(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−{４−［Ｎ−（５，６−ジフェニルピラジン−２−イル）−Ｎ−イソプロピルアミノ］ブチルオキシ}酢酸、２−{４−［Ｎ−（５，６−ジフェニルピラジン−２−イル）−Ｎ−イソプロピルアミノ］ブチルオキシ}−Ｎ−（メチルスルホニル）アセトアミド又はその医薬上許容される塩を有効成分として含有する線維化抑制剤。
【請求項２】
尿細管間質性腎炎、間質性肺炎、肝硬変、慢性膵炎、スキルス胃癌、心筋線維症、骨髄線維症、関節リウマチ、手術後の瘢痕、熱傷性瘢痕、ケロイド、肥厚性瘢痕、強皮症、子宮筋腫、前立腺肥大症、アルツハイマー病、硬化性腹膜炎、Ｉ型糖尿病及び手術後臓器癒着からなる群より選択される疾患を治療するための請求項１に記載の線維化抑制剤。
【請求項３】
間質性肺炎を治療するための請求項１に記載の線維化抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、次の一般式（１）で表される複素環誘導体（以下、「本複素環誘導体（１）」という）又はその医薬上許容される塩を有効成分として含有する線維化抑制剤に関するものである。
【化１】
0005522030.tif 000002
式（１）中、Ｒ１、Ｒ２は、同一又は異なって、ハロゲン原子、アルキル、ハロアルキル、アリールアルキル、アルコキシ、アルキルチオ、アルコキシアルキル、アルキルスルホニル、ヒドロキシ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシ、シアノ及びニトロからなる群から選ばれる１〜３個の置換基で置換されていてもよいアリールを表し；
Ｒ３、Ｒ４は、同一又は異なって、水素原子又はアルキルを表し；
Ｒ５は水素原子、アルキル又はハロゲン原子を表し；
ＹはＮ又はＮ→Ｏを表し；
ＡはＮＲ６を表し、Ｒ６は水素原子、アルキル、アルケニル又はシクロアルキルを表し；
Ｄはヒドロキシで置換されていてもよいアルキレン又はアルケニレンを表すか、又はＡとＤとが一緒になって、次の式（２）で表される二価の基を表し；
【化２】
0005522030.tif 000003
［式（２）中、ｒは０〜２の整数を表し、ｑは２又は３を表し、ｔは０〜４の整数をそれぞれ表す。］
Ｅは、フェニレン又は単結合を表すか、又はＤとＥとが一緒になって、次の式（３）で表される二価の基を表し；
【化３】
0005522030.tif 000004
［式（３）中、ｕは０〜２の整数を表し、ｖは０又は１を表す。］
Ｇは、Ｏ、Ｓ、ＳＯ又はＳＯ２を表し；
Ｑは、カルボキシ、アルコキシカルボニル、テトラゾリル、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル又は次の式（４）で表される基を表す。
【化４】
0005522030.tif 000005
［式（４）中、Ｒ７は、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、若しくはヒドロキシ、又はハロゲン原子、アルキル、ハロアルキル、アリールアルキル、アルコキシ、アルキルチオ、アルコキシアルキル、アルキルスルホニル、ヒドロキシ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシ、シアノ及びニトロからなる群から選ばれる１〜３個の置換基で置換されていてもよい下記１）〜４）のいずれかの基を表す；
１）アルキル、
２）アリール、
３）アリールオキシ、
４）複素環基。］
【背景技術】
【０００２】
臓器等の線維化は、臓器等が何らかの原因、例えば、侵襲又は損傷を受けることによって、細胞外基質が臓器内に過剰に蓄積し、生じるものである。侵襲又は損傷による臓器等の障害の程度が軽微であれば、修復瘢痕も残らず、臓器等は正常に回復する。しかしながら、侵襲又は損傷による臓器等の障害の程度が大きい場合や持続する場合には、修復瘢痕の線維化が臓器等の本来の機能に障害を与えることとなる。更に、それが原因となって新たな線維化が生じるといった悪循環が形成され、最終的には臓器等の機能不全にまで至ることとなる。【０００３】
臓器等の線維化により生じる疾患として、間質性肺炎（肺線維症）等が知られている。間質性肺炎は、なんらかの原因により肺胞壁に炎症がおこり、間質で線維芽細胞が増殖し、コラーゲン線維の過剰な沈着により肺が硬化し、ガス交換が障害され、最終的には呼吸不全に至る疾患である。発症後平均３〜５年で死亡する。間質性肺炎発症の詳細な機序はまだ明らかになっておらず、確立した治療法も存在しない。【０００４】
最近、ブレオマイシンで誘発した間質性肺炎モデルマウスにおいて、プロスタグランジンＩ２（以下、「ＰＧＩ２」という。）受容体作動薬であるＯＮＯ−１３０１が、間質性肺炎の抑制効果を有することが報告されている（例えば、非特許文献１を参照）。【０００５】
本複素環誘導体（１）又はその医薬上許容される塩は、ＰＧＩ２受容体作動剤として、肺高血圧症や閉塞性動脈硬化症の治療に有用であることが既に報告されている（例えば、特許文献１を参照）。【０００６】
【特許文献１】国際公開第０２／０８８０８４号パンフレット
【非特許文献１】Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊ．  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２００６年、ｖｏｌ．２９０、ｐ．５９−６５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、主として、新規な線維化抑制剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、本複素環誘導体（１）が、線維芽細胞の増殖抑制効果を有することを見出し、本発明を完成した。【０００９】
本発明としては、例えば、本複素環誘導体（１）又はその医薬上許容される塩を有効成分として含有する線維化抑制剤を挙げることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本複素環誘導体（１）において、例えば、
Ｒ１、Ｒ２が、同一又は異なって、ハロゲン原子、アルキル及びアルコキシからなる群から選ばれる１〜３個の置換基で置換されていてもよいフェニルであり、
Ｒ３、Ｒ４が、同一又は異なって、水素原子又はアルキルであり、
Ｒ５が水素原子であり、
ＹがＮであり、
ＡがＮＲ６であり、Ｒ６がアルキルであり、
Ｄがアルキレンであり、
Ｅが単結合であり、
ＧがＯであり、
Ｑが、カルボキシ又は式（４）で表される基であり、Ｒ７が、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、若しくはヒドロキシ、又はハロゲン原子、アルキル、ハロアルキル、アリールアルキル、アルコキシ、アルキルチオ、アルコキシアルキル、アルキルスルホニル、ヒドロキシ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシ、シアノ及びニトロからなる群から選ばれる１〜３個の置換基で置換されていてもよい下記１）〜４）のいずれかの基である化合物が好ましい。
１）アルキル、
２）アリール、
３）アリールオキシ、
４）複素環基【００１１】
具体的には、例えば、
２−｛４−［Ｎ−（５，６−ジフェニルピラジン−２−イル）−Ｎ−イソプロピルアミノ］ブチルオキシ｝酢酸（以下、「化合物Ａ」という。）、及び
２−｛４−［Ｎ−（５，６−ジフェニルピラジン−２−イル）−Ｎ−イソプロピルアミノ］ブチルオキシ｝−Ｎ−（メチルスルホニル）アセトアミド（以下、「化合物Ｂ」という）
が好ましい。【００１２】
本発明における「アルキル」としては、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数１〜６のもの、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシルを挙げることができる。とりわけ、炭素数１〜４のものが好ましい。【００１３】
本発明における「ハロアルキル」、「アリールアルキル」、「アルキルチオ」、「アルコキシアルキル」、「アルキルスルホニル」、「モノアルキルアミノ」、「ジアルキルアミノ」、「モノアルキルカルバゾイル」及び「ジアルキルカルバモイル」のアルキル部分としては、前記のアルキルと同じものを挙げることができる。【００１４】
本発明における「アルコキシ」としては、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数１〜６もの、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｎ−ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ｎ−ヘキシルオキシ、イソヘキシルオキシを挙げることができる。とりわけ、炭素数１〜４のものが好ましい。【００１５】
本発明における「アルコキシカルボニル」及び「アルコキシアルキル」のアルコキシ部分としては、前記のアルコキシと同じものを挙げることができる。【００１６】
本発明における「アルケニル」としては、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数２〜６のもの、例えば、ビニル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−ペンテニル、４−ペンテニル、４−メチル−３−ペンテニル、１−ヘキセニル、２−ヘキセニル、３−ヘキセニル、４−ヘキセニル、５−ヘキセニルを挙げることができる。とりわけ、炭素数３又は４のものが好ましい。【００１７】
本発明における「シクロアルキル」としては、炭素数３〜８のもの、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチルを挙げることができる。とりわけ、炭素数５〜７のものが好ましい。【００１８】
本発明における「ハロゲン原子」としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子を挙げることができる。【００１９】
本発明における「アリール」としては、炭素数６〜１０もの、例えば、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチルを挙げることができる。とりわけ、フェニルが好ましい。【００２０】
本発明における「アリールアルキル」及び「アリールオキシ」のアリール部分としては、前記のアリールと同じものを挙げることができる。【００２１】
本発明における「アルキレン」としては、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数１〜８のもの、例えば、メチレン、エチレン、１−メチルエチレン、２−メチルエチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、ヘプタメチレン、オクタメチレンを挙げることができる。とりわけ、炭素数３〜６のものが好ましく、炭素数４のものが特に好ましい。【００２２】
本発明における「アルケニレン」としては、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数２〜８のもの、例えば、エテニレン、１−プロペニレン、２−プロペニレン、１−ブテニレン、２−ブテニレン、３−ブテニレン、１−ペンテニレン、２−ペンテニレン、３−ペンテニレン、４−ペンテニレン、４−メチル−３−ペンテニレン、１−ヘキセニレン、２−ヘキセニレン、３−ヘキセニレン、４−ヘキセニレン、５−ヘキセニレン、１−ヘプテニレン、２−ヘプテニレン、３−ヘプテニレン、４−ヘプテニレン、５−ヘプテニレン、６−ヘプテニレン、１−オクテニレン、２−オクテニレン、３−オクテニレン、４−オクテニレン、５−オクテニレン、６−オクテニレン、７−オクテニレンを挙げることができる。とりわけ、炭素数３〜６のものが好ましく、炭素数４のものが特に好ましい。【００２３】
本発明における「複素環基」としては、次の（１）又は（２）を挙げることができる。
（１）窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選択される１〜４個までのヘテロ原子を有する５又は６員の芳香環基、又はそれらのベンゼン縮合環であって、かかる環構成原子が窒素原子又は硫黄原子の場合、かかる窒素原子、硫黄原子はオキシドを形成していてもよい。例えば、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−インドリル、２−フラニル、３−フラニル、３−ベンゾフラニル、２−チエニル、３−チエニル、３−ベンゾチエニル、１，３−オキサゾール−２−イル、４−イソオキサゾリル、２−チアゾリル、５−チアゾリル、２−ベンゾチアゾリル、１−イミダゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、２−ベンズイミダゾリル、１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル、１Ｈ−テトラゾール−５−イル、２Ｈ−テトラゾール−５−イル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、３−ピラゾリル、２−ピリミジニル、４−ピリミジニル、２−ピラジニル、１，３，５−トリアジン−２−イルを挙げることができる。
（２）環構成原子として、窒素原子、酸素原子又は硫黄原子を、同一又は異なって、１〜４個含んでいてもよい、４〜８員環の飽和環基、又はそれらのベンゼン縮合環基であって、環構成原子が窒素原子又は硫黄原子の場合、かかる窒素原子、硫黄原子はオキシドを形成していてもよい。例えば、ピペリジノ、ピペラジニル、３−メチルピペラジン−１−イル、ホモピペラジニル、モノホリノ、チオモノホリノ、１−ピロリジニル、２−ピロリジニル、２−テトラヒドロフラニルを挙げることができる。【００２４】
本複素環誘導体（１）は、前記特許文献１（国際公開第０２／０８８０８４号パンフレット）に記載の方法により合成することができる。【００２５】
本複素環誘導体（１）は、遊離の塩基又は酸のまま医薬として用いることができるが、公知の方法により医学上許容される塩の形にして用いることもできる。
本複素環誘導体（１）が塩基性を示す場合の「塩」としては、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、フッ化水素酸、若しくは臭化水素酸の無機酸の塩、又は酢酸、酒石酸、乳酸、クエン酸、フマール酸、マレイン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、若しくはカンファースルホン酸の有機酸の塩を挙げることができる。
本複素環誘導体（１）が酸性を示す場合の「塩」としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、又はカルシウム塩等のアルカリ土類金属塩を挙げることができる。【００２６】
本複素環誘導体（１）には、幾何異性体（Ｚ体及びＥ体）が存在するが、各幾何異性体及びそれらの混合物も本複素環誘導体（１）に含まれる。また、本複素環誘導体（１）には、不斉炭素を有するものも存在するが、各光学異性体及びこれらのラセミ体も本複素環誘導体（１）に含まれる。光学異性体は、上記のようにして得られたラセミ体より、その塩基性を利用して、光学活性な酸（例えば、酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、マンデル酸、１０−カンファースルホン酸）を用いて、公知の方法により光学分割するか、或いは予め調製した光学活性な化合物を原料に用いて製造することができる。【００２７】
本発明に係る線維化抑制剤は、例えば、臓器又は組織の線維化が関与する下記の疾患の治療に用いることができる。
（１）腎臓疾患
尿細管間質性腎炎
（２）呼吸器疾患
間質性肺炎（肺線維症）
（３）消化器疾患
肝硬変、慢性膵炎、スキルス胃癌
（４）心血管疾患
心筋線維症
（５）骨・関節疾患
骨髄線維症、関節リウマチ
（６）皮膚疾患
手術後の瘢痕、熱傷性瘢痕、ケロイド、肥厚性瘢痕、強皮症
（７）産科疾患
子宮筋腫
（８）泌尿器疾患
前立腺肥大症
（９）その他の疾患
アルツハイマー病、硬化性腹膜炎、Ｉ型糖尿病、手術後臓器癒着【００２８】
本発明に係る線維化抑制剤は、本複素環誘導体（１）を、そのまま又は医薬上許容される無毒性かつ不活性な担体中に、０．０１〜９９．５％の範囲内で、好ましくは０．５〜９０％の範囲内で含有するものである。【００２９】
上記担体としては、固形、半固形又は液状の希釈剤、充填剤、その他の処方用の助剤を挙げることができる。これらを一種又は二種以上用いることができる。【００３０】
本発明に係る線維化抑制剤は、固形又は液状の用量単位で、末剤、カプセル剤、錠剤、糖衣剤、顆粒剤、散剤、懸濁剤、液剤、シロップ剤、エリキシル剤、トローチ剤等の経口投与製剤、注射剤、坐剤等の非経口投与製剤のいずれの形態をもとることができる。徐放性製剤であってもよい。それらの中で、特に錠剤等の経口投与製剤が好ましい。【００３１】
末剤は、本複素環誘導体（１）を適当な細かさにすることにより製造することができる。【００３２】
散剤は、本複素環誘導体（１）を適当な細かさにし、次いで同様に細かくした医薬用担体、例えば、澱粉、マンニトールのような可食性炭水化物と混合することにより製造することができる。任意に風味剤、保存剤、分散剤、着色剤、香料等を添加することができる。【００３３】
カプセル剤は、まず上述のようにして粉末状となった末剤や散剤あるいは錠剤の項で述べるように顆粒化したものを、例えば、ゼラチンカプセルのようなカプセル外皮の中へ充填することにより製造することができる。滑沢剤や流動化剤、例えば、コロイド状のシリカ、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、固形のポリエチレングリコールを粉末状のものに混合し、その後、充填操作を行うことにより製造することもできる。崩壊剤や可溶化剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムを添加すれば、カプセル剤が摂取されたときの医薬の有効性を改善することができる。また、本複素環誘導体（１）の微粉末を植物油、ポリエチレングリコール、グリセリン、界面活性剤中に懸濁分散し、これをゼラチンシートで包んで軟カプセル剤とすることもできる。【００３４】
錠剤は、賦形剤を加えて粉末混合物を作り、顆粒化もしくはスラグ化し、次いで崩壊剤又は滑沢剤を加えた後、打錠することにより製造することができる。
粉末混合物は、適当に粉末化された物質を上述の希釈剤やベースと混合することにより製造することができる。必要に応じて、結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール）、溶解遅延化剤（例えば、パラフィン）、再吸収剤（例えば、四級塩）、吸着剤（例えばベントナイト、カオリン）等を添加することができる。
粉末混合物は、まず結合剤、例えば、シロップ、澱粉糊、アラビアゴム、セルロース溶液又は高分子物質溶液で湿らせ、攪拌混合し、これを乾燥、粉砕して顆粒とすることができる。このように粉末を顆粒化する代わりに、まず打錠機にかけた後、得られる不完全な形態のスラグを破砕して顆粒にすることも可能である。このようにして作られる顆粒に、滑沢剤としてステアリン酸、ステアリン酸塩、タルク、ミネラルオイル等を添加することにより、互いに付着することを防ぐことができる。
また、錠剤は、上述のように顆粒化やスラグ化の工程を経ることなく、本複素環誘導体（１）を流動性の不活性担体と混合した後に直接打錠することによっても製造することができる。
こうして製造された錠剤にフィルムコーティングや糖衣を施すことができる。シェラックの密閉被膜からなる透明又は半透明の保護被覆、糖や高分子材料の被覆及びワックスよりなる磨上被覆をも用いることができる。【００３５】
他の経口投与製剤、例えば、液剤、シロップ剤、トローチ剤、エリキシル剤もまたその一定量が本複素環誘導体（１）の一定量を含有するように用量単位形態にすることができる。【００３６】
シロップ剤は、本複素環誘導体（１）を適当な香味水溶液に溶解して製造することができる。エリキシル剤は、非毒性のアルコール性担体を用いることにより製造することができる。【００３７】
懸濁剤は、本複素環誘導体（１）を非毒性担体中に分散させることにより製造することができる。必要に応じて、可溶化剤や乳化剤（例えば、エトキシ化されたイソステアリルアルコール類、ポリオキシエチレンソルビトールエステル類）、保存剤、風味付与剤（例えば、ペパーミント油、サッカリン）等を添加することができる。【００３８】
必要であれば、経口投与のための用量単位処方をマイクロカプセル化することができる。当該処方はまた、被覆をしたり、高分子・ワックス等中に埋め込んだりすることにより作用時間の延長や持続放出をもたらすこともできる。【００３９】
非経口投与製剤は、皮下・筋肉又は静脈内注射用とした液状用量単位形態、例えば、溶液や懸濁液の形態をとることができる。当該非経口投与製剤は、本複素環誘導体（１）の一定量を、注射の目的に適合する非毒性の液状担体、例えば、水性や油性の媒体に懸濁し又は溶解し、次いで当該懸濁液又は溶液を滅菌することにより製造することができる。注射液を等張にするために非毒性の塩や塩溶液を添加することができる。また、安定剤、保存剤、乳化剤等を添加することもできる。【００４０】
坐剤は、本複素環誘導体（１）を低融点の水に可溶又は不溶の固体、例えば、ポリエチレングリコール、カカオ脂、半合成の油脂［例えば、ウイテプゾール（登録商標）］、高級エステル類（例えば、パルミチン酸ミリスチルエステル）又はそれらの混合物に溶解又は懸濁させて製造することができる。【００４１】
本発明に係る線維化抑制剤の投与量は、体重、年齢等の患者の状態、投与経路、症状の程度等によって異なるが、一般的には成人に対して、本複素環誘導体（１）の量として、１日当たり０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲内が適当であり、０．１ｍｇ〜１００ｍｇの範囲内がより好ましい。場合によっては、これ以下でも足りるし、また逆にこれ以上の用量を必要とするときもある。また、１日１回から数回の投与又は１日から数日間の間隔で投与することができる。
【実施例】
【００４２】
以下に、試験例を掲げて、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は実施例に示される範囲に限定されるものではない。【００４３】
試験例１
（１）試験方法
ヒト肺線維芽細胞（Ｌｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ社製。以下同じ。）は、ヒト肺線維芽細胞用基礎培地（Ｌｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ社製。以下同じ。）（以下、「基礎培地」という。）にＦＧＭ−２添加因子セット（Ｌｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ社製。以下同じ。）を加えた増殖用培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。ヒト肺線維芽細胞を９６ｗｅｌｌプレートに１×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、増殖用培地で一晩培養した。
当該細胞を１００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（日水製薬社製。以下同じ。）で１回洗浄し、基礎培地を加え２４時間培養した。更に、１００μＬのリン酸緩衝生理食塩水にて１回洗浄し、８０μＬ／ｗｅｌｌの基礎培地を加えた。ここに１００μＭの化合物Ａ又は化合物Ｂの薬液を各ｗｅｌｌに１０μＬずつ添加し、２時間培養した。なお、加えた薬液は、化合物Ａ又は化合物Ｂを予めジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して、１０ｍＭの薬液を調製し、これを基礎培地で１００倍に希釈したものを用いた。無刺激対照群及び対照群に対しては、ＤＭＳＯを基礎培地で１００倍希釈したものを用いた。
ここに１００ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ：ＥＧＦ）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社製）溶液を各ｗｅｌｌに１０μＬずつ添加し、４８時間培養した。なお、無刺激対照群に対しては、基礎培地を用いた。
４８時間培養後、細胞増殖活性を調べるために、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６、ＡＱｕｅｏｕｓアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度の測定にはマイクロプレートリーダー（Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製。以下同じ。）を用いた。
（２）結果
図１に示すように、ヒト肺線維芽細胞は、ＥＧＦ刺激により細胞増殖活性が有意に増加した。一方、化合物Ａ及び化合物Ｂを処理した細胞は、対照群と比べて、細胞増殖活性が有意に減少した。【００４４】
試験例２
（１）試験方法
ヒト肺線維芽細胞は、増殖用培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。ヒト肺線維芽細胞を９６ｗｅｌｌプレートに３×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、増殖用培地で一晩培養した。
当該細胞を１００μＬのリン酸緩衝生理食塩水で１回洗浄し、基礎培地を加え２４時間培養した。更に、１００μＬのリン酸緩衝生理食塩水にて１回洗浄し、８０μＬ／ｗｅｌｌの基礎培地を加えた。ここに１μＭの化合物Ａの薬液を各ｗｅｌｌに１０μＬずつ添加し、２時間培養した。なお、加えた薬液は、化合物Ａを予めＤＭＳＯに溶解して、１ｍＭの薬液を調製し、これを基礎培地で１００倍に希釈したものを用いた。無刺激対照群及び対照群に対しては、ＤＭＳＯを基礎培地で１００倍希釈したものを用いた。
ここに１００ｎｇ／ｍＬのトランスフォーミング増殖因子−α（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−α：ＴＧＦα）（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製）溶液を各ｗｅｌｌに１０μＬずつ添加し、４８時間培養した。なお、無刺激対照群に対しては、基礎培地を用いた。
４８時間培養後、細胞増殖活性を調べるために、試験例１と同様に細胞増殖活性測定試薬を用いて、４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度の測定にはマイクロプレートリーダーを用いた。
（２）結果
図２に示すように、ヒト肺線維芽細胞は、ＴＧＦα刺激により細胞増殖活性が有意に増加した。一方、化合物Ａを処理した細胞は、対照群と比べて、細胞増殖活性が有意に減少した。【００４５】
試験例３
（１）試験方法
ヒト肺線維芽細胞は９６ｗｅｌｌプレートに５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、試験例１と同様に増殖用培地で一晩培養した。当該細胞を１００μＬの基礎培地で１回洗浄し、１００μＬの基礎培地を加え２４時間培養した。更に、１００μＬの基礎培地にて１回洗浄し、８０μＬ／ｗｅｌｌの基礎培地を加えた。ここに０．１、１、１０又は１００μＭの化合物Ａの薬液を各ｗｅｌｌに１０μＬずつ添加した。なお薬液は、化合物Ａを予めＤＭＳＯに溶解して、１０μＭ、１００μＭ、１ｍＭ及び１０ｍＭ濃度に調製し、これらを基礎培地で１００倍に希釈したものを用いた。また無刺激対照群及び対照群として、ＤＭＳＯを基礎培地で１００倍希釈したものを１０μＬずつ添加した。２時間培養後に、１００ｎｇ／ｍＬのトランスフォーミング増殖因子β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  β１：ＴＧＦβ１）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社製。以下同じ。）溶液を１０μＬずつ、また無刺激対照群に対しては基礎培地を１０μＬずつ添加した。４８時間培養後に培地中のプロコラーゲンＩ型Ｃ末端ペプチド（ＰＩＰ）濃度を測定するために培地を回収し、新たに１００μＬの基礎培地を加え、３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）  −２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ  （ＭＴＴ）（ナカライテスク社製）を用いて、細胞増殖活性を測定した。細胞増殖活性の測定は、５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴストック溶液を各ｗｅｌｌに１０μＬずつ添加し、４時間培養した後、各ｗｅｌｌに０．０４Ｍ塩酸イソプロパノール溶液を１００μＬずつ加え、マイクロプレートリーダーで５９５ｎｍにおける吸光度（参照波長６５５ｎｍ）を測定した。４８時間培養後の培地中ＰＩＰ濃度は、Ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｔｙｐｅ  Ｉ  Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＩＰ）  ＥＩＡ  Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製。以下同じ。）を用いて、添付の手順書に従い測定した。本試験の考察は、ＰＩＰ濃度測定値を細胞増殖活性値（吸光度）で補正し、無刺激対照群の平均値を１とした相対値として算出した値（コラーゲン産生の指標）を用いて行った。
（２）結果
図３に示すように、ヒト肺線維芽細胞は、ＴＧＦβ１刺激によりコラーゲン産生が有意に増加した。一方、化合物Ａを処理した細胞は、対照群と比べてコラーゲン産生が有意に減少した。【００４６】
試験例４  
（１）試験方法
ヒト肺線維芽細胞は２４ｗｅｌｌプレートに１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、試験例１と同様に増殖用培地で一晩培養した。当該細胞を５００μＬの基礎培地で１回洗浄し、５００μＬの基礎培地を加え２４時間培養した。更に、５００μＬの基礎培地にて１回洗浄し、４００μＬ／ｗｅｌｌの基礎培地を加えた。ここに試験例３と同様の方法で調製した１、１０又は１００μＭの化合物Ａの薬液を各ｗｅｌｌに５０μＬずつ添加した。また無刺激対照群及び対照群として、ＤＭＳＯを基礎培地で１００倍希釈したものを５０μＬずつ添加した。２時間培養後に１００ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１溶液を各ｗｅｌｌに５０μＬずつ添加し、また無刺激対照群に対しては基礎培地を５０μＬずつ添加した。２４時間培養後、ＳＶ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてＲＮＡから１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを合成した。こうして作製したｃＤＮＡを鋳型として、リアルタイム定量ＰＣＲ法により、Ｉ型コラーゲンα１鎖（ＣＯＬ１α１）、Ｉ型コラーゲンα２鎖（ＣＯＬ１α２）、α平滑筋アクチン（ＡＣＴＡ）、ＴＧＦβ１及びグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のｍＲＮＡ発現量を測定した。リアルタイム定量ＰＣＲはＰｌａｔｉｎｕｍ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒ−Ｍｉｘ−ＵＤＧ  ｗｉｔｈ  ＲＯＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）及び各遺伝子に特異的なプライマーを使用し、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒ−Ｍｉｘ−ＵＤＧ  ｗｉｔｈ  ＲＯＸ添付の手順書に従い、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて行った。本試験の考察は、各遺伝子のｍＲＮＡの発現量をＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正し、無刺激対照群の平均値を１とする相対値として算出した値（ｍＲＮＡ発現レベル）を用いて行った。
（２）結果
図４〜７に示すように、ヒト肺線維芽細胞はＴＧＦβ１刺激により各ｍＲＮＡ発現レベルが増加した。一方、化合物Ａを処理した細胞は、対照群と比べて、各ｍＲＮＡレベルが減少した。【００４７】
試験例５
（１）試験方法
ラット腎間質細胞（ＮＲＦ４９Ｆ細胞）は、９６ｗｅｌｌプレートに１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種し、１０％牛胎児血清（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製。以下同じ）を含むＭｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ培地：日本製薬社製。以下同じ。）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養した。牛胎児血清を含まないＭＥＭ培地（以下、「無血清ＭＥＭ培地」という。）で１回洗浄し、１００μＬの無血清ＭＥＭ培地を加え２４時間培養した。更に、無血清ＭＥＭ培地にて１回洗浄した後、無血清ＭＥＭ培地を８０μＬ／ｗｅｌｌ加えた。ここに試験例１と同様の方法で調製した、１００μＭの化合物Ａの薬液を各ｗｅｌｌに１０μＬずつ添加した。また無刺激対照群及び対照群に対しては、ＤＭＳＯを無血清ＭＥＭ培地で１００倍希釈したものを１０μＬずつ添加した。２時間培養後に１００ｎｇ／ｍＬの血小板由来成長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−ＢＢ：ＰＤＧＦＢＢ）（Ｓｉｇｍａ社製）溶液を各ｗｅｌｌに１０μＬずつ、また無刺激対照群は無血清ＭＥＭ培地を１０μＬずつ添加し培養した。４８時間培養後に、試験例３と同様にＭＴＴ法により細胞増殖活性（吸光度）を測定した。本試験の考察は、無刺激対照群の吸光度の平均値を１とする相対値で表した値（細胞増殖レベル）を用いて行った。
（２）結果
図８に示すように、ラット腎間質細胞は、ＰＤＧＦＢＢ刺激により細胞増殖レベルが有意に増加した。一方、化合物Ａを処理した細胞は、対照群と比べて、細胞増殖レベルが有意に減少した。【００４８】
試験例６
（１）試験方法
ヒト皮膚線維芽細胞（クラボウ社製。以下同じ。）は、９６ｗｅｌｌプレートに５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、１０％の牛胎児血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ培地）（日本製薬社製。以下同じ。）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養した。ヒト皮膚線維芽細胞を牛胎児血清を含まないＤＭＥＭ培地（以下、「無血清ＤＭＥＭ培地」という。）で１回洗浄し、１００μＬの無血清ＤＭＥＭ培地を加え２４時間培養した。更に無血清ＤＭＥＭ培地にて１回洗浄し、８０μＬ／ｗｅｌｌの無血清ＤＭＥＭ培地を加えた。ここに試験例３と同様の方法で調製した０．１、１、１０又は１００μＭの化合物Ａの薬液を各ｗｅｌｌに１０μＬずつ添加した。また無刺激対照群及び対照群に対しては、ＤＭＳＯを無血清ＤＭＥＭ培地で１００倍希釈したものを１０μＬずつ添加し培養した。２時間培養後に１００ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１溶液を各ｗｅｌｌに１０μＬずつ添加し、無刺激対照群に対しては無血清ＭＥＭ培地を１０μＬずつ添加した。４８時間培養後に試験例３と同様にＭＴＴ法により細胞増殖活性（吸光度）と、培地中のＰＩＰ濃度を測定した。本試験の考察は、ＰＩＰ濃度測定値を細胞増殖活性値（吸光度）で補正し、無刺激対照群の平均値を１とした相対値として算出した値（コラーゲン産生の指標）を用いて行った。
（２）結果
図９に示すように、ヒト皮膚線維芽細胞は、ＴＧＦβ１刺激によりコラーゲン産生が有意に増加した。一方、化合物Ａを処理した細胞は、対照群と比べて、コラーゲン産生が有意に減少した。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１は、ＥＧＦで刺激したヒト肺線維芽細胞における、化合物Ａ及び化合物Ｂの細胞増殖抑制効果を示す。縦軸は吸光度を表す。
【００５０】
【図２】図２は、ＴＧＦαで刺激したヒト肺線維芽細胞における、化合物Ａの細胞増殖抑制効果を示す。縦軸は吸光度を表す。
【００５１】
【図３】図３は、ＴＧＦβ１で刺激したヒト肺線維芽細胞における、化合物Ａのコラーゲン産生抑制効果を示す。縦軸は、ＰＩＰ濃度測定値を細胞増殖活性値（吸光度）で補正し、無刺激対照群の平均値を１とした相対値として算出した値を表す。
【００５２】
【図４】図４は、ＴＧＦβ１で刺激したヒト肺線維芽細胞における、ＣＯＬ１α１のｍＲＮＡ発現抑制効果を示す。縦軸は、ＣＯＬ１α１のｍＲＮＡの発現量をＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正し、無刺激対照群の平均値を１とした相対値を表す。
【００５３】
【図５】図５は、ＴＧＦβ１で刺激したヒト肺線維芽細胞における、ＣＯＬ１α２のｍＲＮＡ発現抑制効果を示す。縦軸は、ＣＯＬ１α２のｍＲＮＡの発現量をＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正し、無刺激対照群の平均値を１とした相対値を表す。
【００５４】
【図６】図６は、ＴＧＦβ１で刺激したヒト肺線維芽細胞における、ＡＣＴＡのｍＲＮＡ発現抑制効果を示す。縦軸は、ＡＣＴＡのｍＲＮＡの発現量をＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正し、無刺激対照群の平均値を１とした相対値を表す。
【００５５】
【図７】図７は、ＴＧＦβ１で刺激したヒト肺線維芽細胞における、化合物ＡのＴＧＦβ１のｍＲＮＡ発現抑制効果を示す。縦軸は、ＴＧＦβ１のｍＲＮＡの発現量をＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正し、無刺激対照群の平均値を１とした相対値を表す。
【００５６】
【図８】図８は、ＰＤＧＦＢＢで刺激したラット腎間質細胞における、化合物Ａの細胞増殖抑制効果を示す。縦軸は、無刺激対照群の吸光度の平均値を１とした相対値を表す。
【００５７】
【図９】図９は、ＴＧＦβ１で刺激したヒト皮膚線維芽細胞における、化合物Ａのコラーゲン産生抑制効果を示す。縦軸は、ＰＩＰ濃度測定値を細胞増殖活性値（吸光度）で補正し、無刺激対照群の平均値を１とした相対値として算出した値を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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