(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）またはその変異型と、防腐剤として塩化ベンザルコニウムおよびベンジルアルコールの両方とを含有する液体医薬組成物。
【請求項２】
塩化ベンザルコニウムは０．００５〜０．０３ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し、ベンジルアルコールは５．０〜１２．０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する請求項１に記載の液体医薬組成物。
【請求項３】
ＦＳＨまたはその変異型は１０〜２００μｇ／ｍｌの濃度で存在する請求項１または２に記載の液体医薬組成物。
【請求項４】
酸化防止剤としてメチオニンをさらに含有する請求項１〜３のいずれか一項に記載の液体医薬組成物。
【請求項５】
メチオニンは０．１〜１．０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する請求項４に記載の液体医薬組成物。
【請求項６】
界面活性剤をさらに含有する請求項１〜５のいずれか一項に記載の液体医薬組成物。
【請求項７】
界面活性剤はポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステルである請求項６に記載の液体医薬組成物。
【請求項８】
ポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステルはポリソルベート２０またはポリソルベート８０である請求項７に記載の液体医薬組成物。
【請求項９】
ポリソルベート２０またはポリソルベート８０は０．０５〜０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する請求項８に記載の液体医薬組成物。
【請求項１０】
張性改変剤をさらに含有する請求項１〜９のいずれか一項に記載の液体医薬組成物。
【請求項１１】
張性改変剤は糖アルコールまたは糖である請求項１０に記載の液体医薬組成物。
【請求項１２】
張性改変剤はマンニトールである請求項１１に記載の液体医薬組成物。
【請求項１３】
マンニトールは１．０〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する請求項１２に記載の液体医薬組成物。
【請求項１４】
６．５〜７．５の範囲のｐＨを有する請求項１〜１３のいずれか一項に記載の液体医薬組成物。
【請求項１５】
ｐＨは６．８〜７．２の範囲にある請求項１４に記載の液体医薬組成物。
【請求項１６】
ｐＨはＮａＯＨを使用して調整される請求項１４または１５に記載の液体医薬組成物。
【請求項１７】
生理学的に許容される緩衝剤をさらに含有する請求項１〜１６のいずれか一項に記載の液体医薬組成物。
【請求項１８】
緩衝剤はリン酸塩である請求項１７に記載の液体医薬組成物。
【請求項１９】
緩衝剤は１０〜１００ｍｍｏｌ／ｌの濃度で存在する請求項１７または１８に記載の液体医薬組成物。
【請求項２０】
活性薬剤としてのＦＳＨまたはその変異型と、界面活性剤としてのポリソルベート２０およびポリソルベート８０のうちの少なくとも一方と、張性改変剤としてのマンニトールと、緩衝剤としてのリン酸塩と、安定化剤としてのメチオニンと、防腐剤としてのベンジルアルコールおよび塩化ベンザルコニウムとを含有するが、更なる賦形剤は含有しない請求項１〜１９のいずれか一項に記載の液体医薬組成物。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれかに記載の液体医薬組成物を備えた医薬容器。
【請求項２２】
前記容器は注射器、ガラス瓶、点滴ボトル、アンプルまたはカルプルである請求項２１に記載の医薬容器。
【請求項２３】
前記容器は注射ペン内のカルプルである請求項２１または２２に記載の医薬容器。
【請求項２４】
活性薬剤としてのＦＳＨまたはその変異型を、防腐剤としての塩化ベンザルコニウムおよびベンジルアルコールの両方とさらに医薬賦形剤とを含む水性製剤中に調剤させる、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の液体医薬組成物を調製する方法。
【請求項２５】
ＦＳＨまたはその変異型と塩化ベンザルコニウムおよびベンジルアルコールとを含有する溶液を、ガラス瓶、アンプル、カルプルまたはカートリッジ内に配置することからなる包装された医薬組成物を製造する方法。
【請求項２６】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の液体医薬組成物であって、複数回投与にて使用するための液体医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、卵胞刺激ホルモンポリペプチドと、防腐剤としての塩化ベンザルコニウムおよびベンジルアルコールとを含有する液体医薬組成物に関する。組成物はさらに任意選択で１つまたは複数の他の医薬として許容される賦形剤を含有する。１実施形態では、組成物は酸化防止剤としてメチオニンを含有する。組成物は優れた貯蔵安定性を示し、卵胞刺激ホルモン製剤が有用な治療と考えられる疾患および医学的適応の予防および治療に特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）は下垂体前葉の性腺刺激細胞により生成され、血中へ放出される。ＦＳＨは、雌での卵成熟の制御、および雄での精子形成の制御の際に黄体形成ホルモン（ＬＨ）と共に作用する。ＦＳＨとＬＨはいずれも、別々の遺伝子によりコードされた２つの非共有結合により結合されたα鎖とβ鎖から成るヘテロダイマー糖タンパク質のファミリーに属している。α鎖とβはいずれも糖化すなわちグリコシル化されている。α−サブユニットは９２個のアミノ酸残基から成り、β−サブユニットは１１１個のアミノ酸残基から成り、その各々は２つの潜在的なアスパラギンに結合されるグリコシル化部位を有する。
【０００３】
ヒトＦＳＨは、無排卵女性の治療に、多卵胞発達（過剰排卵）の刺激のために、およびＩＶＦ、ＩＣＳＩ、ＧＩＦＴまたはＣＩＦＴ等の受胎支援の準備に使用されている。  さらに、ヒトＦＳＨは、ＦＳＨ生産が低いか無い女性での卵胞成熟の刺激や、先天性または後天性の低ゴナドトロピン性性機能低下症の男性での精子形成の刺激のために使用されている。
【０００４】
１９８０年代までは、ヒトＦＳＨの主な供給源は、出産適齢期の女性の尿から単離された尿由来のＦＳＨであった。さらに精製された形式の高純度の尿由来ＦＳＨが１９９０年代に導入され、遂には１９９８年以来、組換えＦＳＨが開発され広く使用されるようになった。組換えＤＮＡ技術の到来で、α鎖およびβ鎖をコードする核酸配列でトランスフェクトした細胞培養物でヒトＦＳＨを生産することが可能となった。α鎖およびβ鎖をコードするＤＮＡ配列と、組換えＦＳＨの生産方法が例えば特許文献１〜３に開示されている。
【０００５】
現在、ドイツの市場にはＧＯＮＡＬ−ｆ（登録商標）およびＰｕｒｅｇｏｎ（登録商標）という２つの市販の組換えヒトＦＳＨ製品があり、これらはいずれもヒト野生型α鎖およびβ鎖をコードするＤＮＡ配列をチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現させることにより生産されている。
【０００６】
一般に、タンパク質は半減期は非常に短く、タンパク質活性の発現に不利な温度、水、空気との接触、高圧、物理的／機械的ストレス、有機溶媒、および微生物による汚染等のような様々な要因に曝されることで、モノマーの凝集、ダイマーの解離、および容器の表面への付着のような変性を受ける。
【０００７】
結果として、変性されたタンパク質は本来の物理化学的性質および生理活性効果を失う。タンパク質の変性は不可逆であるため、一度変性したタンパク質は、初期状態にその元の性質を戻すことはほとんど不可能である。
【０００８】
特に、ヒトＦＳＨのように２つの異なるサブユニットから成るヘテロダイマー構造を有
し、かつ各回数百ｍｇ未満の微量で投与されるタンパク質には、水溶液中での二量体の解離および容器の内表面へのタンパク質の吸着によるタンパク質の損失を含めて、比較的高いタンパク質の損失に関連する問題がある。解離したタンパク質は自身の生理活性を失い、解離したモノマーは容易に凝集する。さらに、容器の内表面に吸着されたタンパク質は、変性プロセスを介して容易に凝集する。そのように変性したタンパク質は、人体へ投与されると、人体中で、天然タンパク質に対する抗体を形成する原因としてはたらく可能性がある。
【０００９】
タンパク質製剤のいくつかは凍結乾燥（フリーズドライ）により安定性の問題を克服している。これらの凍結乾燥された調製物は十分な貯蔵寿命を保証するのに十分に安定しているが、投与前に投与再構成が必要であるという欠点を有している。したがって、患者は必ず乾燥糖タンパク質を使用前に溶媒中で（例えば注射用蒸留水）再構成しなければならず、これは患者にとって不利かつ不便である。さらに、ＦＳＨの凍結乾燥調製物と一緒に、溶媒が提供されなければならない。定期的な時期にＦＳＨの注射が必要な患者（例えば排卵誘発のため日用量の組換えヒトＦＳＨを受けている患者）にとって、性腺刺激ホルモン製剤の取り扱い、投薬、および注射が簡単であることは重要である。凍結乾燥された性腺刺激ホルモン調製物の再構築には思慮と注意が要求されるため、可能ならば回避されるべきである。これらの糖タンパク質を、患者に安定な溶液として生産かつ分配でき、患者が再構成なしで薬物を直接注入できれば、性腺刺激ホルモンの使用が容易になるだろう。さらに、フリーズドライプロセスは高価で時間がかかる加工工程であり、性腺刺激ホルモン製剤の調製時にかかる工程が回避されれば有利であろう。
【００１０】
したがって、合理的な貯蔵寿命を保証するのに十分な安定を有する、そのまま使える状態の注射調製物が必要とされている。
そのような制限に対処する代替手段として、タンパク質の安定性を溶液状態のタンパク質に安定化剤を加えることにより改善してもよい。有用なタンパク質安定化剤の例として、界面活性剤、アルブミン等のタンパク質、多糖、アミノ酸、ポリマー、塩類等が知られている。しかしながら、大半の適切な安定化剤は個々のタンパク質の固有の物理化学的性質を考慮して選択され、使用されなければならない。さらに、異なる複数の安定化剤を組み合わせて使用すると、個々の安定化剤間の競合作用および副作用により、期待される効果に対して推測されるのとは反対の副作用が引き起こされる可能性がある。さらに、個々の安定化剤は対応タンパク質の安定化に好都合な特定の濃度範囲を有するため、溶液中に存在するタンパク質の安定化に成功するには注意深い対応と多くの努力を要する。
【００１１】
ＦＳＨはガラス瓶、カルプルまたはアンプル中で単回投与と複数回投与の両方の液体形式で調製されている。単回投与形式は使用に先立って貯蔵時に安定かつ効能を有しなければならない。複数回投与形式は使用に先立って貯蔵時に安定かつ効能を有しなければならないだけでなく、アンプルの密封が損なわれた後でも、安定かつ効能を有し、複数回投与の使用計画の投与期間にわたって細菌が比較的存在しない状態でなければならない。このため、複数回投与形式は静菌剤を含有することが多い。
【００１２】
ＧＯＮＡＬ−ｆ（登録商標）は、ヒト組換えＦＳＨのすぐに使える液体製剤であるが、注射ペンから投与される注射用溶液として利用可能である。かかる溶液は防腐剤としてｍ−クレゾールを含む（ＲＯＴＥ  ＬＩＳＴＥ２００７，Ｎｏ．５０  ００４）。Ｐｕｒｅｇｏｎ（登録商標）も、注射用のすぐに使える液体製剤として利用可能であるが、
防腐剤としてベンジルアルコールを含む（ＲＯＴＥ  ＬＩＳＴＥ２００７  Ｎｏ．５０  
０１０）。
【００１３】
防腐剤を含有するＦＳＨ液体製剤は、特許文献にも記載されている。特許文献４は、フェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベン
ジルアルコール、アルキルパラベン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウムおよびチメロサールから選択された防腐剤を含むＦＳＨおよびＦＳＨ変異型の製剤について記載している。かかる防腐剤の使用法は一般的な方法で言及されているが、組換えヒトＦＳＨの液体製剤における防腐剤の特定の組み合わせまたは混合物に関する開示はない。
【００１４】
さらに、特許文献５は安定化剤としてグリシン、メチオニン、非イオン性界面活性剤およびリン酸緩衝液を含むヒトＦＳＨ水性製剤に関する。さらにかかる製剤は任意選択でベンジルアルコール、クレゾール、パラベンおよびその混合物等の防腐剤を含んでもよい。
【００１５】
特許文献６は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ７７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ８７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ８８、およびＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８から選択された界面活性剤を含むＦＳＨの液体医薬組成物について記載している。組成物は、フェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウムおよびチメロサールから選択された静菌剤をさらに含んでもよい。複数の静菌剤の混合物または組み合わせについては言及されていない。
【００１６】
したがって、複数回の投与に適した、防腐剤を含有する性腺刺激ホルモン製剤を提供することが望まれているが、ヒトタンパク質を含有する保存型医薬製剤の生産は困難であることが分かっている。防腐剤を使用した場合、医薬製剤をより長期間保存すると安定化の問題を生じさせることが観察されている。このプロセスでは、ヒトタンパク質が不活性化されて凝集体を形成し、かかる凝集体が注射された溶液に対して観察される耐性の原因となり得る。注入または注射用の保存医薬製剤の生産の通常のプロセスは、活性なヒトタンパク質成分の場合には使用されないが、それはかかる活性物質が１２１℃のオートクレーブ中での殺菌条件下で不活性化され、それらの構造が破壊されるためである。また、薬学で使用される通常の防腐剤は、活性なヒトタンパク質成分と反応し、かかる成分が不活性化されることも知られている。使用される防腐剤のタイプは、耐性の重要な役割を果たす。すべての防腐剤は、アレルギー率が高いか低い。したがって、ヒトタンパク質製剤中の防腐剤は、良好な保存が達成されるが、特定のヒト糖タンパク質と組み合わせた特定の防腐剤の欠点が最小限であるという点で選択されることが重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】国際公開第８８／ｌ０２７０号
【特許文献２】国際公開第８６／０４５８９号
【特許文献３】欧州出願出願公開第０ ７３５ １３９号
【特許文献４】国際公開第００／０４９１３号
【特許文献５】国際公開第２００４／０３７６０７号
【特許文献６】国際公開第２００４／０８７２１３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
従って、防腐剤の存在により保存されるヒト組換えＦＳＨの新規な液体製剤であって、長期間ヒト組換えＦＳＨ活性を安定に維持することが可能な液体製剤の開発が急務になっている。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明によれば、上記のおよびさらなる課題が独立請求項の特徴により解決される。
有利な実施形態が従属請求項に定義されている。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
活性薬剤としてＦＳＨまたはその変異型を含み、防腐剤として塩化ベンザルコニウムおよびベンジルアルコールの両方を含む液体医薬組成物の形で組換えヒトＦＳＨを調剤すると、単回投与にも複数回投与にも使用可能な、組成物の優れた安定性を提供することが、驚くべきことに判明した。本発明の組成物は、冷蔵せず、活性を有意に損なわず、かつ有意に分解せず、長期間保存可能である。防腐剤としての塩化ベンザルコニウムとベンジルアルコールの組み合わせは、グリコホルモンＦＳＨに関して特に有利であるとされるが、それはかかる組み合わせが優れた保存性を提供し、かつＦＳＨとの不利な相互作用が最小限に抑えられることを保証するためである。
【００２１】
別段の定めがなければ、以下の定義は、本発明を説明するために使用される種々の用語の意味および範囲を例証および定義するように意図される。
用語「ＦＳＨ」は、組換え技術により生産されてもよいし、閉経後の女性の尿等のヒトの供給源から分離されてもよい、ヒトＦＳＨすなわち「ｈＦＳＨ」を含むがこれに限定されない全長成熟タンパク質としての卵胞刺激ホルモンポリペプチドのことを指す。  ヒト糖タンパク質のタンパク質配列およびヒトＦＳＨβサブユニットのタンパク質配列は、科学論文および特許文献（例えば国際公開第２００４／０８７２１３号参照）から当業者には知られている。
【００２２】
本明細書に添付されるように、ヒトＦＳＨのα鎖のアミノ酸配列は配列番号１で示され、ヒトＦＳＨのβ鎖のアミノ酸配列は配列番号２で示される。これらのアミノ酸配列は、ＥＭＢＬデータベースでアクセッション番号Ｊ００１５２およびＮＣＢＩデータベースでアクセッション番号ＮＭ０００５１０でそれぞれ寄託されたヒトＦＳＨのα鎖およびβ鎖野生型アミノ酸配列に相当する。
【００２３】
ヒトＦＳＨをコードする野生型核酸配列は、配列番号３（＝α鎖）および配列番号４（＝β鎖）で示される。
組換えＦＳＨは、ヒトで天然に見出される野生型核酸配列によってコードされてもよいし、またはその発現が野生型アミノ酸配列（つまりヒトで天然に見出される野生型タンパク質配列）を有するＦＳＨになる変更された核酸配列によってコードされてもよい。
【００２４】
ヒトＦＳＨをコードする核酸配列は、例えば、ヒトＦＳＨのα鎖およびβ鎖をコードする核酸配列の一方又は両方を、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞でのコドン使用に適合させて、かかる宿主細胞での組換えＦＳＨの発現レベルおよび収率を増加させるように変更されてもよい。
【００２５】
ヒトＦＳＨをコードし、ＣＨＯ細胞でのコドン利用に関して修飾された核酸配列の例が、国際公開第２００９／０００９１３号に記載されている。ヒトＦＳＨのβ鎖をコードする修飾核酸配列は、配列番号５で示される核酸配列のコード領域であり（配列番号５において、コード領域はヌクレオチド５６から開始し、ヌクレオチド４４２まで延びる）、ヒトＦＳＨのα鎖をコードする修飾核酸配列は、配列番号６で示される核酸配列のコード領域である（配列番号６で、コード領域はヌクレオチド１９から開始し、ヌクレオチド３６６まで延びる）。ヒトＦＳＨのβ鎖をコードする第１の修飾核酸配列と、ヒトＦＳＨのα鎖をコードする第２の修飾核酸配列とを有する組換え核酸分子を備えたＣＨＯ細胞系を、２００７年３月２８日に寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８３３の下、ブラウンシュベイク（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）所在のドイツ細胞バンク（ＤＳＭＺ）に寄託した。
【００２６】
好ましい実施形態では、本発明のＦＳＨ液体製剤は、ＣＨＯ細胞でのコドン利用に関してヒトＦＳＨのβ鎖とα鎖の両方について修飾されたＦＳＨ核酸配列から組換え遺伝子発
現によって得られた組換えヒト野生型ＦＳＨを含む。別の好ましい実施形態では、組換えＦＳＨは国際公開第２００９／０００９１３号に開示されたＦＳＨ核酸配列からの発現により得られる。
【００２７】
「ＦＳＨ変異型」という表現は、ヒトＦＳＨとアミノ酸配列、グリコシル化パターン、またはサブユニット間結合が異なるが、ＦＳＨ活性は示す分子を包含することを意味する。例にはＣＴＰ−ＦＳＨが含まれ、これはLaPoIt et al. (1992) Endocrinology, 131, 2514-2520またはKlein et al. (2003) Human Reprod., 18, 50-56に記載されているような、野生型αサブユニットと、ｈＣＧのカルボキシ末端ペプチドがＦＳＨのβサブユニットのＣ末端に融合されたハイブリッドβサブユニットとから成る長時間作用性修飾組換えＦＳＨである。単一鎖ＣＴＰ−ＦＳＨも含まれるが、これはｈＣＧのカルボキシ末端ペプチドがＦＳＨのβサブユニットのＣ末端に融合されたKlein et al. (2002) Fertility & Sterility, 77, 1248-1255に記載された単一鎖分子である。ＦＳＨ変異型の他の例には、国際公開第０１／５８４９３号に開示されるようなα鎖およびβ鎖の少なくとも一方に追加のグリコシル化部位組み込まれたＦＳＨ分子や、国際公開第９８／５８９５７号に開示されるようなサブユニット間Ｓ−Ｓ結合を有するＦＳＨ分子が含まれる。国際公開第２００４／０８７２１３号には、βサブユニットのカルボキシ末端の欠失が特徴であるＦＳＨ変異型の他の例が開示されている。ＦＳＨ変異型の他の例には、追加のグリコシル化部位を導入するか天然のグリコシル化部位を削除するようにタンパク質のアミノ酸配列を変化させることにより、野生型のＦＳＨと比較してグリコシル化の程度を変更させたＦＳＨ分子が含まれる。
【００２８】
さらに、本発明のＦＳＨまたはＦＳＨ変異型は、化学的部分により修飾されたＦＳＨ分子であってもよい。そのようなＦＳＨ結合体は、例えばポリアルキルエングリコール（例、ＰＥＧ）、ヒドロキシアルキルスターチ（例、ＨＥＳ）または他のポリマー部分を備えてもよい。
【００２９】
ＦＳＨヘテロダイマーまたはＦＳＨ変異型ヘテロダイマーは、任意の適切な方法により、例えば組換えにより、場合に応じて天然供給源からの単離または精製により、または化学合成により、もしくはそれらの任意の組み合わせにより、生産することが可能である。
【００３０】
用語「組換え」の使用は、組換えＤＮＡ技術の使用を通じて生産されるＦＳＨまたはＦＳＨ変異型の調製を指す（例えば国際公開第８５／０１９５８号参照）。ＦＳＨのゲノムおよび相補的ＤＮＡクローンの配列がいくつかの種のαサブユニットとβサブユニットについて知られている。組換え技術を使用した組換えＦＳＨまたはＦＳＨ変異型の種々の生産方法が先行技術に記載されており、例えば欧州特許出願出願公開第０ ７１１ ８９４号および欧州特許出願出願公開第０ ４８７ ５１２号を参照されたい。
【００３１】
本発明に従って使用されるＦＳＨまたはＦＳＨ変異型は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような哺乳動物細胞からを含めて組換え手段によって生産されるだけでなく、尿の供給源のような他の生物学的源から精製されてもよい。許容される方法が先行技術に開示されている。
【００３２】
組換えヒトＦＳＨは、１または複数の精製工程により、宿主細胞培養液上清から精製可能である。適切な精製方法が当業者には周知であり、それにはイオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィおよびゲル濾過が含まれる。組換えヒトＦＳＨを精製する方法が例えば国際公開第００／６３２４８号、国際公開第２００６／０５１０７０号および国際公開第２００５／０６３８１１号に開示されている。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態では、ＦＳＨまたはＦＳＨ変異型は、それぞれヒトＦＳＨに一致するかまたはヒトＦＳＨに由来する。好ましい実施形態では、ＦＳＨまたはＦＳＨ変異型は、組換え技術により生産される。
【００３４】
最も好ましくは、ＦＳＨは組換えにより生産されたヒトＦＳＨであり、特に好ましくは、配列番号３および４（＝野生型核酸配列）または配列番号５および６（＝コドン最適化された核酸配列）のいずれかによりコードされたＦＳＨのヒト糖タンパク質αサブユニットおよびβサブユニットをコードするＤＮＡを備えた１つまたは複数のベクターでトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣細胞で生産される。αサブユニットとβサブユニットをコードするＤＮＡは同じベクター上に存在してもよいし、異なるベクター上に存在してもよい。
【００３５】
組換えＦＳＨは、その尿相当物に勝るいくつかの長所を有する。組換え細胞を使用した培養および単離技術により、バッチの一貫性が可能となる。対照的に、尿ＦＳＨは、サブユニットの純度、グリコシル化パターン、シアリル化および酸化等の特性がバッチによって大幅に変わる。組換えＦＳＨではバッチごとの一貫性と純度が大きいため、かかるホルモンは容易に等電点電気泳動（ＩＥＦ）等の技術を使用して容易に識別および定量化することが可能である。組換えＦＳＨの識別および定量化が可能となるその容易さにより、バイオアッセイにより充填せずにホルモンの質量で（fill-by-mass）ガラス瓶に充填することが可能となる。
【００３６】
用語「ＦＳＨ活性」は、Ｓｔｅｅｌｍａｎ−Ｐｏｈｌｅｙアッセイ（Steelman et al. (1953) Endocrinology 53, 604-616）における卵巣重量増加や女性患者における卵胞成長のようなＦＳＨに関連する生体応答を誘発するＦＳＨ製剤の能力を指す。女性患者における卵胞成長は、例えば刺激の８日目の平均直径が約１６ｍｍの卵胞の数に関して、超音波により評価することが可能である。生物活性はＦＳＨについて認められている基準に関して評価される。
【００３７】
用語「水性希釈剤」は、水を含む液体溶媒を指す。水性溶媒系は、もっぱら水のみから成ってもよいし、または水と１または複数の混和性溶媒とから成ってもよく、糖、緩衝剤、塩類または他の賦形剤等の溶解される溶質を含んでいてもよい。より一般に使用される非水性溶媒は、メタノール、エタノール、プロパノール等の短鎖有機アルコール、アセトン等の短鎖ケトン、およびグリセロール等の多価アルコールである。本発明の好ましい実施形態では、水性希釈剤は水である。すなわち、本発明のすぐに使用できる液体製剤は、水性製剤である。
【００３８】
「張性改変剤」または「等張剤」は、物理的に耐えられ、製剤に接触している細胞膜を横切る水の正味の流れを防止するよう製剤に適切な張性を与える化合物である。適切な等張剤にはグリセロール、アミノ酸またはタンパク質（例えばグリシンまたはアルブミン）、塩類（例えば塩化ナトリウム）、糖（例えばデキストロース、スクロース、トレハロースおよびラクトース）および糖アルコール（例えばマンニトールおよびソルビトール）が含まれるが、これらに限定されない。
【００３９】
用語「静菌薬」または「静菌剤」または「防腐剤」は、抗菌剤として機能するよう製剤に加えられる組成物または物質を指す。本発明の保存されたＦＳＨまたはＦＳＨ変異型を含む製剤は、好ましくはヒトでの市販の実行可能な多用途製品となるのに有効な防腐剤の法定または規制ガイドラインを好ましくは満たす。
【００４０】
本発明の製剤に使用される静菌剤は塩化ベンザルコニウムおよびベンジルアルコールの組み合わせである。塩化ベンザルコニウムとベンジルアルコールに加えて、フェノール、
ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチル等）、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、またはチメロサール等のさらなる防腐剤を組成物に含むことも可能であるが、塩化ベンザルコニウムとベンジルアルコールだけが防腐剤として存在することが好ましい。
【００４１】
用語「緩衝剤」または「生理学的に許容される緩衝剤」は、製剤中で医薬または獣医学的に使用するのに安全であることが知られ、かつ製剤に望ましいｐＨ範囲に製剤のｐＨを維持または制御する効果がある化合物の溶液を指す。ｐＨを中程度な酸性ｐＨから中程度な塩基性ｐＨまでに制御するために許容される緩衝剤には、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、アルギニン、ＴＲＩＳおよびヒスチジン等の化合物が含まれるが、これらに限定されない。望ましい緩衝剤はリン酸緩衝液である。
【００４２】
用語「リン酸緩衝液」は、所望のｐＨに調整されるリン酸またはその塩類を含む溶液を指す。一般に、リン酸緩衝液はリン酸またはリン酸塩（ナトリウムとカリウム塩を含むがこれらに限定されない）から調製される。リン酸ナトリウム塩やリン酸のカリウム一塩基塩、二塩基塩および三塩基塩等のいくつかのリン酸塩が当該技術分野で周知である。リン酸の塩は、生じた塩の水和物として生じることも知られている。リン酸緩衝液は一連のｐＨをカバーしてよく、それは例えば約ｐＨ４から約ｐＨ１０、この香椎範囲は約ｐＨ５から約ｐＨ９、最も好ましい範囲は約６．０から約８．０、最も好ましくは約ｐＨ ７．０
である。好ましい実施形態では、緩衝系は、リン酸緩衝液のみから成り、つまりリン酸塩以外の緩衝剤が製剤中に存在しない。
【００４３】
用語「ガラス瓶」は、入れられた滅菌状態で液体形式のＦＳＨを保持するのに適した貯蔵器を広く指す。本明細書に使用するガラス瓶の例には、アンプル、カートリッジ、ブリスターパッケージ、または注射器、ポンプ（浸透圧ポンプを含む）、カテーテル、経皮パッチ、肺スプレーまたは経口腔粘膜スプレーを介しての患者へのＦＳＨの送達に適した他のそのような貯蔵器を含む。非経口、肺、口腔粘膜、経皮投与のための製品のパッケージに適したガラス瓶は当該技術分野で周知であり、認識されている。
【００４４】
用語「安定性」は、本発明の製剤中のＦＳＨの物理的、化学的、およびコンホメーション的な安定性を指す（生物活性の維持を含む）。タンパク質製剤の不安定さは、ヘテロダイマーのモノマーへの解離、脱グリコシル化、グリコシル化の修飾、酸化（特にαサブユニットの）、または本発明に含まれるＦＳＨポリペプチドの少なくとも１つの生物活性を低減する他の構造的改変による、より高次のポリマーを形成するタンパク質分子の化学分解または凝集により引き起こされ得る。
【００４５】
「安定な」溶液または製剤または医薬組成物は、タンパク質の分解度、修飾、凝集、生物活性の喪失等が許容されるよう制御され、時間が経つにつれて許容できない程には増加しない溶液または製剤または医薬組成物である。好ましくは、製剤は、少なくとも６か月の期間の間、約２−８℃の温度で、少なくとも８０％のＦＳＨ活性を保持する。ＦＳＨ活性はＳｔｅｅｌｍａｎ−Ｐｏｈｌｅｙ卵巣重量増加バイオアッセイを用いて測定することが可能である。
【００４６】
用語「治療」は、卵胞または精巣の刺激、もしくはＦＳＨにより制御される他の生理反応の目的でＦＳＨ投与が望まれる患者の投与、フォローアップ、管理および／またはケアを指す。治療には、精子の質の誘発または改良のためのＦＳＨの投与、雄（男性）でのテストステロン放出の刺激のためのＦＳＨの投与、または雌（女性）での排卵誘発のためのＦＳＨの投与が含まれるがこれらに限定されない。
【００４７】
表現「複数回投与」または「複数回使用」は、ＦＳＨ製剤の一つのガラス瓶、アンプル
、カルプルまたはカートリッジの、１回よりも多い注射（例えば２回、３回、４回、５回、６回、またはそれよりも多い注射）のための使用を含むことを意図する。注射は、少なくとも約１２時間、約２４時間、約４８時間、好ましくは１２日以下までの期間の間になされる。注射は例えば６、１２、２４、４８または７２時間の期間だけ、間隔を空けてよい。
【００４８】
本願発明者らは、防腐剤として塩化ベンザルコニウムおよびベンジルアルコールの両方を用いてＦＳＨまたはＦＳＨ変異型を調製することにより、高いタンパク安定性を示すと同時に優れた保存性を備えた製剤が得られることを見出した。さらに、本発明のＦＳＨ製剤組成物は、当該技術分野で公知のＦＳＨ製剤と比較して、局部耐性の改善（例えば注射部位での炎症がない）を示している。
【００４９】
塩化ベンザルコニウムには、所望の貯蔵期間（例えば６〜１２〜２４か月）にわたってＦＳＨの安定性を維持するのに十分な濃度で、かつ細菌増殖を防止するのに十分な濃度で製剤中に存在することが好ましい。
【００５０】
好ましくは、本発明の液体製剤中の塩化ベンザルコニウムの濃度は、約０．００５ｍｇ／ｍｌ〜約０．０５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約０．０４ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約０．０２ｍｇ／ｍｌ（０．００２％（ｗ／ｖ））である。
【００５１】
ベンジルアルコールには、所望の貯蔵期間（例えば６〜１２〜２４か月）にわたってＦＳＨの安定性を維持するのに十分な濃度で、かつ細菌増殖を防止するのに十分な濃度で製剤中に存在することが好ましい。
【００５２】
好ましくは、本発明の液体製剤中のベンジルアルコールの濃度は、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２０．０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約１．０ｍｇ／ｍｌ〜１５．０ ｍｇ／ｍｌ、
さらにより好ましくは約５．０ ｍｇ／ｍｌ〜約１２．０ ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは１０．０ｍｇ／ｍｌ（１．０％（ｗ／ｖ））である。
【００５３】
本発明の液体製剤中の卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）は、好ましくは約１５０ＩＵ／ｍｌ〜約２，０００ＩＵ／ｍｌ、より好ましくは約３００ＩＵ／ｍｌ〜約１，５００ＩＵ／ｍｌ、さらにより好ましくは約４５０ＩＵ／ｍｌ〜約７５０ＩＵ／ｍｌ、最も好ましくは約６００ＩＵ／ｍｌの濃度で存在する。
【００５４】
組換えＦＳＨの特異的インビボ生物活性は、通常約８，０００ＩＵ ＦＳＨ／ｍｇタン
パク質〜約１６，０００ＩＵ ＦＳＨ／ｍｇタンパク質の範囲である。例えば、市販製品
であるＰｕｒｅｇｏｎ（Ｏｒｇａｎｏｎ社）中の組換えヒトＦＳＨは、約１０，０００ＩＵ ＦＳＨ／ｍｇタンパク質の特異的生物活性を有し、Ｓｅｒｏｎｏ社のＧｏｎａｌ−ｆ
の場合、組換えヒトＦＳＨの生物活性は約１３，６００ＩＵ ＦＳＨ／ｍｇタンパク質で
ある。
【００５５】
ＦＳＨ活性はＦＳＨおよび他の性腺刺激ホルモンに関する公知の方法により決定可能である。かかる方法には例えば酵素免疫活性分析（ＥＩＡ）またはレポーター遺伝子分析が含まれる。生物活性は、尿由来のＦＳＨに対する欧州薬局方第５版に記載されているバイオアッセイにより通常決定される。その際、生物活性は、胎盤性性腺刺激ホルモンで処理された未熟ラットの卵巣を拡大させるＦＳＨ効果と、標準品の同じ効果とを比較することにより推定される。
【００５６】
本発明の液体医薬組成物におけるＦＳＨまたはＦＳＨ変異型の濃度は、通常１０〜２００μｇ／ｍｌの範囲にある。組成物が複数回投与を意図する場合、例えば、注射ペンを用
いると、ＦＳＨまたはＦＳＨ変異型の有効濃度は３０〜１５０μｇ／ｍｌ、好ましくは４０〜１００μｇ／ｍｌの範囲となろう。
【００５７】
一般に、ＦＳＨ濃度は使用（単回投与または複数回投与）、投与経路、投与ツール、およびＦＳＨまたはＦＳＨ変異型の生物活性によって決まる。
たとえＬＨ等の他の性腺刺激ホルモンを含むことが可能でも、ＦＳＨまたはＦＳＨ変異型は医薬組成物中の唯一の医薬として活性な薬剤であることが好ましい。
【００５８】
本発明の医薬組成物は、ガラス瓶、アンプル、カルプル、カートリッジまたは注射器の表面にＦＳＨまたはＦＳＨ変異型が吸着するのを防ぐために界面活性剤、好ましく非イオン性界面活性剤をさらに含有してもよい。ここで、非イオン性界面活性剤はタンパク質溶液の表面張力を低下させ、それにより疎水性表面へのタンパク質の吸着または凝集を防ぐ。本発明に使用可能な非イオン性界面活性剤の好ましい例は、ポリソルベートを主成分とする非イオン性界面活性剤およびポロキサマーを主成分とする非イオン性界面活性剤である。これらの非イオン性界面活性剤は、単独で使用されても任意の組み合わせで使用されてもよい。特に好ましいのは、ポリソルベートを主成分とする非イオン性界面活性剤である。ポリソルベートを主成分とする本発明に使用可能な特定の例には、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０およびポリソルベート８０が含まれる。より好ましいのはポリソルベート２０およびポリソルベート８０であり、最も好ましいのはポリソルベート２０である。ポリソルベート２０は比較的低い臨界ミセル濃度を有する。それゆえ、ポリソルベート２０は低濃度でもタンパク質の表面吸着を減少または防止するだけでなく、タンパク質の化学分解をも抑制する。本発明の液体組成物に高濃度の非イオン性界面活性剤を使用するのは不適切である。その理由は、非イオン性界面活性剤を高濃度で使用すると、干渉効果を生じ、ＵＶ分光法または等電点電気泳動のような分析法を使用してタンパク質の濃度決定や安定性評価を実行している場合に、タンパク質の安定性を正確に評価することが困難となるためである。したがって、本発明の水性製剤は非イオン性界面活性剤を１．０ｍｇ／ｍｌ未満、好ましくは０．０５〜０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で含む。
【００５９】
好ましい実施形態では、ポリソルベート２０は製剤中に存在する唯一の界面活性剤である。
好ましくは、本発明のＦＳＨ製剤は、約６．０〜約８．０の間、より好ましくは約６．５〜約７．５の間、約ｐＨ ６．８、ｐＨ ７．０、ｐＨ ７．２およびｐＨ ７．４を含む。好ましい緩衝剤はリン酸塩であり、好ましい対イオンはナトリウムイオンまたはカリウムイオンである。
【００６０】
溶液全体における緩衝剤濃度は、５ｍＭ、１０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭおよび５００ ｍＭの間で変化し得る。好ましくは緩衝剤濃
度は約５０ｍＭ（５０ｍＭを含む）である。特に好ましいのはｐＨ７．０のリン酸塩イオン中の５０ｍＭの緩衝剤である。
【００６１】
製剤のｐＨは適切な酸または塩基を適切な量で加えることにより調整可能である。  １実施形態では、液体医薬組成物のｐＨはＮａＯＨを使用して調整される。
好ましくは、本発明の製剤は、メチオニン、亜硫酸水素ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の塩、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）およびブチル化ヒドロキシルアニソール（ＢＡＨ）等の酸化防止剤を含む。最も好ましいのはメチオニンである。酸化防止剤はＦＳＨ（特にαサブユニット）の酸化を防止する。
【００６２】
液体医薬組成物中のメチオニンは好ましくは約０．１〜約１．０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．２〜０．８ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在す
る。
【００６３】
好ましい実施形態では、メチオニンは本発明の製剤中に存在する唯一の酸化防止剤である。
好ましくは、本発明の製剤は、安定化剤および等張化剤として、スクロース、デキストロース、ラクトース、ソルビトールおよび／またはグリセロール等の単糖、二糖、または糖アルコールを含む。最も好ましいのは糖アルコール、特に好ましくはマンニトールである。
【００６４】
糖または糖アルコールは好ましくは約１．０〜１０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約５．０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。１実施形態では、マンニトールが５．０ｍｇ／ｍｌの量で本発明の組成物中に存在する。
【００６５】
好ましい実施形態では、マンニトールは、本発明の製剤中に存在する唯一の等張化剤である。
好ましい実施形態では、本発明による製剤はグリシンを含まない。
【００６６】
１実施形態では、本発明の液体医薬組成物は、活性薬剤としてのＦＳＨまたはその変異型と、界面活性剤としてのポリソルベート２０および／またはポリソルベート８０と、張性改変剤としてのマンニトールと、緩衝剤としてのリン酸塩と、安定化剤としてのメチオニンと、防腐剤としてのベンジルアルコールおよび塩化ベンザルコニウムと、水とを含み、さらなる賦形剤は含まない。
【００６７】
上述したように、本発明は、少なくとも２つの静菌剤の組み合わせを含む一回使用および複数回使用のための液体製剤を提供する。本発明の製剤は医薬または獣医学的使用に適している。
【００６８】
１実施形態では、本発明は、包装材料と、水性希釈剤中にＦＳＨまたはＦＳＨ変異型と、ベンジルアルコールおよび塩化ベンザルコニウムと、任意選択で緩衝剤および／または他の賦形剤とを有する溶液が入った容器とを備えたヒト医薬用途のための製品を提供する。包装材料はかかる溶液が最初の使用後２４時間以上の期間保持可能であることを示す書かれた資料を含む。容器は好ましくは注射器、ガラス瓶、点滴ボトル、アンプルまたはカルプルである。最も好ましくは、容器は注射ペン内のカルプルである。
【００６９】
最初の使用の前、つまり容器、ガラス瓶、アンプル、カルプルまたはカートリッジのシールが破られる前には、本発明の製剤は少なくとも約６か月、約１２か月または約２４か月保持されてもよい。好ましい貯蔵条件下では、最初の使用前に、本発明の医薬組成物は約２〜８℃の温度で明るい光を避けて（好ましくは暗所に）維持される。
本発明の製剤は、よく認識されている装置を使用して治療することが可能である。  これらの単一ガラス瓶システムを含む例には、溶液送達用のペン注射型装置が含まれ、例えばＥａｓｙＪｅｃｔ（登録商標）、ＧＯＮＡＬ−Ｆ（登録商標）Ｐｅｎ、Ｈｕｍａｊｅｃｔ（登録商標）、Ｎｏｖｏｐｅｎ（登録商標）、Ｂ−Ｄ（登録商標）Ｐｅｎ、ＡｕｔｏＰｅｎ（登録商標）、Ｆｏｌｌｉｓｔｉｍ（登録商標）Ｐｅｎ、Ｐｕｒｅｇｏｎ（登録商標）ＰｅｎおよびＯｐｔｉＰｅｎ（登録商標）が知られている。
【００７０】
安定した保存製剤が、透明溶液として患者に提供され得る。溶液は一回用であってもよいし、または多数回再使用されてもよく、患者の治療の一回または複数回サイクルを満足し、そのため現在利用可能な計画よりもより便利な治療計画を提供する。
【００７１】
本発明の水性製剤は、使用の準備ができている（すぐに使用できる）溶液であり、いか
なる時点でもＦＳＨ調製の再構成はない。
本明細書で説明するＦＳＨまたはＦＳＨ変異型の安定な保存製剤は、本発明に従う様々な送達方法で患者に投与されてよく、それには皮下または筋内  注射、経皮、肺、口腔粘膜、移植、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプ、経口、または当該技術分野で周知の当業者に理解される他の手段が含まれる。
【００７２】
以下の実施例は本発明の製剤および組成物の調製をさらに詳しく例証するためにのみ提供される。本発明の範囲は単に以下の実施例のみから成るとして解釈されるべきではない。
本発明は、本発明の液体医薬組成物を含む医薬容器にも関する。適切な医薬容器が先行技術から公知である。容器は例えば、注射器、ガラス瓶、点滴ボトル、アンプルまたはカルプルであってよい。好ましい実施形態では、容器が注射器である場合、注射器は針保護システムを備えている。先行技術から周知のそのような針保護システムは傷害の危険を減らす。別の実施形態では、容器は注射ペン内のカルプルである。
【００７３】
本発明は、本発明の液体医薬組成物を調製する方法であって、活性薬剤としてのＦＳＨまたはＦＳＨ変異型が、防腐剤としての塩化ベンザルコニウムおよびベンジルアルコールと、さらなる医薬賦形剤とを含む水性製剤として製剤される方法にも関する。
【００７４】
別の態様では、本発明は、複数回投与のための本発明の液体医薬組成物の使用に関する。本発明の医薬組成物は、有利には不妊およびＦＳＨに関する他の疾患の治療に使用され得る。好ましい実施形態では、本発明のＦＳＨ製剤はヒト治療に使用される。しかしながら、一般に、本発明の医薬組成物は、ヒツジ、ウシ、ブタ、またはウマ等の他の哺乳動物に治療することが可能である。
【００７５】
本発明の医薬液体製剤は、非常に優れた貯蔵安定性を示すことが判明した。本発明の範囲内では、用語「貯蔵が安定」とは、活性ＦＳＨまたはＦＳＨ変異型の内容が２５℃で３か月貯蔵後にいまだ最初の濃度の８０％以上に達していることを意味すると理解される。好ましくは、２５℃での３か月の貯蔵後、ＦＳＨ活性の残りの内容は、いまだ元の活性の少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは、少なくとも９５％に達している。
【００７６】
ＦＳＨまたはＦＳＨ変異型の生物活性は、所与の条件下で、胎盤性性腺刺激ホルモンで処理された未成熟ラットの卵巣拡大の効果を、国際基準の調製物または国際単位で補正された参照調整物（ヨーロッパ薬局方第５版）の同じ効果と比較することにより推測可能である。
インビトロでのＦＳＨ活性の測定はAlbanese et. al. (1994) Mol. Cell Endcrinol. 101:211-219に記載されている。
本発明の製剤に使用されるＦＳＨまたはＦＳＨ変異型の純度は、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは９９％よりも大きい。純度の程度はＨＰＬＣ分析により決定可能である。そのような分析を行なうための適切な材料およびプロトコルをＶｙｄａｃまたはＴＯＳＨＯ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ等の供給業者から得ることが可能である。
【００７７】
本発明の溶液を製剤するための構成成分は従来の供給元から、例えばＳｉｇｍａまたはＭｅｒｃｋ等の会社から得ることが可能である。
本発明の製剤の生産は従来の方法により行なうことが可能である。製剤の構成成分は水性緩衝剤に溶解させることが可能である。代わりに、ＦＳＨまたはＦＳＨ変異型は、精製工程の結果として、水性緩衝剤の形で既に得られてもよい。
【００７８】
最後に、完成した液体製剤は適切な医薬容器に充填され、投与まで保存される。
以下の実施例は、発明の範囲を限定しない本発明の例示を意図する。
実施例
実施例１
組換え技術による組換えヒトＦＳＨの調製
組換えヒトＦＳＨはトランスフェクトされたＣＨＯ宿主細胞中で標準的方法により生産される。かかる方法は、ヒトＦＳＨのα鎖とβ鎖をコードする１または複数の組換え核酸分子から、組換えヒトＦＳＨを生産するＣＨＯ細胞クローンを生成し、宿主細胞を適切な条件で培養し、かつ細胞培養物から組換えヒトＦＳＨを精製することを含む。  上述したように、適切なプロセスは先行技術に記載されている。
【００７９】
好ましい実施形態では、組換えヒトＦＳＨは国際出願第２００９／０００９１３号に記載されているように生産される。
実施例２
液体ＦＳＨ製剤
組換えヒトＦＳＨを含む液体製剤を、下記成分の水性リン酸緩衝液を製剤することにより調製した。
【００８０】
【表１】
0005620824.tif 000002
組換えヒトＦＳＨの生物活性は約１０，０００ＩＶ／ｍｇとして決定した。組成物のｐＨ値はＮａＯＨを添加することにより調製した。すべての成分はヨーロッパ薬局方（Ｐｈ．Ｅｕｒ．）に従う品質である。製剤は２５４ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの張性を有する。
【００８１】
さらに、比較製剤として２つの先行技術のＦＳＨ製剤を調製した。
Ａ）比較製剤Ｇｏｎａｌ−ｆ：１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、６０ｍｇ／ｍｌ  スクロース、０．１ｍｇ／ｍｌ  メチオニン、０．１ｍｇ／ｍｌ  ポロキサマー１８８、３ｍｇ／ｍｌ   ｍ−クレゾール、ｐＨ ７．０。
【００８２】
Ｂ）比較製剤Ｐｕｒｅｇｏｎ：５０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、５０ｍｇ／ｍｌ  スクロース、０．５ｍｇ／ｍｌ  メチオニン、０．２ｍｇ／ｍｌ  ポリソルベート２０、１０ｍｇ／ｍｌ  ベンジルアルコール、ｐＨ ７．０。
実施例３
本発明の製剤の安定性試験
実施例２に記載した水性製剤を１ｍｇ／ガラス瓶に等分量入れ、２〜８℃、２５℃、および３７℃で保存した。２５℃での１２週間および３７℃での９週間の保存後、サンプルを種々の試験パラメータに関して試験した。ヨーロッパ薬局方第５版に従って保存の十分さを試験した。ＦＳＨの回収率（％）、二量体ＦＳＨの減少率（％）（モノマーへのＦＳＨの解離）、およびＦＳＨの純度をＳＥ−ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した。
【００８３】
本発明の製剤は、２〜８℃、２５℃および３７℃での保存にて９５％を超える組換えヒトＦＳＨの回収率を示した。さらに製剤は、２〜８℃、２５℃および３７℃での保存にて５％未満の二量体のＦＳＨの減少率を示した。さらに製剤は、２〜８℃、２５℃および３７℃での保存にて９５％を超えるＦＳＨの純度を示した。
【００８４】
これらの結果から、界面活性剤としてポリソルベート２０、張性改変剤としてマンニトール、緩衝剤としてリン酸塩、安定化剤としてメチオニン、および防腐剤としてベンジルアルコールおよび塩化ベンザルコニウムを含む本発明のＦＳＨ水性製剤は、タンパク質の損失および変性を防止し、タンパク質の構成モノマーへの解離を防止し、かつＦＳＨを長期間安定させることが理解される。さらに、その有益な保存性により、製剤は複数回投与の有用な製剤である。
【００８５】
本発明のＦＳＨ製剤の抗菌薬保存能は、ヨーロッパ薬局方第５版の攻撃試験で決定された。この試験は、一定の微生物の規定された接種物で水性製剤組成物を攻撃し、接種を受けた製剤を所定温度で保存し、一定の時間間隔で製剤からサンプルを取り出し、そのように除去されたサンプル中の生物を数えることから成る。微生物の数に有意な低下があるか少なくとも増加がない場合には、調製物の保存特性は十分である。
【００８６】
本発明のＦＳＨ製剤は、微生物の数の有意な減少を示し、したがって非常に優れた保存特性を実証した。
さらに、本発明の製剤は、先行技術の比較製剤であるＧｏｎａｌ−ｆおよびＰｕｒｅｇｏｎの安定性に匹敵する安定性を有することが観察された。
配列表：
配列番号１：ヒトＦＳＨのα鎖のアミノ酸配列
配列番号２：ヒトＦＳＨのβ鎖のアミノ酸配列
配列番号３：ヒトＦＳＨのα鎖をコードする野生型の核酸配列
配列番号４：ヒトＦＳＨのβ鎖をコードする野生型の核酸配列
配列番号５：ヒトＦＳＨのβ鎖をコードするコドン最適化した核酸配列
配列番号６：ヒトＦＳＨのα鎖を子オードするコドン最適化した核酸配列
【配列表】
0005620824000001.app