(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類のＤＭＰ１、又は、ＤＭＰ１の石灰化促進機能を維持した哺乳類のＤＭＰ１のアミノ酸配列の１個から数個の置換・欠失・付加の配列変異体若しくは哺乳類のＤＭＰ１のアミノ酸配列を部分的に模した数十個のアミノ酸からなる合成ポリペプチド（以下ＤＭＰ１誘導体という）と、I型コラーゲンを併用投与し、それらの結合若しくは共存下で、標的骨形成部位の石灰化の促進をすることを特徴とするＤＭＰ１又はＤＭＰ１誘導体からなる骨若しくは歯の形成剤。
【請求項２】
ＤＭＰ１又はＤＭＰ１誘導体の投与が、標的骨形成部位への充填によるものである請求項１の骨若しくは歯の形成剤。
【請求項３】
ＤＭＰ１又はＤＭＰ１誘導体の投与が、選択的骨組織における遺伝子導入法による産生の増加によるものである請求項１の骨若しくは歯の形成剤。
【請求項４】
ＤＭＰ１又はＤＭＰ１誘導体が、ＤＭＰ１である請求項１〜３のいずれか一に記載の骨若しくは歯の形成剤。
【請求項５】
ＤＭＰ１又はＤＭＰ１誘導体が、ＤＭＰ１の石灰化促進機能を維持した哺乳類のＤＭＰ１のアミノ酸配列の１個から数個の置換・欠失・付加の配列変異体である請求項１〜３のいずれか一に記載の骨若しくは歯の形成剤。
【請求項６】
ＤＭＰ１又はＤＭＰ１誘導体が、哺乳類のＤＭＰ１のアミノ酸配列を部分的に模した数十個のアミノ酸からなる合成ポリペプチドである請求項１〜２のいずれか一に記載の骨若しくは歯の形成剤。
【発明の詳細な説明】
本出願は、参照によりここに援用されるところの、日本特許出願番号特願２００３−０５９１３０からの優先権を請求する。
【技術分野】  本発明は、生体内所望部位の骨の石灰化を促進する手段に関する。さらに詳細には、骨の石灰化促進方法及びそれに使用する石灰化促進因子に関する。特に、ＤＭＰ１（Ｄｅｎｔｉｎ  ｍａｔｒｉｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）の新規な用途に関する。
【背景技術】  骨形成能を有する薬理学的活性剤として、ｒｈＢＭＰ−２、ｒｈＢＭＰ−７、及びＴＧＦ−β、ｂＦＧＦ、ＰＴＨ等の骨形成細胞を分化させ、骨誘導を起こす因子が知られている。しかし、これまでに骨マトリックスの石灰化の速度を速め、より早期に石灰化した成熟した骨を形成する物質等の存在は知られていない。
骨、象牙質及びセメント質は、細胞外マトリックスにリン酸カルシウムが沈着し、石灰化したものである。該細胞外マトリックスは、主にコラーゲンであるが、非コラーゲン性マトリックスも含まれ、非コラーゲン性マトリックスの殆どは酸性リン酸化蛋白質である。該コラーゲンの線維はハイドロキシアパタイト結晶の沈着する足場として機能し、酸性リン酸化蛋白質は細胞外マトリックスの石灰化に関与すると信じられてきた。組替えＤＮＡ技術で同定された該酸性リン酸化蛋白質は、最初ＡＧ１と名づけられ（Ｊ．ＢｉｏｌＣｈｅｍ  １９９３；２６８：１２６２４−１２６３０：非特許文献１）、後にＤＭＰ１と変更された（Ｊ．Ｈｉｓｔｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  １９９４；４２：１５２７−１５３１：非特許文献２）。ＤＭＰ１のｃＤＮＡクローンは、ラットの歯のｃＤＮＡライブラリーから同定され、歯の象牙質に特異的であると考えられてきたが（Ｊ．Ｈｉｓｔｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  １９９４；４２：１５２７−１５３１：非特許文献３）、後に、その発現は他の石灰化組織でも存在することが示された。
最近、本発明者は、歯の形成能を欠失した動物種である鳥類においてもゲノムの中に、ＤＭＰ１遺伝子が存在し、骨組織で特異的にその遺伝子発現がある事から、ＤＭＰ１は骨組織で重要な働きがある事を示峻した（Ｊ．Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ  ２０００；４８：１６０−１６６：非特許文献４）。さらに、本発明者は、鳥類や哺乳類の骨組織では、その動物種に関係なく共通して、ＤＭＰ１遺伝子は骨マトリックスを分泌する骨芽細胞には発現せず、石灰化した骨マトリックスの中に存在する骨細胞に特異的に発現し、その蛋白は骨細胞周囲の骨マトリックスにのみ分布する事を発見した（Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ２００１；１６：２０１７−２０２６：非特許文献５）。ＤＭＰ１の特徴的様相は、酸性アミノ酸含有量が非常に高いこと、また、組織中で高度にリン酸化されることから、組織中では高度に負に荷電する事である。
【非特許文献１】Ｊ．ＢｉｏｌＣｈｅｍ  １９９３；２６８：１２６２４−１２６３０
【非特許文献２】Ｊ．Ｈｉｓｔｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  １９９４；４２：１５２７−１５３１
【非特許文献３】Ｊ．Ｈｉｓｔｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  １９９４；４２：１５２７−１５３１
【非特許文献４】Ｊ．Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ  ２０００；４８：１６０−１６６
【非特許文献５】Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  ２００１；１６：２０１７−２０２６
【発明の開示】
本発明は、新規な骨の石灰化促進手段の提供を課題とし、特にＤＭＰ１の新規な用途を見出すことにある。ＤＭＰ１は、組織中で高度にマイナスにチャージする性状から、カルシウムと結合し、それによって細胞外マトリックスの石灰化を促進していると推測される。これまでに石灰化組織において幾つかの非コラーゲン性蛋白質が同定されてきたが、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞外マトリックスの石灰化を促進させたものはなかった。硬組織工学においてＤＭＰ１の可能な適応を得るために、ＤＭＰ１分子の特徴と石灰化過程におけるその可能な機能を検討した。
本発明者は、上記課題を解決するため、ＤＭＰ１を特異的に骨組織で発現させる手段を確立し、その機能の検討から、ＤＭＰ１の適量産生が生体への副作用を起こすことなく、骨密度の上昇、ひいては骨の石灰化を促進するものであることを見出し本発明を完成した。
本発明は、以下よりなる。
１．標的骨形成部位をマイナスチャージ状態にすることを特徴とする骨の石灰化促進方法。
２．マイナスイオンチャージ状態が、化合物の存在によって達成される前項１の方法。
３．化合物が、ＤＭＰ１又はＤＭＰ１誘導体である前項２の方法。
４．化合物の存在が充填によるものである前項２又は３の方法。
５．化合物の存在が、選択的骨組織における遺伝子導入法による産生の増加による前項２又は３の方法。
６．化合物の存在が、マトリックス物質との結合又は共存である前項４の方法。
７．結合させるマトリックス物質が、コラーゲンである前項６の方法。
８．前項２〜７の何れか一に記載の方法に使用するＤＭＰ１又はＤＭＰ１遺伝子担持ベクターを含む骨の石灰化促進因子。
９．ＤＭＰ１の誘導体又は該遺伝子担持ベクターである前項８の石灰化促進因子。
１０．遺伝子担持ベクターが、骨での特異的発現調節に適合したプロモーターを担持する前項８又は９の石灰化促進因子。
１１．前項１〜７のいずれか一項に記載する骨の石灰化促進方法を用いた骨又は歯の形成方法。
１２．前項１〜７のいずれか一項に記載する骨の石灰化促進方法を用いた骨若しくは歯の疾患及び／又は障害の治療方法。
１３．前項８〜１０のいずれか一項に記載の石灰化促進因子を有効成分として含む骨若しくは歯の疾患及び／又は障害用治療剤。
１４．前項８〜１０のいずれか一項に記載の石灰化促進因子を有効成分として含む骨若しくは歯の形成剤。
１５．前項８〜１０のいずれか一項に記載の石灰化促進因子を有効成分として含む骨又は歯用の医薬組成物。
【図面の簡単な説明】  第１図は、マウスの大腿骨の遠位側の皮質骨の骨密度を測定した図である。
第２図は、マウスの大腿骨の骨幹部の皮質骨の骨密度を測定した図である。
【符号の説明】
第１図の横軸はスライスＮＯ．〔遠位側から骨幹部／大腿骨へ向かって遠位側で１５分割のスライスを調製した。正常では遠位側から石灰化が始まり骨幹部／大腿骨に向けて石灰化度（骨密度）があがる〕、縦軸は骨密度（ｍｇ／ｃｍ３）を表し、Ｔｇ２ＭはＤＭＰ１の５倍強制発現、Ｔｇ３ＨはＤＭＰ１の３０倍強制発現、ＷＴは野生型を意味する。●はＴｇ２Ｍ、▲はＴｇ３Ｈ、○は野生型を示す。各値は平均値を示した。第２図の横軸は各Ｔｇ２Ｍ、Ｔｇ３Ｈ、ＷＴであること、縦軸は骨密度（ｍｇ／ｃｍ３）を表す。
【発明を実施するための最良の形態】  ＤＭＰ１は、アミノ酸数４００〜５５０個の細胞外マトリックス蛋白質である酸性蛋白質である。そのアミノ酸配列及び遺伝子配列は、豊沢等により開示されている（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ  １９９９；４８：１６０−１６６，Ｇｅｎｅ  １９９９；２３４：３０７−３１４，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ  ２０００；５０：３１−３８など）。ＤＭＰ１遺伝子は公知の遺伝子であり、ヒトを含む１０種の動物からＤＭＰ１の配列が報告されている。アミノ酸配列の比較から、全ての種のＤＭＰ１は１６−２１個のアミノ酸を含む疎水性リーダー配列で始まることが知られている。細胞接着性のペプチドＲＧＤモチーフはＤＭＰ１分子特異的ではないが、多くの他の酸性リン酸化蛋白質、例えばオステオポンチン、骨シアロ蛋白質、及び象牙質シアロリン酸化蛋白質に存在することが確認されている。Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列は厳格に哺乳動物のＤＭＰ１配列で保存され、その重要な生物学的機能を有することが考えられる。また、ＤＭＰ１は酸性を示すアミノ酸を非常に多く含有し、また、Ｓｅｒを含む多数のモチーフ配列がリン酸化を受ける事から、組織中で高度にマイナスにチャージしていると判断される。このことから、ＤＭＰ１はカルシウムイオンと強固な結合能を有し、細胞外マトリックスの石灰化に必要であると考えられる。
本発明の一の特徴は、骨形成部位におけるマイナスイオン状態と骨の石灰化の速度との関係を見出したことである。本発明者は、ＤＭＰ１遺伝子を骨組織で選択的に発現させ、その蛋白質を骨基質に蓄積させた。そしてその発現量を種々の条件を変えることで調節し、ＤＭＰ１の産生量と骨の石灰化速度には最適濃度が存在することを確認した。ＤＭＰ１は、組織中で高度にマイナスにチャージする蛋白質であり、このことが骨の石灰化の速度に強く関係することが本発明によって確認された。なお、石灰化はリン酸カルシウムが細胞外マトリックスに沈着する事であるが、ＤＭＰ１がカルシウムイオンを引き寄せ、コラーゲンがリン酸を引き寄せる事により、同部位にカルシウムイオンとリン酸が集積し、リン酸カルシウム結晶が形成され、石灰化が促進されると考えられる。
本発明において、ＤＭＰ１及びその誘導体が石灰化促進因子として機能することを確認した。ＤＭＰ１は、既に遺伝子工学的に産生できることが確立しており、既知の汎用される大腸菌宿主プロモーター系を使った系で大量生産した組み換えＤＭＰ１の使用が可能である。特に、糖鎖構造などの翻訳後修飾は必要でなく、大腸菌が生産するＤＭＰ１で十分である。本発明において、ＤＭＰ１誘導体は、ＤＭＰ１の石灰化促進機能を維持した、特に哺乳類で確認された保存配列を維持したアミノ酸の１個から数個の置換・欠失・付加等の配列変異、及びＤＭＰ１のアミノ酸配列を部分的に模した数十個のアミノ酸からなる合成ポリペプチドをも対象とする。誘導体には、骨形成の足場構造をもつ蛋白質或いは生分解性合成樹脂等も例示される。蛋白質としては、コラーゲン、特にＩ型コラーゲン、生分解性合成樹脂としてはポリ乳酸誘導体が好適に利用できる。結合は、物理的結合或いは化学的結合を問わず、あらゆる可能性があるが、好適にはジスルフィド結合である。また、ＤＭＰ１は誘導体化されていなくとも、マトリックス構造をもつ蛋白質或いは生分解性合成樹脂等との混合物であっても十分である。
本発明の石灰化促進手段において、材料１ｍｌ当りの石灰化を促進するＤＭＰ１の使用量は、骨の石灰化作用を促進する濃度であればいずれでもよい。例えば、通常は０．１μｇ以上、好ましくは数μｇ、より好ましくは５〜２０μｇである。
ＤＭＰ１を例えば、標的骨形成部に充填するためには、既知組成物との配合による汎用手段によってペースト状に調製されていることが好ましい。例えば、コラーゲンやポリ乳酸誘導体等との配合組成物が利用可能である。
ＤＭＰ１遺伝子又はその誘導体遺伝子を担持するベクターは、骨組織への特異的遺伝子導入手段により、本発明の骨石灰化促進機能を発揮することができる。自己増殖ベクターに遺伝子を担持する手段によっても本発明の目的は達成可能である。つまり、ＤＭＰ１遺伝子を担持したベクターも本発明の石灰化促進因子に含めることができる。遺伝子の導入手段は、望ましくはインテグレーションさせる方法、例えばリポソーム法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等によるのが好ましい。しかし一過性に発現させるリポソーム法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、ウイルスベクター法、アテロコラーゲン法等の方法であってもよい。用いるベクターは特に限定されず、公知のプラスミド、ファージ、コスミド、ＢＡＣ、ＹＡＣ、組換えウイルス、トランスポゾン等、通常の組み換え実験によって挿入ＤＮＡ断片を導入することが可能な全ての組換えベクターに適用することができる。ベクターは、当然に自体公知の組合せが好適であるプロモーター、エンハンサーと共に構築することができる。例えば、通常宿主に適したプロモーターが挿入されている市販の蛋白質発現ベクターを用いることができる。
具体的には、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（ストラタジーン社製）、ｐＳＶＫ３（アマシャムファルマシアバイオテク社製）、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック社製）、アテロコラーゲン等が挙げられる。プロモーターは、本発明の実施例では、マウスのｐｒｏ−α１（Ｉ）ｃｏｌｌａｇｅｎプロモーターを使ったが、その他オステオカルシンプロモーター等でもよい。このプロモーターは、骨形成細胞が特異的に分泌する蛋白質のプロモーターであることから、ＤＭＰ１を骨組織で特異的に発現させるために有力な手段を提供するものである。
ベクターへのＤＭＰ１ポリヌクレオチドの挿入は、該ポリヌクレオチド又はこれを含むＤＮＡ断片をベクター中のプロモーターの下流にプロモーターの制御下におかれるように連結して行う。また、プロモーターとＤＭＰ１との間にコザック配列（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｇｅｎｅ，２３４，１８７，（１９９９））を挿入したり、ＤＭＰ１の下流にタグとなるポリペプチドをコードするＤＮＡを挿入した構造を有するベクターも好ましく用いられる。タグとなるポリペプチドとしては特に制限はないが、例えば、ＦＬＡＧタグ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，７，５８０，（１９８９））等が挙げられる。
プロモーターを連結したＤＭＰ１ポリヌクレオチドを標的細胞の染色体中に直接挿入する相同組換え技術（Ａ．Ａ．Ｖｅｒｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５７，２０３６（１９９３））、あるいはトランスポゾンや挿入配列（Ａ．Ａ．Ｖｅｒｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１１，７３９（１９９４））等を用いて発現させることができる。
かくして調製されたＤＭＰ１又はその誘導体は、骨の石灰化を所望する骨形成部位に直接充填することができる。また、ＤＭＰ１遺伝子又はその誘導体遺伝子を担持するベクターを、直接注入、遺伝子銃、注射などによって投与することができる。
本発明により、ＤＭＰ１又はその誘導体は、骨折の接合部充填、感染による腐骨除去後の骨充填、腫瘍や骨髄炎による広範囲切除後のセラミックなどの充填物と既存骨との接合部充填、歯槽膿漏による歯槽骨除去後の歯槽骨充填、入れ歯の歯槽堤形成術のための充填、インプラント植立のための歯槽骨形成のための充填等に有効に使用可能である。本発明の導入により、骨形成細胞が増生し細胞外基質が産生された後、早期に石灰化レベルが上昇し、成熟した骨としての早期機能発揮が可能となる。
また、本発明の石灰化促進因子を有効成分として含む医薬組成物には、薬学的に許容される塩を含むことができる。薬理学的に許容される塩とは、慣用の無毒性の塩すなわち酸付加塩及び各種塩基との塩を挙げることができる。より具体的には、塩酸、硝酸、硫酸等の無機酸塩、酢酸、クエン酸、フマル酸、酒石酸等の有機酸塩、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等のスルホン酸塩及びアラニン、ロイシン、グルタミン酸等のアミノ酸塩並びにアルカリ金属塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（例えばマグネシウム塩、カルシウム塩等）等の無機塩基塩及びトリエチルアミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、エタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩等の有機アミン塩が挙げられる。
本発明の技術的範囲は骨の石灰化促進方法及び骨の石灰化促進因子に限定されるのみではなく、骨の石灰化促進方法を用いた骨若しくは歯の形成方法、骨若しくは歯の疾患及び／又は障害の治療方法にも及ぶ。さらに、本発明は本発明の石灰化促進因子を有効成分として含む医薬組成物を含み、骨若しくは歯の疾患及び／又は障害用治療剤、さらに骨若しくは歯の形成剤をも含むものである。
【実施例】  以下、実施例によって、本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】  ラットＤＭＰ１遺伝子の翻訳領域の開始コドンからストップコドンまでをｐｒｏ−α１（Ｉ）ｃｏｌｌａｇｅｎプロモーター（文献：Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９５；１２９：１４２１−１４３２）で骨組織に選択的に発現させるようｐＮＡＳＳβ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂ．，Ｉｎｃ．）に制限酵素を使って組み込み、トランスジェニックマウス作製用のコンストラクトを構築した。このコンストラクトを使い、Ｃ５７Ｂ／Ｌの受精卵に遺伝子導入し、ＤＭＰ１トランスジェニックマウスを作製し、ＤＭＰ１を強制発現させた骨組識の骨密度（１群４匹で３群）を検討した。生後３ヶ月における大腿骨の各部位における骨密度を測定した。骨組織におけるＤＭＰ１の発現は、Ｎｏｒｔｈｅｒｎでその発現量を検討し、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎでその発現部位を再度確認し、ＤＭＰ１の正常値の約５倍強制発現したもの、正常の約３０倍強制発現したものを正常マウスの場合と比較検討した。
図１は、マウスの大腿骨の遠位側の皮質骨の骨密度を測定したものである。横軸は、遠位側から０．５ｍｍ刻みでスライスし、Ｎｏ．１５までのスライスについて皮質骨の各骨密度（ｍｇ／ｃｍ３）をｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｃｏｍｐｕｔｅｄ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ（ｐＱＣＴ）で測定した。大腿骨などの長幹骨では、骨端軟骨部から骨幹部へと遠位側に行くに従い皮質骨の骨密度が上昇する。ＤＭＰ１を正常の約５倍に強制発現させたＤＭＰ１トランスジェニックマウス（Ｔｇ２Ｍ群）では正常マウス（ＷＴ群）にくらべて骨密度が各スライス部で有為に上昇した。一方、ＤＭＰ１を正常の約３０倍に強制発現させたＤＭＰ１トランスジェニックマウス（Ｔｇ３Ｈ群）は正常マウスにくらべて骨密度に変化はなかった。このことはＤＭＰ１の補充には適応量があり、骨組織に多量に蓄積させると無影響になることが確認された。すなわち、正常の約５倍に強制発現させた場合に、皮質骨の骨密度の上昇率が正常よりも早くなり、石灰化が促進されていることを意味するのである。ここでは、実験系として遺伝子導入法でＤＭＰ１の効果を確認したが、この効果はＤＭＰ１自体を直接、あるいはコラーゲン等のマトリクス物質とともに対象部位に充填しても同様の効果が導けることを証明しているものと思料する。
図２は、マウスの大腿骨の骨幹部の皮質骨の骨密度を測定したものである。横軸は、左から各Ｔｇ２Ｍ（ＤＭＰ１を正常の約５倍に強制発現させたＤＭＰ１トランスジェニックマウス）、Ｔｇ３Ｈ（ＤＭＰ１を正常の約３０倍に強制発現させたＤＭＰ１トランスジェニックマウス）、ＷＴ（正常マウス）について各骨密度（ｍｇ／ｃｍ３）を上記と同様に測定した。この結果、Ｔｇ２Ｍ、Ｔｇ３Ｈ群とＷＴ群間で骨密度に差異はなかった。このことは、石灰化が進み、骨が成熟した骨密度のプラトー状況下ではもはやＤＭＰ１は薬理学的作用をおこすことなく過剰な骨の石灰化を導かないことを示すものである。
【産業上の利用可能性】  本発明の手段は、骨形成に際し、石灰化の足場となる細胞外マトリックス部に石灰化を引き起こしやすくし、石灰化の速度をあげて早期に成熟した骨形成を促すに有効な手段を提供する。その結果、骨治療における新たな臨床的意義を提供するものである。特に、本発明手段は、骨の形成期にあっては、骨の石灰化を促進するが、石灰化レベルが上昇し成熟した骨形成が終了すると、もはや石灰化促進機能は発揮しないものであるから、過石灰化等の副作用を起こさない安全性にも優れた骨疾患の治療手段になりうるものである。
【図１】
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【図２】
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