(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
増殖性の細胞を含む三次元組織体の形成に用いる組織体形成用基材であって、
貫通孔を有する多孔質フィルム表面に、細胞を保持しうる細胞接着性領域が、隣接する細胞接着性領域との間に間隔を介して配置されてなり、その周縁部において細胞非接着性領域が連続領域を形成するように配置されてなり、前記細胞接着性領域の面積が、５０００μｍ２〜２×１０５μｍ２の範囲であり、且つ、前記細胞接着性領域と隣接する細胞接着性領域との間隔の最短距離が、５０μｍ〜１０００μｍの範囲である組織体形成用基材。
【請求項２】
前記細胞接着性領域が、細胞が接着可能な荷電状態を示す領域、親水性を示す領域又は疎水性を示す領域であり、前記多孔質フィルムの所定領域に、生体から取得された細胞接着性物質、合成された細胞接着性物質及びその誘導体から選ばれた少なくとも１種を固定することで形成された請求項１に記載の組織体形成用基材。
【請求項３】
前記細胞非接着性領域が、親水性たんぱく質、親水性高分子鎖を含む化合物、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、及びセグメント化ポリウレタンから選ばれる細胞非接着性物質及びその誘導体から選ばれる少なくとも１種を固定することで形成された請求項１又は請求項２に記載の組織体形成用基材。
【請求項４】
前記貫通孔を有する多孔質フィルムが、孔径０．０１μｍ〜１００μｍの空孔が互いに連通するように形成されてなる多孔質フィルムからなることを特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の組織体形成用基材。
【請求項５】
前記貫通孔を有する多孔質フィルムが、三次元網目構造を有する多孔質フィルムであることを特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載の組織体形成用基材。
【請求項６】
前記多孔質フィルムが、有機溶媒と高分子化合物を含む液を支持体上にキャストして製膜することで形成された、膜中に空隙が形成された多孔質フィルムからなることを特徴とする請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載の組織体形成用基材。
【請求項７】
請求項１乃至請求項６のいずれか１項に記載の組織体形成用基材を枠体で保持してなることを特徴とする、増殖性の細胞を含む三次元組織体の形成に用いる組織体形成キット。
【請求項８】
前記枠体が、前記組織体形成用基材表面に形成された細胞接着性領域を分画するための、組織体形成用基材表面に垂直方向に設置された仕切りを有する枠体であることを特徴とする請求項７に記載の組織体形成キット。
【請求項９】
請求項１乃至請求項６のいずれか１項に記載の組織体形成用基材を準備する基材準備工程と、該組織体形成用基材表面に増殖性の細胞を播種し、培養、増殖させて三次元組織体を形成させる培養工程とを含むことを特徴とする組織体形成法。
【請求項１０】
前記多孔質フィルムの播種面の裏面に、さらに、三次元組織体を形成させることを特徴とする請求項９に記載の組織体形成法。
【請求項１１】
請求項９又は請求項１０に記載の組織体形成法により増殖性の細胞を培養して得られる三次元組織体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、増殖性の細胞を含む三次元組織体の形成に有用な組織体形成用基材、該基材を含む組織体形成キット、それを用いた組織体形成法、及びそれにより得られた三次元組織体に関する。
【背景技術】
【０００２】
培養細胞は、三次元的に集合して組織体を形成した場合には、例えば基材表面を二次元的に接着して、いわゆる単層を形成した場合に比べて、より長期間生存し、生体内における本来の機能をより高いレベルで発現することが報告されている。このため、培養細胞から三次元組織体を形成する技術は、例えば、生体の挙動を再現するシミュレータ、薬品開発における動物実験の代替技術、細胞移植による再生医療技術等への応用が期待されている。
【０００３】
このような培養細胞の三次元体を形成する技術として、従来、例えば、基材に形成され細胞非接着表面をもつウェル内で初代肝細胞を培養することにより、当該ウェル内で当該初代肝細胞が三次元的に集合した組織体を形成させる技術が提案されている（例えば、特許文献１、参照）。ここには、ウェル内に入れる細胞の数を変えることにより、組織体のサイズを制御することが記載されている。しかしながら、この技術においては、形成された三次元組織体が増殖性の細胞を含む場合には、当該細胞が増殖することにより、培養時間の経過に伴って当該三次元組織体のサイズが増加し続けるため、当該三次元組織体のサイズを一定に制御することは困難であった。
【０００４】
他の方法としては、基材の表面に規則的に配置された複数の小領域で内皮細胞を二次元的に培養した後、当該内皮細胞の単層上で初代肝細胞を培養することによって、当該単層上で当該初代肝細胞が三次元的に集合した組織体を形成させる技術が提案されている（例えば、特許文献２参照）。ここでは、互いに隣接して形成される複数の組織体同士の接着を防止するために、複数の小領域の間隔を所定値以上にすべきことが記載されている。しかしながら、増殖性の細胞を含む三次元組織体のサイズの増加を抑制する方法については考慮されていない。
【０００５】
また、細胞増殖に良好な足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）となり得る材料として、非水溶性ポリマーから形成されるハニカム多孔質体の使用が提案されているが（例えば、特許文献３参照）、この多孔質体は、ボトムが存在するハニカム構造、即ち、基底フィルムの表面に基底フィルムに垂直な隔壁で区画された複数の小空間が互いにヘキサゴナルに位置するように形成された構造を有するものであり、増殖した細胞がその機能を長期にわたって保持できるかどうか、またこのハニカム状多孔質体が長期にわたって細胞の機能を保持することのできるセルチップ用基板として利用できるか否かについては報告されていない。
【０００６】
他方で、例えばＥＳ細胞から胚様体を形成させる場合のように代謝の活発な増殖性細胞を長期にわたり培養する場合には、新鮮な培養液の供給や老廃物の排出をスムーズに行うことのできる組織体形成法や、それを達成し得る組織体形成キットの開発が求められていた。一般に、例えばＥＳ細胞からサイズの整った胚様体を多数形成させる場合には、ハンギングドロップ法が用いられているが（例えば、非特許文献１参照）、この方法を適用して組織体を形成するには手間がかかり、当観点からも効率的な三次元組織体形成法や、それを達成し得る組織体形成キットの開発が求められていた。
【特許文献１】特許第３２７０２８６号公報
【特許文献２】国際公開第０３／０１０３０２号パンフレット
【特許文献３】特開２００１−１５７５７４号公報
【非特許文献１】Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３３０：Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｖｏｌ．２（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記問題点を考慮してなされた本発明の目的は、増殖性の細胞を培養した場合においても、形成される三次元組織体のサイズの増加を抑制し得るとともに、代謝性の高い増殖細胞を用いても、長期にわたって該細胞機能を保持し得る、効率的な三次元組織体を形成するために有用な組織体形成用基材及びそれを含む組織体形成キットを提供することにある。
また、本発明のさらなる目的は、前記本発明の組織体形成用基材やそれを含むキットを用いることにより、増殖性の細胞を培養した場合においても、従来に比べて高活性かつ長時間活性を維持することが可能な、サイズの制御された三次元組織体を、効率よく形成することができる組織体形成法及びそれにより得られた細胞の三次元組織体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは鋭意検討を行い、増殖性の細胞を培養する場合において、新鮮な培養液の供給や老廃物の排出をスムーズに行うことのできる貫通孔を有する多孔質フィルムを応用することで、上記目的を達成しうることを見出し、本発明に至った。
前記課題を解決するための手段は以下の通りである。
＜１＞増殖性の細胞を含む三次元組織体の形成に用いる組織体形成用基材であって、貫通孔を有する多孔質フィルム表面に、細胞を保持しうる細胞接着性領域が、隣接する細胞接着性領域との間に間隔を介して配置されてなり、その周縁部において細胞非接着性領域が連続領域を形成するように配置されてなり、前記細胞接着性領域の面積が、５０００μｍ２〜２×１０５μｍ２の範囲であり、且つ、前記細胞接着性領域と隣接する細胞接着性領域との間隔の最短距離が、５０μｍ〜１０００μｍの範囲である組織体形成用基材。
＜２＞  前記細胞接着性領域が、細胞が接着可能な荷電状態を示す領域、親水性を示す領域又は疎水性を示す領域であり、前記多孔質フィルムの所定領域に、生体から取得された細胞接着性物質、合成された細胞接着性物質及びその誘導体から選ばれた少なくとも１種を固定することで形成された＜１＞に記載の組織体形成用基材。
＜３＞  前記細胞非接着性領域が、親水性たんぱく質、親水性高分子鎖を含む化合物、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、及びセグメント化ポリウレタンから選ばれる細胞非接着性物質及びその誘導体から選ばれる少なくとも１種を固定することで形成された＜１＞又は＜２＞に記載の組織体形成用基材。
【０００９】
＜４＞  前記貫通孔を有する多孔質フィルムが、孔径０．０１μｍ〜１００μｍの空孔が互いに連通するように形成されてなる多孔質フィルムからなることを特徴とする＜１＞乃至＜３＞のいずれか１項に記載の組織体形成用基材。
＜５＞  前記貫通孔を有する多孔質フィルムが、三次元網目構造を有する多孔質フィルムであることを特徴とする＜１＞乃至＜４＞のいずれか１項に記載の組織体形成用基材。
＜６＞  前記多孔質フィルムが、有機溶媒と高分子化合物を含む液を支持体上にキャストして製膜することで形成された、膜中に空隙が形成された多孔質フィルムからなることを特徴とする＜１＞乃至＜５＞のいずれか１項に記載の組織体形成用基材。
＜７＞  ＜１＞乃至＜６＞のいずれか１項に記載の組織体形成用基材を枠体で保持してなることを特徴とする、増殖性の細胞を含む三次元組織体の形成に用いる組織体形成キット。
＜８＞  前記枠体が、前記組織体形成用基材表面に形成された細胞接着性領域を分画するための、組織体形成用基材表面に垂直方向に設置された仕切りを有する枠体であることを特徴とする＜７＞に記載の組織体形成キット。
【００１０】
＜９＞  ＜１＞乃至＜６＞のいずれか１項に記載の組織体形成用基材を準備する基材準備工程と、該組織体形成用基材表面に増殖性の細胞を播種し、培養、増殖させて三次元組織体を形成させる培養工程とを含むことを特徴とする組織体形成法。
＜１０＞  前記多孔質フィルムの播種面の裏面に、さらに、三次元組織体を形成させることを特徴とする＜９＞に記載の組織体形成法。
＜１１＞  ＜９＞又は＜１０＞に記載の組織体形成法により増殖性の細胞を培養して得られる三次元組織体。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、増殖性の細胞を培養した場合においても、形成される三次元組織体のサイズの増加を抑制し得るとともに、代謝性の高い増殖細胞を用いても、長期にわたって該細胞機能を保持し得る、効率的な三次元組織体を形成するために有用な組織体形成用基材及びそれを含む組織体形成キットを提供することができる。
また、本発明によれば、増殖性の細胞を培養した場合においても、従来に比べて高活性かつ長時間活性を維持することが可能な、サイズの制御された三次元組織体を、効率よく形成することができる組織体形成法及びそれにより形成された三次元組織体を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下に、本発明の一実施形態に係る組織体形成用基材、組織体形成キットを、その使用法である組織体形成法とともに、図面を参照しつつ説明する。
本実施形態に係る組織体形成方法（以下、「本方法」という）は、特定の多孔質フィルムを用いた本発明の組織体形成用基材（以下、「本基材」と称することがある）を少なくとも１つ準備する工程（以下「準備工程」という）と、該組織体形成用基材表面に配置された細胞接着性領域に細胞を播種して、増殖性および非増殖性の細胞を培養することにより、当該各表面領域に当該細胞を含む三次元組織体（以下、「組織体」という）を形成させる工程（以下、「培養工程」という）と、を含む。
【００１３】
まず、本方法の準備工程について、本基材の詳細な構造とともに説明する。
図１は、この準備工程で準備する組織体形成基材を有する組織体形成キットの一態様を示す斜視図である。この組織体形成キットは、後述する多孔質フィルム１表面２上に細胞接着性領域３ａを備えてなる組織体形成用基材と、その周縁を支持する枠状の保持材５ａとを備える。また、図２は、この準備工程で準備する組織体形成基材を有する組織体形成キットの他の態様を示す斜視図である。この組織体形成キットは、後述する多孔質フィルム１表面２上に細胞接着性領域３ｂを備えてなる組織体形成用基材に、所定の間隔を介して形成された貫通孔を有し、その貫通孔が細胞接着性領域３ｂを有する領域を分画するように形成されてなる板状の保持材５ｂを積層、固定化してなる。
【００１４】
本発明の組織体形成キットは、少なくとも、微細な連通孔を有する多孔質フィルムからなる組織体形成用基材を備え、この可撓性の多孔質フィルムを使用に適する形状に保持し、ハンドリング性を向上するための保持材により保持されてなる態様であることが好ましい。
【００１５】
（１．保持材）
本発明の三次元組織体形成用基材において所望により設けられる保持材としては、後に説明する多孔質フィルムを固定、保持しうる部材として、安定した構造体として機能すれば、形態には制約はないが、例えば、図１に示す如く多孔質フィルム１の周囲に額縁状に設置してなる枠体５ａの形状を有するものであってもよく、また、所定の間隔で互いに直行する枠材である格子状の保持材であってもよい。
また、枠体のように周縁部を保持するものでなくても、それ自体が安定した板状であって、後述する細胞接着性領域を中心に地位させるべく、所定の間隔をもって形成された貫通孔を有する保持材５ｂを、多孔質フィルム１の表面２に積層して固定化してなる、図２に示す如き形態をとってもよい。
【００１６】
この基材の材質は特に限られず、例えば、ガラス、合成樹脂、ＥＰＤＭ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  Ｄｉｅｎｅ  Ｍｏｎｏｍｅｒ）等の合成ゴム、天然ゴム、セラミック、ステンレス鋼等から成形される。合成樹脂としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエステル（ポリエチレンテレフタレート等）、ポリウレタン、ポリスルホン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリビニル、シリコーン等を好ましく用いることができる。
【００１７】
（２．多孔質フィルム）
本発明の組織体形成用基材に用いる多孔質フィルム、即ち、本発明における「貫通孔を有する多孔質フィルム」とは、フィルムの表裏面や、フィルム表面の細胞接着性領域及び細胞非接着性領域の如き異種領域間のいずれかあるいは双方における物質移動の透過パスとなる貫通孔或いは連通孔を有するフィルムのことを指す。基材フィルムとしては、このような貫通孔（連通孔である場合も包含する）を有するフィルムであって、かつ、細胞などの組織体を表面に保持できるものあれば、材質、構造、孔の形態および孔径、孔径分布、孔の位置の分布、開孔率（フィルム面積に対する表面開孔部総面積の割合）は特に限定されず、いずれのものも用いることができるが、より具体的な例として、下記の条件のものを例示することができる。
なお、本発明においては、細胞接着性領域とその周縁部の細胞非接着性領域との関係を「異種領域」と称することがある。
【００１８】
材質については、例えば、ガラス、合成樹脂、ＥＰＤＭ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  Ｄｉｅｎｅ  Ｍｏｎｏｍｅｒ）等の合成ゴム、天然ゴム、セラミック、ステンレス鋼等から成形される。合成樹脂としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエステル（ポリエチレンテレフタレート等）、ポリウレタン、ポリスルホン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリビニル、シリコーン等を好ましく用いることができる。
【００１９】
構造については例えば、いわゆる多孔質有機樹脂製フィルム、セラミックなどの無機材料からなる無機多孔質フィルム、メッシュフィルム、任意の方法による微細加工フィルムなどが挙げられる。
なお、微細加工フィルムの例としては、光リソグラフィー技術を用いた、任意のサイズ・形・分布・パターンの孔（例えば１０μｍ径の均一六角柱状孔をハニカムパターンに配置したフィルム、平均直径が１μｍ〜１０μｍのランダムな円柱多孔がランダムに配置したフィルムなど）を形成した多孔質フィルム、マイクロ打ち抜き加工や射出成形加工で同様に作製した多孔質フィルムなどが挙げられる。
【００２０】
孔の形態および孔径については、例えば、細胞の平均径の８０％以下の円柱状や四角柱状の貫通孔、細胞の平均径よりも狭い孔径であって、表裏面を連通してなる孔を有する多孔構造などが挙げられる。
孔径分布や孔の位置の分布については例えば、精密メッシュフィルターのような単分散なもの、一般的な多孔質フィルムのような多分散なものが挙げられる。
開孔率については、精密メッシュフィルターのように８０％を超えるもの、一般的な多孔質フィルムのように５０％以下のものなど、いずれも目的に応じて使用することができる。
【００２１】
本発明に使用しうる多孔質フィルムにおける孔径としては、前記の如く細胞の平均径の８０％以下の孔径、細胞の平均径よりも狭い孔径であることが三次元組織体の形成には好ましいが、より具体的には、孔径は０．０１μｍ〜１００μｍの範囲であることが好ましく、より好ましくは０．１μｍ〜５０μｍ、さらに好ましくは１μｍ〜２０μｍの範囲である。
なお、この多孔質フィルムにおける空孔の孔径は、市販の高倍率顕微鏡やＳＥＭ表面観察によって測定することができる。
【００２２】
なお、以下に詳述するように、培養する細胞の平均径とこの空孔径との関係を制御することで、例えば、多孔質フィルムの表面のみならず、播種側の裏面にも組織体を形成することが可能となる。
即ち、図１４（Ａ）の模式図で示すように、多孔質フィルム１として孔径が細胞径よりも小さいものを使用してい場合には、細胞播種側の多孔質フィルム１表面２および細胞播種反対側の多孔質フィルム表面（裏面）の両面に組織体５０を形成することができ、多孔質フィルム１を、その孔径が細胞径よりも大きいものを用いて同様の培養を行った場合を図１４（Ｂ）に示すように、細胞播種した多孔質フィルム表面ではなく、その反対側の多孔質フィルム裏面上に組織体５０が形成され、多孔質フィルム孔径を制御することで組織体の形成方向を制御できることが本発明者らの検討により明らかとなった。
【００２３】
多孔質フィルムの作製法については、ワイヤー状、フィラメント状の素材を高密度で編成或いは織成してシート状の織編体とする方法、繊維集合体を繊維の絡み合いや融着、バインダーなどにより成形してなて不織布とする方法、樹脂材料などに発泡、或いは加圧発泡等により連通孔構造を形成して多孔質フィルムや多孔質シートとする方法、有機溶媒と高分子化合物を含む液を支持体上にキャストするキャスト法により連通孔、貫通孔を形成したフィルムを形成する方法、パンチング等の方法で穿孔して多孔質フィルムを得る方法などが挙げられる。
【００２４】
前記多孔質フィルムのうち、最も好ましいのは、有機溶媒と高分子化合物を含む液を支持体上にキャストして膜を形成し、前記膜中に空隙が形成されたハニカム状や或いは任意の形状の連通孔が形成されてなる多孔質フィルムである。
このようなキャスト法を適用して、樹脂基材、溶剤、添加剤などの原料や製膜雰囲気における湿度、湿潤空気の供給条件などの諸条件を調整することにより、連通孔が形成されたフィルムは、形成された空孔が、貫通孔としてのみならず、フィルムの形成方向と平行な位置に隣接して存在する周囲の空孔と連通して、所謂三次元網目構造の如き空隙を有する多孔質フィルムを、複雑な工程を必要とせずに供給できるため、工程の簡易性からも好ましい態様である。本発明に用いられる多孔質フィルムが、フィルムの垂直方向（厚み方向）のみならず、平面方向へも連通する空孔を有することは、培養細胞の酸素や培養液の供給、老廃物等の排出などの物質交換にとって有利な構造であるといえる。
以下、最も好ましい態様である、三次元的に連通する空孔を有する多孔質フィルム（以下、適宜、特定多孔質フィルムと称する）について解説する。
【００２５】
−特定多孔質フィルム−
前記三次元的に連通する空孔を有する多孔質フィルムを始めとする多孔質フィルムの形成に用いる材料には特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。具体的には、例えば、疎水性ポリマー及び両親媒性化合物から選択される少なくとも１種が好適である。
【００２６】
多孔質フィルムを構成する疎水性ポリマーは、公知のもののなかから、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ビニル重合ポリマー（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリフッ化ビニリデン、ポリヘキサフルオロプロペン、ポリビニルエーテル、ポリビニルカルバゾール、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルカルバゾール、ポリテトラフルオロエチレンなど）、ポリエステル（例えば、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリエチレンサクシネート、ポリブチレンサクシネート、ポリ乳酸など）、ポリラクトン（例えばポリカプロラクトンなど）、ポリアミド又はポリイミド（例えば、ナイロンやポリアミド酸など）、ポリウレタン、ポリウレア、ポリカーボネート、ポリアロマティックス、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリシロキサン誘導体、などが挙げられる。これらは、溶解性、光学的物性、電気的物性、膜強度、弾性等の観点から、必要に応じてホモポリマーとしてもよいし、２種以上の構造単位を共重合させてなるコポリマーや２種以上のポリマーの混合物であるポリマーブレンドの形態をとってもよい。
【００２７】
多孔質フィルム形成に用いられる両親媒性化合物には特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、両親媒性ポリマーが挙げられる。
両親媒性ポリマーは、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリアクリルアミドを主鎖骨格とし、疎水性側鎖としてドデシル基、親水性側鎖としてカルボキシル基を併せ持つ両親媒性ポリマー、ポリエチレングリコール／ポリプロピレングリコールブロックコポリマー、などが挙げられる。
前記疎水性側鎖は、アルキレン基、フェニレン基等の非極性直鎖状基であり、エステル基、アミド基等の連結基を除いて、末端まで極性基やイオン性解離基などの親水性基を分岐しない構造であることが好ましい。該疎水性側鎖としては、例えば、アルキレン基を用いる場合には５つ以上のメチレンユニットからなることが好ましい。
前記親水性側鎖は、アルキレン基等の連結部分を介して末端に極性基やイオン性解離基、又はオキシエチレン基などの親水性部分を有する構造であることが好ましい。
【００２８】
両親媒性化合物としては、両親媒性ポリマー以外のものも挙げられる。両親媒性ポリマー以外の両親媒性化合物としては、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、界面活性剤などが好ましい。
両親媒性化合物として用いられる界面活性剤としては、例えば、下記一般式（Ｉ）で表される化合物などが挙げられる。
【００２９】
【化１】
0005583312.tif 000002
【００３０】
前記一般式（Ｉ）中、Ｒ１は脂肪族基、脂環式化合物基、芳香族基、又は、ヘテロ環を表し、Ｒ２は脂肪族基、脂環式化合物基、芳香族基、ヘテロ環、又は、−Ｌ−Ｚを表す。Ｑ１、Ｑ２、及びＱ３はそれぞれ単結合、酸素原子、硫黄原子、又は、−Ｎ（Ｒ３）−を表し、Ｒ３は水素原子、脂肪族基、脂環式化合物基、芳香族基、ヘテロ環、又は、−Ｌ−Ｚを表す。ここで、Ｌは２価の連結基を表し、Ｚはイオン性の基を表す。なお、単結合とは、元素が存在しないことを表し、例えば、Ｑ１が単結合を表すとは、ＰとＲ１とが直接連結されていることを意味する。
【００３１】
前記一般式（Ｉ）中、Ｒ１で表される脂肪族基としては、例えば、直鎖又は分枝の炭素数１〜４０の無置換アルキル基、直鎖又は分枝の炭素数１〜４０の置換アルキル基、直鎖又は分枝の炭素数２〜４０の無置換アルケニル基、直鎖又は分枝の炭素数２〜４０の置換アルケニル基、直鎖又は分枝の炭素数２〜４０の無置換アルキニル基、直鎖又は分枝の炭素数２〜４０の置換アルキニル基等が好ましい。
直鎖又は分枝の炭素数１〜４０の無置換アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−アミル基、ｔｅｒｔ−アミル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、ｔｅｒｔ−オクチル基、２−エチルヘキシル基、ｎ−ノニル基、１，１，３−トリメチルヘキシル基、ｎ−デシル基、ｎ−ドデシル基、セチル基、ヘキサデシル基、２−ヘキシルデシル基、オクタデシル基、エイコシル基、２−オクチルドデシル基、ドコシル基、テトラコシル基、２−デシルテトラデシル基、トリコシル基等が挙げられる。
直鎖又は分枝の炭素数１〜４０の置換アルキル基における置換基としては、例えば、アルコキシル基、アリール基、ハロゲン原子、カルボンエステル基、カルボンアミド基、カルバモイル基、オキシカルボニル基、燐酸エステル基等が挙げられる。具体的には、例えば、ベンジル基、β−フェネチル基、２−メトキシエチル基、４−フェニルブチル基、４−アセトキシエチル基、６−フェノキシヘキシル基、１２−フェニルドデシル基、１８−フェニルオクタデシル基、ヘプタデシルフルオロオクチル基、１２−（ｐ−クロロフェニル）ドデシル基、２−（燐酸ジフェニル）エチル基等が挙げられる。
【００３２】
前記直鎖又は分枝の炭素数２〜４０の無置換アルケニル基としては、例えば、ビニル基、アリル基、３−ブテニル基、２−メチル−２−ブテニル基、４−ペンテニル基、３−ペンテニル基、３−メチル−３−ペンテニル基、５−ヘキセニル基、４−ヘキセニル基、３−ヘキセニル基、２−ヘキセニル基、７−オクテニル基、９−デセニル基、オレイル基、リノレイル基、リノレニル基等が挙げられる。
前記直鎖又は分枝の炭素数２〜４０の置換アルケニル基としては、例えば、２−フェニルビニル基、４−アセチル−２−ブテニル基、１３−メトキシ−９−オクタデセニル基、９，１０−ジブロモ−１２−オクタデセニル基等が挙げられる。
前記直鎖又は分枝の炭素数２〜４０の無置換アルキニル基としては、例えば、アセチレン基、プロパルギル基、３−ブチニル基、４−ペンチニル基、５−ヘキシニル基、４−ヘキシニル基、３−ヘキシニル基、２−ヘキシニル基等が挙げられる。
前記直鎖又は分枝の炭素数２〜４０の置換アルキニル基における置換基としては、例えば、アルコキシル基、アリール基等が挙げられる。具体的には、例えば、２−フェニルアセチレン基、３−フェニルプロパルギル基等が挙げられる。
【００３３】
前記一般式（Ｉ）中、Ｒ１で表される脂環式化合物基としては、例えば、置換又は無置換の炭素数３〜４０のシクロアルキル基、置換又は無置換の炭素数４〜４０のシクロアルケニル基等が好ましい。
前記芳香族基としては、例えば、置換又は無置換の炭素数６〜５０のアリール基等が好ましい。
前記脂環式化合物基における、置換又は無置換の炭素数３〜４０のシクロアルキル基としては、例えば、シクロプロピル基、シクロヘキシル基、２，６−ジメチルシクロヘキシル基、４−ｔｅｒｔ−ブチルシクロヘキシル基、４−フェニルシクロヘキシル基、３−メトキシシクロヘキシル基、シクロヘプチル基等が挙げられる。
前記脂環式化合物基における、置換又は無置換の炭素数４〜４０のシクロアルケニル基としては、例えば、１−シクロヘキセニル基、２−シクロヘキセニル基、３−シクロヘキセニル基、２，６−ジメチル−３−シクロヘキセニル基、４−ｔｅｒｔ−ブチル−２−シクロヘキセニル基、２−シクロヘプテニル基、３−メチル−３−シクロヘプテニル基等が挙げられる。
【００３４】
前記芳香族基における、置換又は無置換の炭素数６〜５０のアリール基の置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシル基、アリール基、ハロゲン原子等が挙げられる。具体的には、例えば、フェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、アントラニル基、ｏ−クレジル基、ｍ−クレジル基、ｐ−クレジル基、ｐ−エチルフェニル基、ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル基、３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル基、ｐ−ｎ−アミルフェニル基、ｐ−ｔｅｒｔ−アミルフェニル基、２，６−ジメチル−４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル基、ｐ−シクロヘキシルフェニル基、オクチルフェニル基、ｐ−ｔｅｒｔ−オクチルフェニル基、ノニルフェニル基、ｐ−ｎ−ドデシルフェニル基、ｍ−メトキシフェニル基、ｐ−ブトキシフェニル基、ｍ−オクチルオキシフェニル基、ビフェニル基、ｍ−クロロフェニル基、ペンタクロロフェニル基、２−（５−メチルナフチル基）等が挙げられる。
【００３５】
前記一般式（Ｉ）中、ヘテロ環としては、例えば、置換又は無置換の炭素数４〜４０の環状エーテル、置換又は無置換の炭素数４〜４０の含窒素環等が好ましい。
前記置換又は無置換の炭素数４〜４０の環状エーテルとしては、例えば、フリル基、４−ブチル−３−フリル基、ピラニル基、５−オクチル−２Ｈ−ピラン−３−イル基、イソベンゾフラニル基、クロメニル基等が挙げられる。
前記置換又は無置換の炭素数４〜４０の含窒素環としては、例えば、２Ｈ−ピロリル基、ピロリル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、インドリジニル基、モルホリル基等が挙げられる。
【００３６】
これらの中でも、炭素数１〜２４の、直鎖、環状、又は分枝の無置換アルキル基、置換基の炭素数を除いた炭素数が１〜２４の、直鎖、環状、又は分枝の置換アルキル基、炭素数２〜２４の、直鎖、環状、又は分枝の無置換アルケニル基、炭素数２〜２４の、直鎖、環状、又は分枝の置換アルケニル基、炭素数６〜３０の置換又は無置換のアリール基が特に好ましい。
前記炭素数１〜２４の、直鎖、環状、又は分枝の無置換アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−アミル基、ｎ−ヘキシル基、シクロヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、２−エチルヘキシル基、ｎ−ノニル基、１，１，３−トリメチルヘキシル基、ｎ−デシル基、ｎ−ドデシル基、セチル基、ヘキサデシル基、２−ヘキシルデシル基、オクタデシル基、エイコシル基、２−オクチルドデシル基、ドコシル基、テトラコシル基、２−デシルテトラデシル基等が挙げられる。
【００３７】
前記置換基の炭素数を除いた炭素数が１〜２４の、直鎖、環状、又は分枝の置換アルキル基としては、例えば、６−フェノキシヘキシル基、１２−フェニルドデシル基、１８−フェニルオクタデシル基、ヘプタデシルフルオロオクチル基、１２−（ｐ−クロロフェニル）ドデシル基、４−ｔｅｒｔ−ブチルシクロヘキシル基等が挙げられる。
前記炭素数２〜２４の、直鎖、環状、又は分枝の無置換アルケニル基としては、例えば、ビニル基、アリル基、２−メチル−２−ブテニル基、４−ペンテニル基、５−ヘキセニル基、３−ヘキセニル基、３−シクロヘキセニル基、７−オクテニル基、９−デセニル基、オレイル基、リノレイル基、リノレニル基等が挙げられる。
前記炭素数２〜２４の、直鎖、環状、又は分枝の置換アルケニル基としては、例えば、２−フェニルビニル基、９，１０−ジブロモ−１２−オクタデセニル基等が挙げられる。
前記炭素数６〜３０の置換又は無置換のアリール基としては、例えば、フェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、ｐ−クレジル基、ｐ−エチルフェニル基、ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル基、ｐ−ｔｅｒｔ−アミルフェニル基、オクチルフェニル基、ｐ−ｔｅｒｔ−オクチルフェニル基、ノニルフェニル基、ｐ−ｎ−ドデシルフェニル基、ｍ−オクチルオキシフェニル基、ビフェニル基、等が挙げられる。
【００３８】
前記一般式（Ｉ）中、Ｑ１、Ｑ２、及びＱ３としては、単結合、酸素原子、又は−Ｎ（Ｒ３）−が好ましく、Ｑ１、Ｑ２、及びＱ３の内の少なくとも２つ以上が酸素原子である
ことが特に好ましい。
【００３９】
前記一般式（Ｉ）中、Ｌとしては、下記一般式（ＩＩ）で表される基が好ましい。
【００４０】
【化２】
0005583312.tif 000003
【００４１】
ただし、前記一般式（ＩＩ）中、Ｙ１、Ｙ２、及びＹ３は、それぞれ同じであっても異なっていてもよく、炭素数１〜４０の置換又は無置換のアルキレン基、或いは、炭素数６〜４０の置換又は無置換のアリーレン基のいずれかを表す。Ｊ１、Ｊ２、及びＪ３は、それぞれ同じであっても異なっていてもく、２価の結合ユニットを表す。ｐ、ｑ、及びｒは、それぞれ独立に、０〜５の整数を表す。ｓは、１〜１０の整数を表す。ａ及びｂは、それぞれ独立に、０〜５０の整数を表す。
【００４２】
前記Ｙ１、Ｙ２、及びＹ３における置換基としては、例えば、前記一般式（Ｉ）におけるＲ１で例示した基が挙げられる。具体的には、例えば、アルキレン基としては、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基、１，４−シクロヘキシレン基、オクタメチレン基、デカメチレン基、２−メトキシ−１，３−プロピレン基等が好ましく、アリーレン基としては、ｏ−フェニレン基、ｍ−フェニレン基、ｐ−フェニレン基、３−クロロ−１，４−フェニレン基、１，４−ナフチレン基、１，５−ナフチレン基等が好ましい。これらの中でも、エチレン基、プロピレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基、１，４−シクロヘキシレン基、オクタメチレン基、デカメチレン基、ｍ−フェニレン基、ｐ−フェニレン基が特に好ましい。
【００４３】
前記Ｊ１、Ｊ２、及びＪ３における２価の結合ユニットとしては、例えば、単結合、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＣＯＮ（Ｒ４）−、−Ｎ（Ｒ４）ＣＯ−、−ＣＯＮ（Ｒ４）ＣＯ−、−Ｎ（Ｒ４）ＣＯＮ（Ｒ５）−、−ＯＣＯＮ（Ｒ４）−、−Ｎ（Ｒ４）ＣＯＯ−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ４）−、−Ｎ（Ｒ４）ＳＯ２−、−Ｎ（ＣＯＲ４）−、−ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲ１）Ｏ−等が好ましい。なお、これらにおいて、Ｒ１は前記一般式（Ｉ）におけるのと同じ意を表し、Ｒ４は水素原子、炭素数１〜６の無置換アルキル基、及び置換基の炭素数を除いた炭素数が１〜６の置換アルキル基のいずれかを表し、Ｒ５はＲ４と同じ意を表すがそれぞれ同じであっても異なっていてもよい。
前記Ｒ４及びＲ５における置換基としては、アリール基、アルコキシル基、ハロゲン原子等が挙げられる。
これらの中では、単結合、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＣＯＮ（Ｒ３）−（Ｒ３は水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基を表す。）、−Ｎ（Ｒ４）ＣＯ−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ４）−、−Ｎ（Ｒ４）ＳＯ２−等が特に好ましい。
【００４４】
前記ｐ、ｑ、及びｒとしては、それぞれ独立に、０〜３の整数が好ましく、０又は１の整数が特に好ましい。
前記ｓとしては、１〜５の整数が好ましく、１〜３の整数が特に好ましい。前記ａ及びｂとしては、それぞれ独立に、０〜２０の整数が好ましく、０〜１０の整数が特に好ましい。
【００４５】
前記一般式（Ｉ）中、Ｚとしては、親水性のアニオン性又はカチオン性のイオン性基が好ましく、アニオン性基が特に好ましい。
前記アニオン性基としては、−ＣＯＯＭ、−ＳＯ３Ｍ、−ＯＳＯ３Ｍ、−ＰＯ（ＯＭ）２−ＯＰＯ（ＯＭ）２が特に好ましい。なお、前記Ｍは、対カチオンを表し、アルカリ金属イオン（例えば、リチウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン等）、アルカリ土類金属イオン（例えば、マグネシウムイオン、カルシウムイオン等）、及びアンモニウムイオンのいずれかが好ましい。これらの中でも、ナトリウムイオン、カリウムイオンが特に好ましい。
前記カチオン性基としては、例えば、−ＮＨ３＋・Ｘ−、−ＮＨ２（Ｒ６）＋・Ｘ−、−ＮＨ（Ｒ６）２＋・Ｘ−、−Ｎ（Ｒ６）３＋・Ｘ−が挙げられる。
前記Ｒ６は、炭素数１〜３のアルキル基（例えば、メチル基、エチル基、２−ヒドロキシエチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基等）を表し、メチル基、２−ヒドロキシエチル基が好ましい。
前記Ｘ−としては、対アニオンを表し、例えば、ハロゲンイオン（例えば、フッ素イオン、塩素イオン、臭素イオン等）、複合無機アニオン（例えば、水酸化物イオン、硫酸イオン、硝酸イオン、燐酸イオン等）、及び有機化合物アニオン（例えば、シュウ酸イオン、蟻酸イオン、酢酸イオン、プロピオン酸イオン、メタンスルホン酸イオン、ｐ−トルエンスルホン酸イオン等）が好ましく、塩素イオン、硫酸イオン、硝酸イオン、酢酸イオンが特に好ましい。
【００４６】
前記一般式（Ｉ）中、Ｒ２としては、例えば、上記Ｒ１で例示した基、上記−Ｌ−Ｚで例示した基の中から選ばれる一価の基が挙げられる。Ｒ１で例示した基から選択される場合は、同一分子内に存在するＲ１と同一構造であっても異なった構造であってもよい。また、−Ｌ−Ｚで例示した基から選択される場合も、同一分子内に存在する−Ｌ−Ｚと同一構造であっても異なった構造であってもよい。これらの中でも、Ｒ１で例示した基から選択される場合が特に好ましい。更に、Ｒ１とＲ２との炭素数の合計が６以上８０以下になることが好ましく、８以上５０以下になる場合が特に好ましい。
【００４７】
前記界面活性剤の具体例〔例示化合物（ＰＷ−１）〜（ＰＷ−５２）〕を以下に例示するが、これら具体例に限定されるものではない。
【００４８】
【化３】
0005583312.tif 000004
【００４９】
【化４】
0005583312.tif 000005
【００５０】
【化５】
0005583312.tif 000006
【００５１】
【化６】
0005583312.tif 000007
【００５２】
【化７】
0005583312.tif 000008
【００５３】
【化８】
0005583312.tif 000009
【００５４】
【化９】
0005583312.tif 000010
【００５５】
【化１０】
0005583312.tif 000011
【００５６】
【化１１】
0005583312.tif 000012
【００５７】
【化１２】
0005583312.tif 000013
【００５８】
前記疎水性側鎖と前記親水性側鎖との比率は、分子の大きさや非極性、極性の強さ、疎水性有機溶媒の疎水性の強さなどに応じて異なり一概には規定できないが、ユニット比（疎水性側鎖／親水性側鎖）は９．９／０．１〜５．５／４．５が好ましい。また、コポリマーの場合、疎水性側鎖の親水性側鎖の交互重合体よりも、疎水性溶媒への溶解性に影響しない範囲で疎水性側鎖と親水性側鎖がブロックを形成するブロックコポリマーであることが好ましい。
【００５９】
多孔質フィルムの原料となる疎水性ポリマー及び両親媒性ポリマーの重量平均分子量（Ｍｗ）は、１０，０００〜１０，０００，０００が好ましく、５０，０００〜１，０００，０００がより好ましい。なお、この重量平均分子量は、ＧＰＣ法により測定した値を採用している。
また、両親媒性化合物が界面活性剤の如き低分子量の化合物である場合の分子量としては、３００〜６００の範囲であることが好ましい。
【００６０】
本発明の特定多孔質フィルムを形成するに際しては、疎水性ポリマーのみを原料とすることもできるが、疎水性ポリマーと両親媒性化合物とを、共に用いることが好ましい。
疎水性ポリマーと両親媒性化合物との組成比率（質量比率）は、前記両親媒性化合物が両親媒性ポリマーである場合は、９９．９：０．１〜５０：５０が好ましく、９５：５〜７５：２５がより好ましい。前記両親媒性化合物の比率が上記範囲において、均一な連通多孔質構造体が得られ、且つ、膜の安定性、特に力学的な安定性を十分に得ることができる。
また、前記両親媒性化合物が両親媒性ポリマーでない場合は、前記疎水性ポリマーと前記両親媒性化合物との組成比率（質量比率）は、９９．９：０．１〜８０：２０が好ましい。前記両親媒性化合物が両親媒性の低分子量化合物である場合、この組成比率において、均一な連通多孔質構造体が得られ、フィルム強度を適切に維持することができる。
なお、両親媒性化合物として、両親媒性ポリマーと両親媒性の低分子化合物を任意の比率で混合して用いてもよい。
【００６１】
多孔質フィルムの原料として用いる疎水性ポリマー及び両親媒性ポリマーは、分子内に重合性基を有する重合性（架橋性）ポリマーであることも好ましい態様である。また、疎水性ポリマー及び／又は両親媒性ポリマーとともに、重合性の多官能モノマーを配合し、この配合物により連通孔を有する多孔質構造体を形成した後、熱硬化法、紫外線硬化法、電子線硬化法等の公知の方法によって硬化処理を施すことも、多孔質フィルム強度向上の観点から好ましい。
【００６２】
疎水性ポリマー及び／又は両親媒性ポリマーと併用しうる多官能モノマーとしては、反応性の点から多官能（メタ）アクリレートが好ましい。前記多官能（メタ）アクリレートの例としては、ジペンタエリスリトールペンタアクリレ−ト、ジペンタエリスリトールヘキサアクリレート、ジペンタエリスリトールカプロラクトン付加物へキサアクリレート又はこれらの変性物、エポキシアクリレートオリゴマー、ポリエステルアクリレートオリゴマー、ウレタンアクリレートオリゴマ−、Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、トリプロピレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジアクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレート、ペンタエリスリトールテトラアクリレート、又はこれらの変性物などが使用できる。
これらの多官能モノマーは耐擦傷性と柔軟性のバランスから、単独で又は２種以上を組み合わせて用いられる。
疎水性ポリマー及び両親媒性ポリマーは、分子内に重合性基を有する重合性（架橋性）ポリマーである場合には、疎水性ポリマー及び両親媒性ポリマーの重合性基と反応しうる重合性の多官能モノマーを併用することも好ましい。
【００６３】
本発明においては、このような基材フィルムを用いて、キャスト法により、以下に示すような条件で製膜することで、貫通孔を有する多孔質フィルムを作製することができる。
このようなキャスト法により製膜した場合、空孔の配列状態が、平面視により互いにヘキサゴナル状に位置するように規則配列してハニカム状構造を形成する。また、隣接する空孔同士は、所定の距離よりも近接した場合、互いに接合して連通することがある。
空孔の大きさは使用する溶媒、疎水性ポリマー、両親媒性化合物の種類や量によって異なるが、主にキャスト雰囲気の湿度と湿潤空気の供給時間でコントロールすることができる。本発明におけるキャスト法によるフィルム形成は、キャスト液の気化熱により周囲の空気の温度低下にともなう凝結により生じた水滴を鋳型として利用しており、例えば相対的に湿度を高くすることで凝結水滴を大きくすることができ、すなわちフィルム形成後の空孔のサイズを大きくすることができる。また、溶媒が蒸発するまでの間は湿潤空気を水分子の供給源として凝結水の成長が進むことから、湿潤空気の供給時間を長くすることにより、凝結水滴を大きくすることができ、すなわち、フィルム形成後の空孔サイズを大きくすることができる。具体的には一般に、湿度６０％ＲＨ〜９５％ＲＨ、乾燥までの湿潤空気の供給時間を１分間から５分間の間でコントロールすることにより、空孔径１μｍから３０μｍの空孔径を制御することができる。貫通構造の特徴を活かすには、やはり使用する溶媒、疎水性ポリマー、両親媒性化合物の種類や量によって異なるが、凝結水滴の集積を促す条件、具体的には、疎水ポリマーの濃度や溶剤選定によりキャスト液の粘度を下げたり、キャスト面を乱さぬ程度に乾燥風量を上げたり、基材を加温することにより対流を促進することが有効である。
具体的にはキャスト液粘度が０．１Ｐａ・ｓ以下、乾燥風はキャスト面と垂直方向に風速０．０５〜０．３ｍ／秒、基板温度をキャスト液の表面温度（市販の放射温度計で測定可能）に対し１〜１０℃高く保持することで、本発明に好ましい貫通孔構造を有する多孔質フィルムを形成することができる。
【００６４】
（３．細胞接着性領域の形成）
次に、前記多孔質フィルムの表面に細胞接着性の領域を形成する方法について説明する。
図１に示す多孔質フィルム１の表面２には細胞接着性領域３ａを有する。ここで、細胞接着性領域３ａとは、培養しようとする細胞に対して親和性を有する領域を指し、このような細胞接着性領域３ａを形成することで、例えば、培養液等の溶液中において、該細胞接着性領域３ａに沈降した細胞は、その形状を、培養時間の経過に伴って、球形から比較的扁平な形状に変化させつつ、当該領域３ａに接着することになる。
【００６５】
具体的に、このような細胞接着性領域３ａを形成するためには、多孔質フィルム１の表面２に、培養液等の溶液中において、細胞が接着可能な荷電状態や親水性・疎水性を示す領域を形成すればよい。より具体的には、該多孔質フィルム１の表面２の所定領域に、生体から取得された細胞接着性物質、もしくは、合成された細胞接着性物質やその誘導体を固定することで形成することができる。
【００６６】
細胞接着性領域３ａを形成するために用いられる細胞接着性物質としては、例えば、培養しようとする細胞の細胞膜に存する細胞表面分子（例えば、インテグリンや糖鎖受容体等）のうち特定のものに対して結合し得る物質を用いることができる。具体的には、生体から取得された細胞接着性物質としては、例えばコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン等の細胞外マトリックスを好ましく用いることができる。
また、合成された細胞接着性物質としては、例えば、細胞接着性を示す特定のアミノ酸配列（例えば、アルギニン・グリシン・アスパラギン酸配列（いわゆるＲＧＤ配列）等）や特定の糖鎖配列（例えば、ガラクトース側鎖等）を有する化合物等を好ましく用いることができる。
これら細胞接着性物質の誘導体としては、例えば、当該細胞接着性物質に任意の官能基や高分子鎖等を、所定の化学反応（例えば、カルボキシル基やアミノ基等の間の縮合反応）等によって結合させたものを好ましく用いることができる。
【００６７】
これら細胞接着性物質またはその誘導体は、例えば、当該細胞接着性物質またはその誘導体を含む水溶液を、多孔質フィルム表面の細胞接着性領域３ａを形成させる部分に付着させ、乾燥させることにより、当該各部分に固定することができ、このようにして任意の領域を細胞接着性領域３ａとすることができる。また、これらの細胞接着性物質またはその誘導体は、例えば、当該細胞接着性物質またはその誘導体を含む水溶液中において、当該細胞接着性物質またはその誘導体が有する官能基と、多孔質フィルム表面２のうち各表面領域３ａを形成させる部分に露出している官能基と、を所定の化学反応（例えば、チオール基と金表面等との化学吸着反応や、カルボキシル基やアミノ基等の間の縮合反応）等によって結合させることによっても当該部分に固定できる。
【００６８】
図１に示す多孔質フィルム１の表面２のうち、複数の細胞接着性領域３ａの周辺部は、細胞非接着性領域（周辺表面）４ａである。すなわち、細胞接着性領域３ａは、細胞非接着性の領域４ａにより周辺を囲まれており、隣接する細胞接着性領域３ａは細胞非接着性の領域４ａにより隔てられて存在することを要する。このとき、細胞非接着性領域４ａは連続領域として存在する。
【００６９】
また、図２は、所定の深さをもつ複数の貫通孔が形成されてなる板状の基材５ｂと前記細胞接着性領域３ａが形成された多孔質フィルム１との積層体からなる組織体形成用基材であり、この多孔質フィルムが底面を構成する有底孔（以下「キャビティ１００」という）が規則的に配置するよう形成されており、この有孔底の略中央には細胞接着性領域３ａが形成され、その周辺部は細胞非接着性領域４ｂで囲まれており、各キャビティ１００の底面として形成されている。即ち、図２に示す底面の細胞接着性領域３ａを除く、多孔質フィルム１の表面２は、細胞非接着性領域４ｂが連続領域として存在し、且つ、積層された板状の基材５ｂ自体も特に細胞接着性を有しない細胞非接着性の表面を有する。
ここで、細胞非接着面の表面とは、例えば、培養液等の水溶液中において、細胞の接着に不適切な特性を示す表面である。したがって、例えば、培養液中において図１における周辺の細胞非接着性領域４ａ表面、或いは、図２におけるキャビティの細胞接着性領域３ａの周辺領域（細胞非接着性領域）４ａに沈降した細胞は、その形状を球状からほとんど変化させず、当該周辺表面４ａまたは周辺領域４ｂ表面には実質的に接着できない。すなわち、周辺表面４ａまたは周辺領域４ｂに沈降した細胞は、当該周辺表面４ａまたは表面領域４ｂに全く接着できずに培養液中で浮遊し、またはいったん接着したとしても、所定の培養時間経過後には培養液の流れ等によって容易に脱着する。
【００７０】
この細胞非接着性物質としては、例えば、細胞接着性領域３ａで培養する細胞の細胞膜に存する細胞表面分子に対して結合しない物質を用いることができる。具体的に、生体から取得された細胞非接着性物質としては、例えば、アルブミン等の高い親水性を示すたんぱく質等を好ましく用いることができる。また、合成された細胞非接着性物質としては、例えば、ポリエチレングリコール等の極めて高い親水性を示す高分子鎖を含む化合物や、ＭＰＣ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）、ｐｏｌｙ−ＨＥＭＡ（ポリヒドロキシエチルメタクリレート）、ＳＰＣ（セグメント化ポリウレタン）等を好ましく用いることができる。また、これら細胞非接着性物質の誘導体としては、例えば、当該細胞非接着性物質に任意の官能基や高分子鎖を、所定の化学反応等によって結合したものを好ましく用いることができる。
【００７１】
これら細胞非接着性物質またはその誘導体は、例えば、当該細胞非接着性物質またはその誘導体を含む水溶液を、図１に示す多孔質フィルム表面２のうち細胞接着性領域３ａを囲む部分４ａ、または図２に示す周辺領域４ｂおよび枠体５ｂ表面に固定することができる。
細胞非接着性物質またはその誘導体は、例えば、当該細胞非接着性物質またはその誘導体を含む水溶液中において、当該細胞非接着性物質またはその誘導体が有する官能基と、多孔質フィルム表面２のうち細胞接着性領域３ａを囲む部分（４ａ）、または図２に示す各細胞非接着性領域４ｂおよび周辺の枠体５ｂ表面に露出している官能基とを所定の化学反応等によって結合させることにより、当該細胞接着性領域３ａを囲む部分（４ａ）、または図２における当該各周辺領域４ｂおよび枠体５ｂ表面に固定できる。
【００７２】
また、図２に示す貫通孔を有する板状の基材（保持材）５ｂに形成されたキャビティ１００は、当該保持材５ｂの材質等に応じて選択される公知の加工方法を用いて、形成することができる。具体的に、例えば、このキャビティ１００は、マシニングセンタ等を用いた穿孔加工、レーザー等を用いた光微細加工、エッチング加工、エンボス加工等により多孔質フイルム表面２に形成し、または射出成形、プレス成形、ステレオリソグラフィ等による基材５ｂの成形時に形成することができる。
【００７３】
このような加工方法により、キャビティ１００は、例えば、所定厚さの基材５ｂの表面２に、貫通孔として形成することができる。また、このキャビティ１００は、例えば基材５ｂに貫通する孔を形成した後に、当該基材５ｂの片面に当該多孔質フィルム１を貼り合わせて底面としてとすることにより有底孔として形成することができる。
【００７４】
また、複数のキャビティ１００は、例えばＣＡＤ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｉｄｅｄ  Ｄｅｓｉｇｎ）プログラムにより河口位置を精密に制御するマシニングセンタ等を用いることにより、図２に示すように、基材５ｂの上に、円形の底面の中心間の距離が一定の間隔となるよう規則的に形成することができる。
【００７５】
また、図１に示す表面２は、各細胞接着性領域３ａと周辺部の細胞非接着性表面４ａとを含むその全体が実質的に平坦な表面となっている。すなわち、細胞接着性領域３ａおよび周辺表面４ａはそれぞれ実質的に平坦な表面であるとともに、多孔質フイルム表面２の全体が実質的に平坦な表面を構成するように互いに連なっている。ここで、実質的に平坦な表面とは、例えば、当該表面の凹凸（例えば、細胞接着性領域３ａと周辺表面４ａとの段差）が細胞１個分の厚みより小さい程度に小さい表面をいう。また、図２に示す多孔質フイルム１表面２のうち、各細胞接着性領域３ａおよび周辺の細胞非接着性領域４ｂもまたそれぞれ実質的に平坦な表面として形成されている。
【００７６】
また、各細胞接着性領域３ａの面積は、培養する細胞のサイズがその種類や状態等によって異なるため一概に言えないが、例えば、３００〜１×１０６μｍ２の範囲であることが好ましく、特に５０００〜２×１０５μｍ２の範囲であることが好ましい。すなわち、図１および図２に示す各細胞接着性領域３ａの直径は、当該細胞接着性領域３ａで培養する細胞の直径の２〜５０倍程度の範囲であることが好ましく、特に５倍〜３０倍程度の範囲であることが好ましい。これは、細胞は各細胞接着性領域３ａ上で三次元的に集合して組織体を形成することから、これらの面積が、当該組織体に含まれる細胞の数を規定するためである。すなわち、各細胞接着性領域３ａの面積を３００μｍ２または細胞の直径の２倍以上とすることで、例えば、組織体を形成するために必要な数の細胞が当該各表面領域３ａに十分に接着することができ、また、必要な数の細胞を各細胞接着性領域３ａ上に保持することができるとともに、細胞接着性領域３ａの面積を１×１０６μｍ２または細胞の直径の５０倍以下とすることにより、この領域３ａで形成される組織体のサイズが適性に保たれ、例えば、当該組織体の深部に含まれる細胞が、当該組織対外の培養液等から栄養や酸素を十分に受けることができずに死滅し、またはその機能を失ってしまうような事態の発生を抑制することができる。本発明においては、各細胞接着性領域３ａの面積は、５０００〜２×１０５μｍ２の範囲としている。
【００７７】
また、図２に示す貫通孔を有する板状の基材５ｂのキャビティ１００の深さ、すなわち板状の基材５ｂの厚みは、用いる細胞の径の１〜２００倍程度の範囲であることが好ましく、特に２倍〜１００倍程度の範囲であることが好適である。即ち、キャビティ１００の深さを上記下限値以上とすることで当該キャビティ１００内から細胞がこぼれることを抑制することができ、細胞を細胞接着性領域３ａ上に確実に保持することが可能となり、また、その深さを上記上限値以下とすることで、当該キャビティ１００内の表面領域３ａ上で保持されている細胞を始点として形成される組織体が、組織体形成基材に形成された有底孔の表面近傍の位置に存在するため、培養工程以降の操作、例えば観察・評価・採取の作業性が良好となる。
【００７８】
また、多孔質フイルム１表面２は、本方法において組織体のサイズを制御するために必要な最低限の数の細胞接着性領域３ａの一部分である、１つの特定の表面領域（以下、「特定領域」という）と、当該特定領域の周辺に、当該特定領域に隣接して配置される複数の表面領域（以下、「隣接領域」という）とを有する。
本発明においては、多孔質フィルム１表面２に、細胞非接着性領域４ａに囲まれて細胞接着性領域３ａが１つのみ存在すればよいが、細胞培養や三次元組織体の形成、或いは、それらを評価するという目的を考慮すれば、多孔質フィルム表面には複数の細胞接着性領域３ａが形成されることが好ましく、培養や評価の効率といった観点からは、その細胞接着性領域３ａは等間隔で複数個設けられることが好ましい。
このような複数の細胞接着性領域３ａとその周辺部の細胞非接着性領域４からなる領域を、以下、領域セットと称する。領域セットに含まれる複数の隣接する細胞接着性領域３ａは、その各々の重心点（円形の隣接領域における円の中心点、四角形の隣接領域における対角線の交点等）から、当該領域セットに含まれる特定領域の重心点までの距離（以下、「重心間隔」という）が互いに等しくなるように配置されている。
【００７９】
ここで、本方法に特徴的なことの一つは、準備工程で準備する多孔質フイルム表面２に含まれる領域セットの重心間隔を変化させることによって、培養工程で特定領域に形成される、増殖性の細胞を含む三次元組織体のサイズを、当該重心間隔に応じて制御できる点である。すなわち、例えば、準備工程において所定の重心間隔の領域セットを含む多孔質フイルム表面２を準備することによって、培養工程において、少なくとも当該領域セットの特定領域に、当該重心間隔によって規定される所定のサイズの組織体を形成できる。
【００８０】
具体的に、例えば、準備工程において特定領域と各隣接領域とが第一の重心間隔で互いに離間して配置された領域セットを含む第一の多孔質フイルム表面を準備した場合には、培養工程において当該第一の重心間隔に応じた第一のサイズの組織体を形成でき、準備工程において特定領域と各隣接領域とが当該第一重心間隔より小さい第二の重心間隔で互いに離間して配置された領域セットを含む第二の多孔質フイルム表面を準備した場合には、培養工程において、当該第二の重心間隔と当該第一の重心間隔との比率に応じた、当該第一のサイズにより小さい第二のサイズの組織体を形成できる。したがって、例えば、準備工程において互いに重心間隔が一定の規則に従って段階的に変化する複数の多孔質フイルム表面を準備した場合には、培養工程において、当該複数の多孔質フイルム表面の複数の特定領域に、当該一定の規則に従って当該複数の多孔質フイルム表面間で段階的に変化するサイズの組織体を形成できる。ここで、重心間隔が一定の規則に従って変化する場合としては、例えば、１つの多孔質フイルム表面の重心間隔に対して、他の１または複数の多孔質フイルム表面の重心間隔が、所定の長さずつ変化し、所定の倍率で変化し、または所定の関数に従って変化する場合等を挙げることができる。
【００８１】
このように、本方法によれば、例えば、重心間隔によって規定される所望サイズの複数の組織体が規則的かつ高密度に配置された組織体アレイチップを得ることができる。また、本方法によれば、例えば、培養する細胞の種類ごとに、所望のサイズの組織体を形成するために設定すべき重心間隔をスクリーニングすることができる。
【００８２】
なお、特定領域の辺縁部と各隣接領域の辺縁部との最短距離（すなわち、例えば、円形状の表面領域３ａおよび表面領域３ｂについては、特定領域の円周部と各隣接領域の円周部との最短距離）は、当該特定領域および各隣接領域で培養する細胞のサイズがその種類や状態等によって異なるため一概には言えないが、５０〜１０００μｍの範囲であることが好ましく、特に１００〜７００μｍの範囲であることが好ましい。これは、この最短距離が５０μｍより小さい場合には、例えば、特定領域に形成される組織体と隣接領域に形成される組織体との間で融合や架橋が起こり、当該複数の組織体が互いに接着した組織体が形成されることにより、組織体のサイズを厳密に制御できない場合があるためである。また、最短距離が１０００μｍより大きい場合には、特定領域に形成される組織体と隣接領域に形成される組織体との距離が大きいために、例えば、複数の組織体を高密度に配置した組織体アレイを得ることができない。本発明においては、特定領域の辺縁部と各隣接領域の辺縁部との最短距離は、５０μｍ〜１０００μｍの範囲としている。
【００８３】
図３は、図１および図２に示す組織体形成用基材表面に形成された領域セット１０についての説明図である。この領域セット１０は、多孔質フイルム表面２に形成された複数の表面領域３ａ（図１および図２参照）のうちの１つである特定領域１１（図３においてハッチングを施して示す領域）と、当該複数の細胞接着性領域３ａまたは周辺の細胞非接着性領域４ａ、４ｂのうち他の一部であって、当該特定領域１１を囲むように配置された６つの隣接領域１２とを有している。特定領域１１および各隣接領域１２は、互いに等しい直径Ｄ１の円形状である。そして、特定領域１１の中心点１１ｃと、各隣接領域１２の中心点１２ｃとの間の距離（以下「中心間隔」という）は、互いに等しい一定値Ｌ１となっている。また、特定領域１１は、その中心点１１ｃが６つの隣接領域１２の各々の中心点１２ｃを結んで形成される正六角形Ｐ１の重心点と一致するよう、その全体が問うが正六角形Ｐ１の中に位置するよう配置されている。また、この領域セット１０においては、正六角形Ｐ１の６つの変の各々の長さＭ１は、中心間隔Ｌ１と同一になっている。
【００８４】
図４は、重心間隔が互いに異なる複数の領域セットの一例についての説明である。図４Ａに示す第一領域セット２０は、互いに等しい一定の直径Ｄ２の円形状領域として形成された１つの特定領域２１および６つの隣接領域２２を有している。特定領域２１と各隣接領域２２との中心間距離Ｌ２は、互いに等しくなっている。また、図４Ｂに示す第二領域セット３０は、第一領域セット２０に含まれる特定領域２１および各隣接領域２２と同一の直径Ｄ２の円形状領域として形成された１つの特定領域３１および６つの隣接領域３２を有し、当該特定領域３１と各隣接領域３２との中心間隔Ｌ３は、当該第一領域セット２０の中心間隔Ｌ２より大きくなっている。また図４Ｃに示す第三領域セット４０は、第一領域セット２０に含まれる特定領域２１および各隣接領域２２と同一の直径Ｄ２の円形状領域として形成された１つの特定領域４１および６つの隣接領域４２を有し、当該特定領域４１と各隣接領域４２との中心間距離Ｌ４は、第二領域セット３０の中心間隔Ｌ３よりさらに大きくなっている。
【００８５】
準備工程においては、例えば、図４に示すような、互いに等しい直径Ｄ２の特定領域２１、３１，４１および隣接領域２２、３２，４２を有し、各隣接領域２２，３２，４２の中心点２２ｃ、３２ｃ、４２ｃを結んで形成される正六角形Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４が互いに掃除となる第一領域セット２０、第二領域セット３０、または第三領域セット４０のうち、互いに異なるいずれか１つの領域セットが形成された複数の多孔質フイルム表面を準備する。すなわち、この準備工程においては、例えば、第一領域セット２０が少なくとも１つ形成された第一多孔質フイルム表面と、第二領域セット３０が少なくとも一つ形成された第二多孔質フイルム表面と、第三領域セット４０が少なくとも一つ形成された第三多孔質フイルム表面とを準備する。なお、この場合の第一多孔質フイルム表面、第二多孔質フイルム表面、および第三多孔質フイルム表面は、例えば、互いに別体に成形された３つの多孔質フイルムの各々の表面として準備されてもよいし、１つの多孔質フイルムの１つの表面のうち互いに異なる３つの部分として準備されてもよい。
【００８６】
なお、領域セットは、複数の表面領域のうちの１つを特定領域として着目することによって便宜的に特定される。したがって、ある領域セットの特定領域が、他の領域セットの複数の隣接領域のうちの１つである場合もある。図５は、多孔質フイルム表面２に形成された複数の表面領域３ｃのうち、複数の領域セットを含む一部分についての説明図である。図５Ａに示す領域セット５０は、複数の表面領域３ｃのうち、ハッチングを施して示す１つの表面領域５１を特定領域として着目するとともに、当該表面領域５１に隣接する６つの表面領域５２ａ、５２ｂ、５２ｃ、５２ｄ、５２ｅ、５２ｆのうち、黒塗りで示す１つの表面領域５２ａを特定領域として着目した場合には、図５Ａに示す領域セットの特定領域５１を６つの隣接領域のうちの１つとして含む他の領域セット５５が特定される。
【００８７】
また、領域セットに含まれる隣接領域の数や特定領域と隣接領域との位置関係は図１〜図５に示すものに限られない。図６は、領域セットの他の例についての説明図である。図６に示す領域セット６０は、互いに等しい直径Ｄ６の円形状に形成された１つの特定領域６１（図６においてハッチングを施して示す領域）と、当該特定領域６１の周辺に配置された３つの隣接領域６２とを有し、当該特定領域６１と当該隣接領域６２との中心間隔Ｌ６は互いに等しくなっている。そして、特定領域６１は、その中心点６１ｃが、３つの隣接領域６２の各々の中心点６２ｃを結んで形成される正三角形Ｐ６の重心に一致するよう当該正三角形Ｐ６の中に配置されている。また、この領域セット６０において、正三角形Ｐ６の３つの辺の各々の長さＭ６は、中心間隔Ｌ６より大きくなっている。
【００８８】
また、図７は、領域セットのさらに他の例についての説明図である。図７Ａに示す領域セット７０は、互いに等しい直径Ｄ７の円形状に形成された１つの特定領域７１（図７Ａおよび図７Ｂにおいてハッチングを施して示す領域）と、当該特定領域７１の周辺に配置された４つの隣接領域７２とを有し、当該特定領域７１と当該各隣接領域７２との中心間隔Ｌ１は互いに等しくなっている。そして、特定領域７１は、その中心点７１ｃが、４つの隣接領域７２の各々の中心点７２ｃを結んで形成される当該四角形Ｐ７の中に配置されている。また、この領域セット７０において、正方形Ｐ７の４つの辺の各々の長さＭ７は、中心間隔Ｌ７より大きくなっている。また、この場合、準備工程においては、例えば、図７Ｂに示すように、その一部に図７Ａに示す領域セット７０を含むよう、縦横に一定の中心間隔Ｌ７で規則的に配置される複数の表面領域３ｄが形成された多孔質フイルム表面を準備する。
【００８９】
なお、各表面領域の形状は、上述のような円形状に限られず、例えば、楕円形状や多角形であってもよい。また、隣接領域の重心点を結んで形成される多角形は、正多角形に限られず、例えば、その他の多角形であってもよい。また、各表面領域が形成される多孔質フイルムは、平板に限られず、例えば、可撓性の高いフィルムや膜等であってもよい。また、細胞非接着性の周辺表面に囲まれた細胞接着性の表面領域は、図２に示すようなキャビティの底面の一部として形成されてもよい。すなわち、例えば、キャビティの円形底面の一部であって、その中央部分に細胞接着性の表面領域を形成するとともに、当該表面領域を囲む当該円形底面の他の一部または残りの部分全体を細胞非接着性の周辺表面として形成することもできる。
このようにして、多孔質フィルム１の表面２に細胞接着性領域３ａを形成することで、本発明の組織体形成用基材を得ることができる。
この組織体形成用基材は、細胞培養における三次元組織体の形成に有用である。
【００９０】
次に、本発明の組織体形成用基材を用いた培養工程について説明する。
この培養工程においては、多孔質フィルム１表面２のうち、各領域セット１０に含まれる複数の細胞接着性領域３ａで増殖性の細胞を培養する。ここで、培養する細胞としては、所定の培養条件下で、細胞同士が三次元的に集合して立体的な組織体を形成するものであれば、由来する動物種や臓器・組織の種類等や、細胞の増殖性・非増殖性を問わず任意の細胞を用いることができる。具体的な例としては、ヒトまたはヒト以外の動物（例えば、サル、ブタ、イヌ、ラット、マウス等）由来の肝臓、膵臓、腎臓、神経、皮膚等から採取される初代細胞、未分化な幹細胞、胚由来のＥＳ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ）、樹立されている株化細胞、またはこれらに遺伝子操作等を施した細胞等であって、増殖可能な細胞を好ましく用いることができる。また、一種類の細胞を単独で用いることもできるし、二種類以上の細胞を任意の比率で混在させて用いることもできる。
【００９１】
また、細胞を培養する際に用いる培養液としては、当該細胞の生存状態や機能等を維持することができるよう、必要な塩類や栄養成分等を適切な濃度で含む水溶液であれば任意の組成のものを用いることができる。具体定期に、例えば、この培養液としては、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｖｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ：ＤＭＥＭ）等の基礎培地に、増殖因子や抗生物質等を添加した培養培地や、いわゆる生理的食塩水等を好ましく用いることができる。
【００９２】
この培養工程において、図１に示す細胞接着性領域３ａとして形成された領域および各隣接領域に接着することにより保持された細胞、および図２に示す細胞接着性領域３ａとして形成された特定領域および各隣接領域に接着することにより保持された細胞は、培養時間の経過に伴って、当該特定領域および各隣接領域で次第に重なり合い、三次元的に集合して、立体的な組織体を形成する。すなわち、細胞接着性の表面領域３ａに係る特定領域および各隣接領域に接着した細胞は、例えば、まず当該特定領域および当該各隣接領域で二次元的に増殖し、その後、さらに互いに積み重なるように三次元的に増殖することにより、所定の厚みを持った組織体を形成する。
【００９３】
この特定領域および各隣接領域で形成される組織体のサイズは、当該組織体に含まれる細胞が増殖することによって、培養時間の経過に伴い増加し得る。しかしながら、本方法においては，少なくとも特定領域に形成された組織体のサイズは、当該特定領域と各隣接領域との重心間隔に応じた一定値に維持される。すなわち、例えば、培養工程において特定領域で形成される組織体のサイズは、培養開始後、所定の期間内は次第に増加するが、当該特定領域と各隣接領域との重心間隔によって規定される所定値に到達した後は、その増加が制限されて、その後の培養器官を通じて当該所定値に維持される。
【００９４】
したがって、例えば、準備工程において、重心間隔が第一の値である領域セットが形成された第一の多孔質フイルム表面と、重心間隔が当該第一の値の所定倍である第二の多孔質フイルム表面とを準備した場合には、培養工程において、第二の多孔質フイルム表面の特定領域には、第一の多孔質フイルム表面の特定領域に形成される組織体のサイズの当該所定倍のサイズの組織体を形成できる。具体的に、例えば、準備工程において、図４Ａに示す第一の領域セット２０が形成された第一の多孔質フイルム表面と、図４Ｂを示す第二の領域セット３０が形成された第二の表面とを準備した場合には、培養工程において、当該第二の領域セット３０に含まれる第二の特定領域３１に形成される組織体のサイズの、当該第一の領域セット２０に含まれる第一の特定領域２１に形成される組織体のサイズに対する比率は、当該第二の領域セット２０の重心間隔Ｌ２に対する比率とほぼ等しくなる。
【００９５】
なお、組織体のサイズとは、例えば、当該組織体の外形を多孔質フイルム表面に投影した場合の形状の代表長さや、多孔質フイルム表面における組織体の厚みである。すなわち、例えば、組織体がほぼ球形状である場合（組織体が細胞接着性の表面領域３ａに接着したドーム状またはほぼ球形状である場合、組織体が細胞非接着性の表面領域４ａで培養液中に浮遊したほぼ球形状である場合を含む）には、当該組織体のサイズは、当該組織体の外形を多孔質フイルム表面に投影した円形状の直径である。このようなほぼ球形状の組織体は、細胞接着性の表面領域３ａの形状に関わらず形成できるが、円形状または多角形状の表面領域３ａで好ましく形成でき、特に円形状の表面領域３ａで好ましく形成できる。また、例えば、組織体の外形を多孔質フイルム表面に投影した形状が楕円体である場合には、当該組織体のサイズは、当該楕円体の長軸又は短軸である。また、例えば、組織体が多孔質フイルム表面に沿ってひも状に延びる場合には、当該ひも状の組織体のサイズは、その長軸方法の長さである。また、例えば、組織体が半球形状等のドーム状である場合には、当該組織体のサイズは、当該組織体の外形を多孔質フイルム表面に投影した円形状の直径または当該多孔質フイルム表面に盛り上がったドーム形状の厚みである。
【００９６】
また、本方法は、準備工程で準備する多孔質フイルム表面の重心間隔と、培養工程で形成される組織体のサイズとの相関関係を示す検量を取得する工程（以下、「データ取得工程」という）を含むこととしてもよい。このデータ取得工程においては、まず培養工程で形成された組織体のサイズを測定する。すなわち、例えば、位相差顕微鏡、蛍光顕微鏡、電子顕微鏡等を用いて、多孔質フイルム表面で形成された組織体を撮影した画像を取得し、当該画像を所定の画像解析ソフトウェアを備えたコンピュータ上で解析することにより、当該組織体のサイズを定量的に測定する。
【００９７】
そして、このデータ取得工程においては、測定された組織体のサイズと、当該組織体が形成された特定領域と各隣接領域との重心間隔とを関連付けた検量データを作成する。すなわち、例えば、図４Ａに示す第一特定領域２１で第一の直径の球状組織体が形成され、図４Ｂに示す第二の特定領域３１では当該第一の直径と、当該第一の特定領域２１に係る第一の重心間隔Ｌ２とを関係付けるとともに、当該第二の直径と、当該第二の特定領域３１にかかる第二の重心間隔Ｌ３とを関連付ける。
【００９８】
この検量データは、例えば所定のサイズの組織体を形成するために設定すべき重心間隔を規定するデータである。すなわち、この検量データは、例えば、組織体のサイズと、当該サイズの組織体を形成するための重心間隔とを互いに対応付けたデータテーブルや関数等である。
【００９９】
また、本方法は、検量データ取得工程において取得された検量データに基づいて、所望のサイズの組織体を形成させるための重心間隔を決定する工程（以下、「決定工程」という）を含むこととしてもよい。この決定工程においては、例えば、既に取得されている検量データによって規定される組織体のサイズと重心間隔との相関関係から、所望のサイズに関連付けられている重心間隔を決定する。すなわち、例えば、検量データにおいて、図４Ａで示す第一の特定領域２１に係る第一の重心間隔を当該第一の重心間隔Ｌ２に決定する。この場合、準備工程において、各隣接領域との重心間隔が決定工程で決定された第一の重心間隔Ｌ２である特定領域を含む領域セットが複数形成された多孔質フイルム表面を準備する。そして、培養工程において、特定領域および各隣接領域のそれぞれで増殖性の細胞を培養することによって、当該特定領域に、そのサイズが第一のサイズに制御された複数の組織体を形成できる。
【０１００】
また、例えば、組織体のサイズと重心間隔との比例関係を規定する検量データが取得されている場合には、決定工程において、当該比例関係を規定する関係式に基づいて、所望のサイズに対応する重心間隔を決定できる。また、所望のサイズの組織体を形成するための重心間隔が、既に取得されている検量データを基づいて決定できない場合には、例えば、上述のように、重心間隔が互いに異なる複数の領域セットの各特定領域で組織体を形成することにより、当該所望サイズの組織体を形成するための重心間隔をスクリーニングする。そして、決定工程では、このスクリーニングにおけるデータ取得工程において得られた検量データに基づいて、所望のサイズの組織体が形成された領域セットの重心間隔を当該所望のサイズに対応する重心間隔として決定する。
【０１０１】
なお、本方法においては重心間隔が互いに異なる複数の多孔質フイルム表面について一度に各工程を実施してもよいし、または、重心間隔が互いに異なる複数の多孔質フイルム表面のうち、各重心間隔の多孔質フイルム表面にについて各工程を繰り返してもよい。すなわち、例えば、第一の重心間隔の第一の多孔質フイルム表面を準備して、当該第一の多孔質フイルム表面で組織体を形成させる第一のサイクルを実施した後、当該第一の重心間隔とは異なる第二の重心間隔の第二の多孔質フイルム表面を準備して、当該第二の多孔質フイルム表面で組織体を形成させる第二のサイクルをさらに実施することとしてもよい。
【０１０２】
また、本実施形態に係る組織体形成キット（以下、「本キット」という）は、重心間隔が第一の距離となるよう特定領域および複数の隣接領域が形成された第一の多孔質フイルムと、重心間隔が当該第一の距離と異なる第二の距離となるよう特定領域および複数の隣接領域が形成された第二の多孔質フイルムと、を含む。すなわち、本キットは重心間隔が互いに異なる複数の領域セットのうち、互いに異なるいずれか一つの領域セットが毛製された複数の多孔質フイルム表面を含む。具体的に、例えば、本キットは図４Ａに示す第一の領域セット２０が形成された第一の多孔質フイルム表面と、図４Ｂに示す第二の領域セット３０が形成された第二の多孔質フイルム表面と、図４Ｃに示す第三の領域セット４０が形成された第三の多孔質フイルム表面とを含む。
【０１０３】
本キットは、領域セットの重心間隔が互いに異なる複数の多孔質フイルムを、一つの多孔質フイルムのうち互いに異なる部分として含むこととしても良い。すなわち、本キットに含まれる、領域セットの重心間隔が互いに異なる複数の多孔質フイルム表面の各々は、一つの多孔質フイルムの表面のうち、互いに異なる部分であってもよい。具体的に、例えば、本キットに含まれる多孔質フイルムの表面の一部には、図４Ａに示す第一の領域セット２０が少なくとも一つ形成され、当該表面のさらに他の一部には、図４Ｂに示す第二の領域セット３０が少なくとも一つ形成され、当該表面のさらに他の一部には、図４Ｃに示す第三の領域セット４０が少なくとも一つが互いに異なる表面部分に形成された多孔質フイルムを、複数含むこととしてもよい。
【０１０４】
また、本キットに含まれる、形成されている領域セットの重心間隔が互いに異なる複数の多孔質フイルム表面の各々は、互いの別体に成形された複数の多孔質フイルムの各々の表面であってもよい。すなわち、この場合、例えば、本キットは、図４Ａに示す第一の領域セット２０が少なくとも一つ形成された表面を有する第一の多孔質フイルムと、当該第一の多孔質フイルムとは別体に成形され、図４Ｂに示す第二の領域セット３０が少なくとも一つ形成された表面を有する第二の多孔質フイルムと、当該第一の多孔質フイルムおよび当該第二の多孔質フイルムとは別体に成形され、図４Ｃに示す第三の領域セット４０が少なくとも一つ形成された表面を有する第三の多孔質フイルムとを含むこととなる。
【０１０５】
そして、本キットに含まれる複数の多孔質フイルム表面に形成された特定領域および書く隣接領域において増殖性の細胞を培養することによって、当該各多孔質フイルム表面の特定領域に、当該各機材表面の重心間隔によって規定されるサイズの組織体を形成させることができる。すなわち、上述のように、例えば、本キットが、重心間隔が複数の多孔質フイルム表面間で規則的に変化するよう、当該複数の多孔質フイルム表面を含む場合には、当該複数の多孔質フイルム表面の各々の特定領域に形成される組織体のサイズは、当該複数の多孔質フイルム表面間で、当該重心間隔に応じて規則的に変化することとなる。具体的に、例えば、本キットが、図４Ａに示す第一の領域セット２０が形成された第一の多孔質フイルム表面と、図４Ｂに示す第二の領域セット３０が形成された第二の多孔質フイルム表面と、図４Ｃに示す第三の領域セット４０が形成された第三の多孔質フイルム表面とを含み、当該第一の領域セット２０の中心間隔Ｌ２、当該第二の領域セット３０の中心間隔Ｌ３、当該第三の領域セット４０の中心間隔Ｌ４が一定の割合で順次増加する場合には、当該第一領域セット２０に形成される第一の組織体、当該第二の領域セット３０で形成さえる第二の組織体、当該第三の領域セット４０で形成される第三の組織体のサイズもまた、当該一定の割合で順次増加するものとすることができる。
【０１０６】
したがって、本キットによれば、例えば、各多孔質フイルム方面に、その重心間隔に応じて制御されたサイズの組織体が規則的かつ高密度に配置された組織体アレイチップを得ることができる。そして、このような組織体アレイチップを用いることにより、例えば、細胞の薬剤に対する応答性（感受性、毒性等）と、当該細胞から形成された組織体のサイズとの相関関係を簡便かつ長時間にわたって精度よく検討することができる。具体的に、例えば、本キットの多孔質フイルム上に癌由来細胞からなり、重心間隔に応じてサイズが一定の割合で変化する複数の組織を形成させ、抗癌剤を含む培養液中における当該組織の応答性（各組織に含まれる細胞の増殖速度、生存率、形態の変化等）を測定することにより、生体における腫瘍塊のサイズと、当該抗癌剤の薬効との相関関係を適切に予測評価することができる。
本発明の組織体形成キットの他の適用態様について述べれば、例えば、本キットによれば、所望のサイズの組織体を形成するための重心間隔を簡便かつ正確にスクリーニングできる。また、本キットにおける多孔質フイルムの細胞接着性の表面領域に組織体を接着させた状態で保持することができる。さらに、本キットに含まれる多孔質フィルムを回収してシート試料として扱うこともできる。多孔質フィルムは従来セルチップに比較して相対的に細胞接着性が低いので、各表面領域で形成された組織体は溶液中に浮遊させることにより容易に回収して取り扱うことも可能である。
【０１０７】
さらに、発明者らは、多孔質フィルムを基材として用いることにより、初めて細胞播種側の多孔質フィルム表面のみならず、細胞播種反対側の多孔質フィルム表面にもスフェロイドが形成できることを本発明に関わる検討を通じて見出した。即ち、図１４（Ａ）、図１４（Ｂ）の模式図に示すように、多孔質フィルム孔径と培養しようとする細胞の大きさとの関係を制御することにより、当該多孔質フィルムの片面のみならず、両面、即ち、播種反対面にも選択的にスフェロイド形成を促すことができることを見出した。このことにより、培養環境の異方性に関する研究や共培養システムの開発などにも本発明の組織体形成キットを応用しうるものであり、その応用範囲は広い。
【実施例】
【０１０８】
以下、本発明の実施例について説明するが、本発明は下記実施例に何ら限定されるものではない。
（実施例１）
＜多孔質フィルムの作製＞
ポリ（ε―カプロラクトン）（ＰＣＬ、Ｗａｋｏ製  重量平均分子量  ７０，０００から１００，０００）と両親媒性ポリアクリルアミドポリマー（下記構造、重量平均分子量  ４９，０００）を重量比１０：１で０．５ｍｇ／ｍＬとなるように塩化メチレンに溶解した。この溶液をガラスシャーレ（Φ９０）上にキャストし、相対湿度８０％の雰囲気下で塩化メチレンを蒸発させることで、開孔径７〜１５μｍのフィルム表裏面で貫通した孔がハニカム状に配置された貫通型ハニカム状多孔質フィルムＡを得た。
【０１０９】
【化１３】
0005583312.tif 000014
【０１１０】
得られた貫通型ハニカム状フィルムＡの構造を電界放出走査型電子顕微鏡（日立ハイテクノロジー社製、Ｓ４３００）で観察したところ、平面視によれば、平均開孔径１１μｍの空孔同士がヘキサゴナル状に規則配列したハニカム状構造を確認できた。隣接する空孔の中心間の間隔は、ほぼ１６μｍ前後であった。空孔は膜の表面から裏面へ単―層を形成しており、個々の空孔は球形状で、隣接空孔同士が互いに連通した構造であった。また、空孔の上下面は何れも開孔しており、フィルムの表裏面が貢通している構造であった。空孔はキャストした周辺の一部を除き、ほぼ全面にわたって分布していた。
【０１１１】
＜比較例１用の多孔質フィルムの作製＞
また比較試料として、以下のフィルムを作製した。
直径１０μｍ、高さ１５μｍの円柱が、隣接する円柱同士の中心間距離１５μｍ間隔でヘキサゴナル状に規則配列した平板金型（サイズ２０ｍｍ×２０ｍｍ）を作製し、前記フラットフィルムに４０℃に保温しながら前記平板金型を０．１Ｐａの荷重で３０秒間押し当て、前記金型から剥がすことで、表面に直径約１０μｍ、深さ約１５μｍの有底キャビティ（非貫通空孔）が中心間距離約１５μｍでヘキサゴナル状に配置された非貫通型ハニカム状フィルムＢを得た。
【０１１２】
＜組織体形成キットの作製＞
ポリメチルメタクリレート（Ｐｏｌｙ  Ｍｅｔｈｙｌ  ＭｅｔｈＡｃｒｙｌａｔｅ：ＰＭＭＡ）製の平板（２４ｍｍ×２４ｍｍ、厚さ４００μｍ）を保持材５ｂとして用い、図２に示すような組成体形成キットＡを作製した。すなわち、キャビティ１００の底面が細胞接着性領域３ａおよび細胞非接着性領域４ｂからなる六角セットが複数形成された多孔質フィルムからなるプレキットＡを作製した。
【０１１３】
具体的に、このポリメチルメタクリレート平板の表面の一部に、１０ｍｍ角の矩形範囲にわたって、マシニングセンタ（卓上型ＮＣ微細加工機、株式会社ピーエムティー製）を用いた穿孔加工処理を施すことにより、直径３００μｍの円形状が、隣接孔中心間距離が４００μｍで規則的に配置して貫通孔を作製した（保持材Ａ）。
【０１１４】
次に前記、貫通型ハニカム状多孔質フィルムＡと保持材Ａを熱圧着して固定し、プレキットＡを得た。
【０１１５】
次にこの貫通型ハニカム状多孔質フィルムを固定したプレキットＡの表面全体（保持材Ａ面側）に、スパッタリング装置（Ｅ−１０３０、日立株式会社）を用いて、厚さ９ｎｍのプラチナ（Ｐｔ）薄膜を形成した。一方、直径が１００μｍであって、長さが２００μｍの円筒状突起を複数有するポリジメチルシロキサン（Ｐｏｌｙ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  Ｓｉｌｏｘａｎｅ）：ＰＤＭＳ）製のスタンプをモールド成形により作製した。すなわち、１０ｍｍ×１０ｍｍの矩形範囲に、六角セットの各表面領域の位置に対応して、その先端の直径１００μｍの円筒断面の中心間距離が、４００μｍとなるようスタンプを作製した。
【０１１６】
そして、前記スタンプを用いてマイクロコンタクトプリンティング法により多孔質フイルム表面に細胞接着性領域３ａを作製した。すなわち、各表面領域に固定する細胞接着物質として準備したコラーゲン（Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ、新田ゼラチン株式会社）を１．５ｍｇ／ｍＬの濃度で含むコラーゲン溶液を調製し、前記スタンプの円筒状突起の先端を前記コラーゲン溶液に浸すことにより、前記円筒状突起の円形先端面に前記コラーゲン溶液を塗布した。そして、スタンプの円筒状突起の先端を、上記プラチナが蒸着された多孔質フイルム表面に押し当てることにより、前記円筒状突起の先端に塗布されていたコラーゲン溶液を前記多孔質フイルム表面に塗布した。さらに、この多孔質フイルム表面に塗布したコラーゲン溶液を窒素雰囲気下において乾燥させることにより、スタンプの円筒状突起の先端に対応した位置に、コラーゲンが固定された細胞接着性領域３ａを形成した。すなわち、直径３００μｍの各マイクロキャビティの中心にそれぞれ直径１００μｍのコラーゲンが設置された。
【０１１７】
また、多孔質フイルム表面のうち、表面領域以外の部分３ｂには、次のようにして細胞非接着性物質を固定した。すなわち、各表面領域を囲む表面に固定する細胞非接着性物質として、重量平均分子量３０，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖とチオール基を有する合成高分子（下記構造：日本油脂株式会社）を準備した。
【０１１８】
【化１４】
0005583312.tif 000015
【０１１９】
そして、上述のように表面領域を形成した多孔質フイルム表面を、この細胞非接着性物質を５ｍＭの濃度で含むエタノール溶液中に浸漬し、窒素雰囲気下において当該細胞非接着性物質のチオール基と、多孔質フイルム表面に形成したプラチナ薄膜のうち露出している部分（すなわち、多孔質フイルム表面のうち表面領域以外の部分）との間に特異的な化学結合を形成させることにより、当該プラチナ薄膜表面に当該細胞非接着性物質を固定した。その後、窒素雰囲気下において、この細胞非接着性物質を固定した多孔質フイルム表面を十分に乾燥させ、次いで、当該多孔質フイルム表面を、７０％エタノール中に浸漬することにより、余剰の細胞非接着物質を当該多孔質フイルム表面から除去するとともに、当該多孔質フイルム表面を滅菌した。
【０１２０】
次に初代ラット肝細胞の調製、および培養を以下のように行った。
まず、初代ラット肝細胞を調製するために０．５ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ（和光純薬工業社製）溶液１５０ｍＬを用意した。７週齢の雄ウィスター系ラット（体重２５０ｇ）の門脈（肝臓に入る血管）にカニューレを導入し、脱血液を３０ｍＬ／ｍｉｎで５分間流した後、３７℃に加温したコラゲナーゼ溶液を１５ｍＬ／ｍｉｎで１０分間流した。コラゲナーゼによって処理された肝臓を培養液に入れ、メスとピペットを使って肝細胞を分散させた。得られた肝細胞懸濁液を３回洗浄し、肝細胞以外の細胞を取り除いた（９５％以上の純度）。このようにして単離した肝細胞を以下の培養実験の種細胞として使用した。
【０１２１】
肝細胞の培養には、ダルベッコ改変イーグル培地（ギブコ社製：ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ）１３．５ｇ／Ｌに、６０ｍｇ／Ｌプロリン、５０ｍｇ／ｍＬ上皮細胞成長因子（フナコシ社製：ＥＧＦ）、１０ｍｇ／Ｌインシュリン（シグマ社製）、７．５ｍｇ／Ｌヒドロコルチゾン（和光純薬工業社製）、０．１μＭ硫酸銅・５水和物（和光純薬工業社製）、３μｇ／Ｌセレン酸（和光純薬工業社製）、５０ｐＭ硫酸亜鉛・７水和物（和光純薬工業社製）、５０μｇ／Ｌリノール酸（シグマ社製）、５８．８ｍｇ／Ｌペニシリン（明治製菓社製）、１００ｍｇ／Ｌストレプトマイシン（明治製菓社製）、１．０５ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウム（和光純薬工業社製）、１．１９ｇ／Ｌの２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（同人堂社製：ＨＥＰＥＳ、２−［４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）を加えた無血清培地を用いた。なお、本実験系においてラット肝細胞は増殖しない。
【０１２２】
ポリスチレン製の培養容器（直径３５ｍｍ、ファルコン社製）の底部に上記滅菌処理後の前記各組織体形成キットＡを載置し、当該培養容器内の当該組織体形成キットの表面に、１．７×１０５個のラット肝細胞を播種した。培養は、５％炭酸ガス、９５％大気の雰囲気下で行い、上記２ｍＬの新鮮培地を用い、２日毎に培地交換を行った。
【０１２３】
得られた肝細胞の培養状態を評価するために、培養の各期間において、位相差顕微鏡による細胞形態を観察した。また、スフェロイドが形成された条件においてはその粒径を測定し、スフェロイド粒径分布を評価した。ここで、スフェロイド粒径の測定は、画像解析ソフトＷｉｎＲＯＯＦ（三谷商事社製）を用い、１条件当たり１００個のスフェロイド粒径を測定し、粒径分布を求めた。培養初期に分散状態であった細胞が徐々に集合化し、細胞同士が結合、凝集化して三次元的な細胞集合体であるスフェロイドを形成することを確認した。
【０１２４】
培養７日目に肝細胞の機能であるアルブミン分泌能を以下の方法にて評価した。培養培地中に分泌されたアルブミンを酵素標識免疫測定法により定量し、単位細胞数あたりのアルブミン分泌速度（μｇ／１０６ｃｅｌｌｓ／ｄａｙ）に換算した。細胞数の測定は、ＤＮＡ−ＤＡＰＩ  （４，  ６−ｄｉａｍｉｎｏｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ、和光純薬工業社製）蛍光法を用いた。すなわち、一定細胞から抽出したＤＮＡとＤＮＡ−ＤＡＰＩの蛍光強度間の検量線を作製し、この関係をもとに培養した細胞の細胞数を算出した。この細胞数をもとに、上記の細胞（１０６Ｃｅｌｌｓ）当たりのアルブミン分泌速度を算出した。
【０１２５】
（比較例１）
また、比較用試料として貫通型多孔質フィルムＡの代わりに前記のようにして得られた非貫通型フラットフィルムＢを用いた以外はまったく同じ方法で作製した組織体形成キットＢを使って同様の実験を行った。
【０１２６】
図８（Ａ）に形成されたラット肝細胞スフェロイドの形態、図９にスフェロイド粒径の変化、図１０にラット肝細胞のアルブミン分泌活性の結果を示す。組成体形成キットＡ上においてラット肝細胞は規則的に配列したスフェロイドを形成し〔図８（Ａ）参照〕、その粒径は一定に維持された（図９）。また、図１０より、本発明の組織体形成法は、多孔質フィルムを用いない場合に比べてスフェロイド培養した肝細胞のアルブミン分泌活性が高いことが示された。
【０１２７】
（実施例２）
増殖性の細胞として、ヒト肝芽腫由来の細胞株であるＨｅｐＧ２細胞（ＲＣＢ１６４８、理化学研究所セルバンク）を用いた。また、培養液としては、ウィリアムズＥ培地（Ｗｉｌｌｉａｍｓ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅ、シグマ社製）１０．８ｇ／Ｌに、５８．８ｍｇ／Ｌのペニシリン（明治製菓社製）、１００ｍｇ／Ｌのストレプトマイシン（明治製菓社製）、２．２ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウム（和光純薬工業社製）、１０％の牛胎児血清（ＦＢＳ、インビトロジェン社製）、を加えた血清添加培養液を調製して用いた。
【０１２８】
ポリスチレン製の培養容器（直径３５ｍｍ、ファルコン社製）の底部に上記滅菌処理後の前記各組織体形成キットＡを載置し、当該培養容器内の当該組織体形成キットの表面に、１．０×１０５個のＨｅｐＧ２細胞を播種した。培養は、５％炭酸ガス、９５％大気の雰囲気下で行い、上記２ｍＬの新鮮培地を用い、２日毎に培地交換を行った。
上記の点以外は、実施例１と同じ方法にて培養および評価実験を実施した。また、上記の点以外は、比較例１と同じ方法にて比較用の培養および評価実験を実施した。
【０１２９】
図８（Ｂ）に形成されたＨｅｐＧ２スフェロイドの形態、図９にスフェロイド粒径の変化、図１１にＨｅｐＧ２細胞のアルブミン分泌活性の結果を示す。組成体形成キットＡ上においてＨｅｐＧ２細胞は規則的に配列したスフェロイドを形成した〔図８（Ｂ）参照〕。また、培養初期は細胞の増殖に伴ってスフェロイド粒径が増加するが、培養１０日目以降は一定に維持された（図９）。さらに、図１１より、本発明の組織体形成法は、多孔質フィルムを用いない場合に比べてスフェロイド培養したＨｅｐＧ２細胞のアルブミン分泌活性が高いことがわかった。
【０１３０】
（実施例３）
増殖性の細胞として、ヒト肝ガン由来細胞株のＨｕＨ７細胞（ＲＣＢ１３６６、理化学研究所セルバンク）を用いた以外は（実施例２）と同じ方法にて培養および評価実験を実施した。また、上記の点以外は（比較例２）と同じ方法にて比較用の培養および評価実験を行った。
【０１３１】
図８（Ｃ）に形成されたＨｕＨ７スフェロイドの形態、図９にスフェロイド粒径の変化、図１２にＨｕＨ７細胞のアルブミン分泌活性の結果を示す。組成体形成キットＡ上においてＨｕＨ７細胞は規則的に配列したスフェロイドを形成した〔図８（Ｃ）参照〕。また、培養初期は細胞の増殖に伴ってスフェロイド粒径が増加するが、培養１０日目以降は一定に維持された（図９）。さらに、図１２より、本発明の組織体形成法は、多孔質フィルムを用いない場合に比べてスフェロイド培養したＨｕＨ７細胞のアルブミン分泌活性が高いことがわかった。
【０１３２】
（実施例４）
膵臓系の増殖性細胞として、ラットランゲルハンス島由来の細胞株であるＲＩＮ−５Ｆ細胞（大日本住友製薬社）を用いた。また、培養液としては、ＲＰＭＩ−１６４０培地（シグマ社製）８．４ｇ／Ｌに、５８．８ｍｇ／Ｌのペニシリン（明治製菓社製）、１００ｍｇ／Ｌのストレプトマイシン（明治製菓社製）、２．２ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウム（和光純薬工業社製）、１０％の牛胎児血清（ＦＢＳ、インビトロジェン社製）、を加えた血清添加培養液を調製して用いた。実施例１と同じ方法にて細胞形態およびスフェロイド粒径の変化を評価した。
【０１３３】
図８（Ｄ）に形成されたＲＩＮ−５Ｆスフェロイドの形態、図９にスフェロイド粒径の変化を示す。組成体形成キットＡ上においてＲＩＮ−５Ｆ細胞は規則的に配列したスフェロイドを形成した〔図８（Ｄ）参照〕。また、培養初期は細胞の増殖に伴ってスフェロイド粒径が増加するが、培養１０日目以降は一定に維持されることが示された（図９）。
【０１３４】
（実施例５）
未分化細胞として、マウスＥＳ細胞株である１２９ＳＶ細胞（大日本住友製薬社）を用いた。また、培養液としては、ＥＳ細胞用培地（大日本住友製薬社）を用いた。実施例１と同じ方法にて細胞形態およびスフェロイド粒径の変化を評価した。
【０１３５】
図８（Ｅ）に形成されたマウスＥＳスフェロイドの形態、図９にスフェロイド粒径の変化を示す。組成体形成キットＡ上においてマウスＥＳ細胞は規則的に配列したスフェロイドを形成した〔図８（Ｅ）参照〕。また、培養初期は細胞の増殖に伴ってスフェロイド粒径が増加するが、培養５日目以降は一定に維持されることが示された（図９）。
【０１３６】
（実施例６）
ポリメチルメタクリレート（Ｐｏｌｙ  Ｍｅｔｈｙｌ  ＭｅｔｈＡｃｒｙｌａｔｅ：ＰＭＭＡ）製の平板（２４ｍｍ×２４ｍｍ、厚さ４００μｍ）を保持材５ａとして用い、図１に示すようなプレキットＣを作製した。すなわち、５ｍｍ×５ｍｍのサイズで格子状に打ち抜き、実施例１と同じ方法で作製した多孔質フィルムを熱圧着した。多孔質フィルムの表面に細胞接着性領域３ａを以下のように形成しうる六角セットが複数形成されたプレキットＣを作製した。
このプレキットＣにおいては、多孔質フィルム１は、保持材５ａの高さ方向の中興近傍に固定化されることにより、多孔質フィルム１の裏面に空間が形成されるように保持される。
【０１３７】
まず、プレキットＣの表面に、実施例１と同じ方法でプラチナ薄膜の設置を行った。さらに、実施例１におけるのと同じ方法で作製したスタンプを用い、直径１００μｍ、中心点の位置が、６つの隣接領域の中心点を結んで形成される正六角形の重心点の位置と一致するようにコラーゲン塗布を行うことにより細胞接着性領域３ａを形成し、組織体形成キットＣを作製した。
【０１３８】
組織体形成キットＡの代わりに組織体形成キットＣを用いる以外は、実施例２と同じ方法にてＨｅｐＧ２の培養実験を行い位相差顕微鏡にてスフェロイド形成状態を観察した。この顕微鏡写真を図１３（Ａ）、（Ｂ）に示す。
また、このときのスフェロイド５０の形成状態を図１４の模式図で示す。ＨｅｐＧ２の細胞径は約１０μｍであるが、図１４（Ａ）に示すように、多孔質フィルム１として孔径が細胞径よりも小さいものを使用している場合には、細胞播種側の多孔質フィルム１表面２および細胞播種反対側の多孔質フィルム表面（裏面）の両面にスフェロイド５０が形成された。このときの表面（細胞播種面）におけるスフェロイド形成状態を図１３（Ａ）に示す。
このとき、多孔質フィルム１を、その孔径が細胞径よりも大きいものを用いて同様の培養を行った場合を図１４（Ｂ）に示す。このときの表面（細胞播種面）におけるスフェロイド形成状態を図１３（Ｂ）に示す。この場合には、細胞播種した多孔質フィルム１表面２ではなく、その反対側の多孔質フィルム表面（裏面）上にスフェロイド５０が形成された。これらの結果は、多孔質フィルム孔径によってスフェロイド５０の形成方向を制御できることを示し、培養環境の異方性に関する研究や共培養システムへの応用が可能である。
【産業上の利用可能性】
【０１３９】
本発明の組織体形成法は、増殖性の細胞の培養においてもサイズの増加を抑制された三次元組織体を形成でき、かつ代謝性の高い増殖細胞を長期にわたって細胞機能保持し得る効率的な三次元組織体形成法を提供できる。このため精度の高く効率的な増殖性細胞の三次元培養研究用キットを提供し、さらには生体の挙動を再現するシミュレータ、薬品開発における動物実験の代替技術、細胞移植による再生医療技術等への応用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】多孔質フィルムの周囲を枠状の保持材で保持してなる本発明の組織体形成キットの一態様を示す斜視図である。
【図２】多孔質フィルムに有孔保持材を積層してなる本発明の組織体形成法の他の態様を示す斜視図及びそこに形成された細胞接着性領域を有するキャビティの部分拡大図である。
【図３】本実施形態に係る組織体形成法において用いられる領域セットの一例についての説明図である。
【図４】本実施形態に係る組織体形成法において用いられる、重心間隔が互いに異なる複数の領域セットの一例についての説明図である。
【図５】本実施形態に係る組織体形成法において用いられる領域セットが形成された多孔質フィルム表面の一例についての説明図である。
【図６】本実施形態に係る組織体形成法において用いられる領域セットの他の例についての説明図である。
【図７】本実施形態に係る組織体形成法において用いられる領域セットのさらに他の例についての説明図である。
【図８】（Ａ）〜（Ｅ）実施例１乃至実施例５において形成されたスフェロイドの形態を示す光学顕微鏡写真である。
【図９】実施例１乃至実施例５において形成されたスフェロイド粒径の経時変化を表したものである。
【図１０】実施例１および比較例１において形成された組織体のアルブミン分泌活性を示すグラフである。
【図１１】実施例２および比較例２において形成された組織体のアルブミン分泌活性を示すグラフである。
【図１２】実施例３および比較例３において形成された組織体のアルブミン分泌活性を示すグラフである。
【図１３】（Ａ），（Ｂ）実施例６において形成された組織体の光学顕微鏡写真である。
【図１４】（Ａ）、（Ｂ）実施例６において形成された組織体の形成状況を示す模式図である。
【符号の説明】
【０１４１】
１      多孔質フィルム
２      多孔質フィルム表面
３ａ    細胞接着性領域
４ａ、４ｂ    細胞接着性領域周辺に位置する細胞非接着性領域
５ａ、５ｂ      保持材
１０    領域セット表面
５０    組織体（スフェロイド）
１００  キャビティ
【図１】
0005583312.tif 000016
【図２】
0005583312.tif 000017
【図３】
0005583312.tif 000018
【図４】
0005583312.tif 000019
【図５】
0005583312.tif 000020
【図６】
0005583312.tif 000021
【図７】
0005583312.tif 000022
【図９】
0005583312.tif 000023
【図１０】
0005583312.tif 000024
【図１１】
0005583312.tif 000025
【図１２】
0005583312.tif 000026
【図１４】
0005583312.tif 000027
【図８】
0005583312.tif 000028
【図１３】
0005583312.tif 000029