(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトにおけるＮＫＴ細胞の機能解析方法であって、
（ａ）ヒト末梢血由来のマクロファージ枯渇単核球を、げっ歯類由来のＣＤ１ｄ発現樹状細胞と共培養し、
（ｂ）ＮＫＴ細胞数および／または機能性ＮＫＴ細胞に特異的な物質を指標として、ＮＫＴ細胞の機能性を評価すること、
を含む方法。
【請求項２】
ＣＤ１ｄ発現樹状細胞が成熟樹状細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＣＤ１ｄ発現樹状細胞が、ＣＤ１ｄリガンドをパルスされた細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ＣＤ１ｄリガンドがα−ＧａｌＣｅｒである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
機能性ＮＫＴ細胞に特異的な物質がＩＦＮ−γである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
ＮＫＴ細胞数および／または機能性ＮＫＴ細胞に特異的な物質を指標とするＮＫＴ細胞の機能性の評価が、機能性ＮＫＴ細胞に特異的な物質を発現する細胞頻度の測定に基づき行われる、請求項１記載の方法。
【請求項７】
げっ歯類がマウスまたはラットである、請求項１記載の方法。
【請求項８】
げっ歯類がマウスである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
末梢血においてリンパ球分画中の細胞に占めるＮＫＴ細胞の頻度が０．０５％〜０．００１％を示すヒトの解析法であって、前記の共培養の期間が７〜１４日間である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
以下、（ａ）−（ｃ）を含むキット：
（ａ）げっ歯類由来のＣＤ１ｄ発現樹状細胞；
（ｂ）ヒト末梢血中に含まれるマクロファージを枯渇させるための試薬；
（ｃ）ヒトＮＫＴ細胞数の測定用試薬およびヒト機能性ＮＫＴ細胞に特異的な物質の測定用試薬からなる群より選ばれる少なくとも１つの試薬。
【請求項１１】
上記（ｂ）の試薬が、抗ＣＤ１４抗体、または抗ＣＤ１４抗体および抗ＣＤ１１ｃ抗体である、請求項１０記載のキット。
【請求項１２】
さらにＣＤ１ｄリガンドを含む、請求項１０記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＫＴ細胞の機能解析法、詳細には、異種動物由来のＣＤ１ｄ発現抗原提示細胞を用いたヒトＮＫＴ細胞の機能解析法、そのための試薬およびキットなどに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＮＫＴ細胞は、Ｔ細胞とＮＫ細胞の両方の特徴を併有するリンパ球系譜（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｌｉｎａｇｅ）を構成する細胞であり、ＭＨＣクラスＩ様分子ＣＤ１ｄ上に提示される抗原により活性化され、抗腫瘍作用等の作用を示す。ＣＤ１ｄ上に提示され、且つＮＫＴ細胞を強力に活性化する抗原としては、例えば、糖脂質α−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）が存在する。初代（ｐｒｉｍａｒｙ）ＮＫＴ細胞は、α−ＧａｌＣｅｒ等の抗原をロードした抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ：ＡＰＣ）により刺激され、分化・増殖し得る。このようなＡＰＣとしては、例えば、マクロファージ、未熟又は成熟樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｃ  ｃｅｌｌ：ＤＣ）等が知られているが、なかでも、α−ＧａｌＣｅｒをパルスした成熟ＤＣは、末梢血中の初代ＮＫＴ細胞を強力に活性化することを本発明者らは以前に報告している（Ｆｕｊｉｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００３，２７２：１４７−５９）。
癌、ウイルス感染症、自己免疫疾患等の免疫関連疾患の患者において、ＮＫＴ細胞の数的減少または機能的低下と病態、例えば病気の進行が連動していることが知られている。従って、このような疾患に対しＮＫＴ細胞解析を病気の進行指標とするための手順を標準化するための方法の開発が求められている。また、現在行われているＮＫＴ細胞療法でも、低頻度ＮＫＴ細胞解析法の開発が求められている。
これまでに、ＮＫＴ細胞の機能解析法として、以下の報告がある。
１）α−ＧａｌＣｅｒパルスしたＡＰＣを用いてＮＫＴ細胞の機能をモニターするＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（Ｆｕｊｉｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００３，２７２：１４７−５９；Ｆｕｊｉｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ２００３，１２２：６１７−２２；Ｍｏｌｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００５，１１６：８７−９３）。
２）ＣＤ１ｄテトラマーを用いた細胞内サイトカイン染色により、ＮＫＴ細胞の機能的解析を行うテトラマーアッセイ（Ｇｕｍｐｅｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００２，１９５：６２５−６３６）。
３）被験体からＮＫＴ細胞を採取し、ＮＫＴ細胞株の作製後、その機能解析を行う方法（Ｔａｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００１，１６７：４０４６−５０；Ｙａｎａｇｉｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００２，１６８：６４９４−９）。
しかしながら、上記１）〜３）には、それぞれ以下の問題がある。
１）の方法については、末梢血ＮＫＴ細胞が低頻度（＜０．０５％）である場合にはその検出が困難であるため、末梢血ＮＫＴ細胞が低頻度である被験体（例えば、癌患者）におけるＮＫＴ細胞の機能解析が難しいという問題がある。また、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによるＮＫＴ細胞の機能解析結果は自己ＡＰＣに依存するものであるため、自己ＡＰＣに依存しないＮＫＴ細胞自体の純粋な機能解析を行い得ないとの問題がある。
２）の方法については、アッセイの検出感度がフローサイトメトリーの検出感度に依存するので、末梢血ＮＫＴ細胞が低頻度（＜０．０５％）である場合には、その機能解析が難しいという問題がある。また、テトラマーアッセイによるＮＫＴ細胞の機能解析結果は、自己ＡＰＣに依存するものであるため、自己ＡＰＣに依存しないＮＫＴ細胞自体の純粋な機能解析を行い得ないとの問題がある。
３）の方法については、長期の培養を必要とするためＩＬ−１２等の二次的因子の影響が加わり、長期培養で生き残った特定のＮＫＴ細胞株の解析になるという問題がある。
【発明の開示】
【０００３】
本発明の目的は、低頻度ＮＫＴ細胞の機能解析を可能とし、また、自己ＡＰＣの機能に依存せず、且つ二次的因子の影響などを回避し得る、従来法に比しより優れたＮＫＴ細胞の機能解析方法を提供することである。
本発明者らは、鋭意検討の結果、自己ＡＰＣの機能に依存せずヒトＮＫＴ細胞の機能解析を行うためには、異種動物由来のＣＤ１ｄ発現ＡＰＣを用いればよいこと、並びに上記解析系では、サイトカイン等の二次的因子の影響を回避し得るため、精度、再現性に優れたアッセイが可能になること、および長期培養により、培養前後のＮＫＴ細胞数の比例関係を維持しつつＮＫＴ細胞を増殖させ得ることから、長期培養によりアッセイの検出感度が向上し、従って低頻度ＮＫＴ細胞の機能解析が可能となることなどを見出した。本発明者らは、これら知見などに基づき、より優れたＮＫＴ細胞の機能解析系を構築することに成功し、もって上記課題を解決することに成功した。
即ち、本発明は、以下の通りである：
〔１〕ヒトにおけるＮＫＴ細胞の機能解析方法であって、
（ａ）ヒト末梢血由来の単核球を、異種動物由来のＣＤ１ｄ発現抗原提示細胞と共培養し、
（ｂ）ＮＫＴ細胞数および／または機能性ＮＫＴ細胞に特異的な物質を指標として、ＮＫＴ細胞の機能性を評価すること、
を含む方法；
〔２〕ＣＤ１ｄ発現抗原提示細胞が成熟樹状細胞である、上記〔１〕の方法；
〔３〕ＣＤ１ｄ発現抗原提示細胞が、ＣＤ１ｄリガンドをパルスされた細胞である、上記〔１〕の方法；
〔４〕ＣＤ１ｄリガンドがα−ＧａｌＣｅｒである、上記〔３〕の方法；
〔５〕単核球がマクロファージ枯渇単核球である、上記〔１〕の方法；
〔６〕機能性ＮＫＴ細胞に特異的な物質がＩＦＮ−γである、上記〔１〕の方法；
〔７〕ＮＫＴ細胞数および／または機能性ＮＫＴ細胞に特異的な物質を指標とするＮＫＴ細胞の機能性の評価が、機能性ＮＫＴ細胞に特異的な物質を発現する細胞頻度の測定に基づき行われる、上記〔１〕の方法；
〔８〕異種動物がげっ歯類である、上記〔１〕の方法；
〔９〕げっ歯類がマウスである、上記〔８〕の方法；
〔１０〕末梢血において約０．０５％〜約０．００１％のＮＫＴ細胞頻度を示すヒトの解析法である、上記〔１〕の方法；
〔１１〕癌、自己免疫疾患、アレルギー疾患及びウイルス感染症からなる群より選択される疾患患者における免疫療法のモニタリング、あるいは病態または予後の判定のための方法である、上記〔１〕の方法；
〔１２〕異種動物由来のＣＤ１ｄ発現抗原提示細胞を含む、ヒトＮＫＴ細胞の解析用試薬；
〔１３〕以下、（ａ）及び（ｂ）を含むキット：
（ａ）異種動物由来のＣＤ１ｄ発現抗原提示細胞；
（ｂ）ヒト単核球の選別用試薬、ヒトＮＫＴ細胞数の測定用試薬およびヒト機能性ＮＫＴ細胞に特異的な物質の測定用試薬からなる群より選ばれる少なくとも１つの試薬；
〔１４〕さらにＣＤ１ｄリガンドを含む、上記〔１３〕のキット。
本発明によれば、低頻度ＮＫＴ細胞の機能解析を可能とし、また、自己ＡＰＣの機能に依存せず、且つ二次的因子の影響などを回避し得る、従来法に比しより優れたＮＫＴ細胞の機能解析方法が可能となるため有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ヒト／マウス樹状細胞の発現プロフィールを示す。ＤＣ：樹状細胞
図２は、樹状細胞を用いた高頻度（％ＮＫＴ＞０．０５％）ＮＫＴ細胞含有群の活性化率の比較を示す。各システムについて、１００、３０、１０倍に希釈したＰＢＭＣを用いてそれぞれ試験した。ＤＣ：樹状細胞  Ｇ：α−ＧａｌＣｅｒ
図３は、樹状細胞を用いた中頻度（０．０１％＜％ＮＫＴ＜０．０５％）ＮＫＴ細胞含有群の活性化率の比較を示す。各システムについて、１００、３０、１０倍に希釈したＰＢＭＣを用いてそれぞれ試験した。ＤＣ：樹状細胞  Ｇ：α−ＧａｌＣｅｒ
図４は、樹状細胞を用いた低頻度（％ＮＫＴ＜０．０１％）ＮＫＴ細胞含有群の活性化率の比較を示す。各システムについて、１００、３０、１０倍に希釈したＰＢＭＣを用いてそれぞれ試験した。ＤＣ：樹状細胞  Ｇ：α−ＧａｌＣｅｒ
図５は、自己、同種異系または異種樹状細胞による混合リンパ球反応（ＭＬＲ）の結果を示す。
図６は、自己ＮＫＴ細胞による樹状細胞の表現型の成熟化を示す。アイソタイプは、マウス抗ヒトＩｇＧ１−ＰＥ抗体を用いた場合の結果を示す。
図７は、自己ＮＫＴ細胞による樹状細胞のサイトカイン産生能の変化を示す図である。
図８は、自己または異種樹状細胞とＮＫＴ細胞との相互作用の様式を示す。
図９は、異種樹状細胞によるヒトＮＫＴ細胞の抗原特異的な活性化を示す。ｈＤＣ：ヒト樹状細胞  ｍＤＣ：マウス樹状細胞  Ｇ：α−ＧａｌＣｅｒ  ｈＮＫＴ：ヒトＮＫＴ細胞  ＣＫ：サイトカインカクテル
図１０は、異種樹状細胞によるヒトＮＫＴ細胞の抗原特異的な正比例の増幅を示す。
図１１は、異種樹状細胞による、健常人における末梢血ＮＫＴ細胞の抗原特異的な増幅およびＩＦＮ−γ産生を実証する。ＤＣ：樹状細胞  Ｇ：α−ＧａｌＣｅｒ
図１２は、異種樹状細胞による、複数の健常人（低頻度ＮＫＴ細胞含有群を含む）における末梢血ＮＫＴ細胞の抗原特異的な増幅およびＩＦＮ−γ産生を実証する。
図１３は、異種樹状細胞によるＮＫＴ細胞の増殖およびＩＦＮ−γ産生能が実証された慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）患者の代表例についての解析結果を示す。
ＤＣ：樹状細胞  Ｇ：α−ＧａｌＣｅｒ
図１４は、異種樹状細胞によるＮＫＴ細胞の増殖およびＩＦＮ−γ産生能が実証されたＣＭＬ患者１０例の解析結果を示す。慢性骨髄性白血病患者としては、イマチニブによる治療を受けている患者を対象とした。ＰＲ：イマチニブによる治療により部分寛解を示した患者群  ＣＲ：イマチニブによる治療により完全寛解を示した患者群
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明は、ヒトＮＫＴ細胞の機能解析方法を提供する。本発明の方法は、例えば、以下（ａ）及び（ｂ）を含み得る：
（ａ）ヒト末梢血由来の単核球を、異種動物由来のＣＤ１ｄ発現抗原提示細胞と共培養すること；
（ｂ）ＮＫＴ細胞数および／または機能性ＮＫＴ細胞に特異的な物質を指標として、ＮＫＴ細胞の機能性を評価すること。
上記（ａ）の共培養は、ＣＤ１ｄ発現ＡＰＣがヒト末梢血由来の単核球に含まれるＮＫＴ細胞を活性化し得る任意の様式で行われ得るが、好ましくはＣＤ１ｄリガンドでパルスされたＣＤ１ｄ発現細胞を用いて行われ得る。これにより、ＣＤ１ｄリガンドがＣＤ１ｄ発現抗原提示細胞上に提示され、ひいてはＣＤ１ｄリガンドを提示した細胞がヒト末梢血由来の単核球に含まれるＮＫＴ細胞を効率良く活性化することで、本発明の方法の感度が向上し得る。
「異種動物」とは、本明細書中で使用される場合、本発明の方法で使用可能な非ヒト動物をいう。本発明の方法では、異種動物由来のＣＤ１ｄ発現ＡＰＣが、ヒトＮＫＴ細胞を活性化し得ることが必要である。このような異種動物としては、例えばニワトリ等の鳥類、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター）又は非げっ歯類（ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、サル）等の哺乳動物が挙げられる。また、本発明の方法では、バックグランドノイズを低く抑え、より精度且つ再現性に優れたＮＫＴ細胞の機能解析を実現するという観点から、ヒト末梢血中に含まれるヒト免疫担当細胞（例えば、Ｔ細胞）と異種動物由来のＣＤ１ｄ発現ＡＰＣとの間で、本発明の方法の精度及び再現性を低下させ得るような免疫応答（例えば、Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ等のＴｈ１タイプサイトカインの産生）を引き起こさないことが重要である。このような観点から、異種動物としては、上述したもののなかでもげっ歯類が好ましく、マウスがより好ましい。
「ＣＤ１ｄ発現抗原提示細胞（ＣＤ１ｄ発現ＡＰＣ）」とは、本明細書中で使用される場合、その細胞表面上にＣＤ１ｄを有し、ＮＫＴ細胞を活性化し得る細胞をいう。ＣＤ１ｄ発現ＡＰＣとしては特に限定されるものではなく、例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞が挙げられるが、なかでも樹状細胞が好ましい。また、ＣＤ１ｄ発現ＡＰＣとしては、例えば、その前駆細胞（例えば、骨髄細胞）から分化誘導された細胞、あるいは末梢血中に見出される分化細胞を使用できるが、凍結保存によってもその機能を保持し得ること、培養後細胞の安定性が維持され得ることから、分化誘導された細胞が好ましい。さらに、ＣＤ１ｄ発現ＡＰＣとしては、未熟又は成熟細胞が使用できるが、成熟細胞が好ましい。ＣＤ１ｄ発現ＡＰＣの誘導および成熟は、自体公知の方法、例えば、骨髄細胞からの不要な細胞（例えば、マクロファージ、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の除去後、ＧＭ−ＣＳＦを添加して７日後にＬＰＳを１６時間添加することにより行われ得る（例えば、Ｆｕｊｉｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：８６７−７４（２００２）参照）。
ＣＤ１ｄ発現抗原提示細胞（ＣＤ１ｄ発現ＡＰＣ）としては、上述の通り種々の細胞を使用できるが、機能性ＮＫＴ細胞の検出感度及び汎用性に優れる点、凍結保存によってもその機能を保持し得る点、入手が容易であり、且つ大量に取得できる点などから、骨髄細胞から分化誘導され、且つ成熟した樹状細胞がより好ましい。
誘導された樹状細胞は、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ（例、マウス等のげっ歯類のＧＭ−ＣＳＦ）等の所定の分化誘導因子の存在下での骨髄細胞の培養により、あるいは脾臓からの樹状細胞の単離などにより入手できるが、生存細胞の安定性に優れることから、ＧＭ−ＣＳＦの存在下での骨髄細胞の培養により入手したものが好ましく使用され得る。
樹状細胞の成熟は、例えば、所定の成熟因子の存在下での未熟樹状細胞の培養により行うことができる。このような成熟因子としては、例えば、ＬＰＳ、ＣＤ１ｄリガンド（後述）、抗ＣＤ４０抗体、ＴＮＦ−α、ＣｐＧ−ＤＮＡが挙げられるが、樹状細胞に対する選択性が優れること、低価格であること、安定性に優れることなどから、ＬＰＳが好ましい。
「ＣＤ１ｄリガンド」とは、本明細書中で使用される場合、ＣＤ１ｄ発現ＡＰＣ上に提示され、以ってヒトＮＫＴ細胞を活性化し得る物質をいう。「ＣＤ１ｄリガンド」としては特に限定されるものではなく、例えば、α−ＧａｌＣｅｒ（α−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ）、α−Ｃ−ＧａｌＣｅｒ（α−Ｃ−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ）、ｉＧＢ３（ｉｓｏｇｌｏｂｏｔｒｉｈｅｘｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ）、ＧＤ３（ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ  ３）、ＧＳＬ−１（α−ｌｉｎｋｅｄ  ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ＧＳＬ−１’ＳＡ（ｇａｌａｃｔｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）が挙げられるが、ヒトＮＫＴ細胞を強力に活性化し、以って本発明の方法の検出感度をより向上させるという観点から、α−ＧａｌＣｅｒ、α−Ｃ−ＧａｌＣｅｒが好ましく、α−ＧａｌＣｅｒがより好ましい。ＣＤ１ｄ発現ＡＰＣのパルスのために用いられるＣＤ１ｄリガンドの濃度は、機能的ＮＫＴ細胞の検出を可能とするような濃度である限り特に限定されないが、例えば約１０〜２００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１００ｎｇ／ｍｌの濃度であり得る。本発明の方法では、好ましくはＣＤ１ｄリガンドによりパルスされたＣＤ１ｄ発現ＡＰＣが使用され得る。従って、本発明の方法は、ＣＤ１ｄ発現ＡＰＣの誘導および成熟と同時に、あるいはその後に、ＣＤ１ｄ発現ＡＰＣをＣＤ１ｄリガンドでパルス処理することを含むことができる。
共培養に用いられるＣＤ１ｄ発現ＡＰＣの濃度は、ＮＫＴ細胞を活性化し、以ってその機能性の評価を可能とするような濃度である限り特に限定されないが、例えば約０．１×１０５〜１×１０５細胞／ｍｌ、好ましくは約０．５×１０５細胞／ｍｌの濃度であり得る。
ヒト末梢血由来の単核球は、解析対象であるヒトＮＫＴ細胞を含む細胞集団である限り特に限定されない。ヒトＮＫＴ細胞は、Ｖα２４及び／又はＶβ１１陽性の細胞であり得る。本発明の方法では、ヒトＮＫＴ細胞を含む限り、ヒト末梢血を所定の処理（例えば、細胞分画処理）に付したもの、又は付していないもののいずれも使用できるが、自己（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）ＣＤ１ｄ発現ＡＰＣの影響を排してヒトＮＫＴ細胞自体の純粋な機能解析を行うという観点から、ヒト末梢血中に含まれるヒトＣＤ１ｄ発現ＡＰＣ（例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞）を除いた（又は枯渇させた）、ヒトＮＫＴ細胞を含む細胞集団が好ましく使用される。ヒト末梢血からのヒトＣＤ１ｄ発現ＡＰＣの除去（または枯渇）は、当該ＡＰＣのマーカー分子を利用することで行うことができる。例えば、ＡＰＣの除去は、ヒト樹状細胞のマーカー分子（例えば、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８３、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＤＲ）、ヒトマクロファージのマーカー分子（例えば、ＣＤ１４）に対する抗体を用いて、あるいは抗ＰＥ抗体結合磁気ビーズ、又は抗ＦＩＴＣ抗体結合磁気ビーズを用いて行われ得る。好ましくは、ヒト末梢血由来の単核球は、抗ＣＤ１４抗体、または抗ＣＤ１４抗体および抗ＣＤ１１ｃ抗体を用いてマクロファージを除去（Ｍφ枯渇）した末梢血由来の単核球であり得る。
共培養に用いられるヒト末梢血由来の単核球は、解析対象のヒトから自体公知の方法により調製できる。培養に用いられる単核球数は、それに含まれるヒトＮＫＴ細胞の機能解析が可能となる限り特に限定されない。なお、単核球に占めるＮＫＴ細胞の割合には、健康状態、疾患等の要因により個体差が生じ、例えば癌患者ではＮＫＴ細胞数が顕著に低下し得ることが報告されている。しかしながら、本発明の方法では、共培養の前後で、ＮＫＴ細胞数の比例関係を維持しつつＮＫＴ細胞を増殖させ得るので、培養開始の際に使用する、単核球に含まれるＮＫＴ細胞数が少ない場合であっても、精度を維持してＮＫＴ細胞の機能性を解析し得るという利点がある。このような観点から、共培養に用いられる単核球の濃度は、例えば約１ｘ１０４〜１０６細胞／ｍｌ、好ましくは約５ｘ１０５細胞／ｍｌであり得る。
また、本発明の方法を行うためには採血する必要があるが、採血量が少なければ少ないほど個体への負担が軽減されるため好ましいものの、過度に少ないと単核球数、ひいてはそれに含まれるＮＫＴ細胞数も減少し、本発明の方法を適切に行い得ないおそれがある。また、後述の実施例より、単核球に占めるＮＫＴ細胞の頻度が０．００１％以上であれば、本発明の方法は、ＮＫＴ細胞を良好に解析し得ることが判明している。従って、例えば、ＮＫＴ細胞の頻度が０．００１％である患者において、９６ウェルプレートを用いて解析を行う場合、１０〜２０ｍｌの末梢血量で十分であると考えられる。このような少ない末梢血量で精度に優れたＮＫＴ細胞の機能解析を行い得ることもまた、本発明の利点の一つである。なお、本発明の方法は、上記容量の末梢血を細胞分画処理（例えば、マクロファージ等のＣＤ１ｄ発現ＡＰＣ除去処理）に付し、あるいは付すことなく、上記（ａ）に供することをさらに含むことができる。
培養期間は、ＮＫＴ細胞の機能性の評価を可能とするものである限り特に限定されない。なお、上記（ａ）の方法論によれば、共培養の前後で、ＮＫＴ細胞数の比例関係を維持しつつＮＫＴ細胞を増殖させ得ることが判明している。従って、本発明の方法は、培養期間を適宜設定することで、精度を保ったまま検出感度を向上させることができる、より少量の末梢血での解析が可能になる等の利点を有する。このような利点を期待して培養を行う場合、好ましい培養期間としては、ＮＫＴ細胞数の比例関係を維持しつつＮＫＴ細胞を増殖させ得るような期間である限り特に限定されないが、例えば約７日以上、好ましくは約７〜１４日、より好ましくは約９〜１２日、さらにより好ましくは約９〜１０日の培養が挙げられる。
共培養に用いられる培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＥａｇｌｅＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ハム培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、およびこれらの混合培地が挙げられる。培地は、例えば、血清（例えば、ＦＣＳ）、血清代替物（例えば、ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（Ｇｉｂｃｏ社製）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ社製））、脂肪酸又は脂質、アミノ酸、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含むことができる。
共培養で用いられる培養器は、細胞の浮遊培養が可能なものであれば特に限定されないが、例えば、９６ウェル丸底プレート等のマルチウェルプレートが挙げられる。
共培養における培養温度、ＣＯ２濃度等の他の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、特に限定されるものではないが、例えば約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。また、ＣＯ２濃度は、例えば約１〜１０％、好ましくは約５％である。
なお、共培養では、ＩＬ−２が使用され得る。これは、ＮＫＴ細胞の生存、維持に有用であるためである。共培養に用いられるＩＬ−２の濃度は、ＮＫＴ細胞の生存、維持に好適である限り特に限定されないが、例えば約５〜１０００Ｕ／ｍｌ、好ましくは約１０〜１００Ｕ／ｍｌ、より好ましくは約１００Ｕ／ｍｌであり得る。
上記（ｂ）では、ＮＫＴ細胞の機能性の評価は、ＮＫＴ細胞数および／または機能性ＮＫＴ細胞に特異的な物質を指標とすることで評価可能である。
「機能性ＮＫＴ細胞に特異的な物質」とは、活性化されたＮＫＴ細胞の機能性の指標となり得る物質をいう。機能性ＮＫＴ細胞に特異的な物質は、細胞内因子、分泌因子等のタンパク質又はそれをコードする転写産物であり得る。機能性ＮＫＴ細胞に特異的な物質としては、例えば、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、パーフォリン、グランザイムＢ等のタンパク質、あるいはそれをコードする転写産物が挙げられるが、簡便かつ高感度であることから、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）が好ましい。なお、ＮＫＴ細胞の機能性の評価に際しては、１種または２種以上の機能性ＮＫＴ細胞に特異的な物質を利用できる。
ＮＫＴ細胞数を指標とするＮＫＴ細胞の機能性の評価は、共培養によりＮＫＴ細胞数が増加したか否か（換言すれば、ＮＫＴ細胞が増幅能を有するか否か）の観点より行われ得る。ＮＫＴ細胞数の測定は、例えば、Ｖα２４抗体、Ｖβ１１抗体、抗インバリアントＮＫＴ抗体を用いて行われ得る。本評価手法によれば、増幅能を保持し得るＮＫＴ細胞の解析が可能である。
機能性ＮＫＴ細胞に特異的な物質を指標とするＮＫＴ細胞の機能性の評価は、該物質を発現している細胞頻度の測定、または培養上清中の該物質量の測定に基づき行われ得る。該物質を発現している細胞頻度の測定は、例えば、該物質に対する抗体を用いる細胞内染色により、あるいは該物質をコードする転写産物を検出可能な核酸プローブまたは増幅可能な複数のプライマー（例えば、プライマー対）などを用いる方法（例えば、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ等のＲＴ−ＰＣＲ）により行われ得る。また、培養上清中の該物質量の測定は、該物質に対する抗体（上述）を用いる免疫学的手法により行われ得る。本評価手法によれば、抗腫瘍作用等の作用を保持し得るＮＫＴ細胞の解析が可能である。
ＮＫＴ細胞の機能性の評価は、上述の通り種々の様式で行うことができるが、機能性ＮＫＴ細胞の数をより正確に判定するという観点より、機能性ＮＫＴ細胞に特異的な物質を発現している細胞頻度の測定に基づき行うことが好ましい。
本発明の方法は、例えば、免疫関連疾患における免疫療法のモニタリング、あるいは病態（例えば、病気の進行度）または予後の判定などに有用である。本発明の方法は、末梢血中のＮＫＴ細胞頻度が低下しているヒトであっても、精度、再現性に優れたＮＫＴ細胞の機能解析を可能とするため、末梢血中のＮＫＴ細胞頻度が低下しているヒトにおける免疫療法のモニタリング等においてその有用性を特に発揮する。本発明の方法は、上記（ａ）の培養期間を適宜設定することで如何なる低頻度ＮＫＴ細胞の機能解析も可能であり得るが、例えば、約０．１％以下、好ましくは約０．０５％以下、より好ましくは約０．０１％以下、さらにより好ましくは約０．００５％以下の低頻度ＮＫＴ細胞の機能性を良好に解析し得る（本明細書中、ＮＫＴ細胞パーセンテージ（％）は、リンパ球分画中の細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞）に占めるＮＫＴ細胞数の割合を示す）。また、本発明の方法により機能性を解析可能なＮＫＴ細胞頻度の下限値は特に限定されるものではないが、約０．００１％以上であれば、ＮＫＴ細胞の機能性を解析し得る。末梢血中のＮＫＴ細胞頻度が低下し得る、あるいは免疫療法のモニタリング、あるいは病態または予後の判定が所望される免疫関連疾患としては、癌（例えば、前立腺癌、肺癌、肝臓癌、卵巣癌、白血病（例、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ球性白血病）、ＭＤＳ（ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫）、自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、慢性関節リウマチ）、アレルギー疾患（例えば、鼻炎、気管支喘息）、ウイルス感染症（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス等のウイルスによる感染症）などが挙げられる。
本発明はまた、ヒトＮＫＴ細胞の解析用試薬を提供する。本発明の試薬は、異種動物由来のＣＤ１ｄ発現ＡＰＣ又はその前駆細胞を含み得る。異種動物由来のＣＤ１ｄ発現ＡＰＣは上述の通りであり、また、ＣＤ１ｄリガンドで刺激処理されたものであっても未処理のものであってもよい。ＣＤ１ｄ発現ＡＰＣの前駆細胞は、分化誘導処理によりＣＤ１ｄ発現ＡＰＣへと分化し得る細胞（上述）であり得る。本発明の試薬が前駆細胞を含む場合、ＣＤ１ｄ発現ＡＰＣへの分化誘導因子を併せて含むことができる。
本発明はさらに、本発明の方法を簡便に行うことを可能とする、診断または医療に用いられ得るキットを提供する。本発明のキットは、例えば、（ａ）異種動物由来のＣＤ１ｄ発現抗原提示細胞、並びに（ｂ）ヒト単核球の選別用試薬、ヒトＮＫＴ細胞数の測定用試薬およびヒト機能性ＮＫＴ細胞に特異的な物質の測定用試薬からなる群より選ばれる少なくとも１つの試薬を含むものであり得る。本発明のキットはまた、ＣＤ１ｄリガンドをさらに含んでいてもよい。本発明のキットはさらに、Ｖα２４及び／又はＶβ１１に対する抗体、抗ＣＤ３抗体、抗インバリアントＮＫＴ抗体などを含むことができる。
ヒト単核球の分画処理用試薬は、ヒトＣＤ１ｄ発現ＡＰＣのマーカー分子（上述）に対する抗体を含むものであり得る。
ヒトＮＫＴ細胞数の測定用試薬は、例えば、Ｖα２４抗体、Ｖβ１１抗体又は抗インバリアントＮＫＴ抗体、あるいはＶα２４又はＶβ１１をコードする転写産物を検出可能な核酸プローブまたは増幅可能な複数のプライマー（例えば、プライマー対）を含むものであり得る。例えば、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行うことも有益であるため、測定用試薬は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ用プライマーを含むものであってもよい。
ヒト機能性ＮＫＴ細胞に特異的な物質の測定用試薬は、ヒト機能性ＮＫＴ細胞に特異的な物質（例えば、ＩＦＮ−γ、パーフォリン又はグランザイムＢ）に対する抗体（上述）、あるいは当該物質をコードする転写産物を検出可能な核酸プローブまたは増幅可能な複数のプライマー（例えば、プライマー対）を含むものであり得る。例えば、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行うことも有益であるため、測定用試薬は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ用プライマーを含むものであってもよい。
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示を示すものにすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】
【０００６】
材料及び方法
（１）サンプル：
末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）は、健常な血液ドナー（東京赤十字）より提供されたｂｕｆｆｙ  ｃｏａｔから入手し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）密度遠心分離により分離した。ＰＢＭＣｓをＰＢＳで３回洗浄し、使用まで液体窒素中で保存した。患者由来のリンパ球は、国立病院機構熊本医療センター（熊本、日本）及び京都大学（京都、日本）から入手した。
（２）試薬及び抗体：
ヒトｒＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１ｂ及びＴＮＦ−αは、Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から購入した。ＩＬ−２は、塩野義製薬株式会社（大阪、日本）から提供してもらった。ＰＧＥ２は、Ｓｉｇｍａ（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。α−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ；２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ−１−Ｏ（α−ガラクトピラノシル）−２（Ｎ−ヘキサコサノイルアミノ）−１，３，４−オクタデカントリオール）は、０．０５％ポリソルベート含有ＰＢＳで希釈した。以下のモノクローナル抗体（ｍＡＢ）は、ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手した（ＦＩＴＣ−コンジュゲートα−ＣＤ３、インバリアント（ｉｎｖａｒｉａｎｔ）ＮＫＴ（６Ｂ１１）、α−ＣＤ４、及びＰＥ−コンジュゲートα−ＣＤ８、α−ＣＤ４０、α−ＣＤ８０、α−ＣＤ８３、α−ＣＤ８６、インバリアントＮＫＴ（６Ｂ１１）、パーフォリン（ｐｅｒｆｏｒｉｎ）、及びＡＰＣ−コンジュゲートα−ＣＤ３、α−ＣＤ１１ｃ、α−ＣＤ１５４、α−ＩＦＮ−γ、α−ＩＬ−４）。α−Ｖα２４−ＦＩＴＣ及びα−Ｖβ１１−ＰＥ  ｍＡｂｓは、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）から購入した。フローサイトメトリー解析のため、細胞をｍＡｂコンジュゲートと共に３０分間インキュベートし、洗浄した後、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で解析した。
［実施例１］ヒト／マウス樹状細胞（ＤＣ）の発現プロフィールの比較
ＮＫＴ細胞の活性化能に対するヒト、マウスＤＣの差異の検討に際し、先ず、ヒト、マウスＤＣの発現プロフィールを検討した。詳細には、成熟マウスＤＣは、マウス骨髄細胞をＧＭ−ＣＳＦの存在下で７日間培養し、次いでＬＰＳを一日添加して培養することにより入手し、フローサイトメトリーでＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０の発現を測定した。成熟ヒトＤＣは、単球の単離後、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４の存在下で培養し、６日後にＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＰＧＥ２を添加して１日間培養することにより入手し、フローサイトメトリーでＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３の発現を測定した。
その結果、ヒトＤＣでは、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＤＲが陽性であり、マウスＤＣにおいても、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｉ−Ａｂが陽性であった（図１）。
以上より、ヒト、マウスＤＣの双方とも、類似した発現プロフィールを示し、また、上記方法論により典型的な成熟骨髄性樹状細胞が得られることが確認された。
［実施例２］α−ＧａｌＣｅｒロード成熟ＤＣを用いた、自己、同種異系又は異種システムのＥＬＩＳＰＯＴアッセイによる高〜低頻度初代（ｐｒｉｍａｒｙ）ＮＫＴ細胞の検出
由来が異なるＤＣにより、末梢血中のＮＫＴ細胞の活性化が異なるかどうかを検討するために、自己、同種異系、または異種システムにおけるＮＫＴ細胞の活性化を、ＩＦＮ−γ産生性を指標としてＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより検討した。
ＤＣは下記の通り調製した。
ヒトＤＣは、ＣＤ１４＋単球を磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｉｎｃ．Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）により精製し、５００Ｕ／ｍｌ  組換えヒトＩＬ−４及び１，０００Ｕ／ｍｌ  組換えヒトＧＭ−ＣＳＦの存在下で７日間培養することにより得た。α−ＧａｌＣｅｒ（１００ｎｇ／ｍｌ）又は等量のビヒクル（ＤＭＳＯ，Ｓｉｇｍａ）をＤＣに５日目にロードし、成熟刺激（１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１β、１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦα、及び１μｇ／ｍｌ  ＰＧＥ２）を６日目に加え、７日目に回収した。
マウス骨髄から誘導したＤＣは、５％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０中で、マウスＧＭ−ＣＳＦを用いて、骨髄前駆細胞から増殖させた。６日目に、α−ＧａｌＣｅｒ（１００ｎｇ／ｍｌ）を未熟骨髄ＤＣに添加し、４０時間培養した。ＤＣの成熟のため、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳを７日目に添加し、１６時間培養した。成熟したα−ＧａｌＣｅｒパルスＤＣを８日目に回収した。
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、下記の通り行った。
ＩＦＮ−γ分泌細胞の検出のため、９６−ｗｅｌｌ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｐｌａｔｅｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を、マウス抗ヒトＩＦＮ−γ（１０μｇ／ｍｌ，Ｍａｂｔｅｃｈ，Ｓｗｅｄｅｎ）でコーティングした。ＰＢＭＣ（１×１０６）をα−ＧａｌＣｅｒ（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在又は非存在下のいずれかで５％ヒトＡＢ血清又は１０％仔ウシ血清を含むＲＰＭＩ（完全培地又はＣＭ；ＧＩＢＣＯ）中にて１６時間インキュベートした。ＰＭＡ（１０μｇ／ｍｌ）及びイオノマイシンをポジティブコントロールとして使用した。培養後、プレートを洗浄し、ビオチン化抗ヒトＩＦＮ−γ（１μｇ／ｍｌ，Ｍａｂｔｅｃｈ）と共にインキュベートした。スポット形成細胞（ＳＦＣ）を顕微鏡で定量した。反応性が１０ＳＦＣ／ウェル以上であり、且つバックグランド（αＧａｌＣｅｒなし）の２倍以上の場合に、アッセイを陽性とスコア付けした。異なるＡＰＣ（自己、同種異系、異種ＤＣ）によるナイーブＮＫＴ細胞の活性化能を培養物中で比較するために、Ｍφ枯渇細胞（１×１０６／ウェル）を、自己α−ＧａｌＣｅｒ又はビヒクルロードＡＰＣ（１×１０５／ウェル）と共にＣＭ中で１６時間培養した。α−ＧａｌＣｅｒ依存性ＩＦＮ−γ産生細胞をＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定した。
その結果、高頻度ＮＫＴ細胞含有群（％ＮＫＴ＞０．０５％）では、α−ＧａｌＣｅｒ依存的に自己、異種ＤＣでＮＫＴ細胞の活性化が確認された（図２）。中頻度ＮＫＴ細胞含有群（０．０１％＜％ＮＫＴ＜０．０５％）でも同様にα−ＧａｌＣｅｒ依存性にＮＫＴ細胞の活性化が確認されたが、その産生量は減少していた（図３）。低頻度ＮＫＴ細胞含有群（％ＮＫＴ＜０．０１％）では、α−ＧａｌＣｅｒ依存性のＮＫＴ細胞活性化は確認されなかった（図４）。
以上より、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、高頻度〜中頻度ＮＫＴ細胞含有群では有効であるが、低頻度ＮＫＴ細胞含有群では必ずしも有効でないことがわかった。
［実施例３］混合リンパ球反応（ＭＬＲ）による、自己、同種異系および異種ＤＣによるヒトＴ細胞応答の評価
同種異系または異種ＤＣ及びヒト由来ＰＢＭＣを用いたシステム（同種異系または異種システム）では、ヒト由来ＰＢＭＣに含まれるＮＫＴ細胞の機能性を評価する際に、ＤＣに起因して生じる非ＮＫＴ細胞（特にヒトＴ細胞）応答に伴う副次的反応（例えば、サイトカイン産生）がヒトＮＫＴ細胞の活性化に影響を及ぼす可能性が考えられた。そこで、このようなシステムにおいて、かかる副次的反応を引き起こし得るＴ細胞応答が生じるか否かを検討した。
Ｔ細胞応答は、混合リンパ球反応により評価した。詳細には、実施例２記載の方法と同様に調製した各タイプの成熟ＤＣ（自己、同種異系及び異種ＤＣ）を放射線処理し、９６ウェル丸底プレートにおいて１×１０５Ｍφ枯渇ＰＢＭＣに加え、６日間培養した。最後の１６時間に、３Ｈ−チミジン（１μＣｉ／ウェル）を加えた。
その結果、同種異系ＤＣはヒトＴ細胞を強く刺激したが、自己または異種ＤＣは、殆ど刺激しなかった（図５）。このことは、自己システムと同様に異種システムにおいても、ヒトＮＫＴ細胞の活性化に影響を及ぼし得るＴ細胞応答が殆ど生じなかったことを示唆する。
以上より、自己または異種システムは、同種異系システムよりも、より純粋にヒトＮＫＴ細胞の機能性を評価し得ることが示唆された。
［実施例４］活性化ＮＫＴ細胞による自己または異種ＤＣの２次的な活性化
自己または異種ＤＣシステムでは、活性化されたヒトＮＫＴ細胞により２次的にＤＣが成熟、活性化され、それに伴いこれらのシステムにおけるヒトＮＫＴ細胞の機能性の評価に影響を及ぼす可能性が考えられた。そこで、活性化されたヒトＮＫＴ細胞によるＤＣの２次的変化を検討した。
未熟なヒト及びマウスＤＣを活性化ヒトＮＫＴ細胞株と２４時間共培養した後、表現型の変化（成熟化の指標）、およびサイトカイン産生能を測定した。ヒト又はマウス由来の５×１０４ＤＣを、９６ウェルプレートにおいて、サイトカインカクテル（ＰＧＥ２、ＩＬ−１ｂ、ＴＮＦ−α）又はＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）を用いて、１００ｎｇ／ｍｌのα−ＧａｌＣｅｒの存在又は非存在下で５×１０３ＮＫＴ細胞株と共に２４時間培養した。各種サイトカイン（ヒトＩＦＮ−γ、ヒトＩＬ−１２ｐ７０及びヒトＩＬ−１０、並びにマウスＩＬ−１２ｐ７０及びマウスＩＬ−１０）測定用ＥＬＩＳＡキット（Ｏｐｔｉ  ＥＩＡ；ＢＤＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を用いて上清をアッセイした。
なお、共培養に用いたＮＫＴ細胞株は、以下の通り調製した。
成熟ＤＣを、成熟刺激すると共に、α−ＧａｌＣｅｒ（１００ｎｇ／ｍｌ）を用いて、培養５−７日に４８時間パルスした。α−ＧａｌＣｅｒでパルスした１×１０４ＤＣを、組換えＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）の存在下で、１×１０５Ｍφ枯渇ＰＢＭＣの各ウェルに加えた。１０−１４日後、Ｖα２４＋ＮＫＴ細胞をＦＩＴＣ標識抗Ｖα２４ｍＡｂで染色し、抗ＦＩＴＣ磁気ビーズを用いて選択した。Ｖα２４＋ＮＫＴ細胞を、１００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２の存在下、ＣＭ中で細胞株として維持し、α−ＧａｌＣｅｒの存在下で放射線照射したＰＢＭＣで再刺激した。
その結果、自己の未熟ＤＣは成熟したが（図６）、異種の未熟ＤＣは成熟しなかった（データ示さず）。またサイトカイン産生も自己ＤＣの場合のみＩＬ−１２の産生が見られたが（図７）、異種ＤＣの場合は見られなかった（データ示さず）。このことは、異種ＤＣを用いた場合、ＤＣにより産生される２次性サイトカインによるＮＫＴ細胞の活性化を考慮する必要はないことを示す（図８）。
以上より、異種システムは、自己システムよりも、より純粋にヒトＮＫＴ細胞の機能性を評価し得ることが示された。
［実施例５］α−ＧａｌＣｅｒパルス異種ＤＣによるヒトＮＫＴ細胞の活性化
異種ＤＣによりヒトＮＫＴ細胞が特異的に活性化できることを明らかにするため、ヒトＮＫＴ細胞を単離し、α−ＧａｌＣｅｒパルス自己、異種ＤＣと共培養した後、培養上清を採取し、ＥＬＩＳＡ法でサイトカイン産生を測定した。
ＮＫＴ細胞をα−ＧａｌＣｅｒとＩＬ−２で増幅後、抗インバリアントＮＫＴ抗体でＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅを用いてソーティングし、α−ＧａｌＣｅｒパルス異種、自己ＤＣとの共培養後、ＥＬＩＳＡ法でＩＦＮ−γを定量した。
その結果、異種システムでは、自己システムよりも低いものの、ＩＦＮ−γ産生が確認された（図９）。
以上より、異種システムにおけるヒトＮＫＴ細胞の機能性の評価に際し、α−ＧａｌＣｅｒ依存性の免疫応答を利用できることが明らかとなった。
［実施例６］異種ＤＣによる抗原特異的なＮＫＴ細胞の増幅
実施例４に記載の方法により作製したＮＫＴ細胞株の段階希釈後、ＮＫＴ細胞除去ＰＢＭＣと混合し、抗原（α−ＧａｌＣｅｌ）の存在下で異種ＤＣと共培養して１０日後に増幅率を算出した。
その結果、異種ＤＣは、培養開始前のＮＫＴ細胞数にかかわらず培養前後で正比例の関係を維持しつつ、抗原特異的にヒトＮＫＴ細胞を増幅した（図１０）。また、増幅培養後では、０．０１〜０．００１％の頻度のＮＫＴ細胞を検出可能であった。
以上より、異種システムでは、培養期間を適切に設定することで、末梢血中に含まれるＮＫＴ細胞が増幅され、以って従来のＥＬＩＳＰＯＴアッセイでなし得なかった低頻度ＮＫＴ細胞の検出が可能となることが示された。
［実施例７］健常人由来の末梢血中に含まれるＮＫＴ細胞の解析
上記実施例の結果をふまえ、本発明者らが開発した異種システムによるＮＫＴ細胞の機能解析プロトコルが、比較的多くのＮＫＴ細胞を含有する健常人の末梢血に含まれるＮＫＴ細胞の機能解析を良好に行い得るか否かを検討するため、本発明者らのプロトコルによる培養（増幅）前後でのＮＫＴ細胞数およびサイトカイン産生能を有するＮＫＴ細胞頻度を測定した。
なお、本発明者らのプロトコルは、以下（１）〜（３）の通りである。
（１）成熟マウスＤＣの調製
先ず、マウス骨髄細胞からマウスＤＣを誘導する。マウス骨髄細胞を、５％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０中で、マウスＧＭ−ＣＳＦの存在下で、３７℃５％ＣＯ２５日間培養する。
次いで、未熟マウスＤＣを成熟させる。上述の通り得られた培養物（未熟マウスＤＣを含む）に対して、６日目にα−ＧａｌＣｅｒ（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加、４０時間培養する。成熟を促進するため、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳを７日目に添加し、１６時間培養する。かくして得られたα−ＧａｌＣｅｒパルス成熟マウスＤＣを８日目に回収する。
（２）被験体由来のＭφ枯渇ＰＢＭＣの調製
健常人からの採血によりＰＢＭＣを入手し、抗ＣＤ１４抗体（必要に応じてＣＤ１１ｃ抗体を併用）及び磁気ビーズを用いてマクロファージ（Ｍφ）を除去することにより、Ｍφ枯渇ＰＢＭＣを得る。
（３）Ｍφ枯渇ＰＢＭＣおよび成熟マウスＤＣの共培養
上記（１）により得られたα−ＧａｌＣｅｒパルス成熟マウスＤＣ（５ｘ１０４細胞／ｍｌ）、および上記（２）により得られたＭφ枯渇ＰＢＭＣ（５ｘ１０５細胞／ｍｌ）を、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０中で、組換えヒトＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）の存在下で、３７℃５％ＣＯ２９日間培養する。
上記（１）〜（３）のプロトコルに従い培養した後、ＮＫＴ細胞数およびサイトカイン産生能を有するＮＫＴ細胞頻度を、フローサイトメトリー、細胞内染色により測定した。なお、比較対照として、ＩＬ−２単独培養群、α−ＧａｌＣｅｒをパルスしない異種ＤＣ群を用いて同様の実験を行った。
その結果、異種ＤＣによるヒトＮＫＴ細胞のα−ＧａｌＣｅｒ依存的な増幅、サイトカイン産生が確認された（図１１〜１２）。
以上より、本発明者らが開発したプロトコルは、健常人（または、比較的多くのＮＫＴ細胞を含有する被験体）における末梢血中のＮＫＴ細胞の活性化を良好に解析し得ることが示された。
［実施例８］慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）患者由来の末梢血中に含まれるＮＫＴ細胞の解析
次いで、ＮＫＴ細胞数が少なく、抗原提示細胞機能の低下が示唆されているＣＭＬ患者由来の末梢血を用いて、本発明者らのプロトコルによる培養（増幅）前後でのＮＫＴ細胞数およびサイトカイン産生能を有するＮＫＴ細胞頻度を測定した。なお、ＣＭＬ患者としては、イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）による治療を受けている患者を対象とした。
イマチニブによる治療を受けているＣＭＬ患者由来末梢血を用いて上記（１）〜（３）のプロトコルに従い培養した後、ＮＫＴ細胞頻度とサイトカイン産生能を、フローサイトメトリー、細胞内染色により測定した。なお、比較対照として、ＩＬ−２単独培養群、α−ＧａｌＣｅｒをパルスしない異種ＤＣ群を用いて同様の実験を行った。
その結果、異種システムは、ＥＬＩＳＰＯＴ法では同定できないこのような患者の末梢血ＮＫＴ細胞（％ＮＫＴ≦０．０２％）を検出可能であった（図１３〜１４）。また、ＣＲの患者ではＮＫＴ細胞数は減少していたが、増幅能、サイトカイン産生能などの機能は保たれていた。一方、ＰＲの患者でもＮＫＴ細胞数は減少していたが、増幅能、サイトカイン産生能などの機能は必ずしも保たれていなかった。
以上より、本発明者らのプロトコルは、低頻度ＮＫＴ細胞を含む末梢血中のＮＫＴ細胞の活性化を良好に解析し得ること、並びに免疫療法のモニタリング等において有用であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明によれば、低頻度ＮＫＴ細胞の機能解析を可能とし、また、自己ＡＰＣの機能に依存せず、且つ二次的因子の影響などを回避し得る、従来法に比しより優れたＮＫＴ細胞の機能解析が可能となる。
本出願は、２００５年６月１７日に日本で出願された特願２００５−１７８２８４を基礎としており、その内容は本明細書中に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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