(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
界面（４３）を形成する共鳴媒質（４１）および非共鳴媒質（４２）を含むタイプのサンプル（１０５）中に誘導された共鳴非線形光信号を検出するための装置（１００）であって、
第１の所定の角振動数ωｐにて所定タイプのサンプルの共鳴媒質を励起するためのポンプビームと呼ばれる少なくとも１つの第１の励起ビームの放射源（８０１）と、
サンプルに入射する前記ポンプビームの光軸に関して少なくとも２つの対称な方向である任意のベクトルｋ方向と、前記ベクトルｋ方向に対称なベクトルｋ’方向とにおいて、前記ポンプビームと、サンプルの共鳴媒質−非共鳴媒質間に形成された界面であって、入射したポンプビームの光軸に沿って非ゼロ成分を有する軸方向界面との相互作用から生じた非線形光信号を検出するための光検出モジュール（１０６）と、
ベクトルｋ方向に沿って検出された前方散乱信号である第１の非線形光信号ＩＦｗｄ（ベクトルｋ）と、ベクトルｋ’方向に沿って検出された前方散乱信号である第２の非線形光信号ＩＦｗｄ（ベクトルｋ’）とを処理することにより、検出された前記第１の非線形光信号ＩＦｗｄ（ベクトルｋ）と前記第２の非線形光信号ＩＦｗｄ（ベクトルｋ’）との差を得ることを可能にする処理装置（１２５）と、を含み、
得られた前記第１の非線形光信号ＩＦｗｄ（ベクトルｋ）と前記第２の非線形光信号ＩＦｗｄ（ベクトルｋ’）との差は、共鳴媒質の振動共鳴または電子共鳴の指標となる装置。
【請求項２】
放射源（８０１）は、第１の角振動数ωｐとは異なる少なくとも第２の角振動数ωｓにて、共鳴媒質を励起するための第２の励起ビームの放射を少なくとも可能にし、
第１の励起ビームと第２の励起ビームとは同一直線上である請求項１に記載の装置。
【請求項３】
放射源は、角振動数ωｐのポンプビームおよび角振動数ωｓのストークスビームの放射を可能にし、これによって所定タイプの前記サンプル中で、角振動数ωａｓ＝２ωｐ−ωｓのＣＡＲＳ散乱信号と呼ばれる非線形光信号が生じることが可能となり、
得られた非線形光信号の差は、共鳴媒質のラマン放射の指標となる請求項２に記載の装置。
【請求項４】
共通の焦点体（４５）中にて１以上の前記励起ビームの焦点を合せることにより、前記１以上の励起ビームが所定タイプの前記サンプルの共鳴媒質と非共鳴媒質との間の界面を横断する焦点レンズ（１０７）を含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項５】
光検出モジュール（１０６）は、少なくとも１つのシャドーマスクと、光軸に関して対称な２つの相補的な半空間に統合された非線形光信号の検出を可能とする少なくとも１つの検出器とを含み、
差は、２つの半空間にて統合された非線形光信号に関してとられる請求項１〜４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項６】
光検出モジュール（１０６）は、
集められた非線形光信号を第１の経路と第２の経路に分離させる光スプリット要素（１１３）と、
各経路において、
非線形光信号を隠すシャドーマスク（１１４，１１５）と、
検出器（１１６，１１７）と、を含み、
各経路の非線形光信号は、２つの半空間に従ってそれぞれ隠される請求項５に記載の装置。
【請求項７】
光検出モジュールは、前記非線形光信号を収集するための集光レンズ（１１１）を含む請求項５または６に記載の装置。
【請求項８】
光検出モジュール（１０６）は、前記光軸に関して少なくとも２つの対称な方向に収集された非線形光信号をそれぞれ検出することを可能にする画像記録システム（１２０）を含み、
差は、検出された少なくとも１組の非線形光信号のペアに関してとられる請求項１〜４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項９】
光検出モジュールは、前記非線形光信号を収集するための集光レンズを含む請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
画像記録システムは、集光レンズの射出瞳上または射出瞳の像上に配置されている請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
前記非線形光信号の光検出モジュール（１０６）は、所定の振動数（ν）にて光軸の周りを回転するマスク（１３０）を含み、
マスクは、前記非線形光信号を部分的に隠し、
検出器は、マスクによって隠されない空間の一部に統合された非線形光信号の検出を可能にすることによって、マスクの回転振動数にて変調され、最大値および最小値を有する非線形光信号を搬送し、
処理装置（１２５）は、マスクの回転振動数にて非線形光信号の振動数成分の振幅を得るために変調された前記非線形光信号の処理を可能にし、
振幅は、前記最大値と最小値の差に比例し、共鳴媒質の振動共鳴または電子共鳴の指標となる請求項１〜４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１２】
処理装置はまた、変調され検出された非線形光信号の振動数成分の位相を得ることも可能にし、
位相は、共鳴媒質および非共鳴媒質の相対位置の指標となる請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
マスクは、光軸の周りを回転する半円盤（１３４）を含む請求項１１または１２に記載の装置。
【請求項１４】
光検出モジュールは、前記非線形光信号を集めるための装置を含む請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１５】
共鳴媒質と非共鳴媒質との界面の異なる位置にて、１以上の励起ビームが所定タイプのサンプルを横断することを可能とする、１以上の励起ビームを角度スキャンするための装置をさらに含む請求項１〜１４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１６】
放射源が少なくとも１つの可変波長励起ビームを放射することにより、所定タイプのサンプルの共鳴媒質の振動共鳴または電子共鳴のスペクトルを得ることを可能にする請求項１〜１５のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１７】
サンプル（１０５）中に誘導された共鳴非線形光信号を検出するための方法であって、
サンプルは、界面（４３）を形成する共鳴媒質（４１）および非共鳴媒質（４２）を含み、
本方法は、
第１の所定の角振動数ωｐにて、ポンプビームと呼ばれる共鳴媒質の少なくとも１つの第１の励起ビームを放射するステップと、
光軸に関して少なくとも２つの対称な方向である任意のベクトルｋ方向と、前記ベクトルｋ方向に対称なベクトルｋ’方向とにおいて、１以上の前記ポンプビームと、サンプルの共鳴媒質−非共鳴媒質間に形成された界面であって、入射したポンプビームの光軸に沿って非ゼロ成分を有する軸方向界面との相互作用から生じた非線形光信号を検出するステップと、
ベクトルｋ方向に沿って検出された前方散乱信号である第１の非線形光信号ＩＦｗｄ（ベクトルｋ）と、ベクトルｋ’方向に沿って検出された前方散乱信号である第２の非線形光信号ＩＦｗｄ（ベクトルｋ’）とを処理することにより、検出された前記第１の非線形光信号ＩＦｗｄ（ベクトルｋ）と前記第２の非線形光信号ＩＦｗｄ（ベクトルｋ’）との差を得ることを可能にするステップと、を含み、
前記ポンプビームは、光軸に沿ってサンプルに入射し、共鳴媒質と非共鳴媒質との前記界面を横断し、
得られた前記第１の非線形光信号ＩＦｗｄ（ベクトルｋ）と前記第２の非線形光信号ＩＦｗｄ（ベクトルｋ’）との差は、サンプルの共鳴媒質の振動共鳴または電子共鳴の指標となる方法。
【請求項１８】
第１の角振動数ωｐとは異なる少なくとも１つの第２の角振動数ωｓにて共鳴媒質を励起するための少なくとも１つの第２の励起ビームを放射するステップを含む請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
角振動数ωｐのポンプビームおよび角振動数ωｓのストークスビームを放射するステップを含み、
前記ポンプビームとストークスビームとの相互作用から生じた非線形光信号は角振動数ωａｓ＝２ωｐ−ωｓのＣＡＲＳ散乱信号と呼ばれる信号であって、 
非線形光信号の差は、共鳴媒質のラマン放射の指標である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
１以上の前記励起ビームは、共通の焦点体（４５）中へと集中されることにより、共鳴媒質と非共鳴媒質との間で前記界面が横断されることを可能とする請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
非線形光信号の検出は、光軸に関して対称な２つの相補的な半空間へと非線形光信号を統合することにより実現され、
検出された非線形光信号を処理するステップは、２つの半空間へと統合された非線形光信号間の差を計算することを含む請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
非線形光信号を検出するステップは、前記光軸に関して少なくとも２つの対称な方向に非線形光信号をそれぞれ検出することにより実現され、
非線形光信号を処理するステップは、検出された少なくとも１組の非線形光信号のペアの信号間の差を計算することを含む請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
非線形光信号を検出するステップは、所定の振動数（ν）にて光軸の周りを回転するマスク（１３０）によって、前記非線形光信号を部分的に隠すことを含み、
非線形光信号を検出するステップは、最大値と最小値を有するマスクの回転振動数にて変調された非線形光信号を搬送するために、マスクによって隠されていない空間の一部へと統合し、
非線形光信号を処理するステップは、変調された非線形光信号のマスクの回転振動数における振動数成分の振幅を決定することを含み、
振幅は、変調された非線形光信号の前記最大値と最小値の差に比例し、共鳴媒質の振動共鳴または電子共鳴の指標となる請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
変調され検出された非線形光信号の振動数成分の位相を決定するステップをさらに含み、
位相は、共鳴媒質および非共鳴媒質の相対位置の指標となる請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
１以上の励起ビームが、角度スキャンを受けることにより、共鳴媒質と非共鳴媒質との間の界面の複数の位置にてサンプルを横断する請求項１７〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも１つの励起ビームが可変の放射波長を有することにより、共鳴媒質の振動共鳴または電子共鳴のスペクトルを得ることが可能となる請求項１７〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、共鳴非線形光信号を検出するための方法およびその方法を実装するための装置に関する。本願発明は、特にＣＡＲＳ散乱の検出に適用できる。
【背景技術】
【０００２】
すべての化学結合は、それらに固有の振動数を有する。光と物質の相互作用を使用することによって、これらの分子振動に関する情報の取得を目指す方法は、振動感受性の光学技術と呼ばれる。これらの技術のうち最もよく知られているのは、赤外（ＩＲ）分光法である。赤外分光法は、サンプル中に存在する化学結合に特異的な吸収線を観察する。１９２８年に発見されたラマン散乱（この効果を発見した物理学者であるチャンドラシェーカル・ヴェンカタ・ラーマンの名前に由来する）は、使用される可視光線を、光線と相互作用する分子の振動スペクトルに接近させることを可能にする。ラマン散乱では、分子に入射する角振動数ωｐのポンプ波が、ストークス波と呼ばれる角振動数ωｓの波（図１（Ａ））およびアンチストークス波と呼ばれる角振動数ωＡＳの波（図１（Ｂ））の中へと非弾性的に散乱される。生成された波とポンプ波との間の振動数の差は、ωｐ−ωｓ＝ωａｓ−ωｐ＝ΩＲとなるように（角振動数ΩＲの）分子ラマン遷移に依存する。この過程を光子的に見ると、ストークス波およびアンチストークス波は、それぞれ基底振動準位および励起振動準位からの吸収に相当する。励起振動準位（Ｂ）からアンチストークス波を生成する過程は、ストークス波を生成する過程よりもずっと起こりにくい。ストークス波を生成する過程は、自発的ラマン分光法において実際に観察される唯一の過程である。ストークス波のスペクトル分布の詳細な研究によって、サンプル中に存在する化学結合の密度に関する情報が生み出される。この非弾性散乱の自発的過程は、蛍光発光に比べて非常に非効率である（１０−１６ｃｍ２／分子に達するフルオロフォア１光子の吸収断面積に対して、ラマン断面積は１０−３０ｃｍ２／分子のオーダーである）。
【０００３】
ＣＡＲＳ（コヒーレントアンチストークスラマン散乱）ラマン分光法は、４つの波を混合する過程であって、サンプル中に存在する振動性結合を検出することができる。この過程は、たとえばＲ．Ｗ．Ｂｏｙｄの非線形光学（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ボストン、１９９２年）に記載されている。本方法は、角振動数ωｐおよびωｓ（または振動数νｐおよびνｓ）の２つのレーザパルスを送出することを含む。この方法の角振動数差は、解析中の振動準位における角振動数Ωに等しい。ωｐ−ωｓ＝Ωというこの共鳴の形態において、角振動数Ωの振動準位は活性化された状態で存在しており、角振動数ωｐのビームを角振動数ωａｓ＝２ωｐ−ωｓのビームへと非弾性的に散乱させることが可能であろう（図２（Ａ））。この新たな放射ωａｓ（以下、「ＣＡＲＳ散乱信号」と呼ぶ）が存在することは、サンプル中に角振動数Ωにて振動する結合が存在する痕跡（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）である。ＣＡＲＳの第１の実装の本質は、スペクトル的にピコ秒という狭さの２つのパルスをサンプルに向けることにある。これらのパルスの角振動数差によって、たった１つの特異的な振動性結合を検出することができるだけである。同定を最適にするためには、サンプル中に存在するすべての振動性結合がテストされる。これは「多重ＣＡＲＳ」（たとえばＭ．ＭｕｌｌｅｒおよびＪ．Ｓｃｈｉｎｓの「多重ＣＡＲＳ分光法を用いた脂質膜の熱力学的状態の画像化」（Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂ１０６巻、３７１５〜３７２３頁（２００２年）を参照）と呼ばれるモードの操作により行われる。ここではスペクトル的に狭いパルスωｐとスペクトル的に広いパルスωｓとがサンプルに向けられる（図２（Ｂ））。したがって、サンプル中に存在するすべての振動準位Ωｉを検出することができ、生じた信号ωａｓのスペクトルを得ることができる。技術的な観点から、狭スペクトルはたとえばピコ秒のレーザから生じ、広域スペクトルはたとえばフェムト秒のレーザ、または超連続体（ＳＣ）を生み出すフォトニック結晶ファイバーから生じる。
【０００４】
図３（Ａ）には、共鳴ＣＡＲＳ散乱の過程が説明されている。共鳴ＣＡＲＳ散乱は、特定される分子の痕跡に接近するために使用される。しかし、図３（Ｂ）に示された非共鳴ＣＡＲＳ寄与が存在する。非共鳴ＣＡＲＳ寄与はサンプルの電子的寄与から生じる。この非共鳴寄与は、様々な化学結合を含むサンプルに対してＣＡＲＳ分光法が実行される場合に重要となりうる。
【０００５】
Ｘｉｅらによる米国特許出願第６８０９８１４号は、ＣＡＲＳ信号の逆行（ｅｐｉ）検出に基づいた顕微鏡サンプルにおけるＣＡＲＳ信号の検出を説明する。この検出は、励起の放射源の波長に相当するサイズの物体の非共鳴ノイズを除去することを可能にする。特に、この検出モードは、波長サイズ以下の物体（たとえばオルガネラ）の可視化、および一般に生物学的サンプルを囲む溶媒の非共鳴背景ノイズの抑制を可能にする。しかし、この検出は、これら波長サイズ以下の物体に内在する非共鳴背景ノイズを抑制できないという欠点を有する。
【０００６】
非共鳴寄与を除去することを可能にするＣＡＲＳ信号を検出するための別の技術が、Ｐｏｔｍａらによる国際特許出願第２００５／１２４３２２号に説明されている。非共鳴ＣＡＲＳ背景ノイズは、局所的な発振器を用いることおよびヘテロダイン検出を行うことによって抑制される。実際には、これには補助的なサンプル中（たとえば溶媒または光ファイバー中）でＣＡＲＳ信号を生成すること、およびこのＣＡＲＳ信号と対象とするサンプルより位相を制御する間に顕微鏡中で得られたＣＡＲＳ信号とを再結合させることが含まれる。この位相制御には、安定化させることが難しい干渉設定が必要となる。実際は、この方法は依然として実験室のデモ段階にある。
【０００７】
Ｒｉｍｋｅらによる国際特許出願第２００８１３５２５７号では、先に引用した国際特許出願第２００５／１２４３２２号に開示されたヘテロダイン検出の設計が使用される。また、使用されたレーザ光源は、１０６４ｎｍにて放射され５３２ｎｍにて複製されたピコ秒レーザを含む。次に５３２ｎｍのビームは光学パラメータ式発振器（ＯＰＯ）に供給される。ＯＰＯは、１／λｓｉｇｎａｌ（ｎｍ）＋λｉｄｌｅｒ（ｎｍ）＝１／５３２（ｎｍ）に従って調整可能な２つの「信号」波長λｓｉｇｎａｌおよび「遊び（ｉｄｌｅｒ）」波長λｉｄｌｅｒを生成する。したがって、１０６４ｎｍのレーザおよび遊びビームは、それぞれポンプビームおよびストークスビームの役割を果たす。信号ビームは、サンプル中で生成されたアンチストークスビームと同波長である。信号ビームは、アンチストークスビームと再結合される。この干渉によって生じた信号は、国際特許出願第２００５／１２４３２２号に説明されたヘテロダイン干渉法に従って検出される。この非常に有効な技術では、２つの信号波長および遊び波長を生成可能なＯＰＯを使用することが必要となる。
【０００８】
非共鳴寄与を除外可能にするＣＡＲＳ信号を検出する別の技術が、Ｘｉｅらによる米国特許出願第７３５２４５８号に記載されている。観察されたアンチストークス波長を（振動数νにて）高速に調節することにより、非共鳴ＣＡＲＳ背景ノイズが抑制される。実際には、２つのビーム（ポンプまたはストークス）のうち１つが、２つの波長を搬送するレーザ光源により供給される。また、もう一方のビームは、レーザ光源によって単一波長にて生成される。第１の光源により搬送される２つの波長間の高速調節によって、ＣＡＲＳ信号の共鳴励起および非共鳴励起を同じ振動数にて調節することが可能となる。したがって、ＣＡＲＳ信号の非共鳴ノイズは、ＣＡＲＳ信号を振動数νにて調節することにより抑制される。実際は、この方法は２つの波長を放射する光源と、調節が機能できる共鳴信号−非共鳴信号間の良好なコントラストとを必要とする。
【０００９】
非共鳴寄与を除外可能にするＣＡＲＳ信号を検出する別の技術が、ＸｉｅおよびＣｈｅｎｇによる米国特許出願第６７８９５０７号に記載されている。この技術は、共鳴信号および非共鳴信号の様々な偏光特性を用いる。自発的ラマン分光法では、振動共鳴が励起ビームの偏光を解消することが知られている。実際は、散乱したビームが励起ビームとの関係で偏光を解消される。この偏光解消効果は、各振動共鳴に特異的な「偏光解消係数」によって定量化される。ＣＡＲＳ散乱に適用すると、この効果は以下のように使用される。つまり、ポンプ励起ビームとストークス励起ビームの直線偏光間に、角度が導入される。次に異なる偏光に従って、共鳴ＣＡＲＳ信号および非共鳴ＣＡＲＳ信号が生成される。次に偏光板がサンプルの下流に導入されることにより、非共鳴信号が消され、一部の共鳴信号が消されずに通過する。この方法は実装するのが簡単だが、検出される共鳴信号のレベルを大幅に低下させてしまう。調べられたラマン共鳴の「偏光解消係数」が１／３に近づくほど、この減少は大きくなる。
【００１０】
本願発明は、共鳴非線形光信号を検出するための原法を提案する。この方法は、実装が簡単で、高速な画像化とも両立しうる。特に、顕微鏡または分光法の画像化用途において、非共鳴ＣＡＲＳノイズを除去することを可能にする。本方法は、共鳴媒質および非共鳴媒質の軸方向界面におけるＣＡＲＳ信号の散乱方向の解析に基づく。より正確には、信号の角度のずれの解析に基づく。
【発明の概要】
【００１１】
第１の態様によると、本願発明は、界面を形成する共鳴媒質および非共鳴媒質を含むタイプのサンプル中に誘導された共鳴非線形光信号を検出するための装置に関する。第１の態様に従った装置は、第１の所定の角振動数ωｐにて所定タイプのサンプルの共鳴媒質を励起するためのポンプビームと呼ばれる少なくとも１つの第１の励起光ビームの放射源と、サンプルに入射する前記ポンプビームの光軸に関して少なくとも２つの対称な方向において、前記入射ポンプビームとサンプルの共鳴媒質−非共鳴媒質間の軸方向界面との相互作用から生じた非線形光信号を検出するための光検出モジュールと、検出された信号を処理することにより、検出信号中の差を得ることを可能とする処理装置と、を含む。得られた差は、サンプルの共鳴媒質の振動共鳴または電子共鳴の指標となる。したがって、説明される本装置は、１以上のビームと解析されるサンプルとの相互作用から生じた非線形光信号の角度がずれることを可能にする。これにより、共鳴媒質および非共鳴媒質の軸方向界面にて、共鳴媒質の振動共鳴または電子共鳴の指標となる信号を得ることができる。
【００１２】
変形態様によると、放射源は、角振動数ωｐのポンプビームおよび角振動数ωｓのストークスビームの放射を可能にする。前記ポンプビームとストークスビームとの相互作用から生じた非線形光信号は、角振動数ωａｓ＝２ωｐ−ωｓのＣＡＲＳ散乱信号と呼ばれる信号である。また、ＣＡＲＳ散乱信号の放射方向の解析から生じた信号は、共鳴媒質のラマン放射の指標となる信号である。
【００１３】
ある態様によると、光検出モジュールは、少なくとも１つのシャドーマスクと、光軸に関して対称な２つの相補的な半空間に統合された非線形光信号の検出を可能にする少なくとも１つの検出器とを含む。差は、２つの半空間にて統合された信号に関してもたらされる。
【００１４】
別の変形態様によると、光検出モジュールは、光軸に関して対称な方向にて集められた非線形光信号を１つ１つ検出可能にする画像記録システムを含む。差は、検出された各信号対（カップル）に関してもたらされる。
【００１５】
別の態様によると、前記非線形光信号を検出するための光検出モジュールは、所定の振動数（ν）にて光軸の周りに回転するマスクを含む。マスクは、前記信号を部分的に隠す。検出器は、最大値および最小値を有するマスクの前記回転振動数における変調信号を搬送するために、検出されるようにマスクによって隠されない空間の一部に統合された光信号の検出を可能にする。また、１つの処理装置は、マスクの回転の前記振動数にて、信号の角振動数成分の振幅（ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）を得るために、変調信号の処理を可能にする。振幅は、前記最大値と最小値の差に比例し、共鳴媒質の振動共鳴または電子共鳴の指標となる。
【００１６】
変形態様によると、本装置はまた、１以上の励起ビームをスキャンすることにより、１以上の励起ビームが共鳴媒質と非共鳴媒質との界面の異なる位置にてサンプルを横断することを可能にする角度スキャン装置を含む。
【００１７】
変形態様によると、放射源は、共鳴媒質の振動共鳴または電子共鳴のスペクトルを得ることを可能にする少なくとも１つの可変波長励起ビームを放射する。
【００１８】
第２の態様によると、本願発明は、サンプル中に誘導された共鳴非線形光信号を検出するための方法に関する。サンプルは、界面を形成する共鳴媒質および非共鳴媒質を含む。本方法は、ポンプビームと呼ばれる共鳴媒質を励起するための少なくとも１つの第１の光線を第１の所定の角振動数ωｐにて放射するステップを含む。前記ポンプビームは、光軸に沿ってサンプルに入射し、共鳴媒質と非共鳴媒質との前記界面を横断する。本方法は、光軸に関して対称な少なくとも２つの方向において、１以上の励起ビームとサンプルの共鳴媒質−非共鳴媒質の軸方向界面との相互作用から生じた非線形光信号を検出するステップと、前記信号間の差が得られることを可能にするために、検出された信号を処理するステップとを含む。得られた信号の差は、サンプルの共鳴媒質の振動共鳴または電子共鳴の指標となる。
【００１９】
変形態様によると、本方法は、角振動数ωｐのポンプビームおよび角振動数ωｓのストークスビームを放射するステップを含む。前記ポンプビームとストークスビームとの相互作用から生じた非線形信号は、ＣＡＲＳ散乱信号と呼ばれる角振動数ωａｓ＝２ωｐ−ωｓの信号である。また、ＣＡＲＳ散乱信号の放射方向の解析から生じた信号は、共鳴媒質のラマン放射の指標となる信号である。
【００２０】
変形態様によると、非線形信号を検出するステップは、信号を光軸に関して対称な２つの相補的な半空間へと統合すること（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）によって実行される。また、信号を処理するステップは、２つの半空間へと統合された信号間の差を計算することを含む。
【００２１】
別の態様によると、非線形信号を検出するステップは、光軸に関して対称な方向に非線形光信号を１つ１つ検出する。また、信号を処理するステップは、検出された各信号対の信号間の差を計算することを含む。
【００２２】
別の態様によると、非線形信号を検出するステップは、所定の振動数（ν）にて光軸の周りを回転するマスクによって前記非線形光信号を部分的に隠すことを含む。また、光信号を検出するステップは、最大値と最小値を有するマスクの前記回転角振動数にて変調信号を搬送するために、マスクによって隠されていない空間の一部へと統合する。また、信号を処理するステップは、前記変調信号のマスクの前記回転角振動数における角振動数成分の振幅を決定することを含む。振幅は、変調信号の前記最大値と最小値の差に比例し、共鳴媒質の振動共鳴または電子共鳴の指標となる。
【００２３】
別の態様によると、１以上の励起ビームが、角度スキャンを受けることにより、共鳴媒質と非共鳴媒質との間の界面の様々な位置にてサンプルを横断する。
【００２４】
別の変形態様によると、少なくとも１つの励起ビームが可変の放射波長を有することにより、共鳴媒質の振動共鳴または電子共鳴のスペクトルを得ることが可能となる。
【００２５】
本願発明の他の利点および特徴は、以下の図を用いて説明された記載を読むことによって明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】（説明済）図１（Ａ）と図１（Ｂ）は、ラマン散乱過程におけるストークス放射およびアンチストークス放射の原理を示す。
【図２】（説明済）図２（Ａ）と図２（Ｂ）は、２つの異なるモードにおけるＣＡＲＳ放射の原理を示す。
【図３】（説明済）図３（Ａ）と図３（Ｂ）は、共鳴および非共鳴ＣＡＲＳ過程の図である。
【図４】共鳴媒質と非共鳴媒質との間の界面において、ＣＡＲＳ散乱を実装するための幾何学的条件を示す略図である。
【図５】図５（Ａ）〜図５（Ｅ）は、励起ビームの焦点の相対位置の関数として、共鳴媒質と非共鳴媒質との間の界面とともにＣＡＲＳ散乱信号のずれを示す図である。
【図６】ヤングの二重スリットの実験設定を示す図である。
【図７】パラメータζ＝（ωｐ−ωｓ−ΩＲ）／Γ（ラマン共鳴に対する正規化偏移）の関数として、ＣＡＲＳ散乱信号のずれを説明する数値シミュレーションにより得られた曲線である。
【図８】図８（Ａ）と図８（Ｂ）は、パラメータζの関数として（図８（Ａ））、および励起ビームの焦点の界面に対するＸ座標上の位置として（図８（Ｂ））、空間（ｋｘ＞０）および空間（ｋｘ＜０）においてそれぞれ計算された光強度、および光強度の差を示す数値シミュレーションにより得られた曲線である。
【図９】図９（Ａ）〜図９（Ｃ）は、ＣＡＲＳ検出を実装するための３つの可能なモダリティを示す図である。
【図１０】本願発明の例示的な態様に従って、ＣＡＲＳ散乱の検出を実装するための装置を示す図である。
【図１１】ポリスチレンビーズ（直径２０μｍ、屈折率ｎ＝１．５６の水溶液に浸されている）に対してラマン偏移の関数としてＣＡＲＳ散乱の強度を示す、図１０の構成を用いて得られた実験的な曲線である。
【図１２】本願発明の別の例示的な態様に従ってＣＡＲＳ散乱を検出を実装するための装置を示す図である。
【図１３】図１３（Ａ）〜図１３（Ｃ）は、本願発明の他の例示的な態様に従ってＣＡＲＳ散乱を検出を実装するための装置を示す図である。
【図１４】図１４（Ａ）と図１４（Ｂ）は、共鳴のない図１３（Ａ）の実験条件下で測定された信号を示す図である。
【図１５】図１５（Ａ）と図１５（Ｂ）は、共鳴のある図１３（Ａ）の実験条件下で測定された信号を示す図である。
【図１６】図１３（Ａ）に従った装置を用いた界面の配向性ならびに共鳴媒質および非共鳴媒質の相対位置を決定を示す図である。
【００２７】
（詳細な説明）
図４は、たとえば解析される媒質を含む媒質、つまり生物学的に興味が持たれた媒質である共鳴媒質４１と、通常は溶媒を含む媒質である非共鳴媒質４２とを含むサンプルを示す。三次非線形感受率は、共鳴媒質４１中で共鳴項χ（３）１Ｒおよび非共鳴項χ（３）１ＮＲによって定義される。非共鳴媒質４２では、三次非線形感受率は非共鳴項χ（３）２ＮＲによって定義される。本願発明に従った検出方法のある態様は、角振動数ωｐのポンプ励起ビームと角振動数ωｓのプローブ励起ビームとの相互作用から生じ、ＣＡＲＳ過程によって散乱された信号（図４の参照数字４４）を空間的に解析するステップから構成される。ポンプ励起ビームとプローブ励起ビームとは同一直線上であって、サンプルの軸方向界面を有する焦点体（ｆｏｃａｌ  ｖｏｌｕｍｅ）４５中のサンプルに入射する。つまり、ある態様は、入射ポンプビームおよびストークスビームの軸に沿った非ゼロ成分を提示するステップから構成される。より具体的には、以下で詳細に説明するように、本方法は、界面の両側において、波動ベクトルｋの空間、つまりＣＡＲＳにより放射された信号の放射方向の空間において、ビームの非線形光強度を解析するステップを含む。この強度は、界面の両側でそれぞれＩＦｗｄ（ベクトルｋ）およびＩＦｗｄ（ベクトルｋ’）として図４で言及されている。以下の説明では、「Ｆｗｄ」との省略形は、後ろ方向に散乱された「Ｅｐｉ」として知られる信号の対語として、前方ＣＡＲＳ散乱信号を表す。
【００２８】
実際に出願人は、軸方向界面においてＣＡＲＳ過程により放射された信号が共鳴によって角度のずれの影響を受けることを実験的および理論的に実証した。
【００２９】
図５（Ａ）〜（Ｅ）は、ＣＡＲＳ散乱信号のずれを、界面に入射するポンプビームおよびストークスビームの相対位置の関数として、一連の略図によって示す。図５（Ａ）〜（Ｅ）は、能動ＣＡＲＳ体４５（ポンプビームおよびストークスビームの焦点）を示す。能動ＣＡＲＳ体４５は、ＣＡＲＳ対象物５０の中を通って移動される（各図は対象物中の能動体（ａｃｔｉｖｅ  ｖｏｌｕｍｅ）の異なる位置に対応する）。ＣＡＲＳ対象物は、その対象物の周囲の媒質が共鳴していないと見なされる場合に、共鳴していると見なされる（以下の記載では、このＣＡＲＳ対象物を「溶媒」と呼ぶ）。ＣＡＲＳ対象物と溶媒との間の界面では、ＣＡＲＳ散乱信号はずれ（または偏向）の影響を受けるようである。出願人は、以下で説明するように、このずれは純粋にＣＡＲＳ対象物と溶媒との干渉過程から生じ、決して屈折の影響によるものではないことを実証している。２つの実例１（図５（Ａ）および（Ｅ））では、溶媒中でＣＡＲＳ体に焦点が合わせられる。ＣＡＲＳ散乱信号は標準的な方向（ポンプビームおよびストークスビームの入射軸に平行である。矢印５１により示される）に放射される。符号２（図５（Ｂ））では、ＣＡＲＳ体はＣＡＲＳ対象物と溶媒との間の界面に焦点が合わせられる。次に、（ポンプビームおよびストークスビームの入射軸に対して）正の角度αにてＣＡＲＳ散乱信号が放射されることにより、波動ベクトルｋの空間において、（ｋｘ＞０）により規定される方向にビームをずれさせる。実例３（図５（Ｃ））では、ＣＡＲＳ体がＣＡＲＳ対象物中の中心に置かれる。その結果ＣＡＲＳ信号は強くなり、標準的な方向（ポンプビームおよびストークスビームの入射軸に平行）に向けられる。次に以下の実例（図５（Ｄ）の符号４および図１４（Ｅ）の符号１）において似た状況が見られる。しかし、実例４ではαが負で、（ｋｘ＜０）によって規定される方向へのずれに対応することに留意することは重要である。出願人は、標準化パラメータζ＝（ωｐ−ωｓ−ΩＲ）／Γ（式中、Γは実験された振動線の分光幅である）の関数としての角αの変化は、媒質１を記述するテンソルχ（３）１＝χ（３）１Ｒ＋χ（３）１ＮＲの位相に従うことを、理論的かつ実験的に実証している。出願人はまた、たとえば中央値１の純粋ラマンスペクトルを決定するために（ｋｘ＞０）と（ｋｘ＜０）によって規定された相補的な半空間にて放射されたＣＡＲＳ信号のエネルギー間の差をとることによって、入射ビームの光軸の周囲に対称散乱方向にてＣＡＲＳ信号を解析することにより、それが可能であることを実証している。
【００３０】
出願人は、この実験的な発見がヤングの二重スリット理論に基づく単純なモデルにより説明できることを実証した。図６は、ヤングの二重スリットの実験設定を示す。ヤングの実験では、単色光源Ｓ（図６には図示せず）が２つのスリット（ＡおよびＢで表示）が空けられた板６１を照射する。これらのスリットは、振幅Ｅ１およびＥ２の二次光源として機能する。ここで、板６１から距離Ｄを空けて配置されたスクリーン６２上で、ＡおよびＢから到達した波の干渉から生じた交互の明暗縞模様が観察される。スクリーン６２の位置Ｍ（ｘ）にて測定された光強度は、以下の式で記述される。
【００３１】
【数１】
0005558587.tif 000002
【００３２】
２次光源のうち１つが他方に対して位相シフトを有すると見なされるなら、位置Ｍ（ｘ）にて測定された強度Ｉ（ｘ）は、以下の式で記述される。
【００３３】
【数２】
0005558587.tif 000003
【００３４】
この結果は、スリットの軸に関して対称な２つの地点Ｍ（ｘ）およびＭ’（−ｘ）にて測定された強度差から得られた強度差ΔＩ（ｘ）＝Ｉ（ｘ）−Ｉ（−ｘ）が、以下の以下の式で記述されるということを示す。
【００３５】
【数３】
0005558587.tif 000004
【００３６】
同様にして、ポンプビームおよびストークスビーム（図４）の入射軸に関して対称な２方向のベクトルｋおよびベクトルｋ’に沿って測定された強度ＩＦｗｄ（ベクトルｋ）および強度ＩＦｗｄ（ベクトルｋ’）の差ΔＩ（ベクトルｋ）の式が、ヤングの二重スリット理論から誘導可能であることを、出願人は実証した。
【００３７】
【数４】
0005558587.tif 000005
【００３８】
ここでは、位相シフトφは共鳴媒質の分子振動の痕跡（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）に由来する。位相シフトφは、差ΔＩ（ベクトルｋ）が共鳴媒質の三次非線形感受率の虚数部、つまり媒質１の純粋ラマンスペクトルに比例するこの式から生じる。
【００３９】
図７は、共鳴媒質１と非共鳴媒質２との間の軸方向界面（図４）に焦点が合わせられたポンプビームおよびストークスビームのベクトル特性を考慮した厳密な数値計算の結果を示す。この解析の目的は、波動ベクトルｋの空間において、標準化ラマン偏移ζ＝（ωｐ−ωｓ−ΩＲ）／Γの関数として放射されたＣＡＲＳ散乱信号の角変位を研究することにある。共鳴のない状態（ζ＝?１０）では、ビームが中心に向けられる。一方、共鳴のある状態（ζ＝０）では、角変位がはっきりと現れる。
【００４０】
図８（Ａ）は、ポンプビームおよびストークスビームが界面（ｘ＝０）に焦点を合わせられた場合の半空間（ｋｘ＞０）および半空間（ｋｘ＜０）に統合されたＣＡＲＳスペクトルを、これらの差ΔＩとともに示す。この差はＩｍ［χ（３）１Ｒ］によって与えられるラマンスペクトルに正確に従う。このことは非共鳴ノイズを有さないＣＡＲＳ分光法に対する本方法の関連性を示す。したがって、たとえばストークスビームの振動数を変化させることによって、共鳴媒質のラマンスペクトルを決定することが可能である。
【００４１】
図８（Ｂ）は、界面に対してポンプビームおよびストークスビームの焦点の関数として半空間（ｋｘ＞０）および半空間（ｋｘ＜０）に積分されたＣＡＲＳ信号を示す。これらの差は、界面の近傍にて一意的にゼロではない。したがって、界面の近傍にて背景ノイズのない非共鳴ＣＡＲＳ画像を得ることができる。
【００４２】
ｋ空間にてＣＡＲＳ信号間で差を見つけるこの新たなアプローチを以下ではＤｋ−ＣＡＲＳ（Ｋ空間における差動的（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）イメージング）という。
【００４３】
図９（Ａ）および図９（Ｃ）は、Ｄｋ−ＣＡＲＳ顕微鏡用の可能な３つの検出モダリティを示す。各検出モダリティに対して、数値シミュレーションは水性溶媒中の直径３μｍのビーズに対して得られた画像を示す（ポンプ波長：７３０ｎｍ、ストークス波長：７８７ｎｍ、励起レンズの水中における開口数：１．２、集光レンズの空気中における開口数：０．５）。この画像は、励起ビームの入射方向Ｚ（図５参照）に垂直なビーズの赤道面に対応するＸＹ平面にて、各ケースにおいて計算される。図９（Ａ）は、Ｘ軸に垂直な界面における検出を可能にするＸ検出モダリティを示す。図９（Ａ）に示す例では、光強度の差は、空間（ｋｘ＞０）（ケースα、図９（Ａ））および空間（ｋｘ＜０）（ケースβ、図９（Ａ））にて統合された。ポンプビームおよびストークスビームの焦点の相対位置を変化させることによって、図９（Ａ）の画像が得られる。図９（Ｂ）の検出モダリティは、Ｙ軸に垂直な界面における検出を可能にする。この例では、異なる位置に対して、空間（ｋｙ＞０）（ケースα、図９（Ｂ））および空間（ｋｙ＜０）（ケースβ、図９（Ｂ））にて積分された（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）光強度の差が計算される。図９（Ｃ）は、検出モダリティＸＹＺを示す。この画像は、それぞれ図９（Ｃ）のケースαおよびβにおいて、２つの反対方向であるベクトルｋ（ｋｘ，ｋｙ，ｋｚ）およびベクトルｋ″（−ｋｘ，−ｋｙ，ｋｚ）にて測定された光強度Ｉα（ｋｘ，ｋｙ）およびＩβ（−ｋｘ，−ｋｙ）において２×２の差をとることにより計算される。これらの方向は、角円錐（ａｎｇｕｌａｒ  ｃｏｎｅ）に含まれる。角円錐の開口角は、ＣＡＲＳ散乱信号を集めるための開口数（たとえば空気中では０．５である）によって規定される。この後者の検出モードでは、すべての界面がビーズの赤道面中に視認される。
【００４４】
図１０は、たとえば共鳴媒質と非共鳴媒質との界面を含むサンプルを研究するために、図９（Ａ）および図９（Ｂ）の検出手段として構成されたＤｋ−ＣＡＲＳの実験実装の第１の例を示す。図１０による検出装置１００は通常、角振動数ωｐの第１の励起ビーム（ポンプビーム）および角振動数ωｓの第２の励起ビーム（ストークスビーム）の放射を可能にするレーザシステム１０１を含む。矢印１０２により示された２つの励起ビームは、同一直線上であって、全体が１０３として参照された装置の光検出モジュール中で、主方向Ｚに従って入射する。光検出モジュール１０３は全体として、主方向Ｚと明確に垂直なＸＹ平面中に配置されたサンプル１０５と相互作用する励起ビームを生成する手段１０４と、励起ビームとサンプル１０５との相互作用から、より具体的にはＣＡＲＳ信号の角度のずれから生じたＣＡＲＳ信号の分散方向を解析する手段とを含む。また光検出モジュール１０３は、光検出モジュール１０６と処理装置１２５とを含む。
【００４５】
レーザシステム１０１は、たとえばいわゆる２色用途において、２つのスペクトル的に狭く調節可能なレーザ光源１０８を含む。レーザ光源１０８は、たとえば６９０〜１０００ｎｍの波長にて放射され、ポンプレーザ８０９によって送出されるチタン：サファイア型、または５３２ｎｍにて放射されるネオジム：ＹＶＯ４型である。調節可能なレーザは、たとえば通常３ピコ秒（ｐｓ）のオーダーのピコ秒のパルスを放射することにより、角振動数ωｐ（通常は波長７３０ｎｍ）のポンプ励起ビームおよび角振動数ωｓのストークス励起ビームを形成する。パルスピッカー（ｐｉｃｋｅｒ）１１０が使用されることにより、ピークパルス力を減らすことなく、ポンプ励起レーザおよびプローブ励起レーザのパルス反復振動数を減少させてもよい。調節可能なストークスビームまたはポンプビームを用いることにより、特にアンチストークス放射スペクトルを、共鳴媒質のラマンスペクトルを決定することを目的とした分光法における用途に対して、スキャンすることができる。たとえば光学パラメータ式発振器（ＯＰＯ）、光学的パラメトリック増幅器（ＯＰＡ）、ピコ秒ネオジム：ガラス発振器、イッテルビウムまたはエルビウム添加光ファイバーなどの他の調整可能なレーザ光源が使用されてもよい。また光源は、観察されるラマン線の分光幅に応じて、ナノ秒（ｎｓ）またはフェムト秒（ｆｓ）のレーザ光源であってもよい。しかし、ナノ秒パルスはスペクトル的には非常に良いが、ピコ秒パルスよりも低い最大出力および低い繰り返し周波数しか有さない。さらに、ナノ秒パルスに関連した熱的効果は、生物学的サンプルによりダメージを与えうる。未加工のフェムト秒パルスは一般に、スペクトルが広すぎる。凝縮相（固体または液体）では線幅が約１０〜２０ｃｍ−１である。これはピコ秒パルスの使用に対応する。
【００４６】
図１０に示す例では、手段１０４は、たとえばサンプルを解析するための共通の焦点体において、ポンプビームおよびストークスビームに焦点を合せることを目的とした励起ビームに焦点を合せるための焦点レンズ１０７を含む。焦点レンズの使用は、顕微鏡用途に特に好適である。しかし、特に薄いサンプルを研究する場合、ＣＡＲＳ信号の放射が焦点ビームを用いて機能するためには、焦点レンズは必須ではない。
【００４７】
図１０に示す例では、光検出モジュール１０６は、放射された非線型光信号（この例ではＣＡＲＳ信号）の収集を可能にする集光レンズ１１１と、励起信号をカットするためのフィルタ１１２と、２つの経路に沿って設けられた光ビームスプリッタと、各経路上に設けられた２つの相補的な半空間が区切られるようにするためのかみそり刃タイプの刃（ｂｌａｄｅ）と、を含む。図１０の場合、刃は、検出モードＸ（図９（Ａ））に対応する２つの半空間（ｋｘ＞０）および半空間（ｋｘ＜０）を区切るように配置されている。変形例によると、刃は、検出モードＹ（図９（Ｂ））に対応する２つの半空間（ｋｙ＞０）および半空間（ｋｙ＜０）を区切るように配置されうる。各経路上には、刃の後方に配置された検出器１１６，１１７によって、各半空間において光強度を測定することが可能となる。検出器は、たとえばアバランシェ光ダイオード（ＡＰＤ）型、高速光ダイオード（ＰＩＮ）型、または光電子増倍管（ＰＭＴ）型である。検出器は、集光部（ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ  ｏｐｔｉｃ）１１８，１１９の上流に位置してもよい。処理ユニットは、検出器１１６，１１７によって検出された信号を受け取り、各経路において測定された光強度における差ΔＩを決定する。出願人らは、差ΔＩが共鳴媒質のラマンスペクトルに比例することを示した。
【００４８】
ある例によると、手段１０４はまた、サンプルのＸＹ平面中に励起ビームスキャン装置も含む。このスキャン装置は、サンプルを形成する共鳴媒質および非共鳴媒質の横断界面に対して励起ビームの焦点を調節するために、分光法用途において、つまり画像化用途において、同時に有用でありうる。このスキャン装置は、サンプルの置換を可能とする装置、または好ましくは励起ビームの角度スキャン装置として機能してもよい（図１０には図示せず）。励起ビーム用の角度スキャンシステムが設けられる場合、励起ビームは軸（光軸）に沿って入射する。光軸はもはや主方向Ｚに統合される必要はない。したがって、２つの半空間を集光レンズの射出瞳または射出瞳の像（ｉｍａｇｅ）に区切ることを可能にする部材を中心に配置することが好ましいであろう。実際は、射出瞳上に配置することによって、サンプルへの入射角がどうであろうと、励起ビームが中心に集められたままにすることができる。
【００４９】
図１１は、図１０に示す実験設定を用いて得られた実験結果を示す。サンプルは、ポリスチレンビーズ（直径２０μｍ）により構成されている。ポリスチレンの芳香族環は、１００３ｃｍ−１および１０３４ｃｍ−１にて振動共鳴を有する。これらのビーズは、屈折率がｎ＝１．５６の水溶液中に浸され、水中の開口数が１．２であるレンズにより励起される。ポンプビームの波長は、７３０ｎｍに設定されている。ストークスビームの波長は、上述したラマン共鳴を通過するように変化できるように構成されている。曲線Ｃ１は、ＣＡＲＳ強度、つまり空間全体で統合された光強度を示す。曲線Ｃ２（実戦）は、それぞれ半空間（ｋｘ＞０）および半空間（ｋｘ＜０）にて測定された強度の差ΔＩを示す。９９５ｃｍ−１にて共鳴がない場合、差ΔＩは何の信号も生じさせない。一方、１０１０ｃｍ−１にて図１０に示すように隠し刀（ｏｃｃｕｌｔｉｎｇ  ｂｌａｄｅｓ）を使用することにより、界面はｘ軸方向の照射（ｉｌｌｕｍｉｎａｔｅ）に従う。これにより、切望された結果が得られる（図８（Ｂ）参照）。検出器１１６，１１７（図１０）が同じ信号を検出するため、刃が取り除かれると信号は現れない。スペクトル的には、ビーズと液体間の２つの対向する界面におけるωｐ−ωｓの関数として、曲線Ｃ２およびＣ３はΔＩにおける変化を示す。出願人は、これらの曲線が、実験的に不確実なエラーをわずかにしか伴わずにラマンスペクトルに従うことを実証した。
【００５０】
したがって、図１０はＤｋ−ＣＡＲＳ検出を実装するための特に単純な態様を示す。様々な変形例がありうる。
【００５１】
ある変形態様によると、かみそり刃１１５，１１６は、２つの相補的な半空間に区切ることを可能にする任意のタイプのシャドーマスクと置換されてもよい。たとえば、これらのマスクは、光ビームスプリッタ１１３上に直接配置されうる。
【００５２】
別の変形態様によると、光検出モジュール１０６は、たとえば電気的に制御された液晶フィルタなどの適応フィルタを用いることにより、アバランシェ光ダイオード型または光電子増倍管型の単一の検出器を備えた単一の経路のみを含む。この場合、１つの半空間上で統合された強度が最初に測定され、次に他の半空間上で強度が測定される。また、強度間で差の計算が行われる。
【００５３】
図１２は、図１０の変形例を示す。ここでは、ＣＡＲＳ信号の散乱方向の解析手段は、ＸＹモード（図９（Ｃ））にて検出するように構成され、単一の経路を備えた光検出モジュール１０６を含む。この変形例によると、画像記録システム、たとえば４つの光ダイオードを有するＣＣＤ型またはＣＭＯＳ型のマトリックスカメラにより形成された単一の検出器によって、シャドーマスクシステムが置換される。このカメラを用いることにより、（フィルタ１１２が除去された場合に）励起ビームのカメラへの入射方向に関して対称な方向に放射された非線形光信号を、１つ１つ検出することが可能となる。したがって、各信号対に対してとられた差が検出される。
【００５４】
実際は、顕微鏡用途では、たとえば励起ビームがサンプル上でスキャンされる場合、励起ビームの入射方向が変化し、たとえば異なるスキャン位置に対して検出器における励起ビームの位置を記録することにより、校正を行うことができる。カメラもまた「溶液中で」校正されてもよい。これを行うために、たとえば均質なＣＡＲＳ媒質中で励起ビームが焦点を合わせられた場合に、励起ビームの異なる入射角に対して信号の位置を記録することができる。したがって、ＣＡＲＳ散乱信号のずれは存在しない。次に、この参照位置に対して偏移が測定される。
【００５５】
顕微鏡用途では、ポンプ励起ビームおよびストークス励起ビームに対するスキャンシステムが使用された場合、集光レンズの射出瞳（ｅｘｉｔ  ｐｕｐｉｌ）または射出瞳の像（ｉｍａｇｅ）にてカメラを配置することが好ましい。これにより、サンプルへの入射角がどうであろうと、励起ビームを集中させたままにすることができる。または、様々なスキャン角度に対して入射励起ビームの位置を考慮するようにカメラを校正することが可能である。この位置は、非線形光信号中の偏移を測定するための基準として機能する。
【００５６】
図１３〜１６は、ＣＡＲＳ信号の放射方向の解析手段の他の変形例を示す。上述の例のように、界面を形成する共鳴媒質および非共鳴媒質を含むサンプル１０５（図１３（Ｂ））がポンプビームおよびストークスビームによって励起される。ポンプビームおよびストークスビームは同一直線上であって、共通の焦点体４５に従ってサンプルに入射する。図１３（Ａ）に示す例では、光検出モジュール１０６は所定の振動数（ν）にて主方向Ｚの周りを回転するマスク１３０を含む。このマスクは、たとえば図１３（Ｃ）に示すように半円盤１３４として形成されることによって、主方向Ｚに垂直なＸＹ平面中でＣＡＲＳ散乱信号を特に隠す。したがって、隠された信号が、焦点レンズ１３１に続いて、たとえば光電子増倍管タイプ、光ダイオードＰＩＮまたはアバランシェ光ダイオードタイプの検出器１３２によって検出される。
【００５７】
共鳴していない場合、ＣＡＲＳ散乱信号が集中される。また、検出器１３２によって検出された信号は、マスクの角度位置θの関数として一定である（図１３（Ｃ）に示されるように、たとえばθはＸ軸との関係で定義される）。図１４（Ａ）から明らかなように、検出された信号Ｓ（θ）は一定である。フーリエ空間では、振動数νにおける信号の高調波は０である（図１４（Ｂ））。
【００５８】
共鳴している場合、ＣＡＲＳ散乱信号はずれてるため、回転マスクに集中していない。したがって、検出器１３２により検出された信号（図１５（Ａ）の曲線１４１）は、以下の方程式にて調節される。
Ｓ（θ）＝ａ  ｃｏｓ（θ＋φ）＋定数
または
Ｓ（ｔ）＝ａ  ｃｏｓ（νｔ＋φ）＋定数
【００５９】
処理装置１２５は、フーリエ変換の振動数νにおける（０でない）振幅（ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）を決定するために、フーリエ変換を計算すること、または好ましくは同期検波により、振動数νにて信号が調節されることを可能にする。この振幅は、信号Ｓ（ｔ）の最大値と最小値の差に比例する。この振幅は、中央値１の虚数部Ｉｍ［χ（３）１Ｒ］に比例するため、共鳴媒質の共鳴振動の指標となる。したがって、軸方向界面にてコントラスト画像を得るために、分光法または顕微鏡用途においてラマンスペクトルが決定可能となる。
【００６０】
さらに、図１６に示すように、フーリエ変換にて得られ、第１の高調波νにて調節された信号の位相φを決定することにより、共鳴媒質および非共鳴媒質の配向性および相対位置に関する情報が提供される。
【００６１】
たとえば１／４の円盤または３／４の円盤など、回転マスクには、半円盤以外の形状が使用されてもよい。さらに、回転マスクは説明したように機械的に製造されてもよいし、電気的に制御可能なフィルタ、たとえば液晶フィルタによって製造されてもよい。
【００６２】
図１３（Ａ）は、ポンプ励起ビームおよびストークス励起ビームに対するスキャンシステムが使用される場合の顕微鏡法の応用を示す。この例では、集光レンズの射出瞳中または射出瞳の像中に回転盤を配置するのが好ましい。これにより、サンプルに対する入射角がどうであろうと、励起ビームが中心に集まる状態が維持される。
【００６３】
Ｄｋ−ＣＡＲＳの実装に対して、離れた場にてＣＡＲＳ信号の散乱方向が解析される。集光レンズ１１１（図１０，１２，１３（Ａ））を使用することにより、実験実装が促進される。しかし、この集光レンズは厳密には必要ではなく、検出はサンプルの下流にて直接行うことができる。
【００６４】
２つのスペクトル的に狭いレーザ光源を用いて、２色用途に関する用途において、ＣＡＲＳの検出を説明してきた。多重用途（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）と呼ばれる用途では、たとえばフェムト秒パルスまたは光ファイバーもしくは他の分散性媒質により生成された超連続体によって生成されたストークスビームのスペクトル的に広い放射源が選択可能である。ポンプ信号自体は、スペクトル的に狭いままである。この用途では、たとえば検出された２つの半空間に入る２つの信号が入力されるＣＣＤカメラを備えた２つのスリット分光計または単一の分光計を用いて、単一パルスにおけるラマンスペクトルを得ることが可能となるであろう。この用途では、半空間（ｋｘ＞０）および半空間（ｋｘ＜０）においてスペクトルを得て、これらの差を生じさせることが問題である。
【００６５】
３色用途と呼ばれる用途では、関連する振動数ω１、ω２およびω３の３つの波長が使用されることにより、角振動数ω１−ω２＋ω３にてＣＡＲＳ信号が生成される。半空間（ｋｘ＞０）および半空間（ｋｘ＜０）において角振動数ω１−ω２＋ω３にて信号を検出してこれらの差を算出することにより、ＣＡＲＳ信号はノイズのない非共鳴な状態にされてもよい。
【００６６】
ＣＡＲＳ散乱の場合にて検出方法を説明してきたが、この検出方法は、分光法用途および顕微鏡用途の両方に対して、軸方向界面にて検出して共鳴媒質と非共鳴媒質との間の界面を明らかにできることによって、他の非線形の２次または３次の処理にも同様に適用される。いずれの場合も、１つ以上の励起ビームの相互作用から生じた非線形光信号の放射方向の解析が、共鳴媒質と非共鳴媒質との間に界面を呈するサンプルを用いて行われる。この放射方向の解析は、共鳴媒質と非共鳴媒質との間の界面を明らかにすること、または共鳴媒質のスペクトルを特徴づけることを可能にする。
【００６７】
ある例によると、第３の共鳴調波（ｈａｒｍｏｎｉｃ）を生成する処理は、角振動数ωｐの単一のポンプ励起ビームを用いて共鳴媒質と非共鳴媒質との間に界面を含むサンプルを励起することによって、共鳴が電子共鳴である場合に使用されうる。たとえば、発振器型のチタン：サファイア、ネオジム：ガラス、またはイッテルビウムまたはエルビウム添加光ファイバーのピコ秒またはフェムト秒レーザ光源である。
【００６８】
他の例によると、４波混合処理は、共鳴が電子共鳴である場合に、角振動数ωｐの単一のポンプ励起ビームを用いて、共鳴媒質と非共鳴媒質との間の界面を含むサンプルを励起することにより使用されうる。たとえば、発振器型のチタン：サファイア、ネオジム：ガラス、またはイッテルビウムまたはエルビウム添加光ファイバーのピコ秒またはフェムト秒レーザ光源である。
【００６９】
上述の２つの例は、電子共鳴を取り扱っている。電子共鳴は、原子、分子、半導体の結晶などにおいて見られる。
【００７０】
別の態様によると、第２の共鳴調波は単一のポンプビームを用いて励起されうる。または、振動数の合計がポンプビームおよびプローブビームを用いて作られうる（二次の非線形効果）。
【００７１】
いくつかの詳細で例示的な態様を用いて本願発明を説明したが、本願発明による検出装置および方法は、当業者に明らかな異なる変形例、修正、および改良を含む。そのため、以下の特許請求の範囲に規定されるように、これらの異なる変形例、修正、および改良が本願発明の範囲に含まれることが理解されるであろう。
【図１Ａ−１Ｂ】
0005558587.tif 000006
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
0005558587.tif 000008
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
0005558587.tif 000010
【図４】
0005558587.tif 000011
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図５】
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【図９】
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【図１１】
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