(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経前駆細胞の膜抗原を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生する方法であって、
ａ．１３．５日齢マウス胚の嗅球から神経幹細胞を含むニューロスフィアを産生する工程と、
ｂ．生存ニューロスフィア細胞によって４ヶ月齢の雄のアルメニアンハムスターを免疫する工程と、
ｃ．上記動物の脾臓を抽出してリンパ球を取得する工程と、
ｄ．リンパ球と、Ｂａｌｂ．ｃマウスから得た非産生マウスミエローマ細胞とを融合して、ハイブリッド細胞またはハイブリドーマを生み出す工程と、
ｅ．ヨウ化プロピジウムの存在下でニューロスフィア細胞フローサイトメトリーを用いて、ハイブリドーマによって産生される抗体の決定および／または選択を行なう工程とを含む方法。
【請求項２】
以下のリスト：
ａ．国際寄託当局デュスチェ サムラング フォン ミクルールガニスメン ウンド ゼル
クルツレン ＧｍｂＨ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH：ＤＳＭＺ）、ブラウンシュワイク、ドイツにＤＳＭアクセス番号Ｎｏ．ＡＣＣ２８８７で寄託されたハイブリドーマによって産生される、ＮＩＬＯ１と称されるモノクローナル抗体、および
ｂ．国際寄託当局デュスチェ サムラング フォン ミクルールガニスメン ウンド ゼル
クルツレン ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）、ブラウンシュワイク、ドイツにＤＳＭアクセス番号
Ｎｏ．ＡＣＣ２８８１で寄託されたハイブリドーマによって産生される、ＮＩＬＯ２と称されるモノクローナル抗体、
から選択されるモノクローナル抗体。
【請求項３】
請求項２に記載のいずれかのモノクローナル抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項４】
請求項２に記載の抗体、または請求項３に記載の抗原結合フラグメントに転写する能力がある、ＤＮＡの遺伝子構築物。
【請求項５】
請求項２に記載のいずれかのモノクローナル抗体の生成ハイブリドーマ。
【請求項６】
前駆細胞が豊富な集団を産生する方法であって、
ａ．細胞集団と、試薬とを接触させる工程であって、
上記試薬は、
i．国際寄託当局ＤＳＭＺ、ブラウンシュワイク、ドイツにＤＳＭアクセス番号Ｎｏ．ＡＣＣ２８８７で寄託されたハイブリドーマによって産生される、ＮＩＬＯ１と称される抗体またはその抗原結合フラグメント、および
ii．国際寄託当局ＤＳＭＺ、ブラウンシュワイク、ドイツにＤＳＭアクセス番号Ｎｏ．ＡＣＣ２８８１で寄託されたハイブリドーマによって産生される、ＮＩＬＯ２と称される抗体またはその抗原結合フラグメント：
を含むリストから選択され、
ｂ．上記試薬と、エピトープまたは抗原決定基との接触がある細胞を選択する工程とを含む方法。
【請求項７】
前駆細胞が豊富な上記集団は、神経前駆細胞または神経誘導細胞を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
神経前駆細胞または神経誘導細胞を含んでいる上記集団は、ニューロスフィアの培養組織由来である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
上記試薬は、酵素、発色団、化学発光材料、放射性核酸またはナノ粒子などのマーカーと結合される、国際寄託当局ＤＳＭＺ、ブラウンシュワイク、ドイツにＤＳＭアクセス番号Ｎｏ．ＡＣＣ２８８７で寄託されたハイブリドーマによって産生される、ＮＩＬＯ１と称されるモノクローナル抗体および／または国際寄託当局ＤＳＭＺ、ブラウンシュワイク、ドイツにＤＳＭアクセス番号Ｎｏ．ＡＣＣ２８８１で寄託されたハイブリドーマによって産生される、ＮＩＬＯ２と称されるモノクローナル抗体を含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前駆細胞の選択は、フローサイトメトリー技術（ＦＡＣＳフローサイトメトリーを含む）もしくは顕微鏡検査を用いて、免疫細胞化学技術（細胞）もしくは免疫組織化学（組織）を用いて、または磁性選択法によって行なう、請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
薬剤をスクリーニングまたは発見する方法であって、以下の工程：
ａ．国際寄託当局ＤＳＭＺ、ブラウンシュワイク、ドイツにＤＳＭアクセス番号Ｎｏ．ＡＣＣ２８８７で寄託されたハイブリドーマによって産生される、ＮＩＬＯ１と称されるモノクローナル抗体および／もしくは国際寄託当局ＤＳＭＺ、ブラウンシュワイク、ドイツにＤＳＭアクセス番号Ｎｏ．ＡＣＣ２８８１で寄託されたハイブリドーマによって産生される、ＮＩＬＯ２と称されるモノクローナル抗体、またはそれらの、１つの抗原結合フラグメントもしくは複数の抗原結合フラグメントと結合される、幹細胞または前駆細胞を含む集団から選択し、幹細胞に関する濃縮された集団を産生する工程と、
ｂ．上記濃縮された集団を非ヒト哺乳動物に接種する工程と、
ｃ．上記哺乳動物、および上記集団を接種されていない別の非ヒト哺乳動物（対照被験体）に対して、薬学的な潜在性を有する組成物を投与する工程と、
ｄ．両哺乳動物における上記投与の作用を比較する工程とを含む方法。
【請求項１２】
薬剤をスクリーニングまたは発見する方法であって、以下の工程：
ａ．国際寄託当局ＤＳＭＺ、ブラウンシュワイク、ドイツにＤＳＭアクセス番号Ｎｏ．ＡＣＣ２８８７で寄託されたハイブリドーマによって産生される、ＮＩＬＯ１と称されるモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと結合される、幹細胞または前駆細胞を含んでいる集団から選択し、国際寄託当局ＤＳＭＺ、ブラウンシュワイク、ドイツにＤＳＭアクセス番号Ｎｏ．ＡＣＣ２８８１で寄託されたハイブリドーマによって産生される、ＮＩＬＯ２と称されるモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと結合される、幹細胞または前駆細胞のさらなる選択によって上記集団をさらに濃縮し、原始細胞の集団と比較した場合、幹細胞に関する濃縮された集団を産生する工程と、
ｂ．幹細胞または前駆細胞に関する上記濃縮された集団を、非ヒト哺乳動物に接種する工程と、
ｃ．上記哺乳動物、および上記集団を接種されていない別の非ヒト哺乳動物（対照被験体）に対して、薬学的な潜在性を有する組成物を投与する工程と、
ｄ．両哺乳動物における上記投与の作用を比較する工程とを含む方法。
【請求項１３】
上記非ヒト哺乳動物はげっ歯動物である、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
上記幹細胞または前駆細胞は、神経幹細胞または神経前駆細胞である、請求項１１または１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＩＬＯ１およびＮＩＬＯ２と称されるモノクローナル抗体の利用に関する。当該抗体は、中枢神経系の前駆細胞を含む前駆細胞を有する集団を同定、単離および濃縮することを目的として、細胞表面マーカーと結合される。また、本発明は、抗体を取得するための特異的な方法、上記抗体を含有する薬学的組成物、およびその利用（例えば、前駆細胞集団における分子または薬剤の作用を特定する方法）に関する。
【背景技術】
【０００２】
わずかな例外はあるが、中枢神経系（central nervous system：ＣＮＳ）の神経集団は、基本的に有糸分裂後の集団と考えられており、それらの死後に置換される能力を有さずに分化している。主に、全哺乳動物の成熟ＣＮＳの２つの領域において活発なニューロン新生プロセスが確認されており、それは自己再生に対する脳の潜在能力（ヒトの脳を含む）を示唆する（Altman and Das, 1965. J Comp Neurol 124: 319-35; Alvarez-Buylla et al., 2000. Prog Brain Res 127: 1-11; Bedard and Parent, 2004. Brain Res Dev Brain Res 151: 159-68; Bonnert et al., 2006. Eur J Neurosci; Lennington et al., 2003. Reprod Biol Endocrinol 1: 99）。このことは、細胞代償療法、ひいては未だ有効な治療方針のない神経変性疾患にとって見込みのある将来を与える。
【０００３】
神経幹細胞はすべての脳細胞の起源、すなわちニューロンおよびグリアを構成する。初期には支持細胞であると考えられるグリア細胞は、様々な機能に関与する星型細胞のアストロサイト、およびミエリンによって軸索を取り囲むことによって当該軸索を保護しているオリゴデンドロサイトを含む。ニューロン新生は、マウスの生涯、そしておそらくヒトの生涯にわたって維持されるが、神経幹細胞の数は成体の脳に極めて少ない。
【０００４】
神経幹細胞は、特に、歯状回の下に位置する側脳室の脳室下帯（subventricular zone：ＳＶＺ）（Doetsch et al., 1999. Cell 97: 703-16）および海馬の顆粒細胞下帯にある中枢神経組織の所定のニッチに主に集中している。終脳脳室下帯（ＳＶＺ）は、嗅球ニューロン（olfactory bulb：ＯＢ）を産生している成体マウス神経幹細胞の主な供給源である（Alvarez-Buylla et al., 2000. Prog Brain Res 127: 1-11; Bedard et al., 2002. Eur J Neurosci 16: 1917-24; Doetsch et al., 2002. Neuron 36: 1021-34; Dutton and Bartlett, 2000. Dev Neurosci 22: 96-105; Pencea et al., 2001. Exp Neurol 172: 1-16）。ＳＶＺは、成体年齢において活発に増殖しており、側脳室の壁を覆っている細胞の薄層からなる（Doetsch et al., 1999. Cell 97: 703- 16）。これら前駆細胞のいくつかは脳室前縁に集中しており、吻側遊走性流（rostral migratory stream：ＲＭＳ）を生み出す。
【０００５】
また、神経幹細胞は、吻側遊走性流による上衣下星細胞の移動の結果として生じる嗅球由来であり得る（Alvarez-Buylla and Lim, 2004. Neuron 41: 683-6）。これらの領域は、所定の神経性細胞、またはニューロスフィアとして知られる細胞の凝集体として規定される。当該所定の神経性細胞は、自己再生増殖を維持することが可能なインビトロにおいて、もしくは組織によって被覆された基質の単層において取得することができる。ＥＦＧおよび塩基性ＦＧＦが補われた適切な培地において神経幹細胞を生育する場合、神経幹細胞は増殖し、自己再生能力を維持し得る。これらの因子を培地から除去すると、主要な神経種であるニューロンおよびグリア細胞（アストロサイトおよびオリゴデンドロサイト）への分化をもたらす。
【０００６】
多能性細胞はこれらの増殖領域から単離され、培養組織においてクローン化されて伸張される。インビトロの環境、すなわち移植後において、これらの細胞は中枢神経系の３つの主要な細胞種を産生する能力を有しているため、神経多能性細胞に分類される。
【０００７】
神経組織の移植による特異的な神経集団の機能的置換は、神経変性疾患の治療にとって魅力的な治療法を示す。しかし従来、神経幹細胞は、組織生体検査または検視によって脳組織から得られるものであり、倫理的問題および免疫適合性の問題をもたらす。したがって、以前として、上記問題を解決する神経幹細胞の供給源を提供する必要がある。
【０００８】
この意義において、モノクローナル抗体は細胞内に存在する抗原（細胞質内抗原）によって神経幹細胞を同定することが知られている。当該抗体が細胞内に存在する抗原と結合し得るためには、結果的に細胞死を伴う原形質膜の透過処理が必要となることから、生存細胞集団の選択に使用され得ないという欠点を有する。ネスチン、Ｓｏｘ２、ビメンチン、またはＧＦＡＰ（極めて未発達な前駆細胞のための）およびダブルコルチン、ＰＳＡ−ＭＣＡＭ、Ｋｉ６７、ならびにβＩＩＩ−チューブリン（増殖性の前駆細胞および神経幹細胞のための）などの神経前駆細胞を特徴づける、多くの細胞質内モノクローナル抗体が存在する。しかし、今日まで、神経前駆細胞の表面抗原に対するわずかな抗体を特徴づけられているに過ぎない。
【０００９】
神経組織の損失は、脳応答および個々の死において進行性損失を伴ういくつかの神経変性疾患の原因であると提議されている。現在、これらの疾患を治す治療法はなく、ある程度緩和する治療が当該疾患の一時的な改善を成し得るのみである。一次的な治療という現状の一つの理由には、新たな神経幹細胞の移植という手法によって、当該細胞を患者に提供することの困難性に起因する。この手法は、損傷された組織の少なくとも一部を再生することが可能であり、おそらく断定的に病状を改善することができる細胞治療である。
【００１０】
しかし現在までに、後述する濃縮、選択および治療剤としての研究または使用のために幹細胞を精製する手段を得ることは実質的に不可能であり、神経細胞に対する新規の表面マーカーを見出す必要があることを明白に示している。
【発明の概要】
【００１１】
このように、幹細胞集団の濃縮に関する前駆細胞、および初期の前躯体を検出することができる手段を見出す必要性がある。それにより、前駆細胞および初期の前躯体の研究および治療薬としての利用が可能になる。
【００１２】
この意義において、および本発明の第１の態様によれば、以下：
ａ．１３．５日齢マウス胚の嗅球から神経幹細胞（neural stem cells：ＮＳＣ）を含
むニューロスフィアを産生する工程と、
ｂ．生存ニューロスフィア細胞によって４ヶ月齢の雄のアルメニアンハムスターを免疫する工程と、
ｃ．上記動物の脾臓を抽出してリンパ球を取得する工程と、
ｄ．リンパ球と、非産生マウスミエローマ細胞とを融合して、ハイブリッド細胞またはハイブリドーマを生み出す工程と、
ｅ．ヨウ化プロピジウムの存在下で、死細胞が分析から除外されるニューロスフィア細胞フローサイトメトリーを用いて、ハイブリドーマによって産生される抗体の決定および／または選択を行なう工程とを含む、前駆細胞の膜抗原を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生する方法を提供する。
【００１３】
本発明の第２の態様によれば、モノクローナル抗体は：
ａ）国際寄託当局デュスチェ サムラング フォン ミクルールガニスメン ウンド ゼルクルツレン ＧｍｂＨ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH：ＤＳＭＺ）、ブラウンシュワイク、ドイツにアクセスＤＳＭ番号Ｎｏ．ＡＣＣ２８８７で２００８年３月１２日に寄託されたハイブリドーマによって産生される、ＮＩＬＯ１（クローン１ Ｂ６．２．１３）と称されるモノクローナル抗体、および、
ｂ）国際寄託当局デュスチェ サムラング フォン ミクルールガニスメン ウンド ゼルクルツレン ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）、ブラウンシュワイク、ドイツにアクセスＤＳＭ番号Ｎｏ．ＡＣＣ２８８１で２００８年２月４日に寄託されたハイブリドーマによって産生される、ＮＩＬＯ２（クローン２ Ｂ７．１０）と称されるモノクローナル抗体、
などから提供され、上述の処理によって取得される。
【００１４】
本発明の第３の態様は、神経誘導細胞の任意のモノクローナル抗体の活性フラグメントからなる。
【００１５】
本発明の別の態様によれば、ＲＮＡまたはＤＮＡの遺伝子構築物は、上記請求項のいずれかに記載の本発明の抗体、または本発明の抗体フラグメントに転写する能力を提供する。
【００１６】
本発明の上記遺伝子構築物は、抗体（ＮＩＬＯ１および／またはＮＩＬＯ２）、または当該抗体フラグメントの配列の、インビトロまたは細胞内における転写を方向づけるとともに、下記の配列型：ａ）少なくとも本発明の抗体の符号化配列、または当該抗体の転写のための、本発明の抗体フラグメントの符号化配列を少なくとも含むヌクレオチド配列（好ましくは二重鎖）、ｂ）遺伝子発現系またはベクターと関連があるヌクレオチド配列（好ましくは二重鎖）、の少なくとも１つを含む。ｂ）のヌクレオチド配列は、少なくとも１つのプロモーターと、また、他の配列と操作上で結合する、本発明の抗体の配列または抗体フラグメントの配列の符号化配列を含んでいる。このプロモーターは重要な上記ヌクレオチド配列の転写を方向づけており、当該他の配列は適切な転写および適切な時間および的確な形態での調節に必須であるか、またはふさわしい配列である。この他の配列としては、例えば、開始シグナルおよび停止シグナル、切断部位、ポリアデニル化シグナル、複製起点、エンハンサー、サイレンサーなどが挙げられる。これら複数の発現系またはベクターは当業者に知られる従来の方法（Sambrook et al., 1989）によって取得され得、本発明の一部を形成する。
【００１７】
本発明の別の態様は、国際寄託当局デュスチェ サムラング フォン ミクルールガニスメン ウンド ゼルクルツレン ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）、ブラウンシュワイク、ドイツにアクセス番号ＤＳＭ Ｎｏ．ＡＣＣ２８８７およびＤＳＭ Ｎｏ．ＡＣＣ２８８１で寄託された、モノクローナル抗体ＮＩＬＯ１およびＮＩＬＯ２を産生するハイブリドーマからなる。
【００１８】
本発明の別の態様では、以下：
ａ）細胞集団と、モノクローナル抗体ＮＩＬＯ１および／またはモノクローナル抗体ＮＩＬＯ２によって認識される細胞表面マーカー中のエピトープまたは抗原決定基を認識する試薬とを接触させる工程と、
ｂ）上記試薬と、上記エピトープまたは抗原決定基との接触がある細胞を選択する工程と、
を含む、幹細胞または前駆細胞が非常に豊富な集団を産生する方法について述べる。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態において、幹細胞はニューロスフィアを先導し得るヒト中枢神経系からの幹細胞である（ＮＳ−ＩＣ）。
【００２０】
本発明に係る本態様のより好ましい実施形態において、神経細胞または神経誘導細胞を含んでいる集団はニューロスフィアの培養組織から取得される。
【００２１】
本発明に係る本態様のより好ましい実施形態において、試薬は下記のリスト：
ａ）モノクローナル抗体ＮＩＬＯ１によって認識される細胞表面マーカー中のエピトープまたは決定基を認識可能な、抗体またはそのフラグメント、
ｂ）モノクローナル抗体ＮＩＬＯ２によって認識される細胞表面マーカー中のエピトープまたは決定基を認識可能な、抗体またはそのフラグメント、
ｃ）ＮＩＬＯ１抗体またはそのフラグメント、
ｄ）ＮＩＬＯ２抗体またはそのフラグメント、
ｅ）抗体ＮＩＬＯ１によって認識される細胞表面マーカーと結合するリガンドまたは分子、
ｆ）抗体ＮＩＬＯ２によって認識される細胞表面マーカーと結合するリガンドまたは分子、
ｇ）蛍光色素接合体、および、
ｈ）磁性粒子を有する接合体
から選択される。
【００２２】
本発明に係る本態様のさらに好ましい実施形態において、試薬は、発色団、化学発光材料、放射性核酸またはナノ粒子などのマーカーと結合されるモノクローナル抗体ＮＩＬＯ１および／またはＮＩＬＯ２を含む。
【００２３】
本発明のさらに好ましい実施形態において、前駆細胞の選択は、フローサイトメトリー技術、すなわちＦＡＣＳフローサイトメトリー（蛍光標示式細胞分取器）、もしくは顕微鏡検査を用いて、免疫細胞化学技術（細胞）もしくは免疫組織化学（組織）を用いて、または磁性選択法もしくは任意の他の陽性選択法によって行なう。
【００２４】
本発明の別の態様は、幹細胞または神経前駆細胞が豊富な集団を提供する。上記豊富な集団は、上述した方法によって得られる。
【００２５】
本発明に係る本態様の好ましい実施形態において、幹細胞または前駆細胞が豊富な集団は、薬物として使用される。
【００２６】
本発明に係る本態様のより好ましい実施形態において、幹細胞または前駆細胞が豊富な集団は、変性疾患または組織破壊過程に生じる疾患の治療に使用される。これらの疾患としては、限定されないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、糖尿病、循環器壊死、造血性欠乏が挙げられる。
【００２７】
本発明の別の態様によれば、薬剤のスクリーニング法および発見法は、以下の工程：
ａ）モノクローナル抗体ＮＩＬＯ１および／もしくはモノクローナル抗体ＮＩＬＯ２と結合される神経細胞または神経誘導細胞を含む集団から選択し、神経細胞または神経誘導体の集団と比較した場合、ヒトニューロスフィア開始細胞（neurosphere initiator cells：ＮＳ−ＩＣ）に関する濃縮された集団を産生する工程と、
ｂ）上記濃縮された集団を非ヒト哺乳動物に接種する工程と、
ｃ）上記哺乳動物、および上記集団を接種されていない別の非ヒト哺乳動物（対照被験体）に対して、薬学的な潜在性を有する組成物を投与する工程と、
ｄ）両哺乳動物における上記投与の作用を比較する工程と、
を含むことが説明される。
【００２８】
本発明の好ましい実施形態において、非ヒト哺乳動物はげっ歯動物である。
【００２９】
本発明の別の態様によれば、薬剤のスクリーニング法および発見法は、以下の工程：
ａ）モノクローナル抗体ＮＩＬＯ１と結合される神経細胞または神経誘導細胞を含む集団から選択し、モノクローナル抗体ＮＩＬＯ２と結合される、神経細胞または神経誘導細胞のさらなる選択によって上記集団をさらに濃縮し、神経細胞または神経誘導体の集団と比較した場合、ヒトニューロスフィア開始細胞（ＮＳ−ＩＣ）に関する濃縮された集団を産生する工程と、
ｂ）ヒトニューロスフィア開始細胞（ＮＳ−ＩＣ）となり得るヒトＣＮＳ−ＳＣに関する上記濃縮された集団を、非ヒト哺乳動物に接種する工程と、
ｃ）上記哺乳動物、および上記集団を接種されていない別の非ヒト哺乳動物（対照被験体）に対して、薬学的な潜在性を有する組成物を投与する工程と、
ｄ）上記投与の作用を比較する工程と、
を含むことが説明される。
【００３０】
本発明に係る方法の本態様の好ましい実施形態では、上述したように、非ヒト哺乳動物がげっ歯動物である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ＮＩＬＯハイブリドーマの起源を示す図である。
【図２】モノクローナル抗体の選択方法を示す図である。
【図３】免疫細胞化学の手法を用いたＮＩＬＯ１およびＮＩＬＯ２によるニューロスフィア細胞の標識を示す。
【図４】ＮＩＬＯ、およびマトリゲル（登録商標）上のニューロスフィア細胞中の神経集団を規定する抗体の二重発現を示す。
【図５】ＳＶＺ神経帯において神経前駆細胞を検出するＮＩＬＯ１を有する脳切片の標識を示す。
【図６】ＳＶＺ神経帯において神経前駆細胞を検出するＮＩＬＯ２を有する脳切片の標識を示す。
【図７】ニューロスフィア由来の細胞、およびＣ２Ｃ１２細胞株中のＮＩＬＯ２によって免疫沈降させた表面タンパク質を示す。
【図８】ニューロスフィア細胞増殖におけるＮＩＬＯ１およびＮＩＬＯ２の作用を示す。
【図９】ニューロスフィア細胞分化におけるＮＩＬＯ１およびＮＩＬＯ２の作用を示す。
【図１０】骨髄に存在する間葉前駆細胞を同定する能力があるＮＩＬＯ１を示す。
【図１１】３次元乳房構造を再構築する能力があるＮＩＬＯ１を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
〔定義〕
本明細書において用いられる用語“抗体”は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち表面マーカーまたはエピトープに対して特異的に結合する（免疫反応を伴って）抗原固定部位を含んでいる分子に関する。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部位としては、例えば、ペプシンなどの酵素による処理抗体を産生し得る、フラグメントＦ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）２を含む。
【００３３】
本明細書において用いられる表現“モノクローナル抗体”または“モノクローナル抗体組成物”は、前駆細胞の特定のエピトープと免疫反応することが可能な抗原固定部位を１種類のみ含んでいる抗体分子の集団を示す。よって、モノクローナル抗体組成物は免疫反応する前駆細胞に対して特有の結合親和性を示す。従来の抗体、すなわち“ポリクローナル抗体”は、典型的に、様々な決定基（エピトープ）に対して方向づけられる、異なる抗体を含む。一方、モノクローナル抗体は、それぞれ抗原の単一のエピトープに対して方向づけられる。
【００３４】
本明細書における用語“エピトープ”は、免疫システム、具体的には抗体、Ｂ細胞またはＴ細胞によって認識されるマクロ分子の一部に関する。通常、エピトープは自己のものとは異なるタンパク質由来であると考えられているが、ホスト由来の配列が認識され、エピトープとして分類されてもよい。
【００３５】
組換えＤＮＡ技術を用いることによって、可変領域または抗原認識領域をバインドする抗体を、ヒト抗体の枠組みに構築することができる。このように、モノクローナル抗体は、遺伝子操作によって生化学的に改変されてもよいし、またはできる限り前駆細胞の認識に必須ではない部分全体または一部の抗体を欠いており、また、当該抗体にさらなる有利な性質を移す別の抗体によって人工的に置換されてもよい。
【００３６】
“組換え抗体”は、抗体をコードする核酸によって形質転換されるか、もしくは核酸導入されているホスト細胞に産生されるか、または相同組換えの結果として同じものを産生するものである。
【００３７】
“形質転換”および“核酸導入”は、細胞に核酸を導入する処理に関して、同義的に用いられる。形質転換または核酸導入の後、核酸は、ホストのゲノムに組み込まれてもよいし、染色体外要素として存在してもよい。“ホスト細胞”は、インビトロの培養組織中の細胞、およびホスト動物中の細胞を含む。米国特許出願第５，５３４，６１５号には、例えば、ポリペプチドの組合え産物に関するこれらいくつかの処理が開示されている。
【００３８】
人為的操作を用いた任意の利用可能な方法によってポリヌクレオチドが細胞に核酸導入されている場合、または細胞が、転換されたポリヌクレオチドを固有に有する元々改変された細胞の子孫である場合、細胞は“遺伝的に改変された”、“核酸導入された”、または“遺伝的に形質転換された”と言われる。多くの場合、ポリヌクレオチドは、転写可能であって、また、重要なタンパク質をコードする配列を含んでいてもよい。これにより、細胞は上記タンパク質を発現することができる。改変された細胞の子孫が同じ改変を有する場合、遺伝的な改変は“遺伝する”と言われる。
【００３９】
また、抗体は“キメリカル”であり得る。免疫グロブリンにおける重鎖領域および／または軽鎖領域は、決定された種からの、もしくは決定された抗体のクラスまたはサブクラスに属している、関連する抗体配列と同一または相同である。一方、残りの鎖は、他の種由来の抗体、または抗体の別のクラスもしくはサブクラスに属している抗体および抗体フラグメントにおいて、それらが所望の生物活性を示すように、関連する配列と同一または相同である（米国特許出願第４，８１６，５６７号）。
【００４０】
用語“超可変領域”は、本明細書において用いられる場合、抗原への結合に関与する抗体のアミノ酸残基に関する。超可変領域は、“相補性決定領域”のアミノ酸残基、および／または“超可変ループ”のアミノ酸残基を含む。骨格残基、すなわち“ＦＲ（framework residues）”は、本明細書において定義されるように、超可変領域の残基とは異なる可変ドメインのアミノ酸残基である。
【００４１】
多くの場合、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レセプター抗体）である。このヒト免疫グロブリンにおいて、レセプターの超可変領域の残基は非ヒト種の超可変領域の残基（ドナー抗体）によって置換されている。非ヒト種としては、マウス、ラット、ラビット、または所望の選択性、親和性および能力を有する、非ヒト霊長類などが挙げられる。
【００４２】
ある場合、ヒト免疫グロブリンのＦｖ領域の骨格残基（ＦＲ）は、関連する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レセプター抗体において、またはドナー抗体において検出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は、抗体機能をさらに改良するために行なわれる。一般的に、ヒト化抗体は、実質的にすべてが少なくとも１つ、および典型的には２つの可変ドメインを含む。ここでは、非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応する超可変ループのすべてまたは略すべて、およびすべてのまたは略すべてのＦＲ領域が、ヒト免疫グロブリン配列の可変ドメインである。また、ヒト化抗体は、免疫グロブリン（Ｆｃ）（一般的にはヒト免疫グロブリン）の不変領域の少なくとも一部を含む。ヒト化抗体を得るための様々な処理は、現在の技術において知られている。
【００４３】
“抗体フラグメント”は、抗体全長の少なくとも一部を含み、通常、抗原結合領域またはその可変領域を含む。抗体フラグメントとしては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント；二重特異性抗体；線形抗体；単鎖抗体分子；および抗体フラグメントによって形成される多特異的抗体を含む。抗体フラグメントを作製するいくつかの技術が開発されている。伝統的に、これらのフラグメントは未処理抗体のタンパク分解によってもたらされる。しかしながら今日では、これらのフラグメントは組換えホスト細胞を用いて直接作製することができる。例えば、抗体フラグメントは、抗体ファージのライブラリーから単離することができる。代替的に、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収することが可能であり、化学的に結合してＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成する。別の実施形態において、Ｆ（ａｂ’）２はロイシンジップＧＣＮ４によって形成されて、Ｆ（ａｂ’）２分子の集合を促進する。別のアプローチによると、組換えホスト細胞培養組織のＦ（ａｂ’）２フラグメントは、直接単離され得る。抗体フラグメントの産生に関する他の技術は、当業者に対して明らかにされるであろう。他の実施形態において、選択された抗体は単鎖Ｆｖフラグメント（single chain Fv fragment：ｓｃＦｖ）である。改定に関しては、国際公報第１９９３／０１６１８５号を参照のこと。
【００４４】
“単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）”または“抗体フラグメント”は、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む。これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。一般的に、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に配置されているポリペプチドをさらに含んでいる。当該ポリペプチドは、抗原結合のための所望の構造を形成することが可能である。
【００４５】
用語“二重特異性抗体”は、２つの抗原結合部位を有する抗体小フラグメントに関する。これらのフラグメントは、同じポリペプチド鎖に軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と結合される重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含んでいる。２つのドメインを同一鎖において対にするには近すぎる配置を採用しているため、これらのドメインは別の鎖の相補的なドメインと対にされ、２つの抗原結合部位を作り出すことを余儀なくされる。
【００４６】
“線形抗体”という表現は、１組の抗原結合領域を形成する、一対のタンデムセグメントＦｄ（ＶＨ−ＣＨ  １  −ＶＨ−ＣＨ  １）を含む抗体に関する。線形抗体は、二重特異的または単一特異的であり得る。
【００４７】
“多特異的抗体”は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して特異性のある結合を有している。一方で、上記分子は通常２つの抗原のみと結合する（すなわち、二重特異的抗体、ＢｓＡｂｓ）。本明細書において用いられる場合、三重特異的抗体などのさらに特異性を有している抗体も表現の範囲内に含まれる。二重特異的抗体の調製に関する処理については現状の技術において知られている。本発明の抗体フラグメントは、前駆細胞のエピトープと特異的に結合する能力を有する。
【００４８】
用語“幹細胞”は、増殖してさらなる幹細胞を産生する能力を有する、比較的無活動の非分化細胞に関する。また、当該細胞は、多数の前駆細胞を産生する能力を有しているとともに、分化細胞、または分化されたもしくは分化可能な娘細胞を生み出し得る。これらの細胞は自己保存することが可能である。すなわち、それぞれの細胞分裂によって、娘細胞が幹細胞にもなり得ることを意味する。
【００４９】
用語“神経幹細胞”（neural stem cell：ＮＳＣ）は、ニューロン、アストロサイトおよびオリゴデントロサイトに分化する能力がある子孫を産生することができる多能性幹細胞に関する。
【００５０】
用語“前駆細胞（progenitor cell）”は、幹細胞由来の未分化細胞に関する。前駆細胞は限定された増殖能力を有する（幹細胞とは異なり、増殖能力が限定され、したがって自己保存を示さない）が、自己再生され得る。この自己再生は、適切な条件において、特定の分化経路および場合により、ニューロン、アストロサイトまたはオリゴデンドロサイトへの分化に関与している。
【００５１】
用語“前駆細胞（precursor cells）”は、インビボまたはインビトロにおいて、幹細胞から得られるとすぐに本発明の方法によって修飾されるか、または操作される生存細胞に関する。この細胞は自己再生可能であり、且つ、多能性を有しているため、当該用語には前駆細胞および幹細胞の両方を含んでいる。インビトロにおいて、神経幹細胞由来の前駆細胞は、典型的にニューロスフィアの形態で成長するが、培養条件によって異なる成長パターンを示し得る。
【００５２】
用語“ニューロスフィア”は、神経幹細胞由来であって、インビトロにおいて培養される細胞の集団に関する。少なくともいくつかの細胞は、ネスチン表現型（陽性）（神経幹細胞の細胞質内マーカーであるネスチンと反応する）である。この集団は、幹細胞および／または前駆細胞からなり、分化した細胞を含んでいてもよいし、含まなくてもよい。
【００５３】
神経組織の好ましい供給源は哺乳動物から得られ、より好ましくはげっ歯動物（例えば、マウスおよびラット）および霊長類の動物から得られ、最も好ましくはヒトから得られる（ヒトの胚組織を除く）。米国特許出願第５，７５０，３７６号および米国特許出願第５，８５１，８３２号には、自己再生可能であり、且つ、多能性を有する、成人ヒト神経組織、成体アカゲザル、マウス胚、および幼若マウスおよび成体マウスからの脳組織から得たＣＮＳ神経幹細胞を単離および増殖する方法が開示されている。本方法は、培養組織において、ＣＮＳ神経幹細胞から得た神経幹細胞を構築すること、およびＣＮＳ神経幹細胞の子孫を分化することを含む。
【００５４】
用語“脳室”は、脳脊髄液の流れを通す中枢神経系内の任意のキャビティまたは処理に関する。よって、当該用語には、側脳室、第３脳室および第４脳室だけでなく、中心導管（central channel）および中脳水道も包含される。
【００５５】
用語“脳室組織”は、ＣＮＳ脳室を覆っており、ＣＮＳ幹細胞および前駆細胞などの、未分化細胞の集まりを含んでいる上衣下星帯を含む組織に関する。
【００５６】
用語“恒常的な増殖性集団”は、成体哺乳動物における前脳の側脳室の上衣下星帯内に位置づけられて分化される細胞集団に関する（スマートによって概要が示される；J. Comp. Neurol. 116:325, (1961)）。この細胞集団は、上衣下星帯のいくつかの領域に当該細胞の約３３％を含む（Morshead and van der Kooy, J. Neurosci. 12:249, (1992)）。
【００５７】
詳細な説明および特許請求の範囲を通して、用語“含む（comprises）”およびそのバリアントは、他の技術的特徴、付加、要素またはステップを除くことを意図したものではない。当業者によれば、本発明の他の目的、利点および特徴は、発明の詳細な説明から部分的に、および本発明の実施例から部分的に寄せ集められ得る。以下の実施例および図面は、説明のために提供されるものであり、本発明を限定することが目的ではない。
【００５８】
〔図面の説明〕
図１．ＮＩＬＯハイブリドーマの起源を示す図である。
【００５９】
１３．５日齢胚の嗅球から産生したニューロスフィアを抗原として使用する。５〜６ランで、３ヶ月の間に５万セルを３回注射することによって、成体アルメニアンハムスター（クリセトゥラス  ミグラトリウス）を免疫する。最終免疫から３日後に、脾臓細胞をＢａｌｂ／ｃ Ｐ３−Ｘ６３．Ａｇ８．６５３の非産生ミエローマと融合させる。ＨＡＴにおいて選択したクローンを生育し、フローサイトメトリーによって分析する。
【００６０】
図２．モノクローナル抗体の選択方法を示す図である。
【００６１】
ａ）１３．５日齢成体マウスの嗅球のニューロスフィア由来の細胞、および６週齢成体マウスの成人マウスのＳＶＺから得たニューロスフィア由来の細胞を所定の強度で標識するモノクローナル抗体を、フローサイトメトリーによって選択する。サイトメトリーはコールターＸＬにおいて行なった。具体的には、細胞形態学による当該抗体の選択を１０，０００回行ない、ヨウ化プロピジウムによって染色されなかった死細胞を除去した。ｂ）ニューロスフィアとして細胞培養組織における別のランの後、ＮＩＬＯ１またはＮＩＬＯ２に関して、６週齢マウスのＳＶＺ由来の神経組織細胞を標識する。
【００６２】
図３．免疫細胞化学の手法を用いたＮＩＬＯ１およびＮＩＬＯ２によるニューロスフィア細胞の標識を示す。
【００６３】
ａ）ネスチンによってニューロスフィアを標識し、さらにＦＩＴＣ抗マウスポリクローナル二次抗体によって標識すると共に、ＮＩＬＯ１によってニューロスフィア標識し、Ｃｙ５によって標識された二次抗ハムスターによってさらに標識した。ｂ）抗ＧＦＡＰ、ＮＩＬＯ１およびＤＡＰＩ（核）によって標識する以外は、ａ）と同様であり、ｃ）、ｄ）およびｅ）、マトリゲル（登録商標）において、ニューロスフィアをＮＩＬＯ２によって標識した。
【００６４】
図４．ＮＩＬＯ、およびマトリゲル（登録商標）上のニューロスフィア細胞中の神経集団を規定する抗体の二重発現を示す。
【００６５】
ａ）およびｃ）ＧＦＡＰを有するＮＩＬＯ１を異なる倍率で示す；ｂ）およびｄ）、ＧＦＡＰを有するＮＩＬＯ２を異なる倍率で示す；ｅ）ＮＩＬＯ１およびネスチンを示す；ｆ）ＮＩＬＯ１およびｋｉ６７を示す。
【００６６】
図５．ＳＶＺ神経帯において神経前駆細胞を検出するＮＩＬＯ１を有する脳切片の標識を示す。
【００６７】
組織低温保持領域をパラホルムアルデヒドで固定し、ＮＩＬＯ１（グリーン−ＦＩＴＣ）ならびにダブルコルチン（doublecortin：ＤＣＸ）、ＧＦＡＰ、ビメンチン、βＩＩＩ−チューブリン（Ｔｕｊ１）、ｋｉ−６７およびＰＳＡ−ＮＣＡＭによって染色した。モノクローナル抗体は表１に示される。
【００６８】
図６．ＳＶＺ神経帯において神経前駆細胞を検出するＮＩＬＯ２を有する脳切片の標識を示す。
【００６９】
組織低温保持領域をパラホルムアルデヒドによって固定し、ＮＩＬＯ２（グリーン−ＦＩＴＣ）ならびにダブルコルチン（ＤＣＸ）、ＧＦＡＰ、ビメンチン、βＩＩＩ−チューブリン（Ｔｕｊ１）、ｋｉ−６７およびＰＳＡ−ＮＣＡＭによって染色した。モノクローナル抗体は表１に示される。
【００７０】
図７．ニューロスフィア由来の細胞、およびＣ２Ｃ１２細胞株中のＮＩＬＯ２によって免疫沈降させた表面タンパク質を示す。
【００７１】
ＮＩＬＯ２によって細胞をインキュベートし、その後５％ブリグ５８（シグマ）の存在下において溶解バッファーと共に使用した。精製した抽出物を様々な方法で発現させた。
【００７２】
図８．ニューロスフィア細胞増殖におけるＮＩＬＯ１およびＮＩＬＯ２の作用を示す。
【００７３】
２４時間、４８時間および７２時間示される抗体濃縮物の存在下において細胞をインキュベートし、増殖を測定するためのＭＴＺテトラゾリウム化合物を用いて増殖量を測定した。
【００７４】
図９．ニューロスフィア細胞分化におけるＮＩＬＯ１およびＮＩＬＯ２の作用を示す。
【００７５】
ニューロスフィアが存在し、ＦＧＦ２およびＥＧＦが存在せず、０．５％ＦＣＳが存在する培地において、細胞をインキュベートする。これは、前駆細胞の急速な分化をもたらし、細胞を分化させる。２日〜４日間示される抗体濃縮物の存在下で、増殖を測定するためのＭＴＺテトラゾリウム用いて細胞の増殖能を測定し、ニューロスフィア構造を分化または維持する能力を測定する。
【００７６】
図１０．骨髄に存在する間葉前駆細胞を同定する能力があるＮＩＬＯ１を示す。
【００７７】
ａ）骨髄細胞をＮＩＬＯ１によるフローサイトメトリー（分別）の手法で選択するか、または、ｂ）間葉細胞を付着する能力および獲得する能力によって選択する。ｃ）骨髄中の間葉前駆細胞またはＮＩＬＯ１によって標識された培養液中で１週間後に選択された間葉前駆細胞。ｄ）Ｓｃａ−１、Ａｌｐｈａ６、ｂｅｔａ１、ＮＩＬＯ１およびＮＩＬＯ２によって標識された骨髄または間葉細胞、ｅ）ニューロスフィア培地において２週間経過したのちのＮＩＬＯ１細胞、およびｆ）そのＴｕｊ１＋細胞における分化、またはｇ）脂肪細胞分化培地（レッドオイルで染色された）において６週間経過した後のＮＩＬＯ１細胞、またはｈ）染色されていない（グリース滴下）。
【００７８】
〔実施形態の詳細な説明〕
以下、本発明者らによって行なわれるアッセイを用いて本発明について説明する。本発明者らは、モノクローナル抗体ＮＩＬＯ１およびＮＩＬＯ２の特異性および有効性を明らかにしている。
【００７９】
＜実施例１．モノクローナル抗体ＮＩＬＯ１およびＮＩＬＯ２の産生＞
本発明者らは、神経幹細胞に対するモノクローナル抗体を取得する方法を示す。当該方法は、抗原刺激源としての、１３．５日胚細胞由来のニューロスフィアの利用、および免疫化のレセプターとしての、特異的なパターンを用いた３カ月齢未満のアルメニアンハムスターの利用を含む。ハムスター起源のモノクローナル抗体を分泌し、神経幹細胞に対して特異性を有する種属間ハイブリドーマの特異的な選択培地の選定の後、脾臓および脾臓とマウスミエローマ細胞との融合物を取得することは、胚起源および成体動物からの神経幹細胞を共に許容する。
【００８０】
（免疫化に用いられる抗原）
ニューロスフィア由来の神経幹細胞（ＮＳＣ）を用いた。ニューロスフィアとして成長するこの細胞は脱凝集することがあり、新たなニューロスフィアを形成する能力がある培養組織においてクローン化され得る。ニューロスフィアの一部を形成するこの細胞は、“インビトロ”の培養組織中で、ニューロンおよびグリア（アストロサイトおよびオリゴデンドロサイト）などの脳の様々な細胞型に分化する能力があるような神経前駆細胞と考えられる。さらに、これらの細胞は“ネスチン”などの規定された細胞内マーカーを有し、ニューロン、オリゴデンドロサイトまたはアストロサイトなどの任意の神経系統の細胞に分化し得る。
【００８１】
増殖中の細胞の状態および特性が、培養組織において続けられるランの回数に依存して変更され得るとはいえ、これらＮＳＣは、細胞希釈ランを通して培養組織において維持され得る。これらＮＳＣに対するモノクローナル抗体を取得するための本手順は、３〜５ラン（ラン０は、マウス組織からこれらの細胞を取得する時間である）のときの細胞を用いる。
【００８２】
成体マウスには、ＮＳＣの取得に用いられ得る様々な脳の領域が存在する。最も重要な神経領域は、脳室下帯（ＳＶＺ）および海馬歯状回の顆粒領域である。しかしながら、成体マウスにおけるＮＳＣ取得率は低く、最低限の数の細胞が連続的に免疫を実行するために必要となることに鑑みて、我々の手順では１３．５日齢マウス由来の胚組織（具体的には、嗅球）からＮＳＣを得る。この組織から重要な量のＮＳＣを得ることは容易であり、それは免疫化に用いられ得る。
【００８３】
（免疫化に用いられる動物）
マウス神経前駆細胞に対するモノクローナル抗体を得るために、４ヶ月齢の雄のアルメニアンハムスターを用いる。独立した部屋および穏やかな環境であるが、他のマウスと同様に、通常の温度および湿度条件の飼育小屋で、動物を飼育する。また、アルメニアンハムスターが他のマウス抗原に対するモノクローナル抗体を取得するために用いられているとはいえ、今日、アルメニアンハムスターが神経成分に対する抗体を産生するために用いられているのでは決してない。重要なのは、アルメニアンハムスターが用いられて、他のハムスター種が同じように用いられないことである。
【００８４】
５×１０６セル／ｍｌ濃度のＰＢＳにて、脱凝集した生存ニューロスフィア細胞を注射し、動物を免疫化した。免疫経路は常に腹膜内とし、皮下注射シリンジを使用して各免疫（“追加免疫”）を別の位置にした。免疫ガイドラインは次の通りである：日数は０日、３０日および６０日とした。ニューロスフィア由来の細胞によって３度目の再免疫の３日後、脾臓を除去するために動物を全身麻酔した後に屠殺した。脾臓はリンパ球を抽出するために用いられており、後述するようにリンパ球とミエローマ細胞とを融合する。
【００８５】
（細胞融合）
融合の手順は他の著者によってこれまでに示されるものに類似する。簡単に言うと、ＮＳＣによって免疫されたハムスターの脾臓由来のリンパ球を培地中で洗浄し、血清を含まないＤＭＥＭにおいて再懸濁する。マウスミエローマ細胞と、融合されることになる細胞とを５０ｍｌファルコンチューブの中で混合する。融合では、Ｐ３−Ｘ６３．Ａｇ８．６５３と称されるＢａｌｂ．ｃから得た１０７非産生ミエローマ細胞と、免疫されたハムスターの脾臓から得た１０６細胞とを使用する。これらの細胞を室温で５分間、１５００ｒ．ｐ．ｍで同時に遠心分離にかけた。浮遊物を吸引によって除去してすべて取り除く。細胞だけを含むチューブを３７℃の湯浴中に置く。細胞懸濁液を時々ゆっくりとかき混ぜながら、１分間に０．４ｍｌのポリエチレングリコール（水に４０％ＰＥＧ）を一滴ずつ添加する。その後、予め３７℃に調節された、血清を含まないＤＭＥＭ培地５ｍｌを３分以下で一滴ずつゆっくりと希釈した。懸濁液を穏やかに混合し、ＤＭＥＭ−１０％ＦＣＳ完全培地で完成させて、３７℃で３０〜４５分間インキュベートする。そして、細胞を平底９６ウェルプレートに０．１ｍｌ／ウェルで分配し、３７℃、５％ＣＯ２に設定されたインキュベーターにおいて保持する。融合から１日後、ＨＡ（２Ｘ）を含有しているＤＭＥＭ−１０％ＦＣＳ培地を０．１ｍｌ／ウェルずつ加える。この培地を求め、週に一度交換する。ハイブリッドを目視により、または低分解能の倒立顕微鏡によって検出する。融合から３週間後、１ウェルにつき２ｍｌの選択培地を有する２４ウェルプレートにコロニーを移植する。
【００８６】
（神経幹細胞に対して特異性を有する抗原の選択）
選択は、ＮＳＣ細胞に対するフローサイトメトリーにおける、本発明の抗体によって陽性標識された細胞の検出によってなされる。ＮＳＣ細胞の誘導体は；１）１３．５日齢胚から得た嗅球ニューロスフィア、２）成体マウスのニューロスフィア、３）ＢＷ５１４７マウスから得た胸腺腫瘍細胞、３）成体マウスの骨髄細胞である。
【００８７】
標識は、１／２に希釈した細胞培養液の上澄みを用いて行なった。二次抗体としては、異なる代替物（ＦＩＴＣ蛍光色素、ＰＥまたはビオチン）によって標識される抗ハムスターＩｇＧ（混合物）（Becton Dickinson,Ltd.）を用いる。
【００８８】
ニューロスフィアＮＳＣ細胞を標識し、ＢＷ５１４７胸腺腫に対してネガティブである融合上澄みを増幅し、凍結する。選択された２９５個のハイブリッドから、約８０個の抗体を選択する。選択された上澄みはＮＩＬＯ１およびＮＩＬＯ２と称されるモノクローナル抗体を含む。
【００８９】
＜実施例２．ＮＩＬＯモノクローナル抗体によるニューロスフィア細胞の同定＞
ＮＩＬＯ１およびＮＩＬＯ２は、ハムスターのＢリンパ球と、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来の非産生ミエローマＰ３− Ｐ３−Ｘ６３．Ａｇ８．６５３．６５３とのハイブリドーマによって産生される、ハムスター免疫グロブリンＩｇＧである。種属間の融合（ハムスター×マウス）であるにも関わらず、ハイブリドーマの安定性は選択およびクローニングを保証するほど十分高い。ＮＩＬＯ１ハイブリドーマおよびＮＩＬＯ２ハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体は、Ｇ−タンパク質またはＡ−タンパク質とのセファロースカラム結合によって精製する。これにより、抗体の純度を保証し、様々な色素（フルオレセイン、フィコエリスリンなど）によって直接標識することが可能になる。現在、ＮＩＬＯ抗体はＦＩＴＣによって、およびＰＥによって標識される。
【００９０】
ＮＩＬＯ１抗体およびＮＩＬＯ２抗体は、免疫細胞化学、免疫組織化学、および本明細書に示される機能調査によって示されるように、神経幹細胞に対して極端な選択性を有する。
【００９１】
一方、これらの抗体と磁性粒子との結合が試験されており、他の供給源からの神経前駆細胞集団の１回のみのランで、迅速な精製が可能である。このことは、１回のランで、細胞再構成実験において用いられている骨髄集団を濃縮することを可能にしている。この状況は、変性疾患（アルツハイマー病、パーキンソン病など）、または組織破壊過程で生じ、今日、非常に多くの影響を伴う疾患（糖尿病、心血管系壊死、造血性欠乏など）に多大な波紋をもたらすことになる。
【００９２】
ＮＩＬＯ抗体の卓越した選択性を実証するために、様々なパターンの実験計画を行なっている。第１の調査は、フローサイトメトリーを用いて検出されるニューロスフィア細胞の標識を実証することからなる。これらの抗体による細胞の標識は、このＤＮＡマーカーに対してネガティブな細胞を排他的に選択するために、ヨウ化プロピジウム（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で行なった。ここでは、生存細胞の標識が保証されており、しかも標識が細胞質内ではない（図２）。モノクローナル抗体ＮＩＬＯ１およびＮＩＬＯ２によって標識された細胞の特性および比率は両者の間で異なっており、各抗体は異なる表面タンパク質を同定することを示唆する。
【００９３】
成体マウスの脳の脳室下帯から産生されたニューロスフィア（図３ａ）、１３．５日齢マウス胚からの脳の嗅球から産生されたニューロスフィア（図３ｂ）、および成体マウスの嗅球から産生されたニューロスフィア（図３ｃ）を、免疫細胞化学技術を用いて分析する。ニューロスフィアを市販の抗ネスチン抗体または抗ＧＦＡＰ抗体を用いて二重染色することによって標識する。二重標識は、染色された細胞の特異性および当該細胞と神経幹細胞との結合を示す。さらに、各標識は、分離され、且つ、マトリゲル（登録商標）を使用した培養プレートの樹脂に付着されたニューロスフィア細胞において行なった。これにより、さらに詳細な個々の分析が可能になる。図４は、マトリゲル中の細胞におけるＧＦＡＰ、ネスチンおよびＫｉ−６７ ＮＩＬＯ１またはＮＩＬＯ２の同時発現を示す。ＧＦＡＰは、極めて前駆型の細胞またはグリア細胞を標識する。ＧＦＡＰを含む両ケースにおいて染色は単細胞であるが、ＧＦＡＰおよびＮＩＬＯの標識は異なる領域に局在化しており、細胞内に同時発生しないことを明白に確認することができる。
【００９４】
図３では、神経幹細胞の細胞質内マーカーであるネスチンが存在しているＮＩＬＯ１細胞の有無を確認することが可能である。とはいえ、ＮＩＬＯ１はネスチン陽性神経前駆細胞内の細胞分集団を標識する。
【００９５】
＜実施例３．脳のＳＶＺ領域におけるＮＩＬＯマーカー＞
ＮＩＬＯ抗体は、成体マウス脳の神経原性領域における限定的に存在することによって証明されるように、神経幹細胞に特異的である。主に、ＮＩＬＯに対してポジティブな細胞は、成体マウスのＳＶＺ領域および海馬の歯状回において検出されている。
【００９６】
ＮＩＬＯ１細胞およびＮＩＬＯ２細胞が神経前駆細胞に関連することを証明するために、ダブルコルチン（doublecortin：ＤＣＸ）、ネスチン（nestin：Ｎｅｓ）、ＧＦＡＰ、ビメンチン、βＩＩＩ−チューブリン、ＰＳＡ−ＮＣＡＭおよびＫｉ６７によって二重標識する、免疫組織化学調査標識を行なう。すべてのマーカーは、神経前駆細胞からの神経細胞の発達において、添付の表１に示すように異なる段階で関連している。組織化学分野は、切片を詳細に分析する目的のため、やや厚い切片（３０ミクロン）でクリオスタットによって実施される。
【００９７】
データは、ＮＩＬＯ１（図５）およびＮＩＬＯ２（図６）が、周期的に前駆細胞を同定している神経前駆細胞集団および原始神経芽細胞の選択マーカーであることを示す。つまり、それらの標識はＤＣＸ、Ｋｉ６７、ビメンチン、βＩＩＩ−チューブリンに対して二重にポジティブなマーカーに同時発生し、ＧＦＡＰマーカーと非常に近接している。それは直接的な同時発生ではないものの、マトリゲル中の細胞の組織化学において観察されるように、非常に近接した領域に同時に局在する。
【００９８】
【表１】
0005643187.tif 000002
0005643187.tif 000003
表１．細胞および神経原性領域におけるＮＩＬＯの有無を検出するために用いられるマーカー
【００９９】
＜実施例４．ＮＩＬＯ抗体によって認識される表面タンパク質の同定＞
これら抗体のうちＮＩＬＯ抗体免疫沈降によって認識される抗体を同定することは、神経前駆細胞において、ＮＩＬＯ抗体によって認識される抗原のおおよその大きさを知るために行なわれている。神経前駆細胞は、ビオチンによって、またはＮＩＬＯ２およびＮＩＬＯ２抗体によって認識される代替可能なＣ２Ｃ１２系統によって、細胞表面において標識されて用いられる。ビオチンによる細胞標識の後、抗体は結合され、続いてＢｒｉｊｉ界面活性剤を用いる材料および方法（Material and Methods using the Briji detergent）において述べられているように溶解される。ニューロスフィア細胞およびＣ２Ｃ１２系統のいずれにおいても、ＮＩＬＯ２によるタンパク質免疫沈降では１４０ｋＤおよび１７０ｋＤａの２つに大多数のバンドがある。一方、ＮＩＬＯ１は“ウェスタンブロット”に用いられなくてよい。これらのデータは、免疫組織化学に基づくこれら抗体の類似の位置に依存せず、各モノクローナル抗体が前駆細胞の細胞表面タンパク質の異なる型を同定することを証明する。極めて関連性のある状況では、前駆細胞の細胞表面タンパク質の異なる型がＮＩＬＯによって同定される表面抗原（細胞レセプター）により同定される。
【０１００】
＜実施例５．ニューロスフィアの増殖分化におけるＮＩＬＯ１抗体およびＮＩＬＯ２抗体の機能性作用＞
ＮＩＬＯの細胞分布は、神経幹細胞において均一である。神経幹細胞は、その前駆細胞の状態で維持される。この状態は、繊維芽細胞成長因子２（fibroblast growth factor 2：ＦＧＦ２）および表皮成長因子（epidermal growth factor：ＥＧＦ）などの成長因子の存在下における厳密な細胞培養条件のもと、ウシ胎児血清（fetal calf serum：ＦＣＳ）の非存在下で保持されることでもたらされる。これらの因子、すなわちＦＧＦおよびＥＧＦの非存在下で、且つ、ＦＣＳの存在下において細胞は増殖を停止し、任意の神経系統細胞：すなわち、ニューロン、オリゴデンドロサイト、またはアストロサイトに分化する。
【０１０１】
神経前駆細胞の増殖におけるＮＩＬＯ抗体の可能な機能性作用は、研究中である。ＮＩＬＯ１抗体およびＮＩＬＯ２抗体を用いることで、抗体と、成体ＯＢまたは１３．５日齢のＯＢからのＳＶＺニューロスフィア由来の神経幹細胞との相互作用は、神経細胞の任意の型（ニューロン、オリゴデンドロサイトまたはアストロサイト）への増殖プロセス（図８）を阻害する能力および分化プロセス（図９）の能力があることが証明されている。
【０１０２】
ニューロスフィアが増殖可能な培養培地において、ニューロスフィアに対して異なる濃度でＮＩＬＯ１およびＮＩＬＯ２をともに添加したとき、細胞増殖は停止する。持続的な抗体の存在下において、細胞は５〜６日後に死滅する。これらすべてのデータは、ＮＩＬＯ抗体が細胞自己再生過程に関連するレセプターを認識すること、または自己再生能力を維持する因子（ＬＩＦまたはその他など）を阻害することを示唆する（図８）。
【０１０３】
０．１％ウシ血清の有無にかかわらず、ＦＧＦ２およびＥＧＦの非存在下であって、且つ、異なる濃度の精製ＮＩＬＯ１の存在下でニューロスフィア細胞が分化培地に認識される場合、抗体の非存在下において観察される作用と比較して、分化プロセスがかなり低減されることがわかっている。ＮＩＬＯ２は、ＮＩＬＯ１よりも標識されないものの、ニューロスフィアの分化に同様の作用をもたらす。
【０１０４】
これらのデータは、神経前駆細胞の表面構造によるＮＩＬＯの継続的な相互作用が、これらの細胞の挙動に重要な変化を生むことを証明している。それは、ＮＩＬＯ抗体が前駆細胞の生態に不可欠な表面構造を認識することを示唆する。
【０１０５】
＜実施例６．ＮＩＬＯ１によって同定された非神経前駆細胞の識別＞
ＮＩＬＯモノクローナル抗体を有する他の組織の分析は、神経領域の外側にこれら抗体によって同様に標識される他の少数集団が存在することを証明した。特に、ＮＩＬＯ１抗体によって同定される２つの前駆細胞集団は、骨髄の間葉前駆細胞および乳房組織の前駆細胞である。
【０１０６】
骨髄においてＮＩＬＯ１によって標識されるごくわずかな細胞、および新生児マウスの脳内移植において神経組織による変化に見込まれる当該細胞の関与が同定された。骨髄内のＮＩＬＯ１によって標識されるどちらかの型の細胞を研究および分析した。細胞播種後、数日の培地に付着して並んだ細胞がＮＩＬＯ１に対してポジティブとなることから（図１０）、ウシ血清を有する培養培地の樹脂に対して付着させることによって間葉細胞を作製した。これらの細胞は、神経組織培養条件（ニューロスフィアを生育するための培養培地）において、Ｓｃａ−１、ならびにアルファ６インテグリンおよびベータ１インテグリンだけでなく、ネスチンマーカーおよびＮＩＬＯ１マーカーもまた得られるため、間葉細胞と考えられる。さらに、βＩＩＩ−チューブリン陽性細胞に関して、ＦＧＦ２因子およびＥＧＦ因子のない培地において分化されるときにこれらのマーカーは見当たらない。これは、当該細胞が間葉細胞の起源である可能性を示唆し得る。さらに、脂肪細胞中の間葉細胞の分化における培養条件のため、これらの細胞はグリースを含む細胞の６週培養組織において生存可能であり（図１０ｈ）、レッドオイルによって標識される（１０ｇ）。このことは、間葉組織由来の様々な種類の組織を産生する能力を証明する。
【０１０７】
＜実施例７．ＮＩＬＯ１による胸組織前駆細胞の同定＞
６週齢マウスの乳房組織の脱凝集状態で、ＮＩＬＯ１にわずかな細胞（＜３％）を同定する能力があることが観察されている。マンモスフィアを形成する能力を有するこれらの細胞は、Ｓｃａ−１によって弱く標識されていることから、前駆細胞であり得ることを示す（図１１ｂ）。この議論を証明するために、脱凝集した乳房組織細胞をＮＩＬＯ１抗体によって標識し、無菌状態で分離した。続いて、ＮＩＬＯ１陽性細胞およびＮＩＬＯ１陰性細胞を実験用マウスの胸腺脂肪中の乳房前駆細胞の移植に用いた。そして、３次元乳房構造の有無を移植後８週目に分析した（図１１ｃ）。観察されるように、サイトメトリーを用いて選択した１２００セルのＮＩＬＯ１細胞は、３次元乳房構造を再構築する能力があった。これらのデータは、ＮＩＬＯ１が乳房組織前駆細胞の構造を認識することを示すと思われる。
【受託番号】
【０１０８】
ＤＳＭ  ＡＣＣ２８８１
ＤＳＭ  ＡＣＣ２８８７
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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