(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９６番目のアミノ酸および２９８番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸がシステイン残基に置き換えられたＦｃ領域をＦｃ受容体結合部分として含む、エフェクター機能を有するポリペプチド。
【請求項２】
細胞結合部分をさらに含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
細胞結合部分が、サイトカイン受容体、細胞接着分子、がん細胞表層分子、がん幹細胞表層分子、血液細胞表層分子、ウイルス感染細胞表層分子からなる群から選択される少なくとも１種の分子を認識またはこれと結合する、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
細胞結合部分が、抗原ＣＤ３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ５２、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＧＦ受容体、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＧＤ３、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＴＮＦα受容体、ＶＥＧＦ受容体、ＣＴＬＡ−４、ＡＩＬＩＭ／ＩＣＯＳ、Ｂ７ｈ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、インテグリン分子からなる群から選択される少なくとも１種の分子を認識またはこれと結合する、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸を含むベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターを有する宿主細胞または宿主生物（ヒトを除く）。
【請求項８】
請求項７に記載の宿主細胞または宿主生物を、核酸がコードするポリペプチドを発現するように培養することを特徴とするポリペプチドの製造方法。
【請求項９】
Ｆｃ領域含有ポリペプチドのＦｃ領域における、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９６番目のアミノ酸および２９８番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸をシステイン残基に置換する工程を含む、エフェクター機能の高いＦｃ領域含有ポリペプチドをin vitroで製造する方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法で製造されたポリペプチド。
【請求項１１】
抗体のＦｃ領域における、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９６番目のアミノ酸および２９８番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸をシステイン残基に置換する工程を含む、抗体のエフェクター機能を高めるin vitro方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法により得られた抗体。
【請求項１３】
抗体のＦｃ領域における、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９６番目のアミノ酸および２９８番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸をシステイン残基に置換するように、抗体産生細胞のＦｃ領域をコードする遺伝子を変異させる工程を含む、高エフェクター機能抗体産生細胞をin vitroで作製する方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法により作製された抗体産生細胞。
【請求項１５】
請求項１〜４および１０のいずれかに記載のポリペプチド、請求項１２に記載の抗体、請求項５に記載の核酸、請求項６に記載のベクター、請求項７に記載の宿主細胞または宿主生物および／または請求項１４に記載の細胞を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、増強されたエフェクター機能を有するポリペプチド、これをコードする核酸、該核酸を含むベクター、該ベクターを有する宿主細胞または宿主生物、前記ポリペプチドを含む医薬組成物、前記ポリペプチドの製造方法、抗体のエフェクター機能を高める方法、および高エフェクター機能抗体産生細胞の作製方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、抗原との結合に関与する可変領域と、生理活性に関与する定常領域とを有しており、重鎖定常領域のＣ末端側はＣＨ２およびＣＨ３からなるＦｃ領域で構成されている。Ｆｃ領域は、抗原への結合に直接関わらないが、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）との結合を介して同分子を表面に有する細胞に種々のエフェクター機能を発現させることができる。具体的には、Ｆｃ領域上のＦｃレセプター結合部位が、エフェクター細胞表面に存在するＦｃＲに結合することにより、抗体被覆粒子の食作用および破壊、免疫複合体の浄化、活性化されたエフェクター細胞による抗体被覆された標的細胞の溶解（抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ））、炎症メディエーターの放出、胎盤トランスファーおよび免疫グロブリン生産の制御等を含むいくつかの重要で多様な生物学的反応が引き起こされる。
近年、こうした抗体の性質を疾患の治療に利用する抗体療法が試みられている。しかしながら、抗体を生産する際には、目的の抗原を認識する抗体を産生する細胞の作製に時間と労力を要し、しかも必要な抗体活性を確保するために動物細胞を用いて産生する必要があるため、これによる抗体産生のコストの上昇が、抗体医療における懸念事項の１つとなっている。したがって、抗体医療の効率的な展開には、コスト削減のための安価な抗体製造方法や高活性な抗体が求められており、こうした製造方法や抗体に関する研究も行われている。【０００３】
抗体が有するエフェクター機能うち、ＡＤＣＣ誘導活性の発現には、ＩｇＧのＦｃ領域と、エフェクター細胞の表面上に存在するＦｃＲとの結合が必要であり、その結合については、抗体のヒンジ領域および定常領域の第２番目のドメイン（以下、ＣＨ２ドメインと表記する）内のいくつかのアミノ酸残基の重要性が示唆されている（例えば、非特許文献１〜３参照）。また、Ｆｃ領域とＦｃＲとの結合には、ＣＨ２ドメインに結合している糖鎖の重要性も示されており（例えば、非特許文献３および４参照）、糖鎖構造の最適化により高いエフェクター機能を有する抗体の作成も報告されている（例えば、特許文献１）参照）。【０００４】
こうした報告を受けて、これまでにＦｃ領域のアミノ酸置換に関する研究が盛んに行われてきた。PrestaらはＦｃ領域アミノ酸のアラニン置換を網羅的に行い、いくつかのアミノ酸置換（Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ）がＦｃγＲＩＩＩａに対する結合能を上昇させ、ＡＤＣＣ活性を上昇させることを見出した（特許文献２参照）。さらにLazarらは、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅの３アミノ酸同時置換により、異なる抗体のＡＤＣＣ活性が共に上昇するというデータを提示している（特許文献３参照）。また、同様の試みが、特許文献４〜９に記載されている。
しかしながら、満足できるエフェクター機能を有する抗体は未だ開発されておらず、さらなる技術的改善が求められていた。【０００５】
【特許文献１】特開２００５−２２４２４０号公報
【特許文献２】国際公開第００／４２０７２号パンフレット
【特許文献３】米国特許出願公開第２００５／００５４８３２号明細書
【特許文献４】国際公開第２００４／０６３３５１号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２００４／０７４４５５号パンフレット
【特許文献６】国際公開第２００５／０７０９６３号パンフレット
【特許文献７】国際公開第２００６／０１９４４７号パンフレット
【特許文献８】国際公開第２００６／１０４９８９号パンフレット
【特許文献９】国際公開第２００６／１０５０６２号パンフレット
【非特許文献１】Eur. J. Immunol., 23, 1098(1993)
【非特許文献２】Immunology, 86, 319(1995)
【非特許文献３】Chemical Immunology, 65, 88(1997)
【非特許文献４】第３回糖鎖科学コンソーシアムシンポジウム講演抄録ｐ30（2005）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、エフェクター機能が増強されたポリペプチドの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の目的を達成するため鋭意研究を行う中で、Ｆｃ領域の特定部位を特定のアミノ酸残基に置換することにより、エフェクター機能を著しく改善し得ることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下に関する。
＜１＞（１）配列番号：１〜６のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをＦｃ受容体結合部分として含む、エフェクター機能を有するポリペプチド、または
（２）（ｉ）配列番号：１〜６のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに１個または２個以上の変異を有するポリペプチド、（ｉｉ）配列番号：７〜１２のいずれかで表される塩基配列を有する核酸もしくは同核酸と同一のポリペプチドをコードする核酸の塩基配列に１個または２個以上の変異を有する核酸によりコードされるポリペプチド、（ｉｉｉ）配列番号：１〜６のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは（ｉ）もしくは（ｉｉ）の変異体をコードする核酸の相補鎖またはその断片にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によりコードされるポリペプチド、および（ｉｖ）配列番号：７〜１２のいずれかで表される塩基配列と６０％以上の相同性を有する核酸によりコードされるポリペプチドからなる群から選択されるＦｃ受容体結合部分を含み、かつ、増強されたエフェクター機能を有するポリペプチド。【０００８】
＜２＞Ｆｃ受容体結合部分が、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９３番目のアミノ酸、２９４のアミノ酸、２９６のアミノ酸、２９７のアミノ酸、２９８のアミノ酸および３００番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸がシステイン残基に置き換えられたＦｃ領域である上記＜１＞のポリペプチド。
＜３＞細胞結合部分をさらに含む上記＜１＞または＜２＞のポリペプチド。
＜４＞細胞結合部分が、サイトカイン受容体、細胞接着分子、がん細胞表層分子、がん幹細胞表層分子、血液細胞表層分子、ウイルス感染細胞表層分子からなる群から選択される少なくとも１種の分子を認識またはこれと結合する上記＜３＞のポリペプチド。【０００９】
＜５＞細胞結合部分が、抗原ＣＤ３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ５２、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＧＦ受容体、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＧＤ３、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＴＮＦα受容体、ＶＥＧＦ受容体、ＣＴＬＡ−４、ＡＩＬＩＭ／ＩＣＯＳ、インテグリン分子からなる群から選択される少なくとも１種の分子を認識またはこれと結合する上記＜４＞のポリペプチド。
＜６＞上記＜１＞〜＜５＞のいずれかのポリペプチドをコードする単離された核酸。
＜７＞上記＜６＞の核酸を含むベクター。
＜８＞上記＜７＞のベクターを有する宿主細胞または宿主生物。
＜９＞上記＜８＞の宿主細胞または宿主生物を、核酸がコードするポリペプチドを発現するように培養することを特徴とするポリペプチドの製造方法。【００１０】
＜１０＞Ｆｃ領域含有ポリペプチドのＦｃ領域における、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９３番目のアミノ酸、２９４のアミノ酸、２９６のアミノ酸、２９７のアミノ酸、２９８のアミノ酸および３００番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸をシステイン残基に置換する工程を含む、エフェクター機能の高いＦｃ領域含有ポリペプチドをin vitroで製造する方法。
＜１１＞上記＜１０＞の方法で製造されたポリペプチド。
＜１２＞抗体のＦｃ領域における、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９３番目のアミノ酸、２９４のアミノ酸、２９６のアミノ酸、２９７のアミノ酸、２９８のアミノ酸および３００番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸をシステイン残基に置換する工程を含む、抗体のエフェクター機能を高めるin vitro方法。
＜１３＞上記＜１２＞の方法により得られた抗体。【００１１】
＜１４＞Ｆｃ領域における、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９３番目のアミノ酸、２９４のアミノ酸、２９６のアミノ酸、２９７のアミノ酸、２９８のアミノ酸および３００番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸をシステイン残基に置換するように、抗体産生細胞のＦｃ領域をコードする遺伝子を変異させる工程を含む、高エフェクター機能抗体産生細胞をin vitroで作製する方法。
＜１５＞上記＜１４＞の方法で作製された抗体産生細胞。
＜１６＞上記＜１＞〜＜５＞および＜１１＞のいずれかのポリペプチド、上記＜１３＞の抗体、上記＜６＞の核酸、上記＜７＞のベクター、上記＜８＞の宿主細胞または宿主生物および／または上記＜１５＞の抗体産生細胞を含む医薬組成物。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のポリペプチドは、著しく向上したエフェクター機能を有しており、抗体療法等に用いる場合には薬剤の使用量を低くすることができるため、経済的であり、副作用を低減することができる。
また、本発明の抗体のエフェクター機能を高める方法は、既存の任意の抗体に適用できるため、応用範囲が広く、医療、獣医療を始めとする種々の分野への多大な貢献が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】抗ＣＤ２０キメラ抗体および本発明のポリペプチドのＣＤ２０結合反応性を評価した結果を示したグラフである。
【図２】抗ＣＤ２０キメラ抗体および本発明のポリペプチドのＣＤ１６結合反応性を評価した結果を示したグラフである。
【図３】抗ＣＤ２０キメラ抗体および本発明のポリペプチドのＡＤＣＣ誘導活性を評価した結果を示したグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、
（１）配列番号：１〜６のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをＦｃ受容体結合部分として含む、エフェクター機能を有するポリペプチド、または
（２）（ｉ）配列番号：１〜６のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに１個または２個以上、好ましくは１個または数個の変異を有するポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号：７〜１２のいずれかで表される塩基配列を有する核酸もしくは同核酸と同一のポリペプチドをコードする核酸の塩基配列に１個または２個以上、好ましくは１個または数個の変異を有する核酸によりコードされるポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号：１〜６のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは（ｉ）もしくは（ｉｉ）の変異体をコードする核酸の相補鎖、またはその断片にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によりコードされるポリペプチド、および
（ｉｖ）配列番号：７〜１２のいずれかで表される塩基配列と６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有する核酸によりコードされるポリペプチド
からなる群から選択されるＦｃ受容体結合部分を含み、かつ、増強されたエフェクター機能を有するポリペプチドに関する。
本発明のポリペプチドの好ましい態様においては、Ｆｃ受容体結合部分が、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９３番目のアミノ酸、２９４のアミノ酸、２９６のアミノ酸、２９７のアミノ酸、２９８のアミノ酸および３００番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸がシステイン残基に置き換えられたＦｃ領域である。【００１５】
本発明において、「増強されたエフェクター機能を有する」とは、本発明のポリペプチドのエフェクター機能が、野生型抗体などの野生型のＦｃ領域を有するポリペプチドと比べて高まっていることを意味する。具体的には、限定することなく、例えば、本発明のポリペプチドのＦｃＲ結合能が、野生型のＦｃ領域を有するポリペプチドと比べて（例えば同一の効果を奏する濃度を指標として）１．５倍以上、好ましくは２倍以上、より好ましくは３倍以上、さらに好ましくは４倍以上、特に好ましくは５倍以上、例えば、６倍、８倍、１０倍、１２倍または１５倍以上高いこと、あるいは、本発明のポリペプチドのＡＤＣＣ誘導活性が、野生型のＦｃ領域を有するポリペプチドと比べて（例えば同一の効果を奏する濃度を指標として）１０倍以上、好ましくは２５倍以上、より好ましくは５０倍以上、さらに好ましくは７５倍以上、特に好ましくは１００倍以上、例えば、１５０倍、２００倍、３００倍、４００倍または５００倍以上高いことを意味する。ポリペプチドのＦｃＲ結合活性やエフェクター機能は、後述の任意の既知の手法により適宜決定することができる。【００１６】
本明細書で用いる「ストリンジェントな条件」という用語は、当該技術分野において周知のパラメータであり、標準的なプロトコル集、例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Press (2001)や、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992)等に記載されている。
本発明におけるストリンジェントな条件は、例えば、６５℃での、３．５×ＳＳＣ（０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７）、フィコール０．０２％、ポリビニルピロリドン０．０２％、ウシ血清アルブミン０．０２％、ＮａＨ２ＰＯ４２５ｍＭ（ｐＨ７）、ＳＤＳ０．０５％、ＥＤＴＡ２ｍＭからなるハイブリダイゼーションバッファーによるハイブリダイゼーションを指す。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡが移された膜は、２×ＳＳＣにて室温において、次いで０．１〜０．５×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳにて６８℃までの温度において洗浄する。あるいは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、ExpressHyb（登録商標）Hybridization Solution（Clontech社）等の市販のハイブリダイゼーションバッファーを用いて、製造者によって記載されたハイブリダイゼーションおよび洗浄条件で行ってもよい。
同程度のストリンジェンシーを生じる結果となる使用可能な他の条件、試薬等が存在するが、当業者はかかる条件に通じていると思われるため、これらについては、本明細書中に特段記載はしていない。しかしながら、本発明の変異体をコードしている核酸の相同体または対立遺伝子の明確な同定ができるよう、条件を操作することが可能である。
【００１７】
本発明のポリペプチドの別の態様としては、
（１）配列番号：１〜６のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）（１）のポリペプチドに１個または２個以上、好ましくは１個または数個の変異を有するが、なお該ポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチド、
（３）配列番号：７〜１２のいずれかで表される塩基配列を有する核酸もしくは同核酸と同一のポリペプチドをコードする核酸の塩基配列に１個または２個以上、好ましくは１個または数個の変異を有する核酸によりコードされ、かつ（１）のポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチド、
（４）（１）のポリペプチドまたは（２）もしくは（３）の変異体をコードする核酸の相補鎖、またはその断片にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によりコードされ、かつ、（１）のポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチド、および
（５）配列番号：７〜１２のいずれかで表される塩基配列と６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有する核酸によりコードされ、かつ、（１）のポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチド
からなる群から選択されるＦｃ受容体結合部分を含む、エフェクター機能を有するポリペプチドが挙げられる。【００１８】
上記（２）〜（５）のポリペプチドが、（１）のポリペプチドと同等の機能を有するか否かは、例えば、ＦｃＲとの結合活性や、細胞結合部位をさらに含む態様においては、ＡＤＣＣ誘導活性などのエフェクター機能を評価することにより判断することができる。（１）のポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチドとしては、例えば、ＦｃＲ結合活性が野生型Ｆｃ領域に比べて増強されているもの、細胞結合部位をさらに含む態様においては、ＡＤＣＣ誘導活性などのエフェクター機能が野生型抗体に比べて増強されているものが挙げられる。ここで「同等」とは、ＦｃＲ結合活性や、細胞結合部位をさらに含む態様におけるエフェクター機能の増強の程度が（１）のポリペプチドと同じレベルであることを含むが、これに限らず、ＦｃＲ結合活性や、エフェクター機能が野生型Ｆｃ領域または野生型抗体に比べて増強していれば、増強の程度が（１）のポリペプチドより小さくても大きくてもよい。ＦｃＲ結合活性やエフェクター機能は、後述の任意の既知の手法により適宜決定することができる。【００１９】
本発明のポリペプチドは、極めて高いＦｃＲ結合能を有するとともに、著しく向上したエフェクター機能を有する。エフェクター機能には、例えば抗体被覆粒子の食作用および破壊、免疫複合体の浄化、活性化されたエフェクター細胞による抗体被覆された標的細胞の溶解（（ＡＤＣＣ））、補体タンパク質による細胞膜破壊（補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ））、炎症メディエーターの放出、胎盤トランスファーおよび免疫グロブリン生産の制御等が含まれる。なかでも、本発明のポリペプチドはＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性が向上しており、特にＡＤＣＣ活性が向上している。
本発明のポリペプチドは、ヒトエフェクター細胞の存在下でＡＤＣＣをより効果的に媒介することができる。ＡＤＣＣは、細胞が媒介する反応を意味しており、エフェクター細胞が抗体を介して標的細胞を認識し、標的細胞の溶解を引き起こす反応である。前記エフェクター細胞には、例えばキラーＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、単球、マクロファージなどが挙げられる。これらのエフェクター細胞は、通常、細胞表層にＦｃＲを発現しており、Ｆｃ領域の構造に応じて、結合可能な種類のＦｃＲを発現する細胞が認識され、細胞障害活性を発現することができる。
本発明のポリペプチドは、Ｆｃ受容体結合部分を介してエフェクター細胞を認識することにより、ＡＤＣＣを誘導、促進することができる。本発明においては、Ｆｃ受容体結合部分がエフェクター細胞の表層分子（ＦｃγＲ等）と容易に結合して効率よく活性化できるためか、少量のポリペプチドで高いＡＤＣＣ活性を速やかに誘導することができる。【００２０】
ＣＤＣは、補体タンパク質が媒介する反応を意味しており、補体タンパク質が抗体を介して標的細胞を認識し、標的細胞の細胞膜の破壊を引き起こす反応である。前記補体タンパク質は、ポリペプチドのＦｃ受容体結合部分に結合することにより活性化される。本発明においては、Ｆｃ受容体結合部分が補体タンパク質（Ｃ１ｑ等）と容易に結合して効率よく活性化できるためか、少量のポリペプチドで高いＣＤＣ活性を速やかに誘導することができる。
また、エフェクター機能が、ＦｃＲの多型により影響を受ける可能性があることが知られている。例えば、ヒトＣＤ１６の第１５８アミノ酸がバリンであるか、フェニルアラニンであるかによって、抗体のＦｃ領域の結合性が影響されることが報告されている（例えば、Koene HR et al., Blood. 1997;90(3):1109-14参照）。それ故、本発明のポリペプチドもこれら多型に応じて特別の反応性を示すことができる。したがって、本発明のポリペプチドは、その一態様において、ＣＤ１６の第１５８アミノ酸がバリンであるヒトにおいて、特に高いエフェクター機能を発揮する。また、本発明のポリペプチドは、別の態様において、ＣＤ１６の第１５８アミノ酸がフェニルアラニンであるヒトにおいて、特に高いエフェクター機能を発揮する。【００２１】
本発明におけるＦｃ受容体結合部分は、エフェクター機能（特にＡＤＣＣ、ＣＤＣ等）を効果的に媒介できる構造であることが好ましい。このような観点から、Ｆｃ受容体結合部分としては、ＩｇＧのＦｃ領域をベースにしたものを用いることができる。なかでも、ヒトＩｇＧのＦｃ領域が好ましく、より好ましくはヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３またはヒトＩｇＧ４のＦｃ領域等が用いられる。本発明においては、元来ＡＤＣＣ活性を有しているヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ３のＦｃ領域が好適に用いられる。また、ＣＤＣ活性はサブクラスに応じて殺効果が異なり、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ４等のＦｃ領域を用いることができる。野生型ヒトＣγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４の塩基配列を、配列番号：５８、６０、６２、６４に、そのアミノ酸配列を、配列番号：５７、５９、６１、６３にそれぞれ示す。なお、生体が有する他のタンパク質と同様、抗体のＦｃ領域にも多型が存在するため、野生型ヒトＣγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４が上記とは異なる塩基配列および／またはアミノ酸配列を有する場合もあるが、本発明のＦｃ受容体結合部分は、かかる多型を有するＦｃ領域をベースにしてもよい。
なお、本明細書において、抗体定常領域における特定のアミノ酸を示すためにＫａｂａｔのＥＵインデックスを参照する場合があるが、これは全て、（Sequence of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（1991））に基づいている。しかしながら、上記インデックスは、特定のアミノ酸の同定に便宜的に用いているに過ぎず、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列は上記文献に記載のものに限定されない。【００２２】
【表１】
0005620106.tif 000002
【００２３】
【表２】
0005620106.tif 000003
【００２４】
【表３】
0005620106.tif 000004
【００２５】
【表４】
0005620106.tif 000005
【００２６】
【表５】
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【００２７】
【表６】
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【００２８】
【表７】
0005620106.tif 000008
【００２９】
本発明におけるＦｃ受容体結合部分のベースとなるＦｃ領域としては、天然に存在する抗体のＦｃ領域に限定されず、これらのＦｃ領域のアミノ酸配列の一部に欠失、付加、置換等の修飾がなされたものであってもよく、対応するアミノ酸配列からなる合成ポリペプチドであってもよい。ベースとなるＦｃ領域におけるアミノ酸残基のシステイン残基への置換は、遺伝子組換え技術を用いた公知の方法、例えば、部位特異的変異導入法などを用いて行うことができる。【００３０】
本発明におけるＦｃ受容体結合部分がＦｃ領域変異体を含む場合、これは典型的には糖鎖結合部位を含んでいる。前記糖鎖結合部位には、必ずしも糖鎖が結合している必要はないが、ＡＤＣＣ活性を促す点で少なくとも一つの糖鎖が結合していることが好ましい。前記糖鎖としては、一以上の単糖からなる糖鎖であれば特に限定されず、例えば抗体重鎖のＦｃ領域に結合している糖鎖やそのグライコフォーム、合成糖鎖のいずれであってもよい。例えば、下記式で表される糖鎖は、ＩｇＧ１抗体重鎖のＦｃ領域における糖鎖結合部位に結合している糖鎖の例である。
【化１】
0005620106.tif 000009
【００３１】
一般に、Ｆｃ領域に結合する糖鎖の構造は、エフェクター機能に密接に関連することが知られており、同機能の向上を目的として、天然型糖鎖に適宜な修飾が施された糖鎖を用いることも好ましい。天然型糖鎖に修飾が施された糖鎖の例としては、例えば、上記式中、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）に結合しているフコース（Ｆｕｃ（α１，６））に対し、付加、欠失、置換等の修飾を施した構造の糖鎖などが挙げられる。糖鎖修飾部位に結合する糖鎖は、Ｏ−結合型、Ｎ−結合型のいずれであってもよいが、好ましくはＮ−結合型糖鎖からなる糖鎖が用いられる。【００３２】
一般に、Ｆｃ領域の糖鎖は、ＩｇＧ抗体のＡＤＣＣ活性にきわめて重要であり、糖鎖の存在そのものや、その糖鎖構造がＡＤＣＣ活性に密接に関与していることが知られている。また、糖鎖修飾部位への糖鎖の結合（特にＮ型糖鎖の発現）には、一般的にＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ｘは任意のアミノ酸残基）というアミノ酸配列が必要である。【００３３】
本発明のポリペプチドは、Ｆｃ受容体結合部分以外のポリペプチド部位として、細胞表層存在分子を認識する部位（細胞結合部分）を有していることが好ましい。前記細胞表層存在分子は、ヒト細胞および非ヒト細胞（マウス細胞等）のいずれの表層に存在する分子であってもよいが、ヒト細胞表層存在分子が好適である。【００３４】
前記ヒト細胞表層存在分子には、例えばサイトカイン受容体、細胞接着分子、がん細胞表層分子、がん幹細胞表層分子、血液細胞表層分子、およびウィルス感染細胞表層分子等が含まれる。このようなヒト細胞表層存在分子の具体例としては、例えばＣＤ３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ５２、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＧＦ受容体、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＧＤ３、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＴＮＦα受容体、ＶＥＧＦ受容体、ＣＴＬＡ−４、ＡＩＬＩＭ／ＩＣＯＳ、およびインテグリン分子等が挙げられる。【００３５】
本発明のポリペプチドは、例えばＩｇＧにおけるＦｃ領域を含むような抗体の変異体、もしくは細胞表層存在分子（特にヒト細胞表層存在分子）を認識するポリペプチド分子とＩｇＧにおけるＦｃ領域とのキメラ分子のようなポリペプチド（抗体様分子）の変異体で構成することができる。抗体および抗体様分子の変異体は、単独でまたはこれらを組み合わせて用いることができる。
より具体的には、本発明のポリペプチドには、抗体の変異体であって、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９３番目のアミノ酸、２９４のアミノ酸、２９６のアミノ酸、２９７のアミノ酸、２９８のアミノ酸および３００番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸がシステイン残基に置き換えられた変異体、および、細胞結合部分およびＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９３番目のアミノ酸、２９４のアミノ酸、２９６のアミノ酸、２９７のアミノ酸、２９８のアミノ酸および３００番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸がシステイン残基に置き換えられたＦｃ領域を含むキメラ分子の変異体が含まれる。本発明のポリペプチドは、置換前の抗体やキメラ分子と比較して、ＦｃＲ結合能および／またはエフェクター機能が向上している。本発明のポリペプチドにおいてＦｃ領域はヒトＩｇＧのＦｃ領域、より好ましくはヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ４の各Ｆｃ領域等が挙げられる。本発明のＦｃ領域は、上述の通り、糖鎖修飾部位にＮ−結合型糖鎖を有していることが好ましい。【００３６】
本発明における抗体とは、抗原結合部位を有し、エフェクター機能（特にＡＤＣＣ）を誘導可能な分子であれば特に限定されず、例えばヒト抗体、マウス抗体等の非ヒト抗体などの天然型抗体およびこれらの誘導体；キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体等の抗原抗体反応を誘導可能な組換え抗体等が含まれる。これらは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれであってもよく、単独でまたは２種以上を組み合わせて用いてもよい。前記天然型抗体の誘導体とは、天然型抗体のアミノ酸配列の一部に、欠失、付加、置換等の変異が導入された抗体を意味しており、これらの変異は自然に生じたものでもよく、人為的なものであってもよい。前記抗原結合部位には、天然型抗体のＦａｂ領域における可変部位ＶＨおよびＶＬ（特に超可変部位ＣＤＲ１〜３）およびこれらと相同な配列からなる領域等が含まれる。【００３７】
なかでも、良好なＡＤＣＣ活性を発揮でき、抗体医薬に適用しやすい点で、組換え抗体、特にキメラ抗体、ヒト化抗体などが好ましく用いられる。前記キメラ抗体とは、２以上の異種または同種の融合タンパク質からなる抗体を意味しており、例えばヒトＩｇＧのＦｃ領域と非ヒトＩｇＧ（マウスＩｇＧ等）のＦａｂ領域とで構成される抗体等が挙げられる。前記ヒト化抗体としては、例えば非ヒトＩｇＧ（マウスＩｇＧ等）の超可変部領域を、ヒトＩｇＧ由来のＦｃ領域を含む残りの領域に融合させた抗体等が挙げられる。【００３８】
抗体としては、種々の抗原に対する抗体を用いることができる。これらの抗体が認識する抗原には、膜貫通分子などのレセプター、成長因子などのリガンド等のポリペプチド；腫瘍関連糖脂質抗原などの米国特許第５０９１１７８号に記載の非ポリペプチド抗原等が含まれる。具体的な抗原としては、例えば、レニン；ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク；α-１-アンチトリプシン；インシュリンＡ-鎖；インシュリンＢ-鎖；プロインシュリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；因子ＶＩＩＩＣ、因子ＩＸ、組織因子、およびvon Willebrands因子等の凝固因子；プロテインＣ等の抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺界面活性剤；ウロキナーゼまたはヒト尿または組織型プラスミノーゲン活性化剤（ｔ−ＰＡ）等のプラスミノーゲン活性化剤；ボンベシン；トロンビン；造血性成長因子；腫瘍壊死因子-αおよび-β；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（regulated on activation normally T-cell expressed and secreted）；ヒトマクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ-１-α）；ヒト血清アルブミン等の血清アルブミン；ミューラー阻害物質；リラキシンＡ-鎖；リラキシンＢ-鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；ベータ−ラクタマーゼ等の微生物タンパク質；ＤＮアーゼ；ＩｇＥ；ＣＴＬＡ-４のような細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは成長因子のレセプター；プロテインＡまたはＤ；リウマチ因子；脳誘導神経向性因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン-３、-４、-５または-６（ＮＴ-３、ＮＴ-４、ＮＴ-５、またはＮＴ-６）、またはＮＧＦ-β等の神経成長因子；血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）；ａＦＧＦおよびｂＦＧＦ等の線維芽成長因子；表皮成長因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ-αおよびＴＧＦ−β（ＴＧＦ-β１、ＴＧＦ-β２、ＴＧＦ-β３、ＴＧＦ-β４、およびＴＧＦ-β５等）等のトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；インシュリン様成長因子-Ｉおよび-ＩＩ（ＩＧＦ-ＩおよびＩＧＦ-ＩＩ）；ｄｅｓ（１-３）-ＩＧＦ-Ｉ（脳ＩＧＦ-Ｉ）、インシュリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９およびＣＤ２０等のＣＤタンパク質；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン-α、-β、および-γ等のインターフェロン；Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＳＣＦ、およびＧ−ＣＳＦ等のコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；ＩＬ-１〜ＩＬ-１０等のインターロイキン（ＩＬ）；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞レセプター；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス性抗原、例えばＡＩＤＳエンベロープの一部等；輸送タンパク質；ホーミングレセプター；アドレシン（addressin）；調節タンパク質；ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ-４およびＶＣＡＭ等のインテグリン；ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４レセプター等の腫瘍関連抗原；およびこれらのポリペプチドの断片等が含まれる。【００３９】
抗体に対する好適な分子標的には、例えばＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ３４等のＣＤタンパク質；ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４レセプター等のＥｒｂＢレセプターファミリー；ＬＦＡ-１、Ｍａｃ１、ｐ１５０.９５、ＶＬＡ-４、ＩＣＡＭ-１、ＶＣＡＭおよびそのαまたはβサブユニットのいずれかを含むαｖ／β３インテグリン（例えば、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８または抗ＣＤ１１ｂ抗体）等の細胞接着分子；ＶＥＧＦ等の成長因子；ＩｇＥ；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３レセプター；肥満（ＯＢ）レセプター；ｍｐｌレセプター；ＣＴＬＡ-４；プロテインＣ等が含まれる。【００４０】
上記に例示の抗原の中でも、可溶型抗原およびその断片は、抗体を産生するための免疫原として使用することができる。例えばレセプターのような膜貫通分子に対しては、例えば、レセプターの細胞外ドメイン等の断片を免疫原として使用することができる。あるいは、膜貫通分子を発現する細胞を免疫原として使用することもできる。そのような細胞は、天然源（例えば、癌株化細胞）から取り出すことができ、または組換えベクターを用いて膜貫通分子等の抗体認識領域を発現するように形質転換された細胞であってもよい。
【００４１】
これらの抗体は、抗原結合部位以外に、細胞表層存在分子を結合可能な部位を有していてもよい。このような構成を有する抗体によれば、標的細胞の認識効率を向上できるため、少量の抗体で高いエフェクター機能を発揮することが可能である。【００４２】
本発明は、限定することなく、例えば下記（１）から（４）のいずれかに記載の抗ＣＤ２０抗体の変異体を提供する。
（１）ＣＤＲ１として配列番号：５１に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：５３に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：５５に記載のアミノ酸配列、およびＣＨとして配列番号：１３〜１８のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体の変異体、
（２）配列番号：２５〜３０のいずれかに記載のアミノ酸配列（Ｈ鎖全長のアミノ酸配列）を有するＨ鎖を含む抗体の変異体、
（３）ＣＤＲ１として配列番号：５１に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：５３に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：５５に記載のアミノ酸配列、およびＦｃ領域として配列番号：１〜６のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体の変異体、
（４）上記（１）、（２）または（３）のいずれかに記載のＨ鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のＬ鎖の対を有する抗体の変異体、
（ｉ）ＣＤＲ１として配列番号：６７に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：６９に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：７１に記載のアミノ酸配列、およびＣＬとして配列番号：７３に記載のアミノ酸配列を有するＬ鎖、
（ｉｉ）配列番号：６５に記載のアミノ酸配列（Ｌ鎖全長のアミノ酸配列）を有するＬ鎖。【００４３】
また本発明はまた、例えば下記（１）から（４）のいずれかに記載の抗ＣＤ２０抗体の変異体を提供する。
（１）配列番号：５２に記載の塩基配列によりコードされるＣＤＲ１、配列番号：５４に記載の塩基配列によりコードされるＣＤＲ２、配列番号：５６に記載の塩基配列によりコードされるＣＤＲ３、および配列番号：１９〜２４のいずれかに記載の塩基配列によりコードされるＣＨを有するＨ鎖を含む抗体の変異体、
（２）配列番号：３１〜３６のいずれかに記載の塩基配列によりコードされるＨ鎖を含む抗体の変異体、
（３）配列番号：５２に記載の塩基配列によりコードされるＣＤＲ１、配列番号：５４に記載の塩基配列によりコードされるＣＤＲ２、配列番号：５６に記載の塩基配列によりコードされるＣＤＲ３、および配列番号：７〜１２のいずれかに記載の塩基配列によりコードされるＦｃ領域を有するＨ鎖を含む抗体の変異体、
（４）上記（１）、（２）または（３）のいずれかに記載のＨ鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のＬ鎖の対を有する抗体の変異体、
（ｉ）配列番号：６８に記載の塩基配列によりコードされるＣＤＲ１、配列番号：７０に記載の塩基配列によりコードされるＣＤＲ２、配列番号：７２に記載の塩基配列によりコードされるＣＤＲ３、および配列番号：７４に記載の塩基配列によりコードされるＣＬを有するＬ鎖、
（ｉｉ）配列番号：６６に記載の塩基配列によりコードされるＬ鎖。【００４４】
本発明における抗体様分子とは、抗原結合部位を有しない点で抗体とは異なるが、細胞結合部分を分子内に有し、当該部位における細胞表層分子との結合を介してエフェクター機能の発現に寄与することができる点で抗体類似の機能を有している。【００４５】
本発明における抗体様分子としては、細胞結合部分とＦｃ領域とを含むキメラ分子等の組換え分子等が用いられる。すなわち本発明は、細胞結合部分およびＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９３番目のアミノ酸、２９４のアミノ酸、２９６のアミノ酸、２９７のアミノ酸、２９８のアミノ酸および３００番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸がシステイン残基に置き換えられたＦｃ領域を含むキメラ分子の変異体を提供する。本発明のキメラ分子の変異体は、エフェクター機能を有する限り、細胞結合部分、およびＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９３番目のアミノ酸、２９４のアミノ酸、２９６のアミノ酸、２９７のアミノ酸、２９８のアミノ酸および３００番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸がシステイン残基に置き換えられたＦｃ領域の間に、ペプチド領域を含むことができる。ペプチド領域としては、次の（１）から（３）が例示できるが、これらに制限されるものではない。（１）リンカー、（２）抗体のヒンジ領域、ならびに、（３）リンカーおよび抗体のヒンジ領域。「抗体のヒンジ領域」には、抗体のヒンジ領域の全長だけでなく、エフェクター機能に寄与する（あるいはエフェクター機能を阻害しない）限り、抗体のヒンジ領域の一部も含まれる。【００４６】
細胞表層存在分子は、上記に例示のものと同様である。すなわち本発明は、サイトカイン受容体、細胞接着分子、がん細胞表層分子、がん幹細胞表層分子、血液細胞表層分子、ウイルス感染細胞表層分子からなる群から選択される少なくとも１種のヒト細胞表層存在分子に結合するキメラ分子の変異体を提供する。前記細胞結合部分は、例えば接着タンパク質の結合ドメインで構成することができる。また前記細胞結合部分は、例えば抗体Ｈ鎖および/またはＬ鎖の可変領域で構成することができる。
本発明の技術は、抗体の抗原認識部位と同様に抗原に結合する機能を持った部位、および、抗体のＦｃ領域を含む分子であって、エフェクター機能を有する分子である限り適用できる技術である。したがって、本発明の技術の適用対象は、抗体分子に限られるものではない。本発明の技術は、細胞結合部分（例えば、接着タンパク質、接着分子、シグナル分子等の結合ドメイン）および、抗体のＦｃ領域を含むキメラ分子全般に適用可能である。ここでいう接着タンパク質は、例えば、細胞間相互作用を媒介する分子であって、細胞の認識部位として細胞外領域を構造内に有する分子である。本発明における抗体様分子は、上記細胞外領域の構造を結合ドメインとして利用するため、本来この分子が結合する細胞表層存在分子を認識することが可能である。【００４７】
前記接着タンパク質としては、例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）、チロシンキナーゼ活性を持つレセプター（レセプターチロシンキナーゼ）等のサイトカインに対するレセプター、造血素および神経成長因子レセプタースーパーファミリー、インテグリン、カドヘリン、（Ｅ-、Ｌ-およびＰ-）セレクチン等の細胞表層存在分子の細胞外ドメインおよびこれと親和性を有する（結合可能な）ポリペプチド分子が挙げられる。前記IgSFには、NCAMやL1のように膜貫通型の細胞接着分子の他に、膜貫通部分を持たないGPI-アンカー型の細胞接着分子も含まれる。
より具体的には、本発明は、ＣＤ３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ５２、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＧＦ受容体、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＧＤ３、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＴＮＦα受容体、ＶＥＧＦ受容体、ＡＩＬＩＭ／ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７ｈ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、インテグリン分子からなる群から選択される少なくとも一つのヒト細胞表層存在分子に結合するキメラ分子の変異体を提供する。【００４８】
本発明における抗体様分子およびその変異体は、結合ドメイン（本明細書においては、「細胞結合部分」や、「細胞表層存在分子を認識する部位」と表現することもある）をＮ末端側、Ｆｃ領域をＣ末端側に有する構造が好ましいが、これに限定されず、Ｆｃ領域をＮ末端側、結合ドメインをＣ末端側に有する構造であってもよい。抗体様分子およびその変異体を構成するＦｃ領域は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを保持していることが好ましく、抗体様分子およびその変異体を構成する結合ドメインは、抗体重鎖のＣＨ１および／または抗体軽鎖に対応する部位に配置されることが好ましい。【００４９】
本発明においては、例えば以下（１）から（３）に記載のキメラ分子の変異体を提供する。
（１）細胞結合部分として配列番号：８９に記載のアミノ酸配列、およびＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９３番目のアミノ酸、２９４のアミノ酸、２９６のアミノ酸、２９７のアミノ酸、２９８のアミノ酸および３００番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸がシステイン残基に置き換えられたＦｃ領域として配列番号：１〜６のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むキメラ分子の変異体、
（２）細胞結合部分として配列番号：８９に記載のアミノ酸配列、抗体のヒンジ領域として配列番号：９３に記載のアミノ酸配列、およびＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９３番目のアミノ酸、２９４のアミノ酸、２９６のアミノ酸、２９７のアミノ酸、２９８のアミノ酸および３００番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸がシステイン残基に置き換えられたＦｃ領域として配列番号：１〜６のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むキメラ分子の変異体、
（３）配列番号：７５〜８０のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるキメラ分子の変異体。【００５０】
また本発明は、例えば以下（１）から（３）に記載のキメラ分子の変異体を提供する。
（１）配列番号：９０に記載の塩基配列によりコードされる細胞結合部分、および配列番号：７〜１２のいずれかに記載の塩基配列によりコードされるＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９３番目のアミノ酸、２９４のアミノ酸、２９６のアミノ酸、２９７のアミノ酸、２９８のアミノ酸および３００番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸がシステイン残基に置き換えられたＦｃ領域を含むキメラ分子の変異体、
（２）配列番号：９０に記載の塩基配列によりコードされる細胞結合部分、配列番号：９４に記載の塩基配列によりコードされる抗体のヒンジ領域、および配列番号：７〜１２のいずれかに記載の塩基配列によりコードされるＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９３番目のアミノ酸、２９４のアミノ酸、２９６のアミノ酸、２９７のアミノ酸、２９８のアミノ酸および３００番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸がシステイン残基に置き換えられたＦｃ領域を含むキメラ分子の変異体、
（３）配列番号：８１〜８６のいずれかに記載の塩基配列によりコードされるキメラ分子の変異体。【００５１】
本発明のキメラ分子の変異体は、細胞結合部分と、抗体のヒンジ領域との間にリンカー配列をさらに有していてもよい。リンカー配列としては、エフェクター機能に寄与する（あるいはエフェクター機能を阻害しない）限り特に制限はないが、例えば配列番号：９１に記載のアミノ酸配列からなるリンカー配列が挙げられる。配列番号：９１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡとしては、例えば配列番号：９２に記載の塩基配列を有するＤＮＡが挙げられるが、これに限定されない。また本発明の「抗体のヒンジ領域」には、抗体のヒンジ領域の全長だけでなく、エフェクター機能に寄与する（あるいはエフェクター機能を阻害しない）限り、抗体のヒンジ領域の一部も含まれる。【００５２】
本発明のポリペプチドは、遺伝子組換え技術等を用いた公知の方法で製造することができる。本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸を用い、該核酸を含むベクターを作製し、該ベクターを有する宿主細胞または宿主生物を得、これらの宿主細胞または宿主生物を核酸がコードするポリペプチドを発現するように培養する方法を用いて製造することができる。【００５３】
ポリペプチドが抗体で構成される場合には、一般的な抗体の製造方法を適用できる。抗体の変異体の製造方法は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Antibodies, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988、Monoclonal Antibodies:principles and practice, Third Edition, Acad. Press, 1993、Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, 1996等に記載された方法を用いることができ、例えば、以下のように宿主細胞中で発現させて取得することができる。また、同様の方法は抗体様分子の製造に適用することもできる。【００５４】
ポリペプチドの製造は、例えばＦｃ受容体結合部分のベースとなるＦｃ領域を含むポリペプチドをコードする核酸において、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９３番目のアミノ酸、２９４のアミノ酸、２９６のアミノ酸、２９７のアミノ酸、２９８のアミノ酸および３００番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸に代えてシステイン残基をコードするように置換された配列からなる核酸を単離する工程；ポリペプチドをコードする単離された核酸を、適切なプロモーターを含む発現ベクターに組み込んで複製可能な組換えベクターを生産する工程；得られた組換えベクターを用いて宿主細胞または宿主生物を形質転換する工程；および形質転換した宿主細胞または宿主生物を培養しポリペプチドを生産する工程を含んでいる。【００５５】
ベースとなるＦｃ領域を含むポリペプチドは、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９３番目のアミノ酸、２９４のアミノ酸、２９６のアミノ酸、２９７のアミノ酸、２９８のアミノ酸および３００番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸以外のアミノ酸や、糖鎖修飾部位に結合した糖鎖等に欠失、付加、置換等の修飾がなされたものであってもよい。【００５６】
本発明のポリペプチドをコードする核酸は、塩基配列に変異を導入する慣用の方法で得ることができ、例えば、ベースとなるＦｃ領域における被置換アミノ酸残基をコードする核酸配列を、システインをコードする「ＴＧＣ」または「ＴＣＴ」に置き換えた核酸配列を含む合成オリゴヌクレオチドを用い、ベースとなるＦｃ領域を含むｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより調製することができる。本発明のポリペプチドは、エフェクター機能を阻害しない範囲で、システイン置換の変異を導入する工程中または導入後に、さらに他の修飾が施されてもよく、例えばアミノ酸配列や糖鎖結合部位に結合する糖鎖の一部に欠失、付加、置換等の修飾が施されてもよい。特に本発明においては、Ｆｃ領域の糖鎖結合部位に結合する糖鎖に公知の修飾を加えることにより、エフェクター機能の向上効果を得ることができ好ましい。【００５７】
複製可能な組換えベクターは、本発明のポリペプチドをコードする核酸（ＤＮＡ断片または全長ｃＤＮＡ）を適切な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより作製できる。発現ベクターとしては、導入する宿主細胞または宿主生物の種類に応じて適宜選択することができ、宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、目的とするポリペプチドをコードする核酸を転写可能なプロモーターを含有しているものが用いられる。これらの組換えベクターは、単独でまたは２種以上を組み合わせて用いてもよい。【００５８】
本発明においては、２以上の組換えベクターを併用してもよい。併用する組換えベクターとしては、例えば、相補的抗体軽鎖または重鎖、あるいは所望のレセプターやリガンドの結合ドメインをコードする核酸、所望の糖鎖修飾酵素をコードする核酸等と、適切なプロモーターとを含む発現ベクターを用いることができる。プロモーターは前記核酸に作動可能に連結していることが好ましい。これらの組換えベクターを併用することにより、より高いエフェクター機能を発現可能なポリペプチドを得ることができる。２以上の組換えベクターを用いる場合には、宿主細胞または宿主生物は同一でも異なってもよい。【００５９】
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。また、本発明においては、宿主細胞として、エフェクター機能に影響を及ぼす糖鎖結合部位に結合する糖鎖に対する修飾酵素の活性が低下または欠失した細胞を選択するか、人為的手法により同活性を低下または欠失させた細胞を用いることができる。このような酵素には、Ｎ−グリコシド結合糖鎖の修飾に係わる酵素等が含まれ、具体的には細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素、例えば、フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ）などのフコース転移酵素等が挙げられる。宿主生物としては、例えば動物個体、植物個体、細菌、ウイルス等が挙げられる。【００６０】
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥＰ１３（ATCC37115）、ＹＥｐ２４（ATCC37051）、ＹＣｐ５０（ATCC37419）等を利用できる。プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等を挙げることができる。宿主細胞としては、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、クリュイベロミセス属、トリコスポロン属、シュワニオミセス属等に属する微生物、例えば、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Kluyveromyces lactis、Trichosporon pullulans、Schwanniomyces alluvius等を挙げることができる。【００６１】
組換えベクターの酵母への導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法（Methods. Enzymol., 194, 182(1990)）、スフェロプラスト法（Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 75, 1929(1978)）、酢酸リチウム法（J. Bacteriology, 153, 163(1983)）、Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 75, 1929(1978)に記載の方法等を挙げることができる。
【００６２】
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社）、ｐＡＧＥ１０７（特開平３−２２９７９；Cytotechnology, 3, 133, (1990)）、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐＣＤＭ８（Nature, 329, 840, (1987)）、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Invitrogen社）、ｐＲＥＰ４（Invitrogen社）、ｐＡＧＥ１０３（J. Biochemistry, 101, 1307(1987)）、ｐＡＧＥ２１０等を挙げることができる。プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（immediate early）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等を挙げることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ラットミエローマ細胞、マウスミエローマ細胞、シリアンハムスター腎臓由来細胞、胚性幹細胞、受精卵細胞等を挙げることができる。【００６３】
組換えベクターの動物細胞への導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法（Cytotechnology, 3, 133(1990)）、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法（Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 84, 7413(1987)）、インジェクション法（マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３）、ＤＥＡＥ−デキストラン法（バイオマニュアルシリーズ４−遺伝子導入と発現・解析法（羊土社）横田崇・新井賢一編（１９９４））、ウイルスベクター法（マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版）等を挙げることができる。【００６４】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York(1992)、Bio/Technology, 6, 47(1988)等に記載された方法によって、タンパク質を発現することができる。すなわち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる。該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにInvitrogen社）等を挙げることができる。【００６５】
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Autographa californica nuclear polyhedrosis virus）等を用いることができる。昆虫細胞としては、Spodopterafrugiperdaの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１（カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York(1992)）、Trichoplusianiの卵巣細胞であるＨｉｇｈ５（Invitrogen社）等を用いることができる。【００６６】
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法（Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 84, 7413(1987)）等を挙げることができる。【００６７】
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等を挙げることができる。プロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等を挙げることができる。宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等を挙げることができる。【００６８】
組換えベクターの植物細胞への導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Agrobacterium）を用いる方法（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（日本特許第２６０６８５６、日本特許第２５１７８１３）等を挙げることができる。遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、前記モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、Ｆｃ領域と他のタンパク質との融合タンパク質発現等を行うことができる。【００６９】
このように１または２以上の組換えベクターが導入された形質転換体は、宿主に応じた培地を用いて、公知の方法に従って培養することにより、培養物中に所望のポリペプチドを生成蓄積することができる。【００７０】
大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フルクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。【００７１】
大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主とする形質転換体の培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中のｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調製は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。【００７２】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地（The Journal of the American Medical Association, 199, 519(1967)）、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地（Science, 122, 501(1952)）、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地（Virology, 8, 396(1959)）、１９９培地（Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1(1950)）、Ｗｈｉｔｔｅｎ培地（発生工学実験マニュアル−トランスジェニック・マウスの作り方（講談社）勝木元也編（１９８７））またはこれら培地にウシ胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。【００７３】
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（Pharmingen社）、Ｓｆ−９００ ＩＩ ＳＦＭ培地（Life Technologies社）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（いずれもJRH Biosciences社）、Grace’s Insect Medium（Nature, 195, 788(1962)）等を用いることができる。培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で、１〜５日間行う。また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。【００７４】
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。培養は、通常ｐＨ５〜９、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。【００７５】
培養している形質転換体は、自然にまたは誘導によりポリペプチドを発現し、培養物中に生成蓄積することができる。ポリペプチドの発現方法としては、直接発現以外に、例えば、前記モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。ポリペプチドの生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させるポリペプチドの構造を変えることにより、該方法を選択することができる。【００７６】
ポリペプチドが宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法（J. Biol. Chem., 264, 17619(1989)）、ロウらの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 86, 8227(1989)；Genes Develop., 4, 1288(1990)）、または特開平０５−３３６９６３、特開平０６−８２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該ポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。【００７７】
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、発現ベクターに、ポリペプチドをコードするＤＮＡ、およびポリペプチドの発現に適切なシグナルペプチドをコードするＤＮＡを挿入し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入の後にポリペプチドを発現させることにより、目的とするポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。また、特開平２−２２７０７５号公報に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された動物個体（トランスジェニック非ヒト動物）または植物個体（トランスジェニック植物）を造成し、これらの個体を用いてポリペプチドを製造することもできる。【００７８】
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、ポリペプチドを生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該ポリペプチドを採取することにより、該ポリペプチドを製造することができる。動物個体を用いてポリペプチドを製造する方法としては、例えば公知の方法（American Journal of Clinical Nutrition, 63, 639S(1996)；American Journal of Clinical Nutrition, 63, 627S(1996)；Bio/Technology, 9, 830(1991)）に準じて遺伝子を導入して作出した動物中に目的とするポリペプチドを生産する方法が挙げられる。【００７９】
動物個体の場合は、例えば、ポリペプチドをコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、ポリペプチドを該動物中に生成・蓄積させ、該動物中よりポリペプチドを採取することにより、ポリペプチドを製造することができる。該動物中の生成・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭６３−３０９１９２）、卵等を挙げることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で発現できるものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。【００８０】
植物個体を用いてポリペプチドを製造する方法としては、例えば抗体分子をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック植物を公知の方法（組織培養, 20(1994)；組織培養, 21(1995)；Trends in Biotechnology, 15, 45(1997)）に準じて栽培し、ポリペプチドを該植物中に生成・蓄積させ、該植物中より該ポリペプチドを採取することにより、ポリペプチドを生産する方法が挙げられる。ポリペプチドをコードする遺伝子を導入した形質転換体により製造されたポリペプチドは、例えばポリペプチドが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、すなわち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ−７５（三菱化学（株）製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Pharmacia社）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、ポリペプチドの精製標品を得ることができる。【００８１】
また、ポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分としてポリペプチドの不溶体を回収する。回収したポリペプチドの不溶体をタンパク質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析することにより、該ポリペプチドを正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法により該ポリペプチドの精製標品を得ることができる。【００８２】
ポリペプチドが細胞外に分泌された場合には、培養上清に該ポリペプチドあるいはその誘導体を回収することができる。すなわち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、ポリペプチドの精製標品を得ることができる。【００８３】
このようにして取得されるポリペプチドとして、例えば、抗体の変異体、抗体の変異体の断片、抗体の変異体のＦｃ領域を有する融合タンパク質（キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体等の抗原抗体反応を誘導可能な組換え抗体；キメラ分子等の抗体様分子）などを挙げることができる。
すなわち、本発明は、エフェクター機能を有する抗体におけるＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９３番目のアミノ酸、２９４のアミノ酸、２９６のアミノ酸、２９７のアミノ酸、２９８のアミノ酸および３００番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸残基をシステイン残基に置換する工程を含む、エフェクター機能が向上した抗体の変異体の製造方法を提供する。より具体的には、本発明は、以下の工程を含むエフェクター機能が向上した抗体の変異体の製造方法を提供する。
（１）エフェクター機能を有する抗体におけるＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９３番目のアミノ酸、２９４のアミノ酸、２９６のアミノ酸、２９７のアミノ酸、２９８のアミノ酸および３００番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸残基をシステイン残基に置換する工程
（２）ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９３番目のアミノ酸、２９４のアミノ酸、２９６のアミノ酸、２９７のアミノ酸、２９８のアミノ酸および３００番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸残基がシステイン残基に置換されたＦｃ領域を有するＨ鎖をコードするＤＮＡ、および、Ｌ鎖をコードするＤＮＡを宿主細胞または宿主生物に導入し、該ＤＮＡを発現させる工程
（３）発現産物を回収する工程。【００８４】
本発明の一つの態様としては、まず、当業者に公知のエフェクター機能を有する抗体におけるＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９３番目のアミノ酸、２９４のアミノ酸、２９６のアミノ酸、２９７のアミノ酸、２９８のアミノ酸および３００番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸残基をシステイン残基に置換する。本発明の別の態様としては、まず、エフェクター機能を有する抗体を製造し、次いで、製造された抗体におけるＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９３番目のアミノ酸、２９４のアミノ酸、２９６のアミノ酸、２９７のアミノ酸、２９８のアミノ酸および３００番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸残基をシステイン残基に置換する。例えば、まず、後述の方法によって所望の抗原に結合する抗体を得て、次いで、得られた抗体がエフェクター機能を有するか否かを当業者に周知の方法によって判定することで、エフェクター機能を有する抗体を製造することができる。エフェクター機能の判定方法としては、例えば実施例に記載の方法が挙げられる。【００８５】
本発明において、アミノ酸残基をシステイン残基に置換する方法は特に限定されるものではないが、例えば、部位特異的変異誘発法（Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vector:an efficient and general procedure for the production of point mutations in any fragment of DNA、Mark J. Zoller and Michael Smith、Nucleic Acids Research、Volume 10 Number 20, 6487-6500, 1982；Directed evolution of green fluorescent protein by a new versatile PCR strategy for site-directed and semi-random mutagenesis Asako Sawano and Atsushi Miyawaki、Nucleic Acids Research、Volume 28, Number 16, e78, 2000）によって行うことができる。【００８６】
本発明においては、次いで、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９３番目のアミノ酸、２９４のアミノ酸、２９６のアミノ酸、２９７のアミノ酸、２９８のアミノ酸および３００番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸残基がシステイン残基に置換されたＦｃ領域を有するＨ鎖をコードするＤＮＡ、および、Ｌ鎖をコードするＤＮＡを、当業者に周知な方法によって宿主細胞または宿主生物に導入し、該ＤＮＡを発現させる。次いで、当業者に周知な方法を利用することにより、発現産物（抗体の変異体）を回収することができる。【００８７】
ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９３番目のアミノ酸、２９４のアミノ酸、２９６のアミノ酸、２９７のアミノ酸、２９８のアミノ酸および３００番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸残基がシステイン残基に置換されたＦｃ領域を有するＨ鎖をコードするＤＮＡは、部分ＤＮＡに分けて製造することができる。部分ＤＮＡの組み合わせとしては、例えば、可変領域をコードするＤＮＡと定常領域をコードするＤＮＡ、あるいはＦａｂ領域をコードするＤＮＡとＦｃ領域をコードするＤＮＡが挙げられるが、これら組み合わせに限定されるものではない。Ｌ鎖をコードするＤＮＡもまた、同様に部分ＤＮＡに分けて製造することができる。【００８８】
以下に所望の抗原に結合する抗体を得る方法に関して述べる。
抗体のＨ鎖またはＬ鎖をコードする遺伝子は既知の配列を用いることも可能であり、また、当業者に公知の方法で取得することもできる。例えば、抗体ライブラリーから取得することも可能であるし、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから抗体をコードする遺伝子をクローニングして取得することも可能である。
抗体ライブラリーについては既に多くの抗体ライブラリーが公知になっており、また、抗体ライブラリーの作製方法も公知であるので、当業者は適宜抗体ライブラリーを入手することが可能である。例えば、抗体ファージライブラリーについては、Clackson et al., Nature 1991, 352: 624-8、Marks et al., J. Mol. Biol. 1991, 222: 581-97、Waterhouses et al., Nucleic Acids Res. 1993, 21: 2265-6、Griffiths et al., EMBO J. 1994, 13: 3245-60、Vaughan et al., Nature Biotechnology 1996, 14: 309-14、および特表平20−504970号公報等の文献を参照することができる。その他、真核細胞をライブラリーとする方法（WO95/15393号パンフレット）やリボソーム提示法等の公知の方法を用いることが可能である。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を元に適切な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に周知であり、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９３／０６２１３、ＷＯ９３／１１２３６、ＷＯ９３／１９１７２、ＷＯ９５／０１４３８、ＷＯ９５／１５３８８を参考にすることができる。【００８９】
ハイブリドーマから抗体をコードする遺伝子を取得する方法は、基本的には公知技術を使用し、所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法に従って免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞（ハイブリドーマ）をスクリーニングし、得られたハイブリドーマのｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（Ｖ領域）のｃＤＮＡを合成し、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結することにより得ることができる。【００９０】
より具体的には、特に以下の例示に限定される訳ではないが、本発明のＨ鎖およびＬ鎖をコードする抗体遺伝子を得るための感作抗原は、免疫原性を有する完全抗原と、免疫原性を示さないハプテン等を含む不完全抗原の両方を含む。例えば、目的タンパク質の全長タンパク質、または部分ペプチドなどを用いることができる。抗原の調製は、当業者に公知の方法により行うことができ、例えば、バキュロウイルスを用いた方法（例えば、ＷＯ９８／４６７７７など）などに準じて行うことができる。ハイブリドーマの作製は、たとえば、Milsteinらの方法（G. Kohler and C. Milstein, Methods Enzymol. 1981, 73: 3-46）等に準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。また、必要に応じ抗原を他の分子と結合させることにより可溶性抗原とすることもできる。受容体のような膜貫通分子を抗原として用いる場合、受容体の細胞外領域部分を断片として用いたり、膜貫通分子を細胞表面上に発現する細胞を免疫原として使用することも可能である。【００９１】
抗体産生細胞は、上述の適切な感作抗原を用いて動物を免疫化することにより得ることができる。または、抗体を産生し得るリンパ球をin vitroで免疫化して抗体産生細胞とすることもできる。免疫化する動物としては、各種哺乳動物を使用できるが、ゲッ歯目、ウサギ目、霊長目の動物が一般的に用いられる。マウス、ラット、ハムスター等のゲッ歯目、ウサギ等のウサギ目、カニクイザル、アカゲザル、マントヒヒ、チンパンジー等のサル等の霊長目の動物を例示することができる。その他、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物も知られており、このような動物を使用することによりヒト抗体を得ることもできる（ＷＯ９６／３４０９６; Mendez et al., Nat. Genet. 1997, 15: 146-56参照）。このようなトランスジェニック動物の使用に代えて、例えば、ヒトリンパ球をin vitroで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させることにより、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８号公報参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９４／０２６０２、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５参照）。【００９２】
動物の免疫化は、例えば、感作抗原をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または生理食塩水等で適宜希釈、懸濁し、必要に応じてアジュバントを混合して乳化した後、動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。その後、好ましくは、フロイント不完全アジュバントに混合した感作抗原を４〜２１日毎に数回投与する。抗体の産生の確認は、動物の血清中の目的とする抗体力価を慣用の方法により測定することにより行われ得る。【００９３】
ハイブリドーマは、所望の抗原で免疫化した動物またはリンパ球より得られた抗体産生細胞を、慣用の融合剤（例えば、ポリエチレングリコール）を使用してミエローマ細胞と融合して作製することができる（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986, 59-103）。必要に応じハイブリドーマ細胞を培養・増殖し、免疫沈降、放射免疫分析（RIA）、酵素結合免疫吸着分析（ELISA）等の公知の分析法により該ハイブリドーマより産生される抗体の結合特異性を測定する。その後、必要に応じ、目的とする特異性、親和性または活性が測定された抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等の手法によりサブクローニングすることもできる。【００９４】
続いて、選択された抗体をコードする遺伝子をハイブリドーマまたは抗体産生細胞（感作リンパ球等）から、抗体遺伝子に特異的に結合し得るプローブ（例えば、抗体定常領域をコードする配列に相補的なオリゴヌクレオチド等）を用いてクローニングすることができる。また、ｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによりクローニングすることも可能である。
【００９５】
構築された抗体遺伝子は公知の方法により発現させ、抗体を取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター／エンハンサー、発現させる抗体遺伝子、およびその３’側下流にポリＡシグナルを機能的に結合させたＤＮＡを含む発現ベクターにて、抗体遺伝子を発現させることができる。例えば、プロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウイルス前期プロモーター／エンハンサーが挙げられる。また、それ以外にも、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスプロモーター／エンハンサーやヒトエロンゲーションファクター−１αなどの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサーを用いることができる。例えば、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーを使用する場合には、Mullingらの方法（Mulling RC et al., Nature （1979） 277: 108-14）に従えば、容易に抗体遺伝子を発現することができる。ヒトエロンゲーションファクター−1αを用いる場合には、Mizushimaの方法（Mizushima, Nucleic Acids Res （1990） 18: 5322）に従えば、容易に抗体遺伝子を発現することができる。大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列、発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させたＤＮＡを含む発現ベクターにて、抗体遺伝子を発現させることができる。例えば、プロモーターとしてＬａｃＺプロモーター、ａｒａＢプロモーターが挙げられる。【００９６】
ハイブリドーマ培養・増殖または遺伝子組換えにより得られた抗体は、均一になるまで精製することができる。抗体の分離、精製は、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えば、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウム等による塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組合せれば、抗体を分離、精製することができる（Antibodies : A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）が、これらに限定されるものではない。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラム、プロテインＬカラム等が挙げられる。このようにして取得された抗体がエフェクター機能を有するか否かは、当業者に周知な方法によって判定可能であり、例えば実施例に記載の方法によって判定することができる。【００９７】
以下に、本発明のポリペプチドの取得のより具体的な例として、ヒト化抗体の製造方法について記すが、他のポリペプチドを当該方法と同様にして取得することもできる。【００９８】
（１）ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターとは、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９３番目のアミノ酸、２９４のアミノ酸、２９６のアミノ酸、２９７のアミノ酸、２９８のアミノ酸および３００番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸残基がシステインに置換されたヒト抗体の重鎖（Ｈ鎖）Ｃ領域およびヒト抗体の軽鎖（Ｌ鎖）Ｃ領域をコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９３番目のアミノ酸、２９４のアミノ酸、２９６のアミノ酸、２９７のアミノ酸、２９８のアミノ酸および３００番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸残基がシステインに置換されたヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域およびヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子をそれぞれクローニングすることにより構築することができる。【００９９】
ヒト抗体のＣ領域としては、任意のヒト抗体のＨ鎖およびＬ鎖Ｃ領域であることができ、例えば、ヒト抗体のＨ鎖のＩｇＧ１サブクラスのＣ領域（以下、ｈＣγ１と表記する）およびヒト抗体のＬ鎖のκクラスのＣ領域（以下、ｈＣκと表記する）等が挙げられる。
ヒト抗体のＨ鎖およびＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子としてはエキソンとイントロンからなる染色体ＤＮＡを用いることができ、また、ｃＤＮＡを用いることもできる。【０１００】
動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７（Cytotechnology, 3, 133(1990)）、ｐＡＧＥ１０３（J. Biochem., 101, 1307(1987)）、ｐＨＳＧ２７４（Gene, 27, 223(1984)）、ｐＫＣＲ（Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 78, 1527(1981)）、ｐＳＧ１βｄ２−４（Cytotechnology, 4, 173(1990)）等が挙げられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー（J. Biochem., 101, 1307(1987)）、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲ（Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 960(1987)）、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター（Cell, 41, 479(1985)）とエンハンサー（Cell, 33, 717(1983)）等が挙げられる。【０１０１】
ヒト化抗体発現用ベクターは、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ（以下、タンデム型と表記する）のどちらでも用いることができるが、ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の発現量のバランスが均衡する等の点からタンデム型のヒト化抗体発現用ベクターの方が好ましい（J. Immunol. Methods, 167, 271(1994)）。タンデム型のヒト化抗体発現ベクターとしては、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（Mol. Immunol., 37, 1035(2000)）、ｐＥＥ１８（Hybridoma, 17, 559(1998)）などが挙げられる。【０１０２】
構築したヒト化抗体発現用ベクターは、ヒト型キメラ抗体およびヒト型ＣＤＲ移植抗体の動物細胞での発現に使用できる。【０１０３】
（２）ヒト以外の動物の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得
ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体のＨ鎖およびＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡは以下のようにして取得することができる。【０１０４】
目的のマウス抗体を産生するハイブリドーマ細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージあるいはプラスミド等のベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、既存のマウス抗体のＣ領域部分あるいはＶ領域部分をプローブとして用い、Ｈ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを有する組換えファージあるいは組換えプラスミドおよびＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを有する組換えファージあるいは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージあるいは組換えプラスミド上の目的のマウス抗体のＨ鎖およびＬ鎖Ｖ領域の全塩基配列を決定し、塩基配列よりＨ鎖およびＬ鎖Ｖ領域の全アミノ酸配列を推定する。【０１０５】
ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等、ハイブリドーマ細胞を作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。【０１０６】
ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法（Methods in Enzymol., 154, 3(1987)）、また全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989）等が挙げられる。また、ハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製するキットとしては、Fast Track mRNA Isolation Kit（Invitrogen社）、Quick Prep mRNA Purification Kit（Pharmacia社）等が挙げられる。ｃＤＮＡの合成およびｃＤＮＡライブラリー作製法としては、常法（Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989；Current Protocols in MolecularBiology, Supplement 1-34）、あるいは市販のキット、例えば、Super ScriptTM Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning（GIBCO BRL社）やZAP-cDNA Synthesis Kit（Stratagene社）を用いる方法などが挙げられる。【０１０７】
ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマ細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターは、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ZAP Express（Strategies, 5, 58(1992)）、pBluescript II SK(+)（Nucleic Acids Research, 17, 9494(1989)）、λzap II（Stratagene社）、λgt10、λgt11（DNA Cloning:A Practical Approach, I, 49(1985)）、Lambda BlueMid（Clontech社）、λExCell、pT7T3 18U（Pharmacia社）、pcD2（Mol. Cell. Biol., 3, 280(1983)）およびpUC18（Gene, 33, 103(1985)）等が用いられる。【０１０８】
ファージあるいはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌としては該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現および維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、XL1-Blue MRF’（Strategies, 5, 81(1992)）、C600（Genetics, 39, 440(1954)）、Y1088、Y1090（Science, 222, 778(1983)）、NM522（J. Mol. Biol, 166, 1(1983)）、K802（J. Mol. Biol., 16, 118(1966)）およびJM105（Gene, 38, 275(1985)）等が用いられる。【０１０９】
ｃＤＮＡライブラリーからのヒト以外の動物の抗体のＨ鎖およびＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡクローンの選択法としては、アイソトープあるいは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法あるいはプラーク・ハイブリダイゼーション法（Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989）により選択することができる。また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Polymerase Chain Reaction（以下、ＰＣＲ法と表記する；Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989；Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-34）によりＨ鎖およびＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを調製することもできる。【０１１０】
上記方法により選択されたｃＤＮＡを、適切な制限酵素などで切断後、pBluescript SK(-)（Stratagene社）等のプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、サンガー（Sanger）らのジデオキシ法（Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 74, 5463(1977)）等の反応を行い、塩基配列自動分析装置、例えば、Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（Pharmacia社）等を用いて解析することで該ｃＤＮＡの塩基配列を決定することができる。【０１１１】
決定した塩基配列からＨ鎖およびＬ鎖Ｖ領域の全アミノ酸配列を推定し、既知の抗体のＨ鎖およびＬ鎖Ｖ領域の全アミノ酸配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991）と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含む抗体のＨ鎖およびＬ鎖Ｖ領域の完全なアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。【０１１２】
さらに、抗体可変領域のアミノ酸配列または該可変領域をコードするＤＮＡの塩基配列がすでに公知である場合には、以下の方法を用いて製造することができる。
アミノ酸配列が公知である場合には、アミノ酸配列を、コドンの使用頻度（Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991）を考慮してＤＮＡ配列に変換し、設計したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ法を行うことによりＤＮＡを得ることができる。塩基配列が公知である場合には、その情報を基に１００塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ法を行うことによりＤＮＡを得ることができる。【０１１３】
（３）ヒト以外の動物の抗体のＶ領域のアミノ酸配列の解析
分泌シグナル配列を含む抗体のＨ鎖およびＬ鎖Ｖ領域の完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＨ鎖およびＬ鎖Ｖ領域の全アミノ酸配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991）と比較することにより、分泌シグナル配列の長さおよびＮ末端アミノ酸配列を推定でき、更にはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、Ｈ鎖およびＬ鎖Ｖ領域の各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＨ鎖およびＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991）と比較することによって見出すことができる。【０１１４】
（４）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＨ鎖およびＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子の上流に、ヒト以外の動物の抗体のＨ鎖およびＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、ヒト以外の動物の抗体のＨ鎖およびＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを、ヒト以外の動物の抗体Ｈ鎖およびＬ鎖Ｖ領域の３’末端側の塩基配列とヒト抗体のＨ鎖およびＬ鎖Ｃ領域の５’末端側の塩基配列とからなり、かつ適切な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡとそれぞれ連結し、それぞれを（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＨ鎖およびＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。【０１１５】
（５）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖およびＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡは、以下のようにして構築することができる。まず、目的のヒト以外の動物の抗体のＨ鎖およびＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲを移植するヒト抗体のＨ鎖およびＬ鎖Ｖ領域のフレームワーク（以下、ＦＲと表記する）のアミノ酸配列を選択する。ヒト抗体のＨ鎖およびＬ鎖Ｖ領域のＦＲのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Protein Data Bank等のデータベースに登録されているヒト抗体のＨ鎖およびＬ鎖Ｖ領域のＦＲのアミノ酸配列、ヒト抗体のＨ鎖およびＬ鎖のＶ領域のＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991）等が挙げられるが、その中でも、十分な活性を有するヒト型ＣＤＲ移植抗体を作製するためには、目的のヒト以外の動物の抗体のＨ鎖およびＬ鎖Ｖ領域のＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）を有するアミノ酸配列を選択することが望ましい。【０１１６】
次に、選択したヒト抗体のＨ鎖およびＬ鎖Ｖ領域のＦＲのアミノ酸配列に目的のヒト以外の動物の抗体のＨ鎖およびＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖およびＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列を設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度（Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991）を考慮してＤＮＡ配列に変換し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖およびＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を設計する。設計したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ法を行う。この場合、ＰＣＲでの反応効率および合成可能なＤＮＡの長さから、Ｈ鎖、Ｌ鎖とも４〜６本の合成ＤＮＡを設計することが好ましい。
また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適切な制限酵素の認識配列を導入することで、（１）で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にクローニングすることができる。ＰＣＲ後、増幅産物をpBluescript SK(-)（Stratagene社）等のプラスミドにクローニングし、（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖およびＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを取得する。【０１１７】
（６）ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＨ鎖およびＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子の上流に、（５）で構築したヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖およびＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、（５）でヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖およびＬ鎖Ｖ領域を構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適切な制限酵素の認識配列を導入することで、（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＨ鎖およびＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。【０１１８】
（７）ヒト化抗体の安定的生産
（４）および（６）に記載のヒト化抗体発現ベクターを適切な動物細胞に導入することによりヒト型キメラ抗体およびヒト型ＣＤＲ移植抗体（以下、併せてヒト化抗体と称す）を安定に生産する形質転換株を得ることができる。動物細胞へのヒト化抗体発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法（特開平２−２５７８９１；Cytotechnology, 3, 133(1990)）等が挙げられる。ヒト化抗体発現ベクターを導入する動物細胞としては、ヒト化抗体を生産させることができる動物細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。
具体的には、マウスミエローマ細胞であるＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞、ＩＲ９８３Ｆ細胞、シリアンハムスター腎臓由来であるＢＨＫ細胞、ヒトミエローマ細胞であるナマルバ細胞などが挙げられるが、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣細胞であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞等が挙げられる。【０１１９】
ヒト化抗体発現ベクターの導入後、ヒト化抗体を安定に生産する形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、G418 sulfate（以下、G418と表記する；SIGMA社）等の薬剤を含む動物細胞培養用培地により選択できる。動物細胞培養用培地としては、RPMI1640培地（日水製薬社）、GIT培地（日本製薬社）、EX-CELL302培地（JRH社）、IMDM培地（GIBCO BRL社）、Hybridoma-SFM培地（GIBCO BRL社）、またはこれら培地にウシ胎児血清（以下、ＦＣＳと表記する）等の各種添加物を添加した培地等を用いることができる。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中にヒト化抗体を生産蓄積させることができる。培養上清中のヒト化抗体の生産量および抗原結合活性は酵素免疫抗体法（以下、ELISA法と表記する；Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14, 1998、Monoclonal Antibodies:Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996）等により測定できる。また、形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系等を利用してヒト化抗体の生産量を上昇させることができる。【０１２０】
ヒト化抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる（Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 8, 1988、Monoclonal Antibodies:Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996）。また、その他に通常、タンパク質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したヒト化抗体のＨ鎖、Ｌ鎖あるいは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと表記する；Nature, 227, 680(1970)）やウエスタンブロッティング法（Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 12, 1988、Monoclonal Antibodies:Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996）等で測定することができる。【０１２１】
以上、動物細胞を宿主としたポリペプチドの製造方法を示したが、上述したように、酵母、昆虫細胞、植物細胞または動物個体あるいは植物個体においても動物細胞と同様の方法によりポリペプチドを製造することができる。【０１２２】
すでに宿主細胞が、ポリペプチドを発現する能力を有する場合には、公知の方法を用いて本発明における、ポリペプチドを発現させる細胞を調製した後に、該細胞を培養し、該培養物から目的とするポリペプチドを精製することにより、本発明のポリペプチドを製造することができる。【０１２３】
また本発明は、細胞結合部分とＦｃ領域とを含むエフェクター機能を有するキメラ分子におけるＦｃ領域中のアミノ酸残基であって、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９３番目のアミノ酸、２９４のアミノ酸、２９６のアミノ酸、２９７のアミノ酸、２９８のアミノ酸および３００番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸残基をシステイン残基に置換する工程を含む、エフェクター機能が向上したキメラ分子変異体の製造方法を提供する。より具体的には本発明は、以下の工程を含むエフェクター機能が向上したキメラ分子変異体の製造方法を提供する。
（１）細胞結合部分とＦｃ領域とを含むエフェクター機能を有するキメラ分子におけるＦｃ領域中のアミノ酸残基であって、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９３番目のアミノ酸、２９４のアミノ酸、２９６のアミノ酸、２９７のアミノ酸、２９８のアミノ酸および３００番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸残基を、システイン残基に置換する工程、
（２）細胞結合部分と、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９３番目のアミノ酸、２９４のアミノ酸、２９６のアミノ酸、２９７のアミノ酸、２９８のアミノ酸および３００番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸残基がシステイン残基に置換されたＦｃ領域とを含むキメラ分子の変異体をコードするＤＮＡを宿主細胞または宿主生物に導入し、該ＤＮＡを発現させる工程、および
（３）発現産物を回収する工程。【０１２４】
本発明のキメラ分子変異体の製造方法で使用するキメラ分子としては、エフェクター機能を有する限り、細胞結合部分とＦｃ領域との間に、ペプチド領域を含むことができる。ペプチド領域としては、次の（１）〜（３）が例示できるが、これらに制限されるものではない。（１）リンカー、（２）抗体のヒンジ領域、ならびに、（３）リンカーおよび抗体のヒンジ領域。「抗体のヒンジ領域」には、抗体のヒンジ領域の全長だけでなく、エフェクター機能に寄与する（あるいはエフェクター機能を阻害しない）限り、抗体のヒンジ領域の一部も含まれる。【０１２５】
本発明のキメラ分子の変異体の製造方法においてはまず、細胞結合部分とＦｃ領域を含むエフェクター機能を有するキメラ分子におけるＦｃ領域中のアミノ酸残基であって、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９３番目のアミノ酸、２９４のアミノ酸、２９６のアミノ酸、２９７のアミノ酸、２９８のアミノ酸および３００番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸残基をシステイン残基に置換する。ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９３番目のアミノ酸、２９４のアミノ酸、２９６のアミノ酸、２９７のアミノ酸、２９８のアミノ酸および３００番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸残基をシステイン残基に置換する方法は特に限定されるものではないが、例えば、上述の部位特異的変異誘発法等によって行うことができる。【０１２６】
本発明のキメラ分子変異体の製造方法においては、次に、細胞結合部分と、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９３番目のアミノ酸、２９４のアミノ酸、２９６のアミノ酸、２９７のアミノ酸、２９８のアミノ酸および３００番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸残基がシステイン残基に置換されたＦｃ領域とを含むキメラ分子変異体をコードするＤＮＡを、当業者に周知な方法を利用して宿主細胞や宿主生物に導入し、該ＤＮＡを発現させる。当業者に周知な方法を利用することにより、発現産物（キメラ分子変異体）を回収することができる。【０１２７】
また本発明は、以下の工程を含むエフェクター機能が向上したキメラ分子変異体の製造方法を提供する。
（１）細胞結合部分とＦｃ領域とを含むキメラ分子を製造する工程、
（２）製造されたキメラ分子がエフェクター機能を有するか否かを判定する工程、
（３）エフェクター機能を有すると判定されたキメラ分子におけるＦｃ領域中のアミノ酸残基であって、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９３番目のアミノ酸、２９４のアミノ酸、２９６のアミノ酸、２９７のアミノ酸、２９８のアミノ酸および３００番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸を、システイン残基に置換する工程、
（４）細胞結合部分と、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９３番目のアミノ酸、２９４のアミノ酸、２９６のアミノ酸、２９７のアミノ酸、２９８のアミノ酸および３００番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸残基がシステイン残基に置換されたＦｃ領域とを含むキメラ分子の変異体をコードするＤＮＡを宿主細胞または宿主生物に導入し、該ＤＮＡを発現させる工程、および
（５）発現産物を回収する工程。
本方法においてはまず、細胞結合部分とＦｃ領域とを含むキメラ分子を製造する。製造されるキメラ分子は、少なくとも細胞結合部分およびＦｃ領域を有するものであり、例えば、細胞結合部分およびＦｃ領域の間にペプチド領域を有するキメラ分子が挙げられるが、これに限定されるものではない。キメラ分子の製造は、以下のようにして行うことが可能である。
まず細胞結合部分をコードするＤＮＡとＦｃ領域をコードするＤＮＡとを、当業者に周知な方法でクローニングする。また必要に応じて、これら以外のペプチドをコードするＤＮＡをクローニングする。Ｆｃ領域の由来は特に限定されず、エフェクター機能を有する抗体に由来するものであってもよいし、エフェクター機能を有しない抗体に由来するものであってもよい。
次いで、細胞結合部分をコードするＤＮＡと、Ｆｃ領域をコードするＤＮＡとを当業者に周知な方法で結合させ（必要に応じて、細胞結合部分をコードするＤＮＡ、およびＦｃ領域をコードするＤＮＡ、これら以外のペプチドをコードするＤＮＡを結合させ）、細胞結合部分とＦｃ領域とを含むキメラ分子をコードするＤＮＡを調製する。次いで、細胞結合部分とＦｃ領域とを含むキメラ分子をコードするＤＮＡを、当業者に周知な方法を利用して宿主細胞や宿主生物に導入し、該ＤＮＡを発現させる。当業者に周知な方法を利用することにより、発現産物（キメラ分子）を回収することができる。【０１２８】
本方法においては次に、上記にて製造したキメラ分子がエフェクター機能を有するか否かを判定する。キメラ分子がエフェクター機能を有するか否かの判定は、当業者に周知な方法によって行うことが可能であり、例えば実施例に記載の方法によって判定することができる。【０１２９】
本方法においては次に、エフェクター機能を有すると判定されたキメラ分子におけるＦｃ領域中のアミノ酸残基であって、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９３番目のアミノ酸、２９４のアミノ酸、２９６のアミノ酸、２９７のアミノ酸、２９８のアミノ酸および３００番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸残基をシステイン残基に置換する。ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９３番目のアミノ酸、２９４のアミノ酸、２９６のアミノ酸、２９７のアミノ酸、２９８のアミノ酸および３００番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸残基をシステイン残基に置換する方法は特に限定されるものではないが、例えば、上述の部位特異的変異誘発法等によって行うことができる。
本発明のキメラ分子変異体の製造方法においては、次に、細胞結合部分と、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９３番目のアミノ酸、２９４のアミノ酸、２９６のアミノ酸、２９７のアミノ酸、２９８のアミノ酸および３００番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸残基がシステイン残基に置換されたＦｃ領域とを含むキメラ分子変異体をコードするＤＮＡを、当業者に周知な方法を利用して宿主細胞や宿主生物に導入し、該ＤＮＡを発現させる。当業者に周知な方法を利用することにより、発現産物（キメラ分子の変異体）を回収することができる。【０１３０】
精製したポリペプチドのタンパク量、抗原もしくはＦｃＲとの結合活性あるいはエフェクター機能を測定する方法としては、Monoclonal Antibodies:principles and practice, Third Edition, Acad. Press, 1993、あるいはAntibodies, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988等に記載の公知の方法を用いることができる。具体的な例としては、ポリペプチドがヒト化抗体の場合、抗原またはＦｃＲとの結合活性や、抗原陽性培養細胞株またはＦｃＲ発現細胞に対する結合活性はELISA法および蛍光抗体法（Cancer Immunol. Immunother., 36, 373(1993)）、フローサイトメトリー法等により測定できる。抗原陽性培養細胞株に対する細胞傷害活性は、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性等を測定することにより、評価することができる（Cancer Immunol. Immunother., 36, 373(1993)）。また、ポリペプチドのヒトでの安全性、治療効果は、カニクイザル等のヒトに比較的近い動物種の適切なモデルを用いて評価することができる。【０１３１】
本発明のポリペプチドは、上記方法により措定されるＡＤＣＣ活性について、システイン置換がなされていないポリペプチドに対する向上効果を得ることができる。このため、抗体療法に用いる場合には薬剤の使用量を低くすることができるため、経済的であり、副作用を少なくすることができる。【０１３２】
本発明のポリペプチドは、上記のようにエフェクター機能が極めて向上されるため、治療、診断、評価等の広範な用途に利用可能である。【０１３３】
本発明の医薬組成物は、上記本発明のポリペプチドを含んでいる。このため、ＡＤＣＣ活性が改善されており、少量の投与量で十分な薬理効果を得ることができ、優れた抗体治療用途に極めて有利である。また、別の態様において、本発明の医薬組成物は、本発明のポリペプチドもしくはそのＦｃ受容体結合部分をコードする核酸、該核酸を含むベクターおよび／または該ベクターを有する宿主細胞または宿主生物を含んでいる。かかる組成物は、例えば、生物個体に存在する任意のまたは特定の抗体のＦｃ受容体結合部分を改変し、そのエフェクター機能を向上させる遺伝子療法に用いることができる。さらに別の態様において、本発明の医薬組成物は、本発明のポリペプチドをコードする核酸を含むベクターで形質転換したポリペプチド産生細胞、または、Ｆｃ領域における、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９３番目のアミノ酸、２９４のアミノ酸、２９６のアミノ酸、２９７のアミノ酸、２９８のアミノ酸および３００番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸がシステイン残基となるように、Ｆｃ領域をコードする遺伝子が改変された抗体産生細胞を含む。かかる組成物は、例えば、高エフェクター機能を有する抗体を体内で持続的に放出できるため、腫瘍の処置や免疫力の増強などを目的とした種々の細胞療法に用いることができる。上記医薬組成物には、上記成分以外に、例えば核酸類、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、その他の有機化合物、無機化合物、賦形剤などの製剤用添加物およびこれらの組み合わせなどが添加されていてもよい。本発明の医薬組成物は、必要に応じて成形手段を用いて製剤化し、経口または非経口に投与することができる。本発明の医薬組成物は、特に注射剤、点滴剤、経皮吸収剤による非経口投与等の方法で好適に利用できる。【０１３４】
より具体的には、本発明は、本発明のポリペプチド、該ポリペプチドもしくはそのＦｃ受容体結合部分をコードする核酸、該核酸を含むベクターおよび／または該ベクターを有する宿主細胞または宿主生物、および医薬的に許容し得る担体を含む、医薬組成物を提供する。また本発明は、本発明のポリペプチド、該ポリペプチドもしくはそのＦｃ受容体結合部分をコードする核酸、該核酸を含むベクターおよび／または該ベクターを有する宿主細胞または宿主生物を投与することを含む、哺乳動物の治療方法を提供する。哺乳動物としては、ヒト、非ヒト哺乳動物（例えばマウス、ラット、サルなど）が挙げられる。
【０１３５】
本発明の医薬組成物は、抗体に加えて医薬的に許容し得る担体を導入し、公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適切な容量が得られるようにするものである。【０１３６】
注射のための無菌組成物は注射用蒸留水などのベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適切な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０(TM)、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。【０１３７】
油性液としてはゴマ油、大豆油が挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適切なアンプルに充填する。【０１３８】
投与は好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。【０１３９】
また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。本発明のポリペプチドを含有する医薬組成物の投与量としては、例えば、１回につき体重１ｋｇあたり、約１μｇから１００ｍｇ（例えば約１μｇから１５ｍｇ、約１０μｇから２０ｍｇ、約０．１ｍｇから２０ｍｇ）の範囲で選ぶことが可能である。本発明の医薬組成物は、1箇所への投与または複数の別々の部位への投与が可能である。また本発明の医薬組成物は連続投与をすることも可能である。数日間以上に渡る繰り返し投与については、状態に応じて、望まれる疾患状態の抑制が起こるまで続けることができる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。【０１４０】
本発明の医薬組成物は、抗体療法を適用可能な広範な疾病の治療に用いることができる。抗体療法が適用される疾病・症状としては、例えば転移性乳ガン（抗ＨＥＲ２抗体）、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞非ホジキン性リンパ腫、血小板減少症、シェーグレン症候群、強直性脊椎炎、感覚障害、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、強皮症、関節リウマチ、多発性硬化症、リンパ球性白血病、１型糖尿病、肝硬変、リンパ腫、移植片拒絶、腎炎、多発性骨髄腫、脈管炎、自己免疫疾患、血液癌、種々のＣＤ２０陽性細胞腫瘍（抗ＣＤ２０抗体）、関節リウマチやクローン病（抗ＴＮＦα抗体）、腎臓移植後の急性拒絶反応（抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２５抗体）等が挙げられる。なお、上記括弧内は治療に用いる抗体を示している。これらの疾病等に対し、従来の抗体に代えて本発明の医薬組成物を利用することにより、治療効果を著しく向上でき、患者の経済的、身体的負担を軽減することができる。さらに、抗体療法に今後適用されうる抗体医薬としても好適に利用できる。さらにまた、本発明の医薬組成物は、患者の体内に存在する抗体のエフェクター機能を高め、患者の免疫力を増強する、種々の免疫療法や疾患の予防にも利用することができる。【０１４１】
また本発明は、エフェクター機能を有する抗体におけるＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９３番目のアミノ酸、２９４のアミノ酸、２９６のアミノ酸、２９７のアミノ酸、２９８のアミノ酸および３００番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸残基をシステイン残基に置換する工程を含む、抗体のエフェクター機能を向上させる方法を提供する。
さらに本発明は、細胞結合部分とＦｃ領域とを含むエフェクター機能を有するキメラ分子におけるＦｃ領域中のアミノ酸残基であって、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９３番目のアミノ酸、２９４のアミノ酸、２９６のアミノ酸、２９７のアミノ酸、２９８のアミノ酸および３００番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸残基をシステイン残基に置換する工程を含む、キメラ分子のエフェクター機能を向上させる方法を提供する。
上記方法において、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９３番目のアミノ酸、２９４のアミノ酸、２９６のアミノ酸、２９７のアミノ酸、２９８のアミノ酸および３００番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸残基の置換は、上述の方法によって適宜行うことができる。【０１４２】
また本発明は、以下の工程を含む、キメラ分子のエフェクター機能を向上させる方法を提供する。
（１）細胞結合部分とＦｃ領域とを含むキメラ分子を製造する工程、
（２）製造されたキメラ分子がエフェクター機能を有するか否かを判定する工程、
（３）エフェクター機能を有すると判定されたキメラ分子におけるＦｃ領域中のアミノ酸残基であって、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９３番目のアミノ酸、２９４のアミノ酸、２９６のアミノ酸、２９７のアミノ酸、２９８のアミノ酸および３００番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸をシステイン残基に置換する工程。
上記方法において、キメラ分子の製造、製造されたキメラ分子がエフェクター機能を有するか否かの判定、およびＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９３番目のアミノ酸、２９４のアミノ酸、２９６のアミノ酸、２９７のアミノ酸、２９８のアミノ酸および３００番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸残基の置換は、上述の方法によって適宜行うことができる。【０１４３】
また、本発明は、Ｆｃ領域含有ポリペプチドのＦｃ領域における、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９３番目のアミノ酸、２９４のアミノ酸、２９６のアミノ酸、２９７のアミノ酸、２９８のアミノ酸および３００番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸をシステイン残基に置換する工程を含む、エフェクター機能の高いＦｃ領域含有ポリペプチドを製造する方法、ならびに、同方法で製造されたＦｃ領域含有ポリペプチドに関する。
さらに、本発明は、抗体のＦｃ領域における、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９３番目のアミノ酸、２９４のアミノ酸、２９６のアミノ酸、２９７のアミノ酸、２９８のアミノ酸および３００番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸をシステイン残基に置換する工程を含む、抗体のエフェクター機能を高める方法、ならびに、同方法により得られた抗体に関する。【０１４４】
本発明において、Ｆｃ領域含有ポリペプチドは、抗体のＦｃ領域を含むポリペプチドであれば特に限定されないが、例えば、抗体、および、細胞結合部分とＦｃ領域とを含む前記キメラ分子を包含する。上記方法における所定のアミノ酸残基のシステイン残基への置換は、上述のような、任意の既知の方法を用いて行うことができる。具体的には、限定されることなく、例えば、Ｆｃ領域含有ポリペプチドまたは抗体をコードする核酸を単離し、該核酸に所定の置換配列を部位特異的変異導入法などにより導入してから、得られた核酸を宿主細胞に導入して発現させることにより達成することができる。上記方法は、典型的にはin vitroで行うが、生体内に存在するＦｃ領域含有ポリペプチド、例えば抗体の遺伝子を、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９３番目のアミノ酸、２９４のアミノ酸、２９６のアミノ酸、２９７のアミノ酸、２９８のアミノ酸および３００番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸がシステイン残基に置換された変異遺伝子と生体内で置換することにより、in vivoにおいても行うことができる。所定の遺伝子を、所定の変異遺伝子とin vivoにおいて置換する方法は当業者に知られている。【０１４５】
本発明はさらに、Ｆｃ領域における、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９３番目のアミノ酸、２９４のアミノ酸、２９６のアミノ酸、２９７のアミノ酸、２９８のアミノ酸および３００番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸をシステイン残基に置換するように、抗体産生細胞のＦｃ領域をコードする遺伝子を変異させる工程を含む、高エフェクター機能抗体産生細胞を作製する方法、ならびに、同方法で作製された抗体産生細胞に関する。【０１４６】
ここで、抗体産生細胞は、抗体産生能を有する細胞であれば特に限定されないが、例えば、Ｂ細胞や形質細胞などの天然に存在する細胞、これら天然に存在する細胞と、他の細胞、例えば腫瘍細胞とのハイブリドーマ、さらには、抗体遺伝子を発現可能に、好ましくは分泌可能に導入された任意の細胞を包含する。抗体産生細胞のＦｃ領域をコードする遺伝子への変異導入は、所望の変異遺伝子を含むベクターによるトランスフェクションなどの任意の既知の方法で行うことができる。上記方法は、典型的にはin vitroで行うが、生体内に存在する抗体産生細胞、例えばＢ細胞や形質細胞の遺伝子を、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９３番目のアミノ酸、２９４のアミノ酸、２９６のアミノ酸、２９７のアミノ酸、２９８のアミノ酸および３００番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸がシステイン残基に置換された変異遺伝子と生体内で置換することにより、in vivoにおいても行うことができる。所定の遺伝子を、所定の変異遺伝子とin vivoにおいて置換する方法は当業者に知られている。【０１４７】
上記方法で作製された抗体産生細胞は、抗体の生産に用いることができるばかりでなく、該細胞の生体への移入を伴う細胞療法などに用いることができる。かかる療法に用いる場合、細胞は移入される動物と同種の細胞が好ましく、移入される個体から採取した自己細胞がさらに好ましい。上記方法で作製された抗体産生細胞は、移入前に、必要に応じて増殖させることもできる。細胞培養や細胞の投与法など、細胞療法にかかる種々の技法は当業者に知られている。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０１４８】
以下、実施例に基づき本発明を詳細に説明する。なお、本発明はこれらの実施例に限定されない。【０１４９】
実施例１  抗ＣＤ２０キメラ抗体のＨ鎖定常領域アミノ酸変異体（Glu293Cys、Glu294Cys、Tyr296Cys、Asn297Cys、Ser298CysおよびTyr300Cys変異体）の作製
１−１．抗ＣＤ２０キメラ抗体（野生型）をコードする遺伝子のクローニング
１−１−１．抗ＣＤ２０マウスＬ鎖可変領域遺伝子
抗ＣＤ２０マウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞からQuickPrep micro mRNA purification kit（Amersham Biosciences社、製品コード27-9255-01）を用いてｍＲＮＡを得、これをもとにFirst-Strand cDNA Synthesis kit（Amersham Biosciences, code 27-9261-01）を用いてｃＤＮＡを作製した。このｃＤＮＡを鋳型として、以下に示すMKV1〜11のいずれかから選択されるセンスプライマーとアンチセンスプライマーMKCとの組み合わせによるＰＣＲ反応によりＬ鎖可変領域遺伝子を増幅した。ＰＣＲ反応は、ｃＤＮＡ  ４μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ  ４μｌ、センスプライマー（２０μＭ）２．５μｌ、アンチセンスプライマー（２０μＭ）２．５μｌ、ＤＭＳＯ  ２．５μｌ、×１０  pfu polymerase buffer  ５μｌ、pfu polymerase  １μｌ、および滅菌水２８．５μｌからなる合計５０μｌの反応液を用い、９４℃  ２分；９４℃  １分、５５℃  ２分、７２℃  ２分（３０サイクル）；７２℃  ４分で反応させ、増幅産物を４℃で保存した。【０１５０】
プライマーのＤＮＡ配列は以下のとおりである。
MKV1 primer：ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTG（配列番号：９５）
MKV2 primer：ATGGAGWCAGACACACTCCTGYTATGGGTG（配列番号：９６）
MKV3 primer：ATGAGTGTGCTCACTCAGGTCCTGGSGTTG（配列番号：９７）
MKV4 primer：ATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGGMWTCTTG（配列番号：９８）
MKV5 primer：ATGGATTTWCAGGTGCAGATTWTCAGCTTC（配列番号：９９）
MKV6 primer：ATGAGGTKCYYTGYTSAGYTYCTGRGG（配列番号：１００）
MKV7 primer：ATGGGCWTCAAGATGGAGTCACAKWYYCWGG（配列番号：１０１）
MKV8 primer：ATGTGGGGAYCTKTTTYCMMTTTTTCAATTG（配列番号：１０２）
MKV9 primer：ATGGTRTCCWCASCTCAGTTCCTTG（配列番号：１０３）
MKV10 primer：ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTCT（配列番号：１０４）
MKV11 primer：ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCC（配列番号：１０５）
MKC primer：ACTGGATGGTGGGAAGATGG（配列番号：１０６）
（上記配列中、Ｍ＝ＡまたはＣ、Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｓ＝ＣまたはＧ、Ｙ＝ＣまたはＴ、Ｋ＝ＧまたはＴである）
上記MKV5 primerとMKC primerの組み合わせにより、抗ＣＤ２０マウスＬ鎖可変領域遺伝子が増幅され、この遺伝子をpCR2.1ベクター（Invitrogen社）に挿入し、pCR2.1-MLVを得た。【０１５１】
１−１−２．抗ＣＤ２０マウスＨ鎖可変領域遺伝子のクローニング
センスプライマーとして下記MHV1〜12 primerのいずれかを、アンチセンスプライマーとして下記MHCG2b primerを用いた以外は上記１−１−１．と同様にして、抗ＣＤ２０マウスＨ鎖可変領域遺伝子を増幅した。
センスプライマー
MHV1 primer：ATGAAATGCAGCTGGGGCATSTTCTTC（配列番号：１０７）
MHV2 primer：ATGGGATGGAGCTRTATCATSYTCTT（配列番号：１０８）
MHV3 primer：ATGAAGWTGTGGTTAAACTGGGTTTTT（配列番号：１０９）
MHV4 primer：ATGRACTTTGGGYTCAGCTTGRTTT（配列番号：１１０）
MHV5 primer：ATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTTCCTT（配列番号：１１１）
MHV6 primer：ATGGCTGTCYTRGSGCTRCTCTTCTGC（配列番号：１１２）
MHV7 primer：ATGGRATGGAGCKGGRTCTTTMTCTT（配列番号：１１３）
MHV8 primer：ATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTG（配列番号：１１４）
MHV9 primer：ATGGMTTGGGTGTGGAMCTTGCTATTCCTG（配列番号：１１５）
MHV10 primer：ATGGGCAGACTTACATTCTCATTCCTG（配列番号：１１６）
MHV11 primer：ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTG（配列番号：１１７）
MHV12 primer：ATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACCTG（配列番号：１１８）
アンチセンスプライマー
MHCG2b primer：CAGTGGATAGACTGATGGGGG（配列番号：１１９）
（上記配列中、Ｍ、Ｒ、Ｗ、Ｓ、ＹおよびＫは上記１−１−１．と同じ意味を有する）
上記MHV7 primerとMHCG2b primerの組み合わせにより、抗ＣＤ２０マウスＨ鎖可変領域遺伝子が増幅され、この遺伝子をpCR2.1ベクター（Invitogen）に挿入し、pCR2.1-MHVを得た。【０１５２】
１−１−３．ヒトＩｇＧ１  Ｌ鎖定常領域遺伝子のクローニング
ヒトの血液からLymphoprep（Axis Shield社）を用いてリンパ球を単離した。このリンパ球からQuickPrep micro mRNA purification kit（Amersham Biosciences社、コード番号27-9255-01）を用いてｍＲＮＡを得、これをもとにFirst-Strand cDNA Synthesis kit（Amersham Biosciences社、コード番号27-9261-01）を用いてｃＤＮＡを作製した。このｃＤＮＡを鋳型にし、プライマーとして以下のものを用いた以外は上記１−１−１．と同様にして、ヒトＩｇＧ１  Ｌ鎖定常領域遺伝子を増幅した。得られた遺伝子をpCR2.1ベクター（Invitrogen社）に挿入し、pCR2.1-LCを得た。
センスプライマー
hIgG1 LCF primer：ACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTC（配列番号：１２０）
アンチセンスプライマー
hIgG1 LCR primer：TTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT（配列番号：１２１）【０１５３】
１−１−４．ヒトＩｇＧ１  Ｈ鎖定常領域遺伝子
プライマーとして以下のものを用いた以外は上記１−１−３．と同様にして、ヒトＩｇＧ１  Ｈ鎖定常領域遺伝子を増幅した。得られた遺伝子をpCR2.1ベクター（Invitrogen社）に挿入し、pCR2.1-HC（野生型）を得た。
センスプライマー
hIgG1 HCF primer：GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC（配列番号：１２２）
アンチセンスプライマー
hIgG1 HCR primer：TTATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCT（配列番号：１２３）【０１５４】
１−１−５．抗ＣＤ２０キメラ抗体Ｌ鎖発現ベクターの構築
抗ＣＤ２０マウスＬ鎖可変領域遺伝子とヒトＩｇＧ１  Ｌ鎖定常領域遺伝子とを発現ベクターにタンデムに組み込み、抗ＣＤ２０キメラ抗体Ｌ鎖発現ベクター（pキメラLC）を作製した。すなわち、発現ベクターBCMGneoのＸｈｏＩおよびＮｏｔＩサイトに、抗ＣＤ２０マウスＬ鎖可変領域遺伝子とヒトＩｇＧ１  Ｌ鎖定常領域遺伝子とを挿入した。抗ＣＤ２０マウスＬ鎖可変領域遺伝子としては、上記１−１−１．で作製したpCR2.1-MLVを鋳型に以下のＰＣＲ反応を行うことで得た断片を、ヒトＩｇＧ１  Ｌ鎖定常領域遺伝子としては、上記１−１−３．で作製したｐＣＲ２．１−ＬＣを鋳型に以下のＰＣＲ反応を行うことで得た断片をそれぞれ用いた。【０１５５】
抗ＣＤ２０マウスＬ鎖可変領域遺伝子断片は、pCR2.1-MLV（２０ｎｇ／μｌ）２μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ  ４μｌ、センスプライマー（２０μＭ）２．５μｌ、アンチセンスプライマー（２０μＭ）２．５μｌ、ＤＭＳＯ  ２．５μｌ、×１０  pfu polymerase Buffer  ５μｌ、pfu polymerase  １μｌおよび滅菌水３０．５μｌからなる合計５０μｌの反応液を用い、９４℃  ２分；９４℃  １分、５５℃  ２分、７２℃  ２分（２０サイクル）；７２℃  ４分で反応させることによって得、４℃で保存した。
センスプライマー
L1 primer：ACCGCTCGAGATGGATTTTCAGGTGCAGATTATCAGC（配列番号：１２４）
アンチセンスプライマー
L2 primer：TTTCAGCTCCAGCTTGGTCCCAGCACC（５’−リン酸化されている）（配列番号：１２５）
また、ヒトＩｇＧ１  Ｌ鎖定常領域遺伝子断片は、鋳型としてpCR2.1-LCを、プライマーとして以下のものをそれぞれ用いた以外は、上記抗ＣＤ２０マウスL鎖可変領域遺伝子と同様にして得た。
センスプライマー
L3 primer：ACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC（５’−リン酸化されている）（配列番号：１２６）
アンチセンスプライマー
L4 primer：ATAGTTTAGCGGCCGCTTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGT（配列番号：１２７）【０１５６】
上記のＰＣＲ反応で得た抗ＣＤ２０マウスＬ鎖可変領域遺伝子断片およびヒトＩｇＧ１  Ｌ鎖定常領域遺伝子断片は、制限酵素ＸｈｏＩ（Takara社）およびＮｏｔＩ（Takara社）でそれぞれ切断してから、Wizard（登録商標）SV Gel and PCR Clean-up System（Promega社）を用いて精製した。次いで、BCMGneoベクターをＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断し、Wizard（登録商標）SV Gel and PCR Clean-up System（Promega社）を用いて精製した断片と、上記精製抗ＣＤ２０マウスＬ鎖可変領域遺伝子断片および精製ヒトＩｇＧ１  Ｌ鎖定常領域遺伝子断片とを混合してライゲーションし、抗ＣＤ２０キメラ抗体L鎖発現ベクター、pキメラLCを得た。得られたベクターをシークエンシングし、目的の断片が挿入されていることを確認した。挿入されたＬ鎖遺伝子およびこれがコードするアミノ酸の配列を、配列番号：６６および６５にそれぞれ示す。【０１５７】
１−１−６．抗ＣＤ２０キメラ抗体Ｈ鎖発現ベクターの構築
抗ＣＤ２０マウスＨ鎖可変領域遺伝子とヒトＩｇＧ１  Ｈ鎖定常領域遺伝子とを発現ベクターにタンデムに組み込み、抗ＣＤ２０キメラ抗体Ｈ鎖発現ベクター（pキメラHC（野生型））を作製した。すなわち、発現ベクターBCMGneoのＸｈｏＩおよびＮｏｔＩサイトに抗ＣＤ２０マウスＨ鎖可変領域遺伝子とヒトＩｇＧ１  Ｈ鎖定常領域遺伝子とを挿入した。抗ＣＤ２０マウスＨ鎖可変領域遺伝子としては、上記１−１−２．で作製したpCR2.1-MHVを鋳型に以下のＰＣＲ反応を行うことで断片を得た断片を、抗ＣＤ２０マウスＨ鎖定常領域遺伝子としては、上記１−１−４．で作製したpCR2.1-HC（野生型）を鋳型に以下のＰＣＲ反応を行うことで得た断片をそれぞれ用いた。抗ＣＤ２０マウスＨ鎖可変領域遺伝子は、鋳型としてpCR2.1-MHVを、プライマーとして以下のものを用いた以外は上記１−１−５．の抗ＣＤ２０マウスＬ鎖可変領域遺伝子と同様にして得た。
センスプライマー
H1 primer：ACCGCTCGAGATGGGATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTC（配列番号：１２８）
アンチセンスプライマー
H2 primer：TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC（５’−リン酸化されている）（配列番号：１２９）
また、ヒトＩｇＧ１  Ｈ鎖定常領域遺伝子は、鋳型としてpCR2.1-HC（野生型）を、プライマーとして以下のものを用いた以外は上記１−１−５．の抗ＣＤ２０マウスＬ鎖可変領域遺伝子と同様にして得た。
センスプライマー
H3 primer：GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC（５’−リン酸化されている）（配列番号：１３０）
アンチセンスプライマー
H4 primer：ATAGTTTAGCGGCCGCTTATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTT（配列番号：１３１）
【０１５８】
上記のＰＣＲ反応で得た抗ＣＤ２０マウスＨ鎖可変領域遺伝子断片およびヒトＩｇＧ１  Ｈ鎖定常領域遺伝子断片は、制限酵素ＸｈｏＩ（Takara社）およびＮｏｔＩ（Takara社）でぞれぞれ切断してから、Wizard（登録商標）SV Gel and PCR Clean-up System（Promega社）を用いて精製した。次いで、BCMGneoベクターをＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断し、Wizard（登録商標）SV Gel and PCR Clean-up System（Promega社）を用いて精製した断片と、上記精製抗ＣＤ２０マウスＨ鎖可変領域遺伝子断片および精製ヒトＩｇＧ１  Ｈ鎖定常領域遺伝子断片とを混合してライゲーションし、抗ＣＤ２０キメラ抗体Ｈ鎖の発現ベクター、pキメラHC（野生型）を得た。得られたベクターをシークエンシングし、目的の断片が挿入されていることを確認した。挿入された野生型Ｈ鎖遺伝子およびこれがコードするアミノ酸の配列を配列番号：５０および４９にそれぞれ示す。【０１５９】
１−２．抗ＣＤ２０キメラ抗体発現ベクターの構築
上記１−１．で得たｐキメラLCおよびｐキメラHC（野生型）から制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩを用いてＬ鎖ｃＤＮＡおよびＨ鎖ｃＤＮＡを分離し、pIRESneo2ベクターおよびpIRESpuro2ベクターにそれぞれ常法により挿入し、Ｌ鎖発現ベクター、抗CD20 mab L chain/pIRESneo2、およびＨ鎖発現ベクター、抗CD20 mab H chain/pIRESpuro2を得た。得られたベクターはABI3100-Avant（Applied Biosystems社）を用いて、取扱説明書に従ってシークエンシングし、ＤＮＡ塩基配列の確認を行った。【０１６０】
１−３．Ｈ鎖定常領域アミノ酸変異体をコードするｃＤＮＡの取得およびアミノ酸改変Ｈ鎖発現ベクターの構築
Ｈ鎖定常領域の293Glu、294Glu、296Tyr、297Asn、298Ser、300TyrをCysに改変させた抗体を取得する目的で、上記１−１−６．で得たpキメラHC（野生型）を鋳型として、QuikChange（Stratagene社）を用いて取り扱い説明書に従い、部位特異的変異導入を行った。Glu293Cys変異導入にはGlu293Cysセンスプライマー （5'-GCCAAGACAAAGCCGCGGTGCGAGCAGTACAACAGCACGTACCGGGTGGTC-3'、配列番号：１３２）およびGlu293Cysアンチセンスプライマー（5'-GACCACCCGGTACGTGCTGTTGTACTGCTCGCACCGCGGCTTTGTCTTGGC-3'、配列番号：１３３）を使用し、pキメラGlu293Cysを得た。Glu294Cys変異導入にはGlu294Cysセンスプライマー（5'-GACAAAGCCGCGGGAGTGCCAGTACAACAGCACGTACCGGGTGGTC-3'、配列番号：１３４）およびGlu294Cysアンチセンスプライマー（5'-GACCACCCGGTACGTGCTGTTGTACTGGCACTCCCGCGGCTTTGTC-3'、配列番号：１３５）を使用し、pキメラGlu294Cysを得た。Tyr296Cys変異導入にはTyr296Cysセンスプライマー（5'-AAGCCGCGGGAGGAGCAGTGCAACAGCACGTACCGGGT-3'、配列番号：１３６）およびTyr296Cysアンチセンスプライマー（5'-ACCCGGTACGTGCTGTTGCACTGCTCCTCCCGCGGCTT-3'、配列番号：１３７）を使用し、pキメラTyr296Cysを得た。Asn297Cys変異導入にはAsn297Cysセンスプライマー（5'-AGGAGCAGTACTGCAGCACGTACCGGGT-3'、配列番号：１３８）およびAsn297Cysアンチセンスプライマー（5'-ACCCGGTACGTGCTGCAGTACTGCTCCT-3'、配列番号：１３９）を使用し、pキメラAsn297Cysを得た。Ser298Cys変異導入にはSer298Cysセンスプライマー（5'-GAGGAGCAGTACAACTGCACGTACCGGGTGG-3'、配列番号：１４０）およびSer298Cysアンチセンスプライマー（5'-CCACCCGGTACGTGCAGTTGTACTGCTCCTC-3'、配列番号：１４１）を使用し、pキメラSer298Cysを得た。Tyr300Cys変異導入にはTyr300Cysセンスプライマー（5'-AGCAGTACAACAGCACGTGCCGGGTGGTCAGCGT-3'、配列番号：１４２）およびTyr300Cysアンチセンスプライマー（5'-ACGCTGACCACCCGGCACGTGCTGTTGTACTGCT-3'、配列番号：１４３）を使用し、pキメラTyr300Cysを得た。挿入されたｃＤＮＡの配列確認はABI3100-Avant（Applied Biosystems社）を用いて、取扱説明書に従って行った。【０１６１】
上記部位特異的変異導入により得た、pキメラGlu293Cys、pキメラGlu294Cys、pキメラTyr296Cys、pキメラAsn297Cys、pキメラSer298Cys、およびpキメラTyr300Cysより制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩを用いてＨ鎖ｃＤＮＡを分離し、それぞれpIRESpuro2ベクターに常法により挿入し、アミノ酸改変Ｈ鎖発現ベクター抗CD20 mab H_Glu293Cys/pIRESpuro2、抗CD20 mab H_Glu294Cys/pIRESpuro2、抗CD20 mab H_Tyr296Cys/pIRESpuro2、抗CD20 mab H_Asn297Cys/pIRESpuro2、抗CD20 mab H_Ser298Cys/pIRESpuro2、抗CD20 mab H_Tyr300Cys/pIRESpuro2をそれぞれ得た。得られたベクターは、ABI3100-Avant（Applied Biosystems社）を用いて、取扱説明書に従ってＤＮＡ塩基配列の確認を行った。各アミノ酸改変抗体Ｈ鎖の遺伝子およびこれがコードするアミノ酸の配列番号を下表に示す。
【表８】
0005620106.tif 000010
【０１６２】
１−４．ＣＨＯ細胞を用いた抗ＣＤ２０キメラ抗体産生細胞株の作製
上記１−２．および１−３．で得たＬ鎖発現ベクター抗CD20 mab L chain/pIRESneo2と、野生型Ｈ鎖発現ベクター抗CD20 mab H/pIRESpuro2または定常領域アミノ酸改変Ｈ鎖発現ベクター抗CD20 mab H_Glu293Cys/pIRESpuro2、抗CD20 mab H_Glu294Cys/pIRESpuro2、抗CD20 mab H_Tyr296Cys/pIRESpuro2、抗CD20 mab H_Asn297Cys/pIRESpuro2、抗CD20 mab H_Ser298Cys/pIRESpuro2、抗CD20 mab H_Tyr300Cys/pIRESpuro2を、FuGENE（登録商標）（Roche社）を用い、取扱説明書に従ってＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣカタログ番号CCL-61）に遺伝子導入した。すなわち、野生型抗体産生細胞を作製する場合は抗CD20 mab L chain/pIRESneo2および抗CD20 mab H/pIRESpuro2を、Glu293Cys改変抗体産生細胞を作製する場合は抗CD20 mab L chain/pIRESneo2および抗CD20 mab H_Glu293Cys/pIRESpuro2を、Glu294Cys改変抗体産生細胞を作製する場合は抗CD20 mab L chain/pIRESneo2および抗CD20 mab H_Glu294Cys/pIRESpuro2を、Tyr296Cys改変抗体産生細胞を作製する場合は抗CD20 mab L chain/pIRESneo2および抗CD20 mab H_Tyr296Cys/pIRESpuro2を、Asn297Cys改変抗体産生細胞を作製する場合は抗CD20 mab L chain/pIRESneo2および抗CD20 mab H_Asn297Cys/pIRESpuro2を、Ser298Cys改変抗体産生細胞を作製する場合は抗CD20 mab L chain/pIRESneo2 および抗CD20 mab H_Ser298Cys/pIRESpuro2を、そしてTyr300Cys改変抗体産生細胞を作製する場合は抗CD20 mab L chain/pIRESneo2および抗CD20 mab H_Tyr300Cys/pIRESpuro2を、ＣＨＯ−Ｋ１細胞にそれぞれ遺伝子導入し、Ｌ鎖およびＨ鎖を共発現させた。【０１６３】
遺伝子導入したＣＨＯ−Ｋ１細胞は、１０％ＦＣＳ（Hyclone社）、ペニシリン−ストレプトマイシン（SIGMA社）含有ＲＰＭＩ１６４０培地（SIGMA社）にて培養し、さらにPuromycin（SIGMA社）５μｇ／ｍｌおよびＧ４１８（和光純薬社）０．６ｍｇ／ｍｌを添加して薬剤選択を行なった。薬剤耐性が確認された細胞は限界希釈を行い、single cell cloneについて抗体産生能を指標としたスクリーニングを行った。抗体発現細胞のスクリーニングは、抗ヒトＩｇγ鎖抗体（SIGMA社）およびＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＦｃ抗体（Cappel社）を用いたサンドイッチELISAにより行い、各抗体を高生産する抗ＣＤ２０キメラ抗体産生細胞株を樹立した。【０１６４】
１−４−１．ＦＵＴ８ノックダウンＣＨＯ−Ｋ１細胞の作製
フコースを含まない抗体を製造するために、フコシルトランスフェラーゼ８（ＦＵＴ８）をノックダウンしたＣＨＯ−Ｋ１細胞を作製した。この細胞に上記１−４．に従って抗体遺伝子を導入することにより、フコースを含まない抗体を作製することができる。
具体的には、ＦＵＴ８  ｓｉＲＮＡセンスプライマー（5’-gatccccgctgagtctctccgaatacttcaagagagtattcggagagactcagcttttta-3’、配列番号：１４４）およびＦＵＴ８  ｓｉＲＮＡアンチセンスプライマー（5’-tcgataaaaagctgagtctctccgaatactctcttgaagtattcggagagactcagcggg-3’、配列番号：１４５）を、常法に従い、ＮａＣｌ存在下９９℃で２分間加熱後、７２℃から４℃まで２時間かけて冷却することによってアニーリングさせた。得られたＤＮＡ断片を、pSuper gfp+neo（OligoEngine社）に挿入した。挿入されたＤＮＡ塩基配列はABI3100-Avant（Applied Biosystems社）を用いて確認を行い、ＦＵＴ８  ｓｉＲＮＡ発現ベクター FUT8 SiRNA/pSuper gfp+neoを構築した。【０１６５】
得られたＦＵＴ８  ｓｉＲＮＡ発現ベクターFUT8 siRNA/pSuper gfp+neoはFuGENE（登録商標）（Roche社）を用い、取扱説明書に従ってＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣカタログ番号CCL-61）に遺伝子導入した。遺伝子導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞は１０％ＦＣＳ（Hyclone社）、ペニシリン−ストレプトマイシン（SIGMA社）含有ＲＰＭＩ１６４０培地（SIGMA社）にて培養し、さらにＧ４１８（和光純薬社）０．６ｍｇ／ｍｌを添加して薬剤選択を行なった。薬剤耐性を獲得した細胞はセルソーター（EPICS ALTRA、Beckman Coulter社）を用いてＧＦＰ発現量を指標にソーティングを行った。ソーティング後の細胞は限界希釈を行い、ＧＦＰ高発現細胞、すなわちＦＵＴ８  ｓｉＲＮＡを高発現する細胞を得た。同細胞におけるＦＵＴ８  ｍＲＮＡ発現量は、ＦＵＴ８発現解析用センスプライマー（5'-TGGTCTACTGCTTCATGATTGCA-3'、配列番号：１４６）、ＦＵＴ８発現解析用アンチセンスプライマー（5'-GCATAGCGCCAATTCTGAGAT-3'、配列番号：１４７）、および、ABI PRISM 7000（Applied Biosystems社）を用いたリアルタイムＰＣＲ法を用いて定量し、ｍＲＮＡ発現量が遺伝子導入前の細胞の２２．８％とＦＵＴ８が発現抑制されていることを確認した。得られたＦＵＴ８  ｓｉＲＮＡ発現量の高い細胞を、ＦＵＴ８ノックダウンＣＨＯ−Ｋ１細胞として実験に使用した。【０１６６】
１−５．抗体の生産および精製
上記１−４．で得た抗ＣＤ２０キメラ抗体産生細胞株を５μｇ／ｍｌ  Puromycin、０．６ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８および１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、培養シャーレの最大細胞密度の６０％まで増殖させた。次に、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋不含リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））で２回洗浄して増殖培地を除去し、０．１％ＢＳＡ添加ＲＰＭＩ１６４０に置換して７日間培養し、上清を回収した。その上清を０．２μｍのフィルターでろ過した後、常法によりProtein Lカラム（PIERCE社）に吸着させ、０．１Ｍグリシンバッファー（ｐＨ２．８）で溶出を行ない、０．７５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を用いてｐＨを中和した。その後、常法によりＰＢＳ（−）に対し透析を行い、評価用抗体とした。【０１６７】
実施例２  AILIM/ICOS-IgFcおよびAILIM/ICOS-IｇFc変異体
１．AILIM/ICOS-IｇFcキメラ分子発現ベクターの作製
１−１．AILIM/ICOSの細胞外ドメイン領域をコードするｃＤＮＡの構築
AILIM/ICOSの細胞外ドメイン領域をコードするｃＤＮＡは、活性化Ｔ細胞のｍＲＮＡから、AILIM/ICOSの既知配列情報を元に設計したプライマーを用いて、常法に従ってＰＣＲ法により単離した。【０１６８】
具体的には、実施例１  １−１−３．で得たヒト末梢血単核球から、Ｔ細胞をPanT-Isolation Kit（Myltenyi社）を用いて取扱説明書に従って精製した。精製Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体（クローンOKT3、Ortho Biotech社）を最終濃度１μｇ／ｍｌ、抗ＣＤ２８抗体（クローン２８．２、BD社）を最終濃度５μｇ／ｍｌとなるよう、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋不含ＰＢＳ（ＰＢＳ（−））でそれぞれ希釈した溶液で、３７℃にて１時間コートしたELISAプレートに、１０５細胞／ウェルになるよう播きこみ、３７℃で２４時間、５％ＣＯ２を含むＣＯ２インキュベータにて培養して活性化Ｔ細胞とした。活性化Ｔ細胞からＲＮＡをTRIzol Reagent（Invitrogen社）にて抽出し、このＲＮＡの１μｇを鋳型としてｃＤＮＡをReverTra Ace-a（東洋紡社）を用いて、取り扱い説明書に従って合成した。この合成したｃＤＮＡ溶液の０．２μｌと、合成オリゴヌクレオチドとして下記のセンスプライマー（5’-tgttgctagcaaacatgaagtcaggcctc-3’、AILIM/ICOSの配列に、ＮｈｅＩサイトの配列を付加したもの、配列番号：１４８）およびアンチセンスプライマー（5’- aacggatccttcagctggcaacaaag -3’、AILIM/ICOSの配列に、ＢａｍＨＩサイトの配列を付加したもの、配列番号：１４９）をそれぞれ５０ｐｍｏｌｅ用いて、最終容量５０μｌの反応系でExTaq polymerase（TaKaRa社）を０．２５μｌ加え、ExTaq polymerase付属のBufferを５μｌ添加して、ＰＣＲ反応を３５サイクル行った。【０１６９】
ＰＣＲ反応後、常法に従って１％アガロースゲル電気泳動を行い、約０．４５ｋｂｐのｃＤＮＡ断片を回収し、Wizard SV Gel and PCR Clean-up System（Promega社）を用いて、取扱説明書に従い精製した。ｃＤＮＡ濃度を２６０ｎｍの吸光度（１Ｏ．Ｄ．２６０＝５０μｇ／ｍｌ）から算出した。この断片、１μｇをそれぞれ１０単位の制限酵素ＮｈｅＩと制限酵素ＢａｍＨＩで、取り扱い説明書に従って３７℃で３時間切断したのち、上記と同様の方法で、制限酵素ＮｈｅＩとＢａｍＨＩで切断された末端を有する、約０．４５ｋｂｐのAILIM/ICOS細胞外領域のｃＤＮＡ断片を得た。【０１７０】
１−２．ヒトＩｇＦｃをコードするｃＤＮＡの構築
一方、ヒトイムノグロブリン１のＦｃ領域（ＩｇＦｃ）をコードするｃＤＮＡは、GenBankアクセッション番号J00228に記載されているＩｇＦｃのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを、ＰＣＲ法を用いて以下の手順で構築した。まず、GenBankアクセッション番号J00228のＩｇＦｃのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの５’末端と３’末端にＰＣＲ反応時の増幅用プライマーの結合塩基配列（ＩｇＦｃ  ｃＤＮＡの５’末端側の制限酵素ＢａｍＨＩ配列、３’末端側の制限酵素ＮｏｔＩ配列も含む）を付加した。設計した塩基配列を５’末端側から約１００塩基ずつ計８本の塩基配列に分け（隣り合う塩基配列は、その末端に約２０塩基の重複配列を有する）、それらをセンス鎖、アンチセンス鎖の交互の順で、下記のセンスプライマー（5’-tgaaggatcccgaggagcccaaatcttgtgacaa-3’、ＩｇＦｃの配列にＢａｍＨＩサイトの配列を付加したもの、配列番号：１５０）およびアンチセンスプライマー（5’- gaagcggccgctcatttacccggagacagggagaggctc -3’、ＩｇＦｃの配列にＮｏｔＩサイトの配列を付加したもの、配列番号：１５１）からなるオリゴヌクレオチドを合成した。それぞれの合成オリゴヌクレオチドを、最終濃度が０．１μＭになるようにＰＣＲ反応液に添加し、最終容量５０μｌの反応系でExTaq polymerase（TaKaRa社）を０．２５μｌ加え、ExTaq polymerase付属のBufferを５μｌ添加して、ＰＣＲ反応を３０サイクル行った。【０１７１】
ＰＣＲ反応後、常法に従って１％アガロースゲル電気泳動を行い、約０．４５ｋｂｐのｃＤＮＡ断片を回収し、Wizard SV Gel and PCR Clean-up System（Promega社）を用いて、取扱説明書に従い精製した。ｃＤＮＡ濃度を２６０ｎｍの吸光度（１Ｏ．Ｄ．２６０＝５０μｇ／ｍｌ）から算出した。この断片、１μｇをそれぞれ１０単位の制限酵素ＢａｍＨＩと制限酵素ＮｏｔＩで、取り扱い説明書に従って３７℃で３時間切断した後、上記と同様の方法で、制限酵素ＢａｍＨＩとＮｏｔＩで切断された末端を有する、約０．７６ｋｂｐのＩｇＦｃ領域のｃＤＮＡ断片を得た。【０１７２】
１−３．AILIM/ICOS-IｇFcキメラ分子発現ベクターの構築
これらのｃＤＮＡ断片を組み込んだ発現ベクターを構築するため、発現ベクター、pIRES-puro2（Clontech社）、１μｇを、それぞれ１０単位の制限酵素ＮｈｅＩと制限酵素ＮｏｔＩで、取り扱い説明書に従って３７℃で３時間切断したのち、上記と同様の方法で、制限酵素ＮｈｅＩとＮｏｔＩで切断された末端を有する、pIRES-puro2 ｃＤＮＡ断片を得た。この断片と、制限酵素ＮｈｅＩとＢａｍＨＩで切断された末端を有する、約０．４５ｋｂｐのAILIM/ICOS細胞外領域のｃＤＮＡ断片、ならびに制限酵素ＢａｍＨＩとＮｏｔＩで切断された末端を有する、約０．７６ｋｂｐのＩｇＦｃ領域のｃＤＮＡ断片をLigation High（東洋紡社）を用いて取り扱い説明書に従って連結した後、形質転換用の大腸菌、ＤＨ５α（東洋紡社）を形質転換した。得られたコロニーをNZY brothにて１６時間、液体培養を行った。形質転換した大腸菌からWizard plus SV Minipreps DNA Purification Kit（Promega社）によりプラスミドを精製し、AILIM/ICOSの細胞外領域とＩｇＦｃを連結したキメラ分子のｃＤＮＡを発現するベクター、pIRESpuro2-AILIM/ICOS-IgFcを得た。その後、ABI 3100-Avant（Applied Biosystems）を用いて、取り扱い説明書に従って反応を行ってＤＮＡ配列を確認した。【０１７３】
２．AILIM/ICOS-IgFc変異体発現ベクターの作製
pIRESpuro2-AILIM/ICOS-IgFcを鋳型として、AILIM/ICOS-IgFc分子の221Glu、222Glu、224Tyr、225Asn、226Serまたは228Tyr（ｋａｂａｔのＥＵ  ｉｎｄｅｘにおける、ＩｇＧの293Glu、294Glu、296Tyr、297Asn、298Serまたは300Tyrにそれぞれ相当）をCysに変異させるため、実施例１  １−３．に記載の各プライマーを用い、QuikChange（登録商標）Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene社）により取扱説明書に従って反応させた。【０１７４】
変異導入後、コンピテント大腸菌を形質転換して得られたコロニーをNZY brothにて１６時間、液体培養を行った。形質転換した大腸菌からWizard plus SV Minipreps DNA Purification Kit（Promega社）によりプラスミドを精製し、Glu221Cys、Glu222Cys、Tyr224Cys、Asn225Cys、Ser226CysまたはTyr228Cysの変異を有する変異体AILIM-IgFc Glu221Cys、AILIM-IgFc Glu222Cys、AILIM-IgFc Tyr224Cys、AILIM-IgFc Asn225Cys、AILIM-IgFc Ser226CysまたはAILIM-IgFc Tyr228Cysの発現ベクター、pIRES-puro2 AILIM-IgFc Glu221Cys、pIRES-puro2 AILIM-IgFc Glu222Cys、pIRES-puro2 AILIM-IgFc Tyr224Cys、pIRES-puro2 AILIM-IgFc Asn225Cys、pIRES-puro2 AILIM-IgFc Ser226CysまたはpIRES-puro2 AILIM-IgFc Tyr228Cysをそれぞれ得た。その後、ABI 3100-Avant（Applied Biosystems）を用いて、取り扱い説明書に従って反応を行ってDNA配列の確認を行った。各変異体をコードする塩基配列および該塩基配列から生成されるアミノ酸配列の配列番号を下表に示す。
【表９】
0005620106.tif 000011
上記配列番号：７５〜８０に記載のアミノ酸配列における１４４〜３７５番目のアミノ酸は、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２１６〜４４７番目のアミノ酸に相当する。なお、変異が導入される前の野生型キメラ分子のアミノ酸配列を配列番号：８７に、それをコードする塩基配列を配列番号：８８にそれぞれ示す。【０１７５】
３．AILIM/ICOS-IgFcおよびAILIM/ICOS-IｇFc変異体を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞の作製
ＣＨＯ−Ｋ１細胞、１ｘ１０６個に対して、FuGENE（登録商標）３６μｌと、pIREpuro2-AILIM/ICOS-IgFc、または各変異体発現ベクター１２μｇとを用いて、取り扱い説明書に従って遺伝子導入を行なった。遺伝子導入後２日目にPuromycinを、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）添加ＲＰＭＩ１６４０培地に終濃度０．５〜５μｇ／ｍｌになるように添加し、その後、９日間培養を行なった。Puromycinにより薬剤耐性ＣＨＯ−Ｋ１細胞の選択を行なった後、限界希釈法により細胞のクローン化を行ない、AILIM/ICOS-IgFcまたはAILIM/ICOS-IｇFc変異体を高発現している細胞を、抗AILIM/ICOS抗体を用いたELISAによりスクリーニングして選択した。【０１７６】
４．AILIM/ICOS-IgFcおよびAILIM/ICOS-IｇFc変異体の生産と精製
AILIM/ICOS-IgFcまたは各AILIM/ICOS-IｇFc変異体を高発現する細胞を、１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、培養シャーレの最大細胞密度の６０％まで増加させた。Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋不含ＰＢＳ（ＰＢＳ（−））で２回洗浄して増殖培地を除去し、０．１％ＢＳＡ添加ＲＰＭＩ１６４０に置換して３日間培養し、上清を回収した。その上清を０．２μｍのフィルターでろ過した後、常法によりProtein Gカラム（Amersham Biosciences社）に吸着させ、０．１Ｍ  グリシン緩衝液（ｐＨ２．８）で溶出を行ない、０．７５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を用いてｐＨを中和した。その後、常法によりＰＢＳ（−）で透析を行なった。この試料中のAILIM/ICOS-IgFc、または各AILIM/ICOS-IｇFc変異体の濃度を、抗AILIM/ICOS抗体を用いたELISA法により測定した。【０１７７】
実施例３  抗ＣＤ２０キメラ抗体Ｈ鎖定常領域アミノ酸改変抗体の評価
実施例１で得た抗体について、抗原との反応性（ＣＤ２０結合活性）、ＮＫ細胞Ｆｃγ受容体ＩＩＩとの反応性（ＣＤ１６結合活性）およびＡＤＣＣ誘導活性を測定した。
１．ヒト末梢血単核球の分離調製
ヒト血液を抗凝固剤（ＣＰＤ）添加採血バック（テルモ社、テルモ血液バックＣＰＤ）に採取した。この血液を、５０ｍｌの遠心チューブ（Falcon社）に１５ｍｌずつ分注したLymphoprep（AXIS-SHIELD社）に重層し、取り扱い説明書に従って、スイング型細胞分離用遠心機にて、室温で１，６００回転、３０分の遠心を行なった。遠心後、取り扱い説明書に従って単核球層を回収し、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、シグマ社）を最終濃度０．５％（ｗ／ｖ）で添加したカルシウム、マグネシウム不含ＰＢＳにて３回洗浄後、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を最終濃度１０％で含有するＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０）に分散して、ヒト末梢血由来単核球の細胞懸濁液とした。【０１７８】
２．ＣＤ２０結合反応性の解析
Ｄａｕｄｉ細胞（ＡＴＣＣカタログ番号CCL-213）を６×１０４個／ウェルの密度で９６穴プレートに分注後、実施例１で得た各抗体変異体（Glu293Cys、Glu294Cys、Tyr296Cys、Ser298CysもしくはTyr300Cys）または野生型抗体を添加し、４℃で１時間反応させた。その後、３ｍＭ  ＥＤＴＡ−０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳ（−）（洗浄バッファー）で洗浄した。次に、洗浄バッファーで５００倍希釈したＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（Zymed社）を５０μｌ／ウェルで添加し、４℃で１時間反応させた。反応後の細胞は洗浄バッファーで洗浄後、TMB substrate（KPL社）を１００μｌ／ウェルで添加して発色後、１Ｍ  ＨＣl（Wako社）を１００μｌ／ウェル添加して反応を停止し、プレートリーダー（VersaMax、Molecular Divices社）で４５０ｎｍのＯＤ値を測定した。結果を図１に示す。同図より、いずれの変異体も野生型と同等のＣＤ２０結合反応性を示すことが明らかとなり、変異体におけるアミノ酸置換が抗原認識能に影響を与えないことが判明した。
【０１７９】
３．ＣＤ１６結合反応性の解析
３−１．ＣＤ１６発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞の作製
常法に従い、ヒト末梢血単核球からTrizol（Invitrogen社）を用いてＲＮＡ抽出を行い、ReverTra Ace（TOYOBO社）を用いてｃＤＮＡ合成を行なった。ＣＤ１６の５’末端と３’末端に結合するＣＤ１６センスプライマー（5’-TTTGAATTCatgtggcagctgctcct-3’、配列番号：１５２）、ＣＤ１６アンチセンスプライマー（5’-AAAGCGGCCGCCCagtctcttgttgagcttc-3’、配列番号：１５３）をそれぞれ合成し、上記ｃＤＮＡを鋳型としてExTaq polymerase（TaKaRa社）を用いてＰＣＲを行なった。すなわち、テンプレートｃＤＮＡ（１０ｎｇ／μｌ）１μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ  ４μｌ、プライマー混合液（各５０μＭ）１μｌ、×１０  Ex Taq polymerase Buffer  ５μｌ、Ex Taq polymerase  ０．２５μｌおよび滅菌水３８．７５μｌからなる合計５０μｌの反応液を用い、９４℃  １分；９４℃  ４５秒、５５℃  １分、７２℃  ２分（３５サイクル）；７２℃  １０分で反応させた。ＰＣＲ反応産物は１％アガロースゲル電気泳動後、ｃＤＮＡ断片をWizard SV Gel and PCR Clean-up System（Promega社）を用いて精製し、さらに制限酵素（ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ）処理を行なってpIRESpuro2に挿入し、ＣＤ１６発現ベクターCD16/pIRESpuro2を得た。得られたベクターはABI3100-Avant（Applied Biosystems社）を用いてＤＮＡ塩基配列の確認を行った。【０１８０】
得られたCD16/pIRESpuro2は、FuGENE（登録商標）（Roche社）を用い、取扱説明書に従ってＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣカタログ番号CCL-61）に遺伝子導入した。遺伝子導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞は１０％ＦＣＳ（Hyclone社）、ペニシリン−ストレプトマイシン（SIGMA社）含有ＲＰＭＩ１６４０培地（SIGMA社）にて培養し、さらにＧ４１８（和光純薬工業株式会社）０．６ｍｇ／ｍｌを添加して薬剤選択を行なった。薬剤耐性が確認された細胞は限界希釈を行い、得られたsingle cell cloneのＣＤ１６発現量は、抗ＣＤ１６抗体を用いてフローサイトメーター（FACS Caliber、BecktonDickinson社）により解析した。ＣＤ１６発現量の高い細胞をＣＤ１６発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞として下記実験に使用した。
【０１８１】
３−２．ＣＤ１６結合反応性解析
ＣＤ１６発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞を６×１０４個／チューブになるように分取し、実施例１で得た各抗体変異体（Tyr296CysもしくはSer298Cys）または野生型抗体を添加して全量を５０μｌ／チューブとし、４℃で１時間反応させた。その後、３ｍＭ  ＥＤＴＡ−０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳ（−）（洗浄バッファー）で洗浄した。次に、洗浄バッファーで２００倍希釈したビオチン標識マウス抗ヒトIgGκ L chain 抗体（Vector Lab社）を１００μｌ／チューブで添加した。４℃で３０分反応後、３ｍＭ  ＥＤＴＡ−０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳ（−）で洗浄し、洗浄バッファーで４００倍希釈したＰＥ標識ストレプトアビジン（BD-Pharmingen社）を１００μｌ／チューブで添加し、４℃で３０分反応させた。反応終了後、３ｍＭ  ＥＤＴＡ−０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳ（−）で２回洗浄してＣＤ１６に結合した抗ＣＤ２０抗体をフローサイトメーター（FACS Caliber、BecktonDickinson社）により解析した。結果を図２に示す。同図より、いずれの変異体のＣＤ１６結合反応性も野生型に対して顕著に向上していることが判明した。すなわち、同一の効果を奏する濃度で比較した場合、Tyr296Cys変異体は野生型の約５倍、Ser298Cys変異体は野生型の約１０倍もの活性を示した。この結果は、本発明のポリペプチドが高いエフェクター機能を有することを示すものである。【０１８２】
４．ＡＤＣＣ誘導活性の解析
ＡＤＣＣ活性の測定には、ターゲット細胞としてＤａｕｄｉ細胞（ＡＴＣＣカタログ番号CCL-213）を、エフェクター細胞として上記１．で得たヒト末梢血単核球をそれぞれ用いた。常法によりＤａｕｄｉ細胞を１０％ＦＣＳ、１０％ＷＥＨＩ−３培養上清（ＩＬ−３）含有ＲＰＭＩ１６４０培地に４×１０５個／ｍｌの濃度になるよう懸濁し、２５μｌずつＵ底９６穴プレート（Falcon社）に播いた。抗ＣＤ２０キメラ抗体アミノ酸変異体（Ser298Cys）または野生型抗ＣＤ２０キメラ抗体を所定濃度になるよう１０％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ１６４０培地で希釈し、２５μｌずつＵ底９６穴プレート（Falcon社）にさらに添加し、３７℃にて１時間反応させた。その後、末梢血単核球を５×１０５個／ウェルとなるように添加し、３７℃にて１６時間培養した。培養後、プレートを遠心して、上清を５０μｌずつウェルごとに回収し、新しい平底９６穴プレートに移した。各ウェルにAssay Buffer（CytoTox96（登録商標）Non-Radioactive Cytotoxicity Assay、Promega社）を５０μｌ加え、室温で３０分、遮光下で反応させ、その後、５０μｌのStop Buffer（CytoTox96（登録商標）Non-Radioactive Cytotoxicity Assay）を加え、それぞれのＯＤ値を４９０ｎｍで測定した。【０１８３】
細胞傷害率を算定するための基準として、細胞成分としてＤａｕｄｉ細胞のみまたはヒト末梢血単核球のみを含むウェルを最終溶液量１００μｌで用意しておき、Ｄａｕｄｉ細胞のみを含むウェルの半数に１０μｌのLysis Buffer（CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay）を添加し、４５分間反応させて、細胞を溶解した。その後、実験条件群と同様に、上清５０μｌを新しい平底９６穴プレートに移し、Assay Buffer（CytoTox96（登録商標）Non-Radioactive Cytotoxicity Assay）を５０μｌ加え、室温で３０分、遮光下で反応させ、その後、５０μｌのStop Buffer（CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay）を加え、それぞれのＯＤ値を４９０ｎｍで測定した。このとき、Ｄａｕｄｉ細胞のみを含むウェルおよびヒト末梢血単核球細胞のみを含むウェルでのＯＤ値の合計を細胞傷害率０％とし、Lysis Bufferを添加したＤａｕｄｉ細胞のみを含むウェルのＯＤ値からLysis Bufferを添加していないＤａｕｄｉ細胞のみを含むウェルのＯＤ値を差し引いた値を１００％として、細胞傷害活性算出のための標準線を求めた。各種条件下における細胞傷害活性はこの標準線から算出した。実験は、各実験条件について３ウェル以上の数で行い、その平均値と標準誤差を算出した。結果を図３に示す。同図より、本発明のポリペプチドが野生型抗体に比べて極めて高いＡＤＣＣ誘導活性を有することが分かる。同一の細胞障害率をもたらす濃度で比較した場合、本発明のポリペプチドは、実に約２００倍もの活性を示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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