(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物であって、
（１）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ１ユニット中に該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を除くバクテリア由来核酸の混入が１０fg以下であり、
（２）前記調製物に対して耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子以外のバクテリア由来の核酸のみを増幅させうるプライマーを用いて、鋳型を加えない条件下３２サイクル以上の遺伝子増幅反応を行ってもバクテリア由来の核酸の増幅産物を検出しない
ことを特徴とする耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物。
【請求項２】
以下の工程：
（１）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を真核細胞に形質転換し、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子発現形質転換体細胞を得る工程、
（２）前記形質転換体細胞を培養する工程、
（３）培養された形質転換体細胞より耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む抽出物を取得し、該抽出物を熱処理する工程、または培養された形質転換体細胞を熱処理した後、熱処理された形質転換体細胞より耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む抽出物を取得する工程、
を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物の製造方法であって、
前記調製物が、
（１）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ１ユニット中に該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を除くバクテリア由来核酸の混入が１０fg以下であり、
（２）前記調製物に対して耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子以外のバクテリア由来の核酸のみを増幅させうるプライマーを用いて、鋳型を加えない条件下３２サイクル以上の遺伝子増幅反応を行ってもバクテリア由来の核酸の増幅産物を検出しない
ものであることを特徴とする耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物の製造方法。
【請求項３】
前記熱処理の温度が５０℃以上であることを特徴とする請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
形質転換に用いる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子が好熱菌または超好熱菌由来で有る事を特徴とする請求項２または３に記載の製造方法。
【請求項５】
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子が、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡである請求項２〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
真核細胞が、菌類、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞のいずれかであることを特徴とする請求項２〜５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
請求項２〜６のいずれかに記載の製造方法により得られた抽出物またはその精製調製物を含むことを特徴とする耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物。
【請求項８】
検体中の検出対象生物を検出する方法において、
以下の工程：
（１）前記検体から調製した核酸と、前記検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマーと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物と、を用いて核酸増幅反応を行う増幅工程と、
（２）前記増幅工程における増幅産物中の前記目的遺伝子の増幅産物を検出する検出工程と、
を有し、
前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物が、
（Ｂ−１）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ１ユニット中に該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を除くバクテリア由来核酸の混入が１０fg以下であり、
（Ｂ−２）前記調製物に対して耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子以外のバクテリア由来の核酸のみを増幅させうるプライマーを用いて、鋳型を加えない条件下３２サイクル以上の遺伝子増幅反応を行ってもバクテリア由来の核酸の増幅産物を検出しない
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物である
ことを特徴とする検体中の検出対象生物の検出方法。
【請求項９】
前記増幅工程が、前記目的遺伝子以外の目的外遺伝子の増幅抑制下で行われる請求項８に記載の検出方法。
【請求項１０】
前記目的外遺伝子の増幅抑制をホットスタート法により行う請求項９に記載の検出方法。
【請求項１１】
前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ１ユニットに対して、過剰量の抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体を用いる請求項１０記載の検出方法。
【請求項１２】
前記検出工程を、前記目的遺伝子の増幅産物を検出可能とし、それ以外の目的外遺伝子の増幅産物は非検出として行う請求項８〜１１のいずれかに記載の検出方法。
【請求項１３】
前記目的遺伝子の増幅産物を検出可能とし、それ以外の目的外遺伝子の増幅産物を非検出とする条件を、
（１）前記目的遺伝子増幅産物の融解温度（ＴｍA）が、前記目的外遺伝子の増幅産物の融解温度（ＴｍB）よりも高くなるように前記プライマーを設計し、
（２）前記増幅産物の検出を、ＴｍAとＴｍBとの間の温度で行う
ことにより設定し、前記目的遺伝子の増幅産物のみを検出する方法を用いて行う
請求項１２に記載の検出方法。
【請求項１４】
前記増幅工程と前記検出工程を、増幅産物の量を表示する表示装置を用いるリアルタイムＰＣＲにより行い、前記目的外遺伝子の増幅産物が前記表示装置において非表示となる請求項１３に記載の検出方法。
【請求項１５】
前記増幅産物の検出を、検出用の標識を有するインターカレーターにより行う請求項８〜１４のいずれかに記載の検出方法。
【請求項１６】
前記検出工程が、増幅産物をゲル上で展開することにより行われる請求項８〜１１のいずれかに記載の検出方法。
【請求項１７】
前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物が真核細胞を宿主として製造した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物であり、該真核細胞が、菌類、植物細胞、昆虫細胞及び動物細胞のいずれかである請求項８〜１６のいずれかに記載の検出方法。
【請求項１８】
前記検出対象生物が細菌、真菌、ウイルスから選ばれる１種または２種以上である請求項８〜１７に記載の検出方法。
【請求項１９】
前記検出対象生物が細菌であり、前記プライマーが、細菌の遺伝子の複数領域を増幅できるユニバーサルプライマーセットである請求項１８に記載の検出方法。
【請求項２０】
前記検出対象生物が、感染症原因菌である請求項８〜１９のいずれかに記載の検出方法。
【請求項２１】
前記検体が、無菌環境であるべき検体である請求項８〜２０のいずれかに記載の検出方法。
【請求項２２】
前記無菌環境であるべき検体が、血液、髄液、羊水、尿、食品、飲料、化粧品、水質検査に供される検体から選択される請求項２１記載の検出方法。
【請求項２３】
前記検出工程において前記増幅工程における増幅産物を定量し、得られた定量結果から前記検体中の検出対象生物を定量する請求項８〜２２のいずれかに記載の検出方法。
【請求項２４】
前記検出工程において前記目的遺伝子の増幅産物を定量または数値化し、その結果から前記検体中に含まれる検出対象生物の個体数を求める請求項２３に記載の検出方法。
【請求項２５】
前記増幅産物を数値化する方法として吸光度測定法またはデンシドメトリー法を用いる請求項２４記載の検出方法。
【請求項２６】
前記目的遺伝子が前記検出対象生物の同定用遺伝子であり、前記目的遺伝子の増幅産物の分析結果から前記検体中に含まれる検出対象生物を定量同定する請求項２３に記載の検出方法。
【請求項２７】
検体中の検出対象生物を定量同定する方法において、
以下の工程：
（１）前記検体から調製した核酸と、前記検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマー（Ｂ）及び（Ｍ）と、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物と、を用いて核酸増幅反応を行う第一の増幅工程と、
（２）前記第一の増幅工程における複数（３〜１０）の増幅産物の融解温度（Ｔｍ値）の組合せを前記目的遺伝子の増幅産物に特異的な融解温度（Ｔｍ値）の組合せに基づいて解析し、前記検体中の検出対象生物の定量同定を行う第一の定量同定工程と、
（３）前記検体から調製した核酸と、前記検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマー（Ｆ）と、細菌を宿主として製造した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物と、を用いて核酸増幅反応を行う第二の増幅工程と、
（４）前記第二の増幅工程における複数（３〜１０）の増幅産物の融解温度（Ｔｍ値）の組合せを前記目的遺伝子の増幅産物に特異的な融解温度（Ｔｍ値）の組合せに基づいて解析し、前記検出対象生物を定量同定する第一の定量同定工程および前記第二の増幅工程における増幅産物を定量し、得られた定量結果から前記検体中の検出対象生物の定量同定を行う第二の定量同定工程と、
を有し、
前記プライマー（Ｂ）、（Ｆ）及び（Ｍ）が、
（Ｂ）細菌の遺伝子の複数領域を増幅できるユニバーサルプライマーセット、および各プライマー塩基配列の全部または１／３以上を含むプライマー、
（Ｆ）真菌の遺伝子の複数領域を増幅できるユニバーサルプライマーセット、および各プライマー塩基配列の全部または１／３以上を含むプライマー、
（Ｍ）メチリシン耐性を示すｍｅｃＡ遺伝子など、その時々の流行に応じた抗生剤耐性遺伝子を特異的に増幅するプライマーセット、
であり、
第一の増幅工程における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物が、
（Ｂ−１）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ１ユニット中に該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を除くバクテリア由来核酸の混入が１０fg以下であり、
（Ｂ−２）前記調製物に対して耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子以外のバクテリア由来の核酸のみを増幅させうるプライマーを用いて、鋳型を加えない条件下３２サイクル以上の遺伝子増幅反応を行ってもバクテリア由来の核酸の増幅産物を検出しない
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物である
ことを特徴とする検体中の検出対象生物の定量同定方法。
【請求項２８】
検体中の検出対象生物を定量同定する方法において、
以下の工程：
（１）前記検体から調製した核酸と、前記検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマー（Ｂ）と、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物と、を用いて核酸増幅反応を行う第一の増幅工程と、
（２）前記第一の増幅工程における複数（３〜１０）の増幅産物の融解温度（Ｔｍ値）の組合せを前記目的遺伝子の増幅産物に特異的な融解温度（Ｔｍ値）の組合せに基づいて解析し、前記検体中の検出対象生物の定量同定を行う第一の定量同定工程と、
（３）前記検体から調製した核酸と、前記検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマー（Ｆ）と、細菌を宿主として製造した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物と、を用いて核酸増幅反応を行う第二の増幅工程と、
（４）前記第二の増幅工程における複数（３〜１０）の増幅産物の融解温度（Ｔｍ値）の組合せを前記目的遺伝子の増幅産物に特異的な融解温度（Ｔｍ値）の組合せに基づいて解析し、前記検出対象生物を定量同定する第一の定量同定工程および前記第二の増幅工程における増幅産物を定量し、得られた定量結果から前記検体中の検出対象生物の定量同定を行う第二の定量同定工程と、
（５）前記検体から調製した核酸と、前記検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマー（Ｍ）と、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物と、を用いて核酸増幅反応を行う第三の増幅工程と、
（６）前記第三の増幅工程における増幅産物の融解温度（Ｔｍ値）を前記目的遺伝子の増幅産物に特異的な融解温度（Ｔｍ値）に基づいて解析し、前記検体中の検出対象生物の定量同定を行う第三の定量同定工程と、
を有し、
前記プライマー（Ｂ）、（Ｆ）及び（Ｍ）が、
（Ｂ）細菌の遺伝子の複数領域を増幅できるユニバーサルプライマーセット、および各プライマー塩基配列の全部または１／３以上を含むプライマー、
（Ｆ）真菌の遺伝子の複数領域を増幅できるユニバーサルプライマーセット、および各プライマー塩基配列の全部または１／３以上を含むプライマー、
（Ｍ）メチリシン耐性を示すｍｅｃＡ遺伝子など、その時々の流行に応じた抗生剤耐性遺伝子を特異的に増幅するプライマーセット、
であり、
第一及び第三の増幅工程における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物が、
（Ｂ−１）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ１ユニット中に該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を除くバクテリア由来核酸の混入が１０fg以下であり、
（Ｂ−２）前記調製物に対して耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子以外のバクテリア由来の核酸のみを増幅させうるプライマーを用いて、鋳型を加えない条件下３２サイクル以上の遺伝子増幅反応を行ってもバクテリア由来の核酸の増幅産物を検出しない
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物である
ことを特徴とする検体中の検出対象生物の定量同定方法。
【請求項２９】
前記細菌の遺伝子が１６ＳｒＲＮＡ遺伝子であり、その増幅領域が３〜１０箇所である請求項２７または２８記載の定量同定方法。
【請求項３０】
前記真菌の遺伝子が１８ＳｒＲＮＡ遺伝子であり、その増幅領域が３〜１０箇所である請求項２７または２８のいずれかに記載の定量同定方法。
【請求項３１】
標準コントロールとして、一定濃度の大腸菌標準株ＤＮＡをテンプレートとし、
細菌の遺伝子の複数領域を増幅できるユニバーサルプライマーセット、および各プライマー塩基配列の全部または一部を含むプライマーセットのいずれか１つを用いて標準Ｔｍ値を毎回測定することにより、前記増幅産物のＴｍ値の測定誤差を補正する工程が付加された請求項２７〜３０のいずれかに記載の定量同定方法。
【請求項３２】
各増幅領域に基づく増幅産物の融解温度の組合せ（ＴｍM1〜ＴｍMN：Ｎは３〜１０）を、前記検出対象生物に特異的な融解温度の組合せ（ＴｍS1〜Ｔｍsn：ｎは３〜１０）に基づいて解析して、前記検出対象生物を定量同定する請求項２７〜３１のいずれかに記載の定量同定方法。
【請求項３３】
前記検出対象生物を同定するためのアルゴリズムとしてＴｍ値そのものの組合せだけでなく、各Ｔｍ値間の差の組合せを利用して同定することで、測定誤差の影響を最小限とする工程が付加された請求項３２に記載の定量同定方法。
【請求項３４】
検体中に含まれる検出対象生物の定量及び／または同定を行うためのセットであって、
検体から調製した核酸を増幅するための耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物と、前記検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマーと、
を有し、
前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物が、
（Ｂ−１）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ１ユニット中に該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を除くバクテリア由来核酸の混入が１０fg以下であり、
（Ｂ−２）前記調製物に対して耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子以外のバクテリア由来の核酸のみを増幅させうるプライマーを用いて、鋳型を加えない条件下３２サイクル以上の遺伝子増幅反応を行ってもバクテリア由来の核酸の増幅産物を検出しない
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物である
ことを特徴とする定量または同定用のセット。
【請求項３５】
検体中に含まれる検出対象生物の定量及び／または同定を行うためのセットであって、
検体から調製した核酸を増幅するための耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物であって、
（Ｂ−１）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ１ユニット中に該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を除くバクテリア由来核酸の混入が１０fg以下であり、
（Ｂ−２）前記調製物に対して耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子以外のバクテリア由来の核酸のみを増幅させうるプライマーを用いて、鋳型を加えない条件下３２サイクル以上の遺伝子増幅反応を行ってもバクテリア由来の核酸の増幅産物を検出しない耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物と、
検体から調製した核酸を増幅するための細菌細胞を宿主として製造した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物と、
前記検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマーと、
を有することを特徴とする定量及び／または同定用のセット。
【請求項３６】
前記プライマーが、以下のプライマー（Ｂ）、（Ｆ）及び（Ｍ）、
（Ｂ）細菌の遺伝子の複数領域を増幅できるユニバーサルプライマーセット、および各プライマー塩基配列の全部または１／３以上を含むプライマー、
（Ｆ）真菌の遺伝子の複数領域を増幅できるユニバーサルプライマーセット、および各プライマー塩基配列の全部または１／３以上を含むプライマー、
（Ｍ）メチリシン耐性を示すｍｅｃＡ遺伝子など、その時々の流行に応じた抗生剤耐性遺伝子を特異的に増幅するプライマーセット、
である請求項３５に記載のセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、耐熱性DNAポリメラーゼを含む酵素調製物およびその製造方法、並びに検出対象生物の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、特定の菌やバクテリア、ウイルス等の検出を目的としたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は２時間程度の短時間で分析結果が分るため医療分野や獣医分野、食品分野などにおいて普及が進んできている。しかしながら、不特定の菌やバクテリア、ウイルス等を短時間に検出する技術は未だ確立されていない。【０００３】
本来無菌環境であるべき場所から極微量の非特定生物を検出同定し定量することは、例えば血液、髄液、羊水、尿等を検体として分析し、ヒトや家畜の感染を初期に検知同定し、早い段階での有効な抗生剤投与に結び付けられること、更には回復の状況を感染菌の定量値によってモニターできることなど非常に大きなメリットが期待できる。また、上水道水、給水タンク、空調循環水、加湿器、温泉水、プール水等、人が生活において吸入（飲水）する可能性のある生活用水や食品、化粧品への所望としない不特定のバクテリア、真菌、ウイルス等の生物の混入をいち早く検出同定できることや、混入レベルを高感度でモニターできるなど生活用水や食品、化粧品などの品質管理分野においても大きなメリットが期待できる。このように検体中での検出対象微生物の定量または同定を高感度、簡便かつ迅速に行う方法が確立できれば技術の波及分野は非常に広いものと想定され、強く求められている。【０００４】
重篤な全身感染症で、確定診断には血液中の起因微生物の検出・同定が必須である敗血症の患者数は、近年、癌治療や臓器移植など医療の高度化に伴って増加している。院内感染の観点からメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）をはじめとする多剤耐性菌が敗血症の起因菌となることも多く、適切な抗生剤を選択し患者を救命するためには、血液中の起因微生物を可能な限り迅速に検出・同定することが臨床上重要である。【０００５】
また、早産の最大の原因である子宮内感染症は胎児が死に至る重篤な感染症であり、羊水中の起因微生物を可能な限り迅速に検出・同定し、最適な抗生剤を発症早期に投与することが胎児の救命にとって重要となる。同様に獣医分野においても、例えばウシの乳房炎は乳牛にとってかなり深刻な病気であり、治療が遅れると淘汰しか手立てが無い場合も多く、産業的にも問題となっている。【０００６】
しかし、現行の感染微生物検査法では一般に培養ボトルでの培養及び選択培地を用いた培養を含む培養法が用いられるため、結果が出るまでに少なくとも数日はかかり、結果が判明するまでの間は経験に基づく治療（empiric therapy）を施行せざるを得なく、盲目的に抗生剤の選択を余儀なくされていることが臨床的現状であり、迅速性が求められる検査では大きな欠点となる。また、微生物の中には抗生剤耐性遺伝子を有する場合もあるため、併行して薬剤感受性試験が行われることも多いが、同定検査法と同様、結果が出るまでに数日を要する。その結果、広域スペクトルの抗生剤使用による多剤耐性菌の出現や、不適切な抗生剤選択により敗血症患者や子宮内感染症の胎児を救命できない事態、或いは乳腺炎の乳牛を淘汰せざるを得ない事態などが生じている。更に、従属栄養細菌を検出する場合は特殊な培養条件が必要なため、偽陰性が生じるリスクも高い。【０００７】
このような背景からPCRを用いた未同定の菌の検出について検討がなされており、敗血症起因微生物DNAの痕跡をPCRにより増幅し、増幅された起因微生物DNAを、経験的に想定した微生物に標的を定めた菌種固有のヌクレオチドプローブとハイブリッド形成させ、起因微生物を検出・同定する試みがなされている（特開平6-90799号公報）。さらに、検出・同定の迅速性を求めて、ハイブリダイゼーションプローブを用いたリアルタイムPCRを基本原理とした敗血症検査技術開発が検討されている（生物試料分析，Vol.28,No5.(2005),400-40）。また、微生物DNAを鋳型として特定のプライマーセットを用いたPCRなどでの遺伝子増幅を行い、次いで微生物に特異的な融解温度（Tm値）の組合せ、あるいは各Tm値間の差を解析することによる起因菌の迅速な検出同定方法が検討されている（WO2007/097323）。しかしながら、PCRを用いて短時間で得られる結果においても精度が担保されていなければならず、従ってPCRにおいては感度と特異度の高さを両立させることが重要とも言える。これら先行技術はPCRによる遺伝子増幅技術を応用してはいるものの想定した標的微生物に限定された方法であり、想定外の微生物であった場合には検出できなかったり、また未同定の微生物を対象とした検出同定方法であってもその定量技術は確立されておらず不可能であった。【０００８】
リアルタイムPCRは、増幅曲線を経時的に表示できる唯一の方法であるため、今日では遺伝子の定量検査に欠かすことの出来ない実験手法となっている。特にサイバーグリーン(SYBR Green)などのインターカレーターを用いた検出法は安価で手軽なため、世界中で広く繁用されている。しかしながら、インターカレーターを用いたリアルタイムPCRには、ターゲットのみならず非特異的増幅産物をも同様に検出してしまい、検出感度が低下する場合があるという問題がある。特に問題となる非特異的増幅産物は、プライマーダイマー（primer dimer）の形成である。プライマーダイマーの形成抑制方法として、プライマー設計の工夫や、ホットスタート（Hot Start）法の利用、修飾プライマーを使用する増幅法（特開2002-291490号公報）、改良されたPCR用の試薬を用いるホットスタートPCR（特開2003-259882号公報）、プライマーダイマーに結合する物質をサンプルに添加する方法（特開2006-254784号公報）などが提案されている。しかしながらプライマーダイマーをはじめとするこれら非特異的増幅産物の形成を完全に阻害することは非常に難しく、各種プライマーダイマー形成抑制方法を用いてもPCRサイクル数の増加に応じて非特異的増幅産物が検出されてしまい、このことがリアルタイムPCRを用いた定量測定における感度低下の主要な要因となっている。また、定性検査においても測定毎にＴｍ値（融解温度：melting temperature）をチェックしてプライマーダイマーによる「偽陽性」を除外しなければならないなど、リアルタイムPCRの測定系にとって大きな問題となっている。【０００９】
PCRに用いるDNAポリメラーゼを提供するために、遺伝子組み換え技術によるDNAポリメラーゼ調製物の製造方法が検討されている（特開2006-180886号公報）。PCR反応において一般的に使用される市販の耐熱性DNAポリメラーゼ調製物の中には高純度精製調製物も市販されているが、これら高純度精製調製物を用いたPCR反応でも、遺伝子増幅反応を通常の30サイクル程度以上行う必要がある場合などにおいては原因不明の非特異的増幅産物が検出されてしまい、その使用には限界があった。【００１０】
PCR法における特異度の高さを確保するために、様々な手法が開発されている。最も簡便な方法はnested PCR法だが、PCRを2回行うという手間と時間が必要となる。そこで、1回のPCRでnested PCRを行う“入れ子増幅方法”（特開平05-292968号公報）が提案されている。この方法は１回の熱サイクルプロフィールのみでnested
PCRを行える優れた方法だが、その出願時には、プライマーや増幅産物のTm値を簡単に実測する技術が無かったためか、未だ実用化されていない。この方法はリアルタイムＰＣＲ技術のある現在では実用化可能である。その他、ハイブリプローブを用いる方法やTaqMan PCR法などが一般に用いられているが、誰でも簡単にプローブを作成できる訳ではなく、費用も高価となる等、迅速性・簡便性・経済性の全てを満たす方法は未だ存在しないのが現状である。【００１１】
以上のように、簡便に極微量の検体微生物からのDNAを増幅し、短時間の内に分析、特に定量または同定分析することができれば、これまで解析不可能であった極微量レベルでの遺伝子についてまで解析可能になるばかりでなく、医療分野や獣医分野、生活用水や食品などの各種検体の分析分野においては迅速且つ正確な判断に繋がるものと考えられるが、その一方で極微量の検体微生物DNAを増幅する場合のPCRにおいて、感度と特異度を共に高く制御することは未だ達成できておらず、未同定の微生物を対象とした場合における迅速な定量、または定量同定についても未だ達成できていなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、PCR法を用いた極微量の検体微生物DNAの増幅に最適な耐熱性DNAポリメラーゼ調製物を提供すること、および該DNAポリメラーゼ調製物を用いた極微量の検体微生物の新規検査に好適な分析方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本明細書には以下の各発明が含まれる。
（Ｉ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む酵素調製物であって、
（１）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ１ユニット中に該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を除くバクテリア由来核酸の混入が１０fg以下であり、
（２）前記酵素調製物に対して耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子以外のバクテリア由来の核酸のみを増幅させうるプライマーを用いて、鋳型を加えない条件下３２サイクル以上の遺伝子増幅反応を行ってもバクテリア由来の核酸の増幅産物を検出しない
ことを特徴とする耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物。【００１４】
（ＩＩ）以下の工程：
（１）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を真核細胞に形質転換し、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子発現形質転換体細胞を得る工程、
（２）前記形質転換体細胞を培養する工程、
（３）培養された形質転換体細胞より耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む抽出物を取得し、該抽出物を熱処理する工程、または培養された形質転換体細胞を熱処理した後、熱処理された形質転換体細胞より耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む抽出物を取得する工程、
を有することを特徴とする耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物の製造方法。【００１５】
（ＩＩＩ）検体中の検出対象生物を検出する方法において、
以下の工程：
（１）前記検体から調製した核酸と、前記検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマーと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物と、を用いて核酸増幅反応を行う増幅工程と、
（２）前記増幅工程における増幅産物中の前記目的遺伝子の増幅産物を検出する検出工程と、
を有し、
前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物が、
（Ａ）真核細胞を宿主として製造した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物、及び
（Ｂ）熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物であって、
（Ｂ−１）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ１ユニット中に該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を除くバクテリア由来核酸の混入が１０fg以下であり、
（Ｂ−２）前記調製物に対して耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子以外のバクテリア由来の核酸のみを増幅させうるプライマーを用いて、鋳型を加えない条件下３２サイクル以上の遺伝子増幅反応を行ってもバクテリア由来の核酸の増幅産物を検出しない耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物
のいずれかであることを特徴とする検体中の検出対象生物の検出方法。【００１６】
（ＩＶ）検体中の検出対象生物を定量同定する方法において、
以下の工程：
（１）前記検体から調製した核酸と、前記検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマー（Ｂ）及び（Ｍ）と、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物と、を用いて核酸増幅反応を行う第一の増幅工程と、
（２）前記第一の増幅工程における複数（３〜１０）の増幅産物の融解温度（Ｔｍ値）の組合せを前記目的遺伝子の増幅産物に特異的な融解温度（Ｔｍ値）の組合せに基づいて解析し、前記検体中の検出対象生物の定量同定を行う第一の定量同定工程と、
（３）前記検体から調製した核酸と、前記検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマー（Ｆ）と、細菌を宿主として製造した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物と、を用いて核酸増幅反応を行う第二の増幅工程と、
（４）前記第二の増幅工程における複数（３〜１０）の増幅産物の融解温度（Ｔｍ値）の組合せを前記目的遺伝子の増幅産物に特異的な融解温度（Ｔｍ値）の組合せに基づいて解析し、前記検出対象生物を定量同定する第一の定量同定工程と前記第二の増幅工程における増幅産物を定量し、得られた定量結果から前記検体中の検出対象生物の定量同定を行う第二の定量同定工程と、
を有し、
前記プライマー（Ｂ）、（Ｆ）及び（Ｍ）が、
（Ｂ）全ての細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の複数領域を増幅できるプライマーセット、および各プライマー塩基配列の全部または１/３以上を含むプライマー、
（Ｆ）全ての真菌の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の複数領域を増幅できるプライマーセット、および各プライマー塩基配列の全部または１/３以上を含むプライマー、
（Ｍ）メチリシン耐性を示すｍｅｃＡ遺伝子など、その時々の流行を反映した抗生剤耐性遺伝子を特異的に増幅するプライマーセット、
であり、
第一の増幅工程における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物が、
（Ａ）真核細胞を宿主として製造した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物、及び
（Ｂ）熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物であって、
（Ｂ−１）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ１ユニット中に該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を除くバクテリア由来核酸の混入が１０fg以下であり、
（Ｂ−２）前記調製物に対して耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子以外のバクテリア由来の核酸のみを増幅させうるプライマーを用いて、鋳型を加えない条件下３２サイクル以上の遺伝子増幅反応を行ってもバクテリア由来の核酸の増幅産物を検出しない耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物
のいずれかである
ことを特徴とする検体中の検出対象生物の定量同定方法。【００１７】
（Ｖ）検体中の検出対象生物を定量同定する方法において、
以下の工程：
（１）前記検体から調製した核酸と、前記検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマー（Ｂ）と、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物と、を用いて核酸増幅反応を行う第一の増幅工程と、
（２）前記第一の増幅工程における複数（３〜１０）の増幅産物の融解温度（Ｔｍ値）の組合せを前記目的遺伝子の増幅産物に特異的な融解温度（Ｔｍ値）の組合せに基づいて解析し、前記検体中の検出対象生物の定量同定を行う第一の定量同定工程と、
（３）前記検体から調製した核酸と、前記検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマー（Ｆ）と、細菌を宿主として製造した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物と、を用いて核酸増幅反応を行う第二の増幅工程と、
（４）前記第二の増幅工程における複数（３〜１０）の増幅産物の融解温度（Ｔｍ値）の組合せを前記目的遺伝子の増幅産物に特異的な融解温度（Ｔｍ値）の組合せに基づいて解析し、前記検出対象生物を定量同定する第一の定量同定工程と前記第二の増幅工程における増幅産物を定量し、得られた定量結果から前記検体中の検出対象生物の定量同定を行う第二の定量同定工程と、
（５）前記検体から調製した核酸と、前記検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマー（Ｍ）と、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物と、を用いて核酸増幅反応を行う第三の増幅工程と、
（６）前記第三の増幅工程における増幅産物の融解温度（Ｔｍ値）を前記目的遺伝子の増幅産物に特異的な融解温度（Ｔｍ値）に基づいて解析し、前記検体中の検出対象生物の定量同定を行う第三の定量同定工程と、
を有し、
前記プライマー（Ｂ）、（Ｆ）及び（Ｍ）が、
（Ｂ）全ての細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の複数領域を増幅できるプライマーセット、および各プライマー塩基配列の全部または１/３以上を含むプライマー、
（Ｆ）全ての真菌の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の複数領域を増幅できるプライマーセット、および各プライマー塩基配列の全部または１/３以上を含むプライマー、
（Ｍ）メチリシン耐性を示すｍｅｃＡ遺伝子など、その時々の流行に応じた抗生剤耐性遺伝子を特異的に増幅するプライマーセット、
であり、
第一及び第三の増幅工程における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物が、
（Ａ）真核細胞を宿主として製造した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物、及び
（Ｂ）熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物であって、
（Ｂ−１）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ１ユニット中に該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を除くバクテリア由来核酸の混入が１０fg以下であり、
（Ｂ−２）前記調製物に対して耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子以外のバクテリア由来の核酸のみを増幅させうるプライマーを用いて、鋳型を加えない条件下３２サイクル以上の遺伝子増幅反応を行ってもバクテリア由来の核酸の増幅産物を検出しない耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物である
ことを特徴とする検体中の検出対象生物の定量同定方法。【００１８】
（ＶＩ）検体中に含まれる検出対象生物の定量及び／または同定を行うためのセットであって、
検体から調製した核酸を増幅するための耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物と、前記検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマーと、
を有し、
前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物が、
（Ａ）真核細胞を宿主として製造した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物、及び
（Ｂ）熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物であって、
（Ｂ−１）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ１ユニット中に該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を除くバクテリア由来核酸の混入が１０fg以下であり、
（Ｂ−２）前記調製物に対して耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子以外のバクテリア由来の核酸のみを増幅させうるプライマーを用いて、鋳型を加えない条件下３２サイクル以上の遺伝子増幅反応を行ってもバクテリア由来の核酸の増幅産物を検出しない耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物
であることを特徴とする定量または同定用のセット。【００１９】
(ＶＩＩ)検体中に含まれる検出対象生物の定量及び／または同定を行うためのセットであって、
検体から調製した核酸を増幅するための、
（Ａ）真核細胞を宿主として製造した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物、及び
（Ｂ）熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物であって、
（Ｂ−１）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ１ユニット中に該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を除くバクテリア由来核酸の混入が１０fg以下であり、
（Ｂ−２）前記調製物に対して耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子以外のバクテリア由来の核酸のみを増幅させうるプライマーを用いて、鋳型を加えない条件下３２サイクル以上の遺伝子増幅反応を行ってもバクテリア由来の核酸の増幅産物を検出しない耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物
のいずれかの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物と、
検体から調製した核酸を増幅するための細菌細胞を宿主として製造した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物と、
前記検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマーと、
を有することを特徴とする定量及び／または同定用のセット。【００２０】
(ＶＩＩＩ)
検体中に含まれる検出対象生物の定量及び／または同定を行うためのシステムにおいて、
（１）前記検体から調製した核酸と、前記検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマーと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと、を用いて核酸増幅反応を行うための増幅装置と、
（２）前記増幅工程における増幅産物の定量を行うための定量装置と、
（３）前記前記増幅産物の定量結果により前記検体中の検出対象生物の量を算出する算出装置と、
（４）前記目的遺伝子の増幅産物の定量結果から前記検体中の検出対象生物の量を算出するためのデータベースと、
を有し、
上記の検出方法または定量同定方法を行うためのものであることを特徴とする定量及び／または同定システム。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、遺伝子増幅反応を利用した検体微生物の検出において、検体微生物の量が少なく、それから採取されるDNAも微量である場合でも検体微生物の検出のためのDNAの選択的増幅を可能とし、かつ製造コストの低減が可能な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物の提供を行うことができる。【００２２】
上記の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物に加えてmasked Primer Dimer法を用いれば、プライマーダイマー形成は、インターカレーターを用いたリアルタイムＰＣＲ法の阻害要因でなくなり、感度を下げることなく定量検査が出来、定性検査でのプライマーダイマーによる偽陽性のリスクも無くなる。すなわち、検出感度限界までの正確な定量（高感度定量法）が可能になる。しかも、本方法は、抗Taq抗体を用いるホットスタート法など従来法に比して簡便かつ経済的である。【００２３】
更に“入れ子増幅法”（特開平05-292968号公報）を応用するか、或いはＰＣＲの伸長時間を工夫することにより、通常２回のPCRを必要とする特異性の高いnested PCRを、１回のPCR（One Step）のみで迅速に施行することが出来る。また、ハイブリプローブ法、TaqMan法などに比して、プライマー設計が簡便かつ経済的である。【００２４】
本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物に加えてmasked Primer Dimer法およびOne Step nested PCR法を組み合わせて用いることにより、迅速・簡便に高感度・高特異度なPCRを行うことができる。【００２５】
本発明によれば、遺伝子検査による検出対象生物の高感度かつ簡易な定量または同定法を迅速に提供することができる。この方法により、本来、無菌環境であるべき或いは極微量の検出対象生物混入が問題となる如何なる検体についても、迅速・簡便で高感度な検出対象生物の定量が可能となる。更には、本定量または定量同定法により無菌状態や一定菌数の維持、感染菌量の変化による治療の効果確認など、患者体内の菌数制御状態や菌数変動状態をモニタリングすることが可能となる。また、検体の培養と本発明の高感度定量法とを組み合わせることにより、迅速な薬剤感受性試験を行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】バクテリア１６s rRNA、真核細胞１８s rRNA遺伝子配列をもとに行った系統樹解析に関する図である。
【図２】熱処理後のSDS-PAGE写真を示す図である。
【図３】大腸菌ＤＮＡをテンプレートとし耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物を用いたPCRの検出限界を示す図である。
【図４】耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物を用いた非特異的核酸混入の検証結果を示す図である。
【図５】（Ａ）はAmpliTaq Gold LDを用いたリアルタイムPCRの増幅曲線解析を示す図である。（Ｂ）はS.cerevisiaeを宿主として生産した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物を用いたリアルタイムPCRの増幅曲線解析を示す図である。
【図６】（Ａ）はAmpliTaq Gold LDを用いたリアルタイムPCRの融解曲線解析を示す図である。（Ｂ）はS.cerevisiaeを宿主として生産した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物を用いたリアルタイムPCRの融解曲線解析を示す図である。
【図７】A.oryzaeを宿主として生産した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物を用いた非特異的核酸混入の検証結果を示す図である。
【図８】masked Primer Dimer法を用いたリアルタイムPCRの増幅曲線解析を示す図である。（Ａ）はS.cerevisiaeを宿主として生産したT.aquaticus由来耐熱性DNAポリメラーゼ調製物、（Ｂ）はS.cerevisiaeを宿主として生産した変異P.furiosus由来耐熱性DNAポリメラーゼ調製物、（Ｃ）はS.cerevisiaeを宿主として生産した変異T.gorgonarius由来耐熱性DNAポリメラーゼ調製物、（Ｄ）はP.pastorisを宿主として生産したT.aquaticus由来耐熱性DNAポリメラーゼ調製物、（Ｅ）はTobacco BY-2を宿主として生産したT.aquaticus由来耐熱性DNAポリメラーゼ調製物を用いた。
【図９】リアルタイムPCRの融解曲線解析を示す図である。  （Ａ）はS.cerevisiaeを宿主として生産したT.aquaticus由来耐熱性DNAポリメラーゼ調製物、（Ｂ）はS.cerevisiaeを宿主として生産した変異P.furiosus由来耐熱性DNAポリメラーゼ調製物、（Ｃ）はS.cerevisiaeを宿主として生産した変異T.gorgonarius由来耐熱性DNAポリメラーゼ調製物、（Ｄ）はP.pastorisを宿主として生産したT.aquaticus由来耐熱性DNAポリメラーゼ調製物、（Ｅ）はTobacco BY-2を宿主として生産したT.aquaticus由来耐熱性DNAポリメラーゼ調製物を用いた。
【図１０】（Ａ）は通常のＰＣＲ条件設定とその蛍光検出ポイントを示す図である。（Ｂ）はmaskedPrimer Dimer法の蛍光検出ポイントを示す図である。
【図１１】（Ａ）はOne Step semi-nested PCR法でのプライマーおよび増幅産物の配置を示す。（Ｂ）はOne Step nested PCR法でのプライマーおよび増幅産物の配置を示す。（Ｃ）はバクテリアから得られた複数のＴｍ値（Bac1〜Bac5）と、それらの平均（average）からの相対値（d1〜d5）を示す。
【図１２】本発明にかかる検出対象生物の定量及び／または同定を行うためのシステムの一例を示すブロック図である。
【図１３】表１プログラム条件により解析を実施した増幅曲線である。図中ＡはE. coliでの増幅曲線であり、Ｂは蒸留水（Ｄ．Ｗ．)での増幅曲線である。
【図１４】表１プログラム条件により解析を実施した融解曲線図である。図中ＡはE.coliの融解曲線であり、Ｂはプライマーダイマーの融解曲線である。
【図１５】（Ａ）は表２プログラム条件によるリアルタイムＰＣＲ結果の増幅曲線図である。図中ＡはE. coliでの増幅曲線であり、Ｂは蒸留水（Ｄ．Ｗ．)での増幅曲線である。（Ｂ）は各試料のDNA抽出液をテンプレートとして真菌の感染菌検査を行った結果を示す図である。図中Ａは陽性コントロールであるC.albicansでの増幅曲線であり、Ｂは、蒸留水（Ｄ．Ｗ．)、水道水（Tap water）、湧水（Spring water）、温泉水（Hot spring water）、空調循環水（Air-conditioningwater）での増幅曲線である。（Ｃ）は各試料のDNA抽出液をテンプレートとして細菌の感染菌検査を行った結果を示す図である。図中、Ａ〜ＤはそれぞれＡ：陽性コントロールであるE.coli（サイクル数14.47）、Ｂ：温泉水（Hot spring water：サイクル数30.54）、Ｃ：空調循環水（Air-conditioning water：サイクル数28.96）及びＤ：蒸留水（Ｄ．Ｗ．)、水道水（Tap water）、湧水（Springwater）での増幅曲線である。
【図１６】シュークリームを検体とした場合の真菌の感染菌検査を行った結果を示す図である。（Ａ）は新鮮なシュークリームにおける増殖曲線である。図中、Ａは陽性コントロールであるC.albicans（サイクル数23.78）での増殖曲線であり、Ｂは蒸留水（Ｄ．Ｗ．）及びシュークリーム（クリーム）（サイクル数45.71）での増殖曲線である。（Ｂ）は、古いシュークリームにおける増殖曲線である。図中、Ａは陽性コントロールであるC.albicans（サイクル数23.78）での増殖曲線であり、Ｂは蒸留水（Ｄ．Ｗ．）及びシュークリーム（クリーム）（サイクル数44.37）での増殖曲線である。
【図１７】シュークリームを検体とした場合の細菌の感染菌検査を行った結果を示す図である。（Ａ）は新鮮なシュークリームにおける増殖曲線である。図中、Ａは陽性コントロールであるE.coli（サイクル数26.55）での増殖曲線であり、Ｂは蒸留水（Ｄ．Ｗ．）及びシュークリーム（クリーム）での増殖曲線である。（Ｂ）は、古いシュークリームにおける増殖曲線である。図中、Ａは陽性コントロールであるE.coli（サイクル数23.78）での増殖曲線であり、Ｂはシュークリーム（クリーム）（サイクル数24.48）での増殖曲線であり、Ｃは蒸留水（Ｄ．Ｗ．）での増殖曲線である。
【図１８】C.albicansによる敗血症患者Ａの血液検体を用いた検査結果を示す図である。（Ａ）は真菌ユニバーサルプライマーにおける増殖曲線である。図中、Ａは陽性コントロールであるC.albicans（サイクル数27.51）での増殖曲線であり、Ｂは血液検体（患者Ａ：サイクル数33.70）での増殖曲線であり、Ｃは蒸留水（Ｄ．Ｗ．）での増殖曲線である。（Ｂ）は細菌ユニバーサルプライマーにおける増殖曲線である。図中、Ａは陽性コントロールであるE.coli（サイクル数33.70）での増殖曲線であり、Ｂは血液試料（患者Ａ）及び蒸留水（Ｄ．Ｗ．）での増殖曲線である。
【図１９】Bacillus speciesによる敗血症患者Ｂの血液検体を用いた検査結果を示す図である。（Ａ）は真菌ユニバーサルプライマーにおける増殖曲線である。図中、Ａは陽性コントロールであるC.albicansでの増殖曲線であり、Ｂは血液検体（患者Ｂ）及び蒸留水（Ｄ．Ｗ．）での増殖曲線である。（Ｂ）は血液検体に対する細菌ユニバーサルプライマーにおける増殖曲線である。図中、Ａは陽性コントロールであるE.coli（サイクル数22.53）での増殖曲線であり、Ｂは血液検体（患者Ｂ：サイクル数34.07）での増殖曲線であり、Ｃは蒸留水（Ｄ．Ｗ．）での増殖曲線である。（Ｃ）は血液培養試料に対する細菌ユニバーサルプライマーにおける増殖曲線である。図中、Ａは血液培養試料（患者Ｂ：サイクル数14.47）での増殖曲線であり、Ｂは陽性コントロールであるE.coli（サイクル数25.64）での増殖曲線であり、Ｃは蒸留水（Ｄ．Ｗ．）での増殖曲線である。
【図２０】MRSAのDNAを鋳型とし、MRSA特異的なプライマーを用いたリアルタイムPCRの結果を示す図である。ＡはＳｐａプライマーでの増殖曲線であり、ＢはmecAプライマーでの増殖曲線であり、Ｃは細菌ユニバーサルプライマーでの増殖曲線であり、Ｄは真菌ユニバーサルプライマーでの増殖曲線である。
【図２１】（Ａ）は検出されたStaphylococcus epidermidisに対し、ゲンタマイシン（GM）とエリスロマイシン（EM）の薬剤感受性を経時的増菌量から検査した図である。（Ｂ）は検出されたBacillus cereusに対し、セファゾリン（CZ）、アンピシリン（AP）、エリスロマイシン（EM）それぞれの薬剤感受性を経時的増菌率から検査した図である。
【図２２】（Ａ）は子宮内感染症の羊水検体１の感染菌検査結果を示す図であり、（Ｂ）は切迫早産の羊水検体２の感染菌検査結果を示す図である。尚、Ａ〜Ｃは細菌ユニバーサルプライマーを用いて検出を試みた結果であり、Ａ：蒸留水、Ｂ：陽性コントロールであるE.coli、Ｃ：羊水検体、である。Ｄ〜Ｆは真菌ユニバーサルプライマーを用いて検出を試みた結果であり、Ｄ：蒸留水、Ｅ：陽性コントロールであるC.albicans、Ｆ：羊水検体、である。Ｇ〜Ｈはマイコプラズマ属特異的プライマーを用いて検出を試みた結果であり、Ｇ：蒸留水、Ｈ：マイコプラズマ陽性コントロール、Ｉ：羊水検体、である。Ｊ〜Ｌはウレアプラズマ属特異的プライマーを用いて検出を試みた結果であり、Ｊ：蒸留水、Ｋ：ウレアプラズマ陽性コントロール、Ｌ：羊水検体、である。
【図２３】semi-nestedプライマーを含む３つのプライマーを混合し、nested PCRが上手く行われているかどうか、増幅産物のＴｍ値により確認した。（Ａ）は表３および表４のAmplification 1のみの実施にて、外側の増幅産物Ｉ（Ｔｍ値８７℃）のみが増幅されていることを示す。（Ｂ）表３および表４のAmplification 2のみの実施にて、内側のnestedされた増幅産物ＩＩ（Ｔｍ値８３℃）のみ（他はプライマーダイマー）が増幅されていることを示す。
【図２４】e-DNAPおよび非表示法を用いた高感度検出方法とOne Step nested PCR法とを併せることで、高感度かつ高特異度のPCRが上手く行われていることを、実際の検体を用いて確認した。（Ａ）はE.Coli特異的プライマーにおいて、表３あるいは表４のプログラムを実施した場合の増殖曲線である。図中、ＡはE.Coliでの増殖曲線であり、Ｂは蒸留水（Ｄ．Ｗ．）、S. aureus、Human DNAでの増殖曲線である。（Ｂ）はE.Coli特異的プライマーにおいて、表３あるいは表４のプログラムを実施した場合の融解曲線である。AはE.Coliでの融解曲線であり、Ｂは蒸留水（Ｄ．Ｗ．）、S. aureus、Human DNAでの融解曲線である。図中の増幅産物は、nestedされた内側の増幅産物II（Ｔｍ値８３℃）のみであり、その他、蒸留水（Ｄ．Ｗ．）、S. aureus、Human DNAの増幅産物は認められない。
【図２５】semi-nestedプライマーを含む３つのプライマーを混合し、nested PCRが上手く行われているかどうか、増幅産物の大きさにより確認した。Amplification1のみの実施にて、外側の増幅産物Ｉ（５４８ｂｐ）のみが増幅される。Amplification 2のみの実施にて、内側のnestedされた増幅産物ＩＩ（１１０ｂｐ）のみが増幅される。Amplification１＋２の実施にて、内側のnestedされた増幅産物ＩＩ（１１０ｂｐ）のみが増幅される。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
（１）耐熱性DNAポリメラーゼ調製物
本発明者らは、市販の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物と同様に、バクテリアを宿主として用いた遺伝子組み換えを利用して耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを生産し、生産された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物の、検体に含まれる検出対象微生物の検出のためのPCRへの適用性について検討した。ところが、PCRを利用した検出対象微生物の検出において、検体中に含まれる微生物の量が少なく、それから採取されるDNAも微量である場合でも、PCRのサイクル数を増加させ検出対象微生物の検出のためのDNAの選択的増幅を可能とし、かつ製造コストの低減が可能な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物の提供を行うことができなかった。
【００２８】
そこで、宿主の適性や生産された耐熱性ポリメラーゼの精製効率などを考慮し、系統樹（Carl
R. Woese, "Bacterial Evolution, "Micro. Biol. Reviews, ５１:２２１-２７１(１９８７)および図１参照）を参考に、各生物の遠縁関係を検証し、宿主として利用できる真核細胞に着目した。真核細胞を宿主として用いて耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの生産を検討した結果、得られた培養抽出沈殿物中に耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの大部分が不溶性として生産され、沈殿物および上清に対し加熱処理する事により不可逆的に可溶化し、またこの工程により活性を有し、且つ、高純度に精製された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを容易に回収できることを見出した。種々の検討を行う中で、この耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物は、バクテリア１６S rRNA遺伝幅において鋳型を添加しないものに対してはＤＮＡ増幅が起こらないという特徴を少なくとも有することが見出された。
【００２９】
以下に本発明について詳細に説明する。
【００３０】
本発明において用いられる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む調製物であり、以下の（Ａ）及び（Ｂ）の要件の少なくとも一方の特徴を有する。
【００３１】
（Ａ）以下の（１）及び（２）の条件を満たす耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物。
（１）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ１ユニット中に該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を除くバクテリア由来核酸の混入が１０fg以下である。
（２）前記調製物に対して耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子以外のバクテリア由来の核酸のみを増幅させうるプライマーを用いて、鋳型を加えない条件下３２サイクル以上の遺伝子増幅反応を行ってもバクテリア由来の核酸の増幅産物を検出しない。
【００３２】
（Ｂ）真核細胞を宿主として製造した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物。
【００３３】
バクテリア由来核酸の混入が「１０fg以下」とは、後述する実施例２−１の「（６−３）PCRの検出限界」における検出方法において「１０fg以下」と判定された場合をいう。
【００３４】
一方、本発明における「抽出物」とは、細胞または菌体から耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む成分を取り出したものであればよく、抽出物を得るために用いる溶媒や抽出方法等については特に限定されるものではない。抽出物を得る方法としては、例えば、以下の方法を挙げることができる。
（１）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを生産させた真核細胞をザイモリアーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キトビアーゼ、キトサナーゼ、β-１、３-グルカナーゼ、リゾチームなどの細胞壁を溶解する酵素により処理する方法。
（２）超音波、フレンチプレス、ガラスビーズなどの物理的な方法、熱を加えることにより細胞壁、細胞膜を破壊する方法等を用いて、細胞または菌体に含まれる成分を水や緩衝液等の溶媒を用いて抽出し抽出物を取得する方法。
（３）分泌シグナルペプチド等を耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子上流に付加することにより該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを細胞外に分泌生産させる方法等を用いて生産された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを菌体外に抽出して抽出物を得る方法。
【００３５】
本発明における「耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物」とは、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む調製物であり、上記の抽出物そのものとして、更には、上記の抽出物用いて精製、希釈、他の物質または化合物との混合などの各種処理を経て得ることができるものである。例えば、以下のものも調製物として挙げることができる。
（Ａ）前記抽出物由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが緩衝作用を有する成分としてリン酸、ホウ酸、炭酸、クエン酸、酢酸、トリス、トリシン、ビスートリシン、ベルナール、ヘペス、ピペス、キャプス、タプス、テス、モプス、メスなどを含む緩衝液に溶解している状態のもの。
（Ｂ）MgCl２やdNTPsなどと共に溶液中に存在している状態のもの。
（Ｃ）これらの（Ａ）及び（Ｂ）の溶液を凍結乾燥等の方法により乾燥させた乾燥状態のもの。
【００３６】
「抽出物」より「耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物」を得る方法としては、精製、希釈、他の物質あるいは化合物との混合等が挙げられる。
【００３７】
精製方法としては、以下の方法を挙げることができる。
（Ｉ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む培地等の抽出物を、イオン交換クロマトグラフィーやハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法。
（II）アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法。
（III）ゲルろ過など分子量の差を利用する方法等を用いるカラムクロマトグラフィー法。（IV）硫安沈殿、アセトン沈殿、ＰＥＧ沈殿、ｐＨ沈殿等を用いて分画する方法。
（V)ポリエチレンイミン等を用いた核酸除去法。
【００３８】
これらの方法の２以上を組み合わせて用いることができる。これらの方法により抽出物に含まれる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの濃縮や宿主由来の浹雑タンパク質や核酸等の低減または除去が可能となる。
【００３９】
希釈方法としては、水や前記緩衝液等の抽出物と混合する溶媒を抽出物に添加する方法が挙げられる。
【００４０】
また、他の物質または化合物との混合方法において、混合する物質または化合物としては特に限定されるものではないが、例えば塩化カリウム、酢酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、酢酸マンガン、硫酸マンガン、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化リチウム、酢酸リチウム、塩化カルシウム、β-メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、ＤＭＳＯ、グリセロール、ホルムアミド、塩化テトラメチルアンモニウム、ＰＥＧ、ツイーン２０、ツイーン８０、トライトン-Ｘ １００、ＮＰ４０、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質（酵素類、抗体、ＢＳＡ等）、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP、dNTPs、サイバーグリーン、エバグリーン、ＳＹＴＯ９、ワックス等から選ばれる１種または２種以上が挙げられる。
【００４１】
「好熱菌」とは、至適生育温度が４５℃以上、もしくは５５℃以上で生育する真正細菌又は古細菌（始原菌）をいう。本発明に適用可能な好熱菌は前期定義に該当する限り特に限定されない。
【００４２】
「超好熱菌」とは、至適生育温度が８０℃以上、もしくは９０℃以上で生育する真正細菌または古細菌（始原菌）をいう。本発明に適用可能な超好熱菌は前記定義に該当する限り特に限定されない。現在１００種類以上の好熱菌、超好熱菌が分離・同定されており、これらはいずれも本発明に適用することができる。かかる好熱菌、超好熱菌としては、サーマス属（Thermus）、バチルス属（Bacillus）サーモコッカス属（Thermococcus）、パイロコッカス属（Pyrococcus）、エアロパイラム属（Aeropyrum）、アクイフェックス属（Aquifex）、 スルフォロバス属（Sulfolobus）、パイロロバス属（Pyrolobus）、メタノパイラス属（Methanopyrus）に属する好熱菌または超好熱菌を挙げることができる。
【００４３】
更に具体的には、例えば、Thermus aquatics、Thermus thermophilus、Bacillus stearothermophilus、
Aquifex pyrophilus、Geothermobacterium ferrireducens、Thermotoga maritime、Thermotoga neopolitana、Thermotoga petrophila、Thermotoga naphthophila、Acidianus infernus、Aeropyrum pernix、Archaeoglobus fulgidus、Archaeoglobus
profundus、Caldivirga maquilingensis、Desulfurococcus amylolyticus、Desulfurococcus
mobilis、Desulfurococcus mucosus、Ferroglobus placidus、Geoglobus ahangari、Hyperthermus butylicus、Ignicoccus islandicus、  Ignicoccus pacificus、Methanococcus
jannaschii、Methanococcus fervens、Methanococcus igneus、Methanococcus infernus、Methanopyrus kandleri、  Methanothermus
fervidus、Methanothermus sociabilis、Palaeococcus ferrophilus、Pyrobaculum
aerophilum、Pyrobaculum calidifontis、Pyrobaculum islandicum、Pyrobaculum oguniense、Pyrococcus furiosus、Pyrococcus abyssi  Pyrococcus horikoshii、Pyrococcus woesei、Pyrodictium abyssi、Pyrodictium brockii、Pyrodictium occultum、Pyrolobus fumarii、Staphylothermus marinus、Stetteria
hydrogenophila、Sulfolobus solfataricus、Sulfolobus shibatae、Sulfolobus tokodaii、Sulfophobococcus zilligii、Sulfurisphaera
ohwakuensis、Thermococcus kodakaraensis、Thermococcus celer、Thermococcus litoralis、Thermodiscus maritimus、Thermofilum pendens、Thermoproteus tenax、Thermoproteus
neutrophilus、Thermosphaera aggregans、Vulcanisaeta distributa、Vulcanisaeta
sounianaなどが挙げられる。
【００４４】
本発明に関わる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物の製造方法は、宿主細胞を用いて耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを生産するものであり、宿主細胞としては真核細胞を用いる。
【００４５】
真核細胞としては菌類、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが挙げられ、宿主細胞としては真核生物由来の細胞であれば良く、特に限定はされない。
菌類としては酵母やカビなどの子嚢菌、糸状菌、担子菌、接合菌などが挙げられ、中でも酵母または糸状菌が好ましく、具体例として、サッカロマイセス属（Saccharomyces）、シゾサッカロマイセス属（Schizosaccharomyces）、カンジダ属（Candida）、ピキア属（Pichia）、ハンゼヌラ属（Hansenula）、クライベロマイセス（Kluyveromyces）属、チゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces）属、ヤロウイア（Yarrowia）属、トリコスポロン（Trichosporon）属、ロドスポリジウム（Rhodosporidi）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、フザリウム（Fusarium） 属、トリコデルマ（Trichoderma）属などが挙げられる。
【００４６】
更なる詳細な具体例としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces
cerevisiae）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、カンジダ・ウチリス（Candida utilis）、カンジダ・ボイディニ（Candida boidini）、ピキア・メタノリカ（Pichia metanolica）、ピキア・アングスタ（Pichia angusta）、ピキア・パストリス（Pichiapastoris）、ピキア・アノマラ（Pichia anomala）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、クライベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces
lactis）、チゴサッカロマイセス・ロウキシ（Zygosaccharomyces rouxii）、ヤロウイア・リポリティカ (Yarrowia lipolytica )、トリコスポロン・プルランス(Trichosporon
pullulans)、ロドスポリジウム・トルロイデス（Rhodosporidium toruloides）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、及びトリコデルマ・リーセイ（Trichoderma
reesei）などを挙げることができる。
【００４７】
動物細胞としてはヒト由来培養細胞、マウス由来培養細胞などが挙げられ、具体例としてはCHO細胞、Hela細胞などが挙げられる。植物細胞としては、植物より誘導した細胞であればよく、望ましくは株化された培養細胞であり、タバコ(Nicotiana)属細胞、シロイヌナズナ(Arabidopsis)属細胞、サツマイモ(Ipomoea)属細胞、ニンジン(Daucus)属細胞、イネ(Oryza)属細胞などが挙げられ、具体的にはNicotiana tabacum
BY-2培養細胞、Arabidopsis thaliana培養細胞、Ipomoea batatas培養細胞、Daucus carota培養細胞、Oryza sativa培養細胞などが挙げられる。昆虫細胞としては、昆虫より誘導した細胞であればよく、望ましくは株化された培養細胞であり、ハスモンヨトウ近似種Spodoptera frugiperdaの 卵巣細胞由来培養細胞sf９株、sf21株、カイコ(Bombix mori)培養細胞Bm-N株などが挙げられる。宿主細胞として好ましくは、酵母などの増殖が早い微生物あるいは真核生物であり、例えば、サッカロマイセス・セレビシエなどのサッカロマイセス属を始めとする酵母、Nicotiana tabacumなどのタバコ(Nicotiana)属植物の培養細胞をはじめとする植物細胞、アスペルギルス・オリザなどのアスペルギルス（Aspergillus）属を始めとする糸状菌が挙げられる。
【００４８】
真核細胞を用いて耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを生産させるには、例えば真核細胞内に耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を少なくとも１遺伝子以上含む遺伝子を導入発現させ、該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを生産させる方法等が挙げられる。
【００４９】
また本明細書における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子は耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードするcＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡなどいかなる遺伝子であってもよく、また１本鎖でも、その相補鎖を有する２本鎖であってもよく、天然、あるいは人工のヌクレオチド誘導体を含んでいてもよい。更に耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが生物由来である場合には、該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの由来についても特に限定されない。
【００５０】
ＤＮＡポリメラーゼは生物の種類に応じて各種同属体が存在する。
【００５１】
本発明で用いられる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの具体例としては、サーマス・アクアティカス（Thermus aquatics）、サーマス・サーモフィラス（Thermus
thermophilus）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、サーモコッカス・ゴルゴナリウス（Thermococcus gorgonarius）、サーモコッカス・コダカラエンシス
KOD１（Thermococcus kodakaraensis KOD１）、パイロコッカス・ウォエセイ（Pyrococcus woesei）パイロコッカス・フリオシス（Pyrococcus
furiosus）、エアロパイラム・ペルニクス（Aeropyrum pernix）、アクイフェックス・アエオリカス（Aquifex aeolicus）、スルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus
tokodaii）パイロロバス・フマリ（Pyrolobus fumarii）、またはメタノパイラス・カンドレリ（Methanopyrus kandleri）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを挙げることができる。
【００５２】
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは遺伝子工学的に人工的に合成された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを包括する。
【００５３】
また、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくは耐熱性を有する生物由来であり、より好ましくはメタン菌、好熱好酸菌、好熱菌、超好熱菌などの原核生物由来である。
【００５４】
本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子は、形質転換される宿主生物において多用されるコドン用法を用いた塩基配列を有する事が好ましい。
【００５５】
例えば、サッカロマイセス・セレビシエに耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を導入する際におけるコドン用法を次に示す。
【００５６】
本来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子に対して、サッカロマイセス属など異種生物のコドン用法に基づいて改変する場合、天然由来耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の塩基配列に対して７０％以上にこのコドン用法が適用されていることが好ましく、より好ましくは、８０％以上であり、さらに好ましくは、９０％以上であり、全てのコドンに対してこのコドン用法が適用されることが最も好ましい。
【００５７】
本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の好ましい形態として、サーマス・アクアティカス由来耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の塩基配列をサッカロマイセス・セレビシエのコドン用法を適用して設計した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子が挙げられる。なかでも、配列番号１１の配列を有する、あるいはこれらの塩基配列からなる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子が好ましい態様である。
【００５８】
また、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子において、mRNAを不安定化する配列を含まないようにする事が好ましく、mRNAを不安定化する配列としては著しい繰り返し配列や耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のＧＣ含量が高い遺伝子配列などが挙げられる。mRNAを不安定化する配列除去の目安として、具体的には１０ｂｐ程度の遺伝子配列の出現頻度が耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子の２％以下にまで抑えることや、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子全体のGC含量を約２０％以上、約４５％以下、に設計することなどが挙げられる。
【００５９】
本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子としては、導入しようとする宿主生物におけるコドン用法の適用、mRNA不安定化に寄与する配列を含まないようにする、好適なGC含量のうち、少なくとも１種類の特徴を有することが好ましい。より好ましくは、２種類以上、最も好ましくは３種類の特徴を有する。また、本耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子においては、宿主生物におけるコドン用法が適用されていることが好ましい。特に、サッカロマイセス属、特にサッカロマイセス・セレビシエを宿主として形質転換する場合には、サッカロマイセス・セレビシエにおけるコドン用法が適用されていることが好ましい。
【００６０】
さらに、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子において、特にコード領域において遺伝子クローニング工程上、不適当な制限酵素サイトを有さないように設計されていることが好ましい。具体的には、EcoRI、HindIII、NotI、SnaBIなどのサイトを含まないことが好ましい。また一方、遺伝子クローニング操作を考慮すれば、コード領域の外側には操作上、有用な制限酵素部位を備えていることが好ましい。例えば、EcoRI、HindIII、NotI、SnaBIなどの制限酵素サイトをコード領域の上流、または下流に有することができる。
【００６１】
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子ホモログとしては、例えば、これらのＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡポリメラーゼ遺伝子ホモログを挙げることができる。すなわち、これらのいずれかのＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の全体もしくは一部あるいはその相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡポリメラーゼ遺伝子ホモログである。かかるホモログは、同時にＤＮＡポリメラーゼ活性を備えるタンパク質をコードしている。
【００６２】
ストリンジェントな条件でハイブリダイズする耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子ホモログとは、例えば、もとの塩基配列の任意の少なくとも２０個、好ましくは２５個、より好ましくは少なくとも３０個の連続した配列を一つあるいは複数個選択したＤＮＡをプローブＤＮＡとして、当業者の周知のハイブリダイセーション技術（Current Protocols I Molecular Biology edit. Ausubel et al., (１９８７) Publish. John Wily & Sons Sectoin ６.３-６.４）などを用いて、ハイブリダイズするＤＮＡを含む。
【００６３】
ここでストリンジェントな条件としては、５０％ホルムアミド存在下でハイブリダイゼーション温度が３７℃であり、より厳しい条件としては、約４２℃である。さらに厳しい条件としては５０％ホルムアミド存在下で約６５℃とすることができる。
【００６４】
なお、アミノ酸配列における変異の数は、もとのタンパク質の機能が維持できる限り制限されないが、全アミノ酸の７０％以内であることが好ましく、より好ましくは、３０％以内であり、さらに好ましくは２０％以内である。
【００６５】
また、このような耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子ホモログは、もとのＤＮＡの塩基配列のコード領域に対して、少なくとも８０％、好ましくは、９０％以上のホモロジーを有する塩基配列を含む、あるいは当該塩基配列からなるＤＮＡであることが好ましい。なお、ＤＮＡの塩基配列のホモロジーは、遺伝子解析プログラムＢＬＡＳＴなどによって決定することができる。
【００６６】
なお、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子は、化学的に合成することもできるし、長鎖ＤＮＡの合成方法として知られている藤本らの手法（藤本英也、合成遺伝子の作製法、植物細胞工学シリーズ７
植物のＰＣＲ実験プロトコール、１９９７、秀潤社、ｐ９５−１００）を採用することもできる。
【００６７】
また、アミノ酸配列における改変は、改変しようとするアミノ酸配列に、部位特異的変位導入法（Current Protocols I Molecular Biology edit. Ausubel et al., (１９８７) Publish . John Wily & Sons Sectoin ８.１-８.５）等を用いて、適宜、置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することにより行うことができる。また、このような改変は、人工的に変異を導入しあるいは合成したものに限られず、人工的な変異処理に基づいて、あるいはこれに限られず自然界におけるアミノ酸の変異によっても生じたものも包括される。
【００６８】
本発明で好適に利用可能である耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子としては、配列番号１、８１及び８２で示される塩基配列からなる遺伝子（対応するアミノ酸配列を以下に示す）を挙げることができる。
配列番号１
aagcttacgt atacaacatg agaggtatgc ttccattgtt
cgaacctaaa ggtagagtat      60
tgttggttga tggtcatcat ctagcttaca gaactttcca
cgctctaaaa ggtttaacaa     120
catcaagagg tgaacctgtt caagctgtat acggttttgc
taagtcttta ctaaaagcat     180
tgaaggaaga cggtgacgcc gttattgttg ttttcgatgc
taaggcacca agttttagac     240
atgaagcata cggtggttat aaggctggaa gagcaccaac
tcctgaagac ttccctagac     300
aattggcact aatcaaggaa ctagtcgact tactaggtct
tgcaagatta gaagtcccag     360
gttatgaggc agatgatgta ctagcctctt tagcaaagaa
ggcagaaaag gagggttatg     420
aagttagaat tttaaccgct gataaggact tatatcaatt
gctatctgat aggattcatg     480
tgttacaccc tgaaggttat ttgataactc cagcttggtt
atgggagaag tacggtttga     540
ggccagacca atgggccgat tatagagctt taaccggcga
cgagtcagac aatcttccag     600
gtgttaaagg aattggcgaa aagactgcta ggaagttgtt
ggaagagtgg ggctccttgg     660
aggccttact taaaaatttg gacaggctaa aaccagcaat
cagggaaaag atactagctc     720
acatggatga tcttaaattg tcttgggact tagccaaggt
cagaactgat ttgcctttag     780
aggtcgactt cgctaagaga agggaacctg atagggaaag
gttaagagcc ttcttggaaa     840
gacttgagtt tggatcatta ttgcatgaat ttggtttatt
agaatcccct aaggccttgg     900
aagaagcacc atggccacct ccagaaggtg cctttgtagg
cttcgtctta agcaggaaag     960
aaccaatgtg ggcagactta ttggctctag ctgctgccag
aggaggaaga gtgcatagag    1020
ccccagaacc atataaagcc ttgagagact tgaaggaagc
aagaggtttg ttagctaaag    1080
atttgagcgt attagccttg agggaaggtt taggactacc
accaggtgac gacccaatgt    1140
tgcttgctta tttgcttgat ccatcaaaca caacacctga
aggagtagct agaaggtatg    1200
gtggagaatg gactgaagag gctggagaga gagccgctct
atctgagaga ttgtttgcta    1260
atttgtgggg tagacttgaa ggtgaggaaa gattgttgtg
gctatacagg gaagtagaaa    1320
ggccattatc tgcagtattg gctcatatgg aggccacagg
cgttagatta gatgttgctt    1380
acttaagagc tttgtcattg gaagtcgccg aagaaattgc
aagacttgaa gctgaggtgt    1440
tcagacttgc cggtcatcca ttcaatctta atagtagaga
ccagctagaa agagtgttat    1500
tcgacgagct tggattacca gcaatcggaa agacagaaaa
gactggtaaa aggtctacaa    1560
gtgccgccgt tttggaagca ttgagggagg cccatccaat
tgttgaaaag atattgcagt    1620
atagagaatt gacaaaatta aaatcaactt atatcgatcc
acttccagac ttaatccatc    1680
caaggacagg cagattacac accaggttta accagaccgc
aactgctaca ggcagattat    1740
catcttcaga tcctaactta caaaacattc ctgtaaggac
tccactaggt cagagaatta    1800
gaagagcttt tatcgctgag gaaggctggt tgcttgtggc
tttagattat agtcaaattg    1860
agttaagggt cttggctcac ttgtctggtg acgaaaatct
tatcagagtt tttcaggaag    1920
gtagggatat acatacagag accgcctcat ggatgtttgg
tgttccaagg gaggccgtcg    1980
atccactaat gaggagagca gccaaaacta ttaactttgg
agtattgtat ggtatgagtg    2040
ctcacagatt atcccaagag ttggccatcc cttacgagga
agcacaggct tttatagaaa    2100
ggtatttcca gtcttttcct aaggttagag catggattga
aaagacacta gaggaaggta    2160
ggaggagggg ttacgtggag accttattcg gaagaaggag
atacgttcca gacttagagg    2220
ctagagtgaa atcagttaga gaagccgcag agagaatggc
attcaatatg ccagtacaag    2280
gcactgccgc agatttgatg aaactagcca tggttaagct
atttccaaga ttggaagaaa    2340
tgggagctag aatgctatta caagttcatg atgaacttgt
tttagaggct cctaaagaaa    2400
gggctgaagc agtggccagg ttagctaaag aagtaatgga
gggcgtttac ccattggcag    2460
ttcctttaga ggtcgaagtg ggtataggtg aagactggct
atctgcaaag gaataagaat    2520
tc                                                                  
2522
配列番号８１
atgattttag atgtggatta cataactgaa gaaggaaaac
ctgttattag gctattcaaa      60
aaagagaacg gaaaatttaa gatagagcat gatagaactt
ttagaccata catttacgct     120
cttctcaggg atgattcaaa gattgaagaa gttaagaaaa
taacggggga aaggcatgga     180
aagattgtga gaattgttga tgtagagaag gttgagaaaa
agtttctcgg caagcctatt     240
accgtgtgga aactttattt ggaacatccc caagatgttc
ccactattag agaaaaagtt     300
agagaacatc cagcagttgt ggacatcttc gaatacgata
ttccatttgc aaagagatac     360
ctcatcgaca aaggcctaat accaatggag ggggaagaag
agctaaagat tcttgccttc     420
gatatagaaa ccctctatca cgaaggagaa gagtttggaa
aaggcccaat tataatgatt     480
agttatgcag atgaaaatga agcaaaggtg attacttgga
aaaacataga tcttccatac     540
gttgaggttg tatcaagcga gagagagatg ataaagagat
ttctcaggat tatcagggag     600
aaggatcctg acattatagt tacttataat ggagactcat
tcgacttccc atatttagcg     660
aaaagggcag aaaaacttgg gattaaatta accattggaa
gagatggaag cgagcccaag     720
atgcagagaa taggcgatat gacggctgta gaagtcaagg
gaagaataca tttcgacttg     780
tatcatgtaa taacaaggac aataaatctc ccaacataca
cactagaggc tgtatatgaa     840
gcaatttttg gaaagccaaa ggagaaggta tacgccgacg
agatagcaaa agcctgggaa     900
agtggagaga accttgagag agttgccaaa tactcgatgg
aagatgcaaa ggcaacttat     960
gaactcggga aagaattcct tccaatggaa attcagcttt
caagattagt tggacaacct    1020
ttatgggatg tttcaaggtc aagcacaggg aaccttgtag
agtggttctt acttaggaaa    1080
gcctacgaaa gaaacgaagt agctccaaac aagccaagtg
aagaggagta tcaaagaagg    1140
ctcagggaga gctacacagg tggattcgtt aaagagccag
aaaaggggtt gtgggaaaac    1200
atagtatacc tagattttag agccctatat ccctcgatta
taattaccca caatgtttct    1260
cccgatactc taaatcttga gggatgcaag aactatgata
tcgctcctca agtaggccac    1320
aagttctgca aggacatccc tggttttata ccaagtctct
tgggacattt gttagaggaa    1380
agacaaaaga ttaagacaaa aatgaaggaa actcaagatc
ctatagaaaa aatactcctt    1440
gactatagac aaaaagcgat aaaactctta gcaaattctt
tctacggata ttatggctat    1500
gcaaaagcaa gatggtactg taaggagtgt gctgagagcg
ttactgcctg gggaagaaag    1560
tacatcgagt tagtatggaa ggagctcgaa gaaaagtttg
gatttaaagt cctctacatt    1620
gacactgatg gtctctatgc aactatccca ggaggagaaa
gtgaggaaat aaagaaaaag    1680
gctctagaat ttgtaaaata cataaattca aagctccctg
gactgctaga gcttgaatat    1740
gaagggtttt ataagagggg attcttcgtt acgaagaaga
ggtatgcagt aatagatgaa    1800
gaaggaaaag tcattactcg tggtttagag atagttagga
gagattggag tgaaattgca    1860
aaagaaactc aagctagagt tttggagaca atactaaaac
acggagatgt tgaagaagct    1920
gtgagaatag taaaagaagt aatacaaaag cttgccaatt
atgaaattcc accagagaag    1980
ctcgcaatat atgagcagat aacaagacca ttacatgagt
ataaggcgat aggtcctcac    2040
gtagctgttg caaagaaact agctgctaaa ggagttaaaa
taaagccagg aatggtaatt    2100
ggatacatag tacttagagg cgatggtcca attagcaata
gggcaattct agctgaggaa    2160
tacgatccca aaaagcacaa gtatgacgca gaatattaca
ttgagaacca ggttcttcca    2220
gcggtactta ggatattgga gggatttgga tacagaaagg
aagacctcag ataccaaaag    2280
acaagacaag tcggcctaac ttcctggctt aacattaaaa
aatcctag                
2328
配列番号８２
atgatcctcg atacagacta cataactgag gatggaaagc
ccgtcatcag gatcttcaag      60
aaggagaacg gcgagttcaa aatagactac gacagaaact
ttgagccata catctacgcg     120
ctcttgaagg acgactctgc gattgaggac gtcaagaaga
taactgccga gaggcacggc     180
actaccgtta gggttgtcag ggccgagaaa gtgaagaaga
agttcctagg caggccgata     240
gaggtctgga agctctactt cactcacccc caggacnnnc
ccgcaatcag ggacaagata     300
aaggagcatc ctgccgttgt ggacatctac gagtacgaca
tccccttcgc gaagcgctac     360
ctcatagaca aaggcttaat cccgatggag ggcgacgagg
aacttaagat gctcgccttc     420
gacatcgaga cgctctatca cgagggcgag gagttcgccg
aagggcctat cctgatgata     480
agctacgccg acgaggaagg ggcgcgcgtt attacctgga
agaatatcga ccttccctat     540
gtcgacgtcg tttccaccga gaaggagatg ataaagcgct
tcctcaaggt cgtcaaggaa     600
aaggatcccg acgtcctcat aacctacaac ggcgacaact
tcgacttcgc ctacctcaag     660
aagcgctccg agaagctcgg agtcaagttc atcctcggaa
gggaagggag cgagccgaaa     720
atccagcgca tgggcgatcg ctttgcggtg gaggtcaagg
gaaggattca cttcgacctc     780
taccccgtca ttaggagaac gattaacctc cccacttaca
cccttgaggc agtatatgaa     840
gccatctttg gacagccgaa ggagaaggtc tacgctgagg
agatagcgca ggcctgggaa     900
acgggcgagg gattagaaag ggtggcccgc tactcgatgg
aggacgcaaa ggtaacctat     960
gaactcggaa aagagttctt ccctatggaa gcccagctct
cgcgcctcgt aggccagagc    1020
ctctgggatg tatctcgctc gagtaccgga aacctcgtcg
agtggttttt gctgaggaag    1080
gcctacgaga ggaatgaact tgcaccaaac aagccggacg
agagggagct ggcaagaaga    1140
agggagagct acgcgggtgg atacgtcaag gagcccgaaa
ggggactgtg ggagaacatc    1200
gtgtatctgg acttccgctc cctgtatcct tcgataataa
tcacccataa cgtctcccct    1260
gatacactca acagggaggg ttgtgaggag tacgacgtgg
ctcctcaggt aggccataag    1320
ttctgcaagg acttccccgg cttcatccca agcctcctcg
gagacctctt ggaggagaga    1380
cagaaggtaa agaagaagat gaaggccact atagacccaa
tcgagaagaa actcctcgat    1440
tacaggcaac gagcaatcaa aatccttgct aatagcttct
acggttacta cggctatgca    1500
aaggcccgct ggtactgcaa ggagtgcgcc gagagcgtta
ccgcttgggg caggcagtac    1560
atcgagacca cgataaggga aatagaggag aaatttggct
ttaaagtcct ctacgcggac    1620
acagatggat ttttcgcaac aatacctgga gcggacgccg
aaaccgtcaa aaagaaggca    1680
aaggagttcc tggactacat caacgccaaa ctgcccggcc
tgctcgaact cgaatacgag    1740
ggcttctaca agcgcggctt cttcgtgacg aagaagaagt
acgcggttat agacgaggag    1800
gacaagataa cgacgcgcgg gcttgaaata gttaggcgtg
actggagcga gatagcgaag    1860
gagacgcagg cgagggttct tgaggcgata ctaaagcacg
gtgacgttga agaagcggta    1920
aggattgtca aagaggttac ggagaagctg agcaagtacg
aggttccacc ggagaagctg    1980
gtcatctacg agcagataac ccgcgacctg aaggactaca
aggccaccgg gccgcatgtg    2040
gctgttgcaa aacgcctcgc cgcaaggggg ataaaaatcc
ggcccggaac ggtcataagc    2100
tacatcgtgc tcaaaggctc gggaaggatt ggggacaggg
ctataccctt tgacgaattt    2160
gacccggcaa agcacaagta cgatgcagaa tactacatcg
agaaccaggt tcttccagct    2220
gtggagagga ttctgagggc ctttggttac cgtaaagaag
atttaaggta tcagaaaacg    2280
cggcaggttg gcttgggggc gtggctaaaa cctaagacat
ga                      
2322
・配列番号１の塩基配列からなる遺伝子に対応するアミノ酸配列
MRGMLPLFEP KGRVLLVDGH HLAYRTFHAL KGLTTSRGEP
VQAVYGFAKS LLKALKEDGD      ６０
AVIVVFDAKA PSFRHEAYGG YKAGRAPTPE DFPRQLALIK
ELVDLLGLAR LEVPGYEADD     １２０
VLASLAKKAE KEGYEVRILT ADKDLYQLLS DRIHVLHPEG
YLITPAWLWE KYGLRPDQWA     １８０
DYRALTGDES DNLPGVKGIG EKTARKLLEE WGSLEALLKN
LDRLKPAIRE KILAHMDDLK     ２４０
LSWDLAKVRT DLPLEVDFAK RREPDRERLR AFLERLEFGS
LLHEFGLLES PKALEEAPWP     ３００
PPEGAFVGFV LSRKEPMWAD LLALAAARGG RVHRAPEPYK
ALRDLKEARG LLAKDLSVLA     ３６０
LREGLGLPPG DDPMLLAYLL DPSNTTPEGV ARRYGGEWTE
EAGERAALSE RLFANLWGRL     ４２０
EGEERLLWLY REVERPLSAV LAHMEATGVR LDVAYLRALS
LEVAEEIARL EAEVFRLAGH     ４８０
PFNLNSRDQL ERVLFDELGL PAIGKTEKTG KRSTSAAVLE
ALREAHPIVE KILQYRELTK     ５４０
LKSTYIDPLP DLIHPRTGRL HTRFNQTATA TGRLSSSDPN
LQNIPVRTPL GQRIRRAFIA     ６００
EEGWLLVALD YSQIELRVLA HLSGDENLIR VFQEGRDIHT
ETASWMFGVP REAVDPLMRR     ６６０
AAKTINFGVL YGMSAHRLSQ ELAIPYEEAQ AFIERYFQSF
PKVRAWIEKT LEEGRRRGYV     ７２０
ETLFGRRRYV PDLEARVKSV REAAERMAFN MPVQGTAADL
MKLAMVKLFP RLEEMGARML     ７８０
LQVHDELVLE APKERAEAVA RLAKEVMEGV YPLAVPLEVE
VGIGEDWLSA
KE             ８３２
・配列番号８１の塩基配列からなる遺伝子に対応するアミノ酸配列
MILDVDYITE EGKPVIRLFK KENGKFKIEH DRTFRPYIYA
LLRDDSKIEE VKKITGERHG      ６０
KIVRIVDVEK VEKKFLGKPI TVWKLYLEHP QDVPTIREKV
REHPAVVDIF EYDIPFAKRY     １２０
LIDKGLIPME GEEELKILAF DIETLYHEGE EFGKGPIIMI
SYADENEAKV ITWKNIDLPY     １８０
VEVVSSEREM IKRFLRIIRE KDPDIIVTYN GDSFDFPYLA
KRAEKLGIKL TIGRDGSEPK     ２４０
MQRIGDMTAV EVKGRIHFDL YHVITRTINL PTYTLEAVYE
AIFGKPKEKV YADEIAKAWE     ３００
SGENLERVAK YSMEDAKATY ELGKEFLPME IQLSRLVGQP
LWDVSRSSTG NLVEWFLLRK     ３６０
AYERNEVAPN KPSEEEYQRR LRESYTGGFV KEPEKGLWEN
IVYLDFRALY PSIIITHNVS     ４２０
PDTLNLEGCK NYDIAPQVGH KFCKDIPGFI PSLLGHLLEE
RQKIKTKMKE TQDPIEKILL     ４８０
DYRQKAIKLL ANSFYGYYGY AKARWYCKEC AESVTAWGRK
YIELVWKELE EKFGFKVLYI     ５４０
DTDGLYATIP GGESEEIKKK ALEFVKYINS KLPGLLELEY
EGFYKRGFFV TKKRYAVIDE     ６００
EGKVITRGLE IVRRDWSEIA KETQARVLET ILKHGDVEEA
VRIVKEVIQK LANYEIPPEK     ６６０
LAIYEQITRP LHEYKAIGPH VAVAKKLAAK GVKIKPGMVI
GYIVLRGDGP ISNRAILAEE     ７２０
YDPKKHKYDA EYYIENQVLP AVLRILEGFG YRKEDLRYQK
TRQVGLTSWL NIKKS          ７７５
・配列番号８２の塩基配列からなる遺伝子に対応するアミノ酸配列
MILDTDYITE DGKPVIRIFK KENGEFKIDY DRNFEPYIYA
LLKDDSAIED VKKITAERHG      ６０
TTVRVVRAEK VKKKFLGRPI EVWKLYFTHP QDVPAIRDKI
KEHPAVVDIY EYDIPFAKRY     １２０
LIDKGLIPME GDEELKMLAF DIETLYHEGE EFAEGPILMI
SYADEEGARV ITWKNIDLPY     １８０
VDVVSTEKEM IKRFLKVVKE KDPDVLITYN GDNFDFAYLK
KRSEKLGVKF ILGREGSEPK     ２４０
IQRMGDRFAV EVKGRIHFDL YPVIRRTINL PTYTLEAVYE
AIFGQPKEKV YAEEIAQAWE     ３００
TGEGLERVAR YSMEDAKVTY ELGKEFFPME AQLSRLVGQS
LWDVSRSSTG NLVEWFLLRK     ３６０
AYERNELAPN KPDERELARR RESYAGGYVK EPERGLWENI
VYLDFRSLYP SIIITHNVSP     ４２０
DTLNREGCEE YDVAPQVGHK FCKDFPGFIP SLLGDLLEER
QKVKKKMKAT IDPIEKKLLD     ４８０
YRQRAIKILA NSFYGYYGYA KARWYCKECA ESVTAWGRQY
IETTIREIEE KFGFKVLYAD     ５４０
TDGFFATIPG ADAETVKKKA KEFLDYINAK LPGLLELEYE
GFYKRGFFVT KKKYAVIDEE     ６００
DKITTRGLEI VRRDWSEIAK ETQARVLEAI LKHGDVEEAV
RIVKEVTEKL SKYEVPPEKL     ６６０
VIYEQITRDL KDYKATGPHV AVAKRLAARG IKIRPGTVIS
YIVLKGSGRI GDRAIPFDEF     ７２０
DPAKHKYDAE YYIENQVLPA VERILRAFGY RKEDLRYQKT
RQVGLGAWLK
PKT            ７７３
宿主に対して上述した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を導入するためのＤＮＡ構築物について説明する。本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を用いて宿主細胞に形質転換して、このＤＮＡによってコードされるタンパク質を発現させることにより、そのＤＮＡポリメラーゼ活性により宿主細胞においてＤＮＡポリメラーゼを産生させることができる。
【００６９】
形質転換にあたっては、上述した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子からなるＤＮＡセグメントを、宿主細胞内で発現可能とするＤＮＡ構築物を用いる。形質転換のためのＤＮＡ構築物の態様としては、特に限定しないでプラスミド（ＤＮＡ）、バクテリオファージ（ＤＮＡ）、レトロトランスポゾン（ＤＮＡ）、人工染色体（ＹＡＣ、ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＭＡＣ等）を、外来遺伝子の導入形態（染色体外あるいは染色体内）や宿主細胞の種類に応じて選択して採用することができる。したがって、本ＤＮＡ構築物は、上述した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の他、これらのいずれかの態様のベクターの構成セグメントを備えることができる。
【００７０】
好ましい原核細胞性ベクター、真核細胞性ベクター、動物細胞性ベクター、植物細胞性ベクターは当該分野において周知である。
【００７１】
なお、プラスミドＤＮＡとしては、例えば、ｐＲＳ４１３、ｐＲＳ４１５、ｐＲＳ４１６、ＹＣｐ５０、ｐＡＵＲ１１２またはｐＡＵＲ１２３などのＹＣｐ型大腸菌−酵母シャトルベクター、ｐＹＥＳ３２またはＹＥｐ１３などのＹＥｐ型大腸菌−酵母シャトルベクター、ｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、ｐＲＳ４０６、ｐＡＵＲ１０１またはｐＡＵＲ１３５などのＹＩｐ型大腸菌−酵母シャトルベクターなどを挙げることができる。ファージＤＮＡとしては、λファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１００、ｇｔ１１、ｚａｐ）、φＸ１７４、Ｍ１３ｍｐ１８又はＭ１３ｍｐ１９などを挙げることができる。
【００７２】
レトロトランスポゾンとしては、Ｔｙ因子などを挙げることができる。ＹＡＣとしては、ｐＹＡＣＣ２などを挙げることができる。
【００７３】
本ＤＮＡ構築物を作製するには、上述した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むフラグメントなどを適当な制限酵素で切断し、使用するベクターＤＮＡの制限酵素部位あるいはマルチクローニングサイトに挿入などすることによる。
【００７４】
本ＤＮＡ構築物の第１の態様は、上述した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子からなるＤＮＡセグメントを発現可能に連結されるプロモーターセグメントを備えている。すなわち、プロモーターにより制御され、そのプロモーターの下流側に上述した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子セグメントが連結されている。
【００７５】
上述した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の発現において、酵母中で発現するプロモーターを使用するのであれば、例えば、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーターなどを使用することが好ましい。
【００７６】
また、本ＤＮＡ構築物の他の態様である第２のＤＮＡ構築物は、本ＤＮＡの他、宿主染色体に相同組換えのためのＤＮＡセグメントを備える。相同組換え用ＤＮＡセグメントは、宿主染色体において上述した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を導入しようとするターゲット部位近傍のＤＮＡ配列と相同なＤＮＡ配列である。相同組換え用ＤＮＡセグメントは、少なくとも１個備えられ、好ましくは、２個備えられている。例えば、２個の相同組換え用ＤＮＡセグメントを、染色体上のターゲット部位の上流側と下流側のＤＮＡに相同なＤＮＡ配列とし、これらのＤＮＡセグメントの間に上述した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を連結することが好ましい。
【００７７】
相同組換えにより宿主染色体に上述した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を導入する場合、宿主染色体上のプロモーターにより制御可能に本ＤＮＡを導入することができる。この場合、目的遺伝子の導入によって、同時に、本来当該プロモーターによって制御されるべき内在性遺伝子を破壊し、この内在性遺伝子に替えて外来の上述した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を発現させることができる。特に、当該プロモーターが、宿主細胞において高発現プロモーターである場合に有用である。
【００７８】
以下、上述したＤＮＡ構築物による宿主の形質転換について説明する。一旦、ＤＮＡ構築物が構築されたら、適当な宿主細胞に、トランスフォーメーション法や、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、酢酸リチウム法、パーティクルガン法、リン酸カルシウム沈殿法、アグロバクテリウム法、ＰＥＧ法、直接マイクロインジェクション法等の各種の適切な手段のいずれかにより、これを導入することができる。ＤＮＡ構築物の導入後、その受容細胞は、選択培地で培養される。
【００７９】
ＤＮＡ構築物によって形質転換された形質転換体においては、ＤＮＡ構築物の構成成分が染色体上あるいは染色体外因子（人工染色体を含む）上に存在することになる。
所望のプロモーター下に上述した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子が導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法やサザンハイブリダイゼーション法により行うことができる。例えば、形質転換体からＤＮＡを調製し、導入部位特異的プライマーによりＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物について、電気泳動において予期されるバンドを検出することによって確認できる。あるいは蛍光色素などで標識したプライマーでＰＣＲを行うことでも確認できる。これらの方法は、当業者において周知である。
【００８０】
酵母が宿主細胞の場合、酵母遺伝子を破壊した株を用いることが出来る。例えば、遺伝子導入の際、ウラシル合成酵素遺伝子がプラスミドに有れば、ウラシル要求性株を用いて、プラスミドが導入された酵母を選抜することができる。また、プロテアーゼ欠損株を用いて、酵母細胞内での過剰発現されたタンパク質の分解を抑制することができる。これらの方法は、当業者において周知である。
【００８１】
以下、上述した形質転換体を用いて耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物の製造について説明する。ＤＮＡ構築物が導入されて得られる形質転換体を培養することにより、培養物中に外来遺伝子の発現産物である耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが生成する。培養物から耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを分離する工程を実施することにより、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物を獲得することができる。なお、本発明において培養物とは、培養細胞あるいは菌体、細胞若しくは菌体の破砕物を包括している。
【００８２】
本発明の形質転換体の培養にあたっては、形質転換体の種類に応じて培養条件を選択することができる。このような培養条件は、当業者においては周知である。
【００８３】
酵母を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化可能な炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば特に限定されず天然培地、合成培地のいずれも使用することができるが、検体微生物が微量である場合に適用可能な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物を生産するためには、合成培地を使用することが好ましい。炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコールを用いることができる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩またはその他の含窒素化合物の他、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等を用いることができる。
【００８４】
無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウムなどを用いることができる。培養は、通常、振とう培養または通気攪拌培養等の好気条件下、３０℃で２４〜７２時間行う。培養期間中、ｐＨは５．０〜７．０に保持することが好ましい。また、ｐＨの調整は、無機あるいは有機酸、アルカリ溶液等を用いて行うことができる。
【００８５】
植物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、炭素源、窒素源、無機塩類、有機物等を含有する植物細胞が培養可能な培地であれば特に限定はなく、例として一般に使用されるＭＳ培地、ＬＳ培地、Gamborg B５培地、ＷＰ培地、ホワイト培地などが挙げられる。炭素源としてはグルコース、フルクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコールが挙げられ、中でもスクロース、グルコースが好ましい。窒素源としては、硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸カルシウム等の硝酸塩、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩もしくは有機酸のアンモニウム塩またはその他の含窒素化合物の他、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、グリシン、アラニン、ヒスチジン、グルタミン、グルタミン酸、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、リジン、アスパラギン、アスパラギン酸、スレオニン、システイン、シスチン、メチオニン、セリン、オルニチン等のアミノ酸などが挙げられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウムなどが挙げられる。有機物としては、ビタミン類としては塩酸チアミン、ニコチン酸、塩酸ピリドキシン、ビオチン、葉酸、パラアミノ安息香酸などが挙げられる他、イノシトール、ココナツミルク、カゼイン加水分解物などが挙げられる。また、植物ホルモンとしてはインドール酢酸、インドール酪酸、ナフタレン酢酸、２,４-ジクロロフェノキシ酢酸等のオーキシン類、ゼアチン、６-ベンジルアデニン、カイネチン等のサイトカイニン類、アブシジン酸、ジベレリン酸などが挙げられるが、植物細胞が培養可能であればこれら植物ホルモンは含んでいても含まなくても良い。培養は通常、振とう培養または通気攪拌培養等の好気条件下、２５℃で５日〜６週間行う。
【００８６】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地またはこれらの培地にウシ胎児血清などを添加した培地を用いることができる。培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、３７℃で１〜３０日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。
【００８７】
培養終了後、培養液や培養菌体などの培養物から耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを所望の形態として得ることができる。例えば耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む調製物を得るには先に挙げた方法が利用できる。更に、先に挙げた抽出物の調製法により得られた抽出物（例えば粗抽出画分）から耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを分離精製して精製品としてもよい。
【００８８】
これらの抽出物に対して、各種クロマトグラフィー、電気泳動などにかけて精製酵素標品を得ることができる。たとえば、セファデックス、ウルトラゲルもしくはバイオゲルなどを用いるゲルろ過、イオン交換体クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲルなどを用いる電気泳動法、アフィニティクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等を用いる分画法を適宜選択し、又はこれらを組み合わせることにより、精製された目的の遺伝子産物を取得することができる。なお、精製された遺伝子産物が有するアミノ酸配列は、公知のアミノ酸分析法により行うことができる。上述した培養法、精製法は、一例であってこれに限定する趣旨ではない。
【００８９】
特に本発明においては、培養産物中に耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの大部分が不溶性となり生成され、これを加熱することにより活性を有し溶解度、純度を向上することができる。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの所望の形態（例えば調製物や精製品）を得るまでの適当な段階で加熱処理を行うことで、宿主菌により生産された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを可溶化及び活性化することができる。例えば、培養菌体破砕後に遠心分離を行い、上清、沈殿に分け、沈殿分画に対し、あるいは、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを菌体内に生産蓄積している菌体に対して加熱処理することで、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの可溶化と活性化の両方を達成することができる。この加熱処理は、好ましくは、５０℃〜１００℃、より好ましくは、７０℃〜８０℃、さらには７３℃〜７５℃で１時間程度行うのが好ましい。また、培養産物の上清分画に対しても、加熱を行うことにより、宿主由来のタンパク質を不溶化し、純度を向上することができる。培養産物の上清分画に対し、加熱は、好ましくは、５０℃〜１００℃、より好ましくは、７０℃〜８０℃、さらには７３℃〜７５℃で１時間程度行うのが好ましい。
【００９０】
本発明にかかる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物の製造では、真核細胞を宿主として耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を導入、発現させることにより、バクテリアDNAを由来とする核酸等の混入が全くない、あるいは極度に低減させた耐熱性DNAポリメラーゼ調製物の取得が可能となる。従って精製品を得る場合においても、精製工程に対して要求される、かかる核酸等の混入に関する精製精度や工程が軽減され、製造コストの低減を図ることができる。
（２）PCR法
本発明にかかる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物を用いるＰＣＲ法としては、検出対象生物を検出するための目的遺伝子の増幅のためのＰＣＲ法であれば種々のＰＣＲ法を利用できる。
【００９１】
好ましいＰＣＲ法としては、以下の方法を挙げることができる。
【００９２】
（Ａ）通常のＰＣＲ法、またはＰＣＲの変法であって、変法とは以下のａ、ｂ、ｃを単独またはＡとＢまたはＡとＣ組み合わせて用いるＰＣＲ法。
ａ．インターカレーターを用いたリアルタイムＰＣＲ法であって、以下の手順を含むＰＣＲ法。
（ａ１）ターゲットとなるＰＣＲ増幅産物のＴｍ値がプライマーダイマー自体の値より高くなるようにプライマーを設計する。
（ａ２）リアルタイムＰＣＲの蛍光検出時の温度をそれらの中間に設定する。
ｂ．試料中の標的核酸内における配列のｓｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄ増幅のための方法であって、以下の段階を含んで成るＰＣＲ法。
（ｂ１）外側のＰＣＲ用プライマーペア、およびｓｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄプライマーを含む増幅反応混合物中に前記の試料を混合する。
（ｂ２）外側の増幅配列を提供するため、段階ｂ１の増幅反応混合物を、テンプレートとなるＤＮＡ上において、外側のＰＣＲ用プライマーペアをアニールおよび伸長させ、かつｓｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄプライマーが働かない温度での増幅反応において処理する。
（ｂ３）ｓｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄされた増幅産物を提供するため、段階ｂ２の混合物を、外側のＰＣＲ用プライマーの片方とｓｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄプライマーのみがアニールする温度か、或いは伸長させる伸長時間での増幅反応において処理する。
ｃ．試料中の標的核酸内における配列のｎｅｓｔｅｄ増幅のための方法であって、以下の段階を含んで成るＰＣＲ法。
（ｃ１）外側のＰＣＲ用プライマーペア、およびｎｅｓｔｅｄプライマーペアを含む増幅反応混合物中に前記の試料を混合。
（ｃ２）外側の増幅配列を提供するため、段階（ｃ１）の増幅反応混合物を、テンプレートとなるＤＮＡ上において、外側のＰＣＲ用プライマーペアをアニールおよび伸長させ、かつｎｅｓｔｅｄプライマーペアが働かない温度での増幅反応において処理する。
（ｃ３）ｎｅｓｔｅｄされた増幅産物を提供するため、段階（ｃ２）の混合物を、ｎｅｓｔｅｄプライマーペアのみがアニールする温度か、或いは伸長させる伸長時間での増幅反応において処理する。
【００９３】
（Ｂ）定量法にかかるＰＣＲ変法としての、インターカレーターを用いたリアルタイムＰＣＲ法であって、以下の手順を含むＰＣＲ法。
（ａ１）ターゲットとなるＰＣＲ増幅産物のＴｍ値がプライマーダイマー自体の値より高くなるようにプライマーを設計する。
（ａ２）リアルタイムＰＣＲの蛍光検出時の温度をそれらの中間に設定する。
（２−３）本発明の検出法および定量法にかかるＰＣＲ変法は、試料中の標的核酸内における配列のｓｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄ増幅のための方法で、以下の段階を含んで成るＰＣＲ法である。
（ｂ１）外側のＰＣＲ用プライマーペア、およびｓｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄプライマーを含む増幅反応混合物中に前記の試料を混合し、
（ｂ２）外側の増幅配列を提供するため、段階ｂ１の増幅反応混合物を、テンプレートとなるＤＮＡ上において、外側のＰＣＲ用プライマーペアをアニールおよび伸長させ、かつｓｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄプライマーが働かない温度での増幅反応において処理する。
（ｂ３）ｓｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄされた増幅産物を提供するため、段階ｂ２の混合物を、外側のＰＣＲ用プライマーの片方とｓｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄプライマーのみがアニールする温度か、或いは伸長させる伸長時間での増幅反応において処理する。
（Ｃ）検出法および定量法としてのＰＣＲ変法としての、試料中の標的核酸内における配列のｎｅｓｔｅｄ増幅のための方法で、以下の段階を含んで成るＰＣＲ法。
（ｃ１）外側のＰＣＲ用プライマーペア、およびｎｅｓｔｅｄプライマーペアを含む増幅反応混合物中に前記の試料を混合する。
（ｃ２）外側の増幅配列を提供するため、段階ｃ１の増幅反応混合物を、テンプレートとなるＤＮＡ上において、外側のＰＣＲ用プライマーペアをアニールおよび伸長させ、かつ干渉プライマーペアの阻害作用でｎｅｓｔｅｄプライマーペアが働かない温度での増幅反応において処理する。
（ｃ３）ｎｅｓｔｅｄされた増幅産物を提供するため、段階ｃ２の混合物を、ｎｅｓｔｅｄプライマーペアのみがアニールする温度か、或いは伸長させる伸長時間での増幅反応において処理する。
【００９４】
本発明にかかる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物に組み合わせると有用なＰＣＲ変法の一つは、masked Primer Dimer法（Ａ法）である。masked Primer
Dimer法は、従来のプライマーダイマーの形成抑制方法とは異なり、プライマーダイマーのみを非表示とする手法である。その手法とは、「プライマーダイマーは増幅産物として小さいが故に、そのＴｍ値が低い傾向にある」ことを考慮し、
（ａ１）ターゲットとなるＰＣＲ増幅産物のＴｍ値が、プライマーダイマーのＴｍ値より高値になるようにプライマーを設計する。
（ａ２）リアルタイムＰＣＲの蛍光検出時の温度をそれらの中間値に設定する。
との手順でインターカレーターを用いたリアルタイムＰＣＲを行う方法である。
【００９５】
以上の手順を踏むことにより、プライマーダイマーのみが二本鎖から一本鎖に解離するため、インターカレーターが結合できない。その結果、プライマーダイマーが蛍光発光せず、モニター上はプライマーダイマーのみ非表示となり、目的の増幅産物は正常に増幅曲線を描くことになる。
【００９６】
Ａ法に用いるプライマーの設計は、ターゲットとなるＰＣＲ増幅産物のＴｍ値がプライマーダイマー自体の値より高くなるようにすれば、特に限定されないが、具体的には、ターゲットとなるＰＣＲ増幅産物のＴｍ値をプライマーダイマー自体のＴｍ値の５℃以上、好適には１０℃以上にプライマーの設計を行えばよい。Ａ法において、リアルタイムＰＣＲの蛍光検出時の温度は、ターゲットとなるＰＣＲ増幅産物のＴｍ値とプライマーダイマーのＴｍ値の中間値に設定すればよいが、中間値は、増幅産物とプライマーダイマーのＴｍ値差の程度に応じて、中間値の前後、例えば、前後１〜４℃程度の幅を持たせることができる。但し、蛍光検出温度は上記の範囲で出来るだけ低い温度の方が好ましい。
【００９７】
インターカレーターを用いたリアルタイムＰＣＲは、装置、手法など通常知られたものを使用すればよく、例えば、インターカレーターとして、サイバーグリーン（SYBR Green I 
）などの蛍光色素を利用したリアルタイムＰＣＲが挙げられる。
【００９８】
本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物に組み合わせると有用なＰＣＲ変法の別の一つは、入れ子増幅法の応用、或いはＰＣＲ伸長時間の工夫である。入れ子増幅法を応用するか或いはＰＣＲ伸長時間を工夫することにより、通常のnested PCR法の様に2回のPCRを分けて行うこと無く、１回のみのPCRでnested PCRが行える（One
Step nested PCR）。このOne Step nested PCR法では、簡単な設計による“nestedプライマー”を加えれば直ぐに施行できるため、誰でも簡単に実施できる。
【００９９】
One Step nested PCR法は、以下のＢ法またはＣ法のＰＣＲ変法である。
Ｂ法：試料中の標的核酸内における配列のsemi-nested増幅のための方法で、以下の段階を含んで成るPCR変法。
(b1)外側のPCR用プライマーペア、およびsemi-nestedプライマーを含む増幅反応混合物中に試料を混合し、
(b2)外側の増幅配列を提供するため、段階b1の増幅反応混合物を、テンプレートとなるDNA上において、外側のPCR用プライマーペアをアニールおよび伸長させ、かつsemi-nestedプライマーがアニールしない温度での増幅反応において処理する。
(b3)semi-nestedされた増幅産物を提供するため、段階b2の混合物を、外側のPCR用プライマーの両方とsemi-nestedプライマーとがアニールするが、nestedされた内側のＰＣＲ増幅産物のみがdenatureする温度での増幅反応において処理する。或いはnestedされた内側のＰＣＲ増幅産物のみが伸長できる伸長時間の増幅反応において処理する。
Ｂ法において、増幅反応混合物は、３種類のプライマーから成る。すなわち、第１のプライマーは外側のＰＣＲ用プライマーペアの一方で、第２のプライマーはsemi-nestedプライマーであり、第３のプライマーは外側のＰＣＲ用プライマーペアのもう一方で、かつsemi-nestedプライマーともペアとなるものである。
【０１００】
Ｂ法において、段階b2にて、外側のPCR用プライマーペアのみをアニールおよび伸長させ、かつsemi-nestedプライマーがアニールしない温度が必要である。また、段階b3にて、外側のPCR増幅産物がdenatureせず、内側のnested PCR増幅産物のみがdenatureして伸長するための温度を提供することが必要である。或いは、段階b3にて、外側のPCR増幅産物が伸長できず、内側のnested PCR増幅産物のみが伸長できる伸長時間を提供することが必要である。Ｂ法において、semi-nestedプライマーペアをアニールさせるため温度は、外側のPCR用プライマーペアをアニールさせるための適切な温度よりも５℃〜２０℃低いことが好ましい。 
Ｂ法の段階a1において、プライマーが一定の温度で増幅反応混合物中に存在していることが好ましい。
【０１０１】
Ｂ法において、第１のプライマーと第３のプライマーのTm値は同じであることが好ましい。Ｂ法において、第２のプライマーは、第１、３いずれかのプライマーとsemi-nestedとなるように内側に設定され、第２のプライマーのTm値は第１、３のプライマーのTm値よりも５〜２０℃低いことが好ましい。Ｂ法において、外側の増幅産物はnestedされた内側の増幅産物よりも十分（３００ｂｐ程度以上）大きいことが好ましい。
【０１０２】
Ｃ法：試料中の標的核酸内における配列のnested増幅のための方法で、以下の段階を含んで成るPCR変法。
（c1）外側のPCR用プライマーペア、およびnestedプライマーペアを含む増幅反応混合物中に試料を混合する。
（c2）外側の増幅配列を提供するため、段階c1の増幅反応混合物を、テンプレートとなるDNA上において、外側のPCR用プライマーペアをアニールおよび伸長させ、かつnestedプライマーペアがアニールしない温度での増幅反応において処理する。
（c3）nestedされた増幅産物を提供するため、段階c2の混合物を、nested された内側のPCR増幅産物のみがdenatureする温度での増幅反応において処理する。或いはnestedされた内側のPCR増幅産物のみが伸長できる伸長時間での増幅反応において処理する。
【０１０３】
Ｃ法において、増幅反応混合物が４種類のプライマーから成る。すなわち、第４、第５のプライマーは外側のＰＣＲ用プライマーペアであり、第６、第７のプライマーはnestedプライマーペアである。Ｃ法において、段階c2にて、外側のPCR用プライマーペアのみアニールおよび伸長させ、nestedプライマーペアが働かない温度が必要である。また、段階c3にて、外側のＰＣＲ増幅産物がdenatureせず、内側のnested PCR産物のみがdenatureして伸長するための温度を提供することが必要である。或いは、段階c3にて、外側のＰＣＲ増幅産物が伸長できず、内側のnested PCR産物のみが伸長できる伸長時間を提供することが必要である。
【０１０４】
Ｃ法において、nestedプライマーペアをアニールさせるための温度が、外側のPCR用プライマーペアをアニールさせるための適切な温度よりも５℃〜２０℃低いことが好ましい。
【０１０５】
Ｃ法において、段階c1にて、第４〜７のプライマーが一定の温度で増幅反応混合物中に存在していることが好ましい。Ｃ法において、第４、第５のプライマーより第６、第７のプライマーのTm値が５℃〜２０℃低いことが好ましい。Ｃ法において、第４、第５のそれぞれのプライマーのTm値は同じであることが好ましい。Ｃ法において、第６、第７のそれぞれのプライマーのTm値は同じであることが好ましい。Ｃ法において、外側の増幅産物はnestedされた内側の増幅産物よりも十分（３００ｂｐ程度以上）大きいことが好ましい。
【０１０６】
＜masked Primer Dimer法＞ 
以下に示す通常のＰＣＲ条件設定では、蛍光検出ポイントは伸長反応(extension)後の７２℃に設定されている。
・Target Temperature:９４℃、５５℃、７２℃
・Incubation Time: 10秒
・Temperature Transition Rate: 20.00 [℃／ｓ]
・Cycle Number: 60
すると、図１３に示す増幅曲線のように、蒸留水（distilled water：D.W.)でプライマーダイマー（ｐｄ）が検出されてしまう。この時、例えばE.Coli検出時の融解曲線(melting curve)を見ると、プライマーダイマーのTm値は７６℃前後、目的（E. coli）のＰＣＲ増幅産物のＴｍ値は９１℃前後である（図１４）。
【０１０７】
そこで、目的のＰＣＲ産物のＴｍ値をプライマーダイマーのＴｍ値より１０℃程高くなるようにプライマーを意図的に設計し、蛍光検出ポイント（ＦＤＰ）をその中間値前後（例えば以下の条件のように８６℃）に設定する（図１０：伸長後でなくとも何処でも良い）。
・Target Temperature:９４℃、５５℃、７２℃、８６℃
・Incubation Time:10秒（９４℃、５５℃、７２℃）；１秒（８６℃）
・Temperature Transition Rate: 20.00 [℃／ｓ]
・Cycle Number: 60
すると、プライマーダイマーが全く検出されない。つまり、プライマーダイマーは非表示となるため、本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物と組み合わせると、図１５（Ａ）のように蒸留水（Ｄ.Ｗ.）で全く増幅しない増幅曲線を得ることが出来る。
【０１０８】
この「非表示法＋本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物＋バクテリアのユニバーサルプライマー」の組合せにより、バクテリアを検出限界まで測定することが可能となり（図１４）、更に検量線が検出限界まで直線性を示すことから、検出限界まで正確に定量出来ることが示された。つまり、本発明法にmasked Primer Dimer法を加えることにより、インターカレーターを用いたリアルタイムＰＣＲ法にて、高感度で正確な細菌の定量測定が初めて可能となる。
【０１０９】
＜One Step nested PCR法＞
以下の様なプライマーを設計する（図１１（Ａ）参照）。
（a）外側のPCR産物（増幅産物I）の、ForwardおよびReverseプライマーのそれぞれのTm値は同じ、或いは近いものとする。
（b）外側のPCR産物のどちらか片方のプライマーとsemi-nestedとなるようなプライマー（プライマーII）を内側に設定する。
（c）semi-nestedプライマーは、外側のPCR産物のプライマーのTm値より５〜２０℃低いTm値となるように設計する。
（d）外側のＰＣＲ産物（増幅産物I）のTm値が８９℃以上となるように、増幅産物Ｉが４００ｂｐ程度以上となるプライマーを設計する。
（e）semi-nested PCR産物（増幅産物II）のTm値が８６℃〜８７℃となるように、増幅産物IIが１００ｂｐ程度となるプライマーを設計する。
【０１１０】
より特異度の高いnested PCRを行う場合、以下の様な新たなプライマーを設計する（図１１（Ｂ）参照）。
（a）外側のPCR産物（増幅産物I）の、ForwardおよびReverseプライマーのそれぞれのTm 値は同じ、或いは近いものとする。
（b）増幅産物IのプライマーのTm値と比較し、nestedとなる２つのプライマー（プライマーII）のTm値は十分（5〜20℃）低く設定する。
（c）増幅産物IのTm値が８９℃以上となるように、増幅産物Iが５００ｂｐ程度以上となるプライマーを設計する。
（d）増幅産物IIのTm値が８６℃〜８７℃となるように、増幅産物IIが１００ｂｐ程度となるプライマーを設計する。
（e）増幅産物III、IVそれぞれのTm値が８９℃以上となるように、増幅産物III、IVそれぞれが３００ｂｐ程度以上となるプライマーを設計する。
【０１１１】
（３）検出対象生物の検出方法
（検出方法）
本発明にかかる検体中の検出対象生物を検出する方法は、
以下の工程：
（１）前記検体から調製した核酸と、前記検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマーと、本発明にかかる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物と、を用いて核酸増幅反応を行う増幅工程と、
（２）前記増幅工程における増幅産物中の前記目的遺伝子の増幅産物を検出する検出工程と、
を有することを特徴とする。
【０１１２】
この検出方法では、増幅工程を、目的遺伝子以外の目的外遺伝子の増幅抑制下で行うことが好ましい。この目的外遺伝子の増幅抑制には抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体を用いるホットスタート法が好適に利用できる。その際、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ１Ｕに対して、過剰量の抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体を用いることが好ましい。
【０１１３】
検出工程は、前記目的遺伝子の増幅産物を検出可能とし、それ以外の目的外遺伝子の増幅産物は非検出として行うことができる。そのための方法としては、目的遺伝子の増幅産物を検出可能とし、それ以外の目的外遺伝子の増幅産物を非検出とする条件を、
（１）目的遺伝子増幅産物の融解温度（ＴｍＡ）が、目的外遺伝子の増幅産物の融解温度（ＴｍＢ）よりも高くなるように前記プライマーを設計し、
（２）増幅産物の検出を、ＴｍＡとＴｍＢとの間の温度で行う
ことにより設定し、目的遺伝子の増幅産物のみを検出する方法が好ましい。
【０１１４】
更に、増幅工程と検出工程を、増幅産物の量を表示する表示装置を用いるリアルタイムＰＣＲにより行い、目的外遺伝子の増幅産物が前記表示装置において非表示となる方法を用いることができる。
【０１１５】
増幅産物の検出には、検出用の標識を有するインターカレーターを用いることができる。
【０１１６】
検出工程は、増幅産物をゲル上で展開することにより行うことができる。増幅産物はゲル電気泳動により展開し可視化することができる。
【０１１７】
検出対象生物としては、細菌、真菌、ウイルスから選ばれる１種または２種以上を挙げることができる。
【０１１８】
本発明の検出方法によれば、検体中の感染症原因菌の高感度検出を達成することが可能となる。更に、本発明の検出方法は、血液、髄液、羊水、尿、食品（食品加工環境の汚染検査も含む）、飲料、化粧品、水質検査、生物実験環境のコンタミネーション検査に供される検体から選択される無菌環境であるべき検体である場合に好適に適用可能である。水質検査に供される検体としては、上水道水、貯水または給水タンク由来水、空調循環水、加湿器水、温泉水又はプール水を挙げることができる。
【０１１９】
検出工程において、目的遺伝子の増幅産物を定量し、その定量結果を利用することにより、検体中の検出対象生物の定量、個体数の測定、存在量の把握、定量同定などを行うことができる。以下、検体中の検出対象生物の定量方法について説明する。
【０１２０】
（定量方法）
本発明にかかる検体中の検出対象生物を定量する方法は以下の工程：
（１）検体から調製したＤＮＡと、検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマーと、本発明にかかる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物と、を用いて核酸増幅反応を行う増幅工程と、
（２）前記増幅工程における増幅産物を定量し、得られた定量結果から前記検体中の検出対象生物を定量する定量工程と、
を有する。
【０１２１】
検出対象生物としては、情報伝達のための核酸を有するものであれば良く、例えば細菌（真正細菌、古細菌）、真菌、ウイルスなどを挙げることができる。本発明にかかる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物を用いた本発明の定量方法は、特に細菌の定量に好適である。定量は、増幅産物の検出結果を、標準の生物を用いた結果とを対比することで行うことができる。本発明の定量方法によれは、検体中の検出対象生物の個体数や全体として質量を定量することが可能である。更に、目的遺伝子として検出対象生物の同定用遺伝子を選択することにより、目的遺伝子の増幅産物の定量結果から検体中に含まれる検出対象生物を定量かつ同定することができる。
【０１２２】
検体からの核酸としては、検体から得られたＤＮＡ、更には検体から得られたＲＮＡに基づいて調製されたｃＤＮＡが利用できる。また、目的に応じてＲＮＡを直接増幅対象としてもよい。
【０１２３】
検体としては無菌環境であるべき検体が挙げられる。この無菌環境であるべき検体としては、血液、髄液、羊水または尿などの、ヒトや家畜の生体からサンプリングした試料を挙げることができる。更に、検体として水質検査に供される検体が利用できる。この水質検査に供される検体としては、上水道水、貯水または給水タンク由来水、空調循環水、加湿器水、温泉水又はプール水を挙げることができる。更に、食品、飲料または化粧品、生物系実験環境での細胞培養液など有機物を含み、細菌や真菌の混入や増殖が品質の劣化に繋がるものも検体として利用できる。
【０１２４】
検体からのＤＮＡの調製は、定法により行うことができ、増幅工程に供する際には、必要に応じてＤＮＡ以外の成分の除去や、ＤＮＡ濃度の調整を行うことができる。
【０１２５】
増幅工程には、ＰＣＲ、なかでもリアルタイムＰＣＲが好適に適用できる。増幅産物の検出には、種々の公知の方法が利用できる。例えば、標識機能を有するインターカレーターを用いる方法や、増幅するＤＮＡ配列に対し特異的にハイブリダイズするヌクレオチドに蛍光物質を結合したプローブを用いる方法などが挙げられる。インターカレーターとしては、エジチジウムブロマイド、サイバー・グリーンＩ（ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ）などが挙げられる。好ましいインターカレーターは、サイバー・グリーンＩである。尚、全てのバクテリアＤＮＡに反応するユニバーサルプライマーを用いる場合は、使用すべきサイバー・グリーンＩは、組換え宿主由来のバクテリアＤＮＡ混入を最小限に抑えた高純度のサイバーグリーンＩを使用することが好ましい。
【０１２６】
この方法における増幅工程は、目的遺伝子以外の目的外遺伝子の増幅を抑制した条件下で行われることが好ましい。この目的外遺伝子の増幅抑制には、例えば、ホットスタート法、修飾プライマーを使用する方法、プライマーダイマーに結合する物質をサンプルに添加する方法、化学物質を耐熱性DNAポリメラーゼが含まれる遺伝子増幅溶液中に添加する方法などが挙げられ、中でもホットスタート法が好ましい。ホットスタート法としては、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体を用いる方法、ｗａｘの融解温度まで酵素とプライマーを分離しておくｗａｘ法などが挙げられる。抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体を用いる方法を行う場合には、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体を、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性が１００％阻害される量以上の過剰量を用いることが好ましい。
【０１２７】
（非表示法）
更に、増幅産物の定量を非表示法により行うことにより、簡便かつ高感度での定量が可能となる。この非表示法は、目的遺伝子の増幅産物を検出可能状態とし、それ以外の目的外遺伝子の増幅産物は非検出状態とする条件下で、増幅産物の検出を行う方法である。
【０１２８】
具体的には、目的遺伝子の増幅産物の検出が可能であり、それ以外の目的外遺伝子の増幅産物の非検出となる条件を、
（１）前記目的遺伝子増幅産物の融解温度（ＴｍＡ）が、前記目的外遺伝子の増幅産物の融解温度（ＴｍＢ）よりも高くなるように前記プライマーを設計し、
（２）前記増幅産物の定量を、ＴｍＡとＴｍＢとの間の温度で行う
ことにより設定する。
【０１２９】
この非表示法は、目的遺伝子の増幅と増幅産物の定量を、増幅産物の量を表示する表示装置を用いるリアルタイムＰＣＲ法に好適に適用できる。この装置を用いる場合には、増幅産物の定量分析時において目的外遺伝子の増幅産物が表示装置において非表示となり、目的外遺伝子の増幅産物による感度への影響を排除することができる。
【０１３０】
目的外遺伝子として特に問題となるのは、プライマーダイマーである。検体から調製されたＤＮＡの量が微量である場合においては、増幅の初期においてはプライマーが検体から調製されたＤＮＡに対して過剰に存在し、プライマーダイマーが形成されていると、これをベースとした増幅産物が形成され、本来検出されるべきＤＮＡの増幅産物をモニターできなくなったり、定量することが不可能となる。かかる、プライマーダイマーの発生に対しては、ホットスタート法及び／または非表示法の利用が好ましい。
【０１３１】
プライマーダイマー（primer
dimer）の形成を完全に阻害することは非常に難しく、各種プライマーダイマー形成抑制方法を用いてもＰＣＲサイクル数の増加に応じてプライマーダイマーが検出されてしまう場合がある。その結果、リアルタイムＰＣＲによる定量測定の感度低下の要因となっている。また、定性検査においても測定毎にＴｍ値（融解温度：melting temperature)をチェックしてプライマーダイマーによる「偽陽性」を除外する手法をとることが必要となる場合がある。
【０１３２】
非表示法は、従来のプライマーダイマーの形成抑制方法とは異なり、プライマーダイマーのみを非表示とする手法（masked Primer Dimer法）であり、「プライマーダイマーは増幅産物として小さいが故に、そのＴｍ値が低い傾向にある」ことを考慮してなされたものである。
【０１３３】
リアルタイムＰＣＲによってmasked Primer Dimer法を行うには、以下の条件を設定する。
（１）ターゲットとなるＰＣＲ増幅産物のＴｍ値が、プライマーダイマーのＴｍ値より高値になるようにプライマーを設計する。
（２）リアルタイムＰＣＲの増幅産物検出時の温度をそれらの中間値に設定する。
【０１３４】
以上の条件設定により、増幅産物検出時において、プライマーダイマーのみが二本鎖から一本鎖に解離する。増幅産物（二本鎖ＤＮＡ）の検出時において、一本鎖ＤＮＡは検出せず、二本鎖ＤＮＡのみを検出する標識、例えば、インターカレーターを用いることにより、プライマーダイマーのみが二本鎖から一本鎖に解離しているので、インターカレーターは結合できない。その結果、プライマーダイマーに基づく検出信号は発生せず、表示装置（モニター）上はプライマーダイマーのみ非表示となり、目的の増幅産物は正常に増幅曲線を描くことになる。
【０１３５】
この非表示法を用いる場合におけるプライマーの設計は、ターゲットとなるＰＣＲ増幅産物のＴｍ値がプライマーダイマー自体の値より高くなるようにすれば、特に限定されないが、ターゲットとなるＰＣＲ増幅産物のＴｍ値をプライマーダイマー自体のＴｍ値の５℃以上、好適には１０℃以上にプライマーの設計を行えばよい。なお、増幅産物のＴｍ値は、測定系に応じて設定する。
具体的には、
（１）既存の設計方法でプライマーダイマーが生じ難いプライマーを設計する。
（２）プライマー自体のTm値を60℃以下になるように設計する。
（３）最近接塩基法で計算することにより、ターゲットとなるPCR増幅産物のTm値が87℃程度かそれ以上になるように設計する。
【０１３６】
これらプライマーを用いて増幅される増幅産物の大きさは、プライマーダイマー自体のTm値より高くなるよう設計された大きさであれば特に限定されないが、リアルタイムPCRでの増幅に好適な50bp〜1000bp、好ましくは50bp〜500bp程度になるようプライマー設計することが好ましい。
【０１３７】
リアルタイムＰＣＲの蛍光検出時の温度は、ターゲットとなるＰＣＲ増幅産物のＴｍ値とプライマーダイマーのＴｍ値の中間値に設定すればよいが、中間値は、増幅産物とプライマーダイマーのＴｍ値差の程度に応じて、中間値の前後、例えば、前後１〜４℃程度の幅を持たせることができる。但し、二本鎖ＤＮＡの安定性を考慮すると、蛍光検出時の温度はなるべく低めに設定する方が好ましい。
【０１３８】
インターカレーターを用いたリアルタイムＰＣＲは、装置、手法など通常知られたものを使用すればよく、例えば、インターカレーターとして、サイバーグリーン（SYBR Green I）を利用したリアルタイムＰＣＲが挙げられる。
【０１３９】
masked Primer Dimer法によれば、プライマーダイマー形成は、インターカレーターを用いたリアルタイムＰＣＲ法の阻害要因でなくなり、感度を下げることなく定量検査が出来、定性検査でのプライマーダイマーによる偽陽性のリスクも無くなる。しかも、本発明方法は、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体を用いるホットスタート法など従来法に比して簡便かつ経済的である。
【０１４０】
この非表示法により、検出限界までの測定が可能となり、更に検量線が検出限界まで直線性を示すことから、リアルタイムＰＣＲ法にて、高感度で正確な定量測定が可能となる。
【０１４１】
（増幅産物からの検出対象生物のＰＣＲ法における定量）
増幅産物の量から検出対象生物の量（存在しない場合も含む）の判定には、増幅を行った際の条件（プロトコール）での既知の検出対象生物量から求めた検量線に基づいて行う方法が好適に利用できる。例えば、ある特定のプロトコールで描いた検量線で、検出限界（感度）が0.1 CFU/mlで３５サイクルであれば、３５サイクルのＰＣＲ反応を行って、検量線で示される基準に基づいて検出対象生物の量を算出することができる。なお、プロトコール中に検体の濃縮ステップを加えたり、エタノール沈殿処理を加えたりすれば、検出限界（感度）を更にあげることができる（例えば６０サイクル位まで）。そうすると、感度も例えば0.000001CFU/mlと非常に高く設定可能となる。また、設定できる検出感度は予め算出しておくことが可能である。例えば、「検出対象の高感度定量方法」による生活用水の定量では、細菌のユニバーサルプライマーのPCR検出感度が10 fg/μl, 真菌のユニバーサルプライマーのPCR検出感度が10 pg/μlであるので、CFU/mlとの換算式を用い、更に最初に検体50mlをペレット化してDNA抽出することを加味すると、
細菌：3.0×10‐1  CFU/ml
真菌：2.8 CFU/ml
となる。なお、プロトコールを変えることで、検出感度を変えることも可能である。
【０１４２】
（増幅産物からの検出対象生物のゲル展開法における定量）
増幅産物（ホットスタート法を用いる場合も含む）をアガロースゲルなどで展開して、その量を蛍光検出における蛍光強度などによって、検出対象生物の定量を簡便に行うことも可能である。
【０１４３】
（細菌の存在の有無を判定する方法）
本発明にかかる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、以下の方法にも好適に用いることができる。
（Ｉ）検体中の細菌の存在の有無を判定する方法において、
以下の工程：
（１）前記細菌に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマー（Ｂ）と、真核細胞を宿主として製造した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む調製物と、を用いて核酸増殖反応を行う第一の増幅工程と、
（２）前記第一の増幅工程における増幅産物を可視化する工程と、
を有し、
前記プライマー（Ｂ）が、
（Ｂ）全ての細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の複数領域を増幅できるプライマーセット、および各プライマー塩基配列の全部または１/３以上を含むプライマー
であることを特徴とする検体中の細菌の存在有無を判定する方法。
【０１４４】
前記増幅産物を可視化する方法としてはゲル電気泳動を用いることができる。
【０１４５】
（ＩＩ）検体中の細菌の存在量を把握する方法において、
以下の工程：
（１）前記細菌に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマー（Ｂ）と、真核細胞を宿主として製造した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む調製物と、を用いて核酸増殖反応を行う第一の増幅工程と、
（２）前記第一の増幅工程における増幅産物を数値化する工程と、
を有し、
前記プライマー（Ｂ）が、
（Ｂ）全ての細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の複数領域を増幅できるプライマーセット、および各プライマー塩基配列の全部または１/３以上を含むプライマー
であることを特徴とする検体中の細菌の存在量を把握する方法。
【０１４６】
前記増幅産物を数値化する方法として吸光度測定法またはデンシドメトリー法を用いることができる。
【０１４７】
（定量同定方法）
上記の検体中の検出対象生物の定量方法は、以下の検出対象生物の定量かつ同定を行う方法に好適に適用できる。
（Ａ）以下の工程：
（１）前記検体から調製したＤＮＡと、前記検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマー（Ｂ）および（Ｍ）と、本発明にかかる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物と、を用いて核酸増幅反応を行う第一の増幅工程と、
（２）前記第一の増幅工程における複数（３〜１０）の増幅産物の融解温度（Ｔｍ値）の組合せを前記目的遺伝子の増幅産物に特異的な融解温度（Ｔｍ値）の組合せに基づいて解析し、前記検体中の検出対象生物の定量同定を行う第一の定量同定工程と、
（３）前記検体から調製したＤＮＡと、前記検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマー（Ｆ）と、細菌を宿主として製造した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物と、を用いて核酸増幅反応を行う第二の増幅工程と、
（４）前記第二の増幅工程における複数（３〜１０）の増幅産物の融解温度（Ｔｍ値）の組合せを前記目的遺伝子の増幅産物に特異的な融解温度（Ｔｍ値）の組合せに基づいて解析し、前記検出対象生物を定量同定する第一の定量同定工程前記第二の増幅工程における増幅産物を定量し、得られた定量結果から前記検体中の検出対象生物の定量同定を行う第二の定量同定工程と、
を有し、
前記プライマー（Ｂ）、（Ｆ）及び（Ｍ）が、
（Ｂ）全ての細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の複数領域を増幅できるプライマーセット、および各プライマー塩基配列の全部または１／３以上を含むプライマー、
（Ｆ）全ての真菌の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の複数領域を増幅できるプライマーセット、および各プライマー塩基配列の全部または１／３以上を含むプライマー、
（Ｍ）メチリシン耐性を示すｍｅｃＡ遺伝子など、その時々の流行に応じた抗生剤耐性遺伝子を特異的に増幅するプライマーセット、
であることを特徴とする検体中の検出対象生物の定量同定方法。
【０１４８】
（Ｂ）以下の工程：
（１）前記検体から調製したＤＮＡと、前記検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマー（Ｂ）と、本発明にかかる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物と、を用いて核酸増幅反応を行う第一の増幅工程と、
（２）前記第一の増幅工程における複数（３〜１０）の増幅産物の融解温度（Ｔｍ値）の組合せを前記目的遺伝子の増幅産物に特異的な融解温度（Ｔｍ値）の組合せに基づいて解析し、前記検体中の検出対象生物の定量同定を行う第一の定量同定工程と、
（３）前記検体から調製したＤＮＡと、前記検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマー（Ｆ）と、細菌を宿主として製造した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物と、を用いて核酸増幅反応を行う第二の増幅工程と、
（４）前記第二の増幅工程における複数（３〜１０）の増幅産物の融解温度（Ｔｍ値）の組合せを前記目的遺伝子の増幅産物に特異的な融解温度（Ｔｍ値）の組合せに基づいて解析し、前記検出対象生物を定量同定する第一の定量同定工程および前記第二の増幅工程における増幅産物を定量し、得られた定量結果から前記検体中の検出対象生物の定量同定を行う第二の定量同定工程と、
（５）前記検体から調製したＤＮＡと、前記検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマー（Ｍ）と、本発明にかかる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物と、を用いて核酸増幅反応を行う第三の増幅工程と、
（６）前記第三の増幅工程における増幅産物の融解温度（Ｔｍ値）を前記目的遺伝子の増幅産物に特異的な融解温度（Ｔｍ値）に基づいて解析し、前記検体中の検出対象生物の定量同定を行う第三の定量同定工程と、
を有し、
前記プライマー（Ｂ）、（Ｆ）及び（Ｍ）が、
（Ｂ）全ての細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の複数領域を増幅できるプライマーセット、各プライマーごとに、は塩基配列の全部またはその１／３以上を含むプライマーから選択でき、
（Ｆ）全ての真菌の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の複数領域を増幅できるプライマーセット、各プライマーごとに、塩基配列の全部またはその１／３以上を含むプライマーから選択でき、
（Ｍ）メチリシン耐性を示すｍｅｃＡ遺伝子など、その時々の流行に応じた抗生剤耐性遺伝子を特異的に増幅するプライマーセット、
であることを特徴とする検体中の検出対象生物の定量同定方法。
【０１４９】
なお、本願発明において、各プライマーセットを構成するプライマーの一部を含むものとしては、ユニバーサルプライマーとしての機能（特定共通領域を認識するという機能）が損なわれなければよく、例えばユニバーサルプライマーとして設計された塩基配列に対して１〜３塩基を削除または追加して得られるものを挙げることができる。
【０１５０】
細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の増幅領域としては３〜１０の増幅領域を設定することが好ましい。また、真菌の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の増幅領域としては３〜１０を設定することが好ましい。
【０１５１】
更に、“全ての細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の複数領域を増幅できるプライマーセット、および各プライマー塩基配列の全部または１／３以上を含むプライマーセット”のいずれか１つを用いて標準Ｔｍ値を毎回測定することにより、前記増幅産物のＴｍ値の測定誤差を補正する工程を付加することにより、より精度の高い測定を行うことができる。
【０１５２】
また、検出対象生物を同定するためのアルゴリズムとしては、上述したＴｍ値そのものの組合せだけでなく、各Ｔｍ値間の差の組合せを利用して同定することで、測定誤差の影響を最小限とする工程を付加することができる。
【０１５３】
また、上記の“標準Ｔｍ値を毎回測定する”必要がなく、機器の試行回毎の測定誤差を補正する方法として、“Ｔｍ値の組合せの平均値を算出し、その平均値からの各Ｔｍ値の相対値の組合せ”を利用することが出来る。つまり、Ｔｍ値の組合せの配置を“形”として同定する方法である。Ｔｍ値の組合せの配置を２次元で示した“形”は測定誤差に影響されない。例えば、検出対象生物に特異的なＴｍ値の組合せ（ｎ個）をＴ１db〜Ｔｎdbとし（dbはdatabase）、その平均値からの相対値をそれぞれｄ１db〜ｄｎdbとする（図１１（Ｃ）：ｎが１〜５の例）。同様に検体から得られた未知の検出対象生物のＴｍ値の組合せ（ｎ個）をＴ１ref〜Ｔｎrefとし（refはreference）、その平均値からの相対値をそれぞれｄ１ref〜ｄｎrefとする（図１１（Ｃ））。そうしてdatabaseと比較し、「相対値の組合せが近似したもの＝Ｔｍ値の組合せの配置の“形”が近いもの」、を同定アルゴリズムとして利用する。
従って、以下の計算式：
【０１５４】
【数１】
0005583602.tif 000002
が０に最も近いものが、求める検出対象生物として同定できる。
以上のアルゴリズムは、コンピュータ上でデータベース型同定ソフトウェアとして利用できる。
【０１５５】
上記の方法（Ａ）及び（Ｂ）は、本発明の耐熱性DNAポリメラーゼ調製物を利用して成し得た定量化技術に、最近接塩基法の「融解温度（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：Ｔｍ値）は塩基配列で決まる」という理論的根拠を元に、菌種毎のＴｍ値の違いを検出対象生物の同定に応用することについて鋭意研究した結果（WO2007/097323）を応用することで初めて完成されるに至ったものである。
【０１５６】
以下、具体的にこれらの方法について説明する。
（１）細菌の１６ＳｒＲＮＡは、ほぼ全ての細菌に共通の塩基配列領域（２０〜４０塩基）を７〜１０ヶ所もつことが知られている。
【０１５７】
その全て或いは一部の箇所にフォワードとリバースのプライマーをそれぞれ設定することにより、３〜１０の遺伝子増幅領域を作製する。
（２）遺伝子増幅領域は、約１５０〜２００塩基であり、プライマーを設定した共通保存領域以外は、それぞれの細菌に固有の塩基配列を持つ。
【０１５８】
従って、Ｔｍ値も塩基配列の違いを反映して固有の値を示し、細菌毎に１〜１０種類の特徴的なＴｍ値を持つことが推定される。それ故、細菌の種類に応じた１〜１０のＴｍ値を調べ、データベース化する。このデータベースを利用して未知の細菌を同定することができる。
【０１５９】
（３）さらに、真菌に固有のプライマーを３〜１０、メチシリン耐性を示すｍｅｃＡ遺伝子など、その時の流行に応じた抗生剤耐性遺伝子のプライマーを併用することで、未知の起因菌に対し、細菌感染とその種類（抗生剤耐性遺伝子の有無を含む）、或いは真菌感染とその種類を同定出来る。
（４）非特異的な遺伝子産物が生じ、目的のＴｍ値に近い値を示す場合、偽陽性のリスクが生じる。
【０１６０】
そのような場合、遺伝子増幅後の増幅産物をアガロース・ゲルに流してバンドの大きさを確認することで、結果を二重にチェックすることが出来る。
【０１６１】
すなわち、従来の遺伝子増幅による検出法で二重チェックするシステムを採用することで検査精度の向上が図れる。
【０１６２】
または、「masked Primer Dimer法などプライマーダイマーの解決法＋本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物＋バクテリアのユニバーサルプライマー」の組合せにより、非特異的増幅産物による偽陽性のリスクをほぼ完全に無くすことが出来る。
【０１６３】
（５）遺伝子増幅方法としてリアルタイムＰＣＲを採用した場合、その定量性を利用して、菌量を治療前後で相対定量することで、治療効果のモニタリングの向上を図ることが出来る。
【０１６４】
（６）リアルタイムＰＣＲ機器には、ヒートブロックで温度制御するブロック型と、空気を介して温度制御するエアバス型の２種類あり、ヒートブロック型では試行回毎に±０．１〜０．３℃（メーカーで異なる）のＴｍ値測定誤差が生じる（同じ試行回ではサンプル間誤差は±０．２℃程）。この測定誤差で菌種同定が妨げられないように、同じ試行回の各Ｔｍ値間の差異パターンを判定に利用する方法を採用することが好ましい。一方、エアバス型のRotor gene6000（キアゲン社）ではチューブ間の温度均一性が±０．０１℃であり、Ｔｍ値測定誤差が生じにくく、好ましい。
【０１６５】
（７）複数菌の感染の場合、リアルタイムＰＣＲにて増幅曲線が立ち上がった後、plateauに達した時点で増幅サイクルをストップし、引き続きＴｍ値の解析を行えば、“最も感染量の多い（恐らく主要な感染微生物と考えられる）微生物のみ、同定することが出来る。
【０１６６】
プライマーは以下のとおりである。
＜組み合わせグループ１＞
（１−１）全ての細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に共通な配列部位から５カ所を選び、フォワードプライマーとリバースプライマーを設定する（増幅産物は４つ）。
【０１６７】
具体的には以下のプライマーの塩基配列の全部または１／３以上を含むプライマーである。
（Ｂ１）大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の８０９番目から９０５番目に相当する９７塩基のＤＮＡを増幅するプライマーセット（ｂａｃｔｅｒｉａ  ｐｒｉｍｅｒ  １：Ｂａｃ．１）。
・配列番号８０．ＧＡＴＴＡＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＴＡＧＴＣＣＡＣＧ  （２４ｍｅｒ）フォワード
・配列番号２．ＣＣＣＧＴＣＡＡＴＴＣＣＴＴＴＧＡＧＴＴＴ  （２１ｍｅｒ）  リバース
（Ｂ２）大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の９２７番目から１０９２番目に相当する１６６塩基のＤＮＡを増幅するプライマーセット（ｂａｃｔｅｒｉａ  ｐｒｉｍｅｒ  ２：Ｂａｃ．２）。
・配列番号３．ＡＡＡＣＴＣＡＡＡＧＧＡＡＴＴＧＡＣＧＧＧ  （２１ｍｅｒ）フォワード
・配列番号４．ＣＧＣＴＣＧＴＴＧＣＧＧＧＡＣ  （１５ｍｅｒ）  リバース
（Ｂ３）大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の１１０８番目から１２１８番目に相当する１１１塩基のＤＮＡを増幅するプライマーセット（ｂａｃｔｅｒｉａ  ｐｒｉｍｅｒ  ３：Ｂａｃ．３）。
・配列番号５．ＧＴＣＣＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧ  （１５ｍｅｒ）フォワード
・配列番号６．ＡＴＴＧＴＡＧＣＡＣＧＴＧＴＧＴＡＧＣＣＣ  （２１ｍｅｒ）  リバース
（Ｂ４）大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の１２４０番目から１３６９番目に相当する１３０塩基のＤＮＡを増幅するプライマーセット（ｂａｃｔｅｒｉａ  ｐｒｉｍｅｒ  ４：Ｂａｃ．４）。
・配列番号７．ＧＧＧＣＴＡＣＡＣＡＣＧＴＧＣＴＡＣＡＡＴ  （２１ｍｅｒ）フォワード
・配列番号８．ＣＣＧＧＧＡＡＣＧＴＡＴＴＣＡＣＣ  （１７ｍｅｒ）  リバース。
【０１６８】
（１−２）全ての真菌の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子に共通な配列部位を選び１組の由来するフォワードプライマーとリバースプライマーを設定する。
【０１６９】
具体的には以下のプライマーの塩基配列の全部または１／３以上を含むプライマーである。
（Ｆ１）真菌の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子のプライマーセット（ｆｕｎｇｉ  ｐｒｉｍｅｒ：Ｆｕｎｇｉ）
・配列番号９．ＧＡＡＴＧＡＧＴＡＣＡＡＴＧＴＡＡＡＴＡＣＣＴＴＡＡＣＧ  （２８ｍｅｒ）  フォワード
・配列番号１０．ＴＡＡＣＴＧＣＡＡＣＡＡＣＴＴＴＡＡＴＡＴＡＣＧＣ  （２５ｍｅｒ）  リバース。
【０１７０】
（１−３）メチシリン耐性を示すｍｅｃＡ遺伝子のプライマーは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  Ｐｒｏｂｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  ２  ソフトウェアを用い、最もスコアが高いプライマーデザインを選定する。
【０１７１】
具体的には、以下のプライマーである。
（Ｍ１）メチシリン耐性を示すｍｅｃＡ遺伝子のプライマーセット（ｍｅｃＡ  ｐｒｉｍｅｒ：ｍｅｃＡ）
・配列番号１３．ＡＴＴＡＴＡＡＡＧＣＡＡＴＣＧＣＴＡＡＡＧＡＡＣＴＡＡＧＴＡ  （３０ｍｅｒ）  フォワード
・配列番号１４．ＣＣＡＡＴＡＡＣＴＧＣＡＴＣＡＴＣＴＴＴＡＴＡＧＣＣ  （２６ｍｅｒ）  リバース。
【０１７２】
＜組み合わせグループ２＞
（２−１）全ての細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に共通な配列部位から１０カ所を選び、フォワードプライマーとリバースプライマーを設定する。
【０１７３】
具体的には以下のプライマーの塩基配列の全部または１／３以上を含むプライマーである。
（Ｂ５）大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の８番目から３４５番目に相当する３３８塩基のＤＮＡを増幅するプライマーセット（ｂａｃｔｅｒｉａ  ｐｒｉｍｅｒ  ５：Ｂａｃ．５）。
・配列番号１５．ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＡＴＧＧＣＴＣＡＧ  （２０ｍｅｒ）フォワード
・配列番号１６．ＣＧＴＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＡＣＣＧＴ  （１８ｍｅｒ）  リバース
（Ｂ６）大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３３６番目から５３４番目に相当する１９９塩基のＤＮＡを増幅するプライマーセット（ｂａｃｔｅｒｉａ  ｐｒｉｍｅｒ  ６：Ｂａｃ．６）。
・配列番号１７．ＧＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡ  （１７ｍｅｒ）フォワード
・配列番号１８．ＴＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧ  （１７ｍｅｒ）  リバース
（Ｂ７）大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の５１９番目から８０５番目に相当する２８７塩基のＤＮＡを増幅するプライマーセット（ｂａｃｔｅｒｉａ  ｐｒｉｍｅｒ  ７：Ｂａｃ．７）。
・配列番号１９．ＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＡ  （１６ｍｅｒ）フォワード
・配列番号２０．ＧＧＡＣＴＡＣＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣＴ  （２３ｍｅｒ）  リバース
（Ｂ８）大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の７８０番目から９６０番目に相当する１８１塩基のＤＮＡを増幅するプライマーセット（ｂａｃｔｅｒｉａ  ｐｒｉｍｅｒ  ８：Ｂａｃ．８）。
・配列番号２１．ＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＴＡＧ  （２３ｍｅｒ）フォワード
・配列番号２２．ＡＡＴＴＡＡＡＣＣＡＣＡＴＧＣＴＣＣＡＣＣ  （２１ｍｅｒ）  リバース
（Ｂ９）大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の９５１番目から１０７０番目に相当する１２０塩基のＤＮＡを増幅するプライマーセット（ｂａｃｔｅｒｉａ  ｐｒｉｍｅｒ  ９：Ｂａｃ．９）。
・配列番号２３．ＴＧＧＴＴＴＡＡＴＴＣＧＡＴＧＣＡＡＣＧＣ  （２１ｍｅｒ）フォワード
・配列番号２４．ＧＡＧＣＴＧＡＣＧＡＣＡＧＣＣＡＴ  （１７ｍｅｒ）  リバース
（Ｂ１０）大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の１０８４番目から１１９２番目に相当する１０９塩基のＤＮＡを増幅するプライマーセット（ｂａｃｔｅｒｉａ  ｐｒｉｍｅｒ  １０：Ｂａｃ．１０）。
・配列番号２５．ＴＴＧＧＧＴＴＡＡＧＴＣＣＣＧＣ  （１６ｍｅｒ）フォワード
・配列番号２６．ＣＧＴＣＡＴＣＣＣＣＡＣＣＴＴＣ  （１６ｍｅｒ）  リバース
（Ｂ１１）大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の１２２０番目から１３８５番目に相当する１６６塩基のＤＮＡを増幅するプライマーセット（ｂａｃｔｅｒｉａ  ｐｒｉｍｅｒ  １１：Ｂａｃ．１１）。
・配列番号２７．ＧＧＣＴＡＣＡＣＡＣＧＴＧＣＴＡＣＡＡＴ  （２０ｍｅｒ）フォワード
・配列番号２８．ＣＣＧＧＧＡＡＣＧＴＡＴＴＣＡＣＣ  （１７ｍｅｒ）  リバース。
【０１７４】
（２−２）真菌の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子に共通な配列部位から７ヶ所を選び、フォワードプライマーとリバースプライマーを設定する。
【０１７５】
具体的には以下のプライマーの塩基配列の全部または１／３以上を含むプライマーである。
【０１７６】
（Ｆ２）カンジダ菌（Ｃ．  Ａｌｂｉｃａｎｓ）の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子（配列番号１６）の１４９番目から４０７番目に相当する２５９塩基のＤＮＡを増幅するプライマーセット（ｆｕｎｇｉ  ｐｒｉｍｅｒ  ２：Ｆｕｎｇｉ  ２）
・配列番号２９．ＧＴＧＧＴＡＡＴＴＣＴＡＧＡＧＣＴＡＡＴＡＣＡＴＧＣ  （２６ｍｅｒ）  フォワード
・配列番号３０．ＧＧＴＡＧＣＣＧＴＴＴＣＴＣＡＧＧ  （１７ｍｅｒ）  リバース
（Ｆ３）カンジダ菌（Ｃ．  Ａｌｂｉｃａｎｓ）の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の３９０番目から５５１番目に相当する１６２塩基のＤＮＡを増幅するプライマーセット（ｆｕｎｇｉ  ｐｒｉｍｅｒ  ３：Ｆｕｎｇｉ  ３）
・配列番号３１．ＧＣＣＴＧＡＧＡＡＡＣＧＧＣＴＡＣＣＡ  （１９ｍｅｒ）  フォワード
・配列番号３２．ＣＣＴＣＣＡＡＴＴＧＴＴＣＣＴＣＧＴＴＡＡＧ  （２２ｍｅｒ）  リバース
（Ｆ４）カンジダ菌（Ｃ．  Ａｌｂｉｃａｎｓ）の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の５３１番目から７６２番目に相当する２３２塩基のＤＮＡを増幅するプライマーセット（ｆｕｎｇｉ  ｐｒｉｍｅｒ  ４：Ｆｕｎｇｉ  ４）
・配列番号３３．ＴＴＡＡＣＧＡＧＧＡＡＣＡＡＴＴＧＧＡＧＧＧ  （２２ｍｅｒ）  フォワード
・配列番号３４．ＧＣＣＴＧＣＴＴＴＧＡＡＣＡＣＴＣＴＡＡＴＴＴ  （２３ｍｅｒ）  リバース
（Ｆ５）カンジダ菌（Ｃ．  Ａｌｂｉｃａｎｓ）の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の９８９番目から１１３４番目に相当する１４６塩基のＤＮＡを増幅するプライマーセット（ｆｕｎｇｉ  ｐｒｉｍｅｒ  ５：Ｆｕｎｇｉ  ５）
・配列番号３５．ＡＴＡＣＣＧＴＣＧＴＡＧＴＣＴＴＡＡＣＣＡ  （２１ｍｅｒ）  フォワード
・配列番号３６．ＧＴＣＡＡＴＴＣＣＴＴＴＡＡＧＴＴＴＣＡＧＣＣＴ  （２４ｍｅｒ）  リバース
（Ｆ６）カンジダ菌（Ｃ．  Ａｌｂｉｃａｎｓ）の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の１２６０番目から１４２８番目に相当する１６９塩基のＤＮＡを増幅するプライマーセット（ｆｕｎｇｉ  ｐｒｉｍｅｒ  ６：Ｆｕｎｇｉ  ６）
・配列番号３７．ＣＡＴＧＧＣＣＧＴＴＣＴＴＡＧＴＴＧＧ  （１９ｍｅｒ）  フォワード
・配列番号３８．ＧＧＧＣＡＴＣＡＣＡＧＡＣＣＴＧＴＴ  （１８ｍｅｒ）  リバース
（Ｆ７）カンジダ菌（Ｃ．  Ａｌｂｉｃａｎｓ）の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の１４１４番目から１６３０番目に相当する２１７塩基のＤＮＡを増幅するプライマーセット（ｆｕｎｇｉ  ｐｒｉｍｅｒ  ７：Ｆｕｎｇｉ  ７）
・配列番号３９．ＡＧＧＴＣＴＧＴＧＡＴＧＣＣＣＴＴＡＧ  （１９ｍｅｒ）  フォワード
・配列番号４０．ＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣＡＡＡ  （１７ｍｅｒ）  リバース
（２−３）  メチシリン耐性を示すｍｅｃＡ遺伝子のプライマーは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  Ｐｒｏｂｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  ２  ソフトウェアを用い、最もスコアが高いプライマーデザインを選定する。
【０１７７】
具体的には、以下のプライマーである。
（Ｍ２）メチシリン耐性を示すｍｅｃＡ遺伝子のプライマーセット（ｍｅｃＡ  ｐｒｉｍｅｒ  ２：ｍｅｃＡ２）
・配列番号４３．ＣＡＡＡＣＴＡＣＧＧＴＡＡＣＡＴＴＧＡＴＣＧＣ  （２３ｍｅｒ）  フォワード
・配列番号４４．ＡＴＧＴＡＴＧＣＴＴＴＧＧＴＣＴＴＴＣＴＧＣ  （２２ｍｅｒ）  リバース
本発明において、Ｔｍ値とは、ＰＣＲ産物の５０％がその相補鎖と解離する時の温度である。また、最近接塩基法によるＴｍ値計算式の「Ｔｍ値は塩基配列で決まる」という理論的根拠を元に、菌種ごとの塩基配列の違いをＴｍ値の組合せの違いとして起因菌同定に応用することができる。従って、「Ｔｍ値から測定誤差の影響を排除する」ことが正確に同定する上で最も重要となる。このため、以下の方法で測定誤差の影響を排除する。
【０１７８】
先ず、Ｔｍ値は緩衝液の組成などが異なる実験条件下では変化するため、塩化マグネシウム濃度の固定されたサイバー・グリーンＩを反応用緩衝液として使用することで、反応液の組成による測定誤差を生じないようにする。次に、リアルタイムＰＣＲ機器自体が試行回毎に測定誤差を生じるため、コントロールとしての標準Ｔｍ値を設定すると共に、同じ試行回での各Ｔｍ値間の差異パターンを判定に利用する。或いは、「“平均値との相対値”の組合せの近似したものが検出対象生物である」とする同定アルゴリズムを利用する。
【０１７９】
本発明において、測定機器の試行間誤差を補正する目的で、基準Ｔｍ値を使用することができる。具体的には、テンプレートとして一定濃度の大腸菌標準株のＤＮＡを用い、細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の一領域を増幅する１つのプライマーセットを使用して毎回Ｔｍ値を測定し、試行回毎のＴｍ値のズレを補正する。すなわち、同じテンプレートに同じプライマーの組み合わせであれば、理論的には毎回同じＴｍ値となる。
【０１８０】
しかし、実際に得られたＴｍ測定値がズレた場合、それは試行間誤差となるので、そのズレ分だけ補正を行えばよい。
【０１８１】
本発明の方法（Ａ）及び（Ｂ）の具体的手順は以下のとおりである。
（ｉ）検体からＤＮＡを調製する。
（ii）得られたＤＮＡに対し、先に挙げた細菌、抗生剤耐性遺伝子、および真菌のプライマーセットを用いて遺伝子増幅後、それぞれのＴｍ値を一時に測定し、細菌、抗生剤耐性遺伝子、および真菌のＴｍ値の組合せを得る。
（iii）真菌であるか否かを判定する。
［上記（ii）のＴｍ値の組合せの中で、全ての真菌の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の一領域〜複数領域を増幅できるプライマーセットを用いて得た真菌に特異的なＴｍ値を先ず解析することで、真菌であるか否か、或いは真菌の種類を判定する。］
（iv）抗生剤耐性遺伝子の有無を判定する。
［上記（ii）のＴｍ値の組合せの中で、メチシリン耐性を示すｍｅｃＡ遺伝子など、その時の流行に応じた抗生剤耐性遺伝子を特異的に増幅するプライマーセットを用いて得た抗生剤耐性菌に固有の遺伝子増幅を解析することで、抗生剤耐性遺伝子の有無を判定する。］
（v）どの細菌であるか絞り込む。
［上記（ii）のＴｍ値の組合せの中で、全ての細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の複数領域を増幅できるプライマーセットを用いて得た細菌に特異的なＴｍ値の組合せを解析することで、細菌の種属を同定する。］
細菌の絞り込みは、具体的には、細菌のＴｍ値の一つに注目して（場合によっては、標準Ｔｍ値で先ず補正する）、そのＴｍ値に値の近い菌種に範囲を狭め、順次Ｔｍ値の差を取って絞り込む、または、直接、標準Ｔｍ値を含む、各Ｔｍ値間の差をとって、その差の組み合わせをフィンガープリントとして同定する。或いは、「“平均値との相対値”の組合せの近似したものが検出対象生物である」とする同定アルゴリズムを利用する。
【０１８２】
また、検出対象生物が、細菌か、真菌か、あるいは抗生剤耐性であるかどうかを迅速、簡便に同定する方法としては、Ｔｍ値を利用しなくても未知の微生物ＤＮＡを抽出し、これを鋳型として、
［１］真菌の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の全ての真菌に共通、且つ真菌特異的に検出するプライマー１つと、細菌を宿主として製造した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物と、
［２］メチシリン耐性を示すｍｅｃＡ遺伝子など、その時の流行に応じた抗生剤耐性遺伝子を特異的に検出するプライマー各々１つずつと、本発明にかかる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物または細菌を宿主として製造した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物と、
［３］細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の全ての細菌に共通、且つ細菌特異的に検出するプライマー１つと、本発明にかかる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物と、
を用いてＰＣＲを行い、アガロース・ゲルに電気泳動して目的サイズのバンドを確認する方法がある。
【０１８３】
以上の方法によれば以下の効果を得ることができる。
（１）４〜１８個、好ましくは４〜１６個のプライマーセットを元にリアルタイムＰＣＲなどの遺伝子増幅を実施し、得られるＴｍ値をデータベースと照合することにより、抗菌薬選択に必要な起因菌の菌種同定、および抗生剤耐性遺伝子の有無が確認出来る。
（２）血液検体の場合、ＤＮＡ抽出からＴｍ値の解析、そして同定までに要する時間は約２時間であり、迅速診断が可能となる。
（３）ＤＮＡを抽出する血液検体の量を一定とした場合、菌量の相対量を定量でき、抗菌薬投与後の治療効果のモニタリングが可能となる。
（４）細菌を宿主として製造した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物と、本発明にかかる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物を使い分けることで、非特異的増幅などの偽陽性のリスクをほぼ完全に無くすことが出来る。
【０１８４】
一方、真菌の同定には、TopoisomeraseII、mitochondria DNA或いは26S ribosomal RNAのユニバーサルプライマーの組合せによりTm値の組合せを得て、それに基づいて同定を行うことが好ましい。
【０１８５】
（定量または同定用のセット）
セットであって、
検体から調製したＤＮＡを増幅するための本発明にかかる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物と、検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマーと、を少なくとも用いて検体中に含まれる検出対象生物の定量及び／または同定を行うためのセットを提供することができる。
【０１８６】
更に、このセットは、
検体から調製したＤＮＡを増幅するための本発明にかかる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物と、
検体から調製したＤＮＡを増幅するための細菌細胞を宿主として製造した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物と、
検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマーと、
を少なくとも用いて構成することができる。
【０１８７】
これらのセットのプライマーとしては、先に挙げたプライマー（Ｂ）、（Ｆ）及び（Ｍ）が利用できる。
【０１８８】
（定量同定システム）
以下の各装置を用いて、上述した方法による検体中に含まれる検出対象生物の定量または同定を行うためのシステムを構成することができる。
（１）検体から調製したＤＮＡと、検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマーと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物と、を用いて核酸増幅反応を行うための増幅装置。
（２）増幅工程における増幅産物の定量を行うための定量装置。
（３）増幅産物の定量結果により検体中の検出対象生物の量を算出する算出装置。
（４）目的遺伝子の増幅産物の定量結果から検体中の検出対象生物の量を算出するためのデータベース。
【０１８９】
増幅装置及び定量装置としてはＰＣＲ装置、中でもリアルタイムＰＣＲ装置が好適に利用できる。また、算出装置としては上記データベースを利用して、検出対象生物の定量及び／または同定を行う予め設定されたプログラムに基づいて動作をするコンピュータシステムなどを利用できる。
【０１９０】
本発明にかかる検出対象生物の定量及び／または同定を行うためのシステムの一例を以下に示す。このシステムは以下の各要素（ユニット）を有することができる。
（１）ＰＣＲ反応装置
（２）データ処理及びデータ処理後の結果を出力するためのコンピュータシステム
（３）データ処理に必要なプログラムを書き込んだデータ処理用ソフト
（４）データ処理に必要なデータベース
（５）ＰＣＲ反応装置を制御するプログラムを有する制御機構
（６）データ処理の結果を表示する表示装置
これらの装置の関係の一例を図１２に示す。このシステムは、ＰＣＲ反応装置１、コンピュータシステム２、データ処理部３、データ処理用プログラム（ソフト）６、データ処理に必要なデータベース４、ＰＣＲ反応装置を制御する制御機構５ａ及び５ｂ及び表示装置７を有している。なお、これらはその２以上を一体化して設けることができる。また、各ユニット間の情報の受け渡しは、信号Ｓ１〜Ｓ７によって行われる。定量装置は、少なくともコンピュータシステム２により構成することができる。
【０１９１】
ＰＣＲ反応装置では上述した検出対象生物の定量及び／または同定のためのＰＣＲ反応が行われる。その制御は、制御機構５によって行うことができる。制御機構５における制御項目の一例として以下の項目を挙げることができる。
Ａ）増幅反応スタート時の条件設定
Ｂ）増幅のためのサイクル数や温度制御のための条件設定
Ｃ）Ｔｍ値の測定のための条件設定
Ｄ）反応終了のための条件設定
Ｅ）目的外遺伝子の増幅を表示装置で非表示とするための条件設定
これらの条件設定から目的に応じて制御項目を選択して設定することができる。条件設定とその実行は、予め設定されたプログラムによって行うことができる。このプログラムは、制御機構５ａまたは５ｂ中の媒体に記録しておくことができる。あるいは、このプログラムは、別途用意した移動（携帯）可能な媒体に記憶させておくか、あるいはインターネットにより配布可能となるように媒体に収容しておき、使用時に制御機構５ａまたは５ｂに接続して利用できるようにしてもよい。コンピュータシステム２中に設けられた、あるいは別途用意されたデータ処理部３でのデータ処理結果を利用してＰＣＲ反応装置の制御を行う場合は、コンピュータシステム２にデータ処理部３からのデータ処理の結果を送り、その結果に基づいて制御機構５ｂからＰＣＲ反応装置の制御のための信号をＰＣＲ反応装置内の制御機構５ａに送信して制御を実行する。ＰＣＲ反応の目的に応じて、ＰＣＲ反応装置側のみでの制御で十分である場合には、制御機構５ａのみを利用してＰＣＲ反応の制御を行う。
【０１９２】
コンピュータシステム２は、各ユニットからの信号を目的に応じて処理可能にプログラムされている。データ処理部２では、例えば以下の処理が行われる。
ｉ）ＰＣＲ反応装置において得られたＰＣＲの増幅反応結果（例えば蛍光強度に関する信号）の処理
ｉｉ）ＰＣＲ増幅反応結果用いた検出対象生物の定量及び／または同定を行うための演算処理
ｉｉｉ）ＰＣＲ反応装置におけるＰＣＲ反応の条件を制御するための信号の出力処理
ｉｖ）ＰＣＲ増幅反応の結果（経時的モニタリングを含む）、検出対象生物の定量及び／または同定の結果の表示装置での表示を指令する処理
これらの処理は、目的とするデータ処理に応じて設定されたデータ処理用のプログラム６に従って実行される。更に、データ処理にデータベースが必要である場合には、データベース４中に格納された情報を利用する。例えば、ＰＣＲでの増幅反応により得られる信号を処理して検出対象生物の定量及び／または同定を行う場合の基準となる既知の生物を用いて得られるデータや、先に説明したＴｍ値を利用した測定対象生物の定量及び／または同定を行う場合は、既知の生物から得られたＴｍ値（複数のＴｍ値からの定量同定を行い場合のＴｍ値の組合せを含む）などをデータベース化して格納しておくことができる。
【０１９３】
データ処理用プログラム６及びデータベース４は、コンピュータシステム２内の媒体中に格納しておくことができる。あるいは、これらの少なくも１つを、別途用意した移動（携帯）可能な媒体に記憶させておくか、あるいはインターネットにより配布可能となるように媒体に収容しておき、使用時にデータ処理部３に接続して利用できるようにしてもよい。
【実施例】
【０１９４】
以下、参考例、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
また、特別な記載がない限り、操作手順は製品キットに付属の説明書に基づいて行った。【０１９５】
（実施例１−１）
（１）ＤＮＡの合成
T.aquatics由来耐熱性ＤＮＡポリメラーゼはGenScript社にて全ＤＮＡ配列を合成した。この際、コドン配列を酵母宿主、S.cerevisiaeに最適化した。合成したＤＮＡは、プラスミドpUC５７に組み込まれGenScript社より提供され、ベクターpUC-TA０１を得た。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子は、５’末端配列にHindIII、３’末端配列にEcoRI制限酵素サイトが入るように設計した。
（２）T.aquatics由来耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ発現用ベクターの構築
合成したT.aquatics由来耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子をプラスミドpYES２（invitrogen社）に挿入し、ベクターpYES-TA０１を構築した。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子は、pUC-TA０１を制限酵素HindIII、EcoRI（TaKaRa
Bio）にて消化し、１％アガロースゲル（Wako）にて電気泳動し、QIAquickゲル抽出キット（Qiagen）にて耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を回収した。プラスミドpYES２はEcoRI、NotI（TaKaRa Bio）にて消化し、ＤＮＡ Ligation Kit Ver.２.１（TaKaRa Bio）にて耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子とpYES２を連結した。
（３）S.cerevisiaeの形質転換
この得られたベクターpYES-TA０１を酵母（Saccharomyces cerevisiae X２１８０株）へ導入した。宿主はウラシル要求株であれば他の酵母を用いることも可能である。形質転換はFastTrackTM-Yeast Transformation Kit（Geno Technology社）を用いた。
（４）S.cerevisiaeによるT.aquatics由来耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの生産
得られた形質転換体は、SD培地（０.６７% Bacto yeast nitrogen base、２% Galactose、）１００mlにて、２８℃、７２時間振とう培養を行った。これらを５０００rpm、１０分間遠心分離し集菌、破砕用緩衝液（５０mM Tris-HCl pH７.５、５０mM
KCl）に懸濁し、０.５mmガラスビーズを用いて菌体を破砕した後１２０００rpm、３０分間遠心分離を行い、酵母破砕液上清および沈殿物を得て細胞抽出物とした。
（５）熱処理による耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ可溶化条件の検討
細胞抽出物について、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ熱処理による可溶化条件の検討を行った。図２は酵母破砕沈殿物を等量の破砕用緩衝液に懸濁したものに対して、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、９０℃、９５℃、１００℃にて熱処理を行い、１２０００rpm、３０分間、４℃にて遠心分離した後上清に対しSDS-PAGEを行った図である。５０℃以上での熱処理において目的タンパク質である耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのバンドが検出され、６５℃から７０℃での熱処理では宿主由来の夾雑タンパク質混入量が減少した。５０℃以上の熱処理を行うことにより耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは可溶化され、かつ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有していた。【０１９６】
（６）ＤＮＡポリメラーゼ活性
（６−１）ラムダＤＮＡ内領域の増幅
ラムダＤＮＡ（NIPPON GENE）をテンプレートとして、活性検出を行った。反応液組成は、１０mM Tris-HCl(pH８.３)、１.５mM MgCl２、５０mM KCl、２００μM dNTPsとなるように調製し、プライマーは、配列番号８３、８４をそれぞれ０.４μMになるよう添加した。
配列番号８３  gatgagttcg tgtccgtaca act
配列番号８４  ggttatcgaa atcagccaca gcgcc
ラムダＤＮＡは０.２μg、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物は上記遠心分離上清を１/４、１/８、１/１６、１/３２、１/６４となるように希釈列を調製後１μl添加し、これらを超純水にて全量５０μlになるように調製した。PCRプログラムを下記のプログラムで実施した。：９４℃ １分間、５０℃ ３０秒間、７２℃ １分間を３０回繰返した。各PCR反応溶液は１％アガロースゲルにて電気泳動を行い、増幅産物を可視化した。
（６−２）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性の定義
得られた耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのユニットをProcedures in
nucleic acid research（Richardson, C. C. (１９６６) ＤＮＡ polymerase from Escherichia coli, pp. ２６３-２７６ In G. L. Cantoni and D.R. Davies (ed.) ）の方法に従い決定した。活性化サケ精子ＤＮＡをテンプレート／プライマーとして用い、活性測定用反応液（２５mM TAPS（pH９.３）、５０mM KCl、２mM MgCl２、１mM β-メルカプトエタノール、各２００μM のdATP, dGTP, dTTP、１００μM [α-３２P]・dCTP(０.０５-０.１ Ci/mmol)、０.２５mg/ml 活性化サケ精子ＤＮＡを含む全量５０μl）中にて７４℃において、３０分間に１０ nmolの全ヌクレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性を１Uとした。
（６−３）PCRの検出限界
図３は大腸菌ＤＮＡをテンプレートとし、PCRでの検出の限界を求めた図である。１００ngから１０fgまではPCR増幅バンドが検出され、１０fgから１fgの間で増幅バンドが未検出であった。大腸菌ＤＮＡは、大腸菌JM１０９（ToYoBo社製）よりＤＮＡ抽出キットFastPure ＤＮＡ Kit（TaKaRa社製）にて抽出、精製した。反応液組成は、１０mM Tris-HCl(pH８.３)、１.５mM MgCl２、５０mM KCl、２００μM dNTPsとなるように調製し、プライマーは、配列番号８５、８６をそれぞれ０.４μMになるよう添加した。
配列番号８５  agcagccgcg gtaat
配列番号８６  ggactaccag ggtatctaat cct
テンプレートは１００ngから１fgまでを１０-１ずつ作成した大腸菌ＤＮＡ希釈列を作成し添加した。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物を１U添加しこれらを超純水にて全量２０μlになるように調製した。PCRプログラムを下記のプログラムで実施した。：９４℃ １分間、５０℃ ３０秒間、７２℃ ３０分間を６０回繰返した。各PCR反応溶液は１％アガロースゲルにて電気泳動を行い、増幅産物を可視化した。
（７）T.aquatics由来耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ発現用ベクターの構築、
T.aquatics由来耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子をプラスミドpPIC ZA（invitrogen社）に挿入し、ベクターpPIC -TA０１を構築した。pYES-TA０１をテンプレートとして用い、KOD Plus（ToYoBo）を用いてPCRにて耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子の増幅を行った。PCRに用いるプライマー（配列番号８７、８８）は、５’末端配列にEcoRI、３’末端配列にNotI制限酵素サイトが入るように設計した。
配列番号８７  cccgaattca tgagggggat gttgccattg
配列番号８８  aaagcggccg ctcattcctt tgcggataac
PCRプログラムを下記のプログラムで実施した。：９４℃ ２分間加熱した後、９４℃
１５秒間、５６℃ ３０秒間、６８℃ ２分３０秒間を３０回繰返した。PCR生成物は次に１％アガロースゲルにて電気泳動し、QIAquickゲル抽出キット（Qiagen）にてPCR断片を回収した。PCR増幅物、pPICZ
Aは共にEcoRI、NotI（TaKaRa Bio）にて消化し、ＤＮＡ Ligation Kit Ver.２.１（TaKaRa Bio）にてPCR増幅断片とプラスミドpPICZ Aを連結した。
（８）E.coliの形質転換、ベクター抽出
連結したベクターをE.coliコンピテントセル DH５α（ToYoBo）へ導入した。大腸菌形質転換体はZeocinを選択マーカーに持つ為、SOC（ToYoBo）培地にて１時間回復させた後、２５μl/mlのZeocin（Invitrogen）を含むLenox（Difco）寒天培地に播種し、３７℃、１６時間静置培養した。寒天プレートから大腸菌コロニーを接種し、ダイレクトコロニーPCR、そして塩基配列を解読し、正しく耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子が組み込まれていることを確認した後、ベクターpPIC -TA０１を得た。
（９）P.pastorisの形質転換
ベクターpYES-TA０１を酵母（Pichia
pastoris GS１１５株）へ導入した。形質転換はFastTrackTM-Yeast
Transformation Kit（Geno Technology社）を用いた。酵母形質転換体はZeocinを選択マーカーに持つ為、YPD培地（Difco）で３時間培養し回復させた後、１００μg/mlのZeocinを含むYPDS（Difco）寒天プレートに播種した。そして、寒天プレートは２８℃、３日間静置培養した。
（１０）形質転換体の選抜
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ高生産株を取得する為、形質転換した寒天プレートよりコロニーを接種し、Zeocin含有濃度を５００μg/ml〜２０００μg/mlと順に上げたYPDS（Difco）寒天プレートで培養し、挿入遺伝子の多コピー形質転換体を選抜した。寒天プレートはZeocin濃度５００μg/ml、１０００μg/ml 、２０００μg/mlと３段階で培養し、各々２８℃、３日間静置培養した。Zeocin濃度２０００μg/mlのYPDS（Difco）寒天プレートで生育した形質転換体を下記の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ生産実験に用いた。【０１９７】
（１１）T.aquatics由来耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの生産
BMGY培地１００mlに形質転換体を接種し、２８℃にて１日振盪培養し菌体量を増やした。次にタンパク質の生産を誘導する為に０.５%メタノールを添加し２８℃にて３日間培養した。これらを５０００rpm、１０分間遠心分離し集菌、破砕用緩衝液（５０mM Tris-HCl pH７.５、５０mM KCl）に懸濁し、０.５mmガラスビーズを用いて菌体を破砕した。次に７０℃、６０分間の熱処理を行い、１２０００rpm、３０分間遠心分離しT.aquatics由来耐熱性DNAポリメラーゼを含む上清を得た。
（１２）P.furiosus由来耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ発現用ベクターの構築
P.furiosus由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子をプラスミドpYES２に挿入し、ベクターpYES -PF０１を構築した。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子はP.furiosusゲノムＤＮＡ（ATCC ４３５８７D-５）をテンプレートとしてPCRにて合成した。PCRに用いるプライマー（配列番号８９、９０）は、５’末端配列にKpnI、３’末端配列にNotI制限酵素サイトが入るように設計し、KOD Plusを用いてPCRを行った。
配列番号８９  gggggtacca tgattttaga tgtggattac
配列番号９０  cccgcggccg cctaggattt tttaatg
PCRプログラムを下記のプログラムで実施した。：９４℃ ２分間加熱した後、９４℃
１５秒間、５６℃ ３０秒間、６８℃ ２分３０秒間を３０回繰返した。PCR生成物は次に１％アガロースゲルにて電気泳動し、QIAquickゲル抽出キットにてPCR断片を回収した。PCR増幅物、pYES２は共にKpnI、NotIにて消化し、ＤＮＡ Ligation Kit Ver.２.１にてPCR増幅断片とpYES２を連結した。【０１９８】
連結したベクターをE.coliコンピテントセル JM１０９（ToYoBo）へ導入した。大腸菌形質転換体は５０μl/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地に播種し、３７℃、１６時間静置培養した。寒天プレートから大腸菌コロニーを接種し、ダイレクトコロニーPCR、そして塩基配列を解読し正しく耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子が組み込まれていることを確認し、ベクターpYES-PF０１を得た。
（１３）T.gorgonarius由来耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ発現用ベクターの構築
T.gorgonarius由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子をプラスミドpYES２に挿入し、ベクターpYES -TG０１を構築した。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子はT.gorgonariusのゲノムＤＮＡ（ATCC ７００６５４D）をテンプレートとしてPCRにて合成した。PCRに用いるプライマー（配列番号９１、９２）は、５’末端配列にKpnI、３’末端配列にNotI制限酵素サイトが入るように設計し、KOD Plusを用いてPCRを行った。
配列番号９１  gggggtacca tgatcctcga tacagac
配列番号９２  cccgcggccg ctcatgtctt aggttttag
PCRプログラムを下記のプログラムで実施した。：９４℃ ２分間加熱した後、９４℃
１５秒間、６０℃ ３０秒間、６８℃ ２分３０秒間を３０回繰返した。PCR生成物は次に１％アガロースゲルにて電気泳動し、QIAquickゲル抽出キットにてPCR断片を回収した。PCR増幅物、pYES２プラスミドは共にKpnI、NotIにて消化し、ＤＮＡ Ligation Kit Ver.２.１にてPCR増幅断片とプラスミドpYES２を連結した。【０１９９】
連結したベクターをE.coliコンピテントセル JM１０９に形質転換した。大腸菌形質転換体は５０μl/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地に播種した。そして、寒天プレートは３７℃、１６時間静置培養した。寒天プレートから大腸菌コロニーを接種し、ダイレクトコロニーPCR、そして塩基配列を解読し正しく耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子が組み込まれていることを確認し、ベクターpYES-TG０１を得た。【０２００】
（１４）酵母の形質転換
この得られたベクターpYES-PF０１、pYES-TG０１を酵母（Saccharomyces cerevisiae X２１８０株）へ導入した。形質転換はFastTrackTM-Yeast Transformation Kitを用いた。
（１５）P.furiosus、T.gorgonarius由来耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの生産
得られた形質転換体は、SD培地（０.６７% Bacto yeast nitrogen base、２% Galactose、）１００mlにて、２８℃、７２時間振とう培養を行った。これらを５０００rpm、１０分間遠心分離し集菌、破砕用緩衝液（５０mM Tris-HCl pH７.５、５０mM
KCl）に懸濁し、０.５mmガラスビーズを用いて菌体を破砕した後遠心分離を行い、酵母破砕液沈殿を得た。この沈殿に対し、沈殿湿重量の２倍量の破砕用緩衝液を添加、懸濁し７０℃、６０分間の熱処理を行い、１２０００rpm、３０分間遠心分離し耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む上清を得た。【０２０１】
（１６）PCRによる非特異的核酸混入の検査
図４は上記の得られた各耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物とTaKaRa Taq（TaKaRa）、AmpliTaq Gold LD（ABI）を用い、非特異的核酸混入が認められるかを調査した実例を示す１%アガロース電気泳動の写真である。レーン１、４、７、１０、１３、１６は４０サイクル、レーン２、５、８、１１、１４、１７は６０サイクルにてテンプレートを添加せずPCRを行ったものである。また、レーン３、６、９、１２、１５、１８は大腸菌１μgをテンプレートとしてPCRを３０サイクルにて試行したものである。プライマーは２５９bpの大腸菌１６S rRNA遺伝子を増幅させ得る配列番号８５、８６を用いて、温度条件、PCR溶液組成は（６−３)と同様の操作にて行った。これより、テンプレートを添加していないにも関わらず、TaKaRa
Taqでは４０サイクル、AmpliTaq Gold LDは６０サイクルにてバクテリア１６S rRNA由来遺伝子の増幅産物が検出された。また、本特許の製造方法により生産された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼでは４０、６０サイクルのPCRでも増幅産物は検出されず、煩雑な精製工程を行わなくとも非特異的核酸混入は認められず、ＰＣＲが実施可能であった。
（１７）リアルタイムPCRによる増幅曲線、融解曲線の解析（非特異的核酸混入の調査）
上記の得られた耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物の非特異的核酸混入を調査する為、リアルタイムPCRを用いて増幅曲線、融解曲線の解析を行った。図５（A）及び図５（B）は増幅曲線、図６（A）及び図６（B）は融解曲線の解析を示す図である。また、図５（A）及び図６（A）はAmpliTaq
Gold LD、図５（B）及び図６（B）はS.cerevisiaeを宿主に生産した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物を用い解析を実施した図である。実線はテンプレートとして大腸菌を添加したもの、点線はテンプレート未添加のものである。リアルタイムPCR試薬として、LightCycler FastStart ＤＮＡ Master SYBR GreenI（Roche社）の１bチューブに対し、１０μlの超純水を加えx１０ Bufferとした。このチューブ内にはTaq ＤＮＡポリメラーゼに最適化された緩衝試薬の他、dNTPsとSYBR GreenIが含まれる。その他に１.５mM MgCl２、それぞれ０.４μMプライマー（配列番号８５、８６）、テンプレートとして大腸菌１μg、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物を１ユニット添加し、超純水にて全量２０μlになるよう調製して、ホットスタート法でリアルタイムＰＣＲ（６０サイクル）を行った。AmpliTaq
Gold LDでは３２サイクル程度で増幅曲線が立ち上がり始め、融解曲線ではテンプレート添加、未添加共に同程度の位置にピークがあり、非特異的核酸混入が認められた。これに対し、本特許の製造方法により製造した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、テンプレート未添加では増幅曲線、融解曲線共に見られなかった。真核細胞を宿主として用いて生産した耐熱性DNAポリメラーゼ調製物では非特異的核酸混入に由来する増幅産物が認められず、細菌を宿主として用いて生産し、バクテリアDNAのコンタミネーションが最小に抑えられるように精製された耐熱性DNAポリメラーゼ調製物を用いた場合では非特異的核酸混入に由来する増幅産物が認められた結果から、大気や水環境中に存在するバクテリアの混入など様々な非特異的核酸混入の可能性がある中で、その主たる要因は耐熱性DNAポリメラーゼの生産過程における宿主由来DNAの耐熱性DNAポリメラーゼ調製物への混入にあるものと考えられた。
（１８）ベクターpYES-PF０１の変異の導入
P.furiosus由来耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの3’−5’エキソヌクレアーゼをコードする遺伝子に変異を導入した。すなわち、DNAポリメラーゼの3’−5’エキソヌクレアーゼ改変を行い活性を調整した（Kongら（1993）、journal
of biological chemistry、vol.268、1965-1975）。具体的には、変異導入に用いるプライマー（配列番号６１、６２）、テンプレートとしてベクターpYES2-PF01、KOD Plusを用いてPCRを行った。
配列番号６１  GATTCTTGCCTTCGCGATCGCAACCCTCTATCACGAAGG
配列番号６２  CCTTCGTGATAGAGGGTTGCGATCGCGAAGGCAAGAATC
PCRプログラムを下記のプログラムで実施した。：９４℃ ２分間加熱した後、９４℃
１５秒間、５６℃ ３０秒間、６８℃ ７分秒間を１５回繰返した。反応後、制限酵素DpnIにてPCR溶液中のテンプレートを消化し、E.coliコンピテントセル JM１０９へ導入した。大腸菌形質転換体は５０μl/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地に播種し、３７℃、１６時間静置培養した。寒天プレートから大腸菌コロニーを接種し、塩基配列を解読し目的位置に変異が導入されていることを確認し、ベクターpYES-PF-M01を得た。また、実施例（１４）、（１５）と同様に形質転換、生産を行い、P.furiosus由来変異耐熱性DNAポリメラーゼ調製物を得た。
（１９）ベクターpYES-TG０１の変異の導入
T.gorgonarius由来耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの3’−5’エキソヌクレアーゼをコードする遺伝子に変異を導入した。変異導入に用いるプライマー（配列番号６３、６４）、テンプレートとしてベクターpYES2-TG01を用い（１８）と同様の方法で変異を導入した。
配列番号６３  GATGCTCGCCTTCGCGATCGCAACGCTCTATCACGAGGGCG
配列番号６４  CGCCCTCGTGATAGAGCGTTGCGATCGCGAAGGCGAGCATC
塩基配列を解読し目的位置に変異が導入されていることを確認し、ベクターpYES-TG-M01を得た。また、実施例（１４）、（１５）と同様に形質転換、生産を行い、T.gorgonarius由来変異耐熱性DNAポリメラーゼ調製物を得た。【０２０２】
（２０）宿主Tobacco-BY2を用いたT.aquaticus由来耐熱性DNAポリメラーゼの生産
（２０−１）転写因子発現用ＤＮＡ断片導入用ベクターの構築
転写因子発現用ＤＮＡ断片を宿主細胞（タバコＢＹ２細胞）に導入するためのベクター（以下転写因子発現用ＤＮＡ断片導入用ベクターと称する）として、ＴｉプラスミドｐＥＲ８（−Ｓｔｕ）
（Dohi, K., Nishikiori, M., Tamai, A., Ishikawa, M., Meshi, T.,
Mori, T. (2006) Inducible virus-mediated expression of a foreign protein in
suspension-cultured cells. Archives of Virology 151, 1075-1084）を用いた。ｐＥＲ８（−Ｓｔｕ）は、恒常的プロモーターＰG10-90の下流にエストロジェンレセプターを含む融合転写因子ＬｅｘＡ−ＶＰ１６−ｈＥＲをコードする遺伝子、ターミネーターＴE9を連結し、さらに薬剤耐性マーカーとしてハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｈｙｇr）を組み込んで構築した。
（２０−２）タンパク質発現用ＤＮＡ断片導入用ベクターの構築
ＴｏＭＶの外被タンパク質をコードする遺伝子を、T.aquaticus由来DNAポリメラーゼをコードする遺伝子（配列番号６５）で置換したＴｏＭＶ変異体を用いた。
配列番号６５
ATGAGGGGGATGTTGCCATTGTTTGAACCTAAAGGGAGGGTTTTACTCGTGGATGGCCATCACCTTGCTTATCGTACTTTCCACGCTCTCAAAGGTTTAACAACCTCTAGGGGAGAGCCAGTTCAAGCTGTGTACGGGTTTGCAAAGTCACTCCTTAAAGCCTTGAAGGAGGACGGTGATGCCGTTATCGTGGTATTCGATGCTAAAGCACCAAGTTTTAGACACGAGGCTTACGGAGGCTATAAGGCTGGACGTGCACCAACTCCCGAGGATTTCCCAAGACAACTCGCCCTGATAAAGGAGTTGGTTGACCTACTTGGATTGGCTAGGTTAGAAGTTCCCGGTTACGAAGCTGACGACGTTTTGGCCTCACTTGCTAAGAAAGCAGAAAAGGAGGGCTACGAAGTTCGTATACTCACAGCCGATAAAGACTTGTATCAACTGTTATCTGATAGGATTCATGTGCTTCACCCCGAAGGGTACCTTATCACCCCTGCCTGGCTGTGGGAAAAGTACGGGCTCAGACCTGACCAGTGGGCTGATTACCGTGCACTCACCGGTGACGAGAGTGACAATCTTCCTGGCGTGAAAGGAATAGGTGAAAAGACAGCTAGAAAATTGCTAGAAGAGTGGGGGTCCCTCGAGGCACTTTTGAAGAACCTTGATAGGTTAAAACCAGCTATTAGAGAAAAGATACTGGCCCATATGGATGACTTGAAACTATCATGGGACTTAGCTAAAGTCAGAACCGATTTACCTTTGGAAGTGGATTTTGCTAAGAGAAGGGAACCAGATAGAGAGAGGCTTAGAGCATTCTTGGAGCGTCTGGAATTTGGATCTTTACTCCACGAGTTCGGTTTGCTTGAGTCTCCCAAGGCACTGGAAGAGGCACCATGGCCTCCACCTGAAGGCGCTTTTGTTGGGTTCGTTCTCAGTAGGAAGGAACCTATGTGGGCAGACTTGCTCGCCCTAGCAGCTGCAAGAGGGGGAAGAGTGCATAGGGCTCCCGAACCTTATAAGGCACTCAGAGATCTTAAGGAGGCTAGGGGCCTCTTGGCAAAGGACCTATCCGTGCTTGCACTCAGGGAAGGATTGGGACTCCCACCCGGTGATGACCCTATGTTATTGGCTTACTTGCTTGACCCATCCAATACCACACCCGAGGGAGTTGCCCGTAGGTATGGGGGCGAGTGGACTGAGGAAGCTGGTGAGAGGGCCGCATTGAGTGAGAGGCTATTTGCCAACTTATGGGGGAGGTTGGAGGGGGAGGAACGTCTGCTATGGCTTTACAGAGAGGTGGAGCGTCCCTTGAGTGCTGTATTAGCTCACATGGAAGCTACAGGCGTCCGTCTAGATGTTGCTTACTTAAGGGCTCTAAGTTTGGAAGTTGCAGAAGAGATCGCCAGATTAGAAGCTGAAGTTTTCAGGTTAGCAGGACACCCTTTTAATCTCAATAGTAGGGACCAACTCGAACGTGTGTTATTTGATGAACTGGGCCTCCCCGCTATAGGGAAAACCGAGAAAACAGGGAAAAGGTCCACATCTGCAGCTGTATTGGAAGCCCTTAGAGAAGCACATCCTATTGTGGAGAAAATACTACAGTACAGGGAGCTAACCAAATTAAAGAGTACCTACATAGATCCATTGCCTGATCTTATTCACCCAAGGACCGGAAGGCTTCACACCCGTTTCAATCAAACCGCAACAGCTACTGGGAGGTTATCATCTTCCGACCCTAACTTGCAAAATATACCTGTTCGTACCCCACTCGGACAGAGAATACGTAGAGCTTTCATTGCCGAAGAGGGATGGCTCTTGGTTGCTTTGGATTATAGTCAGATTGAACTTAGAGTTCTAGCACACCTTAGTGGCGACGAAAACCTCATCAGGGTGTTTCAGGAGGGGAGAGATATACACACCGAAACTGCTTCATGGATGTTTGGGGTGCCCAGGGAAGCCGTAGACCCCCTCATGAGAAGGGCTGCTAAAACAATTAATTTCGGCGTGTTGTACGGAATGTCCGCTCACAGGCTATCACAAGAGTTGGCAATCCCCTATGAAGAGGCTCAAGCCTTCATTGAGAGGTATTTTCAGTCCTTTCCAAAGGTGCGTGCTTGGATAGAGAAAACTTTAGAGGAAGGTAGAAGGAGAGGGTATGTGGAAACTCTATTTGGCAGACGTAGGTACGTTCCTGACCTCGAAGCTAGAGTTAAGTCCGTCAGAGAGGCAGCTGAACGTATGGCATTCAATATGCCTGTTCAAGGAACAGCTGCAGACTTAATGAAATTAGCTATGGTGAAGTTGTTCCCAAGGTTAGAGGAAATGGGTGCAAGAATGCTCCTACAGGTCCATGATGAGCTAGTGTTGGAAGCACCTAAAGAGAGGGCAGAGGCAGTAGCCAGGTTGGCAAAGGAGGTTATGGAAGGGGTGTATCCACTTGCTGTCCCCTTGGAGGTGGAAGTCGGGATCGGTGAGGACTGGTTATCCGCAAAGGAATGAGCTCACTAGT
T.aquatics由来耐熱性ＤＮＡポリメラーゼはGenScript社にて全遺伝子配列を合成した。この際、コドン配列をタバコBY2細胞に最適化した。形質転換用ベクターとしてエストロジェンで転写誘導可能なプロモーターＯLexA−４６を有するＴｉプラスミドを用い、ＯLexA−４６の下流にＴｏＭＶ変異体のｃＤＮＡを連結し、さらにその３’末端にサテライトタバコリングスポットウイルスのリボザイム配列Ｓ-Ｒｚ、３５Ｓターミネーター（３５ＳＴ）を組み込んだタンパク質発現用ＤＮＡ断片を宿主細胞（タバコＢＹ２細胞）に導入するためのベクターpBICER8-ToMV/Taq-SRzを構築した。
（２０−３）第一形質転工程： 転写因子発現用ＤＮＡ断片の宿主細胞への導入
転写因子発現用ＤＮＡ断片導入用ベクターpER8(-Stu)を、タバコＢＹ２細胞にアグロバクテリウム法により導入した。まずpER8(-Stu)をエレクトロポレーション法によってAgrobacterium tumefacince LBA4404系統に導入した。これをスペクチノマイシン（５０ｍｇ／ｌ）を含むAB sucrose培地で前培養した。次にタバコＢＹ２細胞と混合してシャーレに移し、26℃、暗所で４２〜４８時間静置してタバコＢＹ２細胞を形質転換した。タバコＢＹ２細胞用培地にて洗浄した後、カルベニシリン（１００ｍｇ／ｌ）およびハイグロマイシン（２０ｍｇ／ｌ）を含むタバコＢＹ２細胞用固形培地に広げ、形質転換タバコＢＹ２細胞を増殖させた。
（２０−４）選抜工程： 転写因子高発現形質転換体の選抜
形質転換タバコＢＹ２細胞のうち、ノーザンブロット法の結果、転写因子の発現量の高い細胞ラインを選抜した。ここで「細胞ライン」とは、形質転換細胞を増殖させることにより形成された個々のコロニーのことを意味する。【０２０３】
（２０−５）第二形質転換工程： タンパク質発現用ＤＮＡ断片の導入
上記で得られた転写因子高発現タバコＢＹ２細胞ラインに、ウイルスベクター（pBICER8-ToMV/Taq-SRz）をアグロバクテリウム法により導入し形質転換細胞を得た。【０２０４】
（２０−６）タバコBY2細胞の培養、タンパク質発現、抽出
上記で得られた形質転換細胞を１５ｍｌの液体培養にて維持し、７日ごとに１/２００量になるように継代した。また、１/５０量になるよう継代し、継代培養後２日間前培養した細胞を、エストロジェンの終濃度が０．０１ｍMとなるように添加し、さらに２日間培養した。これを５０００rpm、１０分間遠心分離し形質転換細胞を回収し、液体窒素で凍結した後、乳鉢を用いて細胞を破砕した。これに等量の緩衝液（５０mM Tris-HCl pH７.５、５０mM
KCl）を加え懸濁し、７０℃、６０分間の熱処理を行い、１２０００rpm、３０分間遠心分離しT.aquatics由来耐熱性DNAポリメラーゼを含む上清を得た。【０２０５】
（２１）宿主A.oryzaeを用いたT.aqaticus由来耐熱性DNAポリメラーゼの発現
（２１−１）ＤＮＡの合成
T.aquatics由来耐熱性ＤＮＡポリメラーゼはGenScript社にて全ＤＮＡ配列を合成した。（配列番号41）この際、コドン配列をA.oryzaeに最適化した。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子は、５’末端配列にPmeI、３’末端配列にXmaI制限酵素サイトが入るように設計した。
配列番号41
ATGAGAGGCATGCTGCCACTGTTCGAGCCAAAGGGAAGGGTGCTGCTGGTGGACGGACACCATCTGGCCTACAGAACTTTTCACGCTCTGAAGGGACTGACCACATCACGGGGGGAGCCAGTGCAGGCTGTGTATGGATTCGCTAAAAGCCTGCTGAAGGCCCTGAAAGAGGACGGAGATGCTGTGATCGTGGTGTTCGATGCTAAGGCCCCTAGCTTTAGACATGAGGCCTACGGCGGATATAAAGCCGGACGCGCTCCAACCCCCGAGGACTTTCCAAGGCAGCTGGCCCTGATTAAGGAACTGGTGGATCTGCTGGGACTGGCTAGGCTGGAGGTGCCCGGCTACGAAGCTGACGATGTGCTGGCCTCCCTGGCTAAGAAAGCCGAGAAGGAAGGCTACGAGGTGCGCATCCTGACAGCCGACAAAGATCTGTATCAGCTGCTGTCTGACAGGATCCACGTGCTGCATCCCGAGGGGTATCTGATTACTCCTGCCTGGCTGTGGGAAAAGTACGGCCTGAGACCAGACCAGTGGGCTGATTATCGGGCCCTGACTGGCGACGAGTCAGATAACCTGCCCGGAGTGAAAGGCATCGGAGAAAAAACCGCCAGGAAGCTGCTGGAGGAATGGGGCAGCCTGGAGGCTCTGCTGAAAAATCTGGATAGACTGAAGCCCGCCATCCGGGAGAAAATTCTGGCTCACATGGACGATCTGAAGCTGTCTTGGGACCTGGCCAAAGTGAGAACCGACCTGCCTCTGGAGGTGGATTTCGCCAAGAGGAGAGAGCCAGATCGGGAACGCCTGAGGGCTTTCCTGGAGCGGCTGGAATTTGGGTCACTGCTGCATGAGTTTGGCCTGCTGGAAAGCCCAAAGGCTCTGGAGGAAGCTCCATGGCCACCTCCAGAGGGAGCCTTCGTGGGATTTGTGCTGTCCAGGAAAGAACCAATGTGGGCTGACCTGCTGGCTCTGGCTGCTGCCAGAGGGGGACGGGTGCACCGCGCCCCTGAGCCATACAAGGCTCTGCGCGACCTGAAAGAAGCCAGGGGGCTGCTGGCTAAGGATCTGTCAGTGCTGGCTCTGAGGGAGGGACTGGGACTGCCCCCTGGCGACGATCCAATGCTGCTGGCCTACCTGCTGGATCCAAGCAACACTACCCCAGAGGGAGTGGCTAGGAGATATGGAGGGGAATGGACCGAGGAAGCTGGGGAGAGAGCTGCCCTGTCCGAACGGCTGTTCGCTAATCTGTGGGGAAGGCTGGAGGGAGAGGAAAGGCTGCTGTGGCTGTACCGGGAGGTGGAACGCCCTCTGTCCGCTGTGCTGGCTCACATGGAGGCTACAGGCGTGCGCCTGGACGTGGCTTATCTGAGGGCCCTGTCTCTGGAGGTGGCTGAGGAAATCGCCAGACTGGAGGCTGAAGTGTTCCGGCTGGCCGGACATCCCTTTAACCTGAATAGCAGGGACCAGCTGGAGAGAGTGCTGTTCGATGAACTGGGGCTGCCTGCCATTGGCAAGACCGAGAAAACAGGGAAGCGCTCAACAAGCGCTGCTGTGCTGGAGGCTCTGAGGGAAGCTCACCCCATCGTGGAGAAGATTCTGCAGTACAGAGAACTGACTAAGCTGAAATCCACCTATATCGACCCCCTGCCTGATCTGATTCACCCTAGGACAGGCAGACTGCATACTCGCTTCAACCAGACAGCTACTGCCACCGGAAGGCTGAGCTCCTCTGACCCAAACCTGCAGAATATCCCTGTGAGAACCCCACTGGGACAGCGGATCAGGAGAGCTTTTATTGCTGAGGAAGGATGGCTGCTGGTGGCTCTGGATTACTCCCAGATTGAGCTGAGGGTGCTGGCTCACCTGTCTGGGGACGAAAACCTGATCCGCGTGTTCCAGGAGGGCAGGGATATTCATACAGAAACTGCCAGCTGGATGTTTGGAGTGCCTCGCGAGGCTGTGGACCCACTGATGAGGAGGGCTGCCAAGACAATCAATTTCGGAGTGCTGTATGGGATGTCCGCCCACAGGCTGTCTCAGGAGCTGGCTATCCCCTACGAGGAAGCTCAGGCCTTCATCGAAAGATACTTCCAGTCTTTCCCTAAGGTGCGGGCCTGGATTGAGAAAACCCTGGAGGAAGGCAGGAGACGGGGATACGTGGAAACACTGTTCGGCCGCAGGAGATATGTGCCTGACCTGGAGGCCAGGGTGAAGTCAGTGCGCGAGGCTGCCGAAAGGATGGCTTTCAATATGCCTGTGCAGGGAACCGCTGCCGACCTGATGAAACTGGCCATGGTGAAGCTGTTTCCACGCCTGGAGGAAATGGGGGCTAGGATGCTGCTGCAGGTGCATGATGAGCTGGTGCTGGAAGCCCCAAAGGAGAGAGCTGAAGCCGTGGCTCGGCTGGCCAAAGAAGTGATGGAAGGCGTGTACCCCCTGGCTGTGCCTCTGGAGGTGGAAGTGGGAATCGGGGAGGACTGGCTGTCCGCCAAGGAATGA
（２１−２）T.aquatics由来耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ発現用ベクターの構築
自立複製型シャトルベクター（pPTRII:TaKaRa Bio）のHindIII、KpnI制限酵素サイトにTEFプロモーター（配列番号６６）とSDターミネーター（配列番号６７）を挿入しベクターpPTR-TEF-SDtを得た。
配列番号６６
GCGGCCGCGGGTGCAAACGGTGGTCAAAGGATGGTTCAGATACAAATTAGCAACAGGCCAGGCTAGACGCGC
GACTATCCACTGCGGCAAATGGTGAGCTGCAAGCAACGGTAAGATGTGACAGGACGAGCGGTGTGCCGGGAA
AAAAATTGGAGGAGCGCAAAGCGGCGGCTGTCCCTCAGTGGTGCCCAAACGTTATCGATAGTACACCAAGCA
TGGGCAGTGAGCGGCTATACAGAGGGAATAATAGGCATATCGGCACGACTAGATTCGGTAGAAAGCATCGAA
GAGCAATTCATTGAGCATATTATCACGTGGAATGCGATAGCTGTGGCCAGGTTGAGACACCGCAAGTGAAAG
ATACACACATAGATTCTCGATTCGAGCGGTTTGCCTCCGCCACCGCAGTGCATAGCAAGCAAAGAAACGACA
GTTGGCTCATCATCCGTTACATCATTTTTTCTACTGGCTCCGCTCGGTGGGCTCCCAACGAAGCAGCAAAAA
AGTGAGAGAAAAAAACTAGCTTGGCGGGGCAACAGAAGCTAGACCCTTTGGCTCGCTTAGTCAGTGCGCCCA
CTCACTCACACTCAAAAAGGCCACCCCTCCCGCACCCTCTTCTCATCACCGTCTTCATACCACGGTTCGTCA
AGCAATCGTATCTGGTAAGCTTTGACCTCCTCGAGCGGGCTCCACTTTGCTATTTCTTGGATCTGCTCTTTC
TTTTCTCTCTACCTCTTTTTCTAACCTCTCTTCAGAAAGTTCAACCGTACTTCACTCCATCTTCCTACGTCA
CTCTAGA
配列番号６７
TAAAGCGGCGTGCTCTGCACATAACACGTGTCGTGTTTGGGTTCGGTATGGGTAATGGCGAATGGGGACATGCATTTATGGGATAGGGGGCTGGGTTGGTGTAATCAAATGTGCATACAGACCAGCTGATACGAATACTACAACTTACCCCGACACACGCATTCATGTGACGCCCAACACCTCGTCTAACTCATCGGGGCAACTCACCTCAATCCGATTCAGCCTCCCGG
TEFプロモーターはAureobasidium
pulluans由来、SDターミネーターはColletotrichum
orbiculare由来であり、共に抽出したゲノムDNAをテンプレートとしPCRにて増幅を行った。（配列番号６８、６９、７０、７１）TEFプロモーターとSDターミネーターの間にはPmeI、XmaI制限酵素サイトが入るように設計した。
配列番号６８  GCGGCCGCGGGTGCAAACGGTGGTCAAA
配列番号６９  ATATCTAGAGTGACGTAGGAAGATGGAG
配列番号７０  GTTTAAACAGATCTCCCGGGTAAAGCGGCGTGCTCTGCAC
配列番号７１  TATGGTACCGGGAGGCTGAATCGGAT
次にpPTR-TEF-SDtのPmeI、XmaI制限酵素サイトに  T.aquatics由来耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を挿入しベクターpPTR-TEF-Taqを得た。また、FLAGタグを付加するため、ベクターpPTR-TEF-Taqをテンプレートにし、５’末端配列にPmeI、３’末端配列にXmaI制限酵素サイトが入るように設計したプライマー（配列番号７２、７３）を用いて増幅、pPTR-TEF-SDtのPmeI、XmaI制限酵素サイトに挿入しベクターpPTR-TEF-FLTaqを得た。
配列番号７２
ATAGTTTAAACATGGATTATAAGGATGACGATGACAAGATGAGAGGCATGCTGCCAC
配列番号７３
ATGGTACCGGGAGGCTGAATCGGAT
（２１−３）A.oryzaeの形質転換
ベクターpPTR-TEF-FLTaqを糸状菌（Aspergillus oryzae）へ導入した。形質転換はプロトプラスト-PEG法を用いた。CD固形培地（1 L 当たり：NaNO3
6.0g、KCl 0.52g、KH2PO4 1.52 g、1M MgSO4・7H2O 2 ml、Glucose
10.0g、FeSO4・7H2O 1.0mg、ZnSO4・7H2O 8.8mg、CuSO4・5H2O 0.4mg、Na2B4O7・10H2O
0.1mg、(NH4)6Mo7O24・4H2O 0.05mg、Agar 20.0g、1N KOH でpH6.5
に調整）にてA.oryzaeを30℃培養し、これを10 mlの0.1％ Tween 80、0.8％ NaCl に懸濁し、ガラスろ過器（3G2）でろ過し、ろ液を集めた。3,000rpm、5分間遠心して分生子を沈澱させ、上清を除去した。10ml の0.1％ Tween80 で分生子を2回洗浄した後、適量の滅菌水に懸濁し、胞子懸濁液とした。
100mlのCD液体培地にA.oryzaeの胞子懸濁液を植菌し、30℃で20 時間振盪培養した。
ガラスろ過器（3G1）でろ過して菌糸を集め滅菌水で洗浄後、スパーテル等で押さえて菌糸から水分を十分にいた。適当量の菌糸を、50ml ポリプロピレン製遠心管中のプロトプラスト化溶液に加えて懸濁し、30℃、2 時間穏やかに振盪、プロトプラスト化した。これをガラスろ過器（3G2）でろ過し、ろ液を2,000rpmで5分間遠心してプロトプラストを集め、0.8M NaClで2回洗浄した。プロトプラストを2×108/mlとなるようにSolution 1（0.8 M NaCl、10mM CaCl2、10mM Tris-HCl (pH8.0)）に懸濁し、0.2容量のSolution 2（40％ (w/v) PEG4000、50mM CaCl2、50mM Tris-HCl (pH8.0)）を加えて穏やかに懸濁した。0.2 mlのプロトプラスト懸濁液に20μgのpPTR-TEF-FLTaqを加え氷中で30分間静置した。1 mlのSolution
2を加え、穏やかに懸濁し室温で15分間静置した。8.5mlのSolution 1を加え、穏やかに懸濁した。次に、遠心してプロトプラストを集め上清を除き、プロトプラストを0.2mlのSolution 1に懸濁した。プロトプラスト懸濁液を5mlのCD軟寒天選択培地（CD培地のagarを0.5％にし、0.8M
NaCl、0.1μg/ml Pyrithiamine（TaKaRa Bio）を添加し50℃で保温したもの）。に懸濁し、CD 選択培地にプロトプラストが均一に分散するように播種し30℃、7 日間培養した。
（２１−４）A.oryzaeの培養、T.aquatics由来耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの生産
CD培地６００mlに形質転換体を接種し、３０℃にて４日間培養を行った。これらを５０００rpm、１０分間遠心分離し集菌し、破砕用緩衝液（５０mM Tris-HCl pH７.５、５０mM KCl）に懸濁し、０.５mmガラスビーズを用いて菌体を破砕した後７０℃、６０分間の熱処理を行い、１２０００rpm、３０分間遠心分離し耐熱性DNAポリメラーゼを含む上清を得た。これにFLAG Tagged protein
Immunoprecipitation Kit (Sigma)を用いて精製を行い、T.aquatics由来耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物を得た。
（２１−５）PCRによる非特異的核酸混入の検査
図７は上記の得られた耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用い、非特異的核酸混入が認められるかを調査した実例を示すアガロース電気泳動の写真である。レーン１はマーカー、レーン２はテンプレートを添加せず、レーン３は大腸菌DNAをテンプレートとしてPCRを行った。プライマーは配列番号８５、８６を用いて、PCR温度条件、PCR溶液組成は（６−３)と同様に行い、４５サイクルにてPCRを行った。これより、大腸菌をテンプレートとしたものはバクテリア１６S rRNA由来遺伝子の増幅産物が検出され、テンプレートを加えなかったものはバクテリア１６S rRNA由来遺伝子の増幅産物が検出されなかった。
（２２）非表示法（masked Primer Dimer法）を用いた各種耐熱性DNAポリメラーゼによるリアルタイムPCR 
上記の得られた耐熱性DNAポリメラーゼ調製物を用い、非表示法を用いてリアルタイムPCRを行った。リアルタイムPCRでは各々、S.cerevisiaeを宿主として生産したT.aquaticus由来耐熱性DNAポリメラーゼ調製物（図８、A、図９、A）、変異P.furiosus由来耐熱性DNAポリメラーゼ調製物（図８、B、図９、B）、変異T.gorgonarius由来耐熱性DNAポリメラーゼ調製物（図８、C、図９、C）、P.pastorisを宿主として生産したT.aquaticus由来耐熱性DNAポリメラーゼ調製物（図８、D、図９、D）、Tobacco BY-2を宿主として生産したT.aquaticus由来耐熱性DNAポリメラーゼ調製物（図８、E、図９、E）を使用した。また図８、A、B、C、D及びEは増幅曲線、図９、A、B、C、D及びEは融解曲線を示す図である。実線はテンプレートを添加したもの、点線はテンプレート未添加のものである。リアルタイムPCR試薬は（１７）と同様である。リアルタイムPCRのプログラムは９４℃ １分間、５０℃
３０秒間、７２℃ １分間、８４℃ ２秒後蛍光値を検出、を６０回繰返した。リアルタイムPCR結果より、非表示法を用いた事でリアルタイムPCRでの定量性を害する非特異的増幅産物やバクテリアDNAの増幅曲線のシグナルを検出することなく解析可能であった。【０２０６】
（実施例２：非表示法による定量同定Ａ）
以下、宿主S.cerevisiaeにより生産したT.aquaticus由来耐熱性DNAポリメラーゼをe-DNAPと記す。【０２０７】
上記の得られたe-DNAPを用いて非表示法による検体の定量同定を試みた。リアルタイムPCR機器はLightCycler 1.5 (ロシュ・ダイアグノスティックス社)およびRotorGene6000 (キアゲン社)、リアルタイムPCR用試薬は下記構成にて、以下に記載のバクテリア検出用のユニバーサルプライマーを用い、全量20μLの系で行った。
Forward Primer:  CTCCTACGGGAGGCAG  （配列番号４３）
Reverse
Primer:  ACTACCAGGGTATCTAATCCTG  （配列番号４４） 
e-DNAP(5 units/μL ) 1μL, 
E.coli genomic DNA
templateまたは Water PCR grade 2μL, 
SYBR Green I (TAKARA) 300倍希釈液2μL,
PCR primers（10μΜ）0.8μL each, 
10×Buffer (500mM KCl,
100mM Tris-HCl)2μL, 
25mM MgCl2 1μL,
2mM dNTP mix 2μL, 
Water PCR grade 8.4μL
また、リアルタイムＰＣＲのプログラムは表１記載の条件にて行った。【０２０８】
【表１】
0005583602.tif 000003
図１３及び図１４は表１プログラム条件により解析を実施した増幅曲線及び融解曲線図である。
図１３より、テンプレートを含まない状態でも増幅曲線が現れ、図１４より、約76℃付近にプライマーダイマーの融解曲線が認められた。【０２０９】
【表２】
0005583602.tif 000004
図１４の融解曲線結果を参考とし、蛍光検出時の温度をプライマーダイマーとE.coliの中間である８４℃に設定した表２記載の条件にてリアルタイムＰＣＲを行った。【０２１０】
図１５（Ａ）は表２プログラム条件によるリアルタイムＰＣＲ結果の増幅曲線図である。この方法によりテンプレートに水を用いた場合にはプライマーダイマーを表示することなく、テンプレートとしてＥ．ｃｏｌｉを加えたものでは目的増幅産物の正常な増幅曲線が認められた。【０２１１】
（実施例３：非表示法による定量同定Ｂ）
本発明にかかるe-DNAPおよび非表示法を用いて、各種検体中に存在する感染菌の定量同定を試みた。細菌検出用のリアルタイムPCR用試薬およびプライマー構成は（実施例２）と同じである。真菌検出用のリアルタイムPCR用試薬およびプライマー構成は、細菌を宿主として製造した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしてrTaq DNA polymerase (ToYoBo)を用い、以下に記載の真菌検出用のユニバーサルプライマーを用いる以外は、（実施例２）と同じである。
Forward Primer:  GAATGAGTACAATGTAAATACCTTAACG  （配列番号９）
Reverse Primer:  GCTTTCGCAGTAGTTAGTCTTCA  （配列番号４５）
感染菌の濃度単位は一般的にCFU/mlが用いられるため、DNA濃度で計算されるPCR定量法との単位を合わせるために、McFarland比濁法を介して計算を試みた。具体的には、E. Coli, C.Albicansそれぞれを生理食塩水に懸濁した後、0.5
McFarlandの中央値に合わせた菌浮遊液を作り、それぞれを培地に展開してCFU/mlを計算すると同時に、DNAを抽出してDNA/mlを計算し、そのDNA溶液でリアルタイムPCRの検量線を描いた。
CFU/mlとDNA/mlの換算値を以下に示す。
・E.Coli :
0.5 McFarland = 1.3×108 CFU/ml = 8.6μg/ml (8.6 ng/μl)
・C.Albicans
: 0.5 McFarland = 2.5×106 CFU/ml = 18.0μg/ml (18.0 ng/μl)
また、検量線を描いた結果、以下の結果が得られた。
・E.Coli : 相関係数 -1.00で、計算式：cycle数＝-
4.1×concentration + 14.6
・C.Albicans
: 相関係数 -1.00で、計算式：cycle数＝- 4.4×concentration + 14.5 
陽性 and 定量コントロールとして、以下の２つを測定毎に定量する。
・E.Coli :
1.3×105 CFU/μl = 8.6
ng/μl を、2μl        （20μlの測定系）
・C.Albicans
: 2.5×103 CFU/μl =
18.0 ng/μl を、2μl  （20μlの測定系）
以上より、本システムにて細菌、真菌が陽性に出た場合、以下の概算式で定量を行う。
・細菌（E. Coli 換算値）：有効数字 2ケタ
1.3×108×[10の{1-(cycle数-control cycle数+4.1)÷4.1}乗] CFU/ml
・真菌（Candida Albicans 換算値）：有効数字 2ケタ
2.5×106÷18×[10の{3-(cycle数-control cycle数+7.7)÷4.4}乗] CFU/ml  
（１）検出対象の高感度定量方法を用いた生活用水の検査
次に、構築した「検出対象の高感度定量方法」の実用性を評価する目的で、以下の4種の生活用水について検査を行った。
（Ａ）水道水：富山大学附属病院内の上水道水。
（Ｂ）湧水：昭和60年、環境庁から「全国名水100選」の１つに選ばれた富山の名水。
（Ｃ）温泉水：加温循環の温泉水。添加物は無し。
（Ｄ）空調循環水：富山大学附属病院内の空調循環水。【０２１２】
水道水、湧水、温泉水はそれぞれ25ml、空調循環水は１mlを、8000 rpm, 20 min 遠心し、ペレットからInstaGene Matrix（Bio-Rad）を用いてDNAを抽出した。【０２１３】
それらDNA抽出液をテンプレートとして感染菌検査を行った結果、4種の生活用水の何れからも真菌は検出されなかった（図１５（Ｂ）のＢ）。しかし、細菌に関しては、水道水と湧水（名水）に細菌は存在しなかったが、温泉水と空調循環水は陽性と出た（図１５（Ｃ）のＢ、Ｃ）。それらを定量計算した結果、以下の測定値を得た。
・温泉水：1.2 CFU/ml（E.Coli換算値）
・空調循環水：78 CFU/ml（E.Coli換算値）
この結果、温泉水には量的には少ないが細菌が存在し、また、空調循環水には高濃度で細菌が存在することが判明した。【０２１４】
（２）検出対象の高感度定量方法を用いた食品の検査
食品の細菌汚染や真菌汚染は食中毒症の直接の原因となるため、社会的にも重要な検査である。今回、黄色ブドウ球菌による食中毒のリスクの高いシュークリームを検体として用いた。尚、「古いシュークリーム」とは室温にて数日放置したものを使用し、コントロール（新しいシュークリーム）として冷蔵（5℃以下）保存してある賞味期限内のシュークリームを使用した。DNA抽出に際しては、先ず各シュークリームのクリーム部分のみ27.4g採取し、減菌生理食塩水水20mlに添加し遠心分離して上清を除去し、この操作を3回繰り返すことで油成分を除去した。その後、遠心分離したペレットからInstaGene
Matrixを用いてDNAを抽出し、それらをテンプレートとして感染菌検査を行った。【０２１５】
結果、古いシュークリーム、コントロール共に非常に微量の真菌がほぼ同程度検出された（図１６）。シュークリームの皮はイーストで膨らませていることを考慮すれば、真菌による新たな汚染は無いものと考えられる。【０２１６】
細菌汚染に関しては、新しいシュークリームでは細菌は全く検出されなかったが、古いシュークリームの場合、相当数の細菌の増殖を確認した（図１７）。その増殖量を定量計算した結果、以下の測定値を得た。【０２１７】
古いシュークリーム：1.5×107
CFU/(クリーム)g （E.Coli換算値）
（３）検出対象の高感度定量方法を用いた敗血症の検査
次に、検出対象の高感度定量方法を用いた敗血症の検査を試みた。今回、敗血症患者検体として、真菌血症の患者Ａ（Candida Albicansによる敗血症）、細菌血症の患者Ｂ（Bacillus
speciesによる敗血症）それぞれの血液検体を使用した。DNA抽出に際しては、患者Ａ,Ｂそれぞれの血液検体2μlと、更に患者Ｂの血液培養ボトルから2μlを採取し、それぞれInstaGene
Matrixを用いてDNAを抽出し、それらをテンプレートとして感染菌検査を行った。【０２１８】
その結果、患者Ａでは細菌感染はみられず、真菌感染のみ確認された（図１８）。この真菌感染を定量計算した結果、以下の測定値を得た。
・患者Ａ：9.7×104
CFU/（血液）ml  （Candida Albicans 換算値）
また、患者Ｂでは真菌感染はみられず、微量の細菌感染のみ認められた（図１９）。また、血液培養ボトルでも確認したところ、多量の細菌増殖を確認した。この細菌感染を定量計算した結果、以下の測定値を得た。
・患者Ｂ：2.0×105
CFU/（血液）ml  （E.Coli 換算値）
また、図２０はMRSA DNAを鋳型としMRSAに特異的な以下のSpa, mecA primerを用いて行ったリアルタイムPCR結果である。
Spa Forward Primer: 
GCGATTGATGGTGATACGGTT  （配列番号４６）
Spa Reverse Primer: 
AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC  （配列番号４７）
mecA Forward Primer: 
AAAATCGATGGTAAAGGTTGGC  （配列番号４８）
mecA Reverse Primer: 
AGTTCTGCACTACCGGATTTGC  （配列番号４９）
上記実施例に使用したユニバーサルプライマーに加えてMRSA特異的なプライマーを併用することにより、特定の感染菌に的を絞った検査の構築が可能であった。【０２１９】
（実施例４：検出対象の高感度定量方法を応用した薬剤感受性試験）
本発明にかかるe-DNAPおよび非表示法を用いた高感度定量方法を応用して、迅速な液相の薬剤感受性試験を試みた。現行の薬剤感受性試験では結果を得るまでに一般的に数日を要するが、本発明にかかる高感度定量方法を応用すると僅か４〜６時間で結果を得ることが出来る。尚、液相の薬剤感受性試験については既に先行特許に記載されている（WO2002/052034）が、高感度検出法ではない為、一旦培養した後に改めて感受性試験をスタートしなければならず、結果を得るまでに早くても１日程度はかかることになる。【０２２０】
（１）培養
液体培地（ＢＨＩ：Brain Heart Infusion）にそれぞれ等量ずつの検体（敗血症の血液など）を注入し、抗生剤添加あるいは無添加の条件の下、培養前、培養２時間後、培養４時間後に培地を回収し、菌体を遠沈・ペレット化して、それぞれＤＮＡを抽出する。また、ＤＮＡの抽出は自動核酸抽出装置を使用するのが望ましい。【０２２１】
（２）リアルタイムPCRによる菌の定量
細菌検出用のリアルタイムPCR用試薬・条件及びプライマー構成は（実施例２）と同じである。【０２２２】
（３）判定方法
培養前の定量結果を０とし、抗生剤無添加にて培養２時間後、４時間後のそれぞれの定量結果を１００として（抗生剤無添加時の増菌率を１００％として）計算した場合、抗生剤添加での培養２時間後、４時間後の定量結果より増菌率を求めた。
例えば、培養前の菌量をN0h、抗生剤無添加培養２時間後の菌量をN2h、抗生剤添加培養２時間後の菌量をK2hとすると、
抗生剤添加２時間後の増菌率＝（K2h−N0h）/（N2h−N0h）×１００  （％）
と計算できる。或いは、増菌率の比較ではなく、菌量そのものを直接比較しても良い。【０２２３】
（４）結果１：菌量そのものの値を比較した場合
検出されたStaphylococcus epidermidisに対し、ゲンタマイシン（GM）10 μg/mL、エリスロマイシン（EM）10 μg/mLそれぞれの薬剤感受性を培養２時間後、４時間後にてそれぞれ評価した。その結果、２時間後、４時間後共にEMには感受性があるが、GMには感受性の無いことが判明した（図２１（Ａ））。但しStaphylococcus epidermidisは２時間の培養では増菌が少ない為、より正確に評価するには４時間後の方がよい。【０２２４】
（５）結果２：抗生剤無添加時の増菌率を１００％として計算した場合
検出されたBacillus cereusに対し、セファゾリン（CZ）10 μg/mL、アンピシリン（AP）10 μg/mL、エリスロマイシン（EM）10 μg/mLそれぞれの薬剤感受性を培養２、３、４時間後にてそれぞれ評価した。その結果、増菌の多い４時間後を評価すると、APには強い感受性があり（増菌率０％）、CZにもある程度の感受性が認められる（増菌率１６％）が、EMには殆ど感受性が無い（増菌率７６％）ことが分る（図２１（Ｂ））。このように感受性の“程度”については菌の増殖の速さに左右されるため統一した時間設定が求められるが、抗生剤に対し強い感受性を示す、或いは全く感受性を示さないなどの評価は、培養２時間後などの早い段階でも判定可能であった。【０２２５】
（実施例５：検出対象の高感度検出方法を用いた子宮内感染症の羊水検査）
本発明にかかるe-DNAPおよび非表示法を用いた高感度検出法を用いて、迅速且つ簡便な子宮内感染症の羊水検査を行った。早産の最大の原因は子宮内感染症であり、胎児が死に至る危険を有するため、感染の有無を迅速に判定する検査法が求められている。子宮内感染症の感染微生物とは、細菌、真菌に加え、マイコプラズマやウレアプラズマの感染率が非常に高い。マイコプラズマ属・ウレアプラズマ属の塩基配列は細菌とは非常に異なり、細菌のユニバーサルプライマーでは検出できないため、それぞれのプライマーを別途用いる必要がある。【０２２６】
（１）プライマーセットおよびPCR用試薬
細菌および真菌検出用のＰＣＲ用試薬およびプライマー構成は、（実施例３）と同じである。
以下にマイコプラズマ属・ウレアプラズマ属の検出用のプライマー構成を示す。マイコプラズマ属・ウレアプラズマ属の検出にはnested PCR法を用いた。
マイコプラズマ属・ウレアプラズマ属検出にはe-DNAPを使用し、（実施例２）と同じＰＣＲ用試薬を用いた。PCRプログラムは（実施例２）と同じである。
Mycoplasma
Forward Primer: GATGATCATTAGTCGGTGG  （配列番号５０）
Mycoplasma Reverse
Primer: CTACCTTAGGCGGTCGTC  （配列番号５１）
Mycoplasma Forward
nested Primer: GACATCCTTCGCAAAGCTAT  （配列番号５２）
Mycoplasma Reverse
nested Primer: CAGTTACCCAGGCAGTATCTC  （配列番号５３）
Ureaplasma Forward
Primer: GAACGAAGCCTTTTAGGC  （配列番号５４）
Ureaplasma Reverse
Primer: GATACAGCTAGACGTTAAGCATCTA  （配列番号５５）
Ureaplasma Forward
nested Primer: TAACATCAATATCGCATGAGAAG  （配列番号５６）
Ureaplasma
Reverse nested Primer: CAGTACAGCTACGCGTCATT  （配列番号５７）
（２）PCR検出法
上記のプライマーセットにより、羊水中に細菌、真菌、マイコプラズマ属、ウレアプラズマ属のいずれかが存在するか否かを迅速且つ簡便に判定できる。検出法は、リアルタイムＰＣＲ法を用いても良いし、ＰＣＲ産物をアガロースゲルに電気泳動して確認しても良い。e-DNAPを用いる（実施例３）の方法により、高感度に細菌および真菌を検出でき、また、nested
PCR法により高特異度にマイコプラズマ属およびウレアプラズマ属を検出できる。【０２２７】
（３）結果
子宮内感染症疑いの羊水検体１より、細菌の感染が確認された（図２２（Ａ））。また、切迫早産の羊水検体２からは、ウレアプラズマ属の感染が確認された（図２２（Ｂ））。これらの検査は２時間程度で迅速且つ簡便に行うことが出来る。また、本実施例のプライマーセットは例えば培養細胞の培養液中のコンタミネーション（細菌・真菌・マイコプラズマ）など、生物実験環境におけるコンタミネーションの検査に用いることも可能である。【０２２８】
検出されたウレアプラズマ属については、その後更に増幅産物の塩基配列を解析した結果、Ureaplasma parvumであることを確認した。この様に、検出された細菌、真菌、マイコプラズマ属およびウレアプラズマ属のPCR増幅産物をSequencingして種属レベルまで同定することも出来る。または、複数の増幅産物のTm値の組合せを解析したり（WO2007/097323）、或いはユニバーサルプライマーによる増幅産物の更に内側に菌種特異的なnestedプライマー（複数のプライマーによるmultiplex PCRも可能）を用いたりすることで、種属を同定することも可能である。【０２２９】
（実施例６：検出対象の高感度検出方法とOne Step nested PCR法とを併せた検出法）
本発明にかかるe-DNAPおよび非表示法を用いた高感度検出方法に加え、“入れ子増幅法”の応用または伸長時間の工夫により１回の試行でnested PCRを行えば、高感度と迅速性を保ちながら更に高特異度な検出が可能となる。
（１）プライマーセットおよびPCR用試薬
細菌を宿主として製造した市販の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの多くは、E.Coliをその宿主とする。従って、E.Coliやその属に近い菌種を高感度に検出しようとしてPCRを行えば、自ずと偽陽性のリスクが高くなる。そのような問題を解決し、E.Coli を高感度・高特異度で検出するために、e-DNAPを用いた高感度検出方法と共に、“入れ子増幅法”の応用または伸長時間の工夫によりE.Coli特異的プライマーでOne Step semi-nested PCRを行った。尚、ＰＣＲ用試薬は（実施例３）と同じである。以下にE.Coliに特異的なsemi-nestedプライマーセットを示す。
E. Coli specific
Forward Primer: TAACGGCTCACCTAGGCGA  （配列番号５８）
E. Coli specific Reverse
Primer: GTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTG  （配列番号５９）
E. Coli specific
semi-nested Primer: GCAATATTCCCCACTG  （配列番号６０）
配列番号５８、５９のプライマーのTm値はそれぞれ６５℃、配列番号６０のsemi-nestedプライマーのTm値は５５℃となるように設計した。
（２−１）“入れ子増幅法”の応用によるOne Step nested PCR法
配列番号５８、５９のプライマーによる増幅産物Ｉの長さは５４８ｂｐであり、semi-nested PCR増幅産物ＩＩの長さは１１０ｂｐである。この様に、増幅産物の長さに明らかな差をつけて、それぞれの増幅産物のTm値の差が大きくなるようにプライマーの位置を設計した。その結果、増幅産物ＩのTm値は８７℃、増幅産物ＩＩのTm値は８３℃となった。但し、増幅産物のGC%もＴｍ値に影響するため、プライマー設計においては増幅産物のGC%についても十分に検討しなければならない。また、Tm値はPCR Bufferの塩濃度に影響されるため、塩濃度は常に一定に固定すべきである。【０２３０】
次にリアルタイムＰＣＲのプログラムは表３記載の条件にて行った。この条件設定では、e-DNAPおよび非表示法を用いた高感度検出方法に加え、“入れ子増幅法”の応用により１回の試行でnested PCRを行うことが出来る。尚、プログラム中にはnestedプライマーが結合するためのshiftingの設定を加えてある。【０２３１】
【表３】
0005583602.tif 000005
（２−２）伸長時間の工夫によるOne Step nested PCR法
配列番号５８、５９のプライマーによる増幅産物Ｉの長さは５４８ｂｐであり、semi-nested PCR増幅産物ＩＩの長さは１１０ｂｐである。この様に、増幅産物の長さに明らかな差をつけるようにプライマーの位置を設計した。【０２３２】
次にリアルタイムＰＣＲのプログラムは表４記載の条件にて行った。この条件設定では、e-DNAPおよび非表示法を用いた高感度検出方法に加え、伸長時間の工夫により１回の試行でnested PCRを行うことが出来る。【０２３３】
【表４】
0005583602.tif 000006
（３）結果
semi-nestedプライマーを含む３つのプライマーを混合し、“入れ子増幅法”の応用および伸長時間の工夫について、以下のプログラムにてリアルタイムＰＣＲを行い、nested PCRにて上記増幅産物Ｉ、または増幅産物IIのみが増幅されるか増幅産物のＴｍ値やその大きさにより確認した。
（３−１）外側の増幅産物Ｉのみが増幅されることの確認
表３および表４のAmplification 1のプログラム部分のみをそれぞれ50 cycle試行する。ポイントはアニーリング温度の７０℃である。外側のプライマーのＴｍ値は６５℃、内側のsemi-nestedプライマーのＴｍ値は５５℃なので、７０℃のアニーリングでは外側のプライマーしか結合しない。その結果、外側の増幅産物Iのみが増幅される。実験結果では確かに増幅産物ＩのＴｍ値である８７℃かつ５４８ｂｐの増幅産物のみが増幅されている（図２３（Ｂ）、図２５）。
（３−２）内側の増幅産物IIのみが増幅されることの確認
表３および表４のAmplification 2のプログラム部分のみを50 cycle試行する。
表３の“入れ子増幅法”の応用におけるポイントはアニーリングの６０℃と、Denaturationの８５℃である。６０℃のアニーリングではsemi-nestedプライマーを含めた全てのプライマーが結合するが、Denaturation温度が８５℃だと内側の増幅産物ＩＩ（Ｔｍ値８３℃）はdenatureしても、外側の増幅産物Ｉ（Ｔｍ値８７℃）はdenatureしない。その結果、内側の増幅産物IIのみが増幅される。実験結果では確かに増幅産物ＩＩのＴｍ値である８３℃かつ１１０ｂｐの増幅産物のみ（他はプライマーダイマー）が増幅される（図２３（Ａ）、図２５）。【０２３４】
表４の伸長時間の工夫におけるポイントは２秒の伸長時間である。６０℃のアニーリングではsemi-nestedプライマーを含めた全てのプライマーが結合するが、伸長時間が２秒だと内側の増幅産物ＩＩ（１１０ｂｐ）は伸長しても、外側の増幅産物Ｉ（５４８ｂｐ）は伸長できない。その結果、内側の増幅産物IIのみが増幅される。実験結果では確かに増幅産物ＩＩのＴｍ値である８３℃かつ１１０ｂｐの増幅産物のみ（他はプライマーダイマー）が増幅される（図２３（Ａ）、図２５）。
（３−３）e-DNAPおよび非表示法を用いた高感度定量方法であることの確認
表３および表４のプログラム設定でリアルタイムＰＣＲを行った結果、E.Coliの存在下のみで増幅を認め、distilled water (D.W.)、Staphylococcus
aureus（S.aureus）、Human
DNAでは全く増殖を認めなかった（図２４（Ａ）：表３および表４のAmplification 2の増幅のみ表示）。つまり、計60 cycle回してもE. Coli以外は全く増幅を認めず、e-DNAPおよび非表示法を用いて高感度定量が可能であることを確認した。【０２３５】
（３−４）One Step nested PCRの確認
E. ColiのDNAをテンプレートとし、表３および表４のプログラム全体を通して増幅された産物はただ１つであり、その増幅産物のＴｍ値は８３℃かつ１１０ｂｐ、すなわち内側の増幅産物ＩＩのみであった（図２４（Ｂ）、図２５）。この結果、“入れ子増幅法”の応用および伸長時間の工夫により、一回の試行（One Step）でnested PCRが可能であることを確認した。【０２３６】
（３−５）結果まとめ
以上の結果、e-DNAPおよび非表示法を用いて高感度定量方法を行うと同時に、“入れ子増幅法”の応用および伸長時間の工夫によるOne Step nested PCR法を組み合わせれば、ＰＣＲプログラムの工夫のみで、高感度と迅速性を保ちながら更に高特異度な検出が可能となることを確認した。尚、本実施例のnested PCRではE.Coliの特異的プライマーを組み合わせたが、例えば内・外共にバクテリアのユニバーサルプライマーを組み合わせる方法や、外側をバクテリアのユニバーサルプライマーにし、内側を菌種特異的プライマー（複数の特異的プライマーを用いたmultiplex PCRも行える）にする組合せも可能である。また、入れ子増幅法と伸長時間の工夫の両方を一緒にPCRプログラムに組み込むことで、より確実にOne Step nested PCR法を行うことが出来る。【０２３７】
（実施例７：e-DNAPを用いた検出対象微生物の高感度定量同定方法）
未知の感染微生物に対し、複数のユニバーサルプライマーでＰＣＲを行い、複数の増幅産物のＴｍ値の組合せを解析することで感染微生物を迅速・簡便に同定する（WO2007/097323）。感染微生物がバクテリアの場合、本同定法ではバクテリアのユニバーサルプライマーを用いるため、e-DNAPを使用しなければ偽陽性のリスクが生じ、また高感度の検出が出来ない。すなわち、本実施例によるバクテリアの同定にはe-DNAPを使うことが望ましい。また、測定機器はRotorGene6000（キアゲン社）を使用することが望ましい。
（１）プライマーセットとＰＣＲ用試薬
バクテリアのユニバーサルプライマーとして、配列番号１５〜２８を使用する。これにより、７つのＰＣＲ増幅産物が出来る。ＰＣＲ用試薬やＰＣＲ条件は（実施例２）に同じ。
（２）解析方法
敗血症患者の血液検体からDNAを抽出した後、上記リアルタイムＰＣＲを試行して、７つのＰＣＲ増幅産物のそれぞれのＴｍ値を得る。その７つのＴｍ値の組合せを、以下のデータベースと照合する。この時、リアルタイムＰＣＲの試行による定量結果も得られる。
（３）データベース
富山大学附属病院にて過去１年間に敗血症の陽性検体から抽出された４５種のバクテリアそれぞれについて、７つのＴｍ値の組合せが入力されている。尚、７つのＴｍ値とは、配列番号１５〜２８のプライマーを用い、（実施例２）と全く同じＰＣＲ用試薬・ＰＣＲ条件にて取得したものである。
（４）同定方法
患者検体から得られた７つのＴｍ値の平均値を算出し、その平均値からの相対値（絶対値ではない為、±が生じる）を算出する。それら７つの相対値をD1ref〜D7refと記載する。同様に、データベース中のそれぞれのバクテリアについても算出し、それら７つの相対値をD1db〜D7dbと記載する。そして、データベース中の全てのバクテリアに対し、以下の計算を実施する。【０２３８】
【数２】
0005583602.tif 000007
このDist.が０に最も近いバクテリアをデータベースより導き出し、それを検体中の起因菌として同定する。以上の方法はコンピュータの同定ソフトウェア中にアルゴリズムとして組み込んでおり、患者検体から得られた７つのＴｍ値を打ち込むだけで瞬時に同定結果を得ることが出来る。本実施例のアルゴリズムを用いると、試行回毎のＴｍ値の測定誤差は完全に補正される。つまり、測定毎に何℃の誤差が生じても同定には影響しない。この方法で補正できない誤差は、同じ試行回中でサンプル間に生じる測定誤差である。しかし、例えばリアルタイムＰＣＲ機器の１つであるRotorGene6000（キアゲン社）を用いると、サンプル間の測定誤差が±0.01℃なので、誤差は殆ど影響を及ぼすこと無く、正確な同定が可能となる。
（５）結果
患者検体から得られた未知のバクテリアにおける７つのＴｍ値はそれぞれ、
84.98,  84.45,  84.84,  84.31, 
81.20,  81.83,  81.12
であり、同定ソフトウェアによる算出の結果、Dist.=0.05であるKlebsiella pneumoniaeをDist.=0に最も近い起因菌として瞬時に同定することが出来た（表５：同定ソフトウェアによる算出結果）。また、定量も可能であった。【０２３９】
【表５】
0005583602.tif 000008
また、通常の細菌検査より、この患者検体からKlebsiella pneumoniaeが検出され、同定結果が通常法と同じであることを確認した。
尚、Klebsiella pneumoniaeのデータベース上の７つのＴｍ値はそれぞれ、
85.02,  84.48,  84.45,  84.29, 
81.20,  81.84,  81.14,  であった。【０２４０】
本実施例の同定方法はバクテリアに限らず、真菌やその他の生物種の同定にも利用できる。また、mecAなどの抗生剤耐性遺伝子の有無を併行して調べることは臨床上有用である。
【産業上の利用分野】
【０２４１】
本発明にかかる検出対象生物の定量／及びまたは同定方法は、生活用水検査、食品検査、敗血症検査、薬剤感受性試験などに実用可能である。基本的に、本来、無菌的であるべき検体で、感染症に関わるものであれば、他の検体にも応用可能である。例えば、髄液検査や、羊水検査（子宮内感染症）等は社会貢献度が高く、特に本システムの迅速性（2時間以内に結果判明）も役立つと考えられる。
【０２４２】
また、ヒトに関わる分野だけでなく、家畜の感染症などの獣医分野の検査、或いは細胞培養液のコンタミネーションなど生物実験環境の検査も含め、広い範囲での実用化が可能である。
【図１】
0005583602.tif 000009
【図２】
0005583602.tif 000010
【図３】
0005583602.tif 000011
【図４】
0005583602.tif 000012
【図５】
0005583602.tif 000013
【図６】
0005583602.tif 000014
【図７】
0005583602.tif 000015
【図８】
0005583602.tif 000016
【図９】
0005583602.tif 000017
【図１０】
0005583602.tif 000018
【図１１】
0005583602.tif 000019
【図１２】
0005583602.tif 000020
【図１３】
0005583602.tif 000021
【図１４】
0005583602.tif 000022
【図１５】
0005583602.tif 000023
【図１６】
0005583602.tif 000024
【図１７】
0005583602.tif 000025
【図１８】
0005583602.tif 000026
【図１９】
0005583602.tif 000027
【図２０】
0005583602.tif 000028
【図２１】
0005583602.tif 000029
【図２２】
0005583602.tif 000030
【図２３】
0005583602.tif 000031
【図２４】
0005583602.tif 000032
【図２５】
0005583602.tif 000033