(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
異常増殖性疾患および／またはウイルス性疾患の治療用の、少なくとも１つのカモミール属（Ｃｈａｍｏｍｉｌｌａ）の植物の有機抽出物を含む組成物であり、該抽出物がフローレステュビフォルミス（Ｆｌｏｒｅｓ  ｔｕｂｉｆｏｒｍｉｓ）から得られるが、ただし、該ウイルス性疾患の治療用にはジャーマンカモミール（Ｍａｔｒｉｃａｒｉａ  ｃｈａｍｏｍｉｌｌａ（Ｌ．））の単抽出物が除外される組成物。
【請求項２】
該組成物が少なくとも１つのカモミール属（Ｃｈａｍｏｍｉｌｌａ）の植物の有機抽出物、ならびに任意に少なくとも１つの医薬的および／または皮膚科学的に許容される助剤からなることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
該異常増殖性疾患の治療が異常増殖性哺乳類細胞、特に癌細胞の同期化およびＳ期停止を含むことを特徴とする、請求項１〜２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４】
該同期化がオルニチンデカルボキシラーゼの誘導および／またはトポイソメラーゼ（トポイソメラーゼＩＩを含む）の阻害を含むことを特徴とする、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
該有機抽出物が、エタノールを包含する２〜６個の炭素原子を有するアルコールでの抽出、またはアセトンを包含する３〜５個の炭素原子を有するケトンでの抽出によって得られることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
該カモミール属（Ｃｈａｍｏｍｉｌｌａ）の植物が、
−ジャーマンカモミール（Ｍａｔｒｉｃａｒｉａ  ｒｅｃｕｔｉｔａ  Ｌ．）およびコシカギク（Ｍａｔｒｉｃａｒｉａ  ｄｉｓｃｏｉｄｅａ  ＤＣ．）を含むカミツレ属（Ｍａｔｒｉｃａｒｉａ）の種
−ローマカミツレ（Ａｎｔｈｅｍｉｓ  ｎｏｂｉｌｉｓ  Ｌ．）、キゾメカミツレ（Ａｎｔｈｅｍｉｓ  ａｒｖｅｎｓｉｓ  Ｌ．）、カミツレモドキ（Ａｎｔｈｅｍｉｓ  ｃｏｔｕｌａ  Ｌ．）およびコウヤカミツレ（Ａｎｔｈｅｍｉｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉａ  Ｌ．）を含むローマカミツレ属（Ａｎｔｈｅｍｉｓ）の種、
−モロッコカモミール（Ｏｒｍｅｎｉｓ  ｍｕｌｔｉｃａｕｌｉｓ  Ｂｒ．−Ｂｌ．  ＆  Ｍａｉｒｅ）ならびに
−ケープカモミール（Ｅｒｉｏｃｅｐｈａｌｕｓ  ｐｕｎｃｔｕｌａｔｕｓ  ＤＣ．）、からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
該カモミール属（Ｃｈａｍｏｍｉｌｌａ）の植物が、ジャーマンカモミール（Ｍａｔｒｉｃａｒｉａ  ｒｅｃｕｔｉｔａ  Ｌ．）であることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
抽出される植物部分が精油を除去するために前もって水蒸気蒸留にさらされることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
１００００ダルトン未満の分子量を有する成分を収集し、１００００ダルトンを超える分子量を有する成分を除去するために有機抽出物の一次液を分子量濾過にかけ、得られた液体抽出物画分を任意に乾燥粉末に処理することを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
１００００ダルトンを超える分子量を有する成分を収集し、１００００ダルトン未満の分子量を有する成分を除去するために有機抽出物の一次液を分子量濾過にかけ、得られた液体抽出物画分を任意に乾燥粉末に処理することを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
少なくとも１つの医薬的および／または皮膚科学的に許容される助剤を含有することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
該治療が該組成物および少なくとも１つの抗腫瘍剤の同時または連続投与を含むことを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
該治療が、
−該異常増殖性哺乳類細胞、特に該癌細胞を同期化し、それらをＳ期にて停止させるために該組成物を少なくとも５日間投与し、次いで、
−該投与が、少なくとも１つの抗腫瘍剤の投与の開始前に、少なくとも２４時間中止されることを含み、
−該抗腫瘍剤の投与の間、該組成物が投与されず、かつ、
−続く該抗腫瘍剤の排出期の間も、該組成物が投与されない、
ことを特徴とする、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
該治療周期を少なくとも３回繰り返すことを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
該組成物が少なくとも１つのカモミール属（Ｃｈａｍｏｍｉｌｌａ）の植物の有機抽出物、ならびに少なくとも１つの抗腫瘍剤、ならびに任意に少なくとも１つの医薬的および／または皮膚科学的に許容される助剤からなることを特徴とする、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
該抗腫瘍剤が天然、半合成または合成由来であることを特徴とする、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
該抗腫瘍剤が、
−代謝拮抗剤、
−ＤＮＡアルキル化剤、
−有糸分裂阻害剤、および
−ＤＮＡ挿入剤
からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
一次抽出物が、脂質基を有する少なくとも１つの水溶性不純物であって、下記のステップ：
（ｉ）該不純物と複合体を形成する親油性成分と該組成物を接触させること；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）にて形成された複合体より大きな粒径を有する物質を除去する第一除去ステップ；および
（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）にて形成された複合体を除去する第二除去ステップ、
によって除去される不純物を含有することを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
該不純物が、タンパク質基を有するリポ多糖および炭水化物を含み、グラム陰性菌の細胞壁の断片および細胞壁を構成する分子の断片からなる群から選択されるエンドトキシンであることを特徴とする、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
該エンドトキシンが、少なくとも１つの脂質鎖を有する糖タンパク質であることを特徴とする、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
該エンドトキシンが５００ダルトンを超える分子量を有することを特徴とする、請求項１９または２０に記載の組成物。
【請求項２２】
該親油性成分が、脂肪油を含む油であることを特徴とする、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
ステップ（ｉｉｉ）が、０.００１〜０.０１μｍの範囲の孔径を有するフィルターを用いる限外濾過を含むことを特徴とする、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
該抽出物がエンドトキシンを含まない、または実質的に含まないことを特徴とする、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
該抽出物が２５ＥＵ／ｍｌ以下の量のエンドトキシンを含有することを特徴とする、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
該治療が該組成物の注射、または経口、直腸もしくは局所投与によって実現することを特徴とする、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
異常増殖性疾患および／またはウイルス性疾患の治療用の薬剤の製造のための、少なくとも１つのカモミール属（Ｃｈａｍｏｍｉｌｌａ）の植物の有機抽出物を含む組成物の使用であるが、ただし、該ウイルス性疾患の治療用にはジャーマンカモミール（Ｍａｔｒｉｃａｒｉａ  ｃｈａｍｏｍｉｌｌａ  （Ｌ．））の単抽出物が除外される使用。
【請求項２８】
該組成物が請求項２〜２６のいずれか１項に定義した組成物であることを特徴とする、請求項２７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、植物抽出物およびその治療上の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ＷＯ０３／１０１４７９Ａ１は、典型的には筋肉内注射によって一緒に投与される、様々な成分を含む組成物の有用な治療特性を記載している。実施例にて用いられた組成物はカモミール抽出物を含むが、それに起因する直接的な治療活性はない；むしろ、その存在が注射自体の好ましくない効果を軽減しうる抗刺激剤として記載されている。
【０００３】
ＷＯ２００７／０５７６５１Ａ１は、脂質基を有する水溶性不純物、特にカモミールの水性組成物に由来するエンドトキシンを除去する製造方法を開示している。
【０００４】
ＷＯ０１／１３９２９Ａ１には、セイヨウノコギリソウ（Ａｃｈｉｌｌｅａ  ｍｉｌｌｅｆｏｌｉｕｍ）から単離された実質的に純粋な生物活性のある抽出物が記載されている。この抽出物、好ましくは、メタノール抽出物は、抗悪性腫瘍活性を有し、抗癌剤として用いられている。
【０００５】
ＷＯ２００８／１４６００９Ａ１には、ヒト顆粒球細胞株ＨＬ６０における５−リポキシゲナーゼ活性およびヒト膠芽細胞腫細胞株Ｕ８７ＭＧにおけるＤＮＡ合成に対するカモミール精油もしくはブラッククミンの種油または両油の混合物の効果が記載されている。この参考文献には、ヒトマクロファージ細胞株ＴＨＰ１におけるＩＬ−６放出およびヒト前立腺癌細胞ＤＵ１４５におけるＤＮＡ合成に対する該油の効果も記載されている。
【０００６】
ＵＳ６３００３７０Ｂ１には、カモミール精油の製造方法が記載されている。この製造方法において、カモミール抽出残渣は水蒸気蒸留または水性蒸留にさらされる。該カモミール抽出残渣は、前述の出発物質の水蒸気蒸留処理ありまたはなしの条件で、カモミールの花および茎を水性もしくは有機溶媒またはその混合物で処理することによって得られる。
【０００７】
「P.Vilagines, P. Delaveau and R. Vilagines "Inhibition de la replication du poliovirus par un extrait de Matricaria chamomilla (L.)", Comptes Rendus de l'Academie des Sciences, Serie III, Tome 301, No. 6, 1985, pages 289 to 294」は、ポリオウイルス１型の増殖に対するジャーマンカモミール（Ｍａｔｒｉｃａｒｉａ  ｃｈａｍｏｍｉｌｌａ  Ｌ．）の含水アルコール抽出物の効果を記載している。ポリオウイルス発生の初期にこのカモミール抽出物を加えると、該抽出物は細胞およびウイルスＲＮＡ合成を阻害する。この阻害は部分的に可逆性である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
発明の目的
異常増殖性疾患および／またはウイルス性疾患の治療用の組成物を提供することは、本発明の目的である。
【０００９】
ヒトまたは動物の体における異常増殖性哺乳類細胞、特に癌細胞の同期化およびＳ期停止のための組成物を提供することは、本発明のさらなる目的である。
【００１０】
この同期化は、オルニチンデカルボキシラーゼの誘導および／またはトポイソメラーゼＩＩの阻害を含むべきである。
【００１１】
異常増殖性疾患の治療であって、該組成物および少なくとも１つの抗腫瘍剤の同時または連続投与を含む治療用の組成物を提供することも、本発明の目的である。
【００１２】
これらの目的は、本発明で達成される。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の概略
本発明は、独立請求項にて定義する特徴によって特徴付けられる。
【００１４】
好ましい実施態様は、従属請求項にて定義されている。
【００１５】
該組成物は、少なくとも１つのカモミール属（Ｃｈａｍｏｍｉｌｌａ）の植物の有機抽出物、ならびに少なくとも１つの抗腫瘍剤、ならびに任意に少なくとも１つの医薬的および／または皮膚科学的に許容される助剤から成っていてもよい。
【００１６】
驚くべきことに、現在では、ＷＯ２００７／０５７６５１Ａ１などに記載されているように、頭状花（flower heads）から得られたカモミール抽出物は、有用な治療特性を有していることがわかっている。特に、該カモミール抽出物はタンパク質合成に対して実質的な影響を及ぼすことなくＤＮＡおよびＲＮＡ合成を減少させることができることがわかっており、そこから癌の治療における有用性を推定することができる。
【００１７】
さらに驚くべきことに、ジャーマンカモミール（Ｍａｔｒｉｃａｒｉａ  ｒｅｃｕｔｉｔａ  Ｌ．）（フローレステュビフォルミス（Ｆｌｏｒｅｓ  ｔｕｂｉｆｏｒｍｉｓ））の筒状花の有機抽出物は、異常増殖性哺乳類細胞、特に癌細胞の同期化およびＳ期停止に適していることがわかっている。
【００１８】
この同期化は、オルニチンデカルボキシラーゼの誘導（Ｇ０期からＧ１期への移行）ならびにトポイソメラーゼＩＩの阻害（Ｓ期の初期での蓄積および停止）のために生じる。
【００１９】
トポイソメラーゼＩＩの阻害は、水性抽出物よりも有機抽出物での阻害の方が１００倍を超えて強いこともわかった（酵素の完全阻害のための濃度について）。
【００２０】
トポイソメラーゼＩＩの阻害は細胞同期化の有効性に極めて重要であるという事実のために、本発明のジャーマンカモミール（Ｍａｔｒｉｃａｒｉａ  ｒｅｃｕｔｉｔａ  Ｌ．）、（フローレステュビフォルミス（Ｆｌｏｒｅｓ  ｔｕｂｉｆｏｒｍｉｓ））の筒状花の有機抽出物は、対応する水性抽出物よりもはるかに強力である。
【００２１】
発明の記載
本発明は、カモミールの水性抽出物を用いて得られたデータ、およびジャーマンカモミール（Ｍａｔｒｉｃａｒｉａ  ｒｅｃｕｔｉｔａ  Ｌ．）、（フローレステュビフォルミス（Ｆｌｏｒｅｓ  ｔｕｂｉｆｏｒｍｉｓ））の筒状花の有機抽出物、特にアルコール抽出物、例えばエタノール抽出物を用いて得られたデータに基づくものである。
【００２２】
利用できる証拠は、下記のようにして得られたカモミール水性抽出物は、タンパク質生合成を維持する一方、ＤＮＡおよびＲＮＡ生合成を減少させることを示している。これは、該抽出物の望ましい特性の優れた尺度である。
【００２３】
水性および／または有機抽出物は、当業者に周知のいずれかの適当な方法によって得られうる。該抽出物は、水性および／または有機溶媒、特にアルコール溶媒、例えばエタノール溶媒などを用いることによって得ることができ、他の成分から分離される。
【００２４】
水性抽出物の好ましい製造方法は、ＷＯ２００７／０５７６５１Ａ１に記載されている。
【００２５】
好ましくは、本発明の組成物は、医薬補助剤からなる群から選択される、好ましくは医薬品および医薬賦形剤からなる群から選択される少なくとも１つの成分をさらに含む。
【００２６】
水性抽出物は、精製工程にかけてもよい。該抽出物は水溶性成分の多成分混合物を含む。該抽出物は、適切な植物部分に水を加え、懸濁液を得、次いで通常は水の沸点以下の温度、例えば９０〜９４℃まで加熱し、次いで室温まで冷却することによって得られうる。
【００２７】
次いで、該水性抽出物を２段階の濾過ステップにかける。例証目的のためのみに、これらは以下でそれぞれ精密濾過および限外濾過として記載されているであろう。他の技術、例えば親油性バリアの使用なども適しているであろう。各濾過ステップは、必要に応じて、１、２または２を超える段階にて行われてよい。
【００２８】
精密濾過は、除去しなければ限外濾過ステップの有効性を損なうであろう物質を除去するために適用される。
【００２９】
下記のパートにて図面の簡単な説明を提供する：
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１はシステム４に関し、ＨｅｐＧ２細胞におけるＤＮＡ合成（Ａ）、ＲＮＡ合成（Ｂ）、およびタンパク質生合成（Ｃ）に対する実施例４の抽出物の効果を示す。用いた抽出物濃度は１５０、５００、および１６６０μｇ／ｍｌである。
【図２】図２は図１に類似しているが、用いた抽出物濃度は１０、５０、１００、および１５０μｇ／ｍｌである。
【図３】図３はシステム４に関し、ＲＮＡ合成（Ａ）およびタンパク質生合成（Ｂ）に対する実施例４の抽出物の効果を示し、図２（Ａ）に示す結果を考慮して計算している。
【図４】図４はシステム４に関し、ＨＴ１３７６細胞におけるＤＮＡ合成（Ａ）、ＲＮＡ合成（Ｂ）、およびタンパク質生合成（Ｃ）に対する実施例４の抽出物の効果を示す。用いた抽出物濃度は１５０、５００、および１６６０μｇ／ｍｌである。
【図５】図５はシステム４に関し、Ｃ３３−Ａ細胞におけるＤＮＡ合成（Ａ）、ＲＮＡ合成（Ｂ）、およびタンパク質生合成（Ｃ）に対する実施例４の抽出物の効果を示す。用いた抽出物濃度は１５０、５００、および１６６０μｇ／ｍｌである。
【図６】図６はシステム５に関し、２４時間後のＨｅｐＧ２細胞におけるアポトーシスの誘導に対する実施例４の抽出物の効果を示す。用いた抽出物濃度は１０、５０、１００、１５０、および３００μｇ／ｍｌである。
【図７】図７はシステム５に関し、２４時間後のＨｅｐＧ２細胞における細胞毒性（膜完全性）に対する実施例４の抽出物の効果を示す。用いた抽出物濃度は１０、５０、１００、１５０、および３００μｇ／ｍｌである。
【図８】図８はシステム５に関し、４８時間後のＨｅｐＧ２細胞におけるアポトーシスの誘導に対する実施例４の抽出物の効果を示す。用いた抽出物濃度は１０、５０、１００、１５０、および３００μｇ／ｍｌである。
【図９】図９は実施例１０に関し、６、２４、および４８時間後のＨｅｐＧ２細胞におけるオルニチンデカルボキシラーゼ発現の誘導に対する実施例４の抽出物の効果を示す。用いた抽出物濃度は３０、１００、および１５０μｇ／ｍｌである。
【図１０】図１０は実施例１１に関し、無細胞アッセイにおけるトポイソメラーゼＩの阻害に対する実施例７の抽出物の効果を示す。用いた抽出物濃度は０.３、１、３、１０、および３０μｇ／ｍｌである。陽性対照として、カンプトテシンを用いた。
【図１１】図１１は実施例１２に関し、無細胞アッセイにおけるトポイソメラーゼＩＩの阻害に対する実施例７、８、および９の抽出物の効果を示す。用いた抽出物濃度は０.３、１、および３μｇ／ｍｌである。陽性対照として、エトポシドを用いた。
【図１２】図１２は実施例１３に関し、ＨｅｐＧ２細胞におけるＳ期での細胞周期停止の誘導に対する実施例４の抽出物の効果を示す。用いた抽出物濃度は１０、５０、１００、および１５０μｇ／ｍｌである。陽性対照として、カンプトテシンを用いた。
【図１３】図１３は実施例１２に関し、無細胞アッセイにおけるトポイソメラーゼＩＩの阻害に対する実施例７の抽出物の効果を示す。用いた抽出物濃度は０.３、１、３、１０、および３０μｇ／ｍｌである。陽性対照として、エトポシドを用いた。比較目的で、０.３、３、および３０μｇ／ｍｌのα−ビサボロールまたは０.３、３、および３０μｇ／ｍｌのジャーマンカモミール（Ｍａｔｒｉｃａｒｉａ  ｒｅｃｕｔｉｔａ  Ｌ．）の精油を用いた。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
下記のパートにおいて、本発明の可能な実施態様が記載されている。
【実施例】
【００３２】
下記の実施例は、本発明を例証している。
【００３３】
実施例にて得られたサンプルの細菌性エンドトキシンの分析は、希釈係数１：１０.０００を用いたＣａｍｂｒｅｘ  ＰｙｒｏＧｅｎｅアッセイで行った。
【００３４】
実施例１および２
４５ｇの黄色のカモミールの筒状花（Ｃｈａｍｏｍｉｌｌａ  ｒｅｃｕｔｉｔａ）を９００ｇの水（精製水、Ｐｈ．Ｈｅｌｖ．）と混合した。この混合物を、２０〜３０分の間に９０℃〜９４℃の間の温度まで加熱した。その後、３０℃〜３５℃の間の温度に達するまで該混合物を室温（１５℃〜２５℃）で保存した。
【００３５】
薬物残渣を深層濾過によって除去した。得られた粗濾液を、０.２２μｍの膜に通す濾過によって精製した。
【００３６】
精製した濾液に、抽出物質量に対して０.３％（実施例１）または０.１％（実施例２）のヒマシ油（Ｐｈ．Ｅｕｒ．）を加えた。得られた混合物を５分間ホモジナイズした。このようにして製造した抽出物を濾過し（接線流モードにて）、残余分を０.２２μｍの膜を用いて回収した。
【００３７】
得られた透過物を濾過し（接線流モードにて）、残余分を０.１μｍの膜を用いて回収した。最終的に、得られた透過物を濾過し（接線流モードにて）、残余分を１０００ｋＤａの膜を用いて回収した。
【００３８】
各最終濾液の細菌性エンドトキシンの残渣は、＜１００ＥＵ／ｍｌである。
【００３９】
実施例３〜５
ヒマシ油の代わりに、抽出物質量に対して０.３％（実施例３）、１.０％（実施例４；ＶＩＰ−Ｅ＿Ｍａｔｒ’０６＿１００３）および３.０％（実施例５）のミグリオール（ｍｙｇｌｉｏｌ）（Ｐｈ．Ｅｕｒ．）を精製した濾液に加えた以外は、実施例１を繰り返した。
【００４０】
各最終濾液の細菌性エンドトキシンの残渣は、＜１００ＥＵ／ｍｌである。
【００４１】
実施例６
本実施例は修正したプロトコールを使用しており、オートクレーブ内ではなく１０Ｌの二層容器内で攪拌しながら加熱および冷却を行った（加熱装置の最高温度は１４０℃）。
【００４２】
ヒマシ油の代わりにミグリオール（Ｍｙｇｌｉｏｌ）を加えた。ミグリオール（ｍｙｇｌｉｏｌ）は、ハンセラー（Ｈａｎｓｅｌｅｒ）から購入した「非経口使用のためのミグリオール８１２（Ｍｙｇｌｉｏｌ  ８１２  ｆｏｒ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｕｓｅ）」を使用した。該混合物をホモジナイゼーションする代わりに室温で１０分間攪拌した。
【００４３】
上記の製造方法の精密濾過は、全てＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ２システムで行った。実行可能性を高め、時間のかかる洗浄工程を回避するために、本実施例の精密濾過は下記の道具を用いて行った：
【表１】
0005643949.tif 000002
【００４４】
さらに、該抽出物の安定化のために、フェノールを加えた。加えたフェノールの量は、６.０〜８.０ｍｇ／ｍｌであった。フェノールは、１０００ｋＤａ濾過の後に加えた。添加後、全てのフェノールが溶解するまで、懸濁液をおよそ１０分間攪拌した。
【００４５】
各場合においてエンドトキシンレベルは低いものであった。
【００４６】
実施例７（液体抽出物ＶｉＰ−Ｅ＿Ｍａｔｒ’０８＿１１０２の製造）
ジャーマンカモミール（Ｍａｔｒｉｃａｒｉａ  ｒｅｃｕｔｉｔａ  Ｌ．）の花序から１００ｇの筒状花を５００ｇの８０％（ｍ／ｍ）エタノールを用いて、４０℃〜６０℃の間の温度で２時間、攪拌しながら抽出したが、これは溶媒に対する薬物の割合が１／５に相当するものである。その後、セルロースフィルター（ＡＦ  ６  Ｆｉｌｔｒｏｘ（登録商標））を用いて該調合液を深層濾過にかけた。固体含有量が４.４３％（ｍ／ｍ）である３８５ｇの透明な暗褐色の液体抽出物を得た。
【００４７】
実施例８（液体抽出物ＶｉＰ−Ｅ＿Ｍａｔｒ’０８＿１１０６の製造）
ジャーマンカモミール（Ｍａｔｒｉｃａｒｉａ  ｒｅｃｕｔｉｔａ  Ｌ．）の花序から１００ｇの筒状花を５００ｇの９０％（ｍ／ｍ）エタノールを用いて、４０℃〜６０℃の間の温度で２時間、攪拌しながら抽出したが、これは溶媒に対する薬物の割合が１／５に相当する。その後、セルロースフィルター（ＡＦ  ６  Ｆｉｌｔｒｏｘ（登録商標））を用いて該調合液を深層濾過にかけた。固体含有量が１.８９％（ｍ／ｍ）である３９８ｇの透明な暗褐色の液体抽出物を得た。
【００４８】
実施例９（液体抽出物ＶｉＰ−Ｅ＿Ｍａｔｒ’０８＿１１０５の製造）
ジャーマンカモミール（Ｍａｔｒｉｃａｒｉａ  ｒｅｃｕｔｉｔａ  Ｌ．）の花序から１００ｇの筒状花を５００ｇの９９.９％（ｍ／ｍ）エタノールを用いて、４０℃〜６０℃の間の温度で２時間、攪拌しながら抽出したが、これは溶媒に対する薬物の割合が１／５に相当する。その後、セルロースフィルター（ＡＦ  ６  Ｆｉｌｔｒｏｘ（登録商標））を用いて該調合液を深層濾過にかけた。固体含有量が１.５４％（ｍ／ｍ）である４１２ｇの透明な暗褐色の液体抽出物を得た。
【００４９】
下記の実施例は、実施例４、７、８および９の抽出物の薬理活性プロフィールを例証している。
【００５０】
実施例１０（オルニチンデカルボキシラーゼ発現の誘導）
実施例４に従って製造した液体抽出物ＶＩＰ−Ｅ＿Ｍａｔｒ’０６＿１００３を用いて、オルニチンデカルボキシラーゼ発現実験を行った。
【００５１】
オルニチンデカルボキシラーゼ発現の誘導の測定のために、該抽出物をＨｅｐＧ２細胞に濃度１５０、１００、または３０μｇ／ｍｌにて加えた。そのように処理した細胞を１０％ＦＢＳ培地中で６時間、２４時間、または４８時間培養した。
【００５２】
次いで、オルニチンデカルボキシラーゼの量の変化をウェスタンブロット分析によって決定した。
【００５３】
図９に示したデータから、本発明の抽出物が濃度依存様式にてオルニチンデカルボキシラーゼ発現を誘導することは明らかである。
【００５４】
実施例１１（比較例；トポイソメラーゼＩ活性の阻害）
実施例７に従って製造した液体抽出物ＶｉＰ−Ｅ＿Ｍａｔｒ’０８＿１１０２を用いて、トポイソメラーゼＩ活性実験を抽出物濃度０.３、１、３、１０、または３０μｇ／ｍｌで行った。陽性対照として、カンプトテシンについても併せて実験を行った。
【００５５】
トポイソメラーゼＩ活性の阻害の測定のために、トポゲン（ＴｏｐｏＧＥＮ）から購入した精製ヒトＤＮＡトポイソメラーゼＩおよび「トポイソメラーゼＩドラッグスクリーニングキット（Ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ  Ｉ  Ｄｒｕｇ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｋｉｔ）」に該抽出物を加えた。それに関して、製造業者のプロトコールに従って進めた。アガロースゲルを用いた電気泳動によってＤＮＡを分離し、エチジウムブロマイドで染色後、ＵＶ光の下で可視化した。この方法で、トポイソメラーゼＩによって生じた弛緩型ＤＮＡ（トポイソマー）が検出でき、超らせん型ＤＮＡ基質からはっきりと分離できた。
【００５６】
図１０に示したデータから、本発明の抽出物がトポイソメラーゼＩ活性を非常に弱くではあるが濃度依存様式にて阻害することが明らかである。
【００５７】
実施例１２（トポイソメラーゼＩＩ活性の阻害）
実施例７に従って製造した液体抽出物ＶｉＰ−Ｅ＿Ｍａｔｒ’０８＿１１０２、実施例８に従って製造した液体抽出物ＶｉＰ−Ｅ＿Ｍａｔｒ’０８＿１１０６、または実施例９に従って製造した液体抽出物ＶｉＰ−Ｅ＿Ｍａｔｒ’０８＿１１０５を用いて、トポイソメラーゼＩＩ活性実験を抽出物濃度０.３、１、または３μｇ／ｍｌで行った。陽性対照として、エトポシドについても併せて実験を行った。
【００５８】
トポイソメラーゼＩＩの阻害は、トポゲン（ＴｏｐｏＧＥＮ）から購入した精製ヒトＤＮＡトポイソメラーゼＩＩαおよび「トポイソメラーゼＩＩドラッグスクリーニングキット（Ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ＩＩ  Ｄｒｕｇ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｋｉｔ）」を用いて決定した。それに関して、製造業者のプロトコールに従って進めた。アガロースゲルを用いた電気泳動によってＤＮＡを分離し、エチジウムブロマイドで染色後、ＵＶ光の下で可視化した。この方法で、トポイソメラーゼＩＩによって生じた弛緩型ＤＮＡ（トポイソマー）が検出でき、超らせん型ＤＮＡ基質からはっきりと分離できた。
【００５９】
図１１に示したデータから、本発明の抽出物の全てがトポイソメラーゼＩＩ活性を濃度依存様式にて強く阻害することが明らかである。阻害の程度は、抽出溶媒としてのエタノールの％（ｍ／ｍ）濃度が増加するにつれて（９９％＞９０％＞８０％）はっきりと増加している。９９％（ｍ／ｍ）エタノールで製造された抽出物は、３００ｎｇ／ｍｌ程度の低濃度でさえ酵素活性の実質的な完全阻害を示した。
【００６０】
この阻害は、実施例４の水性抽出物で得られた阻害の１００倍を超える強さであった。完全阻害にはおよそ１５０μｇ／ｍｌが必要であった（データは示していない）。
【００６１】
実施例１３（Ｓ期における細胞周期停止の誘導）
実施例４に従って製造した液体抽出物ＶＩＰ−Ｅ＿Ｍａｔｒ’０６＿１００３を用いて、細胞周期分析実験を行った。Ｓ期における細胞周期停止についての陽性対照として、カンプトテシンについても併せて実験を行った。
【００６２】
細胞周期停止の誘導の測定のために、該抽出物をＨｅｐＧ２細胞に濃度１０、５０、１００、または１５０μｇ／ｍｌにて加えた。そのように処理した細胞を、１０％ＦＢＳ培地中で４８時間培養した。
【００６３】
次いで、細胞サイトメトリー分析によって、細胞周期のＧ１、ＳまたはＧ２期にある細胞の量の変化を決定した。
【００６４】
図１２に示したデータから、本発明の抽出物が１０μｇ／ｍｌの低濃度で、インキュベーションの４８時間後にはすでにＳ期における強力な細胞周期停止を誘導することが明らかである。
【００６５】
実施例１４（樹脂抽出物の製造）
実施例９と類似の方法で得られた液体抽出物から、減圧下（３００から１０ｍｂａｒ）でわずかに温度を上昇させて（３５℃から４５℃）溶媒を蒸発させた。乾燥物質含有量が＞９９％（ｍ／ｍ）である６.４ｇの暗褐色の樹脂抽出物を得た。
【００６６】
得られた樹脂抽出物は、精油がない、またはほとんどない（＜０.０１％（ｍ／ｍ））ことが分かった。エタノールの含有量は＜０.０５％（ｍ／ｍ）であり、水の含有量は＜０.０１％（ｍ／ｍ）であることが分かった。
【００６７】
実施例１５（無水液体抽出物の製造）
実施例９と類似の方法で得られた６.４ｇの液体抽出物に、６.４ｇのオレイン酸（Ｐｈ．Ｅｕｒ．）および１９.２ｇのマクロゴール４００（Ｐｈ．Ｅｕｒ．）を加えた。
【００６８】
減圧下（３００から１０ｍｂａｒ）でわずかに温度を上昇させて（３５℃から４５℃）エタノールを蒸発させた。不揮発性成分の含有量が＞９９％（ｍ／ｍ）である３１.８ｇの暗褐色の自由流動性の液体抽出物を得た。
【００６９】
得られた無水液体抽出物は、精油がない、またはほとんどない（＜０.０１％（ｍ／ｍ））ことが分かった。エタノールの含有量は＜０.０５％（ｍ／ｍ）であり、水の含有量は＜０.０１％（ｍ／ｍ）であることが分かった。
【００７０】
実施例１６（無水液体抽出物の製造）
実施例１４と類似の方法で得られた１０ｇの樹脂抽出物に、１０ｇのオレイン酸（Ｐｈ．Ｅｕｒ．）および２０ｇのマクロゴール４００（Ｐｈ．Ｅｕｒ．）を加えた。この混合物をホモジナイズした。
【００７１】
そのようにして得られた無水液体抽出物は、不揮発性成分の含有量が＞９９％（ｍ／ｍ）であった。
【００７２】
実施例１７
２０ｇの黄色のカモミールの筒状花（ローマカミツレ（Ａｎｔｈｅｍｉｓ  ｎｏｂｉｌｉｓ  Ｌ．））を３８０ｇの水（精製水、Ｐｈ．Ｈｅｌｖ．）と混合した。この混合物を、２０〜３０分の間に９０℃〜９４℃の間の温度まで加熱した。その後、３０℃〜３５℃の間の温度に達するまで該混合物を室温（２２℃）で保存した。
【００７３】
薬物残渣を深層濾過によって除去した。得られた粗濾液を、０.２２μｍの膜に通す濾過によって精製した。
【００７４】
精製した濾液に、抽出物質量に対して０.３％のミグリオール（ｍｙｇｌｉｏｌ）（Ｐｈ．Ｅｕｒ．）を加えた。得られた混合物を５分間ホモジナイズした。このようにして製造した抽出物を濾過し（接線流モードにて）、残余分を０.２２μｍの膜を用いて回収した。
【００７５】
得られた透過物を濾過し（接線流モードにて）、残余分を０.１μｍの膜を用いて回収した。最終的に、得られた透過物を濾過し（接線流モードにて）、残余分を１０００ｋＤａの膜を用いて回収した。
【００７６】
乾燥物質含有量が１.１％（ｍ／ｍ）である３０９ｇの透明な水性抽出物が得られた。
【００７７】
実施例１８
ローマカミツレ（Ａｎｔｈｅｍｉｓ  ｎｏｂｉｌｉｓ  Ｌ）の２０ｇの頭状花全体を使用した以外は、実施例１７と同一の方法を用いた。
【００７８】
乾燥物質含有量が１.６％（ｍ／ｍ）である２９５ｇの透明な水性抽出物が得られた。
【００７９】
実施例１９
４０ｇの黄色の筒状花（セイヨウノコギリソウ（Ａｃｈｉｌｌｅａ  ｍｉｌｌｅｆｏｌｉｕｍ  Ｌ．））を７６０ｇの水（精製水、Ｐｈ．Ｈｅｌｖ．）と混合した。この混合物を、２０〜３０分の間に９０℃〜９４℃の間の温度まで加熱した。その後、３０℃〜３５℃の間の温度に達するまで該混合物を室温（２２℃）で保存した。
【００８０】
薬物残渣を深層濾過によって除去した。得られた粗濾液を、０.２２μｍの膜に通す濾過によって精製した。
【００８１】
精製した濾液に、抽出物質量に対して０.３％のミグリオール（ｍｙｇｌｉｏｌ）（Ｐｈ．Ｅｕｒ．）を加えた。得られた混合物を５分間ホモジナイズした。このようにして製造した抽出物を濾過し（接線流モードにて）、残余分を０.２２μｍの膜を用いて回収した。
【００８２】
得られた透過物を濾過し（接線流モードにて）、残余分を０.１μｍの膜を用いて回収した。最終的に、得られた透過物を濾過し（接線流モードにて）、残余分を１０００ｋＤａの膜を用いて回収した。
【００８３】
乾燥物質含有量が１.３％（ｍ／ｍ）である６６７ｇの透明な水性抽出物が得られた。
【００８４】
実施例２０
４０ｇのセイヨウノコギリソウ（Ａｃｈｉｌｌｅａ  ｍｉｌｌｅｆｏｌｉｕｍ  Ｌ．）の頭状花全体を使用した以外は、実施例１９と同一の方法を用いた。
【００８５】
乾燥物質含有量が１.４％（ｍ／ｍ）である６３４ｇの透明な水性抽出物が得られた。
【００８６】
実施例２１
ローマカミツレ（Ａｎｔｈｅｍｉｓ  ｎｏｂｉｌｉｓ  Ｌ．）の花序から２０ｇの筒状花を１００ｇの９９.９％（ｍ／ｍ）エタノールを用いて、４０℃〜６０℃の間の温度で２時間、攪拌しながら抽出したが、これは溶媒に対する薬物の割合が１／５に相当する。その後、セルロースフィルター（ＡＦ  ６  Ｆｉｌｔｒｏｘ（登録商標））を用いて該調合液を深層濾過にかけた。固体含有量が１.６２％（ｍ／ｍ）である７１ｇの透明な暗褐色の液体抽出物を得た。
【００８７】
実施例２２
セイヨウノコギリソウ（Ａｃｈｉｌｌｅａ  ｍｉｌｌｅｆｏｌｉｕｍ  Ｌ．）の花序から４０ｇの筒状花を２００ｇの９９.９％（ｍ／ｍ）エタノールを用いて、４０℃〜６０℃の間の温度で２時間、攪拌しながら抽出したが、これは溶媒に対する薬物の割合が１／５に相当する。その後、セルロースフィルター（ＡＦ  ６  Ｆｉｌｔｒｏｘ（登録商標））を用いて該調合液を深層濾過にかけた。固体含有量が１.６２％（ｍ／ｍ）である１５３ｇの透明な暗褐色の液体抽出物を得た。
【００８８】
実施例２３（ＤＮＡ合成（ＢｒｄＵ取り込みアッセイ））
実施例２１の液体抽出物について、インビトロでヒト肝臓癌細胞（ＨｅｐＧ２）中のＤＮＡ合成を阻害する能力を調べた。
【００８９】
細胞増殖を決定するために、５−ブロモ−２’−デオキシ−ウリジン（ＢｒｄＵ）ラベリング・アンド・ディテクションキットＩＩＩ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ；マンハイム、ドイツ）を用いて、新たに合成されたＤＮＡを定量化した。ＢｒｄＵは、新たな細胞ＤＮＡに取り込まれうるチミジン類似体である。［Gratzner, H. G. (1982) Science 218, 474-475を参照のこと］。
【００９０】
要約すると、ヒト肝臓癌細胞（ＨｅｐＧ２）をトリプシン処理によって収集し、１００００細胞／ウェルで９６ウェルマイクロプレート内に播種した。３７℃で５％ＣＯ２中に２４時間プレインキュベーションした後、下記の濃度の実施例２１の液体抽出物を用いて該細胞を３０時間処理した：０、１、３、１０および１００μｇ／ｍｌ。
【００９１】
次いで、１０μｌのＢｒｄＵ（１００μＭ）を該細胞に加え、さらに１８時間インキュベートした。インキュベーション後、エタノールで固定する前に、該細胞を培地で３回洗浄し、過剰なＢｒｄＵを除去した。ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）で標識した抗ＢｒｄＵ抗体と共にインキュベーションする前に、ＤＮＡをヌクレアーゼで部分的に消化し、取り込まれたＢｒｄＵに該抗体が接近できるようにした。過剰な抗体を洗浄した後、ＰＯＤの基質であるＡＢＴＳを加えた。ＰＯＤはＡＢＴＳの切断を触媒し、有色の反応生成物が生成する。Ｓａｆｉｒｅマルチファンクショナルマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ、メンネドルフ、スイス）を用いて、反応生成物の吸光度を４０５ｎｍ（参照波長は４９０ｎｍ）で測定した。ウェルあたりの測定した吸光度は、細胞ＤＮＡに取り込まれたＢｒｄＵのレベルと直接相関する。
【００９２】
サンプルポイントは三重測定した；誤差は標準偏差として表した（データは示していない）。
【００９３】
サンプルのデータは溶媒対照値のパーセンテージとして表し、ＩＣ５０値はグラフパッド・ソフトウェア社（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ)（Ｐｒｉｓｍ、ｖｅｒｓｉｏｎ  ５、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）を用いて計算した。
【００９４】
結果
結果、実施例２１の液体抽出物は、およそ７μｇ／ｍｌ（６.２２８〜７.８８１μｇ／ｍｌ）のＩＣ５０値を有した。それゆえ、該液体抽出物は、ヒト肝臓癌細胞（ＨｅｐＧ２）の増殖を用量依存様式にて阻害した。
【００９５】
本発明の組成物は、当業者に周知の方法によって製剤化することができる。医薬的に許容される成分が用いられるべきである。
【００９６】
投与は好ましくは静脈内、または、より好ましくは、筋肉内注射によって行われる。
【００９７】
活性成分を含有する医薬組成物は、経口使用に適した形態にあってもよい。
【００９８】
治療上の使用は癌、例えば肺癌、肝臓癌および膵臓癌などの治療（および、おそらくは予防も）を含む。他の使用は、乾癬、強皮症および天疱瘡などの局所疾患、伝染性気管支炎、肉腫（カポジ肉腫など）を含む癌、白血病、皮膚癌ならびに下記で具体的に治療を例証している癌、ならびにＡＩＤＳを含む。より一般的には、該組成物は増殖性およびウイルス性疾患、特にＤＮＡまたはＲＮＡウイルスに関連する疾患の治療に用いられてよい。ＲＮＡウイルスに対する作用は直接的であってよく、一方、ＤＮＡウイルスおよび癌に対する作用は少なくとも進行性であってよい。該薬剤は、運動ニューロン疾患および多発性硬化症などの他の遺伝病の治療にも有用でありうる。
【００９９】
該薬剤は、他のウイルス性疾患の治療にも用いられうる。例えば、ＳＡＲＳ（重症急性呼吸器症候群）の場合には、該ウイルスはコロナウイルスであってよい。さらに、該薬剤は獣医学において、例えばニューカッスル病および鶏痘などの鳥類病において有用性を有してよい。
【０１００】
下記の研究は、実施例４の抽出物を用いて得られた本発明のさらなる態様を例証している。
【０１０１】
１）本研究の目的
システム４：ＲＮＡ、ＤＮＡおよびタンパク質生合成
ＲＮＡ、ＤＮＡおよびタンパク質生合成に対する実施例４の抽出物の影響を、３つの異なる細胞株（ＨｅｐＧ２：肝臓癌細胞；Ｃ３３−Ａ：子宮頚癌細胞およびＨＴ１３７６：膀胱癌細胞）を用いてインビトロで調べた。
【０１０２】
システム５：アポトーシスおよび膜完全性
さらに、ＨｅｐＧ２細胞でアポトーシスの誘導に対する実施例４の抽出物の影響を検査した。同時に、ＨｅｐＧ２細胞で実施例４の抽出物の細胞毒性（膜完全性）を調べた。
【０１０３】
２）材料および方法
２.１）サンプルおよびサンプル製造
【表２】
0005643949.tif 000003
ＶＩＰ−Ｅ＿Ｍａｔｒ’０６＿１００３は実施例４に従って製造した。
【０１０４】
２.２）アッセイ条件
【表３】
0005643949.tif 000004
【０１０５】
２.３）アッセイ
２.３.３）ＲＮＡ／ＤＮＡ合成
ＲＮＡおよびＤＮＡ合成のために、アッセイ細胞（ＨｅｐＧ２：肝臓癌細胞（ヒト）；Ｃ３３−Ａ：子宮頚癌細胞（ヒト）およびＨＴ１３７６：膀胱癌細胞（ヒト））をトリプシン処理によって収集し、１００００細胞／ウェルで９６ウェルプレート内に播種した。該細胞を必要濃度のサンプルで処理した後、該プレートを３７℃で５％ＣＯ２中、２時間インキュベートした。２４時間のさらなるインキュベーションの間、ＲＮＡ合成用に該細胞を５−３Ｈ−ウリジン（１μＣｉ／ｍｌ）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）でパルス処理し、ＤＮＡ合成用に６−３Ｈ−チミジン（１μＣｉ／ｍｌ）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）でパルス処理した。該細胞をＰＢＳで洗浄し、メタノールで５分間、２回固定した。０.３ＮのＴＣＡによってタンパク質を沈殿させた。洗浄ステップ後、１５０μｌの０，３Ｎ  ＮａＯＨを１５分間加え、該細胞を溶解した。細胞を含まないサンプルで陰性対照ｔ（０）を行った。
【０１０６】
ＲＮＡ合成用に取り込まれた５−３Ｈ−ウリジンおよびＤＮＡ合成用に取り込まれた６−３Ｈ−チミジンを検出するために、シンチレーションカクテルを入れたシンチレーションチューブに該サンプルを移した。定量化は、Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ  １９００  ＴＲ液体シンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ、米国）で行った。
【０１０７】
アッセイ条件下で放射標識の量（ｄｐｍ）を決定することによって、いくつかの濃度のサンプルの効果を測定した。用量に依存した値は、陽性対照値のパーセンテージとして表した。サンプルポイントは二重測定し、誤差は平均値からの差として表している。
【０１０８】
特定細胞の５−３Ｈ−ウリジン取り込み率（％）は、ＤＮＡ合成アッセイから得られた結果を考慮して計算した。それぞれの合成値（％）をＤＮＡ合成係数で割った。
【０１０９】
２.３.４）タンパク質生合成
タンパク質生合成用に、アッセイ細胞（ＨｅｐＧ２：肝臓癌細胞（ヒト）；Ｃ３３−Ａ：子宮頚癌細胞（ヒト）およびＨＴ１３７６：膀胱癌細胞（ヒト））をトリプシン処理によって収集し、１００００細胞／ウェルで９６ウェルプレート内に播種した。該細胞を必要濃度のサンプルで処理した後、該プレートを３７℃で５％ＣＯ２中、２時間インキュベートした。２４時間のさらなるインキュベーションの間、該細胞をＬ−［３，４，５−３Ｈ（Ｎ）］−ロイシン（１μＣｉ／ｍｌ）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）でパルス処理した。該細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＲＩＰＡ緩衝液で溶解し、氷上で１５分間インキュベートした。溶解物をチューブに移した。２５０μｌの氷冷ＴＣＡ（２０％）を加え、該サンプルを氷上でさらに１５分間インキュベートした。１００００ｘｇ、４℃で２０分間遠心分離後、上清を除去し、ペレットを２５０μｌのＴＣＡ（５％）中に再懸濁し、再び遠心分離した。各サンプルの回収した溶解物を２５０μｌのＮａＯＨ（０，２Ｎ）中に再懸濁し、５０℃で２分間加熱した。細胞を含まないサンプルで陰性対照ｔ（０）を行った。
【０１１０】
取り込まれたＬ−［３，４，５−３Ｈ（Ｎ）］−ロイシンを検出するために、シンチレーションカクテルを入れたシンチレーションチューブに該サンプルを移した。定量化はＴｒｉ−Ｃａｒｂ  １９００  ＴＲ液体シンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ、米国）で行った。
【０１１１】
アッセイ条件下で放射標識の量（ｄｐｍ）を決定することによって、いくつかの濃度のサンプルの効果を測定した。用量に依存した値は、陽性対照値のパーセンテージとして表した。サンプルポイントは四重測定し、誤差は標準偏差として表している。
【０１１２】
特定細胞のＬ−［３，４，５−３Ｈ（Ｎ）］−ロイシン取り込み率（％）は、ＤＮＡ合成アッセイから得られた結果を考慮して計算した。それぞれの合成値（％）を増殖係数で割った。
【０１１３】
２.３.５）アポトーシスアッセイ
ＨｅｐＧ２細胞（肝臓癌細胞（ヒト））をトリプシン処理によって収集し、１００００細胞／ウェルで１００μｌにて９６ウェルプレート内に播種した。２４時間後、２０μｌのサンプルおよび８０μｌの新鮮培地（総容量２００μｌ）を加えた。該プレートをさらに２４時間インキュベートし、追加実験では４８時間インキュベートした。該プレートを２００ｘｇで１０分間遠心分離後、上清を捨て、ペレットを２００μｌの溶解緩衝液中、室温で３０分間溶解した。最終的に溶解物を２００ｘｇで１０分間遠心分離した。溶媒対照（＝陰性対照）は、サンプルの代わりに溶媒を用いて行った。播種およびインキュベーションは、３７℃で５％ＣＯ２下のインキュベーター内で行った。
【０１１４】
溶解物上清中の細胞質ヒストン関連ＤＮＡ断片（モノおよびオリゴヌクレオソーム）は、インビトロで細胞死検出ＥＬＩＳＡｐｌｕｓキット（Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡｐｌｕｓ  Ｋｉｔ）（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号：１１  ７７４  ４２５  ００１）を業者の推奨に従って用いることによって決定した。
【０１１５】
吸光度はマイクロプレートリーダー装置（ＴＥＣＡＮ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００）を用いて波長λ＝４０５ｎｍで測定し、参照波長はλ＝４９０ｎｍとした。細胞質に放出されたモノおよびオリゴヌクレオソームの特異的濃縮係数は、以下のように計算した：
濃縮係数＝サンプルの吸光度／対応する陰性対照の吸光度
サンプルポイントは二重測定し、誤差は平均値からの差として表している。
【０１１６】
２.３.６）ＬＤＨ−細胞毒性アッセイ（壊死の誘導）
ＬＤＨ−細胞毒性アッセイ（膜完全性／壊死の誘導）：細胞毒性は、ＨｅｐＧ２細胞（肝臓癌細胞（ヒト））で検査した。該細胞を一晩かけて９６ウェルプレート内に１００００細胞／ウェルで播種した。２０μｌの示された濃度の各サンプルおよび溶媒対照ならびに８０μｌの新鮮培地（総容量２００μｌ）を加えた。播種およびインキュベーションは、３７℃で５％ＣＯ２下のインキュベーター内で行った。２４時間のインキュベーション後、ＬＤＨ−細胞毒性アッセイキット（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ、＃Ｋ３１１−４００、カリフォルニア州、米国）を用いて膜完全性を測定した。
【０１１７】
該細胞の膜完全性は、サンプルの影響下で培地に放出された細胞質の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の活性を測定することによって決定した。該酵素の活性は、基質としてのテトラゾリウム塩（ＩＮＴ）から産生されたホルマザンを決定することによって測定した。ホルマザンの量は、プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００）を用いて波長λ＝４９０ｎｍで光学濃度（ＯＤ）を決定することによって直接測定した。
【０１１８】
各検査濃度について、バックグラウンド（サンプルを含むが細胞を含まないアッセイ混合物）のＯＤ値を、細胞を含む場合のＯＤ測定値から引き算した。ＯＤ４９０値をパーセンテージ値に変換し、溶媒で溶解した（トリトンＸ−１００）細胞の測定値に対応する細胞毒性の表示を１００％、および溶媒のみと共にインキュベートした細胞に対応する細胞毒性の表示を０％とした。光学測定は二重に行った。誤差は平均値からの差として表した。
【０１１９】
４）まとめ
ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質生合成について、実施例４の抽出物は下記の効果を示した：ＤＮＡ合成は用量依存的に抑制された一方、かなりの高用量にするまでＲＮＡ合成は依然として影響を受けず、タンパク質生合成はわずかに影響を受けるのみであるか、または、増殖性細胞の量に合わせると、増加さえした（図３）。この効果は、３種全ての細胞株について、非細胞毒性の投与量範囲にて明らかであり、細胞停止および分化可能の兆候として解釈することができる。全ての検査した癌細胞、ＨｅｐＧ２肝臓癌細胞、ＨＴ１３７６膀胱癌細胞およびＣ３３Ａ子宮頚癌細胞は、この現象を示した。
【０１２０】
アポトーシスと壊死（ＬＤＨ漏出および細胞膜完全性の喪失によって示される）の識別のためにＨｅｐＧ２細胞で続いて開始した実験において、２４時間後、検査した最も高い投与量においてさえ、我々はアポトーシスの誘導を検出しなかった。実施例４の抽出物は、アポトーシスにも細胞毒性にも何ら効果を示さなかった。
【０１２１】
それゆえ、追加実験は該細胞を４８時間インキュベーションして行うことを決定した。興味深いことに、４８時間後においても、アポトーシスの誘導がないことが分かった。
【０１２２】
図１３から、実施例７の抽出物は濃度３μｇ／ｍｌ以上からトポイソメラーゼＩＩ活性の完全阻害を示すことが明らかである。３μｇ／ｍｌ未満の濃度では、阻害は検出できない。
【０１２３】
α−ビサボロールは、カモミール属（Ｃｈａｍｏｍｉｌｌａ）の植物の精油の主成分の１つであるが、検査した全ての濃度においてトポイソメラーゼＩＩ活性に影響しなかった。
【０１２４】
ジャーマンカモミール（Ｍａｔｒｉｃａｒｉａ  ｒｅｃｕｔｉｔａ  Ｌ．）の精油は、トポイソメラーゼＩＩ活性をほとんど阻害しなかった。比較的高濃度の３０μｇ／ｍｌでの不完全阻害のみが観察された。
【０１２５】
本発明の目的のために、用語「を含有する（containing）」または「を含む（comprising）」は付加的な化合物または成分も存在してよいことを意味するものとし、一方、用語「からなる（consist）」は明示的に言及したもの以外の付加的な化合物または成分が存在しないことを意味するものとする。
【０１２６】
５）参考文献一覧
１  Toshie H., Noriko N.M., Yoshiyuki A., Mittsuhiro N., Toshiro Y., Naohito O. Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor (GM-CSF) Regulates Cytokine Induction by 1,3-β-D-Glucan SCG in DBA/2 Mice in vitro. J. of IFN and Cytokine Research 24:478-489 (2004).
２  Golenbock D.T., Hampton R.Y., Qureshi N., Takayama K., Raetz C. R. H. (1991) Lipid A-like molecules that antagonize the effect of endotoxins on human monocytes. J. Biol. Chem. 266 (29): 19490-498.
３  Garrelds I.M., van Hal P. Th. W., Haakmat R. C., Hoogsteden H. C., Saxena P. R., Zijlstra F. J.: Time dependent production of cytokines and eicosanoides by human monocytic leukaemia U937 cells; effects of glucocorticosteroids. Mediators of Inflammation: 8, 229-235 (1999).
４  Lindl T. (2000) Zell- und Gewebekultur: Einfuhrung in die Grundlagen sowie ausgewahlte Methoden und Anwendungen. 4.uberarb. und erw. Auflage - Heidelberg; Berlin: Spectrum, Akad. Verlag (ISBN 3-8274-0803-2).
５  Decker T. & Lohmann-Matthes M.L. (1988) A quick and simple method for the quantification of lactate dehydrogenase release in measurements of cellular cytotoxicity and tumor necrosis factor activity. J. Immunol Methods 15 (1): 61-69.
【図１】
0005643949.tif 000005
【図２】
0005643949.tif 000006
【図３】
0005643949.tif 000007
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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