(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
消化管間質腫瘍を患う患者の予後を予測するためのキットであって、
前記患者から得られた腫瘍組織試料におけるＤＤＸ３９のタンパク質を検出または定量する抗ＤＤＸ３９抗体を含み、前記ＤＤＸ３９のタンパク質の発現レベルがコントロールサンプルの発現レベルより高い場合に前記患者の予後が不良であると予測する、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ:gastrointestinalstromal tumor）を患う患者の予後を予測するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
消化管間質腫瘍は、化学療法や放射線治療に抵抗性を示し、手術が唯一の完全寛解療法とされてきた。しかしながら、近年、チロシンリン酸化酵素阻害剤（メシル酸イマチニブ、商品名：グリベック）が治療に用いられるようになった（特許文献１：特表2004-512328）。メシル酸イマチニブは多くの消化管間質腫瘍症例で奏効性を示す一方で重篤な副作用も引き起こすことが報告されている。このため、現在のところ、メシル酸イマチニブは術後再発症例や進行症例に主に処方されている。
【０００３】
予後不良症例を事前にみきわめることができればあらかじめメシル酸イマチニブによる治療を開始することが可能である。このような予後予測マーカーとして、臨床病理像と予後の関係や（非特許文献１：Hasegawa T et al.(2002 Jun)）、Ｋｉｔのエクソン１１における変異と予後の関係（非特許文献２：Andersson J et al.(2006)）が報告されている。しかしながら、これらは実用化のレベルでは十分なものではない。このように、治療方針を決定するほどの確度で信頼され、臨床の場で実用化できるレベルで予後を予測できる腫瘍マーカーや臨床病理学的因子は、消化管間質腫瘍においては確立されていない。また、ｍＲＮＡやタンパク質発現解析による予後不良因子の同定は試みられた例がない。
【０００４】
【特許文献１】特表２００４−５１２３２８号公報 、国際公開第０２/３４７２７号パンフレット
【特許文献２】特開平６−８７８３４号公報、特許第２７０６６８２号明細書、  欧州特許出願公開第０５６４４０９号明細書、米国特許第５５２１１８４号明細書
【特許文献３】特表２００１−５１０１９２号公報、特許第３２７６３５９号明細書、国際公開第９９/０３８５４号パンフレット
【特許文献４】国際公開２００７/０４３２９５号パンフレット
【特許文献５】国際公開２００４/０２２７７８号パンフレット
【非特許文献１】Hasegawa T, Matsuno Y, Shimoda T, Hirohashi S., “Gastrointestinal stromal tumor: consistent CD117 immunostaining for diagnosis, and prognostic classification based on tumor size and MIB-1 grade.”, Human Pathology, 2002 Jun;33(6):p.669-676
【非特許文献２】Andersson J, Bumming P, Meis-Kindblom JM, Sihto H, Nupponen N, Joensuu H, Oden A, Gustavsson B, Kindblom LG, Nilsson B., “Gastrointestinal stromal tumors with KIT exon 11 deletions are associated with poor prognosis.”, Gastroenterology, 2006 May;130(6):p.1573-1581
【非特許文献３】T Sugiura et al., “Intracellular characterization of DDX39, a novel growth-associated RNA helicase”, Experimental cell research, 2007;313:p.782-790
【非特許文献４】Joon T. Park et al., “Notch3 Gene Amplification in Ovarian Cancer”, Cancer Res, 2006;66:p.6312-6318
【非特許文献５】I. Gashaw et al.,“Gene signatures of testicular seminoma with emphasis on expression of ets variant gene 4”, CMLS, Cell. Mol. Life Sci, 2005;62:p.2359-2368
【非特許文献６】J. Takita et al., “Gene expression profiling and identification of novel prognostic marker genes in neuroblastoma”, Genes, Chromosomes And Cancer 40:120-132,2004
【非特許文献７】Skye H. C et al., “Genomic Prediction of Locoregional Recurrence After Mastectomy in Breast Cancer”, J Clin Oncol, 2006;28:p.4594-4601
【非特許文献８】Hasegawa T, Yokoyama R, Lee YH, et al., "Prognostic relevance of a histological grading system using MIB-1 for adult soft-tissue sarcoma.", Oncology, 2000;58:p.66-74
【非特許文献９】Hasegawa T, Yamamoto S, Nojima T, et al., “Validity and reproducibility of histologic diagnosis and grading for adult soft tissue sarcomas.”, Human Pathology, 2002 Jan;33(1):p.111-115
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、消化管間質腫瘍症例において、予後不良症例と予後良好症例を高判別率で識別するキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一の側面によると、消化管間質腫瘍を患う患者の予後を予測するためのキットであって、前記患者から得られた腫瘍組織試料におけるＤＤＸ３９のタンパク質を検出または定量する抗ＤＤＸ３９抗体を含み、前記ＤＤＸ３９のタンパク質の発現レベルがコントロールサンプルの発現レベルより高い場合に前記患者の予後が不良であると予測する、キットが提供される。
【発明の効果】
【０００９】
以下に詳細に説明するように、本発明によると、消化管間質腫瘍症例において、予後不良症例と予後良好症例を高判別率で識別するキットが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下に、本発明の実施の形態を説明する。もっとも、本発明は、以下に説明する実施の形態によって、限定されるものではない。
【００１１】
本発明者等は、驚くべきことに、ＤＤＸ３９というタンパク質の発現が消化管間質腫瘍の術後転移症例の原発巣腫瘍組織において、非転移症例の原発巣腫瘍組織よりも有意に発現が高いことを発見した。本発明者等は、プロテオーム解析によって消化管間質腫瘍患者の予後を予測するための腫瘍マーカーの開発を行った。以下に詳細に説明するように、転移が３年以上なく病理学的悪性度も低かった症例群と、早期（１年以内）に転移を来し病理学的悪性度も高かった症例群とを比較した。手術検体に対して蛍光二次元電気泳動法によるタンパク質の網羅的発現解析を行い、約５０００個のタンパク質スポットの中から両群を区別しうる特定のタンパク質としてＤＤＸ３９を見いだした。
【００１２】
このように、本発明の一の側面によると、消化管間質腫瘍を患う患者の予後を予測するためのキットおよび方法が提供される。すなわち、本発明によると、ＤＤＸ３９を腫瘍マーカーとすることで、消化管間質腫瘍症例のうち予後不良群を予め見出すことができる。さらに、このような症例には早期から消化管間質腫瘍治療剤の投与を開始することで消化管間質腫瘍の治療成績を向上させることが見込まれる。なお、本発明による消化管間質腫瘍の予後の予測は、消化管間質腫瘍の術後または術前のいずれの時点でも行うことができる。例えば、本発明による消化管間質腫瘍の予後の予測は、術前および／または術後におけるメシル酸イマチニブの投与等の化学療法の要否を検討する際に利用することができる。なお、本明細書において、予後不良は、術後に消化管間質腫瘍が転移することや、消化管間質腫瘍の病勢が悪化することをいう。
【００１３】
なお、ＤＤＸ３９（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：Ｏ００１４８）は、ＤＥＡＤ  ｂｏｘ  ＲＮＡ  Ｈｅｌｉｃａｓｅｓの一種であり、正常細胞ではほとんど発現していないことが報告されている。ＲＮＡ  Ｈｅｌｉｃａｓｅｓは、ＲＮＡのスプライシングや輸送などＲＮＡ代謝に重要な役割を担うとされており、また、ＤＥＡＤ  ｂｏｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆａｍｉｌｙは、発生、精子形成、細胞増殖・分化に関与していると考えられている。なお、本明細書においてＤＤＸ３９とは、配列番号１のアミノ酸配列からなり、また配列番号１のアミノ酸配列において、１つ若しくは数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなるものも含む。
【００１４】
これまでに、ＤＤＸ３９はいくつかの腫瘍組織において高発現していることが報告されており（非特許文献３: T Sugiura et al. (2007), 非特許文献４: Joon T. Park et al. (2006), 非特許文献５: I. Gashaw et al. (2005), 非特許文献６: J Takita et al. (2004) ）、乳がんや卵巣癌腫瘍の予後を診断する際の複数の遺伝子マーカーセットの一つとして認識されていた（非特許文献７: Skye H. C et al (2006),  特許文献４:国際公開２００４/０２２７７８号パンフレット）。しかしながら、本発明によれば、ＤＤＸ３９を単一のマーカーとして用いることで腫瘍組織の予後を予測することが可能となる。腫瘍の予後の予測に関し、ＤＤＸ３９の単独マーカーとしての利用は、どの腫瘍についても報告されていない。特に、消化管間質腫瘍におけるＤＤＸ３９の発現に関するものは何ら報告されていない。すなわち、本発明者は、消化管間質腫瘍を患う患者の予後を、ＤＤＸ３９を単一のマーカーとして用いることで予測することが可能であることを見出した。上記のように、単一マーカーによって予後を予測することが可能となることにより、複数マーカーにより予後を予測する際に比べ、技術的により簡便であり、迅速に予測することが可能であり、またコスト面においても実用的なものとなる。
【００１５】
ＤＤＸ３９の発現を検出または定量するための試料は、消化管間質腫瘍を患う患者の罹患組織、血液に由来することが好ましい。試験に供する試料は、患者から採取された検体自体であってもよく、また試験に応じて検体を処理して得られた試料であってもよい。例えば試料を免疫染色法に供する場合、試験に供する試料として、患者から得られた検体から調製したパラフィン切片を用いることができる。また、例えば試料をウェスタン・ブロッティング法またはＲＴ−ＰＣＲに供する場合、試験に供する試料として、患者から得られた検体から調製したタンパク質抽出液またはｍＲＮＡ抽出液を用いることができる。
【００１６】
試料におけるＤＤＸ３９の発現は、以下に例示する通り、任意の方法で検出または定量することができる。なお、ＤＤＸ３９発現の検出または定量は、単にＤＤＸ３９発現の有無を検出するものであってもよく、また、ＤＤＸ３９の発現量を相対的または絶対的に決定するものでもよい。また、ＤＤＸ３９発現は、タンパク質レベルで検出または定量してもよく、またｍＲＮＡレベルで検出または定量してもよい。
【００１７】
タンパク質レベルでの検出または定量は、例えば、免疫染色法（蛍光抗体法、酵素抗体法、重金属標識抗体法、放射性同位元素標識抗体法を含む）、電気泳動法による分離と蛍光、酵素、放射性同位元素等による検出または定量との組み合わせ（ウェスタン・ブロッティング法、蛍光二次元電気泳動法を含む）、酵素免疫測定吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ドット・ブロッティング法等により行うことができる。また、ｍＲＮＡレベルでの検出または定量は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（好ましくはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザン・ブロッティング法、Branched DNAアッセイ等により行うことができる。
【００１８】
ＤＤＸ３９発現の検出または定量の結果は、２種類の段階（陽性および陰性）または３種類以上の段階に分類することができる。ＤＤＸ３９発現の分類は、検出または定量方法に応じて、十分な経験を有する病理医、臨床医、検査技師または検査施設が行うことが好ましい。例えば、ＤＤＸ３９発現の分類は、免疫染色法を用いる場合は病理医が行うことができ、ＲＴ−ＰＣＲを用いる場合は検査技師が行うことができる。
【００１９】
なお、ＤＤＸ３９発現の分類は、患者からの試料におけるＤＤＸ３９の発現量を、コントロールにおけるＤＤＸ３９の発現量と比較することにより行うことが好ましい。ＤＤＸ３９発現の結果を分類する段階の数に応じて、複数のコントロールを用いることが好ましい。例えば、ＤＤＸ３９発現の結果を２種類の段階（陽性および陰性）に分類する場合は、それぞれの段階に対応した２種類のコントロール（ＤＤＸ３９陽性コントロールおよびＤＤＸ３９陰性コントロール）を用いることが好ましい。また、ＤＤＸ３９発現の結果を３種類の段階に分類する場合は、それぞれの段階に対応した３種類のコントロールを用いることが好ましい。また、コントロールの１つとして、健常者または予後良好な消化管間質腫瘍患者に由来するコントロールを用いることが好ましい。なお、コントロールは、予め作成されたものでもよく、また、患者からの試料と同時に試験されたものでもよい。
【００２０】
本発明によると、消化管間質腫瘍を患う患者の予後を予測するためのキットが提供される。当該キットは、患者から得られた試料におけるＤＤＸ３９の発現を検出または定量する手段を含む。すなわち、タンパク質レベルでの検出または定量を行う場合においては、発現を検出または定量する手段は、免疫染色法等を行うための手段を含むことが好ましく、例えば、抗ＤＤＸ３９抗体（モノクローナルおよびポリクローナル抗体、標識化抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体ならびにこれらの結合活性断片を含む）を含むことが好ましい。また、ｍＲＮＡレベルでの検出または定量を行う場合においては、発現を検出または定量する手段は、上記したＲＴ−ＰＣＲ等を行うための手段を含むことが好ましく、例えば、ＤＤＸ３９のｍＲＮＡに対するプローブを含むことが好ましい。さらに、当業者に明らかなように、発現を検出または定量する手段は、バッファー、発色基質、二次抗体、ブロッキング剤等の試薬、試験に必要な器具、コントロール、ならびに取扱説明書および評価指導書（同等の内容の電子データを含むCD-ROM等の記録媒体も含む）等を含むことができる。
【００２１】
実施例において詳細に説明するように、本発明者等は、ＤＤＸ３９の発現が患者の予後不良と相関することを見出した。すなわち、ＤＤＸ３９の発現がより高いほど予後不良となる可能性が高いと予測できる。
【００２２】
なお、ＤＤＸ３９の発現による判断基準は、治療の段階や治療手段（メシル酸イマチニブの投与等）に応じて個々に設定することができる。例えば、術前のメシル酸イマチニブの投与の要否を検討するための判断基準と、術後のメシル酸イマチニブの投与の要否を検討するための判断基準とは異ならせることができる。なお、メシル酸イマチニブは副作用の大きさや医療費の高さが問題となっているが、上記判断基準は、消化管間質腫瘍の外科手術による摘出前および／または摘出後のメシル酸イマチニブの投与の要否を検討する際に用いることが好ましい。
【００２３】
このように本発明によると、消化管間質腫瘍の予後をより高い判別率で予測することができ、ひいては、これに基づきより適切な治療計画を立てることが可能となり、より適切な治療を行うことが可能となる。例えば、消化管間質腫瘍の外科手術による摘出前および／または摘出後のメシル酸イマチニブの投与の要否を検討するために患者の予後を予測する場合、上記したように予後不良となる可能性が高いと判断された際には、メシル酸イマチニブによる化学療法を受ける必要があると判断できる。また、予後不良となる可能性が低いと判断された際には、メシル酸イマチニブによる化学療法の必要はないと判断できる。
【００２４】
実施例において詳細に説明するように、本発明によると、非常に高い感度および特異度で患者の予後を予測することができる。さらに、メシル酸イマチニブは副作用の大きさや医療費の高さが問題となっているが、本発明によると、メシル酸イマチニブによる治療を必要としない患者に対して当該治療薬の投与を回避することで上記問題点を回避でき、さらに、メシル酸イマチニブによる治療を必要とする患者に対してはより迅速に当該治療薬による治療を開始できる。このように、本発明によると診断的価値が非常に高い予後予測方法およびキットが提供される。一方で、本発明による予測は、特殊な装置等を必要とせずに、例えば免疫染色法などの一般的に用いられている簡便な手法で通常の技術レベルの病理医等により廉価に行うことができる。
【００２５】
また、本発明の他の側面によると、消化管間質腫瘍を患う患者のうち、ＤＤＸ３９の発現に基づき定義された患者の消化管間質腫瘍を処置するための医薬組成物が提供される。本発明にかかる医薬組成物は、上記式（Ｉ）で示される４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］−ベンズアミドまたは薬学的に許容されるその塩を活性成分として含む。
【００２６】
４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］−ベンズアミドまたは薬学的に許容されるその塩の製造方法、および抗腫瘍剤としてのその使用は、特許文献２（欧州特許出願公開第０５６４４０９号明細書の実施例２１、ならびに他の対応出願および対応特許、例えば日本国特許第２７０６６８２号明細書、米国特許第５５２１１８４号明細書）に記載されている。
【００２７】
また、４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］−ベンズアミドまたは薬学的に許容されるその塩は、好ましくは薬学的に許容される酸付加塩であり、例えば塩酸、硫酸またはリン酸のような無機酸との塩であるか、あるいは適当な有機カルボン酸またはスルホン酸、例えばトリフルオロ酢酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、ヒドロキシマレイン酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸もしくはシュウ酸のようなモノ−もしくはジ−カルボン酸、またはアルギニンまたはリジンのようなアミノ酸、安息香酸、２−フェノキシ−安息香酸、２−アセトキシ−安息香酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸のような芳香族カルボン酸、マンデル酸またはケイ皮酸のような芳香族−脂肪族カルボン酸、ニコチン酸またはイソニコチン酸のような複素環式芳香族カルボン酸、メタン−、エタン−もしくは２−ヒドロキシエタン−スルホン酸のような脂肪族スルホン酸、またはベンゼン−、ｐ−トルエン−もしくはナフタレン−２−スルホン酸のような芳香族スルホン酸との塩である。
【００２８】
また、４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］−ベンズアミドのモノメタンスルホン酸付加塩およびその好ましい結晶形は、特許文献３（国際特許出願９９/０３６５４号パンフレット、ならびに他の対応出願および対応特許、例えば日本国特許第３２７６３５９号明細書）に記載されている。
【００２９】
本発明にかかる医薬組成物の有効投与量は、患者の年齢、体重、病状、投与様式および臨床像等に依存して、体重約７０ｋｇの患者に対してイマチニブとして例えば１日約１００〜１０００ｍｇ、好ましくは２００〜６００ｍｇ、さらに好ましくは４００ｍｇである。
【００３０】
本発明にかかる医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含むことができる。薬学的に許容される担体として、任意の標準的な担体、緩衝剤および賦形剤（例えばリン酸緩衝食塩水、５％デキストロース水溶液）を用いることができる。好ましい担体は、投与様式に依存する。典型的な投与様式には、経腸（例えば経口）投与または非経口投与（例えば皮下、筋肉内、静脈内もしくは腹腔内注射、または局所、経皮、または経粘膜投与）が含まれ、経口投与が好ましい。例えば、経口投与のためには、カプセル、錠剤および粉末などの固形剤形、またはエリキシル、シロップおよび懸濁液などの液体剤形で投与することができる。
【００３１】
上記したように、本発明にかかる医薬組成物は、ＤＤＸ３９の発現に基づき定義された患者を対象とする。具体的には、本発明にかかる医薬組成物は、上記したように、ＤＤＸ３９の発現に基づき予後不良と予測された患者を対象とすることが好ましい。以上のように、本発明によると、消化管間質腫瘍を患う患者のうち、ＤＤＸ３９の発現に基づき定義された患者の消化管間質腫瘍を処置するための医薬組成物が提供される。
【００３２】
なお、消化管間質腫瘍治療薬であるメシル酸イマチニブが、ノバルティスファーマ株式会社よりグリベック（登録商標）として販売されている。その添付書類には、免疫組織学的検査によりＫＩＴ（ＣＤ１１７）陽性消化管間質腫瘍と診断された患者を当該治療薬の対象とする旨が明記されている。このように、本発明にかかる医薬組成物の対象患者群と、グリベック（登録商標）の対象患者群とは、当業者が明確に区別することが可能であり、本発明にかかる医薬組成物は、その対象患者、すなわち医薬用途において、グリベック（登録商標）とは一線を画する。
【００３３】
なお、本発明にかかる医薬組成物も、グリベック（登録商標）と同様に、さらに免疫組織学的検査によりＫＩＴ（ＣＤ１１７）陽性消化管間質腫瘍と診断された患者を対象とすることが好ましい。広く当業者に行われているように、ＫＩＴ（ＣＤ１１７）陽性の確認は、例えば、抗ヒトｃ−Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）ウサギポリクローナル抗体（コード番号：A4502、ダコ・ジャパン株式会社製）を用いた免疫染色法により行うことができる。免疫染色法は、製造業者の取扱説明書に記載の方法に準じて行うことができる。ＫＩＴ（ＣＤ１１７）陽性の確認は、上記抗ヒトｃ−Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）ウサギポリクローナル抗体の添付書類に記載のように、当該抗体を用いた免疫染色法により行うことができる。
【実施例】
【００３４】
以下に、本発明の実施例を説明する。もっとも、本発明は、以下に説明する実施例によって限定されるものではない。
【００３５】
［材料および方法］
〔１．サンプル〕
（１−１．手術検体）
手術検体を研究に使用することについて文章による同意を得た消化管間質腫瘍を患う患者から得られた手術検体を使用した。消化管間質腫瘍症例の手術検体の使用について、本研究は国立がんセンターの遺伝子倫理委員会の審査および承認を受けた。
【００３６】
（１−２．タンパク質の回収）
症例の手術検体から腫瘍組織を回収し、液体窒素で凍らせた。凍らせた腫瘍組織をマルチビーズショッカー（安井機器、大阪）にて破砕して粉末状にした。粉末状にした組織にタンパク質抽出バッファー（６Ｍ  ウレア、２Ｍ  チオウレア、３％  ＣＨＡＰＳ、１％  TritonX-100）を加えてタンパク質を抽出した。
【００３７】
〔２．蛍光二次元電気泳動〕
（２−１．サンプル調整）
抽出したタンパク質を１５０００回転で遠心し、上精を回収した。上精に含まれるタンパク質をタンパク質定量キット（ＤＣプロテインアッセイキット、Bio-Rad社、米国）にて定量した。抽出したタンパク質５μｇを蛍光色素（サチュレーションダイＣｙ５、GE Healthcare Biosciences社）で標識した。標識は以下のように行った。（１）終濃度３０ｍＭとなるようにｐＨ８．０のトリスバッファーを加え、次に（２）１ｎｍｏｌのＴＥＣＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロライド，Sigma社）を加え、（３）３７度で６０分間処理した。次に、（４）Ｃｙ５蛍光色素を４ｎｍｏｌ加えて、３７度で６０分間処理した。今回の実験に用いたタンパク質サンプルから等量ずつタンパク質サンプルを集めて混合し、内部標準サンプルとした。内部標準サンプルの５μｇを蛍光色素（サチュレーションダイＣｙ３、GE Healthcare Biosciences社）で上記と同様に標識した。Ｃｙ５で標識した個別のサンプルとＣｙ３で標識した内部標準サンプルを混合し、ウレア可溶化液で最終容量４２０μｌとした。その際、終濃度が６５ｍＭとなるようにＤＴＴを、２％となるようにとアンフォライン（GE Healthcare Biosciences社）を加えた。Ｃｙ５で標識した個別サンプルとＣｙ３で標識した内部標準サンプルを混合したサンプルを一枚の二次元電気泳動ゲルで泳動した。
【００３８】
（２−２．電気泳動）
まず、一次元目の泳動はイモビラインゲル（２４ｃｍ、ｐＩ４−７、GE Healthcare Biosciences社）と、Multiphor II（GE Healthcare Biosciences社）を使用した。泳動するタンパク質サンプルでイモビラインゲルを室温にて一晩膨潤させた。泳動は４００００Ｖｈ行った。二次元目の泳動は９−１５％のポリアクリルアミドのグラジエントゲルと、GiantGelRunner（バイオクラフト社）を使用した。泳動は泳動装置一台につき１８Ｗで１７時間、２０度で行った。
【００３９】
（２−３.タンパク質検出）
泳動終了後は、タンパク質を検出する目的で、ガラス板に挟んだままの状態のゲルをレーザースキャナー（Typhoon Trio、GE Healthcare Biosciences社）に載せスキャンした。
【００４０】
（２−４．発現解析）
読み込んだ画像は画像解析ソフトProgenesis（Non-linear Dynamic社）で解析した。
【００４１】
〔３．タンパク質同定〕
（３−１．ゲル内消化法）
全自動スポット回収装置ProHunter（AsOne社）を用いて、ゲルから９６穴プレートにスポットを回収した。ゲルをメタノールで十分洗浄し、タンパク質分解酵素（トリプシン）で３７度にて一晩処理した。この処理によってタンパク質はペプチド化される。得られたペプチドは、６０％アセトニトリルにてゲルを洗浄することで回収した。
【００４２】
（３−２．質量分析）
ペプチドの質量を測定するためにＬＴＱ（サーモ社）を使用した。タンパク質同定のためのデータベース検索にはMasCotを使用した。
【００４３】
〔４．ウェスタン・ブロッティング〕
前述の方法により手術検体より抽出したタンパク質１０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、ニトロセルロース膜に転写した。抗体は抗ＤＤＸ３９抗体（Ｇｅｎｅ  ｗａｙ社）を用いた。抗体の希釈濃度は１０００倍とし、検出にはＥＣＬキット（GE Healthcare Biosciences社）を使用した。
【００４４】
〔６．病理判断〕
（６−１．転移の有無）
外来経過観察中の診察所見および定期的画像検査（ＣＴ，ＭＲＩ，単純Ｘ線写真）により、肺、リンパ節、腹腔など全身のいずれの場所にも明らかな病変の出現がない場合に転移なしと判断した。
【００４５】
（６−２．病理学的悪性度（リスク分類））
非特許文献１（Hasegawa H et al.(2002)）に記載の方法に準じて、表１およびこれに関連した上記記載の通りに病理学的悪性度を判断した。腫瘍分化度、腫瘍壊死およびＭＩＢ−１のそれぞれについて病理医がスコアを決定した。
【００４６】
［実施例１］
消化管間質腫瘍の手術検体からタンパク質を抽出し、蛍光二次元電気泳動法と質量分析装置にて転移、予後に関係するタンパク質を解析した。１）術後１年以内に転移を来しかつ病理学的悪性度（リスク分類）が高度であった９症例、２）術後３年間、転移がなくかつ病理学的悪性度が中等度あるいは低度であった８症例の手術検体を用いた。約５０００個のタンパク質スポットから、両群の間で濃度が異なるタンパク質スポット３８個を選別した（Wilcoxon検定のＰ値が０．０１以下で平均値が２倍以上）。
【００４７】
質量分析装置を用いたタンパク質同定の結果、ＤＤＸ３９というタンパク質に由来するタンパク質スポット（ＤＤＸ３９・スポット）が、３８個のスポット中１個含まれていた。ＤＤＸ３９・スポットの濃度によって、前述の予後不良であった９症例と、予後良好であった８症例を感度（真陽性率、予後不良の患者が検査陽性となる確率）、特異度（真陰性率、予後良好の患者が検査陰性となる確率）ともに１００％で識別することが可能であった（図１参照）。ＤＤＸ３９に対する特異抗体を用いたウェスタン・ブロッティング法を同じ手術検体に対して行った場合においても、感度、特異度ともに１００％の正確さで、予後不良の９症例を予後良好の８症例から識別できた（図２参照）。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】予後不良９症例および予後良好８症例において蛍光二次元電気泳動法により得られたＤＤＸ３９・スポットの濃度を示すグラフである。
【図２】（ａ）予後不良９症例および予後良好８症例におけるウェスタン・ブロッティング法の結果を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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