(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）および（ｂ）の性質を有するラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）に属する乳酸菌。
（ａ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ  ＭＲＳ  Ｂｒｏｔｈ培地で定常状態になるまで３７℃で１６時間培養した菌液を、グレープおよびオレンジの１００％果汁に対してそれぞれ０.４％容量接種したものを３７℃で４８時間培養した時の到達生菌数が、共に１０８ＣＦＵ／ｍｌ以上である
（ｂ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ  ＭＲＳ  Ｂｒｏｔｈ培地で定常状態になるまで３７℃で１６時間培養した菌液を、グレープ、グレープフルーツ、オレンジ、パインおよびアップルの１００％果汁に対してそれぞれ０.４％容量接種したものを３７℃で４８時間培養した時のそれぞれの到達生菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）を１０８で除して加えた増殖スコア値が２５以上である
【請求項２】
プラスミドを持たないものである請求項１に記載のラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌。
【請求項３】
ラクトバチルス・プランタラム  ＹＩＴ  ０１３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３４９）またはラクトバチルス・プランタラム  ＹＩＴ  ０１４８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３５０）である請求項１または２に記載のラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌。
【請求項４】
請求項１ないし３の何れかに記載のラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌を含有する飲食物。
【請求項５】
食品素材に、請求項１ないし３の何れかに記載のラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌を接種し、発酵させることにより得られる発酵物。
【請求項６】
請求項５に記載の発酵物を含有する飲食物。
【請求項７】
食品素材に、請求項１ないし３の何れかに記載のラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌を接種し、発酵させることを特徴とする発酵物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、様々な果汁の発酵に適したラクトバチルス・プランタラムに属する新規乳酸菌およびそれを含有させた飲食物等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトは加齢とともに大腸菌等の有害菌が優勢になり、有害菌が生成する様々な有害物質が人体に悪影響を及ぼすとされている。乳酸菌は自然界から広く分離されるが、ヒトの腸内では、乳酸を生成することにより、腸内のｐＨを酸性に維持し、大腸菌等の腐敗菌や病原菌が腸内で生育および増殖するのを抑制し、腸内環境改善効果を示す。また乳酸菌は、これらの腸内環境改善効果だけでなく、便性改善、感染防御、免疫力の上昇作用、抗アレルギー効果、がん予防効果等の有益な生理的効果を示す。そこで、プロバイオティクスといわれるこれらの有用細菌を腸内に供給して、健康を増進させるため、これらの菌の生菌を含有する乳酸菌飲料、発酵乳、製剤等の摂取が行われている。【０００３】
このような乳酸菌飲料、発酵乳、生菌製剤等で用いられている乳酸菌は、主にヨーグルトやチーズ由来をはじめとする乳原料の発酵に適した乳酸菌であり、具体的には、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・アシドフィラス、ラクトバチルス・ブルガリクス、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ラクトコッカス・ラクティス等の菌株である。【０００４】
一方、近年では消費者の嗜好の多様化があり、乳原料以外の原料、例えば野菜汁や果汁等を発酵基質とするプロバイオティクスに用いる菌株の開発が望まれていた。【０００５】
しかしながら、これまで乳酸菌飲料等の製造に用いられていた上記菌株では、野菜汁や果汁等を発酵基質とした場合、プロバイオティクスとしての効果を得るための高い到達生菌数を達成することができなかった。【０００６】
これまで、野菜汁や果汁を発酵する能力に優れた乳酸菌としては、ラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌が知られている。例えば、ラクトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ  １４４３１は濃縮人参汁（可溶性固形分３６質量％（以下、単に「％」という）を６倍希釈したものを発酵基質として、１０７ＣＦＵ／ｍｌ以上の生菌数に到達することが知られている（特許文献１）。【０００７】
また、有機酸含有量を低減した果汁での発酵に適した乳酸菌として、ラクトバチルス・プランタラム２９９ｖ（ＤＳＭ  ９８４３）が知られている。このラクトバチルス・プランタラム２９９ｖ（ＤＳＭ  ９８４３）には強い後酸性化、顕著な官能性の欠陥、二酸化炭素ガスの発生などの欠点があるが、それを果汁中の有機酸含有量を低減することにより抑制する技術も知られている（特許文献２）。【０００８】
しかしながら、これらのラクトバチルス・プランタラムに属する菌株は様々な野菜汁や果汁に対して、常に高い到達生菌数濃度が得られるものではなく、特に一般に乳酸菌の発酵基質として好適ではないといわれているグレープ等の果汁で使用できるものではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００１−２５２０１２号公報
【特許文献２】特表２００８−５４１７７４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、本発明はラクトバチルス・プランタラムに属し、様々な野菜汁や果汁を発酵基質とした場合であっても高い到達生菌数となる優れた発酵能を有する新規な乳酸菌やこれを含有する飲食物等を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討した結果、特定の１００％果汁を発酵基質とした時の到達生菌数が、共に１０８ＣＦＵ／ｍｌ以上であるラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌が、様々な野菜汁や果汁を発酵基質とした場合であっても高い到達生菌数となることを見出し、本発明を完成させた。【００１２】
すなわち、本発明はグレープおよびオレンジの１００％果汁を発酵基質とした時の到達生菌数が、共に１０８ＣＦＵ／ｍｌ以上であるラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）に属する乳酸菌である。【００１３】
また、本発明は上記乳酸菌を含有する飲食物である。【００１４】
更に、本発明は食品素材に、上記乳酸菌を接種し、発酵させることにより得られる発酵物である。【００１５】
また更に、本発明は上記発酵物を含有する飲食物である。【００１６】
更にまた、本発明は食品素材に、上記乳酸菌を接種し、発酵させることを特徴とする発酵物の製造方法である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌は、様々な野菜汁や果汁、特に果汁を発酵基質として、１０８ＣＦＵ／ｍｌ以上の生菌数に到達するため、様々な発酵基質をベースとするプロバイオティクスに用いられる飲料等の飲食物を調製することができる。【００１８】
また、特に本発明のラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌の中でも寄託した２株はプラスミドを持たないので、安定した品質の飲料等の飲食物を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本明細書において１００％果汁とは、ＪＡＳ法における果汁飲料品質表示基準において１００％ジュースの基準を満たすものを示す。果汁の製法としては、果実を搾ったものを熱処理等行った後、冷凍保存する「ストレート果汁」、あるいは加熱により水分を蒸発させて濃縮した後、冷凍保存する「濃縮還元果汁」のいずれでも良い。「濃縮還元果汁」においては、果汁の濃縮倍率として、２〜１０倍が好ましく、さらに望ましくは３〜８倍が好適である。また、ＪＡＳ法における果汁飲料品質表示基準において１００％ジュースの基準を満たすものであれば、糖類、香料、酸化防止剤等を添加しても良い。
【００２０】
また、本明細書において到達生菌数とは、前培養として１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ  ＭＲＳ  Ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ社製）培地で種菌を定常状態になるまで培養、具体的には３０〜３７℃で１６〜２４時間培養した後、０.４％容量の前培養液を１００％果汁等の発酵基質に接種し、４８時間、３７℃で培養後の生菌数を示す。なお、生菌数の測定はＭＲＳ寒天平板を用いて行う。また、到達生菌数を表す単位であるＣＦＵ／ｍｌは、培養プレートにおいて１ｍｌ播種した時のコロニー形成能を示す。
【００２１】
更に、本明細書においてプラスミドを持たないとは、新鮮な乳酸菌培養液１ｍｌから定法に従ってプラスミドＤＮＡを調製し、０.７％のアガロースゲルで電気泳動した後、ゲルをエチジウムブロマイドで染色し、ＵＶ照射下でプラスミドＤＮＡが無いことが確認できることを示す。
【００２２】
本発明のラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌（以下、「本発明乳酸菌」という）は、グレープおよびオレンジの１００％果汁を発酵基質とした時の到達生菌数が、共に１０８ＣＦＵ／ｍｌ以上、好ましくは１０８〜１０１０ＣＦＵ／ｍｌのものである。
【００２３】
本発明乳酸菌は、常法に従って漬け物、発酵茶、ヒト糞便等からＭＲＳ寒天平板を用いて分離されたラクトバチルス・プランタラムについて上記発酵基質における到達生菌数を基にスクリーニングすることにより得られる。
【００２４】
上記で分離されたラクトバチルス・プランタラムの中から、スクリーニングにより下記の４株が得られた。
【００２５】
・ラクトバチルス・プランタラムＹＩＴ  １００１５株
・ラクトバチルス・プランタラムＹＩＴ  ００６９株
・ラクトバチルス・プランタラムＹＩＴ  ０１４８株
・ラクトバチルス・プランタラムＹＩＴ  ０１３２株
【００２６】
これら４株のうち、ＹＩＴ  ００６９、ＹＩＴ  ０１４８、ＹＩＴ  ０１３２は、グレープ、グレープフルーツ、オレンジ、パイン（パイナップル）およびアップルの１００％果汁を発酵基質とした時のそれぞれの到達生菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）を１０８で除して加えた増殖スコア値が２５以上であった。この増殖スコア値はラクトバチルス・プランタラムが果汁の発酵に適しているかを判断する指標であり、好ましくは２５以上、さらに好ましくは３０〜５０であり、ＹＩＴ  ０１４８およびＹＩＴ  ０１３２は増殖スコア値が３０〜４１であるため、果汁の発酵に特に好適に用いる事が出来る。
【００２７】
なお、ＹＩＴ  ０１３２およびＹＩＴ  ０１４８はプラスミドを持たないものである。一般に、微生物のプラスミドの中には、抗生物質耐性を持つものがあり、これが他の微生物に伝播し、抗生物質耐性を持つ病原菌の出現に繋がることがある。また、プラスミド上の機能不明な遺伝子が他の微生物に与える影響も現時点では十分に解明出来ているわけではないため、菌株の安全性を担保するという観点から、プラスミドを持たないことが望ましい。また、プラスミドは継代中や培養中に欠失する場合があり、これによって微生物の形質が不安定になることがある。しかし、ＹＩＴ  ０１３２およびＹＩＴ  ０１４８はプラスミドを持たないため安定した製品の品質が保持できる。
【００２８】
これらＹＩＴ  ０１３２およびＹＩＴ  ０１４８については、それぞれＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＹＩＴ  ０１３２およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＹＩＴ  ０１４８と名付け、寄託番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３４９およびＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３５０として平成２２年２月２４日付で、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒305-8566茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に国際寄託した。これらの菌株は、以下のような菌学的性質を有する。
【００２９】
＜Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ  ＭＲＳ  Ｂｒｏｔｈで３７℃、２４時間培養したＹＩＴ  ０１３２およびＹＩＴ  ０１４８の菌学的性質＞
（諸性質）
【表１】
0005518178.tif 000002
（糖の発酵性状：ＡＰＩ ５０ＣＨによる測定）
【表２−１】
0005518178.tif 000003
【表２−２】
0005518178.tif 000004
（１６Ｓ ｒＤＮＡ）
１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を用いた菌種同定を以下の方法で行った。すなわち、ＭＲＳ培地を用い３７℃、２４時間、培養した菌液を遠心洗浄した菌体ペレットから抽出したＤＮＡを鋳型として、１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列の全長をＰＣＲ法によって増幅し、増幅産物の塩基配列をＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ法により決定し、得られた塩基配列をデータベースで検索して菌種を同定した。ＹＩＴ  ０１３２、ＹＩＴ  ０１４８の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列（配列番号１、配列番号２）は、ラクトバチルス・プランタラム（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｄ７９２１０）とそれぞれ９９.９％または９９．８％の相同性を示したが、ラクトバチルス・パラプランタラム（accession No.AJ306297）、ラクトバチルス・ペントサス（accession No.D79211）ともそれぞれ９９％以上の高い相同性を示した。これら３菌種は非常に近縁であり、１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列では識別が不可能であるため、判別には３菌種の基準株を対照として、ｒｅｃＡ遺伝子配列を標的とした菌種特異的プライマーによるＰＣＲ法（Appl Environ Microbiol.. 67, 3450-3454 (2001)）を用いた。その結果、ＹＩＴ  ０１３２、ＹＩＴ  ０１４８はラクトバチルス・プランタラムと判別された。
【００３０】
なお、本発明乳酸菌としては、上記菌株の他に、上記菌株の変異株であって、同様の果汁発酵性等を示すものも利用することができる。
【００３１】
上記した本発明乳酸菌は、食品由来の菌であり、その安全性も確認されているものであることから、従来のプロバイオティクスに用いられる乳酸菌と同様に各種の用途に利用し、これを摂取することにより整腸作用等の生理効果を期待できる。
【００３２】
本発明乳酸菌をヒトや動物が摂取する場合の量に厳格な制限はないが、その好適な投与量は生菌数として１日当たり１０５ＣＦＵ〜１０１３ＣＦＵであり、特に１０８ＣＦＵ〜１０１２ＣＦＵが好ましい。また、本発明乳酸菌は継続的に摂取することが好ましいが、これに限定されることは無く、例えば、隔月、隔週、隔日のように摂取間隔を開けた場合や短い摂取期間でもよい。
【００３３】
本発明乳酸菌の生理効果を得るために、例えば、固体または液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬品製剤の形態としたものを利用することができる。このような製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散在、カプセル剤等の固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、凍結乾燥製剤等が挙げられる。これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。上記の医薬用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水等が挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤、賦形剤等の慣用の添加剤を適宜添加することもできる。
【００３４】
また、本発明乳酸菌は、上記のような製剤とするだけでなく、固形状、液状等のいずれの形態の飲食物に含有させることもできる。飲食物に含有させる場合は、そのまま、または種々の栄養成分と共に含有せしめればよい。具体的に本発明乳酸菌を飲食物に含有させる場合は、飲食物として使用可能な添加剤を適宜使用し、慣用の手段を用いて食用に適した形態、すなわち、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ペースト等に成形すればよい。飲食物の種類としては、例えば、ハム、ソーセージ等の食肉加工食品、かまぼこ、ちくわ等の水産加工食品、パン、菓子、バター、粉乳等の食品や、水、果汁、牛乳、清涼飲料、茶飲料等の飲料が挙げられる。なお、飲食物には、動物の飼料も含まれる。
【００３５】
更に、本発明乳酸菌を好適に利用できる飲食物としては、本発明乳酸菌を獣乳、豆乳、果汁、野菜汁等の各種食品素材に接種し、発酵させることにより得られる発酵乳、発酵豆乳、発酵果汁、発酵野菜汁等の発酵物を含有する飲食物が挙げられ、中でも特に発酵果汁を含有する発酵果汁飲料が好ましい。このような飲食物であれば、本発明乳酸菌を生菌の状態で含有するので好ましい。
【００３６】
上記発酵乳、発酵豆乳、発酵果汁、発酵野菜汁等の発酵物を含有する飲食品は、常法に従って製造することができる。具体的に、本発明乳酸菌を用いて発酵果汁飲料を製造する場合には、まず、使用する果汁に適した条件で殺菌した果汁に本発明乳酸菌を単独または他の微生物と同時に接種培養し、これを均質化処理して発酵果汁ベースを得る。次いでこの発酵果汁ベースを用いて、果汁１００％含有飲料様もしくは、シロップや他の未発酵果汁等と混合し、更にフレーバー等を添加して最終製品に仕上げればよい。
【００３７】
上記発酵果汁飲料の原料となる果汁としては、特に限定されないが、グレープ、グレープフルーツ、オレンジ、パイン、アップルなどの果汁が好ましく、特にオレンジ、アップルの果汁が好ましい。
【００３８】
また、発酵野菜汁飲料も、上記発酵果汁飲料と同様に製造することができる。発酵野菜汁飲料の原料となる野菜汁としては、特に限定されないが、ニンジン、ムラサキニンジン等のニンジン、アヤムラサキ、ジェイレッド等のサツマイモ、ケール、トマトなどの野菜汁が好ましく、特にニンジン、アヤムラサキ、ジェイレッドの野菜汁が好ましい。
【００３９】
なお、発酵果汁飲料や発酵野菜汁飲料には、シロップ等の甘味料、乳化剤、増粘（安定）剤、各種ビタミン等の任意成分を配合することができる。シロップとしては、グルコース、ショ糖、フルクトース、果糖ブドウ糖液糖、ブドウ糖果糖液糖、パラチノース、トレハロース、ラクトース、キシロース、麦芽糖、蜂蜜、糖蜜等の糖類、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、ラクチトール、パラチニット、還元水飴、還元麦芽糖水飴等の糖アルコール、アスパルテーム、ソーマチン、スクラロース、アセスルファムＫ、ステビア等の高甘味度甘味料が挙げられる。この他にも、ビタミンＡ、ビタミンＢ類、ビタミンＣ、ビタミンＥ類等のビタミン類、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、鉄、マンガン等のミネラル分、クエン酸、乳酸、酢酸、リンゴ酸、酒石酸、グルコン酸等の酸味料、クリーム、バター、サワークリーム等の乳脂肪、ヨーグルト系、ベリー系、オレンジ系、花梨系、シソ系、シトラス系、アップル系、ミント系、グレープ系、アプリコット系、ペア、カスタードクリーム、ピーチ、メロン、バナナ、トロピカル、ハーブ系、紅茶、コーヒー系等のフレーバー類、ハーブエキス、黒糖エキス等を配合することも可能である。
【００４０】
また、発酵果汁飲料や発酵野菜汁飲料の製造の際には、本発明乳酸菌以外の微生物を併用することも可能である。このような微生物としては例えば、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（B.longum）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（B.bifidum）、ビフィドバクテリウム・アニマーリス（B.animalis）、ビフィドバクテリウム・ズイス（B.suis）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（B.infantis）、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（B.adolescentis）、ビフィドバクテリウム・カテヌラータム（B.catenulatum）、ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラータム（B.pseudocatenulatum）、ビフィドバクテリウム・ラクチス（B.lactis）、ビフィドバクテリウム・グロボサム（B.globosum）等のビフィドバクテリウム属細菌、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・アシドフィルス（L.acidophilus）、ラクトバチルス・ブヒネリ（L.buchneri）、ラクトバチルス・ガリナラム（L.gallinarum）、ラクトバチルス・アミロボラス（L.amylovorus）、ラクトバチルス・ブレビス（L.brevis）、ラクトバチルス・ラムノーザス（L.rhamnosus）、ラクトバチルス・ケフィア（L.kefir）、ラクトバチルス・パラカゼイ（L.paracasei）、ラクトバチルス・クリスパタス（L.crispatus）、ラクトバチルス・ゼアエ（L.zeae）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（L.helveticus）、ラクトバチルス・サリバリウス（L.salivalius）、ラクトバチルス・ガセリ（L.gasseri）、ラクトバチルス・ファーメンタム（L.fermentum）、ラクトバチルス・ロイテリ（L.reuteri）、ラクトバチルス・デルブルッキィ  サブスピーシーズ．ブルガリカス（L.delbrueckii subsp. bulgaricus）、ラクトバチルス・デルブルッキィ  サブスピーシーズ．デルブルッキィ（L.delbrueckii subsp. delbrueckii）、ラクトバチルス・ジョンソニー（L.johnsonii）、ラクトバチルス・ペントサス（Lactobacillus
pentosus）、ラクトバチルス・パラプランタラム(Lactobacillus paraplantarum)等のラクトバチルス属細菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）、等のストレプトコッカス属細菌、ラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ．ラクチス（Lactococcus lactis subsp. lactis）、ラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ．クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremoris）等のラクトコッカス属細菌、エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（E.faecium）等のエンテロコッカス属細菌、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）等のバチルス属細菌、サッカロマイセス・セルビシエ（Saccharomyses cerevisiae）、トルラスポラ・デルブルッキィ（Torulaspora delbrueckii）、キャンジダ・ケフィア（Candida kefyr）等のサッカロマイセス属、トルラスポラ属、キャンジダ属等に属する酵母が挙げられる。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例を挙げて本発明の内容をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら制約されるものではない。【００４２】
実  施  例  １
各種乳酸菌による果汁の発酵試験：
（１）菌株
果汁の発酵能が高い菌株を見出すため、主に果樹を分離源とする表３に記載の乳酸菌４３株を対象とした。
（２）種菌と培養
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ  ＭＲＳ  Ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ社製）を１２１℃１５分オートクレーブ滅菌した後接種した。スポロラクトバチラス属は嫌気培養の為、気相をＮ２置換後ブチルゴム栓で密栓した。その他の菌種は好気培養の為、アルミキャップで蓋をして３０℃で１６時間、定常状態になるまで培養した。
（３）果汁での増殖性
市販の濃縮還元１００％ジュース、グレープ（ドール社製）とオレンジ（ヤクルト本社製）をそれぞれ無菌的に試験管に分注し、０.４％容量の菌液を接種し３７℃で４８時間培養した。
（４）生菌数の測定
培養液を滅菌した希釈液（０.１％酵母エキス溶液）にて適宜希釈後、スパイラルシステムにてＭＲＳ寒天平板培地に塗布し生菌数を測定した。供試株４３株について果汁中の増殖性を調べた結果を表３に示した。
（５）果汁増殖性の検討
グレープジュースではほとんどの菌種が増殖しない中、ラクトバチルス・プランタラムのみがよく増殖し、２株とも１×１０８ＣＦＵ／ｍｌまで生菌数が上昇した。オレンジジュースでは数株を除いて生育し、多くが１×１０７ＣＦＵ／ｍｌ以上の生菌数だった。グレープジュース、オレンジジュース共に嫌気培養のスポロラクトバチルス属はすべての菌株で生育しなかった。以上より、グレープジュース、オレンジジュースを発酵基質とした時に１×１０８ＣＦＵ／ｍｌまで到達生菌数を示す乳酸菌は、ラクトバチルス・プランタラムだけであることが明らかとなった。【００４３】
【表３−１】
0005518178.tif 000005
【表３−２】
0005518178.tif 000006
【００４４】
実  施  例  ２
ラクトバチルス・プランタラムによる果汁の発酵試験：
（１）菌株
ラクトバチルス・プランタラム１２株を対象とした。菌株の由来はＹＩＴ  ０２２０株はＡＴＣＣ  １４４３１、Ｙ  ５００９７株は市販のはっ酵乳、ＹＩＴ  ０１０２株は基準株（ＡＴＣＣ  １４９１７）、Ｙ  ９９００５株は乳製品から分離した２９９ｖ株である。その他の株は漬物、発酵茶、ヒト糞便から分離されたものである。
（２）種菌と培養
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ  ＭＲＳ  Ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ社製）を小試に分注し１２１℃１５分オートクレーブ滅菌した後接種し、アルミキャップで蓋をして３７℃で１６時間、定常状態になるまで培養した。
（３）果汁での増殖性
市販の濃縮還元１００％ジュース、グレープ（ドール社製）、グレープフルーツ（ヤクルト本社製）、オレンジ（ヤクルト本社製）、パイン（ヤクルト本社製）、アップル（ヤクルト本社製）をそれぞれ無菌的に試験管に分注し、０.４％容量の菌液を接種し３７℃で４８時間培養した。
（４）生菌数の測定
培養液を滅菌した希釈液（０.１％酵母エキス溶液）にて適宜希釈後、スパイラルシステムにてＭＲＳ寒天平板培地に塗布し生菌数を測定した。その結果を表４に示した。また、グレープ、グレープフルーツ、オレンジ、パイン、アップルの１００％ジュースを発酵基質とした時のそれぞれの到達生菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）を１０８で除して加えたものを、果汁における増殖スコア値として算出した。その結果も表４に示した。
（５）果汁増殖性の検討
グレープとパインの１００％ジュースを発酵基質とした場合、共に１０８ＣＦＵ／ｍｌ以上の到達生菌数を示した菌株は、ＹＩＴ  １００１５株、ＹＩＴ  ００６９株、ＹＩＴ  ０１４８株およびＹＩＴ  ０１３２株の４株であった。その結果、ラクトバチルス・プランタラムの基準株であるＹＩＴ  ０１０２（増殖スコア１４）や野菜汁や果汁での発酵能が知られている、ＹＩＴ  ０２２０（増殖スコア１０）及びＹ９９００５（増殖スコア１８）よりも、顕著に高い増殖スコアを示す菌株は、ＹＩＴ  ００６９株（増殖スコア２７）、ＹＩＴ  ０１４８株（増殖スコア３０）およびＹＩＴ  ０１３２株（増殖スコア４１）の３株であった。【００４５】
【表４】
0005518178.tif 000007
【００４６】
実  施  例  ３
ラクトバチルス・プランタラム株のプラスミドの有無の確認：
（１）菌株と培養
ＭＲＳ培地を使用し、３７℃で、約２０時間培養した。
（２）プラスミドＤＮＡの調製
新鮮な培養液１ｍｌから３０００×ｇの遠心で菌体を集め、２００μｌのＬｙｓｉｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（５０μｇ／ｍｌ  Ｎ−アセチルムラミダーゼＳＧ、３ｍｇ／ｍｌ  卵白リゾチーム、１００μｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅＡ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁した。３７℃で３０分保温し、菌体をプロトプラスト化した。プラスミドＤＮＡはプロトプラスト化した菌体を３０００×ｇで集め、市販のアルカリ法を用いたプラスミド調製キット（バイオラッドミニプレップ）で調製した。
（３）プラスミドの検出
プラスミドＤＮＡを０.７％のアガロースゲルで電気泳動した後、ゲルをエチジウムブロマイドで染色し、ＵＶ照射下で写真撮影することによりプラスミドの有無を評価した。その結果を表５に示した。
（４）プラスミドの有無
実施例２で良好な果汁発酵能を示した株を含む７株について調査した。７株のうち５株においてプラスミドが見出された。このうち、実施例２でグレープジュースおよびグレープフルーツジュースで１０８ＣＦＵ／ｍｌ以上の到達生菌数を示した菌株である、ＹＩＴ  ０１３２およびＹＩＴ  ０１４８では、共にプラスミドが認められなかった。【００４７】
【表５】
0005518178.tif 000008
【００４８】
実  施  例  ４
乳酸菌飲料（１）：
ブリックス（Ｂｘ）１０に調整した表６に示した果汁または野菜汁を表６に記載の条件で殺菌し、冷却後、ＭＲＳ ｂｒｏｔｈで培養した、ラクトバチルス・プランタラムＹＩＴ  ０１３２を０.４％接種し、３７℃で４８時間培養した。得られた発酵果汁または発酵野菜汁について製造時の生菌数をＭＲＳ寒天平板で測定した（表６）。また、これらの乳酸菌飲料について風味を自由評価したところ、全て飲用に適していたが、オレンジ、アップル、ニンジン、アヤムラサキ、ジェイレッドが特に風味上好ましかった。【００４９】
【表６】
0005518178.tif 000009
【００５０】
実  施  例  ５
乳酸菌飲料（２）：
脱脂粉乳１０％と酵母エキス０.０３％を温水溶解し、１３５℃、３秒の条件で殺菌、冷却後、ＭＲＳ ｂｒｏｔｈで培養したラクトバチルス・プランタラム ＹＩＴ  ０１３２を０.４％接種し、３７℃で４８時間培養した。この乳酸菌飲料のＭＲＳ 寒天平板培地による製造時の生菌数は、５.２×１０８ＣＦＵ／ｍｌであった。味は穏やかな酸味で飲みやすいものであった。【００５１】
実  施  例  ６
乳酸菌飲料（３）：
ブリックス（Ｂｘ）１０に調整した表７に示した果汁または野菜汁を表７に記載の条件で殺菌し、ＭＲＳ ｂｒｏｔｈで前培養したラクトバチルス・プランタラム ＹＩＴ  ０１４８を０.４％接種し、３７℃で４８時間培養した。得られた発酵果汁または発酵野菜汁について製造時の生菌数をＭＲＳ寒天平板で測定した（表７）。また、これらの乳酸菌飲料について風味を自由評価したところ、全て飲用に適していたが、オレンジ、アップル、ニンジン、アヤムラサキ、ジェイレッドが特に風味上好ましかった。【００５２】
【表７】
0005518178.tif 000010
【００５３】
実  施  例  ７
乳酸菌飲料（４）：
脱脂粉乳１０％と酵母エキス０.０３％を温水溶解し、１３５℃、３秒の条件で殺菌、冷却後、ＭＲＳ ｂｒｏｔｈで培養したラクトバチルス・プランタラム ＹＩＴ  ０１４８を０.４％接種し、３７℃で４８時間培養した。この乳酸菌飲料のＭＲＳ 寒天平板培地による製造時の生菌数は、３.２×１０８ＣＦＵ／ｍｌであった。味は穏やかな酸味で飲みやすいものであった。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明乳酸菌は、様々な野菜汁や果汁を発酵基質とした場合であっても高い到達生菌数となる。そのため、プロバイオティクスに好適に用いることができる。
【配列表】
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