(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分：
（a）配列番号：1を含む重鎖可変領域CDR1；
（b）配列番号：13を含む重鎖可変領域CDR2；
（c）配列番号：24を含む重鎖可変領域CDR3；
（d）配列番号：51を含む軽鎖可変領域CDR1；
（e）配列番号：62を含む軽鎖可変領域CDR2；および
（f）配列番号：73を含む軽鎖可変領域CDR3。
【請求項２】
以下を含む、請求項1記載の抗体またはその抗原結合部分：
（a）配列番号：35のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
（b）配列番号：84のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【請求項３】
以下を含む、単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分：
（a）配列番号：5を含む重鎖可変領域CDR1；
（b）配列番号：17を含む重鎖可変領域CDR2；
（c）配列番号：28を含む重鎖可変領域CDR3；
（d）配列番号：55を含む軽鎖可変領域CDR1；
（e）配列番号：66を含む軽鎖可変領域CDR2；および
（f）配列番号：77を含む軽鎖可変領域CDR3。
【請求項４】
以下を含む、請求項3記載の抗体またはその抗原結合部分：
（a）配列番号：39のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
（b）配列番号：88のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【請求項５】
以下を含む、単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分：
（a）配列番号：9を含む重鎖可変領域CDR1；
（b）配列番号：21を含む重鎖可変領域CDR2；
（c）配列番号：32を含む重鎖可変領域CDR3；
（d）配列番号：59を含む軽鎖可変領域CDR1；
（e）配列番号：70を含む軽鎖可変領域CDR2；および
（f）配列番号：81を含む軽鎖可変領域CDR3。
【請求項６】
以下を含む、請求項5記載の抗体またはその抗原結合部分：
（a）配列番号：43のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
（b）配列番号：92のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【請求項７】
請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合部分、および薬学的に許容される担体を含む、組成物。
【請求項８】
治療物質に結合した、請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合部分を含む免疫結合物。
【請求項９】
治療物質がサイトトキシンである、請求項8記載の免疫結合物。
【請求項１０】
治療物質が放射性同位元素である、請求項8記載の免疫結合物。
【請求項１１】
請求項8〜10のいずれか一項に記載の免疫結合物および薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項１２】
請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分とは異なる結合特異性を有する第二の機能的部分に結合した該抗体またはその抗原結合部分を含む二重特異的分子。
【請求項１３】
請求項12記載の二重特異的分子、および薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項１４】
請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分を含む、活性化T細胞またはNK細胞によって媒介される炎症または自己免疫反応を阻害するための組成物。
【請求項１５】
請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分を含む、治療を必要とする被験者における炎症または自己免疫疾患を治療するための組成物。
【請求項１６】
疾患が多発性硬化症である、請求項15記載の組成物。
【請求項１７】
リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患、全身性紅斑性狼瘡、I型糖尿病、炎症性皮膚障害、自己免疫性甲状腺疾患、シェーグレン症候群、肺の炎症、移植の拒絶、脊髄損傷、脳損傷、神経変性疾患、歯肉炎、遺伝子治療による炎症、血管新生疾患、炎症性腎疾患、およびアテローム性動脈硬化症からなる群より選択される、請求項15記載の組成物。
【請求項１８】
炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎およびクローン病からなる群から選択される、請求項17記載の組成物。
【請求項１９】
炎症性皮膚障害が、乾癬および扁平苔癬からなる群から選択される、請求項17記載の組成物。
【請求項２０】
自己免疫性甲状腺疾患が、グレーヴス病および橋本甲状腺炎からなる群から選択される、請求項17記載の組成物。
【請求項２１】
肺の炎症が、喘息、慢性閉塞性肺疾患、肺サルコイドーシス、およびリンパ球性肺胞炎からなる群から選択される、請求項17記載の組成物。
【請求項２２】
脳損傷が、脳卒中である、請求項17記載の組成物。
【請求項２３】
神経変性疾患が、アルツハイマー病およびパーキンソン病からなる群から選択される、請求項17記載の組成物。
【請求項２４】
炎症性腎疾患が、IgA腎症、膜性増殖性糸球体腎炎、および急速進行性糸球体腎炎からなる群から選択される、請求項17記載の組成物。
【請求項２５】
請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分を含む、治療を必要とする被験者における望ましくないIP-10活性を含むウイルスまたは細菌感染症を治療するための組成物。
【請求項２６】
ウイルス感染症が、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、C型肝炎ウイルス（HCV）、単純ヘルペスウイルスI型（HSV-1）、または重症急性呼吸器症候群（SARS）ウイルスによって媒介される、請求項25記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、2003年12月10日に提出された米国特許出願第60/529,180号に対する優先権を主張する。上記の出願の全内容物は、参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
インターフェロンγ誘導タンパク質10（IP-10）（CXCL10としても知られる）は、10 kDaのケモカインであり、当初、インターフェロンγ（IFN-γ）を処置した細胞におけるIP-10遺伝子の発現に基づいて同定された（Luster, A.D.ら（1985）Nature 315:672〜676）。IP-10は、血小板因子4およびβトロンボグロビンのような走化性活性を有するタンパク質、ならびに結合組織活性化ペプチドIIIのようなマイトゲン活性を有するタンパク質と相同性を示す（Luster, A.Dら(1987)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2868〜2871）。IP-10は、内皮細胞、単球、線維芽細胞、およびケラチノサイトを含む多様な細胞によって、IFN-γに反応して分泌される（Luster, A.D and Ravetch, J.V.(1987)J. Exp. Med. 166:1084〜1097）。IP-10はまた、ヒト皮膚における遅延型過敏（DTH）反応において皮膚マクロファージおよび内皮細胞に存在することが示されている（Kaplan, G.ら(1987)J. Exp. Med. 166:1098〜1108）。IP-10は、IFN-γによって誘導されることに基づいて当初同定されたが、IP-10はまた、例えば樹状細胞においてIFN-αによっても誘導されうる（Padovan, E.ら(2002)J. Leukoc. Biol. 71:669〜676）。IP-10発現はまた、星状細胞および小膠細胞のような中枢神経系の細胞においても、IFN-γ、ウイルス、およびリポ多糖類のような刺激によって誘導されうる（Vanguri, R. and Farber, J.M.(1994)J. Immunol. 152:1411〜1418；Ren, L.Q.ら(1998)Brain Res. Mol. Brain Res. 59:256〜263）。IP-10の免疫生物学に関しては、Neville, L.F.ら(1997)Cytokine Growth Factor Rev. 8:207〜219において論評されている。
【０００３】
IP-10の受容体は、7回膜貫通型受容体であるCXCR3であると同定されている（Loetscher, M.ら(1996)J. Exp. Med. 184:963〜969）。CXCR3は、活性化Tリンパ球において発現されるが、休止期Tリンパ球にも、Bリンパ球、単球、または顆粒球にも発現されないことが示されている（Lpetscher, M.ら、上記）。CXCR3発現は、TGF-β1による刺激によってNK細胞においてアップレギュレートされることが示されている（Inngjerdingen, M.ら(2001)Blood 97:367〜375）。CXCR3に関しては他に二つのリガンドが同様に同定されている：MIG（Loetscher, Mら、上記）およびITAC（Cole, K.E.ら(1998)J. Exp. Med 187:2009〜2021）。
【０００４】
CXCR3にIP-10が結合すると、活性化T細胞におけるカルシウム動員および走化性を媒介することが示されている（Loetscher, Mら、上記）。走化性および細胞内カルシウム動員はまた、活性化NK細胞におけるCXCR3に対するIP-10の結合によっても誘導される（Maghazachi, A.A.ら(1997)FASEB J.11:765〜774）。胸腺において、IP-10は、TCRαβ+CD8+ T細胞、TCRγδ+ T細胞およびNK型細胞にとって化学誘引物質であることが示されている（Romagnani, P.ら(2001)Blood 97:601〜607）。
【０００５】
IP-10またはその受容体CXCR3は、多発性硬化症（例えば、Sorensen, T.L.ら(1999)J. Clin. Invest. 103:807〜815を参照されたい）、リウマチ性関節炎（例えば、Patel., D.D.ら(2001)Clin. Immunol. 98:39〜45を参照されたい）、潰瘍性大腸炎（例えば、Uguccioni, M.ら(1999)Am. J. Pathol. 155:331〜336を参照されたい）、肝炎（例えば、Narumi, S.ら(1997)J. Immunol. 158:5536〜5544を参照されたい）、脊髄損傷（例えば、McTigue, D.M.ら(1998)J. Neurosci. Res. 53:368〜376；Gonzalezら(2003)Exp. Neurol. 184:456〜463を参照されたい）、全身性紅斑性狼瘡（例えば、Narumi, Sら(2000)Cytokine 12:1561〜1565を参照されたい）、移植の拒絶（例えば、Zhang, Z.ら(2002)J. Immunol. 168:3205〜3212を参照されたい）、シェーグレン症候群（例えば、Ogawa, N.ら(2002)Arthritis Rheum. 46:2730〜2741）を含む、多様な異なる炎症および自己免疫疾患において同定されている。したがって、活性を阻害する治療物質が望ましく、特にヒトにおいて用いるために適した物質が望ましい。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、IP-10に結合し、多数の望ましい特性を示す単離されたモノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル抗体を提供する。これらの特性には、ヒトIP-10に対する高親和性結合と共に、アカゲザルIP-10との交叉反応性が含まれるが、ヒトMIG、ヒトITAC、またはマウスIP-10とは実質的な交叉反応性を示さない。さらに、抗体は、IP-10のその受容体CXCR3に対する結合を阻害する、受容体発現細胞においてIP-10によって誘導されるカルシウム流入を阻害する、およびIP-10によって誘導される細胞の遊走（走化性）を阻害する。なおさらに、本発明の抗体は、多発性硬化症と診断されたヒト被験者の脳切片においてIP-10に結合することが示されている。
【０００７】
本発明の好ましい態様において、ヒトIP-10は、配列番号：121[Genbankアクセッション番号NP_001556]に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む；CXCR3は、配列番号：122[GenBankアクセッション番号NP_001495]に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む；アカゲザルIP-10は、配列番号：123[GenBankアクセッション番号AAK95955]に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む；マウスIP-10は、配列番号：124[GenBankアクセッション番号NP_067249]に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む；ヒトMIGは、配列番号：125[GenBankアクセッション番号NP_002407]に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む；および／またはヒトITACは、配列番号：126[GenBankアクセッション番号NP_005400]に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【０００８】
一つの態様において、本発明は、IP-10に特異的に結合し、ヒトVH3-33遺伝子、ヒトVH3-30.3遺伝子、ヒトVH5-51遺伝子、およびヒトVH 4-61遺伝子からなる群より選択されるヒトVH生殖系列遺伝子の産物である、またはそれに由来する重鎖可変領域を含む、単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する。もう一つの態様において、本発明は、IP-10に特異的に結合し、ヒトVk A27遺伝子、ヒトVk L15遺伝子、ヒトVk L6遺伝子、およびヒトVk L18遺伝子からなる群より選択されるヒトVk生殖系列遺伝子の産物である、またはそれに由来する軽鎖可変領域を含む、単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する。さらにもう一つの態様において、本発明は、IP-10に対して特異的に結合し、以下を含む、単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する：
（a）ヒトVH3-33遺伝子、ヒトVH3-30.3遺伝子、ヒトVH5-51遺伝子、およびヒトVH 4-61遺伝子からなる群より選択されるヒトVH生殖系列遺伝子の産物である、またはそれに由来する重鎖可変領域；ならびに
（b）ヒトVk A27遺伝子、ヒトVk L15遺伝子、ヒトVk L6遺伝子、およびヒトVk L18遺伝子からなる群より選択されるヒトVk生殖系列遺伝子の産物である、またはそれに由来する軽鎖可変領域。
【０００９】
一つの態様において、本発明は、IP-10に特異的に結合し、以下を含む、単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する：
（a）ヒトVH3-33遺伝子の産物である、またはそれに由来する重鎖可変領域；ならびに
（b）ヒトVk A27、ヒトVk L15遺伝子、およびヒトVk L6遺伝子からなる群より選択されるヒトVk遺伝子の産物である、またはそれに由来する軽鎖可変領域。
【００１０】
もう一つの態様において、本発明は、IP-10に特異的に結合し、以下を含む、単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する：
（a）ヒトVH3-30.3遺伝子の産物である、またはそれに由来する重鎖可変領域；および
（b）ヒトVk L6遺伝子の産物である、またはそれに由来する軽鎖可変領域。
【００１１】
さらにもう一つの態様において、本発明は、IP-10に特異的に結合し、以下を含む、単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する：
（a）ヒトVH5-51遺伝子の産物である、またはそれに由来する重鎖可変領域；および
（b）ヒトVk L18遺伝子の産物である、またはそれに由来する軽鎖可変領域。
【００１２】
さらにもう一つの態様において、本発明は、IP-10に特異的に結合し、以下を含む、単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する：
（a）ヒトVH4-61遺伝子の産物である、またはそれに由来する重鎖可変領域；および
（b）ヒトVk A27遺伝子の産物である、またはそれに由来する軽鎖可変領域。
【００１３】
もう一つの局面において、本発明は、以下である、CDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む重鎖可変領域と、CDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む軽鎖可変領域とを含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する：
（a）重鎖可変領域CDR3配列が、配列番号：24〜34のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列およびその保存的改変を含む、
（b）軽鎖可変領域CDR3配列が、配列番号：73〜83のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列およびその保存的改変を含む、
（c）抗体がIP-10に特異的に結合する、ならびに
（d）抗体が以下の機能的特性の少なくとも一つを示す：
（i）抗体がCXCR3に対するIP-10の結合を阻害すること；
（ii）抗体がIP-10誘導性のカルシウムの流入を阻害すること；
（iii）抗体がIP-10誘導性の細胞の遊走を阻害すること；
（iv）抗体がアカゲザルIP-10と交叉反応すること；
（v）抗体がマウスIP-10と交叉反応しないこと；
（vi）抗体がヒトMIGと交叉反応しないこと；
（vii）抗体がヒトITACと交叉反応しないこと。
【００１４】
好ましい態様において、重鎖可変領域CDR2配列は、配列番号：13〜23のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列、およびその保存的改変を含む；ならびに軽鎖可変領域CDR2配列は、配列番号：62〜72のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列、およびその保存的改変を含む。もう一つの好ましい態様において、重鎖可変領域CDR1配列は、配列番号：1〜12のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列、およびその保存的改変を含む；ならびに軽鎖可変領域CDR1配列は、配列番号：51〜61のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列、およびその保存的改変を含む。抗体は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体となりうる。
【００１５】
もう一つの局面において、本発明は、以下である、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する：
（a）重鎖可変領域が、配列番号：35〜46からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも80％相同であるアミノ酸配列を含む、
（b）軽鎖可変領域が、配列番号：84〜94からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも80％相同であるアミノ酸配列を含む、
（c）抗体がIP-10に特異的に結合する、ならびに
（d）抗体が以下の機能的特性の少なくとも一つを示す：
（i）抗体がCXCR3に対するIP-10の結合を阻害すること；
（ii）抗体がIP-10誘導性のカルシウムの流入を阻害すること；
（iii）抗体がIP-10誘導性の細胞の遊走を阻害すること；
（iv）抗体がアカゲザルIP-10と交叉反応すること；
（v）抗体がマウスIP-10と交叉反応しないこと；
（vi）抗体がヒトMIGと交叉反応しないこと；
（vii）抗体がヒトITACと交叉反応しないこと。
【００１６】
抗体は、例えばヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体となりうる。
【００１７】
本発明の好ましい態様において、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、IP-10に特異的に結合し、以下を含む：
（a）配列番号：1〜12からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1；
（b）配列番号：13〜23からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2；
（c）配列番号：24〜34からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3；
（d）配列番号：51〜61からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1；
（e）配列番号：62〜72からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2；および
（f）配列番号：73〜83からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
【００１８】
他の好ましい態様において、本発明は、IP-10に特異的に結合する、以下を含む単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する：
（a）配列番号：35〜46からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
（b）配列番号：84〜94からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【００１９】
本発明のもう一つの局面において、上記の抗体のいずれかとIP-10に対する結合を競合する抗体またはその抗体結合部分が提供される。
【００２０】
本発明の抗体は、例えば完全長の抗体、例えばIgG1またはIgG4アイソタイプとなりうる。または、抗体は、FabもしくはFab'2抗体のような抗体断片、または一本鎖抗体となりうる。
【００２１】
本発明はまた、サイトトキシンまたは放射活性同位元素のような治療物質に結合した本発明の抗体またはその抗原結合部分を含む免疫結合体を提供する。本発明はまた、抗体またはその抗原結合部分とは異なる結合特異性を有する第二の機能的部分に結合した本発明の抗体または抗原結合部分を含む二重特異的分子を提供する。
【００２２】
本発明の抗体、抗原結合部分、免疫結合体、または二重特異的分子および薬学的に許容される担体を含む組成物も同様に提供される。
【００２３】
本発明の抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸分子も同様に、そのような核酸を含む発現ベクターおよびそのような発現ベクターを含む宿主細胞と共に本発明に含まれる。その上、本発明は、本発明の抗体を発現するヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖トランスジーンを含むトランスジェニックマウスと共に、そのようなマウスから調製された本発明の抗体を産生するハイブリドーマを提供する。
【００２４】
もう一つの局面において、本発明は、T細胞またはNK細胞を、炎症または自己免疫反応が阻害されるように、本発明の抗体またはその抗原結合部分に接触させる段階を含む、活性化T細胞またはNK細胞によって媒介される炎症または自己免疫反応を阻害する方法を提供する。
【００２５】
もう一つの局面において、本発明は、被験者における炎症または自己免疫疾患が治療されるように、本発明の抗体またはその抗原結合部分を被験者に投与する段階を含む、治療を必要とする被験者における炎症または自己免疫疾患を治療する方法を提供する。疾患は、例えば多発性硬化症、リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病）、全身性紅斑性狼瘡、I型糖尿病、炎症性皮膚障害（例えば、乾癬、扁平苔癬）、自己免疫性甲状腺疾患（例えば、グレーヴス病、橋本甲状腺炎）、シェーグレン症候群、肺の炎症（例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患、肺サルコイドーシス、リンパ球性肺胞炎）、移植の拒絶、脊髄損傷、脳損傷（例えば、脳卒中）、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病）、歯肉炎、遺伝子治療による炎症、血管新生疾患、炎症性腎疾患（例えば、IgA腎症、膜性増殖性糸球体腎炎、急速進行性糸球体腎炎）、およびアテローム性動脈硬化症となりうる。
【００２６】
さらにもう一つの局面において、本発明は、被験者におけるウイルスまたは細菌感染症が治療されるように、本発明の抗体またはその抗原結合部分を被験者に投与する段階を含む、治療を必要とする被験者における望ましくないIP-10活性を含むウイルスまたは細菌感染症を治療する方法を提供する。例えば、抗体を用いて、ウイルス性髄膜炎、ウイルス性脳炎、または細菌性髄膜炎を治療することができる。本発明の方法によって治療されるウイルス感染症は、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、C型肝炎ウイルス（HCV）、単純ヘルペスウイルスI型（HSV-1）、または重症急性呼吸器候群（SARS）ウイルスによって媒介されうる。
【００２７】
本発明はまた、本明細書に提供される抗IP-10抗体の配列に基づいて「第二世代」の抗IP-10抗体を作製する方法を提供する。例えば、本発明は、以下を含む、抗IP-10抗体を調製する方法を提供する：
（a）（i）配列番号：1〜12からなる群より選択されるCDR1配列、配列番号：13〜23からなる群より選択されるCDR2配列、および／または配列番号：24〜34からなる群より選択されるCDR3配列を含む重鎖可変領域抗体配列；および（ii）配列番号：51〜61からなる群より選択されるCDR1配列、配列番号：62〜72からなる群より選択されるCDR2配列、および／または配列番号：73〜83からなる群より選択されるCDR3配列を含む軽鎖可変領域抗体配列を提供する段階；
（b）少なくとも一つの変化した抗体配列を作製するために重鎖可変領域抗体配列および／または軽鎖可変領域抗体配列内の少なくとも一つのアミノ酸残基を変化させる段階；ならびに
（c）タンパク質のような変化した抗体配列を発現させる段階。
【００２８】
本発明の他の特徴および長所は、制限的に解釈してはならない以下の詳細な説明および実施例から明らかとなるであろう。本出願を通して引用した全ての参考文献、Genbank登録、特許および公表された特許出願の内容物は、特に参照により本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】1D4ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：99）およびアミノ酸配列（配列番号：35）を示す。CDR1（配列番号：1）、CDR2（配列番号：13）、およびCDR3（配列番号：24）領域を図で示し、V、D、およびJ生殖系列変異を示す。
【図１Ｂ】1D4ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：110）およびアミノ酸配列（配列番号：84）を示す。CDR1（配列番号：51）、CDR2（配列番号：62）、およびCDR3（配列番号：73）領域を図で示し、VおよびJ生殖系列変異を示す。
【図２Ａ】1E1ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：100）およびアミノ酸配列（配列番号：36）を示す。CDR1（配列番号：2）、CDR2（配列番号：14）、およびCDR3（配列番号：25）領域を図で示し、VおよびJ生殖系列変異を示す。
【図２Ｂ】1E1ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：111）およびアミノ酸配列（配列番号：85）を示す。CDR1（配列番号：52）、CDR2（配列番号：63）、およびCDR3（配列番号：74）領域を図で示し、VおよびJ生殖系列変異を示す。
【図３Ａ】2G1ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：101）およびアミノ酸配列（配列番号：37）を示す。CDR1（配列番号：3）、CDR2（配列番号：15）、およびCDR3（配列番号：26）領域を図で示し、VおよびJ生殖系列変異を示す。
【図３Ｂ】2G1ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：112）およびアミノ酸配列（配列番号：86）を示す。CDR1（配列番号：53）、CDR2（配列番号：64）、およびCDR3（配列番号：75）領域を図で示し、VおよびJ生殖系列変異を示す。
【図４Ａ】3C4ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：102）およびアミノ酸配列（配列番号：38）を示す。CDR1（配列番号：4）、CDR2（配列番号：16）、およびCDR3（配列番号：27）領域を図で示し、V、D、およびJ生殖系列変異を示す。
【図４Ｂ】3C4ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：113）およびアミノ酸配列（配列番号：87）を示す。CDR1（配列番号：54）、CDR2（配列番号：65）、およびCDR3（配列番号：76）領域を図で示し、VおよびJ生殖系列変異を示す。
【図５Ａ】6A5ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：103）およびアミノ酸配列（配列番号：39）を示す。CDR1（配列番号：5）、CDR2（配列番号：17）、およびCDR3（配列番号：28）領域を図で示し、V、D、およびJ生殖系列変異を示す。
【図５Ｂ】6A5ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：114）およびアミノ酸配列（配列番号：88）を示す。CDR1（配列番号：55）、CDR2（配列番号：66）、およびCDR3（配列番号：77）領域を図で示し、VおよびJ生殖系列変異を示す。
【図６Ａ】6A8ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：104）およびアミノ酸配列（配列番号：40）を示す。CDR1（配列番号：6）、CDR2（配列番号：18）、およびCDR3（配列番号：29）領域を図で示し、VおよびJ生殖系列変異を示す。
【図６Ｂ】6A8ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：115）およびアミノ酸配列（配列番号：89）を示す。CDR1（配列番号：56）、CDR2（配列番号：67）、およびCDR3（配列番号：78）領域を図で示し、VおよびJ生殖系列変異を示す。
【図７Ａ】6B10ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：105）およびアミノ酸配列（配列番号：41）を示す。CDR1（配列番号：7）、CDR2（配列番号：19）、およびCDR3（配列番号：30）領域を図で示し、V、DおよびJ生殖系列変異を示す。
【図７Ｂ】6B10ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：116）およびアミノ酸配列（配列番号：90）を示す。CDR1（配列番号：57）、CDR2（配列番号：68）、およびCDR3（配列番号：79）領域を図で示し、VおよびJ生殖系列変異を示す。
【図８Ａ】7C10ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：106）およびアミノ酸配列（配列番号：42）を示す。CDR1（配列番号：8）、CDR2（配列番号：20）、およびCDR3（配列番号：31）領域を図で示し、V、D、およびJ生殖系列変異を示す。
【図８Ｂ】7C10ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：117）およびアミノ酸配列（配列番号：91）を示す。CDR1（配列番号：58）、CDR2（配列番号：69）、およびCDR3（配列番号：80）領域を図で示し、VおよびJ生殖系列変異を示す。
【図９Ａ】8F6ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：107）およびアミノ酸配列（配列番号：43）を示す。CDR1（配列番号：9）、CDR2（配列番号：21）、およびCDR3（配列番号：32）領域を図で示し、V、D、およびJ生殖系列変異を示す。
【図９Ｂ】8F6ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：118）およびアミノ酸配列（配列番号：92）を示す。CDR1（配列番号：59）、CDR2（配列番号：70）、およびCDR3（配列番号：81）領域を図で示し、VおよびJ生殖系列変異を示す。
【図１０Ａ】10A12ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：108）およびアミノ酸配列（配列番号：44）を示す。CDR1（配列番号：10）、CDR2（配列番号：22）、およびCDR3（配列番号：33）領域を図で示し、VおよびJ生殖系列変異を示す。または、CDR1内のアミノ酸残基32をシステインからセリン（配列番号：11）に変異させることができ、それによって配列番号：45のVH配列が得られる。
【図１０Ｂ】10A12ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：119）およびアミノ酸配列（配列番号：93）を示す。CDR1（配列番号：60）、CDR2（配列番号：71）、およびCDR3（配列番号：82）領域を図で示し、VおよびJ生殖系列変異を示す。
【図１１Ａ】13C4ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：109）およびアミノ酸配列（配列番号：46）を示す。CDR1（配列番号：12）、CDR2（配列番号：23）、およびCDR3（配列番号：34）領域を図で示し、V、D、およびJ生殖系列変異を示す。
【図１１Ｂ】13C4ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：120）およびアミノ酸配列（配列番号：94）を示す。CDR1（配列番号：61）、CDR2（配列番号：72）、およびCDR3（配列番号：83）領域を図で示し、VおよびJ生殖系列変異を示す。
【図１２】1D4、1E1、2G1、6A5、6A8、7C10、および10A12の重鎖可変領域のアミノ酸配列と、ヒト生殖系列VH3-33アミノ酸配列（配列番号：47）とのアラインメントを示す。
【図１３】6B10および8F6の重鎖可変領域のアミノ酸配列と、ヒト生殖系列VH3-30.3アミノ酸配列（配列番号：48）とのアラインメントを示す。
【図１４】3C4の重鎖可変領域のアミノ酸配列と、ヒト生殖系列VH5-51アミノ酸配列（配列番号：49）とのアラインメントを示す。
【図１５】13C4の重鎖可変領域のアミノ酸配列と、ヒト生殖系列VH4-61アミノ酸配列（配列番号：50）とのアラインメントを示す。
【図１６】1D4、2G1、6A5、6A8、10A12、および13C4の軽鎖可変領域のアミノ酸配列と、ヒト生殖系列Vk A27アミノ酸配列（配列番号：95）とのアラインメントを示す。
【図１７】1E1、6B10および8F6の軽鎖可変領域のアミノ酸配列と、ヒト生殖系列Vk L6アミノ酸配列（配列番号：96）とのアラインメントを示す。
【図１８】3C4の軽鎖可変領域のアミノ酸配列と、ヒト生殖系列Vk L18アミノ酸配列（配列番号：97）とのアラインメントを示す。
【図１９】7C10の軽鎖可変領域のアミノ酸配列と、ヒト生殖系列Vk L15アミノ酸配列（配列番号：98）とのアラインメントを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
発明の詳細な説明
本発明は、IP-10に特異的に結合し、IP-10の機能的特性を阻害する単離されたモノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル抗体に関する。特定の態様において、本発明の抗体は、特定の重鎖および軽鎖生殖系列配列に由来して、および／または特定のアミノ酸配列を含むCDR領域のような、特定の構造特徴を含む。本発明は、単離された抗体、そのような抗体、そのような抗体を含む免疫結合体および二重特異的分子を作製する方法、ならびに本発明の抗体、免疫結合体、または二重特異的分子を含む薬学的組成物を提供する。本発明はまた、炎症または自己免疫反応を阻害するために、例えば様々な炎症または自己免疫反応の治療において抗体を用いる方法と共に、望ましくないIP-10活性を含むウイルス感染症を治療する方法にも関する。
【００３１】
本発明がより容易に理解されるように、特定の用語をまず定義する。さらなる定義は詳細な説明を通して述べる。
【００３２】
「インターフェロンγ誘導タンパク質10」、「IP-10」、および「CXCL10」という用語は互換的に用いられ、これには、ヒトIP-10の変種、イソ型、および種相同体が含まれる。したがって、本発明のヒト抗体は、特定の場合において、ヒト以外の種のIP-10と交叉反応してもよい。他の場合において、抗体はヒトIP-10に対して完全に特異的で、種交叉反応性または他のタイプの交叉反応性を示さなくてもよい。ヒトIP-10の完全なアミノ酸配列はGenBankアクセッション番号NP_001556（配列番号：121）を有する。アカゲザルIP-10の完全なアミノ酸配列は、Genbankアクセッション番号AAK95955（配列番号：123）を有する。マウスIP-10の完全なアミノ酸配列は、GenBankアクセッション番号NP_067249（配列番号：124）を有する。
【００３３】
「CXCR3」という用語は、IP-10（CXCL10）の受容体を指す。ヒトCXCR3の完全なアミノ酸配列は、GenBankアクセッション番号NP_001495（配列番号：122）を有する。
【００３４】
「MIG」という用語は、γインターフェロンによって誘導されるモノカインとしても知られ、IP-10とは異なる、CXCR3のリガンドを指す。ヒトMIGの完全なアミノ酸配列は、GenBankアクセッション番号NP_002407（配列番号：125）を有する。
【００３５】
「ITAC」という用語は、インターフェロン誘導型T細胞α化学誘引物質としても知られ、IP-10とは異なる、CXCR3のリガンドを指す。ヒトITACの完全なアミノ酸配列は、GenBankアクセッション番号NP_005400（配列番号：126）を有する。
【００３６】
「免疫応答」という用語は、例えば、リンパ球、抗原提示細胞、貪食細胞、顆粒球、および上記の細胞または肝臓によって産生された可溶性高分子（抗体、サイトカイン、および補体を含む）の作用を指し、それによって侵入した病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、癌様細胞、または自己免疫もしくは病的な炎症の場合、正常なヒト細胞もしくは組織の選択的な損傷、破壊、またはヒト体内からの消失が起こる作用を指す。
【００３７】
「シグナル伝達経路」とは、細胞の一つの部分から細胞のもう一つの部分へのシグナルの伝達において役割を果たす多様なシグナル伝達分子間の生化学的関連を指す。本明細書において用いられるように、「細胞表面受容体」という句には、例えばシグナルを受けることができる、および細胞の細胞質膜を超えてそのようなシグナルを伝達することができる分子および分子の複合体が含まれる。本発明の「細胞表面受容体」の例は、それに対してIP-10分子が結合するCXCR3受容体である。
【００３８】
本明細書において参照される「抗体」という用語には、抗体全体および任意の抗原結合断片（すなわち、「抗原結合部分」）、またはその一本鎖が含まれる。「抗体」は、ジスルフィド結合によって互いに結合した少なくとも二つの重鎖（H）および二つの軽鎖（L）を含む糖タンパク質、またはその抗原結合部分を指す。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてVHと省略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は三つのドメインCH1、CH2、およびCH3を含む。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてVLと省略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は一つのドメインCLを含む。VHおよびVL領域はさらに、より保存されたフレームワーク領域（FR）と呼ばれる領域が散在する相補性決定領域（CDR）と呼ばれる高度可変領域に関してさらに細分化される。それぞれのVHおよびVLは、三つのCDRおよび四つのFRを含み。これらはアミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順に整列する。FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、多様な免疫系の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第一の成分（C1q）を含む、宿主組織または因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介する可能性がある。
【００３９】
本明細書において用いられるように、抗体の「抗原結合部分」（または単純に「抗体部分」）は、抗原（例えば、IP-10）に対する特異的結合能を保持している抗体の一つまたは複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、完全長の抗体の断片によって行うことができることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に含まれる結合断片の例には、（i）Fab断片、VL、VH、CL、およびCH1ドメインからなる一価の断片；（ii）F(ab')2断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合した二つのFab断片を含む二価の断片；（iii）VHおよびCH1ドメインからなるFd断片；（iv）抗体の一つのアームのVLおよびVHドメインからなるFv断片、（v）VHドメインからなるdAb断片（Wardら（1989）Nature 341:544〜546）；および（vi）単離された相補性決定領域（CDR）が含まれる。さらに、Fv断片の二つのドメイン、VLおよびVHは、異なる遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え法を用いて、VLおよびVH領域が対を形成して一価の分子を形成する一つのタンパク質の鎖としてそれらを作製することができるようにする合成リンカーによって結合させることができる（一本鎖Fv（scFv）として知られる；例えばBirdら(1988)Science 242:423〜426；およびHustonら(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879〜5883を参照されたい）。そのような一本鎖抗体はまた、抗体の「抗原結合部分」という用語に含まれると意図される。これらの抗体断片は、当業者に公知の通常の技術を用いて得られ、断片は無傷の抗体と同じように有用性に関してスクリーニングされる。
【００４０】
本明細書において用いられるように「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すと意図される（例えば、IP-10に特異的に結合する単離抗体は、IP-10以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし、IP-10に特異的に結合する単離抗体は、他の種からのIP-10分子のような他の抗原に対して交叉反応性を有する。その上、単離抗体は、他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まない可能性がある。
【００４１】
本明細書において用いられるように「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一の分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す。
【００４２】
本明細書において用いられるように「ヒト化抗体」という用語には、フレームワーク領域およびCDR領域の双方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体が含まれると意図される。さらに、抗体が定常領域を含む場合、定常領域も同様に、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体には、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでランダムもしくは部位特異的変異誘発によって、またはインビボで体細胞変異導入された変異）が含まれてもよい。しかし、本明細書において記述される「ヒト抗体」という用語には、マウスのようなもう一つの哺乳類種の生殖系列に由来するCDR配列がヒトフレームワーク配列に移植されている抗体は含まれないと意図される。
【００４３】
「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、フレームワークとCDR領域の双方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する単一の結合特異性を示す抗体を指す。一つの態様において、ヒトモノクローナル抗体は、トランスジェニック非ヒト動物、例えばヒト重鎖トランスジーンと軽鎖トランスジーンとを含むゲノムを有するトランスジェニックマウスから得たB細胞を、不死化細胞に融合させて含むハイブリドーマによって産生される。
【００４４】
本明細書において用いられるように、「組換え型ヒト抗体」という用語には、（a）ヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックであるまたはトランスクロモゾームである動物（例えば、マウス）、もしくはそれらから調製されたハイブリドーマ（下記においてさらに記述する）から単離された抗体、（b）ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えばトランスフェクトーマから単離された抗体、（c）組換え型複合ヒト抗体ライブラリから単離された抗体、および（d）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のDNA配列にスプライシングすることを含む任意の他の手段によって調製、発現、作製、または単離された抗体のような、組換え手段によって調製、発現、作製、または単離される全てのヒト抗体が含まれる。そのような組換え型ヒト抗体は、フレームワークおよびCDR領域がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかし、特定の態様において、そのような組換え型ヒト抗体に、インビトロ変異誘発（または、ヒトIg配列に関してトランスジェニックである動物を用いる場合には、インビボ体細胞変異誘発）を供することができ、このように、組換え型抗体のVHおよびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列VHおよびVL配列に由来して関連するが、インビボでヒト抗体生殖系列範囲内には天然で存在しない可能性がある配列となる。
【００４５】
本明細書において用いられるように、「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、IgMまたはIgG1）を指す。
【００４６】
「抗原を認識する抗体」および「抗原に対して特異的な抗体」という句は、本明細書において、「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と互換的に用いられる。
【００４７】
本明細書において用いられるように、「ヒトIP-10に特異的に結合する」抗体は、KD 5×10-9 Mまたはそれ未満、より好ましくは2×10-9 Mまたはそれ未満、およびさらにより好ましくは1×10-10 Mまたはそれ未満でヒトIP-10に結合する抗体を指すと意図される。「アカゲザルIP-10と交叉反応する」抗体は、KD 0.5×10-8 Mまたはそれ未満、より好ましくは5×10-9 Mまたはそれ未満、およびさらにより好ましくは2×10-9 Mまたはそれ未満でアカゲザルIP-10に結合する抗体を指すと意図される。「マウスIP-10と交叉反応しない」、「ヒトMIGと交叉反応しない」、または「ヒトITACと交叉反応しない」抗体は、マウスIP-10、ヒトMIG、またはヒトITACに対して1.5×10-8 Mまたはそれより大きいKDで、より好ましくは5〜10×10-8 Mまたはそれより大きいKDで、およびさらにより好ましくは1×10-7 Mまたはそれより大きいKDで結合する抗体を指すと意図される。特定の態様において、マウスIP-10、ヒトMIGおよび／またはヒトITACと交叉反応しないそのような抗体は、標準的な結合アッセイ法においてこれらのタンパク質に対して本質的に検出不可能な結合を示す。
【００４８】
本明細書において用いられるように、「CXCR3に対するIP-10の結合を阻害する」抗体は、Ki 1 nMまたはそれ未満、より好ましくは0.75 nMまたはそれ未満、さらにより好ましくは0.5 nMまたはそれ未満、およびさらにより好ましくは0.25 nMまたはそれ未満でCXCR3に対するIP-10の結合を阻害する抗体を指すと意図される。
【００４９】
本明細書において用いられるように、「IP-10誘導性のカルシウム流入を阻害する」抗体は、IC50 10 nMまたはそれ未満、より好ましくは7.5 nMまたはそれ未満、さらにより好ましくは5 nMまたはそれ未満、およびさらにより好ましくは2.5 nMまたはそれ未満でIP-10誘導性のカルシウム流入を阻害する抗体を指すと意図される。
【００５０】
本明細書において用いられるように、「IP-10誘導性の細胞の遊走を阻害する」抗体は、IC50 2μg/mlまたはそれ未満、より好ましくは1μg/mlまたはそれ未満、さらにより好ましくは0.5μg/mlまたはそれ未満、およびさらにより好ましくは0.25μg/mlまたはそれ未満でヒトIP-10誘導性の細胞遊走を阻害する抗体を指すと意図される。
【００５１】
本明細書において用いられるように、「Kassoc」または「Ka」という用語は、特定の抗体-抗原相互作用の会合速度を指し、本明細書において用いられる「Kdis」または「Kd」は特定の抗体-抗原相互作用の解離速度を指すと意図される。本明細書において用いられるように、「KD」という用語は、Kaに対するKdの比（すなわちKd/Ka）から得られた解離定数を指すと意図され、モル濃度（M）として表記される。抗体のKD値は、当技術分野で十分に確立された方法を用いて決定することができる。抗体のKDを決定するための好ましい方法は、好ましくはBiacore（登録商標）システムのようなバイオセンサーシステムを用いて表面プラズモン共鳴を用いることによる。
【００５２】
本明細書において用いられるように、IgG抗体の「高親和性」という用語は、標的抗原に対してKD 10-8 Mまたはそれ未満、より好ましくは10-9 Mまたはそれ未満、さらにより好ましくは10-10 Mまたはそれ未満を有する抗体を指す。しかし、「高親和性」結合は、他の抗体アイソタイプに関して変化しうる。例えば、IgMアイソタイプに関する「高親和性」結合は、KD 10-7 Mまたはそれ未満、より好ましくは10-8 Mまたはそれ未満を有する抗体を指す。
【００５３】
本明細書において用いられるように、「被験者」という用語には、任意のヒトまたは非ヒト動物が含まれる。「非ヒト動物」という用語には、全ての脊椎動物、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、は虫類等のような哺乳類および非哺乳類が含まれる。
【００５４】
本発明の様々な局面は以下の小章においてさらに詳細に記述される。
【００５５】
抗IP-10抗体
本発明の抗体は、抗体の特定の機能的特徴または特性を特徴とする。例えば、抗体はヒトIP-10に対して特異的に結合する。さらに、抗体は、アカゲザルのような一つまたは複数の非ヒト霊長類からのIP-10と交叉反応してもよい。好ましくは、抗体はマウスIP-10と交叉反応しない。その上、MIGおよびITACも同様にCXCR3受容体のリガンドであるが、本発明の抗体は好ましくは、ヒトMIGまたはヒトITACと交叉反応しない。
【００５６】
好ましくは、本発明の抗体は、高親和性で、例えばKD 10-8 Mまたはそれ未満、10-9 Mまたはそれ未満、または10-10 Mもしくはそれ未満でIP-10に結合する。
【００５７】
さらに、本発明の抗体は、IP-10の一つまたは複数の機能的活性を阻害することができる。例えば、一つの態様において、抗体はCXCR3に対するIP-10の結合を阻害する。もう一つの態様において、抗体はIP-10によって誘導されるカルシウム流入を阻害する。さらにもう一つの態様において、抗体はIP-10誘導性の細胞遊走（走化性）を阻害する。
【００５８】
様々な種のIP-10および／またはMIGまたはITACに対する抗体の結合能を評価するための標準的なアッセイ法は、例えばELISA、ウェスタンブロット、およびRIAを含み、当技術分野で公知である。適したアッセイ法を実施例において詳細に記述する。抗体の結合速度論（例えば、結合親和性）も同様に、Biacore分析のような、当技術分野で公知の標準的なアッセイ法によって評価することができる。IP-10の機能的特性（例えば、受容体結合、カルシウム流入、走化性）に及ぼす抗体の影響を評価するアッセイ法は、実施例においてさらに詳細に記述される。
【００５９】
したがって、当技術分野で公知のおよび本明細書において記述される方法論に従って決定される、これらのIP-10機能的特性（例えば、生化学、免疫化学、生理的、または他の生物学的活性等）の一つまたは複数を「阻害する」抗体は、抗体の非存在下で認められる場合（例えば、または無関係な特異性の対照抗体が存在する場合）と比較して特定の活性の統計学的に有意な減少に関連すると理解されるであろう。好ましくは、IP-10活性作用を阻害する抗体は、測定したパラメータの少なくとも10％、より好ましくは少なくとも20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、または90％の統計学的に有意な減少を示し、特定の好ましい態様において、本発明の抗体は、IP-10機能的活性を92％、94％、95％、97％、98％、または99％より大きく阻害する可能性がある。
【００６０】
モノクローナル抗体1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12、および13C4
本発明の好ましい抗体は、実施例1および2において記述されるように単離されて構造的に特徴が調べられたヒトモノクローナル抗体1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12、および13C4である。もう一つの好ましい抗体は、10A12（VH CDR1内）の重鎖のアミノ酸残基32位がシステインからセリンに変異している10A12Sである。1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12、10A12S、および13C4のVHアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号：35〜46に示す。1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12、および13C4のVLアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号：84〜94に示す。
【００６１】
これらの抗体のそれぞれがIP-10に結合することができると仮定すると、本発明の他の抗IP-10結合分子を作製するために、VHおよびVL配列を「混合してマッチさせる」ことができる。そのような「混合してマッチさせた」抗体のIP-10結合は、上記および実施例に記述の結合アッセイ法（例えば、ELISA）を用いて試験することができる。好ましくは、VHおよびVL鎖を混合してマッチさせる場合、特定のVH/VL対からのVH配列を構造的に類似のVH配列に置換する。同様に、好ましくは特定のVH/VL対のVL配列を、構造的に類似のVL配列に置換する。例えば、1D4、2G1、6A5、6A8、10A12、または10A12SのVHおよびVL配列は、これらの抗体が同じ生殖系列配列に由来するVHおよびVL配列（VH3-33およびVk A27）を用い、このように構造的類似性を示すことから、混合およびマッチングを特に受けやすい。同様に、6B10および8F6はまた、それらも同じ生殖系列配列（VH3-30.3およびVk L6）に由来するVHおよびVL配列を用いて、このように構造的類似性を示すことから、6B10および8F6のVHおよびVL配列もミキシングおよびマッチングを特に受けやすい。または、例えば、1D4、2G1、6A5、6A8、10A12、または10A12SのVH配列は、本来生殖系列Vk A27のVL配列と対を形成したこと、および13C4のVL配列が同様に生殖系列Vk A27に由来することから、1D4、2G1、6A5、6A8、10A12、または10A12SのVH配列を13C4のVLと対にすることができる。同様に、7C10および1E1のVL配列は生殖系列VH3-33のVH配列と本来対を形成すること、および1D4、2G1、6A5、6A8、10A12、および10A12SのVH配列も同様に生殖系列VH 3-33に由来することから、7C10または1E1のVL配列を1D4、2G1、6A5、6A8、10A12、または10A12SのVH配列と対を形成することができる。モノクローナル抗体1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12、および13C4に関して、本明細書に開示のVHおよびVL配列から、構造的に類似の配列の他のVH/VL対を作製できることは当業者に容易に明らかとなるであろう。
【００６２】
したがって、一つの局面において、本発明は、IP-10に特異的に結合する、以下を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する：
（a）配列番号：35〜46からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
（b）配列番号：84〜94からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【００６３】
好ましい重鎖および軽鎖の組み合わせには、以下が含まれる：
（a）配列番号：35のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および（b）配列番号：84のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または
（a）配列番号：36のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および（b）配列番号：85のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または
（a）配列番号：37のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および（b）配列番号：86のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または
（a）配列番号：38のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および（b）配列番号：87のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または
（a）配列番号：39のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および（b）配列番号：88のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または
（a）配列番号：40のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および（b）配列番号：89のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または
（a）配列番号：41のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および（b）配列番号：90のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または
（a）配列番号：42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および（b）配列番号：91のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または
（a）配列番号：43のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および（b）配列番号：92のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または
（a）配列番号：44もしくは45のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および（b）配列番号：93のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または
（a）配列番号：46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および（b）配列番号：94のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【００６４】
もう一つの局面において、本発明は、1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12、10A12S、および13C4の重鎖および軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3またはその組み合わせを含む抗体を提供する。1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12、10A12S、および13C4のVH CDR1のアミノ酸配列を配列番号：1〜12に示す。1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12、および13C4のVH CDR2のアミノ酸配列を配列番号：13〜23に示す。1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12、および13C4のVH CDR3のアミノ酸配列を配列番号：24〜34に示す。1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12、および13C4のVk CDR1のアミノ酸配列を配列番号：51〜61に示す。1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12、および13C4のVk CDR2のアミノ酸配列を配列番号：62〜72に示す。1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12、および13C4のVk CDR1のアミノ酸配列を配列番号：73〜83に示す。CDR領域は、Kabatシステムを用いて描写する（Kavat, E.A.ら(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版、米国保健社会福祉省、NIH Publication No. 91〜3242）。
【００６５】
これらの抗体のそれぞれがIP-10に結合し、抗原結合特異性がCDR1、2、および3領域によって主に提供されると仮定して、VH CDR1、2、および3配列ならびにVL CDR1、2、および3配列を「混合およびマッチ」させて（すなわち、異なる抗体からのCDRを混合してマッチングさせることができるが、各抗体はVH CDR1、2、および3配列ならびにVL CDR1、2、および3配列を含まなければならない）、本発明の他の抗IP-10結合分子を作製することができる。そのような「混合およびマッチ」抗体のIP-10結合を、先に記述のおよび実施例に記述の結合アッセイ法（例えば、ELISA）を用いて試験することができる。好ましくは、VH CDR配列を混合およびマッチさせる場合、特定のVH配列のCDR1、CDR2、および／またはCDR3配列を構造的に類似のCDR配列に置換する。同様に、VL CDR配列を混合およびマッチさせる場合、特定のVL配列からのCDR1、CDR2および／またはCDR3配列を構造的に類似のCDR配列に置換する。例えば、1D4、1E1、2G1、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12、および10A12SのVH CDR1は、何らかの構造的類似性を共有し、したがって、混合およびマッチングを受けやすいが、3C4および13C4のVH CDR1は1D4、1E1、2G1、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12および10A12SのVH CDR1とは構造的に類似ではなく、このようにそれらと混合およびマッチさせることができない。モノクローナル抗体1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12、および13C4に関して、一つまたは複数のVHおよび／またはVL CDR領域配列を、本明細書に開示のCDR配列からの構造的に類似の配列と置換することによって新規VHおよびVL配列を作製することができることは、当業者に容易に明らかとなるであろう。
【００６６】
したがって、もう一つの局面において、本発明は、IP-10に特異的に結合する、以下を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する：
（a）配列番号：1〜12からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1；
（b）配列番号：13〜23からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2；
（c）配列番号：24〜34からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3；
（d）配列番号：51〜61からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1；
（e）配列番号：62〜72からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2；および
（f）配列番号：73〜83からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
【００６７】
好ましい態様において、抗体は、以下を含む：
（a）配列番号：1を含む重鎖可変領域CDR1；
（b）配列番号：13を含む重鎖可変領域CDR2；
（c）配列番号：24を含む重鎖可変領域CDR3；
（d）配列番号：51を含む軽鎖可変領域CDR1；
（e）配列番号：62を含む軽鎖可変領域CDR2；および
（f）配列番号：73を含む軽鎖可変領域CDR3。
【００６８】
もう一つの好ましい態様において、抗体は、以下を含む：
（a）配列番号：2を含む重鎖可変領域CDR1；
（b）配列番号：14を含む重鎖可変領域CDR2；
（c）配列番号：25を含む重鎖可変領域CDR3；
（d）配列番号：52を含む軽鎖可変領域CDR1；
（e）配列番号：63を含む軽鎖可変領域CDR2；および
（f）配列番号：74を含む軽鎖可変領域CDR3。
【００６９】
もう一つの好ましい態様において、抗体は、以下を含む：
（a）配列番号：3を含む重鎖可変領域CDR1；
（b）配列番号：15を含む重鎖可変領域CDR2；
（c）配列番号：26を含む重鎖可変領域CDR3；
（d）配列番号：53を含む軽鎖可変領域CDR1；
（e）配列番号：64を含む軽鎖可変領域CDR2；および
（f）配列番号：75を含む軽鎖可変領域CDR3。
【００７０】
もう一つの好ましい態様において、抗体は、以下を含む：
（a）配列番号：4を含む重鎖可変領域CDR1；
（b）配列番号：16を含む重鎖可変領域CDR2；
（c）配列番号：27を含む重鎖可変領域CDR3；
（d）配列番号：54を含む軽鎖可変領域CDR1；
（e）配列番号：65を含む軽鎖可変領域CDR2；および
（f）配列番号：76を含む軽鎖可変領域CDR3。
【００７１】
もう一つの好ましい態様において、抗体は、以下を含む：
（a）配列番号：5を含む重鎖可変領域CDR1；
（b）配列番号：17を含む重鎖可変領域CDR2；
（c）配列番号：28を含む重鎖可変領域CDR3；
（d）配列番号：55を含む軽鎖可変領域CDR1；
（e）配列番号：66を含む軽鎖可変領域CDR2；および
（f）配列番号：77を含む軽鎖可変領域CDR3。
【００７２】
もう一つの好ましい態様において、抗体は、以下を含む：
（a）配列番号：6を含む重鎖可変領域CDR1；
（b）配列番号：18を含む重鎖可変領域CDR2；
（c）配列番号：29を含む重鎖可変領域CDR3；
（d）配列番号：56を含む軽鎖可変領域CDR1；
（e）配列番号：67を含む軽鎖可変領域CDR2；および
（f）配列番号：78を含む軽鎖可変領域CDR3。
【００７３】
もう一つの好ましい態様において、抗体は、以下を含む：
（a）配列番号：7を含む重鎖可変領域CDR1；
（b）配列番号：19を含む重鎖可変領域CDR2；
（c）配列番号：30を含む重鎖可変領域CDR3；
（d）配列番号：57を含む軽鎖可変領域CDR1；
（e）配列番号：68を含む軽鎖可変領域CDR2；および
（f）配列番号：79を含む軽鎖可変領域CDR3。
【００７４】
もう一つの好ましい態様において、抗体は、以下を含む：
（a）配列番号：8を含む重鎖可変領域CDR1；
（b）配列番号：20を含む重鎖可変領域CDR2；
（c）配列番号：31を含む重鎖可変領域CDR3；
（d）配列番号：58を含む軽鎖可変領域CDR1；
（e）配列番号：69を含む軽鎖可変領域CDR2；および
（f）配列番号：80を含む軽鎖可変領域CDR3。
【００７５】
もう一つの好ましい態様において、抗体は、以下を含む：
（a）配列番号：9を含む重鎖可変領域CDR1；
（b）配列番号：21を含む重鎖可変領域CDR2；
（c）配列番号：32を含む重鎖可変領域CDR3；
（d）配列番号：59を含む軽鎖可変領域CDR1；
（e）配列番号：70を含む軽鎖可変領域CDR2；および
（f）配列番号：81を含む軽鎖可変領域CDR3。
【００７６】
もう一つの好ましい態様において、抗体は、以下を含む：
（a）配列番号：10または11を含む重鎖可変領域CDR1；
（b）配列番号：22を含む重鎖可変領域CDR2；
（c）配列番号：33を含む重鎖可変領域CDR3；
（d）配列番号：60を含む軽鎖可変領域CDR1；
（e）配列番号：71を含む軽鎖可変領域CDR2；および
（f）配列番号：82を含む軽鎖可変領域CDR3。
【００７７】
もう一つの好ましい態様において、抗体は、以下を含む：
（a）配列番号：12を含む重鎖可変領域CDR1；
（b）配列番号：23を含む重鎖可変領域CDR2；
（c）配列番号：34を含む重鎖可変領域CDR3；
（d）配列番号：61を含む軽鎖可変領域CDR1；
（e）配列番号：72を含む軽鎖可変領域CDR2；および
（f）配列番号：83を含む軽鎖可変領域CDR3。
【００７８】
特定の生殖系列配列を有する抗体
特定の態様において、本発明の抗体は、特定の生殖系列重鎖免疫グロブリン遺伝子からの重鎖可変領域および／または特定の生殖系列軽鎖免疫グロブリン遺伝子からの軽鎖可変領域を含む。
【００７９】
本明細書において示されるように、ヒト生殖系列VH 3-33遺伝子、VH 3-30.3遺伝子、VH 5-51遺伝子またはVH 4-61遺伝子の産物である、またはそれに由来する重鎖可変領域を含む、IP-10に対して特異的なヒト抗体が調製されている。したがって、本発明は、VH 3-33、VH3-30.3、VH5-51、およびVH 4-61からなる群より選択されるヒトVH生殖系列遺伝子の産物である、またはそれに由来する重鎖可変領域を含む、単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する。好ましくは、抗体は、ヒトIP-10ポリペプチドに対して特異的である（例えば、GenBankアクセッション番号NP_001556の配列を含む）。
【００８０】
同様に本明細書において示されるように、ヒト生殖系列Vk A27遺伝子、Vk L15遺伝子、Vk L6遺伝子、またはVk L18遺伝子の産物である、またはそれに由来する軽鎖可変領域を含む、IP-10に対して特異的なヒト抗体が調製されている。したがって、本発明は、Vk A27、Vk L15、Vk L6、およびVk L18からなる群より選択されるヒトVk生殖系列遺伝子の産物である、またはそれに由来する軽鎖可変領域を含む、単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する。好ましくは、抗体はヒトIP-10ポリペプチドに対して特異的である（例えば、GenBankアクセッション番号NP_001556の配列を含む）。
【００８１】
本発明の好ましい抗体は、上記のヒト生殖系列VH遺伝子の産物である、またはそれに由来する重鎖可変領域を含み、同様に上記のヒト生殖系列Vk遺伝子の一つの産物である、またはそれに由来する軽鎖可変領域を含む抗体である。したがって、もう一つの態様において、本発明は以下を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する：
（a）VH 3-33、VH3-30.3、VH5-51、およびVH 4-61からなる群より選択されるヒトVH生殖系列遺伝子の産物である、またはそれに由来する重鎖可変領域；ならびに
（b）Vk A27、Vk L15、Vk L6、およびVk L18からなる群より選択されるヒトVk生殖系列遺伝子の産物である、またはそれに由来する軽鎖可変領域。好ましくは、抗体は、ヒトIP-10ポリペプチドに対して特異的である（例えば、GenBankアクセッション番号NP_001556の配列を含む）。
【００８２】
本発明はまた、特定のVHおよびVk生殖系列遺伝子の産物である、またはそれに由来する重鎖および軽鎖可変領域の好ましい組み合わせを含む抗体を提供する。例えば、好ましい態様において、本発明は、以下である、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する：
（a）ヒトVH 3-33遺伝子（配列番号：47に記載のアミノ酸配列をコードする）の産物である、またはそれに由来する重鎖可変領域を含む；
（b）ヒトVk A27、L15、またはL6遺伝子（配列番号：95、98、および97にそれぞれ記載されるアミノ酸配列をコードする）の産物である、またはそれに由来する軽鎖可変領域を含む；および
（c）IP-10に特異的に結合する。
【００８３】
一つの態様において、抗体は、ヒトVk A27遺伝子の産物である、またはそれに由来する軽鎖可変領域を含む。VH 3-33およびVk A27のVHおよびVkをそれぞれ有する抗体の例には、1D4、2G1、6A5、6A8、10A12、および10A12Sが含まれる。もう一つの態様において、抗体は、ヒトVk L15遺伝子の産物である、またはそれに由来する軽鎖可変領域を含む。VH 3-33およびVk L15のVHおよびVkをそれぞれ有する抗体の例は、7C10である。もう一つの態様において、抗体は、ヒトVk L6遺伝子の軽鎖可変領域を含む。VH 3-33およびVk L6のVHおよびVkをそれぞれ有する抗体の例は、1E1である。
【００８４】
もう一つの好ましい態様において、本発明は、以下である、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する：
（a）ヒトVH 3-30.3遺伝子（配列番号：48に記載のアミノ酸配列をコードする）の、またはそれに由来する重鎖可変領域を含む；
（b）ヒトVk L6遺伝子（配列番号：96に記載されるアミノ酸配列をコードする）の、またはそれに由来する軽鎖可変領域を含む；および
（c）IP-10に特異的に結合する。
VH 3-30.3およびVk L6のVHおよびVkをそれぞれ有する抗体の例には、6B10および8F6が含まれる。
【００８５】
もう一つの好ましい態様において、本発明は、以下である、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する：
（a）ヒトVH 5-51遺伝子（配列番号：49に記載のアミノ酸配列をコードする）の、またはそれに由来する重鎖可変領域を含む；
（b）ヒトVk L18遺伝子（配列番号：97に記載されるアミノ酸配列をコードする）の、またはそれに由来する軽鎖可変領域を含む；および
（c）IP-10に特異的に結合する。
VH 5-51およびVk L18のVHおよびVkをそれぞれ有する抗体の例は、3C4である。
【００８６】
さらにもう一つの好ましい態様において、本発明は、以下である、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する：
（a）ヒトVH 4-61遺伝子（配列番号：50に記載のアミノ酸配列をコードする）の、またはそれに由来する重鎖可変領域を含む；
（b）ヒトVk A27遺伝子（配列番号：95にそれぞれ記載されるアミノ酸配列をコードする）の、またはそれに由来する軽鎖可変領域を含む；および
（c）IP-10に特異的に結合する。
VH 4-61およびVk A27のVHおよびVkをそれぞれ有する抗体の例は、13C4である。
【００８７】
本明細書において用いられるように、ヒト抗体は、抗体の可変領域がヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子を用いる系から得られる場合、特定の生殖系列配列「の産物である」または「に由来する」重鎖または軽鎖可変領域を含む。そのような系には、ヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスを対象抗原によって免疫する段階、またはファージにおいて示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリを対象抗原によってスクリーニングする段階が含まれる。ヒト生殖系列免疫グロブリン配列「の産物である」または「に由来する」ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較する段階、およびヒト抗体の配列に対して配列において最も近い（すなわち最大の％同一性）ヒト生殖系列免疫グロブリン配列を選択する段階によって、同定することができる。特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列「の産物である」または「に由来する」ヒト抗体は、例えば天然に存在する体細胞変異または部位特異的変異の意図的な導入のために、生殖系列配列と比較してアミノ酸の差を含んでもよい。しかし、選択されたヒト抗体は典型的に、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対してアミノ酸配列が少なくとも90％同一であり、他の種（例えば、マウス生殖系列配列）の生殖系列免疫グロブリンアミノ酸配列と比較して、ヒト抗体をヒトであると同定するアミノ酸残基を含む。特定の場合において、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対してアミノ酸配列が少なくとも95％、またはさらに少なくとも96％、97％、98％、もしくは99％同一であってもよい。典型的に、特定のヒト生殖系列配列に由来するヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列からアミノ酸わずか10個の差を示すに過ぎないであろう。特定の場合において、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とアミノ酸わずか5個、またはさらに4、3、2、または1個の差を示すに過ぎない可能性がある。
【００８８】
相同な抗体
さらにもう一つの態様において、本発明の抗体は、本明細書に記述の好ましい抗体のアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖領域を含み、本発明の抗IP-10抗体の所望の機能的特性を保持している。
【００８９】
例えば、本発明は、以下である、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する：
（a）重鎖可変領域が、配列番号：35〜46からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも80％相同であるアミノ酸配列を含む；
（b）軽鎖可変領域が、配列番号：84〜94からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも80％相同であるアミノ酸配列を含む；
（c）抗体がIP-10に特異的に結合する；および
（d）抗体が以下の機能的特性の少なくとも一つを示す：
（i）抗体がCXCR3に対するIP-10の結合を阻害すること；
（ii）抗体がIP-10誘導性のカルシウム流入を阻害すること；
（iii）抗体がIP-10誘導性の細胞遊走を阻害すること；
（iv）抗体がアカゲザルIP-10と交叉反応すること；
（v）抗体がマウスIP-10と交叉反応しないこと；
（vi）抗体がヒトMIGと交叉反応しないこと；
（vii）抗体がヒトITACと交叉反応しないこと。
【００９０】
様々な態様において、抗体は、上記の（d）から（j）に記載した機能的特性の一つもしくは複数、二つもしくはそれ以上、三つもしくはそれ以上、四つもしくはそれ以上、五つもしくはそれ以上、または六つもしくはそれ以上を示してもよい。抗体は例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体となりうる。
【００９１】
他の態様において、VHおよび／またはVLアミノ酸配列は、先に記述した配列に対して85％、90％、95％、96％、97％、98％、または99％相同であってもよい。配列番号：35〜46および84〜94のVHおよびVL領域と高い（すなわち80％またはそれより高い）相同性を有するVHおよびVL領域を有する抗体はそれぞれ、配列番号：35〜46および／または84〜94をコードする核酸分子の変異誘発（例えば、部位特異的またはPCRによる変異誘発）の後に、本明細書に記述の機能的アッセイ法を用いて、コードされた変化した抗体の保持された機能（すなわち上記の（c）〜（j）に記載の機能）に関して試験を行うことによって得ることができる。
【００９２】
本明細書において用いられるように、二つのアミノ酸配列間の％相同性は、二つの配列間の％同一性と同等である。二つの配列間の％同一性は、二つの配列を最適に配置するために導入する必要があるギャップの数、各ギャップの長さを考慮に入れた、配列が共有する同一の位置の数の関数（すなわち、％相同性＝同一の位置の数／位置の総数×100）である。二つの配列間の配列の比較および％同一性の決定は、以下の非制限的な実施例に記述されるように数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。
【００９３】
二つのアミノ酸配列間の％同一性は、ALIGNプログラム（バージョン2.0）に組み入れられているE. Meyers and W. Miller（Comput. Appl. Biosci. 4:11〜17(1988)）のアルゴリズムを用いて、PAM120加重残基表、ギャップ長ペナルティ12およびギャップペナルティ4を用いて決定することができる。さらに、二つのアミノ酸配列間の％同一性は、GCGソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで入手可能）におけるGAPプログラムに組み入れられているNeedleman and Wunsch（J. Mol. Biol. 48:444〜453(1970)）のアルゴリズムを用いて、Blossum 62行列またはPAM250行列のいずれかを用いて、ギャップ加重16、14、12、10、8、6、または4および長さの加重1、2、3、4、5、または6を用いて決定することができる。
【００９４】
さらに、もしくはまたは、本発明のタンパク質配列はさらに、例えば関連する配列を同定するために公共のデータベースに対する検索を行うための「問い合わせ配列」として用いることができる。そのような検索は、Altschulら(1990)J. Mol. Biol. 215:403〜10のXBLASTプログラム（バージョン2.0）を用いて行うことができる。BLASTタンパク質検索は、本発明の抗体分子と相同であるアミノ酸配列を得るために、XBLASTプログラム、スコア＝50、ワード長＝3によって行うことができる。比較目的のためにギャップを加えたアラインメントを得るために、Altschulら(1997)Nucleic Acids Res. 25(17):3389〜3402に記述されるようなGapped BLASTを利用することができる。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、XBLASTおよびNBLAST）のデフォルトパラメータを用いることができる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov.を参照されたい。
【００９５】
保存的改変を有する抗体
特定の態様において、本発明の抗体は、CDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む重鎖可変領域ならびにCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む軽鎖可変領域を含み、これらのCDR配列の一つまたは複数は、本明細書に記述の好ましい抗体（例えば、1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12、10A12Sおよび13C4）またはその保存的改変に基づく特定のアミノ酸配列を含み、抗体は、本発明の抗IP-10抗体の所望の機能的特性を保持している。したがって、本発明は、以下である、CDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む重鎖可変領域ならびにCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む軽鎖可変領域を含む、単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する：
（a）重鎖可変領域CDR3配列が、配列番号：24〜34のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列およびその保存的改変を含む；
（b）軽鎖可変領域CDR3配列が、配列番号：73〜83のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列およびその保存的改変を含む；
（c）抗体がIP-10に対して特異的に結合する；および
（d）抗体が以下の機能的特性の少なくとも一つを示す：
（i）抗体がCXCR3に対するIP-10の結合を阻害すること；
（ii）抗体がIP-10誘導性のカルシウム流入を阻害すること；
（iii）抗体がIP-10誘導性の細胞遊走を阻害すること；
（iv）抗体がアカゲザルIP-10と交叉反応すること；
（v）抗体がマウスIP-10と交叉反応しないこと；
（vi）抗体がヒトMIGと交叉反応しないこと；
（vii）抗体がヒトITACと交叉反応しないこと。
【００９６】
好ましい態様において、重鎖可変領域CDR2配列は、配列番号：13〜23のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列、およびその保存的改変を含み；ならびに軽鎖可変領域CDR2配列は、配列番号：62〜72のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列、およびその保存的改変を含む。もう一つの好ましい態様において、重鎖可変領域CDR3配列は、配列番号：1〜12のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列、およびその保存的改変を含み；ならびに軽鎖可変領域CDR3配列は、配列番号：51〜61のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列、およびその保存的改変を含む。
【００９７】
様々な態様において、抗体は、上記の（d）から（j）に記載した機能的特性の一つもしくは複数、二つもしくはそれ以上、三つもしくはそれ以上、四つもしくはそれ以上、五つもしくはそれ以上、または六つもしくはそれ以上を示してもよい。そのような抗体は例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体となりうる。
【００９８】
本明細書において用いられるように、「保存的配列改変」は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特徴に有意な影響を及ぼさないまたは変化させないアミノ酸改変を指すと意図される。そのような保存的改変には、アミノ酸置換、付加および欠失が含まれる。改変は、部位特異的変異誘発およびPCR媒介変異誘発のような、当技術分野において公知の標準的な技術によって本発明の抗体に導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されている置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β-分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。このように、本発明の抗体のCDR領域内の一つまたは複数のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーの他のアミノ酸に置換することができ、変化した抗体を、本明細書に記述の機能的アッセイ法を用いて、保持された機能（すなわち、上記の（c）〜（j）に記載の機能）に関して試験することができる。
【００９９】
本発明の抗IP-10抗体と同じエピトープに結合する抗体
もう一つの態様において、本発明は、本明細書に記述の1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12、10A12Sまたは13C4抗体と同じエピトープに結合する他のヒト抗体のような、本明細書において提供される本発明の様々な抗IP-10抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。そのようなさらなる抗体は、標準的なIP-10結合アッセイ法において、1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12、10A12Sまたは13C4のような本発明の他の抗体と交叉競合できるか否か（例えば、その結合を統計学的に有意に競合的に阻害する）に基づいて同定することができる。ヒトIP-10に対する例えば1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12、10A12Sまたは13C4の結合を試験抗体が阻害できることは、試験抗体がヒトIP-10に対する結合に関してその抗体と競合できることを示している；そのような抗体は、非制限的な理論に従って、それが競合する抗体とヒトIP-10上の同じまたは関連する（例えば、構造的に類似または空間的に近位の）エピトープに結合してもよい。好ましい態様において、ヒトIP-10上で1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12、10A12Sまたは13C4と同じエピトープに結合する抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。そのようなヒトモノクローナル抗体は、実施例に記述されるように調製および単離することができる。
【０１００】
操作および改変された抗体
本発明の抗体はさらに、改変抗体を操作するための開始材料として本明細書に開示のVHおよび／またはVL配列の一つまたは複数を有する抗体を用いて調製することができる。抗体は、一つまたは双方の可変領域（すなわち、VHおよび／またはVL）内、例えば一つまたは複数のCDR領域内、および／または一つまたは複数のフレームワーク領域内の一つまたは複数の残基を改変することによって操作することができる。さらに、もしくはまたは、抗体は、例えば抗体のエフェクター機能を変化させるために、定常領域内の残基を改変することによって操作することができる。
【０１０１】
行うことができる一つのタイプの可変領域の操作は、CDRの移植である。抗体は主に、重鎖および軽鎖相補性決定領域（CDR）6個に存在するアミノ酸残基を通して、標的抗原と相互作用する。この理由から、CDR内のアミノ酸配列は、CDR外の配列より個々の抗体間で多様である。CDR配列はほとんどの抗体-抗原相互作用に関与していることから、異なる特性を有する異なる抗体からフレームワーク配列に移植された特異的な天然に存在する抗体からのCDR配列を含む発現ベクターを構築することによって、特異的な天然に存在する抗体の特性を模倣する組換え型抗体を発現させることが可能である（例えば、Riechmann, L.ら(1998)Nature 332:323〜327；Jones, P.ら(1986)Nature 321:522〜525；Queen, C.ら(1989)Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029〜10033；Winterに対する米国特許第5,225,539号、ならびにQueenらに対する米国特許第5,530,101号；第5,585,089号；第5,693,762号；および第6,180,370号を参照されたい）。
【０１０２】
したがって、本発明のもう一つの態様は、配列番号：1〜12、配列番号：13〜23、および配列番号：24〜34からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：51〜61、配列番号：62〜72、および配列番号：73〜83からなる群よりそれぞれ選択されるアミノ酸配列を含むCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む軽鎖可変領域を含む、単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分に関する。このように、そのような抗体は、モノクローナル抗体1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12、10A12Sおよび13C4のVHおよびVL CDR配列を含むが、それでもこれらの抗体の異なるフレームワーク領域を含んでもよい。
【０１０３】
そのようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公共のDNAデータベースまたは公表された参考文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子に関する生殖系列DNA配列は、「VBase」ヒト生殖系列配列データベース（インターネットでwww.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbaseで入手可能）と共に、それぞれの内容物が特に参照として本明細書に組み入れられる、Kabat, E.A.ら(1991)「Sequences of Proteins of Immunological Interest」、第5版、米国保健社会福祉省、NIH Publication No. 91-3242；Tomlinson, I.M.ら(1992)「The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops」, J. Mol. Biol. 227:776〜798；およびCox, J.P.L.ら(1994)「A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage.」Eur. J. Immuol. 24:827〜836において認められうる。
【０１０４】
本発明の抗体において用いるための好ましいフレームワーク配列は、本発明の選択された抗体によって用いられるフレームワーク配列と構造的に類似の、例えば本発明の好ましいモノクローナル抗体によって用いられるVH 3-33、3-30.3、4-61、または5-51配列[配列番号：47〜50]および／またはVk A27、L6、L18、またはL15フレームワーク配列[配列番号：95〜98]と類似の配列である。VH CDR1、2および3配列、ならびにVL CDR1、2、および3配列は、そこからフレームワーク配列が由来する生殖系列免疫グロブリン遺伝子において認められる配列と同一の配列を有するフレームワーク領域に移植することができる、またはCDR配列を生殖系列配列と比較して一つもしくは複数の変異を含むフレームワーク領域に移植することができる。例えば、特定の場合抗体の抗原結合能を維持または増強するために、フレームワーク領域内の残基を変異させることが有用である（例えば、Queenらに対する米国特許第5,530,101号；第5,585,089号；第5,693,762号；および第6,180,370号を参照されたい）。
【０１０５】
もう一つのタイプの可変領域変異は、VHおよび／またはVL CDR1、CDR2、および／またはCDR3領域内のアミノ酸配列を変異させて、それによって対象抗体の一つまたは複数の結合特性（例えば、親和性）を改善することである。変異を導入するために部位特異的変異誘発またはPCR媒介変異誘発を行うことができ、抗体結合に及ぼす、または対象となる他の機能的特性に及ぼすその効果を、本明細書に記述のおよび実施例において提供されるインビトロまたはインビボアッセイ法において評価することができる。好ましくは、保存的改変（上記のように）を導入する。変異は、アミノ酸置換、付加、または欠失であってもよいが、好ましくは置換である。その上、典型的にCDR領域内で変化させる残基は、わずか1、2、3、4、または5個に過ぎない。
【０１０６】
したがって、もう一つの態様において、本発明は、（a）配列番号：1〜12からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号：1〜12と比較した場合にアミノ酸置換、欠失、もしくは付加1、2、3、4もしくは5個を有するアミノ酸配列を含むVH CDR1領域；（b）配列番号：13〜23からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号：13〜23と比較した場合にアミノ酸置換、欠失、もしくは付加1、2、3、4もしくは5個を有するアミノ酸配列を含むVH CDR2領域；（c）配列番号：24〜34からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号：24〜34と比較した場合にアミノ酸置換、欠失、もしくは付加1、2、3、4もしくは5個を有するアミノ酸配列を含むVH CDR3領域；（d）配列番号：51〜61からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号：51〜61と比較した場合にアミノ酸置換、欠失、もしくは付加1、2、3、4もしくは5個を有するアミノ酸配列を含むVL CDR1領域；（e）配列番号：62〜72からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号：62〜72と比較した場合にアミノ酸置換、欠失、もしくは付加1、2、3、4もしくは5個を有するアミノ酸配列を含むVL CDR2領域；（f）配列番号：73〜83からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号：73〜83と比較した場合にアミノ酸置換、欠失、もしくは付加1、2、3、4もしくは5個を有するアミノ酸配列を含むVL CDR3領域、を含む、重鎖可変領域を含む、単離された抗IP-10モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【０１０７】
本発明の好ましい置換変異は、10A12 mAbのVH鎖のCDR1内の32位でのシステイン残基の代わりにセリン残基を用いることである。10A12のこの改変型を本明細書において10A12Sと呼ぶ。10A12のVH鎖のアミノ酸配列を配列番号：44に示し、10A12SのVH鎖のアミノ酸配列を配列番号：45に示す。
【０１０８】
本発明の操作された抗体には、例えば抗体の特性を改善するために、VHおよび／またはVL内のフレームワーク残基に対して改変を行った抗体が含まれる。典型的に、そのようなフレームワーク改変は、抗体の免疫原性を減少させるように行われる。例えば、一つのアプローチは、対応する生殖系列配列に対して一つまたは複数のフレームワーク残基を「復帰突然変異」させることである。より詳しく述べると、体細胞変異を受けた抗体は、そこから抗体が由来する生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基を含んでもよい。そのような残基は、抗体のフレームワーク配列を、抗体が由来する生殖系列配列と比較することによって同定することができる。例えば、6A5の場合、VHのアミノ酸残基2位（FR1内）はメチオニンであるが、対応するVH 3-33生殖系列配列におけるこの残基はバリンである（図12を参照されたい）。フレームワーク領域の配列をその生殖系列の形状に戻すために、体細胞変異を、例えば部位特異的変異誘発またはPCR媒介変異誘発によって生殖系列配列に「復帰突然変異」させることができる（例えば、6A5のVHの残基2をメチオニンからバリンに「復帰突然変異」させることができる）。そのような「復帰変異」抗体も同様に、本発明によって含まれると意図される。
【０１０９】
もう一つのタイプのフレームワーク改変は、T細胞エピトープを除去して、それによって抗体の起こりうる免疫原性をそれによって減少させるために、フレームワーク領域内または一つまたは複数のCDR領域内の一つまたは複数の残基を変異させることを含む。このアプローチはまた、Carrらによる米国特許公開第20030153043号にさらに詳細に記述されている。
【０１１０】
フレームワークまたはCDR領域内で行う改変の他にまたはその代わりに、本発明の抗体は、典型的に、血清中半減期、補体固定、Fc受容体結合、および／または抗原依存的細胞障害性のような抗体の一つまたは複数の機能的特性を変化させるために、Fc領域内での改変を含むように操作してもよい。さらに、本発明の抗体は化学的に改変してもよく（例えば、一つまたは複数の化学部分を抗体に結合させることができる）またはそのグリコシル化を変化させるように、再度抗体の一つまたは複数の機能的特性を変化させるように改変してもよい。これらの態様のそれぞれを下記にさらに詳細に記述する。Fc領域における残基の番号付けは、KabatのEUインデックスの通りである。
【０１１１】
一つの態様において、CH1のヒンジ領域は、ヒンジ領域におけるシステイン残基の数が変化するように、例えば増加または減少するように改変される。このアプローチはBodmerらの米国特許第5,677,425号においてさらに記述される。CH1のヒンジ領域におけるシステイン残基の数は、例えば軽鎖および重鎖の集合を容易にするように、または抗体の安定性を増加もしくは減少させるように改変される。
【０１１２】
もう一つの態様において、抗体のFcヒンジ領域は、抗体の生物学的半減期を減少させるように変異させる。より詳しく述べると、抗体が天然のFc-ヒンジドメインSpA結合と比較してブドウ球菌プロテインA（SpA）結合の障害を有するように、一つまたは複数のアミノ酸変異をFc-ヒンジ断片のCH2-CH3ドメイン界面領域に導入する。このアプローチは、Wardらによる米国特許第6,165,745号においてさらに詳細に記述される。
【０１１３】
もう一つの態様において、抗体は、その生物学的半減期を増加させるように改変される。様々なアプローチが可能である。例えば、Wardらに対する米国特許第6,277,375号に記述されるように、一つまたは複数の以下の変異を導入することができる。T252L、T254S、T256F。または、生物学的半減期を増加させるために、Prestaらによって米国特許第5,869,046号および第6,121,022号に記述されるように、IgGのFc領域のCH2ドメインの二つのループから得たサルベージ受容体結合エピトープを含むように、抗体をCH1またはCL領域内で変化させることができる。
【０１１４】
さらに他の態様において、Fc領域は、抗体のエフェクター機能を変化させるために少なくとも一つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基に置換することによって変化させる。例えば、アミノ酸残基234、235、236、237、297、318、320、および322から選択される一つまたは複数のアミノ酸を、抗体がエフェクターリガンドに対して変化した親和性を有するが、親抗体の抗原結合能を保持するように、異なるアミノ酸残基に置換することができる。それに対する親和性が変化するエフェクターリガンドは、例えばFc受容体または補体のC1成分となりうる。このアプローチは、いずれもWinterらによる米国特許第5,624,821号および第5,648,260号にさらに詳しく記述されている。
【０１１５】
もう一つの例において、抗体が、C1q結合の変化、および／または補体依存的細胞障害性（CDC）の減少または消失を示すように、アミノ酸残基329、331、および322から選択される一つまたは複数のアミノ酸を異なるアミノ酸残基に置換することができる。このアプローチは、Idusogieらによる米国特許第6,194,551号にさらに詳しく記述されている。
【０１１６】
もう一つの例において、アミノ酸231および239位内での一つまたは複数のアミノ酸残基を変化させて、それによって抗体の補体固定能を変化させる。このアプローチは、BodmerらによるPCT出願国際公開公報第94/29351号に詳しく記述されている。
【０１１７】
さらにもう一つの例において、Fc領域は、以下の位置：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438、または439での一つまたは複数のアミノ酸を改変することによって、抗体の抗体依存的細胞障害性（ADCC）の媒介能を増加させるように、および／またはFcγ受容体に対する抗体の親和性を増加させるように、改変される。このアプローチは、PrestaによるPCT出願国際公開公報第00/42072号に詳しく記述されている。その上、FcγRI、FcγRII、FcγR IIIおよびFcRnに関するヒトIgG1上の結合部位がマッピングされており、結合の改善を示す変種が記述されている（Shields, R.L.ら(2001),J. Biol. Chem. 276:6591〜6604を参照されたい）。256、290、298、333、334、および339位での特異的変異は、FcγRIIIに対する結合を改善することが示された。さらに、以下の複合変異体は、FcγRIII結合を改善することが示された：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224AおよびS298A/E333A/K334A。
【０１１８】
なおもう一つの態様において、抗体のグリコシル化が改変される。例えば、無グリコシル化抗体を作製することができる（すなわち、抗体はグリコシル化を欠損する）。グリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増加させるように変化させることができる。そのような糖質の改変は、例えば抗体配列内の一つまたは複数のグリコシル化部位を変化させることによって行うことができる。例えば、一つまたは複数の可変領域フレームワークグリコシル化部位を消失させて、それによってその部位でのグリコシル化を消失させる一つまたは複数のアミノ酸置換を行うことができる。そのような無グリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増加させる可能性がある。そのようなアプローチは、Coらの米国特許第5,714,350号および第6,350,861号にさらに詳細に記述されている。
【０１１９】
さらにもしくはまたは、フコシル残基の減少量を有する低フコシル化抗体または二等分GlcNac構造の増加を有する抗体のような、変化したタイプのグリコシル化を有する抗体を作製することができる。そのような変化したグリコシル化パターンは、抗体のADCC能を増加させることが証明されている。そのような糖質改変は、例えば変化したグリコシル化機構を有する宿主細胞において抗体を発現させることによって行うことができる。変化したグリコシル化機構を有する細胞は当技術分野で記述されており、本発明の組換え型抗体を発現させて、それによって変化したグリコシル化を有する抗体を産生するための宿主細胞として用いることができる。例えば、Hanaiらによる欧州特許第1,176,195号は、そのような細胞株において発現された抗体が低フコシル化を示すように、フコシルトランスフェラーゼをコードする機能的に破壊されたFUT8遺伝子を有する細胞株を記述している。PrestaによるPCT出願国際公開公報第03/035835号は、Asn(297)結合炭化水素にフコースを結合させる能力が低下した変種CHO細胞株であるLec 13細胞について記述しており、同様にその宿主細胞において発現された抗体の低フコシル化が得られたことを記述している（同様に、Shields, R.Lら(2002),J. Biol. Chem.277:26733〜26740を参照されたい）。UmanaらによるPCT出願国際公開公報第99/54342号は、操作された細胞株において発現された抗体が、二等分GlcNac構造の増加を示し、それによって抗体のADCC活性の増加が起こる（同様に、Umanaら(1999)Nat. Biotech. 17：176〜180を参照されたい）ように、糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β(1,4)-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII（GnT III））を発現させるように操作された細胞株を記述している。
【０１２０】
本発明によって企図される本明細書に記述の抗体のもう一つの改変は、PEG化である。抗体は例えば、抗体の生物学的（例えば、血清）半減期を増加させるためにPEG化することができる。抗体をPEG化するために、抗体またはその断片を典型的に、一つまたは複数のPEG基が抗体または抗体断片に結合するようになる条件で、PEGの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体のようなポリエチレングリコール（PEG）と反応させる。好ましくは、PEG化は、反応性PEG分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応によって行われる。本明細書において用いられるように、「ポリエチレングリコール」という用語は、モノ(C1-C10)アルコキシまたはアリールオキシ-ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール-マレイミドのような、他のタンパク質を誘導体化するために用いられているPEGの任意の型を含むと意図される。特定の態様において、PEG化される抗体は、無グリコシル化抗体である。タンパク質をPEG化する方法は当技術分野で公知であり、本発明の抗体に適用することができる。例えば、Nishimuraらによる欧州特許第0 154 316号およびIshikawaらによる欧州特許第0 401 384号を参照されたい。
【０１２１】
抗体を操作する方法
先に記述したように、本明細書に開示のVHおよびVL配列を有する抗IP-10抗体を用いて、VHおよび／またはVL配列、またはそれに結合した定常領域を改変することによって、新規抗IP-10抗体を作製することができる。このように、本発明のもう一つの局面において、本発明の抗IP-10抗体、例えば1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12、10A12Sまたは13C4の構造的特徴を用いて、ヒトIP-10およびアカゲザルIP-10に結合するが、マウスIP-10、ヒトMIG、またはヒトITACには結合しない、ならびに同様にIP-10の一つまたは複数の機能的特性（例えば、CXCR3結合、カルシウム流入、走化性）を阻害するような、少なくとも一つの機能的特性を保持する構造的に関連する抗IP-10抗体を作製する。例えば、1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12、10A12Sもしくは13C4またはその変異の一つもしくは複数のCDR領域を、組換えによって公知のフレームワーク領域および／または他のCDRと組み合わせて、先に記述するように、さらなる組換えによって産生された本発明の抗IP-10抗体を作製することができる。他のタイプの改変には、先の章で記述された改変が含まれる。操作された方法の開始材料は、本明細書において提供したVHおよび／またはVL配列の一つまたは複数または一つまたは複数のそのCDR領域である。操作された抗体を作製するために、本明細書において提供されたVHおよび／またはVL配列の一つもしくは複数、または一つもしくは複数のそのCDR領域を有する抗体を実際に調製する必要はない。むしろ、配列に含まれる情報を開始材料として用いて、当初の配列に由来する「第二世代」の配列を作製した後、「第二世代」の配列を調製してタンパク質として発現させる。
【０１２２】
したがって、もう一つの態様において、本発明は、以下を含む、抗IP-10抗体を調製する方法を提供する：
（a）（i）配列番号：1〜12からなる群より選択されるCDR1配列、配列番号：13〜23からなる群より選択されるCDR2配列、および／または配列番号：24〜34からなる群より選択されるCDR3配列を含む、重鎖可変領域抗体配列；ならびに（ii）配列番号：51〜61からなる群より選択されるCDR1配列、配列番号：62〜72からなる群より選択されるCDR2配列、および／または配列番号：73〜83からなる群より選択されるCDR3配列、を含む軽鎖可変領域抗体配列、を提供する段階；
（b）重鎖可変領域抗体配列および／または軽鎖可変領域抗体配列内の少なくとも一つのアミノ酸残基を変化させて、少なくとも一つの変化した抗体配列を作製する段階；および
（c）変化した抗体配列をタンパク質として発現させる段階。
【０１２３】
標準的な分子生物学技術を用いて変化した抗体配列を調製および発現させることができる。
【０１２４】
好ましくは、変化した抗体配列によってコードされる抗体は、機能的特性が以下を含むがこれらに限定されない、本明細書に記述の抗IP-10抗体の機能的特性の一つ、一部、または全てを保持する抗体である：
（i）ヒトIP-10に特異的に結合すること；
（ii）CXCR3に対するIP-10の結合を阻害すること；
（iii）IP-10誘導性のカルシウムの流入を阻害すること；
（iv）IP-10誘導性の細胞の遊走を阻害すること；
（v）アカゲザルIP-10と交叉反応すること；
（vi）マウスIP-10と交叉反応しないこと；
（vii）ヒトMIGと交叉反応しないこと；
（viii）ヒトITACと交叉反応しないこと。
変化した抗体は、上記の（i）〜（viii）に記載の機能的特性の一つもしくは複数、二つもしくはそれ以上、三つもしくはそれ以上、四つもしくはそれ以上、五つもしくはそれ以上、六つもしくはそれ以上、または七つもしくはそれ以上を示してもよい。
【０１２５】
改変抗体の機能的特性は、実施例に記載されるような、当技術分野で利用可能なおよび／または本明細書に記述の標準的なアッセイ法（例えば、ELISA、カルシウム流入アッセイ法、走化性アッセイ法）を用いて評価することができる。
【０１２６】
本発明の抗体を操作する方法の特定の態様において、抗IP-10抗体コード配列の全てまたは一部に沿って変異を無作為または選択的に導入することができ、得られた抗IP-10抗体を、本明細書に記述の結合活性および／または他の機能的特性に関してスクリーニングすることができる。変異法は当技術分野において記述されている。例えば、ShortによるPCT出願国際公開公報第02/092780号は、飽和変異誘発、合成ライゲーションアセンブリ、またはその組み合わせを用いて抗体の変異を作製してスクリーニングする方法を記述している。または、LazarらによるPCT出願国際公開公報第03/074679号は、抗体の物理化学特性を最適にするために、コンピュータースクリーニング法を用いる方法を記述している。
【０１２７】
本発明の抗体をコードする核酸分子
本発明のもう一つの局面は、本発明の抗体をコードする核酸分子に関する。核酸は全細胞、細胞溶解物、または部分精製もしくは実質的に精製型で存在してもよい。核酸は、アルカリ／SDS処置、CsClバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当技術分野で周知の他の技術を含む標準的な技術によって、他の細胞成分または他の混入物から精製されている場合に「単離されている」または「実質的に純粋にされている」。例えば、F. Ausubelら編(1987)「Current Protocols in Molecular Biology.」,Greene Publishing and Wiley Interscience, New Yorkを参照されたい。本発明の核酸は、例えば、DNAまたはRNAとなりえて、イントロン配列を含んでも含まなくてもよい。好ましい態様において、核酸はcDNA分子である。
【０１２８】
本発明の核酸は、標準的な分子生物学技術を用いて得ることができる。ハイブリドーマ（例えば、下記にさらに記述するように、ヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスから調製したハイブリドーマ）によって発現される抗体に関して、ハイブリドーマによって作製される抗体の軽鎖および重鎖をコードするcDNAは、標準的なPCR増幅またはcDNAクローニング技術によって得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリ（例えば、ファージディスプレイ技術を用いて）から得られた抗体の場合、抗体をコードする核酸をライブラリから回収することができる。
【０１２９】
本発明の好ましい核酸分子は、1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12、または13C4モノクローナル抗体のVHおよびVL配列をコードする分子である。1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12、および13C4のVH配列をコードするDNA配列はそれぞれ、配列番号：99〜109に示される。1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12、および13C4のVL配列をコードするDNA配列はそれぞれ、配列番号：110〜120に示される。
【０１３０】
VHおよびVLセグメントをコードするDNA断片が得られた後、例えば、可変領域遺伝子を完全長の抗体鎖遺伝子、Fab断片遺伝子、またはscFv遺伝子に変換するために、これらのDNA断片を標準的な組換えDNA技術によってさらに操作することができる。これらの操作において、VLまたはVHコードDNA断片を、抗体の定常領域または柔軟なリンカーのようなもう一つのタンパク質をコードするもう一つのDNA断片に機能的に結合させる。この状況において用いられるように、「機能的に結合した」という用語は、二つのDNA断片によってコードされるアミノ酸配列がなおもインフレームに留まるように二つのDNA断片を結合させることを意味すると意図される。
【０１３１】
VH領域をコードする単離DNAは、VHコードDNAを、重鎖定常領域（CH1、CH2、およびCH3）をコードするもう一つのDNA分子に機能的に連結させることによって、完全長の重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野で公知であり（例えば、Kabat, E.A.ら(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版、米国保健社会福祉省、NIH Publication No. 91〜3242）、これらの領域を含むDNA断片は、標準的なPCR増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM、またはIgD定常領域となりうるが、最も好ましくはIgG1またはIgG4定常領域である。Fab断片重鎖遺伝子に関して、VH-コードDNAを重鎖CH1定常領域のみをコードするもう一つのDNA分子に機能的に結合させることができる。
【０１３２】
VL領域をコードする単離されたDNAは、VLコードDNAを、軽鎖定常領域CLをコードするもう一つのDNA分子に機能的に結合させることによって、完全長の軽鎖遺伝子に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で公知であり（例えば、Kabat, E.A.ら(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版、米国保健社会福祉省、NIH Publication No. 91〜3242を参照されたい）、これらの領域を含むDNA断片は標準的なPCR増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域はκまたはλ定常領域となりうるが、最も好ましくはκ定常領域である。
【０１３３】
scFv遺伝子を作製するために、VHおよびVL配列が、VHおよびVL領域が柔軟なリンカーによって結合した連続した一本鎖タンパク質として発現されうるように、VHおよびVLコードDNA断片を、柔軟なリンカー、例えばアミノ酸配列(Gly4-Ser)3をコードするもう一つの断片に機能的に結合させる（例えば、Birdら(1988)Science 242:423〜426；Hustonら(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879〜5883；McCaffertyら(1990)Nature 348:552〜554を参照されたい）。
【０１３４】
本発明のモノクローナル抗体の産生
本発明のモノクローナル抗体（mAb）は、通常のモノクローナル抗体の方法論、例えばKohler and Milstein(1975)Nature 256:495の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む、多様な技術によって産生することができる。体細胞ハイブリダイゼーション技法は原則として好ましいが、モノクローナル抗体を産生するための他の技術、例えばBリンパ球のウイルスまたは腫瘍遺伝子形質転換を用いることができる。
【０１３５】
ハイブリドーマを調製するための好ましい動物系は、マウス系である。マウスにおけるハイブリドーマ産生は非常によく確立された技法である。免疫プロトコールおよび融合のために免疫した脾臓を単離する技術は、当技術分野で公知である。融合パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）および融合技法も同様に公知である。
【０１３６】
本発明のキメラまたはヒト化抗体は、上記のように調製したマウスモノクローナル抗体の配列に基づいて調製することができる。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするDNAは、対象マウスハイブリドーマから得ることができ、標準的な分子生物学技術を用いて、非マウス（例えば、ヒト）免疫グロブリン配列を含むように操作することができる。例えば、キメラ抗体を作製するために、当技術分野で公知の方法を用いてマウス可変領域をヒト定常領域に結合させることができる（例えば、Cabillyらに対する米国特許第4,816,567号を参照されたい）。ヒト化抗体を作製するために、当技術分野で公知の方法を用いてマウスCDR領域をヒトフレームワークに挿入することができる（例えば、Winterらの米国特許第5,225,539号、およびQueenらの米国特許第5,530,101号、第5,585,089号、第5,693,762号、および第6,180,370号を参照されたい）。
【０１３７】
好ましい態様において、本発明の抗体はヒトモノクローナル抗体である。IP-10に対するそのようなヒトモノクローナル抗体は、マウス系よりむしろヒト免疫系の一部を有するトランスジェニックまたはトランスクロモゾームマウスを用いて作製することができる。これらのトランスジェニックおよびトランスクロモゾームマウスには、本明細書においてHuMabマウスおよびKMマウスとそれぞれ呼ばれるマウスが含まれ、これらを本明細書において集合的に「ヒトIgマウス」と呼ぶ。
【０１３８】
HuMabマウス（登録商標）（Medarex, Inc.）は、内因性のμおよびκ鎖座を不活化する標的化変異と共に非再配列ヒト重鎖（μおよびγ）およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ座を含む（例えば、Lonbergら(1994)Nature 368(6474):856〜859）。したがって、マウスは、マウスIgMまたはκの発現の減少を示し、免疫に反応して、導入されたヒト重鎖および軽鎖トランスジーンがクラススイッチおよび体細胞変異を受けて、高親和性ヒトIgGκモノクローナル抗体を産生する（Lonberg, N.ら(1994)、上記；Lonberg, N.(1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113:49〜101における論評；Lonberg, N. and Huszar, D.(1995)Intern. Rev. Immunol. 13:65〜93、およびHarding, F. and Lonberg, N.(1995)Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536〜546）。HuMabマウスの調製および使用、ならびにそのようなマウスが有するゲノム改変は、その全ての内容物が全体として特に参照として本明細書に組み入れられる、Taylor, L.ら(1992)Nucleic Acids Research 20:6287〜6295；Chen, J.ら(1993)International Immunology 5:647〜656；Tuaillonら(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720〜3724；Choiら(1993)Nature Genetics 4:117〜123；Chen, J.ら(1993)EMBO J. 12:821〜830；Tuaillonら(1994)J. Immunol. 152:2912〜2920；Taylor, L.ら(1994)International Immunology 6:579〜591；およびFishwild, D.ら(1996)Nature Biotechnology 14:845〜851に詳しく記述されている。さらに、全てLonbergおよびKayに対する米国特許第5,545,806号；第5,569,825号；第5,625,126号；第5,633,425号；第5,789,650号；第5,877,397号；第5,661,016号；第5,814,318号；第5,874,299号；および第5,770,429号；Suraniらに対する米国特許第5,545,807号；全てLonbergおよびKayに対するPCT出願国際公開公報第92/03918号；国際公開公報第93/12227号、国際公開公報第94/25585号、国際公開公報第97/13852号、国際公開公報第98/24884号および国際公開公報第99/45962号；ならびにKormanらに対するPCT出願国際公開公報第01/14424号を参照されたい。
【０１３９】
もう一つの態様において、本発明のヒト抗体は、ヒト重鎖トランスジーンとヒト軽鎖トランスクロモゾームとを有するマウスのような、トランスジーンおよびトランスクロモゾーム上にヒト免疫グロブリン配列を有するマウスを用いて作製することができる。本明細書において「KMマウス」と呼ばれるそのようなマウスは、Ishidaらに対するPCT出願国際公開公報第02/43478号において詳細に記述されている。
【０１４０】
なおさらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するもう一つのトランスジェニック動物系は、当技術分野で入手可能であり、本発明の抗IP-10抗体を作製するために用いることができる。例えば、Xenomouse（Abgenix, Inc.）と呼ばれるもう一つのトランスジェニックシステムを用いることができる；そのようなマウスは例えば、Kucherlapatiらに対する米国特許第5,939,598号；第6,075,181号；第6,114,598号；第6,150,584号；および第6,162,963号に記述されている。
【０１４１】
その上、代わりのトランスクロモゾーム動物システムが、当技術分野で入手可能であり、本発明の抗IP-10抗体を作製するために用いることができる。例えば、「TCマウス」と呼ばれるヒト重鎖トランスクロモゾームおよびヒト軽鎖トランスクロモゾームの双方を有するマウスを用いることができる；そのようなマウスはTomizukaら(2000)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722〜727に記述されている。さらに、ヒト重鎖および軽鎖トランスクロモゾームを有するウシが当技術分野において記述されており（Kuroiwaら(2002)Nature Biotechnology 20:889〜894）、本発明の抗IP-10抗体を作製するために用いることができる。
【０１４２】
本発明のヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリをスクリーニングするために、ファージディスプレイ法を用いて調製することができる。ヒト抗体を単離するためのそのようなファージディスプレイ法は、当技術分野において確立されている。例えば、Ladnerらの米国特許第5,223,409号第5,403,484号、および第5,571,698号；Dowerらの米国特許第5,427,908号、および第5,580,717号；MaCaffertyらの米国特許第5,969,108号および第6,172,197号、ならびにGriffithsらの米国特許第5,885,793号、第6,521,404号、第6,544,731号、第6,555,313号、第6,582,915号、および第6,593,081号を参照されたい。
【０１４３】
本発明のヒトモノクローナル抗体はまた、免疫時にヒト抗体反応が産生されうるように、SCIDマウスを用いて調製することができる。そのようなマウスは、例えばWilsonらの米国特許第5,476,996号および第5,698,767号に記述されている。
【０１４４】
ヒトIgマウスの免疫
ヒトIgマウスを用いて本発明のヒト抗体を産生する場合、Lonberg, N.ら(1994)Nature 368(6474):856〜859；Fishwild, D.ら(1996)Nature Biotechnology 14:845〜851；およびPCT出願国際公開公報第98/24884号および国際公開公報第01/14424号に記述されるように、IP-10抗原および／または組換え型IP-10、またはIP-10融合タンパク質の精製または濃縮調製物によって、そのようなマウスを免疫することができる。好ましくは、マウスは初回注射時6〜16週齢であろう。例えば、IP-10抗原の精製または組換え型調製物（5〜50 μg）を用いてヒトIgマウスを腹腔内注射によって免疫することができる。
【０１４５】
IP-10に対する完全なヒトモノクローナル抗体を作製するための詳細な技法を、下記の実施例1に記述する。様々な抗原による経験の蓄積から、抗原をフロイントの完全アジュバントと共に最初に腹腔内注射によって免疫した後、2週間毎に抗原をフロイントの不完全アジュバントと共に注射した場合に（全体で6回まで）トランスジェニックマウスが反応することが示されている。しかし、フロイント以外のアジュバントも同様に有効であることが判明している。さらに、アジュバントの非存在下では細胞全体が非常に免疫原性であることが判明している。免疫応答は、眼窩後方採血によって得られた血漿試料によって免疫プロトコールの経過のあいだモニターすることができる。血漿をELISA（下記）によってスクリーニングすることができ、抗IP-10ヒト免疫グロブリンの十分な力価を有するマウスを融合のために用いることができる。屠殺および脾臓摘出の3日前に、マウスに抗原を静脈内に追加免疫することができる。各免疫に関して融合2〜3回を行う必要があると予想される。典型的に、マウス6〜24匹を各抗原によって免疫する。通常、HCo7およびHCo12系統の双方を用いる。さらに、HCo7およびHCo12トランスジーンの双方を、二つの異なる重鎖トランスジーン（HCo7/HCo12）を有するマウス1匹に交配させることができる。
【０１４６】
本発明のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製
本発明のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製するために、免疫したマウスから脾細胞および／またはリンパ節細胞を単離して、マウス骨髄腫細胞株のような適当な不死化細胞株に融合させることができる。得られたハイブリドーマを抗原特異的抗体の産生に関してスクリーニングすることができる。例えば、免疫したマウスの脾細胞リンパ球の単細胞浮遊液を、50％PEGによって、1/6の数のP3X63-Ag8.653非分泌マウス骨髄腫細胞（ATCC、CRL 1580）に融合することができる。平底マイクロタイタープレートにおいて細胞を約2×105個で播種した後、20％胎児クローン血清、18％「653」条件培地、5％origin（IGEN）、4 mM L-グルタミン、1 mMピルビン酸ナトリウム、5 mM HEPES、0.055 mM 2-メルカプトエタノール、50単位/mlペニシリン、50 mg/mlストレプトマイシン、50 mg/mlゲンタマイシン、1×HAT（Sigma；HATを融合後24時間で加える）を含む選択培地において2週間インキュベートした。約2週間後、HATをHTに置換した培地において細胞を培養することができる。次に、個々のウェルをヒトモノクローナル抗体IgMおよびIgG抗体に関してELISAによってスクリーニングすることができる。ハイブリドーマの十分な増殖が起こった後、培地を通常10〜14日後に観察することができる。抗体を分泌するハイブリドーマを再度播種して、再度スクリーニングし、ヒトIgGに関してなおも陽性であれば、モノクローナル抗体を限界希釈によって少なくとも2回サブクローニングすることができる。次に、安定なサブクローンをインビトロで培養して、特徴付けのために組織培養培地において抗体の少量を産生させることができる。
【０１４７】
ヒトモノクローナル抗体を精製するために、選択したハイブリドーマを、モノクローナル抗体精製のために、2 Lスピナーフラスコにおいて増殖させることができる。上清を濾過して濃縮してから、プロテインA-セファロース（Pharmacia, Piscataway, N.J.）によるアフィニティクロマトグラフィーを行うことができる。溶出したIgGをゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィーによってチェックして、純度を確認することができる。緩衝液をPBSに交換して、濃度を吸光係数1.43を用いてOD280によって決定することができる。モノクローナル抗体は少量に分けて、-80℃で保存することができる。
【０１４８】
本発明のモノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの作製
本発明の抗体はまた、例えば、当技術分野において周知である（例えば、Morrison, S.(1985)Science 229:1202）組換えDNA技術および遺伝子トランスフェクション法の組み合わせを用いて、宿主細胞トランスフェクトーマにおいて産生することができる。
【０１４９】
例えば、抗体またはその抗体断片を発現させるために、部分的または完全長の軽鎖および重鎖をコードするDNAを、標準的な分子生物学技術（例えば、対象抗体を発現するハイブリドーマを用いるPCR増幅またはcDNAクローニング）によって得ることができ、遺伝子が転写および翻訳制御配列に機能的に結合するように発現ベクターにDNAを挿入することができる。この状況において、「機能的に結合した」という用語は、ベクター内の転写および翻訳制御配列が、抗体遺伝子の転写および翻訳を調節するというその意図される機能を示すように、抗体遺伝子がベクターにライゲーションされていることを意味すると意図される。発現ベクターおよび発現制御配列は、用いる発現宿主細胞と適合性であるように選択される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子を、異なるベクターに挿入することができ、またはより典型的に双方の遺伝子を同じ発現ベクターに挿入する。抗体遺伝子は、標準的な方法によって発現ベクターに挿入する（例えば、抗体遺伝子断片およびベクター上の相補的制限部位のライゲーション、または制限部位が存在しない場合には平滑末端ライゲーション）。本明細書に記述の抗体の軽鎖および重鎖可変領域を用いて、VHセグメントがベクター内でCHセグメントに機能的に結合し、VLセグメントがベクター内でCLセグメントに機能的に結合するように、所望のアイソタイプの重鎖定常および軽鎖定常領域を既にコードする発現ベクターにそれらを挿入することによって、任意の抗体アイソタイプの完全長の抗体遺伝子を作製することができる。さらに、もしくはまたは、組換え型発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで結合するように、抗体鎖遺伝子をベクターにクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド）となりうる。
【０１５０】
抗体鎖遺伝子の他に、本発明の組換え型発現ベクターは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を有する。「調節配列」という用語には、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御するプロモーター、エンハンサー、および他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）が含まれると意図される。そのような調節配列は、例えばGoeddel（Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Acadamic Press, San Diego, CA(1990)）に記述される。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、望ましいタンパク質の発現レベル等のような要因に依存する可能性があることは、当業者によって認識されるであろう。哺乳類宿主細胞発現にとって好ましい調節配列には、サイトメガロウイルス（CMV）、シミアンウイルス40（SV40）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（AdMLP）およびポリオーマ）に由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーのような、哺乳類細胞において高レベルのタンパク質発現を指示するウイルスエレメントが含まれる。または、ユビキチンプロモーターまたはβ-グロビンプロモーターのような、非ウイルス調節配列を用いてもよい。なおさらに、SV40初期プロモーターからの配列および1型ヒトT細胞白血病ウイルスの長末端反復を含む、SRαプロモーター系のような異なる起源からの配列からなる調節エレメント（Takebe, Y.ら(1988)Mol. Cell Biol. 8:466〜472）。
【０１５１】
抗体鎖遺伝子および調節配列の他に、本発明の組換え型発現ベクターは、宿主細胞においてベクターの複製を調節する配列（例えば、複製開始点）および選択マーカー遺伝子のようなさらなる配列を有してもよい。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入される宿主細胞の選択を容易にする（例えば、全てAxelらによる米国特許第4,399,216号、第4,634,665号、および第5,179,017号を参照されたい）。例えば、典型的に選択マーカー遺伝子は、G418、ヒグロマイシン、またはメソトレキセートのような薬物に対する抵抗性を、ベクターが導入されている宿主細胞に付与する。好ましい選択マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）遺伝子（メソトレキセート選択／増幅によってdhfr-宿主細胞において用いるため）およびneo遺伝子（G418選択のため）が含まれる。
【０１５２】
軽鎖および重鎖を発現させるために、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターを標準的な技術によって宿主細胞にトランスフェクトする。様々な型の「トランスフェクション」は、外因性のDNAを原核または真核宿主細胞に導入するために一般的に用いられる広範な技術、例えば、電気穿孔、燐酸カルシウム沈殿、DEAEデキストラントランスフェクション等を含むと意図される。原核または真核宿主細胞のいずれかにおいて本発明の抗体を発現させることは理論的に可能であるが、真核細胞および最も好ましくは哺乳類宿主細胞における抗体の発現は、そのような真核細胞および特に哺乳類細胞が、適切に構築された免疫学的に活性な抗体を集合および分泌させる可能性が原核細胞より高いことから、最も好ましい。抗体遺伝子の原核細胞発現は、高い収率で活性な抗体を産生するためには無効であることが報告されている（Boss, M.A. and Wood, C.R.(1985)Immunology Today 6:12〜13）。
【０１５３】
本発明の組換え型抗体を発現させるための好ましい哺乳類宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（CHO細胞）（例えばR.J, Kaufman and P.A. Sharp(1982)Mol. Biol.159:601〜621において記述されるDHFR選択マーカーと共に用いられる、Urlaub and Chasin(1980)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216〜4220に記述されるdhfr-CHO細胞を含む）、NSO骨髄腫細胞、COS細胞、およびSP2細胞が含まれる。特に、NSO骨髄腫細胞に関して用いるために、もう一つの好ましい発現系は国際公開公報第87/04462号、国際公開公報第89/01036号、および欧州特許第338,841号に開示のGS遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードする組換え型発現ベクターを哺乳類宿主細胞に導入する場合、宿主細胞において抗体を発現させるために、またはより好ましくは宿主細胞が増殖した培養培地に抗体を分泌させるために十分な期間、宿主細胞を培養することによって抗体が産生される。抗体は、標準的なタンパク質精製法を用いて培養培地から回収することができる。
【０１５４】
抗原に対する抗体結合の特徴付け
本発明の抗体は、例えば標準的なELISAによってIP-10に対する結合に関して試験することができる。簡単に説明すると、マイクロタイタープレートを0.25μg/ml精製IP-10のPBS溶液によってコーティングした後、5％ウシ血清アルブミンのPBS溶液によってブロックした。抗体の希釈液（例えば、IP-10免疫マウスからの血漿の希釈液）を各ウェルに加えて、37℃で1〜2時間インキュベートした。プレートをPBS/Tweenによって洗浄した後、アルカリホスファターゼに結合させた二次試薬（例えば、ヒト抗体に関して、ヤギ抗ヒトIgG Fc特異的ポリクローナル試薬）と共に37℃で1時間インキュベートした。洗浄後、プレートをpNPP基質（1 mg/ml）によって展開させて、OD 450-650で分析した。好ましくは、最高の力価を示すマウスを融合のために用いるであろう。
【０１５５】
上記のELISA法はまた、IP-10免疫原との反応陽性を示すハイブリドーマに関してスクリーニングするために用いることができる。IP-10に対して高い結合力で結合するハイブリドーマをサブクローニングしてさらに特徴を調べる。親細胞の反応性を保持する（ELISAによる）各ハイブリドーマからのクローン1個を-140℃で保存されるバイアル5〜10個の細胞バンクを作製するため、および抗体を精製するために選択することができる。
【０１５６】
抗IP-10抗体を精製するために、選択したハイブリドーマをモノクローナル抗体精製のために2 Lスピナーフラスコにおいて増殖させることができる。上清を濾過して濃縮してから、プロテインA-セファロースによるアフィニティクロマトグラフィー（Pharmacia, Piscataway, NJ）を行うことができる。溶出したIgGは、純度を確保するために、ゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィーによってチェックすることができる。緩衝液をPBSに交換して、濃度を吸光係数1.43を用いてOD280によって決定することができる。モノクローナル抗体を少量に分けて、-80℃で保存することができる。
【０１５７】
選択された抗IP-10モノクローナル抗体が独自のエピトープに結合する能力を決定するために、各抗体を市販の試薬を用いてビオチン結合することができる（Pierce, Rockford, IL）。上記のように、IP-10コーティングELISAプレートを用いて、非標識モノクローナル抗体およびビオチン化モノクローナル抗体を用いる競合試験を行うことができる。ビオチン化mAb結合は、ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼプローブによって検出することができる。
【０１５８】
精製抗体のアイソタイプを決定するために、特定のアイソタイプの抗体に対して特異的な試薬を用いて、アイソタイプELISAを行うことができる。例えば、ヒトモノクローナル抗体のアイソタイプを決定するために、マイクロタイタープレートのウェルを1μg/ml抗ヒト免疫グロブリンによって4℃で一晩コーティングした。1％BSAによってブロックした後、プレートを1μg/mlまたはそれ未満の試験モノクローナル抗体または精製アイソタイプ対照に室温で1〜2時間反応させた。次に、ウェルをヒトIgGまたはヒトIgM特異的アルカリホスファターゼ結合プローブに反応させることができる。プレートを上記のように展開して分析する。
【０１５９】
抗IP-10ヒトIgGは、ウェスタンブロッティングによってIP-10抗原に対する反応性に関してさらに試験することができる。簡単に説明すると、IP-10を調製して、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に供することができる。電気泳動後、分離した抗原をニトロセルロースメンブレンに転写して、10％仔ウシ胎児血清によってブロックし、試験すべきモノクローナル抗体によってプロービングした。ヒトIgG結合は、抗ヒトIgGアルカリホスファターゼを用いて検出し、BCIP/NBY基質タブレット（Sigma Chem., St. Louis, Mo）によって展開することができる。
【０１６０】
免疫結合体
もう一つの局面において、本発明は、細胞毒素、薬物（例えば、免疫抑制剤）または放射性毒素のような治療部分に結合した抗IP-10抗体またはその断片を特徴とする。そのような結合体は、本明細書において「免疫結合体」と呼ばれる。一つまたは複数の細胞毒素を含む免疫結合体は「免疫毒素」と呼ばれる。細胞毒素または細胞障害物質には、細胞にとって有害である（例えば殺す）任意の物質が含まれる。例にはタキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミスラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ならびにピューロマイシンおよびその類似体または相同体が含まれる。治療物質にはまた、例えば抗代謝剤（例えば、メソトレキセート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（BSNU）、およびロムスチン（CCNU）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、およびシス-ジクロロジアミンプラチナ（II）（DDP）（シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（これまでのダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（これまでのアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミスラマイシン、およびアンスラマイシン（AMC））、および抗分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が含まれる。
【０１６１】
本発明の抗体に結合することができる他の好ましい治療的細胞毒素の例には、デュオカルマイシン、カリケアミシン、メイタンシン、およびアウリスタチンならびにその誘導体が含まれる。カリケアミシン抗体結合体の例は市販されている（Mylotarg（登録商標）；Wyeth-Ayerst）。
【０１６２】
細胞毒素は、当技術分野で利用できるリンカー技術を用いて本発明の抗体に結合することができる。細胞毒素を抗体に結合するために用いられているリンカーのタイプの例には、ヒドラゾン、チオエーテル、エステル、ジスルフィド、およびペプチド含有リンカーが含まれるがこれらに限定されない。ライソゾーム分画内で低いpHによる切断に対して感受性がある、またはカテプシン（例えば、カテプシンB、C、D）のような腫瘍組織において選択的に発現されるプロテアーゼのようなプロテアーゼによる切断に対して感受性があるリンカーを選択することができる。
【０１６３】
細胞毒素のタイプに関するさらなる考察に関して、治療物質を交代に結合させる方法は、同様にSaito, G.ら(2003)Adv. Drug. Deliv. Rev 55:199〜215；Trail, P.A.ら(2003)Cancer Immunol. Immunother. 52:328〜337；Payne, G.(2003)Cancer Cell 3:207〜212；Allen, T.M.(2002)Nat. Rev. Cancer 2:750〜763；Pastan, I. and Kreitman, R.J.(2002)Curr. Opin. Investig. Drugs. 3:1089〜1091；Senter, P.D. and Springer, C.J.(2001)Adv. Drug. Deliv. Rev. 53:247〜264を参照されたい。
【０１６４】
本発明の抗体はまた、細胞障害性放射性医薬品を作製するために放射活性同位元素に結合させることができ、同様に放射性免疫結合体と呼ばれる。診断または治療的に用いるために抗体に結合させることができる放射活性同位元素の例には、ヨウ素131、インジウム111、イットリウム90およびルテニウム177が含まれるがこれらに限定されない。放射性免疫結合体を調製する方法は当技術分野で確立されている。放射性免疫結合体の例は、Zevalin（登録商標）（IDEC Pharmaceuticals）およびBexxar（登録商標）（Corixa Pharmaceuticals）を含み、市販されており、類似の方法を用いて、本発明の抗体を用いて放射性免疫結合体を調製することができる。
【０１６５】
本発明の抗体結合体を用いて、所定の生体反応を改変することができ、薬物部分は古典的な治療物質に限定されないと解釈される。例えば、薬物部分は、所望の生物活性を有するタンパク質またはポリペプチドであってもよい。そのようなタンパク質には、例えばアブリン、リシンA、シュードモナス（Pseudomonas）のエンドトキシン、もしくはジフテリア毒素のような酵素的に活性な毒素またはその活性断片；腫瘍壊死因子もしくはインターフェロン-γのようなタンパク質；または例えばリンフォカイン、インターロイキン-1（「IL-1」）、インターロイキン-2（「IL-2」）、インターロイキン-6（「IL-6」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「GM-CSF」）、顆粒球コロニー刺激因子（「G-CSF」）、もしくは他の増殖因子が含まれてもよい。
【０１６６】
そのような治療部分を抗体に結合させるための技術は周知であり、例えば、Arnonら「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy.」「Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy」, Reisfeldら(eds), pp.243〜56（Alan R. Liss, Inc. 1985）；Hellstromら、「Antibodies For Drug Delivery」、「Controlled Drug Delivery(2 nd Ed.)」, Robinsonら(eds), pp 623〜53（Marcel Dekker, Inc. 1987）；Thorpe, 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy : A Review」in「Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications.」Pincheraら(eds.), pp.475〜506(1985)：「Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy.」in「Monolonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy」, Baldwinら(eds.), pp.303〜16(Academic Press 1985)、およびThorpeら「The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates」, Immunol. Rev., 62:119〜58(1982)を参照されたい。
【０１６７】
二重特異的分子
もう一つの局面において、本発明は、本発明の抗IP-10抗体またはその断片を含む二重特異的分子を特徴とする。本発明の抗体またはその抗原結合部分は、もう一つの機能的分子、例えばもう一つのペプチドまたはタンパク質（例えば、もう一つの抗体または受容体のリガンド）に誘導体化または連結させて、少なくとも二つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異的分子を作製することができる。本発明の抗体を、実際に、一つより多い他の機能的分子に誘導体化または連結させて、二つより多い異なる結合部位および／または標的部位に結合する多重特異的分子を作製してもよい；そのような多重特異的分子はまた、本明細書において用いられるように「二重特異的分子」という用語に含まれると意図される。本発明の二重特異的分子を作製するために、本発明の抗体は、それによって二重特異的分子が得られるように、もう一つの抗体、抗体断片、ペプチド、または結合模倣体のような一つまたは複数の他の結合分子に機能的に連結させることができる（例えば、化学共役、遺伝的融合、非共有結合会合、またはその他）。
【０１６８】
したがって、本発明には、IP-10に対する少なくとも一つの第一の結合特異性および第二の標的エピトープに対する第二の結合特異性を含む二重特異的分子が含まれる。本発明の特定の態様において、第二の標的エピトープは、Fc受容体、例えばヒトFcγRI（CD64）またはヒトFcα受容体（CD89）である。したがって、本発明には、FcγR、FcαR、またはFcεR発現エフェクター細胞（例えば、単球、マクロファージ、または多形核細胞（PMN））とIP-10を発現する標的細胞の両方に結合することができる二重特異的分子が含まれる。これらの二重特異的分子は、IP-10発現細胞をエフェクター細胞にターゲティングして、IP-10発現細胞の貪食、抗体依存的細胞性細胞障害性（ADCC）、サイトカイン放出、またはスーパーオキシド陰イオンの産生のような、Fc受容体媒介エフェクター細胞活性を誘発する。
【０１６９】
二重特異的分子が多重特異的である本発明の一つの態様において、分子にはさらに、抗Fc結合特異性および抗IP-10結合特異性の他に、第三の結合特異性が含まれうる。一つの態様において、第三の結合特異性は抗増強因子（EF）部分、例えば、細胞障害活性に関与する表面タンパク質に結合し、それによって標的細胞に対する免疫応答を増加させる分子である。「抗増強因子部分」は、所定の分子、例えば抗原または受容体に結合し、それによってFc受容体または標的細胞抗原に対する結合決定因子の作用の増強が起こる抗体、機能的抗体断片、またはリガンドとなりうる。「抗増強因子部分」は、Fc受容体または標的細胞抗原に結合することができる。または、抗増強因子部分は、第一および第二の結合特異性が結合する実体とは異なる実体に結合することができる。例えば、抗増強因子部分は、細胞障害性T細胞（例えば、CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1、または標的細胞に対する免疫応答の増加が起こる他の免疫細胞によって）に結合することができる。
【０１７０】
一つの態様において、本発明の二重特異的分子は、結合特異性として、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、または一本鎖Fvを含む少なくとも一つの抗体、またはその抗体断片を含む。抗体はまた、その内容が特に参照により本明細書に組み入れられる、Ladnerら、米国特許第4,946,778号に記述されるようにFvまたは一本鎖構築物のような軽鎖もしくは重鎖二量体、またはその任意の最小の断片であってもよい。
【０１７１】
一つの態様において、Fcγ受容体に対する結合特異性は、その結合がヒト免疫グロブリンG（IgG）によって遮断されないモノクローナル抗体によって提供される。本明細書において用いられるように、「IgG受容体」という用語は、第1染色体上に存在する任意のγ鎖遺伝子8個を指す。これらの遺伝子は、三つのFcγ受容体クラスに分類される膜貫通または可溶性受容体イソ型を全体で12個コードする。FcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）、およびFcγRIII（CD16）。一つの好ましい態様において、Fcγ受容体はヒト高親和性FcγRIである。ヒトFcγRIは、72 kDa分子であり、これは単量体IgGに対して高い親和性（108〜109 M-1）を示す。
【０１７２】
特定の好ましい抗Fcγモノクローナル抗体の産生および特徴付けは、その教示が完全に参照により本明細書に組み入れられる、FangerらのPCT出願国際公開公報第88/00052号および米国特許第4,954,617号に記述される。これらの抗体は、受容体のFcγ結合部位とは異なる部位でFcγRI、FcγRII、またはFcγRIIIのエピトープに結合し、このようにその結合は、IgGの生理的レベルによって実質的に遮断されない。本発明において有用である特異的抗FcγRI抗体は、mAb 22、mAb 32、mAb 44、mAb 62、およびmAb 197である。mAb 32を産生するハイブリドーマは、American Type Culture Collection ATCCアクセッション番号HB 9469から入手可能である。一つの態様において、抗Fcγ受容体抗体は、モノクローナル抗体22（H22）のヒト化型である。H22抗体の産生および特徴付けは、Graziano, R.F.ら(1995)J. Immunol. 155(10):4996〜5002およびPCT出願国際公開公報第94/10332号に記述されている。H22抗体産生細胞株は、American Type Culture CollectionにHA022CL1の名称で寄託され、アクセッション番号CRL 11177を有する。
【０１７３】
さらに他の好ましい態様において、Fc受容体の結合特異性は、その結合が好ましくはヒト免疫グロブリンA（IgA）によって遮断されないヒトIgA受容体、例えばFc-α受容体（FcαRI（CD89））に結合する抗体によって提供される。「IgA受容体」という用語には、第19染色体に存在する一つのα遺伝子（FcαRI）の遺伝子産物が含まれると意図される。この遺伝子は、55〜110 kDaのいくつかの選択的スプライシング膜貫通イソ型をコードすることが公知である。FcαRI（CD89）は、単球／マクロファージ、好酸球および好中球顆粒球において構成的に発現されるが、非エフェクター細胞集団には発現されない。FcαRIは、IgA1およびIgA2の双方に関して中等度の親和性（〜5×107 M-1）を有し、これはG-CSFまたはGM-CSFのようなサイトカインに対する暴露後増加する（Morton, H.C.ら(1996)Critical Reviews in Immunology 16:423〜440）。IgAリガンド結合ドメイン外でFcαRIに結合するA3、A59、A62、およびA77と同定された四つのFcαRI-特異的モノクローナル抗体が記述されている（Monteiro, R.C.ら(1992)J. Immunol. 148:1764）。
【０１７４】
FcαRIおよびFcγRIは、（1）免疫エフェクター細胞、例えば単球、PMN、マクロファージ、および樹状細胞において主に発現される、（2）高レベルで発現される（例えば、細胞あたり5,000〜100,000個）、（3）細胞障害活性のメディエータである（例えば、ADCC、貪食）、（4）それらにターゲティングされる自己抗原を含む抗原の抗原提示の増強を媒介することから、それらは本発明の二重特異的分子において用いるための好ましい誘発受容体である。
【０１７５】
ヒトモノクローナル抗体が好ましいが、本発明の二重特異的分子において用いることができる他の抗体は、マウス、キメラ、およびヒト化モノクローナル抗体である。
【０１７６】
本発明の二重特異的分子は、当技術分野で公知の方法を用いて、構成成分結合特異性、例えば抗FcγRおよび抗IP-10結合特異性を結合させることによって調製することができる。例えば、二重特異的分子の各結合特異性を個々に産生して、それらを互いに結合させることができる。結合特異性がタンパク質またはペプチドである場合、共有結合のために多様な共役またはクロスリンク剤を用いることができる。クロスリンク剤の例には、プロテインA、カルボジイミド、N-スクシニミジル-S-アセチル-チオアセテート（SATA）、5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)（DTNB）、o-フェニレンジマレイミド（oPDM）、N-スクシニミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート（SPDP）、およびスルホスクシニミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート（スルホ-SMCC）（例えば、Karpovskyら(1984)J. Exp. Med. 160:1686；Liu, MAら(1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648を参照されたい）。他の方法には、Paulus(1985)Behring Ins. Mitt. No. 78, 118〜132；Brennanら(1985)Science 229:81〜83およびGlennieら(1987)J. Immnol. 139:2367〜2375において記述される方法が含まれる。好ましい結合物質はSATAおよびスルホ-SMCCであり、いずれもPierce Chemical Co.（Rockford, IL）から入手できる。
【０１７７】
結合特異性が抗体である場合、それらを、二つの重鎖のC-末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合によって結合させることができる。特に好ましい態様において、ヒンジ領域は結合の前に奇数、好ましくは1個のスルフヒドリル残基を含むように改変される。
【０１７８】
または、双方の結合特異性が同じベクターにおいてコードされ、同じ宿主細胞において発現および構築される。この方法は、二重特異的分子がmAb×mAb、mAb×Fab、Fab×F(ab')2、またはリガンド×Fab融合タンパク質である場合に、特に有用である。本発明の二重特異的分子は、一つの一本鎖抗体および結合決定基を含む一本鎖分子となりうる、または二つの結合決定基を含む一本鎖二重特異的分子となりうる。二重特異的分子は少なくとも二つの一本鎖分子を含む。二重特異的分子を調製する方法は、例えば、米国特許第5,260,203号、米国特許第5,455,030号、米国特許第4,881,175号、米国特許第5,132,405号、米国特許第5,091,513号、米国特許第5,476,786号、米国特許第5,013,653号、米国特許第5,258,498号、および米国特許第5,482,858号に記述される。
【０１７９】
その特異的標的に対する二重特異的分子の結合は、例えば酵素結合イムノソルベントアッセイ法（ELISA）、ラジオイムノアッセイ法（RIA）、FACS分析、バイオアッセイ法（例えば、増殖阻害）またはウェスタンブロットアッセイ法によって確認することができる。これらのアッセイ法のそれぞれは一般的に、対象複合体に対して特異的な標識試薬（例えば、抗体）を用いることによって、特に対象となるタンパク質-抗体複合体の存在を検出する。例えば、FcR-抗体複合体は、例えば、抗体-FcR複合体を認識して特異的に結合する酵素結合抗体または抗体断片を用いて検出することができる。または、複合体は、任意の多様な他のイムノアッセイ法を用いて検出することができる。例えば、抗体を放射活性標識して、ラジオイムノアッセイ法（RIA）において用いることができる（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Weinstraub, B.「Principles of Radioimmunoassays」、Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques. The Endocrine Society, March 1986を参照されたい）。放射活性同位元素は、γカウンターもしくはシンチレーションカウンター、またはオートラジオグラフィーを用いるような手段によって検出することができる。
【０１８０】
薬学的組成物
もう一つの局面において、本発明は、薬学的に許容される担体と共に製剤化された、本発明のモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を一つまたは併用して含む組成物、例えば薬学的組成物を提供する。そのような組成物には、一つまたは併用の（例えば、二つまたはそれ以上の異なる）本発明の抗体、免疫結合体、または二重特異的分子が含まれてもよい。例えば、本発明の薬学的組成物は、標的抗原上で異なるエピトープに結合する、または相補的活性を有する抗体（または免疫結合体もしくは二重特異的分子）の組み合わせを含みうる。
【０１８１】
本発明の薬学的組成物はまた、併用治療において、すなわち他の物質と併用して投与することができる。例えば、併用治療には、少なくとも一つの他の抗炎症または免疫抑制剤と併用した本発明の抗IP-10抗体が含まれうる。併用治療において用いることができる治療物質の例は、本発明の抗体の使用に関する下記の章においてより詳しく記述される。
【０１８２】
本明細書において用いられるように、「薬学的に許容される担体」には、生理的に適合性である任意の全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、ならびに吸収遅延剤等が含まれる。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄、または表皮内投与（例えば注射または注入）に適している。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち抗体、免疫結合体、または二重特異的分子は、酸の作用および化合物を不活化する可能性がある他の天然の条件から化合物を保護する材料によってコーティングしてもよい。
【０１８３】
本発明の薬学的組成物には、一つまたは複数の薬学的に許容される塩が含まれてもよい。「薬学的に許容される塩」は、親化合物の所望の生物活性を保持して、望ましくない毒性作用を付与しない塩を指す（例えば、Berge, S.M.ら(1977)J. Pharm. Sci. 66:1〜19を参照されたい）。そのような塩の例には、酸付加塩および塩基付加塩が含まれる。酸付加塩には、塩酸、硝酸、燐酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、燐等のような非毒性の無機酸と共に、脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸等のような非毒性有機酸に由来する塩が含まれる。塩基付加塩には、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等のようなアルカリ土類金属と共にN,N'-ジベンジルエチレンジアミン、N-メチルグルカミン、クロロプロカイン、塩素、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカイン等のような非毒性の有機アミンに由来する塩が含まれる。
【０１８４】
本発明の薬学的組成物にはまた、薬学的に許容される抗酸化剤が含まれてもよい。薬学的に許容される抗酸化剤の例には、（1）アスコルビン酸、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等のような水溶性抗酸化剤、（2）アスコルビルパルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール（BHA）、ブチル化ヒドロキシトルエン（BHT）、レシチン、プロピルガレート、α-トコフェロール等のような脂溶性抗酸化剤、および（3）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、ソルビトール、酒石酸、燐酸等のような金属キレート剤、が含まれる。
【０１８５】
本発明の薬学的組成物において用いてもよい適した水溶性および非水溶性担体の例には、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、およびその適した混合物、オリーブ油のような植物油、およびオレイン酸エチルのような注射用有機エステルが含まれる。例えば、レシチンのようなコーティング材料を用いることによって、分散剤の場合には必要な粒子径を維持することによって、および界面活性剤を用いることによって、適切な流動性を維持することができる。
【０１８６】
これらの組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤のようなアジュバントを含んでもよい。微生物の存在の予防は、上記の滅菌技法によって、および様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸等を含めることによって確保してもよい。同様に、糖、塩化ナトリウム等のような等張剤を組成物に加えることが望ましいかも知れない。さらに、注射用製剤の吸収持続型は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅らせる物質を含むことによって得てもよい。
【０１８７】
薬学的に許容される担体には、滅菌水溶液または分散液、ならびに滅菌注射溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。薬学的に活性な物質のためにそのような媒体および物質を用いることは、当技術分野で公知である。如何なる通常の培地または物質も活性化合物と不適合性である場合を除き、本発明の薬学的組成物におけるその使用が企図される。補助活性化合物も同様に、組成物に組み入れることができる。
【０１８８】
治療的組成物は典型的に、製造および保存条件で滅菌および安定でなければならない。組成物は、高い薬物濃度に適した溶液、微小乳剤、リポソーム、または他の秩序だった構造として調製することができる。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）、およびその適した混合物を含む溶媒または分散媒体となりうる。適切な流動性は、例えばレシチンのようなコーティングを用いることによって、分散剤の場合には必要な粒子径を維持することによって、および界面活性剤を用いることによって維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば糖、マンニトールのような多価アルコール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましいであろう。注射用組成物の持続的な吸収は、吸収を遅らせる物質、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物に含めることによって得ることができる。
【０１８９】
滅菌注射溶液は、必要な量の活性化合物を、先に列挙した成分の一つまたは組み合わせと共に適当な溶媒に組み入れた後、必要に応じて微細濾過滅菌することによって調製することができる。一般的に、分散剤は、基礎分散培地および先に列挙した中から必要な他の成分を含む滅菌媒体に活性化合物を組み入れることによって調製される。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製法は、既に濾過滅菌されたその溶液から活性成分プラス任意のさらなる所望の成分の粉末を生じる真空乾燥および凍結乾燥（凍結乾燥）である。
【０１９０】
担体材料と配合して単一の投与剤形を生じることができる活性成分の量は、治療すべき被験者、および特定の投与様式に依存して変化するであろう。担体材料と配合して単一の投与剤形を生じることができる活性成分の量は、一般的に治療効果を生じる組成物の量であろう。一般的に100％の中で、この量は活性成分の約0.01％〜約99％、好ましくは約0.1〜約70％、最も好ましくは、薬学的に許容される担体と配合して活性成分約1％〜約30％の範囲であろう。
【０１９１】
投与レジメンは、最適な所望の反応（例えば、治療反応）を提供するように調節される。例えば、1回ボーラス投与を行ってもよく、数回の分割用量を経時的に投与してもよく、または用量を治療的状況の緊急性に応じて比例的に減少または増加させてもよい。投与の容易さおよび用量の均一性のために、非経口組成物を単位投与剤形に調製することが特に都合がよい。本明細書において用いられる単位投与剤形は、治療すべき被験者に関して単位用量として適している物理的に個別の単位を指す；各単位は、必要な薬学的担体に関連して所望の治療効果を生じるように計算された活性成分の既定量を含む。本発明の単位投与剤形の明細は、（a）活性化合物の独自の特徴および得られる特定の治療効果、ならびに（b）個体における感受性の治療のためにそのような活性化合物を合成する場合の当技術分野において固有の制限、によって左右され、直接依存する。
【０１９２】
抗体を投与する場合、用量は、約0.0001〜100 mg/kg、より通常0.01〜5 mg/kg宿主体重の範囲である。例えば、用量は0.3 mg/kg体重、1 mg/kg体重、3 mg/kg体重、5 mg/kg体重、もしくは10 mg/kg体重となりえて、または1〜10 mg/kgの範囲内となりうる。例としての治療レジメンは、1週間に1回、2週間に1回、3週間毎に1回、4週間毎に1回、毎月1回、3ヶ月に1回、または3〜6ヶ月毎に1回の投与を含む。本発明の抗IP-10抗体に関する好ましい投与レジメンには、1 mg/kg体重または3 mg/kg体重を静脈内投与によって投与することが含まれ、抗体は以下の投与スケジュールの一つを用いて投与される：（i）4週間毎に6回投与、その後3ヶ月毎；（ii）3週間毎；（iii）3 mg/kg体重の後に1 mg/kg体重を3週間毎。
【０１９３】
いくつかの方法において、異なる結合特異性を有する二つまたはそれ以上のモノクローナル抗体を同時に投与して、この場合、投与される各抗体の用量は、示された範囲内に入る。抗体は通常、複数回投与される。投与間隔は、例えば毎週、毎月、3ヶ月毎または毎年となりうる。間隔はまた、患者における標的抗原に対する抗体の血液中レベルを測定することによって示されるように不規則となりうる。いくつかの方法において、用量は約1〜1000 μg/mlの抗体血漿濃度を得るように、およびいくつかの方法において約25〜300 μg/mlを得るように調節される。
【０１９４】
または、抗体は徐放製剤として投与することができ、この場合必要な投与回数はより少ない。用量および投与回数は、患者における抗体の半減期に応じて変化する。一般的に、ヒト抗体は最も長い半減期を示し、その後にヒト化抗体、キメラ抗体、および非ヒト抗体が続く。投与の用量および回数は、治療が予防的または治療的であるか否かに依存して変化しうる。予防的適用の場合、比較的低用量を比較的少ない回数で長期間投与する。患者によっては、人生の残りの期間、治療を受け続ける。治療的応用の場合、疾患の進行が減少または停止するまで、および好ましくは患者が疾患症状の部分的または完全な改善を示すまで、比較的高用量を比較的短期間で投与することが時に必要である。その後、患者に予防レジメンを投与することができる。
【０１９５】
本発明の薬学的組成物における活性成分の実際の投与レベルは、患者に対して毒性を示すことなく、特定の患者に関する所望の治療反応、組成物、および投与様式を得るために有効である活性成分の量を得るために変化してもよい。選択された用量レベルは、用いられる本発明の特定の組成物、またはそのエステル、塩、もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、用いる特定の化合物の排泄速度、治療期間、他の薬剤、用いる特定の組成物と併用して用いられる化合物および／または材料、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全身健康およびこれまでの既往、および医学の技術分野において周知の同様の要因を含む多様な薬物動態因子に依存するであろう。
【０１９６】
本発明の抗IP-10抗体の「治療的有効量」によって、好ましくは疾患の症状の重症度の減少、疾患の無症状期間の回数および期間の増加、または疾患罹患による障害または無能の予防が得られる。リウマチ性関節炎（RA）の場合、治療的有効量は好ましくは、例えば疼痛、疲労、朝のこわばり（1時間より長く続く）、びまん性の筋痛、食欲喪失、虚弱、暖かい関節痛、腫脹、圧痛、および無動後の関節のこわばりのような、RAに関連する身体症状のさらなる悪化を予防する。治療的有効量は、好ましくは疾患の初期または予備的徴候が存在する場合に望ましいような、RAの発病を予防または遅らせる。同様に、これにはRAに関連した慢性の進行を遅らせることが含まれる。RAの診断において利用される臨床検査には、化学（IP-10レベルの測定を含む）、血液学、血清学および放射線学が含まれる。したがって、前述の如何なるものもモニターする任意の臨床または生化学アッセイ法を用いて、特定の治療がRAを治療するための治療的有効量であるか否かを決定してもよい。当業者は、被験者の体格、被験者の症状の重症度、および特定の組成物、または選択される投与経路のような要因に基づいてそのような量を決定することができるであろう。
【０１９７】
本発明の組成物は、当技術分野で公知の多様な方法の一つまたは複数を用いて、一つまたは複数の投与経路によって投与することができる。当業者によって認識されるように、投与経路および投与様式は所望の結果に応じて変化するであろう。本発明の抗体の好ましい投与経路には、例えば注射または注入による、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄、または他の非経口投与経路が含まれる。本明細書において用いられるように「非経口投与」という句は、通常、注射による腸内および局所投与以外の投与様式を意味し、これには、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢内、くも膜下、脊髄内、硬膜外、および大槽内注射および注入が含まれるがこれらに限定されない。
【０１９８】
または、本発明の抗体は、局所、表皮、または粘膜内投与経路のような、例えば鼻腔内、経口、膣内、直腸内、舌下、または局所のような、非非経口経路によって投与することができる。
【０１９９】
活性化合物は、インプラント、経皮パッチ、および微小封入送達系を含む、徐放製剤のような迅速な放出に対して化合物を保護するであろう担体と共に調製することができる。エチレン-酢酸ビニル、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような生体分解性の生体適合性ポリマーを用いることができる。そのような製剤の調製に関する多くの方法が特許出願されており、または一般的に当業者に公知である。例えば、「Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems」, J.R. Robinson, ed.Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい。
【０２００】
治療組成物は、当技術分野で公知の医学装置によって投与することができる。例えば、好ましい態様において、本発明の治療組成物は、米国特許第5,399,163号、第5,383,851号、第5,312,335号、第5,064,413号、第4,941,880号、第4,790,824号、または第4,596,556号に開示される装置のような、針のない皮下注射装置によって投与することができる。本発明において有用な周知のインプラントおよびモジュールの例には、以下が含まれる：制御された速度で医薬品を分配するための埋め込み型微量注入ポンプを開示する米国特許第4,487,603号、皮膚を通して医薬品を投与するための治療装置を開示する米国特許第4,486,194号、正確な注入速度で医薬品を送達するための医薬品注入ポンプを開示する米国特許第4,447,233号、持続的薬物送達のための可変流速埋め込み型注入装置を開示する米国特許第4,447,224号、多室区画を有する浸透圧薬物送達システムを開示する米国特許第4,439,196号、および浸透圧薬物送達システムを開示する米国特許第4,475,196号。これらの特許は、参照により本明細書に組み入れられる。そのような多くの他のインプラント、送達システム、およびモジュールが当業者に公知である。
【０２０１】
特定の態様において、本発明のヒトモノクローナル抗体は、インビボで適切な分布を確保するために調製することができる。例えば、血液-脳関門（BBB）は、多くの非常に親水性の化合物を排除する。本発明の治療化合物がBBBを確実に通過するためには（望ましければ）、それらを例えばリポソームにおいて調製することができる。リポソームを製造する方法に関しては、例えば米国特許第4,522,811号、第5,374,548号、および第5,399,331号を参照されたい。リポソームは、特定の細胞または臓器に選択的に輸送され、このように標的化薬物送達を増強する一つまたは複数の部分を含んでもよい（例えば、V.V. Ranade(1989)J. Clin. Pharmacol. 29:685を参照されたい）。例としてのターゲティング部分には、葉酸塩またはビオチン（例えば、Lowらに対する米国特許第5,416,016号を参照されたい）、マンノシド（Umezawaら(1988)Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038）、抗体（P.G. Bloemanら(1995)FEBS Lett. 357:140；M. Owaisら(1995)Antimicrob. Agents Chemother. 39:180）、界面活性剤プロテインA受容体（Briscoeら(1995)Am. J. Physiol. 1233:134）、p120（Schreierら(1994)J. Biol. Chem. 269:9090）が含まれる；同様にK. Keinanen；M.L. Laukkanen(1994)FEBS Lett. 346:123；J.J. Killion, I.J. Fidler(1994)Immunomethods 4:273を参照されたい。
【０２０２】
本発明の用途および方法
本発明の抗体（ならびに免疫結合体および二重特異的分子）は、インビトロおよびインビボ診断および治療的有用性を有する。例えば、これらの分子は、例えばインビトロまたはエクスビボで培養細胞に投与することができる、または例えば多様な障害を治療、予防、または診断するためにインビボで被験者に投与することができる。本明細書において用いられるように、「被験者」という用語には、ヒトおよび非ヒト動物が含まれると意図される。非ヒト動物には、全ての脊椎動物、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類、およびは虫類のような、哺乳類および非哺乳類が含まれる。方法は、異常なIP-10発現に関連した障害を有するヒト患者を治療するために特に適している。IP-10に対する抗体をもう一つの物質と共に投与する場合、両者をいずれかの順序でまたは同時に投与することができる。
【０２０３】
一つの態様において、本発明の抗体（ならびに免疫結合体および二重特異的分子）は、IP-10レベル、またはIP-10を含む細胞のレベルを検出するために用いることができる。これは、例えば試料（インビトロ試料のような）および対照試料を、抗体とIP-10とのあいだに複合体を形成することができる条件で抗IP-10抗体に接触させることによって得ることができる。試料および対照において、抗体とIP-10とのあいだに形成された如何なる複合体も検出および比較される。例えば、本発明の組成物を用いて、ELISAおよびフローサイトメトリー法のような、当技術分野で周知の標準的な検出法を行うことができる。
【０２０４】
したがって、一つの局面において、本発明は、試料および対照試料を、IP-10に特異的に結合する本発明の抗体またはその抗原結合部分に、抗体またはその一部とIP-10とのあいだに複合体が形成される条件で接触させる段階を含む、試料中のIP-10（例えば、ヒトIP-10抗原）の存在を検出する方法、またはIP-10の量を測定する方法をさらに提供する。次に、複合体の形成を検出して、対照試料と比較して試料間の複合体形成に差があれば、試料においてIP-10が存在することが示される。
【０２０５】
同様に、本発明の組成物（例えば、抗体、ヒト抗体、免疫結合体、および二重特異的分子）および使用説明書を含むキットも本発明の範囲に含まれる。キットはさらに、少なくとも一つのさらなる試薬、または一つもしくは複数の本発明のさらなる抗体（例えば、第一の抗体とは異なる標的抗原上のエピトープに結合する補体活性を有する抗体）を含みうる。キットには典型的に、キットの内容物の意図される使用を示す表示が含まれる。表示という用語には、キットに供給されたまたはキットと共に供給された、またはそうでなければキットに添付された任意の書面または記録された材料が含まれる。
【０２０６】
IP-10は、活性化T細胞およびNK細胞において化学誘引作用を有し、炎症および自己免疫反応部位にそのような細胞を動員することが知られている。したがって、本発明の抗IP-10抗体（ならびに免疫結合体および二重特異的分子）は、多様な臨床での適応において、活性化T細胞および／またはNK細胞によって媒介される炎症または自己免疫反応を阻害するために用いることができる。したがって、本発明は、炎症または自己免疫反応が阻害されるように、T細胞またはNK細胞を本発明の抗体またはその抗原結合部分（または本発明の免疫結合体もしくは二重特異性分子）に接触させる段階を含む、活性化T細胞および／またはNK細胞によって媒介される炎症または自己免疫反応を阻害する方法を提供する。本発明の抗体を用いることができる炎症または自己免疫疾患の特定の例には、以下が含まれるがこれらに限定されない。
【０２０７】
A.多発性硬化症および他の脱髄疾患
IP-10 mRNAの発現は、マウス多発性硬化症モデルであるマウス実験的アレルギー性脳脊髄炎（EAE）において増加することが示されている（Godiska, P.ら(1995)J. Neuroimmunol. 58:167〜176）。その上、IP-10レベルの増加は、急性脱随事象の際にMS患者の脳脊髄液において認められている（Sorensen, T.L.ら(1999)J. Clin. Invest. 103:807〜815；Franciottaら(2001)J. Neuroimmunol. 115:192〜198）。IP-10はまた、MS病変において星状細胞によって発現されることが示されているが、非罹患白質では発現されず（Balashov, K.E.ら(1999)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:6873〜6878）、MS斑内のマクロファージ、および周辺の実質における反応性星状細胞によって発現されることが示されている（Simpson, J. E.ら(2000)Neuropathol. Appl. Neurobiol. 26:133〜142）。PCT特許出願国際公開公報第02/15932号は、MSのマウス肝炎ウイルス（MHV）モデルにおいて抗IP-10抗体を投与したところ、Tリンパ球およびマクロファージ浸潤の減少、脱髄の進行の阻害、再有髄化の増加、および神経機能の改善が得られることを示した（同様に、Liu, M.T.ら(2001)J. Immunol. 167:4091〜4097を参照されたい）。マウス抗IP-10抗体の投与は、マウスEAEにおいて臨床および組織学疾患の発生率および重症度を減少させることが示されている（Fife, B.T.ら(2001)J. Immunol. 166:7617〜7624）。
【０２０８】
前述を考慮して、本発明の抗IP-10抗体は、治療を必要とする被験者に抗体を投与することによって、MSおよび他の脱髄疾患の治療において用いることができる。抗体は単独またはインターフェロンβ-1a（例えば、Avonex（登録商標）、Rebif（登録商標））、インターフェロンβ-1b（例えば、Betaseron（登録商標））、グラチラマーアセテート（例えば、Copaxone（登録商標））および／またはミトキサントロン（例えば、Novantrone（登録商標））のような他の抗MS物質と併用して用いることができる。
【０２０９】
B.リウマチ性関節炎
IP-10レベルは、リウマチ性関節炎（RA）患者の滑液、滑膜組織、および血清において有意に上昇していることが示されている（Patel. D.D.ら(2001)Clin. Immunol. 98:39〜45；Hanaokam, R.ら(2003)Arthritis Res. and Therapy 5:R74〜R81）。IP-10受容体であるCXCR3は、RA患者からの滑膜組織内の肥満細胞において選択的に発現されることが示されている（Ruschpler, P.ら(2003)Arthritis Res. Ther. 5:R241〜R252）。アジュバントによる関節炎（AA）のラットモデルにおいて、自己IP-10に対する検出可能な自己抗体反応が報告されている（Salomon, I.ら(2002）J. Immunol. 169:2685〜2693）。その上、IP-10コードDNAワクチンを投与すると、ラットにおける中和抗IP-10抗体の産生を増強して、これらのIP-10自己抗体は無処置ラットにAAの抵抗性を養子免疫移入することができた（Salomon, Iら、上記）。
【０２１０】
前述を考慮して、本発明の抗IP-10抗体は、治療を必要とする被験者に抗体を投与することによって、リウマチ性関節炎の治療に用いることができる。抗体は単独または非ステロイド性抗炎症薬（NSAIDs）、鎮痛薬、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾン、ヒドロコルチゾン）、TNF-阻害剤（アジリムマブ（Humira（登録商標））、エタネルセプト（Enbrel（登録商標））、およびインフリキシマブ（Remicade（登録商標）））、疾患改変抗リウマチ薬（メソトレキセート、シクロホスファミド、シクロスポリン、オーラノフィン、アザチオプリン、チオリンゴ酸金ナトリウム、硫酸ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、ミノサイクリン、ペニシラミンおよびスルファサラジンを含む）、線維筋痛治療薬、骨粗鬆症治療薬、および痛風治療薬のような、他の抗RA物質と併用して用いることができる。
【０２１１】
C.炎症性腸疾患
IP-10発現は、潰瘍性大腸炎患者から採取した結腸生検の固有層に浸潤する細胞において有意に増強されることが示されている（Uguccioni, M.ら(1999)Am. J. Pathol. 155:331〜336）。さらに、IP-10の中和は、急性の結腸炎において上皮潰瘍化からマウスを保護する、および陰窩細胞の生存を増強することが示されている（Sasaki, S.ら(2002)Eur. J. Immunol. 32:3197〜3205）。同様に、ヒトにおけるクローン病と類似の結腸炎を発症するIP-10-/-マウスにおいて、抗IP-10抗体による治療によって、炎症スコアが改善された（Singh, U.P.ら(2003)J. Immunol. 171:1401〜1406）。
【０２１２】
前述を考慮して、本発明の抗IP-10抗体は、治療を必要とする被験者に抗体を投与することによって、潰瘍性大腸炎およびクローン病を含む炎症性腸疾患（IBD）の治療に用いることができる。抗体は単独で、または、メサラミンを含む薬剤（スルファサラジンならびにオルサラジンおよびバルサラジドのような5-アミノサリチル酸（5-ASA）を含む他の物質を含む）、非ステロイド性抗炎症薬（NSAIDs）、鎮痛剤、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾン、ヒドロコルチゾン）、TNF-阻害剤（アジリムマブ（Humira（登録商標））、エタネルセプト（Enbrel（登録商標））、およびインフリキシマブ（Remicade（登録商標））を含む）、免疫抑制剤（6-メルカプトプリン、アザチオプリン、およびシクロスポリンAのような）、および抗生物質のような、他の抗IBD物質と併用して用いることができる。
【０２１３】
D.全身性紅斑性狼瘡
血清中のIP-10レベルは、全身性紅斑性狼瘡（SLE）患者において顕著に増加していることが示されており、レベルは疾患の活動度と相関することが示されている（例えば、Narumi, S.ら(2000)Cytokine 12:1561〜1565を参照されたい）。したがって、もう一つの態様において、本発明の抗IP-10抗体は、治療を必要とする被験者に抗体を投与することによってSLEの治療において用いることができる。抗体は単独または、非ステロイド性抗炎症薬（NSAIDs）、鎮痛剤、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾン、ヒドロコルチゾン）、免疫抑制剤（シクロホスファミド、アザチオプリン、およびメソトレキセート）、抗マラリア剤（ヒドロキシクロロキンのような）、およびdsDNA抗体の産生を阻害する生物製剤（例えば、LJP 394）のような、他の抗SLE剤と併用して用いることができる。
【０２１４】
E. I型糖尿病
血清中のIP-10レベルはI型糖尿病患者において、特に発症したばかりの患者において上昇していることが示されており、レベルは、GAD自己抗体に関して陽性の患者において、GAD反応性γ-インターフェロン産生T細胞数と相関することが示された（Shimada, A.ら(2001)Diabetes Care 24:510〜515）。別の試験において、血清中のIP-10レベルは、新たに診断された疾患を有する患者および疾患のリスクが高い患者において増加していることが判明し、IP-10濃度はIFN-γレベルと相関した（Nicoletti, F.ら(2002)Diabetologia 45:1107〜1110）。その上、β細胞は、IP-10分泌することが示されており、それによってT細胞の化学誘引を引き起こし、CXCR3を欠損するマウスは、晩発性I型糖尿病を有することが示されている（Frigerio, S.ら(2002)Nature Medicine 8:1414〜1420）。
【０２１５】
したがって、もう一つの態様において、本発明の抗IP-10抗体は、治療を必要とする被験者に抗体を投与することによって、I型糖尿病の治療に用いることができる。抗体は、単独またはインスリンのような他の抗糖尿病剤と併用して用いることができる。
【０２１６】
F.炎症性皮膚障害
IP-10発現は多様な炎症性皮膚障害に関連することが示されている。例えば、IP-10は、ケラチノサイトおよび活性な乾癬斑からの皮膚浸潤物において検出されている（Gottlieb, A.B.ら(1988)J. Exp. Med. 168:941〜948）。その上、CXCR3は皮膚CD3+リンパ球によって発現され、このことは、CXCR3が乾癬皮膚へのTリンパ球の移動に関与していることを示唆している（Rottman, J.B.ら(2001)Lab. Invest. 81:335〜347）。したがって、もう一つの態様において、本発明の抗IP-10抗体は、治療を必要とする被験者に抗体を投与することによって、乾癬の治療に用いることができる。抗体は、単独または局所治療（例えば、ステロイド、コールタール、カルシポトリエン、タザロテン、アントラリン、サリチル酸）、光線療法、全身性投薬（例えば、メソトレキセート、経口レチノイド、シクロスポリン、フマル酸エステル）、および／または生物製剤（例えば、アレファセプト、エファリズマブ）のような、他の物質または治療と併用して用いることができる。
【０２１７】
扁平苔癬は、皮膚および口腔粘膜の慢性炎症疾患であり、CXCR3を発現する浸潤性CD4+およびCD8+ T細胞に関連することが示されており、その上、CD8+浸潤性細胞溶解性T細胞は、その細胞溶解顆粒においてIP-10を有することが示されており、病変のケラチノサイトは、IP-10を過剰発現することが示されている（Iijima, W.ら(2003)Am. J. Pathol. 163:261〜268）。したがって、もう一つの態様において、本発明の抗IP-10抗体は、治療を必要とする被験者に抗体を投与することによって、扁平苔癬の治療に用いることができる。抗体は単独、または抗炎症薬、抗ヒスタミン剤、コルチコステロイド、および光線療法のような他の物質または治療と併用して用いることができる。
【０２１８】
IP-10の発現は、慢性円板状紅斑性狼瘡およびジェスナーのリンパ球性皮膚浸潤のような他の炎症性皮膚障害において上昇していることが示されている（Flier, J.ら(2001)J. Pathol. 194:398〜405）。したがって、本発明の抗IP-10抗体は、治療を必要とする被験者に抗体を投与することによって、これらの炎症性皮膚障害の治療に用いることができる。抗体は単独または上記のような他の物質または治療と併用して用いることができる。
【０２１９】
G.自己免疫性甲状腺疾患
IP-10およびCXCR3はいずれも、グレーヴス病（GD）を有する患者の甲状腺において発現されるが、正常な甲状腺組織には発現されない（またはほとんど発現されない）ことが示されており、発現は新たに発症したGD患者において最高であった（Romagnani, P.ら(Am. J. Pathol. 161:195〜206)）。IP-10はまた、橋本甲状腺炎を有する患者の甲状腺組織にも発現されることが示されている（Kemp, E.H.ら(2003)Clin. Endocrinol. 59:207〜213）。したがって、もう一つの態様において、本発明の抗IP-10抗体は、治療を必要とする被験者に抗体を投与することによって、グレーヴス病および橋本甲状腺炎を含む自己免疫性甲状腺疾患の治療に用いることができる。抗体は、単独または抗甲状腺薬、放射活性ヨウ素、および部分的甲状腺切除のような他の物質または治療と併用して用いることができる。
【０２２０】
H. シェーグレン症候群
IP-10 mRNAの発現は、シェーグレン症候群（SS）患者の唾液腺において有意にアップレギュレートされることが示されており、発現は、リンパ様浸潤物に隣接する管上皮において最も顕著である（例えば、Ogawa, N.ら(2002)Arthritis Rheum 46:2730〜2741を参照されたい）。したがって、もう一つの態様において、本発明の抗IP-10抗体は、治療を必要とする被験者に抗体を投与することによって、シェーグレン症候群の治療に用いることができる。抗体は単独または人工潤滑剤（例えば、保存剤を含まない人工涙液、人工唾液、無香料皮膚ローション、生理食塩液鼻腔内スプレー、および膣潤滑剤）、ドライアイの治療のためのLacriserts（登録商標）、塩酸ピロカルピン（Salagen（登録商標））、およびドライマウスの治療のためのセイメリン（Eyoxac（登録商標））、非ステロイド性抗炎症薬（NSAIDs）、ステロイドおよび免疫抑制剤のような、他の抗SS剤と併用して用いることができる。
【０２２１】
I. 肺の炎症
IP-10発現をマウスアレルギー性喘息モデルにおいて調べたところ、結果から、IP-10がアレルゲンのチャレンジ後の肺においてアップレギュレートされていること、およびIP-10の過剰発現は、気道の過敏性の増加、好酸球増多症、IL-4レベルの増加、およびCD8+リンパ球の動員に関連することが示された（Medoff, B.D.ら(2002)J. Immunol. 168:5278〜5286）。その上、慢性閉塞性肺疾患（COPD）を発症する喫煙者は、その気管支上皮においてIP-10を発現することが示されている（Saetta, M.ら(2002)Am. J. Respir. Crit. Care Med.165:1404〜1409）。なおさらに、高レベルのIP-10が肺サルコイドーシスおよびリンパ球性肺胞炎患者の気管支肺胞洗浄液において示されている（Agostini, C.ら(1998)J. Immunol. 161:6413〜6420）。
【０２２２】
したがって、もう一つの態様において、本発明の抗IP-10抗体は、治療を必要とする被験者に抗体を投与することによって、喘息、COPD、肺サルコイドーシス、またはリンパ球性肺胞炎のような、肺の炎症を特徴とする疾患の治療に用いることができる。抗体は、単独または、クロモリンナトリウム、ネドクロミルナトリウム、吸入コルチコステロイド、全身性（例えば、経口）コルチコステロイド、短時間持続型βアゴニスト、短時間持続型気管支拡張剤、長時間作用型βアンタゴニストまたはアゴニスト（経口または吸入）、ロイコトリエン改変剤、テオフィリンおよび酸素療法のような、肺の炎症を減少させる他の物質と併用して用いることができる。
【０２２３】
J. 移植の拒絶
IP-10は、移植された組織の拒絶において役割を果たすことが示されている。例えば、中和性抗IP-10抗体によるマウスの治療は、小腸の同種異系移植片の生存を増加させて、固有層における宿主T細胞およびNK細胞の蓄積を減少させた（Zhang, Z.ら(2002)J. Immunol. 168:3205〜3212）。さらに、膵島の同種異系移植片を移植したマウスにおいて、抗IP-10抗体治療によって同様に、同種異系移植片の生存の増加およびリンパ球の移植片浸潤の減少が認められた（Baker, M.S.ら(2003)Surgery 134:126〜133）。さらに、心移植片はIP-10およびCXCR3を発現するが正常な心臓は発現せず、IP-10レベルの増加は心同種異系移植片の血管症に関連した（Zhao, D.X.ら(2002)J. Immunol. 169:1556〜1560）。CXCR3およびIP-10はまた、肺の同種異系移植片に浸潤する炎症細胞によって発現されることが示されている（Agostini, C.ら(2001)Am. J. Pathol. 158:1703〜1711）。インビボでのCXCR3またはIP-10の中和は、マウス肺移植モデルにおいて、肺移植レシピエントが生存するための主な制限である閉塞性細気管支炎症候群（BOS）を減弱させることが示された（Belperio, J.A.ら(2002)J. Immunol. 169:1037〜1049）。
【０２２４】
前述を考慮して、本発明はまた、治療を必要とする移植のレシピエントに本発明の抗IP-10抗体を投与することによって、移植の拒絶を阻害する方法を提供する。治療することができる組織移植の例には、肝臓、肺（例えば、BOSの治療）、腎臓、心臓、小腸、および膵島細胞が含まれるがこれらに限定されない。抗体は、単独または免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、ミコフェノレートメフェチル、シリリムス、ラパマイシン、タクロリムス）、抗感染剤（例えば、アシクロビル、クロトリマゾール、ガンシクロビル、ニスタチン、トリメトプリムスルファメトキサゾール）、利尿剤（例えば、ブメタニド、フロセミド、メトラゾン）および潰瘍治療薬（例えば、シメチジン、ファルノチジン、ランソプラゾール、オメプラゾール、ラニチジン、スクラルファート）のような、移植の拒絶を阻害するための他の物質と併用して用いることができる。
【０２２５】
K. 脊髄損傷
外傷による脊髄の損傷によって、炎症細胞の浸潤が起こる。IP-10は脊髄損傷後の二次変性において中心的な役割を果たすことが示されている（Gonzalezら(2003)Exp. Neurol. 184:456〜463；同様にPCT特許公開国際公開公報第03/06045号を参照されたい）。IP-10は、挫傷を受けたラット脊髄において損傷後6および12時間で（McTigue, D.M.ら(1998)J. Neurosci. Res. 53:368〜376）および損傷を受けたマウス脊髄において損傷後6時間で（Gonzalezら(2003)上記）有意に上昇することが示されている。したがって、脊髄損傷後のIP-10活性の阻害は、炎症細胞の浸潤を減少させるために、そしてこのように炎症に対する二次的な組織障害を減少させるために有用であることが示されている。阻害はまた、外傷による脳損傷および卒中後の炎症細胞の浸潤を減少させ、二次変性を減少させ、および回復を改善させる可能性がある。このように、本発明はまた、本発明の抗IP-10抗体を被験者に投与する段階を含む、治療を必要とする被験者における脊髄損傷および脳損傷（例えば、脳卒中）を治療する方法を提供する。抗体は、単独、または他の抗炎症剤のような他の物質と併用して用いることができる。
【０２２６】
L. 神経変性疾患
中枢神経系におけるIP-10およびCXCR3発現は、アルツハイマー病（AD）に関連した病理的変化に関連してアップレギュレートされることが判明している（Xia, M.Q. and Hyman, D.T.(1999)J. Neurovirol. 5:32〜41）。AD脳において、CXCR3は、様々な皮質および皮質下領域におけるニューロンおよびニューロンの突起において構成的に発現されることが示され、そしてIP-10は星状細胞において発現されることが示され、そのレベルは正常な脳と比較して顕著に上昇した（Xia, M.Q.ら(2000)J. Neuroimmunol.108:227〜235 ）。したがって、本発明の抗体は、治療を必要とする被験者に抗IP-10抗体を単独、または他の治療物質と併用して投与することによって、アルツハイマー病およびパーキンソン病のような神経変性疾患の治療に用いることができる。抗IP-10抗体をアルツハイマー病治療のために併用することができる物質の例には、コリンエステラーゼ阻害剤（ドネペジル、リバスチグミン、ガランタミン、タクリン）およびビタミンEが含まれる。パーキンソン病治療のために抗IP-10抗体を併用することができる物質の例は、レボドパである。
【０２２７】
M. 歯肉炎
辺縁性歯肉炎は、炎症を有する歯肉組織に関連する。IP-10を産生する細胞は、炎症を有するヒト歯肉組織と共に、CXCR3受容体を発現する細胞において認められている（Kabashima, H.ら(2002)Cytokine 20:70〜77）。したがって、もう一つの態様において、本発明の抗IP-10抗体は、治療を必要とする被験者に抗体を投与することによって、歯肉炎の治療において用いることができる。抗体は、単独、または抗歯肉炎マウスウォッシュ（例えば、抗生物質マウスウォッシュ）、歯周歯石除去、ならびにルートプレーニングおよび歯周手術のような、他の物質または治療と併用して用いることができる。
【０２２８】
N. 遺伝子治療-関連炎症
遺伝子治療において用いられるアデノウイルスベクターとして用いられる複製欠損アデノウイルスは、ウイルスベクターの感染組織において急性の損傷および炎症を引き起こしうる。そのようなアデノウイルスベクターは、NFκBのカプシド依存的活性化を通してIP-10の発現を誘導することが示されている（Borgland, S.L.ら(2000)J. Virol. 74:3941〜3947）。したがって、本発明の抗IP-10抗体は、アデノウイルスベクターのように、IP-10の望ましくない産生を刺激するウイルスベクターを利用する遺伝子治療の際のIP-10誘導性の損傷および／または炎症を阻害するために用いることができる。
【０２２９】
O. 血管新生疾患
IP-10は、インビトロおよびインビボにおいて血管新生を阻害することが示されている（Strieterら(1995)Biochem. Biophys. Res. Commun. 210:51〜57；Angiolilloら(1995)J. Exp. Med. 182:155〜162；Lusterら(1995)J. Exp. Med. 182:219〜231）。血管新生は、外傷に対する治癒反応のような、多くの疾患プロセスにおいて重要な役割を果たしている。例えば、損傷した脊髄内の血管は、損傷後少なくとも28日まで能動的リモデリング状態に留まっている（Popovichら(1997)J. Comp. Neurol. 377:443〜464）。
【０２３０】
IP-10は、内皮細胞の増殖および走化性の阻害を通してその血管抑制作用を発揮すると考えられている。これは、そのヘパリン結合モチーフを通してと共に受容体媒介メカニズムを通してこの作用を発揮する。ヘパリン結合モチーフを通して、これは血管新生因子FGF-2およびVEFG165のその受容体に結合する結合を防止する。同様にこれは、受容体媒介プロセスによってもその作用を発揮する。IP-10の受容体であるCXCR3は、選択的スプライシングを受けて、公知の二つの変種CXCR3AおよびCXCR3Bを産生する。CXCR3A受容体にIP-10が結合すると、標的細胞の増殖および走化性が起こり、一方CXCR3BにIP-10が結合すると、増殖および走化性の阻害と反対の作用を有する。IP-10が血管抑制因子として作用するのはCXCR3B受容体による（Lasagniら(2003)J. Exp. Med. 197:1537〜1549）。
【０２３１】
前述を考慮して、本発明の抗IP-10抗体は、例えばIP-10の血管抑制挙動が治癒を遅らせ、または防止して疾患プロセスを悪化させる、血管新生を必要とする疾患の治療において用いることができる。そのような疾患には：1）創傷治癒、女性の月経周期、妊娠、運動性過栄養等に影響を及ぼす可能性がある異常な生理的血管新生；2）側副血管形成の誘導（心筋虚血、末梢虚血、脳虚血を含む）、冠動脈疾患、末梢血管疾患、卒中、創傷治癒、島細胞移植のような臓器移植後の肥大、骨折および腱の修復、再建手術、組織操作、再狭窄、脱毛、褥瘡およびうっ血性潰瘍、消化管潰瘍、胎盤不全、無菌性壊死、肺および全身高血圧症、血管性痴呆、アルツハイマー病、皮質下梗塞および白質脳症を伴う脳常染色体優性動脈症（CADASIL）、甲状腺偽嚢胞、およびリンパ浮腫を含む、脈管新生の刺激を必要とする可能性がある適応；ならびに3）血管奇形、乾癬、および子癇前症を含む血管リモデリングを必要とする可能性がある適応、が含まれる。本発明の抗体は、単独、または他の血管新生誘導物質と併用して用いることができる。
【０２３２】
P. 炎症性腎疾患
CXCR3受容体は、IgA腎症、膜性増殖性糸球体腎炎、または急速進行性糸球体腎炎を有する患者のメサンギウム細胞によって発現されることが報告されている（Romagnani, P.ら(1999)J. Am. Soc. Nephrol. 10:2518〜2526）。さらに、腎毒性腎炎のマウスモデルにおいて、IP-10 mRNAレベルは、腎炎の腎臓の皮質において腎炎の誘導後7日目で6倍増加した（Schadde, E.ら(2000)Nephrol. Dial. Transplant. 15:1046〜1053）。なおさらに、正常な腎臓と比較して糸球体腎炎のヒト患者の腎生検標本において、高レベルのIP-10発現を認めた（Romagnani, Pら(2002)J. Am. Soc. Nephrol. 13:53〜64）。したがって、本発明の抗IP-10抗体は、IgA腎症、膜性増殖性糸球体腎炎、および急速進行性糸球体腎炎を含む、炎症性腎疾患の治療に用いることができる。本発明の抗体は、単独、または抗生物質、利尿薬、高血圧治療薬および透析のような、糸球体腎炎の治療に用いられる他の物質もしくは治療と併用して用いることができる。
【０２３３】
Q. アテローム性動脈硬化症
IP-10は、アテローム性動脈硬化症の発病に対するその関与に関する平滑筋細胞の重要な特徴である、血管平滑筋細胞のマイトゲンおよび走化性因子であることが示されている（Wang, X.ら(1996)J. Biol. Chem. 271:24286〜24293）。IP-10はまた、LPSまたはインターフェロン-γによる治療後に平滑筋細胞において誘導されることが示されており、同様にバルーン血管形成術後のラット頚動脈において誘導された（Wang, Xら(1996)、上記）。その上、IP-10は、アテローム関連内皮細胞、平滑筋細胞およびマクロファージにおいて発現されることが証明されており、このことはアテローム発生の際の血管壁病変内で認められる活性化T細胞の動員および保持におけるIP-10の役割を示唆している（Mach, F.ら(1999)J. Clin. Invest. 104:1041〜1050）。したがって、本発明の抗IP-10抗体は、アテローム性動脈硬化症の治療または予防において用いることができる。抗体は、単独、または高血圧治療薬およびコレステロール低下薬のような、アテローム性動脈硬化症の治療に用いられる他の物質または治療と併用して用いることができる。
【０２３４】
R. ウイルス感染症
IP-10は、様々なウイルス感染症においてアップレギュレートされ、ウイルス感染症と闘うために活性化T細胞の動員において有用な役割を果たす可能性がある。しかし、特定の場合において、ウイルス感染の際のIP-10の産生によって有害な作用が起こる可能性があり、このように、IP-10活性は、望ましくない可能性があり、本発明の抗IP-10抗体を用いてそのようなウイルス感染症におけるIP-10活性を阻害することは望ましいかも知れない。
【０２３５】
例えば、IP-10は、単球由来マクロファージおよび末梢血リンパ球においてヒト免疫不全ウイルス（HIV）の複製を刺激することが示されている（Lane, B.R.ら(2003)Virology 307:122〜134）。さらに、IP-10レベルは、HIV感染患者の脳脊髄液および脳において、ならびにHIV gp120トランスジェニックマウスの中枢神経系（Asensio, V.Cら(2001)J. Virol. 75:7067〜7077）において上昇している。
【０２３６】
IP-10レベルはまた、慢性持続性C型肝炎ウイルス（HCV）患者および慢性活動性肝炎患者において上昇していることが示されている（Narumi, S.ら(1997)J. Immunol. 158:5536〜5544）。HCV感染肝臓において、IP-10は、肝細胞によって発現されるが、肝臓内の他の細胞タイプによって発現されないことが示されており、CXCR3陽性T細胞の有意に高い比率が血液と比較して肝臓において認められた（Harvey, C.E.ら(2003)J. Leukoc. Biol. 74:360〜369）。
【０２３７】
IP-10の分泌の増加は、マウスにおける急性眼部単純ヘルペスウイルスI型（HSV-1）感染症に対する炎症反応に関連することが示されており、HSV-1感染マウスの抗IP-10抗体による治療は、角膜間質への単核球浸潤を減少させる、角膜病態を減少させる、および角膜間質から網膜へのウイルスの進行を阻害することが示されている（Carr, D.J.ら(2003)J. Virol. 77:10037〜10046）。
【０２３８】
IP-10発現はまた、ウイルス性髄膜炎において発現されることが示されている。IP-10は、ウイルス性髄膜炎患者のCSFに存在することが示されており、好中球、末梢血単核球、および活性化T細胞における走化性活性に関与することが示されている（Lahrtz, F.ら(1997)Eur. J. Immunol. 27:2484〜2489；Lahrtz, F.ら(1998)J. Neuroimmunol.85:33〜43）。
【０２３９】
前述を考慮して、本発明の抗IP-10抗体は、治療を必要とする被験者に抗体を投与することによって、望ましくないIP-10活性を含むウイルス感染症の治療に用いることができる。治療することができるウイルス感染症の非制限的な例には、HIV（例えば、HIV脳炎）、HCV、HSV-1、ウイルス性髄膜炎、重症急性呼吸器症候群（SARS）が含まれる。抗体は単独、またはHIV感染症の場合、ヌクレオシド／ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤および／またはプロテアーゼ阻害剤（およびその組み合わせ）のような抗ウイルス薬、HCV感染症の場合、インターフェロンα2a、PEG化インターフェロンα2a、および／またはリバビリンのような抗ウイルス薬、およびHSV-1感染症の場合、アシクロビル、バラシクロビルおよび／またはファムシクロビルのような他の抗ウイルス薬と併用して用いることができる。
【０２４０】
S. 細菌感染症
細菌感染症は、罹患細胞においてIP-10産生を誘導する（Gasper, N.A.ら(2002)Infect. Immun. 70:4075〜82を参照されたい）。細菌性髄膜炎はまた、特にIP-10発現を誘発することが公知である（Lapinet, J.A.ら(2000)Infect. Immun. 68:6917〜23）。IP-10は、細菌感染症モデルにおいて輸精管の精巣体細胞によって産生され、このことは、細菌感染症の発病において古典的に認められている精巣の炎症の際の好中球およびTリンパ球の蓄積におけるこれらのケモカインの可能性がある役割を強く示している（Aubry, F.ら(2000)Eur. Cytokine Netw. 11:690〜8）。
【０２４１】
前述を考慮して、本発明の抗IP-10抗体は、治療を必要とする被験者に抗体を投与することによって、望ましくないIP-10活性を含む細菌感染症の治療に用いることができる。細菌感染症の例には、細菌性髄膜炎および細菌性肺炎が含まれるがこれらに限定されない。抗体は単独、または抗生物質のような他の抗菌剤と併用して用いることができる。
【０２４２】
本発明は、さらに制限的に解釈すべきではない以下の実施例によってさらに説明する。本出願を通して引用した全ての図面および全ての参考文献、特許、ならびに公表された特許出願の内容物は、特に参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０２４３】
実施例1：IP-10に対するヒトモノクローナル抗体の作製
抗原
大腸菌由来の精製組換え型ヒトIP-10（PeproTech, Inc., カタログ番号300-12）、またはキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）に結合した精製組換え型ヒトIP10を抗原として用いた。
【０２４４】
トランスジェニックHuMabおよびKMマウス
IP-10に対する完全なヒトモノクローナル抗体を、それぞれがヒト抗体遺伝子を発現するHuMabトランスジェニックマウスのHCo7、HCo12、およびHco17系統、ならびにトランスジェニックトランスクロモゾームマウスのKM株を用いて調製した。これらのマウス系統のそれぞれにおいて、内因性のマウスκ軽鎖遺伝子をChenら(1993)EMBO J 12:811〜820に記述されるようにホモ接合的に破壊して、内因性のマウス重鎖遺伝子をPCT公開国際公開公報第01/09187号の実施例1に記述されるようにホモ接合的に破壊した。これらのマウス系統のそれぞれは、Fishwildら(1996)Nature Biotechnology 14:845〜851に記述されるように、ヒトκ軽鎖トランスジーン、KCo5を有する。HCo7系統は、米国特許第5,545,806号、第5,625,825号、および第5,545,807号に記述されるようにHCo7ヒト重鎖トランスジーンを有する。HCo12系統は、PCT公開国際公開公報第01/09187号の実施例2に記述されるようにHCo12ヒト重鎖トランスジーンを有する。HCo17系統は、下記の実施例8に記述されるように、HCo17ヒト重鎖トランスジーンを有する。KM系統は、PCT公開国際公開公報第02/43478号に記述されるようにSC20トランスクロモゾームを含む。
【０２４５】
HuMabおよびKM免疫
IP-10に対する完全なヒトモノクローナル抗体を産生するために、HuMabマウスおよびKMマウスを、抗原として大腸菌由来精製組換え型IP10またはIP10-KLH結合体によって免疫した。HuMabマウスの一般的な免疫スキームは、Lonberg, N.ら(1994)Nature 368(6474):856〜859；Fishwald, D.ら(1996)Nature Biotechnology 14:845〜851、およびPCT公開国際公開公報第98/24884号に記述される。マウスは、抗原の初回注入時6〜16週齢であった。IP10抗原の精製組換え型調製物（5〜50 μg）（例えば、IP10を発現するトランスフェクト大腸菌細胞から精製）を用いて、HuMabマウスおよびKMマウスを腹腔内、皮下（Sc）またはフットパッド注射によって免疫した。
【０２４６】
トランスジェニックマウスは、フロイントの完全アジュバントまたはRibiアジュバントと共に抗原によって、腹腔内（IP）、皮下（Sc）、またはフットパッド（FP）注射によって2回免疫した後、3〜21日後に抗原をフロイントの不完全アジュバントまたはRibiアジュバントと共にIP、Sc、またはFP免疫した（全体で免疫11回まで）。免疫反応は、眼窩後方採血によってモニターした。血漿をELISA（下記のように）によってスクリーニングして、十分な力価の抗IP-10ヒト免疫グロブリンを有するマウスを融合のために用いた。マウスに抗原を静脈内に追加免疫した3および2日後、屠殺して脾臓を摘出した。典型的に、各抗原について10〜35回の融合を行った。各抗原に関して数ダースのマウスを免疫した。HCo7、HCo12、HCo17、およびKMマウス系統の全体で82匹をIP10によって免疫した。
【０２４７】
抗IP-10抗体を産生するHuMabまたはKMマウスの選択
IP-10に結合した抗体を産生するHuMabまたはKMマウスを選択するために、免疫したマウスからの血清をFishwild, D.ら(1996)によって記述されるようにELISAによって試験した。簡単に説明すると、マイクロタイタープレートを、大腸菌の精製組換え型IP10の1〜2μg/ml PBS溶液によって50 μl/ウェルで4℃で一晩コーティングした後、5％ニワトリ血清のPBS//Tween（0.05％）溶液200 μl/ウェルによってブロックした。IP10免疫マウスからの血清の希釈液を各ウェルに加えて室温で1〜2時間インキュベートした、プレートをPBS/Tweenによって洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）結合ヤギ抗ヒトIgG Fcポリクローナル抗体と共に室温で1時間インキュベートした。洗浄後、プレートをABTS基質（Sigma, A-1888、0.22 mg/ml）によって展開して、分光光度計によってOD 415〜495で分析した。抗IP-10抗体の最も高い力価を示したラットを融合のために用いた。融合を下記のように行って、ハイブリドーマの上清をELISAによって抗IP-10活性に関して試験した。
【０２４８】
IP10に対するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製
HuMabマウスおよびKMマウスから単離したマウス脾細胞を、標準的なプロトコールに基づいて、PEGによってマウス骨髄腫細胞株と融合させた。得られたハイブリドーマを抗原特異的抗体の産生に関してスクリーニングした。免疫したマウスからの脾臓リンパ球の単細胞浮遊液を、50％PEG（Sigma）を用いてSP2/0非分泌マウス骨髄腫細胞（ATCC, CRL 1581）の4分の1の数に融合させた。細胞を平底マイクロタイタープレートにおいて約1×105個/ウェルで播種した後、10％ウシ胎児血清、10％P388D1（ATCC, CRL TIB-63）条件培地、3〜5％オリゲン（IGEN）のDMEM溶液（Mediatech, CRL 10013、高グルコース、L-グルタミン、およびピルビン酸ナトリウム）プラス5 mM HEPES、0.55 mM 2-メルカプトエタノール、50 mg/mlゲンタマイシン、および1×HAT（Sigma, CRL P-7185）を含む選択培地において約2週間インキュベートした。1〜2週間後、HATをHTに交換した培地において細胞を培養した。次に、個々のウェルをヒト抗IP-10モノクローナルIgG抗体に関してELISA（上記のように）によってスクリーニングした。十分なハイブリドーマの増殖が起こった後、培地を通常10〜14日後にモニターした。抗体分泌ハイブリドーマを再度播種して、再度スクリーニングして、なおもヒトIgGに関して陽性であれば、抗IP-10モノクローナル抗体を、限界希釈によって少なくとも2回サブクローニングした。次に、安定なサブクローンをインビトロで培養して、さらなる特徴付けのために組織培養培地において少量の抗体を産生した。
【０２４９】
ハイブリドーマクローン1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12、および13C4をさらなる分析のために選択した。
【０２５０】
実施例2：IP-10に対するヒトモノクローナル抗体の構造的特徴付け
1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12、および13C4モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖可変領域をコードするcDNA配列を、標準的なPCR技術を用いて対応するハイブリドーマから得て、標準的なDNAシークエンシング技術を用いてシークエンシングした。DNAシークエンシングのみでは抗体の構造を明白に決定するために十分ではない場合、タンパク質分析（例えば、N-末端アミノ酸分析および質量分析）も同様に行って、結果をDNA配列分析と比較して、それによって正確な抗体構造を決定した。構造分析の結果は以下の通りである。
【０２５１】
1D4の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図1A、ならびに配列番号：99および35にそれぞれ示す。1D4の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図1Bならびに配列番号：110および84にそれぞれ示す。
【０２５２】
1E1の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図2A、ならびに配列番号：100および36にそれぞれ示す。1E1の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図2Bならびに配列番号：111および85にそれぞれ示す。
【０２５３】
2G1の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図3A、ならびに配列番号：101および37にそれぞれ示す。2G1の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図3Bならびに配列番号：112および86にそれぞれ示す。
【０２５４】
3C4の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図4A、ならびに配列番号：102および38にそれぞれ示す。3C4の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図4Bならびに配列番号：113および87にそれぞれ示す。
【０２５５】
6A5の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図5A、ならびに配列番号：103および39にそれぞれ示す。6A5の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図5Bならびに配列番号：114および88にそれぞれ示す。
【０２５６】
6A8の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図6A、ならびに配列番号：104および40にそれぞれ示す。6A8の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図6Bならびに配列番号：115および89にそれぞれ示す。
【０２５７】
6B10の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図7A、ならびに配列番号：105および41にそれぞれ示す。6B10の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図7Bならびに配列番号：116および90にそれぞれ示す。
【０２５８】
7C10の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図8A、ならびに配列番号：106および42にそれぞれ示す。7C10の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図8Bならびに配列番号：117および91にそれぞれ示す。
【０２５９】
8F6の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図9A、ならびに配列番号：107および43にそれぞれ示す。8F6の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図9Bならびに配列番号：118および92にそれぞれ示す。
【０２６０】
10A12の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図10A、ならびに配列番号：108および44にそれぞれ示す。10A12の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図10Bならびに配列番号：119および93にそれぞれ示す。
【０２６１】
13C4の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図11A、ならびに配列番号：109および46にそれぞれ示す。13C4の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図11Bならびに配列番号：120および94にそれぞれ示す。
【０２６２】
1D4、1E1、2G1、6A5、6A8、7C10、および10A12重鎖免疫グロブリン配列を公知のヒト生殖系列免疫グロブリン重鎖配列と比較すると、これらの抗体がヒト生殖系列VH 3-33からのVHセグメントを利用することが示された。1D4、1E1、2G1、6A5、6A8、7C10、および10A12 VH配列の生殖系列VH 3-33配列（配列番号：47）とのアラインメントを図12に示す。Kabat CDR決定システムを用いて1D4、1E1、2G1、6A5、6A8、7C10、および10A12 VH配列のさらなる分析によって、図1A、2A、3A、5A、6A、8A、および10Aに示されるように、重鎖CDR1、CDR2、およびCD3領域が示された。
【０２６３】
6B10および8F6重鎖免疫グロブリン配列を公知のヒト生殖系列免疫グロブリン重鎖配列と比較すると、これらの抗体重鎖がヒト生殖系列VH 3-30.3のVHセグメントを利用することが示された。6B10および8F6 VH配列の生殖系列VH 3-33（配列番号：48）とのアラインメントを図13に示す。Kabat CDR領域決定システムを用いた6B10および8F6 VH配列のさらなる分析により、図7Aおよび9Aにそれぞれ示されるように、重鎖CDR1、CDR2およびCD3領域が示された。
【０２６４】
3C4重鎖免疫グロブリン配列を公知のヒト生殖系列免疫グロブリン重鎖配列と比較すると、この抗体重鎖がヒト生殖系列VH 5-51のVHセグメントを利用することが示された。3C4 VH配列の生殖系列VH 5-51（配列番号：49）とのアラインメントを図14に示す。Kabat CDR領域決定システムを用いた3C4 VH配列のさらなる分析により、図4Aに示されるように、重鎖CDR1、CDR2およびCD3領域が示された。
【０２６５】
13C4重鎖免疫グロブリン配列を公知のヒト生殖系列免疫グロブリン重鎖配列と比較すると、この抗体重鎖がヒト生殖系列VH 4-61のVHセグメントを利用することが示された。13C4 VH配列の生殖系列VH 4-61（配列番号：50）とのアラインメントを図15に示す。Kabat CDR領域決定システムを用いた13C4 VH配列のさらなる分析により、図11Aに示されるように、重鎖CDR1、CDR2およびCD3領域が示された。
【０２６６】
1D4、2G1、6A5、6A8、10A12、および13C4軽鎖免疫グロブリン配列を公知のヒト生殖系列免疫グロブリン軽鎖配列と比較すると、これらの抗体がヒト生殖系列Vk A27からのVLセグメントを利用することが示された。1D4、2G1、6A5、6A8、10A12、および13C4 VL配列の生殖系列Vk A27配列（配列番号：95）とのアラインメントを図16に示す。Kabat CDR決定システムを用いた1D4、2G1、6A5、6A8、10A12、および13C4 VL配列のさらなる分析によって、図1B、3B、5B、6B、10B、および11Bにそれぞれ示されるように、軽鎖CDR1、CDR2、およびCD3領域が示された。
【０２６７】
1E1、6B10、および8F6軽鎖免疫グロブリン配列を公知のヒト生殖系列免疫グロブリン軽鎖配列と比較すると、これらの抗体がヒト生殖系列Vk L6からのVLセグメントを利用することが示された。1E1、6B10、および8F6 VL配列の生殖系列Vk L6配列（配列番号：96）とのアラインメントを図17に示す。Kabat CDR決定システムを用いた1E1、6B10、および8F6 VL配列のさらなる分析によって、図2B、7B、および9Bにそれぞれ示されるように、軽鎖CDR1、CDR2、およびCD3領域が示された。
【０２６８】
3C4軽鎖免疫グロブリン配列を公知のヒト生殖系列免疫グロブリン軽鎖配列と比較すると、3C4抗体軽鎖がヒト生殖系列Vk L18のVL配列を利用することが示された。3C4 VL配列の生殖系列Vk L18（配列番号：97）とのアラインメントを図18に示す。Kabat CDR領域決定システムを用いた3C4 VL配列のさらなる分析により、図4Bに示されるように、軽鎖CDR1、CDR2およびCD3領域が示された。
【０２６９】
7C10軽鎖免疫グロブリン配列を公知のヒト生殖系列免疫グロブリン軽鎖配列と比較すると、7C10抗体軽鎖がヒト生殖系列Vk L15のVL配列を利用することが示された。7C10 VL配列の生殖系列Vk L15（配列番号：98）とのアラインメントを図19に示す。Kabat CDR領域決定システムを用いた7C10 VL配列のさらなる分析により、図8Bに示されるように、軽鎖CDR1、CDR2およびCD3領域が示された。
【０２７０】
実施例3：抗IP-10ヒトモノクローナル抗体の結合特異性および結合速度論の特徴付け
本実施例において、抗IP-10抗体の結合親和性、結合速度論および結合特異性をBiacore分析によって決定した。同様に、結合特異性および交叉競合をELISAによって調べた。
【０２７１】
Biacore分析
抗IP-10抗体をBiacore分析（Biacore AB, Uppsala, Sweden）によって親和性および結合速度論に関して特徴を調べた。大腸菌発現精製組換え型ヒトIP-10（R & D Systems）を、Biacore ABによって提供されたEDC/NHS共役プロトコールを用いて、CM5センサーチップ@97 RUに共役させた。結合は、流速40 μl/分で33〜267 nMの濃度でHBS EP緩衝液（Biacore ABによって提供）において抗体を流動させることによって測定した。抗原-抗体解離速度論を5分間追跡して、解離速度論を8分間追跡した。結合および解離曲線を、BIA評価ソフトウェア（Biacore AB）を用いて1：1ラングミュアー結合モデルに適合させた。結合および解離相単独に関する初回の数十秒間に対応するデータを結合力の影響を最小限にするように曲線を適合するために検討した。実験は25℃および37℃の双方で行った。決定されたKD、konおよびkoff値を25℃での結合に関して表1に、および37℃での結合に関して表2に示す。
【０２７２】
（表１）25℃でのヒトIP-10による結合特徴
0005466691.tif 000002
*6A5バッチ2は、試料6A5と比較した場合の6A5ハイブリドーマ上清からの精製抗体の独立した試料である。
【０２７３】
（表２）37℃でのヒトIP-10による結合特徴
0005466691.tif 000003
【０２７４】
解離相の際の抗体-抗原複合体の半数が解離するために必要な時間であると定義される抗体の半減期（時間）を25℃および37℃で測定した。値は、解離センソグラムのY-軸の50％減少に必要な時間を得るために解離曲線の伸長によって決定した。結果を下記の表3に示す。
【０２７５】
（表３）25℃および37℃での抗体の半減期
0005466691.tif 000004
【０２７６】
25℃でのアカゲザルIP-10、ヒトMIG、ヒトITAC、およびマウスIP-10との抗体の交叉反応性を、ヒトIP-10に関して先に記述した方法と同じ方法を用いてBiacore分析によって決定した。ヒトMIG、ヒトIP-10およびマウスIP-10は購入した（PeproTech, Rocky, Hill, NJ）が、アカゲザルIP-10は組換え発現によって作製して標準的な方法によって精製した。抗原をCM5センサーチップ@140 RU（アカゲザルIP-10）、457 RU（ヒトMIG）、206 RU（ヒトITAC）および150 RU（マウスIP-10）に結合させた。抗体をHBS EP緩衝液において濃度133 nMで5分間流動させることによって解離センソグラムを得た。次に、流動を停止させて、解離を5分間モニターした。結合および解離曲線を、BIA評価ソフトウェア（Biacore AB）を用いてラングミュアー結合モデルに適合させた。交叉反応性実験の結果を下記の表4に要約する。
【０２７７】
（表４）様々なCXCR3リガンドとの抗IP-10の交叉反応性
0005466691.tif 000005
【０２７８】
ELISA分析
ヒトMIG、アカゲザルIP-10またはマウスIP-10に関して抗IP-10抗体の抗原性交叉反応性を調べるために、ELISA法を用いてさらなる実験を行った。ELISAのために用いた技法は、マイクロタイタープレートを1μg/ml組換え型ヒトIP-10、ヒトMIG（PeproTech, カタログ番号300-26）、マウスIP-10（PeproTech, カタログ番号250-16）または組換え型アカゲザルIP-10のいずれかによってコーティングしたことを除き、先の実施例1に記述した通りであった。EC50値（ng/ml）として表記された結果を以下の表5に要約する。
【０２７９】
（表５）様々なCXCR3リガンドによるELISAによる抗IP-10交叉反応性
0005466691.tif 000006
【０２８０】
抗体がIP-10上の異なるエピトープを認識するか否かを決定するために、様々な抗IP-10抗体のあいだの交叉競合試験も同様に、ビオチン化型6A5および2G1を用いてELISAによって行った。競合的ELISAのための技法は、実施例1において先に記述したELISAと類似であった。簡単に説明すると、マイクロタイタープレートを、大腸菌からの精製組換え型IP-10の0.2μg/mlPBS溶液によって50 μl/ウェルでコーディングして4℃で一晩インキュベートした。次に、ウェルを5％ニワトリ血清のPBS/Tween（0.05％）溶液200 μl/ウェルによってブロックした。精製ヒト抗ヒトIP-10抗体の希釈液（2μg/ml〜3.91 ng/ml）を各ウェルに加えて、室温で30分間インキュベートした。プレートをPBS/Tweenによって洗浄した後、0.1μg/mlビオチン-6A5またはビオチン-2G1と共に30分間インキュベートした。プレートをPBS/Tweenによって3回洗浄した。洗浄後、ホスファターゼ標識ストレプトアビジン（KPL、カタログ番号15-30-00）を、5％ニワトリ血清において2000倍希釈して各ウェルに加えて、室温で1時間インキュベートした。洗浄後、プレートをp-NPP基質（Moss, Inc., ロット10274021）によって展開して、分光光度計においてOD 405で分析した。予想されたように、非標識2G1は、IP-10に対する結合に関してビオチン-2G1と競合することができ、その上、非標識6A5、7C10、10A12、10A12S、6B10、8F6、および1D4はそれぞれ、ヒトIP-10に対するビオチン-2G1の結合に競合することができる。同様に、非標識6A5は、IP-10に対する結合に関してビオチン-6A5と競合することができ、その上非標識2G1、7C10、10A12、10A12S、6B10、8F6、および1D4はそれぞれ、ヒトIP-10に対するビオチン-6A5の結合に競合することができる。これらの結果は、これらの抗体のそれぞれが、ヒトIP-10の同じエピトープ（またはエピトープ群）に対して結合特異性を有することを示している。
【０２８１】
実施例4：CXCR3に対するIP-10結合の阻害
本実施例において、抗IP-10抗体が、受容体発現細胞上のその受容体CXCR3に対するヒトIP-10の結合を阻害できるか否かを調べた。最初に、CXCR3を発現するようにトランスフェクトした300.19細胞に対する125I-IP-10結合に関するスキャッチャード分析を行った。細胞を10％FCSおよびG418選択を含むRPMI培地において増殖させた。使用前、細胞をHank's Balanced Salt Solution（HBSS）によって4℃で2回洗浄して、4×107個/mlに調節した。ガラス繊維プレート（Millipore MultiScreen（登録商標）、カタログ番号MAFBN0B50）を0.1％ポリエチレンジアミン溶液200 μlによって実験の1日前にブロックした。試験当日、ブロッキング緩衝液をMilliporeマニホルドを用いて吸引した。プレートを結合緩衝液（50 mM HEPES、pH 7.2、1 mM CaCl2、5 mM MgCl2、0.5％BSA）200 μlによって3回洗浄した。結合緩衝液25マイクロリットルを各ウェルに加えた後、1000倍過剰量の非標識IP-10または結合緩衝液25μlのいずれかを加えた。増加濃度の125I-IP-10（Amersham、カタログ番号IM332-25μCi）25μlを加えた後、細胞1×106個/ウェルの密度25μlを加えた。プレートをプレートシェーカーにおいて室温で60分間インキュベートして、洗浄緩衝液（10 mM HEPES、pH 7.2、0.5 M NaCl、0.5％BSA）によって各200 μlで3回洗浄した。プレートを乾燥させて、シンチラント25μlを加えて、プレートをWallac Microbetaカウンターにおいて計数した。Prismソフトウェアを用いてデータを分析して、KDを計算した。0.231 nMのKDの平均値を受容体結合に関して決定した。
【０２８２】
次に、抗IP-10抗体が100 pM-125I-hIP-10のCXCR3発現細胞に対する結合の阻害能を調べた。競合アッセイ法は、上記の実験と類似のように行った。簡単に説明すると、結合緩衝液25μlをガラス繊維フィルタープレートに加えた後、抗IP-10抗体の増加濃度25μlを加えた。125I-IP-10 25μlを最終濃度0.100 nMで加えた。最後に、密度1×106個/ウェルの細胞25μlを加えて、プレートをプレートシェーカーにおいて室温で60分間インキュベートして、洗浄して上記のように計数した。Prismソフトウェアを用いてEC50値を計算した。Ki値（nM）を以下の式を用いて決定した。
0005466691.tif 000007
【０２８３】
結果を下記の表6に概要する。
【０２８４】
（表６）CXCR3に対するIP-10結合の阻害
0005466691.tif 000008
【０２８５】
実施例5：IP-10誘導性のカルシウム流入の阻害
本実施例において、抗IP-10抗体がIP-10誘導性のカルシウム流入を阻害できるか否かを、CXCR3を発現するようにトランスフェクトした300.19細胞またはCXCR3を発現する抗CD3活性化ヒト末梢血リンパ球（PBLs）のいずれかを用いて調べた。PBLsを調製するために、正常ヒト血液を標準的なFicoll分離によって精製した。3 μg/ml抗CD3抗体によってコーティングしたプレートに細胞を加えて精製ヒトPBLsを刺激して、10％FBSを含むRPMIにおいて増殖させた。3日間インキュベーション後、500 U/ml IL-2を含む増殖培地において細胞を維持した。試験当日、細胞を洗浄して、密度2.5×107個/mlで培地に浮遊させた。CXCR3を発現するようにトランスフェクトした300.19細胞を10％FBSを含むRPMI培地において増殖させた。300.19細胞を2×106個/mlで増殖培地に浮遊させた。
【０２８６】
アッセイ法を行うために、細胞浮遊液100 μlを、ポリ-D-リジン（Corning/Costar、カタログ番号3667）によってコーティングした側面の黒い底の透明な96ウェルプレートに加えた。カルシウム3キットローディング色素（FlexStation（商標）、Molecular Devices, Inc., Sunnyvale, CA）100μlを各ウェルに加えて、プレートを1100 rpmで4分間遠心した後、37℃で30分間インキュベートした。96ウェル試薬プレートを用いて、ヒトIP-10（Peprotech、カタログ番号300-12）を、20 mM HEPESおよび1％FBS（300.19細胞に関して800 pM、ヒトPBLに関して1200 pM）を含むHank's Balanced Salt Solutionにおいて希釈した。IP-10を含む試薬プレートにおいて抗体を連続希釈した。緩衝液単独またはIP-10単独を含む対照ウェルを含めた。各ウェルあたりIP-10/抗体溶液22μlを、色素標識細胞を含むプレートに加えて、FlexStation（商標）機器を用いて製造元の説明書に従って、カルシウム3蛍光を200秒間モニターすることによって、カルシウム流入を決定した。標準的なプロトコールに従って20〜100秒のあいだカルシウム流入を積分することによって、曲線下面積（AUC）を計算した（例えば、Smart, D.ら(1999)Br. J. Pharmacol.128:1〜3）。データをPrism（商標）ソフトウェア（Molecular Devices, Inc., ）を用いて分析して、IC50値（nM）を決定した。結果を下記の表7に要約する。
【０２８７】
（表７）IP-10誘導性のカルシウム流入の阻害
0005466691.tif 000009
【０２８８】
実施例6：IP-10誘導性の細胞遊走の阻害
抗IP-10抗体がIP-10によって誘導される細胞遊走を阻害する能力を、インビトロ走化性アッセイ法において試験した。これらの実験において、CXCR3発現300.19細胞を用いて以下のいずれかによって刺激した：（i）100 ng/ml組換え型ヒトIP-10（rhIP-10）；（ii）THP-1誘導IP-10が濃度16 ng/mlであって、MIG活性が2.5 μg/ml抗MIG（R&D system）の添加によって遮断される、IFNγ（天然のIP-10およびMIGの分泌を誘導する）によって刺激したTHP-1細胞の上清；または（iii）100 ng/ml組換え型アカゲザルIP-10（rrmIP-10）。細胞遊走の阻害は、様々な濃度の抗体を用いて評価して、走化性指標を決定した。
【０２８９】
特に、走化性の阻害は、標準的な96ウェルプレートアッセイ法（Multiscreen MICプレート（Millipore））を用いて評価した。トランスフェクト細胞株に関して5μmフィルターを用い、初代培養細胞に関して3μmフィルターを用いた。反応する細胞（300.19 CXCR3+；MBP-特異的ヒトPBMC細胞）を、走化性緩衝液（RPMI＋1％BSAまたはFBS）に1×106個/mlで浮遊させた。細胞浮遊液100 μlを上部のウェルに加えて37℃で30分間インキュベートさせた。5％CO2を適用した後、底のウェルに加えた。
【０２９０】
ヒトおよびアカゲザルIP-10を100 ng/mlで調製した；THP-1由来IP-10に関して、THP-1細胞をIFN-γ（0.2 ng/ml）によって刺激して、上清を回収した。MS CSF由来IP-10を無希釈で用いた。リガンドを走化性緩衝液150 μLにおいて調製して、下室に入れた。
【０２９１】
走化性阻害アッセイ法において、リガンドを様々な濃度の表記の抗IP-10抗体（5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.613μg/ml、0.3μg/ml、0.015μg/ml）と共に37℃5％CO2においてアッセイ前に30分間プレインキュベートした。上室をウェルの上に置いて、ウェルを37℃5％CO2において2時間インキュベートした。インキュベーション終了時、反応する細胞を上室から吸引した。上室を注意深く除去した。細胞を無作為の視野4個/ウェルで倍率400倍で計数した。データをウェル3個について平均して、走化性指標として表した（すなわち、培地単独に対してリガンドに反応した遊走倍率）。
【０２９２】
結果をIC50値として表記して、下記の表8に概要する。
【０２９３】
（表８）IP誘導性細胞遊走の阻害
0005466691.tif 000010
【０２９４】
多発性硬化症(MS)患者の脳脊髄液（CSF）に反応して抗IP-10抗体がCXCR3発現300.19細胞を阻害するか否かも同様に調べた。この場合も抗MIG抗体を2.5μg/mlでCSF試料に加えて、MIG活性を中和した。実験2回の結果をIC50値として表記し、下記の表9に要約する。
【０２９５】
（表９）MS-CSF誘導性細胞遊走の阻害
0005466691.tif 000011
【０２９６】
細胞遊走試験はまた、抗IP-10抗体がMIG誘導細胞遊走を阻害できるか否かを調べるために、CXCR3発現300.19細胞および200 ng/ml組換え型ヒトMIG（R&D Systems）を用いて行った。抗IP-10抗体6B10、8F6、1D4、6A5バッチ2、10A12、および10A12Sを1μg/mlで個々に試験して、MIG誘導細胞遊走を阻害しないことが判明した。
【０２９７】
実施例7：MS患者の脳切片に対する抗体の結合
本実施例において、抗IP-10抗体が多発性硬化症からの脳切片を染色できるか否かを調べた。57歳女性MS患者の脳切片を死後19.8時間に得て、これは不規則な形状の脳室周囲斑（1.3 cm×1.0 cm）を示し、残りの白質全体に多数のさらなる小さい斑を示した。LFB染色は、完全な脱髄を示した。6A5（バッチ2）および10A12S抗IP-10抗体と共に、陽性対照として抗GFAPおよび抗CD68を用いて、ならびに陰性対照抗体を用いて切片に対して免疫組織化学を行った。
【０２９８】
切片の抗IP-10染色に関して標準的な免疫組織化学プロトコールを用いた。切片を2％〜10％血清を用いてブロックした。2％血清において1：100倍希釈した一次抗体（例えば、6A5）を100 μl/切片で加えた後、RTで1時間インキュベートした。選択的に切片を4℃で一晩インキュベートして、洗浄した。二次抗ヒトビオチン化抗体（2％血清において希釈（100 μl/切片））を加えて、RTで30〜60分間インキュベートした。H2O2のMeOH希釈液を加えることによって、内因性のペルオキシダーゼを除去した。次に、ABC溶液（Vector Labs）を100μl/切片で加えて、RTで30分間インキュベートした。DAB基質溶液を使用直前に調製した。100 μl/切片をスライドガラスに適用した後、暗所で10〜20分間インキュベートした（現像にとって必要であれば）。次に、スライドガラスをヘマトキシリン核染色によって3分間対比染色した（進行を1分後にチェックする）。最後にスライドガラスを2％重炭酸ナトリウムにおいて45秒間インキュベートして、発色させた。
【０２９９】
結果は、6A5および10A12Sの双方が、MS患者の脳切片においてインサイチューでIP-10に結合でき、6A5染色は10A12S染色より強いことを示した。
【０３００】
実施例8：トランスジェニックマウスのHCo17株の構築
pHC2の80 kbインサート、pVX6の25 kbインサート、およびyIgH24染色体の〜460 kb酵母人工染色体断片を同時注入することによってHCo17トランスジェニックマウス系統を作製した。pCH2構築物は単独で、インビボで完全に再配列を受けて、機能的ヒト重鎖免疫グロブリン座を形成することができる；さらなる生殖系列VH多様性を与えるためにpVX6およびyIgH24を加えた。HCo17を産生するために用いたDNA混合物の個々の成分を以下に示す。
【０３０１】
上記のpHC2インサートは、四つの機能的ヒト生殖系列VH遺伝子セグメントを含む：1-69（DP-10）、5-51（DP-73）、4-34（DP-63）、および3-30.3（DP-46）。さらに、この構築物はまた、機能的Dセグメント、全ての6Jセグメントと共にμおよびγ1定常領域セグメントならびに機能的μ-γ1スイッチ領域を含むヒトゲノム配列を含む。
【０３０２】
pVX6インサートはヒト生殖系列VHセグメント3個、すなわちVH1-18（DP-14）、VH5-51（DP-73）、VH-3-23（DP-47）を含む。生殖系列ヒトVH1-18（DP-14）遺伝子を含む8.5 kb HindIII/Sal I DNA断片を、約2.5 kbの5'隣接および5 kbの3'隣接ゲノム配列と共にプラスミドベクターpSP72（Promega, Madison, Wis.）にサブクローニングして、プラスミドp343.7.16を作製した。生殖系列ヒトVH5-51（DP-73）遺伝子を含む7 kb BamHI/HindIII DNA断片を、約5 kbの5'隣接および1 kbの3'隣接ゲノム配列と共にpBR322に基づくプラスミドクローニングベクターpGP1f（Taylorら(1992)Nucleic Acids Res. 20:6287〜6295）にクローニングして、プラスミドp251fを作製した。pGP1fに由来する新規クローニングベクターpGP1kをEcoRV/BamHIによって消化して、約4 kbの5'隣接および5 kbの3'隣接ゲノム配列と共に生殖系列ヒトVH3-23（DP47）遺伝子を含む10 kb EcoRV/BamHI DNA断片にライゲーションした。得られたプラスミドp112.2RR.7をBamHI/SalIによって消化して、p251fの7 kb精製BamHI/SalIインサートにライゲーションした。得られたプラスミドpVx4をXhoIによって消化して、p343.7.16の8.5 kb XhoI/SalIインサートにライゲーションした。クローンをVH1-18遺伝子に関して他の二つのV遺伝子と同じ方向で得た。pVx6と呼ばれるこのクローンを、インサート調製のためにNotIによって消化した。
【０３０３】
酵母人工染色体（YAC）yIgH24は、当初、VH3およびVH4ファミリー特異的プライマーを用いてPCRスクリーニングによって同定され、VH含有量によってヒト第14染色体にマッピングされる。yIgH24が、VHファミリーのメンバー、VH1、VH2、VH3、VH4、およびVH5、ならびに特に少なくともVH1-24、VH 1-45、VH 1-46、VH 2-26、VH3-30、V 3-30.5、VH 3-30.3、VH 3-33、VH 3-43、VH 3-48、VH 3-49、VH 3-53、VH 4-28、VH 4-30、VH 4-30.4、VH 4-30.3、VH4-31、VH 4-34、4-39、およびVH5-51を含むVHセグメントを含むことが確立された。
【０３０４】
pVX6（26 kb）、pHC2（80 kb）、およびyIgH24（〜460 kb）からの精製インサートを1：1：1モル比で混合して、Hoganら（B. Hoganら「Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual」, 2 nd edition 1994, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.）によって記述されるように、1日半の（C57BL/6J×DBA/2J）F2胚の前核にマイクロインジェクションした。pVx6、HC2、およびyIgH24からの配列を含むトランスジェニックマウスの創始動物を、注入した胚から発達させたマウスから確立した。この系統を（HCo17）25950と命名した。
【０３０５】
（HCo17）25950系統を、CMD変異（PCT公開国際公開公報第01/09187号の実施例1に記述される）、JKD変異（Chenら(1993)EMBO J. 12:811〜820）、および（Kco5）9272トランスジーン（Fishwildら(1996)Nature Biotechnology 14:845〜851）を含むマウスと交配させた。得られたマウスは、内因性のマウス重鎖およびκ軽鎖座の破壊に関してホモ接合であるバッググラウンドにおいて、ヒト免疫グロブリン重鎖およびκ軽鎖トランスジーンを発現する。
【０３０６】
配列表の概要
0005466691.tif 000012
0005466691.tif 000013
0005466691.tif 000014
【０３０７】
同等物
当業者は、単なる日常的な実験を用いて、本明細書に記述の本発明の特定の態様の多くの同等物を認識、または確認することができるであろう。そのような動物は、以下の請求の範囲に含まれると意図される。
【図１Ａ】
0005466691.tif 000015
【図１Ｂ】
0005466691.tif 000016
【図２Ａ】
0005466691.tif 000017
【図２Ｂ】
0005466691.tif 000018
【図３Ａ】
0005466691.tif 000019
【図３Ｂ】
0005466691.tif 000020
【図４Ａ】
0005466691.tif 000021
【図４Ｂ】
0005466691.tif 000022
【図５Ａ】
0005466691.tif 000023
【図５Ｂ】
0005466691.tif 000024
【図６Ａ】
0005466691.tif 000025
【図６Ｂ】
0005466691.tif 000026
【図７Ａ】
0005466691.tif 000027
【図７Ｂ】
0005466691.tif 000028
【図８Ａ】
0005466691.tif 000029
【図８Ｂ】
0005466691.tif 000030
【図９Ａ】
0005466691.tif 000031
【図９Ｂ】
0005466691.tif 000032
【図１０Ａ】
0005466691.tif 000033
【図１０Ｂ】
0005466691.tif 000034
【図１１Ａ】
0005466691.tif 000035
【図１１Ｂ】
0005466691.tif 000036
【図１２】
0005466691.tif 000037
【図１３】
0005466691.tif 000038
【図１４】
0005466691.tif 000039
【図１５】
0005466691.tif 000040
【図１６】
0005466691.tif 000041
【図１７】
0005466691.tif 000042
【図１８】
0005466691.tif 000043
【図１９】
0005466691.tif 000044
【配列表】
0005466691000001.app