(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）固体支持体；
ｂ）固体支持体に結合したタンパク質リガンド；
ｃ）タンパク質リガンドと共有結合的に相互作用する、固体支持体に結合した活性化基；
ｄ）固体支持体に結合した会合性基；
を含むアフィニティークロマトグラフィーマトリックスであって、
会合性基がタンパク質リガンドと非共有結合的に相互作用すること；
会合性基と活性化基の両方は、別個に固体支持体に結合されていること；および
固体支持体は、
ｉ）会合性基が固体支持体と相互作用するように、前記固体支持体を前記会合性基に接触させること；
ｉｉ）ステップｉ）の後、活性化基を用いて前記固体支持体を活性化すること；
ｉｉｉ）ステップｉｉ）の後、前記固体支持体をタンパク質リガンドに接触させ、前記活性化基を介して共有結合するようにするとともに、前記会合性基と非共有結合的に相互作用するようにし、前記タンパク質リガンドが前記固体支持体に結合すること；
を含む方法によって、タンパク質リガンドに連結されること
を特徴とする前記アフィニティークロマトグラフィーマトリックス。
【請求項２】
固体支持体が、ビーズである、請求項１に記載のアフィニティークロマトグラフィーマトリックス。
【請求項３】
ビーズが、アガロース・ビーズである、請求項２に記載のアフィニティークロマトグラフィーマトリックス。
【請求項４】
会合性基が、帯電分子種である、請求項１に記載のアフィニティークロマトグラフィーマトリックス。
【請求項５】
帯電分子種が、陽電荷を帯びている、請求項４に記載のアフィニティークロマトグラフィーマトリックス。
【請求項６】
帯電分子種が、陰電荷を帯びている、請求項４に記載のアフィニティークロマトグラフィーマトリックス。
【請求項７】
会合性基が、疎水性である、請求項１に記載のアフィニティークロマトグラフィーマトリックス。
【請求項８】
タンパク質リガンドが、プロテインＡおよびプロテインＧから選ばれる、請求項１に記載のアフィニティークロマトグラフィーマトリックス。
【請求項９】
混合物から標的分子を精製する方法であって、
１）標的分子が請求項１に記載のマトリックスのタンパク質リガンドに結合するように、混合物を、条件の第一の組の下で、請求項１に記載のアフィニティークロマトグラフィーマトリックスと接触させること；および
２）標的分子が請求項１に記載のマトリックスのタンパク質リガンドともはや結合しないように、１）の前記条件を変更し、それによって関心のある物質を精製すること
を含む前記方法。
【請求項１０】
標的分子が、免疫グロブリンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
標的分子が、融合タンパク質である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
融合タンパク質が、Ｆｃ融合タンパク質である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
免疫グロブリンが、モノクロナール抗体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
段階１）の後および段階２）の前に、アガロース支持体を洗浄緩衝液と接触させることを含む不純物を除去するための中間洗浄段階を更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
不純物が、小分子、タンパク質、核酸またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
洗浄緩衝液が、酸性ｐＨおよび塩または両方を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
ｐＨが、５から６．９９の範囲である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
洗浄緩衝液が、５．０から８．０の範囲のｐＨを有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
洗浄緩衝液が、塩基性ｐＨを有し、０．０００１Ｍより多く、０．８Ｍより少ないＮａＣｌを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
ｐＨが、７．４である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
洗浄緩衝液が、アミノ酸またはアルキル化アミノ酸を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
アミノ酸またはアルキル化アミノ酸が、Ｌ−アラニン、ベタイン、グリシンバリン、グルタミン酸およびリジンから選ばれる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
アミノ酸が、帯電アミノ酸である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
ａ）アガロース支持体；
ｂ）前記アガロース支持体に共有結合的に結合しているプロテインＡ；および
ｃ）前記固体支持体に別個におよび共有結合的に結合し、前記プロテインＡと非共有結合的に相互作用する帯電分子種；
を含むアフィニティークロマトグラフィーマトリックスであって、
少なくとも１０ｇ／ＬのプロテインＡがアガロース支持体の表面に結合すること；および
アガロース支持体は、
ｉ）帯電分子種がアガロース支持体と相互作用するように、前記アガロース支持体を前記帯電分子種に接触させること；
ｉｉ）ステップｉ）の後、活性化基を用いて前記固体支持体を活性化すること；
ｉｉｉ）ステップｉｉ）の後、前記アガロース支持体をプロテインＡに接触させ、前記活性化基を介して共有結合するようにするとともに、前記帯電分子種と非共有結合的に相互作用するようにし、前記プロテインＡが前記アガロース支持体に結合すること；
を含む方法によって、プロテインＡに連結されること
を特徴とする、前記アフィニティークロマトグラフィーマトリックス。
【請求項２５】
アガロース支持体がアガロース・ビーズである請求項２４に記載のマトリックス。
【請求項２６】
活性化基が、臭化シアン、アルデヒド、エポキシドおよび活性化されたカルボン酸から成る群から選択される請求項１に記載のマトリックス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照によりその全体を本明細書に組み入れる、２００６年１月６日出願の米国仮出願第６０／７５６８７３号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、一般的にクロマトグラフィーの分野に関する。ある特別な実施形態において、本発明は、アフィニティークロマトグラフィーに関するマトリックスと方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
クロマトグラフィー法は一般的に、タンパク質、核酸および多糖類などの関心のある分子を混合物から分離および／または精製するために用いられる。アフィニティークロマトグラフィーは具体的には、その混合物を、マトリックスに結合した、関心のある分子に特異性なリガンド（即ち、特異的結合相手）を有するマトリックス上を通すことを含む。関心のある分子は、リガンドに接触すると、マトリックスに結合され、従ってその混合物から拘束される。アフィニティークロマトグラフィーは、他の種類のクロマトグラフィーに対してある利点を提供する。それは、高い特異性のある、迅速な、経済的で高収量である精製方法を提供する。
【０００４】
１つの適用において、アフィニティークロマトグラフィーはモノクロナール抗体などのタンパク質を精製する為に用いられ得る。一例として、ＩｇＧサブタイプの抗体を、マトリックスに結合したプロテインＡまたはプロテインＧを有するマトリックス上を通して、ＩｇＧサブタイプの抗体が親和精製され得る（Ｂｏｙｌｅ  ａｎｄ  Ｒｅｉｓ，  １９８７，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ５：６９７；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２，  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；  Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ２００６／０１３４８０５）。
【０００５】
プロテインＡおよびプロテインＧなどのタンパク質リガンドを、固体支持体（例えばクロマトグラフィー媒体）に取り付ける方法は、以前に記述されている（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９２，  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；  Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．５，８７４，１６５；３，９３２，５５７；４，７７２，６５３；４，２１０，７２３；５，２５０，６１２３；欧州特許出願ＥＰ１３５２９５７Ａ１，ＷＯ２００４／０７４４７１．参照）。通常、該媒体は、例えばエポキシド（エピクロルヒドリン）、シアン（臭化シアン（ＣＮＢｒ））、Ｎ，Ｎ−ジスクシンイミジル炭酸塩（ＤＳＣ）、アルデヒドまたは活性化カルボン酸（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）活性化エステル）などの反応性官能基（「活性化基」）で活性化される。これらの活性化基は、ＣＮＢｒの場合のように、基材マトリックスに直接取り付けられ得るか、または通常リンカーのブタンジオールジグリシジルエーテル（通常のエポキシドカップリング剤）中に見られる炭素と酸素の１０員環などの炭素、酸素および窒素原子の直鎖である「リンカー」またはスペーサー分子の一部であり得る。活性化された媒体は、ついでカップリング条件下で、該タンパク質リガンドと平衡化される。該カップリング反応が終了すると、該媒体は完全に洗浄される。プロテインＡに対して、通常タンパク質４−６ｍｇ（リガンド密度）がロードされ４０ｇ／ＬのＩｇＧ最大静的容量（Ｑｓ）が得られる。タンパク質リガンド密度が静的容量を決める。この静的容量は、クロマトグラフィー分離中に使用され得るタンパク質の容量の上限を提供する。一般に、動的容量またはロード容量（Ｑｄ）は与えられた媒体で静的容量と相関する。
【０００６】
アガロース支持体への取り付けに適したプロテインＡの組み換え形もまた記述されている。該タンパク質の組み換え形は末端システインを有するように設計されている（例えば、米国特許第６，３９９，７５０；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｒ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ，  Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ（登録商標）ａｎｄ  Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ  Ｘｔｒａ（登録商標）参照）。この組み換えプロテインＡを用いて、５５から７０の範囲のＩｇＧの静的容量が達成されている。しかし、この組み換えプロテインＡの使用に関連する１つの制約は、それが選択的なカップリング官能基を含むように遺伝子的に設計されなければならず、これは時間を消費し、高価なことである。
【０００７】
タンパク質リガンドを固体支持体にカップリングするためのもう１つの戦略は、「リンカーを利用するカップリング」である。リンカーを利用するカップリングは、以下に詳述するリガンドを利用するカップリングと対照的に、該リガンド（即ち、精製すべき標的分子の特異結合相手）および該リガンドの固体支持体へのカップリングに利用し得る、適した会合官能基の両方を含む単一の分子に依存することで特徴付けられる。この技術は、関心のあるタンパク質リガンドを連結するために設計されたリンカーまたはスペーサーの中に官能基（例えば、帯電アミン）を設計することを含む。これらのシステムにおける該リンカーはまた、該タンパク質を該リンカーにカップリングする為の活性化基も有する。該リンカーは、先ず該固体支持体と会合され、ついでタンパク質と接触される。従って、単一分子のリンカーは、該タンパク質をマトリックスに共有結合的に取り付ける役割と該タンパク質と非共有結合的に相互作用する２つの役割を果たす。これは、カップリング反応の前／中に成分のいくつかの前会合を提供する。この技術は、電気泳動の膜ブロティングのための膜表面にグリカンを連結するために開発された（米国特許第５，５４３，０５４号；Ｃｈａｒｋｏｕｄｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ２８：１０５５）。
【０００８】
リンカーを利用するカップリングのもう一つの例は、市販の商品Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ１５（登録商標）（ＢｉｏＲａｄ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）に見られる。Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ１５（登録商標）は、正に帯電した官能基を含むリンカーアームの１部としてＮＨＳ活性化されたカルボン酸で誘導体化されたアガロース支持体である。正に帯電した官能基は二級アミンである。このアミンは、ｐＨ７．４でプロトン化され、６未満の等電点のタンパク質のカップリングを可能にする。Ａｆｆｉｇｅｌマトリックスの性質およびリンカーを利用するカップリングによって作られた他のこのようなリガンドは、会合性基（正の電荷）が、２つの官能基の固定した１：１の比を提供するタンパク質カップリングリンカーの一部であるために制約を有する。プロテインＡをアガロースにカップリングするためのもう一つの帯電したリンカーアームが米国特許第５，２６０，３７３に記述されている。ここでは、アルギニンを含む短いリンカーアームが、アガロース支持体へのタンパク質カップリングを容易にするために用いられる。このアルギニンリンカーは、ＮＨＳで活性化され、正の電荷を有する。しかし、結果は、リンカーを利用しないカップリングと比べて、ＩｇＧの小幅な改善が達成されるにすぎない。更に、上述の１：１比がここでも同様に維持されている。リンカーを介して固体支持体に結合されたプロテインＡが最近米国特許出願第１０／９２８，７３１に記述されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００６／０１３４８０５号明細書
【特許文献２】米国特許第５，８７４，１６５号明細書
【特許文献３】米国特許第３，９３２，５５７号明細書
【特許文献４】米国特許第４，７７２，６５３号明細書
【特許文献５】米国特許第４，２１０，７２３号明細書
【特許文献６】米国特許第５，２５０，６１２３号明細書
【特許文献７】欧州特許出願公開第１３５２９５７号明細書
【特許文献８】国際公開第２００４／０７４４７１号
【特許文献９】米国特許第６，３９９，７５０号明細書
【特許文献１０】米国特許第５，５４３，０５４号明細書
【特許文献１１】米国特許第５，２６０，３７３号明細書
【特許文献１２】米国特許出願第１０／９２８，７３１号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｂｏｙｌｅ  ａｎｄ  Ｒｅｉｓ，  １９８７，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ５：６９７
【非特許文献２】Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２，  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ
【非特許文献３】ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｒ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ，  Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ（登録商標）ａｎｄ  Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ  Ｘｔｒａ（登録商標）
【非特許文献４】Ｃｈａｒｋｏｕｄｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ２８：１０５５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
発酵および組織培養法（例えば、モノクロナール抗体の製造のため）のスケールアップは、これらの方法で製造される標的分子の容量の増加および濃度の増加をもたらした。リッターあたり１グラムを超す製品濃度は珍しいことではない。これらの製品は販売され得る前に精製が必要である。従って、良好な製品収量を与える増強された結合容量を有し、経済的で、製造が容易なクロマトグラフィーマトリックスの必要性がある。以下に記述する本発明の多様な実施形態はこれらのおよび他の必要性を満たす。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（本発明の概要）
ある実施形態において、本発明は、該マトリックスが固体支持体および少なくとも１つのタンパク質リガンドを含み、その方法が、ａ）会合性基が該固体支持体と反応するように、該固体支持体を該会合性基に接触させること；ｂ）該固体支持体を活性化すること（即ち、活性化基の添加）；ｃ）該タンパク質リガンドが該固体支持体に結合し、ａ）の該会合性基と相互作用するように、該固体支持体を該タンパク質リガンドに接触させること；
を含む、アフィニティークロマトグラフィーマトリックスを作る方法を提供する。
【００１３】
ある他の実施形態において、本発明は、ａ）固体支持体；ｂ）該固体支持体に結合したタンパク質リガンド；ｃ）会合性基が、タンパク質リガンドと相互作用している該固体支持体に別個に結合した会合性基を含む、アフィニティークロマトグラフィーマトリックスを提供する。
【００１４】
更に他の実施形態において、本発明は、
標的分子がマトリックスのタンパク質リガンドに結合するように、条件の第一の組の下で、混合物を
ａ）固体支持体；ｂ）該固体支持体に結合したタンパク質リガンド；およびｃ）会合性基が、該タンパク質リガンドと相互作用している該固体支持体に別個に結合した該会合性基；を含むアフィニティークロマトグラフィーマトリックスと接触させること；および２）標的分子が該マトリックスの該タンパク質リガンドにもはや結合しないように、１）の条件を変更し、それによって関心のある物質を精製することを含む、該混合物から標的分子を精製する方法を提供する。場合により、例えば、リン酸塩緩衝食塩水、水または以下に記述した補充された緩衝液などの適した洗浄剤を用いる１つ以上の洗浄段階が段階１および２の間に行われ得る。該マトリックスは、段階１に先立って適切な緩衝液で平衡化され得る。
【００１５】
更に他の実施形態において、本発明は、ａ）会合性基が固体支持体と相互作用するように、該固体支持体を該会合性基に接触させこと；ｂ）該固体支持体を活性化すること；
ｃ）タンパク質リガンドが該固体支持体に結合し、ａ）の該会合性基と相互作用するように、該固体支持体を該タンパク質リガンドに接触させること；を含む、該タンパク質リガンドを該固体支持体に連結する方法を提供する。
【００１６】
ある更なる実施形態において、本発明は、ａ）帯電分子種がアガロース支持体と共有結合で反応するように、該アガロース支持体を該帯電分子種に接触させること；ｂ）該アガロース支持体を活性化基で活性化すること；
ｃ）プロテインＡが該固体支持体に共有結合し、ａ）の該帯電分子種と非共有結合的に相互作用するように、該アガロース支持体を該プロテインＡに接触させること；を含む、該プロテインＡをアガロース支持体に連結する方法を提供する。
【００１７】
更に他の実施形態において、本発明は、ａ）アガロース支持体；ｂ）該アガロース支持体に共有結合的に結合したプロテインＡ；ｃ）固体支持体と共有結合的に結合し、該プロテインＡと非共有結合的に相互作用する帯電分子種を含む、アフィニティークロマトグラフィーマトリックスを提供する。
【００１８】
更に他の実施形態において、本発明は、アガロース・ビーズの表面に結合したタンパク質リガンドの少なくとも１０ｇ／Ｌを含む、アガロース・ビーズを提供する。該タンパク質リガンド（例えば、プロテインＡ，プロテインＧ）は親和性リガンドとして働き得、従って、標的分子（例えば、関心のあるタンパク質）の特異的結合相手であり得る。
【００１９】
いくつかの実施形態において、タンパク質リガンドは、介在性リンカーなしに、活性化された官能基を介して固体支持体に、例えば共有結合的に結合する。該タンパク質リガンドは、いずれかの介在性リンカー分子によりにまたは介在性リンカー分子なしに、該固体支持体に明確な共有結合を介して共有結合的に結合する１つ以上の会合性基と非共有結合的に相互作用し得る。従って、ある実施形態において、本発明は固体支持体に結合したリンカーを利用しない会合性基を提供する。ある実施形態において、本発明は固体支持体に結合したリンカーを利用しないタンパク質リガンドを提供する。ある実施形態において、会合性基およびタンパク質リガンドはそれぞれ固体支持体に共有結合を介して別個に結合される。
【００２０】
他の実施形態において、タンパク質リガンドは、介在性リンカー分子を有する活性化された官能基を介して、固体支持体に、例えば共有結合的に、結合する。該タンパク質リガンドは、いずれかの介在性リンカー分子なしに、該固体支持体に共有結合的に結合している１つ以上の会合性基と非共有結合的に相互作用し得る。従って、ある実施形態において、本発明は、固体支持体に連結したリンカーを利用しない会合性基および該固体支持体に連結したリンカーを利用するタンパク質リガンドを提供する。
【００２１】
他の実施形態において、本発明は、固体支持体に連結した会合性基および該固体支持体（そこでは、該会合性基および該タンパク質リガンドのいくつかの部分集団がリンカーを介して該固体支持体に連結している。）に連結したタンパク質リガンドを提供する。該タンパク質リガンドのいくつかの集団は、リンカーを介して該固体支持体に連結され得、または該会合性基のいくつかの集団は、該リンカーを介して該固体支持体に連結され得る。いくつかの実施形態において、会合性基およびタンパク質リガンドは両方とも、異なるリンカーを介して固体支持体に連結される集団を有し得る。
【００２２】
更に他の実施形態において、本発明は、例えば共有結合によって、固体支持体に連結したリンカーを利用した会合性基を提供する。該会合性基は、いずれかの介在性リンカー分子なしで、該固体支持体に共有結合したタンパク質リガンドと例えば非共有結合的に相互作用し得る。
【００２３】
本発明の更なる目的及び利点は、一部は以下の記述において説明され、一部は記述から明らかであり、または本発明の実施によって確認され得る。本発明の目的及び利点は、添付の請求項において具体的に指摘した要素および組み合わせによって理解され達成され得る。
【００２４】
先述の一般的な説明及び以下の詳細な説明は単に典型的で、説明のためのものであり、請求した本発明を制限するものでない。
【００２５】
（発明の説明）
固体支持体ヘのリガンドのカップリング方法
ある実施形態において、本発明はタンパク質リガンドをクロマトグラフィー媒体などの予め形成された固体支持体へカップリング（例えば、リガンドを利用するカップリング）する方法を提供する。この方法では、該タンパク質リガンドを共有結合的に結合する活性化剤および該タンパク質リガンドと非共有結合的に相互作用し、該タンパク質リガンドと該活性化剤の間の共有結合の形成を容易にする会合性基が両方とも、別個で明確な反応によって該固体支持体に連結され、該活性化剤および該会合性基は、それらを該固体支持体に共有結合的に結合する該反応に先立って連結されない。この方法は、ａ）該会合性基を該固体支持体と反応させることｂ）該固体支持体を活性化することおよびｃ）タンパク質リガンドを該固体支持体に連結することを含み得る。ある実施形態において、該会合性基および該タンパク質リガンドは両方とも該固体支持体に共有結合的に結合され得るが、該固体支持体を介する以外、お互いに共有結合的に結合されない。該会合性基および該活性化剤は、該固体支持体の外表面に共有結合的に結合され得る。該タンパク質リガンドは、該固体支持体に結合される該活性化剤に共有結合され得る。該会合性基は、該タンパク質リガンドと、例えば非共有結合的に相互作用し得、従って該タンパク質リガンドと該固体支持体の外表面に共有結合的に結合されている該活性化剤の間の共有結合の形成を容易にする。該タンパク質リガンドおよび該会合性基は両方とも、該固体支持体の内表面および微細孔に接近して結合し得ることが意図されている。
【００２６】
段階ａ）およびｂ）が任意の順序で実施され得ることが認識されよう。従っていくつかの実施形態において、本発明は、会合性基およびタンパク質リガンドを固体支持体に連結するために使用され得る２段階反応を提供する。段階ａ）からｃ）を独立して実施することは、該会合性基、該タンパク質リガンドおよび該固体支持体の選択における柔軟性および所望のアフィニティークロマトグラフィーを実施するための条件の最適化を可能にする該タンパク質リガンドに対する該会合性基の比の制御を含む多数の利点を提供する。これは、必然的に該タンパク質リガンドおよび該会合性基の１：１の比をもたらす、例えばリンカーを利用するカップリングなどの該タンパク質リガンドを該固体支持体にカップリングする先述の方法と対照的である。
【００２７】
先述の方法において、該活性化剤および該会合性基は、該固体支持体に結合される前にお互いに共有結合的に連結されるかまたは、該固体支持体を形成する重合反応の一部として該固体支持体の中に直接組み込まれる。これらの方法は、柔軟性に乏しく、およびリガンド密度の制御は至適以下である。ランダムカップリングまたは多点取り付けなどの他の先述の方法は、タンパク質リガンド中の利用できる任意のアミン基に依存する。多点取り付けは、柔軟性または固体支持体へのタンパク質リガンドのカップリングの制御に乏しい。
【００２８】
本発明による更なる利点は、２つ以上の異なる会合性基の使用および／または２つ以上のタンパク質リガンドの使用を含む。更に他の利点は、リガンド密度を厳重に制御し、動的容量、静的容量または両方を最適化する能力を含む。更に他の利点は、マトリックス上の望まない不純物の非特異的結合の量を制限することを提供する。非特異的結合は、所望のタンパク質リガンドを連結する能力のあるアミンを含む化学種などの化学種で固体支持体を被覆することに依存する先述の方法に対して特別な問題である。本発明によって提供されるリガンド密度の制御は、これらの先述の方法に見られる非特異的結合の高いレベルを避ける。
【００２９】
従って、固体支持体への会合性基および活性化剤を結合するための反応のアンカップリングによって、本発明は、該活性化剤および該会合性基の両方の濃度比のより良好な制御を提供し、それによって、標的タンパク質の単離のための、例えばｐＨ，緩衝液中の塩濃度などのクロマトグラフィーの条件の良好な制御および調整を提供する。従って、ある実施形態において、本発明は、タンパク質リガンドおよび会合性基の比の多様性を意図し、該タンパク質リガンド濃度が該会合性基を上回る比および該会合性基の濃度が該タンパク質リガンド濃度を上回る比を含む。本発明の多様な実施形態において複数の異なる会合性基が用いられ得ることが意図される。本複数の発明の多様な実施形態において、固体支持体を活性化するために複数の異なる活性化剤が使用され得ることも意図されている。同様に、本複数の発明の多様な実施形態において、複数の異なるタンパク質リガンドが使用され得ることも意図されている。
【００３０】
本明細書で使用されるタンパク質リガンドは、固体支持体に結合され、関心のある標的分子を特異的に結合することに適しているタンパク質を意味する。タンパク質は、完全長のタンパク質、完全長のタンパク質の断片またはサブユニット、ポリペプチドまたはタンパク質のペプチド断片を含み得る。
【００３１】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、固体支持体への高密度タンパク質リガンドのカップリングを提供する。これは同様に、例えば先述の方法と比べて、該標的分子の結合容量（例えば、静的容量（Ｑｓ）および動的容量（Ｑｄ））を増強する。１例として、先述の方法を用いて、通常、該固体支持体のｍｌあたりｎ−プロテインＡ（ブドウ球菌（スタフィロコッカス／Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ））４−６ｍｇがロードされ得る。本発明の方法を用いて、固体支持体のｍｌあたりプロテインＡ７−１００ｍｇがロードされ得る。ある実施形態において、１０ｍｇ／ｍｌを超すプロテインＡが固体支持体上にロードされ得る。他の実施形態において、少なくとも８ｍｇ／ｍｌが固体支持体上にロードされ得る。本発明のいくつかの実施形態において、プロテインＡを組み換えによる改変（例えば、システイン残基の添加により）またはリンカーを利用するカップリングへの依存のいずれもなしに、増強された静的容量および動的容量が達成される。
【００３２】
ある実施形態において、本発明の方法は、固体支持体を、該固体支持体と反応する能力がある少なくとも１つの会合性基と接触させることを含む。該固体支持体はすでに形成されていてよい（例えば、少なくとも１つの会合性基と反応され得る重合された支持体）。他の実施形態において、固体支持体は前もって形成されていなくてよく（例えば、重合されていない）、会合性基は、化学構成要素に添加され、該化学構成要素は、ついで反応されて組み込まれた該会合性基を有する固体支持体を形成するようにしてよい。該固体支持体と該会合性基の間の反応は、該固体支持体と該会合性基の間の共有結合の形成をもたらし得る。該会合性基は、従って該固体支持体の外表面に共有結合的に結合され得、内表面、例えば微細孔に接近して結合され得る。
【００３３】
会合性基を含む非共有結合的相互作用、例えばイオン相互作用、疎水性相互作用、ファンデアワールス力および水素結合もまた意図される。１例として該会合性基は、帯電分子、例えば、固体支持体に共有結合的に取り付けられているポリマー、と非共有結合的に相互作用し得る。この会合性基はまた、タンパク質リガンドと相互作用し得る。従って該固体支持体は、該タンパク質リガンドが該固体支持体と共有結合的に結合し、該会合性基と非共有結合的に相互作用するように活性化され得る。従って。該非共有結合相互作用は、該タンパク質リガンドの該固体支持体への共有結合を容易にし得る。
【００３４】
いくつかの実施形態において、会合性基は、いずれかの介入分子または連結分子を必要とせずに、固体支持体と直接反応し得る。他の実施形態において、会合性基は、該会合性基の第一の集団が固体支持体と直接反応し、該会合性基の第二の集団が１つ以上のリンカー分子を介して該固体支持体と間接的に反応する混合物として提供され得る。更に、該会合性基は、リンカー分子を用いた活性化によって修飾され得、それによって、少なくともいくつかの会合性基はリンカー分子の中に組み込まれ、他方、いくつかの会合性基は該固体支持体に、例えば共有結合で直接反応することが可能となる。ある化学反応の性質のために、タンパク質リガンドと非共有結合的に相互作用するように設計された該会合性基は該活性化基と反応し得、従って、該会合性基および該活性化基の両方を含むリンカーアームを通して、該タンパク質リガンドを該固体支持体に最終的にカップリングする。しかし、これらの活性化反応は、該固体支持体および該会合性基の両方を修飾し、タンパク質のカップリング位置の分布を生じる。これらの位置の１つの集団は、該会合性基を通して（ＣＮＢｒで活性化された第二級アミンの場合のように）該固体支持体に連結された活性化された基を含む。カップリング位置が、ベースマトリックスに直接取り付けられた活性化された基および修飾されていない会合性基（残りの修飾されていない第二級アミンを有するＣＮＢｒで活性化されたベースマトリックスの場合のように）からなる第二の集団が存在し得る。これは、「リンカーを利用するカップリング」（ここでは、ただ１つのカップリング位置の集団が存在し得る。）および「リガンドを利用するカップリング」（ここでは、カップリング位置の少なくとも２つの可変の集団が存在し得る。）の間の相違の１例である。会合性基および活性化基は、その種類、量および関与する基の反応性において独立に変化され得るために、広範囲のカップリング条件および形態が利用され得る。
【００３５】
会合性基およびタンパク質リガンドの間のすべての非共有結合相互作用が意図される。該タンパク質リガンドとの非共有結合相互作用は、例えばイオン相互作用、疎水性相互作用、水素結合を介する相互作用またはファンデアワールス力を含み得る。
【００３６】
１つの実施形態において、会合性基およびタンパク質リガンドの間の相互作用はイオン性であり得る。例えば、正に帯電した会合性基は、固体支持体に結合され得る。該固体支持体は、ついで、該タンパク質リガンドの該固体支持体への化学結合（例えば、共有結合）を容易にし得る化学官能性によって活性化され得る。該タンパク質リガンドを含む溶液のｐＨは、該タンパク質が、該固体支持体に会合した該会合性基の電荷と相補的な電荷、例えば少なくとも１つの負電荷または正味の負電荷を有するように調整され得る。該固体支持体に結合した正に帯電した該会合性基および負に帯電した該タンパク質間の相互作用は、該タンパク質リガンドの該活性化された固体支持体への結合を容易にし、従って、先述の方法に比べて、増強された結合容量を提供する。帯電分子種は、イオンであるか、または正味の電荷を有する分子であり得る。
【００３７】
タンパク質リガンドを固体支持体にカップリングするための適切な緩衝液の条件を選ぶことは、十分当業者の能力の範囲内である。適した緩衝液は、炭酸塩、重炭酸塩、リン酸塩および酢酸緩衝液などのアミンを含まない任意の緩衝液を含む。該緩衝液の塩濃度は、使用する会合性基に依存し得る。１例として、該塩濃度は、５ｎＭ−１００ｎＭの範囲であり得る。帯電した分子種が用いられる場合、該塩濃度は、少なくとも５ｎＭ、ただし０．１Ｍ未満、少なくとも５ｎＭ、ただし０．０１Ｍ未満、少なくとも５ｎＭ、ただし０．００１Ｍ未満であり得る。ある実施形態において、該塩濃度は、０．０１Ｍであり得る。疎水性分子種が用いられる場合は、高塩濃度が望ましい。従って、該塩濃度は、０．００１Ｍより多く、０．０１Ｍより多く、０．１Ｍより多くてよい。
【００３８】
本発明の方法は、０℃から９９℃の範囲の温度で実施し得る。ある実施形態において、該方法は、６０℃未満、４０℃未満、２０℃未満、１０℃未満の温度で実施され得る。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、４℃の温度で実施され得る。他の実施形態において、本発明の方法は、２０℃の温度で実施され得る。
【００３９】
会合性基
本発明における使用に適した会合性基は、イオン化学種などの帯電分子種および疎水性分子種などの非帯電分子種を含む。該会合性基は、例えば、固体支持体に直接共有結合的に結合することによって、該固体支持体を修飾し得る。イオン化学種の適した例は、第４級アミン、第３級アミン、第２級アミン、第１級アミン、スルホン酸、カルボン酸またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。疎水性分子種の適した例は、フェニル基、ブチル基、プロピル基またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。また、混合状態の分子種、例えば、帯電分子種および疎水性分子種の混合物、が用いられ得る。該会合性基はまた、タンパク質リガンドと相互作用し得る。従って、該会合性基および該タンパク質リガンドの間の相互作用は、相互作用の混合で構成され得る（例えばイオン性および疎水性分子種）。
【００４０】
該会合性基は、該固体支持体上の官能基を該会合性基上の官能基と反応させて該固体支持体に共有結合的に連結され得る。適した官能基は、アミン、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシル、イミン、アルデヒド、ケトン、アルケン、アルキン、アゾ、ニトリル、エポキシド、シアンおよび活性化されたカルボン酸基を含むが、これらに限定されない。１例として、アガロース・ビーズは、グリシジルトリメチルアンモニウムクロリドなどの正に帯電した会合性基のエポキシド官能基と反応され得るヒドロキシ基を含む。当業者は、少なくとも１つの２官能性会合性基が用いられるならば、複数の会合性基が該固体支持体に連結され得ることを認識するであろう。従って、該会合性基は、該固体支持体に直列に結合され得、またはそれらは個別に該固体支持体に直接結合されてよい。
【００４１】
タンパク質リガンドおよび標的分子
それが、関心のある標的分子の特異的結合相手であれば、本発明の実施において、任意のタンパク質リガンドが用いられ得る。タンパク質リガンドの例は、プロテインＡ，プロテインＧ，抗体のＦｃ受容体、ホルモンまたは成長因子の受容体を含み得る。該タンパク質リガンドは、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥなどの免疫グロブリンまたはその断片であり得る。断片は、標的抗原の抗原決定基および／またはＦｃ受容体および／またはプロテインＡおよび／またはプロテインＧを結合する能力を保持している免疫グロブリン断片を含み得る。該タンパク質リガンドは、Ｆｃ分子またはその断片であり得る；Ｆａｂなど；酵素、例えばグルタチオントランスフェラーゼ、チロシンキナーゼ、例えば、ＭＡＰ，Ｓｒｃ、Ｌｃｋ；基剤、例えばグルタチオン。該タンパク質リガンドは、例えば１つ以上のヒスチジンを含むポリペプチドなどのタンパク質タグであり得る。該タンパク質リガンドは、Ｅｍｂｒｅｌ（登録商標）などの融合タンパク質であり得る。該タンパク質リガンドは、転写因子、逆転写酵素、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼなどの核酸結合タンパク質であり得る。標的分子が、受容体である場合は、そのリガンド、例えば成長因子、は本発明の方法において該タンパク質リガンドとして働き得る。該標的分子が、免疫グロブリン、例えばＩｇＧ、またはＦｃ領域の少なくとの１部を含むその断片である場合、該タンパク質リガンドは、プロテインＡ、プロテインＧまたはその機能性断片であり得る。その機能性断片は、ＩｇＧのＦｃ領域またはＦｃ断片に結合する能力を保持しているプロテインＡ断片またはプロテインＧ断片を含み得る。
【００４２】
タンパク質リガンドは、天然起源の分子または設計された分子であり得る。ある実施形態において、固体支持体への結合または該固体支持体上での該タンパク質リガンドの配向のいずれかまたは両方を容易にするために、天然起源の該タンパク質リガンドを遺伝学的に改変することが望ましい場合がある。従って、用いられる会合性基に応じて、当業者は帯電基または疎水基または両方を該タンパク質リガンドの中に設計し得る。これらの改変は、該タンパク質リガンド内のどこででもなされ得る。
【００４３】
タンパク質リガンドが、プロテインＡである場合、本発明は、ｎ−プロテインＡ（天然起源）が用いられる場合、５０ｍｇ／ｍｌより大きい静的結合容量Ｑｓを与え、ｒ−プロテインＡ（組み換えプロテインＡ）が用いられる場合、６５ｍｇ／ｍｌより大きい静的結合容量Ｑｓを与える。該組み換えプロテインＡは、末端システイン以外の修飾を含み得る。
【００４４】
固体支持体、例えばビーズが溶液中に提供されている場合、タンパク質リガンドの適した濃度は、該固体支持体の０．０５−７００μｍｏｌｓ／ｍｌ、該固体支持体の０．１−１００μｍｏｌｓ／ｍｌの範囲であり得る。
【００４５】
標的分子は、選択されるタンパク質リガンドに特異的に結合する任意の分子を含み得る。該タンパク質リガンドが、プロテインＡまたはプロテインＧである場合、該標的分子は、ＩｇＧサブクラスの免疫グロブリンを含み得る。該標的分子の具体的な例は、モノクロナール抗体を含み得る。免疫グロブリンの断片もまた、それらが選択される該タンパク質リガンドに結合する能力を保持するならば意図される。該標的分子はまた、Ｅｍｂｒｅｌ（登録商標）などのＦｃ融合タンパク質を含む融合タンパク質であり得る。
【００４６】
固体支持体および活性化剤
任意の多孔性物質が、固体支持体として用いられ得る。一例として、該多孔性物質は、膜、ゲル、カセット、カラム、チップ、スライド、プレートまたはモノリスの形をとり得るが、これらに限定されない。
【００４７】
該多孔性物質は、有機または無機の分子または有機または無機の分子の混合物から構成され得、および、会合性基、活性化基のいずれかまたは両方と例えば共有結合を形成する、例えばヒドロキシ基などの、反応に適した１つ以上の官能基から構成され得る。該多孔性物質は、親水性化合物、疎水性化合物、疎油性化合物、親油性化合物またはそれらの任意の組み合わせであり得る。該多孔性物質は、ポリマーまたはコポリマーから構成され得る。
【００４８】
適した多孔性物質は、ポリエーテルスルホン、ポリアミド（例えば、アガロース）、セルロース、ポリサッカライド、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスルホン、ポリエステル、ポリビニリデンフルオライド、ポリプロピレン、フルオロカーボン（例えば、ポリ（テトラフルオロエチレンーコーパーフルオロ（アルキルビニルエーテル））、ポリカーボネート、ポリエチレン、ガラス、ポリカーボネート、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリ（アゾラクトン）、ポリスチレン、セラミック、ナイロンおよび金属を含むが、これらに限定されない。
【００４９】
固体支持体は適切な化学官能基で活性化され得る。適した化学官能基は、シアン（例えば臭化シアン）、アルデヒド、エポキシドおよび活性化されたカルボン酸（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。替わりに、会合性基が、第一級、第二級、第三級アミンである場合、該会合性基は、エピクロルヒドリンまたは２官能性エポキシドで活性化され得る。
【００５０】
リンカー
いくつかの実施形態において、本発明は、介入リンカーを介して固体支持体に連結され得る会合性基および／またはタンパク質リガンドを提供する。該リンカーは、リンキング部分に連結した少なくとも１つの官能基を含み得る。該連結部分は、官能基に連結され得る任意の分子を含み得る。従って、該連結部分は任意のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基を含み得る。該連結部分は、１から３０の範囲の炭素原子を含み得る。いくつかの実施形態において、リンカーは３０を超す炭素原子で構成され得る。連結部分は、窒素、酸素および硫黄などの少なくとも１つのヘテロ原子を含み得る。該連結部分は、分枝鎖、非分枝鎖または環状鎖で構成され得る。該連結部分は、２つ以上の官能基で置換され得る。１つの特別な実施形態において、該リンカーはヒドロキシ基を介してアガロースに取り付けられた次の式の化合物を含み得る。
ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２）４ＯＣＨ２ＣＨ（Ｏ）ＣＨ２
【００５１】
標的分子の精製法
ある実施形態において、本発明は、混合物からの標的分子の精製法を提供する。該標的分子は、特異的結合相手が、固体支持体に連結され得るならば、該特異的結合相手を有する任意の分子であり得る。該標的分子の例は、免疫グロブリンなどのタンパク質を含み得る。該免疫グロブリンは、ポリクロナール抗体またはモノクロナール抗体またはその機能的断片であり得る。該機能的断片は、その抗原になお特異的に結合し、一方で、同時に固体支持体に連結したタンパク質リガンドに特異的に結合する能力を保持している可変領域を含む免疫グロブリンの任意の断片を含み得る。
【００５２】
ある実施形態において、その方法は、ａ）条件の第一の組の下で、本発明の固体支持体（本明細書に記述した）を標的分子を含む混合物に、標的分子が、固体支持体にカップルしたタンパク質リガンドに結合するように、接触させること、およびｂ）該標的分子が親和性リガンドにもはや結合しないように、条件を変更することを含む。ある実施形態において、その方法は、段階ａ）およびｂ）の間のｐＨを変えることを含む。ある実施形態において、段階ｂ）は段階ａ）のｐＨよりも酸性であるｐＨで行い得る。ある実施形態において、段階ｂ）はｐＨを変えることを含む。従って段階ａ）は、中性のｐＨ、即ち６−８の範囲のｐＨで実施され得、段階ｂ）は、酸性のｐＨ、例えば１−６の範囲のｐＨで実施され得る。他の実施形態において、その方法は、該緩衝液の塩濃度を変えることを含む。従って、１つの実施形態において、段階ａ）において、例えば、＞０．１Ｍの高い塩濃度が使用され得、および／または段階ｂ）において、例えば、＜０．１Ｍの低い塩濃度が使用され得る。他の実施形態において、段階ａ）において、例えば、＜０．１Ｍの低い塩濃度が使用され得、および／または段階ｂ）において、高い塩濃度が使用され得る。さらに他の実施形態において、該緩衝液の該ｐＨおよび／または塩濃度は、段階ａ）およびｂ）の間で変えられ得る。
【００５３】
１.クロマトグラフィーマトリックスの中間洗浄
ある実施形態において、本発明はまた、非特異的に結合した不純物を除去し、従ってより純粋な最終製品を得るためのクロマトグラフィーマトリックスの洗浄方法を提供する。マトリックスは、当分野で知られている任意のクロマトグラフィーマトリックスを含み得る。１例として、該クロマトグラフィーマトリックスは親和性マトリックスであり得る。該親和性マトリックスは、リガンドを利用するカップリングで作られる親和性マトリックスを含む本明細書に記述する親和性マトリックスのいずれかであり得る。該方法は、該標的分子が該クロマトグラフィーマトリックスに結合後に実施される中間洗浄を含み得る。通常、非特異的に吸着された不純物は、標的化合物または製品を除く任意の成分を含み得る。非特異的に結合した不純物の例は、タンパク質、ＤＮＡ，脂質、エンドトキシン、ウイルス粒子およびフェノール赤、ペプトン、フルロニックＦ６８，アミノ酸を含む他の小分子を含み得る。
【００５４】
中間洗浄剤は、平衡化緩衝液またはフィード（即ち、未精製試料を含む溶液）と類似したｐＨおよび塩濃度を有する緩衝液、および更に、ａ）高い塩濃度（例えば、塩化ナトリウム、塩化アンモニウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸アンモニウムなど）、またはｂ）異なるｐＨ（低いまたは高い）、またはｃ）ａ）およびｂ）の組み合わせ、またはｄ）例えば、界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ）、アミノ酸およびその誘導体または有機溶質（例えば、エチレングリコール）を含む緩衝液を含み得る。中間洗浄は、ＰＢＳなどの洗浄溶液と比べてある化学種の非特異的結合を２−５倍低下し得る。ある実施形態において、ＰＢＳなどの知られている洗浄溶液と比べて、ある化学種の非特異的結合の５倍を超す低下が達成される。
【００５５】
ある実施形態において、本発明は、相溶性マトリックスを、僅かに塩基性ｐＨ（例えば、７．３−７．５）および０−１Ｍの範囲の補充塩濃度を有する緩衝液と接触させることを含む、非特異的結合分子種を除去するための相溶性マトリックスを洗浄する方法を提供する。従って、該緩衝液はＰＢＳまたは追加の塩でさらに補充された、他の任意の緩衝液であり得る。いくつかの実施形態において、該塩濃度は、０．１５Ｍ−１Ｍの範囲である。更に他の実施形態において、該塩濃度は０．２５Ｍ−１Ｍの範囲である。更に他の実施形態において、該塩濃度は、０．２５Ｍ−０．５Ｍの範囲である。
いくつかの実施形態において、該塩濃度は、０．０００１Ｍより多いが、０．８Ｍ未満である。
【００５６】
他の実施形態において、例えばＰＢＳまたは任意の他の適した緩衝液は、酸性のｐＨ（例えば、６．５）および１Ｍ未満であるが、０．０００１Ｍ（例えば、０．４Ｍ）より多い、補充された塩濃度を有し得る。更に他の実施形態において、洗浄緩衝液は、僅かに塩基性のｐＨ（例えば、７．３−７．５）を有し得る。いくつかの実施形態において、洗浄緩衝液は、１つ以上の帯電したアミノ酸を含み得る。洗浄緩衝液は、ベタイン、Ｌ−アラニン、グリシン、バリン、グルタミン酸およびリジンを含むアミノ酸またはアルキル化アミノ酸を含み得る。該アミノ酸またはアルキル化アミノ酸は、０．２５−０．５Ｍの濃度の範囲で存在し得る。ある実施形態において、アミノ酸またはアルキル化アミノ酸の濃度は、０．５Ｍ未満、ただし０．０００１Ｍより多い。更に他の実施形態において、アミノ酸またはアルキル化アミノ酸の濃度は、０．０００１Ｍから１Ｍの範囲であり得る。中間洗浄緩衝液に用いられ得る、適したアミノ酸は、グリシン、バリン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸ならびにｎ−メチルグリシンおよびトリメチルβ−アラニンなどのアミノ酸誘導体を含むが、これらに限定されない。中間洗浄緩衝液が、アミノ酸またはアミノ酸誘導体で補充されている緩衝液を含むある実施形態において、該緩衝液は、僅かに酸性のｐＨ（例えば、６．０−６．９９の範囲内）を有し得る。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】プロテインＡを含む各種のアフィニティークロマトグラフィー媒体の動的および静的容量を示すグラフである。
【図２】会合性基と連結したおよび会合性基と連結していない各種クロマトグラフィー媒体の結合容量を比較したグラフおよび本発明によるリンカーを利用するプロテインＡのカップリング方法である。
【図３】溶出プールにおいて測定されたＣＨＯ細胞タンパク質（ＣＨＯＰ）レベルを示すグラフおよび中間の塩緩衝液の洗浄ありまたはなしでの、会合性基の異なる量での、宿主細胞タンパク質の媒体への結合も示す。ＩｇＧの回収はすべて類似し、〜９０−９５％であった。
【図４ａ】中間の塩洗浄を実施することによる、リガンドを利用するカップリング化学を介して作られたプロテインＡ媒体からの溶出プールにおける宿主細胞タンパク質レベルの減少を示すグラフである。
【図４ｂ】図４ｂ中間の塩洗浄を実施することによる、リガンドを利用するカップリング化学を介して作られたプロテインＡ媒体からの溶出プールにおけるＤＮＡレベルの減少を示すグラフである。
【図５】異なるｐＨおよび塩濃度の緩衝液を用いる中間洗浄を実施することによる、リガンドを利用するカップリング化学を介して作られたプロテインＡ媒体からの溶出プールにおける宿主細胞タンパク質レベルの減少を示すグラフである。
【図６ａ】アラニンまたはベタインを含む緩衝液を用いる中間洗浄を実施することによる、リガンドを利用するカップリング化学を介して作られたプロテインＡ媒体からの溶出プールにおける宿主細胞タンパク質レベルの減少を示すグラフである。
【図６ｂ】各種アミノ酸を含む緩衝液を用いる中間洗浄を実施することによる、リガンドを利用するカップリング化学を介して作られたプロテインＡ媒体からの溶出プールにおける宿主細胞タンパク質レベルの減少を示すグラフである。
【００５８】
（実施例）
【実施例１】
【００５９】
第４級アミンリガンド、臭化シアンおよびｎ−プロテインＡ（１４ｍｇ／ｍｌ）を用いるリガンドを利用するカップリング
アガロース・ビーズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  ＮＪ）を先述した方法（Ｐｏｒａｔｈ  ａｎｄ  Ｆｏｒｎｓｔｅｄｔ，  １９７０，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，５１：４７９）に従って、エピクロルヒドリンを用いて架橋した。該アガロース・ビーズを次の方法に従って、正に帯電した会合性基（例えば、カチオン類）と反応させた：ビーズ１００ｍＬを７５重量％のグリシジルトリメチルアンモニウムクロリド（ＧＴＭＡＣ）１００ｍＬおよび５０重量％の水酸化ナトリウム３．３ｇに加えた。反応溶液を室温で一晩回転振蕩器で激しく振蕩（＞１００ｒｐｍ）した。ついで、該ビーズをろ過し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）２００ｍＬ容量で３回洗浄した。
【００６０】
該ビーズ（１０ｍＬ）をろ過し、ついで２０ｍＬの１ＭＮａ２ＣＯ３中で平衡化させた。試料を０．５ｇＣＮＢｒ／ｍＬのアセトニトリル溶液を含む第二の瓶と共に氷上で冷却した。該溶液が一旦冷却されると、該ビーズにＣＮＢｒのアセトニトリル溶液１．５ｍＬを加え、該ビーズを氷上の振蕩器上に置いた（＞１００ｒｐｍ）。２分後に、もう１つのＣＮＢｒのアセトニトリル溶液１．５ｍＬを該ビーズに加え、該ビーズを再度氷上の振蕩器（＞１００ｒｐｍ）上に置いた。該ビーズを４分間反応させ、ついで２００ｍＬの氷冷水および２００ｍＬの氷冷０．０１２ＭＮａＨＣＯ３で洗浄し，濾過した。濾過ビーズケーキ（１０ｍＬ）をｎ−プロテインＡ１４０ｍｇ（１４ｍｇ／ｍＬ）を含む０．０１２ＭＮａＨＣＯ３１０ｍＬに加えた。該ビーズを一晩室温で振蕩した。該ビーズをついで、０．２ＭＮａＨＣＯ３で洗浄し，濾過した。該ビーズケーキを、０．２ＭＮａＨＣＯ３中の０．５Ｍのエタノールアミン２０ｍＬに加えた。３０分後、該ビーズを０．２ＭＮａＨＣＯ３，０．５ＭＮａＣｌ（ｐＨ４．５）を含む０．１Ｍ酢酸ナトリウムで洗浄し、ついで最後にリン酸塩緩衝食塩水で洗浄した。静的及び動的容量を下の実施例１２に記述したように測定した。
【実施例２】
【００６１】
第４級アミンリガンド、臭化シアンおよびｎ−プロテインＡ（１７．８ｍｇ／ｍｌ）を用いるリガンドを利用するカップリング
アガロース・ビーズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  ＮＪ）を先述した方法（Ｐｏｒａｔｈ  ａｎｄ  Ｆｏｒｎｓｔｅｄｔ，  １９７０，  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，  ５１  ：４７９）に従って、エピクロルヒドリンを用いて架橋した。該アガロース・ビーズを次の方法に従って、正に帯電した会合性基（例えば、カチオン類）と反応させた：ビーズ１００ｍＬを７５重量％のグリシジルトリメチルアンモニウムクロリド（ＧＴＭＡＣ）１００ｍＬおよび５０重量％の水酸化ナトリウム３．３ｇに加えた。反応溶液を室温で一晩回転振蕩器で激しく振蕩（＞１００ｒｐｍ）した。ついで該ビーズをろ過し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）２００ｍＬ容量で３回洗浄した。
【００６２】
該ビーズ（１０ｍＬ）をろ過し、ついで２０ｍＬの１ＭＮａ２ＣＯ３中で平衡化させた。試料を０．５ｇＣＮＢｒ／ｍＬのアセトニトリル溶液を含む第二の瓶と共に氷上で冷却した。該溶液を冷却後、該ビーズにＣＮＢｒのアセトニトリル溶液１．５ｍＬを加え、該ビーズを氷上の振蕩器（＞１００ｒｐｍ）上に置いた。２分後に、もう１つのＣＮＢｒのアセトニトリル溶液１．５ｍＬを該ビーズに加え、該ビーズを氷上の振蕩器（＞１００ｒｐｍ）上に置いた。該ビーズを４分間反応させ、ついで２００ｍＬの氷冷水および２００ｍＬの氷冷０．０１２ＭＮａＨＣＯ３で洗浄し，濾過した。濾過ビーズケーキ（１０ｍＬ）をｎ−プロテインＡ２８５ｍｇ（１７．８ｍｇ／ｍＬ）を含む０．０１２ＭＮａＨＣＯ３１６ｍＬに加えた。該ビーズを一晩室温で振蕩した。該ビーズをついで、０．２ＭＮａＨＣＯ３で洗浄し，濾過した。該ビーズケーキを、０．２ＭＮａＨＣＯ３中の０．５Ｍのエタノールアミン２０ｍＬに加えた。３０分後、該ビーズを０．２ＭＮａＨＣＯ３，０．５ＭＮａＣｌ（ｐＨ４．５）を含む０．１Ｍ酢酸ナトリウムで洗浄し、最後にリン酸塩緩衝食塩水で洗浄した。静的及び動的容量を下の実施例１２に記述したように測定した。
【実施例３】
【００６３】
第４級アミンリガンド、臭化シアンおよびｒ−プロテインＡを用いるリガンドを利用するカップリング
アガロース・ビーズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を先述した方法（Ｐｏｒａｔｈ  ａｎｄ  Ｆｏｒｎｓｔｅｄｔ，  １９７０，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，５１：４７９）に従って、エピクロルヒドリンを用いて架橋した。該アガロース・ビーズを次の方法に従って、正に帯電した会合性基（例えば、カチオン類）と反応させた：ビーズ１００ｍＬを７５重量％のグリシジルトリメチルアンモニウムクロリド（ＧＴＭＡＣ）１００ｍＬおよび５０重量％の水酸化ナトリウム３．３ｇに加えた。反応溶液を室温で一晩回転振蕩器で激しく振蕩（＞１００ｒｐｍ）した。ついで該ビーズをろ過し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水２００ｍＬ容量で３回洗浄した。
【００６４】
該ビーズ（１０ｍＬ）をろ過し、ついで２０ｍＬの１ＭＮａ２ＣＯ３中で平衡化させた。該試料を０．５ｇＣＮＢｒ／ｍＬのアセトニトリル溶液を含む第二の瓶と共に氷上で冷却した。該溶液を冷却後、該ビーズにＣＮＢｒのアセトニトリル溶液１．５ｍＬを加え、該ビーズを氷上の振蕩器（＞１００ｒｐｍ）上に置いた。２分後に、もう１つのＣＮＢｒのアセトニトリル溶液１．５ｍＬを該ビーズに加え、該ビーズを氷上の振蕩器（＞１００ｒｐｍ）上に置いた。該ビーズを４分間反応させ、ついで２００ｍＬの氷冷水および２００ｍＬの氷冷０．０１２ＭＮａＨＣＯ３で洗浄し，濾過した。濾過ビーズケーキ（１０ｍＬ）を市販のｒ−プロテインＡ２５０ｍｇ（２５ｍｇ／ｍＬ）を含む０．０１２ＭＮａＨＣＯ３１０ｍＬに加えた。該ビーズを一晩室温で振蕩した。該ビーズを、ついで、０．２ＭＮａＨＣＯ３で洗浄し，濾過した。該ビーズケーキを、０．２ＭＮａＨＣＯ３中の０．５Ｍエタノールアミン２０ｍＬに加えた。３０分後、該ビーズを０．２ＭＮａＨＣＯ３，０．５ＭＮａＣｌ（ｐＨ４．５）を含む０．１Ｍ酢酸ナトリウムで洗浄し、最後にリン酸塩緩衝食塩水で洗浄した。静的及び動的容量を下の実施例１２に記述したように測定した。
【実施例４】
【００６５】
臭化シアンおよびｎ−プロテインＡ（１７．８ｍｇ／ｍｌ）を用いる、第４級アミンリガンドを用いないリガンドを利用しないカップリング
アガロース・ビーズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を先述した方法（Ｐｏｒａｔｈ  ａｎｄ  Ｆｏｒｎｓｔｅｄｔ，１９７０，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，５１：４７９）に従って、エピクロルヒドリンを用いて架橋した。ついで、該ビーズをろ過し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）２００ｍＬ容量で３回洗浄した。
【００６６】
該ビーズ（１０ｍＬ）をろ過し、ついで２０ｍＬの１ＭＮａ２ＣＯ３中で平衡化させた。試料を０．５ｇＣＮＢｒ／ｍＬのアセトニトリル溶液を含む第二の瓶と共に氷上で冷却した。該溶液を冷却後、該ビーズにＣＮＢｒのアセトニトリル溶液１．５ｍＬを加え、該ビーズを氷上の振蕩器（＞１００ｒｐｍ）上に置いた。２分後に、もう１つのＣＮＢｒのアセトニトリル溶液１．５ｍＬを該ビーズに加え、該ビーズを氷上の振蕩器（＞１００ｒｐｍ）上に置いた。該ビーズを４分間反応させ、ついで２００ｍＬの氷冷水および２００ｍＬの氷冷０．０１２ＭＮａＨＣＯ３で洗浄し，濾過した。濾過ビーズケーキ（１０ｍＬ）をｎ−プロテインＡ２８５ｍｇ（１７．８ｍｇ／ｍＬ）を含む０．０１２ＭＮａＨＣＯ３１６ｍＬに加えた。該ビーズを一晩室温で振蕩した。ついで、該ビーズを０．２ＭＮａＨＣＯ３で洗浄し，濾過した。該ビーズケーキを、０．２ＭＮａＨＣＯ３中の０．５Ｍのエタノールアミン２０ｍＬに加えた。３０分後、該ビーズを０．２ＭＮａＨＣＯ３，０．５ＭＮａＣｌ（ｐＨ４．５）を含む０．１Ｍ酢酸ナトリウムで洗浄し、最後にリン酸塩緩衝食塩水で洗浄した。静的及び動的容量を下の実施例１２に記述したように測定した。
【実施例５】
【００６７】
臭化シアンおよびｎ−プロテインＡを用いる、第４級アミンリガンドを用いないリガンドを利用しないカップリング
アガロース・ビーズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を先述した方法（Ｐｏｒａｔｈ  ａｎｄ  Ｆｏｒｎｓｔｅｄｔ，１９７０，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，５１：４７９）に従って、エピクロルヒドリンを用いて架橋した。ついで該ビーズをろ過し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）２００ｍＬ容量で３回洗浄した。該ビーズ（１０ｍＬ）をろ過し、ついで２０ｍＬの１ＭＮａ２ＣＯ３中で平衡化させた。試料を０．５ｇＣＮＢｒ／ｍＬのアセトニトリル溶液を含む第二の瓶と共に氷上で冷却した。該溶液を冷却後、該ビーズにＣＮＢｒのアセトニトリル溶液１．５ｍＬを加え、該ビーズを氷上の振蕩器（＞１００ｒｐｍ）上に置いた。２分後に、もう１つのＣＮＢｒのアセトニトリル溶液１．５ｍＬを該ビーズに加え、該ビーズを氷上の振蕩器（＞１００ｒｐｍ）上に置いた。該ビーズを４分間反応させ、ついで２００ｍＬの氷冷水および２００ｍＬの氷冷０．０１２ＭＮａＨＣＯ３で洗浄し、濾過した。濾過ビーズケーキ（１０ｍＬ）を市販のｒ−プロテインＡ２５０ｍｇ（２５ｍｇ／ｍＬ）を含む０．０１２ＭＮａＨＣＯ３１０ｍＬに加えた。該ビーズを一晩室温で振蕩した。該ビーズをついで、０．２ＭＮａＨＣＯ３で洗浄し，濾過した。該ビーズケーキを、０．２ＭＮａＨＣＯ３中の０．５Ｍのエタノールアミン２０ｍＬに加えた。３０分後、該ビーズを０．２ＭＮａＨＣＯ３，０．５ＭＮａＣｌ（ｐＨ４．５）を含む０．１Ｍ酢酸ナトリウムで洗浄し、最後にリン酸塩緩衝食塩水で洗浄した。静的及び動的容量を下の実施例１２に記述したように測定した。
【実施例６】
【００６８】
第４級アミンリガンド、ブタンジオールジグリシジルエーテルおよびｎ−プロテインＡを用いるリガンドを利用するカップリング
アガロース・ビーズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ）  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を先述した方法（Ｐｏｒａｔｈ  ａｎｄ  Ｆｏｒｎｓｔｅｄｔ，１９７０，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，５１：４７９）に従って、エピクロルヒドリンを用いて架橋した。該アガロース・ビーズを次の方法に従って、正に帯電した会合性基（例えば、カチオン類）と反応させた：ビーズ５０ｍＬを７５重量％のグリシジルトリメチルアンモニウムクロリド（ＧＴＭＡＣ）４０ｇ、１０ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水および５０重量％の水酸化ナトリウム１．６７ｇに加えた。反応液を室温で一晩回転振蕩器で激しく振蕩（＞１００ｒｐｍ）した。ついで該ビーズをろ過し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）１００ｍＬ容量で３回洗浄した。ビーズの試料を下記のプロトコールを用いて滴定し、第４級アンモニウムリガンド密度を測定した。
【００６９】
該ビーズ（５０ｍＬ、濾過ケーキ）を４．６ＭのＮａＯＨ１５ｍＬを含む瓶に加えた。該混合物をスラリー化し、ついでブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＵＤＧＥ）１９．５ｍＬを加えた。この混合物を３５℃で２時間振蕩した。ついで、該ビーズをＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）７５０ｍＬで洗浄し、１０ｍＭＮａＨＣＯ３２５０ｍＬで平衡化させた。
【００７０】
ＢＵＤＧＥ活性化段階の直後、濾過ビーズケーキ１０ｍＬをｎ−プロテインＡ３０ｇ／Ｌ濃度を含む１０ｍＭＮａＨＣＯ３の１０ｍＬ溶液に加えた。該ビーズをハイブリダイザー中で３７°℃で２時間回転した。２時間後、該ビーズを３０ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）で洗浄した。該濾過ビーズケーキ（１０ｍＬ）を、チオグリセロール１ｍＬおよび０．２ＭのＮａＨＣＯ３および０．５ＭのＮａＣｌを含む緩衝溶液９ｍＬから構成された１０ｍＬ溶液を含む瓶に加えた。該混合物をスラリー化し、室温で一晩回転した。ついで該ビーズを次の緩衝液３０ｍＬで洗浄した：０．１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ８）、０．１５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ８）を含む０．１Ｍのトリス緩衝液、５０ｍＭの酢酸（ｐＨ４．５）、０．００２％のアジドナトリウムを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）。ついで該ビーズを標準曲線にｎ−プロテインＡを用いる標準ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて、記載した静的容量およびプロテインＡリガンド密度について特性化した（下表１参照）。
【実施例７】
【００７１】
第４級アミンリガンド、ブタンジオールジグリシジルエーテルおよびｎ−プロテインＡを用いるリガンドを利用するカップリング
実施例７のビーズは、会合性基の添加を除いて実施例６に記述したビーズと同じである。アガロース・ビーズを次の方法に従って、正に帯電した会合性基（例えば、カチオン類）と反応させた：ビーズ５０ｍＬを７５重量％のＧＴＭＡＣ２５ｇ、２５ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水および５０重量％の水酸化ナトリウム１．６７ｇに加えた。反応液を室温で一晩回転振蕩器上で激しく振蕩（＞１００ｒｐｍ）した。ついで該ビーズをろ過し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）１００ｍＬ容量で３回洗浄した。次の段階（ＢＵＤＧＥ活性化およびプロテインＡカップリング）はすべて実施例６に記載したのと同じであった。ついで該ビーズを標準曲線にｎ−プロテインＡを用いる標準ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて、記載した静的容量およびプロテインＡリガンド密度について特性化した（下表１参照）。
【実施例８】
【００７２】
第４級アミンリガンド、ブタンジオールジグリシジルエーテルおよびｎ−プロテインＡを用いるリガンドを利用するカップリング
実施例８のビーズは、会合性基の添加を除いて実施例６に記述したビーズと同じである。アガロース・ビーズ次の方法に従って、正に帯電した会合性基（例えば、カチオン類）と反応させた：ビーズ５０ｍＬを７５重量％のＧＴＭＡＣ１０ｇ、４０ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）および５０重量％の水酸化ナトリウム１．６７ｇに加えた。反応液を室温で一晩回転振蕩器上で激しく振蕩（＞１００ｒｐｍ）した。ついで該ビーズをろ過し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）１００ｍＬ容量で３回洗浄した。次の段階（ＢＵＤＧＥ活性化およびプロテインＡカップリング）はすべて実施例６に記載したのと同じであった。ついで該ビーズを標準曲線にｎ−プロテインＡを用いる標準ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて、記載した静的容量およびプロテインＡリガンド密度について特性化した（下表１参照）
【００７３】
【表１】
0005643721.tif 000002
【実施例９】
【００７４】
ＣＰＧ上で第４級アミンリガンド、エピクロルヒドリンおよびｎ−プロテインＡを用いるリガンドを利用するカップリング
プロテインＡを会合性基を用いてＣＰＧにカップルするために、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）ＬＣＡ−ＣＰＧ１０００Ａを用いた。ＬＣＡ−ＣＰＧ（１０ｍＬ）を、５０％重量のグリシジルトリメチルアンモニウムクロリドを含む１０ｍＬの水溶液に加えた。反応液を３０℃で一晩軽く（＜１００ｒｐｍ）振蕩した。ついで、該ＣＰＧを５０ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）で洗浄し、濾過して乾燥ケーキを得た。該ＣＰＧを３０℃で２時間軽く振蕩したエピクロルヒドリンの水溶液３５ｍＬに加えた。該ビーズを１００ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）で洗浄し、ついで濾過し、乾燥ケーキを得た。該ビーズ（５ｍＬ）をｎ−プロテインＡ１５ｍｇ／ｍＬ濃度を含む０．０１ＭＮａＨＣＯ３５ｍＬに加えた。カップリング反応液を３５℃で一晩軽く振蕩した。ついで、該ビーズを１００ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）で洗浄し、ついで濾過して、乾燥ケーキを得た。ついで、該ビーズをｐＨ８の０．１Ｍのトリス緩衝液中の１Ｍのエタノールアミン１０ｍＬに加えた。該反応を１時間行い、ついで該ビーズを０．２ＭＮａＨＣＯ３，０．５ＭＮａＣｌ（ｐＨ４．５）を含む０．１Ｍ酢酸ナトリウムそれぞれ５０ｍＬで洗浄し、ついで、最終的にリン酸塩緩衝食塩水で洗浄した。先述したように該静的容量を測定し、結果を表２に示す。該会合性基の濃度は、元素分析により測定した。
【実施例１０】
【００７５】
ＣＰＧ上で第４級アミンリガンド、エピクロルヒドリンを用いないプロテインＡのリガンドカップリング
プロテインＡを会合性基を用いないでＣＰＧに連結するために、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）ＰｒｏｓＳｅｐ５−ＣＨＯ１０００Ａを用いた。該５−ＣＨＯビーズ（５ｍＬ）をｎ−プロテインＡ１５ｍｇ／ｍＬ濃度含む０．０１ＭのＮａＨＣＯ３５ｍＬに加えた。カップリング反応液を３５℃で一晩軽く（＜１００ｒｐｍ）振蕩した。ついで、該ビーズをＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）１００ｍＬで洗浄し、ついで濾過し、乾燥ケーキを得た。ついで、該ビーズをｐＨ８の０．１Ｍのトリス緩衝液中の１Ｍのエタノールアミン１０ｍＬに加えた。反応を１時間行い、ついで該ビーズを０．２ＭＮａＨＣＯ３，０．５ＭＮａＣｌ（ｐＨ４．５）を含む０．１Ｍ酢酸ナトリウムそれぞれ５０ｍｌで洗浄し、ついで最終的にリン酸塩緩衝食塩水で洗浄した。先述した該静的容量を測定し、結果を表２に示す。該会合性基の濃度は元素分析により測定した。
【００７６】
【表２】
0005643721.tif 000003
【実施例１１】
【００７７】
会合性基濃度の測定：第四級アミンリガンドの滴定
第四級アミンリガンド密度を酸塩基滴定を用いて測定した。ビーズの試料１ｍＬを使い捨てプラスチックカラムに置き、ついで、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（１０ｍＬ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）および１ＭＮａＣｌ（１０ｍＬ）で平衡化させた。ついで該ビーズをＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（１０ｍＬ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）４ｍＬで洗浄し、濾過して湿ったビーズケーキを得た。該ビーズを攪拌棒を備えた小さなビーカー中の１ＭＮａＣｌ８０ｍＬに加えた。ビーカにｐＨ計を置いた。該試料を０．０１ＭＨＣｌで滴定した。対照として強アニオン交換ビーズ（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ）を用いた。実施例６−８のデータを下表１に示す。結果は驚くべきことに、低会合性基密度および対応する低リガンド密度は、市販の代替物および替わりの実験条件の両方と比較して、より優れた静的容量を与えることを示す。
【実施例１２】
【００７８】
ＩｇＧの静的および動的容量の測定
上記の実施例に記述した製品それぞれの静的または飽和容量および商業的標準を次の方法を用いて測定した：
１.ＰＢＳ緩衝液中の各試料からビーズ懸濁液（２０％ビーズ）を作成した。
２.該ビーズ懸濁液を攪拌し、５００μＬ試料を１５ｍＬの３つの円錐プラスチック管にピペットで採った。
３.ＰＢＳ中のタンパク質溶液（ＩｇＧ）（１ｍｇ／ｍＬ）を各管（１４ｍＬ）に加えた。
４.該管に栓をし、オービタルシェーカーでゆっくり（＜１００ｒｐｍ）と振蕩した。
５.２４時間後、該ビーズを安定させ、結合後該溶液のＵＶ測定をした。
６.該ＵＶ吸収をＩｇＧ濃度に変換し（ε−１．３８）、物質収支を用いて飽和容量を測定した。
【００７９】
プロテインＡ媒体をＯｍｎｉｆｉｔカラム（０．６６ｃｍ直径、７ｃｍ床高さ）にロードし、ポリクロナールにヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ）の動的結合容量を試験した。該カラムをＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化させ、該タンパク質（１ｇ／Ｌ）を同じ緩衝液を用いてカラムに装填した。１０％破過点における容量を用いて、異なる媒体を比較した。図１は、ＩｇＧの静的および動的容量が如何に２つの市販の標準，  Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ（登録商標）  ａｎｄ  Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ  Ｘｔｒａ（登録商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）及び実施例１−３の製品を比較するかを示す。実施例２−５の結果を図２に示す。表は実施例６−８の静的容量を示す。表２は実施例９−１０の静的容量を示す。
【実施例１３】
【００８０】
中間洗浄を用いて、および用いずに、異なる結合リガンド密度に対するＩｇＧ溶出プールにおける宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）レベル
モデルＨＣＰフィードストックとして、精製したモノクロナール抗体（ｍＡｂ）、血清を含まぬＣＨＯ培地（Ａｎｇｅｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎｏｒｔｈｕｍｂｅｒｌａｎｄ，ＵＫ）を用いた。リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ１  ｐＨ  ７．４−７．５，伝導率１５−１７ｍＳ／ｃｍ）溶液の１０カラム容量（ＣＶ）で平衡化させた後、該フィードの２０ＣＶを実施例６−８に記述した該プロテインＡ媒体を充填したカラム（内径０．６６ｃｍ、長さ７ｃｍ）にロードした。ついで該カラムをＰＢＳの１０ＣＶまたは１ＭＮａＣＩを補充したＰＢＳの８ＣＶ（ｐＨ  ７．４−７．５）で洗浄し、ついで補充されていない  ＰＢＳ（ｐＨ  ７．４−７．５）の２ＣＶで洗浄した。ついで、０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ３）溶出緩衝液の１０ＣＶで洗浄した。０．５から５．５ＣＶのピーク画分を集めた。ついで、該カラムを６Ｍのグアニジン塩酸塩の５ＣＶで洗浄し、ついでＰＢＳ緩衝液で平衡化させた。結合−溶出実験をＢｉｏＣａｄ（登録商標）分取液体クロマトグラフィー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）上で行った。溶出プールの２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収を測定してＩｇＧ濃度および収量を決定した。ＣＨＯＰ濃度についても市販の酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）キット（Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈｐｏｒｔ，ＮＣ）を用いて分析した。結果を図３に示す。結果は高タンパク質リガンド密度に関連した非特異的結合が、適切な中間洗浄緩衝液を用いて容易に相殺されることを示している。表１の結果と組み合わせて、このデータは、本明細書中に記述した方法およびマトリックスの柔軟性は、当業者が非特異的結合のような望ましくない副作用を最小化しながら望ましい容量を最大化することを可能にし、従って、特別な用途に合わせ得る親和性マトリックスを提供することを示唆している。
【実施例１４】
【００８１】
塩緩衝液による中間洗浄を用いた、ＩｇＧ溶出プールにおける宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）およびＤＮＡレベルの減少
モデルＨＣＰフィードストックとして、精製した、ＩｇＧを発現していない、血清を含まないＣＨＯ培地（Ｌａｍｐｉｒｅ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐｉｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＰＡ）を用い、ポリクロナールヒトγグロブリン（ｈｌｇＧ）（ＳｅｒａＣａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｏｃｅａｎｓｉｄｅ，ＣＡ）１ｍｇ／ｍｌでスパイクした。リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ１  ｐＨ７．４−７．５，伝導率１５−１７ｍＳ／ｃｍ）溶液の１０カラム容量（ＣＶ）で平衡化させた後、該フィードの２０ＣＶを実施例２に記述した該プロテインＡ媒体を充填したカラム（内径０．６６ｃｍ、  長さｘ７ｃｍ）に装填した。ついで該カラムを０−１ＭＮａＣＩを補充したＰＢＳ（ｐＨ７．４−７．５）の８ＣＶついで補充されていないＰＢＳ（ｐＨ７．４−７．５）の２ＣＶで洗浄した。ついで、０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ３）溶出緩衝液の１０ＣＶで洗浄した。０．５から５．５ＣＶのピーク画分を集めた。ついで該カラムを６Ｍのグアニジン塩酸塩の５ＣＶで洗浄し、ついでＰＢＳ緩衝液で再平衡化させた。結合−溶出実験をＢｉｏＣａｄ（登録商標）分取液体クロマトグラフィーシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）上で行った。該溶出プールの２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収を測定してＩｇＧ濃度および収量を決定した。ＣＨＯＰ濃度についても市販の酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）キット（Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈｐｏｒｔ，ＮＣ）を用いて分析した。
【００８２】
図４ａは、異なる塩の洗浄緩衝液を用いて測定された溶出プール中のＣＨＯＰレベルを示す。ＮａＣＩの濃度を０から１Ｍに増加すると、ＣＨＯＰ濃度は４５０ｎｇ／ｍｌから８０ｎｇ／ｍｌまで５倍より多く減少した。ＩｇＧの回収はすべて類似しており、９０−９５％であった。
【００８３】
図４ｂは、１ＭＮａＣＩ補充ＰＢＳ緩衝液洗浄を用いて測定された溶出プール中のＤＮＡレベルを示す。リガンドを利用するカップリングから作られたプロテインＡ試料の通常のＰＢＳ洗浄に比べて、塩洗浄は、非特異的に吸着されたＤＮＡのレベルを２０−６０％だけ減少させた。
【実施例１５】
【００８４】
低ｐＨおよび高塩濃度での中間洗浄を用いた、ＩｇＧ溶出プールにおけるＨＣＰレベルの減少
本実験は、ＰＢＳ（ｐＨ６．５および０．４ＭＮａＣＩ補充）の８ＣＶを含む中間洗浄緩衝液を用いたことを除き、上記実施例１４に記述したのと同様の条件下で行った。
【００８５】
図５は、異なるｐＨおよび塩濃度の中間洗浄緩衝液を用いて測定された溶出プール中のＣＨＯＰレベルを示す。０．４ＭＮａＣＩ補充ｐＨ６．５のＰＢＳ緩衝液を用いて得られた結果は、補充されていないＰＢＳ（ｐＨ７．４−７．５）を用いて得られた結果と比べて、〜８の因子だけＣＨＯＰレベルが低下した。
【実施例１６】
【００８６】
アミノ酸またはアルキル化アミノ酸を含む中間洗浄緩衝液を用いた、ＩｇＧ溶出プールにおけるＨＣＰレベルの減少
本実験は、８ＣＶのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４−７．５、伝導率１５−１７ｍＳ／ｃｍ）および０．２５−０．５Ｍベタイン、Ｌ−アラニン、グリシン、またはリジン、または０．１２５−０．２５Ｍバリンまたは０．１５Ｍグルタミン酸含む中間洗浄緩衝液を用いたことを除き、上記実施例１４に記述したのと同様の条件下で行った。
【００８７】
図６ａは、ベタインおよびＬ−アラニンを含む中間洗浄緩衝液を用いて測定された溶出プール中のＣＨＯＰレベルを示す。０．２５ＭのベタインはＣＨＯＰ濃度を減少した。比較すると、アラニンはベタインに比べより有効であった。アラニンの両濃度で、結合ＣＨＯＰは２倍より多く減少した。
【００８８】
図６ｂは、バリン、グリシン、グルタミン酸またはリジンの各種濃度を含中間洗浄緩衝液を用いて測定された溶出プール中のＣＨＯＰレベルを示す。ＰＢＳ洗浄と比較すると、溶出プール中のＣＨＯＰレベルは、アミノ酸洗浄で約３−１０倍低く、その中でリジンおよびグルタミン酸が最も有効であるようである。
【００８９】
本明細書および請求項で用いられる成分、反応条件などの量を表わすすべての数字は、すべての場合において用語「約」で修飾されていると理解されるべきである。従って、反対に指示されていなければ、この明細書および添付の請求項に規定されている数字のパラメーターは、近似値であり、それは本発明によって得られるべく探求されている所望の性質によって変化し得る。少なくとも、および本請求項の範囲に均等論の適用を制限する試みとしてではなく、それぞれの数字のパラメーターは、有効数字および通常の四捨五入方法に照らして解釈されるべきである。
【００９０】
当業者に明白であるように、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の多数の修飾および変更がなされ得る。本明細書に記述された具体的な実施形態は実施例のためにだけに提供したもので、制限的していることを決して意味しない。明細書及び実施例は、単に典型的な例と考えられるべきで、本発明の真の範囲および精神は以下の請求項によって示されていることが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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