(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＧＤ含有ペプチド又はＲＧＤモチーフを有するペプタイドを模倣する非ペプチド性の化合物（ＲＧＤペプチドミメチック）及び、クロロフィル又はバクテリオクロロフィル光増感剤のコンジュゲート、並びに薬学的に許容される担体を含む、
腫瘍壊死領域の診断及び可視化のための、低侵襲性の腫瘍標的画像化における使用のための薬理組成物であって；
該画像化が
（ｉ）    壊死領域を有する腫瘍を有することが疑われる対象に、該薬理組成物を投与するステップ；
（ｉｉ）  投与後少なくとも２４〜４８時間の間に該対象を画像化するステップ；及び
（ｉｉｉ）腫瘍壊死領域の存在又は非存在を診断するステップを含み、
ここで、該クロロフィル又はバクテリオクロロフィル光増感剤が、式ＩＩ：
【化１】
0005620279.tif 000013
［式中、
Ｍは、２Ｈ、又はＭｇ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｓｎ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｉｎ、Ｅｕ、Ｆｅ、Ａｕ、Ａｌ、Ｇｄ、Ｄｙ、Ｅｒ、Ｙｂ、Ｌｕ、Ｇａ、Ｙ、Ｒｈ、Ｒｕ、Ｓｉ、Ｇｅ、Ｃｒ、Ｍｏ、Ｐ、Ｒｅ、Ｔｃ、及びＴｌからなる群から選択される原子、並びにそれらの同位体及び放射性同位体を表し、
Ｒ１、Ｒ’２、及びＲ６は、各々独立に、Ｙ−Ｒ８、−ＮＲ９Ｒ’９、若しくは−Ｎ＋Ｒ９Ｒ’９Ｒ”９Ａ−であり、又はＲ１及びＲ６は一緒になって、ＲＧＤペプチド、若しくはＲＧＤペプチドミメチック残基を含む環を形成し、
Ｙは、Ｏ又はＳであり、
Ｒ４は、−ＣＨ＝ＣＲ９Ｒ’９、−ＣＨ＝ＣＲ９Ｈａｌ、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＮＲ９Ｒ’９、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−Ｎ＋Ｒ９Ｒ’９Ｒ”９Ａ−、−ＣＨＯ、−ＣＨ＝ＮＲ９、−ＣＨ＝Ｎ＋Ｒ９Ｒ’９Ａ−、−ＣＨ２−ＯＲ９、−ＣＨ２−ＳＲ９、−ＣＨ２−Ｈａｌ、−ＣＨ２−Ｒ９、−ＣＨ２−ＮＲ９Ｒ’９、−ＣＨ２−Ｎ＋Ｒ９Ｒ’９Ｒ”９Ａ−、−ＣＨ２−ＣＨ２Ｒ９、−ＣＨ２−ＣＨ２Ｈａｌ、−ＣＨ２−ＣＨ２ＯＲ９、−ＣＨ２−ＣＨ２ＳＲ９、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲ９Ｒ’９、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ＋Ｒ９Ｒ’９Ｒ”９Ａ−、−ＣＯＣＨ３、Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＲ９Ｒ’９、−Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＲ９Ｈａｌ、−Ｃ（ＣＨ３）＝ＮＲ９、−ＣＨ（ＣＨ３）＝Ｎ＋Ｒ９Ｒ’９Ａ−、−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｈａｌ、−ＣＨ（ＣＨ３）−ＯＲ９、−ＣＨ（ＣＨ３）−ＳＲ９、−ＣＨ（ＣＨ３）−ＮＲ９Ｒ’９、−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｎ＋Ｒ９Ｒ’９Ｒ”９Ａ−、又は−Ｃ≡ＣＲ９であり、
Ｒ’４は、メチル又はホルミルであり、
Ｒ８、Ｒ９、Ｒ’９、及びＲ”９は、各々独立に、
（ａ）Ｈ、
（ｂ）Ｃ１〜Ｃ２５ハイドロカルビル、
（ｃ）ハロゲン、ニトロ、オキソ、ＯＲ、ＳＲ、エポキシ、エピチオ、−ＣＯＮＲＲ’、−ＣＯＲ、ＣＯＯＲ、−ＯＳＯ３Ｒ、−ＳＯ３Ｒ、−ＳＯ２Ｒ、−ＮＨＳＯ２Ｒ、−ＳＯ２ＮＲＲ’、−ＮＲＲ’、＝Ｎ−ＯＲ、＝Ｎ−ＮＲＲ’、−Ｃ（＝ＮＲ）−ＮＲＲ’，−ＮＲ−ＮＲＲ’、−（Ｒ）Ｎ−Ｃ（＝ＮＲ）−ＮＲＲ’、Ｏ←ＮＲ−、＞Ｃ＝ＮＲ、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＲ−ＣＯＲ’、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−ＮＲＲ’、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＯＲ、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ、−ＰＲＲ’、−ＯＰＯ３ＲＲ’、−ＰＯ２ＨＲ、及び−ＰＯ３ＲＲ’［式中、Ｒ及びＲ’は各々独立に、Ｈ、ハイドロカルビル、又はヘテロシクリルであり、Ｒ’は、さらにＲＧＤペプチド又はＲＧＤペプチドミメチックの残基であってよく、又はＲ及びＲ’は、これらが結合しているＮ原子と一緒になって、Ｏ、Ｓ、及びＮから選択されるさらなるヘテロ原子を場合により含む３〜７員飽和環を形成し、さらなるＮ原子は置換されていてよい］からなる群から選択される１つ又は複数の官能基によって置換されているＣ１〜Ｃ２５ハイドロカルビル、
（ｄ）正に荷電している基、負に荷電している基、生理学的条件下で正に荷電している基に変換される塩基性基、及び生理学的条件下で負に荷電している基に変換される酸性基からなる群から選択される１つ又は複数の官能基によって置換されているＣ１〜Ｃ２５ハイドロカルビル、
（ｅ）１つ若しくは複数のヘテロ原子、及び／又は１つ若しくは複数の炭素環若しくは複素環部分を含むＣ１〜Ｃ２５ハイドロカルビル、
（ｆ）１つ若しくは複数のヘテロ原子、及び／又は１つ若しくは複数の炭素環若しくは複素環部分を含み、上記（ｃ）及び（ｄ）において定義した１つ又は複数の官能基によって置換されているＣ１〜Ｃ２５ハイドロカルビル、
（ｇ）アミノ酸、ペプチド、ＲＧＤペプチド、タンパク質、単糖、オリゴ糖、多糖の残基、又は多座配位子、及び金属とのそのキレート錯体によって置換されているＣ１〜Ｃ２５ハイドロカルビル、或いは、
（ｈ）アミノ酸、ペプチド、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤペプチドミメチック、タンパク質、単糖、オリゴ糖、多糖の残基、又は多座配位子、及び金属とのそのキレート錯体
であり、
Ｒ８は、Ｒ１、Ｒ’２、及びＲ６が、各々独立にＹ−Ｒ８である場合、さらに、Ｈ＋又は陽イオンＲ＋１０であってよく、
Ｒ＋１０は、金属、アンモニウム基、又は有機陽イオンであり、
Ａ−は、生理学的に許容される陰イオンであり、
ｍは、０又は１であり、
７〜８位の点線は、場合による二重結合を表し、
ここで該ＲＧＤ含有ペプチドが、４〜１００個のアミノ酸から構成されている直鎖若しくは環状のペプチドであり、
該ハイドロカルビルが炭素原子１〜２５個の、飽和又は不飽和、非環状又は環状（芳香属を含む）ラジカルから選択され、ここで該非環状ラジカルは直鎖又は分岐したアルキル、アルケニル又はアルキニルである］のクロロフィル又はバクテリオクロロフィル並びにその薬学的に許容される塩又は光学異性体であり；そして
該式ＩＩのクロロフィル又はバクテリオクロロフィルが少なくとも１つのＲＧＤ含有ペプチド残基又はＲＧＤペプチドミメチック残基を含んでいる；
上記薬理組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の薬理組成物であって、
（ｉ）  ７〜８位の点線が二重結合を表し、光増感剤が式ＩＩのクロロフィルであるか、あるいは
（ｉｉ）７〜８位の点線が非存在であり、光増感剤が式ＩＩのバクテリオクロロフィルであり、
ここで該クロロフィル又はバクテリオクロロフィルが、
（ａ） ＣＯＯ−、ＣＯＳ−、ＳＯ３−、若しくはＰＯ３２−から選択される負に荷電している基；
（ｂ） ＣＯＯＨ、ＣＯＳＨ、ＳＯ３Ｈ、若しくはＰＯ３Ｈ２、若しくはこれらの塩から選択される、生理学的ｐＨで負に荷電している基に変換される酸性基；
（ｃ） −Ｏ＋（ＲＲ’）、−Ｓ＋（ＲＲ’）、−Ｓｅ＋（ＲＲ’）、−Ｔｅ＋（ＲＲ’）、−Ｐ＋（ＲＲ’Ｒ”）、−Ａｓ＋（ＲＲ’Ｒ”）、−Ｓｂ＋（ＲＲ’Ｒ”）、及び−Ｂｉ＋（ＲＲ’Ｒ”）からなる群から選択されるオニウム基；
ピラゾリウム、イミダゾリウム、オキサゾリウム、チアゾリウム、ピリジニウム、キノリニウム、イソキノリニウム、ピリミジニウム、１，２，４−トリアジニウム、１，３，５−トリアジニウム、及びプリニウムから選択される、１つ又は複数のＮ原子及び場合によりＯ若しくはＳ原子を含む芳香族複素環化合物に由来する陽イオン；又は
−Ｎ＋（ＲＲ’Ｒ”）、−（Ｒ）Ｎ−Ｎ＋（ＲＲ’Ｒ”）、Ｏ←Ｎ＋（ＲＲ’Ｒ”）−、＞Ｃ＝Ｎ＋（ＲＲ’）、−Ｃ（＝ＮＲ）−Ｎ＋ＲＲ’Ｒ”、及び−（Ｒ）Ｎ−Ｃ（＝ＮＲ）Ｎ＋ＲＲ’Ｒ”基から選択されるＮ含有基に由来する、末端基であるか若しくはアルキル鎖内に位置する基である陽イオン；又は
（ｄ）  −ＮＲＲ’、−Ｃ（＝ＮＲ）−ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲ−ＮＲ’Ｒ”、−（Ｒ）Ｎ−Ｃ（＝ＮＲ）−ＮＲ’Ｒ”、Ｏ←ＮＲ−、又は＞Ｃ＝ＮＲから選択され、末端基であるか又はアルキル鎖内に位置する、生理学的条件下で正に荷電している基に変換される塩基性基；
から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい、薬理組成物
［ここで、式中、各Ｒ、Ｒ’、及びＲ”は独立に、Ｈ、場合により置換されているハイドロカルビル、若しくはヘテロシクリルであり、
又はＲ、Ｒ’、及びＲ”の２つはＮ原子と一緒になって、３〜７員飽和環を形成し、
ここで、該３〜７員飽和環は、場合によりＯ、Ｓ、若しくはＮ原子を含み、場合によりさらなるＮ原子がさらに置換されており；
ハロ、ヒドロキシル、若しくはアミノによって場合により置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキルによってさらなるＮ原子にて場合により置換されている、アジリジン、ピロリジン、ピペリジン、モルホリン、チオモルホリン、アゼピン、又はピペラジンから選択される］。
【請求項３】
前記式ＩＩのクロロフィル又はバクテリオクロロフィルにおいて、Ｒ６が−ＮＲ９Ｒ’９であり、
式中、Ｒ９はＨであり、Ｒ’９は（ｉ）ＳＯ３Ｈ又はそのアルカリ塩によって置換されたＣ１〜Ｃ１０アルキル；又は(ｉｉ)塩基性基−ＮＲＲ’若しくは−ＮＨ−（ＣＨ２）２〜６−ＮＲＲ’で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
ここで各Ｒ及びＲ’は独立に、Ｈ、アミノによって場合により置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル、又はＲ及びＲ’はＮ原子と一緒になって、５〜６員飽和環を形成し、
ここで、該５〜６員飽和環は、場合によりＯ若しくはＮ原子を含み、
場合によりさらなるＮ原子が−（ＣＨ２）２〜６−ＮＨ２によりさらに置換されている；
請求項２に記載の薬理組成物。
【請求項４】
前記光増感剤が、式ＩＩのバクテリオクロロフィルであり、Ｒ６が−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３Ｋ、−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＳＯ３Ｋ、−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ２、−ＮＨ−（ＣＨ２）２−１−モルホリノ、又は−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ピペラジノ−（ＣＨ２）３−ＮＨ２である、請求項３に記載の薬理組成物。
【請求項５】
前記光増感剤が、式ＩＩのクロロフィル又はバクテリオクロロフィルであり、Ｒ１及びＲ６が一緒になって、ＲＧＤペプチド又はＲＧＤペプチドミメチックを含む環状リングを形成する、請求項１に記載の薬理組成物。
【請求項６】
前記ＲＧＤ含有ペプチドがｃ（ＲＧＤｆＫ）（配列番号１）［ここでｆがＤ−Ｐｈｅを示す］、ｃ（ＲＧＤＫ）（配列番号３）、ｃ（ＲＧＤｆ−ｎ（Ｍｅ）Ｋ）（配列番号４）、又はｃ（ＲＧＤｙＫ）（配列番号５）［ここでｙがＤ−Ｔｙｒを示す］又はＣＤＣＲＧＤＣＧＣ（配列番号９）から選択される環状ペプチドであるか、
あるいは前記ＲＧＤ含有ペプチドがヘキサペプチドＧＲＧＤＳＰ（配列番号６）、ヘプタペプチドＧＲＧＤＳＰＫ（配列番号７）、又は２５−ｍｅｒ（ＧＲＧＤＳＰ）４Ｋ（配列番号８）から選択される線状ペプチドである、
請求項１に記載の薬理組成物。
【請求項７】
コンジュゲートが、３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｉｏｃｈｌｏｒｉｎ）１３１−（２−スルホエチル）アミド−１７３−ｃ（ＲＧＤｆＫ）アミドカリウム塩、又はパラジウム３１−オキソ−１５−メトキシカルボニル−メチル−ロドバクテリオクロリン１３１−（２−スルホエチル）アミド−１７３−ｃ（ＲＧＤｆＫ）アミドカリウム塩である、請求項１に記載の薬理組成物。
【請求項８】
癌が、メラノーマ、前立腺、脳、結腸、卵巣、胸部、結腸直腸、頭部及び頸部、胸部癌から生じる胸壁腫瘍、皮膚、肺、食道、及び膀胱の癌及び腫瘍から選択される、原発腫瘍又は壊死領域を有する転移性腫瘍である、請求項１に記載の薬理組成物。
【請求項９】
壊死領域を有する転移性腫瘍が胸部局在性非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）である、請求項９に記載の薬理組成物。
【請求項１０】
腫瘍壊死領域の前記画像化が、
（ａ）壊死領域を有する腫瘍を有することが疑われる対象に、請求項１に記載のコンジュゲートを投与するステップであって、Ｍは２Ｈ、又は金属ＰｄあるいはＺｎであるステップ、及び
（ｂ）対象に照射し、コンジュゲート投与後少なくとも２４〜４８時間の間に１〜８時間の時間間隔で、疑われる領域の蛍光を測定するステップであって、２４〜４８時間後又はそれより長い時間蛍光を示す領域は前記腫瘍の壊死領域の存在を示すステップを含む、
ダイナミック蛍光画像化である、請求項１に記載の薬理組成物。
【請求項１１】
腫瘍壊死領域の診断のための前記画像化が、
（ａ）壊死領域を有する腫瘍を有することが疑われる対象に、請求項１に記載のコンジュゲートを投与するステップであって、Ｍは、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、９９ｍＴｃ、６７Ｇａ、２０１Ｔｌ、１９５Ｐｔ、６０Ｃｏ、１１１Ｉｎ、又は５１Ｃｒからなる群から選択される放射性同位元素であるステップ、及び
（ｂ）コンジュゲート投与後少なくとも２４〜４８時間の間に１〜８時間の時間間隔で、画像化スキャナーにおいて対象をスキャンし、疑われる領域の放射線レベルを測定するステップであって、２４〜４８時間後又はそれより長く放射線を示す領域は前記腫瘍の壊死領域の存在を示すステップを含む、
放射線診断技術である、請求項１に記載の薬理組成物。
【請求項１２】
腫瘍壊死領域の診断のための前記画像化が、
（ａ）壊死領域を有する腫瘍を有することが疑われる対象に、請求項１に記載のコンジュゲートを投与するステップであって、Ｍは、Ｍｎ３＋、Ｃｕ２＋、Ｆｅ３＋、Ｅｕ３＋、Ｇｄ３＋、又はＤｙ３＋から選択される常磁性金属であるステップ、
（ｂ）前記投与前（時間ゼロ）の患者体内の標的関心領域の少なくとも１つのＭＲ画像、及び前記投与の少なくとも２４〜４８時間後、好ましくは９６時間後の第２の時点又はそれを超える時間点の１つ又は複数のＭＲ画像を産生することによって患者に磁気共鳴画像化を施すステップ、及び
（ｃ）データを加工及び分析して前記腫瘍の壊死領域の存在又は非存在を診断するステップを含む、
分子磁気共鳴画像（ＭＲＩ）化である、請求項１に記載の薬理組成物。
【請求項１３】
（ｉ）ダイナミック蛍光画像化に用いられるコンジュゲートが３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｉｏｃｈｌｏｒｉｎ）１３１−（２−スルホエチル）アミド−１７３−ｃ（ＲＧＤｆＫ）アミドカリウム塩、又はパラジウム３１−オキソ−１５−メトキシカルボニル−メチル−ロドバクテリオクロリン１３１−（２−スルホエチル）アミド−１７３−ｃ（ＲＧＤｆＫ）アミドカリウム塩であり、腫瘍が乳腺又は卵巣の腫瘍であり、壊死領域が薬物注射後３〜８日後に視覚化され、
（ｉｉ）前記放射線診断技術がポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）（ここで、Ｍが６４Ｃｕ又は６７Ｃｕである）又は単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＴ）（ここでＭが、９９ｍＴｃ、６７Ｇａ、１９５Ｐｔ、１１１Ｉｎ、５１Ｃｒ、及び６０Ｃｏからなる群から選択される放射性同位元素である）である、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の薬理組成物。
【請求項１４】
局在性の胸部癌、特に非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）のための低侵襲の処置、検出、及び予後のための請求項１に記載の薬理組成物であって、
（ｉ）前記コンジュゲートが、腫瘍壊死領域に特異的に向い、蓄積する、請求項１に記載の、ＲＧＤ含有ペプチド及びバクテリオクロロフィル誘導体のコンジュゲートであり；
（ｉｉ）ＭＲＩ、蛍光、及びＰＥＴ  ＳＣＡＮ方法によって高い精度で患者の腫瘍を検出予知し、腫瘍マージンの画定し；そして
（ｉｉｉ）胸部温存及び再建を可能にする局在性の壊死領域が腫瘍標的光線力学的治療（ＰＤＴ）により治療される；
薬理組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍学の分野におけるものであり、腫瘍ターゲティング光線力学的画像化による腫瘍の壊死領域の検出、及び光増感剤、特に、クロロフィル及びバクテリオクロロフィル誘導体のＲＧＤモチーフ又はＲＧＤペプチドミメチックを含むペプチドとのコンジュゲートを用いた、腫瘍標的光線力学的治療による前記腫瘍の処置に関する。
【０００２】
（定義及び略語）
Ｂｃｈｌ  ａ：バクテリオクロロフィルａ：第５の同素環、中心Ｍｇ原子、１７３位にフィチル基又はゲラニルゲラニル基、１３２位にＣＯＯＣＨ３基、１３２位にＨ原子、２，７，１２，１８位にメチル基、３位にアセチル基、及び８位にエチル基を有する五環７，８，１７，１８−テトラヒドロポルフィリン、本明細書における化合物１；Ｂｐｈｅ：バクテリオフェオフィチンａ（中心Ｍｇが２つのＨ原子によって置換されているＢｃｈｌ）；Ｂｐｈｅｉｄ：バクテリオフェオフォーバイドａ（中心の金属原子のないＢｐｈｅに由来するＣ−１７２−遊離カルボン酸）；Ｃｈｌ：クロロフィル；ロドバクテリオクロリン（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｉｏｃｈｌｏｒｉｎ）：１７位に−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ基、１３位に−ＣＯＯＨ基、２，７，１２，８位にメチル基、並びに３位及び８位にエチル基を有する、四環７，８，１７，１８−テトラヒドロポルフィリン；Ｐｄ−Ｂｐｈｅｉｄ：ｐｄ−バクテリオフェオフォーバイドａ；ＥＣ：内皮細胞；ＥＣＭ：細胞外マトリックス；ＮＩＲ：近赤外線；ＰＤＴ：光線力学的治療；ＲＧＤ−４Ｃ：環状ノナペプチドＣＤＣＲＧＤＣＦＣ−ＮＨ２；ＲＯＳ：反応性酸素種。
【０００３】
本明細書を通して、バクテリオクロロフィル誘導体のＩＵＰＡＣナンバリングが用いられる。この命名法を用いると、天然のバクテリオクロロフィルは、１３２位及び１７２位に２つのカルボン酸エステルを保有するが、これらは１３３位及び１７３位でエステル化されている。
【背景技術】
【０００４】
原発及び転移の腫瘍の壊死及び低酸素症は、癌患者における腫瘍の攻撃性及び劣悪な予後に強く相関している。あるサイズに到達する固形腫瘍はその酸素供給を超えて成長し、低酸素症、及び最終的に壊死性になる。栄養用の血管から７０μｍを超えて配置された腫瘍領域において間質内の酸素圧は低下し、１５０〜１８０μｍの距離を越えると細胞はほぼ無酸素になる（Ｖａｕｐｅｌら、２００１年）。壊死は、血管の崩壊、及び血管新生の速度よりも早い急速な腫瘍細胞の増殖によって引き起こされる慢性の虚血の結果であると考えられている（Ｌｅｅｋら、１９９９年）。
【０００５】
固形腫瘍における壊死領域は、形態学的な修飾を受ける。最初、もとの構造は基本的に保存されており、壊死細胞はその全体的な形状を維持しているが、高度に好酸性になる。しばらくすると、このパターンは液化壊死によって置き換えられ、液化壊死では細胞構造は分解される（Ｌｅｅｋら、１９９９年）。
【０００６】
壊死も、低酸素症も、劣悪な予後に対する指標として十分に確立されている。上部尿路の移行上皮癌、悪性中皮腫、及び腎細胞癌（ＲＣＣ）において、癌の結果の独立した前兆として、及び予後目的の非常に強力なツールとして、壊死が示唆されていた（Ｅｄｗａｒｄｓら、２００３年、Ｓｅｎｇｕｐｔａら、２００５年、Ｌｅｅら、２００７年）。
【０００７】
胸部の浸潤癌において、壊死は、高い血管密度及び血管新生、高レベルの限局性マクロファージ浸潤、並びに患者の生存の低下に相関していた（Ｋａｔｏら、１９９７年、Ｌｅｅら、１９９７年、Ｌｅｅｋら、１９９９年、Ｔｏｍｅｓら、２００３年）。中心壊死は、浸潤性胸部癌の一般的な特徴であり、劣悪な結果及び腫瘍の攻撃性に関連していた。マクロファージは、走化性因子によって壊死性腫瘍に結合し、低酸素の、又は死滅しつつある腫瘍細胞によって放出されることが示された（Ｌｅｅｋら、１９９９年）。非コメド型（非浸潤性）ＤＣＩＳに対するコメド型（浸潤性）非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）において、管腔における広い壊死領域が観察された（Ｃｕｔｕｌｉら、２００２年）。最高３６０μｍの直径の、ＤＣＩＳ病変の中心の壊死及び低酸素症は、壊死細胞の性質及び挙動において著しい生物学的相違を示した。このように、管における壊死の存在又は非存在は、ＤＣＩＳ分類に対する可能な判定基準であることが見出された（Ｂｕｓｓｏｌａｔｉら、２０００年）。
【０００８】
大多数のこのタイプの腫瘍における壊死は低酸素症に付随することが示された（Ｔｏｍｅｓら、２００３年）。低酸素症及び無酸素症は、腫瘍細胞を酸化ストレスに曝す。長期間の低酸素状態は、突然変異の割合を増大し、腫瘍の進行を加速し、血管新生及び転移の可能性を増大し、増殖促進性のシグナリング経路を活性化することが示された。酸化ストレスに対する適応により、腫瘍細胞がある種の治療モダリティーに耐性になることが多い（Ｂｒｏｗｎら、２００１年）。
【０００９】
壊死と低酸素症の間の相関は非常によく確立されているが、壊死に到達していない低酸素状態、又は急性若しくは重症の低酸素症を必ずしも反映しない壊死が存在し得る（Ｄｅｗｈｉｒｓｔ、１９９８年）。その中には、低酸素症に対するマーカー遺伝子がいくつか存在する：低酸素誘導因子１（ＨＩＦ１）、グルコーストランスポーター１、及び炭酸脱水酵素ＩＸ。３つのマーカー全てを検出するだけで壊死の分類が確実になり（Ｔｏｍｅｓら、２００３年）、遺伝子発現によって壊死として領域を同定するのが非常に複雑になっている。
【００１０】
壊死及び低酸素状態は、癌治療において主要な問題を作り出すことが知られている。放射線の攻撃の促進が劣り、腫瘍体積中に最終的に存在し得る幹細胞は処置に対して良好に反応しないので、低酸素の腫瘍領域は放射線治療に対して比較的耐性であり、腫瘍の再増殖がもたらされる（Ｂｒｏｗｎら、１９９８年、Ｄｅａｎら、２００５年）。殆どの化学療法試薬は循環細胞との相互作用により細胞死を課すので、低酸素症による細胞停止は従来の化学療法に対する耐性をもたらし、非増殖又は増殖の遅い細胞は無傷のままである（Ｔａｎｎｏｃｋ、１９７８年）。さらに、低酸素状態は、通常、薬物の性質を変化させることがある酸性の環境を作り出し、薬物の活性を低下させる（Ｔａｎｎｏｃｋら、１９８９年）。
【００１１】
固形腫瘍の化学療法のさらに問題となる局面の一つは、治療薬を腫瘍中に、特に低酸素症及び壊死の領域に輸送することに関する。腫瘍は、通常、血流が不均一で血管間距離が大きい、不規則で漏出性の微小血管を含んでいる。適当なリンパ性の排管が非存在であり、間質圧が高いことに加えて、これらの特徴により、拡散は腫瘍における栄養及び薬物の血管外輸送の最も重要なメカニズムになっている。しかし、不規則的な血管新生のため、腫瘍細胞の多くは正常組織における細胞よりも毛細血管からの距離が大きく、細胞部位の抗腫瘍薬の濃度が不十分であることに反映される。さらに、リンパ性の排管がないことによる間質液圧の増大により、対流の取り込みは低減され、薬物の、特に巨大分子の薬物の、腫瘍細胞中への分配はさらに阻害される（Ｍｉｎｃｈｉｎｔｏｎら、２００６年）。
【００１２】
したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍内の低酸素症及び壊死の領域を検出する能力は非常に重要である。低酸素症の腫瘍領域を知ることは、処置前若しくは処置間の腫瘍の酸素付加を改善することによって、又は低酸素症を活用する戦略を用いることによってのいずれかで、正しい処置を選択する助けとなり得る（Ｗｅｉｎｍａｎｎら、２００４年）。この取り組みを用いて、２−シクロプロピル−インドロキノン、ＡＱ４Ｎ、チラパザミン（ＴＰＺ）、及びＰＲ−１０４など、低酸素症が活性化する細胞毒を適用すると、処置の結果を改善する助けとなり得る（Ｂｒｏｗｎら、２００４年、Ｌｅｅら、２００７年、Ｐａｔｔｅｒｓｏｎら、２００７年）。
【００１３】
壊死及び低酸素症の同定には組織病理学及び免疫組織化学が通常用いられるが、これらは侵襲性であり、インサイチューで検出することができない。インサイチュー法には、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）（Ｋａｍｅｌら、２００３年、Ｍｅｔｚら、２００３年）、血液酸素化レベル依存−ＭＲＩ（Ｋｅｎｎａｎら、１９９７年）、ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）（Ｌｅｈｔｉｏら、２００４年）、及び拡散強調ＭＲＩ（Ｌａｎｇら、１９９８年）が含まれる。
【００１４】
ＭＲＩ用の壊死結合性造影剤（ＮＡＣＡ）は、ポルフィリンベース及び非ポルフィリンベースの薬剤に分類することができる。最も知られているポルフィリンベースのＮＡＣＡの１つは、主に壊死領域の境界に特異的な壊死の蓄積を示すガドフリン（ｇａｄｏｐｈｒｉｎ）−２である。蓄積のメカニズムは、血清アルブミン（ＳＡ）の輸送に基づくと示唆されていたが、最近の研究はこの取組みを疑問視していた（Ｈｏｆｍａｎｎら、１９９９年、Ｎｉら、２００５年）。
【００１５】
最も悪性の細胞は、血管の非存在下で臨床的に検出可能な腫瘍塊に増殖することができない。こういうわけで、あるサイズに到達した腫瘍（約２〜３ｍｍ３）は、その増殖を支持するために血管新生性の表現型に切り換えなければならない。血管新生性の表現型への切換えは、血管新生因子及び血管新生阻害剤の発現の不均衡を表し得る。血管新生因子の過剰発現及び血管新生阻害剤の下方制御は、両方とも必要であり、新たな血管の増殖を誘発するのに十分であり、これらのプロセスは２つとも通常同時に生じて、腫瘍の血管新生のスイッチを入れる（Ｃａｏ、２００５年）。
【００１６】
腫瘍における血管を示す生化学的特徴は、ある種のインテグリンなどの血管新生関連分子を含むことがある。細胞接着レセプターのインテグリンファミリーは、細胞外マトリックス中の又は細胞表面上の糖タンパク質リガンドを認識する別々の２４αβヘテロ２量体を含んでいる。α５β１、α８β１、αＩＩｂβ３、αＶβ３、αＶβ５、αＶβ６、及びαＶβ８を含めたインテグリンファミリーの多くのメンバーは、これらのリガンド内のＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）モチーフを認識する。これらのリガンドは、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、ビトロネクチン、フォンウィルブランド因子、及び多くの他の大型糖タンパク質を含んでいる（Ｔａｋａｇｉ、２００４年）。それゆえ、ＲＧＤモチーフを含む分子は、原発腫瘍病変、壊死領域、及び標的治療の選択的な取込み並びにその後の画像化及び検出に対する新たな機会を提供することが示唆されている。この分野の調査はますます注目を集めている。画像化用にＲＧＤ標識した成分を用いる報告が多く存在する（Ｔｅｍｍｉｎｇら、２００５年）。文献において報告されている主な欠点は、４〜５ｍｍ未満の腫瘍の部位のレポーティングエレメント（ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔ）の濃度が不十分であることである。こういうわけで、ＲＧＤ標的画像化の使用は主にＰＥＴスキャンに限定され、ＰＥＴスキャンはより感度の高い方法である。
【００１７】
腫瘍の増殖、転移の形成、腫瘍−宿主の相互関係、及び血管新生を理解するには、それらの個々のレベルにおいてさえも腫瘍細胞の容易な追跡を可能にする腫瘍モデルが必要とされる。最も意義深い腫瘍の生物学的パラメータを直接測定するのに用いられた以前の方法は、侵襲性のエンドポイント手順によって実現可能であったにすぎない（Ｌｙｏｎｓ、２００５年）。このような方法の大多数は、速度が遅く、侵襲性であり、必ずしも感度の高い取り組みではない、組織病理学的試験又は免疫組織化学を伴う（Ｙａｎｇら、２０００年）。したがって、腫瘍組織を直接視覚化することができ、非侵襲性であり、細胞レベル及び分子レベルの両方で腫瘍関連のパラメータの測定を可能にする新たな方法を導入することが必要であった。
【００１８】
近年において、いくつかの非侵襲性の方法：ＭＲＩ及び分光法、ＰＥＴ、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法、及びコンピュータ断層撮影が開発されている（Ｌｙｏｎｓ、２００５年）。
【００１９】
トランスジーンベースの画像化方法がいくつか存在する。これらの方法により、優れた腫瘍特異性、生存モデル動物における全身画像化、及び転移の検出で、広範囲の生物学的パラメータの非侵襲性の測定が可能になっている。これらの方法の２つが、生物発光画像法、及び蛍光画像化である。
【００２０】
光学的生物発光は３つの成分：酵素ルシフェラーゼ、基質ルシフェリン、及びアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）をベースとする。この方法では、光の発光を産生するのに光の励起は必要とされない。しかし、これらの成分の１つが非存在であると、検出は不可能である。この方法は、シグナル／ノイズ値が良好であるので、高スループットで細胞生存性又は細胞機能をモニターするのが可能となる（Ｌｙｏｎｓ、２００５年）。ルシフェラーゼ／ルシフェリン法の主な不利点は解剖学的及び画像解像度が低く、したがって麻酔した動物から画像を形成するのに十分な光子を収集するのに相当量の時間を必要とすることである。さらに、組織深度が増大し、基質の外因性の送達が必要とされると、ｉｎ  ｖｉｖｏの光の放出が減弱する（Ｙａｎｇら、２０００年、Ｌｙｏｎｓ、２００５年）。さらに、酵素活性にはＡＴＰが必要とされるので、ｅｘ  ｖｉｖｏ実験を行うのは困難である。重要なことは、この方法はその定量値を低減する主観的なパラメータ表示を伴うことである。
【００２１】
光学的蛍光画像化によって腫瘍の進行をモニターするための別の方法は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及び赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）などの安定した蛍光タンパク質を腫瘍細胞にトランスフェクトすることに基づくものである。この方法では、発光が検出され得る前に外部励起が必要とされる。この方法の主な不利点は、（１）励起及び発光の光線は組織の深度の増大とともに減弱しがちであり、（２）非標識の細胞の自己蛍光はノイズを増大することである（Ｌｙｏｎ、２００５年）。主な利点には、複数のレポーターの波長により多重画像化が可能になる；新鮮組織分析などの分析方法に対するある範囲のｅｘ  ｖｉｖｏの方法との適合性が高い；生存組織における視覚化に一義的に適合させる画像化に対する調製手段が必要ではない；方法が外部的であり、非侵襲的である；方法は、全身の画像をもたらすことができるが原発病変及び転移から抽出された単一細胞の画像ももたらすこともできる、内部的に増殖する腫瘍及び移植された動物における転移の、リアルタイムの蛍光の光学画像化を提供することが含まれる（Ｙａｎｇら、２０００年、Ｌｙｏｎｓ、２００５年）。全身の画像化は、腫瘍の発生を理解するのに最も必要とされるツールの１つである。このように、腫瘍細胞をＧＦＰ又はＲＦＰで遺伝子的に標識することによって、原発腫瘍及び転移腫瘍の外部的な全身画像化が実現され得る（Ｙａｎｇら、２０００年）。
【００２２】
蛍光のタグ付けは、ｉｎ  ｖｉｖｏ、新鮮組織、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏの検出に適する。蛍光タンパク質を発現する腫瘍細胞の使用により、生存動物の画像化及び様々な時間点における腫瘍の進行のフォローアップが可能になっている。ＲＦＰはＧＦＰよりも長波長の発光を有し、したがって高感度、及び顕微鏡的な腫瘍の増殖の解像が可能になっている（ＧＦＰ励起波長−４８９ｎｍ、発光波長−５０８ｎｍ、ＲＦＰ励起波長−５５８ｎｍ、発光波長−５８３ｎｍ）。
【００２３】
非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）は、悪性に見え、乳管の管腔内に蓄積する細胞のクローン増殖を含み、隣接する胸部の間質中への、及び上皮基底膜を越えた侵襲の証拠はない。早期に処置しなければ、非侵襲性のＤＣＩＳ病変が、侵襲性の生命を脅かす疾患に形質転換する機会は相当に存在する。マンモグラフィーが広範囲に用いられた後は、早期にＤＣＩＳと診断される患者の数が劇的に増大し、推奨される処置モダリティーはそれに従って乳房切除術（治癒率ほぼ１００％）から胸部温存（ＢＣ）手術（ＢＣＳ）、例えば、ＲＴ及び補助的な内分泌療法を場合により伴う、乳腺腫瘍摘出術又は最小侵襲胸部手術に向って推移している（Ｋｅｐｐｌｅら、２００４年）。しかし、同側性（同じ乳房）又は対側性（他の乳房）両方のＢＣＳ後の再発率は、ＲＴを伴う場合でも、特に≦４０歳の患者では乳房切除術後よりも有意に高いことが最近見出された（退縮率２５〜３５％、Ｂｉｊｋｅｒ  Ｎら、２００６年、Ｃｕｔｕｌｉら、２００２年）。さらに、多巣性の病変は部分的切開に対して困難をきたし、腫瘍の退縮を完全にするのに不可欠であることが見出された境界を持続的に含むことに対して同じことが当てはまる（Ｃｅｌｌｉｎｉら、２００５年）。さらに、その後にＲＴが続く乳腺腫瘍摘出術の、身体的及び心理学的負担、並びに可能性のある美容上の結果は意義深い。これらの欠点のため、今日のＤＣＩＳの処置及びマネージメントは、胸部癌治療における議論の中心となる問題になっており、処置及び予後の新たな、及び／又は補完的なモダリティーの探求を活気づけている。
【００２４】
ＤＣＩＳは、多様な臨床症状、組織学、細胞特性、及び生物学的潜在性を有する悪性の、生物学的に不均一な形態である。これは、コメド型（侵襲性）及び非コメド型（非侵襲性）の癌に分類されており、コメド型はグレードが高く、潜在的により侵襲性のサブタイプであり、特徴的に管の管腔中に大型の壊死領域及び著明な細胞学的非定型性を有する細胞を含む。低グレードから中等度グレードのＤＣＩＳを有する患者の約３分の２は、異なる病巣間に１ｃｍに到達することがある間隙を有する、多巣性の、同側性の疾患を有すると考えられる（Ｃｕｔｕｌｉら、２００２年）。高グレードの病変は連続性の傾向があり、間隙は５ｍｍより小さい（Ｃｅｌｌｉｎｉら、２００５年）。
【００２５】
非侵襲性のＤＣＩＳの、侵襲性の胸部腫瘍への自然的な発生は１５〜２０年かかり、１４から６０パーセントの女性がそう診断される（Ｂｕｒｓｔｅｉｎら、２００４年）。実際、ＤＣＩＳは、侵襲性の胸部癌を規定する多くの分子イベントがすでに存在する、胸部癌の発生の段階を代表すると思われる（Ｃｕｔｕｌｉら、２００２年、Ｈｏｌｌａｎｄら、１９９０年）。とりわけ、未処置のままである場合、約３０％の低グレードの病変が侵襲性の癌に発達する（Ｓａｎｄｅｒｓら、２００５年）。直径２．５ｃｍを超える病変は、０．１ｍｍを超えないものであり得る潜在性の微小浸潤腫瘍を頻繁に伴う。腫瘍境界の関与により、重要な予後のマーカーがもたらされる。切除の近く（１ｍｍ未満）又はポジティブの境界、高グレード及び／又はコメド型の壊死領域が、再発に対する高リスクに関連する。
【００２６】
多くの他の癌におけるのと同様、胸部癌における新たな血管の形成（血管新生）が、局所の腫瘍の進行及び遠隔転移の発生の両方において中心的役割を果たしている（Ｂｏｅｈｍ−Ｖｉｓｗａｎａｔｈａｎ、２０００年、Ｋｉｅｒａｎら、２００３年）。周囲の正常組織に比べて著しく高い微小血管の密度（ＭＶＤ）が、ＤＣＩＳ組織において見出された（Ｇｕｉｄｉら、１９９４年、Ｇｕｉｄｉら、１９９７年、Ｇｕｉｎｅｂｒｅｔｉｅｒｅら、１９９４年）。血管密度が最も高い線維嚢胞性の病変は、より高リスクの胸部癌に関連する（Ｇｕｉｄｉら、１９９４年、Ｇｕｉｄｉら、１９９７年、Ｇｕｉｎｅｂｒｅｔｉｅｒｅら、１９９４年）。高悪性度のＤＣＩＳ病変の組織病理学的試験は、ＭＶＤ及び血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）発現の増大に関連していた（Ｇｕｉｄｉら、１９９７年、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、２００５年）。臨床病理学的相関によっても、胸部癌の進行における血管新生の主要な役割が確認され、血管新生はＤＣＩＳ治療及び予後に対する魅力的な標的となっている（Ｆｏｌｋｍａｎ、１９９７年、Ｋｒｉｐｐｌら、２００３年、Ｒｅｌｆら、１９９７年）。血管の吸収、腸重積による増殖（Ｐａｔａｎら、１９９６年）、血管の擬態、及び脈管形成は、古典的血管形成に対する腫瘍の依存を低減し得る、自然発生的なプロセスである。とりわけ重要であるのは、炎症性の胸部癌は、見たところ癌細胞が内皮細胞に結合することができないので、脈管形成に殆ど完全に依存するという所見である。
【００２７】
ＤＣＩＳが高密度の血管床に決定的に依存していることで、抗血管新生治療（新しい血管の形成の阻害）及び抗血管治療（既存の血管の閉塞／破壊）（Ｓｈｉｍｉｚｕら、２００５年、Ｔｈｏｒｐｅ、２００４年）が局在性のＢＣ治療に対する魅力的な選択肢となっている（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、２００５年、Ｆｏｌｋｍａｎ、１９９６年）。実際、ベバシズマブ（抗−ＶＥＧＦ−Ａ受容体抗体）及びＳＵ０１１２４８（ＶＥＧＦ受容体チロシンの阻害物質）などの抗血管新生薬は第ＩＩ相の臨床試験中である。興味深いことに、タモキシフェンも抗血管新生活性を有することが見出された。それでも、ますます多くの証拠が抗血管新生の取組みにおける欠陥を指摘している。これらは、慢性処置に対する必要性、「耐性対耐性理論」（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、２００５年、Ｓｔｒｅｕｂｅｌら、２００４年）、及び薬物動態学的耐性の部分的な失敗を含んでいる。これらのハードルに続いて、抗血管の取組みが現在、より有望であると思われ、慢性の処置を必要性としないで腫瘍全体の根絶をもたらすことが期待されている（Ｆｏｌｋｍａｎ、２００４年）。現在出現しつつある、血管標的処置に対する有望な手段は、光線力学的治療（ＶＴＰ）によるものである。
【００２８】
同様に、好適な緩和能を有するターゲティング常磁性金属として、ポジトロン放出性の化学的実体（例えば、６４Ｃｕ）、又はＤＣＩＳの厚い血管床に対する蛍光プローブが、以下に説明するように関連の病変の検出、境界の決定、及び予後に対する新たな手段を開くはずである。胸部癌病変の蛍光の検出は、深さ１０ｍｍまで有用であることが示された（Ｂｒｉｔｔｏｎ、２００６年）。造影剤としてＧｄを有するダイナミックＭＲＩは腫瘍の脈管構造の漏出性の増大に基づいており、胸部における腫瘍の局在化に現在用いられている（Ｒａｎｋｉｎ、２０００年）。しかし、現在のＭＲＩの使用は、短時間存在するが腫瘍組織によって選択的に取り込まれない造影剤の、利用可能な短い積分時間によって制限されている。
【００２９】
光線力学的治療（ＰＤＴ）は、選択された処置部位に、細胞毒性の反応性酸素種（ＲＯＳ）の群発を産生する。これは存続時間が短いので、ＲＯＳの毒性は照射部位に限定される。ＰＤＴは典型的に５つのステップからなる：１．光増感剤の静脈内（ＩＶ）投与、２．望ましい濃度の光増感剤が標的組織に到達するのを可能にする時間、３．深部組織照射用の薄型の（直径０．４ｍｍ又はそれ未満）光ファイバーによる高輝度レーザー光（連続照射に対して最高１Ｗ）での、経皮又は組織内による標的組織の照射と、その結果の細胞毒性ＲＯＳの局所的産生、４．腫瘍壊死の発生及び腫瘍の根絶、５．組織の再建及び治癒。
【００３０】
血管標的ＰＤＴ（ＶＴＰ）は、増感剤投与直後の組織照射によって、又は循環から血管外遊出しない増感剤を用いることによってのいずれかで達成することができる、処置組織の血管内のＲＯＳの産生を狙いとしている。本明細書において「Ｂｃｈｌ誘導体」又は「ＢｃｈｌＤ」と呼ぶ、いく世代かのバクテリオクロロフィル増感剤が、本発明者らの実験室において開発されている。合成された化合物（Ｒｏｓｅｎｂａｃｈ−Ｂｅｌｋｉｎら、１９９６年、ＵＳ５，６５０，２９２）は、対象の組織中への深部の光の透過を可能にするＮＩＲ（７５０〜７６５ｎｍ）において非常に強力な吸収を有し、高フルエンス率（２０ｍＷ〜１Ｗ）の円柱状ファイバーの周囲４ｃｍまでの処置直径を保証している。照射時、局所的に高濃度のＲＯＳ（ＯＨ・及びＯ２−ラジカル）が、循環するＢｃｈｌＤによって腫瘍中及び近傍において産生され、血液凝固及び腫瘍血管の穿孔をもたらし、その後照射数分以内に腫瘍血管新生は完全に停止する。いくつかのＢｃｈｌ誘導体で、内皮細胞の直接的な中毒が観察された（Ｇｒｏｓｓら、２００３年、Ｍａｚｏｒら、２００５年）。現在調査中であるという理由で、腫瘍血管の反応は、周囲の正常組織における血管の反応に比べて著しく迅速且つ強烈である。処置の効力は、高い治癒率（動物生存６０〜９０％）をもたらす（Ｍａｚｏｒら、２００５年）。重要なことに、ＩＶ注射した増感剤は、処置動物の循環から速やかに排除され（Ｔ１／２は分単位から時間単位）（Ｍａｚｏｒら、２００５年）、長時間の皮膚毒性を回避し、必要な場合には処置の繰返しを可能にしている。患者における局在性の前立腺癌に対する第ＩＩ相の臨床試験では、放射線治療が失敗した場合（Ｗｅｅｒｓｉｎｋら、２００５年）、ＢｃｈｌＤベースのＶＴＰは、概ね、５０〜６０％の処置患者の腫瘍病変の上首尾の根絶をもたらし、組織の再建をもたらしている。動物モデル及びヒト両方における第２の処置（第ＩＩ／ＩＩＩ相臨床試験）は、（薬物及び光の投与量に応じて）１セッションあたり同様又はより高い治癒率をもたらし、２〜３セッション後、約９０％の期待される全体の成功率を増大すると思われる。重要なことに、１セッションあたりの著しく高い治癒率が、適用した増感剤の投与量が高い動物試験において見出された。
【００３１】
腫瘍における光線力学的治療（ＰＤＴ）は、光増感剤の投与及び局所的な光線の送達の組合せを含み、これらは両方とも単独では無害の物質であるが、分子酸素の存在下で、細胞を排除することができる細胞毒性の活性酸素種（ＲＯＳ）を生成することができる。バイナリーの処置モダリティーであるので、ＰＤＴはより大きな特異性を可能にし、通常用いられる化学療法又は放射線療法と比べた場合、より選択的ではあるが破壊性の低くない潜在性を有する（Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙら、１９９８年）。
【００３２】
ＰＤＴにおける増感剤として新規なバクテリオクロロフィル（Ｂｃｈｌ）誘導体の適用は、近年、本発明者らによって（Ｚｉｌｂｅｒｓｔｅｉｎら、２００１年、Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒら、２００２年、Ｇｒｏｓｓら、１９９７年、Ｚｉｌｂｅｒｓｔｅｉｎら、１９９７年、Ｒｏｓｅｎｂａｃｈ−Ｂｅｌｋｉｎら、１９９６年、Ｇｒｏｓｓら、２００３年ａ、Ｋｏｕｄｉｎｏｖａら、２００３年、Ｐｒｅｉｓｅら、２００３年、Ｇｒｏｓｓら、２００３年ｂ）また、特許公報ＵＳ５，７２６，１６９、ＵＳ５，６５０，２９２、ＵＳ５，９５５，５８５、ＵＳ６，１４７，１９５、ＵＳ６，７４０，６３７、ＵＳ６，３３３，３１９、ＵＳ６，５６９，８４６、ＵＳ７，０４５，１１７、ＤＥ４１  ２１  ８７６、ＥＰ  １  ２４６  ８２６、ＷＯ２００４／０４５４９２、ＷＯ２００５／１２０５７３において報告されている。これらは、Ｂｃｈｌ誘導体のスペクトル、光物理学、及び光化学により、現在ＰＤＴにおいて用いられている他の増感剤を凌ぐ明らかな長所を有する、最適な集光性の分子となっている。これらＢｃｈｌ誘導体は、殆ど極性であり、循環中に極めて短時間とどまり、実際に他の組織中への血管外遊出はない（Ｂｒａｎｄｉｓ、２００３年、Ｍａｚｏｒら、２００５年）。したがって、これらの化合物は、短時間の（５〜１０分）光との静脈内の一時的な遭遇、及びＰＤＴが産生する細胞毒性ＲＯＳに対する腫瘍血管の高い感受性に頼る血管標的ＰＤＴ（ＶＴＰ）に対する優れた候補物質である。
【００３３】
本発明者らのグループが行った最近の研究は、一次光感作は静脈内であり、虚血性閉塞の急速な発生及び照射期間内の静止があることを示していた。このプロセスは、光化学的に誘発する脂質の過酸化（ＬＰＯ）及び腫瘍の脈管構造に主に限局される早期の内皮細胞死も促進する（Ｋｏｕｄｉｎｏｖａら、２００３年）。低酸素症の発生と一緒のフリーラジカル連鎖反応の光非依存的な進行により、ＬＰＯ及び細胞死は脈管のコンパートメントを越えて広がって、ＰＤＴ約２４時間後に腫瘍の完全な壊死が達成されるまで腫瘍の間質全体を網羅する。したがって、ＰＤＴの一次作用は血液供給を阻止し、二次的に、腫瘍の根絶とともに完了する一連の分子的及び病態生理学的イベントを開始する低酸素症を誘発する。重要なことは、この方法は、産生されたＲＯＳに対する正常血管と腫瘍血管の間の反応の相違によることである。
【００３４】
その全文が本明細書に完全に開示されるように参照によって本明細書に援用される、同出願者の国際出願第ＷＯ２００８／０２３３７８号は、ポルフィリン、クロロフィル、及びバクテリオクロロフィル（Ｂｃｈｌ）誘導体の、ＲＧＤモチーフを含むペプチドとの、又はＲＧＤペプチドミメチックとの新規なコンジュゲート、並びにｉｎ  ｖｉｖｏの光線力学的治療の方法、及び腫瘍、及び加齢黄斑変性などの様々な血管疾患の診断におけるこれらの使用を開示している。特に、Ｂｃｈｌ誘導体ｃ（ＲＧＤｆＫ）−Ｐｄ−ＭＬＴ（化合物２４）は、原発腫瘍の異種移植片において最高４〜８μＭの蓄積を示し、シグナル及び良好なシグナル対ノイズ比の蓄積を可能にする長時間、腫瘍部位にとどまる。
【００３５】
蛍光のタグ付けは、ｉｎ  ｖｉｖｏ、新鮮組織、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏの検出に適する。ｃ（ＲＧＤｆＫ）−Ｐｄ−ＭＬＴは、検出することができる近赤外線（ＮＩＲ）において固有の蛍光を有する。ｃ（ＲＧＤｆＫ）−２Ｈ−ＭＬＴは３桁高い発光能力を有し、したがって標的画像化に対するより優れた候補であり得る。この研究において、本発明者らは、これらの分子は、ヒト胸部腺癌モデルにおける腫瘍境界及び壊死を正確に検出する可能性を開くことを示した。腫瘍境界及び壊死の検出は、腫瘍処置における、最新の、２つの最も取り組みがいのある問題を提示する。さらに、両者とも、処置後の腫瘍の再増殖の誠実な前兆である。したがって、将来、臨床的に適用された場合、前述のＲＧＤ誘導体は、手術台上で腫瘍及び壊死を検出するのに適することが期待される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００３６】
本発明に従って、先に言及したＷＯ２００８／０２３３７８に記載するＲＧＤ−（バクテリオ）クロロフィルコンジュゲートは、腫瘍の非壊死領域におけるよりもずっと長く、腫瘍の壊死領域に向い、蓄積することが、現在見出されている。
【００３７】
したがって、本発明は、低侵襲性の腫瘍標的画像化、腫瘍標的光線力学的治療、及び／又は壊死性腫瘍のオンライン予後のための、前記ＲＧＤ−バクテリオクロロフィル及びＲＧＤ−クロロフィルコンジュゲートの使用、並びにそのための方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を有する腫瘍細胞系のトランスフェクトに用いるプラスミドを示す図である。１Ａ：ｐＤｓＲｅｄ２−Ｎ１プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）、１Ｂ：ｐＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ−Ｈｙｇ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）、１Ｃ：修飾したｐＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ−Ｈｙｇ−Ｃ１
【図２】３秒曝露後、蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、倍率×１０）によって検出されたトランスフェクトした図１の細胞の蛍光クローンを示す図である。図２Ａ：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＲＦＰクローン１（Ｇ４１８に耐性）。図２Ｂ：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＲＦＰクローン３（ハイグロマイシンに耐性）。
【図３】切除した腫瘍の画像、及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ腫瘍断面の組織学的分析（Ｈ＆Ｅ染色）を示す図である。図３Ａ：大型腫瘍（約１ｃｍ３）。図３Ｂ：小型腫瘍（約０．５ｃｍ３）（ＮＤ−壊死領域、ＮＤ−生存領域）。
【図４】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ同所性腫瘍（腫瘍サイズ約１ｃｍ３）における、本明細書以下の化合物１３の蓄積を示す図である。マウスに化合物１３を注射した。薬物注射１５分後から２４時間後に画像を撮影した。図４Ａ（上パネル）：赤色蛍光画像化。図４Ｂ（下パネル）：ＮＩＲ蛍光画像化。
【図５】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ同所性腫瘍（腫瘍サイズ約１ｃｍ３）における、化合物１３の蓄積を示す図である。マウスに化合物１３を注射した。薬物注射１日後から７日後まで画像を撮影した。図５Ａ（上パネル）：赤色蛍光画像化。図５Ｂ（下パネル）：ＮＩＲ蛍光画像化。
【図６】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ同所性腫瘍（腫瘍サイズ約０．５ｃｍ３）における、化合物１３の蓄積を示す図である。マウスに化合物１３を注射した。薬物注射２０分後から２４時間後まで画像を撮影した。図６Ａ（上パネル）：赤色蛍光画像化。図６Ｂ（下パネル）：ＮＩＲ蛍光画像化。
【図７】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ同所性腫瘍（腫瘍サイズ約０．５ｃｍ３）における、化合物１３の蓄積を示す図である。マウスに化合物１３を注射した。薬物注射１日後から３日後まで画像を撮影した。図７Ａ（上パネル）：赤色蛍光画像化。図７Ｂ（下パネル）：ＮＩＲ蛍光画像化。
【図８】腫瘍対側枝側における、化合物１３の蛍光シグナル測定を示すグラフである。光子／秒／ｃｍ２における蛍光シグナルを、９匹の動物において、腫瘍及び側枝側の両方に対して測定した。結果を、化合物１３の注射１５分後から２１６時間後まで撮影した。各時間点における全ての動物に対する平均の結果、及び腫瘍と側枝側の間の蛍光の比を示す。
【図９】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ同所性腫瘍（腫瘍サイズ約１ｃｍ３）における、化合物２４の蓄積を示す図である。マウスに化合物２４を注射した。薬物注射１時間後から２４時間後まで画像を撮影した。図９Ａ（上パネル）：赤色蛍光画像化。図９Ｂ（下パネル）：ＮＩＲ蛍光画像化。
【図１０】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ同所性腫瘍（腫瘍サイズ約１ｃｍ３）における、化合物２４の蓄積を示す図である。マウスに化合物２４を注射し、薬物注射１日後から７日後まで画像を撮影した。図１０Ａ（上パネル）：赤色蛍光画像化。図１０Ｂ（下パネル）：ＮＩＲ蛍光画像化。
【図１１】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ同所性腫瘍（腫瘍サイズ約０．５ｃｍ３）における、化合物２４の蓄積を示す図である。マウスに化合物２４を注射し、薬物注射２０分後から２４時間後まで画像を撮影した。図１１Ａ（上パネル）：赤色蛍光画像化。図１１Ｂ（下パネル）：ＮＩＲ蛍光画像化。
【図１２】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ同所性腫瘍（腫瘍サイズ約０．５ｃｍ３）における、化合物２４の蓄積を示す図である。マウスに化合物２４を注射し、薬物注射１日後から２日後まで画像を撮影した。図１２Ａ（上パネル）：赤色蛍光画像化。図１２Ｂ（下パネル）：ＮＩＲ蛍光画像化。
【図１３】ＭＬＳ−ｍＢａｎａｎａ同所性腫瘍（腫瘍サイズ約１ｃｍ３）における、化合物１３の蓄積を示す図である。マウスに化合物１３を注射した。薬物注射１時間後から２４時間後まで画像を撮影した。図１３Ａ（上パネル）：赤色蛍光画像化。図１３Ｂ（下パネル）：ＮＩＲ蛍光画像化。
【図１４】ＭＬＳ−ｍＢａｎａｎａ同所性腫瘍（腫瘍サイズ約１ｃｍ３）における、化合物１３の蓄積を示す図である。マウスに化合物１３を注射した。薬物注射１日後から４日後まで画像を撮影した。図１４Ａ（上パネル）：赤色蛍光画像化。図１４Ｂ（下パネル）：ＮＩＲ蛍光画像化。
【図１５】ＭＬＳ−ｍＢａｎａｎａ同所性腫瘍（腫瘍サイズ約０．５ｃｍ３）における、化合物１３の蓄積を示す図である。マウスに化合物１３を注射した。薬物注射１０分後から２４時間後まで画像を撮影した。図１５Ａ（上パネル）：赤色蛍光画像化。図１５Ｂ（下パネル）：ＮＩＲ蛍光画像化。
【図１６】ＭＬＳ−ｍＢａｎａｎａ同所性腫瘍（腫瘍サイズ約０．５ｃｍ３）における、化合物１３の蓄積を示す図である。マウスに化合物１３を注射した。薬物注射１日後から４日後まで画像を撮影した。図１６Ａ（上パネル）：赤色蛍光画像化。図１６Ｂ（下パネル）：ＮＩＲ蛍光画像化。
【図１７】ヒト卵巣ＭＬＳ−ｍＢａｎａｎａ原発性壊死性腫瘍及び非壊死性腫瘍における、化合物１３の蓄積の比較を示す図である。化合物１３の注射２日後に画像を撮影した。化合物１３のｉｎ  ｖｉｖｏの全身ＮＩＲ蛍光の画像を撮影した。図１７Ａ：非壊死性腫瘍（約０．５ｃｍ３）。図１７Ｂ：壊死性腫瘍（約１ｃｍ３）。
【図１８】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ同所性腫瘍（腫瘍サイズ約１ｃｍ３）における、化合物２５の蓄積を示す図である。マウスに化合物２５を注射し、薬物注射５分後から２４時間後まで画像を撮影した。図１８Ａ（上パネル）：赤色蛍光画像化。図１８Ｂ（下パネル）：ＮＩＲ蛍光画像化。
【図１９】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ同所性腫瘍（腫瘍サイズ約１ｃｍ３）における、化合物２５の蓄積を示す図である。マウスに化合物２５を注射し、薬物注射１日後から３日後まで画像を撮影した。図１９Ａ（上パネル）：赤色蛍光画像化。図１９Ｂ（下パネル）：ＮＩＲ蛍光画像化。
【図２０】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ同所性壊死性腫瘍（腫瘍サイズ約０．５ｃｍ３）における、化合物２５の蓄積を示す図である。マウスに化合物２５を注射し、薬物注射１０分後から２４時間後まで画像を撮影した。図２０Ａ（上パネル）：赤色蛍光画像化。図２０Ｂ（下パネル）：ＮＩＲ蛍光画像化。
【図２１】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ同所性非壊死性腫瘍（腫瘍サイズ約０．５ｃｍ３）における、化合物２５の蓄積を示す図である。マウスに化合物２５を注射し、薬物注射１日後から３日後まで画像を撮影した。図２１Ａ（上パネル）：赤色蛍光画像化。図２１Ｂ（下パネル）：ＮＩＲ蛍光画像化。
【図２２】同所性ヒト胸部ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ原発性腫瘍（腫瘍サイズ約０．５ｃｍ３）における、遊離ｃ（ＲＧＤｆＫ）投与１時間後に投与した場合の、化合物１３の蓄積の比較アッセイを示す図である。化合物１３を投与し２４時間後に画像を撮影した。図２２Ａ、２２Ｂ：赤色蛍光画像化。図２２Ｃ、２２Ｄ：ＮＩＲ蛍光画像化。図２２Ａ、２２Ｃ：遊離ｃ（ＲＧＤｆＫ）投与１時間後に化合物１３を投与した（競合作用）。図２２Ｂ、２２Ｄ：対照、化合物１３だけを投与した。
【図２３】薬物注射１０分後に測定したＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ同所性腫瘍の、生存領域対壊死領域における化合物１３の蓄積を示す図である。図２３Ａ、２３Ｂ、及び２３Ｃ（上パネル）は、無処置動物の、それぞれ、ｉｎ  ｖｉｖｏの全身写真、赤色蛍光画像、及びＮＩＲ蛍光画像である。図２３Ｄ、２３Ｅ、及び２３Ｆ（下パネル）は、切除した腫瘍（腫瘍を半分に切断した）の、それぞれ、写真、赤色蛍光画像、及びＮＩＲ蛍光画像である（ＮＤ−壊死領域、ＶＤ−生存領域）。
【図２４】薬物注射１時間後に測定したＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ同所性腫瘍の、生存領域対壊死領域における化合物１３の蓄積を示す図である。図２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｃ（上パネル）、及び図２４Ｄ、２４Ｅ、２４Ｆ（下パネル）は、それぞれ図２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｃ、及び図２３Ｄ、２３Ｅ、２３Ｆに対して上記に記載した通りである。
【図２５】薬物注射４時間後に測定したＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ同所性腫瘍の、生存領域対壊死領域における化合物１３の蓄積を示す図である。図２５Ａ、２５Ｂ、２５Ｃ（上パネル）、及び図２５Ｄ、２５Ｅ、２５Ｆ（下パネル）は、それぞれ図２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｃ、及び図２３Ｄ、２３Ｅ、２３Ｆに対して上記に記載した通りである。
【図２６】薬物注射２４時間後に測定したＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ同所性腫瘍の、生存領域対壊死領域における化合物１３の蓄積を示す図である。図２６Ａ、２６Ｂ、２６Ｃ（上パネル）、及び図２６Ｄ、２６Ｅ、２６Ｆ（下パネル）は、それぞれ図２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｃ、及び図２３Ｄ、２３Ｅ、２３Ｆに対して上記に記載した通りである。
【図２７】薬物注射３日後に測定したＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ同所性腫瘍の、生存領域対壊死領域における化合物１３の蓄積を示す図である。図２７Ａ、２７Ｂ、２７Ｃ（上パネル）、及び図２７Ｄ、２７Ｅ、２７Ｆ（下パネル）は、それぞれ図２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｃ及び図２３Ｄ、２３Ｅ、２３Ｆに対して上記に記載した通りである。
【図２８】薬物注射５日後に測定したＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ同所性腫瘍の、生存領域対壊死領域における化合物１３の蓄積を示す図である。図２８Ａ、２８Ｂ、２８Ｃ（上パネル）、及び図２８Ｄ、２８Ｅ、２８Ｆ（下パネル）は、それぞれ図２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｃ、及び図２３Ｄ、２３Ｅ、２３Ｆに対して上記に記載した通りである。
【図２９】薬物注射７日後に測定したＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ同所性腫瘍の、生存領域対壊死領域における化合物１３の蓄積を示す図である。図２９Ａ、２９Ｂ、２９Ｃ（上パネル）、及び図２９Ｄ、２９Ｅ、２９Ｆ（下パネル）は、それぞれ図２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｃ、及び図２３Ｄ、２３Ｅ、２３Ｆに対して上記に記載した通りである。
【図３０】薬物注射９日後に測定したＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ同所性腫瘍の、生存領域対壊死領域における化合物２４の蓄積を示す図である。図３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃ（上パネル）、及び図３０Ｄ、３０Ｅ、３０Ｆ（下パネル）は、それぞれ図２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｃ及び図２３Ｄ、２３Ｅ、２３Ｆに対して上記に記載した通りである。
【図３１】注射７日後に測定したＭＬＳ−ｍＢａｎａｎａ腫瘍の中央壊死における化合物１３の蓄積を示す図である。図３１Ａ、３１Ｂ、３２Ｃ（上パネル）、及び図３１Ｄ、３１Ｅ、３１Ｆ（下パネル）は、それぞれ図２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｃ及び図２３Ｄ、２３Ｅ、２３Ｆに対して上記に記載した通りである。
【図３２】薬物注射７日後に測定したＭＬＳ−ｍＢａｎａｎａ腫瘍の非中央壊死における化合物１３の蓄積を示す図である。図３２Ａ、３２Ｂ、３２Ｃ（上パネル）、及び図３２Ｄ、３２Ｅ、３２Ｆ（下パネル）は、それぞれ図２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｃ及び図２３Ｄ、２３Ｅ、２３Ｆに対して上記に記載した通りである。
【図３３】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ腫瘍断面の、切除した腫瘍の画像及び組織学的分析（Ｈ＆Ｅ染色）を示す図である。図３３Ａ：腫瘍断面表面（肉眼的外観）の写真。図３３Ｂ：断面表面の組織学的提示（肉眼的外観）。図３３Ｃ：３３Ｂにおける囲まれた領域の中倍率視野。図３３Ｄ：壊死組織と生存組織の間の界面の領域の高倍率視野。
【図３４】ヒトＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰのＰＤＴに対する局所反応の代表例を示す図である。背部上にＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ異種移植片（約０．５ｃｍ３）を有するマウスに、化合物１３  ７．５ｍｇ／ｋｇをｉ．ｖ．注射し、８時間後に皮膚を通して照射した。図３４Ａ：０日（処置前）並びに処置１、４、７、１２、及び９０日後に撮影した写真。図３４Ｂ：ｉｎ  ｖｉｖｏの全身赤色蛍光画像化。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明の主な目的は、増感剤を、壊死性腫瘍の壊死領域へと特にターゲティングする光増感剤のコンジュゲートを提供することである。従来の化学療法での腫瘍ターゲティングを凌ぐ、腫瘍標的光線力学的治療（ＰＤＴ）の利点はいくつかある。第１に、ターゲティングされる従来の薬物が蓄積する間、それはプロドラッグでなければ活性であることが多いが、ターゲティングされる光増感剤は局所的に照射されるまで活性ではない。第２に、ターゲティングされる従来の薬物はホーミングアドレス（ｈｏｍｉｎｇ  ａｄｄｒｅｓｓ）を呈する望ましくない標的にも結合し、望ましくない標的で作用するが、ターゲティングされる光増感剤は、関連する照射部位でのみ活性化される。
【００４０】
したがって、広範な一態様において、本発明は、低侵襲性の腫瘍標的画像化、腫瘍標的ＰＤＴ、及び／又は壊死性腫瘍のオンライン予後のための、ＲＧＤ含有ペプチド又はＲＧＤペプチドミメチック、及びクロロフィル又はバクテリオクロロフィルの光増感剤のコンジュゲートの使用に関する。
【００４１】
「ＲＧＤ含有ペプチド」又は「ＲＧＤペプチド」の語は、本明細書において交換可能に用いられ、ＲＧＤモチーフとも呼ばれるＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列を含むペプチドを意味する。本明細書で用いられる「ＲＧＤペプチドミメチック」の語は、ペプチドを模倣し、ＲＧＤモチーフを有する化合物、特に非ペプチド性の化合物を意味する。
【００４２】
ＲＧＤペプチドは、細胞のインテグリン受容体と相互作用し、また、細胞シグナリングのプロセスを開始し、多くの疾患に影響を及ぼす可能性があることが知られている。このようなわけで、インテグリンＲＧＤ結合部位は、魅力的な薬剤標的と考えられている。
【００４３】
ＲＧＤ含有ペプチドは、アミノ酸残基４〜１００個、好ましくは５〜５０個、５〜３０個、５〜２０個、又はより好ましくは５〜１０個から構成される直鎖又は環状のペプチドであってよい。好ましい実施形態において、ＲＧＤペプチドは、アミノ酸残基４、５、６、７、９、又は２５個、最も好ましくは５個から構成される。
【００４４】
本明細書で用いられる「アミノ酸」の語は、２０個の天然に存在するアミノ酸、及び非天然のアミノ酸を含む。
【００４５】
本発明に適する天然のアミノ酸の例には、それだけには限定されないが、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶａｌが含まれる。
【００４６】
非天然のアミノ酸の例には、それだけには限定されないが、４−アミノ酪酸（Ａｂｕ）、２−アミノアジピン酸、ジアミノプロピオン（Ｄａｐ）酸、ヒドロキシリシン、ホモセリン、ホモバリン、ホモロイシン、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、ＴＩＣ、ナフチルアラニン（Ｎａｌ）、Ｐｈｅの環メチル化誘導体、Ｐｈｅのハロゲン化誘導体、又はｏ−メチル−Ｔｙｒが含まれる。
【００４７】
本明細書における「アミノ酸」の語には、ヒドロキシプロリン、ホスホセリン、及びホスホスレオニン；Ｄ−修飾；Ｌｙｓのアミノ末端基又は遊離アミノ基の、アシル化、又はアルキル化、好ましくはメチル化；Ａｓｐ又はＧｌｕのカルボキシ末端基又は遊離カルボキシ基のエステル化又はアミド化；並びにＳｅｒ又はＴｙｒのヒドロキシル基のエステル化又はエーテル化など、ｉｎ  ｖｉｖｏで翻訳後に生じる修飾などの、修飾されているアミノ酸も含まれる。
【００４８】
「アミノ酸」の語には、Ｄ−及びＬ−両方のアミノ酸が含まれる。したがって本発明のコンジュゲートにおいて用いられるペプチドは、オールＤ（グリシンを除く）、オールＬ、又はＬ，Ｄ−アミノ酸であってよい。アミノ酸のＤ−修飾及びペプチド結合のＮ−アルキル化は、生物体の酵素によるペプチド切断を防ぐのに最も有益である。本発明において、Ｄ−アミノ酸は、本明細書で用いる配列番号１のペプチドであるシクロＲＧＤｆＫにおいてＤ−フェニルアラニン「ｆ」残基に関して小文字によって示される。
【００４９】
本発明は環状ペプチドも含む。ペプチドは、Ｎ末端及びＣ末端のカルボキシルとアミノ官能基の間の、又はアミノ酸側鎖の、ジスルフィド、スルフィドの形成、特にラクタム形成など、様々な方法によって環化され得る。環化は、例えば、鎖における様々なポジションの、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ジアミノ酪（Ｄａｂ）酸、ジアミノプロピオン（Ｄａｐ）酸（−ＣＯ−ＮＨ又は−ＮＨ−ＣＯ結合）を組み入れるなどによって、アミド結合の形成によって、当技術分野では知られている任意の方法によって得ることができる。バックボーン対バックボーンの環化も、ｎ＝１〜４であり、さらにＲはアミノ酸の任意の天然又は非天然の側鎖である、式Ｈ−Ｎ（（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ）−Ｃ（Ｒ）Ｈ−ＣＯＯＨ、又はＨ−Ｎ（（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２）−Ｃ（Ｒ）Ｈ−ＣＯＯＨの修飾されているアミノ酸を組み入れることによって得ることができる。
【００５０】
環化は、また、２つのＣｙｓ残基を組み入れることによるＳ−Ｓ結合の形成によって得ることができる。さらなる側鎖対側鎖の環化は、ｎ＝１又は２である、式−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−ＣＨ２−ＣＯ−の相互作用の結合の形成によって得ることができ、これは、例えば、Ｃｙｓ又はホモＣｙｓの組入れ、及びその遊離ＳＨ基の、例えばブロモアセチル化されたＬｙｓ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ、又はＤａｐとの反応によって可能である。
【００５１】
いくつかの実施形態において、ＲＧＤペプチドは、その全文が本明細書に完全に開示されるように参照によって本明細書に援用される、ＵＳ６，５７６，２３９、ＥＰ０９２７０４５、及びＷＯ２００８／０２３３７８において記載されているＲＧＤペプチドであってよい。
【００５２】
好ましい一実施形態において、本発明に従って用いられるペプチドは、配列番号１の環状ペンタペプチドＲＧＤｆＫであり、「ｆ」はＤ−Ｐｈｅ残基を示す。
【００５３】
別の好ましい一実施形態において、ペプチドは、インテグリン受容体に結合する点でＲＧＤモチーフの重要性を促進するのに本明細書で用いられる、配列番号２の環状ペンタペプチドＲＡＤｆＫである。本発明に従って有用であるさらなる環状ペプチドは、本明細書で「ＲＧＤ−４Ｃ」と呼ぶ配列番号９のノナペプチドＣＤＣＲＧＤＣＧＣであり、これは分子中に２つのジスルフィド結合を形成する４個のシステイン残基を含んでいる。
【００５４】
ＲＧＤモチーフのアスパラギン酸残基は、化学的分解を極めて受けやすく、生物活性の喪失がもたらされ、この分解はジスルフィド連結の環化によって防ぐことができる。環状ペプチドは、改善しつつある安定性とともに、ビトロネクチンの細胞への接着を阻害する点で、直鎖ペプチドに比べて高い効力を示す。合成ペプチドにおけるＲＧＤ配列に近接する残基の数及び性質は、個々のインテグリン受容体によってこの配列が認識される方法に重大な影響を有する。インテグリンの結合部位において好ましい接触をなす点で、芳香族残基は特に重要であり得る。αｖβ３へとターゲティングされた環状ＲＧＤペプチドは、細胞表面上の機能的なインテグリン受容体の数を変えない、インテグリン非依存性液相エンドサイトーシス経路によって、内部移行する。さらに、環状ＲＧＤペプチドは、１５分後に飽和に到達するプロセスにおいてリソソーム中に留まり、又はリソソーム中で分解し、ほんの少しだけがリソソームを離れ、細胞質に到達することができる。
【００５５】
他の好ましい実施形態において、ＲＧＤペプチドは、環状ペプチド：（ｉ）テトラペプチドであるシクロＲＧＤＫ（配列番号３）、ペンタペプチドであるシクロＲＧＤｆ−ｎ（Ｍｅ）Ｋ（配列番号４）（ｆはＤ−Ｐｈｅを示し、ｆとＫの間のペプチド結合はメチル化されている）；及びペンタペプチドであるシクロＲＧＤｙＫ（配列番号５）（ｙはＤ−Ｔｙｒを示す）から選択される。
【００５６】
別の一実施形態において、ＲＧＤ含有ペプチドは直鎖であり、ヘキサペプチドであるＧＲＧＤＳＰ（配列番号６）、ヘプタペプチドであるＧＲＧＤＳＰＫ（配列番号７）、及び２５−ｍｅｒ（ＧＲＧＤＳＰ）４Ｋ（配列番号８）から選択されてよい。より好ましい一実施形態において、直鎖ペプチドはＧＲＧＤＳＰである。
【００５７】
本発明の一実施形態において、ＲＧＤペプチドは、ＣＯＯＨなど、その周囲における官能基によって、光増感剤のクロロフィル又はバクテリオクロロフィルの大環状分子に直接連結し、ＲＧＤペプチドのアミノ末端基又は遊離アミノ基とアミドＣＯ−ＮＨ２基を形成する。
【００５８】
別の一実施形態において、ＲＧＤペプチドは、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＳＯ３Ｈ、ＣＯＳＨ、又はＮＨ２などの末端の官能基によって置換されている、それだけには限定されないが、Ｃ１〜Ｃ２５ハイドロカルビレン（Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｙｌｅｎｅ）、好ましくはＣ１〜Ｃ１０アルキレン又はフェニレンなどの、スペーサーアーム／架橋基によって光増感剤の大環状分子に連結し、したがってエーテル、エステル、アミド、チオアミド、又はスルホンアミド基を形成する。
【００５９】
いくつかの実施形態において、光増感剤は、ＲＧｄペプチドミメチックにコンジュゲートしている。
【００６０】
好ましい一実施形態において、ＲＧＤペプチドミメチックは、原子１１個の鎖によって間隔がとられているグアニジン及びカルボキシル末端基を含む非ペプチド性化合物であり、前記原子の少なくとも５つは炭素原子であり、前記鎖は１つ又は複数のＯ、Ｓ、又はＮ原子を含み、オキソ、チオオキソ、ハロゲン、アミノ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ヒドロキシル、又はカルボキシによって場合により置換されていてよく、或いは前記鎖の１つ又は複数の原子は３〜６員の炭素環又は複素環を形成することができる。このタイプの化合物は、その全文が本明細書に完全に開示されるように参照によって本明細書に援用される、同じ出願者のＷＯ９３／０９７９５及びＷＯ２００８／０２３３７８に記載されている。
【００６１】
好ましい実施形態において、上記のＲＧＤペプチドミメチックは、鎖中にＮ原子を含み、オキソ基によって置換されている。より好ましい一実施形態において、ＲＧＤペプチドミメチックは、式：
Ｈ２Ｎ−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ−（ＣＨ２）５−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２）−（ＣＨ２）２−ＣＯＯＨ、又は−ＮＨ−ＲＧＤ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ピペラジノ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−
を有する。
【００６２】
本発明において用いるための光増感剤は、天然でもよく、又はクロロフィル若しくはバクテリオクロロフィルの合成の非天然の誘導体でもよい、クロロフィル又はバクテリオクロロフィル誘導体であり、修飾が大環状分子において、及び／又は周辺において行われており、並びに／或いは中央のＭｇ原子が非存在でもよく、又は診断の目的に、及び／若しくはＰＤＴの目的に適する他の金属原子によって置換されている化合物を含む。
【００６３】
好ましい実施形態において、本発明は、光増感剤が、式Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩ：
【化１】
0005620279.tif 000002
［式中、
Ｍは、２Ｈ、又はＭｇ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｓｎ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｉｎ、Ｅｕ、Ｆｅ、Ａｕ、Ａｌ、Ｇｄ、Ｄｙ、Ｅｒ、Ｙｂ、Ｌｕ、Ｇａ、Ｙ、Ｒｈ、Ｒｕ、Ｓｉ、Ｇｅ、Ｃｒ、Ｍｏ、Ｐ、Ｒｅ、Ｔｌ、及びＴｃからなる群から選択される原子、並びにそれらの同位体及び放射性同位体を表し、
Ｘは、Ｏ又はＮ−Ｒ７であり、
Ｒ１、Ｒ’２、及びＲ６は、各々独立に、Ｙ−Ｒ８、−ＮＲ９Ｒ’９、若しくは−Ｎ＋Ｒ９Ｒ’９Ｒ”９Ａ−であり、又は式ＩＩにおけるＲ１及びＲ６は、これらが結合している炭素原子と一緒になって、ＲＧＤペプチド、若しくはＲＧＤペプチドミメチックを含む環を形成し、
Ｙは、Ｏ又はＳであり、
Ｒ２は、Ｈ、ＯＨ、又はＣＯＯＲ９であり、
Ｒ３は、Ｈ、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、又はＣ１〜Ｃ１２アルコキシであり、
Ｒ４は、−ＣＨ＝ＣＲ９Ｒ’９、−ＣＨ＝ＣＲ９Ｈａｌ、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＮＲ９Ｒ’９、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−Ｎ＋Ｒ９Ｒ’９Ｒ”９Ａ−、−ＣＨＯ、−ＣＨ＝ＮＲ９、−ＣＨ＝Ｎ＋Ｒ９Ｒ’９Ａ−、−ＣＨ２−ＯＲ９、−ＣＨ２−ＳＲ９、−ＣＨ２−Ｈａｌ、−ＣＨ２−Ｒ９、−ＣＨ２−ＮＲ９Ｒ’９、−ＣＨ２−Ｎ＋Ｒ９Ｒ’９Ｒ”９Ａ−、−ＣＨ２−ＣＨ２Ｒ９、−ＣＨ２−ＣＨ２Ｈａｌ、−ＣＨ２−ＣＨ２ＯＲ９、−ＣＨ２−ＣＨ２ＳＲ９、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲ９Ｒ’９、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ＋Ｒ９Ｒ’９Ｒ”９Ａ−、−ＣＯＣＨ３、Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＲ９Ｒ’９、−Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＲ９Ｈａｌ、−Ｃ（ＣＨ３）＝ＮＲ９、−ＣＨ（ＣＨ３）＝Ｎ＋Ｒ９Ｒ’９Ａ−、−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｈａｌ、−ＣＨ（ＣＨ３）−ＯＲ９、−ＣＨ（ＣＨ３）−ＳＲ９、−ＣＨ（ＣＨ３）−ＮＲ９Ｒ’９、−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｎ＋Ｒ９Ｒ’９Ｒ’９Ａ−、又は−Ｃ≡ＣＲ９であり、
Ｒ’４は、メチル又はホルミルであり、
Ｒ５は、＝Ｏ、＝Ｓ、＝Ｎ−Ｒ９、＝Ｎ＋Ｒ９Ｒ’９Ａ−、＝ＣＲ９Ｒ’９、又は＝ＣＲ９−Ｈａｌであり、
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ’９、及びＲ”９は、各々独立に、
（ａ）Ｈ、
（ｂ）Ｃ１〜Ｃ２５ハイドロカルビル、
（ｃ）ハロゲン、ニトロ、オキソ、ＯＲ、ＳＲ、エポキシ、エピチオ、−ＣＯＮＲＲ’、−ＣＯＲ、ＣＯＯＲ、−ＯＳＯ３Ｒ、−ＳＯ３Ｒ、−ＳＯ２Ｒ、−ＮＨＳＯ２Ｒ、−ＳＯ２ＮＲＲ’、−ＮＲＲ’、＝Ｎ−ＯＲ、＝Ｎ−ＮＲＲ’、−Ｃ（＝ＮＲ）−ＮＲＲ’、−ＮＲ−ＮＲＲ’、−（Ｒ）Ｎ−Ｃ（＝ＮＲ）−ＮＲＲ’、Ｏ←ＮＲ−、＞Ｃ＝ＮＲ、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＲ−ＣＯＲ’、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−ＮＲＲ’、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＯＲ、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ、−ＰＲＲ’、−ＯＰＯ３ＲＲ’、−ＰＯ２ＨＲ、及び−ＰＯ３ＲＲ’［式中、Ｒ及びＲ’は各々独立に、Ｈ、ハイドロカルビル、又はヘテロシクリル（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｙｌ）であり、Ｒ”はハイドロカルビル又はヘテロシクリルである］からなる群から選択される１つ又は複数の官能基によって置換されているＣ１〜Ｃ２５ハイドロカルビル、好ましくはＣ１〜Ｃ２５アルキル、アルケニル、又はアルキニル、より好ましくはＣ１〜Ｃ１０又はＣ１〜Ｃ６アルキル、
（ｄ）正に荷電している基、負に荷電している基、生理学的条件下で正に荷電している基に変換される塩基性基、及び生理学的条件下で負に荷電している基に変換される酸性基からなる群から選択される１つ又は複数の官能基によって置換されているＣ１〜Ｃ２５ハイドロカルビル、好ましくはＣ１〜Ｃ２５アルキル、より好ましくはＣ１〜Ｃ１０又はＣ１〜Ｃ６アルキル、
（ｅ）１つ若しくは複数のヘテロ原子、及び／又は１つ若しくは複数の炭素環若しくは複素環部分を含むＣ１〜Ｃ２５ハイドロカルビル、好ましくはＣ１〜Ｃ２５アルキル、より好ましくはＣ１〜Ｃ１０又はＣ１〜Ｃ６アルキル、
（ｆ）１つ又は複数のヘテロ原子、及び／又は１つ又は複数の炭素環若しくは複素環部分を含み、上記（ｃ）及び（ｄ）において定義した１つ又は複数の官能基によって置換されているＣ１〜Ｃ２５ハイドロカルビル、好ましくはＣ１〜Ｃ２５アルキル、より好ましくはＣ１〜Ｃ１０又はＣ１〜Ｃ６アルキル、
（ｇ）アミノ酸、ペプチド、好ましくはＲＧＤペプチド、タンパク質、単糖、オリゴ糖、多糖の残基、又は多座配位子、及び金属とのそのキレート錯体によって置換されているＣ１〜Ｃ２５ハイドロカルビル、好ましくはＣ１〜Ｃ２５アルキル、より好ましくはＣ１〜Ｃ１０又はＣ１〜Ｃ６アルキル、或いは、
（ｈ）アミノ酸、ペプチド、好ましくはＲＧＤペプチド、若しくはＲＧＤペプチドミメチック、タンパク質、単糖、オリゴ糖、多糖の残基、又は多座配位子、及び金属とのそのキレート錯体
であり、
Ｒ７は、さらに、−ＮＲＲ’［式中、Ｒ及びＲ’は、各々、Ｈ、又は負に荷電している基、好ましくはＳＯ３−によって場合により置換されているＣ１〜Ｃ２５ハイドロカルビル、好ましくはＣ１〜Ｃ２５アルキル、より好ましくはＣ１〜Ｃ１０又はＣ１〜Ｃ６アルキルである］であってよく、
Ｒ８は、Ｒ１、Ｒ’２、及びＲ６が、各々独立にＹ−Ｒ８である場合、さらに、Ｈ＋又は陽イオンＲ＋１０であってよく、
Ｒ＋１０は、金属、アンモニウム基、又は有機陽イオンであり、
Ａ−は、生理学的に許容される陰イオンであり、
ｍは、０又は１であり、
７〜８位の点線は、場合による二重結合を表す］
のクロロフィル又はバクテリオクロロフィル並びにその薬学的に許容される塩及び光学異性体であるコンジュゲートであって、
式Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩの前記クロロフィル又はバクテリオクロロフィル誘導体が少なくとも１つのＲＧＤ含有ペプチド残基を含んでいる上記コンジュゲートに関する。
【００６４】
一実施形態において、７〜８位の点線は二重結合を表し、光増感剤は式Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩのクロロフィルである。式Ｉの化合物であって、ＭがＭｇであり、１７３位のＲ１がフィチルオキシであり、１３２位のＲ２がＣＯＯＣＨ３であり、１３２位のＲ３がＨ原子であり、Ｒ５がＯであり、３位のＲ４がビニルであり、７〜８位の点線は二重結合を表し、７位のＲ’４はメチルであり且つ８位のＲ４はエチルである、又は７位のＲ’４はホルミルであり且つ８位のＲ４はエチルである上記化合物は、それぞれクロロフィルａ及びｂであり、これらの誘導体は異なる金属原子、及び／又は異なる置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ’４、及び／又はＲ５を有する。
【００６５】
別の一実施形態において、７〜８位は水素化されており、光増感剤は式Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩのバクテリオクロロフィルである。式Ｉの化合物であって、ＭはＭｇであり、１７３位のＲ１はフィチルオキシ又はゲラニルゲラニルオキシであり、１３２位のＲ２はＣＯＯＣＨ３であり、１３２位のＲ３はＨ原子であり、Ｒ５はＯであり、３位のＲ４はアセチルであり、８位のＲ４はエチルであり、７〜８位の点線が非存在である上記化合物は、バクテリオクロロフィルａであり、それらの誘導体は異なる金属原子、及び／又は異なる置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及び／又はＲ５を有する。
【００６６】
本明細書で用いられる「ハイドロカルビル」の語は、炭素原子１〜２５個の、好ましくは１から２０個の、より好ましくは１から６個の、最も好ましくは２〜３個の炭素原子の、任意の直鎖又は分枝、飽和又は不飽和、非環状又は環状（芳香属を含む）ハイドロカルビル基を意味する。ハイドロカルビルは、好ましくは炭素原子１〜４個のアルキル基、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、又はアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、フェニルなどのアリール又はベンジルなどのアラルキル基であってよく、或いは式Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩの化合物の１７位は、天然Ｃｈｌ及びＢｃｈｌ化合物に由来する基、例えば、ゲラニルゲラニル（２，６−ジメチル−２，６−オクタジエニル）又はフィチル（２，６，１０，１４−テトラメチル−ヘキサデク−１４−エン−１６−イル）である。
【００６７】
本明細書で用いられる「炭素環部分」の語は、環（単数又は複数）中に炭素原子だけを含む単環式又は多環式の化合物を意味する。炭素環部分は、飽和であってよく（即ち、シクロアルキル）、又は不飽和でも（即ち、シクロアルケニル）、又は芳香族（即ち、アリール）でもよい。
【００６８】
本明細書で用いられる「アルコキシ」の語は（Ｃ１〜Ｃ２５）アルキル−Ｏ−基を意味し、Ｃ１〜Ｃ２５アルキルは上記で定義した通りである。アルコキシの例は、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペントキシ、ヘキソキシ、−ＯＣ１５Ｈ３１、−ＯＣ１６Ｈ３３、−ＯＣ１７Ｈ３５、−ＯＣ１８Ｈ３７などである。本明細書で用いられる「アリールオキシ」の語は（Ｃ６〜Ｃ１８）アリール−Ｏ−基を意味し、Ｃ６〜Ｃ１８アリールは上記で定義した通りであり、例えば、フェノキシ及びナフトキシである。
【００６９】
本明細書で用いられる「ヘテロアリール」、又は「複素環部分」、又は「芳香族複素環」、又は「ヘテロシクリル」の語は、Ｏ、Ｓ、及びＮからなる群から選択されるヘテロ原子を１個から３個含む、単環式又は多環式芳香族複素環に由来する基を意味する。詳しい例は、ピロリル、フリル、チエニル、ピラゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、ピリジル、キノリニル、ピリミジニル、１，３，４−トリアジニル、１，２，３−トリアジニル、１，３，５−トリアジニル、ベンゾフリル、イソベンゾフリル、インドリル、イミダゾ［１，２−ａ］ピリジル、ベンズイミダゾリル、ベンズチアゾリル、及びベンズオキサゾリルである。
【００７０】
任意の「炭素環式」、「アリール」、又は「ヘテロアリール」は、ハロゲン、Ｃ６〜Ｃ１４アリール、Ｃ１〜Ｃ２５アルキル、ニトロ、ＯＲ、ＳＲ、−ＣＯＲ、−ＣＯＯＲ、−ＳＯ３Ｒ、−ＳＯ２Ｒ、−ＮＨＳＯ２Ｒ、−ＮＲＲ’、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＲ−ＣＯＲ’、及び−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−ＮＲＲ’などの１つ又は複数の基によって置換されていてよい。多環式芳香族複素環が置換されている場合、置換は、炭素環及び／又は複素環の任意のものにおけるものであってよいことを理解されたい。
【００７１】
本明細書で用いられる「ハロゲン」の語は、フルオロ、クロロ、ブロモ、又はヨードを意味する。
【００７２】
本発明の一実施形態において、コンジュゲートの光増感剤は、少なくとも１つの負に荷電している基、及び／又は生理学的ｐＨで負に荷電している基に変換される少なくとも１つの酸性基を含む、式Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩのクロロフィル又はバクテリオクロロフィルである。
【００７３】
本明細書において定義する「負に荷電している基」は、酸に由来する陰イオンであり、カルボキシレート（ＣＯＯ−）、チオカルボキシレート（ＣＯＳ−）、スルホネート（ＳＯ３−）、及びホスホネート（ＰＯ３２−）を含み、「生理学的条件下で負に荷電している基に変換される酸性基」には、カルボン酸（−ＣＯＯＨ）、チオカルボン酸（−ＣＯＳＨ）、スルホン酸（−ＳＯ３Ｈ）、及びホスホン酸（−ＰＯ３Ｈ２）の基が含まれる。負に荷電している基、又は生理学的条件下でこれらに変換される基を有するＢｃｈｌ誘導体は、その全文が本明細書に完全に開示されるように参照によって本明細書に援用される、同出願者のＷＯ２００４／０４５４９２に記載されている。
【００７４】
より好ましい一実施形態において、本発明のコンジュゲートにおける光増感剤は、式ＩＩのクロロフィル又はバクテリオクロロフィルであり、Ｒ６は−ＮＲ９Ｒ’９であり、Ｒ９はＨであり、Ｒ’９はＳＯ３Ｈによって置換されているＣ１〜Ｃ１０アルキル又はそのアルカリ塩である。最も好ましくは、コンジュゲートは、Ｒ６は−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３Ｋ又は−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＳＯ３Ｋである、式ＩＩのバクテリオクロロフィル誘導体を含む。
【００７５】
本発明の別の一実施形態において、コンジュゲートの光増感剤は、少なくとも１つの正に荷電している基、及び／又は生理学的ｐＨで正に荷電している基に変換される少なくとも１つの塩基性基を含む、式Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩのクロロフィル又はバクテリオクロロフィルである。
【００７６】
本明細書で定義する「正に荷電している基」は、Ｎ含有基に由来し、又はＮを含まないオニウム基に由来する陽イオンを意味する。腫瘍内皮はますます多くの陰イオン性の部位を特徴とするので、正に荷電している基、又は生理学的条件下で正に荷電している基に変換される塩基性基は、本発明のコンジュゲートのターゲティング効率を増大することがある。
【００７７】
本明細書で用いられる「Ｎ含有基に由来する陽イオン」は、例えば、それだけには限定されないが、アンモニウム−Ｎ＋（ＲＲ’Ｒ”）、ヒドラジニウム−（Ｒ）Ｎ−Ｎ＋（ＲＲ’）、アンモニウムオキシＯ←Ｎ＋（ＲＲ’）−、イミニウム＞Ｃ＝Ｎ＋（ＲＲ’）、アミジニウム−Ｃ（＝ＲＮ）−Ｎ＋ＲＲ’Ｒ”、又はグアニジウム−（Ｒ）Ｎ−Ｃ（＝ＮＲ）Ｎ＋ＲＲ’Ｒ”基を意味し、式中、Ｒ、Ｒ’、及びＲ”は、各々独立に、Ｈ、ハイドロカルビル、好ましくは本明細書で定義するＣ１〜Ｃ６アルキル、フェニル若しくはベンジル、又はヘテロシクリルであり、或いは、アンモニウム基において、Ｒ、Ｒ’、及びＲ”の１つはＯＨであってよく、或いはアンモニウム基におけるＲ、Ｒ’、及びＲ”の２つ又はヒドラジニウム基、アンモニウムオキシ基、イミニウム基、アミジニウム基若しくはグアニジウム基におけるＲ及びＲ’は、これらが結合しているＮ原子と一緒になって、Ｏ、Ｓ、又はＮからなる群から選択される１つ又は複数のヘテロ原子を場合により含み、さらなるＮ原子は場合によりさらに置換されている３〜７員飽和環を形成し、或いは前記陽イオンは芳香族複素環における１つ又は複数のＮ原子を含む化合物に由来する。
【００７８】
より好ましい一実施形態において、本発明のコンジュゲートは、式−Ｎ＋（ＲＲ’Ｒ”）のアンモニウム基を含んでおり、各Ｒ、Ｒ’、及びＲ”は独立に、Ｈ、又は、本明細書で定義する通り、場合により置換されているハイドロカルビル、若しくはヘテロシクリルであり、或いはそれらの１つはＯＨであってよい。−Ｎ＋（ＲＲ’Ｒ”）のアンモニウム基は、Ｒ、Ｒ’、又はＲ”の基の任意の２つがＨである２級アンモニウムであってよく、Ｒ、Ｒ’、又はＲ”の１つだけがＨである３級アンモニウムであってよく、或いは、各Ｒ、Ｒ’、又はＲ”が場合により置換されているハイドロカルビル又は本明細書で定義されているヘテロシクリル基である４級アンモニウムであってよい。Ｒ、Ｒ’、又はＲ”の１つがＯＨである場合、基はヒドロキシルアンモニウム基である。好ましくは、アンモニウム基は、Ｒ、Ｒ’、及びＲ”各々が、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ヘキシルなどのＣ１〜Ｃ６アルキルである４級アンモニウム基である。アンモニウム基は分子における末端基であってよく、又は分子におけるアルキル鎖内に見られてもよい。
【００７９】
ヒドラジニウム−（Ｒ）Ｎ−Ｎ＋（Ｒ’Ｒ”）、アミジニウム−Ｃ（＝ＮＲ）−Ｎ＋Ｒ’Ｒ”、及びグアニジウム−（Ｒ）Ｎ−Ｃ（＝ＮＲ）−Ｎ＋Ｒ’Ｒ”基において、Ｒ、Ｒ’、及びＲ”は、各々独立に、Ｈ、若しくはハイドロカルビル、若しくはヘテロシクリルであってよく、又はＲ及びＲ’は、これらが結合しているＮ原子と一緒になって、本明細書で定義する通り、３〜７員飽和環を形成する。これらの基の例には、ＲがＨであり、Ｒ’及びＲ”が各々、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ヘキシルなどのＣ１〜Ｃ６アルキルである基が含まれる。
【００８０】
アンモニウムオキシＯ←Ｎ＋（ＲＲ’）−、及びイミニウム＞Ｃ＝Ｎ＋（ＲＲ’）基において、Ｒ及びＲ’は、各々独立に、Ｈ、又はハイドロカルビル、好ましくはＣ１〜Ｃ６アルキル、若しくはヘテロシクリルであってよく、又はＲ及びＲ’はこれらが結合しているＮ原子と一緒になって、本明細書で定義する３〜７員飽和環を形成する。
【００８１】
別の好ましい一実施形態において、クロロフィル又はバクテリオクロロフィル誘導体は、式−Ｎ＋（ＲＲ’Ｒ”）の環状アンモニウム基を含み、Ｒ、Ｒ’、及びＲ”の２つはＮ原子と一緒になって、本明細書以下に定義する３〜７員飽和環を形成する。
【００８２】
本明細書で定義する通り、Ｒ、Ｒ’、及びＲ”の２つが、これらが結合しているＮ原子と一緒になって形成する「３〜７員飽和環」は、アジリジン、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、若しくはアゼピンなど、Ｎだけを含む環であってよく、又はモルホリン若しくはチオモルホリンなど、Ｏ及びＳから選択されるさらなるヘテロ原子を含んでいてもよい。ピペラジン環におけるさらなるＮ原子は、ハロ、ＯＨ、又はアミノによって置換されていてよいＣ１〜Ｃ６アルキルなどのアルキルによって場合により置換されていてよい。前記飽和環に由来するオニウム基には、アジリジニウム、ピロリジニウム、ピペリジニウム、ピペラジニウム、モルホリニウム、チオモルホリニウム、及びアゼピニウムが含まれる。
【００８３】
本明細書で定義される「Ｎ含有芳香族複素環基に由来する陽イオン」は、Ｏ、Ｓ、若しくはさらなるＮ原子を場合により含む単環式又は多環式化合物であってよいＮ−芳香族複素環化合物に由来する陽イオンを意味する。陽イオンが由来する環は、少なくとも１つのＮ原子を含み、芳香族でなければならないが、他の環（単数又は複数）があるとすれば、部分的に飽和されていてよい。Ｎ−芳香族複素環陽イオンの例には、ピラゾリウム、イミダゾリウム、オキサゾリウム、チアゾリウム、ピリジニウム、ピリミジニウム、キノリニウム、イソキノリニウム、１，２，４−トリアジニウム、１，３，５−トリアジニウム、及びプリニウムが含まれる。
【００８４】
正に荷電している基は、それだけには限定されないが、ホスホニウム［−Ｐ＋（ＲＲ’Ｒ”）］、アルソニウム［−Ａｓ＋（ＲＲ’Ｒ”）］、オキソニウム［−Ｏ＋（ＲＲ’）］、スルホニウム［−Ｓ＋（ＲＲ’）］、セレノニウム［−Ｓｅ＋（ＲＲ’）］、テルロニウム［−Ｔｅ＋（ＲＲ’）］、スチボニウム［−Ｓｂ＋（ＲＲ’Ｒ”）］、又はビスムトニウム［−Ｂｉ＋（ＲＲ’Ｒ”）］基などの窒素を含まないオニウム基であってもよく、各Ｒ、Ｒ’、及びＲ”は、独立に、Ｈ、ハイドロカルビル、又はヘテロシクリル、好ましくは、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、若しくはヘキシル、又はアリールなどのＣ１〜Ｃ６アルキル、好ましくはフェニルである。
【００８５】
式−Ｐ＋（ＲＲ’Ｒ”）のホスホニウム基の例には、Ｒ、Ｒ’、及びＲ”の各々が、メチル、エチル、プロピル、ブチル、若しくはフェニルであり、又はＲがメチル、エチル、プロピル、ブチル、若しくはヘキシルであり、Ｒ’及びＲ”が両方ともフェニルである基が含まれる。式−Ａｓ＋（ＲＲ’Ｒ”）のアルソニウム基の例には、Ｒ、Ｒ’、及びＲ”の各々が、メチル、エチル、プロピル、ブチル、又はフェニルである基が含まれる。式−Ｓ＋（ＲＲ’）のスルホニウム基の例には、Ｒ、及びＲ’の各々が、メチル、エチル、プロピル、ブチル、フェニル、ベンジル、フェネチル、又は置換されているハイドロカルビル基である基が含まれる。
【００８６】
本明細書で定義する「生理学的条件下で正に荷電している基に変換される塩基性基」は、少なくとも理論的には、生理学的条件下で本明細書で定義する正に荷電している基を産生する任意の塩基性基である。本明細書で用いられる生理学的条件は、単に血清を意味するのではなく、身体の様々な組織及び細胞コンパートメントを意味することに留意されたい。
【００８７】
このようなＮ含有塩基性基の例には、それだけには限定されないが、全て本明細書に定義した通りの、アンモニウム基を産生する任意のアミノ基、イミニウム基を産生する任意のイミン基、ヒドラジニウム基を産生する任意のヒドラジン基、アンモニウムオキシ基を産生する任意のアミノオキシ基、アミジニウム基を産生する任意のアミジン基、グアニジウム基を産生する任意のグアニジン基が含まれる。他の例には、ホスフィノ基及びメルカプト基が含まれる。
【００８８】
したがって、本発明のコンジュゲートは、−ＮＲＲ’、−Ｃ（＝ＮＲ）−ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲ−ＮＲ’Ｒ”、−（Ｒ）Ｎ−Ｃ（＝ＮＲ）−ＮＲ’Ｒ”、Ｏ←Ｎ＋Ｒ−、又は＞Ｃ＝Ｎ＋（ＲＲ’）など、生理学的条件下で正に荷電している基に変換される少なくとも１つの塩基性基を含むことができ、式中、各Ｒ、Ｒ’、及びＲ”は、独立に、Ｈ、ハイドロカルビル、好ましくはＣ１〜Ｃ２５アルキル、より好ましくはＣ１〜Ｃ１０若しくはＣ１〜Ｃ６アルキル、又はヘテロシクリルであり、或いはＲ、Ｒ’、及びＲ”の２つはＮ原子と一緒になって、Ｏ、Ｓ、又はＮ原子を場合により含み、さらなるＮ原子にて場合によりさらに置換されている３〜７員飽和環を形成し、或いは塩基性基がＮ含有芳香族複素環基である。
【００８９】
３〜７員飽和環は、ハロ、ヒドロキシ、若しくはアミノによって場合により置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルによってさらなるＮ原子にて場合により置換されているアジリジン、ピロリジン、ピペリジン、モルホリン、チオモルホリン、アゼピン、又はピペラジンであってよく、Ｎ含有芳香族複素環基は、ピラゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、ピリジル、キノリニル、イソキノリニル、ピリミジル、１，２，４−トリアジニル、１，３，５−トリアジニル、又はプリニルであってよい。
【００９０】
正に荷電している基、又は生理学的条件下で正に荷電している基に変換される基を有するＢｃｈｌ誘導体は、その全文が本明細書に完全に開示されるように参照によって本明細書に援用される、同出願者らのＷＯ２００５／１２０５７３に記載されている。
【００９１】
一実施形態において、光増感剤は式ＩＩのクロロフィル又はバクテリオクロロフィルであり、Ｒ６は塩基性基−ＮＲ９Ｒ’９であり、Ｒ９はＨであり、Ｒ’９は塩基性基−ＮＲＲ’若しくは−ＮＨ−（ＣＨ２）２〜６−ＮＲＲ’によって置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルであり、各Ｒ及びＲ’は独立に、Ｈ、場合によりＮＨ２によって置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルであり、又はＲ及びＲ’はＮ原子と一緒に、Ｏ若しくはＮ原子を場合により含み、−（ＣＨ２）２〜６−ＮＨ２によってさらなるＮ原子が場合によりさらに置換されている５〜６員飽和環を形成する。
【００９２】
別の一実施形態において、光増感剤は式ＩＩのバクテリオクロロフィルであり、Ｒ６は−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ２、−ＮＨ−（ＣＨ２）２−１−モルホリノ、又は−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ピペラジノ−（ＣＨ２）３−ＮＨ２である。
【００９３】
さらなる一実施形態において、Ｒ１及びＲ６は一緒になって、ＲＧＤペプチド又はＲＧＤペプチドミメチックを含む環状リングを形成する。
【００９４】
別の一実施形態において、光増感剤は式ＩＩＩのクロロフィル又はバクテリオクロロフィルであり、Ｘは−ＮＲ７であり、Ｒ７は−ＮＲＲ’であり、ＲはＨであり、Ｒ’はＳＯ３−によって置換されているＣ１〜６アルキル又はそのアルカリ塩であり、好ましくは、光増感剤はバクテリオクロロフィルであり、Ｘは−ＮＲ７であり、Ｒ７は−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＳＯ３Ｋである。
【００９５】
別の一実施形態において、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、又はＲ’９の各々は、１つ又は複数の−ＯＨ基によって置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである。例えば、光増感剤は、式ＩＩのクロロフィル又はバクテリオクロロフィルであり、Ｒ６は−ＮＲ９Ｒ’９であり、Ｒ９はＨであり、Ｒ’９はＨＯＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−である。
【００９６】
別の一実施形態において、光増感剤は、式ＩＩのクロロフィル又はバクテリオクロロフィルであり、Ｒ６は−ＮＲ９Ｒ’９であり、Ｒ９はＨであり、Ｒ’９は、多座配位子又は金属とのそのキレート錯体によって置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである。多座配位子の例には、それだけには限定されないが、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、又は大環状配位子であるＤＯＴＡが含まれる。好ましい一実施形態において、多座配位子はＤＴＰＡであり、Ｒ６は−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ−ＤＴＰＡであり、金属はＧｄである。
【００９７】
陽イオンＲ８＋は、Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｌｉ＋、ＮＨ４＋、Ｃａ２＋、などのアルカリ金属若しくはアルカリ土類金属に由来する一価若しくは二価陽イオン、より好ましくはＫ＋であってよく、又はＲ８＋は、アミン若しくはＮ含有基に由来する有機陽イオンである。
【００９８】
本明細書で定義する通り、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ９’に対して定義されるＣ１〜Ｃ２５ハイドロカルビルは、ハロゲン、ニトロ、オキソ、ＯＲ、ＳＲ、エポキシ、エピチオ、アジリジン、−ＣＯＮＲＲ’、−ＣＯＲ、ＣＯＯＲ、−ＯＳＯ３Ｒ、−ＳＯ３Ｒ、−ＳＯ２Ｒ、−ＮＨＳＯ２Ｒ、−ＳＯ２ＮＲＲ’、−ＮＲＲ’、＝Ｎ−ＯＲ、＝Ｎ−ＮＲＲ’、−Ｃ（＝ＮＲ）−ＮＲＲ’、−ＮＲ−ＮＲＲ’、−（Ｒ）Ｎ−Ｃ（＝ＮＲ）−ＮＲＲ’、Ｏ←ＮＲ−、＞Ｃ＝ＮＲ、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＲ−ＣＯＲ’、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−ＮＲＲ’、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＯＲ、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ、−ＰＲＲ’、−ＯＰＯ３ＲＲ’、−ＰＯ２ＨＲ、−ＰＯ３ＲＲ’；ＣＯＯ−、ＣＯＳ−、−ＯＳＯ３−、−ＳＯ３−、−ＯＰＯ３Ｒ−、−ＰＯ２Ｈ−、−ＰＯ３２−、及び−ＰＯ３Ｒ−などの１つ又は複数の負に荷電している基；並びに／又は−Ｐ＋（ＲＲ’Ｒ”）、−Ａｓ＋（ＲＲ’Ｒ”）、−Ｏ＋（ＲＲ’）、−Ｓ＋（ＲＲ’）、−Ｓｅ＋（ＲＲ’）、−Ｔｅ＋（ＲＲ’）、−Ｓｂ＋（ＲＲ’Ｒ”）、−Ｂｉ＋（ＲＲ’Ｒ”）、Ｏ←Ｎ＋（ＲＲ’）−、＞Ｃ＝Ｎ＋（ＲＲ’）、−Ｎ＋（ＲＲ’Ｒ”）、−（Ｒ）Ｎ−Ｎ＋（ＲＲ’Ｒ”）、−（Ｒ）Ｎ−Ｃ（＝ＨＮ）−Ｎ＋ＲＲ’Ｒ”、−Ｃ（＝ＮＨ）−Ｎ＋（ＲＲ’Ｒ”）、又はピラゾリウム、イミダゾリウム、オキサゾリウム、チアゾリウム、ピリジニウム、キノリニウム、ピリミジニウム、１，２，４−トリアジニウム、１，３，５−トリアジニウム、及びプリニウムなどのＮ−芳香族複素環陽イオンなどの１つ又は複数の正に荷電している基から選択される１つ又は複数の官能基によって場合により置換されていてよく、ｎは１から６までの整数であり、Ｒ、Ｒ’、及びＲ”は各々独立に、Ｈ、ハイドロカルビル、又はヘテロシクリルであり、或いはＲ、Ｒ’、及びＲ”の２つは、これらが結合しているＮ原子と一緒になって、Ｏ、Ｓ、若しくはＮからなる群から選択される１つ又は複数のヘテロ原子を場合により含み、さらなるＮ原子が場合によりさらに置換されている３〜７員飽和環を形成する。Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ９’に対して定義されるＣ１〜Ｃ２５ハイドロカルビルは、グリコシルなどの単糖、オリゴ糖、若しくは多糖の残基、又はアミノ酸、ペプチド、若しくはタンパク質の残基、好ましくはＲＧＤペプチドによって置換されていてもよい。さらに、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ９’は、各々独立に、グリコシルなどの単糖、オリゴ糖、若しくは多糖の残基、又はアミノ酸、ペプチド、若しくはタンパク質などの残基、又はＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＥＤＴＡなどの多座配位子、及び金属とのこれらのキレート錯体であってよい。
【００９９】
ＲがＨであるＯＲ基及びＳＲ基において、それぞれヒドロキシ基及びメルカプト基が代表され、ＲがＨ以外である場合、エーテル及びスルフィドが代表される。−ＰＲＲ’基において、Ｒ及びＲ’がＨである場合、ホスフィノ基が代表される。−ＣＯＲ基において、ＲがＨである場合、アルデヒドのホルミル基−ＣＨＯが代表され、ＲがＨ以外である場合、これはアルキルカルボニル及びアリールカルボニル基などのケトンの残基である。ＣＯＯＲ基において、ＲがＨではない場合、これは、アルコキシカルボニル基及びアリールオキシカルボニル基などのカルボン酸エステル基である。同様に、Ｒ及びＲ’がＨ以外である−ＯＳＯ３Ｒ、−ＳＯ３Ｒ、−ＳＯ２Ｒ、−ＯＰＯ３ＲＲ’、−ＰＯ２ＨＲ、及び−ＰＯ３ＲＲ’基においてエステルが代表される。
【０１００】
本発明の好ましい一実施形態において、光増感剤はアンメタレーテッド（ｕｎｍｅｔａｌａｔｅｄ）であり、即ちＭは２Ｈである。他の好ましい実施形態において、光増感剤は、本明細書上記で定義した通りメタル化されており、より好ましくは、ＭはＰｄ、Ｃｕ、又はＭｎであり、最も好ましくはＰｄ又はＣｕである。
【０１０１】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、光増感剤は、式Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩ、より好ましくは式ＩＩのＢｃｈｌであり、Ｍは２Ｈ、Ｃｕ、Ｍｎ、又はＰｄである。他の実施形態において、光増感剤は、式Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩ、より好ましくは式ＩＩのＣｈｌであり、Ｍは２Ｈ、Ｃｕ、Ｍｎ、又はＭｎである。
【０１０２】
いくつかの好ましい実施形態において、コンジュゲートは式ＩＩの光増感剤Ｂｃｈｌを含み、Ｍは、Ｐｄ、Ｍｎ、Ｃｕ、又は２Ｈであり、ｍは０であり、Ｒ１はＮＨ−Ｐであり、ＰはＮＨ−に直接若しくはスペーサーによって連結しているＲＧＤ含有ペプチド又はＲＧＤペプチドミメチックの残基であり、Ｒ’２はメトキシであり、３位のＲ４はアセチルであり、８位のＲ４はエチルであり、Ｒ’４はメチルであり、Ｒ６は−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＳＯ３−Ｍｅ＋であり、ｎは２又は３であり、Ｍｅ＋はＮａ＋又はＫ＋である。
【０１０３】
本発明の最も好ましい一実施形態において、コンジュゲートは式ＩＩのＢｃｈｌを含み、Ｍは２Ｈであり、Ｒ１はＮＨ−Ｐであり、Ｐは、配列番号１のペプチドｃ（ＲＧＤｆＫ）を含むＲＧＤの残基であり、Ｒ’２はメトキシであり、３位のＲ４はアセチルであり、８位のＲ４はエチルであり、Ｒ’４はメチルであり、Ｒ６は、本明細書で化合物１３と呼ぶ、−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３Ｋ、又はｃ（ＲＧＤｆＫ）−２Ｈ−ＭＬＴである。
【０１０４】
別の最も好ましい一実施形態において、ＭはＰｄであり、Ｒ１、Ｒ’２、Ｒ４、Ｒ’４、Ｒ６は上記で定義した通りであり、Ｐは、本明細書で化合物２４と呼ぶ配列番号１のｃ（ＲＧＤｆＫ）、又はｃ（ＲＧＤｆＫ）−Ｐｄ−ＭＬＴである。
【０１０５】
より好ましい一実施形態において、ＭはＭｎ、であり、Ｒ１、Ｒ’２、Ｒ４、Ｒ’４、Ｒ６は上記で定義した通りであり、Ｐは、本明細書で化合物１４と呼ぶｃ（ＲＧＤｆＫ）、若しくはｃ（ＲＧＤｆＫ）−Ｍｎ−ＭＬＴであり、又はＭはＣｕであり、コンジュゲートは、本明細書で化合物１５と呼ばれ、若しくはｃ（ＲＧＤｆＫ）−Ｃｕ−ＭＬＴである。
【０１０６】
さらにより好ましい一実施形態において、式ＩＩのＢｃｈｌにおけるＭは２Ｈであり、Ｒ’２、Ｒ４、Ｒ’４、及びＲ６は上記で定義した通りであり、Ｒ１はＮＨ−Ｐであり、Ｐは、本明細書で化合物４５と呼ぶ配列番号２のｃ（ＲＡＤｆＫ）であり、又はｃ（ＲＡＤｆＫ）−２Ｈ−ＭＬＴであり、又はＰは配列番号５のｃ（ＲＧＤｙＫ）である。
【０１０７】
他のより好ましい実施形態において、Ｍは２Ｈであり、Ｒ１、Ｒ’２、Ｒ４、Ｒ’４、及びＲ６は上記で定義した通りであり、Ｐは、配列番号６のＧＲＧＤＳＰ、又は配列番号７のＧＲＧＤＳＰＫ、又は配列番号８の（ＧＲＧＤＳＰ）４から選択される直鎖ペプチドであり、最も好ましくは、ＰはＧＲＧＤＳＰであり、コンジュゲートは、本明細書で化合物２６と呼ばれ、又は直鎖ＧＲＧＤＳＰ−２Ｈ−ＭＬＴである。
【０１０８】
さらにより好ましい実施形態において、式ＩＩのＢｃｈｌにおいて、ＭはＰｄであり、ｍは０であり、Ｒ１はＮＨ−Ｐであり、Ｐはｃ（ＲＧＤｆＫ）であり、Ｒ’２はメトキシであり、３位のＲ４はアセチルであり、８位のＲ４はエチルであり、Ｒ’４はメチルであり、Ｒ６は、−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＳＯ３Ｋであり、又はＰは、配列番号４の環状ペプチドＲＧＤｆ−ｎ（Ｍｅ）Ｋであり、Ｒ６は−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３Ｋである。
【０１０９】
式ＩＩのＢｃｈｌの中央の金属原子はＰｄであり、ｍ、Ｒ’２、Ｒ４、Ｒ’４は上記で定義した通りであり、Ｒ１はＨＨ−Ｐであり、Ｒ６は−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３Ｋであるさらにより好ましい実施形態は、配列番号７の直鎖ペプチドＧＲＧＤＳＰＫ、又は配列番号８の（ＧＲＧＤＳＰ）４を有するコンジュゲートに関する。
【０１１０】
さらになおより好ましい実施形態において、コンジュゲートは式ＩＩのＢｃｈｌを含んでおり、ＭはＰｄであり、ｍ、Ｒ’２、Ｒ４、Ｒ’４は上記で定義した通りであり、Ｒ１はＮＨ−ＣＨ［（−（ＣＨ２）２−ＣＯ−ＮＨ−Ｐ］２であり、Ｐは配列番号５のＲＧＤ含有ペプチドｃ（ＲＧＤｙＫ）の残基であり、Ｒ６は本明細書で化合物３６と呼ぶ−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３Ｋ、又はｃ（ＲＧＤｙＫ）２−２Ｈ−ＭＬＴである。
【０１１１】
本発明の別の２つのより好ましい実施形態において、式ＩＩのＢｃｈｌにおいて、ＭはＰｄ又は２Ｈであり、ｍは０であり、Ｒ１はＮＨ−Ｐであり、Ｐはｃ（ＲＧＤｆＫ）（配列番号１）の残基であり、Ｒ’２はメトキシであり、３位のＲ４はアセチルであり、８位のＲ４はエチルであり、Ｒ’４はメチルであり、Ｒ６は−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２ＯＨである。
【０１１２】
さらに別のより好ましい一実施形態において、コンジュゲートは上記で言及したＲＧＤペプチド、好ましくは式ＩＩのＢｃｈｌにコンジュゲートしているｃ（ＲＧＤｆＫ）を含み、Ｍは２Ｈであり、ｍ、Ｒ１、Ｒ’２、Ｒ４、Ｒ’４は上記に定義した通りであり、Ｒ６はＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ２、−ＮＨ−（ＣＨ２）２−モルホリノ、又は−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ピペラジノ−（ＣＨ２）３−ＮＨ２のいずれかである。
【０１１３】
さらにより好ましい実施形態は、式ＩＩのＢｃｈｌを含むコンジュゲートに関し、Ｍは２Ｈであり、ｍは０であり、Ｒ１はＮＨ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）であり、Ｒ’２はメトキシであり、３位のＲ４はアセチルであり、８位のＲ４はエチルであり、Ｒ’４はメチルであり、Ｒ６は、−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ−ＣＯ−ＤＴＰＡ、又はＧｄとのそのキレート錯体である。
【０１１４】
本発明は、式ＩＩの光増感剤Ｂｃｈｌを含む好ましいコンジュゲートにさらに関し、ＭはＰｄ又は２Ｈであり、ｍは０であり、Ｒ１はＮＨ−Ｐであり、Ｐは、ＮＨ−に直接、若しくはスペーサーによって連結しているＲＧＤペプチドミメチックの残基であり、Ｒ’２はメトキシであり、３位のＲ４はアセチルであり８位のＲ４はエチルであり、Ｒ’４はメチルであり、Ｒ６は、−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＯＨ、又は−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３Ｋである。
【０１１５】
本発明の別の一実施形態において、コンジュゲートは式ＩＩＩのＢｃｈｌを含み、ＭはＰｄであり、Ｒ１はＮＨ−Ｐであり、Ｐは、ＮＨ−に直接、又はスペーサーによって連結しているＲＧＤ含有ペプチド、又はＲＧＤペプチドミメチックの残基であり、３位のＲ４はアセチルであり、８位のＲ４はエチルであり、Ｒ’４はメチルであり、ＸはＮ−Ｒ７であり、Ｒ７は、−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＳＯ３−Ｍｅ＋であり、Ｍｅ＋はＮａ＋若しくはＫ＋である。
【０１１６】
別の一実施形態において、コンジュゲートは式ＩのＢｃｈｌを含み、ＭはＭｎであり、Ｒ１はＮＨ−Ｐであり、Ｐは、ＮＨ−に直接、又はスペーサーによって連結しているＲＧＤ含有ペプチド又はＲＧＤペプチドミメチックの残基であり、Ｒ２はＯＨであり、Ｒ３はＣＯＯＣＨ３であり、３位のＲ４はアセチルであり、８位のＲ４はエチルであり、Ｒ’４はメチルであり、Ｒ５はＯである。より好ましい実施形態において、Ｍは２Ｈ又はＭｎであり、Ｐは、配列番号１のＲＧＤ含有ペプチドｃ（ＲＧＤｆＫ）、又は配列番号３のｃ（ＲＧＤＫ）の残基である。
【０１１７】
別の一実施形態において、コンジュゲートは式ＩＩのＣｈｌを含み、ＭはＭｎ、Ｃｕ、又は２Ｈから選択され、Ｒ１はＮＨ−Ｐであり、Ｐは、ＮＨ−に直接又はスペーサーによって連結しているＲＧＤ含有ペプチド又はＲＧＤペプチドの残基であり、３位のＲ４はビニルであり、８位のＲ４はエチルであり、Ｒ’４はメチルであり、Ｒ６は、−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３−Ｍｅ＋であり、Ｍｅ＋はＮａ＋又はＫ＋である。
【０１１８】
より好ましい実施形態において、式ＩＩのＣｈｌにおいて、Ｍは２Ｈ又はＣｕ又はＭｎであり、Ｒ４、Ｒ’４、及びＲ６は上記で定義した通りであり、光増感剤は、配列番号１の五員環のＲＧＤ含有ペプチドｃ（ＲＧＤｆＫ）にコンジュゲートしている。
【０１１９】
別の一実施形態において、Ｒ１及びＲ６は一緒になって、−ＮＨ−ＲＧＤ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−又は−ＮＨ−ＲＧＤ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ピペラジノ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−を含む環状リングを形成する。一実施形態において、コンジュゲートは式ＩＩのＢｃｈｌを含み、ｍは０であり、Ｒ’２はメトキシであり、３位のＲ４はアセチルであり、８位のＲ４はエチルであり、Ｒ’４はメチルであり、Ｒ１及びＲ６は一緒になって、−ＮＨ−ＲＧＤ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−を含む環状リングを形成し、ＭはＰｄであり、若しくはＭは２Ｈであり、又はＲ１及びＲ６は一緒になって、−ＮＨ−ＲＧＤ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ピペラジノ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−を含む環状リングを形成し、ＭはＰｄである。
【０１２０】
（産業上の利用可能性）
本発明において用いるために、コンジュゲートは、薬学的に許容される担体を含む薬剤組成物中に配合される。
【０１２１】
一実施形態において、薬剤組成物は光線力学的治療（ＰＤＴ）において用いるための、より詳しくは腫瘍標的ＰＤＴのためのものである。別の一実施形態において、薬剤組成物は、診断目的で用いるための、腫瘍壊死領域の可視化のためのものである。
【０１２２】
中央の金属原子を特定の技術に採用することによって、本発明に従って、いくつかの診断技術を適用することができる。
【０１２３】
ダイナミック蛍光画像化による腫瘍壊死領域の診断に対して、光増感剤におけるＭは２Ｈ、又はＰｄ及びＺｎから選択される金属である。
【０１２４】
放射線診断技術による腫瘍壊死領域の診断に対して、光増感剤におけるＭは、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、９９ｍＴｃ、６７Ｇａ、２０１Ｔｌ、１９５Ｐｔ、６０Ｃｏ、１１１Ｉｎ、及び５１Ｃｒから選択される放射性同位元素である。一実施形態において、放射線診断技術はポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）であり、Ｍは６４Ｃｕ又は６７Ｃｕである。別の一実施形態において、放射線診断技術は単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＴ）であり、Ｍは９９ｍＴｃ、６７Ｇａ、１９５Ｐｔ、１１１Ｉｎ、５１Ｃｒ、及び６０Ｃｏから選択される放射性同位元素である。
【０１２５】
分子磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）による腫瘍壊死領域の診断に対して、Ｍは、Ｍｎ３＋、Ｃｕ２＋、Ｆｅ３＋、Ｅｕ３＋、Ｇｄ３＋、及びＤｙ３＋から選択される常磁性金属であり、又は光増感剤は多座配位子の金属キレート錯体によって置換されており、金属は本明細書上記に定義した通りである。
【０１２６】
一実施形態において、本発明は、
（ａ）壊死領域を有する腫瘍を有することが疑われる対象に、本発明によるコンジュゲートを投与するステップであって、Ｍは２Ｈ、又はＰｄ及びＺｎから選択される金属であるステップ、
（ｂ）対象に照射し、コンジュゲートの投与後少なくとも２４〜４８時間の間に１〜８時間の時間間隔で疑われる領域の蛍光を測定するステップであって、２４〜４８時間後又はそれより長時間後に蛍光を表す領域は腫瘍壊死領域の存在を示すステップ、
を含む、ダイナミック蛍光画像化により腫瘍壊死領域を画像化するための方法に関する。
【０１２７】
好ましい実施形態において、上記の方法に対するコンジュゲートは化合物１３又は化合物２４であり、腫瘍は乳房又は卵巣の腫瘍であり、壊死領域は薬物（コンジュゲート）注射３日から８日後、好ましくは５〜８日後に可視化される。
【０１２８】
別の一実施形態において、本発明は、
（ａ）腫瘍を有することが疑われる対象に、本発明によるコンジュゲートを投与するステップであって、Ｍは６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、９９ｍＴｃ、６７Ｇａ、２０１Ｔｌ、１９５Ｐｔ、６０Ｃｏ、１１１Ｉｎ、又は５１Ｃｒからなる群から選択される放射性同位元素であるステップ、
（ｂ）コンジュゲートの投与後少なくとも２４〜４８時間の間に１〜８時間の時間間隔で、画像化スキャナーにおいて対象をスキャンし、疑われる領域の放射線レベルを測定するステップであって、２４〜４８時間後又はそれ以降に放射線を表す領域は腫瘍壊死領域の存在を示すステップ、
を含む、放射線診断技術によって腫瘍壊死領域を診断するための方法を提供する。
【０１２９】
本発明は、
（ａ）腫瘍を有することが疑われる対象に、本明細書で定義するコンジュゲートを投与するステップであって、Ｍは、Ｍｎ３＋、Ｃｕ２＋、Ｆｅ３＋、Ｅｕ３＋、Ｇｄ３＋、又はＤｙ３＋から選択される常磁性金属であるステップと、
（ｂ）前記投与の前（時間ゼロ）の患者体内の標的関心領域の少なくとも１つのＭＲ画像、及び前記投与後少なくとも２４〜４８時間後、好ましくは９６時間後の第２の時間点又はそれを超える時間点の１つ又は複数のＭＲ画像を産生することにより、患者に磁気共鳴画像化を施すステップと、
（ｃ）データを加工及び分析して前記腫瘍壊死領域の存在又は非存在を診断するステップと
を含む、腫瘍壊死領域を診断するための分子磁気共鳴画像（ＭＲＩ）方法も提供する。
【０１３０】
本発明は、本明細書で定義するコンジュゲートを、必要とする対象に投与するステップと、対象に照射するステップと、コンジュゲートの投与後最初の２〜２４時間後に、腫瘍、好ましくは胸部腫瘍を画像化することによってスキャンするステップとを含み、それによって外科手術用の準備において腫瘍の境界をマッピングすることを含む、外科手術前に腫瘍の境界をマッピングする方法をさらに提供する。
【０１３１】
本発明は、（ｉ）本明細書で定義するコンジュゲート、好ましくはＲＧＤ−Ｂｃｈｌコンジュゲートを対象に投与し、それによってＲＧＤ−Ｂｃｈｌコンジュゲートは腫瘍壊死領域において特異的に向い、蓄積すること、（ｉｉ）高精度で腫瘍を検出し、腫瘍の境界を画定するために、並びにＭＲＩ、蛍光、及びＰＥＴ  ＳＣＡＮの手法による予後のために、上記に記載した任意の方法によってＲＧＤ−Ｂｃｈｌ誘導体で処置した対象の腫瘍標的画像化、及び（ｉｉｉ）胸部温存及び再建を可能にする、局在性壊死領域の腫瘍標的光線力学的治療（ＰＤＴ）を含む、局在性の胸部癌、特に非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）に対する低侵襲処置、検出、及び予後の戦略をさらになお提供するものである。
【０１３２】
本発明において用いられるＲＧＤペプチド−光増感剤コンジュゲートは、壊死性腫瘍の腫瘍ターゲティングＰＤＴに特に適しており、癌性疾患の処置に有用である。
【０１３３】
したがって、一実施形態において、本発明のコンジュゲートは、それだけには限定されないが、メラノーマ、前立腺、脳、結腸、卵巣、胸部、結腸直腸、頭部及び頸部、胸部癌に起因する胸壁腫瘍、皮膚、肺、食道、及び膀胱の癌及び腫瘍などの、前癌性の状態及びいくつかの癌のタイプのＰＤＴによる処置のために、腫瘍学的分野において有用である。化合物は原発腫瘍及び転移性の壊死腫瘍の処置に有用である。
【０１３４】
好ましい一実施形態において、方法は、局在性胸部癌、特に非浸潤性乳管癌の処置に用いられる。
【０１３５】
本発明に従って、壊死性腫瘍の、腫瘍の光線力学的治療のための方法を提供し、これは、（ａ）本発明によるＲＧＤペプチド−光増感剤コンジュゲートを必要とする個体に投与するステップと、（ｂ）本明細書に記載する任意の方法によって、コンジュゲートの注射後少なくとも２４時間、好ましくは２、３、４、５、６、７、又は８日後に、壊死領域の存在を決定した後、腫瘍及びその壊死領域の局所に照射するステップとを含む。
【０１３６】
一態様において、本発明は、腫瘍壊死領域における蛍光Ｃｈｌ／Ｂｃｈｌ−ＲＧＤコンジュゲートの選択的取込み及び長時間の蓄積に基づく腫瘍壊死を検出するための新しい方法に関する。Ｃｈｌ／Ｂｃｈｌ増感剤は、内皮細胞及び腫瘍細胞の特異的な受容体に向うリガンドにコンジュゲートしている。次いで、Ｃｈｌ／Ｂｃｈｌが十分高濃度で蓄積し、周囲組織から排除された後、腫瘍体積及び近接する周囲を照射することによってＲＯＳの光線力学的な産生が開始される。
【０１３７】
化合物２４のＢｃｈｌ成分は、検出することができる近赤外線（ＮＩＲ）に固有の蛍光を有する。最近の実験は、化合物２４を用いて、原発腫瘍の異種移植片における最高４〜８μＭの蓄積を示した。化合物２４は、長時間腫瘍部位に留まり、シグナルの蓄積、及び良好なシグナル対ノイズ比を可能にする。分子のこれらの能力は、おそらくＢｃｈｌと血清アルブミンの間の相互作用によるものであり、そのためこの分子は直接画像化、及び最終的には指向治療のための優れた候補物質となっている。別のＢｃｈｌ誘導体である化合物１３は、３桁高い白熱能力を有し、それゆえ標的画像化のためのさらに優れた候補物質である可能性がある。これらの分子は、ヒト胸部腺癌モデルにおいて腫瘍境界及び壊死を正確に検出する可能性を開くものである。腫瘍境界及び壊死の検出は、腫瘍処置において最も取り組みがいのある、最新の２つの問題を提起している。さらに、両方とも、処置後の腫瘍の再増殖の忠実な前兆である。したがって、将来、臨床に適用される場合、前述のＲＧＤ誘導体は、手術台上で腫瘍及び壊死を検出するのに適することが期待される。
【０１３８】
本発明は、生存性の腫瘍組織中に一時的に留まった後、腫瘍壊死領域においてＲＧＤペプチドとコンジュゲートするＣｈｌ／Ｂｃｈｌ誘導体の長時間の蓄積を実現するための新しい取り組みを導入するものである。蓄積した化合物は、生存性の（投与後短時間）若しくは壊死性の（より長時間）腫瘍領域のｉｎ  ｖｉｖｏの画像化に、及びＢｃｈｌの中央の金属を変えることによって、又は小型の治療薬とさらにコンジュゲートすることによって、ＰＤＴ、化学療法、又は同位体照射療法による腫瘍治療に用いることができる。新しい取組みは、化合物１３及び２４によって例示されている。ｃ（ＲＧＤｆＫ）は、血管新生において上方制御されるαｖβ３及びαｖβ５インテグリンに高度に特異的なリガンドとして、すでに認められている。化合物２５の部分は、ＮＩＲの強力な自己蛍光とのコンジュゲートを提供し、組織取込み後の蛍光画像化に適するものとなっている。
【０１３９】
実験データは、非コンジュゲートの化合物２５に対して短期又は長期の蓄積が観察されなかったので、ＲＧＤ部分が、小型（非壊死性）及び大型（壊死性）両方の腫瘍における化合物１３及び２４の特異的な蓄積に不可欠であることを示している。さらに、処置マウスからの化合物２５の全身の排除は、コンジュゲートした化合物の排除より著しく速かった。ＲＧＤの未決定のメカニズムは、本明細書に記載する競合実験により強化され、競合実験では、過剰の遊離ｃ（ＲＧＤｆＫ）を短時間に、又は化合物１３と同時に注射すると、腫瘍組織による後の取込みが妨げられる。
【０１４０】
壊死性腫瘍と非壊死性腫瘍の間に、化合物１３の蓄積における劇的な違いが観察された。すなわち、まだ壊死を発生していない小型のＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ腫瘍（約０．５ｃｍ３）は、薬物注射後１〜６．５時間以内に腫瘍中の化合物１３の速やかな蓄積、及びその後の速やかな（＜２４時間）排除を示した。殆どの残存する薬物が排除器官（主に腎臓、及び肝臓も）に限局された後々の時間に、ごく少量の薬物を腫瘍中に検出することができた。壊死を発生した大型のＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ腫瘍（＞１ｃｍ３）は、薬物注射４８時間後から、他の器官に比べて、ピーク腫瘍濃度比率に到達するのがより遅い蓄積を示した。腫瘍塊における平均薬物濃度は、薬物注射２４時間後からほんのわずかに低減した。これらの結果は壊死性の腫瘍領域には一般的であるが、腫瘍のタイプで異なる。さらに、肝臓においてより遅い排除速度が観察された以外は、壊死性腫瘍と非壊死性腫瘍における蓄積パターンの間に同様の違いが、化合物２４に対して観察され、これにより化合物１３は臨床に応用するのにより優れた候補物質となった。
【０１４１】
おそらく、本明細書において、胸部癌のモデル及び卵巣癌腫瘍のモデルにおいて壊死領域と非壊死領域における化合物１３の蓄積速度の間に観察された違いは、２つの腫瘍タイプにおける微小環境の様々な性質に関連する。胸部腫瘍において腫瘍体積と微小血管密度の間に逆相関が見られ、腫瘍体積が増大すると、立方センチメートルあたりの微小血管の密度において劇的な減少が存在する。したがって、インテグリンの濃度は比例的に低くなり、したがって、インテグリン依存性の薬物蓄積速度は、比例的に低くならなければならない。
【０１４２】
表示したデータの中で最も顕著な特徴は、化合物１３を投与した後、様々な時間点の壊死性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ腫瘍の切除した腫瘍の蛍光画像化によって実証される、生存腫瘍体積から壊死腫瘍体積中への薬物の蛍光の明らかな置換である。薬物蓄積のＲＧＤ部分に対する依存に引き続いて、多段階の蓄積が可能であり得、この場合第１のステップは、血清アルブミン分子から化合物２５部分（２Ｈ−ＭＬＴ）の解離、並びに微小血管、生存腫瘍細胞、及びおそらくマクロファージ又は好中球におけるαｖβ３インテグリンによる能動的取込みを含む。このステップに、アクセス化合物１３の壊死領域中への受動伝達又はトランスサイトーシス遊走、及び長時間そこからの排液の喪失が続くことが示唆される。非壊死性腫瘍において、薬物は、腫瘍全体を構成する生存領域によって速やかに蓄積するが、壊死が存在しないため薬物は速やかに排除される。化合物２４を注射する場合、切除された腫瘍の蛍光の結果は、化合物１３に対して得られる結果と同様であった。
【０１４３】
壊死性腫瘍及び非壊死性腫瘍における蓄積の速度における同様の違いが、他の腫瘍モデル、即ち、ＭＬＳ−ｍＢａｎａｎａ、ヒト卵巣腫瘍において見出された。しかし、おそらく様々な腫瘍タイプを反映して、速度及び蓄積パターンにおいていくらかの変動が存在する。化合物１３は、非壊死性ＭＬＳ−ｍＢａｎａｎａ腫瘍において速やかに蓄積し、次いでゆっくりと排除される。壊死性腫瘍において、薬物は、最初の１時間以内に生存性の境界において最高濃度に到達し、次いで、壊死ゾーン中に移動し、そこで投与２４時間後に最大濃度に到達する。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰに比べて、高濃度のＭＬＳ−ｍＢａｎａｎａにおける速やかな蓄積は、ＭＬＳ−ｍＢａｎａｎａ細胞におけるインテグリン受容体がより高濃度であることをおそらく反映するものである。
【０１４４】
化合物１３で処置した動物からの大型及び小型の腫瘍の組織学は、示される蓄積パターンを支持し、根底をなすメカニズムに対するいくつかの手がかりを提供すると思われる。最初の数時間に、生存性の腫瘍領域と化合物１３の蛍光の間には非常に良好な重複が存在し、投与２４時間後及びそれより長時間後の１３の蛍光と壊死領域の間に非常に良好な重複が存在する。
【０１４５】
リンパ性の排液が劣り、静脈還流量が遅いことに関連する、腫瘍中の薬物及び造影剤の蓄積に対して多くの報告がある。この現象は、透過性亢進及び滞留（ＥＰＲ）効果と呼ばれ、非特異的な方法で腫瘍組織をターゲティングする手段として以前から示唆されている。ＥＰＲが、壊死領域及び非壊死性腫瘍における化合物１３又は化合物２４の蓄積パターンを説明することは可能である。血清アルブミン（ＳＡ）−薬物複合体の、腫瘍の脈管構造を通した間質性腫瘍組織中への透過が、このような蓄積を説明するのに、最近提唱された（Ｔａｎａｋａ、Ｓｈｉｒａｍｏｔｏら、２００４年）。ＳＡに対してコンジュゲートしている分子が、腫瘍に、さらには壊死領域中に分子の送達をもたらすことを示したいくつかの例が文献に存在する。実際、負に荷電した水溶性のＢｃｈｌ誘導体がＳＡに対して高親和性であることが以前に本発明者らによって示された。このように、化合物１３又は化合物２４は、投与後Ｂｃｈｌ部分によってＳＡにおそらく会合し、血中を循環し、上記で説明したＥＰＲ効果によって腫瘍組織中にＳＡと一緒にさまよいこむ。この場合、壊死領域における独立型の化学的実体として化合物２５の蓄積が期待されるが、試験した腫瘍における化合物２５の保持時間は短く、ＥＰＲ効果による可能な蓄積は除外され得る。
【０１４６】
或いは、Ｂｃｈｌ−ＲＧＤ誘導体がαＶβ３又はαＶβ５インテグリンに遭遇する場合、これはＳＡの担体から脱離し、ＲＧＤ部分によってＳＡ分子に対するよりも大きな親和性でインテグリンに結合しなければならない。この最初の結合の後、化合物１３又は化合物２４はエンドサイトーシスによって上皮細胞中に、又は上皮細胞を超えたトランスサイトーシスによって拡散することができる。薬物は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に直接移動することも可能である。これらの場合において、濃度勾配にしたがった薬物の移動は、化合物１３又は化合物２４が最初その最低濃度である壊死領域に向って傾く。
【０１４７】
提唱されているｃ（ＲＧＤｆＫ）−２Ｈ／Ｐｄ−ＭＬＴのインテグリンとの相互作用は、腫瘍壊死領域における蓄積は、好中球／マクロファージ依存性であることを含意し得る。活性化された好中球及びマクロファージがインテグリンを発現することは、長い間知られている。組織学的結果は、好中球が壊死領域中に（殆ど境界においてであるが）留まることを示している。胸部の侵襲性癌において高濃度のマクロファージの浸潤が存在することは文献から知られている（Ｌｅｅｋ、Ｌａｎｄｅｒｓら、１９９９年）。ＮＡＣＡ（壊死結合性造影剤）では、壊死性の病巣からの最終的な排除に投与後数日かかることが見出され、その間に壊死組織が炎症細胞、大部分は好中球、単球、及び／又はマクロファージによってますます浸潤され、食され、肉芽組織によって置き換えられる天然の治癒プロセスに相関することが見出された。したがって、壊死において保持されるＮＡＣＡは、食作用によって壊死材料と一緒に除去されると考えられている。このように、ＮＡＣＡ−壊死結合後の二次性のマクロファージの取込みは、これらの局所的な濃縮も説明することができる。それゆえ、壊死領域への誘因及び壊死領域における保持は、壊死領域に住み着いている好中球及び／又はマクロファージへの誘因に頼ることができることが示唆される。
【０１４８】
壊死領域における蛍光のＣｈｌｓ／Ｂｃｈｌの可能なターゲティング及び長時間の保持により、これらの早期の検出、並びに腫瘍の予後及び処置の様式を予測する手助けが可能となり得る。さらに、これは低酸素症が誘発する薬物の送達に対する方法を開くものである。
【０１４９】
本発明を、次に、以下の非限定的な実施例によって説明する。
【実施例】
【０１５０】
材料と方法
（ｉ）化合物
Ｂｃｈｌ誘導体、ＲＧＤペプチド、及びこれらのコンジュゲートを、同出願者らのＷＯ２００８／０２３３７８において記載した通りに調製した。これらのコンジュゲート及び化合物は、本明細書においてＷＯ２００８／０２３３７８におけるのと同じアラビア数字によって表される（化合物４５を除く）。
化合物１３［ｃ（ＲＧＤｆＫ）−２Ｈ−ＭＬＴ］：３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｉｏｃｈｌｏｒｉｎ）１３１−（２−スルホエチル）アミド−１７３−ｃ（ＲＧＤｆＫ）アミドカリウム塩。
化合物１４［ｃ（ＲＧＤｆＫ）−Ｍｎ−ＭＬＴ］：マンガン（ＩＩＩ）３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン１３１−（２−スルホエチル）アミド−１７３−（シクロＲＧＤｆＫ）アミドカリウム塩。
化合物１５［ｃ（ＲＧＤｆＫ）−Ｃｕ−ＭＬＴ］：銅（ＩＩ）３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン１３１−（２−スルホエチル）アミド−１７３−（シクロＲＧＤｆＫ）アミドカリウム塩。
化合物２４［ｃ（ＲＧＤｆＫ）−Ｐｄ−ＭＬＴ］：パラジウム３１−オキソ−１５−メトキシカルボニル−メチル−ロドバクテリオクロリン１３１−（２−スルホエチル）アミド−１７３−ｃ（ＲＧＤｆＫ）アミドカリウム塩。
化合物２５［２Ｈ−ＭＬＴ］：３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン１３１−（２−スルホエチル）アミドカリウム塩。
化合物２６［直鎖ＧＲＧＤＳＰ−２Ｈ−ＭＬＴ］：３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン１３１−（２−スルホエチル）アミド−１７３−（ＧＲＧＤＳＰ）アミドカリウム塩。
化合物３６［ｃ（ＲＧＤｙＫ）２−２Ｈ−ＭＬＴ］：３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン１３１−（２−スルホエチル）アミド−１７３−ｂｉｓ（シクロＲＧＤｆＫ）アミドカリウム塩。
化合物４５［ｃ（ＲＡＤｆＫ）−２Ｈ−ＭＬＴ］：３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン１３１−（２−スルホエチル）アミド−１７３−（シクロＲＡＤｆＫ）アミドカリウム塩。
【０１５１】
（ｉｉ）細胞系
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト胸部癌細胞を、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から得た。ピューロマイシンに耐性のヒト卵巣癌細胞をトランスフェクトしたＭＬＳ−ｐＲＳＥＴＢ−ｍＢａｎａｎａは、Ｍｉｃｈａｌ  Ｎｅｅｍａｎ教授（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ、Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｒｅｈｏｖｏｔ、イスラエル）のご好意で提供された。
【０１５２】
（ｉｉｉ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１への赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）のトランスフェクト
トランスフェクトには２つのプラスミド：ネオマイシンに対する耐性遺伝子を保有するｐＤｓＲｅｄ２−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）（図１Ａ）、及びハイグロマイシンに対する耐性遺伝子を保有する、修飾型ｐＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ−Ｈｙｇ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を用い、これらにおいて、図１Ｂにおいて示すプラスミドのＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ遺伝子をｐＤｓＲｅｄ２で置換した（ｐＤｓＲｅｄ２−Ｎ１プラスミドから、図１Ｃ）。トランスフェクトにはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を、製造元のプロトコールに従って用いた。
【０１５３】
（ｉｖ）組織培養
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ細胞を、１ｍｍｏｌ／Ｌピルビン酸ナトリウム、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２５０μｇ／ｍｌハイグロマイシン、０．０６ｍｇ／ｍｌペニシリン、及び０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを補ったＲＰＭＩ１６４０培地中に維持した。細胞を、加湿雰囲気中（５％ＣＯ２、９５％空気）３７℃で単層として増殖させた。ＭＬＳ−ｍＢａｎａｎａ細胞を、１ｍｍｏｌ／Ｌピルビン酸ナトリウム、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１０μｇ／ｍｌピューロマイシン、０．０６ｍｇ／ｍｌペニシリン、及び０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを補ったＭＥＭ−α培地中に維持した。細胞を、加湿雰囲気中（５％ＣＯ２、９５％空気）３７℃で単層として増殖させた。
【０１５４】
（ｖ）動物
メスＣＤ１ヌードマウス（７〜８週齢、約２５ｇ）を収容し、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （Ｒｅｈｏｖｏｔ、イスラエル）のガイドライン（１９９６年）に従って動物施設中、餌及び水を自由に摂取させて飼い慣らした。
【０１５５】
（ｖｉ）マウス腫瘍モデル
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ蛍光ヒト胸部癌細胞、及びＭＬＳ−ｍＢａｎａｎａ蛍光ヒト卵巣癌細胞（食塩水１００μｌ中５×１０６個）をトリプシン処理し、サブコフルーエンシー（ｓｕｂｃｏｆｌｕｅｎｃｙ）で回収し、次いでメスマウスの背部又は乳房の脂肪パッド中に接種した。腫瘍を２つの望ましいサイズ−壊死性腫瘍（約１ｃｍ３、３〜４週間以内）及び非壊死性腫瘍（約０．５ｃｍ３、１〜２週間以内）に発達させた。
【０１５６】
（ｖｉｉ）全身蛍光画像化
マウスに、８５：１５ケタミン：キシラジンの混合液３０μｌをｉ．ｐ．注射することによって麻酔した。乳房の脂肪パッドにおける薬物の蓄積をモニターするために、１５ｍｇ薬物／体重ｋｇの化合物１３、化合物２５、又は化合物２４をマウスの尾部静脈にｉ．ｖ．注射した。赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ｐＲＳＥＴＢ−ｍＢａｎａｎａ、及び光増感剤の蛍光を、ｉｎ  ｖｉｖｏの光学画像化システム、ＩＶＩＳ（登録商標）１００（Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）によってモニターした。腫瘍画像化用のメインフィルターセットは、５００〜５５０ｎｍの励起フィルター及び５７５〜６５０ｎｍの発光フィルターを含んでおり、組織の自己蛍光を差し引くためのバックグラウンドフィルターセットは４６０〜４９０ｎｍの励起フィルター及び５７５〜６５０ｎｍの発光フィルターを含んでいた。薬物画像化のメインフィルターセットは６６５〜６９５ｎｍの励起フィルター及び８１０〜８７５ｎｍの発光フィルターを含んでいた。同じ曝露時間の間に画像を得、定性的な比較を可能にするために同じ直線上のカラースケール上に図示する。
【０１５７】
（ｖｉｉｉ）壊死性腫瘍における蛍光シグナル測定
全身のｉｎ  ｖｉｖｏ画像からの関心領域（ＲＯＩ）である腫瘍境界をマーキングし、円で囲んだ境界内の蛍光シグナルを光子／秒で表した。同じＲＯＩを用いて側副側における光子／秒を測定した。さらに、バックグラウンド測定用に、腫瘍及び側副側のＲＯＩを、３匹の非処置マウスで測定し、平均した。各ＲＯＩからの蛍光の測定値を面積で除して、光子／秒／ｃｍ２における標準化された蛍光シグナル強度を得た。化合物１３注射１５分後から２１６時間後まで、シグナル測定値を回収した。各時間点において、バックグラウンドを差し引き、腫瘍境界と側副側の間における蛍光の比として平均を計算した。
【０１５８】
（ｉｘ）化合物１３と遊離ｃ（ＲＧＤｆＫ）結合の間の比較アッセイ
マウスに過剰（８．５μｍｏｌ）の遊離ｃ（ＲＧＤｆＫ）ペプチドを注射し、１時間後に化合物１３（１４０ｎｍｏｌ）を注射した。対照群には化合物１３（１４０ｎｍｏｌ）だけを注射した。化合物１３注射２４時間後に蛍光画像を撮影した。蛍光画像化メインフィルターセットを、（ｖｉｉ）に記載した通りに用いた。
【０１５９】
（ｘ）切除した腫瘍の蛍光画像化
マウスの尾部静脈に化合物１３  １５ｍｇ／ｋｇをｉ．ｖ．注射した。マウスを屠殺し、腫瘍を切除し、半分に切断し、ＸｅｎｏｇｅｎＩＶＩＳ（登録商標）システムを用いて様々な時間間隔：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰに対して１０分、１時間、４時間、及び２４時間、３日、５日、及び７日、ＭＬＳ−ｍＢａｎａｎａに対して７日画像化した。蛍光画像化に用いたフィルターセットは（ｖｉｉ）に記載されている。
【０１６０】
（ｘｉ）組織学
切除実験後、腫瘍を３．７％ホルムアルデヒド中で固定し、パラフィンブロック中に包埋した。切片を、標準条件下、ヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。
【０１６１】
（ｘｉｉ）ＰＤＴプロトコール
麻酔したマウスに、化合物１３  ７．５ｍｇ／ｋｇ又は１５ｍｇ／ｋｇをｉ．ｖ．注射した。腫瘍を１０分間又は３０分間照射した。薬物の光線の間隔は、薬物注射後８時間又は２４時間であった。１００ｍＷ／ｃｍ２の７５５ｎｍダイオードレーザー（ＣｅｒａｍＯｐｔｅｃ、ドイツ）での経皮照射を用いた。暗所の対照群では、マウスに薬物をｉ．ｖ．注射し、暗所のケージに２４時間配置した。明所の対照群では、マウスに薬物を注射せず、１００ｍＷ／ｃｍ２で１０分間照射した。ＰＤＴ後最初の２日間、マウスに鎮痛薬を適宜投与した（毎日２．５ｍｇ／ｋｇフルネキシン（Ｆｌｕｎｅｘｉｎ））。
【０１６２】
（例１）
蛍光タンパク質での腫瘍細胞のトランスフェクト
トランスフェクト方法を行って、安定してＲＦＰを発現する細胞系を作り出した。このような細胞系は、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ（組織／細胞）で、蛍光顕微鏡及び他の蛍光画像化手段によって検出することができる。自発的な中央壊死を産生することが知られているヒト胸部癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞系が、この目的に選ばれた。２つのプラスミド（図１Ａ、１Ｃ）を用い、安定なクローンを得、蛍光顕微鏡によって検出した（図２Ａ〜２Ｂを参照されたい）。修飾したｐＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ−Ｈｙｇ−Ｃ１プラスミド（図１Ｃ）から産生したクローンは、強力な蛍光を表した。修飾したｐＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ−Ｈｙｇ−Ｃ１でトランスフェクトしたクローン３（図２Ｂ）が、さらなる使用に選ばれた。
【０１６３】
トランスフェクトされた細胞はＲＦＰを恒常的に発現し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方で経時的に蛍光強度における低減はなかった。非トランスフェクト細胞に、赤色の自己蛍光はなかった。
【０１６４】
（例２）
壊死性腫瘍モデル−組織病理学的分析
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ細胞が適切な腫瘍モデルを産生することを立証するために、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ腫瘍を２つのサイズに発達させた。材料と方法、セクション（ｘｉ）に記載した通り、組織学的及び組織病理学的分析を行った。結果を図３Ａ及び３Ｂに示す。約１ｃｍ３の大型の腫瘍は非常に著しい壊死領域を示し（図３Ａ）、約０．５ｃｍ３の小型の腫瘍は壊死領域を示さなかった（図３Ｂ）。
【０１６５】
（例３）
原発性壊死性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ異種移植片腫瘍における化合物１３の取込みのｉｎ  ｖｉｖｏの蛍光画像化
ｉｎ  ｖｉｖｏの壊死性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ腫瘍（≧１ｃｍ３）における化合物１３の蓄積パターンを試験した。図４Ａ〜４Ｂ及び５Ａ〜５Ｂは、ＸｅｎｏｇｅｎＩＶＩＳ（登録商標）システムを用いて、メスＣＤ−１ヌードマウスの乳房パッドにおける、同所性ヒト胸部ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ原発腫瘍における化合物１３の蛍光シグナルの蓄積を例示するものである。上記材料と方法、セクション（ｖｉｉ）に記載したフィルターセットを用いて、全体の動物の画像を同時に記録した。１〜１．５時間ごとに９時間、及び化合物１３注射２４時間後（図４Ａ〜４Ｂ）、次いで２４時間ごとに次の７日間（図５Ａ〜５Ｂ）にダイナミック蛍光画像を獲得した。化合物１３の注射直後、動物全身からＮＩＲ蛍光を検出することができ、循環における薬物が高濃度であることを反映していた。肝臓における、及びある程度は腫瘍における蓄積に伴う循環からの急速な排除が、注射後最初の９時間に観察された（図４Ｂ）。その後日、化合物１３は腫瘍に蓄積し続け、肝臓からは完全に排除され、≧３日から注射後７日のフォローアップ期間の終わりまで、選択的な腫瘍の画像化がもたらされ（図５Ｂ）、その後の排除は極めて遅かった。腫瘍のサイズ及び位置は、ｉｎ  ｖｉｖｏの全身画像の赤色によって見たところ、実験を通して変化しなかった（図４Ａ及び５Ａ）。同様の結果が、≧１ｃｍ３の腫瘍サイズの実験動物９匹に観察された。
【０１６６】
（例４）
原発性非壊死性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ異種移植片腫瘍における化合物１３の取込みのｉｎ  ｖｉｖｏの蛍光画像化
同様のパラメータを、次に、非壊死性である≦０．５ｃｍ３の腫瘍において試験した。図６Ａ〜Ｂ及び７Ａ〜７Ｂは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰを移植したメスＣＤ−１ヌードマウスにおける化合物１３及びＲＦＰからの蛍光シグナルを表す。薬物蓄積のパターンを、上記に記載したＩＶＩＳ（登録商標）システムを用いて、及び例３におけるのと同様の時間間隔で画像化したが、その時間までに薬物が完全に排除されるので３日に限定した。これらの非壊死性腫瘍における蓄積パターンは、壊死性腫瘍に観察されたものと著しく異なっていた。化合物１３のＮＩＲ蛍光は、注射後約２時間の腫瘍において、及び直後の肝臓において（薬物注射後３．５時間）ピーク値に到達した（図６Ｂ）。壊死性腫瘍からの化合物１３の分解された蛍光とは対照的に、注射２日後には非壊死性腫瘍から実際に蛍光は観察され得なかった（図７Ａ）。動物１６匹からの蛍光の測定値の平均において、薬物注射１〜６．５時間後に腫瘍の蛍光のピークが検出された。
【０１６７】
（例５）
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ壊死性腫瘍における化合物１３の取込み及び排除の動力学
壊死性腫瘍における化合物１３の蓄積パターンを半定量的に評価するために、マウス９匹の壊死性腫瘍における化合物１３に対する蛍光シグナルの平均を計算し、２１６時間にわたって、いくつかの時間点でプロットした（図８）。注射後１２時間からその先、腫瘍からの蛍光シグナルは、側副側上の等しい対照領域の蛍光シグナルに比べて特徴的に強力になった。腫瘍と側副側の間の蛍光の比率はやがて増大し、１９２時間から約８のプラトーに到達した。
【０１６８】
（例６）
同所性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ原発性壊死性異種移植片腫瘍における化合物２４の取込み
壊死性原発性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ腫瘍における、メタル化したコンジュゲート化合物２４（ｃ（ＲＧＤｆＫ）−Ｐｄ−ＭＬＴ）のｉｎ  ｖｉｖｏの蓄積パターンを、例３に記載した同じセットの実験を用いて試験した。
【０１６９】
図９Ａ〜９Ｂ及び１０Ａ〜１０Ｂに示した結果は、化合物２４の注射直後に蛍光を検出することができることを実証しており、循環中の薬物が高濃度であることを反映している。肝臓における、及びある程度腫瘍における蓄積に伴う循環からの急速な排除が、注射後最初の８時間に観察された（図９Ｂ）。後日、化合物２４は腫瘍中に蓄積し続けたが、肝臓からの完全な排除は観察されなかった（図１０Ｂ）。化合物２４は、注射後約３日から腫瘍に対する選択的な画像化分子として働くことができ、その後の排除はとりわけ遅いように思われた。しかし、これは化合物１３よりも特異性がいくらか劣っている。腫瘍のサイズ及び位置は、赤色のｉｎ  ｖｉｖｏの全身画像によって見られる通り実験を通して変化しなかった（図９Ａ及び１０Ａ）。これらの結果は、≧１ｃｍ３の腫瘍サイズの動物３匹において観察された。
【０１７０】
（例７）
同所性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ原発性非壊死性異種移植片腫瘍における化合物２４の取込み
例６に示したのと同様の時間間隔を用いて、上記例４に記載したメスＣＤ−１ヌードマウス上に移植したＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ非壊死性腫瘍（約０．５ｃｍ３）において、化合物２４及びＲＦＰからの蛍光シグナルをさらに試験したが、その時間までに腫瘍から薬物が完全に排除されるので２日に限定した。図１１Ａ〜１１Ｂ及び１２Ａ〜１２Ｂに表した結果は、化合物１３に関して、非壊死性腫瘍における蓄積パターンが、壊死性腫瘍に観察された蓄積パターンと著しく異なっていたことを実証している。化合物２４のＮＩＲ蛍光は、注射後約２．５時間の腫瘍において、及び直後の肝臓において（薬物注射５．５時間後、図１１Ｂ）ピーク値に到達した。壊死性腫瘍からの化合物２４の蛍光の解像とは対照的に、非壊死性腫瘍から注射２４時間後に実際に蛍光は観察できなかった（図１２Ｂ）。ピーク腫瘍蛍光（動物５匹からの蛍光の平均測定値）は、薬物注射１〜４．５時間後に検出された。
【０１７１】
（例８）
マウス乳房パッド中に埋め込まれたＭＬＳ−ｍＢａｎａｎａ原発性壊死性腫瘍における化合物１３の取込み
上記の実験において得られた結果の普遍性を確立するために、壊死領域における化合物１３の蓄積を、ＭＬＳ−ｍＢａｎａｎａヒト卵巣癌細胞系から産生した様々な腫瘍タイプにおいてさらに試験した。図１３Ａ〜１３Ｂ及び１４Ａ〜１４Ｂに示す結果は、材料と方法、セクション（ｖｉｉ）に記載したＸｅｎｏｇｅｎＩＶＩＳ（登録商標）システムを用いて、メスＣＤ−１ヌードマウスの乳房パッド中に移植した皮下（ｓ．ｃ．）ヒト卵巣ＭＬＳ−ｍＢａｎａｎａ原発腫瘍における化合物１３からの蛍光シグナルの蓄積を図示するものである。蓄積のパターンを、本明細書上記例３に記載したのと同様の時間間隔でモニターしたが、その時間までに薬物は完全に排除されるので４日に限定した。注射直後、化合物１３のＮＩＲ蛍光は、肝臓及び腫瘍から大部分検出された。肝臓及び腫瘍における蓄積に伴う循環からの迅速な排除が、注射後最初の８時間に生じる（図１３Ｂ）。２日後、化合物１３は腫瘍中に蓄積し続け、一方、肝臓からは殆ど排除され、周囲の干渉のない、腫瘍の選択的な画像化がもたらされた（図１４Ｂ）。ＭＬＳ−ｍＢａｎａｎａ壊死性腫瘍からの排除は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ壊死性腫瘍からの排除よりも著しく速く、３日目には殆ど完了した。腫瘍のサイズ及び位置は、赤色のｉｎ  ｖｉｖｏの全身の画像によって見られるように、実験を通して変化しなかった（図１３Ａ及び１４Ａ）。これらの結果は、≧１ｃｍ３の腫瘍サイズの動物３匹において観察された。
【０１７２】
（例９）
マウス乳房パッド中に埋め込まれたＭＬＳ−ｍＢａｎａｎａ原発性非壊死性腫瘍における化合物１３の取込み
長時間の薬物の蓄積を示さない、非壊死性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ腫瘍における結果に鑑みて、ＭＬＳ−ｍＢａｎａｎａ非壊死性腫瘍における長時間の蓄積を試験した。図１５Ａ〜１５Ｂ及び１６Ａ〜１６Ｂに示した結果は、ＭＬＳ−ｍＢａｎａｎａ非壊死性腫瘍における化合物１３からの蛍光シグナルを表している。蓄積のパターンを、材料と方法、セクション（ｖｉ）に記載した通りに、例４に記載したのと同様の時間間隔を用いてモニターしたが、薬物はその時間までに殆ど完全に排除されるので４日に限定した。非壊死性腫瘍における蓄積パターンは、壊死性腫瘍における蓄積パターンといくらか類似していた。化合物１３のＮＩＲ蛍光は、注射後約１時間の腫瘍においてピーク値に到達した（図１５Ｂ）。肝臓における蓄積は、最初の１時間から検出された。
【０１７３】
図１７Ａ〜１７Ｂに示すように、同じ直線の蛍光スケール上で壊死性腫瘍と非壊死性腫瘍とを比べた場合、壊死性腫瘍中の化合物１３の濃度は非壊死性腫瘍中の濃度よりもはるかに高いと思われる。腫瘍の蛍光のピーク（動物４匹からの蛍光測定値の平均）は、薬物注射１〜３．５時間後に検出された。
【０１７４】
（例１０）
化合物１３蓄積のｃ（ＲＧＤｆＫ）部分に対する依存
化合物１３の腫瘍の取込み、及び得られたＮＩＲ蛍光シグナルの蓄積はＲＧＤ部分によって駆り立てられるか否かを決定するために、２つの実験を行った。第１の実験において、化合物１３注射後、様々な時間の蛍光シグナルの蓄積を、乳房パッドにＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ非壊死性（≦０．５ｃｍ３）及び壊死性（約１ｃｍ３）腫瘍を移植したＣＤ−１ヌードマウスに、遊離２Ｈ−ＭＬＴ（化合物２５）を注射した蛍光シグナルの蓄積と比べた。第２の実験は、化合物１３と遊離ｃ（ＲＧＤｆＫ）の間の競合アッセイであった。
【０１７５】
１０．１  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ原発性、壊死性、及び非壊死性腫瘍における化合物２５の取込み
壊死性腫瘍及び非壊死性腫瘍の両方に対して、化合物２５を最初に注射して１〜１．５時間ごとに８．５〜９時間、及び２４時間（図１８Ａ〜１８Ｂ、及び２０Ａ〜２０Ｂ）、並びにその後３日間２４時間ごとに（図１９Ａ〜１９Ｂ及び２１Ａ〜２１Ｂ）、ダイナミック蛍光画像を獲得した。化合物２５のＮＩＲ蛍光シグナルは、任意の濃度を全て観察した場合、注射後５〜１０分の腫瘍において最高濃度に到達した。蛍光シグナルの値は、（ずっと長い時間間隔で）化合物１３に対して最大に観察された値よりも約２桁小さかった。蛍光シグナルは、注射後２０分に、すでに有意でない値に低下した。一方、蛍光シグナルは、大部分肝臓中及び心臓中に蓄積した。同じ挙動が、壊死性腫瘍を有する動物３匹（図１８Ｂ）、及び非壊死性腫瘍を有する動物２匹に（図２０Ｂ）観察された。
【０１７６】
１０．２  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ原発性非壊死性腫瘍に対する化合物１３と遊離ｃ（ＲＧＤｆＫ）の間の結合の競合アッセイ
特異的な結合を証明するために、遊離ｃ（ＲＧＤｆＫ）リガンドによって化合物１３の蓄積を阻止しようという実験を行った。例３に記載したように、ｃ（ＲＧＤｆＫ）の事前の注射あり又はなしで、化合物１３を投与した。結果を図２２Ａ〜２２Ｄに実証する。化合物１３を遊離ｃ（ＲＧＤｆＫ）投与後に投与した場合、腫瘍中の蓄積は２４時間後に検出されなかったが（図２２Ｃ）、対照群において、化合物１３を単独投与した場合、腫瘍中の蓄積は検出可能であり（図２２Ｄ）、ｃ（ＲＧＤｆＫ）部分による腫瘍に対する化合物１３の特異的な結合を指摘していた。
【０１７７】
（例１１）
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ壊死性腫瘍領域における化合物１３の特異的な蓄積
乳房パッド中に埋め込まれた壊死性及び非壊死性の胸部腫瘍異種移植片の、著しく異なるダイナミック蛍光パターンは、腫瘍組織学と化合物１３の蛍光シグナル蓄積の間の相関を調査する動機となった。そこで、化合物１３を注射した後、示された時間に腫瘍を切除し、半分に切断した。材料と方法、セクション（ｖｉｉ）に記載したようにＸｅｎｏｇｅｎＩＶＩＳ（登録商標）システムを用いて、いくつかの時間点に（注射後１０分、１時間、４時間、及び２４時間、３日、５日、及び７日）画像を撮影した。図２３〜２９に示した結果は、様々な時間点の化合物１３の蛍光の蓄積を示している。各時間点に対して、動物３匹を試験した。薬物注射１０分から４時間後まで、生存領域にのみ薬物の蛍光が観察された（図２３〜２５）。４時間では、壊死領域に向っていくらかの拡散があった。注射後３日から蓄積のパターンが復帰し、蛍光は壊死ゾーンに完全に移動し、周囲の生存細胞に向っていくらかの残りの蛍光の拡散があった（図２７Ｆ）。これらの結果は、５日間及び７日間でも観察された（図２８〜２９）。重要なことに、注射後２４時間に、壊死領域からの高い薬物の蛍光とともに特異的な腫瘍の蛍光がすでに明らかに観察されたが、腫瘍の境界は３日間隔と比べるとそれほど鋭く規定されていなかった（図２６Ｆ）。このセットの実験において、時間の進行とともに化合物１３は生存領域を通って壊死領域中に移動し、長時間そこに特異的に蓄積することが示された。
【０１７８】
（例１２）
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ壊死性腫瘍領域における化合物２４の特異的蓄積
化合物１３に対して観察された蓄積のパターンに鑑みて、他のＢｃｈｌ誘導体を試験した。化合物２４の蓄積のパターンをモニターし、得られた同様の結果が得られた。薬物注射９日後に切除した腫瘍に対する結果を図３０Ａ〜３０Ｆに示す。画像を、上記に記載したとおりＸｅｎｏｇｅｎＩＶＩＳ（登録商標）システムを用いて撮影した。図３０Ｆに見られるように、薬物注射９日後、薬物は腫瘍の壊死領域中に明らかに存在した。これらの結果は、実験した動物全てに（Ｎ＝３）観察された。薬物注射３日後及び５日後に腫瘍を切除した場合に、同様の結果が観察された（各時間点に対してＮ＝３）。
【０１７９】
（例１３）
ＭＬＳ−ｍＢａｎａｎａ壊死性腫瘍領域における化合物１３の特異的な蓄積
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ腫瘍の壊死領域中に観察された化合物１３及び化合物２４両方の蓄積はこの現象の普遍性、並びに治療及び画像化におけるこの潜在的な適用を試験する動機付けをもたらした。そこで、様々なタイプの腫瘍−ＭＬＳ−ｍＢａｎａｎａヒト卵巣癌を用いた。ここでは結果はいくらか異なっていた。ほとんどの場合、このタイプの腫瘍における壊死パターンは中央ではなく、即ち腫瘍の中央に特異的に位置せず、又は腫瘍において一箇所から産生されない、広範囲に広がる壊死が存在した。これらの場合、蓄積は長期間ではなかった。中央壊死が観察されたいくつかの場合において、蓄積パターンはＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ腫瘍における蓄積パターンと同様であった。図３１〜３２は薬物注射７日後に得られた結果を示す。見られるように、中央壊死が観察された場合、薬物は腫瘍の壊死領域に明らかに存在し（図３１Ｆ）、中央壊死が存在しない場合は存在しなかった（図３２Ｆ）。
【０１８０】
（例１４）
切除した腫瘍の画像及び壊死性腫瘍の組織学的切片
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ壊死性腫瘍を切除し、腫瘍の組織学的切片を染色した（ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ））。図３３Ａ〜３３Ｄは、薬物注射４時間後に切除した腫瘍の、腫瘍生存領域及び壊死領域の組織学的切片を示す。これらの所見は、先に得られたＲＦＰ及び化合物１３の組織分布を補完しなければならない。図３３Ａに見られるように、塊のバルク（ｂａｌｋ）は、不透明で、褐色の壊死性組織からなる。図３３Ｂから、肉眼と顕微鏡の特徴の間の相関に注目することができる。中央の壊死組織は好酸性から過好酸性であり、核溶解が広範で、核濃縮及び核崩壊は少なかった。壊死組織中への多核好中球の軽度の浸潤が、殆ど壊死領域の境界に存在した。生存領域は腫瘍の周囲に限られていた。これらは、高密度の細胞シートに整列された新生物細胞の無秩序な増殖からなっていた（図３３Ｄ）。新生物細胞は、丸型から不規則であり、核：細胞質比が高く、小胞の核が不規則であった。注射４時間後の化合物１３の蛍光は、生存領域及び壊死領域の両方に対して、組織学的結果に良好に相関した（図２５Ｆ）。薬物を注射しなかった対照の腫瘍を含めて、試験した壊死性腫瘍全てに対して同様の相関が得られた。
【０１８１】
（例１５）
化合物１３を用いたｉｎ  ｖｉｖｏのＰＤＴ試験
一般的に、ｉｎ  ｖｉｖｏのＰＤＴ試験に対して、上記に記載したようにメスマウスの背部又は乳房の脂肪パッド上に蛍光ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ胸部癌細胞又はＭＬＳ−ｍＢａｎａｎａ卵巣癌細胞を皮下的に接種することによって、マウス腫瘍モデルを産生し、壊死（≧１ｃｍ３）又は非壊死（約０．５ｃｍ３）のサイズに増殖させる。マウスを麻酔し、７．５〜１５ｍｇ／ｋｇの間の様々な濃度の薬物をｉ．ｖ．注射する。腫瘍を１０分間又は３０分間照射し、薬物の光線の間隔は薬物注射後４〜２４時間の間である。
【０１８２】
最適の処置条件を得るために、ＣＤ−１ヌードマウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ腫瘍に対する化合物１３の効果を試験するいくつかのプロトコールを適用した。結果を表１に概略する。
【０１８３】
表１に見られるように、７．５ｍｇ薬物／ｋｇ体重及び１０分の照射により、壊死性腫瘍及び非壊死性腫瘍の両方に対する最良の光線力学的処置の結果がもたらされる。図３４Ａ〜３４Ｂに示す結果は、非壊死性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ腫瘍に対する完全な治癒を実証するものである。処置１日後に浮腫が検出され、その後４日後に軽度の、やがてより広範な壊死が検出された。７日目までに腫瘍の平坦化が観察された。傷は治癒し、ＰＤＴ９０日後に動物は治癒した。ＲＦＰの蛍光に対して先に記載した通りＸｅｎｏｇｅｎＩＶＩＳ（登録商標）システムを用いて、結果をやはり試験した。９０日後、腫瘍の蛍光シグナルは存在しなかった。
【表１】
0005620279.tif 000003
【０１８４】
（例１６）
ヌードマウス／ラットの乳房における局所性非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）モデルの確立
いくつかの細胞系を用いて、マウス及びラットにおけるＤＣＩＳモデルを確立する。第１に、Ｆ−３４４ラットと同系であるＭＡＤＢ１０６細胞を、ラットの乳房パッドに上首尾に（同所性に）以前に埋め込んでおいた。このモデルは、これまでに、様々なＲＧＤ−Ｂｃｈｌ誘導体を有するＰＤＴの有効性、及びその後の抗腫瘍の長時間の免疫の発症をスクリーニングするために用いられている。ラット乳房癌腫瘍に対して同じプロトコールを用いて、２つのヒト細胞系及びさらなるマウス細胞系を同所性に埋め込み、肺及びリンパ節における転移を得る。ｈＴ４７Ｄ及びＨＣＣ１３９５の最初の２つは、ＡＴＣＣ規定及び文献（Ｇａｚｄａｒら、１９９８年）に従って増殖され、ヌード動物の乳房パッドに対する同種移植片として注射される管癌細胞系（ＨＣＣ１３９５は、ＤＣＩＳにできるだけ近いステージ１の原発性乳管癌である）である。第３（４Ｔ１）は、細胞を尾静脈に注射して数週間後に肺の転移を産生するマウス乳房細胞系である。この様々な細胞系により、本発明者らは、胸部癌モデルとして、乳房癌の原発病変、局所的に再発したもの、及び遠隔性の転移に対する（Ｂｃｈｌ誘導体／Ｂｃｈｌ−ＲＧＤ）−ＰＤＴの効果を研究できる。４Ｔ１細胞にルシフェラーゼ及び他の２つの細胞系をトランスフェクトする。ｐＤｓＲｅｄ１−Ｃ１での４Ｔ１のトランスフェクトは現在進行中である。このような蛍光により、（１）Ｂｃｈｌ−ＲＧＤベースの蛍光又はＭＲＩを用いた検出の正確さの評価、（２）非常に高い感度での無処置の動物におけるＢｃｈｌ−ＰＤＴ下の腫瘍の増殖及び退縮のオンラインのモニタリングが可能である。
【０１８５】
（例１７）
一般概念としての壊死蓄積概念の確立
発生時に中央壊死を発生する腫瘍タイプが存在する。このような腫瘍の２つが、以下の細胞系から発生した腫瘍から試験するのに選択されている：ヒトＤＣＩＳ  ＭＣＦ７胸部癌、ヒトＤＣＩＳ  ＭＣＦ１０ＤＣＩＳ（Ｔａｉｔら、２００７年）、ヒトグリア芽細胞腫Ｕ８７、ヒト炎症性胸部癌（ＩＢＣ）ＷＩＢＣ−９（Ｓｈｉｒａｋａｗａら、２００１年）、及びＲＣＣ。
【０１８６】
選択された細胞系は、上記材料と方法、セクション（ｉｉｉ）に記載する通り、修飾型ｐＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ−Ｈｙｇ−Ｃ１プラスミド及びリポフェクタミン（商標）２０００トランスフェクト試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を用いてトランスフェクトを受ける。細胞を、可能であれば同所性に、又はＣＤ−１ヌードマウス中ｓ．ｃ．に埋め込み（各細胞型に対する要求に従って、１〜５×１０６細胞）、所望の限界サイズ（約１ｃｍ３）に増殖させ、壊死を発生させる。壊死領域を組織学的に追跡する。上記の細胞系から発生した２つの適切な腫瘍モデルを、壊死ゾーン、増殖速度、及び画像化のパラメータに基づいてさらなる試験用に選択する。
【０１８７】
全身の蛍光画像化に対して、上記に記載したようにマウスを麻酔し、尾部静脈に化合物１３をｉ．ｖ．注射する（１５ｍｇ／ｋｇ）。薬物及び腫瘍の蛍光を、上記に記載したようにＩＶＩＳ（登録商標）１００画像化システム（Ｘｅｎｏｇｅｎ）によってモニターする。
【０１８８】
切除した腫瘍の蛍光画像化に対して、マウスの尾部静脈に１５ｍｇ／ｋｇの化合物１３をｉ．ｖ．注射する。次いで、様々な時間点でマウスを屠殺し、腫瘍を切除し、半分に切断する。切除した腫瘍の画像化及び壊死領域を評価するためのそれらの組織学的染色を、上記材料と方法、セクション（ｘ）及び（ｘｉ）に従って行う。腫瘍の中央壊死領域における化合物１３の蓄積は、細胞系の起源とは無関係に期待される。
【０１８９】
（例１８）
様々なＲＧＤ部分にコンジュゲートした化合物２５の蓄積パターン
ＲＧＤターゲティングの関連性をさらに確立するために、様々なＲＧＤペプチド及び陰性対照を用いて、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ腫瘍における蓄積のパターンを試験する。
【０１９０】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ細胞を、メスＣＤ−１ヌードマウスに同所性に埋め込み（５×１０６細胞）、１ｃｍ３の壊死サイズに増殖させる。マウスを麻酔し、１５ｍｇ／ｋｇの化合物２６（直鎖ＧＲＧＤＳＰ−２Ｈ−ＭＬＴ）、化合物４５（ｃ（ＲＡＤｆＫ）−２Ｈ−ＭＬＴ）、及び化合物３６（ｃ（ＲＧＤｙＫ）２−２Ｈ−ＭＬＴ）を尾部静脈にｉ．ｖ．注射する。無処置動物における薬物のｉｎ  ｖｉｖｏの蛍光、及び切除した腫瘍の蛍光画像化、及び組織学を、上記材料と方法、セクション（ｖｉｉ）、（ｘ）、及び（ｘｉ）にそれぞれ記載した通りに行う。
【０１９１】
（例１９）
壊死領域における他のＢｃｈｌ−ＲＧＤ誘導体の蓄積
壊死における蓄積パターンが、治療及び／又は画像化の潜在性を有するＢｃｈｌ−ＲＧＤ誘導体全てに対する一般的パラダイムであるか否かを調べるために、さらなるＢｃｈｌ−ＲＧＤ誘導体を試験する。具体的には、化合物１５（ｃ（ＲＧＤｆＫ）−Ｃｕ−ＭＬＴ）及び化合物１４（ｃ（ＲＧＤｆＫ）−Ｍｎ−ＭＬＴ）誘導体を試験する。
【０１９２】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ細胞を、メスＣＤ−１ヌードマウスに同所性に埋め込み（５×１０６細胞）、１ｃｍ３の腫瘍サイズに増殖させる。
【０１９３】
メタル化（例えば、Ｃｕ及びＭｎ）によりＢｃｈｌの蛍光が消失する場合に、腫瘍組織及び非腫瘍組織における化合物濃度を、Ｂｒａｎｄｉｓら（Ｂｒａｎｄｉｓら、２００５年）によって記載されているようにＥＬＡＮ−６０００機器（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ＣＴ）を用いて誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）によって測定する。
【０１９４】
（例２０）
体内分布アッセイ
この実験は、薬物の伝播及び身体の様々な器官における蓄積の経過を定量し、実際に薬物が最終的に腫瘍中に蓄積する普遍的な方法で実証することを目的とする。
【０１９５】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ腫瘍を有するマウスを麻酔し、１５ｍｇ／ｋｇの化合物１３をｉ．ｖ．注射する。注射後いくつかの時間点でマウスを屠殺する。組織（血液、腎臓、肝臓、皮膚、脂肪、筋肉、脾臓、腸、脳、心臓、肺、及び腫瘍）を予め重量測定したバイアル中に採取し、冷凍する。組織試料をホモジナイズし、薬物をメタノール中抽出する（組織１００ｍｇあたりメタノール約１ｍｌ）。次いで、試料を蛍光分析によって薬物含量に対して分析する。
【０１９６】
様々な組織における化合物１３の蓄積の定量を蛍光強度の測定によって行い、エタノール中様々な濃度の化合物１３の蛍光強度を測定することによって得た検量線を基準として用いて、薬物濃度を評価する。上記例３において様々な時間点で得られたｉｎ  ｖｉｖｏのＮＩＲ蛍光画像を、体内分布アッセイからの抽出物の蛍光強度と比べる。結果を用いてｉｎ  ｖｉｖｏ測定を検証する。
【０１９７】
ｉｎ  ｖｉｖｏとｉｎ  ｖｉｔｒｏの蛍光測定の間に直線状の相関が見出されることが予想される。定量分析は、腫瘍組織及び正常組織からの様々な蓄積及び排除をより正確に示すことも予想される。このような測定は、臨床の場にとって非常に有用であり得る。
【０１９８】
（例２１）
画像化及び治療用の、放射性同位元素とのメタレートしたＲＧＤ−バクテリオクロロフィル誘導体
別の治療オプションは、薬物の中央の金属を放射性の金属で置き換えることである。Ｍの寿命が（治療に対して）比較的長いＲＧＤ−Ｍ−Ｂｃｈｌ誘導体などの蓄積は、腫瘍の放射線治療に用いることができる。薬物が身体中に低濃度で留まるが、壊死領域中に次第に蓄積するような間隔で、薬物を投与することもできる。
【０１９９】
薬物に対するＣｕの組込みは、周囲温度で１０〜２０分以内に２Ｈ−Ｂｃｈｌ−ＲＧＤの定量的メタル化を可能にする、本発明者らの研究室で開発された方法によって行われる。得られた化合物は非常に安定で、生理学的条件下でデメタレーション（ｄｅｍｅｔａｌｌａｔｉｏｎ）は起こらない。
【０２００】
腫瘍組織における放射性化合物の蓄積を示すこと、及び、１つ又は２つの処置の後腫瘍の退縮が観察されることが予想される。
（参考文献）
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ−３Ｂ】
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【図１７Ａ−１７Ｂ】
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【図２２Ａ−２２Ｄ】
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【図２３Ａ−２３Ｆ】
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【図２４Ａ−２４Ｆ】
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【図２５Ａ−２５Ｆ】
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【図２６Ａ−２６Ｆ】
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【図２７Ａ−２７Ｆ】
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【図２８Ａ−２８Ｆ】
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【図２９Ａ−２９Ｆ】
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【図３０Ａ−３０Ｆ】
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【図３１Ａ−３１Ｆ】
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【図３２Ａ−３２Ｆ】
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【図３３Ａ−３３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図３４】
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【配列表】
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