(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバシラス・ロイテリ細胞培養物のロイテリン産生機構の制御活性化方法であって、
前記細胞培養物を発酵させることを含む、ラクトバシラス・ロイテリ細胞培養物を製造するステップ；
製造の間にラクトバシラス・ロイテリ細胞培養物にグリセロール及びビタミンＢ１２を添加し、それによりロイテリンを産生するステップ；及び
ラクトバシラス・ロイテリの保存及び貯蔵の間にラクトバシラス・ロイテリ細胞培養物の内部で産生ロイテリンを保持するステップを含む上記方法。
【請求項２】
発酵させるステップが、発酵プロセスの終了後にグリセロールを添加するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
発酵後に、細胞培養物を凍結乾燥するステップとを更に含む、請求項１又は請求項２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
凍結乾燥の前に、細胞培養物に少なくとも１種の凍結保護剤をグリセロールと共に添加するステップを更に含む、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
製造プロセスにおいて、発酵ステップの後、凍結乾燥の前に１〜５００ｍＭのグリセロールを添加する、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ラクトバシラス・ロイテリ細胞培養物を発酵させるステップが、発酵ステップの開始時に１，２−プロパンジオール、コバルト、ビタミンＢ−１２、ビタミンＣ、グリセロール又はそれらの組み合わせの内の少なくとも１つにより細胞培養物を初回刺激するステップを含む、請求項２から５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
病原菌により誘導された障害の治療に用いるための請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法により産生された産物。
【請求項８】
皮膚系の病原菌により誘導された障害の治療に用いるための請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法により産生された産物。
【請求項９】
病原菌により誘導された障害の治療に用いるための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法により産生された産物を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養物の製造の間にグリセロール及び他の物質を添加し、保存及び貯蔵の間に細菌細胞内に産生ロイテリンを維持することによるラクトバシラス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）のロイテリン産生機構の制御活性化に関する。特に本発明は、ロイテリンが充填された大量のＬ．ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）の製造と、疾患の予防や治療等の適用、食品の適用等のためのかかる充填細菌の使用とに関する。
【背景技術】
【０００２】
原核生物の細胞は原始的であると考えられてきたが、中には、細菌細胞内部で原始的な細胞小器官としての役割を果たすと思われる微小区画（ＭＣＳ）として知られている稀な封入物を含有するものもある。カルボキシソーム（二酸化炭素の固定に関与する）は、約３０年間、微生物細胞の中で認識されてきた唯一の微小区画であった。
【０００３】
２００５年、Ｔｏｄｄ  Ｏ．Ｙｅａｔｅｓ教授及び彼の同僚は、細菌の微小区画の最初の構造的詳細を明らかにした。細菌の微小区画タンパク質の最初の高解像度の構造は、幾つかのウイルスにおいて認められるものと非常に類似した構成の仕組みを明らかにする。６個の同じタンパク質サブユニットは、共に六量体ユニットを形成し、その六量体ユニットは、シェルのための構成要素を構成する。これらの六量体ユニットは、共に密接にまとまって、小さな細孔のみを含む分子層を形成する。この密接なまとまりは、細孔を通ること以外の、微小区画内への及び微小区画からの分子の移動を制限すると思われる。
【０００４】
微生物微小区画特異的タンパク質の相同体のクラスター分析は、かかる封入物が、各種の細菌種における７つもの異なる代謝プロセスに関与し得ることを示唆する（Ｔｈｏｍａｓ  Ａ．Ｂｏｂｉｋ．２００７．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ．Ｍｉｃｒｏｂｅ．１：２５〜３１．）。細菌の微小区画の構成要素は、タンパク質及び糖タンパク質だけである。電子顕微観察（微小区画を観察するために必要）は、かかる微小区画を囲み、それらを生細胞内で唯一の公知のタンパク質系代謝区画にする脂質単層や脂質二重層（真核生物のベシクル内の）を示さない。サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、フゾバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、及びエルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）を含む細菌の属のメンバーは、それらの微小区画（１）内の１，２−プロパンジオール（１，２−ＰＤ）又はエタノールアミンを分解するために必要とされる成分を含有する。微小区画の別の性質は、Ｌ．ロイテリの場合は抗微生物性ロイテリンのように、細菌そのものに対して有毒な基質のための容器としての役割を果たすそれらの性能であると考えられる。
【０００５】
Ｂｏｂｉｋによる微小区画シェル遺伝子についてのＧｅｎＢａｎｋ探索は、細菌のゲノムの約２５％（３３７の内の８５）がシェル遺伝子相同体を含むことを示した。それらの相同体遺伝子を担持する細菌のゲノムのそれらの２５％の内のほとんどにおいて、シェル遺伝子は、微小区画関連酵素をコードする他の遺伝子とクラスター形成する。ロイテリン産生のためにコードする遺伝子と、微小区画構造のためにコードする遺伝子とが隣接することが示される。
【０００６】
２００８年５月、Ｓｒｉｒａｍｕｌｕら（Ｓｒｉｒａｍｕｌｕ  ＤＤ、Ｌｉａｎｇ  Ｍ、Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｒｏｍｅｒｏ  Ｄ、Ｒａｕｘ−Ｄｅｅｒｙ  Ｅ、Ｌｕｎｓｄｏｒｆ  Ｈ、Ｐａｒｓｏｎｓ  ＪＢ、Ｗａｒｒｅｎ  ＭＪ、Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  ＭＢ：「ラクトバシラス・ロイテリＤＳＭ２００１６は、メタボロソームにおけるコバラミン依存性ジオールデヒドラターゼを産生し、不均化により１，２−プロパンジオールを代謝する」（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ  ＤＳＭ２００１６  ｐｒｏｄｕｃｅｓ  ｃｏｂａｌａｍｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｉｏｌ  ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ  ｉｎ  ｍｅｔａｂｏｌｏｓｏｍｅｓ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｓ  １，２−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ  ｂｙ  ｄｉｓｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｔｉｏｎ．）Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ２００８，１９０（１３）：４５５９〜４５６７．）は、抗微生物剤を産生する生物であるラクトバシラス・ロイテリが、６５ｍＭの１，２−プロパンジオール（ＰＤ）と少量のグルコースとを含有する改変ＭＲＳ培地上で増殖させた際に細菌の微小区画（カルボキシソーム又はメタボロソーム）を合成する能力を有するという最初の実証を示した。前記生物は、１，２−ＰＤにより誘導されるコバラミン依存性ジオールデヒドラターゼ酵素を産生した。結合されたコバラミン合成及びｐｄｕ（プロパンジオール資化）オペロンは、Ｌ．ロイテリＤＳＭ２００１６ゲノム配列内に存在し、全ｐｄｕオペロンはＰＣＲによりＬ．ロイテリＤＳＭ２００１６の実験室株から増幅され、これによりプロパンジオール代謝生物中のその存在が確認された。しかし、６５ｍＭの１，２−ＰＤと少量のグルコースとを有する改変ＭＲＳ培地における増殖は、この培地における細菌の非常に低い増殖率のため、工業的設定に適用可能ではない。本明細書における本発明とは異なり、Ｓｒｉｒａｍｕｌｕらは、微小区画にロイテリンを充填することを可能にする細胞培養物の製造の間のグリセロールの添加について記載しない。
【０００７】
ラクトバシラス・ロイテリは、抗微生物物質３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド（ＨＰＡ）（ロイテリンとも称される）を産生することが知られている細菌である。ロイテリンの抗菌活性は、例えば米国特許第５，４３９，６７８号；第５，４５８，８７５号；第５，５３４，２５３号；第５，８３７，２３８号；及び第５，８４９，２８９号に記載されている。ロイテリンは、エシェリキア属、サルモネラ属、赤痢菌属、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、クロストリジウム属、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）を含むここまで試験された全ての細菌の属を表す種；並びに更に幾つかの真菌及び他の微生物の増殖を阻害することが可能な低分子量、中性、水溶性の化合物である。グリセロールを外部電子受容体として用いて、しかるに１，３プロパンジオールに変化させる際、ロイテリンが中間物として産生される。この反応は、グルコース等の糖類の発酵につながる際に完了する。
【０００８】
ロイテリンの産生は、前記反応を触媒する酵素グリセロール／ジオールデヒドラターゼ；複雑な経路を介して合成されるコバラミン（ビタミンＢ１２）（前記酵素の補因子）；前記酵素の再生のために用いられる因子；及び幅１００ｎｍ超であり、且つポリペプチドにより形成される微小区画構造を含む複雑な機構に依存する。この種のもの全ては、共に、必要な場合、誘導される５０超の遺伝子を含む。増殖培地への１，２−ＰＤ又はグリセロールの添加は、大量の微小区画構造の産生を初回刺激する。後期段階で細菌培養物にグリセロールを添加することにより、ロイテリンの産生がもたらされる。ロイテリンは、微小区画が前記物質を放出する準備が整うまで、微小区画の中に充填され、貯蔵され、保存される。いかなる増殖や基質（グリセロールを含む）なしで、例えば皮膚上に標準状態のＬ．ロイテリを塗布する（完全に充填された微小区画なしで）場合、ロイテリンの放出は一般にない。従って、活性化され、且つ本明細書における本発明による微小区画内に保存されるロイテリンを有するＬ．ロイテリが、ヒトの皮膚等の不毛な環境内において、食品又は他の同様の部位上において、並びにもちろんプロバイオティックスのためのより従来の塗布領域（例えばヒトを含む動物のＧＩ管、ＧＵ管、口、鼻）内において、正常且つ急速にロイテリンを放出したことは思いがけないことであった。
【０００９】
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ざ瘡プロピオンバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ）等の皮膚病原菌又は特定の酵母の増殖は、感染創と皮膚系の調節異常とに、或いは皮膚又は粘膜の一層重篤な障害（例えば、湿疹、カンジダ症、皮膚炎、膿痂疹等）につながる可能性がある。これらの病原体に対する治療の多くの手段が知られている。抗生物質又は化学的抗菌剤が、最も従来使用される。それらは、例えば、アルデヒド及び誘導体に基づく組成物である。
【００１０】
治療が経口及び／又は局所的抗生物質を含む場合、別の皮膚疾患は酒さであり、これは顔面中部３分の１に影響を及ぼし、一般に紅潮する顔面及び鼻の領域に亘って持続的な発赤を引き起こす。
【００１１】
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）及び関連のグラム陽性病原菌に起因する感染症は、増大する医学的懸念である。これらとしては、ＭＲＳＡ、メチシリン耐性表皮ブドウ球菌（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）（ＭＲＳＥ）、メチシリン耐性コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｃｏａｇｕｌａｓｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）（ＭＲＣＮＳ）が挙げられる。バンコマイシン（糖ペプチド抗生物質）は、現在のところ、これらの感染症を防止するための選択剤である。バンコマイシンの使用の増加に伴い、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）の耐性株の出現は、予想通り事実となった。従って、かかる病原菌（ＭＲＳＡ／ＶＲＳＡ）に対して有効で、同時に望ましくない副作用のない薬剤の必要性が増大している。
【００１２】
黄色ブドウ球菌は、最も一般的には鼻孔にコロニーを形成するが、気道、切開した創傷、静脈内カテーテル及び尿管も感染症の可能性のある部位である。健常人は、数週間から長年の範囲の期間、ＭＲＳＡを無症候性保菌している可能性がある。
【００１３】
治療が困難である可能性があり、且つ種々の原因がある皮膚障害の別の一例は、接触性皮膚炎であり、接触性皮膚炎は、外部の刺激／薬剤との皮膚接触により感受性がある被験者において誘発され得る。
【００１４】
皮膚障害の治療のためにラクトバシラス属を使用することは、既に本技術分野で公知であり、それは例えば米国特許出願第０５／２０１９９６号に記載されている。本発明は、ラクトバシラス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＶＲＩ−００２株等のプロバイオティクス細菌を含有する調合物を用いた皮膚障害の予防及び／又は治療の分野に関する。投与経路は、好ましくは経口である。
【００１５】
バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）等の他の細菌剤は、皮膚又は粘膜上に使用され得る。具体的には、出願ＷＯ９８／４７３７４において、バシラス属の株は、皮膚の細菌感染症、ウイルス感染症又は真菌感染症の予防を目的とした組成物において使用される。
【００１６】
しかし、先行技術に記載されている他の細菌を用いた、局所的又は他の不毛な環境におけるラクトバシラス属による治療による課題は、皮膚又は他の不毛な環境による細菌の短い生存期間である。これは、ロイテリンを分泌するために「スタンバイ」モードになっている充填微小区画を有するＬ．ロイテリを投与することによって、本明細書における本発明により解決される。従って、Ｌ．ロイテリは、死滅する前にロイテリンの分泌を達成する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、１．２ＰＤ又はグリセロールによりロイテリン産生機構を初回刺激し、その後の細胞培養物の製造プロセスにおいて、保存前の特定の時点で細菌培養物にグリセロールを添加することにより、Ｌ．ロイテリのロイテリン産生機構の活性化を制御する方法に関する。また、本発明は、製造プロセスの間のＬ．ロイテリ細菌の微小区画及びロイテリンの最適な増殖及び産生のための条件を改善するための増殖培地へのビタミンＢ１２、コバルト及びビタミンＣの添加にも関する。
【００１８】
特に、本発明は、ロイテリンが充填された大量のＬ．ロイテリ細胞の製造と、例えば疾患の予防及び治療における組成物並びに食品組成物におけるかかる調製された細菌の使用とに関する。更に具体的には、これらの組成物は、皮膚系の病原菌により誘導される障害を予防又は治療する目的のために、例えば局所的にヒトに投与されることを目的とされる。また、これらの組成物は、ＭＲＳＡの治療のための経鼻適用のためにも使用され得る。本発明は、不毛な環境におけるＬ．ロイテリ細菌の増殖及び生存の必要性を回避する。
【００１９】
この点において、本発明の幾つかの実施態様を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において構成の詳細に限定されるものではなく、以下の説明に記載されるか、若しくは図面に示される成分の配列に限定されるものではないことを理解しなければならない。本発明は、他の実施態様が可能であり、各種の方法で実行し、実施することが可能である。また、本明細書において用いられる語法及び用語法は、説明の目的のためであって、限定的であるとみなされるべきでないことを理解しなければならない。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ビタミンＢ１２（上）又はコバルト（下）を有する又は有さないＢ１２−培地において静止期にまで増殖させた株ＤＳＭ１７９３８（白色棒）及びＭＭ４−１Ａ（黒色棒）からの上清中のロイテリンレベルの効果を示すグラフである。
【図２】ＭＲＳ−培地において静止期にまで増殖させた株ＤＳＭ１７９３８及びＭＭ４−１Ａの上清からのレベルの効果を示すグラフである。
【図３ａ】図３ａは、（Ａ、Ｄ）コバルト、ビタミンＢ１２無添加、（Ｂ、Ｅ）５０ｎｇ／ｍｌのコバルト、（Ｃ、Ｆ）１μｇ／ｍＬのビタミンＢ１２による、上清中のロイテリンレベルと、ＭＲＳにおいて静止期にまで増殖させた株ＭＭ４−１Ａの生存率とに対する１，２−ＰＤの添加の効果を示すグラフである。黒色棒は、１，２−ＰＤの無添加を示す。白色棒は、６５ｍＭの１，２−ＰＤの添加を示す。灰色棒は、２００ｍＭの１，２−ＰＤの添加を示す。生存率を、２００ｍＭのグリセロール／水溶液において細胞のインキュベーションの前（０時間）及び後（２時間）に測定した。
【図３ｂ】図３ｂは、１μｇ／ｍＬのビタミンＢ１２の添加による、上清中のロイテリンレベルと、Ｂ１２−培地において静止期にまで増殖させた株ＤＳＭ１７９３８の生存率とに対する１，２−ＰＤの添加の効果を示すグラフである。黒色棒は、１，２−ＰＤの無添加を示す。白色棒は、６５ｍＭの１，２−ＰＤの添加を示す。灰色棒は、２００ｍＭの１，２−ＰＤの添加を示す。生存率は、２００ｍＭのグリセロール／水溶液において細胞のインキュベーションの前（０時間）及び後（２時間）に測定された。
【図４】透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いたＭＣＳの視覚化である。株ＤＳＭ１７９３８（Ａ）及びＭＭ４−１Ａ（Ｂ）を、ＭＲＳにおいて増殖させた。株ＤＳＭ１７９３８（Ａ）及びＭＭ４−１Ａ（Ｂ）を、ビタミンＢ１２（１μｇ／ｍＬ）及び２００ｍＭの１，２−ＰＤの添加によりＭＲＳにおいて増殖させた。白色の矢印は、細菌内に形成されたＭＣＳを示す。
【図５ａ】図５ａは、２００ｍＭのグリセロール水溶液に４５分間曝露した後のＭＭ４−１Ａ細胞の上清中のロイテリンレベルの効果を示す。細菌を、２００ｍＭの１，２−ＰＤ、２００ｍＭのグリセロールの添加又は何も添加しない場合によるＢ１２−培地（５０ｎｇ／ｍＬのコバルト）において増殖させた。
【図５ｂ】図５ｂは、２００ｍＭのグリセロール水溶液に４５分間曝露した後のＭＭ４−１Ａ細胞の上清中のロイテリンレベル（上図）の効果を示す。下図は、２００ｍＭのグリセロール水溶液に４５分間曝露した後の細胞ペレットに関連するロイテリンレベルの効果を示す。細菌を、ＭＲＳ（１）、１μｇ／ｍＬのビタミンＢ１２を添加したＭＲＳ（２）、１μｇ／ｍＬのビタミンＢ１２と２００ｍＭの１，２−ＰＤとを添加したＭＲＳ（３）、１μｇ／ｍＬのビタミンＢ１２と２００ｍＭのグリセロールとを添加したＭＲＳ（４）、１μｇ／ｍＬのビタミンＢ１２と５００ｍＭのグリセロールとを添加したＭＲＳにおいて増殖させた。
【図６】細胞を洗浄し、２００ｍＭのグリセロール／水溶液に４５分間曝露した後のＭＭ４−１Ａ細胞に関連する検出物質のＭＡＳ−ＮＭＲ顕微鏡図（上）である。細胞を、１μｇ／ｍＬのビタミンＢ１２と２００ｍＭのグリセロールとを添加したＭＲＳにおいて増殖させた。矢印は、３−ＨＰＡにおけるアルデヒド基を指す。下の図は、ロイテリン産生に関連する物質を示す。アステリクスで示された物質は、ＭＡＳ−ＮＭＲを用いて検出された。
【図７】スクロースの存在がロイテリン産生を妨げなかったことを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
プロバイオティックスとして使用されるＬ．ロイテリ培養物は、グリセロールの非存在下で培養され、その後凍結乾燥される。それらの細菌において、ロイテリン産生のために使用される機構は活性化されなかったが、好ましい条件下では、系は、細菌がグリセロールと接触した後３０〜６０分間活性となる可能性がある。好ましくない条件下では、この活性化は、非常により長い時間がかかる可能性があるか、又は全く起こらない。
【００２２】
ロイテリンの急速な産生を伴うＬ．ロイテリ含有産物が求められるか、又はＬ．ロイテリの増殖のための条件が好ましくない適用において、Ｌ．ロイテリ培養物は、培養物の製造の間のグリセロールの存在により改良され得る。グリセロール（１〜５００ｍＭ）は、発酵ステップの間に添加され得るか、又はそれは、発酵及び可能な洗浄の後で、凍結乾燥の前の前記ステップの際に凍結保護剤と共に添加され得る。Ｌ．ロイテリの微小区画の形成を含むロイテリン産生機構は、発酵の開始時に１．２ＰＤ又はグリセロールによりロイテリン産生機構を初回刺激することにより改良され得る。
【００２３】
細胞培養産物は幾つかの方法で製造され得るが、その方法としては、以下の３つの異なる方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２４】
１．Ｌ．ロイテリ細胞を含有する凍結乾燥産物により、製造方法の発酵ステップ終了後、凍結乾燥ステップの前にグリセロールをロイテリンに転化させる。この方法で調製された産物は、凍結乾燥細胞と、前記細胞の中及び周囲の両方にロイテリンとを含有する。この製造設計については、凍結乾燥細菌にロイテリンが充填される。
【００２５】
２．１と同様に、しかし、発酵の開始時に１．２ＰＤ又はグリセロール並びに可能な場合コバルト又はビタミンＢ−１２により細菌のロイテリン産生機構を初回刺激する。この製造設計については、凍結乾燥細菌に両方のロイテリンが充填され、その凍結乾燥細菌が、ロイテリンを製造して貯蔵する能力により初回刺激される。
【００２６】
３．Ｌ．ロイテリ細胞を含有する凍結乾燥産物により、発酵及び可能な洗浄ステップの後、凍結乾燥ステップの前に、３７℃で約３０〜４５分間グリセロールを添加し、次いでロイテリン産生を可能にすることでグリセロールをロイテリンに転化させる。ロイテリンの形成のためのグリセロールの添加は、例えば凍結保護剤と共に行うことが可能である。細菌のロイテリン産生機構は、発酵ステップの開始時に１．２ＰＤ又はグリセロールにより初回刺激される。方法２に関連する製造設計３の利点は、方法３が、多くの工業的製造構成における使用により良好に適しており、ロイテリン形成のより良好な制御を可能にすることができるということである。
【００２７】
増殖培地への１，２−ＰＤ又はグリセロールの添加は、生存率及びＭＣＳ形成の両方に影響を及ぼす。プロピオンアルデヒドへの１，２−ＰＤの転化の原因である酵素複合体ＰｄｕＣＤＥは、ロイテリンへのグリセロールの転化の原因でもあり、それは、細菌が１，２−ＰＤの存在下で増殖する際に形成されるＭＣＳが、細菌がグリセロールと接触し且つロイテリンの更なる代謝のための手段を欠く（即ち、細菌が静止期にあるか、又は水溶液中のグリセロールに曝露される）場合にロイテリンの産生のための工場として働くことも可能であるという可能性を切り開く。ＭＣＳにおいて形成されるロイテリンは、ＭＣＳがない細胞よりも大きな量の細胞の中で保持される。このことは、即ち凍結乾燥の前にロイテリンを細菌に「充填」することを可能にする。
【００２８】
我々は、ＳｒｉｒａｍｕｌｕらがＤＳＭ２００１６株について観察したものを、我々のＭＭ４−１Ａ株及びＤＳＭ１７９３８株により繰り返した。しかし、６５ｍＭの１，２−ＰＤ及び少量のグルコースを有する改変ＭＲＳ−培地における増殖は、この培地における細菌の非常に低い増殖率のため工業的設定に適用可能ではない。我々は、その代わりに、非改変ＭＲＳ培地に２００ｍＭの１，２−ＰＤと１ｕｇ／ｍＬのビタミンＢ１２とを添加し、細菌が３７℃で２４時間の増殖の後で可視のＭＣＳを産生するかを試験した（視覚化のための電子顕微観察を使用する）。ＭＭ４−１Ａ株及びＤＳＭ１７９３８株の両方は、これらの条件の下でＭＣＳを産生した（図４）。
【００２９】
１，２−ＰＤと同様にグリセロールはＰｄｕＣＤＥと称される同じ酵素複合体により代謝されるが、従って、１，２−ＰＤについて認められるものと同様に細菌の中でＭＣＳの形成を誘導するためにグリセロールを使用することも可能である。２００ｍＭのグリセロール又は１，２−ＰＤのいずれかにおけるＭＭ４−１Ａ株の増殖は、細菌が水溶液中のグリセロールに１時間未満曝露された後、ロイテリン形成及び細菌細胞ペレットへのその会合に達した際に同じように働く細胞を産生する（図５ａ及び５ｂ）。
【００３０】
ペレットの洗浄に加えて（上記（図５ｂ）参照）、我々は、ＭＡＳ−ＮＭＲを用いてロイテリン含有率についての洗浄細胞ペレットの試験をも行った。次いで、ＭＭ４−１Ａ株を、Ｂ１２（１ｕｇ／Ｌ）と２００ｍＭの１，２−ＰＤとが添加されたＭＲＳ−培地において静止期にまで増殖させた。増殖後、細菌を、水溶液中の２００ｍＭのグリセロールに曝露させ、３７℃で１時間インキュベートした。細胞を氷上に保持し、２００ｍＭのグリセロールを含有する重水（Ｄ２Ｏ）において２回洗浄した。最終ステップからのペレット（およそ２０μＬ湿重量）を、グリセロールを有さない２０μＬのＤ２Ｏに溶解し、ＭＡＳ−ＮＭＲを用いてロイテリン含有率について測定した。我々は、この方法を用いてロイテリンの３種の形態の内の２種と、ロイテリン及び１，２−ＰＤからの幾つかの分解産物とを検出することができた（図６ａ及び６ｂ）。
【００３１】
グリセロール及び１，２−ＰＤによる初回刺激は別として、増殖培地への特定の他の物質の添加は、細胞の生存率、ＭＣＳの形成、ロイテリンの産生、及び細菌の適合性に影響を及ぼすことを示したが、それらの物質は、例えばビタミンＢ１２、コバルト及びビタミンＣである。
【００３２】
増殖培地へのビタミンＢ１２又はコバルトの添加がＬ．ロイテリの適合性に影響を及ぼすことを示すために、ロイテリン産生とＬ．ロイテリ株ＤＳＭ１７９３８及びＭＭ４―１Ａの適合性とに関して異なる２種の増殖培地（ＭＲＳ（Ｏｘｏｉｄ）及びＢ１２アッセイ培地（Ｆｌｕｋａ））を試験した。これらの２種の増殖培地の間の主要な差は、ＭＲＳが酵母抽出物の形態で添加されたビタミンの不確定の組成物を含むのに対して、Ｂ１２アッセイ培地（以下Ｂ１２−培地と称する）が全てのビタミンの確定された組成物を有し、細菌が、それが一斉に欠いているＢ１２を除いて適切に機能する必要があることである。これらの２種の培地の間のビタミン組成物の差に関して最も顕著なことは、Ｂ１２−培地が、おそらくＭＲＳよりも幾らか大きな規模の４ｇ／ＬのビタミンＣから成ることである。
【００３３】
我々は、ビタミンＢ１２又はコバルトの添加に関して、ロイテリン、微小区画（ＭＣＳ）の形成、及び細菌の適合性をモニタするための道具としてＢ１２−培地を使用した。ビタミンＢ１２は、ロイテリンへのグリセロールの変換の原因である酵素複合体ＰｄｕＣＤＥのための必須成分である。ビタミンＢ１２分子が生物学的機能を有するために、それはコバルトイオンを必要とする。ビタミンＢ１２ではなくコバルトが培地中に存在する場合、ｃｏｂオペロンの遺伝子がコバルト含有Ｂ１２分子の形成に必須であるので、ｃｏｂオペロンの遺伝子が発現する場合にロイテリンが形成され得るだけである。ｃｏｂオペロンの発現が調節因子ＰｏｃＲを介して上流のｐｄｕオペロンの発現につながる可能性がある（Ｓａｎｔｏｓ  Ｆ、Ｖｅｒａ  ＪＬ、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｅｉｊｄｅｎ  Ｒ、Ｖａｌｄｅｚ  Ｇ、ｄｅ  Ｖｏｓ  ＷＭ、Ｓｅｓｍａ  Ｆ、Ｈｕｇｅｎｈｏｌｔｚ  Ｊ：「ラクトバシラス・ロイテリＣＲＬ１０９８の完全な補酵素Ｂ１２生合成遺伝子クラスター」（Ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ｂ１２  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｇｅｎｅ  ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ  ＣＲＬ１０９８．）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２００８，１５４（Ｐｔ  １）：８１〜９３；Ｃｈｅｎｇ  Ｓ、Ｌｉｕ  Ｙ、Ｃｒｏｗｌｅｙ  ＣＳ、Ｙｅａｔｅｓ  ＴＯ、Ｂｏｂｉｋ  ＴＡ：「細菌の微小区画：それらの特性及びパラドックス」（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｍｉｃｒｏｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ：ｔｈｅｉｒ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｐａｒａｄｏｘｅｓ．）Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  ２００８，３０（１１〜１２）：１０８４〜１０９５）ので、我々は、ＭＲＳ又はＢ１２−培地へのビタミンＢ１２又はコバルトの添加に関してロイテリン産生及び適合性を試験した。
【００３４】
株（ＤＳＭ１７９３８及びＭＭ４−１Ａ）の両方は、様々な量のビタミンＢ１２又はコバルトのいずれかを有するＢ１２−培地において培養された場合のそれらのロイテリン産生を考慮して、強い影響を受けた（図１）。このことは、直接添加されなければならないか、若しくはコバルトイオンの存在下で細菌により合成されなければならない機能性Ｂ１２分子なしでロイテリン産生が起こり得ないので、論理的である。
【００３５】
Ｂ１２−培地とは対照的に、ＭＲＳ培地は、添加された酵母抽出物がビタミンの混合物を含有するので、既に不確定量のビタミンＢ１２を含有する。普通のＭＲＳ培地において培養されたＭＭ４−１Ａ及びＤＳＭ１７９３８からの測定されたロイテリン産生は、ＭＭ４−１ＡがＤＳＭ１７９３８株と同じレベルのロイテリン産生に達しなかった文献においてより以前に報告されたものと一致した（図２）（Ｓｐｉｎｌｅｒ  ＪＫ、Ｔａｗｅｅｃｈｏｔｉｐａｔｒ  Ｍ、Ｒｏｇｎｅｒｕｄ  ＣＬ、Ｏｕ  ＣＮ、Ｔｕｍｗａｓｏｒｎ  Ｓ、Ｖｅｒｓａｌｏｖｉｃ  Ｊ：「ヒト誘導プロバイオティックラクトバシラス・ロイテリは、多様な腸内細菌性病原体を標的とする抗菌活性を示す」（Ｈｕｍａｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｅｎｔｅｒｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ．）Ａｎａｅｒｏｂｅ  ２００８，１４（３）：１６６〜１７１）。Ｂ１２−培地とは対照的に、ＭＲＳ培地へのビタミンＢ１２又はコバルトの添加によっては、ＭＭ４−１Ａ及びＤＳＭ１７９３８からのロイテリン産生の増大に関する決定的結果は得られなかった。
【００３６】
しかし、ＭＲＳ−培地へのビタミンＢ１２の添加は、ＭＭ４−１Ａ細菌の適合性に関して１，２−プロパンジオール（１，２−ＰＤ）との相乗効果を有する（図３）。ビタミンＢ１２と２００ｍＭの１，２−ＰＤとが添加されたＭＲＳにおいて培養された際のＭＭ４−１Ａ株の適合性の増大は、細菌の周囲の培地中の検出可能なロイテリンの減少と相関している（図３）。我々は、この現象が、ＭＲＳへのビタミンＢ１２及び１，２−ＰＤの添加が細菌内の微小区画（ＭＣＳ）の発生を増加させたことによるかもしれないと推測した。ＭＣＳの発生の増加により、産生ロイテリンは、細菌が有する形成ＭＣＳ内に保持された。
【００３７】
要約すれば、我々は、通常のＭＲＳへのビタミンＢ１２及び１，２−ＰＤの添加が：
【００３８】
ＭＭ４−１Ａ及びＤＳＭ１７９３８の両方において可視のＭＣＳを発生させる（図４）、ビタミンＢ１２（ｌｕｇ／Ｌ）と２００ｍＭの１，２−ＰＤとが添加されたＭＲＳにおいて増殖させたＭＭ４−１Ａについての産生ロイテリンに対する耐性を増加させる（図３）、−ビタミンＢ１２（１ｕｇ／Ｌ）と２００ｍＭの１，２−ＰＤとが添加されたＢ１２−培地において増殖させたＤＳＭ１７９３８についての産生ロイテリンに対する耐性を増加させる（図３ｂ）、ことを示した。
【００３９】
また、我々は、この方法で（又は１，２−ＰＤの代わりに添加されたグリセロールが添加により）増殖させたＭＭ４−１Ａ細菌が、細菌細胞体の中ではより大量の、外側ではより少量のロイテリンを保持することをも示した（図５ｂ）。
【００４０】
１，２−ＰＤが補充されたＭＲＳへのビタミンＢ１２の添加は、内因的に産生されたロイテリンに耐性を有するＭＭ４−１Ａの性能の増大に関する効果を有する。ビタミンＢ１２を有する増殖培地の飽和は、細菌が、１，２−ＰＤの存在下で増殖する際に機能性ＭＣＳを形成することを促進する（図３及び３ｂ）。
【００４１】
ロイテリンを含有する活性化微小区画を充填した保存Ｌ．ロイテリは、各種の組成物、典型的にはクリーム剤、ローション剤、ペースト剤、粉剤、カプセル剤、錠剤、軟膏剤、乳剤、経鼻スプレー等に調合され得る。かかる調合物は、医薬的に許容し得る担体、賦形剤、溶媒又はアジュバントを用いて公知の手段により調製され得る。かかる手法及び成分は、周知であり、標準的なテキスト及びマニュアルに詳細に記載される。
【００４２】
本発明による細菌は、例えば黄色ブドウ球菌、化膿連鎖球菌、ざ瘡プロピオンバクテリウム等の皮膚系の病原菌に関連する障害の予防又は治療を目的とする組成物或いは酵母を調製するために使用され得る。これらの皮膚障害は、特にアトピー性皮膚炎ざ瘡、カンジダ症、膿痂疹又は湿疹性二次感染であり得る。また、皮膚障害は、非細菌性の原因のもの、例えば、酒さ、乾癬、熱傷による創傷、褥瘡、及び他の治癒の遅い創傷でもあり得る。本発明による細菌は、皮膚系の病原菌により誘導される障害の治療用組成物の製造のために使用され得る。特に、前記細菌は、ＭＲＳＡの予防又は治療用組成物の製造のために使用され得る。
【００４３】
前述のことは、本発明の原理だけの例証を示すものと考えられる。更に、多くの改変及び変更が当業者にとって容易であるので、示して記載される厳密な構成及び実施に本発明を限定することが望ましくなく、従って、本発明の範囲内にある全ての適切な改変及び同等物を用いることができる。
【００４４】
また、本発明は、本明細書に記載される通りの本発明の方法により得られる産物を含む医薬組成物をも提供するものである。
【実施例】
【００４５】
（実施例１）
発酵ステップの間に活性化させたロイテリンを含有する充填微小区画を有する凍結乾燥Ｌ．ロイテリ粉剤の製造
発酵培地組成物
一水和デキストロース  ６０ｇ／Ｌ
酵母抽出物ＫＡＶ  ２０ｇ／Ｌ
ペプトン型ＰＳ（ブタ由来）  ２０ｇ／Ｌ
クエン酸水素二アンモニウム  ５ｇ／Ｌ
酢酸ナトリウム（×３  Ｈ２Ｏ）４．７ｇ／Ｌ
リン酸水素二カリウム  ２ｇ／Ｌ
Ｔｗｅｅｎ８０  ０．５ｇ／Ｌ
Ｓｉｌｉｂｉｏｎｅ（消泡剤）  ０．１４ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム  ０．１０ｇ／Ｌ
硫酸マンガン  ０．０３ｇ／Ｌ
硫酸亜鉛七水和物  ０．０１ｇ／Ｌ
水  十分量
遠心分離培地
ペプトンＯ−２４  Ｏｒｔｈａｎａ（ブタ由来）
凍結保護剤
ラクトース（ウシ由来）  ３３％
ゼラチン加水分解物（ウシ由来）  ２２％
グルタミン酸ナトリウム  ２２％
マルトデキストリン  １１％
アスコルビン酸  １１％
【００４６】
凍結乾燥ラクトバシラス・ロイテリ粉剤の製造ステップ
ワーキングセルバンクバイアルからの０．６ｍＬの凍結乾燥ラクトバシラス・ロイテリ粉剤を２０ｍＬの培地に接種する。撹拌やｐＨ調節を行わず、即ち静的に、３７℃でビンの中で１８〜２０時間発酵を行う。
【００４７】
培地の２つの１リットルフラスコに、１リットルにつき９ｍＬの細胞スラリーを接種する。撹拌やｐＨ調節を行わず、即ち静的に、３７℃で２０〜２２時間発酵を行う。
【００４８】
ステップｎｏ．２からの２つの１リットルの細胞スラリーを、６００リットルの容器に接種する。撹拌及びｐＨ調節を行いながら３７℃で１３時間発酵を行う。発酵の開始時、ｐＨは６．５である。２０％の水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨが５．４未満に低下した際にｐＨ調節を開始する。ｐＨ調節をｐＨ５．５に設定する。
【００４９】
ステップｎｏ．３からの接種による１５０００リットルの容器の中で第４及び最終発酵ステップを行う。撹拌及びｐＨ調節を行いながら３７℃で９〜１２時間発酵を行う。発酵の開始時、ｐＨは６．５である。２０％の水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨが５．４未満に低下した際にｐＨ調節を開始する。ｐＨ調節をｐＨ５．５に設定する。培養物が静止期に達する直前に、発酵の最終期において１００ｍＭのグリセロールを添加する。培養物が、水酸化ナトリウム溶液の添加の減少により認めることができる静止期に達する際、発酵は完了する。発酵の間、１０２００リットルの培地及び６００リットルの接種材料におよそ９３０リットルの水酸化ナトリウム溶液を添加する。
【００５０】
最終発酵からの細胞スラリーを、Ａｌｆａ  Ｌａｖａｌからの連続遠心分離機において１０℃で２回分離する。第１の遠心分離の後、細胞スラリーの量をおよそ１１７３０リットルから１２００リットルに減少させる。この量を、３０００リットルの容器の中で１２００リットルのペプトン（ペプトン０−２４、Ｏｒｔｈａｎａ）溶液で洗浄し、再度分離した後、凍結保護剤と混合する。ペプトンによる洗浄ステップは、凍結乾燥方法におけるあらゆる氷点低下を回避するために行う。
【００５１】
第２の遠心分離の後、細胞スラリーの量を４９５リットルに減少させる。この量を１５６ｋｇの凍結保護剤溶液と混合し、およそ６５０リットルの細胞スラリーに達する。
【００５２】
細胞スラリーを１０００リットルの容器にポンピングする。次いで、容器を凍結乾燥設備に輸送する。
【００５３】
凍結乾燥設備において、正確に２リットルの細胞スラリーを凍結乾燥器内の各プレート上に注ぐ。凍結乾燥器の最大容量は６００リットルであり、全ての過剰の細胞スラリー量を捨てる。
【００５４】
ラクトバシラス・ロイテリの細胞スラリーは１８％の乾燥物含有率を有し、それを４〜５日間凍結乾燥させる。
【００５５】
凍結乾燥プロセスの間、そのプロセスにおける圧力は０．１７６ｍｂａｒ〜０．４２ｍｂａｒの間である。圧力が０．４２ｍｂａｒに達した際に真空ポンプを開始する。ＰＲＴ（加圧試験）を用いて、そのプロセスがいつ完了するのかを決定する。ＰＲＴ又は圧力の上昇が１２０秒後に０．０２ｍｂａｒ未満である場合、そのプロセスを停止する。
【００５６】
（実施例２）
発酵ステップの間に初回刺激及び活性化されたロイテリンを含有する充填微小区画を有する凍結乾燥Ｌ．ロイテリ粉剤の製造
増殖培地において更なる２００ｍＭの１，２−ＰＤとビタミンＣ（４ｇ／Ｌ）とビタミンＢ１２（１ｕｇ／ｍＬ）とにより初回刺激される以外は実施例１と同様の製造プロセス。
【００５７】
（実施例３）
発酵ステップの間に初回刺激され、凍結乾燥ステップの前のロイテリン形成のために活性化されるロイテリンを含有する充填微小区画を有する凍結乾燥Ｌ．ロイテリ粉剤の製造。
増殖培地に更なる２００ｍＭの１，２−ＰＤとビタミンＣ（４ｇ／Ｌ）とビタミンＢ１２（１ｕｇ／ｍＬ）とにより初回刺激される以外は実施例１と同様の製造プロセス。しかし、１００ｍＭのグリセロールを発酵期において添加しないが、その代わりに細胞スラリーに添加した後、凍結乾燥設備に輸送する。
【００５８】
（実施例４）
活性化ロイテリン産生機構によるＬ．ロイテリを有する軟膏剤の調製
以下の成分から軟膏剤を調製する：
例えば上記の製造法の内のいずれかを用いた活性化ロイテリン産生機構によるＬ．ロイテリの凍結乾燥粉剤。
生成物（固形脂肪又は蝋により安定する水分を含まない油）のための賦形剤、油、好ましくは植物油、例えばナタネ油やパーム油
固形脂肪、例えば蜜蝋
保存剤及び安定剤、軟膏剤の技術分野で公知のいずれか
【００５９】
前記プロセスは、固体部分を溶融し、油（Ａｋｏｍｅｄ（登録商標）、ＡＡＫ）及び他の成分とを混合することを含む。５５℃未満の温度でその混合物に凍結乾燥粉剤Ｌ．ロイテリを添加する。混合物を、それが固化して軟膏剤が得られるまで撹拌する。
【００６０】
軟膏剤をチューブ内に充填し、封止する。得られた軟膏剤は、１グラムの軟膏剤につき約１０Ｅ＋０８ＣＦＵの調製Ｌ．ロイテリ培養物を含有する。
【００６１】
（実施例５）
ヒト被験者における酒さの治療
酒さの長期の既往歴を有する女性被験者に、本明細書における本発明により製造された凍結乾燥Ｌ．ロイテリ培養物を投与する。被験者には、１日２回、朝及び夜に投与する。その度毎に軟膏剤の薄層を皮膚に塗り込む。
【００６２】
２週後、酒さは、その症状の治療のために処方された抗生物質なしで明白に改善する。Ｌ．ロイテリ治療を中止すると症状は再発するが、Ｌ．ロイテリの標準的な投与により抑制される。
【００６３】
（実施例６）
経鼻スプレー製剤
ロイテリン産生のために用いる準備が整っている微小区画構造を充填したＬ．ロイテリを含む経鼻製剤は、必要に応じて調合器又は他の装置を用いて、投与のための様々な形態、例えばスプレー、滴剤、ゲル剤、軟膏剤、クリーム剤、粉剤又は懸濁液の形態をとることができる。種々の調合器及び送達ビヒクルは本技術分野で公知であり、それらとしては、単回投与アンプル、アトマイザ、ネブライザ、ポンプ、経鼻パッド、経鼻スポンジ、経鼻カプセル等が挙げられる。
【００６４】
更に一般的にいえば、前記製剤は、固体、半固体又は液体の形態をとることができる。固体形態の場合、成分を、配合、タンブル混合、凍結乾燥、溶媒蒸発、同時粉砕、噴霧乾燥、及び本技術分野で公知の他の技術により混ぜ合わすことができる。
【００６５】
鼻腔内投与に適切な半固形製剤は、油を基剤としたゲル剤又は軟膏剤の形態をとることができる。
【００６６】
好ましい一実施態様において、経鼻製剤は液体形態であってよく、その液体形態としては、油溶液、油懸濁液を挙げることができる。液体製剤は、本技術分野で公知の装置を用いて、経鼻スプレーとして、又は経鼻滴剤として投与されるが、その装置としては、液滴式エアゾル剤としての選択量の調合物を送達し得るネブライザが挙げられる。例えば、商業的に入手可能な５０μＬ又は１００μＬの送達容量を有するスプレーポンプは、例えば、成人サイズ及び小児サイズのスプレー先端部と共にＶａｌｏｉｓ（Ｃｏｎｇｅｒｓ、Ｎ．Ｙ．）から入手可能である。
【００６７】
液体製剤は、公知の手法により製造され得る。例えば、経鼻投与用製剤は、油脂性基剤、例えばオリーブ油、ラノリン、シリコーン油、グリセリン脂肪酸等の医薬的に許容し得る油において、ロイテリンを充填したＬ．ロイテリを混合することにより製造され得る。
【００６８】
調合、安定性及び／又は生物学的利用能のために必要な賦形剤が製剤中に含まれ得ることはいうまでもない。例示的な賦形剤としては、糖類（グルコース、ソルビトール、マンニトール、スクロース）、取込み促進剤（キトサン）、増粘剤及び安定性促進剤（セルロース、ポリビニルピロリドン、デンプン等）、緩衝剤、保存剤、及び／又はｐＨを調整するための酸及び塩基等が挙げられる。
【００６９】
具体的な実施例を参照して本発明を記載したが、多くの他の形態で本発明を実施することができることは、当業者に理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７】
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