(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト患者における赤血球レベルを増加させるための組成物であって、該組成物は、配列番号３に対して少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む、有効量のＡｃｔＲＩＩａポリペプチドを含み、該ポリペプチドはアクチビンＡに結合する、組成物。
【請求項２】
前記ポリペプチドが配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ポリペプチドが配列番号２に対して少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ポリペプチドが配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、免疫グロブリンＦｃドメインおよび血清アルブミンからなる群より選択されるポリペプチド部分を含む融合タンパク質である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記融合タンパク質がＩｇＧ１重鎖由来の定常領域を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ポリペプチドが配列番号７に対して少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む、請求項５または６に記載の組成物。
【請求項８】
前記ポリペプチドが配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項５または６に記載の組成物。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、以下の特徴：
ｉ）少なくとも１０−７のＫＤでアクチビンＡに結合する、および
ｉｉ）細胞内のアクチビンＡシグナル伝達を阻害する
のうち１つ以上を有する、請求項７または８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記患者の骨格筋量の１５％未満の増加をもたらす、請求項７〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、２０〜３０日の期間にわたって、前記患者において少なくとも１００ｎｇ／ｍｌの前記融合タンパク質の血清濃度に到達させるような投与のためのものであることを特徴とする、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、前記患者において、１００ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌの範囲の血清濃度に到達させるような投与のためのものであることを特徴とする、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質が、１５日と３０日との間の血清半減期を有する、請求項７〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物が、週に１回以下の頻度で前記患者に投与するためのものであることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物が、月に１回以下の頻度で前記患者に投与するためのものであることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ポリペプチドが、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、およびビオチン化アミノ酸から選択される１以上の修飾されたアミノ酸残基を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物が、前記患者の血中のヘモグロビンレベルを増加させる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記患者が貧血である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記貧血が、多発性骨髄腫に関連する貧血である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記貧血が、骨髄異形成症候群に関連する貧血である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
前記貧血が、地中海貧血症に関連する貧血である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２２】
前記貧血が、慢性腎不全に関連する貧血である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２３】
前記貧血が、急性腎不全に関連する貧血である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２４】
前記貧血が、末期の腎疾患に関連する貧血である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２５】
ヒト患者における赤血球レベルを増加させるための医薬を作製するための、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの使用であって、該ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含み、該ポリペプチドはアクチビンＡに結合する、使用。
【請求項２６】
前記ポリペプチドが、配列番号７に対して少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
前記ポリペプチドが、配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載の使用。
【請求項２８】
ヒト患者における赤血球レベルを増加させるための組成物であって、該組成物は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの有効量を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、２００６年１２月１８日に出願された米国仮特許出願第６０／８７５，６８２号の優先権を主張し、この仮出願は、その全体が本明細書により参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
成熟赤血球（ｍａｔｕｒｅ  ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ，ｏｒ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）は、脊椎動物の循環系において酸素の輸送を担っている。赤血球は、肺において比較的高い酸素分圧（ｐＯ２）で酸素を結合し、そして、比較的低いｐＯ２で身体の領域へと酸素を運搬するタンパク質であるヘモグロビンを高濃度で有する。
【０００３】
成熟赤血球は、赤血球生成と呼ばれるプロセスにおいて、多能性の造血幹細胞から生成される。出生後の個体において、赤血球生成は、主として、骨髄および赤脾臓において生じる。種々のシグナル伝達経路の連繋した作用により、細胞の増殖、分化、生存および死のバランスが制御される。正常な条件下では、赤血球は、身体において一定の赤血球質量を維持する速度で生成され、そして、この生成は、種々の刺激（酸素分圧の増減または組織の要求を含む）に応じて増減し得る。赤血球生成のプロセスは、系統が拘束された前駆体細胞の形成から始まり、そして、一連の別個の前駆体細胞型を通って進行する。赤血球生成の最終段階は、網状赤血球が血流へと放出されるときに生じ、成熟赤血球の形態を帯びながら、そのミトコンドリアおよびリボソームを失う。血中での網状赤血球レベルの上昇、または、網状赤血球：赤血球の比の上昇は、赤血球生成速度の増加を示す。
【０００４】
エリスロポエチン（Ｅｐｏ）は、出生後の脊椎動物における赤血球生成の最も重要な正の調節因子として広く認識されている。Ｅｐｏは、組織酸素分圧の低下（低酸素）および低い赤血球レベルまたは低いヘモグロビンレベルに対し、これを補う赤血球生成性の応答を調節する。ヒトでは、Ｅｐｏレベルの上昇は、骨髄および脾臓における赤血球先駆細胞の生成を刺激することによって、赤血球の形成を促進する。マウスでは、Ｅｐｏは、主として脾臓における赤血球生成を増強する。
【０００５】
種々の臨床的状況において赤血球レベルを増加させるため、そして、特に、貧血の処置のために、組み換え型Ｅｐｏの種々の形態が医師によって使用されている。貧血は、血中のヘモグロビンまたは赤血球が正常レベルよりも低いことによって特徴付けられる、広く定義される状態である。ある場合には、貧血は、赤血球の生成または生存における原発性の障害によって引き起こされる。より一般的には、貧血は、他の系の疾患に対して続発的である（非特許文献１）。貧血は、赤血球の生成速度の低下もしくは破壊速度の増加から、または、出血に起因する赤血球の喪失によって生じ得る。貧血は、例えば、慢性腎不全、骨髄異形成症候群、慢性関節リウマチおよび骨髄移植を含む種々の障害から生じ得る。
【０００６】
Ｅｐｏを用いた処置は、代表的に、数週間の期間にわたり、健康なヒトにおいて約１〜３ｇ／ｄＬのヘモグロビンの上昇をもたらす。貧血の個体に投与された場合、この処置レジメンは、しばしば、ヘモグロビンおよび赤血球のレベルのかなりの増加を提供し、そして、クオリティオブライフの改善と生存の延長につながる。Ｅｐｏは、一様に有効ではなく、多くの個体は、高用量に対してさえも不応性である（非特許文献２）。５０％を超える癌を有する患者がＥｐｏに対して不十分な応答を有し、末期の腎疾患を有する患者の約１０％が低反応性であり（非特許文献３；非特許文献４）、そして、骨髄異形成症候群を有する患者の１０％未満が有利に応答する（非特許文献５）。炎症、鉄およびビタミンの欠乏、不適切な透析、アルミニウムの毒性、および副甲状腺機能亢進を含むいくつかの要因で、治療応答が乏しいことが予測され得、そして、Ｅｐｏに対する抵抗性の分子機構は未だにはっきりとしていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｗｅａｔｈｅｒａｌｌ  ＆  Ｐｒｏｖａｎ（２０００）Ｌａｎｃｅｔ  ３５５，１１６９−１１７５
【非特許文献２】Ｈｏｒｌら（２０００）Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １５，４３−５０
【非特許文献３】Ｇｌａｓｐｙら（１９９７）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １５，１２１８−１２３４
【非特許文献４】Ｄｅｍｅｔｒｉら（１９９８）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １６，３４１２−３４２５
【非特許文献５】Ｅｓｔｅｙ（２００３）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  １０，６０−６７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、患者における赤血球を増加させるための代替的な組成物および方法を提供することが本開示の一つの目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本開示は、一部分で、アクチビンアンタゴニスト、ならびにＡｃｔＲＩＩａおよびＡｃｔＲＩＩｂのアンタゴニストが、赤血球およびヘモグロビンのレベルを増加させるために使用され得ることを実証する。具体的には、本開示は、ＡｃｔＲＩＩａの可溶性形態がアクチビンのインヒビターとして作用し、そして、インビボで投与された場合に、血中の赤血球レベルを増加させることを実証する。可溶性のＡｃｔＲＩＩａよりも低い親和性でアクチビンＡに結合するＡｃｔＲＩＩｂの可溶性形態では、穏やかな作用が観察された。可溶性のＡｃｔＲＩＩａおよびＡｃｔＲＩＩｂはアクチビンとの拮抗とは別の機構によって赤血球レベルに影響を及ぼし得るが、それにもかかわらず、本開示は、望ましい治療因子が、アクチビンとの拮抗もしくはＡｃｔＲＩＩとの拮抗、またはその両方に基づいて選択され得ることを実証する。このような因子は、まとめてアクチビン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストと呼ばれる。したがって、特定の実施形態では、本開示は、患者における赤血球およびヘモグロビンのレベルを増加させるため、そして、処置を必要とする患者における低い赤血球もしくはヘモグロビンのレベルに伴う障害を処置するための、アクチビン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（例えば、アクチビン結合ＡｃｔＲＩＩａポリペプチド、アクチビン結合ＡｃｔＲＩＩｂポリペプチド、抗アクチビン抗体、抗ＡｃｔＲＩＩａ抗体、抗ＡｃｔＲＩＩｂ抗体、アクチビン、ＡｃｔＲＩＩｂもしくはＡｃｔＲＩＩａを標的とする低分子およびアプタマー、ならびに、アクチビン、ＡｃｔＲＩＩｂもしくはＡｃｔＲＩＩａの発現を低下させる核酸を含む）を使用するための方法を提供する。米国特許出願第１１／６０３，４８５号（本明細書中に参考として援用される）に記載されるように、アクチビン−ＡｃｔＲＩＩａアンタゴニストは、骨成長を促進し、そして、骨密度を増加させるために使用され得る。本明細書中に記載されるように、このようなアンタゴニストの赤血球レベルに対する作用は、より迅速であり、そして、このようなアンタゴニストの骨に対する作用よりも低い用量で生じる。したがって、特定の実施形態では、本開示は、骨密度の有意な増加を引き起こすことなく、赤血球またはヘモグロビンのレベルを増加させるための、アクチビン−ＡｃｔＲＩＩａアンタゴニストの使用方法を提供する。例えば、方法は、骨密度の３％未満、５％未満、１０％未満または１５％未満の増加を引き起こし得る。この選択的な作用は、例えば、より低用量のアクチビン−ＡｃｔＲＩＩａアンタゴニストを、より低い頻度で用いることによって、または、より短い半減期を有するアクチビン−ＡｃｔＲＩＩａアンタゴニストを、より低い血清濃度を提供すると計算される用量および頻度で使用することによって、達成され得る。
【００１０】
特定の局面では、本開示は、アクチビンに結合する可溶性のアクチビン結合ＡｃｔＲＩＩポリペプチドを含むポリペプチドを提供する。アクチビン結合ポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩｂポリペプチドであり得る。ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、アクチビン結合ＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的調製物として処方され得る。アクチビン結合ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、１マイクロモル濃度未満、または、１００ナノモル濃度未満、１０ナノモル濃度未満、もしくは１ナノモル濃度未満のＫＤでアクチビンに結合し得る。必要に応じて、アクチビン結合ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、ＧＤＦ１１および／もしくはＧＤＦ８に対してアクチビンに選択的に結合し、そして、必要に応じて、アクチビンに対するＫＤは、ＧＤＦ１１および／もしくはＧＤＦ８に対するＫＤよりも少なくとも１０倍、２０倍もしくは５０倍より低い。特定の作用機構に束縛されることは望まないが、ＧＤＦ１１／ＧＤＦ８を上回るアクチビンの阻害のための選択性のこの度合いは、一貫して筋肉に対して測定可能な作用を伴うことなく、骨または赤血球生成に対して作用することの説明となることが予想される。多くの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、赤血球レベルに対する所望の効果を達成する用量において、筋肉における１５％未満、１０％未満もしくは５％未満の増加を引き起こすものが選択される。組成物は、サイズ排除クロマトグラフィーによって評価したとき、他のポリペプチド成分に対して少なくとも９５％純粋であり得、そして、必要に応じて、組成物は、少なくとも９８％純粋である。このような調製物において使用するためのアクチビン結合ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドは、配列番号２、３、７もしくは１２から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または、配列番号２、３、７もしくは１２から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％もしくは９９％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドのような、本明細書中に開示される任意のものであり得る。アクチビン結合ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドは、天然のＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの機能的フラグメント（例えば、配列番号１〜３から選択される配列の少なくとも１０、２０もしくは３０のアミノ酸を含むもの、または、Ｃ末端の１０〜１５アミノ酸（「テイル」）を欠く配列番号２の配列を含むもの）を含み得る。このような調製物において使用するためのアクチビン結合ＡｃｔＲＩＩｂポリペプチドは、配列番号１６、１７、２０もしくは２１から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または、配列番号１６、１７、２０もしくは２１から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％もしくは９９％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドのような、本明細書中に開示される任意のものであり得る。アクチビン結合ＡｃｔＲＩＩｂポリペプチドは、天然のＡｃｔＲＩＩｂポリペプチドの機能的フラグメント（例えば、配列番号１５〜１７の少なくとも１０、２０もしくは３０のアミノ酸を含むもの、または、配列番号１７のようなＣ末端の１０〜１５アミノ酸（「テイル」）を欠く配列を含むもの）を含み得る。
【００１１】
可溶性のアクチビン結合ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、天然に存在するＡｃｔＲＩＩポリペプチドに対して、（例えば、リガンド結合ドメインにおいて）アミノ酸配列に１以上の変更を含み得る。変更されたＡｃｔＲＩＩａおよびＡｃｔＲＩＩｂポリペプチドの例は、それぞれ、ＷＯ  ２００６／０１２６２７（本明細書中に参考として援用される）のｐｐ．５９〜６０およびｐｐ．５５〜５８に提供される。アミノ酸配列の変更は、例えば、哺乳動物、昆虫もしくは他の真核生物細胞において生成される場合にポリペプチドのグリコシル化を変更し得るか、または、天然に存在するＡｃｔＲＩＩポリペプチドに対して、ポリペプチドのタンパク質分解による切断を変更し得る。
【００１２】
アクチビン結合ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、１つのドメインとして、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩａまたはＡｃｔＲＩＩｂのリガンド結合部分）と、所望の特性（例えば、改善された薬物動態，より容易な精製，特定の組織への標的化など）を提供する１以上のさらなるドメインとを有する融合タンパク質であり得る。例えば、融合タンパク質のドメインは、インビボ安定性、インビボ半減期、取り込み／投与、組織局在化もしくは分布、タンパク質複合体の形成および／または精製のうちの１以上を増強し得る。アクチビン結合ＡｃｔＲＩＩ融合タンパク質は、免疫グロブリンＦｃドメイン（野生型または変異型）、または血清アルブミン、または所望の特性（例えば、改善された薬物動態、改善された溶解性または改善された安定性）を提供する他のポリペプチド部分を含み得る。好ましい実施形態では、ＡｃｔＲＩＩ−Ｆｃ融合物は、Ｆｃドメインと細胞外ＡｃｔＲＩＩドメインとの間に位置する比較的構造の定まらない（ｕｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ）リンカーを含む。この構造の定まらないリンカーは、ＡｃｔＲＩＩの細胞外ドメインのＣ末端におよそ１５アミノ酸の構造の定まらない領域（「テイル」）に対応し得るか、または、１、２、３、４もしくは５アミノ酸、または、比較的二次構造が自由な、５〜１５、２０、３０、５０もしくはそれ以上の長さのアミノ酸の人工配列であり得るか、あるいはこの両方の混合物であり得る。リンカーは、グリシン残基およびプロリン残基が豊富であり得、そして例えば、スレオニン／セリンおよびグリシンの単一の配列、または、スレオニン／セリンおよびグリシンの繰り返し配列（例えば、ＴＧ４（配列番号２２）もしくはＳＧ４（配列番号２３）の単一体もしくは繰り返し）を含み得る。融合タンパク質は、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジン配列、または、ＧＳＴ融合物のような精製配列を含み得る。必要に応じて、可溶性のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分に結合されたアミノ酸または有機誘導体化因子（ｏｒｇａｎｉｃ  ｄｅｒｉｖａｔｉｚｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）に結合されたアミノ酸から選択される１以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。薬学的調製物はまた、骨障害を処置するために使用される化合物のような１以上のさらなる化合物を含み得る。好ましくは、薬学的調製物は、発熱物質を実質的に含まない。一般に、ＡｃｔＲＩＩタンパク質は、患者における望ましくない免疫応答の可能性を無くすために、ＡｃｔＲＩＩタンパク質の天然のグリコシル化を適切に媒介する哺乳動物細胞株において発現されることが好ましい。ヒトおよびＣＨＯの細胞株は、首尾よく使用されており、そして、他の一般的な哺乳動物発現系が有用であることが予想される。
【００１３】
本明細書中に記載されるように、ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃと称されるＡｃｔＲＩＩａタンパク質（ＡｃｔＲＩＩａ部分とＦｃ部分との間に最小のリンカーを有する形態）は、所望の特性（ＧＤＦ８および／もしくはＧＤＦ１１に対するアクチビンへの選択的な結合、高親和性でのリガンド結合、および動物モデルにおける２週間より長い血清半減期を含む）を有する。特定の実施形態では、本発明は、ＡｃｔＲＩＩ−Ｆｃのポリペプチド、および、このようなポリペプチドと薬学的に受容可能な賦形剤とを含む薬学的調製物を提供する。
【００１４】
特定の局面では、本開示は、可溶性のアクチビン結合ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩｂポリペプチド）をコードする核酸を提供する。単離されたポリヌクレオチドは、上述のような可溶性のアクチビン結合ＡｃｔＲＩＩポリペプチドのコード配列を含み得る。例えば、単離された核酸は、ＡｃｔＲＩＩの細胞外ドメイン（例えば、リガンド結合ドメイン）をコードする配列、および、ＡｃｔＲＩＩの、膜貫通ドメインおよび／もしくは細胞外ドメインの一部もしくは全体をコードする配列を含み得るが、膜貫通ドメインもしくは細胞質ドメイン内、または、細胞外ドメインと膜貫通ドメインもしくは細胞質ドメインとの間に位置する終止コドンは除く。例えば、単離されたポリヌクレオチドは、全長ＡｃｔＲＩＩａポリヌクレオチド配列（例えば、配列番号４または５）、または、全長ＡｃｔＲＩＩａポリヌクレオチド配列（例えば、配列番号１８）、または、ＡｃｔＲＩｌａもしくはＡｃｔＲＩＩｂの部分的に短縮されたバージョンを含み得、前記単離されたポリヌクレオチドはさらに、３’末端の前の少なくとも６００ヌクレオチド、または、ポリヌクレオチドの翻訳により必要に応じて全長ＡｃｔＲＩＩの短縮された部分に融合された細胞外ドメインが生じるように他の方法で位置決めされた、転写終止コドンを含む。ＡｃｔＲＩＩａに対する好ましい核酸配列は、配列番号１４である。本明細書中に開示される核酸は、発現のためのプロモーターに作動可能に連結され得、そして、本開示は、このような組換えポリヌクレオチドで形質転換された細胞を提供する。好ましくは、細胞は、ＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞である。
【００１５】
特定の局面では、本開示は、可溶性のアクチビン結合ＡｃｔＲＩＩポリペプチドを作製するための方法を提供する。このような方法は、適切な細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）において、本明細書中に開示される任意の核酸（例えば、配列番号４、５、１４、１８もしくは１９）を発現させる工程を包含し得る。このような方法は、ａ）可溶性のＡｃｔＲＩＩポリペプチドの発現に適した条件下で細胞を培養する工程であって、前記細胞が、可溶性ＡｃｔＲＩＩ発現構築物で形質転換される、工程と；ｂ）このようにして発現された可溶性ＡｃｔＲＩＩポリペプチドを回収する工程とを包含し得る。可溶性ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、粗製であるか、部分的に精製されたか、または、高度に精製された画分として回収され得る。精製は、例えば、以下のうちの１、２、もしくは３またはそれ以上を任意の順序で含む一連の精製工程によって達成され得る：プロテインＡクロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、Ｑセファロース）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（例えば、フェニルセファロース）、サイズ排除クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィー。
【００１６】
特定の局面では、本明細書中に開示されるアクチビン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（例えば、可溶性のアクチビン結合ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドまたは可溶性のアクチビン結合ＡｃｔＲＩＩｂポリペプチド）は、被験体における赤血球の生成を促進するか、または赤血球のレベルを上昇させるための方法において使用され得る。特定の実施形態では、本開示は、必要とする患者において、低い赤血球数もしくは低いヘモグロビンレベルに伴う障害（例えば、貧血）を処置するため、または、赤血球の生成を促進するための方法を提供する。方法は、それを必要とされる被験体に、有効量のアクチビン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを投与する工程を包含し得る。特定の局面では、本開示は、本明細書中に記載されるような障害もしくは状態の処置のための医薬を作製するためのアクチビン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストの使用を提供する。
【００１７】
特定の局面では、本開示は、赤血球の生成を刺激する因子を同定するための方法を提供する。方法は、ａ）アクチビンまたはＡｃｔＲＩＩポリペプチドのリガンド結合ドメインに結合する試験因子を同定する工程；ならびに、ｂ）赤血球、ヘモグロビン、および／または、赤血球前駆体のレベル（例えば、網状赤血球のレベル）に対する因子の作用を評価する工程、を包含する。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
ヒト患者における赤血球レベルを増加させるための方法であって、該方法は、該赤血球レベルの増加を必要とするヒト患者に、以下：
ａ）配列番号２に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ）配列番号３に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；および
ｃ）配列番号２から選択される少なくとも５０の連続するアミノ酸を含むポリペプチド；
ｄ）配列番号１６に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｅ）配列番号１７に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；および
ｆ）配列番号１６から選択される少なくとも５０の連続するアミノ酸を含むポリペプチド
からなる群より選択される有効量のＡｃｔＲＩＩポリペプチドを投与する工程を包含する、方法。
（項目２）
上記ポリペプチドが、以下の特徴：
ｉ）少なくとも１０−７のＫＤでＡｃｔＲＩＩリガンドに結合する、および
ｉｉ）細胞内のＡｃｔＲＩＩシグナル伝達を阻害する
のうち１つ以上を有する、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記ポリペプチドが、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドドメインに加えて、インビボ安定性、インビボ半減期、取り込み／投与、組織局在化もしくは分布、タンパク質複合体の形成および／または精製のうちの１以上を増強する１以上のポリペプチド部分を含む融合タンパク質である、項目１に記載の方法。
（項目４）
上記融合タンパク質が、免疫グロブリンＦｃドメインおよび血清アルブミンからなる群より選択されるポリペプチド部分を含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
上記ポリペプチドが、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分に結合されたアミノ酸または有機誘導体化因子に結合されたアミノ酸から選択される１以上の修飾されたアミノ酸残基を含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
上記赤血球レベルの増加が、血中のヘモグロビンレベルの増加として測定される、項目１に記載の方法。
（項目７）
貧血を処置するための方法であって、該方法は、該貧血の処置を必要とする被験体に、有効量のアクチビン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを投与する工程を包含する、方法。
（項目８）
上記アクチビン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストが、アクチビンまたはＡｃｔＲＩＩのアンタゴニストポリペプチドである、項目７に記載の方法。
（項目９）
上記アクチビン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストポリペプチドが、以下：
ａ）配列番号２に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ）配列番号３に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；および
ｃ）配列番号２から選択される少なくとも５０の連続するアミノ酸を含むポリペプチド；
ｄ）配列番号１６に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｅ）配列番号１７に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；および
ｆ）配列番号１６から選択される少なくとも５０の連続するアミノ酸を含むポリペプチド
からなる群より選択される、項目８に記載の方法。
（項目１０）
上記アクチビン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストポリペプチドが、以下の特徴：
ｉ）少なくとも１０−７のＫＤでＡｃｔＲＩＩリガンドに結合する、および
ｉｉ）細胞内のＡｃｔＲＩＩシグナル伝達を阻害する
のうち１つ以上を有する、項目９に記載の方法。
（項目１１）
上記アクチビン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストポリペプチドが、該アクチビン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストポリペプチドに加えて、インビボ安定性、インビボ半減期、取り込み／投与、組織局在化もしくは分布、タンパク質複合体の形成および／または精製のうちの１以上を増強する１以上のポリペプチド部分を含む融合タンパク質である、項目９に記載の方法。
（項目１２）
上記融合タンパク質が、免疫グロブリンＦｃドメインおよび血清アルブミンからなる群より選択されるポリペプチド部分を含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
上記アクチビンまたはＡｃｔＲＩＩのアンタゴニストポリペプチドが、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分に結合されたアミノ酸または有機誘導体化因子に結合されたアミノ酸から選択される１以上の修飾されたアミノ酸残基を含む、項目８に記載の方法。
（項目１４）
赤血球レベルを増加させる因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
ａ）ＡｃｔＲＩＩポリペプチドのリガンド結合ドメインに対して、ＡｃｔＲＩＩリガンドと競合的に結合する試験因子を同定する工程；および
ｂ）動物における赤血球レベルに対する該因子の効果を評価する工程
を包含する、方法。
（項目１５）
ヒト患者における赤血球レベルを増加させるための医薬を作製するための、アクチビンまたはＡｃｔＲＩＩのアンタゴニストポリペプチドの使用。
（項目１６）
ヒト患者における赤血球レベルを増加させるための方法であって、該方法は、有効量のＡｃｔＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を該患者に投与する工程を包含し、該ＡｃｔＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、以下：
ａ）配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列、
ｂ）配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一なアミノ酸配列、
ｃ）配列番号３のアミノ酸配列３、
ｄ）配列番号２のアミノ酸配列、
ｅ）配列番号７のアミノ酸配列、
ｆ）配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列、
ｇ）配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一なアミノ酸配列、
ｈ）配列番号１７のアミノ酸配列、
ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列、
ｊ）配列番号２０のアミノ酸配列、および
ｋ）配列番号２１のアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、方法。
（項目１７）
上記患者の骨格筋量の１５％未満の増加をもたらす、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
上記ＡｃｔＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質が、約２０〜３０日の期間にわたって、上記患者において少なくとも１００ｎｇ／ｍｌの血清濃度に達するように投与される、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
上記ＡｃｔＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質が、上記患者において、１００ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌの範囲の血清濃度に達するように投与される、項目１６に記載の方法。
（項目２０）
上記ＡｃｔＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質が、１５日と３０日との間の血清半減期を有する、項目１６に記載の方法。
（項目２１）
上記ＡｃｔＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質が、週に１回以下の頻度で上記患者に投与される、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
上記ＡｃｔＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質が、月に１回以下の頻度で上記患者に投与される、項目２０に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、ＣＨＯ細胞において発現されたＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃの精製を示す。タンパク質は、サイジングカラム（左パネル）およびクーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ（右パネル）（左レーン：分子量標準物質；右レーン：ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃ）によって視覚化されるように、単一の十分に画定されたピークとして精製される。
【図２】図２は、ＢｉａＣｏｒｅＴＭアッセイによって測定された、アクチビンおよびＧＤＦ−１１に対するＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃの結合を示す。
【図３Ａ】図３は、雌性非ヒト霊長類における赤血球数に対するＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃの作用を示す。雌性カニクイザル（各群５匹のサルの４つの群）を、プラセボ、または、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇもしくは３０ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃで、０日目、７日目、１４日目および２１日目に処置した。図３Ａは、赤血球（ＲＢＣ）数を示す。図３Ｂは、ヘモグロビンレベルを示す。統計的有意差は、各処置群についての基線に対するものである。５７日目に、各群に２匹のサルが残っていた。
【図３Ｂ】図３は、雌性非ヒト霊長類における赤血球数に対するＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃの作用を示す。雌性カニクイザル（各群５匹のサルの４つの群）を、プラセボ、または、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇもしくは３０ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃで、０日目、７日目、１４日目および２１日目に処置した。図３Ａは、赤血球（ＲＢＣ）数を示す。図３Ｂは、ヘモグロビンレベルを示す。統計的有意差は、各処置群についての基線に対するものである。５７日目に、各群に２匹のサルが残っていた。
【図４Ａ】図４は、雄性非ヒト霊長類における赤血球数に対するＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃの作用を示す。雄性カニクイザル（各群５匹のサルの４つの群）を、プラセボ、または、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇもしくは３０ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃで、０日目、７日目、１４日目および２１日目に処置した。図４Ａは、赤血球（ＲＢＣ）数を示す。図４Ｂは、ヘモグロビンレベルを示す。統計的有意差は、各処置群についての基線に対するものである。５７日目に、各群に２匹のサルが残っていた。
【図４Ｂ】図４は、雄性非ヒト霊長類における赤血球数に対するＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃの作用を示す。雄性カニクイザル（各群５匹のサルの４つの群）を、プラセボ、または、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇもしくは３０ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃで、０日目、７日目、１４日目および２１日目に処置した。図４Ａは、赤血球（ＲＢＣ）数を示す。図４Ｂは、ヘモグロビンレベルを示す。統計的有意差は、各処置群についての基線に対するものである。５７日目に、各群に２匹のサルが残っていた。
【図５Ａ】図５は、雌性非ヒト霊長類における網状赤血球数に対するＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃの作用を示す。カニクイザル（各群５匹のサルの４つの群）を、プラセボ、または、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇもしくは３０ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃで、０日目、７日目、１４日目および２１日目に処置した。図５Ａは、絶対的な網状赤血球数を示す。図５Ｂは、ＲＢＣに対する網状赤血球の割合を示す。統計的有意差は、各処置群についての基線に対するものである。５７日目に、各群に２匹のサルが残っていた。
【図５Ｂ】図５は、雌性非ヒト霊長類における網状赤血球数に対するＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃの作用を示す。カニクイザル（各群５匹のサルの４つの群）を、プラセボ、または、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇもしくは３０ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃで、０日目、７日目、１４日目および２１日目に処置した。図５Ａは、絶対的な網状赤血球数を示す。図５Ｂは、ＲＢＣに対する網状赤血球の割合を示す。統計的有意差は、各処置群についての基線に対するものである。５７日目に、各群に２匹のサルが残っていた。
【図６Ａ】図６は、雄性非ヒト霊長類における網状赤血球数に対するＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃの作用を示す。カニクイザル（各群５匹のサルの４つの群）を、プラセボ、または、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇもしくは３０ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃで、０日目、７日目、１４日目および２１日目に処置した。図６Ａは、絶対的な網状赤血球数を示す。図６Ｂは、ＲＢＣに対する網状赤血球の割合を示す。統計的有意差は、各処置群についての基線に対するものである。５７日目に、各群に２匹のサルが残っていた。
【図６Ｂ】図６は、雄性非ヒト霊長類における網状赤血球数に対するＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃの作用を示す。カニクイザル（各群５匹のサルの４つの群）を、プラセボ、または、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇもしくは３０ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃで、０日目、７日目、１４日目および２１日目に処置した。図６Ａは、絶対的な網状赤血球数を示す。図６Ｂは、ＲＢＣに対する網状赤血球の割合を示す。統計的有意差は、各処置群についての基線に対するものである。５７日目に、各群に２匹のサルが残っていた。
【図７】図７は、実施例５に記載されるヒトの臨床治験からの結果を示し、この図において、曲線下面積（ＡＵＣ）とＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃの投与された用量とは、ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃが静脈内（ＩＶ）投与されたか皮下（ＳＣ）投与されたかに関わらず、線形の相関性を有する。
【図８】図８は、ＩＶもしくはＳＣで投与された患者におけるＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃの血清レベルの比較を示す。
【図９】図９は、ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃの異なる用量レベルに応答した、骨アルカリ性ホスファターゼ（ＢＡＰ）レベルを示す。ＢＡＰは、同化作用性の骨成長についてのマーカーである。
【図１０】図１０は、実施例５に記載されるヒトの臨床治験からの、ヘマトクリットレベルの基線からのメジアン変化を示す。ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃは、示される投薬量で静脈内（ＩＶ）投与された。
【図１１】図１１は、実施例５に記載されるヒトの臨床治験からの、ヘモグロビンレベルの基線からのメジアン変化を示す。ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃは、示される投薬量で静脈内（ＩＶ）投与された。
【図１２】図１２は、実施例５に記載されるヒトの臨床治験からの、ＲＢＣ（赤血球）数の基線からのメジアン変化を示す。ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃは、示される投薬量で静脈内（ＩＶ）投与された。
【図１３】図１３は、実施例５に記載されるヒトの臨床治験からの、網状赤血球数の基線からのメジアン変化を示す。ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃは、示される投薬量で静脈内（ＩＶ）投与された。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
（発明の詳細な説明）
１．概要
トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーは、共通の配列エレメントと構造モチーフを共有する、種々の増殖因子を含む。これらのタンパク質は、脊椎動物および無脊椎動物の両方における広範な種々の細胞型に対して生物学的作用を発揮することが知られる。このスーパーファミリーのメンバーは、胚発生の間に、パターン形成および組織の特殊化において重要な機能を果たし、そして、脂質生成、筋発生、軟骨形成、心臓発生、造血、神経発生および上皮細胞分化を含む種々の分化プロセスに影響を及ぼし得る。このファミリーは、一般に２つの枝：ＢＭＰ／ＧＤＦの枝およびＴＧＦ−β／アクチビン／ＢＭＰ１０の枝、に分けられ、これらのメンバーは、多様な、しばしば相補的な作用を有する。ＴＧＦ−βファミリーのメンバーの活性を操作することによって、しばしば、生物において有意な生理学的変化を引き起こすことが可能である。例えば、ウシのＰｉｅｄｍｏｎｔｅｓｅおよびＢｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅ品種は、ＧＤＦ８（ミオスタチンとも呼ばれる）に機能喪失変異を有しており、筋肉質量の顕著な増加を引き起こしている。Ｇｒｏｂｅｔら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．１９９７，１７（１）：７１−４。さらに、ヒトでは、ＧＤＦ８の不活性な対立遺伝子は、筋肉質量の増加、および、報告によれば、非常に優れた強度と関連している。Ｓｃｈｕｅｌｋｅら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００４，３５０：２６８２−８。
【００２０】
アクチビンは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する二量体ポリペプチド増殖因子である。３つの主なアクチビン形態（Ａ、ＢおよびＡＢ）が存在し、これらは、２つの密接に関連するβサブユニットのホモ二量体／ヘテロ二量体（それぞれ、βAβA、βBβBおよびβAβB）である。ヒトゲノムはまた、アクチビンＣおよびアクチビンＥもコードしているが、これらは、主として肝臓で発現されており、そして、βＣもしくはβＥを含むヘテロ二量体形態もまた知られる。ＴＧＦ−βスーパーファミリーにおいて、アクチビンは、卵巣および胎盤の細胞におけるホルモン生成を刺激し得、神経細胞の生存を支援し得、細胞周期の進行に対して細胞型に依存して正もしくは負に影響を及ぼし得、そして、少なくとも両生類の胚において中胚葉分化を誘導し得る、独特かつ多機能の因子である（ＤｅＰａｏｌｏら、１９９１，Ｐｒｏｃ  Ｓｏｃ  Ｅｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．１９８：５００−５１２；Ｄｙｓｏｎら、１９９７，Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ．７：８１−８４；Ｗｏｏｄｒｕｆｆ，１９９８，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５５：９５３−９６３）。さらに、刺激されたヒト単球性白血病細胞から単離された赤血球分化因子（ＥＤＦ）は、アクチビンＡと同一であることが分かった（Ｍｕｒａｔａら、１９８８，ＰＮＡＳ，８５：２４３４）。アクチビンＡは、骨髄における赤血球生成を促進することが示唆されている。いくつかの組織では、アクチビンのシグナル伝達は、その関連するヘテロ二量体であるインヒビンによって拮抗される。例えば、下垂体からの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出の間に、アクチビンは、ＦＳＨの分泌および合成を促進するが、インヒビンは、ＦＳＨの分泌および合成を抑制する。アクチビンの生活性を調節し得、そして／または、アクチビンに結合し得る他のタンパク質としては、フォリスタチン（ＦＳ）、フォリスタチン関連タンパク質（ＦＳＲＰ）およびα２−マクログロブリンが挙げられる。
【００２１】
ＴＧＦ−βシグナルは、Ｉ型およびＩＩ型のセリン／スレオニンキナーゼレセプターの異種複合体（ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｃ  ｃｏｍｐｌｅｘ）によって媒介され、これらのレセプターは、リガンド刺激の際に、下流のＳｍａｄタンパク質をリン酸化および活性化する（Ｍａｓｓａｇｕｅ，２０００，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１：１６９−１７８）。これらのＩ型およびＩＩ型レセプターは、システインリッチな領域を持つリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および、推定のセリン／スレオニン特異性を持つ細胞質ドメインから構成される膜貫通タンパク質である。Ｉ型レセプターは、シグナル伝達に必須であり；そして、ＩＩ型レセプターは、リガンド結合およびＩ型レセプターの発現に必要とされる。Ｉ型およびＩＩ型のアクチビンレセプターは、リガンド結合後に安定な複合体を形成し、ＩＩ型レセプターによるＩ型レセプターのリン酸化をもたらす。
【００２２】
２つの関連するＩＩ型レセプター（ＡｃｔＲＩＩ）であるＡｃｔＲＩＩａおよびＡｃｔＲＩＩｂが、アクチビンに対するＩＩ型レセプターとして同定されている（ＭａｔｈｅｗｓおよびＶａｌｅ，１９９１，Ｃｅｌｌ  ６５：９７３−９８２；Ａｔｔｉｓａｎｏら、１９９２，Ｃｅｌｌ  ６８：９７−１０８）。アクチビンに加えて、ＡｃｔＲＩＩａおよびＡｃｔＲＩＩｂは、ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ８およびＧＤＦ１１を含むいくつかの他のＴＧＦ−βファミリータンパク質と生化学的に相互作用し得る（Ｙａｍａｓｈｉｔａら、１９９５，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１３０：２１７−２２６；ＬｅｅおよびＭｃＰｈｅｒｒｏｎ，２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９８：９３０６−９３１１；ＹｅｏおよびＷｈｉｔｍａｎ，２００１，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ７：９４９−９５７；Ｏｈら、２００２，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６：２７４９−５４）。ＡＬＫ４は、アクチビン、特にアクチビンＡに対する主たるＩ型レセプターであり、そして、ＡＬＫ−７もまた、アクチビン、特にアクチビンＢに対するレセプターとして機能し得る。
【００２３】
本明細書中に示されるように、ＧＤＦ８もしくはＧＤＦ１１のような他のＴＧＦ−βファミリーメンバーとは対照的にアクチビンＡへの結合にかなりの選択性を示す可溶性ＡｃｔＲＩＩａポリペプチド（ｓＡｃｔＲＩＩａ）は、インビボで赤血球レベルを増加させるのに有効である。任意の特定の機構に束縛されることは望まないが、これらの研究において使用される特定のｓＡｃｔＲＩＩａ構築物によって示される非常に強力なアクチビンの結合（ピコモル濃度の解離定数）を考慮すると、ｓＡｃｔＲＩＩａの作用は、主としてアクチビンアンタゴニスト作用によって引き起こされるものであることが予想される。機構によらず、ＡｃｔＲＩＩａ−アクチビンアンタゴニストが、げっ歯類、サルおよびヒトにおいて赤血球レベルを増加させることは、本開示から明らかである。造血は、エリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦおよび鉄のホメオスタシスを含む種々の要因によって調節される複雑なプロセスであることに注意すべきである。用語「赤血球レベルを増加させる」および「赤血球の形成を促進する」とは、ヘマトクリット、赤血球数およびヘモグロビン測定値のような臨床的に観察可能な測定基準を指し、このような変化が生じる機構に関しては不特定であることが意図される。
【００２４】
また、本明細書中に示されるように、可溶性ＡｃｔＲＩＩｂポリペプチド（ｓＡｃｔＲＩＩｂ）は、インビボで網状赤血球レベルを増加させるのに有効であり、この作用は、長時間にわたり、ヘマトクリットレベルの増加を引き起こすことが予測される。
【００２５】
本明細書中に報告される非ヒト霊長類に関するデータは、マウス、ラットおよびヒトでも再現可能であり、それゆえ、本開示は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよび他のアクチビン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを用いて、げっ歯類からヒトまでに及ぶ哺乳動物において赤血球の生成を促進し、そして、赤血球レベルを増加させるための方法を提供する。アクチビン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストとしては、例えば、以下が挙げられる：アクチビン結合可溶性ＡｃｔＲＩＩａポリペプチド、アクチビン結合可溶性ＡｃｔＲＩＩｂポリペプチド、アクチビン（特に、アクチビンＡもしくはＢサブユニット、または、βＡもしくはβＢとも呼ばれる）に結合し、ＡｃｔＲＩＩａおよび／もしくはＡｃｔＲＩＩｂの結合を破壊する抗体、ＡｃｔＲＩＩａに結合しアクチビンの結合を破壊する抗体、ＡｃｔＲＩＩｂに結合しアクチビンの結合を破壊する抗体、アクチビン、ＡｃｔＲＩＩｂもしくはＡｃｔＲＩＩａの結合について選択された非抗体タンパク質（例えば、このようなタンパク質、ならびに、このようなタンパク質の設計および選択の方法については、例えば、ＷＯ／２００２／０８８１７１、ＷＯ／２００６／０５５６８９およびＷＯ／２００２／０３２９２５を参照のこと）、アクチビン、ＡｃｔＲＩＩｂもしくはＡｃｔＲＩＩａの結合について選択されたランダム化ペプチド（しばしば、Ｆｃドメインに付加される）。アクチビン、ＡｃｔＲＩＩｂもしくはＡｃｔＲＩＩａの結合活性を持つ２つの異なるタンパク質（または他の部分）、特に、それぞれ、Ｉ型（例えば、可溶性Ｉ型アクチビンレセプター）およびＩＩ型（例えば、可溶性ＩＩ型アクチビンレセプター）の結合部位をブロックするアクチビン結合因子は、二機能性の結合分子を生じるように互いに連結され得る。アクチビン−ＡｃｔＲＩＩシグナル伝達軸を阻害する核酸アプタマー、低分子および他の因子が、アクチビン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストとして含まれる。種々のタンパク質がアクチビン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト活性を有し、インヒビン（すなわち、インヒビンαサブユニット）（インヒビンは、全ての組織において例外なくアクチビンと拮抗するわけではないが）、フォリスタチン（例えば、フォリスタチン−２８８およびフォリスタチン−３１５）、ＦＳＲＰ、アクチビンＣ、α（２）−マクログロブリンおよびＭ１０８Ａ（１０８位におけるメチオニンからアラニンへの変化）変異型アクチビンＡが挙げられる。一般に、アクチビンの代替的な形態、特に、Ｉ型レセプター結合ドメインに変化を有するものは、ＩＩ型レセプターに結合し得るが、活性な３次元複合体を形成できず、したがって、アンタゴニストとして機能する。さらに、アクチビンＡ、Ｂ、ＣもしくはＥ、または、特に、ＡｃｔＲＩＩａもしくはＡｃｔＲＩＩｂの発現を阻害する核酸（例えば、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡまたはリボザイム）は、アクチビン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストとして使用され得る。使用されるべきアクチビン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、ＴＧＦ−βファミリーの他のメンバー、特に、ＧＤＦ８およびＧＤＦ１１に関して、アクチビン媒介性のシグナル伝達の阻害についての選択性を示し得る。
【００２６】
本明細書中で使用される用語は、一般に、本開示の文脈の範囲内で、かつ、各々の用語が使用される特定の文脈において、当該分野におけるその通常の意味を有する。本開示の組成物および方法、ならびに、これらの作成方法および使用方法の記載において、専門家にさらなる案内を提供するために、特定の用語が以下または本明細書中の他の場所で論じられている。用語の任意の使用の範囲および意味は、その用語が使用される特定の文脈から明らかである。
【００２７】
「約」および「およそ」は、一般に、測定の性質または正確さを仮定して、測定された量についての誤差の容認可能な程度を意味する。代表的には、例示的な誤差の程度は、所与の値または値の範囲の、２０パーセント（％）内、好ましくは１０パーセント（％）内、そしてより好ましくは５％内である。
【００２８】
あるいは、そして、特に生物学的な系において、用語「約」および「およそ」は、所与の値のあるオーダーの大きさの範囲内、好ましくは、５倍以内、そしてより好ましくは２倍以内の値を意味し得る。本明細書中に与えられる数量は、特に明記しない限り近似値であり、明白に記述されない場合には、用語「約」または「およそ」は、推量され得ることを意味する。
【００２９】
本開示の方法は、配列を互いに比較する工程を包含し得、この比較には、野生型配列の１以上の変異体／配列改変体に対する比較を含む。このような比較は代表的には、例えば、当該分野で周知の配列アラインメントのプログラムおよび／またはアルゴリズム（例えば、少数の名を挙げれば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＭＥＧＡＬＩＧＮ）を用いた、ポリマー配列のアラインメントを含む。当業者は、変異が残基の挿入または欠失を含むようなこのようなアラインメントにおいて、配列のアラインメントは、挿入もしくは欠失された残基を含まないポリマー配列中に「ギャップ」（代表的には、―または「Ａ」で表される）を導入することを容易に理解し得る。
【００３０】
「相同」は、そのあらゆる文法的な形態および語の綴りのバリエーションにおいて、同種の生物におけるスーパーファミリーに由来するタンパク質、ならびに、異なる種の生物に由来する相同なタンパク質を含む、「共通する進化の起源」を有する２タンパク質間の関係をいう。このようなタンパク質（およびこれをコードする核酸）は、％同一性の観点であれ、特定の残基もしくはモチーフおよび保存された位置の存在によるものであれ、その配列類似性によって反映されるように、配列の相同性を有する。
【００３１】
用語「配列類似性」は、そのあらゆる文法的な形態において、共通する進化の起源を共有していても共有していなくても、核酸もしくはアミノ酸間の同一性もしくは対応性の程度をいう。
【００３２】
しかし、一般的な用法および本願において、用語「相同」は、「高度に」のような副詞で修飾されるとき、配列の類似性を指す場合があり、そして、共通する進化の起源に関連していてもしていなくてもよい。
【００３３】
２．ＡｃｔＲＩＩポリペプチド
特定の局面では、本発明は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドに関する。本明細書中で使用される場合、用語「ＡｃｔＲＩＩ」は、ＩＩ型アクチビンレセプターのファミリーを指す。このファミリーは、アクチビンレセプターＩＩａ型およびアクチビンレセプターＩＩｂ型の両方を含む。
【００３４】
特定の局面では、本発明は、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドに関する。本明細書中で使用される場合、用語「ＡｃｔＲＩＩａ」は、任意の種に由来するアクチビンレセプターＩＩａ型（ＡｃｔＲＩＩａ）タンパク質、および、突然変異誘発もしくは他の修飾法によってこのようなＡｃｔＲＩＩａタンパク質から誘導された改変体のファミリーを指す。本明細書におけるＡｃｔＲＩＩａに対する参照は、現在同定されている形態のうちの１つに対する参照であるものと理解される。ＡｃｔＲＩＩａファミリーのメンバーは、一般に、システインリッチな領域を持つリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび推定のセリン／スレオニンキナーゼ活性を持つ細胞質ドメインから構成される、膜貫通タンパク質である。
【００３５】
用語「ＡｃｔＲＩＩａポリペプチド」は、ＡｃｔＲＩＩａファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチド、ならびに、有用な活性を保持するその任意の改変体（変異体、フラグメント、融合物およびペプチド模倣形態を含む）を含むポリペプチドを包含する。例えば、ＷＯ／２００６／０１２６２７を参照のこと。例えば、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの配列に対して少なくとも約８０％同一な、そして、必要に応じて、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％もしくはそれより高い同一性を持つ配列を有する任意の公知のＡｃｔＲＩＩａの配列から誘導されたポリペプチドを包含する。例えば、本発明のＡｃｔＲＩＩａポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩａタンパク質および／またはアクチビンに結合し、これらの機能を阻害し得る。ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドは、インビボで赤血球の形成を促進する際の活性について選択され得る。ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの例としては、ヒトＡｃｔＲＩＩａ前駆体ポリペプチド（配列番号１）および可溶性ＡｃｔＲＩＩａポリペプチド（例えば、配列番号２、３、７および１２）が挙げられる。
【００３６】
ヒトＡｃｔＲＩＩａ前駆体タンパク質配列は以下のとおりである：
【００３７】
【数１】
0005415279.tif 000002
シグナルペプチドに一重下線を付す；細胞外ドメインは太字で示し、そして、潜在的なＮ連結グリコシル化部位に二重下線を付す。
【００３８】
ヒトＡｃｔＲＩａｂの可溶性（細胞外）の、プロセシング後のポリペプチド配列は以下のとおりである：
【００３９】
【数２】
0005415279.tif 000003
細胞外ドメインのＣ末端「テイル」に下線を付す。「テイル」が欠失された配列（Δ１５配列）は以下のとおりである：
【００４０】
【数３】
0005415279.tif 000004
ヒトＡｃｔＲＩＩａ前駆体タンパク質をコードする核酸配列は以下のとおりである：
（ＧｅｎｂａｎｋエントリーＮＭ＿００１６１６のヌクレオチド１６４〜１７０５）
【００４１】
【数４】
0005415279.tif 000005
ヒトＡｃｔＲＩＩａ可溶性（細胞外）ポリペプチドをコードする核酸配列は以下のとおりである：
【００４２】
【数５】
0005415279.tif 000006
特定の局面では、本発明は、ＡｃｔＲＩＩｂポリペプチドに関する。本明細書中で使用される場合、用語「ＡｃｔＲＩＩｂ」は、任意の種に由来するアクチビンレセプターＩＩｂ型（ＡｃｔＲＩＩｂ）タンパク質、および、突然変異誘発もしくは他の修飾法によってこのようなＡｃｔＲＩＩｂタンパク質から誘導された改変体のファミリーを指す。本明細書におけるＡｃｔＲＩＩｂに対する参照は、現在同定されている形態のうちの１つに対する参照であるものと理解される。ＡｃｔＲＩＩｂファミリーのメンバーは、一般に、システインリッチな領域を持つリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび推定のセリン／スレオニンキナーゼ活性を持つ細胞質ドメインから構成される、膜貫通タンパク質である。
【００４３】
用語「ＡｃｔＲＩＩｂポリペプチド」は、ＡｃｔＲＩＩｂファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチド、ならびに、有用な活性を保持するその任意の改変体（変異体、フラグメント、融合物およびペプチド模倣形態を含む）を含むポリペプチドを包含する。例えば、ＷＯ／２００６／０１２６２７を参照のこと。例えば、ＡｃｔＲＩＩｂポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩｂポリペプチドの配列に対して少なくとも約８０％同一な、そして、必要に応じて、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％もしくはそれより高い同一性を持つ配列を有する任意の公知のＡｃｔＲＩＩｂの配列から誘導されたポリペプチドを包含する。例えば、本発明のＡｃｔＲＩＩｂポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩｂタンパク質および／またはアクチビンに結合し、これらの機能を阻害し得る。ＡｃｔＲＩＩｂポリペプチドは、インビボで赤血球の形成を促進する際の活性について選択され得る。ＡｃｔＲＩＩｂポリペプチドの例としては、ヒトＡｃｔＲＩＩｂ前駆体ポリペプチド（配列番号１５）および可溶性ＡｃｔＲＩＩｂポリペプチド（例えば、配列番号１６、１７、２０および２１）が挙げられる。
【００４４】
ヒトＡｃｔＲＩＩｂ前駆体タンパク質の配列は以下のとおりである：
【００４５】
【数６】
0005415279.tif 000007
シグナルペプチドに一重下線を付す；細胞外ドメインは太字で示し、そして、潜在的なＮ連結グリコシル化部位は四角で囲む。
【００４６】
ヒトＡｃｔＲＩＩｂの可溶性（細胞外）の、プロセシング後のポリペプチド配列は以下のとおりである：
【００４７】
【数７】
0005415279.tif 000008
細胞外ドメインのＣ末端「テイル」に下線を付す。「テイル」が欠失された配列（Δ１５配列）は以下のとおりである：
【００４８】
【数８】
0005415279.tif 000009
ヒトＡｃｔＲＩＩｂ前駆体タンパク質をコードする核酸配列は以下のとおりである：
（ＧｅｎｂａｎｋエントリーＮＭ＿００１１０６のヌクレオチド５〜１５４３）
【００４９】
【数９】
0005415279.tif 000010
ヒトＡｃｔＲＩＩｂ可溶性（細胞外）ポリペプチドをコードする核酸配列は以下のとおりである：
【００５０】
【数１０】
0005415279.tif 000011
特定の実施形態では、本発明は、可溶性ＡｃｔＲＩＩポリペプチドに関する。本明細書中で使用される場合、用語「可溶性ＡｃｔＲＩＩポリペプチド」は、一般に、ＡｃｔＲＩＩａもしくはＡｃｔＲＩＩｂタンパク質の細胞外ドメインを含むポリペプチドを指す。用語「可溶性ＡｃｔＲＩＩポリペプチド」は、本明細書中で使用される場合、ＡｃｔＲＩＩａもしくはＡｃｔＲＩＩｂタンパク質の任意の天然に存在する細胞外ドメインならびに任意のその改変体（変異体、フラグメントおよびペプチド模倣形態を含む）を包含する。アクチビン結合ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、アクチビン（例えば、アクチビンＡＡ、ＡＢ、ＢＢ、または、ＣもしくはＥサブユニットを含む形態を含む）に結合する能力を保持するものである。必要に応じて、アクチビン結合ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、１ｎＭ以下の解離定数でアクチビンＡＡに結合する。ＡｃｔＲＩＩタンパク質の細胞外ドメインは、アクチビンに結合し、そして、一般に可溶性であり、したがって、可溶性のアクチビン結合ＡｃｔＲＩＩポリペプチドと呼ばれ得る。可溶性のアクチビン結合ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの例としては、配列番号２、３、７、１２および１３に示される可溶性ポリペプチドが挙げられる。配列番号７は、ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃと呼ばれ、そして、実施例においてさらに記載される。可溶性のアクチビン結合ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの他の例は、ＡｃｔＲＩＩａタンパク質の細胞外ドメインに加え、シグナル配列（例えば、ミツバチメリチンのリーダー配列（配列番号８）、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）リーダー（配列番号９）、またはネイティブなＡｃｔＲＩＩａリーダー（配列番号１０））を含む。配列番号１３に示されるＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃポリペプチドは、ＴＰＡリーダーを使用する。可溶性のアクチビン結合ＡｃｔＲＩＩｂポリペプチドの例としては、配列番号１６、１７、２０に示される可溶性ポリペプチドが挙げられる。アクチビン結合ＡｃｔＲＩＩｂポリペプチドもまた、ＡｃｔＲＩＩｂの細胞外ドメインに加え、シグナル配列（例えば、ミツバチメリチンのリーダー配列（配列番号８）、または組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）リーダー（配列番号９））を含み得る。
【００５１】
ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの機能的に活性なフラグメントは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドをコードする核酸の対応するフラグメントから組換えにより生成されるポリペプチドをスクリーニングすることによって得られ得る。さらに、フラグメントは、従来のＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相ｆ−Ｍｏｃもしくはｔ−Ｂｏｃ化学のような当該分野で公知の技術を用いて化学的に合成され得る。フラグメントは、（組換えにより、または、化学合成により）生成され得、そして、ＡｃｔＲＩＩタンパク質またはアクチビンにより媒介されるシグナル伝達のアンタゴニスト（インヒビター）として機能し得るペプチジルフラグメントを同定するために試験され得る。
【００５２】
ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの機能的に活性な改変体は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドをコードする対応する変異誘発を起こした核酸から組換えにより生成される修飾ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングすることによって得られ得る。改変体は、生成され得、そして、ＡｃｔＲＩＩタンパク質またはアクチビンにより媒介されるシグナル伝達のアンタゴニスト（インヒビター）として機能し得るものを同定するために試験され得る。特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの機能的改変体は、配列番号２または３から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％同一なアミノ酸配列を含む。特定の場合、機能的改変体は、配列番号２または３から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一なアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩｂポリペプチドの機能的改変体は、配列番号１６または１７から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％同一なアミノ酸配列を含む。特定の場合、機能的改変体は、配列番号１７または１８から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一なアミノ酸配列を有する。
【００５３】
機能的改変体は、治療効率または安定性（例えば、エキソビボ貯蔵寿命およびインビボでのタンパク質分解に対する抵抗性）の増強のような目的のために、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの構造を修飾することによって作製され得る。このような改変されたＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、アクチビン結合を保持するように選択される場合、天然に存在するＡｃｔＲＩＩポリペプチドの機能的な等価物とみなされる。改変されたＡｃｔＲＩＩポリペプチドはまた、例えば、アミノ酸の置換、欠失または付加によって生成され得る。例えば、ロイシンのイソロイシンもしくはバリンでの孤立した置換、アスパラギン酸のグルタミン酸での孤立した置換、スレオニンのセリンでの孤立した置換、または、あるアミノ酸の、構造的に関連したアミノ酸での同様の置換（例えば、保存的変異）は、結果として生じる分子の生物学的活性に対して大きな影響を及ぼさないもの予想するのは理にかなっている。保存的置換は、その側鎖が関連しているアミノ酸のファミリー内で行われる置換である。ＡｃｔＲＩＩポリペプチドのアミノ酸配列の変化が機能的なホモログを生じるかどうかは、改変型ＡｃｔＲＩＩポリペプチドが細胞において野生型ＡｃｔＲＩＩポリペプチドと同様の様式で応答を生じる能力を評価することによって容易に決定され得る。
【００５４】
特定の実施形態では、本発明は、ポリペプチドのグリコシル化を変更するようなＡｃｔＲＩＩポリペプチドの特定の変異を帰途する。このような変異は、１以上のグリコシル化部位（例えば、Ｏ−連結もしくはＮ−連結のグリコシル化部位）を導入もしくは排除するように選択され得る。アスパラギン連結グリコシル化認識部位は、一般に、トリペプチド配列、アスパラギン−Ｘ−スレオニンまたはアスパラギン−Ｘ−セリン（ここで、「Ｘ」は任意のアミノ酸である）を含み、この配列は、適切な細胞のグリコシル化酵素によって特異的に認識される。変化はまた、（Ｏ−連結グリコシル化部位については）野生型ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの配列への、１以上のセリンもしくはスレオニン残基の付加、または、１以上のセリンもしくはスレオニン残基での置換によってなされ得る。グリコシル化認識部位の第１位もしくは第３位のアミノ酸の一方もしくは両方における種々のアミノ酸置換もしくは欠失（および／または、第２位におけるアミノ酸の欠失）は、改変されたトリペプチド配列において非グリコシル化をもたらす。ＡｃｔＲＩＩポリペプチドにおける糖質部分の数を増加させる別の手段は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドへのグリコシドの化学的もしくは酵素的なカップリングによるものである。使用されるカップリング様式に依存して、糖は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン；（ｂ）遊離カルボキシル基；（ｃ）遊離スルフヒドリル基（例えば、システインのもの）；（ｄ）遊離ヒドロキシル基（例えば、セリン、スレオニンまたはヒドロキシプロリンのもの）；（ｅ）芳香族残基（例えば、フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンのもの）；または（ｆ）グルタミンのアミド基に付加され得る。ＡｃｔＲＩＩポリペプチド上に存在する１以上の糖質部分の除去は、化学的および／または酵素的に達成され得る。化学的な脱グリコシル化は、例えば、化合物トリフルオロメタンスルホン酸または等価な化合物へのＡｃｔＲＩＩポリペプチドの曝露を含み得る。この処理は、アミノ酸配列をインタクトなままにしつつ、連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除くほとんどもしくは全ての糖の切断を生じる。ＡｃｔＲＩＩポリペプチド上の糖質部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０に記載されるように、種々のエンドグリコシダーゼもしくはエキソグリコシダーゼの使用により達成され得る。ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの配列は、適切な場合、使用される発現系のタイプに応じて調節され得る。というのも、哺乳動物、酵母、昆虫および植物の細胞は全て、ペプチドのアミノ酸配列によって影響され得る異なるグリコシル化パターンを導入し得る。一般に、ヒトにおいて使用するためのＡｃｔＲＩＩタンパク質は、適切なグリコシル化を提供する哺乳動物細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３細胞株またはＣＨＯ細胞株）において発現され得るが、他の哺乳動物発現細胞株も同様に有用であることと期待される。
【００５５】
本開示はさらに、変異、特に、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドのコンビナトリアル変異のセット、ならびに、短縮型変異（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ  ｍｕｔａｎｔ）を作製する方法を企図する；コンビナトリアル変異のプールは、機能的改変体の配列を同定するために特に有用である。このようなコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする目的は、例えば、アクチビンまたは他のリガンドに結合するＡｃｔＲＩＩポリペプチド改変体を作製するため、であり得る。種々のスクリーニングアッセイが以下に提供され、そして、このようなアッセイは、改変体を評価するために使用され得る。例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド改変体は、ＡｃｔＲＩＩリガンドに結合する能力、ＡｃｔＲＩＩリガンドのＡｃｔＲＩＩポリペプチドへの結合を妨害する能力、または、ＡｃｔＲＩＩリガンドにより引き起こされるシグナル伝達と干渉する能力についてスクリーニングされ得る。
【００５６】
ＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはその改変体の活性はまた、細胞ベースのアッセイまたはインビボアッセイにおいて試験され得る。例えば、造血に関与する遺伝子の発現に対するＡｃｔＲＩＩポリペプチド改変体の作用が評価され得る。これは、必要な場合、１以上の組換えＡｃｔＲＩＩリガンドタンパク質（例えば、アクチビン）の存在下で行われ得、そして、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよび／またはその改変体、そして必要に応じてＡｃｔＲＩＩリガンドを生成するように細胞がトランスフェクトされ得る。同様に、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、マウスもしくは他の動物に投与され得、そして、１以上の血液測定値（例えば、ＲＢＣ数、ヘモグロビン、または網状赤血球数）が評価され得る。
【００５７】
天然に存在するＡｃｔＲＩＩポリペプチドに対して、選択性を有するか、または全体的に効力が増加された、コンビナトリアル由来の（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌｌｙ−ｄｅｒｉｖｅｄ）改変体が作製され得る。同様に、突然変異誘発は、対応する野生型ＡｃｔＲＩＩポリペプチドとは劇的に異なる細胞内半減期を有する改変体を生じ得る。例えば、変更されたタンパク質は、タンパク質分解、または、ネイティブなＡｃｔＲＩＩポリペプチドの崩壊もしくは他の方法で不活性化をもたらす他の細胞プロセスに対してより安定性であるかもしくは安定性が低いかのいずれかにされ得る。このような改変体およびこれをコードする遺伝子は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの半減期を調節することによってＡｃｔＲＩＩポリペプチドレベルを変更するために利用され得る。例えば、短い半減期は、より一過性の生物学的作用を生じ得、そして、誘導性の発現系の一部である場合、細胞内での組換えＡｃｔＲＩＩポリペプチドレベルのより厳しい制御を可能にし得る。Ｆｃ融合タンパク質では、変異は、タンパク質の半減期を変更するために、リンカー（存在する場合）および／またはＦｃ部分において作製され得る。
【００５８】
コンビナトリアルライブラリーは、各々が少なくとも潜在的なＡｃｔＲＩＩポリペプチド配列の一部を含むポリペプチドライブラリーをコードする遺伝子の縮重ライブラリー（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｌｉｂｒａｒｙ）によって生成され得る。例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物は、潜在的なＡｃｔＲＩＩポリペプチドのヌクレオチド配列の縮重セットが、個々のポリペプチドとして、あるいは、（例えば、ファージディスプレイのための）より大きな融合タンパク質のセットとして発現可能となるように、遺伝子配列中に酵素的にライゲーションされ得る。
【００５９】
縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的なホモログのライブラリーが作製され得る数多くの方法が存在する。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動ＤＮＡ合成装置において行われ得、そしてその後、合成遺伝子が、適切な発現ベクター中にライゲーションされ得る。縮重オリゴヌクレオチドの合成は当該分野で周知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ，ＳＡ（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら、（１９８１）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｐｒｏｃ．３ｒｄ  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｓｙｍｐｏｓ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ＡＧ  Ｗａｌｔｏｎ編，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  ｐｐ２７３−２８９；Ｉｔａｋｕｒａら、（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら、（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６；Ｉｋｅら、（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１１：４７７を参照のこと）。このような技術は、他のタンパク質の有向の進化（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）において用いられ得る（例えば、Ｓｃｏｔｔら、（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０；Ｒｏｂｅｒｔｓら、（１９９２）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８９：２４２９−２４３３；Ｄｅｖｌｉｎら、（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａら、（１９９０）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８７：６３７８−６３８２；ならびに、米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，１９８，３４６号および同第５，０９６，８１５号を参照のこと）。
【００６０】
あるいは、コンビナトリアルライブラリーを作製するために、他の形態の突然変異誘発が利用され得る。例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド改変体は、例えば、アラニン走査突然変異誘発などを用いるスクリーニングによって（Ｒｕｆら、（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：１５６５−１５７２；Ｗａｎｇら、（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３０９５−３０９９；Ｂａｌｉｎｔら、（１９９３）Ｇｅｎｅ  １３７：１０９−１１８；Ｇｒｏｄｂｅｒｇら、（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８：５９７−６０１；Ｎａｇａｓｈｉｍａら、（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２８８８−２８９２；Ｌｏｗｍａｎら、（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１０８３２−１０８３８；およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍら、（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５）、リンカー走査突然変異誘発によって（Ｇｕｓｔｉｎら、（１９９３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９３：６５３−６６０；Ｂｒｏｗｎら、（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：２６４４−２６５２；ＭｃＫｎｉｇｈｔら、（１９８２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：３１６）；飽和突然変異誘発によって（Ｍｅｙｅｒｓら、（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：６１３）；ＰＣＲ突然変異誘発によって（Ｌｅｕｎｇら、（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １：１１−１９）；または、ランダム突然変誘発（化学突然変異誘発などを含む）によって（Ｍｉｌｌｅｒら、（１９９２）Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；およびＧｒｅｅｎｅｒら、（１９９４）Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ７：３２−３４）、ライブラリーから作製および単離され得る。（特に、コンビナトリアルな設定における）リンカー走査突然変異誘発は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの短縮型（生物活性）形態を同定するための魅力的な方法である。
【００６１】
点突然変異および短縮によって作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、また、その状況のために、特定の特性を持つ遺伝子産物についてのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための、広範囲の技術が当該分野で公知である。このような技術は、一般に、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドのコンビナトリアル突然変異誘発によって作製された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適用可能である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための最も広く使用される技術は、代表的に、複製発現ベクター中への遺伝子ライブラリーのクローニング、得られたベクターライブラリーを用いた適切な細胞の形質転換、および、所望される活性の検出が、遺伝子（その産物が検出される）をコードするベクターの比較的簡単な単離を容易にする条件下でのコンビナトリアル遺伝子発現を含む。好ましいアッセイとしては、アクチビン結合アッセイおよびアクチビン媒介性細胞シグナル伝達アッセイが挙げられる。
【００６２】
特定の実施形態では、本発明のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、さらに、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド中に天然に存在するものに加えて、翻訳後修飾を含み得る。このような修飾としては、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、ホスホリル化、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）およびアシル化が挙げられるがこれらに限定されない。結果として、修飾されたＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、ポリエチレングリコール、脂質、多糖類もしくは単糖類およびリン酸のような非アミノ酸成分を含み得る。このような非アミノ酸成分の、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの機能に対する影響は、他のＡｃｔＲＩＩポリペプチド改変体について本明細書中に記載されるようにして試験され得る。ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの発生直後の形態を切断することによってＡｃｔＲＩＩポリペプチドが細胞内で生成される場合、翻訳後プロセシングもまた、このタンパク質の正確な折り畳みおよび／または機能にとって重要となり得る。異なる細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、ＮＩＨ−３Ｔ３またはＨＥＫ２９３）は、このような翻訳後の活性のための特定の細胞機構および特徴的なメカニズムを有し、そして、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの正確な修飾およびプロセシングを保証するように選択され得る。
【００６３】
特定の局面では、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの機能的改変体または改変された形態は、少なくともＡｃｔＲＩＩポリペプチドの一部分と１以上の融合ドメインとを有する融合タンパク質を含む。このような融合ドメインの周知の例としては、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、またはヒト血清アルブミンが挙げられるがこれらに限定されない。融合ドメインは、所望される特性を与えるように選択され得る。例えば、いくつかの融合ドメインが、アフィニティクロマトグラフィーによる融合タンパク質の単離に特に有用である。アフィニティ精製の目的では、グルタチオン−、アミラーゼ−、およびニッケル−もしくはコバルト−結合化樹脂のような、アフィニティクロマトグラフィーのための適切なマトリクスが使用される。このようなマトリクスの多くは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＧＳＴ精製システムおよび（ＨＩＳ６）融合パートナーと共に有用なＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓＴＭシステム（Ｑｉａｇｅｎ）のような「キット」の形態で利用可能である。別の例としては、融合ドメインは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの検出を容易にするように選択され得る。このような検出ドメインの例としては、種々の蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）、ならびに、「エピトープタグ」（特定の抗体に利用可能な通常は短いペプチド配列である）が挙げられる。特定のモノクローナル抗体に容易に利用可能な周知のエピトープタグとしては、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）およびｃ−ｍｙｃタグが挙げられる。いくつかの場合、融合ドメインは、関連のプロテアーゼが融合タンパク質を部分的に消化し、それによって、そこから組換えタンパク質を解放することを可能にする、第Ｘａ因子またはトロンビンのようなプロテアーゼ切断部位を有する。解放されたタンパク質は、次いで、その後のクロマトグラフィーによる分離によって、融合ドメインから単離され得る。特定の好ましい実施形態では、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、インビボでＡｃｔＲＩＩポリペプチドを安定化させるドメイン（「安定化」ドメイン）と融合される。「安定化」とは、それが、崩壊の減少によるものであるか、腎臓によるクリアランスの減少によるものであるか、他の薬物動態作用によるものであるかとは無関係に、血清半減期を増加させる何かを意味する。免疫グロブリンのＦｃ部分との融合は、広範囲のタンパク質に対して所望の薬物動態特性を与えることが知られる。同様に、ヒト血清アルブミンへの融合は、所望の特性を与え得る。選択され得る融合ドメインの他のタイプとしては、多量体化（例えば、二量体化、四量体化）ドメインおよび機能的ドメイン（例えば、筋肉増殖のさらなる刺激のような付加的な生物学的機能を与えるもの）が挙げられる。
【００６４】
具体例として、本発明は、Ｆｃドメインに融合されたＡｃｔＲＩＩａの可溶性細胞外ドメインを含む融合タンパク質（例えば、配列番号６）を提供する。
【００６５】
【数１１】
0005415279.tif 000012
別の具体例として、本発明は、Ｆｃドメインに融合されたＡｃｔＲＩＩｂの可溶性細胞外ドメインを含む融合タンパク質（例えば、配列番号２１）を提供する。
【００６６】
【数１２】
0005415279.tif 000013
必要に応じて、Ｆｃドメインは、Ａｓｐ−２６５、リジン３２２およびＡｓｎ−４３４のような残基における１以上の変異を有する。特定の場合、これらの変異のうち１以上（例えば、Ａｓｐ−２６５変異）を持つ変異型Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインに対する、Ｆｃγレセプターへの結合能の低下を有する。他の場合では、これらの変異のうち１以上（例えば、Ａｓｎ−４３４変異）を持つ変異型Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインに対する、ＭＨＣクラスＩ関連のＦｃレセプター（ＦｃＲＮ）への結合の増加を有する。
【００６７】
融合タンパク質の異なる成分は、所望の機能と両立するあらゆる様式で配列され得ることが理解される。例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、異種ドメインに対してＣ末端側に配置されても、あるいは、異種ドメインが、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドに対してＣ末端側に配置されてもよい。ＡｃｔＲＩＩポリペプチドドメインと異種ドメインとは、融合タンパク質において隣接している必要はなく、そして、さらなるドメインもしくはアミノ酸配列が、いずれかのドメインに対してＣ末端もしくはＮ末端側に、または、これらのドメイン間に含められてもよい。
【００６８】
特定の実施形態では、本発明のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドを安定化させ得る１以上の修飾を含む。例えば、このような修飾は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドのインビトロ半減期を増強させるか、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの循環半減期を増強させるか、または、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドのタンパク質分解を減少させる。このような安定化修飾としては、融合タンパク質（例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドと安定化ドメインとを含む融合タンパク質が挙げられる）、グリコシル化部位の修飾（例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドのグリコシル化部位の付加が挙げられる）、および糖質部分の修飾（例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドからの糖質部分の除去が挙げられる）が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書中で使用される場合、用語「安定化ドメイン」は、融合タンパク質の場合のように融合ドメイン（例えば、Ｆｃ）を指すだけでなく、糖質部分のような非タンパク質性修飾、または、ポリエチレングリコールのような非タンパク質性部分も含む。
【００６９】
特定の実施形態では、本発明は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの単離および／または精製された形態（他のタンパク質から単離されたか、他の方法で他のタンパク質を実質的に含まないもの）を利用可能にする。ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは一般に、組換え核酸からの発現によって生成される。
【００７０】
３．ＡｃｔＲＩＩポリペプチドをコードする核酸
特定の局面では、本発明は、本明細書中に開示されるフラグメント、機能的改変体および融合タンパク質を含むＡｃｔＲＩＩポリペプチドのいずれか（例えば、可溶性ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドおよび可溶性ＡｃｔＲＩＩｂポリペプチド）をコードする単離されたおよび／または組換えの核酸を提供する。例えば、配列番号４は、天然に存在するヒトＡｃｔＲＩＩａ前駆体ポリペプチドをコードするが、配列番号５は、ＡｃｔＲＩＩａのプロセシングを受けた細胞外ドメインをコードする。例えば、配列番号１８は、天然に存在するＡｃｔＲＩＩｂ前駆体ポリペプチドをコードするが、配列番号１９は、ＡｃｔＲＩＩｂのプロセシングを受けた細胞外ドメインをコードする。本発明の核酸は、一本鎖もしくは二本鎖であり得る。このような核酸は、ＤＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子であり得る。これらの核酸は、例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドを作製するための方法において、また、（例えば、遺伝子治療アプローチにおいて）直接的な治療剤として使用され得る。
【００７１】
特定の局面では、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドをコードする本発明の核酸はさらに、配列番号４または５の改変体である核酸を含むものと理解される。特定の局面では、ＡｃｔＲＩＩｂポリペプチドをコードする本発明の核酸はさらに、配列番号１８または１９の改変体である核酸を含むものと理解される。改変体ヌクレオチド配列は、対立遺伝子改変体のような、１以上のヌクレオチドの置換、付加もしくは欠失によって異なる配列を含む。
【００７２】
特定の実施形態では、本発明は、配列番号４、５、１８または１９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一な単離されたまたは組換えの核酸配列を提供する。当業者は、配列番号４、５、１８または１９に対して相補的な核酸配列、および配列番号４、５、１８または１９の改変体もまた、本発明の範囲内であることを理解する。さらなる実施形態では、本発明の核酸配列は、異種ヌクレオチド配列と共に、または、ＤＮＡライブラリーにおいて、単離、組換えおよび／または融合され得る。
【００７３】
他の実施形態では、本発明の核酸はまた、配列番号４、５、１８または１９に指定されるヌクレオチド配列に対して高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、配列番号の相補配列４、５、１８または１９、あるいは、これらのフラグメントを含む。上述のように、当業者は、ＤＮＡのハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件が変更され得ることを容易に理解する。当業者は、ＤＮＡのハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件が変更され得ることを容易に理解する。例えば、約４５℃における６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）でのハイブリダイゼーションの後に、５０℃における２．０×ＳＳＣの洗浄を行い得る。例えば、洗浄工程における塩濃度は、５０℃における約２．０×ＳＳＣの低ストリンジェンシーから、５０℃における約０．２×ＳＳＣの高ストリンジェンシーまで選択され得る。さらに、洗浄工程における温度は、室温（約２２℃）の低ストリンジェンシー条件から、約６５℃の高ストリンジェンシー条件まで上昇され得る。温度と塩の両方が変更されても、温度または塩濃度が一定に保たれ、他方が変更されてもよい。一実施形態では、本発明は、室温における６×ＳＳＣとその後の室温で２×ＳＳＣでの洗浄の低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸を提供する。
【００７４】
遺伝子コードにおける縮重に起因して配列番号４、５、１８または１９に示される核酸と異なる単離された核酸もまた、本発明の範囲内である。例えば、多数のアミノ酸が１以上のトリプレットによって示される。同じアミノ酸を特定するコドンまたは同義語（例えば、ＣＡＵおよびＣＡＣはヒスチジンに対する同義語である）は、タンパク質のアミノ酸配列に影響を及ぼさない「サイレント」変異を生じ得る。しかしながら、哺乳動物細胞の中には、本発明のタンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらすＤＮＡ配列の多型が存在することが予想される。当業者は、天然の対立遺伝子改変に起因して、所与の種の個体間に、特定のタンパク質をコードする核酸の１以上のヌクレオチド（約３〜５％までのヌクレオチド）におけるこれらの改変がし得ることを理解する。任意およびあらゆるこのようなヌクレオチドの改変と、結果として生じるアミノ酸の多型とは、本発明の範囲内である。
【００７５】
特定の実施形態では、本発明の組換え核酸は、発現構築物において１以上の調節性ヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。調節性のヌクレオチド配列は、一般に、発現のために使用される宿主細胞に対して適切なものである。種々の宿主細胞について、多数のタイプの適切な発現ベクターおよび適切な調節性配列が当該分野で公知である。代表的には、上記１以上の調節性ヌクレオチド配列としては、プロモーター配列、リーダー配列もしくはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始配列および転写終結配列、翻訳開始配列および翻訳終結配列、ならびに、エンハンサー配列もしくはアクチベーター配列が挙げられるがこれらに限定されない。当該分野で公知の構成的もしくは誘導性のプロモーターが、本発明によって企図される。プロモーターは、天然に存在するプロモーター、または、１以上のプロモーターの要素を組み合わせたハイブリッドプロモーターのいずれかであり得る。発現構築物は、プラスミドのようにエピソーム上で細胞中に存在し得るか、または、発現構築物は、染色体中に挿入され得る。好ましい実施形態では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするために、選択可能なマーカー遺伝子を含む。選択可能なマーカー遺伝子は、当該分野で周知であり、そして、使用される宿主細胞により変化する。
【００７６】
本発明の特定の局面では、本発明の核酸は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドをコードし、そして、少なくとも１つの調節性配列に作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む発現ベクターにおいて提供される。調節性配列は当該分野で認識され、そして、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの発現を誘導するように選択される。したがって、用語調節性配列は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメントを含む。例示的な調節性配列は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載される。例えば、作動可能に連結されたときにＤＮＡ配列の発現を制御する広範な種々の発現制御配列のいずれかが、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現させるためにこれらのベクターにおいて使用され得る。このような有用な発現制御配列としては、例えば、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター、ｔｅｔプロモーター、アデノウイルスもしくはサイトメガロウイルスの最初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣもしくはＴＲＣシステム、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによってその発現が誘導されるＴ７プロモーター、ファージλの主要なオペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼもしくは他の糖分解酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター（例えば、Ｐｈｏ５）、酵母α−接合因子（ｍａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）のプロモーター、バキュロウイルス系の多角体プロモーター、ならびに、原核生物もしくは真核生物の細胞、または、そのウイルスの遺伝子の発現を制御することが知られる他の配列、ならびにこれらの種々の組み合わせが挙げられる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択および／または発現されることが所望されるタンパク質のタイプのような要因に依存し得ることが理解されるべきである。さらに、ベクターのコピー数、コピー数を制御する能力およびベクターによってコードされる任意の他のタンパク質（例えば、抗生物質マーカー）の発現もまた考慮される。
【００７７】
本発明の組換え核酸は、クローニングされた遺伝子またはその一部を、原核生物細胞、真核生物細胞（酵母、鳥類、昆虫または哺乳動物）のいずれか、または両方において発現させるために適切なベクター中に連結することによって生成され得る。組換えＡｃｔＲＩＩポリペプチドの生成のための発現ビヒクルとしては、プラスミドおよび他のベクターが挙げられる。例えば、適切なベクターとしては、以下のタイプのプラスミドが挙げられる：原核生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のための、ｐＢＲ３２２由来のプラスミド、ｐＥＭＢＬ由来のプラスミド、ｐＥＸ由来のプラスミド、ｐＢＴａｃ由来のプラスミドおよびｐＵＣ由来のプラスミド。
【００７８】
いくつかの哺乳動物発現ベクターは、細菌中でのベクターの増殖を促進するための原核生物の配列と、真核生物細胞において発現される１以上の真核生物の転写単位の両方とを含む。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏおよびｐＨｙｇ由来のベクターは、真核生物細胞のトランスフェクションに適切な哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターのいくつかは、原核生物細胞および真核生物細胞の両方における複製および薬物耐性選択を容易にするために、細菌プラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２）からの配列を用いて改変される。あるいは、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）またはエプスタイン−バーウイルスのようなウイルスの誘導体（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来およびｐ２０５）が、真核生物細胞におけるタンパク質の一過的な発現のために使用され得る。他のウイルス（レトロウイルスを含む）発現系の例は、遺伝子治療送達系の説明において以下に見出され得る。プラスミドの調製および宿主生物の形質転換において用いられる種々の方法は、当該分野で周知である。原核生物細胞および真核生物細胞の両方についての他の適切な発現系、ならびに、一般的な組換え手順については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１）を参照のこと。いくつかの場合において、バキュロウイルス発現系を用いて組換えポリペプチドを発現させることが望ましくあり得る。このようなバキュロウイルス発現系の例としては、ｐＶＬ由来のベクター（例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３およびｐＶＬ９４１）、ｐＡｃＵＷ由来のベクター（例えば、ｐＡｃＵＷｌ）およびｐＢｌｕｅＢａｃ由来のベクター（例えば、β−ｇａｌを含むｐＢｌｕｅＢａｃ  ＩＩＩ）が挙げられる。
【００７９】
好ましい実施形態では、ベクターは、ＣＨＯ細胞における本発明のＡｃｔＲＩＩポリペプチドの生成のために設計される（例えば、Ｐｃｍｖ−Ｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）、ｐｃＤＮＡ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）およびｐＣＩ−ｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｅ））。明らかであるように、本発明の遺伝子構築物は、例えば、タンパク質（融合タンパク質または改変体タンパク質を含む）を生成するため、精製のために、培養物において増殖させた細胞において本発明のＡｃｔＲＩＩポリペプチドの発現を引き起こすために使用され得る。
【００８０】
本開示はまた、１以上の本発明のＡｃｔＲＩＩポリペプチドのコード配列（例えば、配列番号４、５、１８または１９）を含む組換え遺伝子をトランスフェクトされた宿主細胞に関する。宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、本発明のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を用いる）、酵母細胞または哺乳動物細胞において発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【００８１】
したがって、本発明はさらに、本発明のＡｃｔＲＩＩポリペプチドを生成する方法に関する。例えば、ＡｃｔＲＩＩａもしくはＡｃｔＩＩｂポリペプチドをコードする発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの発現を起こすことが可能な適切な条件下で培養され得る。ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドを含む細胞および培地の混合物から分泌および単離され得る。あるいは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、細胞質または膜画分に保持され得、そして、細胞が回収、溶解され、そして、タンパク質が単離される。細胞培養物は、宿主細胞、培地および他の副産物を含む。細胞培養に適切な培地は、当該分野で周知である。本発明のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、タンパク質の精製についての当該分野で公知の技術（イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの特定のエピトープに特異的な抗体を用いた免疫親和性精製、および、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドに融合させたドメインに結合する因子を用いた親和性精製（例えば、ＡｃｔＲＩＩａ−ＦｃまたはＡｃｔＲＩＩｂ−Ｆｃ融合物を精製するために、プロテインＡカラムが使用され得る）を含む）を用いて、細胞培養培地、宿主細胞またはこの両方から単離され得る。好ましい実施形態では、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、その精製を促進するドメインを含む融合タンパク質である。好ましい実施形態では、精製は、例えば、以下のうちの３またはそれ以上を任意の順序で含む一連のカラムクロマトグラフィー工程によって達成され得る：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィー。精製は、ウイルス濾過およびバッファの交換により完了され得る。本明細書中に示されるように、ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃタンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーによって決定すると、９８％を超える純度、そして、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって決定すると、９５％を超える純度まで精製された。このレベルの純度は、マウス、ラットおよび非ヒト霊長類において所望の結果を達成するのに十分であった。
【００８２】
別の実施形態では、精製用リーダー配列（例えば、組換えＡｃｔＲＩＩポリペプチドの所望の部分のＮ末端に位置するポリ−（Ｈｉｓ）／エンテロキナーゼ切断部位の配列）をコードする融合遺伝子は、Ｎｉ２＋金属樹脂を用いる親和性クロマトグラフィーによる、発現された融合タンパク質の精製を可能にし得る。その後、精製用リーダー配列は、引き続いて、エンテロキナーゼでの処理によって除去され、精製ＡｃｔＲＩＩポリペプチドを提供し得る（例えば、Ｈｏｃｈｕｌｉら、（１９８７）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ４１１：１７７；およびＪａｎｋｎｅｃｈｔら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８：８９７２を参照のこと）。
【００８３】
融合遺伝子を作製するための技術は周知である。本質的には、異なるポリペプチド配列をコードする種々のＤＮＡフラグメントの接合は、ライゲーションのための平滑末端もしくはジグザグの（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じた粘着末端の充填、所望されない接合を回避するためのアルカリ性ホスファターゼ処理、および酵素によるライゲーション、を用いる従来の技術に従って行われる。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成装置を含む従来の技術によって合成され得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、２つの連続した遺伝子フラグメント間の相補的なオーバーハングを生じるアンカープライマーを用いて行われ得、これらのフラグメントは、その後、キメラ遺伝子配列を生じるようにアニーリングされ得る（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：１９９２を参照のこと）。
【００８４】
４．代替的なアクチビンおよびＡｃｔＲＩＩのアンタゴニスト
本明細書中に示されるデータは、アクチビン−ＡｃｔＲＩＩシグナル伝達のアンタゴニストが、赤血球またはヘモグロビンのレベルを増加させるために使用され得ることを示す。可溶性のＡｃｔＲＩＩａおよびＡｃｔＩＩｂポリペプチド、特に、ＡｃｔＲＩＩａ−ＦｃおよびＡｃｔＩＩｂ−Ｆｃが好ましいアンタゴニストであり、そして、このようなアンタゴニストは、アクチビン拮抗以外の機構によって赤血球レベルに影響を及ぼし得る（例えば、アクチビンの阻害は、ある因子があるスペクトルの分子（おそらくは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの他のメンバーを含む）の活性を阻害する傾向の指標となり得、そして、このような集合的な阻害が造血に対して所望の作用をもたらし得る）が、抗アクチビン（例えば、アクチビンβＡ、βＢ、βＣおよびβＥ）抗体、抗ＡｃｔＲＩＩａ抗体、抗ＡｃｔＲＩＩｂ抗体、アンチセンス、ＲＮＡｉもしくはリボザイム核酸、ならびに、アクチビン、ＡｃｔＲＩＩｂもしくはＡｃｔＲＩＩａの他のインヒビター（特に、アクチビン−ＡｃｔＲＩＩａおよび／またはアクチビン−ＡｃｔＲＩＩｂ結合を破壊するもの）を含む他のタイプのアクチビン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストが有用であることが期待される。
【００８５】
ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、可溶性のＡｃｔＲＩＩａもしくはＡｃｔＲＩＩｂポリペプチド）と特異的に反応性であり、そして、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドと、リガンドに対して競合的に結合するか、または、他の方法で、ＡｃｔＲＩＩ媒介性のシグナル伝達を阻害するかのいずれかである抗体は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド活性のアンタゴニストとして使用され得る。同様に、アクチビンβＡ、βＢ、βＣまたはβＥポリペプチドまたはその任意のヘテロ二量体と特異的に反応性であり、そして、ＡｃｔＲＩＩａおよび／またはＡｃｔＲＩＩｂの結合を破壊する抗体は、アンタゴニストとして使用され得る。
【００８６】
ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドに由来する免疫原を使用することによって、ＡｃｔＲＩＩｂポリペプチドまたはアクチビンポリペプチド、抗タンパク質／抗ペプチドの抗血清またはモノクローナル抗体は、標準的なプロトコルによって作製され得る（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ：１９８８）を参照のこと）。哺乳動物（例えば、マウス、ハムスターまたはウサギ）は、アクチビン、ＡｃｔＲＩＩａまたはＡｃｔＲＩＩｂポリペプチド、抗体応答を誘発し得る抗原性フラグメント、または融合タンパク質の免疫原性形態を用いて免疫され得る。タンパク質またはペプチドに対して免疫原性を与えるための技術としては、キャリアに対する結合、または、当該分野で周知の他の技術が挙げられる。ＡｃｔＲＩＩもしくはアクチビンポリペプチドの免疫原性部分は、アジュバントの存在下で投与され得る。免疫の進行は、血漿もしくは血清中の抗体の力価の検出によって監視され得る。免疫原として抗原を用いた標準的なＥＬＩＳＡまたは他のイムノアッセイが、抗体のレベルを評価するために使用され得る。
【００８７】
アクチビン、ＡｃｔＲＩＩａもしくはＡｃｔＲＩＩｂポリペプチドの抗原性調製物を用いた動物の免疫の後、抗血清が得られ得、そして、必要に応じて、血清からポリクローナル抗体が単離され得る。モノクローナル抗体を生成するためには、抗体産生細胞（リンパ球）が免疫された動物から回収され、そして、標準的な体細胞融合手順によって骨髄腫細胞のような不死化細胞と融合されて、ハイブリドーマ細胞を生じ得る。このような技術は当該分野で周知であり、そして、例えば、ハイブリドーマ技術（最初に、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎによって開発された：ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂａｒら、（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，４：７２）およびヒトモノクローナル抗体を生成するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、（１９８５）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．ｐｐ．７７−９６）が挙げられる。ハイブリドーマ細胞は、アクチビン、ＡｃｔＲＩＩａまたはＡｃｔＲＩＩｂポリペプチドと特異的に反応性の抗体の生成について免疫化学的にスクリーニングされ、そして、このようなハイブリドーマ細胞を含む培養物からモノクローナル抗体が単離され得る。
【００８８】
用語「抗体」は、本明細書中で使用される場合、例えば、任意のアイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥなど）の抗体全体、および、選択された抗原と反応性の免疫グロブリンのフラグメントもしくはドメインを含むことが意図される。抗体は、従来の技術を用いてフラグメント化され得、そして、フラグメントは、関心のある特定のエピトープとの有用性および／または相互作用についてスクリーニングされ得る。したがって、この用語は、特定のタンパク質と選択的に反応し得る抗体分子の、タンパク質分解により切断されたか、または、組換えにより調製された部分のセグメントを含む。このようなタンパク質分解および／または組換えのフラグメントの非限定的な例としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ならびにペプチドリンカーによって結合されたＶ［Ｌ］および／またはＶ［Ｈ］ドメインを含む単鎖抗体（ｓｃＦｖ）が挙げられる。ｓｃＦｖは、２以上の結合部位を有する抗体を形成するように共有結合もしくは非共有結合により連結され得る。用語抗体はまた、抗体のポリクローナル調製物、モノクローナル調製物、または他の精製された調製物、および組換え抗体を含む。用語「組換え抗体」は、分子生物学の技術を用いて構築された核酸から発現される、抗体、または、免疫グロブリンの抗原結合ドメイン（例えば、単鎖抗体から発生させたヒト化抗体または完全ヒト抗体）を意味する。単一ドメインの抗体および単鎖抗体もまた、用語「組換え抗体」に含まれる。
【００８９】
特定の実施形態では、本発明の抗体は、モノクローナル抗体であり、そして、特定の実施形態では、本発明は、新規抗体を作製するための方法を利用可能にする。例えば、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩｂポリペプチドまたはアクチビンポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を作製するための方法は、検出可能な免疫応答を刺激するのに有効な抗原ポリペプチドを含む免疫原性組成物の量をマウスに投与する工程と、このマウスから抗体産生細胞（例えば、脾臓からの細胞）を得る工程と、この抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合して抗体産生ハイブリドーマを得る工程と、この抗体産生ハイブリドーマを試験して、抗原に対して特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定する工程と、を包含し得る。一度得られると、ハイブリドーマは、必要に応じて、ハイブリドーマ由来の細胞が、抗原に対して特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する培養条件下で、細胞培養において増殖させられ得る。モノクローナル抗体は、細胞培養物から精製され得る。
【００９０】
形容詞「〜と特異的に反応性の」は、抗体に関して使用される場合、当該分野で一般に理解されるように、抗体は、関心のある抗原（例えば、アクチビン、ＡｃｔＲＩＩａまたはＡｃｔＲＩＩｂポリペプチド）と、関心のものではない他の抗原との間で十分に選択的であり、その抗体が、最小限でも、特定のタイプの生物学的サンプルにおいて関心のある抗原の存在を検出するために有用であることを意味することが意図される。治療用途のような抗体を用いる特定の方法において、より高い低度の結合の特異性が望ましくあり得る。モノクローナル抗体は、一般に、所望される抗原と、交差反応するポリペプチドとの間を効率的に区別する傾向が高い（ポリクローナル抗体と比較して）。抗体：抗原相互作用の特異性に影響する１つの特徴は、抗原に対する抗体の親和性である。所望される特異性はある範囲の多様な親和性で達され得るが、一般に好ましい抗体は、約１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたはそれ以下の親和性（解離定数）を有する。
【００９１】
さらに、所望の抗体を同定するための抗体のスクリーニングに使用される技術は、得られる抗体の特性に影響し得る。たとえば、抗体が溶液中の抗原を結合するために使用される場合、溶液の結合を試験することが望ましくあり得る。抗体と抗原との間の相互作用を試験して、特定の所望される抗体を同定するためには、種々の多様な技術が利用可能である。このような技術としては、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴結合アッセイ（例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭ結合アッセイ、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、サンドイッチアッセイ（例えば、ＩＧＥＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄの常磁性ビーズシステム）、ウェスタンブロット、免疫沈降アッセイおよび免疫組織化学が挙げられる。
【００９２】
アクチビンまたはＡｃｔＲＩＩアンタゴニストである核酸化合物のカテゴリーの例としては、アンチセンス核酸、ＲＮＡｉ構築物および触媒性の核酸構築物が挙げられる。核酸化合物は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。二本鎖の化合物はまた、鎖の一方もしくは他方が一本鎖であるオーバーハングまたは非相補的な領域を含み得る。一本鎖の化合物は、自己相補的な領域を含み得、これは、その化合物が二本鎖のらせん構造の領域と共にいわゆる「ヘアピン」または「ステム−ループ」構造を形成することを意味する。核酸化合物は、全長のＡｃｔＲＩＩ核酸配列またはアクチビンβＡ、βＢ、βＣもしくはβＥの核酸配列のうち、１０００以下、５００以下、２５０以下、１００以下、または、５０以下、３５以下、２５以下、２２以下、２０以下、１８以下もしくは１５以下のヌクレオチドから構成される領域に対して相補的なヌクレオチド配列を含み得る。相補的な領域は、好ましくは、少なくとも８ヌクレオチドであり、任意に、約１８〜３５ヌクレオチドである。相補的な領域は、コード配列部分のような標的転写物のイントロン、コード配列または非コード配列内に入り得る。一般に、核酸化合物は、約８〜約５００のヌクレオチドまたは塩基対の長さを有し、そして、任意に、その長さは、約１４〜約５０ヌクレオチドである。核酸は、ＤＮＡ（特にアンチセンスとしての使用について）、ＲＮＡ、またはＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドであり得る。任意の一本鎖は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物、ならびに、ＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれかとして容易に分類できない修飾された形態を含み得る。同様に、二本鎖の化合物は、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡであり得、そして、任意の一本鎖もまた、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物、ならびに、ＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれかとして容易に分類できない修飾された形態を含み得る。核酸化合物は、バックボーン（ヌクレオチド間結合を含む、天然の核酸中の糖−リン酸部分）または塩基部分（天然の核酸のプリンまたはピリミジン部分）に対する１以上の修飾を含む、種々の修飾のいずれかを含み得る。アンチセンス核酸化合物は、好ましくは、約１５〜約３０ヌクレオチドの長さを有し、そしてしばしば、血清中、細胞中、または、化合物が送達される可能性のある場所（例えば、経口送達される化合物の場合には胃、および吸入される化合物については肺）において、安定性のような特徴を改善するための１以上の修飾を含む。ＲＮＡｉ構築物の場合には、標的転写物に対して相補的な鎖は、一般に、ＲＮＡまたはその修飾物である。他方の鎖は、ＲＮＡであってもＤＮＡであっても任意の他のバリエーションであってもよい。二本鎖もしくは一本鎖の「ヘアピン」ＲＮＡｉ構築物の二重鎖部分は、一般に、Ｄｉｃｅｒ基質として機能する限りは、長さ１８〜４０ヌクレオチドの長さを有し、そして、任意に、約２１〜２３ヌクレオチドの長さを有する。触媒的または酵素的な核酸は、リボザイムまたはＤＮＡ酵素であり得、そしてまた、修飾された形態を含み得る。核酸化合物は、生理学的条件下で、かつ、ナンセンスもしくはセンスの制御がほとんどもしくは全く効果がない濃度で細胞と接触されたときに、標的の発現を約５０���、７５％、９０％またはそれ以上阻害し得る。核酸化合物の作用を調べるための好ましい濃度は、１マイクロモル濃度、５マイクロモル濃度および１０マイクロモル濃度である。核酸化合物はまた、例えば赤血球レベルに対する作用について試験され得る。
【００９３】
５．スクリーニングアッセイ
特定の局面では、本発明は、アクチビン−ＡｃｔＲＩＩａおよび／またはアクチビン−ＡｃｔＲＩＩｂシグナル伝達経路のアゴニストまたはアンタゴニストである化合物（因子）を同定するための、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、可溶性のＡｃｔＲＩＩａポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩｂポリペプチド）およびアクチビンポリペプチドの使用に関する。このスクリーニングによって同定された化合物は、インビボまたはインビトロでの、赤血球、ヘモグロビンおよび／または網状赤血球のレベルを調節する能力を評価するために試験され得る。これらの化合物は、例えば、動物モデルにおいて試験され得る。
【００９４】
アクチビンおよびＡｃｔＲＩＩのシグナル伝達を標的化することによって、赤血球またはヘモグロビンのレベルを増加させるための治療剤についてスクリーニングするための多数のアプローチが存在する。特定の実施形態では、選択された細胞株に対するアクチビンまたはＡｃｔＲＩＩ媒介性の作用を摂動する因子を同定するために、化合物のハイスループットスクリーニングが行われ得る。特定の実施形態では、アッセイは、アクチビンに多雨するＡｃｔＲＩＩａもしくはＡｃｔＲＩＩｂポリペプチドの結合を特異的に阻害もしくは減少させる化合物をスクリーニングおよび同定するために行われる。あるいは、アッセイは、アクチビンに対するＡｃｔＲＩＩａもしくはＡｃｔＲＩＩｂポリペプチドの結合を増強する化合物を同定するために使用され得る。さらなる実施形態では、化合物は、アクチビン、ＡｃｔＲＩＩｂポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩａポリペプチドと相互作用する能力によって同定され得る。
【００９５】
種々のアッセイ形式が十分であり、そして、本開示を考慮すれば、本明細書中に明示的に記載されない形式は、本明細書中に記載されていないにもかかわらず、当業者によって理解される。本明細書中に記載されるように、本発明の試験化合物（因子）は、任意のコンビナトリアル化学の方法によって作製され得る。あるいは、本発明の化合物は、インビボまたはインビトロで合成された天然に存在する生体分子であり得る。組織増殖の調節因子として作用する能力について試験される化合物（因子）は、例えば、細菌、酵母、植物または他の生物によって生成されても（例えば、天然の生成物）、化学的に生成されても（例えば、ペプチド模倣物を含む低分子）、組換えにより生成されてもよい。本発明によって企図される試験化合物としては、非ペプチジル有機分子、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、糖、ホルモンおよび核酸分子が挙げられる。特定の実施形態では、試験因子は、約２０００ダルトン未満の分子量を持つ小さな有機分子である。
【００９６】
本発明の試験化合物は、単一の別個の実体として提供され得るか、または、コンビナトリアル化学によって作製されたような、より複雑度の高いライブラリーにおいて提供され得る。これらのライブラリーは、例えば、アルコール、ハロゲン化アルキル、アミン、アミド、エステル、アルデヒド、エーテルおよび有機化合物の他の分類を含み得る。試験システムに対する試験化合物の提示は、特に、最初のスクリーニング段階において、単離された形態または化合物の混合物としてのいずれかであり得る。必要に応じて、化合物は、必要に応じて他の化合物で誘導体化され得、そして、化合物の単離を容易にする誘導体化基を有し得る。誘導体化基の非限定的な例としては、ビオチン、フルオレセイン、ジゴキシゲニン、緑色蛍光タンパク質、同位体、ポリヒスチジン、磁気ビーズ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、光活性化クロスリンカー、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【００９７】
化合物および天然抽出物のライブラリーを試験する多くの薬物スクリーニングプログラムにおいて、所与の期間に調査される化合物の数を最大にするためには、ハイスループットアッセイが望ましい。精製もしくは半精製されたタンパク質で誘導体化され得るような、無細胞のシステムにおいて行われるアッセイは、試験化合物によって媒介される分子標的における変更の迅速な発生と比較的容易な検出とを可能にするように生成され得るという点で、しばしば、「一次」スクリーニングとして好ましい。さらに、試験化合物の細胞障害性またはバイオアベイラビリティの作用は、一般に、インビトロのシステムでは無視され得るが、その代わりに、このアッセイは主として、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドとアクチビンとの間、および／または、ＡｃｔＲＩＩｂポリペプチドとアクチビンとの間の結合親和性の変更において出現し得るような、分子標的に対する薬物の作用に焦点を当てている。
【００９８】
単なる例示として、本発明の例示的なスクリーニングアッセイでは、関心のある化合物は、通常アクチビンに結合し得る単離および精製されたＡｃｔＲＩＩａポリペプチドと接触される。その後、化合物とＡｃｔＲＩＩａポリペプチドとの混合物に、ＡｃｔＲＩＩａリガンドを含む組成物が加えられる。ＡｃｔＲＩＩａ／アクチビン複合体の検出および定量は、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドとアクチビンとの間の複合体の形成の阻害（または助長）における化合物の効力を決定するための手段を提供する。化合物の効力は、種々の濃度の試験化合物を用いて得られたデータから用量応答曲線を生成することによって評価され得る。さらに、比較のための基線を提供するためのコントロールアッセイもまた行われ得る。例えば、コントロールアッセイでは、単離および精製されたアクチビンは、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドを含む組成物に加えられ、そして、ＡｃｔＲＩＩａ／アクチビン複合体の形成は、試験化合物の非存在下で定量される。一般に、反応物が混合され得る順序は変化し得、そして、同時に混合され得ることが理解される。さらに、適切な無細胞アッセイ系を与えるように、精製したタンパク質の代わりに、細胞の抽出物および溶解物が使用され得る。ＡｃｔＲＩＩｂシグナル伝達に影響を及ぼす化合物は、ＡｃｔＲＩＩｂポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩｂリガンドを用いて、同様の様式で同定され得る。
【００９９】
ＡｃｔＲＩＩポリペプチドとアクチビンとの間の複合体の形成は、種々の技術によって検出され得る。例えば、複合体の形成の調節は、例えば、検出可能に標識されたタンパク質（例えば、放射標識（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈ）、蛍光標識もの（例えば、ＦＩＴＣ）、または、酵素標識されたＡｃｔＲＩＩａまたはＡｃｔＲＩＩｂポリペプチドまたはアクチビンを用いて、イムノアッセイによって、あるいは、クロマトグラフィーによる検出によって定量され得る。
【０１００】
特定の実施形態では、本発明は、直接的または間接的のいずれかで、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドとその結合タンパク質との間の相互作用の程度を測定する、蛍光偏光アッセイおよび蛍光共鳴エネルギー遷移（ＦＲＥＴ）アッセイの使用を企図する。さらに、光導波管（ＰＣＴ公開ＷＯ９６／２６４３２および米国特許第５，６７７，１９６号）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、表面電荷センサ、および表面力センサに基づくもののような、他の検出様式が、本発明の多くの実施形態と適合性がある。
【０１０１】
さらに、本発明は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドとその結合タンパク質との間の相互作用を妨害または助長する因子を同定するための、「ツーハイブリッドアッセイ」としても知られる相互作用トラップアッセイの使用を企図する。例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａら（１９９３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：９２０−９２４；およびＩｗａｂｕｃｈｉら（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：１６９３−１６９６を参照のこと。特定の実施形態では、本発明は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドとその結合タンパク質との間の相互作用を解離させる化合物（例えば、低分子またはペプチド）を同定するための、逆ツーハイブリッドシステムの使用を企図する。例えば、ＶｉｄａｌおよびＬｅｇｒａｉｎ（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２７：９１９−２９；ＶｉｄａｌおよびＬｅｇｒａｉｎ（１９９９）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７：３７４−８１；ならびに米国特許第５，５２５，４９０号；同第５，９５５，２８０号；および同第５，９６５，３６８号を参照のこと。
【０１０２】
特定の実施形態では、本発明の化合物は、本発明のＡｃｔＲＩＩまたはアクチビンポリペプチドと相互作用する能力によって同定される。化合物と、ＡｃｔＲＩＩａ、ＡｃｔＲＩＩｂまたはアクチビンポリペプチドとの間の相互作用は、共有結合性であっても非共有結合性であってもよい。例えば、このような相互作用は、光架橋、放射標識リガンド結合、およびアフィニティクロマトグラフィーを含むインビトロの生化学的な方法を用いて、タンパク質レベルで同定され得る（Ｊａｋｏｂｙ  ＷＢら、１９７４，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ４６：１）。特定の場合には、化合物は、アクチビンまたはＡｃｔＲＩＩポリペプチドに結合する化合物を検出するためのアッセイのような、機構ベースのアッセイにおいてスクリーニングされ得る。これは、固相もしくは液相の結合事象を含み得る。あるいは、アクチビンまたはＡｃｔＲＩＩポリペプチドをコードする遺伝子は、レポーターシステム（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼまたは緑色蛍光タンパク質）と共に細胞中にトランスフェクトされ、そして、必要に応じて、ハイスループットスクリーニングによって、ライブラリーに対して、または、ライブラリーの個々のメンバーを用いてスクリーニングされ得る。他の機構ベースの結合アッセイ（例えば、自由エネルギーの変化を検出する結合アッセイ）が使用され得る。結合アッセイは、ウェル、ビーズもしくはチップに固定されているか、または、固定された抗体によって捕捉されている標的を用いて行われ得るか、あるいは、キャピラリー電気泳動によって分解され得る。結合した化合物は通常、比色または蛍光または表面プラズモン共鳴を用いて検出され得る。
【０１０３】
６．例示的な治療的用途
特定の実施形態では、本発明のアクチビン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（例えば、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩｂポリペプチド）は、げっ歯類および霊長類、特に、ヒト患者のような哺乳動物における赤血球のレベルを増加させるために使用され得る。特定の実施形態では、本発明は、治療上有効量のアクチビン−ＡｃｔＲＩＩａアンタゴニスト（例えば、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチド）、または、治療上有効量のアクチビン−ＡｃｔＲＩＩｂアンタゴニスト（例えば、ＡｃｔＲＩＩｂポリペプチド）を個体に投与することによって、処置または予防を必要とする個体における貧血を処置または予防する方法を提供する。特定の実施形態では、本発明は、治療上有効量のアクチビン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、特に、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドを個体に投与することによって、個体における赤血球の形成を促進する方法を提供する。これらの方法は、哺乳動物、特に、ヒトの治療的および予防的な処置に使用され得る。
【０１０４】
本明細書中で使用される場合、障害または状態を「予防する」治療薬は、統計的標本において、未処置の対照標本に対して、処置標本における障害もしくは状態の出現を低下させるか、あるいは、未処置の対照標本に対して、障害もしくは状態の１以上の症状の発症を遅延させるか、または、重篤度を低下させるような化合物を指す。用語「処置する」は、本明細書中で使用される場合、指定された状態の予防、または、一度確立された状態の改善もしくは除去を含む。いずれの場合にも、予防または処置は、医師または他の医療提供者によって提供される診断、および、治療剤の投与の意図される結果において認識され得る。
【０１０５】
本明細書中で示されるように、アクチビン−ＡｃｔＲＩＩａアンタゴニストおよびアクチビン−ＡｃｔＲＩＩｂアンタゴニストは、健康な個体における赤血球、ヘモグロビンまたは網状赤血球のレベルを増加させるために使用され得、そして、このようなアンタゴニストは、選択された患者集団において使用され得る。適切な患者集団の例としては、貧血を有する患者のような望ましくない低い赤血球またはヘモグロビンレベルを有する患者、および、大きな外科手術またはかなりの血液喪失を生じ得る他の処置を受ける予定の患者のような、望ましくない低い赤血球またはヘモグロビンレベルを生じる危険性のある患者、が挙げられる。一実施形態では、適切な赤血球レベルを有する患者は、赤血球レベルを増加させるためにアクチビン−ＡｃｔＲＩＩａアンタゴニストで処置され、その後、血液が採血され、そして、後に輸血に使用するために保存される。一実施形態では、適切な赤血球レベルを有する患者は、赤血球レベルを増加させるためにアクチビン−ＡｃｔＲＩＩｂアンタゴニストで処置され、その後、血液が採血され、そして、後に輸血に使用するために保存される。
【０１０６】
本明細書中に開示されるアクチビン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、そして特に、ＡｃｔＲＩＩａ−ＦｃおよびＡｃｔＲＩＩｂタンパク質は、貧血を有する患者における赤血球レベルを増加させるために使用され得る。ヒトにおけるヘモグロビンレベルを観察するとき、適切な年齢および性別のカテゴリーにとっての正常値未満のレベルは貧血の指標となり得るが、個体の変動が考慮される。例えば、１２ｇ／ｄｌのヘモグロビンレベルは、一般に、一般的な成人集団において正常の下限と考えられる。潜在的な原因としては、血液喪失、栄養不良、薬物療法反応、骨髄および多くの疾患に伴う種々の問題が挙げられる。より具体的には、貧血は、例えば、慢性腎不全、骨髄異形成症候群、慢性関節リウマチ、骨髄移植を含む種々の障害に関連している。貧血はまた、以下の状態とも関連し得る：固形腫瘍（例えば、乳癌、肺癌、結腸癌）；リンパ系の腫瘍（例えば、慢性リンパ球性白血病、非ホジキンおよびホジキンリンパ腫）；造血系の腫瘍（例えば、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫）；放射線治療；化学療法（例えば、白金を含むレジメン）；炎症および自己免疫疾患（慢性関節リウマチ、他の炎症性関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、急性もしくは慢性の皮膚疾患（例えば、乾癬）、炎症性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）が挙げられるがこれらに限定されない）；急性もしくは慢性の陣疾患または腎不全（特発性もしくは先天性の状態を含む）；急性もしくは慢性の肝臓病；急性もしくは慢性の出血；患者の同種もしくは自己抗体および／または宗教上の理由（例えば、いくつかのエホバの証人（Ｊｅｈｏｖａｈ  Ｗｉｔｎｅｓｓ））に起因する赤血球の輸血が可能ではない状況；感染（例えば、マラリア、骨髄炎）；異常ヘモグロビン症（例えば、例えば、鎌状赤血球病、地中海貧血症を含む）；薬物の使用または乱用（例えば、アルコールの誤用）；輸血を回避するためのあらゆる要因から貧血を有する小児患者；ならびに、循環過負荷に関する問題に起因して輸血を受けることができない、老齢の患者または貧血と共に根底にある心肺疾患を有する患者。
【０１０７】
患者は、患者を標的とするヘモグロビンレベル（通常は、約１０ｇ／ｄｌと約１２．５ｇ／ｄｌの間、代表的には約１１．０ｇ／ｄｌ（Ｊａｃｏｂｓら（２０００）Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １５，１５−１９もまた参照のこと））まで回復させることを意図した投薬レジメンで処置され得るが、より低い標的レベルでは、より少ない心臓血管系の副作用が引き起こされ得る。あるいは、ヘマトクリットレベル（細胞によって占有される血液サンプルの容積の割合）が、赤血球の状態の指標として使用され得る。健康な個体についてのヘマトクリットレベルは、成人男性について４１〜５１％、そして、成人女性について３５〜４５％の範囲である。標的ヘマトクリットレベルは、通常、約３０〜３３％である。さらに、ヘモグロビン／ヘマトクリットレベルは、個々人で変動する。したがって、最適には、標的ヘモグロビン／ヘマトクリットレベルは、患者ごとに個別化され得る。
【０１０８】
本明細書中に開示されるアクチビン−ＡｃｔＲＩＩａアンタゴニストの赤血球レベルに対する迅速な作用は、これらの因子がＥｐｏとは異なる機構によって作用していることを示す。したがって、これらのアンタゴニストは、Ａｐｏに対して上手く応答しない患者において赤血球およびヘモグロビンレベルを増加させるために有用であり得る。例えば、アクチビン−ＡｃｔＲＩＩａアンタゴニストは、通常〜増量した（＞３００ＩＵ／ｋｇ／週）用量のＥｐｏの投与が標的レベルまでのヘモグロビンレベルの増加をもたらさない患者に有益であり得る。不適切なＥｐｏ応答を有する患者は、全てのタイプの貧血について見られるが、より多い数の不応者が、癌を有する患者および末期の腎疾患を有する患者において特に頻繁に観察されている。Ｅｐｏに対する不適切な応答は、構成的（すなわち、Ｅｐｏでの最初の処置の際に観察される）、または後天的（例えば、Ｅｐｏでの反復処置の際に観察される）のいずれかであり得る。
【０１０９】
アクチビン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストはまた、Ｅｐｏの有害な作用に対して感受性である患者を処置するために使用され得る。Ｅｐｏの主たる有害な作用は、ヘマトクリットまたはヘモグロビンレベルの過剰な増加と、赤血球増加症である。ヘマトクリットレベルの上昇は、高血圧（より具体的には、高血圧の深刻化）および脈管の血栓症につながり得る。報告されているＥｐｏの他の有害な作用（このうちいくつかは、高血圧に関するものである）は、頭痛、インフルエンザ様症候群、バイパスの閉塞、血栓症に起因する心筋梗塞および大脳痙攣、高血圧性脳障害、ならびに赤血球血球無形成（ｒｅｄ  ｃｅｌｌ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ  ａｐｐｌａｓｉａ）である（Ｓｉｎｇｉｂａｒｔｉ，（１９９４）Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  ７２（補遺６），Ｓ３６−Ｓ４３；Ｈｏｒｌら（２０００）Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １５（補遺４），５１−５６；Ｄｅｌａｎｔｙら（１９９７）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ４９，６８６−６８９；Ｂｕｎｎ（２００２）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４６（７），５２２−５２３）。
【０１１０】
７．薬学的組成物
特定の実施形態では、本発明のアクチビン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（例えば、ＡｃｔＲＩＩａおよびＡｃｔＲＩｌｂポリペプチド）は、薬学的に受容可能なキャリアと共に処方される。例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、単独で、または、薬学的処方物（治療用組成物）の成分として投与され得る。本発明の化合物は、ヒトまたは獣医学における医薬での使用のために任意の簡便な方法で投与するために処方され得る。
【０１１１】
特定の実施形態では、本発明の治療方法は、全身に、または、移植物もしくはデバイスとして局所的に組成物を投与する工程を包含する。投与される場合、本発明において使用するための治療用組成物は、当然のことながら、発熱物質を含まない生理学的に容認可能な形態である。また上記の組成物中に必要に応じて含められ得るアクチビン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト以外の治療上有用な因子は、本発明の方法において、本発明の化合物（例えば、ＡｃｔＲＩＩａおよびＡｃｔＲＩＩｂポリペプチド）と同時に、または連続して投与され得る。
【０１１２】
代表的に、アクチビン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、非経口投与される。非経口投与に適した薬学的組成物は、１以上のＡｃｔＲＩＩポリペプチドを、１以上の薬学的に受容可能な無菌かつ等張の水性もしくは非水性の溶液、分散液、懸濁液もしくはエマルジョン、または、使用直前に無菌の注射可能な溶液もしくは分散液へと再構成され得る無菌粉末と組み合わせて含み得、この組成物は、抗酸化物質、緩衝液、静菌剤、処方物を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質、または、懸濁剤もしくは増粘剤を含み得る。本発明の薬学的組成物中で採用され得る適切な水性および非水性のキャリアの例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）およびこれらの適切な混合物、植物油（例えば、オリーブ油）、ならびに、注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）が挙げられる。適切な流動性は、例えば、コーティング材料（例えば、レシチン）の使用によって、分散剤の場合には必要とされる粒子径の維持によって、そして、界面活性剤の使用によって維持され得る。
【０１１３】
さらに、組成物は、カプセル化され得るか、または、標的組織部位（例えば、骨髄）へと送達するための形態で注射され得る。特定の実施形態では、本発明の組成物は、標的組織部位（例えば、骨髄）に１以上の治療用化合物（例えば、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩｂポリペプチド）を送達し、発生中の組織（ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｔｉｓｓｕｅ）のための構造を提供し得、そして、最適には身体内へと吸収され得るマトリクスを含み得る。例えば、マトリクスは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの遅速放出を提供し得る。このようなマトリクスは、他の移植される医療用途に現在使用される材料から形成され得る。
【０１１４】
マトリクス材料の選択は、生体適合性、生分解性、機械的特性、美容上の外観および界面の特性に基づく。本発明の組成物の特定の用途が、適切な処方物を画定する。組成物のための可能性のあるマトリクスは、生分解性でかつ化学的に画定された硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸およびポリ無水物であり得る。他の可能性の有る材料は、生分解性でかつ生物学的に十分に画定されたもの（例えば、骨または皮膚のコラーゲンである。さらなるマトリクスは、純粋なタンパク質または細胞外マトリクスの成分から構成される。他の可能性のあるマトリクスは、非生分解性でかつ化学的に画定されたもの（例えば、焼結ヒドロキシアパタイト、バイオグラス、ミョウバン（ａｌｕｍｉｎａｔｅ）、または他のセラミクス）である。マトリクスは、上述のタイプの材料のいずれかの組み合わせ（例えば、ポリ乳酸およびヒドロキシアパタイト、または、コラーゲンおよびリン酸三カルシウム）から構成され得る。生体機能性セラミクスは、組成物中（例えば、カルシウム−ミョウバン−ホスフェート中）で変化され、孔径、粒子径、粒子の形状および生分解性を変更するように加工され得る。
【０１１５】
特定の実施形態では、本発明の方法は、例えば、カプセル、カシェ、丸剤、錠剤、ロゼンジ（矯味矯臭薬を含む基材、通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガントを用いて）、散剤、顆粒剤、または、水性もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液として、または、水中油もしくは油中水の液体エマルジョンとして、または、エリキシルもしくはシロップとして、または、香錠（ゼラチンおよびグリセリン、または、スクロースおよびアカシアのような不活性基材を用いて）および／またはマウスウォッシュなどの形態（この各々が、活性成分として所定量の因子を含む）で、経口投与され得る。因子はまた、ボーラス、舐剤またはペーストとしても投与され得る。
【０１１６】
経口投与のための固体投薬形態（カプセル、錠剤、丸剤、糖衣錠、散剤、顆粒剤など）において、本発明の１以上の治療用化合物は、１以上の薬学的に受容可能なキャリア（例えば、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウム）および／または、以下のうちのいずれかと共に混合され得る：（１）充填剤または増量剤（例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよび／またはケイ酸）；（２）結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアカシア）；（３）湿潤剤（ｈｕｍｅｃｔａｎｔ）（例えば、グリセロール）；（４）崩壊剤（例えば、アガー−アガー、炭酸カルシウム、ジャガイモもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウム）；（５）溶液減速因子（ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｒｅｔａｒｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（例えば、パラフィン）；（６）吸収加速剤（例えば、四級アンモニウム化合物）；（７）湿潤剤（ｗｅｔｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール）；（８）吸着剤（例えば、カオリンおよびベントナイトクレイ）；（９）滑沢剤（例えば、滑石、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムおよびこれらの混合物）；および（１０）着色剤。カプセル、錠剤および丸剤の場合には、薬学的組成物はまた、緩衝剤を含み得る。同様のタイプの固形組成物もまた、ラクトースすなわち乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどのような賦形剤を用いて、軟充填ゼラチンカプセルおよび硬充填ゼラチンカプセル中の充填物（ｆｉｌｌｅｒ）として用いられ得る。
【０１１７】
経口投与のための液体投薬形態としては、薬学的に受容可能なエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシルが挙げられる。活性成分に加え、液体投薬形態は、当該分野で一般に用いられる不活性希釈剤（例えば、水または他の溶媒）、可溶化剤および乳化剤（例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実油、ピーナッツ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物）を含み得る。不活性な希釈剤に加え、経口用組成物はまた、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、甘味剤、矯味矯臭剤、着色剤、芳香剤および保存剤のようなアジュバントを含み得る。
【０１１８】
懸濁液は、活性な化合物に加えて、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガー−アガーおよびトラガント、ならびにこれらの混合物のような懸濁剤を含み得る。
【０１１９】
本発明の組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤のようなアジュバントを含み得る。微生物の作用の阻止は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、ソルビン酸フェノールなど）を含めることによって保証され得る。糖、塩化ナトリウムなどのような等張化剤を組成物中に含めることも望ましくあり得る。さらに、注射可能な薬学的形態の吸収の延長は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅らせる因子を含めることによってもたらされ得る。
【０１２０】
投薬レジメンは、本発明の化合物（例えば、ＡｃｔＲＩＩａおよびＡｃｔＲＩＩｂポリペプチド）の作用を変える種々の要因を考慮して主治医によって決定されることが理解される。種々の要因としては、患者の赤血球数、ヘモグロビンレベルまたは他の診断指標、所望の標的赤血球数、患者の年齢、性別および食事、赤血球レベルの低下に寄与し得るあらゆる疾患の重篤度、投与時間、ならびに他の臨床的要因が挙げられるがこれらに限定されない。最終組成物への他の既知の増殖因子の添加もまた、投薬量に影響を及ぼし得る。進行は、赤血球およびヘモグロビンのレベルの周期的な評価、ならびに、網状赤血球レベルおよび造血プロセスの他の指標の評価によって監視され得る。
【０１２１】
霊長類およびヒトを用いた実験は、化合物が、少なくとも約２０〜３０日の期間にわたって、約１００ｎｇ／ｍｌ以上の血清濃度を達成するために十分な間隔および量で投薬された場合に、赤血球レベルに対するＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃの作用が検出可能であることを実証している。少なくとも２０〜３０日間の機関にわたって、２００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、１０００ｎｇ／ｍｌまたはそれ以上の血清レベルを得る投薬もまた使用され得る。骨への作用は、少なくとも約２０〜３０日の期間にわたって、約２００ｎｇ／ｍｌの血清レベルで観察され得、そして、実質的な作用は、約１０００ｎｇ／ｍｌ以上で始まる。したがって、骨に対してほとんど作用を有さない一方で、赤血球に対する作用を達成することが望ましくあり得る場合、投薬スキームは、約２０〜３０日の期間にわたって、約１００ｎｇ／ｍｌと約１０００ｎｇ／ｍｌとの間の血清濃度を送達するように設計され得る。ヒトでは、２００ｎｇ／ｍｌの血清レベルは、０．１ｍｇ／ｋｇ以上の単回投薬で達成され得、そして、１０００ｎｇ／ｍｌの血清レベルは、０．３ｍｇ／ｋｇ以上の単回投薬で達成され得る。分子の実測血清半減期は、約２０日と３０日との間であって、実質的に多くのＦｃ融合タンパク質よりも長く、したがって、例えば、毎週もしくは隔週ベースで約０．０５〜０．５ｍｇ／ｋｇの投薬によって持続的な有効血清レベルが達成され得るか、または、より長い投薬間隔でより高い用量が使用され得る。例えば、０．１〜１ｍｇ／ｋｇの用量は、毎月または隔月ベースで使用され得る。
【０１２２】
特定の実施形態では、本発明はまた、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドのインビボ産生のための遺伝子治療を提供する。このような治療は、上に列挙したような障害を有する細胞または組織中にＡｃｔＲＩＩａもしくはＡｃｔＲＩＩｂポリヌクレオチド配列を導入することによってその治療作用を達成する。ＡｃｔＲＩＩポリヌクレオチド配列の送達は、キメラウイルスのような組換え発現ベクターまたはコロイド分散系を用いて達成され得る。ＡｃｔＲＩＩポリヌクレオチド配列の治療的送達には、標的化されたリポソームの使用が好ましい。
【０１２３】
本明細書中で教示されるような遺伝子治療に利用され得る種々のウイルスベクターとしては、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、または、レトロウイルスのようなＲＮＡウイルスが挙げられる。レトロウイルスベクターは、マウスもしくはトリのレトロウイルスの誘導体であり得る。単一の外来遺伝子が挿入され得るレトロウイルスベクターの例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベーマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）。多数のさらなるレトロウイルスベクターが多数の遺伝子を組み込み得る。これらのベクターは全て、形質導入された細胞が同定および生成され得るように、選択マーカーについての遺伝子を移送または組み込みし得る。レトロウイルスベクターは、例えば、糖、糖脂質またはタンパク質を付着させることによって、標的特異的とされ得る。好ましい標的化は、抗体を用いて達成される。当業者は、ＡｃｔＲＩＩポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクターの標的特異的な送達を可能にするために、特定のポリヌクレオチド配列がレトロウイルスゲノム中に挿入され得るか、または、ウイルスエンベロープに付着され得ることを認識する。
【０１２４】
あるいは、組織培養細胞は、簡便なリン酸カルシウムトランスフェクション法によって、レトロウイルスの構造遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖをコードするプラスミドを用いて直接トランスフェクトされ得る。これらの細胞は、次いで、関心のある遺伝子を含むベクタープラスミドでトランスフェクトされる。得られた細胞は、培養培地中にレトロウイルスベクターを放出する。
【０１２５】
ＡｃｔＲＩＩポリヌクレオチドのための別の標的化送達システムは、コロイド分散系である。コロイド分散系としては、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズおよび脂質ベースの系（水中油エマルジョン、ミセル、混合型ミセルおよびリポソームを含む）が挙げられる。本発明の好ましいコロイド系は、リポソームである。リポソームは、インビトロおよびインビボで送達ビヒクルとして有用な人工の膜ビヒクルである。ＲＮＡ、ＤＮＡおよびインタクトなビリオンが、水性の内部に被包され得、そして、生物学的に活性な形態で細胞へと送達され得る（例えば、Ｆｒａｌｅｙら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．，６：７７，１９８１を参照のこと）。リポソームビヒクルを用いた効率的な遺伝子移入のための方法は当該分野で公知であり、例えば、Ｍａｎｎｉｎｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：６８２，１９８８を参照のこと。リポソームの組成は、通常ステロイド（特に、コレステロール）との組み合わせでの、リン脂質の組み合わせである。他のリン脂質または他の脂質もまた使用され得る。リポソームの物理的特性は、ｐＨ、イオン強度および二価のカチオンの存在に依存する。
【０１２６】
リポソームの生成において有用な脂質の例としては、ホスファチジル化合物（例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシドおよびガングリオシド）が挙げられる。例示的なリン脂質としては、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンが挙げられる。例えば、臓器特異性、細胞特異性および細胞小器官特性に基づいたリポソームの標的化もまた可能であり、当該分野で公知である。
【実施例】
【０１２７】
本発明は、ここで、一般的に記載されてきたが、単に特定の実施形態および本発明の実施形態を例示する目的のために含められ、本発明を限定することは意図されない以下の実施例を参照するとより容易に理解される。
【０１２８】
実施例１：ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質
出願人は、間に最小限のリンカーを伴ってヒトもしくはマウスのＦｃドメインに融合させたヒトＡｃｔＲＩＩａの細胞外ドメインを有する可溶性ＡｃｔＲＩＩａ融合タンパク質を構築した。この構築物は、それぞれ、ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃと呼ばれる。
【０１２９】
ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃは、ＣＨＯ細胞株から精製されたものとして以下に示される（配列番号７）：
【０１３０】
【数１３】
0005415279.tif 000014
ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃのタンパク質を、ＣＨＯ細胞株中で発現させた。３つの異なるリーダー配列を検討した：
（ｉ）ミツバチメリチン（ＨＢＭＬ）：ＭＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ（配列番号８）
（ｉｉ）組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）：ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰ（配列番号９）
（ｉｉｉ）ネイティブ：ＭＨＬＬＬＦＱＬＬＶＬＬＰＬＧＫＴ（配列番号１０）。
【０１３１】
選択された形態では、ＴＰＡリーダーを採用し、そして、以下のプロセシングを受けていないアミノ酸配列を有する。
【０１３２】
【数１４】
0005415279.tif 000015
このポリペプチドは、以下の核酸配列によってコードされる：
【０１３３】
【数１５】
0005415279.tif 000016
ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃは共に、組換え発現にとって際立って扱いやすかった。図１に示されるように、タンパク質は、単一の十分に画定されたタンパク質のピークとして精製された。Ｎ末端の配列決定は、−ＩＬＧＲＳＥＴＱＥ（配列番号１１）の単一の配列を明らかにした。精製は、例えば、以下のうちの３またはそれ以上を任意の順序で含む一連のカラムクロマトグラフィー工程によって達成され得る：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィー。精製は、ウイルス濾過およびバッファの交換により完了され得る。ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃタンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーによって決定すると、９８％を超える純度、そして、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって決定すると、９５％を超える純度まで精製された。
【０１３４】
ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃは、リガンド（特に、アクチビンＡ）に対する高い親和性を示した。標準的なアミンカップリングの手順を用いて、ＧＤＦ−１１またはアクチビンＡ（「ＡｃｔＡ」）をＢｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５チップ上に固定した。ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃのタンパク質を、このシステム上にローディングし、そして、結合を測定した。ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃは、５×１０１２の解離定数（ＫＤ）でアクチビンに結合し、そして、タンパク質は、９．９６×１０−９のＫＤでＧＤＦ１１に結合した。図２を参照のこと。ＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃも同様に挙動した。
【０１３５】
ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃは、薬物動態研究において非常に安定していた。ラットに、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃタンパク質を投薬し、そして、２４時間、４８時間、７２時間、１４４時間および１６８時間に、タンパク質の血漿レベルを測定した。別の研究では、ラットに、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇを投薬した。ラットでは、ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃは、１１〜１４日の血清半減期を有し、そして、薬物の循環レベルは、２週間後に極めて高かった（１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇの初回投与について、それぞれ、１１μｇ／ｍｌ、１１０μｇ／ｍｌまたは３０４μｇ／ｍｌ）。カニクイザルでは、血漿半減期は１４日よりもかなり長く、そして、薬物の循環レベルは、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇの初回投与について、それぞれ、２５μｇ／ｍｌ、３０４μｇ／ｍｌ、または１４４０μｇ／ｍｌであった。
【０１３６】
実施例２：ＡｃｔＲＨａ−ｈＦｃは、非ヒト霊長類における赤血球レベルを増加させる
この研究では、各群雄性５匹および雌性５匹のカニクイザルの４つの群を用い、各群の各性別につき３匹は２９日目に終結するように計画し、そして、各群の各性別につき２匹は５７日目に終結するように計画した。各動物に、ビヒクル（第１群）または１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇもしくは３０ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ（それぞれ、第２群、第３群および第４群）を、１日目、８日目、１５日目および２２日目に静脈内（ＩＶ）注射により投与した。投薬容量は、３ｍＬ／ｋｇに維持した。最初の投与の２日前、ならびに、最初の投与の後に、１５日目、２９日目、および５７日目（残存する２匹の動物について）に、赤血球レベルの種々の指標を評価した。
【０１３７】
ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃは、全ての用量レベルおよび研究全体にわたる時点で、雄性および雌性について、平均の赤血球パラメータ（赤血球数［ＲＢＣ］、ヘモグロビン［ＨＧＢ］およびヘマトクリット［ＨＣＴ］）における統計的に有意な増加を引き起こし、絶対的および相対的な網状赤血球数における上昇を伴った。図３〜６を参照のこと。
【０１３８】
統計的有意差は、基線における処置群についての平均に対して、各処置群について計算した。
【０１３９】
注目すべきことに、赤血球数およびヘモグロビンレベルの増加は、その強度がエリスロポエチンで報告されている作用とほぼ等しい。これらの作用の開始は、エリスロポエチンよりも、ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃの方がより迅速である。
【０１４０】
同様の結果がラットおよびマウスで観察された。
【０１４１】
実施例３：ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃはヒト患者における赤血球レベルを増加させる
主として健康な閉経後の女性におけるタンパク質の安定性を評価するために行われた、無作為化された二重盲検のプラセボ対照を含む研究において、実施例１に記載されるＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃ融合タンパク質を、ヒト患者に投与した。４８人の被験体を、６つのコホートに無作為化し、ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃまたはプラセボ（５  有効（ａｃｔｉｖｅ）：１  プラセボ）のいずれかの単回用量を与えた。用量レベルは、０．０１〜３．０ｍｇ／ｋｇ静脈内（ＩＶ）および０．０３〜０．１ｍｇ／ｋｇ皮下（ＳＣ）の範囲であった。全ての被験体を、１２０日間追跡した。薬物動態（ＰＫ）解析に加え、骨の形成および再吸収の生化学的マーカーおよびＦＳＨレベルの測定によって、ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃの生物学的活性もまた評価した。
【０１４２】
潜在的な変化を調べるため、研究の経過にわたり、全被験体についてヘモグロビンおよびＲＢＣ数を詳しく検討し、基線レベルと比較した。対照と同じ時間にわたって、血小板数を比較した。血小板数については、経時的に、基線値からの臨床上有意な変化は存在しなかった。
【０１４３】
ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃのＰＫ解析は、用量と共に線形のプロフィールと、約２５〜３２日の平均半減期を示した。ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃの曲線下面積（ＡＵＣ）は、用量に対して線形的に関連しており、そして、ＳＣ投薬後の吸収は、本質的に完全であった（図７および８を参照のこと）。これらのデータは、ＳＣがＩＶ投薬の最初の数日に伴う薬物の血清濃度におけるスパイクを回避しつつ、薬物についての等価なバイオアベイラビリティおよび血清半減期を提供するので、ＳＣが望ましい投薬アプローチであることを示している（図８を参照のこと）。ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃは、同化作用性の骨成長のマーカーである骨特異的アルカリ性ホスファターゼ（ＢＡＰ）の血清レベルの、迅速かつ持続的な用量依存性の増加と、骨再吸収のマーカーであるＣ末端１型コラーゲンテロペプチド（ｔｅｌｏｐｅｐｔｉｄｅ）および酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂレベルの用量依存性の減少とをもたらした。ＰＩＮＰのような他のマーカーは、決定的でない結果を示した。ＢＡＰレベルは、薬物の最高投薬量において飽和に近い作用を示し、この同化作用性の骨バイオマーカーに対する最大の半分の作用が、０．３ｍｇ／ｋｇの投薬量において達成され得、その増加は３ｍｇ／ｋｇまでの範囲であることを示している。薬物についてのＡＵＣに対する薬力学的作用の関係性として計算すると、ＥＣ５０は、５１，４６５（日＊ｎｇ／ｍｌ）である。図９を参照のこと。これらの骨バイオマーカーの変化は、試験した最高用量レベルにおいて約１２０日間持続された。また、アクチビンの阻害と一致して、結成ＦＳＨレベルにおける用量依存性の減少もまた存在した。
【０１４４】
全体として、ＩＶまたはＳＣのいずれで与えたとしても、おそらく０．０１ｍｇ／ｋｇの群と０．０３ｍｇ／ｋｇの群における瀉血を研究するために関連付けられた研究の第１週にわたって、ヘモグロビンにおける非常に小さな薬物に関連しない減少が存在した。０．１ｍｇ／ｋｇのＳＣおよびＩＶのヘモグロビンの結果は安定しており、８〜１５日目までにあまり大きくない増加を示した。０．３ｍｇ／ｋｇのＩＶ用量レベルでは、早くも２日目に見られ、そして、しばしば１５〜２９日目にピークを迎えるＨＧＢレベルのはっきりとした増加が存在した（これは、プラセボ被験体では見られなかった）。この研究のこの時点では、この変化は統計的有意差には到達していなかった。
【０１４５】
全体として、ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃは、赤血球数および網状赤血球数に対して用量依存性の作用を示した。血液学的変化のまとめについては、図１０〜１３を参照のこと。
【０１４６】
実施例４：代替的なＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃタンパク質
本明細書中に記載される方法にしたがって使用され得る種々のＡｃｔＲＩＩａ改変体は、ＷＯ２００６／０１２６２７として公開される国際特許出願（ｐｐ．５５〜５８を参照のこと；その全体が本明細書中に参考として援用される）に記載されている。代替的な構築物は、Ｃ末端テイル（ＡｃｔＲＩＩａの細胞外ドメインの最後から１５アミノ酸）の欠失を有し得る。このような構築物の配列は以下に示される（Ｆｃ部分に下線を付す）（配列番号１２）：
【０１４７】
【数１６】
0005415279.tif 000017
実施例５：ＡｃｔＲＩＩｂ−Ｆｃ融合タンパク質
出願人は、ヒトＦｃドメインに融合させたヒトＡｃｔＲＩＩｂの細胞外ドメインを有する可溶性ＡｃｔＲＩＩｂ融合タンパク質を構築した。アクチビンと細胞外ＡｃｔＲＩＩｂとの共結晶構造は、リガンド結合における細胞外ドメインの最後（Ｃ末端）の１５アミノ酸（本明細書において「テイル」と呼ばれる）に、何らかの役割を示さなかった。この配列は、結晶構造上で分解できず、これらの残基が、結晶中で均一にパッケージングされなかった可撓性ループ中に存在していることが示唆された。ＴｈｏｍｐｓｏｎらＥＭＢＯ  Ｊ．２００３  Ａｐｒ  １；２２（７）：１５５５−６６。この配列はまた、ＡｃｔＲＩＩｂとＡｃｔＲＩＩａとの間で、不完全に保存されている。したがって、これらの残基は、基本的、または、バックグラウンドのＡｃｔＲＩＩｂ−Ｆｃ融合構築物においては省略した。さらに、バックグラウンド融合物における６４位は、アラニンによって占有されており、一般に「野生型」形態と考えられているが、Ａ６４Ｒ対立遺伝子が天然に生じる。したがって、バックグラウンドＡｃｔＲＩＩｂ−Ｆｃ融合物は、以下の配列を有する（Ｆｃ部分に下線を付す）（配列番号２０）：
【０１４８】
【数１７】
0005415279.tif 000018
驚くべきことに、Ｃ末端テイルは、アクチビンおよびＧＤＦ−１１の結合を増強することが見出され、したがって、ＡｃｔＲＩＩｂ−Ｆｃの好ましいバージョンは、以下の配列を有する（Ｆｃ部分に下線を付す）（配列番号２１）：
【０１４９】
【数１８】
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本明細書中に記載される方法にしたがって使用され得る種々のＡｃｔＲＩＩｂ改変体は、ＷＯ２００６／０１２６２７として公開される国際特許出願（例えば、ｐｐ．５９〜６０を参照のこと；その全体が本明細書中に参考として援用される）に記載されている。
【０１５０】
実施例６：ＡｃｔＲＩＩｂ−ｈＦｃは、非ヒト霊長類における赤血球生成を刺激する
雄性および雌性のカニクイザルに、ＡｃｔＲＩＩｂ−ｈＦｃ（ＩｇＧｌ）を、１ヶ月間、週一回、皮下注射により投与した。４８匹のカニクイザル（２４匹／性別）を、４つの処置群（６匹の動物／性別／群）のうちの１つに割り当て、そして、４週間にわたり、週一回（合計５用量）、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇまたｈ３０ｍｇ／ｋｇの、ビヒクルまたはＡｃｔＲＩＩｂ−ｈＦｃのいずれかの皮下注射を施した。評価したパラメータには、一般的な臨床病理学（血液学、臨床化学、凝固および尿検査）を含めた。ＡｃｔＲＩＩｂ−ｈＦｃは、処置した動物において、１５日までに、平均の絶対的網状赤血球値の統計的に有意な上昇を引き起こした。３６日までに、ＡｃｔＲＩＩｂ−ｈＦｃは、平均絶対的網状赤血球および赤血球分泌幅の値の上昇、ならびに、平均血球ヘモグロビン濃度の低下を含む、いくつかの血液学的変化を引き起こした。全ての処置群および両方の性別が影響を受けた。これらの作用は、骨髄からの未成熟な網状赤血球の放出に対するＡｃｔＲＩＩｂ−ｈＦｃの正の作用と一致している。この作用は、処置した動物から薬物を洗い出した後に逆転した（研究の５６日目までに）。したがって、本発明者らは、ＡｃｔＲＩＩｂ−ｈＦｃが赤血球生成を刺激すると結論付ける。
【０１５１】
（参考としての援用）
本明細書中で言及される全ての刊行物および特許は、各個々の刊行物または特許が、具体的かつ個別に参考として援用されると示されるかのように、その全体が本明細書により参考として援用される。
【０１５２】
主題の特定の実施形態が考察されてきたが、上記明細書は、例示的であり、限定的なものではない。本明細書および以下の特許請求の範囲を精査すれば、多くのバリエーションが当業者に明らかとなる。本発明の完全な範囲は、その等価な範囲と共に特許請求の範囲を、そして、このようなバリエーションと共に明細書を参照することによって決定されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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