(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アベーシック部分を含む、配列内に突然変異又は多型性部位を有する互いに異なる核酸鋳型を共通に増幅するためのPCR増幅用プライマーを含むPCR増幅用組成物に核酸鋳型を混合するステップ、及び前記混合物に対しPCR増幅を行うステップを含む、塩基配列内に突然変異部位を有する互いに異なる核酸鋳型を共通に増幅するための、又は塩基配列内に多型性部位を有する互いに異なる核酸鋳型を共通に増幅するためのPCR増幅方法であって、
前記アベーシック部分は、ディースペーサ(dSpacer, 5'-O-dimethoxytrityl-1',2'-dideoxyribose-3'-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite)、メトキシディースペーサ(1'-OMe-dSpacer, 5'-O-dimethoxytrityl-1'-methoxy-2'-dideoxyribose-3'-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite)、ピーシースペーサホスホアミダイト(PC Spacer Phosphoramidite, [4-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)butyramidomethyl)-1-(2-nitrophenyl)-ethyl]-2-cyanoethyl-(N,N-diisopropyl)-phosphoramidite)、アールスペーサシーイーホスホアミダイト(rSpacer CE Phosphoramidite,5'-O-Dimethoxytrityl-1'-Deoxyribose-2'-O-Triisopropylsilyloxymethyl-3'-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite)、スペーサシー12シーイーホスホアミダイト(Spacer C12 CE Phosphoramidite, 12-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)-dodecyl-1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite)、スペーサホスホアミダイト18(Spacer Phosphoramidite 18, 18-O-Dimethoxytritylhexaethyleneglycol,1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite)、スペーサホスホアミダイト9(Spacer Phosphoramidite 9,9-O-Dimethoxytrityl-triethyleneglycol,1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite)及びスペーサホスホアミダイトシー3(Spacer Phosphoramidite C3,3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)propyl-1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite)で構成された群から選択されることを特徴とする、PCR増幅方法。
【請求項２】
プライマー内のアベーシック部分の数は、1〜10個の範囲であることを特徴とする、請求項1に記載のPCR増幅方法。
【請求項３】
プライマー内のアベーシック部分の数は、1〜3個の範囲であることを特徴とする、請求項2に記載のPCR増幅方法。
【請求項４】
アベーシック部分によるTm減少を補償するため、前記プライマーの末端に、鋳型に相補的な塩基を追加したことを特徴とする、請求項1から請求項3の何れか1項に記載のPCR増幅方法。
【請求項５】
前記PCR増幅用組成物は、反応用緩衝溶液、4種のdNTP及びDNAポリメラーゼをさらに含む、請求項1に記載のPCR増幅方法。
【請求項６】
前記PCR増幅用組成物は、染料及び／または安定化剤をさらに含むことを特徴とする、請求項5に記載のPCR増幅方法。
【請求項７】
前記染料は、ブロモフェノールブルー、キシレンシアノール、ブロモクレゾールレッド及びクレゾールレッドで構成された群から選択される1つ以上であることを特徴とする、請求項6に記載のPCR増幅方法。
【請求項８】
前記安定化剤は、ゼラチン、牛血清アルブミン、Thesit、PEG-8000及び多価アルコールで構成された群から選択される1つ以上であることを特徴とする、請求項6に記載のPCR増幅方法。
【請求項９】
PCR増幅用プライマー対のうち1つはアベーシック部分を含むプライマーであり、他の1つはアベーシック部分を含まない正常プライマーであることを特徴とする、請求項1に記載のPCR増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プライマー及びこれを用いたPCR増幅方法に係り、より詳しくは、鋳型DNAの突然変異または多型性(polymorphism)部位に相補的なプライマー内にアベーシック(Abasic)部分を有し、互いに異なる鋳型を共通に増幅することができるプライマー及びこれを用いたPCR増幅方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
重合酵素連鎖反応(以下、「PCR」と記す)として公知の、最も多く用いられる核酸増幅方法は、二本鎖DNAの変性、DNA鋳型へのオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング、及びDNAポリメラーゼによるプライマー延長の繰り返されたサイクル過程を含む(Mullisなど、米国特許第4,683,195号、第4,683,202号及び第4,800,159号;Saiki et al、1985)。PCRに用いられるオリゴヌクレオチドプライマーはDNAの反対側鎖にアニーリングされるようにデザインされ、プライマーのDNAポリメラーゼ延長生成物は他のプライマーのための鋳型鎖として作用する。PCR増幅過程はDNA配列の指数的増加をもたらし、増幅されたDNA配列の長さはオリゴヌクレオチドプライマーの5'-末端により決定される。
【０００３】
核酸増幅、特に、PCR増幅における成功は、プライマーが自分のターゲット配列にのみアニーリングする特異性に依存するので、前記分子相互作用を最適化するのが重要である。プライマーがその完全な相補体にのみアニーリングするのか、或いは1つまたはそれ以上のミスマッチ(mismatch)ヌクレオチド配列を有する配列にもアニーリングするのか否かは、アニーリング温度により決定される。一般に、アニーリング温度が高いと、完全なマッチ鋳型に対するプライマーの特定アニーリング可能性がさらに一層高くなるので、ターゲット配列のみ増幅される可能性がさらに一層高くなる。アニーリング温度が低いと、鋳型とプライマーとの間のより多いミスマッチに対し耐性(tolerance)が発生し、結局非ターゲット配列に対する増幅が増加する。アニーリング温度を調節すれば、鋳型とプライマーとの間のペアリング特異性を変化させることができる。例えば、1つのプライマーのみ存在する対照群で他の生成物が発生するとすれば、このような結果は、前記単一プライマーが鋳型の1つ以上の部位にアニーリングするとのことを表わす。このような場合、アニーリング温度を上昇させるのが好ましい。プライマーのアニーリング特異性に対するアニーリング温度の前記効果を考慮すれば、アニーリング温度に従ってプライマーアニーリングを調節することができるので、プライマーデザインに係りなくプライマーのアニーリング特異性を改善させることのできるアニーリング調整プライマーシステムに対する強い要求があることが分かる。
【０００４】
アニーリング温度だけでなく、プライマーの長さ、GC量及びPCR生成物の長さのようにプライマーパラメータ等は、プライマーのアニーリング特異性のために考慮されなければならない。仮に、前述のパラメータを満足するプライマーが用いられれば、プライマーアニーリングは特定化され、ターゲットDNA増幅でプライマーのアニーリング特異性は相当改良され、プライマーによりもたらされるバックグラウンド問題と非特異性生成物の問題が解決される。よくデザインされたプライマーは、非特異性アニーリング及びバックグラウンド問題を解決するだけでなく、RNA-PCRでcDNAまたはゲノム鋳型等を区別することができるようにする。
【０００５】
多くの場合において、プライマー配列は鋳型配列に対する完全な相補物になることを求めない。鋳型と完全にマッチされなければならないプライマーの部位は3'-末端であり、これは前記末端がDNAポリメラーゼにより延長される部位であるためであり、ここに正確なターゲット配列に対するアニーリング特異性の担保に前記末端が最も重要である。プライマーの5'-末端はターゲット配列に対するアニーリングの特異性の決定にそれほど重要でなく、鋳型に対し非相補的な追加配列、例えば、制限酵素位置とプローモーター配列を運ぶように変形され得る。
【０００６】
分子診断検査または核酸診断検査は、体外診断検査市場の中で最も早い速度で成長する分野で、世界市場で約20%の年平均成長率を見せている。分子診断検査は、2003年30兆ウォンほどの体外診断検査市場の中で8%の占有率を見せているが、2008年には13%以上を占めて売上規模は5兆ウォン以上、年平均成長率は19%程度になるものと見込まれる。分子診断検査法は、疾病を発生させるウイルス、バクテリア、かびなどをPCRで検査するものであって、特定病源菌遺伝子塩基配列に相補的なオリゴヌクレオチド(プライマー、プローブ)を用いて病源菌の感染有無を確認する。PCRを用いた病源菌感染有無診断法は、鋳型になる遺伝子に特異的なプライマーだけを用いて前記遺伝子のみを特異的に検出することにより、陽性及び陰性を判定するための適用法に用いられており、ELISA(enzyme-linked immuno-sorbent assay)を用いた抗原抗体検出法に比べ高い敏感度と経済性を確保することができるとの利点がある。
【０００７】
マルティプレックス(multiplex)PCRは、PCRの別の変形形態であって、同一の反応物で1つ以上のプライマー対を用いて1つ以上のターゲット配列を同時に増幅することができる。1988年に最初に紹介されて以来(Chamberlain et al., Deletion Screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA Amplificationm Nucleic Acids Res., 16, 11141-11156, 1988)、この方法は遺伝子欠失の分析(Anonymous, Diagnosis of Duchenne and Becker muscular dystrophies by polymerase chain reaction, A multicenter study. JAMA 267, 2609-2615, 1992; Henegariu, et al., Rapid screening of the Y chromosome in idiopathic sterile men, diagnostic for deletions in AZF, a genetic Y factor expressed during spermatogenesis, Andrologia, 26, 97-106, 1994)、変異及び遺伝子多型性分析(Shuber et al., Efficient 12-mutation testing in the CFTR gene: a general model for complex mutation analysis, Hum. Mol. Geenet., 2, 153-158, 1993; Mutirangura et al., Mutiplex PCR of three dinucleotide repeats in the Prader-Willi/Angelman critical region (15q11-q13): molecular diagnosis and mechanism of uniparental disomy, Hum. Mol. Genet., 2, 143-151, 1993)、定量分析(Zimmermann et al., Quantitative multiplex competitive PCR of HIV-1 DNA in a single reaction tube, BioTechniques 21, 480-484, 1996)及びRNA検出(Zou et al., Identification of new influenza B virus variants by multiplex reverse transcription-PCR and the heteroduplex mobility assay, J. Clin. Microbiol., 36, 1544-1548, 1998)を含むDNA分析の多様な分野に成功的に用いられている。感染疾患の分野で、この技術はウイルス、バクテリア、菌類及び/または寄生虫の同定に価値のある方法として評価されている。
【０００８】
しかし、マルティプレックスPCRから得た結果は、増幅過程の人為的要素のため度々複雑に出る。このような誤謬の結果として、反応失敗による「偽陰」結果、そして偽生成物の増幅のような「偽陽」結果を含み、前記偽陽結果は本来の認知配列と係わっているが、それとは明らかに異なる配列にプライマーがアニーリングするため発生する。マルティプレックスPCRでプライマーは、その混成化キネティクス(kinetics)が同一のマルティプレックス反応物に用いられる他のプライマーの混成化キネティクスと類似するようにデザインされなければならない。アニーリング温度及びプライマーの濃度はある程度計算され得るが、一般的に条件等はそれぞれのマルティプレックス反応に対し経験的に決定されなければならない。プライマー対が増加するほど、非特異プライミング可能性が増加するため、それぞれのプライマー対を追加するたびに条件等を変形させなければならない。さらに、反応物に対する競争(例えば、プライマーの枯渇)からもたらされる人為的要素はマルティプレックスPCRでさらに増加し、不均等に増幅された産物の収率の差は、サイクルが進められるほどさらに大きくなるためである。したがって、マルティプレックスPCRの反応条件を最適化することは、人力と時間が多く費やされる作業である。互いに異なるマルティプレックスPCRは独特の反応条件等を有するため、新しい診断試験方法の開発は費用を多く要する。
【０００９】
単一塩基変異(single nucleotide polymorphism、以下「SNP」と記す)は、人種、年齢または性別間の染色体が有している塩基配列のうち、個人偏差を表わす塩基変異の中で一塩基対が相違する場合を言い、DNA塩基配列多型性の中で最も多く存在する。人の遺伝子は大凡1,000個当り1個の変異が現われるが、同一の疾病であるとしても個人偏差があるのは全てSNPの差のためであると考えられる。現在まで開発されたSNP分析方法には、SSCP(Single Strand Conformation Polymorphism)、PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)、Allele-specific PCR(AS-PCR)、GC-tailプライマーを用いたTm-shiftジェノタイピング(genotyping)、DASH(Dynamic allele-specific hybridization)、Taqman(5'-exonuclease assay)、Molecular Beacons、OLA(Oligonucleotide ligase assay)、ピロシーケンシング(Pyrosequencing)、単一塩基延長(single base extension)、Fluorescence Polarization及びMALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight)などがあり、これら分析法は、それぞれの鋳型に対し特異なオリゴヌクレオチドや蛍光が標識されたプローブオリゴヌクレオチドを用いて単一塩基変異に対する比較分析を行う。
【００１０】
一方、検出を望む遺伝子がその配列内に突然変異位置を含む多数の多型性遺伝子の形態で存在する場合、正確な遺伝子の増幅のためには当該突然変異位置に相補的な配列を多型性の種類通りプライマーとして製作したあと、実験を行わなければならない。このためには、特定の遺伝子に対する多型性配列全てを知っていなければならないので、配列の不明な多型性遺伝子が存在する場合は所望の遺伝子全てを検出することができなくなるとの問題点がある。したがって、制限された突然変異または多型性が存在する特定の塩基配列等において、これら突然変異部位を一対のプライマーを用いて共通に増幅することのできる簡単な方法の開発が求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、前記のような従来のPCR方法上の問題点を改良するため案出されたものであって、増幅しようとする遺伝子の互いに異なる多型性部位をアベーシック部分に置き換えさせたPCR増幅用プライマー、及び前記プライマーを用いて塩基配列内に突然変異または多型性部位を有する互いに異なる鋳型の核酸を共通に増幅することのできるPCR方法を提供することに目的がある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記目的の達成のため、本発明は配列内にアベーシック部分を含むPCR増幅用プライマーを提供する。
【００１３】
本明細書において、「アベーシック部分」は特定の塩基コーディング情報を有していないヌクレオシドをいうものであって、コーディング情報がないため、対応する鋳型DNAの塩基はアデニン、グアニン、シトシン、チミンのうち何れでも構わない。前記アベーシック部分は、本発明のプライマー内で遺伝子の突然変異部位及び/または多型性部位に該当する所に位置するのが好ましい。前記アベーシック部分には、ディースペーサ(dSpacer, 5'-O-dimethoxytrityl-1',2'-dideoxyribose-3'-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite)、メトキシディースペーサ(1'-OMe-dSpacer, 5'-O-dimethoxytrityl-1'-methoxy-2'-dideoxyribose-3'-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite)、ピーシースペーサホスホアミダイト(PC Spacer Phosphoramidite, [4-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)butyramidomethyl)-1-(2-nitrophenyl)-ethyl]-2-cyanoethyl-(N,N-diisopropyl)-phosphoramidite)、アールスペーサシーイーホスホアミダイト(rSpacer CE Phosphoramidite,5'-O-Dimethoxytrityl-1'-Deoxyribose-2'-O-Triisopropylsilyloxymethyl-3'-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite)、スペーサシー12シーイーホスホアミダイト(Spacer C12 CE Phosphoramidite, 12-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)-dodecyl-1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite)、スペーサホスホアミダイト18(Spacer Phosphoramidite 18, 18-O-Dimethoxytritylhexaethyleneglycol,1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite)、スペーサホスホアミダイト9(Spacer Phosphoramidite 9,9-O-Dimethoxytrityl-triethyleneglycol,1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite)、スペーサホスホアミダイトシー3(Spacer Phosphoramidite C3,3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)propyl-1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite)などから始まって合成されたアベーシック部分を含むPCR増幅用プライマーである。しかし、必ずこれに限定されるものではない。これは若干の構造変化で別のホスホアミダイトを用いるとしても、合成され用いられる遺伝子(プライマー)内のアベーシック部分が同じ構造であれば、本発明がアベーシック部分を含む増幅用プライマーなので、当然本発明の範疇に属する。
【００１４】
前記のようにプライマー配列内にアベーシック部分を含むことにより、同一の遺伝子内に互いに異なる多型性部位を有する鋳型等を1つのプライマー対に全て増幅することができるようになる。プライマー内のアベーシック部分の数は特に限定されるのではないが、3'末端、内在(internal)配列及び5'末端をひっくるめて1〜10個の範囲であるのが好ましく、1〜3個の範囲であるのがより好ましい。アベーシック部分の数が10個を超過することになれば、プライマーのTm値が著しく低くなって鋳型DNA塩基配列にアニーリングがよくできないため、PCR反応がなされない大きな問題点が発生し得る。これにより、突然変異部位を有する互いに異なる鋳型を共通に増幅するとの本発明の目的を達成することができなくなる。
【００１５】
さらに、本発明は反応用緩衝溶液、4種のdNTP、DNAポリメラーゼ、プローブ、及び前記PCR増幅用プライマーを含むPCR増幅用組成物を提供する。
【００１６】
前記反応用緩衝溶液には、Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4、MgCl2等の成分を含む通常のPCR増幅用緩衝溶液を適宜変形して用いることができる。前記4種のdNTPは、dATP、dTTP、dGTP及びdCTPを意味し、用いることのできるDNAポリメラーゼもまた特定の酵素に限定されるものではない。本発明の好ましい実施例では、Taq DNAポリメラーゼ、Klen Taq DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼを用いてPCR増幅を行った。さらに、前記PCR増幅用プライマーは、20uL PCR反応液基準に1pmole〜50pmole範囲の濃度で用いることができ、適宜なプライマー濃度は当業者が容易に決定し得るのが自明である。
【００１７】
本発明のPCR増幅用組成物は、実験上の便宜、PCR反応産物による汚染防止、DNAポリメラーゼとdNTPの安定化及び反応性の向上を図るため、染料及び/または安定化剤を更に含むことができる。このとき、染料にはブロモフェノールブルー(Bromophenol blue)、キシレンシアノール(Xylene cyanole)、ブロモクレゾールレッド(Bromocresol red)またはクレゾールレッド(Cresol red)のうち1つ以上を用いることができ、安定化剤にはゼラチン、牛血清アルブミン(BSA、Bovine Serum Albumin)、Thesit、PEG-8000または多価アルコール(Polyol)のうち1つ以上を用いることができるが、染料及び安定化剤が必ずこれら化合物に限定されるのではない。組成物内の染料の含量は、最終組成物に対し0.0001〜0.01重量%の範囲であり、0.001〜0.005重量%であるのが好ましく、0.001〜0.003重量%であるのがより好ましい。さらに、組成物内の安定化剤は、最終組成物内の濃度が2〜1,000mM範囲であり、100〜500mM範囲であるのが好ましく、100〜300mM範囲であるのがより好ましい。
【００１８】
さらに、本発明は配列内にアベーシック部分を含む前記PCR増幅用プライマーを用いたPCR増幅方法を提供する。
【００１９】
前記方法は、配列内にアベーシック部分を含む前記PCR増幅用プライマーを含むPCR増幅用組成物に鋳型DNAを混合するステップ、及び前記混合物に対しPCR増幅を行うステップを含む。
【００２０】
本発明のPCR増幅方法は、好ましくは塩基配列内に突然変異部位及び/または多型性部位を有する互いに異なる核酸鋳型を共通に増幅するための目的で用いられ得るが、必ずこれに限定されるものではない。さらに、PCR増幅に用いられるプライマー対は、両方のプライマー全てを本発明のアベーシック部分を含むプライマーに用いてもよく、何れか1つのみを本発明のアベーシック部分を含むプライマーに用い、他の1つはアベーシック部分を含まない正常プライマーを用いても構わない。
【００２１】
前記PCR増幅は、変性、アニーリング及び延長段階を繰り返すことにより行われ、このようなPCR増幅の原理は当業者において自明である。前記変性、アニーリング及び伸長温度はそれぞれ85〜95℃で1〜60秒、40〜70℃で1〜60秒及び50〜75℃で1〜60秒間行うのが好ましく、温度範囲及び時間は反応条件に従って適宜調節することができる。例えば、本発明の好ましい実施例によれば、プライマー内部にアベーシック部分が1個置き換えられる場合はメルティング温度(以下、「Tm」と記す)が約8℃低くなり、3'末端にアベーシック部分が1個置き換えられる場合はTmが約1.5℃低くなる。一方、アベーシック部分により低くなったTmを補償するため、プライマーの両末端に、鋳型に対し相補的な塩基を追加してPCRの反応性を調節することができる。例えば、3'末端に相補的な塩基が追加される場合は、2塩基追加のたびにTmが約0.5℃上昇する。さらに、プライマー内にアベーシック部分が1個、2個、3個置き換えられ、同時に5'末端に相補的5塩基が追加された場合は、それぞれ約4℃、約10℃及び約18℃程度Tmが低くなる。このようなTmの温度変化は、用いるDNAポリメラーゼの種類、プライマーの長さ、プライマー内塩基の種類、反応条件などに従って多少変化し得る。前記のようなTm変化の程度に基づきその内部に突然変異部位を含むプライマーをデザインするとき、温度同等性を与えるプライマー製作条件を確立することができるようになり、アベーシック部分を導入して適宜プライマーの長さを長くすることにより、PCR反応の特異性を制御することができ、したがって、塩基配列内に突然変異部位を有する互いに異なる鋳型を一対のプライマーだけで共通に増幅することができるようになる。
【００２２】
本発明の一実施例(実施例1及び2)によれば、人間ゲノムDNAを鋳型にし、アベーシック部分に置き換えられたプライマーを用いてDNAポリメラーゼ別にPCR増幅した結果、Taq DNAポリメラーゼの場合は1塩基置換えの場合でのみ約3〜6℃のTm減少が観察され、Pfu DNAポリメラーゼの場合は1塩基置換えの場合でのみ約6℃のTm減少が観察され、Klen Taq DNAポリメラーゼの場合は1塩基置換えで約1〜2℃のTm減少が観察されたが、PCR反応には問題がないことを確認した。したがって、アベーシック部分を含むプライマーは、多様な種類のDNAポリメラーゼに適用可能であることが分かる。さらに、各DNAポリメラーゼに伴う適正及び最適のアベーシックプライマー条件を設けることができ、これら選定条件等に基づきDNAポリメラーゼ別に突然変異を含むプライマーデザイン時に、温度同等性を与えるプライマー製作条件を確立することができることになる。
【００２３】
本発明の他の実施例(実施例4)によれば、1塩基置換えの場合、プライマーの3'末端に1塩基をアベーシック部分に置き換えれば、対照群プライマー対に比べてTmが約1.5℃減少し、内在塩基配列に1塩基を置き換えれば約8℃減少する。さらに、内在1塩基を置き換えて3'末端に鋳型に対し相補的な5塩基を追加すれば、対照群プライマー対に比べてTmが約4℃減少し、内在2塩基を置き換えて3'末端に鋳型に対し相補的な5塩基を追加すれば約10℃減少し、内在3塩基を置き換えて3'末端に鋳型に対し相補的な5塩基を追加すれば約18℃減少する。内在1塩基を置き換えて3'末端に鋳型に対し相補的な1塩基を追加すれば約5℃減少し、内在1塩基を置き換えて3'末端に鋳型に対し相補的な3塩基を追加すれば約4.5℃減少し、内在1塩基を置き換えて3'末端に鋳型に対し相補的な5塩基を追加すれば約4℃減少する。前記結果を要約すれば、表1の通りである。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
前記結果を解釈すれば、両末端に1塩基を置き換える場合に比べ、内在1塩基を置き換える場合約6.5℃のTm値が減少する。内在1塩基置換え、2塩基置換え及び3塩基置換えの際に、それぞれ3'末端に相補的塩基を5個追加した場合は、内在に置き換えられる塩基数が増加するほど約6℃〜8℃ Tm値が減少しており、内在1塩基置換えに対し3'末端にそれぞれ1塩基追加、3塩基追加及び5塩基追加のように、3'末端に2塩基ずつ追加されるに伴いTm値が約0.5℃ずつ増加する。
【００２６】
前記結果を用いることにより、プライマー位置に対するプライマーデザイン時に温度同等性を与えるプライマー製作条件を確立することができ、アベーシック部分を導入することにより発生し得るTm値の著しい差を最少化した塩基配列を製作することができるようになり、これによるPCR反応の特異性を増加させることができるようになる。
【発明の効果】
【００２７】
前記で検討してみたように、配列内にアベーシック部分を含む本発明のPCR増幅用プライマーは、プライマー塩基配列内にアベーシック部分を含ませることにより、塩基配列内に突然変異部位を有する互いに異なる鋳型を、一対のプライマーを用いて共通に増幅することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】アベーシック部分を含むp55/p53プライマー対を用い、Taq. DNAポリメラーゼで核酸増幅方法(polymerase chain reaction、以下「PCR」と記す)にて増幅した結果を示す電気泳動写真である。
【図２】アベーシック部分を含むp55/p53プライマー対を用い、Klen Taq. DNAポリメラーゼでPCR増幅した結果を示す電気泳動写真である。
【図３】アベーシック部分を含むp63/p55プライマー対を用い、Taq. DNAポリメラーゼでPCR増幅した結果を示す電気泳動写真である。
【図４】アベーシック部分を含むp63/p55プライマー対を用い、Pfu DNAポリメラーゼでPCR増幅した結果を示す電気泳動写真である。
【図５】対照群プライマー対及び前記対照群プライマー対に対し、アベーシック部分が3'末端に1塩基置き換えられたプライマー対、内在塩基配列に1塩基置き換えられたプライマー対、内在塩基配列に2塩基置換えと3'末端に相補的な5塩基追加されたプライマー対をそれぞれ用い、Klen Taq. DNAポリメラーゼでPCR増幅した結果を示す電気泳動写真である。
【図６】対照群プライマー対に対し、アベーシック部分が内在塩基配列に3塩基置き換えられて3'末端に相補的な5塩基追加されたプライマー対、内在塩基配列に1塩基置き換えられて3'末端に相補的な1塩基追加されたプライマー対、内在塩基配列に1塩基置き換えられて3'末端に相補的な3塩基追加されたプライマー対、及び内在塩基配列に1塩基置き換えられて3'末端に相補的な5塩基追加されたプライマー対をそれぞれ用い、Klen Taq. DNAポリメラーゼでPCR増幅した結果を示す電気泳動写真である。
【図７】アベーシック部分の置換え位置の異なるプライマー対を、実時間遺伝子増幅装置を用いて作成したメルティングカーブ結果グラフである。
【図８】アベーシック部分の内在塩基配列置換え個数の異なるプライマー対を、実時間遺伝子増幅装置を用いて作成したメルティングカーブ結果グラフである。
【図９】アベーシック部分が内在1塩基置き換えられて3'末端に追加される塩基個数の異なるプライマー対を、実時間遺伝子増幅装置を用いて作成したメルティングカーブ結果グラフである。図7〜図9において、紫色線は各図のx軸の温度増加変化に伴うy軸の蛍光値の減少変化を表わす線である。
【図１０】B型肝炎ウイルスのS遺伝子の多型性部位に対するプライマーに対し、アベーシック部分が内在1塩基置き換えられた位置を示す図である。
【図１１】内在1塩基がディースペーサに置き換えられたプライマー(dS)、メトキシディースペーサに置き換えられたプライマー(Me-dS)、または正常塩基でなるプライマー(Reg)及びプローブで実時間PCRを行った結果を示すグラフであって、それぞれの線等は濃度の異なる3種類のスタンダードサンプルに対し、PCR増幅サイクル(cycle)数の増加に伴う蛍光値の変化を表わす線である。
【図１２】内在1塩基がディースペーサに置き換えられたプライマー(dS)、メトキシディースペーサに置き換えられたプライマー(Me-dS)、または正常塩基でなるプライマー(Reg)及びプローブで実時間PCRを行った結果を示すグラフであって、それぞれの線等は濃度の異なる3種類のスタンダードサンプルに対し、PCR増幅サイクル(cycle)数の増加に伴う蛍光値の変化を表わす線である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、実施例を介し本発明をより詳しく説明する。
【００３０】
但し、下記実施例は本発明を例示するためのものであるだけで、本発明の内容が下記実施例により限定されるものではない。
【００３１】
実施例1. アベーシック部分を含むp55/p53プライマーを用いたPCR増幅の有効性検証
Taq DNAポリメラーゼ(バイオニア社、以下「Taq」と略称する)及びKlen Taq. DNAポリメラーゼ(バイオニア社、以下「Klen Taq」と略称する)を用い、p55/p53プライマー対を基準に製作されたアベーシックプライマーによる核酸増幅反応性及び特異性を確認した。このため、鋳型DNAには人間ゲノムDNAを用い、プライマー対には下記のような3種のプライマー対を用いた:対照群プライマー対には増幅大きさが211bpであるp55プライマー(塩基配列:5'-CTC TTC CTG CAG TAC TCC CCT GC-3'、配列番号1)及びp53プライマー(塩基配列:5'-GCC CCA GCT CAC CAT CGC TA-3'、配列番号2)を、20μl反応当りそれぞれ15pmoleずつ用いた。第一試料群プライマー対には、p55プライマーの5'末端から10番目の塩基配列である「C」に代えて「N」(ディースペーサ、Glen Research社、Cat. No. 10-1914-xx)に置き換えたNo2-1F(配列番号3)と、p53プライマーの5'末端から9番目の塩基配列である「T」に代えて「N」(ディースペーサ)に置き換えたNo2-1R(配列番号4)を20μl反応当りそれぞれ15pmoleずつ用いた。第二試料群プライマー対には、p55プライマーの5'末端から10番目と11番目の塩基配列であるCAに代えて「NN」(ディースペーサ)に置き換えたNo2-2F(配列番号5)と、p53プライマーの5'末端から9番目と10番目の塩基配列であるTCに代えて「NN」(ディースペーサ)に置き換えたNo2-2R(配列番号6)を20μl反応当りそれぞれ15pmoleずつ用いた。
【００３２】
PCR反応のための酵素には、20μl反応当り1U(U、unit)のTaq DNAポリメラーゼまたは20μl反応当り0.4U(U、unit)のKlen Taq DNAポリメラーゼ(バイオニア社、以下「Klen Taq」と略称する)を用いた。これ以外の反応添加物には、dNTP混合物(2.5mMのそれぞれのdATP、dCTP、dGTP及びdTTP 混合物)を20μl反応当り2μl投入し、TaqとKlen Taq酵素に対する10x反応バッファとして100mM Tris-HCl、400mM KCl、15mM MgCl2、pH 9.0を20μl反応当り2μlを投入した。
【００３３】
PCR増幅のための反応条件は、次の通りである。Taqの場合は、94℃で5分間事前変性ステップを進めたあと、94℃で30秒間変性ステップと漸進的に45℃から59℃の条件で50秒間アニーリングステップ、及び72℃で50秒間伸長ステップを1反応周期にして合計38回の反応周期で行い、以後72℃で5分間最終伸長ステップを進めた。さらに、Klen Taqの場合は、37℃で5分間非特異反応を誘発して94℃で5分間事前変性ステップを進めたあと、94℃で30秒間変性ステップと漸進的に45℃から59℃の条件で50秒間アニーリングステップ、及び72℃で50秒間伸長ステップを1反応周期にして合計38回反応周期で行い、以後72℃で5分間最終伸長ステップを進めた。PCR反応に対する増幅結果は、2.0%アガロースが含まれた0.5x TBEバッファ(Tris base、Boric Acid及び0.5M EDTA、pH 8.0)を用いた電気泳動で確認した。
【００３４】
図1は、Taqに対する対照群プライマー対と、第一試料群プライマー対及び第二試料群プライマー対を用いたPCR反応物に対するアガロースゲル電気泳動結果である。レーン1からレーン10、レーン11からレーン20及びレーン21からレーン30は、それぞれ対照群プライマー対、第一試料群プライマー対及び第二試料群プライマー対を用いた場合を示したものであって、アニーリング温度が順次それぞれ45.1℃、45.3℃、46.3℃、47.7℃、49.4℃、51.4℃、53.3℃、55.3℃、57.6℃及び59.0℃であるときの反応結果であり、Mは100〜2,000bpの範囲を確認することができるDNA大きさマーカー(バイオニア社)である。前記DNA大きさマーカーは、合計13個のDNA二重螺旋のDNA片を含んでおり、細部的には100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1,000bp、1,200bp、1,600bp及び2,000bp大きさのDNA二重螺旋片を含んでいる。対照群の場合、2種類のバンドが強く現われるが、上段のバンドが目的バンドを表わし、下段のバンドはプライマーダイマーバンドの結果を表わし、非特異反応物は目的バンドの上方から見られる、引きずられながら確認されるバンドを表わす。
【００３５】
図1の結果から、第一試料群プライマー対と第二プライマー対の条件で非特異反応とプライマーダイマー様相が減少し、特に第一プライマー対の場合に第二プライマー対より非特異反応とプライマーダイマー様相がより減少することを確認した。さらに、高いPCR反応産物を確認した。
【００３６】
一方、Tm値を比較してみれば、対照群(レーン1〜10)の場合、アニーリング温度が45.1℃、45.3℃、46.3℃、47.7℃、49.4℃、51.4℃、53.3℃、55.3℃、57.6℃及び59.0℃であるとき、鋳型が全て増幅された反面、第一試料群プライマー対(レーン11〜20)では18番目のレーン、即ち、アニーリング温度が55.3℃であるときまでのみ増幅された。したがって、△Tm=59.0℃-55.3℃=3.7℃である。第二試料群プライマー対(レーン21〜30)では26番目のレーン、即ち、アニーリング温度が51.4℃であるときまでのみ増幅された。したがって、△Tm=59.0℃-51.4℃=7.6℃である。
【００３７】
図2は、Klen Taqに対する対照群プライマー対と、第一試料群プライマー対及び第二試料群プライマー対を用いたPCR反応物に対するアガロースゲル電気泳動結果である。レーン1〜レーン30及びMに対する説明は、前記実施例1と同様である。図2の結果から、第一試料群プライマー対と第二試料群プライマー対の条件で、非特異反応とプライマーダイマー様相が減少することを確認した。
【００３８】
一方、前記図1の同じ方法でTm値を比較してみれば、第一試料群プライマー対及び第二試料群プライマー対の△Tmは、それぞれ1.4℃及び5.7℃である。
【００３９】
前記結果から、第一試料群プライマーである内在1塩基置換えの場合、Taq酵素とKlen Taq酵素で非特異反応が減少することを確認し、第二試料群プライマーである内在2塩基置換えの場合もTaq酵素とKlen Taq酵素で非特異反応が減少したことを確認した。即ち、アベーシック部分を導入することにより、非特異反応が増加するのではなく却って減少することが分かるので、鋳型に相補的でないアベーシック部分を導入した本発明のプライマーは、プライマーとしての反応特異性を維持していることを検証した。試料群プライマー塩基配列上で特定塩基をアベーシック部分(ディースペーサ)に置き換えた条件では、適用された全てのDNAポリメラーゼにおいてPCR反応のためのアニーリング温度が多少下降することを確認した。
【００４０】
実施例2. アベーシック部分を含むp63/p55プライマーを用いたPCR増幅の有効性検証
Taq及びPfu DNAポリメラーゼ(バイオニア社、以下「Pfu」と略称する)を用い、p63/p55プライマー対を基準に製作されたアベーシックプライマーに対する核酸増幅反応性及び特異性を確認した。このため、鋳型DNAには人間ゲノムDNAを用い、プライマー対には下記のような3種のプライマー対を用いた:対照群プライマー対には増幅大きさが447bpであるp55プライマー(塩基配列:5'-CTC TTC CTG CAG TAC TCC CCT GC-3'、配列番号1)とp63プライマー(塩基配列: 5'-GGC CAC TGA CAA CCA CCC TTA CC-3'、配列番号7)を、20μl反応当りそれぞれ15pmoleずつ用いた。第一試料群プライマー対には、前記No2-1Fとp63プライマーの5'末端から10番目の塩基配列である「C」に代えて「N」(ディースペーサ)に置き換えたNo3-1R(配列番号8)を20μl反応当りそれぞれ15pmoleずつ用いた。第二試料群プライマー対には、前記No2-2Fとp63プライマーの5'末端から10番目と11番目の塩基配列である「CA」に代えて「NN」(ディースペーサ)に置き換えたNo3-2R(配列番号9)を20μl反応当りそれぞれ15pmoleずつ用いた。
【００４１】
PCR反応のための酵素には、20μl反応当り1UのTaqまたはPfuを用いた。これ以外の反応添加物には、dNTP混合物(2.5mMのそれぞれのdATP、dCTP、dGTP及びdTTP 混合物)を20μl反応当り2μlを投入し、Taq酵素に対する10x反応バッファに100mM Tris-HCl、400mM KCl、15mM MgCl2、pH 9.0を20μl反応当り2μlを投入し、Pfu酵素に対する10x反応バッファには200mM Tris-HCl、100mM KCl、100mM(NH4)2SO4、20mM MgSO4、1% Triton X-100、1mg/mlアセチル化されたBSA、pH 8.8を20μl反応当り2μlを投入した。
【００４２】
PCR反応のための反応条件は、次の通りである。37℃で5分間人為的非特異反応を誘導し、94℃で5分間事前変性ステップを進めたあと、94℃で30秒間変性ステップと漸進的に45℃から59℃の条件で50秒間アニーリングステップ、及び72℃で50秒間伸長ステップを1反応周期にして合計38回反応周期で行い、以後72℃で5分間最終伸長ステップを進めた。PCR反応に対する増幅結果は、2.0%アガロースが含まれた0.5x TBEバッファを用いた電気泳動で確認した。
【００４３】
図3は、Taqに対する対照群プライマー対と、第一試料群プライマー対及び第二試料群プライマー対に対するPCR反応物に対するアガロースゲル電気泳動結果である。レーン1〜レーン30及びMに対する説明は、前記実施例1と同様である。図3の結果から、第一試料群プライマー対と第二試料群プライマー対の条件で非特異反応とプライマーダイマー様相が減少し、特に第一プライマー対の場合により良好な結果を確認した。一方、△Tmはそれぞれ5.7℃及び7.6℃である。
【００４４】
図4は、Pfuに対する対照群プライマー対と、第一試料群プライマー対及び第二試料群プライマー対を用いたPCR反応物に対するアガロースゲル電気泳動結果である。レーン1〜レーン30及びMに対する説明は、前記実施例1と同様である。図4の結果から、第一試料群プライマー対と第二試料群プライマー対の条件で非特異反応とプライマーダイマー様相が減少し、特に第二プライマー対でより良好な結果を確認した。一方、△Tmはそれぞれ5.7℃及び7.6℃である。
【００４５】
前記結果から、TaqとPfuを用いた場合全てで第一プライマー対と第二プライマー対の反応性が増加し、非特異反応は減少した。これから、アベーシックプライマーでもPCR反応性と特異性でその有効性があることを確認し、特定塩基をアベーシック部分(ディースペーサ)に置き換える場合、適用された全てのDNAポリメラーゼにおいてPCR反応のためのアニーリング温度が多少下降することを確認した。
【００４６】
実施例3. アベーシックプライマー製作条件に対するDNAポリメラーゼの有効性検証
対照群プライマー対を基準に、3'末端に1塩基置換え(試料2)、内在塩基配列に1塩基置換え(試料3)、内在塩基配列に2塩基置換えと3'末端に相補的な5塩基追加(試料4)、内在塩基配列に3塩基置換えと3'末端に相補的な5塩基追加(試料5)、内在塩基配列に1塩基置換えと3'末端に相補的な1塩基追加(試料6)、内在塩基配列に1塩基置換えと3'末端に相補的な3塩基追加(試料7)及び内在塩基配列に1塩基置換えと3'末端に相補的な5塩基追加(試料8)の7種の場合でアベーシックプライマーを製作した。
【００４７】
鋳型DNAには人間ゲノムDNAを用い、プライマー対は20μl反応当り12pmole〜40pmoleを用いた。先ず、試料1は対照群プライマーとして増幅大きさが127bpであるF_AP_CONTプライマー(塩基配列:5'-CGT GTT TGT GCC TGT CCT GG-3'、配列番号10)とR_AP_CONTプライマー(塩基配列:5'-CCG CTT CTT GTC CTG CTT GC-3'、配列番号11)対を用い、試料2は前記対照群プライマーに3'末端1塩基が置き換えられたプライマー対としてF_AP_CONT_3-1Nプライマー(塩基配列:5'-CGT GTT TGT GCC TGT CCT GN-3'、配列番号12)とR_AP_CONT_3-1Nプライマー(塩基配列:5'-CCG CTT CTT GTC CTG CTT GN-3'、配列番号13)対を用い、試料3は対照群プライマーに内在塩基配列1塩基が置き換えられたプライマー対としてF_AP_CONT_I-1Nプライマー(塩基配列:5'-CGT GTT TGT GCN TGT CCT GG-3'、配列番号14)とR_AP_CONT_I-1Nプライマー(塩基配列:5'-CCG CTT CTT GTN CTG CTT GC-3'、配列番号15)対を用い、試料4は対照群プライマーに内在塩基配列2塩基が置き換えられて3'末端に相補的な5塩基が追加されたプライマー対としてF_AP_CONT_I-2N_3+5Mプライマー(塩基配列:5'-CGT GTT TNT GCN TGT CCT GGG AGA G-3'、配列番号16)とR_AP_CONT_I-2N_3+5Mプライマー(塩基配列:5'-CCG CTT NTT GTN CTG CTT GCT TAC C-3'、配列番号17)対を用い、試料5は対照群プライマーに内在塩基配列3塩基が置き換えられて3'末端5塩基が追加されたプライマー対としてF_AP_CONT_I-3N_3+5Mプライマー(塩基配列:5'-CGT GTT TNT GCN TGT NCT GGG AGA G-3'、配列番号18)とR_AP_CONT_I-3N_3+5Mプライマー(塩基配列:5'-CCG CTT NTT GTN CTG NTT GCT TAC C-3'、配列番号19)対を用い、試料6は対照群プライマーに内在塩基配列1塩基が置き換えられて3'末端1塩基が追加されたプライマー対としてF_AP_CONT_I-1N_3+1Mプライマー(塩基配列:5'-CGT GTT TGT GCN TGT CCT GGG-3'、配列番号20)とR_AP_CONT_1N_3+1Mプライマー(塩基配列:5'-CCG CTT CTT GTN CTG CTT GCT-3'、配列番号21)対を用い、試料7は対照群プライマーに内在塩基配列1塩基が置き換えられて3'末端3塩基が追加されたプライマー対としてF_AP_CONT_I-1N_3+3Mプライマー(塩基配列:5'-CGT GTT TGT GCN TGT CCT GGG AG-3'、配列番号22)とR_AP_CONT_I-1N_3+3Mプライマー(塩基配列:5'-CCG CTT CTT GTN CTG CTT GCT TA-3'、配列番号23)対を用い、試料8は対照群プライマーに内在塩基配列1塩基が置き換えられて3'末端5塩基が追加されたプライマー対としてF_AP_CONT_I-1N_3+5Mプライマー(塩基配列:5'-CGT GTT TGT GCN TGT CCT GGG AGA G-3'、配列番号24)とR_AP_CONT_I-1N_3+5Mプライマー(塩基配列:5'-CCG CTT CTT GTN CTG CTT GCT TAC C-3'、配列番号25)対を用いた。
【００４８】
PCR反応のための酵素には、20μl反応当り0.4U(U、unit)のKlen Taq酵素を用いた。これ以外の反応添加物には、dNTP混合物(2.5mMのそれぞれのdATP、dCTP、dGTP及びdTTP 混合物)を20μl反応当り2μlを投入し、Klen Taq酵素に対する10x反応バッファとして100mM Tris-HCl、400mM KCl、15mM MgCl2、pH 9.0を20μl反応当り2μlを投入した。
【００４９】
PCR増幅のための反応条件は、次の通りである。94℃で5分間事前変性ステップを進めたあと、94℃で30秒間変性ステップと漸進的に55℃から70℃の条件または46℃から61℃の条件で50秒間アニーリングステップ、及び72℃で50秒間伸長ステップを1反応周期にして合計40回反応周期を進め、以後72℃で5分間最終伸長ステップを進めた。PCR反応に対する反応増幅結果は、2.0%アガロースが含まれた0.5x TBEバッファを用いた電気泳動で確認した。
【００５０】
図5及び図6は、Klen Taq酵素に対する前記8種のプライマー対に対するPCR反応物のアガロースゲル電気泳動結果であって、Mに対する説明は前記実施例1と同様である。
【００５１】
図5においてレーン1〜レーン8は、試料1プライマー対に対しアニーリング温度が順次59.4℃、61.4℃、63.3℃、65.3℃、67.6℃、69.0℃、69.7℃及び70.2℃であるときの反応結果であり、レーン9〜レーン16は、試料2プライマー対に対しアニーリング温度が順次55.5℃、56.3℃、57.1℃、59.4℃、61.4℃、63.3℃、65.3℃及び67.6℃であるときの反応結果であり、レーン17〜レーン24は、試料3プライマー対に対しアニーリング温度が順次46.1℃、46.5℃、47.3℃、48.7℃、50.4℃、52.4℃、54.3℃及び56.3℃であるときの反応結果であり、レーン25〜レーン32は、試料4プライマー対に対しアニーリング温度が順次48.7℃、50.4℃、52.4℃、54.3℃、56.3℃、58.6℃、60℃及び60.7℃であるときの反応結果であり、Mは100bp DNA大きさマーカーである。
【００５２】
さらに、図6においてレーン1〜レーン8は、試料5プライマー対に対しアニーリング温度が順次46.1℃、46.5℃、47.3℃、48.7℃、50.4℃、52.4℃、54.3℃及び56.3℃であるときの反応結果であり、レーン9〜レーン16は、試料6プライマー対に対しアニーリング温度が順次46.1℃、46.5℃、47.3℃、48.7℃、50.4℃、52.4℃、54.3℃及び56.3℃であるときの反応結果であり、レーン17〜レーン24は、試料7プライマー対に対しアニーリング温度が順次46.1℃、46.5℃、47.3℃、48.7℃、50.4℃、52.4℃、54.3℃及び56.3℃であるときの反応結果であり、レーン25〜レーン32は、試料8プライマー対に対しアニーリング温度が順次48.7℃、50.4℃、52.4℃、54.3℃、56.3℃、58.6℃、60℃及び60.7℃であるときの反応結果である。
【００５３】
図5及び図6の結果から、試料1プライマー対は〜63.3℃までPCR増幅産物を確認しており、試料2プライマー対は61.4℃〜63.3℃の条件でのみPCR増幅産物を確認しており、試料3プライマー対、試料5プライマー対及び試料6プライマー対はPCR反応物を確認することができず、試料4プライマー対は〜52.4℃までPCR増幅産物を確認しており、試料7プライマー対は〜47.3℃までPCR増幅産物を確認しており、試料8プライマー対は〜52.4℃までPCR増幅産物を確認した。
【００５４】
前記結果から、対照群プライマー対に対し3'末端の1塩基置換え(試料2)及び内在塩基配列2塩基置換えと3'末端に相補的な5塩基追加(試料4)でもPCR反応が可能であり、このとき対照群プライマー対に比べそれぞれ約11℃乃至約10℃の反応温度が減少することを確認した。さらに、対照群プライマー対に対し内在塩基配列1塩基置換えと3'末端に相補的な3塩基追加(試料7)、及び内在塩基配列1塩基置換えと3'末端に相補的な5塩基追加(試料8)でもPCR反応が可能であり、この場合は対照群プライマー対に比べそれぞれ約16℃及び約11℃の反応温度が減少することを確認した。
【００５５】
実施例4. アプリンプライマー製作条件に対するジソシエーションステップを介したメルティングカーブ検証実験
実施例3で確認された合計8種のアプリンプライマー対に対し、メルティングカーブ(melting curve)方法を用いてそれぞれに対するTm値を測定した。反応当り20μl反応液基準に実施例3での試料1のフォワードプライマー(塩基配列:5'-CGT GTT TGT GCC TGT CCT GG-3'、配列番号10)0.3nmoleと、試料2のフォワードプライマー(塩基配列:5'-CGT GTT TGT GCC TGT CCT GN-3'、配列番号12)0.5nmoleと、試料3のフォワードプライマー(塩基配列:5'-CGT GTT TGT GCN TGT CCT GG-3'、配列番号14)1.0nmoleと、試料4のフォワードプライマー(塩基配列:5'-CGT GTT TGT GCN TGT CCT GGG AGA G-3'、配列番号16)0.5nmoleと、試料5のフォワードプライマー(塩基配列:5'-CGT GTT TNT GCN TGT NCT GGG AGA G-3'、配列番号18)1.0nmoleと、試料6のフォワードプライマー(塩基配列:5'-CGT GTT TGT GCN TGT CCT GGG-3'、配列番号20)1.0nmoleと、試料7のフォワードプライマー(塩基配列:5'-CGT GTT TGT GCN TGT CCT GGG AG-3'、配列番号22)1.0nmole、及び試料8のフォワードプライマー(塩基配列:5'-CGT GTT TGT GCN TGT CCT GGG AGA G-3'、配列番号24)0.5nmoleそれぞれに対し、共通の相補的リバースプライマー(塩基配列:5'-G GTA AGC AAG CAG GAC AAG AAG CGG-3'、配列番号26)0.3nmoleを用いた。これ以外の反応添加物には、10x反応バッファに100mM Tris-HCl、400mM KCl、50mM MgCl2、pH 9.0を20μl反応当り2μlを、10x SYBR Green 2μlを投入した。前記SYBR GreenはDNA二重螺旋鎖のマイナーグルーブ(minor groove)領域に介入する蛍光染料であって、温度が低ければ強く二重螺旋鎖を形成するので、蛍光染料が多く介入することになって蛍光値が高くなり、温度が高ければ二重螺旋鎖が緩むことになって単一鎖になるので、蛍光染料が介入できなくなって蛍光値を検出することができなくなる。実時間遺伝子増幅装置(エキシサイクラー(ExcyclerTM)、バイオニア社)を用いてメルティングカーブを作成しており、これに対する反応条件は次の通りである。94℃で5分間事前変性ステップを進めたあと20℃で5分間維持し、30℃から97℃まで1秒ずつ増加する度に各温度当り10秒留まったあと、蛍光値を測定した。
【００５６】
図7は、対照群プライマー対(試料1)に対しアプリン部分の置換え位置によるメルティングカーブ結果を示すグラフであって、線1は対照群である試料1プライマー対に対し作成されたメルティングカーブ値であり、線2は試料2プライマー対に対し作成されたメルティングカーブ値であり、線3は試料3プライマー対に対し作成されたメルティングカーブ値である。図8は、対照群プライマー対に対し内在塩基配列置換え個数に伴うメルティングカーブ結果を示すグラフであって、線1は対照群である試料1プライマー対に対し作成されたメルティングカーブ値であり、線2は試料8プライマー対に対し作成されたメルティングカーブ値であり、線3は試料4プライマー対に対し作成されたメルティングカーブ値であり、線4は試料5プライマー対に対し作成されたメルティングカーブ値である。図9は、対照群プライマー対に対し内在塩基1塩基置換えと3'末端に追加された相補的な塩基個数に伴うメルティングカーブ結果を示すグラフであって、線1は対照群である試料1プライマー対に対し作成されたメルティングカーブ値であり、線2は試料8プライマー対に対し作成されたメルティングカーブ値であり、線3は試料7プライマー対に対し作成されたメルティングカーブ値であり、線4は試料6プライマー対に対し作成されたメルティングカーブ値であり、線5は試料3プライマー対に対し作成されたメルティングカーブ値である。
【００５７】
前記結果から、対照群プライマー対に対し3'末端にアベーシックで1塩基が置き換えられる場合は約1.5℃程度Tmが減少し、内在塩基配列に1塩基が置き換えられる場合は約8℃程度Tmが減少した(図7参照)。さらに、3'末端に5個の相補的な塩基が追加された場合において、内在塩基配列が1個、2個、3個置き換えられる場合は、対照群プライマー対に比べTmがそれぞれ約4℃、約10℃及び約18℃減少することを確認した(図8参照)。併せて、内在塩基配列が1塩基置き換えられた場合において、3'末端に相補的な塩基が追加される場合は、2塩基追加時ごとにTmが0.5℃ずつ増加することを確認した(図9参照)。
【００５８】
実施例5. B型肝炎ウイルス(HBV)のS遺伝子部位で多型性を示す内在1塩基配列を置き換えたアベーシックプライマーを介したPCR反応有効性検証実験
B型肝炎ウイルスのS遺伝子部位の多型性を示す内在1塩基配列を置き換えたアベーシックプライマー、及びそれに適するプローブを用い、本発明のアベーシックプライマーを介したPCR反応有効性を検証しようとした。ディースペーサの種類に伴う影響を検討するため、2種類のディースペーサ、即ち、ディースペーサとメトキシディースペーサを用いて同一な配列のアベーシックプライマーを製作した(図10を参照)。製作されたプライマー及びプローブの塩基配列は下記表2の通りであり、プローブは5'末端にFAM蛍光染料と3'末端にTAMRA蛍光染料を標識したあと用いた。
【００５９】
【表２】
0005518719.tif 000003
【００６０】
前記アベーシックプライマーとプローブをアプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)7500 FAST実時間PCRシステム(アプライド・バイオシステムズ、USA)を使用して実時間PCRを行った。具体的に、反応当り20μl反応液基準にフォワードプライマー(濃度10pmol)1μl、リバースプライマー(濃度10pmol)1μl、プローブ(濃度5pmol)1μl、1UのTaq酵素を用いており、これ以外の反応添加物としては、dNTP混合物(2.5mMのそれぞれのdATP、dCTP、dGTP及びdTTP 混合物)を20μl反応当り1μlを投入し、Taq酵素に対する10x反応バッファに200mM Tris-HCl、350mM KCl、15mM MgCl2、pH 9.0を20μl反応当り2μlを投入した。下記条件でPCR反応を行った。1)95℃で12分、2)95℃で20秒、3)57℃で40秒、4)2)〜3)ステップで40回繰返し。その結果を図11及び図12に示した。
【００６１】
図11に示した通り、内在1塩基をディースペーサに置き換えたプライマーと、メトキシディースペーサに置き換えたプライマーに用いた場合、二つの条件で同一のCt値を見せた。さらに、図12に示した通り、内在1塩基をメトキシディースペーサに置き換えたプライマーと同じ位置の内在1塩基をメトキシディースペーサに置き換えず正常塩基のプライマーを用いた場合、同じCt値を見せた。前記結果から、本発明のアベーシックプライマーを用いてB型肝炎ウイルスを検出することができることを確認した。
【配列表フリーテキスト】
【００６２】
配列番号１：ｐ５５プライマー
配列番号２：ｐ５３プライマー
配列番号３：Ｎｏ２−１Ｆプライマー  ｎはアベーシック部分（ディースペーサ）
配列番号４：Ｎｏ２−１Ｒプライマー  ｎはアベーシック部分（ディースペーサ）
配列番号５：Ｎｏ２−２Ｆプライマー  ｎはアベーシック部分（ディースペーサ）
配列番号６：Ｎｏ２−２Ｒプライマー  ｎはアベーシック部分（ディースペーサ）
配列番号７：ｐ６３プライマー
配列番号８：Ｎｏ３−１Ｒプライマー  ｎはアベーシック部分（ディースペーサ）
配列番号９：Ｎｏ３−２Ｒプライマー  ｎはアベーシック部分（ディースペーサ）
配列番号１０：Ｆ＿ＡＰ＿ＣＯＮＴプライマー
配列番号１１：Ｒ＿ＡＰ＿ＣＯＮＴプライマー
配列番号１２：Ｆ＿ＡＰ＿ＣＯＮＴ＿３―１Ｎプライマー  ｎはアベーシック部分（ディースペーサ）
配列番号１３：Ｒ＿ＡＰ＿ＣＯＮＴ＿３―１Ｎプライマー  ｎはアベーシック部分（ディースペーサ）
配列番号１４：Ｆ＿ＡＰ＿ＣＯＮＴ＿Ｉ―１Ｎプライマー  ｎはアベーシック部分（ディースペーサ）
配列番号１５：Ｒ＿ＡＰ＿ＣＯＮＴ＿Ｉ―１Ｎプライマー  ｎはアベーシック部分（ディースペーサ）
配列番号１６：Ｆ＿ＡＰ＿ＣＯＮＴ＿Ｉ―２Ｎ＿３＋５Ｍプライマー  ｎはアベーシック部分（ディースペーサ）
配列番号１７：Ｒ＿ＡＰ＿ＣＯＮＴ＿Ｉ―２Ｎ＿３＋５Ｍプライマー  ｎはアベーシック部分（ディースペーサ）
配列番号１８：Ｆ＿ＡＰ＿ＣＯＮＴ＿Ｉ―３Ｎ＿３＋５Ｍプライマー  ｎはアベーシック部分（ディースペーサ）
配列番号１９：Ｒ＿ＡＰ＿ＣＯＮＴ＿Ｉ―３Ｎ＿３＋５Ｍプライマー  ｎはアベーシック部分（ディースペーサ）
配列番号２０：Ｆ＿ＡＰ＿ＣＯＮＴ＿Ｉ―１Ｎ＿３＋１Ｍプライマー  ｎはアベーシック部分（ディースペーサ）
配列番号２１：Ｒ＿ＡＰ＿ＣＯＮＴ＿１Ｎ＿３＋１Ｍプライマー  ｎはアベーシック部分（ディースペーサ）
配列番号２２：Ｆ＿ＡＰ＿ＣＯＮＴ＿Ｉ―１Ｎ＿３＋３Ｍプライマー  ｎはアベーシック部分（ディースペーサ）
配列番号２３：Ｒ＿ＡＰ＿ＣＯＮＴ＿Ｉ―１Ｎ＿３＋３Ｍプライマー  ｎはアベーシック部分（ディースペーサ）
配列番号２４：Ｆ＿ＡＰ＿ＣＯＮＴ＿Ｉ―１Ｎ＿３＋５Ｍプライマー  ｎはアベーシック部分（ディースペーサ）
配列番号２５：Ｒ＿ＡＰ＿ＣＯＮＴ＿Ｉ―１Ｎ＿３＋５Ｍプライマー  ｎはアベーシック部分（ディースペーサ）
配列番号２６：共通リバースプライマー
配列番号２７：ディースペーサを有するフォワードプライマー  ｎはアベーシック部分（ディースペーサ）
配列番号２８：１'−ＯＭｅ−ディースペーサを有するフォワードプライマー  ｎはアベーシック部分（１'−ＯＭｅ−ディースペーサ）
配列番号２９：正常塩基を有するフォワードプライマー
配列番号３０：ディースペーサを有するリバースプライマー  ｎはアベーシック部分（ディースペーサ）
配列番号３１：１'−ＯＭｅ−ディースペーサを有するリバースプライマー  ｎはアベーシック部分（１'−ＯＭｅ−ディースペーサ）
配列番号３２：正常塩基を有するリバースプライマー
配列番号３３：プローブ配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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