(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨再生に関わる骨再生関連細胞と、該骨再生関連細胞を支持する支持体とを含む骨再生組成物を製造するための骨再生組成物製造器具であって、
上記骨再生関連細胞を捕捉するための細胞捕捉部と、
上記細胞捕捉部に細胞回収液を注入し、該細胞捕捉部に捕捉された上記骨再生関連細胞を該細胞捕捉部から流出させるための細胞回収液注入部と、
上記細胞捕捉部から流出した上記骨再生関連細胞を含む細胞回収液を回収するための細胞回収部と、を備え、
上記細胞回収部には、骨再生関連細胞と混合して骨再生組成物として用いることができる支持体が配置されており、
上記細胞回収部において、該細胞回収部に回収された骨再生関連細胞と、上記支持体とが混合され、
上記細胞回収部は、濾過部によって隔てられた第１空間と第２空間とを含み、
上記第１空間には、上記支持体が配置されており、
上記濾過部は、上記第１空間に回収された上記骨再生関連細胞を含む細胞回収液を濾過し、上記骨再生関連細胞を除く成分を上記第２空間に流入させるためのものであることを特徴とする骨再生組成物製造器具。
【請求項２】
上記骨再生関連細胞を含む試料を上記細胞捕捉部に注入するための試料注入部をさらに備え、
上記試料注入部は、
上記細胞回収液注入部が上記細胞捕捉部に対して上記細胞回収液を注入する方向とは逆方向に、上記細胞捕捉部に対して上記試料を注入することを特徴とする請求項１に記載の骨再生組成物製造器具。
【請求項３】
上記試料注入部が上記細胞捕捉部に上記試料を注入したとき、上記試料のうち、上記細胞捕捉部を通過した成分を回収するための廃液回収部をさらに備えることを特徴とする請求項２に記載の骨再生組成物製造器具。
【請求項４】
上記細胞捕捉部を洗浄するための洗浄液を上記細胞捕捉部に注入するための洗浄液注入部をさらに備え、
上記洗浄液注入部は、
上記細胞回収液注入部が上記細胞捕捉部に対して上記細胞回収液を注入する方向とは逆方向に、上記細胞捕捉部に対して上記洗浄液を注入することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の骨再生組成物製造器具。
【請求項５】
上記細胞捕捉部は、フィルター構造を有する細胞分離材を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の骨再生組成物製造器具。
【請求項６】
上記細胞分離材は、白血球および赤血球を含む試料を通液したとき、白血球の３０％〜９０％を通過させ、かつ、赤血球の９０％以上を通過させることを特徴とする請求項５に記載の骨再生組成物製造器具。
【請求項７】
上記骨再生関連細胞は、間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の骨再生組成物製造器具。
【請求項８】
上記支持体は、リン酸カルシウム、天然高分子材料、合成高分子材料、金属材料、またはこれらの２種以上を組み合わせた複合材を含むことを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の骨再生組成物製造器具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨再生組成物製造器具、骨再生組成物の製造方法、骨再生組成物、および骨再生方法に関するものであって、特に、培養操作を行うことなく、閉鎖系内で簡便かつ迅速に骨再生組成物を製造することが可能な骨再生組成物製造器具、骨再生組成物の製造方法、骨再生組成物、および骨再生方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
骨欠損や骨折後の骨癒合不全を修復する方法として、患者の患部以外の健常部から骨を採取して患部へ移植する自家骨移植が最も一般的に知られている。しかし、自家骨移植は、採骨する健常部に対して侵襲的であること、採骨量に限界があること、骨採取部の骨折など合併症の危険性があることなどの問題点があった。
【０００３】
そこで近年、リン酸カルシウムを主成分とする多孔質体を、骨充填材として患部へ充填する骨再生方法が開発されている。
【０００４】
しかし、リン酸カルシウムの充填だけでは骨再生能力は不十分とされており、その適応は再生条件の良好な小さな欠損に限られる。そこで新たに、間葉系幹細胞をリン酸カルシウムに付与して移植する方法が開発されている。
【０００５】
このような骨再生方法では、間葉系幹細胞とリン酸カルシウムとを含む骨再生組成物が用いられる。このような骨再生組成物やその製造方法は、例えば、特許文献１〜３に開示されている。
【０００６】
具体的には、特許文献１には、生体適合性で開放気孔型基材の細孔が真空に曝され、骨誘導物質および／または骨形成物質が流動性態様で、開放気孔型基材の細孔内に発生される真空によってこれらの細孔に吸い込まれることにより、骨誘導物質および／または骨形成物質を含む骨代用材料を製造する方法が開示されている。
【０００７】
上記開放気孔型基材は、少なくとも部分的に、生体再吸収性材料、好ましくはヒドロキシアパタイトまたは燐酸三カルシウムからなることが記載されている。
【０００８】
また、上記骨形成物質は、流動性態様の体細胞の形で存在し、該体細胞は、自己骨髄、自己骨髄からなる分離された濃縮細胞、培養された自己幹細胞、分化した自己幹細胞、または間葉細胞であることが記載されている。
【０００９】
特許文献２には、圧力によって、造血系幹細胞と間葉系幹細胞と血球とからなる所望の細胞を多孔質の生体組織補填材に押し込み、該所望の細胞を該生体組織補填材に浸透させることにより、生体組織欠損部に補填される生体組織補填体を製造することが開示されている。
【００１０】
上記生体組織補填材として、具体的には、β−リン酸三カルシウム（以下、「β−ＴＣＰ」ともいう）からなる円板状の多孔体が記載されている。
【００１１】
特許文献３には、患者から採取した体液から少なくとも間葉系幹細胞を含む濃縮体を分離し、分離された濃縮体を生体組織補填材に散布することにより生体組織補填体を製造することが記載されている。
【００１２】
上記生体組織補填材として、具体的には、β−ＴＣＰからなるブロック状あるいは顆粒状の多孔体が記載されている。
【００１３】
また、骨再生組成物やその製造方法に特化するものではないが、間葉系幹細胞等の幹細胞を調製する方法として、特許文献４および５に開示されるような技術が知られている。
【００１４】
具体的には、特許文献４には、造血組織を除く生体組織の再生に用いられる組織再生用細胞と、夾雑細胞の混合液を細胞分離フィルターに通液し、夾雑細胞を通過させ、組織再生用細胞を捕捉させた後、前記細胞分離フィルターに流体を導入して当該細胞を回収する工程を含む生体組織再生用細胞の分離方法が開示されている。
【００１５】
上記生体組織再生用細胞として、具体的には、間葉系前駆細胞、血管内皮前駆細胞、神経幹細胞が記載されている。
【００１６】
また、特許文献４には、上記生体組織再生用細胞の分離方法で得られた生体組織再生用細胞は、そのまま、あるいは必要に応じさらなる分離精製、培養、活性化、増幅、遺伝子導入、凍結保存、ハイドロキシアパタイトなどの骨補填材との複合化、人工血管との複合化などの各種処理が施された後、各種生体組織の病変および／または欠損の治療や基礎科学分野の研究に用いることができることが記載されている。
【００１７】
また、特許文献５には、密度Ｋ（つまり、目付（ｇ／ｍ２）／厚み（ｍ））は、１．０×１０４≦Ｋ≦１．０×１０６であり、かつ、繊維径が３〜４０μｍの幹細胞分離材または、該幹細胞分離材を容器に充填してなる幹細胞分離フィルターを用いて、体液または生体組織の処理液中から幹細胞を分離、回収する方法が開示されている。
【００１８】
上記幹細胞としては、具体的には、間葉系幹細胞、多能性成体幹細胞、骨髄ストローマ細胞が記載されている。また、上記体液として、具体的には、骨髄液、末梢血、または臍帯血が記載されている。
【００１９】
さらに、上記特許文献４および５とは別に、間葉系幹細胞を調製する方法として、１）骨髄液から培養工程を経て分離する方法、２）骨髄液から細胞分離剤を用いて分離する方法等も用いられる。
【特許文献１】特表２００４−５０５７４７号公報（平成１６（２００４）年２月２６日公表）
【特許文献２】特開２００３−３２００１３号公報（平成１５（２００３）年１１月１１日公開）
【特許文献３】特開２００３−３２００１９号公報（平成１５（２００３）年１１月１１日公開）
【特許文献４】特開２００１−１６１３５２号公報（平成１３（２００１）年６月１９日公開）
【特許文献５】国際公開公報ＷＯ２００７／０４６５０１（２００７年４月２６日公開）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
上説したように、間葉系幹細胞のような生体組織再生用細胞と、β−ＴＣＰのような生体組織補填材とを含む骨再生組成物は、骨再生に用いられるが、このような骨再生組成物を製造する技術は、特許文献１〜３に開示されている。
【００２１】
上記骨再生組成物は、通常、患者に移植して用いられるため、無菌的に製造する必要がある。
【００２２】
しかしながら、特許文献１〜３の技術では、間葉系幹細胞のような生体組織再生用細胞の調製（分離）と、生体組織再生用細胞とβ−ＴＣＰのような生体組織補填材との混合とを、別々の操作として行う。
【００２３】
そのため、特許文献１〜３の技術では、生体組織再生用細胞と生体組織補填材とを無菌性を担保して混合するために、特別な装置が必要となるという問題がある。また、そのような特別な装置を用いる必要があるため、簡便に骨再生組成物を製造できないという問題がある。
【００２４】
さらに、従来、骨再生組成物の製造には、体液や生体組織の処理液から分離された生体組織再生用細胞をそのまま、用いるのではなく、分離後、一旦培養した後、その培養した生体組織再生用細胞を用いることが一般的である。
【００２５】
そのため、大掛かりな細胞培養専門の設備（Ｃｅｌｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｃｅｎｔｅｒ）が別途必要となり、設備投資、センターの維持費など膨大な費用がかかるという問題がある。
【００２６】
このように、従来、臨床用途に利用可能な骨再生組成物を、簡便に製造することができる技術は開発されておらず、そのような技術の開発が切望されている。
【００２７】
本発明は、上記問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、培養操作を行うことなく、閉鎖系内で簡便かつ迅速に骨再生組成物を製造することが可能な骨再生組成物製造器具、骨再生組成物の製造方法、骨再生組成物、および骨再生方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、骨再生に関わる骨再生関連細胞を含む試料からの該骨再生関連細胞の分離と、該骨再生関連細胞と支持体との混合とを、一連の操作として閉鎖系内で行えば、簡便かつ迅速に骨再生組成物を製造できることを独自に見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、以下の産業上有用な以下の発明を包含する。
【００２９】
（１）骨再生に関わる骨再生関連細胞と、該骨再生関連細胞を支持する支持体とを含む骨再生組成物を製造するための骨再生組成物製造器具であって、上記骨再生関連細胞を捕捉するための細胞捕捉部と、上記細胞捕捉部に細胞回収液を注入し、該細胞捕捉部に捕捉された上記骨再生関連細胞を該細胞捕捉部から流出させるための細胞回収液注入部と、上記細胞捕捉部から流出した上記骨再生関連細胞を含む細胞回収液を回収するための細胞回収部と、を備え、上記細胞回収部には、支持体が配置されており、上記細胞回収部において、該細胞回収部に回収された骨再生関連細胞と、上記支持体とが混合されることを特徴とする骨再生組成物製造器具。
【００３０】
（２）上記細胞回収部は上記骨再生組成物製造器具から取り外し可能であって、かつ、上記細胞回収部は、突起部を有する容器部と、上記支持体が封入された支持体封入部と、上記突起部と支持体収納部とを連結する連結部と、を備え、上記骨再生関連細胞を含む細胞回収液を回収した細胞回収部を取り外して、上記骨再生関連細胞を含む細胞回収液の遠心分離を行ったときに、上記骨再生関連細胞の沈殿を収納可能な構造を有し、上記連結部は、開閉により、上記容器部から上記支持体収納部への上記骨再生関連細胞の沈殿の移動を制御するためのものであることを特徴とする（１）の記載の骨再生組成物製造器具。
【００３１】
（３）上記支持体封入部は、上記細胞回収部から取り外し可能であることを特徴とする（２）に記載の骨再生組成物製造器具。
【００３２】
（４）上記支持体封入部は、加圧可能な材質からなることを特徴とする（２）または（３）に記載の骨再生組成物製造器具。
（５）上記細胞回収部は、濾過部によって隔てられた第１空間と第２空間とを含み、上記第１空間には、上記支持体が配置されており、上記濾過部は、上記第１空間に回収された上記骨再生関連細胞を含む細胞回収液を濾過し、上記骨再生関連細胞を除く成分を上記第２空間に流入させるためのものであることを特徴とする（１）に記載の骨再生組成物製造器具。
【００３３】
（６）上記骨再生関連細胞を含む試料を上記細胞捕捉部に注入するための試料注入部をさらに備え、上記試料注入部は、上記細胞回収液注入部が上記細胞捕捉部に対して上記細胞回収液を注入する方向とは逆方向に、上記細胞捕捉部に対して上記試料を注入することを特徴とする（１）〜（５）のいずれかに記載の骨再生組成物製造器具。
【００３４】
（７）上記試料注入部が上記細胞捕捉部に上記試料を注入したとき、上記試料のうち、上記細胞捕捉部を通過した成分を回収するための廃液回収部をさらに備えることを特徴とする（６）に記載の骨再生組成物製造器具。
【００３５】
（８）上記細胞捕捉部を洗浄するための洗浄液を上記細胞捕捉部に注入するための洗浄液注入部をさらに備え、上記洗浄液注入部は、上記細胞回収液注入部が上記細胞捕捉部に対して上記細胞回収液を注入する方向とは逆方向に、上記細胞捕捉部に対して上記洗浄液を注入することを特徴とする（１）〜（７）のいずれかに記載の骨再生組成物製造器具。
【００３６】
（９）上記細胞捕捉部は、フィルター構造を有する細胞分離材を含むことを特徴とする（１）〜（８）のいずれかに記載の骨再生組成物製造器具。
【００３７】
（１０）上記細胞分離材は、白血球および赤血球を含む試料を通液したとき、白血球の３０％〜９０％を通過させ、かつ、赤血球の９０％以上を通過させることを特徴とする（９）に記載の骨再生組成物製造器具。
【００３８】
（１１）上記骨再生関連細胞は、間葉系幹細胞であることを特徴とする（１）〜（１０）のいずれかに記載の骨再生組成物製造器具。
【００３９】
（１２）上記支持体は、リン酸カルシウム、天然高分子材料、合成高分子材料、金属材料、またはこれらの２種以上を組み合わせた複合材を含むことを特徴とする（１）〜（１１）のいずれかに記載の骨再生組成物製造器具。
【００４０】
（１３）骨再生に関わる骨再生関連細胞と、該骨再生関連細胞を支持する支持体とを含む骨再生組成物の製造方法であって、閉鎖系内で、骨再生関連細胞を細胞捕捉部に捕捉し、該細胞捕捉部に細胞回収液を注入することによって、該細胞捕捉部に捕捉された上記骨再生関連細胞を該細胞捕捉部から流出させ、該細胞捕捉部から流出した上記骨再生関連細胞を含む細胞回収液を細胞回収部に回収し、該細胞回収部において、上記骨再生関連細胞を濃縮した後、該骨再生関連細胞と支持体とを混合することを特徴とする骨再生組成物の製造方法。
【００４１】
（１４）上記細胞捕捉部から、上記細胞回収液を用いて上記骨再生関連細胞を流出させる前に、上記細胞捕捉部に対して、上記細胞回収液を注入する方向とは逆方向に、洗浄液を注入して、上記細胞捕捉部を洗浄することを特徴とする（１３）に記載の骨再生組成物の製造方法。
【００４２】
（１５）上記細胞回収部に回収された骨再生関連細胞を培養せずに、上記支持体と混合することを特徴とする（１３）または（１４）に記載の骨再生組成物の製造方法。
【００４３】
（１６）上記骨再生関連細胞は、間葉系幹細胞であることを特徴とする（１３）〜（１５）のいずれかに記載の骨再生組成物の製造方法。
【００４４】
（１７）上記支持体は、リン酸カルシウム、天然高分子材料、合成高分子材料、金属材料、またはこれらの２種以上を組み合わせた複合材を含むことを特徴とする（１３）〜（１６）のいずれかに記載の骨再生組成物の製造方法。
【００４５】
（１８）（１）〜（１２）のいずれかに記載の骨再生組成物製造器具を用いて製造されたことを特徴とする骨再生組成物。
【００４６】
（１９）（１３）〜（１７）のいずれかに記載の骨再生組成物の製造方法を用いて製造されたことを特徴とする骨再生組成物。
【００４７】
（２０）上記支持体１００ｍｇに対して、１個〜５×１０９個の骨再生関連細胞を含むことを特徴とする（１８）または（１９）に記載の骨再生組成物。
【００４８】
（２１）（１８）〜（２０）のいずれかに記載の骨再生組成物を用いて骨を再生させることを特徴とする骨再生方法。
【発明の効果】
【００４９】
以上のように、本発明にかかる骨再生組成物製造器具は、骨再生に関わる骨再生関連細胞を捕捉するための細胞捕捉部と、上記細胞捕捉部に細胞回収液を注入し、該細胞捕捉部に捕捉された上記骨再生関連細胞を該細胞捕捉部から流出させるための細胞回収液注入部と、上記細胞捕捉部から流出した上記骨再生関連細胞を含む細胞回収液を回収するための細胞回収部とを備えている。さらに、上記細胞回収部には、支持体が配置されており、上記細胞回収部において、該細胞回収部に回収された骨再生関連細胞と、上記支持体とが混合される。
【００５０】
それゆえ、骨再生関連細胞と、該骨再生関連細胞を支持する支持体とを含む骨再生組成物を、閉鎖系内で簡便に製造することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５１】
本発明の一実施形態について図１〜図３に基づき説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００５２】
＜Ｉ．骨再生組成物製造器具＞
本発明にかかる骨再生組成物製造器具は、（１）体液から骨再生関連細胞を分離し、（２）分離された骨再生関連細胞と、該骨再生関連細胞と混合して骨再生組成物として用いることができる支持体とを混合することを、閉鎖系内で、一連の操作として行うことを可能にするものである。
【００５３】
したがって、本発明にかかる骨再生組成物製造器具によれば、骨再生組成物を、簡便に製造することができる。
【００５４】
また、本発明にかかる骨再生組成物製造器具によれば、骨再生組成物の製造過程において、骨再生関連細胞の培養を行う必要がない。そのため、骨再生組成物の製造にかかる手間や製造コストを大幅に低減することができる。
【００５５】
本明細書において、「骨再生組成物」は、骨再生関連細胞と、支持体とを少なくとも含み、骨再生に用いるための組成物が意図される。
【００５６】
本明細書において、「骨再生関連細胞」とは、骨再生に関わる細胞が意図され、具体的には、例えば、間葉系幹細胞を挙げることができる。
【００５７】
また、本明細書において、「間葉系幹細胞」とは、体液中から分離され、自己増殖を繰り返す能力を有し、下流の細部系譜への分化が可能な細胞が意図される。具体的には、骨髄由来間葉系幹細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、羊膜由来間葉系幹細胞、胎盤由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞等を挙げることができる。これら間葉系幹細胞は、その由来系統の細胞だけではなく、別系統の細胞にまで分化する能力を有する。ここで、間葉系幹細胞の性質について説明する。
【００５８】
間葉系幹細胞は、分化誘導因子により、例えば、軟骨細胞や、血管内皮細胞、心筋細胞、脂肪組織等、または歯周組織の構成細胞であるセメント芽細胞、歯周靱帯繊維芽細胞等の中胚葉系の細胞に分化する。
【００５９】
また、間葉系幹細胞は、適切な環境下では骨芽細胞に分化し、骨組織を新生することが知られている。この骨組織の新生では、間葉系幹細胞は、不足した骨新生能力を補填する役割を担っていると考えられている。
【００６０】
本明細書において、「支持体」とは、骨再生関連細胞と混合して骨再生組成物として用いることができる支持体が意図される。つまり、骨再生関連細胞を支持するものである。
【００６１】
上記支持体としては、特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、ハイドロキシアパタイト、β−リン酸三カルシウム、炭酸カルシウムまたはリン酸オクタカルシウム等のリン酸カルシウム；コラーゲン、キトサン、またはキチン等の天然高分子材料；ポリリシン、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリシアノアクリレート、またはε−カプロラクタン等の合成高分子材料；純チタン、チタン合金、タンタル、またはステンレス鋼等の金属材料などを挙げることができる。
【００６２】
これらは単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせた複合材として用いてもよい。
【００６３】
また、自家骨、自家骨片、自家骨粉、血管柄付き骨片のような組織及び組織片等を支持体とすることもできる。
【００６４】
上記支持体の形状は特に限定されるものではなく、骨再生関連細胞を保持し得るものであればよい。具体的には、例えば、顆粒状、膜状、チューブ状、平板状、ロール状等の形状を挙げることができる。中でも、疾患部に形状をフィットさせるために、形態は顆粒状が好ましい。
【００６５】
ここで、本発明にかかる骨再生組成物製造器具の一実施形態について、図１〜３を参照しながら、以下、詳細に説明するが本発明はこれに限定されるものではない。
【００６６】
本実施形態にかかる骨再生組成物製造器具１００（骨再生組成物製造器具）は、図１に示すように、細胞分離器１（細胞捕捉部）と、試料注入用シリンジ２（試料注入部）と、廃液バッグ３（廃液回収部）と、洗浄用シリンジ４（洗浄液注入部）と、回収用シリンジ５（細胞回収液注入部）と、混合容器６（細胞回収部）とを備えている。
【００６７】
細胞分離器１、廃液バッグ３および回収用シリンジ５は、三方活栓１２を介して互いに接続されている。
【００６８】
より詳しくは、図１に示すように、細胞分離器１と三方活栓１２とは、配管回路１８によって接続されている。廃液バッグ３と三方活栓１２とは、配管回路２０によって接続されている。
【００６９】
さらに、回収用シリンジ５と三方活栓１２とは、配管回路１９によって接続されている。これにより、結果として、細胞分離器１、廃液バッグ３および回収用シリンジ５は、互いに接続されている。
【００７０】
また、細胞分離器１、試料注入用シリンジ２、洗浄用シリンジ４、および混合容器６は、三方活栓１０および三方活栓１１を介して互いに接続されている。
【００７１】
より詳しくは、図１に示すように、細胞分離器１と三方活栓１１とは、配管回路１７によって接続されている。混合容器６と三方活栓１１とは、配管回路１６によって接続されている。三方活栓１１と三方活栓１０とは、配管回路１５によって接続されている。
【００７２】
また、洗浄用シリンジ４と三方活栓１０とは、配管回路１４によって接続されている。さらに、試料注入用シリンジ２と三方活栓１０とは、配管回路１３によって接続されている。
【００７３】
これにより、結果として、細胞分離器１、試料注入用シリンジ２、洗浄用シリンジ４、および混合容器６は、互いに接続されている。
【００７４】
上記構成によれば、試料注入用シリンジ２から骨再生関連細胞を含む試料溶液を注入すると、三方活栓１０および三方活栓１１を経由して、細胞分離器１に該試料溶液を流入させることができる。
【００７５】
そして、細胞分離器１では、上記試料溶液に含有される骨再生関連細胞は、細胞分離器１に捕捉され、上記試料溶液に含有される夾雑物は、三方活栓１２を経由して、廃液バッグ３に流入（排出）させることができる。
【００７６】
また、上記構成によれば、細胞分離器１に骨再生関連細胞が捕捉された状態で、洗浄用シリンジ４から、洗浄液を注入すると、三方活栓１０および三方活栓１１を経由して、細胞分離器１に該洗浄液を流入させることができる。
【００７７】
これにより、細胞分離器１には、上記試料溶液を流入させたときと同じ向きに、上記洗浄液が流入することになる。そのため、細胞分離器１内の夾雑物を洗い流し、上記洗浄液は、三方活栓１２を経由して、廃液バッグ３に流入（排出）させることができる。
【００７８】
さらに、上記構成によれば、細胞分離器１に骨再生関連細胞が捕捉され、細胞分離器１内の夾雑物が洗い流された状態で、回収用シリンジ５から細胞回収液を注入すると、三方活栓１２を経由して、細胞分離器１に該細胞回収液を流入させることができる。
【００７９】
その結果、細胞分離器１には、上記試料溶液を流入させたときとは逆向きに、上記細胞回収液が流入することになる。そのため、細胞分離器１に捕捉された骨再生関連細胞を細胞分離器１から流出させ、三方活栓１１を経由して、混合容器６に、該骨再生関連細胞を流入させることができる。
【００８０】
骨再生組成物製造器具１００の混合容器６には、図１に示すように、支持体７が配置されている。そのため、混合容器６に流入した骨再生関連細胞は、混合容器６内で、支持体７と混合される。
【００８１】
なお、支持体７としては、上説した支持体を用いればよい。また、混合容器６内における骨再生関連細胞と支持体７との混合方法については、後述するので、ここではその詳細な説明は省略する。
【００８２】
このように、骨再生組成物製造器具１００によれば、骨再生関連細胞を含む試料溶液から、骨再生関連細胞を分離し、さらに、該分離した骨再生関連細胞と支持体７と混合することを、閉鎖系内で、一連の操作として行うことができる。したがって、無菌性を保ったまま、骨再生組成物を簡便に製造することができる。
【００８３】
さらに、骨再生組成物製造器具１００により製造された骨再生組成物は、その製造工程において、骨再生関連細胞の培養を行わないにもかかわらず、後述する実施例に示すように、骨再生能を有する。つまり、骨再生組成物製造器具１００によれば、骨再生関連細胞を培養することなく、骨再生能を有する骨再生組成物を製造できる。それゆえ、骨再生関連細胞の培養工程を省き、骨再生組成物の生産効率を大幅に向上させることができる。
【００８４】
以下、骨再生組成物製造器具１００を構成する各部材について、より具体的に説明する。
【００８５】
細胞分離器１は、骨再生関連細胞を捕捉し、不必要な夾雑物を通過させることが可能である。ここでいう「夾雑物」とは、目的細胞以外の細胞、例えば、赤血球、血小板、リンパ球等が意図される。
【００８６】
細胞分離器１の形態は特に限定されるものではなく、任意の大きさ、形状の細胞分離材を、少なくとも２つの口をもつ容器に充填したものであってもよいし、容器等に充填していない細胞分離材そのものであってもよい。
【００８７】
本実施形態では、細胞分離器１は、フィルター構造を有する細胞分離材を容器内に充填したものであることが好ましい。この場合、細胞分離材は、上記容器に圧縮して充填されていてもよいし、圧縮せずに充填されていてもよい。
【００８８】
より具体的には、例えば、不織布状の細胞分離材を、充填した状態で厚みが０．１ｃｍ〜５ｃｍ、好ましくは、０．１５ｃｍ〜４ｃｍ、より好ましくは０．２ｃｍ〜３ｃｍとなるように、上記容器に充填したものを細胞分離器１として好適に用いることができる。
【００８９】
このような構成の細胞分離器１によれば、赤血球、白血球、血小板等を効率よく除去した上で、骨再生関連細胞を高い回収率で回収することができる。
【００９０】
また、上記細胞分離材として、ロール状の細胞分離材を用いる場合、上記容器に該ロール状の細胞分離材を充填し、ロールの内側から外側に向けて体液を流して、骨再生関連細胞を捕捉する形態としてもよいし、ロールの外側から内側に向けて体液を流して、骨再生関連細胞を捕捉する形態としてもよい。
【００９１】
細胞分離材を充填する容器は、特に限定されるものではなく、球、コンテナ、カセット、バッグ、チューブ、カラム等、任意の形態をとりうる。好ましい具体例としては、例えば、容量約０．１ｍｌ〜１０００ｍｌ程度、直径約０．１ｃｍ〜１５ｃｍ程度の透明または半透明の円柱状容器、あるいは一片の長さ０．１ｃｍ〜２０ｃｍ程度の正方形あるいは長方形で、厚みが０．１ｃｍ〜５ｃｍ程度の四角柱状の容器等を挙げることができる。
【００９２】
上記細胞分離材は、支持体や骨再生関連細胞は通過せず、液体成分を通過させる濾過材であればよい。具体的には、白血球および赤血球を含む試料を通液したとき、白血球の３０％〜９０％を通過させ、かつ、赤血球の９０％以上を通過させることが好ましい。なお、上記「白血球および赤血球を含む試料」としては、骨髄液、末梢血液、密度勾配を利用した分離剤にて体液を処理した産物（分離剤にて処理した体液を任意の液体（培地、生理食塩水、ＰＢＳ等）に再懸濁した試料が意図される。上記分離剤としては、Ficoll、ヒドロキシエチルスターチ等が挙げられる。
【００９３】
上記細胞分離材の材質としては、例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン、高密度ポリエチレン、低密度ポリエチレン等のポリオレフィン、ポリエステル、塩化ビニル、ポリビニルアルコール、塩化ビニリデン、レーヨン、ビニロン、ポリスチレン、アクリル（ポリメチルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリアクロニトリル、ポリアクリル酸、ポリアクリレート等）、ナイロン、ポリウレタン、ポリイミド、アラミド、ポリアミド、キュプラ、ケブラー、カーボン、フェノール、テトロン、パルプ、麻、セルロース、ケナフ、キチン、キトサン、ガラス、綿等を挙げることができる。
【００９４】
中でも、ポリエステル、ポリスチレン、アクリル、レーヨン、ポリオレフィン、ビニロン、ナイロン、およびポリウレタン等の合成高分子を好適に用いることができる。
【００９５】
上記細胞分離材は、これらの材質のうち、単一の材質からなってもよいし、複数の材質を組み合わせた複合材からなってもよい。
【００９６】
２種以上の合成高分子を組み合わせて用いる場合、その組み合わせは特に限定されるものではないが、ポリエステルとポリプロピレンとの組み合わせ、レーヨンとポリオレフィンとの組み合わせ、または、ポリエステルとレーヨンとビニロンとの組み合わせを好適に用いることができる。
【００９７】
２種以上の合成高分子を組み合わせて繊維とする場合、具体的には、例えば、１本の繊維が異成分同士の合成高分子よりなる繊維、あるいは異成分同士が剥離分割した分割繊維でもよい。また、成分の異なる合成高分子単独よりなる繊維をそれぞれ複合化した繊維であってもよい。ここでいう「複合化した繊維」とは、２種以上の繊維を混在させることにより構成した繊維、または、合成高分子単独よりなる繊維をそれぞれ張り合わせた繊維等が意図される。
【００９８】
上記細胞分離材の形態は特に限定されるものではないが、本発明では、フィルター構造を有する細胞分離材を容器内に充填したものを細胞分離器１として用いることが好ましいことから、上記細胞分離材の形態は、上記容器に収納できるものであることが好ましい。
【００９９】
具体的には、例えば、連通孔構造の多孔質体、繊維の集合体、織物等を挙げることができる。中でも、繊維で構成されることが好ましく、不織布であることがより好ましい。
【０１００】
また、上記細胞分離材は、上記例示した材質に対して、細胞分離材としての性能を向上させるための処理が施されたものであってもよい。
【０１０１】
このような処理としては、具体的には、例えば、（１）親水化処理、（２）細胞付着性タンパク質や、骨再生関連細胞上に特異的に発現している特異的抗原に対する抗体の固定化処理を挙げることができる。
【０１０２】
上記親水化処理により、骨再生関連細胞以外の細胞の非特異的な捕捉を抑制することができる。また、体液が細胞分離器１内を通過する際、特定の領域の細胞分離材に偏って通過して、骨再生関連細胞の回収率が低下することを防止することができる。
【０１０３】
また、上記特定のタンパク質の固定化処理によれば、骨再生関連細胞の細胞分離材への付着性をより向上させることができる。
【０１０４】
なお、上記親水化処理や、特定のタンパク質の固定化処理の具体的な方法については特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いればよい。また、細胞分離材の性能を向上させる処理については、例えば、上記特許文献５の内容も本明細書に参考として援用される。
【０１０５】
細胞分離器１は骨再生関連細胞の分離に用いられるため、上記細胞分離材は、通液方向と平行に孔が連通している形態とすることが好ましい。
【０１０６】
また、細胞分離材が繊維である場合、その繊維径が３μｍより小さいと、細胞分離材と白血球との相互作用が高まり、夾雑物（換言すれば、不用細胞）の除去効率が低くなる傾向がある。一方、繊維径が４０μｍより大きいと、有効接触面積の低下やショートパスが起こりやすくなり、骨再生関連細胞の回収率が低下する傾向がある。
【０１０７】
したがって、細胞分離材が繊維である場合の繊維径は、３μｍ〜４０μｍであることが好ましく、５μｍ〜３５μｍであることがより好ましく、５μｍ〜３０μｍであることがさらに好ましい。このような繊維径とすれば、骨再生関連細胞と細胞分離材との相互作用を上げ、骨再生関連細胞の収率を向上させることができる。
【０１０８】
さらに、細胞分離材が繊維である場合、目開きは、３μｍより小さいと、夾雑物の除去効率が低下する傾向がある。一方、上記目開きが１２０μｍより大きいと、骨再生関連細胞の捕捉が困難となる傾向がある。
【０１０９】
したがって、上記目開きは、短径が３μｍ以上で、長径が１２０μｍ以下であることが好ましく、短径が５μｍ以上で、長径が８０μｍ以下であることがより好ましく、短径が５μｍ以上で、長径が５０μｍ以下であることがさらに好ましい。このような目開きとすれば、赤血球等の比較的大きな夾雑物を高い除去効率で除去するとともに、高い回収率で骨再生関連細胞を捕捉することができる。
【０１１０】
なお、ここでいう「細胞分離材が繊維である場合の繊維の目開き」は、下記の方法により求めることができる。まず、細胞分離材が繊維である場合の繊維を走査型電子顕微鏡（以下、「ＳＥＭ」ともいう）にて写真撮影する。次に、そのＳＥＭ画像を用いて、異なる２本以上の繊維が交差することにより形成される実質的な孔の長径、および短径を画像解析装置にて５０ポイント以上測定し、それぞれの平均値を求める。これにより、上記目開きの短径および長径をそれぞれ測定することができる。
【０１１１】
なお、長径は実質的な孔の２点間の最長の距離を、短径は長径を求めた際の２点間の距離の中央値を通り、実質的に孔に接する最短の距離をいう。
【０１１２】
細胞分離器１において、細胞分離材の密度Ｋ（つまり、目付（ｇ／ｍ２）／厚み（ｍ））は、１．０×１０４≦Ｋ≦１．０×１０６であることが好ましく、２．５×１０４≦Ｋ≦７．５×１０５であることがより好ましく、５．０×１０４≦Ｋ≦５．０×１０５であることがさらに好ましく、５．０×１０４≦Ｋ≦２．０×１０５であることが特に好ましい。このような密度であれば、赤血球、白血球、血小板等を高い除去効率で除去できるうえ、骨再生関連細胞を高い回収率で回収することができる。
【０１１３】
なお、密度Ｋは、目付（ｇ／ｍ２）／厚み（ｍ）を示すが、換言すれば、重量（ｇ）／単位体積（ｍ３）と表すこともできる。したがって、密度Ｋは、細胞分離材の単位体積（ｍ３）当りの重量（ｇ）を測定することにより求めることができる。
【０１１４】
なお、細胞分離器１は、上記容器を含まず、細胞分離材のみからなる構成とすることもできる。その場合、具体的には、上記細胞分離材を成型したフィルター、多孔質体、中空糸、メッシュ等を挙げることができる。
【０１１５】
細胞分離器１は、以上説示した通りであるが、細胞分離器１の構成については、例えば、上記特許文献５の内容も本明細書に参考として援用される。
【０１１６】
試料注入用シリンジ２は、骨再生関連細胞を含む試料溶液（以下、「骨再生関連細胞含有試料」ともいう）を細胞分離器１に注入するためのものである。
【０１１７】
試料注入用シリンジ２の材質や形状は、特に限定されるものではなく、従来公知のあらゆるシリンジ、好ましくは医療用シリンジを用いることができる。
【０１１８】
本実施形態にかかる骨再生組成物製造器具１００では、細胞分離器１に骨再生関連細胞含有試料を注入するために、試料注入用シリンジ２を備えているが、本発明はこれに限定されない。すなわち、試料注入用シリンジ２に代えて、細胞分離器１に骨再生関連細胞含有試料を注入する方法に応じて、あらゆる試料注入用具を用いることができる。
【０１１９】
具体的には、例えば、試料注入用シリンジ２に代えて、任意の容器（例えば、バッグ）を用い、骨再生関連細胞含有試料を該任意の容器にプールして、自然落下により、細胞分離器１に骨再生関連細胞含有試料を注入することができる。また、骨再生関連細胞含有試料を入れた任意の容器から、ポンプ等を用いて、細胞分離器１に骨再生関連細胞含有試料を注入してもよい。
【０１２０】
洗浄用シリンジ４、および回収用シリンジ５は、それぞれ、洗浄液、および細胞回収液を細胞分離器１に注入するためのものである。洗浄用シリンジ４、および回収用シリンジ５の材質並びに形状は特に限定されるものでないが、試料注入用シリンジ２と同様のものを用いることができる。また、試料注入用シリンジ２と同様に、細胞分離器１に洗浄液または細胞回収液を注入する方法に応じて、シリンジ以外のものを代用することができる。
【０１２１】
廃液バッグ３は、試料注入用シリンジ２および洗浄用シリンジ４から注入された骨再生関連細胞含有試料および洗浄液のうち、細胞分離器１を通過した成分を回収するものである。廃液バッグ３の材質および形状は特に限定されるものではなく、医療用途に一般的に用いられる廃液バッグを好適に用いることができる。
【０１２２】
また、本実施形態では、廃液バッグ３を備えているが本発明はこれに限定されない。すなわち、試料注入用シリンジ２および洗浄用シリンジ４から注入された骨再生関連細胞含有試料および洗浄液のうち、細胞分離器１を通過した成分を回収することができるものであれば、バッグに限らず、あらゆる容器を代用することができる。
【０１２３】
三方活栓１０〜１２は、それぞれ、３つの口をもち、これら３つの口の任意の２つの口を連通させることが可能なものであればよく、その材質等は特に限定されるものではない。具体的には、例えば、医療用途で用いられるあらゆる三方活栓を用いることができる。
【０１２４】
さらに、配管回路１３〜２０もまた、特に限定されるものではなく、各部材間を、溶液が漏れないように接続できるものであればよい。その材質や形状についても特に限定されるものではない。具体的には、例えば、医療用途で用いられるあらゆるチューブ類を好適に用いることができる。
【０１２５】
以下、混合容器６について詳細に説明する。ここでは、混合容器６の３つの実施形態について説明するが、本発明はこれに限定されない。
【０１２６】
〔混合容器６の第１実施形態〕
混合容器６は、図１に示すように、容器２１内に、フィルター８（濾過部）が配置された構成である。より具体的には、フィルター８は、容器２１の内部空間を二分するように配置されている。これにより、混合容器６は、フィルター８によって隔てられた混合部９ａ（第１空間）と貯留部９ｂ（第２空間）とを有する構成となっている。
【０１２７】
混合容器６において、混合部９ａは、混合容器６内に流入する溶液が、まず、通過する空間である。一方、貯留部９ｂは、混合容器６内に流入する溶液がフィルター８を通過したのち、貯留する空間である。
【０１２８】
フィルター８は、混合部９ａに回収された（流入した）骨再生関連細胞を含む細胞回収液を濾過し、骨再生関連細胞を除く成分を貯留部９ｂに流入させるためのものである。フィルター８は、特に限定されるものではないが、実質的に、細胞程度の大きさの粒子は通さず、細胞よりも小さい粒径の成分のみを通過させることができるフィルターであることが好ましい。具体的には、例えば、通液方向と水平な連通孔を有し、その孔径が２μｍ〜５μｍのフィルターを用いることが好ましい。
【０１２９】
さらに、混合容器６においては、混合部９ａの空間（例えば、フィルター８の上）に、支持体７が配置されている。このような構成によれば、混合容器６の混合部９ａに流入した溶液は、混合部９ａにて、支持体７と混合される。
【０１３０】
したがって、上記構成によれば、混合容器６内に回収された骨再生関連細胞を含む細胞回収液（換言すれば、骨再生関連細胞の細胞懸濁液）は、混合部９ａで支持体７と混合され、その後、骨再生関連細胞を除く成分は、貯留部９ｂに移動する。これにより、フィルター８上には骨再生関連細胞と支持体との混合物が残る。
【０１３１】
そして、混合部９ａに任意の溶液を注入することにより、濃縮された骨再生関連細胞と支持体とを含む骨再生組成物を製造することができる。
【０１３２】
混合部９ａに任意の溶液を注入する方法、および製造された骨再生組成物を混合部９ａから回収する方法は特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、シリンジ等を用いて、混合部９ａに任意の溶液を注入したり、混合部９ａから骨再生組成物を回収したりすることができる。
【０１３３】
容器２１は、特に限定されるものではなく、任意の容器を用いることができる。また、容器２１は硬質容器であってもよいし、軟質容器であってもよい。容器２１の材質としては、具体的には、例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン、高密度ポリエチレン、低密度ポリエチレンなどのポリオレフィン、ポリエステル、塩化ビニル、ポリビニルアルコール、塩化ビニリデン、ビニロン、ポリスチレン、アクリル（ポリメチルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、アクリロニトリル、アクリル酸、アクリル酸エステルなど）、ナイロン、ポリウレタン、ポリイミド、ポリアミド、カーボン、ポリアクリレート、セルロース、キチン、キトサン、およびガラス等を挙げることができる。
【０１３４】
なお、容器２１は、単一の材質からなっていてもよいし、上記例示したような材質を複数組み合わせてなるものであってもよい。
【０１３５】
〔混合容器６の第２実施形態〕
混合容器６は、別の実施形態として、図２に示すように、突起部２７を有する容器２６（容器部）と、支持体７が封入された支持体封入容器２９（支持体封入部）と、チューブ２８（連結部）とからなる。
【０１３６】
容器２６の突起部２７と、支持体封入容器２９とは、チューブ２８によって連結されている。また、容器２６と支持体封入容器２９とは、チューブ２８が閉状態の時、非連通状態にある。一方、チューブ２８が開状態の時、容器２６と支持体封入容器２９とは連通状態となる。
【０１３７】
つまり、チューブ２８は、容器２６から支持体封入容器２９への溶液の移動を制御するためのものである。チューブ２８は、可逆的に開閉可能なものであってもよいし、閉状態から開状態へ一度だけ切り替え可能なものであってもよい。
【０１３８】
閉状態から開状態へ一度だけ切り替え可能な形態としては、例えば、チューブ２８が、開孔可能な非連通のチューブであって、該チューブを折り曲げることにより開孔される形態が挙げられる。なお、チューブ２８の開閉方法は上記に限定されるものではなく、あらゆる開閉方式を用いることができる。
【０１３９】
本実施形態の混合容器６を備える骨再生組成物製造器具１００では、混合容器６は、骨再生組成物製造器具１００から取り外し可能であることが好ましい。
【０１４０】
このような構成によれば、混合容器６内に骨再生関連細胞を含む細胞回収液（換言すれば、骨再生関連細胞の細胞懸濁液）を回収した後、骨再生組成物製造器具１００から取り外すことができる。さらに、取り外した混合容器６を遠心分離器に供し、骨再生関連細胞を濃縮して、突起部２７に沈降（収納）することができる。
【０１４１】
すなわち、突起部２７は、骨再生関連細胞を含む細胞回収液を回収した混合容器６を取り外して、骨再生関連細胞を含む細胞回収液の遠心分離を行ったときに、骨再生関連細胞の沈殿を収納可能な構造を有する。
【０１４２】
その後、チューブ２８を開状態とすれば、突起部２７と、支持体封入容器２９とが連通し、濃縮された骨再生関連細胞が支持体封入容器２９に流入し、間葉系細胞と支持体７とが混合され、骨再生組成物を調製（製造）することができる。
【０１４３】
容器２６の材質や形状は、特に限定されるものではないが、容器２６内に回収された骨再生関連細胞の懸濁液を遠心分離して、骨再生関連細胞を沈殿させる操作に耐えうる材質および形状であることが好ましい。
【０１４４】
具体的には、例えば、一般的に細胞を遠心分離により沈殿させるために用いる遠心チューブや遠心バッグの材質を、上記容器２１の材質として例示したものの中から、選択して好適に用いることができる。
【０１４５】
また、容器２６の形状についても、具体的には、容器２６内に回収された骨再生関連細胞の懸濁液を遠心分離して、骨再生関連細胞を沈殿させることができ、沈殿した骨再生関連細胞を突起部２７に収納できる形状であればよい。
【０１４６】
支持体封入容器２９の材質および形状は特に限定されるものではなく、支持体７を封入できるものであればよい。具体的には、例えば、上記容器２１の材質として例示した材質からなる容器を用いることができる。
【０１４７】
骨再生組成物製造器具１００において、支持体封入容器２９は、容器２６との連通前、すなわち、チューブ２８が閉状態のとき、内部が陰圧状態、好ましくは真空であることが好ましい。
【０１４８】
このような構成によれば、支持体封入容器２９を、容器２６と連通させたときに、必要以上の細部回収液が支持体封入容器２９内に流入することがなく、突起部２７に沈降した骨再生関連細胞（換言すれば、濃縮された骨再生関連細胞）が優先的に支持体封入容器２９内流入する。それゆえ、骨再生関連細胞の細胞濃度が高い骨再生組成物を製造することができる。
【０１４９】
また、支持体封入容器２９は、加圧可能な容器であることが好ましい。加圧可能な容器とは、外圧を加えて容器の空間を縮小可能な容器が意図される。さらに、支持体封入容器２９は、容器２６と切り離せることが好ましい。
【０１５０】
上記構成によれば、支持体封入容器２９内で骨再生組成物を調製した後、支持体封入容器２９をチューブ２８と共に、または支持体封入容器２９のみを、容器２６から切り離して、支持体封入容器２９に外圧を加えることにより、チューブ２８または支持体封入容器２９の開口部を介して、骨再生組成物を押し出し回収することができる。
【０１５１】
また、支持体封入容器２９に外圧を加えることにより、チューブ２８を介して骨再生組成物をそのまま疾患部に移植することもできる。
【０１５２】
より具体的には、例えば、シリンジを支持体封入容器２９として用いれば、ピストンを押し込むことにより、支持体封入容器２９に外圧を加え、骨再生組成物を、支持体封入容器２９から回収したり、疾患部に直接移植したりすることができる。
【０１５３】
また、軟質容器を支持体封入容器２９として用いれば、支持体封入容器２９を指等で押すことにより、支持体封入容器２９に外圧を加え、骨再生組成物を、支持体封入容器２９から回収したり、疾患部に直接移植したりすることができる。
【０１５４】
さらに、硬質容器を支持体封入容器２９として用いれば、ポンプ等の機械を用いて支持体封入容器２９に外圧を加え、骨再生組成物を、支持体封入容器２９から回収したり、疾患部に直接移植したりすることができる。
【０１５５】
支持体封入容器２９から骨再生組成物を回収する方法は、加圧による方法に限定されるものではない。例えば、シリンジ等を用いて支持体封入容器２９から骨再生組成物を回収してもよい。
【０１５６】
〔混合容器６の第３実施形態〕
混合容器６は、さらに別の実施形態として、図３（ａ）に示すように、突起部４８（突起部）を有する容器４７（容器部）と、容器２６の突起部４８に接続可能で、支持体７が封入された支持体封入体５０（支持体封入部）とからなる。
【０１５７】
この実施形態では、骨再生関連細胞を含む細胞回収液（換言すれば、骨再生関連細胞の細胞懸濁液）が容器４７に回収されるまで、容器４７と支持体封入体５０とは非連通状態にある。具体的には、図３（ａ）では、容器４７と支持体封入体５０とは分離された状態にある。ただし、本発明は、これに限定されるものではなく、容器４７と支持体封入体５０とは完全には分離されずに接続されており、支持体封入体５０を、容器４７の方向に押し込むことにより、針５１が容器４７の突起部４８に刺さり、容器４７と支持体封入体５０とが連通される構成とすることもできる。
【０１５８】
また、骨再生関連細胞の細胞懸濁液を回収するまでは、容器４７の突起部４８は、蓋されている。蓋をする方法は特に限定されず、骨再生関連細胞の細胞懸濁液が容器４７から漏れ出さないものであればよい。例えば、ゴム栓によって、容器４７の突起部４８を蓋することができる。
【０１５９】
また、容器４７は、骨再生組成物製造器具１００から取り外し可能であって、回収された骨再生関連細胞の細胞懸濁液を遠心分離により、突起部４８に回収可能であることが好ましい。この場合、突起部４８に装着される蓋は、遠心分離操作によっても、骨再生関連細胞の細胞懸濁液が漏れ出さないものであることが好ましい。
【０１６０】
容器４７の材質や形状は、特に限定されるものではないが、上説した容器２６と同様の材質、形状の容器を用いることができる。
【０１６１】
支持体封入体５０は、図３（ｂ）に示すように、支持体７が封入された容器５３に針５１（連結部）が取り付けられている。針５１は、内部が空洞であり、骨再生関連細胞の細胞懸濁液を通過させることができる。
【０１６２】
上記構成の支持体封入体５０は、針５１を、容器４７の突起部４８の蓋に差込み、貫通させることにより、容器４７の突起部４８と、支持体封入体５０とを連通し、突起部４８から支持体封入体５０へ骨再生関連細胞の細胞懸濁液を移動させることができる。
【０１６３】
容器４７から針５１を通って支持体封入体５０に流入した骨再生関連細胞は、支持体封入体５０の容器５３内で、支持体７と混合され、骨再生組成物が製造される。
【０１６４】
さらに、図３（ｂ）に示すように、支持体封入体５０の針５１は、ゴム５２で被われている。そして、針５１を容器４７の突起部４８の蓋に差し込む際、ゴム５２は針５１によって貫通される。このような構成によれば、閉鎖系を実質的に保った状態で、容器４７の突起部４８と、支持体封入体５０とを連通させることができる。
【０１６５】
また、この実施形態では、容器４７の内部は陰圧であることが好ましく、真空であることがより好ましい。支持体封入体５０は、針５１がゴム５２で覆われているため、容器４７の内部を陰圧、好ましくは真空に保つことができる。
【０１６６】
また、容器４７の内部が陰圧、好ましくは真空であれば、支持体封入体５０と容器４７の突起部４８とを連通させたとき、必要以上の細胞回収液が流入することがなく、沈降して濃縮された骨再生関連細胞のみを、支持体封入体５０の容器５３に優先的に流入させることができる。
【０１６７】
支持体封入体５０から製造された骨再生組成物を回収する方法は、特に限定されるものではない。例えば、シリンジ等を用いて、支持体封入体５０から骨再生組成物を回収することができる。また、支持体封入体５０を容器４７から切り離して、ゴム５２を取り外した後、容器５３に外圧を加えることにより、針５１を通して骨再生組成物を押し出し回収することもできる。このように容器５３に外圧を加えて骨再生組成物を回収する場合、針５１を介して骨再生組成物をそのまま疾患部に移植してもよい。
【０１６８】
＜ＩＩ．骨再生組成物の製造方法＞
本発明にかかる骨再生組成物の製造方法は、骨再生に関わる骨再生関連細胞と、該骨再生関連細胞を支持する支持体とを含む骨再生組成物を製造する方法である。
【０１６９】
本発明にかかる骨再生組成物の製造方法は、上説した本発明にかかる骨再生組成物製造器具を用いて、好適に実施することができる。
【０１７０】
そのため、以下の説明では、上説した骨再生組成物製造器具を用いて骨再生組成物を製造する実施形態について説明するが、本発明はこれに限定されない。すなわち、本発明には、同様の原理を用いて、骨再生組成物を製造する方法も含まれる。
【０１７１】
本実施形態にかかる骨再生組成物の製造方法は、具体的には、骨再生関連細胞を細胞分離器１で捕捉する工程（以下、「細胞捕捉工程」ともいう）と、細胞分離器１に捕捉された骨再生関連細胞を、細胞分離器１に細胞回収液を注入することによって、細胞分離器１から流出させ、細胞分離器１から流出した骨再生関連細胞を含む細胞回収液を混合容器６に回収する工程（以下、「細胞回収工程」）と、混合容器６において、骨再生関連細胞を濃縮した後、骨再生関連細胞と支持体７とを混合する工程（以下、「混合工程」ともいう）とを含む。
【０１７２】
さらに、上記細胞捕捉工程と、細胞回収工程との間に、細胞分離器１に対して洗浄液を注入し、細胞分離器１を洗浄する工程（以下、「洗浄工程」ともいう）を含んでいてもよい。
【０１７３】
以下、上記細胞捕捉工程、洗浄工程、細胞回収工程、および混合工程について、詳細に説明する。
【０１７４】
〔細胞捕捉工程〕
上記細胞捕捉工程では、骨再生関連細胞を細胞分離器１に捕捉する。具体的には、図１に示す試料注入用シリンジ２を用いて、骨再生関連細胞含有試料を細胞分離器１に注入する。
【０１７５】
上記骨再生関連細胞含有試料は、特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、体液、および生体組織の処理液等を挙げることができる。
【０１７６】
本明細書において、「体液」とは、骨再生関連細胞を含む、血液（末梢血、Ｇ−ＣＳＦ動員末梢血を含む）、骨髄液、臍帯血等が意図される。また、体液には、血液（末梢血、Ｇ−ＣＳＦ動員末梢血を含む）、骨髄液、臍帯血等の希釈物；血液（末梢血、Ｇ−ＣＳＦ動員末梢血を含む）、骨髄液、臍帯血等を、フィコール、パーコール、ヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ）、バクティナーチューブ、リンフォプレップ等を用いた比重密度遠心分離法により前処理して調製された細胞懸濁液等も含まれる。
【０１７７】
また、「生体組織の処理液」とは、生体組織を酵素により分解させた処理液（酵素分解処理液）、生体組織を破砕により分解させた処理液（破砕処理液）、生体組織を擦過により分解させた処理液（擦過処理液）、生体組織を浸透抽出により分解させた処理液（浸透抽出処理液）、生体組織を美容整形等で行われる脂肪吸引法により分解させた処理液（脂肪吸引処理液）等が意図される。なお、これら生体組織の処理液については、上記特許文献５の内容も本明細書に参考として援用される。
【０１７８】
また、「生体組織」とは、骨再生関連細胞を含む体液以外の生体組織が意図される。
【０１７９】
上記細胞捕捉工程において、試料注入用シリンジ２を用いて、細胞分離器１に骨再生関連細胞含有試料を注入（換言すれば、通液）する方法は、特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、骨再生関連細胞含有試料を入れた試料注入用シリンジ２のプランジャーを、手や機械を用いて押して、細胞分離器１に骨再生関連細胞含有試料を注入することができる。
【０１８０】
図１に示す骨再生組成物製造器具を用いずに、上記細胞捕捉工程を実施する場合、骨再生関連細胞含有試料をプールしたバックなどから自然落下により、細胞分離器１に骨再生関連細胞含有試料を注入してもよい。
【０１８１】
また、骨再生関連細胞含有試料を入れたシリンジを直接、細胞分離器１に接続し、手や機械で該シリンジのプランジャーを押して、骨再生関連細胞含有試料を細胞分離器１に注入することもできる。
【０１８２】
さらに、骨再生関連細胞含有試料の細胞分離器１への注入には、ポンプなどを使用してもよい。
【０１８３】
上記細胞捕捉工程において、細胞分離器１に骨再生関連細胞含有試料を注入する注入速度（換言すれば、通液速度）は、特に限定されるものではなく、細胞分離器１の形態に応じて適した注入速度とすればよい。
【０１８４】
具体的には、例えば、細胞分離器１として、フィルター構造を有する細胞分離材が充填された細胞分離器を用いる場合、細胞分離材の厚さに対する骨再生関連細胞含有試料の通過速度（線速）として、０．１ｍｍ／ｍｉｎ〜１０００ｍｍ／ｍｉｎとすることが好ましく、０．５ｍｍ／ｍｉｎ〜５００ｍｍ／ｍｉｎとすることがより好ましく、１ｍｍ／ｍｉｎ〜２５０ｍｍ／ｍｉｎとすることがさらに好ましい。
【０１８５】
線速が０．１ｍｍ／ｍｉｎより低いと処理時間が長期化する傾向がある。一方、１０００ｍｍ／ｍｉｎより高いと、骨再生関連細胞含有試料の流水圧により、コロニー形成が可能な骨再生関連細胞が細胞分離器１に捕捉されにくくなる傾向がある。
【０１８６】
しかし、上記線速範囲であれば、処理時間が長期化することなく、また、効率よく骨再生関連細胞を捕捉することができる。
【０１８７】
〔洗浄工程〕
上記洗浄工程では、細胞分離器１洗浄液を注入し、上記細胞捕捉工程後の細胞分離器１を洗浄する。具体的には、洗浄用シリンジ４を用いて、上記細胞捕捉工程において骨再生関連細胞含有試料を流した方向と同方向から、細胞分離器１に洗浄液を注入する。これにより、細胞分離器１中に溜まっている夾雑物を、細胞分離器１から洗い流すことができる。
【０１８８】
上記洗浄液は、特に限定されるものではなく、細胞に対して負の影響を与えない溶液であればよい。具体的に、例えば、生理的食塩液やリンゲル液など注射用剤として一般的に用いられる溶液、リン酸緩衝液等の緩衝液、αＭＥＭ培地やＤＭＥＭ培地等の細胞培養用の培地等を挙げることができる。
【０１８９】
これら例示した溶液の中でも、細胞への負の影響が小さいこと、医療用途での使用実績が多いことから、生理食塩水を好ましく用いることができる。
【０１９０】
上記洗浄工程において、細胞分離器１に洗浄液を注入（換言すれば、通液）する注入速度は、特に限定されなく、細胞分離器１の形態に応じて適した注入速度とすればよい。
【０１９１】
具体的には、例えば、細胞分離器１として、フィルター構造を有する細胞分離材が充填された細胞分離器を用いる場合、細胞分離材の厚さに対する洗浄液の通過速度（線速）として、０．１ｍｍ／ｍｉｎ〜１０００ｍｍ／ｍｉｎとすることが好ましく、０．５ｍｍ／ｍｉｎ〜５００ｍｍ／ｍｉｎとすることがより好ましく、１ｍｍ／ｍｉｎ〜２５０ｍｍ／ｍｉｎとすることがさらに好ましい。
【０１９２】
線速が０．１ｍｍ／ｍｉｎより低いと処理時間が長期化する傾向がある。一方、１０００ｍｍ／ｍｉｎより高いと、洗浄液の流水圧により、コロニー形成が可能な骨再生関連細胞が細胞分離器１から流出する可能性がある。
【０１９３】
しかし、上記線速範囲であれば、処理時間が長期化することなく、また、コロニー形成が可能な骨再生関連細胞を細胞分離器１から流出させることなく、細胞分離器１中に溜まっている夾雑物を、細胞分離器１から流出させることができる。
【０１９４】
上記洗浄工程において、細胞分離器１に注入する洗浄液の量は、特に限定されるものではなく、細胞分離器１の容積に応じて適宜変更すればよい。具体的には、細胞分離器１の容積の１倍量〜１００倍量の洗浄液を注入することが好ましく、１０倍量〜１００倍量の洗浄液を注入することがより好ましい。
【０１９５】
上記の量の洗浄液を注入すれば、最終的に得られる骨再生組成物を治療用として人体に投与する場合であっても、人体に悪影響を与えない程度にまで、夾雑物を除去することができる。
【０１９６】
〔細胞回収工程〕
上記細胞回収工程では、骨再生関連細胞含有試料を注入した方向とは逆方向から、回収用シリンジ５を用いて、細胞分離器１に細胞回収液を注入する。これにより、細胞分離器１に捕捉された骨再生関連細胞を、細胞分離器１から流出させることができる。こうして細胞分離器１から流出した骨再生関連細胞を含む細胞回収液は、混合容器６に回収することができる。
【０１９７】
上記細胞回収液は、特に限定されるものではなく、細胞に対して負の影響を与えない溶液であればよい。具体的に、例えば、生理的食塩液やリンゲル液など注射用剤として一般的に用いられる溶液、リン酸緩衝液等の緩衝液、αＭＥＭ培地やＤＭＥＭ培地等の細胞培養用の培地等を挙げることができる。
【０１９８】
これら例示した溶液の中でも、細胞への負の影響が小さいことから、細胞培養用培地や生理食塩水を好ましく用いることができる。
【０１９９】
また、上記細胞回収液には、細胞保護の観点から、タンパク質を添加しても良い。上記タンパク質は特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、血漿、血清、アルブミン等を挙げることができる。
【０２００】
さらに、上記細胞回収液には、粘張度を上げるための物質を添加してもよい。上記物質は特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、アルブミン、フィブリノーゲン、グロブリン、デキストラン、ヒドロキシエチルスターチ、ヒドロキシエチルセルロース等を挙げることができる。
【０２０１】
このような物質を添加することにより、細胞分離器１に捕捉された骨再生関連細胞の回収率を向上させることができる。
【０２０２】
上記細胞回収工程において、細胞分離器１に細胞回収液を注入（換言すれば、通液）する注入速度は、特に限定されなく、細胞分離器１の形態に応じて適した注入速度とすればよいが、可能な範囲で、高速で注入することが好ましい。
【０２０３】
具体的には、例えば、細胞分離材の厚さに対する細胞回収液の通過速度（線速）として、５０ｃｍ／ｍｉｎ〜１０００ｃｍ／ｍｉｎとすることが好ましく、１００ｃｍ／ｍｉｎ〜５００ｃｍ／ｍｉｎとすることがより好ましい。
上記流速範囲によれば、骨再生関連細胞の回収率を向上させることができる。
【０２０４】
このような線速範囲で、細胞分離器１に対して細胞回収液を注入する場合、例えば、細胞回収液入れた回収用シリンジ５のプランジャーを、手や機械を用いて勢いよく押すことにより上記線速を実現することができる。
【０２０５】
上記細胞回収工程において、細胞分離器１に注入する細胞回収液の量は、特に限定されるものではなく、細胞分離器１の容積に応じて適宜変更すればよい。具体的には、細胞分離器１の容積の１倍量〜１００倍量の細胞回収液を注入することが好ましく、１０倍量〜１００倍量の細胞回収液を注入することがより好ましい。
【０２０６】
上記の量の細胞回収液を注入すれば、細胞分離器１に捕捉された骨再生関連細胞を確実に、回収することができる。
【０２０７】
本発明にかかる骨再生組成物の製造方法では、上記細胞回収工程において、回収した骨再生関連細胞を増幅させる必要はなく、むしろ、回収した骨再生関連細胞を増幅させないことが好ましいが、該骨再生関連細胞を増幅させることを妨げるものではない。すなわち、本発明にかかる骨再生組成物の製造方法では、上記細胞回収工程において、上記骨再生関連細胞を増幅させてもよい。
【０２０８】
具体的には、例えば、上記細胞回収液として、Dulbecco ＭＥＭ培地（日水）、α−ＭＥＭ培地（GIBCO BRL社製）、ＭＥＭ培地（日水）、ＩＭＥＭ培地（日水）、ＲＰＭＩ−１６４０培地（日水）等の培養培地を用いて、骨再生関連細胞を混合容器６に回収し、混合容器６内で骨再生関連細胞を接着または増殖させることにより、骨再生関連細胞を増幅させることができる。
【０２０９】
また、上記培養培地には、必要に応じて血清を５％〜２０％の濃度で添加してもよい。
【０２１０】
骨再生関連細胞を培養により増幅させる場合、培養条件は、特に限定されるものではなく、骨再生関連細胞の種類に応じて適宜設定すればよい。例えば、温度３７℃、ＣＯ２ガス５％の雰囲気下で培養することができる。
【０２１１】
〔混合工程〕
上記混合工程では、上記細胞回収工程後、混合容器６において、骨再生関連細胞と支持体７とを混合する。
【０２１２】
本発明では、上記混合工程において骨再生関連細胞と支持体７とを混合する前もしくは後に、混合容器６内で骨再生関連細胞を濃縮することが好ましい。このような構成によれば、最終的に得られる骨再生組成物を移植に用いる場合、移植に用いる骨再生組成物の体積を、疾患部の大きさに合わせた体積に容易に調整することができる。
【０２１３】
混合容器６内で骨再生関連細胞を濃縮する方法は、特に限定されるものではないが、＜Ｉ．骨再生組成物製造器具＞で説明した方法で濃縮することができる。
【０２１４】
混合容器６内で、骨再生関連細胞と支持体７とを混合する方法は、特に限定されるものではなく、混合容器６の形態に応じて、実質的に骨再生関連細胞と支持体７とを混合できる方法を適宜選択して用いればよい。
【０２１５】
具体的には、例えば、（１）加圧や引圧を与えることにより、骨再生関連細胞と支持体７とを混合する方法、（２）液を加えて、骨再生関連細胞と支持体７とを混合する方法、（３）骨再生関連細胞と支持体７とのチャージを利用して電気的に骨再生関連細胞と支持体７とを混合する方法、（４）振動を与えることにより、骨再生関連細胞と支持体７とを混合する方法等が挙げることができる。
【０２１６】
より具体的に説明すると、上記（１）の方法において加圧する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、シリンジにより空気を介して押圧したり、混合容器６自体を手で押圧したりすることにより、加圧することができる。また、引圧する方法についても特に限定されるものではないが、例えば、シリンジやポンプを用いて引圧することができる。
【０２１７】
また、上記（２）の方法では、例えば、顆粒状の支持体７が入った混合容器６に、細胞分離器１から流出された細胞懸濁液（すなわち、細胞回収液に骨再生関連細胞が懸濁された細胞懸濁液）を、混合容器６の上部から滴下することによって、該細胞懸濁溶液中で支持体７と骨再生関連細胞とを混合させることができる。
【０２１８】
上記（３）の方法では、例えば、支持体７を正に帯電させることにより、骨再生関連細胞は負に帯電しているため、互いに静電的に引き付けあって、支持体７と骨再生関連細胞とを混合することができる。
【０２１９】
上記（４）の方法で、振動を与える方法は特に限定されるものではないが、例えば、手動で、または機械的に容器に振動を与えることができる。
【０２２０】
本発明にかかる骨再生組成物の製造方法は、上説した構成を備えているため、骨再生関連細胞と、支持体とを少なくとも含む骨再生組成物を製造することができる。
【０２２１】
また、本発明では、上記混合工程において、混合容器６内で骨再生関連細胞を濃縮することができるため、骨再生関連細胞の細胞濃度が高い骨再生組成物を製造することができる。
【０２２２】
具体的には、支持体１００ｍｇに対して、１個〜５×１０９個の骨再生関連細胞を含むことが好ましく、５０個〜５×１０８個の骨再生関連細胞を含むことがより好ましく、１×１０２個〜５×１０８個の骨再生関連細胞を含むことがさらに好ましい。
【０２２３】
上記骨再生関連細胞と支持体との混合割合が、上記範囲内であれば、骨再生関連細胞と支持体とを均一に混合することができる。
【０２２４】
また、上記骨再生組成物は、支持体１００ｍｇに対して、１×１０５個〜５×１０９個の有核細胞を含むことが好ましく、１×１０６個〜５×１０８個の有核細胞を含むことがより好ましい。上記有核細胞とは、核を有する細胞が意図され、具体的には、例えば、リンパ球、単球等に代表される単核球、および顆粒球に代表される多核球を挙げることができる。
【０２２５】
このような骨再生組成物によれば、特別の操作をすることなく、そのまま、骨再生治療のための移植に用いることができる。
【０２２６】
また、本発明にかかる骨再生組成物の製造方法は、本発明にかかる骨再生組成物製造器具を用いて好適に実施できるものである。つまり、本発明にかかる骨再生組成物製造器具によれば、１重量部の支持体に対して、少なくとも、０．１重量部〜１０重量部の骨再生関連細胞の細胞懸濁液を含む骨再生組成物を製造することができる。
【０２２７】
したがって、本発明には、本発明にかかる骨再生組成物の製造方法、または本発明にかかる骨再生組成物製造器具で製造された骨再生組成物も含まれる。
【０２２８】
さらに、本発明にかかる骨再生組成物は、骨再生治療のための移植に用いることができるため、本発明にかかる骨再生組成物を用いて骨を再生させる骨再生方法も含まれる。
【０２２９】
なお、本発明にかかる骨再生方法は、本発明にかかる骨再生組成物を用いて骨を再生させるものであればよい。その他の具体的な構成は特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いればよい。
【０２３０】
なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【０２３１】
本発明について、実施例、比較例、および図４〜図１０に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者は本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更、修正、および改変を行うことができる。
【０２３２】
〔実施例１：骨再生組成物製造器具による赤血球および不要白血球の除去〕
図１に示す骨再生組成物製造器具を作製し、該骨再生組成物製造器具を用いて骨髄液を処理したときの赤血球の除去率、および白血球の回収率を測定した。
【０２３３】
なお、細胞分離器１としては、フィルター構造をもつ不織布を容器に充填したカラム（φ２０ｍｍ×長さ８０ｍｍ、容積１ｃｍ３）を用いた。また、混合容器６には、支持体が配置されていない容器を用いた。
【０２３４】
具体的には、まず、ビーグル犬の腸骨から骨髄液１０ｍｌを採取した。そして、この骨髄液１０ｍｌに含まれる赤血球数および白血球数を測定した。その結果、図４に示すように、骨髄液１０ｍｌ中の白血球の総数は、４２９×１０６ｃｅｌｌｓであった。また、骨髄液１０ｍｌ中の赤血球の総数は、７２×１０９ｃｅｌｌｓであった。なお、図４中、処理前の欄に記載している。
【０２３５】
次に、上記骨再生組成物製造器具の洗浄用シリンジ４を用いて、３０ｍｌのＰＢＳを細胞分離器１に注入し、プライミング処理を行った。続いて、上記骨髄液１０ｍｌを、３ｍｌ／ｍｉｎの流速で試料注入用シリンジ２を用いて細胞分離器１に注入した。
【０２３６】
骨髄液の注入後、洗浄用シリンジ４を用いて、１０ｍｌのＰＢＳ（洗浄液）を、３ｍｌ／ｍｉｎの流速で、細胞分離器１に注入した。これにより、不要細胞の洗浄を行った。
【０２３７】
洗浄後、回収用シリンジ５を用いて、３０ｍｌのＤＭＥＭ培地（細胞回収液）を細胞分離器１に注入した。こうして混合容器６に、間葉系幹細胞を含むＤＭＥＭ培地３０ｍｌを回収した。
【０２３８】
得られた間葉系幹細胞を含む細胞回収液３０ｍｌについて、赤血球数および白血球数を測定した。その結果、図４に示すように、白血球の総数は、５６×１０６ｃｅｌｌｓであった。また、赤血球の総数は、１．３２×１０９ｃｅｌｌｓであった。なお、図４中、処理後の欄に記載している。
【０２３９】
以上の結果に基づき、上記骨再生組成物製造器具による赤血球の除去率および白血球の回収率を算出した。その結果、図４に示すように、白血球の回収率は１３．１％、赤血球の除去率は９８．２％であった。
【０２４０】
なお、赤血球の除去率および白血球の回収率は、図４にも示すように、以下の計算式を用いて算出した。
白血球回収率（％）＝処理後白血球総数／処理前白血球総数×１００
赤血球除去率（％）＝１００−処理後赤血球総数／処理前赤血球総数×１００。
【０２４１】
〔実施例２：骨再生組成物製造器具の性能評価〕
骨髄液に、３ｍｌの市販ヒト骨髄液（株式会社ベリタス）を用いた以外は、実施例１と同様の方法でデバイス処理を行った。このときの処理前骨髄液３ｍｌに含まれる赤血球数および白血球数を測定した。
【０２４２】
その結果、骨髄液３ｍｌ中の白血球の総数は、４５×１０６ｃｅｌｌｓであった。また、骨髄液３ｍｌ中の赤血球の総数は、１０×１０９ｃｅｌｌｓであった。
【０２４３】
次に、得られた間葉系幹細胞を含む細胞回収液３０ｍｌについて、赤血球数および白血球数を測定した。その結果、白血球の総数は、６×１０６ｃｅｌｌｓであった。また、赤血球の総数は、０．０５×１０９ｃｅｌｌｓであった。つまり、白血球の回収率は、１３．３％、赤血球の除去率は、９９．５％であった。
【０２４４】
コントロールとして、Ｆｉｃｏｌｌを用いた密度勾配遠心（Ｆｉｃｏｌｌ法）により調製した間葉系幹細胞を含むＤＭＥＭ培地（以下、「コントロール細胞懸濁液」と称する）を用いた。
【０２４５】
なお、コントロール細胞懸濁液の調製は、以下の手順により行った。まず、上記骨髄液３ｍｌに、１ｍｌのＰＢＳを添加した。次に、遠心管に入られた３ｍｌのＦｉｃｏｌｌ（Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅＰＬＵＳ）上に、上記ＰＢＳで希釈した骨髄液４ｍｌを、界面を乱さないように注意深く積層した。
【０２４６】
その後、１８℃〜２０℃で、１４００ｒｐｍ、３０分間遠心分離を行った。その結果、上記骨髄液は、下層から順に、顆粒球および赤血球の層、Ｆｉｃｏｌｌ層、単核球および血小板の層（以下、「単核球層」ともいう）、および血漿の層が積層されるように分離した。
【０２４７】
上記層のうち、単核球層を採取した。採取した単核球に１０ｍｌのＰＢＳを加え、再懸濁した。そして、この懸濁液を、１８℃〜２０℃で、１５００ｒｐｍ、１０分間遠心分離を行った。
【０２４８】
遠心分離後、上清を取り除き、再び、沈殿を１０ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、上記条件で遠心分離を行うとの操作を繰り返し行った。こうして得られた細胞をＤＭＥＭ培地３０ｍｌに懸濁し、コントロール細胞懸濁液とした。
【０２４９】
なお、デバイスを用いた方法では、骨再生組成物は、５分間で調製することができたが、上記コントロール細胞懸濁液の調製には、９０分もの長時間を要した。つまり、本発明にかかる方法によれば、従来法と比較して、より短時間で間葉系幹細胞を分離することができた。
【０２５０】
上記間葉系幹細胞懸濁液および上記コントロール細胞懸濁液における間葉系幹細胞数は、以下の手順により行った。具体的には、細胞回収液の半量である１５ｍｌをＴ−７５フラスコに播種し、３７℃条件下で８日間培養を行った。培養後、培地を除き、クリスタルバイオレット染色を行い、コロニー数をカウントした。ここで、出現したコロニー数を間葉系幹細胞数とした。
【０２５１】
その結果、図５（ａ）に示すように、上記間葉系幹細胞懸濁液（図５（ａ）中、デバイスと記載）１５ｍｌ中には、１６９個の間葉系幹細胞が含まれていた。一方、コントロール細胞懸濁液（図５（ａ）中、Ｆｉｃｏｌｌと記載）１５ｍｌ中には、８８個の間葉系幹細胞が含まれていた。
【０２５２】
上記間葉系幹細胞懸濁液およびコントロール細胞懸濁液における各細胞のマーカーの検出は、以下の手順により行った。具体的には、まず、上記と同様に調製した培養細胞を酵素処理によって回収した（以下、回収培養細胞という）。次に、回収培養細胞を１×１０５個ずつ８本に分注し、そこへ下記抗体を１０μＬ添加した。これをサンプルとし、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ベクトンディッキンソン）にて陽性率を測定した。
【０２５３】
その結果、図５（ｂ）に示すように、回収培養細胞（図５（ｂ）中、デバイスと記載）では、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、およびＣＤ１６６の全ての間葉系幹細胞マーカーを９０％以上の陽性率で検出できた。一方、コントロール回収培養細胞（図５（ｂ）中、Ｆｉｃｏｌｌと記載）では、ＣＤ１６６の陽性率が８０％以下と低かった。
【０２５４】
なお、血管内皮細胞マーカーであるＣＤ３１、造血幹細胞マーカーであるＣＤ１３３およびＣＤ３４、並びに白血球マーカーであるＣＤ４５の陽性率は、回収培養細胞およびコントロール回収培養細胞のいずれにおいても４％以下と低かった。
【０２５５】
このように、本発明にかかる方法によれば、従来法と比較して、より効率よく間葉系幹細胞を分離できることが明らかとなった。
【０２５６】
さらに、上記回収培養細胞を用いて、管腔形成能、骨分化能の測定、および軟骨分化能の評価を行った。
【０２５７】
管腔形成能は、上記回収培養細胞をＭｅｄｉｕｍ１９９培地に懸濁し、以下因子を所定濃度となるように細胞懸濁液に添加した（３％  ＦＢＳ、５０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ  ｂ−ＦＧＦ）。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて前記細胞懸濁液を培養することにより評価した。その結果を図５（ｃ）に示す。
【０２５８】
また、骨分化能は、まず上記回収培養細胞をαＭＥＭ培地に懸濁し、１２ＷＥＬＬ組織培養用プレートに播種し、２４時間培養を行った。次に、以下因子を所定濃度となるようにαＭＥＭ培地に添加し骨分化誘導培地を調製した（１５％  ＦＢＳ、１０ｍＭ  β−ＧＰ、０．１ｍＭ  デキサメサゾン、５０μｇ／ｍｌ  アスコルビン酸）。２４時間培養後、培地を骨分化誘導培地細胞に交換してさらに培養を続け、アリザリン染色することにより評価した。その結果を図５（ｄ）に示す。
【０２５９】
さらに、軟骨分化能は、まず上記回収培養細胞をＤＭＥＭ培地に懸濁し、遠心分離を行うことによってペレットを調製した。次に、以下因子を所定濃度となるようにＤＭＥＭ培地に添加し、軟骨分化誘導培地を調製した（０．１ｍＭ  デキサメサゾン、５０μｇ／ｍｌ  アスコルビン酸、６．２５ｎｇ／ｍｌ  インシュリン、６．２５ｎｇ／ｍｌ  トランスフェリン、６．２５ｎｇ／ｍｌ  亜セレン酸、１．２５ｍｇ／ｍｌ  ウシ血清アルブミン、５．３５ｍｇ／ｍｌ  リノレン酸、１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−β３、４０μｇ／ｍｌ  プロリン）。ペレットの上清を除いた後、軟骨分化誘導培地を添加して培養し、細胞をアルシアンブルー染色することにより評価した。その結果を図５（ｅ）に示す。
【０２６０】
その結果、図５（ｃ）〜（ｅ）に示すように、上記間葉系幹細胞懸濁液に含まれる間葉系幹細胞は、管腔形成能、骨分化能、および軟骨分化能ともに有していた。
【０２６１】
以上の結果、本発明にかかる骨再生組成物製造器具によれば、管腔形成能、骨分化能、および軟骨分化能をともに有する間葉系幹細胞を迅速に分離できることが明らかとなった。
【０２６２】
〔実施例３：骨再生組成物製造器具により分離された間葉系幹細胞の特性評価〕
実施例１と同一の方法を用いて、２匹のビーグル犬からそれぞれ間葉系幹細胞を分離した。それぞれのビーグル犬から分離した間葉系幹細胞を含むＤＭＥＭ培地を、それぞれ３枚ずつのシャーレ（φ６０ｍｍ）上に、１枚あたりの細胞数が２×１０４個となるように播いて、３７℃で２週間培養した。その後、形成されたコロニー数を計測し、３枚のシャーレの平均値を算出した。
【０２６３】
なお、コントロールには、実施例２と同一の方法を用いて、２匹のビーグル犬からそれぞれ採取した骨髄液から調製したコントロール細胞懸濁液を用いた。
【０２６４】
その結果、図６（ａ）および（ｂ）に示すように、本発明の骨再生組成物製造器具により分離された間葉系幹細胞（図６中、「デバイス」と記載）は、コントロール細胞懸濁液中の間葉系幹細胞（図６中、「Ｆｉｃｏｌｌ」と記載）よりも、コロニー形成能が高かった。
【０２６５】
次に、骨再生組成物製造器具を用いて分離した間葉系幹細胞の形態を顕微鏡で観察した。具体的には、１匹のビーグル犬より骨髄液を採取し、前記したコロニー形成能と同様の方法で培養細胞を調製した。該培養細胞を経時的（播種８日後、１０日後、１６日後）に位相差顕微鏡で観察し、写真撮影を行った。観察時の顕微鏡の倍率は１００倍であった。
【０２６６】
その結果、図７に示すように、本発明の骨再生組成物製造器具により分離された間葉系幹細胞（図７中、「デバイス」と記載）は、コントロール細胞懸濁液中の間葉系幹細胞（図７中、「Ｆｉｃｏｌｌ」と記載）と同様に、間葉系幹細胞として正常の形態を有していた。
【０２６７】
さらに、骨再生組成物製造器具を用いて分離した間葉系幹細胞の増殖能を調べた。具体的には、１匹のビーグル犬より骨髄液を採取し、前記したコロニー形成能と同様に培養細胞を調製した。該培養細胞を酵素処理によって一度回収し、４枚のシャーレ（φ６０ｍｍ）に３×１０４個となるように播種した。播種後、経時的（２４、７２、１２０、１６８時間後）にシャーレ上の細胞を酵素処理によって回収し、血球計算盤にて細胞数を計測することで、経時的な細胞数の推移を観察した。
【０２６８】
その結果、本発明の骨再生組成物製造器具により分離された間葉系幹細胞（図７中、「デバイス」と記載）は、コントロール細胞懸濁液中の間葉系幹細胞（図７中、「Ｆｉｃｏｌｌ」と記載）とほぼ同様の増殖曲線を描いた。
【０２６９】
具体的には、培養開始後約７２時間で対数増殖期に入り、培養開始後約１２０時間で定常期に達した。
【０２７０】
〔実施例４：イヌ骨壊死モデルの骨修復〕
（１）骨壊死モデルの作製
体重１３ｋｇ、２４月齢のビーグル犬の両前肢を背側より展開し、月状舟状骨を同定した。同骨骨皮質を開窓し、内部の海綿骨を可及的に除去した。作製した欠損部に液体窒素を満たし、その後１０分間室温で解凍した。この処置を３回繰返し、骨壊死モデルを作製した。
【０２７１】
（２）骨髄液の採取
骨壊死を作製したイヌの腸骨より骨髄液を１０ｍｌ採取した。
【０２７２】
（３）移植細胞画分の調製
直径２０ｍｍの筒状ポリカーボネートの中にレーヨンとポリオレフィンからなる不織布（直径１８ｍｍ、目開き：５μｍ〜４８μｍ）を２４枚積層し、この積層不織布をポリカーボネートのストッパーにて挟み込み、細胞分離材とした。
【０２７３】
この細胞分離材に、線速１．６ｍｍ／ｍｉｎの速度で採取した骨髄液を１０ｍｌ通液した。同方向から生理食塩水を線速１．６ｍｍ／ｍｉｎの速度で１０ｍｌ通液し、細胞分離材を洗浄した。
【０２７４】
次に、牛胎児血清１０％を含む細胞培養液(ＤＭＥＭ培地) ３０ｍｌを、骨髄液を流した方向と逆方向から勢いよく流すことにより、目的とする細胞画分を回収した。
【０２７５】
回収した細胞画分を遠心分離した後、上清を除きＰＢＳ１００μＬを添加した。この細胞懸濁液をβ−ＴＣＰ（β−リン酸三カルシウム）０．１６ｇの入った封入体に流入させて混合し、移植細胞画分（骨再生組成物）とした。
【０２７６】
（４）移植細胞画分（骨再生組成物）の移植
上記（１）で作製した骨壊死部の片足側に調製した移植細胞画分（骨再生組成物）を注入し、この足を（実施例１）とした。反対側足の骨壊死部にβ−ＴＣＰ（β−リン酸三カルシウム）０．１６ｇの入った封入体のみを注入し、この足を（比較例１）とした。各足共に、軟部組織及び皮膚を縫合し手術を終了した。そして、移植２８日後にマイクロＣＴ（SMX-100CT-SV3type, Shimazu）にて骨形成量を測定した。
【０２７７】
その結果、図９（図中、比較例１はβＴＣＰ  ｏｎｌｙと記載、実施例１はβＴＣＰ＋ＭＳＣと記載）に示すように、骨量−骨体積比（全容積に占める骨の割合）が、実施例１では０．７２であるのに対して、比較例１では、では０．６３であった。
【０２７８】
このことから、上記移植細胞画分（骨再生組成物）によれば、骨形成が促進することが明らかとなった。
【０２７９】
また、図９および図１０（ｂ）（図中、比較例１はβＴＣＰ  ｏｎｌｙと記載、実施例１はβＴＣＰ＋ＭＳＣと記載）に示すように、比較例１では明らかな月状舟状骨の圧潰を認めた。
【０２８０】
さらに、病理組織学的には実施例１では比較例１に比べ、骨壊死部の破骨細胞、及び骨芽細胞の浸潤が多く、良好な骨組織の再生が確認された。
【０２８１】
以上の結果、上記移植細胞画分（骨再生組成物）は、骨再生治療に利用可能な骨再生組成物であることが明らかとなった。
【０２８２】
なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【産業上の利用可能性】
【０２８３】
以上のように、本発明では、骨再生に関わる骨再生関連細胞を含む試料からの骨再生関連細胞の分離し、該骨再生関連細胞を培養することなく、そのまま、閉鎖系内で、支持体と混合する。そのため、骨再生治療に利用可能な骨再生組成物を簡便かつ迅速に製造することができる。したがって、本発明は、骨再生に関わる医療用途および医薬品用途に広く用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【０２８４】
【図１】図１は、本発明の一実施形態にかかる骨再生組成物製造器具を示す断片図である。
【図２】図２は、本発明の別の実施形態にかかる骨再生組成物製造器具を示す断片図である。
【図３】図３は、本発明のさらに別の実施形態にかかる骨再生組成物製造器具を示す断片図である。
【図４】図４は、本発明の実施例において、骨再生組成物製造器具による赤血球の除去率および白血球の回収率を示す図である。
【図５】図５は、本発明の実施例において、骨再生組成物製造器具の性能評価結果を示す図であり、（ａ）は分離性能を示す図であり、（ｂ）は表面抗原による間葉系幹細胞の同定結果を示す図であり、（ｃ）〜（ｅ）はそれぞれ分離された間葉系幹細胞の分化能を示す図である。
【図６】図６は、本発明の実施例において、骨再生組成物製造器具を用いて分離した間葉系幹細胞のコロニー形成能を示す図であり、（ａ）および（ｂ）はそれぞれ異なるビーグル犬から分離した間葉系幹細胞のコロニー形成能を示す図である。
【図７】図７は、本発明の実施例において、骨再生組成物製造器具を用いて分離した間葉系幹細胞の培養中の形態を顕微鏡で観察した結果を示す図である。
【図８】図８は、本発明の実施例において、骨再生組成物製造器具を用いて分離した間葉系幹細胞の増殖曲線を示す図である。
【図９】図９は、本発明の実施例において、イヌ月状骨壊死疾患モデルを用いて、骨再生組成物のｉｎ  ｖｉｖｏ治療効果を調べた結果を示す図である。
【図１０】図１０は、本発明の実施例において、イヌ月状骨壊死疾患モデルを用いて、骨再生組成物のｉｎ  ｖｉｖｏ治療効果を調べた結果を示す図であり、（ａ）は骨再生組成物の治療効果を示す図であり、（ｂ）はコントロール（β−ＴＣＰのみ）実験の結果を示す図である。
【符号の説明】
【０２８５】
１      細胞分離器（細胞捕捉部）
２      試料注入用シリンジ（試料注入部）
３      廃液バッグ（廃液回収部）
４      洗浄用シリンジ（洗浄液注入部）
５      回収用シリンジ（細胞回収液注入部）
６      混合容器（細胞回収部）
７      支持体
８      フィルター（濾過部）
９ａ    混合部（第１空間）
９ｂ    貯留部（第２空間）
２６      容器（容器部）
２７      突起部
２８      チューブ（連結部）
２９      支持体封入溶液（支持体封入部）
４７      容器（容器部）
４８      突起部
５０      支持体封入体（支持体封入部）
５１      針（連結部）
１００      骨再生組成物製造器具
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図８】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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