(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に含有されるヌクレオチド三リン酸の測定のための、ヌクレオチド三リン酸の抽出方法であって、以下の工程（ａ）及び（ｂ）からなり、かつ工程（ａ）及び（ｂ）を順次備えたことを特徴とする抽出方法。
（ａ）試料にフェノール化合物を含む溶液を混合する工程； 
（ｂ）前記工程（ａ）で得られた混合液を遠心処理して、上清を抽出液として回収する工程；
【請求項２】
ヌクレオチド三リン酸が、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）及び／又はウリジン三リン酸（ＵＴＰ）である請求項１に記載の抽出方法。
【請求項３】
フェノール化合物を含む溶液が、さらにタンパク質変性剤を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の抽出方法。
【請求項４】
フェノール化合物がフェノールである請求項１〜３のいずれか１に記載の抽出方法。
【請求項５】
試料中に含有されるヌクレオチド三リン酸の測定方法であって、以下の工程（Ａ）〜（Ｃ）を順次備えたことを特徴とする測定方法。
（Ａ）試料にフェノール化合物を含む溶液を混合する工程； 
（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られた混合液を遠心処理して、フェノール化合物を含む上清を抽出液として回収する工程；
（Ｃ）前記工程（Ｂ）で得られたフェノール化合物を含む抽出液中のヌクレオチド三リン酸を、ヌクレオチド三リン酸測定用試薬を用いて定量する工程；
【請求項６】
測定用試薬が、ルシフェラーゼを含むＡＴＰ測定用試薬であって、ルシフェラーゼの発光度を測定することによりＡＴＰを定量することを特徴とする請求項５に記載の測定方法。
【請求項７】
試料からヌクレオチド三リン酸を抽出するためのフェノール化合物を含む溶液からなる抽出用試薬と、ヌクレオチド三リン酸測定用試薬と、前記抽出用試薬を請求項１〜４のいずれかに記載の方法によるヌクレオチド三リン酸の抽出に使用するための説明書とを含むヌクレオチド三リン酸測定用試薬キット。
【請求項８】
ヌクレオチド三リン酸がＡＴＰであり、ヌクレオチド三リン酸測定用試薬がＡＴＰ測定用試薬であることを特徴とする請求項７記載の測定用試薬キット。
【請求項９】
ＡＴＰ測定用試薬が、ルシフェラーゼを含むことを特徴とする請求項８記載の測定用試薬キット。
【請求項１０】
抽出用試薬を調製するための、０．１重量％の８−ヒドロキシキノリンを含むフェノールＴＥ飽和溶液からなる抽出試薬Ａ及びクロロホルムからなる抽出試薬Ｂ、並びに、ルシフェラーゼを含むＡＴＰ測定用試薬とを備えたことを特徴とする請求項７〜９のいずれかに記載の測定用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に含有されるヌクレオチドの抽出方法に関し、具体的にはアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）及び／又はウリジン三リン酸（ＵＴＰ）等のヌクレオチドの抽出方法に関する。さらには、本発明はヌクレオチド抽出用試薬及びヌクレオチド測定用試薬キットに関する。【０００２】
本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願特願２００８−０１７８６３号優先権を請求する。
【背景技術】
【０００３】
ＡＴＰは、すべての生物の細胞内に含まれるヌクレオチドである。試料中に含まれるＡＴＰの測定は、各種工業分野において広く行なわれている。特に、食品衛生、バイオ、臨床検査、医学等の現場では、試料中の微生物の有無の判定、該微生物の細胞数の計数等を目的として、細胞内ＡＴＰの測定が行なわれている。細胞内ＡＴＰを測定する場合、細胞を含む試料に界面活性剤等を添加して細胞内ＡＴＰを抽出した後、抽出されたＡＴＰを測定する方法が多用されている。【０００４】
近年、ヒトで起こる様々な疾患が、組織のエネルギー産生の低下によって起こることが明らかにされている。組織のエネルギー産生の低下とは、具体的には、組織を構成する個々の細胞のＡＴＰレベルの減少を示しており、先天的なミトコンドリア遺伝子の変異によって起こる場合と、後天的な遺伝子変異やウイルス感染等によって起こる場合がある。先天性の疾患としてはミトコンドリア脳筋症(CPEO: chronic progressive external ophthalmoplegia, MELAS: mitochondrial myopathy, encephalopathy, lactic acidosis and stroke-like episodes, MERRF: myoclonus epilepsy associated with ragged red fibers)等が知られており、後天性の疾患としては脳梗塞、脳の神経変性疾患(Alzheimer's 病、Parkinson's病、Huntington's病、ウイルス性の脳症)等が報告されている。また、これらの疾患では、痙攣、てんかん、精神運動発達遅延、筋力低下、肝機能障害、感音性難聴等の全身での臨床症状が認められることが特徴である。【０００５】
このような事実から、生体内の様々な組織のＡＴＰレベルを正確に測定する技術は、1)組織におけるミトコンドリアの病理学の研究、2)遺伝子疾患の診断・予防という観点から、臨床医学的にも重要である。もし、この技術が確立されれば、各組織のエネルギー状態、代謝機能の状態、生理学的ストレスの状態を調べることが可能となる。このような細胞内ＡＴＰレベルの減少・枯渇によって発症する多様な疾患の研究は、その大半が培養細胞を用いた人工的環境下での研究であり、細胞のミトコンドリアの膜電位を指標とした蛍光プローブ(MitoTracker(R)、JC-1(R)：Invitrogen社)等を用いた間接的半定量法による細胞外からのＡＴＰレベルのモニターか、細胞を破壊して含まれるＡＴＰを測定しているのが現状である。【０００６】
ＡＴＰの測定法としては、例えば生物発光反応、具体的にはルシフェリン−ルシフェラーゼ発光反応を利用して測定するキット(ENLITEN(R) ATP Assay System：プロメガ社)がすでに開発されており、市販されている。特に、食品衛生、バイオ、臨床検査、医学等の現場では、試料中の微生物の有無の判定、該微生物の細胞数の計数等を目的として、細胞内ＡＴＰレベルの測定が行なわれている。試料中のＡＴＰレベルを測定する場合、試料からＡＴＰを抽出してＡＴＰを定量的に測定することが必要である。【０００７】
試料からＡＴＰを抽出する方法として、１）過塩素酸をベースにした抽出法(ＰＣＡ抽出法)（非特許文献１）、２）蒸留水中で加熱する方法(Boiling抽出法)（非特許文献２）が報告されている。その後、ＡＴＰ抽出効率の高い方法として、プロテインキナーゼＫで処理をする改良法(Proteinase K抽出法)が報告された（非特許文献３）。また、培養細胞からＡＴＰを抽出する方法として、トリクロロ酢酸をベースにした抽出法（ＴＣＡ抽出法）が報告されている（非特許文献４，５）。さらに、最近では、動物組織のＡＴＰレベルを測定するためのキット(『組織の』ＡＴＰ測定キットTM：東洋ビーネット社)が市販されており、ＰＥＧ含有抽出用溶液がＡＴＰ抽出用試薬として添付されている。【０００８】
このように様々な改良方法を考案しなければならないように、従来の方法は操作が煩雑であったり、試料中のタンパク質変性凝集塊中にＡＴＰが混入して抽出効率が下がる、用いるタンパク質変性剤の影響によるＡＴＰ測定の阻害、等の問題があった。例えば、ＡＴＰの測定法がルシフェリン−ルシフェラーゼ発光反応を利用する方法である場合、上記タンパク質変性剤としてＴＣＡを用いると、測定系が酸性となって発光反応が阻害されるという問題、試料中のタンパク質濃度が高い場合に、変性タンパク質に覆われたＡＴＰが抽出されない問題、等がある。そのため、従来の測定方法では、培養細胞等比較的タンパク質濃度の低い条件ではほぼ正確にＡＴＰレベルを測定することは可能であるが、タンパク質濃度の高い生体組織中のＡＴＰを測定する場合、ＡＴＰの抽出効率が急激に低下してＡＴＰレベルを正確に測定しているとはいえない。【０００９】
さらには、生物の細胞内には、ＡＴＰ以外にもＧＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰや各種デオキシヌクレオチド等多種のヌクレオチドが存在している。これらのヌクレオチドも、生体を維持するために必要であるが、効果的な抽出方法や測定方法が十分に解明されているとはいえない。各種ヌクレオチドが効果的に抽出され、各ヌクレオチド特異的な測定方法が開発されれば、生物中における各ヌクレオチドの存在や機能について更に解明されることになり医療、食品、各種工業分野において有用と考えられるが、これらのヌクレオチドの抽出効率もいまだ十分とはいえない。【００１０】
【非特許文献１】New York Academic Press, 151 (1972)
【非特許文献２】New York Academic Press, 559-572 (1963)
【非特許文献３】J Biochem Biophys Methods, 63: 69-77 (2005)
【非特許文献４】Microbiol Rev, 44: 739-796 (1980)
【非特許文献５】Methods Enzymol, 133: 14-22 (1989)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、簡便に効率よく試料中のヌクレオチドを抽出する方法を提供することを課題とし、具体的にＡＴＰ、ＧＴＰ及び／又はＵＴＰ等のヌクレオチドの抽出方法を提供することを課題とする。さらにはヌクレオチド測定のために使用するヌクレオチド抽出用試薬及びヌクレオチド測定用試薬キットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、フェノール化合物を含む溶液を用いることで、タンパク質変性凝集塊へのＡＴＰ混入による抽出効率の低下を生じることなく、試料から効率よくヌクレオチドを抽出できることを見出し、本発明を完成した。【００１３】
すなわち本発明は、以下よりなる。
［１］試料中に含有されるヌクレオチド三リン酸の測定のための、ヌクレオチド三リン酸の抽出方法であって、以下の工程（ａ）及び（ｂ）からなり、かつ工程（ａ）及び（ｂ）を順次備えたことを特徴とする抽出方法。
（ａ）試料にフェノール化合物を含む溶液を混合する工程； 
（ｂ）前記工程（ａ）で得られた混合液を遠心処理して、上清を抽出液として回収する工程；
［２］ヌクレオチド三リン酸が、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）及び／又はウリジン三リン酸（ＵＴＰ）である前記［１］に記載の抽出方法。
［３］フェノール化合物を含む溶液が、さらにタンパク質変性剤を含むことを特徴とする前記［１］又は［２］に記載の抽出方法。
［４］フェノール化合物がフェノールである前記［１］〜［３］のいずれか１に記載の抽出方法。
［５］試料中に含有されるヌクレオチド三リン酸の測定方法であって、以下の工程（Ａ）〜（Ｃ）を順次備えたことを特徴とする測定方法。
（Ａ）試料にフェノール化合物を含む溶液を混合する工程； 
（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られた混合液を遠心処理して、フェノール化合物を含む上清を抽出液として回収する工程；
（Ｃ）前記工程（Ｂ）で得られたフェノール化合物を含む抽出液中のヌクレオチド三リン酸を、ヌクレオチド三リン酸測定用試薬を用いて定量する工程；
［６］測定用試薬が、ルシフェラーゼを含むＡＴＰ測定用試薬であって、ルシフェラーゼの発光度を測定することによりＡＴＰを定量することを特徴とする前記［５］に記載の測定方法。
［７］試料からヌクレオチド三リン酸を抽出するためのフェノール化合物を含む溶液からなる抽出用試薬と、ヌクレオチド三リン酸測定用試薬と、前記抽出用試薬を前記［１］〜［４］のいずれかに記載の方法によるヌクレオチド三リン酸の抽出に使用するための説明書とを含むヌクレオチド三リン酸測定用試薬キット。
［８］ヌクレオチド三リン酸がＡＴＰであり、ヌクレオチド三リン酸測定用試薬がＡＴＰ測定用試薬であることを特徴とする前記［７］記載の測定用試薬キット。
［９］ＡＴＰ測定用試薬が、ルシフェラーゼを含むことを特徴とする前記８記載の測定用試薬キット。
［１０］抽出用試薬を調製するための、０．１重量％の８−ヒドロキシキノリンを含むフェノールＴＥ飽和溶液からなる抽出試薬Ａ及びクロロホルムからなる抽出試薬Ｂ、並びに、ルシフェラーゼを含むＡＴＰ測定用試薬とを備えたことを特徴とする、前記［７］〜［９］に記載の測定用試薬キット。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のヌクレオチド抽出方法によれば、生体等の試料から効果的にヌクレオチド、具体的にはＡＴＰ、ＧＴＰ及び／又はＵＴＰを抽出することができる。従来では、培養細胞や血液等、タンパク質濃度の低い試料についてはＡＴＰ等所望のヌクレオチドを抽出し、測定することが可能であったが、生体組織等タンパク質濃度の高い試料では、正確な測定結果が得られているとはいえない状況であった。本発明の抽出方法によれば、従来困難であった試料中のヌクレオチドを効果的に抽出することができる。また、本発明の抽出方法により、ＡＴＰ等のヌクレオチドを抽出したのち、ＡＴＰ特異的に反応するルシフェラーゼを含むＡＴＰ測定試薬を用いて測定することにより、ＡＴＰを定量的に、より正確に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】標準核酸混合液（ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ）のＨＰＬＣによるヌクレオチドの分離パターンを示す図である。（実験例１）
【図２】肝組織をフェノールＴＥ飽和溶液を含む抽出用溶液で処理した抽出液中のヌクレオチドのＨＰＬＣ分析結果を示す図である。（実施例２、実験例１）
【図３】肝組織をＴＣＡ含有抽出用溶液で処理した抽出液中のヌクレオチドのＨＰＬＣ分析結果を示す図である。（比較例１、実験例１）
【図４】肝組織をＰＧＥ含有抽出用溶液で処理した抽出液中のヌクレオチドのＨＰＬＣ分析結果を示す図である。（比較例２、実験例１）
【図５】各組織中からの抽出液中のＡＴＰ、ＵＴＰ及びＧＴＰのＨＰＬＣ分析結果を示す図である。（実験例２）
【図６】各組織中からの抽出液について、ルシフェラーゼ試薬を用いたＡＴＰの測定結果を示す図である。（実験例３）
【図７】血液抽出物でのＡＴＰ測定値を示す図である（正常マウス、ヘテロ型欠損マウス、ＪＶＳマウス）（実験例４）
【図８】肝抽出物でのＡＴＰ測定値を示す図である（正常マウス、ヘテロ型欠損マウス、ＪＶＳマウス）（実験例４）
【図９】心臓抽出物でのＡＴＰ測定値を示す図である（正常マウス、ヘテロ型欠損マウス、ＪＶＳマウス）（実験例４）
【図１０】脾臓抽出物でのＡＴＰ測定値を示す図である（正常マウス、ヘテロ型欠損マウス、ＪＶＳマウス）（実験例４）
【図１１】抽出後に含まれるＡＴＰ以外の核酸（ＧＴＰ，ＡＭＰ）のルシフェラーゼ発光反応への影響を確認した図である。（実験例５）
【図１２】健常人の末梢血試料に含まれるＡＴＰ量を確認した図である。（実験例６）
【図１３】各種疾患の末梢血試料に含まれるＡＴＰ量を確認した図である。（実験例７）
【図１４】脳症及び回復期（健常者）の末梢血試料に含まれるＡＴＰ量を確認した図である。（実験例８）
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明のヌクレオチド抽出方法におけるヌクレオチドとは、ＤＮＡやＲＮＡ等のポリヌクレオチドとは区別される核酸であり、具体的にはＡＴＰ、ＧＴＰ及び／又はＵＴＰ等のヌクレオチドをいう。以下、本発明のヌクレオチド、即ちポリヌクレオチドでないヌクレオチドについて、単に核酸という場合もある。
【００１７】
本発明において、試料とは上記ヌクレオチドを含有可能性のある試料であれば良く、生体由来の試料であってもよいし、生体外に存在する試料であってもよい。また、生体は、ヒト及びヒトをのぞく脊柱動物であっても良い。試料として、例えば生体組織、尿、糞便、血液、喀痰、膿汁、細胞、細胞の培養液、飲食物・医薬品・化粧品等の各工業製品・その半製品・その原料、海水、河川水、工業用水、下水、土壌等を挙げることができる。また、細菌汚染検査、清浄度検査、拭き取り検査等の各種検査における検体も、本発明における試料とすることができる。さらには、上記試料を適当な溶媒（例えば、蒸留水、生理的食塩水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等）に懸濁した溶液を試料としてもよい。試料が固形分を含む場合には、該試料を上記溶媒に懸濁するか、ミキサー等でホモジナイズすれば溶液状のものと同様に扱うことができる。
【００１８】
本発明のヌクレオチド抽出方法に使用されるフェノール化合物は、フェノール基を有する化合物であって、試料中のヌクレオチドを抽出しうる化合物であれば良く、特に限定されない。特に好適にはフェノールである。フェノール化合物を含む溶液には、クロロホルムを含んでいても良い。また、フェノール化合物を含む溶液には、タンパク質変性剤を含んでいても良い。ここにおいて、タンパク質変性剤とは、自体公知のものが挙げられ、特に従来のＡＴＰ抽出方法に使用可能であったタンパク質変性剤が好適である。そのようなタンパク質変性剤としては、グアニジンイソチアネート、過塩素酸、ＴＣＡ、プロテインキナーゼＫ等が挙げられる。しかしながら、試料中に、ＡＴＰ分解酵素以外のタンパク質が多く含まれる場合には、タンパク質変性剤を加えることでタンパク質が変性して凝集する場合がある。このような場合には測定対象物であるＡＴＰ等の核酸が変性により凝集したタンパク質中に埋没して抽出が困難になってしまう場合もあり、正確な測定ができるとはいえない。また、従来のＡＴＰ抽出方法である加熱処理方法も、本発明のヌクレオチド抽出方法に組み合わせて処理することができるが、タンパク質が多く含まれる試料の場合には、同様に加熱により変性したタンパク質中に核酸が取り込まれる場合もある。従って、タンパク変性剤や加熱処理を組み合わせないでフェノール化合物を含む溶液で処理することが最も効率的にヌクレオチドを抽出することができるものと考えられる。
【００１９】
本発明のフェノール化合物を含む溶液のpHは特に限定されないが、最も感度良く測定を行うためには、ルシフェラーゼ測定試薬等、核酸測定試薬において最も効率的に反応しうるpHに合わせることが適当と考えられる。本発明のフェノール化合物を含む溶液を用いて試料を処理した場合には、例えばpH 4〜10等どのようなpHの溶液で処理しても、従来の抽出方法に比べて効果的にヌクレオチドが抽出される。例えばルシフェラーゼ試薬を用いてＡＴＰを測定する場合には、ルシフェラーゼの特質によりpH 7〜9付近で効果的な測定を行うことができるため、本発明のフェノール化合物を含む溶液は、これらのpHとすることができ、より好適にはpH 8付近とすることができる。上記のヌクレオチド抽出方法に使用されるフェノール化合物を含む溶液は、試料からのヌクレオチド抽出用試薬として利用することができる。
【００２０】
本発明のヌクレオチド抽出用試薬におけるフェノール化合物の溶媒は、特に限定されないが、例えばTE(10mM Tris-HCl pH8.0, 1mM EDTA)を用いることができる。さらに、必要に応じて安定化剤を加えても良い。
【００２１】
本発明のヌクレオチド抽出方法によると、試料に各種ヌクレオチドが存在する場合は、ＡＴＰのみならず、ＧＴＰやＵＴＰ等も効果的に抽出される。本発明のヌクレオチドの測定は、測定目的対象物に応じて適宜測定方法を選択することができ、自体公知の方法、または今後開発されるあらゆる測定方法を含めることができる。今後開発される方法については、例えばＡＴＰ、ＧＴＰ又はＵＴＰ等の測定用試薬であって、目的に応じて、各々の核酸特異的に測定可能な試薬を用いて測定することが好ましい。
【００２２】
自体公知の方法として、例えばＡＴＰの測定についてはルシフェリン−ルシフェラーゼ発光反応を利用する方法、ＡＴＰ変換反応を利用する方法等を適用することができる。ルシフェリン−ルシフェラーゼ発光反応を利用するＡＴＰの測定方法としては、ルシフェリンおよびルシフェラーゼを含む発光試薬と、標的ＡＴＰとを、金属イオン（マグネシウムイオン等）の存在下で接触させ、生成した光の発光量を測定する方法が挙げられる。例えば、市販のＡＴＰ測定用キットとして、ENLITEN(R) ATP Assay System：プロメガ社、「細胞の」ＡＴＰ測定キットTM：東洋ビーネット社、「組織の」ＡＴＰ測定キットTM：東洋ビーネット社、ルシフェール250プラスTM：キッコーマン、等を用いることができる。これらのＡＴＰ測定用試薬を用いて測定すると、本発明のヌクレオチド抽出方法によりヌクレオチドを抽出して得た試料について、例えばＧＴＰやＵＴＰ等のＡＴＰを除くヌクレオチドが含まれていても、ＡＴＰ特異的に測定することができる。
【００２３】
今後開発されるヌクレオチド測定方法、例えば新たなＡＴＰ測定方法、その他ＧＴＰやＵＴＰ特異的な新規測定方法が開発される場合にも本発明のヌクレオチド抽出方法を適用することができる。
【００２４】
本発明は、フェノール化合物を含む溶液からなる、試料からヌクレオチドを抽出するためのヌクレオチド抽出用試薬にも及ぶ。ヌクレオチド抽出用試薬には、フェノール化合物のほか、さらにクロロホルムを含有していても良い。また、本発明は、ヌクレオチド抽出用試薬及びヌクレオチド測定用試薬を含むヌクレオチド測定用試薬キットにも及ぶ。具体的には、フェノール化合物を含むヌクレオチド抽出用試薬と、ルシフェラーゼを含むＡＴＰ測定用試薬を含むヌクレオチド測定用試薬キットにも及ぶ。
【実施例】
【００２５】
本発明の理解を助けるために、以下に実施例を示して具体的に本発明を説明するが、本発明は本実施例に限定されるものでないことはいうまでもない。【００２６】
（実施例１）トリゾル（TRIzol(R)）試薬を用いたヌクレオチド抽出方法
３週齢のマウス(C57BL/6J)の各組織（心臓、肝臓、脾臓、筋肉、血液）を摘出し、各組織0.05〜0.4 gに、本実施例のヌクレオチド抽出用溶液3.0 mLを加え、ホモジナイズした。
本実施例のヌクレオチド抽出用溶液として、フェノール、グアニジンイソチオシアネートを含む市販のＲＮＡ抽出用試薬であるTRIzol(R)試薬(pH 5.0：Invitrogen社）2.8 mLにクロロホルム200 μLを加えたものを用いた。
上記ホモジナイズを４℃で12,000 rpm×１０分間遠心処理し、上清200 μLを保存用チューブに入れ、−８０℃にて保存した。【００２７】
（実施例２）フェノールＴＥ飽和溶液を用いたヌクレオチド抽出方法
本実施例のヌクレオチド抽出用溶液として、市販のフェノールＴＥ飽和溶液(TE (10mM Tris-HCl pH8.0, 1mM EDTA：WAKO社）2.8 mLにクロロホルム200 μLを加えたものを用いた他は、実施例１と同様の処理を行った。本抽出用溶液は、安定化剤として0.1% (w/v)の8-ヒドロキシキノリンを含み、pH8.0に調整されたものである。【００２８】
（実施例３）フェノールＴＥ飽和溶液(mod.)を用いたヌクレオチド抽出方法
本実施例のヌクレオチド抽出用溶液として、フェノール、グアニジンイソチオシアネートを含むフェノールＴＥ飽和溶液（TE (10 mM Tris-HCl pH8.0, 1 mM EDTA）2.8 mLにクロロホルム200 μLを加えたものを用いた他は、実施例１と同様の処理を行った。本抽出用溶液は、pH 8.0に調整されたものである。【００２９】
（比較例１）ＴＣＡを用いたヌクレオチド抽出方法
本比較例のヌクレオチド抽出用溶液として、市販のＡＴＰ測定用試薬（ENLITEN(R) rLuciferase/Luciferin Reagent：プロメガ社）が推奨しているＡＴＰ抽出用試薬（ＴＣＡ含有）を用いた。
実施例１と同様に３週齢のマウス(C57BL/6J)の各組織（心臓、肝臓、脾臓、筋肉、血液）を摘出した。その後各組織0.05〜0.4 gあたりに0.25 M スクロース溶液（10 mM HEPES-NaOH、pH 7.4）を3.0 mL加え、ホモジナイズした。上清500 μLをチューブに入れ、更に10％ＴＣＡを含む抽出用溶液500 μLをチューブに加えた。上記抽出用溶液を含む試料液を４℃で12,000 rpm×１０分間遠心処理し、上清400 μLを新たなチューブに分注した。1.0 M Tris-Acetate（pH 7.75）を200 μL加えて攪拌した後、−８０℃にて保存した。【００３０】
（比較例２）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いたヌクレオチド抽出方法
本比較例のヌクレオチド抽出用溶液として、市販のＡＴＰ測定用試薬（『組織の』ＡＴＰ測定キットTM：東洋ビーネット社）に添付のＡＴＰ抽出用試薬（ＰＥＧ含有）を用いた。
比較例１と同様に３週齢のマウス(C57BL/6J)の各組織（心臓、肝臓、脾臓、筋肉、血液）を摘出し、各組織0.05〜0.4 gあたりに0.25 M スクロース溶液（10 mM HEPES-NaOH、pH 7.4）を3.0 mL加え、ホモジナイズした。ホモジェネートを４℃で12,000 rpm×１０分間遠心処理し、上清100 μLを新たなチューブに分注した。本比較例のＰＥＧ含有ＡＴＰ抽出用溶液100 μLを加えて攪拌した後、室温にて３０分放置した後、−８０℃にて保存した。【００３１】
（実施例４）改良型ＡＴＰ測定用試薬（rLuciferase/Luciferin Reagent mod.）
改良型ＡＴＰ測定用試薬の組成を以下に示す。
D-ルシフェリンカリウム  (D-Luciferin Potassium Salt) 0.8 mg
ホタル由来遺伝子組換ルシフェラーゼ(Luciferase Recombinant)  1 mg/mL(緩衝液)
緩衝液組成
20 mM トリシン(Tricine: (HOCH2)3C-NHCH2CO2H)
1.05 mM Mg-Carbonate Hydroxide Pentahydrate
2.7 mM 硫酸マグネシウム(Magnesium Sulfate)
33.3 mM ジチオスレイトール(Dithiothreitol)【００３２】
（実験例１）ＨＰＬＣによる抽出産物の解析
実施例２、比較例１及び２の、各ヌクレオチド抽出方法で得られた肝組織の抽出液中のヌクレオチド（ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＩＴＰ）の抽出について調べた。
各抽出物の分析は、東ソー株式会社のＨＰＬＣ分析情報(Data code: G00707)に準じて行った。本分析は溶離液としてアセトニトリル/75 mM カリウム2水素リン酸水溶液(70:30, v/v)、ＨＰＬＣカラムとしてTSK-gel(R) Amide-80(5 μm、I.D. 4.6×250 mm)(東ソー株式会社)およびＨＰＬＣ装置として日立高速液体クロマトグラフィー LaChromTM ELUTEシリーズ：日立ハイテクノロジーズ社を使用して実施した。抽出液は希釈せず0.025 mLをカラムに供し、カラム温度３０℃、1.0 mL/minの流速、260 nmの波長でモニターした。なお、標準核酸物質としてＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ（シグマ社）を使用した。【００３３】
上記の分析結果を、図１〜４に示した。図１は、標準核酸物質の抽出パターンであり、図２は実施例２のフェノールＴＥ飽和溶液（pH8.0）を用いたヌクレオチド抽出方法により得られた抽出物の抽出パターンであり、図３は同様に比較例１のＴＣＡを用いたヌクレオチド抽出方法によるものであり、図４は比較例２のＰＥＧを用いたヌクレオチド抽出方法によるものである。これらの結果より、実施例２の抽出方法により得られた抽出物中には、比較例１、２の抽出方法により得られた抽出物に比べ、ＡＴＰ、ＧＴＰ及びＵＴＰがより多く抽出されることが確認された。【００３４】
（実験例２）各組織中のヌクレオチド量について
実施例２、比較例１及び２の、各ヌクレオチド抽出方法で得られた脳、心臓、肝臓、筋肉の各組織の抽出液中のヌクレオチド（ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ）の抽出について、ＨＰＬＣにより調べた。ＨＰＬＣの測定条件は、実験例１と同様に行った。【００３５】
上記の分析の結果、実施例２の方法で抽出した場合には、比較例１及び２の方法で抽出した場合に比べて、各ヌクレオチドについて高い抽出効果が認められた（図５）。【００３６】
（実験例３）各組織のＡＴＰ抽出について
実施例１〜３、及び比較例１、２の各抽出方法を行った希釈試料10μLを、ENLITEN(R) rLuciferase/Luciferin Reagent：プロメガ社90μLで、1/10倍に希釈し、ＡＴＰの測定を行った。タンパク質量は、ＢＣＡTMタンパク定量アッセイキット（BCATM Protein Assay Kit, PIERCE社）により測定した。【００３７】
その結果、タンパク質あたりのＡＴＰ量は、比較例１及び２の方法で抽出した場合に比べて、実施例１〜３の方法で抽出した場合のほうが、高い結果が得られ、効果的にＡＴＰ量を測定できたことが示唆された（図６）。【００３８】
（実験例４）遺伝性カルニチン欠乏ＪＶＳマウスのＡＴＰ量の測定
本発明のヌクレオチド抽出方法により抽出した場合のＡＴＰ測定値について、動物組織でのＡＴＰの低下を、全身性カルニチン欠損症、即ちミトコンドリアの脂肪酸代謝障害の疾患モデルとして確立しているＪＶＳ(juvenile visceral steatosis) マウスを用いて調べた。ＪＶＳマウスは、sodium-dependent carnitine cotransporter (OCTN2)遺伝子のミスセンス変異を伴ったマウスで、先天性長鎖脂肪酸代謝障害を示す (Lu K, Nishimori H, Nakamura Y, Shima K, Kuwajima M. Biochem Biophys Res Commun 252:290-594, 1998)。このマウス に、インフルエンザウイルス(Influenza A/PR/8/38株）を感染させた場合の、血液、肝臓、心臓及び脾臓でのＡＴＰレベルを測定し、多臓器不全の程度を判定した。【００３９】
７日齢の野生型マウス(C57BL/6J)、OCTN2遺伝子のヘテロ型欠損マウスとホモ型欠損マウス（ＪＶＳマウス）に、インフルエンザウイルスを感染させ、３日放置した。１０日齢の野生型及びＪＶＳマウスについて、インフルエンザウイルス感染なしのマウスと３日間感染させた各マウスについて、実施例１と同様に各組織を摘出し、実施例２の方法に従いヌクレオチド抽出を行い、ＡＴＰの定量を行った。ＡＴＰの定量は、実験例３の方法に従った。【００４０】
各組織におけるＡＴＰレベルを、図７〜１０に示した。各図において、+/+は野生型マウスを、+/-はヘテロ型欠損マウスを、-/-はＪＶＳマウスを示す。各組織について、インフルエンザに感染したマウスでは、非感染マウスに比べて野生型、ヘテロ型欠損、ＪＶＳマウスのいずれでもＡＴＰ量は低下傾向にあるが、中でもＪＶＳマウスの場合ではＡＴＰ量が著名に低値を示した事実から、多臓器不全を来していることが確認された。【００４１】
（実験例５）ルシフェラーゼを用いたＡＴＰ測定試薬のＡＴＰ特異性の確認
以上の実験例の結果より、本発明のヌクレオチド抽出法により動物の組織から効率良くヌクレオチドを抽出することが可能であることが明らかとなった。しかし、実験例１及び２に示したように、動物の組織にはＡＴＰの他にも様々なヌクレオチドが存在する。本実験例では、各抽出液に含まれるＡＴＰ以外のヌクレオチドがルシフェラーゼ発光反応に影響するか否かを検討した。ＡＴＰ各希釈溶液に各濃度のＧＴＰ又はＡＭＰを混合した溶液を調製し、これらの溶液について実験例３の方法に従い、ルシフェラーゼ発光反応を行った。【００４２】
その結果、ルシフェラーゼ発光反応によるＡＴＰ測定には、組織中に存在すると考えられるＧＴＰ、ＡＭＰ量、さらにそのＡＴＰ濃度の106〜109倍のＧＴＰ、ＡＭＰ濃度存在下においても影響のないことが確認された（図１１）。【００４３】
（実験例６） ヒトの血液試料のＡＴＰの測定
健常者（被験者）の末梢血を試料とし、実施例１〜３に示すヌクレオチド抽出方法により抽出したＡＴＰ測定値と、比較例１及び２の、各ヌクレオチド抽出方法で測定したＡＴＰ測定値を比較した。被験者（３名）の末梢血試料は、インフォームド・コンセントを書面で行い、徳島大学倫理審査委員会の承認を得て、採血を行ったものを用いた。ＡＴＰの定量は、実験例３に従った。【００４４】
上記の測定の結果、実施例１〜３の方法で抽出した場合には、比較例１及び２の各抽出法を用いて抽出した場合に比べて、ＡＴＰの高い抽出効果が認められた（図１２参照）。【００４５】
（実験例７）ヒト患者の血液試料のＡＴＰの測定
各種疾患で入院したヒト患者（被験者）の末梢血を試料とし、実施例２の方法で抽出した場合のＡＴＰ測定値について、健常者の末梢血を試料に比べてＡＴＰレベルが低下しているかどうかについて調べた。被験者の末梢血試料は、インフォームド・コンセントを書面で行い、徳島大学の倫理審査委員会の承認を得て、採血を行ったものを用いた。被験者は、脳症患者６名、ミトコンドリア脳筋症の患者５名、そして、脳症の回復期の患者３名であった。【００４６】
上記の測定の結果、脳症（急性期）の患者、ミトコンドリア脳筋症の患者においては、末梢血のＡＴＰレベルは低値（1 mM以下）を示したが、脳症の回復期の患者では、末梢血中のＡＴＰレベルが1.2 mM以上であり、ＡＴＰレベルが回復していることが確認された（図１３参照）。【００４７】
（実験例８）各組織のＡＴＰ抽出量の測定について
脳症で入院したヒト患者（脳症の回復期の患者（健常者）５名、脳症（急性期）の患者４名）の末梢血を試料とし、実施例２の方法で抽出した。既存の市販品及び実施例４の改良型ＡＴＰ測定用試薬を用いたＡＴＰ測定方法の比較試験を行った。
実施例２の方法で抽出した希釈試料（1/10,000倍希釈）10μLを、市販のＡＴＰ試薬（ENLITEN(R) rLuciferase/Luciferin Reagent：プロメガ社）90μLで、1/10倍に希釈し、ルミノメーター（TD-20/2：TURNER DESIGN社）でルシフェラーゼの発光量を測定した。同時に、ＡＴＰ標準溶液（10-7 M）を1/10倍〜1/10,000,000倍まで段階的に希釈した溶液を調製し、ＡＴＰ濃度とルシフェラーゼの発光量との相関関係を表す標準曲線を作成した。この標準曲線をもとに、ルシフェラーゼの発光量から試料中に存在するＡＴＰ濃度を算出した。【００４８】
同様に実施例２の方法で抽出した希釈試料10μLを、実施例４の改良型ＡＴＰ測定用試薬90μLで希釈した。他は、上記市販の試薬を用いた方法と同様の方法で試料中に存在するＡＴＰ濃度を算出した。【００４９】
上記の比較試験の結果、市販のＡＴＰ試薬又は実施例４の改良型ＡＴＰ試薬で測定した場合では、ほぼ同様の結果が得られることが確認された（図１４参照）。【００５０】
以上の結果から、本発明のフェノール化合物を含む溶液を用いたヌクレオチドの抽出法によると、動物組織中のヌクレオチドを効率良く抽出可能なことが確認され、さらに本発明のＡＴＰの測定方法に使用したルシフェラーゼ発光を指標とする試薬では、ルシフェラーゼ発光は抽出した核酸のＡＴＰのみに反応することが再確認された。さらに、改良型ＡＴＰ測定用試薬（rLuciferase/Luciferin Reagent mod.）を用いることで、従来の方法と比較して、より安価に測定試料中のＡＴＰ量の測定を実現可能なことが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
以上詳述したように、本発明のヌクレオチドの抽出方法により、効果的にＡＴＰ、ＧＴＰ又はＵＴＰを抽出可能なことが確認された。従って、効果的にこれらのヌクレオチドの測定を行うことができる。そのため、本発明のヌクレオチド抽出方法に使用する抽出用溶液を、ヌクレオチド抽出用試薬とすることができ、ＡＴＰ、ＧＴＰ又はＵＴＰの測定用試薬キットに含めることができる。特に、現実に市販されているＡＴＰ測定用試薬を用いて測定する場合にも、本発明の抽出方法は有効に利用できることから、既存のＡＴＰ測定用試薬に添付するＡＴＰ抽出用試薬としても用いることができ、このような抽出用試薬を含むＡＴＰ測定用試薬キットとして提供することができる。【００５２】
本発明のヌクレオチドの抽出方法は、各種工業分野、特に、バイオ・臨床検査・医学等の現場における標的ＡＴＰの測定法として好適に使用できる。なかでも、患者の末梢血のＡＴＰレベルを測定する技術は、患者の容態をモニタリングする一つの指標として、医療機関に波及する可能性がある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図５】
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