることができる。ここで、評価値としては、減少（又は増加）しているか否か、或いは減少（又は、増加）の度合いが極端であるか否か、という指標が、代謝障害部位の推定や決定に重要な場合も多い。従って、減少の異常度もマイナスの記号を付して、可能な限り正確に取得されることが好ましい。
【００２９】
上記本発明にかかる代謝物の異常度の取得方法においては、第１工程、及び第２工程が、濃度の取得に際し、代謝物の質量分析により得られる代謝物の質量スペクトルであって、ｍ／ｚと検出強度との関係を表す質量スペクトルにおけるピークを選択し、選択されたピークの大きさに基づいて代謝物の濃度を取得するように構成されると好適である。
【００３０】
この場合、例えば、連続的に低質量から高質量までのイオン強度を表わす複数のピークを逐次選択していき、生データとして記憶しておいてもよい。これに基づいて、濃度や異常度の取得がなされてもよい。
【００３１】
一方、連続的に低質量から高質量までピークを逐次選択するのに代えて、例えば、第２工程が、質量スペクトルのピークの選択に際し、１種の代謝物についての３つの異なるｍ／ｚに対応する３つのピークをそれぞれ選択し、濃度の取得に際し、選択された各ピークの大きさに基づいて１種の代謝物についての３つの異なる濃度をそれぞれ取得するように構成され、第３工程が、第１工程にて取得された平均値と、第２工程にて取得された３つの異なる濃度の対数値とに基づいて、１種の代謝物についての３つの乖離度合を３つの異常度として取得するように構成されてもよい。また、ピーク選択数が３であるのに代えて、化合物に応じて１〜３であってもよい。
【００３２】
通常、分離が完全に達成されることは少なく、物質の溶出時間（ＲＴ）のマススペクトルには通常２、３の成分が混在している場合が多い。そのため、マススペクトル中の特徴的なｍ／ｚを３つ、又は２つ設定しておくことが好ましい。上記構成はかかる知見に基づくものである。なお、イオンがひとつしかない場合は、１つの質量が設定されるか、或いはそのイオンとその同位体イオンの１、２種からなる、２、３種類の質量が設定されてもよい。
【００３３】
上記構成によれば、より正確に代謝物の濃度を取得することができる。従って、正確な濃度を用いて異常度が取得され得る。
【００３４】
本発明にかかる代謝異常の判定方法の特徴は、上述した代謝物の異常度の取得方法により取得された異常度と、異常度と代謝異常の有無との関係、及び／又は、異常度と代謝異常発生の可能性の有無との関係を規定するデータと、に基づいて代謝異常の有無、及び／又は、代謝異常発生の可能性の有無を判定する工程を備えたことにある。
【００３５】
上記構成によれば、代謝異常の判定に際し、ハイスループットに取得され得る異常度が用いられる。従って、容易、且つ、精度良く代謝異常の有無、及び／又は、代謝異常発生の可能性の有無を判定することができる。
【００３６】
上記本発明にかかる代謝異常の判定方法においては、代謝物設定工程にて設定された代謝物の種類が所定の数よりも小さい場合、異常度取得工程が、予め設定された代謝物の物質量に基づく値を取得するように構成され、代謝異常の有無、及び／又は、代謝異常発生の可能性の有無を判定するに際し、異常度と、データとに基づいて判定するのに代えて、異常度取得工程にて取得された代謝物の物質量に基づく値と、所定の値との比較に基づいて代謝異常の有無、及び／又は、代謝異常発生の可能性の有無を判定する工程を備えることが好適である。ここにおいて、「物質量に基づく値」とは、上述したのと同様の意味を表わす。
【００３７】
上記構成によれば、設定される代謝物の物質量或いは濃度が少ない（又は、低い）、或いは無い（不検出）である場合には、異常度を取得するまでもなく、代謝異常の判定に際し物質量に基づく値が利用される。従って、設定され得る代謝物の数に応じて、計算負荷が軽減され得る。
【００３８】
また、本発明にかかるプログラムの特徴は、上述した代謝物の異常度の取得方法、又は、上述した代謝異常の判定方法をコンピュータに実行させる、コンピュータで読み取り可能に構成されたことにある。
【００３９】
また、本発明にかかる異常度の取得装置の特徴は、代謝物を含むサンプルの中から、所定の代謝物を予め設定する代謝物設定手段と、予め設定された代謝物の物質量に基づく値の基準値からの乖離度合を、異常度として取得する異常度取得手段とを備え、異常度取得手段が、代謝物を含むサンプルである対照サンプルについての質量分析を利用して得られる代謝物の物質量に関する情報の中から、代謝物設定工程により予め設定された代謝物に対応する情報を抽出・参照し、参照される情報に基づいて代謝物の物質量に基づく値の基準値を取得する第１手段と、代謝物を含むサンプルである供試サンプルについての質量分析を利用して得られる代謝物の物質量に関する情報の中から、代謝物設定工程により予め設定された代謝物に対応する情報を抽出・参照し、参照される情報に基づいて代謝物の物質量に基づく値を取得する第２手段と、第１手段にて取得された基準値と、第２手段にて取得された物質量に基づく値とに基づいて、乖離度合を異常度として取得する第３手段と、を備えたことにある。
【００４０】
また、本発明にかかるプログラムの特徴は、代謝物を含むサンプルの中から、計測対象となる所定の代謝物を予め設定する代謝物設定工程と、予め設定された代謝物の物質量に基づく値の基準値からの乖離度合を、異常度として取得する異常度取得工程とを備え、異常度取得工程が、代謝物を含むサンプルである対照サンプルについての質量分析を利用して得られる代謝物の物質量に関する情報の中から、代謝物設定工程により予め設定された代謝物に対応する情報を抽出・参照し、参照される情報に基づいて代謝物の物質量に基づく値の基準値を取得する第１工程と、計測対象となる代謝物を含むサンプルである供試サンプルについての質量分析を利用して得られる代謝物の物質量に関する情報の中から、代謝物設定工程により予め設定された代謝物に対応する情報を抽出・参照し、参照される情報に基づいて代謝物の物質量に基づく値を取得する第２工程と、第１工程にて取得された基準値と、第２工程にて取得された物質量に基づく値とに基づいて、乖離度合を異常度として取得する第３工程とを備え、第３工程にて取得された異常度と、異常度と代謝異常の有無との関係、及び／又は、異常度と代謝異常発生の可能性の有無との関係を規定するデータとに基づいて代謝異常の有無、及び／又は、代謝異常発生の可能性の有無を判定する第４工程と、第４工程の判定結果に基づいて診断を行う第５工程とをコンピュータに実行させる、コンピュータで読み取り可能に構成されたことにある。
【発明の効果】
【００４１】
本発明によれば、例えば、予想される症状や、予想される代謝の態様、予想される酵素反応、代謝障害の部位(経路或いは反応)等に応じて分析・評価すべき代謝物を予め設定することができる。即ち、代謝物（化合物）が予めターゲットとして登録され、この登録されたもののみが定量・検索され得る。また、同定できる最大種類のａｎａｌｙｔｅの登録、あるいは、未知物質も定義のうえの登録により、包括的な代謝異常の判定、見逃しのない化学診断、或いは一斉スクリーニングが実施され得る。また、新しい代謝疾患の発見、未知のバイオマーカーの高感度探索、或いは内因性・外因性による代謝障害の部位(経路或いは反応)特定にも活用できる。
【００４２】
また、例えば、基準値を正常なサンプルにおける濃度等に設定しておくことで、異常度が異常度合を表す指標となり得る。このため、容易に異常判定がなされ得る。以上により、ハイスループットな異常度の取得がなされ得る。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】本発明の実施形態にかかる、異常度の取得ならびに代謝異常の判定の工程を示すフローチャートである。
【図２】本発明の実施形態にかかる、代謝物の濃度対数値の平均値と、代謝物の濃度対数値の標準偏差の取得工程を示すフローチャートである。
【図３】マススペクトルにおけるピーク選択を説明するための図である。
【図４】本発明の実施形態にかかる、メタボローム解析を利用して代謝異常の有無を判定するためのシステムを表わす図である。
【図５】４つの供試サンプルにおける１６種類の代謝物毎の異常度をまとめた図である。
【図６】プロピオン酸血症における介入の実例を説明するための図である。
【図７】生体肝移植前後の尿代謝物の解析の実例を説明するための図である。
【符号の説明】
【００４４】
４０  異常度の取得装置
４１  インターフェイス
４２  バス
４３  ＲＯＭ
４４  ＲＡＭ
４５  ＣＰＵ
【発明を実施するための形態】
【００４５】
以下、本発明による代謝物の異常度の取得の方法、代謝異常の判定方法、及びそれを実現するための装置の実施形態について図面を参照しつつ説明する。
【００４６】
（異常度取得ならびに代謝異常の判定の概要）
先ず、異常度取得ならびに代謝異常の判定の概要について説明する。図１は、異常度の取得ならびに代謝異常の判定の工程を示すフローチャートである。図２は、対照サンプルにおける、平均値及び標準偏差の取得の工程を示すフローチャートである。なお、ここにおいて、対照サンプルとは、代謝が正常である場合のサンプルである。また、平均値、及び標準偏差とは、対照サンプル中の代謝物毎の濃度の対数値の平均値、及び標準偏差である。
【００４７】
メタボローム解析としてサンプル中の代謝物濃度を取得し、代謝異常の判定を実行する場合、図１のステップ１０５の工程からスタートする。即ち、ステップ１０５にて、供試サンプルの分析前処理が実施される。なお、サンプルが尿である場合については、その前処理工程を後に詳述する。
【００４８】
次に、ステップ１１０に進み、ターゲットの設定・登録が実施される。即ち、代謝物の種類が設定・登録される。具体的には、上記供試サンプル中の全代謝物のうち、異常判定に必要と思われる代謝物の種類が設定・登録される。例えば、予想される病因に応じて代謝物の種類を設定・登録してもよい。或いはそれらを含むより多くの代謝物をターゲットとして設定してもよい。いずれにしても、代謝物が計測装置を利用して、下記の方法で計測される生データベース（計測データ）が使用され、ついで解析される。
【００４９】
次いで、ステップ１１５に進んで、ＧＣ／ＭＳが利用されて代謝物のマススペクトルが取得・保存される。ここにおいて、ＧＣ／ＭＳは、ガスクロマトグラフと質量分析との組合せを意味している。ここでは、先ず、供試サンプルがＧＣ装置に所定量注入される。そして、代謝物は、その成分毎に分離された後、順次ＭＳ装置に導入される。そして、ＭＳ装置が利用されて、低質量から高質量までのイオンの質量ｍ／ｚとそのイオン量、クロマト保持時間情報、とのデータセットからなるデータが取得されデータベース（後述するＲＡＭ４４に相当）に保存されるようになっている。なお、このＧＣ／ＭＳ計測において、予め選択されたｍ/ｚのイオン量が計測されてもよい。
【００５０】
次いで、ステップ１２０に進み、予めターゲットとして設定・登録された代謝物（ａｎａｌｙｔｅ）の濃度を取得する。なお、濃度の取得に代えて、物質量、相対値等の取得であってもよい。続いて、ステップ１２１に進み、データベース（後述するＲＯＭ４３に相当）に保存されているマススペクトルを引き出して、自動ライブラリの一致度合が取得・表示される。これにより、一致度合によるだけでなく、操作者の目視により化合物を確認することも出来る。以下、濃度の取得プロセスについて説明する。
【００５１】
図３は、所定の代謝物のマススペクトルを示す図である。本例では、マススペクトルにおける３つの検出強度ピークが選択される。即ち、３つのｍ／ｚに対応するピークが選択される。ここにおいて、ピークの選択としては、例えば、検出強度が大きい順に３つ選択されてもよい。そして、既知の濃度におけるピーク値と、上記選択されたピーク値との比較により、濃度が算出・取得される。濃度の算出としては、例えば、既知の濃度のピーク面積と、上記選択されたピーク面積との比であってもよいし、既知の濃度のピーク値（高さ）と、上記選択されたピーク値（高さ）との比であってもよい。これにより、１つの代謝物につき、３つのｍ／ｚに対応する３通りの濃度が取得されることになる。なお、ひとつの化合物、或いはａｎａｌｙｔｅに設定されるイオンについては、イオンの量そのものであってもよい。また、標準のマススペクトルにおける全イオン量に対する当該イオンの強度即ち、Σ％で補正したイオン量であってもよい。後者では複数のイオン間の相対強度の違いが補正される。以上が濃度の取得プロセスの説明である。なお、本システムにおいては、ターゲット、ターゲットに対応するm／zと保持時間、及び保持時間の窓巾が設定される。また、ライブラリのマススペクトルに対しては保持時間、及び保持時間の窓巾が設定されるようになっている。
【００５２】
続いて、ステップ１２５に進み、ステップ１１０にて設定された代謝物のターゲットの設定・登録数が所定の数よりも大きいか否かが判定される。この判定に用いられる所定の数は、逐次変更されてもよい。ここにおいて、所定の数は、本例では、後述する第１ターゲット群Ｐの数と第２ターゲット群Ｑの数との和である。
【００５３】
ステップ１２５にて「Ｙｅｓ」と判定された場合、ステップ１３０に進み、上記ターゲットとして予め設定・登録された代謝物の濃度から、異常度ｎが取得される。具体的には、下記（１）式に基づいて異常度ｎが算出される。
ｎ＝（Ｃｏｎｃ−Ｍｅａｎ）／ＳＤ  ・・・（１）
【００５４】
上記（１）式において、上記Ｍｅａｎ、及び上記ＳＤは、上記図２のフローチャートを経て取得・記憶される値であって、対照サンプルに含まれる代謝物濃度の対数変換値の平均値、及び標準偏差である。上記Ｃｏｎｃは、上記ステップ１２０にて取得された濃度の対数変換値である。これにより、代謝物毎（あるいは代謝物の設定イオン毎）に、異常度ｎが算出・取得されるようになっている。
【００５５】
そして、ステップ１３５に進んで、上記ステップ１３０にて取得された異常度ｎに基づき、供試サンプルの提供元における代謝異常の有無が判定される。具体的には、予めデータベース等に記憶されている代謝物毎の異常度が検索・読み出しが実行され、上記ステップ１３０にて取得された異常度ｎと比較された後ルーチンがいったん終了する。上記異常度の読み出しに際し、より具体的には、下記データベースが利用される。即ち、代謝異常あるいは代謝経路の障害と、異常度ｎとの関連データベースが予め用意され、参照されるようになっている。このデータベースには５、４０、１３０・・種類の代謝異常或いは代謝障害部位と化合物の関連ファイルが様々な形で様々な目的で多種類保存されている。ここにおいて、代謝異常あるいは代謝経路の障害がある場合においては、化合物が増加或いは減少する。このため、この増加或いは減少の度合が異常度ｎに相当する。従って、上記データベースは、代謝異常あるいは代謝経路の障害と、化合物の増加或いは減少（又は、化合物の増加度合い或いは減少度合い）との関連を表わすものと等価である。
【００５６】
他方、上記ステップ１２５にて「Ｎｏ」と判定された場合、ステップ１４０に進み、上記ターゲットとして予め設定・登録された代謝物の濃度（又は物質量）に基づき、代謝異常であるか否かの判定がなされる。この場合、濃度が所定の値よりも大きい場合に、代謝異常であると判定され、ルーチンがいったん終了する。即ち、この場合、異常度ｎが取得されることなく、また、異常度ｎに基づく代謝異常の判定がなされない。
【００５７】
対照サンプルにおける、平均値及び標準偏差の取得を実行する場合、図２のステップ２０５の工程からスタートする。即ち、ステップ２０５にて、対照サンプルの分析前処理が実施される。前処理は、図１のステップ１０５におけるものと同様である。
【００５８】
次に、ステップ２１０に進み、ターゲットの設定・登録が実施される。本工程は、上記ステップ１１０と同様のものである。
【００５９】
次いで、ステップ２１５に進んで、上記図１のステップ１１５と同様、ＧＣ／ＭＳが利用されて代謝物のマススペクトルが取得・保存される。即ち、低質量から高質量までのイオンの強度、クロマト保持時間情報、質量ｍ／ｚと検出強度とのデータセットからなるデータが取得されデータベース（後述するＲＡＭ４４に相当）に保存されるようになっている。例えば、ｍ／ｚ＝５０〜８００のフルスペクトルを計測しＲＡＭ４４に保存しておき、この生データを用いるようにしてもよい。この場合、混在成分のイオンがあるとはいえ、保存されているマススペクトルを引き出して、自動ライブラリの一致度合によるだけでなく、操作者の目視により化合物を確認することも出来る。
【００６０】
続いて、ステップ２２０に進んで、サンプルの計測回数がＮ回（「Ｎ」は２以上の自然数）に到達したか否かが判定される。ステップ２２０にて「Ｎｏ」と判定された場合、ステップ２１５に再び進み、上記設定・登録された代謝物毎の生データが取得される。即ち、サンプルのデータ取得回数がＮ回に到達するまで、ステップ２１５、２２０の工程が繰り返し実行されるようになっている。
【００６１】
そして、ステップ２２０にて「Ｙｅｓ」と判定されると、ステップ２２５に進んで、ステップ２１０にて設定・登録されたターゲットが、上記Ｍｅａｎ、及び上記ＳＤの両方の取得が可能な第１ターゲット群Ｐ、上記Ｍｅａｎ、及び上記ＳＤの両方の取得が不能な第２ターゲット群Ｑとに区別される。加えて、第１ターゲット群Ｐにおいては上記Ｍｅａｎ、及び上記ＳＤが取得され、第２ターゲット群Ｑにおいてはｒａｎｇｅ、或いは上記Ｍｅａnのみが取得される。区別方法としては、任意のターゲットにおける正規分布算出が不適と判定される場合（ゼロである場合も含む）、そのターゲットは第２ターゲット群Ｑに振り分けられる。一方、任意のターゲットにおける正規分布算出が妥当である場合は、第１ターゲット群Ｐに振り分けられる。ここにおいて、Ｍｅａｎは、第１ターゲット群Ｐに含まれるａｎａｌｙｔｅにおける、上述した繰り返し処理により取得されたマススペクトルから求められる濃度をそれぞれ対数変換した値の平均値（算術平均）である。ＳＤは、第１ターゲット群Ｐに含まれるａｎａｌｙｔｅにおける、上述した繰り返し処理により取得されたマススペクトルから求められる濃度をそれぞれ対数変換した値の標準偏差である。即ち、このＭｅａｎ、及びＳＤは、上記設定・登録されたターゲットのうち、第１ターゲット群Ｐに含まれるａｎａｌｙｔｅ毎に対応して算出・取得されるようになっている。
【００６２】
次に、ステップ２３０に進み、上記ステップ２２５にて取得された上記Ｍｅａｎ及び上記ＳＤが、メモリ等に記憶された後、ルーチンがいったん終了する。ここで記憶されている上記Ｍｅａｎ、及び上記ＳＤは、図１のステップ１２５における異常度ｎの算出に使用されるようになっている。本手法によれば、ある代謝異常があるか否かの特定や、異常の有無のスクリーニングが迅速化され得る。また、可能性のある（又は、可能性のない）代謝異常の範囲を示すことで、その範囲内（又は、範囲外）の異常の特定を迅速化することができる。
【００６３】
なお、代謝異常、或いは代謝経路上の障害部位が特定され、その特定に基づいて、その異常、或いはその異常により起きる不都合を軽減するための介入がなされることがある。本手法によれば、その介入を評価或いはモニターすることができる。また、介入の度合いを是正したり、調整することができる。例えば、介入のあり方を是正する手法としては、以下の実例が挙げられる。即ち、発症前の新生児期にｍｅｔｈｙｌｃｉｔｒａｔｅを指標に安定同位体希釈法で定量し、この異常度取得法で発見されたプロピオン酸血症の児が数例いた。特殊ミルクなどの治療が開始されたが、その後のモニタリングにおいて、ｍｅｔｈｙｌｃｉｔｒａｔｅの異常度取得(メチルマロン酸血症では、ｍｅｔｈｙｌｍａｌｏｎａｔｅも追加)に加え、ｐｒｏｐｉｏｎｙｌ−ＣｏＡの前駆体であり、必須アミノ酸であるVal、Ile、Met、Thrなどを含むアミノ酸を安定同位体希釈法で定量し、これらの異常度が取得されるとよい。
【００６４】
また、本発明は症状などの出現以前に、代謝物が変動する多くの代謝異常の検出に用いることができる。具体的には、出生前診断、発症前診断、或いは無症状であるが、その異常を知ることが有益である代謝異常の検出に用いられる。以上が、異常度取得ならびに代謝異常の判定の概要の説明である。
【００６５】
（異常度の取得装置の説明）
次に、上記説明した方法を実現するための装置について説明する。図４は、メタボローム解析を利用して代謝異常の有無を判定するためのシステムを表わす図である。本システムは、分離部と、質量分析部と、異常度の取得装置４０とを備えたものであり、このシステムにて代謝物或いはメタボロームの解析がなされるようになっている。
【００６６】
上記装置４０は、インターフェイス４１と、バス４２と、ＲＯＭ４３と、ＲＡＭ４４と、ＣＰＵ４５と、を備えている周知のコンピュータである。インターフェイス４１及びバス４２は、電気的に互いに接続されている。ＲＯＭ４３、ＲＡＭ４４、ＣＰＵ４５、表示部４６、及び入力部４７は、バス４２を介して互いに電気的に接続されている。また、上記質量分析部は、インターフェイス４１を介してバス４２と電気的に接続されることで、上記質量分析部から送出される信号が、上記判定装置４０にて処理され得るようになっている。更に、上記ＧＣ／ＭＳは、代謝物を含むサンプルを分離部へ注入可能に構成されている。
【００６７】
ＲＯＭ４３には、上述した図１のステップ１１０〜１３５の処理を実行するためのプログラム、及び図２のステップ２１０〜２３０の処理を実行するためのプログラムが格納されている。また、ＲＯＭ４３には、予め病因あるいは代謝障害部位と、代謝物の種類及びその異常度ｎとの関係を規定するデータベースが記憶されている。上述した図１のステップ１３０では、取得された異常度ｎと、このデータベースとに基づき、代謝異常の有無が判定されるようになっている。
【００６８】
ＲＡＭ４４には、図１、及び図２にて設定されるターゲットとしての代謝物が、一時的に登録（記憶）されるようになっている（図１のステップ１１０、及び図２のステップ２１０を参照）。更に、ＲＡＭ４４には、図２にて取得されるＭｅａｎ、及びＳＤが一時的に記憶されるようになっている（図２のステップ２３０を参照）。
【００６９】
ＣＰＵ４５は、ＲＯＭ４３に格納されている上記プログラムにおける処理を実行するようになっている。また、本システムが備える表示部（図示しない）にて、ＧＣ／ＭＳにおけるマススペクトルや、取得された異常度等、判定に必要な情報が可視化されるようになっている。さらに、本システムが備える入力部（図示しない）にてターゲットとしての代謝物を設定・登録するための情報を入力可能に構成されている。以上が、メタボローム解析を利用して代謝異常の有無を判定するためのシステムの説明である。
【００７０】
（実際の作動）
次に、上述のように構成された装置４０の実際の作動について説明する。本例では、供試サンプルとして新生児の尿を用い、先天代謝異常を特定する場合について説明する。この場合、高アンモニア血症であるという情報は有用であるが必須ではない。
【００７１】
＜Ｍｅａｎ及びＳＤの取得における装置の作動＞
Ｍｅａｎ及びＳＤの取得は、対照サンプルを用いて実行される。これは、供試サンプルにおける化合物の異常度ｎの取得の前に実行される。ここにおける対照サンプルは、新生児が被検者の場合には新生児の尿であり、健常で、代謝異常がないことが確認された新生児尿のサンプルである。このように、被験者の年齢と対照者の年齢を近しいものとすることが好ましく、このような対照をＡｇｅ−ｍａｔｃｈｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌと称呼する。ここにおいて、対照サンプル数は、例えば１００とすることができ、大きいほどより真値に近い平均値Ｍｅａｎ，標準偏差ＳＤを得るのに寄与し得る。
【００７２】
先ず、対照サンプルとしての尿を前処理する（図２のステップ２０５を参照）。この前処理は、後述する供試サンプルの前処理と同じ処理である。
【００７３】
そして、対照サンプルをＧＣ／ＭＳの導入口に導入することで、ＧＣ／ＭＳによる分析・測定が開始される。他方で、上記ＣＰＵ４５は、ＲＯＭ４３に格納されている上記プログラムにおける処理を実行する。即ち、上述した図２のステップ２１０〜２３０の処理が順に実行されていく。即ち、サンプル数１００（Ｎ＝１００）に応じて濃度が１００回取得されていくようになっている。次に、ターゲットとしての代謝物の種類を選定し、その情報を入力部４７に入力する。
【００７４】
これにより、代謝物毎の濃度の対数値の平均値Ｍｅａｎ、及び代謝物毎の濃度の対数値の標準偏差ＳＤがそれぞれ取得される（上述した図２のステップ２２５を参照）。そして、取得されたＭｅａｎ、及びＳＤは、ＲＡＭ４４に一時的に記憶される（上述した図２のステップ２３０を参照）。この記憶されたＭｅａｎ、及びＳＤは、異常度ｎの代謝物の種類毎における取得の際に、同代謝物の種類に応じて読み出されて使用されるようになっている。以上が、Ｍｅａｎ及びＳＤの取得における装置の作動の説明である。
【００７５】
＜異常度の取得と、代謝異常の判定における装置の作動＞
先ず、供試サンプルとしての尿を前処理する（図１のステップ１０５を参照）。即ち、３７℃のもと上記尿をウレアーゼと１０分間インキュベートする。次いで、アルコールにて除蛋白を行い、凝縮乾固させた後、トリメチルシリル化を実施する。この前処理により、ＧＣ／ＭＳにて、有機酸、アミノ酸、クレアチニン、糖、糖アルコール、糖酸、ピリミジン、プリン、ヌクレオシド等を一斉に分析可能となる。
【００７６】
そして、供試サンプルをＧＣ／ＭＳの導入口に導入することで、ＧＣ／ＭＳによる分析・測定が開始される。他方で、上記ＣＰＵ４５は、ＲＯＭ４３に格納されている上記プログラムにおける処理を実行する。即ち、上述した図１のステップ１１０〜１３０の処理が順に実行されていく。
【００７７】
これにより、代謝物毎の異常度ｎがそれぞれ取得されていくようになっている（上述した図１の１２５ステップを参照）。なお、異常度ｎの取得に際しては、ＲＡＭ４４に記憶されているＭｅａｎ及びＳＤの値が用いられる。
【００７８】
例えば、１３０種類の代謝障害の判定のためには、予めターゲットとして２００の代謝物が選定される。他方、より狭い範囲の代謝障害の判定では、例えば、高アンモニア血症を伴う先天代謝異常の場合には、略４０種類の病因が存在するので、この４０種類の代謝障害の判定のために、予めターゲットとして数十の代謝物を選定しておいてもよいし、より多くを選定してもよい。そして、その情報を入力部４７に入力する。
【００７９】
以下、高アンモニア血症を認める４名の新生児に対して、メタボローム解析を行った実例を示す。尿メタボローム解析の結果、原発性高アンモニア血症と呼ばれる代謝異常群のひとつであるカルバミルリン酸合成酵素欠損症（ＣＰＳＤ）が疑われ、ＣＰＳＤとの、代謝物レベルの、いわゆる化学診断がなされた。次いで、この化学診断によれば、カルバミルリン酸合成酵素(ＣＰＳ)の責任遺伝子の解析を行えば、１塩基変異によるミスセンス変異などを含む何らかの塩基配列異常が確認される可能性が極めて高いと予測された。そこで、染色体上の位置が分かっているＣＰＳの責任遺伝子の解析を、解析の同意が得られた３名すべてに行った。その結果、新規遺伝子変異をふくむ変異が確認された。つまり、代謝物に基づいて、反応の障害部位が明らかにされ、ＣＰＳ遺伝子の異常が、結果的に酵素触媒下の化学反応の明らかな障害をきたすものはすべて検索される。これが、メタボローム手法が包括的、実際的と評価される所以である。
【００８０】
図５は、本手法による異常度ｎの取得の例を示した図であって、４つの供試サンプルにおける上記１６種類の化合物（ａｎａｌｙｔｅ）毎の異常度ｎとＡｌａｎｉｎｅ／ｌａｃｔａｔｅでは異常度ｎの比を示している。Ｏｒｏｔａｔｅは従来の有機溶媒抽出法による前処理とそれに続くＧＣ／ＭＳ計測で、Ｕｒａｃｉｌ (Ｕｒａｃｉｌはピリミジンの１種で、中性であるため回収される)と同様、分析できる。しかし、Ｏｒｏｔａｔｅは極性の強い有機酸であるため、回収率が低く、従って、定量性にかける。一方、このような分画操作を経ない前処理ではＯｒｏｔａｔｅの感度、定量性が優れる。Ｏｒｏｔａｔｅ、Ｕｒａｃｉｌは、ＣＰＳＤ有無判定のための第１指標群である。そのため、両物質については、安定同位体希釈法、さらには同位体補正式も用いるなどして、より正確な計測・定量が行われる。両者は高アンモニア血症の有無にかかわらず、多くの代謝障害部位の判定にその増減が参照されるべき化合物であるので、このように定量され、さらに２００のターゲットファイルにも含まれており、これらの異常度ｎは自動的に取得される。
【００８１】
また、プロリン (Ｐｒｏ)、グルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アラニン（Ａｌａ）、グリシン（Ｇｌｙ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、リシン（Ｌｙｓ）、α−アミノアジピン酸（αＡＡ）などのアミノ酸は、ＣＰＳＤのための第２指標群を構成する。ＣＰＳＤである場合、第２指標群の異常度ｎは高値であり、多くが３以上を示す。しかし、計測誤差或いは代謝変動の理由で２以下のものがあっても許容される。α−アミノ酪酸などの多くのアミノ酸もＣＰＳＤでは増加傾向を示す。
【００８２】
また、3−メチルグルタコン酸（３−Ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｔａｃｏｎａｔｅ（1））、3−メチルグルタコン酸（３−Ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｔａｃｏｎａｔｅ（２））、５−オキソプロリン（５ＯＰ）、Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｔａｍａｔｅ （ＮＡＧｌｕ）、および、乳酸（Ｌａｃｔａｔｅ）などの有機酸は、ＣＰＳＤのための第３指標群を構成する。ＣＰＳＤである場合、Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｔａｍａｔｅを除き、その異常度ｎは著明に増加する。３−メチルグルタコン酸の増加は他の多くの代謝異常でも認められるので、有機酸のみの分析、或いは３−メチルグルタコン酸のみの増減から、代謝異常の有無、特定、鑑別はなされるべきではない。５−オキソプロリン（５ＯＰ）はＣＰＳＤでは著明に増加する(本疾患では増加しなければならない、実際、図５において、ｃａｓｅ 1では異常度は９．３ときわめて大きい。一方、この患児ではグルタミンが０である。グルタミンの誘導体の５−オキソプロリン（５ＯＰ）の有機酸が９．３と大きく、これはグルタミン増加と見なすことができる。つまり、グルタミンとしての見かけの増加がなくとも、ＣＰＳＤは
除外しない。
【００８３】
このように、代謝物あるいはａｎａｌｙｔｅについて、その値、範囲、或いは異常度から、一義的に増加或いは減少、あるいは異常の有り無しに振り分けることはせず、異常度つきのターゲットのリストが作成され、これらn値を統合的に評価して判定される。そのためにこれらのn値が取得されていることが、重要である。空腹、感染などのストレス下にあっては、代謝系はそうでないときと大きく変わることがあるので、これらのリストから本質的な情報を抽出、選択することが必要である。
【００８４】
次に、Ｌａｃｔａｔｅも増加する。実際、ＣＰＳＤでは誤って原発性高乳酸血症が疑われるほどにＬａｃｔａｔｅが増加することがある。しかし、ｐｙｒｕｖａｔｅ がアミノ基転移を受けて生ずるＡｌａｎｉｎｅ（第２指標群） が増加しており、Ａｌａ／Ｌａｃｔａｔｅの異常度nの比をとると１を越えることが多い。従って、乳酸のみでなく、第１−第３指標群を総合し、その異常度や物質量などを統合的に捉えることで、判断がなされる。
【００８５】
また、図５において、第１指標群のＯｒｏｔａｔｅ、Ｕｒａｃｉｌにおける異常度ｎは多くが「２」以下、あるいはどちらかといえばマイナスであって、図５の実際のデータでは負の異常度を示している。ここにおいて、第２指標群は多くが４以上のｎ値を示すが、計測誤差或いは代謝の変動で４以下のものがあっても許容される。第３指標群を構成する３−メチルグルタコン酸（１，２）の異常度ｎは著明に大きい。５−オキソプロリン（５ＯＰ）も大きいことが必須条件であり、これが大きいときＧｌｎが増加していなくとも、ＣＰＳＤを除外しない。
【００８６】
従来の有機酸あるいはアミノ酸分析（解析）ではＣＰＳＤを効果的にスクリーニングあるいは特定できず、代謝物解析はＣＰＳＤの診断支援に有用でないと考えられている。さらに、これらの代謝物の異常度を全て取得したり、そのリストが作成されることはなかった。しかし、Ｏｒｏｔａｔｅを特に安定同位体希釈法で求め、第１指標としたこと、その異常度を取得したこと、３−メチルグルタコン酸、５−オキソプロリンなどの有機酸を重要な指標としたこと、同一試料のアミノ酸も同一計測で評価し、それらが全体として増加すべきであること、但し、Ｇｌｎのような従来、重要かつ必須の指標とされていたものが、代謝変動、体内外での、或いは分析中の分解、分析誤差などで低値を示しても、このひとつだけで、除外してはいけないと考えること、などなど、第１−第３指標群を総合し、個々の代謝物の異常度（或いは物質量）を統合的に捉えることでＣＰＳＤと判定できる。
【００８７】
８種の原発性高アンモニア血症のうち、ｏｒｏｔａｔｅが増加、或いは増加する傾向のある６種の代謝異常がある。これらにおいても、先の第１指標群が重要である。ただし、異常度nは逆に、多くの場合著しく大きい。Ｏｒｏｔａｔｅに加え、ｏｒｏｔｉｄｉｎｅ、ｕｒｉｄｉｎｅなどのヌクレオシドや、β−ｕｒｅｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｔｅやβ−ｕｒｅｉｄｏｓｕｃｃｉｎａｔｅなどのウレイドが増加する。アミノ酸である第2群はおおむね同様の増加を示す。続発性高アンモニア血症には、ｍｅｔｈｙｌｃｉｔｒａｔｅ、ｍｅｔｈｙｌｍａｌｏｎａｔｅなどが増加する１０種以上の代謝異常（有機酸血症と呼ばれる）が知られており、二次的に高アンモニア血症をきたすことがある。これらも、２００の代謝物の設定で鑑別あるいは除外できる。
【００８８】
これらの指標物質は極性あるいは低極性有機酸、アミノ酸、核酸塩基、ヌクレオシド、ウレイドなど、多岐のクラスの化合物であり、従来、各クラス毎に化合物の計測を要した。各クラス毎の化合物群、複数のクラスの化合物群いずれでも、それらの異常度を含むリストが作成されることはなく、また、これらが統合的に評価されることはなかった。本方法によれば、１回の代謝物計測と、その解析を通して、代謝物あるいは指標物質の物質量、濃度、あるいは変動の度合いの自動一斉取得と、その結果を統合的に捉え、代謝異常についての判定が成される。このような一斉計測、一斉異常度取得、統合評価により、上記図５における４つの供試サンプルすべてが、ＣＰＳＤであると判定される。以上が異常度の取得と、装置の作動の説明である。
【００８９】
なお、本例においては、異常度の取得装置４０にて取得される異常度ｎに基づき、代謝異常の有無等の判定（即ち、診断）が人によりなされているが、これに代えて、装置４０が、上記判定や診断のプログラムがＲＯＭ４３に組み込まれるように構成されてもよい。
【００９０】
以下、図６を参照しながら、プロピオン酸血症における介入の実例について説明する。新生児の尿の代謝物解析から、ｍｅｔｈｙｌｃｉｔｒａｔｅを第１指標にプロピオン酸血症と判定し、その判定をもとに責任遺伝子について、家族の同意を得て遺伝子解析がなされ、ｐｒｏｐｉｏｎｙｌ−ＣｏＡ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅに対応する遺伝子の変異（１塩基変異の、しかも新規変異であって、その後、日本人に多い変異であることが分かった）が確認された児が数例いる。図６は、その１例に於いて、当該特殊ミルクなどの食餌療法による介入が、生後まもなく開始され、その間、継続しているモニタリングのデータである。
【００９１】
Ｍｅｔｈｙｌｃｉｔｒａｔｅと３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎａｔｅは当該疾患における指標(マーカー)と考えられているが、この表から、Ｍｅｔｈｙｌｃｉｔｒａｔｅが３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎａｔｅより、マーカーとしてはるかに優れることがわかる（有機溶媒抽出法では極性の強いＭｅｔｈｙｌｃｉｔｒａｔｅの回収率が悪く、定量性にかけるため、３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎａｔｅと等価な指標と考えられており、そのために、スクリーニングや化学診断において誤ることがあったり（偽陰性など）、診断が迅速になされないことがある。さらに、当該疾患の第１指標であるＭｅｔｈｙｌｃｉｔｒａｔｅが指標とさえ設定されないことがある）。Ｍｅｔｈｙｌｃｉｔｒａｔｅの回収率の高い前処理で、しかも、安定同位体希釈法で定量し、異常度を取得することによって、日本人に多い当該疾患の軽症型でも、あるいは発症前でも、あるいは寛解期に於いてさえ、化学診断がなされる。
【００９２】
当該代謝異常ではｐｒｏｐｉｏｎｙｌ−ＣｏＡの代謝（カルボキシル化）に関わる酵素の機能低下によって、その反応は障害され、その結果、ｐｒｏｐｉｏｎｙｌ−ＣｏＡが蓄積する。高濃度のｐｒｏｐｉｏｎｙｌ−ＣｏＡは生体に様々な影響を及ぼすとされている。一方、蓄積したｐｒｏｐｉｏｎｙｌ−ＣｏＡの副反応によりｍｅｔｈｙｌｃｉｔｒａｔｅが生成される。さて、食餌療法などによって、ｐｒｏｐｉｏｎｙｌ−ＣｏＡの前駆体であるアミノ酸を制限することにより、ｐｒｏｐｉｏｎｙｌ−ＣｏＡの蓄積が緩和され、生体への悪影響が軽減される。しかし、これらのアミノ酸は栄養学的に必須であるので、制限しすぎると、生体として大きな不都合をきたす。従って、過剰でなく、健常範囲であり、不足しないことが重要である。そのためには、これらの値をこの異常度として取得、評価することが、好適である。
【００９３】
ここにおいて、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙは安定同位体希釈法で濃度を求めている。なお、ＧｌｙとＬｅｕは参考に計測している。５才時、Ｖａｌ、Ｉｌｅの異常度nが−２．６、−３．０と小さいが、このとき、Ｍｅｔｈｙｌｃｉｔｒａｔｅは未だ５．８と大きい。このことから、Ｍｅｔｈｙｌｃｉｔｒａｔｅのみをモニタリングの指標とせず、あるいは、たとえば、その値を４以下、あるいは３以下などに合わせることをせず、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒを含むアミノ酸とともに、綜合的な評価が成されるとよい。その評価にも、異常度の一斉取得が好適である。
【００９４】
このような異常度取得、しかも、安定同位体標識化合物或いは極めて、構造類似の化合物を内標準物質として、物質量を測り、或いは定量値を求め、その異常度を取得することは、例えば、糖尿病のマーカーの異常度の一斉取得であれば、その発症前、治療中のモニタリング、或いは、その予後予測に好適である。
【００９５】
以上説明したように、本発明によれば、計測・取得された代謝物の中から、出来るだけ多くの代謝物についての信頼できる情報をうるために、出来るだけ多くの代謝物（化合物）が予めターゲットとして登録され、この登録されたもののみが限定して定量・検索され得る。また、対照サンプルにおける代謝物濃度の対数値の平均値Ｍｅａｎ、及び標準偏差ＳＤが利用されて異常度ｎが算出され得る。このため、異常度ｎが代謝の異常度合を表す指標となり得、容易に代謝異常の有無が判定され得る。以上のことから、ハイスループットな異常度ｎの取得、及びその異常度ｎを利用した代謝異常の有無の判定をすることができる。
【００９６】
この方法により、健常群と異なるある疾患のバイオマーカーの探索、例えば、ある種の心疾患、ある種のがんなどのマーカー検索、疾患の進展を左右するバイオマーカーの探索、医療現場で起きる可能性のある後天的代謝異常の検索など、代謝物が変動する全ての課題の問題把握から解決に用いることができる。たとえば、生体肝移植（ＬＲＬＴ）前後の血漿中指標物質の濃度の変動から、臓器移植の初期の変化を端的に迅速に捉えることが出来る。また、再生医療の評価にも同じく用いることができる。
【００９７】
以下、図７を参照しながら、上記ＬＲＬT前後の尿代謝物の解析の実例について説明する。図７（ａ）は、この異常度の一斉取得により、原発性高アンモニア血症のひとつであるｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ｔｒａｎｓｃａｒｂａｍｙｌａｓｅ（ＯＴＣ）欠損症（ＯＴＣＤ）と化学診断された女児の、肝移植前後のｏｒｏｔａｔｅの異常度を示している。この図のように、２種類のイオンが選択されて、それぞれの異常度と、自動ライブラリ一致率が取得・表示されている。
【００９８】
図７（ｂ）に、この移植に先立ち、母親のドナーとしての適正をみるために行われた、アロプリノール負荷試験成績を示した。ここにおいては、児と母親で条件をそろえて負荷試験がなされた。ここでもｏｒｏｔａｔｅの異常度のみ示している。ｏｒｏｔａｔｅは変動が大きいが、負荷前も患者では、６近い異常度を示すことがあり、２４時間平均では約４である。負荷後はどの時間帯でも高い。一方、母親においては、負荷前がほぼ１であり、負荷後も軽度の増加にすぎず、ドナーとしての適正ありと判定された。肝移植後、児ではｏｒｏｔａｔｅは著明に減少し、生活の質も見違えるほどに改善された。このように異常度取得により、直接的に、客観的評価ができる。
【００９９】
また、本解析法では、結石の成因となる先天代謝異常で、現在でも診断が遅れている高蓚酸結石I型、II型、或いはＡｄｅｎｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ等が、迅速かつ容易に化学診断され得る。実績として、これまで全例で遺伝子異常が確認されている。このように、確実な診断の根拠を迅速に提供することは、患者や家族、ひいては、国民や国家にとって有益となり得る。
【０１００】
上述の記述例は代謝異常であって、その原因が個体における遺伝子異常などの先天的要因、或いは遺伝子発現の異常であったが、代謝物解析では、後天的、或いは外因的要因、即ち化学物質や薬剤などの投与によって、直接或いは間接的に、ある経路或いは反応が障害される場合も、その異常をスクリーニング或いは、特定できる。例えば、化学物質の作用点が、ある代謝物そのものであったり、或いは酵素機能或いは物質の転送機能を担う蛋白質であったり、ある遺伝子であったりする。代謝物の変動と、異常度の一斉取得は、投与物質により、直接或いは間接的に障害されている反応系を明らかにし、化学物質の作用点あるいは作用機序解明に活用できる、あるいはその迅速化に寄与する。この場合、遺伝子への作用がなければ、遺伝子では難しい解析も、メタボローム解析では明らかに出来ることが多い。
【０１０１】
また、本発明によれば、薬剤性肝障害の有無や、その肝障害が肝細胞障害型か、胆汁うっ滞型かなどの評価にも、代謝物質の異常度の一斉取得から、たとえば、チロシン症に近い異常度リストか、シトリン欠損症(胆汁うったいを伴う代謝異常)に近い異常度リストか、などによって、判定できる。あるいは、迅速な判定に寄与する。腎障害についても、尿と血漿或いは、尿と血清などでの異常度リストの統合から、評価される。
【０１０２】
また、本発明は、遺伝子機能解明にも実際的な有用な手法となる。遺伝子改変したマウスの体液、肝臓などの臓器や細胞などのｈｏｍｏｇｅｎａｔｅにつき、対照サンプルとの比較で代謝経路のどこに関与する遺伝子かがわかることが多い。このように、多くの生物の生命科学における基礎研究から応用研究にいたる様々な課題解決のツールとして役立てることが出来る。
【０１０３】
なお、本発明は、生物学的サンプルのメタボローム解析のみならず、人工サンプル、環境サンプル中の化合物を含む試料にも適用でき、更には、生体試料ではない酒やワインなどにおける酵素反応での熟成の有無にも応用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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